KR100391227B1

KR100391227B1 - 인체의 프로그램화 된 세포사멸과 관련있는 펩티드 및 이를 암호하는 디엔에이(dna)

Info

Publication number: KR100391227B1
Application number: KR1019950004069A
Authority: KR
Inventors: 이시다야스마사; 시노하라다카시
Original assignee: 오노 야꾸힝 고교 가부시키가이샤; 혼조 다스쿠
Priority date: 1994-03-01
Filing date: 1995-02-28
Publication date: 2003-10-22
Also published as: KR950032279A; EP0670369A2; CN1113518A; EP0670369A3; JP2003230395A; US5698520A; CA2143491A1; CA2143491C; CN1080311C; US5629204A; JPH07291996A

Abstract

본 발명은 인체 프로그램된 세포 사멸과 관련있는 막 단백질 (PD-1) 및 상기 단백질을 암호하는 신규 DNA에 관한 것이다. PD-1 단백질은 각종 감염, 면역학적 억제 또는 상승, 또는 암 등의 치료에 유용할 수 있다.

Description

인체의 프로그램화된 세포 사멸과 관련 있는 펩티드 및 이를 암호하는 디엔에이{DNA}

기술 분야

본 발명은 세포 사멸과 관련 있는 신규 펩티드, 및 이를 암호하는 디엔에이(이하, DNA로 명함)에 관한 것이다.

배경 기술

각종 동물의 거의 모든 조직에서, 발생학적 및 생리적으로 제어되는 세포 사멸이 관찰되어질 수 있다. 그러한 세포 사멸은 일반적으로 '프로그램'된 것으로 간주되고, 병리학적 기전에 의해 야기되는 '우연적' 사멸과 구분된다. 프로그램화된 사멸중인 대부분의 세포는 RNA 및 단백질의 새로운 합성을 필요로 하는 것으로 밝혀져 있다.

이러한 사실은 특정된 유전자는 아닐지라도 적어도 몇개의 유전자가 프로그램화된 세포 사멸을 야기하기 위해 발현되어야 한다는 것을 암시한다.

한편, '에이폽토시스(apoptosis)'라는 용어는 어떤 부류의 세포 사멸의 형태학적 특징을 나타내는 것이다. 에이폽토시스에 의해 죽어가는 세포에서, 염색질은핵 주위에 응축되는 반면, 미토콘드리아와 다른 세포 소기관들은 영향받지 않는다. 에이폽토시스되는 세포의 특유한 생화학적 특징은, DNA가 단편화되어 올리고뉴클레오솜 조각으로 되는 것이다. 포유동물에서, 에이폽토시스는 종종 프로그램화된 세포 사멸과 형태학적 및 생화학적으로 관련이 있으나, 프로그램화된 사멸중인 일부 세포들은 에이폽토시스의 특징을 명백하게 나타내지 않는다. 또한, 에이폽토시스성 세포 사멸은 어떤 단백질의 합성 없이도 유도될 수 있다. 그러므로, 에이폽토시스는 프로그램화된 세포 사멸과 동의어가 아니라는 것을 주목해야 한다.

최근에, 세포 사멸을 차단시킴으로써 유한증식성 B 세포내에 존재하는 종양 유전자인 bcl-2가 세포 사멸을 제어하는데 중요하다는 것이 명백해졌다.

관련 기술

지금까지 프로그램화된 세포 사멸과 관련있는 특정 펩티드들이 보고되었다. 이런 펩티드 중에서, 대표적인 것은 Fas 항원이다[참고 문헌 : Itoh, N 외 다수, Cell, 66, 233 (1991)].

인체 Fas 항원은 335개의 아미노산으로 구성되며 16개의 소수성 아미노산 N-말단으로 구성된 시그널 펩티드를 갖는 폴리펩티드이며, 그 성숙 단백질은 세포외 도메인(157 아미노산), 경막(transmembrane) 영역(17 아미노산) 및 세포질 도메인(145 아미노산)으로 나누어진 구조일 것으로 추정되었다. 또한, Fas 항원은 세포 사멸을 유도하는 인자(리간드)에 대하여 수용체 기능을 하는 것으로 생각되었다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 Fas 항원으로 대표되는 폴리펩티드의 대안물인 신규 폴리펩티드를 규정하는데 있다.

본 발명에서, 프로그램화된 세포 사멸과 상당한 관련이 있는 유전자를 분리하였고, 그것의 뉴클레오티드 서열을 결정하였고 그것의 아미노산 서열을 추론하였다. 또한, 본 발명자들은 상당히 신규한 폴리펩티드 및 이를 암호하는 DNA를 발견하는데 성공하여 본 발명을 완성하였다.

