ES2617281T3

ES2617281T3 - Anticuerpos anti-glp-1r y sus usos

Info

Publication number: ES2617281T3
Application number: ES10828884.6T
Authority: ES
Inventors: Karyn O'neil; Kristen Picha
Original assignee: Janssen Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2009-10-28
Filing date: 2010-10-27
Publication date: 2017-06-16
Anticipated expiration: 2030-10-27
Also published as: US20140162316A1; JP2013509182A; WO2011056644A3; US20110098443A1; WO2011056644A2; EP2494062A4; JP5774595B2; US8883447B2; US8389689B2; EP2494062A2; EP2494062B1

Abstract

Un anticuerpo aislado reactivo con el receptor de péptido similar al glucagón 1 (GLP-1R) que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (CDR) 1, 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de la cadena pesada 1, 2 y 3 como se muestra en SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, respectivamente, en las que el anticuerpo es un antagonista de GLP-1R.

Description

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Anticuerpos anti-glp-1r y sus usos

5 Descripción

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] La presente invención se refiere a anticuerpos reactivos con GLP-1R, y procedimientos para su fabricación y uso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

15 [0002] La diabetes es una epidemia creciente que se estima que afectará a más de 300 millones de personas para el año 2025, para la cuál La diabetes tipo 2 representa el 90-95% de todos los casos. Complicaciones derivadas de elevados niveles constantes de glucosa en plasma incluyen enfermedad cardiovascular, nefropatía, neuropatía, y retinopatía. Además, las células del páncreas son destruidas y por tanto la secrección de insulina cesa durante las etapas avanzadas de la enfermedad. Los tratamientos actuales para la diabetes pueden generar hipoglucemia y aumento de peso, y dado que los pacientes pueden volverse inmunes a los régimenes de tratamiento con el tiempo, esto puede conducir a la necesidad de terapia de insulina en las últimas etapas de la enfermedad (Narayan et al., Diabetes Research and Clinical Practice 50:S77-S84, 2000; Moller, Nature 414:821-827, 2001).

[0003] El péptido similar al glucagón -1 (GLP-1) es un péptido de 30 aminoácidos (SEQ ID NO: 17) secretado de las

25 células L del intestino después de una prueba de la glucosa oral (Mojsov et al., J. Biol. Chem. 261:11880-11884, 1986; Orskov et al., Diabetes 43:535-539, 1994; Drucker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3431-3438, 1987; Suzuki et al., Endocrinology 125:3109-3114, 1989). En respuesta a la glucosa, GLP-1 se une al receptor GLP-1 (GLP-1R) en el páncreas e induce secrección de insulina (secuencia de aminoácidos de GLP-1R humana mostrada en SEQ ID NO: 1, secuencia de aminoácidos de GLP-1R de ratón mostrada en SEQ ID NO: 2). También se ha mostrado que GLP-1 reduce el vaciado gástrico lo que reduce el bolo de glucosa que es liberado a la circulación y puede reducir la ingesta de comida (Wettergren et al., Dig. Dis. Sci. 38:665-673, 1993). También se ha mostrado que GLP-1 inhibe la apoptosis y aumenta la proliferación de las células en el páncreas (Drucker et al., Mol. Endocrinology 17:161-171, 2003; Perfetti y col., Endocrinology 141:4600-4605, 2000; Hui y col., Endocrinology 144:1444-1455, 2003; Farilla et al., Endocrinology 143:4397-4408, 2002). Por tanto, GLP-1 tiene propiedades

35 atractivas para un tratamiento terapéutico para reducir la glucosa en sangre y preservar las células del páncreas β de pacientes diabéticos.

[0004] Es probable que receptores GLP-1 funcionales localizados en diferentes tipos de tejidos y células contribuyan a la eficacia global observada del péptido pleiotrópico del GLP-1. Por ejemplo, no está claro si GLP-1 regula la ingesta de alimentos mediante un mecanismo mediado de forma central o periféricamente. Investigaciones actuales de la distribución del GLP-1R en los tejidos han dependido casi totalmente de niveles de mARN y no de niveles de proteínas (Bullock et al., Endocrinology 137:2968-2978; Valverde et al., Endocrine 23:77-84, 2004). Otras investigaciones de biodistribución de receptores se beneficiarían de la disponibilidad de anticuerpos específicos del GLP-1R que reaccionan de forma cruzada entre especies, facilitando así la medición de niveles de proteína por

45 ejemplo en regiones definidas del cerebro y tejidos periféricos a través de una gran cantidad de especies. Anticuerpos que identifican y neutralizan la actividad del GLP-1R facilitarían las investigaciones farmacodinámicas. Por ejemplo, el anticuerpo debería utilizarse como una herramienta para diseccionar las contribuciones del cerebro frente a los receptores periféricos del GLP-1 que pueden ser responsables de la mediación del GLP-1.

[0005] Anticuerpos agonistas anti-GLP-1R se han descrito (US 2006/275288). Anticuerpos policlonales de conejo anti-GLP-1R también han sido descritos (Keedes et al., Molecular and Cellular Endocrinology 311:69,76; Beinborn et al., Regulatory Peptides 130:1-6; Schlatter et al., Regulatory Peptides 141:120-128).

[0006] Por tanto, existe una necesidad de anticuerpos contra GLP-1R que facilite la biodistribución, 55 farmacodinámica y mecanismo de investigaciones de acción del GLP-1R y sus ligandos.

Sumario de la Invención

[0007] Un aspecto de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con el receptor de péptido similar al glucagón tipo 1 (GLP-1R) que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (CDRs) 1, 2 y 3 como se muestra en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 respectivamente y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de la cadena pesada 1, 2 y 3 como se muestra en SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, respectivamente, en las que el anticuerpo es una antagonsita del GLP-1R.

65 [0008] Otro aspecto de la invención es un anticuerpo reactivo con el receptor de péptido simiilar al glucagón tipo 1 (GLP-1R) que comprende una región variable de cadena ligera (VL) que tiene una secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 9 y una región variable de la cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 10.

imagen2

[0009] También se desvela en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de 5 anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de la CDR mostrada en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5.

[0010] También se desvela en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpo que comprende las secuencias de aminoácidos de la CDR mostrada en SEQ ID NOs: 6, 7 y 8.

