JP4912144B2 - 造血促進のためのｂｖ８及び／又はｅｇ−ｖｅｇｆの使用 - Google Patents

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Description

造血性及び免疫活性を有する組成物
ジェネンテック，ＩＮＣ等、合衆国国民及び居住者、は２００３年３月１２日提出の米国仮出願第６０／４５４４６２号及び２００３年１０月１４日提出の同第６０／５１１３９０号の優先権を主張してＰＣＴ出願としてこの出願を提出する。
（発明の背景）
Ｂｖ８は、本来カエルのキバラスズガエル(Bombina variegata)の皮膚分泌物から単離された小タンパク質である（Mollay等, Eur. J. Pharmacol. 374:189-196 (1999)）。Ｂｖ８は構造学的に内分泌腺由来脈管内皮増殖因子（ＥＧ−ＶＥＧＦ）を含むペプチドの関連クラスに属する(LeCouter等, Nature, 412:877-884 (2001))。これらの分子の特徴的な構造モチーフは、１０個のシステイン残基が保存範囲内でジスルフィド架橋を形成しているコリパーゼ-ホールドである。
Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦは脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、腫瘍の成長及び生存に重要な役割を有することが知られている血管形成因子の相同体である。Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦは特定の組織の内皮細胞に対して選択的活性を持つ血管形成因子として同定されている。ＥＧ−ＶＥＧＦは培養性の副腎毛細血管内皮細胞の増殖、移動、生存、及び開窓を促進し、卵巣及び精巣における血管形成を誘導した。LeCouter等, 2001, Nature, 412:877-884；LeCouter等, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,100:2685-2690。
ＥＧ−ＶＥＧＦと同様に、Ｂｖ８は副腎皮質毛細血管内皮細胞の増殖、生存、及び移動を促進し、精巣における血管形成を誘導した。LeCouter等, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,100:2685-2690。精巣は相対的に内皮細胞の回転率が高い。ゆえに、ＶＥＧＦ等の他の因子と共にＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦは精巣の血管の完全性維持及び増殖の調節に重要であると考えられる。
ＶＥＧＦは腫瘍の成長及び生存に重要な役割を持つことが知られている血管形成因子である。Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦは特定の組織に選択的活性を有する血管形成因子であるので、更なる分子の特徴付けが望まれるところである。
（発明の概要）
本発明は造血幹細胞（ＨＳＣ）、系統に関連した血液祖先細胞、及びリンパ球におけるＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦの新たな発現及び活性の同定に基づく。特にここで詳述するように、Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及びそれらのレセプターは多くの血液学的悪性細胞系だけでなく骨髄ＨＳＣ、末梢血白血球（ＰＢＬ）において発現される。インビトロ及びインビボの実験により、Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦは骨髄単核細胞及び脾臓由来祖先細胞のコロニー形成の促進、白血球細胞群の増加、及びＢリンパ球及びＴリンパ球の活性促進をすることができる。したがって、Ｂｖ８の核酸及びポリペプチド、ＥＧ−ＶＥＧＦの核酸及びポリペプチド、又はそれらの混合は多くのアッセイに、並びに造血、好中球減少症、免疫不全性疾患、及び自己免疫疾患関連の症状の診断及び治療に用いることができる。
現在のところＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦのレセプターは骨髄造血幹細胞（ＣＤ３４＋）及び系統関連の祖先細胞（ＣＤ３４＋）にみられる。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦはＣＤ３４＋骨髄性及びリンパ球性祖先細胞の増殖を誘導する。この増殖によりＢ細胞、Ｔ細胞、特に好中球を含む白血球細胞数が増加する。Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及びそれらのアゴニストは、例としてリンパ球減少症、好中球減少症等の免疫不全性疾患治療の際に治療的有用性がある。また、これらの分子は、化学療法により引き起こされるような骨髄抑制後に造血の回復を促進するのに有用である。
多種の白血病細胞、例としてＡＬＬ、ＡＭＬ、ＭＰＤ、ＣＭＬ、及びＭＤＳ細胞もまた、Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦのレセプターを発現していることが現在明らかとなっている。成長因子ＥＧ−ＶＥＧＦ及び／又はＢｖ８のアンタゴニストはこれら白血病細胞の増殖阻害に有用である。
また、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦは驚くべきことにＢ及びＴ活性を誘導することが明らかである。これら分子のアゴニスト及びアンタゴニストは免疫応答を制御するのに有用である。Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及びそれらのアゴニストは、免疫障害を持つ個体、例としてＨＩＶ患者のＴ細胞の増殖及び活性を誘導するのに有用である。これらの分子のアンタゴニストは自己免疫疾患関連などの免疫応答を阻害するのに治療的有用性を有する。
骨髄細胞の増殖
一側面では、本発明は骨髄細胞の増殖を誘導する方法を提供する。一実施態様では、本方法は細胞の増殖を誘導するのに有効な量のＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はこれらの混合にＢＭ細胞を接触させることを含んでなる。他の実施態様では、本方法はＢＭ細胞の増殖を誘導するのに有効な量のＢｖ８コード化ポリヌクレオチド配列、ＥＧ−ＶＥＧＦコード化ポリヌクレオチド配列、又はこれらの混合をＢＭ細胞中に導入することを含んでなる。
一実施態様では、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦは天然配列ポリペプチドである。好ましくは、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドは天然ヒトＢｖ８ポリペプチドである。天然ヒトＢｖ８ポリペプチドは配列番号：２又は配列番号：４のアミノ酸配列を含みうる。他の実施態様では、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドは配列番号：６のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、Ｂｖ８ポリペプチドはヘパリン結合可能である。好ましくは、天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドは天然ヒトＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドである。天然ヒトＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドは配列番号：８のアミノ酸配列を含みうる。他の実施態様では、天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦは配列番号：１０のアミノ酸配列を含む。更に他の実施態様ではＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦはイムノアドヘシンである。更なる実施態様ではＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦはキメラである。
一実施態様では、Ｂｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦはＢＭ造血幹細胞及び／又は系統関連の祖先細胞の増殖を促進する。系統関連の祖先細胞は一般的に骨髄性及び／又はリンパ球性系統のものである。
更なる側面では、本発明は必要とする患者において特定の血液細胞数を維持する方法を提供する。一実施態様では、この方法は前記細胞の増殖を促進するのに有効な量で細胞をＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合に接触させ、このことによってそれらの数を維持することを含んでなる。他の実施態様では、この方法は細胞の生存を亢進するのに有効な量のＢｖ８コード化ポリヌクレオチド配列、ＥＧ−ＶＥＧＦコード化ポリヌクレオチド配列、又はこれらの混合を細胞中に導入することを含んでなる。一側面では、特に必要とされる細胞種は、白血球、好ましくは好中球、Ｂリンパ球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、及び／又はＣＤ８＋Ｔリンパ球である。他の側面では、患者は好中球減少症、リンパ球減少症、又は免疫不全性疾患に罹っており、そのため好中球、Ｂリンパ球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、及び／又はＣＤ８＋Ｔリンパ球を必要とする。
異常造血の治療
更に一側面では、本発明は哺乳動物の異常造血関連症状を治療する方法を提供する。一実施態様では、好ましくは本方法は細胞の症状を治療するのに有効な量のＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はこれらの混合、又はこれらのアゴニストないしアンタゴニストを含む組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる。哺乳動物は好ましくはヒトである。
一側面では、本発明の何れかの方法に用いられるＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はこれらの混合を含む組成物は天然配列Ｂｖ８ポリペプチド及び／又は天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドを含んでなる。好ましくは、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドは天然ヒトＢｖ８ポリペプチドである。天然ヒトＢｖ８ポリペプチドは配列番号：２のアミノ酸配列又は配列番号：４のアミノ酸配列を含みうる。他の実施態様では、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドは配列番号：６のアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、Ｂｖ８ポリペプチドはヘパリンを結合する。好ましくは、天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドは天然ヒトＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドである。天然ヒトＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドは配列番号：８のアミノ酸配列を含みうる。他の実施態様では、天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦは配列番号：１０のアミノ酸配列を含む。
血液疾患の治療
また更なる側面では、本発明は哺乳動物、好ましくはヒトの血液疾患を治療する方法を提供する。一実施態様では、本方法は細胞の増殖を阻害するのに有効な量のＢｖ８アンタゴニスト、ＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニスト、又はこれらの混合を哺乳動物に投与することを含んでなる。一実施態様では、本発明の方法で治療可能な血液疾患は、多種の白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄形成不全性疾患、リンパ球増殖性疾患、及びリンパ球形成不全性疾患を含む。好ましくは、血液疾患は、球性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、真性赤血球増加症（ＰＶ）、血小板血症（ＥＴ）、及び骨髄性異形成症（骨髄線維症）等からなる群から選択したものである。
免疫疾患の治療
本発明の更なる側面では、Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合を投与することによって哺乳動物、好ましくはヒトの免疫不全性疾患を治療する方法を提供する。免疫不全性疾患罹患患者はＢ及びＴリンパ球を欠如しており、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球数の亢進が必要である。Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合を供給するとＢ及びＴ細胞数が増加する。免疫不全性疾患は一次的又は二次的でありうる。一実施態様では、二次的免疫不全性疾患はヒト免疫不全性ウイルス（ＨＩＶ）又は肝炎を含む感染性疾患が関連する症状である。他の実施態様では、免疫不全性疾患は、免疫抑制剤、例として制限するものではないが、５フルオロウラシル、ビンクリスチン、シスプラチン、オキソプラチン、メトトレキサート、3'-アジド-3'-デオキシチミジン、パクリタキセル、ドキセタキセル、アントラサイクリン抗生物質、又は二次的免疫抑制効果を有するそれらの混合を含めた治療剤の投与に関連した症状である。
本発明の更なる側面では、哺乳動物、好ましくはヒトの自己免疫疾患を治療する方法を提供する。Ｂｖ８アンタゴニスト、ＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニスト、又はそれらの混合は、活性化Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞数の減少が望まれる自己免疫疾患の治療に有用である。特定の実施態様は、自己免疫疾患に関連するＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶ型過敏性応答を治療するためにここで提供される組成物及び薬剤を用いることを含む。一実施態様では、本方法は、自己免疫疾患を抑制するのに有効な量のＢｖ８アンタゴニスト、ＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニスト、又はそれらの混合を哺乳動物に投与することを含んでなる。他の実施態様では、本方法は、ＣＤ４＋リンパ球及び／又はＣＤ８＋Ｔリンパ球の数を抑制するのに有効な量のＢｖ８アンタゴニスト、ＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニスト、又はそれらの混合を患者に投与することを含んでなる。
免疫応答の制御
本発明の更なる側面では、免疫応答を制御する方法を提供する。Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合、又はそれらのアゴニストはＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、及び／又はＣＤ８＋Ｔリンパ球を活性化させるために投与する。一実施態様では、Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合、又はそれらのアゴニストはＣＤ４＋Ｔリンパ球及び／又はＣＤ８＋Ｔリンパ球の増加を選択的に亢進する又は抑制するために投与することができる。
Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦはＣＤ４＋Ｔリンパ球及びＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるサイトカイン産生を誘導する。一実施態様では、ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＩＬ−２合成を誘導するＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、それらのアゴニスト、又はそれらの混合はＣＤ４＋リンパ球の増殖を誘導するために用いることができる。他の実施態様では、ＣＤ４＋Ｔリンパ球におけるＩＦＮ−γを誘導するＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、それらのアゴニスト、又はそれらの混合はＣＤ４＋Ｔリンパ球の増殖を抑制するために投与することができる。
アンタゴニスト
本発明に用いるＢｖ８アンタゴニスト及びＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストはＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ活性を遮断、阻害、又は最小限に抑える任意の組成物でありうる。これらのアンタゴニストは、抗−Ｂｖ８及び／又は抗−ＥＧ−ＶＥＧＦ抗体ないしそれらのフラグメント、シグナル伝達活性を誘発しないＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦレセプター、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦペプチドを隔離することのできる可溶性Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦレセプターに結合することができる切断型ペプチド、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦレセプター活性に対する干渉能を有する抗−Ｂｖ８及び／又は抗−ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター抗体ないし小分子を含む。一実施態様では、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦレセプターはＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-１及び／又はＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-２である。Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦはいずれも、詳細な説明でより詳しく記載するように、レセプター１及びレセプター２に結合する。
製造品
また更なる側面では、本発明は、容器と、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの使用に関する指示書を含んでなる製造品を提供する。一実施態様では、指示書は異常造血に関与する症状の治療のためのＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの使用に関する。他の実施態様では、指示書は免疫不全性疾患に関連する症状の治療のためのＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの使用に関する。他の側面では、本発明は、容器と、Ｂｖ８アンタゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストと、Ｂｖ８アンタゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストの使用に関する指示書を含んでなる製造品を提供する。一実施態様では、指示書は、血液疾患を治療するためのＢｖ８アンタゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストの使用に関する。他の実施態様では、指示書は、免疫不全性疾患の治療のためのＢｖ８アンタゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストの使用に関する。他の実施態様では、指示書は、自己免疫疾患の治療のためのＢｖ８アンタゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストの使用に関する。
アンタゴニストの同定方法
本発明の他の側面は、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦに候補化合物を接触させ、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的活性に対する化合物の影響を決定し、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的活性が阻害されるアンタゴニストを同定することによる、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストを同定する方法を提供する。一実施態様では、Ｂｖ８アンタゴニストは、内皮細胞の増殖を刺激するＢｖ８の能力の抑制をもって同定する。他の実施態様では、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストは、内皮細胞の生存を亢進するＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの能力の抑制をもって同定する。
（好適な実施態様の詳細な説明）
１．定義
特に他の定義をしない限り、ここで使用される技術的及び科学的用語は、この発明が属する分野の当業者が通常理解するところと同じ意味を持つ。例として、Singleton等, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology ２版, J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)；Sambrook等, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989 )を参照。本発明のために、次の用語を下記のように定義する。
「Ｂｖ８」及び「Ｂｖ８ポリペプチド」なる用語は、互いに交換可能に使用され、天然配列Ｂｖ８、Ｂｖ８変異体、及びキメラＢｖ８を意味し、そそれぞれをここで定義する。場合によっては、Ｂｖ８は天然のグリコシル化を伴わない。「天然のグリコシル化」とは、哺乳動物細胞、特に天然に産生された細胞において産生されるときにＢｖ８に共有結合的に結合している糖質部分を言う。したがって、非ヒト細胞において産生されたヒトＢｖ８は、「天然のグリコシル化を伴わない」であろうＢｖ８の例である。しばしば、Ｂｖ８は、例えば大腸菌のような原核生物において産生される場合のように、全くグリコシル化されていない場合がある。
Ｂｖ８核酸は上述したようなＢｖ８ポリペプチドをコードするＲＮＡ又はＤＮＡであるか、あるいはこのようなＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれに安定に結合したままであって約１０ヌクレオチド長より長い。ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０度において０．１５ＭのＮａＣｌ／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム(ＮａＤｏｄＳＯ４)を用いるもの、又は（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２度において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファーを７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に用いるものである。
ポリヌクレオチドは、他の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに作用可能に結合している。Ｂｖ８核酸は特定の宿主生物において発現されうるようにベクター中において他の核酸配列と作用可能に結合されうる。これは当該分野においてよく知られた方法によってなされうる。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるならば、コード化配列と作用可能に結合している。一般に、「作用可能に結合している」とは、結合しているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、常法に従って、合成のオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「天然配列Ｂｖ８」は、その調製態様にかかわらず、天然由来のＢｖ８と同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。しかして、天然配列Ｂｖ８は、天然に生じるヒトＢｖ８、マウスＢｖ８、あるいは他の哺乳動物種由来のＢｖ８のアミノ酸配列を有し得る。例えば、完全長天然配列ヒトＢｖ８アミノ酸配列は図２（配列番号：２）に示されている。第二の完全長天然配列ヒトＢｖ８は図４（配列番号：４）に示されている。これらの二つの配列は限界(canonical)ヘパリン結合ドメインをコードするエキソンの選択的スプライシングの結果である。よって、アミノ酸配列が図２（配列番号：２）に示されている天然配列ヒトＢｖ８はヘパリン結合ドメインを含む一方、図４（配列番号：４）に示された天然配列Ｂｖ８は含まない。天然配列マウスＢｖ８アミノ酸配列は図６（配列番号：６）に示される。ヒト及びマウスＢｖ８配列はまた例えばWechselberger等（FEBS Lett. 462:177-181 (1999)）及びLi等（Mol. Pharm. 59:692-698 (2001)）に開示されている。そのような天然配列Ｂｖ８は天然から単離することができるか又は組換え及び／又は合成手段によって生産することができる。「天然配列Ｂｖ８」なる用語は、Ｂｖ８の天然に生じるプレプロ、プロ及び成熟型及び切断型、天然に生じる変異体型（例えば選択的スプライシング型、例えば図４（配列番号：４）に示されるもの）、及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。好ましい天然配列Ｂｖ８は図２（配列番号：２）に示されるような完全長天然配列ヒトＢｖ８である。
「Ｂｖ８変異体」とは、天然配列中の一又は複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾及び／又は置換によって、ヒト及びマウスＢｖ８に対して図２、４及び６（配列番号：２、４及び６）に示されるもののように、天然配列Ｂｖ８ポリペプチドの配列とは異なるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なＢｖ８ポリペプチドである。Ｂｖ８変異体は一般には図２（配列番号：２）のヒトＢｖ８のような、天然配列Ｂｖ８と１００％より少ない配列同一性を有する。しかしながら、通常は、生物学的に活性なＢｖ８変異体は、図２（配列番号：２）のヒトＢｖ８のような天然に生じるＢｖ８のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、更により好ましくは少なくとも約８５％、更により好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有し、少なくとも約９５％から少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性まで１％の増加率で好適度が増大するアミノ酸配列を有する。Ｂｖ８変異体には、対応する天然配列Ｂｖ８ポリペプチドの生物学的活性を保持する少なくとも５のアミノ酸のペプチド断片が含まれる。Ｂｖ８変異体にはまた天然Ｂｖ８配列のＮ末端又はＣ末端に、あるいは配列の内部に一又は複数のアミノ酸残基が付加されたＢｖ８ポリペプチドが含まれる。Ｂｖ８変異体には、多くのアミノ酸残基が欠失され、場合によっては一又は複数のアミノ酸残基によって置換されたＢｖ８ポリペプチドが含まれる。また、Ｂｖ８変異体は例えば天然に生じるアミノ酸以外の部分との置換によって、又はアミノ酸を改変して非天然のアミノ酸をつくり出すことによって、共有結合的修飾をされていてもよい。Ｂｖ８変異体はヘパリン結合ドメインを含みうる。
ここで用いられるように、変換可能に用いられている「ＥＧ−ＶＥＧＦ」及び「ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド」なる用語は、天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ変異体、及びキメラＥＧ−ＶＥＧＦを意味し、そそれぞれをここで定義する。場合によっては、ＥＧ−ＶＥＧＦは天然のグリコシル化を伴わない。「天然のグリコシル化」とは、哺乳動物細胞、特に天然に産生された細胞において産生されるときにＥＧ−ＶＥＧＦに共有結合的に結合している糖質部分を言う。したがって、非ヒト細胞において産生されたヒトＥＧ−ＶＥＧＦは、「天然のグリコシル化を伴わない」であろうＥＧ−ＶＥＧＦの例である。しばしば、ＥＧ−ＶＥＧＦは、例えば大腸菌のような原核生物において産生される場合のように、全くグリコシル化されていない場合がある。
ＥＧ−ＶＥＧＦポリヌクレオチドは上述したようなＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドをコードするＲＮＡ又はＤＮＡであるか、あるいはこのようなＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズし、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でそれに安定に結合したままであって約１０ヌクレオチド長より長い。ストリンジェントな条件は、（１）洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０度において０．１５ＭのＮａＣｌ／０．０１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウム(ＮａＤｏｄＳＯ４)を用いるもの、又は（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２度において５０％（vol/vol）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファーを７５０ｍＭのＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと共に用いるものである。
ポリヌクレオチドは、他の核酸配列と機能的な関係に置かれたときに作用可能に結合している。ＥＧ−ＶＥＧＦポリヌクレオチドは特定の宿主生物において発現されうるようにベクター中において他の核酸配列と作用可能に結合されうる。これは当該分野においてよく知られた方法によってなされうる。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現されるならば、ポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード化配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を容易にするような位置にあるならば、コード化配列と作用可能に結合している。一般に、「作用可能に結合している」とは、結合しているＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合には、常法に従って、合成のオリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
「天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦ」は、その調製態様にかかわらず、天然由来のＥＧ−ＶＥＧＦと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。しかして、天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦは、天然に生じるヒトＥＧ−ＶＥＧＦ、マウスＥＧ−ＶＥＧＦ、あるいは他の哺乳動物種由来のＥＧ−ＶＥＧＦのアミノ酸配列を有し得る。ある実施態様では、完全長天然配列ヒトＥＧ−ＶＥＧＦアミノ酸配列は配列番号：８のアミノ酸配列を含む。ある実施態様では、天然配列マウスＥＧ−ＶＥＧＦは配列番号：１０のアミノ酸配列を含む。また、ヒト及びマウスＥＧ−ＶＥＧＦ配列は、例としてLeCouter等, 2001, Nature, 412:877-884に開示される。
そのような天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦは天然から単離することができるか又は組換え及び／又は合成手段によって生産することができる。「天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦ」なる用語は、ＥＧ−ＶＥＧＦの天然に生じるプレプロ、プロ及び成熟型及び切断型、天然に生じる変異体型（例えば選択的スプライシング型）、及び天然に生じる対立遺伝子変異体を特に包含する。好ましい天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦは配列番号：８に示されるような完全長天然配列ヒトＥＧ−ＶＥＧＦである。
「ＥＧ−ＶＥＧＦ変異体」とは、天然配列中の一又は複数のアミノ酸残基の挿入、欠失、修飾及び／又は置換によって、ヒト及びマウスＥＧ−ＶＥＧＦ（配列番号：８及び１０）に対して、天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの配列とは異なるアミノ酸配列を有する生物学的に活性なＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドである。ＥＧ−ＶＥＧＦ変異体は一般には天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦと１００％より少ない配列同一性を有する。しかしながら、通常は、生物学的に活性なＥＧ−ＶＥＧＦ変異体は、天然に生じるＥＧ−ＶＥＧＦのアミノ酸配列と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、更により好ましくは少なくとも約８５％、更により好ましくは少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有し、少なくとも約９５％から少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性まで１％の増加率で好適度が増大するアミノ酸配列を有する。ＥＧ−ＶＥＧＦ変異体には、対応する天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの生物学的活性を保持する少なくとも５のアミノ酸のペプチド断片が含まれる。ＥＧ−ＶＥＧＦ変異体にはまた天然ＥＧ−ＶＥＧＦ配列のＮ末端又はＣ末端に、あるいは配列の内部に一又は複数のアミノ酸残基が付加されたＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドが含まれる。ＥＧ−ＶＥＧＦ変異体には、多くのアミノ酸残基が欠失され、場合によっては一又は複数のアミノ酸残基によって置換されたＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドが含まれる。また、ＥＧ−ＶＥＧＦ変異体は例えば天然に生じるアミノ酸以外の部分との置換によって、又はアミノ酸を改変して非天然のアミノ酸をつくり出すことによって、共有結合的修飾をされていてもよい。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列に関する「パーセントアミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ最大のパーセント配列同一性を達成するために必要に応じて間隙を導入し、配列同一性の一部として如何なる保存的な置換も考慮しない状態での、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列中の残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとしてここに定義される。候補Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列に対するＮ末端、Ｃ末端、もしくは内部の伸長、欠失、又は挿入は何れも、配列の同一性あるいは相同性に影響を与えるとはみなされないであろう。配列比較のための方法とコンピュータプログラムは当該分野においてよく知られている。一つのそのようなコンピュータプログラムは、ジェネンテク社によって著作され、米国著作権庁, Washington D.C., 20559にユーザー用書類と共に提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７として登録されている「ＡＬＩＧＮ−２」である。
「キメラＥＧ−ＶＥＧＦ」分子は、完全長ＥＧ−ＶＥＧＦを含むかその一又は複数のドメインが異種ポリペプチドに融合あるいは結合したポリペプチドである。キメラＥＧ−ＶＥＧＦ分子は、一般に、天然に生じるＥＧ−ＶＥＧＦと共通する少なくとも一つの生物学的性質を共有している。キメラＥＧ−ＶＥＧＦ分子の例は精製のためにエピトープタグを付加したものである。他のキメラＥＧ−ＶＥＧＦ分子はＥＧ−ＶＥＧＦイムノアドヘシンである。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦを含むキメラポリペプチドを意味する。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な残基を有しているが、その長さはＢｖ８の生物学的活性を阻害しないように充分に短いものである。タグポリペプチドは、好ましくは、該タグポリペプチドに対する抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり特異的である。好適なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８−５０のアミノ酸残基（好ましくは約９−３０の残基）を有する。好ましいものは、ニッケルに結合し、タグ付加タンパク質を、記載されているように（例としてLindsay等 Neuron 17:571-574 (1996)を参照）、Ｎｉ-ＮＴＡクロマトグラフィーで分離することを可能にするポリ-ヒスチジン配列である。
「単離された」とは、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ源から精製されたか、あるいは組換えもしくは合成法によって調製され、精製されたＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦを意味する。精製Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦは実質的に他のポリペプチド又はペプチドを含んでいない。ここで「実質的に含んでいない」とは、他の供給源タンパク質の汚染が約５％未満、好ましくは約２％未満、より好ましくは約１％未満、更により好ましくは約０．５％未満、最も好ましくは約０．１％未満であることを意味する。
「本質的に純粋な」タンパク質とは、組成物の全重量基準で少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％、より好ましくは少なくとも約９０重量％、更により好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含む組成物(composition：構成物)を意味する。「本質的に均質な」タンパク質とは、組成物の全重量に対して少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。
「アゴニスト」は、天然配列Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的活性の一又は複数を有する分子又は化合物である。これらには、限定されるものではないが、小有機分子、ペプチド、及びアゴニスト抗Ｂｖ８又は抗ＥＧ−ＶＥＧＦ抗体が含まれうる。
