JP2005120069A - 炎症性疾患治療薬 - Google Patents

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Abstract

【課題】PGI2-PPARδ伝達系の標的遺伝子の解明、さらにPGI2-PPARδ伝達系を標的とした新規炎症性疾患治療薬を提供することである。
【解決手段】マイクロアレイ解析により、PGI2-PPARδ伝達系の標的がIL-13遺伝子であることがわかった。PGI2-PPARδ-IL-13経路と細胞接着との関連を検討した。PPARδを介するIL-13産生が、単球と内皮細胞との接着を著しく抑制することがわかった。PGI2-PPARδ-IL13経路とCOX-2との関連について検討したところ、PGI2/PPARδを介するIL-13産生がCOX-2発現を抑制することが示された。単球−内皮細胞接着やCOX-2は炎症と関連があることが知られている。PGI2-PPARδ-IL13経路を標的とした細胞接着阻害剤やCOX-2阻害剤は抗炎症性疾患薬として利用できる。
【選択図】なし

Description

本発明は、IL-13発現誘導剤、COX-2発現抑制剤、細胞接着阻害剤に関する。
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（PPARs）は、核内ホルモンスーパーファミリーに属するリガンド依存性転写因子であり、標的遺伝子の制御領域中のPPAR応答配列（peroxisome proliferetor response element ，PPRE）に結合することにより、遺伝子発現を制御している（非特許文献1,2）。PPARsは種々の組織に発現し、内皮細胞を含む血管組織にも発現する（非特許文献1,2）。哺乳類では、PPARα、PPARγ、PPARδと名付けられた３種類のPPARサブタイプが明らかになっている。これらのうち、PPARαおよびPPARγは、炎症反応、腫瘍形成、脂肪代謝経路、アテローム動脈硬化、泡沫細胞形成、プラーク安定性と関連していることがわかっている（非特許文献1，2，23-25）。それゆえ、PPARsは血管炎症疾患やアテローム硬化症の治療に対する有望な標的となっている。一方、PPARδは、脂肪酸酸化、エネルギー放散、皮膚創傷治癒、腫瘍形成、細胞運命制御のメディエーターであるとの報告がなされているが（非特許文献3-5）、PPARαやPPARγと異なり、心血管系における機能については殆ど知られていない。
プロスタグランジン類（PGs）は臨床上または生物学的過程において広範な役割を担う物質である。また、PGsがPPARsに対するリガンドの活性化に寄与しうることも知られている（非特許文献1-5）。PGsはアラキドン酸から誘導される脂質メディエーターの一群である（非特許文献6-11）。アラキドン酸はシクロオキシゲナーゼのアイソフォームであるCOX-1とCOX-2によって、プロスタグランジンH2（PGH2）に変換される。COX-2（Cyclooxygenase-2）は炎症において重要な役割を果たしており、COX-2遺伝子は、TNF-αやIL-1βといった炎症誘発性サイトカインによって上方制御される。COXの産物であるPGH2は、特異的合成酵素によって、プロスタグランジンD2やプロスタサイクリン（PGI2）を含む、数種のプロスタノイド群のうちのいずれかに変換される（非特許文献5,6,9）。PGD代謝産物である15-デオキシ-Δ12,14-プロスタグランジン J2 （15d-PGJ2）がPPARγ活性化因子であることが知られている（非特許文献1,12）。それにもかかわらず、15d-PGJ2の生理的関連は不明のままである。というのも、15d-PGJ2は、in vivoで存在することが厳密には証明されていない。一方、最近の研究によって、内因性PGI2はPPARδの天然リガンドであることが明らかにされた（非特許文献5,13）。
PGI2は、強力な血管拡張剤であり、かつ、血小板凝集に対する内因性インヒビターである。また、臨床上では、内皮の健康状態やその機能に影響を与える臨床上重要な因子である。血管内皮は、血管に連続的に横たわる細胞単層である。血管内皮は、恒常性維持や心臓血管系の幅広い病態生理学的プロセスに関与している（非特許文献22）。内皮細胞は、PGI2を含む多くの内因性ホルモン、外因性の医薬品や毒性物質、遺伝子発現や細胞機能不全へと導く、血管内皮の様々な機能変化を誘導する物質全ての作用点となっている（非特許文献17,18）。そのため、この恒常性バランスが内因性または外因性因子によって崩されると、血管内皮の機能不全となり、血管壁の慢性炎症、平滑筋細胞の増殖、泡沫細胞の形成、アテローム硬化症の発生へとつながる（非特許文献14,17,18）。それゆえ、異常なPGI2-シグナル伝達は、炎症やアテローム動脈硬化を起こした血管での障害性血管反応について、重要な役割を果たしていると考えられている（非特許文献14,17）。古典的には、PGI2はGタンパク結合受容体を介してGタンパク質と連結し、cAMPを増加させると考えられてきたが（非特許文献5,6）、他の細胞経路については殆ど知られていない。本発明者らによって、PGI2によるPPARδの活性化が、血管内皮細胞の細胞運命のPGI2依存制御において重要な役割を果たしていることを示す知見が得られている（非特許文献5）。しかしながら、PGI2-PPARδシグナル伝達系に関する分子的詳細は依然として未知のままである。
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本発明は、このような状態に鑑みてなされたものであり、PGI2-PPARδシグナル伝達系の標的遺伝子および分子機構を解明することを目的とする。さらに、PGI2-PPARδシグナル伝達系を標的とした、新たな炎症性疾患治療薬の提供を目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決するため、第一に、PGI2によって活性化されたPPARδに応答する標的の同定を試みた。マイクロアレイ解析の実施の結果、PGI2によって活性化されたPPARδの標的がIL-13遺伝子であることが、初めて明らかになった。従来、転写因子GATA-3のcAMP仲介によるリン酸化がIL-13遺伝子を制御していることが報告されてきた。しかし、本発明者らはPPARδのドミナントネガティブを用いたレポーターアッセイを実施し、PPARδのドミナントネガティブ変異体の共発現がヒト血管内皮細胞におけるIL-13遺伝子発現を抑制することを示した。また、cAMP-responsive element binding protein (CREB)を用いたレポーターアッセイを実施し、CREBのドミナントネガティブの共発現が、PGI2を介するヒトIL-13遺伝子活性化に殆どあるいは全く影響を与えないことを示した。これらの結果は、PGI2-PPARδ-IL13経路の存在を明確に示すものである。また、同時に、ヒトIL-13遺伝子プロモーターがPPREコンセンサス配列の5つのコピーを含んだ短い領域を有すること、およびこの領域はPGI2-PPARδシグナル伝達依存のIL-13発現にとって本質的なものであることも明らかにした。
上記の新規知見を受け、本発明者らは、この経路の生理学的機能を探るべく鋭意検討を行った。TNF-αが血管内皮細胞と白血球との接着を増大させるという知見がある（非特許文献21）。本発明者らは、この知見に注目し、PGI2-PPARδ経路を介して行われる標的遺伝子IL-13制御と単球‐内皮細胞接着との関連の有無を検討した。すると、PPARδを介して起こる血管内皮細胞によるIL-13産生が、TNF-αによって誘導される単球と内皮細胞との接着を著しく抑制することが明らかになった。ヒト単球の血管表面への固着性は、炎症やアテロームの病理学的過程における本質的な一段階であるとの報告がある（非特許文献28）。すなわち本発明者らは、PPARδを介するIL-13産生が単球と内皮細胞との接着を抑制するという新たな知見に基づき、PGI2-PPARδ-IL13経路を標的とする細胞接着抑制剤を作出した。この細胞接着抑制剤は、アテローム動脈硬化を含む炎症性疾患の治療用医薬品として利用できる。
さらに、PGI2-PPARδ-IL13経路とCOX-2との関連について検討を行った。COX-2は炎症の制御に関連し、COX-2の阻害が炎症を抑制することが知られている。本発明者らが、炎症誘発性サイトカインによって初代ヒト血管内皮細胞のCOX-2産生を誘導しCOX-2 mRNA測定を行ったところ、PGI2/PPARδを介するIL-13産生は炎症誘導性サイトカインによって誘導されるCOX-2発現を抑制することが新たに示された。本発明者らは、PGI2-PPARδ-IL13経路を標的とするCOX-2発現抑制剤を作出した。この発現抑制剤も、炎症性疾患の治療用医薬品として利用できる。
また本発明者らは、ヒト血管内皮細胞を用いてRNA干渉法（RNAi）を行い、TNF-α刺激応答による内因性IL-13発現に内因性PGI2産生が関与していることを明らかにした。さらに、siRNA処理によってPGI2を枯渇させたヒト血管内皮細胞へcPGIを外因性添加すると、IL-13の内因性産生を顕著に誘導することを見出した。それゆえ、cPGIは、老化血管内皮のような、PGI2欠乏細胞における血管恒常性維持を図るのに有効である可能性がある。
すなわち、本発明は、新規に見出したPGI2-PPARδ-IL-13経路の利用に関する。本発明は、具体的には以下のとおりである。
（１）PPARδ結合活性を有する物質を有効成分とするIL-13発現誘導剤、
