JPH11299493A - ヒトデルタ―３ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 新規生理活性分子ヒトデルター３を提供す
る。 【効果】 新規分子ヒトデルター３を構成するアミノ酸
配列、遺伝子配列並びに抗体が提供され、本分子は血液
未分化細胞をはじめとする未分化細胞の分化抑制作用を
有し、医薬品、医療品として利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規生理活性物質
に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒトの血液、リンパ液中には多種類の細
胞があり、それぞれが重要な役割を担っている。例え
ば、赤血球は体内での酸素運搬を、血小板は止血作用
を、白血球やリンパ球は感染を防御している。これらの
多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細
胞は体内の種々のサイトカインや環境要因によって刺激
されて、各種血液細胞、破骨細胞、肥満細胞などに分化
することが近年明らかにされてきた。このサイトカイン
として、赤血球への分化についてはエリスロポエチン
（ＥＰＯ）が、白血球への分化については顆粒球コロニ
ー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が、血小板産生細胞である巨
核球への分化については血小板増殖因子（ｍｐｌリガン
ド）が発見されて、前者２つは現在すでに臨床応用がな
されている。

【０００３】血液未分化細胞に関して、特定の血液系列
に分化することが運命づけられた血液前駆細胞とすべて
の系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞に概
念的に分類されている。血液前駆細胞に関してコロニー
アッセイによって同定が可能であるが、造血幹細胞の同
定方法は確立されていない。これらの細胞に関して、ス
テムセルファクター（ＳＣＦ）やインターロイキン３
（ＩＬ−３）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−Ｃ
ＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロ
イキン１（ＩＬ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−
ＣＳＦ）、オンコスタチンＭなどが細胞の分化増殖を促
すことが報告されている。骨髄移植療法に代替される造
血幹細胞移植療法や遺伝子治療への応用のため、造血幹
細胞を体外で増幅することが検討されている。しかし、
この細胞を上記のようなサイトカインを用いて体外で増
殖培養させると、造血幹細胞が本来有している多分化能
および自己複製能が徐々に失われ、５週間培養後には特
定の系列にのみ分化する血液前駆細胞へと変化し、造血
幹細胞の特徴の一つである多分化能が失われることが報
告されている（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏ
ｄ ８６，５１２−５２３，１９９５）。

【０００４】血液前駆細胞の増殖には単独のサイトカイ
ンのみでは効果が十分でなく、複数のサイトカインの共
同作用（シナジー）が重要であることが明らかになって
いる。このことから造血幹細胞の特徴を維持したまま増
殖させるためには、血液未分化細胞を増殖、分化させる
サイトカインと共に分化を抑制するサイトカインが必要
であると考えられている。しかし、一般に細胞の増殖や
分化を促進するサイトカインが多数見いだされているの
に対して、細胞の分化を抑制するサイトカインは少数し
か見いだされていない。例えば、白血病細胞阻害因子
（ＬＩＦ）はマウス胚幹細胞を分化させずに増殖させる
作用が報告されているが、造血幹細胞や血液前駆細胞に
対し、そのような作用は有していない。また、腫瘍細胞
増殖因子（ＴＧＦ−β）は多様な細胞に対して増殖抑制
の作用をするが、造血幹細胞や血液前駆細胞に対する作
用は一定の見解が得られていない。

【０００５】血液細胞のみならず、未分化細胞、特に幹
細胞に関しては組織再生に強く関与すると考えられてい
る。これらの組織再生、並びに各組織の未分化細胞を増
幅させることは成書（吉里勝利著 再生ー甦るしくみ、
１９９６、羊土社）を参考にすることからその幅広い用
途を知ることができる。ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）はショウ
ジョウバエで発見された神経細胞の分化制御に関わるリ
セプター型膜蛋白質であり、ノッチのホモログは線虫
（Ｌｉｎ−１２）、アフリカツメガエル（Ｘｏｔｃ
ｈ）、マウス（Ｍｏｔｃｈ）、ヒト（ＴＡＮ−１）など
の無脊椎動物、脊椎動物の分類を越えた広い動物種から
見いだされている。一方、ショウジョウバエノッチのリ
ガンドとしてショウジョウバエデルタ（Ｄｅｌｔａ）お
よびショウジョウバエセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）の２
つが見いだされており、リセプターのノッチと同様に広
い動物種からノッチリガンドホモログが見いだされてい
る（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９
９５）。特にヒトに関して、ヒトノッチホモログである
ＴＡＮ−１は、幅広く体中の組織に発現されており（Ｅ
ｌｌｉｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６６，６４９
−６６１，１９９１）、またＴＡＮ−１以外に３つのノ
ッチ類縁分子が存在することが報告されている（Ａｒｔ
ａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２６８，２２５−２３２，１９９５）。血液
細胞においては、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法にてＣＤ３４陽性細胞に
ＴＡＮ−１の発現が認められている（Ｍｉｌｎｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．， Ｂｌｏｏｄ８３，２０５７−２０６２，
１９９４）。しかしながらヒトに関して、ノッチのリガ
ンドと考えられるヒトデルタ、ヒトセレイトの遺伝子の
クローニングの報告は１９９７年までなかった。

【０００６】ショウジョウバエノッチについて、そのリ
ガンドとの結合性が詳細に調べられ、ノッチの細胞外部
分に３６あるＥｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａ
ｃｔｏｒ（ＥＧＦ）様繰り返しアミノ酸配列のうち１１
番目と１２番目の繰り返し配列を結合領域として、リガ
ンドとＣａ⁺⁺を介して結合し得ることが示された（文献
のＦｅｈｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６１，５２３
−５３４，１９９０およびＲｅｂａｙ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｅｌｌ ６７，６８７−６９９，１９９１および特表
平７−５０３１２３）。他種のノッチホモログについて
もＥＧＦ繰り返し配列は保存されており、リガンドとの
結合に関して同様の機構が類推されている。リガンドに
おいてもアミノ末端の近くにＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅ
ｒｒａｔｅ−Ｌａｇ−２）と呼ばれるアミノ酸配列とリ
セプターと同様にＥＧＦ様繰り返し配列が保存されてい
る（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓ ｅｔ ａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６８，２２５−２３２，１９
９５）。

【０００７】一方、ＥＧＦ様配列はトロンボモジュリン
（Ｊａｃｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３，８８３４−８８
３８，１９８６）や低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）リセプ
ター（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔａｌ．， Ｃｅｌｌ ３
７，５７７−５８５，１９８４）および血液凝固因子
（Ｆｕｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ５３，５０５
−５１８，１９８８）で見いだされ、細胞外での凝集や
接着に重要な役割を果たすと考えられている。

【０００８】近年クローニングされたショウジョウバエ
デルタの脊椎動物のホモログはニワトリ（Ｃ−デルター
１）とアフリカツメガエル（Ｘ−デルター１）が見いだ
されており、Ｘ−デルター１は原始ニューロンの発生に
Ｘｏｔｃｈを介して作用することが報告されている（Ｈ
ｅｎｒｉｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７
５，７８７−７９０， １９９５およびＣｈｉｔｎｉｓ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３７５，７６１−７６
６，１９９５）。一方、ショウジョウバエセレイトの脊
椎動物のホモログはラットジャグドー１（Ｊａｇｇｅｄ
−１）が見いだされている（Ｌｉｎｄｓｅｌｌ ｅｔ
ａｌ．，Ｃｅｌｌ ８０，９０９−９１７，１９９
５）。この報告によれば、ラットジャグドー１のｍＲＮ
Ａは胎仔ラットの脊髄に検出される。また、ラットノッ
チー１を強制的に過剰発現させた筋芽細胞株とラットジ
ャグドー１発現細胞株の共培養により、この筋芽細胞株
の分化が抑制されることが見いだされているが、ラット
ノッチー１を強制発現させていない筋芽細胞株に対して
はラットジャグドー１が作用しないことが見いだされて
いる。

【０００９】本発明者らはノッチおよびそのリガンドが
神経芽細胞、筋芽細胞の分化制御のみならず、広く未分
化な細胞、特に血液未分化細胞の分化制御を行なうとの
仮説を立てた。しかしヒトへ臨床応用する際、既知のニ
ワトリ型、アフリカツメガエル型などの異種の生物種の
ノッチリガンドでは種特異性、抗原性の問題がある。こ
のためヒトに対する使用を目的とするには、つまり産業
上有用なものとするには、ヒト型のノッチリガンドを取
得することは不可欠である。そこで、本発明者らはノッ
チリガンド分子に共通するＤＳＬドメインとＥＧＦ様ド
メインを有する分子で、ヒト型ノッチ（ＴＡＮ−１な
ど）のリガンドであるヒトデルタホモログ（以下ヒトデ
ルタ）及びヒトセレイトホモログ（以下ヒトセレイト）
が存在すると考え、これらの発見は未分化細胞の分化制
御に有効な医薬品の候補となると考え、それらの発見に
努めた。

【００１０】その結果、ヒトノッチリガンド分子として
ヒトデルター１、ヒトデルター２、ヒトセレイトー１、
ヒトセレイトー２分子の４種の分子の遺伝子クローニン
グを行い、それらの分子が血液未分化細胞に作用するこ
とを見いだしている。（国際公開番号ＷＯ９７／１９１
７２；分化抑制ポリペプチド、国際公開番号ＷＯ９８／
０２４５８；分化抑制剤、及び国際公開番号ＷＯ９８／
５１７９９；新規な分化抑制剤を参照）ヒトノッチリガ
ンド分子に関して、最新の報告によるとヒトデルター１
に関しては国際公開番号ＷＯ９７／０１５７１において
不完全かつ全長ではないヒトデルター１らしき分子の部
分遺伝子並びに部分アミノ酸配列が示され、また、ヒト
セレイトー１（ヒトジャグドー１）については国際公開
番号ＷＯ９６／２７６１０において全長遺伝子並びに全
長アミノ酸配列が、またヒトセレイトー２（ヒトジャグ
ドー２）に関しては同出願において全長ではない部分遺
伝子配列並びに部分アミノ酸配列が示されているが、遺
伝子配列において何らかの間違いがあるらしくフレーム
シフトをおこしてカルボキシ末端のアミノ酸配列が本発
明者により示されたものと全く異なっており、さらにア
ミノ末端に関しては遺伝子クローニングされておらず遺
伝子配列並びにアミノ酸配列は不完全なものとなってい
る。

【００１１】またごく最近になって、アラジール病（Ａ
ｌａｇｉｌｌｅ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）の原因遺伝子とし
てヒトセレイトー１（ヒトジャグドー１）が同定され、
ｃＤＮＡの全長遺伝子クローニングも報告された（Ｏｄ
ａ ｅｔ ａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４３、３７６ー
３７９、１９９７）。さらに、ヒトセレイトー２に関し
てもｃＤＮＡクローニングが発表された（Ｌｕｏ ｅｔ
ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ． １７，６０
５７−６０６７，１９９７）。

【００１２】また、遺伝子配列データベースＧｅｎｂａ
ｎｋリリース１０３（１９９７年１０月）において検索
すると、ヒトセレイトー１に関しては４つのエントリー
があり、ＨＳＵ６１２７６、ＨＳＵ７３９３６，ＨＳＵ
７７７２０及びＨＳＵ７７９１４として登録されてお
り、ヒトセレイトー２に関しては２つのエントリーがあ
りＡＦ００３５２１及びＡＦ０２０２０１として登録さ
れている。また、ヒトデルター１に関しては１つのエン
トリーがあり、ＡＦ００３５２２として登録されてい
る。しかしながら、他のヒトノッチリガンド様分子に関
してはこのデータベース上には認められなかった。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、上記
の４つの分子以外の新規なノッチリガンド分子の遺伝子
配列、アミノ酸配列を明らかにし、この新規ノッチリガ
ンド分子を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決する手段】本発明者らはさらに新しいヒト
ノッチリガンドの探索のため、上記のヒトデルター１遺
伝子を用いたクロスハイブリダイーゼーション法にてお
こなった。ヒトデルター１遺伝子の取得は国際公開番号
ＷＯ９７／１９１７２に従って行うことができる。ま
た、ヒトデルター１の全アミノ酸配列をコードするｃＤ
ＮＡを含むベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを大腸菌ＪＭ１０
９に遺伝子導入した形質転換細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ：Ｊ
Ｍ１０９−ｐＵＣＤＬ−１Ｆとして日本国茨城県つくば
市東１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命
工学工業技術研究所に平成８年１０月２８日に寄託番号
ＦＥＲＭ ＢＰ−５７２８として寄託されており、これ
を取り寄せて入手もできる。

