DE69432511T2

DE69432511T2 - Protein p140 und dafür kodierende DNS

Info

Publication number: DE69432511T2
Application number: DE69432511T
Authority: DE
Inventors: Hisao Shimamotocho Tajima; Koichiro Shimamotocho Kitagawa; Hiroyuki Shimamotocho Ohno
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1993-11-24
Filing date: 1994-11-24
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2014-11-25
Also published as: CN1112127A; DK0659883T3; US5804411A; US6432913B1; EP0659883B1; ATE237683T1; TW311913B; PT659883E; ES2196016T3; CN1057096C; KR100256664B1; US20030170865A1; DE69432511D1; CA2136565A1; US6303320B1; KR950014135A; EP0659883A3; CA2136565C; US5506205A; EP0659883A2

Description

Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid, das Protein p140, das ein am Signalübertragungssystem von Insulin beteiligtes Schlüsselprotein ist; Verfahren zur Herstellung desselben; das Polypeptid codierende DNA; einen von der DNA abgeleiteten Vektor; mit dem Vektor transformierte Wirtszellen; einen Antikörper des Polypeptids; eine das Peptid oder den Antikörper enthaltende pharmazeutische Zusammensetzung; ein Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Diabetes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es das Polypeptid enthält, und Screeningverfahren für das Prophylaxe- und/oder Behandlungsmittel.
Hintergrund der Erfindung
Diabetes, eine anomale Stoffwechselerkrankung, wird durch einen Defekt im Mechanismus des Glucosestoffwechsels ausgelöst.
Unter normalen Bedingungen erfolgt der Glucosestoffwechsel wie folgt: Kohlehydrate, die in Form von Nahrung aufgenommen werden, werden im Darm vor der Absorption in das Kreislaufsystem zu Glucose verdaut. Pankreas-β-Zellen reagieren auf eine Zunahme des Blutglucosespiegels durch Ausschütten von Insulin, was wiederum die peripheren Zielgewebe (Muskeln und Leber) dazu stimuliert, den Blutglucosespiegel zu verringern, indem die Gewebeabsorption der Blutglucose verstärkt wird und anschließend eine Umwandlung in Glykogen zur Speicherung erfolgt.
In Abhängigkeit von den verursachenden Faktoren wird Diabetes in zwei Hauptkategorien klassifiziert: insulinabhängiger Diabetes mellitus (IDDM) und insulinunabhängiger Diabetes mellitus (NIDDM). IDDM (Typ-I-Diabetes) ist ein pathologischer Zustand, bei dem Insulin nicht ausgeschüttet wird oder auch bei einer Ausschüttung durch Pankreas-β-Zellen als Reaktion auf eine durch Nahrungsaufnahme ausgelöste Zunahme des Blutglucosespiegels unzureichend ist. Es ist bekannt, dass die Zerstörung von β-Zellen der Langerhans-Inseln IDDM auslöst. Die derzeitige Therapie verwendet eine Insulinergänzung aus exogenen Quellen.
NIDDM (Typ-II-Diabetes) ist ein pathologischer Zustand, bei dem der Rückkopplungsmechanismus peripherer Gewebe funktionsgestört ist und hinsichtlich der Verringerung des Blutglucosespiegels unwirksam ist, obwohl im Lebendsystem eine normale Insulinausschüttung erfolgt. In den Vereinigten Staaten von Amerika gilt NIDDM als häufige Erkrankung; 5% der Bevölkerung eines Alters von mehr als 40 Jahren leiden an NIDDM. Die an dieser Erkrankung beteiligten verursachenden Faktoren sind noch aufzuklären.
Verwandte Gebiete
Die Aufklärung der Ätiologie von NIDDM, d. h. die Aufklärung des insulininduzierten Glucoseaufnahmemechanismus in peripheren Gewebezellen ist jedoch unklar, da die derzeitigen Kenntnisse des Informationsübertragungsmechanismus von Insulin beschränkt und nicht fest begründet sind.
Von den Langerhans-Inseln ausgeschüttetes Insulin bindet an Insulinrezeptoren an der Zellmembran von peripheren Gewebezellen. Im Hinblick auf die Informationsübertragung nach der Bindung sind die Theorie der Phosphorylasekaskade und die Theorie des sekundären Botenstoffs die derzeitigen Forschungsschwerpunkte.
Diese zwei Theorien lassen sich kurz folgendermaßen erklären:
Theorie der Phosphorylasekaskade:
Wenn Insulin an die α-Untereinheit des Insulinrezeptors bindet, löst die an der inneren Zellmembran vorhandene β-Untereinheit eine Phosphorylierung, die von der Aktivierung der Tyrosinkinasestelle im Rezeptor begleitet wird, aus. Die Phosphorylierung von Substraten durch das letztere Enzym ergibt drei unterschiedliche Proteine. Eines besteht aus 1235 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 185 kD, was dem Insulinrezeptorsubstrat 1 (IRS-1) entspricht. Bei der Tyrosinphosphorylierung von IRS-1 bindet die Phosphorylase von Phosphatidylinosit, PI1-Kinase, an den Komplex und aktiviert diesen. Mit der Informationsübertragung in Verbindung stehende Ereignisse nach der Bindung, die die Lokalisierung des Glucosetransporters in der Membran und die Membranerregung betreffen, müssen noch festgestellt werden. Neben IRS-1 wurde das Vorhandensein von zwei Proteinsubstraten (Shc und PTP-1C) bestätigt. Jedoch wurden der folgende Mechanismus bzw. die folgenden Mechanismen noch nicht vollständig geklärt.
Theorie des sekundären Botenstoffs:
Wenn Insulin an den Insulinrezeptor bindet, wird Phospholipase C spezifisch aktiviert, wobei Phosphatidylinositglykan (PIG) abgebaut wird, wobei Inositglykan (IG) und Diacylglycerin (DAG) durch Hydrolyse gebildet werden. Obwohl berichtet wurde, dass IG verschiedene insulinähnliche Wirkungen zeigt, muss die typische Glucoseaufnahmewirkung noch aufgezeigt werden.
Wenn jedoch Proteinkinase C durch DAG aktiviert wird, wird bekanntlich die Lokalisierung von Proteinkinase C in der Zellmembran gefördert. Dies impliziert, dass DAG aufeinanderfolgend innere Membranproteine phosphoryliert, wobei schließlich die Glucoseaufnahme ausgelöst wird. Diese Verflechtung bleibt jedoch bisher unklar.
Obwohl die zwei unterschiedlichen Denkrichtungen bisher vorherrschend sind, können die mit der Informationsübertragung verbundenen Anfangsstufen der Ereignisse nach der Bindung nur teilweise durch eine der beiden Theorien erklärt werden.
Gemäß Copper et al., 1988, wird das Hormon Amylin von b-Pankreaszellen, die ähnlich denen sind, die Insulin ausschütten, wenn Hyperglykämie vorherrscht, freigesezt. Auf der Grundlage ihrer Erkenntnisse, dass Amylin die Wirkung von Insulin hemmte, zeigten sie auf, dass das Hormon als Insulinantagonist verwendet werden könnte. Ein Folgebericht im Jahr 1991 gibt an, dass die übermäßige Verwendung von Amylin bei transgenen Mäusen NIDDM auslöst. Jedoch ist die Beziehung zwischen Amylin und der Insulininformationsübertragung bis heute ungeklärt.
Mittel zur Lösung der Probleme
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung konzentrieren sich auf die auf Insulin antagonistisch wirkenden Eigenschaften von Amylin. Durch beständige Forschungsaktivitäten, die hinsichtlich der Wirkungen von Amylin auf das Insulininformationsübertragungssystem durchgeführt wurden, identifizierten die Erfinder zunächst die Hemmstelle von Amylin bei der Regulierung des Insulininformationsübertragungssystems, und sie entdeckten die mit diesem Phänomen in Verbindung stehenden Schlüsselproteine, das phosphorylierte Protein 140 und 70 (pp140 und pp70). Die vorliegende Erfindung enthüllt klar die Strukturen der Proteine (DNA-Basesequenzen und Aminosequen zen) und die Aufklärung ihrer Wirkungsweisen, wodurch das bisher mangelhaft erklärte Phänomen der Insulininformationsübertragung vervollständigt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Wirkungen von Vitamin K₅ (VK₅) auf den Blutglucosegehalt in Streptozotocin(STZ)-induzierten diabetischen Ratten.
2 zeigt die Wirkungen von Vitamin K₅ (VK₅) auf den Neutralfettgehalt in Blut von Streptozotocin(STZ)-induzierten diabetischen Ratten.
3 zeigt die Wirkungen von Vitamin K₅ (VK₅) auf den Blutcholesteringehalt in Streptozotocin(STD)-induzierten diabetischen Ratten.
4 zeigt das Hydrophobieprofil für das Polypeptidprotein p140 in der vorliegenden Erfindung.
5 zeigt den pUCSRαML2-Vektor.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polypeptid Protein p140 mit der in SEQ ID No: 1 angegebenen Aminosäuresequenz in im wesentlichen gereinigter Form. Ferner werden DNAs mit Codierung für das Polypeptid ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst. In konkreterer Form ausgedrückt sind diese DNAs diejenigen mit der in SEQ ID No. 2 und 3 angegebenen Nucleotidsequenz.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Diabetes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Polypeptid Protein p140 als Wirkstoff enthält, und die Screeningverfahren für das Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung.
Die vorliegende Erfindung umfasst speziell:

(1) Polypeptide, die aus der Aminosäuresequenz bzw. den Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID No. 1 angegeben sind, aufgebaut sind;
(2) DNAs, die die in SEQ ID No. 2 angegebenen Basesequenzen besitzen;
(3) DNAs, die die in SEQ ID No. 3 angegebenen Basesequenzen besitzen;
(4) ein Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Diabetes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es ein Polypeptid Protein p140 als Wirkstoff enthält; und
(5) ein Verfahren zum Screenen des Mittels zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Diabetes, das durch die Verwendung von Protein p140 gekennzeichnet ist.

