TWI739887B

TWI739887B - 使用包含btk抑制劑的組合產品治療癌症

Info

Publication number: TWI739887B
Application number: TW106128166A
Authority: TW
Inventors: 胡楠; 來汪; 宋兢; 張彤; 康李; 羅侶松; 魏旻; 志偉王; 郭運行
Original assignee: 英屬開曼群島商百濟神州有限公司
Priority date: 2016-08-19
Filing date: 2017-08-18
Publication date: 2021-09-21
Also published as: FI3500299T3; TW201808298A; US11701357B2; US20230364096A1; PT3500299T; WO2018033135A1; CA3034326A1; EP3500299A1; DK3500299T3; US20210275530A1; AU2017313085A1; ES2971881T3; CN110087680B; EP3500299B1; EP4353747A2; CN110087680A; EP3500299A4

Abstract

本申請公開了在受試者中預防癌症、延遲癌症進展或治療癌症的方法，包括向有此需要的受試者施用Btk抑制劑(特別是(S)-7-(1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氫吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺或其醫藥上可接受之鹽與免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑的組合。此外，本申請公開了包含Btk抑制劑(特別是(S)-7-(1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氫吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺或其醫藥上可接受之鹽與免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑的組合的藥物組合產品及其用途。

Description

使用包含BTK抑制劑的組合產品治療癌症

本申請要求2016年8月19日提交的國際申請號PCT/CN2016/096082的優先權，在此以其整體引入作為參考。

本申請公開了在受試者中預防癌症或延遲癌症進展或治療癌症的方法，包括向有此需要的受試者施用Btk抑制劑(特別是(S)-7-(1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氫吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺或其醫藥上可接受之鹽)與免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑的組合產品(combination)。本申請還公開了包含Btk抑制劑(特別是(S)-7-(1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氫吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺或其醫藥上可接受之鹽)與免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑的組合的藥物組合產品及其用途。

布魯頓氏酪氨酸激酶(Bruton's tyrosine kinase,Btk)屬於細胞質酪氨酸激酶的Tec家族，其為人中非受體激酶的第二大家族[Vetrie et al.,Nature 361：226-233,1993；Bradshaw,Cell Signal. 22：1175-84,2010]。其表達在造血體系的除了T細胞的所有細胞譜系中，並定位於骨髓、脾和淋巴結組織中[Smith et al.,J.Immunol. 152：557-565,1994]。編碼Btk的基因中的失活突變造成人中的X連鎖無γ球蛋白血症(XLA)和小鼠中的X連鎖免疫缺陷(XID)[Conley et al.,Annu.Rev. Immunol. 27：199-227,2009]。這兩種疾病的特徵是B細胞發育和功能的引人注目的缺陷，表明Btk對於B細胞發育和功能的關鍵作用。此外，Btk在B細胞中的結構性活化導致自體反應性血漿細胞的累積[Kersseboom et al.,Eur J Immunol. 40：2643-2654,2010]。Btk由在BCR信號通路中的上游Src-家族激酶活化。一旦活化，Btk轉而將磷脂酶-Cγ(PLCγ)磷酸化，導致Ca²⁺調動及NF-κB和MAP激酶通路的活化。此等近端信號傳導事件促進涉及增殖和存活的基因的表達[Humphries et al.,J.Biol.Chem. 279：37651,2004]。除了其作為BCR下游的必要調節作用之外，Btk活性在FcR信號傳導中也發揮關鍵作用。經由FcRγ相關受體的信號傳導通過細胞諸如巨噬細胞還促進Btk依賴性促炎症反應性細胞因子的產生[Di Paolo et al.,Nat.Chem.Biol. 7：41-50,2011]。Btk由於其在BCR和FcR信號傳導通路的近端位置已經是重要的靶標。臨床前研究顯示Btk缺失的小鼠對發展出膠原蛋白誘導的關節炎是抗性的。此外，利妥昔單抗(Rituxan)(一種消耗成熟B細胞CD20抗體)的臨床研究，揭示B細胞在許多炎性疾病諸如類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡和多發性硬化中的關鍵作用[Gurcan et al.,Int.Immunopharmacol. 9：10-25,2009]。此外，Btk的異常活化在B細胞淋巴瘤的病因學中發揮重要作用，表明抑制Btk可用於治療血液惡性腫瘤[Davis et al.,Nature 463：88-92,2010]。

此外，Btk的異常活化在B細胞淋巴瘤的病因學中發揮重要作用，表明抑制Btk可用於治療血液惡性腫瘤[Davis et al.,Nature 463：88-92,2010)]。共價的BTK抑制劑依魯替尼(ibrutinib)(PCI-32765,Imbruvica®)經美國食品和藥物管理局批准，用於治療慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、套細胞淋巴瘤(MCL)和瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)。

WO2014/173289A1公開了一系列作為Btk抑制劑的具有如下通式(I)的稠合雜環化合物或其立體異構體或醫藥上可接受之鹽，其顯示出針對布魯頓氏酪氨酸激酶的強效抑制活性。

未公開的PCT申請PCT/CN2016/095510公開了WO 2014/173289 A1中的Btk抑制劑的晶型，特別是(S)-7-(1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氫吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺(下文稱為化合物1)的晶型，用於治療具有其中Btk發揮重要作用的B細胞受體(BCR)和FcR信號傳導通路的畸變(aberration)的癌症。化合物1已經展示具有強效且不可逆的針對Btk的抑制活性。

本發明的發明人已經發現Btk抑制劑(特別是，上述化合物1)與免疫治療劑或靶向治療劑的組合產品，與上述活性藥劑中每一種單獨的單一療法相比，顯著抑制具有B細胞受體的畸變的癌症中的腫瘤生長。

在第一態樣，本申請公開了在受試者中預防癌症或延遲癌症進展或治療癌症的方法，包括向有此需要的受試者施用治療有效量的式(I)的Btk抑制劑或其立體異構體或其醫藥上可接受之鹽與治療有效量的免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑的組合。

在第二態樣，本申請公開了預防癌症或延遲癌症進展或治療癌症的藥物組合產品，其包含式(I)的Btk抑制劑或其立體異構體或其醫藥上可接受之鹽與免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑的組合。

在第三態樣，本申請公開了式(I)的Btk抑制劑或其立體異構體或其醫藥上可接受之鹽，其與免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑組合，用於預防癌症或延遲癌症進展或治療癌症。在該態樣的一個實施例中，本申請公開了免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑，其與式(I)的Btk抑制劑或其立體異構體或其醫藥上可接受之鹽組合，用於預防癌症或延遲癌症進展或治療癌症。

在第四態樣，本申請公開了藥物組合產品在用於預防癌症或延遲癌症進展或治療癌症的藥物中的用途，所述藥物組合產品包含式(I)的Btk抑制劑或其立體異構體或其醫藥上可接受之鹽以及免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑。

在第五態樣，本申請公開了製品或“套組”，其包含第一容器、第二容器和藥品說明書(package insert)，其中所述第一容器包含至少一個劑量的包含式(I)的Btk抑制劑或其立體異構體或其醫藥上可接受之鹽的藥物，所述第二容器包含至少一個劑量的包含免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑的藥物，並且所述藥品說明書包含使用所述藥物治療癌症的說明。

本申請所述的方法和藥物組合產品，作為組合療法，比任一單一藥劑顯著更有效。

在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述靶向治療劑為抗體。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述靶向治療劑為抗CD20抗體。在上述五個態樣中每一個的一些其它實施例中，所述免疫檢查點抑制劑為抗體。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述免疫檢查點抑制劑為PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、Gal-9、CTLA-4、CD80、CD86、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、HVEM、IDO1、IDO2、TDO、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD90、CD137、CD226、DR3、GITR、ICOS、LAIR1、LIGHT、MARCO、PS、OX-40、SLAM TIGHT、CTCNI的抑制劑或其任意組合。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述免疫檢查點抑制劑為單克隆抗體。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述免疫檢查點抑制劑為PD-1的抑制劑。

在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述癌症為血液癌症。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述血液癌症為白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)或B細胞惡性腫瘤。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述血液癌症為B細胞惡性腫瘤。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述B細胞惡性腫瘤為慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)、毛細胞白血病(HCL)、伯基特樣白血病(BL)、B細胞前淋巴細胞性白血病(B-PLL)、彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、胚芽中心B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)、非胚芽中心B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(非-GCB DLBCL)、未確定亞型的DLBCL、原發性中樞神經系統淋巴瘤(PCNSL)、乳房或睾丸起源的繼發性中樞神經系統淋巴瘤(SCNSL)、多發性骨髓瘤、淋巴結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結內邊緣區B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高級別B細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤(PMBL)、成免疫細胞大細胞淋巴瘤、前體B成淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞性白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、縱膈(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發滲透性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病，或其組合。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述B細胞惡性腫瘤為彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，DLBCL為活化的B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、GCB-DLBCL或非-GCB DLBCL。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述B細胞惡性腫瘤為慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、B細胞前淋巴細胞性白血病(B-PLL)、非-CLL/SLL淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤，或其組合。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述B細胞惡性腫瘤為復發性或難治性(R/R)B細胞惡性腫瘤。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述復發性或難治性B細胞惡性腫瘤為彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述復發性或難治性DLBCL為活化的B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、GCB-DLBCL或非-GCB DLBCL。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述復發性或難治性(R/R)B細胞惡性腫瘤為彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、B細胞前淋巴細胞性白血病(B-PLL)、非-CLL/SLL淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤，或其組合。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述B細胞惡性腫瘤為轉移性B細胞惡性腫瘤。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述轉移性B細胞惡性腫瘤為彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、B細胞前淋巴細胞性白血病(B-PLL)、非-CLL/SLL淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤，或其組合。

在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述癌症為肉瘤或癌。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述癌症選自肛門癌；闌尾癌；膽管癌(即，膽管癌(cholangiocarcinoma))；膀胱癌；乳腺癌；宮頸癌；結腸癌；未知原發性癌(CUP)；食道癌；眼癌；輸卵管癌；胃腸道癌；腎癌；肝癌；肺癌；髓母細胞瘤；黑素瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；甲狀旁腺疾病；陰莖癌；垂體瘤；前列腺癌；直腸癌；皮膚癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；甲狀腺癌；子宮癌；陰道癌；外陰癌；或其組合。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述癌症選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、胃腸道癌、腎癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、近端或遠端膽管癌、黑素瘤，或其組合。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述結腸癌為腺癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸道間質瘤、原發性結直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤、鱗狀細胞癌、粘液腺癌、Signet環細胞腺癌，或其組合。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述癌症為復發性或難治性癌症。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述復發性或難治性癌症選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、胃腸道癌、腎癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、近端或遠端膽管癌、黑素瘤，或其組合。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述癌症為轉移癌。在上述五個態樣中每一個的實施例中，所述轉移癌選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、胃腸道癌、腎癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、近端或遠端膽管癌和黑素瘤。

在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述BTK抑制劑為(S)-7-(1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氫吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺(化合物1)，或其醫藥上可接受之鹽。在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，所述Btk抑制劑和免疫檢查點抑制劑或靶向治療劑同時、順序或間歇給藥。

圖1示出化合物1和抗CD20 mAb(奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab))對REC-1/NK92MI MCL異種移植模型中腫瘤生長的組合作用。