[0011] También se desvela en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica una cadena ligera de anticuerpos que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 9, 11 y 12.

[0012] También se desvela en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica una cadena pesada de anticuerpos que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NOs: 10, 13 y 14.

15 [0013] También se desvela en el presente documento un polinucleótido aislado que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia que se muestra en SEQ ID NOs: 15 y 16.

[0014] También se desvela en el presente documento una cadena ligera de anticuerpos aislado que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NOs: 9, 11 y 12.

[0015] También se desvela en el presente documento una cadena pesada de anticuerpos aislados que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR que se muestra en SEQ ID NOs: 10, 13 y 14.

25 [0016] Otro aspecto de la invención es un vector que codifica las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo de la invención.

[0017] Otro aspecto de la invención es una célula huésped capaz de expresar los anticuerpos aislados de la invención.

[0018] Otro aspecto de la invención es un procedimiento para la fabricación de un anticuerpo reactivo con GLP-1R.

[0019] Otro aspecto de la invención es una línea celular hibridoma que expresa los anticuerpos aislados de la invención.

35 Breve descripción de las figuras

[0020]

Figura 1. PHD 191 inhibió el péptido GLP-1 de unión a GLP-1R humano soluble.

Figura 2. PHD 191 inhibió 121I-GLP-1 de unión al receptor humano.

45

imagen3

Tabla 1 muestra la descripción de la lista de secuencias.

5

15

25

SEQ ID NO:: Descripción

1: GLP-1R humano

2: GLP-1R de ratón

3: PHD 191 LC-CDR1

4: PHD 191 LC-CDR2

5: PHD 191 LC-CDR3

6: PHD 191 HC-CDR1

7: PHD 191 HC-CDR2

8: PHD 191 HC-CDR3

9: PHD 191 LV

10: PHD191 HV

11: PHD 191 LC, humano

12: PHD 191 LC, de ratón

13: PHD 191 LC, IgG1 humana

14: PHD 191 HC, IgG2a de ratón

15: DNA, PHD 191 LC, humano

16: DNA, PHD 191 HC, IgG1 humana

17: GLP-1 (3-37)

Descripción detallada de la invención

35 [0021] El término "antagonista" tal como se usa en el presente documento significa una molécula que inhibe parcial

o totalmente, mediante cualquier mecanismo, un efecto de otra molécula tal como un receptor o un ligando. Un antagonista es capaz de, directa o indirectamente, contrarrestar reducir o inhibir sustancialmente la actividad biológica del GLP-1R. Antagonistas pueden ser anticuerpos, proteínas, o similares. Por ejemplo, un antagonista de anticuerpos puede unirse directamente al GLP-1R e inhibir la actividad biológica del GLP-1R.

[0022] El término "reactivo con" se refiere a la unión del anticuerpo a un antígeno predeterminado con mayor afinidad que la que tiene por otros antígenos o proteínas. Típicamente, un anticuerpo reactivo se une con una constante de disociación (KD) de 10-7 M o menor, y se une a un antígeno predeterminado con una K que es al

menos diez veces menor que su K para una antígeno no especificado (por ejempo, BSA, caseína, o cualquier otro

45 polipéptido especificado). Las expresiones "un anticuerpo que reconoce a un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan indistintamente en el presente documento con la expresión "un anticuerpo reactivo con un antígeno" por ejemplo, un anticuerpo reactivo con GLP-1R. La constante de disociación se puede medir usando procedimientos estándar como se describe a continuación.

D D

[0023] El término "anticuerpos" tal y como se usa en el presente documento se entiende en sentido amplio e incluye moléculas de inmunoglobulina o de anticuerpo que incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales que incluyen murinos, humanos, adaptados a humanos, humanizados y anticuerpos monoclonales quiméricos y fragmentos de anticuerpos.

55 [0024] En general, los anticuerpos son proteínas o cadenas de péptidos que muestran especificidad de unión a un antígeno específico. Anticuerpos intactos son glicoproteínas heterotetraméricas, compuestas de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Típicamente, cada cadena ligera se une a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuros entre cadenas regularmente espaciadas. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; El dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Cadenas ligeras de anticuerpos de algunas especies vertebradas se pueden asignar a uno de dos tipos claramente

65 distintos, a saber kappa () y lambda (λ), sobre la base de secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

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[0025] Immunoglobulinas se pueden asignar a cinco clases principales, a saber, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de la cadena pesada. IgA y IgG se subclasifican adicionalmente como los isotipos IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

5 [0026] La expresión "fragmentos de anticuerpos" significa una porción de un anticuerpo intacto, generalmente la unión del antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen Fab, Fab’, F(ab’)2 y fragmentos Fv, diacuerpos, moléculas de anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos

multiespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos.

10 [0027] Una región variable de cadena ligera o pesada de inmunoglobulina consta de una región "marco" interrumpida por tres "sitios de unión al antígeno". Los sitios de unión al antígeno se definen usando distintos términos como sigue: (i) Regiones determinantes de la complementariedad (CDRs)se basan en la variabilidad de secuencia (Wu and Kabat, J. Exp. Med. 132:211-250, 1970). Generalmente, el sitio de unión al antígeno tiene seis CDRs; tres en el VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3), y tres en el VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) (Kabat et al., Sequences

15 of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) El término "región hipervariable", "HVR", o "HV" se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en estructura tal como se define en Chothia and Lesk (Chothia and Lesk, Mol. Biol. 196:901-917, 1987). Generalmente, el sitio de unión al antígeno tiene seis regiones hipervariables; tres en el VH (H1, H2, H3), y tres en el VL (L1, L2, L3). Chothia y Lesk se refieren a HVs estructuralmente conservadas como

20 "estructuras canónicas". Sistemas numéricos, así como la anotación de CDRs y HVs han sido revisados recientemente por Abhinandan y Martin (Abhinandan and Martin, Mol. Immunol. 45:3832-3239, 2008). (iii) Otra definición de las regiones que forman el sitio de unión al antígeno ha sido propuesta por Lefranc (Lefranc y col., Dev. Comp. Immunol. 27:55-77, 2003) basada en la comparación de dominios V de receptores de inmunoglobulina y células T. La base de datos internacional de inmunogenética (IMGT) (http://www_imgt_org) proporciona una

25 numeración y definición estandarizadas de estas regiones. La correspondencia entre delimitaciones de CDRs, HVs y IMGT se describe en Lefranc y col., Dev. Comp. Immunol. 27:55-77, 2003. (iv) El sitio de unión al antígeno puede también delinearse sobre la base de la Especificidad Determinante del Uso de Residuos (SDRU), según Almagro (Almagro, Mol. Recognit. 17:132-43, 2004), en el que la especificidad determinante de residuos (SDR), se refiere a residuos de aminoácidos de una inmunoglobulina que están directamente implicados en el contacto con antígenos.

