DE69535091T2

DE69535091T2 - Humane prostacyclinsynthase

Info

Publication number: DE69535091T2
Application number: DE69535091T
Authority: DE
Inventors: Tadashi Tanabe
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-27
Publication date: 2007-01-04
Anticipated expiration: 2015-04-28
Also published as: EP0727490B1; CA2166328A1; EP0727490A1; ATE331794T1; US5814509A; WO1995030013A1; DE69535091D1; US20040049015A1; CA2166328C; EP0727490A4

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der aus dem Menschen stammenden Prostacyclin-Synthase kodiert (nachfolgend als PGIS bezeichnet), einen Vektor, der diese DNA enthält, eine Wirtszelle, die mit diesem Vektor transformiert ist, ein Verfahren zum Herstellen von aus dem Menschen stammender PGIS, umfassend das Kultivieren dieser Wirtszelle und das Polypeptid, zur Verwendung als medizinisches Produkt. Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend diese DNA oder einen Vektor, der diese DNA enthält, ein Verfahren zum Fördern der Produktion von Prostaglandin I₂ und ein Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, die durch eine niedrige Produktion an Prostaglandin I₂ induziert werden, und die Verwendung dieser DNA oder dieses Vektors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Thrombose, Myokardinfarkt, Arteriosclerose und Angina pectoris besteht.
Technischer Hintergrund
PGIS ist hauptsächlich in microsomalen Fraktionen vasculärer endothelialer Zellen enthalten, und ist ein Enzym, das die Synthese von Prostaglandin I₂ (nachfolgend bezeichnet als PGI₂) katalysiert, d. h. die Umwandlung von Prostaglandin H₂ (nachfolgend als PGH₂ bezeichnet) in PGI₂.
PGI₂, das durch dieses Enzym synthetisiert wird, hat starke Plättchen-Aggregations-inhibierende Wirkung und eine relaxierende Wirkung auf vasculäre glatte Muskelzellen. Andererseits enthalten Plättchen Thromboxan A₂ (nachfolgend bezeichnet als TXA₂) mit starker plättchen-aggregierender Wirkung und glatte Gefäßmuskulaturkontraktions-fördernde Wirkung, und beide Substanzen wirken antagonistisch im Gefäßsystem, um die Homöostase aufrechtzuerhalten [British Journal of Pharmacology, vol. 76, p 3 (1982)].
Cardiovasculäre Erkrankungen, wie Myokardinfarkt, Thrombose und Arteriosclerose, die unter Erkrankungen bei Erwachsenen gefunden werden, sind kürzlich als durch das Ungleichgewicht der vasculären Produktion von PGI₂ und TXA₂, insbesondere durch nicht ausreichende vasculäre Funktionen aufgrund der niedrigen Produktion an PGI₂ (ibidem) verursacht, angesehen worden.
Zur therapeutischen Behandlung der vermutlich durch niedrige Produktion von PGI₂ induzierten Erkrankungen, kann PGI₂ als pharmazeutisches Produkt von außerhalb des Körpers ergänzt werden. PGI₂ ist jedoch in einem Ausmaß chemisch extrem instabil, dass die praktische Verwendung von PGI₂ selbst als pharmazeutisches Produkt nicht realisierbar sein kann. Im Hinblick auf eine derartige Situation sind beispielsweise stabile PGI₂-Analoga wie Blutcoagulationsinhibitoren oder Vasodilatatoren in Entwicklung.
Die Homöostase beim Menschen und anderen Tieren, die inhärent auf dem Gleichgewicht zwischen PGI₂ und TXA₂ beruht, kann möglicherweise durch Verabreichung stabiler PGI₂-Analoga zerstört werden. Das bedeutet, dass die Verabreichung stabiler PGI₂-Analoga in großen Mengen mit einem Risiko der Absenkung der Reaktivität von Zellen auf PGI₂ assoziiert ist, wodurch deren Fähigkeit auf PGI₂ zu reagieren, gestört ist, wenn eine derartige Reaktivität dringend benötigt wird [Prostaglandins, vol. 19, p 2 (1980)].
Zum Korrigieren des Ungleichgewichts zwischen PGI₂ und TXA₂ und beim Versuchen der Wiederherstellung der normalen Funktionen des Gefäßsystems in Erwartung eines therapeutischen Ef fekts bei Thrombose und ähnlichem, können chemisch stabile Analoga verwendet werden. Daneben werden die Aufklärung der physikochemischen Eigenschaften und biologischen Eigenschaften von PGIS die Aufklärung der Beziehungen zwischen PGIS-Produktion und PGI₂-Produktion bei Verwendung dieser PGIS oder von DNA, die PGIS als Sonde in der Forschung enthält, und die Entwicklung dieses PGIS oder einer DNA, die PGIS als pharmazeutische Produkte zur Regulierung der Produktion von PGI₂ kodiert, als wichtig und signifikant zur Behandlung der oben erwähnten verschiedenen Erkrankungen, die durch das Ungleichgewicht zwischen PGI₂ und TXA₂ verursacht werden, angesehen.
Konventionellerweise ist die Gewebsverteilung von PGIS, d. h. ihr Vorhandensein in vasculären endothelialen Zellen, nichtvasculären glatten Muskelzellen und arteriellen glatten Muskeln verschiedener Organe berichtet worden [Advances in Prostaglandin, Thromboxane, and Leukotriene Research, Vol. 11, Seiten 87-92 (1983) und J. Biol. Chem., Vol. 258, Nr. 9, Seiten 5922-5926 (1983)]. In der Zwischenzeit ist die Isolierung und Reinigung von PGIS aus Schwein und Rind versucht worden (Schwein: Cytochrom P450, Biochemistry, Biophysics and Environmental Implications, Seiten 103-106 (1982); Rind: J. Biol. Chem., Vol. 258, No. 9, Seiten 3285-3293 (1983)], und die N-terminale Aminosäuresequenz, die teilweise stromabwärtsliegende Aminosäuresequenz von Rinder-PGIS berichtet worden [Advances in Prostaglandin, Thromboxane, and Leukotriene Research, Vol. 17, Seiten 29-33 (1987) und Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 197, No. 3, Seiten 1041-1048 (1993)].
Jedoch ist die Isolierung, die Aufreinigung die Aminosäuresequenz der menschlichen PGIS noch nicht aufgeklärt worden.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Aufklärung der Aminosäuresequenz von PGIS, die aus dem Menschen stammt, und die Bereitstellung dieser aus dem Menschen stammenden PGIS sowie der DNA, die diese PGIS kodiert.
Diese PGIS und die DNA, die diese PGIS kodiert, sind nützlich als Reagentien für (1) die Analyse der physikochemischen und biologischen Eigenschaften von PGIS auf molekularem oder genetischem Niveau; (2) die Analyse der Mechanismen, die die Produktion von PGIS kontrollieren, und des Mechanismus, der die Produktion von PGI₂ durch PGIS kontrolliert; und (3) die Untersuchung der Ursache verschiedener cardiovasculärer Erkrankungen, die als, durch das Produktions-Ungleichgewicht zwischen PGI₂ und TXA₂ induziert, angesehen werden, und die molekulare oder genetische Analyse der Entwicklung von therapeutischen Mitteln für diese Erkrankungen. Zusätzlich ist PGIS und die mRNA als Diagnostikum zur Bestimmung des Expressions-Niveaus der Verteilung in den Körpergeweben nützlich. Weiter wird erwartet, dass therapeutische Mittel beispielsweise für zahlreiche cardiovasculäre Störungen wie Thrombose, Myokardinfarkt, Arteriosclerose und Angina pectoris bereitgestellt werden, welche die Produktionsniveaus von PGI₂ nach Einschleusung derselbigen, von Fragmenten davon oder von modifizierten Verbindungen davon in den Körper in einer läsions-spezifischen Weise verstärken.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Bereitstellung eines rekombinanten Vektors, der eine DNA enthält, die aus dem Menschen stammende PGIS kodiert, das Expressionssystem für PGIS, welches eine Wirtszelle umfasst, die mit diesem Vektor transformiert ist, und ein Verfahren zum Herstellen von PGIS durch Gentechnik unter Verwendung dieses Expressionssystems.
Nach einem solchen Verfahren kann die aus dem Menschen stammende PGIS in großen Mengen mit Leichtigkeit und hoher Wirksamkeit hergestellt werden.
Der vorstellige Erfinder hat intensive Studien mit dem Ziel durchgeführt, die oben erwähnten Ziele zu erreichen, und es geschafft, die cDNA, die PGIS kodiert aus menschlichen Aorta-Endothel-Zellen zu klonieren und die Primärstruktur der aus dem Menschen stammenden PGIS anhand der Nucleotidsequenz dieser cDNA zu identifizieren, was zur Vollendung der vorliegenden Erfindung führte.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA, die eine DNA mit einer Nucleotidsequenz umfasst, die eine Aminosäuresequenz der aus dem Menschen stammenden PGIS kodiert, die im Wesentlichen in Sequenz Nr. 12 wiedergegeben ist, bevorzugt eine DNA, die eine DNA mit der im Wesentlichen in Sequenz Nr. 11 gezeigten Nucleotidsequenz 28-1527 umfasst, und mehr bevorzugt eine DNA mit der in 28-1527 gezeigten Nucleotidsequenz, welche in der Sequenz Nr. 11 gezeigt ist zur Verwendung als medizinisches Produkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch einen rekombinanten Vektor, der die oben erwähnte DNA umfasst, eine Wirtszelle, die mit diesem Vektor transformiert ist, und ein Verfahren zum Herstellen der aus dem Menschen stammenden PGIS, umfassend das Kultivieren dieser Wirtszelle in einem Medium und das Gewinnen der aus dem Menschen stammenden PGIS aus der erhaltenen Kultur zur Verwendung als medizinisches Produkt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz der aus dem Menschen stammenden PGIS, die im Wesentlichen in der Sequenz Nr. 12 gezeigt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter eine pharmazeutische Zusammensetzung, die diese DNA umfasst, oder einen rekombinanten Vektor, der diese DNA umfasst. Diese pharmazeuti sche Zusammensetzung kann als Medikament zur Förderung der PGI₂-Produktion oder zur Behandlung der Erkrankungen verwendet werden, die durch eine niedrige Produktion an PGI₂ ausgelöst werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zum Unterstützen der PGI₂-Produktion, umfassend das Einschleusen der oben erwähnten DNA oder eines rekombinanten Vektors, der diese DNA umfasst, in menschliche oder andere Tiere. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Behandlung der Erkrankungen, die durch eine niedrige Produktion an PGI₂ induziert werden, umfassend das Einschleusen der oben erwähnten DNA oder eines rekombinanten Vektors, der diese DNA umfasst, in menschliche oder andere Tiere.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt eine Restriktions-Enzymkarte der menschlichen PGIS-cDNA, und die von λ hPGISl41, pHPGIS135 und pHPGI536 umfasste PGIS-DNA-Region.
2 zeigt eine Restriktions-Enzymkarte des Plasmids pHPGIS36.
