KR20040067841A - Ｇｄｎｆ 리간드 족의 구성원인 아르테민의 신규 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경 세포 손상 및 신경 세포 손상과 관련된 변화를 예방 또는 치료하기 위한 아르테민 (artemin)의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아르테민 또는 아르테민 작용제를 투여함으로써, 손상에 의해 유도된 병리적 변화로부터 포유동물의 뉴런을 보호하는 방법을 제공한다.

Description

ＧＤＮＦ 리간드 족의 구성원인 아르테민의 신규 용도 {New Use of Artemin, a Member of the GDNF Ligand Family}

아르테민은 최근에 동정 및 특성화된 신경성 인자이다. 아르테민은 신경 교세포주-유래의 신경성 인자 (GDNF; glial cell line-derived neurotrophic factor) 족의 구성원이며, GFR-3 수용체를 통해 신호를 전달하는 것으로 보인다 (Baloh et al., Neuron, 21:1291-1302 (1998)). GDNF 족의 모든 공지 구성원들과 유사하게, 아르테민은 도파민성 중뇌 뉴런 및 말초 뉴런 둘 다의 시험관내 생존에 기여하는 것으로 밝혀졌다 (Baloh et al., 상기 문헌). 또한, 아르테민은 시험관내에서 흑질선조체 (nigrostriatal) 도파민성 뉴런을 보호하는 것으로 보인다 (Rosenblad et al., Mol. Cell. Neurosci., 15:199-214 (2000)).

단백질 신경성 인자, 즉 뉴로트로핀 (neurotrophin)은 척추동물 신경계의 증식 및 발생에 영향을 미친다. 또한, 뉴로트로핀은 뇌 및 말초에서 다양한 뉴런 군의 분화, 생존 및 기능을 촉진하는 데 중요한 역할을 한다. 다수의 신경성 인자가 특정 신경 세포의 생존을 증진시키는 잠재적 수단으로서 제안되었다. 따라서, 이들은 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 알츠하이머 질환, 뇌졸중, 간질, 헌팅톤 질환, 파킨슨 질환 및 말초 신경병증과 같은 신경퇴행성 질환의 치료에 유용할 수 있을 것으로 제안된 바 있다.

신경성 인자는, 부분적으로는 신경 성장 인자 (NGF)를 사용하여 종래에 확립된 신경 조직에서의 중요한 신호 전달 기능을 하는 것으로 생각된다. NGF는 시험관내 및 생체내 둘 다에서 발생중인 동물의 교감, 감각 및 기저 전뇌 뉴런의 생존에 기여한다. 외생성 NGF의 투여는 발생시 세포 사멸로부터 뉴런을 보호해 준다. 바꾸어 말하면, 항-NGF 항체의 투여에 의한 내생성 NGF의 제거는 그러한 세포 사멸을 촉진한다 (Heumann, J. Exp. Biol., 132:133-150 (1987); Hefti, J. Neurosci., 6:2155-2162 (1986); Thoenen et al., Annu. Rev. Physiol., 60:284-335 (1980)).

NGF에 대해서는 신경 특성에 기초하여 방대한 연구가 수행되었다 (개략적으로 문헌 [Hefti et al., Neurobiol. Aging, 10:515-533 (1988)] 및 [Levi-Montalcini, Science, 237:1154-1164 (1987)] 참조). 그러나, NGF는 신경보호 효과 및 신경생성 효과 이외에도, 정맥내 (iv), 피하 (sq) 또는 피부내 (id) 주사 또는 뇌실내 (icv) 또는 경막내 (it) 투여 이후에 동물 및 인간 둘 다에서 통각과민 및 통증을 유발한다 (Lewin et al., J. Neurosci., 13:2136-2148 (1993); Lewin et al., Eur. J. Neurosci. 6:1903-1912 (1994); Andreev et al., Pain, 63:109-115 (1995); Petty et al, Ann. Neurol., 36:244-246 (1994); Hao et al., Neurosci. Lett., 286:208-212 (2000)). 이 발견은 NGF 처치와 관련된 통증이 제한된 임상 효능을 갖는 인간에서의 임상 시험에서 도출되었다 (Eriksdotter et al., Dement.Geriatr. Cogn. Disord, 9:246-257 (1998); Petty et al., 상기 문헌; Apfel et al., JAMA, 284:2215-2221 (2000)).

후근 신경절 (DRG)에서의 많은 소직경 감각 뉴런은 NGF 수용체에 높은 친화도를 나타내며 (Verge et al., J. Neuocytol., 18:583-591 (1989); McMahon et al., Neuron, 12:1161-1171 (1994)), 이들 NGF 수용체 발현 뉴런은 또한 감각 신경펩티드, 특히 섭스턴스 P (substance P) 및 CGRP를 주로 발현한다 (Verge et al., 상기 문헌; Averill et al., Eur. J. Neurosci., 7:1484-1494 (1995)). 이들 신경펩티드 뉴런 상의 NGF 위치와 일치하게, NGF로의 처치는 상기 뉴런들에서 상기 펩티드의 발현을 변화시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. NGF로의 처치는 생체내에서 정상적인 수준 이상의 CGRP 및 섭스턴스 P를 유도할 수 있다 (Goederf ef al., Proc. Natl. Acad. Sci., 78:5895-5898 (1981); Amann et al., Neurosci. Let., 203:171-174 (1996)). 시험관내에서 배양된 DRG 뉴런에 대한 NGF의 효과를 조사하는 실험에서 상기 현상이 직접적인 효과임이 밝혀졌다 (Lindsay and Harmar, Nature, 337:362-364 (1989)). 더욱이, NGF 처치는 후각(dorsal horn)으로 뻗은 감각 뉴런으로부터의 섭스턴스 P 및 CGRP의 방출을 증가시켰다 (Malcangio et al., Eur. J. Neurosci., 9:1101-1104 (1997); Malcangio et al., Eur. J. Neurosci., 12:139-144 (2000)).

이들 펩티드-함유 뉴런의 손상은, 뉴런의 세포체에서 뿐만 아니라 뉴런의 말초 돌기 및 척추의 후근으로 뻗은 돌기에서도 펩티드 함량의 결핍을 초래하였다. 예를 들어, 좌골 신경 절단은 DRG 및 척수의 후각 중 좌골 신경 돌기에 상응하는부분 둘 다에서 섭스턴스 P의 함량을 감소시킨다. 손상 후에 NGF를 투여하면, DRG (Verge et al., J. Neurosci., 15:2081-2096 (1995))에서, 그리고 척수 후각 돌기 (Bennett et al., Mol. Cell, Neuosci., 8:211-220 (1996))에서 손상에 의해 유도된 펩티드 함량의 변화가 방지되는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들 뉴런에 대한 손상은 화학적 손상 (화학요법제 또는 캡사이신 (capsaicin)) 또는 대사적 손상 (당뇨병)에 의해 유발될 수도 있으며, 이들 모든 경우에서 뉴런의 펩티드 함량은 손상시 감소하고, NGF 처치는 이와 같은 감소를 역전시키거나 방지할 수 있다 (Apfel, et al., Ann. Neurol., 29:87-89 (1991); Apfel, et al., Ann. Neural., 31:76-80 (1992); Donnerer, et al., Brain Res., 741:103-108 (1996); Apfel et al., Brain Res., 634:7-12 (1994)).

NGF에 의한 섭스턴스 P의 조절은, 섭스턴스 P가 장기간 동안 통증과 관련되어 있었기 때문에 흥미로운 것이다. 사실상, 섭스턴스 P를 말초에 또는 중추에 투여하면 사람 및 실험 동물 둘 다에서 통증 및 통증 관련 행태가 증가한다 (Maeda, et al., J. Neural Transmission, 96:125-133 (1994); Hong et al., Neuroscience, 63:827-836 (1994); Dirig and Yaksh, Neurosci. Let., 220:93-96 (1996); Heppelmann and Pawlak, Neursci. Let., 223:97-100 (1997); Holthusen et al., Neuropeptides, 31:445-448 (1997); Yoon et al., Life Science, 62:319-325 (1998); Hitosugi et al., Met. Find. Exp. Clin. Pharm., 21:409-413 (1999)). 결국, NGF에 의해 유바된 섭스턴스 P의 증가 및 섭스턴스 P의 방출 증가는 NGF 투여와 관련된 통증 및 통각과민에 관여하는 것으로 제안되었다. 이러한 관점과 일치하게, NGF 증가와 관련된 통증은 섭스턴스 P 작용의 길항제에 의해 차단될 수 있다. 예를 들어, NGF를 과다발현하는 마우스는 후각에서 섭스턴스 P의 과다증식을 나타냈고, 또한 통각과민 및 이질통(異質痛)을 나타냈다. 이러한 통증 행태는 섭스턴스 P 수용체 길항제에 의해 예방될 수 있다 (Ma et al., Eur. J. Neurosci., 7:2021-2035 (1995)). 또한 하오 등 (Hao et al.)은, NGF 처치 후 래트에 존재하는 기계적 및 열적 통각과민이 섭스턴스 P 수용체 NK-1에 선택적인 길항제에 의해 완화될 수 있다고 보고한 바 있다 (Neuoscience Lett., 286:208-212 (2000)).

따라서 당업계에는, NGF 처치가 비실용적이게 하는 부작용을 유발하지 않으면서 신경 손상 및 신경 장애를 효과적으로 치료하는 방법에 대한 요구가 존재하는 실정이다. 특히, 펩티드성 감각 뉴런에 대한 효과적인 치료법이 요구되고 있다. 이들 세포는 손상의 결과로서 펩티드 발현이 감소하고, 상기 세포를 손상으로부터 보호하거나 손상 후에 복구시켜주는 치료법은 이들의 펩티드 발현을 증가시켜야만 한다. 그러나, 이러한 펩티드 발현 증가는 통증과 같은 부작용을 유발할 것으로 예상된다.

NGF와 관련된 부가의 몇몇 신경성 인자들이 동정 및 특성화되었다. 이들은 소위 뉴로트로핀 족이라 불리우는 구성원들이며, 여기에는 뇌-유래의 신경성 인자 (BDNF)(Leibrock, et al., Nature, 341:149-152 (1989)), 뉴로트로핀-3 (NT-3)(Kaisho, et al., FEBS Lett., 266:187 (1990); Maisonpierre, et al., Science, 247:1446 (1990); Rosenthal, et al., Neuron, 4:767 (1990)), 뉴로트로핀 4/5 (NT-4/5)(Berkemeier, et al., Neuron, 7:857-866 (1991))가 포함된다. 또한, 동정되었으나 별도의 족에 속하는 분자가 신경교세포-유래의 신경성 인자 (GDNF; Lin et al., Science, 260:1130-1132 (1993))이다. NGF와 유사하게, GDNF 투여는 체중 손실 및 이질통(異質痛)과 관련되어 있다 (Hoane et al, Exp. Neurol., 160:235-243 (1999)).

동정된 신경성 인자는 이들의 아미노산 유사성 및 구조적 유사상에 기초하여 여러가지 족으로 분류할 수 있다. GDNF 족은 GDNF 뿐만 아니라 관련 분자인 뉴르투린 (neurturin) 및 페르세핀 (persephin)을 포함하는 것으로 밝혀졌다 (Lin et al., Science, 260:1130-1132 (1993); Henderson et a1., Science, 266:1062-1064 (1994); Buj-Bello et al., Neuron, 15:821-828 (1995); Kotzbauer et al., Nature, 384:467-470 (1996); Milbrandt et al., Neuron, 20:245-253 (1998)).

GDNF, 뉴르투린 및 페르세핀은 모두 생체내 및 시험관내에서 도파민성 중뇌 뉴런의 생존에 기여하는 것으로 밝혀졌다 (Lin et al., Science, 260:1130-1132 (1993); Henderson et al., Science, 266:1062-1064 (1994); Horger at al., J. Neurosci., 18:4929-4937 (1998); Oppenheim et al., Nature, 373:344-346 (1995); Milbrandt et al., Neuron, 20:245-253 (1998)). 이러한 능력은, 이들 화합물이 신경 손상 또는 신경 퇴행에 기초한 장애들을 치료하는 데 유용할 수 있음을 시사하였다. 흥미롭게도, GDNF 및 뉴르투린은 배양액에서 몇몇 유형의 말초 뉴런의 생존율을 증가시키지만, 페르세핀은 동일한 현상을 나타내지 않았다 (Buj-Bello et al., Neuron, 15:821-828 (1995); Kotzbauer et al., Nature, 384:467-470 (1996); Ebendal at al., J. Neurosci., Res. 40:276-284 (1995); Heuckeroth et al., Dev.Biol., 200:116-129 (1998); Trupp et al., J. Cell Biol., 130:137-148 (1995); Milbrandt et al., Neuron, 20:245-253 (1998)).

GDNF 족 신경성 인자의 모든 구성원은, GFR이라 불리우는 PI-결합 리간드 결합 단백질을 포함하는 수용체 복합체, 및 RET라 불리우는 단백질-티로신 키나아제인 막횡단 신호전달 단백질을 통해 신호를 전달하는 것으로 보인다. RET는 GDNF 신경성 인자 족의 모든 구성원에 공통적인 신호전달 요소인 것 같지만, GFR에는 별개의 4가지 종류 (GFR 1 내지 4)가 있고, 이들은 각각 상이한 리간드에 대해 특이적인 것으로 보인다. GFR 1-RET는 GDNF에 우선적으로 결합하고, GFR 2-RET는 뉴르투린에 우선적으로 결합한다 (Baloh et al,, Neuron, 18:793-802 (1997); Jing et al., Cell, 85:1113-1124 (1996); Klein et al., Nature, 387:717-721 (1997); Sanicola et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:6238-6243 (1997); Suvanto et al., Hum. Molec. Genetics, 6:1267-1273 (1997); Traeanor et al., Nature, 382:80-83 (1996)). 그러나, GDNF에 대한 GFR 1의 명백한 특이성 및 뉴르투린에 대한 GFR 2의 명백한 특이성이 다소 지나치게 단순화될 수 있다는 몇몇 증거가 최근 밝혀졌다 (Wang et al., J. Neurosci. Res., 61:1-9 (2000)). 또한, GFR 1 수용체가 RET 없이도 GDNF로부터의 신호를 전달할 수 있음을 암시하는 증거가 공개되었다 (Trupp et al., J. Biol. Chem., 274:20885-20894 (1999)). 페르세핀은 GFR 4에 결합하는 것으로 보고되었고, 이로 인해 GFR 4-RET를 통해 작용할 가능성이 높다 (Enokido et al., Curr. Biol., 8:1019-1022 (1998)). 한편, GFR 3의 분석은 이것이 GDNF, 뉴르투린 또는 페르세핀에 의해 활성화될 수 있는 RET와 기능적 수용체를 형성할 수 없음을 암시하였다 (Baloh et al., Proc. Natl. Acad Sci., USA 95:5801-5806 (1998)). 이는 GDNF 족의 4번째 구성원이 동정되지 않고 남아있음을 시사한다.

GDNF 족의 4번째 구성원이 최근 동정 및 특성화되어 아르테민이라 명명되었다 (Baloh et al., Neuron, 21:1291-1302 (1998)). 아르테민과 동일하거나 또는 거의 동일한 몇몇 다른 인자들도 동정되어 에노빈 (enovin)(Masure et al., Eur. J. Biochem., 266:892-902 (1999)) 및 뉴블라스틴 (neublastin) (Rosenblad et al., Mol. Cell. Neurosci., 15:199-214 (2000))이라 명명되었다. 예상된 전장 아르테민 단백질은 분비용 신호 펩티드와, 몇몇 보존적 RXXR 푸린 프로테아제 절단 부위에 의해 성숙 영역으로부터 분리되는 프로영역 (proregion)을 함유한다. 또한, 인간 아르테민 유전자는 2개의 가능한 개시 메티오닌을 함유하여, 2가지 상이한 전장 인간 아르테민 폴리펩티드를 생성한다. 그러나, 프로영역의 절단에서 기인한 인간 아르테민의 성숙 형태는 둘 다 동일한 형태이다. 마우스 아르테민 유전자는 대안적인 메티오닌을 함유하지 않는다. 아르테민은 아미노산 수준에서 GDNF (36％ 동일성)보다 뉴르투린 및 페르세핀 (45％ 동일성)과 더 유사하다 (Baloh et al., 상기 문헌).

상기 약술한 바와 같이, 발로 (Baloh) 등의 상기 문헌은 아르테민이 배양액 중 도파민성 중뇌 뉴런의 생존에 기여하는 것으로 보고하였다. 또한, 아르테민은 생체내에서 흑질선조체 도파민성 뉴런을 보호하는 것으로 밝혀졌다 (Rosenblad, 상기 문헌). 또한, GDNF 및 뉴르투린과 유사하게, 아르테민은 시험관내에서 후근 신경절 (DRG) 및 3차 신경절 (TG) 둘 다로부터의 감각 뉴런 서브세트, 결절성 신경절로부터의 내장 감각 뉴런, 및 상경 신경절 (SCG)의 교감 뉴런을 비롯한 말초 뉴런에 기여할 수 있다 (Baloh et al., 상기 문헌).

아르테민은 GFR 3에 결합하여 GFR 3-RET 수용체 복합체를 활성화시키는 것으로 보고되었다 (Baloh et al., 상기 문헌). 일관적으로, 4가지 GDNF 족 뉴로트로핀 중에서 아르테민은 GFR 3 수용체의 발현 패턴과 가장 일치하는 패턴으로 발현된다 (Baloh et al., 상기 문헌). 유사한 결합 및 유사한 발현 결과가 동일한 분자인 에노빈을 사용하여 얻어졌다 (Masure et al., 상기 문헌). 따라서, GFR 3이 아르테민에 대한 기능적 수용체인 것 같다.

뉴런의 발생 및 생존과 관련된 문제점이 급성 손상에서 장기간 퇴화에 이르기까지의 많은 싱경 질환을 일으키는 주요 인자이다. 따라서 본 발명의 목적은, 아르테민을 사용하여 신경 사멸을 예방하고, NGF 처치시 발생하는 유해한 부작용을 수반하지 않으면서 신경 생존율을 증가시키는 수단을 제공하는 것이다.

<발명의 개요>

본 발명은 아르테민이 포유동물의 뉴런 (특히, 작은 감각 뉴런)에서의 손상-유도된 변화를 예방, 완화 및 치료하는 데 매우 효과적이며, 사실상 손상 후 섭스턴스 P의 손실로부터 펩티드성 뉴런을 보호한다는 발견을 토대로 완성된 것이다. 아르테민 투여가 NGF 투여와 유사하게 펩티드 함량을 증가시킬 수 있음에도 불구하고, 아르테민 투여는 예상외로 NGF와 같은 다른 신경 인자의 투여와 관련된 유해한 부작용 (특히, 통각과민)을 나타내지 않는다.

한 측면에서, 본 발명은 손상에 의해 유도된 병리적 변화로부터 포유동물의 뉴런을 보호하는 방법을 제공한다. 이 방법은 포유동물에게 아르테민 또는 아르테민 작용제를 투여하는 것을 포함한다. 아르테민이 투여되는 포유동물은 인간일 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 아르테민 또는 아르테민 작용제의 투여량은 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg이다. 아르테민 또는 아르테민 작용제의 투여는 기계적 또는 열적 통각과민을 수반하지 않는다.

한 실시양태에서, 투여량은 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg이다. 다른 실시양태에서, 투여량은 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 mg/kg이다.

투여는 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 투여는 전신 투여이며, 또한 정맥내, 피부내, 경막내 또는 피하 주사일 수도 있다. 다른 실시양태에서, 투여는 국소 투여이다.

아르테민 또는 아르테민 작용제의 투여는 당업계 공지의 방법에 의해 결정된 바와 같이 반복된다. 한 실시양태에서, 투여는 2주 이상의 기간 동안 주 2회 이상 반복된다. 다른 실시양태에서, 투여는 2주 이상의 기간 동안 주 3회 이상 반복된다.

본 발명의 한 실시양태에서, 아르테민에 의해 영향을 받는 뉴런은 말초 뉴런이다. 보다 바람직하게는, 상기 뉴런이 교감 뉴런, 부교감 뉴런, 감각 뉴런 및 장관 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게는, 상기 뉴런이 작은 섬유 감각 뉴런이다.

본 발명의 또다른 실시양태에서, 뉴런은 운동 뉴런 또는 중추 뉴런이다. 뉴런이 중추 뉴런인 경우, 이들은 바람직하게는 뇌 뉴런 또는 척수 뉴런이다.

본 발명의 첫번째 측면에서 고려되는 손상은 외상, 독성물질, 다른 치료제의 부작용, 외과 수술, 뇌졸중, 허혈, 감염, 대사성 질환, 영양 결핍, 또는 악성 종양과 관련된 것일 수 있다. 또한, 상기 손상은 말초 신경병증, 보다 바람직하게는 말초 감각 신경병증, 보다 더 바람직하게는 당뇨성 신경병증과 관련된 것일 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 아르테민은 천연 서열 아르테민 폴리펩티드 또는 천연 서열 인간 아르테민 폴리펩티드일 수 있다. 한 실시양태에서, 천연 서열 인간 아르테민 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 천연 서열 인간 아르테민 폴리펩티드는 서열 3 또는 서열 5의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 포유동물에서 신경 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 포유동물에게 아르테민 또는 아르테민 작용제를 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg의 투여량으로 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 투여량은 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg 또는 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 mg/kg이다. 상기 투여는 기계적 또는 열적 통각과민을 수반하지 않는다. 아르테민이 투여되는 포유동물은 인간일 수 있다.

본 발명의 상기 측면에서 고려되는 신경 손상은 신경병증 또는 신경퇴행성 질환으로부터 기인한 것일 수 있다. 한 실시양태에서는 신경병증이 말초 신경병증이며, 다른 실시양태에서는 신경병증이 당뇨성 신경병증이다. 또다른 실시양태에서, 신경병증은 작은 섬유 감각 신경병증이다. 보다 바람직하게는, 신경퇴행성 질환이 근위축성 측삭 경화증일 수 있다.

한 실시양태에서는 천연 서열 아르테민 폴리펩티드가 투여된다. 다른 실시양태에서는 천연 서열 인간 아르테민 폴리펩티드가 투여된다. 천연 서열 인간 아르테민 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 천연 서열 인간 아르테민 폴리펩티드는 서열 3 또는 서열 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 아르테민의 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있으며, 바람직하게는 2주 이상의 기간 동안 주 2회 이상 반복된다.

본 발명의 세번째 측면은 용기, 상기 용기 내의 아르테민을 포함하는 제약 조성물, 및 상기 제약 조성물을 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg의 투여량으로 투여하도록 하는 지침을 포함하는 제품에 관한 것이다.

본 발명은 신경 세포 손상 및 신경 세포 손상과 관련된 변화를 예방, 완화 또는 치료하기 위한 아르테민 (artemin)의 용도에 관한 것이다.

도 1은 성숙 인간 아르테민의 아미노산 서열 (서열 1)을 나타낸다.

도 2는 전장 인간 아르테민 한 형태의 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 2)을 나타낸다.

도 3은 도 2의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 인간 아르테민 형태의 아미노산 서열 (서열 3)을 나타낸다.

도 4는 인간 아르테민의 제2 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 4)을 나타낸다.

도 5는 도 4의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 인간 아르테민 변이체의 아미노산 서열 (서열 5)을 나타낸다.

도 6은 마우스로부터 유래한 전장 아르테민을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 (서열 6)을 나타낸다.

도 7은 도 6의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 마우스 아르테민의 아미노산 서열 (서열 7)을 나타낸다.

도 8은 NGF 및 아르테민을 전신 투여 처치한 동물에서의 열 회피 잠재시간 (thermal withdrawal latency)을 나타낸다. NGF를 처치한 동물에서는 열 회피 잠재시간이 처치전 수치의 약 75％로 감소된 반면에, 아르테민을 처치한 동물에서의 잠재시간은 줄어들지 않았다.

도 9는 기계적 민감성 시험을 나타낸다. NGF를 전신 투여 처치한 동물에서는 회피 역치가 처치전 수준의 약 60％로 감소된 반면에, 염수 또는 아르테민을 처치한 동물에서는 처치전 값의 약 90％로 점차 감소되었다.

도 10은 NGF 및 아르테민을 국소 투여 처치한 동물에서의 열 회피 잠재시간을 나타낸다. NGF를 처치한 동물에서는 열 회피 잠재시간이 감소한 반면에, 아르테민을 처치한 동물에서는 처치전의 수준을 유지하였다.

도 11은 기계적 민감성 시험을 나타낸다. NGF를 국소 투여 처치한 동물에서는 회피 역치가 27 g의 처치전 수치에서 약 22 g으로 감소된 반면에, 염수 또는 아르테민을 국소 투여 처치한 동물에서는 회피 역치가 감지할 수 있을 정도로의 감소가 없었다.

도 12는 NGF를 처치한 동물의 체중이 2주에 약 7％ 감소된 반면에, 아르테민 또는 염수를 처치한 동물은 체중 감소가 약 2％ 미만임을 보여준다.

도 13은 스페어드 신경 손상 (spared nerve injury; SNI)을 입은 래트에게 NGF를 지속적으로 처치한 경우에 통증 행태의 빈도가 증가한 반면, 아르테민을 처치한 경우에는 통증 행태의 발생이 감소함을 보여준다.

도 14는 NGF 및 아르테민 둘 다가 허피스 심플렉스 바이러스에 의해 유도되는 사멸로부터 뉴런을 보호함을 보여준다.

도 15는 아르테민의 처치가 좌골 신경 절단 후 관찰되는 작은 감각 뉴런에서의 펩티드 함량 감소를 방지함을 보여준다.

도 16은 펩티드 함량을 정량하는 방법을 나타낸다. 각각의 선을 따라 평균 염색 강도를 계산함으로써, 후각 아래로의 깊이에 대한 염색 강도 변화를 계산하였다.

도 17은 좌골 신경 손상을 입은 래트의 후각 표면에서부터의 깊이에 대해 플롯팅된 섭스턴스 P의 염색 강도를 도시한 것이다. 아르테민은 축삭절개술 (axotomy)에 의해 유도되는 펩티드 손실을 방지한다.

도 18은 아르테민이 축삭절개술에 의해 유도되는 C 섬유 전도 속도 변화로부터 뉴런을 보호함을 보여준다.

도 19는 신생 뉴런의 생존에 대한 아르테민의 생존 강화 효과에 GFRα3의 작용이 필요함을 보여준다. GFRα3 낙아웃 마우스의 뉴런에서, 아르테민의 첨가는 대조군에 비해 생존 증가를 유발하지 않았다.

도 20은 말초 신경 손상이 GFRα3 발현을 상향조절하여, 거의 모든 작은 DRG 세포가 상기 수용체를 발현함을 보여준다. 부수적인 아르테민의 상향조절은 원위부 기저에서 관찰된다.

도 21은 캡사이신을 처치한 경우, 중앙 및 측면 후각에서 섭스턴스 P의 함량이 심각하게 결핍됨을 보여준다. 아르테민의 투여는, 후각 안쪽으로 돌출된 감각 뉴런 돌기의 펩티드 함량을 완전하게 보호한다.

도 22는 아르테민을 뇌실에 주입함으로써, 좌골 신경 절단과 관련된 섭스턴스 P의 손실이 방지됨을 보여준다.

A. 정의

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아르테민" 및 "아르테민 폴리펩티드"는 서로 교환하여 사용되며, 본원에 각각 정의된 천연 서열 아르테민, 아르테민 변이체 및 키메라 아르테민을 지칭한다. 임의로는, 상기 아르테민은 천연 글리코실화와 관련이 없다. "천연 글리코실화"는 아르테민이 포유동물 세포 내에서 생산되는 경우, 특히 자연적으로 발생한 세포 내에서 생산되는 경우에 상기 아르테민에 공유결합된 탄수화물 부분을 지칭한다. 따라서, 인간을 제외한 세포에서 생산된 인간 아르테민은 "천연 글리코실화와 관련이 없는" 것일 수 있는 아르테민의 한 예이다. 때때로, 아르테민이 대장균 (E. coli)과 같은 원핵 생물 내에서 생산되는 경우에는 전혀 글리코실화되지 않을 수 있다.

