CN1681527A

CN1681527A - 使用干扰素－β治疗肾衰竭

Info

Publication number: CN1681527A
Application number: CNA038221071A
Authority: CN
Inventors: 罗伊·R·洛布
Original assignee: Biogen Idec MA Inc
Current assignee: Biogen Inc; Biogen MA Inc
Priority date: 2002-07-17
Filing date: 2003-07-17
Publication date: 2005-10-12
Also published as: CA2492649A1; KR20050021502A; IL200892A0; NO20050827L; IL166256A; UA88440C2; WO2004006756A3; US20070025965A1; EP1553971A4; GEP20084499B; KR20110053390A; JP4883665B2; MXPA05000658A; IS7650A; PL374914A1; CN101664545A; EA200500218A1; EP1553971A2; IL200892A; AU2003256603C1

Abstract

本发明提供了对患有或易患肾小球肾炎或慢性肾衰竭的哺乳动物个体的治疗方法，以及用于该治疗的药物。该方法包括施用IFN－β治疗剂。

Description

使用干扰素-β治疗肾衰竭

发明背景

慢性肾衰竭(CRF)可被定义为由于肾单位显著性及持续性丧失造成的肾小球滤过率(GFR)进行性、持久性和显著性的降低。慢性肾衰竭通常开始于一些肾组织损伤所导致的慢性肾功能不全(即，肾功能持久性降低至少50-60％)，所述损伤致使肾单位显著丧失。初始损伤可与急性肾衰竭事件相关或不相关，或者其可与任何数目的肾疾病相关，所述疾病包括但不限于终末期肾病(end-stage renal disease)，慢性糖尿病性肾病，糖尿病性肾小球病，糖尿病性肾肥大(diabetic renal hypertrophy)，高血压性肾硬化症(hypertensivenephrosclerosis)，高血压性肾小球硬化症，慢性肾小球肾炎，遗传性肾炎，肾发育不良和同种异体肾移植后的慢性排斥反应。无论初始损伤的性质如何，随肾单位进行性丧失和GFR进行性下降慢性，肾衰竭均表现出体征和症状的“最终共同途径”。这种肾功能进行性恶化是缓慢的，在人类患者中通常可跨越数年或数十年，但其似乎是不可避免的。

在人类中，随着慢性肾衰竭的进展，GFR持续降低至低于正常值(例如，5-10ml/min)的10％，个体进入终末期肾病(ESRD)。在该期期间，剩余的肾单位已不足以从血液中除去废产物，同时保持有用产物并维持液体平衡和电解质平衡，这导致其中多种器官系统(特别是心血管系统)功能降低，并迅速开始出现衰竭。此时，除非个体接受肾替代治疗(即，长期血液透析、连续腹膜透析或肾移植)，否则肾衰竭将迅速进展而导致死亡。

能够导致CRF的一种肾病是肾小球肾炎。肾小球肾炎的特征是通常由于免疫复合物形成造成的炎症并导致肾小球增大。免疫复合物在肾小球中的累积导致包括细胞过多(hypercellularity)等在内的免疫反应，其可通过毛细血管腔的狭窄等因素而导致肾小球的完全或部分阻塞。该过程的一个结果是肾小球的正常滤过功能受到抑制。阻塞可发生在多个肾小球中，直接损害肾功能并通常导致蛋白质在构成肾小球的微血管的管壁发生异常沉积。所述沉积能反过来导致肾小球基底膜的损伤。那些未被阻塞的肾小球的渗透性增加，使得大量蛋白质进入尿中，这种病症称为蛋白尿。

在很多例严重肾小球肾炎中，在包曼间隙(Bowman’s space)中形成称为新月体的病理结构，其进一步阻碍了肾小球滤过。这些结构仅可通过对活体组织检查或尸检所获得的组织样品进行显微镜检测而被观察到，因此在出现这些结构的那些患者中不是总能观察到。新月体是细胞增多的表现，且被认为源自壁上皮细胞(parietal epithelial cells)(构成包曼囊的内衬层的细胞)的广泛异常增生。临床研究已经大致显示出具有新月体的肾小球的百分比和疾病的临床严重程度以及与患者预后之间存在相关性。新月体在大量存在时是较差预后的指征。

在美国，每年在每百万人中大约有600名患者接受长期透析，每名患者每年的平均费用约为$60,000-$80,000。在每年新发的终末期肾病病例中，大约28-33％是由于糖尿病肾病(或糖尿病性肾小球病或糖尿病性肾肥大)，24-29％是由于高血压肾硬变(或高血压性肾小球硬化症)，而15-22％是由于肾小球肾炎。所有长期透析患者的5年生存率约为40％，但对于65岁以上的患者，五年生存率降至约20％。仅在美国，肾功能的进行性丧失已导致近二十万名患者需要依赖长期透析，且其每年导致数万例早产儿死亡，因此需要能防止肾功能的进行性丧失的治疗方法。

发明概述

在一个实施方案中，本发明提供了治疗患有或易患肾小球肾炎的哺乳动物中的肾小球肾炎或慢性肾衰竭的方法，包括对该哺乳动物施以治疗有效量的IFN-β治疗剂。本发明还提供了IFN-β治疗剂在制备用于治疗或预防肾小球肾炎的药剂中的用途。所述肾小球肾炎可选自局灶性肾小球硬化症(focal glomeruloscerosis)，塌陷性肾小球病(collapsing glomerulopathies)，微小病变病(minimal change disease)，新月体性肾小球肾炎(crescenticglomerulonephritis)，肾炎综合征(nephritic syndrome)，肾病综合征(nephroticsyndrome)，原发性肾小球肾炎(primary glomerulonephritis)，继发性肾小球肾炎(secondary glomerulonephritis)，增生性肾小球肾炎(proliferativeglomerulonephritis)，膜性肾小球肾炎(membraneous glomerulonephritis)，膜性增生性肾小球肾炎(membranoproliferative glomerulonephritis)，免疫复合物性肾小球肾炎(immune-complex glomerulonephritis)，抗肾小球基底膜(抗-GBM)型肾小球肾炎(anti-glomerular basement membrane(anti-GBM)glomerulonephritis)，少-免疫型肾小球肾炎(pauci-immuneglomerulonephritis)，糖尿病性肾小球病(diabetic glomerulopathy)，慢性肾小球肾炎(chronic glomerulonephritis)或遗传性肾炎(hereditary nephritis)。IFN-β可以是成熟或未成熟的且可缺少起始甲硫IFN-β氨酸。可以是人IFN-β，例如，IFN-β-1a和IFN-β-1b。IFN-β可以是与含有SEQ ID NO：4的全长成熟人IFN-β有至少约95％的同一性的蛋白质。IFN-β可以是包含或具有SEQ ID NO：4的全长成熟人IFN-β。IFN-β可以是糖基化的或非糖基化的。IFN-β治疗剂还可以是包含与人免疫球蛋白分子的恒含定区(例如，IgG1的重链)融合的SEQ ID NO：4的全长成熟人IFN-β。例如，IFN-β治疗剂可包含SEQ ID NO：14。IFN-β治疗剂还可包括PEG化IFN-β。

IFN-β治疗剂可包括稳定剂，其可以是酸性氨基酸。其还可以是精氨酸。IFN-β治疗剂的pH可以是约4.0至7.2。在优选的实施方案中，IFN-β治疗剂是AVONEX。

IFN-β治疗剂可经胃肠道外进行施用，例如，静脉内(i.v.)，皮下和肌肉(i.m.)。该方法可包括对哺乳动物施以若干剂量的IFN-β治疗剂。IFN-β治疗剂可经数天进行施用。例如，其可以约6MIU的剂量每周施用。其还可以用约3、6或12MIU的剂量以每周三次进行施用。施用IFN-β治疗剂可减轻哺乳动物中的例如蛋白尿，肾小球细胞增生或肾小球炎症。

在优选的实施方案中，所述哺乳动物是人。所述人可以是患者。所述哺乳动物可以是以例如至少一个肾小球将要出现炎症为指征的很可能患肾小球肾炎的哺乳动物。所述哺乳动物是这样的哺乳动物，其很可能患慢性肾衰竭，或患有例如以慢性肾功能不全的存在为指征的慢性肾衰竭。存在至少一个肾小球的炎症、肾小球肥大、肾小管肥大、肾小球硬化症或肾小管间质硬化症的哺乳动物即可被鉴定为患有肾小球肾炎。在具体实施方案中，所述哺乳动物不带有导致肾小球肾炎的病毒或其中的肾小球肾炎不是由病毒导致的，所述病毒例如肝炎病毒，诸如乙型或丙型肝炎病毒等。在其它实施方案中，所述哺乳动物不患有终末期肾衰竭或肾细胞癌。

附图简述

图1显示一种融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)和氨基酸序列(SEQ ID NO：12)，该融合蛋白的组成为：VCAM信号序列与成熟全长人IFN-β(SEQ ID NO：3和4)融合，并且该成熟全长人IFN-β与人IgG1Fc(ZL5107)的铰链区、CH2和CH3区融合，其中SEQ ID NO：4的第162位甘氨酸被半胱氨酸取代。

图2显示一种融合蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：13)和氨基酸序列(SEQ ID NO：14)序列，该融合蛋白的组成为：VCAM信号序列与成熟全长人IFN-β(SEQ ID NO：3和4)融合，该成熟全长人IFN-β与G4S连接体(linker)融合，并且该G4S连接体与人IgG1Fc(ZL6206)的铰链区、CH2和CH3区融合，其中SEQ ID NO：4的第162位甘氨酸被半胱氨酸取代。

图3显示肾毒性肾炎(NTN)大鼠在第7，14，21和28日的蛋白尿水平，所述大鼠已用3×10⁵单位的大鼠IFN-β/日，6×10⁵单位的大鼠IFN-β/日或单独的载体(“对照”)治疗，所述治疗始于第0日，每周治疗6曰。

图4显示肾毒性肾炎(NTN)大鼠在第7，14，21和28日的蛋白尿水平，所述大鼠已用6×10⁵单位的大鼠IFN-β/日或单独的载体(“对照”)治疗，所述治疗始于第0日，每周治疗6日。

图5显示肾毒性肾炎(NTN)大鼠从第0日至第7日的肾小球增生细胞数量，所述大鼠已用6×0⁵单位的大鼠IFN-β/日或单独的载体(“RSA”)治疗，每周治疗6日。

图6显示Thy1肾小球肾炎大鼠在第7和第10日的蛋白尿水平，所述大鼠已用6×10⁵单位的大鼠IFN-β/日或单独的载体(“RSA”)治疗，所述治疗自第0日至第10日，每周治疗6日。

图7显示Thy1肾小球肾炎大鼠在第7或第10日的肌酸清除率水平，所述大鼠已用6×10⁵单位的大鼠IFN-β/日或单独的载体(“对照”)治疗，所述治疗自第0日至第10日，每周治疗6日。

图8显示Thy1肾小球肾炎大鼠在第10日的肾小球增生评分，所述大鼠已用6×10⁵单位的大鼠IFN-β/日或单独的载体(“对照”)治疗，所述治疗自第0日至第10日，每周治疗6日。

图9显示患有嘌呤霉素氨基核苷肾病(puromycin aminonucleosidenephropathy)(PAN)的大鼠在第7和14日的蛋白尿水平，所述大鼠已用6×10²、6×10³、6×10⁴、或6×10⁵单位的大鼠IFN-β/日或单独的载体(“对照”)治疗。

发明详述

本发明至少部分基于如下发现，即在哺乳动物中的至少一些肾小球肾炎症状可通过对哺乳动物施用IFN-β而得以改善。具体而言，已经发现通过施用IFN-β可显著减少蛋白尿，肾小球细胞增生和炎症。由此，本发明提供了用于治疗哺乳动物中的肾小球肾炎的方法和组合物。

1. 定义：

为更清楚和简明地指出本发明的主题，对本说明书和所附权利要求中所使用的术语给出如下定义。

除非文中另有清楚的描述，说明书和所附权利要求中所使用的单数形式“一种”，“该”和“所述”包括指称对象的复数。

“肾小球滤过率”或“GFR”与血浆所携带的物质进入尿的清除率成正比，所述物质不与血清蛋白结合，可自由地经由肾小球滤过，且既不由肾小管分泌也不被肾小管重吸收。因此，如本文所用，GFR优选通过下述等式进行确定：

GFR = \frac{U_{conc} \times V}{P_{conc}}

其中U_conc是标记物的尿浓度，P_conc是标记物的血浆浓度，V是以ml/min计的尿流速率。任选地，根据体表面积校正GFR。因此，本文所用的GFR值可被看作是以ml/min/1.73m²为单位的。GFR的优选检测方法是胰岛素的清除率，但是因为检测该物质的浓度很困难，故在临床情况中通常使用肌酐清除率。例如，对于平均体型、健康的男性人类个体(70kg，20-40岁)而言，当肌酐的血浆浓度为0.7-1.5mg/dL时，预期通过肌酐清除率测定的GFR通常为约125ml/min。对于可比的、平均体型的女性来说，肌酐水平为0.5-1.3mg/dL时，预期通过肌酐清除率测定的GFR值通常约115ml/min。在良好健康情况下，人的GFR值相对稳定直至约40岁(GFR通常开始减退的年龄)。对于存活至85或90岁的个体而言，GFR可降低至40岁时GFR的50％。根据对个体的年龄，体重，性别，体表面积和肌肉含量，以及通过血液实验确定的某些标记化合物(例如，肌酐)的血浆浓度可以估计“预期的GFR”或“GFR_exp”。因此，作为例示，预期的GFR或GFR_exp可按下述进行估计：

{GFR}_{\exp} \approx \frac{(140 - age) \times weight (kg)}{72 \times P_{conc} (mg / dl)}

该估计无须考虑诸如体表面积、肌肉含量或体脂百分比等因素。但是，使用血清肌酐水平作为标记物，该公式已经作为估计GFR的廉价方式而用于男性人类个体。因为肌酐由横纹肌产生，考虑到肌肉质量的预期差异，故女性人类个体的预期的GFR或GFR_exp通过用相同公式乘以0.85来进行估计。(参见Lemann，等.(1990)Am.J.Kidney Dis.16(3)：236-243.)

本文中，“肾小球肾炎”，“肾炎”，“急性肾炎”和“肾小球性肾炎”可以互换使用。

“IFN-β-1a”是指含有野生型人IFN-β的氨基酸序列并被糖基化的IFN-β分子。

“IFN-β-1b”是指含有野生型人IFN-β的氨基酸序列的IFN-β分子，其中第17位的半胱氨酸被丝氨酸取代；第1位的甲硫氨酸(“起始物甲硫氨酸”)缺失，且该分子未被糖基化。

“IFN-β变体”是指这样的野生型IFN-β蛋白质，其具有一或多种修饰，例如氨基酸缺失、添加、取代、翻译后修饰，或包括一或多个非天然存在的氨基酸残基或残基之间的连接。术语“IFN-β变体”还包括IFN-β的一部分。“生物活性IFN-β变体”是对肾病，例如肾小球肾炎具有至少部分治疗活性的IFN-β变体。例如，IFN-β变体可以是相对于野生型IFN-β而言含有一个或多个氨基酸的插入、缺失或取代的天然存在的IFN-β，即天然存在的变体或多态性变体，或者可以是非天然存在的IFN-β。

“分离的”(可以与“基本上纯的”互换使用)在用于多肽时，是指这样的多肽，借助其来源或操作，其可：(i)作为部分表达载体的表达产物存在于宿主细胞中；或(ii)连接于蛋白质或其它化学部分，所述物质不包括与其天然连接的蛋白质或其它化学部分；或(iii)不存在于自然界，例如，通过将至少一个疏水性部分附加或添加到蛋白质来通过化学方法修饰所述蛋白质，从而使该蛋白质成为非天然形式。“分离的”还指下列蛋白质：(i)化学合成的；或(ii)在宿主细胞中表达并通过纯化从相结合的污染蛋白质中分离。该术语一般指已经同与其天然结合的其它蛋白质和核酸分开的多肽。优选的，所述多肽还与诸如用于纯化它的抗体或凝胶基质(聚丙烯酰胺)等物质分开。当应用于核酸时，“分离的”(可以与“基本上纯的”互换使用)是指RNA或DNA多核苷酸、部分基因组多核苷酸、cDNA或合成多核苷酸，由于其起源或操作，其：(i)不和与其天然结合的所有核苷酸相结合(如作为表达载体或其一部分存在于宿主细胞中)；或(ii)与自然状况下并不与之连接的核酸或其它化学部分连接；或(iii)为天然不存在的。“分离的”还指下列多核苷酸序列，所述序列：(i)通过例如聚合酶链式反应(PCR)在体外扩增；(ii)通过化学方法合成；(iii)通过克隆重组产生；或(iv)通过切割和凝胶分离来纯化。

当核酸与另一核酸序列发生功能上的关系时，该核酸即为“可操作地连接于”另一核酸。例如，如果DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则编码前序列或分泌型前导序列(例如，信号序列或信号肽)的DNA与编码多肽的DNA可操作性地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则启动子或增强子可操作地连接于编码序列；如果核糖体结合位点的位置有利于翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接于编码序列。一般而言，“可操作地连接于”是指被邻接的DNA序列是连续的，并且在例如分泌型前导序列的情况下为邻接的并处于阅读相。连接(linking)通过在方便的限制性位点进行接合(ligation)来完成。若这样的位点不存在，可依照常规实施方法使用合成的寡核苷酸接头(adaptor)或连接体。

“同一性百分比”或“相似性百分比”指两种多肽、分子之间或两种核酸之间的序列相似性。如果所比较的两种序列中的同一位置被相同碱基或氨基酸单体亚基所占据，则所述两个分子在该位置上是相同的。两种序列之间的同一性百分比是两种序列的匹配性或同一性位置的数目除以所比较的位置数目之后再×100的函数。例如，如果在两种序列中，10个位置中的6个是匹配的或同一的，则这两种序列具有60％的同源性。作为例示，DNA序列CTGACT和CAGGTT享有50％同源性(所有6个位置中有3个匹配)。一般而言，比较是在对两种序列进行比对以产生最大同一性时进行的。使用例如下面详细描述的Karlin和Altschul的方法可以提供这种比对。当涉及核酸时，“同源性百分比”和“同一性百分比”可互换使用，而在涉及多肽时，“同源性百分比”是指相似性的程度，其中表示其它氨基酸的保守性取代的氨基酸被认为与这些其它氨基酸是同一的。参照序列中残基的“保守取代”是用与相应的参照残基在物理或功能上相似的氨基酸进行的取代，所述氨基酸例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质，包括形成共价键或氢键的能力等。特别优选的保守取代是满足Dayhoff等，5：Atlas ofProtein Sequence And Structure，5：Suppl.3，chapter 22：354-352，Nat.Biomed.Res.Foundation，Washington，D.C.(1978)中定义的“可接受的点突变”标准的那些取代。两个氨基酸序列或两个核酸序列的同源性百分比和同一性百分比可采用如Karlin和Altschul(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA 90：5873(1993)所改进的Karlin和Altschul的比对算法(Proc.Nat.Acad.Sci.，USA 87：2264(1990)进行确定。将所述算法纳入Altschul等，J.Mol.Biol.215：403(1990)等的NBLAST或XBLAST程序中。BLAST搜索采用NBLAST程序，评分＝100，字长(wordlength)＝12来实施，以获得与本发明的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白分搜索采用XBLAST程序，评分＝50，字长＝3来实施，以获得与对照多肽同源的氨基酸序列。为得到用于比较的缺口比对，使用如Altschul等，Nuleic Res.，25：3389(1997)中所述的有缺口的BLAST(gappedBLAST)。当使用BLAST和有缺口的BLAST时，使用各程序(XBLAST和NBLAST)的默认参数。参见 http：//www/ncbi.nlm.nih.gov。

