KR20050021502A - 인터페론-β를 이용한 신부전증의 치료법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사구체신염 또는 만성 신부전증에 걸리거나 발병할 위험성이 있는 포유류 대상의 치료 방법 및 상기 포유류의 치료에 사용하기 위한 약제를 제공한다. 본 방법은 IFN-β 치료제의 투여를 포함한다.

Description

인터페론-β를 이용한 신부전증의 치료법{THERAPIES FOR RENAL FAILURE USING INTERFERON-β}

만성 신부전증 (chronic renal failure, CRF)은 네프론의 현저한 계속적인 손실로 인한 사구체 여과율(glomerular filtration rate, GFR)의 점진적이며 영구적인 현저한 감소로 정의될 수 있다. 만성 신부전증은 일반적으로 만성 신부전 (즉, 적어도 50-60%의 신장 기능의 영구적인 감소)이 네프론 단위의 현저한 손실이 야기된 신장 조직에 대한 약간의 상해에 의해 생기는 시점에서 시작된다. 초기 상해는 급성 신부전증의 에피소드와 결부될 수 있거나 결부될 수 없거나, 말기 신장 질환, 만성 당뇨병성 신장병증, 당뇨병성 사구체병증, 당뇨병성 신장 비대, 고혈압성 신장 경화증, 고혈압성 사구체 경화증, 만성 사구체신염, 유전성 신장염, 신장 형성 장애 및 신장 동종 이식체 이식에 이은 만성 거부를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 수의 신장 장애와 결부될 수 있다. 초기 상해의 성질과는 상관 없이, 만성 신부전증은 네프론이 점진적으로 손실되며 GFR이 점진적으로 저하되는 징후 및 증상의 "최종 공통 경로"를 나타낸다. 이러한 신장 기능의 점진적인 악화는 느려서 일반적으로 인간 환자에 있어서는 다년간 또는 수십년에 미치지만, 피할 수 없는 것으로 보인다.

인간에 있어서는, 만성 신부전증이 진행되고 GFR이 정상의 10% 미만까지 (예를 들어 5-10 ml/분) 계속하여 감소됨에 따라, 대상은 말기 신장 질환 (end-stage renal disease, ESRD)으로 들어가게 된다. 상기의 기 동안, 나머지 네프론이 유용한 생성물은 보유하고 유체 및 전해질 균형은 유지하면서 혈액으로부터의 노폐물은 적당하게 제거하는 능력이 없는 것에 의해 다수의 기관계, 특히 심혈관계가 급속하게 그 기능이 상실되기 시작할 수 있는 소모성 질환 (decline)이 생긴다. 이 시점에서, 신부전증은 대상이 신장 대체 요법 (즉, 장기간의 혈액 투석, 계속적인 복막 투석, 또는 신장 이식)을 받지 않는 한 급속하게 사망으로 진행된다.

CRF로 이어질 수 있는 하나의 신장 질환은 사구체신염이다. 사구체신염은 일반적으로 면역 복합체 형성으로 인한 것인 사구체의 염증 및 그로 인한 확장을 그 특징으로 한다. 사구체에서의 면역 복합체의 축적에 의해 그 중에서도 과다 세포성 (hypercellularity)를 포함하는, 다른 인자 중에서 모세 혈관 내강의 협착을 통하여 사구체의 완전하거나 부분적인 차단을 야기할 수 있는 염증 반응이 생긴다. 이러한 과정의 하나의 결과는 사구체의 정상적인 여과 기능의 억제이다. 차단은 사구체의 정상적인 여과 기능의 억제이다. 차단은 다수의 사구체에서 발생하여 신장 기능을 직접적으로 위태롭게 하며 종종 사구체를 형성하는 모세 혈관의 벽에서의 단백질의 비정상적인 침착을 야기할 수 있다. 이러한 침착은 다시 사구체 기저막에 손상을 야기할 수 있다. 차단되지 않은 사구체는 투과성이 증가되어 다량의 단백질이 소변 내로 통과되게 하는데 이 상태를 단백뇨라고 한다.

중증 사구체신염의 다수의 경우에 있어서, 반월 (crescent)로 불리우는 병리학적 구조가 보우만 주머니 (Bowman's space) 내에서 형성되어 사구체 여과를 더 방해한다. 이러한 구조는 생검체 또는 부검체에 의해 수득되는 조직 샘플의 현미경 검사에 의해서만 볼 수 있으며, 따라서 이들이 나타나는 환자에서 항상 관찰되는 것은 아니다. 반월은 과다 세포성을 나타내는 것이며 바우만 캡슐의 내부 라이닝 (lining)을 형성하는 체벽 (parietal) 상피 세포의 광범위한 비정상적인 증식으로부터 생기는 것으로 생각된다. 임상 연구에 의하면 반월을 포함하는 사구체의 퍼센트와 이 질환의 임상적 중증도, 따라서 환자의 예후 사이에는 대략적인 상관 관계가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 다수로 존재시 반월은 나쁜 예후이다.

미국에서는 환자 당 연간 $60,000-$80,000에 달하는 평균 비용으로 백만명 중 대략 600명의 환자가 매해 장기 투석을 받는다. 매해 말기 신장 질환의 새로운 사례 중 28-33%에 달하는 사례는 당뇨성 신장병증 (또는 당뇨성 사구체병증 또는 당뇨성 신장 비대)으로 인한 것이며, 24-29%는 고혈압성 신장 경화증 (또는 고혈압성 사구체 경화증)으로 인한 것이며, 15-22%는 사구체신염으로 인한 것이다. 모든 장기 투석 환자의 경우 5년 생존률은 대략 40%이지만, 65세보다 많은 연령의 환자의 경우에는 상기 생존률이 대략 20%로 감소된다. 따라서 미국에서만 거의 20만명의 환자가 생기게 하여 장기적인 투석에 의존적이 되도록 하며, 매해 수만명이 조기 사망하게 하는 신장 기능의 점진적인 손실을 방지하는 치료법에 대한 필요성이 존재한다.

발명의 개요

본 발명은 하나의 실시 형태에 있어서 사구체신염에 걸렸거나 사구체신염이 발병할 가능성이 있는 포유류에 있어서 사구체신염 또는 만성 신부전증을 치료하는 방법으로서 상기 포유류에게 치료적 유효량의 IFN-β 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 사구체신염의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 IFN-β 치료제의 용도를 제공한다. 사구체신염은 국소 사구체 경화증, 쇠약성 (collapsing) 사구체병증, 미세 변화 질환, 반월상 사구체신염, 신염 증후군, 신장병 증후군, 일차성 사구체신염, 이차성 사구체신염, 증식성 사구체신염, 막성 사구체신염, 막 증식성 사구체신염, 면역 복합체성 사구체신염, 항-사구체 기저막성 (항-GBM) 사구체신염, 면역 복합체가 거의 없는 (pauci-immune) 사구체신염, 당뇨성 사구체병증, 만성 사구체신염, 및 유전성 신장염으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. IFN-β는 성숙 또는 미성숙형일 수 있으며 개시자인 메티오닌이 결여될 수 있다. IFN-β는 인간 IFN-β, 예를 들어 IFN-β-1a 및 IFN-β-1b일 수 있다. IFN-β는 서열 번호 4를 가지는 전장의 성숙형 인간 IFN-β와 약 95% 이상 동일한 단백질일 수 있다. IFN-β는 서열 번호 4의 서열을 포함하거나 서열 번호 4의 서열로 구성된 전장의 성숙형 인간 IFN-β일 수 있다. IFN-β는 글리코실화되거나 비-글리코실화될 수 있다. IFN-β 치료제는 또한 인간 면역글로불린 분자의 불변 도메인, 예를 들어 IgG1의 중쇄에 융합된 서열 번호 4의 서열을 포함하는 전장의 성숙형 인간 IFN-β일 수 있다. 예를 들어 IFN-β 치료제는 서열 번호 14의 서열을 포함할 수 있다. IFN-β 치료제는 페길화 IFN-β를 또한 포함할 수 있다.

IFN-β 치료제는 산성 아미노산일 수 있는 안정화제를 포함할 수 있다. 이는 또한 아르기닌일 수 있다. IFN-β 치료제의 pH는 4.0 내지 7.2 사이일 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, IFN-β 치료제는 AVONEX?이다.

IFN-β 치료제는 비경구적으로 투여될 수 있는데, 예를 들어 정맥내 (i.v.), 피하 및 근육내 (i.m.) 투여될 수 있다. 본 방법은 여러 용량의 IFN-β 치료제를 포유류에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. IFN-β 치료제는 수일에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어 IFN-β 치료제는 6 MIU의 용량으로 주 1회 투여될 수 있다. 이는 또한 3,6 또는 12 MIU의 용량으로 1주일에 3회 투여될 수 있다. IFN-β 치료제의 투여에 의해 예를 들어 포유류에서 단백뇨, 사구체 세포 증식 또는 사구체 염증을 감소시킬 수 있다.

바람직한 실시 형태에 있어서, 포유류는 인간이다. 인간은 환자일 수 있다. 포유류는 예를 들어 하나 이상의 사구체의 앞으로 나타날 염증의 징후에 의해 나타내어지는 바와 같이 사구체신염이 발병할 가능성이 있는 포유류일 수 있다. 포유류는 만성 신부전증을 발병할 가능성이 있거나 예를 들어 만성 신부전의 존재에 의해 나타내어지는 바와 같이 만성 신부전증에 걸린 포유류일 수 있다. 포유류는 하나 이상의 사구체의 염증; 사구체 비대; 세뇨관 비대; 사구체 경화증; 또는 세뇨관간질성 경화증의 존재에 의해 사구체신염을 앓고 있는 것으로 확인된다. 특정 실시 형태에 있어서, 포유류는 바이러스, 예를 들어 사구체신염을 야기하는 간염 바이러스, 예를 들어 B형 또는 C형 간염 바이러스를 보유하거나 사구체신염이 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌포유류가 아니다. 다른 실시 형태에 있어서, 포유류는 말기 신부전증 또는 신장 세포 암종에 걸리지 않았다.

도 1은 인간 IgG1Fc (ZL5107)의 경첩 (hinge), CH2 및 CH3 도메인에 융합된 전장의 성숙형 인간 IFN-β (서열 번호 3 및 4)에 융합된 VCAM 신호 서열로 구성된 융합 단백질의 뉴클레오티드 (서열 번호 11) 및 아미노산 (서열 번호 12) 서열을 도시하는데, 여기서, 서열 번호 4의 아미노산 162의 글리신은 시스테인으로 대체된다.

도 2는 인간 IgG1Fc (ZL6206)의 경첩, CH2 및 CH3 도메인에 융합된 G4S 링커에 융합된 전장의 성숙형 인간 IFN-β (서열 번호 3 및 4)에 융합된 VCAM 신호 서열로 구성된 융합 단백질의 뉴클레오티드 (서열 번호 13) 및 아미노산 (서열 번호 14) 서열을 도시하는데, 여기서, 서열 번호 4의 아미노산 162의 글리신은 시스테인으로 대체된다.

도 3은 0일에서 시작하여 주당 6일 동안 일일 3 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β, 일일 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β 또는 벡터 단독 ("대조")으로 처리한 신독성 신장염 (NTN)에 걸린 쥐에서의 7일, 14일, 21일 및 28일에서의 단백뇨의 수준을 도시한다.

도 4는 0일에서 시작하여 주당 6일 동안 일일 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β 또는 벡터 단독 ("대조")으로 처리한 신독성 신장염 (NTN)에 걸린 쥐에서의 7일, 14일, 21일 및 28일에서의 단백뇨의 수준을 도시한다.

도 5는 0일에서 7일까지 주당 6일 동안 일일 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β 또는 벡터 단독 ("RSA")으로 처리한 신독성 신장염 (NTN)에 걸린 쥐에서의 사구체로부터 유래한 증식 세포의 갯수를 도시한다.

도 6은 0일에서 시작하여 10일까지 주당 6일 동안 일일 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β 또는 벡터 단독 ("RSA")으로 처리한 Thy 1 사구체신염에 걸린 쥐에서의 7일 및 10일에서의 단백뇨의 수준을 도시한다.

도 7은 0일에서 시작하여 10일까지 주당 6일 동안 일일 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β 또는 벡터 단독 ("RSA")으로 처리한 Thy 1 사구체신염에 걸린 쥐에서의 7일 또는 10일에서의 크레아틴의 제거율 수준을 도시한다.

도 8은 0일에서 시작하여 10일까지 주당 6일 동안 일일 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β 또는 벡터 단독 ("RSA")으로 처리한 Thy 1 사구체신염에 걸린 쥐에서의 10일에서의 사구체 증식 점수를 도시한다.

도 9는 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드 신장병증 (PAN)에 걸린 쥐를 일일 6 x 10² 단위, 6 x 10³ 단위, 6 x 10⁴ 단위 또는 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β 또는 벡터 단독 ("대조")으로 처리한 쥐에서의 7일 및 14일에서의 단백뇨의 수준을 도시한다.

본 발명은 적어도 부분적으로는 포유류에서의 사구체신염의 적어도 약간의 증상이 INF-β를 포유류에게 투여함으로써 개선될 수 있다는 발견에 기초한다. 특히, 단백뇨, 사구체 세포 증식 및 염증은 IFN-β의 투여에 의해 유의하게 감소된다는 것이 관찰되었다. 따라서 본 발명은 포유류에 있어서 사구체신염을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.

1. 정의:

청구되는 발명의 주제를 더욱 명료하고 간결하게 나타내기 위하여 기술한 상세한 설명 및 첨부된 청구의 범위에 사용되는 특정 용어에 대하여 하기의 정의를 제공한다.

본 명세서 및 첨부된 청구의 범위에서 사용되는 바와 같이, 단수형 "한 (a)", "하나 (an)" 및 "그 (the)"는 문맥이 달리 명료하게 지시하지 않는 한 복수개의 지시 대상을 포함한다.

"사구체 여과율" 또는 "GFR"은 혈청 단백질에 의해 결합되어 있지 않으며 사구체를 가로질러 자유롭게 여과되며 신장 세뇨관에 의해 분비되지도 않고 재흡수되지도 않는 혈장에서 생성된 (plasma-borne) 물질의 소변 내로의 제거율에 비례한다. 이와 같이, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 GFR은 바람직하게는 하기 방정식에 의해 정의된다:

여기서, U_conc는 마커의 소변 중 농도이며, P_conc는 마커의 혈중 농도이며 V는 ml/분 단위의 소변 유속이다. 선택적으로는 GFR은 체표면적에 대하여 보정된다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 GFR 값은 ml/분/1.73 m²의 단위로 간주될 수 있다. 바람직한 GFR의 측정치는 인슐린의 제거율이지만, 상기 물질의 농도의 측정의 어려움 때문에 임상 세팅에서는 크레아티닌의 제거율이 일반적으로 사용된다. 예를 들어, 평균 사이즈의 건강한 인간 남성 (70 kg, 20-40세)의 경우, 크레아티닌 제거율로 측정되는 전형적인 GFR은 대략 125 ml/분이며 크레아티닌의 혈중 농도는 0.7-1.5 mg/dL일 것으로 기대된다. 필적하는 평균 사이즈의 여성의 경우, 크레아티닌 제거율로 측정되는 전형적인 GFR은 대략 115 ml/분이며 크레아티닌의 수준은 0.5-1.3 mg/dL일 것으로 기대된다. 건강이 양호한 시기 동안 인간의 GFR 값은 GFR이 나이가 듦에 따라 일반적으로 감소되기 시작하는 약 40세까지는 비교적 안정하다. 85세 또는 90세까지 생존하는 대상에 있어서는 GFR이 40세에 필적하는 값의 50%까지 감소될 수 있다. "기대되는 GFR" 또는 "GFR_exp"의 개산치가 대상의 연령, 체중, 성별, 체표면적 및 근육 조직량의 정도와, 혈액 시험으로 측정되는 일부 마커 화합물 (예를 들어 크레아티닌)의 혈중 농도 상의 고려 사항에 기초하여 제공될 수 있다. 이와 같이, 예로서, 기대되는 GFR 또는 GFR_exp는 하기와 같이 개산될 수 있다:

이러한 개산치는 표면적, 근육 조직량의 정도, 또는 체지방 퍼센트와 같은 인자와 같은 고려 사항을 고려하지 않는다. 그럼에도 불구하고 혈중 크레아티닌의 수준을 마커로 사용하여 상기 식을 GFR의 개산의 값싼 수단으로 인간 남성에 대하여 이용하였다. 크레아티닌은 횡문근에 의해 생성되기 때문에 인간 여성 대상의 기대되는 GFR 또는 GFR_exp는 근육량에서의 기대되는 차이를 설명하기 위하여 동일한 방정식에 0.85를 곱하여 개산한다 (문헌[Lemann, et al. (1990) Am. J. Kidney Dis. 16 (3): 236-243] 참조).

"사구체신염", "신장염", "급성 신장염" 및 "사구체 신장염"은 본 명세서에서 서로 바꾸어서 사용될 수 있다.

"IFN-β-1a"는 야생형 인간 IFN-β의 아미노산 서열을 가지는 IFN-β를 나타내며 글리코실화되어 있다.

"IFN-β-1b"는 야생형 IFN-β의 아미노산 서열을 가지는 IFN-β 분자를 나타내는데, 여기서 17 위치의 시스테인은 세린으로 대체되며; 1 위치의 메티오닌 ("개시자 메티오닌")은 결여되어 있고, 이 분자는 글리코실화되어 있지 않다.

"IFN-β 변이체"는 하나 이상의 변경, 예를 들어 아미노산 결실, 부가, 치환, 번역후 변경을 가지거나 이들 사이에 하나 이상의 비천연 아미노산 잔기 또는 결합부를 포함하는 야생형 IFN-β 단백질을 나타낸다. IFN-β의 일부는 "IFN-β 변이체"라는 용어에 포함된다. "생물학적으로 활성인 IFN-β 변이체"는 신장 장애, 예를 들어 사구체신염의 치료에 있어서 적어도 약간의 활성을 가지는 IFN-β 변이체이다. IFN-β 변이체는 예를 들어 야생형 IFN-β와 관련하여 하나 이상의 아미노산이 삽입, 결실 또는 치환된 천연 IFN-β, 즉, 천연 돌연변이체 또는 다형성 변이체일 수 있거나 비천연 IFN-β일 수 있다.

"단리된" ("실질적으로 순수한"과 서로 바꾸어서 사용됨)이라는 것은 폴리펩티드에 적용시 원천 또는 조작에 의해서 (i) 발현 벡터의 일부의 발현 생성물로서 숙주 세포에 존재하거나; (ii) 자연에서 결합되어 있는 것 이외의 단백질 또는 다른 화학 물질 부분에 결합되거나; (iii) 자연에서는 나타나지 않는 폴리펩티드, 예를 들어 단백질이 자연에서 발견되지 않는 형태로 존재하도록 하나 이상의 소수성 부분을 단백질에 첨부 또는 부가함으로써 화학적으로 조작된 단백질을 의미한다. "단리된"이라는 것은 또한 (i) 화학적으로 합성되거나; (ii) 숙주 세포에서 발현되어 결부된 오염 단백질로부터 정제되어지는 단백질을 의미한다. 이 용어는 일반적으로 자연적으로 나타나는 다른 단백질 및 핵산으로부터 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 바람직하게는 폴리펩티드는 폴리펩티드의 정제를 위하여 사용되는 항체 또는 겔 매트릭스 (폴리아크릴아미드)와 같은 물질로부터도 분리된다. "단리된" (실질적으로 순수한"과 서로 바꾸어서 사용됨)이라는 것은 핵산에 적용시 원천 또는 조작에 의해서 (i) 자연에서 결부되는 폴리뉴클레오티드 모두와 결부되지 않거나 (예를 들어 발현 벡터 또는 그의 일부로 숙주 세포에 존재함); (ii) 자연에서 결합되는 것 이외의 핵산 또는 다른 화학 물질 부분에 결합되거나; (iii) 자연에서 나타나지 않는 RNA 또는 DNA 폴리뉴클레오티드, 게놈 폴리뉴클레오티드의 일부, cDNA 또는 합성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. "단리된"이라는 것은 또한 (i) 예를 들어 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 시험관 내에서 증폭되거나; (ii) 화학적으로 합성되거나; (iii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생성되거나; (iv) 절단 및 겔 분리에 의해 정제되는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계 내로 두어질 경우 다른 핵산에 "작동가능하게 결합"된다. 예를 들어 전서열 (presequence) 또는 분비 리더 (예를 들어 신호 서열 또는 신호 펩티드)에 있어서의 DNA는 DNA가 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질 (preprotein)로 발현될 경우 폴리펩티드를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 결합되며; 프로모터 또는 인핸서는 그가 서열의 전사에 영향을 줄 경우 코딩 서열에 작동가능하게 결합되며; 리보좀 결합 부위는 그가 번역을 돕도록 위치화된다면 코딩 서열에 작동가능하게 결합된다. 일반적으로 "작동가능하게 결합된"이라는 것은 결합되는 DNA 서열이 접해 있으며, 예를 들어 분비 리더의 경우, 접해 있으며 판독 상으로 존재한다는 것을 의미한다. 결합은 편리한 제한 효소 부위에서의 라이게이션에 의해 성취된다. 이러한 부위가 존재하지 않을 경우 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커가 통상적인 실행에 따라 사용될 수 있다.