3 zeigt eine Restriktions-Enzymkarte des Plasmids pHPGISl35.
4 zeigt eine Restriktions-Enzymkarte des Plasmids pHPGISl.
5 zeigt eine Restriktions-Enzymkarte des menschlichen PGIS-Expressionsvektors pCMV-HPGIS1.
6 zeigt den Expressionsvektor pUC-CAGGS.
7 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse der Analyse nach Dünnschicht-Chromatographie der PGIS-Aktivität in Zellen zeigt, die pCMV-HPGIS1 eingeschleust worden ist.
8 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse der Analyse durch Dünnschicht-Chromatographie der PGIS-Aktivität in einer positiven Kontrolle zeigt (Rinderplättchenmicrosomen).
9 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse der Analyse einer Negativ-Kontrolle nach Dünnschicht-Chromatographie zeigt, in die pCMV allein eingeschleust wurde.
10 ist ein Graph, der die Wirkungen der Einschleusung des menschlichen PGIS-Expressionsvektors auf die Proliferation glatter Blutgefäßmuskelzellen zeigt.
11 ist eine Fotografie, die die Ergebnisse einer RNA-Blot (Electrophorese)-Analyse menschlicher PGIS-mRNA zeigt, die mit Cytokinen behandelt wurde.
12 ist eine Fotografie, die die Verteilung der PGISmRNA-Expression im menschlichen Körper zeigt (Pancreas, Niere, Skelettmuskulatur, Leber, Lunge, Placenta, Hirn und Herz) mittels Electrophorese.
13 ist eine Fotografie, die die Verteilung der PGISmRNA-Expression im menschlichen Körper zeigt (periphere Leukozyten, Dickdarm, Dünndarm, Eierstöcke, Hoden, Prostata, Thymus und Milz) nach Electrophorese.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird im Detail im Folgenden beschrieben. Das durch die DNA der vorliegenden Erfindung kodierte Polypeptid hat die katalytische Wirkung, PGH₂ in PGI₂ umzuwandeln, und hat eine Aminosäuresequenz einer aus dem Menschen stammenden PGIS, die im Wesentlichen in der Sequenzliste, Sequenz Nr. 12 gezeigt ist, die später erwähnt wird.
Unter „im Wesentlichen" wird verstanden, dass das erfindungsgemäße Peptid nicht auf das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz beschränkt ist, die in Sequenz Nr. 12 gezeigt ist, sondern auch eine Deletion, Substitution und Addition bezüglich einiger der Aminosäuren in der Aminosäuresequenz, die in Sequenz Nr. 12 gezeigt ist, einschließt, sofern das Polypeptid immunologische und biologische Aktivität (menschliche PGIS-Aktivität) ähnlich der einer aus einem Menschen stammenden PGIS mit dieser Aminosäuresequenz hat.
Während die Deletions-, Substitutions- und Additionsstelle der Aminosäuren nicht besonders begrenzt ist, muss mindestens der 441. Cystein-Rest und die Region darum in der in Sequenz Nr. 12 gezeigten Aminosäuresequenz ausgespart bleiben. Das liegt daran, dass die aus dem Menschen stammende PGIS homolog mit dem bekannten Cytochrom P450 in der Aminosäuresequenz ist, da sie einen Cys-Rest am C-terminalen Ende der Aminosäuresequenz hat, die die Häm-bindende Stelle bildet (5. Ligand), welcher für die Expression der biologischen Wirkung des Cytochrom P450 wichtig ist, und spekuliert wird, dass es ein neues Protein ist, das zu der Cytochrom P450-Familie gehört [siehe Seibutsu Butsure, vol. 32, No. 1, Seiten 10-15 (1992)].
Das durch die erfindungsgemäße DNA kodierte Polypeptid hat bevorzugt eine Aminosäuresequenz der aus einem Menschen stammenden PGIS, die in der Sequenz Nr. 12 gezeigt ist.
Die PGIS-Aktivität, die das erfindungsgemäße Polypeptid besitzt, ist die katalytische Aktivität, PGH₂ in PGI₂ umzuwandeln. Diese PGIS-Aktivität kann gemäß dem Verfahren von Salmon, J. A. und Flower, R. J. et al. [Methods Enzymol., 86, pp. 91-99 (1982)] bestimmt werden, worin die Umwandlung von ¹⁴(-markiertem PGH₂ in PGI₂ durch Trennen des Metabolits von 6-keto-PGF₁☐ durch Dünnschichtchromatographie und Nachweisen der Radioaktivität dieses 6-keto-PGF₁☐ untersucht wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine DNA, die eine DNA umfasst, welche eine Nucleotidsequenz hat, die die Aminosäuresequenz der im Wesentlichen in Sequenz Nr. 12 gezeigten aus dem Menschen stammenden PGIS kodiert.
Diese DNA kann irgendeine sein, solange sie eine DNA umfasst, die eine Nucleotidsequenz hat, die die vorher erwähnte Aminosäuresequenz der aus dem Menschen stammenden PGIS kodiert, und wird beispielhaft dargestellt durch eine DNA, die das Polypeptid mit der Aminosäuresequenz, die in der Sequenz Nr. 12 gezeigt ist, kodiert, oder ein Polypeptid mit äquivalenter immunologischer und biologischer Aktivität. Genauer gesagt, ist es eine DNA, die die Nucleotidsequenz 28-1527 in der in Sequenz Nr. 11 gezeigten Nucleotidsequenz umfasst.
Allgemein gesagt ermöglicht die Gen-Rekombinationstechnik die Umwandlung mindestens eines Nucleotids einer DNA-Sequenz eines Gens in ein unterschiedliches Nucleotid, entsprechend der Degneriertheit des genetischen Codes, ohne die Aminosäuresequenz eines Proteins, die durch das Gen produziert wird, zu ändern. Daher umfasst die erfindungsgemäße DNA eine DNA, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die durch Modifizierung durch Substitution gewonnen wird, basierend auf dem genetischen Code, der 28.-1527. Nucleotidpositionen der in der Sequenzliste gezeigten Sequenz Nr. 11.
Die erfindungsgemäße DNA kann durch jedes Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise umfasst die vorliegende Erfindung komplementäre DNA (cDNA), die aus mRNA hergestellt wird, DNA, die aus genomischer DNA hergestellt wird, DNA, die durch chemische Synthese gewonnen wird, DNA, die durch Amplifizierung durch PCR unter Verwendung von RNA oder DNA als Matrize, hergestellt wird, und DNA, die durch geeignetes Kombinieren dieser Verfahren hergestellt wird.
Die erfindungsgemäße DNA kann durch ein Verfahren gewonnen werden, das das Klonieren von cDNA aus mRNA der aus dem Menschen stammenden PGIS mit einem konventionellen Verfahren umfasst, ein Verfahren, das das Splicing einer isolierten genomischen DNA für PGIS umfasst, ein Verfahren, das die chemische Synthese oder ein anderes Verfahren umfasst. (1) Beispielsweise umfasst ein Verfahren zum Klonieren von cDNA aus mRNA, die die aus dem Menschen stammende PGIS kodiert, die folgenden Schritte.
Zellen, die die aus dem Menschen stammende PGIS herstellen, wie menschliche Aorta-Endothelzellen, werden kultiviert, und mRNA, die diese PGIS kodiert, wird aus der Kultur hergestellt. mRNA wird beispielsweise durch Benutzung der Gesamt-RNA hergestellt, die durch ein bekanntes Verfahren wie das Guanidin-Thiocyanat-Verfahren [Chirgwin, J. M. et al., Biochem., 18, 5294 (1979)] hergestellt wurde, durch das Verfahren mit warmem Phenol und AGPC für die Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Oligo(dT)-Cellulose oder Poly-U-Sepharose.
Unter Verwendung der gewonnenen mRNA als Matrize, wird die cDNA-Kette durch ein bekanntes Verfahren unter Verwendung einer Reversen Transcriptase synthetisiert [z. B. das Verfahren von Okayama, H. et al.: Okayama, H. et al., Mol. Cell. Biol., 2, 161 (1982) and ibid. 3, 280 (1983)], und das Verfahren von Gubler, U. und Hoffman, B. J.: Gubler, H. and Hoffman, B. J., Gene, 25, 263 (1983), wodurch selbige in doppelsträngige cDNA umgewandelt wird. Diese cDNA wird in einen Plasmidvektor oder einen Phagenvektor inseriert, mit dem Escherichia coli transformiert wird, oder nach in vitro Verpackung transfiziert, um eine cDNA-Bibliothek herzustellen.
Der hier verwendete Plasmidvektor ist nicht irgendeiner bestimmten Begrenzung unterworfen, solange er durch Replikation im Wirt bewahrt werden kann, und der Phagenvektor ist eben falls nicht begrenzt, solange er im Wirt proliferieren kann. Beispiele der konventionell verwendeten Klonierungsvektoren schließen pUC119, λ gt10 und λ gt11 ein. Wenn ein immunologisches Screening, das unten erwähnt wird, verwendet werden soll, enthält der Vektor vorzugsweise einen Promotor, der in der Lage ist, das PGIS-Gen in dem Wirt zu exprimieren.
Das Insertionsverfahren einer cDNA in ein Plasmid wird beispielhaft durch ein Verfahren dargestellt, das in Maniatis, T. et al. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982)] beschrieben ist. Das Verfahren zur Insertion einer cDNA in einen Phagenvektor schließt das Verfahren von Hyunh, T. V. et al. ein [DNA Cloning, a practical approach, 1, 49 (1985)]. Zur Vereinfachung kann ein kommerziell erhältlicher Ligationskit (z. B. solche, die von Takara Shuzo hergestellt werden) verwendet werden. Das rekombinante Plasmid und der Phagenvektor, der auf diese Weise gewonnen wird, werden in einen geeigneten Wirt wie prokaryotische Zellen eingeschleust (z. B. E. coli HB101, DH5 und MC1061/P3).
Das Verfahren zum Einschleusen eines Plasmids in einen Wirt schließt das Calciumchlorid-Verfahren und das Calciumchlorid-/Rubidiumchlorid-Verfahren, das in Maniatis, T. et al. [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982)] beschrieben ist, sowie das Elektroporationsverfahren ein. Das Verfahren zum Einschleusen eines Phagenvektors in einen Wirt wird beispielhaft wiedergegeben durch das Verfahren, das die in vitro Verpackung von Phagen-DNA und das Einschleusen derselben in proliferierende Wirtszellen umfasst. Die Verpackung in vitro kann leicht durch Verwendung eines kommerziell erhältlichen in vitro-Verpackungskits (z. B. das Produkt von Strategene und das Produkt von Amersham) durchgeführt werden.
Die erfindungsgemäße cDNA, die die PGIS kodiert, kann aus der cDNA-Bibliothek, die durch das oben erwähnte Verfahren herge stellt worden ist, durch eine Kombination allgemeiner cDNA-Screening-Verfahren isoliert werden.