在施用于患有或易患肾小球肾炎或慢性肾衰竭的个体时，如果给药的IFN-β治疗剂的量足以导致肾功能的标准指标在临床上显著性改善，则该IFN-β治疗剂被称为具有“疗效”，且该IFN-β治疗剂的量被称为“治疗上有效的”。所述肾功能的指标是医学领域众所周知的，包括(但不限于)，BUN水平增长率，血清肌酐增长率，BUN的静态检测，血清肌酐的静态检测，肾小球滤过率(GFR)，BUN/肌酐比值，钠(Na+)的血清浓度，肌酐的尿/血浆比值，尿素的尿/血浆比值，尿摩尔渗透压浓度，日尿量等(参见，例如，Brenner和Lazarus(1994)，in Harrison′s Principles of Internal Medicine，13thedition，Isselbacher等，eds.，McGraw Hill Text，New York；Luke和Strom(1994)，in Internal Medicine，4th Edition，J.H.Stein，ed.，Mosby-YearBook，Inc.St.Louis.)。在优选的实施方案中，施用治疗有效量的IFN-β治疗剂导致蛋白尿、肾小球细胞增生的降低或肾小球中存在的炎症细胞，例如，CD8+T细胞和巨噬细胞的降低。

2. IFN-β治疗剂

可根据本发明使用的IFN-β治疗剂包括野生型IFN-β及及其生物活性变体，例如，天然存在的和非天然存在的变体。SEQ ID NO：1和2中分别列出野生型天然存在的人IFN-β的核苷酸和氨基酸序列，其分别与GenBank登记号M28622和AAA36040的序列相同。这些IFN还被描述于，例如，Seghal(1985)J.Interferon Res.5：521中。全长人IFN-β蛋白质的长度为187个氨基酸，SEQ ID NO：1的编码序列对应于76-639位核苷酸。信号序列对应于1-21位氨基酸。该IFN-β的成熟形式的氨基酸序列对应于22-187位氨基酸(SEQ ID NO：1的139-639位核苷酸)。SEQ ID NO：4和3中分别列出了成熟人IFN-β蛋白质及编码所述蛋白质的核苷酸序列。

哺乳动物细胞中产生的IFN-β是糖基化的。天然存在的野生型IFN-β在SEQ ID NO：4的成熟多肽的残基80(Asn 80)或SEQ ID NO：2的未成熟多肽的残基101(Asn 101)处是糖基化的。

IFN-β治疗剂还包括非人IFN-β，例如，来自脊椎动物，诸如哺乳动物，例如，非人灵长类，牛，羊，猪，马，猫，犬，大鼠和小鼠；或鸟类或两栖动物。来自这些物种的IFN-β序列可获自GenBank和/或公开出版物，或可通过这样的核酸来确定，所述核酸与来自其它物种的IFN-β发生低严谨度杂交而被分离。

野生型IFN-β蛋白质的变体包括含有与野生型IFN-β具有至少约70％、80％、90％、95％、98％或99％同一性或同源性的氨基酸序列的蛋白质，例如含有SEQ ID NO：2或4的人IFN-β。变体可具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。例如，可以使用野生型IFN-β蛋白质的生物活性片段。所述片段可具有在蛋白质的C-或N-末端缺失的、添加的或取代的1、2、3、5、10或20个氨基酸。变体还可具有1、2、3、5、10或达20个氨基酸的取代、删除或添加。一些变体可具有低于约50、40、30、25、20、15、10、7或5个氨基酸的取代、缺失或添加。取代可以用天然存在的氨基酸或用其类似物例如D-立体异构氨基酸来进行。

本发明的范围还包括由在严谨条件下与编码天然存在IFN-β的核酸或其互补链发生杂交的核酸所编码的IFN-β变体，所述核酸例如，SEQ ID NO：1或3所示。促进DNA杂交的适宜的严谨条件，例如，6.0×氯化钠/枸酸钠(SSC)，约45℃，随后用2.0×SSC，在50℃进行洗涤是本领域技术人员所已知的，或可见于Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中。例如，洗涤步骤中的盐浓度可选自低严谨度的约2.0×SSC，50℃至高严谨度的约0.2×SSC，50℃。此外，洗涤步骤中的温度可从低严谨条件即室温(约22℃)增至高严谨条件即约65℃。温度和盐均可改变，或盐浓度的温度(temperature of salt concentration)可保持恒定而其它变量改变。在优选的实施方案中，编码IFN-β变体的核酸与SEQ ID NO：1或3之一或其互补体在中等严谨条件下(例如在约2.0×SSC和约40℃并包括洗涤)杂交。在特别优选的实施方案中，编码IFN-β变体的核酸与SEQID NO：1或3之一或其互补体在高严谨条件下(例如在约0.2×SSC和约65℃并包括洗涤)结合。

示例性修饰是对蛋白质的二级和三级结构影响最小的保守性修饰。示例性保守性取代包括Dayhoff在Atlas of Protein Sequence and Structure5(1978)，以及Argos在EMBO J.，8，779-785(1989)中所公开的那些取代。例如，属于下组之一的氨基酸代表保守性改变：ala，pro，gly，gln，asn，ser，thr；cys，ser，tyr，thr；val，ile，leu，met，ala，phe；lys，arg，his；和phe，tyr，trp，his。

其它修饰包括用一种氨基酸取代另一种，所述取代不一定代表保守性取代。例如，可进行基本上不影响IFN-β三维结构的取代。非糖基化人IFN-β的三维结构描述于，例如Radhakrishnan等.(1996)Structure 4：1453中，而糖基化IFN-β的三维结构描述于，例如Karpusas等.(1997)PNAS 94：11813)中。基本上，IFN-β包括五个螺旋：螺旋A(由SEQ ID NO：4的大约2-22位氨基酸组成)；螺旋B(由SEQ ID NO：4的大约51-71位氨基酸组成)；螺旋C(由SEQ ID NO：4的大约80-107位氨基酸组成)；螺旋D(由SEQ ID NO：4的大约118-136位氨基酸组成)和螺旋E(由SEQ ID NO：4的大约139-162位氨基酸组成)(Karpusas等，如上)。螺旋A，B，C和E构成左旋的、2型四-螺旋束。长的手上环(overhand loop)(AB环)连接螺旋A和B，而三个较短的环(称为BC，CD和DE)连接剩余的螺旋(Karpusa等，如上)。在先的研究已经显示出IFN-β分子的N-末端，C-末端和糖基化C螺旋区不位于受体结合位点内(参见，WO 00/23472和USSN 09/832，659)。由此，这些区域中的突变不会对IFN分子的生物活性产生显著的不利作用。先前还已知螺旋C中的突变(成熟人IFN-β的81，82，85，86和89位氨基酸)导致相对于野生型IFN-β具有较高抗病毒活性分子(参见，WO 00/23472和USSN09/832,659)。相似地，已经显示出螺旋A中的突变(成熟人IFN-β的2，4，5，8和11位氨基酸)和CD环(110，11，113，116和119位氨基酸)相对于天然存在的野生型人IFN-β具有较高的受体结合活性以及较高的抗病毒和抗增生活性(参见，WO 00/23472和USSN 09/832,659)。

其它优选的修饰或取代消除了分子间交联或错误二硫键形成的位点。例如，已知IFN-β具有三个cys残基(位于SEQ ID NO：4的野生型位17，31和141)。一种IFN变体是其中17位cys(C)被ser(S)取代的IFN，例如美国专利4,588,585所述。其它IFN-β变体包括，在根据野生型IFN-β(具有，例如SEQ ID NO：4)编号时，具有例如，17位的cys(C)被一个或多个ser(S)取代以及101位val(V)被phe(F)、trp(W)、tyr(Y)或his(H)，优选为phe(F)所取代的IFN-β变体，诸如，例如美国专利6,127,332中所述。其它优选的变体包括含有野生型IFN-β的序列(例如，含有SEQ ID NO：4)的多肽，其中当根据野生型IFN-β编号时，101位val(V)被phe(F)、tyr(Y)、trp(W)、his(H)或phe(F)所取代，这同样在例如美国专利6,127,332中所述。

其它IFN-β变体是缺少起始物甲硫胺酸的成熟IFN-β分子，例如，SEQID NO：4的1位个甲硫氨酸。示例性IFN-β变体缺少起始物甲硫氨酸并具有至少一个氨基酸取代，例如在成熟形式的17位，如美国专利号4,588,585中所述。

IFN-β分子还可通过用一个或多个衍生化氨基酸(可以是天然或非天然的氨基酸，其中正常存在的侧链或末端基因通过化学反应进行修饰)取代一个或多个氨基酸进行修饰。所述修饰包括，例如，γ-羧基化，β-羧基化，PEG化，硫酸化，磺化，磷酸化，酰胺化，酯化，N-乙酰化，苄基酰化(carbobenzylation)，甲苯磺酰化(tosylation)和本领域已知的其它修饰。

其它修饰包括使用氨基酸类似物或衍生的氨基酸，其中侧链被延长或缩短，同时仍能提供羧基、氨基或其它反应性前体官能团用于进行环化反应，以及具有包含适宜官能团的变体侧链的氨基酸类似物。例如，所述化合物可包括氨基酸类似物，例如氰基丙氨酸、刀豆氨酸(canavanine)、S-亚甲胱氨酸(djenkolic acid)、正亮氨酸、3-磷酸丝氨酸、高丝氨酸、二羟基苯丙氨酸、5-羟色氨酸、1-甲基组氨酸、3-甲基组氨酸、二氨基庚二酸、鸟氨酸或二氨基丁酸。其它适用于此处的具有侧链的天然存在的氨基酸代谢产物或前体可被本领域技术人员所识别，且包含在本发明的范围内。

其它IFN-β变体包括反转或逆向(retro)肽序列。“反转”或“逆向”肽序列是指共价结合的氨基酸残基(或其类似物或模拟物)的全部序列的一部分，其中氨基酸主链中肽键结构的正常羧基至氨基方向被反转从而，以常规的左至右方向进行阅读时，肽的氨基部分在羧基部分之前(而非之后)。一般参见，Goodman，M.和Chorev，M.Accounts of Chem.Res.1979，12，423。此处描述的反转方向的肽包括(a)其中一个或多个氨基端残基被改为反转(“rev”)方向(由此在分子的最左部产生第二个“羧基端”)的那些肽，和(b)其中一个或多个羧基端残基被改为反转(“rev”)方向(由此在分子的最右部产生第二个“氨基端”)的那些肽。在正常方向的残基和反转方向的残基之间的交界处不能形成肽(酰胺)键。因此，本发明的一些反转的多肽可通过使用适宜的氨基酸模拟物部分，采用反转的肽(反转的酰胺)键来连接序列两个相邻部分而形成。在上述(a)的情况下，二酮化合物的中心残基可方便地用于连接含有两个酰胺键的结构从而得到肽模拟物结构。在上述(b)的情况下，二酮化合物的中心残基也可用于连接含有两个酰胺键的结构从而得到肽模拟物结构。此外，在所述多肽中键合的反转方向一般还需要反转氨基酸残基的对映结构体构型的反转，以便保持与非反转的肽的侧链空间定向相似。肽反转部分中氨基酸的构型优选为(D)，而非反转部分的构型优选为(L)。当适于优化结合活性时，相反或混合的构型也是可接受的。多肽的修饰进一步描述于，例如，美国专利号6,399,075中。

IFN-β治疗剂还包括与异源多肽融合的IFN-β蛋白质及其变体(例如，成熟蛋白质)。例如，为了延长IFN-β蛋白质的半寿期或增进其产生，可加入异源多肽。示例性异源多肽包括免疫球蛋白(Ig)分子或其部分，例如，Ig分子的轻链或重链的恒定区。在一个实施方案中，IFN-β蛋白质或其变体与免疫球蛋白轻链、重链或二者的铰链区和恒定区的全部或部分融合或连接。因此，本发明描述了包括如下部分的分子的特征：(1)IFN-β蛋白质部分(即，IFN-β或其变体)，(2)第二个肽，例如，能增加IFN-β部分的可溶性或体内寿命的肽，例如，免疫球蛋白超家族成员或其片段或一部分，例如，IgG的一部分或片段，例如，人IgG1重链恒定区，例如，CH2，CH3，和铰链区。具体来说，“IFN-β/Ig融合体”是包含与免疫球蛋白链的N-末端连接的具有生物活性的IFN-β部分的蛋白质。一种IFN-β/Ig融合体是“IFN-β/Fc融合体”，其是包含与至少部分免疫球蛋白恒定区连接的IFN-β部分的蛋白质。优选的Fc融合体包括与含有免疫球蛋白重链C末端区的抗体片段连接的IFN-β部分。

由此，在一个实施方案中，融合蛋白的通式为X-Y-Z，其中X是含有IFN-β的氨基酸序列的多肽，或其一部分或变体；Y是任选的连接体部分；而Z是一种多肽，其包含除X部分的干扰素β以外的至少部分多肽。在其它实施方案中，融合蛋白具有式Z-Y-X，其中非IFN-β多肽融合至连接体的N末端部分，所述连接体被融合至IFN-β多肽或其部分或变体的N末端部分。Z部分可以是包含免疫球蛋白样区的部分多肽。所述其它多肽的实例包括CD1，CD2，CD4以及I类和II类主要组织相容性抗原的成员。所述多肽的实例参见美国专利5,565,335(Capon等)。

Z部分可以包括例如多个组氨酸残基，或者优选地包括免疫球蛋白的Fc区，这里定义的“Fc”是包括免疫球蛋白重链的C末端区的抗体的片段。

Y部分可以是能使IFN-β部分保持其生物活性的任何连接体。Y部分还可以是约2-约5个氨基酸；约3-约10个氨基酸长或10个以上氨基酸。在优选的实施方案中，Y包括或由GlyGlyGlyGlySer(SEQ ID NO：6)所组成，所述序列由例如核苷酸序列GGCGGTGGTGGCAGC(SEQ ID NO：5)所编码。Y还包括或由肠激酶识别位点，例如，AspAspAspAspLys(SEQ ID NO：8)组成，所述序列由例如GACGATGATGACAAG(SEQ ID NO：7)所编码。在其它实施方案中，Y包括或由SerSerGlyAspAspAspAspLys(SEQ ID NO：10)组成，所述序列由例如AGCTCCGGAGACGATGATGACAAG(SEQ ID NO：9)所编码。

此外，还可采用将两种分子结合在一起的任何化学反应实施IFN-β部分(X)和第二、非IFN-β部分Z(例如免疫球蛋白的Fc区)之间的偶联，只要X和Z部分保持其各自的活性即可。所述化学结合可包括很多化学机制，例如共价键结合，亲和性结合，嵌入，配位结合和络合作用。在IFN-β部分和Z部分之间形成共价结合的代表性偶联剂(即通式中的连接体“Y”)可以包括有机化合物，例如硫酯类，碳化二亚酰胺，琥珀酰亚胺酯类，二异氰酸酯，例如甲苯-2，6-二异氰酸酯，谷二醛(gluteraldehydes)，重氮苯和六亚甲基二胺类，例如双-(对重氮苯甲酰基(p-diazonium-benzoyl))-乙二胺，亚氨酸酯类的双功能衍生物，例如己二酰亚胺酸二甲酯(diamethyladipimidate)，和双活性氟化合物，例如1，5-二氟-2，4-二硝基苯。所列出的物质并非意在穷尽本领域公知的多种类别的化学偶联剂。其中的很多种是可通过商业途径获得的，例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)；4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α(2-吡啶基-二硫代)-甲苯(SMPT：Pierce Chem.Co.，Cat.#21558G)。

优选的IFN-β/Ig融合蛋白包括或由SEQ ID NO：12所组成，其中SEQID NO：12包含与人IgG1Fc(ZL5107)融合的全长成熟形式的人IFN-β(即，SEQ ID NO：4)(参见WO 00/23472和USSN 09/832,659)(参见图1)。SEQ IDNO：11中列出了相应的核苷酸序列。编码人IFN-β的DNA终止于核苷酸三联体568-570(编码精氨酸的AAC)，而编码人IgG1恒定区DNA开始于三联体(编码门冬氨酸的GAC)，始于SEQ ID NO：11的574位核苷酸。

SEQ ID NO：14中列出了另一优选的IFN-β/Ig融合蛋白，其由SEQ IDNO：13编码(参见WO 00/23472和USSN 09/832,659)(参见图2)。这种融合蛋白包含与G4S连接体相连接的人IFN-β。G4S连接体(由SEQ ID NO：7的571-585位核苷酸所编码)包含氨基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：9)。制备这些蛋白质的方法描述于WO 00/23472和USSN 09/832,659中。

在优选的实施方案中，IFN-β多肽经其C-末端与免疫球蛋白Fc区的至少一部分融合。IFN-β形成氨基端部分，而Fc区形成羧基端部分。在这些融合蛋白中，Fc区优选限于恒定区的铰链区以及CH2和CH3区。这些融合体中的Fc区还可限于能形成分子间二硫键的铰链区部分、以及CH2和CH3区或其功能等效体。这些恒定区可来源于任何哺乳动物性来源(优选人类)，并可源于任何适宜的类型和/或同种型，包括IgA，IgD，IgM，IgE和IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。

