JPH08188596A

JPH08188596A - リセプター型チロシンキナーゼの新規なリガンド

Info

Publication number: JPH08188596A
Application number: JP7003677A
Authority: JP
Inventors: Seiji Sakano; 誠治坂野; Mitsuharu Ono; 満春大野
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1994-10-19
Filing date: 1995-01-13
Publication date: 1996-07-23

Abstract

(57)【要約】【目的】血液未分化細胞の増殖を刺激する化合物を提
供する。【構成】リセプター型チロシンキナーゼに対する新規
なリガンドについて、その物理化学的性質、アミノ酸配
列、ｃＤＮＡ配列、作製方法、生産方法、リガンドに特
異的な抗体、生理作用から構成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はリセプター型チロシンキ
ナーゼの新規なリガンドである新規生理活性物質に関す
るものである。

【０００２】

【従来の技術】ヒトの血液中には多種類の細胞があり、
それぞれが重要な役割を担っている。例えば、赤血球は
体内での酸素運搬を、血小板は止血作用を、白血球は免
疫系を構成して感染を防御している。これらの多様な細
胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞は体内
の種々の造血因子や環境要因により影響を受け、各種血
液細胞、破骨細胞、肥満細胞などに分化することが近年
明らかにされてきた。この造血因子として、赤血球への
分化についてはエリスロポエチン（ＥＰＯ）が、白血球
への分化については顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳ
Ｆ）が、血小板産生細胞である巨核球への分化について
は血小板増殖因子（ｍｐｌ−Ｌ）が発見され、前者の２
つは現在すでに臨床応用がなされている。しかし未だに
血液細胞の分化、増殖、特に造血幹細胞を含む血液未分
化細胞の増殖メカニズムには、不明な点が多い。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】造血幹細胞等の血液未
分化細胞に関しては、これらの分化や増殖のメカニズム
において特に不明点が多いために、これを特異的に増殖
させる因子は、その存在が指摘されているにも関わらず
発見されていない。この最大の原因として血液未分化細
胞の増殖を促す物質が十分に見いだされていないことに
ある。本発明の課題は、血液未分化細胞の増殖を促す新
規な化合物を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決する手段】近年の研究からチロシンキナー
ゼが動物、昆虫の発生や分化に大きく関わっていること
が明らかになっており、血液未分化細胞の分化、増殖に
おいてもチロシンキナーゼが大きく関与していることが
考えられる。タンパク質中に存在するアミノ酸であるチ
ロシンを特異的にりん酸化する酵素であるチロシンキナ
ーゼは細胞外から細胞内、さらに細胞核内への転写調
節、シグナル伝達を司る重要な物質である。また、これ
らのチロシンキナーゼをコードする遺伝子の転座、点変
異により細胞が癌化したりする異常が起こることが知ら
れている。さらに、これらをコードする遺伝子に類似し
た遺伝子を持つウイルスに感染することにより、細胞が
癌化したり、生物個体に癌が生じることが知られてい
る。したがって、チロシンキナーゼを理解し、その遺伝
子構造、タンパク質構造を知ることは癌などに代表され
る細胞の異常増殖状態に起因する病気の診断・治療にと
って極めて重要である。たとえば、ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍ
ｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）などの遺伝
子増幅法を利用したり、ＤＮＡ、ＲＮＡプローブを用い
たり、制限酵素を用いたりして、チロシンキナーゼの遺
伝子の一部もしくは全部を検出することにより、生体中
の点変異や遺伝子組換え、発現量の有無を調べ、血液疾
患などの病気の診断に利用しうる。

【０００５】チロシンキナーゼの生理活性部位は約２５
０個のアミノ酸残基から構成されている。また、チロシ
ンキナーゼ群のアミノ酸配列の中には、きわめてよく保
存された配列があり（Hanks et al. Science 241:42,19
88）、保存されたアミノ酸配列に対応するＤＮＡ配列を
設計し、ＲＴ（ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔ
ｉｏｎ）−ＰＣＲ法のプライマーとして利用すれば、新
たにチロシンキナーゼ遺伝子断片を得ることができる
（Wilks. Methods in Enzymology 200:533, 1991）。リ
セプター型チロシンキナーゼの一種であるｃ−ｋｉｔは
血液未分化細胞の表面に発現しており、肥満細胞増殖因
子でなおかつ血液未分化細胞の増殖因子の１つでステム
セルファクター（ＳＣＦ）のリセプターであることがわ
かっており（Witte. Cell 63: 5,1992）、リセプター型
チロシンキナーゼｃ−ｋｉｔを介して細胞の分化が制御
されている。

【０００６】血液細胞の分化、増殖過程を研究するにあ
たり、有効な手段はその目的に見合った細胞株、もしく
は細胞を利用することにあるが、ヒト巨核芽球白血病細
胞株ＵＴ−７（日本国、熊本大学医学部遺伝発生医学研
究施設分化制御部門、須田年生教授もしくは日本国、自
治医科大学血液科、小松則夫講師より入手可能）は顆粒
球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ），
インターロイキン３（ＩＬ−３）などの造血因子に依存
して増殖する細胞株であり、ＧＭ−ＣＳＦ存在下でＰＭ
Ａ（Ｐｈｏｒｂｏｌ１２−Ｍｙｒｉｓｔａｔｅ１３
−Ａｃｅｔａｔｅ）にて刺激すると巨核球に分化し、ま
た、エリスロポエチン存在下で酪酸にて刺激すると赤芽
球に分化する多分化能を持った細胞である（Komatu et
al. Cancer Res. 51:341,1991 ）。したがって、ＵＴ−
７細胞の利用は血液細胞の分化、増殖、特に血液未分化
細胞の研究にとって有効であると考えられる。

【０００７】本発明者らは、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて、
ヒト巨核芽球白血病細胞株ＵＴ−７から造血幹細胞の分
化、増殖に関与するチロシンキナーゼ遺伝子のクローニ
ングを行った。その結果、ＵＴ−７細胞が未分化な状態
ではｍＲＮＡ発現が強く認められるが、巨核球への分化
に伴い発現が認められなくなる新規なリセプター型チロ
シンキナーゼ遺伝子断片を見い出した。この遺伝子断片
をプローブとして用い、ヒト胎盤及びヒト胎児肝臓のｃ
ＤＮＡライブラリーから、全長をコードするｃＤＮＡを
得、その全塩基配列を決定し、本遺伝子を遺伝子導入し
た形質転換細胞株を作製し、本遺伝子がコードしている
ペプチドの発現細胞およびポリペプチド産生系を作製
し、このポリペプチドを用いてポリクローナル抗体及び
モノクローナル抗体を作製し、本遺伝子の発現を指標
に、有用な生理活性物質が探索できることなどについて
研究を行っていた。本遺伝子に関してはＢｅｎｎｅｔｔ
らの論文（Bennett et al.,J.Biol.Chem.,269,14211-14
218,1994）、及び本発明者らによる特願平５−３０２７
０４号の明細書に記載されている。

【０００８】一般にリセプター型チロシンキナーゼに対
するリガンドは、リセプターの細胞外部分に特異的に結
合して、さらに細胞内部分のチロシンキナーゼ酵素活性
を惹起し、自己りん酸化を引き起こす性質を有する物質
として規定され、リセプター型チロシンキナーゼにおい
ては、ほぼ１つのリセプターに対して１つのリガンドが
対応して生体内に存在する。また、リセプターの発現部
位、発現細胞、及び発現の変化などは、そのリガンドが
作用して、生理活性を発揮する場所並びに細胞を特定で
きるため、生体内の機能を知ることができる。本発明で
使用した上記の新規リセプター型チロシンキナーゼは参
考例７に記載したように、未分化な形質を有する血液由
来細胞株が、刺激剤により分化して増殖能力を失うと共
にそのｍＲＮＡ発現が消失する。従って、このリセプタ
ー型チロシンキナーゼが未だ未知の血液細胞の増殖因子
のリセプターであり、その発現の変化から、特に未分化
な状態での血液細胞の増殖因子のリセプターであること
が推察される。この新規リセプター型チロシンキナーゼ
の細胞外部分に結合して、さらに細胞内部分のチロシン
キナーゼ酵素活性を惹起し、自己りん酸化を引き起こす
物質は本発明のリセプター型チロシンキナーゼの新規な
リガンドと考えられ、本新規リセプター型チロシンキナ
ーゼが血液細胞分化に伴い消失することから血液未分化
細胞の維持、増殖にとって、このリガンドが有効な医薬
品として利用できる。そこで、本発明で使用したリセプ
ター型チロシンキナーゼに１対１に対応するリガンドが
目的の物質と考えその発見に努めた。

【０００９】本発明者らはこのリセプター型チロシンキ
ナーゼのリガンドつまりリセプターに特異的に結合し、
細胞内にシグナルを伝え、細胞を活性化する化合物の探
索を各種ヒト細胞培養上清の中から発見すべく進めた。
そして、鋭意研究の結果、リセプター型チロシンキナー
ゼの新規リガンドである血液未分化細胞の増殖を促す新
規タンパク質の発現細胞の同定に成功し、さらにその発
現細胞から本発明の化合物の精製法を確立し、精製を行
い単離した。そして、アミノ末端（Ｎ末端）のアミノ酸
配列を決定し、このアミノ酸配列を基にＰＣＲ法にてｃ
ＤＮＡプローブを作製し、全長のアミノ酸配列をコード
するｃＤＮＡを単離し、このｃＤＮＡを用いてリガンド
の発現系を作製した。このようにして作製されたこれら
天然型並びにリコンビナント型リガンドの生理活性を確
認した。その結果、これらリガンドが他の既知物質とは
異なった作用を有し、また血液未分化細胞の維持、増殖
にとって、有効な医薬品となる効果を示した。更にこれ
らを免疫原として抗体を作製し、精製法を確立し本発明
が完成した。

【００１０】すなわち、本発明は少なくとも分子量が２
３５００±１５００ダルトンであり、呈色反応において
クマシー染色反応、パス染色反応に陽性であり、配列表
の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドに結合する、理化学的性質を有することを特徴とす
る化合物、さらに、当該化合物であって少なくとも配列
表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの発現細胞に反応させることにより、少なくとも
当該ポリペプチドのチロシン残基をりん酸化させる化合
物、また、当該化合物が、そのアミノ末端のアミノ酸配
列として少なくとも配列表の配列番号４に記載のアミノ
酸配列を包含する化合物、また、当該化合物が、糖鎖を
有する化合物、また、当該化合物が少なくとも配列表の
配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド
の一部もしくは全部を含有してなる化合物に関する。さ
らに、少なくとも配列表の配列番号５に記載のアミノ酸
配列を有するポリペプチドの一部もしくは全部を含有し
てなる化合物、また、少なくとも配列表の配列番号６に
記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部もしく
は全部を含有してなる化合物、さらに、少なくとも配列
表の配列番号５に記載のアミノ酸配列の一部もしくは全
部を含有するポリペプチドが２量体、もしくはそれ以上
の多量体の構造を有してなる複合体、また、少なくとも
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列の一部もしく
は全部を含有するポリペプチドが２量体、もしくはそれ
以上の多量体の構造を有してなる複合体に関し、配列表
の配列番号５に記載のアミノ酸配列の一部もしくは全部
をコードするＤＮＡ、また、配列表の配列番号６に記載
のアミノ酸配列の一部もしくは全部をコードするＤＮＡ
に関する。また、さらに、配列表の配列番号５もしくは
６に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて作
成された当該アミノ酸配列を含有するポリペプチドを含
有してなる化合物の生産方法、さらに、これらに示した
化合物群から選ばれる化合物もしくは配列表の配列番号
５もしくは６に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドの一部もしくは全部を特異的に認識する抗体に関す
る。

【００１１】以下、本発明を詳細に説明する。遺伝子操
作に必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発
現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニン
グ、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃ
ＤＮＡライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実
験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができ
る。前記の通常の実験書としては、たとえば、Maniatis
らの編集した Molecular Cloning, A laboratory manua
l, 1989, Eds., Sambrook,J., Fritsch, E.F., and Man
iatis, T., Cold SpringHarbor Laboratory Pressを挙
げることができる。

【００１２】本発明のリセプター型チロシンキナーゼの
新規なリガンドは配列表の配列番号５、６及び７のアミ
ノ酸配列からなる群より選ばれるアミノ酸配列の一部も
しくは全部を含有するが、自然界で生じることが知られ
ている生物種内変異、アレル変異等の突然変異及び人為
的に作製可能な点変異による変異によって生じる、リセ
プター型チロシンキナーゼの新規なリガンド活性を有す
る相同変異体も、本発明のリセプター型チロシンキナー
ゼの新規なリガンドに含まれる。なお、この”リセプタ
ー型チロシンキナーゼの新規なリガンド活性”とは、少
なくとも配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有
するポリペプチドに結合する活性、もしくは配列表の配
列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド
の発現細胞に反応させることにより、少なくとも当該ポ
リペプチドのチロシン残基をりん酸化させる活性のいず
れかを含むものとする。

【００１３】また、アミノ酸レベルの変異がなくとも、
自然界から分離した、染色体ＤＮＡ、またはｃＤＮＡに
おいて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコード
するアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配
列が変異した例はしばしば認められる。また、５’非翻
訳領域及び３’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配
列の規定には関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配
列は変位しやすい。このような遺伝コードの縮重によっ
て得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。

【００１４】本発明に使用した新規リセプター型チロシ
ンキナーゼのｃＤＮＡを得る行程は、後述する参考例１
〜６に記載した通りである。すなわち、チロシンキナー
ゼ遺伝子に特徴的なアミノ酸配列に対応したＰＣＲプラ
イマーの作製並びにＰＣＲはＷｉｌｋｓの方法（Proc.N
atl.Acad.Sci.USA 86:1603, 1989）で行うことができ
る。すなわち、市販のＤＮＡ合成機でオリゴヌクレオチ
ドを合成し、精製後、それをプライマーとしてＰＣＲに
より特定部位を増幅する。これにより、チロシンキナー
ゼの一部分、約２００ｂｐを増幅することができる。こ
のＰＣＲ産物であるＤＮＡ断片をアガロース電気泳動な
どで分離し、精製し回収する。この回収したＤＮＡ断片
を各種ベクターにクローニングし、遺伝子配列を決定
し、各種チロシンキナーゼの配列との比較からチロシン
キナーゼ遺伝子の断片がクローニングされていることを
確認する。この方法に従いクローニングし、遺伝子配列
を決定した遺伝子断片は配列表の配列番号３のＤＮＡ配
列の２６４２番から２８１２番に相当する。この配列は
チロシンキナーゼの活性部分の中央に位置しており、細
胞内シグナル伝達に重要な役割を果たすアミノ酸配列を
コードする。

【００１５】全長のクローニングには、前記の方法にて
部分クローニングした遺伝子をアイソトープ標識、及び
各種非アイソトープ標識し、ｃＤＮＡライブラリーをハ
イブリダイゼーションなどの方法にてスクリーニングす
ることによって得ることができる。アイソトープの標識
法としては、たとえば［32Ｐ］γ−ＡＴＰとＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼを用いて末端をラベルする方法や、
他のニックトランスレーション法またはプライマー伸長
法などによる標識法が利用できる。

【００１６】本発明に使用した新規リセプター型チロシ
ンキナーゼのｃＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号３に
ＤＮＡの二本鎖のセンス配列及びそれに対応するアミノ
酸配列と共に示した。塩基配列は最初（５’側）の４０
９塩基の５’非翻訳領域、それに続く２９６１塩基の新
規リセプター型チロシンキナーゼをコードする領域、及
びさらにそれに続く９１９塩基の３’非翻訳領域からな
る。また、新規リセプター型チロシンキナーゼのアミノ
酸配列は、配列表の配列番号３のアミノ酸配列の−１５
番から−１番にあたる１５アミノ酸から構成されるシグ
ナルペプチド、配列表の配列番号３のアミノ酸配列の１
番から５２２番にあたる５２２アミノ酸で構成される細
胞外部分、配列表の配列番号３のアミノ酸配列の５２３
番から５４８番にあたる２６アミノ酸から構成される細
胞膜貫通部分、配列表の配列番号３のアミノ酸配列の５
４９番から９７２番にあたる４２４アミノ酸から構成さ
れる細胞内部分、より構成される。さらに、細胞内部分
においては配列表の配列番号３のアミノ酸配列の６００
番から８５９番にあたる２６０アミノ酸はチロシンキナ
ーゼ酵素活性部分である。尚、本新規リセプター型チロ
シンキナーゼｃＤＮＡの全塩基配列を含むベクターｐＢ
ＳＲＴＫＦＵＬＬを大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に
遺伝子導入した形質転換細胞は、日本国通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所において寄託番号ＦＥＲＭ
ＢＰ−４８８３として１９９４年１１月１１日に寄託さ
れている。

【００１７】本発明で使用した新規リセプター型チロシ
ンキナーゼは、すでにクローニングされているリセプタ
ー型チロシンキナーゼであるヒトＥＰＨ（Hirai et a
l., Science, 238, 1717-1720,1987）、ヒトＥＣＫ（Li
ndberg and Hunter, Mol. Cell. Biol., 10, 6316-632
4, 1990）、ラットＥＬＫ（Lhotak et al., Mol. Cell.
Biol., 11, 2496-2502, 1991）、ヒトＨＥＫ（Wicks et
al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 89, 1611-1615, 199
2）、マウスＳＥＫ（Gilardi-Hebenstreit et al., Onc
ogene, 7, 2499-2506, 1992）、チキンＣｅｋ−５（Pas
quale, Cell Regulation, 2, 523-534, 1991 ）と類似
した構造を持つが、そのアミノ酸配列のホモロジーは最
も高い場合のＥＬＫで５６．３％であり、これらの物質
とは遺伝子が異にする新規なアミノ酸配列を有する新規
な物質であり、前掲の論文並びに本願の発明者により初
めて明らかにされた物質である。

【００１８】配列表の配列番号１で表されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドは新規リセプター型チロシンキ
ナーゼの細胞外部分のシグナルペプチドを除いた部分の
アミノ酸配列を有するポリペプチドに相当する。また、
配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドは新規リセプター型チロシンキナーゼのシグ
ナルペプチドを除くアミノ酸配列を有するポリペプチド
に相当する。本発明に使用した新規リセプター型チロシ
ンキナーゼの遺伝子の入手法としては、参考例に記載の
方法以外にも、市販のヒト胎盤もしくは胎児肝臓ｃＤＮ
ＡもしくはｃＤＮＡライブラリーを直接テンプレートと
して使用し、配列表の配列番号３に記載のＤＮＡ配列の
２０ｍｅｒ程度のセンスプライマー及びアンチセンスプ
ライマーを作製し、ＰＣＲを行って作製したり、またこ
のＰＣＲ産物をプローブにしてライブラリーを参考例に
記載の方法でスクリーニングをして得ることができる。

【００１９】さらに、本発明で使用した新規リセプター
型チロシンキナーゼのｃＤＮＡは、ＵＴ−７以外にも、
血液細胞株であるヒト慢性骨髄性白血病細胞株Ｋ５６２
（日本国理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎ
ｏ．ＲＣＢ００２７）及びヒト急性巨核芽球性白血病細
胞株ＣＭＫ（Blood 74:42,1989）などから、又非血液細
胞株では肝細胞ガン細胞株Ｈｅｐ３Ｂ（アメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクション（以下ＡＴＣＣと示
す）より入手可能、ＨＢ８０６４）及びヒト胎児肺繊維
芽細胞株ＭＲＣ−５（理化学研究所、細胞開発銀行より
入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０２１１）などから、後述する
参考例１〜６と実質的に同様の操作で得ることができ
る。またさらに、新規リセプター型チロシンキナーゼ遺
伝子の合成ＤＮＡ法で人為的にオリゴヌクレオチドを作
製し、それらを連結して合成ＤＮＡを調整する方法によ
れば、遺伝子コードの縮重により、アミノ酸配列を変え
ることなく遺伝子配列を変化させることによって目的の
組換えＤＮＡを調整することができる。

【００２０】本発明で使用した新規リセプター型チロシ
ンキナーゼの性質は参考例７に記載した通りである。す
なわち、本発明で使用したリセプター型チロシンキナー
ゼの遺伝子のｍＲＮＡは、未分化な形質を有する血液由
来細胞株が、刺激剤により分化して増殖能力を失うと共
に発現が消失する。従って、このリセプター型チロシン
キナーゼが未だ未知の血液細胞の増殖因子のリセプター
であり、その発現の変化から、特に未分化な状態での血
液細胞の増殖因子のリセプターであることが推察され
る。

【００２１】また、本発明で使用した新規リセプター型
チロシンキナーゼの遺伝子の発現方法並びにリガンド同
定に必要なポリペプチドの産生方法、精製方法は参考例
８から１０に記載した通りである。すなわち、参考例に
示した方法並びに成書の方法により、配列表の配列番号
１及び配列番号２のアミノ酸配列をもつポリペプチドを
コードするＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、微
生物または細胞（たとえば昆虫細胞または動物細胞）な
どを宿主とする形質転換体を得て、その形質転換体に新
規リセプター型チロシンキナーゼのポリペプチドを産生
させることができる。さらに、新規リセプター型チロシ
ンキナーゼをより安定な条件で発現させる場合には有核
細胞、特に動物培養細胞を宿主として発現させるのが好
ましい。また、細胞外部分のポリペプチドの精製はアフ
ィニティークロマトグラフィーにより精製でき、これを
免疫原に用いることで抗体を作製することができる。

【００２２】このリガンドを取得するために、はじめに
リガンド産生細胞を選択することが必要であり、本発明
におけるリガンド発現細胞の同定は実施例１から４に記
載した通りである。すなわち、その方法として、ＢＩＡ
ｃｏｒｅ（ファルマシア社製）を用いる方法が挙げられ
る。本機は表面プラズモン共鳴の原理に基づきタンパク
質の結合を検出することができる。すなわち、各種ヒト
細胞株の培養上清、細胞膜上の分子と配列表の配列番号
１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドとの結
合を調べ、結合する物質を産生する細胞株を選ぶことが
できる。

【００２３】また、別の方法として、各種細胞株の上清
もしくは細胞そのものと配列表の配列番号２に記載のポ
リペプチド発現細胞株を共に培養し、新規リセプター型
チロシンキナーゼのチロシン残基のりん酸化を調べるこ
とにより、リガンドを発現している細胞株を決定でき
る。また更に、別の方法として配列表の配列番号１に記
載のポリペプチドもしくはこのポリペプチドに抗体認識
部位、例えば実施例に記載したヒトＩｇＧのＦｃ部分、
ＦＬＡＧ（ＩＢＩＦＬＡＧＥｐｉｔｏｐｅ．１、
１、１９９２年Ｋｏｄａｋ社参照）等のアミノ酸配列
がつながるようなアミノ酸配列をコードする遺伝子を作
製して、フローサイトメーターで細胞を染色して細胞表
面上にあるリガンドを発現している細胞を同定できる。
本発明に於いて、以上の方法を用いて本発明のリガンド
発現細胞として、少なくともヒト結腸ガン由来細胞株Ｃ
−１（株式会社免疫生物研究所より購入可能、参考文献
として佐藤ら．医学のあゆみ、９６：８７６、１９７６
年）が同定された。

【００２４】以上のような、結合もしくはりん酸化を指
標にしてその発現細胞を同定できれば次にその精製が必
要である。本発明におけるリガンドの精製及び呈色反
応、Ｎ末端アミノ酸配列、分子量測定による同定は実施
例５から９に記載した通りである。すなわち、このよう
に決定された細胞株の培養上清、細胞膜画分、細胞を特
定の酵素処理して作製された溶液などを配列表の配列番
号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを用
いて作製されたアフィニティーゲル等の担体を用いて精
製し、更に配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含有す
るポリぺプチドをに対する結合、もしくは配列表の配列
番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの
発現細胞に反応させることによりその配列表の配列番号
２に記載のポリペプチドのチロシン残基をりん酸化させ
る活性を指標にしてゲル濾過、イオン交換等の分離操作
に行うことにより純品を精製する事ができる。

【００２５】このようにして、精製されたリセプター型
チロシンキナーゼの新規なリガンドは、すなわち少なく
ともポリアクリルアミド電気泳動において分子量が２３
５００±１５００ダルトンであり、呈色反応においてク
マシー染色反応、パス染色反応に陽性であり、配列表の
配列番号１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含有する
ポリペプチドに結合する理化学的性質を対比すれば公知
物とは異なる新規な化合物であることは明らかである。
さらに、この新規化合物に関し、当該化合物について少
なくとも配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含
有するポリペプチドの発現細胞に反応させることによ
り、少なくとも当該ポリペプチドのチロシン残基をりん
酸化させる化合物、当該化合物が、そのアミノ末端のア
ミノ酸配列として少なくとも配列表の配列番号４に記載
のアミノ酸配列を包含する化合物、当該化合物が、糖鎖
を有する化合物、当該化合物が少なくとも配列表の配列
番号５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの一
部もしくは全部を含有してなる化合物に関していること
を見いだした。またさらに、少なくとも配列表の配列番
号５に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部
もしくは全部を含有してなる化合物、また、少なくとも
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドの一部もしくは全部を含有してなる化合物、少
なくとも配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列の一
部もしくは全部を含有するポリペプチドが２量体、もし
くはそれ以上の多量体の構造を有してなる複合体、配列
表の配列番号６に記載のアミノ酸配列の一部もしくは全
部を含有するポリペプチドが２量体、もしくはそれ以上
の多量体の構造を有してなる複合体、配列表の配列番号
５に記載のアミノ酸配列の一部もしくは全部をコードす
るＤＮＡ、配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列の
一部もしくは全部をコードするＤＮＡ、配列表の配列番
号５もしくは６に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮ
Ａを用いて作成された当該アミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドを含有してなる化合物の生産方法、これらに示
した化合物群から選ばれる化合物もしくは配列表の配列
番号５もしくは６に記載のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドの一部もしくは全部を特異的に認識する抗体を見
いだした。

【００２６】新規なリセプター型チロシンキナーゼの細
胞外部分である配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列を含有するポリペプチド、もしくは該ポリペプチド配
列を含むポリペプチドを動物細胞において発現させた糖
タンパク質に結合し、本発明であるリガンドの細胞外部
分もしくは少なくとも配列表の配列番号５に記載のアミ
ノ酸配列は、該リセプター型チロシンキナーゼを調節し
得るものである。さらにその結合部位は、少なくとも配
列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列の全体、もしく
はその一部から成るアミノ酸配列を有するポリペプチド
を含むと考えられる。なお、ここでいう「一部」とは、
アミノ酸配列のうち、アミノ酸１２残基以上をいう。

【００２７】さらに、本発明であるリガンドの生理活性
中心は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含
有するポリペプチドの発現細胞に反応させることより当
該ポリペプチドのチロシン残基をりん酸化させる配列表
の配列番号５に記載のアミノ酸配列の一部として同定す
ることが可能である。配列表の配列番号４に記載したア
ミノ酸配列は分離精製された該リガンドのプロテインシ
ークエンサー（アプライドバイオシステム社）にて決定
されたアミノ基末端（Ｎ末端）の配列のＮ末端から８番
目までのアミノ酸配列を示す。また、配列表の配列番号
１９にＮ末端から同定できた全アミノ酸配列を示す。こ
の配列表の配列番号４のアミノ酸配列をタンパク質デー
タベースであるＮＢＲＦ−ＰＤＢ（ナショナル・バイオ
メディカル・リサーチ・ファウンデーション、リリース
４０．０、１９９４年３月）及びＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ
（ユーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・ラボラ
トリー、リリース２９．０、１９９４年６月）において
検索を行ったところ、同一の配列を有する公知のタンパ
ク質は見いだされず、新規な配列であった。

【００２８】したがって、本発明のリガンド、すなわち
少なくともポリアクリルアミド電気泳動において分子量
が２３５００±１５００ダルトンであり、呈色反応にお
いてクマシー染色反応、パス染色反応に陽性であり、配
列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を少なくとも含
有するポリペプチドに結合することを対比し、さらにＮ
基末端のアミノ酸配列が配列表の配列番号４に記載の配
列であるポリペプチドを含有する化合物は、明らかに公
知物とは異なる新規物質と判断される。