"동일성 퍼센트" 또는 "유사성 퍼센트"는 2개의 폴리펩티드, 분자 사이, 또는 2개의 핵산 사이의 서열 유사성을 나타낸다. 비교되는 2개의 서열 모두에서의 위치를 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛이 점유한다면, 각각의 분자는 그 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 2개의 서열에 의해 공유되는 매칭 또는 동일 위치의 갯수 나누기 비교되는 위치의 갯수 x 100의 함수이다. 예를 들어 2개의 서열에 있어서 10개의 위치 중 6개가 매치되거나 동일하다면, 2개의 서열은 60% 상동성이다. 예로, DNA 서열 CTGACT 및 CAGGTT는 50% 상동성을 공유한다 (총 6개의 위치 중 3개가 매치됨). 일반적으로 비교는 2개의 서열이 최대로 동일해지도록 정렬되면 행한다. 이러한 정렬은 예를 들어 이하에 더욱 상세하게 기술되는 Karlin 및 Altschul의 방법을 사용하여 제공될 수 있다. 핵산을 언급하자면, "상동성 퍼센트" 및 "동일성 퍼센트"는 서로 바꾸어서 사용되며, 반면 폴리펩티드를 언급하자면, "상동성 퍼센트"는 유사성 정도를 나타내는데, 다른 아미노산의 보존된 치환을 나타내는 아미노산은 상기 다른 아미노산과 동일하다고 생각된다. 참조 서열에 있어서 잔기의 "보존성 치환"은 상응하는 참조 잔기와 물리적으로 또는 기능적으로 유사한, 예를 들어 공유 결합 또는 수소 결합을 형성하는 능력을 비롯하여 유사한 크기, 형상, 전하, 화학적 특성 등을 가지는 아미노산으로 대체하는 것이다. 특히 바람직한 보존성 치환체는 문헌[Dayhoff et al., 5 : Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, chapter 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C.(1978)]에서 "허용되는 점 돌연변이"에 대하여 정의된 기준을 충족시키는 것이다. 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 상동성 또는 동일성 퍼센트는 문헌[Karlin and Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci. , USA 90: 5873 (1993)]에서 수정된 바와 같이 문헌[Karlin and Altschul, Proc. Nat. Acad. Sci., USA 87: 2264 (1990)]의 정렬 알고리즘을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990)]의 NBLAST 또는 XBLAST 프로그램 내로 포함된다. BLAST 탐색 (search)은 NBLAST 프로그램, 스코어 = 100, 단어 길이 = 12로 수행하여 본 발명의 핵산에 상동성인 뉴클레오티드 서열을 얻는다. BLAST 단백질 탐색은 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행하여 참조 폴리펩티드에 상동성인 아미노산 서열을 얻는다. 비교를 위한 갭화 정렬을 얻기 위하여, 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389 (1997)]에 기술된 바와 같이 갭화 BLAST를 이용한다. BLAST 및 갭화 BLAST의 이용시, 각각의 프로그램 (XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용된다. http://www/ncbi.nlm.nih. gov. 참조.

IFN-β 치료제는 "치료 효능"을 가진다고 하며, IFN-β 치료제의 양은 IFN-β 치료제의 상기 양의 투여가 사구체신염 또는 만성 신부전증에 걸렸거나 발병할 위험이 있는 대상 (예를 들어 동물 모델 또는 인간 환자)에게 투여시 신장 기능의 표준 마커에서 임상적으로 유의한 개선을 야기하기에 충분하다면 "치료적으로 유효"하다고 한다. 신장 기능의 이러한 마커는 의학 문헌에 잘 알려져 있으며, BUN 수준의 증가율, 혈중 크레아티닌의 증가율, BUN의 정적 측정치, 혈중 크레아티닌의 정적 측정치, 사구체 여과율 (GFR), BUN/크레아티닌의 비, 나트륨 (Na+)의 혈중 농도, 크레아티닌에 있어서의 소변/혈중 비, 우레아에 있어서의 소변/혈중 비, 요 삼투압 농도, 일일 소변 배설량 등을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다 (예를 들어 문헌[Brenner and Lazarus (1994), in Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th edition, Isselbacher et al., eds., McGraw Hill Text, New York]; 문헌[Luke and Strom (1994), in Internal Medicine, 4th Edition, J.H. Stein, ed., Mosby-Year Book, Inc. St. Louis.] 참조). 바람직한 실시 형태에 있어서, 치료적 유효량의 IFN-β 치료제의 투여에 의해 단백뇨가 감소되거나, 사구체 세포가 증식되거나 염증성 세포, 예를 들어 CD8⁺ T 세포 및 마크로파지의 사구체에서의 존재가 감소된다.

2. IFN-β 치료제

본 발명에 따라 사용될 수 있는 IFN-β 치료제는 야생형 IFN-β 및 생물학적으로 활성인 그의 변이체, 예를 들어 천연 및 비천연 변이체를 포함한다. 야생형 인간 IFN-β의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열이 서열 번호 1 및 2에 각각 나타내어져 있는데 이들은 각각 젠뱅크 (GenBank) 등록 번호 M28622 및 AAA36040와 동일하다. 이러한 IFN은 예를 들어 문헌[Seghal (1985) J. Interferon Res. 5: 521]에도 기술되어 있다. 전장 인간 IFN-β 단백질은 길이가 187개의 아미노산이며, 서열 번호 1의 코딩 서열은 뉴클레오티드 76-639에 상응한다. 신호 서열은 아미노산 1 내지 21에 상응한다. 이러한 IFN-β의 성숙형의 아미노산 서열은 아미노산 서열 22-187 (서열 번호 1의 뉴클레오티드 139-639)에 상응한다. 성숙형 인간 IFN-β 단백질 및 그를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 4 및 3에 각각 나타낸다.

포유류 세포에서 생성되는 IFN-β는 글리코실화된다. 천연 야생형 IFN-β는 서열 번호 4의 성숙형 폴리펩티드의 잔기 80 (Asn 80) 또는 서열 번호 2의 미성숙형 폴리펩티드의 잔기 101 (Asn 101)에서 글리코실화된다.

IFN-β 치료제는 예를 들어 척추 동물, 예를 들어 포유류, 예를 들어 비인간 영장류, 소, 양, 돼지, 말, 고양이, 개, 쥐 및 생쥐; 또는 조류 또는 양서류 유래의 비인간 IFN-β도 포함한다. 상기 종 유래의 IFN-β 서열은 젠뱅크 및/또는 간행물로부터 얻을 수 있거나 다른 종 유래의 IFN-β를 이용한 낮은 엄격도의 혼성화에 의해 단리되는 핵산으로부터 결정될 수 있다.

야생형 IFN-β 단백질의 변이체는 야생형 IFN-β, 예를 들어 서열 번호 2 또는 4의 서열을 가지는 인간 IFN-β와 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하거나 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지는 단백질을 포함한다. 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 가질 수 있다. 예를 들어 야생형 IFN-β 단백질의 생물학적으로 활성인 단편이 사용될 수 있다. 이러한 단편에서는 단백질의 C- 또는 N-말단에서 1, 2, 3, 5, 10개 또는 20개까지의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환될 수 있다. 변이체는 또한 1, 2, 3, 5, 10개 또는 20개까지의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있을 수 있다. 일부 변이체는 약 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7 또는 5개 미만의 아미노산 치환, 결실 또는 부가가 있을 수 있다. 천연 아미노산 또는 그의 유사체, 예를 들어 D-입체 이성질체 아미노산에서 치환이 일어날 수 있다.

또한 본 발명의 범주 이내인 것은 천연 IFN-β를 코딩하며, 엄격한 조건 하에서 예를 들어 서열 번호 1 또는 3으로 나타내어지는 핵산, 또는 그의 상보체에 혼성화되는 핵산에 의해 코딩되는 IFN-β 변이체이다. DNA 혼성화를 촉진하는 적당한 엄격도 조건, 예를 들어 약 45℃에서의 6.0 x 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC), 이어서 50℃에서의 2.0 x SSC의 세척이 당 업계의 숙련자에게 공지되어 있거나 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]에서 찾을 수 있다. 예를 들어 세척 단계에서의 염 농도는 50℃에서의 약 2.0 x SSC의 낮은 엄격도 내지 50℃에서의 약 0.2 x SSC의 높은 엄격도를 선택할 수 있다. 또한, 세척 단계에서의 온도는 실온, 약 22℃에서의 낮은 엄격도 조건에서 약 65℃에서의 높은 엄격도 조건까지 증가시킬 수 있다. 온도 및 염 둘 모두는 변화될 수 있거나, 온도 또는 염 농도는 다른 변수는 변화시키면서 일정하게 유지할 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, IFN-β 변이체를 코딩하는 핵산은 예를 들어 약 2.0 x SSC 및 약 40℃에서의, 또는 약 2.0 x SSC 및 약 40℃에서의 세척을 비롯한 중간 정도의 엄격한 조건 하에서 서열 번호 1 또는 3의 서열 중 하나 또는 그의 상보체에 혼성화된다. 특히 바람직한 실시 형태에 있어서, IFN-β 변이체를 코딩하는 핵산은 예를 들어 0.2 SSC 및 약 65℃에서의, 또는 0.2 SSC 및 약 65℃에서의 세척을 비롯한 높은 엄격도 조건 하에서 서열 번호 1 또는 3의 서열 중 하나 또는 그의 상보체에 결합된다.

예시적인 변경은 보존성 변경인데, 이는 단백질의 2차 및 3차 구조에 최소한의 영향을 미친다. 예시적인 보존성 치환은 문헌[Dayhoff in the Atlas of Protein Sequence and Structure 5 (1978)] 및 문헌[Argos in EMBO J., 8, 779-785 (1989)]에 기술된 것을 포함한다. 예를 들어 하기 군 중 하나에 속하는 아미노산은 보존성 변화를 대표한다: ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr; cys, ser, tyr, thr; val, ile, leu, met, ala, phe; lys, arg, his; 및 phe, tyr, trp, his.

다른 변경은 하나의 아미노산을 보존성 치환을 반드시 나타낼 필요는 없을 수 있는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 포함한다. 예를 들어 IFN-β의 3차원 구조에 본질적으로 영향을 주지 않는 치환이 행해질 수 있다. 비-글리코실화 인간 IFN-β의 3차원 구조가 예를 들어 문헌[Radhakrishnan et al. (1996) Structure 4: 1453]에 기술되어 있으며 글리코실화 IFN-β의 3차원 구조가 예를 들어 문헌[Karpusas et al. (1997) PNAS 94: 11813]에 기술되어 있다. 본질적으로는 IFN-β는 5개의 하기 나선: 대략 서열 번호 4의 아미노산 2-22로 구성된 나선 A; 대략 서열 번호 4의 아미노산 51-71로 구성된 나선 B; 대략 서열 번호 4의 아미노산 80-107로 구성된 나선 C; 대략 서열 번호 4의 아미노산 118-136으로 구성된 나선 D 및 대략 서열 번호 4의 아미노산 139-162로 구성된 나선 E를 포함한다 (문헌[Karpusas et al., supra]). 나선 A, B, C 및 E는 왼손형 (left-handed)의 제2형의 4개의 나선의 다발을 형성한다. 나선 A 및 B를 연결하는 긴 오버핸드형 (overhand) 루프인 AB 루프 및 나선의 나머지를 연결하는 더 짧은 3개의 루프 (BC, CD 및 DE로 명명됨)가 있다 (Karpusa et al., supra). 이전의 연구에 의하면 INF-β 분자의 N-말단, C-말단 및 글리코실화 C 나선 영역은 수용체 결합 부위 내에 놓여 있지 않다는 것이 밝혀졌다 (WO 00/23472 및 USSN 09/832,659 참조). 따라서 상기 영역에서의 돌연변이는 IFN 분자의 생물학적 활성에 유의하게 악영향을 주지는 않는다. 나선 C에서의 돌연변이 (성숙형 인간 IFN-β의 아미노산 81, 82, 85, 86 및 89)에 의해 야생형 IFN-β에 비해 항바이러스 활성이 더 높은 분자가 생성된다는 것이 이전에 또한 밝혀져 있었다 (WO 00/23472 및 USSN 09/832,659 참조). 이와 유사하게, 나선 A (성숙형 인간 IFN-β의 아미노산 2, 4, 5, 8 및 11) 및 CD 루프 (아미노산 110, 11, 113, 116 및 119)에서의 돌연변이는 천연 야생형 인간 IFN-β에 비하여 수용체에 대한 결합 활성이 더 높고 항바이러스 활성 및 항증식 활성이 더 높다는 것이 밝혀졌다 (WO 00/23472 및 USSN 09/832,659 참조).

다른 바람직한 변경 또는 치환은 분자간 가교 결합 또는 부정확한 다이설파이드 결합 형성 부위를 제거한다. 예를 들어 IFN-β는 서열 번호 4의 야생형 위치 17, 31 및 141에서 3개의 cys 잔기를 가지는 것으로 알려져 있다. 하나의 IFN 변이체는 예를 들어 미국 특허 제4,588,585호에 기술되어 있는 바와 같이 17 위치의 cys (C)가 ser (S)으로 치환된 IFN이다. 다른 IFN-β 변이체는 예를 들어 미국 특허 제6,127,332호에 기술된 것과 같이 예를 들어 서열 번호 4를 가지는 야생형 IFN-β에 따라 번호를 매길 경우 예를 들어 17 위치에서 cys (C)가 ser (S)으로 치환되고 101 위치의 val (V)이 phe (F), trp (W), tyr (Y), 또는 his (H), 바람직하게는 phe (F)로 치환된 것 중 하나 이상을 가지는 IFN-β 변이체를 포함한다. 다른 바람직한 변이체는, 예를 들어 미국 특허 제6,127,332호에 또한 기술된 바와 같이 예를 들어 서열 번호 4를 가지는 야생형 IFN-β의 서열을 가지는 폴리펩티드를 포함하는데, 여기서, 야생형 IFN-β에 따라 번호를 매길 경우 101 위치의 val (V)이 phe (F), tyr (Y), trp (W), his (H), 또는 phe (F)로 치환되어 있다.

다른 IFN-β 변이체는 개시자 메티오닌, 예를 들어 서열 번호 4의 메티오닌 1이 결여된 성숙형 IFN-β 분자이다. 예시적인 IFN-β 변이체는 미국 특허 제4,588,585호에 개시된 바와 같이 개시자 메티오닌이 결여되어 있으며 예를 들어 성숙형의 17 위치에서 하나 이상의 아미노산이 치환되어 있다.

IFN-β 분자는 또한 하나 이상의 아미노산을, 정상적으로 나타나는 측쇄 또는 말단기가 화학 반응에 의해 변경된 천연 또는 비천연 아미노산인 하나 이상의 유도체화 아미노산으로 대체함으로써 변경시킬 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 감마-카르복실화, β-카르복실화, 페길화, 설페이트화, 설포네이트화, 포스포릴화, 아미드화, 에스테르화, N-아세틸화, 카르보벤질화, 토실화 및 당 업계에 공지된 다른 변경을 포함한다.

다른 변경은 아미노산 유사체 또는 유도체화 아미노산 -여기서, 측쇄는 환화를 위한 카르복실, 아미노 또는 기타 반응성 전구체 작용기를 여전히 제공하면서 길어지거나 짧아짐 - 과, 적당한 작용기를 가지는 변이체 측쇄를 가지는 아미노산 유사체의 사용을 포함한다. 예를 들어 본 발명의 화합물은 아미노산 유사체, 예를 들어 시아노알라닌, 카나바닌, 드젠콜산, 노르류신, 3-포스포세린, 호모세린, 다이하이드록시페닐알라닌, 5-하이드록시트립토판, 1-메틸히스티딘, 3-메틸히스티딘, 다이아미노피멜산, 오르니틴 또는 다이아미노부티르산을 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 측쇄를 가지는 다른 천연 아미노산 대사 산물 또는 전구체가 당 업계의 숙련자에 의해 인지되며 본 발명의 범주 내에 포함된다.

다른 INF-β 변이체는 반대 또는 역의 펩티드 서열을 포함한다. "반대" 또는 "역"의 펩티드 서열은 아미노산 골격에 있어서 정상적인 카르복실에서 아미노 방향의 펩티드 결합의 형성이 통상적으로 좌측에서 우측 방향으로 판독하면 이 펩티드 결합의 아미노 부분이 카르보닐 부분에 (다음에 오는 것이라기보다는) 선행하도록 반대로 되어 있는 공유 결합된 아미노산 잔기 (또는 그의 유사체 또는 모방체)의 전체 서열 부분을 나타낸다. 일반적으로 문헌[Goodman, M. and Chorev, M. Accounts of Chem. Res. 1979, 12, 423] 참조. 본 명세서에 기술된 반대로 배향된 펩티드는 (a) 하나 이상의 아미노 말단 잔기가 반대 ("rev") 배향으로 전환된 것 (따라서 분자의 가장 좌측 부분의 두번째 "카르복실 말단"을 생성함), 및 (b) 하나 이상의 카르복실 말단 잔기가 반대 ("rev") 배향으로 전환된 것 (따라서 분자의 가장 우측의 부분에서 두번째 "아미노 말단"을 생성함)을 포함한다. 펩티드 (아미드) 결합은 정상적인 배향의 잔기와 반대 배향의 잔기 사이의 공통 영역에서는 형성될 수 없다. 따라서 본 발명의 특정의 반대의 폴리펩티드는 적당한 아미노산 모방체 부분을 이용하여 형성시킴으로써 반대의 펩티드 (반대의 아미드) 결합을 이용하는 서열의 두 인접 부분을 결합시킬 수 있다. 상기 (a)의 경우, 다이케토 화합물의 중앙 잔기를 이용하여 구조체를 2개의 아미드 결합으로 결합시켜 펩티도모방체 구조체를 성취하는 것이 편리할 수 있다. 마찬가지로 상기 (b)의 경우, 다이아미노 화합물의 중앙 잔기는 펩티도모방체 구조체의 형성을 위하여 2개의 아미드 결합으로 구조체를 결합시키는 데에 유용하다. 이러한 폴리펩티드에 있어서의 반대 방향의 결합은 또한 반대형이 아닌 펩티드의 공간 배향과 유사한 측쇄 공간 배향을 유지하기 위하여 반대의 아미노산 잔기의 거울상 이성질체 구조의 역위를 일반적으로 필요로 한다. 펩티드의 반대로 된 부분의 아미노산의 구조는 바람직하게는 (D)이며, 반대로 되지 않은 부분의 구조는 바람직하게는 (L)이다. 정반대의, 또는 혼합된 구조는 결합 활성의 최적화에 적당할 경우 허용가능하다. 폴리펩티드의 변경은 예를 들어 미국 특허 제6,399,075호에 추가로 기술되어 있다.

IFN-β 치료제는 또한 이종성 폴리펩티드에 융합된 IFN-β 단백질 및 그의 변이체 (예를 들어 성숙형 단백질)를 포함한다. 이종성 폴리펩티드는 예를 들어 IFN-β 단백질의 반감기를 연장시키거나 그의 생성을 향상시킬 목적으로 부가될 수 있다. 예시적인 이종성 폴리펩티드는 면역글로불린 (Ig) 분자 또는 그의 일부, 예를 들어 Ig 분자의 경쇄 또는 중쇄의 불변 도메인을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, IFN-β 단백질 또는 그의 변이체는 면역글로불린의 경쇄, 중쇄 또는 둘 모두의 경첩 영역 및 불변 영역의 모두 또는 일부에 융합되거나 그렇지 않을 경우 결합된다. 따라서 본 발명은 (1) IFN-β 단백질 부분 (즉, IFN-β 또는 그의 변이체), (2) 제2 펩티드, 예를 들어 IFN-β 부분의 용해도 또는 생체내 수명을 증가시키는 것, 예를 들어 면역글로불린 수퍼 패밀리 구성원 또는 그의 단편 또는 일부, 예를 들어 IgG의 일부 또는 단편, 예를 들어 인간 IgG1 중쇄 불변 영역, 예를 들어 CH2, CH3 및 경첩 영역을 포함하는 분자를 그 특징으로 한다. 구체적으로는 "IFN-β/Fc 융합물"은 면역글로불린 사슬의 N-말단에 결합된 생물학적 활성 IFN-β 부분을 포함하는 단백질이다. IFN-β/Ig 융합물 화학종은 면역글로불린의 불변 도메인의 적어도 일부에 결합된 IFN-β 부분을 포함하는 단백질인 "IFN-β/Fc 융합물"이다. 바람직한 Fc 융합물은 면역글로불린 중쇄의 C 말단 도메인을 포함하는 항체의 단편에 결합된 IFN-β 부분을 포함한다.

따라서, 하나의 실시 형태에 있어서, 융합 단백질은 일반식 X-Y-Z를 가지며, 여기서, X는 IFN-β의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 또는 그의 일부 또는 변이체이며; Y는 선택적 링커 부분이며; Z는 부분 X의 인터페론 β 이외의 폴리펩티드의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드이다. 다른 실시 형태에 있어서, 융합 단백질은 식 Z-Y-X를 가지며, 여기서 비-IFN-β 폴리펩티드는 IFN-β 폴리펩티드 또는 그의 일부 또는 변이체의 N-말단 부분에 융합되는 링커의 N-말단 부분에 융합된다. 부분 Z는 면역글로불린 유사 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 일부일 수 있다. 이러한 다른 폴리펩티드의 예로는 CD1, CD2, CD4, 및 클래스 I과 클래스 II의 주 조직 적합성 항원의 구성원을 들 수 있다. 예를 들어 이러한 폴리펩티드의 미국 특허 제5,565,335호 (Capon et al.) 참조.

