MXPA01013265A

MXPA01013265A - Proteina citoplasmica que liga calcio inducida por un trauma de cabeza.

Info

Publication number: MXPA01013265A
Application number: MXPA01013265A
Authority: MX
Inventors: Christoph Seyfried
Original assignee: Merck Patent Gmbh
Priority date: 1999-06-22
Filing date: 2000-06-14
Publication date: 2002-07-02
Also published as: NO20016340D0; KR20020011445A; BR0011802A; AU5681700A; EP1185650A1; AR024419A1; ZA200200511B; NO20016340L; CA2375480A1; CN1357041A; WO2000078947A1; JP2003503024A; CZ20014480A3; PL364763A1

Abstract

Se dan a conocer polipeptidos y polinucleotidos de la ANIC-BP y metodos para producir tales polipeptidos mediante tecnicas recombinantes. Asimismo se dan a conocer metodos para la utilizacion de los polipeptidos y polinucleotidos de ANIC-BP en ensayos de diagnostico.

Description

Proteina citoplasmática que liga calcio inducida por un trauma de cabeza Campo de la invención La presente invención se relaciona con una proteína humana, aguda, que liga calcio y es inducida por neuronas (en inglés: ANIC-BP) y polinucleótidos que identifican y codifican esta proteína. La invención también proporciona vectores de expresión, células hospedantes y anticuerpos. Además la invención proporciona métodos para producir la proteína y para tratar o prevenir desórdenes asociados con la expresión de la proteína. La invención se relaciona asimismo con la inhibición o activación de la acción de tales polinucleótidos y polipéptidos .

Fundamentos de la invención El ataque cerebral o de apoplejía y el trauma agudo de cabeza, la esclerosis múltiple y el daño de la médula espinal son enfermedades para las cuales no hay terapia disponible hasta el momento. El ataque cerebral o de apoplejía es la tercera causa de muerte y las cargas tanto para los pacientes como para los sistemas sociales son enormes. En el caso del ataque isquémico, que es la causa de la mayoría de los ataques cerebrales o de apoplejía, un evento inicial es el bloqueo de REF. : 134248 los vasos sanguíneos en el cerebro. En el mundo occidental los accidentes de traumas de cabeza son la enfermedad líder de la gente joven. El ataque cerebral hemorrágico causado por un impacto mecánico y ruptura arterial afecta a una menor cantidad de pacientes. Es muy común que los productos farmacéuticos aprobados sean difícilmente disponibles. Los enfoques comúnmente disponibles de los tratamientos se basan en conceptos fisiopatológicos derivados del trabajo experimental con isquemia cerebral focal. Estos incluyen estrategias farmacológicas para recanalización arterial, inhibición de procesos inflamatorios y protección neuronal. Además se está trabajando en estrategias de reperfusión arterial. Se están completando estudios clínicos avanzados con antagonistas del receptor de adhesión endotelial dependiente de leucocito polimorfonuclear, pero hasta ahora no ha surgido ninguna estrategia terapéutica. Sin embargo, es probable que cualquier estrategia que vaya dirigida sólo a una única etapa dentro de la cascada isquémica produzca sólo un beneficio modesto. Por lo tanto, las terapias futuras se basarán en terapias de combinación. Se ha demostrado que una combinación de ácido acetilsalicílico (ASA) en dosis baja y dipiridamol de liberación modificada es aditiva en la prevención secundaria del ataque cerebral (Tijssen et al., Int . J.Clin. Pract . , supl. 91, 14-16, 1997) . Otra combinación que se propone corrientemente para la evaluación clínica es tPA más un agente ** • * * neuroprotector efectivo. Sin embargo, los resultados de estos estudios están lejos de ser altamente efectivos. Por lo tanto, existe una necesidad urgente por aprender más acerca de los mecanismos fisiopatológicos para poder proporcionar blancos de drogas que se puedan usar para desarrollar nuevas drogas y establecer regímenes útiles más generales para el tratamiento de pacientes que padecen de efectos dañinos agudos para las neuronas y desórdenes tales como esclerosis múltiple. Esta invención se enfoca en proteínas que ligan Ca2+ dado que ha habido considerable evidencia del papel neuroprotector de las proteínas que ligan Ca2+ . Aunque no se conoce definitivamente la función precisa de las proteínas que ligan calcio (PLCa) , se ha propuesto que las PLCas actúan modulando o amortiguando (hacen de buffer de) los niveles intracelulares de Ca2+. Dado que una sobrecarga de Ca2+ activa procesos bioquímicos conduciendo a proteólisis y malfunción mitocondrial, esta capacidad moduladora de las PLCas puede tener un efecto protector contra el daño neuronal excitotóxico (Heinzmann et al., TINS, 15, 259-64, 1992). Existe una variedad de evidencias que apoyan la propuesta de este papel de las PLCas en la modulación de los niveles de Ca2+ y en la neuroprotección . Las principales proteínas que ligan Ca2+ (PLCas) expresadas en el sistema nervioso central (parvalbúmina, caldindina-D28K y calretinina) tienen un patrón muy inusual y selectivo de expresión en varias poblaciones neuronales. Entre las neuronas que expresan PLCas, la mayoría sólo expresa un tipo, aunque una pequeña cantidad de neuronas expresa más de una de las proteínas principales que ligan calcio. Existe una evidencia cada vez mayor que la presencia o ausencia de PLCas en ciertos tipos de células está sujeta al fenómeno conocido como vulnerabilidad selectiva. La vulnerabilidad selectiva es una propiedad de tipos específicos de neuronas de morir en respuesta a tipos particulares de daño del sistema nervioso central (SNC) . Por ejemplo, las neuronas CAÍ del hipocampo son selectivamente vulnerables a la isquemia global, las células Purkinje de cerebelo son selectivamente vulnerables al trauma de cabeza, a ataque cerebral o de apoplejía, y a la exposición fetal a alcohol, y neuronas en la sustancia negra son selectivamente vulnerables en el mal de Parkinson. Se ha hecho un esfuerzo para asociar la vulnerabilidad neuronal selectiva a los patrones de expresión de varias PLCas y algunos autores informan que se encuentran niveles elevados de PLCas en poblaciones neuronales que son selectivamente vulnerables a daño, mientras que otros informan que existen niveles elevados de PLCas en poblaciones neuronales que son selectivamente resistentes a daño. Por ejemplo, se informó que neuronas que expresan elevados niveles de parvalbúmina son selectivamente vulnerables a la toxicidad inducida por AMPA ( eiss et al. , Neurol.. 40 , 1288-1292, 1990), mientras que se informó que ..m*se±«x.j ~. neuronas que expresan elevados niveles de calbindina-D28K son selectivamente resistentes a la toxicidad inducida por glutamato (Baimbridge et al. , TINS, 15, 303-8, 1992). En forma similar, las neuronas de hipocampo que expresan elevados niveles de calretinina son resistentes a dosis tóxicas del glutamato de la excitotoxina, de NMDA, cainato y quiscualato (Winsky et al., en: Novel Calcium-Binding Proteins, 277-300, 1991) . Asimismo se ha mostrado que las PLCas presentan una expresión alterada en varios estados patológicos del SNC, pero nuevamente no se puede deducir a partir de los resultados si la expresión de PLCas está relacionada con la vulnerabilidad selectiva o resistencia selectiva frente al daño. Se informó que las neuronas que expresan la calbindina-D28K son selectivamente vulnerables en la enfermedad de Alzheimer (lacopino et al. PNAS, 87, 4078-82, 1990, Hof et al. Exp.

Neurol., 111, 293-301, 1991) y en la enfermedad de Huntington (Kiyama et al., Brain Res., 526, 303-07, 1990), aunque las neuronas que expresan la calbindina-D28K en la sustancia negra no son selectivamente vulnerables en el mal de Parkinson (Yamada et al., Brain Res., 526, 303-07, 1990). En un modelo de jerbo de isquemia global se ha mostrado que la presencia de parvalbúmina en ciertos tipos de células de hipocampo está asociada positivamente con la sobrevivencia (Tortosa et al., Neurosci., 1, 33-43, 1993), aunque otro estudio sugirió que las interneuronas de hipocampo que expresan la parvalbúmina son selectivamente vulnerables en la enfermedad de Alzheimer (Brady et al., Neurosci., 80, 1113-25, 1997). Los ratones con un gen inhibido de calbindina presentan déficits funcionales (por ej . ataxia) que sugieren una disfunción severa en neuronas que normalmente expresan estas PLCas (por ej . células Purkinje de cerebelo) a pesar del hecho que estas neuronas parecen morfológicamenre normales. Este hallazgo sugiere que las PLCas son vitales para los patrones de actividad celular (Airaksinen et al., PNAS, 94, 1488-93, 1997) . Además, se ha mostrado que la infección retroviral de motoneuronas con calbindina-D28k presenta efectos neuroprotectores contra la toxicidad inducida por la IgG de pacientes con esclerosis lateral amiotrófica (Ho et al., PNAS, 93, 6796-801, 1996) y se ha mostrado que la transfección con calbindina-D28k protege células PC12 de la toxicidad debido a sustracción de suero, exposición a glutamato y la neurotoxina MPP+ (McMahon et al., Molec. Brain Res., 526, 303-07, 1998). En conclusión, existe considerable información relacionada con el papel que juegan las proteínas que ligan calcio en la neurodegeneración. Es cierto que algunas PLCas proporcionan protección y otras causan vulnerabilidad selectiva, pero todavía no se ha aclarado si la expresión de ciertas PLCas dentro de diferentes poblaciones neuronales conducen a diferentes respuestas funcionales de una cierta PLCa. Otra observación es que la severidad de diferentes tipos de daño del SNC puede afectar la aparente eficacia neuroprotectora de PLCas, o sea una PLCa puede conferir resistencia en un modelo de daño que involucre un daño moderado, pero puede ser incapaz de modular los aumentos de Ca2+ en daños más severos del SNC. Por lo tanto hay considerable evidencia que las PLCas confieren tanto resistencia como vulnerabilidad en procesos de daño del SNC, pero todavía se debe seguir investigando sobre el mecanismo involucrado y la regulación de la respuesta. Recientemente se ha aislado una familia de genes que comprende el gen no identificado funcionalmente (M025) a partir de una genoteca de ADNc derivada de ratón (Miyamoto et al., Mol. Reprod. Dev., 39, 1-7, 1993). La genoteca se construyó a partir de ARN aislado de un ratón embriónico precoz. La secuencia de aminoácidos pronosticada para M025 reveló que el gen M025 puede presentar homología estructural con proteínas que ligan calcio PLCas y carecen de dominios que abarcan la membrana, indicando que la proteína podría estar involucrada en el desarrollo citosólico del huevo no fertilizado. Sin embargo, la función real de esta proteína sigue siendo desconocida. Se ha clonado otro gen del tipo Mo25 a partir de una genoteca de ADNc de Drosophila (Nozaki et al., DNA Cell. Biol., 15, 505-09, 1996). La secuencia de aminoácidos deducida del ADNc del Mo25 presenta un 69.3% de identidad con el homólogo Mo25 de ratón. Un homólogo en Saccharomyces cerevisiae se codificó en un marco de lectura abierto cerca del gen de la subunidad de la calcineurina B. Más recientemente se ha aislado otro gen de mutantes hym A de Aspergillus (Karos et al., Mol. Gen Genet., 260, 5Í0-521, 1999) y resultó que correspondía a los homólogos en levaduras, plantas, moscas, lombrices, peces, ratones y en el hombre. Hasta ahora no se ha definido una función celular para la proteína Hym en ninguno de los organismos descritos. Al igual que en muchas otras proteínas en las que la contribución funcional se entiende sólo parcialmente, el proceso de descubrimiento de la droga está permanentemente sujeto a una revolución fundamental dado que abarca "genómicos funcionales", o sea una elevada biología de procesamiento basada en el genoma y en genes. Este enfoque como medio para identificar genes y productos génicos como blancos terapéuticos está reemplazando rápidamente enfoques anteriores basados en la "clonación posicional". Se identificaría un fenotipo, que es una función biológica o enfermedad genética, y esto se asociaría entonces con el gen responsable, basado en su posición sobre el mapa genético. Los genómicos funcionales se basan en gran medida en las tecnologías de secuenciado de ADN de alto procesamiento y en varias herramientas de bioinformática para identificar secuencias de genes de potencial interés de bases de datos de biología molecular actualmente disponibles. Hay una necesidad continua de identificar y caracterizar otros genes y sus polipéptidos/proteínas relacionadas como blancos para el descubrimiento de drogas.