아르테민 핵산은, 상기 정의한 것과 같은 아르테민 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 또는 DNA이거나, 또는 이러한 DNA 또는 RNA와 혼성화되어 엄격 혼성화 조건하에서 안정하게 결합된 상태로 남아있으며, 약 10개 초과의 뉴클레오티드 길이를 갖는 RNA 또는 DNA이다. 엄격 조건은 (1) 세척시, 예를 들어 0.15 M NaCl/0.015 M 시트르산나트륨/0.1％ NaDodSO₄및 50℃와 같은, 낮은 이온강도 및 고온을 이용하거나, 또는 (2) 혼성화시, 42℃에서 포름아미드 (예를 들어, 0.1％ 소 혈청 알부민/0.1％ 피콜/0.1％ 폴리비닐피롤리돈/50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)을 포함하는 50 부피/부피％ 포름아미드)와 같은 변성제와 750 mM NaCl, 75 mM 시트르산나트륨을 함께 사용하는 것이다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 작동가능하게 연결된다. 아르테민 핵산은 벡터 내에서 다른 핵산 서열과 작동가능하게 연결되어, 특정한 숙주 생물 내에서 발현될 수 있다. 이것은 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 프리서열 (presequence) 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는, 해당 폴리펩티드가 그의 분비에 관여하는 프리단백질 (preprotein)로서 발현되는 경우 상기 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되거나; 프로모터 또는 인핸서는, 코딩 서열의 전사에 영향을 미치는 경우 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는, 리보솜 결합 부위는 코딩 서열의 번역을 촉진하도록 배치될 때 상기 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우에는 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서가 반드시 인접하여 위치해야 하는 것은 아니다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서의 라이게이션을 통해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.

"천연 서열의 아르테민"은, 수득 방법에 관계 없이, 자연에서 유래한 아르테민과 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 아르테민은 자연적으로 발생하는 래트 아르테민, 뮤린 아르테민, 인간 아르테민 또는 임의 포유동물 종에서의 아르테민의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 2종의 천연 서열의 전장 인간 아르테민 아미노산 서열을 도 3 및 도 5 (서열 3 및 서열 5)에 나타내었다. 상기 서열이 2종인 것은 인간 아르테민 유전자에서 2종의 가능한 개시 메티오닌이 존재하기 때문이다. 천연 서열의 마우스 아르테민 아미노산 서열을 도 7 (서열 7)에 나타내었다. 이러한 천연 서열의 아르테민 폴리펩티드는 자연에서 단리될 수 있거나, 또는 재조합 및(또는) 합성 방법에 의해 생산될 수 있다. 용어 "천연 서열의 아르테민"은 구체적으로는 자연 발생의 프리프로, 프로 및 성숙 형태, 및 말단이 절단된 (truncated) 형태의 아르테민, 자연 발생의 변이체 형태 (예를 들어, 다르게 스플라이싱된 형태) 및 자연 발생의 대립유전자 변이체를 포함한다. 바람직한 천연 서열 아르테민은 도 1 (서열 1)에 나타낸 바와 같은 성숙 인간 천연 서열 아르테민이다. 인간 아르테민의 성숙 형태는 상기 2종의 전장 천연 서열에서 각각 발견되는 거대한 프로영역의 단백질분해성 절단에 의해 얻어진다.

"아르테민 변이체"는, 도 1의 서열 (서열 1)과 같은 천연 서열 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 삽입, 결실, 변형 및(또는) 치환함으로써, 천연 서열 아르테민 폴리펩티드 (예를 들어, 도 1에 나타낸 성숙 인간 아르테민)의 서열과 상이한아미노산 서열을 갖는, 생물학적 활성 아르테민 폴리펩티드이다. 일반적으로 아르테민 변이체는, 도 1 (서열 1)의 성숙 인간 아르테민과 같은 천연 서열 아르테민과 100％이하의 서열 동일성을 갖는다. 그러나, 통상적으로 생물학적 활성 아르테민 변이체는 도 1 (서열 1)의 성숙 인간 아르테민과 같은 자연 발생의 아르테민 아미노산 서열과 약 60％ 이상의 서열 동일성을 갖고, 바람직하게는 약 65％, 70％, 75％, 80％ 이상의 서열 동일성을 갖고, 더 바람직하게는 약 85％ 내지 약 99％의 범위내에서 1％씩 증가하는 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 상기 아르테민 변이체에는 상응하는 천연 서열 아르테민 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유한, 5개 이상의 아미노산, 바람직하게는 10개 이상의 아미노산, 더 바람직하게는 15개 이상의 아미노산, 더욱 더 바람직하게는 20개 이상의 아미노산으로 구성된 펩티드 단편이 포함된다. 또한, 상기 아르테민 변이체에는 1개 이상의 아미노산 잔기가 천연 아르테민 서열의 N-말단 또는 C-말단, 또는 내부에 부가된 아르테민 폴리펩티드가 포함된다. 또한, 상기 아르테민 변이체에는 다수의 아미노산 잔기가 결실되고 임의로는 1개 이상의 아미노산 잔기에 의해 치환된 아르테민 폴리펩티드가 포함된다. 또한, 상기 아르테민 변이체는, 예를 들어 자연 발생의 아미노산 이외의 다른 잔기에 의해 치환되거나, 또는 아미노산 잔기를 변형시켜 자연 발생이 아닌 아미노산을 생성시킴으로써 공유결합적으로 변형될 수도 있다.

본원에서는 아르테민 서열과 관련하여 "아미노산 서열 동일성 (％)"을, 서열을 정렬하고, 필요할 경우 최대 서열 동일성 (％)을 얻기 위해 갭 (gap)을 도입한 후, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 상태에서, 아르테민 서열의 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 백분률로서 정의하였다. 후보 아르테민 서열의 N-말단, C-말단 또는 내부에서의 연장, 결실 또는 삽입은 서열 동일성 또는 상동성에 영향을 주지 않는 것으로 해석될 것이다. 상기 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램은 당업계에 잘 알려져 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 한 예로는 "ALIGN-2"가 있으며, 이것은 제넨테크, 인크. (Genentech, Inc.)에 의해 개발되고 미국 저작권청 (미국 워싱톤 D.C. 20559에 소재)에 사용자 문서로 보관되어 있으며, 미국 저작권 등록번호 TXU510087로 등록되어 있다.

"키메라 아르테민" 분자는 이종폴리펩티드에 융합되거나 또는 결합된 전장 아르테민 또는 이것의 1개 이상의 도메인을 포함하는 폴리펩티드이다. 일반적으로 키메라 아르테민 분자는 자연 발생의 아르테민과 1개 이상의 동일한 생물학적 특성을 갖는다. 키메라 아르테민의 한 예로는 정제 목적으로 에피토프가 태깅 (tagging)된 것이다. 또다른 키메라 아르테민 분자는 아르테민 면역어드헤신이다.

본원에 사용된 용어 "에피토프 태깅된"은 "태그 (tag) 폴리펩티드"에 융합된 아르테민을 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. 태그 폴리펩티드는 생산될 수 있는 항체에 대해 에피토프를 제공하는 다수의 잔기를 갖고 있으며, 또한 아르테민의 생물학적 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 바람직하게는, 태그 폴리펩티드는 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와 실질적으로 교차반응하지 않도록 매우 독특하다. 일반적으로, 적합한 태그 폴리펩티드는 6개 이상의 아미노산 잔기를 갖고, 보통은 약 8개 내지 50개의 아미노산 잔기 (바람직하게는 약 9개 내지 30개 잔기)를 갖고 있다. 바람직한 것으로는, 니켈과 결합하는 폴리-히스티딘서열이 있으며, 이로 인해 Ni-NTA 크로마토그래피에 의해 태깅된 단백질을 단리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Lindsay et al. Neuron 17:571-574 (1996)] 참조).

아르테민 "작용제"는 천연 서열 아르테민의 생물학적 특성을 1개 이상 갖는 분자 또는 화합물을 지칭한다. 그 예로는 유기 소분자, 펩티드 및 작용제 항-아르테민 항체가 포함되지만, 이것에만 제한되는 것은 아니다.

"단리된 아르테민"은 아르테민 공급원에서 정제된 아르테민, 또는 재조합 또는 합성 방법에 의해 제조 후 정제된 아르테민을 지칭한다. 정제된 아르테민에는 다른 폴리펩티드 또는 펩티드가 실질적으로 존재하지 않는다. 본원에서 "실질적으로 존재하지 않는"은 다른 공급원의 단백질이 약 5％이하, 바람직하게는 약 2％ 이하, 더 바람직하게는 약 1％ 이하, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5％ 이하, 가장 바람직하게는 약 0.1％ 이하로 혼합되어 있는 것을 지칭한다.

"본질적으로 순수한" 단백질은, 조성물의 총 중량에 대해 단백질을 약 90 중량％ 이상, 바람직하게는 약 95 중량％ 이상, 더 바람직하게는 약 90 중량％ 이상, 더욱 바람직하게는 약 95 중량％ 이상 포함하는 조성물을 지칭한다. "본질적으로 균일한" 단백질은 조성물의 총 중량에 대해 단백질을 약 99 중량％ 이상 포함하는 조성물을 지칭한다.

"아르테민" 또는 "단리된 아르테민", 또는 아르테민의 "작용제"와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "생물학적 특성"은 천연 서열의 아르테민 (이 아르테민이 천연 구조이든 변성된 구조이든 상관없음)에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 유발되거나 또는 수행되는, 이펙터 또는 항원성의 기능 또는 활성을 갖고 있음을 의미한다. 이펙터 기능에는 수용체 결합 (바람직하게는 높은 친화도를 지님), 세포의 생존, 분화 및(또는) 증식 강화, 및 손상-유도된 변화로부터 세포 (특히, 뉴런)의 보호가 포함된다.

"아르테민" 또는 "단리된 아르테민", 또는 아르테민의 작용제와 관련하여 사용되는 경우, 용어 "생물학적 활성"은 천연 서열 아르테민의 이펙터 기능을 나타내거나 또는 공유하는 아르테민 폴리펩티드를 의미한다. 아르테민의 주요 이펙터 기능은 뉴런의 생존을 자극하는 능력이다. 아르테민의 또다른 주요 이펙터 기능은 손상-유도된 변화로부터 뉴런을 보호하는 능력이다. 바람직한 생물학적 활성에는, 말초 (교감, 부교감, 감각 및 장관) 뉴런, 운동 뉴런 및 중추 (뇌 및 척수) 뉴런을 비롯하여, 손상을 입은 뉴런 세포의 시험관내 또는 생체내에서의 분화, 증식, 유지, 및(또는) 재생을 증진시키는 능력이 포함된다. 특히 바람직한 생물학적 활성은, 예를 들어 말초 신경병증 또는 다른 신경퇴행성 질환과 같은 신경병증을 완화 (치료 및 예방 포함)시키거나, 또는 손상을 입은 신경 세포를 치료하는 능력이다. 상기 손상을 입은 뉴런은 감각 뉴런, 교감 뉴런, 부교감 뉴런 또는 장관 뉴런 (예를 들어, 후근 신경절 뉴런), 운동 뉴런 및 중추 뉴런 (예를 들어, 척수 뉴런)일 수 있다. 상기 손상에는 외상, 독성물질, 다른 치료제의 부작용, 외과 수술, 뇌졸중, 허혈, 감염, 대사성 질환, 영양 결핍, 또는 악성 종양을 비롯한 임의 원인에 의한 것일 수 있다.

"아르테민 수용체"는 아르테민이 결합하여 아르테민의 생물학적 특성을 매개하는 분자이다.

"항체" (Ab) 및 "면역글로불린" (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖고 있는 당단백질이다. 항체는 특정 항원에 대해 결합 특이성을 갖고 있는 반면에, 면역글로불린은 항체와, 항원 특이성이 결여된 임의 항체-유사 분자 둘 다를 포함한다. 예를 들어, 면역글로불린의 폴리펩티드는 림프계에 의해 낮은 수준으로 생산되고, 골수종에 의해 증가된 수준으로 생산된다.

"천연 항체" 및 "천연 면역글로불린"은 보통 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이며, 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성되어 있다. 각각의 경쇄는 1개의 공유 이황결합에 의해 중쇄에 연결되어 있는 반면에, 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄에서는 이황결합의 수가 다양하다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 일정한 간격으로 쇄 내부의 이황 브리지 (disulfide bridge)를 갖고 있다. 각각의 중쇄는 한쪽 말단의 가변 도메인 (V_H)과 그 뒤에 다수의 불변 도메인을 갖고 있다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단의 가변 도메인 (V_L)과 다른쪽 말단의 불변 도메인을 갖고 있고, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되어 있으며, 경쇄의 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬되어 있다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄의 가변 도메인 사이에 경계를 형성하는 것으로 생각된다.

용어 "가변적인"은 상기 가변 도메인들의 특정 부분 서열이 항체들간에 매우 상이하다는 것을 지칭하며, 상기 가변 도메인은 각 특정 항체의 특정 항원과의 결합 및 특이성을 나타내는 데 이용된다. 그러나 상기 가변성이 항체의 가변 도메인 전반에 걸쳐 고르게 분포되어 있는 것은 아니다. 이것은 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인 둘 다에 "초가변 영역"으로 불리는 3개의 단편에 집중되어 있다. 가변 도메인에서 매우 보존적인 부분을 프레임워크 영역 (framework region, FR)이라 한다. 천연의 중쇄 및 경쇄에서의 가변 도메인 각각은, 루프 연결을 형성하고 몇몇 경우에는 β-쉬이트 (sheet) 구조의 일부를 형성하는 3개의 초가변 영역에 의해 연결된, 주로 β-쉬이트 구조의 4가지 FR (각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4)을 포함한다. 각각의 쇄에서의 초가변 영역은 FR들에 의해 다른 쇄의 초가변 영역과 근접하여 연결되어 있고, 항체의 항원-결합 부위 형성에 기여한다 (문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991), pp647-669] 참조). 불변 도메인은 항체-항원 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항체-의존 세포 독성에서의 항체 관여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "초가변 영역"은, 항체 결합에 관여하는 항원의 아미노산 잔기를 지칭한다. 상기 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인의 잔기 약 24 내지 34 (L1), 50 내지 56 (L2) 및 89 내지 97 (L3), 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31 내지 35 (H1), 50 내지 65 (H2) 및 95 내지 102 (H3); Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), 및(또는) "초가변 루프"로부터의 아미노산 잔기 (즉, 경쇄 가변 도메인에서의 잔기 26 내지 32 (L1), 50 내지 52 (L2) 및 91 내지 96 (L3), 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26 내지 32 (H1), 53 내지 55 (H2) 및 96 내지 101 (H3; Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다.

항체를 파파인으로 분해하면, 각각 단일 항원-결합 부위를 지닌 "Fab"로 불리는 두개의 동일한 항원-결합 단편과 나머지 "Fc" 단편 (이 명칭은 쉽게 결정화되는 능력을 반영한 것임)이 생성된다. 펩신을 처리함으로써 2개의 항원-결합 부위를 갖고 있는 F(ab')₂단편이 생성되고, 이것은 여전히 항원과 교차결합될 수 있다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 부위 및 항원-결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인과 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단한 비공유결합으로 연결된 이량체로 구성되어 있다. 이러한 구조에서, 각각의 가변 도메인에서의 3개 초가변 영역은, V_H-V_L이량체의 표면에 있는 항원-결합 부위를 결정하는 역할을 한다. 결과적으로, 6개의 초가변 영역이 항체에 대한 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단지 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 CDR을 단지 3개만 포함하는 Fv의 절반)만으로도, 비록 전체 결합 부위보다 친화도는 낮지만, 항체를 인식하고 결합할 수 있는 능력이 있다.

또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함하고 있다. 항체의 힌지 영역에서 1개 이상의 시스테인을 포함한 중쇄 CH1 도메인의 카르복실 말단에 소수의 잔기를 부가한 Fab' 단편은 Fab 단편과 다르다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기가 유리 티올기를 함유하고 있는 Fab'를 나타내기 위해 본원에서 지정한 것이다. F(ab')₂항체 단편은 본질적으로 Fab' 단편의 쌍으로서 생성되었으며, 이들 사이에는 힌지 시스테인이 존재한다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종에서 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인 아미노산 서열에 따라 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 2종의 상이한 타입중 하나에 속할 수 있다.

중쇄의 불변 도메인 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 군으로 분류될 수 있다. 면역글로불린에는 5개의 주요 군 (IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)이 있으며, 이들 중 몇개는 아군 (이소타입)(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2)으로 더 분류될 수 있다. 면역글로불린의 각각의 상이한 군에서의 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불리운다. 서로 다른 군의 면역글로불린들의 서브유닛 구조 및 3차원 구조는 공지되어 있다.

본원에 사용된 용어 "항체"는 광범위한 의미로 사용되었으며, 구체적으로는 인간, 비-인간 (예, 뮤린) 및 인간화 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예, 이중특이적 항체) 및 항체 단편 (단, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 경우)을 포함한다.

"항체 단편"에는 전장 항체의 일부, 일반적으로는 그의 항원 결합 도메인 또는 그의 가변 도메인이 포함된다. 항체 단편의 예에는 Fab, Fab', F(ab')₂및 Fv 단편, 디아바디 (diabody), 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편들로부터형성된 다중 특이적 항체가 포함된다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 고도로 특이적이다. 추가로, 상이한 결정부위 (에피토프)에 대해 유도된 상이한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 유도된다. 수식어구 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 항체의 특성을 나타내고, 어떤 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 의미로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al, Nature 256:495 (1975)]에 처음으로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조할 수도, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.

본원의 모노클로날 항체에는 구체적으로 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되었거나 또는 특정한 항체 군 또는 아군에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있지만, 상기 쇄(들)의 나머지 부분은 다른 종으로부터 유래되었거나 또는 다른 항체 군 또는 아군에 속하는 항체 뿐만 아니라 상기 항체 단편의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성이 있는 "키메라" 항체(면역글로불린)가 포함된다 (단, 이들은 원하는 생물학적 활성을 나타내야 함) (미국 특허 제4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).

비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 가진 마우스, 래트, 토끼 또는 인간을 제외한 영장류와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 초가변 영역 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 몇몇 경우에서는, 인간 면역글로불린 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 대체한다. 추가로, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능을 더 증진시킨다. 통상적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하는데, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 영역은 비-인간 면역글로불린 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 면역글로불린 서열의 FR이다. 또한 인간화 항체는 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc) 중 적어도 일부, 전형적으로는 인간 면역글로불린의 적어도 일부를 포함할 것이다. 보다 상세한 내용은 문헌 [Jones et al,, Nature 321:522-525 (1986)], [Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 V_H및 V_L도메인을 포함하는데, 이 도메인은 단일 폴리펩티드쇄에 존재한다. 통상적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 원하는 항원 결합 구조를 형성할 수 있는 V_H와 V_L도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv에 대한 개관은 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조한다.

용어 "디아바디"는 2개의 항원-결합 부위가 있는 항체 단편을 나타내는데, 여기서 단편은 동일한 폴리펩티드쇄 내의 경쇄 가변 도메인 (V_L)과 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H) (V_H-V_L)을 포함한다. 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 2개 도메인 사이에서 페어링하지 못하는 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보 도메인과 페어링시키고 2개의 항원-결합 부위를 형성시킨다. 디아바디는, 예를 들어 EP 404,097호, WO 93/11161호 및 문헌 [Hollinger ef al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)]에 더욱 상세히 기재되어 있다.

본 출원에 사용된 표현 "선형 항체"는 문헌 [Zapata et al. Protein Eng. 8 (10):1057-1062 (1995)]에 기재된 항체를 나타낸다. 요컨대, 상기 항체는 항원-결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 (tandem) Fd 세그먼트 (V_HC_H1-V_HC_H1)의 쌍을 포함한다. 선형 항체는 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

용어 "에피토프"는 단백질 항원 상의 (모노클로날 또는 폴리클로날) 항체에대한 결합 부위를 나타내기 위해 사용한다.

"작용제 항체"는 아르테민 작용제인 항체를 의미하고, 따라서 천연 아르테민 서열의 생물학적 특징을 하나 이상 가지고 있다.

용어 "아르테민 면역어드헤신"은 용어 "아르테민-면역글로불린 키메라"와 서로 교환하여 사용되고, (천연 또는 변이체) 아르테민 분자의 적어도 일부를 면역글로불린 서열과 조합한 키메라 분자를 나타낸다. 필수적이지는 않지만 바람직하게는 면역글로불린 서열은 면역글로불린 불변 도메인이다. 면역어드헤신은 수많은 다양한 인간 항체의 화학적 및 생물학적 특징을 가질 수 있다. 면역어드헤신은 적절한 인간 면역글로불린 힌지 및 불변 도메인 (Fc) 서열과 연결된 원하는 특이성을 가진 인간 단백질 서열로 해석될 수 있기 때문에, 관심있는 결합 특이성을 전체 인간 성분을 사용하여 달성할 수 있다. 상기 면역어드헤신은 환자에 대해 최소의 면역원성이고, 장기간 또는 반복된 사용할 때 안전하다.

치료 용도로 기재된 동종다량체 면역어드헤신의 예로는 세포-표면 CD4에 대한 HIV의 결합을 차단하는 CD4-IgG 면역어드헤신이 있다. 임신한 여성에게 분만 직전에 CD4-IgG를 투여하는 단계 I 임상 시험에서 얻어진 데이타는 상기 면역어드헤신이 HIV의 모체-태아 전달을 차단하는 데 유용할 수 있음을 시사한다 (문헌 [Ashkenazi et al., Intern. Rev. Immunol. 10:219-227 (1993)] 참조). 종양 괴사 인자 (TNF)와 결합하는 면역어드헤신이 또한 발견되었다. TNF는 패혈성 쇼크의 주요 조절인자인 것으로 보여지는 전염증성 사이토카인이다. 패혈성 쇼크의 마우스 모델에 기초하여, TNF 수용체 면역어드헤신은 패혈증 치료시 임상적 이용을 위한후보로서 가능성을 나타냈다 (문헌 [Ashkenazi, A. et al (1991) PNAS USA 88:10535-10539] 참조). IgG Fc 영역과 융합된 TNF 수용체 서열을 포함하는 면역어드헤신인 ENBREL (등록상표) (에타너셉트)이 1998년 11월 2일 미국 식품 의약청 (FDA)에 의해 류마티스성 관절염 치료용으로 승인되었다. 류마티스성 관절염의 치료시 ENBREL (등록상표)의 확대된 신규 용도는 2000년 6월 6일 FDA에 의해 입증되었다. ENBREL (등록상표)을 비롯한 TNF 차단제에 대한 최근의 정보에 대해서는 문헌 [Lovell et al., N. Engl. J. Med. 342:763-169 (2000)], 동일 문헌 p 810-811, [Weinblatt et al., N. Engl. J. Med. 340:253-259 (1999)] 및 [Maini and Taylor, Annu. Rev. Mod 51:207-229 (2000)]에 개관된 내용을 참조한다.

면역어드헤신 구조의 2개의 암 (arm)이 상이한 특이성을 갖는 경우, 면역어드헤신은 이중특이적 항체와 유사하게 "이중특이적 면역어드헤신"이라 부른다. 문헌 [Dietsch et al, J. Immunol. Methods 162:123 (1993)]에는 결합 분자, E-셀렉틴 및 P-셀렉틴의 세포외 도메인을 조합한 이중특이적 면역어드헤신이 기재되어 있는데, 이 때 각각의 셀렉틴은 자연 발생의 상이한 세포형에서 발현된다. 결합 연구는 이렇게 형성된 이중특이적 면역글로불린 융합 단백질이 단일 특이적 면역어드헤신으로부터 유래된 것과 비교하여 골수 세포주와의 결합 능력이 증가되었음을 나타낸다.

용어 "이종어드헤신 (heteroadhesin)"은 표현 "키메라 이종다량체 어드헤신"과 서로 교환하여 사용되고 키메라 분자 (아미노산 서열)의 복합체를 나타내는데, 각각의 키메라 분자는 이종다량체성 수용체 단량체의 각 세포외 도메인과 같이 생물학적으로 활성인 부분이 다량체화 도메인과 결합된 것이다. "다량체화 도메인"은 이종다량체 복합체 내에서 키메라 분자의 안정한 상호작용을 증가시킨다. 다량체화 도메인은 면역글로불린 서열, 류신 지퍼, 소수성 영역, 친수성 영역, 또는 키메라 이종다량체의 키메라 분자 사이에 분자간 디술피드 결합을 형성하는 유리 티올을 통해 상호작용할 수 있다. 다량체화 도메인은 면역글로불린 불변 영역을 포함할 수 있다. 또한 다량체화 영역을 조작하여, 입체 상호작용이 안정한 상호작용을 증가시킬뿐만 아니라, 단량체의 혼합물로부터 동종다량체에 비해 이종다량체의 형성을 증진시킬 수 있다. "융기 (protuberance)"는 제1 폴리펩티드의 경계면에서 작은 아미노산 측쇄를 더 큰 측쇄 (예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체함으로써 구성할 수 있다. 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 측쇄 (예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 폴리펩티드의 경계면 상에 융기와 동일하거나 유사한 크기의 보충 "공간 (cavity)"이 임의로 형성된다. 필수적이지는 않지만 바람직하게는, 면역글로불린 서열은 면역글로불린 불변 도메인이다. 본 발명 키메라의 면역글로불린 잔기는 IgG₁, IgG₂, IgG₃또는 IgG₄서브타입, IgA, IgE, IgD 또는 IgM으로부터 수득될 수 있고, 바람직하게는 IgG₁또는 IgG₃으로부터 수득된다.

본원에 사용된 "치료"는 유익하거나 바람직한 임상 결과를 얻기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적을 위해, 유익하거나 바람직한 임상 결과는 측정가능하거나 측정할 수 없는 증상의 경감, 질환 정도의 감소, 질환 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음), 질환 진행의 지연 또는 느려짐, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및진정 (부분적으로 또는 전체적으로)을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료받지 않았을 경우에 예상되는 생존기간과 비교하여 생존기간이 연장됨을 의미할 수 있다. "치료"는 발병을 예방하거나 장애의 병리상태를 변경시키기 위해 수행된 간섭이다. 따라서, "치료"는 치료학적 치료 및 예방학적 처치 또는 방해 처치 모두를 나타낸다. 치료가 필요한 대상체에는 이미 장애를 앓는 대상체 뿐만 아니라, 장애가 예방되어야 하는 대상체도 포함된다. 구체적으로, 치료는 세포 퇴화 손상의 병리상태, 예를 들어 신경 세포의 병리상태를 직접적으로 예방하거나, 지연시키거나 다른 방법으로 감소시킬 수 있고, 또는 세포, 예를 들어 뉴런이 다른 치료제에 의해 더 잘 치료될 수 있게 한다. 바람직한 실시양태에서는, 치료가 표적 뉴런의 감퇴를 감소시키거나 지연시키고(거나) 표적 뉴런의 기능 회복을 자극한다.

(만성) 신경퇴행성 질환 또는 급성 신경계 손상의 "병리상태"에는 신경 기능장애, 퇴화, 손상 및(또는) 사멸 등을 비롯하여, 환자의 복지에 영향을 주는 모든 현상이 포함된다.

용어 "신경퇴행성 질환" 및 "신경퇴행성 장애"는 말초 신경병증; 운동신경 장애, 예를 들어 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 루게릭 (Lou Gehrig) 질환, 벨 (Bell) 마비, 및 척추성 근 위축증 또는 마비와 관련된 각종 증상; 및 다른 인간 신경퇴행성 질환, 예를 들어 알츠하이머 (Alzheimer) 질환, 파킨슨 (Parkinson) 질환, 간질, 다발성 경화증, 헌팅턴 (Huntington) 무도병, 다운 증후군, 신경 난청 및 메니에르 (Meniere) 질환을 포함하나 이에 제한되지 않는 신경 퇴화 및(또는)기능장애와 관련된 모든 장애 병리상태를 포함하는 광범위한 의미로 사용된다.