【００２９】実施例５から７に示したように本発明のリ
ガンドはリガンドの発現細胞の細胞培養上清中より精製
ができ得るが、リガンド発現細胞の細胞膜上にも同様の
配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含有するポリペプ
チドが結合すること、さらに配列表の配列番号３に記載
のアミノ酸配列を含有するポリペプチドの発現細胞を反
応させることにより、その配列表の配列番号３に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドのチロシン残基を
りん酸化させること、また、下記に示した該リガンドの
ｃＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列の解析結果か
ら膜貫通部分が存在することなどから、細胞膜上にも該
リガンドが存在することは明らかであるため、別の方法
として細胞膜表面からも精製できる。その膜上に存在す
る分子は、分子量が細胞外部分のみの分子よりも大きく
なる。該リガンドの細胞膜表面における存在形態は遺伝
子配列から推察されるアミノ酸配列の構造から疎水性の
アミノ酸配列からなる膜貫通部分を有するペプチドアン
カー型物質と考えられる。

【００３０】大量にかつ安価にこのリガンドを得るため
には、実施例１０及び１１に示した方法を参考として、
該リガンドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を取得
し、動物細胞などの有核細胞、又は大腸菌等の原核細胞
に遺伝子導入し、このリガンドを生産させ、そこから単
離してくることができる。例えば、実施例９に示したよ
うに、単離精製したリガンドのポリペプチド部分のＮ末
端からのアミノ酸配列を決定し、さらに必要があればト
リプシンなどのプロテアーゼ処理、また化学物質処理に
より断片化して、アミノ酸配列を決定したり、カルボキ
シル基末端（Ｃ末端）のアミノ酸配列を決定することが
可能である。このようにして決定されたアミノ酸配列、
例えば、配列表の配列番号１９に記載のアミノ酸配列お
よび、実施例１０に記載した方法を参考として、オリゴ
ＤＮＡプローブもしくはＰＣＲプライマーを設計して、
リガンドを発現している細胞株のｃＤＮＡもしくはｃＤ
ＮＡライブラリー、またゲノムＤＮＡもしくはゲノムラ
イブラリーからハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ
法、また両者を組み合わせた方法などでスクリーニング
することにより、リガンドの全長のアミノ酸配列をコー
ドする遺伝子を取得することができる。

【００３１】また、別の方法としてリガンド発現細胞の
ｃＤＮＡライブラリーを発現ベクターに組み込み、ＣＯ
Ｓ細胞などで発現させ、目的の遺伝子をスクリーニング
する発現クローニングなどの手法でリガンドのｃＤＮＡ
を分離することができる。発現クローニングには、配列
表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドの結合を利用したセルソーターによる分画法、ラ
ジオアイソトープを用いたフィルムエマルジョンによる
検出法、等の方法、もしくはｃＤＮＡライブラリー導入
細胞株自身もしくはその細胞培養上清と配列表の配列番
号２のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現する
細胞株との共培養により、該ポリペプチドのチロシン残
基がりん酸化されることを指標にした方法が挙げられ
る。

【００３２】このようにして得られた該リガンドをコー
ドするｃＤＮＡ塩基配列を配列表の配列番号７にＤＮＡ
の二本鎖のセンス配列及びそれに対応するアミノ酸配列
と共に示した。塩基配列は該リガンドをコードする領域
とその前後の数十ＤＮＡ配列についてのみ示した。該ｃ
ＤＮＡ配列から予想されるアミノ酸配列をＫｙｔｅ−Ｄ
ｏｏｌｉｔｌｅの方法（J.Mol.Biol. 157:105,1982）に
従って、アミノ酸配列から疎水性部分、親水性部分を解
析した。その結果、本発明のリガンドは細胞膜タンパク
として、細胞上に発現されることが明らかとなった。

【００３３】つまり、この解析結果によれば、該リガン
ドのアミノ酸配列は、配列表の配列番号７のアミノ酸配
列の−２５番から−１番にあたる２５アミノ酸から構成
されるシグナルペプチド、配列表の配列番号７のアミノ
酸配列の１番から１９５番にあたる１９５アミノ酸で構
成される細胞外部分、配列表の配列番号７のアミノ酸配
列の１９６番から２２５番にあたる３０アミノ酸から構
成される細胞膜貫通部分、配列表の配列番号７のアミノ
酸配列の２２６番から３０８番にあたる８３アミノ酸か
ら構成される細胞内部分、より構成される。ただし、シ
グナルペプチド部分以外の各部分は、あくまでもアミノ
酸配列から予測されたドメイン構成であり、実際に細胞
上および溶液中での存在形態は、上記の構成と若干異な
ることも十分考えられ、上記に一応規定された各ドメイ
ンの構成アミノ酸が、１から１０アミノ酸配列前後する
ことも考えられる。

【００３４】また、配列表の配列番号５に記載したアミ
ノ酸配列は配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１番か
ら１９５番に当たる部分のアミノ酸配列、すなわちシグ
ナルペプチドを除く上記の細胞外部分のアミノ酸配列を
示し、また、配列表の配列番号６のアミノ酸配列は配列
表の配列番号７のアミノ酸配列の１番から３０８番のア
ミノ酸配列、すなわちシグナルペプチドを除く全体のア
ミノ酸配列を示す。

【００３５】Ｎ末端のアミノ酸配列、すなわち配列表の
配列番号１９に示すアミノ酸配列と、配列表の配列番号
７のアミノ酸配列の１番からの配列は、配列表の配列番
号１９のアミノ酸が決定できなかった３箇所のXXX 部分
を除き、アミノ酸配列は完全に一致した。アミノ酸配列
から予想されることとして、糖鎖が付加される部分はＮ
−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グリコシド結合可
能な部分として、配列表の配列番号７のアミノ酸配列の
１１番及び１１４番のアスパラギン残基が挙げられる。
しかし、該１１番のアスパラギンは実施例９で行ったア
ミノ酸シークエンスの際には、測定に何等影響を与えな
かったため、少なくとも本発明で使用した該Ｃ−１細胞
が産生している該リガンドにおいては糖鎖が付加されて
いない形態であると考えられる。また、Ｎ−アセチル−
Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部
分として、セリンまたはスレオニン残基の頻出する配列
表の配列番号７のアミノ酸配列の１４４番のセリン以降
の細胞外部分が挙げられる。特に、その可能性の高い部
分として、配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１５５
番のスレオニン、及び１６８番のセリンから１７２番の
セリンまでのセリン残基もしくはスレオニン残基、及び
１８１番のセリンから１８３番のスレオニンまでのセリ
ン残基もしくはスレオニン残基が挙げられる。これらの
糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのもの
よりも一般に生体内での分解に対して安定性であり、ま
た強い生理活性を有していると考えられる。

【００３６】また、実際に実施例７に示された精製され
た該リガンドは細胞外部分がメタロプロテアーゼ等のタ
ンパク質分解酵素により、細胞膜上のアミノ酸配列を切
断することで、細胞上清中に遊離した分子と考えられ
る。例えば、その切断部位は細胞外部分と細胞膜貫通部
分の配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１９５番のイ
ソロイシンと１９６番のロイシンの間であり、その他の
部分において同様にタンパク質分解酵素等により消化さ
れて切断された可能性もある。

【００３７】本発明で明らかにされた該リガンドの遺伝
子配列並びにアミノ酸配列をジェンバンク（Ｇｅｎｂａ
ｎｋ、１９９４年１０月、リリース８５）において検索
したところ、最も類似性のあるの物質として、ＬＥＲＫ
−２（論文として Beckmannet al.,EMBO J. 13:3757,19
94.、Fletcher et al.,Oncogene 9:3241,1994. また特
許としてＷＯ９４／１１３８４を参照）が挙げられた
が、アミノ酸配列では全体でホモロジーが５４％であ
り、本発明のリガンドとＬＥＲＫ−２とは全く異なった
物質である。また、このＬＥＲＫ−２は上記に示した本
発明で使用した新規リセプター型チロシンキナーゼに最
もホモロジーのあった前述のリセプター型チロシンキナ
ーゼＥＬＫの結合タンパクもしくはリガンドとして同定
された物質である。本発明のリガンドの全長をコードし
ているｃＤＮＡ配列から推定されたアミノ酸配列と上記
のＬＥＲＫ−２のアミノ酸配列を詳細に比較したとこ
ろ、ジスルフィド結合をしていると予想されるシステイ
ン残基４つ、すなわち配列表の配列番号７のアミノ酸配
列の３７番、６４番、７６番及び１２８番のシステイン
残基は両者に共通している。また、Ｎ−アセチル−Ｄ−
グルコサミンがＮ−グリコシド結合可能な部分、すなわ
ち配列表の配列番号７のアミノ酸配列の１１４番のアス
パラギン残基も共通していることが挙げられる。さら
に、細胞内部分に当たる配列表の配列番号７のアミノ酸
配列の２７６番から３０８番の部分の３３アミノ酸にわ
たって完全にそのアミノ酸配列が保存されている。

【００３８】そのため、本発明のリガンドと上記のＬＥ
ＲＫ−２を対比するため、ＬＥＲＫ−２の遺伝子をＰＣ
Ｒ法にてヒト胎盤のｃＤＮＡより取得し、本発明同様に
発現させて、その本発明に使用した該リセプター型チロ
シンキナーゼに対する機能の解析を行った。その結果、
該リセプターに対して、弱いながら結合したが、その結
合は本発明のリガンドより十分に弱く、また、該リセプ
ターのりん酸化を引き起こす作用を有さなかった。した
がって、ＬＥＲＫ−２は本発明のリガンドと構造上の類
似性はあるが、生理的な作用としては同等の効果を有さ
ない物質である。

【００３９】上記の方法にて分離した該リガンドのアミ
ノ酸配列をコードするｃＤＮＡを用いた色々な形態を有
したリガンドの発現方法、精製方法は実施例１３から１
４に記載した通りである。すなわち、上記の方法にて分
離した該リガンドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
を適当な発現ベクターにつなぎ、動物細胞、昆虫細胞な
どの有核細胞、バクテリアなどの原核細胞を宿主として
リガンドを生産させることができ、この生産したリガン
ドは上記の方法で精製することができる。より安定した
生産条件としては動物細胞が望ましい。したがって、配
列表の配列番号５もしくは６に記載のアミノ酸配列の１
部もしくは全部をコードするＤＮＡを使用して形質転換
を行った細胞、さらに、配列表の配列番号５もしくは６
に記載のアミノ酸配列の１部もしくは全部をコードする
ＤＮＡを使用して、配列表の配列番号５もしくは６記載
のアミノ酸配列の１部もしくは全部を含有してなる化合
物の製造方法に関しても本発明に含まれる。

【００４０】さらに、本発明におけるリガンドには、上
記したリセプター型チロシンキナーゼの新規なリガンド
活性を有し、なおかつ配列表の配列番号５及び６からな
る群より選ばれるアミノ酸配列の一部もしくは全部を含
有するポリペプチドを含むことを特徴とした化合物が含
まれる。また、リセプター型チロシンキナーゼの新規な
リガンド活性を有する相同変異体をコードするＤＮＡ
も、本発明のＤＮＡに含まれる。実施例１３に記載した
ように、本発明のリガンドの発現させる形態としては、
配列表の配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドをコードするｃＤＮＡを用いる方法でもよい
が、この状態では膜結合型であり、精製、製剤化などを
より効率的に行うべく、実施例１７および１８に記載し
たように、少なくとも生理活性を有する部分としては配
列表の配列番号５に記載したアミノ酸配列、すなわち該
リガンドの細胞外部分のみ可能である。したがって、細
胞外部分を含有する形態を配列表の配列番号５に記載の
アミノ酸配列をコードするＤＮＡを用い、分泌型で発
現、生産させる方が望ましい。

【００４１】また、さらにその形態としては単独の化合
物でもかまわないが、複合体の形態を有するリガンドで
も可能である。本発明で使用する”複合体”は２種類以
上の物質を単に混ぜ合わせた混合物ではなく、１種類も
しくは２種類以上の化合物が共有結合を含む何らかの結
合様式を有してなる化合物、コンジュゲート、またはコ
ンプレックスの総称を意味する。その例としては、実施
例１４で作製されたイムノグロブリンとのキメラタンパ
クのジスルフィド結合による共有結合を介した複合体、
実施例１４および実施例１６作製されたＦＬＡＧ配列を
有するリガンドと抗ＦＬＡＧ抗体による抗原抗体反応を
介した複合体などの形態が挙げられる。

【００４２】また、さらに強い生理活性、すなわち該新
規リセプター型チロシンキナーゼ発現細胞において、よ
り低濃度で該リセプター型チロシンキナーゼの自己りん
酸化を引き起こし、なおかつより比活性の高いコロニー
刺激活性を有する形態として、多量体を形成し得る形態
で発現させることが望ましい。実施例に記載したヒトＩ
ｇＧのＦｃ部分とのキメラタンパク質として発現させて
抗体のヒンジ部分によりジスルフィド結合をした多量体
として発現させる方法、また、抗体認識部位をＣ末端も
しくはＮ末端に発現するキメラタンパクとして発現さ
せ、発現させた該リガンドの細胞外部分を含むポリペプ
チドをＣ末端もしくはＮ末端の抗体認識部位を特異的に
認識する抗体と反応させることにより多量体を形成させ
る方法が挙げられる。さらに、別の方法として、抗体の
ヒンジ領域部分のみとの融合タンパクを発現させて、ジ
スルフィド結合にて２量体を形成させる方法、もしくは
その他の該リガンドの活性に何等影響を与えない方法で
ジスルフィド結合を生じさせる形のペプチドをＣ末端、
Ｎ末端もしくはその他の部位に発現するように作成され
た融合タンパクから構成された２量体以上の高い比活性
を有する多量体型該リガンドを得ることもできる。ま
た、さらに配列表の配列番号５のアミノ酸配列をコード
するＤＮＡをアミノ酸に翻訳するさいにフレームの合う
形で２つ以上直列に並べ多量体構造を発現させる方法な
どもある。その他、現在知られている２量体以上の多量
体構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。した
がって、遺伝子工学的な技術により２量体もしくはそれ
以上の形態を有す形の該リガンド、もしくは配列表の配
列番号５もしくは６に記載のアミノ酸配列の１部もしく
は全部を含有してなる化合物に関しても本発明に含まれ
る。

【００４３】また、その他の方法として、化学的な架橋
剤を用いて発現、精製された該リガンドの細胞外部分の
ポリペプチドを架橋する方法が挙げられる。例えば、リ
シン残基を架橋するジメチルスベロイミデート２塩酸塩
など、システイン残基のチオール基で架橋するＮ−（γ
−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドなど、ア
ミノ基とアミノ基を架橋するグルタールアルデヒドなど
が上げられ、これら及びその他のあらゆるタンパク質、
糖質の架橋反応を用いて、２量体以上の多量体を形成さ
せることができる。したがって、化学的な架橋剤により
２量体もしくはそれ以上の多量体の形態を有す形の該リ
ガンド、もしくは配列表の配列番号５もしくは６に記載
のアミノ酸配列の１部もしくは全部を含有してなる化合
物に関しても本発明に含まれる。なお、本発明で示した
リガンドの２量体及び多量体とは、本発明のリガンド、
すなわち少なくともリセプター型チロシンキナーゼの新
規なリガンド活性を有し、さらに配列表の配列番号５及
び６からなる群より選ばれるアミノ酸配列の一部もしく
は全部のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む化
合物からなる群より選ばれる２つもしくはそれ以上の化
合物から構成される物質を意味する。

【００４４】実施例１３および実施例１６に示した様
に、配列表の配列番号６のアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡを有する発現ベクターを用いて、細胞膜上の分子と
して細胞に発現させると、同様に生理活性を有する形態
を取る。したがって、配列表の配列番号６のアミノ酸配
列、もしくは配列表の配列番号５のアミノ酸配列のＣ末
端に疎水性にアミノ酸を有するようなアミノ酸配列を有
するポリペプチドが、Ｎ末端が外にでる形で、脂質、り
ん脂質などの生体膜などを模倣した、ミセルもしくはリ
ポソームの形態を有する物質上に存在し、膜上を自由に
動き廻れるような形態を取った形にすれば同様に強い生
理活性を有する。従って、このような形態を取った該リ
ガンド、すなわち膜の形態を有する物質上に存在する、
少なくともリセプター型チロシンキナーゼの新規なリガ
ンド活性を有し、さらに配列表の配列番号５及び６から
なる群より選ばれるアミノ酸配列の一部もしくは全部の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む化合物につ
いても医薬品などとして使用する際に有効な方法であ
る。

【００４５】体外において血液系細胞を増殖、活性化
し、体内に細胞を戻す医療方法への適応には、上記のよ
うな形態を有した該リガンドを直接培地中に加えること
も可能だが、固定化する事が望ましい。固定化の方法と
しては該リガンドのアミノ基、カルボキシル基を利用し
たり、適当なスペーサーを用いたり、上記の架橋剤を用
いたりして、培養容器にリガンドを共有結合させること
ができる。したがって、固体表面に存在する形態を有
し、さらに少なくともリセプター型チロシンキナーゼの
新規なリガンド活性を有し、さらに配列表の配列番号５
及び６からなる群より選ばれるアミノ酸配列の一部もし
くは全部のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含む
化合物に関しても本発明に含まれる。

【００４６】上記の方法で生産された該リガンドは次の
ステップである精製において、上記に示した本発明で使
用した新規リセプター型チロシンキナーゼの細胞外部分
のポリペプチドを利用した方法以外に、実施例１５に示
したように、該リガンドを適当な動物に免疫を行い、作
製されたポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を用
いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製する
こともできる。

【００４７】本発明のリガンドはヒトさい帯血単核球の
コロニー形成を促すことから、血液未分化細胞の増殖を
促す作用を有す。したがって、医薬品として用いるなら
ば、上記に示した形態を有する本発明のリガンドの凍結
乾燥品を、用時注射用蒸留水にて溶解もしくは懸濁して
使用し得る形状が望ましい。例えば０．１から１０００
μｇ／ｍｌの濃度に調製した注射剤、点滴剤として提供
することが簡便である。また、安定性保つために、ヒト
アルブミンなどの安定化剤と混合させることもできる。
さらに、血液系細胞を体外にて増殖、活性化させる場合
には医薬品同様に、凍結乾燥品、もしくは溶液剤を作製
して、培地に加える、もしくは培養に使用する容器に固
定化することができる。また、毒性については、マウス
に対して１μｇ／Ｋｇを腹腔内投与したがマウスの死亡
例は確認されなかった。

【００４８】また、本発明のインビトロの生理活性は、
あらゆる疾患モデルマウス、またはそれらに準ずる疾患
に似た症状を呈するラット、サル等の動物をモデルとし
て投与を行い、その身体的、生理的な機能の回復、異常
を調べることにより可能となる。例えば、造血細胞に関
する異常であれば、５−ＦＵ系の抗癌剤を投与して、骨
髄抑制モデルマウスを作製し、このマウスに本発明の化
合物を投与した群としなかった群の骨髄細胞、末梢血細
胞の数、生理的な機能を調べることで明らかになる。ま
た更に、体外で造血幹細胞を含む造血未分化細胞の培
養、増殖を調べる場合には、マウス骨髄細胞を培養器な
どを利用して、培養を行い、その際に本発明の化合物を
加えた群と加えなかった群で培養後の細胞を致死量放射
線照射マウスに細胞移植を行い、その結果の回復の度合
いを、生存率、血球数の変動などを指標にすることで調
べることが出来る。勿論、これらの結果が人にも外挿で
きるため、本化合物の薬効としての評価として有効なデ
ータを得ることが出来る。

【００４９】また、本化合物のポリペプチドをコードし
ているｍＲＮＡがどの臓器において発現されているかを
示した実施例１２の結果、並びにリセプターのｍＲＮＡ
の発現結果である参考例７の結果を対比すれば、これら
の臓器でも何らかの作用を有している可能性があり、そ
の点から、本化合物が何らかの生理活性またそれに準じ
る薬効が生じるであろう臓器として肺、腎臓が挙げら
れ、この点からこの臓器が関連する疾患がその対象とし
て予想される。また、肝臓に関しては、本リセプター型
チロシンキナーゼ遺伝子が肝臓ガンにおいて強く発現さ
れていることが本発明の参考例７の肝臓ガン細胞株Ｈｅ
ｐ３Ｂのノーザンブロットの結果、並びにＢｅｎｎｅｔ
ｔらの論文（Bennett et al.,J.Biol.Chem.,269,14211-
14218,1994）、及び本発明者らによる特願平５−３０２
７０４号の明細書に記載されており、その点から本発明
の化合物は肝臓ガン、肝臓正常組織の増殖等に関連し、
これらに関連する疾患に取って有効な薬剤もしくは有効
な薬剤のスクリーニング系などに応用できる。本発明の
化合物を医薬品として利用する場合、その適応疾患とし
て、白血病、骨髄移植時の早期回復剤、抗癌剤投与時の
骨髄抑制回復剤及びその予防剤などの造血細胞に関連す
る疾患が考えられる。その際の投与量としてはその形
態、活性にもよるが、具体的には０．１ｍｇ／Ｋｇから
１００ｍｇ／Ｋｇ程度投与すればよい。

【００５０】また、実施例１２に示したように配列表の
配列番号の７の遺伝子配列の一部もしくは全部をコード
するＤＮＡを用いれば、ノ−ザンブロットが可能であ
る。したがって、本遺伝子の発現を調べる方法として、
配列表の配列番号７の一部の遺伝子配列を有する１６ｍ
ｅｒもしくはそれ以上の長さを有する相補し得る核酸、
つまりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらがメチ
ル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、またはチ
オフォスフェート化された誘導体によって行うことが出
来る。実施例１２に示した方法と同様な方法でマウス、
ラット等の他の生物の本遺伝子のホモログの検出や遺伝
子クローニングができる。さらに、人を含めたゲノム上
の遺伝子のクローニングも同様に可能である。従って、
そのようにしてクローニングされたこれら遺伝子を用い
れば、本リガンドの更に詳細な機能も明らかにすること
ができる。例えば、近年の遺伝子操作技術を用いれば、
トランスジェニックマウス、ジーターゲッティングマウ
ス、また、本遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化した
ダブルノックアウトなどのあらゆる方法を用いることが
できる。また、本遺伝子のゲノム上の異常があれば、遺
伝子診断、遺伝子治療への応用も可能である。

【００５１】また、実施例１５に示したこれらの化合物
を特異的に認識する抗体を用いれば、本発明の化合物群
の検出、測定が可能であり、上記に示した疾患などの診
断薬として使用でき得る。また、本発明に述べたあらゆ
る形態をとった該リガンド、すなわち少なくともリセプ
ター型チロシンキナーゼの新規なリガンド活性を有し、
さらに配列表の配列番号５及び６からなる群より選ばれ
るアミノ酸配列の一部もしくは全部のアミノ酸配列を含
有するポリペプチドを含む化合物およびそれらから構成
される複合体を組み合わせてなるものは本発明に含まれ
る。以下参考例及び実施例によって、本発明をより具体
的に説明するが、本発明は何らこれらによって限定され
るものではない。

【００５２】

【参考例】

【００５３】

【参考例１】ヒト血液細胞株ＵＴ−７のＰｏｌｙ
（Ａ）+ＲＮＡの調製ＵＴ−７細胞の培養、継代は、培地として牛胎児血清
（ＦＣＳ、以下本特許で用いたＦＣＳは全てフィルトロ
ン社製）を１０％含むイスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉ
ＭＤＭ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を用い、ヒト顆粒球
マクロファージコロニー刺激因子（ｈＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
ｎｔｅｒｇｅｎ社製）を２ｎｇ／ｍｌとなるように加
え、ＣＯ2 インキュベーターにて３７℃の条件で行っ
た。未刺激細胞は、同じ条件で培養した細胞を用いた。
巨核球に分化させる際には、細胞濃度２×１０⁵ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｌに希釈し、ｈＧＭ−ＣＳＦを２ｎｇ／ｍｌと
なるように加え、さらにＰｈｏｒｂｏｌ１２−Ｍｙｒ
ｉｓｔａｔｅ１３−Ａｃｅｔａｔｅ（ＰＭＡ：ｓｉｇ
ｍａ社製）を１０ｎｇ／ｍｌとなるように加え、３日間
培養後細胞を回収した。これらの各条件で培養した細胞
を各々細胞数１×１０8 個回収し、ＰＢＳ（−）（ニッ
スイ株式会社）にて３回洗浄し、ＲＮＡの抽出に用い
た。回収した細胞からＬｉｔｈｉｕｍＣｈｌｏｒｉｄ
ｅ／Ｕｒｅａ法（Eur.J.Biochem.107:303 (1980)）にて
ＴｏｔａｌＲＮＡを抽出した。次に、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ
−ｄＴ３０（宝酒造社製）にて、Ｐｏｌｙ（Ａ）+ Ｒ
ＮＡを分離・精製した。

【００５４】

【参考例２】チロシンキナーゼに特異的なプライマー
の作成Ｗｉｌｋｓの方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1603,1
989 ）に従い、チロシンキナーゼのサブドメイン７と９
に対応し、かつ制限酵素の認識部位を連結した混合プラ
イマー、すなわちセンスプライマーＰＴＫＩ： 5'-TTGT
CGACAC(AC)G(AG)GA(CT)(CT)T(CG)GC(ACGT)GC(ACGT)(AC)
G-3'、（２７ｍｅｒ：制限酵素の認識部位としてＳａｌ
Ｉ部位が付加されている。配列表の配列番号８に記載）
およびアンチセンスプライマーＰＴＫＩＩ：3'-CT(AG)C
A(CG)ACC(AT)(CG)(AG)A(AT)ACCTTAAGGT-5'（２４ｍｅ
ｒ：制限酵素の認識部位としてＥｃｏＲＩ部位が付加さ
れている。配列表の配列番号９に記載）を用い以下のＰ
ＣＲを行った。

【００５５】合成オリゴヌクレオチドは固相法を原理と
する全自動ＤＮＡ合成機を使用して作成した。全自動Ｄ
ＮＡ合成機としてはアプライドバイオシステム社３９１
ＰＣＲ−ＭＡＴＥを使用した。ヌクレオチド、３'-ヌク
レオチドを固定した担体、溶液、および試薬は同社の指
示に従って使用した。所定のカップリング反応を終了
し、トリクロロ酢酸で５’末端の保護基を除去したオリ
ゴヌクレオチド担体を濃アンモニア中にて室温で１時間
放置することにより担体からオリゴヌクレオチドを遊離
させた。次に、核酸及びりん酸の保護基を遊離させるた
めに、核酸を含む反応液を、封をしたバイアル内におい
て濃アンモニア溶液中で５５℃にて１４時間以上放置し
た。担体及び保護基を遊離した各々のオリゴヌクレオチ
ドの精製をアプライドバイオシステム社のＯＰＣカート
リッジを使用して行い、２％トリフルオロ酢酸で脱トリ
チル化した。精製後のプライマーは最終濃度が１μｇ／
μｌとなるように脱イオン水に溶解してＰＣＲに使用し
た。

【００５６】

【参考例３】ｃＤＮＡの合成参考例１により得られたＰｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡを用い
てｃＤＮＡの合成を行った。すなわち、Ｐｏｌｙ（Ａ）
+ ＲＮＡの２μｇを脱イオン水１２．３μｌに溶解し、
１０×緩衝液（５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭＭｇＣｌ2 、
０．０１％ゼラチン）２μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ
（宝酒造社製）４μｌ、前述のチロシンキナーゼに特異
的なアンチセンスプライマーＰＴＫＩＩ（１μｇ／μ
ｌ）１μｌ、アビアンミエロブラストシスウイルス逆転
写酵素（ａｖｉａｎｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ
ｖｉｒｕｓｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａ
ｓｅ：ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ社製：３２Ｕ／μｌ）
０．２μｌ、及びＲＮａｓｅインヒビター（Ｂｏｅｈｒ
ｉｎｇｅｒ社製：４０Ｕ／μｌ）０．５μｌ加えて３７
℃で７５分間放置後、６５℃で１０分間放置した。

