DE69726741T2

DE69726741T2 - Verwendungen von angiogenischer factor vegf145 in der behandlung von kardiovaskulaeren krankheiten

Info

Publication number: DE69726741T2
Application number: DE69726741T
Authority: DE
Inventors: Gera Neufeld; Eli Keshet; Israel Vlodavsky; Zoya Poltorak
Original assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd; Collateral Therapeutics Inc
Current assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd; Collateral Therapeutics Inc
Priority date: 1996-09-06
Filing date: 1997-09-04
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2017-09-05
Also published as: KR20000068506A; CN1236390A; EA199900262A1; IL128727A; CA2265252C; EP0925360A1; EA004646B1; JP2001500728A; NZ334508A; AU4247197A; EP0925360B1; WO1998010071A1; IL128727A0; CA2265252A1; US6583276B1; US6589782B1; ES2212127T3; AU737898B2; ATE256186T1; HK1020756A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Kardiovaskuläre Erkrankungen sind allgemein gekennzeichnet durch eine beeinträchtigte Blutversorgung des Herzens oder anderer Zielorgane. Myokardinfarkte (MI), üblicherweise als Herzanfälle bezeichnet, sind führende Todesursache, da 30% in den ersten Monaten nach dem Herzanfall tödlich verlaufen. Herzanfälle sind das Ergebnis verengter oder blockierter Koronararterien im Herzen, wodurch das Herz nur mangelhaft mit den nötigen Nährstoffen und Sauerstoff versorgt wird. Wenn die Blutversorgung des Herzens gefährdet ist, reagieren die Zellen unter Bildung von Verbindungen, die das Wachstum neuer Blutgefässe induzieren, um die Blutversorgung des Herzens zu steigern. Diese neuen Blutgefässe werden als kollaterale Blutgefässe bezeichnet. Der Vorgang, durch welchen neue Blutgefässe zum Wachstum ausserhalb des bestehenden Blutgefässsystems induziert werden, wird Angiogenese genannt, und die Substanzen, die von den Zellen zum Induzieren von Angiogenese erzeugt werden, sind die angiogenetischen Faktoren.
Leider ist die körpereigene natürliche angiogenetische Reaktion begrenzt und oft inadäquat. Aus diesem Grunde hat die Entdeckung angiogenetischer Wachstumsfaktoren zur Entwicklung von alternativen therapeutischen Strategien geführt, welche die Ergänzung der natürlichen angiogenetischen Reaktion durch Versorgung mit exogenen angiogenetischen Substanzen zum Ziel haben.
Man hat schon versucht, die Angiogenese durch Verabreichen verschiedener Wachstumsfaktoren zu stimulieren. U.S. 5'318'957, Cid et al., beschreiben ein Verfahren zur Stimulierung von Angiogenese durch Verabreichung von Haptoglobinen (Glykoproteine mit zwei durch Disulfidverbindungen verknüpften Polypeptidketten). Intrakoronare Injektion eines rekombinanten Vektors, der den menschlichen Fibroblastenwachstumsfaktor-5 (FGF-5) in einem Tiermodell exprimiert (d. h. Gentransfer in vivo), führte zu einer erfolgreichen Besserung von Anomalien bei der Durchblutung und Funktion des Herzmuskels. (Giordano, F. J., et al., Nature Med. 2, 534–539 (1996)). Auch rekombinante Adenoviren wurden verwendet, um angiogenetische Wachstumsfaktoren in vivo zu exprimieren. Hierzu gehört der acidische Fibroblastwachstumsfaktor (Muhlhauser, J. et al., Hum. Gene Ther. 6, 1457–1465 (1995)), und eine der VEGF-Formen, nämlich VEGF₁₆₅ (Muhlhauser, J. et al., Circ. Res. 77, 1077-1086 (1995)).
Eine der Reaktionen des Herzmuskels auf Durchblutungsstörungen umfasst die Aktivierung des Gens, das für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor ("VEGF" = Vascular Endothelial Growth Factor, mit „VEGFs" als Pluralform) kodiert (Banai, S. et al., Cardiovasc. Res. 28: 1176–1179 (1994)). Die VEGFs sind eine Familie von angiogenetischen Faktoren, die das Wachstum neuer kollateraler Blutgefässe induzieren. Die Wachstumsfaktoren der VEGF-Familie sind spezifisch angiogenetische Wachstumsfaktoren, die fast ausschliesslich auf Endothelzellen (ausgekleidete Blutgefässzellen) abzielen (berichtet von Ferrara et al., Endocr. Rev. 13: 18–32 (1992); Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146: 1029–39 (1995); Thomas, J. Biol. Chem. 271: 603–06 (1996)). Die Expression des VEGF-Gens steht in räumlichem und zeitlichem Zusammenhang mit Ereignissen der physiologischen Angiogenese, und die Auslöschung des VEGF-Gens durch gezielte Genstörung bei Mäusen führt zu Embryonentod, weil sich die Blutgefässe nicht entwickeln. Es ist deshalb der einzige bekannte angiogene Wachstumsfaktor, der als spezifischer physiologischer Regulator der Angiogenese zu wirken scheint.
In vivo induzieren die VEGFs die Angiogenese (Leung et al., Science 246: 1306–09 (1989)) und erhöhen die Gefässdurchlässigkeit (Senger et al., Science 219: 983–85 (1983)). Die VEGFs sind jetzt als wichtige physiologische Regulatoren der kapillaren Blutgefässbildung erkannt. Sie sind beteiligt an der normalen Bildung von neuen Kapillaren, einschliesslich des Organwachstums, des fötalen Wachstums (Peters et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8915–19 (1993), der Wiederherstellung von Gewebe (Brown et al., J. Exp. Med. 176: 1375–79 (1992)), dem Menstruationszyklus und der Schwangerschaft (Jackson et al., Placenta 15: 341–53 (1994); Cullinan & Koos, Endocrinology 133: 829–37 (1993); Kamat et al., Am. J. Pathol. 146: 157–65 (1995)). VEGFs scheinen während der fötalen Entwicklung eine wesentliche Rolle in der de novo Bildung von Blutgefässen aus Blutinseln zu spielen (Risau & Flamme, Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 11: 73–92 (1995)), wie anhand Entwicklung und Sterblichkeit von Embryos nachgewiesen wurde, denen ein einzelnes VEGF-Allel fehlte (Carmeliet et al., Nature 380: 435–38 (1996)). Ausserdem werden VEGFs in Verbindung gebracht mit krankhaftem Blutgefässwachstum, das für viele Krankheiten chrakteristisch ist, einschliesslich fester Tumore (Potgens et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 3: 57–70 (1995)), Retinopathien (Miller et al., Am. J. Pathol. 145: 574–84 (1994); Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331: 1480–87 (1994); Adamis et al., Am. J. Ophthalmol. 118: 445–50 (1994)), Schuppenflechte (Detmar et al., J. Exp. Med. 180: 1141–46 (1994)) und rheumatoider Arthritis (Fava et al., J. Exp. Med. 180: 341–46 (1994)).
Am Modell der chronischen Extremitätenischämie bei Kaninchen wurde gezeigt, dass wiederholte intramuskuläre Injektion oder ein einzelner intraarterieller Bolus von VEGF die kollaterale Blutgefässbildung erhöhen kann, wie durch Messungen der Durchblutung von ischämischen hinteren Extremitäten bewiesen wurde (Pu et al., Circulation 88: 208–15 (1993); Bauters et al., Am. J. Physiol. 267:H1263-71 (1994); Takeshita et al., Circulation 90 [Teil 2], II-228-34 (1994); Bauters et al., J. Vusc. Surg. 21: 314–25 (1995); Bauters et al., Circulation 91: 2802-09 (1995); Takeshita et al., J. Clin. Invest. 93: 662–70 (1994)). Bei diesem Modell wurde auch gefunden, dass VEGF mit basischem FGF zur Besserung der Ischämie synergetisch zusammenwirkt (Asahara et al., Circulation 92:[Anhang 2], II-365-71 (1995)). Es wurde auch berichtet, dass VEGF die Wiederherstellung des ballongeschädigten Karotisepithels bei Ratten beschleunigt, während es gleichzeitig die krankhafte Verdickung der darunterliegenden glatten Muskelschichten verhindert, wobei Lumen-Durchmesser und Durchblutung erhalten blieben (Asahara et al., Circulation 91: 2793–2801 (1995)). Es wurde auch gezeigt, dass VEGF die EDRF (Endothelinderivierter Relaxin-Faktor (Stickoxid))-abhängige Relaxation von Koronararterien bei Hunden induziert und dadurch möglicherweise zur erhöhten Durchblutung ischämischer Bereiche über einen, nicht mit der Angiogenese zusammenhängenden Sekundärmechanismus beiträgt (Ku et al., Am. J. Physiol. 265: H586–H592 (1993)).
Die Aktivierung des Gens, das für VEGF kodiert, führt durch abwechselndes Spleissen zur Bildung von mehreren unterschiedlichen VEGF-Varianten oder Isoformen, wobei dieselbe chromosomale DNA zu verschiedenen mRNA-Transkripten führt, die unterschiedliche Exone enthalten und dadurch unterschiedliche Proteine erzeugen. Solche Varianten wurden zum Beispiel in U.S. 5'194'596 von Tischer et al. beschrieben, wo humanvaskuläre Endothel-Zellwachstumsfaktoren bestimmt wurden, die eine Peptidsequenzlänge von 121 und 165 Aminosäuren (d. h. VEGF₁₂₁ und VEGF₁₆₅) aufweisen. Ausserdem wurden auch VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₆ beschrieben und über diese berichtet (Neufeld, G. et al., Cancer Metastasis Rev. 15: 153–158 (1996)).
Wie in 1 dargestellt, enthält der durch die Exone 1–5 kodierte Bereich Informationen, die zur Erkennung der bekannten VEGF-Rezeptoren KDR/flk-1 und flt-1 (Keyt, B. A. et al., J Biol. Chem. 271: 5638–5646 (1996)) erforderlich sind, und ist bei allen bekannten VEGF-Isoformen vorhanden. Die durch das Exon 8 kodierten Aminosäuren sind ebenfalls in allen bekannten Isoformen vorhanden. Die Isoformen können jedoch durch An- oder Abwesenheit der durch Exone 6 und 7 des VEGF-Gens kodierten Peptide unterschieden werden, und die An- oder Abwesenheit der durch diese Exone kodierten Peptide zieht strukturelle Unterschiede nach sich, die in funktionelle Unterschiede zwischen den VEGF-Formen übersetzt werden (berichtet in: Neufeld, G. et al., Cancer Metastasis Rev. 15, 153–158 (1996)).
Das Exon 6 kann nach 72 bp am Donatorspleissort terminieren, wobei es 24 Aminosäuren zu VEGF-Formen beiträgt, die es als VEGF₁₈₉ enthalten. Diese Exon-6-Form wird als Exon 6a bezeichnet. Die VEGF RNA kann jedoch am 3'-Ende von Exon 6 durch Benützung eines abwechselnden Spleissortes, angeordnet bei 51 bp stromabwärts vom ersten gespleisst werden, wodurch sich ein grösseres Exon-6-Produkt ergibt, das 41 Aminosäuren enthält. Die zusätzlichen 17 Aminosäuren, die als Ergebnis dieses abwechselnden Spleissens zum Exon-6-Produkt zugefügt wurden, werden hier als Exon 6b bezeichnet. VEGF₂₀₆ enthält das verlängerte Exon 6, das aus 6a und 6b zusammengesetzt ist, aber diese VEGF-Form ist viel seltener als VEGF₁₈₉ (Tischer, E. et al., J Biol. Chem. 266, 11947–11954; Houck, K. A. et al., Mol. Endocrinol. 12, 1806–1814 (1991)).
Eine mutmassliche fünfte Form von VEGF, VEGF₁₄₅, wurde durch Anwendung von PCR in menschlichen Endometrium festgestellt. Die Autoren sagen, dass die cDNA-Sequenz der VEGF₁₄₅-Spleissvariante anzeigte, dass sie die Exone 1–5, 6 und 8 enthielt. Es ist jedoch unsicher, ob die Autoren gefunden haben, dass die Spleissvariante die Exone 6a und 6b wie in VEGF₂₀₆, das Exon 6a wie in VEGF₁₈₉ oder das Exon 6b enthielt. Die Autoren sagen, dass deshalb, weil die Spieissvariante das Exon 6b behält, es wahrscheinlich sei, dass es von den Zelle ebenso wie die anderen Mitglieder der Familie, die dieses Exon enthalten, zurückbehalten wird (Charnock-Jones et al., Biology of Reproduction 48, 1120–1128 (1993). Siehe auch Bacic, M. et al., Growth Factors 12, 11–15 (1995)). Die Bioaktivität dieser Form wurde bisher nicht festgestellt. (Cheung, C. Y. et al., Am. J. Obstret Gynecol., 173, 753–759 (1995); Anthony, F. W. et al., Placenta, 15, 557–561 (1994)). Die verschiedenen Isoformen und die Exone, die für die Isoformen kodieren, sind in 1 dargestellt.
Die vier bekannten Formen von VEGF entstehen durch abwechselndes Spleissen von bis zu acht Exonen des VEGF-Gens (VEGP₁₂₁, Exone 1–5, 8; VEGF₁₆₅, Exone 1–5, 7, 8; VEGF₁₈₉, Exone 1–5, 6a, 7, 8; VEGF₂₀₆ Exone 1–5, 6a, 6b, 7, 8 (Die Exone 6a und 6b beziehen sich auf 2 alternativ gespleisste Formen desselben Exons)) (Houck et al., Mol. Endocr. 5: 1806–14 (1991)). Alle VEGF-Gene kodieren für Signalpeptide, die das Protein auf den sekretorischen Weg lenken. Beispielsweise kodiert die VEGF₁₆₅-cDNA für eine 191-Aminosäure-Restsequenz, die aus einer sekretorischen 26-Signalpeptid-Restsequenz besteht, die bei Sekretion des Proteins aus Zellen gespalten wird, und der reifen 165-Proteinrest-Untereinheit. Allerdings wurde nur bei VEGF₁₂₁ und VEGF₁₆₅ gefunden, dass sie leicht von Zellen sekretiert, wohingegen VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₆ mit den Erzeugerzellen assoziiert bleiben. Diese VEGF-Formen besitzen eine zusätzliche hochbasische Sequenz, die durch Exon 6 entsprechend den Resten 115–139 in VEGF₁₈₉ und den Resten 115–156 in VEGF₂₀₆ kodiert wird. Diese Additionen verleihen eine hohe Affinität zu Heparin und die Fähigkeit zur Assoziation mit der extrazellulären Matrix (Matrixtargetsequenz) (Houck, K. A. et al., J. Biol. Chem. 267: 26031–37 (1992) und Thomas, J. Biol. Chem. 271: 603–06 (1996)). Die mitogenen Aktivitäten von VEGF₁₂₁ und VEGF₁₆₅ sind ausweislich der Ergebnisse verschiedener Gruppen (Neufeld, G. et al., Cancer Metastasis Rev. 15: 153–158 (1996) ähnlich, obwohl eine Forschungsgruppe Hinweise darauf gefunden hat, dass VEGF₁₂₁ signifikant weniger aktiv ist (Keyt, B. A. et al., J. Biol. Chem. 271: 7788–7795 (1996)). Es ist nicht klar, ob die zwei längeren VEGF-Formen, VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₆, so aktiv oder weniger aktiv sind, als die beiden kürzeren Formen, da sie nicht in der für quantitative Messungen erforderlichen reinen Form erhalten werden konnten. Dieses Versagen ist teilweise durch deren starke Assoziation mit den Erezeugerzellen und extrazellulären Matrizen bedingt, die durch Anwesenheit von Exon-6-derivierten Sequenzen beeinträchtigt wird, was offenbar in Synergie mit Exon-7-derivierten Sequenzgruppen wirkt (Neufeld, G. et al, Cancer Metastasis Rev. 15: 153–158 (1996)).
Wie hier ausführlicher beschrieben ist, hat jede der oben charakterisierten VEGF-Spleissvarianten eine oder mehr der folgenden Nachteile in Bezug auf die Stimulierung der Angiogenese von Endothelzellen bei der Behandlung kardiovaskulärer Leiden:
(i) das Versagen der Bindung an die extrazelluläre Matrix (ECM), was zu einem schnelleren Verbrauch und einer kürzeren Wirkungsdauer führt, (ii) Versagen der Sekretion in das Medium (d. h. in Zellassoziation verbleibend), sodass die Endothelzellen nicht erreicht werden und keine Einwirkung auf diese erfolgt, und (iii) Anfälligkeit für oxidative Schädigung, was zu einer kürzeren Halbwertszeit führt.
Es besteht daher Bedürfnis nach einer neuen Form von VEGF, die die oben erwähnten Nachteile vermeidet und nutzbringend zur Stimulierung von Angiogenese bei Patienten mit kardiovaskulären Leiden eingesetzt werden kann, was äusserst wünschenswert wäre.
VEGF₁₄₅ hat sich als sehr aktives Mitogen für vaskuläre Endothelzellen erwiesen, das in vivo als angiogener Faktor wirkt. Im Vergleich mit früher beschriebenen VEGF-Arten erwies sich VEGF₁₄₅ in Bezug auf Zellverteilung, Anfälligkeit für oxidative Schädigung und Fähigkeit zur Bindung an die extrazelluläre Matrix (ECM) als vorteilhaft. Frühere Untersuchungen mit Bezug auf die Bindungsaffinitäten der verschiedenen VEGF-Isoformen ergaben, dass VEGF₁₆₅, dem das Exon 6 fehlt, relativ schwach an Heparin und auch sehr schwach an die extrazelluläre Matrix gebunden wird (Park, J. E. et al., Mol. Biol. Cell 4: 1317–1326 (1993)). VEGF₁₄₅, das so schwach wie VEGF₁₆₅ an Heparin bindet, bindet viel besser als VEGF₁₆₅ an die extrazelluläre Matrix. Im Unterschied zu VEGF₁₈₉ wird VEGF₁₄₅ von Erzeugerzellen sekretiert und bindet effizient an die ECM. Diese Kombination von Eigenschaften macht VEGF₁₄₅ zur einzigen bekannten VEGF-Variante, die von Erzeugerzellen unter gleichzeitiger Beibehaltung der Bindungseigenschaften an die extrazelluläre Matrix sekretiert wird. Deshalb neigt es zur Diffusion zu den avisierten Blutgefässen, während einige der erzeugten VEGF₁₄₅ von extrazellulären Matrixkomponenten längs des Diffusionswegs zurückgehalten werden. Dieser gebundene ECM-Vorrat dissoziiert langsam, was eine längere Wirkungsdauer ermöglicht. Ausserdem wird die Bioaktivität von VEGF₁₄₅ im Unterschied zu VEGF-Formen, wie VEGF₁₂₁, gegen Oxidationsschäden geschützt und verleiht ihm dadurch eine längere Halbwertszeit.