"말초 신경병증"은 운동, 감각, 감각운동 또는 자율신경 장애 중 하나 또는 조합으로 나타나는, 말초신경에 영향을 주는 신경퇴행성 질환이다. 예를 들어, 말초신경 장애는 유전적으로 획득되거나, 전신성 질환으로부터 야기될 수 있거나, 독성물질, 예를 들어 항암제와 같은 신경독성 약물, 또는 공업적 오염물질 또는 환경 오염물질에 의해 유도될 수 있다. "말초 감각 신경병증"은 특발성이거나, 당뇨병의 결과 (당뇨성 신경병증), 암의 성장억제 약물 치료법 (예를 들어, 화학요법제, 예를 들어 빈크리스틴, 시스플라틴, 메톡트렉세이트, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘, 또는 탁산, 예를 들어 파클리탁셀 [TAXOL (등록상표), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재 브리스톨-마이어스 스퀴브 옹콜로지 (Bristol-Myers Squibb Oncology)] 및 독세탁셀 [TAXOTERE (등록상표), 프랑스 앙토뉘 소재 롱-프랑 로라 (Rhone-Poulenc Rorer)]로 치료), 알콜중독, 후천성 면역 결핍증 (AIDS) 또는 유전적 소인으로 발생할 수 있는 말초 신경 뉴런의 퇴화를 특징으로 한다. 예를 들어, 유전적으로 획득된 말초 신경병증에는 레프섬 (Refsum) 질환, 크라베 (Krabbe) 질환, 이염성 백질 이양증, 파브리 (Fabry) 질환, 데제린-솟타스 (Dejerine-Sotta) 증후군, 무베타리포 단백혈증 및 샤르코-마리-투스 (Charcot-Marie-Tooth) (CMT) 질환 (비골 근육 위축증 또는 유전성 운동 감각 신경병증 (HMSN)으로도 알려짐)이 포함된다. 말초 신경병증의 대부분의 유형은 수개월 또는 수년에 걸쳐 천천히 발병한다. 임상적 관행에서 상기 신경병증을 만성이라 부른다. 때때로 말초 신경병증이 수일에 걸쳐 급속히 발병하는데, 이를 급성이라 부른다. 말초 신경병증은 통상적으로 감각 및운동 신경에 함께 영향을 주어 혼합된 신경 및 운동 신경병증을 야기하지만, 단일 감각 신경병증 및 단일 운동 신경병증이 또한 알려져 있다.

본 발명의 문맥에 사용된 용어 "독성물질"은 그의 화학 작용을 통해 신경계 성분의 활성을 손상, 감소 또는 저해하는 물질을 의미한다. 독성물질 (또한 "신경독성물질"로 불리움)의 후보 목록에는 상기 열거된 물질, 알콜, 금속, 공업적 독소, 식품 및 의약의 오염물 등이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.

치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예를 들어 개, 말, 양, 고양이, 젖소 등을 비롯한 포유동물로 분류된 임의의 동물을 의미한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.

본 발명 문맥의 표현 "세포", "세포주" 및 "세포 배양액"은 서로 교환하여 사용되고, 상기 모든 의미에는 자손이 포함된다. 따라서, 단어 "형질전환체" 및 "형질전환된 (숙주) 세포"에는 일차 대상 세포 및 형질전환 횟수와는 관계없이 그로부터 유래된 배양액이 포함된다. 모든 자손은 계획적인 또는 의도하지 않은 돌연변이 때문에 DNA 함량이 정확히 동일하지 않을 수 있다는 것이 또한 이해된다. 최초 형질전환된 세포에 대해 스크리닝하는 경우에 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손도 포함된다. 구별된 의미로 사용하는 경우, 이는 문맥으로부터 명확할 것이다.

본원에서 "외생성" 성분은 세포에 대해 이종이거나, 또는 세포와 동종이되 통상적으로 성분이 발견되지 않는 숙주 세포 핵산 내에 위치한 핵산 서열을 의미하는 것으로 정의된다.

B. 본 발명의 수행 방법

1. 아르테민 변이체의 동정

본원에 기재된 전장 천연 서열 아르테민 폴리펩티드 이외에, 아르테민 변이체가 본 발명에서 동정되고, 제조되고, 사용되는 것으로 생각된다. 아르테민 변이체는 아르테민 DNA에서 적절히 뉴클레오티드를 변화시키고(거나) 원하는 아르테민 폴리펩티드의 합성에 의해 제조할 수 있다. 당업자는 아미노산 변화가 아르테민의 번역 후 프로세싱을 변화시킬 수 있다는 것, 예를 들어 글리코실화 부위의 개수 또는 위치를 변화시킬 수 있음을 알 것이다. 아르테민 변이체의 제조 방법은 천연 서열 아르테민을 코딩하는 핵산을 아르테민 변이체를 코딩하는 핵산으로 치환하는 것을 제외하고는, 하기에 상세히 기술한 바와 같이 천연 서열에서와 동일한 것이 바람직하다.

아르테민을 코딩하는 핵산 분자가 본 발명의 방법에 사용된다. 인간 아르테민의 2개의 전장 변이체를 코딩하는 cDNA는 도 2 및 4 (서열 번호 2 및 4)에 제공되고, 상응하는 아미노산 서열은 도 3 및 5 (서열 번호 3 및 5)에 제공된다. 마우스 아르테민을 코딩하는 cDNA는 도 6 (서열 번호 6)에 제공되고, 상응하는 아미노산 서열은 도 7 (서열 번호 7)에 제공된다. 본 발명에 사용된 폴리뉴클레오티드는 혼성화 스크리닝 및 PCR 방법론과 같은 당업자에게 잘 알려진 표준 기술을 이용하여 수득할 수 있다.

아르테민 아미노산 서열을 코딩하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 사용하여 아르테민의 발현을 유도하는 재조합 분자를 제조할 수 있다. 추가로, 본 발명의방법은 또한 아르테민 코딩 서열과 이종 단백질에 대한 제2 코딩 서열 사이의 융합 폴리뉴클레오티드를 사용할 수 있다.

전체 아르테민 cDNA를 코딩하는 임의의 종으로부터 전장 상동성 cDNA 서열을 클로닝하거나 패밀리 구성원 또는 대립유전자 변이체와 같은 변이체 형태를 코딩하기 위해, 본원에 개시된 cDNA 서열의 임의 일부에 상응하는 단편으로부터 제조된 표지 DNA 프로브를 사용하여 아르테민을 발현하는 것으로 예상되는 세포 또는 조직 유형으로부터 유래된 cDNA 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 더 구체적으로는, 코딩 서열의 5' 또는 3' 말단에 상응하는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 더 긴 뉴클레오티드 서열을 수득할 수 있다.

상이한 조직의 다중 cDNA 라이브러리를 스크리닝하여 전장 cDNA를 수득할 필요가 있다. 완전한 5' 말단 코딩 영역을 코딩하는 cDNA 클론을 동정하기 어려운 경우 (종종 cDNA 클로닝시 처하게 되는 상황임), RACE (cDNA 말단의 급속 증폭) 기술을 이용할 수 있다. RACE는 불완전한 cDNA의 5' 말단을 증폭하기 위한 입증된 PCR에 기초한 전략이다. 유일한 앵커 (anchor) 서열을 함유한 인간 태반으로부터 합성된 5'-RACE-레디 (Ready) RNA는 상업적으로 입수가능하다 (클론테크 (Clontech)). cDNA의 5' 말단을 얻기 위해, 준비된 앵커 프라이머 및 3' 프라이머를 사용하여 5'-RACE-레디 cDNA에서 PCR을 수행한다. 이어서 제조사의 지시에 따라 앵커 프라이머 및 일련의 (nested) 3' 프라이머를 사용하여 제2 PCR을 수행한다. 일단 전장 cDNA 서열이 수득되면, 이를 아미노산 서열로 번역하고, 특정 랜드마크 (landmark), 예를 들어 번역 개시 및 종결 부위와 접하고 있는 연속 오픈 리딩 프레임, 가능한 신호 서열 및 본원에 개시된 아르테민 서열에 대한 최종적인 전체 구조 유사성에 대해 조사할 수 있다.

별법으로, 표지된 프로브를 사용함으로써 관심있는 임의 생물체로부터 유래된 게놈 라이브러리를 하기 기재된 적절한 엄격 조건을 이용하여 스크리닝 할 수 있다.

본원에 개시된 아르테민 코딩 서열에 기초하여 고안된 2개의 축퇴성 (degenerate) 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀 (pool)을 사용하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 아르테민 코딩 서열 또는 상동성 서열을 단리할 수 있다. 반응을 위한 주형은 아르테민의 대립유전자를 발현하는 것으로 알려지거나 예상되는 인간 또는 인간 이외의 세포주 또는 조직으로부터 제조된 mRNA의 역전사 (RT)에 의해 수득된 cDNA일 수 있다.

PCR 생성물을 서브클로닝하고 서열분석하여, 증폭된 서열이 아르테민 코딩 서열의 서열을 나타내는지를 확인할 수 있다. 이어서 PCR 단편을 사용하여 다양한 방법으로 전장 cDNA를 단리할 수 있다. 예를 들어, 증폭된 단편을 표지하여 사용함으로써 박테리오파지 cDNA 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 별법으로, 표지된 단편을 사용하여 게놈 라이브러리의 스크리닝을 통해 게놈 클론을 단리할 수 있다.

또한, PCR 기술을 이용하여 전장 cDNA 서열을 단리할 수 있다. 예를 들어, RNA를 적절한 세포원 또는 조직원으로부터 표준 방법에 따라 단리할 수 있다. 제1 가닥 합성의 프라이밍을 위해 증폭된 단편의 가장 5' 말단에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 RNA에서 RT 반응을 수행할 수 있다. 이어서 생성된 RNA/DNA 하이브리드는 표준 말단 트랜스퍼라제 반응을 이용하여 구아닌으로 "테일링"시킬 수 있고, 하이브리드를 RNAase H로 분해할 수 있고, 이어서 제2 가닥 합성을 폴리-C 프라이머로 프라이밍할 수 있다. 따라서, 증폭된 단편의 cDNA 서열 상류를 용이하게 단리할 수 있다.

아르테민 유전자의 돌연변이 또는 대립유전자 변이체의 cDNA 클론을, 예를 들어 PCR을 이용하여 단리할 수 있다. 이런 경우, 올리고-dT 올리고뉴클레오티드를 돌연변이 아르테민 대립유전자를 가지고 있는 것으로 추정되는 개체에서 발현되는 것으로 알려지거나 예상되는 조직으로부터 단리된 mRNA와 혼성화시키고, 역전사효소로 새로운 가닥을 연장함으로써 제1 cDNA 가닥을 합성할 수 있다. 이어서 cDNA의 제2 가닥을 정상적인 유전자의 5' 말단과 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드를 사용하여 합성할 수 있다. 이어서 상기 2가지 프라이머를 사용하여, 생성물을 PCR로 증폭하고, 적합한 벡터로 클로닝하고, 당업자에게 잘 알려진 방법으로 DNA 서열 분석을 수행하였다. 돌연변이 아르테민 대립유전자의 DNA 서열을 정상적인 아르테민 대립유전자의 DNA 서열과 비교하여, 돌연변이 아르테민 유전자 산물 기능의 상실 또는 변화를 초래하는 돌연변이(들)을 동정할 수 있다.

별법으로, 돌연변이 아르테민 대립유전자를 가지고 있는 것으로 예상되거나 알려진 개체로부터 수득된 DNA를 사용하여 게놈 라이브러리를 구성하거나, 돌연변이 아르테민 대립유전자를 발현하는 것으로 알려지거나 예상되는 조직의 RNA를 사용하여 cDNA 라이브러리를 구성할 수 있다. 이어서 손상되지 않은 아르테민 유전자 또는 임의 적합한 그의 단편을 표지하고, 이를 프로브로 사용하여 상기 라이브러리에서 상응하는 돌연변이 아르테민 대립유전자를 동정할 수 있다. 이어서 돌연변이 아르테민 유전자 서열을 함유하는 클론을 정제하고 당업자에게 잘 알려진 방법에 따라 서열 분석을 수행할 수 있다.

추가로, 예를 들어 돌연변이 대립유전자를 가지고 있는 것으로 예상되거나 알려진 개체에서 돌연변이 아르테민 대립유전자를 발현시키는 것으로 알려지거나 예상된 조직에서 단리된 RNA로부터 합성된 cDNA를 사용하여, 발현 라이브러리를 구성할 수 있다. 이런 방법으로, 추정되는 돌연변이 조직에 의해 제조된 유전자 산물을 발현시키고, 하기 기재된 바와 같이 정상적인 아르테민 유전자 산물에 대해 증가된 항체와 관련된 표준 항체 스크리닝 기술을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드는 서로 교환가능하고, 데옥시리보뉴클레오시드 또는 리보뉴클레오티드로 구성되었는지 무관하게, 그리고 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 결합, 예를 들어 포스포트리에스테르, 포스포라미데이트, 실록산, 카르보네이트, 카르복시메틸에스테르, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 티오에테르, 브리지 포스포라미데이트, 브리지 메틸렌 포스포네이트, 브리지 포스포라미데이트, 브리지 포스포라미데이트, 브리지 메틸렌 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 브리지 포스포로티오에이트 또는 술톤 결합 및 상기 결합의 조합으로 구성되었는지 무관하게 임의의 핵산을 나타낸다.

구체적으로는 용어 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 뉴클레오티드에는 또한 생물학적으로 발생하는 5개의 염기 (아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 및 우라실) 이외의염기로 구성된 핵산이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시히드록시메틸)우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카르복시메틸아미노메틸-우라실, 디히드로우라실, 베타-D-갈락토실쿠에오신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿠에오신, 5-메톡시카르복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 와이부톡신, 수도우라실, 쿠에오신, 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 5-메틸-2-티오우라실, 3-(3-아미노-3-N-2-카르복시프로필)우라실, (acp3)w 및 2,6-디아미노푸린 등을 포함하는 군으로부터 선택된 1종 이상의 변형된 염기 잔기를 함유할 수 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 폴리뉴클레오티드는 아라비노스, 2-플루오로아라비노스, 크실룰로스 및 6탄당 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는 군으로부터 선택된 하나 이상의 변형된 당 잔기를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 폴리뉴클레오티드의 공급원에 의해 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오티드는 인간 또는 인간 이외의 동물에서 얻은 것이거나, 임의의 재조합 공급원으로부터 얻은 것이거나, 시험관내 또는 화학적 합성법을 통해 합성한 것일수 있다. 뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 이중 가닥, 단일 가닥 또는 부분적인 이중 가닥 형태로 존재할 수 있다.

본 발명에서 유용한 핵산의 예로는 안티센스 DNA 및(또는) RNA; 리보자임; 유전자 치료용 DNA; DNA 및(또는) RNA 키메라; 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 수퍼코일 DNA 및(또는) 3중 나선 DNA 등을 비롯한 다양한 구조 형태의 DNA; Z-DNA 등과 같은 올리고뉴클레오티드 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 핵산은 대량의 핵산 제조에 전형적으로 사용되는 임의의 통상적인 수단으로 제조될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 RNA는 시판되는 시약 및 합성기를 사용하여 당업계에 공지된 방법 (예를 들어, 문헌 [Gait, 1985, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, England] 참조)에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. RNA는 SP65 (미국 위스콘신주 메디슨에 소재하는 프로메가 코포레이션 (Promega Corporation) 제품)와 같은 플라스미드를 사용한 시험관내 전사를 통해 고수득율로 생산될 수 있다.

특히, mRNA 전구체의 얼터네이티브 (alternative) 스플라이싱 또는 프로세싱으로 생성된 mRNA 전사체를 포함하는, 아르테민 핵산 서열에 의해 코딩된 임의의 mRNA 전사체가 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

뉴클레아제의 안정성 증가 등을 원하는 몇몇 경우에서는 뉴클레오시드간 결합을 변형시킨 핵산이 바람직할 수 있다. 변형된 뉴클레오시드간 결합을 함유하는 핵산도 당업계에 공지된 시약 및 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 포스포네이트 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트 메톡시에틸 포스포르아미데이트, 포름아세틸, 티오포름아세틸, 디이소프로필실릴, 아세트아미데이트, 카르바메이트, 디메틸렌-술피드 (-CH₂-S-CH₂), 디메틸렌-술폭시드 (-CH₂-SO-CH₂), 디메틸렌-술폰 (-CH₂-SO₂-CH₂), 2'-0-알킬 및 2'-디옥시-2'-플루오로포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 결합을 함유하는 핵산의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다 (문헌 [Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-584], [Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett. 31:335] 및 이들 문헌에 인용된 참고문헌 참조).

본 발명의 몇몇 실시양태에서, 사용된 뉴클레오티드는 α-아노머형 뉴클레오티드이다. 통상의 β-단위와는 반대로, α-아노머형 뉴클레오티드는 상보적인 RNA와 특이적 이중 가닥 하이브리드를 형성하여, 가닥들이 서로에게 평행하게 놓인다 (문헌 [Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6625-6641] 참조). 상기 뉴클레오티드는 2'-O-메틸리보뉴클레오티드 (문헌 [Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15:6131-6148] 참조) 또는 키메라 RNA-DNA 유사체 (문헌 [Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215:327-330] 참조)이다.

핵산은 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단으로 정제할 수 있다. 예를 들어, 핵산은 역상 또는 이온 교환 HPLC, 크기 배제 크로마토그래피 또는 겔 전기영동으로 정제할 수 있다. 물론, 당업자라면 정제 방법이 부분적으로는 정제될 DNA의 크기에 따라 달라질 것임을 인식할 것이다.

또한, 아르테민 코딩 서열 또는 이의 상보체의 10개 이상의 뉴클레오티드 (즉, 혼성화가능한 일부)를 함유하는 단리되거나 정제된 폴리뉴클레오티드도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 아르테민 코딩 서열의 (연속적인) 뉴클레오티드를 25개, 50개, 100개, 150개 또는 200개 이상 함유하거나, 전장 아르테민 코딩 서열을 함유한다. 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 추가로, 본 발명은 상기 코딩 서열의 상보체에 선택적으로 혼성화가능한 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드를 10, 25, 50, 100, 150 또는 200개 이상 함유하거나, 전장 아르테민 코딩 서열을 함유한다.

또한, 아르테민의 돌연변이체, 아르테민의 펩티드 단편, 아르테민의 말단절단 (truncated) 형태 및 아르테민 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열도 본 발명의 방법에 유용할 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드로는 관련없는 단백질 또는 펩티드에 융합된 전장 아르테민 서열, 아르테민의 말단절단 형태 또는 아르테민의 펩티드 단편을 코딩하는 뉴클레오티드, 예를 들어 Ig Fc 도메인에 융합된 도메인 (이는 생성된 융합 단백질 (예를 들어 아르테민-Ig)의 혈류 중 안정성 및 반감기를 증가시킴); 또는 마커로서 사용할 수 있는 형광 단백질 또는 발광 단백질 등과 같은 효소에 융합된 도메인 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

적어도 부분적으로는, 미국 특허 제5,605,793호 및 동 제5,837,458호 (이들의 전문이 본원에 참고문헌으로 도입됨)에 기재되어 있는 몇가지 형태의 유도된 진화, 예를 들어 유전자 셔플링 (shuffling) 및(또는) 반복적 (recursive) 서열 재조합 등에 의해 발생된 아르테민 폴리뉴클레오티드 변이체도 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 기술을 이용하여, 기능적 및(또는) 구조적 특성이 변경된 기능적 및(또는) 구조적으로 유사한 단백질을 코딩하는 신규 서열의 발생을 위한 출발점으로서 아르테민 코딩 서열 또는 복수개의 아르테민 코딩 서열을 사용할 수 있다.

상기 기재한 아르테민을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열과 관련성이 높은 유전자 상동체도 본 발명에 유용할 수 있다. 관련성이 높은 유전자 상동체는 도 1 (서열 1)의 성숙 인간 아르테민 등과 같은 자연 발생 아르테민의 아미노산 서열과의 아미노산 서열 동일성이 약 60％ 이상, 바람직하게는 약 65％, 70％, 75％, 80％ 이상이고, 더욱 바람직하게는 아미노산 서열 동일성이 약 85％ 이상에서 약 99％ 이상까지 1％씩 증가하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다. 관련성이 높은 상동체는 아르테민과 기능적 활성을 공유하는 단백질을 코딩할 수 있다.

또한, 본 발명의 방법은 (a) 임의의 상기 아르테민 코딩 서열 및(또는) 이들의 상보체 (즉, 안티센스)를 함유하는 DNA 벡터; (b) 임의의 상기 아르테민 코딩 서열의 발현을 유도하는 조절 요소에 작동가능하게 결합된 임의의 상기 아르테민 코딩 서열을 함유하는 DNA 발현 벡터; (c) 숙주 세포에서 임의의 상기 아르테민 코딩 서열의 발현을 유도하는 조절 요소와 작동가능하게 결합된 임의의 상기 아르테민 코딩 서열을 함유하는 유전자 조작된 숙주 세포; 및 (d) 외생성으로 도입된 조절 요소의 제어하에서 내생성 아르테민 유전자를 발현하는 (즉, 유전자 활성화) 유전자 조작된 숙주 세포를 사용하는 것이 유리하다.

본원에 기재되어 있는 천연 서열 아르테민 또는 아르테민의 다양한 도메인에서의 변이는, 예를 들어 미국 특허 제5,364,934호 등에 개시된 임의의 보존적 및 비보존적 돌연변이 기술 및 지침을 이용하여 수행될 수 있다. 변이는 천연 서열 아르테민과 비교할 때 아르테민의 아미노산 서열이 변화되게 하는, 아르테민를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 경우에 따라, 아르테민의 하나 이상의 도메인에서 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 변이시킨다. 어떤 아미노산 잔기가 원하는 활성에 유해한 효과를 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 지는 아르테민의 서열을 공지된 상동성 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 만들어진 아미노산 서열 변화의 수를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어 류신의 세린으로의 치환, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 경우에 따라 약 1 내지 5개의 아미노산에서 발생할 수 있다. 허용되는 변이는 서열 내에 아미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 생성된 변이체를 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 활성에 대해 시험함으로써 결정할 수 있다.

본 발명의 방법에서 아르테민 폴리펩티드 단편은 또한 유용하다. 예를 들어 전장 천연 단백질과 비교할 때, 이러한 단편들은 N-말단 또는 C-말단에서 절단되어 있거나 내부 잔기가 없을 수 있다. 특정 단편은 아르테민 폴리펩티드의 원하는 생물학적 활성에 필수적이지 않은 아미노산 잔기를 갖지 않는다.

아르테민 단편은 많은 통상의 기술 중 임의의 기술을 통해 제조할 수 있다.원하는 펩티드 단편은 화학적으로 합성할 수 있다. 별법의 접근법은 효소적 분해 방법, 예를 들어 단백질을 특정 아미노산 잔기에 의해 정의되는 부위에서 절단한다고 공지된 효소로 처리하거나 또는 DNA를 적합한 제한 효소로 잘라내고 원하는 단편을 단리함으로써 아르테민 단편을 생성하는 것을 포함한다. 다른 적합한 기술은 원하는 폴리펩티드 단편을 코딩하는 DNA 단편을 단리하고 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 통해 증폭하는 것을 포함한다. DNA 단편의 원하는 말단부를 한정하는 올리고뉴클레오티드는 PCR에서 5' 및 3' 프라이머로 사용된다. 바람직하게는, 아르테민 폴리펩티드 단편은 도 1 (서열 1)에 개시된 천연 아르테민 폴리펩티드와 한가지 이상의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 공유한다.

특정 실시양태에서, 목적물의 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 1에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 1에서 치환예로서 명명되거나 아미노산 군에 대해서 하기에서 더욱 상세하게 설명된 바와 같이 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.

아르테민 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 골격의 구조가, 예를 들어 쉬이트 또는 나선 형태로서 유지되거나, (b) 표적 부위에서 분자의 하전 또는 소수성이 유지되거나, 또는 (c) 측쇄의 용적이 유지되는 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:

(1) 소수성: 노르류신 (norleucine), met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비보존적 치환은 상기 한 군의 구성원을 다른 군의 것으로 교환시키는 것이다. 또한, 이렇게 치환되는 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나, 더욱 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.

변이체는 올리고뉴클레오티드-매개 (부위 지정) 돌연변이유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 클로닝된 DNA에 부위 지정 돌연변이유발법 (문헌 [Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986)], [Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)] 참조), 카세트 돌연변이유발법 (문헌 [Wells et al., Gene, 34:315 (1985)] 참조), 제한 선택 돌연변이유발법 (문헌 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)] 참조) 또는 다른 공지된 기술을 수행하여 아르테민 변이체 DNA를 제조할 수 있다.

또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 이용하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 전형적으로, 알라닌은 베타-탄소 밖의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 배열을 변경시킬 가능성이 적기 때문에 바람직한 스캐닝 아미노산이다 (문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)] 참조). 또한, 알라닌은 전형적으로 가장흔한 아미노산이기 때문에 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 (문헌 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman ＆ Co., N.Y.)], [Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)] 참조). 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체 (isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.

2. 아르테민 및 아르테민 변이체의 생산

아르테민 및 아르테민 변이체 생산에 적합한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 아르테민에 대한 바람직한 기술과 아르테민 변이체에 대한 바람직한 기술이 동일하기 때문에, 하기에 기재한 기술은 아르테민 변이체 뿐만 아니라 천연 서열 아르테민에도 적용된다.

바람직한 생산 방법은 상기 폴리펩티드의 내생성 공급원으로부터의 아르테민 단리, 펩티드 합성 (펩티드 합성기를 사용) 및 재조합 기술 (또는 이들 기술의 임의의 조합)을 포함한다. 재조합 기술을 이용한 아르테민의 생산 방법은 문헌 [Baloh et al., Neuron 21:1291-1302 (1998)] 및 WO 00/18799호에 기재되어 있다. 하기에는 다른 재조합 기술을 기재한다.

하기의 논의 중 대부분은 아르테민 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환된 세포를 배양하고, 상기 세포 배양액으로부터 폴리펩티드를 회수하는, 아르테민의 재조합 생산에 관한 것이다. 또한, 1991년 5월 16일자로 공개된 WO 91/06667호에 개시된 바와 같이 본 발명의 아르테민을 상동성 재조합으로 생산할 수 있다고 여겨진다.

간단히 말하자면, 상기 방법은 증폭가능한 유전자 (예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR) 또는 하기 논의된 다른 유전자) 및 아르테민 유전자 중 코딩 영역 유전자 좌위의 DNA 서열과 상동성이며 길이가 약 150 bp 이상인 1개 이상의 플랭킹 (flanking) 영역을 포함하는 작제물 (즉, 벡터)을 사용하여 아르테민-코딩 유전자를 함유하는 제1 인간 세포를 형질전환시켜 아르테민 유전자를 증폭시키는 단계를 포함한다. 증폭가능한 유전자는 아르테민 유전자의 발현을 방해하지 않는 부위에 존재해야 한다. 형질전환을 수행하여 작제물이 제1 세포의 게놈으로 상동성있게 통합되어 증폭가능한 영역을 규정하도록 한다.

그 후, 작제물을 포함하는 제1 세포는 상기 작제물에 존재하는 증폭가능한 유전자 또는 다른 마커에 의해 선별된다. 마커 유전자의 존재는, 작제물의 숙주 게놈으로의 통합 및 존재를 입증하는 것이다. 선별은 제2 숙주에서 수행될 것이므로 제1 세포에 대한 추가의 선별은 필요하지 않다. 원한다면, 상동성 재조합 사건의 발생은 PCR을 이용하여, 생성된 증폭 DNA 서열을 서열분석하거나 올바른 상동성 통합체의 DNA가 존재할 경우에 적당한 길이의 PCR 단편을 결정하고 이러한 단편을 함유하는 세포만을 증식시킴으로써 측정할 수 있다. 원한다면, 선별된 세포에 적당한 증폭제 (예를 들어, 증폭가능한 유전자가 DHFR인 경우, 메토트렉세이트)로 스트레스를 부가하여 이 세포를 상기 시점에서 증폭시킴으로써, 복수개 카피의 표적 유전자가 수득될 수도 있다. 그러나, 증폭 단계는 하기 기재한 제2 형질전환 이후까지 수행하지 않는 것이 바람직하다.

선별 단계 후에는 선별된 제1 세포로부터, 증폭가능한 영역 전체를 포함할정도로 충분히 큰 게놈의 DNA 일부를 단리한다. 그 후, 제2 포유동물 발현 숙주 세포를 상기 게놈 DNA 일부로 형질전환시켜 클로닝하고, 증폭가능한 영역을 함유하는 클론을 선별한다. 그 후, 증폭가능한 영역이 제1 세포에서 아직 증폭되지 않은 경우에는, 상기 영역을 증폭제로 증폭시킨다. 최종적으로, 아르테민을 함유하는 증폭가능한 영역을 복수개 카피로 포함하게 된 제2 발현 숙주 세포를 배양하여, 유전자가 발현되고 단백질이 생산되도록 한다.