부분 Z는 예를 들어 복수개의 히스티딘 잔기, 또는 바람직하게는 면역글로불린의 Fc 영역을 포함할 수 있는데, "Fc"는 본 명세서에서 면역글로불린의 중쇄의 C 말단 도메인을 포함하는 항체 단편으로 정의된다.

부분 Y는 IFN-β 부분이 그의 생물학적 활성을 보유하도록 하는 임의의 링커일 수 있다. 부분 Y는 길이가 하나의 아미노산 또는 2개 이상의 아미노산일 수 있다. Y는 또한 길이가 약 2개 내지 약 5개의 아미노산; 약 3개 내지 약 10개의 아미노산 또는 10개 이상의 아미노산일 수 있다. 바람직한 실시 형태에 있어서, Y는 GlyGlyGlyGlySer (서열 번호 6)으로 구성되거나 그를 포함할 수 있는데, 이는 예를 들어 뉴클레오티드 서열 GGCGGTGGTGGCAGC (서열 번호 5)에 의해 코딩된다. Y는 또한 엔테로키나제 인식 부위, 예를 들어 AspAspAspAspLys (서열 번호 8)으로 구성되거나 그를 포함할 수 있는데, 이는 예를 들어 GACGATGATGACAAG (서열 번호 7)에 의해 코딩된다. 다른 실시 형태에 있어서, Y는 SerSerGlyAspAspAspAspLys (서열 번호 10)으로 구성되거나 그를 포함하는데, 이는 예를 들어 AGCTCCGGAGACGATGATGACAAG (서열 번호 9)에 의해 코딩된다.

또한 IFN-β 부분 (X)과 두번째의 비-IFN-β 부분 Z (예를 들어 면역글로불린의 Fc 영역) 사이의 커플링은 X 및 Z 부분이 본질적으로 그의 개개의 활성을 보유하기만 한다면 두 분자를 함께 결합시키는 임의의 화학 반응에 의해 또한 행해질 수 있다. 이러한 화학적 결합은 다수의 화학적 기전, 예를 들어 공유 결합, 친화성 결합, 삽입 (intercalation), 공액 결합 및 복합화를 포함할 수 있다. IFN-β 부분과 Z 부분 사이의 공유 결합을 조성하기 위한 대표적인 커플링제 (즉, 상기 일반식에 있어서의 링커 "Y")는 유기 화합물, 예를 들어 티오에스테르, 카르보다이이미드, 숙신이미드 에스테르, 다이아이소시아네이트, 예를 들어 톨릴렌-2,6-다이아이소시아네이트, 글루테르알데하이드, 다이아조벤젠 및 헥사메틸렌 다이아민, 예를 들어 비스-(p-다이아조늄-벤조일)에틸렌다이아민, 이미도에스테르의 2작용성 유도체, 예를 들어 다이메틸 아디프이미데이트, 및 비스-활성 불소 화합물, 예를 들어 1,5-다이플루오로-2,4-다이니트로벤젠을 포함할 수 있다. 상기 목록은 당 업계에 공지된 다양한 화학적 커플링제류를 총망라하려는 것이 아니다. 상기 중 다수는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜다이티오)프로피오네이트 (SPDP), 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노-프로필) 카르보다이이미드 하이드로클로라이드 (EDC); 4-숙신이미딜옥시카르보닐-알파-메틸-알파-2-(피리딜-다이티오)-톨루엔 (SMPT: Pierce Chem. Co., 카탈로그 번호 21558G)와 같은 것으로 구매가능하다.

바람직한 IFN-β/Ig 융합 단백질은 인간 IgG1Fc (ZL5107)에 융합된 전장의 성숙형 인간 IFN-β, 즉, 서열 번호 4의 서열을 포함하는 서열 번호 12의 서열로 구성되거나 그를 포함한다 (WO 00/23472 및 USSN 09/832,659 참조) (도 1 참조). 상응하는 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 11에 나타내어져 있다. 인간 IFN-β를 코딩하는 DNA는 삼중 뉴클레오티드 568-570 (아르기닌을 코딩하는 AAC)에서 끝나며 인간 IgG1 불변 영역을 코딩하는 DNA는 서열 번호 11의 574번 뉴클레오티드로 시작되는 삼중 뉴클레오티드 (아스파르트산을 코딩하는 GAC)에서 시작한다.

다른 바람직한 IFN-β/Ig 융합 단백질은 서열 번호 14에 나타내어져 있으며 서열 번호 13에 의해 코딩된다 (WO 00/23472 및 USSN 09/832,659 참조) (도 2 참조). 상기 후자의 융합 단백질은 그 자신이 인간 IgG1Fc (ZL6206)에 결합된 G4S 링커에 결합된 인간 IFN-β로 구성된다. G4S 링커 (서열 번호 7의 뉴클레오티드 571 내지 585에 의해 코딩됨)는 아미노산 서열 GGGGS (서열 번호 9)로 구성된다. 이러한 단백질의 생성 방법은 WO 00/23472 및 USSN 09/832,659에 기술되어 있다.

바람직한 실시 형태에 있어서, IFN-β 폴리펩티드는 그의 C-말단을 통하여 면역글로불린의 Fc 영역의 적어도 일부에 융합된다. IFN-β는 아미노 말단 부분을 형성하며, Fc 영역은 카르복시 말단 부분을 형성한다. 이러한 융합 단백질에 있어서, Fc 영역은 바람직하게는 불변 도메인 경첩 영역 및 CH2와 CH3 도메인에 한정된다. 이러한 융합물 중 Fc 영역은 또한 분자간 다이설파이드 가교를 형성할 수 있는 경첩 영역의 일부와, CH2 및 CH3 도메인, 또는 그의 기능적 등가물에 한정될 수 있다. 이러한 불변 영역은 임의의 포유류 원천 (바람직하게는 인간)으로부터 유래될 수 있으며 IgA, IgD, IgM, IgE와 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 비롯한 임의의 적당한 종류 및/또는 이소형으로부터 유래될 수 있다.

Ig 융합물을 코딩하는 재조합 핵산 분자는 당 업계에 공지된 임의의 방법으로 얻을 수 있거나 (문헌[Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.) 공식적으로 입수가능한 클론으로부터 얻을 수 있다. 면역글로불린의 중쇄 또는 경쇄 불변 영역을 코딩하는 유전자의 제조 방법은 예를 들어 Robinson, R. 등의 PCT 출원 공보 제W087/02671호에 교시되어 있다. 인터페론 분자 또는 단편을 코딩하는 cDNA 서열은 중쇄 Ig 불변 영역을 코딩하는 cDNA에 직접 결합될 수 있거나 링커 서열을 통하여 결합될 수 있다. 본 발명의 추가의 실시 형태에 있어서, 재조합 벡터 시스템이 올바른 판독 프레임의 인터페론 β를 코딩하는 서열에 합성 경첩 영역을 제공하도록 창조될 수 있다. 또한, 재조합 벡터 시스템의 일부로 RNA 절단/폴리아데닐화 부위 및 하류 서열을 포함하는 면역글로불린 유전자의 3' 측면 영역에 상응하는 핵산을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 면역글로불린 융합 단백질-코딩 서열의 상류에 신호 서열을 엔지니어링하여 재조합 벡터로 형질전환된 세포로부터의 융합 분자의 분비를 돕는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명은 융합 단백질을 포함하는 이량체 융합 분자와 단량체 또는 다량체 분자를 제공한다. 이러한 다량체는 IgM 오량체 또는 IgA 이량체와 같이 일반적으로 다가인 Ig 분자의 Fc 영역, 또는 그의 일부를 사용하여 생성시킬 수 있다. J 사슬 폴리펩티드가 IgM 오량체 및 IgA 이량체의 형성 및 안정화에 필요할 수 있다는 것을 알 수 있다. 대안적으로는 IFN-β 융합 단백질의 다량체는 Ig 분자의 Fc 영역에 대하여 친화성을 가지는 단백질, 예를 들어 단백질 A를 사용하여 형성시킬 수 있다. 예를 들어 복수개의 IFN-β/면역글로불린 융합 단백질을 단백질 A-아가로스 비드에 결합시킬 수 있다.

이러한 다가 형태는 이들이 다수의 인터페론 β 수용체 결합 부위를 보유하기 때문에 유용하다. 예를 들어 2가의 용해성 IFN-β는 링커 영역 (부분 Y)에 의해 분리되는 서열 4의 아미노산 1 내지 166의 2개의 탠덤 (tandem) 반복체 (또는 서열 번호 3의 1 내지 498번 핵산에 의해 코딩되는 것) (일반식 중 부분 X)로 구성될 수 있는데, 상기 반복체는 면역글로불린 불변 도메인 (부분 Z)의 적어도 일부에 결합된다. 다른 다가 형태가 예를 들어 통상적인 커플링 기술을 사용하여 IFN-β/Ig 융합물을, 피콜 (Ficoll), 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란으로 구성된 군으로부터 선택되는 중합체인 임상적으로 허용가능한 담체 분자에 화학적으로 커플링시킴으로써 또한 제작할 수 있다. 대안적으로는 IFN-β는 바이오틴에 화학적으로 커플링시키고, 이어서 바이오틴-인터페론 β Fc 콘쥬게이트를 아비딘에 결합시켜 사가 아비딘/바이오틴/인터페론 β 분자를 생성할 수 있다. IFN-β/Ig 융합물은 다이니트로페놀 (DNP) 또는 트라이니트로페놀 (TNP) 및 항-DNP 또는 항-TNP-IgM으로 침전된 생성된 콘쥬게이트에 공유 결합에 의해 커플링되어 인터페론 β 수용체 결합 부위에 대하여 10가인 십량체 콘쥬게이트를 또한 형성할 수 있다.

본 발명의 단백질의 유도체는 생물학적 활성을 보유하는 일차 단백질의 다양한 구조적 형태도 포함할 수 있다. 예를 들어 이온화가능한 아미노 및 카르복실기의 존재로 인하여 IFN-β 단백질 및 그의 변이체는 산성 또는 염기성 염의 형태로 존재할 수 있거나 중성 형태로 존재할 수 있다. 개개의 아미노산 잔기는 산화 또는 환원에 의해 변경될 수도 있다. 또한 IFN-β의 일차 아미노산 구조 (N- 및/또는 C-말단 말단부 포함) 또는 글리칸은 다른 화학 물질 부분, 예를 들어 글리코실기, 폴리알킬렌 글리콜 중합체, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 지질, 포스페이트, 아세틸기 등과 공유 결합성 또는 군집성 콘쥬게이트를 형성함으로써, 또는 아미노산 서열의 돌연변이를 생성함으로써 변경 ("유도체화")시킬 수 있다.

인터페론 β/Ig의 다른 유도체는 예를 들어 재조합체 배양에 있어서 추가의 N-말단 또는 C-말단으로서의 합성에 의해 다른 단백질 또는 폴리펩티드와의 인터페론 β 또는 그의 단편의 공유 결합성 또는 군집성 콘쥬게이트를 포함한다. 예를 들어 콘쥬게이트화 펩티드는 이 단백질이 그의 합성 부위로부터 세포막 또는 세포벽의 내부 또는 외부의 기능 부위로 번역과 동시에 또는 번역 후에 이동되게 하는 단백질의 N-말단 영역의 신호 (또는 리더) 폴리펩티드 서열 (예를 들어 효모의 알파-인자 리더)일 수 있다. 예를 들어 신호 펩티드는 IFN-β의 신호 펩티드, 즉, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1-138에 상응하는 서열 번호 2의 아미노산 1-21일 수 있다. 신호 펩티드는 또한 VCAM의 신호 펩티드, 즉, 서열 번호 11의 뉴클레오티드 1-72에 의해 코딩되는 서열 번호 12의 아미노산 1-24일 수 있다.

이종성 폴리펩티드 (예를 들어 펩티드) 또는 다른 분자가 IFN-β 치료제의 정제를 돕기 위하여 또는 상기 정제에 있어서의 표지로 또한 사용될 수 있다. 이러한 펩티드는 당 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드는 본 명세서에서 "태그 (Tag) 펩티드"를 코딩하는 "태그 서열"로도 칭해지는 마커 서열에 프레임에 맞게 (in frame) 융합될 수 있는데, 마커 서열은 본 발명의 폴리펩티드의 표식 및/또는 정제를 가능하게 한다. 바람직한 실시 형태에 있어서, 마커 서열은 헥사히스티딘 태그, 예를 들어 PQE-9 벡터에 의해 공급되는 태그이다. 다수의 다른 태그 펩티드가 구매가능하다. 빈번하게 사용되는 다른 태그는 c-myc로부터 유래되는 10개의 잔기의 서열을 포함하는 myc-에피토프 (예를 들어 문헌[Ellison et al. (1991) J Biol Chem 266 : 21150-21157] 참조), pFLAG 시스템 (International Biotechnologies, Inc.), pEZZ-단백질 A 시스템 (Pharmacia, NJ), 및 헤모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)의 헤마글루티닌 단백질의 16개의 아미노산 부분을 포함한다. 또한 시약으로서 예를 들어 태그 폴리펩티드와 특이적으로 상호 작용하는 항체가 입수가능하거나 제조 또는 확인될 수 있는 한 태그로서 임의의 폴리펩티드가 사용될 수 있다.

하나의 실시 형태에 있어서, IFN-β 단백질 또는 그의 변이체는 하기 펩티드 중 하나와 N- 또는 C-말단에서 융합된다: 뉴클레오티드 서열 CATCATCATCATCATCAT (서열 번호 15)에 의해 코딩될 수 있는 HisHisHis HisHisHis (서열 번호 16); 뉴클레오티드 서열 TCCGGGGGCCATCATCATCATCATCAT (서열 번호 15)에 의해 코딩될 수 있는 SerGlyGlyHisHisHisHisHisHis (서열 번호 18) 및 뉴클레오티드 서열 TCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCTCCGGAGACGATGATGACAAG (서열 번호 19)에 의해 코딩될 수 있는 SerGlyGlyHisHisHisHisHisHisSerSerGlyAspAspAspAspLys (서열 번호 20).

인터페론 β의 아미노산 서열은 또한 펩티드 AspTyrLysAspAspAspAspLys (DYKDDDDK) (서열 번호 21)에 결합될 수 있다 (문헌[Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204, 1988]). 후자의 서열은 고도로 항원성이며 특이적 단일클론 항체에 의해 가역적으로 결합되는 에피토프를 제공하여 발현된 재조합 단백질의 신속한 분석 및 손쉬운 정제를 가능하게 한다. 상기 서열은 또한 Asp-Lys 페어링 (pairing) 바로 다음의 잔기에서 소 점막 엔테로키나제에 의해 특이적으로 절단된다.

다른 실시 형태에 있어서, IFN-β 치료제는 알부민 단백질, 그의 변이체 또는 일부에 융합된 IFN-β 단백질 또는 그의 변이체를 포함한다. 이러한 융합 단백질은 예를 들어 WO 01/77137에 기술되어 있는 바와 같이 생성시킬 수 있다.

IFN-β 치료제는 폴리펩티드가 아닌 분자도 포함할 수 있다. 예를 들어 IFN-β 단백질 또는 그의 변이체는 중합체, 예를 들어 생분해성 중합체에 공유 결합에 의해 또는 공유 결합이 아닌 것에 의해 결합될 수 있다. 예를 들어 IFN-β 단백질 또는 그의 변이체는 WO 00/23114에 기술되어 있는 바와 같이 페길화될 수 있는데, 예를 들어 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)에 결합될 수 있다.

본 발명의 광범위한 범주 내에서, 하나보다 많은 중합체 분자도 부착될 수 있다는 것이 또한 고려되지만, 단일 중합체 분자가 IFN-β와의 콘쥬게이션에 이용될 수 있다. 최종 사용의 용도에 적당하다면 콘쥬게이팅 중합체가 임의의 기, 부분, 또는 다른 콘쥬게이트화 화학종을 이용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 예로서, 일부 용도에서는 UV-분해 내성 또는 항산화성, 또는 다른 특성 또는 특징을 중합체에 부여하는 작용기 부분을 중합체에 공유 결합에 의해 결합시키는 것이 유용할 수 있다. 추가의 예로서, 일부 용도에서는 중합체를 작용화하여 성질이 반응성이거나 가교 결합성이 되게 하여 전체 콘쥬게이션된 물질의 다양한 특성 또는 특징을 증강시키는 것이 유리할 수 있다. 따라서 중합체는 고려되는 목적에 있어서 콘쥬게이션된 IFN-β 조성물의 효능을 방해하지 않는 임의의 작용기, 반복기, 결합 또는 기타 구성 구조를 포함할 수 있다.

IFN-β는 콘쥬게이션이 비-말단 반응기로부터 분지될 수도 있지만 가장 바람직하게는 중합체 상의 말단 반응기를 통하여 콘쥬게이션된다. 반응기(들)를 포함하는 중합체는 본 명세서에서 "활성화 중합체"로 명시된다. 반응기는 단백질 상의 자유 아미노기 또는 기타 반응기와 선택적으로 반응한다. 활성화 중합체(들)는 부착이 라이신의 알파 아미노기 또는 입실론-아미노기와 같은 임의의 이용가능한 IFN-β 아미노기에서 일어날 수 있도록 반응하게 된다. (이용가능하다면) IFN-β의 자유 카르복실릭기, 적합하게 활성화된 카르보닐기, 하이드록실, 구아니딜, 산화 탄수화물 부분 및 메르캅토기도 부착 부위로 사용될 수 있다.

중합체는 IFN-β 분자 또는 그의 변이체 또는 IFN-β 분자에 직접 또는 간접적으로 결합된 다른 아미노산 상의 임의의 위치에 부착될 수 있지만 가장 바람직한 중합체 커플링 부위는 IFN-β 분자의 N-말단이다. 이차 부위(들)는 C-말단 또는 C-말단 부근 및 당 부분을 통한 것이다. 따라서 본 발명은 그의 가장 바람직한 실시 형태로서 (i) IFN-β 또는 그의 변이체의 N-말단 커플링된 중합체 콘쥬게이트; (ii) IFN-β 또는 그의 변이체의 C-말단 커플링된 중합체 콘쥬게이트; (iii) 중합체 콘쥬게이트의 당-커플링된 콘쥬게이트와; (iv) IFN-β 단백질 또는 그의 변이체의 N-, C- 및 당-커플링된 중합체를 고려한다.

단백질 농도에 따라 단백질 1몰 당 일반적으로 약 1.0 내지 약 10몰의 활성화 중합체가 이용된다. 최종 양은 생성물의 비특이적 변경은 최소화하면서 동시에 최적 활성을 유지하는 화학적 특성은 규정하고, 동시에, 가능하다면 단백질의 반감기는 최적화하면서 반응의 정도는 최대화하는 것 사이의 균형이다. 바람직하게는 단백질의 생물학적 활성의 약 50% 이상이 보유되며 가장 바람직하게는 100%가 보유된다.

반응은, 생물학적 활성 물질을 불활성 중합체와 반응시키는 데에 사용되는 임의의 적합한 방법에 의해, 반응기가 N-말단의 알파 아미노기 상에 존재할 경우 바람직하게는 약 5-7의 pH에서 일어날 수 있다. 일반적으로 이 공정은 활성화 중합체 (하나 이상의 말단 하이드록실기를 가질 수 있음)를 제조하는 단계, 그 후 단백질을 활성화 중합체와 반응시켜 제형에 적합한 용해성 단백질을 생성하는 단계를 포함한다. 상기 변경 반응은 하나 이상의 단계를 포함할 수 있는 여러 방법으로 수행될 수 있다.

전술한 바와 같이 본 발명의 가장 바람직한 실시 형태에서는 중합체에의 결합부로서 IFN-β의 N-말단 말단부가 이용된다. N-말단 변경 IFN-β를 선택적으로 얻기 위한 적합한 방법이 이용가능하다. 하나의 방법의 예로는 IFN-β 상에서의 유도화에 이용가능한 상이한 형태의 일차 아미노기의 차별적 반응성 (라이신 상의 입실론 아미노기 대 N-말단 메티오닌 상의 아미노기)을 이용하는 환원성 알킬화 방법이 있다. 적당한 선택 조건 하에서 카르보닐기를 포함하는 중합체를 이용한 N-말단에서의 IFN-β의 실질적으로 선택적인 유도체화가 성취될 수 있다. 이 반응은 라이신 잔기의 입실론 아미노기와 IFN-β의 N-말단 잔기의 알파 아미노기의 pKa 차이가 이용되도록 하는 pH에서 수행된다. 이러한 유형의 화학적 특성은 당 업계의 숙련자에게 잘 알려져 있다.