Solche Verfahren schließen beispielsweise ein Verfahren ein, in dem ein Oligonucleotid, das als der Aminosäuresequenz einer menschlichen PGIS entsprechend angesehen wird, chemisch getrennt synthetisiert und mit ³²P markiert wird, um eine Sonde zu ergeben, und ein Klon mit der gewünschten cDNA wird durch die bekannte Kolonienhybridisierung gescreent [Crunstein, M. and Hogness, D. S., Proc. Natl. Acid. Sci. USA, 72, 3961 (1975)], oder durch Plaquehybridisierung [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (1982)]; und ein Verfahren, in dem ein PCR-Primer hergestellt wird, und eine spezifische Region der PGIS durch das PCR-Verfahren amplifiziert wird, welches gefolgt wird vom Auswählen eines Klons mit einem DNA-Fragment, das diese Region kodiert. Wenn eine cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines Vektors (z. B. λ gt11-Phagenvektor) hergestellt wird, welcher in der Lage ist, die verwendete cDNA zu exprimieren, wird der ins Auge gefasste Klon auf Grundlage einer Antigen-Antikörper-Reaktion unter Verwendung des später erwähnten PGIS-Antikörpers ausgewählt. Wenn große Zahlen an Klonen zu behandeln sind, ist ein auf PCR beruhendes Screening vorzuziehen.
Die Nucleotidsequenz einer so erhaltenen DNA kann durch das Maxam-Gilbert-Verfahren bestimmt werden [Maxam, A. M. and Gilbert, W., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 560 (1977)], oder durch das synthetische Dideoxynucleotid-Ketten-Abbruchverfahren unter Verwendung des Phagen M13 [Sanger. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 74, 5463-5467 (1977)]. Das PGIS-Gen kann durch Spalten von allem oder einem Teil davon aus dem gewonnen Klon unter Verwendung eines Restrictionsenzyms und ähnlich gewonnen werden.
(2) Ein Präparationsverfahren umfassend das Isolieren von DNA, welche PGIS kodiert aus genomischer DNA menschlicher Aorta-Gefäßzellen schließt beispielsweise das folgende Verfahren ein.
Menschliche Aorta-Gefäßzellen werden bevorzugterweise unter Verwendung von SDS oder Proteinase K lysiert, und die DNA wird durch die entsprechende Extraktion mit Phenol von Proteinen befreit. Die RNA wird vorzugsweise mit Ribonuclease verdaut. Die gewonnene DNA wird teilweise mit einem geeigneten Restrictionsenzym verdaut, und das gewonnene DNA-Fragment wird mit einem geeigneten Phagen oder Cosmid amplifiziert, um eine Bibliothek zu bilden. Dann wird der Klon mit der gewünschten Sequenz beispielsweise durch ein Verfahren nachgewiesen, bei dem eine DNA-Sonde mit einer radioaktiven Markierung verwendet wird, und ein vollständiges oder teilweises PGIS-Gen wird aus diesem Klon ausgeschnitten, indem ein Restrictionsenzym und ähnliche verwendet werden.
(3) Die erfindungsgemäße DNA kann durch chemische Synthese durch ein konventionelles Verfahren hergestellt werden, das auf der Nucleotidsequenz beruht, welche in der Sequenzliste als Sequenz Nr. 11 wiedergegeben ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter einen rekombinanten Vektor, welcher eine DNA umfasst, die das oben erwähnte PGIS kodiert. Der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders begrenzt, sofern er durch Replikation oder Selbst-Proliferation in zahlreichen prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen bewahrt werden kann, und schließt einen Plasmidvektor und einen Phagenvektor ein.
Der rekombinante Vektor kann leicht durch Ligieren der DNA, welche die aus dem Menschen stammende PGIS der vorliegenden Erfindung kodiert, mit einem kommerziell erhältlichen rekombinanten Vektor (Plasmid-DNA und Bacteriophagen-DNA) mit einem konventionellen Verfahren hergestellt werden. Verwendbare rekombinante Vektoren schließen beispielsweise die aus Escherichia coli stammenden Plasmide pBR322, pBR325, pUC12 und pUC13 ein; die aus Hefe stammenden Plasmide pSH19 und pSH15; und aus Bacillus subtilis-stammende Plasmide pUB110, pTP5 und pC194. Beispiele für Phagen schließen Bacteriophagen wie den λ-Phagen ein, und tierische oder Insektenviren wie ein Retrovirus, Vaccinia-Virus, Nukleares-Polyhedrose-Virus und Adeno-Virus [z. B. pVL1392, pBK283, Autographa californica Nuclear Polyhedrosis Virus (AcNPV) and Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus (BmNPV)].
Wenn die Produktion von PGIS durch Expression des PGIS-Gens beabsichtigt wird, ist ein Expressionsvektor nützlich. Der Expressionsvektor ist nicht besonders limitiert, solange er das PGIS-Gen in zahlreichen prokaryontischen und/oder eukaryontischen Wirtszellen exprimieren kann, und er dazu in der Lage ist, die Proteine herzustellen. Bevorzugt sind solche, die von Insektenviren stammen, welche Insektenzellen infizieren und PGIS in diesen Zellen produzieren, und solche, die aus Tierviren stammen, welche Tierzellen infizieren und PGIS in diesen Zellen produzieren.
Wenn Bakterien, insbesondere Escherichia coli, als Wirtszelle verwendet wird, besteht der Expressionsvektor im Allgemeinen aus mindestens einer Promotor-Operator-Region, einem Initiationscodon, DNA, die die PGIS der vorliegenden Erfindung kodiert, dem Terminationscodon, der Terminator-Region und einem Replicon.
Wenn Hefe, eine Tierzelle oder eine Insektenzelle als Wirtszelle verwendet wird, besteht der Expressionsvektor vorzugsweise aus mindestens einem Promotor, einem Initiationscodon, DNA, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung kodiert, und dem Terminationscodon. Er kann DNA kodieren, die ein Signalpeptid, eine Enhancer-Sequenz, eine nicht-translatierte Region an der 5'- oder 3'-Seite des Polypeptids, eines Splice-Junction, eine Polyadenylierungsstelle, eine Selektionsmarker-Region, ein Replicon und ähnliche enthält.
Die Promotor-Operator-Region zum Exprimieren des Polypeptids in Bakterien enthält Promotor, Operator und eine Shine-Dalgarno (SD) Sequenz wie AAGG. Wenn der Wirt Escherichia coli ist, dann enthält die Region vorzugsweise beispielsweise Trp-Promotor, lac-Promotor, recA-Promotor, λ-PL-Promotor und lpp-Promotor. Der Promotor zum Exprimieren von PGIS in Hefe schließt beispielsweise den PH05-Promotor, den PGK-Promotor, den GAP-Promotor und den ADH-Promotor ein, und wenn der Wirt eine Bakterie ist, welche zum Genus Bacillus gehört, können der SLOl-Promotor, der SP02-Promotor, sowie der penP-Promotor verwendet werden. Wenn der Wirt eine eukaryontische Zelle wie eine Tierzelle ist, schließen Beispiele für den Promotor den SV40-Promotor, einen Retrovirus-Promotor, einen Hitzeschock-Promotor, einen Polyhedron-Promotor, den ein Nuk1ear-Polyhedrose-Virus hat, einen Cytomegalievirus-Promotor, einen Adenovirus-Promotor und einen β-Rctin-Promotor ein, sind aber nicht darauf begrenzt. Die Verwendung eines Enhancers ist ebenfalls zur Expression wirksam.
Vorzuziehende Initiationscodons schließen beispielsweise den Methionincodon (ATG) ein.
Der Terminationscodon wird beispielhaft dargestellt durch konventionelle Terminationscodons wie TAG und TGA.
Als Terminatorbereich können konventionelle intakte oder synthetische Terminatoren verwendet werden.
Unter Replicon wird eine DNA verstanden, die in der Lage ist, die Gesamt-DNA in der Wirtszelle zu reproduzieren, und wird beispielhaft wiedergegeben durch natürlich auftretende Plasmide, künstlich modifizierte Plasmide (DNA-Fragment, das aus einem natürlich auftretenden Plasmid hergestellt wurde) und ein synthetisches Plasmid. Beispiele für bevorzugte Plasmide schließen das Plasmid pBR322 und künstliche Modifikationen davon ein (DNA-Fragmente, die durch Behandlung von pBR322 mit einem geeigneten Restriktionsenzym gewonnen wurden) im Falle von E. coli; Hefe 2 μ Plasmid und Hefe-chromosomale DNA im Falle von Hefe; und Plasmid pRSVneo ATCC 37198, Plasmid pSV2dhfr ATCC 37145, Plasmid pdBPV-MMTneo ATCC 37224 und Plasmid pSV2neo ATCC 37149 im Fall von Säugerzellen.
Die Enhancer-Sequenz, die Polyadenylierungsschnittstelle und die Splice Junction können solche sein, die konventionellerweise vom Fachmann verwendet werden, z. B. die aus SV40 stammen.
Als Selektionsmarker können konventionelle nach konventionellen Verfahren verwendet werden. Beispiele hierfür schließen ein Gen ein, das resistent gegenüber Antibiotika ist, wie Tetracyclin, Ampicillin und Kanamycin.
Der erfindungsgemäße Expressionsvektor kann durch Ligieren von mindestens einem der oben erwähnten Promotoren, dem Initiationscodon, der DNA, die PGIS kodiert, dem Terminationscodon und einer Terminator-Region in sequenzieller Form oder in zyklischer Form eine geeignete replizierbare Einheit umfassen. Dafür können geeignete DNA-Fragmente wie ein Linker oder andere Restriktionsschnittstellen durch ein konventionelles Verfahren wie den Verdau mit einem Restriktionsenzym und die Ligierung unter Verwendung von T4DNA-Ligase nach Bedarf verwendet werden.
Die Transformante kann durch Einschleusen des oben erwähnten Expressionsvektors in eine Wirtszelle hergestellt werden.
Beispiele für Wirtszellen schließen Mikroorganismen wie beispielsweise Bakterien (z. B. Bakterien, die zu den Genera Escherichia und Bacillus gehören), Hefe wie solche, die zum Genus Saccharomyces gehören, Tierzellen sowie Insektenzellen ein. Spezifisch beispielhaft angegeben werden Escherichia coli K12DH1, M103, JA221, HB101, C600, XL-1 Blue und JM109 als Bakterien, die zum Genus Escherichia gehören; und Bacillus subtilis 207-21 als Bakterien, die zum Genus Bacillus ge hören. Beispiele der Hefe schließen Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R-, NA87-11A und DKD-5D ein. Beispiele der Tierzellen schließen die Affenzelle COS-7, Vero, chinesische Hamsterzellen CHO, Maus-L-Zellen, menschliche FL-Zellen und menschliche 293-Zellen ein. Beispiele für Insektenzellen schließen BmN4 und Sf9 ein. Bevorzugt sind Insektenzellen und Tierzellen.
Die bevorzugte Wirtszelle zum Klonieren der DNA-Sequenz und dem Konstruieren des Vektors ist im Allgemeinen eine prokaryontische Zelle. Der hergestellte Expressionsvektor wird verwendet, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren. Die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle oder eine eukaryontische Zelle sein. Bevorzugt sind Insektenzellen (z. B. BmN4 und Sf) und Tierzellen.