Bei einer Verabreichung von Amylin (0,1 mg/kg, i.p., t.i.d.) an gesunde Ratten während 7 Tagen wird eine dramatische Abnahme in den beiden Punkten der Insulinrezeptorpopulation und der ausgeschütteten Insulinmenge beobachtet. Diese Beobachtungen werden begleitet von Abnahmen in den beiden Punkten der Glucosetransporter-4 (Glut 4)-Menge und der synthetisierten Glykogenmenge (weniger als 50% Abnahme im Vergleich zu der der Kontrollgruppe) mit einer 1,7-fachen Zunahme des Blutglucosegehalts. Ferner wurde in Experimenten unter Verwendung von L6-Zellen (ATCC-Stamm Nr. CRL-1458) von Rattenskelettmuskelmyoblasten eine verringerte Glucoseaufnahme in den Zellen bei Amylinverabreichung beobachtet.
Als nächstes wurden Veränderungen der insulininduzierten Tyrosinphosphorylierungskaskade in mit Amylin behandelten Skelettmuskelmyoblasten untersucht, indem der Anti-Phosphotyrosin-Antikörper mit dem Western-Blotting-Verfahren verwendet wurde. Beispielsweise war, wenn L6-Zellen mit Insulin in den Experimenten inkubiert wurden, die Tyrosinphosphorylierung verstärkt. Eine Vorbehandlung mit Amylin unter ähnlichen Bedingungen bestätigte jedoch das Vorhandensein von zwei unterschiedlichen Proteinen, die die Phosphorylierung hemmten. Diese Proteine werden im folgenden als pp140 und pp70 entsprechend ihrem jeweiligen Molekulargewicht bezeichnet. Ferner werden die Vorläufer dieser Proteine vor der Phosphorylierung jedoch im folgenden als p140 bzw. p70 bezeichnet.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung stellten pp140 und pp70 her und isolierten und reinigten diese, bevor sie deren partielle Aminosäuresequenzen bestimmten. Beim Vergleichen von Ähnlichkeiten der Aminosäuresequenzen mit zuvor dokumentierten Sequenzen von Polypeptiden in Swiss Plot Release 2.0 fällt pp70 mit dem zuvor bekannten glucoseregulierten Protein 70 zusammen. Die Ergebnisse postulieren jedoch, dass pp140 ein völlig unbekanntes neues Protein ist. Daher isolierten die Erfinder der vorliegenden Erfindung mRNA von p140 aus den Rattenskelettmuskelmyoblasten und sie konstruierten die cDNA unter Verwendung der isolierten mRNA von p140, bevor sie die gesamte Basesequenz und vollständige Aminosäuresequenz des Proteins bestimmten. Die Ergebnisse vervollständigen daher die vorliegende Erfindung, indem sie ein vollständig neues Polypeptid und die dieses Polypeptid codierende gesamte DNA-Kette erfolgreich enthüllen.
Aus den obigen Erkenntnissen ist klar, dass Amylin die Phosphorylierung von p140 und p70 zu pp140 bzw. pp70 hemmen kann. Im Gegensatz dazu wird, wenn angenommen wird, dass Amylin den Prozess von der Insulinrezeptorbindung bis zur Glucoseaufnah me unterdrückt, nahegelegt, dass die Phosphorylierung von p140 und p70 unter Bildung von pp140 und pp70 eine wichtige Rolle im Glucoseaufnahmemechanismus von Zellen spielen kann.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung versuchten den Wirkungsmechanismus bzw. die Wirkungsmechanismen von p140 und p70 daher aufzuklären.
Wenn Rattenskelettmuskelmyoblasten (Ratten-L6-Zellen) in insulinergänzten Kulturen inkubiert wurden, wurde das Auftreten einer pp140-Bande am Tag 3 mit einer pp140-Produktion am Tag 9 konstant beobachtet. In etwa dem gleichen Abstand (Tag 3) wurde das Auftreten von Glut 4 in ähnlicher Weise mit einer allmählichen Zunahme der Ratten-L6-Zellteilung beobachtet. Ferner wurde in einem ähnlichen Kultursystem am Tag 7 die Bildung mehrerer Kerne von Rattenskelettmuskelmyoblasten mit anschließender Teilung unter Bildung der Muskelzellen beobachtet. Im Falle von pp70 erschienen die Zellen am Tag 7 und behielten das Dirigieren der Produktion des Proteins bis zum Tag 14 bei.
Bei der Überprüfung der Lokalisierung von pp140 in den Zellen fand sich jedoch, wenn Insulin zu nicht-serumbehandelten L6-Zellen gegeben wurde, das Protein 10 min nach der Kultur in der Mikrosommembran (MM) des Cytoplasmas in der Zelle. Das pp140 verschwand danach. Ferner wurde pp140 in der permeablen Membran (PM) der Zellen frühestens 1 ~ 2 h nach der Kultur beobachtet. Aufgrund dieser Erkenntnisse wird postuliert, dass pp140 im Zellcytoplasma unmittelbar nach der Insulinbehandlung synthetisiert wurde und dieses Protein anschließend zur permeablen Membran (PM) 1 ~ 2 h danach übertragen wurde. Ferner wurde, wenn die Lokalisierung von pp70 in L6-Zellen mit einem ähnlichen experimentellen Ansatz untersucht wurde, pp70 zunächst in der MM unmittelbar nach dem Starten der Kul-tur lokalisiert, es zeigte einen Spitzenwert der phosphory lierten Menge 10 min nach der Kultur und es erreichte allmählich nicht-erfassbaren Werte 3 h nach der Kultur. Ferner war pp70 unmittelbar nach dem Starten der Kultur ebenfalls im Kern lokalisiert und der Proteingehalt nahm allmählich zu, wobei ein Spitzenwert 3 h nach der Kultur registriert wurde. Aufgrund der obigen Proteinlokalisierungsmuster existiert pp70 in Abwesenheit von Insulin in der MM, und dieses Protein wird innerhalb von 3 h nach einer Insulinbehandlung zur Kernfraktion bewegt.
Auf der Grundlage der obigen Ergebnisse kann der Informationsübertragungsmechanismus von pp140 wie folgt postuliert werden. Kurz gesagt wird, wenn Insulin an den Rezeptor bindet, der letztere durch Autophosphorylierung aktiviert. Die Information durchläuft dann verschiedene Aktivierungsstufen über die Phosphorylierung von Proteinphosphorylasen, wobei anschließend p140 zu pp140 phosphoryliert wird. Das aktivierte pp140 ist auf der permeablen Membran(PM)oberfläche lokalisiert, bevor p70 phosphoryliert wird, nachdem verschiedenen Proteinphosphorylierungsprozesse gleichzeitig durchgeführt wurden. Das phosphorylierte pp70 ist aktiviert und wird dann in den Kern bewegt, wobei es anschließend biologische Aktivitäten durch die Glut-4-Expression im Kern auslöst. Auf der Grundlage dieser Information wird das im Cytoplasma produzierte Glut 4 daher mobilisiert, wobei es sich auf der permeablen Membran(PM)oberfläche lokalisiert, um schließlich die Glucoseaufnahme auszulösen.
Der obige Informationsübertragungsmechanismus macht Nachfolgeexperimente nötig, um einen konkreten Beweis des Phänomens zu Recht zu erbringen. Auf jeden Fall kann nun gefolgert werden, dass die Aktivierung von p140 eine essentielle Stufe ist, die zum Auslösen der Glucoseaufnahme in Zellen und zu einer anschließenden Hypoglykämie im Kreislaufsystem erforderlich ist.
So wird ein Verfahren zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Diabetes, insbesondere insulinunabhängigem Diabetes mellitus (NIDDM) beschrieben, das durch Tyrosinphosphorylierung von Protein p140 gekennzeichnet ist.
Ferner wird ein Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Diabetes, insbesondere insulinunabhängigem Diabetes mellitus (NIDDM) beschrieben, das durch Tyrosinphosphorylierung von Protein p140 gekennzeichnet ist. Das Verfahren und das Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Diabetes, das durch Tyrosinphosphorylierung von Protein p140 gekennzeichnet ist, umfasst alle oder die gesamten Verfahren und Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Diabetes auf der Grundlage des Hauptwirkmechanismus, der Tyrosinphosphorylierung von Protein p140 umfasst.
Ferner sind Zellen, die Protein p140 am Tyrosin phosphorylieren nicht nur auf Skelettmuskelmyoblasten (Ratten-L6-Zellen) beschränkt, sondern sie umfassen auch alle anderen Zellen, die die Phosphorylierung positiv anregen. Insgesamt umfassen Zellen, bei denen bestätigt wurde, dass sie die Phosphorylierung zeigen, Ratten-FaO-Hepatocyten, humane A673-Muskelzellen und HepG2-Hepatocyten.
Organe außer Muskeln und Leber, wie Herz, Gehirn, Milz, Lungen, Nieren, Hoden, Plazenta und Pankreas, zeigten wiederholt Auftreten von p140 mRNA gemäß der vorliegenden Erfindung. Ohne lediglich auf Muskeln und Leber beschränkt zu sein, können die Wirkungen der Tyrosinphosphorylierung daher weit durch das Lebendsystem ausstrahlen. Aufgrund dieser Erkenntnis ist daher der Wirkungsmechanismus der vorliegenden Erfindung nicht auf Muskel- und Leberzellen beschränkt, sondern er umfasst auch die Herz-, Gehirn-, Milz-, Lungen-, Nieren-, Hoden-, Plazenta- und Pankreaszellen.
Wenn das Polypeptid der vorliegenden Erfindung mit Aminosäuresequenzen bereits bekannter Polypeptide, die mit dem Swiss Prot Release 2.0 aufgezeichnet wurden, verglichen wurde, wurden Kandidaten mit einer vollständigen ganzen Sequenz, die der des Polypeptids ähnlich war, nicht identifiziert. Ferner wurde keine einzelne cDNA des vollständigen gesamten Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit Codierung für die früher dokumentierten Nucleotidsequenzen, die in GenBank Release 70 aufgezeichnet waren, lokalisiert. Es wurde daher bestätigt, dass das Peptid der vorliegenden Erfindung ein vollständig neues Protein ist.
Des weiteren wurden Epithelzellkinase (Eck) und etwa 40 Identität erkannt, wenn die Ergebnisse mit Aminosäuresequenzen von Polypeptiden, die bereits in Swiss Prot Release 2.0 dokumentiert sind, verglichen wurden. Daher wurde postuliert, dass ein neues Protein der vorliegenden Erfindung zur Eck-Familie gehört.
In der vorliegenden Erfindung umfasst ein Polypeptid der SEQ. ID NO: 1 in im wesentlichen gereinigter Form im allgemeinen das Polypeptid in einer Produktion, in der mehr als 90%, beispielsweise 95%, 98% oder 99% des Polypeptids in der Produktion das der SEQ. ID NO: 1 sind.
Ein Polypeptidhomologon der SEQ. ID NO: 1 ist im allgemeinen zu mindestens 70%, zweckmäßigerweise mindestens 80 oder 90 und vorzugsweise mindestens 95% homolog zu dem Polypeptid der SEQ. ID NO: 1 über eine Region von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30, beispielsweise 40, 60 oder 100 oder mehr fortlaufenden Aminosäuren.
Im allgemeinen besitzen Fragmente der SEQ. ID NO: 1 oder von deren Homologa eine Länge von mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, beispielsweise 20, 25, 30, 40, 50 oder 60 Aminosäuren.
Eine DNA mit der Fähigkeit zur selektiven Hybridisierung mit der DNA der SEQ. ID NO: 2 oder 2 ist im allgemeinen mindestens 70%, zweckmäßigerweise mindestens 80 oder 90% und vorzugsweise mindestens 95% homolog zu der DNA der SEQ. ID NO: 2 oder 3 über einen Bereich von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 30, beispielsweise 40, 60 oder 100 oder mehr fortlaufenden Nucleotiden.
Fragmente der DNA der SEQ. ID NO: 2 oder 3 besitzen eine Länge von mindestens 10, vorzugsweise mindestens 15, beispielsweise 20, 25, 30 oder 40 Nucleotiden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Bereitstellung von Replikations- und Expressionsvektoren, die DNA gemäß der Erfindung umfassen. Die Vektoren können beispielsweise Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren sein, die mit einem Replikationsursprung, optional einem Promotor zur Expression der DNA und optional einem Regulator des Promotors ausgestattet sind. Der Vektor kann ein oder mehrere selektierbare bzw. selektionsfähige Markergene, beispielsweise ein Ampicillinresistenzgen, enthalten. Der Vektor kann in vitro, beispielsweise zur Produktion von der DNA entsprechender RNA, oder zur Transfektion oder Transformation einer Wirtszelle verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Bereitstellung von Wirtszellen, die mit den Vektoren zur Replikation und Expression von DNA gemäß der Erfindung, die die DNA der SEQ. ID NO: 2 oder 3 oder das offene Leseraster derselben umfassen, transformiert oder transfiziert sind. Die Zellen werden so gewählt, dass sie mit dem Vektor kompatibel sind, und sie können beispielsweise Bakterien-, Hefe-, Insek ten- oder Säugetierzellen sein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Verfahrens zur Produktion eines Polypeptids, das das Kultivieren von Wirtszellen der vorliegenden Erfindung unter zur Expression eines Polypeptids der Erfindung wirksamen Bedingungen umfasst. Vorzugsweise wird ein derartiges Verfahren ferner unter Bedingungen durchgeführt, bei denen das Polypeptid der Erfindung exprimiert und dann von den Wirtszellen produziert wird.
DNA gemäß der Erfindung kann auch in die im vorhergehenden beschriebenen Vektoren in Antisense-Orientierung eingeführt werden, um die Produktion von Antisense-RNA zu ermöglichen. Antisense-RNA kann ebenfalls durch Synthesemaßnahmen produziert werden. Eine derartige Antisense-RNA kann in einem Verfahren zur Steuerung der Konzentrationen eines Polypeptids der Erfindung in einer Zelle verwendet werden.
Durch die Erfindung erfolgt auch die Bereitstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegenüber einem Polypeptid gemäß der Erfindung. Durch die Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zur Produktion von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern gegen die Polypeptide der Erfindung. Monoklonale Antikörper können durch herkömmliche Hybridomtechnologie unter Verwendung eines Polypeptids der Erfindung oder eines Fragments desselben als Immunogen hergestellt werden. Polyklonale Antikörper können auch durch herkömmliche Maßnahmen, die das Impfen eines Wirtstiers, beispielsweise einer Ratte oder eines Kaninchens, mit einem Polypeptid der Erfindung und das Gewinnen des Immunserums umfassen, hergestellt werden.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt auch die Bereitstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ein Poly peptid der Erfindung oder einen Antikörper desselben in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel und/oder Träger enthalten.
Wie bekannt ist, sind eine bis sechs Arten eines Codons, das eine Aminosäure codiert, bekannt (beispielsweise eine Codonart für Met und sechs Codonarten für Leu). Daher kann die Nucleotidsequenz von DNA verändert werden, um das Polypeptid mit der gleichen Aminosäuresequenz zu codieren.
Die in (2) angegebene DNA ist die Ausführungsform der in (2) angegebenen DNA und sie ist die Sequenz in der natürlichen Form.
Die in (3) angegebene DNA gibt die in (2) spezifizierte DNA mit einer Nichttranslationsregion an.
Die DNA mit einer in SEQ. ID NO: 3 angegebenen Nucleotidsequenz kann nach den folgenden Verfahren hergestellt werden, d. h.:

(i) durch Isolieren von mRNA aus einer Zelllinie, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung produziert (beispielsweise Rattenskelettmuskelmyoblasten-L6-Zellen),
(ii) durch Herstellen eines ersten Strangs (einsträngige DNA) aus auf diese Weise erhaltener mRNA und anschließendes Herstellen eines zweiten Strangs (doppelsträngige DNA) (Synthese von cDNA),
(iii) durch Einführen der auf diese Weise erhaltenen cDNA in einen geeigneten Plasmidvektor,
(iv) durch Transformieren von Wirtszellen mit der auf diese Weise erhaltenen rekombinanten DNA (Herstellen der cDNA-Bibliothek),
(v) durch randomisiertes Klonieren in großem Maßstab der auf diese Weise erhaltenen cDNA-Bibliothek und an schließendes Sequenzieren von durchschnittlich 300 Basen vom 5'-Ende jedes Klons, und
(vi) durch Sequenzieren der vollständigen Länge eines Klons, der eine neue Basesequenz aufweist.

Genauer gesagt kann Stufe (i) gemäß dem Verfahren von H. Okayama et al. (Beschreibung in Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)) unter Verwendung von L6-Zellen von Rattenskelettmuskelmyoblasten, die sich in der logarithmischen Wachstumsphase befinden, durchgeführt werden. Beispiele für Zellen, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung erzeugen, sind Zellen von Ratten oder Menschen von Muskeln, Leber, Herz, Hirn, Milz, Lungen, Nieren, Hoden, Plazenta oder Pankreas, und vorzugsweise sind es Rattenskelettmuskelmyoblasten-L6-Zellen (ATCC-Stamm Nr. CRL-1458), Rattenleber-FaO-Zellen, humane Muskel-A673-Zellen oder humane Leber-HepG2-Zellen. Die Stufen (ii), (iii) und (iv) sind eine Reihe von Stufen zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek, und sie können gemäß dem Verfahren von Gubler & Hoffman (Gene, Band 25, S. 263, 1983) mit leichter Modifizierung durchgeführt werden. Als Beispiele für den in Stufe (iii) verwendeten Plasmidvektor sind viele Vektoren, die in einem E. coli-Stamm (beispielsweise pBR 322) und in Bacillus subtilis (beispielsweise pUB 110) funktional sind, bekannt, und pGEM-3Zf(+) (3 199 bp, hergestellt von Promega Corp.), das in E, coli funktional ist, kann vorzugsweise verwendet werden. Als Beispiele für den in Stufe (iv) verwendeten Wirt sind bereits viele Zellen bekannt. Beliebige Zellen können verwendet werden, und DH5-kompetente Zellen, die gemäß dem in Gene, Band 96, S. 23, 1990, beschriebenen Verfahren hergestellt wurden, können vorzugsweise verwendet werden. Das Klonieren in Stufe (v) kann durch als solche bekannte Verfahren durchgeführt werden und das Sequenzieren kann gemäß dem Verfahren von Maxam-Gilbert oder dem Didesoxyterminationsverfahren durchgeführt werden. Die Stufe (vi) kann gemäß dem in Molecular Cloning (Autor J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, verlegt bei Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Als folgende Stufe ist es notwendig, zu überprüfen, ob die auf diese Weise erhaltene DNA richtig für das zu produzierende Protein codiert oder nicht. Die Prüfung erfordert:

(i) die Umwandlung der DNA-Sequenz in die Aminosäuresequenz in einem möglichen Raster,
(ii) die Bestätigung, dass die auf diese Weise erhaltene DNA die gesamte oder nahezu die gesamte Länge der intakten mRNA umfasst. Diese Bestätigung kann nach der hier im vorhergehenden beschriebenen Stufe (vi) und wirksam zwischen der Stufe (v) und der Stufe (vi) durchgeführt werden.

Die Stufe (II) kann mittels Northern-Analyse durchgeführt werden.
Sobald die in SEQ. ID NO: 2 und 3 angegebenen Nucleotidsequenzen bestimmt sind, kann die DNA der vorliegenden Erfindung durch chemische Synthese, durch das PCR-Verfahren oder durch Hybridisierung unter Verwendung eines Fragments der DNA der vorliegenden Erfindung als Sonde erhalten werden. Ferner kann die DNA der vorliegenden Erfindung in einer gewünschten Menge durch Transformation eines geeigneten Wirts mit einer Vektor-DNA, in die eine DNA der vorliegenden Erfindung insertiert ist, und anschließendes Kultivieren der Transformante erhalten werden.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung (die in SEQ. ID NO: 1 angegeben sind) können hergestellt werden durch:

(1) Isolieren und Reinigen aus einem Organismus oder einer kultivierten Zelle,
(2) chemische Synthese oder
(3) unter Verwendung biotechnologischer Fertigkeiten, vorzugsweise das in (3) beschriebene Verfahren.

