CN1547483A - Artemin-gdnf配体家族的一个成员的新用途 - Google Patents

Artemin-gdnf配体家族的一个成员的新用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及artemin在预防和治疗神经细胞损伤以及与神经细胞损伤相关变化中的用途。更具体地，本发明提供了一种保护哺乳动物神经元避免损伤引起的病变的方法，以及一种通过给予artemin或artemin激动剂治疗哺乳动物神经元损伤的方法。

Description

ARTEMIN-GDNF配体家族的一个成员的新用途
发明领域
本发明涉及artemin对于预防、改善或治疗神经细胞损伤及神经细胞损伤相关变化的用途。
发明背景
Artemin是最近鉴定和特征分析的一种神经营养因子。Artemin是胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)家族的一个成员，并显示通过GFR-3受体传导信号(Baloh等，Neuron，21：1291-1302(1998))。象所有已知的GDNF家族成员一样，已发现artemin支持体内多巴胺能中脑神经元和外周神经元的存活(Baloh等，见上文)。另外，artemin还显示保护体内黑质纹状体多巴胺能神经元(Rosenblad等，Mol.Cell.Neurosci.，15：199-214(2000))。
蛋白质神经营养因子或神经营养蛋白影响脊椎动物神经系统的生长和发育。另外，认为在脑和外周神经中它们对促进多种神经细胞群的分化、存活和功能起着重要作用。已提议将许多神经营养因子作为增强特异性神经细胞存活的潜在方法。因此有人提出它们可能在神经变性疾病例如肌萎缩性侧索硬化(ALS)、老年性痴呆、中风、癫痫症、亨廷顿病、帕金森氏症和外周神经病的治疗中有用。
神经营养因子被认为在神经组织中具有重要的信号传导功能，部分是根据用神经生长因子(NGF)建立的先例。在体外或体内NGF支持正在发育的动物的交感神经、感觉神经和基底前脑神经元的存活。在发育过程中给予外源性NGF可拯救神经元避免细胞死亡。相反，给予抗-NGF抗体除去或没收内源性NGF可促进这种细胞死亡。(Henmann，J.Exp.Biol.，132：133-150(1987)；Hefti，J.Neurosci.，6：2155-2162(1986)；Thoenen等，Annu.Rev.Physiol.，60：284-335(1980))。
基于其神经营养特性，NGF已成为众多研究的主题。(回顾见Hefti等，Neurobiol.Aging，10：515-533(1988)和Levi-Montalcini，Science，237：1154-1164(1987))。然而，除了其神经保护和神经再生效应，在静脉内(iv)、皮下(sq)或皮内注射或脑室内(icv)或鞘内(it)给予后，NGF还在动物和人体中产生痛觉过敏和疼痛(Lewin等，J.Neurosci.，13：2136-2148(1993)，Lewin等，Eur.J.Neurosci.6：1903-1912(1994)，Andreev等，Pain，63：109-115(1995)；Petty等，Ann.Neurol.，36：244-246(1994)；Hao等.，Neurosci.Lett.，286：208-212(2000))。这些发现在人体的临床试验中得到证实，其中伴随NGF治疗引发的疼痛限制了它的临床效果。见例如Eriksdotter等，Dement.Geriatr.Cogn.Disord.，9：246-257(1998)，Petty等，见上文，和Apfel等，JAMA，284：2215-2221(2000)。
背根神经节(DRG)中许多小直径的感觉神经元表达高亲和力的NGF受体(Verge等，J.Neurocytol.，18：583-591(1989)，McMahon等，Neuron，12：1161-1171(1994)和这些表达NGF受体的神经元也大量地表达感觉神经肽，特别是物质P和CGRP(Verge等，见上文，和Averill等，Eur.J.Neurosci.，7：1484-1494(1995))。与NGF受体定位在这些肽能神经元上相一致，已显示用NGF处理可改变这些神经元中的这些肽的表达。用NGF处理可引起体内肽CGRP和物质P的超常水平(Goedert等，Proc.Nat.Acad.Sci.，78：5895-5898(1981)和Amann等，Neurosci.Let.，203：171-174(1996))。体外检验NGF对DRG神经元生长影响的实验显示这是一种直接影响(Lindsay和Harmar，Nature，337：362-364(1989))。此外，NGF处理引起物质P和CGRP从感觉神经元投射到背角的释放增加(Malcangio等，Eur.J.Neurosci.，9：1101-1104(1997)和Malcangio等，Eur.J.Neurosci.，12：139-144(2000))。
已显示这些含肽神经元的损伤导致，不仅神经元胞体中，而且它们的外周突起中以及它们的突起进入脊髓的背角中肽含量的缺乏。例如，坐骨神经横切导致DRG和脊髓背角对应于坐骨神经突起的区域物质P含量的下降。已证实损伤后给予NGF防止DRG(Verge等，J.Neurosci.，15：2081-2096(1995))和脊髓背角突起中这种损伤引起的肽含量的变化。(Bennett等，Mol.Cell.Neurosci.，8：211-220(1996))。对这些神经元的损伤还可由化学(化疗剂或辣椒素)或代谢(糖尿病)损伤引起，在所有这些情况下神经元的肽含量依据损伤的程度而下降并且NGF治疗能够逆转或预防这种下降(Apfel等，Ann.Neurol.，29：87-89(1991)，Apfel等，Ann.Neurol.，31：76-80(1992)，Donnerer等，Brain Res.，741：103-108(1996)和Apfel等，Brain Res.，634：7-12(1994))。
因为物质P长期与疼痛有关，所以人们对NGF调节物质P感兴趣。的确，不论是外周还是中枢给予物质P都在人和实验动物中引起疼痛增加和疼痛相关行为的增加(Maeda等J.Neural Transmission，96：125-1337：2021-2035(1995))。另外，Hao等报道NGF治疗后大鼠中存在的机械的和热痛觉过敏可因选择性针对物质P受体NF的拮抗剂而得到减轻(NeuroscienceLett.286：208-212(2000))。
因此本领域需要一种方法能够有效地治疗神经损伤和神经病学疾病而不产生副作用使NGF治疗不可行。特别是，需要对肽能感觉神经元的有效治疗方法。由于损伤，这些细胞减少了它们的肽表达，损伤后保护它们或修复它们的治疗也必须增加它们肽的表达。然而人们预测肽表达的这种增加会导致诸如疼痛等副作用。
已鉴定和特征分析了与NGF有关的几种其它神经营养因子。所谓的神经营养蛋白家族有几个成员包括脑衍生的神经营养因子(BDNF)(Leibrock等，Nature，341：149-152(1989))，神经营养蛋白-3(NT-3)(Kaisho等，FEBS Lett.，266：187(1990)；Maisonpierre等，Science，247：1446(1990)；Rosenthal等，Neuron，4：767(1990))，神经营养蛋白4/5(NT-4/5)(Berkemeier等，Neuron，7：857-866(1991))。还鉴定了但是属另一个分子家族的胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF；Lin等Science，260：1130-1132(1993))。与NGF相似，GDNF的给予与体重减轻和异常性疼痛相关(Hoane等，Exp.Neurol.，160：235-243(1999))。
根据氨基酸和结构相似性可将鉴定的神经营养因子分组为不同的家族。发现GDNF家族不仅包括GDNF，还包括相关的分子neurturin和persephin(Lin等.，Science，260：1130-1132(1993)；Henderson等.，Science，266：1062-1064(1994)；Buj-Bello等，Neuron，15：821-828(1995)；Kotzbauer等，Nature，384：467-470(1996)；Mibrandt等，Neuron，20：245-2(1998))。
已发现GDNF，neurturin和persephin体内和体外都支持多巴胺能中脑神经元的存活(Lin等，Science，260：1130-1132(1993)；Henderson等，Science，266：1062-1064(1994)；Horger等，J.Neurosci.，18：4949-4937(1998)；Oppenheim等，Nature，373：344-346(1995)；Milbrandt等Neuron，20：245-253(1998))。该功能表明这些化合物可能在治疗神经元损伤或变性这基础的疾病时有用。令人感兴趣的是，在培养中GDNF和neurturin还能够提高几种类型的外周神经元的存活，而persephin没有显示相同的效果(Buj-Bello等，Neuron，15：821-828(1995)；Kotabauer等，Nature，384：467-470(1996)；Ebendal等，Neurosci，Res.40：276-284(1995)；Heuckeroth等，Dev.Biol.，200：116-129(1998)；Trupp等.，J.Cell Biol.130：137-148(1995)；Milbrandt等Neuron，20：245-253(1998))。
神经营养因子GDNF家族的所有成员显示通过一受体复合物传导信号，该复合物包括称作GFR的PI-连接的配体结合蛋白，和被称作RET的蛋白质-酪胺酸激酶的一跨膜信号传导蛋白。而对于GDNF神经营养因子家族的所有成员RET似乎是共同的信号传导因子，这里有4种不向的GFR(GFR 1-4)，其中的每一个显示出对不同配体有相对特异性。GFR 1-RET优先结合GDNF，而GFR 2-RET优先结合neurturin(Baloh等，Neur 18：793-802(1997)；Jing等，Cell，85：1113-1124(1996)；Klein等，Nature，387：717-72l(1997)；Sanicola等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94：6238-6243(1997)；Suvanto等，Hum.Molec.Genetics，6：1267-1273(1997)；Traeanor等，Nature，382：80-83(1996))。然而，最近有一些证据显示这种GFR 1对GDNF和GFR 2对neurturin显示的特异性可能有点被过于简单化了(Wang等，J.Neurosci.Res.，61：1-9(2000)。另外，已发表的证据显示即使在RET缺乏的情况下GFR 1受体可能能够从GDNF转导信号(Trupp等，J.Biol.Chem.，274：20885-20894(1999))。已报道persephin可与GFR 4结合，并因此可能通过GFR 4-RET起作用(Enokido等，Curr.Biol.，8：1019-1022(1998))。另一方面，GFR 3的分析表明它不能与能被GDNF、neurturin或persephin活化的RET形成功能性受体(Baloh等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 95：5801-5806(1998))。这提示GDNF家族的第四个成员尚需鉴定。
最近鉴定和特征分析了GDNF家族的第四个成员称之为artemin(Baloh等，Neuron，21：1291-1302(1998))。也鉴定了与artemin相同或几乎相同的几种其它因子称作enovin(Masure等，Eur.J.Biochem.266：892-902(1999))和neublastin(Rosenblad等，Mol.Cell.Neurosci.，15：199-214(2000))。预测的全长artemin蛋白含有一个用于分泌的信号肽和被几个保守的RXXR弗林蛋白酶切割位点与成熟区域分开的前区域。另外，人artemin基因含有两个可能的起始甲硫氨酸，导致两种全长不同的人artemin多肽的另一种的生产。然而，在这两种形式中该前区域切割产生的人artemin的成熟形式是相同的。小鼠artemin基因不含有可另一个甲硫氨酸。在氨基酸水平上artemin与neuturin和persephin(45％相同)比与GDNF(36％相同)更相似(Baloh等，见上文)。
如上简单所述，Baloh等，(见上文)报道在培养中artemin支持多巴胺能中脑神经元的生存。还发现artemin保护体内黑质纹状体多巴胺能神经元(Rosenblad，见上文)。此外，如同GDNF和neuturin，artemin能够支持体外外周神经元，包括背根神经节(DRG)和三叉神经神经节(TG)的感觉神经元亚组、结扎神经节(NG)的内脏感觉神经元和颈上神经节的交感神经元(SGC)(Baloh等，见上文)。
已报道artemin能够结合GFR 3和活化GFR 3-RET受体复合物(Baloh等，见上文)。相一致地，4种GDNF家族神经营养蛋白中，artemin以与GFR 3受体最相符的形式表达(Baloh等，见上文)。用相同的分子enovin获得相似的结合和表达结果(Masure等，见上文)。因此显示GFR 3是artemin的功能性受体。
神经元的发育和存活问题对于许多神经病学疾病从急性损伤到长期变性是主要的问题，。因此，本发明的目的是提供一种方法，该方法使用artemin来预防神经元死亡和提高神经元的存活而无伴随的使用NGF治疗所见的有害副作用。
发明概述
本发明基于artemin在预防、改善和治疗损伤引起的神经元变化中具有高效率的发现，特别是哺乳动物小感觉神经元，和，事实上，保护肽能神经元损伤后物质P不损失。尽管与NGF类似，artemin给予可提高肽的含量，但出乎意料的是它没有有害副作用，具体地说，没有常常与给予其它神经营养因子如NGF相关连的痛觉过敏。
一个方面，本发明提供了一种保护哺乳动物的神经元不产生损伤引起的病理变化的方法。该方法包括给予哺乳动物artemin或artemin激动剂。给予artemin的哺乳动物可以是人。在一个具体的实施例中，artemin或artemin激动剂的剂量在约0.01g/kg和约1g/kg之间。artemin或artemin激动剂的给予不含伴有机械性或热痛觉过敏。
在一个实施例中，给药剂量在约0.1g/kg和约1g/kg之间。在另一个实施例中给药剂量在约0.1mg/kg和约1mg/kg之间。
可使用本领域熟练的技术人员已知的任何方法给药。在一个较佳的实施例中，给药是全身性的并可通过静脉内、皮内、鞘内或皮下注射进行。在另一个实施例中给药可以是局部给药。
如本领域已知的方法的确定，应重复给予artemin或artemin激动剂。在一个实施例中，一周内重复给药至少两次，持续至少两周。在另一个实施例中，一周内重复给药至少三次，持续至少两周。
在本发明的一个实施例中，受artemin影响的神经元是外周神经元。较佳地，该神经元选自交感神经、副交感神经、感觉和肠神经元。更佳地，该神经元是小纤维感觉神经元。
在本发明的另一个实施例中，神经元是运动神经元或中枢神经元。当该神经元是中枢神经元时，它们较佳的可能是脑或脊髓神经元。
本发明第一个方面所考虑的损伤可与能外伤、毒性剂、其它治疗剂的不良副作用、外科手术、中风、局部缺血、感染、代谢疾病、营养缺乏或恶性肿瘤相关。该损伤还可与外周神经病、较佳地是外周感觉神经病，甚至更佳地是糖尿病性神经病相联系。
本发明方法中使用的artemin可以是天然序列的artemin多肽或天然序列的人artemin多肽。在一个实施例中天然序列的人artemin多肽含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。天然序列的人artemin多肽还可含有或者SEQ ID N0：3或者SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
本发明另一个方面是治疗哺乳动物神经元损伤的一种方法。该方法包括给予哺乳动物artemin或artemin激动剂，其剂量在约0.01g/kg和约1g/kg之间。在另一个实施例中，剂量在约0.1g/kg和1mg/kg之间或约0.1mg/kg和约1mg/kg之间。给药不会伴有机械性或热痛觉过敏。给予artemin的哺乳动物可以是人。
本发明该方面所考虑的神经元损伤可产生自神经病或神经变性疾病。在一个实施例中神经病是外周神经病，在另一个实施例中是糖尿病性神经病。在另一个实施例中神经病是小-纤维感觉神经病。更具体的神经变性疾病可以是肌萎缩性侧索硬化。
在一个实施例中给予天然序列的artemin多肽。在另一个实施例中给予天然序列的人artemin多肽。天然序列的人artemin多肽可含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列。另外，天然序列的人artemin多肽可含有SEQ ID NO：3或者SEQ ID NO：5的氨基酸序列。Artemin的给予可以是全身性的或局部性的，较佳地一周内至少重复两次，持续两周。
本发明的第三个方面是生产工艺，它包括一个容器、在该容器中装有含artemin的药物组合物和以在约0.01g/kg和约1mg/kg之间的剂量给予该药物组合物的说明书。
附图简述
图1描述了成熟的人artemin的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。
图2描述了全长人artemin的一种形式的多核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。
图3描述了图2多核苷酸序列编码的人artemin形式的氨基酸序列(SEQ IDNO：3)。
图4描述了编码人artemin的第二种变体的多核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
图5描述了图4多核苷酸序列编码的人artemin的变体氨基酸序列(SEQ IDNO：5)。
图6描述了衍生自小鼠的编码全长artemin的多肽序列(SEQ ID NO：6)。
图7描述了图6多核苷酸序列编码的小鼠artemin的氨基酸序列(SEQ IDNO：7)。
图8描述了用NGF和artemin全身性治疗的动物热消退潜伏期。在NGF治疗的动物中，热消退潜伏期下降到处理前值的约75％，而用artemin治疗的动物潜伏期没有下降。
图9描述了机械敏感性试验。用NGF全身性治疗的动物的消退阈值下降到它们处理前水平的大约60％，而用盐水或者artemin治疗的动物该阈值逐渐下降到它们处理前水平的约90％。
图10描述了用NGF和artemin局部治疗的动物的热消退潜伏期。热消退潜伏期在用NGF治疗的动物中下降，而在用artemin治疗的动物中保持在它们治疗前的水平。
图11描述了机械敏感性试验。用NGF局部治疗的动物中，消退阈值从处理前的27克的阈值下降到大约22克，而用盐水或者artemin局部治疗的动物中消退阈值没有可见到的下降。
图12显示NGF治疗的动物在两周内损失了它们体重大约7％，而artemin或者盐水治疗的动物损失它们的体重不足2％。
图13显示经NGF持续治疗具有轻微神经损伤的大鼠疼痛行为发生频率增加，而经artemin治疗疼痛行为发生率减少。
图14显示NGF和artemin保护神经元避免了单纯疱疹病毒引起的死亡。
图15显示artemin治疗消除了坐骨神经横切后所见的小感觉神经元肽含量的下降。
图16显示量量测定肽能含量的方法。通过计算沿每条线染色的平均强度，计算出染色强度随背角深度加深的变化。
图17描述了对于坐骨神经损伤的在鼠，以物质P染色的强度对背角表面深度作图，artemin预防了轴突切开术引起的肽损失。
图18显示artemin保护神经元免于轴突切开术引起的C纤维传导速率的改变。
图19显示artemin对新生儿神经元存活，的增强作用需要GFRα3行使功能。在GFRα3敲除小鼠的神经元中，加入artemin没有引起在对照中所见的存活增加。
图20显示外周神经损伤引起GFRα3表达的上调，因此，几乎所有小DRG细胞表达了该受体。在远侧残端可见伴随的artemin上调。
图21显示辣椒素治疗引起中间和外侧背角的物质P含量的深度缺乏。artemin给药完全保护了感觉神经元投射进入背角的肽含量。
图22显示artemin注入脑室防止了与坐骨神经横切相关连的物质P的损失。
发明详述
A. 定义
如本文所使用的，可交换使用的术语“artemin”和“artemin激动剂”，是指天然序列的artemin、artemin的变体、和嵌合性artemin，本文每一个都做定义。任选地，该artemin不伴有天然糖基化。“天然糖基化”指在哺乳动物的细胞中产生artemin时，特别是在细胞中自然产生artemin时，碳水化合物部分与artemin共价结合。因此，在非-人细胞中生产的人artemin是可能“不伴有天然糖基化”的artemin的一个例子。当在如大肠杆菌等原核细胞中产生artemin的情况下，有时artemin可能根本不是糖基化的。
如上文所定义的，artemin核酸是编码artemin多肽的RNA或DNA，或者能与这种DNA或RNA杂交并在严谨杂交条件下保持与之稳定结合，其长度大于约10个核苷酸。严谨条件是(1)使用低离子强度和高温洗涤，例如0.15M NaCl/0.015M柠檬酸钠/0.1％NaDodSO4，50℃，或(2)在杂交过程中使用如甲酰胺等变性剂，例如含有0.1％的牛血清清蛋白/0.1％ Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH 6.5含750mM NaCl的的50％(vol/vol)甲酰胺，75mM柠檬酸钠，42℃。
当把核酸置于功能性关系中时，核酸可操作性地与另一个核酸序列连接。在载体中artemin核酸可与另一个核酸序列操作性地连接，因此它可在一个具体的宿主生物中表达。这可通过本领域熟知的方法进行。例如，一个前序列或分泌性前导序列的DNA与一个多肽的DNA操作性地连接，如果它是作为参与该多肽分泌的前蛋白质表达的；一个启动子或增强子与一编码序列操作性地连接，如果它影响到该序列的转录；或者一个核糖体结合位点与一编码序列操作性连接，如果它定位可促进翻译。通常，“可操作性地连接”是指被连接的DNA序列是毗连的，在分泌性前导序列的情况下，是毗连的并在阅读框中。然而，增强子不必是毗连的。连接可通过在方便的限制性位点进行连接而实现。如果这种位点不存在，则可按照常规方法使用合成的寡核苷酸连接物或接头。
“天然序列的artemin”包括具有与天然产生的artemin相同的氨基酸序列的多肽，不管采取怎样的制备方法。因此，天然序列的artemin可具有天然产生的大鼠artemin、小鼠artemin、人artemin、或任何其它种类哺乳动物的artemin的氨基酸序列。例如，图3和图5显示的两种天然序列全长人artemin氨基酸序列(SEQID NOS：3和5)。这两种序列是人artemin基因中存在两个可能的起始甲硫氨酸而致。图7显示了天然序列小鼠的artemin氨基酸序列(SEQ ID NOS：7)。这种天然序列的artemin多肽可从天然分离得到或通过重组和/或合成方法产生。术语“天然序列的artemin”具体包含天然产生的artemin的前蛋白质、蛋白质和成熟形式和截短形式，天然产生的变异形式(例如交替剪接形式)，和天然产生的等位基因变体。优选的天然序列的artemin是如图1所示的成熟的人天然序列的artemin(SEQ IDNOS：1)。人artemin的成熟形式是在两种全长天然序列之一个中发现的大的前区域的蛋白酶水解切割产物。
“artemin变体”是具有与天然序列artemin多肽的序列(如图1所示的成熟的人artemin)不同的氨基酸序列的生物活性artemin多肽，是通过在天然序列(如图1的序列(SEQ ID NOS：1))中插入、缺失、修饰和/或替换一种或多种氨基酸残基得到的。通常Artemin变体与图1成熟的人artemin(SEQ ID NOS：1)的天然序列artemin的序列相同性低于100％。然而，一般，生物活性artemin变体具有与如图1成熟的人artemin(SEQ ID NOS：1)的天然产生的artemin的氨基酸序列至少约60％的氨基酸序列相同性的氨基酸序列，较佳的至少约65％、70％、75％、80％，以1％递增量增加，优选至少约85％到至少约99％的氨基酸序列相同性。Artemin变体包括，保留了相应天然序列artemin多肽的生物活性的至少5个氨基酸的肽片段，较佳至少10个氨基酸，更佳至少15个氨基酸，还要佳至少20个氨基酸的肽片段。Artemin变体还包括artemin多肽，其特征在于在天然artemin序列的N-或C-端或其中加入一种或多种氨基酸残基。Artemin变体还包括artemin多肽，其中许多氨基酸残基缺失和任选地被一种或多种氨基酸残基替代。Artemin变体还可被共价修饰，例如被不同于天然产生的氨基酸部分替代或通过修饰一个氨基酸残基而产生非天然产生的氨基酸。