인체내의 프로그램화된 세포 사멸과 상당한 관련성이 있는 유전자를 단리하기 위해서, 마우스 T 세포 하이브리도마 2B 4.11에서 획득한 마우스 PD-1(일본 특허 공개 공보 제5-336973호)을 프로브로서 사용하였다.

국립 생체의학 연구협회의 데이타 베이스내의 모든 공지 서열에 대한 컴퓨터 프로그램을 이용하여, 본 발명에서 동정된 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교했을때, 마우스 PD-1을 제외하고는, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열과 동일하거나 상당한 상동성이 있는 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드는 없었다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 Fas 항원에 대해 상동성을 갖지 않는다는 것이 확인되었다.

발명의 구성

본 발명은 프로그램화된 세포 사멸에 깊이 관여하는 폴리펩티드(이하에서 인체 PD-1으로 약칭함)에 관한 것이다.

본 발명은 서열 번호 1에 기재된 아미노산을 가진, 상당히 정제된 형태의 폴리펩티드, 그 동족체, 또는 서열의 단편 또는 단편의 동족체 및 상기 폴리펩티드를 암호하는 DNA에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 서열 번호 2 또는 3에 기재된 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA 및 서열 번호 2 또는 3에 기재된 뉴클레오티드 서열에 선택적으로 하이브리드하는 단편을 가지는 DNA에 관한 것이다.

본 발명은 다음에 관한 것이다.

(1) 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드,

(2) 상기 (1)에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 DNA,

(3) 서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA, 및

(4) 서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가지는 DNA.

실질적으로 정제된 형태의 서열 번호 1의 폴리펩티드는 일반적으로 제제내의 폴리펩티드 90% 이상(예, 95%, 98% 또는 99%)이 서열번호 1의 폴리펩티드인, 제제내에 폴리펩티드를 포함하는 것이다.

서열 번호 1의 폴리펩티드 동족체는 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상(예, 40, 60 또는 100개 이상)의 인접 아미노산의 영역에 걸쳐 서열 번호 1의 폴리펩티드와 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 또는 90% 이상 및 더욱 바람직하게는 95% 이상 상동성일 것이다. 이러한 폴리펩티드 동족체는 이하부터 본 발명에 기재된 폴리펩티드로 불리울 것이다.

일반적으로, 서열 번호 1 또는 그 동족체의 단편은 길이가 10개 이상, 바람직하게는 15개 이상(예, 20개, 25개, 30개, 40개, 50개 또는 60개)의 아미노산으로서, 본 명세서에 사용된 용어인 "본 발명에 기재된 폴리펩티드"에 역시 포함된다.

서열 번호 2 또는 3의 DNA에 선택적으로 하이브리드할 수 있는 DNA는 20개 이상, 바람직하게는 30개 이상(예, 40개, 60개 또는 100개) 또는 그 이상의 인접뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 서열 번호 2 또는 3의 DNA와 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 또는 90% 이상 및 더 바람직하게는 95% 이상 상동성인 것이다. 이러한 DNA는 "본 발명에 기재된 DNA"라는 용어에 포함된다.

서열 번호 2 또는 3의 DNA 단편은 길이가 15개 이상, 바람직하게는 20개 이상(예, 25개, 30개 또는 40개)의 뉴클레오티드로서, 또한 본 명세서에서 사용된 용어인 "본 발명에 따른 DNA" 에 포함된다.

본 발명의 또 다른 양태로서 본 발명에 기재된 DNA를 포함하는 복제 및 발현 벡터를 제공한다. 예를 들어, 벡터로는, 복제 기점(origin), 선택적으로 상기 DNA의 발현을 위한 프로모터 및 선택적으로 프로모터의 조절 인자를 구비한 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 벡터는 1종 이상의 선별가능한 마커유전자, 예컨대 암피실린 내성 유전자를 함유할 수 있다. 벡터는, 예컨대 DNA 에 상응하는 RNA 생산을 위해 시험관내 사용되거나, 또는 숙주 세포를 형질감염 또는 형질전환시키는데 사용될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 서열 번호 2 또는 3, 또는 그것의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하여, 본 발명에 기재된 DNA의 복제 및 발현을 위한 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 세포는 벡터와 상용성인 것을 선택하며, 예를 들면 박테리아, 효모, 곤충 또는 포유류의 세포가 가능하다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 폴리펩티드를 발현시키는데 효과적인 조건하에서 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는, 폴리펩티드 생산 방법을 제공한다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드가 발현된 후 숙주 세포로부터 생산되는 조건하에서, 상기 방법을 수행하는 것이 바람직하다.