Der Expressionsvektor wird eingeschleust (d. h. Transformation, die als Konzept verwendet wird, einschließlich Transfection im vorliegenden Verfahren) in Wirtszellen durch ein konventionell bekanntes Verfahren.
Beispielsweise kann im Falle von Bakterien (z. B. Escherichia coli und Bacillus subtilis) das Verfahren von Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 69, 2110 (1972)], das Protoplasten-Verfahren [Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)] oder das Kompetenz-Verfahren [J. Mol. Biol., 56, 209 (1971)] verwendet werden; im Falle von Saccharomyces cerevisiae kann das Verfahren von Hinnen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 75, 1927 (1978)] oder das Lithium-Verfahren [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)] verwendet werden; im Falle von Tierzellen kann das Verfahren von Graham [Virology., 52, 456 (1973)], die Lipofectin-Methode oder HVJ-Liposom-Methode [Hypertension, 21, 894-899 (1993)], verwendet werden; und im Falle von Insektenzellen kann das Verfahren von Summers et al. [Mol. Cell. Biol., 3, 2156-2165 (1983)] für die Transformation verwendet werden.
Die aus dem Menschen stammende PGIS kann durch das Kultivieren einer Transformante in einem Nährmedium (wobei der Begriff als Konzept verwendet wird und die Transfectante der vorliegenden Erfindung einschließt) hergestellt werden, umfassend den Expressionsvektor, der wie oben hergestellt wurde.
Das Nährmedium enthält bevorzugt eine Kohlenstoffquelle, eine anorganische Stickstoffquelle oder eine organische Stickstoffquelle, die für das Wachstum der Wirtszelle (Transformante) notwendig ist. Beispiele für Kohlenstoffquellen schließen Glucose, Dextran, lösliche Stärke und Saccharose ein; Beispiele für anorganische Stickstoffquellen oder organische Stickstoffquellen schließen Ammoniumsalze, Salpetersäuresalze, Aminosäuren, Mais-weiche Liquor, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl und Kartoffelflüssigextrakt ein. Falls gewünscht, können andere Nährstoffe, wie anorganische Salze (z. B. Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid), Vitamine und Antibiotika, wie Ampicillin und Kanamycin, zum Medium hinzugegeben werden.
Die Kultur wird nach im angesprochenen Gebiet bekannten Verfahren durchgeführt. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH des Mediums und Kulturdauer werden passend bestimmt, so dass die maximale Leistungsfähigkeit der PGIS erzielt werden kann. Spezifische Medien- und Kulturbedingungen, die der Wirtszelle entsprechend benutzt werden, werden im Folgenden beispielhaft angegeben, sind jedoch nicht beschränkend.
Wenn der Wirt eine Bakterie, Actinomyces, Hefe oder filamentöser Pilz ist, sind beispielsweise Flüssigmedien, die die oben erwähnten Nährstoffquellen enthalten, geeignet. Bevorzugt ist ein Medium mit einem pH von 5-8.
Wenn der Wirt Escherichia coli ist, ist das bevorzugte Medium M9-Medium [Miller, J., Exp. Mol. Genet., p. 431, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. In diesem Fall wird die Kultivierung unter Belüftung und Bewegung, falls notwendig, bei 14-43°C für ungefähr 3 bis 24 h durchgeführt.
Wenn der Wirt eine Bakterie ist, die zu dem Genus Bacillus gehört, wird die Kultur unter Belüftung und Bewegung, falls notwendig, bei 30-40°C für ungefähr 16 bis 96 h durchgeführt.
Wenn der Wirt eine Hefe ist, wird das Medium beispielhaft wiedergegeben durch das Burkholder Minimal-Medium [Bostian, K. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)], welches bevorzugterweise einen pH von 5-8 hat. Die Kultivierung wird im Allgemeinen bei 20-35°C für ungefähr 14 bis 144 h unter Belüftung und, falls notwendig, Bewegung durchgeführt .
Wenn der Wirt eine Tierzelle ist, kann das Medium beispielhaft wiedergegeben werden durch MEM-Medium, das ungefähr 5-20 % fötales Kälberserum enthält [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium (J. Am. Med. Assoc., 199, 519 (1967)] und 199-Medium [Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)]. Der pH-Wert des Mediums beträgt bevorzugt ungefähr 6-8, und die Kultur wird im Allgemeinen bei ungefähr 30-40°C für ungefähr 15 bis 60 h unter Belüftung und, falls notwendig, Bewegung durchgeführt.
Wenn der Wirt eine Insektenzelle ist, wird das Medium beispielhaft wiedergegeben durch Grace's Medium, welches bevorzugt einen pH von ungefähr 5-8 hat, das fötales Kälberserum enthält [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404 (1985)]. Die Kultivierung wird im Allgemeinen bei ungefähr 20-40°C für ungefähr 15 bis 100 h unter Belüftung und, falls notwendig, Bewegung durchgeführt.
Die aus dem Menschen stammende PGIS, die durch die erfindungsgemäße DNA kodiert wird, kann wie folgt aus der oben erwähnten Kultur gewonnen werden.
D. h., dass wenn die aus dem Menschen stammende PGIS in dem Flüssigteil der Kultur vorhanden ist, die so erhaltene Kultur einer Filtration oder Zentrifugation unterworfen wird, um das Kulturfiltrat (Überstand) abzutrennen, und das PGIS wird aus diesem Kulturfiltrat mit Hilfe eines konventionellen Verfahrens gereinigt und abgetrennt, das für die Reinigung und Isolierung natürlicher oder synthetischer Proteine benutzt wird.
Das Reinigungsverfahren und die Isolierung schließt beispielsweise ein Verfahren ein, bei dem die Löslichkeit benutzt wird, wie Aussalzen oder Lösungsmittelpräcipitation, ein Verfahren, bei dem ein Unterschied der Molekulargewichte benutzt wird, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelectrophorese, ein Verfahren, das die Ladung benutzt, wie Ionenaustausch-Chromatographie und Hydroxyapatit-Chromatographie, ein Verfahren, das die spezifische Affinität wie die Affinitäts-Chromatographie verwendet, ein Verfahren, das die Differenz der Hydrophobizität benutzt, wie Umkehrphasen-Hochleistungsflüssig-Chromatographie, und ein Verfahren, das einen Unterschied des isoelektrischen Punkts benutzt, wie die isoelektrische Fokussierung.
Wenn die aus dem Menschen stammende PGIS in dem Periplasma oder Cytoplasma der kultivierten Transformante vorhanden ist, wird die Kultur einem konventionellen Verfahren unterworfen, wie einer Filtration und Zentrifugation, um die Zellen zu sammeln; die Zellen werden in einem geeigneten Puffer suspendiert und einer Analyse der Zellwand und/oder Zellmembran durch Ultraschall unter Verwendung von Lysozym oder durch Einfrieren/Auftauen unterworfen; und die Membranfraktion, die die PGIS enthält, wird durch Zentrifugieren oder Filtrieren gewonnen. Diese Membranfraktion wird mit einem Tensid wie Triton gelöst, um eine Ausgangslösung zu ergeben. Die Ausgangslösung wird durch ein konventionelles Verfahren behandelt, das oben beispielhaft wiedergegeben wurde, um die PGIS zu isolieren und zu reinigen.
Die DNA, die die aus dem Menschen stammende PGIS kodiert, kann für die Gentherapie verwendet werden. Die DNA, die die aus dem Menschen stammende PGIS kodiert, oder ein rekombinanter Vektor, der diese DNA umfasst, wird in den Menschen oder andere Tiere eingeschleust, wobei PGIS in dem Menschen oder in anderen Tieren produziert wird, um die Produktion von PGI₂ zu fördern. Die geförderte PGI₂-Produktion wiederum ermöglicht die Behandlung (therapeutische Behandlung oder Verbesserung von Symptomen) der Erkrankungen, die durch eine niedrige Produktion von PGI₂ induziert werden. Beispiele für Erkrankungen, die durch eine niedrige Produktion von PGI₂ induziert werden, schließen cardiovasculäre Erkrankungen wie Thrombose, Myokardinfarkt, Arteriosclerose und Angina pectoris ein. Der rekombinante Vektor kann in den Menschen oder in andere Tiere in Form von Zellen, die mit diesem rekombinanten Vektor transformiert sind, eingeschleust werden.
Die Gentherapie, die das Gen (einschließlich der DNA und des rekombinanten Vektors) der vorliegenden Erfindung benutzt, erlaubt, ein geeignetes Umfeld festzulegen, bei dem das erfindungsgemäße Gen, das in einen Menschen oder ein anderes Tier eingeschleust wurde, seine Funktion vollständig zeigen kann. Die Behandlung kann durch ein konventionelles Verfahren verabreicht werden, solange es die Expression der gewünschten Wirkungen des Gens der vorliegenden Erfindung beabsichtigt. Ein solches Verfahren wird durch ein virologisches Mittel beispielhaft wiedergegeben, bei dem ein Retrovirus-Vektor oder Adenovirus-Vektor benutzt wird, ein physikalisches Mittel, zum Einschleusen des Gens durch ein Partikel-Gewehr-Verfahren oder durch die Verwendung von nackter DNA, und einem chemisches Verfahren wie dem Lipidverfahren [Molecular Medicine, Vol. 30, Nr. 12, S. 1526 (1993); Jikken Igaku, Vol. 12, Nr. 3, S. 15, 28 und 40 (1994); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1137 (1995)]. Ein Verfahren, bei dem ein Adenovirus-Vektor verwendet wird, welcher für die Gentherapie von cystischer Fibrose verwendet werden kann, und dafür bekannt ist, eine wirksame Einschleusung eines Gens in differenzierte Zellen und Gewebe zu ermöglichen, und die Expression darin, und ein Verfahren bei dem fusogene Liposomen verwendet werden, die die Einschleusung eines optionalen Gens in Gewebszellen in vivo erlauben, sind für die Genbehandlung der vorliegenden Erfindung vorzuziehen.
Die Dosis der DNA oder des rekombinanten Vektors der vorliegenden Erfindung ist entsprechenden Anpassungen entsprechend dem Geschlecht, dem Alter und dem Körpergewicht der Patienten, der Art der Erkrankung und der Symptome derselben, und dem Verabreichungsweg unterworfen. Beispielsweise werden allgemein 100 μg-10 mg DNA verabreicht.
Der DNA oder der rekombinante Vektor der vorliegenden Erfindung wird durch intravenöse Injektion, transmucöse Verabreichung, orale Verabreichung unter Verwendung von Mitteln mit enterischer Beschichtung oder topische Verabreichung verabreicht, wobei der topischen Verabreichung unter Verwendung eines Katheters und ähnlicher der Vorzug gegeben wird.