编码Ig融合体的重组核酸分子可通过本领域已知的任何方法获得(Maniatis等，1982，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，或获自公众可得到的克隆。例如，Robinson，R.等，PCT申请，公开号WO87/02671中教导了编码免疫球蛋白的重或轻链恒定区的基因的制备方法。编码干扰素分子或片段的cDNA序列可直接与编码重Ig恒定区的cDNA相连或可借助连接序列与之相连。在本发明的其它实施方案中，可制备重组载体系统以使编码干扰素β的序列适应于含有合成铰链区的正确的阅读框。此外，需要包括与免疫球蛋白基因的3′侧翼区相对应的核酸其作为重组载体系统的一部分，所述基因包含RNA切割/多腺苷酸化位点和下游序列。此外，可能需要改造位于编码免疫球蛋白融合蛋白的序列上游的信号序列以易于从用重组载体转化的细胞中分泌融合分子。

本发明提供了包括融合蛋白在内的二聚体融合分子以及单体或多聚体分子。所述多聚体可通过使用通常为多价的Ig分子(诸如IgM五聚体或IgA二聚体)的Fc区或其一部分来生成。应当理解，可能需要J链多肽来形成和稳定IgM五聚体和IgA二聚体。可选地，IFN-β融合蛋白的多聚体可采用对Ig分子的Fc区具有亲和力的蛋白质，诸如蛋白A来形成。例如，可将多个IFN-β/免疫球蛋白融合蛋白与蛋白质A-琼脂糖珠结合。

这些多价形式是可以使用的，因为其具有多个干扰素β受体结合位点。例如，二价可溶性IFN-β可由被连接体区(Y部分)隔离的SEQ ID NO：4的1-166位氨基酸(或由SEQ.ID.NO：3的1-498位核酸所编码的氨基酸)(通式中的X部分)的两个串联重复所组成，该重复与免疫球蛋白恒定区(Z部分)的至少一部分相结合。可选的多价体形式还可通过，例如，采用常规偶联技术通过化学方法将IFN-β/Ig融合体与任何临床上可接受的载体分子相偶联来构建，所述载体为选自Ficoll、聚乙二醇或葡聚糖的聚合物。可选地，IFN-β可通过化学方法与生物素偶联，然后使生物素-干扰素βFc结合物与抗生物素蛋白结合，结果产生四价抗生物素蛋白/生物素/干扰素β分子。IFN-β/Ig融合体还可与二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP)共价偶联，结果得到用抗-DNP或抗-TNP-IgM沉淀的结合物，以形成具有对干扰素β受体结合位点的效价为10的十聚结合物。

本发明的蛋白质的衍生物还包括保持生物活性的初级蛋白的多种结构形式。由于存在可电离的氨基和羧基，例如，IFN-β蛋白质及其变体可以是酸性或碱性盐形式，或可以是中性形式。各氨基酸残基还可通过氧化或还原进行修饰。此外，IFN-β的一级氨基酸结构(包括N-和/或C-末端)或INF-β聚糖可通过以下方式进行修饰(“衍生”)：与其它化学部分，诸如糖基基团、聚亚烷基二醇聚合物诸如聚乙二醇、脂类、磷酸盐、乙酰基等形成共价的或聚集的结合物，或形成氨基酸序列突变体。

干扰素β/Ig的其它衍生物包括干扰素β或其片段与其它蛋白质或多肽形成的共价或聚集结合物，诸如通过在重组培养中作为附加的N-末端或C-末端而合成。例如，结合的肽可以是在蛋白质N-末端区的信号(或前导)多肽序列，其在共翻译或翻译后水平上指导蛋白质从其合成位点转至其在细胞膜或细胞壁内或外的功能位点(例如，酵母α-因子前导序列)。例如，信号肽可以是IFN-β的信号肽，即SEQ ID NO：2的1-21位氨基酸(对应于SEQID NO：1的1-138位核苷酸)。信号肽还可以是VCAM的信号肽，即，SEQID NO：12的1-24位氨基酸(由SEQ ID NO：11的1-72核苷酸所编码)。

异源多肽(例如肽)或其它分子还可以用作标记或用于辅助IFN-β治疗剂的纯化。所述肽是本领域众所周知的。例如，本发明的多核苷酸可在框内与标记序列(本文也称编码“Tag肽”的“Tag序列”)融合，其能允许本发明的多肽的标记和/或纯化。在优选的实施方案中，标记序列是六组氨酸标记，例如，由PQE-9载体所提供的。许多其它Tag肽可经商业途径获得。其它经常使用的Tags包括myc-表位(例如，参见Ellison等.(1991)J Biol Chem266：21150-21157)，其包括来自c-myc的10个残基的序列，pFLAG系统(International Biotechnologies公司)，pEZZ-蛋白A系统(Pharmacia，NJ)，和流感嗜血杆菌(haemophilus influenza)血凝素蛋白质的16个氨基酸的部分。此外，只要试剂，例如与Tag多肽特异性相互作用的抗体能够获得或可被制备或鉴定，可将任何多肽用作Tag。

在一个实施方案中，IFN-β蛋白质或其变体在N-或C-端与下述肽之一融合：HisHisHis HisHisHis(SEQ ID NO：16)，其可由核苷酸序列CATCATCATCATCATCAT(SEQ ID NO：15)编码；SerGlyGlyHisHisHisHisHisHis(SEQ ID NO：18)，其可由核苷酸序列TCCGGGGGCCATCATCATCATCATCAT(SEQ ID NO：15)所编码和SerGlyGlyHisHisHisHisHisHisSerSerGlyAspAspAsp AspLys(SEQ ID NO：20)，其可由核苷酸序列TCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCTCCGGAGACG ATGATGACAAG(SEQ ID NO：19)所编码。

干扰素β的氨基酸序列还可以连接于肽AspTyrLysAspAspAspAspLys(DYKDDDDK)(SEQ ID NO：21)(Hopp等，Bio/Technology 6：1204，1988)。后一序列是高度抗原性的并提供与特异性单克隆抗体可逆性结合的表位，使得可以进行所表达的重组蛋白的快速测定和便易的纯化。该序列还可被牛粘膜肠激酶在紧接Asp-Lys对之后的残基进行特异性切割。

在其它实施方案中，IFN-β治疗剂包括与白蛋白、其变体或一部分融合的IFN-β蛋白质或其变体。可按，例如，WO 01/77137中所述制备融合蛋白。

IFN-β治疗剂还可包括不是多肽的分子，例如，与聚合物如生物可降解的聚合物共价或非共价连接的IFN-β蛋白质或其变体。例如，IFN-β蛋白质或其变体可以是PEG化的，例如，与聚乙二醇(PEG)连接，如WO00/23114中所述。

在本发明的宽范围中，单个聚合物分子可用于与IFN-β的结合。应当理解，只要适于最终应用，结合的聚合物可使用任何基团、部分或其它结合的种类。例如，在一些应用中，将能够赋予聚合物UV-降解抗性、或抗氧化或其它性质或特性的功能性部分与聚合物共价结合是有用的。作为另一例子，在一些应用中，使聚合物功能化以使其具有反应性或可交联性，有利于增强整个结合后的物质的多种性质或特性。由此，该聚合物可包含任何官能度、重复基团、连接或其它构成性结构，所述构成特性不会妨碍结合的IFN-β组合物对其预期目的的功效的其它构成结构。

虽然偶联也可通过非末端反应基团的分枝形成，但IFN-β最优选经聚合物上的末端反应性基团进行偶联。此处将具有反应性基团的聚合物命名为“活化的聚合物”。反应性基团选择性地与蛋白质上的游离氨基或其它反应性基团反应。活化的聚合物发生反应，从而可在任何可用的IFN-β氨基诸如赖氨酸的α氨基或ε氨基处发生结合。IFN-β的游离的羧基基团，适宜活化的羰基，羟基，胍基，氧化的碳水化合物部分和巯基(若可用)也可用作结合位点。

虽然聚合物可结合于IFN-β分子或其变体或者与IFN-β分子直接或间接连接的其它氨基酸的任何地方，用于聚合物偶联的最优选的位点是IFN-β分子的N-末端。第二位点位于或邻近C-末端，且通过糖部分。因此，本发明预期了其最优选的实施：(i)IFN-β方案或其变体的N-末端偶联的聚合物结合物(polymer conjugate)；(ii)IFN-β或其变体的C-末端偶联的聚合物结合物；(iii)聚合物结合物的糖-偶联的结合物；(iv)以及IFN-β蛋白质或其变体的N-，C-和糖偶联的聚合物结合物。

根据蛋白质浓度，一般采用大约1.0至大约10摩尔的活化的聚合物/每摩尔蛋白质。最终的量平衡在使反应程度最大化和产物非特异修饰最小化之间，同时，在维持最佳活性的同时(如果可能)使蛋白质半寿期最优化。优选的，蛋白质的生物学活性保留至少大约50％，最优选保留100％。

可以通过使生物学活性物质与惰性聚合物发生反应的任何合适方法进行反应，如果反应基团位于N末端的α-氨基上，则优选pH大约5-7。一般而言，该过程涉及制备活化的聚合物(其可能具有至少一个末端羟基)，然后使蛋白质与活化的聚合物发生反应，以产生适合于配制的可溶性蛋白质。上述修饰反应可以通过可能涉及一个或多个步骤的多种方法进行。

如上所述，本发明最优选的实施方案利用了IFN-βN末端与聚合物的连接。选择性得到N末端修饰的IFN-β的适宜方法是可以获得。还原性烷基化法例示了一种方法，该方法利用了IFN-β上可用于衍生化的不同种类伯氨基团(赖氨酸的ε-氨基对N末端甲硫氨酸的氨基)的不同反应性。在适当的选择条件下，可以实现含羰基的聚合物在IFN-β的N末端对其基本上选择性地进行衍生化。该反应在能够利用赖氨酸ε-氨基和IFN-β的N末端残基的α-氨基之间的pKa差异的pH条件下进行。该类化学方法是本领域普通技术人所熟知的。

例如，可以使用这样的反应方案，其中所述选择性通过在低pH(一般5-6)，在可使PEG-醛聚合物与IFN-β在氰基硼氢钠存在时发生反应的条件下进行反应而得以维持。在对PEG-IFN-β进行纯化并用SDS-PAGE，MALDI质谱和肽测序/作图进行分析后，产生了N末端由PEG部分特异性靶向的IFN-β。

IFN-β的晶体结构显示出N和C末端彼此接近(参见Karpusas等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.94：11813-11818)。由此，IFN-β的C末端的修饰也应当对活性具有最小的影响。在没有简单的化学策略可以将聚亚烷基二醇聚合物(诸如PEG)靶向在C末端时，可直接通过基因改造产生可用于靶向聚合物部分的位点。例如，在C末端或其附近的位点掺入Cys允许使用马来酰亚胺、乙烯砜或卤代醋酸酯活化的聚亚烷基二醇(如PEG)进行特异修饰。由于这些试剂具有对Cys的高选择性，故这些衍生物可特异性用于改造的半胱氨酸的修饰。其它策略，诸如掺入可被靶向的组氨酸标记(Fancy等，(1996)Chem.&Biol.3：551)或附加的糖基化位点，代表了用于修饰IFN-β的C末端的其它选择。

一些IFN-β上的聚糖也位于允许进一步修饰而不改变活性的位置。用于靶向糖作为化学修饰位点的方法也是已知的，因此可以将聚亚烷基二醇聚合物直接且特异性添加到IFN-β上经氧化而活化的糖。例如，可以产生聚乙二醇-酰肼，其可通过与醛和酮缩合形成相对稳定的腙连接。此特性已经用于通过氧化的寡糖连接对蛋白质进行修饰。参见Andresz，H.等，(1978)，Makromol.Chem.179：301。具体而言，用亚硝酸盐(酯)处理PEG-羧甲基酰肼产生的PEG-羧甲基氮化物是能与氨基发生反应的亲电子活性基团。此反应也可以用于制备聚亚烷基二醇修饰的蛋白质。参见美国专利4,101,380和4,179,337。

巯基连接体介导的化学方法能进一步促进蛋白质的交联。该过程例如，可通过使用诸如高碘酸钠在碳水化合物部分上产生反应性醛基，通过醛形成胱胺结合体，并通过胱胺上的疏基诱导交联等步骤进行实施(参见Pepinsky，B.等，(1991)，J.Biol.Chem.，266：18244-18249和Chen，L.L.等，(1991)J.Biol.Chem.，266：18237-18243)。由此，这类化学方法被认为也适于用聚亚烷基二醇聚合物进行的修饰，其中向糖中掺入连接体并将聚亚烷基二醇聚合物附于该连接体上。虽然含有氨基巯基(aminothiol)或肼的连接体能够用于加入单个聚合物基团，连接体的结构可以有所变化以便加入多个聚合物，和/或改变聚合物相对于IFN-β的空间取向。

示例性聚合物包括水溶性聚合物诸如聚亚烷基二醇聚合物。所述聚合物的非限制性实例包括其它聚环氧烷同聚物，诸如聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇、其共聚物和其嵌段共聚物。适宜的水溶性和非肽聚合物主链的其它实例包括聚(氧乙烯化多元醇)、聚(烯醇)、聚(乙烯基砒咯烷酮)、聚(羟基丙基甲基丙烯酰胺(hydroxypropylmethacrylamide))、聚(α-羟酸(hydroxyacid))、聚(乙烯醇)、聚磷腈、聚唑啉、聚(N-丙烯酰吗啉)及其共聚物、三元共聚物，及其混合物。在一个实施方案中，聚合物主链是平均分子量为约200Da至约400,000Da的聚(乙二醇)或一甲氧基聚乙二醇(monomethoxypolyethylene glycol)(mPEG)。应当理解，其它相关的聚合物也适用于实施本发明，而术语PEG或聚(乙二醇)的使用意在包括而非排除该方面。术语PEG包括任何形式的聚(乙二醇)，包括烷氧基PEG，双功能PEG、多臂(multi-armed)PEG、叉状(forked)PEG、分枝(branched)PEG、悬垂(pendent)PEG或其中具有可降解键的PEG。

在一个实施方案中，在兴趣聚合物系统中掺入C1-C4烷基聚亚烷基二醇的聚亚烷基二醇残基，优选聚乙二醇(PEG)，或这种二醇的聚(氧)烯二醇残基。由此，蛋白质所附着的聚合物可以是聚乙二醇(PEG)的同聚物或聚氧乙烯化多元醇，条件是在所有情况中该聚合物在室温均可溶于水。所述聚合物的非限制性实例包括聚环氧烷同聚物，诸如PEG或聚丙二醇、聚氧乙烯化二元醇、其共聚物和其嵌段共聚物，条件是维持该嵌段共聚物的水溶性。聚氧乙烯化多元醇的实例包括，例如，聚氧乙烯化甘油、聚氧乙烯化山梨醇、聚氧乙烯化葡萄糖等等。聚氧乙烯化甘油的甘油主链与天然存在于例如动物或人中的单、二、和三甘油酯的主链相同。因此，这种分支化不必视为机体的外来试剂。

作为聚环氧烷的替代，可以使用葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物等等。本领域普通技术人员将领会，前文所列均为示例，本发明涵盖具有本文所述性质的所有聚合物材料。

聚合物不需要具有任何特定分子量，但是分子量优选大约300至100,000，更优选10,000至40,000。具体而言，20,000以上的分子量对于防止由于肾过滤导致的蛋白质损失而言最佳。

在本发明的实践中，在聚亚烷基二醇衍生化聚合物-IFN-β缀合物的配制中具有很多有利性，这与聚亚烷基二醇衍生物的下列特性相关：水溶性的改进，同时不诱发抗原性或免疫原性应答；高度生物相溶性；聚亚烷基二醇衍生物不存在体内生物降解；和易于被活有机体排泄。

此外，在本发明的其它方面，可以利用与聚合物组分共价键合的IFN-β，其中结合的性质波及可切割的共价化学键。这使得能够在从IFN-β上切割下聚合物的过程中进行控制。IFN-β药物和聚合物之间的这种共价键可以通过化学或酶反应切割。聚合物-IFN-β产物保留了可接受量的活性。同时，结合的聚合物中存在的聚乙二醇部分赋予聚合物-IFN-β结合物高水溶性和长时间在血液中循环的能力。作为这些改进特征的结果，本发明涵盖了活性聚合物-IFN-β种类经胃肠外、经鼻、和经口的递送和前述IFN-β经水解切割后在体内应用中的生物利用度。

可使用多种反应方案而很容易地实施聚合物与IFN-β的反应而得到各种结合物，例如在N末端结合的产物，IFN-β结合物的活性和稳定性可以使用不同分子大小的聚合物通过多种方式进行改变。缀合物的溶解性可以通过改变掺入聚合物组合物中的聚乙二醇片段的比例和大小进行改变。

在一个实施方案中，通过蛋白质与活化的聚亚烷基二醇化合物(PCG)制备根据本发明的结合物。例如，在存在还原剂(例如，氰基硼氢化钠)时，IFN可经由还原型烷基化而与PEG-醛反应以产生PEG-蛋白质结合物(经由胺键连接)。参见，例如，欧洲专利0154316 B1和国际专利申请号’PCT/US03/01559。

在本发明的一些实施方案中，人IFN-β用下述活化的聚亚烷基二醇进行PEG化：20kDa mPEG-O-2-甲基丙醛，20kDa mPEG-O-p-甲苯基-O-2-甲基丙醛，20kDa mPEG-O-m-甲苯基-O-2-甲基丙醛，20kDa mPEG-O-p-苯乙醛，20kDa mPEG-O-p-苯基丙醛和20kDa mPEG-O-m-苯乙醛，从而分别得到20kDa mPEG-O-2-甲基丙醛-修饰的IFN-β，20kDa mPEG-O-p-甲苯基-O-2-甲基丙醛-修饰的IFN-β，20kDa mPEG-O-m-甲苯基-O-2-甲基丙醛-修饰的IFN-β，20kDa mPEG-O-p-苯乙醛-修饰的IFN-β，20kDa mPEG-O-p-苯丙醛-修饰的IFN-β和20kDamPEG-O-m-苯乙醛-修饰的IFN-β。下面给出用20kDa mPEG-O-2-甲基丙醛和20kDa mPEG-O-p-苯乙醛修饰的人IFN-β的制备和特征的详细叙述，其还被公开于国际专利申请PCT/US03/01559中。

在一个实施方案中，PEG化的IFN-β的制备如下。将250μg/ml的IFN-β，例如IFN-β-1a批量中间(bulk intermediate)在100mM磷酸钠pH 7.2，200mM NaCl中(已通过所有为用于人体进行的试验的临床大批量药物)用等体积100mM MES pH 5.0稀释，然后用HCl将pH调整至5.0。将样品以6mg IFN-β/ml树脂加入SP-SepharoseFF柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)。用5mM磷酸钠pH 5.5，75mM NaCl洗柱，然后用30mM磷酸钠pH 6.0，600mM NaCl洗脱产物。分析洗脱级分在280nm的吸光度值，采用1mg/ml溶液的消光系数为1.51而从吸光度来估计样品中干扰素的浓度。