예를 들어 소듐 시아노보로하이드라이드의 존재 하에 PEG-알데하이드 중합체가 IFN-β와 반응되게 하는 조건 하에서 낮은 pH (일반적으로 5-6)에서 반응을 수행함으로써 이러한 선택성을 유지하는 반응 방법이 사용될 수 있다. PEG-IFN-β의 정제 및 SDS-PAGE를 이용한 분석, MALDI 질량 분광법 및 펩티드 서열 결정/지도화 후 N-말단이 PEG 부분에 의해 특이적으로 표적화된 IFN-β가 생성되었다.

IFN-β의 결정 구조에 의하면 N- 및 C-말단이 서로에게 인접하여 위치하는 것으로 나타났다 (문헌[Karpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 11813-11818] 참조). 따라서 IFN-β의 C-말단의 변경은 또한 활성에 최소의 영향을 미쳐야 한다. PEG와 같은 폴리알킬렌 글리콜 중합체를 C-말단에 표적화하는 간단한 화학적 전략은 존재하지 않지만 이 중합체 부분의 표적화에 사용될 수 있는 부위를 유전적으로 조작하는 것은 간편하다. 예를 들어 C-말단 또는 C-말단 부근의 부위에 Cys를 삽입하면 말레이미드, 비닐설폰 또는 할로아세테이트-활성화 폴리알킬렌 글리콜 (예를 들어 PEG)을 사용한 특정 변경이 가능해진다. 이러한 유도체는 상기 시약의 Cys에 대한 높은 선택성으로 인하여 조작되는 시스테인의 변경에 특이적으로 사용될 수 있다. 표적화될 수 있는 히스티딘 태그의 삽입과 같은 다른 전략 (문헌[Fancy et al., (1996) Chem. & Biol. 3: 551]) 또는 추가의 글리코실화 부위는 IFN-β의 C-말단의 변경에 있어서의 다른 대안을 대표한다.

특정 IFN-β 상의 글리칸도 활성의 변화 없이 추가의 변경을 가능하게 하는 위치에 존재한다. 화학적 변경을 위한 부위로서의 당을 표적화하는 방법도 잘 알려져 있으며 따라서 폴리알킬렌 글리콜 중합체를 산화를 통하여 활성화된 IFN-β 상의 당에 직접적으로, 그리고 특이적으로 부가할 수 있다는 것이 가능하다. 예를 들어 알데하이드 및 케톤과의 축합에 의해 비교적 안정한 히드라존을 형성하는 폴리에틸렌글리콜-히드라지드가 생성될 수 있다. 이러한 특성은 산화 올리고당류 결합을 통한 단백질의 변경에 사용되었다. 문헌[Andresz, H. et al., (1978), Makromol. Chem. 179: 301] 참조. 특히, PEG-카르복시메틸 히드라지드를 나이트라이트로 처리하면 아미노기에 대하여 반응성을 가지는 친핵성 활성기인 PEG-카르복시메틸 아지드가 생성된다. 이 반응을 사용하여 폴리알킬렌 글리콜-변경 단백질도 제조할 수 있다. 미국 특허 제4,101,380호 및 동 제4,179,337호 참조.

티올 링커-매개된 화학 반응은 또한 단백질의 가교 결합을 도울 수 있다. 이는 예를 들어 과요오드산나트륨으로 탄수화물 부분 상의 반응성 알데하이드를 생성하고, 알데하이드를 통하여 시스타민 콘쥬게이트를 형성하고 시스타민 상의 티올기를 통하여 가교 결합을 유발함으로써 수행될 수 있다 (문헌[Pepinsky, B. et al., (1991), J. Biol. Chem., 266: 18244-18249] 및 문헌[Chen, L. L. et al., (1991) J. Biol. Chem., 266: 18237-18243] 참조). 따라서 이러한 유형의 화학 반응은 링커가 당 내로 삽입되고 폴리알킬렌 글리콜 중합체가 링커에 부착되는 폴리알킬렌 글리콜 중합체를 이용한 변경에 적당할 것으로 기대된다. 아미노티올 또는 히드라진 함유 링커에 의해 단일 중합체 기의 부가가 가능해지지만 링커의 구조는 다중 중합체가 부가되고/되거나 IFN-β에 대하여 이 중합체의 공간 배향이 변화되도록 다양하게 할 수 있다.

예시적인 중합체는 수용성 중합체, 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 중합체를 포함한다. 이러한 중합체의 비제한적 목록은 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 폴리올, 그의 공중합체 및 그의 블록 공중합체와 같은 다른 폴리알킬렌 옥사이드 단일중합체를 포함한다. 적합한 수용성 및 비-펩티드 중합체 골격의 다른 예는 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시프로필메타크릴아미드), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린, 폴리(N-아크릴로일모르폴린) 및 그의 공중합체, 삼원중합체 및 혼합물을 포함한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 중합체 골격은 평균 분자량이 약 200 Da 내지 약 400,000 Da인 폴리(에틸렌 글리콜) 또는 모노메톡시 폴리에틸렌 글리콜 (mPEG)이다. 다른 관련 중합체도 본 발명의 실행에서 사용하기에 적합하며, 이와 관련하여 PEG 또는 폴리(에틸렌 글리콜)이라는 용어를 사용하는 것은 포함하려는 고려이고 배제하려는 것은 아님을 알아야 한다. PEG라는 용어는 알콕시 PEG, 2작용성 PEG, 다중-팔 (armed) PEG, 갈래진 (forked) PEG, 분지 PEG, 펜던트 PEG, 또는 내부에 분해성 결합을 갖는 PEG를 비롯한 임의의 형태의 폴리(에틸렌 글리콜)을 포함한다.

하나의 실시 형태에 있어서, C1-C4 알킬 폴리알킬렌 글리콜, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 폴리알킬렌 글리콜 잔기, 또는 이러한 글리콜의 폴리(옥시)알킬렌 글리콜 잔기가 목적하는 중합체 시스템에 혼입된다. 따라서 단백질이 부착되는 중합체는, 모든 경우에 이 중합체가 실온에서 물에 용해될 수 있다면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)의 단일중합체일 수 있거나 폴리옥시에틸화 폴리올이다. 이러한 중합체의 비제한적 예는 폴리알킬렌 옥사이드 단일중합체, 예를 들어 PEG 또는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시에틸렌화 글리콜, 그의 공중합체 및 블록 공중합체의 수 용해도가 유지된다면 블록 공중합체를 포함한다. 폴리옥시에틸화 폴리올의 예는 예를 들어 폴리옥시에틸화 글리콜, 폴리옥시에틸화 소르비톨, 폴리옥시에틸화 글루코스 등을 포함한다. 폴리옥시에틸화 글리세롤의 글리세롤 골격은 예를 들어 모노-, 다이- 및 트라이글리세리드에서 동물 및 인간에서 자연적으로 나타나는 동일한 골격이다. 따라서 이러한 분지화는 체내에서 외래 제제로서 반드시 보여질 필요는 없다.

폴리알킬렌 옥사이드에 대한 대안으로서, 덱스트란, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리아크릴아미드, 폴리비닐 알코올, 탄수화물 기재의 중합체 등도 사용될 수 있다. 당 업계의 숙련자라면 전술한 목록이 단순히 예시적인 것이며 본 명세서에 기술된 품질을 가지는 모든 중합체 물질이 고려된다는 것을 인지할 것이다.

중합체는 특정 분자량을 가질 필요는 없지만 분자량은 약 300 내지 100,000 사이, 더 바람직하게는 10,000 내지 40,000 사이인 것이 바람직하다. 특히 20,000 이상의 크기가 신장에서의 여과로 인한 단백질 손실의 방지에 가장 좋다.

폴리알킬렌 글리콜 유도체화는 하기의 폴리알킬렌 글리콜 유도체의 특성과 결부된 바와 같이 본 발명의 실행에 있어서의 중합체-IFN-β 콘쥬게이트의 제형화에 있어서 다수의 유리한 특성을 가진다: 수용해도의 개선과 동시에 항원성 또는 면역원성 반응을 전혀 야기하지 않음; 고도의 생체 적합성; 폴리알킬렌 글리콜 유도체의 생체내에서의 생분해의 부재; 및 살아있는 유기체의 배설의 용이함.

또한, 본 발명의 다른 태양에 있어서, 중합체 성분에 공유 결합된 IFN-β가 이용될 수 있는데, 여기서 콘쥬게이션의 성질은 절단성의 화학 공유 결합을 포함한다. 이는 중합체가 IFN-β로부터 절단될 수 있는 시간 코스의 제어를 가능하게 한다. 이러한 IFN-β 약물과 중합체 사이의 공유 결합은 화학 반응 또는 효소 반응에 의해 절단될 수 있다. 중합체-IFN-β 생성물은 허용가능한 양의 활성을 보유한다. 동시에 폴리에틸렌 글리콜의 일부가 콘쥬게이팅 중합체에 존재하여 중합체-IFN-β 콘쥬게이트에게 높은 수 용해성 및 연장된 혈액 순환 능력을 부여한다. 이러한 개선된 특징의 결과로서 본 발명은 활성 중합체-IFN-β 화학종의 비경구, 비강 및 경구 전달과, 생체내에서의 용도에 있어서의 가수분해에 의한 절단 후의 IFN-β 그 자체의 생체이용성을 고려한다.

중합체를 IFN-β와 반응시켜 콘쥬게이트, 예를 들어 N-말단 콘쥬게이션된 생성물을 얻는 것은 매우 다양한 반응 방법을 사용하여 손쉽게 실시할 수 있다. IFN-β 콘쥬게이트의 활성 및 안정성은 상이한 분자 크기의 중합체를 사용함으로써 다양한 방식으로 변화시킬 수 있다. 콘쥬게이트의 용해도는 중합체 조성물에 혼입되는 폴리에틸렌 글리콜 단편의 비율 및 크기를 변화시킴으로써 변화시킬 수 있다.

하나의 실시 형태에 있어서, 본 발명에 따른 콘쥬게이트는 단백질을 활성화 폴리알킬렌 글리콜 화합물 (PCG)와 반응시킴으로써 제조한다. 예를 들어 IFN을 환원제 (예를 들어 소듐 시아노보로하이드라이드)의 존재 하에 환원성 알킬화를 통하여 PEG-알데하이드와 반응시켜 아민 결합을 통하여 부착되는 PEG-단백질 콘쥬게이트를 생성할 수 있다. 예를 들어 유럽 특허 제0154316 B1호 및 국제 특허 출원 제PCT/US03/01559호 참조.

본 발명의 특정 실시 형태에 있어서, IFN-β는 하기의 활성화 폴리알킬렌 글리콜: 20 kDa의 mPEG-0-2-메틸프로피온알데하이드, 20 kDa의 mPEG-O-p-메틸페닐-O-2-메틸프로피온알데하이드, 20 kDa의 mPEG-O-m-메틸페닐-0-2-메틸프로피온알데하이드, 20 kDa의 mPEG-O p-페닐아세트알데하이드, 20 kDa의 mPEG-O p-페닐프로피온알데하이드, 및 20 kDa의 mPEG-O-m-페닐아세트알데하이드로 페길화 (PEGylated)하여 20 kDa의 mPEG-0-2-메틸프로피온알데하이드-변경 IFN-β, 20 kDa의 mPEG-O-p-메틸페닐-0-2-메틸프로피온알데하이드-변경 IFN-β, 20 kDa의 mPEG-O-m-메틸페닐-O-2-메틸프로피온알데하이드-변경 IFN-β, 20 kDa의 페닐아세트알데하이드-변경 IFN-β, 20 kDa의 mPEG-0-p-페닐프로피온알데하이드-변경 IFN-β, 및 20 kDa의 mPEG-O-m-페닐아세트알데하이드-변경 IFN-β를 각각 얻는다. 20 kDa의 mPEG-0-2-메틸프로피온알데하이드 및 20 kDa의 mPEG-O-p-페닐아세트알데하이드로 변경된 인간 IFN-β의 제조 및 특징에 대한 상세한 설명이 이하에 나타내어져 있으며 국제 특허 출원 제PCT/US03/01559호에도 제공되어 있다.

하나의 실시 형태에 있어서, 페길화 IFN-β는 하기와 같이 제조한다. pH 7.2, 200 mM NaCl의 100 mM 인산나트륨 중 250 μg의 IFN-β, 예를 들어 IFN-β-1a 벌크 중간체 (인간에서의 사용을 위한 모든 시험을 통과한 임상 배치의 벌크 약물)를 동일 부피의 pH 5.0의 100 mM MES로 희석시키고, pH를 HCl로 5.0으로 조정하였다. 샘플을 수지 1 ml당 IFN-β 6 mg으로 하여 SP-세파로스? FF 컬럼 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 상에 로딩한다. 이 컬럼을 pH 5.5, 75 mM NaCl의 5 mM 인산나트륨으로 세척하고 생성물을 pH 6.0, 600 mM NaCl의 30 mM 인산나트륨으로 용출시킨다. 용출 분획에 있어서 280 nm에서의 흡광도 값을 분석할 수 있으며 샘플 중 인터페론의 농도는 1 mg/ml의 용액에 있어서 1.51의 소광 계수를 사용하여 흡광도로부터 개산할 수 있다.

SP 용출물로부터의 1 mg/ml의 IFN-β 용액에 pH 6.0의 0.5 M 인산나트륨을 50 mM로 첨가하고, 소듐 시아노보로하이드라이드 (Aldrich, Milwaukee, WI)를 5 mM로 첨가하고, 20K의 PEG 알데하이드 (Shearwater Polymers, Huntsville, AL)를 5 mg/ml로 첨가한다. 샘플을 실온에서 20시간 동안 인큐베이션한다. 페길화 인터페론을 이동상으로 pH 5.5, 150 mM NaCl의 5 mM 인산나트륨을, 그리고 SP-세파로스? FF를 이용한 세파로스? 6 FPLC 크기 분류용 (sizing) 컬럼 (Pharmacia) 상에서의 순차적 크로마토그래피 단계에 의해 반응 생성물로부터 정제한다. 크기 분류용 컬럼에 의해 변경 및 미변경 IFN-β의 기저선 분리가 생긴다. 겔 여과물로부터의 PEG-인터페론 β 함유 용출물 풀을 물로 1:1로 희석시키고 1 ml의 수지 당 2 mg의 인터페론 β를 SP-세파로스? 컬럼 상에 로딩한다. 이 컬럼을 pH 5.5, 75 mM의 NaCl의 5 mM 인산나트륨으로 세척하고 이어서 페길화 인터페론 β를 pH 5.5, 800 mM NaCl의 5 mM 인산나트륨으로 컬럼으로부터 용출시킨다. 용출 분획에 있어서 280 nm의 흡광도에 의해 단백질 함량을 분석한다. PEG 부분은 280 nm에서의 흡광도에 기여하지 않기 때문에 페길화 인터페론 농도를 인터페론 등가물로 보고한다. 상기 방법 및 얻어지는 페길화 IFN-β의 특성화가 WO 00/23114에 또한 기술되어 있다. IFN-β의 PEG 콘쥬게이션은 그의 항바이러스 활성을 변경시키는 것으로 생각되지는 않는다. 또한 페길화 IFN-β의 비활성은 비-페길화 IFN-β의 비활성보다 훨씬 더 큰 것으로 밝혀졌다 (약 10배) (WO 00/23114).

IFN-β는 또한 20K의 PEG 알데하이드에 대하여 상기한 바와 동일한 프로토콜에 따라 Fluka, Inc. (카탈로그 번호 75936, Ronkonkoman, NY)로부터 구매될 수 있는 5K의 PEG-알데하이드 부분으로 페길화될 수 있다.

20 kDa의 mPEG-0-2-메틸프로피온알데하이드-변경 IFN-β는 하기와 같이 제조될 수 있다. pH 7.2, 200 mM NaCl의 100 mM 인산나트륨 중 250 μg/mL의 10 mL의 IFN-β-1a 벌크 중간체 (인간에서의 사용을 위한 모든 시험을 통과한 임상 배치의 벌크 약물)를 pH 5.0의 165 mM MES 12 mL 및 5N HCl 50 μL로 희석시킨다. 이 샘플을 300 μL의 SP-세파로스 FF 컬럼 (Pharmacia) 상에 로딩한다. 컬럼을 pH 5.5, 75 mM NaCl의 5 mM 인산나트륨 300 μL로 3회 세척하고 단백질을 pH 5.5, 600 mM NaCl의 5 mM 인산나트륨으로 용출시킨다. 용출 분획에 있어서 280 nm에서의 흡광도를 분석하고 샘플 중 IFN-β의 농도를 1 mg/mL의 용액에 있어서 1.51의 소광 계수를 사용하여 개산한다. 피크 분획을 풀링하여 IFN-β의 농도가 3.66 mg/mL이 되게 하는데, 이는 이후에 물로 1.2 mg/mL으로 희석시킨다.

희석된 SP-세파로스 용출물 풀로부터의 IFN-β 0.8 mL에 pH 6.0의 0.5 M 인산나트륨을 50 mM로 첨가하고, 소듐 시아노보로하이드라이드 (Aldrich)를 5 mM로 첨가하고, 20 kDa mPEG-0-2-메틸프로피온알데하이드를 5 mg/mL로 첨가한다. 샘플을 실온의 암소에서 16시간 동안 인큐베이션시킨다. 페길화 IFN-β를 하기와 같이 0.5 mL SP-세파로스 FF 컬럼 상에서 반응 혼합물로부터 정제한다: 0.6 mL의 반응 혼합물을 pH 5.0의 20 mM MES 2.4 mL로 희석시키고, SP-세파로스 컬럼 상에 로딩한다. 컬럼을 pH 5.5, 75 mM NaCl의 인산나트륨으로 세척하고 이어서 페길화 IFN-β를 pH 6.4, 400 mM NaCl의 25 mM MES를 이용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 페길화 IFN-β를, 이동상으로 pH 5.5, 150 mM NaCl의 5 mM 인산나트륨을 이용하여 수퍼로스 6 HR 10/30 FPLC 크기 분류용 컬럼 상에서 더 정제한다. 크기 분류용 컬럼 (25 mL)을 20 mL/h로 흐르게 하고 0.5 mL의 분획을 수집한다. 용출 분획을 280 nm에서의 흡광도에 대하여 분석하고, 풀링하고 풀 중의 단백질 농도를 측정한다. PEG 부분은 280 nm에서의 흡광도에 기여하지 않기 때문에 페길화 IFN-β의 농도를 IFN 등가물로 보고한다. 풀 샘플을 분석을 위하여 옮기고 나머지를 HSA-함유 제형 완충제로 30 μg/mL로 희석시키고 0.25 mL/바이알로 분취하고 -70℃에서 보관할 수 있다.

20 kDa mPEG-O-p-페닐아세트알데하이드-변경 IFN-β를 하기와 같이 제조할 수 있다. pH 7.2, 200 mM NaCl의 100 mM 인산나트륨 중 250 μg/mL의 20 mL의 IFN-β 벌크 중간체 (인간에서의 사용을 위한 모든 시험을 통과한 임상 배치의 벌크 약물)를 pH 5.0의 165 mM MES 24 mL 및 물 24 mL로 희석시킨다. 이 샘플을 600 μL의 SP-세파로스 FF 컬럼 (Pharmacia) 상에 로딩한다. 컬럼을 pH 5.5, 75 mM NaCl의 5 mM 인산나트륨 900 μL로 2회 세척하고 단백질을 pH 5.5, 600 mM NaCl의 5 mM 인산나트륨으로 용출시킨다. 용출 분획에 있어서 280 nm에서의 흡광도를 분석하고 샘플 중 IFN-β의 농도를 1 mg/mL의 용액에 있어서 1.51의 소광 계수를 사용하여 개산한다. 피크 분획을 풀링하여 IFN-β의 농도가 2.3 mg/mL이 되게 한다. SP-세파로스 용출물 풀로부터의 IFN-β-1a 1.2 mL에 pH 6.0의 0.5 M 인산나트륨을 50 mM로 첨가하고, 소듐 시아노보로하이드라이드 (Aldrich)를 5 mM로 첨가하고, 20 kDa mPEG-0-p-페닐아세트알데하이드를 10 mg/mL로 첨가한다. 샘플을 실온의 암소에서 18시간 동안 인큐베이션시킨다. 페길화 IFN-β를 하기와 같이 0.75 mL SP-세파로스 FF 컬럼 상에서 반응 혼합물로부터 정제할 수 있다: 1.5 mL의 반응 혼합물을 pH 5.0의 20 mM MES 7.5 mL, 물 7.5 mL 및 5N HCl 5 μL로 희석시키고, SP-세파로스 컬럼 상에 로딩한다. 컬럼을 pH 5.5, 75 mM NaCl의 인산나트륨으로 세척하고 이어서 페길화 IFN-β를 pH 6.0, 600 mM NaCl의 20 mM MES를 이용하여 컬럼으로부터 용출시킨다. 페길화 IFN-β를, 이동상으로 pH 5.5, 150 mM NaCl의 5 mM 인산나트륨을 이용하여 수퍼로스 6 HR 10/30 FPLC 크기 분류용 컬럼 상에서 더 정제한다. 크기 분류용 컬럼 (25 mL)을 20 mL/h로 흐르게 하고 0.5 mL의 분획을 수집한다. 용출 분획을 280 nm에서의 흡광도에 의해 단백질 함량에 대하여 분석하고, 풀링하고 풀 중의 단백질 농도를 측정한다. 페길화 IFN-β 용액 1 mL 당 1 mg에 있어서 2의 소광 계수를 사용하여 280 nm에서의 흡광도에 에의 PEG (20 kDa mPEG-O-p-페닐아세트알데하이드는 페길화 IFN-β의 용액 1 mg에 있어서 280 nm에서의 소광 계수가 0.5임)의 기여에 대하여 조정한 후 페길화 IFN-β의 농도를 IFN 등가물로 보고한다. 풀 샘플을 분석을 위하여 옮길 수 있으며, 나머지를 HSA-함유 제형 완충제로 30 μg/mL로 희석시키고 0.25 mL/바이알로 분취하고 -70℃에서 보관할 수 있다.

