JP4139508B2

JP4139508B2 - ヒトデルター３

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Publication number: JP4139508B2
Application number: JP03813999A
Authority: JP
Inventors: 誠治坂野; 誠榎本
Original assignee: Asahi Kasei Corp
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2008-08-27
Anticipated expiration: 2019-02-17
Also published as: JPH11299493A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規生理活性物質に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの血液、リンパ液中には多種類の細胞があり、それぞれが重要な役割を担っている。例えば、赤血球は体内での酸素運搬を、血小板は止血作用を、白血球やリンパ球は感染を防御している。これらの多様な細胞は骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞は体内の種々のサイトカインや環境要因によって刺激されて、各種血液細胞、破骨細胞、肥満細胞などに分化することが近年明らかにされてきた。このサイトカインとして、赤血球への分化についてはエリスロポエチン（ＥＰＯ）が、白血球への分化については顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が、血小板産生細胞である巨核球への分化については血小板増殖因子（ｍｐｌリガンド）が発見されて、前者２つは現在すでに臨床応用がなされている。
【０００３】
血液未分化細胞に関して、特定の血液系列に分化することが運命づけられた血液前駆細胞とすべての系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞に概念的に分類されている。血液前駆細胞に関してコロニーアッセイによって同定が可能であるが、造血幹細胞の同定方法は確立されていない。これらの細胞に関して、ステムセルファクター（ＳＣＦ）やインターロイキン３（ＩＬ−３）、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭなどが細胞の分化増殖を促すことが報告されている。骨髄移植療法に代替される造血幹細胞移植療法や遺伝子治療への応用のため、造血幹細胞を体外で増幅することが検討されている。しかし、この細胞を上記のようなサイトカインを用いて体外で増殖培養させると、造血幹細胞が本来有している多分化能および自己複製能が徐々に失われ、５週間培養後には特定の系列にのみ分化する血液前駆細胞へと変化し、造血幹細胞の特徴の一つである多分化能が失われることが報告されている（Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８６，５１２−５２３，１９９５）。
【０００４】
血液前駆細胞の増殖には単独のサイトカインのみでは効果が十分でなく、複数のサイトカインの共同作用（シナジー）が重要であることが明らかになっている。このことから造血幹細胞の特徴を維持したまま増殖させるためには、血液未分化細胞を増殖、分化させるサイトカインと共に分化を抑制するサイトカインが必要であると考えられている。しかし、一般に細胞の増殖や分化を促進するサイトカインが多数見いだされているのに対して、細胞の分化を抑制するサイトカインは少数しか見いだされていない。例えば、白血病細胞阻害因子（ＬＩＦ）はマウス胚幹細胞を分化させずに増殖させる作用が報告されているが、造血幹細胞や血液前駆細胞に対し、そのような作用は有していない。また、腫瘍細胞増殖因子（ＴＧＦ−β）は多様な細胞に対して増殖抑制の作用をするが、造血幹細胞や血液前駆細胞に対する作用は一定の見解が得られていない。
【０００５】
血液細胞のみならず、未分化細胞、特に幹細胞に関しては組織再生に強く関与すると考えられている。これらの組織再生、並びに各組織の未分化細胞を増幅させることは成書（吉里勝利著再生ー甦るしくみ、１９９６、羊土社）を参考にすることからその幅広い用途を知ることができる。
ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）はショウジョウバエで発見された神経細胞の分化制御に関わるリセプター型膜蛋白質であり、ノッチのホモログは線虫（Ｌｉｎ−１２）、アフリカツメガエル（Ｘｏｔｃｈ）、マウス（Ｍｏｔｃｈ）、ヒト（ＴＡＮ−１）などの無脊椎動物、脊椎動物の分類を越えた広い動物種から見いだされている。一方、ショウジョウバエノッチのリガンドとしてショウジョウバエデルタ（Ｄｅｌｔａ）およびショウジョウバエセレイト（Ｓｅｒｒａｔｅ）の２つが見いだされており、リセプターのノッチと同様に広い動物種からノッチリガンドホモログが見いだされている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８，２２５−２３２，１９９５）。特にヒトに関して、ヒトノッチホモログであるＴＡＮ−１は、幅広く体中の組織に発現されており（Ｅｌｌｉｓｅｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６６，６４９−６６１，１９９１）、またＴＡＮ−１以外に３つのノッチ類縁分子が存在することが報告されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８，２２５−２３２，１９９５）。血液細胞においては、ＰＣＲ（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法にてＣＤ３４陽性細胞にＴＡＮ−１の発現が認められている（Ｍｉｌｎｅｒｅｔａｌ．，Ｂｌｏｏｄ８３，２０５７−２０６２，１９９４）。しかしながらヒトに関して、ノッチのリガンドと考えられるヒトデルタ、ヒトセレイトの遺伝子のクローニングの報告は１９９７年までなかった。
【０００６】
ショウジョウバエノッチについて、そのリガンドとの結合性が詳細に調べられ、ノッチの細胞外部分に３６あるＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）様繰り返しアミノ酸配列のうち１１番目と１２番目の繰り返し配列を結合領域として、リガンドとＣａ⁺⁺を介して結合し得ることが示された（文献のＦｅｈｏｎｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６１，５２３−５３４，１９９０およびＲｅｂａｙｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ６７，６８７−６９９，１９９１および特表平７−５０３１２３）。他種のノッチホモログについてもＥＧＦ繰り返し配列は保存されており、リガンドとの結合に関して同様の機構が類推されている。リガンドにおいてもアミノ末端の近くにＤＳＬ（Ｄｅｌｔａ−Ｓｅｒｒａｔｅ−Ｌａｇ−２）と呼ばれるアミノ酸配列とリセプターと同様にＥＧＦ様繰り返し配列が保存されている（Ａｒｔａｖａｎｉｓ−Ｔｓａｋｏｎａｓｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８，２２５−２３２，１９９５）。
【０００７】
一方、ＥＧＦ様配列はトロンボモジュリン（Ｊａｃｋｍａｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３，８８３４−８８３８，１９８６）や低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）リセプター（Ｒｕｓｓｅｌｌｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ３７，５７７−５８５，１９８４）および血液凝固因子（Ｆｕｒｉｅｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ５３，５０５−５１８，１９８８）で見いだされ、細胞外での凝集や接着に重要な役割を果たすと考えられている。
【０００８】
近年クローニングされたショウジョウバエデルタの脊椎動物のホモログはニワトリ（Ｃ−デルター１）とアフリカツメガエル（Ｘ−デルター１）が見いだされており、Ｘ−デルター１は原始ニューロンの発生にＸｏｔｃｈを介して作用することが報告されている（Ｈｅｎｒｉｑｕｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３７５，７８７−７９０，１９９５およびＣｈｉｔｎｉｓｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３７５，７６１−７６６，１９９５）。一方、ショウジョウバエセレイトの脊椎動物のホモログはラットジャグドー１（Ｊａｇｇｅｄ−１）が見いだされている（Ｌｉｎｄｓｅｌｌｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ８０，９０９−９１７，１９９５）。この報告によれば、ラットジャグドー１のｍＲＮＡは胎仔ラットの脊髄に検出される。また、ラットノッチー１を強制的に過剰発現させた筋芽細胞株とラットジャグドー１発現細胞株の共培養により、この筋芽細胞株の分化が抑制されることが見いだされているが、ラットノッチー１を強制発現させていない筋芽細胞株に対してはラットジャグドー１が作用しないことが見いだされている。
【０００９】
本発明者らはノッチおよびそのリガンドが神経芽細胞、筋芽細胞の分化制御のみならず、広く未分化な細胞、特に血液未分化細胞の分化制御を行なうとの仮説を立てた。しかしヒトへ臨床応用する際、既知のニワトリ型、アフリカツメガエル型などの異種の生物種のノッチリガンドでは種特異性、抗原性の問題がある。このためヒトに対する使用を目的とするには、つまり産業上有用なものとするには、ヒト型のノッチリガンドを取得することは不可欠である。そこで、本発明者らはノッチリガンド分子に共通するＤＳＬドメインとＥＧＦ様ドメインを有する分子で、ヒト型ノッチ（ＴＡＮ−１など）のリガンドであるヒトデルタホモログ（以下ヒトデルタ）及びヒトセレイトホモログ（以下ヒトセレイト）が存在すると考え、これらの発見は未分化細胞の分化制御に有効な医薬品の候補となると考え、それらの発見に努めた。
【００１０】
その結果、ヒトノッチリガンド分子としてヒトデルター１、ヒトデルター２、ヒトセレイトー１、ヒトセレイトー２分子の４種の分子の遺伝子クローニングを行い、それらの分子が血液未分化細胞に作用することを見いだしている。（国際公開番号ＷＯ９７／１９１７２；分化抑制ポリペプチド、国際公開番号ＷＯ９８／０２４５８；分化抑制剤、及び国際公開番号ＷＯ９８／５１７９９；新規な分化抑制剤を参照）
ヒトノッチリガンド分子に関して、最新の報告によるとヒトデルター１に関しては国際公開番号ＷＯ９７／０１５７１において不完全かつ全長ではないヒトデルター１らしき分子の部分遺伝子並びに部分アミノ酸配列が示され、また、ヒトセレイトー１（ヒトジャグドー１）については国際公開番号ＷＯ９６／２７６１０において全長遺伝子並びに全長アミノ酸配列が、またヒトセレイトー２（ヒトジャグドー２）に関しては同出願において全長ではない部分遺伝子配列並びに部分アミノ酸配列が示されているが、遺伝子配列において何らかの間違いがあるらしくフレームシフトをおこしてカルボキシ末端のアミノ酸配列が本発明者により示されたものと全く異なっており、さらにアミノ末端に関しては遺伝子クローニングされておらず遺伝子配列並びにアミノ酸配列は不完全なものとなっている。
【００１１】