【００１５】このヒトデルター１遺伝子の色々な長さの
部分遺伝子を調製し、これらをプローブとして用い、多
くのｃＤＮＡライブラリーを色々なハイブリダイーゼシ
ョン条件でスクリーニングを行い、クロスハイブリダイ
ゼーションにて新たなノッチリガンド様分子を発見すべ
く進めた。そして、鋭意研究の結果、ヒト胎児脳ｃＤＮ
Ａライブラリーよりノッチリガンド分子に共通するＤＳ
Ｌ様ドメインを有している新規分子、新規ヒトデルター
３のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの単離に成功
し、このｃＤＮＡを用いて各種形態を有する蛋白質の発
現系を作製した。また、これらの蛋白質の精製法を確立
し、精製を行い単離した。

【００１６】新規ヒトデルター３のアミノ酸配列は、配
列表の配列番号１から５に示し、それらをコードするＤ
ＮＡ配列を配列表の配列番号６に示した。このようにし
て作製された蛋白質の生理作用を神経未分化細胞、前脂
肪細胞、肝細胞、筋芽細胞、皮膚未分化細胞、血液未分
化細胞、免疫未分化細胞など、多数の細胞を用いて探索
した。その結果、この新規ヒトデルター３は血液未分化
細胞に対して分化制御作用を有し、かつ未分化な状態に
維持する生理作用を有することを見いだした。

【００１７】さらにマウスに対する毒性試験では明らか
な毒性は観察されず有効な医薬品となる効果を示し、本
発明が完成した。したがって本願分子を含む薬剤、本願
分子を含む培地、本願分子が固定化された器材は、血液
未分化細胞などの未分化細胞を未分化な状態で保つこと
ができる全く新しい医薬品、医療品である。また該ヒト
デルター３を免疫原として抗体を作製し、精製法を確立
し、本発明が完成した。

【００１８】すなわち、本発明は（１）少なくとも配列
表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチド、（２）少なくとも配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチド、（３）少なくと
も配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有する
ポリペプチド、（４）少なくとも配列表の配列番号４に
記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（５）少
なくとも配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を含
有するポリペプチド、（６）未分化細胞の分化抑制作用
を有する前記（１）乃至（５）のポリペプチド、また、
（７）未分化細胞が血液未分化細胞である前記（６）の
ポリペプチドに関する。また、（８）前記（１）乃至
（５）のポリペプチドを含有する医薬組成物、（９）前
記（１）乃至（５）のポリペプチドを含有する細胞培養
培地、また（１０）細胞が血液未分化細胞である前記
（９）の細胞培養培地に関する。

【００１９】さらに、（１１）少なくとも配列表の配列
番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（１
２）少なくとも配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡ、（１３）少なくとも配列表の配
列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
（１４）少なくとも配列表の配列番号４に記載のアミノ
酸配列をコードするＤＮＡ、（１５）少なくとも配列表
の配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａ、（１６）少なくとも配列表の配列番号６に記載の５
３０番から５８０番の塩基配列を含有する前記（１１）
のＤＮＡ、（１７）少なくとも配列表の配列番号６に記
載の５３０番から６４０番の塩基配列を含有する前記
（１２）のＤＮＡ、（１８）少なくとも配列表の配列番
号６に記載の７７番から６４０番の塩基配列を含有する
前記（１３）のＤＮＡ、（１９）少なくとも配列表の配
列番号６に記載の７７番から１４６８番の塩基配列を含
有する前記（１４）のＤＮＡ、（２０）少なくとも配列
表の配列番号６に記載の７７番から１７５９番の塩基配
列を含有する前記（１５）のＤＮＡに関し、（２１）前
記（１１）乃至（２０）のＤＮＡ群の中から選ばれるＤ
ＮＡと、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡと連結
してなる組み換えＤＮＡ体、（２２）前記（２１）の組
み換えＤＮＡ体により形質転換された細胞、また、（２
３）前記（２２）の細胞を培養し培養物中より生産され
た化合物を採取することを特徴とする前記（１）乃至
（５）のポリペプチドの製造方法、また、（２４）配列
表の配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを
特異的に認識する抗体に関する。

【００２０】以下、本発明を詳細に説明する。遺伝子操
作に必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発
現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニン
グ、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃ
ＤＮＡライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実
験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができ
る。前記の通常の実験書としては、たとえば、Ｍａｎｉ
ａｔｉｓらの編集した Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｒｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，
１９８９，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉ
ｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，
Ｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌｏｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。

【００２１】本発明のポリペプチドは少なくとも配列表
の配列番号１から５のアミノ酸配列からなるポリペプチ
ドを有するが、自然界で生じることが知られている生物
種内変異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可
能な点変異による変異によって生じる改変体も、それら
が配列表の配列番号１から５のポリペプチドの性質を失
わない限り本発明のポリペプチドに含まれる。そのアミ
ノ酸の改変、置換に関しては例えばＢｅｎｎｅｔｔらの
出願（ＷＯ９６／２６４５）などに詳しく記載されてお
り、これらを参考にして作製することができる。

【００２２】また、配列表の配列番号１から５のアミノ
酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に
ついては配列表の配列番号６にアミノ酸配列とともに示
した。この遺伝子配列に関し、アミノ酸レベルの変異が
なくとも、自然界から分離した、染色体ＤＮＡ、または
ｃＤＮＡにおいて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮ
Ａがコードするアミノ酸配列を変化させることなくＤＮ
Ａの塩基配列が変異した例はしばしば認められる。ま
た、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はポリペプチド
のアミノ酸配列の規定には関与しないので、それらの領
域のＤＮＡ配列は変異しやすい。このような遺伝コード
の縮重によって得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含
まれる。

【００２３】本発明で記載する未分化細胞とは、特定の
刺激によって増殖可能な細胞であり、かつ特定の刺激に
よって特定の機能を有する細胞に分化可能な細胞と規定
され、これらの中には皮膚組織系の未分化細胞、脳神経
系の未分化細胞、筋肉系の未分化細胞、血液系の未分化
細胞などが含まれ、各々幹細胞といわれる自己複製能力
を有しかつその系統の細胞を生み出す能力を有する細胞
を含む。また、分化抑制作用とは、これらの未分化細胞
が自律的もしくは他律的に分化する現象を抑制する作用
であり、具体的には未分化な状態を維持する作用であ
る。また、本発明で記載する血液未分化細胞とは、血液
コロニーアッセイで同定が可能な特定の血液系列に分化
することが運命づけられた血液前駆細胞および全ての系
列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞を含む細
胞群と規定される。

【００２４】配列表において、配列表の配列番号１のア
ミノ酸配列は本発明のヒトデルター３のＤＳＬドメイン
の部分配列のアミノ酸配列であり、配列番号５に示した
本発明のヒトデルター３の成熟型全長アミノ酸配列のア
ミノ酸番号１５２番から１６８番に相当している。配列
表の配列番号２のアミノ酸配列は本発明のヒトデルター
３のＤＳＬドメインのアミノ酸配列であり、配列番号５
に示した本発明のヒトデルター３の成熟型全長アミノ酸
配列のアミノ酸番号１５２番から１８８番に相当してい
る。配列表の配列番号３のアミノ酸配列は本発明のヒト
デルター３のシグナルペプチドを除いたアミノ末端から
ＤＳＬドメインまでの活性中心を含むアミノ酸配列であ
り、配列番号５に示した本発明のヒトデルター３の成熟
型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から１８８番に
相当している。配列番号４のアミノ酸配列は、本発明の
ヒトデルター３のシグナルペプチドを除いた細胞外ドメ
インの配列であり、配列番号５に示した本発明のヒトデ
ルター３成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番か
ら４６４番に相当している。配列番号５のアミノ酸配列
は、本発明のヒトデルター３の成熟型全長アミノ酸配列
である。配列番号６の配列は本発明のヒトデルター３の
ｃＤＮＡ配列、及びそのコード領域に対応する全アミノ
酸配列である。

【００２５】なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の
左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下Ｎ末）及び
カルボキシル基末端（以下Ｃ末）であり、また塩基配列
の左端及び右端はそれぞれ５’末端及び３’末端であ
る。未知のヒトノッチリガンドの遺伝子をクローニング
するために次の方法が考え得る。ヒトノッチリガンドは
生物の進化の過程で、ある程度アミノ酸配列、遺伝子配
列が保存されていることから、別のノッチリガンド分子
の遺伝子をプローブに用いてクローニングすることは原
理的に可能である。しかしながら、このようなクロスハ
イブリダイゼーション法においては、どの部分をプロー
ブとして用いるのが適当であるか、ハイブリダイゼーシ
ョンの条件はどのようにするかなど多くの検討点があ
り、決して容易ではない。また、クロスハイブリダイゼ
ーション法は多くの類似の遺伝子を同時にクローニング
してしまうため遺伝子配列解析に時間がかかるため、ク
ローニングした遺伝子が目的の分子であるかどうか同定
することは極めて困難であった。

【００２６】本発明者はヒトデルター１遺伝子から１０
種類以上の遺伝子断片を作製し、これをプローブとして
１０種類以上の異なる臓器由来のｃＤＮＡライブラリー
のスクリーニングを数多くのハイブリダイゼーション条
件、洗浄条件にて行ない、新しいデルタ様分子の発見に
努めた。このプラークハイブリダイゼーションにおいて
プローブをアイソトープ標識、及び各種非アイソトープ
標識し、ライブラリーをスクリーニングすることによっ
てクローンを得ることができる。アイソトープの標識法
としては、たとえば［³²Ｐ］γ−ＡＴＰとＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼを用いて末端をラベルする方法や、他
のニックトランスレーション法またはプライマー伸長法
などによる標識法が利用できる。

【００２７】その結果、本発明者らは実施例１におい
て、ヒトデルター１の全長遺伝子の部分遺伝子、すなわ
ち配列表の配列番号７に示した遺伝子配列を有するプロ
ーブを用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリ
ーニングを行い、１次スクリーニングではおよそ１００
個のポジティブプラークを分離し、２次スクリーニング
において、およそ８０個のポジティブプラークをクロー
ン化し、これらのクローンの遺伝子配列の決定をおこな
った。これらをクローニングした遺伝子の大半はプロー
ブに用いたヒトデルター１遺伝子であったが、この中の
２つのクローンがヒトデルター１に類似した本願の新規
ヒトデルター３遺伝子であることであることが判明し、
目的の新規ノッチリガンド分子を見いだすことに成功し
た。

【００２８】この配列をデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋ
リリース１０３、１９９７年１０月）で比較したとこ
ろ、本分子のマウスホモログと考えられるマウスデルタ
ー３が、Ｙ１１８９５として登録されており、マウス分
子はＤｕｎｗｏｏｄｉｅらにより発表されていた（Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２４、３０６５−３０７６、１
９９７）。しかしながら、彼らの報告では一部の遺伝子
配列が未決定であり、またヒト分子に関しては今だ報告
のない新規分子である。