비천연 중합체에 커플링된 글리코실화 IFN-β를 본 발명의 방법에서 사용할 수 있다. 이 중합체는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함할 수 있다. 폴리알킬렌 부분은 알데하이드기, 말레이미드기, 비닐설폰기, 할로아세테이트기, 복수개의 히스티딘 잔기, 히드라진기 및 아미노티올기로부터 선택되는 기에 의해 인터페론-β에 커플링될 수 있다. IFN-β는 폴리에틸렌 글리콜 부분에 커플링될 수 있는데, 여기서 IFN-β는 불안정한 결합에 의해 폴리에틸렌 글리콜 부분에 결합되며, 불안정한 결합은 생화학적 가수분해 및/또는 단백질 분해에 의해 절단될 수 있다. 중합체의 분자량은 약 5 내지 약 40 킬로달톤일 수 있다. 사용될 수 있는 다른 IFN-β는 폴리알킬렌 글리콜 부분을 포함하는 중합체에 N-말단에서 커플링된 생리학적으로 활성인 글리코실화 인터페론-β를 함유하는 생리학적 활성 인터페론-β 조성물이며, 생리학적 활성 인터페론-β 및 폴리알킬렌 글리콜 부분은 생리학적 활성 인터페론-β 조성물 중 생리학적 활성 인터페론-β가 항바이러스 분석에 의해 측정시 상기 부분이 결여된 생리학적 활성 인터페론-β와 관련하여 실질적으로 유사한 활성을 가지도록 배열된다.

이종성 폴리펩티드 또는 다른 분자는 IFN-β 단백질 또는 그의 변이체에 공유 결합 또는 비-공유 결합에 의해 결합될 수 있다. "공유 결합에 의해 커플링되는"이라는 것은 본 발명의 상이한 부분이 서로에게 공유 결합에 의해 직접 결합되거나, 그렇지 않으면 개재 부분(들), 예를 들어 가교, 스페이서 또는 결합 부분(들)을 통하여 서로에게 간접적으로 공유 결합에 의해 결합되는 것을 의미한다. 개재 부분(들)은 "커플링기"로 불리워진다. "콘쥬게이션된"이라는 용어는 "공유 결합에 의해 커플링된"과 서로 바꾸어서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용하기 위한 IFN-β는 글리코실화되거나 비-글리코실화 (또는 미글리코실화)될 수 있다. 비-글리코실화 IFN-β가 예를 들어 원핵 생물 숙주 세포에서 생성될 수 있다. IFN-β 단백질 또는 그의 변이체는 IFN-β 상에서는 보통은 존재하지 않는 다당류의 부착에 의해 또한 변경될 수 있다.

3. IFN-β 치료제의 제조 방법

본 발명의 IFN-β 치료제는 임의의 적합한 방법, 예를 들어 IFN-β 치료제를 코딩하는 핵산을 제작하는 단계 및 이 핵산을 적합한 형질전환 숙주에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 이러한 방법에 의해 재조합 IFN-β 치료제가 제조된다. IFN-β 치료제는 화학적 합성법 또는 화학적 합성법과 재조합 DNA 기술의 조합에 의해서도 제조될 수 있다.

하나의 실시 형태에 있어서, IFN-β 치료제를 코딩하는 핵산은 IFN-β 또는 그의 변이체를 코딩하는 DNA의 단리 또는 합성으로 제작한다. 예를 들어 IFN-융합 단백질은 예를 들어 본 명세서에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다. 천연 IFN-β 핵산은 당 업계에 잘 알려진 방법에 따라 얻을 수 있다. 예를 들어 핵산은 IFN-β를 발현하는 것으로 알려진 세포, 예를 들어 백혈구로부터 얻어지는 RNA와, IFN-β 유전자, 예를 들어 서열 번호 1의 서열에 기초한 프라이머를 사용하여 역전사효소-폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR)으로 단리할 수 있다. IFN-β 단백질을 코딩하는 핵산은 또한 라이브러리, 예를 들어 IFN-β를 발현하는 세포로부터 만들어진 cDNA 라이브러리를 프로브, 예를 들어 IFN-β 서열의 일부를 포함하는 올리고뉴클레오티드로 스크리닝함으로써 단리할 수 있다.

대안적으로는, 완전한 아미노산 서열을 사용하여 역번역되는 유전자를 제작할 수 있다. IFN-β 치료제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA 올리고머를 합성할 수 있다. 예를 들어 원하는 폴리펩티드의 일부를 코딩하는 여러 작은 올리고뉴클레오티드를 합성하고 이어서 함께 라이게이션시킬 수 있다. 개개의 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 상보적 어셈블리 (assembly)를 위한 5' 또는 3' 오버행 (overhang)을 포함한다.

당 업계에 잘 알려진 방법으로 IFN-β 단백질을 코딩하는 핵산 내로 변화를 도입할 수 있다. 예를 들어 변화는 예를 들어 문헌[Mark et al., "Site-specific Mutagenesis Of The Human Fibroblast Interferon Gene", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. 5662-66 (1984)] 및 미국 특허 제4,588,585호에 기술된 바와 같이 부위 특이적 돌연변이 유발법에 의해 만들어질 수 있다.

IFN-β 치료제를 코딩하는 핵산을 제작하는 다른 방법은 화학적 합성법을 통한 것이다. 예를 들어 원하는 IFN-β 치료제를 코딩하는 유전자는 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 원하는 IFN-β 치료제의 아미노산 서열에 기초하여 고안된다.

발현 시스템에서의 발현을 위한 핵산의 선택시, 재조합 IFN-β 치료제가 생성되는 숙주 세포 또는 발현 시스템에서 선호되는 코돈을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어 특정 코돈은 원핵 생물 세포에서 다른 것에 비하여 우선적으로 발현된다는 것이 알려져 있다 ("코돈 선호도").

IFN-β 치료제를 코딩하는 DNA 서열은 신호 서열을 코딩하는 DNA 서열을 또한 포함할 수 있거나 포함할 수 없다. 이러한 신호 서열은 존재할 경우 IFN-β 치료제의 발현을 위하여 선택되는 세포에 의해 인지되는 것이어야 한다. 신호 서열은 원핵 생물, 진핵 생물, 또는 이 둘의 조합의 서열일 수 있다. 신호 서열은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 여러 상이한 것이 당 업계에 기술되어 있다. 신호 서열은 천연 (즉, 자연 발생) IFN-β의 것일 수 있다. 신호 서열의 포함은 IFN-β 치료제가 생성되는 재조합 세포로부터 분비될 것이 요망되는지에 따라 달라진다. 선택된 세포가 원핵 생물 세포일 경우, DNA 서열이 신호 서열을 코딩하지 않는 것이 일반적으로 바람직하다. 선택된 세포가 진핵 생물 세포일 경우, 신호 서열이 코딩되는 것이 일반적으로 바람직하며 가장 바람직하게는 야생형 IFN-β 신호 서열이 사용되는 것이 일반적으로 바람직하다.

일단 어셈블링되면 (합성, 부위 특이적 돌연 변이 유발법 또는 다른 방법에 의해) IFN-β 치료제를 코딩하는 핵산은 발현 벡터 내로 삽입되며, 여기서 상기 핵산은 원하는 형질전환 숙주에서의 IFN-β 치료제의 발현에 적당한 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합된다. 적절한 어셈블리는 뉴클레오티드 서열 결정, 제한 효소 지도화, 및 적합한 숙주 또는 숙주 세포에서의 생물학적 활성 폴리펩티드의 발현에 의해 확인할 수 있다. 당 업계에 잘 알려진 바와 같이, 숙주 또는 숙주 세포에서 트랜스펙션된 유전자의 높은 발현 수준을 얻기 위해서는 유전자는 선택된 발현 숙주에서 기능성인 전사 및 번역 발현 제어 서열에 작동가능하게 결합되어야 한다.

발현 제어 서열 및 발현 벡터의 선택은 선택되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 생물 숙주, 예를 들어 진핵 생물 숙주 세포에 유용한 발현 벡터는 예를 들어 SV40, 소 유두종 (papilloma) 바이러스, 아데노바이러스 및 사이토메갈로바이러스 유래의 발현 제어 서열을 포함하는 벡터, 예를 들어 하기 벡터: pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo 및 pHyg 유래 벡터를 포함한다. 대안적으로는 바이러스, 예를 들어 소 유두종 바이러스 (BPV-1), 또는 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스로부터 유래된 것 (pHEBo, pREP-유래체 및 p205)를 진핵 생물 세포에서의 일시적인 단백질 발현에 사용할 수 있다. 플라스미드의 제조 및 숙주 유기체의 형질전환에 이용되는 다양한 방법이 당 업계에 잘 알려져 있다. 다른 적합한 발현 시스템에 대해서는, 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Chapters 16 and 17] 참조.

박테리아 숙주에 유용한 발현 벡터는 공지된 박테리아 플라스미드, 예를 들어 col E1, pCRl, pBR322, pMB9 및 그의 유도체를 비롯한 이. 콜라이 (E. coli) 유래의 플라스미드, 숙주 범위가 더욱 넓은 플라스미드, 예를 들어 RP4, 파지 DNA, 예를 들어 다수의 파지 람다 유래체, 예를 들어 NM989, 및 기타 DNA 파지, 예를 들어 M13 및 필라멘트성 단일 가닥 DNA 파지를 포함한다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2.mu. 플라스미드 및 그의 유도체를 포함한다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941을 포함한다. 문헌[Cate et al., "Isolation Of The Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting Substance And Expression Of The Human Gene In Animal Cells", Cell, 45, pp. 685-98 (1986)]을 또한 참조.

또한, 매우 다양한 발현 제어 서열 중 임의의 것이 상기 벡터에 사용될 수 있다. 이러한 유용한 발현 제어 서열은 전술한 발현 벡터의 구조 유전자와 결부된 발현 제어 서열을 포함한다. 유용한 발현 제어 서열의 예는 예를 들어 SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, 파지 람다의 주 오퍼레이터 및 프로모터, 예를 들어 PL, fd 코트 (coat) 단백질의 제어 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소의 프로모터, 산 포스파타제의 프로모터, 예를 들어 Pho5, 효모 α-교배 시스템의 프로모터 및 원핵 생물 또는 진핵 생물 세포의 유전자 발현을 제어하는 것으로 알려진 다른 서열과, 다양한 그의 조합을 포함한다.

박테리아, 진균류 (효모 포함), 식물, 곤충, 포유류 또는 다른 적당한 동물 세포 또는 세포주와, 트랜스제닉 동물 또는 식물을 비롯한 임의의 적합한 숙주를 사용하여 IFN-β 치료제를 생성할 수 있다. 예시적인 숙주는, 이. 콜라이, 슈도모나스 (Pseudomonas), 바실루스 (Bacillus), 스트렙토마이에스 (Streptomyces), 진균류, 효모, 곤충 세포, 예를 들어 스포도프테라 프루아이페르다 (Spodoptera fruaiperda) (SF9), 동물 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 및 생쥐 세포, 예를 들어 NS/0, 아프리카 그린 원숭이 세포, 예를 들어 COS 1, COS 7, BSC1, BSC 40과 BMT 10, 및 인간 세포와, 조직 배양된 식물 세포를 포함한다. 이러한 세포는 아메리칸 유형 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, ATCC)으로부터 입수될 수 있다. 동물 세포 발현에 바람직한 숙주 세포는 배양된 CHO 세포 및 COS 7 세포, 특히 CHO-DDUKY-β 1 세포주를 포함한다.

물론 모든 벡터 및 발현 제어 서열이 동일하게 잘 기능하여 본 명세서에 기술된 DNA 서열을 발현하는 것은 아님을 알아야 한다. 또한 모든 숙주가 동일한 발현 시스템과 동일하게 잘 기능하는 것은 아니다. 그러나 당 업계의 숙련자라면 불필요한 실험 없이 상기 벡터, 발현 제어 서열 및 숙주 중에서 선택할 수 있다. 벡터의 카피 (copy) 수, 이 카피 수를 제어하는 능력, 및 이 벡터에 의해 코딩되는 임의의 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 고려되어야 한다. 예를 들어 본 발명에서 사용하기에 바람직한 벡터는 IFN-β 치료제를 코딩하는 DNA가 카피 수로 증폭되게 하는 것을 포함한다. 이러한 증폭가능한 벡터가 당 업계에 잘 알려져 있다. 이들은 예를 들어 DHFR 증폭에 의해 (예를 들어 미국 특허 제4,470,461호, 문헌[Kaufman and Sharp, "Construction Of A Modular Dihydrafolate Reductase cDNA Gene: Analysis Of Signals Utilized For Efficient Expression", Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)] 참조) 또는 글루타민 신테타제 ("GS") 증폭에 의해 증폭될 수 있는 벡터 (예를 들어 미국 특허 제5,122,464호 및 유럽 특허 공개 공보 제338,841호 참조)를 포함한다.

발현 제어 서열의 선택에 있어서 다양한 인자가 또한 고려되어야 한다. 이는 예를 들어 서열의 상대적인 강도, 그의 제어성, 및 특히 잠재적인 이차 구조에 대한 고려 사항으로서 IFN-β 치료제를 코딩하는 실제 DNA 서열과의 그의 상용성을 포함한다. 숙주는 선택된 벡터와의 그의 상용성, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 생성물의 독성, 그의 분비 특성, 폴리펩티드로 정확하게 폴딩되는 그의 능력, 그의 발효 또는 배양 상의 요건, 및 DNA 서열에 의해 코딩되는 생성물의 정제의 용이성에 대한 고려 사항에 의해 선택되어야 한다.

이러한 파라미터 내에서 당 업계의 숙련자라면 예를 들어 CHO 세포 또는 COS 7 세포를 사용하여 발효물 또는 대규모 동물 배양물 상에서 원하는 DNA 서열을 발현하는 다양한 벡터/발현 제어 서열/숙주 조합을 선택할 수 있다. IFN-β 변이체를 발현시키기 위한 CHO 세포주 CHO-KUKX-B1 DHFR sup의 사용이 미국 특허 제6,127,332호에 또한 기술되어 있다.

IFN-β 치료제는 시험관내 시스템, 예를 들어 시험관내 번역 시스템, 예를 들어 세포 용해물, 예를 들어 망상 적혈구 용해물에서 또한 생성될 수 있다. 본 명세서에서 "무세포 번역 시스템"이라는 용어와 서로 바꾸어서 사용될 수 있는 "시험관내 번역 시스템"이라는 용어는 RNA 분자를 단백질로 번역하는 데에 필요한 적어도 최소한의 요소를 포함하는 무세포 추출물인 번역 시스템을 나타낸다. 시험관내 번역 시스템은 일반적으로 거대 분자, 예를 들어 효소, 번역, 개시 및 연장 인자, 화학 시약 및 리보좀을 포함한다. 예를 들어 시험관내 번역 시스템은 적어도 리보좀, ^tRNA, 개시자 메티오닐-^tRNA^Met, 번역에 연루된 단백질 또는 복합체, 예를 들어 eIF₂, eIF₃, 캡(cap)-결합 단백질 (CBP)을 포함하는 캡-결합 (CP) 복합체 및 진핵 생물 개시 인자 4F (eIF_4F)를 포함할 수 있다. 다양한 시험관내 번역 시스템은 당 업계에 잘 알려져 있으며 구매가능한 키트를 포함한다. 시험관내 번역 시스템의 예는 진핵 생물 용해물, 예를 들어 토끼 망상 적혈구 용해물, 토끼 난모 세포 용해물, 인간 세포 용해물, 곤충 세포 용해물 및 맥아 추출물을 포함한다. 용해물은 Promega Corp. (Madison, Wis.); Stratagene (La Jolla, Calif.); Amersham (Arlington Heights, Ill.); 및 GIBCO/BRL (Grand Island, N.Y.)과 같은 제조자로부터 구매가능하다. 시험관내 번역 시스템에 사용하기 위한 RNA는 당 업계에 공지된 방법에 따라 예를 들어 SP6 또는 T7 프로모터를 사용하여 시험관 내에서 제조할 수 있다.

다른 방법에 있어서, IFN-β 치료제는 숙주 세포 내의 내인성 유전자로부터 발현된다. 이 방법은 IFN-β 유전자의 코딩 영역의 상류에 이종성 프로모터, 예를 들어 유도성 프로모터를 삽입하는 단계, 내인성 IFN-β 유전자를 발현시키는 단계 및 생성되는 IFN-β를 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 이종성 프로모터는 당 업계에 공지된 방법에 따라 "넉-인 (knock-in)"에 의해, 또는 대안적으로는 IFN-β 유전자 내에서의 프로모터의 삽입에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.

본 발명에 따라 얻어지는 IFN-β 치료제는 이 치료제의 제조에 사용되는 숙주 유기체에 따라 글리코실화되거나 글리코실화되지 않을 수 있다. 박테리아가 숙주로 선택된다면 생성되는 IFN-β 치료제는 글리코실화되지 않는다. 반면, 진핵 생물 세포는 IFN-β 치료제를 글리코실화한다.

형질전환 숙주에 의해 생성되는 IFN-β 치료제는 임의의 적합한 방법에 따라 정제될 수 있다. IFN-β를 정제하기 위한 다양한 방법이 공지되어 있다. 예를 들어 미국 특허 제4,289,689호, 동 제4,359,389호, 동 제4,172,071호, 동 제4,551,271호, 동 제5,244,655호, 동 제4,485,017호, 동 제4,257,938호, 동 제4,541,952호 및 동 제6,127,332호 참조. 바람직한 실시 형태에 있어서, IFN-β는 예를 들어 문헌[Okamura et al., "Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent Column Chromatography And N-Terminal Amino Acid Sequence." Biochem., 19, pp. 3831-35 (1980)]에 기술되어 있는 바와 같이 면역 친화성에 의해 정제된다.

예를 들어 IFN-β 단백질 및 그의 변이체는 통상적인 조건에 따라, 예를 들어 추출, 침전, 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 전기영동 등에 따라 단리 및 정제될 수 있다. 예를 들어 인터페론 단백질 및 단편은 그의 용액을 인터페론 수용체가 고정된 컬럼에 통과시킴으로써 정제될 수 있다 (미국 특허 제4,725,669호 참조). 이어서 결합된 인터페론 분자는 무질서 지향성 (chaotropic) 염을 이용한 처리 또는 수성 아세트산을 이용한 용출에 의해 용출될 수 있다. 면역글로불린 융합 단백질은 이 융합 단백질을 포함하는 용액을, 융합 단백질의 Fc 부분에 선택적으로 결합하는 고정화 단백질 A 또는 단백질 G를 포함하는 컬럼에 통과시킴으로써 정제할 수 있다. 예를 들어 문헌[Reis, K. J., et al., J. Immunol. 132: 3098-3102 (1984)]; PCT 출원 공보 제W087/00329호 참조. 이어서 키메라 항체를 무질서 지향성 염을 이용한 처리 또는 수성 아세트산을 이용한 용출에 의해 용출할 수 있다.

대안적으로는 인터페론 단백질 및 면역글로불린-융합 분자를 항-인터페론 항체 컬럼, 또는 항-면역글로불린 항체 컬럼 상에서 정제하여 실질적으로 순수한 단백질을 수득할 수 있다. "실질적으로 순수한"이라는 용어는 자연적으로 단백질과 결부된 불순물이 단백질에 없다는 것을 고려하는 것이다. 실질적으로 순수하다는 것은 전기영동에 의한 단일 밴드로 입증될 수 있다.

생성 및 정제된 IFN-β는 예를 들어 펩티드 지도화에 의해 특성화될 수 있다. 예를 들어 IFN-β 치료제 샘플은 예를 들어 미국 특허 제6,127,332호에 기술된 바와 같이 엔도프로티나제 Lys-C로 절단되어 역상 HPLC 상에서 분석될 수 있다.

바람직한 실시 형태에 있어서, IFN-β 치료제에는 실질적으로 다른 세포 물질, 예를 들어 단백질이 없다. "정제된 IFN-β 치료제 제제"라는 용어는 오염 세포 물질, 예를 들어 핵산, 단백질 및 지질이 약 20% (건조 중량으로) 미만, 바람직하게는 오염 세포 물질이 약 5% 미만인 IFN-β 치료제 제제를 나타낸다. 바람직한 IFN-β 치료제 제제는 오염 세포 물질이 약 2% 미만이며 바람직하게는 오염 세포 물질이 약 1% 미만이며 가장 바람직하게는 오염 세포 물질이 약 0.5; 0.2; 0.1; 0.01; 0.001% 미만이다.