Breve Descripción de la Invención La presente invención se relaciona con la ANIC-BP, en particular polipéptidos de la ANIC-BP y polinucleótidos de la ANIC-BP, materiales recombinantes y métodos para su producción. Tales polipéptidos y polinucleótidos son de interés en relación con métodos para el tratamiento de ciertas enfermedades, que incluyen pero no se limitan a, ataque cerebral o de apoplejía y el trauma agudo de cabeza, la esclerosis múltiple y el daño de la médula espinal, a las que se hará referencia en adelante como "enfermedades de la invención". En otro aspecto, la invención se relaciona con métodos para identificar agonistas y antagonistas (por ej . inhibidores) en los que se usan materiales proporcionados por la invención, y condiciones de tratamiento asociadas con un desequilibrio de la ANIC-BP con los compuestos identificados. En otro aspecto, la invención se relaciona con ensayos de diagnóstico para la detección de enfermedades asociadas con una actividad o nivel inapropiado de la ANIC-BP.

Descripción de la invención En un primer aspecto, la presente invención se relaciona con polipéptidos de la ANIC-BP. Tales polipéptidos incluyen: (a) un polipéptido aislado codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia de SEC ID NO: 1; (b) un polipéptido aislado que comprende una secuencia polipeptídica con al menos 95%, -96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia polipeptídica de la secuencia de SEC ID NO: 2; (c) un polipéptido aislado codificado por la secuencia polipeptídica de SEC ID NO: 2 ; (d) un polipéptido aislado con por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia polipeptídica de SEC ID NO: 2 ; (e) la secuencia polipeptídica de SEC ID NO: 2 y (f) un polipéptido aislado con una secuencia polipeptídica con un índice de Identidad de 0.95, 0.96, 0.97, 0.98 o 0.99 comparado con la secuencia polipeptídica SEC ID NO: 2; (g) fragmentos y variantes de tales polipéptidos en (a) a (f) Se cree que los polipéptidos de la presente invención son miembros de la familia de polipéptidos de la proteína que liga *Calcio. Por lo tanto, son de interés porque podrían ser útiles como un novedoso blanco de droga.

En adelante se hace referencia a las propiedades biológicas de ANIC-BP como "actividad biológica de ANIC-BP" o "actividad de la ANIC-BP" . Un polipéptido de la presente invención presenta preferentemente por lo menos una actividad biológica de ANIC-BP . Los polipéptidos de la presente invención también incluyen variantes de los polipéptidos previamente mencionados, incluyendo todas las formas alélicas y variantes de maduración por corte y unión. Tales polipéptidos difieren del polipéptido de referencia por cortes y uniones (splice) , eliminaciones y sustituciones que pueden ser conservadoras o no conservadoras, o cualquier combinación de los mismos. Las variantes particularmente preferidas son aquellas en las que varios, por ejemplo de 50 a 30, de 30 a 20, de 20 a 10, de 10 a 5, de 5 a 3, de 3 a 2, de 2 a l o l aminoácido son insertados, sustituidos o eliminados, en cualquier combinación. Los fragmentos de polipéptidos preferidos de la presente invención incluyen un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácido que tiene por lo menos 30, 50, o 100 aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácidos de SEC ID ?O: 2, o un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 30, 50 0 100 aminoácidos contiguos truncados o eliminados de la secuencia de aminoácidos de SEC ID ?O: 2. Los fragmentos preferidos son los fragmentos biológicamente activos que median la actividad biológica de la ANIC-BP, incluyendo aquellos con una actividad similar o 'mejorada, o con una actividad indeseablemente disminuida. También se prefieren aquellos fragmentos que son antagónicos o inmunogénicos en un animal, especialmente en el humano . Los fragmentos de los polipéptidos de la invención se podrán utilizar para producir el correspondiente polipéptido de largo total por medio de síntesis de péptidos, por lo tanto, estas variantes podrán emplearse como intermedios para producir los polipéptidos de largo total de la invención. Los polipéptidos de la presente invención pueden aparecer en la forma de proteína "madura" o pueden ser parte de una proteína más grande tal como una proteína precursora o de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contenga secuencias secretoras o líder, prosecuencias, secuencias que ayudan en la purificación, por ejemplo residuos de histidina múltiple, o una secuencia adicional para estabilizar durante la producción recombinante. Los polipéptidos de la presente invención pueden ser preparados de cualquier manera conveniente, por ejemplo por aislamiento de fuentes naturales, por células hospedantes obtenidas mediante ingeniería genética que comprendan sistemas de expresión ( vide infra ) o por síntesis química utilizando or ejemplo, sintetizadores automáticos de péptidos, o una combinación de dichos métodos. Los métodos para preparar tales polipéptidos se entienden perfectamente en el arte. En un aspecto más amplio, la presente invención se relaciona con los polinucleótidos de la ANIC-BP. Tales polinucleótidos incluyen: (a) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene por lo menos 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% de identidad con la secuencia de polinucleótidos de SEC ID NO: 1; (b) un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de la SEC ID NO: 1; (c) un polinucleótido aislado que tiene por lo menos un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con el polinucleótido de SEC ID NO: 1; (d) el polinucleótido aislado de SEC ID NO: 1; (e) un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos codificante de una secuencia polipeptídica que tiene por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia polipeptídica de SEC ID NO: 2; (f) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos codificante del polipéptido de la SEC ID NO : 2 ; (g) un polinucleótido aislado con una secuencia de polinucleótidos codificante que tiene por lo menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con la secuencia de polipéptido de SEC ID NO: 2; (h) un polinucleótido aislado que codifica al polipéptido de SEC ID NO: 2; (i) un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de polinucleótidos con un índice de Identidad de 0.95, 0.96, 0.97, 0.98 o 0.99 comparado con la secuencia de polinucleótidos de SEC ID NO: 1; (j) un polinucleótido aislado que tiene una secuencia de polinucleótidos codificante de la secuencia polipeptídica con un índice de Identidad de 0.95, 0.96, 0.97, 0.98 o 0,99 comparado con la secuencia polipeptídica SEC ID NO: 2, y polinucleótidos que son fragmentos y variantes de los polinucleótidos antes mencionados o que son complementarios de los mismos en todo su largo. Los fragmentos preferidos de los polinucleótidos de la presente invención incluyen un polinucleótido aislado que abarca una secuencia de nucleótidos que posee al menos 15, 30, 50, o 100 nucleótidos contiguos de la secuencia SEC ID NO: 1, o un polinucleótido aislado que comprende una secuencia que posee al menos 30, 50, o 100 nucleótidos contiguos truncados o eliminados de la secuencia SEC ID NO: 1. Las variantes preferidas de los polinucleótidos de la presente invención incluyen variantes de maduración por corte y unión, variantes alélicas y polimorfismos incluyendo polinucleótidos que tienen uno o más polimorfismos de nucleótidos individuales (SNPs) . Los polinucleótidos de la presente invención también incluyen polinucleótidos que codifican a las variantes polipeptídicas que comprenden la secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 2 y en la que varios, por ejemplo, de 50 a 30, de 30 a 20, de 20 a 10, de 10 a 5, de 5 a 3, de 3 a 2, de 2 a 1 o 1 residuo de aminoácido son sustituidos, eliminados o agregados, en cualquier combinación. En otro aspecto, la presente invención provee polinucleótidos que son transcriptos de ARN de las secuencias de ADN de la presente invención. Por consiguiente, se provee un polinucleótido de ARN que: (a) comprende transcriptos de ARN de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido de SEC ID NO: 2; (b) es el transcripto de ARN de la secuencia de ADN que codifica al polipéptido de SEC ID NO: 2; (c) comprende un transcripto de ARN de la secuencia de ADN de SEC ID NO: 1; o (d) es el transcripto de ARN de la secuencia de ADN de SEC ID NO: 1 y polinucleótidos de ARN que son complementarios del mismo . La secuencia de polinucleótidos de SEC ID NO: 1 muestra homología con Hym A (Nozaki el al. DNA cell. Biol., 15, 505-09, 1996) y Mo25 (Karos et al., Mol. Gen. Genet., 260, 510- 521, 1999) . La secuencia de polinucleótidos de SEC ID NO: 1 es una secuencia de ADNc que codifica al polipéptido de SEC ID NO: 2. La secuencia de polinucleótidos que codifica al polipéptido de SEC ID NO: 2 puede ser idéntica a la secuencia que codifica al polipéptido de SEC ID NO: 1 o puede ser una secuencia diferente a SEC ID NO: 1, que como resultado de la redundancia (degeneración) del código genético, también codifica al polipéptido de SEC ID NO: 2. El polipéptido de SEC ID NO: 2 se relaciona con otras proteínas de la familia de la proteína que liga al *Calcio, y tiene homología y/o similitud estructural con las proteínas Hym A y Mo25. Se espera que los polipéptidos y los polinucleótidos preferidos de la presente invención tengan, inter alia , funciones/propiedades biológicas similares a sus polipéptidos y polinucleótidos homólogos. Además, los polipéptidos y polinucleótidos preferidos en esta invención tienen por lo menos una actividad de la ANIC-BP. Los polinucleótidos de la presente invención se 'pueden obtener utilizando técnicas de clonación y rastreo corrientes de una genoteca de ADNc derivada de ARNc de células del sistema nervioso central humano, (ver por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ) . Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden obtener de fuentes naturales tales como una genoteca de ADN genómico o se pueden sintetizar utilizando las técnicas conocidas y comercialmente disponibles del mercado. Cuando se utilizan los polinucleótidos de la presente invención para la producción recombinante de polipéptidos de la presente invención, el polinucleótido puede incluir la secuencia que codifica al polipéptido maduro, en sí mismo, o la secuencia que codifica al polipéptido maduro en el marco de lectura con otras secuencias codificantes tales como aquellas que codifican una secuencia líder o secretora, una secuencia preproteínica o proproteínica o preproproteínica u otras porciones de péptidos de fusión. Por ejemplo, se puede codificar una secuencia marcadora que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En algunas realizaciones preferidas de este aspecto de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como se proporciona en el vector pQE (Qiagen, Inc.) y se describe en Gentz et al., Proc Nati Acad Sci USA (1989) 86:821-824, o es una marca HA. El polinucleótido también puede contener secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como secuencias transcriptas no traducidas, señales de empalme y poliadenilación, sitios de unión al ribosoma y secuencias que estabilizan el ARNm. Los polinucleótidos idénticos o con suficiente identidad respecto de una secuencia de polinucleótidos de SEC ID NO: 1, se pueden utilizar como sondas de hibridización para ADNc y AE genómico o como cebadores para una reacción de amplificación de ácido nucleico (por ejemplo, PCR) . Tales sondas o cebadores se pueden utilizar para aislar ADNcs de largo completo y códigos genómicos codificantes de polipéptidos de la presente invención y para aislar ADNc y clones genómicos de otros genes (incluyendo genes codificantes de parálogos de recursos humanos y ortólogos y parálogos provenientes de especies diferentes a la humana) que tienen una alta similitud de secuencia con la SEC ID NO: 1, típicamente por lo menos 95% de identidad. Las sondas y los cebadores preferidos generalmente comprenderán por lo menos 15 nucleótidos, preferentemente, al menos 30 nucleótidos y podrán tener por lo menos 50 sino 100 nucleótidos. Las sondas particularmente preferidas tendrán entre 30 y 50 nucleótidos. Los cebadores particularmente preferidos tendrán entre 20 y 25 nucleótidos. Un polinucleótido codificante de un polipéptido de la presente invención, que incluya homólogos de otras especies diferentes a la humana, se podrá obtener mediante un proceso que comprenda los pasos de rastreo de una genoteca bajo condiciones de estricta hibridización con una sonda marcada que tenga la secuencia de SEC ID NO: 1 o un fragmento, preferentemente por lo menos 15 nucleótidos; y aislamiento de ADNc de largo total y clones genómicos que contengan la mencionada secuencia polinucleotídica. Dichas técnicas de hibridización son bien conocidas por el experto en el arte. Las condiciones estrictas de hibridización preferidas incluyen incubación nocturna a 42 °C en una solución que comprende: 50% de formamida, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato de trisodio 15 mM) , fosfato de sodio 50 mM (pH 7.6), 5x solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano y 20 microgramos/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y cortado; seguido de lavado de los filtros en 0.1 x SSC a aproximadamente 65°C. Por lo tanto, la presente invención también incluye polinucleótidos aislados preferentemente con una secuencia de nucleótidos de por lo menos 100, obtenidos mediante rastreo de genoteca bajo estrictas condiciones de hibridización con una sonda marcada que presentaba la secuencia de SEC ID NO: 1 o un fragmento de la misma, preferentemente de por lo menos 15 nucleótidos . El experto en el arte apreciará, que en muchos casos, una secuencia aislada de ADNc estará incompleta, dado que la región codificante del polipéptido no se extiende a lo largo de toda la hebra hasta el extremo 5' . Esto es una consecuencia de la transcriptasa reversa, una enzima con un "procesamiento" inherentemente bajo (una medida de la habilidad de la enzima para permanecer unida al molde durante la reacción de polimerización) , que no completa copia de ADN del molde de ARNm durante la síntesis de ADNc de la primera hebra. Existen diversos métodos disponibles y bien conocidos por aquellos experimentados en el arte para obtener ADNcs de largo completo, o de extender ADNcs cortos, por ejemplo aquellos basados en el método de Amplificación Rápida de extremos de ADNc (RACE) (ver por ejemplo Frohman et al., Proc. Nat Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988) . Las recientes modificaciones en la técnica, ejemplificadas por la tecnología de Marathón (marca registrada) (Clontech Laboratories Inc.) por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNcs más largos. En la tecnología Marathón (marca registrada), se prepararon ADNcs a partir de un ARNm extraído de un tejido elegido y una secuencia ' adaptadora ' ligada a cada extremo. Entonces se lleva a cabo la amplificación del ácido nucleico (PCR) para amplificar el extremo 5' de ADNc "ausente" utilizando una combinación de genes específicos y cebadores de oligonucleótidos adaptadores específicos. Entonces se repite la reacción de PCR utilizando los cebadores 'apareados1, esto es, cebadores diseñados para templar dentro del producto amplificado (típicamente un cebador específico adaptador que temple más allá de 3 ' en la secuencia adaptadora y un cebador específico de un gen que temple más allá de 5 ' en la secuencia genética conocida) . Los productos de esta reacción se pueden analizar entonces por secuenciación de ADN y se puede elaborar un ADNc de largo completo, ya sea uniendo el producto directamente al ADNc existente para darle uno secuencia completa o llevando a cabo una PCR de largo completo utilizando la nueva información de la secuencia para el diseño del cebador 5 ' .