Beispiele für ein Expressionssystem, wenn ein Polypeptid unter Verwendung biotechnischer Fertigkeiten hergestellt wird, sind beispielsweise das Expressionssystem von Bakterien, Hefe, Insektenzellen und Säugetierzellen.
Beispielsweise kann die Expression in E. coli durch Anfügen des Initiationscodons (ATG) an das 5'-Ende einer DNA mit Codierung für eine Nucleotidsequenz, die in SEQ. ID NO: 3 angegeben ist, Verbinden der auf diese Weise erhaltenen DNA mit der stromabwärtigen Seite eines geeigneten Promotors (beispielsweise trp-Promotor, lac-Promotor, λp_L-Promotor, T7-Promotor und dergleichen) und das anschließende Insertieren derselben in einen Vektor (beispielsweise pBR322, pUC18, pUC19 und dergleichen), der in einem E. coli-Stamm funktional ist, wobei ein Expressionsvektor hergestellt wird, durchgeführt werden. Danach kann ein E. coli-Stamm (beispielsweise E. coli-DH1-Stamm, E. coli-JM109-Stamm, E. coli-HB101-Stamm und dergleichen), der mit dem auf diese Weise erhaltenen Expressionsvektor transformiert ist, in einem geeigneten Medium unter Bildung des gewünschten Polypeptids kultiviert werden. Wenn ein Signalpeptid eines Bakteriums (beispielsweise das Signalpeptid von pel B) verwendet wird, kann das gewünschte Polypeptid auch in das Periplasma sezerniert werden. Ferner kann ein Fusionsprotein mit einem anderen Polypeptid ebenfalls ohne weiteres hergestellt werden.
Ferner kann die Expression in einer Säugetierzelle durch beispielsweise Insertieren der in SEQ. ID NO: 3 angegebenen DNA stromabwärts eines geeigneten Promotors (beispielsweise SV40-Promotor, LTR-Promotor, Metallothioneinpromotor und dergleichen) in einem geeigneten Vektor (beispielsweise Retrovirusvektor, Papillomavirusvektor, Vacciniavirusvektor, SV40- Vektor und dergleichen) unter Bildung eines Expressionsvektors und Transformieren einer geeigneten Säugetierzelle (beispielsweise Affen-COS-7-Zelle, Chinese-Hamster-CHO-Zelle, Maus-L-Zelle und dergleichen) mit dem auf diese Weise erhaltenen Expressionsvektor und anschließendes Kultivieren der Transformante in einem geeigneten Medium unter Bildung eines gewünschten Polypeptids in dem Kulturmedium durchgeführt werden. Das auf diese Weise erhaltene Polypeptid kann nach herkömmlichen biochemischen Verfahren isoliert und gereinigt werden.
Das Protein der vorliegenden Erfindung umfasst die Reaktionsprodukte des phosphorylierten und/oder an eine Zuckerkette gebundenen Proteins. Kurz gesagt, enthält die vorliegende Erfindung p140-gebundene Polysaccharidketten und Tyrosinphosphoryliertes p140 (pp140), die sich in p140-Polypeptiden finden.
Wirkungen der Erfindung
Es wird postuliert, dass das Protein p140 den im vorhergehenden genannten Wirkungsmechanismus besitzt. Das Protein-p140-Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann daher nicht nur hyperglykämische Zustände verbessern, wenn es alleine verwendet wird, sondern es kann auch zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Diabetes, insbesondere insulinunabhängigem Diabetes mellitus (NIDDM) verwendet werden.
Ferner können polyklonale oder monoklonale Antikörper gegen das Protein-p140-Polypeptid der vorliegenden Erfindung bei der Bestimmung der Menge des Polypeptids im Organismus verwendet werden und dadurch zum Zwecke der Untersuchung der Beziehung zwischen dem Polypeptid und Krankheiten oder zum Zwecke der Diagnose von Krankheiten und dergleichen verwendet werden. Ein polyklonaler und monoklonaler Antikörper desselben kann nach herkömmlichen Verfahren unter Verwendung des Polypeptids oder Fragments desselben als Antigen hergestellt werden.
Die DNA der vorliegenden Erfindung kann als wichtiges und wesentliches Templat bei der Herstellung des Polypeptids der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei dieses verschiedene Verwendungsmöglichkeiten für die Diagnose und Behandlung von Genkrankheiten besitzen sollte (die Behandlung von Gendefektkrankheiten und die Behandlung durch Hemmen der Expression des Polypeptids durch Antisense-DNA (RNA) und dergleichen). Ferner kann Genom-DNA unter Verwendung der DNA der vorliegenden Erfindung als Sonde isoliert werden. In ähnlicher Weise ist es möglich, Gene mit hoher Homologie zur DNA der vorliegenden Erfindung bei Menschen oder die anderer Arten zu isolieren.
Ferner wird ein Mittel zur Prophylaxe und/oder Behandlung von Diabetes, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine Verbindung, die eine Tyrosinphosphorylierung von Protein p140 durchführen kann, als Wirkstoff enthält, beschrieben.
Alles in allem umfassen tyrosinphosphorylierte Protein-p140-Produkte nicht nur die derzeit erkannten Substanzen, die diese Aktivitäten besitzen, sondern auch alle Substanzen, bei denen erkannt wird, dass sie diese Aktivitäten besitzen. Derzeit ist beispielsweise für die folgenden Verbindungen bestätigt, dass sie die Aktivität der Tyrosinphosphorylierung aufweisen:

(1) die Benzol- oder Naphthalinderivate der Formel (I)
worin R¹ von n Arten jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, C₁_₄-Alkyl, Hydroxy, Amino oder COOR² (worin R² ein Wasserstoffatom oder C₁_₄-Alkyl ist) bedeutet, n 1–3 ist, und nicht-toxische Salze derselben und nicht-toxische Säureadditionssalze derselben,
(2) die Benzochinon- oder Naphthochinonderivate der Formel (II)
worin R³ von m Arten jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, C_1-12-Alkyl, C₁ _-9-Alkoxy, C₁ _-9-Alkylthio, Hydroxy, Halogen, Phenyl oder halogensubstituiertes Phenyl bedeutet, m 1–4 ist,
(3) die Rhodanin- oder Thiazolidinderivate der Formel (III)
worin X ein Sauerstoff- oder Schwefelatom ist, R⁴ und R⁵ jeweils unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, Phenyl oder mit C₁ _-9-Alkyl, C_1-8-Alkoxy, einem Halogenatom oder einer Nitrogruppe substituiertes Phenyl bedeuten oder R⁹ und R⁵ zusammengenommen für Benzyliden, mit C₁_₄-Alkyl, C_1-8-Alkoxy, einem Halogenatom oder einer Nitrogruppe substituiertes Benzyliden oder β-Methylcinnamiliden stehen, R⁶ ein Wasserstoffatom oder C₁ _-9-Alkyl bedeutet, und nicht-toxische Salze derselben und nicht-toxische Säureadditionssalze derselben.