关于artemin序列的“氨基酸序列相同性百分比”本文定义为候选序列中与artemin序列中的残基相同的氨基酸残基的百分比，如果需要，经过序列对比和引入缺口后，获得最大百分比的序列相同性，而不考虑作为序列相同性部分的任何保守替代。N-末端、C-末端、或内部延伸、缺失或插入候选的artemin序列都不认为影响序列相同性或同源性。用于对比的方法和计算机程序是本领域熟知的。一种这样的计算机程序为“ALIGN-2”，由Genentech，Inc制作，它及其用户文件已在Washington，D.C.20559的美国版权事务所(United State Copyright Office)申请版权，在那里注册为美国版权注册第TXU 510087号(U.S.Copyright RegistrationNo.510087)。
“嵌合性artemin”分子是含有全长artemin或融合或结合于异源多肽的其一种或多种功能域的多肽。该嵌合artemin分子通常将具有至少一种与天然产生的artemin共同的生物学特性。嵌合性artemin分子的一个例子是用于纯化目的的加尾表位。另一种嵌合性artemin分子是artemin免疫粘附素。
当本文使用术语“加尾表位”时，是指含有与“尾巴多肽”融合的artemin的嵌合多肽。该尾巴多肽具有足够的残基以提供一个表位，针对这一表位可产生抗体，但是它足够短，因此不会干扰artemin的生物活性。较佳的尾巴多肽是完全独特的，所以针对它的抗体基本上不会与其它表位产生交叉反应。合适的尾巴多肽通常具有至少6个氨基酸残基并常常介于约8-50个氨基酸残基之间(较佳地在约9-30个残基之间)。优选的是聚-组氨酸序列，它可与镍结合，从而得以用Ni-NTA层析法分离此种加尾蛋白质(见例如，Lindsay等，Neuron 17：571-574(1996))。
Artemin“激动剂”是具有天然序列artemin的一种或多种生物学特性的分子或化合物。这些可包括、但不限于，小的有机分子、肽、和激动剂抗artemin抗体。
“分离的artemin”是指已从artemin源纯化的或通过重组或合成方法制备并纯化的artemin。纯化的artemin基本上不含其它多肽或肽。这里“基本上不含”是指其它源蛋白的污染少于约5％，较佳少于约2％，更佳少于约1％，还要佳少于约0.5％，最佳少于约0.1％。
“基本纯的”蛋白质是指根据某组合物的总重，含有至少约90％重量的蛋白质的该组合物，较佳至少约95％的重量，更佳至少约90％的重量，还要佳至少约95％的重量。“基本均一的”蛋白质是指根据组合物的总重量，含有至少99％重量的蛋白质的组合物。
当“生物学特性”与“artemin”或“分离的artemin”或artemin的“激动剂”结合使用时，指具有天然序列artemin(不论是其天然或变性构象)所直接或间接引起或行施的效应器功能或抗原功能或活性。效应器功能包括受体结合(较佳地以高亲和力结合)、细胞成活率的提高、分化和/或增殖以及预防损伤引起的细胞，特别是神经元的变化。
当“生物学活性”与“artemin”或“分离的artemin”或artemin的激动剂结合使用时，指显示或具有天然序列artemin的效应器功能的artemin多肽。Artemin的一项主要的效应器功能是它刺激神经元存活的能力。Artemin的另一项主要的效应器功能是它预防损伤引起的神经元变化的能力。不受限制地说优选的生物活性包括促进损伤的神经元细胞体外或体内的发育、增殖、维持和/或再生的能力，包括外周(交感神经、副交感神经、感觉、和肠)神经元、运动神经元、和中枢(脑和脊髓)神经元。特别优选的生物学活性是改善(包括治疗和预防)神经病的能力，例如，外周神经病或其它神经变性疾病，或修复损伤的神经细胞。损伤的神经元可以是感觉、交感神经、副交感神经、或肠神经元，例如背根神经节神经元、运动神经元、和中枢神经元，例如脊髓的神经元。损伤可以是任何原因，包括外伤、毒性剂、其它治疗剂的不良副作用、外科手术、中风、局部缺血、感染、代谢疾病、营养缺乏和各种恶性肿瘤。
“artemin受体”是一种分子，该分子能与artemin结合并介导artemin的生物学性能。
“抗体”(Abs)和“免疫球蛋白”(Igs)是具有相同结构特征的糖蛋白。抗体显示对特异性抗原的结合专一性，而免疫球蛋白包括抗体和缺乏抗原特异性的其它抗体样分子。后一种的多肽，例如，由淋巴系统以低水平产生和骨髓瘤以提高水平产生。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”通常是具有约150,000道尔顿的异质四聚(heterotetrameric)糖蛋白，由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链组成。每个轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键的数量在不同的免疫球蛋白同种型的重链中不同。每个重链和轻链通常还有规律地具有分隔的链内二硫桥。每个重链一端具有一个可变区(VH)随后是一些恒定区。每个轻链一端具有一个可变区(VL)，另一端具有一个恒定区；轻链恒定区与重链的第一恒定区相匹配，轻链可变区与重链可变区相匹配。据认为特殊的氨基酸残基形成轻链和重链可变区之间的界面。
术语“可变的”指抗体中可变区的某些部分序列上存在着广泛不同，并用于各特异性抗体对其特异性抗原的结合和特异性这一事实。然而，可变性并不均匀分布于抗体的整个可变区。它集中于轻链和重链的可变区内，被称为高变区的三个区段中。可变区的较高保守性部分被称做框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各含4个FR(分别为FR1、FR2、FR3和FR4)，大部分采取片层构型，由三个高变区连接，形成环状连接，在有些情况下形成部分的片层结构。每个链的高变区与另一链的高变区由于FR而密切靠近在一起，形成抗体的抗原结合位点(见Kabat等，免疫学感兴趣蛋白质的序列Sequences of Protein of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)，647-699页)。恒定区不直接参与涉及抗体与抗原结合，但显示各种效应器功能，例如抗体参与的抗体依赖性细胞毒性。
本文使用术语“高变区”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。该高变区包括“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即轻链可变区的残基24-34(L1)，50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变区的31-35(H1)，50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，免疫学感兴趣蛋白质的序列Sequences of Protein of Immunological Interest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))，和/或“高变环”的那些残基(即轻链可变区的残基26-32(L1)，50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变区的26-32(H1)，53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.193：901-917(1987))。“框架”或“FR”残基是除本文所定义的高变区残基以外的那些可变区残基。
抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，每个片段具有一个的抗原结合位点，和一个残余的“Fc”片段，其名称反应了其易于结晶的能力。木瓜蛋白酶处理产生一个F(ab’)2片段，它具有两个抗原结合位点并仍能交连抗原。
“Fv”是含有完整抗原-识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由一个重链和一个轻链可变区以紧密的、非-共价结合的二聚体组成的。就是在这种构型中，每个可变区域的三个高变区相互作用，在VH-VL二聚体的表面上限定了抗原结合位点。总起来说，六个高变区赋予了抗体的抗原结合特异性。然而，即使是一个可变区(或仅含有对抗原特异的三个高变区Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力比完整结合位点低。
Fab片段还含有轻链恒定区和重链第一恒定区(CH1)。Fab’片段不同于Fab片段的是其重链CH1区羧基末端增加了几个残基，包括抗体绞链区的一种或多种半胱氨酸。本文Fab’-SH指Fab’，其中恒定区的半胱氨酸残基具有一个游离的巯醇基。F(ab’)2抗体片段起源于链间具有铰链半胱氨酸的Fab’片段对产生。还已知其它化学偶联的抗体片段。
任何种类脊椎动物的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可分为两种明显不同的类型之一，根据它们恒定区氨基酸序列称作kappa(κ)和lambda(λ)。
根据重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的类。这里有五个主要的免疫球蛋白类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，这些类别中的几类可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别被称作α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构就三维构型是熟知的。
本文术语“抗体”使用其最广义，具体包括人、非人(例如小鼠)和人源化的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多-特异性抗体(例如双特异性抗体)，和抗体片段，只要它们显示所需的生物活性。
“抗体片段”含有全长抗体的一部分、通常是其抗原结合区或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；对抗体；线性抗体；单链抗体分子；和抗体片段形成的多特异性抗体。
本文使用的术语“单克隆抗体”指从基本上同型的抗体群中获得的抗体，即该群所含的各个抗体是相同的，除了可能以很少量存在的天然产生的突变外。单克隆抗体是高度特异性的，针对一个抗原位点。而且，与常规的(多克隆)抗体 制剂形成对比，该制剂通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体，每一个单克隆抗体针对抗原上的一种决定簇。修饰词“单克隆的”表示从基本上均一的抗体群获得的抗体的特征，不应认为需要通过任何特殊的方法进行抗体的生产。例如，本发明所用的单克隆抗体可通过Kohler等，Nature 256：495(1975)首先描述的杂交瘤方法制备，或用重组DNA方法制备(见例如，美国专利号4，816，567)。例如还可用Clackson等，Nature 352：624-628(1991)和Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)描述的方法从噬菌体抗体文库中分离该“单克隆抗体”。
本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)及其片段，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自具体动物抗体中的相应序列相同或同源，或属于特殊的抗体类别或亚类，而链的剩余部分与衍生自另一种动物的抗体中的相应序列相同或同源，或属于另一抗体类别或亚类，只要它们显示所需的生物活性(美国专利号4,816,567；和Morrison等，Pro.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
非人(例如小鼠)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者的高变区残基被非人动物(供体抗体)如小鼠、大鼠、家兔或具有所需特异性、亲和力和生产能力的非人灵长类动物的高变区残基所取代。在一些例子中，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基所取代。而且人源化抗体可包含在受者抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进抗体的性能。通常，人源化抗体实质上将包括全部至少一个、通常两个可变区，其中所有或基本上所有的高变区对应于非人免疫球蛋白的高变区，并且所有的或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的一部分。对于进一步详细描述，见Jone等，Nature 321：522-525(1986)：Reichmann等，Nature 332：323-329(1988)和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-598(1992)。
“单链Fv”或“sFv”抗体片段含有抗体的VH和VL区域，其中这些区域以一条多肽链存在。通常，Fv多肽在VH和VL区域之间还含有一个多肽接头，它能够使sFv形成抗原结合的所需结构。SFv的综述见Pluckthun，单克隆抗体的药理学(Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies)，113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，269-315页(1994)。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，这些片段含有与相同多肽链(VH-VL)轻链可变区(VL)相连的重链可变区(VH)。通过采用一个短得而不能使同一链上的两个区域配对的接头，迫使该区域与另一链的互补区域配对而产生两个抗原结合位点。双抗体在以下论文中有更全面地描述，例如EP 404.097；WO93/11161；和Hollinger等，Proc.Natl Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
当本申请使用术语“线性抗体”时，是指在Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)中描述的抗体。简言之，这些抗体含有一对串联的Fd节段(VH-CHl-VH-CHl)，它们形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异或单特异的。
使用的术语“表位”指蛋白质抗原上的(单克隆或多克隆)抗体结合位点。
“激动剂抗体”意思是抗体是一种artemin激动剂，因此具有天然序列artemin的一项或多项生物学特性。
术语“artemin免疫粘附素”可与术语“artemin-免疫球蛋白嵌合体”交换使用，并指一种嵌合分子，该嵌合分子把至少artemin分子(天然的或变体)的一部分与免疫球蛋白序列结合。较佳的免疫球蛋白序列，是免疫球蛋白的恒定区，但不一定是。免疫粘附素可具有人抗体的许多有价值的化学和生物特性。由于免疫粘附素可从具有所需特异性的人的蛋白质序列连接于适当的人免疫球蛋白铰链区和恒定区(Fc)序列而构建，因此可完全采用人的元件获得感兴趣的结合特异性。这种免疫粘附素对患者免疫原性很小，对于前期或重复使用是安全的。
已描述了用于治疗的异质多聚体免疫粘附素的例子，包括用于阻断HIV与细胞-表面CD4结合的CD4-IgG免疫粘附素。从一期临床试验获得的数据(其中CD4-IgG给予刚刚分娩的孕妇)，表明这种免疫粘附素在预防HIV的母-胎转移可能有用(Ashkenazi等，Intern.Rev.Immunol.10：219-227(1993))。还开发了一种与肿瘤坏死因子TNF结合的免疫粘附素。TNF是一种促炎细胞因子，已显示它是脓毒性休克的主要介质。根据脓毒性休克的小鼠模型，显示TNF受体免疫粘附素有希望作为候补物质临床用于治疗脓毒性休克(Ashkenazi，A.等(1991)PNAS USA 88：10535-10539)。ENBREL(etanercept)，一种含有与IgG Fc区域融合的TNF受体序列的免疫粘附素，由美国食品和药物管理局(U.S，Food and Drug Administratin)(FDA)，于1998年11月2日批准用于风湿性关节炎的治疗。2000年6月6日FDA批准在风湿性关节炎治疗中ENBREL的新的扩展应用。对于最近的关于TNF阻断剂包括ENBREL的信息，见Lovell等，N.Engl.J.Med.342：763-169(2000)，和第810-811页所附的编者评论；和Weinblatt等，N.Engl.J.Med.340：253-259(1999)；Maini和Taylor的综述，Annu.Rev.Med.51：207-229(2000)。
如果免疫粘附素结构的两臂具有不同的特异性，与双特异性抗体类似，该免疫粘附素被称作“双特异性免疫粘附素”。Dietsch等，J.Immunol.Methods162：123(1993)描述了这种双特异性粘附素，该粘附素联合了粘附分子E-选择蛋白和P-选择蛋白的胞外结构域，天然情况下，这两种选择蛋白各自在不同类型的细胞中表达。结合研究表明，如此形成的双特异性免疫球蛋白融合蛋白与其衍生的单特异性免疫粘附素相比，具有增强的与髓样细胞系结合的能力。
术语“异质粘附素”与术语“嵌合性异质多聚粘附素”可交换使用，均指一种嵌合分子(氨基酸序列)的复合物，其中每一个嵌合分子结合一个生物活性部分，例如具有多聚化结构域的每个异质多聚受体单体的胞外结构域。“多聚化结构域”能促进异质多聚复合物中嵌合分子的稳定性相互作用。多聚化结构域可通过免疫球蛋白序列、亮氨酸拉链、疏水性区域、亲水性区域、或形成嵌合性异质多聚体的嵌合分子之间分子间二硫键的游离硫醇而相互作用。多聚化结构域可含有免疫球蛋白恒定区。另外，可以工程化改进多聚化区域，这样空间相互作用不仅促进稳定性相互作用，还进一步促进形成异质二聚体超过单体混合物形成的同质二聚体。通过用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链，构建了“突出物”。任选地通过在第二多肽的界面上用较小的氨基酸(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链产生了与该突出物相同或相似大小的补偿性“空穴”免疫球蛋白序列较佳地，是免疫球蛋白恒定区但不一定是。本发明嵌合体中的免疫球蛋白部分可从IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型、IgA、IgE、IgD或IgM获得，但较佳的是IgG1或IgG3。
如本文所使用的，“治疗”是为获得有益的或所需的临床结果的一种方法。为了本发明的目的，有益的或所需的临床结果包括，但不仅限于，症状的缓和、疾病程度的减轻、疾病趋于稳定状态(即没有恶化)、疾病进程延缓或减慢、疾病状态的改善和减轻，和缓解(或部分或全部)，不论可检测或不可检测。“治疗”还意味与若未接受治疗所预期的存活相比，延长了存活。“治疗”是以预防疾病发展或改变疾病病理为目的进行的干预。因此，“治疗”指治疗处理和预防疾病的措施。需要治疗的人包括已经生病的患者以及需要进行疾病预防的人。具体地说，治疗可直接预防、减缓或减少损伤引起的细胞变性病理变化，例如神经细胞病变，或可使细胞，例如神经元对其它治疗剂的治疗更加敏感。在一个较佳的实施例中，治疗减少或减缓了衰退和/或刺激可靶神经元功能的恢复。
(慢性)神经变性疾病或急性神经系统损伤的“病理”包括所有影响患者健康的现象，包括但不限于，神经元机能失调、变性、损伤和/或死亡。
采用的术语“神经变性疾病”和“神经变性失调”，最广义上其病理学包括神经元变性和/或功能失调，包括但不限于，外周神经病；运动神经失调，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)、Lou Gehrig症、Bell麻痹，和各种症状包括脊柱肌肉萎缩或麻痹；和其它人神经变性疾病，例如老年性痴呆症、帕金森症、癫痫症、多发性硬化、亨廷顿氏舞蹈病、唐氏综合征、神经性耳聋和梅尼埃病。
“外周神经病”是一种影响外周神经的神经变性疾病，最常见的表现为一种运动、感觉、运动感觉、或自主功能失调或联合失调。例如外周神经病可遗传获得，可因全身性疾病所致，或可由毒性剂所诱导，例如神经毒性药物，如抗肿瘤制剂，或工业或环境污染物。“外周感觉神经病”以外周感觉神经元的变性为特征，它可能是自发的，例如作为糖尿病的结果(糖尿病性神经病)，癌症中抑制细胞的药物疗法(例如用化学治疗剂长春新碱、顺氯氨铂、氨甲基叶酸、3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷或taxanes，例如紫衫醇[TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ]和多烯紫衫醇[TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France]进行处理)、酒精中毒、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)、或遗传倾向性的结果而发生。遗传获得的外周神经病包括，例如，雷弗素姆氏病、克拉伯病、异染色性脑白质障碍症、法布莱氏病、代-克综合征、无β脂蛋白血症和夏-马-图(CMT)病(也称作进行性肌萎缩症或遗传性运动感觉神经病(HMSN))。大多数类型的外周神经病发展缓慢，经历几个月或几年的病程。在临床实践中这种神经病被称作慢性病。有时外周神经病发展迅速，经历几天的病程，被称作急性病。外周神经病通常一起影响感觉和运动神经以致引起混合的感觉和运动神经病，但也已知道有纯粹的感觉和纯粹的运动神经病。
本发明上下文中使用的术语“毒性剂”指一种物质，通过该物质的化学作用，损伤、削弱、或抑制神经系统成分的活性。有很长的毒性剂(也称作“神经毒剂”)列表包括不限于，化学治疗剂、例如上文所列的酒精、金属工业毒素、食物和药品的污染物等。
为了治疗的目的，“哺乳动物”指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、驯化和饲养的动物，和动物园或运动或宠物动物，如狗、马、羊、猫、牛等。优选的哺乳动物是人。
在本发明的上下文中，术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可相互交替使用，所有这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的(宿主)细胞”包括原代主体细胞和其衍生的培养物，而不考虑转移的数量。还应理解由于故意的或无意的突变，所有子代细胞的DNA含量可能不完全相同。包括对初始转化的细胞作筛选具有相同功能或生物活性的突变体子代。这里意指的不同名称在上下文中是清楚的。
本文所定义的“外源性”元件指对细胞是外来的核酸序列，或与细胞同源但在宿主细胞核酸的位置中通常没有发现该元件。
B.进行本发明的方法
1. Artemin变体的鉴定
除了本文所描述的全长天然序列artemin多肽外，考虑在本发明中可以鉴定、制备和使用artemin变体。可在artemin DNA中引入适当的核苷酸变化制备artemin变体，和/或合成所需的artemin多肽。本领域熟练技术人员将理解氨基酸变化可改变artemin的翻译后加工，例如改变糖基化位点的数量或位置。Artemin变体的产生方法优选与下文详细描述的天然序列artemin的方法相同，唯一的差别是用编码artemin变体的核酸替代编码天然序列artemin的核酸。
在本发明的方法中采用编码artemin的核酸分子。图2和4中显示了编码两个人artemin的全长变体的cDNA(SEQ ID NOS：2和4)，图3和5提供了相应的推断出的氨基酸序列(SEQ ID NOS：3和5)。编码小鼠artemin的cDNA提供于图6中(SEQID NOS：6)，其相应地推断出的氨基酸序列提供于图7中(SEQ ID NOS：7)。本发明中使用的多核苷酸可采用本领域熟练技术人员熟知的标准技术获得，例如杂交筛选和PCR方法。
编码artemin氨基酸序列的任何核苷酸序列可用于产生指导artemin表达的重组分子。另外，本发明的方法还可采用artemin编码序列和异源蛋白质的第二编码序列之间的融合多核苷酸。
为了从编码完全artemin cDNA的任何种类动物克隆全长同源cDNA序列或克隆家族成员或变体形式例如等位基因变体，可从对应于本文公开的cDNA序列的任何部分的片段制得标记的DNA探针，来筛选据认为表达artemin的细胞或组织类型衍生的cDNA文库。更具体地，对应于该编码序列5’或3’末端的寡核苷酸可用于获得较长的核苷酸序列。
可能需要筛选不同组织的多重cDNA文库以获得全长cDNA。在难以鉴定编码完全5’末端编码区域的cDNA克隆的情况下，这是在cDNA克隆中经常遇到的情况，可使用RACE(cDNA末端的快速扩增)技术。RACE是一种被证明的用于扩增不完成的cDNA5’末端的PCR为基础的策略。从含有唯一的锚定序列的人胎盘合成的5’-RACE-Ready RNA可商品化购得(Clontech)。为了获得该cDNA的5’末端，采用提供的锚定引物和3’引物在5’-RACE-Ready RNA上进行PCR。然后使用锚着引物和嵌套3’引物根据制造商的说明进行第二次PCR。一旦获得，可将全长cDNA序列翻译成氨基酸序列并检验某些标志，例如侧接翻译起始点和终止点的连续开放阅读框、潜在的信号序列和最终的整体结构类似于本文所公开的artemin序列。