Los polipéptidos recombinantes de la presente invención se pueden preparar por medio de los métodos bien conocidos en el arte de células huésped diseñadas genéticamente que comprenden sistemas de expresión. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la presente invención se refiere a los sistemas de expresión que comprenden un polinucleótido o polinucleótidos de la presente invención, a células huésped que se diseñan genéticamente con tales sistemas de expresión y a la producción de polipéptidos de la invención por técnicas recombinantes. Los sistemas de traducción libres de células también pueden emplearse para producir tales proteínas usando ARNs derivados de las construcciones de ADN de la presente invención. Para la producción recombinante, las células huésped pueden diseñarse genéticamente para incorporar los sistemas de expresión o porciones de los mismos para los polinucleótidos de la presente invención. Los polinucleótidos se pueden introducir en células hospedantes por medio de los métodos descritos en muchos manuales estándares de laboratorio tales como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y Sambrook et al., ( ibid) . Los métodos preferidos para la introducción de polinucleótidos en células hospedantes incluyen, por ejemplo, transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, transvección, microinyección, transfección catiónica mediada por lípidos, electroporación, transducción, carga por raspado o scrapeado (scrape loading), introducción balística o infección. Los ejemplos representativos de células hospedantes adecuadas incluyen células bacterianas, tales como células de Sptreptococci , Staphylococci, E. coli , Streptomyces y Bacillus subtilis, tales como células de levadura y células de Aspergill us, células de insectos tales como las células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9, células animales tales como las CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 y células del melanoma de Bowes; y células de plantas. Se puede utilizar una gran variedad de sistemas de expresión, por ejemplo, sistemas cromosómicos, episomales y derivados de virus, ejemplo, vectores derivados de plásmidos bacterianos, de bacteriófagos, de transposones, de episomas de levadura, de elementos de inserción, de elementos cromosómicos de levadura, de virus tales como los baculovirus, papova virus, tales como el SV40, virus de vaccinia, adenovirus, virus de viruela de pollo, virus de pseudorabia y retrovirus, y vectores derivados de las combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos genéticos de plásmidos y bacteriófagos, tales como cósmidos y fagémidos. Los sistemas de expresión pueden tener regiones de control que regulan y generan expresión. En general, se puede usar cualquier sistema o vector que sea capaz de mantener, propagar o expresar un polinucleótido para producir un polipéptido en una célula huésped. La secuencia de polinucleótidos apropiada se puede insertar en un sistema de expresión mediante cualquier variedad de las técnicas de rutina conocidas, tales como por ejemplo, las establecidas en Sambrook et al., ( ibid) . Se pueden incorporar las señales de secreción apropiadas en el polipéptido elegido para permitir que la secreción de la proteína traducida penetre en el lumen del retículo endoplasmático, en el espacio periplasmático o en el entorno extracelular. Estas señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas. Si se debe expresar un polipéptido de la presente invención para ser utilizado en ensayos de rastreo, en general se prefiere que el polipéptido se produzca en la superficie de la célula. En este caso, las células se pueden cosechar antes de utilizarlas en el ensayo de rastreo. Si el polipéptido se segrega en el medio, se puede recobrar el medio y purificar y recuperar el polipéptido. Si se produce intracelularmente, primero se deben lisar las células antes de recuperar el polipéptido. Los polipéptidos de la presente invención se pueden recuperar y purificar a partir de cultivos de células recombinantes por medio de métodos conocidos incluyendo el sulfato de amonio o la precipitación de etanol, la extracción de ácido, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrofóbica, afinidad cromatográfica, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Generalmente, se prefiere emplear la cromatografía líquida de alto desarrollo para la purificación. Se pueden usar las técnicas conocidas para el plegado de proteínas para regenerar la conformación activa, cuando el polipéptido se desnaturaliza durante la síntesis intracelular, el aislamiento y/o la purificación. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden utilizar como reactivos de diagnóstico mediante la detección de mutantes en el gen asociado. La detección de la forma mutada del gen caracterizado por el polinucleótido de la SEC ID NO: 1 en el ADNc o en la secuencia genómica que se asocia con una disfunción proporcionará una herramienta de diagnóstico, que se puede agregar al o definir el diagnóstico de una enfermedad, o la susceptibilidad a una enfermedad que sea el resultado de una menor expresión o mayor expresión de un gen o de una expresión espacial o temporal alterada del gen. Aquellos individuos con mutaciones genéticas se pueden detectar a nivel del ADN por medio de una variedad de técnicas bien conocidas en el arte. Los ácidos nucleicos para diagnóstico se pueden obtener a partir de las células de un individuo, tales como sangre, orina, saliva, biopsia de tejidos o material de autopsia. El ADN genómico se puede usar directamente por detección o se puede amplificar enzimáticamente utilizando PCR, preferentemente RT-PCR, u otras técnicas de amplificación previas al análisis. El ARN o el ADNc también se pueden utilizar de manera similar. Las eliminaciones y las inserciones se pueden detectar por el cambio de tamaño del producto amplificado comparado con el genotipo normal. Las mutaciones de punto se pueden identificar por hibridación de ADN amplificado con secuencias de nucleótidos de la ANIC-BP marcadas. Las secuencias perfectamente apareadas se pueden diferenciar de las duplas no apareadas a partir de la digestión con ARNasa o a partir de las diferencias en las temperaturas de fusión. La diferencia de secuenciación en el ADN también se puede detectar mediante alteraciones en la movilidad electroforética de los fragmentos de ADN con geles, con o sin agentes desnaturalizantes, o por medio de secuenciación directa de ADN (ver, por ejemplo, Myers et al., Science (1985) 230:1242). Los cambios de secuencia en ubicaciones especiales también se pueden revelar por medio de ensayos de protección de nucleasa, tales como ARNasa y protección SI o el método de corte químico (ver Cotton et al., Proc Nati Acad Sci USA (1985) 85:9397-4401). Se puede construir un conjunto de sondas de oligonucleótidos que abarca la secuencia ANIC-BP del polinucleótido o sus fragmentos para llevar a cabo un rastreo eficiente de mutaciones genéticas, por ejemplo. Tales grupos preferentemente son grupos de alta densidad o rejillas. Los métodos tecnológicos de conjunto (array) son bien conocidos y tienen aplicabilidad general y se pueden utilizar para dirigir una variedad de interrogantes en genética molecular incluyendo la expresión genética, la unión genética y la variabilidad genética, ver, por ejemplo, M. Chee et al., Science, 274, 610- 613 (1996) y otras referencias que se citan en el mismo. Se puede utilizar la detección de niveles de polipéptido anormalmente disminuidos o aumentados o de la expresión de ARNm para diagnosticar o determinar la susceptibilidad de un individuo a contraer la enfermedad de la invención. La expresión disminuida o aumentada se puede medir a nivel del ARN utilizando cualquiera de los bien conocidos métodos del arte de cuantificación de los polinucleótidos, tales como por ejemplo, la amplificación de ácido nucleico, por ejemplo PCR, RT-PCR, protección de ARNasa, Northern Blotting y otros métodos de hibridización. Las técnicas de conjunto que se pueden utilizar para determinar los niveles de una proteína, tal como un polipéptido de la presente invención, en una muestra derivada de una célula hospedante son bien conocidas por los expertos en el arte. Tales métodos de conjunto, incluyen radioinmunoensayos, ensayos de unión competitiva, Western Blot y ensayos ELISA. De esta manera y en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un kit (estuche) de diagnóstico que comprende: a) un polinucleótido de la presente invención, preferentemente el nucleótido de la secuencia de SEC ID NO: 1, o cualquier fragmento o un transcripto de ARN del mismo. b) una secuencia de nucleótido complementaria a la de (a) ; c) un polipéptido de la presente invención, preferentemente el polipéptido de SEC ID NO: 2 o un fragmento del mismo, o d) un anticuerpo del polipéptido de la presente invención preferentemente del polipéptido de SEC ID NO: 2. Se podrá apreciar que cualquier equipo de este tipo, (a) , (b) , (c) o (d) puede comprender un componente sustancial. Tal estuche podrá ser de uso para él diagnóstico de una enfermedad o la susceptibilidad a una enfermedad, enfermedades especiales de la invención, entre otras. Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención son de valor para los estudios de localización de cromosomas. La secuencia va dirigida específicamente y puede hibridizar con una ubicación particular sobre un cromosoma humano individual. El mapeo de secuencias relevantes para los cromosomas de acuerdo con la presente invención es un primer paso importante en la correlación de aquellas secuencias con una enfermedad asociada a los genes. Una vez que una secuencia ha sido mapeada con una ubicación precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma se puede correlacionar con los datos del mapa genético. Tales datos se encuentran por ejemplo en, V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (disponible en línea por medio de John Hopkins University Welch Medical) . La relación entre los genes y las enfermedades que han sido mapeadas con la misma región cromosómica se identifican entonces por medio de un análisis de unión (co-herencia de genes físicamente adyacentes) . La localización precisa en un cromosoma humano de una secuencia genómica (fragmento genético etc . ) se puede determinar mediante mapeo de híbrido de radiación (HR) (Walter, M. Spillett, D. Thomas, P. Weissenbach, J. Goodfellow, P., 1994) A method for constructing radiation hybrid maps of whole genomes, Nature Genetics 7, 22-28) . Se encuentran disponibles paneles de HR en el Instituto de Investigaciones Genéticas (en inglés: Research Genetics) (Hunstville, AL, USA) por ejemplo, el panel de HR de GeneBridge 4 (Hum Mol Genet 1996 Mar; 5(3) : 339-46 A radiation hybrid map of the human genome. Gyapay G, Schmidt K, Fizames C, Jones H, Vega-Czarny N, Spillett D, Muselet D, Prud'Homme JF, Dib C, Auffray C. Morissette J. Weisesebach J, Goodfellow PN) . Para determinar la ubicación cromosómica de un gen utilizando este panel, se realizan 93 PCRs utilizando cebadores diseñados desde el gen de interés sobre ADNs de HR. Cada uno de estos ADNs contiene fragmentos genómicos humanos elegidos al azar mantenidos en un medio de hámster (líneas celulares híbridas humanas/hámster) . Estas PCRs dan 93 marcas que indican la presencia o ausencia del producto de la PCR del gen de interés. Estas marcas se comparan con las marcas creadas utilizando productos de PCR para las secuencias genómicas de ubicación conocida. Esta comparación se lleva a cabo en http://www.genome.wi.mit.edu Las secuencias de polinucleótidos de la presente invención también son valiosas herramientas para estudios de expresión de tejido. Dichos estudios permiten la determinación de patrones de expresión de los polinucleótidos de la presente invención que pueden dar una indicación sobre los patrones de expresión de los polipéptidos codificados en el tejido, a partir de la detección de los ARNms que los codifican. Las técnicas utilizadas son bien conocidas en el arte e incluyen técnicas de hibridización in situ de los clones dispuestos en una rejilla, por ejemplo hibridización de microarray de ADNc (Schenna et al. Science, 270, 467-470, 1995 and Shalon et al, Genome Res, 6, 639-645, 1996) y técnicas de amplificación de nucleótidos tales como PCR. Un método preferido utiliza la tecnología TAQMAN (Marca Registrada) disponible en Perkin Elmer. Los resultados de estos estudios pueden suministrar información sobre una función normal del polipéptido en el organismo. Además, los estudios comparativos del patrón de expresión normal de ARNms con los de ARNms codificados mediante una forma alternativa del mismo gen (por ejemplo, uno con una alteración en el polipéptido que codifica una mutación potencial o regulatoria) puede proporcionar información valiosa sobre la función de los polipéptidos de la presente invención, o el papel que juega una expresión inadecuada en el caso de enfermedad. Tal expresión inapropiada puede ser de naturaleza temporal, espacial, o simplemente cuantitativa. Los polipéptidos de la presente invención se expresan en el cerebro humano. Otro aspecto de la presente invención se relaciona con los anticuerpos. Los polipéptidos de la invención o sus fragmentos, o las células que los expresan se pueden utilizar como inmunógenos para producir anticuerpos que son inmunoespecíficos para los polipéptidos de la presente invención. El término "inmunoespecífico" significa que los anticuerpos tienen sustancialmente mayor afinidad por los polipéptidos de la presente invención que por otros polipéptidos en del arte anterior. Los anticuerpos que se generan contra los polipéptidos de la presente invención se obtienen a partir de la administración de los polipéptidos o fragmentos portadores de epítopes, o de células a un animal, preferentemente no humano, utilizando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se puede utilizar cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de líneas celulares continuas. Los ejemplos incluyen la técnica de hibridoma (Kohier, G and Milstein, C, Nature (1975) 256:495- 497), la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de célula B humana (Kozbor et al., Inmunology Today (1983) 4:72) y la técnica de EBV-hibridoma (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985). Las técnicas para la producción de anticuerpos de cadena simple, tales como las descritas en la Patente Estadounidense No 9,946,778, se pueden adaptar para producir anticuerpos de cadena simple para los polipéptidos de esta invención. También se pueden emplear ratones transgénicos u otros organismos incluyendo otros mamíferos, para expresar anticuerpos humanizados. Los anticuerpos arriba mencionados se pueden emplear para aislar o para identificar clones que expresen el polipéptido o para purificar polipéptidos mediante cromatografía de afinidad. Los anticuerpos contra los polipéptidos de la presente invención también se pueden emplear para el tratamiento de las enfermedades de lá presente invención, entre otras. Los polipéptidos y los polinucleótidos de la presente invención también se pueden utilizar como vacunas. De esta manera, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para inducir una respuesta inmunológica en un mamífero que consiste en la inoculación a un mamífero de un polipéptido de la presente invención, adecuado para producir anticuerpos y/o respuesta inmune de células T, incluyendo, por ejemplo, células T productoras de citocina o células T citotóxicas para proteger al mencionado animal de la enfermedad, una vez que dicha enfermedad se ha establecido en el individuo o no. La respuesta inmunológica en un mamífero se puede inducir también por un método que consiste en la liberación del polipéptido de la presente invención por medio de la expresión del polinucleótido dirigida por un vector; dicho polinucleótido codifica para el polipéptido in vivo para inducir una respuesta inmunológica tal que proteja al mencionado animal de las enfermedades de la invención. Una forma de administrar el vector es acelerándolo en las células deseadas como un recubrimiento sobre las partículas o de otra manera. Tal vector de ácido nucleico puede consistir en ADN, ARN o un ácido nucleico modificado o un híbrido de ADN/ARN. Para su uso como vacuna normalmente se proporciona un polipéptido o un vector de ácido nucleico en una formulación de vacuna (composición) . La formulación también puede comprender un portador adecuado. Dado que un polipéptido se puede romper en el estómago, se administra preferentemente en forma parenteral (por ejemplo, inyección subcutánea, intramuscular, intravenosa o intradérmica) . Las formulaciones adecuadas para la administración incluyen soluciones inyectables estériles acuosas o no acuosas que pueden contener antioxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que transforman a la formulación en isotónica con la sangre del recipiente, y suspensiones estériles acuosas o no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o espesantes. Las formulaciones se pueden presentar en contenedores de una sola dosis o pueden ser contenedores de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas selladas y frascos y se pueden almacenar en condiciones de frío seco con el solo requerimiento de agregarle un portador líquido estéril inmediatamente antes del uso. La formulación de la vacuna también puede incluir sistemas adyuvantes para intensificar la inmunogenicidad de la formulación, tales como sistemas de aceites en agua y otros sistemas conocidos en el arte. La dosis dependerá de la actividad específica de la vacuna y se podrá determinar fácilmente mediante experimentos de rutina. Los polipéptidos de la presente invención poseen una o más funciones biológicas que son de importancia en uno o más estados de la enfermedad, en particular en las enfermedades de la invención mencionadas anteriormente .' Por lo tanto, es de utilidad identificar a los componentes que estimulan o inhiben la función o el nivel del polipéptido. De esta manera, en otro aspecto, la presente invención provee un método para rastrear compuestos para identificar los que estimulan o inhiben la función o el nivel del polipéptido. Estos métodos identifican los agonistas o los antagonistas que se pueden emplear para fines terapéuticos y profilácticos de las enfermedades de la invención tal como se menciona anteriormente. Los compuestos se pueden identificar a partir de una variedad de fuentes, por ejemplo, células, preparaciones libres de células, bibliotecas químicas, colecciones de compuestos químicos y mezclas de productos naturales. Tales agonistas o antagonistas, identificados de esta manera, pueden ser sustratos naturales o modificados, ligandos, receptores, enzimas, etc., del polipéptido según el caso, o un mimético estructural o funcional del mismo (ver Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Capítulo 5 (1991) o una molécula pequeña. El método de rastreo puede simplemente medir la unión al polipéptido de un compuesto candidato, o a células o membranas portadoras del polipéptido, o una proteína de fusión del mismo, a partir de una marca asociada directa o indirectamente con el compuesto candidato. Alternativamente, el método de rastreo puede comprender la medición o detección (cualitativa o cuantitativamente) de la unión competitiva (e.g. agonista o antagonista) . Además, estos métodos de rastreo pueden probar si el compuesto candidato da una señal generada por activación o inhibición del polipéptido, utilizando sistemas apropiados para la detección de células portadoras del polipéptido. Los inhibidores de la activación en general se analizan en presencia de un agonista conocido y el efecto sobre la activación por el agonista se observa por la presencia del compuesto candidato. Además, los métodos de rastreo pueden comprender simplemente los pasos de mezclar un compuesto candidato con una solución que contenga al polipéptido de la presente invención, para formar una mezcla; medir la actividad de la ANIC-BP en la mezcla y comparar la actividad de la ANIC-BP con una mezcla de control que no contenga al compuesto candidato. Los polipéptidos de la presente invención se pueden emplear con métodos de rastreo convencionales de baja capacidad y también en formatos de rastreo de alto procesamiento (en inglés HTS) . Dichos formatos (HTS) incluyen no sólo el uso bien establecido de placas de microtitulación de 96, y más recientemente 384, pozos, sino también los métodos emergentes tales como el método de nanopozo descrito por Schullek et al, Anal Biochem., 296, 20-29, (1997). Las proteínas de fusión, tales como las obtenidas de la porción Fc del polipéptidos y de la ANIC-BP, así como se describieron anteriormente, también se pueden utilizar para ensayos de alto procesamiento para identificar antagonistas para el polipéptido de la presente invención (ver D. Bennett et al., J. Mol Recognition, 8:52-58 (1995) and K. Johanson et al., J. Biol Chem, 270 (16): 9959-9471 (1995)).