【００２９】ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、
実施例１に記載したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳ以外
にも、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、
ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（いずれも宝
酒造社製）などが挙げられるが、その他のものであって
も宿主内で複製増殖できるものであればいずれも用いる
ことができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクタ
ーとしては、例えばλｇｔ１０、λｇｔ１１などが挙げ
られるが、その他のものであっても宿主内で増殖できる
ものであれば用いることができる。このようにして、得
られたプラスミドは適当な宿主、例えばエシェリヒア
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ）属菌などにカルシウムクロライド法等を用い
て導入する。上記エシェリヒア属菌の例としては、エシ
ェリヒア コリＫ１２ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＬＥ
３９２、ＪＭ１０９などが挙げられる。上記バチルス属
菌の例としてはバチルス、サチリスＭＩ１１４等が挙げ
られる。また、ファージベクターは、例えば増殖させた
大腸菌にインビトロパッケージング法（Ｅｎｑｕｉｓｔ
ａｎｄ Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ
ｏｌ． ６８：２８１−、１９７９）を用いて導入する
ことができる。

【００３０】該アミノ酸配列をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔ
ｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． １５７：１０
５，１９８２）に従って、アミノ酸配列から疎水性部
分、親水性部分を解析した。その結果、本発明のヒトデ
ルター３は細胞膜通過部分を１つ有する細胞膜蛋白質と
して、細胞上に発現されることが明らかとなった。ヒト
デルター３のアミノ酸配列の解析によれば、ヒトデルタ
ー３の前駆体のアミノ酸配列は配列表の配列番号６のア
ミノ酸配列に示す５８２アミノ酸残基からなり、シグナ
ルペプチド領域は同配列表のアミノ酸配列の−２１番の
メチオニンから−１番のプロリンにあたる２１アミノ酸
残基、細胞外領域は同配列表の１番のアラニンから４６
４番のアルギニンにあたる４６４アミノ酸残基、細胞膜
通過領域は同配列表のアミノ酸配列の４６５番のチロシ
ンから４８９番のバリンにあたる２５アミノ酸残基、細
胞内領域は同配列表の４９０番のアルギニンから５６１
番のアラニンにあたる７２アミノ酸残基が該当すること
が推定された。ただし、これらの各部分は、あくまでも
アミノ酸配列から予測されたドメイン構成であり、実際
に細胞上および溶液中での存在形態は、上記の構成と若
干異なることも十分考えられ、上記に一応規定された各
ドメインの構成アミノ酸が、１０アミノ酸配列前後する
ことも考えられる。

【００３１】本願分子ヒトデルター３の１９９９年２月
時点までに報告のあるノッチリガンド様分子との全長ア
ミノ酸配列の比較では、前出のマウスデルター３とは８
３．４％、ヒト由来の分子としてヒトデルター１とは３
８．７％、ヒトデルター２とは４０．２％、ヒトセレイ
トー１とは３４．３％、ヒトセレイトー２とは３７．３
％であった。ノッチのリガンドホモログは進化論的に保
存された共通の配列を有している。すなわちＤＳＬ配列
と繰り返して存在するＥＧＦ様配列である。ヒトデルタ
ー３とヒトデルター１およびヒトデルター２との比較に
より、ヒトデルター３のアミノ酸配列からこれら保存さ
れた配列を推定した。すなわち、ＤＳＬ配列は配列表の
配列番号５のアミノ酸配列の１５２番のシステインから
１８８番のシステインにあたる３７アミノ酸残基に相当
した。ＥＧＦ様配列は６回繰り返して存在し、配列表の
配列番号５のアミノ酸配列のうち、第１ＥＧＦ様配列は
１９４番システインから２２２番システインまで、第２
ＥＧＦ様配列は２５２番システインから２８３番システ
インまで、第３ＥＧＦ様配列は２９０番システインから
３２４番システインまで、第４ＥＧＦ様配列は３３１番
システインから３６２番システインまで、第５ＥＧＦ様
配列は３６９番システインから４００番システインま
で、第６ＥＧＦ様配列は４０７番システインから４３８
番システインに該当した。

【００３２】また、第１ＥＧＦ様配列と第２ＥＧＦ様配
列の間には、他のデルタ様分子とは異なり、２つのシス
テインが存在した。ヒトデルター３のアミノ酸配列から
予想されることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−ア
セチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グリコシド結合可能な
部分は見いだされなかったが、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラ
クトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部分とし
て、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分が考え
られる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方がポリ
ペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に対して
安定であり、また強い生理活性を有していると考えられ
る。したがって、配列表の配列番号１、２、３、４また
は５の配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中
にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＯ−
グリコシド結合してなるポリペプチドのように糖が付加
された配列表の配列番号１、２、３、４または５のポリ
ペプチドも本発明に含まれる。

【００３３】ショウジョウバエノッチおよびそのリガン
ドの結合に関する研究により、ショウジョウバエノッチ
のリガンドがノッチに結合するために必要なアミノ酸領
域は、シグナルペプチドが切断された成熟体蛋白質の少
なくともＮ末からＤＳＬ配列までであることが明らかに
されている（特表平７−５０３１２１）。また、同様に
線虫を用いたＦｉｔｚｇｅｒａｌｄとＧｒｅｅｎｗａｌ
ｄ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２１、４２７５−４２
８２、１９９５）の研究からノッチリガンド様分子ＡＰ
Ｘ−１はノッチ様リセプターの活性化にとって少なくと
も全長のアミノ末端からＤＳＬドメインまでで十分であ
ることが明らかにされている。同様に、ノッチリガンド
様分子Ｌａｇ−２でもアミノ末端からＤＳＬドメインま
でのポリペプチドでノッチ様リセプターの活性化を引き
起こすことが知られている（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ８、１７５１
−１７６２、１９９７）。更に最近の報告では、Ｊａｇ
ｇｅｄ−１のＤＳＬドメインの部分ペプチドを用いた研
究から、ＤＳＬドメインの一部（アミノ酸配列としては
Cys Asp Asp Tyr Tyr Tyr Gly Phe Gly Cys Asn Lys Ph
e Cys Arg Pro Arg）でも同様な活性を有したとの報告
もある（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ８、
４３−５５、１９９８）。Ｊａｇｇｅｄ−１と本願のヒ
トデルター３のＤＳＬドメインのアミノ酸配列を比較す
ると活性があったとされる配列は配列表の配列番号１の
アミノ酸配列に相当する。

【００３４】これらのことから、ヒトノッチリガンド分
子のリガンド作用発現に必要な領域は少なくともＤＳＬ
ドメインの一部の配列表の配列番号１のアミノ酸配列で
あり、また、ＤＳＬドメイン全体、すなわち配列表の配
列番号２のアミノ酸配列を含む領域であり、また、少な
くともヒトデルター３のリガンド作用の発現に必要な領
域は配列表の配列番号３に示したアミノ酸配列である。
いずれも、新規なアミノ酸配列である。

【００３５】また、配列表の配列番号の６の遺伝子配列
の一部もしくは全部をコードするＤＮＡを用いれば、ヒ
トデルター３のｍＲＮＡの検出が可能である。たとえ
ば、これらの遺伝子の発現を調べる方法として、配列表
の配列番号６の一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒか
ら１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ程度も
しくはそれ以上の相補し得る核酸、つまりアンチセンス
ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらがメチル化、メチルフォス
フェート化、脱アミノ化、またはチオフォスフェート化
された誘導体を用い、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ
等の手法によって行うことが出来る。さらに、ヒトを含
めたゲノム上の遺伝子のクローニングも同様に可能であ
る。従って、そのようにしてクローニングされたこれら
遺伝子を用いれば、該ヒトデルター３の更に詳細な機能
も明らかにすることが出来る。例えば、近年の遺伝子操
作技術を用いれば、トランスジェニックマウス、ジーン
ターゲッティングマウス、また、本遺伝子と関連する遺
伝子を共に不活化したダブルノックアウトなどのあらゆ
る方法を用いることが出来る。また、本遺伝子のゲノム
上の異常があれば、遺伝子診断、遺伝子治療への応用も
可能である。

【００３６】ヒトデルター３ポリペプチドを生産する方
法は実施例２に示したように、発現ベクターｐｃＤＮＡ
３．１を用いて行うことができる。さらに、上記の方法
にて分離したヒトデルター３のアミノ酸配列をコードす
るｃＤＮＡを用いた色々な形態を有したヒトデルター３
ポリペプチドの生産、精製には多数の方法が成書によっ
て知られている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ， Ｇｅｎｅ Ｔｒ
ａｎｓｆｅｒ ａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ − Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｓｔｏｃｋｔｏ
ｎ Ｐｒｅｓ，１９９０．および横田ら、バイオマニュ
アルシリーズ４, 遺伝子導入と発現・解析法, 羊土社、
１９９４）。すなわち、分離した該ヒトデルター３のア
ミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクター
につなぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バクテ
リアなどの原核細胞を宿主として生産させることができ
る。

【００３７】本発明のヒトデルター３を発現させる際
に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはその
５’末端に翻訳開始コドンを有し、また、３’末端には
翻訳終止コドンを有してもよい。これらの翻訳開始コド
ンや翻訳終止コドンは適当な合成ＤＮＡアダプターを用
いて付加することもできる。更に該ＤＮＡを発現させる
には上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては
上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由来プラスミド、
酵母由来プラスミド、あるいはλファージなどのバクテ
リオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィル
スなどの動物ウィルスなどが挙げられる。

【００３８】本発明に用いられるプロモーターとして
は、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー
ターであればいかなるものでもよい。形質転換する際の
宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロモータ
ー、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが好
ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１プ
ロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、宿
主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプ
ロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。

【００３９】宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０
由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、
メタルチオネインプロモーター、ヒートショックプロモ
ーター、アクチンプロモーターなどが利用できる。もち
ろん、ポリペプチドの生産には化学的な手法、すなわち
あらゆるペプチド合成手法も応用できる。特に配列表の
配列番号１、配列番号２等の短いアミノ酸配列のポリペ
プチドには有効である。

【００４０】本発明のポリペプチドを発現させる時、配
列表の配列番号１〜５のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａのみでもかまわないが、産生されたポリペプチドの検
出を容易にするための既知抗原エピトープをコードする
ｃＤＮＡを付加したり、多量体構造を形成させるために
イムノグロブリンＦｃをコードするｃＤＮＡを付加する
ことで、特別の機能を付加した蛋白質を生産させること
もできる。

【００４１】ヒトデルター３に関して本発明者らは実施
例２に示したごとく、細胞外タンパク質を発現する発現
ベクターとして１）配列表の配列番号４に記載のアミノ
酸配列の１番から４６４番のアミノ酸をコードするＤＮ
Ａ、２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列の１
番から４６４番のアミノ酸のＣ末側に８アミノ酸、すな
わち Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysのアミノ酸配列
（以下ＦＬＡＧ配列、配列表の配列番号８）を持つペプ
チドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、
および３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列の
１番から４６４番のアミノ酸のＣ末側にヒトＩｇＧ１の
ヒンジ部分以下のＦｃ配列（ＷＯ９７／１９１７２に記
載されている）を付加し、ヒンジ部分のジスルフィド結
合により２量体構造を有するキメラタンパク質をコード
するＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（米国ＩＮ
ＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に各々別々につなぎ、ヒトデルタ
ー３の細胞外部分発現ベクターを作製した。

【００４２】また、ヒトデルター３の全長タンパク質を
発現する発現ベクターとして４）配列表の配列番号５の
１番から５６１番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、およ
び５）配列表の配列番号５の１番から５６１番のアミノ
酸のＣ末端側にＦＬＡＧ配列を持つペプチドを付加した
キメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐ
ｃＤＮＡ３．１に各々別々につなぎ、ヒトデルター３の
全長発現ベクターを作製した。このようにして構築され
た該ヒトデルター３をコードするＤＮＡを含有する発現
プラスミドを用いて、形質転換体を製造した。