圖2示出化合物1和抗CD20 mAb(奧濱尤妥珠單抗)對人TMD-8 DLBCL異種移植模型中腫瘤生長的組合作用。

圖3示出抗CD20 mAb(利妥昔單抗)和BTK抑制劑(包括化合物1和依魯替尼)對人REC-1 MCL異種移植模型中腫瘤生長的組合作用。

圖4示出抗CD20 mAb(利妥昔單抗)和BTK抑制劑(包括化合物1和依魯替尼)對人REC-1 MCL異種移植模型中腫瘤重量的組合作用(在第14天)。

圖5示出抗PD-1 mAb(Mab 1)和化合物1對人A431鱗狀細胞癌異源模型中腫瘤體積的組合作用。

圖6示出化合物1和抗PD-1 mAb(派姆單抗(pembrolizumab))對人A431鱗狀細胞癌異源模型中腫瘤體積的組合作用。

圖7示出BTK抑制劑(包括化合物1和依魯替尼)對抗CD20 mAb(奧濱尤妥珠單抗)誘導的ADCC作用的影響。

圖8示出化合物1結晶形式的X射線衍射圖。

圖9示出化合物1的晶型的¹H-NMR。

圖10示出化合物1的晶型的¹³C-NMR。

縮寫(1)：

縮寫(2)：

定義

除非在本申請件中另外具體指定，否則本申請所使用的所有其他科學和技術術語具有本發明所屬領域的技術人員通常理解的含義。

本申請包括所附申請專利範圍使用的單數形式的詞語如“一”、“一種”和“所述”，包括它們對應的複數指代，除非上下文清楚地表明其他情況。

術語“或”用來表示並可與術語“及/或”互換使用，除非上下文另外清楚表示其他含義。

在本說明書和申請專利範圍的全文中，除非上下文有其他要求，術語"包含"及變體如"含有"和"包括"，將會被理解隱含包括所述活性劑(例如，mAb或Btk抑制劑)或所述氨基酸序列，但是不排除任何其他活性成份或氨基酸序列。當本申請使用時，術語"包含"可與術語"含有"或“包括”互換。

術語"烷基"是指選自1-18，或1-12，或1-6個碳原子的直鏈或支鏈飽和烴基的烴基。烷基的實例包括甲基、乙基、1-丙基或正丙基("n-Pr")、2-丙基或異丙基("i-Pr")、1-丁基或正丁基("n-Bu")、2-甲基-1-丙基或異丁基("i-Bu")、1-甲基丙基或仲丁基("s-Bu")和1,1-二甲基乙基或叔丁基("t-Bu")。烷基的其他實例包括1-戊基、2-戊基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、3-甲基-2-丁基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、1-己基、2-己基、3-己基、2-甲基-2-戊基、3-甲基-2-戊基、4-甲基-2-戊基、3-甲基-3-戊基、2-甲基-3-戊基、2,3-二甲基-2-丁基和3,3-二甲基-2-丁基。低級烷基表示1-8、優選1-6、更優選1-4個碳原子；低級烯基或炔基表示2-8、2-6或2-4個碳原子。

術語"烯基"是指選自包含至少一個C=C雙鍵和2-18或2-12或2-6個碳原子的直鏈烴基或支鏈烴基的烴基。烯基的實例選自乙烯基(ethenyl或vinyl)、丙-1-烯基、丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯、己-1-烯基、己-2-烯基、己-3-烯基、己-4-烯基和己-1,3-二烯基。

術語"炔基"是指包含至少一個C≡C三鍵和2-18或2-12或2-6個碳原子的直鏈烴基或支鏈烴基的烴基。炔基的實例包括乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基(炔丙基)、1-丁炔基、2-丁炔基和3-丁炔基。

術語"環烷基"是指選自飽和及部分飽和的環狀烴基的烴基，包括單環和多環(例如，二環和三環)基團。例如，環烷基可具有3-12或3-8或3-6個碳原子。再例如，環烷基可為具有3-12或3-8或3-6個碳原子的單環基團。單環環烷基的實例包括環丙基、環丁基、環戊基、1-環戊-1-烯基、1-環戊-2-烯基、1-環戊-3-烯基、環己基、1-環己-1-烯基、1-環己-2-烯基、1-環己-3-烯基、環己二烯基、環庚基、環辛基、環壬基、環癸基、環十一烷基和環十二烷基基團。二環環烷基的實例包括具有7-12個環原子的排列為選自[4,4]、[4,5]、[5,5]、[5,6]和[6,6]環體系二環的彼等，或排列為選自二環[2.2.1]庚烷、二環[2.2.2]辛烷和二環[3.2.2]壬烷的橋接二環的彼等。所述環可為飽和的或者具有至少一個雙鍵(即，部分飽和的)，但不是完全共軛的，且不是芳族的，如本申請所定義的芳族的。

本申請的術語"芳基"是指選自以下的基團：5和6元碳環芳族環，例如，苯基；二環體系諸如7-12元二環體系，其中至少一個環為碳環和芳族環，選自例如萘和茚滿；和三環體系諸如10-15元三環體系，其中至少一個環為碳環和芳族環，例如，芴。例如，所述芳基選自稠合至任選含有至少一個選自N、O和S的雜原子的5至7元環烷基或雜環的5和6元碳環芳族環，條件是當碳環芳族環與雜環稠合時，連接點在碳環芳族環處，且當碳環芳族環與環烷基稠合時，連接點可位於碳環芳族環處或位於環烷基處。從經取代的苯衍生物形成的且在環原子處具有自由價的二價基團命名為經取代的亞苯基。通過以自由價從碳原子除去一個氫原子而衍生自名稱以"-基"結尾的單價多環碳基團的二價基團通過將“亞”添加至對應的單價基團名稱中，例如，具有兩個連接點的萘基稱為亞萘基。然而，芳基不包括下文分開定義的雜芳基或者與下文分開定義的雜芳基不重疊。因此，如果一個或多個碳環芳族環與雜環芳族環稠合，所得環體系為雜芳基，而不是如本申請定義的芳基。

術語"鹵素"或"鹵基"是指F、Cl、Br或I。

術語"雜烷基"是指包含至少一個雜原子的烷基。

術語"雜芳基"是指選自以下的基團：5-7元芳族單環，其包含1、2、3或4個選自N、O和S的雜原子且其餘環原子為碳；8-12元二環，其包含1、2、3或4個選自N、O和S的雜原子且其餘環原子為碳且其中至少一個環為芳族的且在芳族環中存在至少一個雜原子；和11-14元三環，其包含1、2、3或4個選自N、O和S的雜原子且其餘環原子為碳且其中至少一個環為芳族的且在芳族環中存在至少一個雜原子。例如，雜芳基包括與5-7元環烷基環稠合的5-7元雜環芳環。就其中僅一個環包含至少一個雜原子的上述稠合二環雜芳基環系而言，連接點可位於雜芳環或環烷基環。當雜芳基中S和O原子的總數超過1時，彼等雜原子不彼此相鄰。在一些實施例中，雜芳基中S和O原子的總數不大於2。在一些實施例中，芳族雜環中S和O原子的總數不大於1。雜芳基的實例包括但不限於(由優先指定為1的連接位置開始編號)，吡啶基(諸如2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基)、噌啉基、吡嗪基、2,4-嘧啶基、3,5-嘧啶基、2,4-咪唑基、咪唑並吡啶基、異噁唑基、噁唑基、噻唑基、異噻唑基、噻二唑基、四唑基、噻吩基、三嗪基、苯並噻吩基、呋喃基、苯並呋喃基、苯並咪唑基、吲哚基、異吲哚基、二氫吲哚基、酞嗪基、吡嗪基、噠嗪基、吡咯基、三唑基、喹啉基、異喹啉基、吡唑基、吡咯並吡啶基(諸如1H-吡咯並[2,3-b]吡啶-5-基)、吡唑並吡啶基(諸如1H-吡唑並[3,4-b]吡啶-5-基)、苯並噁唑基(諸如苯並[d]噁唑-6-基)、蝶啶基、嘌呤基、1-氧雜-2,3-二唑基、1-氧雜-2,4-二唑基、1-氧雜-2,5-二唑基、1-氧雜-3,4-二唑基、1-硫雜-2,3-二唑基、1-硫雜-2,4-二唑基、1-硫雜-2,5-二唑基、1-硫雜-3,4-二唑基、呋咱基、苯並呋咱基、苯並噻吩基、苯並噻唑基、苯並噁唑基、喹唑啉基、喹喔啉基、二氮雜萘基、呋喃並吡啶基、苯並噻唑基(諸如苯並[d]噻唑-6-基)、吲唑基(諸如1H-吲唑-5-基)和5,6,7,8-四氫異喹啉基。

術語“雜環的”、“雜環”或“雜環基”是指選自4-12元單環、二環和三環飽和及部分不飽和環的環，其除1、2、3或4個選自氧、硫和氮的雜原子外還包含至少一個碳原子。“雜環”還指與5、6及/或7元環烷基、碳環芳環或雜芳環稠合的包含至少一個選自N、O和S的雜原子的5-7元雜環，條件是當雜環與碳環芳環或雜芳環稠合時，連接點位於雜環，而當雜環與環烷基稠合時，連接點可位於環烷基或雜環。

“雜環”還指包含至少一個選自N、O和S的雜原子的脂族螺環，條件是連接點位於雜環。所述環可為飽和的或具有至少一個雙鍵(即部分不飽和的)。雜環可取代有側氧基。連接點可為雜環中的碳或雜原子。雜環不是本申請定義的雜芳基。雜環的實例包括但不限於(由優先指定為1的連接位置開始編號)，1-吡咯啶基、2-吡咯啶基、2,4-咪唑烷基、2,3-吡唑烷基、1-六氫吡啶基、2-六氫吡啶基、3-六氫吡啶基、4-六氫吡啶基、2,5-呱嗪基、吡喃基、2-嗎啉基、3-嗎啉基、氧雜環丙基、氮雜環丙基、硫雜環丙基、氮雜環丁基、氧雜環丁基、硫雜環丁基、1,2-二硫雜環丁基、1,3-二硫雜環丁基、二氫吡啶基、四氫吡啶基、硫嗎啉基、氧硫雜環己基、呱嗪基、高呱嗪基、高六氫吡啶基、氮雜環庚基、氧雜環庚基、硫雜環庚基、1,4-氧硫雜環己基、1,4-二氧雜環庚基、1,4-氧硫雜環庚基、1,4-氧氮雜環庚基、1,4-二硫雜環庚基、1,4-硫氮雜環庚基、1,4-二氮雜環庚基、1,4-二噻烷基、1,4-氮硫雜環己基、氧氮雜

基、二氮雜

基、硫氮雜

基、二氫噻吩基、二氫吡喃基、二氫呋喃基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、四氫吡喃基、四氫噻喃基、1-吡咯啉基、2-吡咯啉基、3-吡咯啉基、二氫吲哚基、2H-吡喃基、4H-吡喃基、1,4-二噁烷基、1,3-二氧雜環戊基、吡唑啉基、吡唑烷基、二噻烷基、二硫雜環戊基、吡唑烷基、咪唑啉基、嘧啶酮基、1,1-二側氧基-硫嗎啉基、3-氮雜二環[3.1.0]己基、3-氮雜二環[4.1.0]庚基和氮雜二環[2.2.2]己基。經取代的雜環還包括取代有一個或多個側氧基部分的環系，諸如六氫吡啶基-N-氧化物、嗎啉基-N-氧化物、1-側氧基-1-硫嗎啉基和1,1- 二側氧基-1-硫嗎啉基。

取代基選自：鹵素、-R^a、-OR^a、=O、=NR^a、=N-OR^a、-NR^aR^b、-SR^a、-SiR^aR^aR^b、-OC(O)R^a、-C(O)R^a、-CO₂R^a、-CONR^aR^b、-OC(O)NR^aR^b、-NR^bC(O)R^a、-NR^a-C(O)NR^bR^b、-NR^a-SO₂NR^b、-NR^bCO₂R^a、-NH-C(NH₂)=NH、-NR^aC(NH₂)=NH、-NH-C(NH₂)=NR^a、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₂NR^aR^b、-NR^bSO₂R、-CN和-NO₂、-N₃、-CH(Ph)₂、全氟(C₁-C₄)烷氧基和全氟(C₁-C₄)烷基，數目為0至3，特別優選具有0、1或2個取代基的彼等基團。R^a、R^b和R^c各自獨立地指氫、未取代的(C₁-C₈)烷基和雜烷基、未取代的芳基、取代有1至3個鹵素的芳基、未取代的烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基-(C₁-C₄)烷基。當R^a和R^b連接至同一氮原子時，它們與氮原子結合形成5、6或7元環。因此，-NR^aR^b包括1-吡咯啶基和4-嗎啉基，"烷基"包括諸如三鹵代烷基(例如，-CF₃和-CH₂CF₃)的基團，並且當芳基為1,2,3,4-四氫萘時，其可取代有經取代或未經取代的(C₃-C₇)螺環烷基。所述(C₃-C₇)螺環烷基可以如對"環烷基"定義的相同方式取代。優選的取代基選自：鹵素、-R^a、-OR^a、=O、-NR^aR^b、-SR^a、-SiR^aR^aR^b、-OC(O)R^a、-C(O)R^a、-CO₂R^a、-CONR^aR^b、-OC(O)NR^aR^b、-NR^bC(O)R^a、-NR^bCO₂R^a、-NR^a-SO₂NR^bR^b、-S(O)R^a、-SO₂R^a、-SO₂NR^aR^b、-NR^bSO₂R、-CN和-NO₂、全氟(C₁-C₄)烷氧基和全氟(C₁-C₄)烷基，其中R^a和R^b如上所定義。