（２）PPARδ結合活性を有する物質がプロスタサイクリン、プロスタサイクリンアナログ、またはこれらの塩である、上記（１）に記載のIL-13発現誘導剤、
（３）下記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の単離されたDNA又は該DNAが挿入されたベクターを含むIL-13発現誘導剤
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号２に記載する配列からなるDNA
（ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたDNA
（ｄ）配列番号２に記載の配列とストリンジェントな条件においてハイブリダイズするDNA、
（４）IL-13発現誘導剤を有効成分とするCOX-2発現抑制剤、
（５）下記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の単離されたDNA又は該DNAが挿入されたベクターを含むCOX-2発現抑制剤
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号４に記載する配列からなるDNA
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたDNA
（ｄ）配列番号４に記載の配列とストリンジェントな条件においてハイブリダイズするDNA、
（６）下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の単離されたタンパク質を有効成分とするCOX-2発現抑制剤
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に記載する配列とストリンジェントな条件においてハイブリダイズするDNAによってコードされたタンパク質、
（７）IL-13発現誘導剤を有効成分とする細胞接着阻害剤、
（８）下記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の単離されたDNA又は該DNAが挿入されたベクターを含む細胞接着阻害剤
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸からなるタンパク質をコードするDNA
（ｂ）配列番号４に記載する配列からなるDNA
（ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたDNA
（ｄ）配列番号４に記載の配列とストリンジェントな条件においてハイブリダイズするDNA、
（９）下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の単離されたタンパク質を有効成分とする細胞接着阻害剤
（ａ）配列番号３に記載のアミノ酸からなるタンパク質
（ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
（ｃ）配列番号４に記載する配列とストリンジェントな条件においてハイブリダイズするDNAによってコードされたタンパク質、
（１０）下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含む、炎症性疾患の治療または予防用医薬品
（ａ）上記（１）から上記（３）のいずれかに記載のIL-13発現誘導剤
（ｂ）上記（４）から上記（６）のいずれかに記載のCOX-2発現抑制剤
（ｃ）上記（７）から上記（９）のいずれかに記載の細胞接着阻害剤、
（１１）上記（１）から上記（３）に記載のIL-13発現誘導剤を投与することによりL-13発現を誘導する方法、
（１２）被験物質をPPARδと接触させる工程を含む、IL-13発現誘導剤のスクリーニング方法、
（１３）患者から採取した試料を基に、IL-13プロモーター配列中の配列番号５,配列番号６, 配列番号７,配列番号８,または／および配列番号９に記載した配列を検出する工程を含む、上記（１０）に記載の炎症性疾患の治療または予防医薬品の有効性を個々の患者について判定する方法。
本発明により、新規のIL-13発現誘導剤、COX-2発現抑制剤、細胞接着阻害剤が提供された。これらは炎症性疾患の新たな治療用医薬品となり得る。
本発明は、新規なIL-13発現誘導剤を提供する。本発明は、上述のとおり、本発明者によってPGI2がPPARδに結合しIL-13発現を誘導することが見出され、さらにPGI2-PPARδ-IL-13経路の機能について分子生物学的に実証されたことに基づく。
本発明のIL-13発現誘導剤として、「PPARδ結合活性を有する物質を有効成分とするIL-13発現誘導剤」を挙げることができる。「PPARδ結合活性を有する物質を有効成分とするIL-13発現誘導剤」とは、PPARδ結合活性を有する物質そのものをそのままIL-13発現誘導剤とする場合を含む。本発明者らは、PPARδリガンドであるPGI2のシグナルをPPARδが受けると、IL-13プロモーター領域中のPPREコンセンサス配列との結合を介してIL-13内因性産生が誘導されることを実証した。したがって、PGI2を初めとして、PPARδ結合活性がある物質はIL-13発現誘導目的に使用可能である。
このようなIL-13発現誘導目的で使用し得るPPARδ結合活性を有する物質の好適な例として、プロスタサイクリン（prostacyclin, epoprostenol, PGI2）、プロスタサイクリンアナログ、またはこれらの塩を挙げることができる。プロスタサイクリンアナログは、細胞透過性であることが望ましい。プロスタサイクリンアナログの具体例として、カルバサイクリン（Carbacyclin, Carbaprostacyclin, cPGI）, Beraprost, Taprostene, Nileprost, OP-2507, Iloprost, Cicaprost, Ciprostene, Treprostinil, Bonsentanを挙げることができる。PPARδ結合IL-13発現誘導剤として、より好適な例は、プロスタサイクリン、カルバサイクリンである。また、PPARδ結合活性が知られている物質の他の例として、PPARδアゴニストであるGW501516， L-165041, L-165461, L-783483, L-796449を挙げることができる（非特許文献38、39）。上記化合物の構造式を下記の化１から化５に示す。
このようなPPARδアゴニストも、IL-13産生誘導効果を有する限り、本発明の「PPARδ結合活性を有する物質を有効成分とするIL-13発現誘導剤」に相当する。
本発明のIL-13発現誘導剤の調製にあたり、プロスタサイクリン（EMD Bioscience）、カルバサイクリン（EMD Bioscience）、ベラプラストナトリウム（商品名：トルナー、プロサイリン）等、一般に市販品が入手可能なものは市販のものを使用してもよい。
IL-13発現誘導剤の調製として、被験物質をPPARδと接触させる工程を含むスクリーニング方法を用いることができる。このスクリーニング方法は、PPARδ結合活性を利用する。上記スクリーニング方法は、各種公知の方法によることができる。例えば、調製しようとする本発明物質がタンパク質であれば、ウエストウエスタン法、ツーハイブリッド法や免疫沈降法などの公知方法によって、候補物質群の中から、PPARδと結合するタンパク質をスクリーニングすることができる。また、表面プラズモン共鳴（SPR)により分子相互作用を解析する装置（例としてBIACORE）を利用してスクリーニングすることもできる。
さらに調製しようとする本発明物質が低分子であれば、例えば、コンビナトリアルケミストリーによって作られたライブラリーの低分子物質を公知方法によってハイスループットスクリーニングすることにより、調製することができる（Wrighton NC; Farrell FX; Chang R; Kashyap AK; Barbone FP; Mulcahy LS;Johnson DL; Barrett RW; Jolliffe LK; Dower WJ., Small peptides as potent mimetics of the protein hormone erythropoietin, Science (UNITED STATES) Jul 26 1996, 273 p458-64、Verdine GL., The combinatorial chemistry of nature. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996, 384 p11-13、Hogan JC Jr.,Directed combinatorial chemistry. Nature (ENGLAND) Nov 7 1996,384 p17-9）。ハイスループットスクリーニングは、市販のシンチレーションプロキシミティアッセイ法（scintillation proximity assay; SPA）を利用したシステム（例として、LEADseeker，Amersham Pharmacia Biotech）を用いることもできる。
上記のようにスクリーニングされたPPARδ結合活性を有する物質の中から、さらにIL-13発現誘導能を有する物質を選択し、本発明のIL-13発現誘導剤とすることができる。IL-13誘導能は、実施例のように、ヒト血管内皮細胞を被験物質存在下で培養し、IL-13産生量をELISA法等によって測定することで判断できる。