30 SDRU, como se define por Almagro es una medida precisa de un número y distribución de SDR para diferentes tipos de antígenos como se define por análisis de estructuras cristalinas de complejos antígenos-anticuerpos.

[0028] El término "región de consenso" como se usa en el presente documento significa un sitio de unión al antígeno delineado para incluir todos los residuos de aminoácidos delineados individualmente por Kabat, Chothia o

35 IMGT, o cualquier otra delineación del sitio de unión al antígeno adecuada.

[0029] "Marco" o "secuencia marco" son las secuencias restantes de una región variable menos los sitios de unión al antígeno. Puesto que la definición exacta de un sitio de unión al antígeno puede determinarse por varias delineaciones como las descritas anteriormente, el significado de secuencias de marco está sujeto a interpretaciones

40 consecuentemente diferentes. Una secuencia marco como se usa en el presente documento significa aquellas secuencias en la región variable de un anticuerpo además de las definidas como secuencias de sitios de unión al antígeno.

[0030] La expresión "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se usa en el presente documento significa un anticuerpo

45 (o fragmento de anticuerpo) obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos típicamente contra un único determinante antigénico. El modificador "monoclonal" indica el carácter sustancialmente homogéneo del anticuerpo y no requiere producción de anticuerpo por ningún procedimiento particular.

50 [0031] La expresión "actividad biológica del GLP-1R" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier actividad que ocurre como resultado de la unión al ligando, por ejemplo, GLP-1 (7-37) al GLP-1R. Actividades ejemplares del GLP-1R son una acumulación intracelular de AMP cíclica, liberación de calcio, secreción de insulina,

o fosforilación mediada por la quinasa de proteínas objetivo. Los ensayos que miden la actividad biológica del GLP1R son bien conocidos en la técnica.

55 [0032] El término "GLP-1R" como se usa en el presente documento se refiere a proteína GLP-1R humana que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en el número de acceso de GenBank no: NP_002053 (SEQ ID NO: 1). El GLP-1R de ratón tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en el número de acceso de GenBank no: NP_067307 (SEQ ID NO: 2).

60 [0033] Códigos de aminoácidos convencionales de una y tres letras son usados en el presente documento como siguen:

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Aminoácido: Código de tres letras Código de una letra

5: Alanina Arginina ala arg A R

10: Asparragin a Aspartato Cisteína asn asp cis N D C

15: Glutamato Glutamina Glicina Histidina glu gln gli his E Q G H

Isoleucina: ile I

20: Leucina Lisina leu lis L K

Metionina: met M

Fenilalanina: fe F

25: Prolina Serina pro ser P S

Treonina: tre T

30: Triptófano Tirosina Valina trp tir val W Y V

35

Composiciones de materia

[0034] La presente invención se refiere a anticuerpos que son reactivos con GLP-1R humano y usos de tales

40 anticuerpos. Tales anticuerpos del GLP-1R pueden tener las propiedades de unión a un receptor GLP-1R e inhibir la señalización mediada por receptores GLP-1R. Mecanismos ejemplares por el que la señalización de GLP-1R puede ser inhibida por tales antagonistas incluye inhibición de unión al ligando, o inhibición de rutas de señalización secuencia abajo. Anticuerpos que son reactivos con GLP-1R humano pueden ser también anticuerpos no neutralizantes que pueden usarse para detectar proteína GLP-1R en muestras biológicas, por ejemplo, suero, tejido,

45 células, o tejido o células fijas. Los anticuerpos de la invención son útiles por ejemplo como reactivos de investigación, reactivos de diagnóstico, evaluación de biodistribución del GLP-1R, y en investigaciones farmacodinámicas. Por ejemplo, es poco probable que los anticuerpos del GLP-1R atraviesen la barrera hematoencefálica. Por tanto, los anticuerpos antagonistas del GLP-1R, cuando se dosifican a animales pueden usarse para determinar el efecto de bloquear selectivamente actividades periféricas pero no centrales del GLP-1

50 sobre por ejemplo la ingesta de alimento. Además, anticuerpos específicos para GLP-1R son valiosos para determinar los niveles de receptor en distintas secciones del cerebro y en el nervio vago, ya que la expresión de GLP1-R en ambos podría contribuir al efecto del GLP-1 en la ingesta de alimento.

[0035] Una realización particular de la invención es un anticuerpo aislado reactivo con GLP-1R que tiene secuencias

55 de aminoácidos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena ligera (LCDR1), (LCDR2) y (LCDR3) que tienen secuencias de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente, y secuencias de aminoácidos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de cadena pesada (HCDR1), (HCDR2) y (HCDR3) que tienen secuencias de aminoácidos como se muestra SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, en las que el anticuerpo es una antagonista de GLP-1R.

60 [0036] En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo aislado reactivo con GLP-1R que comprende una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 10.

65 [0037] También se desvela en el presente documento cadenas ligeras aisladas que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NO: 11 y 12, y cadenas pesadas aisladas que tienen secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 13 y 14. [0038] Para generar anticuerpos antagonistas al GLP-1R el dominio de unión al GLP-1 en el receptor debe

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5 abordarse. GLP-1R pertenece a una subclase de siete receptores acoplados a la proteína G transmembranal, y en el pasado ha sido complicado desarrollar anticuerpos contra este tipo de receptor (Michel at al., Naunyn-Schmied Arch Pharmacol. 379:385-388, 2009; Sangawa et. al., Hybridoma 27:331-335, 2008; Huang y col., J. Mol. Recog. 18:327333, 2005). El GLP-1R contiene un dominio N terminal extracelular relativamente grande que ha demostrado que es un determinante importante en la afinidad de unión al GLP-1 (Wilmen y col., Feder. Europ. Biochem. Soc. 398:43-47, 1996). Por tanto, es probable que anticuerpos contra el dominio N-terminal compitan con agonistas de GLP-1R para su unión y por consiguiente inhibir los efectos secuencia abajo.