아르테민을 코딩하는 DNA는, 아르테민 mRNA를 보유하고 이를 검출가능한 수준으로 발현한다고 여겨지는 조직으로부터 제조된 임의의 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서 아르테민 DNA는, 예를 들어 복수개의 인간 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. 또한, 아르테민-코딩 유전자는 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 올리고뉴클레오티드 합성을 통해 수득할 수도 있다.

라이브러리는 관심 유전자 또는 이에 의해 코딩되는 단백질을 동정하기 위해 고안된 프로브 (예를 들어, 아르테민에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝한다. 선별된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]의 제10장 내지 제12장에 기재된 바와 같은 표준 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 아르테민을 코딩하는 유전자를 단리하기 위한 별법의 수단은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]의 제14절에 기재된 바와 같이 PCR 방법을 이용하는것이다.

아르테민 cDNA의 바람직한 단리 방법은 주의깊게 선별된 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 다양한 인간 조직으로부터의 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 가양성 (false positive) 결과를 최소화할 만큼 충분히 길고 충분히 명백해야 한다. 바람직한 서열은 본원에서 개시한 자연 발생 아르테민으로부터 수득된다.

올리고뉴클레오티드는 스크리닝될 라이브러리의 DNA와 혼성화된 후에 검출될 수 있도록 표지되어야 한다. 당업계에 공지된 바와 같이, 바람직한 표지 방법은³²P-표지된 ATP와 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 방사성 표지하는 것이다. 그러나, 다른 방법을 이용하여 올리고뉴클레오티드를 표지할 수 있으며, 예를 들면 바이오티닐화 또는 효소 표지 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

아르테민을 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 추가의 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 많은 벡터들이 이용가능하다. 통상적으로, 벡터 성분으로는 하나 이상의 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열 등이 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 아르테민은 재조합 방법을 통해 직접 생산될 수 있을 뿐만 아니라 바람직하게는 성숙 단백질 또는 성숙 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위를갖는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열인 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수도 있다. 통상적으로, 신호 서열은 벡터의 성분이거나 벡터 내로 삽입된 아르테민 DNA의 일부일 수 있다. 선택된 이종 신호 서열은 숙주 세포에 의해 인식되어 프로세싱 (즉, 신호 펩티다제에 의한 절단)되는 서열인 것이 바람직하다. 천연 아르테민 신호 서열을 인식하여 프로세싱하지 않는 원핵생물 숙주 세포의 경우, 신호 서열은 예를 들어 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열 안정성 장독소 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열로 치환된다. 효모에서의 분비를 위해서, 천연 신호 서열은 예를 들어 효모 인버타제 리더, α-인자 리더 (사카로마이세스 (Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) α-인자 리더를 포함함; 클루이베로마이세스 α-인자 리더는 1991년 4월 23일자로 허여된 미국 특허 제5,010,182호에 기재되어 있음) 또는 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일자로 공개된 EP 362,179호) 또는 1990년 11월 15일자로 공개된 WO 90/13646호에 기재된 신호 서열로 치환될 수 있다. 포유동물 세포 발현시에는 천연 신호 서열 (예를 들어 통상적으로 생체내 인간 세포로부터의 아르테민 분비를 지시하는 아르테민 프리서열 (presequence))이 만족스럽긴 하지만, 다른 포유동물 신호 서열, 예를 들어 다른 동물 아르테민으로부터의 신호 서열 및 동일하거나 관련된 종에서 분비된 폴리펩티드로부터의 신호 서열 및 바이러스 분비 리더, 예를 들어 허피스 심플렉스 바이러스 gD 신호가 적합할 수 있다.

이러한 전구체 영역을 위한 DNA는 성숙 아르테민 또는 이의 가용성 변이체를코딩하는 DNA에 리딩 프레임 내에서 라이게이션된다.

발현 벡터 및 클로닝 벡터 모두는 선택된 1종 이상의 숙주 세포에서 벡터가 복제될 수 있게 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터 중의 이러한 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제될 수 있도록 하는 서열이며, 복제 기점 또는 자율 복제 서열을 포함한다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대하여 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 적합하고, 2μ 플라스미드 복제 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 복제 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는데 유용하다. 일반적으로, 포유동물 발현 벡터인 경우에는 이러한 복제 기점 성분이 필요없다 (전형적으로, SV40 복제 기점이 사용될 수 있는데, 이는 단지 SV40 복제 기점이 초기 프로모터를 함유하기 때문임).

대부분의 발현 벡터는 "셔틀" 벡터이며, 즉, 이들은 1종 이상 군의 생물체에서 복제될 수 있으나, 발현을 위해서는 다른 생물체를 형질감염시킬 수 있다. 예를 들어, 벡터를 대장균에서 클로닝한 후에, 상기 벡터로 효모 또는 포유동물 세포를 형질감염시키면, 숙주 세포 염색체와 독립적으로 복제될 수는 없다 할 지라도 발현될 수는 있다.

DNA는 숙주 게놈에 삽입하여 증폭시킬 수도 있다. 이는 바실러스 (Bacillus) 종을 숙주로서 사용함으로써 쉽게 달성되며, 예를 들어 바실러스 게놈 DNA에 존재하는 서열에 상보적인 DNA 서열을 벡터에 포함시킴으로써 쉽게 달성된다. 이러한벡터로 바실러스를 형질감염시키면, 게놈과의 상동성 재조합이 일어나 아르테민 DNA가 삽입된다. 그러나, 아르테민을 코딩하는 게놈 DNA의 회수는 외생성으로 복제된 벡터의 경우보다 더 복잡한데, 이는 아르테민 DNA 절단에 제한 효소 분해가 필요하기 때문이다.

발현 벡터 및 클로닝 벡터는 선별가능한 마커라고도 지칭되는 선별 유전자를 함유해야 한다. 이 유전자는 선별용 배양 배지 중에서 배양시킨 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 코딩한다. 선별 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환된 것이 아닌 숙주 세포는 상기 배양 배지 중에서 생존하지 못할 것이다. 전형적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결함을 보완하는 단백질, 또는 (c) 복합 배지로부터 이용할 수 없는 필수 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩하며, 예를 들어 바실러스의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자이다.

선별 방안의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 이용하는 것이다. 이종 유전자를 사용하여 성공적으로 형질전환시킨 세포는 약물 내성을 부여하는 단백질을 생성함으로써 선별 시험에서 생존한다. 예를 들어, 이러한 우성 선별법은 네오마이신, 마이크로페놀산 및 히그로마이신 등의 약물을 이용한다.

포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 다른 예로는 아르테민 핵산 수용에 감응성 있는 (competent) 세포를 동정할 수 있게 하는 마커, 예를 들어 DHFR 또는 티미딘 키나아제 등이 있다. 포유동물 세포 형질전환체에, 마커를 획득한 형질전환체만이 특이하게 적응하여 생존하게 되는 선별 압력을 가한다. 선별 압력은 배지 중 선별 작용제의 농도를 연속적으로 변화시킴으로써 선별 유전자 및 아르테민을 코딩하는 DNA 모두를 증폭시키게 되는 조건하에서 형질전환체를 배양함으로써 부가된다. 증폭은 성장에 필수적인 단백질 생산에 대한 요구가 보다 큰 유전자가 연속 세대 재조합 세포의 염색체 내에서 계속적으로 반복되는 과정이다. DNA 증폭으로 인해 아르테민의 합성량이 증가된다. 증폭가능한 유전자의 다른 예로는 메탈로티오네인-I 및 -II, 바람직하게는 영장류 메탈로티오네인 유전자, 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카르복실라제 등이 있다. 바람직한 벡터 시스템은 미국 특허 제5,561,053호에 기재되어 있다.

예를 들어, 모든 형질전환체를 DHFR의 경쟁적 길항제인 메토트렉세이트 (Mtx)를 함유하는 배양 배지 중에서 배양함으로써, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포를 먼저 동정한다. 야생형 DHFR이 이용될 경우에 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포주이고, 이를 문헌 [Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조하여 증식시킨다. 그 후, 형질전환된 세포를 증가된 수준의 메토트렉세이트에 노출시킨다. 이로써, 복수개 카피의 DHFR 유전자가 합성되는 동시에, 발현 벡터, 예를 들어 아르테민을 코딩하는 DNA를 포함하는 다른 DNA가 복수개 카피로 합성된다. 이러한 증폭 기술은, 예를 들어 Mtx에 내성이 높은 DHFR 유전자 돌연변이체를 사용하는 경우에는 내생성 DHFR이 존재한다 할지라도 임의의 다른 적합한 숙주, 예를 들어 ATCC CCL61 CHO-K1에 사용할 수 있다 (EP 117,060호).

별법으로, 아르테민, 야생형 DHFR 단백질 및 기타의 선별가능한 마커, 예를 들어 아미노글리코시드 3'-포스포트랜스퍼라제 (APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환 또는 동시형질전환시킨 숙주 세포 (특히, 내생성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)는 선별가능한 마커에 대한 선별 작용제, 예를 들어 카나마이신, 네오마이신 또는 G418 등의 아미노글리코시드계 항생제를 함유하는 배지 중에서의 세포 배양을 통해 선별할 수 있다. 미국 특허 제4,965,199호를 참조한다.

효모에서 사용하기 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는trp1유전자이다 (문헌 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)] 참조).trp1유전자는 트립토판에서의 성장능이 없는 효모의 돌연변이 균주 (예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선별 마커를 제공한다 (문헌 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)] 참조). 그 후, 효모 숙주 세포 게놈 내trp1결함 (lesion)의 존재는 트립토판 부재하에서의 배양에 의한 형질전환 검출에 효과적인 환경을 제공한다. 유사하게,Leu2-결핍 효모 균주 (ATCC 20,622 또는 38,626)는Leu2유전자를 보유하는 공지된 플라스미드에 의해 보완된다.

또한, 1.6 ㎛ 원형 플라스미드 pKD1로부터 유래한 벡터도 클루이베로마이세스 효모의 형질전환에 사용할 수 있다 (문헌 [Bianchi et al., Curr. Genet., 12:185 (1987)] 참조). 더욱 최근에는, 재조합 송아지 키모신을 대규모 생산하기 위한 발현 시스템이 클루이베로마이세스 락티스 (K. lactis)에 관해 보고되었다 (문헌 [Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990)] 참조). 클루이베로마이세스의 산업용 균주에 의해 성숙 재조합 인간 혈청 알부민이 분비되도록 하기 위한, 안정한 복수 카피 발현 벡터도 개시된 바 있다 (문헌 [Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)] 참조).

통상적으로, 발현 벡터 및 클로닝 벡터는 숙주 생물체에 의해 인식되며, 아르테민 핵산에 작동가능하게 연결된 프로모터를 함유한다. 프로모터는 구조 유전자의 출발 코돈에 대해 상류 (5') (일반적으로, 약 100 내지 1000 bp 이내)에 위치한 비번역 서열로서, 이와 작동가능하게 연결된 특정 핵산 서열, 예를 들어 아르테민 핵산 서열의 전사 및 번역을 제어한다. 전형적으로, 이러한 프로모터는 유도가능한 프로모터 및 구성적 (constitutive) 프로모터의 2개 군으로 분류된다. 유도가능한 프로모터는 배양 조건에서의 어떤 변화, 예를 들어 영양분의 존재 또는 부재 또는 온도 변화 등에 반응하여 자신의 제어를 받는 DNA로부터의 전사를 증가된 수준으로 개시하는 프로모터이다. 현재, 다양한 잠재적 숙주 세포에 의해 인식되는 많은 수의 프로모터들이 공지되어 있다. 제한 효소 분해를 통하여 공급 DNA로부터 프로모터를 분리하고, 단리된 프로모터 서열을 벡터에 삽입함으로써, 이들 프로모터는 아르테민을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된다. 천연 아르테민 프로모터 서열 및 많은 이종 프로모터를 둘 다 사용하여 아르테민 DNA의 증폭 및(또는) 발현을 유도할 수 있다. 그러나, 이종 프로모터가 바람직한데, 이는 이러한 프로모터가 천연 아르테민 프로모터에 비해 일반적으로 아르테민에 대한 더 높은 수준의 전사 및 더 높은 수준의 수율을 허용하기 때문이다.

원핵생물 숙주에 사용하기 적합한 프로모터로는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 (문헌 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978)], [Goeddel et al.,Nature, 281:544 (1979)] 참조), 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 (문헌 [Goeddel, Nucleic acid Res., 8:4057 (1980)], EP 36,776호 참조) 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어 tac 프로모터 (문헌 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)] 참조) 등이 있다. 그러나, 다른 공지된 박테리아 프로모터가 적합하다. 이들의 뉴클레오티드 서열은 공개되어 있기 때문에, 당업자라면 링커 또는 연결기를 사용하여 임의의 필요한 제한 부위를 제공함으로써 아르테민을 코딩하는 DNA에 이들을 작동가능하게 라이게이션시킬 수 있다 (문헌 [Siebenlist et al., Cell, 20:269 (1980)] 참조). 또한, 박테리아 시스템에서 사용하기 위한 프로모터는 아르테민을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가노 (Shine-Dalgarno (S.D.)) 서열도 함유할 것이다.

진핵생물에 대한 프로모터 서열이 공지되어 있다. 실제로 모든 진핵생물 유전자에는 전사 개시 부위로부터 대략 25 내지 30개 염기 상류에 위치한 AT-풍부 영역이 존재한다. 많은 유전자에서, 전사 출발 지점으로부터 70 내지 80개 염기 상류에서 발견되는 다른 서열은 CXCAAT 영역 (여기서, X는 임의의 뉴클레오티드일 수 있음)이다. 대부분의 진핵생물 유전자의 3' 말단은 AATAAA 서열이며, 이는 코딩 서열의 3' 말단에 폴리-A 테일을 부가하는 신호일 수 있다. 이들 서열 모두가 진핵생물 발현 벡터에 적합하게 삽입된다.

효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나아제 (문헌 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 참조) 또는 다른 당분해 효소 (문헌 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)],[Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)] 참조), 예를 들어 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나아제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나아제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나아제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나아제에 대한 프로모터 등이 있다.

성장 조건에 의한 전사 제어라는 추가의 이점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알콜 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스와 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현시에 사용하기 적합한 벡터 및 프로모터는 EP 73,657호에 추가로 기재되어 있다. 또한, 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 유리하게 사용된다.

포유동물 숙주 세포 내의 벡터로부터의 아르테민 전사는 바이러스, 예를 들어 폴리오마 바이러스, 파울폭스 (fowlpox) 바이러스 (1989년 7월 5일자로 공개된 UK 2,211,504), 아데노바이러스 (예를 들어 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 가장 바람직하게는 원숭이 바이러스 40 (SV40)의 게놈으로부터 얻은 프로모터, 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 열-충격 프로모터 및 아르테민 서열과 통상적으로 관련된 프로모터이되, 숙주 세포 시스템과 상용가능한 프로모터에 의해 제어된다.

SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 기점도 함유하는 SV40 제한 단편으로서 편리하게 수득된다 (문헌 [Fiers et al., Nature, 273:113 (1978)], [Mulligan et al., Science, 209:1422-1427 (1980)], [Pavlakis et al., Proc. Natl, Acad Sci. USA, 78:7398-7402 (1981)] 참조). 인간 사이토메갈로바이러스의 극초기 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 편리하게 수득된다 (문헌 [Greenaway et al., Gene, 18:355-360 (1982)] 참조). 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현시키는 시스템은 미국 특허 제4,419,446호에 개시되어 있다. 이러한 시스템의 변형은 미국 특허 제4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 원숭이 세포에서 면역 인터페론을 코딩하는 cDNA의 발현에 관한 문헌 [Gray et al., Nature, 295:503-508 (1982)], 마우스 세포에서 허피스 심플렉스 바이러스로부터의 티미딘 키나아제 프로모터의 제어하에 면역 인터페론 cDNA의 발현에 관한 문헌 [Reyes et al., Nature, 297:598-601 (1982)], 배양된 마우스 및 토끼 세포에서 인간 인터페론 1의 발현에 관한 문헌 [Canaani et al., Proc. Natl, Acad Sci. USA, 79:5166-5170 (1982)] 및 라우스 육종 바이러스의 장쇄 말단 반복부를 프로모터로서 사용한, CV-1 원숭이 신장 세포, 닭 배아 섬유아세포, 차이니스 햄스터 난소 세포, HeLa 세포 및 마우스 NIH-3T3 세포에서 박테리아 CAT 서열의 발현에 관한 문헌 [Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79:6777-6781 (1982)]을 참조한다.

고등 진핵생물에 의한, 본 발명의 아르테민을 코딩하는 DNA의 전사는 종종 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 DNA의 시스-액팅 (cis-acting) 요소로서, 보통 약 10 내지 300 bp이며 프로모터에 대해 작용하여 전사를증가시킨다. 인핸서는 비교적 방향 및 위치에 독립적이며, 전사 단위에 대해 5' (문헌 [Laimins et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA, 78:993 (1981)] 참조) 및 3' (문헌 [Lusky et al., Mol Cell Bio, 3:1108 (1983)] 참조), 인트론 내 (문헌 [Banerji et al., Cell, 33:729 (1983)] 참조) 뿐만 아니라 코딩 서열 그 자체 내 (문헌 [Osborne et al., Mol. Cell Bio., 4:1293 (1984)] 참조)에도 존재한다. 현재, 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터의 많은 인핸서 서열들이 공지되어 있다. 그러나, 전형적으로는 진핵생물 세포 바이러스로부터의 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점의 뒷부분 상의 SV40 인핸서 (bp 100 내지 270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 뒷부분 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서 등이 있다. 또한, 진핵생물 프로모터의 활성화를 위한 인핸서 요소에 관한 문헌 [Yaniv, Nature, 297:17-18 (1982)]을 참조한다. 인핸서는 아르테민 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.

또한, 진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물의 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터도 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 함유할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵생물 DNA 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비번역 영역으로부터 이용가능하다. 이들 영역은 아르테민을 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 세그먼트를 함유한다.

1종 이상의 상기 기재한 서열을 함유하는 적합한 벡터의 제조는 표준 라이게이션 기술을 이용한다. 단리된 플라스미드 또는 DNA 단편은 요구되는 플라스미드가 생성되도록 하는 형태로 절단, 조작 및 재라이게이션시킨다.

플라스미드의 올바른 서열을 확인하고자 하는 분석을 위해서, 라이게이션 혼합물을 사용하여 대장균 K12 균주 294 (ATCC 31,446) 및 적절하다면 암피실린 또는 테트라사이클린 내성에 의해 선별된 성공적인 형질전환체를 형질전환시킨다. 형질전환체로부터 플라스미드를 프렙하여, 제한 엔도뉴클레아제 분해로 분석하고(하거나) 문헌 [Messing et al., Nucleic Acids Res., 9:309 (1981)]의 방법 또는 문헌 [Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980)]의 방법에 따라 서열분석한다.

아르테민 및 아르테민 변이체 제조에 특히 유용한 것은 아르테민을 코딩하는 DNA가 포유동물의 세포에서 일시적으로 발현하도록 하는 발현 벡터이다. 일반적으로, 일시적 발현은 숙주 세포에서 효율적으로 복제될 수 있는 발현 벡터의 사용을 포함하므로, 숙주 세포는 발현 벡터를 많은 카피수로 축적한 후에 발현 벡터에 의해 코딩된 원하는 폴리펩티드를 높은 수준으로 합성한다 (Sambrook et al., 상기 문헌, pp. 16.17-16.22.). 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포를 포함하는 일시적 발현 시스템은 클로닝된 DNA에 의해 코딩된 폴리펩티드의 양성 확인을 편리하게 할 뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드를 원하는 생물학적 또는 생리학적 성질에 대해 신속하게 스크리닝할 수 있게 한다. 따라서, 생물학적으로 활성인 아르테민의 유사체 및 변이체를 동정할 목적상, 일시적 발현 시스템이 본 발명에 특히 유용하다.

재조합 척추동물 세포 배양액에서 아르테민을 합성하도록 하기에 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981)], [Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979)], EP 117,060호 및 EP 117,058호에 기재되어 있다. 포유동물의 세포 배양액에서 아르테민을 발현시키기에 특히 유용한 플라스미드는 pRK5 (EP 307,247호) 또는 pSV16B이다 (1991년 6월 13일자로 공개된 WO 91/08291호).

본원에서 벡터 내의 DNA를 클로닝하거나 발현시키기에 적합한 숙주 세포로는 상기 기재한 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포이다. 이러한 목적에 적합한 원핵생물로는 진정세균, 예를 들어 그람-음성 또는 그람-양성 생물체, 예를 들어 에쉐리히아 (Eshcerichia), 예를 들어 대장균, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어 세라티아 마르세스칸스 (Serratia marcescans) 및 시겔라 (Shigella) 등의 장내세균과 바실러스 (Bacillus), 예를 들어 바실러스 섭틸리스 (B. subtilis) 및 바실러스 리체니포르미스 (B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710호에 기재된 바실러스 리체니포르미스 (B. licheniformis) 41P), 슈도모나스 (Pseudomonas), 예를 들어 슈도모나스 아에루기노사 (P. aeruginosa) 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 등이 있다. 바람직한 대장균 클로닝 숙주는 대장균 294 (ATCC 31,446)이지만, 대장균 B, 대장균 X1776 (ATCC 31,537) 및 대장균 W3110 (ATCC 27,325) 등과 같은 다른 균주들도 적합하다.이러한 예는 단지 예시적인 것으로서 제한하는 것이 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 생성물 발효에 통상적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모(母) 숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 단백질분해 효소를 최소량으로 분비해야 한다. 예를 들어, 균주 W3110은 단백질을 코딩하는 유전자에서 유전적 돌연변이를 초래하도록 변형시킬 수 있으며, 이러한 숙주의 예로는 대장균 W3110 균주 27C7 등이 있다. 27C7의 완전한 유전자형은 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 ompT degP41kan^r이다. 균주 27C7은 1991년 10월 30일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 ATCC 55,244로 기탁되었다. 별법으로, 1990년 8월 7일자로 허여된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 주변세포질 프로테아제 돌연변이체를 보유하는 대장균 균주가 사용될 수 있다. 별법으로, 클로닝 방법, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 중합효소 반응이 적합하다.

원핵생물 뿐만 아니라, 섬유상 진균 또는 효모 등과 같은 진핵 미생물도 아르테민 코딩 벡터의 클로닝 숙주 또는 발현 숙주로서 적합하다. 하등 진핵생물 숙주 미생물 중에서, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 또는 보통의 제빵용 효모가 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 수많은 다른 속, 종 및 균주, 예를 들어 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (문헌 [Beach et al., Nature, 290:140 (1981)], 1985년 5월 2일자로 공개된 EP 139,383호); 클루이베로마이세스 숙주 (미국 특허 제4,943,529호, Fleer et al., 상기 문헌), 예를 들어 클루이베로마이세스 락티스 (K. lactis) (MW98-8C, CBS683,CBS4574, [Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)]), 클루이베로마이세스 프라길리스 (K. fragilis) (ATCC 12,424), 클루이베로마이세스 불가리쿠스 (K. bulgaricus) (ATCC 16,045), 클루이베로마이세스 위케라미 (K. wickeramii) (ATCC 24,178), 클루이베로마이세스 왈티이 (K. waltii) (ATCC 56,500), 클루이베로마이세스 드로소필라룸 (K. drosophilarum) (ATCC 36,906) [Van den Berg et al., 상기 문헌]), 클루이베로마이세스 써모톨레란스 (K. thermotolerans) 및 클루이베로마이세스 막시아누스 (K. marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226호); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070호), [Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia) (EP 244,234호); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa) [Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)]; 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (Schwanniomyces occidentalis) (1990년 10월 31일지로 공개된 EP 394,538호); 및 섬유상 진균, 예를 들어 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일자로 공개된 WO 91/00357호) 및 아스퍼길러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어 아스퍼길러스 니둘란스 (A. nidulans) (문헌 [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983)], [Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983)], [Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)]) 및 아스퍼길러스 니게르 (A. niger) (문헌 [Kelly et al., EMBO J., 4:475-479 (1985)]) 등이 통상적으로 이용가능하고, 본원에 유용하다.

글리코실화된 아르테민의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물체로부터 유래된다. 이러한 숙주 세포는 복잡한 프로세싱 및 글리코실화 활성이 가능하다. 원칙적으로, 척추동물 배양액인지 무척추동물 배양액인지의 여부에 관계없이, 임의의 고등 진핵생물 세포 배양액을 사용할 수 있다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 세포 및 곤충 세포 등이 있다. 수많은 배큘로바이러스 균주 및 변이체 및 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) (모충), 아에데스 애기프티 (Aedes aegypti) (모기), 아에데스 알보픽투스 (Aedes albopictus) (모기), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) (초파리) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) 등과 같은 숙주로부터의 상응하는 허용 곤충 숙주 세포가 확인된 바 있다. 예를 들어 문헌 [Luckow et al., Bio/Technology, 6:47-55 (1988)], [Miller et al., in Genetic Engineering, Setlow et al., eds., Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), pp. 277-279] 및 [Maeda et al., Nature, 315:592-594 (1985)]을 참조한다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 균주, 예를 들어 오토그라파 캘리포니카 (Autographa califonica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) NPV의 Bm-5 균주가 공개적으로 입수가능하며, 이러한 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 본 발명에 따른 바이러스로서 본원에서 사용될 수 있다.

목화, 옥수수, 감자, 대두, 페추니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양액을 숙주로서 사용할 수 있다. 전형적으로, 식물 세포는 아르테민-코딩 DNA를 함유하도록 미리 조작해 둔 특정 균주의 박테리아 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와의 인큐베이션에 의해 형질감염된다. 식물 세포 배양액과 아그로박테리움 투메파시엔스의 인큐베이션 동안, 아르테민을 코딩하는 DNA가 식물 세포 숙주로 전달되어 상기 숙주가 형질감염되고, 적당한 조건하에서 아르테민-코딩 DNA를 발현할 것이다. 또한, 식물 세포와 상용가능한 조절 서열 및 신호 서열, 예를 들어 노팔린 신타제 프로모터 및 폴리아데닐화 신호 서열도 이용가능하다 (문헌 [Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., 1:561 (1982)] 참조). 또한, T-DNA 780 유전자의 상류 영역으로부터 단리된 DNA 세그먼트는 재조합 DNA를 함유하는 식물 조직에서 식물-발현가능한 유전자의 전사 수준을 활성화시키거나 증가시킬 수 있다 (1989년 6월 21자로 공개된 EP 321,196호).

그러나, 가장 큰 관심은 척추동물 세포에 있으며, 척추동물 세포를 배양 (조직 배양)시켜 증식시키는 것은 통상적인 과정이 되었다. 예를 들어, 문헌 [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)]를 참조한다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예로는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양을 통해 성장시키기 위해 서브클로닝된 293 세포(들) [Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)]); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 차이니스 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]; 마우스 세르톨리 세포 [TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)]; 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카산 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)]; MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 세포주 (Hep G2) 등이 있다.

아르테민 생산을 위해, 상기 발현 벡터 또는 클로닝 벡터로 숙주 세포를 형질감염 및 바람직하게는 형질전환시키고, 적당하다면 프로모터를 유도하거나 형질전환체를 선별하거나 원하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키도록 변형시킨 통상적의 영양 배지 내에서 배양한다.

형질감염은 숙주 세포에 발현 벡터가 수용되어 사실상 임의의 코딩 서열이 발현되는지의 여부를 지칭한다. 수많은 형질감염 방법, 예를 들어 CaPO₄및 전기천공법 등이 당업자에게 공지되어 있다. 일반적으로, 숙주 세포 내에서 이러한 벡터의 작용에 대한 임의의 현상이 나타나는 경우, 이를 성공적인 형질감염으로 인식한다.