바람직한 IFN-β 치료제 조성물에는 다른 세포 단백질 (본 명세서에서 "오염 단백질"로도 칭해짐)이 또한 실질적으로 없는데, 즉, 조성물은 오염 단백질이 약 20% (건조 중량으로) 미만이며 바람직하게는 오염 단백질이 약 5% 미만이다. 바람직한 본 발명의 폴리펩티드 제제는 오염 단백질이 약 2% 미만이며; 더욱 더 바람직하게는 오염 단백질이 약 1% 미만이며 가장 바람직하게는 오염 단백질이 0.5; 0.2; 0.1; 0.01; 0.001% 미만이다.

IFN-β 제제의 순도와 농도는 예를 들어, 샘플을 겔 전기영동시킴으로써, 그리고, 문헌[Robert K. Scopes, Protein Purification, Principles and Practice, Third Ed., Springer Verlag New York, 1993], 및 그 안에 인용된 문헌들에 개시된 바와 같이, 당업계에 공지된 방법에 따라 결정될 수 있다.

IFN-β 치료제의 생물학적 활성은 예를 들어, EP-B1-41313호 및 WO 00/23472호에 개시된 바와 같이, 예를 들어 항바이러스 활성의 항체 중화, 단백질 키나제, 올리고아데닐레이트 2,5-A 신테타제 또는 포스포디에스테라제 활성의 유도와 같은 당업계에 공지된 임의의 적절한 방법에 의해 분석할 수 있다. 그러한 분석은 또한 면역조절 분석(예를 들어, 미국 특허 4,753,795호 참고), 성장 억제 분석, 및 인터페론 수용체를 발현하는 세포에의 결합의 측정을 포함한다. 예시적인 항바이러스 분석은 미국 특허 6,127,332호 및 WO 00/23472호에 더 개시된다.

IFN-β 치료제가 사구체신염을 치료하는 능력은 또한 예를 들어 실시예에서 개시되고 여기서 더 개시된 것들과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다. 시험은 예를 들어 실시예에서 개시된 대로 실시될 수 있다.

IFN-β 치료제는 또한 하기의 상표로 시판되는 것을 구입할 수 있다: AVONEX? (IFN-β-1a) (Biogen, Inc., Cambridge, MA), REBIF? (IFN-β-1a) (Serono, S.A., Geneva, Switzerland); BETAFERON? 또는 Bferon (IFN-β-1b) (Schering Aktiengesellschaft, Berlin, Germany); 및 BETASERON? 또는 Bseron (Berlex, Montville, NJ;IFN-β-ss-1b). AVONEX? 및 REBIF?는 차이니즈 햄스터 난소 세포에서 생산된 재조합 인간 글리코실화 IFN-β이다. BETAFERON? 및 BETASERON?는 세균에서 생산된다.

4. IFN-β 치료제를 이용한 치료 방법

본 발명은 IFN-β 치료제의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 사구체신염에 걸리거나 사구체신염이 발병할 가능성이 있는 대상에서 사구체신염 또는 만성 신부전증을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 대상은 사구체신염 또는 만성 신부전증에 걸린 것으로 확인된 대상일 수 있다.

"급성신장염" 또는 "급성 사구체신염"으로도 불리는 사구체신염은 사구체에 영향을 미치는 급성이지만, 일시적인 염증 과정이며, GFR의 급성 감소, 결과적으로 유체 불균형 및 전해질 비정상을 일으킨다. 사구체신염의 증상은 하기를 포함한다: 단백뇨; 사구체 여과율(GFR) 감소; 수분 보유를 야기하여 고혈압 및 부종을 일으키는, 질소혈증(요독증, 과다한 혈액 우레아 질소- BUN) 및 염 보유를 포함한 혈청 전해질 변화; 혈뇨 및 적혈구 캐스트를 포함한 비정상 요침전물; 저알부민혈증; 과지질혈증; 및 지질뇨증.

예를 들어 하기하는 바와 같은 많은 질환들이 사구체신염에 관련된다. 충분히 심각하면, 급성 사구체신염이 급성 또는 빠르게 진행하는 신부전으로 귀결될 수도 있다. 빠르게 진행하는 신부전과 연합된 급성 사구체신염은 그 임상적 행동때문에 빠르게 진행하는 사구체신염으로 불릴 수도 있는 일반적인 시나리오이다. 사구체 벽의 손상이 급성 사구체신염에서 일관되게 발견되므로, 적혈구와 알부민은 보우만의 공간으로 들어가서 소변으로 갈 것이다. 소변내의 적혈구 세포, 신부전 및 유체 항상성 이상의 조합은 신장염 증후군으로 불린다. 혈장 단백질의 다량 손실은 신장증후군으로 불리는 상태를 야기할 수 있으며, 이 경우 소변으로 손실된 단백질은 혈청 단백질 균형을 깨뜨려 저혈청 알부민, 지질 이상 및 부종을 야기한다. 따라서, 일반적으로 적혈구 세포 캐스트를 갖는 단백뇨(알부민뇨) 및 혈뇨의 실험적 발견은 급성 사구체신염의 진단을 위해 필요한 반면, 이들 발견의 부재는 다른 진단을 제안한다. 예를 들어, 요세뇨관간질 신장염은 사구체 모세뇨관에 상관없이 신장 세뇨관 및 간질의 일시적인 급성 염증에 관련된다. 급성 사구체신염에서처럼, 혈뇨, 적혈구 세포 캐스트 및 GFR 감소가 발생하지만, 단백뇨는 덜 발견되며 주로 알부민 대신 저분자량 단백질에 관련된다.

많은 질환이 급성 사구체신염의 증후군을 일으킨다. 신장 생검은 일반적으로 어느 정도의 신부전이 존재하건 하지 않건 간에 급성 사구체신염을 가진 환자를 평가하기 위해 요구된다. 진단, 예후 및 치료는 모두 신장 생검에서 확인된 정확한 조직학적 및 미세구조 패턴에 의해 결정된다. 더욱이, 생검 조직은 흔히 실시되는 면역형광 분석을 이용하여, 면역 복합체, 면역글로불린 및 특정 사구체신염에 관련된 다른 물질의 유형을 결정하기 위해 분석될 수 있다. 신장에 영향을 주는 질환은 그들이 사구체 여과율에 영향을 미쳐 일부 유형의 신부전을 야기하기에 충분한 네프론 단위 손상을 야기하건 안하건간에, 그들의 발병기전에 따라 분류될 수 있다.

사구체 질환의 다양한 특징을 설명하기 위해 전통적인 명명법이 생겨났다. 사구체신염은 상기한 바와 같이 종종 염증 과정을 가르킴에도 불구하고, 사구체 질환, 사구체병증 및 사구체신염은 문헌에서 서로 바꾸어서 사용될 수 있다. 사구체 질환은 병리학이 신장에서 발생하여 그로부터 전신성으로 확대될 때 일차로 분류되며; 사구체 질환은 그들이 일부 다른 다중시스템 질환으로부터 생겨날 때 이차로 명명된다. 광학 현미경에서 보여지는 병리학적 특징은 사구체 질환의 유형의 추가적인 특징 규명을 가능하게 한다. 사구체 뭉치의 일부에 영향을 주는 병변은 부분성으로 불리는 반면, 사구체 뭉치의 거의 모두에 영향을 주는 병변은 전신성으로 불린다. 사구체내의 세포 수의 증가를 특징으로 하는 이상은 세포수 증가가 백혈구의 침윤에 의한 것이건 또는 기존 사구체 세포의 증식에 의한 것이건 간에 증식성으로 불린다. 보우만 캡슐 세포에 관련된 세포 증식은 모세뇨관외로 불리며; 내피 또는 혈관사이 세포에 관련된 증식은 모세뇨관내 또는 모세뇨관내로 불린다. 보우만 주머니에 모여 반달 모양을 형성한 세포 집단은 반월로 불리며, 대개 증식성 마루 상피 세포 및 침윤성 단핵구로 이루어진다. 반월상 사구체신염은 사구체에서 반월 형성을 특징으로 하는 급성 사구체신염 유형이다. 이 상태는 종종 빠르게 진행하는 신부전과 연합되므로, 용어 반월 사구체신염은 빠르게 진행하는 사구체신염과 서로 바꾸어서 이용될 수 있다. 만일 사구체 질환이 면역 침전물에 의한 사구체 기저막의 확장을 특징으로 하면, 막성으로 불린다. 전술한 용어들의 조합은 그들의 주요 병리학적 특징에 기초하여 사구체 질환을 설명하기 위해 이용된다. 염증성 사구체병증으로도 불리는 증식성 사구체병증은 국소 증식성 사구체신염, 확산 증식성 사구체신염, 혈관간 증식성 사구체신염, 및 반월상 사구체신염과 같은 상태를 포함하며, 각 용어는 증식성 세포의 위치 및/또는 유형을 제안한다. 이들 상태는 요 침전물내의 혈액 세포 및 단백질을 특징으로 하지만, "신장염" 모습으로 불리는 신장증후군을 야기할 단백질 손실양은 없다. 막성 사구체병증은 사구체 기저막과 내장 상피 세포를 포함한, 단백질을 위한 사구체 여과 장벽에의 변화에 관련된다. 막성 사구체병증, 최소 변화 질환, 및 국소 및 부분 사구체경화증을 포함한 이러한 병들은 심각한 단백질 손실을 야기하여 신장증후군을 일으킬 수 있다. 이름이 시사하는 바와 같이, 막증식성 사구체신염은 세포 증식 및 변화된 사구체 여과 장벽 둘 모두를 시사하는 임상적 특징을 갖는 하이브리드 질환이다. 단백질성 또는 원섬유 물질의 혈관외 침착을 특징으로 하는 이들 질환은 사구체 침착 질환으로 불린다. 이들은 신장 및 신장 성분 둘다를 포함할 수 있으며, 따라서 증식성 또는 막성 질환에서의 발견과 중복된다. 신장에 영향을 주는 최종 카테고리는 신장 미세혈관구조내에서 응고가 발생하는 질환인 혈전미세혈관병증이다. 이들 카테고리의 각각은 특정 유형의 병인을 갖는다.

증식성 사구체병증의 스펙트럼이 존재하여, 상이한 조직병리학적 특징이 상이한 염증 과정으로부터 생김을 제안한다. 예를 들어, 확산 증식성 사구체신염은 갑작스런 심한 항원 부하에 대한 급성 면역 반응을 나타낼 수 도 있다. 반월 사구체신염은 예비감작된 개체에서 보다 작은 항원 챌린지에 대한 덜 급격한 면역 반응에 관련될 수도 있다. 국소 증식성 또는 혈관간 증식성 사구체신염은 스펙트럼의 가장 덜 공격적인 끝을 나타내며, 이때 환자는 단지 느리게 진행하는 신장 불충분을 경험할 수 있다.

신장 생검의 면역형광 연구는 증식성 사구체병증의 주요 원인을 구별하는 것을 돕는다. 세 가지의 광범위한 진단 카테고리가 있으며, 각각은 격렬한 세포 증식과 결합된 면역형광에서 가시적인 면역글로불린 침착의 특정 패턴과 관련된다. 면역글로불린의 과립 침착은 첫번째 카테고리를 특징으로 한다: 면역-복합체 사구체신염. 사구체 기저막을 따른 면역글로불린의 선형 침착은 두번째 카테고리의 특징이다: 항-GBM 질환. 최소의 면역글로불린 침착은 세번째 카테고리의 특징이다: : 소수-면역 사구체신염. 상기 면역-복합체 사구체신염은 알려진 항원성 자극에 대한 반응을 나타낼 수도 있으며(예를 들어 연쇄구균감염후 사구체신염), 또는 다중시스템 면역-복합체 질환(예를 들어 루푸스, 한랭글로불린혈증, 또는 세균성 심내막염)의 일부를 형성할 수도 있으며; 일부 경우에는, 어떤 원인도 결정될 수 없으며 그 질환은 원인불명으로 간주된다. 항-GBM 질환은 제IV형 콜라겐을 공격하는 자가항체가 형성되는 드문 질환이다. 항-GBM 질환을 가진 환자의 대다수는 또한 굳파스퇴르 증후군으로 불리는 상태인 폐 출혈을 갖는다. 소수-면역 사구체신염은 비정상적인 농도의 순환성 항호중구 세포질 항체를 특징으로 하여, 체액 면역의 이상조절을 의미한다.

면역학적으로 매개된 사구체신염은 후천성 신장 질환의 큰 분획을 차지한다. 일반적으로 사구체 뭉치내의 항체, 종종 자가항체의 침착이 있다. 항체-매개 사구체신염에 관련된 세포 면역 기작은 항체 생산을 조절하고 항체-의존성 세포독성을 유도한다. 환자에서 대부분의 항체-매개 사구체신염은 자가항원과 순환 항체의 반응에 의해 시작된다.

항체는 몇가지 상이한 과정의 결과로서 사구체에서 발견될 수도 있다. 첫째, 순환 자가항체는 정상 사구체의 성분인 고유 자가항원과 반응할 수도 있다. 둘째, 사구체내에 침착된 순환 자가항체 및 외인성 항원은 사구체 면역 복합체의 제자리 형성을 야기할 수도 있다. 세째, 전신성 순환에서 형성된 면역 복합체는 사구체내에 포획될 수도 있다. 항체 침착의 위치는 사구체 질환의 임상적 특징을 상당히 결정할 것이다. 내피밑 공간 또는 사구체간질에서 항체의 급성 침착은 사구체 모세뇨관으로부터 백혈구와 혈소판의 신속한 보충을 특징으로 하는 격렬한 신장 반응을 야기할 수 있다. 내피밑 공간에서 항체의 침착은 일반적으로 덜 격렬한 염증성 세포 침윤물을 갖는 단백뇨를 특징으로 하는 콩팥 유형 반응을 유도한다.

이들 면역 과정은 사구체내에서 염증 반응의 캐스캐이드를 개시하여, 사구체 손상 및 이어지는 회복을 야기할 수도 있다. 고유의 또는 이식된 사구체 항원에 대한 자가항체의 반응성은 보체, 화학유인물질, 케모카인 및 사이토카인의 생산을 야기한다. 이로 인해 보체 의존성 및 보체 비의존성 기작이 시작되어, 사구체 세포의 손상을 일으킨다. 백혈구와 혈소판은 또한 사구체로 보충되어 추가 손상을 야기한다. 수개월 내지 수년에 걸친 지속적인 면역 복합체 침착은 또한 기저막 생산의 주목할만한 증가를 야기할 수 있다. 임의의 면역-매개 사구체병증을 위한 용해 과정은 국소 면역 활성이 그쳐야 발생할 수 있으며, 더 이상의 항체 생산 또는 면역 복합체 형성이 없으며, 침착된 및 순환중인 면역 복합체가 제거되고, 추가의 염증 세포 보충이 방지되며, 신장 조직에서 염증 매개자가 분해되며, 혈관 톤과 내피 접착성이 정상화된다.

사구체 손상에 이어, 반흔을 남기는 치료가 있을 수도 있다. 회복은 완전하며 남아있는 손상은 없다. 보다 일반적으로는, 사구체 반흔 형성은 광범위하여 신장 기능에 영향을 준다. 사구체에서의 치유 과정에 수반되는 사이토카인인 전환성 성장 인자 β(TGF-β)가 세포외 매트릭스의 생산을 자극하며, 매트릭스 단백질을 분해하는 조직 프로테아제의 합성을 억제하여, 사구체 손상 후 반흔 형성을 증가시킴이 인식되어 왔다. 사구체 손상 후의 반흔형성은 기존의 생존 네프론을 더 손상시켜, 진행성 네프론 손실을 야기한다. 더 많은 기능성 네프론이 소실되면, 나머지 네프론이 전술한 대로, 그들을 손상시키는 과정을 보상한다. 최종 결과는 신장 기능의 진행성 감소로서, 마지막 단계 신장 질환의 최종 단계를 갖는 만성 신부전증으로 끝날 수도 있다.

IFN-β 치료제는 또한 HIV 감염으로 인한 원인불명 및 이차 형태를 포함한, 국소 사구체경화증 및 쇠약성 사구체병증을 치료하기 위해 이용될 수 있다. 쇠약성 사구체병증은 신속하게 진행하는 질환으로서 효과적인 치료법이 없는 신부전을 야기한다. 이 질환은 주로 HIV 환자에서 발생한다. 단백뇨가 이 질환에서 주요 역할을 하므로, 단백뇨를 상당히 감소시키는 IFN-β 치료제가 이 질환을 개선하는 데 상당한 효과를 가질 것이다. 단백뇨가 주요 역할을 하며 IFN-β 치료제가 유용할 것으로 예상되는 다른 질환은 최소 변화 신장병증(MCN) 및 최소 변화 신장증후군(MCNS)으로도 불리는 최소 변화 질환이다.

따라서, IFN-β 치료제는 사구체의 염증과 관련된 신장 상태, 예를 들어 하기 신장 상태 중 임의의 것을 치료하기 위해 이용될 수 있다: 국소 사구체경화증 및 쇠약성 사구체병증, 최소 변화 질환, 급성 사구체신염, 반월 사구체신염, 신장염 증후군, 콩팥 증후군, 일차 사구체신염, 이차 사구체신염, 증식성 사구체신염, 막성 사구체신염, 막증식성 사구체신염, 면역-복합체 사구체신염, 항-사구체 기저막(항-GBM) 사구체신염, 소수-면역 사구체신염, 당뇨성 사구체병증, 만성 사구체신염 및 선천성 신장염. 만성 신장 질환 및 말기 신장 질환과 같은, 이들 신장 질환에서 생기는 임의의 질환 또는 상태는 또한 본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있다.

5. 치료 대상

일반적으로, 본 발명의 방법은 사구체신염, 만성 신부전증에 걸리거나 발병할 위험이 있는 임의의 포유류 대상, 또는 신장 대체 치료(즉, 장기 투석 또는 신장 이식)의 위험이 있는 임의의 포유류 대상을 위해 이용될 수 있다. "사구체신염, 만성 신부전증에 걸리거나 발병할 위험이 있는 대상"은 기능성 네프론의 진행성 손실과 관련된 신장 기능의 진행성 손실로 고통받을 것으로 합리적으로 예상되는 대상이다. 대상이 사구체신염 또는 만성 신부전증에 걸리거나 발병할 위험이 있는지 여부는 관련 의학 또는 수의학 분야의 당업자가 일상적으로 할 수 있는 결정이다. 사구체신염 또는 만성 신부전증에 걸리거나 발병할 위험이 있는(또는 신장 대체 치료가 필요할 위험이 있는) 대상은 하기를 포함하며 이에 한정되지 않는다: 만성 신부전증, 말기 신장 질환, 만성 당뇨성 신장병증, 고혈압성 신장경화증, 만성 사구체신염, 선천성 신장염, 및/또는 신장 형성이상으로 고통받는 것으로 간주될 수 있는 대상; 단백뇨, 혈청 전해질 변화, 예를 들어 질소혈증(요독증, 즉, 과다한 혈액 우레아 질소 또는 "BUN")을 갖는 대상 ; 고혈압 및 부종을 야기하는 염 보유, 혈뇨 및 적혈구 캐스트를 포함한 비정상 요침전물; 저알부민혈증, 과지질혈증, 및 지질뇨; 사구체 비대증, 세뇨관 비대증, 만성 사구체경화증, 및/또는 만성 요세뇨관간질 경화증을 나타내는 생검을 갖는 대상; 신장 섬유증 또는 정상보다 작은 신장을 나타내는 초음파, MRI, CAT 스캔, 또는 다른 비침입성 검사를 갖는 대상. 사구체신염 또는 CRF에 걸리거나 발병할 위험이 있는 대상의 추가 징후는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 하기 모두가 대상이 사구체신염 또는 CRF에 걸리거나 발병할이 있는지를 결정하기 위한 기준이다: 요침전물에 존재하는 비정상적인 수의 광범위한 캐스트를 갖는 대상; 장시간에 걸쳐 대상에 대해 예상되는 GFR의 약 50% 미만, 더욱 구체적으로는 약 40%, 30%, 또는 20%인 GFR을 갖는 대상; 장시간에 걸쳐 약 50 ml/min 미만, 더욱 구체적으로는 약 40 ml/min, 30 ml/min 또는 20 ml/min인 GFR을 가지며 적어도 약 50kg의 몸무게를 갖는 남성; 장시간에 걸쳐 약 40 ml/min 미만, 더욱 구체적으로는 약 30 ml/min, 20 ml/min 또는 10 ml/min인 GFR을 가지며 적어도 약 40kg의 몸무게를 갖는 여성; 건강하지만 다른 점은 유사한 대상에 의해 보유된 기능성 네프론의 수의 약 50% 미만, 더욱 구체적으로는 약 40%, 30% 또는 20%인 기능성 네프론 수를 보유하는 대상; 신장 하나를 갖는 대상; 및 신장 이식 수용자인 대상.