[0039] Anticuerpos ejemplares pueden ser anticuerpos de isótopos de IgG, IgD, IgGA o IgM. Además, tales anticuerpos pueden ser modicados después de la traducción mediante procesos tales como glicosilación,

15 isomerización, deglicosilación o modificación covalente no natural tales como la adición de fracciones de polietilenglicol (pegilación) y lipidación. Tales modificaciones pueden ocurrir in vivo o in vitro. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden conjugarse al polietilenglicol (PEGilato) para mejorar sus perfiles farmacocinéticos. La conjugación puede realizarse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Se ha mostrado que la conjugación de anticuerpos terapéuticos con PEG mejora la farmacodinámica y no interfiere en la función (Deckert et al., Int. J. Cancer 87:382-390, 2000; Knight et al., Platelets 15:409-418, 2004; Leong et al., Cytokine 16:106-119, 2001; and Yang et al., Protein Eng. 16:761-770, 2003).

[0040] Propiedades farmacocinéticas de los anticuerpos de la invención podrían también mejorarse mediante modificaciones al Fc por técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las cadenas pesadas del 25 isótopo IgG4 contienen una unidad Cis-Pro-Ser-Cys (CPSC) en la región bisagra capaz de formar uniones disulfuro inter o intra cadena pesada, por ejemplo, los dos residuos cis en la unidad CPSC pueden unir enlaces disulfuros con los correspondientes residuos cis en la otra cadena pesada (inter) o los dos residuos cis dentro de una unidad CPSC dada pueden unir disulfuros entre ellos (intra). Se cree que las enzimas isomerasas in vivo son capaces de convertir enlaces inter cadena pesada de moléculas de IgG4 en enlaces intra cadena pesada y vice versa (Aalberse and Schuurman, Immunology 105:9-19, 2002). Por consiguiente, dado que los pares de cadena pesada: ligera en aquellas moléculas IgG4 con enlaces intra cadena pesada en la región bisagra no están asociados covalentemente entre sí, pueden disociarse en monómeros HL que luego se reasocian con monómeros derivados de otras moléculas de IgG4 que forman moléculas biespecíficas y heterodiméricas de IgG4. En un anticuerpo de IgG biespecífico, los dos Fav de la molécula de anticuerpo difieren en los epítopes a los que ellos se unen. La sustitución del residuo de

35 ser en la unidad CPSC de la región bisagra de IgG4 con pro da como resultado "un comportamiento tipo IgG1", es decir, las moléculas forman enlaces disulfuros estables entre cadenas pesadas y por lo tanto, no son susceptibles al intercambio de HL con otras moléculas de IgG4. En otra realización, los anticuerpos de la invención comprenderán un dominio de Fc de IgG4 con una mutación de S a P en la unidad CPSC. La localización de la unidad CPSC se encuentra típicamente en el residuo 228 de una cadena pesada madura pero que puede cambiar dependiendo de las longitudes de CDR.

[0041] Además, secuencias de aminoácidos pueden intercambiarse o eliminarse dentro del dominio de Fc que afecta la unión a los receptores además de un receptor de rescate en los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, las regiones Fc del anticuerpo implicadas en la actividad de ADCC, se pueden eliminar en los anticuerpos de la

45 invención. Por ejemplo, la mutación de Leu234/Leu235 en la región bisagra de IgG1 a L234A/L235A o Fe235/Leu236 en la región bisagra de IgG4 a P235A/L236A minimiza la unión a FcR y reduce la capacidad de la inmunoglobulina de mediar en la citotoxicidad dependiente de complemento y ADCC. En una realización, los anticuerpos de la invención comprenderán un dominio de Fc de IgG4 con mutaciones P235A/L236A. La localización de estos residuos identificados anteriormente es típica en una cadena pesada madura pero que puede cambiar dependiendo de las longitudes de CDR.

[0042] Los antagonistas de anticuerpos de la invención pueden unirse a GLP-1R con una Kd menor o igual a aproximadamente 10-7, 10-8, 10-9, 10-10, 10-11 or 10-12 M. La afinidad de una molécula dada para un GLP-1R puede determinarse mediante cualquier procedimiento adecuado. Tales procedimientos utilizan aparatos Biacore o

55 KinExA, ELISA o ensayos de unión competitiva conocidos por los expertos en la técnica.

[0043] Las moléculas de anticuerpos antagonistas que se unen a GLP-1R con una afinidad deseada pueden seleccionarse de bibliotecas de variantes o fragmentos mediante técnicas que incluyen maduración de la afinidad de anticuerpos. Antiocuerpos antagonistas pueden identificarse sobre la base de su inhibición de actividad biológica de GLP-1R mediante cualquier procedimiento adecuado. Tales procedimientos pueden utilizar ensayos de gen reportador o ensayos que midan la producción intracelular cíclica del AMP conocidos por los expertos en la técnica. Anticuerpos adecuados para estudios de distribución y farmacodinámica pueden probarse mediante metodología rutinaria, tales como inmunohistoquímica o ensayos ELISA.