Die DNA, die die aus dem Menschen stammende PGIS kodiert, und ein rekombinanter Vektor, der diese DNA der vorliegenden Erfindung umfasst, werden mit konventionellen, pharmazeutisch annehmbaren Trägern, Excipienten, Verdünnungsmitteln, Verlängerungsmitteln, Zersetzungsmitteln, Stabilisatoren, Konservierungsmitteln, Puffern, Emulgatoren, Geschmacksstoffen, Farbstoffen, Süßungsmitteln, Verdickungsmitteln, Elixieren, Lösungsmitteln und anderen Additiven wie Wasser, Salzlösung, Phosphatpuffer, Pflanzenöl, Ethanol, Polyethylenglycol, Glycerol, Gelatine, Lactose, Glucose, Mannitol, Stärke, Saccharose, Magnesiumstearat, Hydroxypropylcellulose, Talg, Lanolin und Petrolat gemischt, und können in Form einer Injektion, Tablette, Pulver, Kapsel, eines enterisch beschichteten Mittels, einer Salbe, Suspension, Emulsion, eines Sprays, eines Inhalats, eines Nasensprays und ähnliche verwendet werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine erfindungsgemäße DNA oder einen rekombinanten Vektor enthält, der diese erfindungsgemäße DNA umfasst, kann Säugern wie dem Menschen, Mäusen, Ratten, Kaninchen, Schweinen, Kühen, Schafen, Hunden und Katzen verabreicht werden.
Wirkungen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die erstmalige Aufklärung der Aminosäuresequenz der aus dem Menschen stammenden PGIS sowie der Nucleotidsequenz der DNA, die das Enzym mit dieser Sequenz kodiert. Auf Grundlage der Aufklärung dieser Aminosäuresequenz und der Nucleotidsequenz wird ein Verfahren zur Herstellung von PGIS durch Gentechnik und ein Expressionssystem, das damit verwandt ist, bereitgestellt.
Die PGIS und die erfindungsgemäße DNA, die diese kodiert, sind nützlich als Reagentien für

(1) die Analyse der physikochemischen Eigenschaften und biologischen Eigenschaften von PGIS auf molekularem oder genetischem Niveau,
(2) die Analyse des Mechanismus der Regulierung der PGIS-Produktion und des Mechanismus der Regulierung der PGI₂-Produktion durch PGIS, und
(3) die Untersuchung der Ursache verschiedener cardiovasculärer Erkrankungen, die als durch das Produktionsungleichgewicht zwischen PGI₂ und TXA₂ induziert, angesehen werden, und die Analyse auf molekularem oder genetischem Niveau zur Entwicklung therapeutischer Mittel für diese Erkrankungen.

Zusätzlich sind sie als Diagnostika zur Bestimmung der in vivo-Gewebs-Expressions-Niveaus und zur Verteilung von PGIS oder mRNA nützlich.
Außerdem können sie als therapeutische Mittel für verschiedene cardiovasculäre Erkrankungen wie Thrombose, Myokardinfarkt, Arteriosclerose und Angina pectoris verwendet werden, welche das Produktionsniveau an PGI₂ erhöhen, auf Grundlage einer läsions-spezifischen Einschleusung von PGIS, von DNA, die PGIS kodiert, eines Fragments davon oder eines modifizierten Produkts davon in den Menschen oder andere Tiere.
Das Expressionssystem der PGIS, welches einen rekombinanten Vektor umfasst, der die erfindungsgemäße DNA enthält, welche die aus dem Menschen stammende PGIS kodiert, und eine Wirtszelle, die mit diesem Vektor transformiert ist, ist zur Produktion durch Gentechnik nützlich, welche eine leichte und effiziente Massenproduktion der aus dem Menschen stammenden PGIS ermöglicht.
Das Plasmid, Enzym, z. B. ein Restriktionsenzym, T4DNA-Ligase und andere Substanzen, die in den Beispielen der vorliegenden Erfindung verwendet werden sollen, sind kommerziell erhältlich und können gemäß konventionellen Verfahren verwendet werden. Die Verfahren zur Klonierung von cDNA, die Bestimmung der Nucleotidsequenz, die Transfection einer Wirtszelle, die Kultur einer Transfectante, die Ernte und die Reinigung von PGIS aus der erhaltenen Kultur sind Fachleuten im Gebiet wohl bekannt, oder können aus der Literatur bekannt gemacht werden.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete pHPGIS36 (PBJT-BA-4, Hinterlegungsnummer FERM BP-4653) und pHPGI5135 (PBJT-BA-5, Hinterlegungsnummer FERM BP-4654) sind international beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt.
Beispiele und Referenzbeispiele
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden detailliert mit Hilfe von Beispielen und Referenzbeispielen beschrieben, auf welche die vorliegende Erfindung nicht begrenzt ist.
Beispiel 1: Bestimmung der cDNA-Nucleotidsequenz
(1) Herstellung von λ hPGIS141
Eine menschliche Genom-Bibliothek (Genomische Lungen-Fibroplasten-Zelllinie W I 38, hergestellt von Clone-Tech) wurde zu ungefähr 2 × 10⁵ PFU ausgesät, und mit Plaque-Hybridisierung unter Verwendung einer Rinder-cDNA als Sonde durchmustert, welche zuvor von dem Erfinder hergestellt worden ist (siehe Tanabe, T., Hara, S., Miyata, A., Brugger, R., and Ullrich, V. (1993) in Abstract book of 3rd international conference on eicosanoid and other bioactive lipids in cancer, inflammation and radiation Injury, S. 137).
Als Ergebnis wurden vier positive Signale erhalten, von denen eins von einem einzelnen Plaque isoliert wurde. Die Flüssigkultur führte zur Massenherstellung der Phagen-DNA. Nach der Reinigung wurde sie mit verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut, gefolgt von einer Kartierung. Ein Fragment, das ein Exon umfasst, wurde durch Southern-Hybridisierung identifiziert, was von einer Strukturanalyse durch DNA-Sequenzierung gefolgt wurde, um zu bestätigen, dass der schließlich isolierte Klon (λ hPGIS141) die menschliche PGIS kodierte.
Der so erhaltene λ hPGIS141 wurde strukturell durch Restriktionsenzym-Schnittstellenkartierung und Nucleotidsequenz-Bestimmung analysiert, und es wurde herausgefunden, dass λ hPGIS141 die Region enthält, die den Nucleotiden 673-855 der Rinder-PGIS cDNA (SQ Nr. 8) entspricht.
Auf Grundlage der Nucleotidsequenz des λ hPGIS141 cDNA-Fragments, das auf diese Weise gewonnen wurde, wurden die Primer [SQ Nr. 1: P1 Primer (674-689), SQ Nr. 2: P2 Primer (699-718), SQ Nr. 3: P3 Primer (696-713), SQ Nr. 4: P4 Primer (805-822)] mit den Sequenzen, die in der Sequenzliste SQ-Nummern 1-4 dargestellt sind, synthetisiert.
(2) Amplifikation von cDNA mit Hilfe des PCR-Verfahrens
Die 3'-stromabwärts liegende Region und die 5'-stromaufwärts liegende Region der cDNA wurden durch das PCR-Verfahren (Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, 1479-1484 (1991)) amplifiziert, indem diese Primer und poly(A)⁺ RNA (mRNA) von 1 μg menschlicher Aorta-Gefäßendothelzellen (nachfolgend als HAEC bezeichnet, hergestellt von Kurabo) als Matrize amplifiziert wurde.
Für die Amplifikation der cDNA, die der 3'-stromabwärts gelegenen Region entspricht, wurde die cDNA mit einem dT₁₇ Adapter (5'-GACTCGAGTCGACATCGA-(T)₁₇-3' SQ Nr. 5) geprimt und verlängert, um eine erste cDNA-Kette zu ergeben, die mit dem P1 Primer (674-689) und dem Adapter-Primer (SQ Nr. 6) amplifiziert wurde, und dann mit dem P2 Primer (699-718) und dem Adapter-Primer (SQ Nr. 6). Die 5'-stromaufwärts gelegene Region der cDNA wurde unter Verwendung eines 5'-RAGE-Systems (GIBCO BRL) amplifiziert. Nach dem Protokoll wurde ein homomerer dC-Anhang an die erste cDNA-Kette angehängt, und eine zweite cDNA-Kette wurde unter Verwendung eines Adapter-Primers (5'-(CUA)4 GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG-3') (SQ. Nr. 7) gebildet. Die Amplifikation im ersten Schritt wurde unter Verwendung des P4 Primers und des Adapter-Primers (SQ Nr. 7) durchgeführt. Die Amplifizierung des zweiten Schritts wurde unter Verwendung des P3 Primers und des Adapter-Primers (SQ Nr. 7) durchgeführt. Das PCR-Verfahren wurde in 35 Zyklen gemäß dem folgenden Zyklusprofil wiederholt.

Denaturierung 94°C 1 Minute
Anlagerung 54°C 1 Minute
Verlängerung 72°C 3 Minuten

Die entsprechenden PCR-Produkte (3'-Stromabwärts-Region Amplifikationsprodukt und 5'-Stromaufwärts-Region Amplifikationsprodukt) wurden teilweise herausgenommen und mittels Electrophorese unter Verwendung eines 1%igen Agarosegels gereinigt.
Es wurde eine Southern-Hybridisierung unter Verwendung von Rinder-cDNA (pBPGISI) als Sonde durchgeführt, und die DNA wurde aus der Bande extrahiert, die mit dieser Sonde kreuzhybridisierte. Die gewonnene DNA wurde in pBluescriptII SK(-) kloniert.
D. h. Klonierung und Screening wurden durch die folgenden Schritte durchgeführt:

(1) Ausschneiden der Bande, die ein Signal zeigte, aus einem Gel, nach der Electrophorese
(2) Agarase-Verdau bei 40°C für 1 h (Agarase 1 Einheit/100 μl Gel)
(3) Extraktion von DNA mit Phenol und anschließende Ethanol-Präzipitation
(4) Lösen dieses DNA-Ethanol-Präzipitats in sterilem Wasser und Behandlung mit Polynucleotidkinase bei 37°C für 1 h
(5) Endreparatur mit Klenow-Fragment (16°C, 1 h)
(6) Ligation unter Verwendung des Takara-Ligationskits
(7) Transformation mit einem konventionellen Verfahren
(8) Aussäen auf einer Platte
(9) Bilden einer Replica mit einem konventionellen Verfahren und
(10) Kolonien-Hybridisierung auf einem Nitrocellulosefilter der Replica durch ein konventionelles Verfahren, in dem Rinder-PGIS cDNA als Sonde verwendet wurde.

Die Hybridisierung wurde bei 60°C in 6 x SSC [1 x SSC enthalten 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat (pH 7,0)], 5 x Denhardt's Lösung, 250 μg/ml Lachssperma DNA, 0,1 % SDS und dem cDNA-Fragment (10⁶ cpm/ml), welches durch ein Zufalls-Primingverfahren markiert wurde, durchgeführt. Der gewonnene Filter wurde zweimal mit 3 x SSC und 0,1 % SDS bei Raumtemperatur für 5 min gewaschen, und zweimal mit 0,1 x SSC und 0,1 % SDS bei 50°C für 15 min. Das Filter wurde luftgetrocknet und gegenüber einem Fuji-Röntgenstrahlen-Film unter Verwendung eines Verstärker-Schirms bei -80°C für 12-16 h exponiert.