Genauer gesagt, umfassen die Verbindungen der Formel (I) 4-Amino-2-hydroxybenzoesäure, 4-Amino-1-naphthol, 4-Amino-2-naphthol, 1-Aminonaphthalin, 1,4-Dihydroxynaphthalin, 4-Amino-2-methyl-1-naphthol (im folgenden als Vitamin K₅ abgekürzt), 1,4-Dihydroxy-2-naphthensäure und dergleichen.
Die Verbindungen der Formel (II) umfassen 2-Methyl-l,4-benzochinon, 2,6-Di-tert.-butyl-1,4-benzochinon, 2,6-Dibrom-1,4-benzochinon, 2,3,4,5-Tetrafluor-1,4-benzochinon, 1,4-Naphthochinon, 2-Methyl-1,4-naphthochinon (im folgenden als Vitamin K₃ abgekürzt), 2-Hydroxy-3-methyl-1,4-naphthochinon, 2-(3,7-Dimethyloctyl)-3-hydroxy-1,4-naphthochinon, 2-Methoxy-3-methyl-1,4-naphthochinon, 2-Hydroxy-1,4-naphthochinon, 3-(4-Chlorphenyl)-2-hydroxy-1,4-naphthochinon, 2-Propylthio-1,4-naphthochinon und dergleichen.
Die Verbindungen der Formel (III) umfassen 5-Phenylrhodanin, 5-Phenyl-1,3-thiazolidin-2,4-dion, 5-Benzylidenrhodanin, 5-Benzyliden-1,3-thiazolidin-2,4-dion, 5,5-Diphenylrhodanin, 5,5-Diphenyl-1,3-thiazolidin-2,4-dion, 5-(4-Isoamyloxybenzyliden)rhodanin, 5-(4-Isoamyloxybenzyliden)-1,3-thiazolidin-2,4-dien, 5-(β-Methylcinnamyliden)rhodanin-3-essigsäure und dergleichen und nicht-toxische Salze derselben und nicht-toxische Säureadditionssalze derselben.
Hierbei sind die geeigneten nicht-toxischen Salze beispielsweise Salze eines Alkalimetalls (beispielsweise Kalium, Natrium und dergleichen), Salze eines Erdalkalimetalls (beispielsweise Calcium, Magnesium und dergleichen), Ammoniumsalze, Salze eines pharmazeutisch akzeptablen organischen Amins (beispielsweise Tetramethylammonium, Triethylamin, Methylamin, Dimethylamin, Cyclopentylamin, Benzylamin, Phenethyla min, Piperidin, Monoethanolamin, Diethanolamin, Tris(hydroxymethyl)amin, Lysin, Arginin, N-Methyl-D-glucamin und dergleichen).
Hierbei umfassen die geeigneten Säureadditionssalze die Salze mit anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure, und die Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Trifluoressigsäure, Milchsäure, Weinsäure, Oxalsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Isethionsäure, Glucuronsäure und Gluconsäure.
Die Verbindungen der Formeln (I), (II) und (III) sind als solche bekannt oder sie können unter Verwendung von anderen Ausgangsmaterialien ohne weiteres durch als solche bekannte Verfahren hergestellt werden.
Wenn die verwendeten Substanzen einer Tyrosinphosphorylierung unterzogen werden, verbessern diese Mittel nicht nur die von Diabetes stammenden hyperglykämischen Zustände, sondern sie sind auch zur Behandlung und/oder Prophylaxe von Diabetes, insbesondere insulinunabhängigen Diabetes mellitus (NIDDM) verwendbar.
Es wurde bestätigt, dass die Toxizität der verschiedenen Wirkstoffe und Salze derselben sehr gering ist. Daher können die verschiedenen Wirkstoffe und Säureadditionssalze derselben als sicher und zur pharmazeutischen Verwendung geeignet angesehen werden.
Für den im vorhergehenden beschriebenen Zweck können das Polypeptid, die einzelnen Wirkstoffe und Säureadditionsalze derselben normalerweise systemisch oder partiell, üblicherweise durch orale oder parenterale Verabreichung verabreicht werden.
Die zu verabreichenden Dosismengen bestimmen sich in Abhängigkeit von beispielsweise Alter, Körpergewicht, den Symptomen, der gewünschten therapeutischen Wirkung, dem Verabreichungsweg und der Dauer der Behandlung. Beim erwachsenen Menschen betragen die Dosismengen pro Person pro Dosis bei oraler Verabreichung bis zu mehrere Male pro Tag zwischen 10 μg und 1000 mg und bei parenteraler Verabreichung bis zu mehrere Male pro Tag und bei kontinuierlicher intravenöser Verabreichung zwischen 1 und 24 h pro Tag zwischen 10 μg und 100 mg.
Wie im vorhergehenden angegeben, hängen die zu verwendenden Dosismengen von verschiedenen Bedingungen ab. Daher können Fälle auftreten, bei denen niedrigere oder größere Dosismengen als die im vorhergehenden angegebenen Bereiche verwendet werden können.
Bei der Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung können diese als feste Zusammensetzungen, flüssige Zusammensetzungen oder andere Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung, als Injektionen, Einreibungen oder Suppositorien zur parenteralen Verabreichung verwendet werden.
Feste Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung umfassen Presstabletten, Pillen, Kapseln, dispergierbare Pulver und Granulate. Kapseln umfassen harte Kapseln und weiche Kapseln.
Bei derartigen Zusammensetzungen werden eine oder mehrere der aktiven Verbindungen mit mindestens einem inerten Verdünnungsmittel (wie Lactose, Mannit, Glucose, Hydroxypropylcellulose, mikrokristalline Cellulose, Stärke, Polyvinylpyrrolidon, Magnesiummetasilicataluminat) gemischt. Die Zusammensetzungen können auch, wie es normale Praxis ist, weitere Substanzen neben den inerten Verdünnungsmitteln umfassen: beispielsweise Gleitmittel (wie Magnesiumstearat), den Zerfall fördernde Mittel (wie Cellulosecalciumglykolat), Stabilisierungsmittel (wie Lactose) und eine Auflösung unterstützende Mittel (wie Glutaminsäure, Asparginsäure).
Die Tabletten oder Pillen können, falls gewünscht, mit einem Film aus gastrischem oder enterischem Material (wie Zucker, Gelatine, Hydroxypropylcellulose oder Hydroxypropylmethylcellulosephthalat) überzogen oder mit mehr als zwei Filmen überzogen werden. Ein Überzug kann die Aufnahme in Kapseln aus absorbierbaren Materialien, wie Gelatine, umfassen.
Flüssige Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung umfassen pharmazeutisch akzeptable Lösungen, Emulsionen, Suspensionen, Sirupe und Elixiere. Bei derartigen Zusammensetzungen sind eine oder mehrere der aktiven Verbindungen in einem inerten Verdünnungsmittel bzw. inerten Verdünnungsmitteln, die üblicherweise einschlägig verwendet werden (beispielsweise gereinigtes Wasser, Ethanol) enthalten. Neben inerten Verdünnungsmitteln können derartige Zusammensetzungen auch Hilfsstoffe (wie Benetzungsmittel, Suspendiermittel), Süßungsmittel, Aromastoffe, Duftstoffe und Konservierungsmittel umfassen.
Andere Zusammensetzungen zur oralen Verabreichung umfassen Sprayzusammensetzungen, die nach bekannten Verfahren hergestellt werden können und die eine oder mehrere der aktiven Verbindungen umfassen. Sprayzusammensetzungen können neben inerten Verdünnungsmitteln weitere Substanzen umfassen: beispielsweise Stabilisierungsmittel (wie Natriumsulfat), isotonische Puffer (wie Natriumchlorid, Natriumcitrat, Citronensäure). Zur Herstellung derartiger Sprayzusammensetzungen kann beispielsweise das im US-Patent Nr. 2 868 691 oder 3 095 355 beschriebene Verfahren verwendet werden.
Injektionen zur parenteralen Verabreichung umfassen sterile, wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emul sionen. In derartigen Zusammensetzungen sind eine oder mehrere aktive Verbindungen mit mindestens einem inerten wässrigen Verdünnungsmittel (wie destilliertes Wasser zu Injektionszwecken, physiologische Salzlösung) oder inerten nichtwässrigen Verdünnungsmittel (wie Propylenglykol, Polyethylenglykol, Olivenöl, Ethanol, POLYSORBATE 80 (registriertes Warenzeichen)) gemischt.
Injektionen können neben inerten Verdünnungsmitteln weitere Materialien umfassen: beispielsweise Konservierungsmittel, Feuchthaltemittel, Emulgatoren, Dispergiermittel, Stabilisierungsmittel (wie Lactose) und eine Auflösung fördernde Mittel (wie Glutaminsäure, Asparginsäure).
Sie können beispielsweise durch Filtration durch ein Bakterienrückhaltefilter, durch Einarbeiten von Sterilisationsmitteln in die Zusammensetzungen oder durch Bestrahlung sterilisiert werden. Sie können auch in Form steriler fester Zusammensetzungen durch beispielsweise Gefriertrocknen hergestellt werden, die dann in sterilem Wasser oder einem anderen sterilen Verdünnungsmittel bzw. anderen sterilen Verdünnungsmitteln zu Injektionszwecken unmittelbar vor der Verwendung gelöst werden können.
Andere Zusammensetzungen zur parenteralen Verabreichung umfassen Flüssigkeiten zur äußeren Anwendung und endermische Einreibungen, Salben, Suppositorien und Pessare, die eine oder mehrere der aktiven Verbindungen umfassen und nach als solche bekannten Verfahren hergestellt werden können.
Beispiel
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, ohne diese jedoch zu beschränken.
Beispiel 1
Reinigungsverfahren für pp140
Unter Verwendung von Zellschalen (225 cm²) wurden Ratten-L6-Zellen 7–10 Tage lang in einer 5%-CO₂-Atmosphäre bei 37°C inkubiert. Das Kulturmedium wurde in Abständen von 3 Tagen mit dem nach Dulbecco modifizierten Eagle-Medium (das 10 Rinderfetusserum (BFS) enthielt) ersetzt. 2 h nach der Behandlung der aus Skelettmuskelmyoblasten entwickelten Muskelzellen mit serumfreiem Medium wurden 500 μM Vanadinsäure (Vanadat) zu der Kultur gegeben und weitere 10 min lang inkubiert. Die Zellen wurden dann in Tris-Puffer (400 μM Vanadat mit Proteaseinhibitor) suspendiert, lysiert und zentrifugiert, bevor der Überstand isoliert wurde.
Der Überstand wurde mit Octa(ethylenglykol)ether (C12E8) auf eine Endkonzentration von 0,1% eingestellt, bevor er über eine Millipore-Membran filtriert wurde. Ein Protein-G-Sepharosegel, an das Anti-phosphotyrosin-Antikörper gebunden waren, wurde mit der filtrierten Probe gefüllt. Das tyrosinphosphorylierte Protein (pp140) adsorbierte an dem Gel. Nach dem Spülen der Säule mit 25 mM Trispuffer wurde pp140 mit 10 mM Phenylphosphat eluiert. Das Eluat wurde mit Centricon 30 eingeengt, bevor pp140 durch das Acetonfällverfahren gefällt wurde.
Beispiel 2
Tyrosinphosphorylierung von p140 in verschiedenen Geweben
Unter Verwendung des nach Dulbecco modifizierten Eagle-Medium (das 10% BFS enthielt) wurden verschiedene Zellen (1 × 10⁵ Zellen/Schale) unter einer 5%-CO₂-Atmosphäre 5–8 Tage lang bei 37°C inkubiert. Die Zellen waren Skelettmuskelzellen, die sich aus Skelettmuskelmyoblasten differenziert hatten. Die differenzierten Zellen, die zuvor 4 h lang in serumfreiem, nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium behandelt wurden, wurden mit und ohne Amylin (100 pM) inkubiert, bevor sie weitere 24 h lang inkubiert wurden. Kulturen wurden mit Insulin (100 nM) behandelt und danach über einen festen Zeitraum (10 oder 60 min) inkubiert.
Nach dem Spülen der Kulturen mit eiskaltem Phosphatpuffer wurden die Zellen mit Phosphatpuffer, der 0,5% Octa(ethylenglykol)ether (C₁₂E₈) enthielt, lysiert. Das pp140 wurde durch Sepharoperlen, an die Phosphotyrosinantikörper (Transformation Corp.) gebunden war, gewonnen, bevor es mit Phenylphosphat und Western-Blotting-Verfahren eluiert bzw. erfasst wurde. Der Bandengehalt von pp140 wurde mittels eines Densitometers unter Verwendung von gereinigtem pp140 als Standard bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
TABELLE 1 Wirkungen der p140-Tyrosinphosphorylierung auf verschiedene Gewebe
In Tabelle 1 wurden die Kulturen 24 h vor der Zugabe von Insulin (100 nM) mit Amylin (100 pM) behandelt.
Beobachtung
Das Auftreten von pp140, das innerhalb von 10 min beobachtet wurde, wenn Ratten-L6-Zellen mit Insulin inkubiert wurden, wurde durch eine Amylinbehandlung antagonistisch beeinflusst. Außerdem wurde dieses Phänomen in ähnlicher Weise bei Rattenhepatocyten, FaO-Zellen, erkannt. Ferner ist dieses Phänomen nicht nur auf Ratten begrenzt. Bei humanen Muskelzellen (A673-Zellen) und Hepatocyten (HepG2-Zellen) wurde das Phänomen in ähnlicher Weise erkannt. Es wird postuliert, dass Amy-lin eine bestimmte Stufe oder bestimmte Verfahren, bevor die p140-Phosphorylierung durch das Phosphorylierungssignal von Insulin ausgelöst wird, unterdrückt.
Beispiel 3