また、本発明は新規IL-13発現誘導剤として、単離されたプロスタサイクリン合成酵素遺伝子および該遺伝子を挿入したベクターを含むIL-13発現誘導剤を提供する。プロスタサイクリン合成酵素遺伝子として、具体的には、配列番号２に記載する配列からなるDNA、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNAを挙げることができる。プロスタサイクリン合成酵素は、プロスタグランジンH2（PGH2）からプロスタサイクリン（PGI2）を産生する反応を触媒する。プロスタサイクリン合成酵素遺伝子を直接またはベクターとして細胞に導入すれば、プロスタサイクリン合成酵素が産生される。産生されたプロスタサイクリン合成酵素は、プロスタサイクリンの内因性産生を誘導または上方制御する。産生誘導されたプロスタサイクリンは、PGI2-PPARδ-IL-13経路を介してIL-13の産生を誘導する。すなわち、プロスタサイクリン合成酵素遺伝子は、プロスタサイクリンおよびPPARδを介してIL-13発現を誘導することができる。
本明細書において「単離した」とは、物質が本来の環境（たとえば自然に発生する物質であればその自然環境）から取り出されたことをいい、物質の環境状態が人為的に変えられたことを意味する。また「単離」とは、対象化合物が実質的に富む試料中に存在する化合物および／または対象化合物が部分的または実質的に精製されている試料中に存在する化合物を含むことを意味する。ここで「実質的に精製した」という用語は、その天然の環境から切り離されて、天然に関連している他の成分を少なくとも60％、好ましくは75％、および最も好ましくは90％含まないことを指す。
プロスタサイクリン合成酵素遺伝子は当業者に周知の各種方法によって調製することができる。例えば、配列番号２に記載された配列の一部をプローブとし、当業者に周知のハイブリダイゼーション技術によって、プロスタサイクリン合成酵素が発現している細胞、例えば血管内皮細胞のcDNAから調製することができる。また、配列番号２に記載の配列の一部をプライマーとし、mRNAからRT-PCRを実施して得ることもができる。あるいは、市販のDNA合成機を用いて、人工的に合成してもよい。
さらに、上記DNAに類似するDNAもまた、本発明の新規IL-13発現誘導剤の一例である。該類似するDNAとして、配列番号２に記載の配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNAであって、PGH2からPGI2を産生する反応を触媒し得るタンパク質をコードしたDNAを挙げることができる。
該類似するDNAを調製するには、上記配列番号２に記載された塩基配列の一部をプローブとし、ヒトや、ヒト以外の脊椎動物の細胞等からストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする方法を挙げることができる。
上記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、適宜選択することができる。一例を示せば、25％ホルムアミド、より厳しい条件では50％ホルムアミド、4×SSC、50mM Hepes pH7.0、10×デンハルト溶液、20μg/ml変性サケ精子DNAを含むハイブリダイゼーション溶液中、42℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行った後、標識したプローブを添加し、42℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行う。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は、「1xSSC、0.1% SDS、37℃」程度で、より厳しい条件としては「0.5xSSC、0.1% SDS、42℃」程度で、さらに厳しい条件としては「0.2xSSC、0.1% SDS、65℃」程度で実施することができる。このようにハイブリダイゼーションの洗浄の条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAの単離を期待しうる。但し、上記SSC、SDSおよび温度の条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記若しくは他の要素（例えば、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間など）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
このようなハイブリダイゼーション技術を利用して単離されるDNAがコードするポリペプチドは、通常、プロスタサイクリン合成酵素とアミノ酸配列において高い相同性を有する。高い相同性とは、少なくとも40％以上、好ましくは60％以上、さらに好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上、さらに好ましくは少なくとも95％以上、さらに好ましくは少なくとも97％以上（例えば、98から99％）の配列の相同性を指す。アミノ酸配列の同一性は、例えば、Karlin and Altschul によるアルゴリズムBLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993)によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえば score = 50、wordlength = 3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
上記配列番号２に類似するDNAの調製は、別の公知手段によることも可能である。例えば、エキソヌクレアーゼを用いるdeletion mutant作製法、カセット変異法等のsite-directed mutagenesisによってプロスタサイクリン合成酵素DNAを人為的に改変させ、調製することができる。
上述した各DNAを使用するときは、適当なベクターに挿入して用いることができる。ベクターに挿入したものも、本発明の新規IL-13発現誘導剤の別の態様の一つである。使用するベクターは、目的に応じて適当な発現ベクターを選択することができる。具体的には、哺乳動物由来のベクター（例えば、pcDNA3 (インビトロジェン社製)や、pEGF-BOS (Nucleic Acids. Res., 18(17), p.5322, 1990)、pEF 、pCDM8、pCXN、昆虫細胞由来のベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（インビトロジェン社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来のベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来のベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来のベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロジェン社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来のベクター（例えば、pPL608、pKTH50）、大腸菌ベクター（M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script）、などが挙げることができる。本発明においては、哺乳動物細胞内で発現可能なベクターを用いることが好ましく、又、発現ベクターを用いることが好ましい。ベクターを細胞へ導入するには、例えば、リン酸カルシウム法(Virology, Vol.52, p.456, 1973)、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製）を用いた方法、エレクトロポレーション法(Nucleic Acids Res., Vol.15, p.1311, 1987) 、リポフェクション法(J. Clin. Biochem. Nutr., Vol.7, p.175, 1989)、ウィルスにより感染導入方法(Sci.Am., p.34, 1994) 、パーティクルガンなどから選択することにより行うことができる。
上述した本発明の新規IL-13発現誘導剤は、PGI2-PPARδ-IL-13経路を介してIL-13遺伝子の発現を誘導する。したがって、本発明のIL-13発現誘導剤は、PGI2-PPARδ-IL-13経路の生体内機能解明に関する学術・研究目的に使用できる。また、IL-13が制御する生体現象をIL-13の上流から制御する目的で、in vitroまたはin vivoで広く使用することもできる。さらに、本発明IL-13発現誘導剤は、下記に詳述するCOX-2発現抑制剤、細胞接着阻害剤、炎症性疾患治療または予防用医薬品として使用することができる。これは、本発明の新規IL-13発現誘導剤が、PGI2-PPARδ-IL-13経路を介してCOX-2発現抑制作用および単球-内皮接着阻害作用を有することが確認されたことに基づく。本発明のIL-13発現誘導剤のその他の用途としては、老化血管内皮のような、PGI2欠乏細胞における血管恒常性維持を図り、炎症性疾患を予防する目的で使用できる可能性がある。