「アンタゴニスト」という用語は最も広義で使用され、天然Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの生物学的活性を部分的又は完全にブロックし、阻害し、もしくは中和するあらゆる分子を含む。好適なアンタゴニスト分子には特にアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドのフラグメント又はアミノ酸配列変異体、可溶性Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦレセプター又はそのフラグメント、ペプチド、小有機分子等々含まれる。Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法はＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドを候補アゴニストもしくはアンタゴニスト分子に接触させ、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドに通常伴う一又は複数の生物学的活性における検出可能な変化を測定することを含みうる。
ここでの目的において「活性な」又は「活性」とは、天然又は自然に生じるＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的及び／又は免疫学的活性を保持しているＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの形態を意味し、ここで「生物学的」活性とは、天然又は自然に生じるＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦによって引き起こされる（阻害性又は刺激性の）生物学的機能であって、天然又は自然に生じるＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦが有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は自然に生じるＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦが有する抗原性エピトープに対する抗体の生産を誘導する能力を意味する。
よって、「生物学的に活性」とは、これが「Ｂｖ８」、「単離されたＢｖ８」、Ｂｖ８のアゴニスト、「ＥＧ−ＶＥＧＦ」、「単離されたＥＧ−ＶＥＧＦ」、あるいはＥＧ−ＶＥＧＦのアゴニストと結合して用いられる場合、それぞれの天然配列Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのエフェクター機能を示し又は共有するＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドを意味する。Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの主要なエフェクター機能は、内皮細胞の増殖を刺激するその能力である。更により好ましくは、生物学的活性は、造血を制御する能力である。
「生物学的性質」は、これが「Ｂｖ８」あるいは「単離されたＢｖ８」あるいはＢｖ８の「アゴニスト」と結合して用いられる場合、（天然か変性されたコンフォメーションかにかかわらず）天然配列Ｂｖ８によって直接又は間接に引き起こされ又はなされるエフェクター又は抗原機能又は活性を有することを意味する。エフェクター機能には、内皮細胞の増殖、血管形成の誘導及び／又は造血の制御の向上が含まれる。
「生物学的性質」は、これが「ＥＧ−ＶＥＧＦ」あるいは「単離されたＥＧ−ＶＥＧＦ」あるいはＥＧ−ＶＥＧＦの「アゴニスト」と結合して用いられる場合、それぞれ（天然か変性されたコンフォメーションかにかかわらず）天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦによって直接又は間接に引き起こされ又はなされるエフェクター又は抗原機能又は活性を有することを意味する。エフェクター機能には、内皮細胞の増殖、血管形成の誘導及び／又は造血の制御の向上が含まれる。
「Ｂｖ８レセプター」はＢｖ８が結合し、Ｂｖ８の生物学的性質を媒介する分子である。また、Ｂｖ８レセプターが結合し、ＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的特性を媒介しうる。それ故に、「Ｂｖ８レセプター」なる用語は、Ｂｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-１及びＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-２を意味するものを含む(LeCouter等, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690；Lin等, 2002, J. Biol. Chem., 277:19276-19280；Masuda等, 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 293:396-402)。
「ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター」はＥＧ−ＶＥＧＦが結合し、ＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的性質を媒介する分子である。また、ＥＧ−ＶＥＧＦレセプターが結合し、Ｂｖ８の生物学的特性を媒介しうる。それ故に、「ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター」なる用語は、Ｂｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-１及びＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-２を意味するものを含む(LeCouter等, 2003 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690；Lin等, 2002, J. Biol. Chem., 277:19276-19280；Masuda等, 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun., 293:396-402)。
ここでの「抗体」という用語は最も広義で使用され、所望の生物学的活性を示す限りはヒト、非ヒト（例えばマウス）及びヒト化モノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片を特に包含する。
「抗体」(Ａｂ)と「免疫グロブリン」(Ｉｇ)は同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対して結合特異性を示すものであるが、免疫グロブリンには、抗体と抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えばリンパ系により低レベルで、骨髄腫により増加したレベルで産生される。
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変わる。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性と特異性に使用されていることを意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。それは、軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造、ある場合にはその一部を形成するように結合してループを形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲｓ（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲｓによって近接して互いに保持され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD. (1991), p647-669を参照のこと)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しているものではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞障害活性への抗体の関与を示す。
ここで使用される場合、「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９-９７(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)）及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk, J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含んでなる。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに定義した高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化するその能力を表す、残りの「Ｆｃ」断片が産生される。ペプシンでの処理により、２つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るＦ(ａｂ')２断片が得られる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。各可変ドメインの３つの高頻度可変領域が相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を形成するのはこの構造においてである。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性をもたらす。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低いが、抗原を認識して結合する能力を有している。
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に数個の残基が付加されている点でＦａｂ断片と相違する。ここで、Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'を表すものである。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、最初は、間にヒンジシステインを有しているＦａｂ'断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
任意の脊椎動物種由来の抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる二つの明確に異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に従って、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、それらの幾つかは更にサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３，ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分類される。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び３次元構造はよく知られている。
「抗体断片」は、完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に対している。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む通常の(ポリクローナル)抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との修飾詞は、実質的に均一な抗体集団から得られているという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature 256, 495 (1975)により記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、あるいは例えば組換えＤＮＡ法によって作製することができる(例えば、米国特許第４８１６５６７号参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えばClackson等, Nature 352:624-628(1991)、及びMarks等, J. Mol. Biol. 222:581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号; Morrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855(1984))。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型とは非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体はレシピエントの高頻度可変領域残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体に又はドナー抗体に見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の性能を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全ての高頻度可変領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの、可変ドメインの実質的に全てを含む。例としてCarter等, 米国特許第6,054,297号に記載のように、ＦＲは選択的にコンセンサス又は修飾したコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、場合によっては、免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものをまた含む。更なる詳細について、Jones等, Nature 321, 522-525(1986)；Reichmann等, Nature 332, 323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にするようにポリペプチドリンカーをＶＨ及びＶＬドメイン間に更に含む。ｓＦｖの概説については、Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol.113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp.269-315 (1994)を参照のこと。
「ダイアボディ(diabodies)」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を意味し、その断片は同じポリペプチド鎖（ＶＨ-ＶＬ）内で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して、二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)に更に十分に記載されている。
「線形抗体」という表現は、この出願において使用される場合、Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を意味する。簡単に言えば、これらの抗体は抗原結合領域の対を形成する直列のＦｄセグメント（ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１）を含む。直鎖状抗体は二重特異的でも単一特異的でもよい。
「エピトープ」という用語は、タンパク質抗原上の（モノクローナル又はポリクローナル）抗体との結合部位を指すために使用される。
「アゴニスト抗体」とは、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦアゴニストである抗体を意味し、よって天然配列Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的性質の一又は複数を有する。
「Ｂｖ８イムノアドヘシン」及び「ＥＧ−ＶＥＧＦイムノアドヘシン」なる用語は、「Ｂｖ８免疫グロブリンキメラ」及び「ＥＧ−ＶＥＧＦ免疫グロブリンキメラ」なる用語と交換可能に用いられ、それぞれＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ分子（天然又は変異体）の少なくとも一部を免疫グロブリン配列と組合わせるキメラ分子を意味する。免疫グロブリン配列は、好ましくは免疫グロブリン定常ドメインであるが、必ずしもそうでなければならないものではない。イムノアドヘシンはヒト抗体の多くの貴重な化学的及び生物学的性質を有しうる。イムノアドヘシンは適切なヒト免疫グロブリンヒンジ及び定常ドメイン（Ｆｃ）配列に結合した所望の特異性を有するヒトタンパク質配列から構築することができるので、対象の結合特異性は完全にヒトの成分を使用して達成することができる。かかるイムノアドヘシンは患者には最小に免疫原性であり、慢性的な又は繰り返しの使用に対して安全である。
治療用途として記載されているホモ多量体イムノアドヘシンの例には、ＨＩＶの細胞表面ＣＤ４への結合を阻止するＣＤ４-ＩｇＧイムノアドヘシンが含まれる。ＣＤ４-ＩｇＧを妊娠中の女性に分娩直前に投与したPhase Iの臨床治験から得られたデータは、このイムノアドヘシンがＨＩＶの母子移行の防止において有用であることを示唆している（Ashkenazi等, Intern. Rev. Immunol. 10: 219-227 (1993)）。また、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合するイムノアドへシンも開発されている。ＴＮＦは、敗血性ショックの主要なメディエータであることが分かっている炎症誘発性サイトカインである。敗血性ショックのマウスモデルに基づいて、ＴＮＦレセプターイムノアドヘシンは、敗血性ショックの治療において臨床的に用いるための候補として有望であることが示されている（Ashkenazi, A.等 (1991) PNAS USA 88:10535-10539）。ＩｇＧ Ｆｃ領域に融合したＴＮＦレセプター配列を含んでなるイムノアドヘシンであるＥＮＢＲＥＬ(登録商標)(エタネルセプト)は、慢性関節リウマチの治療に対して１９９８年１１月２日に米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認された。慢性関節リウマチの治療におけるＥＮＢＲＥＬ(登録商標)の新しく拡大した用途が２０００年６月６日にＦＤＡによって承認された。ＥＮＢＲＥＬ(登録商標)を含む、ＴＮＦ阻害薬に関する最近の情報については、Lovell等, N. Engl. J. Med. 342: 763-169 (2000)、及び８１０−８１１頁の添付の論説；及びWeinblatt等, N. Engl. J. Med. 340: 253-259 (1999)；Maini及びTaylor, Annu. Rev. Med. 51: 207-229 (2000)の概説を参照のこと。
イムノアドヘシン構造の二つの腕が異なる特異性を持つ場合、このイムノアドヘシンは二重特異的抗体に倣って「二重特異的イムノアドヘシン」と呼ばれる。Dietsch等, J. Immunol. Methods 162:123 (1993)は、アドヘシン分子の細胞外ドメイン、Ｅ-セレクチン及びＰ-セレクチンを組み合わせた、このような二重特異的イムノアドヘシンを記載しており、そのセレクチンの各々は天然では異なる細胞型中で発現される。結合実験により、そのように形成された二重特異的免疫グロブリン融合タンパク質が、それ由来の単一特異的イムノアドヘシンと比較して骨髄細胞株に結合する向上した能力を有していることが示された。
「ヘテロアドヘシン」なる用語は「キメラヘテロ多量体アドヘシン」なる表現と交換可能に使用され、各キメラ分子がヘテロ多量体レセプターモノマーの各々の細胞外ドメインのような生物学的に活性な部分を多量体化ドメインと組み合わせているキメラ分子（アミノ酸配列）の複合体を意味する。「多量体化ドメイン」はヘテロ多量体複合体内のキメラ分子の安定な相互作用を促進する。多量体化ドメインは、免疫グロブリン配列、ロイシンジッパー、疎水性領域、親水性領域、又はキメラヘテロ多量体のキメラ分子間に細胞間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを介して作用しうる。多量体化ドメインは免疫グロブリン定常領域を含みうる。加えて、多量体化領域は、立体的相互作用が安定な相互作用を促進するばかりでなく、モノマー混合物からホモ二量体よりもヘテロ二量体の生成を更に促進するように、操作されうる。「隆起(protuberances)」は、第一のポリペプチドの接合点からの小アミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えばチロシン又はトリプトファン）と置き換えることにより構築される。隆起に対する同一又は類似のサイズの代償的「空洞(cavities)」は、場合によっては、大きなアミノ酸側鎖をより小さなもの（例えばアラニン又はスレオニン）と置き換えることにより第二のポリペプチドの接合点上につくり出される。免疫グロブリン部分は、必ずではないが好ましくは、免疫グロブリン定常ドメインである。本発明のキメラの免疫グロブリン部分はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得ることができるが、好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ３から得ることができる。
ここで使用される場合、「治療」とは、有益な又は所望される臨床結果を得るためのアプローチ法である。この発明の目的において、有益な又は所望される臨床結果には、限定されるものではないが、検出可能か検出不可能かにかかわらず、症状の緩和、疾病範囲の減少、疾病の安定した（つまり、悪くならない）状態、病気進行の遅延又は減速、疾病状態の回復又は緩和、及び沈静化（部分的又は全体的にかかわらず）が含まれる。「治療」はまた治療を受けない場合に予測される生存性に比較した延命を意味し得る。「治療」は、疾患の病状の進行又は変化を防止する意図で実施される介入である。従って、「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を意味する。治療が必要な者には、既に疾患を有する者並びに疾患が防止されるべき者が含まれる。すなわち、治療は、細胞変性又は損傷の病理状態、例えば癌治療における腫瘍細胞の病理状態を直接的に防止し、遅延させ又は減少等させうるか、あるいは他の療法剤による治療に細胞をより感受性にしうる。
「慢性」投与とは、急性態様とは異なり、初期の治療効果（活性）を長時間にわたって維持するようにする、連続的な態様での薬剤の投与を意味する。「間欠」投与とは、中断なく連続的になされるのではなく、むしろ周期的になされる性質の治療である。
治療目的たる「哺乳動物」は、ヒト、他の高等霊長類、家庭及び酪農用動物、及び動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等々を含む哺乳類に分類されるあらゆる動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。
「癌」及び「癌性」なる用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、限定するものではないが、癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれる。そのような癌のより特定の例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、肺非小細胞癌、肺の腺癌、肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣がん、肝癌、膀胱ガン、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝性癌及び様々な頭部及び頸部癌が含まれる。
「血液疾患」は血液細胞の形成異常変化及び血液悪性腫瘍を引き起こす血液細胞の異常な増殖及び分化に特徴がある疾患を指す。多くの血液疾患は白血病、骨髄増殖性疾患（MPD）、骨髄形成異常性疾患、リンパ増殖性疾患及びリンパ球形成異常性疾患として分類できる。これら多くの疾患は子供だけでなく大人にも起こりうる。血液疾患の例には、限定するものではないが、急性脊髄性白血病（AML）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ALL）、多発性骨髄腫、Ｔ細胞リンパ腫、リンパ形成異常白血病、赤血球増加症（PV）、本態性血小板血症（ET）及び骨髄胃形成（骨髄線維症）が含まれる。
「好中球減少症」なる用語は、循環系好中球数の異常低下又は減少に特徴づけられる疾患又は症状を指す。好中球減少症は、疾患、遺伝的疾患、薬、毒素、放射線及び多くの治療的な処置、例として高用量化学療法及び従来の腫瘍学治療の結果でありうる。好中球減少症に関連した疾患又は症状の例には、限定するものではないが、血液疾患、結核、腸チフス、肝炎、敗血症、急性細菌性疾患、重症マイコバクテリウム又は菌類の疾患、及び単核細胞増加症を含む伝染病、放射線、免疫抑制薬及び副腎皮質ホルモンを含む骨髄障害性及び免疫抑制剤の投与、細胞障害性化学療法又は放射線療法、白血病、骨髄腫、ホジキン病及びリンパ腫を含む浸潤性及び血液疾患、無顆粒球症及び無形成性貧血、組織サイトーシス及び類肉腫症、熱傷、脾臓摘出及び麻酔を含む手術及び外傷、アルコール性肝硬変、老化、抗痙攣剤、尿毒症、糖尿病、ビタミン及びミネラル欠乏症、及び栄養失調が含まれる。血中に循環している好中球数が少ないため実質的に任意の侵入微生物に闘う患者の能力を障害するので、好中球減少症罹患患者は感染及び疾患の実質的リスクがある。
「免疫不全性疾患」なる用語は、免疫応答の減少又は欠損で特徴づけられる疾患又は症状を指す。Ｂ細胞、Ｔ細胞、食細胞、又は捕捉物は不完全でありうる。免疫不全性疾患は一次的又は二次的でありうる。リンパ球減少症、好中球減少症、単球減少症及び顆粒球減少症を含む白血球減少症は一次的にも二次的にも免疫不全性疾患に関連している。一次的免疫不全性疾患の例には、限定するものではないが、高-IgMを有する免疫グロブリン欠乏（Ig）及び無ガンマグロブリン血症を含むＢ細胞欠損症、ディジョージ症候群、慢性皮膚粘膜カンジダ症、Igを有する複合免疫不全症、、ヌクレオシドホスホリラーゼ、及び原因不明のＣＤ４リンパ球減少症を含むＴ細胞欠乏、重症複合免疫不全症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、及びＸ染色体連鎖リンパ球増殖性症候群を含む複合T及びＢ細胞欠損が含まれる。二次的免疫不全性疾患の例には、限定するものではないが、ヒト後天性免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎、インフルエンザ、結核、腸チフス、敗血症、サイトメガロウイルス、急性細菌性疾患、重症マイコバクテリウム又は菌類の疾患、先天性風疹、伝染性単核症、及びウィルス性発疹を含む感染性疾患関連症状、放射線、免疫抑制薬及び副腎皮質ホルモンを含む骨髄障害性及び免疫抑制剤の投与、細胞障害性化学療法又は放射線療法、白血病、骨髄腫、ホジキン病及びリンパ腫を含む浸潤性及び血液疾患、無顆粒球症及び無形成性貧血、組織サイトーシス及び類肉腫症、熱傷、脾臓摘出及び麻酔を含む手術及び外傷、アルコール性肝硬変、老化、抗痙攣剤、移植片対宿主病、尿毒症、糖尿病、ビタミン及びミネラル欠乏症、及び栄養失調が含まれる。
「自己免疫疾患」なる用語は、特定の自己抗原に対する持続性適応免疫応答が媒介する疾患を指す。自己免疫疾患は、疾患関連過敏性応答のクラスによって分類できる。Ｉ〜ＩＩＩ型は抗体媒介性である。Ｉ型応答は肥満細胞活性化を誘導するＩｇＥ媒介性である。ＩＩ及びＩＩＩ型は補体媒介性又は食作用機構の何れかを活性化するＩｇＧ媒介性である。ＩＩ型応答は組織障害を引き起こす細胞表面又は細胞質関連抗原に対するものである。ＩＩＩ型応答は可溶性抗原に対するもので、組織障害は免疫複合体に誘発された下流の応答に起因する。ＩＶ型応答はＴリンパ球媒介性であり、２つのクラスに分類される。１つめのクラスは、組織障害が主にマクロファージ媒介性炎症性Ｔ細胞（ＴＨ１細胞）に起因する。２つめのクラスは、組織障害が直接的に細胞障害性Ｔ細胞に起因する。自己免疫疾患の例には、限定するものではないが、移植片対宿主病、クローン病及び大腸炎を含む炎症性腸疾患、ギラン-バレ症候群、狼瘡、多発性硬化症、重症筋無力症、視覚神経炎、乾癬、慢性関節リウマチ、グラーブ病、自己免疫性肝炎、Ｉ型糖尿病、無形成性貧血、間質性膀胱炎、硬皮症、外陰の潰瘍と疼痛、神経ミオトニ、及び白斑が含まれる。
疾患の「病理状態」には、患者の健康を損なうあらゆる現象が含まれる。癌の場合には、これに限定されるものではないが、異常又は制御不能な細胞成長、転移、隣接細胞の正常機能の阻害、サイトカイン又は他の分泌産物の異常なレベルでの放出、炎症又は免疫反応の抑制又は悪化等々が含まれる。
一又は複数の更なる治療薬「と組み合わせて」の投与は、同時（一時）及び任意の順序での連続投与を含む。
ここで用いられる「担体」には、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤が含まれ、用いられる用量及び濃度でそれらに曝露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例には、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭが含まれる。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小胞体であり、哺乳動物への薬物（Ｂｖ８ポリペプチド又はその抗体、ＥＧ−ＶＥＧＦポリヌクレオチド又はその抗体、又はそれらの混合など）の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質構造に類似する二層形成体として配される。
「小分子」とは、ここで、約５００ダルトン未満の分子量を持つものと定義される。
ここで用いられる「血管内皮成長因子」、「ＶＥＧＦ」、「ＶＥＧＦポリペプチド」及び「ＶＥＧＦタンパク質」という用語は、天然配列ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ変異体（ここでさらに定義される）を包含する。ＶＥＧＦポリペプチドは、種々の供給源、例えばヒト組織型又はその他の供給源から単離されるか、又は組み換え及び／又は合成方法によって調製される。
「天然配列ＶＥＧＦ」には、天然に由来するＶＥＧＦと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。そのような天然配列ＶＥＧＦは自然界から単離することができるか、又は組換え及び／又は合成法によって生産される。「天然配列ＶＥＧＦ」という用語には、特にＶＥＧＦの天然に生じる切断型又は分泌型（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然に生じる変異型（例えば、選択的スプライシング型）及び天然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の一実施態様では、天然配列ＶＥＧＦは、例えば、米国特許第５３３２６７１号及び第５２４０８４８号；ＰＣＴ公報国際公開第９８／１００７１号；Leung等, Science 246: 1306-1309(1989)；及びKeck等, Science 246: 1309-1312(1989)に記載の、それぞれ１２１、１４５、１６５、１８９、２０６のアミノ酸残基からなる５つの既知のアイソフォームの一つである。
「ＶＥＧＦ変異体ポリペプチド」とは、天然配列ＶＥＧＦのアミノ酸配列と少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、更により好ましくは少なくとも約９５％、最も好ましくは少なくとも約９８％のアミノ酸配列同一性を有する、以下に定義したような活性ＶＥＧＦポリペプチドを意味する。このようなＶＥＧＦ変異体ポリペプチドには、例えば、天然配列の、Ｎ末端及び／又はＣ末端において、並びに一又は複数の内部ドメイン内において、一又は複数のアミノ酸残基が付加され、又は欠失されているＶＥＧＦポリペプチドが含まれる。本発明の一実施態様では、ＶＥＧＦは、例えば、ＰＣＴ公報国際公開第９７／０８３１３号及び同第００／６３３８０号及び米国特許第６０２０４７３号に記載の、天然ＶＥＧＦのレセプター特異的変異体である。
ＶＥＧＦに関する配列同一性（アミノ酸又は核酸の何れか）は、特にＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦに関して記載されているのと同じ手法を用いて決定される。同様に、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのアゴニスト及びアンタゴニストのための定義は、限定されるものではないが抗体を含み、ＶＥＧＦアゴニスト及びアンタゴニストへ適用する。
２．本発明を実施するための方法
本発明は造血幹細胞（ＨＳＣ）、系統に関連した血液祖先細胞、及びリンパ球におけるＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦの新たな発現及び活性の同定に基づく。特にここで詳述するように、Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及びそれらのレセプターは多くの血液学的悪性細胞系だけでなく骨髄ＨＳＣ、末梢血白血球（ＰＢＬ）において発現される。インビトロ及びインビボの実験により、Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦは骨髄単核細胞及び脾臓由来関連単核細胞祖先細胞のコロニー形成の促進、白血球細胞群の増加、及びＢリンパ球及びＴリンパ球の活性促進をすることができる。したがって、Ｂｖ８の核酸及びポリペプチド、ＥＧ−ＶＥＧＦの核酸及びポリペプチド、又はそれらの混合は多くのアッセイに、並びに造血、好中球減少症、免疫不全性疾患、及び自己免疫疾患関連の症状の診断及び治療に用いることができる。
Ａ．造血
造血は増殖及び分化プロセスを指し、血球の異なるタイプは増殖及び分化する能力を有する多分化能の幹細胞から発達する。血液中の大部分の血液細胞は短命であり、ゆえに生きている間常に交換されることが必要である。循環の成熟した血液細胞のレベルは、失血、感染症などにわたって異なる環境ストレスに応答して、急速に変化することができる。ヒトの造血の主な部位は、胎生約20週齢以降、骨髄（BM）、軟骨吸収細胞及び骨芽細胞を含む骨ホメオスタシスに関係する細胞だけでなく、造血幹細胞（HSC）、内皮細胞（ＥＣ）及び他の間質細胞を含む不均一な細胞集団からなる組織である。Gerber及びFerrara, 2003, J. Mol. Med., 81:20-31。
正常な造血は、多分化能の幹細胞の二重機能に基づく。広範囲な自己複製は未分化幹細胞数を維持するのに対して、分化は3つの主要血液細胞系統のうちの1つに分類される様々なタイプの成熟した血液細胞の形成に結果としてなる：リンパ系、骨髄性及び、赤血球細胞系統。リンパ系はＢ細胞及びＴ細胞からなり、それは抗体生産及び抗原検出において集合的に機能し、それによって、細胞性及び体液性免疫系として機能する。骨髄系統は、単球（マクロファージ）、顆粒球（好中球を含む）及び巨大核細胞から成っており、血流の抗原をモニタして、血流から抗原を除去し、感染性作用物質を撃退し、血液凝固に関係している血小板を生産する。赤血球血統は、体全体にわたって酸素を運搬する赤血球から成る。
造血幹細胞は、好中球、赤血球、血小板等になるように運命づけられた関連祖先細胞と同様に、これらの幹/祖先細胞の表面上に存在する特定の原始「マーカ」抗原の存在により大部分の他の細胞を区別することができる。この特定のマーカ抗原を認識することができる一群の抗体は「分化34のクラスター」または「CD34」と呼ばれる。名称「CD34+」は、抗体のCD34群によって認識される特定の細胞表面抗原を有するものとして細胞を記述するために用いる。それから、幹細胞はCD34+である。しかしながら、CD34+である大多数の骨髄細胞は、Bリンパ球祖先細胞及び骨髄祖先細胞である。
１．造血因子
初期及び分化した造血細胞の発達は、さまざまな非造血器官（例えば肝臓、腎臓）及び正常なＴリンパ球と同様にBM微小環境内の周辺の細胞によって分泌される多くの造血成長因子、サイトカイン及びケモカインによって調整される。これら全ての因子は、一緒にBMに存在する造血細胞の生物学的機能及び運命を制御する。Janowska-Wieczorek等., 2001, Stem Cells, 19:99-107。
少なくとも4つのコロニー刺激因子（CSF）が、好中球産生の調節において協働することは公知である。GM-CSF（顆粒球及びマクロファージ）、IL-3（インターロイキン３）、G-CSF（顆粒球）及びCSF-1としても公知であるM-CSF（マクロファージ）と称される4つの因子は、マクロファージ、Ｔ細胞、内皮細胞及び他のタイプの細胞によって合成される。CSFに反応する潜在的祖先細胞は、一つには、その特定のCSFのための細胞表面上のレセプタの存在により、また、一つには、特定のCSFの濃度によって決定される。また、アクセサリー細胞を介してまたは他の必須の成長因子、例えばc-kitリガンド、IL-6（インターロイキン６）、IL-11（インターロイキン11）、IL-4（インターロイキン４）及びIL-1（インターロイキン１）との相乗作用の何れによっても、間接的な刺激に対して若干の徴候がある。
２．好中球
ヒト免疫系の主要な感染症及び疾患と戦う細胞は、骨髄系統に由来し、血液系を循環する白血球細胞（白血球）である。白血球の多くのタイプの中の好中球（異形核及び高度に顆粒化された細胞質を含む顆粒細胞のサブタイプ）は、最も共通した細胞型であり、ヒトの全白血球細胞数の約3分の2を占める。好中球は、可動性で、感染の際に発生する走化性刺激に応答性で、侵入している微生物を殺すために感染した組織へ移動することができる。微生物を包み込んで、活性酸素及び殺菌性酵素を放出する好中球の能力により殺傷が起こる。Baggiolini, 1984, Experientia, 40:906-909。
好中球は一連の中間の前駆細胞を経て幹細胞から分化するものであり、それらの核のサイズ、それらの核の形状、細胞サイズ、核/細胞質の比率、顆粒の存在/欠如、及び染色特徴といった特徴を含む顕微鏡的な形態的外観によって分類することができる。まず最初に、インビトロで直接測定されることができない多分化能の幹細胞は、全ての骨髄細胞系の前駆体を生成する骨髄「祖先細胞」を誘導する。第1の骨髄プロジェニターはCFU-GEMMと呼称される「コロニー形成単位−顆粒球、赤血球、マクロファージ及び巨大核細胞」である。CFU-GEMMプロジェニターは、次に、「コロニー形成単位 ― 顆粒球及びマクロファージ ― 」として別に公知であるCFU-GM祖先細胞を誘導するであろう。これらの記述用語の全てにおいて、「コロニー」は、本願明細書の実施例5に記載の状況の下で、１４日間インビトロクローン成長アッセイで測定されるように、50以上の細胞を生じることができる細胞を指す。これらの細胞は、少なくとも6回分裂する。
CFU-GMはプロジェニターである;それは顆粒球及びマクロファージにしか分化しない。それは他の細胞型への分化も初期祖先細胞への分化もすることができない。それからCFU-GM祖先細胞は骨髄芽細胞へ分化しうる。CFU-GEMMから骨髄芽細胞への分化のために要する時間は、約1〜4日であると考えられている。骨髄芽細胞は、一旦完全に発達（分化）しうると、そのような細胞のように好中球の「前駆体」と称される一連の細胞の初めとなり、好中球しか形成しない。好中球は６回より少ない細胞分裂しか行えないため、前述のインビトロコロニーアッセイでのコロニーを形成できない。
分化が骨髄芽細胞段階へ進行すると、骨髄芽細胞は、約４〜６日で次々と骨髄球に分化する前骨髄細胞へと最終的に分化する。さらに5日ほど以内で、骨髄球は、次々と群をなした好中球に分化する後骨髄球に分化する。これらの群をなした好中球は最終的に約０．３〜２日の半減期を有する成熟した、分節化した好中球に分化する。「プロジェニター（祖先）」なる用語は、幹細胞及びコロニーを形成することができる細胞を指すために用いる。「前駆」は骨髄芽細胞、前骨髄球及び骨髄球、場合によっては後骨髄球及び群をなした好中球を指すために用いられる。