本申請中的術語“稠合環”是指多環環系，例如二環或三環環系，其中兩個環僅共享兩個環原子和一個鍵。稠合環的實例可包括稠合二環環烷基環，諸如具有7-12個環原子的彼等二環環烷基環，其排列成選自上述[4,4]、[4,5]、[5,5]、[5,6]和[6,6]環系的二環；稠合二環芳基環，諸如上述7至12元二環芳基環系；稠合三環芳基環，諸如上述10至15元三環芳基環系；稠合二環雜芳基環，諸如上述8至12元二環雜芳基環；稠合三環雜芳基環，諸如上述 11至14元三環雜芳基環；及上述稠合二環或三環雜環基環。

當化合物含有烯烴雙鍵時，除非另有指明，否則這種雙鍵意在包括E和Z幾何異構體兩者。

一些化合物可存在有不同的氫連接點，稱為互變異構體。例如，包括羰基-CH₂C(O)-基團(酮形式)的化合物可經歷互變現象形成羥基-CH=C(OH)-基團(烯醇形式)。當適用時，還意在包括酮和烯醇形式這兩者，單獨地以及其混合物。

術語"醫藥上可接受之鹽"包括但不限於與無機酸形成的鹽，選自，例如，鹽酸鹽、磷酸鹽、二磷酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、亞磺酸鹽和硝酸鹽；以及與有機酸形成的鹽，選自，例如，蘋果酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、苯甲酸鹽、水楊酸鹽、硬脂酸鹽、烷醇鹽諸如乙酸鹽，和與HOOC-(CH₂)_n-COOH(其中n選自0至4)形成的鹽。類似地，醫藥上可接受之陽離子的實例包括但不限於，鈉、鉀、鈣、鋁、鋰和銨。

此外，如果得到的化合物為酸加成鹽，游離鹼可通過將酸鹽的溶液鹼化得到。相反，如果產物為游離鹼，則加成鹽諸如醫藥上可接受之加成鹽可如下製備：根據從鹼化合物製備酸加成鹽的常規操作，將游離鹼溶解於合適的有機溶劑中並以酸處理該溶液。本領域技術人員會認識到無需過度實驗就可用於製備無毒性醫藥上可接受之加成鹽的各種合成方法。

本申請中的術語“施用”、“給藥”、“治療”和“處置”，當應用於動物、人類、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物體液時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人類、受試者、細胞、組織、器官或生物體液的接觸。對細胞的處置包括試劑與細胞的接觸及試劑與體液的接觸，其中所述體液與細胞接觸。術語“施用”和“處置”也指例如試劑、診斷劑、結合化合物或另一種細胞的體外和離體處置，例如對細胞的體外和離體處置。本申請中的術語“受試者”包括任何有機體，優選動物，更優選哺乳動物(例如，大鼠、小鼠、犬、貓、兔)且最優選人類。

"有效量"是指有效“治療”受試者中的疾病或病症的至少一種化合物及/或其至少一種立體異構體及/或其至少一種醫藥上可接受之鹽的量，並且該量在一定顯著程度上會引起諸如當施用時正在尋求的組織、系統、動物或人的生物學或醫學響應，該量足以預防待治療病況或病症的一種或多種症狀的發展或在一定程度上進行緩解。治療有效量會根據化合物、疾病及其嚴重程度和待治療的哺乳動物的年齡、重量等而變化。

術語"至少一個取代基"包括，例如，1至4個、如1至3個、進一步如1或2個取代基。例如，本申請中的"至少一個取代基R¹⁶"包括1至4個、諸如1至3個、進一步如1或2個選自本申請描述的R¹⁶列表的取代基。

本申請中的術語“抗體”以最廣義使用且具體涵蓋抗體(包括全長單克隆抗體)及抗體片段，只要其識別抗原諸如靶向抗原(例如，CD20)或免疫檢查點(例如，PD-1)即可。抗體分子通常為單特異性的，但也可描述為獨特特異性、異種特異性或多特異性的。抗體分子借助于特異性結合位點與抗原上的特異性抗原決定簇或表位結合。

本申請中的術語“單克隆抗體”或“mAb”或“Mab”是指基本上均質的抗體群，即包含在群中的抗體分子除可少量存在的可能天然存在的突變外在氨基酸序列態樣是相同的。相反地，常規(多克隆)抗體製品通常包含多種不同的抗體，所述多種不同的抗體在其可變域特別是其CDR中具有不同的氨基酸序列，所述常規(多克隆)抗體製品通常對不同的表位都具有特異性。修飾語“單克隆”表示由基本上均質的抗體群獲得的抗體的特徵且不應被解釋為需要通過任何特定方法產生抗體。單克隆抗體(mAb)可通過本領域技術人員已知的方法獲得。參見例如美國專利4,376,110。本申請公開的mAb可為任何免疫球蛋白類別，包括IgG、IgM、IgD、IgE、IgA及其任何亞類。可對產生mAb的雜交瘤進行體外或體內培養。體內產生可獲得高滴度的mAb，其中將來自各個雜交瘤的細胞腹膜內注射到小鼠(諸如原始-始發態(pristine-primed)Balb/c小鼠)中以產生含有高濃度期望mAb的腹水液。可使用本領域技術人員公知的柱層析法由上述腹水液或培養物上清液純化同種型IgM或IgG的mAb。

通常，基本抗體結構單元包含四聚體。每個四聚體包含兩對相同的多肽鏈，每對具有一條“輕鏈”(約25kDa)和一條“重鏈”(約50-70kDa)。每條鏈的氨基末端部分包含主要負責抗原識別的具有約100-110個或更多個氨基酸的可變區。重鏈的羧基末端部分可限定主要負責效應子功能的恒定區。通常，人輕鏈被分類為κ和λ輕鏈。另外，人重鏈通常被分類為α、δ、ε、γ或μ且將抗體的同種型分別限定為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。在輕鏈和重鏈中，可變區和恒定區通過具有約12個或更多個氨基酸的“J”區連接，其中重鏈還包含具有約10個或更多個氨基酸的“D”區。

每個輕鏈/重鏈(Vl/Vh)對的可變區形成抗體結合位點。因此，完整抗體通常具有兩個結合位點。除雙功能或雙特異性抗體外，兩個結合位點通常是相同的。

通常，重鏈和輕鏈的可變結構域都包含位於相對保守的框架區(FR)之間的三個高變區(也稱為“互補決定區(CDR)”)。CDR通常通過框架區來對齊，由此能夠結合特異性表位。通常，從N末端到C末端，輕鏈和重鏈可變結構域兩者均包含FR-1(或FR1)、CDR-1(或CDR1)、FR-2(或FR2)、CDR-2(或CDR2)、FR-3(或FR3)、CDR-3(或CDR3)和FR-4(或FR4)。通常，根據以下文獻的定義將氨基酸指派至各個結構域：Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat等，National Institutes of Health,Bethesda,Md.,5<m>ed.,NIH Publ. No.91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32：1-75；Kabat等(1977)J.Biol.Chem.252：6609-6616；Chothia等(1987)J Mol.Biol.196：901-917；或Chothia等(1989)Nature 342：878-883。

術語“高變區”是指抗體的負責抗原結合的氨基酸殘基。高變區包含來自“互補決定區”或“CDR”(即輕鏈可變結構域中的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3及重鏈可變結構域中的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3)的氨基酸殘基。參見Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(通過序列定義抗體的CDR區)；另見Chothia and Lesk(1987)J.Mol.Biol.196：901-917(通過結構定義抗體的CDR區)。術語“框架”或“FR”是指除本申請定義為CDR殘基的高變區殘基外的彼等可變結構域殘基。

除非另有說明，否則“抗體片段”或“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段，即保留與由全長抗體結合的抗原特異性結合的能力的抗體片段，例如保留一個或多個CDR區的片段。抗原結合片段的實例包括但不限於，Fab、Fab’、F(ab’)₂和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如，單鏈Fv(sc-Fv)；納米抗體；和由抗體片段形成的多特異性抗體。

與特定靶標蛋白“特異性結合”的抗體是與其它蛋白質相比優先與該靶標結合的抗體，但是該特異性不需要絕對結合特異性。若抗體的結合在例如不產生不期望的結果諸如假陽性的情況下決定樣品中靶標蛋白的存在，則抗體被認為就其所預期的靶標而言是“特異性的”。可用于本發明的抗體或其結合片段將以比與非靶標蛋白的親和力大至少2倍、優選大至少10倍、更優選大至少20倍且最優選大至少100倍的親和力與靶標蛋白結合。據說，本申請抗體與包含給定氨基酸序列的多肽例如成熟人PD-1分子的氨基酸序列特異性結合，條件是其與包含該序列的多肽結合，但是不與不具有該序列的蛋白質結合。

本申請中的術語“人抗體”是指僅包含人免疫球蛋白序列的抗體。若在小鼠、小鼠細胞或衍生自小鼠細胞的雜交瘤中產生，則人抗體可含有鼠型糖鏈。類似地，“小鼠抗體”或“大鼠抗體”是指分別僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗體。

術語“人源化抗體”是指以下抗體形式，其含有來自非人類(例如，鼠類)抗體以及人抗體的序列。上述抗體含有衍生自非人類免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗體將包含基本上所有至少一個且通常為兩個可變結構域，其中所有或基本上所有高變環與非人類免疫球蛋白的彼等高變環是對應的且所有或基本上所有FR區是人免疫球蛋白序列的彼等FR區。人源化抗體任選還將包含免疫球蛋白恒定區(Fc)通常為人免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分。當必要時，將前綴“hum”、“hu”、“Hu”或“h”添加至抗體克隆名稱以區分人源化抗體與親本齧齒動物抗體。齧齒動物抗體的人源化形式通常將包含與親本齧齒動物抗體相同的CDR序列，儘管可包括某些氨基酸取代以增加親和力、增加人源化抗體的穩定性或出於其它原因。

本申請中的術語“癌症”或“腫瘤”表示或描述的是涉及具有侵入或擴散至身體其他部分的可能性的異常細胞生長的生理狀況。“疾病”是指任何病、不適、恙、症狀或適應症，且可用術語“病症”或“病況”替代。