【００４３】宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バ
チルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。動物細
胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ−７、Ｖｅｒ
ｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ細胞Ｓ
Ｆ９などが挙げられる。実施例３に示したごとく、上記
の１）〜５）の発現ベクターをそれぞれ別々に遺伝子導
入し、ヒトデルター３をＣＯＳ−７細胞（理化学研究
所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）で発
現させ、これら発現プラスミドで形質転換された形質転
換体が得られる。さらに、各形質転換体をそれぞれ公知
の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により培
養することによって各種ヒトデルター３ポリペプチドを
製造することができる。

【００４４】実施例４に示したごとく、上記の様な培養
物からヒトデルター３ポリペプチドを分離精製すること
ができる。また、一般的には下記の方法により行うこと
ができる。すなわち、培養菌体あるいは細胞から抽出す
るに際しては、培養後、公知の方法、たとえば遠心分離
法などで菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液
に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解な
どによって菌体あるいは細胞を破砕した後、遠心分離や
濾過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることが
できる。緩衝液の中に尿素、塩酸グアニジンなどのタン
パク変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が
含まれていてもよい。培養溶液中に分泌される場合に
は、培養液を公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌
体あるいは細胞と分離し、上清を集める。

【００４５】このようにして得られた細胞抽出液あるい
は細胞上清に含まれるヒトデルター３は公知のタンパク
質精製法を用いることで、精製できる。その精製の過程
でタンパク質の存在を確認するために、上記に示したＦ
ＬＡＧ、ヒトＩｇＧＦｃなどの融合タンパクの場合に
は、それら既知抗原エピトープに対する抗体を用いたイ
ムノアッセイで検出して精製を進めることができる。ま
た、このような融合タンパク質として発現させない場合
には、実施例５に記載した抗体を用いて検出することが
できる。

【００４６】ヒトデルター３を特異的に認識する抗体は
実施例５に示したように作製することができる。また成
書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
ｍａｎｕａｌ， Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，
Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クロー
ニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子
を用いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によっ
ても作製することができる。このように作製された抗体
はヒトデルター３の精製に利用できる。すなわち、実施
例５に示したこれらのヒトデルター３を特異的に認識す
る抗体を用いれば、本発明のヒトデルター３の検出、測
定が可能であり、細胞の分化異常に伴う疾患例えば悪性
腫瘍など疾患の診断薬として使用でき得る。

【００４７】精製方法としてより有効な方法としては抗
体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げら
れる。この際に用いる抗体としては実施例５に記載した
抗体を用いることができる。また、融合タンパクの場合
には、実施例４に示したように、ＦＬＡＧであればＦＬ
ＡＧに対する抗体、ヒトＩｇＧＦｃであればＰｒｏｔｅ
ｉｎ Ｇ、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａを用いることができる。

【００４８】このように精製されたヒトデルター３タン
パクの生理機能を、各種細胞株、マウス、ラットなどの
生物個体を用いた各種生理活性アッセイ法、分子生物学
的手法に基づく細胞内シグナル伝達の各種アッセイ法、
ノッチリセプターとの結合などの色々なアッセイ法にて
知ることができる。本発明者らはヒトデルター３のＩｇ
Ｇ１キメラ蛋白質を用いて、血液未分化細胞への作用を
観察した。すなわち、実施例６に示したようにＣＤ３４
陽性細胞画分を濃縮した臍帯血由来血液未分化細胞にお
いて、各種サイトカイン存在下でコロニー形成する血液
未分化細胞に対してコロニー形成作用の抑制活性を有す
ることを見いだした。

【００４９】またさらに、実施例７に示したように本願
ヒトデルター３のＩｇＧ１キメラ蛋白質は血管内皮細胞
の増殖に対して抑制的作用を有しており、血管新生作用
を阻害する活性を有する。したがって、Ｆｏｌｋｍａｎ
とＫｌａｇｓｂｒｕｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５，４４
２−４４７、１９８７）によって提唱された血管新生を
抑制することで治療できるであろう疾患、病態に対する
治療薬剤として使用できる。

【００５０】この結果から、ヒトデルター３は血液未分
化細胞の分化を抑制し、それらの作用は血液幹細胞から
コロニー形成細胞にわたって作用することが明らかであ
る。これらの生理作用は血液未分化細胞の体外増殖に必
要な作用であり、特にヒトデルター３を含有する細胞培
養培地で培養した細胞は抗癌剤投与後の骨髄抑制回復に
有効であり、他の条件を整えることにより体外での造血
幹細胞の増幅を可能とするであろう。さらに、医薬品と
して用いた場合には、抗癌剤などの副作用で見られる骨
髄抑制作用を保護し、軽減する作用がある。

【００５１】さらに、血液細胞以外の未分化細胞におい
ても、細胞の分化を抑制する作用が主に期待でき、また
組織再生を促す作用等が期待できる。医薬品として用い
るならば、本発明のポリペプチドを適当な安定化剤、例
えばヒト血清アルブミンなどと共に凍結乾燥品を作製
し、用時注射用蒸留水にて溶解もしくは懸濁して使用し
得る形状が望ましい。例えば０．１から１０００μｇ／
ｍｌの濃度に調製した注射剤、点滴剤として提供するこ
とができる。本発明者らが実施例８に示したように本発
明の化合物１ｍｇ／ｍｌ、ヒト血清アルブミン５ｍｇ／
ｍｌとなるようにバイアルに小分けし、長期にわたって
該化合物の活性は保持された。さらに、細胞を体外にて
培養、活性化させる場合には医薬品同様に、凍結乾燥
品、もしくは溶液剤を作製して、培地に加える、もしく
は培養に使用する容器に固定化することができる。ま
た、本発明のポリペプチドの毒性については、マウスに
対していずれのポリペプチドも１０ｍｇ／Ｋｇを腹腔内
投与したがマウスの死亡例は確認されなかった。

【００５２】また、本発明のポリペプチドのインビトロ
の生理活性は、あらゆる疾患モデルマウス、またはそれ
らに準ずる疾患に似た症状を呈するラット、サル等の動
物をモデルとして投与を行い、その身体的、生理的な機
能の回復、異常を調べることにより可能となる。例え
ば、造血細胞に関する異常であれば、５−ＦＵ系の抗癌
剤を投与して、骨髄抑制モデルマウスを作製し、このマ
ウスに本発明のポリペプチドを投与した群としなかった
群の骨髄細胞、末梢血細胞の数、生理的な機能を調べる
ことで明らかになる。また更に、体外で造血幹細胞を含
む造血未分化細胞の培養、増殖を調べる場合には、マウ
ス骨髄細胞を培養器などを利用して、培養を行い、その
際に本発明の化合物を加えた群と加えなかった群で培養
後の細胞を致死量放射線照射マウスに細胞移植を行い、
その結果の回復の度合いを、生存率、血球数の変動など
を指標にすることで調べることが出来る。勿論、これら
の結果が人にも外挿できるため、本ポリペプチドの薬効
としての評価として有効なデータを得ることが出来る。

【００５３】本発明の化合物を医薬品として利用する場
合、その適応として、細胞の分化異常に伴う疾患、例え
ば白血病、悪性腫瘍の治療があげられ、体外でヒト由来
細胞を培養して、その本来の機能を保ったまま増殖させ
る、もしくは新たな機能を持たせる等を行う細胞治療、
組織損傷後の再生時に投与することにより本来その組織
が有していた機能を損なうことなく再生させる治療法な
どの応用が可能である。その際の投与量としてはその形
態などにもよるが、具体的には１０μｇ／Ｋｇから１０
ｍｇ／Ｋｇ程度投与すればよい。

【００５４】また、さらに強い生理活性を有する形態と
して、多量体を形成し得る形態で発現させることが望ま
しい。多量体構造を有するヒトデルター３は、実施例２
および３に記載したヒトＩｇＧのＦｃ部分とのキメラタ
ンパク質として発現させて抗体のヒンジ部分によりジス
ルフィド結合をした多量体として発現させる方法、ま
た、抗体認識部位をＣ末端もしくはＮ末端に発現するキ
メラタンパクとして発現させ、発現させた該ヒトデルタ
ー３の細胞外部分を含むポリペプチドをＣ末端もしくは
Ｎ末端の抗体認識部位を特異的に認識する抗体と反応さ
せることにより多量体を形成させる方法が挙げられる。
さらに、別の方法として、抗体のヒンジ領域部分のみと
の融合タンパクを発現させて、ジスルフィド結合にて２
量体を形成させる方法、もしくはその他のヒトデルター
３の活性に何等影響を与えない方法でジスルフィド結合
を生じさせる形のペプチドをＣ末端、Ｎ末端もしくはそ
の他の部位に発現するように作成された融合タンパクか
ら構成された２量体以上の高い比活性を有する多量体型
ヒトデルター３を得ることもできる。

【００５５】また、さらに配列表の配列番号１、２、
３、４及び５のアミノ酸配列を含むポリペプチドから選
ばれる１つ以上のポリペプチドを遺伝子工学的に２つ以
上直列にもしくは並列に並べ多量体構造を発現させる方
法などもある。その他、現在知られている２量体以上の
多量体構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。
したがって、遺伝子工学的な技術により作製される２量
体もしくはそれ以上の形態を有する形の配列表の配列番
号１、２、３、４及び５に記載のアミノ酸配列を含むポ
リペプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。

【００５６】また、その他の方法として、化学的な架橋
剤を用いて多量体化する方法が挙げられる。例えば、リ
シン残基を架橋するジメチルスベロイミデート２塩酸塩
など、システイン残基のチオール基で架橋するＮ−（γ
−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドなど、ア
ミノ基とアミノ基を架橋するグルタールアルデヒドなど
が挙げられ、これらの架橋反応を利用して、２量体以上
の多量体を形成させることができる。したがって、化学
的な架橋剤により作製される２量体もしくはそれ以上の
多量体の形態を有す形の配列表の配列番号１、２、３、
４もしくは５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチド
を含む化合物に関しても本発明に含まれる。

【００５７】体外において細胞を増殖、活性化し、体内
に細胞を戻す医療方法への適応には、上記のような形態
を有したヒトデルター３を直接培地中に加えることも可
能だが、固定化する事も同様に可能である。固定化の方
法としてはこれらのポリペプチドのアミノ基、カルボキ
シル基を利用したり、適当なスペーサーを用いたり、上
記の架橋剤を用いたりして、培養容器にポリペプチドを
共有結合させることができる。したがって、固体表面に
存在する形態を有す配列表の配列番号１、２、３、４及
び５のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに関しても
本発明に含まれる。

【００５８】また、自然界に存在するヒトデルター３は
細胞膜蛋白質であることから、これらの分子を発現する
細胞と血液未分化細胞を共培養することによっても、実
施例で行った分化抑制作用を発現させることができる。
したがって、配列表の配列番号１、２、３、４、もしく
は５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて形質転
換した細胞と未分化細胞を共培養する方法についても本
願に含まれる。

【００５９】発現させる細胞は実施例３で示したＣＯＳ
−７細胞でもかまわないが、ヒト由来の細胞が望まし
く、また更に発現させる細胞は細胞株ではなくヒトの体
内の血液細胞でも体細胞でもかまわない。したがって、
遺伝子治療用のベクターに組み込んで体内で発現させる
こともできる。また、本願分子すなわち配列表の配列番
号１、２、４、もしくは５のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドとこれらのリセプターとの結合を阻害すること
は細胞分化を促進する分子、化合物を見つけだす手段と
して利用できる。その方法としては、ラジオアイソトー
プなどを用いた結合実験、ノッチリセプターの下流分子
である転写調節因子群を用いたルシフェラーゼアッセ
イ、Ｘ線構造解析を行いコンピューター上でのシミュレ
ーションなどあらゆる方法が応用できる。したがって、
配列表の配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプ
チドを用いた薬剤スクリーニング方法に関しても本願に
含まれる。