본 발명에 기재된 DNA는 또한 안티센스 RNA를 생성하는지 증명하기 위해 전술한 벡터내에 안티센스 배향으로 삽입될 수도 있다. 안티센스 RNA는 합성 방법에 의해 생성될 수도 있다. 이러한 안티센스 RNA는 세포내에서 본 발명의 폴리펩티드 양을 조절하는 방법에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 기재된 폴리펩티드에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 제공한다. 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 생성하는 방법을 추가로 제공한다. 면역원으로서 본 발명의 폴리펩티드 또는 그 단편을 이용하여 통상의 하이브리도마 기술에 의해 모노클로날 항체를 제조할 수 있다. 또한, 숙주 동물(예, 래트 또는 래빗)에 본 발명의 폴리펩티드를 접종하고, 면역 혈청을 회수하는 통상의 방법으로 폴리클로날 항체를 제조할 수 있다.

본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 희석제 및/또는 담체와 함께 본 발명의 폴리펩티드 또는 그 항체를 함유하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 폴리펩티드는 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가진 것 뿐 아니라 그 아미노산 서열의 일부가 결실된 것(예, 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열내에서 생체 활성을 나타내는 필수 서열만으로 이루어진 폴리펩티드), 아미노산 서열의 일부가 다른 아미노산으로 대체된 것(예, 유사한 특성을 가진 아미노산으로 대체된 것) 및 다른 아미노산이 그 아미노산 서열의 일부내로 첨가되거나 삽입된 것을 포함한다.

잘 알려져 있는 바와 같이, 하나의 아미노산을 암호하는 코돈에는 1 내지 6종의 코돈이 있다[예, 메티오닌(Met)의 경우 1종의 코돈, 및 류신(Leu)의 경우 6종의 코돈이 공지됨]. 따라서, DNA의 뉴클레오티드 서열이 변경되어 동일한 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 암호할 수 있다.

전술한 (2)에 구체화된 본 발명의 DNA는, 서열 번호 1에 제시된 폴리펩티드(1)를 암호하는 모든 뉴클레오티드 서열 그룹을 포함한다. 뉴클레오티드 서열을 변화시키면 폴리펩티드의 생성율을 향상시킬 가능성이 있다.

전술한 (3)에 구체화된 DNA는 (2)에 제시된 DNA의 구체예로서, 천연 형태의 서열이다.

전술한 (4)에 제시된 DNA는 비 해독성 영역을 가진, (3)에 구체화된 DNA 서열을 나타낸다.

본 발명의 DNA는 유전자 재조합, 화학적 합성 또는 당업자에게 공지된 방법으로 얻을 수 있다.

인체 PD-1은 포유류에 흔히 존재하고, 구조적 특징에 있어서 Fas 항원과 다른 일련의 폴리펩티드를 포함한다. 즉, 본 발명의 PD-1은 본 발명에 명시된 인체 PD-1 및 상동성이 높은 다른 포유동물의 PD-1(즉, 인체 PD-1 항원과 교차 면역 반응할 수 있는 면역학적 등가물을 의미한다)을 포함한다.

인체 PD-1의 구조적 특징은 하기와 같다.

인체 PD-1은 288개의 아미노산으로 이루어진 막 결합 형태의 단백질로 예측된다. 인체 PD-1은 N-말단부와 중간 부분에 각각 위치된 두개의 소수성 영역을 함유하며, 각각 시그날 펩티드 및 경막(transmembrane) 분절로 작용하는 것으로 추정된다.

PD-1 단백질의 N-말단부 서열을 전형적인 시그날 펩티드 절단 부위와 비교해보면 시그날 펩티드는 메티오닌(Met)1 부터 아르기닌(Arg)20 까지라는 것을 예상할 수 있다. 그러므로, 예측되는 PD-1 단백질의 성숙 형태는 268개의 아미노산을 함유할 것이며, 세포외 도메인(147개의 아미노산), 경막 영역(27개의 아미노산) 및 세포질 도메인(94개의 아미노산)으로 구성된다. 이 추정상의 세포외 도메인에서 4개의 유력한 N-글리코실화 부위가 발견된다.

PD-1 단백질의 아미노산 서열을 국립 생체의학 연구협회 데이타 베이스에 등록된 모든 서열과 비교한 결과, PD-1 단백질의 세포외 도메인이 면역글로불린상과(上科)중의 일부와 상동성이라는 것을 알 수 있었다. 보존된 아미노산 패턴 및 역평행 베타 가닥 수에 기초하여, 면역글로불린 도메인을 V, C1 및 C2 세트로 분류하였다. PD-1 내 두개의 시스테인 잔기(Cys 54 및 Cys 123) 사이의 68개의 아미노산 잔기는, V세트 서열의 이황화 가교된 면역글로불린 도메인과 유사하였다. 또한, 많은 V 세트 서열에 특징적인 4개의 아미노산 잔기 모두 PD-1 내에 보존되어 있었다(Arg 94, Phe 95, Asp 117 및 Gly 119).