或者，可采用标记探针通过使用与文所描述的适当严谨条件筛选任何感兴趣生物物的基因的文库。
Artemin编码序列或同源序列的分离可采用根据本文公开的artemin编码序列设计的两个简并寡核苷酸引物库通过聚合酶链反应(PCR)进行。反应的模板可以是通过mRNA的反转录(RT)获得的cDNA，该mRNA可从例如已知或怀疑能表达artemin等位基因的人或非人细胞系或组织制备。
可将PCR产物亚克隆和测序以确保扩增的序列代表artemin编码序列的序列。然后可经各种方法使用此PCR片段来分离全长cDNA克隆。例如，可标记扩增的片段并用于筛选噬菌体cDNA文库。或者，标记的片段可通过筛选基因组文库用于分离基因组克隆。
还可采用PCR技术分离全长cDNA序列。例如，可使用标准方法从适当的细胞或组织源分离RNA。使用对用于引发第一链合成的扩增片段的大多数5’末端特异的寡核苷酸引物，在RNA上进行RT反应。然后对产生的RNA/DNA杂交链可用标准的末端转移酶反应加上鸟嘌呤尾巴，杂交链可用RNA酶消化，然后可用聚-C引物引发第二链的合成。因此，扩增片段上游的cDNA序列可容易地分离。
例如，采用PCR可分离artemin基因的突变体或等位基因变体的cDNA克隆。在这种情况下，可通过寡取-dT寡核苷酸与mRNA杂交合成第一cDNA链，该mRNA分离自己知或怀疑在推测携带突变体artemin等位基因的个体中表达的组织，并通过使用反转录酶延伸新链。然后采用与正常基因5’端特异性杂交的寡核苷酸合成cDNA的第二链。采用这两种引物，然后通过PCR扩增该产物，克隆入适当的载体，并通过本领域熟练技术人员熟知的方法进行DNA序列分析。通过突变体artemin等位基因的DNA序列与正常artemin等位基因的DNA序列比较，可确定造成突变体artemin基因产物功能丧失和改变的突变。
或者，可采用从怀疑或已知携带突变体artemin等位基因的个体获得的DNA，构建基因组文库，或可采用从已知或怀疑表达突变体artemin等位基因的组织获得的RNA，构建cDNA文库。然后可标记未受损伤的artemin基因或其任何适合的片段并用作探针来鉴定这个文库中相应的突变体artemin等位基因。然后可纯化含有突变体artemin基因序列的克隆并根据本领域熟练技术人员所熟知的方法进行序列分析。
另外，可采用例如从RNA合成的cDNA构建表达文库，，该RNA分离自被怀疑或已知携带这种突变体等位基因的已知或怀疑表达突变体artemin等位基因的组织，。以这种方式，可表达从推定的突变体组织制得的基因产物并用标准抗体筛选技术联合针对正常artemin基因产物产生的抗体进行筛选，如下文所述。本文使用的术语核酸、多核苷酸和核苷酸可相互交换使用，指任何核酸，不论是由脱氧核糖核苷或是核糖核苷组成，或者是由磷酸二酯键或修饰的键组成，例如磷酸三酯键、亚磷酰胺、硅氧烷、碳酸盐、羧基甲酯、乙酰胺酯、氨基甲酸、硫醚、桥连亚磷酰胺、桥连甲叉磷酸酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、二硫代磷酸酯、桥连硫代磷酸酯或sultone键，和这些键的联合。
术语核酸、多核苷酸和核苷酸还具体包括由五种生物学发生的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、和尿嘧啶)之外的碱基组成的核酸。例如，本发明的多核苷酸含有至少一种修饰的碱基部分，该部分选自但不仅限于5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基-尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-mannosylqueosine、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、queosine、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氧基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2，6-二氨基嘌呤。
而且，本发明采用的多核苷酸可包含至少一个选自但不限于阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖的修饰的糖部分。
本发明的方法不受多核苷酸的来源所限制。多核苷酸可以来自人或非人哺乳动物、衍生自任何重组体源、体外合成或通过化学合成。核苷酸可以是DNA或RNA并可以双链、单链或部分双链形式存在。
本发明所用的核酸包括(通过实施例但不仅限于)寡核苷酸例如反义DNA和/或RNA；核糖酶；用于基因治疗的DNA；DNA和/或RNA嵌合体；DNA的各种结构形式包括单链DNA、双链DNA、超螺旋DNA和/或三股螺旋DNA；Z-DNA等。核酸可通过任何通常用于大量制备核酸的常规方法制备。例如，可采用商业购得的试剂和合成仪使用本领域熟知的方法化学合成DNA和RNA(见如，Gait，1985，寡核苷酸合成：一种实用的方法Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford，England)。采用质粒如SP65通过体外转录可产生大量的RNA(PromegaCorporation，Madison，WI)。
artemin核酸序列编码的任何mRNA转录物可在本发明的方法中使用，具体包括mRNA前体经交替剪接或加工产生的mRNA转录物。
在一些情况下，当需要增加核酸酶的稳定性时，优选具有修饰的核苷间连接键的核酸。含有修饰的核苷间连接键的核酸也可采用本领域熟知的试剂和方法合成。例如，合成含有膦酸盐硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、亚磷酰胺、甲氧基乙基亚磷酰胺、formacetal、thioformacetal、二异丙基硅烷、乙酰胺酯、氨基甲酸、二亚甲基-硫化物(-CH2-S-CH2)、二亚甲基-亚砜(-CH2-SO-CH2)、二亚甲基-砜(-CH2-SO2-CH2)、2’-O-烷基、和2-脱氧-2’-氟基硫代磷酸核苷间连接键的核酸的方法是本领域熟知的(见Uhlmann等，1990，Chem.Rev.90：543-584；Schneider等，1990，Tetrahedron Lett.31：335和本文引用的参考文献)。
在本发明的一些实施例中，所用的核苷酸是一种异头核苷酸。一个异头核苷酸与互补RNA形成特异性双链杂合体，与通常的单元相反，该双链相互平行(Gautier等，1987，Nucl.Acids Res.15：6625-6641)。该核苷酸是2-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等，1987，Nucl.Acids Res.15：6131-6148)，或嵌合性RNA-DNA类似物(Inoue等，1987，FEBS Lett.215：327-330)。
可使用本领域熟知的任何适当的方法纯化此核酸。例如，此核酸可使用反向或离子交换HPLC、大小排阻层析或凝胶电泳进行纯化。当然，本领域熟练技术人员将认识到纯化方法将部分取决于待纯化的DNA的大小。
具有artemin编码序列或其互补序列的至少10个核苷酸(即可杂交的部分)的分离或纯化的多核苷酸，也可用于本发明的方法中。在其它实施例中，此多核苷酸含有artemin编码序列的至少25个(连续的)核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、或200个核苷酸，或全长artemin编码序列。核酸可以是单链或双链的。另外，本发明涉及选择性地与上述编码序列的互补体杂交的多核苷酸。在较佳的实施例中，此多核苷酸含有至少10、25、50、100、150或200个核苷酸或全长artemin编码序列。
编码artemin突变体、artemin的肽片段、artemin的截短形式和artemin融合蛋白的核苷酸序列也可用于本发明的方法中。编码融合蛋白的核苷酸可包括但不限于：全长artemin序列、artemin的截短形式、或编码与无关的蛋白质或肽融合的artemin肽片段的核苷酸，例如，与IgFc区融合的结构域，它提高了产生的融合蛋白(例如artemin-Ig)在血流中的稳定性和半衰期；或者与酶例如荧光蛋白或发光蛋白融合，它们可用作标记物。
而且，artemin多核苷酸变体可至少部分通过某种形式的直接演化而产生，例如基因改组和/或循环序列重组，描述见美国专利号5,605,793，和5837458这里全文引入作为参考，可用于本发明的方法。例如，采用这种技术可以使用artemin编码序列，或多个artemin编码序列作为新序列产生的起始点，该新序列编码具有改变的功能和/或结构特征的功能和/或结构相似的蛋白质。
上述编码artemin多核苷酸序列的高度相关的基因同系物，也可用于本发明。高度相关的基因同系物是编码蛋白质的多核苷酸，该蛋白质至少约60％的氨基酸序列与天然产生的artemin的氨基酸序列相同，如图1中的成熟的人artemin(SEQ IDNOS：1)，较佳地至少约65％、70％、75％、80％，以1％的递增量，氨基酸序列的相同性优选地从至少约85％增加到至少约99％。高度相关同系物可编码与artemin共享功能活性的蛋白质。
通过采用(a)含有任何前述artemin编码序列和/或它们的互补序列(即反义)的DNA载体；(b)含有任何前述artemin编码序列的DNA表达载体，该artemin编码序列与指导编码序列表达的调控元件操作性连接；(c)含有任何前述artemin编码序列的基因工程改造的宿主细胞，该artemin编码序列与宿主细胞中指导编码序列表达的调控元件操作性连接；和(d)在外源引入的调控元件的控制下(即基因活化)表达内源artemin基因的基因工程改造的宿主细胞，本发明的方法也是有利的。
例如可采用美国专利5,364,934中提出的用于保守或非保守性突变的技术和方法制备天然序列的artemin中或本文描述的artemin的各结构域中的变异。变异可以是替换、缺失或加入一种或多种编码artemin的密码子，结果产生与天然序列artemin相比artemin的氨基酸序列的变化。变异任选地通过在artemin的一种或多种结构域内用其它氨基酸替换至少一个氨基酸。确定哪一个氨基酸残基可被插入、替换或缺失而对所需的活性没有不良影响的方法，可通过artemin序列与已知蛋白质分子的同源序列的比较，和使高度同源区域中制备的氨基酸序列的变化数量最少而建立。氨基酸替换可能是用另一个具有相似结构和/或化学特性的氨基酸替换一个氨基酸的结果，例如用丝氨酸替换亮氨酸，即保守氨基酸的替换。插入或缺失可任选地在约1-5个氨基酸的范围内。可通过在序列中系统地进行氨基酸的插入、缺失或替换以及检测所产生的变体的活性来确定允许的变异，该活性是由全长或成熟天然序列所显示的。
Artemin多肽片段也可用于本发明的方法。这种片段在N-末端或C-末端可以是截短的，或与全长天然蛋白质比较时可缺少内部残基。某些片段所缺少氨基酸残基对于artemin多肽所需的生物活性不是必需的。
可使用许多常规技术的任何一种制备artemin片段。可以化学合成所需的肽片段。另一个方法包括使用酶切消化产生artemin片段，例如，使用已知能在特定氨基酸残基所确定的位点切割蛋白质的酶处理该蛋白质，或者使用适当的限制性酶消化DNA和分离所需的片段来产生artemin片段。然而另一个适合的方法包括使用聚合酶链反应(PCR)分离和扩增编码所需多肽片段的DNA片段。在PCR中，在5’和3’引物处采用确定DNA片段所需末端的寡核苷酸。较佳地，artemin多肽片段与图1中所示的天然artemin多肽(SEQ ID NOS：1)共有至少一种生物和/或免疫活性。
在一个具体的实施例中，感兴趣的保守性替换见表1优选替换的标题下。如果这种替换导致生物活性的改变，那么引入表1称为示范性替换的、或者参考下文氨基酸分类而进一步描述的更多的变化，并筛选产物。
                        表       1
  原先的残基         示范性替换    优选替换
    Ala(A)        val；leu；ile       val
    Arg(R)        lys；gln；asn       lys
    Asn(N)     gln；his；lys；arg       gln
    Asp(D)            glu       glu
    Cys(C)            ser       ser
    Gln(O)            asn       asn
    Glu(E)            asp       asp
    Gly(G)          pro；ala       ala
    His(H)     asn；gln；lys；arg       arg
    Ile(I)   leu；val；met；ala；phe
        正亮氨酸       leu
    Leu(L)    正亮氨酸；ile；val
      met；ala；phe       ile
    Lys(K)       arg；gln；asn       arg
    Met(M)       leu；phe；ile       leu
    Phe(F)   leu；val；ile；ala；tyr       leu
    Pro(P)            ala       ala
    Ser(S)            thr       thr
    Thr(T)            ser       ser
    Trp(W)          tyr；phe       tyr
    Tyr(Y)     trp；phe；thr；ser       phe
    Val(V)     ile；leu；met；phe
       Ala；正亮氨酸       leu
通过选择性替换实现Artemin多肽的功能或免疫相同性的实质性修饰，这种替换在它们对保持(a)替换区域内多肽主链的结构，例如片层或螺旋构象(b)分子在靶位点的电荷或疏水性，或(c)侧链的大小上效果显著不同。天然产生的残基根据共同的侧链特性被分为几组：
(1)亲水性残基：正亮氨酸、met、ala、val、leu，ile；
(2)中性亲水残基：cys、ser、thr；
(3)酸性残基：asp、glu；
(4)碱性残基：asn、gln、his、lys、arg；
(5)影响链取向的残基：gly、pro、和
(6)芳香族残基：trp、tyr、phe。
非保守性替换将把这些类别之一的一个成员换成另一个类别。还可将这种替换的残基引入保守替换位点，或更佳地，引入剩余(非保守)位点。
可采用本领域已知的方法制备这些变体，例如寡核苷酸介导的(定点)诱变，丙胺酸扫描和PCR诱变。定点诱变[Carter等，Nucl.Acids.Res.，13：4331(1986)；Zoller等，Nucl.Acids.Res.，10：6487(1987)]。盒式诱变[Wells等，Gene，34：315(1985)]限制性选择诱变[Wells等Philos.Trans.R.Soc.London SerA，317：415(1986)]或其它已知可在克隆DNA上进行以产生artemin变体DNA的技术。
还可采用扫描性氨基酸分析鉴定沿着一毗连序列的一种或多种氨基酸。优选的扫描性氨基酸是相对小的中性氨基酸。这种氨基酸包括丙胺酸、甘氨酸、丝氨酸和半胱氨酸。丙氨酸是这些组别中通常优选的扫描氨基酸，因为它消除了β-碳侧链并且不太可能改变变体的主链构象[Cunningham和Wells，Science，244：1081-1086(1989)]。丙氨酸还是通常优选的因为它是最常见的氨基酸。而且，经常可以在埋藏和显露位置发现它[Creighton，蛋白质The Proteins(W.H.Freeman和Co.，N.Y.)；Chothia，J.Mol.Biol.，150：1(1976)]。如果丙氨酸替换没有产生足够数量的变体，可使用同位氨基酸。
2.  Artemin和artemin变体的产生
适合于artemin和artemin变体产生的技术是本领域所熟知的。因为优选的技术对于artemin和artemin变体是相同的，所以下文描述的技术适用于artemin变体以及天然序列的artemin。
优选的产生方法包括从多肽的内生源分离artemin，肽合成(采用肽合成仪)和重组技术(或这些技术的任何组合)。使用重组技术制备artemin的方法描述见Baloh等，Neuron21：1291-1302(1998)和WO 00/18799。下文描述了其它重组技术。
下文大部分的讨论涉及通过培养用含有artemin核酸的载体转化的细胞和从细胞培养物中回收多肽重组产品artemin的方法。还进一步预想本发明的artemin可通过同源重组产生，如WO 91/06667，1991年5月16日公开内容所提供的。
简言之，该方法包括用一构建物(即载体)转化含有artemin编码基因的原代人细胞，该构建物含有一个可扩增的基因(如二氢叶酸还原酶(DHFR)或下文讨论的其它基因)和至少一个长度至少约为150bp的侧翼区，该侧翼区与artemin基因的编码区的基因座上的DNA序列同源以保证artemin基因的扩增。此可扩增的基因必须位于不干扰artemin基因表达的位点。进行转化，这样此构建物同源整合入该原代细胞的基因组中以确定可扩增区域。
然后借助此可扩增的基因或存在于此构建物中的其它标记物选出含有此构建物的原代细胞。标记基因的存在确定了此构建物的存在和整合进入宿主基因组。不需要进行原代细胞的进一步挑选，因为将在第二宿主中进行选择。如果需要，当存在正确的同源性整合体的DNA和仅扩增含有这些片段的细胞时，同源重组的发生可通过采用PCR和测定所产生的扩增的DNA序列或测定PCR片段的适当长度而确定。还有如果需要，此时可用适当的扩增剂(如果可扩增的基因是DHFR，采用氨甲蝶呤)给细胞加压来扩增选出的细胞，这样可获得靶基因的多个拷贝。然而较佳地，直到下文描述的第二次转化后才进行扩增步骤。
选择步骤后，将足够大的包括全部扩增区的基因组的DNA部分与选择的原代细胞分离。然后用这些基因组DNA部分转化第二哺乳动物表达宿主细胞并克隆，选择含有扩增区的克隆。如果在原代细胞中没有扩增，那么借用扩增剂扩增该扩增区域。最后，培育现已包含含有artemin的扩增区的多个拷贝的第二表达宿主细胞以表达该基因和产生蛋白质。
编码artemin的DNA可从具有artemin RNA并以可检测的水平表达它的组织的cDNA文库获得。因此，artemin DNA可方便地从制备的cDNA文库获得，例如，从多种人组织中获得。编码artemin的基因还可从基因组文库或通过寡核苷酸合成获得。
采用设计用于鉴定感兴趣基因或其编码蛋白质的探针(例如artemin的抗体或约20-80个碱基的寡核苷酸)筛选基因文库。用选择的探针筛选cDNA或基因文库也可采用标准方法进行，该方法描述见Sambrook等，分子克隆：实验室手册，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)的10-12章。分离编码artemin的基因的另一个方法是使用上文Sanbrook等14节描述的PCR方法。
分离artemin cDNA的优选方法是采用仔细选择的寡核苷酸序列筛选各种人组织的cDNA文库。选择作为探针的寡核苷酸序列应足够长并足够明确，此将假阳性减到最小。优选的序列可从本文公开的天然产生的artemin获得。
必须标记此寡核苷酸，这样可根据被筛选的基因文库中与DNA的杂交来检测它。优选的标记方法是如本领域所熟知的使用具有多核苷酸激酶的32P-标记的ATP来放射性标记此寡核苷酸。然而，也可使用其它的方法，包括但不限于，生物素化或酶标记来标此记寡核苷酸。
可将编码artemin的核酸(例如cDNA或基因组DNA)插入一可复制载体作进一步克隆(DNA扩增)或表达。许多载体可以购得。载体成分通常包括但不仅限于，一种或多种如下成分：一个单链、复制起始位点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、转录终止序列。
本发明的artemin不仅可直接重组生产，还可作为与异源多肽融合的多肽，异源多肽较佳地是信号序列或其它在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特异性切割位点的多肽。通常，信号序列可以是载体的一种成分，或者它可以是插入载体的artemin DNA的一部分。选择的异源信号序列较佳地是可被宿主细胞识别和加工(即被信号肽酶切割)的信号序列。对于不能识别和加工天然artemin信号序列的原核宿主细胞，此信号序列可用选自，例如，碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒素II前导序列的原核细胞信号序列替换，。对于酵母分泌，天然信号序列可由例如酵母转化酶前导序列、凝血因子前导序列(包括酿酒酵母和克鲁维酵母因子前导序列，后者描述见1991年4月23日发表的美国专利5,010,182号)、或酸性磷酸酶前导序列、C.albicans葡糖淀粉酶前导序列(发表于1990年4月4日的EP362,179)、或描述于1990年11月15日发表的WO 90/13646中的信号序列所替换。在哺乳动物细胞表达中，天然信号序列(例如通常指导体内人细胞artemin分泌的artemin前序列)是令人满意的，虽然其它哺乳动物的信号序列可能是适合的，例如其它动物artemin的信号序列，和相同或相关种类动物分泌性的多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹Gd信号序列。
将这种前体区域的DNA在阅读框中与编码成熟artemin或其可溶变体的DNA连接。
表达和克隆载体都含有能使此载体在一种或多种选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中这种序列是一种能使此载体独立于宿主染色体DNA而复制的序列，并包括复制起点或自主复制序列。这种序列对于各种细菌、酵母和病毒是熟知的。质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰阴性菌，2个质粒起点适用于酵母，和各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，复制成分的起点对于哺乳动物表达载体是不需要的(通常使用SV40起点，因为它含有早期启动子)。
大部分的表达载体是“穿梭”载体，即，它们在至少一类生物中能够复制，但可被转染进入另一生物以进行表达。例如，将一个载体克隆于大肠杆菌中，然后将相同的载体转染进入酵母或哺乳动物细胞以进行表达，即使它不能独立于宿主细胞的染色体进行复制。
还可通过插入到宿主基因组中来扩增DNA。这采用芽胞杆菌属细菌作为宿主很容易完成，例如，采用包含于载体中的DNA序列，该序列与芽胞杆菌属基因组DNA中发现的序列互补。用这种载体转染芽胞杆菌导致基因组的同源重组和arteminDNA的插入。然而，编码artemin的基因组DNA的回收比外源复制的载体的回收更加复杂，因为需要限制酶消化切除artemin DNA。
表达和克隆载体应含有一选择基因，也称作选择标记。该基因编码转化的宿主细胞在选择性培养基中存活和生长所必需的蛋白质。未被含有该选择基因的载体转化的宿主细胞在培养基中将不能存活。典型的选择基因编码的蛋白质能(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如，对氨卡青霉素、新霉素、氨甲基叶酸或四环素的抗性，(b)补充营养缺陷型的不足，或(c)提供复合培养基不能得到的关键性营养素，例如编码牙胞杆菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。
选择方案的一个例子利用一种药物阻止宿主细胞的生长。 用异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，并因此使选择方案成功。这种显性选择的例子采用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。