【００５７】

【参考例４】チロシンキナーゼに特異的なプライマー
によるＰＣＲＰＣＲによる増幅は以下のように行った。参考例３で得
られたｃＤＮＡ溶液２０μｌを使用し、１０×緩衝液
（５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ８．３）、１５ｍＭＭｇＣｌ2 、０．０１％ゼ
ラチン）８μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（宝酒造社
製）６．４μｌ、前述のチロシンキナーゼに特異的なセ
ンスプライマーＰＴＫＩ（１μｇ／μｌ）１．５μｌ、
及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ：Ｐ
ｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社製、５Ｕ／μｌ）０．２μｌ
を加え、最後に脱イオン水を加えて全量を１００μｌと
して、９４℃で１分間、３７℃で２分間、７２℃を３分
間からなる行程を１サイクルとして、この行程を４０サ
イクル行い、最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを
行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電
気泳動を行い、エチジュウムブロマイド（日本ジーン社
製）にて染色後、紫外線下で観察し、約２１０ｂｐのｃ
ＤＮＡが増幅されていることを確認した。

【００５８】

【参考例５】ＰＣＲ産物のクローニング及び塩基配列
の決定ＰＣＲ産物の全量を低融点アガロース（ＧＩＢＣＯＢ
ＲＬ社製）にて作成した２％アガロースゲルにて電気泳
動し、エチジュウムブロマイドにて染色後、紫外線照射
下にて約２１０ｂｐのバンドを切り出し、ゲルと同体積
の蒸留水を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完
全に溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノール（日本ジ
ーン社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心分離
後上清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和フェ
ノール：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにクロロ
フォルムにて行った。最終的に得られた溶液からｃＤＮ
Ａをエタノール沈澱して回収した。回収したｃＤＮＡを
制限酵素ＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）及びＳａｌＩ（宝酒
造社製）にて消化したのち、ベクターへの組み込みに用
いた。

【００５９】ベクターとしてはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩＫＳ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製、以下ｐＢｌ
ｕｅｓｃｒｉｐｔと示す）を用い、先のｃＤＮＡを組み
込む前に、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにて消化し
て、上記の方法で精製した。これらの処理を行ったベク
ターと先のｃＤＮＡのモル比が１：５となるように混ぜ
合わせて、ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂ社製
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにてベクターにｃＤＮＡを組み込
んだ。ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
を大腸菌ＪＭ１０９（東洋紡社製）に遺伝子導入し、ア
ンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍｌ含むＬ
−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔
き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニー
をランダムに選択し、ｃＤＮＡが組み込まれていること
を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩにて消化して、２１
０ｂｐのｃＤＮＡが切れ出されてくることを確認し、確
認されたクローンについて、組み込まれているｃＤＮＡ
の塩基配列をアプライドバイオシステム社の螢光シーク
エンサーにて決定した。その結果、未刺激のＵＴ−７細
胞からはクローニングされたが、ＵＴ−７を巨核球に分
化させた場合にはクローニングされなかったチロシンキ
ナーゼ遺伝子断片を得た。この遺伝子断片は配列表の配
列番号３の２６４２番目から２８１２番目であった。

【００６０】

【参考例６】ｃＤＮＡライブラリーの作成及び新規チ
ロシンキナーゼ遺伝子の全長クローニング及びその解析前述の方法にて分離精製された未刺激状態のＵＴ−７細
胞のＰｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを用いてｃＤＮＡライブラ
リーを作成した。ＵＴ−７ｃＤＮＡライブラリーの作成
にはｐＣＤＭ８ベクターｃＤＮＡライブラリー作成キッ
ト（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用い、添付の作成方
法に従って作成した。さらに、前述の方法に従ってヒト
胎盤よりＰｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡラ
イブラリーを作成した。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリー
の作成にはλＺＡＰｃＤＮＡライブラリー作成キット
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用い、添付の作成方法
に従って作成した。

【００６１】次に、これらのｃＤＮＡライブラリーから
コロニーハイブリダイゼーションもしくはプラークハイ
ブリダイゼ−ションにて全長ｃＤＮＡを持ったクローン
の検索を５×１０⁵相当のコロニーもしくはプラークか
ら行った。出現したコロニーもしくはプラークをナイロ
ンフィルター（ＨｙｂｏｎｄＮ＋：Ａｍｅｒｓｈａｍ
社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをアルカ
リ処理（１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＮａＯＨを染
み込ませたろ紙上に７分間放置）し、次いで中和処理
（１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ
（ｐＨ７．２）、１ｍＭＥＤＴＡを染み込ませたろ紙
上に３分間放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．
３６ＭＮａＣｌ、０．０２Ｍりん酸ナトリウム（ｐ
Ｈ７．７）、２ｍＭＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間
振とう後洗浄し、風乾した。その後、０．４ＭＮａＯ
Ｈを染み込ませたろ紙上に２０分間放置し、５倍濃度の
ＳＳＰＥ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。
このフィルターを用いて放射性同位元素32Ｐにて標識さ
れたｃＤＮＡプローブにてスクリーニングを行った。

【００６２】放射性同位元素32Ｐにて標識されたｃＤＮ
Ａプローブは以下のように作成した。すなわち、新規チ
ロシンキナーゼの部分ｃＤＮＡが組み込まれたｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔより、ＳａｌＩとＥｃｏＲＩにてベクタ
ーより切り出し、低融点アガロースゲルからＤＮＡ断片
を精製回収した。得られたｃＤＮＡ断片をＤＮＡラベリ
ングキット（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌ
ｉｎｇｓｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用い
て標識した。すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液
５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸
騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝
液１０μｌ、α−32Ｐ−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮ
Ａポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７
℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラ
ム（ＱｕｉｃｋＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎＳｅｐｈａ
ｄｅｘＧ−５０：ベーリンガーマンハイム社製）で精
製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用し
た。

【００６３】前述の方法にて作成したフィルターを、各
々の成分の最終濃度が５倍濃度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃
度のデンハルト液（和光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ
（ドデシル硫酸ナトリウム）、及び１０ｍｇ／ｍｌの沸
騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡであるプレハイブ
リダイゼーション液中に浸し、６５℃にて２時間振とう
したのち、前述の方法で32Ｐ標識されたプローブを含む
プレハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダ
イゼーション液に浸し、６５℃にて１６時間振とうし、
ハイブリダイゼーションを行った。

【００６４】次に、フィルターを０．１％ＳＤＳを含む
ＳＳＰＥ溶液に浸し、６５℃にて振とうし２回洗浄後、
さらに０．１％ＳＤＳを含む１０倍希釈したＳＳＰＥ溶
液に浸し、６５℃にて４回洗浄した。洗浄を終了したフ
ィルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグ
ラフィーを行った。その結果、強く露光された部分のク
ローンを拾い、再度コロニー及びプラークを蒔き直し前
述の方法にてスクリーニングを行い、完全に単独のクロ
ーンを分離した。

【００６５】ＵＴ−７のライブラリーから分離されたク
ローンのうちインサートサイズの大きい２クローンを前
掲のＭａｎｉａｔｉｓらの実験書に掲載の方法に従いプ
ラスミドを精製し、制限酵素ＸｈｏＩにて消化し、低融
点アガロース電気泳動にてｃＤＮＡを精製し、ｐＢｌｕ
ｅｓｃｒｉｐｔに組み込んだ。組み込まれたｃＤＮＡの
サイズはおよそ３．０ｋｂｐ及び１．６ｋｂｐであっ
た。また、ヒト胎盤ライブラリーから分離されたクロー
ンのうちインサートサイズの大きい２クローンをＭａｎ
ｉａｔｉｓらの実験書に掲載の方法に従いファージＤＮ
Ａを精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様にｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔに組み込んだ。組み込まれたｃＤ
ＮＡのサイズはおよそ３．８ｋｂｐ（ｃｌｏｎｅ２）及
び３．５ｋｂｐ（ｃｌｏｎｅ９）であった。

【００６６】これらのクローンのｃＤＮＡの両端の遺伝
子配列をファルマシア社ＡＬＦＤＮＡシークエンサーお
よびファルマシア社ＡＬＦシークエンサー用ラベリング
キットを用い、添付の使用説明書に従い決定した。さら
に全長の塩基配列決定を行うため宝酒造株式会社キロシ
ークエンス用デリューションミュータント・キットを用
い、添付の使用説明書に従い、デリューションミュタン
トを作成し、ｃＤＮＡの両方向についての塩基配列を決
定した。その結果、全長のｃＤＮＡがクローニングされ
ていないことが判明したため、さらにｃｌｏｎｅ２の制
限酵素ＸｈｏＩサイトから５’部分の約２００ｂｐ（配
列表の配列番号３の４８４番から６９６番に当たる）を
用いて、市販のヒト胎児肝臓ｃＤＮＡライブラリーλｇ
ｔ１１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を同様な方法にてスク
リーニングした結果、ＸｈｏＩサイトより５’方向のｃ
ＤＮＡを含むクローン（ｃｌｏｎｅＭ１、配列表の配
列番号３の１番から１２１４番目に当たる）がクローニ
ングでき、遺伝子配列をシークエンスして、本発明の全
長ｃＤＮＡ遺伝子の塩基配列が決定された。

【００６７】全長の遺伝子配列を持ったＤＮＡの作製は
配列表の配列番号３に記載のＤＮＡのＸｈｏＩサイトを
用いて上記のｃｌｏｎｅ２とｃｌｏｎｅＭ１のつなぎ、
ライブラリーのリンカーのＥｃｏＲＩサイトを用いてｐ
ＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩサイトにサブクロー
ニングして作製した。以下、本ベクターをｐＢＳＲＴＫ
ＦＵＬＬと示す。以上のようにして作製した遺伝子の遺
伝子配列を配列表の配列番号３に示した。

【００６８】

【参考例７】新規リセプター型チロシンキナーゼ遺伝
子のノーザンブロッティングによるｍＲＮＡの発現本新規リセプター型チロシンキナーゼのｍＲＮＡの発現
を調べるため、あらかじめｍＲＮＡが転写されているフ
ィルターであるＣｌｏｎｔｅｃｈ社ＨｕｍａｎＭ
ｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢ
ｌｏｔ、ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕ
ｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔＩＩ、Ｈｕｍａｎ
ＦｅｔａｌＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒ
ｔｈｅｒｎＢｌｏｔ並びに実施例１に示した方法にて
回収されたｍＲＮＡをアガロースゲル電気泳動し、Ｚｅ
ｔａ−Ｐｒｏｂ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）にトランスファ
ーして作成したフィルターを用い、ｐＢＳＲＴＫＦＵＬ
Ｌを制限酵素ＳｍａＩにて消化して、１％のアガロース
ゲルで電気泳動を行い、７４６ｂｐの断片（配列表の配
列番号３の６１０番目から１３５５番目）を切り出し、
ＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩ（ＢＩＯ１０１社製）を用いて
精製した遺伝子断片を前掲のＤＮＡラベリングキット
（ＭｅｇａＰｒｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇｓ
ｙｓｔｅｍ：Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）にて前述の方法で
32Ｐ標識し発現を調べた。

【００６９】その結果、ヒト成人組織のうち心臓、胎
盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、すい臓、脾臓、前立腺、
卵巣で発現が認められた。しかしながら、脳、胸腺、精
巣、小腸、大腸、末梢血リンパ球においては発現が認め
られなかった。また、ヒト胎児組織では心臓、肺、肝
臓、腎臓において発現が認められたが、脳においては発
現が認められなかった。

【００７０】また、血液細胞株では前述の骨髄巨核芽球
性白血病細胞株ＵＴ−７、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株
Ｋ５６２（理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、
Ｎｏ．ＲＣＢ００２７）及びヒト急性巨核芽球性白血病
細胞株ＣＭＫ（Blood 74:42,1989）に発現されており、
非血液細胞株では肝細胞ガン細胞株Ｈｅｐ３Ｂ（アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下ＡＴＣ
Ｃと示す）より入手可能、ＨＢ８０６４）及びヒト胎児
肺繊維芽細胞株ＭＲＣ−５（理化学研究所、細胞開発銀
行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０２１１）に発現が認め
られた。さらに、ＵＴ−７、Ｋ５６２、ＣＭＫに於いて
はＰＭＡによる細胞分化を起こさせるとその発現がほぼ
完全に認められなくなることが確認された。しかしなが
ら、ヒトさい帯血から樹立された細胞株ＫＭＴ−２（理
化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ
０７１２），ヒト慢性骨髄性白血病細胞株ＫＧ１ａ（Ａ
ＴＣＣより入手可能、ＣＣＬ２４６．１）、急性リンパ
球性白血病細胞株ＭＯＬＴ−４（ＡＴＣＣより入手可
能、ＣＣＬ１５８２）に於いては発現が認められなかっ
た。以上のことから、この遺伝子は血液細胞が未分化の
状態において発現されており、血液細胞が分化すること
にともない、その発現が消失することが推察された。し
たがって、この新規リセプター型チロシンキナーゼは血
液幹細胞の維持、巨核球分化に関連すると考えられた。

【００７１】

【参考例８】新規リセプター型チロシンキナーゼペプ
チド発現細胞株の作成配列表の配列番号２に記載のポリペプチドをコードする
ＤＮＡおよびコダック社製ＩＢＩＦＬＡＧを用いて、
配列表の配列番号２のアミノ酸配列のＣ末端に８アミノ
酸、すなわちアミノ酸配列として Asp Tyr Lys Asp Asp
Asp Asp Lysを持つポリペプチド（ＦＬＡＧ、配列表の
配列番号１３に記載）を付加したポリペプチドをコード
するＤＮＡを、ＳＲαのプロモターとネオマイシン耐性
遺伝子を含む発現ベクターｐＭＫＩＴｎｅｏ（丸山ら、
９１年度日本分子生物学会予稿集、東京医科歯科大学丸
山より入手可能）に各々別々につなぎ、発現ベクターを
作製した。

【００７２】配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含有
するポリペプチド発現細胞の発現ベクター作製にあたっ
て、配列表の配列番号３の３’非転写領域を除き制限酵
素ＥｃｏＲＩサイトを付加するため、5'-AACTCGAGATCTC
TGCTGAGGACCTG-3'の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマ
ー１、配列表の配列番号１０に記載）、5'-AAGAATTCTCA
GTACTGCGGGGCCGGTC-3'の配列であるオリゴＤＮＡ（プラ
イマー２、配列表の配列番号１１に記載）をプライマー
として用いて、ｐＢＳＲＴＫＦＵＬＬをテンプートとし
て用いてＰＣＲを行った。およそ１６０ｂｐのＤＮＡが
増幅されていることをアガロースゲル電気泳動で確認
後、このＰＣＲ産物を参考例５記載の方法にて精製し
て、制限酵素ＸｈｏＩ及びＥｃｏＲＩにて処理し、同様
に処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＮｅｗＥｎｇｌ
ａｎｄＢｉｏＬａｂ社製Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて
この精製した遺伝子をつないでサブクローニングした。
その後、４クローンのコロニーからプラスミドＤＮＡを
精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、遺
伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配列、すなわち配列
表の配列番号３のＤＮＡ配列の３２３０番から３３７３
番の配列を持ったフラグメントであることを確認した。
以下、本フラグメントを有するベクターをｐＢＳＦ１と
する。

【００７３】さらに、配列表の配列番号２の新規リセプ
ター型チロシンキナーゼ全長アミノ酸配列のポリペプチ
ドのＣ末端に８アミノ酸、すなわちアミノ酸配列として
AspTyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysを持つポリペプチド
（ＦＬＡＧ、配列表の配列番号１３に記載）を付加した
ポリペプチドをコードする遺伝子配列を持つ発現ベクタ
ーの作製にあたって、同様な方法で上記のプライマー
１、5'-GGGAATTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCGTACTGCGGG
GCCGGTCCTCCTGT-3' の配列であるオリゴＤＮＡ（プライ
マー３、配列表の配列番号１２に記載）をプライマーと
してＰＣＲを行い、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクロ
ーニングして、４クローンをシークエンスし、遺伝子配
列を確認して、目的の遺伝子配列、すなわち配列表の配
列番号３のＤＮＡ配列の３２３０番から３３７０番の配
列の３’端に5'-GATTATAAAGATGATGATGATAAATGA-3' （配
列表の配列番号１３に記載）がつながった配列を有する
フラグメントであることを確認した。以下、本フラグメ
ントを有するベクターをｐＢＳＦ２とする。

【００７４】次に、ｐＢＳＲＴＫＦＵＬＬを制限酵素Ｂ
ａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化し、上記と同様な方法で
精製したおよそ３ｋｂｐの遺伝子断片、すなわち配列表
の配列番号３のＤＮＡ配列の３８４番から４２９０番の
配列を有する遺伝子の３’末端にλＺＡＰｃＤＮＡライ
ブラリー作製に使用したリンカー、すなわち宝酒造社製
ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＢａｍＨＩＡｄａｐｔｏｒの
ＢａｍＨＩ部分がつながった配列を有するＤＮＡ断片
を、同様にＢａｍＨＩで消化後脱りん酸化処理を行った
ｐＵＣ１９（宝酒造社製）にＴ４ＤＮＡリガーゼでつ
なぎ、サブクローニングした。遺伝子の方向は配列表の
配列番号３のＤＮＡ配列の５’方向のＢａｍＨＩの部分
がｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトのＳａｌＩ側
にあり、３’方向がＥｃｏＲＩ側にあることを確認され
たクローンを選択した。以下、このベクターをｐＵＣＲ
ＴＫＦＵＬＬとする。

【００７５】このようにして作製されたｐＵＣＲＴＫＦ
ＵＬＬを制限酵素ＳａｌＩとＢｇｌＩＩにて消化し、ア
ガロースゲル電気泳動にておよそ３ｋｂｐのフラグメン
ト、すなわち配列表の配列番号３のＤＮＡ配列の３８４
番から３２３０番の配列の５’末端の先にｐＵＣ１９の
制限酵素サイトのＳａｌＩからＢａｍＨＩまでの部分が
つながったフラグメントを切り出し、前述の方法で精製
した。この遺伝子断片をＦ３とする。同様に、ｐＢＳＦ
１及びｐＢＳＦ２ついて制限酵素ＳａｌＩ及びＢｇｌＩ
Ｉ消化を行い、マルチクローニングサイトのＳａｌＩサ
イトからベクター中のフラグメントのＢｇｌＩＩサイト
の部分およそ３０ｂｐの遺伝子断片を除いた遺伝子断片
を上記の方法にて精製した。これらの遺伝子断片を各々
Ｆ１，Ｆ２とする。そして、Ｆ１とＦ３、Ｆ２とＦ３を
各々前述の方法でつなぎ、制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔ
Ｉで配列表の配列番号３のポリペプチドをコードする部
分の遺伝子断片が切り出されるベクターｐＢＳＦＵＬＬ
１及び制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩで配列表の配列番
号２のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧアミノ酸配列を
有するポリペプチドをコードする部分に対応する遺伝子
断片が切り出されるベクターｐＢＳＦＵＬＬ２を作製し
た。

【００７６】このようにして作製されたベクターｐＢＳ
ＦＵＬＬ１、ｐＢＳＦＵＬＬ２を制限酵素ＳａｌＩ、Ｎ
ｏｔＩ、ＰｖｕＩにて消化し、電気泳動にておよそ３ｋ
ｂｐの遺伝子断片、すなわち新規リセプター型チロシン
キナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子断片部分を
含む遺伝子断片を分離し精製した。この２種の遺伝子断
片を前掲のｐＭＫＩＴｎｅｏを制限酵素ＳａｌＩ及びＮ
ｏｔＩ処理して、スタッファー部分を除いたものにＴ４
ＤＮＡリガーゼにてつなぎ、新規リセプター型チロシ
ンキナーゼの発現ベクターを構築した。以上のように作
製されたＦＬＡＧ配列を含まないベクターをｐＭＫＦＵ
ＬＬ、ＦＬＡＧ配列を含むベクターをｐＭＫＦＵＬＬＦ
ＬＡＧとする。

【００７７】遺伝子導入する細胞株はマウスｐｒｏ−Ｂ
ｃｅｌｌｌｉｎｅＢａ／Ｆ３（理化学研究所、細
胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．ＲＣＢ０８０５）及び
マウス繊維芽細胞Ｂａｌｂ／３Ｔ３ｃｌｏｎｅＡ３
１（理化学研究所、細胞開発銀行より入手可能、Ｎｏ．
ＲＣＢ０００５）に行った。遺伝子導入前の細胞の培養
はＢａ／Ｆ３はＲＰＭＩ１６４０（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ
社製）、１０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌマウスＩＬ−
３（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）で培養し、Ｂａｌｂ／３Ｔ
３はＤ−ＭＥＭ（ダルベッコ改編ＭＥＭ培地、ＧＩＢＣ
Ｏ−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した。

【００７８】発現ベクターは制限酵素ＮｒｕＩ（宝酒造
社製）にて消化して、直鎖型にしてから遺伝子導入し
た。Ｂａ／Ｆ３での遺伝子導入細胞株の作製は次のよう
に行った。すなわち、前日に細胞の培地を交換し、細胞
数を５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして一晩培養した。
翌日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて
２回遠心洗浄後、１ｍＭＭｇＣｌ₂、ＰＢＳ（−）に
１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにして細胞を調
製した。遺伝子導入はＢｉｏ−Ｒａｄ社製遺伝子導入装
置ジーンパルサー用いたエレクトロポレーション法で行
った。上記の細胞懸濁液を５００μｌエレクトロポレー
ション専用セル（０．４ｍｍ）に取り、発現ベクターを
２０μｇ加え、氷中で５分間放置する。その後、１回目
は２５μＦ，６００Ｖの条件で電圧をかけ、１分間室温
で放置後、更に２回目は９６０μＦ、２５０Ｖの条件で
電圧をかけた。その後、氷中で５分間放置後、直径１０
ｃｍ細胞培養用ディシュで上記の培地１０ｍｌで一晩培
養を行った。翌日、遠心にて上記の培地にＧ４１８（Ｓ
ｉｇｍａ社製）を１ｍｇ／ｍｌとなるように加えた培地
の２０ｍｌに懸濁し、２４穴細胞培養プレートに１ｍｌ
分けて培養した。１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８入りの同様な
培地を用いて２日おきに半量の培地を交換して培養を１
０日間程度ほど行い、細胞が増殖してきたウエルから細
胞を培地量１０ｍｌで細胞濃度１×１０⁶ｃｅｌｌｓ／
ｍｌ程度まで増やした後、細胞濃度が０．０２から０．
０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるよう９６穴プレートに限外
希釈して培養し、クローニングをおこない、クローン化
された遺伝子の安定発現する細胞を得た。以降は、この
ようにして作製されたＢａ／Ｆ３に遺伝子導入し、配列
表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有すポリペプ
チドを安定発現する細胞株をＢａ／Ｆ３／ＦＵＬＬと示
し、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有す
るポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧアミノ酸配列を有す
るポリペプチド安定発現細胞株をＢａ／Ｆ３／ＦＵＬＬ
ＦＬＡＧと示す。また、同時に同じ方法でｐＭＫＩＴｎ
ｅｏそのものを遺伝子導入したコントロールの形質転換
細胞株を作製しこれをＢａ／Ｆ３／ＣＯＮと示す。

【００７９】Ｂａｌｂ／３Ｔ３での遺伝子導入細胞株の
作製は次のように行った。すなわち、前日に細胞の培地
を交換し、細胞数を直径１０ｃｍの細胞培養用ディッシ
ュあたり５×１０⁶個にして１０ｍｌの上記培地を加え
一晩培養した。翌日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、Ｐ
ＢＳ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭＭｇＣｌ2、
ＰＢＳ（−）に１×１０7 ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう
にして細胞を調製した。遺伝子導入はＢｉｏ−Ｒａｄ社
製遺伝子導入装置用いたエレクトロポレーション法で行
った。上記の細胞懸濁液５００μｌをエレクトロポレー
ション専用セル（０．４ｍｍ）に取り、発現ベクターを
２０μｇ加え、氷中で５分間放置する。その後、あいだ
を１分間室温で放置して、２回の３μＦ、４５０Ｖの電
圧をかけた。その後、氷中で５分間放置後、直径１０ｃ
ｍ細胞培養用ディッシュで上記の培地１０ｍｌで３日間
培養を行った。３日後、上記の培地にＧ４１８（Ｓｉｇ
ｍａ社製）を４００μｇ／ｍｌとなるように加えた培地
に交換し、その後２日おきに培地の１／３を交換して１
０日間ほど培養を続けた。１０日後、ディッシュ上に形
成されたコロニーをトリプシン溶液（ＧＩＢＣＯ−ＢＲ
Ｌ社製）を使ってはがし、クローン化された遺伝子の安
定発現細胞株を得た。以降は、このようにして作製され
たＢａｌｂ／３Ｔ３の配列表の配列番号２に記載のアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチドの安定発現細胞株をＢ
ａｌｂ／ＦＵＬＬと示し、配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドのＣ末端にＦＬＡ
Ｇアミノ酸配列を有するポリペプチドの安定発現細胞株
をＢａｌｂ／ＦＵＬＬＦＬＡＧと示す。また、同時に同
じ方法でｐＭＫＩＴｎｅｏそのものを遺伝子導入したコ
ントロールの形質転換細胞株を作製しこれをＢａｌｂ／
ＣＯＮと示す。

【００８０】また、新規リセプター型チロシンキナーゼ
の細胞外部分、つまり配列表の配列番号１に記載のポリ
ペプチドを含有するポリペプチドを動物細胞に産生させ
る発現ベクターを構築した。すなわち、配列表の配列番
号１の新規リセプター型チロシンキナーゼ細胞外部分ア
ミノ酸配列のポリペプチドのＣ末端に８アミノ酸、すな
わちアミノ酸配列として Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
Lysを持つポリペプチド（ＦＬＡＧ配列表の配列番号１
３に記載）を付加したポリペプチドをコードする遺伝子
配列を持つ発現ベクターの作製にあたって、全長の場合
と同様な方法で、5'-CGGAATTCGTGCGGTTCCTGAAGACGTCAG-
3'の配列であるオリゴＤＮＡ（プライマー４、配列表の
配列番号１４に記載）、5'-GGGAATTCATTTATCATCATCATCT
TTATAATCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCA-3'の配列であるオ
リゴＤＮＡ（プライマー５、配列表の配列番号１５に記
載）をプライマーとして、配列表の配列番号３の遺伝子
を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをテンプートとして用い
てＰＣＲを行った。およそ１５０ｂｐのＤＮＡが増幅さ
れていることをアガロースゲル電気泳動で確認後、この
ＰＣＲ産物を参考例５記載の方法にて精製して、制限酵
素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様の制限酵素処理をし、末
端の脱りん酸処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＮｅｗ
ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂ社製Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼにて遺伝子をつないでサブクローニングした。
その後、１０クローンのコロニーからプラスミドＤＮＡ
を精製して、シークエンスをして遺伝子配列を確認し、
遺伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配列、すなわち配
列表の配列番号３のＤＮＡ配列の１８５３番から２０２
０番の配列の３’端に5'-GATTATAAAGATGATGATGATAAATGA
-3' （配列表の配列番号１３に記載）がつながった配列
を有するフラグメントであることを確認した。また、ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔつながった遺伝子断片の方向は遺
伝子配列確認の際に、配列表の配列番号３に示す配列の
５’末端部分の上流にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのマルチ
クローニングサイトのＳａｌＩサイト、また、３’のＦ
ＬＡＧ配列をコードする遺伝子配列の下流にＮｏｔＩサ
イトが来るようにつながったクローンを選びだした。以
下、本ベクターをｐＢＳＦ４とする。

【００８１】上記のベクターｐＵＣＲＴＫＦＵＬＬを制
限酵素ＳａｌＩ及びＡａｔＩＩ（東洋紡社製）にて消化
し、上記の方法でおよそ１．６ｋｂｐの遺伝子断片を精
製した。本遺伝子断片は配列表の配列番号３のＤＮＡ配
列の３８４番から１８５２番までの配列を含む。同様
に、ｐＢＳＦ３を制限酵素ＳａｌＩ及びＡａｔＩＩで消
化し、上記の方法でおよそ３．２ｋｂｐの遺伝子断片を
精製した。この２つの遺伝子断片をつなぎ作製されたベ
クターを、更に制限酵素ＳａｌＩ及びＮｏｔＩにて消化
して上記の発現ベクターｐＭＫＩＴｎｅｏにつないで、
配列表の配列番号１のアミノ酸配列のＣ末端にＦＬＡＧ
配列を有するポリペプチドを産生しうるベクターを作製
した。この発現ベクターをｐＭＫＥＸＦＬＡＧとする。