예측된 PD-1 단백질의 세포질 도메인은, 항원 수용체 및 Fc 수용체와 결합되는 폴리펩티드 대부분의 세포질 미부(tail)에서 발견되는 콘센서스 서열(Asp/Glu-X8-Asp/Glu-X2-Tyr-X2-Leu/Ile-X7-Tyr-X2-Leu/Ile)의 변이체를 포함한다. 이 콘센서스 서열중 1개의 시그날 단위가 시그날을 형질도입하는데 충분하다는 것이 최근에 밝혀졌다.

기타 다른 포유류의 PD-1은 그 서열중의 아미노산의 수나 종류가 다르거나 다르지 않거나 간에 인체 PD-1과 구조적 특징이 유사할 것으로 추정된다.

제조

본 발명의 인체 PD-1을 암호하는 DNA는 하기 방법으로 제조할 수 있다.

서열 번호 2 및 3에 제시된 뉴클레오티드 서열이 일단 결정되면, 본 발명의 DNA는 화학적 합성, PCR 방법 또는 프로브로서 본 발명의 DNA 단편을 사용하여 하이브리드화하는 방법으로 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 DNA를 삽입한 벡터 DNA로 적절히 숙주 세포를 형질 전환시킨 후, 형질전환체를 배양함으로써 본 발명의 DNA를 목적량으로 얻을 수 있다.

본 발명의 PD-1 폴리펩티드(서열 번호 1로 나타냄)는 하기 방법에 의해 제조할 수 있으며, 바람직한 것은 (3)에 기재된 방법이다.

(1) 유기체 또는 배양 세포로부터 분리 및 정제하는 방법,

(2) 화학적으로 합성하는 방법, 또는

(3) 생명공학 기술을 사용하는 방법.

생명공학 기술을 사용하여 폴리펩티드를 제조할 때 사용되는 발현 시스템의 예로는 박테리아, 효모, 곤충 세포 및 포유류 세포의 발현 시스템이 있다.

예컨대, 성숙 펩티드를 암호하는 DNA의 5' 말단부에 개시 코돈(ATC)을 첨가하고, 얻어지는 DNA를 적절한 프로모터(예, trp 프로모터, lac 프로모터, λPL 프로모터, T7 프로모터 등)의 하류에 연결한 후, 이것을 이. 콜리 균주내에서 기능하는 벡터(예, pBR322, pUC18, pUC19 등)내로 삽입하여 발현 벡터를 제조함으로써, 이. 콜리중에서의 발현을 수행할 수 있다.

이와 같이 얻어진 발현 벡터로 형질전환된 이.콜리 균주(예, E. coli DH1 균주, E. coli JM109 균주, E. coli HB101 균주 등)를 적절한 배지에서 배양하면 목적하는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 박테리아의 시그날 펩티드(예, pel B의 시그날 펩티드)를 사용하면, 목적하는 폴리펩티드가 주변세포질(periplasm)내로 방출될 수 있다. 또한, 다른 폴리펩티드와의 융합 단백질 역시 용이하게 생산될 수 있다.

또한, 포유류 세포내에서 발현은 예를 들어 PD-1을 암호하는 총 DNA를 적절한 벡터(예, 레트로바이러스 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 벡시니아 바이러스 벡터, SV40 벡터 등)내의 적절한 프로모터(예, SV40 프로모터, LTR 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터 등)의 하류내로 삽입하여 발현 벡터를 얻고, 이 발현 벡터로 적절한 포유류 세포(예, 원숭이 COS-7 세포, 중국산 햄스터 CHO 세포, 마우스 L 세포 등)를 형질전환시킨 후, 그 형질전환체를 적절한 배지중에서 배양하여 배양 배지내에 목적하는 폴리펩티드를 얻으므로써 수행할 수 있다. 이와 같이 얻은 폴리펩티드는 통상의 생화학적 방법에 의해 분리 및 정제할 수 있다.

본 발명에 의해 얻은 PD-1 유전자를 암호하는 DNA는, 프로브로서 다른 동물의 PD-1 유전자를 분리하는데 사용할 수 있다.

서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가진 cDNA는 하기 단계로 이루어진 방법에 따라 제조할 수 있다.

(i) 본 발명의 폴레펩티드를 생성하는 세포주(예, 인체 식도암 세포주)로부터 mRNA를 분리하는 단계,

(ii) 얻은 mRNA로부터 제1 가닥(1본쇄 DNA)을 제조한 후, 제2 가닥(2본쇄 DNA)을 제조하는 단계(cDAN의 합성),

(iii) 이 cDNA를 적절한 파지 벡터내에 삽입하는 단계,

(iv) 이 재조합 DNA로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계(cDNA 라이브러리의 제조),

(v) 프로브로서 마우스 PD-1의 cDNA를 사용하여, 상기에서 얻은 cDNA 라이브러리를 플라크 하이브리드화로 선별하는 단계,

(vi) 이와 같이 얻은 양성 클론으로부터 파지 DNA를 제조한 다음, 플라스미드 벡터로 방출되는 cDNA를 서브클로닝한 후, 제한 효소 지도를 제조하는 단계, 및

(vii) 제한 효소로 절단된 각각의 단편의 서열을 결정한 다음, 이들을 조합하여 총 길이의 완전한 서열을 얻는 단계.