用于哺乳动物细胞的适当的选择性标记的另一个例子，是能够鉴定有能力摄入artemin核酸的细胞的那些标记，例如DHFR或胸苷激酶。将哺乳动物细胞转化体，置于只有摄入此标记物的转化体才能存活的选择性压力下。在培养基中选择性试剂的浓度相继改变的条件下培养此转化体施加选择压力，因此导致此选择基因和编码artemin的DNA的扩增。扩增是一个过程，通过该过程，对于生长至为关键的蛋白质的生产有更大需求的基因，在重组细胞的延续后代的染色体中串联性复制。从扩增的DNA合成了数量增加的artemin。其它可扩增基因的例子包括金属硫蛋白-I和-II，较佳地是灵长类动物的金属硫蛋白基因，腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。美国专利第5,561,053号提供了一个优选的载体系统。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞首先通过在含有氨甲叶酸(Mtx)(一种DHFR的竞争性拮抗物)的培养基中培养所有的转化体而得以鉴定。当使用野生型DHFR时，适当的宿主细胞是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980)所描述进行了制备和繁殖。然后使该转化的细胞接触水平增加的氨甲叶酸。这导致多拷贝DHFR基因的合成，以及伴随地，多拷贝的含有表达载体的其它DNA例如编码artemin的DNA的合成。该扩增技术可采用任何其它适合的宿主，例如ATCC No.CCL61 CHO-K1， 虽然存在内源性DHFR，例如，可使用对Mtx具有高度抗性的突变体DHFR基因(EP 117,060)。
或者用编码artemin的DNA序列宿主细胞(具体是含有内源DHFR的野生型宿主)，野生型DHFR蛋白质、和另一个选择标记例如氨基糖苷3’-磷酸 转移酶(APH)转化或共转化的，可通过培育于含有选择试剂的培养基的细胞进行选择。选择标记例如有氨基糖苷类抗生素，如卡那霉素、新霉素、或G418。见美国专利4,965,199。
用于酵母的适合的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp 1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979))。该trp 1基因可向在色氨酸中缺乏生长能力的酵母突变株，例如ATCC No.44076或PEP4-1提供选择标记。Jones，Genetics，85：12(1977)。存在于酵母宿主细胞基因组中trp 1的损伤然后提供了通过在缺乏色氨酸时的培育检测转化的有效环境。类似地，可用具有Leu2基因的已知质粒补充Leu2-缺陷酵母菌株(ATCC 20,822或38,626)。
另外，衍生自1.6m环形质粒pKD1的载体可用于克鲁维酵母的转化。Bianchi等，Curr.Genet.，12：185(1987)。最近，报道了用于K.乳糖醇的大规模生产重组小牛凝乳蛋白酶的表达系统。Van den Berg，Bio/Technology，8：135(1990)。还公开了使用克鲁维酵母的工业菌株用于成熟重组人血清白蛋白分泌的稳定的多拷贝表达载体。Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991)。
表达和克隆载体通常含有一个可为宿主生物识别并操作性连接于artemin核酸的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5’)的非翻译性序列(通常在100-1000个bp内)，它控制具体核酸序列例如与它们操作性连接的artemin核酸序列的转录和翻译，。这种启动子通常分为两类，可诱导的和组成型启动子。可诱导的启动子是对培养条件的一些变化(例如存在或缺乏营养素或温度的改变)的反应中诱导在它们控制下的DNA转录水平提高的启动子。目前已经知道各种潜在的宿主细胞所识别的许多启动子。这些启动子经限制酶消化从源DNA除去启动子与artemin编码DNA操作性连接并将分离的启动子序列插入载体。天然artemin启动子序列和许多异源启动子可用于指导artemin DNA的扩增和/或表达。然而，异源启动子是优选的，因为与天然artemin启动子比较时它们通常允许artemin更大量的转录和更高的产量。
适合原核宿主使用的启动子包括-内酰胺酶和乳糖启动子系统(Chang等，Nature，275：615(1978)；Goeddel等，Nature，281：544(1979))，碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)；EP 36，776)，和杂交启动子例如tac启动子。DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，80：21-25(1983)。但是，其它已知的细菌启动子是适合的。已公开了它们的核苷酸序列，因此能使熟练的工作人员采用提供所需限制位点的接头或衍接将它们与编码artemin的DNA操作性连接(Siebenlist等，Cell，20：269(1980)。在细菌系统中使用的启动子还将包含一个操作性连接于编码artemin的DNA的Shine-Delgarno(S.D.)序列。
对于真核细胞的启动子序列是已知的。实际上所有真核细胞基因都具有位于转录起始位点的上游约25-30个碱基的AT-富含区。发现位于许多基因转录起始位点上游70-80个碱基的另一个序列是CXCAAT区，其中X可以是任何核苷酸。大多数真核生物基因的3’末端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3’末端添加poly-A尾巴的信号。所有这些序列都适合插入真核细胞的表达载体中。
酵母宿主适合的启动序列例子包括3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等，J.Biol.Chem.，255：2073(1980))或其它糖酵解酶(Hess等，J.Adv.Enzyme Reg.，7：149(1968)；Holland，Biochemistry，17：4900(1978)，例如烯醇化酶、甘油醇-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、果糖磷酸激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡糖异构酶、和葡糖激酶。
其它酵母启动子，是具有受生长条件控制的转录的额外优点的可诱导的启动子，有乙醇脱氢酶2、同种细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢相关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醇-3-磷酸脱氢酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。酵母表达中使用的适当的载体和启动子进一步描述见EP 73,657。酵母增强子与酵母启动子一起使用也是有优点的。
例如，从以下病毒基因组获得的启动子可控制从哺乳动物宿主细胞载体转录artemin，例如从多瘤病毒、鸡痘病毒(发表于1989年7月5日的UK 2,211,504)、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和最佳的是猿猴病毒40(SV 40)，异源哺乳动物的启动子，例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子获得的启动子，热休克蛋白启动子，和通常与artemin序列连接的启动子获得的启动子，只要这种启动子与宿主细胞系统相容。
SV40病毒的早期和晚期启动子常规作为SV限制片段获得，该片段也含有SV40病毒复制起点。Fiers等Nature，273：113(1978)；Mulligan等，Science，209：1422-1427(1980)；Pavlakis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：7398-7402(1981)。人巨细胞病毒的立即早期启动子常规作为HindIII E限制片段获得。Greenaway等，Gene，18：355-360(1982)。在美国专利4,419,446中公开了哺乳动物宿主中使用的牛乳头瘤病毒作为载体的表达DNA的系统。该系统的改进描述见美国专利4,601,978。还见Gray等，Nature，295：503-508(1982)关于在猴子细胞中表达编码免疫干扰素的cDNA；Reyes等，Nature，297：598-601(1982)关于在单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子的控制下小鼠细胞表达人干扰素cDNA；Canaani等；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：5166-5170(1982)关于在培养的小鼠和家兔细胞中表达人干扰素1基因；和Gorman等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：6777-6781(1982)关于在CV-1猴肾细胞、鸡胚成纤维细胞、中华仓鼠卵巢细胞、海拉细胞和小鼠NIH-3T3细胞中使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子，表达细菌CAT序列。
在载体中插入一个增强子序列常能增加高等真核生物转录编码本发明artemin的DNA。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10-300bp，它作用于启动子以增加其转录。增强子是取向和位置相对独立的，在内含子中(Banerji等，Cell，33：729(1983))，以及在编码序列本身中，已发现它们位于转录单元的5’(Laimins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：993(1981))和3’端(Lusky等，Mol.Cell Bio.，3：1108(1983))。Osborne等，Mol.Cell Bio.，4：1293(1984)。现已知许多来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的增强子序列。然而，人们通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括位于复制起始与的晚期侧的SV40增强子(bp100-270)，巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起始占晚期侧的多瘤病毒增强子和腺病毒增强子。也见Yaniv，Nature，297：17-18(1982)关于活化真核生物启动子的增强元件。增强子可在artemin编码序列的5’或3’位置剪接进入载体，但是它宜定位于启动子的5’位点。
用于真核生物宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人，或其它多细胞生物的有核细胞)的表达载体还将含有转录终止和稳定mRNA所必需的序列。这种序列常可从5’，有时从3’，真核生物或病毒DNA或cDNA的非翻译区得到。这些区域含有转录的核苷酸区段作为编码artemin的mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酸化片段。
含有一种或多种上述成分的适当载体的构建可采用标准的连接技术。切割分离的质粒或DNA片段、定制和以所需形式重连接以产生所需的质粒。
为了分析以证实所构建的质粒中具有正确的序列，使用连接混合物转化大肠杆菌K12菌株294(ATCC 31，446)并在适当时用氨卡青霉素或四环素抗性选择成功的转化株。制备转化株的质粒，经限制性内切酶消化分析，和/或采用Messing等，Nucleic Acids Res.，9：309(1981)的方法或Maxam等，酶学中的方法Methods inEnzymology，65：499(1980)的方法测序。
在artemin和artemin变体的制备中特别有用的表达载体，是用于在哺乳动物细胞中表达编码artemin的DNA的表达载体。通常，瞬时表达包括采用能够在宿主细胞中有效复制的表达载体，这样宿主细胞累积了许多拷贝的表达载体，进而合成高水平的表达载体编码的所需多肽。Sambrook等，见上文，16.17-16.22页。含有适当的表达载体和宿主细胞的瞬时表达系统，，得以方便地正鉴定克隆的DNA所编码的多肽，以及快速筛选具有所需生物或生理特性的多肽。因此，为了鉴定具有生物活性的artemin的同系物和变体，瞬时表达系统在本发明中特别有用。
适合于在重组脊椎动物细胞培养物中合成artemin的其它方法、载体和适当的宿主细胞描述见Gething等，Nature，293：620-625(1981)；Mantei等，Nature，281：40-46(1979)；EP117060和EP 117,058。对哺乳动物细胞培养表达artemin的特别有用的质粒是pRK5(EP 307,247)或发表于1991年6月13日的pSV16B.WO91/08291。
克隆和表达本文载体中的DNA的合适宿主细胞是上述的原核生物、酵母或高等真核生物细胞。用于本发明目的的合适的原核生物包括真细菌、例如革兰阴性或革兰阳性菌，例如，肠杆菌科如埃希菌属，如大肠杆菌、肠杆菌属、欧文菌属、克氏杆菌属、变形杆菌属、沙门菌属例如鼠伤寒沙门菌、沙雷菌属例如Serratiamarcescans，和志贺菌属，以及杆菌例如B.subtilis和B.licheniformis(例如1989年4月12日发表的00266，710所公开的B.licheniformis 41P)，假单胞杆菌属例如P.aeruginosa，和链霉菌属。虽然其它菌株例如E.coliB、E.coliX 1776(ATCC31，537)和R.coli W3110(ATCC 27，325)是适合的，一种优选的大肠杆菌克隆宿主是E.coli294(ATCC 31，446)。这些例子是举例说明而不是限制。菌株W3110是特别优选的宿主或亲代宿主，因为它是重组DNA产物发酵的常用宿主菌株。较佳地，宿主细胞应分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可修饰菌株W3110以在编码蛋白质的基因中实现一基因突变，这种宿主的例子包括E.coliW3110菌株27C7。27C7的完全基因型是tonA ptr3 phoA E15(argF-lac)169 ompT degP41kan。1991年10月30日将菌株27C7以ATCC编号.55,244储存于美国典型培养物保藏中心American TypeCulture Collection。另外，可使用1990年8月7日签发的美国专利4,946,783公开的具有突变性周质蛋白酶的大肠杆菌菌株。另外，克隆的方法，即PCR或其它核酸聚合酶反应是适用的。
除原核微生物外，真核微生物例如丝状真菌或酵母菌是artemin编码载体的适合的克隆和表达宿主。酿酒酵母、或普通面包酵母是在低等真核宿主微生物中最通常使用的。然而，许多其它菌属、菌种和菌株是通常可得到和用于本文的，例如pombe酵母菌(Beach等，Nature，290：140(1981)；1985年5月2日发表的EP139,383)；克鲁维酵母菌属宿主(美国专利4,943,529；Fleer等，见上文)例如K.lactis(MW98-8C，CBS683，CBS4574；Louvencourt等，J.Bacteriol.，737(1983))，K.fragilis(ATCC 12，424)，K.bulgaricus(ATCC 16，045)，K.wickeramii(ATCC24，178)，K.waltii(ATCC 56，500)，K.drosophilarum(ATCC 36，906；Van den Berg等，见上文)K.thermotolerans，和K.marxianus；yarrowia(EP 402,226)；Pichiapastoris(EP 183,070；Sreekrishna等，J.Basic Microbiol.，28：265-278(1988))；念珠菌属；木霉菌属reesia(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；脉孢菌属crassa(Neurospora crassa)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：5259-5263(1979))；Schwanniomyces例如Schwanniomyces occidentalis(发表于1990年10月31日的EP 394,538)；和丝状真菌例如脉孢菌属、青霉属、Tolypocladium(1991年1月10日发表的WO 91/00357)和曲霉菌属宿主例如A.nidulans(Ballance等，Biochem.Biophys.Res.Commun.112：284-289(1983)；Tiburn等，Gene，26：205-221(1983)；Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：1470-1474(1984))和黑曲霉(A.niger.)Kelly等，EMBO J.，4：475-479(1985)。
用于糖基化artemin表达的适合的宿主细胞衍生自多细胞生物。这种宿主细胞能够复合加工和糖基化活性。原则上，从脊椎动物或非脊椎动物培养物获得的任何高等真核细胞培养物都能工作。非脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。来自宿主的许多杆状病毒株和变体以及相应的许可性昆虫宿主细胞例如有已鉴定的草地夜蛾(毛虫)、埃及伊蚊(蚊子)、果蝇属melanogaster(果蝇)、和家蚕。见如Luckow等，Bio/Technology，6：47-55(1988)；Miller等，基因工程GeneticEngineering，Setlow等编，第8卷(Plenum Publishing，1986)277-279页；和Maeda等，Nature，315：592-594(1985)。用于转染的各种病毒株是可公开获得的，例如桃木属加州NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，并根据本发明这种病毒可用作本文的病毒，具体用于表皮球菌细胞的转染。
棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛花、番茄和烟草的植物细胞培养物可用作宿主。通常，通过与细菌根癌土壤杆菌的某些菌株一起培养转染植物细胞，它经事先处理以含有artemin编码DNA。在植物细胞培养物与根癌土壤杆菌共同培育的过程中，编码artemin的DNA转移进入植物细胞宿主，这样植物细胞被转染，并将在适当的条件下表达artemin编码DNA。另外，调节和信号序列应与获得的植物细胞相容，例如胭脂碱合成酶启动子和聚腺苷酸化信号序列。Depicker等，J.Mol.Appl.Gen.，1：561(1982)。另外，从T-DNA780基因的上游区域分离的DNA区段能够活化或增加植物可表达基因在含有重组DNA的植物组织中的转录水平。发表于1989年6月21日的EP 321,196。
然而，在脊椎动物细胞中最有趣的培养物中脊椎动物细胞的增殖(组织培养)已成为常规程序。见如，组织培养Tissue Culture，Academic Press，Kruse和Patterson，编，(1973)。有用的哺乳动物宿主细胞系例子是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系(用于在悬浮培养物中生长的293或293亚克隆细胞，Graham等，J.Gen.Virol.，36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中华仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV 1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝脏细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝脏细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳房肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.，383：44-68(1982))；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(HepG2)。
转染宿主细胞，优选用上述表达或克隆载体转化进行artemin的生产，并在经适常规营养培养基中培养，用于诱导型启动子、选择转化体、或扩增编码所需序列的基因。
转染指宿主细胞摄入表达载体，无论实际上是否表达了任何编码序列。许多转染方法是普通技术人员已知的，例如CaPO4和电穿孔。当在宿主细胞中发生该载体运作的各种指示时通常认可为转化成功。
转化意味着引导DNA进入生物机体，因此或者作为染色体外元件或者通过染色体整合，该DNA可复制。取决于所用的宿主细胞，采用适合于这些细胞的标准方法进行转化。如上文Sambrook等的1.82节描述采用氯化钙进行钙处理，或对于原核细胞或其它含有大量细胞壁屏障的细胞通常采用电穿孔。如Shaw等，Gene，23：315(1983)和1989年6月29日发表的WO 89/05859所描述，用根癌土壤杆菌感染用于某些植物细胞的转化。另外，如1991年1月10日发表的WO 91/00358中描述，可使用超声处理转染植物。
对于不具有这种细胞壁的哺乳动物细胞，Graham等，Virology，52：456-457(1978)所描述的磷酸钙沉淀方法是优选的。哺乳动物细胞宿主转化一般的状况描述见1983年8月16日签发的美国专利4,399,216。通过根据Van Solingen等，J.Bact.，130：946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，76：3829(1979)的方法进行酵母的转化。然而，也可使用引导DNA进入细胞的其它方法例如通过细胞核显微注射、电穿孔、细菌原生质体与完整细胞的融合、或聚阳离子，例如聚凝胺、聚鸟氨酸等。对于转化哺乳动物细胞的各种技术，见Keown等，酶学中的方法Methods in Enzymology，185：527-537(1990)和Mansour等，Nature，336：348-352(1988)。
如上文Sanbrook等一般描述的，用于生产本发明artemin多肽的原核细胞在适当的培养基中培养。
用于生产本发明artemin的哺乳动物宿主细胞可在各种培养基中培养。商业购得的培养基例如Ham’F10(Sigma)、极限必需培养基Minimal EssentialMedium((MEM)，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium((DMEM)，Sigma)适用于培养此宿主细胞。另外，Ham等.Meth.Enz.，58：44(1979)，Barnes等，Anal.Biochem.，102：255(1980)美国专利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/034030；WO 87/00195；或U.S.Patent Re.30,985描述的任何培养基可用作此宿主细胞的培养基。任何这些培养基可根据需要添加激素和/或其它生长因子(例如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(例如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(例如HEPES)、核苷(例如腺苷和胸苷)、抗生素(例如GENTAMYCINTM药物)、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的最低浓度存在的无机化合物)，葡萄糖或等价能源。还包括本领域熟练技术人员已知的适当浓度的任何其它需要的添加物 。培养条件例如温度、pH等，是事先选择用于所选宿主细胞表达的那些条件，是普通技术人员懂得的。
通常，使哺乳动物细胞培养的产量最大化的原理、方法和实用技术可在“哺乳动物细胞生物技术：一种实用方法”(Mammalian Cell Biotechnology：a PracticalApproach，M.Butler，编(IRL Press，1991)中找到。
本公开中所指的宿主细胞包括培养的细胞和宿主动物体内的细胞。
根据本文提供的序列，可测定样品中的基因扩增和/或表达，直接通过例如，常规的DNA印迹法、RNA印迹法来定量测定mRNA的转录(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：5201-5205(1980))，斑点印迹法(DNA分析)，或采用适当的标记探针原位杂交。可使用各种标记，最常用的是放射性同位素，具体是32P。然而，也可采用其它技术，例如使用生物素修饰的核苷酸以引导进入多核苷酸。生物素可用作结合亲和物或抗体的位点，它可用各种各样标记进行标记，例如放射性核素、荧光素、酶或其它。另外，可使用能够识别特异性双链体，包括DNA双链体、RNA双链体和DNA-RNA杂交双链体或DNA-蛋白质双链体的抗体。进而可标记这些抗体并可进行试验，检测接合于表面的双链体，因此根据表面上形成的双链体，可检测到结合于该双链体的抗体的存在。
或者，基因表达可通过免疫方法测定，例如组织切片的免疫组织化学染色和细胞培养或体液的分析，直接定量测定基因表达产物。使用组织化学染色技术制备细胞样品，通常经过脱水和固定，然后与标记的对偶联的基因产物特异性的抗体反应，其中该标记通常是视力可检测的，例如酶标记、荧光标记、发光标记等。适用于本发明的具体的敏感染色技术见Hsu等，Am.J.Clin.Path.，75：734-738(1980)所描述。