この段階的形態学的な分化の間、前駆細胞の表面上の抗原に変化がみられる。例えば、幹細胞、CFU-GEMM及びCFU-GMは、CD34+である。CFU-GM段階を越えて分化する造血細胞は、もはやCD34+でない。発現の類似した経過は、細胞表面抗原CD33及びCD45RAについて観察される。前骨髄細胞前駆細胞に続く全ての好中球前駆細胞は、CD34-、CD33+、CD38+、CD13+、CD45RA-及びCD15+として特徴づけられることができる。より成熟した細胞も、CD11+及びCD16+として特徴づけられることができる (Terstappen等, 1990, Leukemia, 4:657)。しかしながら、細胞表面抗原発現のこのような変化が突然であるというよりはむしろ、段階的であると認識しなければならず、特定の前駆細胞型のある細胞は特定の細胞表面抗原に対して陽性であり、同じタイプの他の細胞は陰性でありうる。さらに、特定の細胞型が特定の細胞表面抗原に対して陽性であるか陰性であるかは、その決定をするために使用する特定の方法にある程度依存する。細胞表面抗原発現による細胞分化の特徴づけは、細胞形態学などの細胞分化を特徴づける他の方法によって確認することができる。
「好中球減少症」は、異常に低い数の循環血中好中球によって特徴づけられる症状である。実質的に血液を循環している好中球の数が減少すると侵入する任意の微生物と戦う患者の能力が弱まるので、好中球減少症罹患患者は感染症及び疾患のリスクがある。好中球減少症そのものは、多くの治療的処置、例として高用量化学療法（HDC）及び従来の腫瘍治療と同様に、疾患、遺伝的疾患、薬剤、毒素及び放射線の結果でありうる。例えば、多くの癌が極めて高用量の放射線または抗悪性腫瘍（抗癌）薬に感受性があるとわかっていても、そのような強いＨＤＣが癌細胞を殺すだけでなく、機能的免疫系を維持するのに必要な好中球の軍を生成する役割を果たす造血系細胞をも破壊するので、広く使われていない。好中球祖先及び前駆細胞の完全な破壊は成熟した好中球を生成する患者の短期能力を排除し、それによって、感染と戦う患者の能力をひどく損なう。また、患者は「免疫不全」となり、日和見感染に罹りやすくなる。このような症状は、最後に病的状態及び死に至るかもしれない。また、造血系に重症傷害があるといった他の状況に直面すると、結果として好中球及び前駆体の実質的低下になる。
３．血液疾患
血液疾患は、血液細胞及び血液学的な悪性腫瘍の形成異常変化に至る血液細胞の異常な増殖及び分化によって特徴づけられる。多くの血液疾患の発症は、一細胞型が影響力をもつクローン化の過程である。ある場合では、他の細胞型も異常に成長する。さらにまた、特定の疾患の異常な細胞は、未分化造血祖先、多分化能の幹細胞又は系統付けられた前駆細胞の何れかのクローンの誘導体を表す。Gerber及びFerrara, 2003, J. Mol. Med., 81:20-31；Raskind等, 1998, Leukemia, 12:108-116。多くの血液疾患は白血病、骨髄増殖性疾患（MPD）及び骨髄形成異常の疾患として分類されることができる。これらの疾患の多くは、子供だけでなく成人にも起こる。
急性骨髄白血病（AML）は、成人に起こる急性白血病で最も一般的なタイプである。いくつかの遺伝する遺伝的疾患及び免疫不全状態は、AMLのリスク増加と関係している。これらは、ランダムな染色体破損に至るＤＮＡ安定性の欠損を伴う疾患、例としてブルーム症候群、ファンコーニ貧血、Li-Fraumeni kindreds、毛細血管拡張性運動失調、及びＸ染色体連鎖の無ガンマグロブリン血症を含む。細胞アラビン（Ara-C）は、AMLを治療するために、単独で、又は、アントラサイクリン或いはダウノルビシンと組み合わせて使われていた。
急性リンパ性白血病（ALL）は、さまざまなサブタイプによって示される異なった臨床特徴を有する異質な疾患である。再発生の細胞遺伝学的異常が、ALLにおいて示された。最も一般的な細胞遺伝学的異常は、第９及び第２２染色体転座を伴う。結果として生じるフィラデルフィア染色体は、患者に悪い予後を表す。ビンクリスチン、アントラサイクリン及びプレドニゾンは、ALLを治療するために用いられている。
骨髄増殖性疾患（MPD）は、造血細胞の異常な増殖によって特徴づけられる。各々の特定のMPDにおいて、1つの特定の細胞型が影響力をもつが、いくつかまたは全ての他のBM細胞型が、より小さい範囲で異常に増殖しているという徴候もある。例えば、慢性骨髄性白血病（CML）は、多能な幹細胞のクローン化MPDである。CMLは、フィラデルフィア染色体を形成する第９及び第２２染色体の転座が関与する特異的染色体異常によって、血液中に多数の異常な成熟した顆粒球の循環がみられることに特徴づけられる。イオン化放射線はCMLの発症と関係している。水酸化尿素、インターフェロン（INF）及びAra-Cは、CML患者を治療するために用いられている。他の一般的なMPDには、これに限定されるものではないが、真性赤血球増加症（PV；赤血球の過剰増加）、重要な血小板血症（ET;血小板の過剰増加）及び骨髄異形成（別名骨髄線維症）が含まれる。
骨髄形成異常症候群（MDS）は、骨髄、赤血球及び巨核球系列を含む造血系統の一以上に形成異常変化がみられるため、一緒に分類される異質なクローンの造血幹細胞疾患である。これらの変化は、結果として3つの系統のうちの一以上に血球減少をもたらす。一般的にMDSに悩む患者は、貧血症、好中球減少症（感染症）又は血小板減少（出血）に関連した合併症を呈する。通常、約10%から約70%のMDS患者は、急性白血病を発症する。
Ｂ．Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦ
Bv8は、最初はキバラスズガエル（Bombina Variegata）の皮膚分泌物から単離した小さいタンパク質である(Mollay等, 1999, Eur. J. Pharmacol., 374:189-196)。Bv8は、消化酵素コリパーゼ、アフリカツメガエル頭部-オーガナイザー、Dickkopf (Glinka等, 1998, Nature, 391:357-362)、毒物プロテインＡ（VPRA）(Joubert及びStrydom, 1980, Hopper-Seyler's Z. Physiol. Chem., 361:1787-1794 )又はMIT-1 (Schweitz等 1999, FEBS Lett., 461:183-188 )の構造的に関連したクラス、ブラックマンバ(Dendroaspis polylepis polylepis)毒物の非毒性成分、及び最近同定された内分泌腺由来脈管内皮成長因子（EG-VEGF）(LeCouter等, Nature, 412:877-884 (2001)を含むペプチドの構造的関連クラスに帰属する。顕著な構造モチーフは、保存された範囲内に１０のシステイン残基が５つのジスルフィド架橋を形成しているコリパーゼ-ホールドである。EG-VEGF（VPRAと80%同一）及びVPRAは、Bv8ペプチドに最も密接に関連があり、それぞれ83%及び79%の同一性がある。プロキネチシン2とも称されるBv8のマウス及びヒトオルソログ(Li 等, 2001, Mol. Pharm., 59:692-698)が近年同定され、ニューロン生存、消化管平滑筋収縮、及び日内運動変動に対する効果を含むこれらのタンパク質の種々の活性が、報告された。Li等, 2001; Melchiorri等, 2001, Eur. J. Neurosci. 13:1694-1702 ; Cheng等, 2002, Nature 417:405-410。
EG-VEGF及びBv8は、特定の組織の内皮細胞に選択的な活性を有する血管形成因子として同定された。内皮細胞の多様な構造及び機能的な特性及び種々のインビボ及びエクスビボ系からの所見により、内皮細胞表現型及び成長の局所的、組織特異的調節因子の存在を示唆する。ヒト（h）EG-VEGF mRNAの発現は、主にステロイド産生腺に限定されていることがわかった：卵巣、精巣、副腎及び胎盤。EG-VEGFは、培養した副腎毛細血管の内皮細胞の増殖、移動、生存及び開窓を促進した。また、他の組織でなく卵巣に供給されるときに、広範囲な血管形成を誘発した。LeCouter等, 2001, Nature, 412:877-884。
Bv8は、精巣で大部分が発現されていることがわかり、主に一次精母細胞に限定されている(LeCouter等, 2003, PNAS 5:2685-2690)。EG-VEGFの様に、Bv8は、副腎皮質毛細血管の内皮細胞の増殖、生存及び移動を誘発することが可能である。Bv8遺伝子発現は、低酸素症ストレスによって誘発される。マウス精巣へのBv8又はEG-VEGFのアデノウイルス運搬により、強力な血管形成反応が起こる。さらに、Bv8/EG-VEGF（Bv8/EG-VEGFレセプタ-1及びBv8/EG-VEGFレセプタ-2）の2つのＧタンパク質結合レセプタの精巣内の発現は、脈管内皮細胞に局在していた(LeCouter等, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,100:2685-2690；Lin等, 2002, J. Biol. Chem. 277:19276-19280；Masuda 等, 2002, Biochem. Biophys. Res. Commun. 293:396-402)。精巣は、比較的高い内皮細胞の代謝回転を呈する。したがって、Bv8及びEG-VEGFは、VEGFのような他の因子とともに、精巣の完全な状態の維持及び血管の増殖を調整する際に重要であると考えられる。
Ｃ．Ｂｖ８変異体の同定
ここに記載した完全長天然配列Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドに加えて、Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦ変異体を同定し、調製し、本発明において使用することができると考えられる。Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦ変異体は、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦＤＮＡ中に適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び／又は所望のＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者であれば、例えばグリコシル化部位の数又は位置の変化のように、アミノ酸変化がＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの翻訳後過程を改変しうることを理解するであろう。Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦ変異体の生産方法は、好ましくは、以下に詳細に記載する天然配列Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦについてのものと同じであり、唯一の違いは天然配列をコードしているポリヌクレオチドを、変異体をコードしているポリヌクレオチドに置き換えることである。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードする核酸分子が本発明の方法において使用される。ヒトＢｖ８の二つの完全長変異体をコードしているｃＤＮＡは図１及び２（配列番号：１及び２）に提供し、対応する推定アミノ酸配列は図２及び４（配列番号：２及び４）に提供する。マウスＢｖ８をコードしているｃＤＮＡは図５（配列番号：５）に提供し、対応する推定アミノ酸配列は図６（配列番号：６）に提供する。二つの完全長天然ＥＧ−ＶＥＧＦをコードしているｃＤＮＡ（配列番号：７及び９）、及び対応する推定アミノ酸配列（配列番号：８及び１０）は本発明の方法に有用である。本発明において使用されるポリヌクレオチドは、例えばハイブリダイゼーションスクリーニング及びＰＣＲ法のような、当業者によく知られている標準的な方法を用いて得ることができる。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのアミノ酸配列をコードする任意のヌクレオチド配列を使用して、それぞれＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの発現を促す組換え分子を産生させることができる。また、本発明の方法はＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列と異種タンパク質の第二のコード化配列の融合ポリヌクレオチドを利用することもできる。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦｃＤＮＡ全体をコードしている任意の種からの完全長の相同ｃＤＮＡ配列をクローニングするために、あるいは対立遺伝子変異体のような変異体型又はファミリーメンバーをクローニングするために、ここで開示されたｃＤＮＡ配列の任意の部分に対応する断片から構築された標識ＤＮＡプローブを用いて、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦを発現すると思われる細胞又は組織型から誘導されたｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることができる。より詳細には、コード化配列の５'又は３'末端の何れかに対応するオリゴヌクレオチドを用いて、より長いヌクレオチド配列を得ることができる。
完全長ｃＤＮＡを得るには異なった組織の複数のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることが必要であろう。ｃＤＮＡクローニングにおいてよく遭遇する状況であるが、完全な５'末端コード領域をコードしているｃＤＮＡクローンを同定することが難しい場合には、ＲＡＣＥ（Rapid Amplification of cDNA Ends(ｃＤＮＡ末端の高速増幅)）法を使用することができる。ＲＡＣＥは不完全なｃＤＮＡの５'末端を増幅するための実績のあるＰＣＲベースの方策である。独特なアンカー配列を含むヒト胎盤から合成した５'-ＲＡＣＥ-Ｒｅａｄｙ ＲＮＡは市販されている（Clontech）。ｃＤＮＡの５'末端を得るために、提供されたアンカープライマーと３'プライマーを使用して５'-ＲＡＣＥ-Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡに対してＰＣＲを実施する。ついで、製造者の指示書に従って、アンカープライマーとネステッド３'プライマーを使用して二次のＰＣＲを実施する。ひとたび得られると、完全長ｃＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、翻訳開始及び終結部位に隣り合う連続のオープンリーディングフレーム、潜在的なシグナル配列のようなある種の目印及び最後にここに開示されたＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列への全体的な構造類似性を調べる。
あるいは、標識されたプローブを用い、後記されるような適切なストリンジェントな条件を使用して対象の任意の生物から得られたゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列又は相同配列の単離は、ここに開示されるＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列を元にして構築された二つの変性オリゴヌクレオチドプライマープールを使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施することができる。反応の鋳型は、例えばＢｖ８対立遺伝子又はＥＧ−ＶＥＧＦ対立遺伝子を発現することが知られているか又は発現すると思われるヒト又は非ヒト細胞株又は組織から調製されたｍＲＮＡの逆転写（ＲＴ）によって得られるｃＤＮＡでありうる。
ＰＣＲ増幅配列がＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列の配列を示すことを確認するためにＰＣＲ産物をサブクローニングし、配列を決定する。ついで、ＰＣＲ産物は様々な方法により完全長ｃＤＮＡクローンを単離するために使用することができる。例えば、増幅断片は標識され、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用されうる。あるいは、標識された断片はゲノムライブラリーのスクリーニングを介してゲノムクローンを単離するために使用することができる。
また、ＰＣＲ技術は完全長ｃＤＮＡ配列を単離するために用いることができる。例えば、ＲＮＡは適切な細胞又は組織源から標準的な方法に従って単離することができる。ＲＴ反応は、第一鎖合成のプライミングのための増幅断片のほぼ５'末端に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＲＮＡについて実施されうる。ついで、得られたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを、標準的な末端転移酵素反応を使用してグアニンを「尾部につけ(tailed)」、ＲＮＡアーゼＨでハイブリッドを消化し、ついで第二鎖の合成を、ポリＣプライマーを用いてプライミングすることができる。このようにして、増幅断片の上流のｃＤＮＡ配列を容易に単離することができる。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子の対立遺伝子変異体又は突然変異体のｃＤＮＡクローンを、例えばＰＣＲを用いて単離することができる。この場合、第一ｃＤＮＡ鎖は変異体Ｂｖ８対立遺伝子、変異体ＥＧ−ＶＥＧＦ対立遺伝子又はそれらの混合を有していると推定される個体中でＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ又はそれらの混合を発現することが知られているか発現すると思われる組織から単離したｍＲＮＡにオリゴ-ｄＴオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、逆転写酵素を用いて新しい鎖を伸長させることによって合成されうる。ついで、ｃＤＮＡの第二鎖は正常遺伝子の５'末端に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用して合成される。ついで、これらの二つのプライマーを使用して、産物をＰＣＲにより増幅し、適切なベクターにクローニングし、当業者によく知られている方法によってＤＮＡ配列分析を行う。突然変異Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ対立遺伝子のＤＮＡ配列を正常なＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ対立遺伝子のものと比較することによって、突然変異Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子産物の機能の喪失又は改変を生じる突然変異(群)を確実にすることができる。
あるいは、変異体Ｂｖ８対立遺伝子又は変異体ＥＧ−ＶＥＧＦ対立遺伝子を有するものと思われるか有することが知られている個体から得られたＤＮＡを使用してゲノムライブラリーを構築することができ、あるいは変異体Ｂｖ８対立遺伝子又は変異体ＥＧ−ＶＥＧＦ対立遺伝子を発現することが知られているか発現すると思われる組織からのＲＮＡを使用しｃＤＮＡライブラリーを構築することができる。ついで、機能を損なっていないＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子又はその任意の適切な変異体に標識を施し、そのようなライブラリーにおいて対応する変異体Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ対立遺伝子を同定するためにプローブとして使用できる。ついで、当業者によく知られた方法によって、変異体Ｂｖ８遺伝子配列又は変異体ＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子配列を含むクローンを精製し、配列解析を行うことができる。
また、変異体Ｂｖ８対立遺伝子又は変異体ＥＧ−ＶＥＧＦ対立遺伝子を有するものと思われるか有することが知られている個体においてそのような変異体対立遺伝子を発現することが知られているか発現すると思われる組織から単離されたＲＮＡから例えば合成されたｃＤＮＡを使用して発現ライブラリーを構築することができる。このようにして、推定される変異体組織によって産生された遺伝子産物を発現させ、以下に記載するような、通常のＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子産物に対する抗体と組み合わせて、標準的な抗体スクリーニング法を使用してスクリーニングすることができる。
ここで使用されるところでは、核酸、ポリヌクレオチド及びヌクレオチドなる用語は交換可能であり、デオキシリボヌクレオシドからなるものであれ又はリボヌクレオシドからなるものであれ、またホスホジエステル結合からなるものであれ又は改変された結合、例えばホスホトリエステル、ホスホルアミデート、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート(acetamidate)、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホルアミデート、架橋ホスホルアミデート、架橋メチレンホスホネート、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホスホロジチオエート、架橋ホスホロチオエート又はスルトン結合、及びそのような結合の組合せからなるものであれ、あらゆる核酸を意味する。
核酸、ポリヌクレオチド及びヌクレオチドなる用語はまた５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン及びウラシル）以外の塩基からなる核酸を特に含む。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、５-フルオロウラシル、５-ブロモウラシル、５-クロロウラシル、５-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４-アセチルシトシン、５-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、５-カルボキシメチルアミノメチル-２-チオウリジン、５-カルボキシメチルアミノメチル-ウラシル、ジヒドロウラシル、β-Ｄ-ガラクトシルキュェオシン、イノシン、Ｎ６-イソペンテニルアデニン、１-メチルグアニン、１-メチルイノシン、２,２-ジメチルグアニン、２-メチルアデニン、２-メチルグアニン、３-メチルシトシン、５-メチルシトシン、Ｎ６-アデニン、７-メチルグアニン、５-メチルアミノメチルウラシル、５-メトキシアミノメチル-２-チオウラシル、β-Ｄ-マンオシルキュェオシン、５Ｎ-メトキシカルボキシメチルウラシル、５-メトキシウラシル、２-メチルチオ-Ｎ６-イソペンテニルアデニン、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、プソイドウラシル、キュェオシン、２-チオシトシン、５-メチル-２-チオウラシル、２-チオウラシル、４-チオウラシル、５-メチルウラシル、ウラシル-５-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-５-オキシ酢酸（ｖ）、５-メチル-２-チオウラシル、３-(３-アミノ-３-Ｎ-２-カルボキシプロピル)ウラシル、(ａｃｐ３)ｗ、及び２,６-ジアミノプリンを含む群から選択される少なくとも一の修飾塩基部分を含んでいるかもしれない。
更に、本発明において使用されるポリヌクレオチドは、限定されるものではないが、アラビノース、２-フルオロアラビノース、キシルロース、及びヘキソースを含む群から選択される少なくとも一の修飾糖部分を含みうる。
本発明の方法はポリヌクレオチドの供給源によって制限されることは意図されていない。ポリヌクレオチドはヒト又は非ヒト哺乳動物由来であり、任意の組換え体供給源から誘導され、インビトロで又は化学合成によって合成され得る。ヌクレオチドはＤＮＡ又はＲＮＡであり得、二本鎖、単鎖又は部分的に二本鎖の形態で存在しうる。
本発明において有用な核酸には、限定することなく例示すると、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスＤＮＡｓ及び／又はＲＮＡｓ；リボザイム；遺伝子療法のためのＤＮＡ；ＤＮＡ及び／又はＲＮＡキメラ；単鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、高次コイルＤＮＡ及び／又は三重らせん体ＤＮＡ；Ｚ-ＤＮＡ等々が含まれる。核酸は多量に核酸を調製するために典型的に使用される任意の常套的手段によって調製することができる。例えば、ＤＮＡｓ及びＲＮＡｓは当該分野でよく知られた方法によって市販試薬及びシンセサイザーを使用して化学的に合成することができる（例えば、Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Englandを参照）。ＲＮＡｓはＳＰ６５のようなプラスミド（Promega Corporation, Madison, WI）を使用してインビトロ転写を介して高収量で産生させることができる。
ｍＲＮＡ前駆体の選択的スプライシング又はプロセシングから生じるｍＲＮＡ転写物を特に含む、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ核酸配列によってコードされている任意のｍＲＮＡ転写物を本発明の方法において使用することができる。
ヌクレアーゼ安定性の増加が望まれている場合のような、ある状況では、改変されたヌクレオシド間結合を有する核酸が好ましい。改変されたヌクレオシド間結合を含む核酸はまた当該分野においてよく知られた試薬と方法を使用して合成することができる。例えば、ホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート、メトキシエチルホスホルアミデート、ホルムアセタール、チオホルムアセタール、ジイソプロピルシリル、アセトアミデート、カルバメート、ジメチレン-スルフィド（-ＣＨ２-Ｓ-ＣＨ２）、ジメチレン-スルホキシド（-ＣＨ２-ＳＯ-ＣＨ２）、ジメチレン-スルホン（-ＣＨ２-ＳＯ２-ＣＨ２）、２'-Ｏ-アルキル、及び２'-デオキシ-２'-フルオロホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含む核酸を合成する方法は当該分野でよく知られている（Uhlmann等, 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Schneider等, 1990, Tetrahedron Lett. 31:335及びそこで引用された文献）。
本発明のある実施態様では、使用されるヌクレオチドはα-アノマーヌクレオチドである。α-アノマーヌクレオチドは、通常のβユニットと異なり、鎖が互いに平行に走る、相補ＲＮＡとの特異的二本鎖ハイブリッドを形成する（Gautier等, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641）。ヌクレオチドは２'-０-メチルリボヌクレオチドであり（Inoue等, 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148）、又はキメラＲＮＡ-ＤＮＡアナログである（Inoue等, 1987, FEBS Lett. 215:327-330）。
核酸は当該分野においてよく知られているように任意の適切な手段によって精製することができる。例えば、核酸は逆相又はイオン交換ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー又はゲル電気泳動によって精製することができる。勿論、当業者であれば、精製方法は精製すべきＤＮＡのサイズに部分的に依存することは認識しているであろう。
Ｂｖ８コード化配列、ＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列、それらの混合、又はその相補鎖の少なくとも１０のヌクレオチド（つまりハイブリダイズ可能な部分）を有する単離又は精製されたポリヌクレオチドをまた本発明の方法において使用することができる。他の実施態様では、ポリヌクレオチドはＢｖ８コード化配列、ＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列、又はそれらの混合、又は完全長Ｂｖ８コード化配列、完全長ＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列、又はそれらの混合の少なくとも２５の（連続）ヌクレオチド、５０のヌクレオチド、１００のヌクレオチド、１５０のヌクレオチド、又は２００のヌクレオチドを含んでいる。核酸は一本鎖又は二本鎖でありうる。また、本発明は前記コード化配列の相補鎖に選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチドに関する。好適な実施態様では、ポリヌクレオチドはＢｖ８コード化配列、ＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列、又はそれらの混合の少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０又は２００ヌクレオチド又は全長を含む。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの突然変異体、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのペプチド断片、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの切断型、及びＢｖ８融合タンパク質又はＥＧ−ＶＥＧＦ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列もまた本発明の方法において有用でありうる。融合タンパク質をコードしているヌクレオチドには、限定されるものではないが、無関係のタンパク質又はペプチドに融合した完全長Ｂｖ８配列又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの切断型、又は無関係のタンパク質又はペプチドに融合しているＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのペプチド断片をコードするヌクレオチド、例えば血流中において生じる融合タンパク質（例えばＢｖ８-Ｉｇ又はＥＧ−ＶＥＧＦ-Ｉｇ）の安定性及び半減期を増大させるＩｇＦｃドメインに融合したドメイン；又はマーカーとして使用することができる蛍光タンパク質又は発光タンパク質のような酵素が含まれうる。
更に、出典明示によりその全体が取り込まれている米国特許第５６０５７９３号及び第５８３７４５８号に記載されている、遺伝子シャフリング及び／又は繰り返し配列組換えのような、ある形態の定方向進化によって、少なくとも部分的に産生されたＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦポリヌクレオチド変異体を本発明の方法において使用することができる。例えば、そのような技術を使用して、改変された機能及び／又は構造的特徴を有する機能的に及び／又は構造的に類似のタンパク質をコードしている新規配列の生成のための出発点としてＢｖ８コード化配列及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列、又は複数のＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列を使用することができる。
上に記載されたＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化ポリヌクレオチド配列の高度に関連した遺伝子相同体もまた本発明において有用であろう。高度に関連した遺伝子相同体は、図２又は図４（配列番号：２及び４）の成熟ヒトＢｖ８、及び成熟ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ（配列番号：８）のような、天然に生じるＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％のアミノ酸配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約８５％から少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性まで１％の増分で増加するタンパク質をコードしているポリヌクレオチドである。高度に関連した相同体はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと機能的活性を共有するタンパク質をコードし得る。
本発明の方法はまた（ａ）前記のＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列及び／又はその相補鎖（すなわち、アンチセンス）の何れかを含むＤＮＡベクター；（ｂ）コード化配列の発現を指令する調節エレメントと作用可能に関連した前記Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列、又はそれらの混合の何れかを含むＤＮＡ発現ベクター；（ｃ）宿主細胞中におけるコード化配列の発現を指令する調節エレメントと作用可能に関連した前記Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化配列、又はそれらの混合の何れかを含む遺伝子操作した宿主細胞；及び（ｄ）外因的に導入された調節エレメント（すなわち、遺伝子活性化）の制御下で内因性Ｂｖ８遺伝子又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子を発現する遺伝子操作された宿主細胞を使用することによって恩恵を受ける。
天然配列Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ、あるいはここに記載されたＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの様々なドメインの変異は、例えば、米国特許第５３６４９３４号に記載された保存的及び非保存的突然変異のための技術と指針の任意のものを使用してなすことができる。変異は、天然配列Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦと比較してＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのアミノ酸配列に変化を生じる一又は複数のＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化コドンの置換、欠失又は挿入でありうる。場合によっては、変異は、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのドメインの一又は複数において少なくとも一のアミノ酸を任意の他のアミノ酸と置換することによる。所望の活性に悪影響を与えないで、どのアミノ酸残基を挿入、置換又は欠失するかを決定するための指針は、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの配列を既知の相同なタンパク質分子の配列と比較し、高い相同性の領域においてなされたアミノ酸配列の変化の数を最小にすることによって見出すことができる。アミノ酸置換は一つのアミノ酸を、類似の構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸と置き換えた結果であり得、例えばロイシンのセリンへの置換、つまり保存的アミノ酸置換でありうる。挿入又は欠失は場合によっては約１から５のアミノ酸の範囲でありうる。許容される変異は、配列中にアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的につくり出し、得られた変異体を、完全長又は成熟天然配列が示す活性について試験することによって決定することができる。
Ｂｖ８ポリペプチド断片及びＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド断片がまた本発明の方法において有用である。そのような断片は、完全長天然タンパク質と比較した場合、例えばＮ末端又はＣ末端が切断され、又は内部の残基を欠いている可能性がある。ある種の断片はＢｖ８ポリペプチド又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの所望の生物学的活性には必須ではないアミノ酸残基を欠く。
Ｂｖ８断片及びＥＧ−ＶＥＧＦ断片は多くの従来の方法の任意のものによって調製することができる。所望のペプチド断片を化学的に合成してもよい。他のアプローチ法は、酵素消化により、例えば特定のアミノ酸残基により定まる部位でタンパク質を切断することが知られている酵素でタンパク質を処理するか、適当な制限酵素でＤＮＡを消化させることによりＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ断片を産生し、所望の断片を単離することを含む。更に他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応法(ＰＣＲ)により、所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片を単離し増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドをＰＣＲにおける５'及び３'プライマーに使用する。好ましくは、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド断片は、天然Ｂｖ８ポリペプチド及び／又は天然ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドそれぞれと少なくとも一つの生物学的及び／又は免疫学的活性を共有する。
特定の実施態様では、関心のある保存的置換を、好ましい置換と題して表１に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に置換例と表記され、又はアミノ酸分類を参照して以下に記載されるように、より実質的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
表１
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Ｂｖ８ポリペプチド又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はヘリカルコンフォメーション、（ｂ）標的部位の電荷又は疎水性、あるいは（ｃ）側鎖の嵩を維持しながら、その影響が有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいてグループ分けできる：
（１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
（２）中性の親水性：cys, ser, thr;
（３）酸性：asp, glu;
（４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
（５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