在来自SP洗脱物的1mg/ml溶液中，将0.5M磷酸钠pH 6.0加至50mM，将氰基硼氢化钠(Aldrich，Milwaukee，WI)加至5mM，而将20K PEG醛(Shearwater Polymers，Huntsville，AL)加至5mg/ml。将样品于室温保温20小时。通过在Superose6 FPLC分离柱(sizing column)(Pharmacia)(用5mM磷酸钠pH 5.5，150mM NaCl作为流动相)和SP-SepharoseFF上进行顺序层析步骤以从反应产物中纯化PEG化的干扰素。分离柱导致修饰的和未修饰的IFN-β的基线分离。来自凝胶过滤的含PEG-干扰素β的洗脱合并物用水按1∶1进行稀释，然后以2mg干扰素β/ml树脂加入SP-Sepharose柱。用5mM磷酸钠pH 5.5，75mM NaCl洗柱，然后用5mM磷酸钠pH5.5，800mM NaCl从柱洗脱PEG化干扰素β。通过280nm的吸光度分析蛋白质含量。由于PEG部分对280nm的吸光度不产生影响，报道了干扰素等效物中PEG化干扰素的浓度。所得PEG化的IFN-β的这些方法和特征描述被进一步描述在WO 00/23114中。IFN-β的PEG的结合未显示出改变了其抗病毒活性。此外，发现PEG化的IFN-β的比活性远高于(约10倍)非PEG化IFN-β的比活性(WO 00/23114)。

IFN-β还可用可以购买的(例如，购自Fluka公司(目录号75936，Ronkonkoman，NY))5K PEG-醛部分按照上述与20K PEG醛相同的方案进行PEG化。

20kDa mPEG-O-2-甲基丙醛-修饰的IFN-β的制备如下。将在100mM磷酸钠pH 7.2，200mM NaCl中250μg/ml的10ml IFN-β-1a批量中间体(已通过所有为用于人体进行的试验的临床大批量药物)用12ml的165mMMES pH 5.0和50μl的5N HCl稀释。将样品加入300μl SP-Sepharose FF柱(Pharmacia)。用3×300μl的5mM磷酸钠pH 5.5，75mM NaCl洗柱，然后用5mM磷酸钠pH 5.5，600mM NaCl洗脱蛋白质。分析洗脱级分在280nm的吸光度，采用1mg/ml溶液的消光系数为1.51，而从吸光度来估计样品中IFN-β的浓度。合并洗脱峰级分以得到3.66mg/mL的IFN-β浓度，其随后用水稀释至1.2mg/mL。

在来自洗脱的SP-Sepharose洗脱合并物的0.8mL IFN-β中，将0.5M磷酸钠pH 6.0加至50mM，将氰基硼氢化钠(Aldrich)加至5mM，而将20kDa mPEG-O-2-甲基丙醛加至5mg/ml。将样品在黑暗中于室温保温16小时。通过0.5mL SP-Sepharose FF柱如下从反应混合物中纯化PEG化IFN-β如下：用2.4mL 20mM MES pH 5.0稀释0.6ml的反应混合物，然后将其加入SP-Sepharose柱。用磷酸钠pH 5.5，75mM NaCl洗柱，然后用25mM MESpH 6.4，400mM NaCl从柱洗脱PEG化的IFN-β。以5mM磷酸钠pH 5.5，150mM NaCl作为流动相在Superose 6HR 10/30 FPLC分离柱上进一步纯化PEG化IFN-β。以20mL/h在分离柱(25mL)上进行分离，收集0.5mL级分。通过280nm的吸光度来分析洗脱级分的蛋白质含量，合并所述级分，并确定合并物的蛋白质浓度。由于PEG部分对280nm的吸光度不产生影响，报道了IFN等效物中PEG化的IFN-β浓度。取合并物样品进行分析，剩余部分可用含HAS的配制缓冲液稀释至30μg/mL，以0.25mL/管进行等分，保存于-70℃。

20kDa mPEG-O-p-苯乙醛-修饰的IFN-β的制备如下。将在100mM磷酸钠pH 7.2，200mM NaCl中，将250μg/ml的20ml IFN-β批量原料药(已通过所有为用于人体进行的试验的临床大批量药物)用24ml的165mMMES pH 5.0，100μl的5N HCl，和24mL水进行稀释。将样品加入600μlSP-Sepharose FF柱(Pharmacia)。用2×900μl的5mM磷酸钠pH 5.5，75mM NaCl洗柱，然后用5mM磷酸钠pH 5.5，600mM NaCl洗脱蛋白质。分析洗脱级分的280nm的吸光度，采用1mg/ml溶液的消光系数为1.51而从吸光度来估计样品中IFN-β的浓度。合并洗脱峰级分以得到2.3mg/mL的IFN-β浓度，其随后用水稀释至1.2mg/mL。在来自SP-Sepharose洗脱合并物的1.2mL IFN-β-1a中，将0.5M磷酸钠pH 6.0加至50mM，将氰基硼氢化钠(Aldrich)加至5mM，而将20kDa mPEG-O-p-苯乙醛加至10mg/ml。将样品在黑暗中于室温保温18小时。在0.75mL SP-Sepharose FF柱上如下从反应混合物中纯化PEG化的IFN-β如下：用7.5mL 20mM MESpH 5.0，7.5mL水，和5μl的5N HCl稀释反应混合物，然后将其加入SP-Sepharose柱。用磷酸钠pH 5.5，75mM NaCl洗柱，然后用20mM MESpH 6.0，600mM NaCl从柱洗脱PEG化的IFN-β。以5mM磷酸钠pH 5.5，150mM NaCl作为流动相在Superose 6 HR 10/30 FPLC分离柱上进一步纯化PEG化的IFN-β。以20mL/h在分离柱(25mL)上进行分离，收集0.5mL级分。通过在280nm的吸光度来分析洗脱级分的蛋白质含量，合并所述级分，并确定合并物的蛋白质浓度。根据1mg/mL PEG化IFN-β溶液的消光系数为2，调节PEG(1mg/mL溶液中20kDa mPEG-O-p-苯乙醛在280nm的消光系数为0.5)对280nm的吸光度后，报道了IFN等效物中PEG化IFN-β的浓度。取合并物样品进行分析，剩余部分可用含HAS的配制缓冲液稀释至30μg/mL，以0.25mL/管进行等分，保存于-70℃。

与非天然存在的聚合物偶联的糖基化IFN-β可用于本发明的方法。聚合物可包括聚亚烷基二醇部分。聚亚烷基部分可通过选自醛基，马来酰亚胺基，乙烯砜基，卤代乙酸酯基，多个组氨酸残基，肼基和氨硫醇基的基团而与干扰素-β偶联。IFN-β可与聚乙二醇部分偶联，其中IFN-β通过不稳定性键而与聚乙二醇部分偶联，其中不稳定性键可被生物化学性水解和/或蛋白酶解作用断裂。聚合物的分子量可以是约5-约40千道尔顿。其它可用的IFN-β是包含N-末端与含有聚亚烷基二醇部分的聚合物偶联的生理活性糖基化干扰素-β的生理活性干扰素-β组合物，其中将生理活性干扰素-β和聚亚烷基二醇部分进行排列，以便在通过抗病毒测定时，生理活性干扰素-β组合物中的生理活性干扰素-β具有相对于缺少所述部分的生理活性干扰素-β基本上相似的活性。

异源多肽或其它分子可与IFN-β蛋白质或其变体共价或非共价连接。“共价偶联的”是指本发明的不同部分或互相直接共价结合，或经一或多个插入部分，诸如桥接、间隔子或接合部分或多个部分而间接地共价连接。插入部分或多个部分被称为“偶联基团”。术语“结合的”可与“共价偶联的”互换使用。

用于本发明的IFN-β可以是糖基化或非糖基化(或未糖基化的)。非糖基化IFN-β可在例如原核宿主细胞中制备。IFN-β蛋白质或其变体还可通过附着正常情况下IFN-β上不存在的多糖而进行修饰。

3. 产生IFN-β治疗剂的方法

本发明的IFN-β治疗剂可通过任何适宜的方法进行制备，诸如包括构建编码IFN-β治疗剂的核酸和在适宜的转化的宿主中表达该核酸的方法。该方法将制备重组IFN-β治疗剂。IFN-β治疗剂还可通过化学合成或化学合成与重组DNA技术的联合进行制备。

在一个实施方案中，通过分离或合成编码IFN-β或其变体的DNA序列来构建编码IFN-β治疗剂的核酸。例如，IFN-β融合蛋白可按照，例如本文所述进行制备。天然存在的IFN-β核酸可根据本领域众所周知的方法获得。例如，核酸可利用从已知表达IFN-β的细胞(例如，白细胞)中获得的RNA，和基于IFN-β基因序列(例如，SEQ ID NO：1)的引物，通过逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)进行分离。编码IFN-β蛋白质的核酸还可通过利用探针(例如，包含部分IFN-β序列的寡核苷酸)筛选文库而进行分离，所述文库例如从表达IFN-β的细胞中制备的cDNA文库。

可选地，可将完整氨基酸序列用于构建反-翻译(back-translated)的基因。可以合成包含编码IFN-β治疗剂的核苷酸序列的DNA寡聚体。例如，可以合成编码部分所需多肽的小寡核苷酸，然后将其连接在一起。各寡核苷酸通常包含用于互补装配的5′或3′突出端。

通过本领域众所周知的方法可在编码IFN-β蛋白质的核酸中引入改变。例如，改变可通过定点诱变，如Mark等，″Site-specific Mutagenesis Of TheHuman Fibroblast Interferon Gene″，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，pp.5662-66(1984)和美国专利4,588,585中所述的方法产生。

构建编码IFN-β治疗剂的核酸的另一方法是通过化学合成方法。例如，通过采用寡核苷酸合成仪的化学方法可以合成编码所需IFN-β治疗剂的基因。所述寡核苷酸根据IFN-β治疗剂的氨基酸序列进行设计。

当选择用于在表达系统中表达的核酸时，需要选择在产生重组IFN-β治疗剂的宿主细胞或表达系统中优先(favor)的那些密码子。例如，已知在原核细胞中特定密码子比其它密码子优先表达(“密码子优选性”)。

编码IFN-β治疗剂的DNA序列还可以包括或者不包括编码信号序列的DNA序列。所述信号序列(如果存在)应可被为表达IFN-β治疗剂所选的细胞识别。信号序列可以是原核生物的和/或真核生物的。信号序列是本领域众所周知的，本领域中描述了一些不同的信号序列。信号序列可以是天然的(即，天然存在的)IFN-β的信号序列。信号序列所包含的内容依赖于其是否需要从产生分泌信号序列的重组细胞分泌IFN-β治疗剂。如果所选择的细胞是原核生物的，一般优选所述DNA序列不编码信号序列。如果所选择的细胞是真核生物的，一般优选所述DNA序列编码信号序列而最优选使用野生型IFN-β信号序列。

一经装配(通过合成、定点诱变或其它方法)，编码IFN-β治疗剂的核酸被插入至表达载体中，并可操作地连接于适于在所需转化的宿主中表达IFN-β治疗剂的表达控制序列。适当的转配可通过核苷酸测序，限制性作图和生物活性的多肽在适宜的宿主或宿主细胞中的表达得到证实。本领域已知，为了获得转染的基因在宿主或宿主细胞中的高表达水平，基因必须可操作地连接于在所选定表达宿主中具有功能的转录和翻译表达控制序列。

表达控制序列和表达载体的选择依赖于宿主细胞的选择。可以使用多种表达宿主/载体组合。可用于真核宿主，例如真核宿主细胞的表达载体为例如含有来自SV40，牛乳头瘤病毒，腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体，例如，下述载体：pcDNAI/amp，pcDNAI/neo，pRc/CMV，pSV2gpt，pSV2neo，pSV2-dhfr，pTk2，pRSVneo，pMS G，pSVT7，pko-neo和pHyg来源的载体。可选地，病毒诸如牛乳头瘤病毒(BPV-1)，或Epstein-Barr病毒(pHEBo，pREP-来源的和p205)的衍生物可用于在真核细胞中瞬时表达蛋白质。质粒制备和宿主生物体的转化中所用的多种方法是本领域众所周知的。关于其它适宜的表达系统可以参见Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch和Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)第16和17章。

可用于细菌宿主的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自大肠杆菌的质粒，包括col E1，pCR1，pBR322，pMB9及其衍生物；宿主范围较宽的质粒，诸如RP4，噬菌体DNA，例如，λ噬菌体的多种衍生物(例如NM989)和其它DNA噬菌体，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体等。可用于酵母细胞的表达载体包括2.mu.质粒及其衍生物。可用于昆虫细胞的载体包括pVL941。同样参见，Cate等，″Isolation Of The Bovine And Human Genes ForMullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In AnimalCells″，Cell，45，pp.685-98(1986)。

此外，这些载体中可使用任意的各种表达控制序列。所述可用的表达控制序列包括与前面表达载体的结构基因相关联的表达控制序列。可用的表达控制序列的实例包括，例如，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子，lac系统，trp系统，TAC或TRC系统，噬菌体λ的主要操纵子和启动子区，例如PL，fd外壳蛋白质的控制区，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子，例如，Pho5，酵母α-交配系统的启动子和已知控制原核或真核细胞或其病毒及其多种组合的基因表达的其它序列。

任何适宜的宿主均可用于制备IFN-β治疗剂，所述宿主包括细菌、真菌(包括酵母)、植物、昆虫、哺乳动物或其它适宜的动物细胞或细胞系，以及转基因动物或植物。示例性宿主包括大肠杆菌、假单胞菌(pseudomonas)、芽孢杆菌(Bacillus)、链霉菌(Streptomyces)、真菌、酵母的菌株、昆虫细胞诸如Spodoptera fruaiperda(SF9)，动物细胞诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和小鼠细胞诸如NS/0，非洲绿猴细胞诸如COS 1，COS 7，BSC 1，BSC 40和BMT 10，人细胞，以及组织培养中的植物细胞。所述细胞可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。优选用于动物细胞表达的宿主细胞包括培养的CHO细胞和COS 7细胞，特别是CHO-DDUKY-β1细胞系。

当然，应当理解的是并非所有载体和表达控制序列表达本文所述的DNA序列的功能是完全相同的。所有含有相同表达系统的的宿主的功能也不完全相同。但是，本领域技术人员无需大量实验即可在这些载体，表达控制序列和宿主中作出选择。还应当考虑载体的拷贝数，控制拷贝数的能力，和由该载体编码的任何其它蛋白质(诸如抗生素标记)的表达。例如，用于本发明的优选载体包括那些能使编码IFN-β治疗剂的DNA的拷贝数扩增的载体。所述可扩增的载体是本领域众所周知的。它们包括，例如，能通过DHFR扩增(参见，例如，Kaufman，美国专利4,470,461，KaOufman andSharp，″Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene：Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression″，Mol.Cell.Biol.，2，pp.1304-19(1982))或谷氨酰胺合成酶(“GS”)扩增(参见，例如，美国专利5,122,464和欧洲公开的申请338,841)而被扩增的载体。

在选择表达控制序列时，还应考虑多种因素。它们包括，例如，序列的相对强度(strength)，其可控性，及其与编码IFN-β治疗剂的实际DNA序列的相容性，特别要考虑可能的二级结构。宿主的选择应当考虑其对所选载体的相容性，本发明的DNA序列所编码产物的毒性，其分泌特性，其使多肽正确地折叠的能力，其发酵或培养需要以及DNA序列所编码产物的纯化容易程度。

根据这些参数，本领域技术人员可选择能够例如，利用CHO细胞或COS 7细胞，在发酵或大规模动物培养中表达所需DNA序列的多种载体/表达控制序列/宿主组合。美国专利6,127,332中进一步描述了CHO细胞系CHO-KUKX-B1 DHFR sup在表达INF-β变体中的用途。

IFN-β治疗剂还可在体外系统中制备，例如，在体外翻译系统，例如，细胞裂解物(例如，网织红细胞(reticulocyte)裂解物)中。术语“体外翻译系统”(其在本文中可与术语“无细胞翻译系统”互换使用)是指这样的翻译系统，其为至少包含RNA分子翻译为蛋白质所需最少元件的无细胞提取物。体外翻译系统通常包括大分子，诸如酶，翻译，启始和延长因子，化学试剂和核糖体。例如，体外翻译系统可至少包括核糖体，^tRNA，启始物甲硫氨酰-^tRNA^Met，翻译所涉及的蛋白质或复合物，例如，eIF₂，eIF₃，包含帽结合蛋白(CBP)的帽结合(cap-binding(CB))复合物和真核启始因子4F(eIF_4F)。多种体外翻译系统在本领域中是众所周知的，包括可购得的试剂盒。体外翻译系统的实例包括真核裂解物，诸如兔网织红细胞裂解物，兔卵母细胞裂解物，人细胞裂解物，昆虫细胞裂解物和麦胚提取物。裂解物可经商业途径从制造厂商处获得，诸如Promega公司，Madison，Wis.；Stratagene，LaJolla，Calif.；Amersham，Arlington Heights，Ill.；和GIBCO/BRL，Grand Island，N.Y。用于体外翻译系统的RNA可在体外、例如采用SP6或T7启动子、根据本领域已知的方法来制备。

在其它方法中，在宿主细胞中由内源基因表达IFN-β治疗剂。该方法可包括在IFN-β基因的编码区上游插入导源启动子，例如，诱导型启动子，表达内源IFN-β基因和回收制备的IFN-β。异源启动子可根据本领域已知的方法通过“敲入(knock-in)”，或可选地，通过在IFN-β基因中插入启动子而被导入细胞中。

根据用于制备的该治疗剂的宿主生物体，按照本发明得到的IFN-β治疗剂可以是糖基化的或非糖基化的。如果选用细菌作为宿主，则制备的IFN-β治疗剂将是非糖基化的。另一方面，真核细胞需要糖基化的IFN-β治疗剂。

由转化的宿主制备的IFN-β治疗剂可根据任何适宜的方法进行纯化。纯化IFN-β的多种方法均为已知的。参见，例如，美国专利号4,289,689，4,359,389，4,172,071，4,551,271，5,244,655，4,485,017，4,257,938，4,541,952和6,127,332。在优选的实施方案中，IFN-β治疗剂通过免疫亲合作用进行纯化，如例如，Okamura等，“Human Fibroblastoid Interferon：ImmunosorbentColumn Chromatography And N-Terminal Amino Acid Sequence.”Biochem.，19，pp.3831-35(1980)中所述。