用于体液样品的免疫组织化学染色和/或分析的抗体可以是单克隆或多克隆抗体，并可如本文所描述的制备。
较佳地，artemin作为分泌的多肽可从培养基回收，尽管它还可从宿主细胞裂解物回收。如果artemin是膜结合的，可使用适合的去污剂溶液(例如Triton-X 100)使其从膜上释放下来。
当在不同于人源细胞的重组细胞中生产artemin时，该artemin完全不含人源蛋白质或多肽。但是，需要从重组细胞蛋白质或多肽中纯化artemin以获得基本上均一的artemin。首先，可离心培养基或裂解物以除去颗粒细胞碎片。然后可用如下步骤从污染的可溶蛋白质或多肽中纯化artemin，适合的纯化步骤的例子为：在离子交换柱上分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅层析；聚焦层析；免疫亲和；表位尾接合树脂；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如Sephadex G-75进行凝胶过滤；和蛋白质A琼脂糖凝胶柱除去污染物例如IgG。
3.artemin的修饰
本发明的范围包括artemin和artemin变体的共价修饰。一种类型的共价修饰包括使artemin多肽的定向氨基酸残基与有机衍生试剂反应，该试剂能够与artemin的选择的侧链或N-或C-末端残基反应。例如，对于在纯化抗artemin抗体的方法中使artemin与水不溶性载体基质或表面交联，可采用双双能试剂进行衍生。通常使用的交联剂包括例如1，1-二(重氮基乙酰)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯，例如，4-叠氮水杨酸酯、同质双功能亚氨酸酯，包括二琥珀酰亚胺酯例如3，3’-二硫基双(琥珀酰亚胺丙酸酯)，双功能马来亚胺例如二-N-马来亚胺-1，8-辛烷和试剂例如甲基-3-[(P-叠氮苯基)二硫]propioimidate。
其它修饰包括分别对相应的谷氨酰和天冬氨酰残基，谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基的脱酰胺，脯氨酸和赖氨酸的羟基化、丝氨酸或苏氨酸残基的羟基磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α氨基的甲基化(T.E.Creighton，蛋白质：结构和分子特性Protein：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman和Co.，SanFrancisco，79-86页(1983))，N-末端胺的乙酰化和C-末端羧基的酰胺化。
本发明范围内包括的另一种类型的artemin多肽的共价修饰，包括改变该多肽的天然糖基化模式。为了本文的目的，“改变天然的糖基化模式”指缺失一种或多种天然序列artemin中发现的碳水化合物部分(或者通过除去基础糖基化位点或者通过用化学和/或酶方法除去糖基化)，和/或加入在天然序列artemin中不存在的一种或多种糖基化位点。另外，该短语包括天然蛋白质的糖基化中性质的改变，包括特性和存在的各种碳水化合物部分的比例的改变。
向artemin多肽添加糖基化位点可通过改变氨基酸序列实现。例如可通过向天然序列artemin添加或替换一种或多种丝氨酸或苏氨酸残基(对于O-连接的糖基化位点)进行改变。Artemin氨基酸序列可任选地通过在DNA水平上的变化而改变，具体地通过在预选的碱基上突变编码artemin多肽的DNA，这样产生的密码子将翻译成为所需氨基酸。
在artemin多肽上增加碳水化合物部分数目的另一方法是通过化学或酶连接糖苷于该多肽。本领域描述了这种方法，例如在1987年9月11日发表的WO 87/05330中，和在Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，259-306页(1981)中。
除去存在于artemin多肽上的碳水化合物部分可通过化学或酶法完成或通过编码用作糖基化作用靶位点的氨基酸残基的密码子的突变性替代完成。化学去糖基化技术是本领域已知的并由，例如，Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys.，259：52(1987)和Edge等，Aanl.Biochem.，118：131(1981)描述。如Thotakura等，Meth.Enzymol.，138：350(1987)所描述，多肽上的碳水化合物部分的酶切可通过使用各种内切或外切糖苷酶完成。
Artemin另一种类型的共价修饰包括以美国专利4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417，4,791,192或4,179,337中提出的方式，将artemin多肽连接于各种非蛋白质聚合体之一上，例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙醇或聚氧化烯。
本发明的artemin还可以形成嵌合分子的方式进行修饰，该嵌合分子包括与另一个异源多肽或氨基酸序列融合的artemin。
在一个实施例中，这种嵌合分子包括artemin与尾巴多肽的融合，它提供了一个抗-加尾抗体可与之选择性结合的表位。该表位尾通常位于artemin的氨基或羧基末端。可使用针对此尾巴多肽的抗体检测artemin的这种表位尾形式的存在。而且，此表位尾的供给使得能采用抗尾抗体或与此表位尾结合的另一种类型的亲和基质，通过亲和纯化方便地纯化artemin。各种尾多肽及它们的各自的抗体是本领域已知的。例子包括聚组氨酸(poly-his)或聚-组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)尾；线毛 (flue)HA尾多肽及其抗体12CA5[(Field等，Mol.Cell.Biol.，8：2159-2165(1988))；c-myc尾和8F9、3C7、6E10，G4、B7和9E10抗体[Evan等，分子和细胞生物学Molecular and Cellular Biology，5：3610-3616(1985)]；和单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)尾及其抗体[Paborsky等，蛋白质工程Protein Engineering，3(6)：547-553(1990)]。其它尾多肽包括旗肽[Hopp等，Bio Technology，6：1204-1210(1988)]；KT3表位肽[Martin等，Science，255：192-194(1992)]；α-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.，266：15163-15166(1991)]；和T7基因10蛋白肽尾[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：6393-6397(1990)]。
在另一个实施例中，此嵌合分子可含有artemin与免疫球蛋白或免疫球蛋白特定区域的融合。对于此嵌合分子的二价形式(也称作“免疫粘附素”)，这种融合可以是与IgG分子的Fc区域的融合。
最简单和最直接的免疫粘附素设计联合了“粘附素”蛋白的结合区与免疫球蛋白重链的铰链区和Fc区。通常，当制备用于本发明的artemin-免疫球蛋白嵌合体时，编码artemin的核酸将以c-末端与编码免疫球蛋白恒定区序列的N-末端的核酸融合，但是N-末端融合也是可能的。
通常在这种融合中，编码的嵌合多肽将至少保留免疫球蛋白的功能活性铰链区以及重链恒定区的CH2和CH3区。还可对恒定区Fc部分的C-末端、或重链CH1的紧靠N-末端或轻链的相应区域进行融合。
融合的精确位点不是关键性的；具体位点是已知的，并且为了优化artemin-免疫球蛋白嵌合体的生物活性可选择融合位点。
在一些实施例中，artemin免疫球蛋白嵌合体装配成单体、或异质-或同质-多聚体，具体地是二聚体或四聚体，主要描述于WO 91/08298。
在一个较佳的实施例中，将artemin序列融合于抗体C-末端部分的N-末端(具体是Fc区)，而含有免疫球蛋白例如免疫球蛋白G1(IgG1)的效应等功能。可钭整个重链恒定区与artemin序列融合。然而，更佳地，在融合中采用一个始于紧靠木瓜蛋白酶切割位点上游的铰链区的序列(化学上定义为IgG Fc，残基216，将重链恒定区的第一个残基作为114，或其它免疫球蛋白的类似位点)。在一个具体的较佳的实施例中，将artemin氨基酸序列与IgG1、IgG2或IgG3重链的铰链区和CH2和CH3融合，或与CH1、铰链区、CH2和CH3区域融合。融合的精确位点不是关键性的，可通过常规试验确定最适位点。
在一些实施例中，将artemin-免疫球蛋白嵌合体装配，成多聚体具体是同质-二聚体或四聚体。通常，这些装配的免疫球蛋白具有已知的单元结构。一种基本的四链结构单元是其中存在IgG、IgD和IgE的形式。四链结构单元在较高分子量免疫球蛋白中重复；IgM通常以二硫键聚合在一起的基本四链结构单元的五聚体存在。IgA球蛋白，偶尔是IgG球蛋白，也可以多聚体形式存在于血清中。在多聚体情况下，各个四链结构单元可以相同或不同。
或者，可将artemin序列插入免疫球蛋白重链和轻链序列之间，这样得到含有嵌合重链的免疫球蛋白。在这个实施例中，将artemin序列与免疫球蛋白各臂中的免疫球蛋白重链的3’末端融合，或者插入铰链区和CH2区之间，或者插入CH2和CH3区之间。Hoogenboom等，Mol.Immunol.，28：1027-1037(1991)报道了相似的构建物。
虽然，在本发明的免疫粘附素中不要求存在免疫球蛋白轻链，但免疫球蛋白轻链或者可与artemin-免疫球蛋白重链融合多肽共价结合而存在，或者直接与artemin融合。在前者情况下，编码免疫球蛋白轻链的DNA通常与编码artemin-免疫球蛋白重链融合蛋白的DNA共同表达。一旦分泌，杂交的重链和轻链将共价结合以提供含有两个二硫键连接的免疫球蛋白重链-轻链对的免疫球蛋白样结构。适合于制备这种结构的方法，例如，公开于1989年3月28日签发的美国专利4,816,567号。
在一个较佳的实施例中，本发明免疫粘附素的结构中所用的免疫球蛋白序列来自IgG免疫球蛋白重链恒定区。对于人免疫球蛋白粘附素，采用人IgG1和IgG3免疫球蛋白序列是优选的。采用IgG1的一个主要的优点是IgG1免疫粘附素可在固定化蛋白质A上有效纯化。相反，IgG3的纯化需要蛋白质G，一种用途明显少的介质。但是，当为具体的免疫粘附素构建选择Ig融合配偶时，应考虑免疫球蛋白的其它结构和功能特性。例如，IgG3的铰链区更长和更加灵活，所以它可适用于当与IgG1融合时不能折叠或正常行使功能的更大的粘附素区域，。另一个考虑可能是效价；IgG免疫粘附素是二价同质二聚体，而Ig亚型如IgA和IgM可分别产生基本的Ig同质二聚体单元的二聚体或五聚体结构。对于设计用于体内的artemin免疫粘附素，由Fc区赋予的药物动力学特性和效应器功能也是重要的。尽管IgG1、IgG2和IgG4都具有21天的体内半衰期，但它们活化补体系统的相对能力是不同的。IgG4不活化补体，IgG2在补体活化上比IgG1弱很多。而且，与IgG1不同，IgG2不与单个核细胞或嗜中性粒细胞上的Fc受体结合。而IgG3对于补体活化是最适合的，其体内半衰期大约是其它IgG同种亚型的1/3。对于设计用作人的药物的免疫粘附素，另一个重要的考虑因素是具体同种型的同种异体型变体的数量。通常，具有较少的血清学明确的同种异体型的IgG同种型是优选的。例如，IgG1仅具有4个血清学明确的同种异体型位点，其中2个(G1m和2)位于Fc区域；这些位点中的一个G1m1是非免疫原性的。相反，在IgG3中有12个血清学明确的同种异体型位点，它们全部位于Fc区域；这些位点中仅3个(G3m5、11和12)具有一个非免疫原性的同种异体型。因此，3号免疫粘附素潜在的免疫原性比1号免疫粘附素的强。
关于亲代免疫球蛋白，一个有用的连接点刚好在在形成两个重链间二硫键的铰链区半胱氨酸的上游。在经常用的设计中，将此分子artemin部分C-末端残基的密码子直接放置于IgG1铰链区序列DKTHTCPPCP的密码子的上游。
适用于构建和表达免疫粘附素的通常方法与本文公开的关于artemin的方法相同。通过将编码框内artemin部分的cDNA序列与Ig cDNA序列融合，最方便地构建了artemin免疫粘附素。但是，也可采用与基因组Ig片段的融合(见例如，Gascoigne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：2936-2940(1987)；Aruffo等，Cell，61：1303-1313(1990)；Stamenkovic等，Cell，66：1133-1144(1991))。后一串的融合需要存在表达所需的Ig调节序列。编码IgG重链恒定区的cDNA可通过杂交或聚合酶链反应(PCR)技术，根据公布的脾或外周血淋巴细胞的cDNA文库的序列而分离得到。将编码artemin和免疫粘附素Ig部分的cDNA串联插入一质粒载体，指导在选择的宿主细胞中有效表达。对于哺乳动物细胞中的表达，可使用pRK5为基础的载体(Schall等，Cell，61：361-370(1990))和CDM8-为基础的载体(Seed，Nature，329：940(1989))。使用寡核苷酸指导的缺失诱变除去设计的连接密码子之间的额外序列，可产生精确的连接。(Zoller等，Nucleic Acids Res.，10：6487(1982)；Capon等，Nature，337：525-531(1989))。可使用合成的寡核苷酸，其中每一半与所需接点两侧的序列互补；理想地，这些是36-48聚体。另外，可采用PCR技术将框内分子的两个部分与适当载体连接。
用于artemin免疫粘附素表达的宿主细胞系的选择，主要取决于表达载体。另一个考虑是需要的蛋白质量。瞬时转染常常可生产毫克数量。例如，腺病毒EIA-转化的293人胚肾细胞系可通过磷酸钙方法的修饰瞬时转染pRK5-基的载体得以有效表达免疫粘附素。可采用CDM8-为基础的载体通过DEAE-葡聚糖方法转染COS细胞(Aruffo等，Cell，61：1303-1313(1990)；Zettmeissl等，DNA Cell Biol.US，9：347-353(1990))。如果想要更大量的蛋白质，宿主细胞系稳定转染后可表达免疫粘附素。例如，在编码二氢叶酸还原酶(DHFR)并赋邓对G418抗性的附加质粒存在，可将pRK5-为基础的载体引入中华仓鼠卵巢(CHO)细胞。可在培养中选择抗G418的克隆；这些克隆在增加水平的DHFR抑制剂氨甲蝶呤存在下培育；选择克隆，其中对编码DHFR和免疫粘附素序列的基因拷贝数共扩增。如果免疫粘附素在其N-末端含有一个疏水性前导序列，它有可能被转染的细胞加工或分泌。具有更复杂结构的免疫粘附素的表达可能需要特殊的适合的宿主细胞；例如，轻链或J链组分可由某些骨髓瘤或杂交瘤细胞宿主提供(Gascoigne等，1987，见上文，Martin等，J.Virol.，67：3561-3568(1993))。
可通过亲和层析方便地纯化免疫粘附素。蛋白质A作为亲和配体的适用性取决于嵌合体中所用的免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白质A可用于纯化基于人1，2或4重链的免疫粘附素(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。对所有小鼠同种型和人3推荐蛋白质G(Guss等，EMBO J.，5：1567-1575(1986))。亲和配体附着的基质最常见的是琼脂糖，但是其它基质也是可用的。机械稳定性基质例如可控的微孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯，允许比用琼脂糖可获得的流速更快和加工时间更短。免疫粘附素结合蛋白质A或G亲和柱的条件完全由Fc区的特征即其种类和同种型所决定；。通常当选择适当的配体时，有效结合直接产生于非条件性培养液。免疫粘附素的一个可鉴别特征是，对于人1分子，对于蛋白质A的结合能力相对于相同的Fc类型的抗体有些减弱。结合的免疫粘附素可在酸性pH(3.0或大于3.0)时，或在含有温和离液盐的中性pH缓冲液中有效洗提。此亲和层析步骤可产生纯度大于95％的免疫粘附素制剂。
可使用本领域已知的其它方法代替蛋白质A或G亲和层析以纯化免疫粘附素。在亲硫凝胶层析(Hutchens等，Anal.Biochem.，159：217-226(1986))和固定的金属螯合层析(Al-Mashikhi等，J.Dairy Sci.，71：1756-1763(1988)中免疫粘附素的行为与抗体类似。然而与抗体形成对比，它们在离子交换柱上的行为不仅由它们的等电点，而且还由于它们的嵌合特性分子中可能存在的带电偶极子所决定。
如果需要，免疫粘附素可制成双特异性。因此，本发明的免疫粘附素可联合一个artemin区域和一个功能域，例如来自另一个细胞因子和神经营养因子的功能域。由于纯化容易，对于由抗体样结构一个臂上的嵌合抗体重链和另一个臂上的嵌合抗体重链-轻链对组成的双特异型分子、三聚体分子是优选的。与传统用于产生双特异型免疫粘附素的抗体产生的四头体(它产生10个四聚体混合物)相反，用编码三聚体免疫粘附素结构三个链的核酸转染的细胞，产生仅三个分子的混合物，从该混合物中获得的所需产品的纯化相应地更加容易。
4.artemin激动剂的制备和鉴定
a.小分子的筛选
小分子可具有作为artemin激动剂的能力并因此在神经细胞损伤的预防和治疗中有用。这种小分子可包括天然产生的小分子、合成的有机或无机化合物和肽。然而本发明的小分子不限于这些形式。广泛的小分子文库可商业购得并且筛选这些分子所需活性的各种分析方法是本领域熟知的。
较佳地，候选的artemin激动剂小分子在快速鉴定潜在激动剂的试验中第一次被鉴定。这种试验的一个例子是蛋白质-蛋白质结合试验，其中测定了候选分子与GFR受体结合的能力。在另一个实施例中，测定了候选分子干扰artemin与GFR结合的能力。
在一个优选的实施例中，小分子artemin激动剂通过它们模拟artemin的一种或多种生物活性的能力得以鉴定。例如，可对小分子支持培养物中多巴胺能中脑神经元存活的能力进行筛选，如Baloh等，Nauron 21：1291-1302(1998)描述的。还可对它们在轴索突切开术后，预防轴突切开术引起的脊髓背角物质P流失的能力进行筛选，如实施例6中所描述，不产生用实施例1-4方法测定的疼痛和痛觉过敏。
鉴定为artemin激动剂的化合物可用于本发明的方法，例如保护哺乳动物神经元避免损伤引起的病理变化。
b.激动剂抗体的制备和鉴定
本发明中考虑了模拟artemin生物学特性的激动剂人和非人多克隆和单克隆抗体(包括非人单克隆抗体的人源化形式)。这些抗体包括氨基酸序列变体、糖基化变体和抗体的片段。产生这种抗体和选择激动剂抗体的一般技术是本领域已知的并在下文简要描述。
(i)多克隆抗体
制备多克隆抗体的方法是本领域已知的。多克隆抗体可在哺乳动物中产生，例如通过免疫制剂和，如果需要，佐剂的一次或多次注射。通常免疫试剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射进入哺乳动物。将免疫制剂与已知在免疫的哺乳动物中具有免疫原性的蛋白质结合可能是有用的，例如血清白蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂。可用佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM。
(ii)单克隆抗体
可使用Kohler等，Nature，256：495(1975)第一次描述的杂交瘤方法制备单克隆抗体，或可使用重组DNA方法制备(美国专利4,816,567号)。
在杂交瘤方法中，对小鼠或其它适当的宿主动物，例如仓鼠或短尾猿猴，如本文上述方法进行免疫以诱导产生或能够产生将与免疫所用蛋白质特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可体外免疫淋巴细胞。然后，采用适当的融合剂(例如聚氧乙烯)使淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：原理和实践Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，55-103页，(Academic Press，1986)。
在适当的培养基中接种和培育这样制备的杂交瘤细胞，该培养基优选含有一种或多种能抑制未融合细胞、亲代骨髓瘤细胞生长和存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，杂交瘤的培养基典型地将包括次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，在这种条件下，阻止了缺乏HGPRT的细胞的生长。
优选的骨髓瘤细胞是那些能有效融合、支持选出的抗体生成细胞稳定产生高水平抗体，并对培养基例如HAT培养基敏感的细胞。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是小鼠骨髓瘤细胞系，例如购自Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California USA的MOP-21和M.C.-11小鼠肿瘤细胞衍生的细胞，和购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Rockville，Maryland USA)的SP-2或X63-Ag8-653细胞。对于人单克隆抗体的生产还报道了人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系(Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用，(Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applicat ions)，51-63页，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)。
测试培育杂交瘤细胞的培养基有无产生针对抗原的单克隆抗体。较佳地，杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性可通过免疫沉淀反应或体外结合试验，例如放射免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验定(ELISA)测定。
单克隆抗体的结合亲和力可，例如，通过Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析测定。
鉴定到产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，可将该细胞通过有限稀释步骤亚克隆和用标准方法培育(Goding，单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，59-103页(AcademicPress，1986))。用于这一目的的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可作为腹水瘤在动物体内生长。
通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白质A-琼脂糖凝胶、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，可适当地从培养基、腹水液或血清分离得到亚克隆分泌的单克隆抗体。
容易地分离编码单克隆抗体的DNA并用常规方法测序(例如采用能够与编码单克隆抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可用作这种DNA的优选来源。一旦分离，可将置该DNA入表达载体中，然后转染入宿主细胞，大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞，中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以在重组的宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。还可修饰此DNA，例如，以人重链和轻链恒定区编码序列取代同源的小鼠序列，Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：6851(1984)，或将非-免疫球蛋白多肽的全部或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价结合。以这种方式，制备具有本文所述artemin激动剂单克隆抗体结合特异性的“嵌合”或“杂交”抗体。
还可采用合成蛋白质化学(包括交联剂)已知的方法体外制备嵌合或杂交抗体。例如，可采用二硫键交换反应或通过形成硫醚键构建免疫毒素。用于这一目的的适当试剂的例子包括亚氨基硫醇盐和甲基-4-mercaptobutyrimidate.