（６）芳香族：trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類のものに交換することを必要とするであろう。また、そのような置換残基は、保存的置換部位に、あるいはより好ましくは残っている（非保存）部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ突然変異誘発等の当該分野で知られた方法を用いてなすことができる。部位特異的突然変異誘発（Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)）、カセット突然変異誘発（Wells等, Gene, 34: 315 (1985)）、制限的選択突然変異誘発（Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)）又は他の知られた技術をクローニングしたＤＮＡに実施してＢｖ８変異体ＤＮＡ及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ変異体ＤＮＡを作製することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析法を用いることもできる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である（Cunningham及びWells, Science, 244: 1081-1085 (1989)）。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的に好ましい。さらに、それは埋もれた位置と露出した位置の双方に見出されることが多い（Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1(1976)）。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリックな(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
Ｄ．Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及びそれらの変異体の生産
Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及びそれらの変異体の生産に適した技術は当該分野においてよく知られている。好適な技術は天然ポリペプチドと変異体に対して同一であるので、以下に記載する技術はＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦ変異体並びに天然配列Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦそれぞれに適用される。
好適な生産方法には、ポリペプチドの内因性源からのＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの単離、（ペプチドシンセサイザーを用いた）ペプチド合成及び組換え技術（又はこれらの技術の任意の組み合わせ）が含まれる。
以下の検討の殆どは、Ｂｖ８核酸、ＥＧ−ＶＥＧＦ核酸又はそれらの混合を含むベクターで形質転換された細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによりＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦを組換え生産することに関する。しかし、当業者であれば、Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦの製造には多くの方法があることは分かっているであろう。
簡単に述べると、この方法はＢｖ８をコードしている遺伝子又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードしている遺伝子を含むヒトの一次細胞を、（ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）又は以下に記載するそれ以外のもののような）増殖可能な遺伝子及びＢｖ８遺伝子又はＥＧ−ＶＥＧＦの増幅を生じるＢｖ８遺伝子又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子のコード化領域の遺伝子座におけるＤＮＡ配列が相同である少なくとも約１５０ｂｐの長さの少なくとも一のフランキング領域を含むコンストラクト（すなわち、ベクター）で形質転換することを含む。増殖可能な遺伝子はＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害しない部位にあるものでなければならない。形質転換は、増殖可能な位置を定めるようにコンストラクトが一次細胞のゲノムに相同的に組込まれるような方法で行われる。
コンストラクトを有する一次細胞はついで増殖可能な遺伝子又はコンストラクト中に存在する他のマーカーによって選択される。マーカー遺伝子の存在はコンストラクトの存在及び宿主ゲノムへの組込みを可能にする。選択は第二の宿主で行われるため、一次細胞の更なる選択は必要とされない。所望されるならば、相同組換えの発生は、ＰＣＲを用いて、得られた増殖ＤＮＡ配列を配列決定するか、又は正確な相同組換え体のＤＮＡが存在する場合にはＰＣＲ断片の適切な長さを決定し、そのような断片を含む細胞のみを拡張することで、決定することができる。また所望されるならば、選択された細胞を、（増幅可能遺伝子がＤＨＦＲならメトトレキセートのような）適当な増幅化剤を用いて細胞にストレスを付与することによってこの時点で増幅させ、目的とする遺伝子の複数の複製を得ることができる。しかし、好ましくは、増幅工程は、以下に記載する第二の形質転換の後まで行われない。
選択工程の後に、全増幅可能領域を含むのに十分な大きさがあるゲノムのＤＮＡ部分を、選択された一次細胞から単離する。ついで、二次の哺乳動物発現宿主細胞をこれらのゲノムＤＮＡ部分で形質転換してクローニングし、増幅可能領域を含むクローンを選択する。ついで、増幅可能領域を、一次細胞で既に増幅されていなければ、増幅剤を用いて増幅させる。最後に、今はＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦを含む増幅可能領域の複数の複製物を含む二次発現宿主細胞を増殖させ、遺伝子を発現しタンパク質を産生させる。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードしているＤＮＡは、Ｂｖ８ｍＲＮＡ又はＥＧ−ＶＥＧＦｍＲＮＡそれぞれを有し、それを検出可能なレベルで発現すると思われる組織から調製したｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのＤＮＡは、例えば複数のヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。Ｂｖ８をコードしている遺伝子又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードしている遺伝子はゲノムライブラリーあるいはオリゴヌクレオチド合成法によってもまた得ることができる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子からコードされるタンパク質を同定するために設計された（Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦに対する抗体又は約２０−８０塩基のオリゴヌクレオチド等の）プローブを用いてスクリーニングされる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、Sambrook等, Molecular Cloning: A laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)の１０−１２章に記載されている標準的な方法を使用して実施することができる。Ｂｖ８をコードしている遺伝子又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードしている遺伝子を単離する他の手段は、上掲のSambrook等のセクション１４に記載のＰＣＲ法を用いるものである。
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦのｃＤＮＡを単離する好ましい方法は、注意深く選択したオリゴヌクレオチド配列を使用して様々なヒト組織由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、擬陽性が最小限に抑えられるように十分な長さを持ちかつ十分に明瞭でなければならない。好ましい配列はここに開示された天然に生じるＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦから得ることができる。
オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡにハイブリダイズしたときに検出できるように標識されていなければならない。標識化の好ましい方法は、当該分野においてはよく知られているように、３２Ｐ標識ＡＴＰをポリヌクレオチドキナーゼと共に用いてオリゴヌクレオチドを放射標識することである。しかし、限定されることなく、ビオチン標識あるいは酵素標識を含む他の方法をオリゴヌクレオチドを標識するために使用することができる。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードしている核酸（例えばｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は更なるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のために複製可能ベクター中に挿入される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には、限定されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。
この発明に有用なＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦは、直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、好ましくはシグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても生産される。一般には、シグナル配列はベクターの成分であり得、あるいはベクター中に挿入されるＢｖ８ＤＮＡ又はＥＧ−ＶＥＧＦＤＮＡの一部でありうる。好適に選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然Ｂｖ８シグナル配列又はＥＧ−ＶＥＧＦシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンＩＩリーダーからなる群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は１９９１年４月２３日発行の米国特許第５０１０１８２号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー（１９９０年４月４日公開のＥＰ３６２１７９）、又は１９９０年１１月１５日に公開された国際公開９０／１３６４６号に記載されたシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞での発現においては、天然シグナル配列（例えばインビボにてヒト細胞からのＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの分泌を通常は指令するＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦプレ配列）が満足できるが、例えば他の動物のＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド由来のシグナル配列、及び同一又は関連した種の分泌されたポリペプチド由来のシグナル配列、並びに例えば単純ヘルペスｇＤシグナルのようなウイルス分泌リーダーのような、他の哺乳動物シグナル配列も適している。
このような前駆体領域のＤＮＡは、成熟型Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ、又はその可溶型変異体をコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点が初期プロモーターを有しているため典型的には用いられる)。
多くの発現ベクターは「シャトル」ベクターである。すなわち、それらは少なくとも一つのクラスの生物において複製可能であるが、発現のために他の生物に形質移入され得る。例えば、大腸菌中にベクターがクローニングされ、そのベクターが酵母あるいは哺乳動物細胞に形質移入され、宿主細胞染色体と独立して複製することはできないとしても、発現する。
またＤＮＡは宿主ゲノムに挿入することによって増幅され得る。これは、例えばベクターにバシラス(Bacillus)ゲノムＤＮＡに見られる配列と相補的なＤＮＡ配列を含めることにより、宿主としてバシラス種を用いて容易に達成される。このベクターを用いたバシラスの形質移入は、ゲノムとの相同組換え及びＢｖ８ ＤＮＡ及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ ＤＮＡの挿入をもたらす。しかし、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードするゲノムＤＮＡの回収は、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ ＤＮＡを切除するのに制限酵素による消化を必要とするために、外来的に複製したベクターの場合よりも複雑である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。この遺伝子は選択培養培地中での形質転換宿主細胞の生存又は成長に必要なタンパク質をコードしている。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は培養培地中では生存しない。典型的な選択遺伝子は、（ａ）例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、（ｂ）栄養要求性欠陥を補い、又は（ｃ）例えばバシリに対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択技術の一例では、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種遺伝子で首尾よく形質転換された細胞は、薬物耐性を付与し、選択工程で生存するタンパク質を産生する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸又はハイグロマイシンが使用される。
哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの他の例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ核酸を捕捉するのに適した細胞を同定することのできるものである。哺乳動物細胞の形質転換細胞は、マーカーを捕捉することによって当該形質転換細胞のみが生存できるように独特に適応化された淘汰圧下に置かれる。淘汰圧は、培地中の選択剤の濃度が次第に変化する条件下で形質転換細胞を培養することにより課され、選択遺伝子とＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードするＤＮＡの双方を増幅させる。増幅は、成長に重要なタンパク質の生産に対する要求度が高い遺伝子が、組換え細胞の後の世代の染色体内にタンデムに反復されるプロセスである。増幅されたＤＮＡから増大した量のＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦが合成される。増幅可能な遺伝子の他の例には、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等々が含まれる。好適なベクター系は米国特許第５５６１０５３号に提供されている。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトレキセート(Ｍｔｘ)を含む培養培地中で形質転換体の全てを培養することにより同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性が欠けるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。形質転換した細胞は次に濃度の高いメトトレキセートに接触させる。これによりＤＨＦＲ遺伝子の複数のコピーが合成され、同時に、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードするＤＮＡのような発現ベクターを含む他のＤＮＡの複数コピーが作られる。この増幅方法は、もし例えばＭｔｘに高度に耐性がある変異体ＤＨＦＲ遺伝子が使用されたような場合には内在性ＤＨＦＲの存在にかかわらず、任意の他の適切な宿主、例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１ＣＨＯ−Ｋ１を用いて使用することができる(ＥＰ１１７０６０)。
あるいは、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979)）。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン中で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における増殖による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
更に、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。Bianchi等, Curr. Genet., 12:185(1987)。より最近では、組換え子ウシキモシンの大量生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている。Fleer等, Bio/Technology,9:968-975(1991)。
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ核酸配列に作用可能に結合されたプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に結合されたＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ核酸配列のような、特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造的な遺伝子(一般的に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは、典型的には、誘導性クラス及び構成的クラスの２つのクラスに属する。誘導性プロモーターは、養分の存在あるいは不存在、温度変化等の培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを排除し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ｂｖ８をコードするＤＮＡ及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＢｖ８プロモーター配列、天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦプロモーター配列、及び多くの異種プロモーターを何れもＢｖ８ ＤＮＡ又はＥＧ−ＶＥＧＦ ＤＮＡそれぞれの増幅及び／又は発現を指令するために用いることができる。しかしながら、異種プロモーターも、天然のプロモーターと比較してＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦのより大なる転写と高い収量を一般に可能にするので、好適である。
原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Chang等, Nature, 275:615 (1978), Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); ＥＰ３６７７６）、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)。しかし、他の既知のバクテリアプロモーターも好適である。これらのヌクレオチド配列は公表されており、よって当業者は、任意の所望の制限部位を提供するためにリンカーあるいはアダプターを使用することでＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードするＤＮＡ（Siebenlist等, Cell, 20:269 (1980)）にそれらを作用可能に結合させることが可能である。細菌系で使用されるプロモーターもまたＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。実質的に全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に見出されるＡＴリッチ領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｘが任意のヌクレオチドであるＣＸＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ（Hitzeman等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)）又は他の糖分解酵素（Hess等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17：4900(1978)）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターである、他の酵母プロモーターとしては、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に好適に用いられるベクターとプロモータはＥＰ７３６５７に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＢｖ８転写及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス(１９８９年７月５日公開のＵＫ２２１１５０４)、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び最も好ましくはサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、熱衝撃プロモーター、そしてＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列に通常付随するプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点をさらに含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。Fiers等, Nature, 273:113 (1978);Mulligan等, Science, 209:1422-1427 (1980); Pavlakis等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩＥ制限断片として簡便に得られる。Greenaway等, Gene, 18:355-360 (1982)。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変形は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、サル細胞での免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡの発現について、Gray等, Nature, 295：503-508(1982)を；単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を；培養されたマウス及びウサギの細胞におけるヒトインターフェロンβ１遺伝子の発現について、Canaani等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79：5166-5170(1982)を；プロモーターとしてラウス肉腫ウイルスの長い末端反復を用いたＣＶ-１サル腎臓細胞、ニワトリ胚線維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、及びマウスＮＩＨ-３Ｔ３細胞における細菌ＣＡＴ配列の発現について、Gorman等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982)を参照のこと。
より高等の真核生物による本発明のＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動エレメントである。エンハンサーは、相対的に配向及び位置が独立しており、転写ユニットの５'（Laimins等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:993 (1981)）及び ３'（Lusky等, Mol. Cell Bio., 3:1108 (1983)）、イントロン内部（Banerji等, Cell, 33:729 (1983)）並びにコード化配列自身の内部（Osborne等, Mol. Cell Bio., 4:1293 (1984)）に見出されている。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００-２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強エレメントについては、Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、Ｂｖ８コード配列又はＥＧ−ＶＥＧＦコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、しばしば３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい型に再ライゲーションする。
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又はMessing等, Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)の方法又はMaxam等, Methods in Enzymology, 65:499 (1980)の方法によって配列決定する。
Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及びそれらの変異体の調製に特に有用なものは、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターである。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む。上掲のSambrook等、１６．１７−１６．２２頁。適切な発現ベクターと宿主細胞を含む一過性発現系は、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、生物学的に活性なＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの変異体及びアナログを同定する目的のために特に有用である。
組換え脊椎動物細胞培養でのＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合の合成に適合化させるのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); ＥＰ１１７０６０; 及びＥＰ１１７０５８に記載されている。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの哺乳動物細胞での培養発現のための特に有用なプラスミドはｐＲＫ５（ＥＰ３０７２４７）又はｐＳＶＩ６Ｂである。１９９１年６月１３日に公開の国際公開９１／０８２９１。
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現させるために適した宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物には、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリキアのような腸内細菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)（例えば、１９８９年４月１２日公開のＤＤ２６６７１０に開示されたバシリリチェニフォルミス４１Ｐ）、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセスが含まれる。宿主のクローニングするための一つの好適な大腸菌は、大腸菌２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１５３７）及び大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７３２５）のような他の株も適している。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ産物発酵に対して一般的な宿主株であるので、特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌しなければならない。例えば、株Ｗ３１１０は、タンパク質をコードする遺伝子に遺伝子突然変異をさせるように修飾してもよく、そのような宿主の例には、大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７が含まれる。２７Ｃ７の完全な遺伝子型は、ｔｏｎＡ ｐｔr３ ｐｈｏＡΔＥ１５ Δ(ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９ ｏｍｐＴΔｄｅｇＰ４１ｋａｎｒである。株２７Ｃ７は１９９１年１０月３０日にアメリカンタイプカルチャーコレクションにＡＴＣＣ番号５５２４４として寄託された。あるいは、１９９０年８月７日発行の米国特許第４９４６７８３号に開示された変異体周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を用いることもできる。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物が、Ｂｖ８コード化ベクター及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、あるいは一般的にパン酵母は、下等真核生物宿主微生物として最も一般的に使用される。しかし、多くの他の属、種、系統が一般に入手でき、ここで有用である。例えば、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)（Beach等, Nature, 290: 140 (1981); １９８５年５月２日公開のＥＰ１３９３８３）；クルヴェロミセス(Kluveromyces)宿主（米国特許第４９４３５２９号; 上掲のFleer等）、例えばＫ．ラクチス(K. lactis)（MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 (1983)）、Ｋ．フラギリス(K. fragilis)（ＡＴＣＣ１２４２４）、ケー．ブルガリクス(K. bulgaricus)（ＡＴＣＣ１６０４５）、ケー．ウィケラミイ(K. wickeramii)（ＡＴＣＣ２４１７８）、ケー．ワルチイ(K. waltii)（ＡＴＣＣ５６５００）、ケー．ドロソフィラルム(K. drosophilarum)（ＡＴＣＣ３６９０６; 上掲のVan den Berg等）、ケー．サーモトレランス(K. thermotolerans)及びケー．マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)（ＥＰ４０２２２６）；ピッチャパストリス(Pichia pastoris)（ＥＰ１８３０７０; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 (1988)）；カンジダ；トリコデルマレーシア(reesia)（ＥＰ２４４２３４）；アカパンカビ（Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 (1979)）；シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)（１９９０年１０月３１日公開のＥＰ３９４５３８）；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)（１９９１年１月１０日公開のＷＯ９１／００３５７）；及びアスペルギルス宿主、例えばＡ．ニダランス（Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 (1983); Tilburn等, Gene, 26: 205-221 (1983); Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 (1984)）及びＡ．ニガー(クロカビ)（Kelly等, EMBO J., 4: 475-479 (1985)）が含まれる。
グリコシル化Ｂｖ８及び／又はグリコシル化ＥＧ−ＶＥＧＦの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑なプロセシング及びグリコシル化活動が可能である。原則的には、脊椎動物であろうと無脊椎動物培養であろうと、任意のより高等の真核生物細胞培養が使用できる。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。例えば、Luckow等, Bio/Technology, 6:47-55 (1988); Miller等, Genetic Engineering, Setlow等, eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp.277-279; 及びMaeda等, Nature, 315:592-594 (1985)を参照のこと。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、それらのウイルスは、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera fugiperda)細胞の形質移入のために、本発明に係るウイルスとして使用できる。
綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。典型的には、植物細胞は、細菌アグロバクテリウム・トゥメファシエンスの、既にＢｖ８コード化ＤＮＡ、ＥＧ−ＶＥＧＦコード化ＤＮＡ、又はそれらの混合を含むように操作された所定の菌株と共にインキュベートすることによってトランスフェクトされる。A. トゥメファシエンスと共に植物細胞培養をインキュベートする間に、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードするＤＮＡが、植物細胞宿主にそれが形質移入されるよう移され、そして適切な条件下でＢｖ８をコードするＤＮＡ及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードするＤＮＡが発現される。加えて、例えば、ノパリンシンターゼプロモーター及びポリアデニル化シグナル配列のような、植物細胞と適合しうる調節及びシグナル配列が利用できる。Depicker等, J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)。また、Ｔ-ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から分離されるＤＮＡセグメントは、組換えＤＮＡを含む植物組織中の植物発現遺伝子の転写レベルを活性化又は増強しうる。１９８９年６月２１日公開のＥＰ３２１１９６。
しかしながら、関心は脊椎動物細胞の場合に最も高く、培養(組織培養)での脊椎動物細胞の増殖は常套手段になっている。例えば、Tissue Culture, Academic Press, Kruse及びPatterson編(1973)を参照のこと。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977)）;ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(CHO, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）;サルの腎細胞 (ＣＶＩ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２); イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２); ヒト肺細胞 (Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ８０６５); マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１);ＴＲＩ細胞（Mather等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）;ＭＲＣ５細胞;及びＦＳ４細胞；及びヒト肝癌株（Ｈｅｐ Ｇ２）である。
宿主細胞をトランスフェクトし、好ましくは上述のＢｖ８産生及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ産生のための発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された標準栄養培地で培養する。
形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを意味する。多数の形質移入の方法が当業者に知られている。例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功した形質移入が一般に認められる。
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等のセクション１．８２に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に使用される。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開８９／０５８５９に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開された国際公開９１／００３５８に記載されているように、超音波処理を用いて植物を形質移入することもできる。
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham等, Virology, 52:456-457(1978)のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は、１９８３年８月１６日に発行の米国特許第４３９９２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact. 130: 946(1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829(1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチンもまた用いることができる。形質転換哺乳動物細胞のための様々な技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537(1990)及びMansour等, Nature, 336:348-352(1988)を参照のこと。
Ｂｖ８ポリペプチド、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド、又はそれらの混合を産生するために使用される原核細胞は上掲のＳａｍｂｒｏｏｋ等に一般的に記載されているようにして、好適な培地中で培養される。
本発明のＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ又はそれらの混合を生成するために用いられる哺乳動物宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」,シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「DMEM」,シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開９０／０３４３０；国際公開８７／００１９５；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンＴＭ薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)に見出すことができる。