65 [0044]Anticuerpos de la presente invención pueden producirse mediante una serie de técnicas, por ejemplo mediante el procedimiento de hibridoma de Kohler et al., Nature 256:495-497, 1975. MAbs quiméricos que contienen

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65

una región variable de cadena ligera y de cadena pesada derivada de un anticuerpo donante (típicamante murina) asociado con regiones constantes de cadena ligera y pesada derivadas de un anticuerpo aceptor (típicamente especies mamíferas tales como humanos), pueden prepararsse mediante el procedimiento desvelado en la patente americana. No. 4.816.567. mAbs injertados con CDR que tienen CDRs derivados de una inmunoglobulina donante no humana (típicamente murina) y las partes derivadas de la inmunoglobulina restante de la molécula que se derivan de una o más inmunoglobulinas humanas pueden prepararse mediante técnicas conocidas por los expertos en la técnica tal como se desvela en la patente americana. No. 5.225.539. Secuencias marco humanas útiles para el injerto pueden seleccionarse de la base de datos pertinente por los expertos en la técnica. Opcionalmente, mAbs injertados con CDR pueden humanizarse adicionalmente mediante la incorporación de residuos de soporte estructural alterados para preservar la afinidad de unión mediante técnicas tales como las desveladas en Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:10029-10032, 1989 and Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421, 1991. MAbs totalmente humanos carentes de secuencias cualesquiera humanas pueden prepararse a partir de ratones transgénicos de inmunoglobulina humana mediante técnicas referenciadas en, por ejemplo, Lonberg et al., Nature 368:856-859, 1994; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-851, 1996; and Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156, 1997. MAbs humanos pueden también prepararse y optimizarse a partir de bibliotecas de presentación de péptidos por técnicas referenciadas en, por ejemplo, Knappik et al., J. Mol. Biol. 296:57-86, 2000; and Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-84 2001.

[0045]La preparación de antígenos inmunogénicos, y la producción de anticuerpos monoclonales puede realizarse mediante técnicas adecuadas tales como producción de proteína recombinante. Los antígenos inmunogénicos pueden administrarse a un animal en forma de proteína purificada, o mezclas de proteínas que incluyen las células enteras o extractos de tejido o célula, o el antígeno puede formarse de nuevo en el cuerpo del animal a partir de ácidos nucléicos que codifican dicho antígeno o una porción del mismo.

[0046] Se ha desvelado también en el presente documento un polinucleótido aislado que codifica a los anticuerpos de la invención o su complemento. Polinucleótidos ejemplares se desvelan en el presente documento, sin embargo, otros polinucleótidos, los cuáles, dada la degeneración del código genético o preferencias en el uso de codones en un sistema de expresión dado, que codifica el anticuerpo de la invención son también desvelados. Polinucleótidos aislados comprenden los polinucleótidos que tiene una secuencia mostrada en SEQ ID NO: 15 o 16 son desvelados. Los ácidos nucléicos desvelados en el presente documento pueden prepararse usando procedimientos recombinantes, (b) técnicas sintéticas, (c) técnicas de purificación, o combinaciones de las mismas, como es bien conocido en la técnica. ADN que codifica a anticuerpos monoclonales es fácilmente aislado y secuenciado mediante procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de murina). Cuando de produce un hibridoma, tales células pueden servir como fuente de dicho ADN. Alternativamente, el uso de técnicas de presentación en las que la secuencia de codificación y e producto de traducción están unidos, tales como bibliotecas de presentación de péptidos o ribosómicas, la selección del aglutinante y el ácido nucléico se simplifica. Tras la selección del péptido, las regiones codificantes del anticuerpo del péptido pueden aislarse y usarse para generar anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos humanos, o cualquier otro fragmento de unión al antígeno deseado, y pueden ser expresadas en cualquier huésped deseado, incluyendo células mamíferas, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias.

[0047] Otra realización de la invención es un vector como se recita en las reivindicaciones 5-7. Vectores desvelados en el presente documento pueden ser vectores de plásmidos, vectores víricos, vectores basados en transposones o cualquier otro vector adecuado para la introducción de los polinucleótidos desvelados en el presente documento en un organismo o antecedente genético por cualquier medio. Un vector ejemplar consta de un promotor de CMV, sitio de unión del T7, secuencia líder de VH, un sitio BGH poliA, un origen de replicación, un origen de ColE1, un promotor de CMV y una beta-lactamasa, y puede incluir polinucleótidos que codifican una región constante del anticuerpo, por ejemplo, la región constante gamma2a de un ratón.

[0048] Otra realización de la invención es una célula huésped que comprende el vector de la invención tal como un vector que codifica un polipéptido que comprende una cadena ligera de inmunoglobulina que tiene la secuencia de aminoácido mostrada en SEQ ID NO: 11 y una cadena pesada de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 13. Dichas células huésped pueden ser células eucarióticas, células bacterianas, células vegetales o células de arqueas. Cálulas eucarióticas ejemplares pueden ser de mamífero, insecto, aviar u otros orígenes animales. Las células eucarióticas de mamíferos incluyen líneas celulares inmortalizadas tales como hibridomas o líneas celulares de mieloma tales como SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Wiltshire, UK, ECACC No. 85110503), FO (ATCC CRL-1646) y Ag653 (ATCC CRL-1580) líneas celulares murínicas. Una línea celular de mieloma humano ejemplar es U266 (ATTC CRL-TIB-196). Otras líneas celulares útiles incluyen las derivadas de células de ovario de hámster chino (CHO) tales como CHO-K1SV (Lonza Biologics), CHO-K1 (ATCC CRL-61, Invitrogen) o DG44.

[0049] Otra realización de la invención es un procedimiento de preparación de un anticuerpo reactivo con GLP-1R que comprende el cultivo de una célula huésped de la invención y recuperación del anticuerpo producido por la célula huésped. Procedimientos para preparar anticuerpos y purificarlos son bien conocidos en la técnica.

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[0050] Otra realización de la invención es una línea celular de hibridoma que produce un anticuerpo de la invención.

Ejemplo 1

Generación de proteína GLP-1R soluble

[0051] cADNs que codifican receptores GLP-1 solubles de ratón y humano correspondientes a los aminoácidos 24145 de humano (SEQ ID NO: 1) y aminoácidos 21-143 de ratón (SEQ ID NO: 2) El receptor GLP-1 se preparó usando técnicas de síntesis génica (patente americana. No. 6,670,127; patente americana. No. 6.521.427). Plásmidos para la expresión de los receptores solubles sintéticos se prepararon mediante técnicas de biología molecular estándar. Cada plásmido codificó una secuencia Kozak, una secuencia de señales de la hormona de crecimiento humana, la región soluble del GLP-1R humano o murínica, y una etiqueta 6xHis de un C-terminal para facilitar la purificación. Vectores se transfectaron transitoriamente a células HEK293T mediante procedimientos estándar y las proteínas secretadas se purificaron por IMAC, usando resina talón.