在一些實施例中，所述癌症為血液癌症。在一些實施例中，所述血液癌症為白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、霍奇金淋巴瘤(HL)或B細胞惡性腫瘤。在一些實施例中，所述血液癌症為B細胞惡性腫瘤。在一些實施例中，所述B細胞惡性腫瘤為慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)、毛細胞白血病(HCL)、伯基特樣白血病(BL)、B細胞前淋巴細胞性白血病(B-PLL)、彌散性大B細胞淋巴瘤 (DLBCL)、胚芽中心B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)、非胚芽中心B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(非-GCB DLBCL)、亞型未確定的DLBCL、原發性中樞神經系統淋巴瘤(PCNSL)、乳房或睾丸來源的繼發性中樞神經系統淋巴瘤(SCNSL)、多發性骨髓瘤、淋巴結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結內邊緣區B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、非伯基特高級別B細胞淋巴瘤、原發性縱隔B細胞淋巴瘤(PMBL)、成免疫細胞大細胞淋巴瘤、前體B成淋巴細胞性淋巴瘤、B細胞前淋巴細胞性白血病、淋巴漿細胞性淋巴瘤、脾邊緣區淋巴瘤、漿細胞骨髓瘤、漿細胞瘤、縱膈(胸腺)大B細胞淋巴瘤、血管內大B細胞淋巴瘤、原發滲透性淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫病，或其組合。在一些實施例中，所述B細胞惡性腫瘤為彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些實施例中，所述DLBCL為活化的B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、GCB-DLBCL或非-GCB DLBCL。在一些實施例中，所述B細胞惡性腫瘤為慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、B細胞前淋巴細胞性白血病(B-PLL)、非-CLL/SLL淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤，或其組合。在一些實施例中，所述B細胞惡性腫瘤為復發性或難治性(R/R)B細胞惡性腫瘤。在一些實施例中，所述復發性或難治性(R/R)B細胞惡性腫瘤為彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些實施例中，所述復發性或難治性DLBCL為活化的B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、GCB-DLBCL或非-GCB DLBCL。在一些實施例中，所述復發性或難治性(R/R)B細胞惡性腫瘤為慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、B細胞前淋巴細胞性白血病(B-PLL)、非-CLL/SLL淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤，或其組合。在一些實施例中，所述B細胞惡性腫瘤為轉移性B細胞惡性腫瘤。在一些實施例中，所述轉移性B細胞惡性腫瘤為彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、B細胞前淋巴細胞性白血病(B-PLL)、非-CLL/SLL淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤，或其組合。在一些實施例中，所述癌症為肉瘤或癌。在一些實施例中，所述癌症選自肛門癌；闌尾癌；膽管癌(即，膽管癌(cholangiocarcinoma))；膀胱癌；乳腺癌；宮頸癌；結腸癌；未知原發性癌(CUP)；食道癌；眼癌；輸卵管癌；胃腸道癌；腎癌；肝癌；肺癌；髓母細胞瘤；黑素瘤；口腔癌；卵巢癌；胰腺癌；甲狀旁腺疾病；陰莖癌；垂體瘤；前列腺癌；直腸癌；皮膚癌；胃癌；睾丸癌；喉癌；甲狀腺癌；子宮癌；陰道癌；或外陰癌；或其組合。在一些實施例中，所述癌症選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、胃腸道癌、腎癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、近端或遠端膽管癌、黑素瘤，或其組合。在一些實施例中，所述結腸癌為腺癌、胃腸類癌腫瘤、胃腸道間質瘤、原發性結直腸淋巴瘤、平滑肌肉瘤、黑素瘤、鱗狀細胞癌、粘液腺癌、Signet環細胞腺癌，或其組合。在一些實施例中，所述癌症為復發性或難治性癌症。在一些實施例中，所述復發性或難治性癌選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、胃腸道癌、腎癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、近端或遠端膽管癌、黑素瘤，或其組合。在一些實施例中，所述癌症為轉移癌。在一些實施例中，所述轉移癌選自膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、胃腸道癌、腎癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、近端或遠端膽管癌和黑素瘤。

術語“CDR”是指免疫球蛋白可變區中的互補性決定區，使用Kabat編碼系統進行限定，除非另有指明。

免疫檢查點抑制劑

在一些實施例中，Btk抑制劑與免疫檢查點抑制劑共同施用，所述免疫檢查點抑制劑為PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、Gal-9、CTLA-4、 CD80、CD86、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、BTLA、HVEM、IDO1、IDO2、TDO、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD90、CD137、CD226、CD276、DR3、GITR、ICOS、LAIR1、LIGHT、MARCO、PS、OX-40、SLAM TIGHT、CTCNI的抑制劑或其組合。

“免疫檢查點(檢查點蛋白)”是免疫系統中調高信號(共刺激分子)或調低信號的分子。並且它們還調節T細胞活化或功能。許多癌症通過抑制T細胞信號保護自身不受免疫系統攻擊。完全或部分降低、抑制、干涉或調控一個或多個檢查點蛋白的“免疫檢查點抑制劑”已經越來越多地被視為癌症免疫治療的靶標。已知多個檢查點蛋白，諸如PD-1(程序性死亡分子1,CD279)及其配位體PD-L1(也稱為CD274或B7-H1)和PD-L2；TIM-3(T細胞免疫球蛋白結構域和粘蛋白結構域3，也已知為HAVCR2)及其配位體Gal-9；CTLA-4(細胞毒性T淋巴細胞相關的蛋白4,CD152)及其配位體CD80和CD86；和A2AR(腺苷A2A受體)；B7-H3(CD276)；B7-H4(VTCN1)；BTLA(B和T淋巴細胞衰減器，CD272)及其配位體HVEM(皰疹病毒侵入介體)；IDO(吲哚胺2,3-雙加氧酶)；LAG3(淋巴細胞活化基因-3)；VISTA(T細胞活化的V結構域Ig抑制劑)；KIR(殺傷細胞免疫球蛋白樣受體)。此等蛋白負責T細胞響應的共調解性和抑制性相互作用。免疫檢查點蛋白調節和保持生理免疫響應的持續時間和幅度及自身耐受。免疫檢查點抑制劑包括抗體或衍生自抗體。

免疫系統具有對於保持自身耐受和調控免疫響應很關鍵的多個抑制通路。在T細胞中，響應的幅度和質量經由通過T細胞受體的抗原識別而啟動，並且由平衡共刺激性和抑制性信號的免疫檢查點蛋白調節。

PD-1為免疫檢查點蛋白，其限制在對感染的炎性響應時外周組織中T細胞的活性且體外限制自身免疫性PD-1阻斷，在混合淋巴細胞反應中通過特定抗原靶標或同種細胞增強響應於挑戰的T細胞增殖和細胞因子產生。PD- 1表達和響應之間的強的聯繫顯示為PD-1的阻斷(Pardoll,Nature Reviews Cancer,12：252-264,2012)。PD-1阻斷可通過包括結合PD-1或其配位體的抗體的多種機制來完成。PD-1和PD-L1阻斷劑的實例，也稱為PD-1和PD-L1抑制劑，描述於US7488802；US7943743；US8008449；US8,168,757；US8217149及WO03042402、WO2008156712、WO2010089411、WO2010036959、WO2011066342、WO2011159877、WO2011082400、WO2011161699和WO2015035606中。在一些實施例中，所述PD-1抑制劑包括特異性結合PD-1的抗體或其抗原結合片段。在某些其他實施例中，所述PD-1阻斷劑包括抗PD-1抗體和類似的結合蛋白，諸如描述於US8008449B2中的納武單抗(nivolumab)(MDX 1106,BMS 936558,ONO-4538,Opdivo®)，一種通過其配位體PD-L1和PD-L2結合PD-1並阻斷PD-1的活化的全人IgG4抗體；公開於US8168757B2中的派姆單抗(pembrolizumab)(lambrolizumab,MK-3475或SCH 900475,Keytruda®)，一種針對PD-1的人源化單克隆IgG4抗體；皮地利珠單抗(pidilizumab)(CT-011)，一種結合PD-1的人源化抗體；AMP-224，一種B7-DC的融合蛋白；一種抗體Fc部分；BMS-936559(MDX-1105-01)，用於PD-L1(B7-H1)阻斷，用於PD-1阻斷。

其他疫檢查點蛋白為CTLA-4，其下調T細胞活化的通路(Fong et al.,Cancer Res.69(2)：609-615,2009；Weber Cancer Immunol.Immunother,58：823-830,2009)。CTLA-4的阻斷已經顯示增加T細胞活化和增殖。CTLA-4的抑制劑包括抗CTLA-4抗體。抗CTLA-4抗體結合CTLA-4並阻斷CTLA-4與其在抗原遞呈細胞上表達的配位體CD80/CD86的相互作用並由此阻斷負性下調由此等分子的相互作用引起的免疫響應。抗CTLA-4抗體的實例描述於美國專利號：5,811,097；5,811,097；5,855,887；6,051,227；6,207,157；6,682,736；6,984,720；和7,605,238。一種抗CDLA-4抗體為曲美木單抗(tremelimumab)(替西木單抗(ticilimumab),CP-675,206)。在一個實施例中，所述抗CTLA-4抗體為伊匹單抗(ipilimumab)(MDX-010,MDX-101,Yervoy®)，一種結合CTLA-4的全人單克隆IgG抗體。伊匹單抗以名稱Yervoy^TM上市並經批准用於治療不可切除的或轉移性黑素瘤。其他免疫檢查點抑制劑包括：LAG-3抑制劑，諸如IMP321，一種可溶性Ig融合蛋白(Brignone et al.,2007,J.Immunol.179：4202-4211)；B7抑制劑，諸如B7-H3和B7-H4抑制劑，例如，抗B7-H3抗體MGA271(Loo et al.,2012,Clin.Cancer Res.July 15(18)3834)；TIM3抑制劑；A2AR抑制劑；BTLA抑制劑；IDO抑制劑，例如，INCB024360，一種IDO1抑制劑；VISTA抑制劑；或KIR抑制劑，諸如利麗單抗(lirilumab)(INN)，一種結合KIR2DL1/2L3的抗體。

在一些實施例中，所述免疫檢查點抑制劑為抗體或其抗原結合片段，或化學分子藥物。在一些實施例中，所述免疫檢查點抑制劑為化學分子藥物，其為PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、Gal-9、CTLA-4、CD80、CD86、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、BTLA、HVEM、IDO1、IDO2、TDO、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD90,CD137、CD226、CD276、DR3、GITR、ICOS、LAIR1、LIGHT、MARCO、PS、OX-40、SLAM TIGHT、CTCNI的抑制劑，或其組合；或抗體或其抗原結合片段，其特異性結合一種或多種選自以下的檢查點蛋白：PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、Gal-9、CTLA-4、CD80、CD86、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、BTLA、HVEM、IDO1、IDO2、TDO、LAG3、VISTA、KIR、2B4、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD90、CD137、CD226、CD276、DR3、GITR、ICOS、LAIR1、LIGHT、MARCO、PS、OX-40、SLAM TIGHT或CTCNI。在一些實施例中，所述免疫檢查點抑制劑為抗PD-1抗體。在一些實施例中，所述免疫檢查點為單克隆抗體。在一些實施例中，所述免疫檢查點抑制劑為納武單抗或皮地利珠單抗。

在一些實施例中，所述免疫檢查點抑制劑為在WO 2015/035606 A1中公開的單克隆抗體或其片段。

優選地，所述抗PD-1單克隆抗體為包含重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(Vl)的抗體，其含有下列互補決定區(CDR)：

優選地，所述抗PD-1單克隆抗體為包含重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(Vl)的抗體，其含有下列CDR的任意組合：

優選地，所述抗PD-1單克隆抗體為包含重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(Vl)的抗體，其包含：

優選地，所述抗PD-1單克隆抗體為含有IgG4重鏈效應子或恒定域的抗體，其包含SEQ ID NO：83-88中的任一種。

優選地，所述抗PD-1單克隆抗體為含有F(ab)或F(ab)2的抗體，其包含上述結構域，包括重鏈可變區(Vh)、輕鏈可變區(Vl)和IgG4重鏈效應子或恒定域。

優選地，所述抗PD-1單克隆抗體為包含重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(Vk)及IgG4重鏈效應子或恒定域的抗體，其包含SEQ ID NO：87或88，其中所述重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(Vl)包含：

優選地，所述抗PD-1單克隆抗體為包含重鏈可變區(Vh)和輕鏈可變區(Vl)(各包含SEQ ID No 24和SEQ ID No 26)及IgG4重鏈效應子或恒定域(包含SEQ ID NO 88)的抗體，下文稱為Mab 1，其特異性結合PD-1，特別是包括K45和I93或者I93、L95和P97的PD-1殘基；並且抑制PD-1介導的細胞信號傳導和免疫細胞的活性，抗體結合至一組其配位體結合所要求的氨基酸殘基。

所述抗PD1單克隆抗體及其抗體片段可根據WO2015/035606 A1中的公開內容製備，將其全文公開內容作為參考引入本申請。在優選的實施例中，所述抗PD1單克隆抗體為Mab 1，其以約2mg/kg Q3W至約200mg/kg Q3W的劑量施用。

靶向治療劑

在一些實施例中，所述Btk抑制劑與靶向治療劑共同施用。

靶向治療為癌症醫學治療的一種主要模式，其通過干擾癌變和腫瘤生長所需的特定靶向分子阻斷癌細胞的生長，而不是簡單地干擾所有快速分化的細胞。作為治療B細胞惡性腫瘤的重要靶標的B淋巴細胞抗原CD20(CD20)為活化的糖基化的磷蛋白質，其表達在所有開始於前B階段(CD45R+,CD117+)的B細胞的表面並逐步增加濃度直到成熟。

在一些實施例中，所述靶向治療劑為抗體。在一些實施例中，所述靶向治療劑為抗CD20抗體。在一些實施例中，所述靶向治療劑為單克隆抗體。在一些實施例中，所述靶向治療劑選自利妥昔單抗(rituximab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫單抗(tositumonmab)、奧法木單抗(ofatumumab)或奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab)。