형질전환은 DNA를 염색체외 요소로서 또는 염색체의 통합체로서 생물체에 도입함으로써 상기 DNA가 복제될 수 있게 하는 것을 의미한다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 그 세포에 적합한 표준 기술을 이용하여 수행된다. 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]의 제1.82절에 기재된 바와 같이 염화칼슘을 사용하는 칼슘 처리법을 이용하거나, 원핵생물 또는 실질적인 세포-벽 장벽을 함유하는 다른 세포인 경우에는 통상적으로 전기천공법을 이용한다. 문헌 [Shaw et al.,Gene, 23:315 (1983)] 및 1989년 6월 29일자로 공개된 WO 89/05859호에 기재된 바와 같이, 특정 식물 세포의 형질전환에는 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염이 사용된다. 또한, 1991년 1월 10일자로 공개된 WO 91/00358호에 기재된 바와 같이, 식물은 초음파 처리를 이용하여 형질감염시킬 수 있다.

이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham et al., Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법이 바람직하다. 포유동물 세포 숙주 시스템 형질전환의 일반적인 측면은 1983년 8월 16일자로 허여된 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모로의 형질전환은 통상적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:949 (1977)] 및 [Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)]의 방법에 따라 수행된다. 그러나, 세포에 DNA를 도입시키기 위한 다른 방법, 예를 들어 핵내 미세주입, 전기천공법, 온전한 세포와 박테리아 프로토플라스트의 융합, 또는 다중양이온 (polycation) (예를 들어, 폴리브렌, 폴리오르니틴 등)을 이용할 수도 있다. 포유동물 세포를 형질전환 시키기 위한 다양한 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)] 및 [Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.

본 발명의 아르테민 폴리펩티드를 제조하는 데 사용되는 원핵 세포는 상기 문헌 (Sambrook et al.)에 일반적으로 기재된 적합한 배지에서 배양된다.

본 발명의 아르테민을 생산하기 위해 사용되는 포유동물 숙주 세포는 각종배지 중에서 배양할 수 있다. 상업적으로 시판되는 배지, 예를 들어 Ham's F10 (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM, Sigma)가 숙주 세포의 배양에 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth. Enz., 58:44 (1979)]; [Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980)], 미국 특허 제4,767,704호; 동 제4,657,866호, 동 제4,927,762호, 동 제4,560,655호 또는 동 제5,122,469호, WO 90/03430호, WO 87/00195호 또는 미국 특허 등록 제30,985호에 기재된 배지를 숙주 세포의 배양 배지로서 사용할 수 있다. 이들 배지에는 호르몬 및(또는) 다른 성장 인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 또는 상피 세포 성장 인자), 염 (예를 들어, 나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 인산염), 완충액 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오시드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (예를 들어 GENTAMYCIN (등록상표) 약물), 미량 원소 (통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨), 및 글루코스 또는 동등한 에너지 공급원이 필요에 따라 보충될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충물이 당업계 숙련자에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수도 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에 대해 이전에 사용된 조건이고, 당업계 숙련자에게 자명할 것이다.

통상적으로는, 포유동물 세포 배양의 생산성을 최대화하기 위한 원리, 프로토콜 및 실행 기술을 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)]에서 찾아볼 수 있다.

본 개시내용에서 언급되는 숙주 세포에는 배양되는 세포 뿐만 아니라 숙주동물 내의 세포도 포함된다.

유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어, 본원에 제공된 서열에 기초하여, mRNA의 전사를 정량화하는 통상적 서던 블로팅 (southern blotting), 노던 (northern) 블로팅 (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)), 도트 (dot) 블로팅 (DNA 분석), 또는 원래 위치에서의 (in situ) 혼성화 (적절하게 표지된 프로브 사용함)에 의해 직접적으로 샘플에서 측정할 수 있다. 여러 표지가 이용될 수 있으며, 가장 통상적으로 동위원소, 특히³²P가 사용된다. 그러나 다른 기술, 예를 들어 바이오틴-수식된 뉴클레오티드를 폴리뉴클레오티드에 도입하는 것을 이용하는 방법도 이용될 수 있다. 바이오틴은 광범위한 표지, 예를 들어 방사선 핵종, 형광체, 효소 등으로 표지될 수 있는 아비딘 또는 항체에 결합하는 부위로서 작용한다. 별법으로, DNA 이중체, RNA 이중체 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 비롯한 특정 이중체를 인식할 수 있는 항체가 이용될 수도 있다. 이어서, 항체를 표지하고, 이중체가 표면에 결합되는 부위에서 분석을 수행함으로써, 표면에 이중체가 형성될 때 이중체에 결합한 항체의 존재를 검출할 수 있다.

별법으로, 유전자 발현은 직접적으로 유전자 산물의 발현을 정량화하는 면역학적 방법, 예를 들어 조직 세그먼트의 면역조직화학적 염색 및 세포 배양 또는 체액의 분석법에 의해 측정될 수 있다. 면역조직화학적 염색 방법에 있어서, 세포 샘플은 일반적으로 탈수 및 고정된 후에, 결합된 유전자 산물에 특이적인 표지 항체와 반응시킴으로써 제조되며, 여기서 표지는 일반적으로 시각적으로 검출 가능한 표지, 예를 들어 효소 표지, 형광 표지, 발광 표지 등이다. 본 발명에서 사용하기에 적합한, 특히 감도가 높은 염색법은 문헌 [Hsu et al., Am. J. Clin. Path. 75:734-738 (1980)]에 기재되어 있다.

면역조직화학적 염색 및(또는) 샘플액의 분석법에 유용한 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이며, 이들은 본원에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

아르테민은 숙주 세포 용해물로부터 회수될 수도 있지만, 바람직하게는 분비된 폴리펩티드로서 배양 배지로부터 회수된다. 아르테민이 막에 결합된 경우, 아르테민은 적합한 계면활성제 용액 (예컨대, Triton-X 100)을 사용하여 막으로부터 유리될 수 있다.

아르테민이 인간에서 기원하지 않은 재조합 세포에서 생성된 경우에는 인간 기원의 단백질 또는 폴리펩티드가 전혀 존재하지 않는다. 그러나, 실질적으로 균일한 아르테민 제제를 얻기 위해서는 재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 아르테민을 정제할 필요가 있다. 제1 단계로서, 배양 배지 또는 용해물을 원심분리하여 세포 파쇄 입자를 제거할 수 있다. 이어서, 아르테민을 적합한 정제 방법으로 오염 가용성 단백질 및 폴리펩티드로부터 정제할 수 있으며, 여기서 적합한 정제 방법의 예로는 이온 교환 컬럼 상의 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 상의 크로마토그래피; 크로마토포커싱; 면역친화법; 에피토프-태그 (epitope-tag) 결합 수지; SDS-PAGE; 황산 암모늄 침전; 예를 들어 세파덱스 G-75를 이용한 겔 여과; 및 IgG와 같은 오염물을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼이 있다.

3.아르테민의 변형

아르테민 및 아르테민 변이체의 공유결합 변형은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 변형의 한 형태는 아르테민의 선택된 측쇄, 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화 작용제와 아르테민 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이관능성 작용제를 사용한 유도체화는, 예를 들어 항-아르테민 항체 정제 방법에 사용하기 위한 수불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 아르테민을 가교결합시키거나 그 반대로 가교결합시키는 데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제에는, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어 4-아지도살리실산과의 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 비롯한 동종이관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질이 포함된다.

다른 변형에는 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기의 각각 대응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로의 탈아미드화, 프롤린 및 리신의 히드록실화, 세릴 또는 트레오닐 잔기의 히드록실기의 인산화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 알파-아미노기의 메틸화 (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman ＆ Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-말단 아민의 아세틸화 및 C-말단 카르복실기의 아미드화가 포함된다.

본 발명의 범위에 포함되는 아르테민 폴리펩티드의 공유결합 변형의 또다른형태는 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원의 목적상 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 아르테민에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부분의 결실 (근원적인 글리코실화 부위를 제거하거나 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써) 및(또는) 천연 서열 아르테민에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 여러 가지 탄수화물 부분의 특성 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어서의 질적 변화를 포함한다.

아르테민에 대한 글리코실화 부위의 부가는 아미노산 서열을 변화시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 변화는, 예를 들어 천연 서열 아르테민에 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 부가 또는 치환시킴으로써 이루어질 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). 아르테민 아미노산 서열은 임의로는 특히 원하는 아미노산으로 번역될 코돈이 생성되도록 아르테민 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 미리 선택된 염기에서 돌연변이화시킴으로써, DNA 수준에서의 변화를 통해 변화시킬 수 있다.

아르테민에 존재하는 탄수화물 부분의 수를 증가시키는 다른 방법은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어 1987년 9월 11일자로 공개된 WO 87/05330호 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.

아르테민에 존재하는 탄수화물 부분의 제거는 화학적으로 또는 효소에 의해 달성되거나 글리코실화에 대한 표적으로 기능하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이에 의한 치환으로 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)] 및 [Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 부분의 효소에 의한 절단은 문헌 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)]에 기재된 바와 같이 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다.

아르테민의 공유결합 변형의 또다른 형태는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 또는 폴리옥시알킬렌 중의 하나에 아르테민을 연결시키는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 아르테민은 또다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 융합된 아르테민을 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 변형될 수도 있다.

한 실시양태에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 아르테민의 융합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 아르테민의 아미노-말단 또는 카르복실-말단에 위치한다. 상기 에피토프 태그가 부착된 형태의 아르테민의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체 또는 에피토프 태그에 결합하는 또다른 형태의 친화성 매트릭스를 사용하는 친화도 정제법으로 아르테민을 쉽게 정제할 수 있게 된다. 여러 가지 태그 폴리펩티드 및 이들의 각 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘 (폴리-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (폴리-his-gly) 태그, 플루 (flue) HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 (Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)), c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 (Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)), 및 허피스 심플렉스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 (Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)) 등이 있다. 다른 태그 폴리펩티드로는 Flag-펩티드 (Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)), KT3 에피토프 펩티드 (Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)), 알파-튜불린 에피토프 펩티드 (Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)) 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 (Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990))가 있다.

다른 실시양태에서, 키메라 분자는 아르테민과 면역글로불린 또는 면역글로불린의 특정 영역과의 융합체를 포함한다. 키메라 분자의 2가 형태 ("면역어드헤신"으로 지칭되기도 함)의 경우, 상기 융합체는 IgG 분자의 Fc 영역과의 융합체일 수 있다.

가장 간단하고, 가장 수월한 면역어드헤신 고안은 면역글로불린 중쇄의 힌지 및 Fc 영역을 갖는 "어드헤신" 단백질의 결합 영역(들)을 조합하는 것이다. 통상적으로는, 본 발명에 사용하기 위한 아르테민-면역글로불린 키메라를 제조하는 경우, 아르테민을 코딩하는 핵산은 면역글로불린 불변 도메인 서열의 N-말단을 코딩하는 핵산에 C-말단 융합될 것이지만, N-말단 융합도 가능하다.

전형적으로, 키메라 폴리펩티드를 코딩하는 이러한 융합체에 면역글로불린 중쇄의 불변 영역의 적어도 기능적으로 활성인 힌지, 및 CH2 및 CH3 도메인이 보유될 것이다. 또한, 불변 도메인의 Fc 부위의 C-말단, 또는 중쇄의 CH1에 대한 인접한 N-말단 또는 경쇄의 상응하는 영역에도 융합된다.

융합되는 정확한 부위는 중요하지 않은데, 특정 부위는 공지되어 있고, 아르테민-면역글로불린 키메라의 생물학적 활성을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 아르테민-면역글로불린 키메라는 단량체, 또는 동종- 또는 이종-다량체로서, 특히 이량체 또는 삼량체로서, 구체적으로는 WO 91/08298호에 설명된 바와 같이 어셈블링된다.

바람직한 실시양태에서, 아르테민 서열은 면역글로불린의 이펙터 (effector) 기능, 예컨대 면역글로불린 G₁(IgG1)을 함유한 항체 (특히, Fc 도메인)의 C-말단 부위의 N-말단에 융합된다. 전체 중쇄 불변 영역을 아르테민 서열에 융합시키는 것이 가능하다. 그러나, 파파인 절단 부위 (화학적으로 IgG Fc로 정의됨; 잔기 114가 되는 중쇄 불변 영역의 1번째 잔기를 갖는 잔기 216, 또는 다른 면역글로불린의 유사 부위를 가짐)의 바로 상류의 힌지 영역 중의 시작 서열이 융합에 사용되는 것이 더 바람직하다. 특히 바람직한 실시양태에서, 아르테민 아미노산 서열은 힌지 영역 및 CH2 및 CH3에 융합되거나, 또는 IgG1, IgG2 또는 IgG3 중쇄의 CH1, 힌지, CH2 및 CH3 도메인에 융합된다. 융합되는 정확한 부위는 중요하지 않고, 최적 부위는 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 아르테민-면역글로불린 키메라는 다량체, 특히 호모-이량체 또는 -삼량체로서 어셈블링된다. 일반적으로, 이들 어셈블링된 면역글로불린은 공지된 단위 구조를 가질 것이다. 기본 4쇄 구조 단위는 IgG, IgD 및 IgE가 존재하는 형태이다. 4-단위는 고분자량 면역글로불린에서 반복되는데, IgM이 일반적으로 이황결합에 의해 서로 결합된 기본 4-단위의 오량체로서 존재한다. IgA 글로불린, 때때로 IgG 글로불린은 혈청에서 다량체 형태로도 존재할 수 있다. 다량체의 경우에, 각각의 4-단위는 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

별법으로, 아르테민 서열은 키메라 중쇄를 포함하는 면역글로불린을 얻을 수 있도록 면역글로불린 중쇄와 경쇄 서열 사이에 삽입될 수 있다. 이 실시양태에서, 아르테민 서열은 힌지와 CH2 도메인 사이, 또는 CH2와 CH3 도메인 사이의 면역글로불린의 각각의 암 (arm) 중의 면역글로불린 중쇄의 3'말단에 융합된다. 유사한 작제물이 문헌 [Hoogenboom et al., Mol. Immunol., 28:1027-1037 (1991)]에 보고되어 있다.

면역글로불린 경쇄의 존재가 본 발명의 면역어드헤신에 요구되지는 않지만, 면역글로불린 경쇄는 아르테민-면역글로불린 중쇄 융합 폴리펩티드에 공유결합되거나, 또는 아르테민에 직접 융합되어 존재할 수 있다. 전자의 경우에, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 전형적으로 아르테민-면역글로불린 중쇄 융합 단백질을 코딩하는 DNA와 동시 발현된다. 분비시에, 하이브리드 중쇄와 경쇄가 공유결합하여 2개의 이황결합된 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 포함하는 면역글로불린-유사 구조를 제공할 것이다. 이러한 구조의 제조에 적합한 방법은, 예를 들어 1989년 3월 28일자로 허여된 미국 특허 제4,816,567호에 개시되어 있다.

바람직한 실시양태에서, 본 발명의 면역어드헤신 작제물에 사용되는 면역글로불린 서열은 IgG 면역글로불린 중쇄 불변 도메인으로부터 유래된다. 인간 면역어드헤신의 경우, 인간 IgG1 및 IgG3 면역글로불린 서열을 사용하는 것이 바람직하다. IgG1을 사용하는 주요 이점은 IgG1 면역어드헤신이 고정화된 단백질 A 상에서 유효하게 정제될 수 있다는 것이다. 대조적으로, IgG3의 정제는 다용성이 상당히 떨어지는 매체인 단백질 G를 필요로 한다. 그러나, 특정 면역어드헤신 작제물용으로 Ig 융합 파트너를 선택하는 경우에 면역글로불린의 다른 구조 및 기능 특성이 고려되어야 한다. 예를 들어, IgG3 힌지가 더 길고 더 유연하기 때문에 IgG1에 융합될 때 적절하게 폴딩되지 않거나 또는 기능할 수 없는 더 큰 어드헤신 도메일 수용할 수 있다. 또한, 원자가도 고려될 수 있는데, IgG 면역어드헤신은 2가 호모-이량체인 반면, IgA 및 IgM과 같은 Ig 서브타입은 각각 기본 Ig 호모-이량체 단위의 이량체 또는 오량체 구조를 발생시킬 수 있다. 생체내에서 사용하기 위해 고안하는 아르테민 면역어드헤신의 경우, Fc 영역으로 상술된 약물동력학적 특성 및 이펙터 기능도 중요하다. IgG1, IgG2 및 IgG4 모두의 생체내 반감기가 21일이지만, 보체 시스템을 활성화시킬 때 이들의 상대적 능력은 상이하다. IgG4는 보체를 활성화시키지 않고, IgG2는 IgG1보다 보체 활성에 있어 상당히 더 약하다. 또한, IgG1와는 다르게, IgG2는 단핵 세포 또는 호중구 상의 Fc 수용체에 결합하지 않는다. IgG3은 보체 활성화에 최적인 반면, 그의 생체내 반감기는 다른 IgG 이소타입의 약 1/3이다. 인간 치료술로서 사용되기 위해 고안되는 면역어드헤신에 대한 또다른 중요한 고려 사항은 특정 이소타입의 알로타입 (allotpe) 변이체의 수이다. 일반적으로, 보다 소수의 혈청학적으로 정의된 알로타입을 갖는 IgG 이소타입이 바람직하다. 예를 들어, IgG1은 단지 4개의 혈청학적으로 정의된 알로타입 부위만을 가지며, 이들 중 2개 (G1m 및 2)는 Fc 영역에 위치하고, 이들 중 1개인 G1m1 위치는 비-면역원성이다. 대조적으로, IgG3에는 12개의 혈청학적으로 정의된 알로타입이 있으며, 이들 모두는 Fc 영역에 있고, 이들 부위 중 단지 3개 (G3m5, 11 및 21)는 비면역원성인 하나의 알로타입을 가진다. 따라서, 3개의 면역어드헤신의 잠재적인 면역원성은 1개의 면역어드헤신보다 더 크다.

모(母) 면역글로불린과 관련하여, 유용한 연결점은 2개의 중쇄 사이에 이황결합을 형성하는 힌지의 시스테인의 바로 상류이다. 종종 사용되는 고안에서, 분자의 아르테민 부분의 C 말단 잔기에 대한 코돈은 IgG1 힌지 영역의 서열 DKTHTCPPCP에 대한 코돈의 바로 상류에 위치한다.

면역어드헤신의 제조 및 발현에 적합한 일반 방법은 아르테민에 관해 상술된 것과 동일하다. 아르테민 면역어드헤신은 아르테민 부분을 코딩하는 cDNA 서열을 Ig cDNA 서열과 프레임에 맞게 융합시킴으로써 가장 편리하게 제조된다. 그러나, 게놈 Ig 단편에 대한 융합도 사용될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2936-2940 (1987)]; [Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)]; [Stamenkovic et al., Cell, 66:1133-1144 (1991)] 참조). 융합의 후자 유형은 발현을 위해 Ig 조절 서열이 존재해야 한다. IgG 중쇄 불변영역을 코딩하는 cDNA는 비장 또는 말초혈 림프구로부터 유래한 cDNA 라이브러리로부터 공지 서열에 기초하여 혼성화 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해 단리될 수 있다. 아르테민 및 면역어드헤신의 Ig 부분을 코딩하는 cDNA는 선택된 숙주 세포에서 효율적인 발현을 유도하는 플라스미드 벡터 내에 탠덤으로 삽입된다. 포유동물 세포에서 발현하는 경우, pRK5-기재 벡터 (문헌 [Schall et al., Cell, 61:361-370 (1990)] 및 CDM8-기재 벡터 [Seed, Nature, 329:840 (1989)] 참조)가 사용될 수 있다. 정확한 접합 (junction)은 올리고뉴클레오티드-유래의 결실 돌연변이 유발법 (문헌 [Zoller et al., Nucleic Acids Res., 10:6487 (1982)]; [Capon et al., Nature, 337:525-531 (1989)] 참조)을 이용하여 고안된 접합 코돈들 사이의 여분의 서열을 제거함으로서 생성될 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드가 사용될 수 있으며, 여기서 각각의 절반은 목적하는 접합부의 어느 한쪽 서열에 상보적인데, 이상적으로는 36 내지 48-머이다. 별법으로, PCR 기술을 이용하여 분자의 2개 부분을 프레임에 맞게 적절한 벡터와 연결시킬 수 있다.

아르테민 면역어드헤신을 발현하기 위한 숙주 세포의 선택은 주로 발현 벡터에 의존한다. 또다른 고려 사항은 요구되는 단백질의 양이다. 밀리그람 수준의 양은 종종 일시적인 형질감염에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스 EIA-형질전환된 293 인간 배아 신장 세포주는 pRK5-기재 벡터를 사용하여 인산칼슘법의 변형법으로 일시적 형질감염시켜 효율적인 면역어드헤신을 발현시킬 수 있다. CDM8-기재 벡터는 DEAE-덱스트란 방법 (문헌 [Aruffo et al., Cell, 61:1303-1313 (1990)]; [Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. US, 9:347-353 (1990)] 참조)으로COS 세포를 형질감염시키는 데 사용될 수 있다. 단백질을 더 많은 양으로 요구하는 경우, 숙주 세포주의 안정한 형질감염 후에 면역어드헤신을 발현시킬 수 있다. 예를 들어, pRK5-기재 벡터는 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)를 코딩하고 G418에 대한 내성을 부여하는 추가의 플라스미드의 존재하에 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포 내로 도입될 수 있다. G418에 내성인 클론을 배양액에서 선별하고, 이들 클론을 증가된 수준의 DHFR 억제제 메토트렉세이트의 존재하에 배양하여 클론을 선별하며, 여기서 DHFR과 면역어드헤신 둘 다의 서열을 코딩하는 유전자 카피수가 동시에 증폭된다. 면역어드헤신이 그의 N-말단에 소수성 리더 서열을 함유하는 경우, 이 면역어드헤신은 형질감염된 세포에 의해 프로세싱되어 분비되는 것 같다. 보다 복잡한 구조를 갖는 면역어드헤신의 발현은 특히 적합한 숙주 세포를 요구할 수 있는데, 경쇄 또는 J 쇄와 같은 구성 성분이 특정 골수종 또는 하이브리도마 세포 숙주에 의해 제공될 수 있다 (Gascoigne et al., 1987, 상기 문헌; Martin et al., J. Virol., 67:3561-3568 (1993)).

면역어드헤신은 친화도 크로마토그래피에 의해 편리하게 정제될 수 있다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 키메라에 사용되는 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 따라 다르다. 단백질 A는 인간 1, 2 또는 4 중쇄를 기초로 하는 면역어드헤신 정제에 사용될 수 있다 (Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13 (1983)). 단백질 G는 모든 마우스 이소타입 및 인간 3의 경우에 바람직하다 (Guss et al., EMBO J., 5:1567-1575 (1986)). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스로 가장 흔한 것은 아가로스이지만, 다른 매트릭스도 사용가능하다.기계적으로 안정한 매트릭스, 예컨대 조절된 세공의 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 달성될 수 있는 것보다 신속한 유속 및 더 짧은 작업 시간을 가능하게 한다. 면역어드헤신이 단백질 A 또는 G 친화도 컬럼에 결합하기 위한 조건은 Fc 도메인의 특성, 즉 그의 종 및 이소타입에 의해 전반적으로 규정된다. 일반적으로, 적절한 리간드가 선택되는 경우, 조건화되지 않은 배양액으로부터 직접적으로 효율적인 결합이 발생한다. 면역어드헤신의 특색있는 한 특징은, 인간 1 분자의 경우 단백질 A에 대한 결합능이 동일한 Fc 유형의 항체에 비해 다소 감소된다는 것이다. 결합된 면역어드헤신은 산성 pH (3.0 이상)에서, 또는 온화한 카오트로픽 (chaotropic) 염을 함유한 중성 pH 완충액에서 효율적으로 용출될 수 있다. 이 친화도 크로마토그래피 단계는 순도 95％ 초과의 면역어드헤신을 제조할 수 있다.

당업계에 공지된 다른 방법을 단백질 A 또는 G 상의 친화도 크로마토그래피 대신에 이용하여, 또는 상기 방법에 부가하여 면역어드헤신을 정제할 수 있다. 면역어드헤신은 티오필릭 (thiophilic) 겔 크로마토그래피 (Hutchens et al., Anal. Biochem., 159:217-226 (1986)) 및 고정화된 금속 킬레이트 크로마토그래피 (Al-Mashikhi et al., J Dairy Sci., 71:1756-1763 (1988))에서의 항체와 유사하게 거동한다. 그러나, 항체와 대조적으로, 이온 교환 컬럼 상에서 이들의 거동은 그의 등전점 뿐만 아니라 그의 키메라성 때문에 분자에 존재할 수 있는 전하 이중극에 의해 규정된다.

필요에 따라, 면역어드헤신은 이중특이적으로 제조될 수 있다. 따라서, 본발명의 면역어드헤신은 아르테민 도메인, 및 또다른 사이토카인 또는 신경성 인자로부터의 도메인과 같은 소정의 도메인을 포함할 수 있다. 이중특이적 분자의 경우, 1개의 암 (arm) 중의 키메라 항체 중쇄와 키메라 항체-유사 구조의 다른 암 중의 키메라 항체 중쇄-경쇄 쌍으로 이루어진 삼량체 분자가 정제의 용이함 때문에 유리하다. 10개의 사량체 혼합물을 생성하는 이중특이적 면역어드헤신의 생산에 전통적으로 사용되는 항체-생산 쿼드로마 (quadroma)와는 대조적으로, 삼량체 면역어드헤신 구조의 쇄 3개를 코딩하는 핵산을 사용하여 형질감염시킨 세포가 단지 3종의 분자의 혼합물을 생산하기 때문에, 이 혼합물로부터의 목적하는 생성물을 정제하는 것이 더 용이하다.

4.아르테민 작용제의 제조 및 동정

a. 소분자 스크리닝

소분자는 아르테민 작용제로서의 능력을 갖기 때문에, 신경 세포 손상 예방 및 치료에 유용할 수 있다. 이러한 소분자에는 자연 발생의 소분자, 합성 유기 또는 무기 화합물 및 펩티드가 포함될 수 있다. 그러나, 본 발명의 소분자는 이들 형태로 제한되지는 않는다. 소분자의 대규모 라이브러리는 상업적으로 시판되고 있으며, 목적하는 활성에 대한 이들 분자를 스크리닝하기 위해 광범위한 분석은 당업계에 공지되어 있다.

후보 아르테민 작용제 소분자는, 바람직하게는 먼저 잠재적인 작용제를 신속하게 동정할 수 있는 분석으로 동정된다. 이러한 분석의 예로는 GFR 수용체에 대한 후보 분자의 결합능을 측정하는 단백질-단백질 결합 분석이 있다. 또다른 예로는, GFR에 대한 아르테민 결합을 방해하는 후보 분자의 능력을 측정하는 것이 있다.

바람직한 실시양태에서, 소분자 아르테민 작용제는 아르테민의 하나 이상의 생물학적 활성을 모방하는 그의 능력으로 동정된다. 예를 들어, 소분자는 문헌 [Baloh et al., Neuron 21:1291-1302 (1998)]에 기재된 바와 같이 배양시 도파민성 중뇌 뉴런의 생존에 기여하는 그의 능력에 대하여 스크리닝된다. 이 소분자는 실시예 1 내지 4에 주어진 방법으로 측정된 통증 또는 통각과민없이, 실시예 6에 기재된 바와 같이 축삭절개 후 척수의 후각에서 축삭절개술-유도의 섭스턴스 P 손실을 방지하는 그의 능력으로 스크리닝될 수도 있다.

아르테민 작용제로서 동정된 화합물은, 예를 들어 손상-유도된 병리적 변화로부터 포유동물의 뉴런을 보호하기 위해 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.

b. 작용제 항체의 제조 및 동정

아르테민의 생물학적 특성을 모방하는 작용제 인간 및 비-인간 폴리클로날 및 모노클로날 항체 (비-인간 모노클로날 항체의 인간화 형태를 포함함)도 본 발명에서 고려된다. 이들에는 아미노산 서열 변이체, 글리코실화 변이체 및 항체의 단편이 포함된다. 이러한 항체의 생산 및 작용제 항체의 선별에 대한 일반 기술은 당업계에 공지되어 있고, 하기에 간단하게 기술되어 있다.

(i) 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는, 예를 들어 면역화제 및, 필요에 따라 면역보강제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 발생될 수 있다. 전형적으로, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 다중 피하 또는 복막내 주사에 의해 포유동물에 주사될 수 있다. 면역화제를, 면역화되는 포유동물에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질 (예를 들어, 혈청 알부민 또는 대두 트립신 억제제)와 결합시키는 것이 유용할 수 있다. 사용될 수 있는 면역보강제의 예로는 프로인트 완전 면역보강제 및 MPL-TDM이 있다.