Wirkungen verschiedener Testverbindungen auf die p140-Phosphorylierung
Ratten-L6-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/Schale) wurden in dem nach Dulbecco modifizierten Eagle-Medium (das 10% BFS enthielt) 8 Tage lang unter einer 5%-CO₂-Atmosphäre bei 37°C inkubiert. Die verwendeten Zellen waren aus Skelettmuskelmyoblasten differenzierte Muskelzellen. Nach der Behandlung der differenzierten Skelettmuskelzellen in serumfreiem, nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium während 4 h wurden verschiedene Testverbindungen (10 mM, mit Ausnahme von Insulin, 1 mM) zugegeben, bevor die Kulturen über einen festen Zeitraum weiter inkubiert wurden.
Nach dem Spülen der Kulturen mit eiskaltem Phosphatpuffer wurden die Zellen mit Phosphatpuffer, der 0,5% Octa(ethylenglykol)ether (C₁₂E₈) enthielt, lysiert. Das pp140 wurde durch Cephaloperlen, an die Phosphortyrosinantikörper (Transformation Corp.) gebunden war, gewonnen, bevor es mit Phenylphosphat und Western-Blotting-Verfahren eluiert bzw. erfasst wurde. Der Bandengehalt von pp140 wurde mittels eines Densitometers unter Verwendung von gereinigtem pp140 als Standard bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angegeben.
TABELLE 2 Wirkungen der p140-Tyrosinphosphorylierung auf verschiedene Testverbindungen
Beispiel 4
Verstärkungswirkung auf die Glucoseaufnahme
Ratten-L6-Zellen (1 × 10⁵ Zellen/Schale) wurden in nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (das 10% BFS enthielt) 8 Tage lang unter einer 5%-CO₂-Atmosphäre bei 37°C inkubiert. Die verwendeten Zellen waren aus Skelettmuskelmyoblasten differenzierte Skelettmuskelzellen. Nach einer 2-stündigen Behandlung der differenzierten Skelettmuskelzellen in serumfreiem, nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium wurden verschiedene Testverbindungen (10 mM, mit Ausnahme von Insulin, 1 mM) zugegeben, bevor die Kulturen über einen festen Zeitraum von 2 h weiter inkubiert wurden. Die Kulturen wurden danach 20 min lang mit Krebs-Ringer-Phosphatpuffer (pH-Wert: 7,4) behandelt und dann mit 5 mM ³H-2-Desoxyglucose (0,05 mCi/ml) inkubiert. 3 min nach Beginn der Inkubation wurde der aufgenommene Radioaktivitätsgehalt in den Zellen mit einem Flüssigszintillationszähler bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 angegeben.
TABELLE 3 Verstärkungswirkung auf die Glucoseaufnahme
Beobachtung
Von allen Verbindungen, die die p140-Phosphorylierung förderten, wurde festgestellt, dass sie eine Glucoseaufnahmewirkung aktivierten (Tabelle 2 und 3).
Beispiel 5
Wirkungen von Vitamin K₅ auf Diabetes
Das Diabetes-Modell unter Verwendung von Streptozotocin (STZ) wurde in männlichen Wistar-Ratten (STZ-Ratten) etabliert.
Nach der Verabreichung verschiedener intraperitonealer (i.p.) Tagesdosisgaben von Vitamin K₅ während 3 aufeinanderfolgenden Tagen an STZ-Ratten (eine Verabreichung pro Tag) wurden der Gehalt von Glucose, Neutralfett und Cholesterin im Blut bestimmt. Entsprechend erhielten STZ- und normale Ratten Vehikel (physiologische Kochsalzlösung) mit identischen Tagesraten und identischer Dauer verabreicht, bevor ähnliche Blutindizes, die im vorhergehenden genannt wurden, bestimmt wurden. Außerdem wurden Ratten, die subkutan (s.c.) Insulin (8 U/kg) pro Tag (eine Verabreichung pro Tag) während 3 aufeinanderfolgenden Tagen verabreicht erhielten, als positive Kontrollen verwendet. Die Ergebnisse sind in 1 bis 3 angegeben.
Beobachtungen
Die Verabreichung von Vitamin K₅ während 3 aufeinanderfolgenden Tagen löste eine Erholung von den Änderungen, die bei allen Blutindizes bei Ratten gefunden wurden, d. h. dem Gehalt an Glucose, Neutralfett und Cholesterin, aus.
Beispiel 6
Analyse der partiellen Aminosäuresequenz von pp140
In Beispiel 1 gereinigtes pp140 wurde durch Elektrophorese isoliert, anschließend in einer PVDF-Membran transkribiert, mit Trypsin behandelt und ferner mittels Flüssigchromatographie isoliert. Das auf diese Weise isolierte pp140-Fragment wurde dann unter Verwendung des automatischen Gasphasenproteinsequenzierers Modell 470A/PTH Analyzer Modell 120A (ABI oder Applied Biosystem Inc. Corp., USA) und des intensiv angewandten Edman-Abbauverfahrens sequenziert, bevor dessen partielle Aminosäuresequenz bestimmt wurde. Die Sequenz ist in der Sequenztabelle 5 bis 7 angegeben.
Beispiel 7
Partielle Aminosäuresequenzierung von pp140 durch das Polymerasekettenreaktions(PCR)verfahren
Unter Verwendung intensiv verwendeter Verfahren wurden verschiedene Primer von den auf diese Weise isolierten partiellen Aminosäurefragmenten abgeleitet und deren jeweilige Kombinationen durchgeführt, bevor das PCR-Verfahren angewandt wurde. Die Ergebnisse zeigten ein spezifisches amplifiziertes Fragment mit einer ungefähren Länge von 400 bp.
Beispiel 8
Isolierung und Reinigung von mRNA
Während der logarithmischen Wachstumsphase wurde mRNA aus 3 × 10⁷ Muskelmyoblasten-L6-Zellen (ATCC-Stamm Nr. CRL-1458) gemäß dem Verfahren von Okayama et al. (Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)) isoliert.
Kurz gesagt, wurde nach der Lyse der Zellen mit 5,5 M GTC-Lösung (5,5 M Guanidinthiocyanat, 25 mM Natriumcitrat und 0,5 % Natriumlaurylsarcosin) das Lysat über eine Cäsiumtrifluoracetatlösung (Dichte: 1,51) geschichtet und das Zelllysat mit 120 000 x g 20 h zentrifugiert und danach die gesamte RNA im Pellet gewonnen. Die RNA-Probe wurde zweimal über eine oligo-dT-Cellulose-Säule gegeben, bevor durch Reinigung 106 μg poly(A)⁺RNA gewonnen wurden.
Beispiel 9
Gewebeverteilung von p140-mRNA
Aus verschiedenen Geweben wurde poly(A)⁺RNA gemäß den von Beispiel 8 ähnlichen Verfahren gereinigt. Die jeweiligen aus Gewebe stammenden poly(A)⁺RNA-Proben (jede Probe: 2 μg) wurden einer Agarosegelelektrophorese unterzogen und anschlie ßend durch ein Filter geschickt. Das offene Leseraster von 2 kb wurde markiert und als innere Kontrolle verwendet, bevor eine normale Hybridisierung erfolgen konnte. Eine Autoradiographie wurde an der spezifisch gebundenen Sonde durchgeführt und sie wurde mittels densitometrischen Analysen mit einem Imaginganalysator verwendet. Wenn das Auftreten von β-ActinmRNA in den verschiedenen Geweben als 100 angenommen wurde, sind der relative Gehalt von p140 in Geweben in Tabelle 4 angegeben.
TABELLE 4 Gewebeverteilung von p140-mRNA
Beobachtung
Die Prüfung der gesamten untersuchten verschiedenen Gewebe zeigt das Auftreten von mRNA, deren Wirkungen doch über einen großen Bereich von Geweben ausstrahlen. Ein hohes Auftreten von mRNA findet sich speziell im Pankreas des Menschen.
Beispiel 10
Erstellen der cDNA-Bibliothek
Eine cDNA-Bibiothek wurde gemäß dem modifizierten Verfahren von Gubler und Hoffman (Gene, 25, 263 (1983)) erstellt.
Aus der in Beispiel 2 abgeleiteten poly(A)⁺RNA (5 μg) wurde mit dem Enzym der reversen Transkription ein erster Strang konstruiert und anschließend ein zweiter Strang mit EcoRI-Adaptorligation transformiert, bevor überschüssige Adaptoren und Primer durch Gelfiltrationssäulenchromatograpie (Sephacryl S-500HR-Säule; Pharmacia Corp.) entfernt wurden. Die verbliebenen 1620 ng der cDNA-Fraktion wurden anschließend gewonnen.
Die obigen Konstruktionsverfahren für eine cDNA-Bibliothek wurden mit einem λgt-10-Klonierungssystemkit (Amersham Corp.) durchgeführt.
Als nächstes wurden der λgt-10-Phage (Amersham Corp.) und der λZAPII-Phage (Stra Tagene Corp.) an den EcoRI-behandelten Armen zu einer mittleren Länge von 1,8 kb legiert. Eine PhagencDNA-Bibliothek einer unabhängigen Zahl von 3 × 10⁵ wurde erstellt.
Beispiel 11
Klonierung und Sequenzierung
Auf der Basis der in Beispiel 10 erstellten Phagen-DNA-Bibliothek wurden Klone zu etwa 1 × 10⁵ Plaques/Platte dupliziert. Die in Beispiel 7 geernteten Fragmente von etwa 400 bp wurden als Sonden eingesetzt, bevor ein Durchmustern durchgeführt wurde. Bei den positiven Kontrollen wurde eine Subklonierung langer Stränge der Inserts an der EcoRI-Stelle des Plasmidvektors pGEM-3Zf(+) (3199 bp; Promega Corp.) festge stellt. Eine Sequenzierung wurde mit T7 oder SP6 als Primer durchgeführt.
Die DNA-Sequenzierung wurde auf der Basis des Didesoxyterminatorverfahrens gemäß dem Cyclosequenzierungsverfahren unter Verwendung eines fluoreszierenden Diterminators (ABI, USA) durchgeführt. Ferner wurde das Lesen der Sequenz mit einem DNA-Sequenzierer (Modell 373A; ABI, USA) durchgeführt.
Auf diese Weise wurden Nucleotidsequenzen von im Mittel 300 Basen, ausgehend von der 5'- oder der 3'-Seite des jeweiligen Klons, festgestellt.
Beispiel 12
Partielle Sequenzanalyse
Wenn die Nucleotidsequenz von Beispiel 11 einer Homologierecherche mit allen in einer bereits registrierten Datenbank (GenBank und EMBL) gespeicherten Nucleotidsequenzen mit dem FASTA-Programm von Lipman und Pearson unterworfen wurden, wurden die sequenzierten Klone als Klone, die neue Sequenzen enthielten, identifiziert. Die Nucleotidsequenzen des identifizierten Klons wurden in Aminosäuresequenzen auf der Basis von drei möglichen konstruierten Rastern umgewandelt.
Ferner wurden in den Aminosäuresequenzen auch neue Aminosäuresequenzen entdeckt.
Jedoch umfasst der cDNA-Klon, der kloniert wurde, nicht zwangsläufig die gesamte Länge der mRNA. In diesem Fall ist es sehr unwahrscheinlich, dass der Klon den N-Terminus der Aminosäuresequenz enthält.
Daher wurde Northern-Analyse verwendet, um zu bestimmen, ob die gesamte Länge des ermittelten Klons vollständig war. Mit anderen Worten, wurde die poly(A)⁺RNA, die durch die Verfahrensmaßnahmen von Beispiel 8 → Beispiel 9 durch Elektrophorese isoliert wurde, auf eine Nylonmembran geblottet. Wenn das subklonierte cDNA-Insert als Sonde hybridisiert wurde, wurde eine einzelne Bande an der Position von etwa 4400 by beobachtet. Da die Größe der Klone etwa 2200 by betrug, wurde eine PCR an der 5'- und 3'-Seite durchgeführt, um die gesamte Länge der cDNA mit den 3'-RACE (BRL Corp.)-System- und 5'-RACE (CLONTECH Corp.)-Systemkits zu lesen.
Beispiel 13
Bestimmen der Sequenz und des offenen Leserasters der gesamten Länge der cDNR
Ein Random Sequencing der gesamten Länge der cDNA-Sequenz wurde gemäß dem Verfahren von Sambrook et al. (Molecular Cloning: Hrsg. J. Sambrook, E. F. Fritsch, T. Maniatis, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt.
Kurz gesagt, wurde ein Plasmid aus dem Klon gewonnen und das isolierte cDNA-Insert dann gereinigt, bevor eine Ligation und Fragmentierung durchgeführt wurde. Das Ende des DNA-Fragments wurde ferner durch T4-Polymerase geglättet und DNA-Fragmente einer Länge von etwa 400 by wurden mittels Agaroseelektrophorese gewonnen. Die auf diese Weise erhaltenen DNA-Fragmente wurden in die SmaI-Seite eines Plasmidvektors und von pGEM-3Zf(+) (3199 bp; Promega Corp.) kloniert, bevor die Transformation in E. coli erfolgte. 80 Kolonien wurden willkürlich entnommen und die Plasmid-DNAs wurden gereinigt, bevor eine DNA-Sequenzierung dieser 20 Plasmide (die cDNA-Fragmente als Inserts besaßen) erfolgte. Die DNA-Sequenzierung und das Lesen der Sequenz wurde gemäß dem in Beispiel 11 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Sequenzdaten der cDNA-Fragmente wurden zu den Verknüpfungssequenzen mit dem DNA-Sequenzprogramm von DNASIS konstruiert. Ruf diese Weise wurde die in SEQ. ID NO: 3 angegebene Basissequenz konstruiert. Aus Sequenzdaten der gesamten Länge der cDNA wurde das offene Leseraster (ORF) bestimmt. Die Aminosäuresequenz wurde ferner translatiert und die auf diese Weise ermittelte Sequenz ist in SEQ. NO: 1 angegeben. Eines der Raster besitzt das ORF von 2993 bp, das annähernd 3000 by der gesamten ORF-Länge der Eck-Familie entspricht. Daher wird postuliert, dass das Polypeptid der vorliegenden Erfindung eine Gesamtlänge von 2993 by besitzt.