上記IL-13発現誘導剤のうち、プロスタサイクリン合成酵素遺伝子、類似遺伝子および該遺伝子を挿入したベクターを含むIL-13発現誘導剤を治療目的で使用する方法として、遺伝子治療を一例として挙げることができる。IL-13発現誘導剤を用いる遺伝子治療は、プロスタサイクリン合成酵素遺伝子の異状を補正することを目的に、炎症性疾患の要因を有する患者等の細胞に外部から正常な遺伝子を導入し、細胞の表現型を変化させることにより、炎症性疾患の治療を行う方法である。遺伝子治療は、生体に直接遺伝子を導入し、細胞に遺伝子を組み込む方法（in vivo法）と、患者の細胞を採取し、体外で細胞に遺伝子を導入した後、該細胞を再度、患者に移植する方法(ex vivo法)に分けられる。in vivo法遺伝子治療の場合、上記IL-13発現誘導剤等をそのままあるいはベクターに挿入し、筋肉注射、局所注射、塗布、吸入等の投与方法により生体へ導入することが可能と考えられる。
本発明は、新規なCOX-2発現抑制剤を提供する。有効成分の具体例として、IL-13発現誘導剤、IL-13遺伝子、IL-13類似遺伝子およびこれら遺伝子が挿入されたベクター、IL-13タンパク質を挙げることができる。本発明者らは、本発明のIL-13発現誘導剤がPGI2-PPARδ-IL-13経路を介してCOX-2発現を抑制することを実証した。さらに、本発明者らは、上述のIL-13発現誘導剤によるCOX-2発現抑制効果が、抗IL-13抗体によって著しく減少することを確認した。この結果は、IL-13タンパク質がCOX-2発現抑制効果に本質的に関与していることを示す。またこのことから、上述した本発明のIL-13発現誘導剤に限らず、IL-13の産生を誘導する物質は全般的に、COX-2発現抑制効果を期待できる。このように、IL-13発現誘導剤、IL-13タンパク質等は、COX-2発現抑制剤となり得る。
本発明のCOX-2発現抑制剤は、種々の公知方法で調製することができる。例えば、IL-13タンパク質であれば、IL-13発現細胞から抗IL-13抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィによって精製することができる。また市販されているIL-13をCOX-2発現抑制剤としてもよい。IL-13遺伝子は、配列番号４に記載の配列の一部をプローブとし、上述のプロスタサイクリン合成酵素について述べた方法と同様にして調製することができる。類似遺伝子の調製は、配列番号４に記載の配列の一部をプローブとし、ヒトやヒト以外の脊椎動物の細胞等からストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする方法等によることができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、上述プロスタサイクリン合成酵素について述べたとおりである。また、カセット変異法などの他の公知方法によって調製してもよい。ベクターの調製、IL-13発現誘導剤の調製は上述のとおりである。これらをそのまま、あるいは賦形剤等の適当な添加剤とともにCOX-2発現抑制剤とすることができる。
COX-2は炎症を促進する物質である。COX-2阻害による炎症抑制は周知であり、多くのCOX-2阻害剤がNSAIDsと呼ばれる抗炎症剤として広く使用されている。従来のNSAIDs はCOX-1とCOX-2の両方を阻害するが、celecoxibやrofecoxib 等の選択的COX-2阻害剤も臨床上で抗炎症剤として使用されている。本発明のCOX-2発現抑制剤は、既存のCOX-2阻害剤と同様に、ヒトやその他動物における炎症性疾患の治療または予防のための医薬品として利用することができる。本発明における炎症性疾患とは、炎症症状を呈する疾患の総称である。関節リウマチ、リウマチ様脊椎炎、変形性関節炎、痛風性関節炎、炎症性腸疾患、クローン病、ギランバレー症候群、強皮症、繊維症、皮膚炎、乾癬、血管性浮腫、湿疹様皮膚炎、高増殖性皮膚疾患（hyperproliferative skin disease）、皮膚の炎症状態（inflammatory skin condition）、糸球体腎炎、腎炎、血管炎症、アテローム動脈硬化症、脈管炎、静脈炎、動脈炎、大動脈炎、PTCA後再狭窄、バイパス手術後再狭窄、移植拒絶反応（同種腎臓移植拒絶、同種心臓移植拒絶、これらに伴う脈管障害等）、アナフィラキシー、敗血症、血栓症、虚血／再灌流傷害、自己免疫疾患は、本発明における炎症性疾患に含まれる。これら疾患に限らず、炎症症状を呈する疾患であれば本発明における炎症性疾患に含まれる。本発明における炎症性疾患として、好ましいのは血管の炎症性疾患、腸の炎症性疾患、アテローム動脈硬化症である。
COX-2については、上記炎症性疾患関与のほかに、ポリープ形成に重要な役割を果たしていること（Oshima et al., Cell 87:803-809 (1996)）が報告されている。また、COX-2活性化が腫瘍組織内の血管形成を促進していることも明らかになっている。米国では、COX-2阻害剤のcelecoxibは、大腸ポリープ症への適応が認められている。これら知見から、本発明のCOX-2発現抑制剤は、癌や家族性大腸ポリープ症（家族性大腸ポリポーシス, familial adenomatous polyposis, FAP）の治療に応用し得る。
プロスタサイクリン合成酵素遺伝子やIL-13遺伝子を利用したCOX-2発現抑制剤を治療目的で使用する方法として、遺伝子治療の方法をとることができる。遺伝子治療については、上述の説明のとおりである。
また本発明は、新規な細胞接着阻害剤を提供する。本明細書における接着は、接着と粘着の両概念を含む。本明細書では簡潔にするため、接着と記載する。また同様に、本明細書における接着性は、接着性と粘着性の両概念を含む。本発明の細胞接着阻害剤による接着阻害は、細胞の種類を問わないが、好ましくは、白血球-血管内皮細胞間、より好ましくは、単球-血管内皮細胞間の接着阻害である。有効成分の具体例として、IL-13発現誘導剤、IL-13遺伝子および該遺伝子が挿入されたベクター、IL-13タンパク質を挙げることができる。本発明者らは、cPGI、IL-13が単球系白血球と血管内皮細胞の接着を阻害することを、初めて具体的に示した。したがって、IL-13発現誘導剤、IL-13遺伝子および該遺伝子が挿入されたベクター、IL-13タンパク質は細胞接着阻害剤となり得る。IL-13の細胞接着阻害効果が実証されていることから、PGI2-PPARδ-IL-13経路を介さないでIL-13発現誘導効果を発揮する物質も、IL-13発現誘導剤である細胞接着阻害剤として、本発明に含まれる。
本発明の細胞接着阻害剤を調製する方法は、COX-2発現抑制剤について記載したとおりである。
本発明の細胞接着阻害剤は、炎症や動脈硬化で観察される細胞接着現象を制御できるため、これら疾患および血管医学についての分子医学的研究に有用である。また、血管の細胞と血管内皮の接着は動脈硬化等の際に観察される現象の一つである。これを防止する本発明の細胞接着阻害剤は、遺伝子治療等により、ヒトやその他動物における炎症性疾患の治療用医薬品として利用することができる。
本発明のIL-13発現誘導剤、COX-2発現抑制剤、細胞接着阻害剤を医薬品として用いる場合は、適宜製剤化することができる。製剤化にあたっては、例えば、薬理学上許容される媒体や、安定剤などと組み合わせて製剤とすることができる。また、投与経路や投与量、投与方法は、治療目的や治療対象に合わせて適切なものを選択することができる。
本発明は、本発明の新規IL-13発現誘導剤を投与することによりIL-13発現を誘導する方法を提供する。本方法は、PGI2-PPARδ-IL-13経路の機能究明等を目的とする研究・学術方法として使用できる。また、静脈内投与や遺伝子治療等の方法をとることにより、ヒト及び／またはその他の動物の炎症性疾患の治療方法として使用可能である。
さらに本発明は、患者から採取した試料を基に、上記炎症性疾患治療用医薬品の有効性を判断する方法を提供する。本発明の方法は、IL-13プロモーター配列中の配列番号５,配列番号６, 配列番号７,配列番号８,または／および配列番号９に記載した配列を検出する工程を含む。実施例に記載するとおり、本発明者らは、PGI2-PPARδ-IL-13経路を介したIL-13発現において、IL-13プロモーター領域に配列番号５から配列番号９に記載した 5つのPPREコンセンサス配列を含む領域が必須であることを発見した。該PPREコンセンサス配列を配列番号５から配列番号９に、また該コンセンサス配列を含む領域を図2A、図2Bに示す。IL-13プロモーター領域の該PPREコンセンサス配列を欠いている患者に対して上記医薬品を投与しても、IL-13の内因性産生を誘導できず、該医薬品の期待する効果を得ることができない。個々の患者について、IL-13プロモーター領域中の該PPREコンセンサス配列の有無を確認し、該PPREコンセンサス配列が存在する患者にのみ上記医薬品を投与すれば、無駄な治療を行うことなく、いわゆるテーラーメード治療を施すことが可能となる。
本発明の方法の一例を説明する。まず、個々の患者から試料を採取する。採取する試料として、血液、毛髪、組織などを挙げることができる。患者試料から当業者に公知の方法によってゲノムDNAを調製する。さらに、公知IL-13プロモーター領域の一部をプローブとして、IL-13プロモーター領域を含むDNAを調製する。このとき、転写開始点の上流-288から-407塩基の範囲が含まれるように調製する。このように調整した被験試料について、配列番号A,B,C,Dまたは／およびEの一部または全部をプローブとして、サザンハイブリッド法を行い、PPREコンセンサス配列を検出する。または、配列番号A,B,C,Dまたは／およびEの一部をプライマーとして、PCR法等の核酸増幅によりPPREコンセンサス配列を検出する。PPREコンセンサス配列が検出された患者は、上記炎症性疾患治療用医薬品の投与が有効であると判断できる。PPREコンセンサス配列が検出されない患者は、上記炎症性疾患治療用医薬品によるIL-13産生誘導ができないため、上記炎症性疾患治療用医薬品の効果がないと判断できる。