例如，根据常规方法，诸如提取，沉淀，层析，亲合层析，电泳等，可以分离和纯化所述IFN-β蛋白质合其变体。例如，通过将其溶液通过其上固定有干扰素受体的柱子可以纯化干扰素蛋白和片段(参见美国专利4,725,669)。然后通过用离液序列高的盐处理或者通过用含水乙酸洗脱可以洗脱结合的干扰素分子。通过使含有融合蛋白的溶液通过含有选择性结合该融合蛋白的Fc部分的固定化蛋白质A或蛋白质G的柱子，可以纯化免疫球蛋白融合蛋白。参见，例如，Reis，K.J.，等，J.Immunol.132：3098-3102(1984)；PCT申请，申请号WO87/00329。然后用离液序列高的盐处理或者通过用含水乙酸洗脱可以洗脱嵌合的抗体。

可选地，可以在抗干扰素抗体柱上，或者在抗免疫球蛋白抗体柱上，纯化干扰素蛋白和免疫球蛋白-融合分子，得到基本上纯的蛋白质。术语“基本上纯的”意指所述蛋白质不含与其天然结合的杂质。通过电泳的单一条带可以证实基本上纯。

已制备和纯化的IFN-β可通过，例如肽谱法(peptide mapping)进行特征描述。例如，IFN-β治疗剂样品可按照例如，美国专利号6,127,332中所述用内蛋白酶Lys-C消化然后在反相HPLC上分析。

在优选的实施方案中，IFN-β治疗剂基本上不含其它细胞性物质，例如，蛋白质。术语“IFN-β治疗剂的纯化制剂”是指含有低于约20％(以干重计)的污染性细胞性物质，例如，核酸，蛋白质和脂质，优选含有低于约5％污染性细胞性物质的IFN-β治疗剂制剂。优选的IFN-β治疗剂制剂含有低于约2％的污染性细胞性物质；甚至更优选低于约1％的污染性细胞性物质和最优选低于约0.5；0.2；0.1；0.01；0.001％的污染性细胞性物质。

优选的IFN-β治疗剂组合物也基本上不含其它细胞性蛋白质(本文也称为“污染性蛋白质”)，即，该组合物含有低于约20％(以干重计)的污染性蛋白质，优选含有低于约5％的污染性蛋白质。优选的目的多肽的制剂含有低于约2％的污染性蛋白质；甚至更优选低于约1％的污染性蛋白质和最优选低于约0.5；0.2；0.1；0.01；0.001％的污染性蛋白质。

IFN-β制剂的纯度和浓度可根据本领域已知的方法进行测定，例如，通过对样品进行凝胶电泳，如例如，Robert K.Scopes，Protein Purification，Principles And Practice，Third Ed.，Springer Verlag New York，1993的描述(引入此处作为参考)。

IFN-β治疗剂的生物活性可采用本领域已知的任何适宜方法进行测定，例如，抗病毒活性的抗中和，诱导蛋白激酶，寡腺苷酸2，5-A合成酶或磷酸二酯酶活性，例如，EP-B1-41313和WO 00/23472中所述。所述测定法还包括免疫调节测定法(参见，例如，美国专利4,753,795)，生长抑制分析和与表达干扰素受体的细胞的结合的检测。美国专利6,127,332和WO00/23472中进一步描述了示例性抗病毒实验。

IFN-β治疗剂治疗肾小球肾炎的能力还可在动物模型中进行评估，例如，实施例和本文进一步描述的那些动物模型。测试可按照，例如实施例中所述进行实施。

IFN-β治疗剂还可以按下述商品名购得：AVONEX(INF-β-1a)(Biogen公司，Cambridge，MA)；REBIF(IFN-β-1a)(Serono，S.A.，Geneva，Switzerland)；BETAFERON或Bferon(IFN-β-1b)(Schering Aktiengesellschaft，Berlin，Germany)；和BETASERON或Bseron(Berlex，Montville，NJ；IFN-β-1b)。AVONEXREBIF是在中国仓鼠卵巢细胞中制备的重组人糖基化IFN-β。BETAFERON和BETASERON是在细菌中制备的。

4. 用IFN-β治疗剂进行治疗的方法

本发明提供了在患有或有易患肾小球肾炎的个体中治疗肾小球肾炎或慢性肾衰竭的方法，包括对该个体施以治疗有效量的IFN-β治疗剂。该个体可以是已被鉴别为患有肾小球肾炎或慢性肾衰竭的个体

肾小球肾炎(也称为“急性肾炎或“急性肾小球肾炎”)是能影响肾小球的急性但短暂的炎症过程，其导致GFR的急性降低，结果导致液体失衡和电解质异常。肾小球肾炎的症状包括：蛋白尿；肾小球滤过率(GFR)降低；血清电解质改变，包括氮质血症(尿毒症，过多的血尿素氮-BUN)和盐潴留，导致可造成高血压和水肿的水潴留；血尿和包括红细胞管型的异常尿沉渣；低白蛋白血症；高脂血症；和脂肪尿。

大量疾病(如下述)包括肾小球肾炎。如果非常严重，急性肾小球肾炎可导致急性或急进性肾衰。急进性肾衰相关性急性肾小球肾炎是常见情形，其因为临床表现而可命名为急进行性肾小球肾炎。由于对肾小球壁的损伤是急性肾小球肾炎中的一致发现，红细胞和白蛋白将进入包曼间隙并进入尿中。红细胞进入尿，肾衰竭和液体内环境异常的组合被称为肾炎综合征。血浆蛋白质的大量丢失可导致称为肾病综合征的病症，其中尿中的蛋白质丢失消耗血清蛋白平衡，导致低血清白蛋白，脂质异常和水肿。因此蛋白尿(白蛋白尿)和血尿(一般具有红细胞管型)的实验室所见是诊断急性肾小球肾炎所必须的，而缺失这些发现则提示其它诊断。例如，肾小管间质性肾炎包括肾小管和间质的短暂急性炎症而不涉及肾小球毛细血管。在急性肾小球肾炎时，发生血尿，红细胞管型和GFR的降低，但蛋白尿不明显，主要涉及低分子量蛋白质而不是白蛋白。

大量疾病单元(disease entities)可造成急性肾小球肾炎的症状。无论肾衰竭程度是否出现，都通常需要进行肾活检以便对患有急性肾小球肾炎的患者进行评价。诊断，预后和治疗均可通过对肾活检所鉴定的精确组织学的和超微结构模式进行确定。此外，分析活检组织可用于确定具体的肾小球肾炎所涉及的免疫复合物，免疫球蛋白和其它物质的类型，通常采用免疫荧光分析法。对肾产生影响的疾病可根据其发病机制而分类，而无论其是否导致足以影响肾小球滤过率的肾单位损害并由此导致某些类型的肾衰竭。

传统命名法是为描述肾小球疾病的多种特征而产生的。在文献中，肾小球疾病，肾小球病和肾小球肾炎可以互换使用，虽然术语肾小球肾炎通常意指炎症过程，如上述。当在肾中发生病理并由此导致全身症状时，将肾小球疾病分类为原发型；当其来自一些其它、多系统病症时，将肾小球疾病分类为继发型。光学显微镜下所观测到的病理学特征能进一步描述该类型肾小球疾病的特征。影响部分肾小球簇(glomerular tuft)的损伤被命名为节段性的，而影响几乎全部肾小球簇的损伤被称为总体性的。特征在于肾小球中细胞数量增加的异常被称为增生性，无论细胞数量的增加是否是由于白细胞浸润或固有肾小球细胞的增生。涉及包曼囊细胞的细胞增生被称为毛细血管外的(extracapillary)；包含内皮或系膜细胞的增生被称为毛细血管内的(intracapillary)或毛细血管里的(endocapillary)。在包曼间隙中聚集并呈半月形的细胞的聚集体被称为新月体，和通常由增生的壁上皮细胞和浸润的单核细胞构成。新月体肾小球肾炎是特征在于肾小球中形成新月体的急性肾小球肾炎类别。由于该病症通常伴随急进性肾衰竭，术语新月体肾小球肾炎可与急进行性肾小球肾炎互换使用。如果肾小球疾病的特征在于由于免疫沉积造成肾小球基底膜扩张，即将其命名为膜性的。可将上述命名的组合用于基于主要的病理学特征来描述肾小球疾病。增生性肾小球病(也被称为炎性肾小球病)包括诸如局灶增生性肾小球肾炎，弥漫增生性肾小球肾炎，系膜增生性肾小球肾炎和新月体性肾小球肾炎的病症，每个命名均提示了增生细胞的定位和/或类型。这些病症的特征在于尿沉渣中有血细胞和蛋白质，但蛋白质丢失量不能导致肾病综合征，即所谓的“肾炎”型。膜性肾小球病包括蛋白质的肾小球滤过屏障的改变，包括肾小球基底膜和腔上皮细胞。这些病症(包括膜性肾小球病，微小病变病以及局灶性和节段性肾小球硬化症)导致严重的蛋白质丢失，其可导致肾病综合征。如名称所示，膜性增生性肾小球肾炎是具有指示细胞增生和改变的肾小球滤过屏障的临床特征的杂合(hybrid)病症。特征在于蛋白质性或纤维性物质的显著血管外沉积这些病症被称为肾小球性沉积病(glomerular deposition disease)。其可包括肾炎的和肾病的成分，由此与在增生性或膜性病症中的发现重叠。影响肾的疾病的另一种类为血栓形成性微血管病(thromboticmicroangiopathy)，其为在肾微血管系统中发生凝块的疾病。这些分类的每一种均具有具体类型的病因学。

存在增生性肾小球病谱，这提示了由不同炎症过程导致不同组织病理学特征。例如，弥漫增生性肾小球肾炎可代表针对突然的严重抗原负载的急性免疫反应。新月体肾小球肾炎可包括针对在已经预先致敏的个体中的较小抗原攻击的较不显著的免疫反应。局灶增生性或系膜增生性肾小球肾炎在该病谱中进展的程度最轻，其中患者可仅经历缓慢的进行性肾功能不全。

肾活检的免疫荧光研究可辅助辨别增生性肾小球病的主要原因。存在三种广义的诊断性分类，每种均伴随免疫荧光下可见的免疫球蛋白沉积以及活跃的细胞增生的具体模式。免疫球蛋白颗粒状沉积是第一类即免疫复合物性肾小球肾炎的特征。免疫球蛋白沿肾小球基底膜的线性沉积为第二类即抗-GBM病的特征。免疫球蛋白的沉积最少是第三类即少-免疫型肾小球肾炎的特征。免疫复合物性肾小球肾炎可表示对已知抗原性刺激的反应(例如链球菌感染后肾小球肾炎)，或可构成多系统免疫复合物病症(例如，狼疮、冷球蛋白血症或细菌性心内膜炎)的一部分；在一些情况下，可能无法确定病因且该疾病被认为是自发性的。抗-GBM病是很罕见的疾病，其中形成攻击IV型胶原的自身抗体。大多数患有抗-GBM病的患者还会具有肺出血，称为古德帕斯丘综合征(Goodpasture’s syndrome)的病症。少-免疫型肾小球肾炎的特征在于循环抗中性粒细胞胞浆抗体的水平异常，该异常提示体液免疫的某些失调。

免疫介导的肾小球肾炎可用于解释大部分获得性肾病。通常，在肾小球簇中存在抗体沉积，所述抗体通常是自身抗体。抗体介导的肾小球肾炎中包含的细胞性免疫机制进一步调节抗体生成并诱导抗体依赖性细胞毒。大多数患者中的抗体介导的肾小球肾炎由循环抗体与自身抗原的反应启动。

作为一些不同过程的结果，可在肾小球中发现抗体。首先，循环自身抗体可与作为正常肾小球组分的内在自身抗原发生反应。其次，循环自身抗体和已经在肾小球中沉积的外部抗原可导致在原位形成肾小球型免疫复合物。再次，在系统循环中形成的免疫复合物可被俘获至肾小球中。抗体沉积的定位将在很大程度上决定肾小球疾病的临床特征。抗体在内皮下间或系膜中的急性沉积能触发特征在于从肾小球毛细血管快速募集白细胞和血小板的活跃的肾炎型反应。在上皮下间隙中的抗体沉积通常诱导肾病型反应，其特征在于蛋白尿和活性较小的炎症细胞浸润。

任何这些免疫过程可在肾小球中启动免疫级联反应，导致肾小球损伤和随后的修复。自身抗体对内在的或植入的肾小球抗原的反应性导致产生补体，化学引诱物，化学因子和细胞因子。由此启动补体依赖性和补体非依赖性机制，导致肾小球细胞的损伤。粒细胞和血小板也被募集至肾小球中，其触发进一步的损伤。历经数月至数年的持续的免疫复合物沉积还能引起基底膜生成的显著增加。在局部免疫活性终止前(不会进一步产生抗体或形成免疫复合物，除去沉积的和循环免疫复合物，防止炎症细胞的进一步募集，肾组织中的炎性介质消散，和血管紧张度以及内皮粘附性的正常化)，不能对任何免疫介导的肾小球病进行处理。

在肾小球损伤后，出现愈合并形成瘢痕。可以实现无残留损伤的修复。更通常的，肾小球瘢痕形成是广泛的，其存在对肾功能影响。已经认识到，转化生长因子β(TGF-β)(参与肾小球修复过程的细胞因子)刺激细胞外基质产生并抑制能降解基质蛋白质的组织蛋白酶的合成，由此增强了肾小球损伤后的瘢痕形成。肾小球损伤后的瘢痕形成进一步损伤残留的活性肾单位，这导致进行性肾单位丧失。随着丢失更多的功能性肾单位，残留的肾单位进行代偿(如上述)，这一过程同样损伤肾单位。最终的结果可以是肾功能的进行性降低，导致慢性肾衰竭，并最终进入终末期肾病阶段。

IFN-β治疗剂还可胜于治疗局灶性肾小球硬化症和塌陷性肾小球病，包括原发性形式和由于HIV感染的继发性形式。塌陷性肾小球肾炎是能导致无法有效治疗的肾衰竭的急进性疾病。该疾病大多发生在HIV患者中。由于蛋白尿在这些疾病中起主要作用，故此预期能显著降低蛋白尿的IFN-β治疗剂将对这些疾病的改善产生显著作用。其中蛋白尿起主要作用且预期IFN-β治疗剂对其有用的另一疾病是微小病变病，也称为微小病变性肾病(MCN)和微小病变性肾病综合征(MCNS)。

由此，IFN-β治疗剂可用于治疗与肾小球炎症相关的肾病症，例如，任何下述肾病症：局灶性肾小球硬化症和塌陷性肾小球病，微小病变病，急性肾小球肾炎，新月体性肾小球肾炎，肾炎综合征，肾病综合片，原发性肾小球肾炎，继发性肾小球肾炎，增生性肾小球肾炎，膜性肾小球肾炎，膜性增生性肾小球肾炎，免疫复合物性肾小球肾炎，抗肾小球基膜(抗-GBM)型肾小球肾炎，少-免疫型肾小球肾炎，糖尿病性肾小球病，慢性肾小球肾炎，和遗传性肾炎。诸如慢性肾病和终末期肾病等由这些肾病导致的任何疾病或病症也可以根据本发明的方法进行治疗。

5. 治疗个体

一般情况下，本发明的方法可用于患有，或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭，或可能需肾替代治疗(即，长期透析或肾移植)的任何哺乳动物个体。“患有，或易患肾小球肾炎或慢性肾衰竭的个体”是合理地预期会患与功能性肾单位进行性丧失相关的肾功能进行性丧失的个体。相关医学和兽医领域中的领域技术人员可常规地确定对个体是否患有或易患肾小球肾炎或慢性肾衰竭。患有，或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭(或可能患肾替代治疗)的个体包括(但不限于)下述个体：被认为患慢性肾衰竭、终末期肾病、慢性糖尿病性肾病、高血压性肾硬化症、慢性肾小球肾炎、遗传性肾炎和/或肾发育不良的个体；患有蛋白尿、血清电解质改变例如氮质血症(尿毒症，即，血尿素氮或“BUN”过高)；盐潴留(导致高血压和水肿)、血尿和包括红细胞管型的异常尿沉渣；血白蛋白减少，高脂血症和脂肪尿的个体；活检显示肾小球肥大、肾小管肥大、慢性肾小球硬化症和/或慢性肾小管间质硬化的个体；超声、MRI、CAT扫描或其它非侵入性检测显示肾纤维化或肾小于正常大小的个体。患有，或易患肾小球肾炎或CRF的个体的其它指征是本领域技术人员众所周知的。例如，下述均可作为确定个体是否患有，或易患肾小球肾炎或CRF的标准：尿沉渣中具有不正常数量的宽大管型的个体；GFR长期低于个体预期GFR的约50％，更具体地低于约40％、30％或20％的个体；体重为至少约50kg且GFR长期低于约50ml/min，更具体地低于约40ml/min、30ml/min或20ml/min的男性人类个体；体重为至少约40kg且GFR长期低于约40ml/min，更具体地低于约30ml/min、20ml/min或10ml/min的女性人类个体；功能性肾单位数量低于健康相似个体所具有的功能性肾单位数量的约50％，更具体地低于约40％、30％或20％的个体；具有单个肾的个体；和是肾移植受体的个体。

可治疗的哺乳动物个体包括(但不限于)人类个体或患者。此外，本发明还可用于治疗作为宠物而饲养的家养哺乳动物(例如，犬，猫，马)、具有显著商业价值的动物(例如，奶牛，肉牛，运动用动物)、具有显著科学价值的动物(例如，俘获的或自由的濒危物种)，或具有价值的其它动物。被治疗的个体无须表现出除与易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或终末期肾病(例如，需要肾替代治疗)相关的那些指征之外的用IFN-β治疗剂治疗的指征。即，除所述指征外，被治疗的个体被预期为不存在用IFN-β治疗剂治疗的指征。然而，在一些情况下，个体可表现出将提示用IFN-β治疗剂治疗的其它症状(例如，病毒性疾病，诸如肝炎感染)。在所述情况下，应相应地调整治疗以避免给予过多的剂量。

医学或兽医领域中的技术人员能够识别基本上易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或有需要肾替代治疗风险的个体。具体而言，预期临床实验和非临床实验，以及积累的经验(与目前公开的和其它治疗方法相关的)能为熟练医师提供确定所给个体是否患有，或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或需要肾替代治疗，以及任何具体治疗(包括根据本发明的治疗)是否最适于个体的所需要的信息。

一般情况下，如果哺乳动物性个体已经被诊断为患有，或将被认为患有通常会导致与功能性肾单位进行性丧失相关的肾功能进行性丧失的病症，则该个体被认为患有，或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或有需要肾替代治疗的风险。所述病症包括(但不限于)终末期肾病，慢性糖尿病性肾病，糖尿病性肾小球病，糖尿病性肾肥大，高血压性肾硬化症，高血压性肾小球硬化症，慢性肾小球肾炎，遗传性肾炎，肾发育不良和肾异体移植后的慢性排斥反应等等。这些疾病，以及本领域已知的其它疾病和病症，通常会导致功能性肾单位的进行性丧失并导致慢性肾衰竭的开始。