この明細書において言及される宿主細胞は培養中の細胞並びに宿主動物内にある細胞を包含する。
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法（Thomas,Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)）、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾されたヌクレオチドもまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性ヌクレオチド、蛍光剤又は酵素のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位として作用する。また、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク質二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、又はルミネサンス標識である。本発明において使用するのに適した特に感度のよい染色方法はHsu等, Am. J. Clin. Path., 75:734-738 (1980)に記載されている。
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、ここに記載されたようにして調製することができる。
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦは、好ましくは、培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、宿主細胞溶解液から回収することもできる。Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦが膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて膜から引き離すことができる。
Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合がヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられるときは、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含んでいない。しかしながら、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦに関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドからＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを精製することが必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；免疫親和性；エピトープタグ結合樹脂；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
Ｅ．Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦの修飾
Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ及びそれらの変異体の共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一つの型は、Ｂｖ８ポリペプチド及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの標的化アミノ酸残基を、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのＮ末端又はＣ末端残基、又は選択された側鎖と反応できる有機誘導体化剤と反応させることである。二官能性試薬による誘導体形成は、例えば、抗Ｂｖ８抗体又はＥＧ−ＶＥＧＦ抗体それぞれを精製する方法に使用する水不溶性支持体マトリックス又は表面へのＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの架橋に有用であり、またその逆も同様である。通常使用される架橋剤には、例えば、１,１-ビス(ジアゾアセチル)-２-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４-アジドサリチル酸とのエステル、３,３'-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオナート)のようなジスクシンイミジルエステルを包含するホモ二官能性イミドエステル、ビス-Ｎ-マレイミド-１,８-オクタンのような二官能性マレイミド、及びメチル-３-［(ｐ-アジドフェニル)ジチオ］プロピオイミダートのような試薬が含まれる。
その他の修飾は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へのグルタミニル及びアスパラギニル残基の脱アミド化、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のαアミノ基のメチル化［T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, PP.79-86 (1983)］、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化を含む。
本発明の範囲内に含まれるＢｖ８ポリペプチド及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、（化学的及び／又は酵素的手段によるグリコシル化部位の除去又はグリコシル化の欠失の何れかによって）天然配列Ｂｖ８に見出される一又は複数の糖鎖部分を欠失させ、及び／又は天然配列Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ天然配列に存在しない一又は複数のグリコシル化部位を付加することを意味することをここでは意図している。また、その語句には、性質の変化及び存在する様々な糖鎖部分の割合を含む、天然タンパク質のグリコシル化の定性的変化が含まれる。
Ｂｖ８ポリペプチド又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列の変更によって達成されうる。この変更は、例えば、天然配列Ｂｖ８又は天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦへの一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ結合グリコシル化部位の場合)。場合によっては、Ｂｖ８アミノ酸配列又はＥＧ−ＶＥＧＦアミノ酸配列はＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳するコドンが産生されるように予め選んだ塩基でＢｖ８ポリペプチド又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドをコードしているＤＮＡを突然変異することによって変更される。
Ｂｖ８ポリペプチド又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの方法は１９８７年９月１１日公開の国際特許出願第ＷＯ８７／０５３３０号及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp259-306 (1981)に記載されている。
Ｂｖ８ポリペプチド又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的あるいはグリコシル化の標的となるアミノ酸残基をコードするコドンの突然変異的置換によりなされる。例えば、化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem Biophys., 259:52 (1987)及びEdge等, Anal. Biochem., 118:131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的開裂は、Thotakura等, Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを使用して達成することができる。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの共有結合的修飾の他の型は、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載されているように、Ｂｖ８ポリペプチド又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドそれぞれを、種々の非タンパク性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンに結合させることを含んでいる。
また、本発明のＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦは、他の異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列と融合したＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合するエピトープを提供するタグポリペプチドとのＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの融合体を含む。エピトープタグは一般にＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのアミノ又はカルボキシル末端に位置させられる。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦのこのようなエピトープタグが付けられた形は、その存在をタグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグを供給すると、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の種類のアフィニティーマトリックスを用いたアフィニティー精製によって直ぐに精製することができる。様々なタグポリペプチドとその各抗体は従来から良く知られている。例には、ポリヒスチジン（poly-his)又はポリヒスチジングリシン(poly-his-gly)タグ；ｆｌｕＨＡタグポリペプチドとその抗体１２ＣＡ５（Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165(1988)）；ｃ-ｍｙｃタグとそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)）；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパクＤ(ｇＤ)タグとその抗体（Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553(1990)）が含まれる。他のタグポリペプチドには、Ｆｌａｇペプチド（Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210(1988)）；ＫＴ３エピトープペプチド（Martin等, Science, 255:192-194(1992)）；αチューブリンエピトープペプチド（Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)）；及びＴ７遺伝子１０タンパクペプチドタグ（Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)）が含まれる。
もう一つの実施態様では、キメラ分子はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含む。キメラ分子の二価形態（「イムノアドヘシンとも呼ぶ」）には、このような融合はＩｇＧ分子のＦｃ領域であり得る。
最も簡単で最も直接的なイムノアドヘシンの設計は、「アドヘシン」タンパク質の結合ドメインを免疫グロブリン重鎖のヒンジ及びＦｃ領域と組み合わせるものである。通常は、本発明における使用のためにＢｖ８-免疫グロブリンキメラ又はＥＧ−ＶＥＧＦ-免疫グロブリンキメラを調製する場合、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードする核酸を、免疫グロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸にＣ末端的に融合させるが、Ｎ末端融合もまた可能である。
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。
融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ-免疫グロブリンキメラの生物活性を最適化するために選択されうる。
ある実施態様では、Ｂｖ８-免疫グロブリンキメラ及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ免疫グロブリンキメラは単量体として、又はヘテロ多量体もしくはホモ多量体として、特に国際公開第９１／０８２９８号に本質的に例証されているように二量体又は四量体として構築される。
好適な実施態様では、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列は、例えば免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)のような免疫グロブリンのエフェクター機能を含む抗体のＣ末端部分（特にＦｃドメイン）のＮ末端に融合される。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、（ＩｇＧのＦｃを化学的に定める；重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６、又は他の免疫グロブリンの類似部位)パパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列が融合において使用される。特に好適な実施態様では、Ｂｖ８アミノ酸配列及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアミノ酸配列はＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ３重鎖のヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又はＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合される。融合がなされる正確な部位は重要ではなく、最適な部位は日常的な実験により決定することができる。
ある実施態様では、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ免疫グロブリンキメラは多量体として、特にホモ二量体又はホモ四量体として構築されている。一般に、これらの構築された免疫グロブリンは既知のユニット構造を有する。基本的な４つの鎖構造ユニットはＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する形態である。４つのユニットはより高分子量の免疫グロブリンでは繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって互いに結合された異本的な４つのユニットの五量体として存在する。ＩｇＡグロブリンと、時折ＩｇＧグロブリンもまた血清中に多量体の形で存在しうる。多量体の場合には、各４つのユニットは同じでも異なっていてもよい。
あるいは、Ｂｖ８配列又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、Ｂｖ８配列又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３’末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等,Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時にハイブリッド重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、二つのジスルフィド結合免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば１９８９年３月２８日に発行された米国特許第４８１６５６７号に開示されている。
好適な実施態様では、本発明のイムノアドヘシンの構築に使用される免疫グロブリン配列はＩｇＧ免疫グロブリン重鎖定常ドメインからのものである。ヒトイムノアドヘシンに対しては、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ３免疫グロブリン配列の使用が好ましい。ＩｇＧ１を使用する主な利点は、ＩｇＧ１イムノアドヘシンを固定化プロテインＡ上で効率的に精製することができることにある。これに対して、ＩｇＧ３の精製には多目的性が顕著に欠ける培地であるプロテインＧが必要となる。しかし、特定のイムノアドヘシンの構築のためにはＩｇ融合対を選択する場合に免疫グロブリンの他の構造的及び機能的性質を考慮しなければならない。例えば、ＩｇＧ３のヒンジは長くより可撓性であるので、ＩｇＧ１に融合した場合には正しく折りたたまれない又は機能しない大きなアドヘシンドメインを収容することができる。他の考慮は結合価であろう；ＩｇＧイムノアドヘシンは二価のホモ二量体であるが、ＩｇＡ及びＩｇＭのようなＩｇサブタイプは基本的なＩｇホモ二量体ユニットの二量体又は五量体構造をそれぞれ生じうる。インビボ用途のために構築されるＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦイムノアドヘシンでは、Ｆｃ領域によって特定されるエフェクター機能及び薬物動態学的性質がまた重要である。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４は全て２１日のインビボ半減期を持っているが、補体系を活性化させるその相対能力は異なっている。ＩｇＧ４は補体を活性化させず、ＩｇＧ２はＩｇＧ１よりも補体活性化が有意に弱い。更に、ＩｇＧ１とは異なり、ＩｇＧ２は単核細胞又は好中球上のＦｃレセプターに結合しない。ＩｇＧ３は補体活性化には最適であるが、そのインビボ半減期は他のＩｇＧアイソタイプのおよそ１／３である。ヒトの治療薬として使用されるために構築されるイムノアドヘシンに対する他の重要な考慮事項は特定のアイソタイプのアロタイプ変異体の数である。一般に、血清学的に定義されるアロタイプが少ないＩｇＧアイソタイプが好ましい。例えば、ＩｇＧ１は４つのみの血清学的に定義されるアロタイプ部位を有し、その２つ（Ｇ１ｍ及び２）はＦｃ領域に位置している；そしてこれらの部位の一つＧ１ｍ１は非免疫原性である。これに対して、ＩｇＧ３には１２の血清学的に定義されるアロタイプがあり、その全てがＦｃ領域にある；これらの部位の３つのみ（Ｇ３ｍ５、１１及び２１）が非免疫原性である一つのアロタイプを有している。よって、γ３イムノアドヘシンの潜在的な免疫原性はγ１イムノアドヘシンのものよりも大きい。
親免疫グロブリンに対しては、有用な接合点は２つの重鎖間にジスルフィド結合を形成するヒンジのシステインの直ぐ上流である。頻繁に使用される設計では、分子のＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ部分のＣ末端残基のコドンがＩｇＧ１ヒンジ領域の配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰのコドンの直ぐ上流に置かれる。
イムノアドヘシンの構築と発現に適した一般的な方法はＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦに関して上に開示したものと同じである。Ｂｖ８イムノアドヘシン及びＥＧ−ＶＥＧＦイムノアドヘシンは、最も簡便には、Ｂｖ８部分又はＥＧ−ＶＥＧＦ部分それぞれをコードするｃＤＮＡ配列をＩｇ ｃＤＮＡ配列にインフレームとなるように融合させることによって構築される。しかしながら、ゲノムＩｇ断片との融合体もまた使用することができる（例えばGascoigne等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2936-2940 (1987); Aruffo等, Cell, 61:1303-1313 (1990); Stamenkovic等, Cell, 66:1133-1144 (1991)を参照）。後者のタイプの融合には発現のためのＩｇ調節配列が存在する必要がある。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードしているｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーション又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって、脾臓又は末梢血リンパ球由来のｃＤＮＡライブラリーからの刊行された配列に基づいて単離することができる。イムノアドヘシンのＩｇ部分及びＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦをコードしているｃＤＮＡを、選択された宿主細胞中での効率的な発現を指令するプラスミドベクター中にタンデムで挿入する。哺乳動物細胞での発現には、ｐＲＫ５ベースのベクター（Schall等, Cell, 61:361-370 (1990)）及びＣＤＭ８ベースのベクター（Seed, Nature, 329:840 (1989)）を使用することができる。正確な接合部はオリゴヌクレオチド特異的欠失突然変異誘発を使用して設計された接合コドン間の余分な配列を除去することによってつくることができる（Zoller等, Nucleic Acids Res., 10:6487 (1982); Capon等, Nature, 337:525-531 (1989)）。それぞれ半分が所望の接合部の各側の配列に相補的である合成オリゴヌクレオチドを使用することができ；これらは理想的には３６から４８量体である。あるいは、ＰＣＲ法を使用して、適切なベクターにインフレームになるように分子の二つの部分を接合することができる。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦイムノアドヘシンの発現のための宿主細胞株の選択は発現ベクターに主に依存する。他の考慮事項は必要とされるタンパク質の量である。ミリグラム量はしばしば一過性形質移入によって生産できる。例えば、アデノウイルスＥＩＡ形質転換２９３ヒト胎児由来腎臓細胞株に、リン酸カルシウム法の変形法によってｐＲＫ５ベースのベクターを用いて一過性に形質移入し、効率的なイムノアドヘシンの発現を可能にする。ＣＤＭ８ベースのベクターを用いて、ＤＥＡＥ-デキストラン法によってＣＯＳ細胞に形質移入することができる（Aruffo等, Cell, 61:1303-1313 (1990); Zettmeissl等, DNA Cell Biol. US, 9:347-353 (1990)）。多量のタンパク質が所望される場合には、宿主細胞株の安定な形質移入後にイムノアドヘシンを発現させることができる。例えば、ｐＲＫ５ベースベクターは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードしＧ４１８耐性を付与する更なるプラスミドの存在下でチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中に導入することができる。Ｇ４１８に耐性のあるクローンを培養中に選択することができる；これらのクローンはＤＨＦＲインヒビターのメトトレキセートのレベルを増加させた状態で成長させる；ＤＨＦＲ及びイムノアドヘシン配列をコードする遺伝子コピーの数が同時に増幅されているクローンが選択される。イムノアドヘシンがそのＮ末端に疎水性リーダー配列を含んでいる場合には、それは形質移入細胞によってプロセッシングされ分泌される可能性が高い。より複雑な構造を持つイムノアドヘシンの発現には独特に適合された宿主細胞が必要となりうる；例えば、軽鎖又はＪ鎖のような成分がある種のミエローマ又はハイブリドーマ細胞宿主によって提供されうる（上掲のGascoigne等, 1987, Martin等, J. Virol., 67:3561-3568 (1993)）。
イムノアドヘシンはアフィニティークロマトグラフィーによって簡便に精製できる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性はキメラに使用される免疫グロブリンＦｃドメインのアイソタイプ及び種に依存する。プロテインＡはヒトγ１、γ２又はγ４重鎖に基づくイムノアドヘシンを精製するために使用できる（Lindmark等, J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている（Guss等, EMBO J. 5: 1567-1575 (1986)）。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他のマトリックスも使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。プロテインＡ又はＧアフィニティーカラムへイムノアドヘシンを結合させるための条件はＦｃドメインの特性によって完全に支配される；つまり、その種及びアイソタイプである。一般に、適切なリガンドが選択されると、効率的な結合が無条件培地流体から直接生じる。イムノアドヘシンの一つの顕著な特徴は、ヒトγ１分子の場合、プロテインＡに対する結合能が同じＦｃタイプの抗体に対して若干消失していることである。結合したイムノアドヘシンは酸性ｐＨ（３．０かそれ以上）又は穏やかなカオトロピック塩を含む中性ｐＨバッファーの何れかで効率的に溶出させることができる。このアフィニティークロマトグラフィー工程により＞９５％の純度のイムノアドヘシンの調製物を得ることができる。
従来から知られている他の方法も、イムノアドヘシンの精製のために、プロテインＡ又はＧのアフィニティークロマトグラフィーの代わりに又はそれに加えて使用することができる。イムノアドヘシンは、硫黄親和性ゲルクロマトグラフィー（Hutchens等, Anal. Biochem., 159:217-226 (1986)）及び固定化金属キレートクロマトグラフィー（Al-Mashikhi等, J. Dairy Sci., 71:1756-1763 (1988)）では抗体と同様に挙動する。しかし、抗体とは異なり、イオン交換カラムにおけるその挙動はその等電点によってだけでなく、そのキメラの性質による分子中に存在しうる電荷双極子によっても支配される。
望まれるならば、イムノアドヘシンは二重特異的になされ得る。よって、本発明のイムノアドヘシンはＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦドメイン及び、ＶＥＧＦ、Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦに限定しない他の成長因子由来のドメインのようなドメインを組合せうる。二重特異的分子では、その抗体様構造の一方のアームがキメラ抗体重鎖で他方のアームがキメラ抗体重鎖-軽鎖対からなる三量体分子が、精製が簡単であるので有利である。１０の四量体の混合物をつくり出す、二重特異的イムノアドヘシンの産生に伝統的に使用されている抗体産生クアドローマと異なり、三量体イムノアドヘシン構造の３つの鎖をコードしている核酸を形質移入した細胞は、３つの分子のみの混合物を生産し、よってこの混合物からの所望される産物の精製は簡単である。
Ｆ．Ｂｖ８活性及びＥＧ−ＶＥＧＦ活性のモジュレーター
本発明はまたＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの一又は複数の生物学的活性を模倣又は亢進し（アゴニスト）あるいはＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの効果を阻害する（アンタゴニスト）ものを同定するために化合物をスクリーニングする方法をも包含する。Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦアゴニスト及びアンタゴニストはまたＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦモジュレーターとそれぞれ呼ばれる。アンタゴニスト薬物候補のスクリーニングアッセイはＢｖ８ポリペプチド及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドに結合し又はそれと複合体を形成し、あるいは他の細胞性タンパク質とのＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの相互作用に干渉等する化合物を同定するように設計される。
１．小分子スクリーニング
小分子は、Ｂｖ８アゴニスト又はアンタゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアゴニスト又はアンタゴニストとして作用しうる能力を持ち得、よって治療的に有用でありうる。かかる小分子には、天然に生じる小分子、合成の有機又は無機化合物及びペプチドが含まれうる。しかし、本発明の小分子はこれらの形態に限定されるものではない。小分子の広範なライブラリーが商業的に利用でき、所望の活性についてこれらの分子をスクリーニングするための様々なアッセイ法が当該分野でよく知られている。
候補Ｂｖ８アゴニスト又はアンタゴニスト、及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアゴニスト又はアンタゴニスト小分子は、好ましくは、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ活性の潜在的なモジュレーターの迅速な同定を可能にするアッセイで最初に同定される。そのようなアッセイの例は、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦレセプターに候補分子が結合する能力が測定されるタンパク質-タンパク質結合アッセイである。他の例では、Ｂｖ８レセプターへのＢｖ８の結合、又はＥＧ−ＶＥＧＦレセプターへのＥＧ−ＶＥＧＦの結合を妨害する候補分子の能力が測定される。ある実施態様では、Ｂｖ８レセプター又はＥＧ−ＶＥＧＦレセプターそれぞれはＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-１及び／又はＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-２である。
好適な実施態様では、小分子Ｂｖ８アゴニスト及びＥＧ−ＶＥＧＦはＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦそれぞれの一又は複数の生物学的活性を模倣するその能力によって同定される。例えば、内皮細胞の増殖を誘導し、以下に記載されているように内皮細胞生存を促進し、又は血管形成を誘導するその能力について候補化合物はスクリーニングされる。Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの記載した生物学的活性の一以上を誘導する候補化合物はアゴニストとして同定される。
他の実施態様では、小分子Ｂｖ８アンタゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストはＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦそれぞれの生物学的活性の一又は複数を阻害するその能力によって同定される。例えば、以下に記載されているように、内皮細胞の増殖、内皮細胞の生存、血管形成を阻害する能力について候補化合物をスクリーニングする。Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの記載した生物学的活性の一以上を誘導する候補化合物はアンタゴニストとして同定される。
候補化合物が血管形成を誘導する又は阻害する能力は、例としてＷＯ０２／００７１１及びＷＯ０３／０２０８９２に記載のようなマウス検査で決定する。
内皮細胞の増殖は、例としてＷＯ０２／００７１１及びＷＯ０３／０２０８９２に記載のように決定する。簡単に言えば、候補アンタゴニスト化合物に作用していた候補アゴニスト化合物又はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを含む、１０％ウシ血清アルブミン添加の低グルコースＤＭＥＭ中で内皮細胞を生育させる。６又は１２ウェルディッシュに４０００〜６０００細胞／ｍｌの濃度で内皮細胞をおく。アッセイ５〜７日目に内皮細胞をトリプシン処理して、Coulterカウンターを用いて細胞数を定量する。
内皮細胞の生存は、例としてＷＯ０２／００７１１及びＷＯ０３／０２０８９２に記載のように決定する。簡単に言えば、およそ２×１０５ウシ脳毛細血管細胞を１０％ウシ血清アルブミン添加低グルコースＤＭＥＭ中に設置し、２４時間インキュベートする。そうして培地を吸引して、候補アンタゴニスト化合物に作用していた候補アゴニスト化合物又はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを含む培地に再設置する。細胞を４８時間インキュベートして、トリプシン処理し、７０％エタノールにて固定する。固定した細胞をプロピジウムヨウ素にて染色し、ＲＮアーゼ及び細胞のサブＧ１プロファイルをＦＡＣ分析にて決定する。
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアゴニスト又はアンタゴニストとして同定された化合物は本発明の方法に用いることができる。例として、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストは癌の治療に利用しうる。
２．抗体の調製と同定
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ、及びアンタゴニストヒト及び非ヒトポリクローナル及びモノクローナル抗体（非ヒトモノクローナル抗体のヒト化型を含む）の生物学的性質を模倣し、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的性質を阻害するアゴニストヒト及び非ヒトポリクローナル及びモノクローナル抗体（非ヒトモノクローナル抗体のヒト化型を含む）もまた本発明において考慮される。これらにはアミノ酸配列変異体、グリコシル化変異体及び抗体断片が含まれる。そのような抗体の生産とアゴニスト抗体の選択のための一般的な技術は当該分野において知られており、以下に簡単に説明する。
（ｉ）ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体を調製する方法は、当該分野で知られている。例えば、ポリクローナル抗体は、免疫剤の一又は複数回、そして所望するならばアジュバントの注入によって哺乳動物で産生することができる。典型的には、免疫化剤及び／又はアジュバントが複数回の皮下又は腹腔内注射によって哺乳動物に注射されるであろう。免疫剤を免疫化した哺乳動物にとって免疫原性であることが知られているタンパク質、例えば血清アルブミン、又は大豆トリプシンインヒビターと結合させることが有益であり得る。用いられ得るアジュバントの例には、完全フロイントアジュバント及びＭＰＬ-ＴＤＭが含まれる。
（ｉｉ）モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は、Kohlerら, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４，８１６，５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターもしくはマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの産生を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰ-２１およびＭ．Ｃ．-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヴィル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)）。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson等, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定した後、該細胞を限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外では免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。ＤＮＡはまた、例えば、相同的マウス配列の代わりにヒト重鎖及び軽鎖定常部のコード化配列を置換することによって（Morrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード化配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード化配列の全て又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。そのように、「キメラ」又は「ハイブリッド」抗体は、ここに記載したＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦアゴニストモノクローナル抗体、もしくはＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストモノクローナル抗体の結合特異性を有するように調製される。
キメラ又はハイブリッド抗体は、また、架橋剤に関するものを含む、既知の合成タンパク質化学の方法を用いてインビトロで調製され得る。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合の形成によって構築され得る。この目的に関して適した試薬の例としては、イミノチオレート及びメチル-４-メルカプトブチルイミデートが含まれる。
抗体の組換え生産は以下に更に詳細に説明する。
（ｉｉｉ）ヒト化抗体
一般的に、ヒト化抗体には非ヒトを源にする一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は本質的にはWinterと共同研究者（Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536(1988)）の方法に従って、齧歯類ＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(Cabilly, 上掲)である。実際には、ヒト化抗体は典型的にはある程度のＣＤＲ残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されるヒト抗体である。
抗体が、抗原及び他の好ましい生物学的特性に対する高い親和性の保持をともなってヒト化されることは重要である。この目的を達成するために、好ましい方法によって、ヒト化抗体は、親及びヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列及び概念上のヒト化産物の分析の工程によって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、広く入手可能であり、当該分野に熟練した者にとっては良く知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の可能性のある三次元立体配置構造を例示して表示するコンピュータープログラムが入手可能である。これら表示の検討によって、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の可能性ある役割の分析が可能になる、すなわち、候補免疫グロブリンのその抗原へ結合する能力に影響を及ぼす残基の分析である。この方法では、標的抗原に対して増大した親和性のような所望される抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基がコンセンサス及び移入配列から選択されて組み合わされることが可能である。一般的に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を与えることに、直接的かつ最も実質的に関与している。更なる詳細については、米国出願第５８２１３３７号及び同第６０５４２９７号を参照のこと。