【００６０】

【発明の実施の形態】以下に発明を実施する形態につい
て実施例を示すが、必ずしもこれらに限定されるもので
はない。

【００６１】

【実施例１】 新規ヒトデルター３のｃＤＮＡクローニ
ング配列表の配列番号７のヒトデルター１遺伝子をプロ
ーブとして用いて新たなヒトデルタホモログの遺伝子ク
ローニングを行った。プローブは以下のようにして作成
した。すなわち、国際公開番号ＷＯ９７／１９１７２に
記載のヒトデルター１ｃＤＮＡ、すなわち、ベクターｐ
ＵＣＤＬ−１Ｆを鋳型としてＰＣＲ法にて作製した。
尚、ベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを大腸菌ＪＭ１０９に遺
伝子導入した形質転換細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０
９−ｐＵＣＤＬ−１Ｆとして日本国茨城県つくば市東一
丁目一番三号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工
業技術研究所に寄託されている。寄託日は平成８年１０
月２８日であり、寄託番号はＦＥＲＭ ＢＰ−５７２
８。プライマーは配列表の配列番号９のセンスプライマ
ー及び配列表の配列番号１０のアンチセンスプライマー
を用いた。

【００６２】これらプライマーを用いたＰＣＲによる増
幅は以下のように行った。ｐＵＣＤＬ−１Ｆ溶液を１μ
ｌ（０．１μｇ相当）を鋳型として使用し、１０×緩衝
液（５００ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、０．０１％ゼ
ラチン）５μｌ、ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ（日本国宝
酒造社製）４μｌ、前述のセンスプライマー（１０ｐｍ
ｏｌ／μｌ）２μｌおよびアンチセンスプライマー（１
０ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ：日本国宝酒造社製、５Ｕ／μ
ｌ）０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量
を５０μｌとして、９５℃で４５秒間、５５℃で４５秒
間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、
この行程を３０サイクル行い最後に７２℃にて７分間放
置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％ア
ガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド
（日本国日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察
し、約５５０ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確
認した。

【００６３】このＰＣＲ産物をアガロースゲルより切り
出し、ＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩキット（Ｂｉｏ１０１社
製）にて添付の取扱説明書に従いＤＮＡプローブを精製
し、２５ｎｇ／μｌとなるように蒸留水に希釈して、配
列表の配列番号７に示した配列を有するＤＮＡプローブ
を作製した。このようにして作製した配列表の配列番号
７の遺伝子配列を有するＤＮＡをプローブとして用い、
以下のようにライブラリーのスクリーニングを行った。

【００６４】ライブラリースクリーニングは、ヒト胎児
脳由来のｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ１０にｃＤＮＡ
が挿入されたもの、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を対象
にプラークハイブリダイゼーションにて行った。出現し
たプラークをナイロンフィルター（Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ
＋：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し、転写したナ
イロンフィルターをアルカリ処理（１．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、０．５Ｍ ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に７分間
放置）し、次いで中和処理（１．５Ｍ ＮａＣｌ、０．
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡを染み込ませたろ紙上に３分間放置）を２回行い、
次にＳＳＰＥ溶液（０．３６Ｍ ＮａＣｌ、０．０２Ｍ
りん酸ナトリウム（ｐＨ７．７）、２ｍＭ ＥＤＴ
Ａ）の２倍溶液中で５分間振とう後洗浄し、風乾した。
その後、０．４Ｍ ＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に２
０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液で５分間振とう
後洗浄し、再度風乾した。このフィルターを用いて放射
性同位元素³²Ｐにて標識された上記のヒトデルタ−１プ
ローブにてスクリーニングを行った。

【００６５】放射性同位元素³²Ｐにて標識されたＤＮＡ
プローブは以下のように作成した。得られたＤＮＡ断片
をＤＮＡラベリングキット（Ｍｅｇａｐｒｉｍｅ ＤＮ
Ａｌａｂｅｌｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ：米国Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ社製）を用い、添付の説明書に従って標識した。す
なわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５μｌ及び脱イ
オン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰水浴を５分間
行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液１０μｌ、α
−［³²Ｐ］−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮＡポリヌク
レオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７℃で１０分
間水浴し、更にその後、セファデックスカラム（Ｑｕｉ
ｃｋ Ｓｐｉｎ Ｃｏｌｕｍｎ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ
−５０：独逸国ベーリンガーマンハイム社製）で精製
し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用し
た。

【００６６】ハイブリダイゼーションは前述の方法にて
作成したフィルターを、各々の成分の最終濃度が５倍濃
度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデンハルト液（日本国和
光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウ
ム、日本国和光純薬社製）、及び１０μｇ／ｍｌの沸騰
水浴により変性したサケ精子ＤＮＡ（米国Ｓｉｇｍａ社
製）であるプレハイブリダイゼーション液中に浸し、６
５℃にて２時間振とうしたのち、前述の方法で³²Ｐ標識
されたプローブを含むプレハイブリダイゼーション液と
同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、５５℃に
て１６時間振盪し、ハイブリダイゼーションを行った。
その後、０．１％ＳＤＳを含むＳＳＣ溶液に浸し、室温
で振盪し６回洗浄後、さらに０．１％ＳＤＳを含む３倍
希釈したＳＳＣ溶液に浸し、１回洗浄した。洗浄を終了
したフィルターを増感スクリーンを使用して、オートラ
ジオグラフィーを行った。その結果、強く露光された部
分のクローンを拾い、再度プラークを蒔き直し前述の方
法にてスクリーニングを行い、完全に単独のクローンを
分離した。上記の条件でおよそ１２０万個のプラークを
１次スクリーニングとして行った結果、約１００個のプ
ラークがポジティブと判断され、これらを同様な方法で
２次スクリーニングを行って各ファージを分離した。

【００６７】成書の方法に従い、これらのすべてのクロ
ーンのファージを約１×１０⁹ ｐｆｕ調製し、ファージ
ＤＮＡをウィザードラムダプレップ（米国Ｐｒｏｍｅｇ
ａ社製）にて精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、
同様にＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＫＳ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込み、末
端の遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーにてＤＮＡ遺伝
子配列を解析した。

【００６８】大多数のクローンは前述のヒトデルター１
遺伝子に相当した。ヒトデルター１以外の配列であると
確認された遺伝子については、更にプライマーウォーキ
ング法にて配列を決定した。この中にヒトデルター１に
は似ているが異なる遺伝子配列を有し、なおかつコンピ
ューターソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘＣＤ Ｖｅｒ３７
（日本国ソフトウエア開発株式会社製）にてＧｅｎｂａ
ｎｋリリース１００上には存在しない新規な配列を含む
クローンが見いだされた。同一の配列を有しているクロ
ーンとして＃５、＃１１であり、これらのクローンのＤ
ＮＡ配列を、プライマーウオーキング法にて、パーキン
エルマーＡＢＩＤＮＡシークエンサーを用いて５’方
向、３’方向の両方向から、本発明の全長のｃＤＮＡ塩
基配列を決定した。

【００６９】その結果、クローン＃５、およびクローン
＃１１は新しいヒトデルター１、ヒトデルター２に類似
した分子であることからヒトデルター３と命名した。ク
ローン＃１１は配列表の配列番号６に記載のＤＮＡ配列
の全配列を含み、クローン＃５は配列表の配列番号６に
記載のＤＮＡ配列の３７７番から１８７４番までの配列
にさらに３’方向に３００ベースほど長いクローンであ
った。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＫＳのＥｃｏＲＩ
サイトにライゲーションされているクローン＃１１を含
むベクターをｐＢＳＤＬ−３と命名する。

【００７０】

【実施例２】 ヒトデルター３発現ベクターの作製実施
例１のヒトデルター３の全長をコードするベクターｐＢ
ＳＤＬ−３を用いて、次の１）から５）に挙げるヒトデ
ルター３蛋白質の発現ベクターを作製した。制限酵素サ
イトの付加、短い遺伝子配列の挿入は全て米国Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅ社製ＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ
Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ
Ｋｉｔを用い、添付の取扱い説明書に従って行った。
また、配列の付加などを行った際には実施例１に記載し
た方法で遺伝子配列を決定して、作業中の遺伝子配列の
変更などを確認して進めた。

【００７１】１）分泌型ヒトデルター３蛋白質（ＨＤ３
ＥＸ）発現ベクター配列表の配列番号４のアミノ酸配列
の１番から４６４番のポリペプチドをコードするｃＤＮ
Ａを、サイトメガロウィルスのプロモーターとネオマイ
シン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に
つなぎ、発現ベクターを作製した。ｐＢＳＤＬ−３をテ
ンプレートとして、細胞外部分のカルボキシル末端部
分、すなわち配列表の配列番号４のアミノ酸配列の４６
４番目のアルギニン残基までをコードするＤＮＡ配列に
続き、終止コドン、更に制限酵素ＸｂａＩサイトを付加
するため、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用
い、配列表の配列番号１１及び配列番号１２の遺伝子配
列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、終
止コドン、さらにＸｂａＩサイトの付加を行った。次
に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにて消化
し、切り出されてくる約１５００ｂｐの遺伝子断片を同
様な制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３．１につないで発現
ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤ３ＥＸと命
名した。

【００７２】２）分泌型ヒトデルター３のＦＬＡＧキメ
ラ蛋白質（ＨＤ３ＥＸＦＬＡＧ）発現ベクター配列表の
配列番号４のアミノ酸配列の１番から４６４番のポリペ
プチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを
付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、発現ベ
クターｐｃＤＮＡ３．１につなぎ、発現ベクターを作製
した。

【００７３】ｐＢＳＤＬ−３をテンプレートとして用
い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列
表の配列番号４の４６４番目のセリン残基までをコード
するＤＮＡ配列に続き、ＦＬＡＧ配列を付加し、ついで
終止コドン、更に制限酵素ＸｂａＩサイトを付加するた
め同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、配列
表の配列番号１１及び配列番号１３の遺伝子配列を有す
るオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦ
ＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さら
にＸｂａＩサイトの付加を行った。次に、このベクター
をＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにて消化し、切り出されて
くる約１５００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理
したｐｃＤＮＡ３．１につないで発現ベクターを構築し
た。このベクターをｐＨＤ３ＥＸＦＬＡＧと命名した。

【００７４】３）分泌型ヒトデルター３のＩｇＧ１Ｆｃ
キメラ蛋白質（ＨＤ３ＥＸＩｇ）発現ベクター配列表の
配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
のＣ末にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ部分のア
ミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子
配列をｐｃＤＮＡ３．１につなぎ、発現ベクターを作製
した。

【００７５】イムノグロブリンＦｃタンパクとの融合タ
ンパクの作製はＺｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌらの方法（Ｚｅ
ｔｔｌｍｅｉｓｓｌ ｅｔ ａｌ．，ＤＮＡ ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ．，９，３４７−３５４，１９９０）にした
がって、イントロンを含むゲノムＤＮＡを用いた遺伝子
を利用し、その遺伝子をＰＣＲ法を用いて作製した。そ
の作製法に関しては国際公開番号ＷＯ９７／１９１７２
にも記載してある。この遺伝子は５’端に制限酵素Ｂａ
ｍＨＩサイトを有し、３’端にＸｂａＩサイトを有し、
ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳのＢａｍＨＩサイトとＸ
ｂａＩサイトにクローニングされている。以下、このプ
ラスミドをｐＢＳｈＩｇＦｃとする。

【００７６】ｐＢＳＤＬ−３をテンプレートとして用
い、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔを用い、細胞
外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列
番号４の４６４番目のアルギニン残基の後に、制限酵素
ＢａｍＨＩサイトを付加し、さらにその下流に上記のヒ
トイムノグロブリンＩｇＧ１ＦｃをコードするＤＮＡを
つなぐためのＸｂａＩサイトを付加するために、配列表
の配列番号１１と配列番号１４のオリゴヌクレオチドに
て、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用い、こ
れらのサイトの付加を行った。また、この際にはＢａｍ
ＨＩサイトの付加によりアミノ酸をコードするフレーム
がずれないように、配列表の配列番号６のＤＮＡ配列上
の４６４番目のアルギニンをコードするＤＮＡ配列はＣ
ＧＣからＣＧＧに変更した。

