KR100256664B1 - 단백질 p140의 신규 폴리펩티드 및 그를 암호하는 dna - Google Patents

단백질 p140의 신규 폴리펩티드 및 그를 암호하는 dna Download PDF

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Abstract

본 발명은 인슐린의 신호전달체계에 관여하는 주 단백질인 신규의 단백질 p140 폴리펩티드; 이의 제조방법; 상기 폴리펩티드를 암호하는 DNA; 상기 DNA로 유도된 벡터; 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포; 상기 폴리펩티드의 항체; 상기 펩티드 또는 항체를 포함하는 제약학적 조성물; 상기 단백질 p140의 티로신 인산화를 특징으로하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료방법; 상기 예방 및/또는 치료 방법을 위한 예방 및/또는 치료용 약제; 활성성분으로서 단백질 p140의 티로신을 인산화 할 수 있는 화합물 및 상기 예방 및 또는 치료 약제의 스크리닝 방법을 포함함을 특징으로 하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약제에 관한 것이다.
단백질 p140의 티로신 인산화는 글루코즈 흡수에 의한 저혈당의 유도에 필수적인 단계이다. 본 발명에서 단백질 p140의 티로신 인산화에 기초한 예방 및/또는 치료의 방법 및 약제는 당뇨병-유도된 고혈당 상태를 개선시킬 뿐아니라 당뇨병, 특히 비-인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM)의 치료 및/또는 예방에 유용하다.

Description

단백질 p140의 신규 폴리펩티드 및 그를 암호하는 DNA
제1도는 스트렙토조토신(STZ) 유도된 당뇨병성 쥐에서 혈중 글루코즈 함량에 대한 비타민 K5(VK5)의 효과를 도시한 그래프.
제2도는 스트렙토조토신(STZ) 유도된 당뇨병성 쥐에서 혈중 중성지방 함량에 대한 비타민 K5(VK5)의 효과를 도시한 그래프.
제3도는 스트렙토조토신(STZ) 유도된 당뇨병성 쥐에서 혈중 콜레스테롤 함량에 대한 비타민 K5(VK5)의 효과를 도시한 그래프.
제4도는 본 발명에서 단백질 p140의 폴리펩티드에 대한 소수성 프로필을 도시함.
제5도는 pUCSRaML2 벡터를 도시한다.
본 발명은 인슐린의 신호 전달 체계에 관여하는 주 단백질인 신규의 단백질 p140 폴리펩티드, 이의 제조방법, 이 폴리펩티드를 암호하는 DNA, 이 DNA로 유도된 벡터, 이 벡터로 형질전환된 숙주세포, 상기 폴리펩티드의 항체, 상기 펩티드 또는 항체를 포함하는 약학 조성물, 상기 단백질 p140의 티로신 인산화(본 명세서의 상세한 설명에는 인산화로 부르기도 함)를 특징으로 하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료 방법, 이러한 예방 및/또는 치료 방법을 위한 예방 및/또는 치료용 약제, 활성 성분으로서 단백질 p140의 티로신을 인산화할 수 있는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약제 및 상기 예방 및/또는 치료 약제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
비정상적 대사 질환인 당뇨병은, 글루코즈 대사 기작의 결함에 의해 유도된다.
정상 상태하에서, 글루코즈 대사는 다음과 같이 일어난다. 식품 형태로 섭취된 탄수화물은 순환계내로 흡수되기 전에 장에서 글루코즈로 분해된다. 췌장의 β 세포는 혈중 글루코즈 농도 증가에 응답 반응하여 인슐린을 분비하고, 이어서 표적 주변 조직(근육 및 간)을 자극하여 혈중 글루코즈의 조직 흡수와, 그 다음 저장용 글리코겐으로의 전환을 촉진함으로써 혈중 글루코즈 농도를 감소시킨다.
원인 인자에 따라, 당뇨병은 2개의 범주로 분류된다. 인슐린 의존성 당뇨병(IDDM) 및 비인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM), IDDM(제I형 당뇨병)은 식품 섭취에 의해 유도된 혈중 글로코즈 농도의 증가에 반응하여 췌장의 β 세포에 의해 인슐린이 분비되지 않거나, 불충분하게 분비되는 병리학적 상태를 의미한다. 췌장섬의 β 세포의 파괴가 IDDM을 유도하는 것으로 알려져 왔다. 최근의 치료법은 외부 공급원으로부터 인슐린을 보충하는 요법이 사용된다.
NIDDM(제II형 당뇨병)은 생체계내에서 정상적인 인슐린 분비가 일어남에도 불구하고, 주변 조직의 피드백 기작이 기능 부전으로 혈중 글루코즈 농도가 감소되지 않는 병리학적 상태를 의미한다. 미국에서, NIDDM은 흔히 나타나는 질병이며 40세 이상의 인구중 5%가 NIDDM 을 앓고있다. 그러나, 이 질병에 연관된 원인성 인자는 아직 밝혀지지 않았다.
NIDDM의 병인의 해명, 즉 주변 조직 세포에서 인슐린 유도된 글루코즈 흡수 기작의 해명은 인슐린의 정도 전달 기작에 대한 현재의 지식이 제한되고 확립되지 않은 상태로 남아 있기 때문에 불명확한 상태이다.
췌장섬으로부터 분비된 인슐린은 주변 조직 세포의 세포막에 존재하는 인슐린 수용체에 결합한다. 결합후 정보 전달에 관해서는 포스포릴라제 증배계 이론과 제2메신저 이론에 근거하여 현재 연구 중이다.
간단하게, 이들 두 이론을 하기와 같이 설명할 수 있다.
포스포릴라제 증배계 이론
인슐린이 인슐린 수용체의 α서브유닛에 결합할 경우, 내부 세포막상에 존재하는 β서브유닛은 수용체내 티로신 키나제 위치의 활성화를 수반하는 인산화를 일으킨다. 상기 티로신 키나제 효소에 의해 인산화된 기질로는 3 종류의 단백질이 밝혀져 있다. 그 중 1개는 1,235 개의 아미노산으로 구성되며, 분자량 185 kD의 인슐린 수용체 기질-1(IRS-1)이다. IRS-1의 티로신 인산화시, 포스파티딜이노시톨에 대한 포스포릴라제인 Pl 1-키나제는 복합체에 결합하여 복합체를 활성화한다. 막 및 막 주름내 글루코즈 수송자의 국재화에 관한 정보 전달에 관계하는 결합후 과정은 아직 확립되지 않고 있다. IRS-1 이외에 2개의 단백질 기질(Shc 및 PTP-1C)의 존재는 확인되었다. 그러나, 후속 기작에 대해서는 완전히 설명되어 있지 않은 상태이다.
제2메신저이론
인슐린이 인슐린 수용체에 대해 결합하면, 포스포리파제 C는 특이적으로 활성화되어 가수분해에 의해 포스파티딜이노시톨 글리칸(PIG)을 분해하여 이노시톨글리칸 (IG) 및 디아실글리세롤(DAG)을 생성한다. IG는 다양한 인슐린 유사 효과를 나타내는 것으로 보고되어 왔음에도 불구하고, 전형적인 글루코즈 흡수 효과에 대해 아직 입증된 바는 없다.
그러나, 프로테인 키나제 C가 DAG에 의해 활성화될 경우, 세포막내 프로테인 키나제 C의 국재화가 촉진되는 것으로 알려져 있다. 이것은 DAG가 순차적으로 내막 단백질을 인산화하여 최종적으로 글루코즈 흡수를 일으킴을 암시한다. 그러나, 이 암시는 아직 불명확한 상태로 남아있다.
지금까지 상기 2가지 다른 학설이 우세하게 인정되고 있음에도 불구하고, 정보 전달에 관한 결합후 과정의 초기 단계는 어떤 이론에 의해서든지 단지 부분적으로 밖에 설명될 수 없었다.
1988년에 코퍼등에 따르면, 고혈당증이 심각한 경우, 인슐린을 분비하는 것과 유사하게 b 췌장세포로 부터 방출되는 호르몬을 발견하고, 아밀린이라 불렀다. 또한, 아밀린이 인슐린의 작용을 억제한다는 발견에 기초하여, 상기 호르몬이 인슐린 길항물질로 사용될 수 있음을 밝혔다. 또, 1991년 추가 보고서를 통해 돌연변이 생쥐내에서 아밀린의 초과량 사용은 NIDDM을 유도한다는 것을 밝혔다. 그러나, 아밀린과 인슐린 정보 전달과의 관계는 아직까지 미개척된 상태이다.
본 발명의 발명자들은 아밀린의 인슐린 길항작용성 특성에 촛점을 맞추었다. 인슐린 정보 전달 체계에 대한 아밀린의 효과에 대한 지속적인 연구 수행으로 본 발명자들은 인슐린 정보 전달 체계를 조절하는데 있어서 아밀린의 억제 위치를 최초로 규명하였으며, 이 현상과 관련된 주 단백질인 인산화된 단백질 140과 70(pp140 및 pp70)을 발견하였다. 본 발명은 상기 단백질의 구조(DNA 염기 서열 및 아미노산 서열) 및 지금까지 불충분하게 설명된 인슐린 정보 전달 현상을 충분히 보충하는 그들의 기능을 명백히 밝혔다.
본 발명은 도시한 서열 번호 1로부터 합성된 상기 단백질 p140의 천연 아미노산 서열의 상동체 및 단편 서열에 관한 것이다. 또한, 이 상동체 및 단편 서열의 관련 폴리펩티드를 암호하는 DNA도 본 발명에 포함된다. 더 구체적인 양태로 표현하면, 상기 DNA는 서열 번호 2 및 3에 예시한 염기 서열에 하이브리드하는 단편을 선택적으로 암호하고(또는) 포함하는 것이다.