【００８２】さらに、同様に配列表の配列番号１に記載
のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末端にヒトイ
ムノグロブリンＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ部分の
アミノ酸配列を有するポリペプチドを産生しうるベクタ
ーは以下のように作製した。すなわち、配列表の配列番
号１の新規リセプター型チロシンキナーゼ細胞外部分ア
ミノ酸配列のポリペプチドのＣ末端にヒトＩｇＧのヒン
ジ部分以下のＦｃ部分のアミノ酸配列を付加したポリペ
プチドをコードする遺伝子配列を持つ発現ベクターの作
製にあたって、上記の場合と同様な方法で、プライマー
４、5'-AAGGATCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCA-3'の配列で
あるオリゴＤＮＡ（プライマー６、配列表の配列番号１
６に記載）をプライマーとして、配列表の配列番号３の
遺伝子を含むｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔをテンプートとし
て用いてＰＣＲを行った。およそ１５０ｂｐのＤＮＡが
増幅されていることをアガロースゲル電気泳動で確認
後、このＰＣＲ産物を参考例５記載の方法にて精製し
て、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩにて消化し、同
様の制限酵素処理をしたｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＮｅ
ｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂ社製Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼにて遺伝子をつないでサブクローニングした。
その後、得られた１０クローンのコロニーからプラスミ
ドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列を
確認した結果、遺伝子配列に誤りがなく目的の遺伝子配
列、すなわち配列表の配列番号３のＤＮＡ配列の１８５
３番から２０２０番の配列を有するフラグメントである
ことを確認した。以下、このベクターをｐＢＳＦ５とす
る。

【００８３】次に、イムノグロブリンＦｃタンパクとの
融合タンパクの作製はＺｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌらの方法
（Zettlmeissl et al.,DNA cell Biol.,9,347-354,199
0）にしたがって、イントロンを含むゲノムＤＮＡを用
いた遺伝子を利用し、その遺伝子をＰＣＲ法を用いて作
製した。すなわち、ヒトゲノムＤＮＡをテンプレートと
して使用して、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ部分をコードする遺伝
子配列を制限酵素ＢａｍＨＩサイトのついた5'-AACCATC
CCCGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCA-3' の配列を有するオ
リゴＤＮＡ（プライマー７、配列表の配列番号１７に記
載）、制限酵素ＸｂａＩサイトのついた5'-CCTCTAGAGTC
GCGGCCGTCGCACTCATTTACC-3' の配列を有するオリゴＤＮ
Ａ（プライマー８、配列表の配列番号１８に記載）をプ
ライマーとして用いてＰＣＲを行い、およそ１．４ｋｂ
ｐのバンドを精製し、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＸｂａＩ
（宝酒造社製）で処理をして、同様の制限酵素処理をし
たｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ
ＢｉｏＬａｂ社製Ｔ４ＤＮＡｌｉｇａｓｅにて遺
伝子をつないでサブクローニングした。その後、プラス
ミドＤＮＡを精製して、シークエンスをして遺伝子配列
を確認し、遺伝子配列が確かにヒトＩｇＧ１のヘビーチ
ェーンのヒンジ部分にあたるゲノムＤＮＡであることを
確認した（その配列はKabat et al.,Sequence of Immun
ological Interest, NIH publication No91-3242, 1991
を参照のこと）。以下、このベクターをｐＢＳｈＩｇＦ
ｃとする。

【００８４】上記のベクターｐＢＳＦ５を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ及びＥｃｏＲＩにて消化し、上記の方法にておよ
そ１５０ｂｐの遺伝子断片を精製し、ついで上記のベク
ターｐＢＳｈＩｇＦｃを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏ
ＲＩにて消化し、上記の方法にておよそ４．４ｋｂｐの
遺伝子断片を精製し、この両者をＮｅｗＥｎｇｌａｎ
ｄＢｉｏＬａｂ社製Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて遺伝
子をつなぎ、次にこのように作製されたベクターを制限
酵素ＳａｌＩ及びＡａｔＩＩで消化し、上記の方法でお
よそ４．４ｋｂｐの遺伝子断片を精製した。また同時
に、上記のベクターｐＵＣＲＴＫＦＵＬＬを制限酵素Ｓ
ａｌＩ及びＡａｔＩＩで消化し、上記の方法でおよそ
１．６ｋｂｐの遺伝子断片を精製した。この２つの遺伝
子断片をつなぎ作製されたベクターを、更に制限酵素Ｓ
ａｌＩ及びＮｏｔＩにて消化して上記の発現ベクターｐ
ＭＫＩＴｎｅｏにつないで、配列表の配列番号１のアミ
ノ酸配列のＣ末端にヒトＩｇＧ１Ｆｃのアミノ酸配列を
有するポリペプチド産生ベクターを作製した。この発現
ベクターをｐＭＫＥＸＩｇとする。

【００８５】発現ベクターｐＭＫＥＸＦＬＡＧ、及びｐ
ＭＫＥＸＩｇの遺伝子導入はＣＯＳ−７（理化学研究
所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）にて
行った。ＣＯＳ−７の培養法並びに遺伝子導入方法はＢ
ａｌｂ／３Ｔ３と同様に行い、遺伝子を導入した細胞を
得た。遺伝子導入の翌日、細胞の培養上清無血清のＤ−
ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を４日間おきに交換
し、２週間にわたって培養上清を分取した。分取した培
養上清を各々セントリコン３０（アミコン社製）にてバ
ッファーを培地からＰＢＳ（−）に交換及び１０倍に濃
縮した。

【００８６】細胞上清中に配列表の配列番号１に示すポ
リペプチドを含有するポリペプチドが産生されているこ
とを確認するため、以下のようにウエスタンブロットに
て確認した。すなわち、濃縮した培養上清をＡＣＩジャ
パン社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽及びＳＤＳ−
ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラディエントゲ
ル５〜１０％）を用い、添付の取扱い説明書に従ってＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。サンプルは２ーメルカプ
トエタノール（２−ＭＥ）を加え過熱処理した還元条件
下のサンプルと、その処理を行わなかった非還元条件下
のサンプルについて行い、マーカーとしてはＡｍｅｒｓ
ｈａｍ社製レインボーマーカー（高分子量用）を用い、
サンプルバッファー、泳動バッファーについては添付の
取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了
後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィルタ
ー（ＢｉｏＲａｄ社製）にＢｉｏＲａｄ社製ミニトラン
スブロットセルにより転写した。

【００８７】このように作製されたフィルターを５％Ｂ
ＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）、ＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭＴｒ
ｉｓ、１３７ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％
Ｔｗｅｅｍ２０）に４℃一晩揺すりながらブロッキン
グした。目的のタンパク質がＦＬＡＧキメラの場合は一
次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＦＬ
ＡＧＭ２（コダック社製）、二次抗体としてペルオキ
シダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ社
製）を反応させた。また、ＩｇＧキメラの場合は、ペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇ羊抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ
社製）を反応させた。抗体の反応時間は各々室温で一時
間反応させ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分間室温で
揺すり洗浄する操作を３回づつ繰り返した。最後の洗浄
後、フィルターをＡｍｅｒｓｈａｍ社製ＥＣＬウエスタ
ンブロッティング検出システムの反応液に五分間浸し、
サランラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。その
結果、ＦＬＡＧキメラではいずれの場合もおよそ８０ｋ
ダルトン程度のタンパクが、また、ＩｇＧキメラでは２
−ＭＥ処理の場合は１１０ｋダルトン、未処理の場合は
２２０ｋダルトンの蛋白が検出できた。以上の結果か
ら、目的の配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を
含有するポリペプチド産生細胞を得ることが出来た。細
胞外部分はアミノ酸組成から予想される分子量よりとも
におよそ２０キロダルトン大きく、糖鎖付加されている
と予想された。

【００８８】

【参考例９】新規リセプター型チロシンキナーゼ細胞
外部分蛋白の精製参考例８に記載のベクターｐＭＫＥＸＦＬＡＧ及びｐＭ
ＫＥＸＩｇを用いて作製された細胞培養上清を各々５リ
ットル作製した。これらの培養上清をコダック社製Ａｎ
ｔｉ−ＦＬＡＧＭ２ＡｆｆｉｎｉｔｙＧｅｌカラ
ムおよびファルマシア社製ｐｒｏｔｅｉｎＧセファ
ロースカラムもしくはＰｒｏｔｅｉｎＡセファロース
カラム通して、各々のタンパクをカラムに吸着させた。
カラムのサイズは共に１ｃｍ×３ｃｍで容積はおよそ２
ｍｌであり、流速は全て１ｍｌ／ｍｉｎ．で行った。吸
着後、カラムをＰＢＳ（−）２０ｍｌで洗浄し、その
後、０．５ＭＴｒｉｓーグリシン（ｐＨ３．０）で溶出
した。溶出画分を２ｍｌずつ分取し、０．５ＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）２００μｌづつ加えて、各々の
画分を上記の方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動が
終わった後、和光純薬社製銀染キットワコーＩＩで添付
の説明書に従い染色した。その結果、ＦＬＡＧキメラ、
ＩｇＧＦｃキメラとも参考例８に記載したウエスタンブ
ロットの結果と同様大きさのバンドに精製タンパクが得
られていることが確認できた。この結果から、配列表の
配列番号１記載のポリペプチドを純品で得ることが出来
た。より高純度なポリペプチドを得るために、上記の方
法で精製されたＦＬＡＧキメラ、ＩｇＧＦｃキメラタン
パクを各々のゲル濾過にて精製を行った。アフィニティ
ーカラムからの溶離液をアミコン社製セントリコン３０
にて濃縮及びＰＢＳ（−）へのバッファー交換を行い、
ゲル濾過はファルマシア社製ＦＰＬＣシステムを用い、
同社のＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムにて行った。実施例
８の２−ＭＥなしの条件のウエスタンブロット結果と同
様の分子量の位置に溶離されるメインピークを分取し
た。以下、このように精製された配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドとＦＬＡＧも
しくはＩｇＧＦｃとのキメラタンパクを各々ＥＸＦＬＡ
Ｇ−ＰＴＮ、ＥＸＩｇ−ＰＴＮと示す。

【００８９】

【参考例１０】新規リセプター型チロシンキナーゼを
認識するモノクローナル抗体の樹立及び新規リセプター
型チロシンキナーゼの発現の確認上記のように精製されたＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮを免疫原
として、成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を
作成した。免疫は３回行い、１回に１匹あたり３０μｇ
を免疫し、３回目の免疫前に採血を行い、血清を分取し
て、免疫したＥＸＦＬＡＧ−ＰＴＮを用いた抗体価の測
定を行い、スクリーニングの際には細胞培養上清がＥＸ
ＦＬＡＧ−ＰＴＮ、ＥＸＩｇ−ＰＴＮを共に認識するウ
エルからクローニングを行った。その結果、マウスモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマが樹立され
た。

【００９０】このようにして作成されたモノクローナル
抗体を用いて、ＵＴ−７、ＭＲＣ−５、および上記の形
質転換細胞株Ｂａ／Ｆ３／ＦＵＬＬ、Ｂａ／Ｆ３／ＦＵ
ＬＬＦＬＡＧ、Ｂａｌｂ／ＦＵＬＬ及びＢａｌｂ／ＦＵ
ＬＬＦＬＡＧをコールター社製フローサイトメーターＥ
ＰＩＣＳエリートにて細胞表面の抗原解析を行った。抗
体による染色は成書の方法に従って行った。１次抗体と
してハイブリドーマ培養上清からファルマシア社製Ｍａ
ｂｔｒａｐＧＩＩを用い、添付の説明書に従って精製し
た抗体を用い、２次抗体としてベクトンデッキンソン社
製ヤギ抗マウスＩｇＦＩＴＣ標識で行った。その結果、
ＵＴ−７、ＭＲＣ−５及び新規リセプター型チロシンキ
ナーゼ遺伝子を導入した細胞が上記のモノクローナル抗
体により染色されることが確認された。

【００９１】また、Ｂａ／Ｆ３／ＦＵＬＬ、Ｂａ／Ｆ３
／ＦＵＬＬＦＬＡＧ、Ｂａｌｂ／ＦＵＬＬ及びＢａｌｂ
／ＦＵＬＬＦＬＡＧの細胞破砕物を用いて同モノクロー
ナル抗体によるウェスタンブロットを行った。細胞破砕
物の調整は以下のように行った。２×１０⁶個の細胞を
セルリシスバッファー（５０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ
７．５）、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０％グリ
セロール、１０ｍＭＮａ ₄Ｐ₄Ｏ₇、１００ｍＭＮ
ａＦ、４ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＮａ₃ＶＯ₄、５０
μｇ／ｍｌＡｐｒｏｔｉｎｉｎ、１００μＭＬｅｒ
ｐｅｐｔｉｎ、２５μＭＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１ｍ
ＭＰＭＳＦ）２００μｌに懸濁し、氷中に２０分間放
置し、その後１４０００ｒｐｍで２０分間遠心し上清を
取り細胞破砕物を得た。このようにして得た各種細胞破
砕物を同マウスモノクローナル抗体を用いて、参考例８
に記載の方法でウェスタンブロットを行った。その結
果、１３０キロダルトンのバンドを特異的に認識するこ
とが確認できた。以上の結果から新規リセプター型チロ
シンキナーゼを認識するモノクローナル抗体を樹立し、
なおかつ配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含
有するポリペプチド産生細胞株が確かに作製されている
ことを確認した。

【００９２】

【実施例】

【００９３】

【実施例１】各種ヒト細胞培養上清の分取及び濃縮精
製上記の方法で精製した配列表の配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列を含有するポリペプチド２種、つまりＦＬＡ
Ｇ、及びＩｇＧＦｃキメラタンパクを用いて、リガンド
を発現している細胞の同定をバイオセンサーＢＩＡｃｏ
ｒｅ（ファルマシア社製）にて行った。

【００９４】ＢＩＡｃｏｒｅで測定するサンプルの調製
は以下のように行った。細胞の名前、細胞の種類、細胞
増殖継代時の培地、細胞の入手先については表１にまと
めた。細胞の培養は表１に示すように各々の細胞に対応
した培地で培養し、付着細胞の場合はコーニング社製の
Ｔー２２５フラスコにコンフルエントになった時点で、
血清を含まないＩＭＤＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）、
１０ｎｇ／ｍｌＰＭＡを含むＩＭＤＭ、１００Ｕ／ｍｌ
ヒトＴＮＦを含むＩＭＤＭに交換し、４日間培養して培
養上清を回収した。付着細胞の場合は細胞濃度５×１０
⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように上記の条件で４日間培
養し培養上清を回収した。回収した培養上清はアミコン
社製セントリプレップ１０で濃縮して、溶液交換し、最
終的にファルマシア社製ＢＩＡｃｏｒｅ用ＨＢＳバッフ
ァーに溶液交換濃縮倍率４０倍から２００倍としてサン
プルを得た。

【００９５】

【実施例２】バイオセンサーＢＩＡｃｏｒｅを用いた
細胞培養上清のスクリーニングＢＩＡｃｏｒｅのセンサーチップには参考例９に記載の
方法で作製、精製されたＥＸＩｇ−ＰＴＮ及びＥＸＦＬ
ＡＧ−ＰＴＮを１００μｇ／ｍｌの濃度に１０ｍＭ酢酸
ナトリウムバッファー（ｐＨ４．０）にて調製し、活性
化されたＢＩＡｃｏｒｅセンサーチップＣＭＣｅｎｔ
ｉｆｉｅｄ（ファルマシア社製）に添付の取扱い説明書
の方法にしたがってアミノカップリングにて結合させ
た。インジェクション量は５０μｌで２回行い、結合後
エタノールアミンでブロッキングして、ベースラインが
安定するまで、ＨＢＳバッファーで洗浄した。流速は以
下のサンプルの測定を含め全て５μｌ／ｍｉｎで行っ
た。結合前と結合後のＢｉｎｄｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔ
ｙ（ＲＵ、ＲｅｓｐｏｎｓｅＵｎｉｔｓ）はおよそ１
００００ＲＵ程度であった。

【００９６】ＢＩＡｃｏｒｅのサンプル導入、測定の条
件は以下のように行った。上記のペプチドが結合したセ
ンサーチップに対しサンプル量３０μｌ（６分間）で流
した。そのプロファイルの１例を図１に示す。ＲＵ値は
初めのベースラインの部分、サンプルが入ることによる
マストランスポート（ベースラインの上がり）を起こし
リガンドがリセプターに結合する部分、通常のＨＳＢバ
ッファーに置換される部分において異なっている。図１
に矢印で示した２点の値、つまり初めのベースラインの
値（サンプル導入の３０秒前の値。図１のＡで示す）と
最終的にＨＳＢバッファーに置き変わった直後値（つま
りサンプル導入後６分１０秒後の値。図１のＢで示す）
の２点の値の差を上昇値として、最終的なＢｉｎｄｉｎ
ｇＡｃｔｉｖｉｔｙとした。１回サンプルを測定しお
わった毎に５０ｍＭ酢酸ナトリウムを含む０．５ＭＮａ
Ｃｌ（ｐＨ４．０）を１５μｌ流してセンサーチップを
洗浄した。

【００９７】測定結果を表２および表３に示す。表２お
よび表３から解るように、ＥＸＩｇ−ＰＴＮ及びＥＸＦ
ＬＡＧ−ＰＴＮの両方にわたって高い値を示したリガン
ド発現細胞候補の代表的な細胞株としてはＣ−１細胞、
リガンドを発現していない細胞株としてはＢＴ−２０細
胞が明らかになった。

【００９８】

【実施例３】新規リセプター型チロシンキナーゼ細胞
外蛋白を用いたリガンド発現細胞の同定もし、リガンドが細胞膜上にも存在するならば、細胞を
参考例９で作製した新規リセプター型チロシンキナーゼ
の細胞外部分を含むポリペプチドでリガンド発現細胞は
染色されるはずである。そこで、参考例９に示したよう
に作製された配列表の配列番号１のアミノ酸配列を含有
するポリペプチドＥＸＩｇ−ＰＴＮを用いて、リガンド
発現細胞の同定をフローサイトメーターにて行った。

【００９９】実施例２でリガンド発現細胞候補とされ
た、Ｃ−１及び発現されていないと考えられたＢＴ−２
０について、５×１０⁶個の細胞を調製し、まず初めに
２％ＦＣＳを含むＰＢＳ（−）（以下ＰＢＳ−Ｆと示
す）に懸濁して、遠心分離３０００ｒｐｍ、１分間の条
件で遠心分離し、洗浄した。そして、これらの細胞を正
常マウス血清（Ｃａｐｐｅｌ社製）をＰＢＳ−Ｆにて１
００倍希釈した溶液の５０μｌに懸濁して、氷中１時間
放置した後、上記の方法で１回洗浄し、次に参考例９で
作製されたＥＸＩｇ−ＰＴＮを５００ｎｇ／μｌの濃度
でＰＢＳ−Ｆにて作製された溶液の５０μｌもしくはＰ
ＢＳ−Ｆの５０μｌに懸濁し氷中にて３０分間放置し
た。その後、上記の方法で２回洗浄した後、ＦＩＴＣ標
識抗ヒトＩｇＧ１（ＢｉｎｄｉｎｇＳｉｔｅ社製）を
同様に反応させて、２回洗浄した後、最終的に２００μ
ｌのＰＢＳ−Ｆに懸濁してフローサイトメーターにて解
析した。フローサイトメーターはコールター社製ＥＰＩ
ＣＳエリートを使用した。

【０１００】その結果を図２に示す。なお、図２の縦軸
は細胞数を示す。横軸は相対蛍光強度を示し、右に行く
ほど強くなる。この結果から、Ｃ−１についてはＥＸＩ
ｇ−ＰＴＮを加えなかったコントロールに比べ蛍光ピー
クのシフト見られ、細胞表面上にもリガンドが存在する
ことが判った。また、ＢＴ−２０については、このよう
なピークのシフトは認められないことから細胞膜上にリ
ガンドが発現されていないことが判った。以上の結果か
ら、少なくとも結腸癌由来細胞株Ｃ−１はリガンド候補
分子を細胞表面にも発現していることが判明した。

【０１０１】

【実施例４】新規リセプター型チロシンキナーゼ遺伝
子導入細胞を用いた自己りん酸化アッセイ系によるリガ
ンド発現細胞の同定実施例２及び３の結果、リガンドを
発現していると考えられる細胞株の１つＣ−１細胞が結
合だけではなく参考例８に記載の形質転換細胞Ｂａ／Ｆ
３／ＦＵＬＬＦＬＡＧの細胞膜表面上に発現されている
新規リセプター型チロシンキナーゼの自己りん酸化を引
き起こすかどうかについて調べるため以下の実験を行っ
た。

【０１０２】すなわち、実施例２に記載した方法で作製
されたＣ−１細胞培養上清濃縮液、Ｃ−１細胞それ自
身、参考例１０に記載のモノクローナル抗体作製時の抗
体価測定時採取されたマウス抗血清について、新規リセ
プター型チロシンキナーゼが反応して自己りん酸化され
得るかどうか調べた。りん酸化を行う前日に新しい培地
に交換し、細胞数５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌにしたＢ
ａ／Ｆ３／ＦＵＬＬＦＬＡＧを実験当日細胞数を５×１
０6 個取り出して以下の５種の液５００μｌに懸濁し
て、２０分間、３７℃にてＣ０2 インキュベーター中で
反応させた。

【０１０３】５種の反応液は反応系１．培地（ＲＰＭＩ
１６４０、１０％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌマウスＩＬ
−３）のみ、反応系２．Ｃ−１細胞５×１０⁶個を反応
系１の培地で懸濁した懸濁液、反応系３．参考例１０に
記載のマウス抗血清を反応系１の培地で１００倍希釈し
た溶液、反応系４．参考例１０に記載のマウス抗血清を
反応系１の培地で５００倍希釈した溶液、反応系５．実
施例２に記載した方法で作製されたＣ−１細胞の細胞培
養上清をセントリプレップ１０（アミコン社製）にて５
０倍濃縮し、反応系１の培地に溶液交換を行った溶液、
で行った。

【０１０４】反応後細胞をすぐさま氷中に置き、あらか
じめ冷やしておいた２ｍＭバナジン酸ナトリウム（Ｎａ
3 ＶＯ4 ）を含むＰＢＳ（−）を１ｍｌ加え、４℃にて
３０００ｒｐｍ、１分間遠心して細胞を沈降させ、同様
の作業をさらにもう１度行った後、参考例１０記載の方
法で細胞破砕溶液を得た。この細胞破砕溶液にＫｏｄａ
ｋ社製Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＭ２Ａｆｆｉｎｉｔｙ
Ｇｅｌを３０μｌ加えて、沈澱を起こさないようにゆっ
くりと回転させながら、４℃にて反応させて、ゲル上に
ＦＬＡＧアミノ酸配列を有する配列表の配列番号２のア
ミノ酸配列を有するポリペプチドを吸着させた。反応
後、４℃、５０００ｒｐｍの条件で３分間遠心を行いゲ
ルを沈澱させて、ゲルを吸わないように上清を除いた
後、参考例１０に記載のセルリシスバッファーを２００
μｌ加えて懸濁した。更に同様に遠心操作、懸濁操作を
３度行い、ゲルの沈澱物を得た。以上と同様な実験をＢ
ａ／Ｆ３／ＦＵＬＬＦＬＡＧだけではなくＢａ／Ｆ３／
ＣＯＮについても行って同様のゲル沈澱物を得た。

【０１０５】このゲル沈澱物に参考例８に記載の方法で
ウェスタンブロットを行った。ゲルの沈澱物３０μｌの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加えて、２−Ｍ
Ｅ存在下で沸騰水浴５分行い、１５μｌを１つのレーン
に流してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。同一サンプルが転
写されたＰＶＤＦメンブランを２組作り、１組は目的の
ＦＬＡＧ配列を有する配列表の配列番号２番のアミノ酸
配列を有するポリペプチドが回収されていることを確認
し、もう一方ではチロシン残基のりん酸化の有無の判定
に用いた。この結果を図３に示す。Ａ及びＢは目的の配
列表の配列番号２のアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドＢａ／Ｆ３／ＦＵＬＬＦＬＡＧの結果で、Ｃ及びＤは
それのコントロールであるＢａ／Ｆ３／ＣＯＮの結果で
ある。抗体の染色はＡ及びＣが抗りん酸化チロシン抗体
（ＵＢＩ社製）で、Ｂ及びＤはＡｎｔｉ−ＦＬＡＧＭ２
（Ｋｏｄａｋ社製）によっておこなった。各レーンの番
号は上記の反応系の番号に対応する。矢印はＦＬＡＧ配
列を有する配列表の配列番号２に記載のポリペプチドの
位置を示す。

【０１０６】この結果から、Ｃ−１細胞との共培養、も
しくはマウス抗血清の刺激によって新規リセプター型チ
ロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を活性化させ、
自己のチロシン残基のりん酸化を引き起こすことが判明
した。しかしながら、培地のみではそのようなチロシン
残基のりん酸化は見られなかった。さらに、マウス抗血
清の濃度条件を変化させても、Ｃ−１細胞との共培養ほ
ど強くりん酸化されていないことから、ポリクローナル
抗体は本発明のリガンドと同等の作用を有するが、明ら
かに本発明のリガンドの方がより強く新規リセプター型
チロシンキナーゼの酵素活性を上昇させ、より強くチロ
シン残基のりん酸化を引き起こし、新規リセプター型チ
ロシンキナーゼを通した生理活性作用を細胞に及ぼすと
考えられた。

【０１０７】一方、Ｃ−１細胞の培養上清の５０倍濃縮
液ではチロシン残基の極めて弱いりん酸化しか引き起こ
さなかったが、実施例２のＢＩＡｃｏｒｅの結果ではリ
ガンドが細胞培養上清に存在することから、細胞培養上
清中のリガンド量が極めて少なく５０倍濃縮程度の濃度
では十分に新規リセプター型チロシンキナーゼの細胞内
部分のチロシンキナーゼ活性を上昇させない、もしくは
細胞表面上の方では部分的に高濃度になり高い活性を有
すためかは不明であるが、結果的に極めて弱いチロシン
自己りん酸化しか引き起こさなかったと推定された。

【０１０８】同様な実験をヒト正常血清、マウス正常血
清、ＦＣＳ、細胞株としてはＢＴ−２０について行った
がチロシン残基のりん酸化は確認できなかったことか
ら、この反応は新規リセプター型チロシンキナーゼに対
する、Ｃ−１細胞上にある特異的なリガンドによる作用
によると考えられた。以上の実施例２、３及び４の結果
からリガンド発現細胞としてすくなくともＣ−１があげ
られ、またそのリガンドはその細胞培養上清、及び細胞
膜上に存在し、これらから精製できることが示された。

【０１０９】

【実施例５】新規リセプター型チロシンキナーゼを用
いたリガンドのアフィニティーカラムによる精製実施例４までの結果から、結腸癌由来細胞株Ｃ−１がリ
セプター型チロシンキナーゼの新規なリガンドを確実に
発現していると考えられることから、その培養上清から
ｐＥＸＩｇ−ＰＴＮを結合させたアフィニティーゲルカ
ラムを用いて精製することを試みた。

【０１１０】Ｃ−１の上清は実施例１に記載の方法で作
製されて最終的に５４０ｍｌ分取し、これをアミコン社
製セントリプレップ１０で４５ｍｌにした濃縮液を用い
た。この濃縮液を実施例２に記載した方法にて測定した
ＢＩＡｃｏｒｅの値は１３４ＲＵであった。アフィニテ
ィーカラムの作製はファルマシア社製ＣＮＢｒ活性化Ｓ
ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂにて添付の取扱い説明書に従い行
った。最終的に４．１ｍｇのＥＸＩｇ−ＰＴＮが３．５
ｍｌのゲルに結合したアフィニティーゲルが作製でき
た。カップリング効率は９９．６％であった。このゲル
の２ｍｌを２ｃｍ²×１ｃｍのサイズのカラムを作製し
た。このカラムに対し上記の細胞培養上清濃縮液を２０
ｍｌ／ｈｒの速度で流し、その後同一速度でＰＢＳ
（−）を１５ｍｌ流して洗浄し、最終的に０．１Ｍ酢酸
ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ（ＰＨ４．０）にて溶出
した。この溶離液を１ｍｌづつ分取し、各画分に１ＭＴ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌづつ加え
て、中和した。