[0052] El antígeno de GLP-1R (#3527) humano soluble se marcó con biotina usando enlace EZ sulfo-NHS-LC

biotina según las instrucciones del fabricante (Pierce Chemical Company, St. Louis, MO). La actividad del biotinilado 3527 se confirmó usando CNTO736, una creación mediante Mimetibody™ de GLP-1 (Picha et al., Diabetes 57:1926-34, 2008). Una placa Maxisorp de 96 pocillos fue revestida (100 ml/pocillo) con 5-mg/mL de cualquier biotinilado o 3527 no marcado y se incubó a 4°C toda la noche. Las placas se lavaron con TBST y se bloquearon con 300 ml/pocillo de Chemiblocker 1X durante 1 hora en RT. Las placas fueron lavadas con TBST. Las diluciones en serie (1:3) de CNTO736 o CNTO1996 (control negativo que carece del péptido GLP-1) se prepararon comenzando en 10mg/ml, se añadieron a los pocillos apropiados en la placa (100 ml/pocillo), y se dejaron unir durante 1 hora en RT. Las placas fueron lavadas con TBST. Las placas se trataron durante 1 hora en RT con 100ml/pocillo del anticuerpo de detección IgG (H+L)-AP de cabra antihumano diluído 1:5000 en TBST. El sustrato Attophos (1:5) detectó actividad AP. Biotinilado 3527 retuvo un perfil de unión comparable al 3527 no marcado (datos no mostrados).

Ejemplo 2

Identificación de anticuerpos de GLP-1R antihumanos

[0053] La panoramización de la solución de la biblioteca combinatoria de anticuerpos GOLD (HuCAL GOLD) fue desarrolada usando un método de captura de perlas magnéticas antígeno-estreptavidina biotinilado como se ha descrito (Rothe y col., J. Mol. Biol. 376:1182-1200, 2008; Steidl y col., Mol. Immunol. 46: 135-144, 2008) en tres rondas posteriores. Fabs recuperados de la última ronda de selección se subclonaron en el vector de expresión pMORPHx9_Mx_MH Fab que contiene una etiqueta Myc e His6 (Rauchenberger et al., J. Biol. Chem. 278:3819438205, 2003). Células TG1 de E. coli (#200123, Stratagene, La Jolla, CA) fueron transformadas mediante electroporación, y los Fabs producidos por la bacteria.

[0054] Se seleccionaron Fabs para su unión al 3527 (Rauchenberger et al., J. Biol. Chem. 278:38194-38205, 2003). Los Fabs que se unieron al 3527, más de cinco veces la base se secuenciaron para determinar el número de clones Fab únicos. Se seleccionaron 39 Fabs para la secuenciación. De los 39 clones secuenciados, PHD191 se identificó 3 veces, o el 8% de las coincidencias totales. Las secuencias de aminoácidos de los CDRs y las regiones variables de cadena ligera y pesada de PHD191 se muestran en SEQ ID NOs: 3-10.

Ejemplo 3

PHD 191 Fab que inhibe la unión de GLP-1 a GLP-1R soluble humana

[0055] Se revistieron placas Maxisorp de 96-pocillos (100 µl/pocillo) con 5µg/mL de GLP-1R (shGLP1-R) soluble humano en PBS y se incubó a 4°C. Las placas se lavaron con TBST y se bloquearon con 300 µl/pocillo de Chemiblocker 1X durante 1 hora en RT. Las placas fueron lavadas con TBST. Se preparó una mezcla de diluciones en serie (1:2) de PHD 191 Fab comenzando en 25 µg/ml y péptido GLP-1 humano biotinilado se mantuvo constante a 75 ng/ml. Esta mezcla se añadió a las placas (100 µl//pocillo) y se incubó en RT durante 1 hora. Las placas fueron lavadas con TBST. Las placas se trataron durante 1 hora en RT con 100 ml/pocillo del anticuerpo de detección Strep-AP diluído 1:2000 en TBST. El sustrato Attophos (1:5) detectó actividad AP. PHD 191 inhibió la unión del péptido GLP-1 humano al GLP-1R humano soluble (Figura 1).

Ejemplo 4

Transferencia de PHD 191 a Formatos IgG1 humana /IgKappa humana e IgG2a murina /IgKappa murina [0056] El PHD 191 se subclonó en vectores completos de expresión de inmunoglobulina (Krebs et al., J. Immunol. Meth. 254:67-84, 2001). Se crearon construcciones similares para las de IgKappa murina de PHD 191, IgG1 humana, y las de IgKappa humanas.

imagen7

5 [0057] Vectores completos de cadena ligera y pesada se transformaron en células DH10B según las instrucciones del fabricante. Colonias individuales se seleccionaron para la inserción de la región variable correcta mediante PCR y análisis de secuencias. ADN fue aislado para cada clon correcto y se usó para transfecciones usando procedimientos estándar, y los insertos se secuenciaron. Las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada se muestran en SEQ ID NOs: 11-14.

[0058] Los vectores que codifican parejas de cadenas ligeras y pesadas se cotransfectaron en células HEK293E. Los sobrenadantes que contienen los anticuerpos secretados fueron purificados por afinidad usando resina de proteína A según protocolos estándar.