또한, 본 발명은 상기 단백질 p140의 티로신 인산화를 특징으로 하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료 방법; 이 예방 및/또는 치료 방법을 위한 예방 및/또는 치료용 약제; 활성 성분으로서 단백질 p140의 티로신을 인산화할 수 있는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약제; 및 상기 예방 및/또는 치료용 약제의 스크리닝 방법도 포함한다.
본 발명은 구체적으로
(1) 서열 번호 1에 예시한 아미노산 서열(들)로 합성된 폴리펩티드.
(2) 상기 (1)에 기재된 폴리펩티드을 암호하는 DNA,
(3) 서열 번호 2에 예시한 염기 서열을 포함하는 DNA,
(4) 서열 번호 3에 예시한 염기 서열을 포함하는 DNA,
(5) 단백질 p140의 티로신 인산화를 특징으로 하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료 방법,
(6) 단백질 p140의 티로신 인산화를 특징으로 하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약제,
(7) 활성 성분으로서 단백질 p140의 티로신을 인산화할 수 있는 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약제, 및
(8) 단백질 p140을 사용하는 것을 특징으로 하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약제의 스크리닝 방법을 포함한다.
건강한 쥐에게 7일 동안 아밀린(0.1 mg/kg, 복강내로, 1일 3회)을 투여하면, 인슐린 수용체 집단 및 분비된 인슐린 양의 범위가 모두 현저히 감소된다. 이 외에도, 글루코즈 수송자 4(Glut4)의 양 및 합성된 글리코겐 함량 역시 모두 감소(대조용 그룹과 비교하여 50% 미만으로 감소)하는 것으로 관찰되었고, 반면 혈중 글루코즈 농도는 1.7배 증가한 것으로 나타났다. 또, 쥐 골격근 근아세포의 L6 세포(ATCC 균주 번호 : CRL-1458)를 사용하는 실험에서는, 아밀린 투여시 세포내 글루코즈 흡수가 감소되는 것이 관찰되었다.
다음으로, 아밀린 처리된 골격근 근아세포에서 인슐린 유도된 티로신 인산화 증배계 중의 변화를 웨스턴 블롯법으로 항포스포티로신 항체를 사용하여 조사하였다. 상기 실험에서 L6 세포를 인슐린과 함께 배양하는 경우, 티로신 인산화는 증강되었다. 그러나, 유사한 조건하에서 아밀린으로 전처리한 후 인슐린과 함께 배양한 결과 인산화를 억제하는 2개의 다른 단백질이 존재함을 확인하였다. 이들 단백직은 그들 각각의 분자량에 따라 pp140과 pp70으로 칭한다. 또한, 인산화전 상기 단백질의 전구체는 이제부터 각각 p140과 p70으로 칭한다.
본 발명자는 pp140 및 pp70을 제조, 분리 및 정제한 후 부분적인 아미노산 서열을 결정하였다. 이 아미노산 서열과 스위스 프롯 릴리즈 2.0에 보관되고 있는 이전에 보고된 폴리펩티드 서열의 유사성을 비교해본 결과, pp70은 이전에 공지된 글루코즈 조절 단백질 70과 일치하였다. 그러나, pp140의 결과는 이전에 공지된 바 없는 전적으로 신규한 단백질이었다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 쥐 골격근 근아세포로 부터 p140의 mRNA를 분리하고, 분리된 p140의 mRNA를 사용하여 cDNA를 합성한 뒤, 전체적인 염기 서열 및 상기 단백질의 완전한 아미노산 서열을 결정하였다. 그 결과는 폴리펩티드 및 이 폴리펩티드를 암호하는 총 DNA 쇄가 완전히 신규의 것임을 입증함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 발견으로부터, 아밀린은 각각 p140을 pp140으로, p70을 pp70으로의 인산화를 억제할 수 있는 것으로 이해된다. 아밀린이 인슐린 수용체 결합에서부터 글루코즈 흡수까지의 과정을 억제한다고 간주할 경우, 역으로 해석하면 pp140 및 pp70을 생성하는 p140 및 p70의 인산화는 세포의 글루코즈 흡수 기작에서 중요역할을 한다는 것을 암시한다.
따라서, 본 발명의 발명자들은 p140 및 p70의 작용 기작을 해명하고자 시도하였다.
쥐 골격근 근아세포(쥐 L6 세포)를 인슐린 보충된 배양액에서 배양하는 경우, 3 일째에 pp140 밴드의 출현, 9 일째에 pp140의 생성이 꾸준히 관찰되었다. 유사한 간격(3일)으로 Glut4의 출현이 쥐 L6 세포 분열시 점차 증가하면서 유사하게 관찰되었다. 게다가, 쥐 골격근 근아세포의 다핵화는 유사한 배양계내에서 근세포를 형성하는 후속 분열과 함께 7 일째에 관찰되었다. pp70의 경우에서, 상기 세포는 7일째에 나타나며 14 일까지 단백질 생성을 지속하였다.
그러나, 세포내 pp140의 국재화를 조사한 결과, 이 단백질은 인슐린을 비혈청 처리된 L6 세포에 첨가하고 10 분동안 배양한 후 세포내 세포질의 과립체 막(MM)내에서 발견되었다. 그후 pp140은 사라졌다. 또한, pp140은 배양후 1 내지 2 시간째 세포 투과성 막(PM)에서 최초로 관찰되었다. 이러한 발견으로부터, pp140은 인슐린 처리 직후 세포질내에서 합성되며, 그 후 1 내지 2 시간내에 투과성 막(PM)으로의 이전이 일어난다는 것을 알 수 있다. 또한, 유사한 실험적 접근을 사용하여 L6 세포내 pp70 국재화를 조사한 결과, pp70은 배양 개시 직후 MM 내에 최초로 위치하고 배양후 10 분에서 최고 인산화량을 기록한 뒤, 배양후 3 시간째 점차 검출할 수 없는 값으로 감소하였다. 게다가, pp70은 배양개시 직후핵내에 위치하며, 그 단백질 함량은 점진적으로 증가하여 배양후 3 시간째 최고치를 기록하였다. 이러한 단백질 국재화 패턴으로부터, pp70은 인슐린 부재시 MM에 존재하지만, 인슐린 처리후 3 시간 내에 핵 분획으로 이동한다는 것을 알 수 있다.
상기 결과에 기초하여 pp140 정보 전달 기작은 하기와 같이 추정할 수 있다. 간단히 설명하면, 인슐린이 그 수용체에 결합하는 경우, 수용체는 자가 인산화에 의해 활성화된다. 정보는 단백질 포스포릴라제의 인산화에 의해 다양한 활성화 단계를 거쳐 후속적으로 p140을 pp140으로 인산화시킨다. 이 활성화된 pp140은 투과성 막(PM) 표면상에 위치하고, 그 후 p70이 다양한 단백질 인산화 과정을 동시에 수행한 후 인산화된다. 인산화된 pp70은 활성화된 후 핵내로 이동하여 핵내에서 Glut4 발현의 생물학적 활성을 일으킨다. 이 정보에 기초할 때, 세포질내에서 생성된 Glut4는 투과성 막(PM) 표면상에 위치하기 위해 이동하여 실질적으로 글루코즈 흡수를 일으키는 것이다.
상기 정보 전달 기작은 이 현상의 확고한 증거를 정당하게 확립할 수 있는 후속 실험을 하기에 제공한다. 어떤 경우에서든지, p140의 활성화는 세포내 글루코즈 흡수 및 잇따른 순환계내 저혈당을 유도하는데 필요한 필수적인 단계로 결론지을 수 있다.
이와 같이, 본 발명는 단백질 p140의 티로신 인산화를 특징으로 하여, 당뇨병, 특히 비인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM)을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
게다가, 본 발명은 단백질 p140의 티로신 인산화를 특징으로 하여, 당뇨병, 특히 비인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM)을 예방 및/또는 치료하는 약제에 관한 것이다.
본 발명에서, 단백질 p140의 티로신 인산화를 특징으로 하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료 방법과 약제는 단백질 p140의 티로신 인산화를 포함하는 주작용 기작에 기초한 당뇨병의 예방 및/또는 치료 방법 및 약제 모두 또는 전체를 포함한다.
추가로, 단백질 p140의 티로신을 인산화하는 세포는 골격근 근아세포(쥐 L6 세포) 뿐아니라 상기 인산화를 양성적으로 유도하는 모든 기타 세포를 포함한다. 대체로 상이 인산화를 나타내는 것으로 확인되어온 세포는 쥐 FaO 간세포, 인간 A673 근세포 및 HepG2 간세포를 포함한다.
간, 심장, 뇌, 비장, 폐, 신장, 고환, 태반 및 췌장같은 기관과 기타 근육은 본 발명의 p140 mRNA의 출현을 반복적으로 나타냈다. 근육 및 간에만 제한되지 않고, 티로신 인산화의 효과는 생체계를 통해 광범위하게 영향을 미친다. 이 발견으로부터 본 발명의 작용 기작은 근육 및 간 세포로 제한되지 않고, 심장세포, 뇌세포, 비장세포, 폐세포, 신장세포, 고환세포, 태반세포 및 췌장세포도 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드를 스위스 프롯 릴리즈 2.0에 기록된 이전에 공지된 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교하는 경우, 완전한 전체 서열이 본 발며의 폴리펩티드의 서열과 유사한 폴리펩티드는 동정되지 않았다. 또한, 젠뱅크 릴리즈 70에 기록된 이전에 보고된 뉴클레오티드 서열을 암호하는 본 발명의 완전한 전체 폴리펩티드의 단일 cDNA는 찾을 수 없었다. 따라서, 상기 본 발명의 펩티드는 완전히 신규의 단백질로 확인된다.
추가로, 상피 세포 키나제(Eck)로서 스위스 프롯 릴리즈 2.0에 이전에 기록된 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교한 결과 약 40% 동일함이 확인되었다. 따라서, 본 발명의 신규의 단백질은 Eck 족에 속하는 것으로 추정하였다.