【０１１１】このようにアフィニティーカラムにて精製
分画された溶液を各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて中に含
まれているタンパク分子の分子量の確認を行った。その
際のサンプルバッファーは２−ＭＥを含まないものを用
い、加熱しない非還元条件で行い、ゲルは１５〜２０％
のグラディエントゲルを用いて行った。分子量マーカー
はファルマシア社製ＬＭＷＫｉｔＥを用いた。電気
泳動終了後、和光純薬社製ワコー銀染キットＩＩを用い
て、添付の染色方法に従って銀染色を行った。その結果
を図４に示す。溶出液に入れ替わった直後から溶離され
てくるバンドが各種確認されたが、この中のバンドのど
れが目的のリガンドに当たるかは、この時点では不明で
あった。そのため、濃縮前、カラム素通り画分、洗浄
液、及び分画した溶離液（これについては５分の１希
釈）の各画分を、ミリポア社製ウルトラフリーＣ３ＬＧ
Ｃ（１０Ｋカット）を用いて、ＨＢＳバッファーに溶液
交換し、再度ＢＩＡｃｏｒｅで実施例２に記載の方法で
測定した。その結果を表４に示す。この結果から、配列
表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するポリペプ
チドを含むポリペプチドに結合するリガンドと考えられ
る化合物が確かにフラクション番号４の画分をピークと
して濃縮、精製されていることが確認できた。

【０１１２】

【実施例６】リセプター型チロシンキナーゼの新規な
リガンドのゲル濾過精製及び分子量の測定次に、実施例５に示したアフィニティー精製されたピー
クのフラクション番号４の画分の３００μｌをミリポア
社製ウルトラフリーＣ３ＬＧＣ（１０Ｋカット）を用い
て、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）に溶
液交換し、同時に６倍に濃縮し、ゲル濾過を行った。

【０１１３】ゲル濾過のカラムはファルマシア社製Ｓｕ
ｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３０を使用し、分離バッフ
ァーは０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）を
使用した。流速は４０μｌ／ｍｉｎの条件でおこなっ
た。サンプルの分離前にファルマシア社製分子量マーカ
測定キットＬＭＷ用にて溶離位置の分子量の測定をおこ
なったのち、上記のサンプルのゲル濾過を行い、１画分
２０μｌに分画した。

【０１１４】このように分子量分画されたサンプルをＨ
ＢＳバッファーにて１０培希釈し、ＢＩＡｃｏｒｅの測
定を行った。ゲル濾過フラクションの２１４ｎｍの吸収
光度の値変化を図５に示し、各フラクションのＢＩＡｃ
ｏｒｅの測定結果を図６に示す。この結果からフラクシ
ョン番号１３及び１４にピークおよびフラクション番号
２１及び２２にピークを持つ配列表の配列番号２のアミ
ノ酸配列を有すポリペプチドに結合するリガンドのピー
クが検出された。特に、後者のフラクション番号２１及
び２２にピークとするリセプター型チロシンキナーゼの
新規なリガンドの分子量は、前もって行った分子量マー
カーの結果から、ゲル濾過の結果より２８０００±２０
００ダルトンと推定された。

【０１１５】

【実施例７】リセプター型チロシンキナーゼの新規な
リガンドのアフィニティーカラムを用いた再精製及び純
品作製さらに、上記のゲル濾過の活性画分（フラクション番号
２０から２３）を回収して、再度実施例５に記載の方法
で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有する
ポリペプチドを用いたアフィニティーカラムにて精製し
た。カラムは小スケールのベットボリューム１５０μｌ
のものを用いて、自然落下にて溶出した。上記の活性画
分フラクション番号１２から１５を集め、上記の小スケ
ールカラムに流した。その後、１５０μｌの０．０２％
Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（−）を８回流して洗浄し
た後、１５０μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５Ｍ
ＮａＣｌ（ＰＨ４．０）を４回流して各画分に分画して
溶出した。溶出液には１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．
５）を３０μｌづつ加えて中和した。

【０１１６】このようにして最終精製されたリガンドを
その純度を確かめるために、各画分をミリポア社製ウル
トラフリーＣ３ＬＧＣ（１０Ｋカット）を用いて１０μ
ｌに濃縮後、各画分ごとにＳＤＳ−ＰＡＧＥにて中に含
まれている物質の確認を行った。その際のサンプルバッ
ファーは２−ＭＥを含まないものを用い、加熱しない非
還元条件で行い、ゲルは１５〜２０％のグラディエント
ゲルを用いて行った。分子量マーカーはファルマシア社
製ＬＭＷＫｉｔＥを用いた。電気泳動終了後、和光
純薬社製ワコー銀染キットＩＩを用いて、添付の染色方
法に従って銀染色を行った。

【０１１７】結果を図７に示す。この結果から２３５０
０±１５００ダルトンのバンドがフラクション番号１及
び２に単一物として精製されていることが確認された。
以上の結果から、これらの方法で本発明のリセプター型
チロシンキナーゼの新規なリガンドが精製できることが
示され、純品を得ることが出来た。実施例６のゲル濾過
の分子量の結果とＳＤＳ−ＰＡＧＥの分子量の結果は一
致しないがゲル濾過はゲルとの相互作用などによりその
推定分子量が実際の物質と異なることがあるため、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥの値である２３５００±１５００ダルトン
が本発明のリセプター型チロシンキナーゼの新規なリガ
ンドの分子量と推察された。

【０１１８】

【実施例８】リセプター型チロシンキナーゼの新規な
リガンドの呈色反応実施例７に記載の方法で精製されたリガンドの純品を、
実施例５に記載の方法で同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこ
なった。このようにして新規なリガンドが泳動されたポ
リアクリルアミドゲルを、タンパク質の特異的な染色法
であるクマシーブリリアントブルー染色和光純薬社製ク
イックＣＣＢキットを用いて、添付の実験方法に従って
染色を行ったところ、本発明のリガンドであるおよそ２
４０００ダルトンのバンドが染色され、本発明のリガン
ドにはタンパク質が含まれていることが判明した。

【０１１９】更に、同様に作製されたポリアクリルアミ
ドゲルを糖鎖の特異的な染色法であるＰＡＳ染色にて検
出した。すなわち、リガンドが泳動されたポリアクリル
アミドゲルを１２．５％のトリクロロ酢酸溶液に３０分
間振とうしながら浸し、次に蒸留水にて同様に３０秒間
振とうしながら浸し、ついで１％過ヨウ素酸を含む３％
酢酸溶液にて５０分間振とうしながら浸した。その後、
蒸留水にてよく振とうして洗浄をおこなった。洗浄は１
回１０分間で８回行った。洗浄後、暗所にてフクシン液
（１ｇの塩基性フクシン（和光純薬社製）を６０℃に加
熱した２００ｍｌの蒸留水に溶かし、これに対して１ｇ
の亜硫酸水素ナトリウム、２０ｍｌの１ＮＨＣｌを加え
て作製した。）に１時間程度浸して染色した。最後に
０．５％亜硫酸ナトリウム溶液にて１０分間振とうして
洗浄し、更にこれを２回繰り返し、最終的に蒸留水中に
置きバンドの観察を行ったところ、ＰＡＳ染色されてい
る赤色バンドが分子量およそ２４０００ダルトンに確認
できた。この結果から本発明のリガンドは糖を含むこと
が判明した。以上の２つの呈色反応の結果から、本発明
のリガンドは糖タンパク質を含む化合物であることが判
明した。

【０１２０】

【実施例９】リセプター型チロシンキナーゼの新規な
リガンドのＮ末端からのアミノ酸配列の決定実施例７に記載した方法により精製した新規リガンドを
含む溶液を、プロスピン（アプライドバイオシステム社
製）にのせ、遠心後、専用のポンチでプロスピン中のＰ
ＶＤＦフィルターを取り出した。フィルターは、５０％
メタノール水溶液、及び精製水でよく洗浄後、ペプチド
シークエンサー解析機にてＮ末端の配列を決定した。ペ
プチドシークエンサーは、アプライドバイオシステム社
のプロテイン・シークエンサーｍｏｄｅｌ４９２を使用
し、附属の取扱い説明書に従って解析を行った。

【０１２１】Ｎ末端からの解析の結果、配列表の配列番
号１９に記載したアミノ酸配列、すなわちＮ末端からLy
s-SerーIleーValーLeuーGluーProーIleーTyrーTrpーAsnーSerーSerー
AsnーーSer-Lys-Phe-Leu-Pro-Gly-Gln-Gly-Leu-Val-Leu-T
yr-Pro-Gln-Ile-Gly-Asp-Lys-Leu-Asp-Ile-Ile-XXX-Pro
-Lys-Val-Asp-XXX-Lys-Thr-Val-Gly-XXX-Tyrの配列を有
していることが示された。ただし、このアミノ酸配列に
はアミノ酸残基が決定できなかった残基が３つあり、こ
れらの残基については各々XXX と示した。この結果か
ら、本発明のリガンドは配列表の配列番号１のアミノ酸
配列を有すポリペプチドを含む化合物であることが示さ
れた。アミノ酸残基が不明である部分に関して、配列表
の配列番号１９のアミノ酸配列の３７番のアミノ酸残基
前後のアミノ酸配列が明瞭に判断できていることから、
ジスルフィド結合したシステイン残基、もしくは糖鎖な
どで修飾されたアミノ酸残基など、アミノ酸が何らかの
修飾を受けた結果アミノ酸配列が決定できなかったと考
えられる。

【０１２２】

【実施例１０】ＰＣＲ法によるリガンドのｃＤＮＡプ
ローブの作成実施例９で行ったＮ末端からのアミノ酸配列より、オリ
ゴヌクレオチド混合プライマーを用いたＰＣＲ法にてｃ
ＤＮＡプローブの作成を行った。すなわち、実施例１に
記載のＰＭＡを含む条件で培養された該Ｃ−１細胞のｍ
ＲＮＡよりｃＤＮＡを作成し、実施例９の結果判明した
アミノ酸配列よりセンス及びアンチセンスの２０ｍｅｒ
の混合プライマーを合成し、ＲＴ−ＰＣＲを行い、ｐＢ
ｌｕｅｓｃｒｉｐｔにサブクローニングして、遺伝子配
列を決定し、その遺伝子がコードしているアミノ酸配列
と実施例９で決定されたアミノ酸配列を比較して、確か
にリガンドのアミノ酸配列の一部をコードしているｃＤ
ＮＡプローブであることを確認した。

【０１２３】Ｃ−１細胞からのｍＲＮＡ、すなわちＰｏ
ｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡの分離、精製は次のように行った。
実施例１の条件で培養したＣ−１細胞をセルスクレイパ
ー（コーニング社製）で剥し、ＰＢＳ（−）で２回遠心
分離洗浄を行った。この細胞沈澱物の細胞数３×１０⁸
個を４Ｍグアニジン・イオシアネート、２０ｍＭ酢酸ナ
トリウム（ｐＨ５．２）、０．１ＭＤＴＴ，０．５％
Ｎ−ラウリルサルコシルから構成される全ＲＮＡ抽出溶
液２０ｍｌに懸濁させ、テルモ社製の２０Ｇの針を通す
ことにより完全に溶解、分散させた。その後、５０００
ｇで遠心分離を２０分間行い、上清を回収した。次に、
上記の全ＲＮＡ抽出溶液で全量を２５ｍｌとした後、
５．７Ｍ塩化セシウム、０．１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．
０）溶液の１２ｍｌを前もって入れておいた遠心分離チ
ューブに重層し、１８℃にて２５０００回転で一晩遠心
分離した。

【０１２４】遠心分離の結果、全ＲＮＡを含む沈澱物を
回収し、それにＴＥＳ溶液（１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ
７．４）、５ｍＭＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ）の７２０
μｌを加えて室温に１０分間放置して溶解し、この溶液
を１．５ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、溶液に
対して同体積のクロロフォルム／１−ブタノール（４：
１）を加えて良く撹拌し、１５０００回転、５分間遠心
分離し、上層を回収し同様の操作を更にもう１度繰り返
し、上層を回収した。

【０１２５】次に回収した溶液を２本のエッペンドルフ
チューブに等量ずつ分注し、各々に３Ｍ酢酸ナトリウム
溶液（ｐＨ５．２）を３０μｌ、エタノールを８５０μ
ｌ加えて、−８０℃に３０分間放置後、４℃にて１５０
００回転で遠心分離を１５分間行い、全ＲＮＡを沈澱さ
せた。更に同様に、全ＲＮＡを含む沈澱物を各々３６０
μｌの滅菌蒸留水に溶かして、３Ｍ酢酸ナトリウム溶液
（ｐＨ５．２）を３６μｌ、エタノールを１ｍｌ加え、
−８０℃に３０分間放置後、４℃にて１５０００回転で
遠心分離を１５分間行い、再度全ＲＮＡを沈澱させて精
製した。このようにして得られた全ＲＮＡを７０％エタ
ノールで洗浄し、風乾した後、各々１００μｌの滅菌蒸
留水に溶解し、２６０ｎｍの吸光度にてＲＮＡ量を定量
した。この結果、２．４ｍｇの全ＲＮＡが回収されてい
ることが確認された。次に、上記の方法で得られたＣ−
１細胞の全ＲＮＡからｍＲＮＡ、すなわちＰｏｌｙ
（Ａ）+ ＲＮＡの分離を行った。分離はファルマシア社
製のｍＲＮＡｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔを用
い、添付の説明書に従って、オリゴｄＴカラムによる精
製を行った。この結果、６００μｇの全ＲＮＡより１５
μｇのＰｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡが回収された。

【０１２６】このようにして、精製されたＰｏｌｙ
（Ａ）+ ＲＮＡをライフサイセンス社製Ｆｉｒｓｔ−ｓ
ｔｒａｎｄｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＫｉｔ
（宝酒造株式会社より購入）を用いて、添付の取扱い説
明書に従って、ｃＤＮＡの合成を行った。すなわち、上
記のＰｏｌｙ（Ａ）+ ＲＮＡの２μｇを最終的に体積が
１６μｌになるように希釈し、これに対して本キットに
添付のオリゴｄＴ（１２−１８）溶液（０．５μｇ／μ
ｌ）もしくはランダムヘキサマー（１００ｎｇ／μｌ）
を１μｌ加え、７０℃に１０分間放置し、次いで氷中に
１０分間放置した。次に、キットに添付の５×緩衝液を
５μｌ、ＲＮａｓｅインヒビターであるＲＮａｓｉｎ溶
液を１μｌ、０．２５ＭＤＴＴを１μｌ、アビアンミ
エロブラストシスウイルス逆転写酵素（ａｖｉａｎｍ
ｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓｖｉｒｕｓｒｅｖｅｒ
ｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ：２５Ｕ／μｌ）溶
液を１μｌを各々加え、４１℃で６０分間放置してｃＤ
ＮＡを合成した、その後７２℃に１０分間放置して酵素
を失活させ、これを次のＰＣＲに用いた。

【０１２７】リガンドのアミノ酸配列の１部をコードす
るｃＤＮＡプローブの作製の為のＰＣＲは次のように行
った。すなわち、配列表の配列番号１９に記載のリガン
ドのＮ末端からアミノ酸配列の５番目のロイシンから１
１番目のアスパラギンまでのアミノ酸配列、すなわちLe
uーGluーProーIleーTyrーTrpーAsn のアミノ酸配列をコードす
るｃＤＮＡ配列のあらゆる可能性に対応した２０ｍｅｒ
のオリゴヌクレオチド混合センスプライマー、すなわち
配列表の配列番号２０に記載の配列（5'-(TC)T(ACGT)GA
(AG)CC(ACGT)AT(TCA)TA(TC)TGGAA-3',プライマー９）を
有す合成ＤＮＡ、更にこのアミノ酸配列のＣ末端方向の
アミノ酸配列、すなわち配列表の配列番号１９に記載の
アミノ酸配列の３４番目のアスパラギン酸から４１番目
のバリンまでのアミノ酸配列、すなわちAsp-Ile-Ile-XX
X-Pro-Lys-Val のアミノ酸配列に関して、アミノ酸配列
が不明であるXXX 部分については、実施例９に示したよ
うにリガンドが内部でジスルフィド結合しているシステ
イン残基であり、ペプチドシークエンサーで解析不能で
あったと予想されたため、Asp-Ile-Ile-Cys-Pro-Lys-Va
l のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列のあらゆる
可能性に対応した２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチド混合
アンチセンスプライマー、すなわち配列表の配列番号２
１に記載の配列（5'-AC(TC)TT(ACGT)GG(AG)CA(AGT)AT(A
GT)AT(AG)TC-3'、プライマー１０）を有す合成ＤＮＡの
以上２種を参考例２に記載した方法に従って作製した。

【０１２８】ＰＣＲによるプローブ作製は以下のように
行った。上記の方法で作製されたＣ−１のｃＤＮＡ溶液
を２種混合し、この混合液の１０μｌを使用し、１０倍
濃度緩衝液（５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭＭｇＣｌ2 、
０．０１％ゼラチン）１０μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕ
ｒｅ（宝酒造社製）８μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラ
ーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ：Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社
製、５Ｕ／μｌ）０．５μｌを加え、上記のプライマー
９及び１０が最終濃度で１０μＭになるように加え、最
後に脱イオン水を加えて全量を１００μｌとして、９５
℃で０．５分間、４２℃で０．５分間、７２℃を１分間
からなる行程を１サイクルとして、この行程を５サイク
ル行い、続いて、９５℃で０．５分間、４８℃で０．５
分間、７２℃を１分間からなる行程を１サイクルとし
て、この行程を３５サイクル行い、最後に７２℃にて７
分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を
３％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジュウムブロ
マイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察
し、約１１０ｂｐのＤＮＡが増幅されていることを確認
した。

【０１２９】次にこのＰＣＲ産物の全量を低融点アガロ
ースにて作成した３％アガロースゲルにて電気泳動し、
エチジュウムブロマイドにて染色後、紫外線照射下にて
約１１０ｂｐのバンドを切り出し、ゲルの３倍量のＴＥ
溶液を加え、６５℃にて１０分間加熱し、ゲルを完全に
溶かしたのち、等量のＴＥ飽和フェノール（日本ジーン
社製）を加えて、１５０００ｒｐｍ５分間遠心分離後上
清を分離し、さらに同様な分離作業をＴＥ飽和フェノー
ル：クロロフォルム（１：１）溶液、さらにクロロフォ
ルムにて行った。最終的に得られた溶液からＤＮＡをエ
タノール沈澱して回収した。回収したＤＮＡを宝酒造社
製のＤＮＡＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔを用いて、添付
の取扱い説明書に従い、末端の平滑化を行い、次いで宝
酒造社製Ｔ４ＰｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅＫｉｎ
ａｓｅを用いて、同社発行の遺伝子工学製品ガイド（１
９９４ー１９９５年版）に記載の方法に従って、末端の
りん酸化を行った。

【０１３０】このように末端が平滑化、りん酸化された
ＰＣＲ産物を、前もって制限酵素ＥｃｏＲＶ（宝酒造社
製）で消化し、末端を宝酒造社製ＡｌｋａｌｉｎｅＰ
ｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＣＩＡＰ）にて、同社発行の遺
伝子工学製品ガイド（１９９４ー１９９５年版）に記載
の方法に従って末端の脱りん酸化したｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔに宝酒造社製ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔ
Ｖｅｒ２を用いて、添付の取扱い説明書に従ってライ
ゲーションを行った。

【０１３１】このライゲーション液の２μｌを大腸菌Ｊ
Ｍ１０９（東洋紡社製）に遺伝子導入し、アンピシリン
を５０μｇ／ｍｌ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半
固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置
し、現れてきたコロニーをランダムに選択し、ｃＤＮＡ
が組み込まれていることをＭ１３ユニバーサルプライマ
ー、リバースプライマー（これらのプライマーの配列な
どに付いてはストラタジーン社のｐＢｌｅｕｓｃｒｉｐ
ｔの取扱い説明書を参考にして参考例２に記載した方法
で作製した。）を用いたＰＣＲ法にて、インサートを含
まないｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔより１１０ｂｐ大きなバ
ンドが確認されるクローンを選択した。確認されたクロ
ーンについて、組み込まれているｃＤＮＡの塩基配列を
アプライドバイオシステム社の螢光ＤＮＡシークエンサ
ーにて決定した。

【０１３２】その結果、配列表の配列番号７に記載のＤ
ＮＡ配列の１３８番から２０４番の配列を有す遺伝子断
片を有しているＰＣＲ産物がクローニングされているこ
とが確認され、リガンドのアミノ酸配列の一部のアミノ
酸配列をコードしているｃＤＮＡ断片のプローブが作製
された。そのＤＮＡプローブの遺伝子配列を配列表の配
列番号２２にそれがコードするアミノ酸配列と共に示
す。本ＤＮＡ配列と配列表の配列番号７に記載のＤＮＡ
配列の１１８番から２２４番の配列とは５カ所異なって
いるが、これらはＰＣＲプライマー由来のＤＮＡ配列部
分にあたり、ＰＣＲにより人工的に作製されたものに由
来すると考えられる。

【０１３３】

【実施例１１】Ｃ−１細胞ｃＤＮＡライブラリーの作
成及びリガンドの全長ｃＤＮＡクローニング並びにその
解析実施例１０で作製したｃＤＮＡプローブを用いて、リガ
ンドのアミノ酸配列の全長をコードするｃＤＮＡのクロ
ーニングを行った。まず初めに、実施例１０で精製され
たＰｏｌｙＡ+ ＲＮＡを用いて、Ｃ−１細胞のｃＤＮＡ
ライブラリーを作製した。ｃＤＮＡの作製はＧＩＢＣＯ
ＢＲＬ社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＮａ
ｓｅＨ- を使用した。実施例１０で精製されたＰｏｌｙ
Ａ+ ＲＮＡの２μｇを最終的な体積が６μｌとなるよう
に５ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）で希釈し、６５℃で
５分間放置し、次いで氷上に５分間放置後、次の溶液を
加えた。すなわち、上記のＧＩＢＣＯＢＲＬ社のＳｕ
ｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＲＮａｓｅＨ- に添付の
５×ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅバッ
ファー（０．２５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、０．３７５Ｍ塩化カリウム、１５ｍＭ塩化マグネ
シウム）を５μｌ、０．１ＭＤＴＴを２．５μｌ、１
０ｍＭｄＮＴＰ溶液（ベーリンガーマンハイム社製の１
００ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ溶
液を等量混ぜ合わせて作製し、各々の最終濃度が１０ｍ
Ｍとなるように蒸留水で希釈して作製した溶液）を１．
５μｌ、プロメガ社製のＲＮａｓｅインヒビター溶液を
１μｌ、ＧＩＢＣＯＢＲＬ社製の５００μｇ／ｍｌオ
リゴｄＴ（１２−１８）溶液を２．５μｌ、滅菌蒸留水
を１０．５μｌを加えた。その後、１０分間室温で放置
し、次にＧＩＢＣＯＢＲＬ社のＳｕｐｅｒＳｃｒｉ
ｐｔＩＩＲＮａｓｅＨ- 酵素溶液を１μｌ加え、３
７℃で１時間放置した。そして、更に同酵素溶液を１μ
ｌ加え、４５℃で３０分間放置し、次に氷中で２０分間
放置した。以上の過程により一本鎖ｃＤＮＡが作製され
た。

【０１３４】そして次に、この溶液に１０×Ｓｅｃｏｎ
ｄ−Ｓｔｒａｎｄ反応用バッファー（１８０ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、９０６ｍＭ塩化カリウ
ム、４６ｍＭ塩化マグネシウム）を２０μｌ、０．１Ｍ
ＤＴＴを７．５μｌ、上記の１０ｍＭｄＮＴＰ溶液を
３μｌ、滅菌蒸留水を１３４．４μｌを各々加え、氷中
に５分間放置後、ファルマシア社製ＲＮａｓｅＨ（２ｕ
ｎｉｔ／μｌ）を２μｌ、ファルマシア社製ＤＮＡポリ
メラーゼ（５０ｕｎｉｔ／μｌ）を８．１μｌを加え、
１６℃に２時間半放置した。その後、フェノール／クロ
ロフォルム（１：１）溶液を２００μｌ加え、良く混ぜ
合わせた後、１５０００回転で５分間遠心分離した後、
上層を回収し、さらにクロロフォルムを２００μｌ加
え、同様に遠心分離し上層を回収した。次に、３Ｍ酢酸
ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を１６．７μｌ、エタノ
ールを４３４μｌ加え、−８０℃に３０分間放置した
後、４℃、１５０００回転で１５分間遠心分離し、２本
鎖になったＣ−１のｃＤＮＡを沈澱させた。その後、７
０％エタノールで洗浄した後、風乾し、滅菌蒸留水で１
／１０に希釈したＴＥバッファー（日本ジーン社製）の
３０μｌに溶解した。

【０１３５】次に、このｃＤＮＡを宝酒造社製のＤＮＡ
ＢｌｕｎｔｉｎｇＫｉｔを用いて、添付の取扱い説
明書に従い、末端の平滑化を行い、最終的に２０μｌの
ＴＥバッファーに溶解した。このｃＤＮＡを用いて、ア
マシャム社製ｃＤＮＡクローニングシステムλｇｔ１０
にて、添付の実験方法に従って、Ｃ−１細胞のλｇｔ１
０ｃＤＮＡライブラリーを作製した。最終的に作製され
たｃＤＮＡのタイターはホストとしてＮＭ５１４（上記
キットに添付されている）使用して測定したところ、お
よそ１×１０⁸ｐｆｕ／μｇｐｏｌｙＡ+ ＲＮＡであ
った。

【０１３６】以上の方法で作製されたｃＤＮＡライブラ
リーを参考例６に記載した方法と同様の方法でプラーク
ハイブリダイゼーション法にてスクリーニングした。検
索したライブラリーのプラーク数は４×１０⁵個で、ス
クリーニングに用いたプローブは配列表の配列番号２２
に記載のＤＮＡ配列を有するＤＮＡをＰＣＲ法にて作製
し、そのラベリング方法は同様に参考例６に記載したラ
ベリング方法で32Ｐラベルした。

【０１３７】スクリーニングの結果、最終的に４クロー
ン分離された。クローン名はＴ２、Ｔ３、Ｔ５、Ｔ６と
命名した。各々クローンのファージＤＮＡをＭａｎｉａ
ｔｉｓらの編集した前述の成書の方法に従い、精製し
た。これらの４種のＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩにて消
化してアガロールゲル電気泳動にて、λｇｔ１０からリ
ガンドのｃＤＮＡのインサート部分を切り出し、アガロ
ールゲル電気泳動にてそのサイズを調べたところ、全て
のクローンとも３つのバンドが確認された。それらのお
およそのＤＮＡのサイズは各々Ｔ２が３００ｂｐ、５０
０ｂｐ、１８００ｂｐで、Ｔ３が３００ｂｐ、８００ｂ
ｐ、４０００ｂｐで、Ｔ５が３００ｂｐ、８００ｂｐ、
１５００ｂｐで、Ｔ６が３００ｂｐ、８００ｂｐ、２０
００ｂｐであった。そこでこれらの１２種のバンドをア
ガロースゲルから切り出して、前述の方法で精製し、前
もって制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、末端の脱りん酸
化を行ったｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔに前述の方法でライ
ゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した。こ
れらのクローンに各々の遺伝子断片がサブクローニング
されていることを確認後、プラスミドＤＮＡを精製し
て、アプライドバイオシステム社製ＤＮＡシークエンサ
ーと同社の蛍光ラベリングキットを使用して遺伝子配列
を決定した。また、上記の３００ｂｐ以上のサイズのＤ
ＮＡについては各々制限酵素サイトのマッピングを行
い、その結果生じた遺伝子断片を上記の方法でサブクロ
ーニングを行うこと及び宝酒造社製のキロシーキエンス
用デリューションミュータント・キットを用い、添付の
取扱い説明書に従ってデリューションミュータント作製
することを組み合わせて両方向からの遺伝子配列を決定
した。