【００７７】この様にして作製したベクターをＸｂａ
Ｉ、ＢａｍＨＩにて消化し、上記のｐＢＳｈＩｇＦｃを
ＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し切り出されてくる約１
２００ｂｐの遺伝子断片をつないで最終的に目的の分泌
型ヒトデルター３のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質をコード
する遺伝子断片を含むベクターを作成した。最後に、こ
のベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにて消化し、切
り出されてくる約２７００ｂｐの遺伝子断片を同様な制
限酵素処理したｐｃＤＮＡ３．１につないで発現ベクタ
ーを構築した。このベクターをｐＨＤ３ＥＸＩｇと命名
した。４）全長型ヒトデルター３の蛋白質（ＨＤ３Ｆ）
発現ベクター配列表の配列番号５のアミノ酸配列の１番
から５６１番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、
発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１につなぎ、発現ベクター
を作製した。

【００７８】ｐＢＳＤＬ−３を制限酵素ＥｃｏＲＩにて
消化し、切り出されてくる約１９００ｂｐの遺伝子断片
を同制限酵素で消化した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１
につないで、遺伝子挿入方向をＰＣＲ法にて確認して、
発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤ３Ｆと
命名した。５）全長型ヒトデルター３のＦＬＡＧキメラ
蛋白質（ＨＤ３ＦＬＡＧ）発現ベクター配列表の配列番
号５のアミノ酸配列の１番から５６１番のポリペプチド
のＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加し
たキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、発現ベクター
ｐｃＤＮＡ３．１につなぎ、発現ベクターを作製した。

【００７９】ｐＢＳＤＬ−３をテンプレートとして、カ
ルボキシル末端部分にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終
止コドン、更に制限酵素ＸｂａＩサイトを付加するため
同様に配列表の配列番号１１及び配列番号１５の遺伝子
配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、
Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コ
ドン、さらにＸｂａＩサイトの付加を行った。次に、こ
のベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにて消化し、切
り出されてくる約１８００ｂｐの遺伝子断片を同様な制
限酵素処理したｐｃＤＮＡ３．１につないで発現ベクタ
ーを構築した。このベクターをｐＨＤ３ＦＬＡＧと命名
した。

【００８０】

【実施例３】 各種発現ベクターの細胞への遺伝子導入
と発現実施例２で作製した発現ベクターはＣＯＳ−７細
胞（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ
０５３９）に遺伝子導入した。遺伝子導入前の細胞の培
養はＤ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、米国ＧＩ
ＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した。遺伝
子導入の前日に細胞の培地を交換し、細胞数を５×１０
⁵ ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして一晩培養した。遺伝子導入の
当日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて
２回遠心洗浄後、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、ＰＢＳ（−）に
１×１０⁷ ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにして細胞を調
製した。遺伝子導入は米国Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製遺伝子導
入装置ジーンパルサーを用いたエレクトロポレーション
法で行った。上記の細胞懸濁液を５００μｌエレクトロ
ポレーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベク
ターを２０μｇ加え、氷中で５分間放置した。その後、
３μＦ，４５０Ｖの条件で２回電圧をかけ、その２回の
間は１分間室温で放置した。その後、氷中で５分間放置
後、上記の培地１０ｍｌをあらかじめ分注した直径１０
ｃｍ細胞培養用ディシュに細胞を播種し、３７℃、５％
炭酸ガスインキュベーターで培養した。

【００８１】その翌日、培養上清を除去し、ディッシュ
に付着した細胞をＰＢＳ（−）１０ｍｌで２回洗浄し、
発現ベクターｐＨＤ３ＥＸ、ｐＨＤ３ＥＸＦＬＡＧ、及
びｐＨＤ３ＥＸＩｇの場合は無血清のＤ−ＭＥＭ１０ｍ
ｌを加えてさらに７日間培養し、培養上清を回収し、セ
ントリコン３０（米国アミコン社製）にてバッファーを
ＰＢＳ（−）に置換すると同時に１０倍濃縮を行い、細
胞培養上清を得た。

【００８２】また、ｐＨＤ３Ｆ及びｐＨＤ３ＦＬＡＧの
場合は、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭに培地を交換
し、さらに３日間培養し、細胞破砕物を調製した。すな
わち、２×１０⁶ 個の細胞をセルリシスバッファー（５
０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％ Ｔｒｉｔｏ
ｎＸ１００、１０％ グリセロール、４ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、５０μｇ／ｍｌ Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１００μＭ
Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、２５μＭ Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ
Ａ、１ｍＭ ＰＭＳＦ）２００μｌに懸濁し、氷中に２
０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍで２０分間遠心
し上清を取り細胞破砕物を得た。

【００８３】こうして得られたサンプルを用いてウェス
タンブロッティング法にて蛋白の発現を確認した。すな
わち、濃縮した培養上清もしくは細胞破砕物を日本国バ
イオクラフト社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽及び
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエ
ントゲル５〜１５％）を用い、添付の取扱い説明書に従
ってＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。サンプルは２−メ
ルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加えて５分間の沸騰
水浴加熱処理により還元処理を行ったものと、この処理
を行わない非還元状態のものを用い、マーカーとしては
Ａｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマーカー（高分子量
用）を用い、サンプルバッファー、泳動バッファーにつ
いては添付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブ
ランフィルター（米国ＢｉｏＲａｄ社製）に同社製ミニ
トランスブロットセルにより転写した。

【００８４】このように作製されたフィルターをブロッ
クエース（日本国大日本製薬社製）、もしくは５％牛由
来アルブミン（米国シグマ社製）を含むＴＢＳ−Ｔ（２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．
６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０に４℃一晩振盪してブ
ロッキングした。その後、ＥＣＬウェスタンブロッティ
ング検出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に添付の
説明書に従い、実施例５に記載した抗ヒトデルター３マ
ウスモノクローナル抗体、もしくはＦＬＡＧキメラの場
合（ＨＤ３ＥＸＦＬＡＧ、ＨＤ３ＦＬＡＧ）は一次抗体
としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ
Ｍ２（米国コダック社製）を用い、二次抗体としてペル
オキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（米国Ａｍｅｒｓ
ｈａｍ社製）を反応させた。また、ＩｇＧキメラの場合
（ＨＤ３ＥＸＩｇ）は、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩ
ｇヒツジ抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させ
た。

【００８５】抗体の反応時間は各々室温で一時間反応さ
せ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分間室温で振盪洗浄
する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィル
ターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム
（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の反応液に５分間浸し、
ポリ塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フィルムに感光
させた。

【００８６】その結果、還元処理を行ったサンプルはｐ
ＨＤ３ＥＸとｐＨＤ３ＥＸＦＬＡＧの導入によって得ら
れた蛋白質は約６０ｋダルトン、ｐＨＤ３ＥＸＩｇの導
入によって得られた蛋白質は約８５ｋダルトン、一方、
非還元状態のサンプルはｐＨＤ３ＥＸＩｇを導入した場
合、約１６０ｋダルトンのバンドを検出し、還元条件の
ほぼ２倍の分子量であることから、２量体が形成されて
いることを確認した。また、ｐＨＤ３ＦとｐＨＤＦＬＡ
Ｇでは共に約８０ｋダルトンのバンドを検出した。

【００８７】これらの実験では、コントロールとしてイ
ンサートのないｐｃＤＮＡ３．１ベクターを導入したＣ
ＯＳ−７細胞の細胞破砕物および培養上清を同様に試験
したが、抗ヒトデルター３マウスモノクローナル抗体、
抗ＦＬＡＧ抗体、抗ヒトＩｇ抗体に反応するバンドは検
出されなかった。以上の結果から、これら５種の発現ベ
クターはいずれも目的のポリペプチドを生産することが
できた。

【００８８】

【実施例４】 遺伝子導入細胞による分泌型ヒトデルタ
ー３蛋白質の精製実施例３の方法で発現が検出されたＨ
Ｄ３ＥＸＦＬＡＧもしくはＨＤ３ＥＸＩｇを含むＣＯＳ
−７細胞培養上清を大量調製し、アフィニティーカラム
によってこれらキメラ蛋白質を精製した。ＨＤ３ＥＸＦ
ＬＡＧに関しては、実施例３に記載した方法によって取
得した２リットルの培養上清をＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ Ｍ
２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（米国コダック社製）を
充填したカラムに通して、キメラ蛋白質が有するＦＬＡ
Ｇ配列とゲルのＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体のアフィニティ
ーによりキメラ蛋白質をカラムに吸着させた。カラムは
内径１０ｍｍのディスポカラム（米国ＢｉｏＲａｄ社
製）を用い、上記ゲルを５ｍｌ充填した。吸着は培地ボ
トル→カラム→ペリスターポンプ→培地ボトルの環流式
回路を組み立て、流速１ｍｌ／分で７２時間循環させ
た。その後、カラムをＰＢＳ（−）３５ｍｌで洗浄し、
０．５ＭＴｒｉｓ−グリシン（ｐＨ３．０）５０ｍｌで
溶出した。あらかじめ小チューブ（米国ファルコン社製
２０６３）に０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）
を２００μｌ分注しておき、溶出液は２ｍｌずつ２５画
分をそのチューブに分取し、各々の画分を中和した。

【００８９】上記の方法で精製された分泌型ＦＬＡＧキ
メラ蛋白質の溶出画分の各１０μｌは、実施例３に記載
の還元処理を行い、５−１５％濃度勾配ポリアクリルア
ミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、電気
泳動終了後、日本国和光純薬社製ワコー銀染キットＩＩ
を用いて、添付の説明書に従って銀染色を行った。結果
として、ＨＤ３ＦＬＡＧは第４番から第８番の溶出画分
にバンドが検出され、この分子量は実施例３で得られた
抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロッティングの結果
と一致した。この結果からＨＤ３ＥＸＦＬＡＧの純品が
精製された。

【００９０】ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質、すなわちＨＤ
３ＥＸＩｇに関しては、ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様の
操作で培養上清の２リットルをスウェーデン国ファルマ
シア社製Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａセファロースカラムに吸着
させ、溶出画分を分取した。ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同
様に溶出液の一部を用いて、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ電気泳動および銀染色により溶出画分の決定、サイ
ズの確認、純度検定を行った。結果として、溶出画分の
第４番から第１５番にバンドが検出され、サイズは抗ヒ
トＩｇ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果と
一致した。この結果からＨＤ３ＥＸＩｇの純品が精製さ
れた。

【００９１】

【実施例５】 ヒトデルター３を認識する抗体作成実施
例４に記載の方法で精製されたＨＤ３ＥＸＦＬＡＧを免
疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後、全血の
採血を行い、血清を採取して、米国ＢｉｏＲａｄ社製の
エコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の取
扱い説明書に従って、抗ヒトデルター３ウサギポリクロ
ーナル抗体を作製した。

【００９２】また、実施例４に記載した方法で精製され
たＨＤ３ＥＸＦＬＡＧを免疫原として、成書の方法に従
いマウスモノクローナル抗体を作成した。すなわち、上
記のように精製されたＨＤ３ＥＸＦＬＡＧをＢａｌｂ／
ｃマウス（日本国日本エスエルシー社製）に１匹あたり
１０μｇを皮下・皮内に免疫した。２回の免疫後、眼底
採血を行い血清中の抗体価の上昇を認めた後、３回目の
免疫を行ってからマウスの脾臓細胞を取り出し、マウス
ミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣＴＩＢ
９）とポリエチレングリコール法にて細胞融合を行っ
た。ＨＡＴ培地（日本国免疫生物研究所製）にてハイブ
リドーマを選択し、酵素抗体法にてヒトデルター３の細
胞外部分を認識する抗体を培地中に産生しているハイブ
リドーマ株を分離し、ヒトデルター３を特異的に認識す
るマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
産生株が樹立された。