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
（実施例１）プロスタサイクリン-PPARδ-IL-13経路の発見
細胞内PGI2-PPARδシグナル伝達系の下流メディエーターを同定するため、細胞内PGI2を発現するヒト細胞について、cDNA マイクロアレイ解析を実施した。発明者らによる以前の報告にしたがい（非特許文献5）、野生型PGIS（PGISwt）用発現ベクターでトランスフェクトしたヒト胎生期腎細胞HEK-293を用い、細胞内PGI2の内因性発現を起こした。同様にして、不活化変異体 PGIS（PGISC441A）を発現させ、対照とした。
PGISwt用発現ベクターとしてpCMV/PGISWT （非特許文献19）を、PGISC441A用発現ベクターとしてpCMV/PGISC441A （非特許文献19）を用いた。HEK-293 細胞（1.2 x 104 cells/cm2）にこれら発現ベクターのいずれかをLipofectAMINE (Invitrogen)を用いてトランスフェクトし、該細胞を10％ FBS、2mM L-グルタミン、100 U/ml ペニシリン、100mg/mlストレプトマイシンを含むDMEM（Gibco-Invitrogen (Gaithersburg, MD)）中で36時間保持した。Poly(A+) mRNA（1.5μg）は、Isogen（ニッポンジーン）とOligotex-dT30 super mRNA purification kit （タカラバイオ)を用いて3 x 106細胞から調製した。サンプルは、9,182 human cDNA クローンを含む遺伝子発現マイクロアレイ（GEM）DNAチップを用いて解析した(HUMAN UniGEM V Ver2.0, IncyteGenomics, Palo Alto, CA)。Poly(A+) mRNA からCy3- またはCy5- 標識デオキシヌクレオチド3リン酸(dNTPs)が取り込まれたcDNAを調製する作業、ガラス上アレイへのハイブリダイゼーション、品質管理、及び標準化は、IncyteGenomicsに委託した。全てのデータ解析は、２つのアッセイのaverage fold changeを用いて行った。データは、PGISwt 対 PGISC441A比として表記した。
結果（HEK-293細胞においてPGISにより産生される細胞内PGI2によって顕著に上方制御される遺伝子の代表例）を表１に示す。細胞内PGI2を顕著に産生している細胞内では、IL-13遺伝子が数倍にも上方制御されていることが明らかになった。
PGI2によるIL-13の発現制御効果が、心臓血管系由来の細胞においても、上述の細胞と同様に観察できるかどうかを確認するため、ヒト培養臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）をカルバプロスタサイクリン（Carbaprostacyclin：cPGI）で処理し、特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、細胞から抽出したIL-13 ｍRNAについてRT-PCRを実施した。cPGIは、膜透過性の性質を持つ、PGI2の安定アナログである。
ヒト培養臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）およびヒト大動脈内皮細胞(HAEC)はクラボウ（東京,日本）から入手し、供給元の説明書にしたがって、2％のFBSと成長因子混合物を含むEGM-2成長培地で培養した。EGM-2成長培地及び成長因子混合物は、三光純薬（東京,日本）の製品を使用した。上記細胞からのトータルRNA調製は、Isogen （Nippon Gene, 東京, 日本）に依頼した。cPGIはCayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI)から購入した。IL-13トータルRNAは、ヒト血管内皮細胞HUVEC（1.2 x 104 cells/cm2）をcPGI（10μM）で12時間刺激し、刺激した上記細胞からIsogen (ニッポンジーン)を用いて調製した。トータルRNA（0.5μg）はSuperScript RT-PCR システム （Invitrogen）による解析を行うのに用いた。上記解析は、製造業者の方法によって実施した。プライマーは、ヒトIL-13用として、IL-13センス(5'-GACTGCAGTCCTGGCTCTTGC-3')、IL-13アンチセンス（5'-TGAGTCCACAGCTGAGATGCC-3'）を、ヒトβ-アクチン用として、β-アクチンセンス（5'-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA-3'）、β-アクチン アンチセンス （5'-CGGTTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG-3'; アンチセンス）の各オリゴヌクレオチドプライマーを用いた。それぞれのPCRを行うのに、50μlの反応液あたり1μlのDNAを用いた。β-アクチンについて行ったRT-PCR（25サイクル）は、mRNA存在比に対する内部標準として用いた。IL-13について行ったRT-PCRのサイクル数は25から45の範囲であった。各遺伝子に対するRT-PCR効率はプラトーではなく、サイクル数は最小に維持された。サンプルをゲル電気泳動で解析し、ゲルをエチジウムブロマイドで染色してバンドを得た。サンプルは、相当するβ-アクチンの発現に基づいて標準化した。
結果を図１Aに示す。初代培養HUVECをcPGI処理することにより、明らかなIL-13ｍRNA発現の誘導が観察された。これらの結果は、上記処理を受けた細胞においてIL-13遺伝子の発現が誘導されたことを示す。
また、cPGI処理によるIL-13発現誘導をタンパク質レベルでも確認した。HUVEC(1.2 x 104 cells/cm2)をcPGI（0,1,10,100μM）で24時間処理し、培地中のIL-13タンパク質を測定した。IL-13量は、ヒトIL-13 ELISA システム（Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK）を用いて測定した。図1Bに示すように、IL-13 を検出することができた。
さらに、ヒト血管内皮細胞(1.2 x 104 cells/cm2)に、3コピーのPPREを含むルシフェラーゼレポーターベクター(PPREx3-Luc)をトランスフェクトし、cPGI（0,1,10,100μM）を添加して、2％FBSを含むEGM-2中で培養した。24時間後にルシフェラーゼ活性を測定したところ、含PPREレポーターベクターのルシフェラーゼ活性のcPGI依存活性化とIL-13タンパク質産生との間には、用量依存的相関関係が観察された（図1B、図C）。初代培養されたヒト大動脈内皮細胞(HAEC)を同じ条件下でcPGI処理したときも、同様の結果が得られた（データ非提示）。
今回得られた上記知見を受け、PGI2依存IL-13誘導メカニズムの分子的機序の解明を試みた。ヒトIL-13遺伝子のプロモーター領域をPPREコンセンサス配列に探したところ、-407,-351,-336,-325,-300の位置にある5つのPPREコンセンサス配列が明らかになった（図2A）。そこで、HUVECにIL-13プロモーター領域を含むルシフェラーゼ（Luc）レポーターベクターをトランスフェクトしてcPGI（10μM）存在または非存在下で培養し、ルシフェラーゼ活性測定を行った。
PPRE及びGATA配列を含むヒトIL-13遺伝子プロモーター配列は、ヒト白血球のゲノムDNAからPCR法によって単離した。1,366bpフラグメントの単離には、プライマーA （5'-CAGAGAGGGTGGGAATGACG-3'; センス）及びプライマーD （5'-GTGCCAACAGGATTGAGGAGCGGA-3'; アンチセンス）、413bpフラグメントの単離には、プライマーB （5'-GTCGGGATTTTATGAATGAA -3'; センス）及びプライマーDを用いた。286bpフラグメントは、プライマーC （5'-AGGCAAGTGAGAGCAATGAC-3'; センス）及びプライマーDを用いて単離した。この286bpのフラグメントは、PPRE配列を欠いている。各フラグメントをpGL3-プロモーターベクター（Promega, Madison, WI）のMluI-XbaIサイトに挿入し、IL-13-ルシフェラーゼ レポーターベクターを構築した。IL-13プロモーター領域の1,366bp、413bpまたは286bpを含むルシフェラーゼ（Luc）レポーターベクターをHUVEC(1.2 x 104 cells/cm2)にトランスフェクトし、cPGI（10μM）存在または非存在下で培養した。24時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。