Btk抑制劑

“Btk抑制劑”是指式(I)化合物或其立體異構體或或其醫藥上可接受之鹽。

如在上述五個態樣中的每一個中所公開的，所述Btk抑制劑為式(I)化合物，

或其立體異構體或其醫藥上可接受之鹽，其中：A為含0-3個N、S或O的雜原子的5或6元芳族環；每個W獨立地為-(CH₂)-或-C(O)-；L為鍵、CH₂、NR¹²、O或S；S/D為單鍵或雙鍵，並且當為雙鍵時，R⁵和R⁷不存在；m為0、或1-4的整數；n為0、或1-4的整數，其中當n大於1時，每個R²可不同；p為0、或1-2的整數，其中當p為0時，m為非零，且當p大於1時，每個R⁶和每個R⁷可不同；R¹、R⁴、R⁵、R⁶和R⁷各自獨立地為H、鹵素、雜烷基、烷基、烯基、環烷基、芳基、飽和或不飽和雜環基、雜芳基、炔基、-CN、-NR¹³R¹⁴、-OR¹³、-COR¹³、-CO₂R¹³、-CONR¹³R¹⁴、-C(=NR¹³)NR¹⁴R¹⁵、-NR¹³COR¹⁴、-NR¹³CONR¹⁴R¹⁵、-NR¹³CO₂R¹⁴、-SO₂R¹³、-NR¹³SO₂NR¹⁴R¹⁵或-NR¹³SO₂R¹⁴，其中所述烷基、烯基、炔基、環烷基、雜芳基、芳基及飽和或不飽和雜環基任選取代有至少一個取代基R¹⁶，其中(R⁴和R⁵)或(R⁴和R⁶)或(R⁶或R⁷)或(R⁶和R⁶，當p為2時)，與它們所連接的原子一起，可形成選自以下的環：任選取代有至少一個取代基R¹⁶的環烷基、飽和或不飽和雜環、芳基和雜芳基環；R²為鹵素、烷基、-S-烷基、-CN、-NR¹³R¹⁴、-OR¹³、-COR¹³、-CO₂R¹³、- CONR¹³R¹⁴、-C(=NR¹³)NR¹⁴R¹⁵、-NR¹³COR¹⁴、-NR¹³CONR¹⁴R¹⁵、-NR¹³CO₂R¹⁴、-SO₂R¹³、-NR¹³SO₂NR¹⁴R¹⁵或-NR¹³SO₂R¹⁴；R¹²為H或低級烷基；R¹³、R¹⁴和R¹⁵各自獨立地為H、雜烷基、烷基、烯基、炔基、環烷基、飽和或不飽和雜環基、芳基或雜芳基；其中(R¹³和R¹⁴)及/或(R¹⁴和R¹⁵)與它們所連接的原子一起，各自可形成選自以下的環：任選取代有至少一個取代基R¹⁶的環烷基、飽和或不飽和雜環、芳基和雜芳基環；R¹⁶為鹵素、經取代或未經取代的烷基、經取代或未經取代的烯基、經取代或未經取代的炔基、經取代或未經取代的環烷基、經取代或未經取代的芳基、經取代或未經取代的雜芳基、經取代或未經取代的雜環基、側氧基、-CN、-OR^a、-NR^aR^b、-COR^a、-CO₂R^a、-CONR^aR^b、-C(=NR^a)NR^bR^c、-NR^aCOR^b、-NR^aCONR^aR^b、-NR^aCO₂R^b、-SO₂R^a、-SO₂芳基、-NR^aSO₂NR^bR^c或-NR^aSO₂R^b，其中R^a、R^b和R^c獨立地為氫、鹵素、經取代或未經取代的烷基、經取代或未經取代的烯基、經取代或未經取代的炔基、經取代或未經取代的環烷基、經取代或未經取代的芳基、經取代或未經取代的雜芳基、經取代或未經取代的雜環基，其中(R^a和R^b)及/或(R^b和R^c)與它們所連接的原子一起可形成選自以下的環：環烷基、飽和或不飽和雜環、芳基和雜芳基環。

在一些實施例中，式(I)化合物是光學純的。

在一些實施例中，S/D為雙鍵，且R⁵和R⁷不存在；p為1且m為0、1或2；A為苯基；且R⁴和R⁶，與它們所連接的原子一起，形成下式的環：

其中Q為-CH₂-；J為-CH₂-；且d和b各自獨立地為0、或1-4的整數；S/D為單鍵；p為1且m為0、1或2；A為苯基；或 S/D為單鍵；p為0且R⁶和R⁷不存在；A為苯基。

在一些實施例中，A為苯基；W為-(CH₂)-；L為O；S/D為單鍵；m為1；n為0；p為1；R¹為苯基；R²不存在；R⁵為H；且R⁶和R⁷為H；得到組合結構：

在一些實施例中，R⁴為含N的C₁-C₈烷基、含N的C₃-C₈環烷基和苯基，各自任選經取代。

在一些實施例中，R⁴為甲基氨基、苯胺基團、氮雜環丁烷基、吡咯啶基、六氫吡啶基、氮雜環庚烯基，各自N取代有選自以下的部分：苄基、醯基、丙烯醯基、經取代的丙烯醯基、丙炔醯基和經取代的丙炔醯基。

在一些實施例中，R⁴選自以下結構：

在一些實施例中，R⁴為1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基(即，WO 2014/173289 A1中的化合物27)。

如在上述五個態樣中每一個所公開的，所述Btk抑制劑為式(II)化合物-即，化合物1,

或其醫藥上可接受之鹽。

本申請公開的Btk抑制劑，諸如式(II)化合物，可通過在WO 2014/173289 A1和未公開PCT申請PCT/CN2016/095510中公開的合成路線合成，將其全部內容引入本申請作為參考。本申請公開的Btk抑制劑，即化合物1，可根據PCT/CN2016/095510中的方法製備，將其全部內容引入本申請作為參考。

組合療法

組合療法可按同時或分開或依序方案來施用。當依序施用時，組合可按兩次或更多次給藥來施用。組合施用包括使用分開的製劑共同施用和以任意順序連續施用，其中優選存在兩種(或所有)活性劑同時發揮其生物活性的時段。

任何上述共同施用的藥劑的合適劑量是目前使用的彼等劑量且可由於Btk抑制劑和靶向治療劑或免疫檢查點抑制劑的組合作用(協同作用)諸如增加的治療指數或減輕的毒性或其它副作用或後果而降低。

在抗癌療法的具體實施例中，Btk抑制劑和靶向治療劑或免疫檢查點抑制劑可進一步與手術療法和放射療法組合。

在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，本申請公開的Btk抑制劑和靶向治療劑或免疫檢查點抑制劑的量及施用的相對時間安排通過待治療的患者的個體需要、施用途徑、疾病或病痛的嚴重程度、給藥時間表以及指定醫生所作出的評價和判斷來確定。

本申請公開的Btk抑制劑和靶向治療劑或免疫檢查點抑制劑可按多種已知方式施用，諸如口服、局部、經直腸、胃腸外、通過吸入噴霧或經由植入的儲庫，儘管任何給定情況下最合適的途徑將取決於具體的宿主及施用活性成分所針對的病症的性質和嚴重程度。本申請使用的術語“胃腸外”包括皮下、皮內、靜脈內、肌內、關節內、動脈內、滑膜內、胸骨內、鞘內、病灶內和顱內注射或輸注技術。

在上述五個態樣中每一個的一個實施例中，本申請公開的Btk抑制劑和靶向治療劑或免疫檢查點抑制劑可按不同途徑施用。在優選的實施例中，所述Btk抑制劑口服施用，而靶向治療劑或免疫檢查點抑制劑腸胃外施用，諸如皮下、皮內、靜脈內或腹膜內施用。在優選的實施例中，所述BTK抑制劑每天一次、每天兩次、每天三次、每天四次或每天五次施用，並且以約80mg/天至約640mg/天的劑量施用。在優選的實施例中，所述BTK抑制劑以320mg QD或160mg BID的劑量施用。

實例

本發明進一步由解釋本發明的以下實例進行示例性說明，但是並不受其限制。

實例1 製備(S)-7-(1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氫吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺(化合物1)及其晶型A

步驟1：合成BG-2

在氮氣氣氛下，于10℃向EA(5v)、HOBT(1.2當量)、EDCI(1.2當量)、4-苯氧基苯甲酸(BG-1,80Kg,1.0當量)和丙二腈(1.2當量)的溶液添加TEA(2.4當量)。然後混合物於室溫攪拌直到反應完成。混合物然後離心且濾餅以EA洗滌。濾液以NaHCO₃水溶液洗滌兩次並以NH₄Cl洗滌。有機相以1.5N H₂SO₄洗滌兩次並攪拌。從甲醇和純化水濃縮，析出。固體通過離心收集並經真空乾燥。如此得到79.9Kg的BG-2。¹H NMR(DMSO-d₆)δ 7.62(d,J=8.6Hz,2H),7.46-7.38(m,2H),7.18(t,J=7.4Hz,1H),7.06(d,J=8.0Hz,2H),6.94(d,J=8.6Hz,2H)。

步驟2：合成BG-3

在氮氣氣氛下，於85℃將BG-2(79.9kg,1.0當量)在MeCN(5.0v)中的溶液添加至三甲氧基甲烷(12.0v)。攪拌所得混合物直到反應完成。取樣用於HPLC分析。真空濃縮。殘餘物從i-PrOH和己烷析出。混合物經離心，且濾餅以己烷洗滌並經真空乾燥。如此得到71.7Kg的產物。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ 7.70(d,J=8.4Hz,2H),7.52-7.45(m,2H),7.28(t,J=7.6Hz,1H),7.22-7.06(m,4H),3.93(s,3H)。

步驟3：合成BG-4

在氮氣氣氛下，於低於15℃向反應器中，向BG-3(71.6kg,1.0當量)在乙醇(2.5v)中的溶液滴加在氫氧化肼(1.0當量)乙醇(0.6v)中的溶液。將溶液加熱至室溫並攪拌直到反應完成。將水(4.0v)添加至反應器。溶液然後冷卻至5℃，離心且濾餅以水(1.0v)洗滌。濾餅真空乾燥。如此得到66.9Kg的產物。¹H NMR(DMSO-d₆)δ 12.11(br s,1H),7.80(d,J=8.8Hz,2H),7.46-7.39(m,2H),7.18(t,J=7.6Hz,1H),7.12-7.04(m,4H),6.43(br s,2H)。

步驟4至6：合成BG-8

于低於15℃，向DCM(8.0v)、BG-5(80.0Kg,1.0當量)、N,O-二甲基羥基胺鹽酸鹽(1.2當量)、HOBt(1.2當量)和EDCI(1.2當量)的混合物，滴加TEA(2.6當量)。混合物於室溫攪拌直到反應完成，離心且濾餅以DCM(1.0v)洗滌兩次。濾液以20% NH₄Cl水溶液(3×4.0v)洗滌。濾液經真空濃縮得到粗產物BG-6，其不經進一步純化用於後續步驟。殘餘物溶解在甲苯(5.0v)和THF(1.0v)中，冷卻至10℃，於10℃滴加MeMgBr(1.4當量)且然後於室溫攪拌直到反應完成。溶液冷卻至低於10℃。於低於10℃滴加飽和NH₄Cl水溶液。混合物經離心、分離、過濾，且有機相以NaCl水溶液洗滌兩次。有機相經濃縮得到粗產物，其不經進一步純化用於後續步驟。在DMF(2.5v)和DMF-DMA(2.5v)中的殘餘物於110℃攪拌直到反應完成。反應混合物經冷卻且然後添加DCM。最終混合物以飽和NH₄Cl水溶液洗滌。有機層經濃縮並通過添加己烷而析出。混合物經離心且收集濾餅。濾餅經真空乾燥。如此得到82.2Kg的期望產物。¹H NMR(DMSO-d₆)δ 7.49(d,J=12.6Hz,1H),5.01(d,J=12.6Hz,1H),3.99-3.82(m,2H),3.14-2.94(m,2H),2.89-2.61(m,6H),2.49-2.37(m,1H),1.66-1.56(m,2H),1.39(s,9H),1.39-1.20(m,2H)。