下文将更加具体地描述重组产生抗体的方法。
(iii)人源化的抗体
通常，人源化抗体其中具有非人来源的一种或多种氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称作“输入”残基，它们通常取自“输入”的可变区。人源化可主要按照Winter及其合作者的方法进行(Jones等，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等，Science，239：1534-1536(1988))，系用啮齿动物的CDR或CDR序列取代相应的人抗体序列。
因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(Cabilly，见上文)，其中基本上少于一个完整的人可变区被非人动物的相应序列所取代。实际上，人源化抗体是典型的人抗体，其中一些CDR残基和可能一些FR残基被啮齿动物抗体中类似位点的残基所取代。
重要的是人源化抗体应保留对抗原的高度亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到这一目的，根据优选的方法，采用亲代和人源化序列的三维模型，通过对亲代序列和各种概念上的人源化产物的分析制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型可通常购得，并为本领域熟练技术人员所熟悉。可购得说明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序。检查这些显示得以分析这些残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析能影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可从共有序列和输入序列选出FR残基并将其组合，这样，得到所需的抗体特征，例如对靶抗原提高的亲和力。通常，CDR残基直接地和最实质地涉及影响抗原结合。对于进一步的详情见1992年8月21日提交美国专利申请序列号07/934,373，它是1991年6月14日提交的专利申请序列号为07/715,272的部分延续申请。
(iv)人的抗体
人单克隆抗体可通过杂交瘤方法制备。用于人单克隆抗体生产的人骨髓瘤和小鼠-人异骨髓瘤细胞系已由，例如，Kozbor，J.Immnol.133，3001(1984)，和Brodeur，等，单克隆抗体生产技术和应用(Monoclonal Antibody Prodution Techniques andApplications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，New York，1987)所描述。
现在能够生产转基因动物(例如小鼠)，该转基因动物免疫后能够产生人抗体库而不产生内源性免疫球蛋白。例如，已描述了嵌合性小鼠和种系突变小鼠中抗体重链接合区(JH)基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。在这样的种系突变的小鼠中，人种系免疫球蛋白基因阵列的转移将导致抗原攻击后人抗体的生产。见例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：2551-255(1993)；Jakobovits等，Nature 362“255-258(1993)。Mendez等(Nature Genetics15：146-156(1997))进一步改进了此技术，并产生了一株称作“异种小鼠II”(xenomouse II)的转基因小鼠，当用抗原攻击时，产生高亲和力的完全人抗体。这通过兆碱基人重链和轻链基因座的种系整合进入小鼠而完成，该小鼠具有如上述的内源JH区段的缺失。异种小鼠II含有1,020kb的人重链基因座，该基因座含有约66个VH基因、完整的DH和JH区以及三个不同的恒定区(μ，σ和χ)，还具有800kb的人κ基因座，该基因座含有32Vκ基因、Jκ区段和Cκ基因。在所有方面，这些小鼠产生的抗体与在人中所见的极为相象，包括基因重排、装配、和文库。由于内源性JH区段的缺失阻止了小鼠基因座中基因的重排，该人抗体的表达超过内源性抗体。
另外，可采用噬菌体展示技术(McCafferty等，Nature 348：552-553(1990)，从未免疫的供体获得的免疫球蛋白可变(V)区的基因库，体外生产人抗体和抗体片段。根据这一技术，可将抗体V区基因框内克隆入丝状噬菌体，例如M13或fd的大或小包衣蛋白基因中，并在噬菌体颗粒表面上作为功能性抗体片段展示。因为丝状噬菌体颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还导致编码显示那些特性的抗体的编码基因的选择。因此，噬菌体模拟了B-细胞的一些特性。噬菌体展示可以多种形式进行；对于它们的评论见，如Johnson，Kevin S.和Chiswell，David J.，Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)。几种来源的V-基因节段可用于噬菌体展示。Clackson等，Nature 352：624-628(1991)从衍生自免疫小鼠脾的小的随机组合的V基因文库分离得到了抗-唑酮抗体的多样性阵列。可构建未免疫人供体的V基因库，可基本上依照Marks等，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)，或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)描述的技术分离针对抗原(包括半抗原)多样性阵列的抗体。在天然免疫应答反应中，抗体基因以高速累积突变(体细胞高空变)。引入一些变化将赋予高的亲和力，显示高亲和性表面免疫球蛋白的B-细胞在随后的抗原攻击中优先复制和分化。通过采用称为“链改组”的技术可模拟这一自然过程(Marks等，Bio/Technol.10：779-783[1992])。在该方法中，噬菌体展示获得的“初级”人抗体的亲和力可通过用从未免疫供体获得的V区基因天然产生的变体文库取代重链和轻链V区基因而得以改进。这一技术得以产生亲和力nM范围的抗体和抗体片段。制备非常大的噬菌体抗体库(也称作“所有基因文库的母体”(“the mother-of-all libraries”)的方法已由Waterhouse等，Nucl.Acids Res.21：2265-2266(1993)描述，从这样大的噬菌体文库直接分离高亲和力的人抗体由Griffith等，EMBO J.(1994)报道(出版中)。基因改组也可用于从啮齿动物抗体产生人抗体，其中人抗体具有与起始的啮齿动物抗体相似的亲和力和特异性。根据这种称作“表位印记”的方法，用噬菌体展示技术获得啮齿动物抗体的重链或轻链V区基因，以人V区基因库取代，产生啮齿动物-人嵌合体。抗原选择导致能够恢复功能性抗原结合位点的人可变区的分离，即，表位控制(印记)配偶体的选择。为了取代余下的啮齿动物V区重复这一过程时，获得了人的抗体(见PCT专利申请WO 93/06213，发表于1993年4月1日)。与传统的通过CDR移植人源化啮齿动物抗体不同，本技术提供完全的人抗体，它不具有啮齿动物来源的构架和CDR残基。
(v)双特异性抗体
双特异性抗体是单克隆抗体，优选人或人源化抗体，该抗体对至少两个不同的抗原具有结合特异性。在本发明的情况下，其中一个结合特异性是针对artemin受体的从而提供一种一个激动剂抗体，另一个是针对任何其它的抗原，优选针对另一个受体或受体亚基。
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统上，双特异性抗体的重组生产依据两个免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello，Nature 305，537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(quadromas)产生10个不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一个具有正确的双特异性结构。通常使用亲和层析步骤进行正确分子的纯化相当烦琐，并且产量低。相似的方法公开于PCT申请出版物WO 93/08829(发表于1993年5月13日)，和Traunecker等，EMBO 10，3655-3659(1991)。
根据不同的或更优选的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定区序列融合。该融合物较佳地具有一个免疫球蛋白重链恒定区，含有至少部分的铰链区、CH2和CH3区域。较佳地具有含有轻链结合所需位点的第一重链恒定区((CH1)，存在于至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链，如果需要，和免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体中，并共转染入适当的宿主生物中。当在构建中采用不相等比例的三种多肽链提供最佳产量时，这给予了在实施例中调节三种多肽片段相互比例的极大灵活性。然而，当至少两个多肽链以等比例表达导致高产量时或当该比例不具有特别的意义时，将两个或全部三个多肽链的编码序列插入一个表达载体中是可能的。在本方法的一个较佳的实施例中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和另一个臂上的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。发现这种不对称的结构有利于所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链混合物相分离，由于存在的免疫球蛋白轻链为该双特异性分子的一半，故提供了简易的分离方法。该方法公开发表于1994年3月3日的PCT出版物WO 94/04690中。
产生双特异性抗体的更加具体的资料参见，例如Suresh等，酶学方法(Methodsin Enzymology)121，210(1986)。
(vi)异型偶联抗体
异型偶联抗体由两个共价连接的抗体组成。例如，已建议使用这种抗体将免疫系统细胞靶向不良的细胞(美国专利4,676,980)，和治疗HIV感染(PCT申请出版物WO 91/00360和WO 92/200373；EP 03089)。可使用任何方便的交联方法制备异型偶联抗体。适当的交联剂是本领域熟知的，并同许多交联技术一起公开于美国专利第4,676,980中。
(vii)抗体片段
在某些实施例中，artemin激动剂抗体(包括小鼠、人和人源化抗体以及抗体变体)是一种抗体片段。已开发了各种用于抗体片段生产的技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化而获得(见例如，Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Methos  24：107-117(1992)和Brennan 等，Science229：81(1985))。然而，现在这些片段可直接通过重组宿主细胞生产。例如，Fab’-SH片段可直接从大肠杆菌回收并化学偶联形成F(ab’)2片段(Carter等，Bio/Technology 10：163-167(1992))。在另一个实施例中，采用亮氨酸拉链GCN4促进F(ab’)2分子的装配形成F(ab’)2。依据另一个方法，Fv、Fab或F(ab’)2片段可直接从重组宿主细胞培养物中分离得到。其它用于抗体生产的技术对熟练的操作人员来说是显而易见的。
(viii)激动剂抗体的鉴定
可根据它们与GFRα3受体的相互作用鉴定潜在的artemin激动剂抗体。例如，可采用本领域熟知的蛋白质印迹技术筛选各种抗体与GFRα3结合的能力。由于artemin似乎通过GFRα3起作用(见实施例8)，抗体和GFRα3之间的任何相互作用将表明该抗体可用作artemin激动剂。
实际的artemin激动剂抗体可依据它们的生物学活性来鉴定。在一个实施例中，通过它们体外诱导新生背根神经节神经元存活的能力鉴定artemin激动剂抗体，如实施例8中描述的那样。
如实施例6所述还可根据它们预防轴突切开术后，轴突切开术诱导的脊髓背角物质P流失的能力鉴定artemin激动剂抗体。
5.与artemin相互作用的蛋白质的筛选试验
可采用适合于检测蛋白质-蛋白质相互作用的任何方法鉴定蛋白质，包括但不限于与artemin相互作用的跨膜或细胞内蛋白质。可采用的传统方法是免疫共沉淀、交联和通过梯度或层析柱共纯化来鉴定与artemin相互作用的蛋白质。对于这种试验，artemin组分可以是全长蛋白质、其可溶性衍生物、对应于感兴趣区域的肽、或含有artemin的一些区域的融合蛋白质。
可采用导致编码能够与artemin相互作用的蛋白质的基因同时鉴定的方法。这些方法包括，例如用标记的artemin或其变体，以与熟知的gt11文库的抗体探查技术相似的方式探测表达文库。
只是为了举例说明但不为其所限，详细描述了体内检测蛋白质相互作用的一种方法：双-杂交系统。已描述了这种系统的一种方案(Chien等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：9578-9582)并可从Clontech(Palo Alto，CA)商业购得。
简言之，利用这种系统，构建编码两种杂交蛋白的质粒：一种质粒包括编码转录激活蛋白的DNA结合区的核苷酸，配合于编码artemin或多肽、肽或它们的融合蛋白的核苷酸序列，以及包含编码转录激活蛋白活化域的核苷酸的另一质粒，核苷酸融合于编码已作为cDNA文库的一部分重组进入这一质粒的未知蛋白质的cDNA。将该DNA-结合域融合质粒和cDNA文库转化入含有一个报道基因(例如HBS或lacZ)的酿酒酵母的一个菌株中，其调节区含有转录激活剂结合位点。此两种杂交蛋白任何一个都不能单独激活报道基因的转录：DNA结合域杂交体不能激活是因为它不能提供活化功能，活化域杂交体不能激活是因为它不能定位于激活剂结合位点。这两个杂交蛋白的相互作用重建了功能性激活剂蛋白，并导致报道基因的表达，这可通过报道基因产物试验来检测。
可采用双-杂交系统或相关方法筛选与“饵”基因产物相互作用的蛋白质的激活域文库。作为举例而不作为限制，artemin可用作饵基因产物。将整个基因组或cDNA序列与编码激活域的DNA融合。将该文库以及编码融合于DNA结合域的饵artemin基因产物的杂交体的质粒共同转化入酵母报道菌株，并筛选产生的表达报道基因的转化体。例如，但不受限制，可将铒artemin基因序列，即基因的开放阅读框克隆λ-载体使其经翻译融合于编码GAL4蛋白的DNA结合域的DNA。纯化这些克隆，并分离负责报道基因表达的文库质粒。然后用DNA测序鉴定该文库质粒编码的蛋白质。
检测产生与饵artemin基因产物相互作用的蛋白质的细胞系的cDNA文库，可采用本领域常规应用的方法进行。根据本文描述的具体的系统，例如，可将cDNA片段插入载体，这样它们经翻译融合入GAL4的转录激活域。可将这种文库与饵artemin基因-GAL4融合质粒共转化入酵母菌株，该菌株含有受包含GAL4激活序列的启动子驱动的lacZ基因。将编码蛋白质的cDNA、与GAL4转录激活域融合，与饵artemin基因产物相互作用，将重建活性GAL4蛋白并因此驱动表达。驱动表达的克隆可用本领域常规方法检测。然后可从这些菌株纯化cDNA，并采用本领域常规方法用于产生和分离饵artemin基因相互作用蛋白。
a.调节artemin表达或活性的化合物的试验
下面的试验设计用于鉴定与(或结合)artemin相互作用的化合物、干扰artemin与其结合配偶相关物或底物相互作用的化合物、并用于鉴定调节artemin基因表达活性(即，调节artemin基因表达的水平)或调节体内artemin水平的化合物。另外可采用鉴定与artemin基因调节序列(例如启动子序列)结合的化合物的试验和，可调节artemin基因表达。见如，Platt，K.A.，1994，J.Biol.Chem.269：28558-28562，本文全部将其引入作为参考。
可根据本发明筛选的化合物包括但不限于，肽、抗体及其片段，和其它有机化合物(例如peptidomimetics)，该有机化合物与artemin或artemin受体结合，或者模拟天然配体(例如激动剂)引发的活性或抑制天然配体(拮抗物)引发的活性。
这种化合物可包括但不限于，肽例如，可溶性肽，包括但不限于随机肽文库的成员；(见例如Lam，K.S.等，1991，Nature 354：82-84；Houghten，R.等，1991，Nature 354：84-86)，和由D-和/或L-构型的氨基酸组成的组合化学衍生分子文库，磷酸肽(包括但不限于指导磷酸肽文库的随机或部分简并性成员；见，例如Songyang，Z.等，1993，Cell 72：767-778)，抗体(包括但不限于多克隆、单克隆、人源化的、抗-独特型、嵌合或单链抗体，以及FAb，F(ab)2和FAb表达文库片段，及其表位-结合片段)，和小有机或无机分子。
其它根据本发明可被筛选的化合物包括，但不限于小有机分子，该小有机分子能够穿过血脑屏障进入适当的细胞(例如，脉络膜、垂体、下丘脑等)并影响artemin基因或一些涉及artemin介导通路的其它基因的表达(例如通过与参与基因表达的调节区或转录因子相互作用)；或影响或替换artemin的活性或涉及artemin信号转导、分解代谢或代谢途径的一些其它细胞内因子的活性的化合物。
计算机模拟和检索技术允许鉴定化合物，或改进已鉴定的能调节artemin表达或活性的化合物。对已鉴定的这种化合物或组合物，可鉴定它的活性位点或区域。这种活性位点通常可能是配体结合位点。活性位点可用本领域已知的方法包括，例如，从肽的氨基酸序列、从核酸的核苷酸序列、或者从具有其天然配体的相关化合物或组合物的复合体的研究鉴定。在后者情况下，可采用化学或X-射线晶体图方法通过寻找复合的配体在该因子何处来找寻活性位点。
其次，确定活性位点的三维几何结构。这可通过已知的方法进行，包括可确定完整的分子结构X-射线晶体图。另一方面，固相或液相NMR可用于确定某些分子内距离。可采用任何其它结构测定的实验方法以获得部分或全部的几何结构。可用天然或人工的复合配体测定几何结构，它可提高活性位点结构测定的精确性。
如果测定一个不完全的或不够精确的结构，可使用计算机为基础的数字模拟方法完善结构或改进其精确性。可使用任何公认的建模方法，包括对具体的生物聚合体如蛋白质或核酸的特异性参数化模型，基于计算分子运动的分子动力学模型，基于热集合的统计学力学模型或组合的模型。对于大多数类型的模型，代表构成原子和基团之间的力的标准分子力场是必需的，并可从物理化学中已知的力场选择。不完全的或不够精确的实验结构可用作对这些模型方法计算的完全和更精确结构的限制因素。
最后，或者通过实验，通过建模，或通过组合，测定了活性位点(或结合位点)的结构，通过检索含有化合物连同它们的分子结构信息的数据库可鉴定候选的调节化合物。这种检索搜寻具有与测定的活性位点结构匹配并与限定该活性位点的基团相互作用的化合物。这种检索可以手工进行，但较佳地用计算机辅助进行。从这种检索中发现的这些化合物是artemin活性的潜在调节剂。
另外，可采用这些方法从已知的调节化合物或配体中鉴定得到改进的调节化合物。可修饰已知化合物的组合物并且该修饰的结构效应可用上述的适用于新的组合物的实验和计算机建模方法测定。然后将改变后的结构与该化合物的活性位点结构作比较以确定是否产生了改进的配合或相互作用结果。照这种方式可快速地评估组合物中的系统变异，例如通过改变侧基，以获得具有改进的特异性或活性的修饰的调节化合物或配体。
基于artemin活性位点(或结合位点)的鉴定的用于鉴定调节化合物的进一步的实验和计算机建模方法，以及相关的转导和转录因子对本领域熟练技术人员将是显而易见的。
分子建模系统的例子是CHARMm和QUANTA程序(Polygen Corporation Waltham，MA)。CHARMm执行能量最小化和分子动力学功能。QUANTA执行构建、分子结构的图解建模和分析。QUANTA允许相互作用的构成的改变、显示和分子彼此间行为的分析。
许多文章评议了与特异性蛋白质相互作用药物的计算机模型，例如Rotivinen等，1988，Acta Pharmaceutical Fennica 97：159-166；Ripka，New Scientist 54-57(1988年6月16日)，Mckinaly和Rossmann，1989，Annu.Rev.Pharmacol.Toxiciol.29：111-122；Perry和Davies，OSAR：药物设计中定量的结构-活性相互关系Quantitative Structure-Activity Relationships in Drug Design 189-193页(AlanR.Liss，Inc.1989)；Lewis和Dean，1989 Proc.R.Soc.Lond.236：125-140和141-162；和，关于核酸成分的模型受体，Askew等，1989，J.Am.Chem.Soc.111：1082-1090。其它筛选和图解描述化学试剂的计算机程序可从如下公司购得，例如BioDesign，Inc.(Pasadena，CA.)，Allelix，Inc.(Mississauga，Ontario，Canada)，和Hypercube，Inc.(Cambridge，Ontario)。尽管这些最初是设计用于对具体的蛋白质具有特异性的药物，它们也可用于设计对DNA或RNA的各区域具有特异性的药物，只要鉴定了这些区域。
尽管上文描述了关于能够改变结合的化合物的设计和产生，人们还可筛选已知化合物的文库，包括自然产物或合成的化合物，以及生物活性物质，包括蛋白质，对于化合物它们是抑制剂或激活剂。
通过本文所述的那些试验鉴定的化合物例如在阐明artemin基因产物的生物功能中可能是有用的。可给予患者这种化合物的药物有效剂量以治疗多种生理或精神疾病的任何一种。治疗有效量指该化合物的量足以导致任何生物症状的缓解、阻滞、预防或改变。
b.与artemin结合的化合物的试验
可设计一些系统来鉴定能够与artemin相互作用(或结合)或模拟artemin的化合物，或能够干扰artemin与相关受体、结合配偶体或底物结合的化合物。鉴定的化合物可用于，例如调节野生型和/或突变型artemin基因产物的活性；可用于精心设计artemin的生物学功能；可用于在筛选中鉴定破坏正常artemin相互作用的化合物；或它们自身可破坏或活化这种相互作用。
用于鉴定与artemin、或相关受体或底物结合的化合物的试验原理，包括在某种条件下制备artemin和测试化合物的反应混合物，并持续一段时间足以让两种成分反应和结合，这样形成一个在反应混合物中可以除去和/或检测的复合物。所用的artemin种类可能依据筛选试验的目的而不同。例如，当需要天然受体的激动剂时，可采用在该试验系统(例如标记、分离产生的复合物等)中能够提供优点的全长artemin、或可溶性截短的artemin、肽、或含有一种或多种与蛋白质或多肽融合的artemin结构域的融合蛋白。当找寻与artemin直接相互作用的化合物时，可采用对应于artemin的肽和含有artemin的融合蛋白。
可以各种方法进行此筛选试验。例如，进行这种试验的一种方法将包括将artemin、多肽、肽、或从其融合蛋白、或测试底物锚定在固相上并检测反应的结束后锚定在固相上的artemin/测试化合物的复合物。在一个用这种方法的实施例中，可将artemin反应物锚定在固体表面，没有锚定的测试化合物可以直接或者间接地被标记。
在实践中，微量滴定板可方便地用作固相。锚定成分可通过非共价或共价连接而固定化。非共价连接可简单地通过用蛋白质溶液包被固体表面并干燥而完成。或者，固定的抗体优选对固定的蛋白质具有特异性的单克隆抗体，可用于将该蛋白质锚定于固体表面。可事先制备这种表面并储存。
为了进行该试验，将非固定化的成分加入到含有锚定成分的包被表面。反应完成后，在某种条件下除去未反应的成分(例如通过洗涤)，这样形成的任何复合物将保持固定在固体表面上。锚定于固体表面的复合物的检测可采用多种方式完成。当先前预标记未固定化成分时，检测到表面上固定的标记表明形成了复合物。当先前不预标记未固定的成分时，可采用间接标记来检测锚定在表面上的复合物，例如采用对先前未固定的成分具有特异性的标记抗体(进而可直接标记该抗体或用标记的抗-Ig抗体间接标记该抗体)。
或者，可在液相中进行反应，从未反应的成分中分离出反应产物，并检测复合物；例如，采用对artemin蛋白、多肽、肽或融合蛋白或测试化合物具有特异性的固定化抗体来锚定在溶液中形成的任何复合物，和对可能的复合物的其它成分具有特异性的标记的抗体来检测锚定复合物。
c.干扰artemin相互作用的化合物的试验
对于所讨论的目的，与artemin相互作用的大分子是指“结合配偶体”。这些结合配偶体可能涉及artemin介导的生物学途径。因此，需要鉴定干扰或破坏这种结合配偶体相互作用的化合物，它可用于在身体内调节或增强artemin的活性，和/或控制与这些活性(或其缺陷)有关的疾病。
用于识别能够干扰artemin及其配偶体或配偶体对之间相互作用的化合物的试验系统的基本原理，包括制备包含artemin或其某些变体的反应混合物，并且在一定条件下结合配偶体持续一段时间，使之足以允许二者相互作用和结合，并由此形成复合体。为了测定化合物的抑制活性，在检测的化合物存在或不存在的情况下制备反应混合物。检测化合物可以最初包含于该反应混合物中，或者可在加入artemin和其结合配偶体后加入。在不含有测定的化合物或含有安慰剂的条件下培养对照反应混合物。然后检测artemin和结合配偶体之间的任何复合物的形成。在对照反应中而不是在含有检测化合物的反应混合物中形成了复合物，表明该化合物干扰了artemin和反应结合配偶体的相互作用。另外，还可将在含有检测化合物和正常artemin蛋白质的反应混合物中的形成的复合物与在含有检测化合物和突变型artemin的反应混合物中形成的复合物相比较。这种比较对需要鉴定特异性破坏突变型或突变的artemin而不是正常蛋白质的相互作用的化合物时是重要的。
干扰artemin与结合配偶体之间的相互作用的化合物的试验，可以异质或同质形式进行。异质性试验包括将artemin或者结合配偶体锚定在固相上并在反应结束时检测锚定在固相上的复合物。在同质试验中，整个反应在液相中进行。两种方法中，可改变添加反应物的次序以获得被检验的化合物的不同信息。例如，能通过竞争干扰此相互作用的测试化合物可通过在检测底物存在的情况下进行反应来鉴定；即，事先或同时将检测底物与artemin和反应结合配偶体一起加入反应混合物。或者，对破坏预形成的复合物的测试化合物，例如，以较高结合常数取代复合物的一个组分的化合物，可通过在复合物形成后向反应混合物中加入该测试化合物来测定。下文简要描述了各种形式。