Das erhaltene DNA-Insert wurde in pBluescriptII SK(-) subkloniert. Durch diese Schritte wurde ein Klon (pHPGI5135), welcher die 3'-stromabwärts gelegene Region der DNA von aus dem Menschen stammender PGIS enthält, und ein Klon (pHPGIS36), der die 5'-stromaufwärts-Region der DNA der aus dem Menschen stammenden PGIS enthält, gewonnen. Dann wurde die Nucleotidsequenz des DNA-Inserts der entsprechenden Klone durch das Sanger-Verfahren [Sanger, F., Nickle, S., and Coulson, A. R. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467], in dem der Taq dye primer cycle sequence kit (hergestellt von Applied Biosystems) und des DNA-Sequenziergeräts vom Modell 373A (hergestellt von Applied Biosystems) bestimmt. Als Ergebnis wurde herausgefunden, dass der pHPGIS36-Klon als DNA-Insertionssequenz eine Nucleotidsequenz von 740 Basenpaaren (SQ Nr. 9) einer cDNA der humanen PGIS hatte, mit einer Adaptersequenz am 5'-Ende, auf deren Grundlage eine Teilaminosäuresequenz der PGIS, umfassend 237 Aminosäurereste identifiziert wurde, worin ATG die Translations-Initiations-Sequenz (Met) ist.
Es wurde ebenfalls herausgefunden, dass der pHPGIS135-Klon als DNA-Insertionssequenz eine 1277 Basenpaare lange Nucleotidsequenz (SQ Nr. 10) der cDNA der humanen PGIS umfasste, mit einer Adaptersequenz am 3'-Ende, auf deren Grundlage eine Teilaminosäuresequenz der PGIS der Carboxy-Endregion beginnend an der 226. Asparaginsäure identifiziert wurde. Die Nucleotidsequenz der humanden PGIS-cDNA, die im pHPGIS36-Klon enthalten ist, und die Aminosäuresequenz, die hiervon abgeleitet wurde, sind in Sequenz Nr. 9 in der Sequenzliste, die später aufgeführt wird, wiedergegeben, und die Nucleotidsequenz der humanen PGIS-cDNA, die in dem pHPGIS135-Klon enthalten ist, und die Aminosäuresequenz, die hiervon abgeleitet wurde, sind in der Sequenz Nr. 10 wiedergegeben. 1 zeigt eine Restriktionsenzym-Karte der Menschen-PGIS-cDNA und den Bereich der menschlichen PGIS-cDNA, welcher der DNA entspricht, die in λ hPGIS141, pHPGIS36 und pHPGIS135 enthalten ist. 2 zeigt eine Restriktionsenzym-Karte von pHPGIS136 und 3 zeigt eine Restriktionsenzym-Karte von pHPGIS135.
Menschliche PGIS-cDNA, die durch das oben erwähnte Klonieren gewonnen wurde, hatte eine Consensus-Sequenz des Inititiationscodons von Eukaryonten, die durch Kozak et al. gezeigt wurde [Nucleic Acids Res. 12, 857-872 (1984)], ungefähr beim Translationsinitiationscodon, und ungefähr 500 Codons davon entfernt einen TGA-Codon, der dem Terminationscodon entspricht. Auf dieser Grundlage wurde herausgefunden, dass die cDNA der klonierten humanen PGIS 1977 Basenpaare umfasst, die 1500 Basenpaare umfasst, welche 500 Aminosäurereste kodiert, wie in Sequenz Nr. 12 gezeigt wird, und das Molekulargewicht des Proteins, das hierdurch kodiert wird, lag vermutlich bei ungefähr 57.000.
Der Vergleich der Aminosäuresequenz, die durch diese DNA kodiert wird, mit der Aminosäuresequenz der aus dem Rind stammenden PGIS, welche separat durch den vorstelligen Erfinder kloniert wurde, zeigte eine ungefähr 88%ige Homologie. Die Untersuchung der Rinder-PGIS des vorstelligen Erfinders hat ergeben, dass die Rinder-PGIS eine 31%ige Homologie mit Cholesterin 7α-Hydroxylase hat, die zu der Cytochrom P450 7-Familie (CYP7) gehört, und die Region um den 441. Cysteinrest, welcher die Häm-Bindungsstelle ist (5. Ligand) von Cytochrom P450 war konserviert. Die humane PGIS konservierte die Aminosäuresequenz, die diesem Bereich entspricht, ähnlich und dieser Bereich wird als eine wichtige Rolle in der PGIS-Aktivität spielend, angesehen.
Obwohl die Rinder-PGIS eine 31%ige Homologie mit Cholesterin 7α-Hydroxylase hat, hat sie nur eine 16%ige Homologie mit der humanen Thromboxansynthase, die zur Cytochrom P450-Familie gehört, und nicht mehr als 40 % Homologie mit irgendeinem der bekannten Cytochrom P450-Proteine. Es wird daher postuliert, dass es eine neue Familie in der Cytochrom P450-Superfamilie ist, und dass die humane PGIS ebenfalls in diese neue Familie gehört.
Eine Suche nach solch einer strukturellen Korrelation der Aktivität ist für die Untersuchung und Entwicklung pharmazeutischer Produkte unerlässlich. Eine solche Suche wird nur erfüllt, nachdem die Primärstruktur der humanen PGIS aufgeklärt worden ist. Daher ist die vorliegende Erfindung, die die Primärstruktur der humanen PGIS zum ersten Mal beschreibt, extrem wichtig und bedeutsam für die Forschung, ebenfalls unter industriellem Aspekt.
Beispiel 2: Expression der humanen PGIS
(1) Konstruktion des Expressionsvektors für die humane PGIS
Die cDNA-Insertionsregion wird jeweils aus dem gewonnen pHPGI536-Klon und dem pHPGIS135-Klon unter Verwendung eines geeigneten Restriktionsenzyms ausgeschnitten und gereinigt. Die beiden gewonnenen Fragmente wurden thermisch denaturiert (95°C für 10 min), gefolgt von einer Anlagerung. cDNA wird unter Verwendung einer DNA-Polymerase in beide Richtungen nach 5' und 3' aus der überlappenden Region als Synthese-Initiations-Region repliziert. Unter Verwendung der gewonnenen cDNA vollständiger Länge als Matrize, wird ein Primer aus jedem Bereich des Initiationscodons oder des Terminationscodons synthetisiert und eine PCR durchgeführt. Bei dieser Gelegenheit wird eine geeignete Restriktionsenzym-Schnittstelle als Ankerschnittstelle am 3'-Ende des Primers konstruiert.
Das so gewonnene PCR-Produkt wird gereinigt, die Nucleotidsequenz davon wird bestätigt, und das Produkt wird mit BamHI und SmaI (BglII) verdaut, um ein BamHI-SmaI (BglII) Fragment zu ergeben. Dieses BamHI-SmaI (BglII) Fragment wird in die BamHI-SmaI-Schnittstelle des pVL1393-Expressionsvektors eingeschleust, der zuvor mit BamHI-SmaI behandelt worden ist. Das rekombinante Plasmid, das sich so gebildet hat (PGIS7) wird durch Restriktionsenzym-Kartierung und DNA-Sequenz-Analyse charakterisiert.
(2) Baculovirus-Expressionssystem
Sf9-Zellen (hergestellt von InVitrogen) werden als Mono-Layer in Grace's Insektenmedium, enthaltend 10 % fötales Kälberserum, 0,33 % Yeastolat und 0,33 % Lactoalbumin-Hydrolysat bei 27°C kultiviert. Zur Herstellung eines rekombinanten Virus werden Sf9-Zellen (1,5 × 10⁶-Zellen) rekombinantes Plasmid (PGIS7, 50 μg) und Wildtyp-Baculovirus-DNA (AcNPV; 1 μg) gemischt und mit dem Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren transfiziert. Das rekombinante Baculovirus wird isoliert und durch eine Kombination aus Plaque-Assay und Slot-Hybridisierung unter Verwendung eines 32P-markierten Fragments aus PGIS als Sonde amplifiziert.
Diese Sf9-Zellen werden mit Wildtyp-Baculovirus oder rekombinantem Baculovirus infiziert. Drei Tage nach der Infektion werden die Zellen eingesammelt (auf 2 × 10⁸-Zellen) und für 5 h in einem serumhaltigen Medium mit oder ohne 10 μM Hämin inkubiert.
Die gewonnenen Zellen werden mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und bei -80°C aufbewahrt. Die microsomalen Fraktionen der Zellen werden gemäß dem Verfahren von Haurand und Ullrich et al. hergestellt [J. Biol. Chem. 260, 15059-15067 (1985)]. Die erhaltenen Zellen (2 × 10⁸-Zellen) werden in einer Lösung (20 ml) aus 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (pH 7,0), 10 mM EDTA, 5 mM Glucose, 0,1 mM Dithiothreitol (DTT), 1,15 % KCl, 2 μg/ml Leupeptin, 2 μg/ml Pepstatin, 10 μg/ml Sojabohnentrypsin-Inhibitor und 44 μg/ml Phenylmethylsulfonylfluorid homogenisiert und einer Ultraschallbehandlung (30 sec, 4-mal) unter Verwendung eines Branson Sonifiers vom Modell 450 unterworfen.
Das erhaltene Homogenat wird bei 7.000 x g für 15 min zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wird bei 105.000 x g für 60 min zentrifugiert. Das gewonnene Sediment wird in 10 mM Kaliumphosphat-Puffer (3 ml, pH 7,0), enthaltend 20 % Glycerol, 1 mM DTT und 1 mM EDTA, durch Beschallung suspendiert. Die Proteinkonzentration wird durch das Lowry-Verfahren unter Verwendung von Rinderserum-Albumin als Standard bestimmt, und eine Lösung zur Immunblot-Analyse und ein PGIS-Assay mit 5 mg/ml wird hergestellt.
(3) Western-Immunblot-Analyse
Die infizierten Sf9-Zellen und die Microsomen-Fraktion aus menschlichen Plättchen werden einer 10%igen SDS-PAGE gemäß dem Verfahren von Laemmli [Nature 227, 680-685 (1979)] unterzogen. Das migrierte Protein wird electrophoretisch auf eine Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran (Immobilon, Millipore) gemäß dem Verfahren von Towbin et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354 (1979)] übertragen. Tris-HCl gepufferte Salzlösung (TBS) (pH 7,4) enthaltend 10 % Pferdeserum wird bei Raumtemperatur für 30 min vorbehandelt, und die Blot-Membran wird mit einem polyclonalen Antikörper gegen Rinder-PGIS in TBS, enthaltend 3 % entrahmte Milch, inkubiert.