【００９３】このようにして樹立されたハイブリドーマ
の培養上清をスウェーデン国ファルマシア社製Ｍａｂ
ＴｒａｐＧ ＩＩを用いて、添付の取扱い説明書に従っ
て、抗ヒトデルター３モノクローナル抗体を精製し作製
した。これらモノクローナル抗体を用いてアフィニティ
ーカラムを作製した。アフィニティーカラムの作製はス
ウェーデン国ファルマシア社製ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ４Ｂにて添付の取扱い説明書に従い行った。
このゲルの２ｍｌを用いて２ｃｍ² ×１ｃｍのサイズの
カラムを作製した。

【００９４】抗ヒトデルター３モノクローナル抗体を結
合させたカラムに対してｐＨＤ３ＥＸを遺伝子導入した
ＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液を２０ｍｌ／ｈｒの速度
で流し、その後同一速度でＰＢＳ（−）を１５ｍｌ流し
て洗浄し、最終的に０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ
ＮａＣｌ（ＰＨ４．０）にて溶出した。この溶離液を１
ｍｌづつ分取し、各画分に１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
９．５）を２００μｌづつ加えて、中和した。

【００９５】さらに実施例３に記載の方法に従って、各
々の精製蛋白質を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
い、銀染色、及びウェスタンブロッティングを行ない、
分子量の推定を行った。この結果、ｐＨＤ３ＥＸを遺伝
子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液からは約５５
ｋダルトンのＨＤ３ＥＸが精製されていることが確認さ
れ、これらアフィニティーカラムでヒトデルター３タン
パク質が精製可能であることが明らかとなった。

【００９６】

【実施例６】 ＨＤ３ＥＸＩｇの血液未分化細胞のコロ
ニー形成に対する作用ＨＤ３ＥＸＩｇの血液未分化細胞
に対する生理作用を観察するため、ＣＤ３４陽性細胞を
ＨＤ３ＥＸＩｇおよび既存のサイトカイン存在下で無血
清半固形培地で培養し、コロニー形成細胞の増減を観察
した。ヒト臍帯血もしくはヒト正常骨髄血のＣＤ３４陽
性細胞は臍帯血もしくは成人正常骨髄血をシリカ液（日
本国免疫生物研究所製）により添付の説明書にしたがっ
て処理し、その後フィコールパック（スエーデン国ファ
ルマシア社製）による比重遠心分離法により低密度細胞
画分（＜１．０７７ｇ／ｍｌ）を分画した単核球より分
離した。

【００９７】ＣＤ３４陽性細胞の分離はノルウェー国Ｄ
ｙｎａｌ社製ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ ＣＤ３４
とＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤＳ ＣＤ３４を用い、添付の
取扱説明書に従って分離した。分離後、その純度はＦＩ
ＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体ＨＰＣＡ２（米国ベクトンデッ
キンソン社製）で染色し、同社のフローサイトメーター
（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）にて検定し、８５％以上の
純度を有していることを確認して用いた。

【００９８】このようにして分離したＣＤ３４陽性細胞
４００個が下記の培地１ｍｌ中に存在するように均一に
懸濁し、３５ｍｍディッシュ（米国ファルコン社製）に
まき、３７℃、５％炭酸ガス、５％酸素ガス、９０％窒
素ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベー
ターで２週間の培養後、形成された血球コロニーを倒立
顕微鏡下で計測した。

【００９９】培養に用いた培地はα−ｍｅｄｉｕｍ（米
国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）に２％Ｄｅｉｏｎｉｚｅｄ
Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ Ａｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、
米国Ｓｉｇｍａ社製）、１０μｇ／ｍｌ ヒトインスリ
ン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、２００μｇ／ｍｌ トラン
スフェリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、１０^-5Ｍ ２−メ
ルカプトエタノール（日本国ナカライテスク社製）、１
６０μｇ／ｍｌ ソイビーンレシチン（米国Ｓｉｇｍａ
社製）、９６μｇ／ｍｌ コレステロール（米国Ｓｉｇ
ｍａ社製）、０．９％ メチルセルロース（日本国和光
純薬社製）で行った。

【０１００】上記の培地に、最終的に１μｇ／ｍｌの濃
度となるようにヒトデルター３細胞外Ｉｇキメラ蛋白質
（ＨＤ３ＥＸＩｇ）を加え、比較区にはＩｇＧＦｃ部分
の影響を見るため、ヒトＩｇＧ１（米国Ａｔｈｅｎｓ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）
を同濃度加えた。同時に加えたサイトカイン条件は１０
０ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦ（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社
製）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−３（米国Ｉｎｔｅｒ
ｇｅｎ社製）、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６（米国
Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）である。

【０１０１】その結果、比較区ではコロニー形成が細胞
４００個当たり５５±１０であったが、ＨＤ３ＥＸＩｇ
を加えた場合には３１±５と著明にコロニー形成が抑制
を受けた。この結果から、本願分子ヒトデルター３は血
液未分化細胞に作用することが明らかとなった。

【０１０２】

【実施例７】 ヒトデルター３の血管内皮細胞増殖に及
ぼす変化血管内皮細胞は、日本国クラボウ社製の正常ヒ
ト大動脈血管内皮細胞と正常ヒト肺動脈血管内皮細胞の
それぞれ４次継代培養細胞を用いた。細胞は、３次培養
の継代時に組織培養用９６ウェルプレート（米国ファル
コン社製）に５０００細胞数／ウェルずつ蒔き、日本国
クラボウ社製のヒトリコンビナントＥＧＦを１０ｎｇ／
ｍｌ，ヒトリコンビナントＦＧＦ−Ｂを５ｎｇ／ｍｌ各
々含有する低血清血管内皮細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄ
ｉａ−ＥＧ２、日本国クラボウ社製）中で培養し、その
際、最終的に１μｇ／ｍｌの濃度となるようにヒトデル
ター３細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＤ３ＥＸＩｇ）を加
え、比較区にはＩｇＧＦｃ部分の影響を見るため、ヒト
ＩｇＧ１（米国Ａｔｈｅｎｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎ
ｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を同濃度加えた。尚、対
照はＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２以外の添加蛋白質無しの条
件で培養を行った。培養は３７℃，５％炭酸ガス，１０
０％湿度雰囲気下で３日間行った後に、細胞を計数し
た。

【０１０３】血管内皮細胞の計数は、Ｂｏｒｅｎｆｒｅ
ｕｎｄとＰｕｅｒｎｅｒ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｉ
ｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９
（１），７−９，１９８４）によって開発された方法、
すなわち、生体染色色素のｎｅｕｔｒａｌ ｒｅｄ（３
−ａｍｉｎｏ−７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−
ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏ
ｒｉｄｅ）が生きている細胞においてのみ原形質膜を通
りリソソームに蓄積されることを利用したニューラルレ
ッド法を原理とした日本国クラボウ社製のＮＲ試薬セッ
トを用い、５４０ｎｍの吸光度は日本国日本インターメ
ッド社製イムノリーダー（ＮＪ−２０００）で測定し
た。その結果、大動脈血管内皮細胞の場合は対照区では
吸光度の値がＯｐｔｉｃａｌ Ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）
として０．１８±０．０２であり、ヒトＩｇＧ１添加区
ではほぼ同様な０．２０±０．０２であったが、ＨＤ３
ＥＸＩｇ添加区では０．１０±０．０１と著明に少なか
った。また、肺動脈血管内皮細胞の場合は対照区では
０．１８±０．０２であり、ヒトＩｇＧ１添加区ではほ
ぼ同様な０．１９±０．０１であったが、ＨＤ３ＥＸＩ
ｇ添加区では０．０８±０．０１と著明に少なかった。
これらの結果から、ＨＤ３ＥＸＩｇは血管内皮細胞の増
殖を抑制することがわかった。

【０１０４】

【実施例８】 薬剤の作製実施例４及び５の方法で精製
された各ポリペプチド１ｍｇに対して人血清アルブミン
（ミドリ十字社製）５ｍｇとなるように１ｍｌの蒸留水
に溶解し、０．２２μｍの滅菌フィルターにて濾過滅菌
後、バイアル瓶に分注して凍結乾燥して作製した。

【０１０５】

【発明の効果】本発明のヒトデルター３分子は血液未分
化細胞をはじめとする未分化細胞の増殖、分化抑制にと
って有効な化学品となり、医薬品、医療品として使用が
可能である。

【０１０６】

【配列表】 <110>Asahi Chemical Industry Co., Ltd <120>ヒトデルター３ <130>X11-00085 <150>JP 特願平10-37484 <151>1998-02-19 <160>15 <210>1 <211>17 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>1 Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro 1 5 10 15 Arg <210>2 <211>37 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>2 Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro 1 5 10 15 Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro 20 25 30 Leu Glu Asp Glu Cys 35 <210>3 <211>188 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>3 Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 10 15 Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu 20 25 30 Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu 35 40 45 Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr 50 55 60 Thr Glu Gln Pro Gly Ala Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly 65 70 75 80 Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro 100 105 110 Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu 130 135 140 Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala 145 150 155 160 Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro 165 170 175 Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu Cys 180 185

【０１０７】 <210>4 <211>464 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>4 Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 10 15 Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu 20 25 30 Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu 35 40 45 Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr 50 55 60 Thr Glu Gln Pro Gly Ala Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly 65 70 75 80 Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro 100 105 110 Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu 130 135 140 Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala 145 150 155 160 Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro 165 170 175 Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Pro 180 185 190 Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro 195 200 205 Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val 210 215 220 Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro 245 250 255 Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys 260 265 270 Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val 275 280 285 Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly 290 295 300 Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln 305 310 315 320 Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys 325 330 335 Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg 340 345 350 Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp 355 360 365 Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly 370 375 380 Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys 385 390 395 400 Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly 405 410 415 Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly 420 425 430 Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser 435 440 445 Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg 450 455 460

【０１０８】 <210>5 <211>561 <212>PRT <213>Homo sapiens <400>5 Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly 1 5 10 15 Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu 20 25 30 Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu 35 40 45 Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr 50 55 60 Thr Glu Gln Pro Gly Ala Pro Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly 65 70 75 80 Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe 85 90 95 Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro 100 105 110 Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu 130 135 140 Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala 145 150 155 160 Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro 165 170 175 Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Pro 180 185 190 Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro 195 200 205 Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val 210 215 220 Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala 225 230 235 240 Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro 245 250 255 Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys 260 265 270 Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val 275 280 285 Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly 290 295 300 Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln 305 310 315 320 Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys 325 330 335 Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg 340 345 350 Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp 355 360 365 Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly 370 375 380 Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys 385 390 395 400 Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly 405 410 415 Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly 420 425 430 Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser 435 440 445 Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg 450 455 460 Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala 465 470 475 480 Gly Ala Ala Leu Leu Leu Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln 485 490 495 Asp Ala Gly Ser Arg Leu Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His 500 505 510 Ala Leu Pro Asp Ala Leu Asn Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ser Gly 515 520 525 Asp Gly Pro Ser Ser Ser Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp 530 535 540 Pro Gln Gly Ile Tyr Val Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu 545 550 555 560 Ala