15 Ejemplo 5

Caracterización de PHD 191

Reactividad cruzada con murina GLP-1R

[0059] La especificidad de unión de PHD 191 se caracterizó usando dos formatos de ensayo ELISA diferentes. Ambos formatos de ensayo mostraron que PHD 191 se une al GLP-1R humano y también reacciona de forma cruzada con el GLP-1R de murina. El primer ensayo de caracterización fue una ensayo de captura de neutravidin. Se revistieron placas Maxisorp de 96 pocillos (100 µl/pocillo) con 5 mg/ml de neutravidin en PBSy se incubaron a 25 4°C toda la noche. Las placas revestidas se lavaron con TBST. 2 mg/ml de GLP-1R (3445) de murina soluble biotinilado, GLP-1R (3527) humano soluble biotinilado, u otras proteínas de control biotinilado (IL-23 de ratón, IL-12 de ratón, IL-18 de ratón, transferrina de rata) fueron añadidas (100 µl/pocillo) y se dejó que se unieran al neutravidin durante 1 hora en RT. Las placas se lavaron con TBST y se bloquearon con 300 µl/pocillo de Chemiblocker 1X durante 1 hora en RT. Las placas se lavaron con TBST. Se prepararon las diluciones en serie (1:2) del PHD 191 mAb comenzando en 5mg/ml, se añadieron a los pocillos (100µl/pocillo), y se dejó que se unieran durante 1 hora en RT. Las placas se lavaron con TBST. Las placas se trataron durante 1 hora en RT con 100 ml/pocillo del anticuerpo de detección IgG (H+L)-AP de cabra antihumano diluído 1:5000 en TBST. El sustrato Attophos (1:5) detectó actividad AP. PHD 191 se unió específicamente al GLP-1R soluble humano, reaccionó de forma cruzada con GLP1R murino soluble y no tuvo unión a proteínas biotiniladas independientes (0.4 nM y 2.5 nM para GLP-1R humano y

35 murino respectivamente).

[0060] Para confirmar la reactividad cruzada de PHD 191 al GLP-1R murino, se realiza un segundo ensayo de caracterización usando receptor no marcado revestido directamente sobre la placa. Se revistieron placas Maxisorp de 96-pocillos (100 µl/pocillo) con 5 mg/ml de GLP-1R humano o murino no marcado en PBS y se incubaron a 4°C toda la noche. Las placas revestidas se lavaron con TBST y se bloquearon con 300 µl/pocillo de Chemiblocker 1X durante 1 hora en RT. Las placas se lavaron con TBST. Se prepararon diluciones en serie de PHD 191 Mab (1:3) comenzando en 30 µg/ml, se añadieron a la placa (100 µl/pocillo y se dejó que se unieran durante 1 hr en RT. Las placas se lavaron con TBST. Las placas se trataron durante 1 hora en RT con 100 µl/pocillo del anticuerpo de detección IgG (H+L)-AP de cabra antihumano diluido 1:5000 en TBST. El sustrato Attophos (1:5) detectó actividad

45 AP. El ensayo de capa directo confirmó que PHD 191 reaccionó de forma cruzada con GLP-1R murino soluble (0.8 nM y 11.9 nM, para GLP-1R humano y murino soluble respectivamente).

Inhibición de la unión de GLP-1 al GLP-1R humano

[0061] Un ensayo de unión de GLP-1 125I se usó para determinar si PHD 191 podía inhibir la unión del péptido GLP-1 al receptor humano expresado en células. El receptor GLP-1 humano que sobreexpresa a las células HEK293F se incubó toda la noche a 4° C en presencia de 3nM 125I GLP-1 junto con un ajuste de dosis de PHD

191. GLP-1 125I no ligado se enjuagó y se midió el cómputo asociado a la célula. Los datos se ajustaron a una hipérbola para obtener una IC50 de 48.5 nM (Figura 2). Suponiendo una Kd para GLP-1 de unión al GLP-1R

55 humano de 3 nM (previamente determinada) e inhibición competitiva, este dato indica que la Ki para PHD 191 es aproximadamente 20 nM.

Inhibición de estimulación de AMP cíclico mediante GLP-1

[0062] Se usaron dos formatos de ensayo para mostrar que PHD 191 inhibió la acumulación de cAMP mediada por GLP-1. En el primer formato, se añadió un ajuste de dosis de PHD 191 en presencia de 0.3 nM de péptido GLP-1 al receptor GLP-1R humano sobreexpresado por células HEK293F. En el segundo formato, una respuesta a la dosis del péptido GLP-1 en presencia de 1 mM PHD 191 se añadió a las células de sobreexpresión del GLP-1R. En ambos casos, la acumulación de cAMP total después de siete minutos de estimulación fue cuantificada usando el kit 65 de ensayo del cAMP LANCE de PerkinElmer. El ajuste de dosis de la dosis dependiente de PHD 191 redujo la

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acumulación cAMP dependiente de GLP-1, indicando una reducción en la señalización del péptido GLP-1 en presencia del anticuerpo. Los datos se ajustaron a una ecuación que describe un único evento de unión que proporciona una IC50 de 3.3 nM. PHD 191 también modificó la EC50 de 0,3 a 1,5 nM cuando el péptido GLP-1 fue

probado en un ensayo cAMP. 5 Ejemplo 6

Distribución de GLP-1R humanos a tejidos

[0063] La expresión proteínica del GLP-1R humano se evaluó en tejidos normales mediante inmunohistoquímica. Se detectó proteína GLP-1R en islotes pancreáticos, neuronas del SNC y células epiteliales del intestino.

[0064] Se obtuvieron muestras de cerebro de donantes normales de los servicios analíticos de biología S.A. Las disecciones del cerebro se prepararon y se calificaron por un neurobiólogo (Analytical Biological Services, Inc). Se 15 obtuvieron muestras de otros tejidos normales humanos del banco de tejidos Qual Tek, y se calificaron por un patólogo. La inmunohistoquímica en tejidos humanos se realizó de la siguiente manera. Se cortaron cuatro secciones de microtejidos de bloques integrados en parafina fijados con formalina, ubicados en portaobjetos, y secados a 60°C. Estos fueron desparafinados mediante cuatro cambios de xileno de 5 minutos, seguidos de una sucesión graduada de alcohol a agua destilada. Se probó la reactividad inmunohistoquímica de todas las muestras de tejidos al PHD 191, usando el siguiente protocolo. Brevemente, se penetraron los tejidos usando sHIER 2 durante 20 minutos y luego digeridos durante 10 minutos con Pro K a una dilución 1:15. Muestras de tejidos se incubaron posteriormente con el anticuerpo primario, PHD 191 durante 63 horas a 4° C a 5 µg/ml o 7.5 µg/ml. Para experimentos de bloqueo los tejidos se incubaron con PHD 191 en presencia de exceso 20 molar del dominio extracelular de GLP-1R. Se usó un anticuerpo de control de isótopo no específico de ratón para confirmar la 25 especificidad de tinción. Se usó un sistema de detección ABC usando el protocolo MIPE en el Techmate para marcar el anticuerpo primario ligado. Después de la tinción, los portaobjetos se deshidrataron mediante una sucesión de alcohol a etanol absoluto seguido de enjuagues con xileno. Los portaobjetos se cubrieron de forma permanente con cubreobjetos de vidrio y permount. Los portaobjetos se examinaron bajo un microscopio para evaluar la tinción. La tinción positiva viene indicada por la presencia de un producto de reacción (DAB-HRP) de cromógeno marrón. Contratinción con hematoxilina proporcionó una tinción nuclear azul para evaluar morfología celular y tisular. Se obtuvieron imágenes representativas con una cámara Olympus Microfire digital (M/N S97809) unida a un microscopio Olympues BX60 y exhibidas en un monitor de pantalla plana Dell con el DPI fijado en 96 y la rsolución de pantalla fija en 1152 con 864 píxeles. Las imágenes se enfocaron nítidamente mediante la iluminación de Koehler. Algunas imágenes fueron tomadas con un objetivo de 40x o mayor como una serie de toda la gama