（ｉｖ）ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の生産のためのヒトミエローマ及びマウス-ヒトヘテロミエローマ細胞株は，例えば，Kozbor, J. Immunol. 133, 3001(1984), 及びBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987）によって記載されている。
免疫化することで、内因性免疫グロブリンの生産なしに、ヒト抗体のレパートリーを生産することが可能なトランスジェニック動物（例えばマウス）を生産することが現在は可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系変異体マウスでの抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子のホモ接合体欠失は、内因性抗体の生産の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系変異体マウスでのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子配列の転移は、抗原の挑戦によってヒト抗体の生産を引き起こす。例えば、Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551-255(1993)；Jakobovits等, Nature 362, 255-258(1993)を参照のこと。
Mendez等(Nature Genetics 15: 146-156[1997]）は、さらに技術を改良し、抗原の挑戦を受けた際に、高親和性の完全なヒト抗体を生成する「XenomouseII」と命名されたトランスジェニックマウスの系統を作製した。これは、上に記載したような内因性のＪＨセグメントへの欠損をともなうマウスへのメガベースヒト重鎖及び軽鎖遺伝子座の生殖細胞系組み込みによって達成された。XenomouseIIは、およそ６６ＶＨ遺伝子、完全なＤＨ及びＪＨ領域及び３つの異なる定常領域（μ，δ及びχ）を含む１０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を有し、そしてまた、３２Ｖκ遺伝子、Ｊκセグメント及びＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスで生産される抗体は、遺伝子再構成、構築及びレパートリーを含む全ての点でヒトにおいて見られるものと極めて類似している。ヒト抗体は、マウス遺伝子座での遺伝子再構成を防ぐ内因性のＪＨセグメントの欠損のために、内因性抗体より優先的に多く発現される。
あるいは、ファージディスプレイ技術（MaCafferty等, Nature 348, 552-553[1990]）を、免疫化されていない供与体の免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからヒト抗体及び抗体断片をインビトロで生産することに用いることができる。この技術によると、抗体Ｖドメイン遺伝子は、Ｍ１３又はｆｄのような糸状バクテリオファージの主要又は副コートタンパク質遺伝子のいずれかへインフレームでクローンされ、ファージ粒子の表面上に機能性抗体断片として表示される。糸状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むことから、抗体の機能的特性に基づいた選択も、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択をする結果となる。従って、ファージは、Ｂ細胞の幾つかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々のフォーマットでおこなうことができる；それらの概説として、例えば、Johnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3, 564-571(1993)を参照せよ。Ｖ遺伝子セグメントの幾つかのソースをファージディスプレイのために用いることができる。Clackson等, Nature 352, 624-628(1991)は、免疫化したマウスの脾臓から取り出したＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトリアルライブラリーから、多様な抗-オキサゾロン抗体を単離した。免疫化していないヒト供与体のＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、多様な抗原（自己抗原を含む）に対する抗体を、基本的にMarks等, J. Mol. Biol. 222, 581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12, 725-734(1993)によって記載されている技術に従って単離することができる。天然免疫応答では、抗体遺伝子は高速度で変異を蓄積する（体細胞過剰変異）。導入された幾つかの変化は、より高い親和性を与え、そして高親和性表面免疫グロブリンを表示するＢ細胞は、後の抗原の挑戦の間に、優先的に複製されて分化する。この天然プロセスは、「鎖シャフリング」として知られている技術を用いて模倣することができる（Marks等, Bio/Technol. 10, 779-783[1992]）。この方法では、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を、重鎖及び軽鎖Ｖ領域遺伝子を、免疫化していない供与体から得られたＶドメイン遺伝子の天然に生じる変異体（レパートリー）のレパートリーで経時的に置き換えることによって改良することができる。この技術は、ｎＭの程度での親和性で、抗体及び抗体断片の生産を可能にする。かなり大きなファージ抗体レパートリーを作製するための戦略（「全てのライブラリーのもと」としても知られている）は、Waterhouseら., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266(1993)によって記載され、そのような大きなファージライブラリーからの直接の高親和性ヒト抗体の単離は、Griffith等, 1993, EMBO J. 12:725-734によって報告されている。ジーンシャッフリングは、また、げっ歯動物の抗体からヒト抗体を誘導するために用いられ、そのヒト抗体は、最初のげっ歯抗体に対して類似の親和性及び特異性を有する。「エピトープ・インプリンティング」とも呼ばれるこの方法によると、ファージディスプレイ技術によって得られたげっ歯抗体の軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換されて、げっ歯-ヒトキメラを作成する。抗原での選択は、機能性抗原結合部位を使うことができるヒト可変部の単離を引き起こす結果となる、すなわちエピトープは、パートナーの選択を支配（インプリント）する。残りのげっ歯Ｖドメインを置換するために工程が繰り返されると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日に発行のＰＣＴ特許出願国際公開９３／０６２１３を参照のこと）。ＣＤＲ移植によるげっ歯抗体の伝統的なヒト化とは違って、この技術によって、げっ歯起源のフレームワーク又はＣＤＲ残基を有しない完全なるヒト抗体を提供される。
（ｖ）二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の同時発現に基づく（Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内の一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、通常はアフィニティークロマトグラフィー工程によってなされるが、かなり面倒であり、産物の収率は低い。同様の手順が１９９３年５月１３日公開の国際公開９３／０８８２９、及びTraunecker等, EMBO 10:3655-3659 (1991)に開示されている。
異なる、より好ましい方法によって、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを、免疫グロブリン定常ドメイン配列へ融合することができる。この融合は、好ましくは、少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には、軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするＤＮＡ、そして望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主微生物へ同時形質移入する。これにより、組立に使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチドフラグメントの相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２または３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供)ことからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、１９９４年３月３日公開の国際公開９４／０４６９０に開示されている。
二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。
（ｖｉ）ヘテロコンジュゲート抗体
ヘテロコンジュゲート抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため（米国特許第４６７６９８０号）及びＨＩＶ感染の治療のために（ＰＣＴ出願国際公開９１／００３６０；国際公開９２／２００３７３；ＥＰ０３０８９）提案されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋方法を用いて作製することができる。適した架橋剤は当該分野でよく知られており、米国特許第４６７６９８０号に、多くの架橋方法と共に開示されている。
（ｖｉｉ）抗体断片
ある実施態様では、アゴニスト及び／又はアンタゴニスト抗体（マウス、ヒト及びヒト化抗体、及び抗体変異体を含む）は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導される(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81 (1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167 (1992))。他の実施態様では、Ｆ(ａｂ')２分子の組立を促進するロイシンジッパーＧＣＮ４を使用してＦ(ａｂ')２が形成される。他のアプローチ法では、Ｆｖ、Ｆａｂ又はＦ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。
（ｖｉｉｉ）アゴニスト抗体の同定
Ｂｖ８アゴニスト抗体及びＥＧ−ＶＥＧＦアゴニスト抗体は、限定するものではないが、内皮細胞の増殖、内皮細胞の生存、及び血管形成を含むＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的活性を引き起こす能力に基づいて同定する。内皮細胞の増殖、内皮細胞の生存、及び血管形成を決定するアッセイは当分野において既知である。内皮細胞の増殖の誘導は小分子の項目で記載したように分析することができる。Ｂｖ８アゴニスト抗体及びＥＧ−ＶＥＧＦアゴニスト抗体は、例としてWO02/00711及びWO03/020892に記載のようにマウス検査におけるその血管形成誘導能力により同定することができる。
（ｉｘ）アンタゴニスト抗体の同定
Ｂｖ８アンタゴニスト抗体及びＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニスト抗体は、例として前述の一アッセイを用いて、限定するものではないが、内皮細胞の増殖、内皮細胞の生存、及び血管形成を含むＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害する能力に基づいて同定する。
Ｇ．Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと相互作用するタンパク質のスクリーニング
タンパク質-タンパク質相互作用を検出するのに適した任意の方法を、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと相互作用する、限定するものではないが膜貫通又は細胞内タンパク質を含む、タンパク質又は他の分子を同定するために使用することができる。使用することができる伝統的な方法としては、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦと相互作用するタンパク質を同定するための免疫共沈降、架橋及び勾配又はクロマトグラフィーカラムでの同時精製である。このようなアッセイにおいては、Ｂｖ８成分又はＥＧ−ＶＥＧＦ成分は完全長タンパク質、その可溶型誘導体、対象のドメインに対応するペプチド、又はＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのある領域を含む融合タンパク質でありうる。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦと相互作用可能なタンパク質をコードする遺伝子の同時の同定を可能にする方法を用いることができる。これらの方法には、例えば、標識Ｂｖ８、標識ＥＧ−ＶＥＧＦ又は標識したそれらの変異体を使用して、λｇｔ１１ライブラリーの抗体探索のよく知られた方法と同様な形で、発現ライブラリーを探索することが含まれる。
インビボでのタンパク質相互作用を検出する方法、２ハイブリッド(two-hybrid)系を、例示のためのみで限定をしないで詳細に説明する。この系の一つのバージョンが開示され（Chien等, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582）、クローンテック（Palo Alto, CA）から市販されている。
簡単に述べると、このような系を使用して、一方のプラスミドが、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれ由来のポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質をコードしているヌクレオチド配列に融合した転写活性化因子タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードしているヌクレオチドからなり、他方のプラスミドが、ｃＤＮＡライブラリーの一部としてこのプラスミド中に組み込まれた未知のタンパク質をコードしているｃＤＮＡに融合した転写活性化因子タンパク質のドメインをコードしているヌクレオチドからなる２ハイブリッドタンパク質をコードしているプラスミドが構築される。ＤＮＡ結合ドメイン融合プラスミドとｃＤＮＡライブラリーは、その調節領域が転写活性化因子の結合部位を含むレポーター遺伝子（例えばＨＢＳ又はｌａｃＺ）を含む酵母サッカロミセス・セレビシェの株に形質転換される。何れかのハイブリッドタンパク質だけではレポーター遺伝子の転写を活性化できない：ＤＮＡ結合ドメインハイブリッドは、活性化機能を提供しないので、活性化できず、活性化ドメインハイブリッドは、活性化因子の結合部位に局在化できないので、活性化できない。２ハイブリッドタンパク質の相互作用は機能的活性化因子タンパク質を再構成し、レポーター遺伝子の発現を生じ、該レポーター遺伝子はレポーター遺伝子産物のアッセイによって検出される。
２ハイブリッド系又は関連方法は、「ベイト」遺伝子産物と相互作用するタンパク質の活性化ドメインライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。例を挙げると、限定するものではないが、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦはベイト遺伝子産物として使用することができる。全ゲノム又はｃＤＮＡ配列が活性化ドメインをコードしているＤＮＡに融合される。このライブラリーとＤＮＡ結合ドメインに融合したベイトＢｖ８遺伝子産物又はベイトＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子産物のハイブリッドをコードしているプラスミドを酵母レポーター株中に同時形質転換し、得られた形質転換体を、レポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。例えば、限定するものではないが、ベイトＢｖ８遺伝子配列又はベイトＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子配列、例えば遺伝子オープンリーディングフレームを、それがＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードしているＤＮＡに翻訳的に融合されるようにベクター中にクローニングすることができる。これらのコロニーを精製し、レポーター遺伝子の発現の生じるライブラリープラスミドを単離する。ついで、ＤＮＡ配列決定法を使用して、ライブラリープラスミドによってコードされているタンパク質を同定する。
ベイトＢｖ８遺伝子産物又はベイトＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子産物と相互作用するタンパク質が検出されることになる細胞株のｃＤＮＡライブラリーは、当該分野において常套的に実施されている方法を用いて作製できる。ここに記載された特定の系によれば、例えば、ｃＤＮＡ断片を、それらがＧＡＬ４の転写活性化ドメインに翻訳的に融合されるようにベクター中に挿入することができる。このライブラリーを、ＧＡＬ４活性化配列を含むプロモーターによって作用されるｌａｃＺ遺伝子を含む酵母株中にベイトＢｖ８遺伝子-ＧＡＬ４融合プラスミド又はベイトＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子-ＧＡＬ４融合プラスミドと共に同時形質転換できる。ベイトＢｖ８遺伝子産物又はベイトＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子産物と相互作用するＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合したｃＤＮＡコード化タンパク質が活性なＧＡＬ４タンパク質を再構成し、よって発現を駆動する。発現を駆動するコロニーは当該分野で常套的な方法によって検出することができる。ついで、ｃＤＮＡをこれらの株から精製し、使用して、当該分野で常套的に実施されている方法を用いてベイトＢｖ８遺伝子相互作用タンパク質又はベイトＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子相互作用タンパク質を製造し単離することができる。
１．Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ発現又は活性を調節する化合物
次のアッセイは、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦと相互作用する（例えば結合する）化合物、その結合対、同族体又はレセプターとのＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの相互作用を妨害する化合物、及びＢｖ８遺伝子発現及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子発現の活性を調節する（つまりＢｖ８遺伝子発現及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子発現レベルを調節する）か又は体中のＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦのレベルを調節する化合物を同定するように設計されている。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子調節配列（例えばプロモーター配列）に結合し、従ってＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子の発現を調節しうる化合物を同定するアッセイもまた利用できる。出典明記によりその全体がここに取り込まれる、例えばPlatt, K.A., 1994, J. Biol. Chem. 269:28558-28562を参照のこと。
本発明によってスクリーニングすることができる化合物には、限定されるものではないが、ペプチド、可溶性レセプター又はその断片、抗体とその断片、及びＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ、又はＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプターに結合し天然リガンド（アゴニスト）によって惹起された活性を模倣するか又は天然リガンド（アンタゴニスト）によって惹起された活性を阻害する他の有機化合物（例えばペプチドミメティックス）が含まれる。
そのような化合物には、限定されるものではないが、ペプチド、例えば、限定されるものではないがランダムペプチドライブラリーのメンバーを含む可溶型ペプチド；（例えばLam, K.S.等, 1991, Nature 354:82-84; Houghten, R等, 1991, Nature 354:84-86を参照）、及びＤ形及び／又はＬ形アミノ酸からなるコンビナトリアル化学誘導分子ライブラリー、ホスホペプチド（限定するものではないが、ランダムな又は部分的に縮重した定方向ホスホペプチドライブラリーのメンバーを含む；例えばSongyang, Z等, 1993, Cell 72:767-778を参照）、抗体（限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、抗イディオタイプ、キメラ又は単鎖抗体、ＦＡｂ、Ｆ(ａｂ')２及びＦＡｂ発現ライブラリー断片、及びそのエピトープ結合断片を含む）、及び小有機又は無機分子が含まれうる。
本発明によってスクリーニングできる他の化合物には、限定されるものではないが、適切な細胞（例えば内皮細胞）中に進入し得、Ｂｖ８遺伝子又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子、もしくはＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ媒介経路に関与するある種の他の遺伝子の発現に（例えば遺伝子発現に関与する転写因子又は調節領域との相互作用によって）影響を及ぼす小有機分子；又はＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの活性又はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦシグナル伝達、異化、又は代謝経路に関与するある種の他の細胞内因子の活性に影響を及ぼし又はそれに代わる化合物が含まれる。
コンピュータモデル化及び検索技術によって、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ発現又は活性を調節可能な化合物の同定、又は既に同定された化合物の改良が可能になる。そのような化合物又は組成物を同定すれば、活性な部位又は領域が同定される。そのような活性部位は典型的にはリガンド結合部位であるかも知れない。例えばペプチドのアミノ酸配列から、核酸のヌクレオチド配列から、又はその天然リガンドとの関連化合物又は組成物の複合体の研究から、当該分野で知られている方法を使用して活性部位を同定することができる。後者の場合、化学的又はＸ線結晶学的方法を用いて、因子のどこに複合体化リガンドが見出されるかを見出すことにより活性な部位を見出すことができる。
次に、活性な部位の３次元幾何構造が決定される。これは、完全な分子構造を決定することができる、Ｘ線結晶構造解析を含む既知の方法によってなすことができる。他方、固相又は液相ＮＭＲを用いて、ある分子内距離を決定することができる。構造決定の任意の他の実験的方法を使用して、部分的な又は完全な幾何構造を得ることができる。幾何構造は、天然又は人工の複合体化リガンドを用いて測定することができ、これは決定される活性部位構造の精度を増大しうる。
不完全な又は不十分に精確な構造が決定される場合、コンピュータベースの数値モデリング方法を用いて、構造を完全にし又はその精度を改善することができる。タンパク質又は核酸のような特定の生体高分子に特異的なパラメータ化モデル、分子の動きの計算に基づく分子動力学モデル、熱アンサンブルに基づく統計的力学モデル、又は組合せモデルを含む、任意の認識されたモデリング方法を用いることができる。殆どのタイプのモデルに対して、構成原子及び基間の力を表す標準的な分子力場が必要であり、物理化学において知られている力場から選択することができる。不完全な又は精度が悪い実験的な構造は、これらのモデリング法によって計算される完全でより精確な構造に対する制約となり得る。
最後に、実験的であれ、モデリングによってであれ、又は組合せによってであれ、活性な部位（又は結合部位）の構造を決定すると、その分子構造に関する情報に沿って化合物を含むデータベースを検索することによって候補の調節化合物を同定することができる。そのような検索は、決定された活性な部位の構造に一致し、活性な部位を定める基と相互作用する構造を持つ化合物を探す。そのような検索はマニュアルであってもよいが、好ましくはコンピュータ支援のものである。この検索から見出されたこれらの化合物はＢｖ８活性及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ活性の潜在的なモジュレーターである。
あるいは、これらの方法を用いて、既に知られている調節化合物又はリガンドから改善された調節化合物を同定することができる。既知の化合物の組成(composition)は修飾でき、修飾の構造的効果は、新しい組成に適用される上述の実験的及びコンピュータモデリング方法を使用して決定することができる。ついで、変更された構造が、改善された一致又は相互作用を生じるかを決定するために化合物の活性部位構造と比較される。このようにして、例えば側方基を変えることによる組成の系統的な変動を、改善された特異性又は活性のリガンド又は改変された調節化合物を得るために速やかに評価することができる。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの活性部位（又は結合部位）の同定に基づいて調節化合物、及び関連した伝達及び転写因子を同定するのに有用な更なる実験的及びコンピュータモデリング法は当業者には明らかであろう。
分子モデリング系の例はＣＨＡＲＭｍ及びＱＵＡＮＴＡプログラム（Polygen Corporation, Waltham, MA）である。ＣＨＡＲＭｍはエネルギー最小化及び分子力学関数を実行する。ＱＵＡＮＴＡは分子構造の構築、グラフモデリング及び解析を実行する。ＱＵＡＮＴＡは相互作用構造、修飾、可視化及び分子の互いの挙動の解析を可能にする。
多くの文献が特定のタンパク質と相互作用する薬物のコンピュータモデリングについて総説しており、例えばRotivinen等, 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166; Ripka, New Scientist 54-57 (1988年6月16日); McKinaly及びRossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29:111-122; Perry及びDavies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design pp.189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989); Lewis及びDean, 1989 Proc. R. Soc. Lond. 236:125-140及び141-162であり;また核酸成分のためのモデルレセプターに対しては、Askew等, 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090である。化学物質をスクリーニングし画像で示す他のコンピュータプログラムは、BioDesign社（Pasadena, CA）、Allelix社（Mississauga, Ontario, Canada）、及びHypercube社（Cambridge, Ontatio）のような会社から入手できる。これらのものは特定のタンパク質に特異的な薬物へ利用するために主として設計されているが、ＤＮＡ又はＲＮＡの領域に特異的な薬物の設計に、その領域が特定された場合には、適合化させることができる。
結合性を改変しうる化合物の設計と製造について上述したが、インヒビター又はアクチベーター化合物に対して、天然の生成物又は合成化学物質、及びタンパク質を含む生物学的に活性な物質を含む、既知の化合物のライブラリーをスクリーニングすることもできる。
ここに記載されるもののようなアッセイによって同定される化合物は、例えばＢｖ８遺伝子産物及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子産物の生物学的機能を解明するのに有用であろう。そのような化合物は様々な生理学的疾患の何れかを治療するために治療的に有効な用量で患者に投与することができる。治療的に有効な用量とは、何れかの生物学的徴候のあらゆる改善、障害、防止又は改変を生じるのに十分な化合物の量を意味する。
ｂ．Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦに結合する化合物
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと相互作用し（例えば結合し）又はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを模倣することができ、あるいは同族体レセプター、結合対又は基質へのＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの結合を妨害することができる化合物を同定するシステムが設計できる。同定される化合物は、例えば野生型及び／又は変異体Ｂｖ８遺伝子産物、ＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子産物、又はそれらの混合の活性を調節するのに有用であり得；Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの生物学的機能を詳しく調べるのに有用であり得；正常なＢｖ８の相互作用及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの相互作用を破壊する化合物を同定するためのスクリーニングに使用し得、あるいはそのような相互作用をそれ自身が破壊し又は活性化させうる。
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ、又はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ同族体レセプター又は基質に結合する化合物を同定するために使用されるアッセイの原理は、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと試験化合物の反応混合物を、二つの化合物が相互作用し結合し、よって除去され及び／又は反応混合物において検出され得る複合体を形成する条件と時間で、調製することを含む。使用されるＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ種はスクリーニングアッセイの目標に応じて変わりうる。例えば、天然レセプターのアゴニストが所望される場合は、完全長Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ、又は可溶型切断Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ、ペプチド、又はアッセイ系において利点を生じるタンパク質又はポリペプチド（例えば標識、得られた複合体の単離等々）に融合した一又は複数のＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦドメインを含む融合タンパク質を用いることができる。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと直接相互作用する化合物が探索されている場合は、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦに対応するペプチド及びＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦを含む融合タンパク質を用いることができる。
スクリーニングアッセイは様々な方法で実施することができる。例えば、そのようなアッセイを実施する一方法は、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド、ペプチド、又はそれからの融合タンパク質、又は試験物質を固相に固着させ、反応の終わりに固相に固着したＢｖ８／試験化合物複合体又はＥＧ−ＶＥＧＦ／試験化合物複合体を検出することを含むであろう。そのような方法の一実施態様では、Ｂｖ８反応物又はＥＧ−ＶＥＧＦ反応物が固相に固着させられ、固着しない試験化合物が、直接的か間接的に、標識されうる。
実際には、マイクロタイタープレートを固相として簡便に利用することができる。固着成分は非共有又は共有結合によって固定されうる。非共有結合は固体表面にタンパク質の液を単に被覆し乾燥させることによって達成できる。あるいは、固定化されるタンパク質に特異的な固定化抗体、好ましくはモノクローナル抗体は固体表面にタンパク質を固着させるために使用できる。表面は前もって準備し保存できる。
アッセイを実施するために、非固定化成分を、固着成分を含む被覆表面に加える。反応が完了した後、未反応の成分を、形成されたあらゆる複合体が固体表面上に固定化されたままになる条件下で（例えば洗浄により）除去する。固体表面に固着した複合体の検出は多くの方法で達成することができる。前の非固定化成分が事前に標識されている場合は、表面に固定化された標識の検出が、複合体が形成されたことを示す。前の非固定化成分が事前に標識されていない場合は、間接的な標識を用いて、例えば前の非固定化成分に特異的な標識抗体（該抗体はついで直接的に標識され又は間接的に標識抗Ｉｇ抗体で標識されうる）を使用して、表面上に固着された複合体を検出することができる。
あるいは、反応を液相中で実施することができ、反応産物は未反応成分から分離され、複合体が、例えば溶液中に形成されたあらゆる複合体を固着させるためにＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質又は試験化合物に特異的な固定化抗体を、固着した複合体を検出するために可能な複合体の他の成分に特異的な標識抗体を使用して、検出される。
ｃ．Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ相互作用を妨害する化合物
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと相互作用する巨大分子は、この検討の目的では「結合対」と称する。これらの結合対はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ媒介生物学的経路に関与している可能性が高い。従って、体内におけるＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ活性を調節し又は増大させ、及び／又はこの活性（又はその欠乏）に関連する疾患を制御するのに有用でありうるそのような結合対の相互作用に干渉し又はこれを破壊する化合物を同定することが望ましい。
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦと結合対又は結合対類間の相互作用を妨害する化合物を同定するために使用されるアッセイ系の基本的原理は、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそのある種の変異体と、その結合対の反応混合物を、二つが相互作用し結合し、よって複合体を形成する条件と時間で、調製することを含む。阻害活性について化合物を試験するために、反応混合物を試験化合物の存在下及び非存在下で調製する。試験化合物は反応混合物中に最初から含められるか、又はＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦとその結合対の添加に続いて添加されうる。コントロール反応混合物は試験化合物を含めないで又はプラシーボと共にインキュベートされる。ついでＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦと結合対の間のあらゆる複合体の形成を検出する。試験化合物を含む反応混合物ではなく、コントロール反応における複合体の形成は、化合物がＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦと相互作用結合対の相互作用を妨害することを示している。また、試験化合物と通常のＢｖ８タンパク質又は通常のＥＧ−ＶＥＧＦタンパク質を含む反応混合物内における複合体の形成は、また試験化合物と変異体Ｂｖ８又は変異体ＥＧ−ＶＥＧＦそれぞれを含む反応混合物内の複合体形成と比較されうる。この比較は、通常のタンパク質ではなく変異体、又は変異されたＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦの相互作用を特異的に破壊する化合物を同定することが望まれる場合に重要でありうる。
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと結合対間の相互作用を妨害する化合物のアッセイは不均一又は均一な様式で実施することができる。不均一アッセイはＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ又はそれらの結合対の何れかを固相に固着させ、反応の終わりに固相上に固着した複合体を検出することを含む。均一アッセイでは、全反応が液相中で実施される。何れのアプローチでも、反応物の添加順序は試験されている化合物に関して異なった情報を得るために変化させることができる。例えば、競合によって相互作用を妨害する化合物は、試験物質の存在下で反応を行わしめることにより、すなわち、試験物質を、Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ及び相互作用性結合対に先だって又はそれらと同時に反応混合物に加えることにより、同定することができる。あるいは、前もって形成された複合体を破壊する化合物、例えば複合体から成分の一つを分離させる高い結合定数を持つ化合物を、複合体の形成後に試験化合物を反応混合物に添加することによって試験することができる。様々な様式を以下に簡単に説明する。
不均一アッセイ系では、ポリペプチド（Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ）又はポリペプチドの相互作用性結合対の何れかが固体表面に固着される一方、非固着種が直接的にか間接的に標識される。実際には、マイクロタイタープレートを簡便に利用することができる。固着種は非共有又は共有結合によって固定されうる。非共有結合は固体表面にポリペプチド又は結合対の液を単に被覆し乾燥させることによって達成できる。あるいは、固定化される種に特異的な固定化抗体を、固体表面に種を固着させるために使用できる。表面は前もって準備し保存できる。