본 발명에서, 실질적으로 정제된 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드 생성된 폴리펩티드의 90% 이상, 예를들어 95%, 98% 또는 99%가 서열 번호 1의 폴리펩티드인 생성된 폴리펩티드를 통상 포함할 것이다.
서열 번호 1의 펩티드 동족체는 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80 또는 90% 이상 및 보다 바람직하게는 95% 이상이 서열 번호 1의 폴리펩티드와 20이상, 바람직하게는 30 이상, 예를 들어 40, 60 또는 100 이상의 인접 이미노산 부위에 걸쳐 유사할 것이다. 그럽 펩티드 동족체도 이하에서는 본 발명에 따른 폴리펩티드로 부를 것이다.
통상, 서열 번호 1의 단편 또는 그의 동족체는 길이가 10 이상, 바람직하게는 15 이상, 예를들어 20, 25, 30, 40, 50 또는 60 개의 아미노산이며, 본 명세서에서 사용된 용어 "본 발명에 따른 폴리펩티드"에 포함된다.
서열 번호 2 또는 3의 DNA에 선택적으로 하이브리드를 형성할 수 있는 DNA는 서열 번호 2 또는 3의 DNA와 통상 70% 이상, 바람직하게는 80 또는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상이 20 이상, 바람직하게는 30 이상, 예를들어 40, 60 또는 100 이상의 인접하는 뉴클레오티드 영역에 걸쳐 상동성인 것이다. 이런 DNA 역시 용어 "본 발명에 따른 DNA"에 포함되는 것이다.
서열 번호 2 또는 3의 DNA 단편은 길이가 10 이상, 바람직하게는 15 이상, 예를들어 20, 25, 30 또는 40 개의 뉴클레오티드이며, 또한 본 명세서에서 사용한 "본 발명에 따른 DNA"에 포함된다.
본 발명은 추가의 양태로서 본 발명에 따른 DNA를 포함하는 복제 및 발현 벡터를 제공한다. 예를들어, 벡터는 복제 원점과 경우에 따라 상기 DNA의 발현을 위한 프로모터(promoter) 및 프로모터의 레귤레이터(regulator)를 보유한 플라스미드, 비루스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 1 개 이상의 선택성 마커(marker) 유전자, 예를 들어 암피실린 내성 유전자를 포함할 수 있다. 벡터는 시험관내에서, 예를 들어 DNA에 상응하는 RNA의 생성 또는 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환시키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 서열 번호 2 또는 3의 DNA 또는 이의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 본 발명에 따른 DNA의 복제 및 발현을 위한 벡터를 사용하여 형질전환 또는 형질 감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 세포는 벡터와 화합성인 것으로 선택하며, 예를들어 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유동물 세포일 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 본 발명의 폴리펩티드를 발현하기에 효과적인 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양함을 포함하여, 폴리펩티드를 생성하는 방법을 제공한다. 바람직하게 그 방법은 본 발명의 폴리펩티드가 발현되고 숙주 세포로부터 생성되는 조건하에서 수행한다.
또한, 본 발명에 따른 DNA는 안티센스 RNA의 생성을 입증하기 위해 안티센스 방향으로 상기 벡터에 삽입할 수 있다. 안티센스 RNA는 합성법에 의해 생성할 수 있다. 이런 안티센스 RNA는 세포내에서 본 발명의 폴리펩티드 농도를 조절하는 방법에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드에 대한 단일클론 또는 다중클론 항체를 제공한다. 추가로 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 단일클론 또는 다중클론 항체의 생성방법을 제공한다. 단일클론 항체는 면역원으로서 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용하여 종래의 하이브리도마 기술로 제조할 수 있다. 또한, 다중클론 항체는 본 발명의 폴리펩티드를 숙주 동물, 예를들어 쥐 또는 토끼에게 접종하고 면역 혈청을 회수하는 것을 포함하는 종래의 방법으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 약학적으로 허용가능한 희석제 및/또는 담체와 연합하여, 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드는 아미노산 서열의 일부가 결실된 폴리펩티드(예를들어, 서열 번호 1에 도시한 아미노산 서열내에서 생물학적 활성을 나타내는 필수 서열만을 포함하는 폴리펩티드), 아미노산 서열의 일부가 기타 아미노산으로 대체된 폴리펩티드(예를들어, 유사한 성질을 갖는 아미노산으로 대체된 폴리펩티드) 및 아미노산 서열의 일부분에 기타의 아미노산이 첨가 또는 삽입된 폴리펩티드 뿐아니라 서열 번호 1에 도시한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
공지된 바와 같이, 1개의 아미노산을 암호하는 코돈에는 1 내지 6 종류(예를들어, Met을 위한 1 종류의 코돈 및 Leu을 위한 6 종류의 코돈)가 알려져 있다. 따라서, DNA 뉴클레오티드 서열은 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호하면서 변할 수 있다.
(2)에 기재한 본 발명의 DNA는 서열 번호 1에 도시한 폴리펩티드(1)를 암호하는 모든 뉴클레오티드 서열의 그룹을 포함한다. 뉴클레오티드 서열을 변화시키면 폴리펩티드의 생성 수율이 증가될 가능성이 있다.
(3)에 기재한 DNA는 (2)에 도시한 DNA의 양태이며, 자연 형태의 서열이다.
(4) 기재한 DNA는 비번역부위를 가진 (3)에 상술한 DNA 서열을 나타낸다.
서열 번호 3에 도시한 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA는 하기 방법에 의해 제조할 수 있다.
(i) 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 세포주(예를들어, 쥐 골격근 근아세포 L6 세포)로 부터 mRNA를 분리하고,
(ii) 이렇게 얻은 mRNA로부터 제1쇄(1본쇄 DNA)를 제조하고, 뒤이어 제2쇄(이본쇄 DNA)를 제조(cDNA의 합성)하고,
(iii) 얻어지는 cDNA를 적당한 플라스미드 벡터에 삽입하고,
(iv) 이렇게 얻은 재조합 DNA를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시키고(cDNA 라이브러리의 제조),
(v) cDNA 라이브러리로부터 다량으로 무작위 클로닝하고, 뒤이어 각 클론의 5' 말단으로부터 평균 300 개의 염기를 서열 결정하고, 및
(vi) 신규의 염기 서열을 갖는 클론의 전길이를 서열결정한다.
상세히 설명하면, 단계 (i)은 대수 증식기의 쥐 골격근 근아세포의 L6 세포를 사용하여 문헌[참조 : Enzymology, 154, 3 (1987)]에 기술된 오카야마 에이치 등의 방법에 따라 수행할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 생성하는 세포의 예는 쥐 또는 인간의 근육, 간, 심장, 뇌, 비장, 폐, 신장, 고환, 태반 또는 췌장세포이며, 바람직하게는 쥐 골격근 근아세포 L6세포(ATCC 균주 번호 : CRL-1458), 쥐 간 FaO 세포, 인간 근율 A673 세포 또는 인간 간 HepG2 세포이다. 단계(ii), (iii) 및 (iv)는 cDNA 라이브러리를 제조하기 위한 일련의 단계이며, 문헌[참조 : Gene, Vol. 25, pp. 263, 1983]에 기술된 구블러와 호프만의 방법을 약간 변형하여 수행할 수 있다. 단계(iii)에서 사용하는 플라스미드 벡터의 예는 이.콜리 균주내에서 작용하는 많은 벡터(예를들어, pBR 322) 및 바실러스 섭틸리스 내에서 작용하는 벡터(예를들어, pUB 110)가 공지되어 있으며, 이. 콜리에서 작용하는 pGEM-3Zf(+)(프로메가 코오포레이션에서 제조하는 3,199 bp)를 바람직하게 사용할 수 있다. 단계 (iv)에서 사용한 숙주의 예로는 많은 세포가 이미 공지되어 있다. 어떤 세포라도 사용할 수 있으나, 문헌[참조 : Gene, Vol. 96, pp. 23, 1990]에 기술된 방법으로 제조된 DH5 감응 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 단계(v)에서 클로닝은 공지된 방법 그 자체로 수행할 수 있고 서열 결정은 맥삼-길버트 법 또는 디데옥시 종결법으로 수행할 수 있다. 단계 (vi)은 문헌[Molecular Cloning: Sambrook, J., Fritsch, E.F. 와 Maniatis, T., published by Cold Spring Harbor Laboratory Press in 1989] 에 기재된 방법으로 수행할 수 있다.
후속 단계로서, 이렇게 얻은 DNA가 올바른 단백질을 생성하는지의 여부를 조사할 필요가 있다. 조사는 (I) DNA 서열을 가능한 프레임하에 아미노산 서열로 전환시키는 단계, (II) 이렇게 얻은 DNA가 완전한 또는 거의 완전한 길이의 천연 mRNA를 생성하는지 확인하는 단계를 필요로 한다. 이들 확인은 전술한 단계(vi) 이후에 수행할 수 있으며, 효과적으로 단계(v)와 단계(vi) 사이에 수행할 수 있다.
상기 단계(II)는 노던 분석으로 수행할 수 있다.
일단 서열 번호 2와 3에 도시한 뉴클레오티드 서열이 결정되면, 본 발명의 DNA는 화학적 합성법, 프로브로서 본 발명의 DNA의 단편을 이용하는 PCR 방법 또는 하이브리드화로 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA는 이 DNA가 삽입된 벡터 DNA를 사용하여 적당한 숙주를 형질전환시키고, 뒤이어 형질전환된 세포를 배양함으로써 목적하는 양으로 얻을 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드(서열 번호 1)는
(1) 유기체 또는 배양된 세포로부터 분리 및 정제,
(2) 화학적으로 합성, 또는
(3) 생명공학 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 바람직한 것은 (3)에 기재된 방법을 이용하는 것이다.
생명공학 기술을 이용하여 폴리펩티드를 제조하는 경우, 발현체계는, 예를들어 박테리아, 효모, 곤충세포 및 보유동물세포의 발현체계이다.