【０１３８】その結果、明らかになった遺伝子配列か
ら、上記のＴ２、Ｔ３、Ｔ５、Ｔ６の４クローンとも共
通であった約３００ｂｐの遺伝子断片は配列表の配列番
号７のＤＮＡ配列の１３５番から３８１番の部分にあた
る２４６ｂｐ遺伝子配列を有する遺伝子断片であること
が明らかとなった。したがって、ちょうどこれらの遺伝
子断片は配列表の配列番号７のＤＮＡ配列の１３５番か
ら１４０番及び３７６番から３８１番にある制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩのサイトで切り出されたものであることが明ら
かになった。次に、Ｔ２の５００ｂｐ、Ｔ３の８００ｂ
ｐ、Ｔ５の８００ｂｐ、Ｔ６の５００ｂｐの１方向にお
いて遺伝子配列に一致部分が見いだされ、さらにその一
致しなかった方向に関しては、ライブラリー作製に使用
したアマシャム社製ｃＤＮＡクローニングシステムλｇ
ｔ１０のアダプターの配列が見いだされた。また、Ｔ２
の１８００ｂｐ、Ｔ３の４０００ｂｐ、Ｔ５の１５００
ｂｐ、Ｔ６の２０００ｂｐにおいても同様に１方向にお
いて遺伝子配列に一致部分が見いだされ、さらにその一
致しなかった方向に関しては、ライブラリー作製に使用
したアマシャム社製ｃＤＮＡクローニングシステムλｇ
ｔ１０のアダプターの配列が見いだされた。また、最も
大きな遺伝子断片Ｔ３の約４０００ｂｐの遺伝子断片に
ついては、そのアダプター配列に続きＰｏｌｙＡの配列
が見いだされた。

【０１３９】これらの遺伝子配列から、各々クローンの
各々の遺伝子断片方向とつながり方をＰＣＲ法を用いた
方法及び上記のファージＤＮＡの制限酵素サイトのマッ
ピング、さらにそれらの遺伝子配列を決定し、これらを
対比した結果、リガンドをコードしているｃＤＮＡは、
その５’方向には各々のクローンの約５００〜８００ｂ
ｐの遺伝子断片が位置し、ついで約３００ｂｐの遺伝子
断片が、そして３’方向には残りの約１５００〜４００
０ｂｐの遺伝子断片が位置していることが明らかになっ
た。上記のように並べたｃＤＮＡ遺伝子配列をそれがコ
ードしているアミノ酸配列を配列表の配列番号１９に記
載したリガンドのＮ末端アミノ酸配列を対比した結果、
該リガンドがタンパク質として翻訳された際のアミノ酸
配列は配列表の配列番号７に記載したアミノ酸配列であ
ることが明らかとなった。また、上記のクローンＴ３由
来のアミノ酸配列をコードしているｃＤＮＡの遺伝子配
列をその遺伝子配列がアミノ酸をコードしている部分及
びその前後の遺伝子配列を同様に配列表の配列番号７に
記載した。

【０１４０】本遺伝子配列の全長を有するｃＤＮＡは上
記のクローンＴ３であるため、各々の制限酵素ＥｃｏＲ
ＩサイトにおいてｃＤＮＡの方向が合う形でつないで
（およそ５０００ｂｐ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのマ
ルチクローニングサイト上につないで作製したプラスミ
ドをｐＢＳ−ＬＩＧ−ＦＵＬＬとし、配列表の配列番号
７に記載のＤＮＡ配列を有する遺伝子断片（およそ１０
００ｂｐ）のみを同様にｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのマル
チクローニングサイト上につないで作製したプラスミド
をｐＢＳ−ＬＩＧ−ＣＯＤＥとした。

【０１４１】

【実施例１２】ノーザンブロティングによるリガンド
のｍＲＮＡ発現の解析本発明のリガンドをコードしてい
るｍＲＮＡの発現を調べるため、あらかじめｍＲＮＡが
転写されているフィルターであるＣｌｏｎｔｅｃｈ社
ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔ
ｈｅｒｎＢｌｏｔ、ＨｕｍａｎＭｕｌｔｉｐｌｅＴ
ｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔＩＩ、Ｈｕ
ｍａｎＦｅｔａｌＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅ
ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔを用い、実施例１１で分
離された配列表の配列番号７のＤＮＡ配列の１３８番か
ら３８１番の２４６ｂｐの遺伝子断片、すなわちリガン
ドのアミノ酸配列をコードしている部分の制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩで切り出されるおよそ３００ｂｐの遺伝子断片を
用いて、前述の方法にて32Ｐ標識してそのｍＲＮＡのサ
イズ、発現臓器を調べた。

【０１４２】その結果、ｍＲＮＡのサイズはおよそ５２
００ｂであり、バンドは１種類しか確認されなかった。
また、発現臓器に関しては、ヒト成人組織のうち心臓、
脳、胎盤、肺、骨格筋、腎臓、脾臓、前立腺、精巣、卵
巣、小腸で発現が認められ、特に胎盤、肺、腎臓におい
て若干は強く発現が認められた。しかしながら、肝臓、
すい臓、胸腺、大腸、末梢血リンパ球においては発現が
極めて弱いか、もしくは発現が認められなかった。ま
た、ヒト胎児組織では心臓、脳、肺、腎臓において発現
が認められたが、肝臓においては発現が認められなかっ
た。

【０１４３】また、同様のプローブを用いて、同様の方
法でラットの臓器における発現をＣｌｏｎｔｅｃｈ社
ＲａｔＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅＮｏｒｔｈ
ｅｒｎＢｌｏｔを用いて調べたところ、ｍＲＮＡのサ
イズはおよそ５０００ｂであり、心臓、脳、脾臓、肺、
骨格筋、精巣に発現が認められ、特に肺において強い発
現が認められた。しかしながら、肝臓、腎臓においては
発現が認められなかった。これらの結果から、実施例１
１でクローニングされたｃＤＮＡのクローンＴ３はほぼ
全ｍＲＮＡの遺伝子配列を含んでいると予想される。

【０１４４】

【実施例１３】遺伝子導入によるリガンド発現細胞の
作成上記の配列表の配列番号７記載の遺伝子を用いて、リガ
ンドの発現ベクター並びにリガンドとのキメラタンパク
の発現ベクターを作製し、リガンドの遺伝子を発現させ
た。発現させた形態及び方法を１）〜５）に上げた。す
なわち、１）配列表の配列番号７に記載したＤＮＡ配列、すなわ
ち全長のｃＤＮＡを、発現ベクターを用いて、動物細胞
に遺伝子導入してシグナルペプチドを含む膜結合型とし
て発現させ、最終的にシグナルペプチドを含まない形
態、すなわち配列表の配列番号６のアミノ酸配列を含有
する形態のリガンドとして細胞表面上に発現させ、最終
的に培養上清中に発現させる方法。

【０１４５】２）発現された該リガンドの検出を容易に
するため、配列表の配列番号７に記載のＤＮＡ配列の終
止コドンの前、すなわち配列表の配列番号７のＤＮＡ配
列の１０２９番のＣと１０３０番のＴの間に、配列表の
配列番号１３のＤＮＡ配列を有するＤＮＡが挿入された
遺伝子配列を有するＤＮＡを、発現ベクターを用いて、
１）と同様に発現させ、細胞内部分のＣ末端に配列表の
配列番号１３に記載のアミノ酸配列、すなわちＦＬＡＧ
配列を有する形態を取るように発現させる方法。

【０１４６】３）配列表の配列番号７に記載のＤＮＡ配
列の３１番から６９０番のＤＮＡ配列の３’末端に停止
コドンが挿入された遺伝子配列を有するＤＮＡ、すなわ
ち配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列の−２５番
から１９５番のアミノ酸配列のみをコードするｃＤＮＡ
を、発現ベクターを用いて、動物細胞に遺伝子導入し
て、シグナルペプチドを含む分泌型として発現させ、最
終的にシグナルペプチドを含まない形態、すなわち配列
表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を含有する形態の
リガンドとして、培養上清中に発現させる方法。

【０１４７】４）配列表の配列番号７に記載のＤＮＡ配
列の３１番から６９０番のＤＮＡ配列の３’末端に配列
表の配列番号１３のＤＮＡ配列を有するＤＮＡ、次いで
停止コドンが挿入された遺伝子配列を有するＤＮＡ、す
なわち配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列の−２
５番から１９５番のアミノ酸配列のＣ末端に配列表の配
列番号１３のアミノ酸配列が結合したアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを、発現ベクターを用いて、３）と同様
に発現させ、最終的にシグナルペプチドを含まない形
態、すなわち配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列
のＣ末端に配列表の配列番号１３のアミノ酸配列、すな
わちＦＬＡＧ配列を有する形態を取るリガンドとして、
培養上清中に発現させる方法。

【０１４８】５）配列表の配列番号７に記載のＤＮＡ配
列の３１番から６９０番のＤＮＡ配列の３’末端に、参
考例８に示した方法で作製されたヒトＩｇＧＦｃ部分を
コードするゲノム遺伝子配列を有するＤＮＡがつながっ
た配列を有するＤＮＡ、すなわち配列表の配列番号７に
記載のアミノ酸配列の−２５番から１９５番のアミノ酸
配列コードするＤＮＡとそのＣ末端にヒトＩｇＧ１のＦ
ｃ部分のアミノ酸配列をイントロンを含む形態でコード
するＤＮＡを、発現ベクターを用いて、３）と同様に発
現させ、最終的にシグナルペプチドを含まない形態、す
なわち配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列のＣ末
端にヒトＩｇＧ１のＦｃ部分のアミノ酸配列を有する形
態で発現され、最終的にそのＩｇＧＦｃ部分のヒンジ領
域のシステイン残基がおこすジスルフィド結合により、
２量体を形成した形態を有するリガンドとして、培養上
清中に発現させる方法。これらの１）から５）の形態を
取り得る発現ベクター参考例８に示した発現ベクターｐ
ＭＫＩＴｎｅｏを用いて作製した。作製の詳細は参考例
８に示した方法と同様の方法に従い、ＰＣＲ法等を用い
て作製した。作製された１）から５）の発現ベクターを
各々、１）はｐＭＫＬｉｇＦＵＬＬ、２）はｐＭＫＬｉ
ｇＦＵＬＬＦＬＡＧ、３）はｐＭＫＬｉｇＥＸ、４）は
ｐＭＫＬｉｇＥＸＦＬＡＧ、５）はｐＭＫＬｉｇＥＸＩ
ｇとする。

【０１４９】遺伝子導入はｐＭＫＬｉｇＦＵＬＬに関し
ては該ＣＯＳ−７細胞及び該Ｃ−１細胞に行い、残りの
は該ＣＯＳ−７細胞のみで行い、その遺伝子導入法は参
考例８に示したエレクトロポレーション法で行い、その
他の培養条件等については参考例８に記載したＣＯＳ−
７細胞の条件で行った。１）に示した方法で作製された
Ｃ−１細胞を、遺伝子導入後、１日間１０％ＦＣＳ入り
の条件で培養し、その後無血清培地に置き換え、培養上
清を４日間おきに３回を分取した。同様操作を、リガン
ド遺伝子を含まない発現ベクターを用いて、遺伝子導入
を行い、コントロールとした。この様にして作製された
培養上清２種を、実施例１に記載の方法で１０倍に濃縮
し、実施例２に記載した方法に従い、ＢＩＡｃｏｒｅを
用いて、それらのＢｉｎｄｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔｙを
ＥＸＩｇ−ＰＴＮの結合したチップで測定した。その結
果、コントロールではＢｉｎｄｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔ
ｙが結合活性が９８ＲＵであったが、リガンド遺伝子導
入サンプルでは３１０ＲＵであった。

【０１５０】さらに、この２種の培養上清を実施例５か
ら７に記載の方法と同様の方法でリガンドの精製を行っ
たところ、２３５００±１５００ダルトンのリガンドが
精製された。精製されたリガンドの精製量は、ポリアク
リルアミド電気泳動ゲルの銀染色の結果から、視覚的に
確認したところ、リガンド遺伝子導入サンプルはコント
ロールに比べておよそ３倍程度であった。また、この様
に精製されたリガンドを、再度同様にＢＩＡｃｏｒｅに
てＢｉｎｄｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔｙを測定したとこ
ろ、コントロールに比べておよそ３．５倍のＢｉｎｄｉ
ｎｇＡｃｔｉｖｉｔｙを有していることが明らかにな
った。この結果から、配列表の配列番号７の遺伝子導入
細胞株はリガンドをより効率的に産生することが出来る
ことが明らかになった。

【０１５１】同様な実験、すなわち上記の遺伝子導入、
培養上清分取、培養上清からのリガンドの精製をＣＯＳ
−７細胞にて行い、参考例８に記載した方法に従い、非
還元条件下でサンプルを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行
い、銀染色を行ってバンドの確認を行ったところ、コン
トロールでは２３５００±１５００ダルトンのバンドは
確認されなかったが、遺伝子導入細胞上清中には２３５
００±１５００ダルトンのバンドが同様に確認された。
この精製されたリガンドを実施例９に記載の方法でＮ末
端のアミノ酸配列を決定したところ、配列表の配列番号
４に記載したアミノ酸配列を有していた。これらの結果
から、リガンドを発現していない、もしくは発現の弱い
細胞株に配列表の配列番号７の遺伝子導入を行うことに
より、リガンドを産生させることが出来ることが明らか
になった。

【０１５２】次に、２）に示した発現ベクターで遺伝子
導入を行ったＣＯＳ−７細胞を、ＦＣＳ入り培地で４日
間培養後、参考例９に記載した方法で細胞の破砕物を得
て、参考例８に記載した方法に従い、還元条件下でサン
プルを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＦＬＡＧ抗体を
用いた抗体染色法にてウエスタンブロットを行い、上記
の２）に示したＣ末端にＦＬＡＧ配列を有する配列表の
配列番号６のアミノ酸配列を含有するリガンドが細胞上
に発現されているかを調べた。その結果、分子量が３０
０００から６００００ダルトン程度の極めて幅広い部分
が染色された。しかしながら、コントロールのＣＯＳ−
７細胞はそのようなバンドは認められなかったことか
ら、本リガンドが細胞上で発現された場合、極めて幅広
い分子量を有してなる物質として発現されることが明ら
かになった。

【０１５３】次に、３）に示した方法で作製されたＣ−
１細胞を、遺伝子導入後、１日間１０％ＦＣＳ入りの条
件で培養後、無血清培地に置き換え、培養上清を４日間
おきに３回を分取した。この様にして作製された培養上
清を、実施例１に記載の方法で１０倍に濃縮し、実施例
５から７に記載の方法と同様の方法でリガンドの精製を
行ったところ、２３５００±１５００ダルトンのリガン
ドが精製された。この精製されたリガンドを実施例９に
記載の方法でＮ末端のアミノ酸配列を決定したところ、
配列表の配列番号４に記載したアミノ酸配列を有してい
た。これらの結果から、リガンドを発現していない、も
しくは発現の弱い細胞株に、少なくとも３）で示した遺
伝子を遺伝子導入を行うことにより、リガンドを産生さ
せることが出来ることが明らかになった。

【０１５４】次に、４）に示した方法で作製されたＣ−
１細胞を、遺伝子導入後、１日間１０％ＦＣＳ入りの条
件で培養後、無血清培地に置き換え、培養上清を４日間
おきに３回を分取した。この様にして作製された培養上
清を、実施例１に記載の方法で１０倍に濃縮した。この
濃縮液を参考例８に記載した方法に従い、非還元条件下
でサンプルを調製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＦＬＡＧ
抗体を用いた抗体染色法にてウエスタンブロットを行な
った。このようにして、上記の４）に示したＣ末端にＦ
ＬＡＧ配列を有する配列表の配列番号５のアミノ酸配列
を含有するポリペプチドを含むリガンドが培養上清中に
発現されているかを調べた。その結果、分子量がおよそ
２００００から５００００ダルトン程度の極めて幅広い
部分が染色され、特に強く染まった部分は、４２０００
ダルトンを中心とした部分と、２４０００ダルトンを中
心とした部分であった。しかしながら、コントロールの
ＣＯＳ−７細胞の培養上清では、そのようなバンドは認
められなかったことから、上記の４）に示したＣ末端に
ＦＬＡＧ配列を有する配列表の配列番号５のアミノ酸配
列をコードするＤＮＡを動物細胞に遺伝子導入すると、
およそ２００００から５００００ダルトンのリガンド、
またこれらには少なくとも分子量が４２０００ダルトン
付近、２４０００ダルトン付近であるリガンドが含まれ
ていることが明らかになった。

【０１５５】次に、５）に示した方法で作製されたＣ−
１細胞を、遺伝子導入後、１日間１０％ＦＣＳ入りの条
件で培養後、無血清培地に置き換え、培養上清を４日間
おきに３回を分取した。この様にして作製された培養上
清を、実施例１に記載の方法で１０倍に濃縮した。この
濃縮液を参考例８に記載したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びペル
オキシダーゼ標識抗ヒトＩｇ羊抗体を用いた抗体染色法
にてウエスタンブロットを行なった。但し、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥのさいのサンプル調製の条件として、還元条件下
のサンプルと非還元条件下のサンプルの２つで行った。
このようにして、上記の５）に示したＣ末端にヒトＩｇ
ＧのＦｃ部分のアミノ酸配列を有する配列表の配列番号
５のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含むリガン
ドが培養上清中に発現されているかを調べた。その結
果、還元条件下では、分子量の中心がおよそ６００００
ダルトン程度の極めて幅広い部分のバンドが染色され、
非還元条件では１５００００ダルトン程度の極めて幅広
いの部分のバンドが染色された。しかしながら、コント
ロールのＣＯＳ−７細胞の培養上清では、そのようなバ
ンドは認められなかったことから、上記の５）に示した
Ｃ末端にヒトＩｇＧのＦｃ部分のアミノ酸配列を有する
配列表の配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
を動物細胞に遺伝子導入すると、還元条件下では、分子
量の中心がおよそ６００００ダルトン程度、非還元条件
では１５００００ダルトン程度をのヒトＩｇＧのＦｃ部
分とリガンドと融合物が培養上清中に産生し、また分子
量の大きさとヒトＩｇＧのＦｃ部分のアミノ酸配列の構
造から、この融合物は２量体もしくはそれ以上の多量体
構造を有していることが明らかになった。

【０１５６】以上に示した結果から、上記１）〜５）の
方法を用いれば、該リガンドの生産効率の向上、並びに
該リガンド未産生細胞に該リガンドを産生させることが
出来、さらに配列表の配列番号５及び６のアミノ酸配列
を有するポリペプチドの１部もしくは全部を含有してな
る化合物が作製でき、また、それらの２量体もしくはそ
れ以上の多量体構造を有す複合体が作製することができ
ることが示された。

【０１５７】

【実施例１４】遺伝子導入細胞により生産されたリガ
ンド細胞外部分の精製実施例１３記載の４）及び５）の方法で作製されたＣＯ
Ｓ−７の培養上清を用いて、参考例９に記載した方法に
て各々の細胞培養上清中からアフィニティーカラムにて
リガンドとの融合蛋白を精製した。４）の培養上清に関
しては、培養上清の５ｌをコダック社製Ａｎｔｉ−ＦＬ
ＡＧＭ２ＡｆｆｉｎｉｔｙＧｅｌカラムに通し
て、リガンドをＣ末端部分のＦＬＡＧ配列を有する部分
でカラムに吸着させた。カラムのサイズは共に１ｃｍ×
３ｃｍで容積はおよそ２ｍｌであり、流速は全て１ｍｌ
／ｍｉｎ．で行った。吸着後、カラムをＰＢＳ（−）２
０ｍｌで洗浄し、その後、０．５ＭＴｒｉｓーグリシン
（ｐＨ３．０）で溶出した。溶出画分を２ｍｌずつ分取
し、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）２００μ
ｌずつ加えて、各々の画分を中和した。また、５）の培
養上清に関しては、培養上清の５ｌをファルマシア社製
ＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースカラムに通して、上
記と同じカラムのサイズ、流速で行った。また、洗浄、
溶離に関しても同様に行った。

【０１５８】さらに、上記の方法で精製されたＣ末端に
ＦＬＡＧ配列を有する配列表の配列番号５のアミノ酸配
列を含有するポリペプチドを含むリガンド、及びＣ末端
にヒトＩｇＧのＦｃ部分のアミノ酸配列を有する配列表
の配列番号５のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを
含むリガンドを各々のゲル濾過にて精製を行った。アフ
ィニティーカラムからの溶離液をアミコン社製セントリ
コン３０にて濃縮及びＰＢＳ（−）へのバッファー交換
を行い、ゲル濾過はファルマシア社製ＦＰＬＣシステム
を用い、同社のＳｕｐｅｒｏｓｅ１２カラムにて行っ
た。その溶離画分を各々実施例２に記載したＢＩＡｃｏ
ｒｅを用いて、それらのＢｉｎｄｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔ
ｙをＥＸＩｇ−ＰＴＮの結合したチップで測定した。次
に、ＢｉｎｄｉｎｇＡｃｔｉｖｉｔｙの高い画分を
４）の培養上清由来、５）の培養上清由来各々別々にま
とめ、さらに、上記の方法で濃縮し、それらを実施例１
４に記載した方法でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、さらに銀
染色を行った。その結果、実施例１４で得られたウエス
タンブロットの結果染色された部分に対応する部分が銀
染色された。したがって、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列を有す
る配列表の配列番号５のアミノ酸配列を含有するポリペ
プチドを含むリガンド（以降この物質をＬｉｇＦＬＡＧ
−ＰＴＮとする）及び、Ｃ末端にヒトＩｇＧのＦｃ部分
のアミノ酸配列を有する配列表の配列番号５のアミノ酸
配列を含有するポリペプチドを含むリガンド（以降この
物質をＬｉｇＩｇ−ＰＴＮ）の精製物を得た。これら精
製産物を実施例９に記載の方法でＮ末端のアミノ酸配列
を決定したところ、配列表の配列番号４に記載したアミ
ノ酸配列を共に有していた。この様にして、ＬｉｇＦＬ
ＡＧ−ＰＴＮ及びＬｉｇＩｇ−ＰＴＮを精製できること
が示された。

【０１５９】

【実施例１５】リガンドを認識する抗体作成、タンパ
ク発現の確認配列表の配列番号７に記載のアミノ酸配列の１１番から
３７番のアミノ酸配列から構成されるオリゴペプチドを
常法に従い、アプライドバイオシステム社製ペプチド合
成機により作製し、カブトガニ由来ヘモシアニン（ＫＬ
Ｈ、シグマ社製）と末端のシステイン残基で結合させ
て、これを免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測
定後、全血の採血を行い、血清を採取して、ＢｉｏＲａ
ｄ社製のエコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、
添付の取扱い説明書に従って、抗リガンドウサギポリク
ローナル抗体を精製して作製した。

【０１６０】さらに、実施例１４に記載の方法で精製さ
れたＬｉｇＦＬＡＧ−ＰＴＮを免疫原として、上記の方
法と同様に、ウサギに免疫して抗リガンドウサギポリク
ローナル抗体を作製した。また、実施例１４に記載した
方法で精製されたＬｉｇＦＬＡＧ−ＰＴＮを免疫原とし
て、成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成
した。すなわち、上記のように精製されたＬｉｇＦＬＡ
Ｇ−ＰＴＮをＢａｌｂ／ｃマウス（日本エスエルシー社
製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫した。２
回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上昇を認
めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓細胞を
取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８
（ＡＴＣＣＴＩＢ９）とポリエチレングリコール法に
て細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本免疫生物研究所
製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にてリガ
ンドの細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生してい
るハイブリドーマ株を株を分離し、リガンドを特異的に
認識するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマ産生株が樹立された。

【０１６１】このようにして樹立されたハイブリドーマ
の培養上清をファルマシア社製ＭａｂＴｒａｐＧＩ
Ｉを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗リガンド
モノクローナル抗体を精製し作製した。これらの抗体を
用いて、実施例７で精製されたリガンド、及び実施例１
３の１）、２）及び３）の方法で作製した遺伝子導入さ
れたＣＯＳ−７細胞の細胞培養から、実施例５から７に
記載の方法で精製された各々のリガンドの濃縮液を、参
考例８に記載の条件でウエスタンブロットを行った。た
だし、ウサギで作製したポリクローナル抗体に関して
は、２次抗体としてアマシャム社製抗ウサギＩｇ羊抗体
を使用した。その結果、すべて２５０００ダルトン付近
のブロードな部分のバンドを染色でき、これらの抗体は
何れもリガンドを特異的に識別できることが明らかにな
った。同様に、実施例１３の４）及び５）に記載の方法
で作製し、実施例１４に記載の方法で作製したＬｉｇＦ
ＬＡＧ−ＰＴＮ及びＬｉｇＩｇ−ＰＴＮについては、Ｂ
ｉｏＲａｄ社製のＰＶＤＦメンブランを用い、添付の取
扱い説明書に従って、ドットブロットをおこなった。す
なわち、ＬｉｇＦＬＡＧ−ＰＴＮ及びＬｉｇＩｇ−ＰＴ
Ｎの溶液の５μｌをＢｉｏＲａｄ社製ＰＶＤＦ上に落と
し、風乾後、実施例８に記載したウエスタンブロットの
条件と同様の方法で抗体染色した。その結果、共にコン
トロール抗体では染色されなかったが上記の精製抗体全
てにより染色されることが明らかになった。

【０１６２】さらに、特に上記モノクローナル抗体に関
して、Ｃ−１細胞及び実施例１３の１）の方法で遺伝子
導入され、４日後のＣＯＳ−７細胞について、参考例１
０に記載した方法でコールター社製フローサイトメータ
ーＥＰＩＣＳエリートにて細胞表面のリガンドの発現の
解析を行った。抗体による染色は成書の方法に従って行
った。１次抗体として上記の精製されたモノクローナル
抗体を用い、２次抗体としてベクトンデッキンソン社製
ヤギ抗マウスＩｇＦＩＴＣ標識で行った。その結果、Ｃ
−１細胞の全て、並びに遺伝子導入ＣＯＳ−７細胞およ
そ２０％が上記のモノクローナル抗体により染色される
ことが確認された。以上の結果から、本実施例に示され
た抗体は実施例７で精製されたリガンド、Ｃ−１細胞上
に存在するリガンド、並びに実施例１３の各々の条件で
発現が確認されたリガンドを特異的に認識することが確
認された。

【０１６３】

【実施例１６】リガンドによるチロシン残基りん酸化
反応実施例７で精製されたリガンド、及び実施例１４で得ら
れたＬｉｇＦＬＡＧ−ＰＴＮ及びＬｉｇＩｇ−ＰＴＮが
参考例８に記載の形質転換細胞Ｂａ／Ｆ３／ＦＵＬＬＦ
ＬＡＧの細胞膜表面上に発現されている新規リセプター
型チロシンキナーゼの自己りん酸化を引き起こすかどう
かについて調べるため以下の実験を行った。

【０１６４】りん酸化を行う前日に新しい培地に交換
し、細胞数５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌにしたＢａ／Ｆ
３／ＦＵＬＬＦＬＡＧを実験当日細胞数を５×１０6 個
取り出して以下の３種の液５００μｌに懸濁して、２０
分間、３７℃にてＣ０2 インキュベーター中で反応させ
た。反応液は反応系１．培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０
％ＦＣＳ、１００μｇ／ｍｌマウスＩＬ−３）のみ、反
応系２．Ｃ−１細胞５×１０6 個を反応系１の培地で懸
濁した懸濁液、反応系３．実施例７で精製されたリガン
ドを５００μｇ／ｍｌの濃度で含む反応系１の培地、反
応系４．実施例７で精製されたリガンドを１００μｇ／
ｍｌの濃度で含む反応系１の培地、反応系５．ＬｉｇＦ
ＬＡＧ−ＰＴＮを５００μｇ／ｍｌの濃度で含む反応系
１の培地、反応系６．ＬｉｇＦＬＡＧ−ＰＴＮを１００
μｇ／ｍｌの濃度で含む反応系１の培地、反応系７．Ｌ
ｉｇＩｇ−ＰＴＮを５００μｇ／ｍｌの濃度で含む反応
系１の培地、反応系８．ＬｉｇＩｇ−ＰＴＮを１００μ
ｇ／ｍｌの濃度で含む反応系１の培地、で行った。