在异质试验系统中，将artemin或者相互作用的结合配偶体锚定在固体表面，同时直接或间接标记未锚定的物质。在实践中，方便地采用了微量滴定板。锚定的物质可通过非共价或共价连接固定化。非共价连接可简单地用artemin或结合配偶体溶液包被固体表面并干燥完成。另外，对锚定物质具有特异性的固定化抗体可用于将该种类锚定在固体表面。可事先制备这种表面并储存。
为了进行这一试验，使固定化物质的配偶体接触用或不用测试化合物包被的表面。反应完成后，除去未反应的组分(例如通过洗涤)任何形成的复合物将保持固定在固体表面上。锚定在固体表面的复合物的检测可以多种方法完成。其中预标记未固定的物质，检测到固定在表面上的标记表明形成了复合物。当不预标记未固定的物质时，可采用间接标记来检测锚定在表面上的复合物；例如，采用对先前未标记的物质具有特异性的标记抗体(进而可直接标记该抗体或用标记的抗-Ig抗体间接标记)。依据加入反应成分的次序，可检测抑制复合物形成或破坏预形成的复合物的测试化合物。
另外，此反应可在存在或不存在测试化合物的液相中进行，从未反应的组分中分离出反应产物，并检测复合物；例如，采用对结合成分具有特异性的固定化抗体锚定溶液中形成的任何复合物，和对其它配偶体具有特异性的标记抗体来检测锚定的复合物。还有，依据向液相中加入反应物的次序，可鉴定抑制复合物或破坏预形成的复合物的测试化合物。
在本发明的另一个实施例中，可采用异质试验。在这种方法中，制备artemin和相互作用的结合配偶体的预形成的复合物，其中标记artemin或者其结合配偶体，但是由于复合物的形成扑灭了标记产生的信号(见例如，Rubenstein描述的美国专利4,109,496号，它利用这一方法进行免疫试验)。加入与预形成的复合物的一种物质竞争并取代之的测试底物将导致产生超过本底的信号。以这种方法，可鉴定破坏此相互作用的测试底物。
在一个具体的实施例中，可制备artemin融合物用于固定化。例如，artemin或其肽片段可采用例如pGEX-5X-1的融合载体与谷胱甘肽-S转移酶(GST)融合，以这种方式其结合活性保留在产生的融合蛋白中。可使用本领域常规使用的方法和上文所描述的方法纯化相互作用结合配偶体并用于产生单克隆抗体。该抗体可用放射性同位素125I进行标记，例如，使用本领域常规使用的方法。在一个异质试验中，可将融合蛋白锚定在谷胱甘肽-琼脂糖颗粒上。然后可将该相互作用结合配偶体加入存在或不存在测试化合物的液相中，使相互作用或结合得以发生。在反应结束时，可将未结合的物质洗去，将标记的单克隆抗体加入此系统中得以与复合的成分结合。Artemin和相互作用结合配偶体之间的反应可通过测定与谷胱甘肽-琼脂糖颗粒保持结合的放射活性的量来检测。成功抑制测试化合物相互作用将导致测定的放射活性下降。
另外，GST融合蛋白和相互作用结合配偶体可在缺乏固体谷胱甘肽-琼脂糖颗粒的液体中混合在一起。在各物质得以相互作用的过程中或相互作用之后，可加入测试化合物。然后，将该混合物加入谷胱甘肽-琼脂糖颗粒并洗去未结合的物质。此外，artemin和结合配偶体之间相互作用的抑制程度，可通过加入标记抗体并测定与谷胱甘肽-琼脂糖颗粒相关的放射活性而检测。
在本发明的另一个实施例中，可采用这些相同的技术，采用对应于artemin结合域和/或相互作用结合配偶体(如果结合配偶体是蛋白质)的肽片段，取代其中一个或二个全长蛋白质。本领域中常规使用的许多方法可用于鉴定和分离结合位点。这些方法包括，但不仅限于，诱变编码其中一个蛋白质的基因和在共免疫沉淀试验中筛选结合的破坏。然后可选择编码该复合物中第二种物质的基因中的补偿突变。编码各蛋白质基因的序列分析将揭示对应于该蛋白质中参与相互作用结合区域的突变。另外，可采用上述方法将一个蛋白质锚定于固体表面，使得以与其标记的结合配偶体相互作用或与之结合，该标记的结合配偶体已用例如胰蛋白酶等蛋白水解酶处理。洗涤后，一个相对短的、包含结合区域的标记的肽可因与固体物质结合而保留，可分离该标记的肽并作氨基酸测序鉴定。并且，一旦获得编码细胞内结合配偶体的基因，可工程改造短的基因片段用于表达该蛋白质的肽片段，然后可测定该蛋白质的肽片段结合活性并纯化或合成。
为了举例说明，而不是为了限制，通过制备GST融合蛋白并使它与谷胱甘肽-琼脂糖颗粒结合，可将artemin锚定于上述的固体物质。相互作用结合配偶体可用例如35S等放射性同位素进行标记，用例如胰蛋白酶等蛋白水解酶进行酶切。然后可将酶切产物加入锚定的融合蛋白并使之结合。洗去未结合的肽后，可洗脱代表细胞内结合配偶体结合域的标记的结合物质、纯化，并用熟知的方法分析氨基酸序列。这样鉴定的肽可合成产生或使用重组DNA技术与适当的促进蛋白质融合。
6.药物组合物
可将纯化形式的artemin包裹在制备的微囊中，例如通过凝聚技术或通过界面聚合作用(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微囊和聚(羟甲基)微囊)，包裹胶体药物传递系统中(例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、毫微颗粒和毫微囊剂)或大乳剂中。这种技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，1980，(A.Osol，编)。
Artemin的治疗制剂可通过将具有所需纯度、优选基本纯的artemin与最适的生理学可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences，见上文)混合，以冻干饼或水性溶液的形式制备。可接受的运载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度时对接触其的细胞或哺乳动物无毒。例子包括缓冲液例如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、免疫球蛋白、明胶；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮、氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；盐形成平衡离子例如钠；和/或非离子表面活性剂例如Tween、Pluronics或PEG。
用于体内给予的artemin必须是无菌的。这可采用本领域已知的方法方便地完成，例如在冻干和重组前或之后通过无菌过滤膜过滤。Artemin可以冻干形式储存。通常将治疗用artemin组合物放置于一个具有无菌入口的容器中，例如，静脉输液袋或具有皮下注射针头可刺穿的塞子的小瓶中。
任选地，artemin与其它神经营养因子联用或共同给予，该神经营养因子包括，但不限于NGF、NT-3、和/或BDNF，并与其它用于神经变性疾病的常规疗法一同使用。
Artemin可通过灌注进入CNS的液体储存器持续地给药，虽然弹丸注射是可接受的。在一个实施例中，artemin较佳地给予脑室或以其他方式引入CNS或脊髓液中。它可通过留置导管采用持续给药方法例如唧筒给予，或者可通过埋植给予，例如持续释放载体的大脑内埋植。更具体的是，artemin可通过长期埋植套管给予或在渗透性微型真空泵的帮助下长期注入给予。可获得通过小管递送蛋白质进入脑室的皮下唧筒。高度复杂的唧筒可通过皮肤再填充，并在没有外科干预的情况下设定递送速率。
包括皮下唧筒设备或通过一个完全埋植的药物递送系统进行持续地脑室内灌注的适合给予方法和递送系统的例子，是用于老年性痴呆患者给药和Harbaugh，J.Neural Transm.Suppl.，24：271(1987)；和DeYebenes等，Mov.Disord，2：143(1987)描述的帕金森氏症的动物模型以多巴胺、多巴胺作用药和胆碱功能药物的那些例子。Artemin激动剂抗体可以相同的方式给予，或通过给予进入血流或淋巴。
缓释制剂的适当的例子包括呈定型颗粒形式的半透性聚合物基质，例如，薄膜、或微囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶(如，聚(2-羟基-丙烯酸酯)，如Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982)描述的或聚(乙烯乙醇))，聚交酯(美国专利3,773,919，EP 58,481)，L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯基乙酸乙烯酯(Langer等，见上文)或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物，例如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射的微球)，以及聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)。
例如乙烯基-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸的聚合体能够释放分子超过100天，而某些水凝胶释放蛋白质的时间期限要短一些。当包裹的蛋白质存留在身体中很长时间，由于暴露于37℃的湿气中它们可能变性或聚集，导致生物活性的丧失，免疫原性可能改变。可根据所使用的机制，设计用于蛋白质稳定化的合理策略。例如，如果发现聚集机制是通过硫代-二硫化物互换分子间S-S键形成，可通过改变带巯基的残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂和开发特异性聚合物基质组合物而实现稳定化。
缓释artemin组合物还包括脂质体包裹的artemin。含有artemin的脂质体可通过本领域已知的方法制备。(Epstein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.，82：3688；Hwang等，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4030；DE 3,218,121 A：EP 52322A；EP 36676A；EP 88046A；EP143949a、EP142641a、日本专利申请83-118008、美国专利4485045和4544545，以及EP 102，324A)。通常，脂质体为小(约200-800埃)单实型，其中脂质含量大于约30摩尔％的胆固醇，调整所选的比例用于最适的artemin疗法。
当局部应用时，artemin可适当地与其它成分组合，例如运载体和/或佐剂。对于这种其它成分的自然特性没有限制，除了它们必须是生理上可接受的和对于它们的计划给药是有效的，并不会减少组合物活性成分的活性。适当的运载体的例子包括软膏、乳剂、凝胶、或悬浮剂，含或不含纯化的胶原蛋白。还可将该组合物渗入透皮膜片、膏药、和绷带中，较佳地以液体或半液体的形式。
为了获得凝胶剂型，配制在液体组合物中的artemin可与有效量的水溶性多糖或合成的聚合物例如PEG混合，以形成具有适当粘度的凝胶而局部施用。可采用的多糖包括，例如，纤维素衍生物如醚的纤维素衍生物，包括烷基纤维素、羟烷基纤维素、和烷基羟烷基纤维素，例如，甲基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、和羟丙基纤维素；淀粉和分馏淀粉；琼脂；褐藻酸和藻酸盐；阿拉伯树胶；支链淀粉；琼脂糖；角叉藻聚糖、葡聚糖、糊精；果聚糖、菊淀粉、甘露聚糖、木聚糖；阿拉伯聚糖、几丁聚糖、动物淀粉、葡聚糖、和合成的生物聚合体；以及树胶例如黄原酸胶；胍尔豆胶；豆角胶；阿拉伯树胶；黄蓍胶；和梧桐胶；以及它们的衍生物和混合物。本文中较佳的凝胶制剂是一种对生物系统惰性的、无毒、易于制备、并不会太过松软或粘稠，并不会使其中所持有的artemin不稳定的凝胶。
多糖优选醚化纤维素的衍生物，更优选纯度明确如USP列出的那样的纤维素衍生物，例如甲基纤维素和羟烷基纤维素衍生物，例如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、和羟丙基甲基纤维素。本发明中最优选的是甲基纤维素。
用于胶凝化作用的聚乙二醇通常是低和高分子量PEG的混合物以获得适当的粘度。例如，当以适当的比例混合以获得糊剂时，分子量为400-600的PEG与分子量为1500的PEG的混合物对本目的是有效的。
用于多糖和PEG的术语“水溶性”指包括胶体溶液和分散体。通常，纤维素衍生物的溶解性是由乙醚基团的替换程度决定的，并且本文使用的稳定性衍生物应在纤维素链中每一个脱水葡萄糖单位中具有足够量的这种乙醚基团以使衍生物可溶于水。通常至少每个脱水葡萄糖单位替代0.35个乙醚基团的乙醚替代程度是足够的。另外纤维素衍生物可以碱性金属盐的形式存在，例如，Li、Na、K、或Cs盐。
如果甲基纤维素用于凝胶中，较佳地它含有约2.5％，更佳地约3％的凝胶，并且artemin以约300-1000mg/ml凝胶量存在。
半渗透性、可移植的膜装置可用作在一定的情况下递送药物的方法。例如，可包裹分泌artemin、artemin变体、artemin嵌合体或artemin激动剂的细胞，并且这种装置可植入患者体内。例如，它们可植入患有帕金森氏症的患者的脑中。见，Aebischer等的美国专利4,892,538号；Aebischer等的美国专利5,011,472号；Aebischer等的美国专利5,106,627号；PCT申请WO 91/10425；PCT申请WO 91/10470；Winn等，Exper.Neurology，113：322-329(1991)；Aebischer等，Exper.Neurology，111：269-275(1991)；和Tresco等，ASAIO，38：17-23(1992)。因此，还包括预防或治疗神经元损伤的方法，该方法包括将分泌artemin、或视具体病性所需其激动剂或拮抗剂的细胞移植入需要它们的患者的体内。最后，本发明包括向患者移植植入物预防和治疗神经损伤的装置，该植入物包括半渗透膜，和在所述的膜中包裹分泌artemin(或视具体病情所需其激动剂或拮抗剂)的细胞，和能够透过artemin(或其激动剂和拮抗剂)和不能透过对细胞有害的患者的因子的所述的膜。活体外转化患者自身的细胞以产生artemin，可将其直接植入患者，任选地不用这种包裹。活细胞膜包裹的方法是本领域普通技术人员熟悉的，包裹细胞的制备及将它们移植给患者无过多实验可完成。
含有rtemin或artemin激动剂的药物组合物优选装载在一个适当的容器中。该容器中宜附有该药物组合物的适当的用法和剂量的详细说明。本领域熟练技术人员将认识到这些说明将根据治疗方法的变化而改变。
7.治疗方法
我们相信发现了artemin作为增强神经细胞存活的制剂的用途。因此它用于预防、改善或治疗神经系统变性疾病(“神经变性疾病”)，包括但不限于例如老年性痴呆、帕金森氏症、慢性舞蹈病、ALS、周围神经病、和其它特征为神经元坏死或缺失的症状，不论是中枢、外周还是运动神经元。另外，它可用于治疗损伤的神经细胞，例如外伤引起的神经损伤，烧伤和创伤、糖尿病、肾功能失调、和用于治疗癌症和AIDS的化学疗法的毒性作用。在适当情况下，它还可用于预防或缓解神经损伤或未受伤细胞对神经损伤的有害反应。
本发明的基础是发现在哺乳动物中用artemin治疗的好处是不伴有用NGF治疗所见的有疑问的副作用。本文所述的实验证明artemin具有神经保护特性，例如保护神经元免于损伤相关病变的能力和保护神经元免于病毒诱导的死亡的能力。然而，artemin的保护作用不伴有疼痛或痛觉过敏。
在本发明的一个实施例中，给予神经损伤患者治疗有效量的artemin。如果神经细胞和/或其轴突的存活或功能受损，疾病或内科紊乱应认为是神经损伤。这种神经损伤因为某种情况而发生，该情况包括(a)物理损伤，它引起靠近损伤部位的轴突和/或神经细胞体的变性；(b)局部缺血，如中风；(c)接触神经毒素，例如癌症和AIDS的化学治疗剂，如顺氯氨铂和双脱氧胞苷(ddC)；(d)慢性代谢疾病，例如糖尿病或肾功能失调；和(e)神经变性疾病例如帕金森氏症、老年性痴呆、和肌萎缩性脊髓侧索硬化(ALS)，它们引起特异性神经细胞群的变性。涉及神经损伤的情况包括帕金森氏症、老年性痴呆、和肌萎缩性脊髓侧索硬化、中风、糖尿病多发性神经病、中毒神经病、和例如脑和脊髓的物理损伤或胳膊和手或其它身体部分的压挤或刀伤引起的对神经系统的物理损伤，包括暂时或永久地终止血液向部分神经系统流动，如中风。
因此，本发明包括埋植细胞需要的患者体内来预防、改善或治疗神经损伤的方法，所述细胞选自能天然产生artemin的或经工程发行能分泌artemin的细胞。当患者是人时优选分泌的artemin是可溶性成熟的人artemin。较佳地，植入物优选无-免疫原性和/或防止植入细胞免疫原被免疫系统识别。对于CNS递送，植入物的优选部位是脊髓的脑脊髓液。
在一个实施例中，上文第5节描述的筛选试验鉴定的化合物可用于调节artemin的活性或表达水平。具体地说，经鉴定能够刺激artemin与其受体结合的化合物可用于治疗，当需要artemin活性的水平提高时。相似地，经鉴定能够提高artemin基因表达化合物可用于相似的治疗。
在一个实施例中，外周神经损伤的患者，特别是外周感觉神经病可通过artemin给药治疗。特别地，设想患有糖尿病型神经病的患者将给予artemin进行治疗。
在另一个实施例中，给予患者artemin保护外周神经元免于因损伤引起的病变。然而，还设想给予患者artemin以中枢和运动神经元保护避免病变引起的损伤。
在另一个实施例中，将artemin与一种或多种化学治疗剂联合给予患者，例如在癌症的治疗中。设想在用化学治疗剂治疗前、治疗中或之后给予artemin，这样来预防或治疗神经损伤。较佳的化学治疗剂包括但不限于长春新碱、顺氯氨铂、氨甲蝶呤、3’-叠氮基-3-脱氧胸苷、taxanes(例如，paclitaxe(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和doxetax(TAXOTERE，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France))和/或anthracycline抗生素。附有生产商的说明，确定化学治疗剂的制品和剂量给予时间表，或者可由熟练医生凭经验确定。对于这种化学治疗剂的制品和剂量给予时间表的描述见Chemotherapy ServiceEd.，M.C.Perry，Willians和Wilkins，Baltinore，MD(1992)。
治疗所用的artemin的有效量将取决于，例如治疗对象、给药途径、和患者状况。因此，为了获得最佳的治疗效果，治疗学家必须确定剂量并根据需要修改给药途径。通常，临床医生将给予artemin直到剂量能获得所期效果。
用于全身性治疗的每日剂量范围可从0.01g/kg到50mg/kg或更多，取决于上文提到的因素。作为另一普通建议，配制artemin并将它以一定剂量递送到靶位点或组织，该剂量能够在组织中建立有效但无过分毒性的artemin水平。如果可能，组织内的浓度应通过持续注入、缓释、局部应用、植入artemin表达细胞、或按照经验决定的频率进行注射来维持。该治疗过程通过常规试验不难监控。
在哺乳动物中，损伤引起的神经元病变优选给予约0.01g/kg到约1mg/kg的artemin或artemin激动剂来预防或治疗。在一个实施例中，损伤引起的神经元病变在哺乳动物中优选给予约0.1g/kg到约1mg/kg的artemin或artemin激动剂来预防或治疗。更优选给予约1g/kg到约1mg/kg和甚至更优选约10g/kg到约1mg/kg的artemin或artemin激动剂。在另一个实施例中，损伤引起的哺乳动物神经元病变中优选给予约0.1mg/kg到约1mg/kg的artemin或artemin激动剂来预防或治疗。给予artemin的途径与已知的方法一致，例如静脉内、皮内、腹膜内、脑内、肌肉内、眼内、动脉内或刨伤内，注射或灌输、局部给予、或采用缓释系统。在一个较佳的实施例中，artemin通过静脉内、皮内、鞘内或皮下注射给予。然而在另一个实施例中是局部给予。
必须根据个人情况决定剂量给予方案。然而，在一个优选的实施例中，每天给予artemin和artemin激动剂，较佳地隔天给予，更佳地每周至少两次。治疗宜持续六个月，更佳一个月，甚至更加至少两周。本领域熟练技术人员将理解恰当的剂量给予方案必须由治疗学家根据个人情况决定。
在一个实施例中，给予糖尿病型神经病患者artemin和artemin激动剂。通过静脉注射给予约0.5g/kg和1mg/kg之间的剂量，每周至少三次持续至少两周。患者没有遭受与注射有关的疼痛或痛觉过敏。
8.生产用品
本发明的另一个方面考虑包括用于治疗和预防神经元损伤的材料的生产用品。该生产用品包括一个容器和在容器上或与容器连接的标签或包装说明书。适当的容器包括，例如，瓶子、小瓶、注射器等。该容器可从各种材料例如玻璃和塑料制得。该容器装有包含artemin的组合物和标签或包装说明书，明要以约0.01g/kg和1mg/kg之间的剂量给予此组合物。任选地，标签还可显示该组合物是用于神经元损伤的治疗和/或预防。
实施例1
全身性NGF给药引起发热和机械性痛觉过敏而artemin不引起这种反应
全身性给予后测定NGF和artemin对发热和机械性疼痛阈值二者的影响。NGF或artemin或盐作皮下注射雌性Fischer大鼠的颈背部，这些大鼠事先使之适应并检验以确定它们对有害的热或机械刺激的消退阈值。治疗后2小时、24小时或48小时再次检验它们。试验者没有看到进行全部检验的动物处理。采用Hargreaves方法测定热消退潜伏期，使用电子版的von Frey hairs测定机械阈值。NGF的剂量是1mg/kg，artemin的剂量为5mg/kg。图8和图9中给出的结果清楚地显示，当与仅用盐治疗的动物相比较时，用NGF治疗的动物热消退潜伏期和机械阈值快速地和长时间地下降，而在那些用artemin治疗的动物中没有明显变化。图8显示用NGF治疗的动物热消退潜伏期下降到治疗前值的约75％，而在用artemin治疗的动物热消退潜伏期停留在治疗前值的90％到95％之间。用盐治疗的动物显示测定的热消退潜伏期约为它们处理前数值的95％。在机械致敏试验中，用NGF治疗的动物其消退阈值下降至它们治疗前水平的约60％，而用盐或artemin治疗的动物逐渐下降至它们治疗前数值的约90％(图9)。
实施例2
NGF的局部给药引起发热和机械性痛觉过敏而artemin不引起这种反应
局部给药后测定了NGF和artemin对发热和机械性疼痛阈值的影响。将NGF或者artemin或盐注射入雌性Fischer大鼠一只后腿的足底表面，该大鼠事先使之适应经检验以确定它们对有害的热或机械刺激的消退阈值。治疗后8小时、24小时或48小时再次检验它们。试验者没有看到进行全部检验的动物处理。采用Hargreaves方法测定热消退潜伏期，使用电子版的von Frey hairs测定机械阈值。NGF的剂量是1g，artemin的剂量为5g。图10和图11中给出的结果清楚地显示，当与仅用盐治疗的动物比较时，用NGF治疗的动物热消退潜伏期和机械阈值快速地和长时间地下降，而在那些用artemin治疗的动物中没有明显变化。用NGF治疗的动物热消退潜伏期在24小时内从约6秒下降到约4.5秒，而用artemin或盐治疗的动物热消退潜伏期停留在处理前的6秒(图10)。在机械致敏试验中，用NGF治疗的动物其消退阈值从处理前的27g下降至约22g，而用盐或artemin治疗的动物其消退阈值没有明显下降(图11)。
实施例3
全身性NGF治疗引起体重减轻而artemin不引起这种状况
采用体重减轻作为NGF、artemin或盐全身性治疗引起长期疼痛的一般度量标准。雌性Fischer大鼠用1mg/kg的NGF、5mg/kg的artemin或盐一周一次进行治疗。通过颈背皮下给予。第一次注射前和治疗一周和两周后分别给动物称重。如图12中所见，用NGF治疗的动物在两周后体重减少约7％，而用artemin或盐治疗的动物体重减少了不到2％。
实施例4
artemin治疗减少了疼痛相关行为的发生率
采用大鼠遗留神经损伤模型评估了artemin对神经病疼痛的影响。在该模型中，刚好在坐骨三叉神经的末梢，胫神经和腓神经被剪切并连接，而腓肠神经和隐神经保持完整。这去除了顶端和后腿足底表面的神经支配并导致长期持续的神经病疼痛状态。动物在外科手术后立即开始足底内注射artemin(5g)、NGF(5g)或盐进行治疗，一周三次。将治疗动物与假外科手术的动物相比较，后者的神经暴露但未剪切或连接。治疗12天后测定自发的疼痛行为。动物放置于一个小有机玻璃箱中，记数5分钟所有脚爪保护、举起或微跳的情况。正常动物或假外科手术的动物这种行为的频率非常低，而遗留神经损伤动物相对频繁地显示了这些行为。图13可见，NGF持续治疗与盐治疗的、手术后大鼠相比，手术后12天这些行为出现的频率增加。另一方面，用artemin治疗，这些与疼痛相关的行为的发生率减少(图13)。
实施例5
artemin和NGF保护成熟DRG神经元
免于单纯疱疹病毒诱导的死亡
体外评估了NGF或artemin保护成熟DRG神经元免于单纯疱疹病毒诱导的死亡的能力。将成熟大鼠背根神经节的神经元在NGF(100ng/ml)、artemin(1g/ml)存在的培养基或基础培养基中培养11天，然后用不同浓度的单纯疱疹病毒感染。感染后两天记数存活的细胞。图14显示了NGF和artemin保护神经元免于病毒的毒性作用。
实施例6
artemin治疗预防轴突切开术引起的脊髓背角物质P的损失
artemin保护小纤维感觉神经元免于损伤相关病变的能力，可通过检测artemin给予对轴突切开术后正常产生的感觉神经肽减少的影响来测定。由于感觉神经元的纤维中含有各种神经肽的存在，对于脊髓背角的浅层，可看到小纤维感觉神经元的中央突起。由于纤维萎缩与纤维的肽含量减少的联合作用，坐骨神经横切后，此层中的肽含量下降。将artemin(12g/天)递送入鞘内间隙基本上完全阻止了这种减少。图15，显示脊髓背角切面物质P的染色。轴突切开术的同侧与盐治疗的动物的对侧相比染色强度下降，而artemin治疗侧这种强度差异基本上被消除。
图16显示了定量测定这一结果的方法。测定平均染色强度在150，一个象素宽带开始于背角的顶部。简言之，如图中显示的 线条位于背角的中央和内侧区域的 下面。每一个垂直的线条由150个水平象素宽线组成。计算每一线的平均强度。这 样得到随背角下深度的变化的染色强度变化。然后将这些值以对侧未损伤的背角的 染色强度的％表示，并描绘于图16中。
图17中，物质P染色强度(Y-轴)对从大鼠背角表面开始的深度(X-轴)作图，该大鼠一侧的坐骨神经被切伤。将坐骨神经损伤侧与未手术侧相比，背角物质P的免疫染色明显下降。动物经持续灌注12g/天的artemin鞘内治疗，预防了轴突切开术引起的肽的损失。
实施例7
artemin预防轴突切开术后C-纤维传导速度的变化