Técnicas de rastreo Los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos del polipéptido de la presente invención también se pueden utilizar para configurar métodos de rastreo para detectar el efecto de los compuestos agregados sobre la producción de ARNm y los polipéptidos en células. Por ejemplo, se puede construir un ensayo ELISA para medir los niveles de polipéptido secretados o asociados a las células utilizando anticuerpos monoclonales o policlonales a partir de los métodos convencionales conocidos en el arte. Los mismos se pueden utilizar para descubrir agentes que pueden inhibir u optimizar la producción del polipéptido (también llamados los agonistas o antagonistas, respectivamente) a partir de células o tejidos manipulados adecuadamente. El polipéptido de la presente invención se puede utilizar para identificar receptores unidos a membrana o solubles, si es que existen, a través de técnicas estándares de unión de receptores conocidas en el arte. Estas incluyen, pero no se limitan a unión de ligandos, ensayos de entrecruzamiento en los que el polipéptido se marca con un isótopo radioactivo (por ejemplo, 125I), modificado químicamente (por ejemplo, biotinilado) , o fusionado a una secuencia polipeptídica apropiada para la detección o purificación, e incubado con una fuente del receptor putativo (células, membranas celulares, sobrenadantes de células, extractos de tejidos, fluidos corporales. Otros métodos incluyen técnicas biofísicas tales como la resonancia de plasmon de superficie y la espectroscopia. Estos métodos de rastreo se pueden utilizar también para identificar agonistas y antagonistas del polipéptido que compiten con la unión del polipéptido a sus receptores, si los hubiere. Los métodos estándares para realizar dichos estudios se conocen en el arte. Los ejemplos de los antagonistas de los polipéptidos de la presente invención incluyen anticuerpos o, en algunos casos, oligonucleótidos o proteínas que están estrechamente relacionados con los ligandos, sustratos, receptores, enzimas, etc., según sea el caso, del polipéptido, e.g., un fragmento de los ligandos, sustratos, receptores, enzimas, etc., o una pequeña molécula que se une al polipéptido de la presente invención pero que no provoca respuesta, de manera tal, que se previene la actividad del polipéptido. Los métodos de rastreo también pueden comprender el uso de la tecnología transgénica y del gen de la ANIC-BP. El arte de construir animales transgénicos esta bien establecido. Por ejemplo, el gen de la ANIC-BP se puede introducir mediante microinyección en el pronúcleo macho de ovocitos, transferencia retroviral a embriones pre- o post-implante, o inyección de células madre embriónicas modificadas genéticamente, por ejemplo, por electroporación, dentro de blastocitos hospedantes. Los animales transgénicos especialmente útiles son los llamados animales "knock-in" en los que un gen animal se reemplaza por el equivalente humano dentro del genoma de ese animal. Los animales transgénicos knock-in son útiles en el proceso de descubrimiento de drogas, para la validación de blancos, donde el compuesto es específico para el blanco humano. Otros animales transgénicos útiles son los llamados "knock-out" en los que se anula parcial o totalmente la expresión del ortólogo animal de un polipéptido de la presente invención y codificado- por una secuencia endógena de ADN en una célula. El knock-out del gen puede apuntar a células o tejidos como una consecuencia de las limitaciones de la tecnología o puede estar presente en todas o sustancialmente en todas las células del animal. La tecnología transgénica animal también ofrece un sistema de clonación-expresión de animal completo en el que los genes introducidos se expresan para dar como resultado grandes cantidades de polipéptidos de la presente invención. Los estuches de rastreo para usar en los métodos arriba descriptos constituyen otro aspecto de la presente invención. Tales estuches de rastreo incluyen: a) un polipéptido de la presente invención; b) una célula recombinante que expresa al polipéptido de la presente invención; o c) una membrana celular que expresa un polipéptido de la presente invención; o d) un anticuerpo para el polipéptido de la presente invención; donde se prefiere el polipéptido de la SEC ID NO: 2.