またごく最近になって、アラジール病（Ａｌａｇｉｌｌｅｓｙｎｄｒｏｍｅ）の原因遺伝子としてヒトセレイトー１（ヒトジャグドー１）が同定され、ｃＤＮＡの全長遺伝子クローニングも報告された（Ｏｄａｅｔａｌ．、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ４３、３７６ー３７９、１９９７）。さらに、ヒトセレイトー２に関してもｃＤＮＡクローニングが発表された（Ｌｕｏｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，６０５７−６０６７，１９９７）。
【００１２】
また、遺伝子配列データベースＧｅｎｂａｎｋリリース１０３（１９９７年１０月）において検索すると、ヒトセレイトー１に関しては４つのエントリーがあり、ＨＳＵ６１２７６、ＨＳＵ７３９３６，ＨＳＵ７７７２０及びＨＳＵ７７９１４として登録されており、ヒトセレイトー２に関しては２つのエントリーがありＡＦ００３５２１及びＡＦ０２０２０１として登録されている。また、ヒトデルター１に関しては１つのエントリーがあり、ＡＦ００３５２２として登録されている。しかしながら、他のヒトノッチリガンド様分子に関してはこのデータベース上には認められなかった。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、上記の４つの分子以外の新規なノッチリガンド分子の遺伝子配列、アミノ酸配列を明らかにし、この新規ノッチリガンド分子を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決する手段】
本発明者らはさらに新しいヒトノッチリガンドの探索のため、上記のヒトデルター１遺伝子を用いたクロスハイブリダイーゼーション法にておこなった。
ヒトデルター１遺伝子の取得は国際公開番号ＷＯ９７／１９１７２に従って行うことができる。また、ヒトデルター１の全アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含むベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した形質転換細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＤＬ−１Ｆとして日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に平成８年１０月２８日に寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−５７２８として寄託されており、これを取り寄せて入手もできる。
【００１５】
このヒトデルター１遺伝子の色々な長さの部分遺伝子を調製し、これらをプローブとして用い、多くのｃＤＮＡライブラリーを色々なハイブリダイーゼション条件でスクリーニングを行い、クロスハイブリダイゼーションにて新たなノッチリガンド様分子を発見すべく進めた。
そして、鋭意研究の結果、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーよりノッチリガンド分子に共通するＤＳＬ様ドメインを有している新規分子、新規ヒトデルター３のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡの単離に成功し、このｃＤＮＡを用いて各種形態を有する蛋白質の発現系を作製した。また、これらの蛋白質の精製法を確立し、精製を行い単離した。
【００１６】
新規ヒトデルター３のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１から５に示し、それらをコードするＤＮＡ配列を配列表の配列番号６に示した。
このようにして作製された蛋白質の生理作用を神経未分化細胞、前脂肪細胞、肝細胞、筋芽細胞、皮膚未分化細胞、血液未分化細胞、免疫未分化細胞など、多数の細胞を用いて探索した。その結果、この新規ヒトデルター３は血液未分化細胞に対して分化制御作用を有し、かつ未分化な状態に維持する生理作用を有することを見いだした。
【００１７】
さらにマウスに対する毒性試験では明らかな毒性は観察されず有効な医薬品となる効果を示し、本発明が完成した。したがって本願分子を含む薬剤、本願分子を含む培地、本願分子が固定化された器材は、血液未分化細胞などの未分化細胞を未分化な状態で保つことができる全く新しい医薬品、医療品である。また該ヒトデルター３を免疫原として抗体を作製し、精製法を確立し、本発明が完成した。
【００１８】
すなわち、本発明は（１）少なくとも配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（２）少なくとも配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（３）少なくとも配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（４）少なくとも配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（５）少なくとも配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、（６）未分化細胞の分化抑制作用を有する前記（１）乃至（５）のポリペプチド、また、（７）未分化細胞が血液未分化細胞である前記（６）のポリペプチドに関する。また、（８）前記（１）乃至（５）のポリペプチドを含有する医薬組成物、（９）前記（１）乃至（５）のポリペプチドを含有する細胞培養培地、また（１０）細胞が血液未分化細胞である前記（９）の細胞培養培地に関する。
【００１９】
さらに、（１１）少なくとも配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（１２）少なくとも配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（１３）少なくとも配列表の配列番号３に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（１４）少なくとも配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（１５）少なくとも配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、（１６）少なくとも配列表の配列番号６に記載の５３０番から５８０番の塩基配列を含有する前記（１１）のＤＮＡ、（１７）少なくとも配列表の配列番号６に記載の５３０番から６４０番の塩基配列を含有する前記（１２）のＤＮＡ、（１８）少なくとも配列表の配列番号６に記載の７７番から６４０番の塩基配列を含有する前記（１３）のＤＮＡ、（１９）少なくとも配列表の配列番号６に記載の７７番から１４６８番の塩基配列を含有する前記（１４）のＤＮＡ、（２０）少なくとも配列表の配列番号６に記載の７７番から１７５９番の塩基配列を含有する前記（１５）のＤＮＡに関し、（２１）前記（１１）乃至（２０）のＤＮＡ群の中から選ばれるＤＮＡと、宿主細胞中で発現可能なベクターＤＮＡと連結してなる組み換えＤＮＡ体、（２２）前記（２１）の組み換えＤＮＡ体により形質転換された細胞、また、（２３）前記（２２）の細胞を培養し培養物中より生産された化合物を採取することを特徴とする前記（１）乃至（５）のポリペプチドの製造方法、また、（２４）配列表の配列番号５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを特異的に認識する抗体に関する。
【００２０】
以下、本発明を詳細に説明する。
遺伝子操作に必要なｃＤＮＡの作製、ノーザンブロットによる発現の検討、ハイブリダイゼーションによるスクリーニング、組換えＤＮＡの作製、ＤＮＡの塩基配列の決定、ｃＤＮＡライブラリーの作製等の一連の分子生物学的な実験は通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。前記の通常の実験書としては、たとえば、Ｍａｎｉａｔｉｓらの編集したＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，Ａｌａｂｏｒａｒｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，１９８９，Ｅｄｓ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬｏｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓを挙げることができる。
【００２１】
本発明のポリペプチドは少なくとも配列表の配列番号１から５のアミノ酸配列からなるポリペプチドを有するが、自然界で生じることが知られている生物種内変異、アレル変異等の突然変異及び人為的に作製可能な点変異による変異によって生じる改変体も、それらが配列表の配列番号１から５のポリペプチドの性質を失わない限り本発明のポリペプチドに含まれる。そのアミノ酸の改変、置換に関しては例えばＢｅｎｎｅｔｔらの出願（ＷＯ９６／２６４５）などに詳しく記載されており、これらを参考にして作製することができる。
【００２２】
また、配列表の配列番号１から５のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列については配列表の配列番号６にアミノ酸配列とともに示した。この遺伝子配列に関し、アミノ酸レベルの変異がなくとも、自然界から分離した、染色体ＤＮＡ、またはｃＤＮＡにおいて、遺伝コードの縮重により、そのＤＮＡがコードするアミノ酸配列を変化させることなくＤＮＡの塩基配列が変異した例はしばしば認められる。また、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域はポリペプチドのアミノ酸配列の規定には関与しないので、それらの領域のＤＮＡ配列は変異しやすい。このような遺伝コードの縮重によって得られる塩基配列も本発明のＤＮＡに含まれる。
【００２３】
本発明で記載する未分化細胞とは、特定の刺激によって増殖可能な細胞であり、かつ特定の刺激によって特定の機能を有する細胞に分化可能な細胞と規定され、これらの中には皮膚組織系の未分化細胞、脳神経系の未分化細胞、筋肉系の未分化細胞、血液系の未分化細胞などが含まれ、各々幹細胞といわれる自己複製能力を有しかつその系統の細胞を生み出す能力を有する細胞を含む。また、分化抑制作用とは、これらの未分化細胞が自律的もしくは他律的に分化する現象を抑制する作用であり、具体的には未分化な状態を維持する作用である。また、本発明で記載する血液未分化細胞とは、血液コロニーアッセイで同定が可能な特定の血液系列に分化することが運命づけられた血液前駆細胞および全ての系列への分化能と自己複製能を有する造血幹細胞を含む細胞群と規定される。
【００２４】
配列表において、配列表の配列番号１のアミノ酸配列は本発明のヒトデルター３のＤＳＬドメインの部分配列のアミノ酸配列であり、配列番号５に示した本発明のヒトデルター３の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１５２番から１６８番に相当している。配列表の配列番号２のアミノ酸配列は本発明のヒトデルター３のＤＳＬドメインのアミノ酸配列であり、配列番号５に示した本発明のヒトデルター３の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１５２番から１８８番に相当している。配列表の配列番号３のアミノ酸配列は本発明のヒトデルター３のシグナルペプチドを除いたアミノ末端からＤＳＬドメインまでの活性中心を含むアミノ酸配列であり、配列番号５に示した本発明のヒトデルター３の成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から１８８番に相当している。配列番号４のアミノ酸配列は、本発明のヒトデルター３のシグナルペプチドを除いた細胞外ドメインの配列であり、配列番号５に示した本発明のヒトデルター３成熟型全長アミノ酸配列のアミノ酸番号１番から４６４番に相当している。配列番号５のアミノ酸配列は、本発明のヒトデルター３の成熟型全長アミノ酸配列である。配列番号６の配列は本発明のヒトデルター３のｃＤＮＡ配列、及びそのコード領域に対応する全アミノ酸配列である。