Zusammenfassend besitzt VEGF₁₄₅ ganz klar eine besondere Kombination von biologischen Eigenschaften, die es von anderen VEGF-Formen unterscheidet. Diese besondere Eigenschaftskombination von VEGF₁₄₅ macht es zu einem bevorzugten therapeutischen Agens für die Behandlung des kardiovaskulären Systems und seiner Erkrankungen sowie anderer Leiden durch Proliferation von Gefässzellen. Insbesondere kann die cDNA in der Gentherapie zur Behandlung des kardiovaskulären Systems und seiner Erkrankungen verwendet werden.
Proliferation der Endothelzellen, wie sie bei Angiogenese auftritt, ist auch zur Vorbeugung von Rezidivstenose (Restenose) nach einer Ballondilatation (Angioplastie) nützlich. Die Ballondilatation verletzt oft die endotheliale Auskleidung der Innenwände von Blutgefässen. Glatte Muskelzellen dringen häufig in die geöffneten Blutgefässe ein und verursachen eine sekundäre Verstopfung in einem Vorgang, der als Rezidivstenose (Restenose) bekannt ist. Die Proliferation der Endothelzellen an der Peripherie des balloninduzierten Schadensgebietes zur Bedeckung der luminalen Oberfläche der Gefässe mit eines neuen Monolayers von Endothelzellen, würde potentiell die ursprüngliche Struktur des Blutgefässes wiederherstellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Polynukleotid, das für VEGF₁₄₅ kodiert, zur Herstellung eines Medikaments, das geeignet ist zum Transfizieren von Zellen zur Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung bei einem Säuger durch Transfizieren von Zellen mit dem Polynukleotid, wobei die kardiovaskuläre Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend Erkrankungen der Herzkranzgefässe, kongestive Herzinsuffizienz, Ischämie, Herzinfarkt und periphere Angiopathien.
Bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Anwendung sind in den Ansprüchen 2–15 umschrieben.
Weiter betrifft die Erfindung ein Medikament, das eine filtrierte injizierbare Adenovirusvektorzubereitung enthält, welche umfasst:
einen rekombinanten adenoviralen Vektor, der keinen Wildtyp-Virus enthält und umfasst:
eine adenovitrale Teilsequenz, aus der die E1A/E1B-Gene gelöscht worden sind, und ein Transgen, das für ein VEGF₁₄₅ kodiert, getrieben von einem Promotor, der von der adenoviralen Teilsequenz flankiert ist;
und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine graphische Darstellung der Exone, die für verschiedene VEGF-Isoformen kodieren.
2 ist eine Nukleotidsequenz der VEGF₁₄₅ cDNA-Protein kodierenden Region [SEQ. ID. No. 1]. Unterstrichen ist die vom reifen Protein abgespaltene Sequenz, die für eine Signalsequenz zur Sekretion kodiert.
3 ist die Aminosäurenproteinsequenz eines reifen VEGF₁₄₅-Monomeren [SEQ. ID. No.2].
4 ist eine photographische Darstellung, die die Expression von reduziertem und nicht-reduziertem rekombinanten VEGF₁₄₅ und den Vergleich mit VEGF₁₆₅ zeigt. VEGF₁₄₅ und VEGF₁₆₅ wurden in Sf9-Insektenzellen erzeugt, die mit rekombinanten Bakuloviren infiziert sind, die für VEGF₁₄₅ und VEGF₁₄₅ kodieren, wie angegeben. Konditioniertes Medium, das rekombinantes VEGF enthielt, wurde gesammelt, und 10 μl-Aliquote wurden entweder unter Verwendung von 0,1 M Dithiotreitol (Darstellung A) reduziert oder nicht reduziert (Darstellung B). Die Proteine wurden durch SDS/PAGE (12% Gel) abgetrennt und durch Elektroblotting auf Nitrocellulose übertragen. Die Filter wurden 1 Std. bei Zimmertemperatur mit einem Puffer, der 10 mM Tris/HCl pH 7,0, 15 M NaCl und 0,1% Tween 20 (TBST) enthielt, ergänzt mit 10% Magermilch, blockiert. Die Filter wurden 2 Stunden bei Zimmertemperatur mit Kaninchen-anti-VEGF-polyklonalen Antikörpern in TBST (23) inkubiert, dreimal mit TBST gewaschen und mit anti-Kaninchen-IgG-Peroxydase-konjugierten Antikörpern 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Gebundene Antikörper wurden mit dem ECL-Detektionssystem sichtbar gemacht.
5 ist eine photographische Aufnahme, welche die Bindung von VEGF₁₄₅ mRNA zeigt, wie sie sich in einem Reverse-PCR Versuch bei der Analyse von mRNA zeigt, die von zwei karzinomatösen Zelllinien aus dem weiblichen Reproduktionssystem abgeleitet wurden (HeLa- und A431-Zellen). Die gesamte RNA aus den HeLa- und A431-Zellen wurde in cDNA übersetzt und mittels PCR verstärkt, wobei radioaktiv gekennzeichnete Nukleotide verwendet wurden, wie dies für die Stoffe und Verfahren beschrieben ist. Plasmide, welche die VEGF₁₂₁-cDNA, die VEGF₁₆₅-cDNA und die VEGF₁₄₅-rekombinante cDNA enthalten, wurden in gesonderte PCR-Reaktionen mit zugesetztem Primer, wie er für die Stoffe und Verfahren beschrieben ist, eingebracht. Dargestellt ist ein Autoradiogramm des Gels.
6 ist ein Diagramm, das einen Versuch beschreibt, der zeigt, dass rekombinantes VEGF₁₄₅ zu vasku lären Endothelzellen mitogenetisch ist. VEGF₁₄₅ stimuliert die Proliferation der Endothelzellen: HUVEC-Zellen wurden in 24 Petrischalen (20'000 Zellen/Schale) vorgelegt und VEGF₁₂₁ (♢), VEGF₁₄₅ (
) sowie VEGF₁₄₅ ()jeden zweiten Tag in steigenden Konzentrationen zugefügt, wie für die Stoffe und Verfahren beschrieben. Die Zellen wurden nach vier Tagen in einem Coulter-Zähler gezählt.
7 ist eine photographische Aufnahme eines Versuchs, der zeigt, dass VEGF₁₄₅ an den KDR/flk-1 VEGF-Rezeptor bindet, aber nicht an zwei VEGF₁₆₅-spezifische VEGF-Rezeptoren, die an den vaskulären Endothelzellen gefunden wurden. Die Wirkung von VEGF₁₄₅ auf die ¹²⁵I-VEGF₁₆₅-Bindung an Endothelzellen: ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ (10 ng/ml) wurde an konfluente HUVEC-Zellen gebunden, die in 5 cm-Schalen wuchsen, und zwar während 2 Std. bei 4°C in Gegenwart von 1 μg/ml Heparin und den folgenden Konzentrationen von VEGF₁₄₅ (μg/ml): Bahn 1, 0; Bahn 2, 0,05; Bahn 3, 0,1; Bahn 4, 0,25; Bahn 5, 0,5; Bahn 6, 1; Bahn 7, 2; Bahn 8, 3. Auf Bahn 9 wurden 2 mg/ml VEGF₁₂₁ gegeben. Das gebundenes ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ wurde dann mit den Zellen unter Verwendung von DSS vernetzt und die vernetzten Komplexe wurden mittels von Autoradiographie sichtbar gemacht.
8 beschreibt zwei Versuche, die zeigen, dass VEGF₁₄₅ – aber nicht VEGF₁₆₅- an ECM bindet, die von Rinderhorn-Endothelzellen erzeugt wurde.

a. 96 mit ECM beschichtete Petrischalen wurden mit steigenden Konzentrationen von VEGF₁₄₅ (
) oder VEGF₁₆₅ (☐) inkubiert. Die Menge des an die ECM gebundenen VEGF wurde unter Verwendung von M-35 anti-VEGF monoklonalem, Antikörper quantifiziert, wie dies für die Stoffe und Verfahren beschrieben ist.
b. ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ (Bahnen 1 und 2: je 30 ng/ml) oder ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ (Bahn 3: 50 ng/ml) wurden an mit ECM-beschichtete Schalen gebunden. Heparin (10 μg/ml) wurde mit dem VEGF₁₄₅ auf Bahn 2 zugegeben. Die Bindung und nachfolgende Extraktion der gebundenen Wachstumsfaktoren wurden ausgeführt, wie dies für die Stoffe und Verfahren beschrieben ist. Die extrahierten Wachstumsfaktoren wurden der SDS/PAGE (12% Gel) und nachfolgend der Autoradiographie unterworfen.
c. Das 125I-VEGF₁₄₅, welches im Versuch gemäss Darstellung B (0,2 ng) verwendet worden war, wurde unter reduzierenden Bedingungen auf einem 12% SDS/PAGE-Gel chromatographiert. Gezeigt ist ein Autoradiogramm des Gels.

9 beschreibt einen Versuch, der die Wirkungen der Heparinasedigestion einer von Rinderhorn-Endothelzellen erzeugten ECM anhand der Bindung von VEGF₁₄₅ und bFGF an die ECM zeigt.

a. Wirkung von Heparin und Heparinase auf die Bindung von Wachstunsfaktoren: mit ECMbeschichtete Schalen wurden mit oder ohne 0,1 μ/ml Heparinase-II im Bindungspuffer 2 Std. bei 37°C inkubiert. Anschliessend wurde ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ (40 ng/ml) oder ¹²⁵I-bFGF (114 ng/ml) den Schalen in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 μg/ml Heparin zugefügt. Nach der folgenden Inkubation, 3 Std. bei 25°C, wurden die Schalen gewaschen und die ECM-assoziierten jodierten Wachstumsfaktoren wurden durch 15-minütige Digestion mit Trypsin bei 37°C dissoziiert. Die Menge der gebundenen Wachstumsfaktoren wurde durch Verwendung eines Gammazählers (100% Bindung entsprach 15'000 und 25'000 CPM/Schale für ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ bzw. ¹²⁵I-FGF) bestimmt.
b. Wirkung von Heparin und Heparinase-II auf die Freisetzung von gebundenen Wachstunsfaktoren von ECM: ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ oder ¹²⁵I-bFGF wurden wie oben beschrieben an mit ECM beschichtete Schalen gebunden. Die Schalen wurden gewaschen und allein mit Bindungspuffer, mit 10 μg/ml Heparin oder mit 0,1 μ/ml Heparinase-II in einem Endvolumen von 50 μl re-inkubiert. Nach 12 Std. Inkubieren bei 25°C wurde die Integrität der ECM unter dem Mikroskop verifiziert, und für die Zählung in einem Gammazähler wurden 45 μl Aliquote entnommen. NaOH wurde den Schalen zugegebenund die Menge der ECM-assoziierten Wachstumsfaktorenbestimmt. Der Versuch wurde parallel zum oben beschriebenen Versuch (Tafel A) durchgeführt. Die Versuche in den A und B wurden zweifach durchgeführt, wobei die Abweichungen unter 10% lagen. Es sind die Mittelwerte gezeigt. Die Versuche wurden viermal mit ähnlichen Resultaten wiederholt.

10 ist ein Diagramm, das zeigt, dass VEGF₁₄₅ bei Bindung an die ECM biologisch aktiv ist. 24 Petrischalen wurden als Schalen innen mit einer ECM beschichtet, die von BCE-Zellen erzeugt worden war, die in Gegenwart von 30 nM Chlorat kultiviert wurden. Die ECM-beschichteten Schalen wurden bei steigenden Konzentrationen von VEGF₁₄₅ (
) oder VEGF₁₆₅, wie angegeben, inkubiert und ausführlich wie beschrieben gewaschen. HUVEC-Zellen (15'000 Zellen/Schale) wurden in den mit ECM-beschichteten Schalen im Wachstumsmedium ohne Wachstumsfaktoren vorgelegt. Die Zellen wurden trypsinisiert und nach drei Tagen gezählt. Die Zahlen stellen die mittlere Zellenzahl von jeweils zwei Schalen dar.
11 ist eine photographische Aufnahme von Ballungen aus Alginatklümpchen, die Zellen enthalten, welche VEGF₁₄₅ exprimieren oder nicht exprimieren. Ballungen, die VEGF₁₄₅ exprimierende Zellen enthalten, sind mit Blut gesättigt. VEGF₁₄₅ stimuliert Angiogenese in vivo: Die angiogenetische Aktivität von VEGF₁₄₅ wurde mithilfe des Alginattests bestimmt. Stabile Klone von BHK-21-Zellen, die mit dem MIRB-Expressionsvektor (MIRB) oder mit dem VEGF₁₄₅-Expressionsvektor MIRB/VEGF₁₄₅ transfiziert wurden, wurden in DMEM auf eine Konzentration von 2,7 × 10⁷ Zellen/ml trypsinisiert und suspendiert. Natriumalginat (1,2%, 0,66 ml) wurde mit 1,33 ml der Zellsuspension vermischt. Durch Behandlung mit einer Lösung von 80 mM CaCl₂ wurden Klümpchen von 1 μl Durchmesser gebildet. Die Klümpchen wurden dreimal mit Salzlösung gewaschen. Jeder Balb/c Maus aus einer Vierergruppe wurden 400 μl gepackter Klümpchen mit einem gegebenen Zelltyp subkutan injiziert.
Nach vier Tagen wurden die Ballungen aus Klümpchen operativ entfernt und photographiert. Bereiche mit viel Blut erscheinen in der Photographie als dunkle Stellen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Hier werden die folgenden Abkürzungen verwendet: BCE Rinderhorn-Endothelzellen

bFGF	Basischer Fibroplastwachstumsfaktor
ECM	Extrazelluläre Matrix
HUVEC	Humane Endothelzellen aus Nabelvenen
VEGF	Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor
VEGF_xxx	Vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor mit einer bestimmten Anzahl (xxx) an Aminosäuren

Der Ausdruck "kardiovaskuläre Erkrankung", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Krankheit, die auf kardiovaskuläre Insuffizienz zurückzuführen ist und dabei Erkrankungen der Herzkranzgefässe, kongestive Herzinsuffizienz und periphere Angiopathien einschliesst, ohne darauf beschränkt zu sein. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung betreffen die Behandlung von Säugern, vorzugsweise Menschen.
Das VEGF₁₄₅-Protein bildet aktive Monodimere, die durch Disulfidbrücken gebunden sind (3).
VEGF₁₄₅ ist ein aktives Mitogen für vaskuläre Endothelzellen und wirkt in vivo als angiogenetischer Faktor.
VEGF₁₄₅ wurde mit früher beschriebenen VEGF-Arten in Bezug auf Zellverteilung, Empfindlichkeit auf Oxidationsschädigung und die Fähigkeit zur Bindung an extrazelluläre Matrix (ECM) verglichen. VEGP₁₄₅ wird von Erzeugerzellen abgeschieden und kann effizient an die ECM binden, was es zur einzig bekannten VEGF-Variante mit diesen beiden Attributen macht.
Die hier verwendete Bezeichnung "vaskulärer Endothelzellenwachstumsfaktor" oder "VEGF" bezieht sich auf eine Familie von angiogenetischen Wachstumsfaktoren, die durch das humane VEGF-Gen kodiert werden.
"VEGF₁₄₅" bezieht sich auf eine VEGF-Form, die etwa 145 Aminosäuren enthält, die aus der abwechselnden Spleissung von VEGF mRNA hervorgehen und welche die durch Exone 1–5, 6a und 8 des VEGF-Gens kodierten Peptide enthalten. Der Ausdruck "VEGF₁₄₅" umfasst auch derivative und funktionelle Äquivalente der nativen VEGF₁₄₅-Nukleinsäure oder Aminosäurensequenz. Reife VEGF₁₄₅-Monomere enthalten die in 3 dargestellte Aminosäuresequenz. Die hier verwendete Bezeichnung VEGF₁₄₅ umfasst jedoch sowohl die reife Form, als auch die Pro-Form von VEGF₁₄₅, einschliesslich einer Signalsequenz oder Derivate oder funktioneller Äquivalente hiervon. VEGF₁₄₅ wird in verschiedenen Zellinien exprimiert (4) und es konnte gezeigt werden, dass es auch in karzinösen Ovarienzellen OC238 exprimiert wird, wobei die Sequenzierung der Region um die Exone 5–8 von VEGF cDNA, die aus den OC238-Zellen hergestellt wurde, angewendet wurde. "Derivate" eines VEGF₁₄₅-Polypeptids oder einer Untereinheit hiervon sind funktionelle Äquivalente, die eine ähnliche Aminosäurensequenz haben und bis zu einem gewissen Grad die Aktivitäten von VEGF₁₄₅ behalten. Als "funktionelles Äquivalent" wird ein Derivat mit einer Aktivität bezeichnet, welche die Aktivität von VEGF₁₄₅ ersetzen kann. Bevorzugte funktionelle Äquivalente behalten den vollen Aktivitätswert von VEGF₁₄₅, wie er in Tests, die Fachpersonen auf diesem Gebiet bekannt sind, und/oder in den hier beschriebenen Tests, gemessen werden kann. Bevorzugte funktionelle Äquivalente haben Aktivitäten, die im Bereich von 1% bis 10'000% der Aktivität von VEGF₁₄₅, insbesondere im Bereich von 10% bis 1000% und am meisten bevorzugt im Bereich von 50% und 200% liegen. Derivate haben eine mindestens 50%ige Sequenzähnlichkeit, vorzugsweise eine 70%ige, noch bevorzugter eine 90%ige und am meisten bevorzugt eine 95%ige Sequenzähnlichkeit mit VEGF₁₄₅. "Sequenzähnlichkeit" bezieht sich auf "Homologie", die zwischen Aminosäurensequenzen in zwei verschiedenen Polypeptiden ungeachtet der Herkunft des Polypeptids beobachtet wird.