상세히 설명하면, 단계(i)은 인체 세포주를 적절한 자극제(예, IL-1 등)로 자극한 후, 또는 자극 없이 오카야마, 에이치.와 그의 동료들의 방법(Okayama, H. et al., Methods in Enzymology, vol. 154, p 3, 1987)에 따라 수행할 수 있다. 본 발병의 폴리펩티드를 생산하는 세포의 예로는 인체 세포주 YTC3 이 바람직하다.

단계(ii),(iii) 및 (iv)는 cDNA 라이브러리를 제조하는 일련의 단계로, 거불러 앤드 호프만의 방법(Gubler & Hoffman, Gene, vol. 25, pp. 263, 1983)을 약간 변형시킨 방법에 따라 수행할 수 있다. 단계(iii)에 사용된 플라스미드 벡터의 예로서, 다수의 플라스미드 벡터(예, pBR 322, pBluescript II 등) 및 파지 벡터(예, λgt10, λDASH II 등)가 공지되어 있으며, 파지 벡터 λgt10(43.3kbp; Stratagene)을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

단계(iv)에서 사용되는 숙주 세포로서, 이. 콜리(E. coli) NM514(Stratagene) 가 바람직할 수 있다.

단계(v) 및 (vi)은 문헌[Molecular Cloning, Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. 저술, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 출판]에 기재된 방법에 따라 수행할 수 있다.

단계(vii)은 문헌 [Molecular Cloning, Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. 저술, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 출판)에 기술된 방법에 따라 수행할 수 있다.

단계(vii)에서의 서열 결정 방법은 맥삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법 또는 디데옥시 종결 방법에 따라 수행할 수 있다.

이와 같이 얻은 cDNA가 완전한 길이 또는 거의 완전한 길이를 암호하는지를 검사할 필요가 있다. 이런 확인 과정은 프로브로서 상기 cDNA를 사용하여 노던 분석(Northern analysis)으로 수행할 수 있다(Molecular Cloning 참조). cDNA의 길이가 하이브리드화 밴드에서 얻은 mRNA의 길이와 거의 같다면, 그 cDNA는 거의 완전한 길이인 것으로 추정된다.

PD-1 유전자를 암호하는 DNA 또는 DNA 단편은, 프로브 또는 프라이머로서 PD-1 유전자를 검출하는데 사용될 수 있고, 상기 폴리펩티드와 생체내 방어 기전,면역 기능 또는 암과 같은 질병간의 관계를 연구하기 위한 목적으로, 또는 질병을 진단하기 위한 목적 등에 사용될 수 있다.

본 발명의 DNA는, 통상적인 유전자 재조합에 의해 PD-1 폴리펩티드, 그 폴리펩티드 단편 또는 그 유도체(각종 용도를 포함하는 것으로 예측됨)를 제조하는데, 중요한 필수 주형으로서 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드, 그 폴리펩티드 단편 또는 그 폴리펩티드 유도체는 감염증, 면역 기능의 저하 또는 항진, 또는 종양의 예방 및 치료에 사용될 수 있을 것이다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편에 대한 폴리클로날 및 모노클로날 항체는 통상적인 방법으로 제조할 수 있고, 유기체내 상기 폴리펩티드를 정량하는데 이들을 사용할 수 있으며, 상기 폴리펩티드와 질병과의 관계를 연구하기 위한 목적으로, 또는 질병을 진단하기 위한 목적 등에 사용될 수 있다. 인체 항체와 달리 키메라 항체인 상기 모노클로날 항체는 그 자체를 치료제로 사용할 수 있다.

상기 폴리클노날 및 모노클로날 항체는, 항원으로서 상기 폴리펩티드 또는 그 단편을 사용하여 통상의 방법으로 제조할 수 있다.

약제 적용

본 발명의 목적 달성을 위해, 본 발명의 폴리펩티드는 통상적으로 전신 또는 국부에, 보편적으로 경구 또는 비경구적으로, 바람직하게는 경구, 정맥내 또는 심실내로 투여할 수 있다.

투여 용량은 연령, 체중, 증상, 목적하는 치료 효과, 투여 경로 및 치료 지속 기간 등에 따라 결정한다. 성인의 경우, 1인당 투여 용량은 일반적으로 경구 투여시 1일당 수회 이하로 100 ㎍ 내지 100 mg이고, 비경구 투여시 1일당 수회이하로 10 ㎍ 내지 100 mg이다.