치료될 수 있는 포유류 대상은 인간 대상 또는 환자를 포함하며 이에 한정되지 않는다. 또한, 본 발명은 인간의 친구로서 유지되는 가축(예를 들어 개, 고양이, 말)의 치료에 이용될 수 있으며, 이들은 상당한 상업적 가치를 가지며(예를 들어 젖소, 소고기용 소, 경기용 동물), 상당한 과학적 가치를 가지며(예를 들어 멸종 위기의 종의 포획 또는 자유 표본), 또는 다른 가치를 갖는다. 치료를 위한 대상은 사구체신염, 만성 신부전증 또는 말기 신장 질환의 위험과 관련된 징후, 예를 들어 신장 대체 치료의 필요외의 다른, IFN-β 치료제를 이용한 치료를 위한 징후를 제시할 필요가 없다. 즉, 치료 대상은 IFN-β 치료제를 이용한 치료를 위한 다른 치료 징후가 없을 것으로 예상된다. 하지만, 일부 경우에, 대상은 IFN-β 치료제를 이용한 치료가 표시될 다른 증상(예를 들어 간염 감염과 같은 바이러스 질환)을 나타낼 수도 있다. 그러한 경우에, 치료는 과다한 투여를 피하도록 적절하게 조절되어야 한다.

의학 또는 수의학 분야의 당업자는 사구체신염, 만성 신부전증의 상당한 위험 또는 신장 대체 치료에 대한 상당한 위험이 있는 대상을 인식하도록 훈련된다. 특히, 현재 개시된 것 및 기타 치료 방법에 관련한 임상 및 비임상 시험 및 축적된 경험은 주어진 대상이 사구체신염, 만성 신부전증에 걸리거나 발병할 위험, 또는 신장 대체 치료가 필요할 위험이 있는 지 여부, 및 본 발명에 따른 치료를 포함한 임의의 특정 치료가 대상의 필요에 가장 적절한 지 여부를 결정하는 데 있어 숙련된 실시자에게 정보를 제공할 것으로 예상된다.

일반적인 문제로서, 포유류 대상은 기능성 네프론의 진행성 손실과 관련된 신장 기능의 진행성 손실로 이끄는 상태로 고통받는 것으로 이미 진단되었거나, 또는 현재 고통받는 것으로 간주되면, 사구체신염, 만성 신부전증에 걸리거나 발병할 위험이 있거나 또는 신장 대체 치료를 필요로 할 위험이 있는 것으로 간주될 수도 있다. 그러한 상태는 말기 신장 질환, 만성 당뇨성 신장병증, 당뇨성 사구체병증, 당뇨성 신장 비대증, 고혈압성 신장경화증, 고혈압성 사구체경화증, 만성 사구체신염, 선천성 신장염, 신장 형성이상 및 신장 이식체 이식 후의 만성 거부 등을 포함하며 이에 한정되지 않는다. 이들 및 다른 질환 및 당업계에 공지된 상태는 일반적으로 기능성 네프론의 점진적인 손실 및 만성 신부전증의 착수로 이끈다.

빈번하게, 의학 또는 수의학 분야의 당업자는 신장 생검 샘플의 검사시에 예후, 진단 또는 치료 결정을 할 수도 있다. 그러한 생검은 신장의 질환을 진단하는 데 유용한 많은 정보를 제공한다. 사구체신염, 만성 신부전증에 걸리거나 발병할 위험이 있는, 또는 신장 대체 치료가 필요한 위험이 있는 대상은, 사구체에서 예를 들어 T 세포와 거대세포와 같은 염증 세포의 존재, 사구체 비대증, 세뇨관 비대증, 사구체경화증, 요세뇨관간질 경화증 등을 포함하며 이에 한정되지 않는, 신장 생검으로부터의 조직학적 징후에 의해 인식될 수 있다.

신장 형태를 평가하기 위한 덜 침입성인 기법은 MRI, CAT 및 초음파 스캔을 포함한다. 대조 제제 또는 영상화 제제(예를 들어 방사성 염료)를 이용하는 스캐닝 기법 또한 이용가능하지만, 이들중 일부는 신장 조직 및 구조에 특히 독성이며 따라서 그들의 사용은 사구체신염 또는 만성 신부전증에 걸리거나 발병할 위험이 있는 대상에서는 잘못된 충고일 수도 있다. 그러한 비침입성 스캐닝 기법은 신장 섬유증 또는 경화증, 국소 신장 괴사, 신장 낭, 및 신장 대 비대증과 같은 상태를 검출하는 데 이용될 수 있으며, 상기 상태는 대상을 사구체신염, 만성 신부전증을 갖거나 위험이 있는, 또는 신장 대체 치료를 필요로 할 위험이 있는 카테고리에 놓을 것이다.

빈번하게, 예후, 진단 및/또는 치료 결정은 신장 기능의 임상적 징후에 기초할 것이다. 한 가지 그러한 징후는 비정상적인 수의 "광범위한" 또는 "신부전" 캐스트의 요침전물내의 존재이며, 이것은 세뇨관 비대증을 나타내며 만성 신부전증을 정형화하는 보상성 신장 비대증을 제안한다. 신장 기능의 다른 징후는 사구체 유동율(GFR)이며, 이것은 특정 마커의 제거 속도를 정량함으로써 직접 측정되거나, 또는 간접적인 측정으로부터 추측될 수 있다.

본 발명의 치료 방법은 GFR의 임의의 특정 측정 또는 신장 기능의 임의의 기타 특정 마커를 제시하는 대상으로 제한될 필요가 없다. 사실, 대상의 GFR, 또는 신장 기능의 임의의 다른 특정 마커는 본 발명의 치료를 실시하기 전에 결정될 필요는 없다. 그럼에도 불구하고, GFR의 측정은 신장 기능을 평가하는 바람직한 수단으로 간주된다.

당업계에 공지된 바대로, GFR은 혈장으로부터 소변으로의 기준물 또는 마커 화합물의 제거 속도를 반영한다. 고려되는 마커 화합물은 일반적으로 사구체에 의해 자유롭게 여과되지만 신장 세뇨관에 의해 활발하게 분비되거나 재흡수되지 않으며 순환 단백질에 의해 크게 결합되지 않는 것이다. 제거 속도는 일반적으로 24시간내에 생산된 소변의 부피, 및 소변과 혈장내의 마커의 상대적인 농도에 관련되는, 상기에 제시한 식에 의해 정의된다. 보다 정확하게는, GFR은 또한 신체 표면적에 대해 보정되어야 한다. "황금표준" 기준 화합물은 그 여과 특성 및 혈청-결합의 결핍때문에 인슐린이다. 하지만, 이 화합물의 농도는 혈액 또는 소변에서 정량하기 어렵다. 따라서, 크레아티닌을 포함한 다른 화합물의 제거 속도가 종종 인슐린 대신 이용된다. 또한, 마커의 실제 소변 농도, 생산된 소변의 실제 일일 부피, 또는 실제 신체 표면적의 고려를 생략함으로써 실제 GFR의 평가를 단순화하는 다양한 식이 종종 이용된다. 이들 값은 다른 인자에 기초한 개산치, 동일한 대상을 위해 확립된 기본 값, 또는 유사한 대상을 위한 표준 값에 의해 대체될 수 있다. 이들 개산치는 하지만 정상 또는 건강한 대상의 신장 기능에 기초한 부적절한 가정을 수반할 수 있으므로 주의하여 사용하여야 한다. 또한, p-아미노히푸레이트(PAH)의 제거가 신장 제거 속도를 평가하기 위해 이용된다.

일부 특징을 가진 건강한 대상을 위한 GFR의 예상값을 설명하는 다양한 방법과 식이 개발되었다. 특히, 혈장 크레아티닌 수준, 연령, 체중 및 성별에 기초한 GFR 예상값을 제공하는 식이 이용가능하다(예를 들어 "정의" 부분 참고). 물론 다른 식이 이용될 수 있으며, 주어진 연령, 체중, 성별, 및/또는 혈장 크레아티닌 농도의 대상을 위해 표준 값의 표가 생성될 수 있다. GFR을 측정하거나 개산하는 보다 새로운 방법(예를 들어 NMR 또는 MRI 기법을 이용) 또한 이제 당업계에서 이용가능하며 본 발명에 따라 이용될 수 있다(예를 들어 미국 특허 5,100,646호와 5,335,660호).

일반적으로, GFR이 측정되거나 평가되는 방식과 무관하게, 대상은 장기적으로 그 대상에 대해 예상되는 GFR의 약 50% 미만의 GFR을 가질 때, 사구체신염, 만성 신부전증에 걸리거나 발병할 위험이 있거나, 또는 신장 대체 치료를 필요로 할 위험이 있는 것으로 간주될 수 있다. 상기 위험은 GFR이 더 낮게 떨어질 수록 더 큰 것으로 간주된다. 따라서 대상은 만성적으로 기대되는 GFR의 약 40%, 30% 또는 20% 미만인 GFR을 가질 경우 위험이 증가하는 것으로 간주된다. 체죽이 약 50 kg 이상인 인간 남성 대상은 만성적으로 약 50 ml/분 미만인 GFR을 가질 경우 사구체신염, 만성 신부전증 상태에 있거나 그의 위험성을 갖거나, 신장 대체 요법이 필요한 위험에 있는 것으로 간주될 수 있다. 이 위험성은 GFR이 더욱 낮게 감소될수록 더욱 커진다고 생각된다. 따라서 대상은 만성적으로 약 40, 30 또는 20 ml/분 미만인 GFR을 가질 경우 위험이 증가한다고 간주된다. 체중이 약 40 kg 이상인 인간 여성 대상은 만성적으로 약 40 ml/분 미만인 GFR을 가질 경우 사구체신염, 만성 신부전증 상태에 있거나 그의 위험성을 갖거나, 신장 대체 요법이 필요한 위험에 있는 것으로 간주될 수 있다. 이 위험성은 GFR이 더욱 낮게 감소될수록 더욱 커진다고 생각된다. 따라서, 대상은 만성적으로 약 30, 20 또는 10 ml/분인 GFR을 가질 경우 위험성이 증가된다고 간주된다. 일반적으로 대상은 건강하며 유사한 대상의 기능성 네프론 단위의 갯수의 약 50% 미만인 갯수의 기능성 네프론 단위를 보유할 경우 사구체신염, 만성 신부전증 상태에 있거나 그의 위험성을 갖거나, 신장 대체 요법이 필요한 위험에 있는 것으로 간주된다. 상기한 바와 같이, 이 위험성은 기능성 네프론의 갯수가 더욱 감소할수록 더 커지는 것으로 생각된다. 따라서, 대상은 유사한 건강한 대상에 있어서의 갯수의 약 40, 30 또는 20% 미만인 갯수의 기능성 네프론을 가진다면 위험이 증가된다고 생각된다.

마지막으로, 다른 신장의 손실과는 상관 없이 (예를 들어 신체적 외상, 수술에 의한 제거, 출생 시의 결함) 단일 신장을 보유하는 대상이 사구체신염, 만성신부전증의 위험이 있거나 신장 대체 요법이 필요하다는 것이 명백한 것으로 생각될 수 있다. 이는 하나의 신장이 나머지 신장을 괴롭힐 수 있는 질환 또는 병으로 인하여 손실된 대상의 경우 특히 사실이다. 이와 유사하게, 이미 신장 이식체를 이식받거나 이미 장기 투석 (예를 들어 장기 혈액 투석 또는 계속적인 외래 복강 투석)을 받고 있는 대상은 사구체신염, 만성 신부전증의 위험이 있거나 추가의 신장 대체 요법이 필요한 것으로 간주될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 치료될 수 있는 대상은 IFN-β로 치료될 수 있는 것으로 알려진 병 또는 질환, 예를 들어 다중 경화정 및 바이러스 감염에 걸린 이들을 또한 포함한다. 예시적인 바이러스 감염은 간염, 예를 들어 B형 간염 감염을 포함한다. 이러한 상황에 있어서, 두 병 모두의 치료를 위하여 수정된 IFN-β 치료제 투여 섭생이 개발될 수 있다. 대상은 또한 IFNβ로 치료될 수 있는 바이러스 감염에 걸리지 않거나 사구체신염을 야기하는 바이러스 감염에 걸리지 않은 대상일 수 있다. 따라서 예시적인 대상은 간염 바이러스, 예를 들어 B형 또는 C형 간염 바이러스를 보유하지 않거나, 사구체신염이 간염 바이러스, 예를 들어 B형 또는 C형 간염 바이러스에 의해 야기되지 않은 대상을 포함한다. 대안적으로는, 대상은 바이러스 감염에 의해 야기되는 사구체신염에 걸리거나 발병할 가능성이 있는 대상일 수도 있다. 다른 실시 형태에 있어서, 대상은 말기 신부전증 또는 신장 세포 암종에 걸리지 않았다.

6. 제형 및 치료 방법

IFN-β 치료제는 이용되는 특정 신장 치료제와 양립성인 임의의 경로에 의해 투여될 수 있다. 따라서 적당할 경우 투여는 정맥내, 복강내, 및 신장 캡슐내 경로의 투여를 비롯한 경구 또는 비경구 투여일 수 있다. 또한, 투여는 본 명세서에 기술된 약제(들 (즉, IFN-β 치료제)의 볼루스 (bolus)의 주기적인 주사에 의한 것일 수 있거나, 외부 (예를 들어 i.v. 백) 또는 내부 (예를 들어 생분해성 이식체 또는 이식된 펌프)의 저장기로부터의 정맥내 또는 복강내 투여에 의해 더욱 계속적으로 행할 수 있다. 본 발명에 따른 방법에 있어서, IFN-β 치료제는 바람직하게는 비경구적으로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "비경구"라는 용어는 에어로졸, 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척수강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.

본 발명의 약제는 임의의 적합한 수단으로, 바람직하게는 직접적으로 (예를 들어 조직 위치로의 국소 투여 또는 주입에 의해 국부적으로) 또는 전신적으로 (예를 들어 비경구 또는 경구 투여에 의해) 개체에게 제공될 수 있다. 약제를 예를 들어 정맥내, 피하 또는 근육내 투여에 의해 비경구적으로 제공할 경우 약제는 바람직하게는 수성 용액의 일부를 포함한다. 이 용액은 원하는 약제를 대상에게 전달하는 것 외에도 대상의 전해질 및/또는 부피 균형에 악영향을 주지 않도록 생리학적으로 허용가능하다. 따라서 약제의 수성 매체는 보통의 생리 염수 (예를 들어 0.9% NaCl, 0.15 M, pH 7-7.4)를 포함할 수 있다.

IFN-β 치료제는 바람직하게는 다수의 공지된 담체 중 임의의 것, 예를 들어 물, 염수, 포스페이트 완충 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 또는 그의 조합일 수 있는 제약적으로 허용가능한 담체를 함유하는 살균 제약 조성물로 투여된다. INF-β 치료제는 예를 들어 IFN-β 치료제의 안정화를 위한 하나 이상의 다른 단백질을 함유하는 조성물의 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어 IFN-β 치료제를 알부민과 혼합시킬 수 있다.

제약 조성물은 IFN-β 치료제를 임의의 제약적으로 허용가능한 담체와 함께 함유할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "담체"라는 용어는 허용가능한 보조제 및 비히클을 포함한다. 본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 제약적으로 허용가능한 담체는 이온 교환제, 알루미나, 스테아르산알루미늄, 레시틴, 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 완충제 물질, 예를 들어 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산칼륨, 포화된 식물 지방산의 부분적 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어 프롤라민 설페이트, 제2인산수소나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트라이실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로오스계 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 울 (wool) 지방을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다.

IFN-β 또는 그의 변이체는 리포좀 전달 시스템의 형태, 예를 들어 작은 단층 소포, 큰 단층 소포 및 다중층 소포의 형태로 투여될 수도 있다. 리포좀은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린을 포함하는 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다. 미국 특허 제5,262,564호에 기술된 바와 같이, 일부 실시 형태에 있어서, 지질 성분의 필름을 약물의 수용액으로 수화시켜 약물을 캡슐화하는 지질층을 형성한다.

IFN-β 또는 그의 변이체는 또한 표적성 약물 담체로서 용해성 중합체와 커플링시킬 수 있다. 이러한 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리하이드록시프로필-메타크릴아미드-페놀, 폴리하이드록시에틸아스파나미드페놀, 또는 팔미토일 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥사이드폴리라이신을 포함할 수 있다. IFN-β 또는 그의 변이체는 또한 단백질, 예를 들어 수용체 단백질 및 알부민에 커플링시킬 수 있다. 또한, IFN-β 또는 그의 변이체는 약물의 방출 제어 성취에 유용한 생분해성 중합체류, 예를 들어 폴리아세트산, 폴리입실론 카프로락톤, 폴리하이드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리다이하이드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 하이드로겔의 가교 결합 또는 양쪽 친매성 블록 공중합체에 커플링시킬 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 제약 조성물은 주사가능한 살균 제제, 예를 들어 주사가능한 살균 수성 또는 유성 현탁물의 형태일 수 있다. 이러한 현탁물은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당 업계에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 주사가능한 살균 제제는 비독성의 비경구용으로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 주사가능한 살균 용액 또는 현탁물일 수도 있는데, 예를 들어 1,3-부탄다이올 중 용액으로서 존재할 수 있다. 이용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매 중에는 물, 링거액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 불휘발성의 살균 오일이 용매 또는 현탁 매체로 통상적으로 이용된다. 이러한 목적에 있어서, 합성 모노- 또는 다이-글리세리드를 비롯한 임의의 순한 (bland) 불휘발성 오일이 이용될 수 있다. 지방산, 예를 들어 올레산 및 그의 글리세리드 유도체가 제약적으로 허용가능한 천연 오일, 예를 들어 올리브유 또는 피마자유, 특히 그의 폴리옥시에틸화 버전의 것이 그러하듯이 주사약 제제에서 유용하다. 이러한 오일 용액 또는 현탁물은 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제도 함유할 수 있다.

INF-β 치료제를 함유하는 제약 조성물은 경구용으로도 주어질 수 있다. 예를 들어 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁물 또는 용액을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 경구용으로 허용가능한 투여 형태로 투여될 수 있다. 경구용의 정제의 경우, 일반적으로 사용되는 담체는 락토스 및 옥수수 전분을 포함한다. 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘도 일반적으로 첨가된다. 캡슐 형태의 경구 투여에 있어서 유용한 희석제는 락토스 및 건조 옥수수 전분을 포함한다. 수성 현탁물이 경구용으로 필요할 경우 활성 성분은 윤활 및 현탁제와 조합된다. 필요할 경우 특정의 감미제, 착향제 또는 착색제도 첨가될 수 있다. 국소적 경피 패치도 사용될 수 있다.

바람직한 실시 형태에 있어서, IFN-β 또는 그의 변이체는 안정화제를 함유하는 액체 조성물로 제공된다. 안정화제는 IFN-β 또는 그의 변이체의 중량을 기준으로 0.3% 내지 5%의 양으로 존재할 수 있다. 안정화제는 아미노산, 예를 들어 산성 아미노산 (예를 들어 글루탐산 및 아스파르트산) 또는 아르기닌 또는 글리신일 수 있다. 안정화제가 아르기닌-HCl일 경우, 그의 농도는 바람직하게는 0.5% (w/v) 내지 5% 범위이며 가장 바람직하게는 3.13%이다 (150 mM의 아르기닌-HCl과 동일함)). 안정화제가 글리신일 경우, 그의 농도는 바람직하게는 0.5% (w/v) 내지 2.0% 범위이며 가장 바람직하게는 0.52%이다 (66.7 mM 내지 266.4 mM과 동일하며, 가장 바람직하게는 70 mM임). 안정화제가 글루탐산일 경우 그의 농도는 바람직하게는 100 mM 내지 200 mM 범위이며, 가장 바람직하게는 170 mM이다 (1.47% 내지 2.94% 범위의 w/v 퍼센트와 동일하며 가장 바람직하게는 2.5%임). IFN-β 또는 그의 변이체의 바람직한 액체 제형 중 농도 범위는 약 30 ㎍/ml 내지 약 250 ㎍/ml이다. 바람직한 농도 범위는 48 내지 78 ㎍/ml이며 가장 바람직한 농도는 약 60 ㎍/ml이다. 국제 표준 값의 면에서는 Biogen 국제 표준치가 천연 인터페론 #Gb-23-902-531에 대한 WHO 국제 표준치에 대하여 표준화되어 IU 단위의 농도 범위 (0.5 ml의 주사 부피에 있어서)는 약 6 IMU 내지 50 IMU이며 가장 바람직한 농도는 12 IMU이다.

바람직하게는 아미노산 안정화제는 약 pH 5.0의 용액 중의 그의 산성 형태 (아르기닌-HCl) 형태로 혼입되는 아르기닌이다. 따라서, 다이온성 부형제가 바람직하다. 바람직하게는 액체 조성물은 용기, 예를 들어 시린지 내에 담기는데, 여기서, 용기는 IFN-β에 대하여 불활성인 물질, 예를 들어 실리콘 또는 폴리에트라플루오로에틸렌으로 코팅되며 액체와 접촉하는 표면을 가진다. 더욱 더 바람직한 조성물의 pH는 4.0 내지 7.2 사이이다. 안정화제를 함유하는 용액은 바람직하게는 동결건조되지 않으며, 제조 및 보관 동안 산소 포함 기체에 처해지지 않은 것이다.