图18显示坐骨神经中C-纤维的传导速度的Q-sum曲线图。对大鼠进行一侧坐骨神经切割，并使之恢复一周。在这一周中，以12g/天的剂量通过持续鞘内灌注盐或artemin治疗它们。坐骨神经切割或者假手术后的七天，用氨基申酸乙酯麻痹动物并进行椎板切除术以暴露腰区的背根。梳理出L4和L5背根的各条纤维并通过坐骨神经刺激鉴定各根纤维的动作电位。测定了每个动物的100-200根纤维的各C-纤维传导速度。与先前的工作相一致，轴突切开术和盐治疗引起Q-sum曲线明显左移(图18)，对应于轴突切开术后C-纤维传导速度减慢。然而，已进行了轴突切开术并用artemin治疗的动物显示非常少的移动，表明得到了保存避免了损伤引起的传导速度的移动。
实施例8
artemin诱导的新生DRG神经元的存活需要GRF3
解剖获得野生型或GRF3缺陷小鼠背根神经节中的新生神经元并在培养基中放置24小时。这一时间结束时计算活细胞的数量。从野生型动物得到的培养物中，与不加入任何因子的相比，artemin使大量神经元存活(图19)。如图19中可见，然而，在GFRα3敲除小鼠的神经元中，加入artemin没有产生超过对照的培养物中所见的存活增加。另一方面，NGF诱导了野生型和敲除小鼠神经元的相似程度的存活。这表明artemin对新生神经元存活的影响需要GFRα3的作用。
实施例9
轴突切开术后GFRα3存在于几乎所有的小细胞上
大约40％的背根神经节(DRG)细胞表达GFRα3 mRNA。大多数表达GFRα3的DRG细胞是小直径细胞。如图20中可见，外周神经损伤引起GFRα3表达的上调，因此几乎所有的小DRG细胞表达了该受体(全部细胞的66％)。在远侧残端具有伴随的artemin上调。这些数据表明artemin可能具有对损伤的小感觉神经元的神经保护作用。
实施例10
外周递送的artemin保护肽能神经元免于辣椒素的影响
用辣椒素(50mg/kg)全身性治疗大鼠以损伤小直径纤维。一些动物每天用artemin治疗(5g，足底内给予)持续5天。5天后，取出脊髓，并对背角侧面和中间区域中物质P的免疫反应性进行染色。如图21中显示，辣椒素处理引起背角的中间和侧面区域内物质P含量的深度缺乏。通过经脚爪给予artemin完全阻止了侧面背角的这种缺乏，而经脚爪给予artemin在中部背角中得到了超常水平的物质P。因此，外周artemin的给予完全保护了感觉神经元投射进入背角的肽含量避免了辣椒素的有害作用。
实施例11
ICV artemin预防坐骨神经轴突切开术后背角物质P的损失
用套管植入小鼠的侧脑室并切割小鼠左侧的坐骨神经。用一种渗透性的微型真空泵以12g/天的速度经套管注入artemin或运载体。8天后，取出脊髓，并对背角侧面和中间区域中物质P的免疫反应性进行染色。图22显示用运载体处理的经轴突切开术动物，与对照侧(绿色)相比，显示损伤侧物质P的染色强度降低(蓝色)。在保持已知的坐骨神经投射模式中，该作用在背角的中部区域最明显。Artemin的注入大大防止了损伤侧物质P的损失(红色)并引起在对照侧肽染色的增加(黑色)。
                                  序  列  表
                                    序列表
<110>基因技术股份有限公司(Genentech，Inc.)
     H.S.菲利普斯(Phillips，Heidi S.)
     D.L.谢尔顿(Shelton，David L.)
<120>ARTEMIN-GDNF配体家族的一个成员的新用途
<130>GENENT.042QPC
<150>60/257601
<151>2000-12-22
<160>7
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>113
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys
 1               5                  10                  15
Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His
            20                  25                  30
Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg
        35                  40                  45
Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala
    50                  55                  60
Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys
65                  70                  75                  80
Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser
                85                  90                  95
Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu
            100                 105                 110
Gly
<210>2
<211>663
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>2
atggaacttg gacttggagg cctctccacg ctgtcccact gcccctggcc taggcggcag 60
cctgccctgt ggcccaccct ggccgctctg gctctgctga gcagcgtcgc agaggcctcc 120
ctgggctccg cgccccgcag ccctgccccc cgcgaaggcc ccccgcctgt cctggcgtcc 180
cccgccggcc acctgccggg gggacgcacg gcccgctggt gcagtggaag agcccggcgg 240
ccgccgccgc agccttctcg gcccgcgccc ccgccgcctg cacccccatc tgctcttccc 300
cgcgggggcc gcgcggcgcg ggctgggggc ccgggcagcc gcgctcgggc agcgggggcg 360
cggggctgcc gcctgcgctc gcagctggtg ccggtgcgcg cgctcggcct gggccaccgc 420
tccgacgagc tggtgcgttt ccgcttctgc agcggctcct gccgccgcgc gcgctctcca 480
cacgacctca gcctggccag cctactgggc gccggggccc tgcgaccgcc cccgggctcc 540
cggcccgtca gccagccctg ctgccgaccc acgcgctacg aagcggtctc cttcatggac 600
gtcaacagca cctggagaac cgtggaccgc ctctccgcca ccgcctgcgg ctgcctgggc 660
tga                                                               663
<210>3
<211>220
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>3
Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp
 1               5                  10                  15
Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu
            20                  25                  30
Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro
        35                  40                  45
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    50                  55                  60
Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg
65                  70                  75                  80
Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro
                85                  90                  95
Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly
            100                 105                 110
Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln
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Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg
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Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
    210                 215                 220
<210>4
<211>714
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>4
atgcccggcc tgatctcagc ccgaggacag cccctccttg aggtccttcc tccccaagcc 60
cacctgggtg ccctctttct ccctgaggct ccacttggtc tctccgcgca gcctgccctg 120
tggcccaccc tggccgctct ggctctgctg agcagcgtcg cagaggcctc cctgggctcc 180
gcgccccgca gccctgcccc ccgcgaaggc cccccgcctg tcctggcgtc ccccgccggc 240
cacctgccgg ggggacgcac ggcccgctgg tgcagtggaa gagcccggcg gccgccgccg 300
cagccttctc ggcccgcgcc cccgccgcct gcacccccat ctgctcttcc ccgcgggggc 360
cgcgcggcgc gggctggggg cccgggcagc cgcgctcggg cagcgggggc gcggggctgc 420
cgcctgcgct cgcagctggt gccggtgcgc gcgctcggcc tgggccaccg ctccgacgag 480
ctggtgcgtt tccgcttctg cagcggctcc tgccgccgcg cgcgctctcc acacgacctc 540
agcctggcca gcctactggg cgccggggcc ctgcgaccgc ccccgggctc ccggcccgtc 600
agccagccct gctgccgacc cacgcgctac gaagcggtct ccttcatgga cgtcaacagc 660
acctggagaa ccgtggaccg cctctccgcc accgcctgcg gctgcctggg ctga       714
<210>5
<211>237
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>5
Met Pro Gly Leu Ile Ser Ala Arg Gly Gln Pro Leu Leu Glu Val Leu
 1               5                  10                  15
Pro Pro Gln Ala His Leu Gly Ala Leu Phe Leu Pro Glu Ala Pro Leu
            20                  25                  30
Gly Leu Ser Ala Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala
        35                  40                  45
Leu Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser
    50                  55                  60
Pro Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly
65                  70                  75                  80
His Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg
                85                  90                  95
Arg Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro
            100                 105                 110
Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro
        115                 120                 125
Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser
    130                 135                 140
Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu
145                 150                 155                 160
Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser
                165                 170                 175
Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg
            180                 185                 190
Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr
        195                 200                 205
Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr
    210                 215                 220
Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
225                 230                 235
<210>6
<211>675
<212>DNA
<213>鼠科(Murine)
<400>6
atggaactgg gacttgcaga gcctactgca ttgtcccact gcctccggcc taggtggcag 60
tcagcctggt ggccaaccct agctgttcta gccctgctga gctgcgtcac agaagcttcc 120
ctggacccaa tgtcccgcag ccccgccgct cgcgacggtc cctcaccggt cttggcgccc 180
cccacggacc acctgcctgg gggacacact gcgcatttgt gcagcgaaag aaccctgcga 240
cccccgcctc agtctcctca gcccgcaccc ccgccgcctg gtcccgcgct ccagtctcct 300
cccgctgcgc tccgcggggc acgcgcggcg cgtgcaggaa cccggagcag ccgcgcacgg 360
accacagatg cgcgcggctg ccgcctgcgc tcgcagctgg tgccggtgag tgcgctcggc 420
ctaggccaca gctccgacga gctgatacgt ttccgcttct gcagcggctc gtgccgccga 480
gcacgctccc agcacgatct cagtctggcc agcctactgg gcgctggggc cctacggtcg 540
cctcccgggt cccggccgat cagccagccc tgctgccggc ccactcgcta tgaggccgtc 600
tccttcatgg acgtgaacag cacctggagg accgtggacc acctctccgc cactgcctgc 660
ggctgtctgg gctga                                                  675
<210>7
<211>224
<212>PRT
<213>鼠科(Murine)
<400>7
Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg
 1               5                  10                  15
Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu
            20                  25                  30
Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro
        35                  40                   45
Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp His
    50                  55                  60
Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Thr Leu Arg
65                  70                  75                  80
Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala
                85                  90                  95
Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala
            100                 105                 110
Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg
        115                 120                 125
Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser
    130                 135                 140
Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg
145                 150                 155                 160
Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly
                165                 170                 175
Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys
            180                 185                 190
Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr
        195                 200                 205
Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
    210                 215                 220

Claims (25)

1.artemin或其激动剂在药物生产中的应用，其特征在于，所述药物用于保护哺乳动物的神经元避免损伤引起的病变，而不伴有机械或热痛觉过敏，给药的剂量范围在0.01g/kg和1mg/kg之间。
2.artemin或其激动剂在药物生产中的应用，其特征在于，所述药物用于治疗哺乳动物神经元的损伤，而不伴有机械或热痛觉过敏，给药的剂量范围在0.01g/kg和1mg/kg之间。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述剂量范围在0.1g/kg和1mg/kg之间。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述剂量范围在0.1mg/kg和1mg/kg之间。
5.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述给药一周至少重复2-3次，持续时间至少为两周。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述给药一周至少重复三次，持续时间至少为两周。
7.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述给药是全身性给药。
8.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述给药是局部给药。
9.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述神经元选自中枢神经元、外周神经元和运动神经元。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述外周神经元选自交感神经、副交感神经、感觉和肠神经元。
11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述感觉神经元选自背根神经节的感觉神经元、三叉神经节的感觉神经元和结扎神经节的感觉神经元。
12.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述中枢神经元是脑或脊髓神经元。
13.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述损伤与创伤、毒性剂、其它治疗剂不良副作用、外科手术、中风、局部缺血、感染、代谢疾病、营养缺乏、或恶性肿瘤有关。
14.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述损伤与周围神经病有关。
15.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述损害产生自神经病或神经变性疾病。
16.如权利要求14或15所述的应用，其特征在于，所述神经病是外周感觉神经病。
17.如权利要求17所述的应用，其特征在于，所述外周感觉神经病是糖尿病型神经病。
18.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述artemin是天然序列artemin多肽。
19.如权利要求18所述的应用，其特征在于，所述artemin是天然序列的人artemin多肽。
20.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述artemin包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
21.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述artemin包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。
22.如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述artemin包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
23.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述哺乳动物是人。
24.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述artemin是一种免疫粘附素。
25.一种生产用品，其特征在于，所述用品包括：
(a)一个容器；
(b)一种放在容器中的含有artemin的药物组合物；和
(c)以某一剂量给予所述药物组合物的说明，其中，所述剂量在0.01μg/kg和1mg/kg之间。
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