전술한 바와 같이, 사용되는 투여 용량은 각종 조건에 따라 달라진다. 그러므로, 상기 특정 범위 이하 또는 그 이상의 투여량을 사용하는 경우도 있을 수 있다.

본 발명의 화합물은 경구 투여시 고형 조성물, 액상 조성물 또는 이들 이외의 다른 조성물로, 비경구 투여시 주사제, 도포제 또는 좌약 등으로 투여할 수 있다.

경구 투여용 고형 조성물로는 압축 정제, 환제, 캅셀, 분산성 산제, 과립제가 포함된다. 캅셀로는 연질 캅셀 및 경질 캅셀이 있다.

상기 조성물에 있어서, 1종 이상의 활성 화합물(들)은 1종 이상의 불활성 희석제(예, 락토즈, 만니톨, 글루코즈, 히드록시프로필 셀룰로즈, 미소결정질 셀룰로즈, 전분, 폴리비닐피롤리돈, 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트 등)와 부가혼합된다. 또한, 이 조성물은 통상의 경우와 같이 불활성 희석제외의 부가적인 성분, 예컨대 윤활제(예, 마그네슘 스테아레이트 등), 붕해제(예, 셀룰로즈 칼슘 글리콜레이트 등), 안정화제(예, 인체 혈청 알부민, 락토즈 등) 및 용해 보조제(예, 아르기닌, 아스파라긴산 등)를 함유할 수도 있다.

정제 또는 환제는, 필요에 따라 위용성 물질 또는 장용성 물질(예, 설탕, 젤라틴, 히드록시프로필 셀룰로즈 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로즈 프탈레이트 등)의 필름, 또는 2가지 이상의 필름으로 피복할 수도 있다. 또한, 피복제는 젤라틴과 같은 흡수성 물질의 캅셀내에 내용물을 포함할 수 있다.

경구 투여용 액상 조성물로는 약학적 허용 유제, 용액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 이 조성물에서, 1종 이상의 활성 화합물(들)은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제(예, 정제수, 에탄올 등)내에 포함된다. 불활성 희석제 외에도, 상기 조성물들은 보조제(예, 습윤제, 현탁화제등), 감미제 향미제, 방향제 및 보존제를 함유할 수 있다.

기타 경구 투여용 조성물은, 공지의 방법에 의해 제조할 수 있고 1종 이상의 활성 화합물(들)을 함유하는 분무 조성물을 포함한다. 분무 조성물은 불활성 희석제외의 부가적인 성분, 예컨대 안정화제(아황산 나트륨 등), 등장성 완충액(염화 나트륨, 구연산 나트륨, 구연산 등)을 함유할 수 있다. 이러한 분무 조성물을 제조하기 위해서는, 미국 특허 제2,868,691호 또는 제3,095,355호(본 명세서의 참고문헌)에 기재된 방법을 사용할 수 있다.

비경구용 주사제로는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 및 유탁액을 포함한다. 이 조성물에서, 1종 이상의 활성 화합물(들)은 하나 이상의 불활성 수성 희석제(들)(예, 주사용 증류수, 생리적 식염수 등) 또는 불활성 비수성 희석제(들)(예, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일, 에탄올, 폴리솔베이트 80TM 등)과 부가 혼합된다.

주사제는 불활성 희석제외의 부가적인 성분, 예컨대 방부제, 습윤제, 유화제, 분산제, 안정화제(예, 인체 혈청 알부민, 락토즈 등) 및 용해 보조제(예, 아르기닌, 아스파라긴산 등)와 같은 보조제를 함유할 수도 있다.

이들을, 예컨대 박테리아 보유 필터를 통해 여과하거나, 조성물내에 멸균제를 첨가하거나 또는 방사선 조사함으로써 멸균할 수 있다. 또한, 예컨대 동결 건조시킴으로써 멸균 고형 조성물의 형태로 이들을 제조할 수도 있고, 사용 직전 주사용 멸균수 또는 기타 주사용 멸균 희석제중에 이들을 용해시킬 수 있다.

비경구 투여용 기타 조성물로는 1종 이상의 활성 화합물(들)을 함유하는 외용 액체 및 도포제(연고 등), 직장 투여용 좌제 및 페사리가 있으며, 이들은 공지의 방법으로 제조할 수 있다.

실시예

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로서, 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: 세포 배양

인체 세포주(CESS, HPB-ALL, Jarkat, TC3, CCRF-CEM, JM 및 MOLT-4F)를 10% 열불활성화시킨 태내(fetal) 송아지 혈청, 2mM의 글루타민, 50μM의 2-메르캅토에탄올, 100U/㎖의 페니실린 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신을 보충한 RPMI 1640(Gibco)에서 배양하였다.