結果を図2Bに示す。cPGI 処理によりルシフェラーゼ活性は著しく増加した。逆に、PPREコンセンサス配列を除去したベクターのルシフェラーゼ活性は、cPGIによって増加しなかった。ヒトIL-13遺伝子発現の制御において-108から-44までのGATA配列が重要であること、cAMPはp38活性化およびGATAタンパク質リン酸化を通じてIL-13遺伝子発現を増加していることが報告されている（非特許文献19）。しかしながら、PPREsを伴わないGATA配列を含むレポーターベクターのルシフェラーゼ活性は、本発明者らの実験では、cPGIによって非常に弱い増加を示したに過ぎなかった（図2B）。
次に、cPGI処理によるIL-13発現誘導にPPARδが関与しているかどうかについて検討した。ヒト血管内皮細胞（1.2 x 104 cells/cm2）に、413bpのIL-13プロモーター配列を含むIL-13-ルシフェラーゼ レポーターベクター 0.2μg、β-ガラクトシダーゼ発現ベクター 0.1μg、野生型 PPARδwt,ドミナントネガティブ変異体 PPARδdn,野生型 CREBwt（CREB ： cAMP-responsive element binding protein）,ドミナントネガティブ変異体CREBdnいずれかの発現ベクター またはmockベクター 0.7μgを、TransIT LT-1 (PanVera Co., Madison, WI) を用いてコトランスフェクトした。PPARδwt、PPARδdn （非特許文献5）、CREBwt、及びCREBdnを発現させるためのベクターは、pcDNAPPARδwt（非特許文献5）、pcDNAPPARδL431A/G434A（非特許文献5）、pCMVCREB (Clontech, Palo Alto, CA) 及びpCMVCREB133 (Clontech) をそれぞれ用いた。トランスフェクションから17時間後に、2%FBSを含む新鮮なEGM-2で細胞をインキュベートした。さらに24時間後、細胞をPBSで洗浄し、10μMのcPGIと共に2%FBSを含むEGF-2中で24時間培養した。ルシフェラーゼ活性及びβ-ガラクトシダーゼ活性を既報（非特許文献５）にしたがって定量し、抽出物のルシフェラーゼ活性をβ-ガラクトシダーゼ活性にあわせて標準化した。
結果を図3に示す。ドミナントネガティブPPARδ（PPARδdn）のコトランスフェクションは、IL-13遺伝子のPPREコンセンサス配列を含むレポーターベクターに由来するルシフェラーゼ活性が、cPGI依存的に増加することを抑制した。一方、ドミナントネガティブCREB（CREBdn）の共発現は、同一条件下において、cPGI依存的なレポーターベクターのルシフェラーゼ活性に対し、何ら効果を示さなかった。これらのデータは、PGI2関与のIL-13タンパク質誘導およびヒトIL-13遺伝子発現は、PPARδ活性化に依存すること、及びヒトIL-13遺伝子は、ヒト血管内皮細胞においてPGI2-PPARδシグナル伝達系の標的であることを示している。
（実施例２）PPARδ依存IL-13分泌によるヒト血管内皮細胞と単球白血球U937細胞の接着阻害
炎症性サイトカインTNF-αが血管内皮細胞において、PGI2の内因性産生を誘導することが知られている。そこで、TNF-αを用いてPGI2産生を誘導し、PGI2によって活性化された後のPGI2-PPARδ-IL-13経路の生理学的機能について検討した。
HUVEC(1.2 x 104 cells/cm2)をヒトTNF-α添加または非添加（0,0.1,1,10ng/ml）で、37℃、24時間培養した。インキュベーションした培地を回収し、PGI2産生を観察した。PGI2量は、6-keto-PGF1αELISA kit (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI) を用い、製造業者の方法にしたがって、PGI2の安定代謝物である6-keto-PGF11α量として測定した。結果を図4A に示す。HUVECをTNF-αで処理すると、PGI2内因性産生は著しく誘導されることが示された。
また、ヒト血管内皮細胞(1.2 x 104 cells/cm2)の単層に、3コピーのPPREを含むルシフェラーゼレポーターベクター（PPRE x3-Luc)をトランスフェクトし、37℃、24時間培養した。細胞をTNF-α（0,0.1,1,10ng/ml）およびcPGI（0,2,10μM）で24時間処理した後、レポーターベクターのルシフェラーゼ活性を測定した。結果を図4B に示す。PPREを含むレポーターベクターの相対的ルシフェラーゼ活性は、TNF-α処理により増大した。
また、ヒト血管内皮細胞単層(1.2 x 104 cells/cm2)をTNF-α（0,0.1,1,10ng/ml）およびcPGI（0,2,10μM）でインキュベートした後、該細胞のIL-13産生を測定した。IL-13量は、ヒトIL-13 ELISA システム（Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK）を用いて測定した。IL-13産生もまた、TNF-α処理により増大した（図4C）。cPGIの外因性添加により、ルシフェラーゼ活性及びIL-13産生は用量依存的に増強された（図4B,C）。
次に、PGI2-PPARδ-IL-13経路の生理学的機能について具体的検討を行った。TNF-αが血管内皮細胞と白血球との接着を増大させることが知られている（非特許文献21）。そこで、HUVECと白血球細胞を用いて接着アッセイを行い、血管内皮細胞と白血球との接着におけるIL-13の関与について検討した。
HUVEC (2.5 x 104 cells/cm2)を12穴プレートで24時間培養し、コンフルエントな単層をTNF-α（0または10ng/ml）、cPGI（0または10μM）、組換えヒトIL-13（0または10ng/ml）を含むEGM-2中で、抗IL-13抗体（0または0.5μg/ml）と共に、37℃、24時間、プレインキュベートした。ヒト単球系白血球細胞U937細胞を、10％FBS、100 U/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン、RPMI1640(Gibco-Invitrogen)を含む、RPMI 1640 (Gibco-Invitrogen)で培養し、2.5μM カルセイン-AM (Molecular Probes, Eugene, OR)で、室温において45分標識した後、洗浄し、血清フリーEGM-2中に再懸濁した。カルセイン標識U937細胞(8 x 104 cells/well)を前処理した内皮細胞に添加し、cPGI (0,10μM)、組換えIL-13(0,10ng/ml)、抗IL-13モノクローナル抗体（0,0.5μg/ml）と共にインキュベートした。U937細胞は、37℃、30分の条件下、前処理した内皮細胞と接着可能状態に置かれた。接着の評価には、蛍光イメージアナライザー（FLA-2000；富士フィルム、東京、日本）を使用した。洗浄の前後に全細胞または接着細胞を対象として、プレートをそれぞれスキャンし、相対的接着を計算した。
TNF-αでHUVECを処理すると、ヒト単核系白血球U937細胞と内皮細胞との間で接着が増加することが観察された（図4D、レーン1,2）。興味深いことに、TNF-αと抗IL-13抗体で処理すると、単球系白血球と内皮細胞との接着が著しく増強された（図4D、レーン3）。反対に、外部からcPGIまたはIL-13を添加すると、接着は阻害された（図4D,レーン4,5）。
また、12wellプレート中のヒト血管内皮細胞のコンフルエントな単層をTNF-α（0または10ng/ml）およびcPGI（0または10μM）、抗IL-13モノクローナル抗体存在（0.5μg/ml）または非存在下、37℃で0時間から24時間、プレインキュベートした。ヒト単球系白血球U937細胞(8 x 104cells/well in 12-well plates)を、2.5μMカルセイン-AMを用いて45分室温で標識し、前処理した内皮細胞に添加し、cPGI（0,10μM）および抗IL-13モノクローナル抗体（0,0.5μg/ml）を用いて30分間室温でインキュベートし、接着解析を行った。
図4Eに示すように、単球系白血球U937は、時間依存的に内皮単層に接着した。逆に、コントロールのTNF-α非存在下でプレインキュベートした内皮細胞では、単球と内皮との接着は増加しなかった。cPGI存在下でTNF-αとプレインキュベートしたHUVECでは、単球との接着が著しく阻害された。さらに、抗IL-13抗体の添加は、このcPGI-依存接着阻害を顕著に抑制した（図4E）。これらのデータは、炎症誘発性サイトカインTNF-αによって誘導される単球系白血球U397と血管内皮細胞との相互作用の制御において、IL-13がPGI2-PPARδ経路の活性化を通じて重要な役割を果たしていることを示唆する。