Die Fähigkeit der Derivate, eine gewisse Aktivität beizubehalten, kann mit den hier beschriebenen Methoden und/oder mit Methoden zur Aktivitätsmessung anderer VEGF-Isoformen, die den Fachpersonen auf diesem Gebiet bekannt sind, gemessen werden. Zu den Derivaten gehören u. a. Modifikationen, welche während oder nach der Translation auftreten, zum Beispiel durch Phosphorylierung, Glykosylierung, Vernetzung, Acylierung, Eiweissspaltung, Kopplung an ein Antikörpermolekül, Membranmolekül oder einen anderen Ligand (siehe Ferguson et al., 1988, Annu. Rev. Biochem 57: 285–320).
Spezielle Typen von Derivaten sind u. a. auch Aminosäure-Abänderungen, wie Deletionen, Substitutionen, Additionen und Aminosäuremodifikationen. Eine "Deletion" bezieht sich auf das Fehlen eines (oder mehrerer) Aminosäurereste(s) im Polypeptid. Eine "Addition" bezieht sich auf die Anwesenheit eines (oder mehrerer) Aminosäurereste im betreffenden Polypeptid. Additionen und Deletionen zu bzw. aus einem Polypeptid können an der endständigen Amino- oder endständigen Carboxylgruppe und/oder intern erfolgen. "Modifikationen" von Aminosäuren betreffen die Alteration einer natürlich vorkommenden Aminosäure zur Herstellung einer nicht natürlich vorkommenden Aminosäure. Eine "Substitution" bezieht sich auf den Ersatz eines (oder mehrerer) Amino säurereste(s) durch (einen) andere(n) Aminosäurerest-Polypeptid. Die Derivate können verschiedene Kombinationen von Änderungen einschliesslich mehr als einer Änderung und verschiedene Typen von Änderungen umfassen.
Obwohl die Wirkung einer Aminosäureveränderung abhängig von Faktoren ist, wie Phosphorylierung, Glykosylierung, ketteninterne Vernetzung, Tertiärstruktur und die Rolle der Aminosäure in der aktiven Stellung oder einer möglichen allosterischen Stelle, wird im Allgemeinen bevorzugt, dass die substituierte Aminosäure aus der gleichen Gruppe stammt, wie die ersetzte Aminosäure. Bis zu einem gewissen Grad enthalten die folgenden Gruppen austauschbare Aminosäuren: basisches Aminosäurenlysin, Arginin und Histidin; die sauren Aminosäuren Asparaginsäure und Glutaminsäure; die neutralen polaren Aminosäuren Serin, Threonin, Cystein, Glutamin, Asparagin und in vermindertem Masse auch Methionin; die nicht polaren aliphatischen Aminosäuren Glycin, Alanin, Valin, Isoleucin und Leucin (wegen der Grösse sind jedoch Glycin und Alanin beziehungsweise Valin, Isoleucin und Leucin jeweils enger verwandt); und die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin. Ausserdem scheinen trotz Einordnung in unterschiedliche Kategorie Alanin, Glycin und Serin bis zu einem gewissen Grad austauschbar zu sein, wobei Cystein zusätzlich in diese Gruppe passt oder den polaren neutralen Aminosäuren zuzuordnen ist.
Obwohl Prolin eine nichtpolare neutrale Aminosäure ist, verursacht ihr Ersatz wegen ihrer Wirkungen auf die Konformation Schwierigkeiten. Deshalb sind Substitutionen durch oder mit Prolin nicht bevorzugt, ausser es können dieselben Konformationsresultate erzielt werden. Die Konformation verleihenden Eigenschaften von Proliwesten können erzielt werden, wenn eine oder mehrere von diesen durch Hydroxyprolin (Hyp) ersetzt wird bzw. werden.
Beispiele modifizierter Aminosäuren sind unter anderen die Folgenden: veränderte neutrale nichtpolare Aminosäuren, wie Aminosäuren der Formel HN₂(CH₂)_nCOOH, worin n 2 bis 6 ist, Sarcosin (Sar), t-Butylalanin (t-BuAla), t-Butylglycin (t-BuGly), N-Methylisoleucin (N-Melle) und Norleucin (Nleu); veränderte neutrale aromatische Aminosäuren, wie Phenylglycin; veränderte polare, aber neutrale Aminosäuren, wie Citrulin (Cit) und Methioninsulfonid (MSO); veränderte neutrale und nichtpolare Aminosäuren, wie Cyclohexylalanin (Cha); veränderte saure Aminosäuren, wie Cysteinsäure (Cya); und veränderte basische Aminosäuren, wie Ornithin (Orn).
Bevorzugte Derivate haben eine oder mehrere Aminosäureänderung(en), welche die Rezeptorbindungsaktivität von VEGF₁₄₅ nicht signifikantbeeinträchtigen. In den Bereichen der VEGF₁₄₅-Polypeptidsequenz, die für die VEGF₁₄₅-Aktivität nicht notwendig ist, können Aminosäuren deletiert, addiert oder substituiert werden, ohne Gefahr zu laufen, die Aktivität zu beeinträchtigen. In den Bereichen, die für VEGF₁₄₅-Aktivität erforderlich sind, sind Aminosäureänderungen weniger bevorzugt, da dort ein grösseres Risiko der Aktivitätsbeeinflussung von VEGF₁₄₅ besteht. Solche Änderungen sollten konservative Änderungen sein. Zum Beispiel können ein oder mehrere Aminosäurereste innerhalb der Sequenz durch eine andere Aminosäure ähnlicher Polarität, die als funktionelles Äquivalent wirkt, substituiert werden.
Die beibehaltenen Bereiche sind in der Regel für die Proteinaktivität wichtiger als abgeänderten Bereiche. Zur Bestimmung der beibehaltenen und nicht beibehaltenen Bereiche, die für die Rezeptoraktivität wichtig sind, können Standardverfahren angewandt werden, welche in vitro Mutagenesetechniken oder Deletionsanalysen und Messungen der Rezeptoraktivität verwenden, wie vorliegend beschrieben.
Derivate können nach chemischen Standardverfahren und molekulare Nukleinsäure-Rekombinationsrnethoden erhalten werden. Modifikationen eines speziellen Polypeptids können absichtlich erzielt werden, etwa durch ortsgerichtete Mutagenese und Aminosäurensubstitution während der Festphasensynthese, oder können zu fällig sein, wie durch Mutationen in Wirtszellen, welche das Polypeptid erzeugen. Polypeptide enthaltende Derivate können durch Anwendung von Standardverfahren erhalten werden, wie jenen, die in Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben sind. Beispielsweise ist in Kapitel 15 von Sambrook ein Verfahren zur ortsgerichteten Mutagenese geklonter DNA beschrieben.
Die Erfindung bietet ein Nukleinsäuremolekül, oder Polynukleotid, das für VEGF₁₄₅ kodiert. In einigen Fällen ist es wünschbar, dass diese Nukleinsäuremoleküle angereichert oder gereinigt werden. Durch die Verwendung des Ausdrucks "angereichert" in Bezug auf Nukleinsäuremoleküle soll ausgedrückt werden, dass die spezifische DNA- oder RNA-Sequenz einen signifikant höheren Anteil (2–5-fach) der gesamten in den vorhandenen Zellen oder betreffenden Lösung als in normalen oder erkrankten Zellen oder Zellen darstellt, aus denen eine Sequenz entnommen wurde. Dies könnte von einer Person durch präferentielle Verminderung der Menge anderer vorhandener DNA oder RNA oder durch präferentielle Vergrösserung der Menge der spezifischen DNA- oder RNA-Sequenz oder durch eine Kombination dieser beiden Möglichkeiten verursacht werden. Es ist jedoch zu bemerken, dass angereichert nicht bedeutet, dass keine anderen DNA- oder RNA-Sequenzen vorhanden sind, sondern lediglich, dass die relative Menge der fraglichen Sequenz signifikant erhöht worden ist. Der Ausdruck "signifikant" wird hier verwendet, um auszudrücken, dass das Mass der Erhöhung für die Person, die eine solche Erhöhung erfährt, nützlich ist, und bedeutet allgemein eine zu anderen Nukleinsäuren relative Erhöhung von etwa mindestens dem Zweifachen, vorzugsweise mindestens dem 5 bis 10-Fachen oder noch mehr. Die Bezeichnung impliziert auch nicht, dass keine DNA oder RNA aus anderen Quellen vorliegt. Die DNA aus anderer Quelle kann zum Beispiel DNA aus Hefe oder einem bakteriellen Genom, oder einen Klonierungsvektor, wie pUC19 umfassen. Die Bezeichnung unterscheidet sich von natürlich auftretenden Ereignissen, wie virale Infektionen oder tumorartige Geschwülste, in denen das Mass einer mRNA relativ zu anderen Spezies von mRNA natürlich erhöht sein kann. Diese Bezeichnung soll somit nur diejenigen Fälle umfassen, in denen eine Person interveniert hat, um den Anteil der gewünschten Nukleinsäure zu erhöhen.
Das Nukleinsäuremolekül kann aus einer bestehenden VEGF₁₄₅-Nucleotidsequenz durch Modifikation unter Verwendung von beispielsweise einer auf Oligonucleotid gerichteten Mutagenese, oder durch Deletion von Sequenzen unter Verwendung von Restriktionsenzymen, oder wie hier beschrieben, aufgebaut werden. Standard-Rekombinationsverfahren für die Mutagenese, wie die in vitro-gerichtete Mutagenese (Hutchinson et al., J. Biol. Chem. 253: 6551, (1978), Sambrook et al., Kapitel 15, supra), die Verwendung von TAB^®-Kopplungen (Pharmacia) und die PCR-gerichtete Mutagenese können zur Erzeugung solcher Mutationen verwendet werden. Das Nukleinsäuremolekül kann auch nach der Triester-Methode oder durch Verwendung eines automatischen DNA-Synthesizers synthetisiert werden.
Die Beschreibung bietet auch rekombinante DNA-Vektoren, vorzugsweise in einer Zelle oder in einem Organismus. Die rekombinanten DNA-Vektoren können eine Sequenz enthalten, die für das VEGF₁₄₅-Protein kodiert, oder ein funktionelles Derivat davon in einem Vektor, der einen Promotor enthält, der die Transkription in einer Wirtszelle initiiert. Der rekombinante DNA-Vektor kann einen transkriptionalen, in einer Zelle operativen Initiierungsbereich und einen transkriptionalen, in einer Zelle operativen Terminierungsbereich enthalten. Wenn der DNA-Vektor genügend Kontrollsequenzen enthält, wie einen Initiierungs- und/oder Terminierungsbereich, derart, dass das eingesetzte Nukleinsäuremolekül in einer Wirtszelle exprimiert werden kann, kann der Vektor auch "Expressionsvektor" genannt werden.
Die vorliegende Beschreibung betrifft auch eine Zelle oder einen Organismus, der das oben beschriebene Nukleinsäuremolekül oder den rekombinanten DNA-Vektor enthält und dabei fähig ist, ein VEGF₁₄₅-Peptid zu exprimieren. Das Peptid kann von Zellen gereinigt werden, die zur Expression des Polypeptids verändert wurden. Eine Zelle wird als "zur Expression eines gewünschten Polypeptids verändert" bezeichnet, wenn die Zelle durch Genmanipulation so verändert wurde, dass sie ein Protein produziert, das sie normalerweise nicht produziert oder das die Zelle normalerweise in geringerem Masse produziert. Fachleute auf diesem Gebiet können Methoden zum Einführen und Exprimieren sowohl von genomischen- cDNA – als auch von synthetischen Sequenzen in entweder eukaryotische oder prokaryotische Zellen adaptieren.
Ein Nukleinsäuremolekül, wie DNA, wird als "fähig zur Expression" eines Polypeptids bezeichnet, wenn es Nukleotidsequenzen enthält, die transkriptionale und translationale Steuerungsinformation enthält und wenn solche Sequenzen an Nukleotidsequenzen "funktionsfähig gekoppelt" sind, die für das Polypeptid kodieren. Die genaue Art der Steuerungsbereiche, die zur Expression von Gensequenzen benötigt werden, können von Organismus zu Organismus variieren, werden aber im Allgemeinen einen Promotorbereich enthalten, der bei Prokaryoten sowohl den Promotor (der die Initiierung der RNA-Transkription lenkt) als auch die DNA-Sequenzen enthält, die nach dem Transkribieren in RNA die Initiatialisierung der Synthese signalisiert. Solche Regionen werden normalerweise diejenigen 5'-nicht-kodierenden Sequenzen enthalten, die bei der Initiierung von Transkription und Translation mitwirken, wie die TATA-box, die Decksequenz, die CAAT-Sequenz und ähnliche.
Beispielsweise kann die ganze kodierende Sequenz von VEGF₁₄₅ mit einer oder mehreren der Folgenden in einem entsprechenden Expressionsvektor zusammengefasst sein, um eine solche Expression zu ermöglichen:
(1) eine exogene Promotor-Sequenz, (2) eine Ribosomen-Bindungsstelle, (3) ein Polyadenylationssignal, (4) ein Sekretionssignal. Zur Verbesserung der Expression in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle können in den 5'-unübersetzten und 3'-unübersetzten Sequenzen Modifikationen gemacht werden, oder man kann Codone so modifizieren, dass obwohl sie für eine identische Aminosäure kodieren, das Codon ein bevorzugtes Codon im gewählten Expressionssystem sein kann. Die Verwendung solch bevorzugter Codone ist beispielsweise beschrieben in Grantham et al., Nuc. Acids Res., 9: 43–74 (1981), und Lathe, J. Mol. Biol. 183: 1–12 (1985), auf die hier ausdrücklich verwiesen wird. Wenn gewünscht, kann die nicht kodierende Region 3' zur genomischen VEGF₁₄₅-Proteinsequenz mit dem Nukleinsäuremolekül, das für VEGF₁₄₅ kodiert, funktionsfähig gekoppelt sein. Diese Region kann im rekombinanten DNA-Vektor für dessen Transkriptionsabschluss-Steuersequenzen wie Terminierung und Polyadenylierung verwendet werden. Dadurch, dass man die 3'-Region im natürlichen Zusammenhang mit der der DNA-Sequenz hält, die für VEGF₁₄₅ kodiert, kann man die transkriptionalen Terminierungssignale erzeugen. Alternativ kann eine in der Wirtszelle funktionelle 3'-Region substituiert werden.
Eine funktionsfähige Kopplung ist eine Kopplung, in der die regulatorischen DNA-Sequenzen und die DNA-Sequenz, für die eine Expression angestrebt wird, so verbunden sind, dass sie eine Gensequenzexpression erlauben. Zwei DNA-Sequenzen (wie eine Promotor-Regionsequenz und eine VEGF₁₄₅-Proteinsequenz) heissen funktionsfähig gekoppelt, wenn der Charakter der Kopplung zwischen den zwei DNA-Sequenzen nicht (1) zur Introduktion einer Frameshift-Mutation in der kodierenden Sequenz führt, (2) mit der Fähigkeit der Promotor-Regionsequenz die Transkription von VEGF₁₄₅ PROTEIN Gensequenz zu lenken, interferiert, oder (3) mit der Fähigkeit der VEGP₁₄₅ PROTEIN Gensequenz durch die Promotor-Regionsequenz transkribiert zu werden, interferiert. Deshalb ist eine Promotor-Region mit einer DNA-Sequenz funktionsfähig als gekoppelt anzusehen, wenn der Promotor zur Transkription jener DNA-Sequenz fähig ist. Deswegen sind zur Exprimierung von VEGF₁₄₅ transkriptionale und translationale Signale erforderlich, die von einem geeigneten Wirt erkannt werden.
Fachpersonen auf diesem Gebiet ist es ersichtlich, dass das VEGF₁₄₅-Protein auch in verschiedenen Zellsystemen, nämlich sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen, exprimiert werden kann, wobei alle im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegen.
Obwohl das erfindungsgemässe VEGF₁₄₅-Protein in prokaryotischen Zellen exprimiert werden kann, die im Allgemeinen sehr effizient und geeignet für die Produktion von rekombinanten Proteinen sind, wird das von diesen Zellen erzeugte VEGF₁₄₅ nicht glykosyliert und hat deswegen in vivo eine kürzere Halbwertszeit. Prokaryoten sind vorwiegend die verschiedenen Bakterienstämme von Kolibakterien. Es können jedoch auch andere mikrobielle Stämme verwendet werden, einschliesslich anderer Bakterienstämme. Anerkannte prokaryotische Wirte sind unter anderen Bakterien wie E. coli, Bazillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia und dergleichen. Der prokaryotische Wirt muss mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen im Expressionsplasmid kompatibel sein.
In prokaryotischen Systemen können Plasmidvektoren verwendet werden, die Replikationsstellen und aus mit dem Wirt kompatiblen Spezies abgeleitete Kontrollsequenzen enthalten. Beispiele geeigneter Plasmidvektoren sind unter anderen pBR322, pUC118, pUC119 und dergleichen; geeignete Phagen oder Bakteriophagevektoren können γgt10, γgt11 und dergleichen enthalten; geeignete Virusvektoren können pMAM-neo, pKRC und dergleichen enthalten. Vorzugsweise hat der ausgewählte Vektor der vorliegenden Erfindung die Fähigkeit, sich in der gewählten Wirtszelle zu replizieren.