Aufgrund von dessen Hydrophobie wurde ferner postuliert, dass das Protein p140 ein typisches Typ-I-Membranprotein ist (4 markiert die Zone mit entweder hoher (+) oder niedriger (-) Hydrophobie).
Insgesamt ist das p140-Polypeptid ein typisches Membranprotein mit 993 Aminosäuren und die Länge von dessen ORF beträgt 2982 bp. Ferner ist das geschätzte Molekulargewicht des p140-Polypeptids 109 8b0 Da und 140 kD, wenn dieses aufgrund der Bindungen von dessen Polysaccharidkette abgeschätzt wurde.
Beispiel 14
Konstruktion eines Plasmidvektors zur Verwendung zur Herstellung eines Expressionsvektors
Als Expressionsvektor wurde ein Derivat von pUC-SRαML-1 (dieser Vektor und die Herstellung desselben sind in der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 559428 offenbart) verwendet. Dieses Derivat wurde so konstruiert, dass zwei Fragmentarten, die im folgenden angegeben sind:
zwischen PstI und SacI bzw.
zwischen der SpeI- und KpnI-Stelle an der Multiklonierungsstelle insertiert wurden.
Der pUC-SRαML1-Vektor wurde mit PstI und SacI verdaut und der entstandene Verdau wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, wobei ein Fragment von etwa 4,1 kbp hergestellt und gewonnen wurde und anschließend die Phosphorsäuregruppe des 5'-Endes durch eine BAP (bakterielle alkalische Phosphatase)-Behandlung entfernt wurde. Das phosphorylierte DNA-Fragment T7 wurde mit dem auf diese Weise hergestellten Fragment von etwa 4,1 kbp aus pUC-SRαML1 ligiert, um eine Ringform herzustellen. Der erhaltene Vektor wurde ferner mit Spel und Kpnl verdaut und der erhaltene Verdau wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, wobei ein Fragment von etwa 4,1 kbp hergestellt und gewonnen wurde und danach die Phosphorsäuregruppe des 5'-Endes durch eine BAP (bakterielle alkalische Phosphatase)-Behandlung entfernt wurde. Das phosphorylierte DNA-Fragment SP6 wurde mit dem auf diese Weise hergestellten Fragment von etwa 4,1 kbp ligiert, wobei eine Ringform gebildet wurde. Der auf diese Weise konstruierte Plasmidvektor erhielt die Bezeichnung pUC-SRαML2 (siehe 3).
Beispiel 15
Konstruktion eines Expressionsvektors
Die Primer X, Y und YH, die mit Ratten-p140-cDNA hybridisieren, wurden synthetisiert. Die Sequenzen der Primer X, Y und YH sind die folgenden:
Primer X
Primer Y
Primer YH
Das Plasmid, das cDNA von p140 enthält, wurde einer PCR unter Verwendung der auf diese Weise synthetisierten Oligonucleotide X und Y als Template unterzogen. Das auf diese Weise erhaltene PCR-Fragment enthält eine an der 5'-Seite des Initiationscodons positionierte Sequenz, die einer einem Fachmann bekannten Cozac-Sequenz entspricht, und cDNA, die für ein aus dem p140-Protein bestehendes Proteinmolekül codiert. Das PCR-Fragment wurde mit SalI-SpeI verdaut und der erhaltene Verdau wurde abgetrennt und gereinigt und dann in die SalI-SpeI-Stelle des in Beispiel 14 hergestellten pUC-SRαML2 insertiert, wobei ein Expressionsvektor pUC-SRαML2-p140-A erhalten wurde.
Ferner wurde das cDNA von p140 enthaltende Plasmid einer PCR unter Verwendung der synthetisierten Oligonucleotide X und YH als Template unterzogen. Das auf diese Weise erhaltene PCR-Fragment enthält eine an der 5'-Seite des Initiationscodons positionierte Sequenz, die der einem Fachmann bekannten Cozac-Sequenz entspricht, und cDNA, die für ein Protein, das aus dem p140-Protein und sechs weiteren Histidin (His)-Resten, die an dessen C-Terminus gebunden sind, besteht, co diert. Das PCR-Fragment wurde mit SalI-SpeI verdaut und der erhaltene Verdau wurde abgetrennt und gereinigt und dann in die SalI-SpeI-Stelle des in Beispiel 14 hergestellten pUC-SRαML2 inseriert, wobei ein Expressionsvektor pUC-SRαML2-p140-B erhalten wurde.
Ferner wurden die Primer Z und ZH synthetisiert. Die Sequenzen der Primer Z und ZH sind die folgenden (Diese wurden an das aminoterminale Ende der Transmembranregion in cDNA angefügt):
Primer Z
Primer ZH
Das cDNA von p140 enthaltende Plasmid wurde einer PCR unter Verwendung der auf diese Weise synthetisierten Oligonucleotide X und Z als Template unterzogen. Das auf diese Weise erhaltene PCR-Fragment enthält eine an der 5'-Seite des Initiationscodons positionierte Sequenz, die der einem Fachmann bekannten Cozac-Sequenz entspricht, und cDNA, die für ein Polypeptid, das aus dem extrazellulären Teil des p140-Proteins besteht, codiert. Das PCR-Fragment wurde mit SalI und NotI verdaut und der erhaltene Verdau wurde abgetrennt und gereinigt und dann in die SalI-SpeI-Stelle des in Beispiel 14 hergestellten pUC-SRαML2 insertiert, wobei ein Expressionsvektor pUC-SRαML2-p140-C erhalten wurde.
Ferner wurde das cDNA von p140 enthaltende Plasmid einer PCR unter Verwendung der synthetisierten Oligonucleotide X und ZH als Template unterzogen. Das auf diese Weise erhaltene PCR-Fragment enthält eine an der 5'-Seite des Initiationscodons positionierte Sequenz, die der einem Fachmann bekannten Cozac-Sequenz entspricht, und cDNA, die für ein Polypeptid, das aus dem extrazellulären Teil des p140-Proteins und sechs weiteren Histidin (His)-Resten, die an dessen C-Terminus gebunden sind, besteht, codiert. Das PCR-Fragment wurde mit Sa-lI-SpeI verdaut und der erhaltene Verdau wurde abgetrennt und gereinigt und dann in die SalI-SpeI-Stelle des in Beispiel 14 hergestellten pUC-SRαML2 insertiert, wobei ein Expressionsvektor pUC-SRαML2-p140-D erhalten wurde.
Jedes der auf diese Weise konstruierten Plasmide pUC-SRαML2-p140-A, pUC-SRαML2-p140-B, pUC-SRαML2-p140-C und pUC-SRαML2-p140-D wurden in einen E. coli-Stamm DH5 transfiziert, aus einer 100-ml-Kultur der gebildeten Transformante gewonnen und dann zweimal mittels CsCl-Dichtegradientenzentrifugation gereinigt.
Beispiel 16
Expression in COS-Zellen
Jede der Plasmid-DNA-Zubereitungen pUC-SRαML2, pUC-SRαML2-p140-A, pUC-SRαML2-p140-B, pUC-SRαML2-p140-C und pUC-SRαML2-p140-D wurde mittels des Diethylaminoethyl(DEAE)-Dextranverfahrens (J. Immunology, 136, 4291 (1986)) in COS-7-Zellen (Cell, 23, 175 (1981)) eingeführt.
Das heißt, etwa 1,8 × 10⁶ COS-7-Zellen wurden in einen Kolben eines Fassungsvermögens von 225 cm² (hergestellt von Corning) zusammen mit 50 ml eines flüssigen Kulturmediums (nach Dulbecco modifiziertes MEM-Medium, das mit 10% entkomplementiertem Rinderfetusserum ergänzt war) überimpft. Nach der Inkubation in einem Kohlendioxidinkubator (37°C, 5% CO₂) über Nacht und der anschließenden Entfernung des Kulturüberstands wurden 12 ml eines DNA-Cocktails (nach Dulbecco modifiziertes MEM-Medium, das mit 15 μg jeder Plasmid-DNA, 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 7,4) und 400 μg/ml DEAE-Dextran ergänzt war) zu jedem Kolben gegeben und eine Kultur während 3 h bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ durchgeführt. Danach wurde der DNA-Cocktail durch 15 ml einer Chloroquinlösung (nach Dulbecco modifiziertes MEM-Medium, das mit 150 μM Chloroquin und 7% entkomplementiertem Rinderfetusserum ergänzt war) ersetzt und anschließend wurde weitere 3 h kultiviert.
Nach dem Entfernen der Chloroquinlösung wurde das im vorhergehenden genannte flüssige Kulturmedium (50 ml) zu jedem der erhaltenen Kolben gegeben, die dann bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO₂ 72 h lang inkubiert wurden, wobei ein Wachstum der Zellen in jedem Kolben in nahezu Einzelschichtform festgestellt wurde. Nach dem Entfernen des Kulturüberstands wurden die Zellen in jedem Kolben mit einem serumfreien flüssigen Kulturmedium (Handelsbezeichnung SFM-101, bei Nissui Pharmaceutical Co., Ltd. erhältlich) gewaschen und dann mit 75 ml des gleichen serumfreien flüssigen Kulturmediums versetzt und die Kultur wurde weitere 72 h lang fortgesetzt. Danach wurden die erhaltenen Kulturüberstände gewonnen und die Zellen, wie in Beispiel 1 angegeben, lysiert. Diese Überstände und Zelllysate wurden zur Entfernung von Zellabfällen durch ein Membranfilter (Handelsbezeichnung STERIVEX-GS, bei Millipore Corp. erhältlich) filtriert. Die auf diese Weise erhaltenen Kulturüberstandsproben wurden zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert. Die Zelllysate der COS-Zellen, die mit einem Plasmid, das die pUC-SRαML2-p140-A- und pUC-SRαML2-p140-B-Inserte enthielt, transformiert wurden, sollten exprimierte reife Proteineinheiten von Polypeptiden, die dem p-140-Protein entsprechen, enthalten. Und Kulturüberstände von COS-Zellen, die mit einem Plasmid, das die pUC-SRαML2-p140-C- und pUC-SRαML2-p140-D-Inserte enthielt, transformiert wurden, sollten sezernierte Polypeptide, die dem extrazellulären Teil des p140-Proteins entsprechen, enthalten.
Beispiel 17
Bestätigung der Expression
Eine Portion von 2 ml der einzelnen in Beispiel 16 erhaltenen Kulturüberstände von transformierten COS-Zellen wurde unter Verwendung eines Zentrifugenkonzentrationsfilters (Handelsbezeichnung Centricon-10, bei Millipore Corp. erhältlich) auf ein Volumen von 100 ml eingeengt. Eine Portion von 1 μl der einzelnen auf diese Weise eingeengten Proben wurde mit dem gleichen Volumen eines Ladepuffers (0,125 M Tris-HCl-Puffer (pH-Wert 6,8), 4% Natriumdodecylsulfat und 30% Glycerin) zur Verwendung für SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) gemischt, und das Gemisch wurde 3 min lang bei 90°C behandelt und dann einer SDS-PAGE unterzogen.
Im Falle der pUC-SRαML2-p140-B- und pUC-SRαML2-p140-D-Proteine mit am C-Terminus der Proteine eingeführtem His-Hexamer wurden nicht nur deren entsprechendfe Zelllysate und COS-Zellkulturüberstände, sondern auch deren gereinigte Produkte der SDS-PAGE-Analyse unterzogen.
Die Reinigung des Proteins wurde mittels Metallchelataffinitätschromatographie (Biotechnology, 9, 273 (1991)) unter Verwendung der Funktion von His zur Bildung von komplexen Verbindungen mit verschiedenen Übergangsmetallionen durchgeführt. Das heißt, ein Kulturüberstand (350 ml) oder von COS-Zellen erhaltene Zelllysate (100 ml) wurden mit einer wässrigen Natriumchloridlösung in einer derartigen Menge gemischt, dass die Endkonzentration des Salzes 1 M betrug und das erhaltene Gemisch wurde auf eine mit 4 ml einer chelatbildenden Sepharose mit gebundenem Zink (Handelsbzeichnung Chelating Sepharose Fast-Flow, von Pharmacia erhältlich) gepackte Säule appliziert, um das Protein am Harz zu adsorbieren. Die Säule wurde mit 50 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0), der eine 1 M wässrige Natriumchloridlösung (40 ml) enthielt, gewaschen, und das in der Säule zurückgehaltene Protein wurde mit 50 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0), der eine 1 M wässrige Natriumchloridlösung und 0,4 M Imidazol enthielt, eluiert. Danach wurde das erhaltene Eluat auf ein Volumen von 100 μl eingeengt, und eine Portion der eingeengten Probe wurde einer SDS-PAGE-Analyse unterzogen.
Die SDS-PAGE-Analyse wurde unter Verwendung eines SDS-10/20-Gradienten-Gels durchgeführt, und ein Produkt, das einem Molekulargewicht von p140 entspricht, wurde in aus COS-Zellen, die mit pUC-SRαML2-p140-A und -p140-B transfiziert waren, hergestellten Proben nachgewiesen. Ferner wurde ein Polypeptid, das dem Molekulargewicht des extrazellulären Teils von p140 entspricht, in unbehandelten und gereinigten Überständen, nicht den Zelllysaten, die aus mit pUC-SRαML2-p140-C und -p140-D transfizierten COS-Zellen hergestellt waren, nachgewiesen.
Formulierungsbeispiel 1
Die folgenden Komponenten wurden gemäß einem herkömmlichen Verfahren gemischt und ausgestanzt, wobei 100 Tabletten, die jeweils 5 mg des Wirkstoffs enthielten, erhalten wurden.