실시예 2 : 노던 블롯 분석

총 RNA를 상기 세포주로부터 구아니듐 이소티오시아네이트 방법(전술한 분자 클로닝 참조)으로 추출하여 제조한 후, 올리고텍스-dT 30 <수퍼> (Daiichi ChemcalCo.)에 의해 총 RNA로부터 폴리(A)⁺RNA를 분리하였다. 3㎍의 폴리(A)⁺RNA를 1.2% 포름알데히드-아가로즈 겔 상에서 분리시킨 후 나일론 막(Biodyne A, Japan Genetic)으로 이동시켰다. 필터를 80℃에서 2 시간 동안 가열하였다. 마우스 PD-1의 암호 영역을 함유하는 EcoRI 단편(1kb)에 대해³²P로 랜덤 프라이밍을 수행하여 프로브로서 제조하였다. 이 프로브의 고유 활성(specific activity)은 약 9×10⁸d.p.m./㎍이었다. 10x 덴하르트 용액(Denhardt's), 1M NaCl, 50mM 트리스(pH7.5), 10mM EDTA, 1% SDS 및 1mg/㎖의 초음파처리된 연어 정자 DNA 내에서 65℃ 15 시간 동안 하이브리드화시켰다. 필터를 65℃에서 10분동안 1×SSC, 0.1% SDS로 세척하였다. 자동 방사선 사진에 의해 림프구 세포주 YTC3으로부터 하이브리드화 시그날 (2.3kb)을 관찰하였다.

실시예 3 : cDNA 라이브러리의 작제 및 인체 PD-1 cDNA의 클로닝

cDNA 라이브러리는 타임 세이버 cDNA 합성 킷트(Pharmacia)를 사용하여 YTC 3 세포주로부터 추출된 5㎍의 폴리(A)⁺RNA로 작제하였다. cDNA 제1 가닥은 올리고 dT 프라이머로 합성하였다. EcoRI-NotI 어답터에 연결된 이본쇄 cDNA를 λgt 10 벡터내로 클로닝시킨 후 파지(Gigapack II Gold, Stratagene)내로 팩키지하였다. 파지는 이.콜리 NM 514의 배양판(1awn)상에 플레이팅하였다. 파지 DNA는 형질감염시켜 각 플레이트로부터 라이브러리 필터를 복제하였다. 필터를 80℃에서 2 시간 동안 구워서, 60℃에서 15 시간 동안 하이브리드화시켰다. 블루스크립트 SK 플라스미드 벡터(Stratagene)로부터 EcoRI로 절제한 마우스 PD-1 암호 영역(1kb)을 프로브로서 사용하였다. 필터를 1×SSC 및 0.1% SDS로 60℃에서 10분간 세척하였다. 자동 방사선 사진에 의해 1.2×10⁶파지로부터 51개의 양성 시그날을 관찰하였다. 이 클론들을 분리 정제하였다. 선택된 약 23개의 클론들을 추가 분석한 결과, 관찰된 가장 긴 cDNA 삽입체는 2.1kb였다. 이 결과는 서던 블롯 분석의 결과와 일치하였다.

실시예 4 : DNA의 서열 결정

인체 cDNA 라이브러리로부터 분리된 cDNA 삽입체를 블루스크립트 SK 플라스미드 벡터(Stratagene)내로 서브클로닝시키고, 변형된 T7 DNA 중합효소(United States Biochemical) 및 [α-³²P]dCTP(3000 Ci/mmol, Amersham)를 사용하여 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결 방법(Sanger et al., 1977)으로 서열 결정하였다. 블루스크립트 플라스미드의 특이적 프라이머를 서열 결정용 프라이머로서 사용하였다. cDNA의 양 가닥을 완전히 서열 결정함으로써 뉴클레오티드 서열결정을 수행하였다. 그 결과로부터, 서열 번호 2에 나타난 뉴클레오티드 서열을 얻었다. 뉴클레오티드 서열로부터 추론된 펩티드 서열(서열 번호 1에 나타냄)이 결정되었다. 추론된 아미노산의 총수는 288개이고, 그 수는 마우스 PD-1의 것과 동일하다. 그 상동성은 각각 약 60%로 나타났다.

실시예 5: 서던 블롯팅

통상의 방법(전술한 분자 클로닝 참조)에 의하여 각종 동물 세포로부터 게놈 DNA를 분리하였다. DNA를 EcoRI, BamHI 또는 Hind III로 제조자의 추천에 따라 절단한 후, 전기영동(100V, 0.8% 아가로즈겔, TEA 완충액)시켜서 분리시켰다. DNA 단편을 10분동안 0.25N HCl로 세척하고, 30분동안 0.2N NaOH/0.6M NaCl로 변성시킨 후 1 시간 동안 0.6M NaCl/0.2M 트리스(pH7.5)로 중화시키고, 표준 서던 방법에서 사용되는 나일론 막(Bidyne A)으로 전이시켰다. 필터를 2 시간 동안 구웠다.