Um VEGF₁₄₅-Polypeptide oder Untereinheiten (oder ein funktionelles Derivat davon) in einer prokaryotischen Zelle zu exprimieren, ist es notwendig, die VEGF₁₄₅-Proteinsequenz funktionsfähig an einen funktionellen prokaryotischen Promotor zu koppeln. Solche Promotoren können entweder konstitutiv oder vorzugsweise regulierbar (d. h. induzierbar oder derepressierbar) sein. Beispiele konstitutiver Promotoren umfassen den int. Promotor von Bakteriophage λ, den bla-Promotor der β-Laktamase-Gensequenz von pBR322 und den CAT-Promotor der Chloramphenicolacetyl-Transferase-Gensequenz von pPR325 und dergleichen. Beispiele für induzible prokaryotische Promotoren sind unter anderen die hauptsächlichen Rechts- und Linkspromotoren von Bakteriophage λ (P_L, und P_R), die trp, recA, λacZ, λacl und gal-Promotoren von E. coli, die α-Amylase (Ulmanen et al., J. Bacteriol. 162: 176–182 (1985)) und die ϛ-28-spezifischen Promotoren von B. subtilis (Gilman et al., Gene sequence 32: 11–20 (1984)), die Promotoren der Bakteriophagen von Bazillus (Gryczan, The Molecular Biologya of the Bacilli, Academic Press, Inc. NY (1982)), und Streptomyces-Promotoren (Ward et al., Mol. Gen. Genet.203: 468–478 (1986)). Prokaryotische Promotoren wurden von Glick (J. Ind. Microbiot. 1: 277–282 (1987)); Cenatiempo (Biochimie 68: 505–516 (1986)); und Gottesman (Ann. Rev. Genet. 18: 415–442 (1984)) beschrieben.
Eine angemessene Expression in einer prokaryotischen Zelle erfordert auch die Anwesenheit einer Ribosomen-Bindungsstelle stromaufwärts der gensequenz-kodierenden Sequenz. Solche Ribosomen-Bindungsstellen wurden beispielsweise von Gold et al. (Ann. Rev. Microbiol. 35: 365–404 (1981)) beschrieben. Die Ribosomen-Bindungsstelle und andere zur Initiierung einer Translation erforderlichen Sequenzen sind funktionsfähig mit dem Nukleidsäuremolekül gekoppelt, das für VEGF₁₄₅ kodiert, zum Beispiel durch Inframe-Ligation von synthetischen Oligonukleotiden, die solche Kontrollsequenzen enthalten. Zur Expression in prokaryotischen Zellen ist keine Signalpeptidsequenz erforderlich. Die Auswahl der Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren, Transformations verfahren und dergleichen ist abhängig vom Typ der Wirtszellen, die zum Exprimieren der Gene verwendet werden.
Die hier verwendeten Bezeichnungen "Zelle", Zelllinie" und "Zellkultur" sind austauschbar und alle diese Bezeichnungen umfassen auch jeweils die Fortpflanzungen. So umfassen die Bezeichnungen "Transformanten" oder "transformierte Zellen" die jeweiligen primären Zellen und die daraus abgeleiteten Kulturen, ungeachtet der Anzahl von Übertragungen. Vom in prokaryotischen Zellen exprimierten VEGF₁₄₅ wird erwartet, dass es eine Mischung von in geeigneter Weise initiierten VEGF₁₄₅-Proteinpeptiden mit der N-terminalen Sequenz, die sich aus der Sequenz des Expressionsvektors ergibt, und VEGP₁₄₅-Proteinpeptiden enthält, die ein N-terminales Methionin haben, das durch unvollständige Spaltung vom Initiierungsmethionin während der bakteriellen Expression entsteht. Beide Typen von VEGF₁₄₅-Peptiden werden als im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegend angesehen, da von der Anwesenheit eines N-terminalen Methionins nicht zu erwarten ist, dass es die Bioaktivität beeinflusst. Es versteht sich auch, dass nicht alle Nachkommen wegen der beabsichtigten oder zufälligen Mutationen einen identischen DNA-Gehalt haben. Definitionsgemäss haben die mutierten Nachkommen dieselbe Funktionalität wie die der ursprünglich transformierten Zelle.
Bevorzugte prokaryotische Vektoren sind u. a. Plasmide wie jene, die zur Replikation in Kolibakterien fähig sind (wie z. B. pBR322, ColEl, pSC101, pACYC 184, πVX). Solche Plasmide sind z. B. beschrieben von Sambrook (siehe "Molecular Cloning: A Laboratory Manual ", zweite Ausgabe, Sambrook, Fritsch & Maniatis (Hrsg.), Cold Spring Harbour Laboratory (1989)). Bacillus Plasmide sind u. a. pC194, pC221, pT127 und dergleichen. Solche Plasmide wurden von Gryczan ( The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY (1982), S. 307–329) beschrieben. Geeignete Streptomyces-Plasmide sind u. a. p1J101 (Kendall et al., J. Bacteriol. 169: 4177–4183 (1987)), und Streptomyces-Bakteriophagen, wie φC31 (Chater et al., Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, Akademiai Kaido, Budapest, Ungarn (1986), S. 45–54). Pseudomonas-Plasmide wurden von John et al., (Rev. Infect. Dis. 8: 693–704 (1986)), und Izaki (Jpn. J. Bacteriol. 33: 729–742 (1978)) beschrieben.
Eukariotische Wirtszellen, die in den Expressionssystemen verwendet werden können, sind nicht streng eingegrenzt, vorausgesetzt, sie sind zur Verwendung für die Expression von VEGF₁₄₅ geeignet. Beispiele bevorzugter eukarytorischer Wirte sind u. a. Hefe, Pilze, Insektenzellen, Säugenzellen entweder in vivo oder in Gewebekulturen. Säugerzellen, die als Wirtszellen verwendet werden können, sind u. a. HeLa-Zellen, Zellen mit Fibroblast-Ursprung, wie VERO oder CHO-K1, oder Zellen lymphoiden Ursprungs und deren Derivate.
Die VEGF₁₄₅-Proteine können auch in Humanzellen, wie den Human-embryonen-Nieren-293EBNA-Zellen, exprimiert werden, welche das nukleare Epstein-Barr-Virus-Antigen 1 exprimieren, wie sie zum Beispiel von Olofsson, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 2576–2581 (1996) beschrieben worden sind. Die Zellen werden unter Anwendung der Calciumphosphatfällung mit den Expressionsvektoren transfiziert, worauf die Zellen dann mindestens 48 Std. inkubiert werden. Die VEGF₁₄₅-Peptide können dann wie in Beispiel 3 beschrieben aus dem Überstand gereinigt erhalten werden.
Ausserdem sind auch Pflanzenzellen verfügbar, und mit Pflanzenzellen kompatible Kontrollsequenzen als Wirtszellen verfügbar, wie das Blumenkohl-Mosaikvirus 35S und 19S und der Nopalin-Synthesepromotor sowie Polyadenylation-Signalsequenzen. Eine andere bevorzugte Wirtszelle ist eine Insektenzelle, zum Beispiel Drosophilia-Larven. Bei Verwendung von Insektenzellen als Wirtszellen kann der Drosophila-Alkoholdehydrogenasepromotor verwendet werden, s. Rubin, Science 240: 1453–1459 (1988).
Es kann auch irgend eine Reihe von Hefegensequenz-Expressionssystemen verwendet werden, die Promotor- und Abschlusselemente aus den aktiv exprimierten Gensequenzen enthalten, die für glykolytische Enzyme kodieren und in grossen Mengen erzeugt werden, wenn Hefe in einem glukosereichem Medium gezüchtet wird. Auch die bekannten glykolytischen Gensequenzen können sehr effizient transkriptionale Kontrollsignale liefern. Hefe bietet wesentliche Vorteile dahingehend, dass sie auch posttranslationale Peptidmodifikationen bewirken kann. Es existiert eine Anzahl rekombinanter DNA-Strategien, welche starke Promotor-Sequenzen und eine hohe Anzahl von Plasmidkopien benutzen, die zur Produktion der gewünschten Proteine in Hefe verwendet werden können. Hefe erkennt Führungssequenzen auf geklonten Säuger-Gen-Sequenz-Produkten und scheidet peptidtragende Führungssequenzen ab (d. h. Prä-Peptide). Für einen Säugerwirt stehen verschiedene mögliche Vektorsysteme für die Expression von VEGP₁₄₅-Peptiden zur Verfügung.
Eine grosse Vielfalt von transkriptionalen und translationalen regulatorischen Sequenzen kann abhängig vom Charakter des Wirts eingesetzt werden. Die transkriptionalen und translationalen Steuersignale können aus viralen Quellen abgeleitet werden, wie Adenovirus, Rinder-Papilloma-Virus, Cytomegalovirus, Affenvirus oder dergleichen, bei welchen die Steuersignale mit einer besonderen Gensequenz assoziiert sind, die ein hohes Mass an Expression haben. Wahlweise können Promotoren aus exprimierten Säugerprodukten eingesetzt werden wie Aktin, Kollagen, Myosin und dergleichen. Transkriptionale regulatorische Initiierungssignale können gewählt werden, die Repression oder Aktivation zulassen, sodass die Expression der Gensequenzen moduliert werden kann. Von Interesse sind Steuersignale, die temperatursensitiv sind, sodass durch Verändern der Temperatur die Expression reprimiert oder initiiert werden kann, oder die Gegenstand chemischer (wie Metabolit-) Regulierung sind.
Die Expression von VEGF₁₄₅ in eukaryotischen Wirten erfordert die Verwendung eukaryotischer Steuerregionen. Solche Regionen enthalten im Allgemeinen eine Promotorregion, die ausreicht, um die Initiierung der RNA-Synthese einzuleiten. Bevorzugte eukaryotische Promotoren sind u. a. beispielsweise der Promotor der Maus-Metallothionein-I-Gensequenz (Hamer et al., J. Mol. Appl. Gen. 1: 273–288 (1982)); der TK-Promotor vom Herpes-Virus (McKnight, Cell 31: 355–365 (1982)); der SV40 early-promotor (Benoist et al., Nature (London) 290: 304–310 (1981)); der Hefe-gal4-Gensequenzpromotor (Johnston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79: 6971–6975 (1982); Silver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 5951–5955 (1984)).
Die Translation eukaryotischer mRNA wird bei dem Codon initiiert, das für das erste Methionin kodiert. Aus diesem Grunde wird vorzugsweise sichergestellt, dass die Kopplung zwischen einem eukaryotischen Promotor und einer DNA-Sequenz, die für ein VEGF₁₄₅ (oder ein funktionelles Derivat davon) kodiert, keine intervenierenden Codone enthält, die für Methionin (d. h. AUG) kodieren können. Die Anwesenheit eines solchen Codons führt entweder zu Bildung eines Fusionsproteins (wenn sich das AUG-Codon im gleichen Ableserahmen wie die für VEGF₁₄₅-Proteinkodierende Sequenz befindet) oder einer sogenannten Frameshift-Mutation (wenn sich das AUG-Codon nicht im gleichen Ableserahmen wie die für VEGF₁₄₅-proteinkodierende Sequenz befindet).
Ein VEGF₁₄₅-Nukleinsäuremolekül und ein funktionsfähig gekoppelter Promotor können in eine prokaryotische oder eukaryotische Empfängerzelle als ein nicht replizierendes DNA (oder RNA)-Molekül, das entweder ein lineares Molekül oder vorzugsweise ein geschlossenes kovalentes zirkulares Molekül ist, eingeführt werden. Weil solche Moleküle nicht zur autonomen Replikation fähig sind, kann die Genexpression durch die vorübergehende Expression der eingeführten Sequenz erfolgen. Alternativ kann eine permanente Expression durch die Integration der in das Wirtschromosom eingeführten DNA-Sequenz auftreten.
Man kann einen Vektor verwenden, der die gewünschten Gensequenzen in das Wirtszellenchromosom integrieren kann. Zellen, welche die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosomen integriert haben, können auch durch Einführen eines oder mehrerer Markierungen ausgewählt werden, welche die Selektion von Wirtszellen ermöglichen, die den Expressionsvektor enthalten. Die Markierung kann einem auxotrophen Wirt Prototrophie, Biozidresistenz, z. B. gegen Antibiotika oder Schwermetalle wie Kupfer oder dergleichen verleihen. Die selektierbare Markierungsgensequenz kann entweder direkt an die zu exprimierenden DNA-Gensequenzen gekoppelt, oder in die gleiche Zelle durch Ko-transfektion eingeführt werden. Zusätzliche Elemente können auch für eine optimale Synthese vom Einzelstrang-mRNA-Bindungsprotein benötigt werden. Diese Elemente können Spleisssignale, sowie Transkriptionspromotoren, Verstärker und Abschlusssignale enthalten. Zu den cDNA-Expressionsvektoren, die solche Elemente enthalten, gehören die von Okayama, Molec. Cell. Biol. 3:280 (1983) beschriebenen.
Das eingeführte Nukleinsäuremolekül kann in ein Plasmid oder einen viralen Vektor inkorporiert sein, der zur autonomen Replikation in der Empfängerwirtszelle befähigt ist. Aus der grossen Vielfalt von Vektoren kann irgendeiner zu diesem Zweck verwendet werden. Zu den für die Wahl eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors wesentlichen Faktoren sind zu zählen: die Leichtigkeit, mit der Empfängerzellen, welche den Vektor enthalten, erkannt und gegenüber den Empfängerzellen, die den Vektor nicht enthalten, ausgewählt werden können; die Anzahl Kopien des Vektors, welche für einen bestimmten Wirt gewünscht werden; und ob es wünschbar ist, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Spezies „pendeln" lassen zu können.
Bevorzugte eukaryotische Plasmide sind u. a. zum Beispiel BPV, Vaccinia, SV40, 2-Mikronkreise und dergleichen, oder deren Derivate. Solche Plasmide sind in Fachkreisen bekannt (Botstein et al., Miami Wntr. Symp. 19: 265–274 (1982); Broach, in: "The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and In-hertance", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 445–470 (1981); Broach, Cell 28: 203–204 (1982); Ballon et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10: 39–48 (1980); Maniatis, in: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Vol. 3, Gene Sequence Expression, Academic Press, NY, S. 563–608 (1980).
Wenn der Vektor oder das Nukleinsäuremolekül, das den/die Konstrukt(e) enthält, zur Expression präpariert ist, kann das/die DNA-Konstrukte) in entsprechende Wirtszellen durch eines von vielen geeigneten Mitteln eingeführt werden, d. h. Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplast-Fusion, Elektroporation, Partikelpistolen-Technik, Lipofektion, Calciumphosphatfällung, direkte Mikroinjektion, DEAM-Dextran-Transfektion und dergleichen. Das effektivste Verfahren zur Transfektion von eukaryotischen Zelllinien mit Plasmid-DNA variiert mit dem gegebenen Zelltyp. Nach der Einführung des Vektors werden die Empfängerzellen in einem selektiven Medium gezüchtet, welches für die vektor-enthaltenden Zellen selektiviert. Die Expression des(r) geklonten Genmoleküls(e) führt zur Bildung von VEGF₁₄₅. Dies kann in den transformierten Zellen als solchen stattfinden, oder anschliessend an die Induktion dieser Zellen zur Differenzierung (zum Beispiel durch Zuführ von Bromdeoxyuracil zu Newoblastom-Zellen oder dergleichen). Zur Bildung von erfindungsgemässen Peptiden können ganz verschiedene Inkubationsbedingungen angewendet werden. Die am meisten bevorzugten Bedingungen sind jene, die physiologische Bedingungen nachahmen.
Die Erzeugung stabiler Transfektanten kann beispielsweise durch Transfektion einer entsprechenden Zelllinie mit einem eukaryotischen Expressionsvektor, wie pCEP4, bewerkstelligt werden, in dem die kodierende Sequenz für VEGF₁₄₅ in die mehrfache Klonstelle geklont worden ist. Diese Expressionsvektoren enthalten eine Promotorregion, wie den Human-Cytomegalovirus-Promotor (CMV), der die Transfektion der gewünschten DNA-Moleküle in hohem Masse in einer Vielzahl von Säugerzellen antreibt. Ausserdem enthalten diese Vektoren Gene zur Auswahl von Zellen, die die fraglichen DNA-Moleküle stabil exprimieren. Die wählbare Markierung im pCEP4-Vektor kodiert für ein Enzym, das Resistenz gegen Hydromycin, einen metabolitischen Hemmer, verleiht, der der Kultur beigefügt wird, um die nicht transfizierten Zellen abzutöten.
Zellen, die die transfizierte DNA stabil aufgenommen haben, können anhand ihrer Resistenz gegen Selektionsmedien, wie oben beschrieben, identifiziert werden, und klonale Zelllinen werden durch Ausdehnung der resistenten Kolonien erzeugt. Die Expression von VEGF₁₄₅ durch diese Zelllinien kann mit in Fachkreisen bekannten Verfahren bewertet werden, zum Beispiel durch Lösungshybridisierung und Northernblot-Analyse.
Pharmazeutische Zubereitungen und therapeutische Verwendung
Ein Ziel dieser Erfindung ist es, VEGF₁₄₅ in einer pharmazeutischen Zubereitung zu bieten, die sich für therapeutische Zwecke zur Stimulierung vaskulärer Zellproliferation eines Patienten durch Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zubereitung eignet, die VEGF₁₄₅ enthält.
Eine „therapeutisch wirksame Menge" bedeutet die Menge einer Verbindung, welche beim Patienten die gewünschte therapeutische Wirkung bewirkt. In Bezug auf eine Krankheit oder Störung ist es zum Beispiel die Menge, die ein oder mehrere Symptome der Krankheit oder Störung bis zu einem gewissen Grad vermindert und die physiologischen oder biochemischen Parameter, die mit der Krankheit oder Störung zusammenhängen oder sie verursacht haben, entweder teilweise oder vollständig, wieder normalisiert. Bei Verwendung zur therapeutischen Behandlung eines Patienten wird mit einer Menge zwischen 0,1 mg/kg und 100 mg/kg gerechnet, vorzugsweise weniger als 50 mg/kg, bevorzugter weniger als 10 mg/kg und noch bevorzugter weniger als 1 mg/kg. Die Menge der Verbindung hängt ab vom Alter, der Grösse und der Krankheit des Patienten.