步驟7：合成BG-9

在氮氣氣氛下，將甲苯(8.0v)、AcOH(0.5v)、BG-8(1.2當量)和BG-4(66.9Kg 1.0當量)的混合物加熱至95℃並攪拌直到反應完成。混合物經冷卻，濃縮並從甲醇析出。混合物經離心且濾餅以甲醇洗滌。濾餅經真空乾燥。如此得到107.8Kg的產物。¹H NMR(DMSO-d₆)δ 8.78(d,J=4.6Hz,1H),8.15-8.07(m,2H),7.51-7.41(m,2H),7.34(d,J=4.6Hz,1H),7.27-7.19(m,3H),7.17-7.10(m,2H),4.24-4.02(m,2H),3.81-3.69(m,1H),3.12-3.82(m,2H),2.15-2.04(m,2H),1.76-1.60(m,2H),1.43(s,9H)。

步驟8：合成BG-10

在N₂下，向THF(10.0v)、BG-9(13.0Kg,1.0當量)和D-DBTA(1.0 當量)的混合物添加Pd/C(10% w/w)，將氫氣引入反應器且將氫氣壓力保持至1.8MPa。反應器緩慢地加熱至40℃並攪拌直到反應完成。混合物然後經冷卻，過濾，且濾餅以THF洗滌。濾液經收集並真空濃縮。添加DCM。殘餘物經NaHCO₃水溶液洗滌，濃縮並從MTBE和己烷析出，然後離心。收集濾餅並真空乾燥，得到期望化合物(收率：94.8%和純度：98.5%)。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ 7.82-7.76(m,2H),7.56-7.51(m,1H),7.45-7.37(m,2H),7.21-7.14(m,1H),7.12-7.03(m,4H),4.09-3.91(m,3H),3.30-3.22(m,2H),2.82-2.55(m,2H),2.18-1.99(m,2H),1.98-1.86(m,1H),1.69-1.58(m,1H),1.56-1.45(m,1H),1.38(s,9H),1.32-1.13(m,2H)。

步驟9：合成BG-11

在氮氣氣氛下，向BG-10(100.0Kg 1.0當量)在DCM(6.0v)中的溶液中滴加HCl/EtOH(20.9% w/w,2.0v)。攪拌混合物直到反應完成。將MTBE(4.0v)添加至溶液，冷卻。各濾餅通過離心收集並以己烷(2.0V)洗滌，然後濾餅在己烷(5v)中漿料化，並再次離心。濾餅以己烷(2.0V)洗滌並經真空乾燥。如此得到85.2Kg的產物。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ 9.25-8.85(m,2H),7.84-7.70(m,2H),7.47-7.37(m,2H),7.18(t,J=7.4Hz,1H),7.12-7.03(m,4H),5.73(br s,2H),4.12-4.03(m,1H),3.25-3.19(m,4H),2.90-2.73(m,2H),2.28-2.12(m,1H),2.10-2.00(m,1H),1.99-1.86(m,1H),1.84-1.52(m,4H)。

步驟10：合成BG-11A

BG-11(85.0Kg,1.0當量)在水(6.0v)和NaOH(3.0當量)中的混合物在室溫攪拌直到反應完成。收集濾餅並在MTBE(6.0v)漿料化。混合物然後離心以收集濾餅。濾餅經真空乾燥。如此得到71.3Kg產物。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ 7.82-7.74(m,2H),7.54-7.49(m,1H),7.45-7.38(m,2H),7.21-7.14(m,1H),7.12-7.04(m,4H),4.03-3.95(m,1H),3.29-3.21(m,2H),3.00-2.87(m,2H),2.46-2.31(m,2H),2.11-1.83(m,3H),1.58-1.12(m,4H)。

步驟11：合成BG-11B

在氮氣氣氛下，將乙醇/水/乙酸(7：3：1,46v)和BG-11A(30kg,1.0當量)在反應器中的混合物加熱至70±5℃，然後伴隨不小於65℃的溫度滴加D-DBTA(1.20當量)在乙醇/水/乙酸(7：3：1,4v)中的溶液。所得溶液於60-65℃攪拌16小時，然後冷卻至室溫。通過離心收集固體並且以乙醇(2.0v)洗滌。濾餅在乙醇/水/AcOH(7：3：1,20v)的混合溶劑中於55℃漿料化16小時並冷卻至室溫。固體通過離心收集，並以乙醇(2.0v)洗滌。濾餅經真空乾燥(收率：37.9%)。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ 8.76(br s,2H),7.99-7.89(m,4H),7.83-7.75(m,2H),7.66-7.57 (m,3H),7.52-7.45(m,4H),7.45-7.39(m,2H),7.21-7.14(m,1H),7.13-7.03(m,4H),5.64(s,2H),4.08-4.00(m,1H),3.29-3.19(m,4H),2.85-2.72(m,2H),2.21-1.40(m,7H)。

步驟12：合成BG-11C

在氮氣氣氛下，于室溫向二氯甲烷(15.0v)和20.0% KOH水溶液(3.0v)的混合物分批添加BG-11B(48.0kg,1.0當量)。反應完成後，有機層經收集並且水層以二氯甲烷(5.0v)萃取。合併各有機層。於室溫將濃HCl(0.36v)添加至上述有機層。攪拌所得混合物直到反應完成。固體通過離心收集並以二氯甲烷(1.0v)洗滌。收集的固體以MTBE(6.0v)漿料化。固體通過離心收集並以MTBE(1.0v)洗滌，然後真空乾燥。如此得到31.5Kg的產物(收率：100%)。

步驟12：合成BG-11D(備選中間體)

將ACN(5.0v)、軟水(10.0v)、KOH(5.0當量)添加至反應器並攪拌至少15min。將BG-11B(1.0當量)分份添加至反應器。攪拌混合物直到反應完成。濾餅通過離心收集，在ACN(1.0v)和軟水(5.0v)中漿料化，並真空乾燥得到產物。

步驟13：合成BG-12

在氮氣氣氛下，BG-11C(15.0Kg 1.0當量)在MsOH(2.5v)中的溶液於85℃攪拌直到反應完成。冷卻至5℃後，純化水(4.0v)滴加至體系中並保持溫度不超過35℃(溫度增加明顯)。所得溶液於30℃攪拌16小時，且然後以DCM(2×3.0v)洗滌。水相經收集。將DCM(6.0v)添加至水相，混合物冷卻至5℃。以20% NaOH水溶液將pH值調節至11~12(溫度增加明顯)，伴隨攪拌，溫度不超過30℃。分開並收集有機相。水相以DCM(3.0v)萃取。合併各有機層經並濃縮。MTBE(4.0v)添加至該殘餘物。混合物然後經濃縮並從正庚烷中析出。固體通過離心收集並且在真空烘箱中乾燥。由此得到12.55Kg產物(收率：94.9%)。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ 7.52-7.46(m,2H),7.45-7.38(m,2H),7.21-7.13(m,1H),7.12-7.03(m,4H),6.64(s,1H),3.99-3.90(m,1H),3.29-3.22(m,2H),3.03-2.90(m,2H),2.48-2.36(m,2H),2.03(dd,J=13.9,5.6Hz,2H),2.14-1.99(m,1H),1.97-1.85(m,1H),1.65-1.15(m,3H)。

步驟14：合成BG-13

在N₂氣氛下，將MeOH(13.5v)、純化水(4.5v)和BG-12(8.5Kg, 1.0當量)在反應器中的混合物加熱至50℃。向混合物中滴加L-DBTA(0.7當量)在MeOH/純化水(1.5v/0.5v)中的溶液，同時將溫度保持在50℃。添加後，混合物於50℃攪拌至少2小時，且然後冷卻至室溫並於室溫攪拌至少16小時。濾餅通過離心收集並以MeOH(2.0v)洗滌。濾餅在真空烘箱中乾燥。如此得到9.08Kg的產物(收率：74.8%)。

步驟15：合成(S)-7-(1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氫吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺(化合物1)

在N₂氣氛下，將ACN(12.0v)、水(12.5v)、BG-13(8.0Kg,1.0當量)和NaHCO₃(2.5當量)添加至反應器。然後將混合物冷卻至-5~0℃。向混合物中滴加丙烯醯氯(1.1當量)在MeCN(0.5v)中的溶液並攪拌直到反應完成。然後將EA(6.0v)添加至反應器中並攪拌。收集有機相。水層以EA(3.0v)進一步萃取。合併有機相並以鹽水洗滌。收集有機層並濃縮。

殘餘物通過以3% w/w甲醇/DCM(21.0v)溶離的矽膠(2wt)柱純化。收集化合物1溶液並真空濃縮。殘餘物從EA/MTBE(2.0v)析出。濾餅通過離心收集為產物。

步驟15：合成(S)-7-(1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氫吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺(化合物1，備選方法)

CH₃CN(10.0v)、純化水(5.0v)、NaOH(1.5當量)和BG-13(1.0當量)的混合物經攪拌得到澄清溶液。EtOAc(6.0v)然後添加至反應中並分離。有機相經收集並以15%鹽水(3.0v)洗滌。上述製備的有機相經濃縮並且將溶劑交換為CH₃CN(剩餘體積：NMT 5.0v)。添加CH₃CN(7.5v)和純化水(12.5v)並冷卻至15-20℃。將L-(+)-酒石酸(0.5當量)和NaHCO₃(2.5當量)添加至反應混合物。丙烯醯氯(1.1當量)在CH₃CN(0.5v)中的溶液滴加至反應混合物中。反應完成後，將EtOAc(6.0v)添加至反應混合物並收集有機層。水相進一步以EA(3.0v)萃取。合併各有機層，以15%鹽水(5.0v)洗滌並濃縮。溶劑交換為DCM(剩餘體積：1.5-2.0v)並通過矽膠柱純化(矽膠：100-200篩，2.0 w/w；溶離劑：3% w/wMeOH/DCM(約50v)。收集的溶液經濃縮並交換為EtOAc(4.0v)。於50℃將MTBE(6.4v)滴加至殘餘物。然後冷卻混合物至5℃且離心收集濾餅。

步驟16：製備化合物1的晶型A

化合物1的上述濾餅溶解在7.0體積的DCM中，且然後交換為溶劑EA。從EA/MTBE中重結晶後，離心收集濾餅，並真空乾燥。如此得到4.44Kg產物(收率：70.2%)。

產物然後由在PANalytical Empyrean X射線粉末衍射儀上產生的X射線粉末衍射(XRPD)圖方法表徵，其中XRPD參數如下：X射線波長(Cu,kα,Kα1(Å)：1.540598,Kα2(Å)：1.544426；Kα2/Kα1強度比：0.50)；X射線管設置(45Kv,40mA)；發散狹縫(自動)；掃描模式(連續)；掃描範圍(°2TH)(3°-40)；步長(°2TH)(0.0131)；掃描速度(°/min)(約10)。XRPD結果發現所得到的產物為如圖 8所示的結晶。

在圖9中所示的質子核磁共振(¹H-NMR)在Bruker 400M NMR光譜儀上在DMSO-d₆中收集。¹H-NMR(DMSO-d₆)δ 7.50(d,J=8.6Hz,2H),7.46-7.38(m,2H),7.17(t,J=7.6Hz,1H),7.08(d,J=7.6Hz,2H),7.05(d,J=8.8Hz,2H),6.85-6.72(m,1H),6.67(s,1H),6.07(dd,J=16.8,2.2Hz,1H),5.64(dd,J=10.4Hz,2.2Hz,1H),4.55-4.38(m,1H),4.17-3.94(m,2H),3.33-3.22(m,2H),3.08-2.88(m,1H),2.67-2.51(m,1H),2.36-2.15(m,1H),2.12-1.82(m,2H),1.79-1.65(m,1H),1.63-1.49(m,1H),1.38-1.08(m,2H)。