Nach dem Waschen mit TBS, enthaltend 0,05 % Tween 20, wird die Membran in TBS, enthaltend 3 % entrahmte Milch, bei 37°C für 30 min zusammen mit einem Anti-Maus-IgG-Pferdeantikörper inkubiert, der mit Meerrettichperoxidase konjugiert ist (hergestellt von Vector Laboratories). Nach gründlichem Waschen mit TBS, enthaltend 0,05 % Tween 20, wird die Bande, die eine positive immunologische Reaktion zeigt, unter Verwendung eines Immunostaining-HRP-Kit (hergestellt von Konica) nachgewiesen.
Beispiel 3: Expression humaner PGIS in kultivierten Tierzellen
(1) Herstellung der humanen PGIS-cDNA vollständiger Länge
Der erhaltene pHPGIS36-Klon wurde mit den Restriktionsenzymen SalI und NspI ausgeschnitten und gereinigt, um das SalI-NspI-Fragment zu ergeben. Der pHPGIS135-Klon wurde mit den Restriktionsenzymen PstI und BamHI ausgeschnitten, und gereinigt, um das PstI-BamHI-Fragment zu ergeben.
Weiter wurden die Primer [SQ Nr. 13: P5 Primer (676-699), SQ Nr. 14: P6 Primer (832-855)] mit den Sequenzen, die in den Sequenznummern 13 und 14 der Sequenzliste dargestellt sind, auf Grundlage der Nucleotidsequenz von λ hPGIS141 synthetisiert. Unter Verwendung dieser Primer und λ hPGIS141 als Matrize, wurde eine durchgehende Region der menschlichen PGIS-cDNA mit dem PCR-Verfahren amplifiziert, mit den Restriktionsenzymen NspI und PstI gespalten, gereinigt und die Nucleotidsequenz wurde bestätigt, und als NspI-PstI-Fragment verwendet. Dieses SalI-NspI-Fragment, PstI-BamHI-Fragment und NspI-PstI-Fragment wurden miteinander verbunden und in die SalI-BamHI-Schnittstelle des pBluescriptII SK+ (hergestellt von STRATAGENE) eingefügt, welcher zuvor mit SalI-BamHI behandelt worden war, wodurch ein Plasmid (pHPGISl) hergestellt wurde, das die gesamte Länge der menschlichen PGIS-cDNA enthält. 4 zeigt die Restriktionsenzym-Karte von pHPGISl.
(2) Herstellung des humanen PGIS-Expressionsvektors für kultivierte Tierzellen
Die inserierte PGIS-cDNA-Region des Menschen wurde aus dem erhaltenen pHPGIS1-Klon mit den Restriktionsenzymen SalI und BamHI ausgeschnitten, und gereinigt, um ein 5alI-BamHI-Fragment zu ergeben. Dieses SalI-BamHI-Fragment wurde in die SalI-BamHI-Schnittstelle des pCMV7 Expressionsvektor [geliefert von Dr. David W. Russel, University of Texas Southwestern Medical Center, Cell, 75, 187-197 (1993); J. Biol. Chem., 264, 8222-8229 (1989)], welcher zuvor mit SalI-BamHI behandelt worden ist, wodurch ein Menschen-PGIS Expressionsvektor (pCMV-HPGIS 1) für kultivierte Tierzellen hergestellt wurde. 5 zeigt die Restriktionsenzymkarte von pCMV-HPGIS 1.
(3) Expression der humanen PGIS in kultivierten Tierzellen
Menschliche, aus fötalen Nieren stammende 293-Zellen (hergestellt von Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) wurden in einer 60-mm-Schale zu 3 × 10⁵ Zellen ausgesät, und eine Mono-Layer wurde bei 37°C für 24 h in Dulbecco's modifizierten Eagle's medium (DMEM), enthaltend 10 % fötales Kälberserum, 100 E/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin kultiviert. Dann wurden ein rekombinantes Plasmid (pCMV-HPGIS 1, 3 μg) und pVA1 [Adenovirus VA1-Gen, 3 μg: geliefert von W. Russel, University of Texas Southwestern Medical Center, Mol. Cell. Biol., 7, 549-551 (1987)] gemischt und durch das Lipofectin-Verfahren (GIBCO BRL) transfiziert. 40 h nach der Transfektion wurden die Zellen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung gewaschen und gesammelt. Die Zellen wurden in 10 mM Calciumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 10 mM EDTA, 10 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 5 mM Glucose, 0,1 mM Dithiothreitol (DTT), 1,15 % KCl, 2 μg/ml Leupeptin, 2 μg/ml Pepstatin und 10 μg/ml Sojabohnentrypsin-Inhibitor suspendiert und einer Ultraschallbehandlung (10 sec, 10-mal) unter Verwendung eines ASTRATON^TM Modells XL2020 unterzogen.
Das erhaltene Homogenat wurde bei 100.000 x g für 60 min zentrifugiert, und das erhaltene Sediment wurde in 10 mM Calciumphophatpuffer (pH 7,0), enthaltend 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 20 % Glycerol und 0,1 mM DTT suspendiert. Die Proteinkonzentration der erhaltenen Probe wurde unter Verwendung eines BCA (Bicinchoninsäure) Protein Concentration Determination Kit (hergestellt von PIERCE) unter Verwendung von Rinder-Serumalbumin als Standard durchgeführt. Die PGIS-Aktivität der erhaltenen Probe wurde durch Umsetzen derselben mit ¹⁴C-markiertem PGH₂ (5 nM) als Substrat bei 24°C für 2 min bestimmt, wobei 6-keto-PGF₁α, welches ein Metabolit des hergestellten PGI₂ ist, durch Dünnschicht-Chromatographie nachgewiesen, und indem die Radioaktivität des 6-keto-PGF₁α nachgewiesen wurde. 7 zeigt die nachgewiesene PGIS-Aktivität, 8 zeigt die PGIS-Aktivität einer Positiv-Kontrolle (Rinderplättchenmicrosomen) und 9 zeigt die Analyseergebnisse einer Negativ-Kontrolle, in die pCMV7 alleine eingeschleust war durch Dünnschichtchromatographie.
Als Ergebnis der Bestimmung unter Verwendung einer Probe, die aus der Zelle hergestellt wurde, in die ein Expressionsvektor eingeschleust wurde, der die humane PGIS-cDNA enthält, wurde ein Spot 6-keto-PGF₁α, welches ein Metabolit von PGI₂ ist, nachgewiesen, wie durch den Pfeil in 7 gezeigt wird. Die Ergebnisse waren die gleichen wie jene, die unter Verwendung von Rinderplättchenmicrosomen erzielt wurden, welche PGIS als Positivkontrolle enthielten (8). Im Gegensatz dazu ergab die Bestimmung unter Verwendung einer Probe, die aus einer Zelle hergestellt wurde, in die ein Expressionsvektor ohne humane PGIS-cDNA eingeschleust worden war, keinen Spot 6-keto-PGF₁α. Der Spot PGH₂ war dicker (9) als in 7 und 8. Die obigen Ergebnisse bedeuten, dass PGIS-cDNA, welche in dem Expressionsvektor eingeschlossen ist, als rekombinantes Protein (rekombinantes PGIS) mit PGIS-Aktivität exprimiert wurde, und dass dieses Protein auf PGH₂ einwirkte, um 6-keto-PGF₁α hervorzubringen, welches ein Metabolit von PGI₂ ist.
Beispiel 4: Expression von humaner PGIS in kultivierten Tierzellen
sMenschliche PGIS-cDNA wurde mit der XhoI-Schnittstelle des Expressionsvektors pUC-CAGGS verbunden (mit einem Enhancer des Cytomegalievirus und dem Hühner-β-Actinpromotor) wie in 6 gezeigt [hergestellt gemäß der Beschreibung in Gene 108, 193-200 (1991)], um einen Expressionsvektor herzustellen. Zwei Arten von Vektoren, d. h. dieser Vektor und ein leerer Vektor ohne menschliche PGIS-cDNA wurden in glatte Gefäßmuskelzellen, die jeweils aus Rattenaorta hergestellt wurden, durch HVJ-Liposomen-Verfahren eingeschleust [Hypertension 21, 894-899 (1993)], und in einem serumfreien Medium [Dubecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) enthaltend 5 × 10^-7 M Insulin, 50 μg/ml Transferin, 0,2 mM Ascorbinsäure, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin] in einem CO₂-Inkubator bei 37°C für 2 Tage inkubiert. Dann wurde das Medium gegen ein Medium ausgetauscht, das 1 % oder 5 fötales Kälberserum (FCS) enthält, und ³H-Thymidin wurde 16 h später hinzugegeben. 8 h nach der Zugabe von Thymidin, wurde die Thymidinaufnahme durch ein konventionelles Verfahren bestimmt.
Die Ergebnisse werden in 10 gezeigt, worin die Kontrolle eine Zelle war, in die ein leerer Vektor eingeschleust wurde, und PGIS eine Zelle war, in die ein Expressionsvektor eingeschleust war, der mit der humanen PGIS-cDNA verbunden war.
Die Zugabe von Serum zur glatten Gefäßmuskelzelle, die in Abwesenheit von Serum kultiviert wurde, führte zu einer verbesserten Proliferation, welche die Thymidinaufnahme erhöhte. In der glatten Gefäßmuskelzelle, in die ein Expressionsvektor mit darin ligierter humaner PGIS-cDNA eingeschleust wurde, war die Thymidinaufnahme, d. h. die Proliferation, signifikant unterdrückt, wenn sie mit einer Zelle verglichen wurde, in die ein leerer Vektor eingeschleust wurde. Dieses Ergebnis lässt die Möglichkeit einer PGIS-cDNA-Einschleusung vermuten, welche das abnormale Wachstum von glatten Muskelzellen in der vasculären Intima unterdrückt, was bei Arteriosclerose und ähnlichen beobachtet wird.
Beispiel 5: Herstellen eines anti-PGIS polyclonalen Antikörpers PGIS, gelöst in 0,5 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und eine äquivalente Menge Adjuvans wurden emulgiert und subkutan in ein Kaninchen injiziert. Danach wurden ähnliche subkutane Injektionen 2-mal alle 10 Tage verabreicht, und Blut wurde 10 Tage nach der letzten subkutanen Injektion aus dem Kaninchen entnommen. Anti-PGIS/IgG wurde gereinigt und das vom Kaninchen erhaltene anti-PGIS-Serum wurde aus dem Blut des Kaninchens unter Verwendung von Protein-A-Sepharose 4B (Bio-Rad) hergestellt.
Beispiel 6: Herstellung eines monoklonalen anti-PGIS-Antikörpers
➀ Maus
Männliche Mäuse der Inzuchtlinie BALB/c (5 Wochen alt) wurden aufgezogen und bei einer Standard-Pellet-Diät in einer Tieraufzuchträumlichkeit (23+1°C, 70 % Feuchtigkeit) bei optionaler Bewässerung gezüchtet.
➁ Immunogen
Die aus dem Menschen stammende gereinigte PGIS wurde verwendet. Die menschliche PGIS wurde bis zu einer Konzentration von 1 mg/ml mit Dulbecco's PBS hergestellt, in Teströhrchen zu 100 μg verteilt, und durch Einfrieren bei -80°C zur Verwendung aufbewahrt.