Die optimale Zubereitung und Verabreichungsart von Verbindungen der vorliegenden Anmeldung für einen Patienten hängt ab von Faktoren, die Fachpersonen bekannt sind, wie die spezielle Krankheit oder Störung, die erwünschte Wirkung und der Patiententyp. Während die Verbindungen typischerweise zur Behandlung menschlicher Patienten verwendet werden, können sie auch zur Behandlung ähnlicher oder identischer Krankheiten bei anderen Säugern, wie anderen Primaten, Haustieren, wie Schweinen, Vieh oder Geflügel, sowie Sporttieren und Schosstieren, wie Pferden, Hunden oder Katzen verwendet werden.
Vorzugsweise wird die therapeutisch wirksame Menge als eine pharmazeutische Zubereitung verabreicht. Ein pharmazeutisches Mittel oder Zubereitung beziehen sich auf ein Mittel oder eine Zubereitung in einer zur Verabreichung an einen multizellulären Organismus, wie den Menschen, geeigneten Form Geeignete Formen hängen teilweise ab von der Verwendung oder dem Verabreichungsweg, zum Beispiel oral, transdermal, oder als Injektion. Solche Formen sollten es dem Mittel oder der Zubereitung erlauben, eine angepeilte Zelle zu erreichen, ob die Zielzelle in einem multizellulären Wirt oder in einer Kultur vorliegt. Zum Beispiel sollten in den Blutkreislauf injizierte pharmakologische Mittel oder Zubereitungen löslich sein. Andere Faktoren sind der Fachwelt bekannt und umfassen Gesichtspunkte, wie Toxizität und Formen, die dem Mittel oder der Zubereitung die Wirkung nehmen.
Die beanspruchten Zubereitungen können auch als pharmazeutisch annehmbare Salze (z. B. Säureadditionssalze) und/oder Komplexe davon formuliert sein. Pharmazeutisch annehmbare Salze sind in Konzentrationen, bei denen sie verabreicht werden nicht-toxische Salze. Die Herstellung solcher Salze kann die pharmakologische Verwendung durch Änderung der physiko-chemischen Merkmale der Zubereitung erleichtern, ohne die Zuberei tung von der Entfaltung ihrer physiologischen Wirkung abzuhalten. Beispiele nützlicher Änderungen physikalischer Eigenschaften sind u. a. die Herabsetzung des Schmelzpunktes zur Erleichterung der transmukosalen Verabreichung und die Erhöhung der Löslichkeit zur Erleichterung der Verabreichung von höheren Medikamentkonzentrationen.
Pharmazeutisch annehmbare Salze sind u. a. saure Additionssalze, wie das Sulfat, Hydrochlorid, Phosphat, Sulfonat, Sulfamat, Sulfat, Acetat, Citrat, Laktat, Tartrat, Methansulfonat, Ethansulfonat, Benzensulfonat, p-Toluensulfonat, Cyclohexylsulfonat, Cyclohexylsulfamat und Chinat. Pharmazeutisch annehmbare Salze können aus Säuren erhalten werden, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Sulfonsäure, Sulfamidsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Malonsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, p-Toluolsulfonsäure, Cyclohexylsulfonatsäure, Cyclohexylsulfamatsäure und Chininsäure. Solche Salze können zum Beispiel durch Reaktion der freien Säure- oder Basenform des Produkts mit einem oder mehreren Äquivalenten der entsprechenden Base oder Säure in einem Lösungsmittel oder Medium hergestellt werden, in dem das Salz unlöslich ist, oder in einem Solvens wie Wasser, das dann im Vakuum oder durch Gefriertrocknung oder durch Ionenaustausch eines bestehenden Salzes mit einem anderen Ion auf einem geeigneten Ionenaustauschharz entfernt wird.
Träger oder Bindemittel können ebenfalls zur Erleichterung der Verabreichung der Verbindung verwendet werden. Beispiele von Trägern und Bindemitteln sind u. a. Calciumcarbonat, Calciumphosphat, verschiedene Zuckerarten wie Laktose, Glukose oder Saccharose, oder Stärketypen, Cellulosederivate, Gelatine, pflanzliche Öle, Polyethylenglykole und physiologisch verträgliche Lösungsmittel. Die Zubereitungen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können auf verschiedene Arten verabreicht werden einschliesslich der folgenden: intravenös, intraperitoneal, subkutan und intramuskulär, oral, topisch oder transmukosal.
Die gewünschte Isotonizität kann erreicht werden durch Verwendung von Natriumchlorid oder pharmazeutisch annehmbaren Mitteln, wie Dextrose, Borsäure, Natriumtartrat, Propylenglykol, Polyolen (wie Mannit und Sorbit) oder anderen anorganischen oder organischen gelösten Stoffen. Natriumchlorid wird insbesondere für Puffer bevorzugt, die Natriumionen enthalten.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können für eine Vielzahl von Verabreichungsformen zusammengestellt werden, einschliesslich systemischer und topischer oder lokaler Verabreichungsformen. Allgemeine Methoden und Formulierungen finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18te Ausgabe, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Siehe auch Wang, Y. J. und Hanson, M. A. „Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42:2S (1988). Eine geeignete Verabreichungsform kann am besten vom Arzt individuell für den jeweiligen Patienten bestimmt werden.
Als systemische Verabreichungsform wird das Injizieren bevorzugt, z. B. intramuskulär, intavenös, intraperitoneal, subkutan, intrathekal oder intracerebroventrikular. Zum Injizieren sind die erfindungsgemässen Verbindungen als flüssige Lösungen formuliert, vorzugsweise in physiologisch verträglichen Puffern wie Hank's Lösung oder Ringer's Lösung. Wahlweise sind die erfindungsgemässen Verbindungen mit einem oder mehreren Bindemitteln formuliert (z. B. Propylenglykol), die allgemein gemäss USP-Standards als sicher anerkannt sind. Sie können zum Beispiel in einem inerten Öl suspendiert sein, wobei ein pflanzliches Öl, wie Sesamöl, Erdnussöl, Olivenöl oder ein anderer annehmbarer Träger geeignet ist. Vorzugsweise sind sie in einem wässrigen Träger suspendiert, zum Beispiel in einem isotonischen Puffer bei einem pH von etwa 5,6 bis 7,4. Solche Zubereitungen können nach herkömmlichen Sterilisationsverfahren sterilisiert oder können steril gefiltert werden. Die Zubereitungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen enthalten, wie es für annähernd physiologische Bedingungen erforderlich ist, wie pH-Puffer. Nützliche Puffer sind u. a. beispielsweise Natriumacetat/Essigsäure-Puffer. Man kann auch eine Form von Vorrats- oder „Depot"-Präparaten für eine langsame Freisetzung anwenden, sodass die therapeutisch wirksame Menge des Präparats über mehrere Stunden oder Tage nach der transdermalen Injektion oder Verabreichung an den Kreislauf abgegeben wird. Ausserdem können die Verbindungen in fester Form formuliert und vor der Verwendung wieder gelöst oder suspendiert werden. Auch gefriergetrocknete Formen gehören hierzu.
Ein aufgeblasener Ballonkatheter mit VEGF₁₄₅-Protein, das den Ballon überzieht, kann zur Abgabe der Substanz in eine Zielarterie eingesetzt werden.
Alternativ können die Verbindungen auch oral verabreicht werden. Zur oralen Verabreichung sind die Verbindungen als herkömmliche Arzneiformen wie Kapseln, Tabletten oder Tonika formuliert.
Die systemische Verabreichung kann auch durch transmukosale oder transdermale Mittel erfolgen oder die Moleküle können oral verabreicht werden. Für die transmukosale oder transdermale Verabreichung werden in der Formulierung zum Durchdringen der Schranke geeignete Eindringmittel verwendet. Solche Eindringmittel sind allgemein in der Fachwelt bekannt und sind u. a. zum Beispiel Gallensalze und Fusidinsäure-Derivate zur transmukosalen Verabreichung. Ausserdem können Detergentien zur Erleichterung des Eindringens verwendet werden. Die transmukosale Verabreichung kann zum Beispiel durch Nasensprays oder durch Benützung von Suppositorien erfolgen. Für die orale Verabreichung werden die Moleküle als konventionelle Arzneiformen wie Kapseln, Tabletten und flüssige Präparate formuliert.
Für die topische Verabreichung werden die erfindungsgemässen Verbindungen als Salben, Gele oder Cremes formuliert, wie es Fachpersonen allgemein bekannt ist.
Wenn gewünscht, können Lösungen der obigen Verbindungen mit einem Verdickungsmittel, wie Methylcellulose, angedickt werden. Sie können in emulgierter Form hergestellt werden, entweder Wasser-in-Öl oder Öl-in-Wasser. Hierzu sind zahlreiche pharmazeutisch annehmbare Emulgiermittel geeignet, einschliesslich zum Beispiel Akazienpulver, nicht-ionischer Tenside (so wie Tween) oder ionischer Tenside (wie Alkali-polyetheralkoholsulfate oder -sulfonate, z. B. ein Triton).
Erfindungsgemäss brauchbare Zubereitungen werden durch Mischen der Zutaten nach allgemein akzeptierten Verfahren hergestellt. Zum Beispiel können die ausgewählten Komponenten einfach in einem Mischer oder einem anderen Standardgerät gemischt werden, um ein konzentriertes Gemisch zu erzeugen, das dann durch Zugabe von Wasser oder eines Verdickungsmittels und möglicherweise eines Puffers zur Steuerung des pH-Werts oder eines zusätzlichen gelösten Stoffes zur Steuerung der Tonizität auf eine Endkonzentration und Viskosität eingestellt werden kann.
Die Mengen der verschiedenen zu verabreichenden erfindungsgemässen Verbindungen können nach Standardverfahren bestimmt werden. Im Allgemeinen liegt eine therapeutisch wirksame Menge zwischen etwa 1 nMol und 3 μMol des Moleküls, vorzugsweise zwischen etwa 10 nMol und 1 μMol, abhängig vom Alter und Grösse des Patienten und der Krankheit oder Störung des Patienten. Im Allgemeinen ist es eine Menge zwischen etwa 0,1 und 50 mg/kg Körpergewicht des Patienten.
Für die ärztliche Verwendung werden die Zubereitungen als Dosierungseinheiten, die einen Anteil eines VEGF₁₄₅ enthalten.
Gentherapie
VEGF₁₄₅ wird auch in der Gentherapie von Nutzen sein (überprüft in Miller, Nature 375: 455–460 (1992)). Miller gibt an, dass sich Vorteile in der Praxis der Human-Gentherapie ergeben haben, die positive Anfangsergebnisse zeigen. Die Grundlagen der Gentherapie sind beschrieben in Mulligan, Science 260: 926–931 (1993). Ein Beispiel für Gentherapie wird in Beispiel VII gegeben, das die Verwendung einer Adenovirusvermittelten Gentherapie beschreibt.
Als weiteres Beispiel kann ein Expressionsvektor, der die für VEGF₁₄₅ kodierende Sequenz enthält, in Zellen eingeführt werden, worauf man die Zellen in vitro vermehrt und dann in grosser Anzahl den Patienten infundiert. In einem weiteren Beispiel wird ein DNA-Segment, das einen Promotor nach Wahl (zum Beispiel einen starken Promotor) enthält, in Zellen transferiert, die endogenes VEGF₁₄₅ enthalten, in einer solchen Weise, dass das Promotor-Segment die Expression des endogenen VEGF₁₄₅-Gens verstärkt (zum Beispiel wird das Promoter-Gen in die Zelle transferiert, sodass es direkt an das endogene VEGF₁₄₅-Gen angekoppelt wird).
Die Gentherapie kann die Verwendung eines Adenovirus-Vektors umfassen, der eine Nukleotid-Sequenz, die für VEGF₁₄₅ kodiert, enthält, oder ein nacktes Nukleinsäuremolekül, das für VEGF₁₄₅ kodiert. Alter nativ können reife Zellen, die ein Nukleinsäuremolekül enthalten, das für VEGF₁₄₅ kodiert, injiziert werden. Beispiel VII erläutert ein Verfahren zur Gentherapie unter Verwendung eines Adenovirus-Vektors zur Unterstützung einer Angiogenese-Therapie.
Von Viren abgeleitete Expressionsvektoren, wie Retroviren, das Vaccinia-Virus, Adenovirus, adenoassozüertes Virus, Herpesviren, verschiedene RNA-Viren oder das Rinder-Papilloma-Virus können zur Abgabe von Nukleotidsequenzen (z. B. cDNA), die für rekombinantes VEGF₁₄₅ kodieren, an die Zellen-Zielpopulation verwendet werden. Es können den Fachpersonen bekannte Verfahren zur Bildung rekombinanter viraler Vektoren mit kodierenden Sequenzen angewandt werden. Siehe zum Beispiel Nabel, E. G., Circulation, 91, 541–548 (1995), die Verfahren sind beschrieben in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989), und in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989). Alternativ können rekombinante Nukleinsäuremoleküle kodierende Proteinsequenzen als nackte DNA oder in rekonstituierten Systemen, z. B. Liposomen oder anderen Lipidsystemen zur Abgabe an Zielzellen, verwendet werden (siehe z. B. Felgner et al., Nature 337: 387–8 (1989)). Es gibt verschiedene andere Methoden für den direkten Transfer von Plasmid-DNA in Zellen zur Anwendung in der Gentherapie von Menschen, die auf dem Targetieren der DNA auf Zellrezeptoren durch Komplexbildung der Plasmid-DNA zu Proteinen beruhen. Siehe Miller, Nature 357: 455–60 (1992).
In seiner einfachsten Form kann Gentransfer einfach durch Injektion minimer Mengen von DNA in den Kern einer Zelle durch Mikroinjektion durchgeführt werden. Capecchi, M. R., Cell 22: 479–88 (1980). Wurden einmal rekombinante Gene in eine Zelle eingeführt, können sie mit den zelleigenen normalen Mechanismen zur Transkription und Translation erkannt werden, und es wird ein Genprodukt exprimiert. Andere Verfahren zum Einführen von DNA in grössere Zellmengen wurden ebenfalls getestet. Hierzu gehören unter anderen: Transfektion, wobei DNA mit CaPO₄ ausgefällt und von Zellen mittels Pinozytose aufgenommen wird (Chen, C. und Okayama, H., Mol. Cell Biol. 7: 2745–52 (1987)}; Elektroporation, bei der Zellen grossen Spannungspulsen ausgesetzt werden, um Löcher in der Membran anzubringen (Chu, G. et al., Nucleic Acids Res., 15: 1311–26 (1487)); Lipofektion/Liposom-Fusion, bei der DNA lipophile Bläschen gepackt wird, die mit der Zielzelle verschmelzen (Felgner, P. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413–7 (1987)); und Partikelbeschuss durch Verwendung von DNA, die an kleine Projektile gebunden ist (Yang, N. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 9568–72 (1990)). Ein anderes Verfahren zum Einbringen von DNA in Zellen ist das Koppeln der DNA an chemisch modifizierte Proteine.
Ebenfalls wurde gezeigt, dass man mit Adenovirus-Proteinen Endosome destabilisieren und die Aufnahme von DNA in Zellen verstärken kann. Die Beimischung von Adenovirus zu DNA-Komplexe enthaltenden Lösungen oder die Bindung von DNA an Polylysin, das mit dem Adenovirus kovalent verbunden ist, wobei proteinvernetzende Mittel benutzt werden, erhöht die Aufnahme und Expression der rekombinanten Gene wesentlich. Curiel, D. T. et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol., 6: 247–52 (1992).
Ein Ballonkatheter, wie er für Angioplastie verwendet wird, kann eingesetzt werden, bei dem der Ballon mit der VEGF₁₄₅-DNA oder Vektoren überzogen ist, wie dies von Riessen, R., Human Gene Therapy, 4, 749–758 (1993), beschrieben ist und hier durch Verweisung aufgenommen wird.
Der hier verwendete Ausdruck „Gentransfer" bedeutet den Vorgang der Einführung eines fremden Nukleinsäuremoleküls in eine Zelle. Gentransfer wird üblicherweise benützt, um die Expression eines speziellen, durch das Gen kodierten Produkts zu ermöglichen. Das Produkt kann ein Protein, Polypeptid, Gegensinn-DNA oder RNA oder enzymatisch aktive RNA enthalten. Gentransfer kann in Kulturzellen oder durch direkte Verabreichung an Tiere erfolgen. Allgemein bedingt Gentransfer den Vorgang des Kontakts eines Nukleinsäuremoleküls mit einer Zielzelle durch nicht-spezifische oder rezeptor-vermittelte Interaktionen, die Aufnahme von Nukleinsäuremolekülen in die Zelle durch die Membran oder durch Endozytose, und die Freisetzung von Nukleinsäuremolekülen aus der Plasmamembran oder dem Endosom. Ausserdem kann die Expression die Bewegung der Nukleinsäuremoleküle in den Zellkern und die Bindung an entsprechende nukleäre Faktoren zur Transkription erfordern.
Der hier verwendete Ausdruck „Gentherapie" bedeutet eine Form des Gentransfers, ist in der Definition von Gentransfer, wie sie hier verwendet wird, enthalten und bezieht sich speziell auf Gentransfer zur Expression eines therapeutischen Produkts aus einer Zelle in vivo oder in vitro. Gentransfer kann ex vivo auf Zellen ausgeführt werden, welche dann in einen Patienten transplantiert werden, oder kann durch direkte Verabreichung des Nukleinsäuremoleküls oder Nukleinsäureprotein-Komplexes an den Patienten erfolgen.
Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform wird ein Vektor verwendet, der Nukleinsäuremolekül-Sequenzen besitzt, die für VEGF₁₄₅ kodieren, in welchem die Nukleinsäuremolekül-Sequenz nur in einem spezifischen Gewebe exprimiert wird. Methoden zum Erzielen gewebe-spezifischer Genexpression sind in International Publication No. WO 93/09236, eingereicht am 3. November 1992 und veröffentlicht am 13. Mai 1993, beschrieben.