TNF-αやIL-1のような炎症誘発サイトカインは、内皮細胞機能の制御において決定的な支配力を持ち、多くの細胞反応を調節している（非特許文献26,27）。ヒト単球の血管表面への固着性は、炎症やアテロームの病理学的過程における本質的な一段階である（非特許文献28）。実際、TNF-αはアテローム硬化型プラーク中に見つかっており、TNF-αはアテローム硬化動脈内では免疫反応性であるが、正常動脈では免疫反応性ではない（非特許文献29）。炎症状態では、損傷細胞から放出されたTNF-αによって、血管内皮細胞が徐々に損傷され、好接着性（proadhesive）、凝血原となる（非特許文献30）。TNF-αによる内皮細胞の刺激が白血球接着分子の表面発現を増加させることが知られている（非特許文献31）。単球の接着分子の発現を含む、TNF-αに応答して起こるこれらの内皮細胞の反応は、アテローム動脈硬化の発病において重要である。ヒト血管内皮細胞は、TNF-αにより活性化されると、細胞表面のE-セレクチン発現が増加し、白血球接着性となることが報告されている。また、ヒトのアテローム硬化症を発症した動脈の免疫組織化学的解析によって、内膜肥厚やアテローム性プラーク部位でE-セレクチン発現が増加していることが明らかになっている（非特許文献33）。TNF-α存在下において、内皮細胞はE-セレクチン発現増加とU937細胞接着を示す（非特許文献34）。IL-13は、TNF-αまたはIL-1により活性化された内皮細胞でのE-セレクチンmRNA発現、及びこれら細胞への白血球接着の両方を抑制することが報告されてきた（非特許文献35）。これらの研究は、今回の本発明者らによる知見を強く裏付けるものである。
（実施例３）cPGI-PPARδ依存IL-13分泌によるCOX-2発現阻害の検討
PGI2や他のPGIsは、炎症を含む、多様な生理学および病理学過程に関与している。さらに、COX-2は炎症の制御に関し重要な役割を果たしており、COX-2遺伝子は炎症誘導性因子によって上方制御される。血管内皮細胞でのCOX-2遺伝子発現に対し、PGI2/PPARδ依存IL-13産生がどのような効果を有するかを検討するため、HUVEC中のCOX-2 mRNAをRT-PCR により測定した。
COX-2の解析のため、ヒト血管内皮細胞をTNF-α（1 ng/ml）およびIL-1β（20 ng/ml）で1時間にわたり前処理し、cPGI（0,10μM）、抗ヒトIL-13モノクローナル抗体（0,0.5μg/ml）、コントロールIgG（0,0.5μg/ml）で12時間処理を行った。該ヒト血管内皮細胞からトータルRNAを調製した。トータルRNA（0.5μg）はSuperScript RT-PCR システム （Invitrogen）による解析を行うのに用いた。上記解析は、製造業者の方法によって実施した。プライマーは、COX-2センス（5'-GGGTTGCTGGGGGAAGAAATGTG-3'）、COX-2アンチセンス(5'-GGTGGCTGTTTTGGTAGGCTGTG-3')の各オリゴヌクレオチドプライマーを用いた。
図５に示すように、HUVECを炎症誘導サイトカインであるTNF-αとIL-1βによって処理したところ、COX-2 mRNAの発現が誘導された。この血管内皮細胞において誘導しうるCOX-2発現は、cPGIの外因性添加により著しく抑制された（図5、レーン3）。さらに、このcPGI依存COX-2発現抑制は、抗IL-13抗体を添加することにより、著しく阻害された。逆に、コントロールIgGを添加しても、COX-2 mRNA発現のcPGI依存阻害は影響されなかった。これらのデータは、cPGIの外因性添加によって、IL-13産生を介して内皮細胞でのCOX-2遺伝子発現を制御しうることを示す。
IL-13が引き金となるいくつかの事象について、COX-2発現阻害に強力に関与していることが知られている。例えば、IL-13は、IL-1おとりレセプターの発現を誘導し（非特許文献36）、IL-1レセプターアンタゴニストの発現を促進する（非特許文献37）。これらの効果は、自己分泌や傍分泌（パラ分泌）による継続的COX-2活性化を減少させる。これらの研究は、本発明者らによる今回の結果を支持するものである。このように、本発明者らにより新規に確認されたPGI2-PPARδ-IL-13経路は、COX-2遺伝子発現の制御および血管内皮細胞における炎症のコントロールに重要な役割を果たしている可能性がある。
（実施例４）ヒト血管内皮細胞における内因性IL-13発現の制御における内因性PGI2産生と外因性PGIの効果
内因性PGI2合成の減少は、血栓症、血管炎症、アテローム動脈硬化の発生および進行において重要な役割を担っていると考えられている。しかしながら、ヒト血管内皮細胞によるPGI2の内因性産生とヒト血管内皮細胞におけるIL-13発現の関係については知られていない。ヒト血管内皮細胞におけるIL-13発現に対する内因性PGI2産生の効果を評価するために、PGI2合成酵素（PGIS）遺伝子についてRNAiによるサイレンシングをHUVEC内で行った。
下記のセンス及びアンチセンス配列を有するsiRNA二本鎖を作成した。
PGIS1, 5'- GGAAACGGCUGAAGAAUUAUU-3' (センス)、5'-UAAUUCUUCAGCCGUUUCCUU-3' (アンチセンス);
PGIS2, 5'-GCGGAGAGCUCGAGAGUAUUU-3'(センス)、5'-AUACUCUCGAGCUCUCCGCUU-3' (アンチセンス);
PGIS3, 5'-CCGGCUACCUGACUCUUUAUU-3' (センス)、5'-UAAAGAGUCAGGUAGCCGGUU-3' (アンチセンス);
PGIS4, 5'-UCAACAGCAUCAAACAAUUUU-3' (センス) and 5'-AAUUGUUUGAUGCUGUUGAUU-3' (アンチセンス).
siRNAs の合成およびアニールは Dharmacon Research Inc. (Lafayette, CO)に委託した。コントロールのノン−サイレンシング siRNAとして、センス二本鎖(5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3') 及びアンチセンス二本鎖(5'-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3')を、Qiagen (Valencia, CA)から購入した。
LipofectAMINE2000 (Invitrogen)を用い、1ウエルあたり200 pmolのアニールしたRNA混合物または同量のコントロールsiRNA を細胞にトランスフェクトした。12時間後、HVJ-リポソームトランスフェクションキット(GenomeONE; 石原産業,大阪, 日本)を用い、製造業者の方法に従い、同量のsiRNAをトランスフェクトした。LipofectAMINE2000 及びHVJ-リポソームを用いて、三日ごとに細胞にsiRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションから10日たった細胞を解析に用いた。細胞のミクロソーム画分を調製し、抗PGIS P4ポリクローナル抗体を用い、既報に従ってイムノブロッティングを実施し（非特許文献５）、解析した。siRNAで10日間処理した細胞を、2%FBS、TNF-α（0,10ng/ml）を含む新鮮EGM-2中でcPGI（10μM）と共にまたは無しで培養した。インキュベーション培地を回収し、6-ケト-PGF1αまたはIL-13量をELISAキットで測定した。
図6Aに示すように、siRNA処理はPGISの内因性発現を抑制した。逆に、コントロールのsiRNAはPGIS発現に何ら効果を与えなかった。さらに、PGI2産生を6-keto-PGF1αとして測定したところ、siRNA処理した細胞では検出されなかった（図6B）。図6Cに示すように、TNF-αに関連するIL-13産生は、PGI2産生を欠く細胞で減少した。さらに、cPGIの外因性添加は、PGI2産生を欠く細胞において、内因性IL-13産生を増加させた。これらの結果は、ヒト血管内皮細胞によるPGI2の内因性産生が、該細胞でのTNF-α刺激に応答するIL-13発現に貢献すること、およびcPGIはPGI2産生能力を減じた内皮細胞において、内因性IL-13発現を制御することができることを示す。
初代培養ヒト血管内皮細胞でのIL-13産生に関する外因性cPGIの効果を示す図である。（A）ヒト血管内皮細胞(1.2 x 104 cells/cm2)をcPGI（10μM）で12時間処理し、IL-13 mRNA発現をRT-PCRで検出した（上パネル）。βアクチンを内部標準として測定した（下パネル）。（B）ヒト血管内皮細胞(1.2 x 104 cells/cm2)をcPGI（0,1,10,100μM）で24時間処理し、培地中の発現したIL-13タンパク質量をELISA法によって測定した。（C)ヒト血管内皮細胞(1.2 x 104 cells/cm2)に、3コピーのPPREを含むルシフェラーゼレポーターベクター(PPREx3-Luc)をトランスフェクトし、cPGI（0,1,10,100μM）を用い、2％FBSを含むEGM-2中で培養した。24時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果を3回の実験の平均値±標準偏差で示した。 ヒトIL-13プロモーター配列中に５コピーのPPREコンセンサス配列が存在することを示す図である。（A）ヒトIL-13遺伝子は-407から-288に5コピーのPPRE領域を有する。（B）IL-13プロモーター領域の1,366,413または286bpを含むルシフェラーゼ（Luc）レポーターベクターをヒト血管内皮細胞(1.2 x 104 cells/cm2)にトランスフェクトし、cPGI（10μM）存在または非存在下で培養した。24時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。推定PPREコンセンサス配列を含む領域は、初代培養ヒト血管内皮細胞のPGI2依存IL-13発現に本質的なものである。結果は3回の実験の平均値±標準偏差である。 cPGI依存ヒトIL-13活性化における PPARおよびCCEB(CCEBdn)のドミナントネガティブの効果を示す図である。