인체 PD-1의 암호 영역을 함유하는 EcoRI-StuI 단편(900bp)에 대해³²P 랜덤 프라이밍을 수행하여 프로브로서 제조하였다. 이 프로브의 비활성은 약 9×10⁸d.p.m./㎍이었다. 10x 덴하르트 용액, 1M NaCl, 50mM 트리스(pH7.5), 10mM EDTA, 1% SDS 및 1mg/ml의 초음파 처리된 연어 정자 DNA 내에서 65℃하에 10분 동안 하이브리드시켰다. 필터를 65℃에서 10분 동안 1×SSC, 0.1% SDS로 세척하였다. 임의 효소로 클론을 절단하여 하나의 밴드만을 자동 방사선 사진으로 검측하였을 때, 인체 PD-1 유전자는 단일 복사물로서 존재한다는 것이 밝혀졌다.

프로브로서 마우스 PD-1의 암호 영역을 함유하는 EcoRI 단편(1kb)을 사용하여, 실시예 2에 기재된 것과 동일한 조건(하이브리드화 및 세척)에 의해 각종 동물의 게놈 DNA로 서던 하이브리드화시켰다. 오직 인체 및 마우스의 게놈 DNA에서만 하이브리드화 시그날이 검출되었고, 초파리, 제노푸스(Xenopus) 및 래빗의 게놈 DNA에서는 시그날이 검출되지 않았다.

실시예 6: 인체 PD-1 게놈 클론의 분리

Sau3AI 부분 절단 및 BamHI 부위로의 결찰을 통해, 식도암 세포주 유래의 게놈 DNA 라이브러리를 λDASH II 벡터에 작제하였다(교토 대학교, 의과 대학, 병리학 제1부, 니시야마 교수에게서 얻음). 인체 PD-1 유전자는 블루스크립트 SK 벡터로부터 EcoRI분해에 의해 절단된 인체 PD-1 총 cDNA와 상기 라이브러리를 하이브리드화시켜 분리하였다. 랜덤 프라이밍에 의해 프로브를³²P로 표지화하였다. 1×10⁶파지 플라크로부터 두개의 양성 클론을 분리하고 정제한 후, 수개의 제한 효소로 절단하고, 동일한 프로브를 사용하여 서던 하이브리드화에 의해 분석하였다. CISS(염색체 동일계내 억제)로부터, 인체 PD-1 유전자가 2q37.3상에 지도화된다는 것이 밝혀졌다.

서열 목록

Claims

서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 보유한 아미노산 서열을 가진 실질적으로 정제된 형태의 폴리펩티드.
제1항에 있어서,

서열 번호 1에 제시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드.
제1항에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 DNA.
제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드에 대한 모노클로날 또는 폴리클로날 항체.
약학적 허용 희석제 및/또는 담체와 함께, 제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드 또는 제4항에 기재된 항체를 함유하고, 감염증, 면역 기능 저하 또는 항진, 또는 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약학 조성물.
서열 번호 1에 제시된 잔기 1 내지 268의 아미노산 서열, 또는 서열 번호 1에 제시된 잔기 1 내지 268의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 보유한 아미노산 서열을 가진 실질적으로 정제된 형태의 폴리펩티드.
제2항에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 DNA.
제3항 또는 제7항에 있어서,

서열 번호 2에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA.
제3항 또는 제7항에 있어서,

서열 번호 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA.
제3항 또는 제7항에 기재된 DNA를 포함하는 복제 및 발현 벡터.
제8항에 기재된 DNA를 포함하는 복제 및 발현 벡터.
제9항에 기재된 DNA를 포함하는 복제 및 발현 벡터.
제10항에 기재된 복제 및 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 비인간 숙주 세포.
제11항에 기재된 복제 및 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 비인간 숙주 세포.
제12항에 기재된 복제 및 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 비인간 숙주 세포.
제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드를 발현시키기에 효과적인 조건하에서 제13항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 생산 방법.
제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드를 발현시키기에 효과적인 조건하에서 제14항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 생산 방법.
제1항 또는 제2항에 기재된 폴리펩티드를 발현시키기에 효과적인 조건하에서 제15항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 폴리펩티드의 생산 방법.
제6항에 있어서, 서열 번호 1에 제시된 잔기 1 내지 268의 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드.
제6항에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 DNA.
제19항에 기재된 폴리펩티드를 암호하는 DNA.
제20항 또는 제21항에 있어서, 서열 번호 3에 제시된 잔기 85 내지 888의 뉴클레오티드 서열을 가진 DNA.