예를들어, 이.콜리에서의 발현은 서열 번호 3에 도시한 뉴클레오티드 서열을 암호하는 DNA의 5' 말단에 개시 코돈(ATG)을 첨가하고, 이렇게 얻은 DNA를 적당한 프로모터(예를 들어, trp 프로모터, lac 프로모터, λPL프로모터, T7 프로머터등)의 하류에 연결한 후, 그것을 발현벡터를 제조하기 위해 이.콜리 균주내에서 작용하는 벡터(예를들어, pBR322, pUC18, pUC19 등) 내로 삽입함으로써 수행된다. 이렇게 얻은 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 이.콜리 균주(예를들어, 이.콜리 DH1 균주, 이.콜리 JM109 균주, 이.콜리 HB101 균주등)를 적당한 배지내에서 배양하여 목적하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 박테이라의 시그널 펩티드(예를들어, pelB의 시그널 펩티드)를 이용할 경우, 목적하는 폴리펩티드 세포질로 분비될 수 있다. 게다가, 기타 폴리펩티드와의 융합 단백질 역시 쉽게 생성될 수 있다.
추가로, 포유동물세포내에서의 발현은, 예를들어 서열 번호 3에 도시한 DNA를 적당한 벡터(예를들어, 레트로 비루스 벡터, 파필로마 비루스 벡터, 종두비루스 벡터, SV40 벡터등)내의 적당한 프로모터(예를들어, SV40 프로모터, LTR 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터등)의 하루에 삽입하여 발현 벡터를 얻고, 이렇게 얻은 발현 벡터를 사용하여 적당한 포유동물세포(예를들어, 원숭이 COS-7 세포, 중국 햄스터 CHO 세포, 쥐 L 세포등)를 형질전환시킨 후, 형질전환된 세포를 적당한 배지내에서 배양하여 목적하는 폴리펩티드를 배양 배지내에 얻는다. 이렇게 얻은 폴리펩티드는 종래의 생화학적 방법으로 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 단백질은 인산화된 및/또는 당 연결된 단백질의 반응 생성물을 포함한다. 간단히, 본 발명은 p140 폴리펩티드내에서 발견되는 p140-결합된 다당류 사슬 및 티로신 인산화된 p140(pp140)을 포함한다.
단백질 p140은 전술한 작용 기작을 가지는 것으로 추정된다. 그러므로, 본 발명의 단백질 p140 폴리펩티드는 단독으로 사용되는 경우 고형당 질환을 개선시킬 뿐 아니라 당뇨병, 특히 비인슐린 의존성 당뇨병(NIDDM)의 예방 및/또는 치료에 유용할 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질 p140 폴리펩티드에 대한 다중클론 또는 단일클론 항체는 유기체내에서 상기 폴리펩티드의 정량에 사용할 수 있고, 이로써 상기 폴리펩티드와 질병사이의 관계 조사 또는 질병 진단등의 목적으로 사용할 수 있다. 이의 다중클론 및 단일클론 항체는 항원으로서 상기 폴리펩티드 또는 이의 단편을 사용하는 종래의 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 DNA는 진단 및 유전자 질병의 치료(유전자 결손 질병의 치료 및 안티센스 DNA(RNA)등에 의해 폴리펩티드의 발현의 저해로 인한 치료) 및 진단이나 기타 다양한 용도를 가질 것으로 기대되는 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는데 중요하고 필수적인 주형으로 이용할 수 있다. 추가로, 게놈 DNA는 프로브로서 본 발명의 DNA를 이용하여 분리할 수 있다. 유사하게, 인간 또는 기타의 종에서 본 발명의 DNA와 높은 상동성을 갖는 유전자의 분리도 가능하다.
추가로, 본 발명은 활성 성분으로서 단백질 p140의 티로신을 인산화할 수 있는 화합물을 포함하는 것으로 특징지워지는, 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약제에 관한 것이다.
대체로, 티로신 인산화된 단백질 p140 생성물은 상기 활성을 갖는 것으로 현재 확인된 물질 뿐아니라 차후에 상기 활성을 가질 것으로 확인되는 모든 물질을 포함된다.
현재, 티로시 인산화 활성을 갖는 화합물을 확인된 것은 다음과 같다.
(1) 하기 일반식(I)의 벤젠 또는 나프탈렌유도체 및 이의 비독성 염과 이의 비독성 산부가염
상기 식에서, R1은 각각 독립적으로 수소 원자, C1-4 알킬, 히드록시, 아미노 또는 COOR2(여기서, R2는 수소 원자 또는 C1-4 알킬이다)이며, n은 1 내지 3이다.
(2) 하기 일반식 (II)의 벤조퀴논 또는 나프토퀴논 유도체
상기 식에서, R3은 각각, 독립적으로 수소원자, C1-12 알킬, C1-4 알콕시, C1-4 알킬티오, 히드록시, 할로겐, 페닐 또는 할로겐으로 치환된 페닐이며, m은 1 내지 4이다.
(3) 하기 일반식(III)의 로다닌 또는 타졸리딘 유도체 및 이의 비독성 염과 이의 비독성 산 부가염.
상기 식에서, X는 산소 원자 또는 황원자, R4및 R5는 각각 독립적으로 수소 원자, 페닐 또는 C1-4 알킬로 치환된 페닐, C1-8 알콕시, 할로겐원자 또는 니트로, 또는 R4및 R5는 함께 벤질리덴 또는 C1-4 알킬, C1-8 알콕시, 할로겐원자 또는 니트로로 치환된 벤진리덴 또는 β-메틸신나밀리덴이며, R6은 수소원자 또는 C1-4 알킬이다.
더욱 구체적으로, 일반식(I)의 화합물은 4-아미노-2-히드록시벤조산, 4-아미노-1-나프톨, 4-아미노-2-나프톨, 1-아미노나프탈렌, 1,4-디히드록시 나프탈렌, 4-아미노-2-메틸-1-나프톨(이하, 비타민 K5로 약칭함), 1,4-디히드록시-2-나프텐산등을 포함한다.
일반식(II)의 화합물은 2-메틸-1,4-벤조퀴논, 2,6-디-3차-부틸-1,4-벤조퀴논, 2,6-디브로모-1,4-벤조퀴논, 2,3,4,5-테트라플루오로-1,4-벤조퀴논, 1,4-나프토퀴논, 2-메틸-1,4-나프토퀴논(이하, 비타민 K3로 약칭함), 2-히드록시-3-메틸-1,4-나프토퀴논, 2-(3,7-디메틸옥틸)-3-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2-메톡시-3-메틸-1,4-나프토퀴논, 2-히드록시-1,4-나프토퀴논, 3-(4-클로로페닐)-2-히드록시-1,4-나프토퀴논, 2-프로필티오-1,4-나프토퀴논 등을 포함한다.
일반식(III)의 화합물은 5-페닐로다닌, 5-페닐-1,3-티아조디딘-2,4-디온, 5-벤질리덴로다닌, 5-벤질리덴-1,3-티아조디딘-2,4-디온, 5,5-디페닐로다닌, 5,5-디페닐-1,3-티아조디딘-2,4-디온, 5-(4-이소아밀옥시벤질리덴)로다닌, 5-(4-이소아밀옥시 벤질리덴)-1,3-티아조디딘-2,4-디엔, 5-(β-메틸시나밀리덴)로다닌-3-아세트산등과 이의 비독성 염 및 이의 비독성 산부가염을 포함한다.
본 발명에서, 적당한 비독성염은, 예를들어 알칼리 금속(예를들어, 칼륨, 나트륨등)의 염, 알칼리 토금속(예를들어, 칼슘, 마그네슘등)의 염, 암모늄 염, 약학적으로 허용가능한 유기 아민염(예를 들어, 테트라메틸암모늄, 트리에틸아민, 메틸아민, 디메틸아민, 시클로펜틸아민, 벤질아민, 페네틸아민, 피페리딘, 모노에탄올아민, 디에탄올아민, 트리스(히드록시메틸)아민, 리신, 아르기닌, N-메틸-D-글루카민등)의 염이다.
본 발명에서, 적당한 산부가염은 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산 및 질산 같은 무기산 부가염, 또는 아세트산, 트리플루오로아세트산, 젖산, 주석산, 옥살산, 푸마르산, 말레산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 이세티온산, 글루쿠론산 및 글루콘산 같은 유기산 부가염을 포함한다.
일반식(I), (II) 및 (III)의 화합물은 그 자체로 잘 공지되어 있고, 기타 출발 물질은 공지된 방법으로 쉽게 제조할 수 있다.
본 발명에서 사용된 물질이 티로신 인산화를 수행하는 경우, 이들 약제는 당뇨병 유래의 고혈당 증상을 개선할 뿐 아니라 당뇨병, 특히 비인슐린 의존성 당뇨병 (NIDDM)의 예방 및/또는 치료에 유용하다.
본 발명의 다양한 활성 성분 및 이의 염의 독성은 매우 낮은 것으로 확인되었다. 그러므로, 본 발명의 각종 활성성분 및 이의 산 부가염은 안전하고 적당한 약학적 용도를 고려해볼 수 있다.
상기한 목적을 위해, 본 발명의 폴리펩티드, 각각의 활성성분 및 이의 산부가염은 보통 전신 또는 국부로 투여할 수 있으며, 통상 경구 또는 비경구로 투여한다.
투여량은 연령, 체중, 징후, 목적하는 치료효과, 투여경로 및 치료 기간 등에 따라 결정된다. 성인의 경우, 1인당 1회 투여량은 경구 투여시 1일당 수회 미만으로 10㎍ 내지 1000 mg 이며, 비경구 투여시 1일 수회 미만으로 10 ㎍ 내지 100 mg 또는 정맥으로 1 일당 1 내지 24 시간 연속 투여한다.
전술한 바와 같이, 사용되는 투여량은 다양한 상태에 따라 달라진다. 그러므로, 경우에 따라 상기 정의한 양보다 더 적은 양 또는 더 많은 양을 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물을 투여하는 경우, 경구투여를 위해 고체 조성물, 액체 조성물 또는 기타 조성물로 사용하고, 비경구투여를 위해서는 주사, 도포제 또는 좌약등으로 사용한다.