(ii) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature, 256:495 (1975)]에서 처음 기술된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수도, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 제4,816,567호)을 이용하여 제조할 수도 있다.

하이브리도마 방법에서, 면역화를 위해 사용된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하도록 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예컨대 햄스터 또는 짧은꼬리 (amcaque) 원숭이를 상기한 바와 같이 면역화시킨다. 별법으로, 림프구를 시험관내에서 면역화시킬 수 있다. 이어서, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, pp. 590-103 (Academic Press, 1986)).

이렇게 제조한 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합 골수종 모세포의 성장 또는 생존을 억제시키는 1종 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 중에 접종하고 배양시킨다. 예를 들어, 골수종 모세포가 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT) 효소가 결핍된 경우, 하이브리도마용 배양배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 억제시킨다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체 생산 세포에 의해 항체가 높은 수준으로 안정하게 생산되도록 하며, HAT 배지와 같은 배지에 감수성이 있는 것이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 뮤린 골수종 세포주, 예를 들어 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center; 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection, 미국 매릴랜드주 록빌 소재)으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체의 생산용으로 기술되어 있다 (Kozbar, J. Immunol. 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987)).

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지를 항원에 대해 유도된 모노클로날 항체의 생산에 대해 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법에 의해, 또는 방사성면역분석법 (RIA) 또는 효소결합 면역흡수 분석법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석에 의해 측정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는, 예를 들어 문헌 [Munson et al, Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐쳐드 (Scatchard) 분석에 의해 측정될 수 있다.

원하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 후, 한계 희석 절차에 의해 클론을 서브클로닝시키고 표준 방법으로 배양한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principals and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배지로는, 예를 들어 DMEM 또는 RPMI-1640 배지가 있다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 증식할 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는, 예를 들어 단백질 A-세파로스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화도 크로마토그래피와 같은 통상의 면역글로불린 정제 절차에 의해 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리된다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 이용하여 (예를 들어, 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용하여) 쉽게 단리되고 서열분석된다. 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 발현 벡터 내로 삽입할 수 있고, 이어서 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 다른 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니스 햄스터 난소 (CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염되어 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킨다. DNA는 또한, 예를 들어 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열로 치환하거나 (Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A., 81:6851 (1984)), 또는 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린폴리펩티드에 대한 모든 또는 부분 코딩 서열을 공유결합시킴으로써 변형될 수 있다. 이 방식으로, 본원에 기술되는 아르테민 작용제 모노클로날 항체의 결합 특이성를 갖는 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체가 제조된다.

키메라 또는 하이브리드 항체는 또한 가교결합제를 사용하는 것을 비롯한 합성 단백질 화학의 공지 방법으로 시험관내에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역독소는 이황화물 교환 반응에 의해 또는 티오에테르 결합의 형성에 의해 제조될 수 있다. 이 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티리미데이트가 있다.

항체의 재조합 생성물은 하기에 더 상세히 기술될 것이다.

(iii) 인간화 항체

일반적으로, 인간화 항체는 비-인간 공급원으로부터 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-인간 아미노산 잔기는 흔히 "임포트(import)" 잔기로 언급되며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열을 설치류 CDR 또는 CDR 서열로 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988))에 따라 수행할 수 있다.

따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 것보다 실질적으로 적은 키메라 항체 (Cabilly, 상기 문헌)이다. 실제로, 인간화 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체에서 상동성 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.

항체를 항원에 대한 고친화성 및 다른 유리한 생물학적 특성과 함께 인간화시키는 것이 중요하다. 이 목적을 달성시키기 위해, 바람직한 방법에 따라, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원 모델을 사용하여 모서열 및 다양한 개념의 인간화 생성물의 분석 방법에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상 사용가능하고, 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 3차원 형태 구조를 도시하고 나타내는 컴퓨터 프로그램이 입수가능하다. 결과로 나타난 자료들을 검사하는 것은, 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 적절한 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방법으로, FR 잔기는 목적하는 항체 특성, 예컨대 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도가 달성되도록 컨센서스 (consensus) 및 임포트 서열로부터 선택 및 조합될 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 항원 결합에 영향을 주는 직접적이고 가장 실질적인 요인이다. 추가의 상세한 내용은, 1991년 6월 14일자로 출원된 미국 출원 제07/715,272호의 부분 계속출원인 미국 출원 제07/934,373호 (192년 8월 21일자로 출원됨)를 참고한다.

(iv) 인간 항체

인간 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법으로 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체를 제조하기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주는, 예를 들어 문헌 [Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984)] 및 [Brodeur, et al.,Monoclonal Antibody Production Technique and Applications, pages 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]에 기재되어 있다.

또한, 면역화시에 내생성 면역글로불린의 생성없이 인간 항체의 레퍼토리를 생성할 수 있는 형질전환 (transgenic) 동물 (예를 들어, 마우스)의 제조가 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포주 돌연변이 마우스 내의 항체 중쇄 연결 영역 (J_H) 유전자의 동형접합성 결실의 결과, 내생성 항체 생산이 완전히 억제된다고 설명되어 있다. 그러한 생식세포주 돌연변이 마우스 내에 인간 생식세포주 면역글로불린 유전자 배열을 이식한 결과, 항원 접종시에 인간 항체가 생산될 것이다. 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-255 (1993)]; [Jakobovits et al., Nature 362:255-258 (1993)]을 참조할 수 있다.

멘데즈 (Mendez) 등 (Nature Genetics 15:146-156 (1997))은 기술을 추가로 개선시켰고, 항원 접종시 고친화성의 완전한 인간 항체를 생성하는 "제노마우스 (Xenomouse) II"로서 고안된 형질전환 마우스 계통을 생성시켰다. 이는 상술한 바와 같이 내생성 J_H세그먼트가 결실된 마우스로 100만 염기쌍의 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 좌위를 생식세포주 통합시킴으로써 달성되었다. 제노마우스 II는 약 66개의 V_H유전자, 완전한 D_H및 J_H영역 및 3개의 상이한 불변 영역 (μ, δ 및 χ)를 함유한 1,020 kb의 인간 중쇄 유전자 좌위를 가지고, 또한 32개의 Vκ 유전자, Jκ 세그먼트 및 Cκ 유전자를 함유한 800 kb의 인간 κ 유전자 좌위를 가진다. 이들 마우스에서 생성된 항체는 유전자 재배열, 어셈블리 및 레퍼토리를 비롯한 모든 면에서 인간에서 나타나는 것과 매우 유사하다. 인간 항체는 뮤린 유전자 좌위에서의 유전자 재배열을 방지하는 내생성 J_H세그먼트의 결실 때문에 내생성 항체보다 우선적으로 발현된다.

별법으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty at al, Nature 348:552-553 (1990))은 인간 항체 및 항체 단편을 비면역화된 공여자로의 면역글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 시험관내 제조하는 데 이용될 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자는 섬유상 박테리오파지, 예컨대 M13 또는 fd의 메이저 또는 마이너 코트 단백질 유전자 내로 프레임에 맞게 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상의 기능성 항체 단편으로 나타난다. 섬유상 입자가 파지 게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능성에 기초한 선별은 또한 그의 특성을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자를 선별하게 한다. 따라서, 파지는 B-세포 특성의 일부와 유사하다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있는데, 그의 개관은 문헌 [Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993)]을 참조할 수 있다. V-유전자 세그먼트의 몇몇 공급원은 파지 디스플레이에 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]에는 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 랜덤 조합 라이브러리로부터 다양한 배열의 항-옥사졸론 항체를 단리하는 것에 대해 기재되어 있다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레퍼토리는 제조될 수 있고, 항원 (자가-항원을 포함함)의 다양한 배열에 대한 항체는 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol 222:581-597 (1991)] 또는 [Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]에 기재된 기술에 따라 실질적으로 단리될 수 있다. 자연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적한다 (체세포 과돌연변이). 도입된 변화의 일부는 더 큰 친화도를 제공할 것이고, 고-친화성 표면 면역글로불린을 나타내는 B 세포는 차후 항원 접종 동안 우선적으로 복제 및 분화한다. 이 자연 과정은 "체인 셔플링 (chain shuffling)" (Marks et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992))으로서 공지된 기술을 이용하여 모방될 수 있다. 이 방법에서, 파지 디스플레이에 의해 획득한 "제1 (primary)" 인간 항체의 친화도는 이어서 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 비면역화된 공여자로부터 획득한 V 도메인 유전자의 자연 발생 변이체 (레퍼토리)의 레퍼토리로 치환함으로써 개선될 수 있다. 이 기술은 nM 범위의 친화도를 갖는 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있게 해준다. 매우 큰 파지 항체 레퍼토리 ("모든 것의 어머니 (mother-of-all) 라이브러리"로도 공지됨)를 제조하는 방법은 문헌 [Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21:2265-2266 (1993)]에 기재되어 있고, 고친화성 인간 항체를 이러한 큰 파지 라이브러리로부터 직접적으로 단리하는 것은 문헌 [Griffith et al., EMBO J. (1994), 발행 중]에 의해 보고되었다. 유전자 셔플링은 인간 항체가 출발 항체인 설치류 항체와 유사한 친화도 및 특이성을 가지는 경우, 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도하는 데 사용될 수도 있다. "에피토프 각인 (epitope imprinting)"으로서 언급되기도 하는 이 방법에 따라, 파지 디스플레이 기술로 수득한 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인 유전자는 인간 V 도메인 유전자의 레퍼토리로 치환되어 설치류-인간 키메라를 생성한다. 항원의 선별은 기능성 항원-결합 부위를 회복할 수 있는 인간 가변 도메인을 단리하게 한다. 즉 에피토프가 파트너의 선택을 제어 (각인)한다. 잔존한 설치류 V 도메인을 치환하기 위해 이 과정을 반복하는 경우, 인간 항체가 수득된다 (PCT 특허 출원 WO 93/06213호 참조, 1993년 4월 1일자로 공개됨). CDR 이식에 의한 설치류 항체의 전통적인 인간화와는 다르게, 이 기술은 설치류 기원의 골격 또는 CDR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다.

(v) 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체, 바람직하게는 인간, 또는 인간화 항체이다. 본원의 경우에는, 결합 특이성 중 하나는 작용제 항체를 제공하는 아르테민 수용체에 대한 것이고, 다른 하나는 임의의 다른 항원, 바람직하게는 또다른 수용체 또는 수용체 서브유닛에 대한 것이다.

이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 동시발현에 기초하며, 여기에서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿼드로마)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 일반적으로 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 수행되는 정확한 분자의 정제는 다소 번거롭고, 생산 수율이 낮다. 유사한 방법이 PCT 출원 공개 WO 93/08829호 (1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

다른 연구 또는 더 바람직한 연구에 따라, 원하는 결합 특이성을 갖는 항체의 가변 도메인 (항체-항원 결합 부위)을 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이 융합은 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인과의 융합이 바람직하다. 경쇄 결합을 위해 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 융합체의 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합체를 코딩하는 DNA 및, 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 개별적으로 발현 벡터에 삽입하고, 적합한 숙주 생물체에 동시 형질감염시킨다. 이것은 제작에 사용되는 3종의 폴리펩티드쇄의 동일하지 않은 비율이 원하는 이중특이적 항체의 최적 수율을 제공하는 실시양태에서 3종의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는 데 있어서 보다 높은 유연성을 제공한다. 그러나, 비율이 같은 2종 이상의 폴리펩티드쇄가 고수율로 발현되거나 상기 비율이 특별히 중요하지 않을 때, 2종 또는 3종 모두의 폴리펩티드쇄에 대한 코딩 서열을 단일 발현 벡터에 삽입할 수 있다. 이 방법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 한쪽 암 (arm)에 있는 제1 결합 특이성을 나타내는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 다른쪽 암에 있는 (제2의 결합 특이성을 제공하는) 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍으로 구성되어 있다. 이중특이적 분자의 절반에만 면역글로불린 경쇄가 존재하여 용이하게 분리되도록 하기 때문에, 이러한 비대칭 구조가 원치않는 면역글로불린쇄 조합으로부터 원하는 이중특이적 화합물을 용이하게 분리할 수 있게 한다는 것이 밝혀졌다. 이 방법은 1994년 3월 3일자로 공개된 PCT 공개WO 94/04690호에 개시되어 있다.

이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121:210(1986)]을 참조한다.

(vi) 이종접합 항체

이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는, 예를 들어 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 제안되었다 (PCT 출원 공개 WO 91/00360호 및 동 WO 92/200373호; EP 03089호). 이종접합 항체는 임의의 편리한 가교결합제를 사용하여 제조할 수 있다. 적합한 가교결합제는 다수의 가교결합 기술과 함께 당업계에 공지되어 있고, 미국 특허 제4,676,980호에 개시되어 있다.

(vii) 항체 단편

특정 실시양태에서, 아르테민 작용제 항체 (뮤린, 인간 및 인간화 항체 및 항체 변이를 포함함)는 항체 단편이다. 다양한 기술이 항체 단편의 생산을 위해 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 무손상 항체의 단백질 분해를 통해 유도된 것이었다 (Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992); Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접적으로 생산될 수도 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접적으로 회수할 수 있고, F(ab')₂단편을 형성하도록 화학적으로 커플링시킬 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). 또다른 실시양태에서, F(ab')₂는 류신 지퍼 GCN4를 사용하여 형성시켜, F(ab')₂분자의 어셈블리를 촉진시킨다. 또다른 연구에 따라, Fv, Fab 또는 F(ab')₂단편을 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접적으로 단리할 수 있다. 항체 단편를 생산하기 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다.

(viii) 작용제 항체의 동정

GFR 3 수용체와 잠재적인 아르테민 작용제 항체의 상호작용에 기초하여 잠재적인 아르테민 작용제 항체를 동정할 수 있다. 예를 들어, GFR 3에 결합하는 능력에 대해 각종 항체를 스크리닝하는 데 당업계에 공지된 웨스턴 (Western) 블로팅 기술을 이용할 수 있다. 아르테민은 GFR 3 (실시예 8 참조)을 통해 작용하는 것으로 보이기 때문에, 항체와 GFR 3 사이의 임의의 상호작용은 항체가 아르테민 작용제와 작용할 수 있다는 것을 의미할 것이다.

생물학적 활성에 기초하여 실제 아르테민 작용제 항체를 동정한다. 한 실시양태에서, 실시예 8에 기재된 바와 같이 신생 후근 신경절 뉴런을 시험관내 도입하는 능력으로 아르테민 작용제 항체를 동정한다.

또한, 실시예 6에 기재된 바와 같이 축삭절개 후에 척수의 후각에서 축살절개술-유도된 섭스턴스 P의 손실을 방지하는 그의 능력에 기초하여 아르테민 작용제 항체를 동정할 수 있다.

5.아르테민과 상호작용하는 단백질에 대한 스크리닝 분석

단백질-단백질 상호작용을 검출하는데 적합한 임의의 방법을 이용하여 막횡단 또는 세포내 단백질을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 아르테민과 상호작용하는 단백질을 동정할 수 있다. 아르테민과 상호작용하는 단백질을 동정하기 위해 이용될 수 있는 전통적인 방법중에는 동시면역침전법, 가교결합법, 및 농도구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시정제법이 있다. 이러한 분석에 있어서, 아르테민 성분은 전장 단백질, 그의 가용성 유도체, 목적 도메인에 상응하는 펩티드, 또는 아르테민의 특정 영역을 포함하는 융합 단백질일 수 있다.

아르테민과 상호작용할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 동시에 동정하는 방법을 이용할 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어 표지된 아르테민 또는 그의 변이체를 사용하는, gt11 라이브러리의 항체 프로빙에 대해 잘 알려진 기술과 유사한 방식으로 발현 라이브러리를 프로빙하는 것을 포함한다.

생체내에서 단백질 상호작용을 검출하는 한가지 방법인 투 하이브리드 시스템 (two hybrid system)이 상세히 기재되어 있지만, 이는 단지 설명을 위한 것이지 한정하고자 하는 것은 아니다. 이러한 시스템의 한가지 형태는 문헌 [Chien et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578-9582]에 기재되어 있으며, 클론테크 (Palo Alto, CA)사에서 시판한다.

요컨대, 상기 시스템을 이용하여, 2가지 하이브리드 단백질을 코딩하는 플라스미드를 제조한다: 이중에서 한 플라스미드는 아르테민을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 융합된 전사 활성인자 단백질 또는 그로부터 유래하는 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질의 DNA-결합 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드로 구성되며, 다른 플라스미드는 이 플라스미드내에 cDNA 라이브러리 부분으로 재조합된, 알려지지 않은 단백질을 코딩하는 cDNA에 융합된 전사 활성인자 단백질의 활성화 도메인을 코딩하는 뉴클레오티드로 구성된다. DNA-결합 도메인 융합 플라스미드 및 cDNA 라이브러리를 이용하여 전사 활성인자의 결합 부위를 포함하는 조절 영역을 갖는 리포터 유전자 (예, HBS 또는lacZ)를 포함하는 효모 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주를 형질전환시킨다. 각각의 하이브리드 단백질 단독은 리포터 유전자의 전사를 활성화시킬 수 없는데, DNA-결합 도메인 하이브리드는 그가 활성화 기능을 제공하지 않기 때문에 활성화시킬 수 없으며, 활성화 도메인 하이브리드는 그가 활성인자의 결합 부위에 위치할 수 없기 때문에 그러하지 못하다. 상기 두 하이브리드 단백질의 상호작용은 기능성 활성인자 단백질을 재구성하고 리포터 유전자를 발현시키는데, 발현은 리포터 유전자 산물의 분석에 의해 검출한다.

투 하이브리드 시스템 또는 관련 방법을 이용하여 "베이트 (bait)" 유전자 산물과 상호작용하는 단백질에 대한 활성화 도메인 라이브러리를 스크리닝할 수 있다. 예를 들어, 한정하려는 것은 아니지만, 아르테민을 베이트 유전자 산물로 사용할 수 있다. 전체 게놈 또는 cDNA 서열을 활성화 도메인을 코딩하는 DNA에 융합시킨다. 상기 라이브러리, 및 DNA-결합 도메인에 융합된 베이트 아르테민 유전자 산물의 하이브리드를 코딩하는 플라스미드를 사용하여 효모 리포터 균주를 동시형질전환시키고, 생성된 형질전환체를 리포터 유전자를 발현시키는 것들에 대하여 스크리닝한다. 예를 들어, 한정하고자 하는 것은 아니지만, 베이트 아르테민 유전자 서열, 예를 들어 유전자의 오픈 리딩 프레임을 그가 GAL4 단백질의 DNA-결합 도메인을 코딩하는 DNA에 전사가능하게 융합되도록 벡터내에 클로닝할 수 있다. 이러한 콜로니를 정제하고, 리포터 유전자를 발현시키는 라이브러리 플라스미드를 단리한다. 이후, DNA 서열분석을 이용하여 라이브러리 플라스미드에 의해 코딩되는 단백질을 동정한다.

당업계에서 통상적으로 실시되는 방법을 이용하여, 베이트 아르테민 유전자 산물과 상호작용하는 단백질이 결실된 세포주의 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 본원에 기재된 특정 시스템에 따라, 예를 들어 cDNA 단편들을 이들이 GAL4의 전사 활성화 도메인에 전사가능하게 융합되도록 벡터내에 삽입할 수 있다. 이 라이브러리를 베이트 아르테민 유전자-GAL4 융합 플라스미드와 함께 사용하여 GAL4 활성화 서열을 포함하는 프로모터에 의해 유도되는lacZ유전자를 포함하는 효모 균주를 동시형질전환시킬 수 있다. 베이트 아르테민 유전자 산물과 상호작용하는, GAL4 전사 활성화 도메인에 융합된 cDNA 코딩 단백질은 활성 GAL4 단백질을 재구성하며, 그에 따라 발현을 유도할 것이다. 발현을 유도하는 콜로니는 당업계에서 통상적인 방법에 의해 검출할 수 있다. 이후, cDNA를 그러한 균주로부터 정제할 수 있으며, 이를 사용하여 당업계에서 통상적으로 실시되는 기술에 의해 베이트 아르테민 유전자-상호작용 단백질을 생산 및 단리할 수 있다.

a. 아르테민의 발현 또는 활성을 조절하는 화합물에 대한 분석

하기 분석을 설계하여 아르테민과 상호작용 (예, 결합)하는 화합물, 아르테민과 그의 결합 파트너, 동족체 (cognate) 또는 기질과의 상호작용을 방해하는 화합물, 및 아르테민 유전자의 발현 활성을 조절 (즉, 아르테민 유전자의 발현 수준을 조절)하거나 체내 아르테민의 수준을 조절하는 화합물 동정한다. 아르테민 유전자 조절 서열 (예, 프로모터 서열)과 결합함으로써 아르테민 유전자의 발현을 조절할 수 있는 화합물을 동정하는 분석을 추가로 이용할 수 있다 (예를 들어, 전체 개시내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Platt, K. A., 1994, J. Biol. Chem. 269:28558-28562] 참조).

본 발명에 따라 스크리닝될 수 있는 화합물로는 아르테민 또는 아르테민 수용체에 결합하여 천연 리간드에 의해 유발되는 활성을 모방하거나 (즉, 작용제) 천연 리간드에 의해 유발되는 활성을 억제하는 (즉, 길항제) 펩티드, 항체 및 그의 단편, 및 다른 유기 화합물 (예, 펩티드모방체)가 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

이러한 화합물로는, 예를 들어 랜덤 펩티드 라이브러리 (예를 들어, 문헌 [Lam, K. S. et al., 1991, Nature 354:82-84; Houghten, R. et al., 1991, Nature 354:84-86] 참조), 및 D 및(또는) L-형태의 아미노산으로 구성된 복합화학-유도된 분자 라이브러리, 포스포펩티드 (랜덤 또는 부분적으로 축퇴성인 지시된 포스포펩티드 라이브러리의 구성원을 포함하지만 이에 한정되지 않음. 예를 들어, 문헌 [Songyang, Z. et al., 1993, Cell 72:767-778] 참조), 항체 (폴리클로날, 모노클로날, 인간화, 항-유전자형, 키메라 또는 단일쇄 항체, 및 FAb, F(ab)₂및 FAb 발현 라이브러리 단편, 및 그의 에피토프-결합 단편), 및 유기 또는 무기 소분자의 구성원들을 포함하지만 이에 한정되지 않는 가용성 펩티드와 같은 펩티드가 포함되지만이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따라 스크리닝될 수 있는 다른 화합물로는 혈-뇌 장벽을 통과하고, 적절한 세포 (예, 맥락막총, 뇌하수체, 시상하부 등의 세포)에 진입하고, 아르테민 유전자 또는 (예를 들어, 유전자 발현에 관여하는 조절 영역 또는 전사 인자와 상호작용함으로써) 아르테민 매개된 경로에 관여하는 어떤 다른 유전자의 발현에 영향을 줄 수 있는 유기 소분자; 또는 아르테민의 활성 또는 아르테민의 신호 전달, 이화 또는 대사 경로에 관여하는 어떤 다른 세포내 인자의 활성에 영향을 주거나 이를 대체하는 화합물들이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

컴퓨터 모델링 및 조사 기술에 의해 아르테민의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 화합물을 동정하거나 이미 동정된 화합물을 개선시킬 수 있다. 이러한 화합물 또는 조성물을 동정하여 활성 부위 또는 영역을 확인한다. 상기 활성 부위는 전형적으로 리간드 결합 부위일 수 있다. 예를 들어, 펩티드의 아미노산 서열로부터의 방법, 핵산의 뉴클레오티드 서열로부터의 방법, 또는 적절한 화합물 또는 조성물과 그의 천연 리간드와의 복합체 연구로부터의 방법을 비롯한, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 활성 부위를 확인할 수 있다. 후자의 경우, 화학적 방법 또는 X-선 결정학 방법에 의해 인자상에서 결합된 리간드가 존재하는 부위를 알아냄으로써 활성 부위를 찾을 수 있다.

이어서, 활성 부위의 3차원 기하 구조를 결정한다. 이는 완전한 분자 구조를 결정할 수 있는, X-선 결정학을 비롯한 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 한편, 고상 또는 액상 NMR을 이용하여 일정한 분자내 거리를 결정할 수 있다. 구조 결정에 대한 임의의 다른 실험 방법을 이용하여 부분적인 또는 완전한 기하 구조를 얻을 수 있다. 결정되는 활성 부위 구조의 정확성을 증가시킬 수 있는 천연 또는 인공의 결합 리간드를 사용하여 기하 구조를 결정할 수 있다.

구조가 불완전하거나 불충분한 정확도로 결정된다면, 컴퓨터에 기초한 수치상 모델링 방법을 이용하여 구조를 완전하게 결정하거나 그의 정확성을 향상시킬 수 있다. 단백질 또는 핵산과 같은 특정 생중합체에 특이적인 파라미터화된 모델, 분자의 운동에 대한 컴퓨터 계산에 기초한 분자의 동적 모델, 열 앙상블에 기초한 통계학적 메카닉스 모델 또는 조합 모델을 비롯한 임의의 공지 모델링 방법을 이용할 수 있다. 모델 유형의 대부분의 경우, 구성 원자와 기들 사이의 힘을 나타내는 표준적인 분자상 힘의 범위가 필요하며, 물리화학에서 공지된 힘의 범위로부터 선택할 수 있다. 불완전하거나 정확도가 적은 실험적 구조는 상기 모델링 방법에 의해 컴퓨터 계산된, 완전하고 보다 정확한 구조를 제약하는 역할을 할 수 있다.

마지막으로, 실험적으로 모델링하거나 조합하여 활성 부위 (또는 결합 부위)의 구조를 결정한다면, 화합물들을 이들의 분자 구조에 대한 정보와 함께 포함하는 데이타베이스를 검색하여 후보 조절 화합물을 동정할 수 있다. 이러한 검색에 의해 결정된 활성 부위 구조와 매칭되고 활성 부위를 형성하는 기들과 상호작용하는 구조를 갖는 화합물을 찾는다. 이러한 검색은 수동적인 방법일 수 있지만, 바람직하게는 검퓨터로 이를 보조한다. 이 검색으로부터 찾아낸 화합물들은 아르테민 활성에 대한 가능한 조절인자이다.

또는, 이러한 방법을 이용하여 이미 공지된 조절 화합물 또는 리간드로부터향상된 조절 화합물을 동정할 수 있다. 공지된 화합물의 조성을 변화시킬 수 있으며, 이러한 변화의 구조적 효과는 새로운 조성에 대하여 적용되는 상기 설명된 실험 및 컴퓨터 모델링 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 이후, 변형된 구조를 화합물의 활성 부위의 구조와 비교하여 향상된 적응 또는 상호작용이 일어나는지를 결정한다. 이러한 방식에서, 예를 들어 측기를 변화시킴으로써 조성의 전체적인 변화를 빠르게 평가하여 향상된 특이성 또는 활성의 변형된 조절 화합물 또는 리간드를 얻을 수 있다.

아르테민 활성 부위 (또는 결합 부위)의 확인에 기초한 조절 화합물, 및 관련된 트랜스덕션 및 전사 인자를 동정하는데 유용한 추가의 실험 및 컴퓨터 모델링 방법은 당업자에게 자명할 것이다.

분자 모델링 시스템의 예로는 CHARMm 및 QUANTA 프로그램 (Polygen Corporation Waltham, MA)이 있다. CHARMm은 에너지 최소화 및 분자 역학 기능을 수행한다. QUANTA는 분자 구조의 구성, 그래픽 모델링 및 분석을 수행한다. QUANTA는 상호작용성 구성 변형, 시각화, 및 분자들 서로의 거동 분석을 가능케 한다.