Se podrá apreciar que en cualquiera de estos estuches, (a), (b) , (c) o (d) pueden abarcar un compuesto sustancial.

Glosario Se proporcionan las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de ciertos términos utilizados frecuentemente con anterioridad. "Anticuerpos" tal como se utiliza aquí incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales, quiméricos, de cadena simple, y anticuerpos humanizados así como también fragmentos Fab, incluyendo los productos de un Fab u otra biblioteca de expresión de inmunoglobulinas. "Aislado" significa alterado por "la mano del hombre" de su estado natural; es decir; si ocurre naturalmente, se ha cambiado o removido de su entorno original, o ambos. Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido naturalmente presente en un organismo viviente no se ha "aislado ", pero el mismo polinucleótido o polipéptido que se introduce en un organismo mediante un proceso de transformación, manipulación genética o cualquier otro método recombinante ha sido "aislado" aún cuando todavía está presente en el mencionado organismo, pudiendo dicho organismo ser viviente o no viviente. "Polinucleótido" en general se refiere a cualquier polirribonucleótido (ARN) o polidesoxirribonucleótido (ADN) , que puede ser ARN o ADN modificado o no modificado. Los "polinucleótidos" incluyen, sin limitación, ADN de hebra simple o doble, ADN que es una mezcla de regiones de hebra simple o doble, moléculas híbridas que abarcan ADN y ARN que puede ser de hebra simple o, más típicamente, de doble hebra o una mezcla de regiones de hebra simple y doble. Además, "el polinucleótido" se refiere a regiones de triple hebra que comprenden ARN o ADN o ambos ARN y ADN. El término "polinucleótido" también incluye ADNs o ARNs que contienen una o más bases modificadas y ADNs o ARNs con el esqueleto modificado por razones de estabilidad u otras. Las bases "modificadas" incluyen por ejemplo, bases tritiladas y bases poco comunes tales como la inosina. Se pueden realizar una serie de modificaciones en el ADN y el ARN, así, "polinucleótido" abarca formas de polinucleótidos modificadas química, enzimática o metabólicamente tales como se encuentran típicamente en la naturaleza, así como también las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células. "Polinucleótido" también abarca polinucleótidos relativamente cortos, a los que a menudo se hace referencia como oligonucleótidos . "Polipéptido" se refiere a cualquier polipéptido que abarca uno o dos aminoácidos unidos entre sí por uniones peptídicas o uniones peptídicas modificadas, es decir; isósteros peptídicos. "Polipéptidos" se refiere a ambas cadenas cortas, a las que comúnmente se hace referencia como péptidos, oligopéptidos u oligómeros, y a cadenas más largas, generalmente llamadas como proteínas. Los polipéptidos pueden contener aminoácidos diferentes de los 20 aminoácidos codificados genéticamente. "Polipéptidos" incluyen secuencias de aminoácidos modificadas por procesos naturales, procesamiento de post-traducción, o por técnicas de modificación química que son conocidas en el arte. Tales modificaciones se describen en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como también en la voluminosa literatura de investigación. Las modificaciones se pueden presentar en cualquier lugar del polipéptido, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de aminoácidos y el extremo amino o carboxilo. Se podrá apreciar que el mismo tipo de modificación puede estar presente, en el mismo o diferentes grados, en varios sitios de un polipéptido determinado. Un polipéptido determinado también puede contener varias clases de modificaciones. Los polipéptidos se pueden ramificar como resultado de la ubiquitinación, y pueden ser cíclicos, con o sin ramificación. Los polipéptidos cíclicos, ramificados y ramificados cíclicos pueden ser el resultado de procesos naturales de post-traducción o se pueden preparar por vías sintéticas. Las modificaciones incluyen acetilación, acilación, ribosilación de ADP, amidación, biotinilación, unión covalente de flavina, unión covalente de la porción heme, unión covalente de un nucleótido o un derivado nucleótido o polinucleótido, unión covalente de un lípido o un derivado de lípido, unión covalente de fosfotidilinositol, entrecruzamiento, ciclización, formación de enlace de disulfuro, demetilación, formación de entrecruzamiento covalentes, formación de cistina, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gama, glicosilación, formación de anclaje GPI, hidroxilación, ionización, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, selenoilación, sulfatación, adición mediada por ADN de transferencia de aminoácidos a proteínas tal como la arginilación, y la ubiquitinación (ver, por ejemplo, Proteins-Structure and Molecular Properties, 2nd. Ed. T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York, 1993; Wold, F. , Post-translational Protein Modifications : Perspectives and Prospects, 1-12, in Post-translational Covalent Modifications of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol, 182, 626-646, 1990, and Rattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad, Sci, 663, 48-62,1992). "Fragmentos" de una secuencia de polipéptido se refiere a la secuencia polipeptídica que es más corta que la secuencia de referencia pero que retiene esencialmente la misma función biológica o actividad que el polipéptido de referencia. El "Fragmento" de la secuencia de polinucleótidos se refiere a la secuencia de polinucleótidos que es más corta que la secuencia de referencia SEC ID NO: 1. El término "variantes" se refiere a un polinucleótido o a un polipéptido que difiere del polinucleótido del polipéptido de referencia, pero conserva las propiedades esenciales del mismo. Una variante típica del polinucleótido difiere de la secuencia de polinucleótidos del polinucleótido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no alterar la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Los cambios de nucleótidos pueden resultar en sustituciones de aminoácidos, adiciones, eliminaciones, fusiones y truncamientos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia tal como se discute posteriormente. Una variante característica del polipéptido difiere de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de referencia. En general, las alteraciones son limitadas, de manera que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante guardan estrecha similitud y en muchas regiones, son idénticas. Una variante y un polipéptido de referencia pueden diferir entre sí en la secuencia de aminoácidos en una o más sustituciones, inserciones, eliminaciones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácido sustituido o insertado puede o no ser uno codificado por el código genético. Las sustituciones típicamente conservadoras incluyen: Gly, Ala; Val; lie, Leu; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr; Lys, Arg; y Phe y Tyr. Una variante del polinucleótido o del polipéptido se puede presentar naturalmente como en el caso de un alelo, o puede ser una variante que no se sepa que se presenta naturalmente. Las variantes de los polinucleótidos y de los polipéptidos que no se presentan naturalmente se pueden lograr a partir de técnicas de mutagénesis o por síntesis directa. También se incluyen como variantes los polipéptidos que poseen una o más modificaciones post-traducción, por ejemplo glicosilación, fosforilación, metilación del aminoácido aminoterminal, fosforilación de serinas y treonina y modificaciones de las glicinas C-terminales . El término "alelo" se refiere a una de dos o más formas alternativas del gen que se presenta en un locus determinado del genoma. El término "Polimorfismo" se refiere a la variación en la secuencia del polinucleótido (y la secuencia polipeptídica codificada, sí es relevante) en una posición dada en el genoma dentro de una población. El término "Polimorfismo de Nucleótido Individual" (PNI) (en inglés SNP) se refiere a la presencia de variabilidad de nucleótidos en una posición de nucleótidos individual en el genoma, dentro de una población. Un PNI se puede presentar dentro del gen o dentro de regiones intergénicas del genoma. El PNI se puede analizar utilizando una Amplificación Específica de Alelo (ASA) . Se requieren por lo menos 3 cebadores para el proceso. Se utiliza un cebador común en complemento inverso respecto del polimorfismo que se está analizando. El cebador común puede tener entre 50 y 1500 pb de la base polimórfica. Los otros dos (o más) cebadores son idénticos entre sí con la excepción que la base 3' terminal forma una burbuja para aparearse con uno de los dos (o más; alelos que conforman el polimorfismo. Se llevan a cabo dos (o más) reacciones de PCR en el ADN de muestra, cada una utilizando un cebador común y un cebador de los Cebadores Específicos de Alelo. El término "Variantes de maduración por corte y unión" como se expresa aquí se refiere a las moléculas de ADNc producidas por las moléculas de ARN inicialmente transcriptas desde la misma secuencia de ADN genómico, pero que han sufrido una unión o empalme de ARN alternativo. La unión de ARN alternativo tiene lugar cuando un transcripto de ARN primario sufre una maduración por corte y unión, en general para remover los intrones, lo que lleva a la producción de más de una molécula de ARNm, cada una de ellas puede codificar diferentes secuencias de aminoácidos. El término variante de maduración por corte y unión también se refiere a las proteínas codificadas por las moléculas de ADNc antes mencionadas . "Identidad" refleja la relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias de polinucleótidos, determinada por la comparación de secuencias. En general, identidad se refiere a correspondencia de un nucleótido exacto a nucleótido o aminoácido a aminoácido de dos secuencias de polipéptido, respectivamente, a lo largo de las secuencias que se comparan. "% de Identidad" - Para las secuencias donde no hay una correspondencia exacta, se puede determinar "el porcentaje de identidad". En general, las dos secuencias a ser comparadas se alinean para dar una correlación máxima entre las secuencias. Esto puede incluir la inserción de "brechas" en una o las dos secuencias, para optimizar el grado de alineación. Un porcentaje de identidad se puede determinar en el largo completo de cada una de las secuencias objeto de comparación (llamada alineación global), que es especialmente adecuado para las secuencias del mismo largo o de un largo similar, o en largos más cortos y definidos (llamado alineación local), que es más adecuado para las secuencias de largo diferente. El término "similitud" es otra medida más sofisticada de la relación entre dos secuencias polipeptídicas. En general, la "similitud" significa una comparación entre los aminoácidos de dos cadenas de polipéptidos, sobre una base residuo por residuo, considerando no sólo las correspondencias exactas entre pares de residuos, comparando uno de cada una de las secuencias (como identidad) sino también cuando no existe una correspondencia exacta, en el caso de que sobre una base evolutiva un residuo pueda sustituir a otro. La probabilidad tiene un valor (score) asociado a partir del cual se puede determinar el "% de similitud" de las dos secuencias. Los métodos para comparar la identidad y la similitud de dos o más secuencias son conocidos en el arte. Así, por ejemplo, se pueden usar programas disponibles en Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 9.1 (Devereux J et al, Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984, disponibles en el Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin, USA) , por ejemplo, los programas BESTFIT y GAP, para determinar el porcentaje de identidad y el porcentaje de similitud entre dos secuencias de polipéptidos. BESTFIT utiliza el algoritmo de "homología local" de Smith y Waterman (J. Mol Biol, 147, 195-197, 1981, Advances in Applied Mathematics, 2, 482-489, 1981) y encuentra la mejor región de similitud individual entre las dos secuencias. BESTFIT es más apropiado para comparar los dos polinucleótidos o dos secuencias de polinucleótidos que son de diferente longitud y el programa asume que la secuencia más corta representa una porción de la más larga. En comparación, GAP alinea dos secuencias, encontrando una "similitud máxima", de acuerdo al algoritmo de Neddleman and Wunsh (J Mol Biol., 48, 443-453, 1970) . GAP es más apropiado para comparar secuencias que tienen aproximadamente el mismo largo y se espera una alineación en todo el largo. Preferentemente, los parámetros "Gap Weight" y "Lenght Weight" utilizados en cada programa son 50 y 3, para las secuencias de polinucleótidos, y 12 y 4 para las secuencias polipeptídicas, respectivamente. Preferentemente, el porcentaje de identidad y similitud se determina cuando las dos secuencias objeto de comparación se encuentran en su alineación óptima. En el arte se conocen muy bien otros programas para determinar la identidad y/o la similitud entre las secuencias, por ejemplo la familia de programas BLAST (Altschul S F et al., J Mol Biol, 215, 403-410, 1990 Altschul SF et al., Nucleic Acids Res., 25: 389-3402, 1997, disponibles en el National Center for Biotechnology Information (NCBI), Bethesda, Maryland, USA y accesibles a través de la pagina de NCBI en www.ncbi.nlm.nih.gov) y FASTA (Pearson W R, Methods in Enzymology, 183, 63-99, 1990; Pearson W R and Lipman D J, Proc Nat Acad Sci USA, 85, 2444-2448, 1988, disponibles como parte del "Wisconsin Sequence Analysis Package" (Paquete de Análisis de secuencias de Wisconsin) . Preferentemente, se utiliza la matriz de sustitución de aminoácidos BLOSUM62 (Henikoff S and Henikoff J G. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89, 10915-10919, 1992) en la comparación de secuencias polipeptídicas incluyendo aquellas donde las secuencias de polinucleótidos se traducen a aminoácidos antes de efectuar la comparación. Preferentemente, se usa el programa BESTFIT para determinar el % de identidad de una secuencia de polinucleótido o un polipéptido a analizar con respecto a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos de referencia estando óptimamente alineada y los parámetros de programa fijados como valor, así como se ha descrito aquí, anteriormente . El término "índice de Identidad" es una medida de la relación de las secuencias utilizada para comparar una secuencia candidata de (polinucleótidos o polipéptidos) y una secuencia de referencia. De esta manera, por ejemplo, una secuencia candidata de polinucleótidos que tenga por ejemplo un índice de Identidad de 0.95 comparado con una secuencia de polinucleótidos de referencia es idéntica a la secuencia de referencia excepto que la posible secuencia de polinucleótidos puede incluir un promedio de hasta cinco diferencias por cada 100 nucleótidos de la secuencia de referencia. Tales diferencias se seleccionan del grupo que consiste en por lo menos una eliminación, sustitución de nucleótido incluyendo transversión y transición o inserción. Estas diferencias pueden ocurrir en las posiciones terminales 5 ' o 3 ' de la secuencia de polinucleótidos de referencia o en cualquier sitio dentro de estas posiciones, intercaladas individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia de polinucleótidos con un índice de Identidad de 0.95 comparado con la secuencia del polinucleótido de referencia, se puede eliminar, sustituir o insertar un promedio de hasta 5 en cada 100 de los nucleótidos de la secuencia de referencia, o se puede realizar cualquiera de estas combinaciones, como se describió anteriormente. Los mismo se aplica muta tis mutandis para otros Valores del índice de Identidad, por ejemplo 0.96, 0.97, 0.98 y 0.99. De igual manera, para un polipéptido, una secuencia polipeptídica candidata por ejemplo, con un índice de Identidad de 0.95 comparado con la secuencia polipeptídica de referencia es idéntica a la secuencia de referencia con la excepción de que la secuencia polipeptídica puede incluir un promedio de hasta 5 diferencias por cada 100 aminoácidos de la secuencia de referencia. Estas diferencias se seleccionan del grupo que tiene por lo menos una eliminación, sustitución de aminoácido, incluyendo las sustituciones conservativas y no conservativas, o una inserción. Estas diferencias se pueden presentar en las posiciones amino o carboxilo terminales de la secuencia del polipéptido de referencia intercaladas ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. En otras palabras, para obtener una secuencia del polipéptido que tenga un índice de Identidad de 0.95 comparado con la secuencia del polipéptido de referencia, se puede eliminar, sustituir o insertar un promedio de hasta 5 en cada 100 aminoácidos de la secuencia de referencia, o en cualquier combinación, como se ha señalado anteriormente. Lo mismo se aplica muta tis mutandis para otros valores del índice de Identidad, por ejemplo, 0.96, 0.97, 0.98 y 0.99. La relación entre el número de diferencias de nucleótidos 0 aminoácidos y el índice de Identidad se puede expresar por medio de la siguiente ecuación: na < xa - (xa • 1) , en la que: na es el número de diferencias de nucleótidos o aminoácidos, xa es el número total de nucleótidos o aminoácidos en SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 2, respectivamente, 1 es el índice de Identidad, • es el símbolo para el operador de multiplicación y, en el que cualquier producto no entero de xa y 1 se redondea hacia abajo al número entero más cercano antes de restarlo de Xa- El término "Homólogo" es un término genérico utilizado en el arte para indicar una secuencia de polinucleótidos o de polipéptidos con un alto grado de relación de una determinada secuencia con la secuencia de referencia. Tal relación se puede cuantificar determinando el grado de identidad y/o de similitud entre las dos secuencias, tal como se definió anteriormente. Dentro de este término genérico se encuentran los términos "ortólogo" y "parálogo". "Ortólogo" se refiere a un polinucleótido o polipéptido que es el equivalente funcional del polinucleótido o del polipéptido en otras especies. El "parálogo" se refiere al polinucleótido o al polipéptido que dentro de la misma especie es funcionalmente similar. El término "proteína de fusión" se refiere a la proteína codificada por dos genes fusionados no relacionados, o fragmentos de los mismos. Se han dado a conocer ejemplos en las patentes estadounidenses US 5541087, US 5726044, en las patentes europeas EP 574395, EP 493418 y EP 0232 262. En los casos de la ANIC-BP Fc, es ventajoso usar una inmunoglobulina de la región Fc como parte de la proteína de fusión para lograr la expresión funcional de la Fc-ANCI-BP, para mejorar las propiedades farmacocinéticas de tal proteína de fusión cuando la misma se utiliza para terapia o para generar un dímero de la Fc-ANIC-BP. La construcción del ADN de la Fc-ANIC-BP abarca en dirección a 5' a 3' , un cásete de secreción, es decir, una secuencia de señal que dispara la exportación desde una célula mamífera, y un ADN codificante de un fragmento de la región Fc, de una inmunoglobulina como parte de la fusión y un ADN codificante de la Fc-ANIC-BP. En algunos usos, sería deseable poder alterar las propiedades funcionales intrínsecas (unión de complemento, unión del receptor de Fc) mutando los lados funcionales de Fc y dejando el resto de la proteína de fusión sin tocar o eliminando completamente la parte de Fc después de la expresión. Todas las publicaciones y referencias que incluyen pero no se limitan a patentes y solicitudes de patentes citadas en esta especificación, se incorporan aquí por referencia en su totalidad, como si se indicara específica e individualmente incorporar aquí por referencia a cada publicación o referencia individual tal como se indicó anteriormente. Cualquier solicitud de patente para la que esta solicitud reclame prioridad se incorpora también por referencia en su totalidad en la forma descrita anteriormente para publicaciones y referencias .