【０１６５】反応後細胞をすぐに氷中に置き、あらかじ
め冷やしておいた２ｍＭＮａ3 ＶＯ4 を含むＰＢＳ
（−）を１ｍｌ加え、４℃にて３０００ｒｐｍ、１分間
遠心して細胞を落とし、同様の作業をさらにもう１度行
った後、参考例１０記載の方法で細胞破砕溶液を得た。
この細胞破砕溶液にＫｏｄａｋ社製Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ
Ｍ２ＡｆｆｉｎｉｔｙＧｅｌを３０μｌ加えて、
沈澱を起こさないようにゆっくりと回転させながら、４
℃にて反応させて、ゲル上にＦＬＡＧアミノ酸配列を有
する配列表の配列番号３のアミノ酸配列を含有するポリ
ペプチドを吸着させた。反応後、４℃、５０００ｒｐｍ
の条件で３分間遠心を行いゲルを沈澱させて、ゲルを吸
わないように上清を除いた後、参考例１０に記載のセル
リシスバッファーを２００μｌ加えて懸濁した。更に同
様に遠心操作、懸濁操作を３度行い、ゲルの沈澱物を得
た。同様の方法によりコントロール実験実験をＢａ／Ｆ
３／ＦＵＬＬＦＬＡＧだけではなくＢａ／Ｆ３／ＣＯＮ
についても行って同様のゲル沈澱物を得た。

【０１６６】このゲル沈澱物に参考例８に記載の方法で
ウェスタンブロットを行った。ゲルの沈澱物３０μｌの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーを加えて、２−Ｍ
Ｅ存在下で沸騰水浴を５分行い、１５μｌを１つのレー
ンに流してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。同一サンプルが
転写されたＰＶＤＦメンブランを２組作り、１組は目的
のＦＬＡＧ配列を有する配列表の配列番号３番のアミノ
酸配列を有するポリペプチドが回収されていることを確
認し、もう一方ではそれのチロシン残基がりん酸化され
ているかの判定に用いた。

【０１６７】この結果、りん酸化が確認されたのは反応
系２、３、５、７及び８であり、そのりん酸化の程度は
反応系２、７、及び８が強く、反応系３、５はそれより
も弱く、視覚的にみたところ半分以下程度であった。し
たがって、Ｃ−１細胞との共培養と同様実施例８で精製
されたリガンド、実施例１４で得られたＬｉｇＦＬＡＧ
−ＰＴＮ及びＬｉｇＩｇ−ＰＴＮは新規リセプター型チ
ロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性を活性化させ、
自己のチロシン残基のりん酸化を引き起こすことが判明
した。しかしながら、培地のみではそのようなチロシン
残基のりん酸化は見られなかった。しかしながら、実施
例８で精製されたリガンド、実施例１４で得られたＬｉ
ｇＦＬＡＧ−ＰＴＮは希釈された条件、すなわち反応系
４、６の条件ではりん酸化を惹起しなかった。一方、Ｌ
ｉｇＩｇ−ＰＴＮは同様な濃度に希釈した条件下でも十
分なりん酸化活性を有し、前の２者よりもずっと強い活
性を有していた。

【０１６８】さらに、この点に付いて詳細に解析するた
め、実施例１４で得られたＬｉｇＦＬＡＧ−ＰＴＮにつ
いて、反応系９．反応系５に対して、コダック社製モノ
クローナル抗体Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＭ２を１００μｇ
／ｍｌとなるように添加した反応系、反応系１０．反応
系６に対して、コダック社製モノクローナル抗体Ａｎｔ
ｉ−ＦＬＡＧＭ２を１００μｇ／ｍｌとなるように添
加した反応系、そしてコントロールとして、反応系１
１．反応系１に対して、コダック社製モノクローナル抗
体Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＭ２を１００μｇ／ｍｌとなる
ように添加した反応系、で同様な実験を行った。

【０１６９】その結果、反応系９及び１０では十分にり
ん酸化がされており、反応系２、７、及び８と同等な程
度のりん酸化活性を有していた。また、コントロールの
反応系１１ではりん酸化は見られなかった。したがっ
て、実施例８の方法で精製されたリガンドは配列表の配
列番号３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド
をりん酸化する活性を有することが明らかになった。ま
た、実施例１４で得られたＬｉｇＦＬＡＧ−ＰＴＮ及び
ＬｉｇＩｇ−ＰＴＮに付いても同様であった。また、こ
の中で最も高い活性を有している形態はＬｉｇＩｇ−Ｐ
ＴＮの形態であり、さらにＬｉｇＦＬＡＧ−ＰＴＮもＣ
末端部分を認識する抗ＦＬＡＧ抗体を投与することによ
り、同様の強い活性を示すことから、２量体もしくはそ
れ以上の多量体構造を有してなる形態の方が、より強い
活性を有するリガンドの形態として望ましいことが明ら
かになった。よって、これらの化合物は本リガンドは新
規リセプター型チロシンキナーゼを発現している細胞に
作用して、チロシン残基のりん酸化を促して増殖のシグ
ナルを伝え得る化合物であることが示された。

【０１７０】

【実施例１７】リガンドの生理活性実施例７で精製されたリガンド、及び実施例１４で得ら
れたＬｉｇＦＬＡＧ−ＰＴＮ及びＬｉｇＩｇ−ＰＴＮを
用いてその生理活性の確認を行った。ヘパリンを加えた
さい帯血にＰＢＳ（−）を等量加え、フィコールパック
（ファルマシア社製）にてさい帯血中の単核細胞を遠心
分離により分離した。

【０１７１】このようにして分離された細胞を更に２回
ＰＢＳ（−）にて遠心分離で洗浄し最終的に細胞濃度が
５×１０⁶ｃｅｌｌｓ／ｍｌにＩＭＤＭ培地にて懸濁し
てさい帯血単核球懸濁液を調製した。コロニーアッセイ
に必要な試薬は前もって以下のように調製した。３％メ
チルセルロース溶液はメチルセルロース（和光純薬社
製）を沸騰水にて撹拌しながら溶かし、体温程度まで冷
えた後に、前もって作製した２倍濃度のＩＭＤＭ培地を
等量加え、４℃にて５日間程度放置して作製した。１０
％ＢＳＡ溶液はＳｉｇｍａ社製ＢＳＡを蒸留水に加え
て、ゆっくりと撹拌しながら４℃にて２日間放置して、
完全に溶けたら、０．２２μｍのメンブランフィルター
（ミリポア社製）にて濾過して作製した。この溶液につ
いては使用直前に７．５％重炭酸ナトリウム溶液（ＧＩ
ＢＣＯ−ＢＲＬ社製）を１０％ＢＳＡ溶液５ｍｌあたり
２００μｌ加えた。５６３７コンディションメディウム
（５６３７ＣＭ）はヒト細胞株５６３７をコーニング社
製Ｔー２２５フラスコを用いて１０％ＦＣＳを含むＲＰ
ＭＩ１６４０培地５０ｍｌにて、およそ５日間培養した
培養上清を０．２２μｍのメンブランフィルター（ミリ
ポア社製）にて濾過し作製した。

【０１７２】上記のようにコロニーアッセイ用に調製し
たさい帯血単核球細胞懸濁液を３０μｌ、１０％ＢＳＡ
溶液を３００μｌ、１０ｍＭ２ーメルカプトエタノール
溶液を１５μｌ、４００Ｕ／ｍｌのヒトエリスロポエチ
ン（中外製薬社製）溶液を１５μｌ，これらを混ぜ合わ
した溶液に対して、反応系１．ＩＭＤＭ培地のみ、反応
系２．５６３７ＣＭを３００μｌ、反応系３．実施例７
で精製されたリガンドを７００μｇ、反応系４．実施例
１４で得られたＬｉｇＦＬＡＧ−ＰＴＮを９００μｇ、
反応系５．実施例１４で得られたＬｉｇＩｇ−ＰＴＮを
３００μｇ、の各々を加え、最終的な体積が１．８ｍｌ
になるようにＩＭＤＭ培地を加えた。

【０１７３】この３者に対して上記のように作製された
３％メチルセルロース溶液を１．２ｍｌ加えて、良く撹
拌して均一にし静置して、気泡が抜けた後、シリンジを
用いて１ｍｌをファルコン社製３５ｍｍディッシュに均
一になるようにまき、３７℃のＣＯ2 インキュベーター
にて２週間培養した。２週間の培養後、１つのディッシ
ュあたりのコロニー数を倒立顕微鏡（オリンパス社製）
にて計測した。その結果、反応系１のＩＭＤＭのみでは
コロニー形成が極めて少なく（１個及び０個）、反応系
２の５６３７ＣＭではコロニーの形成が多くみられ（５
６個及び４８個）、反応系３のリガンドを含むディッシ
ュはその中間的な値（２２個及び２８個）の数のコロー
ニ形成が観察できた。

【０１７４】また、別のさい帯血のサンプルを用いた実
験から、反応系１のＩＭＤＭのみではコロニー形成が極
めて少なく（１個及び０個）、反応系２の５６３７ＣＭ
ではコロニーの形成が多くみられ（３５個及び２８
個）、反応系３のリガンドを含むディッシュはその中間
的な値（８個及び１２個）、反応系４のＬｉｇＦＬＡＧ
−ＰＴＮを含むディシュでは３とほぼ同じ（１２個と１
４個）、反応系５のＬｉｇＩｇ−ＰＴＮを含むディシュ
ではそれらよりも若干多く（２０個と２２個）の数のコ
ロニー形成が観察できた。

【０１７５】さらに別の実験として別のさい帯血のサン
プルにおいて、コロニー形成を促すことが知られている
ヒトインターロイキン３（ＩＬ−３、インタージェン社
製）、ヒトＧＭ−ＣＳＦ（インタージェン社製）、ヒト
ＳＣＦ（インタージェン社製）を加えた条件に対し、さ
らにコロニーの形成を促すかについて調べた。すなわ
ち、上記の反応系１、反応系３、反応系４に加えて、反
応系５．最終濃度がＩＬ−３が１０ｎｇ、ＧＭ−ＣＳＦ
が２０ｎｇ、ＳＣＦが２００ｎｇ、反応系６．反応系５
の条件に実施例７で精製されたリガンドを５００μｇ、
反応系７．反応系５の条件に実施例１４で得られたＬｉ
ｇＩｇ−ＰＴＮを１００μｇ、とした各々の反応系にお
いて同様のコロニーアッセイを行った。

【０１７６】その結果、反応系１は０個及び０個、反応
系３は７個及び８個、反応系４は１５個及び１２個、反
応系５は５５個と６８個、反応系６は６３個と７５個、
反応系７は８０個と８９個であった。また、顕微鏡下で
観察した結果、反応系７のコロニーは他の反応系に比べ
て視覚的に判断したところ、２割から５割程度大きかっ
た。これらの結果からリガンドは血液未分化細胞の増殖
を促し、コロニー形成作用を有し、２量体もしくはそれ
以上の多量体を有する構造の方がよりその活性が高いこ
とが判明した。

【０１７７】

【表１】

【０１７８】

【表２】

【０１７９】

【表３】

【０１８０】

【表４】

【０１８１】

【発明の効果】本発明のリセプター型チロシンキナーゼ
の新規なリガンドは血液未分化細胞の増殖にとって有効
な化学品となり、医薬品として使用が可能である。

【０１８２】

【配列表】

配列番号１配列の長さ：５２２配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：ヒト配列 Leu Glu Glu Thr Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Thr Ala Asp Leu Lys 1 5 10 15 Trp Val Thr Phe Pro Gln Val Asp Gly Gln Trp Glu Glu Leu Ser Gly 20 25 30 Leu Asp Glu Glu Gln His Ser Val Arg Thr Tyr Glu Val Cys Asp Val 35 40 45 Gln Arg Ala Pro Gly Gln Ala His Trp Leu Arg Thr Gly Trp Val Pro 50 55 60 Arg Arg Gly Ala Val His Val Tyr Ala Thr Leu Arg Phe Thr Met Leu 65 70 75 80 Glu Cys Leu Ser Leu Pro Arg Ala Gly Arg Ser Cys Lys Glu Thr Phe 85 90 95 Thr Val Phe Tyr Tyr Glu Ser Asp Ala Asp Thr Ala Thr Ala Leu Thr 100 105 110 Pro Ala Trp Met Glu Asn Pro Tyr Ile Lys Val Asp Thr Val Ala Ala 115 120 125 Glu His Leu Thr Arg Lys Arg Pro Gly Ala Glu Ala Thr Gly Lys Val 130 135 140 Asn Val Lys Thr Leu Arg Leu Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Phe Gln Asp Gln Gly Ala Cys Met Ala Leu Leu Ser Leu His 165 170 175 Leu Phe Tyr Lys Lys Cys Ala Gln Leu Thr Val Asn Leu Thr Arg Phe 180 185 190 Pro Glu Thr Val Pro Arg Glu Leu Val Val Pro Val Ala Gly Ser Cys 195 200 205 Val Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro Ser Leu Tyr Cys 210 215 220 Arg Glu Asp Gly Gln Trp Ala Glu Gln Pro Val Thr Gly Cys Ser Cys 225 230 235 240 Ala Pro Gly Phe Glu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Lys Cys Arg Ala Cys 245 250 255 Ala Gln Gly Thr Phe Lys Pro Leu Ser Gly Glu Gly Ser Cys Gln Pro 260 265 270 Cys Pro Ala Asn Ser His Ser Asn Thr Ile Gly Ser Ala Val Cys Gln 275 280 285 Cys Arg Val Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Thr Asp Pro Arg Gly Ala Pro 290 295 300 Cys Thr Thr Pro Pro Ser Ala Pro Arg Ser Val Val Ser Arg Leu Asn 305 310 315 320 Gly Ser Ser Leu His Leu Glu Trp Ser Ala Pro Leu Glu Ser Gly Gly 325 330 335 Arg Glu Asp Leu Thr Tyr Ala Leu Arg Cys Arg Glu Cys Arg Pro Gly 340 345 350 Gly Ser Cys Ala Pro Cys Gly Gly Asp Leu Thr Phe Asp Pro Gly Pro 355 360 365 Arg Asp Leu Val Glu Pro Trp Val Val Val Arg Gly Leu Arg Pro Asp 370 375 380 Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Val Thr Ala Leu Asn Gly Val Ser Ser Leu 385 390 395 400 Ala Thr Gly Pro Val Pro Phe Glu Pro Val Asn Val Thr Thr Asp Arg 405 410 415 Glu Val Pro Pro Ala Val Ser Asp Ile Arg Val Thr Arg Ser Ser Pro 420 425 430 Ser Ser Leu Ser Leu Ala Trp Ala Val Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala 435 440 445 Val Leu Asp Tyr Glu Val Lys Tyr His Glu Lys Gly Ala Glu Gly Pro 450 455 460 Ser Ser Val Arg Phe Leu Lys Thr Ser Glu Asn Arg Ala Glu Leu Arg 465 470 475 480 Gly Leu Lys Arg Gly Ala Ser Tyr Leu Val Gln Val Arg Ala Arg Ser 485 490 495 Glu Ala Gly Tyr Gly Pro Phe Gly Gln Glu His His Ser Gln Thr Gln 500 505 510 Leu Asp Glu Ser Glu Gly Trp Arg Glu Gln 515 520

【０１８３】配列番号２配列の長さ：９７２配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：アミノ酸起源生物名：ヒト配列 Leu Glu Glu Thr Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Thr Ala Asp Leu Lys 1 5 10 15 Trp Val Thr Phe Pro Gln Val Asp Gly Gln Trp Glu Glu Leu Ser Gly 20 25 30 Leu Asp Glu Glu Gln His Ser Val Arg Thr Tyr Glu Val Cys Asp Val 35 40 45 Gln Arg Ala Pro Gly Gln Ala His Trp Leu Arg Thr Gly Trp Val Pro 50 55 60 Arg Arg Gly Ala Val His Val Tyr Ala Thr Leu Arg Phe Thr Met Leu 65 70 75 80 Glu Cys Leu Ser Leu Pro Arg Ala Gly Arg Ser Cys Lys Glu Thr Phe 85 90 95 Thr Val Phe Tyr Tyr Glu Ser Asp Ala Asp Thr Ala Thr Ala Leu Thr 100 105 110 Pro Ala Trp Met Glu Asn Pro Tyr Ile Lys Val Asp Thr Val Ala Ala 115 120 125 Glu His Leu Thr Arg Lys Arg Pro Gly Ala Glu Ala Thr Gly Lys Val 130 135 140 Asn Val Lys Thr Leu Arg Leu Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Leu Ala Phe Gln Asp Gln Gly Ala Cys Met Ala Leu Leu Ser Leu His 165 170 175 Leu Phe Tyr Lys Lys Cys Ala Gln Leu Thr Val Asn Leu Thr Arg Phe 180 185 190 Pro Glu Thr Val Pro Arg Glu Leu Val Val Pro Val Ala Gly Ser Cys 195 200 205 Val Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro Ser Leu Tyr Cys 210 215 220 Arg Glu Asp Gly Gln Trp Ala Glu Gln Pro Val Thr Gly Cys Ser Cys 225 230 235 240 Ala Pro Gly Phe Glu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Lys Cys Arg Ala Cys 245 250 255 Ala Gln Gly Thr Phe Lys Pro Leu Ser Gly Glu Gly Ser Cys Gln Pro 260 265 270 Cys Pro Ala Asn Ser His Ser Asn Thr Ile Gly Ser Ala Val Cys Gln 275 280 285 Cys Arg Val Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Thr Asp Pro Arg Gly Ala Pro 290 295 300 Cys Thr Thr Pro Pro Ser Ala Pro Arg Ser Val Val Ser Arg Leu Asn 305 310 315 320 Gly Ser Ser Leu His Leu Glu Trp Ser Ala Pro Leu Glu Ser Gly Gly 325 330 335 Arg Glu Asp Leu Thr Tyr Ala Leu Arg Cys Arg Glu Cys Arg Pro Gly 340 345 350 Gly Ser Cys Ala Pro Cys Gly Gly Asp Leu Thr Phe Asp Pro Gly Pro 355 360 365 Arg Asp Leu Val Glu Pro Trp Val Val Val Arg Gly Leu Arg Pro Asp 370 375 380 Phe Thr Tyr Thr Phe Glu Val Thr Ala Leu Asn Gly Val Ser Ser Leu 385 390 395 400 Ala Thr Gly Pro Val Pro Phe Glu Pro Val Asn Val Thr Thr Asp Arg 405 410 415 Glu Val Pro Pro Ala Val Ser Asp Ile Arg Val Thr Arg Ser Ser Pro 420 425 430 Ser Ser Leu Ser Leu Ala Trp Ala Val Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala 435 440 445 Val Leu Asp Tyr Glu Val Lys Tyr His Glu Lys Gly Ala Glu Gly Pro 450 455 460 Ser Ser Val Arg Phe Leu Lys Thr Ser Glu Asn Arg Ala Glu Leu Arg 465 470 475 480 Gly Leu Lys Arg Gly Ala Ser Tyr Leu Val Gln Val Arg Ala Arg Ser 485 490 495 Glu Ala Gly Tyr Gly Pro Phe Gly Gln Glu His His Ser Gln Thr Gln 500 505 510 Leu Asp Glu Ser Glu Gly Trp Arg Glu Gln Leu Ala Leu Ile Ala Gly 515 520 525 Thr Ala Val Val Gly Val Val Leu Val Leu Val Val Ile Val Val Ala 530 535 540 Val Leu Cys Leu Arg Lys Gln Ser Asn Gly Arg Glu Ala Glu Tyr Ser 545 550 555 560 Asp Lys His Gly Gln Tyr Leu Ile Gly His Gly Thr Lys Val Tyr Ile 565 570 575 Asp Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala Val Arg Glu Phe Ala 580 585 590 Lys Glu Ile Asp Val Ser Tyr Val Lys Ile Glu Glu Val Ile Gly Ala 595 600 605 Gly Glu Phe Gly Glu Val Cys Arg Gly Arg Leu Lys Ala Pro Gly Lys 610 615 620 Lys Glu Ser Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Gly Gly Tyr Thr Glu 625 630 635 640 Arg Gln Arg Arg Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met Gly Gln Phe 645 650 655 Glu His Pro Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Val Thr Asn Ser Met 660 665 670 Pro Val Met Ile Leu Thr Glu Phe Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Ser 675 680 685 Phe Leu Arg Leu Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val Ile Gln Leu Val Gly 690 695 700 Met Leu Arg Gly Ile Ala Ser Gly Met Arg Tyr Leu Ala Glu Met Ser 705 710 715 720 Tyr Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn 725 730 735 Leu Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Phe Leu Glu Glu 740 745 750 Asn Ser Ser Asp Pro Thr Tyr Thr Ser Ser Leu Gly Gly Lys Ile Pro 755 760 765 Ile Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Phe Arg Lys Phe Thr Ser 770 775 780 Ala Ser Asp Ala Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Ser 785 790 795 800 Phe Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp Val Ile Asn 805 810 815 Ala Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Pro Asp Cys Pro Thr 820 825 830 Ser Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Asp Arg Asn Ala 835 840 845 Arg Pro Arg Phe Pro Gln Val Val Ser Ala Leu Asp Lys Met Ile Arg 850 855 860 Asn Pro Ala Ser Leu Lys Ile Val Ala Arg Glu Asn Gly Gly Ala Ser 865 870 875 880 His Pro Leu Leu Asp Gln Arg Gln Pro His Tyr Ser Ala Phe Gly Ser 885 890 895 Val Gly Glu Trp Leu Arg Ala Ile Lys Met Gly Arg Tyr Glu Glu Ser 900 905 910 Phe Ala Ala Ala Gly Phe Gly Ser Phe Glu Leu Val Ser Gln Ile Ser 915 920 925 Ala Glu Asp Leu Leu Arg Ile Gly Val Thr Leu Ala Gly His Gln Lys 930 935 940 Lys Ile Leu Ala Ser Val Gln His Met Lys Ser Gln Ala Lys Pro Gly 945 950 955 960 Thr Pro Gly Gly Thr Gly Gly Pro Ala Pro Gln Tyr 965 970