Vitamin K₅ 500,0 mg

Carboxymethylcellulosecalcium 200,0 mg

Magnesiumstearat 100,0 mg

mikrokristalline Cellulose 9,2 mg.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polypeptid des Proteins p140 mit der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Aminosäuresequenz in im wesentlichen gereinigter Form.
DNA mit Codierung für ein Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Nucleotidsequenz.
DNA mit Codierung für ein Polypeptid nach Anspruch 1 mit der in SEQ ID NO: 3 angegebenen Nucleotidsequenz.
Replikations- und Expressionsvektor, der DNA nach einem der Ansprüche 2 oder 3 umfasst.
Mit einem Replikations- und Expressionsvektor nach Anspruch 4 transformierte oder transfizierte Wirtszellen.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids durch Züchten von Wirtszellen nach Anspruch 5 unter Bedingungen, die die Expression eines Polypeptids nach Anspruch 1 bewirken.
Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper zu einem Polypeptid nach Anspruch 1.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid nach Anspruch 1 oder einen Antikörper nach Anspruch 7 in Verbin dung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel und/oder Träger enthält.
Mittel zur Verhinderung und/oder Behandlung von Diabetes, das ein Polypeptid nach Anspruch 1 enthält.
Verwendung eines Polypeptids nach Anspruch 1 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verhinderung oder Behandlung von Diabetes.
Verfahren zum Screenen eines Mittels zur Verhinderung und/oder Behandlung von Diabetes, wobei das Verfahren durch die Verwendung von Protein p140 gemäß Patentanspruch 1 gekennzeichnet ist.