Leyendas de las Figuras : Figura 1 Gel de amplificación diferencial (differential display) de un ARNm representativo con banda diferencialmente regulada en el hemisferio cerebral contralateral al lado del daño. La flecha marca la banda diferencial expresada.

Figura 2 RT-PCR con el fragmento del gen de 270 pb de rata Mo25 en el cerebelo luego de DCT en los ciclos 5, 10, 15, 20, 25 y 30, respectivamente. Notar la marcada expresión en el trazo L2 en los ciclos 20, 25 y 30. L2: ADNc de la parte no lesionada de la rata con DCT; R2: ADNc de la parte lesionada de la rata con DCT.

Figura 3 Análisis de transferencia en gota (dot blot) con fragmento de gen de 270 pb marcado radioactivamente con P de rata Mo25 con ARNm del cerebelo de una rata después de un DCT.

Se examinaron 6 ratas individuales. 3 se trataron con DCT y 3 con animales operados ficticiamente.

Figura 4 Transferencias Northern (Northern • Blots) de múltiples tejidos (Clontech Laboratories Inc, Palo Alto, CA, USA), con fragmento de gen de 270 pb marcado radioactivamente con 32P de rata Mo25 hibridizado sobre 8 tejidos de rata.

Figura 5 Hibridización in situ de secciones de cerebro de rata. Se utilizaron sondas sentido y antisentido especificas para SICCBP y Mo25. Se han monitoreado fuertes señales de iluminación a lo largo de troncos nerviosos mielinados (Corpus Callosum, Tractus opticus, tractus olfatorius intermedius, cerebellum commissura anterior) utilizando las sondas antisentido.

Figura 6 Expresión de la ANIC-BP en una PCR de TaqMan de Tiempo Real en ratas 7 días después del daño cerebral severo. Sección cortical no lesionada, se compararon lados corticales lesionados y cerebelo con cerebro de rato operada ficticiamente y tejido cerebral de ratas sacrificadas 7 días después del experimento. Las barras de error son errores estándares de la media, (en inglés S.E.M.).

Otros Ejemplos Ejemplo 1 Modelo de daño cerebral traumático Se estudió la identificación de los genes regulados positiva o negativamente en respuesta al daño cerebral traumático (DCT) en ratas utilizando el método de fluido lateral. Se indujo un DCT moderado centrado en la corteza parietal derecha con el método de percusión de fluido lateral en ratas macho Sprague-Dawley. 5 días después del DCT, se sacrificaron las ratas y se analizó el tejido cerebral disecado con una amplificación diferencial de ARNm por PCR (differential display) . Se confirmó la regulación positiva de la proteína en el cerebelo de cerebro con trauma mediante una RT-PCR. Las ratas de control se anestesiaron y se retractó el músculo temporal, pero no se efectuó craneotomía. Luego de sobrevivir 5 días, se anestesiaron y sacrificaron todas las ratas, se disecó el cerebro y se congeló en nitrógeno líquido. Se utilizó una segunda serie de ratas con DCT para tinción histoquímica e inmunohistoquímica. Una semana después del DCT, se anestesiaron estas ratas y se realizó una perfusión con solución salina seguida de paraformaldehído al 3%. Los cerebros se cortaron en un icrótomo congelante en secciones coronales de 30 µm.

Ejemplo 2 Inmunohistoquímica Se marcaron secciones de cerebelo con anticuerpos monoclonales contra la proteína que liga calcio. El inmunocomplejo se visualizó utilizando el método de avidina-biotina/DAB. Como control positivo se usó la Calbindina-D (28kD) como marcador confiable de las células Purkinje de cerebelo.

Ejemplo 3 Hibridización in situ Los oligodesoxinucleótidos seleccionados de la Secuencia No. 1 (Sentido, antisentido) se diseñaron de acuerdo con los métodos corrientes conocidos por aquellos expertos en el arte. Estas sondas se utilizaron para hibridización in situ en secciones de tejido cerebral de rata de acuerdo con los métodos conocidos en el arte. Se visualizaron autorradiografías luego de 5 días de exposición a película Kodak BioMax.

Ejemplo 4 Aislamiento de ARNm de ratas con DCT Se desarrolló una amplificación diferencial de ARNm por PCR (differential display) como método para identificar y analizar expresiones de genes alterados a nivel de ARNm de cualquier célula eucariótica (Liang and Pardee, Science 257, 967, 1992) . En la presente invención, utilizamos este método para estudiar los genes regulados positiva y negativamente en respuesta al daño cerebral traumático, para obtener una mejor información de los efectos moleculares del daño del sistema nervioso central (den Daas et al, Meeting of the American Neuroscience Society Washington D.C., USA; 1998). El modelo animal para el daño cerebral traumático se llama modelo de percusión lateral de fluidos y se lleva a cabo de la siguiente manera: se induce un daño cerebral traumático moderado centrado en la corteza parietal derecha del cerebro con el método de percusión lateral de fluido en ratas macho Sprague-Dawley. Las ratas de control se anestesiaron y se retractó el músculo temporal, pero no se llevó a cabo craneotomía. Luego de sobrevivir 5 días, las ratas se anestesiaron y sacrificaron, se realizó la disección del cerebro y se congeló el mismo en nitrógeno líquido. Se homogenizaron los cerebros enteros y se aisló el ARN total (Sambrook et al. 1989) .

Amplificación diferencial de ARNm por PCR (differential display) Se analizó el ARN obtenido con una amplificación diferencial de ARNm por PCR. Se llevó a cabo una transcripción reversa de ARNm utilizando cebadores oligo-dT con dos nucleótidos adicionales en todas las combinaciones posibles, (cebadores de las secuencias monoméricas en la dirección del gen de expresión, 13 simples) , de esta manera se ancló la reacción al principio de la cola poli (A) . La amplificación del AD?c se llevó a cabo con el mismo cebador 3 ' y con un segundo cebador 5' decámero arbitrario (cebador de las secuencias monoméricas que proceden en la dirección opuesta de un gen de expresión) . Los productos amplificados se analizaron en un gel de poliacrilamida al 10% no desnaturalizado (Amersham Pharmacia Biotech, Alemania) . Se visualizó el AD? mediante tinción con plata. Luego de la tinción, se secaron los geles durante una hora a temperatura ambiente (Fig. 1) . Las bandas reguladas diferencialmente se recortaron del gel. Se eluyó el ADN, se reamplificó y se subclonó en un vector pCR2.1 (Invitrogen, USA). Los fragmentos subclonados se secuenciaron con el método Sanger (Sanger F., et al, PNAS, USA 74, 5463-5467) y se compararon las secuencias con bancos de datos genómicos. La validación del fragmento de gen obtenido se realizó con una PCR de transcriptasa reversa (RT-PCR) . Para la confirmación de la Mo25 de rata expresada diferencialmente, se analizó la secuencia con RT-PCR utilizando el sistema de RT-PCR de un solo tubo de titanio (Boehringer Mannheim, Alemania) con 19 cebadores específicos simples y 21 cebadores simples. Se usó un microgramo del ARN total del control y de animales con DCT para la RT-PCR. Se llevaron a cabo más validaciones de genes utilizando la técnica de trasferencia en gota con sondas de Mo25 de rata y se llevaron a cabo análisis Northern blot con sondas de Mo25 humano . PCR de Transcriptasa Reversa (RT-PCR) Para confirmar la proteína que liga calcio inducida por un ataque y expresada diferencialmente se analizó la secuencia con una RT-PCR utilizando el sistema de RT-PCR de un tubo de titanio (Boehringer Mannheim, Alemania) con 19 cebadores simples y 21 cebadores simples. Para la RT-PCR se usó un microgramo del ARN total del control y de animales con DCT.

PCR de tiempo Real Se estudió la distribución de la ANIC-BP en el cerebro de la rata luego del trauma de cabeza con la técnica PCR Taqman de tiempo real en un sistema de detección de secuencias ABI prisma 7700 (PE, Applied Biosystems, Alemania) . Con esta técnica se pueden medir las concentraciones absolutas de AR?m con un alto grado de sensibilidad. Se diseñaron cebadores especiales con un largo de 25 y 29 pb y sondas TaqMan simples 32 (colorante reportero: FAM/ colorante de enfriamiento: TAMRA.

Proteína que liga Ca2+ La proteína separada por SDS-PAGE se transfirió sobre una membrana de nitrocelulosa y se analizó para determinar la unión de Ca2+ marcado radioactivamente utilizando el método descrito por Maruyama, K. et al. (J. Biochem. 95: 511-519, 1984) . Luego de la incubación, se lavó el sobrante del isótopo y se expuso la membrana a una película Kodak XOMAT.TM durante un tiempo apropiado. Se desarrolló una banda en la posición de la proteína de unión. La presencia de la proteína de unión de confirmó utilizando un anticuerpo específico para la proteína de unión aplicando ese anticuerpo con el método Western Blot que es conocido en el arte.