如圖10所示的碳核磁共振(¹³C-NMR)在Bruker 400M NMR光譜儀上在DMSO-d₆中收集。化合物1的晶型A的¹³C-NMR光譜。

實例2 抗CD20 mAb和BTK抑制劑的組合在人REC-1/NK92MI套細胞淋巴瘤異種移植模型中的效果

方法

在補充有10%(v/v)胎牛血清和100μg/mL青黴素和鏈黴素的RPMI1640完全培養基中培養REC-1細胞。過表達CD16和FcRγ鏈的NK92MI/CD16V細胞系由親代細胞系NK92MI建立。細胞保養在補充有0.2mM肌醇；0.1mM 2-巰基乙醇；0.02mM葉酸；1×NEAA的MEMα中，終濃度調整至20%(v/v)胎牛血清和100μg/mL青黴素和鏈黴素。以環磷醯胺(在鹽水中製備，150mg/kg,i.p.)和雙硫侖(在0.8%Tween-80/鹽水中製備，125mg/kg,p.o.,一劑環磷醯胺後1小時)每日一次預處理NOD/SCID小鼠兩天。

在植入當天，培養基以新鮮培養基替換。四小時後，移除培養基並如上文所述收集細胞。在冷(4℃)PBS中重懸細胞並添加相同體積的基質膠，分別得到終濃度為5×10⁷個細胞/mL的REC-1和終濃度為1×10⁷個細胞/mL的 NK92MI/CD16V。接種前將重懸的細胞置於冰上。細胞接種前以75%乙醇清潔每只小鼠的右脅腹區域。隨後在右前脅腹經由26號針頭對動物皮下共注射在200μl細胞懸液中的1×10⁷個REC-1細胞和2×10⁶個NK92MI/CD16V細胞。

接種後第3天，將動物隨機分為四組，其中每組12只小鼠。所述組由對照組(無藥物處理)、2.5mg/kg化合物1、2mg/kg奧濱尤妥珠單抗(Gazyva®，從Roche獲得)及化合物1和奧濱尤妥珠單抗的組合(分別為2.5mg/kg和2mg/kg)構成。處理以10mL/kg體重的體積施用，在給藥前即刻評估並相應調整給藥體積。通過每日兩次(BID)口服灌胃(p.o.)施用化合物1並通過每週一次(QW)腹膜內(i.p.)注射施用奧濱尤妥珠單抗。植入後，使用卡尺在兩個維度量測原代腫瘤的體積。

每週兩次記錄個體體重，其中在研究的過程中每日監測小鼠的臨床毒性指征。兩次量測後，當其腫瘤體積達到2,500mm³時、腫瘤潰爛時或體重減輕超過20%時，使用二氧化碳將小鼠實施安樂死。

使用下式計算腫瘤體積：V=0.5×(a×b²)，其中a和b分別為腫瘤的長徑和短徑。使用下式計算腫瘤生長抑制(TGI)：% TGI=100×[1-(處理_t/安慰劑_t)]

處理_t=在時間t時處理的腫瘤體積

安慰劑_t=在時間t時安慰劑的腫瘤體積

結果

在人REC-1/NK92MI MCL異種移植模型中檢查了化合物1和奧濱尤妥珠單抗的體內效力。作為單一藥劑，化合物1在該模型中顯示具有活性，在第23天具有72%TGI，而作為單一藥劑，奧濱尤妥珠單抗顯示不具有抗腫瘤效果。這兩種藥劑的組合在第23天引起98%TGI，其比任一種單一藥劑都更加顯著有效(圖1)。

實例3 抗CD20 mAb和BTK抑制劑的組合在人TMD-8 DLBCL異種移植模型中的作用

方法

在補充有10%(v/v)胎牛血清和100μg/mL青黴素和鏈黴素的RPMI1640完全培養基中培養TMD-8 DLBCL細胞。在植入當天，培養基以新鮮培養基替換。四小時後，移除培養基並如上文所述收集細胞。在冷(4℃)PBS中重懸細胞並添加相同體積的基質膠，得到終濃度為5×10⁷個細胞/mL的TMD-8細胞。接種前將重懸的細胞置於冰上。細胞接種前以75%乙醇清潔每只小鼠的右脅腹區域。隨後在右前脅腹經由26號針頭對動物皮下注射在200μl細胞懸液中的1×10⁷個TMD-8細胞。

接種後第7天，將動物隨機分為四組，其中每組10只小鼠。所述組由對照組(無藥物處理)、7.5mg/kg化合物1、10mg/kg奧濱尤妥珠單抗(Gazyva®，從Roche獲得)及化合物1和奧濱尤妥珠單抗的組合構成。處理以10mL/kg體重的體積施用，在給藥前即刻評估並相應調整給藥體積。通過每日兩次(BID)口服灌胃(p.o.)施用化合物1並通過每週一次(QW)腹膜內(i.p.)注射施用奧濱尤妥珠單抗。植入後，使用卡尺在兩個維度量測原代腫瘤的體積。

兩次量測後，當其腫瘤體積達到2,500mm³時、腫瘤潰爛時或體重減輕超過20%時，使用二氧化碳將小鼠實施安樂死。

處理_t=在時間t時處理的腫瘤體積

安慰劑_t=在時間t時安慰劑的腫瘤體積

結果

在第46天，化合物1和奧濱尤妥珠單抗的治療分別導致81%和61%的腫瘤生長抑制(TGI)。使用化合物1在7.5mg/kg(1CR/4PR/5)觀察到目標響應，且使用奧濱尤妥珠單抗在10mg/kg(0CR/2PR/2)觀察到目標響應。化合物1和奧濱尤妥珠單抗的組合比每一種單一藥劑處理都更加有效並導致111%的TGI和90%(1CR/8PR/9)的整體響應率(圖2)。

實例4 抗CD20 mAb和BTK抑制劑的組合在人REC-1 MCL異種移植模型中的作用

方法

在補充有10%(v/v)胎牛血清和100μg/mL青黴素和鏈黴素的RPMI1640完全培養基中培養REC-1細胞。在植入當天，培養基以新鮮培養基替換。四小時後，移除培養基並如上文所述收集細胞。在冷(4℃)PBS中重懸細胞並添加相同體積的基質膠，得到終濃度為5×10⁷個細胞/mL的REC-1細胞。接種前將重懸的細胞置於冰上。細胞接種前以75%乙醇清潔以每只小鼠的右脅腹區域。隨後在右前脅腹經由26號針頭對動物皮下注射在200μl細胞懸液中的1×10⁷個REC-1細胞。

接種後第9天，將動物隨機分為6組，其中每組7只小鼠。所述組由對照組(無藥物處理)、25mg/kg依魯替尼、7.5mg/kg化合物1、200μg/劑量的利妥昔單抗、化合物1和利妥昔單抗的組合(分別為7.5mg/kg和200μg/劑量)及依魯替尼和利妥昔單抗(分別為25mg/kg和200μg/劑量)的組合構成。化合物1和依魯替尼以10mL/kg體重的體積施用，在給藥前即刻評估並相應調整給藥體積。通過每日兩次(BID)口服灌胃(p.o.)施用化合物1和依魯替尼並通過每四天一次 (Q4D)腹膜內(i.p.)注射施用利妥昔單抗。植入後，使用卡尺在兩個維度量測原代腫瘤的體積。

處理_t=在時間t時處理的腫瘤體積

安慰劑_t=在時間t時安慰劑的腫瘤體積

結果

如圖3所示，利妥昔單抗、化合物1和依魯替尼治療組中腫瘤生長遲緩。化合物1實現了與依魯替尼相似的抗腫瘤效果，分別具有85%和83%的TGI。化合物1和利妥昔單抗的組合比每一種單一藥劑都更加有效，而依魯替尼和利妥昔單抗的組合未顯示明顯的組合效果。在第14天，當與依魯替尼和利妥昔單抗的組合治療相比時，與利妥昔單抗組合的化合物1引起明顯更低的腫瘤重量(圖4)。

實例5 抗PD-1 mAb和Btk抑制劑的組合在人A431表皮樣癌同種異體模型中的作用

方法

在植入當天，從由健康志願者捐贈的150mL血液分離人外周血單核細胞(PBMC)。簡而言之，將外周血收集入含有肝素鈉的真空血液收集管。通過密度梯度離心使用Histopaque-1077分離PBMC並通過達爾伯克磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)洗滌一次。以適當體積用DPBS懸浮細胞沉澱，得到1×10⁸個細胞/mL的終濃度並在接種前置於冰上。

在補充有10%(v/v)胎牛血清和100μg/mL青黴素和鏈黴素的DMEM完全培養基中培養A431細胞。在植入當天，培養基以新鮮培養基替換。五小時後，移除培養基並如上文所述收集細胞，不同的是，在冷(4℃)DPBS中重懸細胞，得到5×10⁷個細胞/mL的終濃度並在接種前置於冰上。以1：1：2的比率混合A431細胞、PBMC和基質膠。以環磷醯胺(在鹽水中製備，150mg/kg,i.p.)和雙硫侖(在0.8% Tween-80/鹽水中製備，125mg/kg,p.o.,一劑環磷醯胺後1小時)每日一次預處理NOD/SCID小鼠一天。細胞接種前以70%乙醇清潔每只小鼠的右腋下區域。第二劑環磷醯胺後24小時，在右前脅腹經由26號針頭對每只動物皮下注射2.5×10⁶個A431細胞和5×10⁶個PBMC(50%基質膠中的200μl細胞混合物)。

自細胞接種後第0天起，將動物隨機分為4組，其中每組10-11只小鼠。所述組由對照組(無藥物處理)、15mg/kg化合物1、10mg/kgMab 1，及化合物1和Mab 1(分別為15mg/kg和10mg/kg)的組合構成。處理以10mL/kg體重的體積施用，在給藥前即刻評估並相應調整給藥體積。通過每日兩次(BID)口服灌胃(p.o.)施用化合物1並通過每週一次(QW)腹膜內(i.p.)注射施用Mab 1。植入後，使用卡尺在兩個維度量測原代腫瘤的體積。

每週兩次記錄個體體重，其中在研究的過程中每日監測小鼠的臨床毒性指征。當其腫瘤體積達到2,500mm³時、腫瘤潰爛時或體重減輕超過20%時，使用二氧化碳將小鼠實施安樂死。

使用下式計算腫瘤體積：V=0.5×(a×b²)，其中a和b分別為腫瘤的長徑和短徑。

結果

在人表皮樣癌同種異體模型中檢查了化合物1和Mab 1的體內效力。作為單一藥劑，Mab 1在該模型中顯示邊際效應而化合物1在該模型中未顯示抗腫瘤效果。如圖5所示，與任一種單一藥劑相比，這兩種藥劑的組合展示了更好的效力。

實例6 抗PD-1 mAb和BTK抑制劑的組合在人A431表皮樣癌同種異體模型中的作用

方法

在植入當天，從由健康志願者捐贈的150mL血液分離人外周血單核細胞(PBMC)。簡而言之，將外周血收集入包含肝素鈉的真空血液收集管。通過密度梯度離心使用Histopaque-1077分離PBMC並通過達爾伯克磷酸鹽緩衝鹽水(DPBS)洗滌一次。以適當體積用DPBS懸浮細胞沉澱以給出5×10⁷個細胞/mL的終濃度並在接種前置於冰上。

在補充有10%(v/v)胎牛血清和100μg/mL青黴素和鏈黴素的DMEM完全培養基中培養A431細胞。在植入當天，培養基以新鮮培養基替換。五小時後，移除培養基並如上文所述收集細胞，不同的是，在冷(4℃)DPBS中重懸細胞，得到5×10⁷個細胞/mL的終濃度並在接種前置於冰上。以1：1：2的比率混合A431細胞、PBMC和基質膠。以環磷醯胺(鹽水中製備，150mg/kg,i.p.)和雙硫侖(在0.8% Tween-80/鹽水中製備，125mg/kg,p.o.,一劑環磷醯胺後1小時)每日一次預處理NOD/SCID小鼠一天。細胞接種前以70%乙醇清潔每只小鼠的右腋下區域。第二劑環磷醯胺後24小時，在右前脅腹經由26號針頭對每只動物皮下注射2.5×10⁶個A431細胞和5×10⁶個PBMC(50%基質膠中的200μl細胞混合物)。

自細胞接種後第0天起，將動物隨機分為4組，其中每組10-11只小鼠。所述組由對照組(無藥物處理)、15mg/kg化合物1、10mg/kg派姆單抗，及化合物1和派姆單抗(分別為15mg/kg和10mg/kg)的組合構成。處理以10mL/kg體重的體積施用，在給藥前即刻評估並相應調整給藥體積。通過每日兩次(BID)口服灌胃(p.o.)施用化合物1並通過每週一次(QW)腹膜內(i.p.)注射施用派姆單抗。植入後，使用卡尺在兩個維度量測原代腫瘤的體積。