【００２５】
なお、配列表に記載されたアミノ酸配列の左端及び右端はそれぞれアミノ基末端（以下Ｎ末）及びカルボキシル基末端（以下Ｃ末）であり、また塩基配列の左端及び右端はそれぞれ５’末端及び３’末端である。
未知のヒトノッチリガンドの遺伝子をクローニングするために次の方法が考え得る。ヒトノッチリガンドは生物の進化の過程で、ある程度アミノ酸配列、遺伝子配列が保存されていることから、別のノッチリガンド分子の遺伝子をプローブに用いてクローニングすることは原理的に可能である。しかしながら、このようなクロスハイブリダイゼーション法においては、どの部分をプローブとして用いるのが適当であるか、ハイブリダイゼーションの条件はどのようにするかなど多くの検討点があり、決して容易ではない。また、クロスハイブリダイゼーション法は多くの類似の遺伝子を同時にクローニングしてしまうため遺伝子配列解析に時間がかかるため、クローニングした遺伝子が目的の分子であるかどうか同定することは極めて困難であった。
【００２６】
本発明者はヒトデルター１遺伝子から１０種類以上の遺伝子断片を作製し、これをプローブとして１０種類以上の異なる臓器由来のｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを数多くのハイブリダイゼーション条件、洗浄条件にて行ない、新しいデルタ様分子の発見に努めた。
このプラークハイブリダイゼーションにおいてプローブをアイソトープ標識、及び各種非アイソトープ標識し、ライブラリーをスクリーニングすることによってクローンを得ることができる。アイソトープの標識法としては、たとえば［³²Ｐ］γ−ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて末端をラベルする方法や、他のニックトランスレーション法またはプライマー伸長法などによる標識法が利用できる。
【００２７】
その結果、本発明者らは実施例１において、ヒトデルター１の全長遺伝子の部分遺伝子、すなわち配列表の配列番号７に示した遺伝子配列を有するプローブを用いてヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行い、１次スクリーニングではおよそ１００個のポジティブプラークを分離し、２次スクリーニングにおいて、およそ８０個のポジティブプラークをクローン化し、これらのクローンの遺伝子配列の決定をおこなった。これらをクローニングした遺伝子の大半はプローブに用いたヒトデルター１遺伝子であったが、この中の２つのクローンがヒトデルター１に類似した本願の新規ヒトデルター３遺伝子であることであることが判明し、目的の新規ノッチリガンド分子を見いだすことに成功した。
【００２８】
この配列をデータベース（Ｇｅｎｂａｎｋリリース１０３、１９９７年１０月）で比較したところ、本分子のマウスホモログと考えられるマウスデルター３が、Ｙ１１８９５として登録されており、マウス分子はＤｕｎｗｏｏｄｉｅらにより発表されていた（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２４、３０６５−３０７６、１９９７）。しかしながら、彼らの報告では一部の遺伝子配列が未決定であり、またヒト分子に関しては今だ報告のない新規分子である。
【００２９】
ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、実施例１に記載したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ以外にも、例えば大腸菌由来のｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９（いずれも宝酒造社製）などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内で複製増殖できるものであればいずれも用いることができる。またｃＤＮＡを組み込むファージベクターとしては、例えばλｇｔ１０、λｇｔ１１などが挙げられるが、その他のものであっても宿主内で増殖できるものであれば用いることができる。このようにして、得られたプラスミドは適当な宿主、例えばエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などにカルシウムクロライド法等を用いて導入する。上記エシェリヒア属菌の例としては、エシェリヒアコリＫ１２ＨＢ１０１、ＭＣ１０６１、ＬＥ３９２、ＪＭ１０９などが挙げられる。上記バチルス属菌の例としてはバチルス、サチリスＭＩ１１４等が挙げられる。また、ファージベクターは、例えば増殖させた大腸菌にインビトロパッケージング法（ＥｎｑｕｉｓｔａｎｄＳｔｅｒｎｂｅｒｇ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：２８１−、１９７９）を用いて導入することができる。
【００３０】
該アミノ酸配列をＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅの方法（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５，１９８２）に従って、アミノ酸配列から疎水性部分、親水性部分を解析した。その結果、本発明のヒトデルター３は細胞膜通過部分を１つ有する細胞膜蛋白質として、細胞上に発現されることが明らかとなった。
ヒトデルター３のアミノ酸配列の解析によれば、ヒトデルター３の前駆体のアミノ酸配列は配列表の配列番号６のアミノ酸配列に示す５８２アミノ酸残基からなり、シグナルペプチド領域は同配列表のアミノ酸配列の−２１番のメチオニンから−１番のプロリンにあたる２１アミノ酸残基、細胞外領域は同配列表の１番のアラニンから４６４番のアルギニンにあたる４６４アミノ酸残基、細胞膜通過領域は同配列表のアミノ酸配列の４６５番のチロシンから４８９番のバリンにあたる２５アミノ酸残基、細胞内領域は同配列表の４９０番のアルギニンから５６１番のアラニンにあたる７２アミノ酸残基が該当することが推定された。ただし、これらの各部分は、あくまでもアミノ酸配列から予測されたドメイン構成であり、実際に細胞上および溶液中での存在形態は、上記の構成と若干異なることも十分考えられ、上記に一応規定された各ドメインの構成アミノ酸が、１０アミノ酸配列前後することも考えられる。
【００３１】
本願分子ヒトデルター３の１９９９年２月時点までに報告のあるノッチリガンド様分子との全長アミノ酸配列の比較では、前出のマウスデルター３とは８３．４％、ヒト由来の分子としてヒトデルター１とは３８．７％、ヒトデルター２とは４０．２％、ヒトセレイトー１とは３４．３％、ヒトセレイトー２とは３７．３％であった。ノッチのリガンドホモログは進化論的に保存された共通の配列を有している。すなわちＤＳＬ配列と繰り返して存在するＥＧＦ様配列である。ヒトデルター３とヒトデルター１およびヒトデルター２との比較により、ヒトデルター３のアミノ酸配列からこれら保存された配列を推定した。すなわち、ＤＳＬ配列は配列表の配列番号５のアミノ酸配列の１５２番のシステインから１８８番のシステインにあたる３７アミノ酸残基に相当した。ＥＧＦ様配列は６回繰り返して存在し、配列表の配列番号５のアミノ酸配列のうち、第１ＥＧＦ様配列は１９４番システインから２２２番システインまで、第２ＥＧＦ様配列は２５２番システインから２８３番システインまで、第３ＥＧＦ様配列は２９０番システインから３２４番システインまで、第４ＥＧＦ様配列は３３１番システインから３６２番システインまで、第５ＥＧＦ様配列は３６９番システインから４００番システインまで、第６ＥＧＦ様配列は４０７番システインから４３８番システインに該当した。
【００３２】
また、第１ＥＧＦ様配列と第２ＥＧＦ様配列の間には、他のデルタ様分子とは異なり、２つのシステインが存在した。ヒトデルター３のアミノ酸配列から予想されることとして、糖鎖が付加される部分はＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンがＮ−グリコシド結合可能な部分は見いだされなかったが、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンのＯ−グリコシド結合を推定する部分として、セリンまたはスレオニン残基が頻出する部分が考えられる。これらの糖鎖が付加されたタンパクの方がポリペプチドそのものよりも一般に生体内での分解に対して安定であり、また強い生理活性を有していると考えられる。したがって、配列表の配列番号１、２、３、４または５の配列を含有するポリペプチドのアミノ酸配列の中にＮ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミンなどの糖鎖がＯ−グリコシド結合してなるポリペプチドのように糖が付加された配列表の配列番号１、２、３、４または５のポリペプチドも本発明に含まれる。
【００３３】
ショウジョウバエノッチおよびそのリガンドの結合に関する研究により、ショウジョウバエノッチのリガンドがノッチに結合するために必要なアミノ酸領域は、シグナルペプチドが切断された成熟体蛋白質の少なくともＮ末からＤＳＬ配列までであることが明らかにされている（特表平７−５０３１２１）。また、同様に線虫を用いたＦｉｔｚｇｅｒａｌｄとＧｒｅｅｎｗａｌｄ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ１２１、４２７５−４２８２、１９９５）の研究からノッチリガンド様分子ＡＰＸ−１はノッチ様リセプターの活性化にとって少なくとも全長のアミノ末端からＤＳＬドメインまでで十分であることが明らかにされている。同様に、ノッチリガンド様分子Ｌａｇ−２でもアミノ末端からＤＳＬドメインまでのポリペプチドでノッチ様リセプターの活性化を引き起こすことが知られている（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎｅｔａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ８、１７５１−１７６２、１９９７）。更に最近の報告では、Ｊａｇｇｅｄ−１のＤＳＬドメインの部分ペプチドを用いた研究から、ＤＳＬドメインの一部（アミノ酸配列としてはCys Asp Asp Tyr Tyr Tyr Gly Phe Gly Cys Asn Lys Phe Cys Arg Pro Arg）でも同様な活性を有したとの報告もある（Ｌｉｅｔａｌ．、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ８、４３−５５、１９９８）。Ｊａｇｇｅｄ−１と本願のヒトデルター３のＤＳＬドメインのアミノ酸配列を比較すると活性があったとされる配列は配列表の配列番号１のアミノ酸配列に相当する。
【００３４】
これらのことから、ヒトノッチリガンド分子のリガンド作用発現に必要な領域は少なくともＤＳＬドメインの一部の配列表の配列番号１のアミノ酸配列であり、また、ＤＳＬドメイン全体、すなわち配列表の配列番号２のアミノ酸配列を含む領域であり、また、少なくともヒトデルター３のリガンド作用の発現に必要な領域は配列表の配列番号３に示したアミノ酸配列である。いずれも、新規なアミノ酸配列である。
【００３５】