➂ Immunisierungsverfahren
Menschliche PGIS 100 μg/0,5 ml und eine äquivalente Menge an Freund's kompletten Adjuvans wurden gemischt. Ein emulgiertes Antigen (20 μg) wurde den 5 männlichen BALB/c-Mäusen (5 Wochen alt) intraperitoneal und subcutan an einem Dutzend Stellen am Rücken alle zwei Wochen über zwei Monate verabreicht. Nach der Immunisierung über zwei Monate wurde der Antikörper-Titer gemessen, und die Mäuse mit einem hohen Antikörper-Titer wurden herausgenommen, und es wurde ihnen eine zusätzlich intraperitoneale Verabreichung von 50 μg, 100 μg oder 200 μg davon in jeder zweiten Woche gegeben.
Nach der Immunisierung über zwei Monate, wurde verschiedenen Mäusen intraperitoneal 100 μg davon nach einer leeren Verabreichung nach einem Monat verabreicht. Eine Woche später wurden 100 μg davon intravenös für eine zusätzliche Immunisierung injiziert.
➃ Zellfusion
Drei Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Milzen der BALB/c-Mäuse entfernt, um Suspensionen aus Milzzellen in EMEM-Kulturmedium herzustellen. Die Milzzellen wurden 4-mal mit EMEM-Kulturmedium gewaschen und gezählt.
Zur Zellfusion wurde 2-Amino-6-oxy-8-azapurain (8-Azaguanin)aus einer resistenten BALB/c-Mausmyelom-Zelllinienkultur (P3-X63-Ag8·653, nachfolgend bezeichnet als X63-Zellen) als Parentalzelllinie verwendet. Die X63-Zellen wurden in RPMI-1640 Kulturmedium (20 μg/ml, enthaltend 8-Azaguanin) ergänzt mit 5 % inaktiviertem fötalen Kälberserum (FCS), subkultiviert und die X63-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden 3-mal mit RPMI-1640 Kulturmedium gewaschen und gezählt.
Die Zellfusion wird in RPMI-1640 Kulturmedium durchgeführt, das Polyäthylenglycol 4000 in einer Konzentration von 50 (w/v) % enthält.
D. h., dass die Milzzellen und die X63-Zellen in einem Verhältnis von 10:1 gemischt werden und bei 1500 U/min zentrifugiert werden. Der Überstand wird entfernt, und die Zellpellets werden gut suspendiert und einer Zellfusion gemäß dem Verfahren von Köhler und Milstein unter Verwendung von Polyäthylenglucol unterzogen. Danach werden die Milzzellen in HAT-Selektionsmedium (10 % FCS hinzugegeben zum RPMI-1640 Kulturmedium, das 1 × 10^-4 M Hypoxanthin, 4 × 10^-7 M Aminopterin und 1,6 × 10^-5 M Thymidin enthält) suspendiert, so dass die Milzzellen in einer Konzentration von 3,5 × 10⁶ Zellen/ml vorliegen. Dann wurde die Zellsuspension in jeder Vertiefung einer 96 Well Microtestplatte bei 100 μl aufgeteilt und in einem Kohlensäuregas-Inkubator (37°C, 95 % Feuchtigkeit, 8 Kohlendioxidgas) kultiviert. Am Tag 1 und am Tag 2 nach Beginn der Kultivierung wurde ein Tropfen HAT-Medium zu jedem Well hinzugegeben, und 2 Tropfen am Tag 7 und am Tag 9 nach Beginn der Inkubation, worauf eine weitere Kultivierung folgte.
➄ Screening
10 Tage nach dem Beginn der Kultur begannen Klonzellen zu entstehen. Zur Bestätigung der Antikörperproduktion wurde der Hybridom-Kulturüberstand einem Antigen-Antikörper-Reaktionstest unterworfen.
Das bedeutet, dass 50 μl jedes Hybridom-Kulturüberstandes und der menschlichen PGIS-Antigenflüssigkeit in eine Microtiterplatte mit U-förmigem Boden platziert wurde, und hier zu 50 μl einer 20%igen Suspension aus Sepharose 4B gegeben wird, an die Antimaus-Immunglobulin-Antikörper gebunden ist. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur für 1 h gerührt, und für 10 min stehen gelassen. Nach der Bestätigung einer vollständigen Sedimentierung der Antimaus-Immunglobulin-Antikörper gebundenen Sepharose 4B am Boden der Vertiefung, werden 20 μl des Überstands abgenommen, und hinsichtlich der Konzentration der restlichen humanen PGIS in dem Überstand durch das PGIS-ELISA-System bestimmt. Wenn ein monoclonaler anti-Menschen-PGIS -Antikörper gegen menschliche PGIS in dem Hybridom-Kulturüberstand vorhanden ist, reagieren menschliche PGIS und anti-Menschen-PGIS monoklonaler Antikörper, und Antimaus-Immunglobulin-Antikörper gebundenes Sepharose 4B-Sediment wird als Antigen-Antikörper-Komplex gebildet, um die Konzentration der restlichen menschlichen PGIS in dem Überstand zu senken, wodurch die Gegenwart eines monoklonalen Antikörpers anti-Menschen-PGIS bewiesen wird.
Referenzbeispiel 1: RNA Blot-Analyse
Eine RNA-Blot-Hybridierungsanalyse wurde durchgeführt, um den Einfluss verschiedener Arten von Cytokinen auf die Expression von aus der HAEC-stammenden humanen PGIS mRNA zu untersuchen.
Die gesamte RNA (30 μg), die aus jeder HAEC stammte, welche für 24 h mit verschiedenen Arten von Cytokinen inkubiert wurde [IL-1α (1 ng/ml), IL-1β (1 ng/ml), IL-6 (2,5 ng/ml), TNF-α (5 ng/ml) und TNF-β (1 ng/ml)] wurde mit Formamid denaturiert, electrophoretisch auf einem 1%igen Agarosegel, enthaltend 1,5 % Formaldehyd, denaturiert und auf eine Nylonmembran übertragen. Eine Sonde [pHPGIS 135 und Glyeraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)] wurden mit [α^-32P]dCTP mittels des Random-Priming-Verfahrens [Feinberg, A. P., and Vogelstein, B. (1983) Anal. Biochem. 132, 6-13] markiert.
Dann wurde eine Hybridisierung gemäß dem Verfahren, das in Biochem. Biophys. Res. Commun. 178, p 1479-1484 (1991) beschrieben ist, durchgeführt. Die Membran, die erhalten wurde, wurde mit 0,1 x SSC (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumzitrat, pH 7,0), enthaltend 0,1 % SDS, bei 60°C gewaschen, an der Luft getrocknet und eine Autoradiographie wurde durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Die Hauptbande der aus HAEC stammenden menschlichen PGIS-mRNA wurde bei ungefähr 6 kb gefunden, und es wurden 3 weitere schwächere Banden gefunden (3,2, 2,5 und 1,7 kb). Die Testergebnisse zeigten, dass die Expression der menschlichen PGIS-mRNA, die für 24 h mit IL-1α, IL-1β oder IL-6 inkubiert war, zweifach anstieg, verglichen mit der Kontrolle ohne Cytokinbehandlung. Daher wird ein Anstieg der PGI₂-Produktion, welcher durch Cytokine verursacht wird, als auf die erhöhte Expression und Produktion von PGIS zurückzuführend, angesehen, was durch Cytokine erreicht wurde. D. h., dass die Behandlung mit Cytokin eine extrem nützliche Methode zur Erhöhung der PGIS-Expression ist, und um die PGIS-Aktivität zu steigern, welche wiederum die PGI₂-Produktion beschleunigt.
Referenzbeispiel 2: In vivo-Verteilung von PGIS-mRNA
Es wurde eine RNA-Blot-Analyse durchgeführt, um die Verteilung der PGIS-mRNA-Expression im menschlichen Körper zu untersuchen. Genauer gesagt wurde ein Filter von Clone-Tech bezogen, auf dem poly (A)⁺-RNA verschiedener menschlicher Gewebe electrophoretisch aufgetrennt und geblottet wurde. hPGISl35 wurde mit ³²P durch das oben erwähnte Verfahren markiert, und einem Northern Blot Hybridisierungsverfahren unter gleichen Bedingungen wie oben unterworfen.
Die Ergebnisse sind in 12 und in 13 gezeigt. Die Ergebnisse bestätigen, dass PGIS-mRNA stark und umfassend in menschlichen Geweben exprimiert ist, insbesondere im Uterus, dem Herzen, der Skelettmuskulatur, der Lunge und der Prostata, und mit signifikanten Niveaus, obwohl schwächer, im Dünndarm, der Niere, der Leber und dem Hirn. Diese Ergebnisse stimmen mit den konventionellen Berichten der enzymatischen Aktivität und Verteilung im Gewebe bei immunologischen Reaktionen der PGIS überein, was vermuten lässt, dass zahlreiche biologische Rollen für PGIS neben der Wirkung im Gefäßsystem angenommen werden können. Die 6 kb Haupt- und stärkste Bande, und die drei schwachen Banden, die in 11 gezeigt sind, wurden in allen oben erwähnten Geweben beobachtet, obwohl die relative Stärke unter den schwachen Banden zwischen den Geweben variierte. Solche verschiedenen Arten des Vorhandenseins von Transkriptionsprodukten lässt ein mögliches unterschiedliches Splicing der mRNA oder das Vorliegen eines analogen Gens (Isozym) vermuten, wie bei der Prostaglandin-Endoperoxidase gefunden wird. Sequenzliste

Claims

DNA mit einer Nukleotidsequenz oder einer degenerierten Nukleotidsequenz davon, die für eine Aminosäuresequenz einer Prostacyclinsynthase (PGIS), wie in der Sequenzliste, Sequenz Nr. 12 wiedergegeben, codiert, zur Verwendung als medizinisches Produkt.
DNA gemäß Anspruch 1, wobei die DNA eine DNA mit einer Nukleotidsequenz von Position 28 bis 1527, wie in der Sequenzliste, Sequenz Nr. 11 wiedergegeben, umfasst, zur Verwendung als medizinisches Produkt.
Rekombinanter Vektor umfassend eine DNA gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2 zur Verwendung als medizinisches Produkt.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend die DNA gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2 oder den rekombinanten Vektor gemäß Anspruch 3 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Verwendung einer DNA mit einer Nukleotidsequenz oder einer degenerierten Nukleotidsequenz davon, die für eine die für eine Aminosäuresequenz einer Prostacyclinsynthase (PGIS), wie in der Sequenzliste, Sequenz Nr. 12 wiedergegeben, codiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Thrombose, Myokardinfarkt, Arteriosklerose und Angina pectoris.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei die DNA eine DNA mit einer Nukleotidsequenz von Position 28 bis 1527, wie in der Sequenzliste, Sequenz Nr. 11 wiedergegeben, umfasst.
Verwendung eines rekombinanten Vektors gemäß Anspruch 3 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Erkrankung, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus Thrombose, Myokardinfarkt, Arteriosklerose und Angina pectoris.