【０１０９】 <210>6 <211>1874 <212>DNA <213>Homo sapiens <220> <221>CDS <222>(14)...(1759) <400>6 ggtctcccca cgg atg tcc ggg ctc ctc tcc cag act gtg atc cta gcg 49 Met Ser Gly Leu Leu Ser Gln Thr Val Ile Leu Ala -21 -20 -15 -10 ctc att ttc ctc ccc cag aca cgg ccc gct ggc gtc ttc gag ctg cag 97 Leu Ile Phe Leu Pro Gln Thr Arg Pro Ala Gly Val Phe Glu Leu Gln -5 -1 1 5 atc cac tct ttc ggg ccg ggt cca ggc cct ggg gcc ccg cgg tcc ccc 145 Ile His Ser Phe Gly Pro Gly Pro Gly Pro Gly Ala Pro Arg Ser Pro 10 15 20 tgc agc gcc cgg ctc ccc tgc cgc ctc ttc ttc aga gtc tgc ctg aag 193 Cys Ser Ala Arg Leu Pro Cys Arg Leu Phe Phe Arg Val Cys Leu Lys 25 30 35 cct ggg ctc tca gag gag gcc gcc gag tcc ccg tgc gcc ctg ggc gcg 241 Pro Gly Leu Ser Glu Glu Ala Ala Glu Ser Pro Cys Ala Leu Gly Ala 40 45 50 55 gcg ctg agt gcg cgc gga ccg gtc tac acc gag cag ccc gga gcg ccc 289 Ala Leu Ser Ala Arg Gly Pro Val Tyr Thr Glu Gln Pro Gly Ala Pro 60 65 70 gcg cct gat ctc cca ctg ccc gac ggc ctc ttg cag gtg ccc ttc cgg 337 Ala Pro Asp Leu Pro Leu Pro Asp Gly Leu Leu Gln Val Pro Phe Arg 75 80 85 gac gcc tgg cct ggc acc ttc tct ttc atc atc gaa acc tgg aga gag 385 Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg Glu 90 95 100 gag tta gga gac cag att gga ggg ccc gcc tgg agc ctg ctg gcg cgc 433 Glu Leu Gly Asp Gln Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala Arg 105 110 115 gtg gct ggc agg cgg cgc ttg gca gcc gga ggc ccg tgg gcc cgg gac 481 Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp 120 125 130 135 att cag cgc gca ggc gcc tgg gag ctg cgc ttc tcg tac cgc gcg cgc 529 Ile Gln Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg 140 145 150 tgc gag ccg cct gcc gtc ggg acc gcg tgc acg cgc ctc tgc cgt ccg 577 Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro 155 160 165 cgc agc gcc ccc tcg cgg tgc ggt ccg gga ctg cgc ccc tgc gca ccg 625 Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro 170 175 180 ctc gag gac gaa tgt gag gcg ccg ccg gtg tgc cga gca ggc tgc agc 673 Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Pro Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser 185 190 195 cct gag cat ggc ttc tgt gaa cag ccc ggt gaa tgc cga tgc cta gag 721 Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gln Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu 200 205 210 215 ggc tgg act gga ccc ctc tgc acg gtc cct gtc tcc acc agc agc tgc 769 Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys 220 225 230 ctc agc ccc agg ggc ccg tcc tct gct acc acc gga tgc ctt gtc cct 817 Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro 235 240 245 ggg cct ggg ccc tgt gac ggg aac ccg tgt gcc aat gga ggc agc tgt 865 Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys 250 255 260 agt gag aca ccc agg tcc ttt gaa tgc acc tgc ccg cgt ggg ttc tac 913 Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr 265 270 275 ggg ctg cgg tgt gag gtg agc ggg gtg aca tgt gca gat gga ccc tgc 961 Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys 280 285 290 295 ttc aac ggc ggc ttg tgt gtc ggg ggt gca gac cct gac tct gcc tac 1009 Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr 300 305 310 atc tgc cac tgc cca ccc ggt ttc caa ggc tcc aac tgt gag aag agg 1057 Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gln Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg 315 320 325 gtg gac cgg tgc agc ctg cag cca tgc cgc aat ggc gga ctc tgc ctg 1105 Val Asp Arg Cys Ser Leu Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu 330 335 340 gac ctg ggc cac gcc ctg cgc tgc cgc tgc cgc gcc ggc ttc gcg ggt 1153 Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly 345 350 355 cct cgc tgc gag cac gac ctg gac gac tgc gcg ggc cgc gcc tgc gct 1201 Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala 360 365 370 375 aac ggc ggc acg tgt gtg gag ggc ggc ggc gcg cac cgc tgc tcc tgc 1249 Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser Cys 380 385 390 gcg ctg ggc ttc ggc ggc cgc gac tgc cgc gag cgc gcg gac ccg tgc 1297 Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys 395 400 405 gcc gcg cgc ccc tgt gct cac ggc ggc cgc tgc tac gcc cac ttc tcc 1345 Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser 410 415 420 ggc ctc gtc tgc gct tgc gct ccc ggc tac atg gga gcg cgg tgt gag 1393 Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu 425 430 435 ttc cca gtg cac ccc gac ggc gca agc gcc ttg ccc gcg gcc ccg ccg 1441 Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro 440 445 450 455 ggc ctc agg ccc ggg gac cct cag cgc tac ctt ttg cct ccg gct ctg 1489 Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gln Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Leu 460 465 470 gga ctg ctc gtg gcc gcg ggc gtg gcc ggc gct gcg ctc ttg ctg gtc 1537 Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu Val 475 480 485 cac gtg cgc cgc cgt ggc cac tcc cag gat gct ggg tct cgc ttg ctg 1585 His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gln Asp Ala Gly Ser Arg Leu Leu 490 495 500 gct ggg acc ccg gag ccg tca gtc cac gca ctc ccg gat gca ctc aac 1633 Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu Asn 505 510 515 aac cta agg acg cag gag ggt tcc ggg gat ggt ccg agc tcg tcc gta 1681 Asn Leu Arg Thr Gln Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser Val 520 525 530 535 gat tgg aat cgc cct gaa gat gta gac cct caa ggg att tat gtc ata 1729 Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gln Gly Ile Tyr Val Ile 540 545 550 tct gct cct tcc atc tac gct cgg gag gcc tgacgcgtct cctccatccg cac 1782 Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala 555 560 ctggagtcag agcgtggatt tttgtatttg ctcggtggtg cccagtctct gccccagagg 1842 ctttggagtt caatcttgaa ggggtgtctg gg 1874

【０１１０】 <210>7 <211>550 <212>DNA <213>Homo sapiens <400>7 tactcctgta cctgcccacc cggcttctac ggcaaaatct gtgaattgag tgccatgacc 60 tgtgcggacg gcccttgctt taacgggggt cggtgctcag acagccccga tggagggtac 120 agctgccgct gccccgtggg ctactccggc ttcaactgtg agaagaaaat tgactactgc 180 agctcttcac cctgttctaa tggtgccaag tgtgtggacc tcggtgatgc ctacctgtgc 240 cgctgccagg ccggcttctc ggggaggcac tgtgacgaca acgtggacga ctgcgcctcc 300 tccccgtgcg ccaacggggg cacctgccgg gatggcgtga acgacttctc ctgcacctgc 360 ccgcctggct acacgggcag gaactgcagt gcccccgtca gcaggtgcga gcacgcaccc 420 tgccacaatg gggccacctg ccacgagagg ggccaccgct atgtgtgcga gtgtgcccga 480 ggctacgggg gtcccaactg ccagttcctg ctccccgagc tgcccccggg cccagcggtg 540 gtggacctca 550

【０１１１】 <210>8 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysのアミノ酸配列、すなわちＦＬＡＧ配列 をコードするDNA。 <400>8 gat tat aaa gat gat gat gat aaa tga 27 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210>9 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ヒトデルター１由来プローブの作製用に設計したセンスプライマー。 <400>9 tactcctgta cctgcccacc 20 <210>10 <211>20 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>ヒトデルター１由来プローブの作製用に設計したアンチセンスプライマー 。 <400>10 tgaggtccac caccgctggg 20 <210>11 <211>27 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>各種ヒトデルター３蛋白質の発現ベクターの作製用に設計したプライマー 。 <400>11 tctagaaagc ttatcgatac cgtcgac 27 <210>12 <211>24 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>分泌型ヒトデルター３蛋白質の発現ベクターの作製用に設計したプライマ ー。 <400>12 tcagcgctga gggtccccgg gcct 24 <210>13 <211>51 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>分泌型ヒトデルター３のＦＬＡＧキメラ蛋白質の発現ベクターの作製用に 設計したプライマー。 <400>13 tcatttatca tcatcatctt tataatcgcg ctgagggtcc ccgggcctga g 51 <210>14 <211>32 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>分泌型ヒトデルター３のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質の発現ベクターの作製 用に設計したプライマー。 <400>14 aaaggatccc gctgagggtc cccgggcctg ag 32 <210>15 <211>51 <212>DNA <213>Artificial Sequence <220> <223>全長型ヒトデルター３のＦＬＡＧキメラ蛋白質の発現ベクターの作製用に 設計したプライマー。 <400>15 tcatttatca tcatcatctt tataatcggc ctcccgagcg tagtaggaag g 51

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 35/14 Ｚ // Ａ６１Ｋ 35/14 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも配列表の配列番号１に記載の
   アミノ酸配列を含有するポリペプチド。
2. 【請求項２】 少なくとも配列表の配列番号２に記載の
   アミノ酸配列を含有するポリペプチド。
3. 【請求項３】 少なくとも配列表の配列番号３に記載の
   アミノ酸配列を含有するポリペプチド。
4. 【請求項４】 少なくとも配列表の配列番号４に記載の
   アミノ酸配列を含有するポリペプチド。
5. 【請求項５】 少なくとも配列表の配列番号５に記載の
   アミノ酸配列を含有するポリペプチド。
6. 【請求項６】 未分化細胞の分化抑制作用を有する請求
   項１乃至５に記載のポリペプチド。
7. 【請求項７】 未分化細胞が血液未分化細胞である請求
   項６に記載のポリペプチド。
8. 【請求項８】 請求項１乃至５に記載のポリペプチドを
   含有する医薬組成物。
9. 【請求項９】 請求項１乃至５に記載のポリペプチドを
   含有する細胞培養培地。
10. 【請求項１０】 細胞が血液未分化細胞である請求項９
    に記載の細胞培養培地。
11. 【請求項１１】 少なくとも配列表の配列番号１に記載
    のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
12. 【請求項１２】 少なくとも配列表の配列番号２に記載
    のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
13. 【請求項１３】 少なくとも配列表の配列番号３に記載
    のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
14. 【請求項１４】 少なくとも配列表の配列番号４に記載
    のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
15. 【請求項１５】 少なくとも配列表の配列番号５に記載
    のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
16. 【請求項１６】 少なくとも配列表の配列番号６に記載
    の５３０番から５８０番の塩基配列を含有する請求項１
    １に記載のＤＮＡ。
17. 【請求項１７】 少なくとも配列表の配列番号６に記載
    の５３０番から６４０番の塩基配列を含有する請求項１
    ２に記載のＤＮＡ。
18. 【請求項１８】 少なくとも配列表の配列番号６に記載
    の７７番から６４０番の塩基配列を含有する請求項１３
    に記載のＤＮＡ。
19. 【請求項１９】 少なくとも配列表の配列番号６に記載
    の７７番から１４６８番の塩基配列を含有する請求項１
    ４に記載のＤＮＡ。
20. 【請求項２０】 少なくとも配列表の配列番号６に記載
    の７７番から１７５９番の塩基配列を含有する請求項１
    ５に記載のＤＮＡ。
21. 【請求項２１】 請求項１１乃至２０に記載のＤＮＡ群
    の中から選ばれるＤＮＡと、宿主細胞中で発現可能なベ
    クターＤＮＡと連結してなる組み換えＤＮＡ体。
22. 【請求項２２】 請求項２１に記載した組み換えＤＮＡ
    体により形質転換された細胞。
23. 【請求項２３】 請求項２２に記載の細胞を培養し培養
    物中より生産された化合物を採取することを特徴とする
    請求項１乃至５に記載のポリペプチドの製造方法。
24. 【請求項２４】 配列表の配列番号５のアミノ酸配列を
    有するポリペプチドを特異的に認識する抗体。