通常，医学或兽医领域中的技术人员可根据对肾活检样品的检测作出预后、诊断或治疗决定。所述活组织检查提供了可用于诊断肾病症的丰富信息。患有，或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或有需要肾替代治疗风险的个体，可通过从肾活检得到的组织学指征而被识别，所述指征包括(但不限于)肾小球中存在例如T细胞和巨噬细胞的炎症细胞，肾小球肥大，肾小管肥大，肾小球硬化症，肾小管间质硬化症，等等。

用于评估肾形态学的侵入性程度较低的技术包括MRI，CAT和超声扫描。使用对比剂或显像剂(例如，放射性染料)的扫描技术也是可用的，但是，应当注意，这些技术中的一些技术对肾组织和结构尤其有毒，因此，在患有，或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭的个体中使用它们是欠妥的。所述非侵入性扫描技术可用于检测诸如肾纤维化或硬化，局灶性肾坏死，肾囊肿，和肾总体肥大(renal gross hypertrophy)的病症，所述病症能将个体归类为患有或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或的个体。

通常，预后、诊断和/或治疗的确定要根据肾功能的临床指征。一种所述指征是在尿沉渣中存在异常数量的“宽大”或“肾衰竭”管型，其是肾小管肥大的指征并提示了指示慢性肾衰竭的肾代偿性肥大。肾功能的另一指征是肾小球滤过率(GFR)，其可通过定量具体标记物的清除率而直接检测，或可从间接的检测中进行推断。

本发明的治疗方法无须局限于具有任何特定GFR，或肾功能的任何其它特定指标的个体。事实上，个体的GFR，或肾功能的任何其它特定指标无须在实施本发明的检测之前确定。但是，GFR的检测被认为是评估肾功能的优选检测方法。

如本领域众所周知的，GFR反映了参比或标记化合物从血浆至尿的清除率。所考虑的标记化合物通常是可被肾小球自由滤过，但不被肾小管活性分泌或重吸收，且不与循环蛋白质明显结合的化合物。清除率通常用上述公式确定，所述公式涉及24小时期间产生的尿的体积，以及尿和血浆中标记物的相对浓度。为了更精确，GFR还应针对体表面积进行校正。“金标准”参比化合物是胰岛素，这是因为其滤过特性和缺少血清结合。然而，在血或尿中难以定量该化合物的浓度。因此，通常用其它化合物(包括肌酐)的清除率而不是胰岛素。此外，通常使用通过忽略标记物的实际尿浓度，实际日产尿量，或实际体表面积来寻求简化实际GFR的估计的多种公式。这些值可以用基于其它因子的估计值、用相同个体的基线值，或用相似个体的标准值代替。然而，这些估计值应谨慎使用，因为其可能伴有基于正常或健康个体的肾功能的不恰当的假设。此外，对氨基马尿酸(PAH)的清除率可用于估计肾清除率。

本领域中已经建立了多种方法和公式，其描述了针对具有特定特征的健康个体的GFR期望值。具体而言，提供基于血浆肌酐水平，年龄，体重和性别的GFR的期望值的公式是可用的(参见，例如，本文的“定义”章节)。当然，也可使用其它公式，并可针对特定年龄，体重，性别和/或血清肌酐浓度的个体制作标准值表。现在，在现有技术中还可以获得更新的检测或估计GFR的方法(例如，使用NMR或MRI技术)，并可根据本发明使用(参见，例如，美国专利5,100,646和5,335,660)。

一般情况下，无论检测或估计GFR的方法如何，当个体的GFR长期低于该个体的期望GFR的约50％时，所述个体可被认为患有，或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或有需要肾替代治疗的风险。随着GFR降得更低，所述风险将被认为更大。因此，如果个体的GFR长期低于期望GFR的约40％、30％或20％，则认为该个体患病可能性渐增。当个体的GFR长期低于约50ml/min时，体重至少约50kg的男性人类个体被认为患有，或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或有需要肾替代治疗的风险。随着GFR降得更低，所述风险将被认为更大。因此，如果该个体的GFR长期低于约40、30或20ml/min，则认为该个体患病可能性渐增。当个体的GFR长期低于约40ml/min时，体重至少约40kg的女性人类个体被认为患有，或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或有需要肾替代治疗的风险。随着GFR降得更低，所述风险将被认为更大。因此，如果个体的GFR长期低于约30、20或10ml/min，则认为该个体患病的可能性渐增。一般情况下，如果个体的功能性肾单位的数量低于健康(但相似的)个体的功能性肾单位数量的约50％，则该个体被认为患有，或易患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或有需要肾替代治疗的风险。如上述，随着功能性肾单位的进一步减少，所述风险将被认为更大。因此，如果个体的功能性肾单位的数量低于相似但健康的个体的数量的约40％、30％或20％，则认为该个体患病的可能性渐增。

最后，应当注意无论丧失另一肾的方式如何(例如，物理创伤，手术切除，出生缺陷)，具有单个肾的个体初步即可被认为有患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或需要肾替代治疗的风险。这对于由于折磨残留肾的疾病或病症的原因而丧失一个肾的那些个体而言尤其如此。相似地，已经接受肾移植，或正在接受长期透析(例如，长期血液透析或连续流动式腹膜透析)的个体可被认为有患肾小球肾炎、慢性肾衰竭或需要进一步肾替代治疗剂的风险。

可根据本发明的方法治疗的个体还包括患有已知可用IFN-β进行治疗的疾病或病症，例如，多发性硬化和病毒感染的那些个体。示例性病毒感染包括肝炎，例如，乙型肝炎感染。在这种情况下，可发展出适于治疗所述两种病症的IFN-β治疗剂的施用方案。个体还可以是不患有可用IFN-β治疗的病毒感染或导致肾小球肾炎的病毒感染的个体。由此，示例性个体包括不携带肝炎病毒，例如，乙型或丙型肝炎病毒，或其中肾小球肾炎不是由肝炎病毒，例如，乙型或丙型肝炎病毒所致的那些个体。可选地，该个体还可以是患有或很可能患由病毒感染所致的肾小球肾炎的个体。在其它实施方案中，个体不患有终末期肾衰竭或肾细胞癌。

6. 制剂和治疗方法

IFN-β治疗剂要通过适合具体肾治疗剂使用的任何途径进行施用。因此，适宜地，施用可以是口服或胃肠外的，包括静脉内，腹膜内和囊内(intracapsular)的施用途径。此外，可以通过周期性注射本文所述药物(即，IFN-β治疗剂)的药团(bolus)来给药，或可经由外部容器(例如，静脉注射袋)或内部容器(例如，可生物蚀解的植入物或植入的泵)通过静脉内或腹膜内更连续地给药。在根据本发明的方法中，IFN-β治疗剂优选经胃肠外途径进行施用。本文所使用的术语“胃肠外”包括气雾剂、经皮下、经静脉内、经肌肉内、经关节内、经滑膜腔内、经胸骨内、经鞘内、经肝内、经损伤内和经颅内注射或输注技术。

本发明的药物可通过任何适宜的形式提供给个体，优选直接地(例如，局部地，如通过注射或局部施用于组织部位)或全身性(例如，经胃肠外或口服)。当经胃肠外(诸如通过静脉内、皮下或肌肉内)施用药物时，药物优选包括水溶液部分。该溶液是生理学上可接受的，以便除将所需药物递送给该个体外，该溶液不会另外地对该个体的电解质和/或容量平衡产生不利作用。因此，用于药物的水介质可包括普通生理盐水(例如，0.9％NaCl，0.15M，pH 7-7.4)。

IFN-β治疗剂优选以包含可药用的载体的无菌药物组合物进行施用，所述可药用的载体可以是任何本领域众所周知的众多载体，诸如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，或其组合。IFN-β治疗剂可被制成包含一种或多种其它蛋白质(例如用于稳定IFN-β治疗剂)的组合物。例如，IFN-β治疗剂可与白蛋白混合。

药物组合物可包括IFN-β治疗剂和任何可药用的载体。本文所使用的术语“载体”包括可接受的佐剂和载体。可用于本发明的药物组合物中的可药用的载体包括(但不限于)离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质诸如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质类，诸如硫酸谷醇溶蛋白(prolamine sulfate)、磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶体硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，基于纤维素的物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜡，聚乙烯-聚氧苯烯-嵌段聚合物，聚乙二醇和羊毛脂(wool fat)。

IFN-β或其变体还可以采用脂质体递送系统(诸如小型单层泡，单层大泡和多层泡)的形式进行施用。脂质体可由多种磷脂制得，所述磷脂包括胆固醇、硬脂酰胺或磷脂酰胆碱。在一些实施方案中，脂质部分的膜通过水溶液水合从而形成包封药物的脂质层，如美国专利5,262,564中所述。

IFN-β或其变体还可以与作为可靶向的药物载体的可溶性聚合物偶联。所述聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羟基乙基天冬酰胺苯酚或软脂酰残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸(polyethyleneoxidepolylysine)。IFN-β或其变体还可以与蛋白质，诸如受体蛋白质和白蛋白等偶联。此外，IFN-β或其变体可与用于实现药物的控制性释放的生物可降解聚合物类偶联，所述聚合物例如，聚乳酸，聚ε己内酯(polyepsilon caprolactone)，聚羟基丁酸，聚原酸酯(polyorthoester)，聚缩醛(polyacetals)，聚二氢吡喃，聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacrylates)和水凝胶的交联的或两亲性嵌段共聚物相偶联。

根据本发明的，药物组合物可以是无菌注射剂形式，例如无菌注射水混悬剂或油性混悬剂。该混悬剂可按照本领域已知的方法采用适宜的分散剂或湿润剂和混悬剂进行配制。无菌注射剂还可以是在无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬剂，例如1，3-丁二醇溶液。可使用的可接受的载体和溶剂是水，林格液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、非挥发油通常可被用作溶剂或悬浮介质。为这一目的，可使用任何温和的非挥发油，包括合成甘油一酯或甘油二酯。和天然药物学上可接受的油诸如橄榄油或蓖麻油，特别所述油的聚氧乙烯形式一样，脂肪酸诸如油酸及其甘油酯衍生物也可用于制备注射剂。这些油溶液或混悬剂还可包括长链醇稀释剂或分散剂。

包含IFN-β治疗剂的药物组合物还可以经口服给药。例如，其可通过任何口服可接受的剂型，包括(但不限于)胶囊、片剂、水混悬剂或溶液进行施用。在用于口服使用的片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常，还要加入润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于以胶囊剂形式的口服施用，可用的溶剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服使用需要水混悬剂时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂联合。如需要，还可以加入一些甜味剂、调味剂或着色剂。还可以使用局部透皮贴剂。

在优选的实施方案中，提供了作为包含稳定剂的液体组合物的IFN-β或其变体。稳定剂的存在量可以是IFN-β或其变体重量比的0.3％至5％。稳定剂可以是氨基酸，诸如酸性氨基酸(例如，谷氨酸和门冬氨酸)或精氨酸或甘氨酸。如果稳定剂是精氨酸-HCl，其浓度将优选为0.5％(w/v)至5％，最优选为3.13％(等效于150mM精氨酸-HCl)。如果稳定剂是甘氨酸，其浓度将优选为0.5％(w/v)至2.0％，最优选为0.52％(等效于66.7mM至266.4mM，最优选70mM)。如果稳定剂是谷氨酸，其浓度将优选为100mM至200mM，最优选为170mM(等效于1.47％至2.94％的w/v百分数且最优选为2.5％)。液体制剂中IFN-β或其变体的优选浓度范围为约30μg/ml至约250μg/ml。优选浓度范围为48至78μg/ml，最优选浓度范围为约60μm/ml。考虑到国际标准值，Biogen内部标准已经用干扰素(天然#Gb-23-902-531)的WHO国际标准进行标准化，由此IU浓度(对于0.5ml注射体积)范围是约6IMU-50IMU，最优选的浓度是12IMU。

优选地，氨基酸稳定剂是是精氨酸，所述精氨酸在约pH 5.0的溶液中以其酸性形式(精氨酸-HCl)掺入。由此，优选多离子赋形剂。优选地，液体组合物被包含在容器内，例如，注射器，其中容器具有与液体接触的表面，该表面已涂覆了对IFN-β惰性的物质，例如，硅酮或聚四氟乙烯。更优选的组合物的pH为4.0-7.2。包含稳定剂的溶液优选未被冻干且在制备和保存期间未被置于包含氧气的气体中。

用于在本发明中将pH保持在约4.0-约7.2的范围，优选约4.5-约5.5，最优选5.0的有机酸和磷酸盐缓冲液可以是有机酸及其盐的常规缓冲液，诸如枸橼酸盐缓冲液(例如，枸橼酸一钠-枸橼酸二钠混合物，枸橼酸-枸橼酸三钠混合物，枸橼酸-枸橼酸一钠混合物，等)，琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸一钠混合物，琥珀酸-氢氧化钠混合物，琥珀酸-琥珀酸二钠混合物，等)，酒石酸盐缓冲液，延胡索酸盐缓冲液，葡萄糖酸盐缓冲液，草酸盐缓冲液，乳酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，和醋酸盐缓冲液，如WO98/28007中所述。

示例性制剂(按WO 98/38007中所述进行制备)包括：

(i)pH 5.0的20mM醋酸盐缓冲液，该缓冲液优选预先未被冻干，其中缓冲液包含IFN-β和至少一种选自如下的成分：(a)150mM精氨酸-HCl；(b)100mM氯化钠和70mM甘氨酸；(c)150mM精氨酸-HCl和15mg/ml人血清白蛋白；(d)150mM精氨酸-HCl和0.1％Pluronic F-68；(e)140mM氯化钠；(g)140mM氯化钠和15mg/ml人血清白蛋白；和(g)140mM氯化钠和0.1％Pluronic F-68；

(ii)包含IFN-β或其变体，170mM L-谷氨酸和150mM氢氧化钠的pH5.0的液体，该液体优选预先未被冻干；和

(iii)pH 7.2的20mM磷酸盐缓冲液，该缓冲液优选预先未被冻干，其中缓冲液包含IFN-β和至少一种选自如下的成分：(a)140mM精氨酸-HCl和(b)100mM氯化钠和70mM甘氨酸。

优选的组合物还包括聚山梨醇酯，例如，0.005％w/v的聚山梨醇酯20。

IFN-β可被配制为干粉形式，其在施用于个体之前可被或可不被溶解或混悬。具体而言，已经显示出与聚合物(例如，PEG)结合的IFN-β在干燥形式下特别稳定(参见，例如，WO 00/23114和PCT/US/95/06008)。

本发明的药物组合物还可通过鼻气雾剂进行施用或使用雾化器、干粉吸入器或压力定量气雾剂来吸入。所述组合物可根据药物配制领域众所周知的技术进行制备，并可制备为盐水溶液，其可使用苯甲醇或其它适宜的保存剂，增强生物利用度的吸收促进剂，碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂。根据其它实施方案，包含本发明的化合物的组合物还可包括选自皮质激素，抗炎剂，免疫抑制剂，抗代谢物或免疫调节物的添加剂。这些类别的每一类中的化合物可选自″Comprehensive Medicinal Chemistry″，Pergamon Press，Oxford，England，pp.970-986(1990)中适宜组标题下所列的任何化合物，上述文献的内容引入此处作为参考。具体的化合物是茶碱，柳氮磺吡啶和氨基水杨酸盐(抗炎剂)；环孢菌素，FK-506和雷帕霉素(rapamycin)(免疫抑制剂)；环磷酰胺和甲氨蝶呤(抗代谢物)；类固醇(吸入的、口服或局部的)和其它干扰素(免疫调节物)。

可用于胃肠外施用的溶液可通过药物领域中众所周知的任何方法进行制备，所述方法描述于，例如， Remington′s Pharmaceutical Sciences(Gennaro，A.，ed.)，Mack Pub.，1990中。

胃肠外可注射的给药通常采用经皮下、经肌肉内或经静脉内注射和输注。例如，当在一周中采用皮下注射来递送0.01-100μg/kg，或更优选0.01-10μg/kg的IFN-β，例如，PEG化IFN-β时，分别在0和72小时注射0.005-50μg/kg，或更优选0.005-5μg/kg。此外，根据美国专利3,710,795(引入此处作为参考)，胃肠外施用的一种途径采用了植入缓释或持续释放系统，其能确保保持剂量的恒定水平。

本领域技术人员应能理解，配制的组合物包含治疗有效量的IFN-β治疗剂。即，它们包含在足以防止、抑制、延缓或减轻持久或进行性肾功能丧失，或提供有效治疗的时间内，为肾组织或其它适宜的组织提供适宜浓度的IFN-β治疗剂。本领域技术人员应能理解，本发明的治疗剂组合物中所述化合物的浓度将根据很多因素，包括所选试剂的生物效能，所使用化合物的化学特性(例如，疏水性)，化合物赋形剂的组成，给药途径和所拟定的治疗(包括是否将活性成分直接施用于肾或肾包囊(renal capsule)，或是否将所述活性成分系统给药)。优选的给药物量也可有赖于诸如肾组织状况，肾功能丧失程度和具体个体的整体健康状态等变量。给药物量可连续，或每日施用，但目前优选的是只要能维持满意的反应(如例如，通过测定适宜的医学指标和/或生命质量指征所检测到的肾功能的稳定和/或改善)，即可每周一次、两次或三次施用所述剂量。还可以采用频率较低的剂量(例如每月剂量)。对于需要连续、一周两次或一周三次进行透析的个体来说，用连续、一周两次或一周三次的静脉内或腹膜内输注代替上述透析不会被认为造成不适宜的不便。此外，为易于频繁输注，可植入半-永久性支架(例如，静脉内、腹膜内或囊内(intracapsular))。

使用IFN-β的给药方案的选择要依据多种因素，包括患者的体型，种族，年龄，体重，性别和医疗条件；所要治疗的病症的严重程度；给药途径；患者的肾和肝功能；以及所采用的具体化合物或其盐。还应考虑本发明的化合物的活性和患者对副作用的敏感性。普通熟练医师或兽医可很容易地确定和给出有效预防、逆转或阻止病症进展所需的药物量。

本发明的口服剂量(优选对于PEG化INF-β治疗剂而言)为约0.01-100μg/kg/日，口服；或更优选0.01-10μg/kg/日，口服。组合物优选以包含0.5-5000μg，或更优选0.5-500μg的活性成分的刻痕片(seored tablet)的形式提供。