경구 투여용 고체조성물은 압축 정제, 환제, 캡슐, 소산성 분말 및 과립을 포함한다. 캡슐은 연질캡슐과 경질캡슐을 포함한다.
상기 조성물에서, 1종 이상의 활성 화합물(들)은 1종 이상의 불활성 희석제(예를들어, 락토오즈, 만니톨, 글루코즈, 히드록시프로필 셀룰로즈, 미세결정성 셀룰로즈, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트 등)를 혼합한다. 또한, 조성물은 불활성희석제 이외의 추가물질, 예를들어 (마그네슘 스테아레이트 같은) 윤활제, (셀룰로즈 칼슘 글리콜레이트 같은) 붕해제, (락토오즈 같은) 안정제 및 (글루탐산, 아스파라긴산 같은) 용해 보조제를 포함할 수 있다.
필요에 따라, 정제 또는 환제는 위 또는 장용 필름 물질(예를들어, 설탕, 젤라틴, 히드록시프로필 셀룰로즈 또는 히드록시프필메틸 셀룰로즈 프탈레이트 등)로 피복하거나, 또는 2 개 이상의 필름으로 피복할 수 있다. 피막은 젤라틴 같은 흡수성 재료의 캡슐내에 내용물을 포함할 수 있다.
경구 투여용 액체 조성물은 약학적으로 허용가능한 용액, 유화제, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 이런 조성물에서, 1종 이상의 활성 화합물(들)은 당해 기술분야에서 통상 사용되는 (정제수, 에탄올 같은) 불활성 희석제 내에 포함시킬 수 있다. 불활성 희석제외에, 이런 조성물은 (습윤제, 현탁제 같은) 보조제, 감미료, 향신료, 향료 및 보존제를 포함할 수 있다.
경구 투여용 기타 조성물은 1종 이상의 활성 화합물(들)을 포함하며 공지의 방법으로 제조할 수 있는 분무 조성물을 포함한다. 분무 조성물은 불활성 희석제 이외의 추가물질, 예를들어 (나트륨 술페이트 같은) 안정제, (염화나트륨, 구연산 나트륨, 구연산 같은) 등장 완충용액을 포함할 수 있다. 예를들어, 그런 분무 조성물을 제조하는데에는 미국 특허 제2,868,691호 또는 제3,095,355호에 기재된 방법을 사용할 수 있다.
비경구 투여용 주사액은 멸균된 수성 또는 비수성용액, 현탁액 또는 유화제를 포함한다. 그런 조성물에서, 1종 이상의 활성 화합물(들)은 1종 이상의 (주사용 증류수, 생리적 염용액같은) 불활성 수성 희석제(들) 또는 [프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유, 에탄올, 폴리소르베이트(POLYSORBATE)80(등록상표) 같은] 불활성 비수성 희석제(들)와 혼합한다.
주사액은 불활성 희석제 이외의 추가 물질, 예를들어 보존제, 습윤제, 유화제, 분산제, (락토오즈같은) 안정제, (글루탐산, 아스파라긴산 같은) 용해 보조제를 포함할 수 있다.
주사액은, 예를들어 박테리아 보유 필터를 통한 여과, 조성물내 멸균제 첨가 또는 방사선 조사에 의해 멸균할 수 있다. 또한, 동결건도 등에 의해 멸균된 고체 조성물 형태로 제조할 수 있으며, 사용직전에 주사용 멸균수 또는 몇몇 기타 멸균 희석제(들)에 용해시킬 수 있다.
비경구 투여용 기타 조성물은, 1종 이상의 활성 화합물(들)을 포함하고 공지된 방법 자체로 제조할 수 있는 외용 액체, 내피성 도포제, 연고, 좌약 및 페사리를 포함한다.
[실시예]
하기하는 실시예는 본 발명을 예시하나 제한하지는 않는다.
[실시예 1]
pp140의 정제 방법
세포 트래이(225 ㎠)를 이용하여, 쥐 L6 세포를 5% CO2 분위기중에서 7 내지 10일 동안 37℃에서 배양하였다. 배양배지는 (10% 소 태내 혈청(BFS)을 포함하는) 둘베코의 변형된 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)를 사용하여 3일 간격으로 교체하였다. 골격근 근아세포로부터 발육한 근육세포를 무혈청 배지로 처리한 지 2 시간후, 500μM의 바나드산(바나데이트)을 배지에 첨가하고 10 분동안 추가로 배양하였다. 트리스 완충용액(프로테아제 저해제를 갖는 400 μM의 바나데이트)에 세포를 현탁시켜, 용해시키고 원심분리한 후 상청액을 분리하였다.
밀리포어 막을 통해 여과하기 전에 옥타(에틸렌 글리콜)에테르(C12E8)로 상청액의 최종 농도를 0.1%로 조정하였다. 항포스포티로신 항체가 결합된 단백질 G 세파로즈 겔에 여과된 샘플을 충전하였다. 티로신 인산화된 단백질 (pp140)은 걸에 흡착시켰다. 25 mM의 트리스 완충용액으로 컬럼을 세정한후, 10 mM의 페닐 포스페이트를 사용하여 pp140을 용출하였다. 센트리콘(Centricon) 30으로 용출액을 농축하고, 아세톤 침전법으로 pp140을 침전시켰다.
[실시예 2]
다양한 조직에서 p140의 티로신 인산화
둘베코의 변형된 이글 배지(10% BFS를 포함)를 사용하여, 다양한 세포(1x 105세포/접시)를 5% CO2대기중에서 5 내지 8일 동안 37℃에서 배양하였다. 세포는 골격근 근아세포로부터 분화된 골격근 세포를 사용하였다. 사전에 무혈청 둘베코의 변형된 이글 배지내에서 4 시간 동안 처리한 분화된 세포는 24시간 동안의 추가 배양전에 아밀린(100 pM)의 존재 및 부재 하에서 배양하였다. 그 후 인슐린(100 nM)으로 처리한 배양액을 고정된 간격(10 또는 60 분)동안 배양하였다.
배양액을 빙냉 인산염 완충 용액으로 세정한 후, 0.5%의 옥타(에틸렌 글리콜)에테르(C12E8)를 포함하는 인산염 완충용액으로 세포를 용해시켰다. 용출전에 pp140은 포스포티로신 항체(트랜스포메이션 코오포레이션)가 결합된 세파로비드로 회수하고, 페닐포스페이트 및 웨스턴 블로팅 방법에 의해 각각 검출하였다. pp140의 밴드 함량은 스탠다드로서 정제된 pp140을 사용하여 농도계로 결정하였다. 결과는 표 1에 예시한다.
[표 1]
표 1에서, 배양액은 인슐린(100 nM) 첨가 24 시간전에 아밀린(100 pM)으로 처리하였다.
관찰
쥐 L6 세포를 인슐린과 함께 10분 이내로 배양하는 경우 관찰된 pp140의 출현은 아밀린 처리시 길항작용을 나타내었다. 게다가, 이 현상은 쥐 간세포, FaO에서 유사하게 확인되었다. 추가로, 이 현상은 단지 쥐에만 한정되지 않았다. 인간근세포(A673 세포) 및 간세포(HepG2 세포)에서도, 이 현상이 유사하게 확인되었다. 이것은 p140 인산화가 인슐린의 인산화 신호에 의해 촉발되기 전에 아밀린이 특정 단계 또는 과정을 억제하는 것으로 추정된다.
[실시예 3]
p140 인산화에 대한 다양한 검사 화합물의 효과
쥐 L6 세포(1 x 105세포/접시)를 5% CO2분위기하의 (10% BFS를 포함하는) 둘베코의 변형된 이글 배지내에서 8일동안 37℃에서 배양하였다. 사용한 세포는 골격근 근아세포에서 분화된 근세포이다. 무혈청 둘베코의 변형된 이글 배지에서 상기 분화된 골격근 세포를 4 시간동안 처리한 후, 다양한 검사 화합물(10 mM; 인슐린은 1 mM)을 첨가한 후, 고정된 간격동안 추가로 배양하였다.
배양액을 빙냉 인산염 완충 용액으로 세정한 후, 0.5%의 옥타(에틸렌 글리콜)에테르(C12E8)를 포함하는 인산염 완충용액으로 세포를 용해시켰다. 용출 전에 pp140은 포스포티로신 항체(트랜스포메이션 코오포레이션)가 결합된 세파로비드로 회수하고, 페닐포스페이트 및 웨스턴 블로팅 방법에 의해 각각 용출 및 검출하였다. pp140의 밴드 함량은 스탠다드로서 정제된 pp140을 사용하는 농도계로 결정하였다. 결과는 표 2에 예시한다.
[표 2]
[실시예 4]
글루코즈 흡수에 대한 증강작용 활성
쥐 L6 세포(1 x 105세포/접시)를 5% CO2분위대기하의 (10% BFS를 포함하는) 둘베코의 변형된 이글 배지내에서 8일동안 37℃에서 배양하였다. 사용한 세포는 골격근 근아세포에서 분화된 근세포이다. 무혈청 둘베코의 변형된 이글 배지에서 4 시간동안 상기 분화된 골격근 세포를 처리한 후, 다양한 검사 화합물(10 mM; 인슐린은 1 mM)을 첨가한 후, 2 시간의 고정된 간격동안 추가로 배양하였다. 그 후, 20분 동안 크렙스-링거(Crebs-Ringer) 인산염 완충용액 (pH : 7.4)으로 처리한 배양액을 5 mM3H-2-데옥시글루코즈(0.05 mCi/ml)와 함께 추가로 배양하였다. 배양후 최초 3 분에, 액체 섬광 계수기를 사용하여 세포내 흡수 방사능 함량을 결정하였다. 결과는 표 3에 예시한다.