【０１８４】配列番号３配列の長さ：４２９０及び９８７配列の型：核酸及びアミノ酸鎖の数：二本鎖及び一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸起源生物名：ヒトただし遺伝子配列のＸは遺伝子配列が未決定。配列 GGGCTGGCG GGGAGGGAAC ACAGGTCAGT GTGGGGACAG GGGTCACGGT 49 GGACACGGGG GTGGGCTGTC TCAGGGGGGG AGACCGCGAG CGGCCGGCTC AGCCCCCGCC 109 ACCCGGGGCG GGACCCCGAG GCCCCGGAGG GACCCCAACT CCAGCCACGT CTTGCTGCGC 169 GCCCGCCCGG CGCGGCCACT GCCAGCACGC TCCGGGCCCG CCGCCCGCGC GCGCGCACAG 229 ACGCGGGGCC ACACTTGGCG CCGCCGCCCG GTGCCCCGCA CGCTCGCATG GGCCCGCGCT 289 GAGGGCCCGA CGAGGAGTCC CGCGCGGAGT ATCGGCGTCC ACCCGCCCAG GGAGAGTCAG 349 ACCTXXXXXG GCGAGGGCCC CCCAAACTCA GTTCGGATCC TACCCGAGTG AGGCGGCGCC 409 ATG GAG CTC CGG GTG CTG CTC TGC TGG GCT TCG TTG GCC GCA GCT TTG 457 Met Glu Leu Arg Val Leu Leu Cys Trp Ala Ser Leu Ala Ala Ala Leu -15 -10 -5 -1 1 GAA GAG ACC CTG CTG AAC ACA AAA TTG GAA ACT GCT GAT CTG AAG TGG 505 Glu Glu Thr Leu Leu Asn Thr Lys Leu Glu Thr Ala Asp Leu Lys Trp 5 10 15 GTG ACA TTC CCT CAG GTG GAC GGG CAG TGG GAG GAA CTG AGC GGC CTG 553 Val Thr Phe Pro Gln Val Asp Gly Gln Trp Glu Glu Leu Ser Gly Leu 20 25 30 GAT GAG GAA CAG CAC AGC GTG CGC ACC TAC GAA GTG TGT GAC GTG CAG 601 Asp Glu Glu Gln His Ser Val Arg Thr Tyr Glu Val Cys Asp Val Gln 35 40 45 CGT GCC CCG GGC CAG GCC CAC TGG CTT CGC ACA GGT TGG GTC CCA CGG 649 Arg Ala Pro Gly Gln Ala His Trp Leu Arg Thr Gly Trp Val Pro Arg 50 55 60 65 CGG GGC GCC GTC CAC GTG TAC GCC ACG CTG CGC TTC ACC ATG CTC GAG 697 Arg Gly Ala Val His Val Tyr Ala Thr Leu Arg Phe Thr Met Leu Glu 70 75 80 TGC CTG TCC CTG CCT CGG GCT GGG CGC TCC TGC AAG GAG ACC TTC ACC 745 Cys Leu Ser Leu Pro Arg Ala Gly Arg Ser Cys Lys Glu Thr Phe Thr 85 90 95 GTC TTC TAC TAT GAG AGC GAT GCG GAC ACG GCC ACG GCC CTC ACG CCA 793 Val Phe Tyr Tyr Glu Ser Asp Ala Asp Thr Ala Thr Ala Leu Thr Pro 100 105 110 GCC TGG ATG GAG AAC CCC TAC ATC AAG GTG GAC ACG GTG GCC GCG GAG 841 Ala Trp Met Glu Asn Pro Tyr Ile Lys Val Asp Thr Val Ala Ala Glu 115 120 125 CAT CTC ACC CGG AAG CGC CCT GGG GCC GAG GCC ACC GGG AAG GTG AAT 889 His Leu Thr Arg Lys Arg Pro Gly Ala Glu Ala Thr Gly Lys Val Asn 130 135 140 145 GTC AAG ACG CTG CGT CTG GGA CCG CTC AGC AAG GCT GGC TTC TAC CTG 937 Val Lys Thr Leu Arg Leu Gly Pro Leu Ser Lys Ala Gly Phe Tyr Leu 150 155 160 GCC TTC CAG GAC CAG GGT GCC TGC ATG GCC CTG CTA TCC CTG CAC CTC 985 Ala Phe Gln Asp Gln Gly Ala Cys Met Ala Leu Leu Ser Leu His Leu 165 170 175 TTC TAC AAA AAG TGC GCC CAG CTG ACT GTG AAC CTG ACT CGA TTC CCG 1033 Phe Tyr Lys Lys Cys Ala Gln Leu Thr Val Asn Leu Thr Arg Phe Pro 180 185 190 GAG ACT GTG CCT CGG GAG CTG GTT GTG CCC GTG GCC GGT AGC TGC GTG 1081 Glu Thr Val Pro Arg Glu Leu Val Val Pro Val Ala Gly Ser Cys Val 195 200 205 GTG GAT GCC GTC CCC GCC CCT GGC CCC AGC CCC AGC CTC TAC TGC CGT 1129 Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro Ser Leu Tyr Cys Arg 210 215 220 225 GAG GAT GGC CAG TGG GCC GAA CAG CCG GTC ACG GGC TGC AGC TGT GCT 1177 Glu Asp Gly Gln Trp Ala Glu Gln Pro Val Thr Gly Cys Ser Cys Ala 230 235 240 CCG GGG TTC GAG GCA GCT GAG GGG AAC ACC AAG TGC CGA GCC TGT GCC 1225 Pro Gly Phe Glu Ala Ala Glu Gly Asn Thr Lys Cys Arg Ala Cys Ala 245 250 255 CAG GGC ACC TTC AAG CCC CTG TCA GGA GAA GGG TCC TGC CAG CCA TGC 1273 Gln Gly Thr Phe Lys Pro Leu Ser Gly Glu Gly Ser Cys Gln Pro Cys 260 265 270 CCA GCC AAT AGC CAC TCT AAC ACC ATT GGA TCA GCC GTC TGC CAG TGC 1321 Pro Ala Asn Ser His Ser Asn Thr Ile Gly Ser Ala Val Cys Gln Cys 275 280 285 CGC GTC GGG TAC TTC CGG GCA CGC ACA GAC CCC CGG GGT GCA CCC TGC 1369 Arg Val Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Thr Asp Pro Arg Gly Ala Pro Cys 290 295 300 305 ACA ACC CCT CCT TCG GCT CCG CGG AGC GTG GTT TCG CGC CTG AAC GGC 1417 Thr Thr Pro Pro Ser Ala Pro Arg Ser Val Val Ser Arg Leu Asn Gly 310 315 320 TCC TCC CTG CAC CTG GAA TGG AGT GCC CCC CTG GAG TCT GGT GGC CGA 1465 Ser Ser Leu His Leu Glu Trp Ser Ala Pro Leu Glu Ser Gly Gly Arg 325 330 335 GAG GAC CTC ACC TAC GCC CTC CGC TGC CGG GAG TGC CGA CCC GGA GGC 1513 Glu Asp Leu Thr Tyr Ala Leu Arg Cys Arg Glu Cys Arg Pro Gly Gly 340 345 350 TCC TGT GCG CCC TGC GGG GGA GAC CTG ACT TTT GAC CCC GGC CCC CGG 1561 Ser Cys Ala Pro Cys Gly Gly Asp Leu Thr Phe Asp Pro Gly Pro Arg 355 360 365 GAC CTG GTG GAG CCC TGG GTG GTG GTT CGA GGG CTA CGT CCT GAC TTC 1609 Asp Leu Val Glu Pro Trp Val Val Val Arg Gly Leu Arg Pro Asp Phe 370 375 380 385 ACC TAT ACC TTT GAG GTC ACT GCA TTG AAC GGG GTA TCC TCC TTA GCC 1657 Thr Tyr Thr Phe Glu Val Thr Ala Leu Asn Gly Val Ser Ser Leu Ala 390 395 400 ACG GGG CCC GTC CCA TTT GAG CCT GTC AAT GTC ACC ACT GAC CGA GAG 1705 Thr Gly Pro Val Pro Phe Glu Pro Val Asn Val Thr Thr Asp Arg Glu 405 410 415 GTA CCT CCT GCA GTG TCT GAC ATC CGG GTG ACG CGG TCC TCA CCC AGC 1753 Val Pro Pro Ala Val Ser Asp Ile Arg Val Thr Arg Ser Ser Pro Ser 420 425 430 AGC TTG AGC CTG GCC TGG GCT GTT CCC CGG GCA CCC AGT GGG GCT GTG 1801 Ser Leu Ser Leu Ala Trp Ala Val Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Val 435 440 445 CTG GAC TAC GAG GTC AAA TAC CAT GAG AAG GGC GCC GAG GGT CCC AGC 1849 Leu Asp Tyr Glu Val Lys Tyr His Glu Lys Gly Ala Glu Gly Pro Ser 450 455 460 465 AGC GTG CGG TTC CTG AAG ACG TCA GAA AAC CGG GCA GAG CTG CGG GGG 1897 Ser Val Arg Phe Leu Lys Thr Ser Glu Asn Arg Ala Glu Leu Arg Gly 470 475 480 CTG AAG CGG GGA GCC AGC TAC CTG GTG CAG GTA CGG GCG CGC TCT GAG 1945 Leu Lys Arg Gly Ala Ser Tyr Leu Val Gln Val Arg Ala Arg Ser Glu 485 490 495 GCC GGC TAC GGG CCC TTC GGC CAG GAA CAT CAC AGC CAG ACC CAA CTG 1993 Ala Gly Tyr Gly Pro Phe Gly Gln Glu His His Ser Gln Thr Gln Leu 500 505 510 GAT GAG AGC GAG GGC TGG CGG GAG CAG CTG GCC CTG ATT GCG GGC ACG 2041 Asp Glu Ser Glu Gly Trp Arg Glu Gln Leu Ala Leu Ile Ala Gly Thr 515 520 525 GCA GTC GTG GGT GTG GTC CTG GTC CTG GTG GTC ATT GTG GTC GCA GTT 2089 Ala Val Val Gly Val Val Leu Val Leu Val Val Ile Val Val Ala Val 530 535 540 545 CTC TGC CTC AGG AAG CAG AGC AAT GGG AGA GAA GCA GAA TAT TCG GAC 2137 Leu Cys Leu Arg Lys Gln Ser Asn Gly Arg Glu Ala Glu Tyr Ser Asp 550 555 560 AAA CAC GGA CAG TAT CTC ATC GGA CAT GGT ACT AAG GTC TAC ATC GAC 2185 Lys His Gly Gln Tyr Leu Ile Gly His Gly Thr Lys Val Tyr Ile Asp 565 570 575 CCC TTC ACT TAT GAA GAC CCT AAT GAG GCT GTG AGG GAA TTT GCA AAA 2233 Pro Phe Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala Val Arg Glu Phe Ala Lys 580 585 590 GAG ATC GAT GTC TCC TAC GTC AAG ATT GAA GAG GTG ATT GGT GCA GGT 2281 Glu Ile Asp Val Ser Tyr Val Lys Ile Glu Glu Val Ile Gly Ala Gly 595 600 605 GAG TTT GGC GAG GTG TGT CGG GGG CGG CTC AAG GCC CCA GGG AAG AAG 2329 Glu Phe Gly Glu Val Cys Arg Gly Arg Leu Lys Ala Pro Gly Lys Lys 610 615 620 625 GAG AGC TGT GTG GCA ATC AAG ACC CTG AAG GGT GGC TAC ACG GAG CGG 2377 Glu Ser Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Gly Gly Tyr Thr Glu Arg 630 635 640 CAG CGG CGT GAG TTT CTG AGC GAG GCC TCC ATC ATG GGC CAG TTC GAG 2425 Gln Arg Arg Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met Gly Gln Phe Glu 645 650 655 CAC CCC AAT ATC ATC CGC CTG GAG GGC GTG GTC ACC AAC AGC ATG CCC 2473 His Pro Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Val Thr Asn Ser Met Pro 660 665 670 GTC ATG ATT CTC ACA GAG TTC ATG GAG AAC GGC GCC CTG GAC TCC TTC 2521 Val Met Ile Leu Thr Glu Phe Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Ser Phe 675 680 685 CTG CGG CTA AAC GAC GGA CAG TTC ACA GTC ATC CAG CTC GTG GGC ATG 2569 Leu Arg Leu Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val Ile Gln Leu Val Gly Met 690 695 700 705 CTG CGG GGC ATC GCC TCG GGC ATG CGG TAC CTT GCC GAG ATG AGC TAC 2617 Leu Arg Gly Ile Ala Ser Gly Met Arg Tyr Leu Ala Glu Met Ser Tyr 710 715 720 GTC CAC CGA GAC CTG GCT GCT CGC AAC ATC CTA GTC AAC AGC AAC CTC 2665 Val His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu 725 730 735 GTC TGC AAA GTG TCT GAC TTT GGC CTT TCC CGA TTC CTG GAG GAG AAC 2713 Val Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Phe Leu Glu Glu Asn 740 745 750 TCT TCC GAT CCC ACC TAC ACG AGC TCC CTG GGA GGA AAG ATT CCC ATC 2761 Ser Ser Asp Pro Thr Tyr Thr Ser Ser Leu Gly Gly Lys Ile Pro Ile 755 760 765 CGA TGG ACT GCC CCG GAG GCC ATT GCC TTC CGG AAG TTC ACT TCC GCC 2809 Arg Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Phe Arg Lys Phe Thr Ser Ala 770 775 780 785 AGT GAT GCC TGG AGT TAC GGG ATT GTG ATG TGG GAG GTG ATG TCA TTT 2857 Ser Asp Ala Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Ser Phe 790 795 800 GGG GAG AGG CCG TAC TGG GAC ATG AGC AAT CAG GAC GTG ATC AAT GCC 2905 Gly Glu Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp Val Ile Asn Ala 805 810 815 ATT GAA CAG GAC TAC CGG CTG CCC CCG CCC CCA GAC TGT CCC ACC TCC 2953 Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Pro Asp Cys Pro Thr Ser 820 825 830 CTC CAC CAG CTC ATG CTG GAC TGT TGG CAG AAA GAC CGG AAT GCC CGG 3001 Leu His Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Asp Arg Asn Ala Arg 835 840 845 CCC CGC TTC CCC CAG GTG GTC AGC GCC CTG GAC AAG ATG ATC CGG AAC 3049 Pro Arg Phe Pro Gln Val Val Ser Ala Leu Asp Lys Met Ile Arg Asn 850 855 860 865 CCC GCC AGC CTC AAA ATC GTG GCC CGG GAG AAT GGC GGG GCC TCA CAC 3097 Pro Ala Ser Leu Lys Ile Val Ala Arg Glu Asn Gly Gly Ala Ser His 870 875 880 CCT CTC CTG GAC CAG CGG CAG CCT CAC TAC TCA GCT TTT GGC TCT GTG 3145 Pro Leu Leu Asp Gln Arg Gln Pro His Tyr Ser Ala Phe Gly Ser Val 885 890 895 GGC GAG TGG CTT CGG GCC ATC AAA ATG GGA AGA TAC GAA GAA AGT TTC 3193 Gly Glu Trp Leu Arg Ala Ile Lys Met Gly Arg Tyr Glu Glu Ser Phe 900 905 910 GCA GCC GCT GGC TTT GGC TCC TTC GAG CTG GTC AGC CAG ATC TCT GCT 3241 Ala Ala Ala Gly Phe Gly Ser Phe Glu Leu Val Ser Gln Ile Ser Ala 915 920 925 GAG GAC CTG CTC CGA ATC GGA GTC ACT CTG GCG GGA CAC CAG AAG AAA 3289 Glu Asp Leu Leu Arg Ile Gly Val Thr Leu Ala Gly His Gln Lys Lys 930 935 940 945 ATC TTG GCC AGT GTC CAG CAC ATG AAG TCC CAG GCC AAG CCG GGA ACC 3337 Ile Leu Ala Ser Val Gln His Met Lys Ser Gln Ala Lys Pro Gly Thr 950 955 960 CCG GGT GGG ACA GGA GGA CCG GCC CCG CAG TAC 3370 Pro Gly Gly Thr Gly Gly Pro Ala Pro Gln Tyr 965 970 TGACCTGCAG GAACTCCCCA CCCCAGGGAC ACCGCCTCCC CATTTTCCGG GGCAGAGTGG 3430 GGACTCACAG AGGCCCCCAG CCCTGTGCCC CGCTGGATTG CACTTTGAGC CCGTGGGGTG 3490 AGGAGTTGGC AATTTGGAGA GACAGGATTT GGGGGGTTCT GCCATAATAG GAGGGGAAAA 3550 TCACCCCCCC AGCCACCTCG GGGAACTCCA GACCAAGGGT GAGGGCGCCT TTCCCTCAGG 3610 ACTGGGTGTG ACCAGAGGAA AAGGAAGTGC CCAACATCTC CCAGCCTCCC CCAGGTGCCC 3670 CCCCTCACCT TGATGGGTGC GTTCCCGCAG ACCAAAGAGA GTGTGACTCC CTTGCCAGCT 3730 CCAGAGTGGG GGGGCTGTCC CAGGGGGCAA GAAGGGGTGT CAGGGCCCAG TGACAAAATC 3790 ATTGGGGTTT GTAGTCCCAA CTTGCTGCTG TCACCACCAA ACTCAATCAT TTTTTTCCCT 3850 TGTAAATGCC CCTCCCCCAG CTGCTGCCTT CATATTGAAG GTTTTTGAGT TTTGTTTTTG 3910 GTCTTAATTT TTCTCCCCGT TCCCTTTTTG TTTCTTCGTT TTGTTTTTCT ACCGTCCTTG 3970 TCATAACTTT GTGTTGGAGG GAACCTGTTT CACTATGGCC TCCTTTGCCC AAGTTGAAAC 4030 AGGGGCCCAT CATCATGTCT GTTTCCAGAA CAGTGCCTTG GTCATCCCAC ATCCCCGGAC 4090 CCCGCCTGGG ACCCCCAAGC TGTGTCCTAT GAAGGGGTGT GGGGTGAGGT AGTGAAAAGG 4150 GCGGTAGTTG GTGGTGGAAC CCAGAAACGG ACGCCGGTGC TTGGAGGGGT TCTTAAATTA 4210 TATTTAAAAA AGTAACTTTT TGTATAAATA AAAGAAAATG GGACGTGTCC CAGCTCCAGG 4270 GGTGAAAAAA AAAAAAAAAA 4290

【０１８５】配列番号４配列の長さ：８配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：ヒト配列：Lys Ser Ile Val Leu Glu Pro Ile 配列番号５配列の長さ：１９５配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：アミノ酸起源生物名：ヒト配列 Lys Ser Ile Val Leu Glu Pro Ile Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Ser Lys 1 5 10 15 Phe Leu Pro Gly Gln Gly Leu Val Leu Tyr Pro Gln Ile Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Asp Ile Ile Cys Pro Lys Val Asp Ser Lys Thr Val Gly Gln Tyr 35 40 45 Glu Tyr Tyr Lys Val Tyr Met Val Asp Lys Asp Gln Ala Asp Arg Cys 50 55 60 Thr Ile Lys Lys Glu Asn Thr Pro Leu Leu Asn Cys Ala Lys Pro Asp 65 70 75 80 Gln Asp Ile Lys Phe Thr Ile Lys Phe Gln Glu Phe Ser Pro Asn Leu 85 90 95 Trp Gly Leu Glu Phe Gln Lys Asn Lys Asp Tyr Tyr Ile Ile Ser Thr 100 105 110 Ser Asn Gly Ser Leu Glu Gly Leu Asp Asn Gln Glu Gly Gly Val Cys 115 120 125 Gln Thr Arg Ala Met Lys Ile Leu Met Lys Val Gly Gln Asp Ala Ser 130 135 140 Ser Ala Gly Ser Thr Arg Asn Lys Asp Pro Thr Arg Arg Pro Glu Leu 145 150 155 160 Glu Ala Gly Thr Asn Gly Arg Ser Ser Thr Thr Ser Pro Phe Val Lys 165 170 175 Pro Asn Pro Gly Ser Ser Thr Asp Gly Asn Ser Ala Gly His Ser Gly 180 185 190 Asn Asn Ile 195 配列番号６配列の長さ：３０８配列の型：アミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：アミノ酸起源生物名：ヒト配列 Lys Ser Ile Val Leu Glu Pro Ile Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Ser Lys 1 5 10 15 Phe Leu Pro Gly Gln Gly Leu Val Leu Tyr Pro Gln Ile Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Asp Ile Ile Cys Pro Lys Val Asp Ser Lys Thr Val Gly Gln Tyr 35 40 45 Glu Tyr Tyr Lys Val Tyr Met Val Asp Lys Asp Gln Ala Asp Arg Cys 50 55 60 Thr Ile Lys Lys Glu Asn Thr Pro Leu Leu Asn Cys Ala Lys Pro Asp 65 70 75 80 Gln Asp Ile Lys Phe Thr Ile Lys Phe Gln Glu Phe Ser Pro Asn Leu 85 90 95 Trp Gly Leu Glu Phe Gln Lys Asn Lys Asp Tyr Tyr Ile Ile Ser Thr 100 105 110 Ser Asn Gly Ser Leu Glu Gly Leu Asp Asn Gln Glu Gly Gly Val Cys 115 120 125 Gln Thr Arg Ala Met Lys Ile Leu Met Lys Val Gly Gln Asp Ala Ser 130 135 140 Ser Ala Gly Ser Thr Arg Asn Lys Asp Pro Thr Arg Arg Pro Glu Leu 145 150 155 160 Glu Ala Gly Thr Asn Gly Arg Ser Ser Thr Thr Ser Pro Phe Val Lys 165 170 175 Pro Asn Pro Gly Ser Ser Thr Asp Gly Asn Ser Ala Gly His Ser Gly 180 185 190 Asn Asn Ile Leu Gly Ser Glu Val Ala Leu Phe Ala Gly Ile Ala Ser 195 200 205 Gly Cys Ile Ile Phe Ile Val Ile Ile Ile Thr Leu Val Val Leu Leu 210 215 220 Leu Lys Tyr Arg Arg Arg His Arg Lys His Ser Pro Gln His Thr Thr 225 230 235 240 Thr Leu Ser Leu Ser Thr Leu Ala Thr Pro Lys Arg Ser Gly Asn Asn 245 250 255 Asn Gly Ser Glu Pro Ser Asp Ile Ile Ile Pro Leu Arg Thr Ala Asp 260 265 270 Ser Val Phe Cys Pro His Tyr Glu Lys Val Ser Gly Asp Tyr Gly His 275 280 285 Pro Val Tyr Ile Val Gln Glu Met Pro Pro Gln Ser Pro Ala Asn Ile 290 295 300 Tyr Tyr Lys Val 305

【０１８６】配列番号７配列の長さ：１０５１及び３３３配列の型：核酸及びアミノ酸鎖の数：二本鎖及び一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ、及びアミノ酸起源生物名：ヒト配列 GGAGTGCGCG GAGCTGGGAG TGGCTTCGCC 30 ATG GCT GTG AGA AGG GAC TCC GTG TGG AAG TAC TGC TGG GGT GTT TTG 78 Met Ala Val Arg Arg Asp Ser Val Trp Lys Tyr Cys Trp Gly Val Leu -25 -20 -15 -10 ATG GTT TTA TGC AGA ACT GCG ATT TCC AAA TCG ATA GTT TTA GAG CCT 126 Met Val Leu Cys Arg Thr Ala Ile Ser Lys Ser Ile Val Leu Glu Pro -5 -1 1 5 ATC TAT TGG AAT TCC TCG AAC TCC AAA TTT CTA CCT GGA CAA GGA CTG 174 Ile Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Ser Lys Phe Leu Pro Gly Gln Gly Leu 10 15 20 GTA CTA TAC CCA CAG ATA GGA GAC AAA TTG GAT ATT ATT TGC CCC AAA 222 Val Leu Tyr Pro Gln Ile Gly Asp Lys Leu Asp Ile Ile Cys Pro Lys 25 30 35 GTG GAC TCT AAA ACT GTT GGC CAG TAT GAA TAT TAT AAA GTT TAT ATG 270 Val Asp Ser Lys Thr Val Gly Gln Tyr Glu Tyr Tyr Lys Val Tyr Met 40 45 50 55 GTT GAT AAA GAC CAA GCA GAC AGA TGC ACT ATT AAG AAG GAA AAT ACC 318 Val Asp Lys Asp Gln Ala Asp Arg Cys Thr Ile Lys Lys Glu Asn Thr 60 65 70 CCT CTC CTC AAC TGT GCC AAA CCA GAC CAA GAT ATC AAA TTC ACC ATC 366 Pro Leu Leu Asn Cys Ala Lys Pro Asp Gln Asp Ile Lys Phe Thr Ile 75 80 85 AAG TTT CAA GAA TTC AGC CCT AAC CTC TGG GGT CTA GAA TTT CAG AAG 414 Lys Phe Gln Glu Phe Ser Pro Asn Leu Trp Gly Leu Glu Phe Gln Lys 90 95 100 AAC AAA GAT TAT TAC ATT ATA TCT ACA TCA AAT GGG TCT TTG GAG GGC 462 Asn Lys Asp Tyr Tyr Ile Ile Ser Thr Ser Asn Gly Ser Leu Glu Gly 105 110 115 CTG GAT AAC CAG GAG GGA GGG GTG TGC CAG ACA AGA GCC ATG AAG ATC 510 Leu Asp Asn Gln Glu Gly Gly Val Cys Gln Thr Arg Ala Met Lys Ile 120 125 130 135 CTC ATG AAA GTT GGA CAA GAT GCA AGT TCT GCT GGA TCA ACC AGG AAT 558 Leu Met Lys Val Gly Gln Asp Ala Ser Ser Ala Gly Ser Thr Arg Asn 140 145 150 AAA GAT CCA ACA AGA CGT CCA GAA CTA GAA GCT GGT ACA AAT GGA AGA 606 Lys Asp Pro Thr Arg Arg Pro Glu Leu Glu Ala Gly Thr Asn Gly Arg 155 160 165 AGT TCG ACA ACA AGT CCC TTT GTA AAA CCA AAT CCA GGT TCT AGC ACA 654 Ser Ser Thr Thr Ser Pro Phe Val Lys Pro Asn Pro Gly Ser Ser Thr 170 175 180 GAC GGC AAC AGC GCC GGA CAT TCG GGG AAC AAC ATC CTC GGT TCC GAA 702 Asp Gly Asn Ser Ala Gly His Ser Gly Asn Asn Ile Leu Gly Ser Glu 185 190 195 GTG GCC TTA TTT GCA GGG ATT GCT TCA GGA TGC ATC ATC TTC ATC GTC 750 Val Ala Leu Phe Ala Gly Ile Ala Ser Gly Cys Ile Ile Phe Ile Val 200 205 210 215 ATC ATC ATC ACG CTG GTG GTC CTC TTG CTG AAG TAC CGG AGG AGA CAC 798 Ile Ile Ile Thr Leu Val Val Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Arg Arg His 220 225 230 AGG AAG CAC TCG CCG CAG CAC ACG ACC ACG CTG TCG CTC AGC ACA CTG 846 Arg Lys His Ser Pro Gln His Thr Thr Thr Leu Ser Leu Ser Thr Leu 235 240 245 GCC ACA CCC AAG CGC AGC GGC AAC AAC AAC GGC TCA GAG CCC AGT GAC 894 Ala Thr Pro Lys Arg Ser Gly Asn Asn Asn Gly Ser Glu Pro Ser Asp 250 255 260 ATT ATC ATC CCG CTA AGG ACT GCG GAC AGC GTC TTC TGC CCT CAC TAC 942 Ile Ile Ile Pro Leu Arg Thr Ala Asp Ser Val Phe Cys Pro His Tyr 265 270 275 GAG AAG GTC AGC GGG GAC TAC GGG CAC CCG GTG TAC ATC GTC CAG GAG 990 Glu Lys Val Ser Gly Asp Tyr Gly His Pro Val Tyr Ile Val Gln Glu 280 285 290 295 ATG CCC CCG CAG AGC CCG GCG AAC ATT TAC TAC AAG GTC 1029 Met Pro Pro Gln Ser Pro Ala Asn Ile Tyr Tyr Lys Val 300 305 TGAGAGGGAC CCTGGTGGTA CC 1051 配列番号８配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-TTGTCGACAC(AC)G(AG)GA(CT)(CT)T(CG)GC(ACG
T)GC(ACGT)(AC)G-3' 配列番号９配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-TGGAATTCCA(AT)A(AG)(CG)(AT)CCA(CG)AC(AG)T
C-3' 配列番号１０配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-AACTCGAGATCTCTGCTGAGGACCTG-3' 配列番号１１配列の長さ：２８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-AAGAATTCTCAGTACTGCGGGGCCGGTC-3' 配列番号１２配列の長さ：５７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-GGGAATTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCGTACTGCG
GGGCCGGTCCTCCTGT-3' 配列番号１３配列の長さ：２７及び８配列の型：核酸及びアミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ及びアミノ酸起源：化学合成法による配列番号１４配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-CGGAATTCGTGCGGTTCCTGAAGACGTCAG-3' 配列番号１５配列の長さ：５８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-GGGAATTCATTTATCATCATCATCTTTATAATCCTGCTCCC
GCCAGCCCTCGCTCTCA-3'

【０１８７】配列番号１６配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-AAGGATCCTGCTCCCGCCAGCCCTCGCTCTCA-3' 配列番号１７配列の長さ：３７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-AACCATCCCCGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCA-3' 配列番号１８配列の長さ：３３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-CCTCTAGAGTCGCGGCCGTCGCACTCATTTACC-3' 配列番号１９配列の長さ：配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質起源生物名：ヒトただしXXXは配列が決定できなかった残基を示す。配列 Lys Ser Ile Val Leu Glu Pro Ile Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Ser Lys 1 5 10 15 Phe Leu Pro Gly Gln Gly Leu Val Leu Tyr Pro Gln Ile Gly Asp Lys 20 25 30 Leu Asp Ile Ile XXX Pro Lys Val Asp XXX Lys Thr Val Gly XXX Tyr 35 40 45 配列番号２０配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-(TC)T(ACGT)GA(AG)CC(ACGT)AT(TCA)TA(TC)TGG
AA-3' 配列番号２１配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ起源：化学合成法による配列：5'-AC(TC)TT(ACGT)GG(AG)CA(AGT)AT(AGT)AT(AG)T
C-3' 配列番号２２配列の長さ：１０７及び３５配列の型：核酸及びアミノ酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＤＮＡ及びアミノ酸起源：化学合成法及びヒト配列 CTT GAG CCG ATC TAT TGG AAT TCC TCG AAC TCC AAA TTT CTA CCT GGA 48 Leu Glu Pro Ile Tyr Trp Asn Ser Ser Asn Ser Lys Phe Leu Pro Gly 1 5 10 15 CAA GGA CTG GTA CTA TAC CCA CAG ATA GGA GAC AAA TTG GAT ATA ATT 96 Gln Gly Leu Val Leu Tyr Pro Gln Ile Gly Asp Lys Leu Asp Ile Ile 20 25 30 TGC CCG AAA GT 107 Cys Pro Lys 35

【図面の簡単な説明】

【図１】ＢＩＡｃｏｒｅによるＢｉｎｄｉｎｇＡｃｔ
ｉｖｉｔｙ測定の１例の図

【図２】フローサイトメーターによるリガンド発現細胞
の蛍光ピークを測定した図

【図３】りん酸化アッセイによるリガンド発現細胞の電
気泳動のＸ線写真

【図４】１次精製されたリガンドの電気泳動の写真

【図５】ゲル濾過によるクロマトグラフィーパターンの
図

【図６】ゲル濾過による分離液の各画分のＢｉｎｄｉｎ
ｇＡｃｔｉｖｉｔｙの図

【図７】最終精製されたリガンドの電気泳動の写真

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成７年１月１９日

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図３

【補正方法】変更

【補正内容】

【図３】

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

【手続補正３】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図７

【補正方法】変更

【補正内容】

【図７】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｎ 15/02 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/573 Ａ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも分子量が２３５００±１５０
０ダルトンであり、呈色反応においてクマシー染色反
応、パス染色反応に陽性であり、配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに結合す
る、理化学的性質を有することを特徴とする化合物。
【請求項２】少なくとも配列表の配列番号２に記載の
アミノ酸配列を含有するポリペプチドの発現細胞に反応
させることにより、少なくとも当該ポリペプチドのチロ
シン残基をりん酸化させる請求項１に記載の化合物。
【請求項３】化合物が、そのアミノ末端のアミノ酸配
列として少なくとも配列表の配列番号４に記載のアミノ
酸配列を包含する請求項１記載の化合物。
【請求項４】化合物が、糖鎖を有する化合物である請
求項１記載の化合物。
【請求項５】化合物が少なくとも配列表の配列番号５
に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの一部もし
くは全部を含有してなる請求項１記載の化合物。
【請求項６】少なくとも配列表の配列番号５に記載の
アミノ酸配列を有するポリペプチドの一部もしくは全部
を含有してなる化合物。
【請求項７】少なくとも配列表の配列番号６に記載の
アミノ酸配列を有するポリペプチドの一部もしくは全部
を含有してなる化合物。
【請求項８】少なくとも配列表の配列番号５に記載の
アミノ酸配列の一部もしくは全部を含有するポリペプチ
ドが２量体、もしくはそれ以上の多量体の構造を有して
なる複合体。
【請求項９】少なくとも配列表の配列番号６に記載の
アミノ酸配列の一部もしくは全部を含有するポリペプチ
ドが２量体、もしくはそれ以上の多量体の構造を有して
なる複合体。
【請求項１０】配列表の配列番号５に記載のアミノ酸
配列の一部もしくは全部をコードするＤＮＡ。
【請求項１１】配列表の配列番号６に記載のアミノ酸
配列の一部もしくは全部をコードするＤＮＡ。
【請求項１２】配列表の配列番号５もしくは６に記載
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて作成された
当該アミノ酸配列を含有するポリペプチドを含有してな
る化合物の生産方法。
【請求項１３】請求項１に記載の化合物もしくは配列
表の配列番号５もしくは６に記載のアミノ酸配列を有す
るポリペプチドの一部もしくは全部を特異的に認識する
抗体。