35 focal del campo de visión y se combinaron con Plus 5.1 (MediaCybernetics) de profundidad ampliada para imagen-Pro de la función de campo para obtener una imagen compuesta con enfoque nítido para todo el campo de la imagen de visión.

[0065]Se identificaron islotes pancreáticos en la sección del páncreas humano sobre la base de evaluación histológica después de una contratinción con hematoxilina. El análisis de IHC del páncreas humano mostró la presencia de GLP-1R humanas en células islote. Se confirmó la especificidad de la tinción en experimentos de bloqueo en los que la preincubación de PHD191 con dominio extracelular de GLP-1R inhibía completamente la tinción. Se detectó también GLP-1R en neuronas en la amídgala, hipotálamo, núcleo arcuato, y área postrema. GLP1R no fue detectado en dos muestras de la corteza cerebral. No se detectó tinción en ninguna sección cerebral

45 tintada con anticuerpos de control de isótopos no específicos de ratón.

[0066] En muestras de tejido que contienen epitelio, ocasionalmente se observó tinción en células epiteliales. En cuatro de 14 muestras de pulmón algunas de las vías aéreas bronquiales tenían células epiteliales con tinción en la superficie luminal y tinción perinuclear en células basales. En dos de 4 muestras de cólon, la superficie luminal tenía fuerte tinción. En una de 3 muestras de mama, se observó tinción perinuclear en las células que recubren los conductos. No se observó reactividad en los controles negativos para esas muestras.

[0067] En una de 3 muestras del intestino delgado y en dos de 4 muestras de cólon, se observó reactividad en células de cripta aisladas. La localización y la frecuencia de estas células de la cripta tintadas en el cólon e intestino

55 delgado es coherente con células entero-endocrinas.

[0068] Se observaron células inmunes reactivas en la mayoría de los tejidos. Estos eran típicamente granulocitos polimorfonucleares dentro de vasos sanguíneos o células con morfología de macrófagos o mastocitos. Para confirmar la especificidad de tinción, se repitió IHC con un subconjunto de muestras en presencia de un exceso de antígeno (dominio N-terminal de GLP-1R). Bajo estas condiciones la reactividad de PHD 191 fue inhibida de forma significativa en neuronas, células epiteliales, y células de islote pancreáticas. Sólo se observó inhibición parcial de PHD 191 en células inmunes, por lo que la especificidad de tinción de PHD 191 en células inmunes queda por determinar.

65 [0069] La información descrita en el presente documento detalla el descubrimiento y caracterización de PHD 191. EL PHD 191 reaccionó de forma cruzada con GLP-1R murina y se unió a GLP-1R expresado en células. El PHD 191

Claims

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Reivindicaciones

5 1. Un anticuerpo aislado reactivo con el receptor de péptido similar al glucagón 1 (GLP-1R) que comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de la complementariedad de la cadena ligera (CDR) 1, 2 y 3 como se muestra en las SEQ ID NO: 3, 4 y 5, respectivamente y las secuencias de aminoácidos de las CDRs de la cadena pesada 1, 2 y 3 como se muestra en SEQ ID NOs: 6, 7 y 8, respectivamente, en las que el anticuerpo es un antagonista de GLP-1R.

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2. El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena ligera (VL) que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 9 y una región variable de cadena pesada (VH) que tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 10, en la que opcionalmente

15 (a) la cadena ligera (LC) tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 11 y la cadena pesada (HC) tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 13; o

(b) la cadena ligera (LC) tiene la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO: 12 y la cadena pesada (HC) tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 14.

20 3. El anticuerpo aislado de reivindicación 1, o 2 en el que el anticuerpo comprende un fragmento de Fab.
4. El anticuerpo aislado de reivindicación 1, 2 o 3 que tiene un isotipo seleccionado de un grupo que comprende IgG1 humana y IgG2a de ratón.

25 5. Un vector que codifica cadenas ligeras y pesadas de anticuerpo en las que la cadena ligera comprende las secuencias de aminoácidos de las regiones determinantes de complementariedad (CDRs) 1, 2 y 3 como se muestra en SEQ ID NOs: 3, 4 y 5 respectivamente y la cadena pesada comprende las secuencias de aminoácidos de las CDRs de la cadena pesada 1, 2 y 3 como se muestra en SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente.

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6. El vector de reivindicación 5 en el que la cadena ligera del anticuerpo comprende la secuencia de aminoácido que se muestra en SEQ ID NOS: 9, 11 o 12 y la cadena pesada de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos moestrada en SEQ ID NO: 10, 13 o 14.

35 7. Un vector conforme a la reivindicación 6 que comprende un polinucleótido que tiene una secuencia que se muestra en SEQ ID NO: 15 y 16.
8. Una célula huésped que comprende (i) el vector de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7; o (ii) que comprende un vector que codifica la cadena ligera de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos

40 que se muestra en SEQ ID NOS: 9, 11 o 12 y un vector que codifica la cadena pesada de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NOS: 10, 13 o 14.
9. Un procedimiento de preparación de un anticuerpo reactivo con GLP-1R que comprende el cultivo de la

célula huésped de la reivindicación 8 y recubrir el anticuerpo producido por la célula huésped. 45

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