对于任何施用途径，可使用分开的(divided)或单次剂量。例如，本发明的化合物可每日或每周以单次剂量施用，或将总剂量以二、三或四个分开的剂量进行施用。

任何上述药物组合物可包含0.1-99％，1-70％，或优选，1-50％的本发明的活性化合物作为活性成分。

疾病的过程及其对药物治疗的反应可通过临床检查和实验室检测随诊。本发明治疗的有效性通过前述病症(例如慢性肝炎)的体征和症状减轻的程度以及干扰素的常见副作用(即，流行性感冒样症状诸如发热，头痛，寒战，肌痛，疲劳等和中枢神经系统相关症状诸如抑郁，感觉异常，注意力不集中等)消除或实质上减轻的程度来测定。

IFN-β治疗剂可单独施用或与已知对治疗本文所述病症有益的其它分子(例如，抗炎症药)联合施用。当与其它药物联合使用时，可能需要相应地改变IFN-β治疗的剂量。

可与载体物质联合以生产单独的剂量形式的活性成分的量将依据所治疗的宿主以及具体的给药方式而变化。然而，应当理解对任何特定患者的具体剂量和治疗方案应依赖于多种因素，所述因素包括所使用的具体化合物的活性，年龄，体重，总体健康，性别，饮食，给药时间，排泄速率，药物组合和治疗医师的判断和将要治疗的疾病的严重度。活性成分的量还有赖于与该成分共同施用的治疗性或预防性药剂。

IFN-β治疗剂的有效剂量和给药频率应依据多种因素，诸如抑制剂的性质、患者的体型，治疗目的、要治疗的病理性质，所采用的具体药物组合物，和治疗医师的判断。可采用的活性成分化合物剂量水平为约0.001至约100mg/kg体重/日，优选约0.1至约50mg/kg体重。最优选地，IFN-β治疗剂以约0.1mg/kg体重至约20mg/kg体重，优选约1mg/kg体重至约3mg/kg体重并在每个第1-14日进行施用。优选剂量包括每周或每周三次注射约6MIU。剂量的优化可例如，通过施用IFN-β治疗剂，然后评价IFN-β治疗剂的循环或局部浓度来确定。

在最优选的实施方案中，对需要的个体施以AVONEX。AVONEX作为包含下述物质的冻干粉售卖：

每1ml剂量的配制：

30mcg干扰素-b-1a (6百万国际单位(MIU))

50mM磷酸钠

100mM氯化钠

15mg人血清白蛋白

pH 7.2

AVONEX干扰素的比活为2×10⁸单位/mg，即，200MU抗病毒活性/每毫克的IFN-b-1a蛋白质。患者用无菌水重新溶解该粉剂，然后每周一次通过肌肉内注射1ml。AVONEX还可按包含下述物质的液体制剂进行制备：

每0.5ml剂量的配制：

30mcg(μg)IFN-b-1a(6百万国际单位(MIU))

20mM醋酸盐 (醋酸钠和醋酸)

150mM精氨酸HCl

0.005％w.v聚山梨醇酯20

注射用水

pH 4.8

该制剂可包装在载药(pre-filled)注射器内。患者可手动使用所提供的注射器或与自动注射器(autoinjector)联合使用。给药方案为每周一次通过肌肉内注入6MUI(即，30mcg)。

在另一实施方案中，IFN-β是Rebif，其作为冻干粉和液体制剂提供。冻干粉包含下列物质：

每2.0ml剂量的配制：

3MIU IFN-b-1a

甘露醇

HSA

醋酸钠

pH 5.5

Rebif干扰素的比活为2.7×10⁸单位/mg，即，270MU抗病毒活性/每毫克IFN-b-1a蛋白质。患者用氯化钠溶液(0.9％NaCl)重新溶解该粉剂，随后每周三次通过皮下注射。液体Rebif的配制如下：

每0.5ml剂量的配制：

6或12MIU IFN-b-1a

4或2mg HSA

27.3mg甘露醇

0.4mg醋酸钠

注射用水

该液体制剂可包装在载药注射器内，可以用或不用自动注射器装置(Rebiject)每周三次(6或12MIU，分别对应于66μg/周或132μg/周)经皮下施用。

而在另一实施方案中，IFN-β是BETASERON(获自Berlex)，其为在大肠杆菌中制备的包含cys-17至ser突变的IFN-β。该非糖基化IFN-β的效力低于在CHO细胞中产生的AVONEX或REBIF。以250mcg(8MIU)的剂型(包括冻干和液体制剂)售卖所述药剂，其用于每隔一日经皮下注射。BETAFERON为另一可购得的IFN-β，其可根据制造商说明书经皮下施用。

IFN-β或其变体还可与可溶性IFN I型受体或其一部分，诸如该受体的IFN-结合链联合施用，诸如，例如美国专利6,372,207中所述。如该专利所述，以I型IFN与所述受体的IFN结合链的复合物形式给药改善了IFN的稳定性并增强了IFN的效力。该复合物可以是非共价复合物或共价复合物。

IFN-β治疗剂可在肾小球肾炎的动物模型中进行测试。在，例如，小鼠，大鼠，豚鼠，猫，犬，绵羊，山羊，猪，牛，马和非人灵长类中的肾小球肾炎哺乳动物模型，可通过对动物的肾组织实施适宜的直接或间接损伤或创伤而产生。肾小球肾炎的动物模型可，例如，通过将抗体注射至肾小球基膜，诸如在实施例所述的大鼠动物模型肾毒性肾炎(NTN)中。其它动物模型可通过将抗-Thyl抗体注射至动物(如实施例进一步所述)而产生。而其它动物模型可通过用自体肾小球基底膜进行免疫或通过单侧输尿管梗塞(UUO)来建立。

当施用于患有或易患肾小球肾炎或慢性肾衰竭的哺乳动物个体(例如，人类患者)时，可评价IFN-β治疗剂使肾功能的标准指标发生临床显著改善的治疗效力。肾功能的所述指标是医学领域中从所周知的，其包括(不限于)蛋白尿增加率，BUN水平，血清肌酐增加率，BUN的静态检测，血清肌酐的静态检测，肾小球滤过率(GFR)，BUN/肌酐比，血清钠(Na+)浓度，肌酐的尿/血浆比，尿素的尿/血浆比，尿摩尔渗透压浓度，每日尿排出量等(参见，例如，Brenner和Lazarus(1994)，in Harrison′s Principles of Internal Medicine，13th edition)。

本发明通过下述实施例(非限制性的)进一步进行描述。所有引用的参考文件(包括如本申请全文引用的参考文献，公布的专利，公开的专利申请)的内容清楚地包含在本文中作为参考。

除非另有所指，本发明的实施将采用细胞生物学，细胞培养，分子生物学，转基因生物学，微生物学，重组DNA和免疫学的常规技术，其为本领域的常规技术。现有文件中对所述技术有详细的解释。参见，例如，Molecular Cloning A Laboratory Manual，2nd Ed.，ed.by Sambrook，Fritsch和Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes Iand II(D.N.Glover ed.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis等，美国专利：4,683,195；Nucleic Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，Alan R.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the treatise，Methods InEnzymology(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Gene Transfer Vectors For MammalianCells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology，Vols.154 and 155(Wu et al.eds.)，ImmunochemicalMethods In Cell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，AcademicPress，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

实施例

实施例1： IFN-β诱导肾衰竭中蛋白尿的显著减少

该实施例描述了IFN-β显著降低了大鼠动物模型NTN(肾毒性肾炎)中的蛋白尿，所述动物模型是在组织学上与人新月体性肾小球肾炎(导致慢性肾衰竭)非常相似的炎性模型。

通过i.v.注射肾毒性血清(NTS)在大鼠中诱导该疾病，所述血清通过用大鼠肾小球基底膜(GBM)的冻干制剂免疫兔来制备。NTS快速地结合GBM，其导致伴有促炎细胞因子和粘附分子上调的强烈的、肾小球内炎症反应。有白细胞流进入肾小球。肾小球随后出现具有纤维蛋白沉积和毛细血管袢破裂的坏死区。这导致在包曼间隙中出现炎症细胞和增生性肾小球上皮细胞的新月体-累积(crescents-accumulation)。该炎症区的特征在于在尿中丢失大量蛋白质。随着胶原在簇中累积和新月体的纤维性转化，肾小球发生进行性瘢痕化。大鼠随后出现终末肾衰竭。因此，在该模型中，大鼠对抗-GBM抗体产生反应，产生急性但短暂的肾病，随后100％的动物以明显的(well-defined)病程进展为CRF。不同的大鼠品种对该形式的肾损伤具有不同的敏感性，Wistra-Kyoto(WKY)大鼠极其敏感。该动物模型进一步描述于，例如，Tam等，(1999)Nephrol.Dial.Transplant.14：1658和Allen等，(1999)J.Immunol.162：5519中。

用于该研究的IFN-β是对应于GenBank登录号P70499的22-184位氨基酸的大鼠IFN-β。大鼠IFN-β在适合在悬浮液中生长的中国仓鼠卵巢(CHO)S-32细胞中表达并被分泌至培养基中。在发酵培养中，该细胞在包含血清的培养基内生长。采用在Pharmacia SP-Sepharose，Blue Sepharose和Superose 12树脂，以及Biorad Bio-Scale Ceramic Hydroxyapatite和Bio-ScaleS树脂上进行顺序层析(sequential chromatography)，从调节条件后的(conditioned)培养基中纯化IFN-β。然后以25mM枸橼酸盐/150mMNaCl(pH 4.5)对IFN-β进行彻底地透析，并过滤消毒的(0.2μm)。经考马斯染色的非还原性SDS-PAGE凝胶的光密度测定(densitometry)，确定IFN-β制剂的纯度＞99％。经在大鼠RATEC细胞上的测定，比活测定为约3×10⁸单位/mg。

在该实施例中，在获自Charles River实验室的28只WKY大鼠中诱导NTN。在14日处死4只大鼠用于基线组织学(baseline histology)，其余的随机接受以下处理：IFN-β3×10⁵单位/日、经腹膜内(i.p.)；IFN-β6×10⁵单位/日i.p；或仅接受载体。以6日/每周给予注射，治疗持续至第30日。第7日检测蛋白尿，然后每周检测一次。在14日，28日和处死时从大鼠取血。处死时，将肾，肺，肝和脾在福尔马林中固定，并将肾快速冷冻(snap frozen)。

在该和/或下述实施例中所分析的功能参数的评估如下：

白蛋白尿/蛋白尿：其反映肾小球的渗漏，并在较小程度上反映了滤过的蛋白质在肾小管中代谢的衰竭。对所述数据的解释是困难的，因为其是两个独立变量的产物；增高的GBM通透性导致更多的蛋白尿，但降低的肾小球滤过率减少肾小球性蛋白尿。

收获前24小时在代谢笼(metabolic cage)内收集尿。尿白蛋白浓度通过火箭免疫电泳法测定(rocket immunoelectrophoresis)。尿蛋白浓度通过硫代水杨酸(sulphosalicylic acid)沉淀法测定。

血清肌酐和肌酐清除率(CrCI)：收获时取外周血用以采用Olympus试剂和Olympus AU600分析仪(Olympus，Eastleigh，U.K.)测定血清肌酐浓度。还要测定尿肌酐浓度(Bayer RA-XT，Newbury，U.K.)以便计算肌酐清除率。

存活率：这些研究的终点是猝死或处死以解除痛苦(relieve distress)。通过不知情的(blinded)独立观测者每曰观察所述动物，并根据第三方意见处死濒死动物。事实上，存活实验中约半数动物到达“处死”终点。

获得苏木精和伊红染色的切片，采用任意评分尺度来粗略评估肾小球瘢痕形成、肾小管排出物(tubular dropout)、间质炎性浸润和间质纤维化。

肾小球纤维化：通过计算机估计被Masson-Trichrome组织化学方法染为绿色的肾皮质区的百分数，所述方法提供了评估肾内胶原“负载”的方式。还可选择各肾小球作为目的区域以便计算比肾小球纤维化(specificglomerular fibrosis)。为了定量肾小球内的间质纤维化，采用标准三色方法(马休(Martius)黄，亮晶体猩红(Brilliant Crystal Scarlet)和苯胺蓝)对石蜡包埋的肾切片进行染色。为定量肾小球纤维蛋白沉积(例如，纤维蛋白样坏死)，采用能将纤维蛋白染为红/橙色的马休黄对石蜡包埋的肾切片染色。采用装备了Photonic数码照相机(Photonic Science，East Sussex，U.K.)的Olympus BX40显微镜(Olympus Optical，London，U.K.)在×200放大率下检查所述切片。获得图像并用Image-Pro Plus^TM软件进行分析(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)。

在用免疫过氧化物酶对肾切片的纤连蛋白ED(A)区进行染色以后，染为棕色的％肾皮质区的定量能够区分不同功能性严重度的CRF。相似地，III型胶原免疫组织化学能用于计算染色的％肾皮质区。

肾小球α-平滑肌肌动蛋白(SMA)表达通过免疫荧光进行检测。该蛋白限定了肾小球中“肌成纤维(myofibroblastic)”细胞群，所述细胞群被认为是肾小球纤维化中的关键因素。对α-SMA的免疫荧光染色的定量与肾小球马森三色纤维化评分具有良好的相关性。

图3中所示的结果显示出在第21曰和第28日，用两种IFN-β剂量治疗的动物中蛋白尿出现显著降低。在血清肌酸、肌酸清除率、盲法(blinded)H&E切片上的肾小球性或小管间质性瘢痕形成(即，组织学瘢痕形成)、肾小球巨噬细胞或CD8数量；或肾小球ED(A)纤连蛋白或IV型胶原沉积等方面没有差异。

实施例2： IFN-β还显著减少了肾损伤急性期期间的蛋白尿

该实施例显示出除能在肾衰竭的晚期减少蛋白尿外，IFN-β还显著季肾损伤急性期期间的蛋白尿。

在该实施例中，通过i.v.注射0.1ml NTS在32只大鼠中诱导NTN，如上述。用大鼠IFN-β6×10⁵单位/日i.p.、以6日/周、从第0日至第14日对8只路易大鼠进行治疗。用RSA i.p.、6日/周、从第0日至第14日对8只大鼠进行治疗。用大鼠IFN-β6×10⁵单位/日i.p.、6日/周、从第0日至第28日对8只大鼠进行治疗。用RSA i.p.、6日/周、从第0日至第28日对8只大鼠进行治疗。于第7，14，21和28日在代谢笼内收集尿，用以检测蛋白尿和肌酐。于第14日和处死时对所有动物取血，用于检测血清肌酐。每组的半数大鼠在第14日处死，而半数在第28日处死。在第28日处死大鼠前一小时，对其注射BrdU以便评估细胞增生。在福尔马林中固定下述组织：肾，肺，肝和脾，用于组织学检测。在卡诺依氏固定液(Carnoy’s fixative)中固定肾切片，用于BrdU染色。肾也被快速冷冻。在H&E染色的切片中，半定量评估肾小球瘢痕形成，肾小管萎缩和纤维化。

图4中所示结果显示了在第14，21和28日，IFN-β导致蛋白尿显著减少。第14日和28日的血清肌酸和肌酸清除率不存在显著差异。组织学上，在第14日，肾小球巨噬细胞(ED1+细胞)和CD8+细胞显著减少，但在第28日数量较多。在第28日，肾小球α-平滑肌肌动蛋白也显著减少。因此，IFN-β治疗具有对蛋白尿的作用，降低了炎症，但对瘢痕形成没有明显作用。

在其它实施例中，在16只WKY大鼠中诱导NTN，其中8只用大鼠IFN-β6×10⁵单位/日i.p.、6日/周、从第0日至第7日进行治疗，而另外的8只用仅用载体(大鼠血清白蛋白-RSA)治疗，i.p.，6日/周，从第0日至第7日。在第6和7日将大鼠圈养于代谢笼内。在第7日处死所有大鼠。在处死大鼠前一小时，对其注射BrdU以便评估细胞增生。处死时，将肾，肺，肝和脾在福尔马林中固定。肾在卡诺依氏固定液中固定以进行BrdU染色并快速冷冻。结果显示蛋白尿、肾小球组织学或肾小球的巨噬细胞或CD8细胞数量不存在显著差异。然而，相对于对照动物，第7日在用IFN-β治疗的动物中较低。此外，相对于对照动物，用IFN-β治疗的动物中肾小球中的增生性细胞数目显著较低(参见图5)。

实施例3： IFN-β在肾衰竭动物模型Thy肾小球肾炎中诱导了蛋白尿的显著降低

该实施例显示出在肾小球系膜增生性肾小球肾炎中，IFN-β也能显著地减少蛋白尿。

在该实施例中，使用了Thy1肾小球肾炎动物模型。这是系膜增生性肾小球肾炎的动物模型，其特征在于增加的蛋白尿，系膜细胞增生和系膜基质的累积。该模型基于系膜细胞表达Thy1抗原的事实。对路易大鼠(lewisrat)单次i.v.注射单克隆抗-Thy1抗体。这导致快速且可重现的补体介导的肾小球系膜细胞坏死(系膜溶解(mesangiolysis))。到第24小时，蛋白尿明显并持续至少10日。系膜溶解之后为修复期，其中系膜细胞增生并生成过量的系膜基质。这是蛋白尿和系膜细胞增生的可重现模型。

通过注射0.2ml(2.5mg/kg)抗-Thy1抗体ER4，在16只路易大鼠和4只WKY大鼠中诱导Thy1肾小球肾炎。从第0日至第10日，8只路易大鼠接受大鼠IFN-β6×10⁵单位/日i.p.、6日/周。从第0日至第10日，8只路易大鼠仅接受载体(大鼠血清白蛋白-RSA)，i.p.、6日/周。4只WKY大鼠不接受治疗，从第0日至第10日观察疾病的进展。于第6和7和9和10日将大鼠圈养于代谢笼内。在第10日处死大鼠。在处死大鼠前一小时，对其注射BrdU以便评估细胞增生。处死时，将肾，肺，肝和脾在福尔马林中进行固定。将肾在卡诺依氏固定液中固定以进行BrdU染色并快速冷冻。

图6中所示结果显示出在第7日和第10日时，蛋白尿显著减少。然而，在血清肌酐中未显示任何差异，在治疗组中肌酐清除率显示出较低的趋势(图7)。如通过肾小球微血管瘤的存在所评估的那样，在急性肾小球损伤中未出现差异。然而，在用IFN-β治疗的大鼠中，肾小球细胞过多显著减轻(图8)。