また、配列表の配列番号の６の遺伝子配列の一部もしくは全部をコードするＤＮＡを用いれば、ヒトデルター３のｍＲＮＡの検出が可能である。たとえば、これらの遺伝子の発現を調べる方法として、配列表の配列番号６の一部の遺伝子配列を有する１２ｍｅｒから１６ｍｅｒ以上、さらに望ましくは２０ｍｅｒ程度もしくはそれ以上の相補し得る核酸、つまりアンチセンスＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらがメチル化、メチルフォスフェート化、脱アミノ化、またはチオフォスフェート化された誘導体を用い、ハイブリダイゼーション、ＰＣＲ等の手法によって行うことが出来る。さらに、ヒトを含めたゲノム上の遺伝子のクローニングも同様に可能である。従って、そのようにしてクローニングされたこれら遺伝子を用いれば、該ヒトデルター３の更に詳細な機能も明らかにすることが出来る。例えば、近年の遺伝子操作技術を用いれば、トランスジェニックマウス、ジーンターゲッティングマウス、また、本遺伝子と関連する遺伝子を共に不活化したダブルノックアウトなどのあらゆる方法を用いることが出来る。また、本遺伝子のゲノム上の異常があれば、遺伝子診断、遺伝子治療への応用も可能である。
【００３６】
ヒトデルター３ポリペプチドを生産する方法は実施例２に示したように、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１を用いて行うことができる。さらに、上記の方法にて分離したヒトデルター３のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを用いた色々な形態を有したヒトデルター３ポリペプチドの生産、精製には多数の方法が成書によって知られている（Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒａｎｄＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ − ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＳｔｏｃｋｔｏｎＰｒｅｓ，１９９０．および横田ら、バイオマニュアルシリーズ４, 遺伝子導入と発現・解析法, 羊土社、１９９４）。すなわち、分離した該ヒトデルター３のアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを適当な発現ベクターにつなぎ、動物細胞、昆虫細胞などの真核細胞、バクテリアなどの原核細胞を宿主として生産させることができる。
【００３７】
本発明のヒトデルター３を発現させる際に、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはその５’末端に翻訳開始コドンを有し、また、３’末端には翻訳終止コドンを有してもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することもできる。更に該ＤＮＡを発現させるには上流にプロモーターを接続する。ベクターとしては上記の大腸菌由来プラスミド、枯草菌由来プラスミド、酵母由来プラスミド、あるいはλファージなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。
【００３８】
本発明に用いられるプロモーターとしては、遺伝子発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
形質転換する際の宿主がエシェリヒア属菌である場合はｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーターなどが好ましく、宿主がバチルス属菌である場合にはＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーターなどが好ましく、宿主が酵母である場合にはＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
【００３９】
宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウィルスのプロモーター、メタルチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、アクチンプロモーターなどが利用できる。
もちろん、ポリペプチドの生産には化学的な手法、すなわちあらゆるペプチド合成手法も応用できる。特に配列表の配列番号１、配列番号２等の短いアミノ酸配列のポリペプチドには有効である。
【００４０】
本発明のポリペプチドを発現させる時、配列表の配列番号１〜５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡのみでもかまわないが、産生されたポリペプチドの検出を容易にするための既知抗原エピトープをコードするｃＤＮＡを付加したり、多量体構造を形成させるためにイムノグロブリンＦｃをコードするｃＤＮＡを付加することで、特別の機能を付加した蛋白質を生産させることもできる。
【００４１】
ヒトデルター３に関して本発明者らは実施例２に示したごとく、細胞外タンパク質を発現する発現ベクターとして１）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列の１番から４６４番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、２）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列の１番から４６４番のアミノ酸のＣ末側に８アミノ酸、すなわち Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lysのアミノ酸配列（以下ＦＬＡＧ配列、配列表の配列番号８）を持つペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡ、および３）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列の１番から４６４番のアミノ酸のＣ末側にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ配列（ＷＯ９７／１９１７２に記載されている）を付加し、ヒンジ部分のジスルフィド結合により２量体構造を有するキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（米国ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社）に各々別々につなぎ、ヒトデルター３の細胞外部分発現ベクターを作製した。
【００４２】
また、ヒトデルター３の全長タンパク質を発現する発現ベクターとして４）配列表の配列番号５の１番から５６１番のアミノ酸をコードするＤＮＡ、および５）配列表の配列番号５の１番から５６１番のアミノ酸のＣ末端側にＦＬＡＧ配列を持つペプチドを付加したキメラタンパク質をコードするＤＮＡを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１に各々別々につなぎ、ヒトデルター３の全長発現ベクターを作製した。このようにして構築された該ヒトデルター３をコードするＤＮＡを含有する発現プラスミドを用いて、形質転換体を製造した。
【００４３】
宿主としては例えばエシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。動物細胞としては、例えばサル細胞であるＣＯＳ−７、Ｖｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ、カイコ細胞ＳＦ９などが挙げられる。
実施例３に示したごとく、上記の１）〜５）の発現ベクターをそれぞれ別々に遺伝子導入し、ヒトデルター３をＣＯＳ−７細胞（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）で発現させ、これら発現プラスミドで形質転換された形質転換体が得られる。さらに、各形質転換体をそれぞれ公知の方法により、適当な培地中で適当な培養条件により培養することによって各種ヒトデルター３ポリペプチドを製造することができる。
【００４４】
実施例４に示したごとく、上記の様な培養物からヒトデルター３ポリペプチドを分離精製することができる。また、一般的には下記の方法により行うことができる。
すなわち、培養菌体あるいは細胞から抽出するに際しては、培養後、公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌体あるいは細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチーム及び／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破砕した後、遠心分離や濾過により粗抽出液を得る方法などを適宜用いることができる。緩衝液の中に尿素、塩酸グアニジンなどのタンパク変性剤や、トリトンＸ−１００などの界面活性剤が含まれていてもよい。培養溶液中に分泌される場合には、培養液を公知の方法、たとえば遠心分離法などで菌体あるいは細胞と分離し、上清を集める。
【００４５】
このようにして得られた細胞抽出液あるいは細胞上清に含まれるヒトデルター３は公知のタンパク質精製法を用いることで、精製できる。その精製の過程でタンパク質の存在を確認するために、上記に示したＦＬＡＧ、ヒトＩｇＧＦｃなどの融合タンパクの場合には、それら既知抗原エピトープに対する抗体を用いたイムノアッセイで検出して精製を進めることができる。また、このような融合タンパク質として発現させない場合には、実施例５に記載した抗体を用いて検出することができる。
【００４６】
ヒトデルター３を特異的に認識する抗体は実施例５に示したように作製することができる。また成書（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，Ｅ．Ｈａｒｌｏｗｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）に示された各種の方法ならびに遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組換え体抗体によっても作製することができる。このように作製された抗体はヒトデルター３の精製に利用できる。すなわち、実施例５に示したこれらのヒトデルター３を特異的に認識する抗体を用いれば、本発明のヒトデルター３の検出、測定が可能であり、細胞の分化異常に伴う疾患例えば悪性腫瘍など疾患の診断薬として使用でき得る。
【００４７】
精製方法としてより有効な方法としては抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。この際に用いる抗体としては実施例５に記載した抗体を用いることができる。また、融合タンパクの場合には、実施例４に示したように、ＦＬＡＧであればＦＬＡＧに対する抗体、ヒトＩｇＧＦｃであればＰｒｏｔｅｉｎＧ、ＰｒｏｔｅｉｎＡを用いることができる。
【００４８】
このように精製されたヒトデルター３タンパクの生理機能を、各種細胞株、マウス、ラットなどの生物個体を用いた各種生理活性アッセイ法、分子生物学的手法に基づく細胞内シグナル伝達の各種アッセイ法、ノッチリセプターとの結合などの色々なアッセイ法にて知ることができる。
本発明者らはヒトデルター３のＩｇＧ１キメラ蛋白質を用いて、血液未分化細胞への作用を観察した。すなわち、実施例６に示したようにＣＤ３４陽性細胞画分を濃縮した臍帯血由来血液未分化細胞において、各種サイトカイン存在下でコロニー形成する血液未分化細胞に対してコロニー形成作用の抑制活性を有することを見いだした。
【００４９】
またさらに、実施例７に示したように本願ヒトデルター３のＩｇＧ１キメラ蛋白質は血管内皮細胞の増殖に対して抑制的作用を有しており、血管新生作用を阻害する活性を有する。したがって、ＦｏｌｋｍａｎとＫｌａｇｓｂｒｕｎ（Ｓｃｉｅｎｃｅ２３５，４４２−４４７、１９８７）によって提唱された血管新生を抑制することで治療できるであろう疾患、病態に対する治療薬剤として使用できる。