[표 3]
관찰
p140 인산화를 촉진하는 모든 화합물은 글루코즈 흡수 활성을 활성화시키는 것으로 확인되었다.
[실시예 5]
당뇨병에 대한 비타민 K5의 효과
스트렙토조토신(STZ)을 사용한 당뇨병 모델은 수컷 위스타르 쥐(STZ 쥐)에게 형성시켰다. STZ 쥐에서 3 일 연속 비타민 K5의 다양한 1 일 투여량을 복강내로(i.p.) 투여(1 일 1 회 투여)한 후, 혈중 글루코즈, 중성 지방 및 콜레스테롤 함량을 측정하였다. 따라서, STZ 및 보통 쥐에게 동일한 1 일 투여량과 기간 동안 부형제(생리식염수)를 투여한 후, 상기 유사한 혈액내 지수를 측정하였다. 추가로, 3일 연속 1 일당 인슐린(8 U/kg)을 피하(s.c.) 투여(1일당 1회 투여)한 쥐를 양성 대조용으로 사용하였다. 결과는 제1도 내지 제3도에 도시한다.
관찰
3 일 연속 비타민 K5의 투여는 쥐에서 모든 혈액내 지수, 즉 글루코즈, 중성 지방 및 콜레스테롤 함량에서 발견되는 변화의 회복을 유도하였다.
[실시예 6]
pp140의 부분적인 아미노산 서열의 분석
실시예 1에서 정제한 pp140을 전기영동으로 분리하고, PVDF 막으로 이전하고 트립신으로 처리한 다음 액체 크로마토그래피를 사용하여 추가 분리하였다. 이렇게 분리된 pp140 단편을 470A-모델 자동 기체상 단백질 서열 결정기/120A-모델 PTH 분석기(미국, ABI 또는 어플라이드 바이오시스템 인코오포레이티드 코오포레이션) 및 통용되는 에드만 분해법을 사용하여 서열을 결정한 후, 그 부분 아미노산 서열을 결정하였다. 결정된 서열은 서열 표 5 내지 7에 기재하였다.
[실시예 7]
폴리머라제 연쇄 반응(PCR)법에 의한 pp140의 부분적인 아미노산 서열결정
광범위한 응용법을 사용하여, 이렇게 분리된 부분적인 아미노산 단편으로부터 여러가지 프라이머를 유도하고, 그 각각을 조합한 후 PCB 법에 사용하였다. 그 결과 길이가 약 400bp인 특이적으로 증폭된 단편을 얻었다.
[실시예 8]
mRNA의 분리 및 정제
대수 증식기중에, 문헌[참조 : Methods in Enzymology 154, 3(1987)]에 기재된 오카야마등의 방법에 의해 3 x 107근육 근아세포 L6 세포(ATCC 균주 : CRL-1458)로부터 mRNA를 분리하였다.
간단히 설명하면, 세포를 5.5M GTC 용액(5.5M 구아니딘 티오시아네이트, 25 mM 나트륨시트레이트 및 0.5% 나트륨 로릴 사르코신)으로 용균시킨 후, 용균물을 세슘 트리플루오로아세테이트 용액(밀도 : 1.51)상에 층적하고, 20 시간 동안 120,000 x g으로 원심분리하여 모든 RNA를 펠렛으로 회수하였다. RNA 샘플을 올리고-dT-셀룰로즈 컬럼을 통해 2 번 통과시킨 다음, 정제 회수하여 106 ㎍의 폴리(A)+RNA를 얻었다.
[실시예 9]
p140 mRNA의 조직 분포
다양한 조직으로 부터, 실시예 8과 유사한 방법으로 폴리(A)+RNA를 정제하였다. 각 조직 유래의 폴리(A)+RNA 샘플(각각의 샘플 : 2㎍)을 아가로즈겔 전기영동하고 필터를 통해 후속하여 이동시켰다. 2kb의 오픈 리딩 프레임을 표지하고 내부 대조용으로 사용하여 일반적인 하이브리드화를 실시하였다. 특이 결합된 프로브에 대해 방사성사진법을 수행하고 상분석기를 사용하여 농도 측정 분석을 실시하였다. 각 조직내 β-액틴 mRNA의 빈도를 100으로 하였을 경우, 조직내 p140의 상대적인 함량을 표 4에 나타내었다.
[표 4]
(-)는 수행하지 않은 실험을 의미한다.
관찰
조사 결과, 연구한 다양한 모든 조직에서 mRNA가 출현하였으며, 그 효과는 조직의 광범위한 범위에 걸쳐 영향을 미치는 것으로 생각된다. 높은 mRNA의 빈도는 특히 인간의 췌장에서 발견되었다.
[실시예 10]
cDNA 라이브러리의 구축
cDNA 라이브러리는 문헌[참조 : Gene 25, 263, (1983)]에 기재된 변형된 구블러와 호프만의 방법으로 구축하였다.
실시예 2에서 얻어진 폴리(A)+RNA(5 ㎍)로부터, 역전사 효소를 사용하여 제1쇄를 합성하고, 뒤이어 EcoR1 어댑터 연결로 제2쇄를 변형시킨 후 초과량의 어댑터와 프라이머는 젤 여과 컬럼 크로마토그래피(세파크릴 S-500HR 컬럼 : 파마시아 코오포레이션)를 사용하여 제거하였다. 이어서, 잔류하는 cDNA 분획 1,620 ng을 후속하여 회수하였다.
상기한 cDNA 라이브러리의 제조과정은 λgt 10 클로닝 시스템 키트(아메르샴 코오포레이션)으로 수행하였다.
다음으로, λgt 10 파지(아메르샴 코오포레이션) 및 λZAPII 파지(스트라타진 코오포레이션)를 평균 길이 1.8kb인 EcoRl 처리함 아암(arm)에 연결하였다. 그 결과, 각각 3 x 105인 파지 cDNA 라이브러리를 구축하였다.
[실시예 11]
클로닝 및 서열결정
실시예 10에서 구축한 파지 DNA 라이브러리에 기초하여, 클론을 약 1 x 105플라그/평판의 농도로 파종하였다. 실시예 7에서 얻은 약 400 bp의 단편을 프로브로 사용하여 스크리닝을 실시하였다. 양성 대조용으로, 플라스미드 벡터 pGEM-3Zf(+) (3199 bp; 프로메가 코오포레이션)의 EcoRl 측부내에 장쇄 삽입물을 서브클로닝하고, T7 또는 SP6은 프라이머로서 서열 결정하였다.
디데옥시 종결법에 기초한 DNA 서열결정은 형광 2중 종결제(미국, ABI)를 사용하는 시클로 서열결정법으로 수행하였다. 또한, 서열 판독은 DNA 서열결정기(미국, ABI의 모델 373A)를 사용하여 실현하였다.
이와 같이 하여, 각 클론의 5' 또는 3' 말단으로부터 평균 300 개의 염기를 가진 뉴클레오티드의 서열을 확립하였다.
[실시예 12]
부분 서열 분석
실시예 11로 부터의 뉴클레오티드 서열을 리프만과 피어슨의 FASTA 프로그램을 사용하여 이미 등록된 데이타베이스(젠뱅크 및 EMBL)에 저장된 모든 뉴클레오티드 서열과 상동성을 탐색한 결과, 서열 결정된 클론은 신규의 서열을 포함하는 클론으로 동정되었다. 동정된 클론의 뉴클레오티드 서열은 가능한 3개의 프레임에 기초하여 아미노산 서열로 전환하였다.
이 아미노산 서열 역시 신규의 아미노산 서열인 것으로 나타났다.
그러나, 클론된 cDNA 클론은 mRNA 전길이를 포함하고 있을 필요는 없다. 이런 경우, 상기 클론은 아미노산 서열의 N-말단을 포함할 가능성이 거의 없다.
이렇게, 확립된 클론이 전체 길이인지 여부를 결정하기 위해 노던분석을 사용하였다. 즉, 실시예 8 → 실시예 9의 과정으로부터 분리된 폴리(A)+RNA를 전기 영동 후, 나일론막 위에 블로팅하였다. 서브클론된 cDNA 삽입물을 프로브로서 하이브리드한 결과, 약 4400bp 위치에서 단일 밴드를 관찰하였다. 클론의 크기가 약 2200 bp이기 때문에, cDNA 전길이를 판독하기 위해, 3'-RACE (BRL 코오포레이션)시스템 및 5'-RACE (클론테크 코오포레이션) 시스템 키트를 사용하여 5'측과 3'측의 PCR을 실시하였다.
[실시예 13]
전체 cDNA 길이의 서열 및 오픈 리딩 프레임의 결정
cDNA 서열의 전체 길이의 무작위 서열결정은 문헌 [참조 : Molecular Cloning : ed. Sambrook J. Fritsch EF. Maniatis T; 1989, Cold Spring Harbr Laboratory Press]에 기재된 샘브룩등의 방법으로 수행하였다.
간단히 설명하면, 클론으로부터 플라스미드를 회수하고 cDNA 삽입물을 분리하여 정제한 뒤 결찰 및 단편화하였다. DNA 단편의 말단은 T4 폴리머라제를 사용하여 평활말단화하고, 길이가 약 400 bp 인 DNA 단편을 아가로즈 전기영동으로 회수하였다. 이렇게 얻은 DNA 단편을 플라스미드 벡터, pGEM-3Zf(+)(3199 bp; 프로메가 코오포레이션)의 Smal 측부에 클로닝한 후, 대장균을 형질 전환시켰다. 80 개의 콜로니를 무작위로 취하여 플라스미드 DNA를 제조한 후, 이들 20 개의 플라스미드(삽입물로서 cDNA 단편 포함)의 DNA를 서열 결정하였다. DNA 서열 결정 및 서열 판독은 실시예 11에 기재된 방법으로 수행하였다. cDNA 단편의 서열자료는 DNASIS의 DNA 서열 프로그램을 사용하여 결찰된 서열로 구성한 뒤, 서열 번호 3에 기재된 염기 서열을 얻었다. 전체 cDNA 길이의 서열 자료로부터, 오픈 리딩 프레임(ORF)을 결정하였다. 또한, 아미노산 서열을 번역하고, 이렇게 얻은 서열을 서열 번호 1에 기재하였다. 프레임중의 하나는 2993 bp ORF를 포함하였는데, EcK 족의 전체 ORF 길이가 약 3,000 bp인 것으로부터 본 발명의 폴리펩티드도 2,993 bp가 전체 길이인 것으로 추정되었다.