ヒト血管内皮細胞(1.2 x 104 cells/cm2)を413bpのIL-13プロモーター配列を含むIL-13ルシフェラーゼベクター及び、野生型PPARδ（PPARδwt）、ドミナントネガティブPPARδ（PPARδdn）,野生型CREB(CREBwt)またはドミナントネガティブCREB(CREBdn)をコトランスフェクトし、cPGI（10μM）で処理した。24時間後、ルシフェラーゼ活性を測定した。結果は、3回の実験の平均値±標準偏差で示した。 初代培養ヒト血管内皮細胞とヒト単球白血球U937細胞との接着におけるTNF-α、外因性cPGI、抗ヒトIL-13モノクローナル抗体の効果を示す図である。（A）ヒト血管内皮細胞(1.2 x 104 cells/cm2)の単層をTNF-α（0,0.1,1,10ng/ml）存在下で、37℃,24時間インキュベートし、細胞のPGI2産生を6-ケト-PGF1αとして測定した。（B）ヒト血管内皮細胞(1.2 x 104 cells/cm2)の単層に、3コピーのPPREを含むルシフェラーゼレポーターベクター（PPRE x3-Luc)をトランスフェクトし、37℃、24時間培養した。細胞を24時間TNF-α（0,0.1,1,10ng/ml）およびcPGI（0,2,10μM）で処理した後、レポーターベクターのルシフェラーゼ活性を測定した。（C）ヒト血管内皮細胞単層(1.2 x 104 cells/cm2)をTNF-α（0,0.1,1,10ng/ml）およびcPGI（0,2,10μM）でインキュベートした後、該細胞のIL-13産生を測定した。（D）12wellプレート中のヒト血管内皮細胞のコンフルエントな単層をTNF-α（0または10ng/ml）及び抗IL-13抗体（0または0.5μg/ml）、cPGI（0または10μM）または組換えヒトIL-13（0または10ng/ml）で37℃、24時間、プレインキュベートした。カルセイン標識単球白血球U937細胞(8 x 104 cells/well)を前処理した内皮細胞に添加し、接着解析をMaterials and Methods記載のとおり実施した。結果は、3回の実験の平均値±標準偏差で示した。（E）12wellプレート中のヒト血管内皮細胞のコンフルエントな単層をTNF-α（0または10ng/ml）およびcPGI（0または10μM）、抗IL-13モノクローナル抗体存在（0.5μg/ml）または非存在下、37℃で0時間から24時間、プレインキュベートした。ヒト単球白血球U937細胞(8 x 104cells/well in 12-well plates)を、2.5μMカルセイン-AMを用いて45分室温で標識し、前処理した内皮細胞に添加し、cPGI（0,10μM）および抗IL-13モノクローナル抗体（0,0.5μg/ml）を用いて30分間室温でインキュベートし、接着解析をMaterials and Methodsに記載のとおり行った。結果は、3回の実験の平均値±標準偏差で示した。 初代培養ヒト血管内皮細胞でのTNF-αとIL-1βの組み合わせにより誘導されたCOX-2発現における外来cPGIとヒトIL-13モノクローナル抗体の効果を示す図である。ヒト血管内皮細胞(1.2 x 104 cells/cm2)をTNF-α（１ng/ml）,IL-1β（20ng/ml）で1時間前処理した後、cPGI（0,10μM）,抗ヒトIL-13モノクローナル抗体（0,0.5μg/ml）、およびコントロールIgG（0,0.5μg/ml）で処理した。12時間後、細胞中のCOX-2遺伝子発現の変化をMaterials and Methodに記載のとおりRT-PCRで解析した。 初代培養ヒト血管内皮細胞中の内因性IL-13発現制御におけるPGI2内因性産生および外因性cPGIの効果を示す図である。（A）ヒトPGIS特異的なsiRNA４種の混合物、またはノンサイレンシングコントロールを、Materials and Mehods 記載のようにして、初代培養ヒト血管内皮細胞にトランスフェクトし、ウエスタン解析を行った。レーン1、2はコントロール、レーン３はsiRNA混合物処理細胞。siRNAによる10日間の細胞処理は、PGIS内因性発現を減少させた。（B）siRNA混合物またはノンサイレンシングコントロールで処理したヒト血管内皮細胞を2％FBSおよびTNF-α（0,10ng/ml）を含むEGM中で24時間培養した。培地中に産生されたPGI2量を6-ケト-PGF1αとしてELISA法で測定した。6-ケト-PGF1αの産生は、siRNA処理細胞において完全に抑制された。N.D.は検出限界以下を表す。結果は、3回の実験の平均値±標準偏差で示した。（C）ヒト血管内皮細胞でのIL-13内因性産生におけるsiRNA処理と外因性cPGI添加の効果を示す図である。siRNAまたはノンサイレンシングRNAiで処理した細胞を、2％FBS,TNF-α（0,10ng/ml）及びcPGI（0,10μM）を含むEGN-2で24時間培養し、培地中に産生されたIL-13量をELISA法で測定した。結果は、3回の実験の平均値±標準偏差で示した。

Claims (13)

  1. PPARδ結合活性を有する物質を有効成分とするIL-13発現誘導剤。
  2. PPARδ結合活性を有する物質がプロスタサイクリン、プロスタサイクリンアナログ、またはこれらの塩である、請求項１に記載のIL-13発現誘導剤。
  3. 下記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の単離されたDNA又は該DNAが挿入されたベクターを含むIL-13発現誘導剤。
    （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA
    （ｂ）配列番号２に記載する配列からなるDNA
    （ｃ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたDNA
    （ｄ）配列番号２に記載の配列とストリンジェントな条件においてハイブリダイズするDNA
  4. IL-13発現誘導剤を有効成分とするCOX-2発現抑制剤。
  5. 下記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の単離されたDNA又は該DNAが挿入されたベクターを含むCOX-2発現抑制剤。
    （ａ）配列番号３に記載のアミノ酸からなるタンパク質をコードするDNA
    （ｂ）配列番号４に記載する配列からなるDNA
    （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたDNA
    （ｄ）配列番号４に記載の配列とストリンジェントな条件においてハイブリダイズするDNA
  6. 下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の単離されたタンパク質を有効成分とするCOX-2発現抑制剤。
    （ａ）配列番号３に記載のアミノ酸からなるタンパク質をコードするDNA
    （ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号４に記載する配列とストリンジェントな条件においてハイブリダイズするDNAによってコードされたタンパク質
  7. IL-13発現誘導剤を有効成分とする細胞接着阻害剤。
  8. 下記の（ａ）から（ｄ）のいずれかに記載の単離されたDNA又は該DNAが挿入されたベクターを含む細胞接着阻害剤。
    （ａ）配列番号３に記載のアミノ酸からなるタンパク質をコードするDNA
    （ｂ）配列番号４に記載する配列からなるDNA
    （ｃ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしたDNA
    （ｄ）配列番号４に記載の配列とストリンジェントな条件においてハイブリダイズするDNA
  9. 下記の（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の単離されたタンパク質を有効成分とする細胞接着阻害剤。
    （ａ）配列番号３に記載のアミノ酸からなるタンパク質
    （ｂ）配列番号３に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質
    （ｃ）配列番号４に記載する配列とストリンジェントな条件においてハイブリダイズするDNAによってコードされたタンパク質
  10. 下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載の物質を含む、炎症性疾患の治療または予防用医薬品。
    （ａ）請求項１から請求項３のいずれかに記載のIL-13発現誘導剤
    （ｂ）請求項４から請求項６のいずれかに記載のCOX-2発現抑制剤
    （ｃ）請求項７から請求項９のいずれかに記載の細胞接着阻害剤
  11. 請求項１から請求項３に記載のIL-13発現誘導剤を投与することによりIL-13発現を誘導する方法。
  12. 被験物質をPPARδと接触させる工程を含む、IL-13発現誘導剤のスクリーニング方法。
  13. 患者から採取した試料を基に、IL-13プロモーター配列中の配列番号５,配列番号６, 配列番号７,配列番号８,または／および配列番号９に記載した配列を検出する工程を含む、請求項１０に記載の炎症性疾患の治療または予防医薬品の有効性を判定する方法。
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