实施例4： IFN-β在嘌呤霉素氨基核苷肾病(PAN)动物模型中诱导了蛋白尿的显著降低

在每只200g的4只雄性Wistar大鼠中诱导PAN。两只大鼠经腹膜内(i.p.)在第0日接受20mg嘌呤霉素氨基核苷(PA；)，两只大鼠在第0日经血管内(intra vascularly)(i.v.)注射接受20mg(PA；)。在第3-4和7-8日将大鼠置于代谢笼内。在第8日处死所有大鼠。结果显示在i.p.注射的大鼠中，蛋白尿的平均值在第4日和第8日分别为46(mg/24小时)和287，而在i.v注射的大鼠中，在第4日和第8日所述值分别为122和194。

下面显示了IFN-β在动物模型中的作用。如上述，在大鼠中，PAN减轻。大鼠接受6×10²，6×10³，6×10⁴，6×10⁵单位大鼠IFN-β或仅接受缓冲液。图9中所示结果显示即使是在最低剂量IFN-β时，施用IFN-β在7日和14日显著减少了蛋白尿。

因此，本实施例以及前述实施例的结果显示出IFN-β降低了肾病中的炎症(如蛋白尿和肾小球增生的降低所证明的那样)并减少了炎症细胞，例如，肾小球巨噬细胞和CD8+细胞的减少。因此，IFN-β可用于治疗(例如防止)肾小球肾炎，急性和慢性肾衰竭。

等同物

本领域技术人员应理解，或能够确定利用常规实验，可获得所述本发明的具体实施方案的多种等同物。所述等同物意在包含在权利要求内。

序列表

<110>

<120>使用干扰素-β治疗肾衰竭

<130>BII-001.25

<160>4

<170>PatentIn version 3.0

<210>1

<211>840

<212>DNA

<213>人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(76)..(639)

<400>1

acattctaac tgcaaccttt cgaagccttt gctctggcac aacaggtagt aggcgacact 60

gttcgtgttg tcaac atg acc aac aag tgt ctc ctc caa att gct ctc ctg 111

Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu

1 5 10

ttg tgc ttc tcc act aca gct ctt tcc atg agc tac aac ttg ctt gga 159

Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly

15 20 25

ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag tgt cag aag ctc ctg tgg caa 207

Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln

30 35 40

ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc aag gac agg atg aac ttt gac 255

Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp

45 50 55 60

atc cct gag gag att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gcc 303

Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala

65 70 75

gca ttg acc atc tat gag atg ctc cag aac atc ttt gct att ttc aga 351

Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg

80 85 90

caa gat tca tct agc act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac ctc 399

Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu

95 100 105

ctg gct aat gtc tat cat cag ata aac cat ctg aag aca gtc ctg gaa 447

Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu

110 115 120

gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc agg gga aaa ctc atg agc agt 495

Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser

125 130 135 140

ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gcc 543

Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala

145 150 155

aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc ata gtc aga gtg gaa atc cta 591

Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu

160 165 170

agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt aca ggt tac ctc cga aac tga 639

Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

175 180 185

agatctccta gcctgtgcct ctgggactgg acaattgctt caagcattct tcaaccagca 699

gatgctgttt aagtgactga tggctaatgt actgcatatg aaaggacact agaagatttt 759

gaaattttta ttaaattatg agttattttt atttatttaa attttatttt ggaaaataaa 819

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<210>2

<211>187

<212>PRT

<213>人(homo sapiens)

<400>2

Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser

1 5 10 15

Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg

20 25 30

Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg

35 40 45

Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu

50 55 60

Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile

65 70 75 80

Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser

85 90 95

Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val

100 105 110

Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu

115 120 125

Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys

130 135 140

Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser

145 150 155 160

His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr

165 170 175

Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

180 185

<210>3

<211>501

<212>DNA

<213>人(homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(501)

<400>3

atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48

Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln

1 5 10 15

tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96

Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu

20 25 30

aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag ctg cag 144

Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln

35 40 45

cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gag atg ctc cag 192

Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln

50 55 60

aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat 240

Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn

65 70 75 80

gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aat gtc tat cat cag ata aac 288

Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn

85 90 95

cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 336

His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr

100 105 110

agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384

Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg

115 120 125

att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc 432

Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr

130 135 140

ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt 480

Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu

145 150 155 160

aca ggt tac ctc cga aac tga 501

Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

165

<210>4

<211>166

<212>PRT

<213>人(homo sapiens)

<400>4

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1 5 10 15

Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu

20 25 30

Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln

35 40 45

Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln

50 55 60

Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn

65 70 75 80

Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn

85 90 95

His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr

100 105 110

Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg

115 120 125

Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr

130 135 140

Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu

145 150 155 160

Thr Gly Tyr Leu Arg Asn

165

Claims

1.IFN-β治疗剂在制备用于治疗或预防哺乳动物肾小球肾炎的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述肾小球肾炎选自局灶性肾小球硬化症，塌陷性肾小球病，微小病变病，新月体性肾小球肾炎，肾炎综合征，肾病综合征，原发性肾小球肾炎，继发性肾小球肾炎，增生性肾小球肾炎，膜性肾小球肾炎，膜性增生性肾小球肾炎，免疫复合物性肾小球肾炎，抗肾小球基底膜(抗-GBM)型肾小球肾炎，少-免疫型肾小球肾炎，糖尿病性肾小球病，慢性肾小球肾炎或遗传性肾炎。

3.权利要求1或2的用途，其中所述IFN-β治疗剂包括成熟IFN-β。

4.权利要求1-3任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂缺少第一个甲硫氨酸。

5.权利要求1-4任一项的用途，其中所述IFN-β是人IFN-β。

6.权利要求5的用途，其中所述IFN-β与具有SEQ ID NO：4的全长成熟人IFN-β有至少约95％的同一性。

7.权利要求6的用途，其中所述IFN-β包括SEQ ID NO：4。

8.权利要求1-7任一项的用途，其中所述IFN-β是糖基化的。

9.权利要求1-7任一项的用途，其中所述IFN-β是非糖基化的。

10.权利要求5的用途，其中所述IFN-β是IFN-β-1a。

11.权利要求5的用途，其中所述IFN-β是IFN-β-1b。

12.权利要求1-11任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂包括与免疫球蛋白分子恒定区融合的IFN-β。

13.权利要求12的用途，其中所述免疫球蛋白分子是人免疫球蛋白分子。

14.权利要求13的用途，其中所述免疫球蛋白分子是IgG1的重链。

15.权利要求14的用途，其中所述IFN-β包括SEQ ID NO：14。

16.权利要求1-15任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂包括PEG化的IFN-β。

17.权利要求1-16任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂包括稳定剂。

18.权利要求17的用途，其中所述稳定剂是酸性氨基酸。

19.权利要求18的用途，其中所述稳定剂是精氨酸。

20.权利要求1-19任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂的pH为约4.0-7.2。

21.权利要求1-20任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂经静脉内(i.v.)施用。

22.权利要求1-20任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂经肌肉内(i.m.)施用。

23.权利要求1-20任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂经皮下施用。

24.权利要求1-23任一项的用途，其中所述治疗包括对哺乳动物施以数个剂量的IFN-β治疗剂。

25.权利要求24的用途，其中所述IFN-β治疗剂以约6MIU的剂量每周施用一次。

26.权利要求24的用途，其中所述IFN-β治疗剂以约3MIU的剂量每周施用三次。

27.权利要求1-26任一项的用途，其中所述治疗减轻了哺乳动物中的蛋白尿。

28.权利要求1-27任一项的用途，其中所述治疗减轻了肾小球细胞增生。

29.权利要求1-28任一项的用途，其中所述治疗减轻了肾小球炎症。

30.权利要求1-29任一项的用途，其中所述哺乳动物是人。

31.权利要求30的用途，其中所述哺乳动物是通过至少一个肾小球将患炎症的指征而被认为易患肾小球肾炎的哺乳动物。

32.权利要求1-31任一项的用途，其中所述哺乳动物不带有导致肾小球肾炎的病毒或其中所述的肾小球肾炎不是由病毒导致的。

33.权利要求32的用途，其中所述哺乳动物不带有肝炎病毒或其中所述的肾小球肾炎不是由肝炎病毒导致的。

34.权利要求33的用途，其中所述哺乳动物不带有乙型或丙型肝炎病毒或其中所述的肾小球肾炎不是由乙型或丙型肝炎病毒导致的。

35.权利要求1-34任一项的用途，其中所述哺乳动物不患有终末期肾衰竭或肾细胞癌。

36.IFN-β治疗剂在制备用于治疗或预防哺乳动物慢性肾衰竭的药物中的用途。

37.权利要求36的用途，其中所述IFN-β治疗剂包括成熟IFN-β。

38.权利要求36-37任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂缺少第一个甲硫氨酸。

39.权利要求36-38任一项的用途，其中所述IFN-β是人IFN-β。

40.权利要求39的用途，其中所述IFN-β与具有SEQ ID NO：4的全长成熟人IFN-β有至少约95％的同一性。。

41.权利要求40的用途，其中所述IFN-β包括SEQ ID NO：4。

42.权利要求36-41任一项的用途，其中所述IFN-β是糖基化的。

43.权利要求36-41任一项的用途，其中所述IFN-β是非糖基化的。

44.权利要求39的用途，其中所述IFN-β是IFN-β-1a。

45.权利要求39的用途，其中所述IFN-β是IFN-β-1b。

46.权利要求36-45任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂包括与免疫球蛋白分子恒定区融合的IFN-β。

47.权利要求46的用途，其中所述免疫球蛋白分子是人免疫球蛋白分子。

48.权利要求47的用途，其中所述免疫球蛋白分子是IgG1的重链。

49.权利要求48的用途，其中所述IFN-β包含SEQ ID NO：14。

50.权利要求36-49任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂包括PEG化的IFN-β。

51.权利要求36-50任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂包括稳定剂。

52.权利要求51的用途，其中所述稳定剂是酸性氨基酸。

53.权利要求52的用途，其中所述稳定剂是精氨酸。

54.权利要求36-53任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂的pH为约4.0～7.2。

55.权利要求36-54任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂经静脉内(i.v.)施用。

56.权利要求36-54任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂经肌肉内(i.m.)施用。

57.权利要求36-54任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂经皮下施用。

58.权利要求36-57任一项的用途，其中所述治疗包括对哺乳动物施以数个剂量的IFN-β治疗剂。

59.权利要求58的用途，其中所述IFN-β治疗剂以约6MIU的剂量每周施用一次。

60.权利要求58的用途，其中所述IFN-β治疗剂以约3MIU的剂量每周施用三次。

61.权利要求36-60任一项的用途，其中所述治疗减轻了哺乳动物中的蛋白尿。

62.权利要求36-61任一项的用途，其中所述治疗减轻了肾小球细胞增生。

63.权利要求36-62任一项的用途，其中所述治疗减轻了肾小球炎症。

64.权利要求36-63任一项的用途，其中所述哺乳动物是人。

65.权利要求64的用途，其中所述哺乳动物是通过慢性肾功能不全的指征而被认为易患慢性肾衰竭的哺乳动物。

66.权利要求36-65任一项的用途，其中所述哺乳动物不带有导致慢性肾衰竭的病毒或其中所述的慢性肾衰竭不是由病毒导致的。

67.权利要求66的用途，其中所述哺乳动物不带有肝炎病毒或其中所述的慢性肾衰竭不是由肝炎病毒导致的。

68.权利要求67的用途，其中所述哺乳动物不带有乙型或丙型肝炎病毒或其中所述的慢性肾衰竭不是由乙型或丙型肝炎病毒导致的。

69.权利要求36-68任一项的用途，其中所述哺乳动物不患有终末期肾衰竭或肾细胞癌。

70.治疗哺乳动物的肾小球肾炎的方法，包括鉴定患有肾小球肾炎的哺乳动物，并对该哺乳动物施以治疗有效量的IFN-β治疗剂。

71.权利要求70的方法，其中所述肾小球肾炎选自局灶性肾小球硬化症，塌陷性肾小球病，微小病变病，新月体性肾小球肾炎，肾炎综合征，肾病综合征，原发性肾小球肾炎，继发性肾小球肾炎，增生性肾小球肾炎，膜性肾小球肾炎，膜性增生性肾小球肾炎，免疫复合物性肾小球肾炎，抗肾小球基底膜(抗-GBM)型肾小球肾炎，少-免疫型肾小球肾炎，糖尿病性肾小球病，慢性肾小球肾炎或遗传性肾炎。

72.权利要求70或71的方法，其中所述IFN-β治疗剂包括成熟IFN-β。

73.权利要求70-72任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂缺少第一个甲硫氨酸。

74.权利要求70-73任一项的方法，其中所述IFN-β是人IFN-β。

75.权利要求74的方法，其中所述IFN-β与具有SEQ ID NO：4的全长成熟人IFN-β有至少约95％的同一性。

76.权利要求75的方法，其中所述IFN-β包括SEQ ID NO：4。

77.权利要求70-76任一项的方法，其中所述IFN-β是糖基化的。

78.权利要求70-77任一项的方法，其中所述IFN-β是非糖基化的。

79.权利要求74的方法，其中所述IFN-β是IFN-β-1a。

80.权利要求74的方法，其中所述IFN-β是IFN-β-1b。

81.权利要求70-80任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂包括与免疫球蛋白分子恒定区融合的IFN-β。

82.权利要求81的方法，其中所述免疫球蛋白分子是人免疫球蛋白分子。

83.权利要求82的方法，其中所述免疫球蛋白分子是IgG1的重链。

84.权利要求83的方法，其中所述IFN-β包括SEQ ID NO：14。

85.权利要求70-84任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂包括PEG化的IFN-β。

86.权利要求70-85任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂包括稳定剂。

87.权利要求86的方法，其中所述稳定剂是酸性氨基酸。

88.权利要求87的方法，其中所述稳定剂是精氨酸。

89.权利要求70-88任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂的pH为约4.0～7.2。

90.权利要求70-89任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂经静脉内(i.v.)施用。

91.权利要求70-89任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂经肌肉内(i.m.)施用。

92.权利要求70-89任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂经皮下施用。

93.权利要求70-92任一项的方法，其中所述治疗包括对哺乳动物施以数个剂量的IFN-β治疗剂。

94.权利要求93的方法，其中所述IFN-β治疗剂以约6MIU的剂量每周施用一次。

95.权利要求93的方法，其中所述IFN-β治疗剂以约3MIU的剂量每周施用三次。

96.权利要求70-95任一项的方法，其中所述治疗减轻了哺乳动物中的蛋白尿。

97.权利要求70-96任一项的方法，其中所述治疗减轻了肾小球细胞增生。

98.权利要求70-97任一项的方法，其中所述治疗减轻了肾小球炎症。

99.权利要求70-98任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。

100.权利要求99的方法，其中所述哺乳动物是通过存在选自下组的病症而被鉴定为患有肾小球肾炎的哺乳动物：至少一个肾小球的炎症；肾小球肥大；肾小管肥大；肾小球硬化；或肾小管间质硬化。

101.权利要求70-100任一项的方法，其中所述哺乳动物不带有导致肾小球肾炎的病毒或其中所述的肾小球肾炎不是由病毒导致的。

102.权利要求101的方法，其中所述哺乳动物不带有肝炎病毒或其中所述的肾小球肾炎不是由肝炎病毒导致的。

103.权利要求102的方法，其中所述哺乳动物不带有乙型或丙型肝炎病毒或其中所述的肾小球肾炎不是由乙型或丙型肝炎病毒导致的。

104.权利要求70-103任一项的方法，其中所述哺乳动物不患有终末期肾衰竭或肾细胞癌。

105.治疗哺乳动物的慢性肾衰竭的方法，包括鉴定患有慢性肾衰竭的哺乳动物，并对该哺乳动物施以治疗有效量的IFN-β治疗剂。

106.权利要求105的方法，其中所述IFN-β治疗剂包括成熟IFN-β。

107.权利要求105-106任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂缺少第一个甲硫氨酸。

108.权利要求105-107任一项的方法，其中所述IFN-β是人IFN-β。

109.权利要求108的方法，其中所述IFN-β与具有SEQ ID NO：4的全长成熟人IFN-β有至少约95％的同一性。

110.权利要求109的方法，其中所述IFN-β包括SEQ ID NO：4。

111.权利要求105-110任一项的方法，其中所述IFN-β是糖基化的。

112.权利要求105-110任一项的方法，其中所述IFN-β是非糖基化的。

113.权利要求108的方法，其中所述IFN-β是IFN-β-1a。

114.权利要求108的方法，其中所述IFN-β是IFN-β-1b。

115.权利要求105-114任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂包括与免疫球蛋白分子恒定区融合的IFN-β。

116.权利要求115的方法，其中所述免疫球蛋白分子是人免疫球蛋白分子。

117.权利要求116的方法，其中所述免疫球蛋白分子是IgG1的重链。

118.权利要求117的方法，其中所述IFN-β包括SEQ ID NO：14。

119.权利要求105-118任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂包括PEG化的IFN-β。

120.权利要求105-119任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂包括稳定剂。

121.权利要求120的方法，其中所述稳定剂是酸性氨基酸。

122.权利要求121的方法，其中所述稳定剂是精氨酸。

123.权利要求105-122任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂的pH为约4.0～7.2。。

124.权利要求105-123任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂经静脉内(i.v.)施用。

125.权利要求105-123任一项的用途，其中所述IFN-β治疗剂经肌肉内(i.m.)施用。

126.权利要求105-123任一项的方法，其中所述IFN-β治疗剂经皮下施用。

127.权利要求105-126任一项的用途，包括对哺乳动物施以数个剂量的IFN-β治疗剂。

128.权利要求127的方法，其中所述IFN-β治疗剂以约6MIU的剂量每周施用一次。

129.权利要求127的方法，其中所述IFN-β治疗剂以约3MIU的剂量每周施用三次。

130.权利要求105-129任一项的方法，其中所述治疗减轻了哺乳动物中的蛋白尿。

131.权利要求105-130任一项的方法，其中所述治疗减轻了肾小球细胞增生。

132.权利要求任一项105-131的方法，其中所述治疗减轻了肾小球炎症。

133.权利要求105-132任一项的方法，其中所述哺乳动物是人。

134.权利要求133的方法，其中所述哺乳动物通过慢性肾功能不全的存在而被鉴定为患有慢性肾衰竭。

135.权利要求105-134任一项的方法，其中所述哺乳动物是不含有导致慢性肾衰竭的病毒或其中所述的慢性肾衰竭不是由病毒导致的哺乳动物。

136.权利要求135的方法，其中所述哺乳动物不带有肝炎病毒或其中所述的慢性肾衰竭不是由肝炎病毒导致的。

137.权利要求136的方法，其中所述哺乳动物不带有乙型或丙型肝炎病毒或其中所述的慢性肾衰竭不是由乙型或丙型肝炎病毒导致的。

138.权利要求105-137任一项的方法，其中所述哺乳动物不患有终末期肾衰竭或肾细胞癌。