【００５０】
この結果から、ヒトデルター３は血液未分化細胞の分化を抑制し、それらの作用は血液幹細胞からコロニー形成細胞にわたって作用することが明らかである。これらの生理作用は血液未分化細胞の体外増殖に必要な作用であり、特にヒトデルター３を含有する細胞培養培地で培養した細胞は抗癌剤投与後の骨髄抑制回復に有効であり、他の条件を整えることにより体外での造血幹細胞の増幅を可能とするであろう。さらに、医薬品として用いた場合には、抗癌剤などの副作用で見られる骨髄抑制作用を保護し、軽減する作用がある。
【００５１】
さらに、血液細胞以外の未分化細胞においても、細胞の分化を抑制する作用が主に期待でき、また組織再生を促す作用等が期待できる。
医薬品として用いるならば、本発明のポリペプチドを適当な安定化剤、例えばヒト血清アルブミンなどと共に凍結乾燥品を作製し、用時注射用蒸留水にて溶解もしくは懸濁して使用し得る形状が望ましい。例えば０．１から１０００μｇ／ｍｌの濃度に調製した注射剤、点滴剤として提供することができる。本発明者らが実施例８に示したように本発明の化合物１ｍｇ／ｍｌ、ヒト血清アルブミン５ｍｇ／ｍｌとなるようにバイアルに小分けし、長期にわたって該化合物の活性は保持された。さらに、細胞を体外にて培養、活性化させる場合には医薬品同様に、凍結乾燥品、もしくは溶液剤を作製して、培地に加える、もしくは培養に使用する容器に固定化することができる。また、本発明のポリペプチドの毒性については、マウスに対していずれのポリペプチドも１０ｍｇ／Ｋｇを腹腔内投与したがマウスの死亡例は確認されなかった。
【００５２】
また、本発明のポリペプチドのインビトロの生理活性は、あらゆる疾患モデルマウス、またはそれらに準ずる疾患に似た症状を呈するラット、サル等の動物をモデルとして投与を行い、その身体的、生理的な機能の回復、異常を調べることにより可能となる。例えば、造血細胞に関する異常であれば、５−ＦＵ系の抗癌剤を投与して、骨髄抑制モデルマウスを作製し、このマウスに本発明のポリペプチドを投与した群としなかった群の骨髄細胞、末梢血細胞の数、生理的な機能を調べることで明らかになる。また更に、体外で造血幹細胞を含む造血未分化細胞の培養、増殖を調べる場合には、マウス骨髄細胞を培養器などを利用して、培養を行い、その際に本発明の化合物を加えた群と加えなかった群で培養後の細胞を致死量放射線照射マウスに細胞移植を行い、その結果の回復の度合いを、生存率、血球数の変動などを指標にすることで調べることが出来る。勿論、これらの結果が人にも外挿できるため、本ポリペプチドの薬効としての評価として有効なデータを得ることが出来る。
【００５３】
本発明の化合物を医薬品として利用する場合、その適応として、細胞の分化異常に伴う疾患、例えば白血病、悪性腫瘍の治療があげられ、体外でヒト由来細胞を培養して、その本来の機能を保ったまま増殖させる、もしくは新たな機能を持たせる等を行う細胞治療、組織損傷後の再生時に投与することにより本来その組織が有していた機能を損なうことなく再生させる治療法などの応用が可能である。その際の投与量としてはその形態などにもよるが、具体的には１０μｇ／Ｋｇから１０ｍｇ／Ｋｇ程度投与すればよい。
【００５４】
また、さらに強い生理活性を有する形態として、多量体を形成し得る形態で発現させることが望ましい。
多量体構造を有するヒトデルター３は、実施例２および３に記載したヒトＩｇＧのＦｃ部分とのキメラタンパク質として発現させて抗体のヒンジ部分によりジスルフィド結合をした多量体として発現させる方法、また、抗体認識部位をＣ末端もしくはＮ末端に発現するキメラタンパクとして発現させ、発現させた該ヒトデルター３の細胞外部分を含むポリペプチドをＣ末端もしくはＮ末端の抗体認識部位を特異的に認識する抗体と反応させることにより多量体を形成させる方法が挙げられる。さらに、別の方法として、抗体のヒンジ領域部分のみとの融合タンパクを発現させて、ジスルフィド結合にて２量体を形成させる方法、もしくはその他のヒトデルター３の活性に何等影響を与えない方法でジスルフィド結合を生じさせる形のペプチドをＣ末端、Ｎ末端もしくはその他の部位に発現するように作成された融合タンパクから構成された２量体以上の高い比活性を有する多量体型ヒトデルター３を得ることもできる。
【００５５】
また、さらに配列表の配列番号１、２、３、４及び５のアミノ酸配列を含むポリペプチドから選ばれる１つ以上のポリペプチドを遺伝子工学的に２つ以上直列にもしくは並列に並べ多量体構造を発現させる方法などもある。その他、現在知られている２量体以上の多量体構造を持たせるあらゆる方法が適応可能である。したがって、遺伝子工学的な技術により作製される２量体もしくはそれ以上の形態を有する形の配列表の配列番号１、２、３、４及び５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。
【００５６】
また、その他の方法として、化学的な架橋剤を用いて多量体化する方法が挙げられる。例えば、リシン残基を架橋するジメチルスベロイミデート２塩酸塩など、システイン残基のチオール基で架橋するＮ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミドなど、アミノ基とアミノ基を架橋するグルタールアルデヒドなどが挙げられ、これらの架橋反応を利用して、２量体以上の多量体を形成させることができる。したがって、化学的な架橋剤により作製される２量体もしくはそれ以上の多量体の形態を有す形の配列表の配列番号１、２、３、４もしくは５に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む化合物に関しても本発明に含まれる。
【００５７】
体外において細胞を増殖、活性化し、体内に細胞を戻す医療方法への適応には、上記のような形態を有したヒトデルター３を直接培地中に加えることも可能だが、固定化する事も同様に可能である。固定化の方法としてはこれらのポリペプチドのアミノ基、カルボキシル基を利用したり、適当なスペーサーを用いたり、上記の架橋剤を用いたりして、培養容器にポリペプチドを共有結合させることができる。したがって、固体表面に存在する形態を有す配列表の配列番号１、２、３、４及び５のアミノ酸配列を含有するポリペプチドに関しても本発明に含まれる。
【００５８】
また、自然界に存在するヒトデルター３は細胞膜蛋白質であることから、これらの分子を発現する細胞と血液未分化細胞を共培養することによっても、実施例で行った分化抑制作用を発現させることができる。したがって、配列表の配列番号１、２、３、４、もしくは５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを用いて形質転換した細胞と未分化細胞を共培養する方法についても本願に含まれる。
【００５９】
発現させる細胞は実施例３で示したＣＯＳ−７細胞でもかまわないが、ヒト由来の細胞が望ましく、また更に発現させる細胞は細胞株ではなくヒトの体内の血液細胞でも体細胞でもかまわない。したがって、遺伝子治療用のベクターに組み込んで体内で発現させることもできる。
また、本願分子すなわち配列表の配列番号１、２、４、もしくは５のアミノ酸配列を有するポリペプチドとこれらのリセプターとの結合を阻害することは細胞分化を促進する分子、化合物を見つけだす手段として利用できる。その方法としては、ラジオアイソトープなどを用いた結合実験、ノッチリセプターの下流分子である転写調節因子群を用いたルシフェラーゼアッセイ、Ｘ線構造解析を行いコンピューター上でのシミュレーションなどあらゆる方法が応用できる。したがって、配列表の配列番号１、２、３、４もしくは５のポリペプチドを用いた薬剤スクリーニング方法に関しても本願に含まれる。
【００６０】
【発明の実施の形態】
以下に発明を実施する形態について実施例を示すが、必ずしもこれらに限定されるものではない。
【００６１】
【実施例１】
新規ヒトデルター３のｃＤＮＡクローニング
配列表の配列番号７のヒトデルター１遺伝子をプローブとして用いて新たなヒトデルタホモログの遺伝子クローニングを行った。
プローブは以下のようにして作成した。すなわち、国際公開番号ＷＯ９７／１９１７２に記載のヒトデルター１ｃＤＮＡ、すなわち、ベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを鋳型としてＰＣＲ法にて作製した。尚、ベクターｐＵＣＤＬ−１Ｆを大腸菌ＪＭ１０９に遺伝子導入した形質転換細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ：ＪＭ１０９−ｐＵＣＤＬ−１Ｆとして日本国茨城県つくば市東一丁目一番三号に所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。寄託日は平成８年１０月２８日であり、寄託番号はＦＥＲＭＢＰ−５７２８。プライマーは配列表の配列番号９のセンスプライマー及び配列表の配列番号１０のアンチセンスプライマーを用いた。
【００６２】
これらプライマーを用いたＰＣＲによる増幅は以下のように行った。ｐＵＣＤＬ−１Ｆ溶液を１μｌ（０．１μｇ相当）を鋳型として使用し、１０×緩衝液（５００ｍＭＫＣｌ、１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、１５ｍＭＭｇＣｌ₂、０．０１％ゼラチン）５μｌ、ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（日本国宝酒造社製）４μｌ、前述のセンスプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌおよびアンチセンスプライマー（１０ｐｍｏｌ／μｌ）２μｌ、及びＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ：日本国宝酒造社製、５Ｕ／μｌ）０．２μｌを加え、最後に脱イオン水を加えて全量を５０μｌとして、９５℃で４５秒間、５５℃で４５秒間、７２℃を２分間からなる行程を１サイクルとして、この行程を３０サイクル行い最後に７２℃にて７分間放置してＰＣＲを行った。このＰＣＲ産物の一部を２％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本国日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約５５０ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。
【００６３】
このＰＣＲ産物をアガロースゲルより切り出し、ＧｅｎｅｃｌｅａｎＩＩキット（Ｂｉｏ１０１社製）にて添付の取扱説明書に従いＤＮＡプローブを精製し、２５ｎｇ／μｌとなるように蒸留水に希釈して、配列表の配列番号７に示した配列を有するＤＮＡプローブを作製した。このようにして作製した配列表の配列番号７の遺伝子配列を有するＤＮＡをプローブとして用い、以下のようにライブラリーのスクリーニングを行った。
【００６４】
ライブラリースクリーニングは、ヒト胎児脳由来のｃＤＮＡライブラリー（λｇｔ１０にｃＤＮＡが挿入されたもの、米国ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を対象にプラークハイブリダイゼーションにて行った。出現したプラークをナイロンフィルター（ＨｙｂｏｎｄＮ＋：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）に転写し、転写したナイロンフィルターをアルカリ処理（１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に７分間放置）し、次いで中和処理（１．５ＭＮａＣｌ、０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２）、１ｍＭＥＤＴＡを染み込ませたろ紙上に３分間放置）を２回行い、次にＳＳＰＥ溶液（０．３６ＭＮａＣｌ、０．０２Ｍりん酸ナトリウム（ｐＨ７．７）、２ｍＭＥＤＴＡ）の２倍溶液中で５分間振とう後洗浄し、風乾した。その後、０．４ＭＮａＯＨを染み込ませたろ紙上に２０分間放置し、５倍濃度のＳＳＰＥ溶液で５分間振とう後洗浄し、再度風乾した。このフィルターを用いて放射性同位元素³²Ｐにて標識された上記のヒトデルタ−１プローブにてスクリーニングを行った。