다수의 문헌들이 특정 단백질과 상호작용성인 약물의 컴퓨터 모델링을 다루고 있고, 그러한 문헌의 예로는 문헌 [Rotivinen, et al., 1988, Acta Pharmaceutical Fennica 97:159-166], [Ripka, New Scientist 54-57 (June 16, 1988) McKinaly and Rossmann, 1989, Annu. Rev. Pharmacol. Toxiciol. 29:111-122], [Perry and Davies, OSAR: Quantitative Structure-Activity Relationshipsin Drug Design pp. 189-193 (Alan R. Liss, Inc. 1989)], [Lewis and Dean, 1989 Proc. R Soc. Lond. 236:125-140 and 141-162]이 있으며, 핵산 성분에 대한 모델 수용체에 대하여는 문헌 [Askew, et al., 1989, J. Am. Chem. Soc. 111:1082-1090]에서 다루고 있다. 화합물을 스크리닝하고 이를 도식적으로 나타내는 다른 컴퓨터 프로그램은 바이오디자인, 인크. (BioDesign, Inc.)(Pasadena, CA.), 알렐릭스, 인크. (Allelix, Inc.)(Mississauga, Ontario, Canada), 및 하이퍼큐브, 인크. (Hypercube, Inc.)(Cambridge, Ontario)와 같은 회사들로부터 입수할 수 있다. 이들은 특정 단백질에 대해 특이적인 약물에 적용하기 위해 주로 설계되지만, 영역이 확인된 경우 DNA 또는 RNA 영역에 특이적인 약물의 설계에 맞도록 변형시킬 수 있다.

상기에서는 결합을 변형시킬 수 있는 화합물의 설계 및 생성에 대하여 기술하였지만, 당업자라면 천연 생성물 또는 합성 화합물을 포함하는 공지된 화합물 및 단백질을 비롯한 생물학적으로 활성인 물질의 라이브러리를, 억제제 또는 활성제인 화합물에 대하여 스크리닝할 수 있을 것이다.

본원에 기재된 것들과 같은 분석을 통해 확인된 화합물은, 예를 들어 아르테민 유전자 산물의 생물학적 기능을 설명하는데 있어서 유용할 수 있다. 이러한 화합물을 대상체에게 치료 유효량으로 투여하여 임의의 다양한 생리학적 질환 또는 정신 질환을 치료할 수 있다. 치료 유효량이란 임의의 생물학적 증상을 어느 정도로 개선, 방해, 예방 또는 변화시키는데 충분한 화합물의 양을 의미한다.

b. 아르테민에 결합하는 화합물에 대한 분석

시스템을 설계하여 아르테민과 상호작용 (예, 결합)하거나 그를 모방하거나 아르테민과 동족체 수용체, 결합 파트너 또는 기질의 결합을 방해할 수 있는 화합물을 동정할 수 있다. 동정된 화합물은, 예를 들어 야생형 및(또는) 돌연변이 아르테민 유전자 산물의 활성을 조절하는데 유용하거나; 아르테민의 생물학적 기능을 정교화하는데 유용하거나; 정상적인 아르테민 상호작용을 파괴하는 화합물을 동정하는 스크리닝에 이용하거나; 또는 자체적으로 상기 상호작용들을 파괴하거나 활성화할 수 있다.

아르테민, 또는 아르테민 동족체 수용체 또는 기질과 결합하는 화합물을 동정하는데 이용되는 분석 원리는 아르테민과 시험 화합물의 반응 혼합물을 이들 두 성분들이 상호작용하고 결합하여 반응 혼합물 중에서 제거되고(되거나) 검출될 수 있는 복합체를 형성하기에 충분한 조건 및 시간하에 제조하는 것을 포함한다. 사용된 아르테민 종은 스크리닝 분석의 목적에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 천연 수용체의 작용제가 바람직한 경우, 전장 아르테민, 또는 가용성 말단절단된 아르테민, 펩티드, 또는 분석 시스템 (예, 생성된 복합체의 표지화, 단리 등)에서 이점을 제공하는 단백질 또는 폴리펩티드에 융합된 하나 이상의 아르테민 도메인을 포함하는 융합 단백질을 이용할 수 있다. 아르테민과 직접 상호작용하는 화합물을 찾는 경우, 아르테민에 상응하는 펩티드 및 아르테민을 포함하는 융합 단백질을 사용할 수 있다.

스크리닝 분석은 다양한 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 그러한 분석을 수행하는 한가지 방법은 아르테민, 폴리펩티드, 펩티드, 또는 그로부터의 융합단백질, 또는 시험 물질을 고상에 앵커링시키는 단계 및 반응의 종결시에 고상에 앵커링된 아르테민 시험 화합물 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 방법의 한 실시양태에서, 아르테민 반응물을 고상 표면에 앵커링시킬 수 있으며, 앵커링되지 않은 시험 화합물을 직접 또는 간접적으로 표지할 수 있다.

실제로, 마이크로타이터 플레이트를 고상으로 편리하게 이용할 수 있다. 앵커링된 성분은 비-공유 또는 공유 부착에 의해 고정시킬 수 있다. 비-공유 부착은 고상 표면을 단백질 용액으로 코팅하고 건조시켜 간단히 달성할 수 있다. 별법으로, 고정된 항체, 바람직하게는 고정될 단백질에 대해 특이적인 모노클로날 항체를 사용하여 단백질을 고상 표면에 앵커링시킬 수 있다. 표면은 미리 제조하여 보관할 수 있다.

분석을 수행하기 위해, 비-고정된 성분을 앵커링된 성분을 포함하는 코팅된 표면에 가하였다. 반응이 종결된 후, 비만응 성분을 형성된 임의의 복합체가 고상 표면에 고정되어 있도록 하는 조건하에 (예를 들어, 세척에 의해) 제거한다. 고상 표면에 앵커링된 복합체의 검출은 많은 방식으로 달성할 수 있다. 앞서 비-고정된 성분을 예비-표지한 경우, 표면상에 고정된 표지의 검출은 복합체가 형성되었음을 나타낸다. 앞서 비-고정된 성분을 예비-표지하지 않은 경우, 간접적인 표지를 사용하여, 예를 들어 앞서 비-고정된 성분에 대해 특이적인 표지된 항체를 사용하여 표면에 앵커링된 복합체를 검출할 수 있다 (즉, 항체는 표지된 항-Ig 항체를 사용하여 직접 또는 간접적으로 표지할 수 있다).

별법으로, 반응은 액상에서 수행할 수 있으며, 반응 생성물을 비만응 성분들로부터 분리하고, 예를 들어 용액 중 형성된 임의의 복합체를 앵커링시키는 아르테민 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 융합 단백질 또는 시험 화합물에 대해 특이적인 고정된 항체 및 앵커링된 복합체를 검출하는, 가능한 복합체의 다른 성분에 대해 특이적인 표지된 항체를 사용하여 복합체를 검출한다.

c. 아르테민 상호작용을 방해하는 화합물에 대한 분석

아르테민과 상호작용하는 거대분자를 논의의 목적상 "결합 파트너"라고 부른다. 이 결합 파트너는 아르테민 매개된 생물학적 경로에 관여할 수 있다. 따라서, 체내에서 아르테민 활성을 조절하거나 증가시키고(시키거나) 이 활성 (또는 그의 결핍)과 관련된 질환을 억제하는데 유용할 수 있는 상기 결합 파트너의 상호작용을 방해하거나 파괴하는 화합물을 동정하는 것이 바람직하다.

아르테민과 그의 결합 파트너 또는 파트너들 사이의 상호작용을 방해하는 화합물을 동정하는데 이용되는 분석 시스템의 기본적인 원리는 아르테민 또는 그의 어떤 변이체 및 결합 파트너를 포함하는 반응 혼합물을, 이들 두 성분이 상호작용하여 결합함으로써 복합체를 형성하기에 충분한 조건 및 시간하에 제조하는 것을 포함한다. 화합물을 억제 활성에 대하여 시험하기 위해, 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 반응 혼합물을 제조한다. 시험 화합물은 먼저 반응 혼합물에 포함시키거나, 아르테민과 그의 결합 파트너를 첨가한 이후의 시점에서 첨가할 수 있다. 조절 반응 혼합물을 시험 화합물 없이 인큐베이션하거나 위약 (placebo)과 함께 인큐베이션한다. 이후, 아르테민과 결합 파트너 사이의 임의의 복합체 형성을 검출한다. 대조 반응에서는 복합체가 형성되지만 시험 화합물을 포함하는 반응 혼합물에서는 복합체가 형성되지 않는 것에 의해 상기 화합물이 아르테민과 상호작용성 결합 파트너의 상호작용을 방해한다는 것을 알 수 있다. 또한, 시험 화합물 및 정상의 아르테민 단백질을 포함하는 반응 혼합물 내의 복합체 형성을, 시험 화합물 및 돌연변이 아르테민을 포함하는 반응 혼합물 내의 복합체 형성과 비교할 수도 있다. 이러한 비교는 돌연변이 또는 돌연변이된 아르테민의 상호작용을 특이적으로 파괴하지만 정상 단백질은 파괴하지 않는 화합물을 동정하는 것이 바람직한 경우에 있어서 중요할 수 있다.

아르테민과 결합 파트너 사이의 상호작용을 방해하는 화합물의 분석은 이종 또는 동종 포맷으로 수행할 수 있다. 이종 분석은 아르테민 또는 결합 파트너를 고상에 앵커링시키는 단계 및 반응의 종결시에 고상에 앵커링된 복합체를 검출하는 단계를 포함한다. 동종 분석에서, 전체 반응은 액상에서 수행한다. 각 방법에서, 반응물 첨가 순서를 달리하여 시험된 화합물에 대하여 다른 정보를 얻을 수 있다. 예를 들어, 경쟁에 의한 상호작용을 방해하는 시험 화합물은 반응을 시험 물질의 존재하에 수행하여, 즉 시험 물질을 아르테민 및 상호작용성 결합 파트너의 첨가에 앞서 또는 그의 첨가와 동시에 반응 혼합물에 가하여 동정할 수 있다. 별법으로, 예비-형성된 복합체를 파괴하는 시험 화합물, 예를 들어 복합체로부터의 성분들 중 하나를 대체하는 높은 결합 상수를 갖는 화합물은 복합체가 형성된 다음 시험 화합물을 반응 혼합물에 첨가하여 시험할 수 있다. 하기에서는 그러한 다양한 포맷을 간략하게 설명하고 있다.

이종 분석 시스템에서, 아르테민 또는 상호작용성 결합 파트너를 고상 표면에 앵커링시키며, 비-앵커링된 종은 직접 또는 간접적으로 표지한다. 실제로, 마이크로타이터 플레이트가 편리하게 이용된다. 앵커링된 종은 비-공유 또는 공유 부착에 의해 고정시킬 수 있다. 비공유 부착은 고상 표면을 아르테민 또는 결합 파트너의 용액으로 코팅시키고 건조하여 간단하게 달성할 수 있다. 별법으로, 앵커링될 종에 대해 특이적인 고정된 항체를 사용하여 종을 고상 표면에 앵커링시킬 수 있다. 표면은 미리 제조하여 보관할 수 있다.

분석을 수행하기 위해, 고정된 종의 파트너를 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 코팅된 표면에 노출시킨다. 반응이 종결된 후, 비만응 성분들을 (예를 들어, 세척에 의해) 제거하는데, 형성된 임의의 복합체는 고상 표면에 고정된 채로 있을 것이다. 고상 표면에 앵커링된 복합체의 검출은 많은 방식으로 달성할 수 있다. 비-고정된 종을 예비-표지하는 경우, 표면상에 고정된 표지의 검출에 의해 복합체가 형성되었음을 알 수 있다. 비-고정된 종을 예비-표지하지 않은 경우, 간접적인 표지를 사용하여, 예를 들어 초기 비-고정된 종에 대해 특이적인 표지된 항체를 사용하여 표면상에 앵커링된 복합체를 검출할 수 있다 (즉, 항체를 직접 표지하거나 표지된 항-Ig 항체를 사용하여 간접적으로 표지할 수 있음). 반응 성분의 첨가 순서에 따라, 복합체 형성을 억제하거나 예비형성된 복합체를 파괴하는 시험 화합물을 검출할 수 있다.

별법으로, 반응은 시험 화합물, 비만응 성분으로부터 분리된 반응 생성물 및 검출된 복합체의 존재 또는 부재하에 액상에서, 예를 들어 용액 중에서 형성된 임의의 복합체를 고정시키는 결합 성분 중 1종에 특이적인 고정화 항체 및 고정된 복합체를 검출하기 위한 또 다른 파트너에 특이적인 표지화된 항체를 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 반응물의 액상에의 첨가 순서에 따라, 복합체를 억제하거나 미리 형성된 복합체를 분리하는 시험 화합물을 동정할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태에 있어서, 균질 분석법을 이용할 수 있다. 이러한 접근법에 있어서는, 아르테민과 상호작용성 결합 파트너와의 미리 형성된 복합체를 제조하는데, 여기서 아르테민 또는 이의 결합 파트너 중 하나는 표지화되지만, 표지에 의해 발생된 시그널은 복합체의 형성으로 인해 켄칭된다 (면역 분석법에 대해 상기한 접근법을 이용하는 미국 특허 제4,109,496호(Rubenstein) 참조). 미리 형성된 복합체로부터의 종들 중 하나와 경쟁하여 이를 대체하는 시험 물질의 첨가는 배경값보다 높은 시그널의 발생을 초래할 것이다. 이러한 방식으로, 반응을 중단시키는 물질을 동정할 수 있다.

특정 실시양태에 있어서, 아르테민 융합체를 고정화용으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 아르테민 또는 이의 펩티드 단편을 이의 결합 활성이 생성된 융합 단백질에서 유지되는 방식으로 융합 벡터, 예를 들어 pGEX-5X-1을 사용하여 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 유전자에 융합시킬 수 있다. 상호작용성 결합 파트너를 당해 분야에서 통상적으로 시행되고 위에서 기술된 방법을 이용하여 모노클로날 항체를 발생시키기 위해 정제하여 사용할 수 있다. 당해 항체를 당해 분야에서 통상적으로 시행되는 방법에 의해 방사성 동위원소¹²⁵I로 표지화시킬 수 있다. 이질 분석법에 있어서, 융합 단백질을 글루타티온-아가로스 비드에 고정시킬수 있다. 이어서, 상호작용성 결합 파트너를 상호작용 및 결합이 발생하도록 하는 방식으로 시험 화합물의 존재 또는 부재하에 첨가할 수 있다. 반응 기간의 말기에, 비결합 재료를 세척 제거할 수 있고, 표지화된 모노클로날 항체를 시스템에 첨가하여, 복합체화된 성분에 결합시킬 수 있다. 아르테민 및 상호작용성 결합 파트너 사이의 상호작용은 글루타티온-아가로스 비드와 결합되어 잔류하는 방사능의 양을 측정함으로써 검출할 수 있다. 시험 화합물에 의한 상호작용의 성공적인 억제는 측정된 방사능의 감소를 초래할 것이다.

별법으로, GST 융합 단백질 및 상호작용성 결합 파트너를 고체 글루타티온-아가로스 비드의 부재하에 액체 중에서 함께 혼합할 수 있다. 시험 화합물을 상기 종들이 상호작용하는 동안 또는 이후에 첨가할 수 있다. 이어서, 당해 혼합물을 글루타티온-아가로스 비드에 첨가할 수 있고, 비결합 재료를 세척 제거한다. 또한, 아르테민 및 결합 파트너 사이의 상호작용의 억제도는 표지화된 항체를 첨가하고 비드와 결합된 방사능을 측정함으로써 검출할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에 있어서, 전장 단백질 중 하나 또는 둘 다 대신에 아르테민 및(또는) 상호작용성 또는 결합 파트너 (결합 파트너가 단백질인 경우에)의 결합 영역에 상응하는 펩티드 단편을 사용하는 상기한 동일 기법을 이용할 수 있다. 당해 분야에서 통상적으로 시행되는 다수의 방법을 이용하여, 결합 부위를 동정하고 단리할 수 있다. 이들 방법은 단백질 중 하나를 코딩하는 유전자의 돌연변이 유발법 및 동시-면역침전 분석법에서의 결합 중단에 대한 스크리닝을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 이어서, 복합체 중의 제2 종을 코딩하는 유전자에서의 보상 돌연변이를 선택할 수 있다. 각각의 단백질을 코딩하는 유전자의 서열 분석에 의해 상호작용성 결합에 관련된 단백질 부위에 상응하는 돌연변이를 밝힐 것이다. 별법으로, 하나의 단백질을 상기한 방법을 이용하여 고체 표면에 고정시키고, 트립신과 같은 단백질분해 효소로 처리한 이의 표지화된 결합 파트너와 상호작용시켜 이에 결합시킬 수 있다. 세척 후에, 결합 영역을 포함하는 상대적으로 짧은 표지화된 펩티드는 고체 재료와 결합되어 잔류할 수 있으며, 이는 아미노산 서열분석에 의해 단리하여 동정할 수 있는 할 수 있다. 또한, 세포내 결합 파트너를 코딩하는 유전자가 수득되면, 짧은 유전자 세그먼트를 단백질의 펩티드 단편을 발현시키도록 조작할 수 있으며, 이후 이를 결합 활성에 대해 시험하고 정제하거나 합성할 수 있다.

예를 들어, 비한정적으로 GST 융합 단백질을 제조하여, 이를 글루타티온 아가로스 비드에 결합시킴으로써, 아르테민을 상기한 바와 같은 고체 재료에 고정시킬 수 있다. 상호작용성 결합 파트너를³⁵S와 같은 방사성 동위원소로 표지화시키고, 트립신과 같은 단백질분해 효소로 분해할 수 있다. 이어서, 분해 생성물을 고정된 융합 단백질에 첨가하여, 결합시킬 수 있다. 비결합된 펩티드를 세척 제거한 후, 세포내 결합 파트너 결합 영역을 나타내는 표지화된 결합 재료를 용출시키고, 정제하고, 익히 공지된 방법에 의해 아미노산 서열에 대해 분석할 수 있다. 이와 같이 동정된 펩티드를 합성적으로 제조하거나 재조합 DNA 기법을 이용하여 적합한 촉진적 단백질에 융합시킬 수 있다.

6.제약 조성물

정제된 형태의 아르테민을, 예를 들어 코아세르베이션 기법에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐 (예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐)내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)내에 또는 마크로에멀젼내에 포획시킬 수 있다. 상기한 기법은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, 1980, (A. Osol, Ed)]에 개시되어 있다.

아르테민의 치료적 제형을 바람직한 순도를 갖는, 바람직하게는 본질적으로 순수한 아르테민을 임의의 생리적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌)와 혼합함으로써 동결건조된 케이크 또는 수성 액제 형태로 제조한다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에 대해 무독성이다. 이의 예는 완충액, 예를 들어 인산염, 시트르산염 및 또 다른 유기산; 아스코르브산을 포함한 산화제; 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리딘, 아미노산, 예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 단당류, 이당류 및 또 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 당 알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨; 염-형성 카운터이온, 예를 들어 나트륨; 및(또는) 비이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈 (Tween), 플루로닉스 (Pluronics) 또는 PEG를 포함한다.

생체내 투여에 사용할 아르테민은 무균이어야 한다. 이는 당해 분야에 공지된 방법, 예를 들어 동결건조 및 재구성 이전 또는 이후에 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 아르테민은 동결건조된 형태로 저장할 수 있다. 치료적 아르테민 조성물은 일반적으로는 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어 피하 주사침에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥내 액제 백 또는 바이알에 넣는다.

아르테민은 임의로 NGF, NT-3 및(또는) BDNF를 포함하나 이에 한정되지는 않는 또 다른 향정신성 인자와 배합하거나 이와 함께 투여하고, 퇴행성 신경 장애에 대한 또 다른 통상적인 치료제와 병용한다.

아르테민은 CNS의 수액 저장소내로의 주입에 의해 연속적으로 투여할 수 있지만, 볼루스 주사도 허용된다. 한 실시양태에 있어서, 아르테민은 바람직하게는 뇌실로 투여하거나, 달리 CNS 수액 또는 척수액내로 유입할 수 있다. 이는 펌프와 같은 연속 투여 수단을 이용하는 내재 카테터에 의해 투여할 수 있거나, 이는 서방성 비히클의 이식, 예를 들어 뇌내 이식에 의해 투여할 수 있다. 보다 구체적으로는, 아르테민을 장기적으로 이식된 캐뉼라를 통해 주사하거나 삼투 펌프의 원조로 장기적으로 주입할 수 있다. 소형 배관에 의해 단백질을 뇌실에 전달하는 피하 펌프가 이용가능하다. 고도로 정교한 펌프를 피부를 통해 재충전시킬 수 있으며, 이들의 전달 속도는 외과적 수술없이 설정할 수 있다.

적합한 투여 프로토콜 및 전체적으로 이식된 약물 전달 시스템을 통한 연속적 뇌실내 주입의 피하 펌프 장치를 포함한 전달 시스템의 예는 문헌 [Harbaugh, J. Neural Transm. Suppl., 24:271 (1987)] 및 [DeYebenes, et al., Mov. Disord, 2:143 (1987)]에 기술된 알츠하이머 환자 및 파킨스병의 모델에 대한 도파민, 도파민 작용제 및 콜린성 작용제의 투여에 사용되는 것들이다. 아르테민 작용제 항체는 동일한 방식으로 또는 혈류 또는 림프로의 투여에 의해 투여한다.

서방성 제제의 적합한 예는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스를 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 문헌 [Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) 및 Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)]에 기술된 바와 같은 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호, 유럽 특허 제58,481호), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트와의 공중합체 (문헌 [Sidman, et al., Biopolymers 22:547 (1983)]), 비분해성 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer, et al., 상기 문헌) 또는 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어 Lupron Depot™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로스피어) 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산 (유럽 특허 제133,988호)을 포함한다.

에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일을 초과하는 동안 분자의 방출을 가능하게 하지만, 특정의 히드로겔은 보다 짧은 시간 동안 단백질을 방출한다. 캡슐화된 단백질이 장기간 동안 체내에 잔류하는 경우에, 이들은 37℃에서 수분에의 노출의 결과로서 변성되거나 응집될 수 있으며, 이는 생물적 활성의 상실 및 면역원성에서의 가능한 변화를 초래한다. 합리적인 전략을 관련된 메카니즘에 따라 단백질 안정화를 위해 고안할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 발견되는 경우에, 안정화는 술프히드릴 잔기를 변화시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적합한 첨가제를 사용하고, 특정한 중합체 매트릭스 조성물을 개발함으로써 달성할 수 있다.

서방성 아르테민 조성물은 또한 리포좀에 의해 포획된 아르테민을 포함한다. 아르테민을 함유하는 리포좀은 당해 분야에 공지된 방법 (문헌 [Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acid. Sci. 82:3688]; [Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030]; DE 3,218,121A호; EP 52322A호; EP 36676A호; EP 88046A호; EP 143949A호; EP 142641A호; 일본 특허원 제83-118008호; 미국 특허 제4, 485,045호 및 제4,544,545호; 및 EP 제102,324A호)에 의해 제조한다. 통상적으로, 리포좀은 지질 함량이 약 30 몰％ 이상의 콜레스테롤인 소형 (약 200-800Å) 단일층판 유형의 것이고, 여기서 선택된 비율은 최적의 아르테민 치료법에 대해 조정한다.

국소 도포하는 경우에, 아르테민을 담체 및(또는) 보조제와 같은 기타 성분과 적합하게 배합한다. 상기한 기타 성분이 이들의 목적하는 투여에 대해 생리적으로 허용되고 유효하여야 하며, 조성물의 활성 성분의 활성을 손상시킬 수 없는 경우를 제외하고는, 이들의 특성에 제한은 없다. 적합한 비히클의 예는 정제된 콜라겐을 함유하거나 함유하지 않는 연고, 크림, 겔 또는 현탁제를 포함한다. 또한,조성물을 바람직하게는 액체 또는 반액체 형태로 경피 패치, 석고 및 붕대에 주입할 수 있다.

겔 제형을 수득하기 위해, 액체 조성물로 제형화된 아르테민을 유효량의 수용성 다당류 또는 합성 중합체, 예를 들어 PEG와 혼합하여, 국소 도포할 적합한 점도의 겔을 형성시킬 수 있다. 사용할 수 있는 다당류는, 예를 들어 알킬 셀룰로스, 히드록시알킬 셀룰로스 및 알킬히드록시알킬 셀룰로스, 예를 들어 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 카복시메틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 및 히드록시프로필 셀룰로스를 포함한 에테르화 셀룰로스 유도체와 같은 셀룰로스 유도체; 전분 및 분획화 전분; 한천; 알긴산 및 알긴산염; 아라비아 검; 풀루란; 아가로스; 카라기난; 덱스트란; 덱스트린; 프럭탄; 이눌린; 만난; 크실란; 아라비난; 키토산; 글리코겐; 글루칸; 및 합성 생중합체; 및 크산탄 검, 구아 검, 로커스트 빈 검, 아라비아 검, 트라가칸트 검 및 카라야 검과 같은 검; 및 이들의 유도체 및 혼합물을 포함한다. 본원에서 바람직한 겔화제는 생물적 시스템에 불활성이고, 무독성이고, 제조하기에 간단하고, 과도하게 유출성이거나 점성이지 않은 것이며, 겔화제내에 확보된 아르테민을 탈안정화시키지 않을 것이다.

바람직하게는, 다당류는 에테르화 셀룰로스 유도체, 보다 바람직하게는 USP에서 충분히 정의되고, 정제되고, 기재된 것, 예를 들어 메틸셀룰로스 및 히드록시알킬 셀룰로스 유도체, 예를 들어 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스이다. 메틸셀룰로스가 본원에서 가장 바람직하다.

겔화에 유용한 폴리에틸렌 글리콜은 전형적으로는 적합한 점도를 수득하기 위한 저분자량 PEG와 고분자량 PEG의 혼합물이다. 예를 들어, 분자량 1500의 PEG와 분자량 400 내지 600의 PEG의 혼합물이 페이스트를 수득하기 위한 적합한 비로 혼합된 경우에 상기 목적에 효과적일 것이다.

다당류 및 PEG에 적용되는 경우에 용어 "수용성"은 콜로이드성 용액 및 분산액을 포함하고자 한다. 일반적으로는, 셀룰로스 유도체의 용해도는 에테르기의 치환도에 의해 측정하고, 본원에서 유용한 안정화 유도체는 셀룰로스 쇄내에 무수 글루코스 단위당 충분한 양의 상기 에테르기를 가져, 유도체가 수용성으로 되도록 해야 한다. 무수 글루코스 단위당 0.35개 이상의 에테르의 에테르 치환도가 일반적으로 충분하다. 또한, 셀룰로스 유도체는 알칼리 금속 염, 예를 들어 Li, K 또는 Cs 염 형태일 수 있다.

메틸셀룰로스를 겔로 사용하는 경우에, 바람직하게는 이는 겔의 약 2 내지 5％, 보다 바람직하게는 약 3％를 구성하고, 아르테민은 겔 ml당 약 300 내지 1000mg의 양으로 존재한다.

반투과성의 이식가능한 막 장치가 특정한 환경에서 약물을 전달하기 위한 수단으로서 유용하다. 예를 들어, 아르테민, 아르테민 변이체, 아르테민 키메라 또는 아르테민 작용제를 분비하는 세포를 캡슐화시킬 수 있고, 상기 장치를 환자에 이식시킬 수 있다. 예를 들어, 이들을 파킨슨병에 걸린 환자의 뇌에 이식시킬 수 있다 (미국 특허 제4,892,538호 (Aebischer et al); 미국 특허 제5,011,472호 (Aebischer et al.); 미국 특허 제5,106,627호 (Aebischer et al.); PCT 출원 WO91/10425호; PCT 출원 WO 91/10470호; 문헌 [Winn et al., Exper. Neurology, 113:322-329 (1991)], [Aebischer et al, Exper. Neurology, 111:269-275 (1991)] 및 [Tresco et al, ASAIO, 38:17-23 (1992)] 참조). 따라서, 특별한 조건에 필요로 할 수 있는 경우에 아르테민, 이의 작용제 또는 길항제를 분비하는 세포를 이를 필요로 하는 환자의 체내에 이식하는 것을 포함하는, 뉴런에 대한 손상을 예방하거나 치료하는 방법을 또한 포함한다. 최종적으로, 본 발명은 아르테민 (또는 이의 작용제 또는 길항제)에 대해 투과성이고, 세포에 유해한 환자로부터의 인자에 대해 불투과성인 반투과성 막, 및 상기 막내에 캡슐화된 아르테민 (또는 특별한 조건에 필요로 할 수 있는 경우에 이의 작용제 또는 작용제)을 분비하는 세포를 포함하는 이식물의 환자에의 이식에 의해 신경 손상을 예방하거나 치료하는 장치를 포함한다. 생체외에서 아르테민을 생성하도록 형질전환된 환자 자신의 세포를 임의로 상기한 캡슐화의 부재하에 환자에 직접적으로 이식할 수 있다. 생존 세포의 막 캡슐화에 대한 방법은 당업자에게 친숙하며, 캡슐화 세포의 제조 및 이의 환자에의 이식은 과도한 실험작업없이 수행할 수 있다.