또한, 단백질 p140은 소수성에 기초할 때 전형적인 제I형 막 단백질임을 알 수 있었다(제4도는 고(+) 또는 저(-)의 소수성 구역을 구분한다).
즉, 상기 p140 폴리펩티드는 그의 ORF의 길이가 2982 bp 이고 993개의 아미노산을 가진 전형적인 막 단백질이다. 또한, 상기 p140 폴리펩티드의 추정된 분자량은 109,860 Da이지만, 그의 다당류 사슬의 결합으로부터 평가하는 경우 140 KD이었다.
[실시예 14]
발현 벡터 제조용 플라스미드 벡터의 구성
발현 벡터로서, pUC-SRαML-1(이 벡터는 유럽 특허 출원 제559428호에 벡터 및 이의 제법이 개시되어 있다) 유도체를 사용하였다. 이 유도체는 다음과 같은 2 종류의 단편을 각각 Pstl 및 Sacl 사이 및 다중 클로닝 부위 내의 Spel 및 Kpnl 사이에 삽입하기 위해 구성하였다.
pUC-SRαML1 벡터를 Pstl 및 Sacl으로 분해하고 이어서 생성되는 분해물을 아가로즈겔 전기영동하여 약 4.1 kbp의 단편을 제조 및 회수한 후, BAP (박테리아의 알칼리성 포스파타제)를 사용하여 5' 말단 인산기를 제거하였다.
pUC-SRαML1로부터 이렇게 제조한 약 4.1 kbp의 단편과 인산화된 DNA 단편 T7을 결찰시켜 원형으로 만들었다. 결과적으로 생성되는 벡터를 Spel과 Kpnl로 분해하고 이어서 생성되는 분해물을 아가로즈겔 전기영동하여 약 4.1 kbp의 단편을 제조 및 회수한 후, BAP(박테리아의 알칼리성 포스파타제)로 처리하여 5'-말단 인산기를 제거하였다. 이렇게 제조한 약 4.1 Kbp의 단편과 인산화된 DNA 단편 SP6을 결찰시켜 원형으로 만들었다. 이 방법으로 구성된 플라스미드 벡터를 pUC-SRαML2 라 칭하였다(참조 : 제3도).
[실시예 15]
발현 벡터의 구성
쥐 p140 cDNA에 어닐링하는 프라이머 X, Y 및 YH를 합성하였다. 프라이머 X, Y 및 YH의 서열은 하기와 같다.
프라이머 X
프라이머 Y
프라이머 TH
이렇게 합성한 올리고뉴클레오티드 X 및 Y를 주형으로 사용하여 p140의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 PCR하였다. 이렇게 얻은 PCR 단편은 개시 코돈의 5'에 인접한 당해 기술분야에 공지된 코작(Cozac) 서열 및 p140 단백질로 구성되는 단백질 분자를 암호하는 cDNA를 포함하였다. 이 PCR 단편을 Sall-Spel로 분해하고, 이어서 생성되는 분해물을 분리 및 정제한 후, 실시예 14에서 제조한 pUC-SRαML2의 Sall-Spel에 삽입하여 발현벡터 pUC-SRαML2-p140-A를 얻었다.
또한, 상기 합성된 올리고뉴클레오티드 X 및 YH를 주형으로 사용하여 p140의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 PCR하였다. 이렇게 얻은 PCR 단편은 개시 코돈의 5'에 인접한 당해 기술분야에 공지된 코작(Cozac) 서열 및 p140 단백질과 그의 C 말단에 부착된 6 개의 추가 히스티딘(His) 잔기로 구성되는 단백질 분자를 암호하는 cDNA를 포함하였다. 이 PCR 단편을 Sall-Spel로 분해하고, 이어서 생성되는 분해물을 분리 및 정제한 후, 실시예 14에서 제조한 pUC-SRαML2의 Sall-Spel 부위에 삽입하여 발현벡터 pUC-SRαML2-p140-B를 얻었다.
또, 프라이머 Z 및 ZH를 합성하였다. 프라이머 Z와 ZH의 서열은 하기와 같다(이들은 cDNA 내 경막 영역의 아미노 말단에 인접해 있다).
프라이머 Z
프라이머 ZH
이렇게 합성한 올리고뉴클레오티드 X 및 Z를 주형으로 사용하여 p140의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 PCR하였다. 이렇게 얻은 PCR 단편은 개시 코돈의 5'에 인접한 당해 기술분야에 숙련자들에게 공지된 코작 서열 및 p140 단백질 세포외 부분으로 구성되는 폴리펩티드를 암호하는 cDNA를 포함하였다. 이 PCR 단편을 Sall 및 Notl로 분해하고, 이어서 생성되는 분해물을 분리 및 정제한 후, 실시예 14에서 제조한 pUC-SRαML2의 Sall-Spel 위치내에 삽입하여 발현벡터 pUC-SRαML2-p140-C를 얻었다.
또한, 상기 합성된 올리고뉴클레오티드 X 및 ZH를 주형으로 사용하여 p140의 cDNA를 포함하는 플라스미드를 PCR하였다. 이렇게 얻은 PCR 단편은 개시 코돈의 5'에 인접한 당해 기술분야에 숙련자들에게 공지된 코작 서열 및 p140 단백질 세포외 부분으로 구성된 폴리펩티드 및 그의 C 말단에 부착된 6 개의 추가 히스티딘(His) 잔기를 암호하는 cDNA를 포함하였다. 이 PCR 단편을 Sall 및 Notl로 분해하고, 이어서 생성되는 분해물을 분리 및 정제한 후, 실시예 14에서 제조한 pUC-SRαML2의 Sall-Spel 위치내에 삽입하여 발현벡터 pUC-SRαML2-p140-D를 얻었다.
이렇게 구성된 각 pUC-SRαML2-p140-A, pUC-SRαML2-p140-B, pUC-SRαML2-p140-C 및 pUC-SRαML2-p140-D로 대장균 균주 DH 5를 형질 감염시키고, 이어서 생성되는 형질전환체 배양액 100 ml으로부터 회수한 후, CsCl 밀도 구배 원심분리를 2회 수행하여 정제하였다.
[실시예 16]
COS 세포내에서 발현
각각의 플라스미드 DNA 제조물 pUC-SRαML2, pUC-SRαML2-p140-A, pUC-SRαML2-p140-B, pUC-SRαML2-p140-C 및 pUC-SRαML2-p140-D를 문헌[참조 : J. Immunology, 136, 4291(1986)]에 기재된 디에틸아미노에틸 (DEDAE) 덱스트란 법에 의해 COS-7 세포[참조 : Cell, 23, 175 (1981)] 내로 도입하였다.
즉, 약 1.8 x 106COS-7 세포를 액체 배양 배지(10% 보체제거된 태아 소혈청으로 보충된 둘베토의 변형된 MEM 배지) 50 ml와 함께 225 ㎠ 용량의 플라스크(코닝 제품) 내로 접종하였다. 이산화탄소 배양기(37℃, 5% CO2) 내에서 밤새 배양하고 배양 상청액을 후속 제거한 후, DNA 혼합액(각각의 플라스미드 DNA 15 ㎍으로 보충된 둘베코의 변형된 MEM 배지, 50 mM의 트리스-HCl 완충용액(pH 7.4) 및 DEAE-덱스트란 400 ㎍/ml) 12 ml를 각각의 플라스크에 첨가하고, 5% CO2대기 중에서 3 시간동안 37℃에서 배양하였다. 그후, DNA 혼합액을 클로로퀸 용액(150 μM의 클로로퀸 및 7% 보체제거된 태아소 혈청으로 보충된 둘베코의 변형된 MEM 배지)으로 대체하고, 3 시간동안 추가로 배양하였다.
클로로퀸 용액을 제거한 후, 각 플라스크에 전술한 액체배양 배지(50 ml)를 첨가하고 5% CO2 분위기중에서 72 시간동안 37℃에서 배양하여, 각 플라스크에서 거의 단일층 형태의 세포 증식을 확인하였다. 배양 상청액을 제거한 후, 각 플라스크내의 세포를 무혈청 액체 배양 배지(니슈 파마슈티칼 컴퍼니, 리미티드에서 시판하는 상표명 SFM-101)로 세척한 후, 동일한 무혈청 액체 배양 배지 75 ml을 보충하고 72 시간동안 배양을 계속하였다. 그후, 결과적으로 생성되는 배양 상청액을 회수하고 실시예 1에서와 같이 세포를 용균하였다. 이들 상청액 및 세포 용균물을 막 여과기(밀리포어 코오포레이션에서 시판되는 상표명 스테리벡스 (STERIVEX)-GS)를 통해 여과하여 세포잔해를 제거하였다. 이렇게 얻은 배양 상청액 샘플은 나중에 사용하기 위해 4℃에서 보관하였다. pUC-SRαML2-p140-A와 pUC-SRαML2-p140-B 삽입물을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 COS 세포의 세포용해물은 p140 단백질과 상응하는 폴리펩티드의 발현된 성숙 단백질부분을 포함할 것으로 기대된다. pUC-SRαML2-p140-C와 pUC-SRαML2-p140-D 삽입물을 포함하는 플라스미드로 형질전환된 COS 세포의 배양 상청액은 p140 단백질 세포외 부분에 상응하는 분비된 폴리펩티드를 포함할 것으로 예상된다.