Bei allen oben genannten Vektoren besteht eine weitere Aufgabe der Erfindung darin, dass die im Vektor enthaltene Nukleinsäuresequenz Additionen, Deletionen oder Modifikationen von einigen oder allen Sequenzen der Nukleinsäure aufweisen kann, wie oben angegeben.
Eine andere bevorzugte Ausführungsform betrifft ein Verfahren zum Gen-Ersatz. Die hier verwendete Bezeichnung „Gen-Ersatz" bezieht sich auf die Bereitstellung einer Nukleinsäuremolekül-Sequenz, die geeignet ist, in einem animalischen Wesen in vivo exprimiert zu werden und dabei die Funktion eines endogenen Gens, das dem animalischen Wesen fehlt oder defekt ist, zu bieten oder zu erweitern.
Klinische Anwendungen
Das Stimulieren von Angiogenese in Säugern durch Transfektion der Endothelzellen mit einer Polynukleotid-Kodierung für VEGF₁₄₅ kann zum Beispiel nach einer Methode durchgeführt werden, die von Giordano et al. in „Intracoronary Gene Transfer of Fibroblast Growth Factor-5 Increases Blood Flow an Contractile Function in an Ischemic Region of the Heart ", Nature Medicine, Vol. 2 No. 5, S. 534–539, Mai 1996, beschrieben wurde und hier durch Verweisung aufgenommen wird. VEGF₁₄₅ wird aus Zellen freigesetzt, die durch Adenovirus-Vektoren infiziert sind, welche die Expression von VEGF₁₄₅ in Herzzellen steuern. Diese Freisetzbarkeit findet sich auch bei VEGF₁₂₁ und VEGF₁₆₅, aber nicht bei VEGF₁₈₉ oder VEGF₂₀₆. Im Unterschied zu VEGF₁₂₁ und VEGF₁₆₅ wird VEGF₁₄₅ von ECM-Molekülen teilweise zurückgehalten, während es gegen Endothel-Zielzellen in benachbarten Blutgefässen diffundiert. Das gebundene VEGF₁₄₅ kann später langsam freigesetzt werden und deshalb die angiogenetische Wirkung im Vergleich mit VEGF₁₂₁, oder VEGF₁₆₅ verlängern. Ausserdem ist das ECM-gebundene VEGF₁₄₅ aktiv und versorgt die neu synthetisierten Blutgefässe während der kritischen Phase der Blutgefässreifung, bis das Bestehen der Blutgefässe nicht länger von der Gegenwart von angiogenetischen Wachstumsfaktoren abhängig ist. Deshalb ist VEGF₁₄₅ als therapeutisches Mittel zur Verwendung für die Induktion von kollateralen Blutgefässen wirksamer als irgendeine andere VEGF-Form Diese Vorteile können kritisch sein, wenn die Verwendung von auf Adenovirus beruhenden Expressionsvektoren für gen-therapeutische Freisetzung von angiogenetischen Agenzien in Betracht kommt. Ein Vorteil der Verwendung von adenovirusbasierten Vektoren besteht darin, dass sie im Allgemeinen sicher sind. Das Virus ist nach der anfänglichen Infektion rasch abgestorben, und dies wird von einem Absinken der Produktion des rekombinanten Proteins begleitet (Kass-Eisler, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498–11502 (1993)). Weil die VEGF₁₄₅-Bindungseigenschaften erlauben, dass es verglichen mit anderen abgeschiedenen Formen langsamer freigesetzt wird, ist zu erwarten, dass VEGF₁₄₅ im Vergleich zu anderen VEGF-Formen ein wirksameres therapeutisches Mittel ist.
Die Ballon-Angioplastie ist eine mehrheitlich angewandte Behandlung von ischämischen Herzerkrankungen und beruht auf dem Aufblasen eines Ballons in einem verstopften Blutgefäss, um das blockierte Blutgefäss zu öffnen. Leider führt diese Behandlungsmethode zu Verletzungen der Endothelzellen-Auskleidung der Innenwände von Blutgefässen. Glatte Muskelzellen sickern oft in die geöffneten Blutgefässe und verursachen eine sekundäre Verstopfung in einem als Restenose bezeichneten Vorgang. VEGF₁₄₅ kann zur Induktion von Proliferation der Endothelzellen eingesetzt werden, die sich an der Peripherie des balloninduzierten beschädigten Bereiches befinden, um die luminale Oberfläche des Gefässes mit einer neuen einzelligen Schicht von Endothelzellen zu bedecken, in der Hoffnung, die ursprüngliche Struktur des Blutgefässes wiederherzustellen. Adenovirusvermittelte Gentherapie kann auch in diesem Fall als ein Verfahren anwendbar sein, das die Abgabe von Induktoren von Endothelzellproliferation auf die Läsion anstrebt, die von der Ballon-Angioplastie hervorgerufen wurde. Durch die Fähigkeit, an die ECM zu binden, kann diese Anwendung verschiedene Vorteile bieten.
Zur Vorbeugung der an eine Ballon-Angioplastie anschliessenden Restenose kommen zwei Typen von Verfahren in Betracht. Es ist möglich, ein Protein oder einen Expressionsvektor abzugeben, welcher die Expression eines solchen Proteins auf die Seite des Verschlusses leiten wird, und zwar durch Verwendung des Ballons, der zur Öffnung des verstopften Gefässes benötigt wird. Solch ein Protein wird auch die Proliferation der nichtendothelialen Zellen inhibieren, die in das wiedergeöffnete Blutgefäss eindringen, bis die Endothelzellen auf beiden Seiten der verwundeten Endothel-Zellmonoschicht eine Aussicht auf Wiedernachwachsen haben. Dies kann mit der Abgabe eines Proteins oder eines Vektors, wie eines rekombinanten Adenovirus, der das Nachwachsen der Endothel-Zellschicht beschleunigen würde, verbunden sein. Wachstumsfaktoren, wie FGF-5, bFGF oder HGF, sind jedoch auch mitogenetisch zu glatten Muskelzellen und würden ihre Proliferation induzieren, was das Gegenteil des gewünschten Effekts wäre. Andererseits sind die VEGF für Endothelzellen spezifisch. VEGF₁₄₅ wird sich in diesem Zusammenhang wegen seiner ECM-Bindungseigenschaften als besonders nützlich erweisen. Beispielsweise wird das VEGF₁₄₅ nach der Applikation durch Infektion anliegender Zellen mit für das Protein kodierendem Adenovirus, direkter Transfektion mit Plasmid-DNA, die für das Protein kodiert, oder der direkten Abgabe des Proteins an der ausgesetzten extrazellulären Matrix im ballonbehandelten Gefäss haften und die Proliferation sowie das Nachwachsen der Endothelzellen, besonders am Ort der Läsion, fördern. Deshalb wird sich VEGF₁₄₅ genau in der Gegend, wo seine Aktivität erforderlich ist, ansiedeln und konzentrieren, was es zu einem besonders aussichtsreichen Anwärter für die Behandlung von Restenose macht.
Die koronäre Angioplastie ist häufig von der Einsetzung eines Stents begleitet, um die Gefässfunktionen erhalten zu helfen und die Restenose zu vermeiden. Stents wurden schon zur Vermeidung von Thrombosen mit Heparin überzogen, bis der durch den Stent neugebildete Kanal endothelialisieren konnte. VEGF₁₄₅ kann direkt auf dem Stent angewandt werden, oder Nukleinsäuren, die für das VEGF₁₄₅ kodieren, wie Plasmide, cDNA oder Adenovirus-Vektoren können für die direkte Transfektion anliegender Zellen durch in Fachkreisen bekannte Verfahren auf dem Stent angewandt werden. Lokal appliziertes oder durch Transfektion erzeugtes VEGF₁₄₅ wird die Endothelialisation des Stents verstärken und somit Thrombosen und Restenose vermindern.
Weitere Anwendungen des erfindungsgemässen Wachstumsfaktors stehen in Aussicht. Ein Beispiel betrifft die Behandlung von Ulcus. Ulcus ist eigentlich ein im Magen angesiedeltes Geschwür. Es konnte gezeigt werden, dass die Stabilisierung von angiogenetischen Wachstumsfaktoren in der Behandlung von Zwölffingerdarmgeschwüren wirksam sein kann und dass die Stabilisierung angiogenetischer Wachstumsfaktoren ein Mechanismus sein kann, durch den einige therapeutische Mittel, wie Sucralfat, günstige Wirkungen ergeben (Szabo, S. et al, Gastroenterology 106: 1106–1111 (1994)). Da VEGF ein angiogenetischer Wachstumsfaktor ist, der unter sauren Bedingungen sehr stabil ist, steht sein Einsatz zur Behandlung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren in Aussicht. Die Heparin-Bindungsfähigkeit von VEGF₁₄₅, die es in aktivem Zustand hält, und seine erwartete Eignung zur Bindung an die exponierte ECM im Wundbereich weist darauf hin, dass sich VEGF₁₄₅ geeigneter als andere VEGF-Formen für die Behandlung von Magen- und Zwölffingerdarmgeschwüren erweisen wird.
Zum Verständnis der vorliegenden Erfindung dienen die folgenden Beispiele, welche die Ergebnisse von Versuchsreihen beschreiben. Diese auf die Erfindung bezogenen Beispiele sind natürlich nicht als die Erfindung beschränkend auszulegen und bekannte oder später entwickelte Abwandlungen der Erfindung, die für Fachleute ersichtlich sind, werden als unter die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung fallend angesehen.
BEISPIEL I
Isolierung und Charakterisierung von VEGF₁₄₅
Durch reverse PCR-Analyse von mRNA aus OC-238 humaner Ovarienkarzinom-Epithelzellen sowie HeLa-Zellen und A431-Zellen (5) wurde eine VEGF-mRNA-Form entdeckt, die in der Grösse der erwarteten Grösse einer VEGF-mRNA-Form, welche für ein putativ ausgereiftes Protein von 145 Aminosäuren kodiert, entsprach. Ein reverse-PCR-Produkt aus OC-238-Zellen wurde sequenziert und es wurde gefunden, dass es die Exon- Struktur 1–5, 6a, 8 enthält, was die erwartete Struktur einer mRNA ist, die für VEGF₁₄₅ kodiert. Die sequenzierte cDNA wurde durch Verwendung des Primers GGAGAGATGAGCTTCCTACAG und TCACCGCCTTGGCTTGTCACA erhalten, was den Sequenzen, welche für die Aminosäuren 92–98 von VEGF (allgemein für alle VEGF-Formen) kodieren, und den sechs Carboxyl-terminal-Aminosäuren von VEGF, die durch das Exon 8 des VEGF-Gens kodiert wurden, entspricht. In allen diesen Zelllinien schien die erwartete und für 145 Aminosäure kodierende cDNA auf Ebenen exprimiert zu werden, die vergleichbar mit jenen von VEGF₁₆₅ und höher als jene von VEGF₁₈₉ waren. Die mRNA, die für diese VEGF-Form kodiert, wurde in verschiedenen anderen transformierten Zelllinien, wie den C6-Gliomzellen und U937-Zellen, nicht gefunden. Die Sequenzanalyse des putativen PCR-Produkts aus den OC-238-Zellen zeigte, dass die mRNA die Exone 1–5, 6 und 8 des VEGF-Gens in Sequenz (VEGF₁₄₅) enthält.
Um rekombinantes VEGF₁₄₅ zu erzeugen, wurde ein VEGF₁₄₅-cDNA-Konstrukt durch Deletion der durch Exon 7 kodierten Oligonukleotide aus der VEGF₁₈₉-cDNA hergestellt. Zur Verstärkung der Exone 1–6 der VEGF-cDNA verwendete Primers waren der externe Primer GCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGG, der einer puc118-Sequenz entspricht, und der interne Primer ACGCTCCAGGACTTATACCGGGA, der einer Sequenz am 3'-Ende von Exon 6 entspricht. Die zur Verstärkung des 3'-Endes der VEGF-cDNA verwendeten Primers waren komplementär zur puc118-Sequenz GGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTC und z um 3'-Ende der Exon-6-Sequenz (unterstrichen) sowie zum Anfang von Exon 8 (CGGTATAAGTCCTGGAGCGTATGTGACAAGCCGAGGCGGTGA). Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte gefällt und die Produkte re-amplifiziert, wozu nur die puc118-ageleiteten externen Primers verwendet wurden. Das Produkt wurde gel-filtriert, in den PCR-II-Vektor subkloniert und durch der Verwendung des Sequenase-II-Kits, das von U.S. Biochamical Corp. (Cleveland, Ohio) erhältlich ist, sequenziert. Diese cDNA wurde für Untersuchungen der Proteinexpression weiterverwendet.
Diese rekombinante VEGF₁₄₅-cDNA wurde dazu verwendet, einen rekombinanten Baculovirus zu konstruieren, der die VEGF₁₄₅-cDNA enthält. Das Virus wurde dazu benützt, Sf9-Zellen zu infizieren, wie dies für VEGF₁₄₅ von Cohen, T. et al., Growth Factors 7: 131–138 (1992), beschrieben ist und hier durch Verweisung aufgenommen wird. Das meiste VEGF₁₄₅, das durch infizierte Sf9-Zellen erzeugt wurde, wurde im konditionierten Medium als Homodimer von 41 kDa mit kleinen Mengen von monomerem VEGF₁₄₅ (4) gefunden. Die VEGF₁₄₅-Dimere dissoziierten in Monomere nach Reduktion mit Dithiotreitol. Das VEGF₁₄₅ wurde teilweise durch Verwendung von Heparin-Sepharose gereinigt. Das Protein wurde aus der Kolonne durch Verwendung eines schrittweisen Salzgradienten eluiert. Der grösste Teil des VEGF₁₄₅ wurde bei 0,6–0,7 Mol NaCl eluiert, was daraufhinweist, dass die Heparin-Bindungsaffinität von VEGF₁₄₅ ähnlich ist wie die von VEGF₁₄₅. Die rekombinante VEGF₁₄₅ war biologisch aktiv und induzierte die Proliferation von aus Human-Nabelvenen abgeleiteten Endothelzellen (HUVEC-Zellen). Der ED₅₀-Wert von VEGF₁₄₅ betrug 30 ng/ml, wobei ED₅₀ von VEGF₁₄₅ 6-mal tiefer lag (6).
BEISPIEL II
Proliferation von Endothelzellen und Angiogenese
Um zu bestätigen, dass VEGF₁₄₅ Angiogenese in vivo induzieren kann, wurde die VEGF₁₄₅-cDNA in den Bam-HI-Ort des Säuger-Expressionsvektors MIRB subkloniert, und zwar nach dem von Macarthur, C. A. et al., Cell Growth Differ. 6: 817–825 (1995) beschriebenen Verfahren, auf das hier durch Verweisung Bezug genommen wird. Das MIRB/VEGF₁₄₅-Plasmid wurde in aus BHK-21 Hamsternieren abgeleitete Zellen transfiziert und stabile Zelllinien, die VEGF₁₄₅ Produzierten, isoliert. Das von den Säugerzellen erzeugte VEGF₁₄₅ war biologisch aktiv und wurde in das Wachstumsmedium abgeschieden. Es wurde ein stabiler Klon, der 0,1 mg VEGF₁₄₅ auf 10⁶ Zellen produzierte, wurde isoliert. Die VEGF₁₄₅ exprimierenden Zellen wurden in Alginatklumpen eingebettet und die Klumpen wurden balb/c-Mäusen unter die Haut implantiert und zwar nach einem Verfahren, das von Plunkett, M. L. et al., Lab. Invest. 62: 510–517 (1990), beschrieben worden ist und auf das hier durch Verweisung Bezug genommen wird. Alginatklümpchen, die die eingeschlossenen Zellen enthielten, wurden nach vier Tagen entfernt und photographiert (11). Cluster von Alginatklumpen, die VEGF₁₄₅-exprimierende Zellen enthielten, waren dunkelrot und blutgetränkt, während Klumpen, die mit dem Vektor allein transfizierte Zellen enthielten, einen viel geringeren Blutgehalt aufwiesen. Bei Untersuchungen bei einer stärkeren Vergrösserung erschienen die Klümpchen, welche die VEGF₁₄₅-erzeugenden Zellen enthielten, viel vaskularisierter als die Klümpchen, die die Steuerzellen enthielten. Diese Ergebnisse sind konsistent mit dem erwarteten Verhalten einer vaskulären Zellproliferation oder eines angiogenese-fördernden Faktors.
BEISPIEL III
Rezeptor-Bindungsmerkmale
Das VEGF₁₆₅ bindet an drei VEGF-Rezeptoren auf HUVEC-Zellen, während VEGF₁₂₁ nur an den grösseren dieser Rezeptoren bindet. Der übliche Rezeptor, an den sowohl VEGF₁₂₁ als auch VEGF₁₆₅ binden, ist der KDR/flk-1-VEGF-Rezeptor (Gitay-Goren, H. et al., J. Biol. Chem. 271: 5519–5523 (1946)). Um das Erkennungsmuster von VEGF₁₄₅ zu bestimmen, wurde ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ (erzeugt wie beschrieben in Gitay-Goren, H. et al., J. Biol. Chem. 271: 5519–5523 (1996), hier durch Verweisung aufgenommen) in Gegenwart von 1 μg/ml Heparin und steigenden Konzentrationen von VEGF₁₄₅ an HUVEC-Zellen gebunden. Das gebundene ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ wurde anschliessend mit den VEGF-Rezeptoren kovalent vernetzt. Das VEGF₁₄₅ hemmte die Bindung von ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ an den KDR/flk-1-Rezeptor der HUVEC-Zellen, aber nicht an die zwei kleineren VEGF₁₆₅-spezifischen Rezeptoren der Zellen (7). Dieses Resultat wurde in einem zellfireien Bindungsversuch bestätigt, in dem VEGF₁₄₅ mit ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ um die Bindung an ein lösliches Fusionsprotein konkurrierte, das den extrazellulären Bereich des flk-1-Rezeptors enthielt. Im Gegensatz dazu konkurrierte VEGF₁₄₅ eher unwirksam mit ¹²⁵I-VEGF₁₆₅ um die Bindung an die zwei kleineren VEGF-Rezeptoren, was ein Hinweis darauf ist, dass die Affinität von VEGF₁₄₅ zu diesen zwei Rezeptoren wesentlich niedriger ist, als jene von VEGF₁₆₅. Die Gegenwart von Exon 6 ist nicht ausreichend, um eine effiziente Bindung von VEGF₁₄₅ an diese zwei Rezeptoren zu ermöglichen, und zwar trotz der Heparin-Bindungseigenschaften, die Exon 6 auf VEGF₁₄₅ überträgt.