【００６５】
放射性同位元素³²Ｐにて標識されたＤＮＡプローブは以下のように作成した。得られたＤＮＡ断片をＤＮＡラベリングキット（ＭｅｇａｐｒｉｍｅＤＮＡｌａｂｅｌｉｎｇｓｙｓｔｅｍ：米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を用い、添付の説明書に従って標識した。すなわち、ＤＮＡ２５ｎｇにプライマー液５μｌ及び脱イオン水を加えて全量を３３μｌとして沸騰水浴を５分間行い、その後、ｄＮＴＰを含む反応緩衝液１０μｌ、α−［³²Ｐ］−ｄＣＴＰ５μｌ、及びＴ４ＤＮＡポリヌクレオチドキナーゼ溶液２μｌを加えて、３７℃で１０分間水浴し、更にその後、セファデックスカラム（ＱｕｉｃｋＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎＳｅｐｈａｄｅｘＧ−５０：独逸国ベーリンガーマンハイム社製）で精製し、５分間沸騰水浴をしたのち、２分間氷冷後使用した。
【００６６】
ハイブリダイゼーションは前述の方法にて作成したフィルターを、各々の成分の最終濃度が５倍濃度のＳＳＰＥ溶液、５倍濃度のデンハルト液（日本国和光純薬社製）、０．５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、日本国和光純薬社製）、及び１０μｇ／ｍｌの沸騰水浴により変性したサケ精子ＤＮＡ（米国Ｓｉｇｍａ社製）であるプレハイブリダイゼーション液中に浸し、６５℃にて２時間振とうしたのち、前述の方法で³²Ｐ標識されたプローブを含むプレハイブリダイゼーション液と同一組成のハイブリダイゼーション液に浸し、５５℃にて１６時間振盪し、ハイブリダイゼーションを行った。その後、０．１％ＳＤＳを含むＳＳＣ溶液に浸し、室温で振盪し６回洗浄後、さらに０．１％ＳＤＳを含む３倍希釈したＳＳＣ溶液に浸し、１回洗浄した。洗浄を終了したフィルターを増感スクリーンを使用して、オートラジオグラフィーを行った。その結果、強く露光された部分のクローンを拾い、再度プラークを蒔き直し前述の方法にてスクリーニングを行い、完全に単独のクローンを分離した。上記の条件でおよそ１２０万個のプラークを１次スクリーニングとして行った結果、約１００個のプラークがポジティブと判断され、これらを同様な方法で２次スクリーニングを行って各ファージを分離した。
【００６７】
成書の方法に従い、これらのすべてのクローンのファージを約１×１０⁹ｐｆｕ調製し、ファージＤＮＡをウィザードラムダプレップ（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にて精製し、制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、同様にＥｃｏＲＩで消化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）に組み込み、末端の遺伝子配列をＤＮＡシークエンサーにてＤＮＡ遺伝子配列を解析した。
【００６８】
大多数のクローンは前述のヒトデルター１遺伝子に相当した。ヒトデルター１以外の配列であると確認された遺伝子については、更にプライマーウォーキング法にて配列を決定した。この中にヒトデルター１には似ているが異なる遺伝子配列を有し、なおかつコンピューターソフトウエアＧｅｎｅｔｙｘＣＤＶｅｒ３７（日本国ソフトウエア開発株式会社製）にてＧｅｎｂａｎｋリリース１００上には存在しない新規な配列を含むクローンが見いだされた。同一の配列を有しているクローンとして＃５、＃１１であり、これらのクローンのＤＮＡ配列を、プライマーウオーキング法にて、パーキンエルマーＡＢＩＤＮＡシークエンサーを用いて５’方向、３’方向の両方向から、本発明の全長のｃＤＮＡ塩基配列を決定した。
【００６９】
その結果、クローン＃５、およびクローン＃１１は新しいヒトデルター１、ヒトデルター２に類似した分子であることからヒトデルター３と命名した。クローン＃１１は配列表の配列番号６に記載のＤＮＡ配列の全配列を含み、クローン＃５は配列表の配列番号６に記載のＤＮＡ配列の３７７番から１８７４番までの配列にさらに３’方向に３００ベースほど長いクローンであった。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳのＥｃｏＲＩサイトにライゲーションされているクローン＃１１を含むベクターをｐＢＳＤＬ−３と命名する。
【００７０】
【実施例２】
ヒトデルター３発現ベクターの作製
実施例１のヒトデルター３の全長をコードするベクターｐＢＳＤＬ−３を用いて、次の１）から５）に挙げるヒトデルター３蛋白質の発現ベクターを作製した。制限酵素サイトの付加、短い遺伝子配列の挿入は全て米国Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製ＥｘＳｉｔｅＰＣＲ−ＢａｓｅｄＳｉｔｅ−ＤｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔを用い、添付の取扱い説明書に従って行った。また、配列の付加などを行った際には実施例１に記載した方法で遺伝子配列を決定して、作業中の遺伝子配列の変更などを確認して進めた。
【００７１】
１）分泌型ヒトデルター３蛋白質（ＨＤ３ＥＸ）発現ベクター
配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１番から４６４番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、サイトメガロウィルスのプロモーターとネオマイシン耐性遺伝子を含む発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１につなぎ、発現ベクターを作製した。
ｐＢＳＤＬ−３をテンプレートとして、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号４のアミノ酸配列の４６４番目のアルギニン残基までをコードするＤＮＡ配列に続き、終止コドン、更に制限酵素ＸｂａＩサイトを付加するため、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔを用い、配列表の配列番号１１及び配列番号１２の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、終止コドン、さらにＸｂａＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにて消化し、切り出されてくる約１５００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３．１につないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤ３ＥＸと命名した。
【００７２】
２）分泌型ヒトデルター３のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＤ３ＥＸＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号４のアミノ酸配列の１番から４６４番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１につなぎ、発現ベクターを作製した。
【００７３】
ｐＢＳＤＬ−３をテンプレートとして用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号４の４６４番目のセリン残基までをコードするＤＮＡ配列に続き、ＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＸｂａＩサイトを付加するため同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔを用い、配列表の配列番号１１及び配列番号１３の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さらにＸｂａＩサイトの付加を行った。次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにて消化し、切り出されてくる約１５００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３．１につないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤ３ＥＸＦＬＡＧと命名した。
【００７４】
３）分泌型ヒトデルター３のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質（ＨＤ３ＥＸＩｇ）発現ベクター
配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドのＣ末にヒトＩｇＧ１のヒンジ部分以下のＦｃ部分のアミノ酸配列を付加したポリペプチドをコードする遺伝子配列をｐｃＤＮＡ３．１につなぎ、発現ベクターを作製した。
【００７５】
イムノグロブリンＦｃタンパクとの融合タンパクの作製はＺｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌらの方法（Ｚｅｔｔｌｍｅｉｓｓｌｅｔａｌ．，ＤＮＡｃｅｌｌＢｉｏｌ．，９，３４７−３５４，１９９０）にしたがって、イントロンを含むゲノムＤＮＡを用いた遺伝子を利用し、その遺伝子をＰＣＲ法を用いて作製した。その作製法に関しては国際公開番号ＷＯ９７／１９１７２にも記載してある。この遺伝子は５’端に制限酵素ＢａｍＨＩサイトを有し、３’端にＸｂａＩサイトを有し、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳのＢａｍＨＩサイトとＸｂａＩサイトにクローニングされている。以下、このプラスミドをｐＢＳｈＩｇＦｃとする。
【００７６】
ｐＢＳＤＬ−３をテンプレートとして用い、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔを用い、細胞外部分のカルボキシル末端部分、すなわち配列表の配列番号４の４６４番目のアルギニン残基の後に、制限酵素ＢａｍＨＩサイトを付加し、さらにその下流に上記のヒトイムノグロブリンＩｇＧ１ＦｃをコードするＤＮＡをつなぐためのＸｂａＩサイトを付加するために、配列表の配列番号１１と配列番号１４のオリゴヌクレオチドにて、同様にＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔを用い、これらのサイトの付加を行った。また、この際にはＢａｍＨＩサイトの付加によりアミノ酸をコードするフレームがずれないように、配列表の配列番号６のＤＮＡ配列上の４６４番目のアルギニンをコードするＤＮＡ配列はＣＧＣからＣＧＧに変更した。
【００７７】
この様にして作製したベクターをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し、上記のｐＢＳｈＩｇＦｃをＸｂａＩ、ＢａｍＨＩにて消化し切り出されてくる約１２００ｂｐの遺伝子断片をつないで最終的に目的の分泌型ヒトデルター３のＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質をコードする遺伝子断片を含むベクターを作成した。最後に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにて消化し、切り出されてくる約２７００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３．１につないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤ３ＥＸＩｇと命名した。