アッセイを実施するために、固定化種の対を、試験化合物を被覆した又は被覆していない表面に暴露する。反応が完了した後、未反応の成分を（例えば洗浄により）除去し、形成されたあらゆる複合体が固体表面上に固定化されたまま残る。固体表面に固着した複合体の検出は多くの方法で達成することができる。非固定化種が事前に標識されている場合は、表面に固定化された標識の検出が、複合体が形成されたことを示す。非固定化種が事前に標識されていない場合は、間接的な標識を用いて、例えば最初の非固定化種に特異的な標識抗体（該抗体はついで直接的に標識され又は間接的に標識抗Ｉｇ抗体で標識されうる）を使用して、表面上に固着された複合体を検出することができる。反応成分の添加順序に応じて、複合体形成を阻害し又は前もって形成された複合体を破壊する試験化合物を検出することができる。
あるいは、反応を試験化合物の存在下又は非存在下で液相中で実施することができ、反応産物は未反応成分から分離され、複合体が、例えば溶液中に形成されたあらゆる複合体を固着させるために結合成分の一つに特異的な固定化抗体を、固着した複合体を検出するために他の結合対に特異的な標識抗体を使用して、検出される。再び、液相への反応物の添加順序に応じて、複合体形成を阻害し又は前もって形成された複合体を破壊する試験化合物を同定することができる。
本発明の他の実施態様では、均一アッセイを用いることができる。このアプローチ法では、ポリペプチド（Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ）と相互作用結合対の前もって形成された複合体で、ポリペプチド又はその結合対の何れかが標識されているが、標識によって生じるシグナルが複合体の形成のためにクエンチされるものが調製される（例えばイムノアッセイにこの方法を利用しているRubensteinの米国特許第４１０９４９６号を参照のこと）。前もって形成された複合体と競合し、それから種の一つを置換する試験物質の付加により、バックグラウンドを超えるシグナルが生成される。このようにして、相互作用を破壊する試験物質を同定することができる。
特定の実施態様では、Ｂｖ８（又はＥＧ−ＶＥＧＦ）融合体を固定化のために調製することができる。例えば、ポリペプチド（Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ）又はそのペプチド断片を、その結合活性が、得られる融合タンパク質中に維持されるように、ｐＧＥＸ-５Ｘ-１のような融合ベクターを使用してグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合させることができる。当該分野で常套的に実施され上述された方法を使用して、相互作用結合対を精製し、モノクローナル抗体を得るために使用することができる。この抗体は、当該分野で常套的に実施されている方法によって、例えば放射性同位元素１２５Ｉで標識することができる。不均一アッセイでは、融合タンパク質をグルタチオン-アガロースビーズに固着させることができる。ついで、相互作用性結合対を、相互作用と結合を生じせしめる形で試験化合物の存在下又は不存在下で加えることができる。反応期間の終わりに、未結合物質を洗い去ることができ、標識されたモノクローナル抗体を系に添加して複合体成分に結合させることができる。ポリペプチド（Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ）と相互作用性結合対の間の相互作用は、グルタチオン-アガロースビーズに付随して残る放射能の量を測定することによって検出することができる。試験化合物による相互作用の阻害が成功すると、測定放射能は減少することになる。
あるいは、ＧＳＴ融合タンパク質と相互作用性結合対は固体グルタチオン-アガロースビーズの不存在下で液体中で互いに混合することができる。試験化合物は種が相互作用させられる間又はその後に加えることができる。ついで、この混合物をグルタチオン-アガロースビーズに加えることができ、未結合物質を洗い流す。再び、Ｂｖ８と結合対間又はＥＧ−ＶＥＧＦと結合対間の相互作用の阻害度は、標識抗体を加え、ビーズに付随する放射能を測定することによって検出することができる。
本発明の他の実施態様では、これらの同じ方法を、完全長タンパク質の一つ又は双方の代わりに、ポリペプチド（Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦ）及び／又は相互作用性又は結合対（結合対がタンパク質である場合）の結合ドメインに対応するペプチド断片を使用して用いることができる。当該分野で常套的に実施される任意の数の方法を使用して、結合部位を特定し分離することができる。これらの方法には、限定するものではないが、タンパク質の一つをコードする遺伝子の突然変異誘発及び免疫共沈降アッセイでの結合破壊のスクリーニングが含まれる。ついで、複合体中の第二の種をコードしている遺伝子の代償性突然変異体を選択することができる。各タンパク質をコードしている遺伝子の配列解析は、相互作用性結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異を明らかにする。あるいは、一つのタンパク質を、上述の方法を使用して固体表面に固着させ、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で処理されたその標識された結合対と相互作用させ結合させることができる。洗浄後に、結合ドメインを有する比較的短い標識されたペプチドは固体物質に付随したままであり得、これを単離してアミノ酸配列決定によって同定することができる。また、細胞内結合対をコードする遺伝子がひとたび取得されると、短い遺伝子セグメントを遺伝子操作してタンパク質のペプチド断片を発現させ、ついでその結合活性を試験し、精製又は合成することができる。
例えば、限定するものではないが、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦは、ＧＳＴ融合タンパク質を作製し、それをグルタチオンアガロースビーズに結合させることにより、上述のような固形物質に固着させることができる。相互作用性結合対は３５Ｓのような放射性同位元素で標識し、トリプシンのようなタンパク質分解酵素で開裂させることができる。ついで、開裂産物を固着融合タンパク質に加え、結合させることができる。未結合ペプチドを洗って除去した後、細胞内結合対結合ドメインを表す標識された結合物質を、よく知られた方法によって溶離させ、精製し、そのアミノ酸配列を分析することができる。このようにして同定されたペプチドは、合成的に製造し又は組換えＤＮＡ法を使用して適切な有益な(facilitative)タンパク質に融合させることができる。
Ｈ．製薬組成物
Ｂｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦのアゴニスト及びアンタゴニストを含むここに記載したＢｖ８ポリペプチド、ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド、及びそのモジュレーターは治療剤として用いることができる。本発明のこれらポリペプチド及びモジュレーターは、製薬的に有用な組成物を調製する公知の方法に従って処方することができ、ここでのＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ産物は製薬的に許容可能な担体ビヒクルと混合されて組み合わされる。Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合の治療用製剤は、所望される程度の純度を持つ、好ましくは本質的に純粋なＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを、凍結乾燥ケーク又は水溶液の形態で、任意成分の生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤と混合することにより調製される（上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences）。許容される担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で曝露される細胞又は哺乳動物に非毒性である。例としては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はトゥイーン(TWEEN)、プルロニクス(Pluronics)、又はＰＥＧ等の非イオン性界面活性剤が含まれる。
インビボ投与に使用されるＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦは滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過等、当該分野に置いて知られている任意の方法により容易に達成される。Ｂｖ８は凍結乾燥形態で保存してもよい。治療用Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ及びそれらの混合組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
Ｂｖ８は場合によっては他の成長因子と組み合わされ、又はそれと併せて投与される。例えばＥＧ−ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦと組み合わされうる。場合によってＥＧ−ＶＥＧＦは他の成長因子に結合させるか、組み合わせて投与する。例としてＢｖ８又はＶＥＧＦと結合しうる。
Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらのモジュレーターは、癌、他の血液疾患、好中球減少症、免疫不全性疾患、自己免疫疾患等を処置する他の一般的な治療法と共に使用してもよい。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変わりうる。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できる指針を提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42-96のMordenti, J. 及びChappell, W.「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド又はモジュレーターの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド又はモジュレーターを持続放出投与することが望まれる場合、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド又はモジュレーター、又はそれらの混合のマイクロカプセル化が考えられる。例えば、精製形態のＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合は、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル（例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）中に、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中又はマクロエマルション中に捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16版, 1980（A.Osol編）に開示されている。
Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合は治療用に使用するために徐放性調製物中に導入してもよい。徐放性調製物の適切な例には、マイクロカプセル又はフィルム等の、成形品の形態である半透性ポリマーマトリックスが含まれる。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)に記載されたようなヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１)、Ｌ-グルタミン酸とエチル-γ-Ｌ-グルタメートのコポリマー（Sidman等, Biopolymers 22:547 (1983)）、非分解性エチレン酢酸ビニル（上掲のLanger等）又は分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupron DepotＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３９８８）が含まれる。
エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日にわたって分子を放出できるが、所定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。カプセル化タンパク質は、長時間体内に残存すると、３７度の水分に曝される結果、変性又は凝集し、生物学的活性の喪失や免疫原性の変化のおそれがある。関連するメカニズムに応じてタンパク質の安定化のために合理的な処置が案出できる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合であることが分かったら、スルフヒドリル残基を改変し、酸性溶液から凍結乾燥し、水分量を調整し、適当な添加物を使用し、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することにより、安定化を達成することができる。
また、持続放出Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ組成物はリポソーム的に封入されたＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを含む。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを含有するリポソームは、それ自体周知である方法（Epstein等, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688; Hwang等, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030；独国特許出願公開第３２１８１２１号；欧州特許出願公開第５２３２２号；同第３６６７６号；同第８８０４６号；同第１４３９４９号；同第１４２６４１号；日本国特許出願第８３−１１８００８号；米国特許第４４８５０４５号及び同第４５４４５４５号；及び欧州特許出願公開第１０２３２４号）によって調製される。通常、リポソームは、脂質含有量が約３０モル％以上コレステロールであり、選択される割合が最適なＢｖ８治療法に対して調節された微小(約２００-８００オングストローム)な単ラメラ状のものである。
局所適用される場合、Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合は好適には他の成分、例えば担体及び／又はアジュバントと組み合わされる。そのような他の成分の性質には、それらの意図している投与について製薬的に許容可能でかつ有効であり、組成物の活性成分の活性を低下させ得ないこと以外に制限はない。適当なビヒクルの例には、軟膏、クリーム、ゲル、又は懸濁液を含み、精製コラーゲンを含んでも含まなくてもよい。また、組成物は経皮パッチ、プラスター、及び包帯に、好ましくは液体又は半液体形態で含浸させてもよい。
ゲル製剤を得るためには、液体組成物に製剤したＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合を、有効量の水溶性多糖類又はＰＥＧなどの合成ポリマーと混合して、局所投与するのに適した粘度のゲルを形成してもよい。用いられる多糖類は、例えば、セルロース誘導体、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、及びアルキルヒドロキシアルキルセルロースを含むエーテル化セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロース；デンプン及び分留デンプン；寒天；アルギン酸及びアルギン酸塩；アラビアゴム；プルラン；アガロース；カラゲナン；デキストラン；デキストリン；フルクタン；イヌリン；マンナン；キシラン；アラビナン；キトサン；グリコーゲン；グルカン；及び合成バイオポリマー；並びにガム、例えばキサンタンガム；グアーガム；イナゴマメガム；アラビアゴム；トラガカントガム；及びカラヤガム；及びそれらの誘導体及び混合物である。ここで好ましいゲル化剤は、生物学系に不活性で、非毒性で、調製が簡単で、なおかつ流動性がありすぎず粘性すぎず、そこに保持されるＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを不安定にさせないものである。
好ましくは、多糖類はエーテル化セルロース誘導体、より好ましくは良好に定義され、精製され、米国特許に列挙されたものであり、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース誘導体である。ここで最も好ましいのはメチルセルロースである。
ゲル化に有用なポリエチレングリコールは、典型的には適切な粘度を得るための低分子量及び高分子量のＰＥＧｓの混合物である。例えば、分子量４００−６００のＰＥＧと分子量１５００のものとの混合物は、ペーストを得るのに適した比率で混合した場合にこの目的に有効となるであろう。
多糖類及びＰＥＧｓに適用される「水溶性」という用語は、コロイド溶液及び分散物を含むことを意味する。一般に、セルロース誘導体の溶解度はエーテル基の置換度によって決まり、ここで有用な安定化誘導体は、そのようなエーテル基をセルロース鎖の無水グルコース単位当りに誘導体を水溶性とするのに十分な量有していなければならない。無水グルコース単位当りに少なくとも０．３５のエーテル基というエーテル置換度が一般に十分である。また、セルロース誘導体はアルカリ金属塩、例えばＬｉ、Ｎａ、Ｋ、又はＣｓ塩の形態であってもよい。
ゲルにメチルセルロースが用いられる場合、好ましくはゲルの約２−５％、より好ましくは約３％を含み、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦはゲル１ｍｌ当たりに約３００−１０００ｍｇの量で存在する。
ある状況では、インプラント可能な半透膜デバイスは薬剤送達手段として有用である。例えば、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ変異体、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦキメラ又はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアゴニスト又はアンタゴニストを分泌する細胞をカプセル化し、そのようなデバイスを患者の体内にインプラントすることができる。従って、特定の条件によってそれを必要とする患者の体内にＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを分泌する細胞をインプラントすることを含む、癌、他の血液疾患、好中球減少症、免疫疾患、自己免疫疾患等を防止し又は治療する方法も含まれる。最後に、本発明は、半透膜と、その膜内にカプセル化されるＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ（又は特定の条件に対して要求されうるそれらのアゴニストもしくはアンタゴニスト）を分泌する細胞を含むインプラントの患者への移植によって、癌、他の血液疾患、好中球減少症、免疫不全性疾患、自己免疫疾患等を防止又は治療するデバイスを含み、該膜はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ（又はそれらのアゴニストもしくはアンタゴニスト）に対して透過性であり、細胞に有害な患者からの因子に対して不透過性である。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを生成するように生体外で形質転換された患者自身の細胞を、場合によってはそのようなカプセル化をしないで、患者に直接移植することができる。生存している細胞の膜カプセル化方法は当業者には周知であり、カプセル化細胞の準備や患者内へのその移植は過度の実験を行わなくとも実施できる。
Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合、又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを含む製薬的組成物は好ましくは適切な容器中に配される。容器には好ましくは製薬組成物の適切な使用法と用量を詳細に記載した指示書が添付される。当業者には、これらの指示書は治療方法に応じて変わることが分かるであろう。
Ｉ．治療方法
ここで提供されるＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及びそれらのアゴニスト及びアンタゴニストは多くの診断的分析及び治療に使用することができる。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦは、限定するものではないが、造血幹細胞、ＣＤ３４＋骨髄祖先細胞、ＣＤ３４＋リンパ球祖先細胞、骨髄前駆細胞、リンパ球前駆細胞、単球、及びリンパ球を含めた骨髄細胞及びそれらのプロジェニーの増殖を誘導する。この増殖によりＢ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、及び特に好中球を含めた白血球細胞数が増加する。
Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及びそれらのアゴニストは、例として、限定するものではないが、骨髄祖先細胞、骨髄前駆細胞、好中球、リンパ球祖先細胞、リンパ球前駆細胞、及びリンパ球を含む骨髄細胞及びそれらのプロジェニーの増殖を上昇させ、又は、好中球、Ｂ細胞、又はＴ細胞等の特定の血液細胞型の生存を亢進させるのが望ましい場合の疾患又は症状の治療において治療的有効性がある。ある実施例では、疾病又は疾患を治療するのに有効な量のＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらのアゴニストを哺乳動物に投与する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合はポリペプチド又は核酸の形態で投与しうる。
例として、Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及びそれらのアゴニストは、好中球減少症、リンパ球減少症、又は一次的又は二次的なものでありうる免疫不全性疾患関連の症状及び疾患の治療に治療的有効性がある。これらの症状及び疾患は、例として遺伝性疾患、Ｂ細胞欠乏症、Ｔ細胞欠乏症、バクテリア及びウイルス感染を含む感染性疾患、浸潤性及び血液学的疾患、手術及び外傷、及び二次的免疫抑制効果を有する治療剤の摂取に関連しうる。
ある例では、二次的免疫抑制効果が結果として免疫不全性疾患になる。Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合は骨髄抑制からの造血回復促進のために、例として、治療処置を受けている癌患者であって、治療剤が循環する白血球レベルをひどく低くして患者の免疫系を損なう場合に利用しうる。Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合は、造血回復の促進及び／又は循環する好中球、Ｂ細胞及びＴ細胞数の増加のために、放射線療法、高用量化学療法、又は他の抗癌剤に先立って、組み合わせて、又はそれに続いて投与してよい。
Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合は、他の化合物又は組成物と共に投与してよい。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦは化合物又は組成物を用いた処置に先立って、その処置の間に、又はその処置の後に投与して、Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、及び／又は化合物又は組成物の治療効果を増加させる。前述のように、化合物又は組成物は化学療法剤でありうる。好適な化学療法剤には、限定されるものではないが、ビンクリスチン、シスプラチン、オキソプラチン、メトトレキセート、３'-アジド-３'-デオキシチミジン、タキサン類（例えばパクリタキセル（タキソール(登録商標), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ）及びドキセタキセル（タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France））及び／又はアントラサイクリン系抗生物質が含まれる。このような化学療法剤の調製物及び投与計画を決定する際には製造者の指示書に従ってもよいし、又は熟練した医療専門家が経験的に決定してもよい。そのような化学療法のための調製物と投与計画はまたChemotherapy Service編, M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。
他の実施態様では、Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合は、ＶＥＧＦ又はそれらのアゴニストと共に投与する。ＶＥＧＦはＶＥＧＦのレセプター選択的変異体でありうる。一実施態様では、化合物はＶＥＧＦ又はそのアゴニストのＦＬＴ１レセプター選択的変異体である。他の実施態様では、化合物はＶＥＧＦ又はそのアゴニストのＫＤＲレセプター選択的変異体である。
Ｂｖ８とＥＧ−ＶＥＧＦとそれらの混合のアンタゴニストは血球の異常増殖又は異常分化関連の血液疾患の治療に治療的有効性がある。異常増殖又は異常分化は結果として血液細胞の形成異常変化及び血液悪性腫瘍を引き起こす。特定の実施態様では、白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄形成異常症候群、リンパ球増殖性疾患、及びリンパ球形成異常疾患患者の治療を含む。ＡＬＬ、ＡＭＬ、ＭＰＤ、ＣＭＬ及びＭＤＳ細胞等の多種の白血病疾患の細胞はＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦのレセプターを発現することが明らかとなっている。Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦのアンタゴニストはこれら白血球細胞の増殖抑制に有用である。
Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦはＢ及びＴ細胞活性化を誘導する。これら分子のアゴニスト及びアンタゴニストは免疫応答の調節に治療的有効性がある。Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合又はそれらのアゴニストはＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、及び／又はＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖及び／又は活性化を誘導するために投与する。Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦのアンタゴニストはＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、及び／又はＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖及び／又は活性化を阻害するために投与する。
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦはＣＤ４＋Ｔリンパ球の増殖及び活性化を誘導又は阻害しうる。Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦはＣＤ４＋Ｔリンパ球でのサイトカイン産生を誘導する。ある実施態様では、サイトカインは、ＩＬ−２及び／又はＩＦＮ−γである。ＣＤ４＋Ｔリンパ球でのＩＬ−２合成を選択的に誘導するＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦアゴニストはＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖誘導に有用である。ＣＤ４＋Ｔリンパ球でのＩＦＮ−γ合成を選択的に誘導するＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦアゴニストはＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖阻害に有用である。
Ｂｖ８アンタゴニスト、ＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニスト、及びそれらの混合は、活性化Ｂ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞数を減少させたいときの自己免疫疾患の治療に有用でありうる。特定の実施態様では、自己免疫疾患関連のＩＩ型、ＩＩＩ型及びＩＶ型過敏性反応を治療するためにここに提供する組成物及び薬剤を用いることを含む。好ましい実施態様では、自己免疫疾患は炎症性腸疾患、クローン病、大腸炎、又は移植片対宿主病である。
上のセクション４及び５のスクリーニングアッセイによって同定されたもののような化合物を、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ活性又は発現のレベルを調節するために使用することができる。具体的に、Ｂｖ８アンタゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストであること、又はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦがそのレセプターに結合するように刺激することができることが同定された化合物は、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ活性レベル増強が望まれる場合の治療に有用である。同様に、Ｂｖ８遺伝子発現、ＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニスト遺伝子発現、又はそれらの混合を増加させることが同定された化合物はこのタイプの治療に有用である。Ｂｖ８アゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアゴニスト及びＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ遺伝子発現を増強する化合物は、好中球減少症、リンパ球減少症、及び免疫不全性疾患の、好中球、Ｂリンパ球、及び／又はＴリンパ球数の増加が望まれる場合に有用である。
上のセクション４及び５のスクリーニングアッセイによって同定されたＢｖ８アンタゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストのような化合物は、ここで示すようなＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ活性又は発現レベルそれぞれの調節に用いることができる。上のセクション４及び５のスクリーニングアッセイによって同定されたＢｖ８アゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアゴニストのような化合物は、ここで示すような免疫応答の調節に有用である。
骨髄細胞増殖の増加方法及び骨髄細胞増殖の抑制方法はインビボ又はインビトロで行うことができると理解される。ある場合では、特定の細胞型の増殖を刺激することを目的として、Ｂｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合をインビトロで細胞試料に添加する。そうしてＢｖ８、ＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそれらの混合で処置した試料は、スクリーニングアッセイに用いたり、治療を必要とする個体又は動物モデル内に移植することができる。
治療的に使用されるＢｖ８又はＢｖ８アゴニスト又はアンタゴニスト、ＥＧ−ＶＥＧＦ又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの有効量は、例えば、治療目的、投与経路、及び患者の状態に依存する。従って、治療士は用量を定め、必要とされる投与経路を変更して最適な治療効果を得ることが必要であろう。典型的には、臨床医が、所望の効果を達成する用量に到達するまでＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦを投与する。全身治療のための典型的な毎日の用量は、投与経路に依存して、約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ哺乳動物体重／日あるいはそれ以上、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲であろう。異なった処方が異なった治療化合物及び異なった疾患に有効であり、例えばある器官又は組織を標的とする投与が、他の器官又は組織への投与とは異なる形で送達することを必要としうると予想される。
あるいは、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦは、効果的であるが過度に毒性ではないＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦレベルを組織に形成することができる用量で標的部位又は組織に処方され送達される。この組織内濃度は、可能ならば連続注入、持続放出、局所適用、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ発現細胞移植、又は経験的に決定した頻度で注射により維持されなければならない。この治療法の経過は一般的なアッセイによって容易にモニターされる。
投薬計画は個人の状況に基づいて決定されなければならない。しかし、好適な実施態様では、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストは、毎日、より好ましくは一日おきに、更により好ましくは毎週少なくとも２回、投与される。治療は、好ましくは６ヶ月、より好ましくは１ヶ月、更により好ましくは少なくとも２週間、継続される。当業者には、正確な投薬計画は個人の状況に基づいて診療士によって決定されなければならないことが分かるであろう。
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドをまた遺伝子治療法において使用することもできる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が細胞内に導入される。「遺伝子治療」には、１回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの一回又は繰り返しの投与の、遺伝子治療剤の投与とが含まれる。アンチセンスＲＮＡｓ及びＤＮＡｓを、ある種の遺伝子のインビボでの発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それがインヒビターとして作用する細胞中に移入できることは既に示されている。（Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143-4146 [1986]）。オリゴヌクレオチドは、例えばそれらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって、その取込みを促進するように修飾してもよい。
生存可能な細胞に核酸を導入するために利用できる様々な技術がある。その技術は、核酸が培養細胞にインビトロで移入されるか、あるいは意図する宿主の細胞にインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等々を含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス（典型的にはレトロウイルス）ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質-リポソーム媒介形質移入である（Dzau等, Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993)）。ある状況では、核酸供給源に、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の、標的細胞を標的にする薬剤を提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び／又は取込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。
Ｂｖ８配列もまた診断方法において使用することができる。Ｂｖ８の過剰発現は生殖器官の嚢胞又は癌の徴候である。更に、変異型又は機能障害Ｂｖ８について、患者からの試料を分析することができる。一般に、そのような方法は患者からの試料中のＢｖ８の発現をコントロールの発現と比較することを含む。
また、Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ配列をコードするペプチド又は核酸配列も診断方法に用いることができる。Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの異常発現は、造血、血液疾患の発症、好中球減少症の発症、免疫不全性疾患の発症、自己免疫疾患の発症において異常を示すであろう。更に、患者からの試料をＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦの変異又は形成異常について分析することができる。一般的に、そのような方法は患者試料におけるＢｖ８発現及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ発現を対照試料のものと比較することを含む。
Ｊ．製造物品
他の側面では、本発明は、疾病又は疾患の治療又は予防のために有用な物質を含む製造物品を考える。製造物品は好ましくは容器及び容器上の又は容器に付随したラベル又はパッケージ挿入物を含む。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ等が含まれる。容器はガラス及びプラスチックのような様々な材料から形成することができる。容器はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを含有する組成物を収容し、ラベル又はパッケージ挿入物は好ましくはＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦ、又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストを使用するための指示書を提供する。一実施態様では、製造物品はＢｖ８アンタゴニスト及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦアンタゴニストと、そのアンタゴニストを白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄形成異常性疾患等の血液疾患の治療又は予防のために使用するための指示書を含んでいる。他の実施態様では、製造物品はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと、異常造血に関連する症状を治療又は予防するためにそのポリペプチドを使用するための指示書を含んでいる。更に他の実施態様では、製造物品はＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦと、免疫不全性疾患を治療するためにポリペプチドを使用するための指示書を含んでいる。パッケージ挿入物はまた適切な投薬計画を示していてもよい。一実施態様では、挿入物は、組成物が約０．０１μｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの間の用量で投与されるべきであることを示す。
実施例
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従って使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書を通して特定された細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、ＶＡである。
ここに引用するすべての文献は出典明記によりここに組み込まれる。
実施例１
Ｂｖ８及びそのレセプターの発現分析