BEISPIEL IV
ECM Bindungscharakteristik
VEGF₁₈₉ bindet wirksam an die ECM, die durch CEN4-Zellen erzeugt ist, während VEGF₁₆₅ daran sehr schwach und VEGF₁₂₁ überhaupt nicht daran bindet. Die Tatsache, dass VEGF₁₈₉ Heparin mit hoher Affinität bindet, führte zur Vorstellung, dass die Wechselwirkung von VEGF₁₈₉ mit der ECM durch Heparin-Sulfat Proteoglykane vermittelt wird (Houck, K. A. et al., J. Biol. Chem. 267: 26031–26037 (1992); Park, J. E. et al., Mol. Biol. Cell 4: 1317–1326 (1993)). Die Heparin-Bindungsaffinitäten von VEGF₁₄₅ und VEGF₁₆₅ sind ähnlich und wesentlich niedriger als die Bindungsaffinitäten von VEGF₁₈₉, und deshalb war zu erwarten, dass VEGF₁₄₅ schwächer an die ECM bindet. Überraschenderweise zeigten Versuche, in denen VEGF₁₄₅ an eine von cornealen Rinder-Endothelzellen erzeugte ECM gebunden war, dass VEGF₁₄₅ wirksam gebunden hatte, wohingegen die Bindung von VEGF₁₆₅ marginal war. Aus diesen Versuchen, deren Resultate in 8 gezeigt sind, ist zu ersehen, dass VEGF₁₄₅ wirksam an die ECM bindet, während VEGF₁₆₅ viel weniger wirksam bindet, wenn überhaupt. Die Bindung von ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ an die ECM war wesentlich, aber nicht vollständig durch 10 g/ml Heparin gehemmt. Das in diesen Versuchen verwendete ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ enthielt einige Verunreinigungen, aber das hauptsächliche jodierte Protein, das aus der ECM wiederhergestellt war, hatte eine Masse, die jener von ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ entsprach (siehe 8b). Um sicherzustellen, dass ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ an die ECM und nicht an die ungeschützten Plastikoberflächen bindet, wurde die ECM abgekratzt, durch Zentrifugierung gewaschen und die Menge von adsorbiertem ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ im Klümpchen bestimmt. Die ECM enthielt 70% des adsorbierten ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ Ausgehend vom Vorangehenden wird angenommen, dass die Gegenwart des von Exon-6 abgeleiteten Peptids in VEGF₁₄₅ eine wirksame Bindung an die ECM ermöglicht, während das von Exon-7 abgeleitete Peptid von VEGF₁₆₅ diese Eigenschaft nicht bietet. Deshalb unterscheidet sich VEGF₁₄₅ dieser Hinsicht wesentlich von VEGF₁₂₁ oder VEGF₁₆₅.
BEISPIEL V
ECM Bindungscharakteristik
Die oben beschriebenen Versuche zeigten, dass VEGF₁₄₅ an die ECM bindet, während VEGF₁₆₅ weit weniger wirksam daran bindet. VEGF₁₄₅ und VEGF₁₆₅ binden mit ähnlichen Affinitäten an Heparin, was darauf hinweist, dass die Bindung an ECM nicht durch heparin-ähnliche Moleküle vermittelt wird. Die Wechselwirkung von bFGF mit der ECM wird vermittelt durch Heparinsulfat-Proteoglykane. Um zu ermitteln, ob VEGF₁₄₅ mit der ECM durch Verwendung eines bFGF-ähnlichen Bindungsmechanismus wechselwirkt, wurde ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ an mit ECM beschichtete Schalen in Gegenwart von 10 μg/ml Heparin gebunden. Die Bindung von VEGF₁₄₅ wurde bis zu 60% gehemmt, während die Bindung von ¹²⁵I-bFGF an die ECM bis zu 80% gehemmt wurde. Die Bindung von ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ an die ECM wurde in Anwesenheit von 0,8 Mol Salz auch bis zu 80% gehemmt, was darauf hinweist, dass die Wechselwirkung nicht hydrophob ist. Diese Ergebnisse sind vereinbar mit dem erwarteten Verhalten von Proteinen, die an die ECM über Heparin-ähnliche Moleküle binden. Unerwartet wurde jedoch beobachtet, dass ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ auch imstande war, wirksam an eine ECM zu binden, die mit Heparinase-II biologisch abgebaut war. Im Gegensatz dazu hatte es fast keine Bindung von ¹²⁵I-bFGF an die mit Heparinase-II behandelte ECM (9a). Die Beobachtung deutet darauf hin, dass VEGF₁₄₅ nicht durch Bindung an ECM-angeschlossene Heparin-ähnliche Moleküle an die ECM bindet.
Um die Art der Wechselwirkung von VEGF₁₄₅ mit der ECM weiter zu untersuchen, wurde die Fähigkeit von Heparin und Heparinase-Behandlung zur Freisetzung von gebundenen VEGF₁₄₅ von der ECM getestet. Ähnliche Unterschiede wurden beobachtet, wenn ECM, die gebundenes ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ oder ¹²⁵I-bFGF enthielt, mit Heparin inkubiert oder mit Heparinase-II abgebaut wurde. Wenn die mit ECM beschichteten Schalenböden zwei Std. bei 37°C mit Bindungspuffer inkubiert wurden, dissoziierten 20% des gebundenen ¹²⁵I-bFGF und 13% des gebundenen ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ von der ECM. Diese Freisetzung kann teilweise der proteolytischen Aktivität zugeschrieben werden, die der ECM innewohnt. Wenn dem Puffer 10 μg/ml Heparin beigefügt wurden, wurden nur 33% des ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ aus der Matrix freigesetzt, verglichen mit der Freisetzung von 78% vom gebundenen ¹²⁵I-bFGF. Ein sogar noch schärferer Unterschied wurde beobachtet, wenn dem Bindungspuffer Heparinase-II beigefügt wurde. Das Enzym setzte 72% des gebundenen ¹²⁵I-bFGF frei, aber nur 17% des gebundenen ¹²⁵I-VEGF₁₄₅ (9b). Ähnliche Resultate wurden erhalten, wenn der Versuch mit unmarkiertem VEGF₁₄₅ unter Benützung eines handelsüblichen monoklonalen Anti-VEGF-Antikörpers zum Aufspüren von an die ECM gebundenem VEGF durchgeführt wurde.
Zur Bewertung der Wirksamkeit der Heparinase-II-Digestion wurde die ECM metabolisch mit ³⁵S-Sulfat markiert und die markierte ECM wurde mit Heparinase-II abgebaut. Die Digestion setzte 80–85% der markierten Sulfatreste frei. Um zu entscheiden, ob VEGF₁₄₅ an die an sulfatierten Glykosaminoglykanen verarmte ECM binden kann, wurden BCE-Zellen in Anwesenheit von 30 mMol Chlorat gezüchtet, einem Hemmer für Glykosaminoglykansulfation, und zwar nach der von Miao, H. Q. et al., J. Biol. Chem. 271: 4879–4886 (1996) beschriebenen Methode. Die ECM, die in An- oder Abwesenheit von Chlorat erzeugt wurden, wurden weiter mit einer Mischung von Heparinasen I, II und III digeriert. Keine dieser Behandlungen vermochte die Bindung von VEGF₁₄₅ an die ECM trotz einer > 95%-Abnahme des Sulfatgehalts in der ECM zu hemmen.
Die von BCE-Zellen erzeugte ECM enthält bFGF, das für Endothelzellen mitogenetisch ist. Endothelzellen proliferieren jedoch nicht, wenn sie auf ECM gesät werden, die in Anwesenheit von Chlorat erzeugt wurde, da bFGF nicht an eine ECM bindet, die an sulfatierten heparin-ähnlichen Molekülen verarmt ist. VEGF ₁₄₅ bindet an ECM, welche in Gegenwart von Chlorat erzeugt wurde, und deshalb wurde untersucht, ob ein an solche ECM gebundenes VEGF₁₄₅ seine Bioaktivität behält. Mit in Anwesenheit von Chlorat erzeugter ECM überzogene Schalenunterteile wurden mit steigenden Konzentrationen von VEGF₁₄₅ oder VEGF₁₆₅ inkubiert. Die Schalenunterteile wurden anschliessend gründlich gewaschen und HUVEC-Zellen darin ausgesät. Die mit VEGF₁₄₅ inkubierte ECM induzierte Proliferation von vaskulären Endothelzellen, während mit VEGF₁₆₅ inkubierte ECM dies nicht tat, was darauf hinweist, dass mit ECM vereinigtes VEGF₁₄₅ biologisch aktiv ist (10). BEISPIEL VI Vergleich von VEGF₁₄₅ mit anderen VEGF-Formen Tabelle 1: Übersicht der Unterschiede von VEGF₁₄₅ und anderen VEGF-Formen
a. Vergleich mit VEGF₁₆₅
VEGF₁₆₅ enthält die Exone 1–5, 7 und 8 des VEGF-Gens und Exon 6 fehlt. Es bindet Heparin mit einer ähnlichen Affinität, wie die von VEGF₁₄₅ VEGF₁₄₅ bindet an einen einzelnen VEGF-Rezeptor auf aus der Nabelvene abgeleiteten Humanzellen, der als der KDR/flk-1-VEGF-Rezeptor identifiziert wurde. Im Gegensatz dazu bindet VEGF₁₆₅ an zwei zusätzliche Rezeptoren hoher Affinität, die auf vaskulären Endothelzellen und verschiedenen anderen Zelltypen anwesend sind (Neufeld, G. et al., Cancer Metastasis Rev. 15: 153–158 (1996)). Es ist bisher nicht klar, ob VEGF₁₆₅-Bindung vorkommt, aber wenn ja, dann sollten Endothelzellen verglichen mit VEGF₁₆₅ eine eingeschränktere biologische Reaktion auf VEGF₁₄₅ zeigen. VEGF₁₆₅ ist anfällig für Oxidationsmittel. Diese sind in entzündetem Gewebe oder bei Verwundungen besonders reichlich vorhanden. Wenn durch Oxidation beschädigtes VEGF₁₆₅ jedoch an auf Endothelzellen gefundene heparin-ähnliche Moleküle bindet, wird die Aktivität des beschädigten VEGF₁₆₅ wiederhergestellt (Gitay-Goren, H. et al., J. Biol. Chem. 271: 5519–5523 (1996)). Diese Eigenschaft wird auch von VEGF₁₄₅ geteilt. Ausserdem bindet VEGF₁₆₅ sehr schwach an ECM, wenn überhaupt. Die residuale Bindung von VEGF₁₆₅ an die ECM wird nach dem biologischen Abbau der ECM mittels Heparinase gehemmt. Im Gegensatz dazu wird die Bindung von VEGF₁₄₅ n die ECM durch vorangehende Digestion der ECM durch Heparinase nicht verändert. Deshalb wird trotz der ähnlichen Heparin-Bindungsaffinitäten von VEGF₁₆₅ und überraschend VEGF₁₄₅, das VEGF₁₄₅ abgesondert und bindet, nicht wie bei VEGF₁₆₅, wirksam an die ECM.
b. Vergleich mit VEGF₁₂₁
VEGF₁₂₁ enthält die Exone 6 und 7 des VEGF-Gens nicht. Im Gegensatz zu VEGF₁₄₅ bindet VEGF₁₂₁ nicht an Heparin. Wie VEGF₁₄₅ bindet VEGF₁₂₁ nicht an die zwei kleineren VEGF-Rezeptoren, die in den Endothelzellen und in verschiedenen Typen von Krebszellen gefunden werden können. Sowohl VEGF₁₂₁ als auch VEGF₁₄₅ werden aus Zellen abgesondert, aber VEGF₁₂₁ bindet nicht an die ECM. VEGF₁₂₁ wird durch Oxidation wie VEGF₁₆₅ und VEGF₁₄₅ inaktiviert, aber die Aktivität lässt sich nicht durch Bindung an heparin-ähnliche Moleküle wiederherstellen.
c. Vergleich mit VEGF₁₈₉ und VEGF₂₀₆
VEGF₁₈₉ enthält durch Exon-6 und Exon-7 des VEGF-Gens kodierte Peptide. Es bindet an Heparin mit einer höheren Affinität, verglichen mit VEGF₁₄₅. Es bindet auch sehr gut an die ECM. Im Unterschied zu VEGF₁₄₅ wird VEGF₁₈₉ jedoch nicht in das Medium von VEGF₁₈₉ erzeugenden Zellen abgesondert und bleibt zellverbunden. Die Eigenschaften von VEGF₂₀₆ sind denen von VEGF₁₈₉ ähnlich.
Obwohl Heparin fähig ist, VEGF₁₄₅ aus der ECM freizusetzen, wie für VEGF₁₈₉ beobachtet wurde, ist es wahrscheinlich, dass VEGF₁₄₅ ECM-residente Heparinsulfate nicht zur Bindung an die Matrix verwendet. Bisher konnte keine angiogetische Reaktion mit intaktem VEGF₁₈₉ festgestellt werden. Dies kann an der festen Verbindung von VEGF₁₈₉ mit den VEGF₁₈₉-erzeugenden Zellen und der in der Nähe der VEGF₁₈₉-erzeugenden Zellen gefundenen ECM liegen. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass VEGF₁₄₅ aus erzeugenden Zellen freigesetzt wird und Angiogenese in vivo vorantreibt. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass die Affinität von VEGF₁₄₅ an die ECM wahrscheinlich niedriger ist, als jene von VEGF₁₈₉. Somit besitzt VEGF₁₄₅ eine einzigartige Kombination von Eigenschaften, die es in bestimmten Situationen verglichen mit anderen VEGF-Formen zu einem geeigneteren therapeutischen Mittel machen können.
BEISPIEL VII
Gen-Transfer-vermittelte Angiogenese-Therapie durch Verwendung von VEGF₁₄₅
Für VEGF₁₄₅ kodierende DNA wird für Gen-Transfer-vermittelte Angiogenese-Therapie verwendet, wie dies zum Beispiel in der Patentanmeldung PCT/US96/02631, veröffentlicht am 6. September 1996 als WO6/26742 beschrieben ist, auf die hier durch Verweisung ausdrücklich Bezug genommen wird.
Adenovirale Konstrukte
Ein Helfer-unabhängiges replikations-deffizientes Human-Adenovirus-5-Replikationssystem kann für den Gentransfer verwendet werden. Ein Nukleinsäuremolekül, das für VEGF₁₄₅ kodiert, kann in den Polylinker von Plasmid ACCMVPLPA geklont werden, der den CMV-Promotor und das SV40 Polyadenylationssignal enthält, flankiert von partiellen adenoviralen Sequenzen, aus denen die E1A- und E1B-Gene (erforderlich für virale Replikation) entfernt wurden. Dieses Plasmid wurde in 293 Zellen mit Plasmid JM 17 ko-transferiert (Lipofektion), welches das ganze humane Adenovirus-5-Genom enthält, und zwar mit einer zusätzlichen 4,3 kb-Insertion, die das pJM17 zu gross macht, um enkapsidiert zu werden. Die homologe Wiederherstellungsrekombination führt zu adenoviralen Vektoren, welche das Transgen in Abwesenheit von E 1A/E1B-Sequenzen enthält. Obwohl diese Rekombinanten in Säugerzellen nicht-replikativ sind, können sie sich in 293 Zellen fortpflanzen, die mit E1A/E1B transformiert wurden und diese unerlässlichen Genprodukte sind in trans vorgesehen. Transfizierte Zellen wurden zum Nachweis des cytopathischen Effekts überwacht, der üblicherweise 10–14 Tage nach der Transfektion auftritt. Zur Identifikation erfolgreicher Rekombinanten werden Zellüberstände aus Pflanzen, die einen cytopathischen Effekt zeigen, mit Proteinase K (50 mg/ml mit 0,5% Natriumdodecylsulfat und 20 mMol EDTA) 60 Min. bei 56°C behandelt, mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Erfolgreiche Rekombinanten werden dann mit PCR durch Primerverwendung identifiziert (Biotecnigues, 15: 868–72 (1993)), und zwar komplementär zum CMV-Promotor und SV40 Polyadenylationsequenzen zur Verstärkung der VEGF₁₄₅-Nukleinsäure-Insertion und Primere (Biotecniques, 15: 868–72 (1993)), die zur begleitenden Verstärkung adenoviraler Sequenzen vorgesehen sind. Erfolgreiche Rekombinanten werden dann zweimal Plaque-gereinigt. Die Virenstöcke werden in 293 Zellen zu Titern vermehrt, die zwischen 10¹⁰ und 10¹² viralen Partikeln liegen und die vor Gebrauch durch doppelte CsCl-Gradientkonfiguration gereinigt werden. Das zur Erzeugung rekombinanter Adenoviren verwendete System erzwingt eine Verpackungsgrenze von 5 kb für Transgen-Insertionen. Die VEGF₁₄₅-Gene, die vom CMV-Promotor und mit den SV40 Polyadenylationsequenzen getrieben werden, liegen gut innerhalb der Packungsbedingungen. Rekombinante Vektoren werden nach Standard-Verfahren plaqueaufgereinigt. Die resultierenden viralen Vektoren werden auf 293 Zellen zu Titern vermehrt im 10¹⁰–10¹² viralen Partikelbereich. Die Zellen werden bei 80% Konfluenz infiziert und bei 36–48 Std. geerntet. Nach Ausfrierzyklen wird die zelluläre Masse durch Standard-Zentrifugation zu Klümpchen geformt und der Virus ferner durch doppelte CsCl-Gradient-Ultrazentrifugation gereinigt (diskontinuierlicher 1,33/1,45 CsCl-Gradient; Cäsium in 5 mMol Tris, 1 mMol EDTA (pH 7,8); 90'000 × g (2 Std.), 105'000 × g (18 Std.)). Vor der in vivo-Injektion werden die Virusstöcke durch Gel-Filtration durch Sepharose-Kolonnen, wie G25 Sephadex, entsalzt. Der resultierende Virusstock hat einen viralen Endtiter ungefähr im 10¹⁰–10¹² Viruspartikelbereich. Das adenovirale Konstrukt sollte deshalb hochpurifiziert sein und keinem Wildtyp-Virus (potentiell replikativ) enthalten.