４）全長型ヒトデルター３の蛋白質（ＨＤ３Ｆ）発現ベクター
配列表の配列番号５のアミノ酸配列の１番から５６１番のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１につなぎ、発現ベクターを作製した。
【００７８】
ｐＢＳＤＬ−３を制限酵素ＥｃｏＲＩにて消化し、切り出されてくる約１９００ｂｐの遺伝子断片を同制限酵素で消化した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１につないで、遺伝子挿入方向をＰＣＲ法にて確認して、発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤ３Ｆと命名した。
５）全長型ヒトデルター３のＦＬＡＧキメラ蛋白質（ＨＤ３ＦＬＡＧ）発現ベクター
配列表の配列番号５のアミノ酸配列の１番から５６１番のポリペプチドのＣ末端にＦＬＡＧ配列をコードするｃＤＮＡを付加したキメラ蛋白質をコードするｃＤＮＡを、発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１につなぎ、発現ベクターを作製した。
【００７９】
ｐＢＳＤＬ−３をテンプレートとして、カルボキシル末端部分にＦＬＡＧ配列を付加し、ついで終止コドン、更に制限酵素ＸｂａＩサイトを付加するため同様に配列表の配列番号１１及び配列番号１５の遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして、Ｃ末端にＦＬＡＧ配列をコードする遺伝子並びに終止コドン、さらにＸｂａＩサイトの付加を行った。
次に、このベクターをＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩにて消化し、切り出されてくる約１８００ｂｐの遺伝子断片を同様な制限酵素処理したｐｃＤＮＡ３．１につないで発現ベクターを構築した。このベクターをｐＨＤ３ＦＬＡＧと命名した。
【００８０】
【実施例３】
各種発現ベクターの細胞への遺伝子導入と発現
実施例２で作製した発現ベクターはＣＯＳ−７細胞（理化学研究所、細胞開発銀行から入手可能、ＲＣＢ０５３９）に遺伝子導入した。
遺伝子導入前の細胞の培養はＤ−ＭＥＭ（ダルベッコ改変ＭＥＭ培地、米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社製）１０％ＦＣＳにて培養した。遺伝子導入の前日に細胞の培地を交換し、細胞数を５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｍｌにして一晩培養した。遺伝子導入の当日、遠心分離にて細胞を沈澱させ、ＰＢＳ（−）にて２回遠心洗浄後、１ｍＭＭｇＣｌ₂、ＰＢＳ（−）に１×１０⁷ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるようにして細胞を調製した。遺伝子導入は米国Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製遺伝子導入装置ジーンパルサーを用いたエレクトロポレーション法で行った。上記の細胞懸濁液を５００μｌエレクトロポレーション専用セル（０．４ｃｍ）に取り、発現ベクターを２０μｇ加え、氷中で５分間放置した。その後、３μＦ，４５０Ｖの条件で２回電圧をかけ、その２回の間は１分間室温で放置した。その後、氷中で５分間放置後、上記の培地１０ｍｌをあらかじめ分注した直径１０ｃｍ細胞培養用ディシュに細胞を播種し、３７℃、５％炭酸ガスインキュベーターで培養した。
【００８１】
その翌日、培養上清を除去し、ディッシュに付着した細胞をＰＢＳ（−）１０ｍｌで２回洗浄し、発現ベクターｐＨＤ３ＥＸ、ｐＨＤ３ＥＸＦＬＡＧ、及びｐＨＤ３ＥＸＩｇの場合は無血清のＤ−ＭＥＭ１０ｍｌを加えてさらに７日間培養し、培養上清を回収し、セントリコン３０（米国アミコン社製）にてバッファーをＰＢＳ（−）に置換すると同時に１０倍濃縮を行い、細胞培養上清を得た。
【００８２】
また、ｐＨＤ３Ｆ及びｐＨＤ３ＦＬＡＧの場合は、１０％ＦＣＳを含むＤ−ＭＥＭに培地を交換し、さらに３日間培養し、細胞破砕物を調製した。すなわち、２×１０⁶個の細胞をセルリシスバッファー（５０ｍＭＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、１％ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１０％グリセロール、４ｍＭＥＤＴＡ、５０μｇ／ｍｌＡｐｒｏｔｉｎｉｎ、１００μＭＬｅｕｐｅｐｔｉｎ、２５μＭＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ、１ｍＭＰＭＳＦ）２００μｌに懸濁し、氷中に２０分間放置し、その後１４０００ｒｐｍで２０分間遠心し上清を取り細胞破砕物を得た。
【００８３】
こうして得られたサンプルを用いてウェスタンブロッティング法にて蛋白の発現を確認した。
すなわち、濃縮した培養上清もしくは細胞破砕物を日本国バイオクラフト社製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ用電気泳動槽及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ用ポリアクリルアミドゲル（グラジエントゲル５〜１５％）を用い、添付の取扱い説明書に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった。サンプルは２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を加えて５分間の沸騰水浴加熱処理により還元処理を行ったものと、この処理を行わない非還元状態のものを用い、マーカーとしてはＡｍｅｒｓｈａｍ社製レインボーマーカー（高分子量用）を用い、サンプルバッファー、泳動バッファーについては添付の取扱い説明書に従って作製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ終了後、アクリルアミドゲルをＰＶＤＦメンブランフィルター（米国ＢｉｏＲａｄ社製）に同社製ミニトランスブロットセルにより転写した。
【００８４】
このように作製されたフィルターをブロックエース（日本国大日本製薬社製）、もしくは５％牛由来アルブミン（米国シグマ社製）を含むＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭＴｒｉｓ、１３７ｍＭＮａＣｌ（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０に４℃一晩振盪してブロッキングした。その後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社）に添付の説明書に従い、実施例５に記載した抗ヒトデルター３マウスモノクローナル抗体、もしくはＦＬＡＧキメラの場合（ＨＤ３ＥＸＦＬＡＧ、ＨＤ３ＦＬＡＧ）は一次抗体としてマウスモノクローナル抗体Ａｎｔｉ−ＦＬＡＧＭ２（米国コダック社製）を用い、二次抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇ羊抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。また、ＩｇＧキメラの場合（ＨＤ３ＥＸＩｇ）は、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇヒツジ抗体（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）を反応させた。
【００８５】
抗体の反応時間は各々室温で一時間反応させ、各反応間はＴＢＳ−Ｔにて１０分間室温で振盪洗浄する操作を３回ずつ繰り返した。最後の洗浄後、フィルターをＥＣＬウエスタンブロッティング検出システム（米国Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）の反応液に５分間浸し、ポリ塩化ビニリデンラップに包んでＸ線フィルムに感光させた。
【００８６】
その結果、還元処理を行ったサンプルはｐＨＤ３ＥＸとｐＨＤ３ＥＸＦＬＡＧの導入によって得られた蛋白質は約６０ｋダルトン、ｐＨＤ３ＥＸＩｇの導入によって得られた蛋白質は約８５ｋダルトン、一方、非還元状態のサンプルはｐＨＤ３ＥＸＩｇを導入した場合、約１６０ｋダルトンのバンドを検出し、還元条件のほぼ２倍の分子量であることから、２量体が形成されていることを確認した。
また、ｐＨＤ３ＦとｐＨＤＦＬＡＧでは共に約８０ｋダルトンのバンドを検出した。
【００８７】
これらの実験では、コントロールとしてインサートのないｐｃＤＮＡ３．１ベクターを導入したＣＯＳ−７細胞の細胞破砕物および培養上清を同様に試験したが、抗ヒトデルター３マウスモノクローナル抗体、抗ＦＬＡＧ抗体、抗ヒトＩｇ抗体に反応するバンドは検出されなかった。
以上の結果から、これら５種の発現ベクターはいずれも目的のポリペプチドを生産することができた。
【００８８】
【実施例４】
遺伝子導入細胞による分泌型ヒトデルター３蛋白質の精製
実施例３の方法で発現が検出されたＨＤ３ＥＸＦＬＡＧもしくはＨＤ３ＥＸＩｇを含むＣＯＳ−７細胞培養上清を大量調製し、アフィニティーカラムによってこれらキメラ蛋白質を精製した。
ＨＤ３ＥＸＦＬＡＧに関しては、実施例３に記載した方法によって取得した２リットルの培養上清をＡｎｔｉ−ＦＬＡＧＭ２ＡｆｆｉｎｉｔｙＧｅｌ（米国コダック社製）を充填したカラムに通して、キメラ蛋白質が有するＦＬＡＧ配列とゲルのＡｎｔｉ−ＦＬＡＧ抗体のアフィニティーによりキメラ蛋白質をカラムに吸着させた。カラムは内径１０ｍｍのディスポカラム（米国ＢｉｏＲａｄ社製）を用い、上記ゲルを５ｍｌ充填した。吸着は培地ボトル→カラム→ペリスターポンプ→培地ボトルの環流式回路を組み立て、流速１ｍｌ／分で７２時間循環させた。その後、カラムをＰＢＳ（−）３５ｍｌで洗浄し、０．５ＭＴｒｉｓ−グリシン（ｐＨ３．０）５０ｍｌで溶出した。あらかじめ小チューブ（米国ファルコン社製２０６３）に０．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌ分注しておき、溶出液は２ｍｌずつ２５画分をそのチューブに分取し、各々の画分を中和した。
【００８９】
上記の方法で精製された分泌型ＦＬＡＧキメラ蛋白質の溶出画分の各１０μｌは、実施例３に記載の還元処理を行い、５−１５％濃度勾配ポリアクリルアミドゲルによるＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、電気泳動終了後、日本国和光純薬社製ワコー銀染キットＩＩを用いて、添付の説明書に従って銀染色を行った。結果として、ＨＤ３ＦＬＡＧは第４番から第８番の溶出画分にバンドが検出され、この分子量は実施例３で得られた抗ＦＬＡＧ抗体によるウェスタンブロッティングの結果と一致した。この結果からＨＤ３ＥＸＦＬＡＧの純品が精製された。
【００９０】
ＩｇＧ１Ｆｃキメラ蛋白質、すなわちＨＤ３ＥＸＩｇに関しては、ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様の操作で培養上清の２リットルをスウェーデン国ファルマシア社製ＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースカラムに吸着させ、溶出画分を分取した。