아르테민 또는 아르테민 작용제를 포함하는 제약 조성물을 바람직하게는 적합한 용기내에 넣는다. 용기에는 바람직하게는 제약 조성물의 적합한 사용법 및 투여량을 상세하게 기술한 지침이 동봉되어 있다. 당업자는 상기한 지침이 치료 방법에 따라 달라질 수 있음을 알 것이다.

7.치료 방법

아르테민은 신경 세포의 생존율을 증진시키기 위한 제제로서 사용할 수 있는것으로 간주된다. 따라서, 이는 비제한적으로 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤 무도병, ALS, 말초 신경병증, 및 중추, 말초 또는 운동 뉴런이든지 뉴런의 괴사 또는 상실을 특징으로 하는 기타 상태를 포함한, 신경계의 퇴행성 장애 ("신경퇴행성 질환")의 예방, 완화 또는 치료에서 유용하다. 또한, 이는 손상된 신경 세포, 예를 들어 외상성 상태, 예를 들어 화상 및 창상, 당뇨병, 신부전증, 및 암 및 AIDS를 치료하는데 사용되는 화학요법제의 독성 효과에 의해 손상된 세포를 치료하는데 유용할 수 있다. 적합한 경우에, 이는 신경 손상 또는 비손상된 세포에서의 신경 손상에 대한 유해한 반응을 예방하거나 완화시키는데 유용할 수 있다.

본 발명은 포유동물에서의 아르테민 치료의 이점이 NGF 치료를 이용하는 경우에 나타나는 문제의 부작용을 수반하지 않는다는 발견을 기초로 한 것이다. 본원에 기술된 실험은 아르테민이 뉴런을 손상과 관련된 병리적 변화로부터 보호하는 능력 및 뉴런을 바이러스-유발된 사멸로부터 보호하는 능력을 갖는 것을 입증한다. 그러나, 아르테민의 보호 효과는 통증 또는 통각과민을 수반하지 않는다.

본 발명의 한 실시양태에 있어서, 신경 손상을 앓는 환자에게 치료적 유효량의 아르테민을 투여한다. 질환 또는 의학적 장애는 신경 세포 및(또는) 이의 축색 돌기의 생존율 또는 기능이 손상되는 경우에 신경 손상인 것으로 고려된다. 이러한 신경 손상은 (a) 손상 부위 근처의 축색 돌기 및(또는) 신경 세포체의 퇴행을 유발하는 물리적 손상; (b) 발작으로서의 허혈; (c) 암 및 AIDS 화학요법제, 예를 들어 각각 시스플라틴 및 디데옥시시티딘 (ddC)과 같은 신경독소에의 노출; (d) 당뇨병 또는 신부전증과 같은 만성 대사 질환; 및 (e) 특정한 뉴런 집단의 퇴행을 유발하는, 파킨슨병, 알츠하이머병 및 근위축성 측삭 경화증 (ALS)과 같은 신경퇴행성 질환을 포함한 장애의 결과로서 발생한다. 신경 손상을 포함한 상태는 파킨슨병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증, 발작, 당뇨성 다발신경병증, 독성 신경병증, 및 발작에서와 같이 신경계 부분에의 혈류의 일시적 및 영구적 중단을 포함한, 뇌 및 척수의 물리적 손상 또는 팔과 손 또는 신체의 다른 부분에 대한 압궤 또는 절단 손상에 위해 유발되는 것과 같은 신경계에 대한 물리적 손상을 포함한다.

따라서, 본 발명은 신경 손상의 예방, 완화 또는 치료를 필요로 하는 환자의 신체에 아르테민을 생성시키는 천연 능력에 대해 선택되거나 아르테민을 분비하도록 조작된 세포를 이식함으로써 신경 손상을 예방하거나, 완화시키거나 치료하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, 환자가 인간인 경우에 분비된 아르테민은 가용성의 성숙한 인간 아르테민이다. 이식물은 바람직하게는 비면역원성이고(이거나), 면역원 이식된 세포가 면역계에 의해 인식되는 것을 방지한다. CNS 전달을 위해, 이식물에 대해 바람직한 위치는 척수의 뇌척수액이다.

한 실시양태에 있어서, 상기한 섹션 5에서의 스크리닝 분석법에 의해 동정된 화합물을 사용하여 아르테민 활성 또는 발현의 수준을 조절할 수 있다. 구체적으로는, 아르테민의 이의 수용체에의 결합을 자극할 수 있는 동정된 화합물은 아르테민 활성의 증가된 수준을 목적하는 치료에 유용할 수 있다. 유사하게는, 아르테민 유전자 발현을 증가시킬 수 있는 것으로 동정된 화합물을 유사한 치료에 유용할 수 있다.

한 실시양태에 있어서, 말초 신경 손상, 특히 말초 감각 신경병증에 걸린 환자를 아르테민 투여로 치료한다. 특히, 당뇨성 신경병증에 걸린 환자를 아르테민 투여에 의해 치료할 수 있는 것으로 고려된다.

다른 실시양태에 있어서, 아르테민을 환자에게 투여하여, 말초 뉴런을 손상 유도된 병리적 변화로부터 보호한다. 또한, 아르테민을 환자에게 투여하여, 중추 및 운동 뉴런을 손상 유도된 병리적 변화로부터 보호할 수 있는 것으로 또한 고려된다.

또 다른 실시양태에 있어서, 아르테민을 암 치료에서와 같이 1종 이상의 화학요법제와 함께 환자에게 투여한다. 아르테민은 신경 손상이 예방되거나 치료되도록 화합요법제로의 치료 이전에, 동안에 또는 이후에 투여할 수 있는 것으로 고려된다. 바람직한 화학요법에는 빈크리스틴, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 3'-아지도-3-데옥시티미딘, 탁산 (예: 파클리탁셀 (TAXOL^R, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 독세탁솔 (TAXOTERE^R, Rhone Poulenc Rorer, Antony, France)) 및(또는) 안트라시클린 항생제를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 제조업자 지시사항은 상기한 화학요법제에 대한 제조법 및 투약 스케쥴을 결정하는데 있어 따를 수 있거나, 이는 숙련된 시행자에 의해 실험적으로 결정할 수 있다. 상기한 화학요법에에 대한 제조법 및 투약 스케쥴은 또한 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에 기술되어 있다.

치료적으로 사용되는 아르테민의 유효량은, 예를 들어 치료 대상, 투여 경로 및 환자의 상태에 따라 달라질 것이다. 따라서, 치료사가 최적의 치료 효과를 수득하는데 필요한 투여량을 적정하고 투여 경로를 변경하는 것이 필요할 것이다. 전형적으로는, 임상의는 목적하는 효과를 달성하는 투여량에 이를 때까지 투여할 것이다.

전신 치료에 대한 전형적인 1일 투여량은 약 0.01 ㎍/kg 내지 50 mg/kg 또는 위에서 언급한 인자에 따라 그 이상의 범위일 것이다. 또 다른 일반적인 제안으로서, 아르테민을 제형화 한 다음, 유효하지만 과도하게 독성이지 않은 아르테민 수준을 조직에서 확립할 수 있는 투여량으로 표적 부위 또는 조직에 전달한다. 조직내 농도는 가능하면 연속 주입, 지속적 방출, 국소 도포, 아르테민-발현 세포 이식물 또는 실험적으로 결정된 빈도로의 주사에 의해 유지시켜야 한다. 이러한 치료법의 진행은 통상적인 분석법에 의해 용이하게 모니터링한다.

바람직하게는, 포유동물에서 손상-유도된 병리적 신경 변화는 아르테민 또는 아르테민 작용제를 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg 투여함으로써 예방 또는 치료된다. 한 실시양태에 있어서, 포유동물에서 손상-유도된 신경 변화는 아르테민 또는 아르테민 작용제를 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg 투여함으로써 예방 또는 치료된다. 보다 바람직하게는, 약 1 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg, 훨씬 더 바람직하게는 약 10 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg의 아르테민 또는 아르테민 작용제를 투여한다. 또다른 실시양태에 있어서, 포유동물에서 손상-유도된 신경 변화는 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 mg/kg을 투여함으로써 예방 또는 치료된다. 더욱 바람직하게는 약 0.25 내지 약1 mg/kg, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.75 내지 약 1 mg/kg의 아르테민 또는 아르테민 작용제를 투여한다. 아르테민의 투여 경로는 공지된 방법, 예를 들어 정맥내, 피내, 복강내, 뇌내, 근육내, 안내, 동맥내 또는 병변내 경로로 주사 또는 주입, 국소 투여, 또는 서방형 방출 시스템에 따른다. 바람직한 실시양태에서는, 아르테민을 정맥내, 피내, 경막내 또는 피하 주사에 의해 투여한다. 그러나, 또다른 실시양태에서는 국소 투여한다.

투여 방법은 개체의 상황을 기준으로 결정되어야 한다. 그러나, 바람직한 실시양태에서는, 아르테민 또는 아르테민 작용제를 매일, 더욱 바람직하게는 이틀에 한번, 훨씬 더 바람직하게는 주 2회 이상 투여한다. 바람직하게는 6개월 동안, 더욱 바람직하게는 1개월 동안, 훨씬 더 바람직하게는 2주 이상 동안 치료를 계속한다. 당업자라면 정확한 투여 방법이 개체의 상황을 기준으로 치료자에 의해 결정될 수 있다는 것을 잘 알 것이다.

한 예로, 아르테민 또는 아르테민 작용제는 당뇨병성 신경병증으로 고통받고 있는 환자에게 투여된다. 약 0.5 ㎍/kg 내지 1 mg/kg의 투여량을 정맥내 주사에 의해 주 3회 이상 2주 이상 동안 투여한다. 환자는 주사와 관련된 통증 또는 통각과민으로 고통받지 않는다.

8.제품

본 발명의 또다른 측면으로, 신경 손상의 치료 또는 예방에 유용한 물질을 함유하는 제품을 고려한다. 상기 제품은 용기, 및 상기 용기상에 또는 그와 함께 있는 라벨 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는 예를 들어 병, 바이알,주사기 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 및 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 아르테민을 포함하는 제약 조성물, 및 상기 조성물을 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg의 투여량으로 투여하도록 하는 지침을 보유한다. 임의로, 상기 라벨은 또한 상기 조성물이 신경 손상의 치료 및(또는) 예방에 유용함을 나타낼 수 있다.

실시예 1

전신 투여한 NGF는 열적 및 기계적 통각과민을 야기시키지만, 아르테민은 그렇지 않다.

열적 및 기계적 통증 역치 둘 다에 대한 NGF 및 아르테민의 효과를 전신 전달 후에 측정하였다. 미리 순응시켜서 유해한 열적 또는 기계적 자극에 대한 그들의 회피 역치를 시험한 암컷 피셔 (Fischer) 래트의 목덜미에 NGF, 아르테민 또는 염수를 피하 주사하였다. 투여한 지 2시간, 24시간 또는 48시간 후에, 이들에 대해 재시험하였다. 모든 시험에서 동물에게 한 처치에 대해 사람들이 모르게 하였다. 열 회피 잠재시간은 하그리브스 (Hargreaves)의 방법으로 측정하고, 기계적 역치는 폰 프레이 헤어 (von Frey hair)의 전자 버젼을 이용하여 측정하였다. NGF의 투여량은 1 mg/kg이고, 아르테민의 투여량은 5 mg/kg이었다. 도 8 및 9에 제시된 결과는 NGF를 처치한 동물에서 열적 잠재시간 및 기계적 역치가 급속하고 장기적으로 감소된 반면, 염수만을 처치한 동물에 비해 아르테민을 처치한 동물에서는 유의한 변화가 없음을 명확히 보여준다. 도 8은 NGF를 처치한 동물에서는 열 회피잠재시간이 처치전 값의 대략 75％로 저하된 반면, 아르테민을 처치한 동물에서는 처치전 값의 90％ 내지 95％로 유지됨을 보여준다. 염수로 처치한 동물에서는 시험 잠재시간이 처치전 값의 대략 95％를 나타냈다. 기계적 민감성의 시험에서, NGF를 처치한 동물의 회피 역치는 처치전 값의 대략 60％로 저하된 반면, 염수 또는 아르테민을 처치한 동물에서는 점차적으로 처치전 값의 약 90％로 저하되었다 (도 9).

실시예 2

NGF의 국소 투여는 열적 및 기계적 통각과민을 야기시키지만, 아르테민은 그렇지 않다.

열적 및 기계적 통증 역치 둘 다에 대한 NGF 및 아르테민의 효과를 국소 전달 후에 측정하였다. 미리 순응시켜서 유해한 열적 또는 기계적 자극에 대한 그들의 회피 역치를 시험한 암컷 피셔 래트의 한 뒷발의 발바닥 표면에 NGF, 아르테민 또는 염수를 주사하였다. 투여한 지 2시간, 24시간 또는 48시간 후에, 이들에 대해 재시험하였다. 모든 시험에서 동물에게 한 처치에 대해 사람들이 모르게 하였다. 열 회피 잠재시간은 하그리브스의 방법으로 측정하고, 기계적 역치는 폰 프레이 헤어의 전자 버젼을 이용하여 측정하였다. NGF의 투여량은 1 ㎍이고, 아르테민의 투여량은 5 ㎍이었다. 도 10 및 11에 제시된 결과는 NGF를 처치한 동물에서 열적 잠재시간 및 기계적 역치가 급속하고 장기적으로 감소된 반면, 염수만을 처치한 동물에 비해 아르테민을 처치한 동물에서는 유의한 변화가 없음을 명확히 보여준다. NGF를 처치한 동물에서 열 회피 잠재시간은 24시간 후 약 6 초 내지 대략 4.5초로 저하된 반면, 아르테민 또는 염수를 처치한 동물에서는 처치전 값인 6 초로 유지되었다 (도 10). 기계적 민감성 시험에서, NGF를 처치한 동물의 회피 역치는 27 g의 처치전 값에서 대략 22 g으로 저하된 반면, 염수 또는 아르테민으로 처치한 동물에서는 회피 역치가 거의 저하되지 않았다 (도 11).

실시예 3

전신 투여한 NGF 처치는 체중 감소를 야기시키지만, 아르테민은 그렇지 않다.

NGF, 아르테민 또는 염수의 전신 투여 처치에 의해 유도되는 만성 통증의 일반적인 측정법으로서 체중 손실을 이용하였다. 암컷 피셔 래트를 NGF 1 mg/kg, 아르테민 5 mg/kg 또는 염수로 주 1회 처치하였다. 목덜미에 피하 전달하였다. 첫번째 주사하기 전에 및 처치한 지 1주 및 2주 후에 동물의 체중을 측정하였다. 도 12에서 알 수 있는 바와 같이, NGF를 처치한 동물은 2주만에 체중의 대략 7％가 손실된 반면, 아르테민 또는 염수를 처치한 동물에서는 그들의 처음 체중의 2％ 미만이 손실되었다.

실시예 4

아르테민 처치는 통증-관련 행태의 빈도를 감소시킨다.

신경병증성 통증에 대한 아르테민의 효과는 래트에서 스페어드 신경 손상 모델을 이용하여 평가하였다. 이 모델에서는, 경골 (tibial) 및 비골 (peroneal) 신경을 절단하여, 좌골 삼분지부의 말단에 연결시키고, 비복 (sural) 및 복재 (saphenous) 신경은 손상되지 않게 두었다. 이로써 뒷발의 상부 및 발바닥 신경이제거되었고, 장기 지속되는 신경병증성 통증의 상태로 이어졌다. 상기 수술을 시작한 직후에, 동물의 발바닥을 아르테민 (5 ㎍), NGF (5 ㎍) 또는 염수로 매번 20 ㎕씩 주 3회 처치하였다. 처치된 동물을, 신경이 노출되긴 하였으나 절단 또는 연결되지는 않은 모의 시험 동물과 비교하였다. 처치한지 12일 후에 자발적인 통증 행태를 측정하였다. 동물을 작은 플렉시글래스 (Plexiglass) 박스에 두고, 발 조심, 발 들어올리기 또는 발 가볍게 치기의 모든 사례를 5분 간격으로 계수하였다. 정상 동물 또는 모의 수술 동물은 매우 드물게 상기 행태를 나타내는 반면, 스페어드 신경 손상 동물은 비교적 자주 상기 행태를 나타내었다. 도 13에서 알 수 있는 바와 같이, NGF로 지속적으로 처치한 경우에는 염수 처치한 조작 래트의 경우에 비해 12일 후 상기 행태의 빈도가 증가되었다. 한편, 아르테민을 처치한 경우에는 상기 통증-관련 행태의 빈도가 감소되었다 (도 13).

실시예 5

아르테민 및 NGF 둘 다 허피스 심플렉스 바이러스 유도된 사멸으로부터 성체 DRG 뉴런을 보호한다.

허피스 심플렉스 바이러스로 인한 뉴런의 사멸을 방지하는 NGF 또는 아르테민의 능력을 시험관내에서 평가하였다. 성인 래트 후근 신경절로부터 얻은 뉴런을 NGF (100 ng/ml), 아르테민 (1 ㎍/ml) 또는 기초 배지의 존재하에 11일 동안 배양한 후, 상이한 농도의 허피스 심플렉스 바이러스로 감염시켰다. 감염시킨 지 2일 후 생존 세포를 계수하였다. 도 14는 NGF 및 아르테민 둘 다 바이러스의 독성 작용으로부터 뉴런을 보호함을 보여준다.

실시예 6

아르테민 처치는 척수의 후각에서 축삭절개술-유도된 섭스턴스 P의 손실을 예방한다.

손상과 관련된 병리적 변화로부터 작은 섬유 감각 뉴런을 보호하는 아르테민의 능력을, 축삭절개술 후 일반적으로 일어나는 감각 신경펩티드의 감소에 대한 아르테민 투여의 효과를 측정함으로써 시험하였다. 척수의 후각의 표층으로 작은 섬유 감각 뉴런의 중심 돌출은 감각 뉴런의 섬유내에 함유된 다양한 신경펩티드의 존재로 인해 가시화될 수 있다. 상기 층의 펩티드 함량은 좌골 신경의 절개 후, 섬유의 퇴축과 섬유의 펩티드 함량 감소로 인해 감소된다. 아르테민 (12 ㎍/일)을 경막내 공간으로 전달하면 상기와 같은 감소가 본질적으로 완전히 차단된다. 도 15에는, 섭스턴스 P에 대해 염색한 척수 후각의 단면이 도시되어 있다. 염수를 처치한 동물에서는 축삭절개한 동측에서의 염색 강도가 대측에 비해 감소되었으나, 아르테민을 처치한 경우에는 이러한 강도 차이가 본질적으로 없었다.

도 16은 상기 결과를 정량화하는 방법을 도시한 것이다. 평균 염색 강도는 후각의 상단에서 시작되는 150개의 픽셀로 된 넓은 선으로 측정하였다. 간단히 설명하면, 도시된 바와 같이 막대선을 후각의 중앙 및 중앙외측 영역으로부터 아래쪽으로 위치시켰다. 각각의 수직 막대는 150개의 평행한 픽셀로 된 넓은 선으로 이루어져 있었고, 이들 각각을 따라 평균 강도를 계산하였다. 이와 같이, 후각의 깊이에 따른 염색 강도의 변화량을 산출하였다. 그 후, 이들 값을 대측 비손상 후각 염색 강도에 대한 ％로 나타내어, 도 16에 도시하였다.

도 17에서, 하나의 좌골 신경이 절단된 래트에 대해 섭스턴스 P의 염색 강도 (Y-축)와 후각의 표면에서부터의 깊이 (X-축)를 플롯팅하였다. 좌골 손상측에서는 비조작측에 비해 후각에서 면역염색된 섭스턴스 P가 상당히 감소되었다. 연속 주입을 통해 경막내로 아르테민을 12 ㎍/일 처치한 동물에서는, 상기 축삭절개술-유도된 펩티드의 손실이 예방되었다.

실시예 7

축삭절개술 후 아르테민은 C-섬유 전도 속도를 변화시킨다.

도 18은 좌골 신경에서의 C-섬유 전도 속도에 대한 Q-sum 플롯을 보여준다. 래트의 한쪽편 좌골 신경을 절개한 후, 1주일 동안 회복되게 하였다. 상기 주간 동안, 래트에게 매일 12 ㎍/일의 투여량을 경막내에 연속 주입함으로써 염수 또는 아르테민을 처치하였다. 좌골 신경 절개 또는 모의 조작 7일 후, 동물을 우레탄으로 마취시키고, 추궁판절개술을 수행하여 허리 부분의 후근을 노출시켰다. 후근 L4 및 L5를 개개의 섬유로 분리하고, 개개 섬유의 활동 전위를 좌골 신경의 자극에 의해 확인하였다. 개개 C-섬유에 대한 전도 속도는 각 동물 당 100 내지 200개 섬유로 측정되었다. 선행 연구와 일치하게, 축삭절개술 및 염수 처치는 Q-sum 곡선에서의 독특한 좌향 이동을 유발하였으며, 이는 축삭절개술 후 C-섬유의 전도 속도 감소에 해당한다. 그러나, 축삭이 절개되고 아르테민을 처치된 동물에서는 이동이 거의 없었는데, 이는 손상에 의해 유도된 전도 속도 이동으로부터 보호됨을 시사한다.

실시예 8

아르테민 유도된 신생 DRG 뉴런의 생존은 GFR 3을 필요로 한다.

야생형 마우스 또는 GFR 3 결핍 마우스로부터의 신생 뉴런을 후근 신경절로부터 분리하여 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 시간이 끝났을 때 생존 세포를 계수하였다. 야생형 동물로부터 유래한 배양액에서, 아무 성분도 첨가하지 않는 것에 비해 아르테민은 다수의 뉴런이 생존하도록 하였다 (도 19). 그러나, 도 19에 도시된 바와 같이 GFR 3 낙아웃 마우스에서는 아르테민의 첨가가 대조군 배양액에서 나타나는 것보다 더 생존을 유발하지는 않았다. 반면, NGF 유도된 생존은 낙아웃 마우스와 야생형 마우스에서 유사한 정도였다. 이는 신생 뉴런의 생존에 대한 아르테민의 효과가 GFR 3의 기능을 필요로 한다는 것을 시사한다.

실시예 9

GFR 3은 축삭절개술 후 거의 모든 소세포에 존재한다.

대략 40％의 후근 신경절 (DRG) 세포는 GFR 3 mRNA를 발현한다. GFR 3을 발현하는 대부분의 DRG 세포는 소직경 세포이다. 도 20에서 알 수 있는 바와 같이, 말초 신경 손상은 GFR 3 발현을 상향조절하여, 거의 모든 DRG 소세포가 수용체를 발현한다 (전체 세포의 66％). 말단에서는 아르테민의 상향조절이 수반되었다. 이들 데이타는 아르테민이 손상된 작은 감각 뉴런에 대한 신경보호 작용을 가질 수 있음을 제시한다.

실시예 10

말초 전달된 아르테민은 캡사이신으로부터 뉴런을 보호한다.

래트를 캡사이신 (50 mg/kg)으로 전신 투여 처치하여, 소직경 섬유를 손상시켰다. 일부 동물은 아르테민 (5 ㎍ 발바닥내로 전달)을 매일 5일 동안 처치하였다. 5일 후, 척수를 제거하고, 후각의 외측 및 중앙 영역에서 섭스턴스 P의 면역반응성에 대해 염색하였다. 도 21에 도시된 바와 같이, 캡사이신 처치는 후각의 중앙 및 외측 영역 둘 다에서 섭스턴스 P 함량의 심각한 결핍을 야기시켰다. 외측 후각에서의 결핍은 아르테민을 발에 투여함으로써 완전히 차단된 반면, 중앙 후각에서는 아르테민을 발에 투여하였을 때 섭스턴스 P가 정상 이상의 수준으로 얻어졌다. 따라서, 아르테민의 말초 투여는 캡사이신의 해로운 효과로부터 후각으로 돌출되는 감각 뉴런의 펩티드 함량을 완전히 보호하였다.

실시예 11

좌골 축삭절개술 후 ICV 아르테민은 후각 섭스턴스 P의 손실을 예방한다.

마우스의 측뇌실에 캐뉼라를 이식하고, 좌측 좌골 신경을 절단하였다. 아르테민 또는 비히클을 삼투압 미니펌프가 장착된 캐뉼라를 통해 12 ㎍/일의 속도로 주입하였다. 8일 후, 척수를 제거하고, 후각의 외측 및 중앙 영역에서 섭스턴스 P의 면역반응성에 대해 염색하였다. 도 22는 비히클을 처치한 축삭절개된 동물이 대조군측 (녹색)에 비해 병변측 (청색)에서 섭스턴스 P에 대한 염색 강도의 손실을 나타냄을 보여준다. 이 효과는 좌골 신경의 공지된 돌출 패턴이 유지되는 중앙 후각에서 가장 현저하다. 아르테민 주입에 의해 병변측 (적색)에 있는 섭스턴스 P의 손실이 주로 예방되었고, 대조군측 (흑색)에서는 펩티드의 염색이 증가되었다.

<서열 목록>

Claims (25)

1. 아르테민 (artemin) 또는 그의 작용제의, 포유동물에서 손상으로 인한 병리적 변화로부터 뉴런을 보호하며 기계적 또는 열적 통각과민을 수반하지 않는, 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg의 투여 범위로 투여되는 의약 제조에 있어서의 용도.
2. 아르테민 또는 그의 작용제의, 포유동물에서 뉴런 손상을 치료하고 기계적 또는 열적 통각과민을 수반하지 않는, 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg의 투여 범위로 투여되는 의약 제조에 있어서의 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여 범위가 약 0.1 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg인 용도.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여 범위가 약 0.1 mg/kg 내지 약 1 mg/kg인 용도.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여가 2주 이상의 기간 동안 주 2회 이상 반복되는 것인 용도.
6. 제5항에 있어서, 상기 투여가 2주 이상의 기간 동안 주 3회 이상 반복되는것인 용도.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여가 전신 투여인 용도.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 투여가 국소 투여인 용도.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 뉴런이 중추 뉴런, 말초 뉴런 및 운동 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 용도.
10. 제9항에 있어서, 상기 말초 뉴런이 교감 뉴런, 부교감 뉴런, 감각 뉴런 및 장관 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 용도.
11. 제10항에 있어서, 상기 감각 뉴런이 후근 신경절로부터의 감각 뉴런, 삼차 신경절로부터의 감각 뉴런 및 결절 신경절로부터의 감각 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 용도.
12. 제9항에 있어서, 상기 중추 뉴런이 뇌 뉴런 또는 척수 뉴런인 용도.
13. 제1항에 있어서, 상기 손상이 외상, 독성물질, 다른 치료제의 부작용, 외과 수술, 뇌졸중, 허혈, 감염, 대사성 질환, 영양 결핍, 또는 악성 종양과 관련된 것인 용도.
14. 제1항에 있어서, 상기 손상이 말초 신경병증과 관련된 것인 용도.
15. 제2항에 있어서, 상기 손상이 신경병증 또는 신경퇴행성 질환으로부터 기인한 것인 용도.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 신경병증이 말초 감각 신경병증인 용도.
17. 제17항에 있어서, 상기 말초 감각 신경병증이 당뇨성 신경병증인 용도.
18. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아르테민이 천연 서열 아르테민 폴리펩티드인 용도.
19. 제18항에 있어서, 상기 아르테민이 천연 서열 인간 아르테민 폴리펩티드인 용도.
20. 제19항에 있어서, 상기 아르테민이 서열 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인 용도.
21. 제19항에 있어서, 상기 아르테민이 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 것인 용도.
22. 제19항에 있어서, 상기 아르테민이 서열 5의 아미노산 서열을 포함하는 것인 용도.
23. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 용도.
24. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 아르테민이 면역어드헤신 (immunoadhesin)인 용도.
25. (a) 용기,

    (b) 상기 용기 내의, 아르테민을 포함하는 제약 조성물, 및

    (c) 상기 제약 조성물을 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 1 mg/kg의 투여량으로 투여하도록 하는 지침

    을 포함하는 제품.