[실시예 17]
발현의 확인
실시예 16에서 얻은 형질전환된 COS 세포의 배양 상청액 각각 2 ml를 원심분리 농축여과기[밀리포어 코오포레이션에서 시판되는 상표명 센트리콘(Centricon)-10]를 사용하여 부피 100 ㎕로 농축하였다. 이렇게 농축한 각 샘플 1 ㎕를 SDS-PAGE(나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 용도의 동일 부피의 로딩 완충용액(0.125 M 트리스-HCl 완충용액(pH 6.8), 4% 나트륨 도데실 술페이트 및 30% 글리세롤)과 혼합하고, 혼합물을 3분 동안 90℃에서 처리한 후 SDS-PAGE를 수행하였다.
단백질의 C 말단에 His 6단량체를 도입시킨 pUC-SRαML2-p140-B와 pUC-SRαML2-p140-D 단백질의 경우, COS 세포 배양 상청액과 상응하는 세포 용균물 뿐아니라 그들의 정제 생성물에 대해서도 SDS-PAGE 분석을 실시하였다. 단백질의 정제는 다양한 전이금속이온과 착화합물을 형성하는 His의 기능을 이용하여, 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피[참조 : Biotechnology, 9, 273, (1991)]로 수행하였다. 즉, COS 세포로 부터 얻은 세포 용해물(100 ml) 또는 배양 상청액(350 ml)을 염의 최종 농도가 1M이 될 정도의 염화나트륨 수용액과 혼합하고, 이어서 생성된 혼합물을 아연 결합된 킬레이팅 세파로즈(파마시아에서 시판되는 상표명, 킬레이팅 세파로즈 페스트-플로우) 4 ml가 충전된 컬럼에 적용하여 단백질을 수지에 흡착시켰다. 컬럼은 1M의 염화나트륨 수용액(40 mL)이 포함된 50 mM의 인산염 완충 용액(pH 7.0)으로 세척하고, 컬럼내 잔존 단백질을 1M의 염화나트륨 수용액 및 0.4M의 이미다졸이 포함된 50 mM의 인산염 완충 용액(pH 7.0)으로 용출하였다. 그 후, 생성되는 용출물은 부피 100 μ1 로 농축하고, 농축한 샘플의 일부를 SDS-PAGE 분석하였다.
SDS 10/20 구배 겔을 이용하여 SDS-PAGE 분석한 결과, pUC-SRαML2-p140-A와 p140-B로 형질감염된 COS 세포로부터 제조한 샘플내에서 p140의 분자량과 상응하는 생성물이 검출되었다. 또한, p140의 세포외부분의 분자량에 상응하는 폴리펩티드는 pUC-SRαML2-p140-C와 p140-D로 형질감염된 COS 세포로부터 제조된, 세포 용해질이 아닌 미처리 정제된 상청액내에서 검출되었다.
제제예 1
하기 성분들을 종래의 방법으로 혼합한 후 타정하여 각각 활성성분 5 mg을 포함하는 100 개의 정제를 얻었다.
·비타민 K5 · · · · · · · 500.0 mg
·카르복시메틸셀룰로즈 칼슘 · · · · · 200.0 mg
·마그네슘 스테아레이트 · · · · · 100.0 mg
·미세결정성 셀룰로즈 · · · · · 9.2 mg
서열 목록
(1) 일반 정보 :
(i) 출원인 :
(A) 명칭 : 오노 야쿠힝 고교 가부시키가이샤
(B) 거리 : 도쇼마치 2 죠메 1 반 5 고
(C) 도시 : 오사카시 쥬오쿠
(D) 주 : 오사카후
(E) 나라 : 일본
(F) 우편 코드(ZIP) : 541
(G) 전화 : 06-222-5551
(H) 팩스 : 06-222-5706
(ii) 발명의 명칭 : 단백질 피 140(p140)의 신규 폴리펩티드 및 그것을 암
호하는 디엔에이(DNA)
(iii) 서열의 수 : 16
(2) 서열 번호 1에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 993 개의 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(C) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : 단백질
(vi) 기원
(A) 생물명 : 쥐
(F) 조직의 종류 : 골격근 근아세포
(H) 세포주 : L6
(xi) 서열 : 서열 번호 1 :
(2) 서열 번호 2에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 2982 개의 염기 쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : cDNA to mRNA
(vi) 기원
(A) 생물명 : 쥐
(F) 조직의 종류 : 골격근 근아세포
(H) 세포주 : L6
(xi) 서열 : 서열 번호 2 :
(2) 서열 번호 3에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 4027 개의 염기 쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : cDNA to mRNA
(vi) 기원
(A) 생물명 : 쥐
(F) 조직의 종류 : 골격근 근아세포
(H) 세포주 : L6
(xi) 서열 : 서열 번호 3 :
(2) 서열 번호 4에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 4027 개의 염기 쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : cDNA to mRNA
(vi) 기원
(A) 생물명 : 쥐
(F) 조직의 종류 : 골격근 근아세포
(H) 세포주 : L6
(ix) 특징 :
(A) 이름/키 : CDS
(B) 위치 : 262..3243
(C) 동정 방법 : 몇몇 기타 패턴과 유사성 비교.
(xi) 서열 : 서열 번호 4 :
v
v
(2) 서열 번호 5에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 11 개의 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : 단백질
(vi) 기원
(A) 생물명 : 쥐
(F) 조직의 종류 : 골격근 근아세포
(H) 세포주 : L6
(xi) 서열 : 서열 번호 5 :
(2) 서열 번호 6에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 10 개의 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : 단백질
(vi) 기원
(A) 생물명 : 쥐
(F) 조직의 종류 : 골격근 근아세포
(H) 세포주 : L6
(xi) 서열 : 서열 번호 6 :
(2) 서열 번호 7에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 5 개의 아미노산
(B) 서열의 형 : 아미노산
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : 단백질
(vi) 기원
(A) 생물명 : 쥐
(F) 조직의 종류 : 골격근 근아세포
(H) 세포주 : L6
(xi) 서열 : 서열 번호 7 :
(2) 서열 번호 8에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 28 개의 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : DNA(합성)
(xi) 서열 : 서열 번호 8 :
(2) 서열 번호 9에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 28 개의 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : DNA(합성)
(xi) 서열 : 서열 번호 9 :
(2) 서열 번호 10에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 32 개의 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : DNA(합성)
(xi) 서열 : 서열 번호 10 :
(2) 서열 번호 11에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 23 개의 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : DNA(합성)
(xi) 서열 : 서열 번호 11 :
(2) 서열 번호 12에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 44 개의 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : DNA(합성)
(xi) 서열 : 서열 번호 12 :
(2) 서열 번호 13에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 37 개의 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : DNA(합성)
(xi) 서열 : 서열 번호 13 :
(2) 서열 번호 14에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 55 개의 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : DNA(합성)
(xi) 서열 : 서열 번호 14 :
(2) 서열 번호 15에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 44 개의 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : DNA(합성)
(xi) 서열 : 서열 번호 15 :
(2) 서열 번호 16에 대한 정보 :
(i) 서열 특성 :
(A) 서열의 길이 : 62 개의 염기쌍
(B) 서열의 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 1본쇄
(D) 토폴로지 : 직쇄상
(ii) 분자의 종류 : DNA(합성)
(xi) 서열 : 서열 번호 16 :

Claims (11)

  1. 실질적으로 정제된 형태인 서열 번호 1에 도시한 아미노산 서열을 갖는 단백질 p140의 폴리펩티드.
  2. 제1항에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 DNA.
  3. 제2항에 있어서, 서열 번호 2에 도시한 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA.
  4. 제2항에 있어서, 서열 번호 3에 도시한 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 기재된 DNA를 포함하는 복제 및 발현 벡터.
  6. 제5항에 따른 복제 및 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주세포.
  7. 제1항에 기재된 폴리펩티드를 발현하기에 효과적인 조건하에서 제6항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 폴리펩티드 생성 방법.
  8. 제1항에 기재된 폴리펩티드를 약학적으로 허용가능한 희석제 및/또는 담체와 혼합하여 포함하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 단백질 p140의 티로신을 인산화함을 특징으로 하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약제.
  10. 단백질 p140의 티로신을 인산화할 수 있는 화합물을 활성성분으로서 포함함을 특징으로 하는 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약제.
  11. 단백질 p140의 사용을 특징으로 하는, 당뇨병의 예방 및/또는 치료용 약제의 스크리닝 방법.
KR1019940031010A 1993-11-24 1994-11-24 단백질 p140의 신규 폴리펩티드 및 그를 암호하는 dna KR100256664B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5506205A (en) * 1993-11-24 1996-04-09 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Polypeptide of protein p140 and DNAs encoding it
GB0208089D0 (en) 2002-04-09 2002-05-22 Oxford Glycosciences Uk Ltd Protein
EP2046313A4 (en) * 2006-07-10 2012-01-25 Glucox Biotech Ab USE OF NAPHTHOQUINONES IN THE TREATMENT AND CONTROL OF DIABETES, INSULIN RESISTANCE AND HYPERGLYCEMIA
EP2152303A4 (en) * 2007-05-01 2011-10-05 Univ Texas CHLAMYDIA ANTIGENS AS REAGENTS FOR THE DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CHLAMYDIA INFECTION AND DISEASE
US7892567B2 (en) * 2007-10-01 2011-02-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for immunization against chlamydial infection and disease
JP4798125B2 (ja) * 2007-12-13 2011-10-19 株式会社デンソー 照度センサ
CN105085630A (zh) * 2015-08-31 2015-11-25 苏州普罗达生物科技有限公司 mTOR抑制多肽及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5260200A (en) * 1991-01-18 1993-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Isolated DNA encoding an insulin receptor substrate
US5811396A (en) * 1991-03-14 1998-09-22 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services TRK tyrosine kinase receptor is the physiological receptor for nerve growth factor
US5506205A (en) * 1993-11-24 1996-04-09 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Polypeptide of protein p140 and DNAs encoding it

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