Ｂｖ８の発現パターンを明らかにするために、多種のヒト、マウス及びラット組織から得た組織及び細胞系のパネルを表すＲＮＡアレイについてドットブロット分析を行った。組織／細胞ＲＮＡアレイ及びブロットはＣＬＯＮＴＥＣＨより購入した。ｃＤＮＡプローブは既に報告されている方法(LeCouter等, 2001, Nature)にてヒト又はマウスＢｖ８コード化配列５０ｎｇを用いて調節した。図１３に示すように、Ｂｖ８の発現は、末梢血中の白血球、骨髄組織及び既に特徴化されている精巣 (LeCouter等, 2003, PNAS)に限局していることが明らかとなった。
ｈＢｖ８を発現する細胞型を同定するために、白血球レベルの上昇がある一連の炎症組織試料を用いてインサイツハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）を行った。組織はＩＳＨ用に処理し、標準的方法と材料を用いて［３３Ｐ］ＵＴＰ標識ＲＮＡプローブを生成した。ｈＢｖ８のセンス及びアンチセンスプローブは、ヌクレオチド５３３−１１３２；ｍＢｖ８、ヌクレオチド８８６−１６１１；及びｍＲ−１、ヌクレオチド２２０−９４６に一致するｃＤＮＡ断片より合成した。このプローブはｍＲ−２に８１．２％の同一性がある。炎症性扁桃及び炎症性虫垂内の主に好中球及び関連浸潤細胞においてＢｖ８の強いハイブリダイゼーションシグナルが検出された（図１４）。
Ｂｖ８及びそのレセプターの細胞の発現パターンを確認するために、造血細胞及び白血病細胞系についてリアルタイム量的ＰＣＲ分析を行った(Heid等, 1996, Genome Res., 6:986-994)。ヒト及びマウス造血幹細胞、系統関連祖先細胞又は白血病細胞系より、ＲＮアーゼキットを用いて製造者の指示書に従って、全ＲＮＡを調製した。ヒト細胞の調製品はAllCells Inc.(Berkeley, CA)より購入し、系統関連マウス細胞及び幹細胞（Ｓｃａ＋ｃ−Ｋｉｔ＋）は２８の大腿部プールより調製して既に示されている(Gerber, 2002, Nature)ように貯蔵した。ヒト細胞系（ＨＬ−６０、Ｋ５６２、Ｈｅｌ−９２、ＴＦ−１及びＫＧ−１）はＡＴＣＣより入手した。リアルタイム量的ＰＣＲ分析のために、１００ｎｇの全ＲＮＡを用いた。マウス及びヒト両方の試料について精巣ＲＮＡを用いて標準カーブを描いた。この分析に用いたプライマー及びプローブを以下のように示した：
Figure 0004912144
図１５Ａ−Ｄに示すように、ｈＢｖ８ｍＲＮＡは骨髄及び精巣において最も顕著に発現しているのに対して、胎盤では精巣のおよそ１０％のレベルで発現していた（図１５Ａ）。異なる造血細胞型では、ｈＢｖ８ｍＲＮＡは、好中球では顕著に、単球及び骨髄単核細胞でも同じく中程度に発現されている（図１５Ｂ）。相対的にＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター１及びレセプター２は何れもＣＤ３４＋細胞、ＡＣ１３３及びＢＭ−ＭＮＣにおいて高レベルで発現されており、好中球又は単球では発現がみられない（図１５Ｃ、Ｄ）。
また、ｈＢｖ８及びｈＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプターの発現をリアルタイム量的ＰＣＲ分析によって多種の白血病細胞系について研究した。図１６に示すように、ある白血病細胞系（例として、ＨＬ６０ ＣＭＬ、Ｋ５６２ ＣＭＬ及びＫＧ−１ ＡＭＬ）ではＢｖ８及びそのレセプターの両方を有意なレベルで発現している。
実施例２
コロニー形成アッセイ
マウス及びヒト造血細胞におけるＢｖ８の生物学的機能をメチルセルロースコロニー形成アッセイを用いて研究した。マウス骨髄単核細胞は２０％ＦＣＳを含む冷却（４度）ＩｓｃｏｖｅＭＤＭ ３ｍｌにてマウス大腿部を洗い流して回収した。赤血球細胞は１０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌを含む１０ｍＭトリスｐＨ７．２にて溶解して氷上に１０分置いた。残りの単核細胞は培養液中で洗浄し、遠心分離によりペレット状にした。メチルセルロース培養のために、すべてStemCell Technologies Incより購入し、その製造者の指示書に従って、培養調製物（ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｍ３４３４、ＳＣＦ、ＩＬ−３、ＩＬ−６及びＥｐｏと Ｍ３３３４を含む完全培地、Ｅｐｏを単独で含む基礎培地）を入れてある各３５ｍｍ格子状プレートに７００００個の細胞を設置した。マウスＩＬ−３、ＩＬ−６及びＳＣＦはStemCell Technologies Inc.より購入し、ＶＥＧＦ、ＥＧ−ＶＥＧＦ及びＢｖ８は既に示したように(LeCouter等., 2001, Nature, 412:877-884；LeCouter等, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100:2685-2690)、Genentechで生成した。外来性因子の最終濃度は以下の通りである：マウスＩＬ−３ １０ｎｇ／ｍｌ、マウスＩＬ−６ １０ｎｇ／ｍｌ、マウスＳＣＦ ５０ｎｇ／ｍｌ、ＶＥＧＦ １０ｎｇ／ｍｌ、ＥＧ−ＶＥＧＦ ５又は５０ｎＭないしはマウスＢｖ８ ５０ｎＭ。３７度及び５％ＣＯ２にて１２日間培養した後、光学顕微鏡を用いて３通りの試料について造血コロニーを数えた。
図１７Ａに示すように、５ｎＭ又は５０ｎＭの何れかでＢｖ８を添加するとマウスＢＭ−ＭＮＣにおいて形成されるコロニー数が著しく増加した。
ヒト培養物について、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ ４４３４完全培地、４３３０基礎培地、又は示したようにＩＬ−３ １０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−６ １０ｎｇ／ｍｌ、Ｇ−ＣＳＦ ５ｎｇ／ｍｌ、ＧＭ−ＣＳＦ ５ｎｇ／ｍｌ、ＥＧ−ＶＥＧＦ ５０ｎＭ、及びＢｖ８ ５０ｎＭを添加した基礎培地(すべてStemCell Technologies Inc.より入手)中に７００００個の骨髄由来単核細胞(AllCells Inc)を置いた。培養１４〜１６日後に顕微鏡にて細胞コロニーを同定して数を数えた。
図１７Ｂに示すように、少なくとも系統関連骨髄性祖先細胞のあるタイプのコロニー形成はＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦにより増加した。例えば、ＩＬ−３及びＩＬ−６を添加した基礎培地にＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦを添加すると、ＣＦＵ−ＧＭ細胞ではそれぞれおよそ１．７倍及びおよそ２．２倍に；ＣＦＵ−Ｇ細胞ではそれぞれおよそ１．７倍及びおよそ２．５倍；及びＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞ではそれぞれおよそ４倍及びおよそ７倍にコロニー数が増加した。言うまでもないが、コロニー数に関するこの増加は顆粒球コロニー刺激因子として既知のＧ−ＣＳＦで処理した群と似ていた。
実施例３
細胞流動アッセイ
免疫不全（ヌード）マウスに尾静脈を介してＬａｃＺ（５×１０８ｐｆｕ）、ＶＥＧＦ（１０７ｐｆｕ）、ＥＧ−ＶＥＧＦ（５×１０８ｐｆｕ）又はＢｖ８（５×１０８ｐｆｕ）をコードしているアデノウイルスを注入した。この投与経路は全身での分泌因子産生が起こることを目的として行った。ＨＳＣ流動性を評価するために、第３、６及び１２日目に眼窩静脈叢より血液試料を採取し、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて差次的な血液細胞数を決定した。第６及び１２日目に検死を行い、体重及び器官重量を測定した。Ｂｖ８によりＢＢＣ上皮細胞の生存が亢進した。特に、２％ＦＣＳ又は２５ｎＭのＥＧ−ＶＥＧＦの何れかを含むものよりもＢｖ８を含む培養物においてよりわずかのアポトーシス細胞しか見られなかった。Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦは、それ自体が有する成長因子又は１０％ＦＣＳの何れよりも大幅に細胞生存を亢進する２つの化合物と組み合わせて相乗効果を示した。
図１８に示すように、アデノウイルスＢｖ８の注入により、白血球細胞数はおよそ２〜２．５倍に増加した。一方、赤血球細胞又は血小板数には有意な変化は見られなかった。ＥＧ−ＶＥＧＦ発現がアデノウイルス注入により誘導されたときも同様の効果が見られた。
実施例４
リンパ球におけるＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター発現
ヒト及びマウスリンパ球でのＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦ及びそれぞれのレセプターの発現をリアルタイム量的ＰＣＲ分析を用いて研究した。厳密に単離したヒト及びマウス精製細胞と市販の調製物(AllCells Inc., Berkley, CA)からのヒト細胞を用いてレセプター発現について分析した。常磁性ビーズ(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)に結合させた適当な抗体（それぞれ、抗ＣＤ１９、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、及び抗ＣＤ５６抗体）による陽性反応によってＢ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びナチュラルキラー細胞を選択した。簡単に言えば、ＭＡＣＳバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）９０μｌ中の１０７個の全細胞と常磁性ビーズ結合型の抗体１０μｌを４度で１５分間インキュベートした。そうして、ビーズを余分なＭＡＣＳバッファー中で洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離し、更にペレットをＭＡＣＳバッファー２ｍｌに懸濁した。そうして、細胞懸濁液をＭＡＣＳ分離器(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)の磁場内に設置しているＬＳ＋／ＶＳ＋選択カラム(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)にアプライした。カラムはＭＡＣＳバッファー３ｍｌで２度すすぎ、分離器から取り除き、陽性細胞分画をカラムを付属した吸引具を用いてＭＡＣＳバッファーによりカラムから洗い流した。
ＲＮアーゼキット(Qiagen, Valencia, CA)を用いて製造者の指示書に従って確実に選択細胞から全ＲＮＡを調製した。少なくとも独立して精製した２つのヒト及びマウスＲＮＡ単離物について同様な結果を持つ研究を分析した。リアルタイム量的ＰＣＲ分析のために、５０ｎｇの全ＲＮＡを反応のテンプレートとして用いて、ＥＧ−ＶＥＧＦ、Ｂｖ８、それら同系のレセプター（Ｂｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター−１及びＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター−２）の発現を評価した(LeCouter等, 2003, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 100:2685-2690)。マウス及びヒト試料の両方について、精巣ＲＮＡを用いて標準カーブを描いた。この分析に用いたプライマー及びプローブを以下に示す：
Figure 0004912144
図１９Ａ−Ｄに示すように、ヒト及びマウスのＢ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びナチュラルキラー細胞はＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター−１及びレセプター−２を発現している。これらの結果は、初めに好中球により発現されるＢｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦリガンドに対してこれらリンパ球がインビボで応答していることを表す。
実施例５
Ｂｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦによるＢ細胞増殖誘導
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦが持つＢ細胞増殖亢進能力について研究した。Ｂａｌｂ／Ｃ又はＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスの脾臓よりＢ細胞を単離した。マウスから脾臓を採取し、機械的に２つのスライドグラスに分離した。細胞調製物をＭＡＣＳバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）に懸濁して、４０μｍナイロン細胞濾し器に通した。そうしてできた単一細胞懸濁液をフィコール勾配(Lymphocyte M, Cedarlane Laboratories Ltd., Ontario, Canada)にアプライし、２５００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。界面にある細胞を回収して、ＭＡＣＳバッファーにて３度洗浄した。そうして、実施例１に記載のようにＣＤ１９マイクロビーズ(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を用いて精製した細胞集団からＢ細胞を陽性的に選択した。
増殖アッセイのために、ＲＰＭＩアッセイ培地（１０％胎仔ウシ血清及びペニシリン／ストレプトマイシン溶液を添加したＲＭＰＩ１６４０(Life Technologies, Inc., Rockville, MD)）を入れた平底９６ウェルプレートに１ウェル当たり５×１０５個の細胞を置いた。各ウェルに２〜２００ｎＭの濃度範囲で組み換えＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦを加えた。いくつかのウェルには２０又は３０μｇ／ｍｌの抗マウスＩｇＭ Ｆａｂフラグメント(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を加えてＢ細胞の基礎的活性を引き起こした。ポジティブコントロールには、組み換えＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦの代わりに各ウェルに１μｇ／ｍｌのＬＰＳ(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)又は１０μｇ／ｍｌのＢｌｙ(Genentech, Inc., South San Francisco, CA)を加えた。細胞を３７度で７２時間インキュベートして、１ｍｌ当たり１μキュリーの３Ｈ−チミジン(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)で刺激した。Filtermate 196 Harvester (Packard, Boston, MA)を用いて試料を回収し、マイクロプレートシンチレーションカウンター(Packard, Boston, MA)を用いて分析した。
マウスＢ細胞の増殖を３Ｈ−チミジン取り込みを評価することによって分析した。図２０に示すように、Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦのそれぞれはＢ細胞での３Ｈ−チミジン取り込みを４〜６倍再生可能に増加させた。このデータにより、Ｂリンパ球に対するマイトジェン及び生存因子としてのＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦの機能を示唆した。
実施例６
Ｂｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦによるＴ細胞増殖誘導
Ｂｖ８及び／又はＥＧ−ＶＥＧＦが持つＣＤ４＋Ｔ細胞増殖亢進能力について研究した。Ｂａｌｂ／Ｃ又はＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスの脾臓よりＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。実施例５に記載のように脾臓を採取し、機械的に分離した。そうして、実施例５に記載のように細胞調製物をＭＡＣＳバッファーに懸濁して精製した。そうして、ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)を用いて精製した細胞集団からＴ細胞を陰性的に選択した。
簡単に言うと、１０７個の全細胞を含むＭＡＣＳバッファー（０．５％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）とＭＡＣＳ抗ハプテンマイクロビーズ１０μｌを４度で１０分間インキュベートした。そうして、ビーズを余分なＭＡＣＳバッファー中で洗浄し、３００×ｇで１０分間遠心分離し、ペレットをＭＡＣＳバッファー２ｍｌに懸濁した。そうして、細胞懸濁液をＭＡＣＳ分離器(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)の磁場内に設置しているＬＳ＋／ＶＳ＋選択カラム(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)にアプライした。ＣＤ４＋Ｔ細胞豊富な分画を示すカラムからの溶出物を回収した。カラムは３ｍｌのＭＡＣＳバッファーにて４度すすぎ、ＣＤ４＋Ｔ細胞豊富な分画である溶出物を回収した。ＣＤ４＋Ｔ細胞豊富な分画をＭＡＣＳバッファーにて洗浄し、そしてＲＰＭＩアッセイ培地に懸濁した。
陰性的に選択したＣＤ４＋Ｔ細胞を用いた増殖アッセイは実施例５に記載のように行った。各ウェルに２〜２００ｎＭの濃度範囲で組み換えＢｖ８又はＥＧ−ＶＥＧＦを加えた。いくつかのウェルは、炭酸塩バッファーｐＨ９．０中の抗マウスＣＤ３抗体０．５μｇ／ｍｌ(Pharmingen, LaJolla, CA)及び／又は抗マウスＣＤ２８抗体１μｇ／ｍｌ(Pharmingen, LaJolla, CA)を用いて３７度で２時間あらかじめコーティングした。抗体はＴ細胞表面上でそれぞれのレセプターと交差結合して基礎的活性を引き起こした。抗ＣＤ２８抗体と組み合わせて抗ＣＤ３抗体を加えると最適な活性が引き起こされた。
図２１Ａ及びＢに示すように、Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦのそれぞれはＴ細胞での３Ｈ−チミジン取り込みを５〜８倍増加させた。このデータにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するマイトジェン及び潜在的生存因子としてのＢｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦの機能を示唆した。
実施例７
ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカイン産生ＥＧ−ＶＥＧＦの誘導
ＥＧ−ＶＥＧＦが持つＣＤ４＋Ｔ細胞でのサイトカイン産生誘導能力について研究した。ＣＤ４＋Ｔ細胞は実施例６に記載のように単離し精製した。Ｔ細胞増殖アッセイは実施例６に記載のように行った。各ウェルに２〜２００ｎＭの濃度範囲で組み換えＥＧ−ＶＥＧＦを加えた。ウェルは、炭酸塩バッファーｐＨ９．０中の抗マウスＣＤ３抗体０．５μｇ／ｍｌ(Pharmingen, LaJolla, CA)及び／又は抗マウスＣＤ２８抗体１μｇ／ｍｌ(Pharmingen, LaJolla, CA)を用いて３７度で２時間あらかじめコーティングした。抗体はＴ細胞表面上でそれぞれのレセプターと交差結合して基礎的活性を引き起こした。抗ＣＤ２８抗体と組み合わせて抗ＣＤ３抗体を加えると最適な活性が引き起こされた。インキュベーションの工程の前に、３０μｌ等量のＲＰＭＩアッセイ培地を回収して、等量の新鮮アッセイ培地と置き換えた。７２時間のインキュベーションの工程の間、サイトカイン産生分析のために２４時間時点で３０μｌ等量のＲＰＭＩアッセイ培地を回収し、等量の新鮮ＲＰＭＩアッセイ培地と置き換えた。二度目の等分は３Ｈ−チミジンを添加する直前に回収した。回収した試料は Luminex Multiplex Assay system (Luminex Corp., Austin, TX)を用いてＩＬ−２及びＩＦＮ−γについて分析を行った。
ＥＧ−ＶＥＧＦによる刺激の後、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのサイトカイン産生をモニターした。リガンド添加から２４時間以内にＥＧ−ＶＥＧＦはＴ細胞によるＩＬ−２（図２２Ａ及びＢ）及びＩＦＮ−γ（図２２Ｃ及びＤ）産生を誘導した。ＥＧ−ＶＥＧＦを含む７２時間インキュベーション後にはＴ細胞により産生されたＩＦＮ−γの濃度はアッセイの検出限界を超えた。これらの結果により、Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦはＣＤ４＋Ｔ細胞応答の発生調節能を有することが示唆される。
実施例８
５−ＦＵ骨髄抑制後のＢｖ８誘導性回復
Ｂｖ８が持つ５−ＦＵによる骨髄抑制後の造血回復を亢進する能力を研究した。ＡｄＥａｓｙベクターシステム(Stratagene, LaJolla, CA)を用いて組み換えアデノウイルスを生成した。マウスＢｖ８（配列番号：６）又は完全長ヒトＥＧ−ＶＥＧＦ（配列番号：８）の８１アミノ酸イソ型をコードするｃＤＮＡをｐＣＭＶシャトルベクターのマルチクローニングサイトにクローニングした。製造者の指示に従って、２９３細胞中で組み換え及びその後の増幅を行った。ＡＡＶ精製キット(Virapur, San Diego, CA)を用いて上澄み及び細胞ペレットからウイルスを精製した。CMV-LacZウイルスをコントロールとして用いて標準的プラークアッセイによりウイルス力価を決定した。レセプター選択的ＶＥＧＦ変異型を付加的コントロールに含めた。
コントロールヌードマウスには尾静脈から組み換えアデノウイルスを注入した。各動物へのウイルス用量は１０８ｐｆｕを含む１００μｌのリン酸緩衝液とした。ウイルス投与から１２日間、血液細胞数をモニターした。マウスの眼窩静脈叢血から血液試料を採取し、Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ自動血液分析機(Abbott Diagnostics, Santa Clara, CA)を用いて分析した。自動分析と同時に光学顕微鏡を用いて手動で差次的に数を数えた。
骨髄抑制の導入の３日前に試験動物に組み換えアデノウイルスを注入した。各動物へのウイルス用量は１０８ｐｆｕを含む１００μｌのリン酸緩衝液とした。マウスに骨髄抑制を引き起こすために、単一用量１２５ｍｇ／ｋｇの５−フルオロウラシル(Adrucil, NDC 0013-1046-94)を腹膜に注入した。５−ＦＵ投与後５、１０及び１４日目に血液細胞数及び差次的数を測定した。マウスの眼窩静脈叢血から血液試料を採取し、Ｃｅｌｌ Ｄｙｎ自動血液分析機(Abbott Diagnostics, Santa Clara, CA)を用いて分析した。自動分析と同時に光学顕微鏡を用いて手動で差次的に数を数えた。５−ＦＵ投与後１４日目に動物を屠殺し脾臓を採取した。脾臓は重量を測定した後に、実施例５に記載のように機械的に分離した。Coulterカウンター(Beckman Coulter, Miama, FL)を用いて単一細胞懸濁液中の細胞数を数えることによって脾臓細胞質を測定した。３通りのマウス完全Methocult (Stem Cell Technologies, Inc.)培地に各脾臓から得た２×１０４個の細胞を播いて、培養１０〜１４日後に造血細胞個ローにタイプを記録した。
図２３Ａに示すように、Ｂｖ８処置群の白血球細胞数はこの一連の実験にわたって他の群より著しく高かった。このデータと一致して、顆粒球及び単球の数も高かった（図２３Ｂ及びＣ）。Ｂｖ８処置マウスではコントロール群よりも脾臓細胞質が著しく大きかった（少なくとも２．５倍）（図２４）。加えて、Ｂｖ８脾臓は、ウイルス無し又はＬａｃＺ処置マウスよりも著しく多くの数の祖先細胞を含んでいた（図２４）。
上記の明細書文書は当業者が本発明を実施するには十分であると考えられる。しかしながら、ここに示され記載されたものに加えて本発明の様々な変更は、上の説明から当業者には明らかであり、特許請求の範囲内のものである。
ヒトＢｖ８相同体をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：１）を示す。それぞれ開始コドン（核酸位置１１に始まる「ａｔｇ」）及び終止コドン（核酸位置３９８に始まる「ｔａａ」）の位置を太線フォント及び下線で表す。 配列番号：１のコード化配列由来のヒトＢｖ８相同体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：２）を示す。推定シグナル配列はアミノ酸１から２１を含む。 ヒトＢｖ８相同体の選択的スプライシング型をコードするｃＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：３）を示す。それぞれ開始コドン（核酸位置１１に始まる「ａｔｇ」）及び終止コドン（核酸位置３９４に始まる「ｔａａ」）の位置を太線フォント及び下線で表す。 配列番号：３のコード化配列由来のヒトＢｖ８相同体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：４）を示す。 マウスＢｖ８相同体のヌクレオチド配列（配列番号：５）を示す。それぞれ開始コドン（核酸位置４６に始まる「ａｔｇ」）及び終止コドン（核酸位置３８２に始まる「ｔａｇ」）の位置を太線フォント及び下線で表す。 配列番号：５のコード化配列由来のマウスＢｖ８相同体ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６）を示す。 マウス及びヒトＢｖ８相同体のアラインメントを示す。潜在的ヘパリン結合ドメインはボックスで囲んでいる。このドメインは選択的スプライシングがなされた転写物には存在していない。推定シグナル配列は下線で示す。マウス及びヒトＢｖ８相同体はおよそ９６％の同一性である。 ヒト天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦをコードするｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列（配列番号：７）を示す。 配列番号：７のコード化配列由来のヒト天然配列ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：８）を示す。 天然マウスＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド（配列番号：１０）をコードするｃＤＮＡのポリヌクレオチド配列（配列番号：９）を示す。 ヒト天然ＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド（配列番号：８）及び天然マウスＥＧ−ＶＥＧＦポリペプチド（配列番号：８）のアライメントを示す。 ヒトＢｖ８相同体（配列番号：４のアミノ酸２８−１０８）及びヒトＥＧ-ＶＥＧＦ（配列番号：１０のアミノ酸２０−１０５）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。シグナル配列は何れの分子についても示していない。ヒトＢｖ８はヒトＥＧ-ＶＥＧＦに対しておよそ６０％の同一性である。 精巣と共に骨髄、ＰＢＬにおけるｈＢｖ８シグナルを明らかにするＲＮＡアッセイのドットブロッドハイブリダイゼーションの結果を示す。 好中球及び関連した浸潤細胞におけるＢｖ８の制限的発現を明らかにするインサイツハイブリダイゼーション研究の結果を示す撮像。図１４Ａ及びＢは扁桃炎でのＢｖ８発現を示すもので、図１４Ａは組織のヘマトキシリン−エオジン染色を示し、図１４Ｂは３３Ｐ標識プローブを用いた同組織試料におけるＢｖ８発現を示す。図１４Ｃ及びＤは虫垂炎でのＢｖ８発現を示すもので、図１４Ｃは組織のヘマトキシリン−エオジン染色を示し、図１４Ｄは３３Ｐ標識プローブを用いた同組織試料におけるＢｖ８発現を示す。 多種組織及び細胞におけるＢｖ８及びそのレセプターのリアルタイム量的ＰＣＲ発現解析の結果を示すグラフ。精巣と同様に骨髄においてＢｖ８の強い発現が示される。 多種組織及び細胞におけるＢｖ８及びそのレセプターのリアルタイム量的ＰＣＲ発現解析の結果を示すグラフ。多種の造血細胞におけるＢｖ８の差次的発現を示す。 多種組織及び細胞におけるＢｖ８及びそのレセプターのリアルタイム量的ＰＣＲ発現解析の結果を示すグラフ。Ｂｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-１の造血細胞発現を示す。 多種組織及び細胞におけるＢｖ８及びそのレセプターのリアルタイム量的ＰＣＲ発現解析の結果を示すグラフ。Ｂｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-２の造血細胞発現を示す。 多種の白血病細胞系におけるＢｖ８及びＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-１及びＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-２のリアルタイム量的ＰＣＲ発現解析の結果を示す棒グラフ。（Ａ）ＨＬ６０ ＣＭＬ；（Ｂ）Ｋ５６２ＣＭＬ；（Ｃ）Ｈｅｌ−９２赤白血球病；（Ｄ）ＴＦ−１汎血球減少症；（Ｅ）ＫＧ−１ＡＭＬ。 多種の成長因子存在下での骨髄単核細胞インビトロ培養物中のコロニー形成を示すグラフ。Ｂｖ８（５ｎＭ及び５０ｍＭ）がマウス骨髄単核細胞のコロニー形成を増加することを示す。Ｃｔは実施例２に記載のように完全培地を示す。ｂａｓａｌは実施例２に記載のように基本培地を示す。 多種の成長因子存在下での骨髄単核細胞インビトロ培養物中のコロニー形成を示すグラフ。ＥＧ−ＶＥＧＦに類似のＢｖ８がヒト骨髄単核細胞培養物中のある種の骨髄祖先細胞のコロニー形成を増加することを示す。Ｃｔは実施例２に記載のように完全培地を示す。ｂａｓａｌは実施例２に記載のように基本培地を示す。 ＥＧ−ＶＥＧＦに類似のＢｖ８がインビボでの白血球細胞を増加することを示すグラフ。Ｂｖ８発現アデノウイルスベクターのインビボ導入後３日目（薄い灰色）、６日目（濃い灰色）、又は１２日目（白抜き棒線）に細胞数を測定した。 ヒト及びマウス由来のＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、及びナチュラルキラー細胞におけるＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-１及びＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-２のリアルタイム量的ＰＣＲ発現解析の結果を示すグラフ。図１９Ａ及びＢは、ヒト（図１９Ａ）及びマウス（図１９Ｂ）由来のＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、及びナチュラルキラー細胞におけるＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-１の相対的発現レベルを示す。図１９Ｃ及びＤは、ヒト（図１９Ｃ）及びマウス（図１９Ｄ）由来のＢリンパ球、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、及びナチュラルキラー細胞におけるＢｖ８／ＥＧ−ＶＥＧＦレセプター-２の相対的発現レベルを示す。 Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦが生体外でのマウスＢリンパ球内３Ｈ−チミジン取り込みを増加させることを示すグラフ。 Ｂｖ８及びＥＧ−ＶＥＧＦが生体外でのマウスＣＤ４＋Ｔリンパ球内３Ｈ−チミジン取り込みを増加させることを示すグラフ。挿入図はＥＧ−ＶＥＧＦ又はＢｖ８の濃度増加時のＣＤ４＋Ｔ細胞内３Ｈ−チミジン取り込みを示す。 ＥＧ−ＶＥＧＦがＣＤ４＋Ｔ細胞でのサイトカイン産生を誘導することを示すグラフ。ＥＧ−ＶＥＧＦはＣＤ４＋Ｔ細胞でのＩＬ−２及びＩＦＮ−γの産生を誘導した。 ５−ＦＵによる骨髄抑制後にＢｖ８がインビボで造血回復を亢進することを示すグラフ。Ｂｖ８発現アデノウイルスベクターのインビボ導入後５日目、１１日目、又は１４日目に細胞数を測定した。ＦｌｔｓｅｌはＦＬＴ１レセプターに選択的に結合するＶＥＧＦ変異型を示す。ＫＤＲｓｅｌはＫＤＲレセプターに選択的に結合するＶＥＧＦ変異型を示す。Ｂｖ８は５−ＦＵによる骨髄抑制後に白血球細胞数、顆粒球細胞数、単核細胞数、及び血小板数を増加させた。 ５−ＦＵによる骨髄抑制後にＢｖ８がインビボで造血回復を亢進することを示すグラフ。Ｂｖ８発現アデノウイルスベクターのインビボ導入後５日目、１１日目、又は１４日目に細胞数を測定した。ＦｌｔｓｅｌはＦＬＴ１レセプターに選択的に結合するＶＥＧＦ変異型を示す。ＫＤＲｓｅｌはＫＤＲレセプターに選択的に結合するＶＥＧＦ変異型を示す。Ｂｖ８は５−ＦＵによる骨髄抑制後に白血球細胞数、顆粒球細胞数、単核細胞数、及び血小板数を増加させた。 ５−ＦＵによる骨髄抑制に続いて多種の成長因子存在下インビトロでの脾臓由来関連単核細胞コロニー形成を示すグラフ。Ｂｖ８にて処置した動物から単離した脾臓細胞は、非ウイルス又はＬａｃＺ処理対照マウスより著しく多く骨髄祖先細胞を含んでいた。

Claims (25)

  1. リンパ系細胞又はそのプロジェニーの増殖を誘導する方法であって、該細胞を（ｉ）Ｂｖ８ポリペプチド又は（ｉｉ）Ｂｖ８ポリペプチド及びＥＧ-ＶＥＧＦに接触させることを含んでなる方法であって、前記Ｂｖ８は配列番号：２、４又は６と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、内皮細胞の増殖を誘導するポリペプチドであり、前記ＥＧ−ＶＥＧＦは配列番号：１０又は配列番号：８のアミノ酸残基２０−１０５と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、内皮細胞の増殖を誘導するポリペプチドである方法。
  2. 前記プロジェニー細胞が、リンパ球前駆細胞、リンパ細胞、又はそれらの混合を含有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記プロジェニーがＢ細胞、Ｔ細胞、又はそれらの混合である、請求項２に記載の方法。
  4. 前記Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項３に記載の方法。
  5. 哺乳動物の免疫不全性疾患の治療をするための薬剤であって、（ｉ）Ｂｖ８ポリペプチド又は（ｉｉ）Ｂｖ８ポリペプチド及びＥＧ-ＶＥＧＦを含有してなる薬剤であって、前記Ｂｖ８は配列番号：２、４又は６と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、内皮細胞の増殖を誘導するポリペプチドであり、前記ＥＧ−ＶＥＧＦは配列番号：１０又は配列番号：８のアミノ酸残基２０−１０５と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、内皮細胞の増殖を誘導するポリペプチドである薬剤。
  6. 前記免疫不全性疾患が一次的免疫不全性疾患又は二次免疫不全性疾患である、請求項５に記載の薬剤。
  7. 前記免疫不全性疾患がＢリンパ球疾患又はＴリンパ球疾患である、請求項５に記載の薬剤。
  8. 前記免疫不全性疾患が、リンパ球減少症、好中球減少症、単球減少症又は顆粒球減少症である、請求項５に記載の薬剤。
  9. 前記免疫不全性疾患が、化学療法と関係する症状、感染症、細菌性感染、ヒト免疫不全ウイルス(ＨＩＶ)感染、白血病、骨髄増殖性疾患、骨髄異形成性疾患、免疫抑制剤の投与又は放射線照射である、請求項５に記載の薬剤。
  10. 前記化学療法が、５フルオロウラシル、ビンクリスチン、シスプラチン、オキソプラチン、メトトレキサート、3'-アジド-3'-デオキシチミジン、パクリタキセル、ドキセタキセル、アントラサイクリン抗生物質、又はそれらの混合を用いた治療を含む、請求項９に記載の薬剤。
  11. 前記免疫抑制剤が一次的又は二次的な免疫抑制効果を有する治療剤である、請求項９に記載の薬剤。
  12. 前記Ｂｖ８がヒトＢｖ８ポリペプチドである、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
  13. 前記Ｂｖ８が配列番号：２、配列番号：４、又は配列番号：６に示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
  14. 前記Ｂｖ８がヘパリンに結合する、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
  15. 前記Ｂｖ８が融合ポリペプチド、キメラポリペプチド又はイムノアドヘシンをさらに含んでなる、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
  16. 前記ＥＧ−ＶＥＧＦがヒトＥＧ-ＶＥＧＦポリペプチドである、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
  17. 前記ＥＧ-ＶＥＧＦが配列番号：１０又は配列番号：８のアミノ酸残基２０−１０５に示すアミノ酸配列を含んでなる、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
  18. 前記ＥＧ-ＶＥＧＦが融合ポリペプチド、キメラポリペプチド又はイムノアドヘシンを含んでなる、請求項１ないし４の何れか一項に記載の方法。
  19. (ａ) 混合物を形成させるためにＢｖ８と化合物を接触させ、
    (ｂ) 該混合物をリンパ系祖先細胞、又はそれらのプロジェニーに投与し、
    (ｃ) 該細胞のＢｖ８誘導性増殖又はＢｖ８誘導性活性化を阻害する化合物をＢｖ８のアンタゴニストとして同定する
    ことを含む、Ｂｖ８のアンタゴニストの同定方法であって、前記Ｂｖ８は配列番号：２、４又は６と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、内皮細胞の増殖を誘導するポリペプチドである、方法。
  20. (ａ) リンパ系祖先細胞、又はそれらのプロジェニーにＢｖ８を接触させ、
    (ｂ) この接触させた細胞に化合物を投与し、
    (ｃ) 該細胞のＢｖ８誘導性増殖又はＢｖ８誘導性活性化を阻害する化合物をＢｖ８のアンタゴニストとして同定する
    ことを含む、Ｂｖ８のアンタゴニストの同定方法であって、前記Ｂｖ８は配列番号：２、４又は６と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、内皮細胞の増殖を誘導するポリペプチドである、方法。
  21. (ａ) 混合物を形成させるためにＥＧ-ＶＥＧＦと化合物を接触させ、
    (ｂ) 該混合物をリンパ系祖先細胞、又はそれらのプロジェニーに投与し、
    (ｃ) 該細胞のＥＧ-ＶＥＧＦ誘導性増殖又はＥＧ-ＶＥＧＦ誘導性活性化を阻害する化合物をＥＧ-ＶＥＧＦのアンタゴニストとして同定する
    ことを含む、ＥＧ-ＶＥＧＦのアンタゴニストの同定方法であって、前記ＥＧ-ＶＥＧＦは配列番号：１０又は配列番号：８のアミノ酸残基２０−１０５と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、内皮細胞の増殖を誘導するポリペプチドである、方法。
  22. (ａ) リンパ系祖先細胞、又はそれらのプロジェニーにＥＧ-ＶＥＧＦを接触させ、
    (ｂ) この接触させた細胞に化合物を投与し、
    (ｃ) 該細胞のＥＧ-ＶＥＧＦ誘導性増殖又はＥＧ-ＶＥＧＦ誘導性活性化を阻害する化合物をＥＧ-ＶＥＧＦのアンタゴニストとして同定する
    ことを含む、ＥＧ-ＶＥＧＦのアンタゴニストの同定方法であって、前記ＥＧ-ＶＥＧＦは配列番号：１０又は配列番号：８のアミノ酸残基２０−１０５と少なくとも９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、内皮細胞の増殖を誘導するポリペプチドである、方法。
  23. 前記プロジェニーが、リンパ系前駆細胞、又はリンパ細胞である、請求項１９ないし２２の何れか一項に記載の方法。
  24. 前記プロジェニーが、Ｂ細胞、又はＴ細胞である、請求項１９ないし２２の何れか一項に記載の方法。
  25. 前記Ｔ細胞がＣＤ４＋Ｔ細胞である、請求項２４に記載の方法。
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