Ischämiemodell für Angiogenese bei Schweinen
Eine Linksthorakotomie wird bei Hausschweinen (30–40 kg) unter sterilen Bedingungen für die Instrumentation durchgeführt. (Hammond et al., J. Clin. Invest. 92: 2644–52, und Roth et al., J. Clin. Invest. 91: 939–49 (1993)). Katheter wurden im linken Vorhof und in der Aorta platziert, was ein Mittel zur Messung regionalen Blutflusses und zur Überwachung von Drücken bietet. In den linken Vorhof werden Drähte eingezogen, um ECG-Aufzeichnungen und Vorhof-Pacing zu überwachen. Schliesslich wurde ein nicht-glykosidischer Bitterstoff(Amaroid) um das proximale LCx platziert. Nach der Entwicklung eines stabilen Ischämie-Grades erhält die Behandlungsgruppe ein adenovirales Konstrukt, das ein VEGF₁₄₅-Gen enthält, welches von einem CMV-Promotor getrieben wird. Kontrolltiere erhalten Gentransfer mit einem adenoviralen Konstrukt, das ein Reporter-Gen, lacZ, enthält, das durch einen CMV-Promotor getrieben wird.
35 ± 3 Tage nach der Platzierung vom Amaroid werden Untersuchungen zu einem Zeitpunkt begonnen, an dem die kollaterale Gefässentwicklung und pacing-induzierte Dysfunktion stabil sind (Roth et al., Am. J. Physiol. 253: 1-11279-1288 (1987), und Roth et al., Circulation 82: 1778–89). Tiere mit Bewusstsein werden in eine_r Schlinge aufgehängt und die Drücke in der LV, LA und Aorta und das Elektrokardiogramm in digitalem Format online aufgenommen (in Ruhe und während atrialen Pacings bei 200 bpm). Zweidimensionale und M-modale Bilder wurden unter Verwendung eines ultraschallabbildenden Systems von Hewlett Packard erhalten. Bilder werden aus einem rechts-parasternalen Zugang an der mittelpapillären Muskelschicht aufgenommen und auf einem VHS- Band aufgezeichnet. Es werden Bilder mit Tieren im Grundzustand und erneut während des rechten Vorhof-Pacings (HR = 200 bpm) aufgenommen. Diese Untersuchungen wurden einen Tag vor dem Gentransfer durchgeführt und 14 ± 1 Tage später wiederholt. Geschwindigkeit-Druck-Produkte und Links-Vorhofdrücke sollten beiden Gruppen vor und nach dem Gentransfer ähnlich sein, was ähnliche myokardiale Sauerstoffnachfrage und Ladebedingungen andeutet. Echokardiographische Messungen werden durchgeführt, wozu Standardkriterien benützt werden (Sahn et al., Circulation 58:1072 (1978)). End-diastolische Wanddicke (EDWTh) und end-systolische Wanddicke (EDWTh) wurden bei 5 fortlaufenden Pulsschlägen gemessen und gemittelt. Der Wandverdickungsprozentsatz (%WTh) wird berechnet [(EDWTh – ESWTh)/EDWTh] × 100. Die Daten sollten ohne Kenntnis, von welchem Gen die Tiere erhalten haben, analysiert werden. Um die Reproduzierbarkeit der echokardiografischen Messresultate aufzuzeigen, sollten Tiere auf zwei folgenden Tagen abgebildet werden und die hohe Korrelation (r² = 0,90; p = 0,005) zeigen.
35 ± 3 Tage nach der Platzierung des Amaroids, ausreichend lange nach Abschluss des Amaroids, aber vor dem Gentransfer, werden kontrastreiche echokardiografische Untersuchungen durchgeführt, und zwar unter Benützung des Kontrastmaterials (Leovist), welches im linken Vorhof während des Vorhof-Pacings (200 bpm) injiziert wird. Die Untersuchungen werden 14 ± 1 Tage nach dem Gentransfer wiederholt. Die Spitzenkontrastintensität wird aus den Videoaufnahmen gemessen, wobei ein computer-gestütztes Videoanalyseprogramm verwendet wird (Color Vue II, Nova Microsonics, Indianapolis, Indiana), dass eine objektive Messung der Videointensität bietet. Die Kontrastuntersuchungen werden ohne Kenntnis, von welchem Gen die Tiere erhalten haben, analysiert.
Am Schluss der Untersuchung werden die Tiere anästhesiert und eine Mittellinien-Thorakotomie durchgeführt. Die brachycephalische Arterie wurde isoliert, eine Kanüle eingesetzt und andere grosse Gefässe ligatiert. Die Tiere erhalten intravenös Heparin (10'000 IU) und Papaverin (60 mg). Kaliumchlorid wird zur Induktion von diastolischem Herzstillstand abgegeben und die Aorta quergespannt. Salzlösung wird durch die brachycephalische Arterienkanüle gegeben (120 mmHg-Druck), wobei die Kranzarterien durchströmt werden. Glutaraldehyd-Lösung (6,25%, 0,1 Mol Cacodylatpuffer) wird eingeströmt (120 mmHg-Druck), bis das Herz gut stabilisiert ist. Das Herz wird dann entfernt, die Bettungen mithilfe farbkodierter Farbstoffe, die anterograd durch die linke anterior absteigende (LAD), linke circumflex (LCx) und rechte Koronararterien injiziert werden, identifiziert. Das Amaroid wird untersucht, um den Abschluss zu bestätigen. Aus den normal durchfluteten und ischämischen Regionen genommene Proben werden in Drittel aufgeteilt und die endokardialen und epikardialen Drittel in Plastik gebettet. Die Analyse unter dem Mikroskop wird zur Quantifizierung der Kapillarzahl durchgeführt, wie früher beschrieben (Mathieu-Costello et al., Am. J. Physiol. 359:H204 (1990)). Vier 1 μm dicke Querschnitte werden aus jeder Subprobe entnommen (Endokardium und Epikardium von jeder Region) und zur Bestimmung der Kapillarzahl pro Faserzahlverhältnis bei 400-facher Vergrösserung wird eine Punktzählung vorgenommen. Pro Subprobe werden zwanzig oder fünfundzwanzig Hochleistungsfelder gezählt. In jeder Region sollte die Kapillarzahl zu Faserzahl-Verhältnisse im Endokardium und Epikardium ähnlich sein, sodass die 40–50 Felder pro Region gemittelt werden können, um das Verhältnis der transmuralen Kapillarzahl zu Faserzahl zu gewinnen.
Zur Begründung, dass verbesserte regionale Funktionen und Blutfluss aus transgener Expression resultieren, können PCIR und PT-PCR zum Erkennen transgener VEGF₁₄₅-DNA und mRNA im Myokard aus Tieren, die VEGF₁₄₅-Gentransfer erfahren haben, verwendet werden. Die Verwendung eines Sense-Primers zum CMV-Promotor [GCAGAGCTCGTTTAGTGAAC] und eines Antisense-Primers zur internen VEGF₁₄₅-Genseuenz PCIR wird zur Verstärkung des erwarteten 500 bp-Fragments benützt. Die Verwendung eines Sense-Primers am Anfang der VEGF₁₄₅-Sequenz und eines Antisense-Primers zur internen VEGF₁₄₅-Gensequenz RT-PCR wird zur Verstärkung des erwarteten 400 bp-Fragments benützt.
Abschliessend wird ein gegen VEGF₁₄₅ gerichteter Antikörper verwendet. Die VEGF₁₄₅-Proteinexpression kann 48 Stunden sowie 14 ± 1 Tage nach dem Gentransfer in Zellen und Myokard aus Tieren, die Gentransfer mit einem VEGF₁₄₅-Gen erfahren haben, nachgewiesen werden.
Das helfer-unabhängige replikations-deffiziente Human-Adenovirus-5-Replikationssystem wird zur Gewinnung Transgen-enthaltender Vektoren verwendet. Das in vivo injizierte Material sollte hochgereinigt sein und keinen (replikationsfähigen) Wildtyp-Adenovirus enthalten. Damit werden die adenovirale Infektion und entzündliche Infiltration in das Herz minimiert. Durch direktes Injizieren des Materials in das Lumen der Kranzarterie durch koronare Katheter ist es möglich, effektiv auf das Gen zu zielen. Bei Abgabe in dieser Weise sollte keine transgene Expression in Hepatozyten vorkommen, und im Urin sollte zu keiner Zeit nach der intrakoronaren Injektion virale RNA gefunden werden.
Die Injektion des koronaren Konstrukts (4,0 ml enthalten etwa 10¹¹ virale Partikel von Adenovirus) erfolgtdurch Injizieren von 2,0 ml in die linke und rechte Koronararterie (kollateraler Fluss zur LCx-Bettung schien aus beiden Gefässen zu kommen). Die Tiere werden anästhetisiert und der arterielle Zugang über die rechte Halsschlagader durch Zuschneiden erlangt; dann wird eine SF-Cordis-Scheide platziert. Ein 5F-Mehrzweck(A2)-Koronarkatheter wird in die Koronararterien eingelegt. Die Schliessung des LCx-Amaroids wird durch Kontrastinjektion in die linke Hauptkranzarterie bestätigt. Die Katheterspitze wird dann 1 cm im arteriellen Lumen platziert, sodass es während der Injektion zu minimalem Materialverlust zur proximalen Aorta kommt. Dieses Verfahren wird für jedes der Schweine ausgeführt.
Nach einmaligem Gentransfer werden drei Strategien für eine erfolgreiche Inkorporation und Expression des Gens festgelegt: (1) Einige Konstrukte können ein Reporter-Gen (lacZ) enthalten; (2) Myokard wird aus den relevanten Bettungen entnommen und ein Immunoblotting durchgeführt, um die Anwesenheit vom VEGF₁₄₅-Protein zu quantifizieren; und (3) PCR wird zum Aufspüren von VEGF₁₄₅-mRNA und DNA verwendet.
Die erhaltenen regionalen kontraktilen Funktionsdaten sollten zeigen, dass Kontrollschweine einen ähnlichen Grad von pacing-induzierter Dysfunktion im ischämischer Region vor und 14 ± 1Tage nach Gentransfer zeigen. Im Gegensatz dazu sollten Schweine, die VEGF₁₄₅-Gentransfer erfahren haben, einen Anstieg der Wandverdickung in der ischämischen Region während des Pacings zeigen, was zeigt, dass ein erfindungsgemässer VEGF₁₄₅-Gentransfer mit einer verbesserten Kontraktion in der ischämischen Region während des Pacings zusammenhängt. Wandverdickung in normal durchströmter Region (das interventrikuläre Septum) sollte während des Pacings normal und unbeeinflusst vom Gentransfer sein. Der Prozentsatz der Funktionsabnahme, die durch transthorakische Echokardiographie gemessen wird, sollte dem Prozentsatz der Abnahme, die durch Sonomikrometrie während des Vorhofpacings im selben Modell gemessen wurde (Hammond et al., J. Clin. Invest. 92:2644 (1993)), sehr ähnlich sein und die Genauigkeit der Echokardiographie zur Beurteilung ischämischer Dysfunktion aufzeigen.
SEQUENZ LISTUNG
Allgemeine Gesichtspunkte der Therapie
Allgemein befähigt die vorliegende Erfindung zur Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen in einem Säuger, einschliesslich des Menschen, und umfasst den Schritt der Transfektion von Zellen des Säugers mit einem Polynukleotid, das für eine VEGF₁₄₅-Spezies kodiert, wie in Anspruch 1 definiert; eine solche VEGF₁₄₅-Spezies kann auch zur Verstärkung von Medikament-permeation bei Tumoren verwendet werden.
Bevorzugte Ausführungsformen einer solchen Behandlung haben u. a. eines oder mehrere der folgenden Merkmale:

– Das Polynukleotid ist in einen Vektor geklont;
– der Vektor enthält Adenovirus-Partikel
– Adenovirus-Vektorpartikel werden dem Säuger durch Injektion abgegeben;
– die Zahl der Adenovirus-Partikel liegt zwischen etwa 10¹⁰ und etwa 10¹⁴;
– die Zahl der Adenovirus-Partikel liegt zwischen etwa 10¹¹ und etwa 10¹³;
– die transfizierten Zellen sind Herzzellen;
- die Injektion ist eine intrakoronare Injektion;
– Adenovirus-Partikel werden etwa 1 cm in das Lumen der linken und rechten Kranzarterien injiziert;
– die Zellen sind in vivo transfiziert ;
– die Zellen sind ex vivo transfiziert;
– das Polynukleotid wird in die Kranzarterie durch einen Katheter eingeführt, der in die Arterie eingesetzt ist;
– der Katheter umfasst einen aufblasbaren Ballon, der eine äussere Oberfläche hat, die so angepasst ist, dass sie die Innenwand der Arterie belegt, und wobei das Polynukleotid auf der äusseren Ballonoberfläche bereitliegt;
– das Polynukleotid enthält die Grundsequenz, wie sie im Sequenzlisting durch SEQ ID No. 1 definiert ist;
– die Behandlung umfasst den Schritt der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von VEGF₁₄₅ an diesen Säuger zur Stimulierung vaskulärer Zellproliferation;
– eine Behandlung zur Verstärkung der Endothelialisation erkrankter Gefässe umfasst den Schritt der Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer VEGF₁₄₅-Spezies an einen Säuger, wie in Anspruch 1 definiert;
– die Endothelialisation eine Re-endothelialisation nach Angioplastie ist;
– die Re-endothelialisation zur Verminderung oder Verhinderung von Restenose ausgeübt wird; bei einer solchen Behandlung wird der Patient mit oder ohne einen Stent behandelt;
– die Behandlung oder Verabreichung kann eine Gentherapie sind u. a., und einer aufblasbarer Ballonkatheter, der mit einem Polynukleotid beschichtet ist, das für eine VEGF₁₄₅-Spezies kodiert, wie in Anspruch 1 definiert, kann zur Ausübung der Gentherapie verwendet werden;
– die Behandlung mit einem Poiynukleotid, das für eine VEGF₁₄₅-Spezies kodiert, wie in Anspruch 1 definiert, kann zur Verstärkung von Medikament-permeation bei Tumoren angewandt werden, z. B. durch Verabreichung eines nukleinsäuremoleküls, das für eine VEGF₁₄₅-Spezies kodiert, an einen Patienten, wie in Anspruch 1 definiert; Alternativ kann die VEGF₁₄₅-Spezies direkt in die Tumor-Zelle abgegeben werden.

Darüber hinaus ist die vorliegende Erfindung auf eine Polynukleotidsequenz gerichtet, die für eine VEGF₁₄₅-Spezies kodiert, wie in Anspruch 1 definiert, zur Verwendung für die Herstellung von Arzneien zur Behandlung kardiovaskulärer Erkrankungen und/oder zur Verbesserung der Medikament-permeation bei Tumoren.

Claims

Verwendung von Polynukleotid, das für VEGF₁₄₅ kodiert, zur Herstellung eines Medikaments, das geeignet ist zum Transfizieren von Zellen zur Behandlung einer kardiovaskulären Erkrankung bei einem Säuger durch Transfizieren von Zellen des Säugers mit dem Polynukleotid, wobei die kardiovaskuläre Erkrankung gewählt ist aus der Gruppe umfassend Erkrankungen der Herzkranzgefässe, kongestive Herzinsuffizienz, Ischämie, Herzinfarkt und periphere Angiopathien.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid in einen Vektor geklont ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei der Vektor Adenoviruspartikel umfasst.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Adenoviruspartikel zur Verabreichung an den Säuger durch Injektion geeignet sind.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei die Zahl der Adenoviruspartikel zwischen etwa 1010 und etwa 1014 liegt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Zahl der Adenoviruspartikel zwischen etwa 1011 und etwa 1013 liegt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die transfizierten Zellen Herzzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die transfizierten Zellen Kranzgefässzellen sind und das Medikament für intrakoronare Injektionen geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament für Injektionen bei ungefähr 1 cm in die Lumina der linken und rechen Kranzarterien geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament für Transfektion der Zellen in vivo geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament für Transfektion der Zellen ex vivo geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Medikament zur Einführung des Polynukleotids in die Kranzarterienzellen durch einen in die Arterie eingesetzten Katheter geeignet ist.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei der Katheter einen aufblasbaren Ballon mit einer äusseren Oberfläche enthält, die sich der Innenwand der Arterie anpasst, und wobei das Polynukleotid auf der Oberfläche des Ballons angeordnet ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polynukleotid die Grundsequenz umfasst, wie sie in Sequence Listing durch SEQ ID No. 1 definiert ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Säuger ein Mensch ist.
Medikament, das eine filtrierte injizierbare Adenovirusvektorzubereitung enthält, welche umfasst: einen rekombinanten adenoviralen Vektor, der keinen Wildtyp-Virus enthält und umfasst: eine adenovirale Teilsequenz, aus der die E1A/E1B-Gene gelöscht sind, und eine Transgen, das für ein VEGF145 kodiert, getrieben von einem Promotor, der von der adenoviralen Teilsequenz flankiert ist; und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.