結果

在人表皮樣癌同種異體模型中檢查了化合物1和派姆單抗的體內效力。化合物1和派姆單抗在該模型中都未顯示抗腫瘤效果。如圖6所示，這兩種藥劑的組合未顯示組合效果。

實例7A BTK抑制劑對BTK相對於ITK的選擇性

方法：

BTK和ITK的生化IC50確定

在基於時間分辨的熒光共振能量轉移(TR-FRET)方法的測定中測試了化合物1和依魯替尼對BTK激酶的抑制。簡而言之，測定在如下條件進行：在384低體積黑板中，在包含BTK激酶、5μM ATP、2μM肽底物和0-10μM化合物的反應混合物中，在含有50mM Tris pH7.4、10mM MgCl₂、2mM MnCl₂、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.005% Tween-20、20nM SEB和0.01% BSA的緩衝液中。將激酶與化合物在室溫溫育60分鐘並通過添加ATP和肽底物啟動反應。在室溫反應60分鐘後，添加等體積的終止/檢測溶液。密封平板並在室溫溫育1小時，並在PHERAstar FS平板讀取器(BMG Labtech)上記錄TR-FRET信號。

ITK測定方案與BTK測定相似，不同的是以下改良：在激酶反應中使用3μM ATP和2μM TK底物。

ITK p-PLCγ1細胞測定

一旦由T細胞受體(TCR)聚集活化，ITK直接磷酸化PLCγ1殘基Tyr783並隨後活化NF-κB通路，導致白細胞介素2(IL-2)產生的增加。以所示濃度的依魯替尼或化合物1處理Jurkat細胞2小時。處理後，將細胞暴露至10mM過氧化氫10分鐘。通過蛋白免疫印跡分析(westem blot analysis)檢測PLCγ1、p-PLCγ1(Y783)。使用Quantity One和Prism 5軟件計算IC50。

ITK IL-2生成細胞測定

在具有所示濃度的依魯替尼或化合物1的培養基中共培養HuT-78細胞和Hek293/OS8V細胞20小時。基於培養基IL-2水平計算依魯替尼和化合物1的效力。

BTK佔據細胞測定

以增加濃度的化合物1處理Z-138細胞2小時。將細胞裂解物裝載至以檢測探針預先固定的ELISA平板。溫育過夜後，使用PBST洗滌平板3次並通過BTK抗體檢測探針綴合的BTK蛋白。基於在OD450nm信號強度間比率的抑制計算化合物的效力。以GraphPad Prism軟件使用S形劑量-響應函數計算IC50值。

結果：

在生化測定中，化合物1對於BTK的選擇性相比於ITK為187倍，而魯替尼對於BTK的選擇性相比於ITK為17倍，表明對於BTK相比於ITK的抑制，化合物1比依魯替尼具有更強的選擇性。

在PLCγ1磷酸化測定(Jurkat細胞)和IL-2生成測定(HuT-78細胞)中，在抑制H₂O₂誘導的PLCγ1磷酸化和IL-2生成中，化合物1顯示為依魯替尼效果的1/44和1/10，表明化合物1在ITK抑制中比依魯替尼弱得多。

實例7B BTK抑制劑對抗CD20 mAb誘導的ADCC效應的影響

方法

在補充有10%(v/v)胎牛血清和100μg/mL青黴素和鏈黴素的RPMI1640完全培養基中培養Mino細胞。從親代細胞系NK92MI建立過表達CD16和FcRγ鏈的NK92MI/CD16V細胞系。細胞保養在補充有0.2mM肌醇；0.1mM 2-巰基乙醇；0.02mM葉酸；1×NEAA的MEMα中，終濃度調整至20%(v/v)胎牛血清和100μg/mL青黴素和鏈黴素。

將作為靶細胞(T)的Mino細胞(2x10⁴個細胞/孔)一式三份鋪板于96孔板中。以媒介物或各種濃度的BTK抑制劑處理細胞1小時，隨後以NK92MI細胞(4x10⁴個細胞/孔，作為效應細胞(E))共接種，並使用媒介物和奧濱尤妥珠單抗(2ug/孔)共處理額外24小時。溫育後，收集每孔中無細胞的上清，並使用人IFN-γ ELISA Ready-SET-Go套組量測人IFN-γ的水平。

結果

通過在NK細胞和Mino細胞的共培養物中的IFN-γ分泌評估奧濱尤妥珠單抗誘導的ADCC(圖7)。依魯替尼以劑量依賴性方式抑制IFN-γ分泌。在1μM，依魯替尼強抑制IFN-γ分泌。與之相反，化合物1在該測定中效果較差。在測試的高劑量(10μM)，其對於IFN-γ分泌與1μM的依魯替尼具有相似的抑制效果。該結果表明，在抑制奧濱尤妥珠單抗誘導的ADCC中，化合物1比依魯替尼弱至少10倍。這與化合物1為更具選擇性的BTK抑制劑一致，其在生化和細胞測定中都比依魯替尼具有更弱的ITK抑制活性。

實例8 與抗CD20抗體組合的BTK抑制劑的臨床試驗階段結果

化合物1和奧濱尤妥珠單抗在具有B細胞惡性腫瘤的患者中的多中心、開放標簽的1期試驗正在澳大利亞和美國進行，且在包括未治療(TN)的或復發性/難治性(R/R)的慢性淋巴細胞性(CLL)/小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)和R/R濾泡性淋巴瘤(FL)的疾病特異性隊列中由劑量遞增階段和劑量擴展階段構成。劑量遞增組成是在28天週期中測試與奧濱尤妥珠單抗組合的每日一次(QD)320mg或每日兩次(BID)160mg的化合物1。並且，依照標準CLL劑量(每週三次1000mg的裝載劑量，隨後在第2-6個週期的第一天1000mg)施用奧濱尤妥珠單抗。正在進行的劑量擴展的組成是測試與奧濱尤妥珠單抗時間表相同的160mg BID測試劑量的化合物1。在2017年3月31日，45位具有CLL/SLL的患者和17位具有FL的患者登記參加試驗。

43位具有CLL/SLL(18 TN,25 R/R)和15位具有R/R FL的患者具有大於12周的隨訪並可評價其功效。在TN CLL/SLL中，7.0個月的中值隨訪(2.8-11.8個月)後，整體響應率(ORR)為89%，其中在22%的患者中完全響應(CR)且在67%的患者中部分響應(PR)。在11%的患者中觀察到病情穩定(stable disease)(SD)。在R/R CLL/SLL中，在8.0個月的中值隨訪(3.8-14.0個月)，ORR為92%，其中在16%的患者中為CR且在76%的患者中為PR。在4%的患者中觀察到SD。在R/R FL中，在6.2個月的中值隨訪(1.2-10.7個月)，ORR為73%，其中在33%的患者中為CR且在40%的患者中為PR。在13%的患者中觀察到病情穩定。一位具有R/R CLL/SLL的患者具有進展性疾病(Richter轉化)，且兩位具有R/R FL的患者具有進展性疾病。

化合物1和奧濱尤妥珠單抗在具有B細胞惡性腫瘤的患者中的多中心、開放標簽的1期試驗正在澳大利亞和美國進行，且在包括未治療(TN)的或復發性/難治性(R/R)的慢性淋巴細胞性(CLL)/小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)和R/R濾泡性淋巴瘤(FL)的疾病特異性隊列中由劑量遞增階段和劑量擴展階段構成。劑量遞增組成是在28天週期中測試與奧濱尤妥珠單抗組合的每日一次(QD)320mg或每日兩次(BID)160mg的化合物1。並且，依照標準CLL劑量(每週三次1000mg的加載劑量，隨後在週期2-6的第一天1000mg)施用奧濱尤妥珠單抗。正在進行的劑量擴展的組成是測試與奧濱尤妥珠單抗時間表相同的160mg BID測試劑量的化合物1。在2017年3月31日，45位具有CLL/SLL的患者和17位具有FL的患者登記參加試驗。

上述實例和一些實施例的描述應理解為說明性，而並非是對本發明進行限制，本發明由申請專利範圍限定。容易理解的是，可利用上述特徵的多種變化和組合而不脫離申請專利範圍中所述的本發明。所有這樣的變化旨在包括于本發明的範圍內。援引的全部參考文獻通過引用以其整體併入本申請。

Claims

一種Btk抑制劑的用途，其係用於製造供在受試者中延遲癌症進展或治療癌症的方法中使用之藥劑，該方法包括向有此需要的受試者施用治療有效量的Btk抑制劑與治療有效量的抗CD20抗體或抗PD-1抗體的組合，其中所述Btk抑制劑為(S)-7-(1-丙烯醯基六氫吡啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)-4,5,6,7-四氫吡唑並[1,5-a]嘧啶-3-甲醯胺或其醫藥上可接受之鹽；其中所述抗CD20抗體為利妥昔單抗(rituximab)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、托西莫單抗(tositumonmab)、奧法木單抗(ofatumumab)或奧濱尤妥珠單抗(obinutuzumab)；其中所述抗PD-1抗體為包含SEQ ID No 24的重鏈可變區(Vh)氨基酸序列、SEQ ID No 26的輕鏈可變區(Vl)氨基酸序列和SEQ ID NO 88的IgG4恒定域氨基酸序列的抗PD-1抗體。
如請求項1的用途，其中所述抗CD20抗體為利妥昔單抗或奧濱尤妥珠單抗。
如請求項2的用途，其中所述抗CD20抗體為奧濱尤妥珠單抗，任選其中所述Btk抑制劑以320mg QD或160mg BID的劑量在28天週期中施用，並且奧濱尤妥珠單抗通過每週三次1000mg的裝載劑量接著在第2-6個週期的第一天1000mg的劑量施用。
如請求項1的用途，其中所述抗PD-1抗體以2mg/kg Q3W至200mg/kg Q3W的劑量施用。
如請求項1的用途，其中所述癌症為血液癌症。
如請求項5的用途，其中所述血液癌症為復發性或難治性血液癌症或轉移性血液癌症。
如請求項5的用途，其中所述血液癌症選自白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或B細胞癌症。
如請求項7的用途，其中所述淋巴瘤選自非霍奇金淋巴瘤(NHL)或霍奇金淋巴瘤(HL)。
如請求項5的用途，其中所述血液癌症為慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、非-CLL/SLL淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)、毛細胞白血病(HCL)、伯基特樣白血病(BL)、B細胞前淋巴細胞性白血病(B-PLL)、彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、原發性中樞神經系統淋巴瘤(PCNSL)、乳房或睾丸起源的繼發性中樞神經系統淋巴瘤(SCNSL)、多發性骨髓瘤，或其兩種或更多種的組合。
如請求項7的用途，其中所述B細胞癌症為彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化的B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、胚芽中心B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)、非胚芽中心B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(非-GCB DLBCL)或亞型不確定的彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)。
如請求項6的用途，其中所述復發性或難治性血液癌症為復發性或難治性(R/R)B細胞癌症。
如請求項11的用途，其中所述復發性或難治性B細胞癌症為彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化的B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、胚芽中心B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)或非胚芽中心B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(非-GCB DLBCL)。
如請求項6的用途，其中所述復發性或難治性血液癌症選自慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、小淋巴細胞性淋巴瘤(SLL)、B細胞前淋巴細胞性白血病(B-PLL)、非-CLL/SLL淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤(FL)、套細胞淋巴瘤(MCL)、邊緣區淋巴瘤(MZL)、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血症(WM)、多發性骨髓瘤，或其組合。
如請求項6的用途，其中所述轉移性血液癌症為轉移性B細胞癌症。
如請求項14的用途，其中所述轉移性B細胞癌症選自彌散性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)、活化的B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(ABC-DLBCL)、胚芽中心B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(GCB-DLBCL)或非胚芽中心B細胞彌散性大B細胞淋巴瘤(非-GCB DLBCL)。
如請求項1的用途，其中所述癌症選自膀胱癌、乳腺癌、胃腸道癌、腎癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、近端或遠端膽管癌和黑素瘤。
如請求項1的用途，其中所述癌症選自結腸癌。
如請求項1的用途，其中所述BTK抑制劑以320mg QD或160mg BID的劑量施用。