ＦＬＡＧキメラ蛋白質と同様に溶出液の一部を用いて、還元条件でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および銀染色により溶出画分の決定、サイズの確認、純度検定を行った。結果として、溶出画分の第４番から第１５番にバンドが検出され、サイズは抗ヒトＩｇ抗体を用いたウェスタンブロッティングの結果と一致した。この結果からＨＤ３ＥＸＩｇの純品が精製された。
【００９１】
【実施例５】
ヒトデルター３を認識する抗体作成
実施例４に記載の方法で精製されたＨＤ３ＥＸＦＬＡＧを免疫原としてウサギに免疫して、抗体価の測定後、全血の採血を行い、血清を採取して、米国ＢｉｏＲａｄ社製のエコノパック血清ＩｇＧ精製キットを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗ヒトデルター３ウサギポリクローナル抗体を作製した。
【００９２】
また、実施例４に記載した方法で精製されたＨＤ３ＥＸＦＬＡＧを免疫原として、成書の方法に従いマウスモノクローナル抗体を作成した。すなわち、上記のように精製されたＨＤ３ＥＸＦＬＡＧをＢａｌｂ／ｃマウス（日本国日本エスエルシー社製）に１匹あたり１０μｇを皮下・皮内に免疫した。２回の免疫後、眼底採血を行い血清中の抗体価の上昇を認めた後、３回目の免疫を行ってからマウスの脾臓細胞を取り出し、マウスミエローマ細胞株Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８（ＡＴＣＣＴＩＢ９）とポリエチレングリコール法にて細胞融合を行った。ＨＡＴ培地（日本国免疫生物研究所製）にてハイブリドーマを選択し、酵素抗体法にてヒトデルター３の細胞外部分を認識する抗体を培地中に産生しているハイブリドーマ株を分離し、ヒトデルター３を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ産生株が樹立された。
【００９３】
このようにして樹立されたハイブリドーマの培養上清をスウェーデン国ファルマシア社製ＭａｂＴｒａｐＧＩＩを用いて、添付の取扱い説明書に従って、抗ヒトデルター３モノクローナル抗体を精製し作製した。
これらモノクローナル抗体を用いてアフィニティーカラムを作製した。アフィニティーカラムの作製はスウェーデン国ファルマシア社製ＣＮＢｒ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂにて添付の取扱い説明書に従い行った。このゲルの２ｍｌを用いて２ｃｍ²×１ｃｍのサイズのカラムを作製した。
【００９４】
抗ヒトデルター３モノクローナル抗体を結合させたカラムに対してｐＨＤ３ＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液を２０ｍｌ／ｈｒの速度で流し、その後同一速度でＰＢＳ（−）を１５ｍｌ流して洗浄し、最終的に０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．５ＭＮａＣｌ（ＰＨ４．０）にて溶出した。この溶離液を１ｍｌづつ分取し、各画分に１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）を２００μｌづつ加えて、中和した。
【００９５】
さらに実施例３に記載の方法に従って、各々の精製蛋白質を還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、銀染色、及びウェスタンブロッティングを行ない、分子量の推定を行った。この結果、ｐＨＤ３ＥＸを遺伝子導入したＣＯＳ−７細胞培養上清濃縮液からは約５５ｋダルトンのＨＤ３ＥＸが精製されていることが確認され、これらアフィニティーカラムでヒトデルター３タンパク質が精製可能であることが明らかとなった。
【００９６】
【実施例６】
ＨＤ３ＥＸＩｇの血液未分化細胞のコロニー形成に対する作用
ＨＤ３ＥＸＩｇの血液未分化細胞に対する生理作用を観察するため、ＣＤ３４陽性細胞をＨＤ３ＥＸＩｇおよび既存のサイトカイン存在下で無血清半固形培地で培養し、コロニー形成細胞の増減を観察した。
ヒト臍帯血もしくはヒト正常骨髄血のＣＤ３４陽性細胞は臍帯血もしくは成人正常骨髄血をシリカ液（日本国免疫生物研究所製）により添付の説明書にしたがって処理し、その後フィコールパック（スエーデン国ファルマシア社製）による比重遠心分離法により低密度細胞画分（＜１．０７７ｇ／ｍｌ）を分画した単核球より分離した。
【００９７】
ＣＤ３４陽性細胞の分離はノルウェー国Ｄｙｎａｌ社製ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−４５０ＣＤ３４とＤＥＴＡＣＨａＢＥＡＤＳＣＤ３４を用い、添付の取扱説明書に従って分離した。分離後、その純度はＦＩＴＣ標識抗ＣＤ３４抗体ＨＰＣＡ２（米国ベクトンデッキンソン社製）で染色し、同社のフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）にて検定し、８５％以上の純度を有していることを確認して用いた。
【００９８】
このようにして分離したＣＤ３４陽性細胞４００個が下記の培地１ｍｌ中に存在するように均一に懸濁し、３５ｍｍディッシュ（米国ファルコン社製）にまき、３７℃、５％炭酸ガス、５％酸素ガス、９０％窒素ガス、１００％湿度雰囲気下の炭酸ガスインキュベーターで２週間の培養後、形成された血球コロニーを倒立顕微鏡下で計測した。
【００９９】
培養に用いた培地はα−ｍｅｄｉｕｍ（米国ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ製）に２％ＤｅｉｏｎｉｚｅｄＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍＡｌｂｕｍｉｎ（ＢＳＡ、米国Ｓｉｇｍａ社製）、１０μｇ／ｍｌヒトインスリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、２００μｇ／ｍｌトランスフェリン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、１０^-5Ｍ２−メルカプトエタノール（日本国ナカライテスク社製）、１６０μｇ／ｍｌソイビーンレシチン（米国Ｓｉｇｍａ社製）、９６μｇ／ｍｌコレステロール（米国Ｓｉｇｍａ社製）、０．９％メチルセルロース（日本国和光純薬社製）で行った。
【０１００】
上記の培地に、最終的に１μｇ／ｍｌの濃度となるようにヒトデルター３細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＤ３ＥＸＩｇ）を加え、比較区にはＩｇＧＦｃ部分の影響を見るため、ヒトＩｇＧ１（米国ＡｔｈｅｎｓＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を同濃度加えた。同時に加えたサイトカイン条件は１００ｎｇ／ｍｌのヒトＳＣＦ（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）、１０ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−３（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）、１００ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−６（米国Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社製）である。
【０１０１】
その結果、比較区ではコロニー形成が細胞４００個当たり５５±１０であったが、ＨＤ３ＥＸＩｇを加えた場合には３１±５と著明にコロニー形成が抑制を受けた。この結果から、本願分子ヒトデルター３は血液未分化細胞に作用することが明らかとなった。
【０１０２】
【実施例７】
ヒトデルター３の血管内皮細胞増殖に及ぼす変化
血管内皮細胞は、日本国クラボウ社製の正常ヒト大動脈血管内皮細胞と正常ヒト肺動脈血管内皮細胞のそれぞれ４次継代培養細胞を用いた。細胞は、３次培養の継代時に組織培養用９６ウェルプレート（米国ファルコン社製）に５０００細胞数／ウェルずつ蒔き、日本国クラボウ社製のヒトリコンビナントＥＧＦを１０ｎｇ／ｍｌ，ヒトリコンビナントＦＧＦ−Ｂを５ｎｇ／ｍｌ各々含有する低血清血管内皮細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２、日本国クラボウ社製）中で培養し、その際、最終的に１μｇ／ｍｌの濃度となるようにヒトデルター３細胞外Ｉｇキメラ蛋白質（ＨＤ３ＥＸＩｇ）を加え、比較区にはＩｇＧＦｃ部分の影響を見るため、ヒトＩｇＧ１（米国ＡｔｈｅｎｓＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を同濃度加えた。尚、対照はＨｕＭｅｄｉａ−ＥＧ２以外の添加蛋白質無しの条件で培養を行った。培養は３７℃，５％炭酸ガス，１００％湿度雰囲気下で３日間行った後に、細胞を計数した。
【０１０３】
血管内皮細胞の計数は、ＢｏｒｅｎｆｒｅｕｎｄとＰｕｅｒｎｅｒ（ＪｏｕｒｎａｌｏｆＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＭｅｔｈｏｄｓ９（１），７−９，１９８４）によって開発された方法、すなわち、生体染色色素のｎｅｕｔｒａｌｒｅｄ（３−ａｍｉｎｏ−７−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎａｚｉｎｅｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）が生きている細胞においてのみ原形質膜を通りリソソームに蓄積されることを利用したニューラルレッド法を原理とした日本国クラボウ社製のＮＲ試薬セットを用い、５４０ｎｍの吸光度は日本国日本インターメッド社製イムノリーダー（ＮＪ−２０００）で測定した。その結果、大動脈血管内皮細胞の場合は対照区では吸光度の値がＯｐｔｉｃａｌＤｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ）として０．１８±０．０２であり、ヒトＩｇＧ１添加区ではほぼ同様な０．２０±０．０２であったが、ＨＤ３ＥＸＩｇ添加区では０．１０±０．０１と著明に少なかった。また、肺動脈血管内皮細胞の場合は対照区では０．１８±０．０２であり、ヒトＩｇＧ１添加区ではほぼ同様な０．１９±０．０１であったが、ＨＤ３ＥＸＩｇ添加区では０．０８±０．０１と著明に少なかった。これらの結果から、ＨＤ３ＥＸＩｇは血管内皮細胞の増殖を抑制することがわかった。
【０１０４】
【実施例８】
薬剤の作製
実施例４及び５の方法で精製された各ポリペプチド１ｍｇに対して人血清アルブミン（ミドリ十字社製）５ｍｇとなるように１ｍｌの蒸留水に溶解し、０．２２μｍの滅菌フィルターにて濾過滅菌後、バイアル瓶に分注して凍結乾燥して作製した。
【０１０５】
【発明の効果】
本発明のヒトデルター３分子は血液未分化細胞をはじめとする未分化細胞の増殖、分化抑制にとって有効な化学品となり、医薬品、医療品として使用が可能である。
【０１０６】
【配列表】

【０１０７】

【０１０８】

【０１０９】

【０１１０】

【０１１１】

Claims

少なくとも配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、又は少なくとも配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含有する血液未分化細胞培養培地。
少なくとも配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチド、又は少なくとも配列表の配列番号５に記載のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを含有する、血液未分化細胞のための分化抑制剤。