LISTADOS DE SECUENCIAS < U0 > Merck Patent GmbH < 120> csbeína aguda qje liga calcio neur ial <130> ANICBPJDDWS <140> < 111 > <160> 2 <17C> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1026 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1) .. (1026) <400> 1 atg ccg ttc ccg ttt ggg aag tet cae aaa tet cea gca gac att gtg 48 Met Pro Phe Pro Phe Gly Lys Ser His Lys Ser Pro Ala Asp He Val 1 5 10 15 aag aat ctg aag gag age atg gct gtt ctg gaa aag caa gac att tet 96 Lys Asn Leu Lys Glu Ser Met Ala Val Leu Glu Lys Gln Asp He Ser 20 25 30 gat aaa aaa gca gaa aag gct aca gaa gaa gtt tec aaa aat ctg gtt 144 Asp Lys Lys Ala Glu Lys Ala Thr Glu Glu Val Ser Lys Asn Leu Val 35 40 45 gcc atg aaa gaa att ctg tat ggc aca aat gaa aaa gag cct cag aca 192 Ala Met Lys Glu He Leu Tyr Gly Thr Asn Glu Lys Glu Pro Gln Thr 50 55 60 gaa gca gta gct caa ctt gct caa gaa ctc tat aat agt ggg ctc ctt 240 Glu Ala Val Ala Gln Leu Ala Gln Glu Leu Tyr Asn Ser Gly Leu Leu 65 70 75 80 age acc ctg gta gct gat tta cag ctc att gac ttt gag ggc aaa aaa 288 Ser Thr Leu Val Ala Asp Leu Gln Leu He Asp Phe Glu Gly Lys Lys 85 90 95 gac gtg gct caa att ttc aac aat att ctc aga aga caa att ggt acg 336 Asp Val Ala Gln He Phe Asn Asn He Leu Arg Arg Gln He Gly Thr 100 105 110 c aga act cct act gtt gaa tac ate tgc acc caa cag aat att ttg ctc 384 Arg Thr Pro Thr Val Glu Tyr He Cys Thr Gln Gln Asn He Leu Phe 115 120 125 atg tta ttg aaa ggg tat gaa tet cea gaa ata gct cta aat tgt gga 432 Met Leu Leu Lys Gly Tyr Glu Ser Pro Glu He Ala Leu Asn Cys Gly 130 135 140 ata atg tta aga gaa tgc ate aga cat gaa c a ctt gca aaa ate att 480 He Met Leu Arg Glu Cys He Arg His Glu Pro Leu Ala Lys He He 145 150 155 160 ? tC(3 <3<? tc<3 9aa cag ttt tat gat ttc ttc aga tat gtc gaa atg tca 528 Leu Trp Ser Glu Gln Phe Tyr Asp Phe Phe Arg Tyr Val Glu Met Ser 165 170 175 aca ttt gac ata gct tca gat gca ttt gcc aca ttc aag gat tta ctt 576 Thr Phe Asp He Ala Ser Asp Ala Phe Ala Thr Phe Lys Asp Leu Leu 180 185 190 aca aga cat aaa ttg ctc agt gca gaa ttt ttg gaa cag cat tat gat 624 Thr Arg His Lys Leu Leu Ser Ala Glu Phe Leu Glu Gln His Tyr Asp 195 200 205 5 aga ttt ttc agt gaa tat gag aag tta ctt cat tca gaa aat tat gtg 672 Arg Phe Phe Ser Glu Tyr Glu Lys Leu Leu His Ser Glu Asn Tyr Val 210 215 220 aca aaa aga cag tca ctg aag ctt ctc ggt gaa cta cta cta gat aga 720 Thr Lys Arg Gln Ser Leu Lys Leu Leu Gly Glu Leu Leu Leu Asp Arg 225 230 235 - 240 cae aac ttc aca att atg aca aaa tac ate agt aaa cct gag aac ctc 768 His Asn Phe Thr He Met Thr Lys Tyr He Ser Lys Pro Glu Asn Leu 245 250 255 aaa tta atg atg aac ctg ctg cga gac aaa agt cgc aac ate cag ttt 816 0 Lys Leu Met Met Asn Leu Leu Arg Asp Lys Ser Arg Asn He Gln Phe 260 265 270 gag gcc ttt cae gtt ttt aag gtg ttt gta gcc aat cct aac aag acg 864 Glu Ala Phe His Val Phe Lys Val Phe Val Ala Asn Pro Asn Lys Thr 275 280 285 cag ccc ate cta gac ate ctc ctc aag aac cag gcc aaa ctc ata gag 912 Gln Pro He Leu Asp He Leu Leu Lys Asn Gln Ala Lys Leu He Glu 290 295 300 ttc ctc age aag ttt cag aac gac agg acg gag gat gag cag ttt aac 960 Phe Leu Ser Lys Phe Gln Asn Asp Arg Thr Glu Asp Glu Gln Phe Asn 305 310 315 320 gac gag aag acc tat tta gtt aaa cag ate agg gat ttg aag aga cea 10C8 Asp Glu Lys Thr Tyr Leu Val Lys Gln He Arg Asp Leu Lys Arg Pro 325 330 335 gct cag caa gaa gct taa 1026 Ala Gln Gln Glu Ala 340 <210> 2 <211> 341 <212> PRT <213> Homo sapiens 10 <400> 2 Met Pro Phe Pro Phe Gly Lys Ser His Lys Ser Pro Ala Aso He Val 1 5 10 15 Lys Asn Leu Lys Glu Ser Met Ala Val Leu Glu Lys Gln Asp He Ser 20 25 30 Asp Lys Lys Ala Glu Lys Ala Thr Glu Glu Val Ser Lys Asn Leu Val 35 40 45 Ala Met Lys Glu He Leu Tyr Gly Thr Asn Glu Lys Glu Pro Gln Thr 50 55 60 Glu Ala Val Ala Gln Leu Ala Gln Glu Leu Tyr Asn Ser Gly Leu Leu 65 70 5 80 , _- Ser Thr Leu Val Ala Asp Leu Gln Leu He Asp Phe Glu Gly Lys Lys 85 90 95 Asp Val Ala Gln He Phe Asn Asn He Leu Arg Arg Gln He Gly Thr 100 105 110 Arg Thr Pro Thr Val Glu Tyr He Cys Thr Gln Gln Asn He Leu Phe 115 120 125 Met Leu Leu Lys Gly Tyr Glu Ser Pro Glu He Ala Leu Asn Cys Gly 130 135 140 ' He Met Leu Arg Glu Cys He Arg His Glu Pro Leu Ala Lys He He 145 150 155 160 Leu Trp Ser Glu Gln Phe Tyr Aep Phe Phe Arg Tyr Val Glu Met Ser 165 170 175 Thr Phe Asp He Ala Ser Asp Ala Phe Ala Thr Phe Lys Asp Leu Leu 0 180 185 190 Thr Arg His Lys Leu Leu Ser Ala Glu Phe Leu Glu Gln His Tyr Asp 195 200 205 Arg Phe Phe Ser Glu Tyr Glu Lys Leu Leu His Ser Glu Asn Tyr Val 210 215 220 Thr Lys Arg Gln Ser Leu Lys Leu Leu Gly Glu Leu Leu Leu Asp Arg 225 230 235 240 His Asn Phe Thr He Met Thr Lys Tyr He Ser Lys Pro Glu Asn Leu 245 250 255 •Lys Leu Met Met Asn Leu Leu Arg Asp Lys Ser Arg Asn He Gln Phe 260 265 270 Glu Ala Phe His Val Phe Lys Val Phe Val Ala Asn Pro Asn Lys Thr 275 280 285 Gln Pro He Leu Asp He Leu Leu Lys Asn Gln Ala Lys Leu He Glu 290 295 300 Phe Leu Ser Lys Phe Gln Asn Asp Arg Thr Glu Asp Glu Gln Phe Asn 305 310 315 320 Asp Glu Lys Thr Tyr Leu Val Lys Gln He Arg Asp Leu Lys Arg Pro 325 330 335 Ala Gln Gln Glu Ala 340 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un polipéptido aislado seleccionado de uno de los grupos, caracterizado porque consiste de: (a) un polipéptido aislado codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia de SEC ID NO: 1; (b) un polipéptido aislado que comprende una secuencia polipeptídica con al menos 95% de identidad con la secuencia polipeptídica de la secuencia de SEC ID NO: 2; (c) un polipéptido aislado que tiene al menos 95% de identidad con la secuencia polipeptídica de la secuencia de SEC ID NO: 2; y (d) una secuencia polipeptídica de la SEC ID NO: 2 y (e) fragmentos y variantes de tales polipéptidos en (a) a (d) . 2. El polipéptido aislado como se reivindica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el polipéptido de SEC ID NO:
2.
3. El polipéptido aislado como se reivindica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es la secuencia polipeptídica de SEC ID NO: 2.
4. Un polinucleótido aislado seleccionado de uno de los grupos, caracterizado porque consiste de: (a) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene por lo menos 95% de identidad con la secuencia de polinucleótidos de SEC ID
NO: 1 ; (b) un polinucleótido aislado que tiene por lo menos un 95% de identidad con el polinucleótido de SEC ID NO: 1; (c) un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos codificante de una secuencia polipeptídica que tiene por lo menos 95% de identidad con la secuencia polipeptídica de SEC ID NO: 2; (d) un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de polinucleótidos codificante de la secuencia de polipéptidos que tiene por lo menos 95% de identidad con la secuencia de polipéptidos de SEC ID NO: 2; (e) un polinucleótido aislado con una secuencia de nucleótidos de al menos 100 nucleótidos obtenidos por rastreo de una genoteca bajo estrictas condiciones de hibridización con una sonda marcada con la secuencia de
SEQ ID NO: 1 o un fragmento de la misma con al menos 15 nucleótidos; (f) un polinucleótido que es el ARN equivalente a un polinucleótido de (a) a (e) ; o una secuencia de polinucleótidos complementaria a dicho polinucleótido y polinucleótidos que son variantes o fragmentos de los polinucleótidos mencionados anteriormente o que son complementarios de los polinucleótidos mencionados anteriormente en todo el largo de los mismos. 5. Un polinucleótido aislado de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque se selecciona del grupo que consiste de: (a) un polinucleótido aislado que comprende el polinucleótido de SEC ID NO: 1; (b) el polinucleótido aislado de SEC ID NO: 1; (c) un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de polinucleótidos codificante de una secuencia polipeptídica de SEQ ID NO: 2; y (d) un polinucleótido aislado codificante del péptido de SEQ ID NO: 2. 6. Un sistema de expresión, caracterizado porque comprende un polinucleótido capaz de producir un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 cuando dicho vector de expresión está presente en una célula hospedante compatible.
7. Una célula hospedante recombinante caracterizada porque comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 6 o una membrana de la misma que expresa un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.
8. Un proceso para producir un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende la etapa de cultivo de células hospedantes como se define de conformidad con la reivindicación 7 bajo condiciones suficientes para la producción de dicho polipéptido y recuperación del polipéptido del medio de cultivo.
9. Una proteína de fusión, caracterizada porque comprende la región Fc de inmunoglobulinas y cualquiera de los polipéptidos de conformidad con la reivindicación 1.
10. Un anticuerpo inmunoespecífico para el polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
11. Un método de rastreo para identificar compuestos que estimulan o inhiben la función o el nivel del polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende un método seleccionado del grupo compuesto de: (a) la medición o detección, cuantitativa o cualitativa, de la unión de un compuesto candidato al polipéptido (o a las células o membranas que expresan al polipéptido) o de una proteína de fusión del mismo por medio de una marca directa o indirecta asociada al compuesto candidato; (b) la medición de la competencia por la unión al polipéptido (o a las células o membranas que expresan a dicho polipéptido) de un compuesto candidato o de una proteína de fusión del mismo en la presencia de un competidor marcado; (c) el análisis si el compuesto candidato genera una señal por activación o inhibición del polipéptido, usando sistemas de detección apropiados para las células o membranas celulares que expresan al polipéptido; (d) la mezcla de un compuesto candidato con una solución que contiene un polipéptido de la reivindicación 1 para formar una mezcla, medición de la actividad del polipéptido en la mezcla, y comparación de la actividad de la mezcla con una mezcla de control que no contiene al compuesto candidato; o (e) detección del efecto de un compuesto candidato sobre la producción de ARNm codificante de dicho polipéptido o dicho polipéptido en células usando por ejemplo, un ensayo ELISA, y (f) producción de dicho compuesto de acuerdo con técnicas biotecnológicas o químicas estándares.