본 발명에서 pH를 약 4.0 내지 약 7.2 사이의 범위, 바람직하게는 약 4.5 내지 약 5.5, 가장 바람직하게는 5.0로 유지하기 위하여 사용되는 포스페이트 완충제 및 유기 산은, WO 98/28007에 또한 기술되어 있는 바와 같이, 통상적인 유기산 및 그의 염의 완충제, 예를 들어 시트레이트 완충제 (예를 들어 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산일나트륨 혼합물 등), 석시네이트 완충제 (예를 들어 석신산-석신산일나트륨 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-석신산이나트륨 혼합물 등), 타르트레이트 완충제, 푸마레이트 완충제, 글루코네이트 완충제, 옥살레이트 완충제, 락테이트 완충제, 포스페이트 완충제 및 아세테이트 완충제일 수 있다.

WO 98/38007에 기술된 바와 같이 제조될 수 있는 예시적 제형은 하기를 포함한다:

(i) 이전에 동결 건조시키지 않는 것이 바람직하며 IFN-β 및 (a) 150 mM 아르기닌-HCl; (b) 100 mM 염화나트륨 및 70 mM 글리신; (c) 150 mM 아르기닌-HCl 및 15 mg/ml의 인간 혈청 알부민; (d) 150 mM 아르기닌-HCl 및 0.1% 플루로닉 (Pluronic) F-68; (e) 140 mM 염화나트륨; (f) 140 mM 염화나트륨 및 15 mg/ml의 인간 혈청 알부민; 및 (g) 140 mM 염화나트륨 및 0.1% 플루로닉 F-68로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 pH 5.0의 20 mM 아세테이트 완충제;

(ii) 이전에 동결 건조시키지 않는 것이 바람직하며 IFN-β 또는 그의 변이체, 170 mM L-글루탐산 및 150 mM 수산화나트륨을 포함하는 pH 5.0의 액체; 및

(iii) 이전에 동결 건조시키지 않는 것이 바람직하며, IFN-β와, (a) 140 mM 아르기닌-HCl 및 (b) 100 mM 염화나트륨과 70 mM 글리신으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 pH 7.2의 20 mM 포스페이트 완충제.

바람직한 조성물은 폴리소르베이트, 예를 들어 0.005% (w/v)의 폴리소르베이트 20도 포함한다.

IFN-β는 대상에게 투여하기 이전에 용해 또는 현탁될 수 있거나 용해 또는 현탁될 수 없는 건조 분말 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 중합체, 예를 들어 PEG에 콘쥬게이션된 IFN-β는 건조 형태로 특히 안정하다는 것이 밝혀졌다 (예를 들어 WO 00/23114 및 PCT/US/95/06008 참조).

본 발명의 제약 조성물은 또한 분무기, 건조 분말 흡입기 또는 계량형 흡입기의 사용을 통한 비강 에어로졸 또는 흡입에 의해 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 제약 제형의 분야에서 잘 알려진 기술에 따라 제조되며 벤질 알코올 또는 기타 적합한 방부제, 생체 흡수성의 증강을 위한 흡수 촉진제, 탄화플루오르, 및/또는 기타 통상적인 용해제 또는 분산제를 이용하여 염수 중 용액으로 제조할 수 있다. 다른 실시 형태에 따르면 본 발명의 화합물을 함유하는 다른 조성물은 코르티코스테로이드, 항염증제, 면역 억제제, 항-대사 산물, 및 면역 조정제로 구성된 군으로부터 선택되는 추가의 약제를 또한 함유할 수 있다. 이러한 각각의 종류 내의 화합물은 문헌["Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Oxford, England, pp. 970-986 (1990)]의 적당한 그룹 표제 하에 열거된 것 중 임의의 것으로부터 선택될 수 있는데, 상기 문헌의 개시 내용은 본 명세서에 참고로 채택된다. 구체적인 화합물로는 테오필린, 설파살라진 및 아미노살리실레이트 (항염증제); 사이클로스포린, FK-506, 및 라파마이신 (면역 억제제); 사이클로포스파미드 및 메토트렉세이트 (항대사물질); 스테로이드 (흡입, 경구 또는 국소용) 및 다른 인터페론 (면역 조정제)가 있다.

비경구 투여에 유용한 용액은 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, A., ed.), Mack Pub., 1990]에 기술되어 있는 제약 업계에서 잘 알려진 임의의 방법으로 제조할 수 있다.

주사가능한 비경구 투여법은 일반적으로 피하, 근육내 또는 정맥내 주사와 주입에 사용된다. 예를 들어 피하 주사법을 사용하여 1주일에 걸쳐 0.01-100 ㎍/kg, 또는 더 바람직하게는 0.01-10 ㎍/kg의 IFN-β, 예를 들어 페길화 IFN-β를 전달할 경우, 각각 0.005-50 ㎍/kg, 또는 더 바람직하게는 0.005-5 ㎍/kg을 0 및 72시간에 2회 주사하여 투여할 수 있다. 또한, 본 명세서에 참고로 채택된 미국 특허 제3,710,795호에 따르면 비경구 투여에 대한 한가지 접근법에서는 서방 또는 지속 방출 시스템의 이식법이 이용된다.

당 업계의 숙련자라면 알 수 있듯이, 제형화 조성물은 치료적 유효량의 IFN-β 치료제를 함유한다. 즉, 본 조성물은 신장 기능의 영구적 또는 점진적 손실을 방지하거나, 예방하거나, 지연시키거나 완화시키기에 충분한 시간 동안 신장 조직 또는 기타 적당한 조직에 IFN-β 치료제의 적당한 농도를 제공하거나, 그렇지 않을 경우 치료 효능을 제공하는 양을 포함한다. 당 업계의 숙련자라면 알 수 있듯이, 본 발명의 치료 조성물에 기술된 화합물의 농도는 선택된 약제, 이용되는 화합물의 화학적 특성 (예를 들어 소수성), 화합물 부형제의 제형, 투여 경로, 및 활성 성분을 신장 또는 신장용 캡슐 내로 직접 투여할 것인지, 또는 전신적으로 투여할 것인지를 비롯한 구상되는 치료법을 비롯한 다수의 인자에 따라 달라진다. 투여될 바람직한 투여량은 또한 신장 조직의 상태, 신장 기능 손실 정도, 및 특정 대상의 전체적인 건강 상태와 같은 변수에 따라 달라질 수 있다. 투여량은 연속적으로, 또는 매일 투여될 수 있지만, 현재로서는 (예를 들어 적당한 의학적 마커 및/또는 생활 지표의 질에 의한 신장 기능의 안정화 및/또는 개선에 의해 측정됨) 만족스러운 반응이 지속될 만큼 오랫동안 주당 1회, 2회 또는 3회 투여하는 것이 바람직하다. 덜 빈번한 투여, 예를 들어 매월 투여하는 것도 이용될 수 있다. 그렇지 않을 경우 계속적인 2주마다 1회 또는 3주마다 1회의 혈액 투석 기간을 필요로 하는 대상의 경우, 계속적인 2주마다 1회 또는 3주마다 1회의 정맥내 또는 복강내 주입은 부당하게 불편한 것으로 생각되지 않는다. 또한, 빈번한 주입을 돕기 위하여, 반영구적인 부목의 이식 (예를 들어 정맥내, 복강내 또는 캡슐내)이 권고될 수 있다.

IFN-β를 이용하는 투여 섭생은 환자의 형태, 종, 연령, 체중, 성별 및 의학적 상태; 치료할 병의 중증도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 이용되는 특정 화합물 또는 그의 염을 비롯한 다양한 인자에 따라 선택된다. 본 발명의 화합물의 활성 및 부작용에 대한 환자의 민감성도 고려된다. 숙련된 의사 또는 수의사라면 병의 진행을 예방하거나, 싸우거나 막는 데에 필요한 약물의 유효량을 손쉽게 결정하여 처방할 수 있다.

본 발명의 경구 투여량, 바람직하게는 페길화 IFN-β 치료제의 경구 투여량은 경구적으로 약 0.01-100 ㎍/kg/일 범위, 또는 더 바람직하게는 경구적으로 약 0.01-10 ㎍/kg/일 범위이다. 본 조성물은 바람직하게는 0.5-5000 ㎍, 더 바람직하게는 0.5-500 ㎍의 활성 성분을 포함하는 점수화된 정제의 형태로 제공된다.

임의의 투여 경로에 있어서, 분할 또는 단일 용량이 사용될 수 있다. 예를 들어 본 발명의 화합물은 단일 용량으로 매일 또는 매주 투여될 수 있거나 총 투여량이 2, 3 또는 4회의 분할된 투여량으로 투여될 수 있다.

상기의 본 제약 조성물 중 임의의 것은 활성 성분으로 0.1-99%, 1-70%, 또는 바람직하게는 1-50%의 본 발명의 활성 화합물을 함유할 수 있다.

질환의 코스 및 약물 치료에 대한 그의 반응에 이어 임상 조사 및 연구실에서의 발견을 할 수 있다. 본 발명의 요법의 유효성은 병, 예를 들어 만성 간염의 전술한 징후 및 증상이 완화되는 정도 및 정상적인 인터페론의 부작용 (즉, 독감 유사 증상, 예를 들어 발열, 두통, 오한, 근육통, 피로 등과 중추 신경계 관련 증상, 예를 들어 우울증, 이상 감각, 집중력 장애 등)을 제거하거나 실질적으로 감소시키는 정도에 의해 결정된다.

IFN-β 치료제는 단독으로, 또는 본 명세서에 기술한 병의 치료에 유익한 것으로 알려진 다른 분자, 예를 들어 항-염증약과 조합하여 투여할 수 있다. 다른 약제와 조합하여 사용할 경우, IFN-β 치료제의 투여량을 그에 따라 변경하는 것이 필요할 수 있다.

담체 물질과 조합되어 단일 투여 형태를 생성할 수 있는 활성 성분의 양은 치료되는 숙주, 및 특정 투여 양식에 따라 달라진다. 그러나 임의의 특정 환자를 위한 특정 투여량 및 치료 섭생은 이용되는 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 종합 건강, 성별, 음식물, 투여 시점, 배설률, 약물 조합, 및 치료 의사의 판단과 치료될 특정 질환의 중증도를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다. 활성 성분의 양은 또한 만일 있다면 이 성분과 함께 공동 투여되는 치료제 또는 예방제에 따라 달라질 수 있다.

IFN-β 치료제의 유효 투여량 및 투여 속도는 다양한 인자, 예를 들어 억제제의 성질, 환자의 사이즈, 치료 목적, 치료할 병리의 성질, 사용되는 특정 제약 조성물, 및 치료 의사의 판단에 따라 달라진다. 1 kg의 체중 당 일일 약 0.001 내지 약 100 mg, 바람직하게는 1 kg의 체중 당 약 0.1 내지 약 50 mg의 투여량 수준의 활성 성분 화합물이 유용하다. 가장 바람직하게는 IFN-β 치료제는 1 kg의 체중 당 약 0.1 mg 내지 1 kg의 체중 당 약 20 mg 사이의 범위의 용량, 바람직하게는 1 kg의 체중 당 약 1 mg 내지 1 kg의 체중 당 약 3 mg 사이의 범위의 용량으로 매 1-14일 간격으로 투여된다. 바람직한 투여는 1주 당, 또는 1주 당 3회의 약 6 MIU의 주사로 구성된다. 투여량의 최적화는 예를 들어 IFN-β 치료제의 투여, 이어서 IFN-β 치료제의 순환 또는 국부 농도의 평가에 의해 결정될 수 있다.

가장 바람직한 실시 형태에 있어서, AVONEX?를 그를 필요로 하는 대상에게 투여한다. AVONEX?는 하기로 구성된 동결건조된 분말로 판매된다:

1 ml 용량 당 제형:

30 mcg의 인터페론-b-la (6 MIU (million international units))

50 mM 인산나트륨

100 mM 염화나트륨

15 mg 인간 혈청 알부민

pH 7.2

AVONEX? 인터페론의 비활성은 2 x 10⁸ 단위/mg, 즉, 1 mg의 IFN-b-1a 단백질 당 200 MU의 항바이러스 활성이다. 환자는 분말을 살균수로 재구성한 후 1 ml을 주당 1회 근육내 주사한다. AVONEX?는 또한 하기로 구성된 액체 제형으로 제조될 수 있다:

0.5 ml 용량 당 제형:

30 mcg (㎍) IFN-b-la (6 MIU)

20 mM 아세테이트 (아세트산나트륨 및 아세트산)

150 mM 아르기닌 HCl

0.005% (w.v) 폴리소르베이트 20

주사용 물

pH 4.8

본 제형은 예비 충전 시린지에 포장될 수 있다. 환자는 제공된 대로 시린지를 수동으로 사용하거나 자동 주사기와 함께 사용할 수 있다. 투여 스케쥴은 주당 1회 6 MUI (즉, 30 mcg)를 근육내 주사하는 것이다.

다른 실시 형태에 있어서, IFN-β는 동결 건조 분말 및 액체 제형으로 제공되는 Rebif이다. 본 동결 건조 분말은 하기로 구성된다:

2.0 ml 용량 당 제형

3 MIU의 IFN-b-1a

만니톨

HSA

아세트산나트륨

pH 5.5

Rebif 인터페론의 비활성은 2.7 x 10⁸ 단위/mg, 즉, 1 mg의 IFN-b-1a 단백질 당 270 MU의 항바이러스 활성이다. 환자는 분말을 염화나트륨 용액 (0.9% NaCl)로 재구성한 후 주당 3회 피하 주사한다. 액체 Rebif의 제형은 하기와 같다:

0.5 ml 용량 당 제형:

6 또는 12 MIU의 IFN-b-1a

4 또는 2 mg의 HSA

27.3 mg의 만니톨

0.4 mg의 아세트산나트륨

주사용 물

본 액체 제형은 예비충전 시린지에 포장되며 자동 주사기 장치 (Rebiject)를 사용하거나 사용하지 않고 주당 3회 피하에 투여한다 (각각 66 ㎍/주 또는 132 ㎍/주에 상응하는 6 또는 12 MIU).

또다른 실시 형태에 있어서, IFN-β는 이. 콜라이에서 생성되며 cys-17을 ser로 돌연변이시킨 것을 포함하는 IFN-β인 BETASERON? (Berlex제)이다. 상기 비-글리코실화 IFN-β는 CHO 세포에서 모두 생성되는 AVONEX? 또는 REBIF?보다 덜 강력하다. 용량은 격일로 피하 주사하기 위한 동결 건조 제형 및 액체 제형 둘 모두에 있어서 250 mcg (8 MIU) 용량으로 판매된다. BETAVERON?는 제조자의 지시에 따라 피하 투여될 수 있는 다른 구매가능한 IFN-β이다.

IFN-β 또는 그의 변이체는 예를 들어 미국 특허 제6,372,207호에 기술된 바와 같이 용해성 IFN 제I형 수용체 또는 그의 일부, 예를 들어 이 수용체의 IFN-결합 사슬과 함께 투여될 수도 있다. 상기 특허에 기술된 바와 같이 IFN 제I형을 수용체의 IFN 결합 사슬과의 복합체 형태로 투여하면 IFN의 안정성이 개선되며 IFN의 효험이 증강된다. 이 복합체는 비-공유 결합 복합체 또는 공유 결합 복합체일 수 있다.

IFN-β 치료제는 사구체신염의 동물 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들어 생쥐, 쥐, 기니아 피그, 고양이, 개, 양, 염소, 돼지, 소, 말 및 비인간 영장류에 있어서의 사구체신염의 포유류 모델은 동물의 신장 조직에 직접적이거나 간접적인 적당한 상해 또는 외상을 야기함으로써 생성할 수 있다. 사구체신염의 동물 모델은 예를 들어 실시예에 기술한 쥐 동물 모델의 신독성 신장염 (NTN)에서와 같이 사구체 기저막에 항체를 주사함으로써 생성할 수 있다. 다른 동물 모델은 실시예에서 추가로 기술되는 바와 같이 동물에게 항-Thy1 항체를 주사함으로써 생성할 수 있다. 또다른 동물 모델은 자가 사구체 기저막으로 면역화하거나 편측 요관 폐쇄 (unilateral ureteric obstruction, UUO)에 의해 확립된다.

IFN-β 치료제는 사구체신염 또는 만성 신부전증을 앓고 있거나 발병할 위험성이 있는 포유류 대상 (예를 들어 인간 환자)에게 투여할 경우 신장 기능의 표준 마커를 임상적으로 유의하게 개선시키는 데 있어서의 치료 효능에 대하여 평가할 수 있다. 이러한 신장 기능의 마커는 의학 문헌에 잘 알려져 있으며, 제한됨이 없이, 단백뇨 증가율, BUN 수준, 혈청 크레아티닌의 증가율, BUN의 정적 측정치, 혈청 크레아티닌의 정적 측정치, 사구체 여과율 (GFR), BUN/크레아티닌의 비, 나트륨 (Na⁺)의 혈청 농도, 크레아티닌에 있어서의 소변/혈중 비, 우레아에 있어서의 소변/혈중 비, 요 삼투압 농도, 일일 소변 배출량 등을 포함한다 (예를 들어 문헌[Brenner and Lazarus (1994), Harrison's Principles of Internal Medicine, 13th edition] 참조.

본 발명은 하기 실시예로 추가로 예시되지만 이는 어떠한 방식으로든 한정하는 것으로 파악되어서는 아니된다. 모든 인용된 참고 문헌 (본 출원 전반에 걸쳐 인용된 참고 문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원을 포함함)의 내용은 본 명세서에 참고로 분명히 채택된다.

본 발명의 실행에서는, 달리 나타내지 않는 한 세포 생물학, 세포 배양학, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 및 면역학의 통상적인 기술이 이용되는데, 이는 당 업계의 기술 이내이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2^nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989)]; 문헌[DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed.,1985)]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. , 1984)]; Mullis 등의 미국 특허 제4,683,195호; 문헌[Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J.Higgins eds. 1984)]; 문헌[Transcription And Translation (B. D.Hames & S. J. Higgins eds. 1984)]; 문헌[Culture Of Animal Cells (R.I. Freshney, Alan R. Liss,Inc., 1987)]; 문헌[Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986)]; 문헌[B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; 논문 [Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)]; 문헌[Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory)]; 문헌[Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987)]; 문헌[Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986)]; Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)] 참조.

실시예 1: IFN-β는 신부전증에서 유의한 단백뇨 감소를 유도한다

본 실시예에서는 IFN-β가 만성 신부전증에 이르게 하는 인간 반월성 사구체신염과 조직학적으로 밀접하게 닮은 염증 모델인 쥐 동물 모델 NTN (신독성 신장염)에서 단백뇨를 유의하게 감소시킨다는 것이 기술되어 있다.

이 질환은 동결 건조시킨 쥐 사구체 기저막 (GBM) 제제로 토끼를 면역화하여 생성시킨 신독성 (NTS) 혈청을 i.v. 주사함으로써 쥐에서 유발시킨다. NTS는 신속하게 GBM에 결합하여 강력한 사구체내 염증 반응을 생성시키고 전-염증성 사이토카인 및 점착 분자를 상향 조절한다. 백혈구가 사구체 내로 유입된다. 이어서 사구체에서 섬유소의 침착 및 모세 혈관 루프의 파괴를 가지는 괴사 지역이 나타난다. 그에 의해 염증성 세포의 반월상 축적이 나타나고 바우만 주머니에서의 증식 사구체 상피 세포가 나타나게 된다. 이러한 염증성 공간은 소변에서의 다량의 단백질의 손실을 그 특징으로 한다. 사구체는 혈관총에서의 콜라겐의 축적 및 반월의 섬유질로의 전환으로 진행성 반흔이 나타난다. 이어서 쥐는 말기 신부전증이 발병된다. 이와 같이 본 모델에서는 급성이지만 일시적인 신장 질환에 걸린 쥐는 항-GBM 항체에 반응하며 이어서 100%의 동물이 우수하게 규정된 코스 상에서 CRF로 진행한다. 상이한 쥐 주는 이러한 유형의 신장 상해에 대하여 감수성이 다양한데, Wistra-Kyoto (WKY) 쥐가 극도로 민감하다. 이러한 동물 모델은 예를 들어 문헌[Tam et al. (1999) Nephrol. Dial. Transplant. 14: 1658] 및 문헌[Allen et al. (1999) J. Immunol. 162: 5519]에 또한 기술되어 있다.

본 연구에서 사용되는 IFN-β는 젠뱅크 등록 번호 P70499의 아미노산 22-184에 상응하는 쥐 IFN-β였다. 쥐 IFN-β는 현탁 상태로 성장하도록 적합화된 차이니즈 햄스터 난소 (Chinese Hamster Ovary, CHO) S-32 세포에서 발현시키며 배양 배지 내로 분비되게 한다. 이 세포를 발효기 배양에서 혈청 포함 배지에서 배양하였다. IFN-β를 Pharmacia SP-세파로스, 블루 세파로스, 및 수퍼로스 12 수지와, Biorad Bio-Scale 세라믹 하이드록시아파타이트 및 Bio-Scale S 수지 상에서의 순차적인 크로마토그래피를 사용하여 조절된 배양 배지로부터 정제하였다. 이어서 IFN-β를 25 mM 시트레이트/150 mM NaCl (pH 4.5)에 대하여 대대적으로 투석시키고 필터-여과시켰다 (0.2 ㎛). IFN-β 제제는 쿠마씨 (Coomassie)로 염색한 비환원 SDS-PAGE 겔의 밀도법에 의해 측정되는 바와 같이 >99% 순수하였다. 비활성은 쥐 RATEC 세포 상에서 측정되는 바와 같이 약 3 x 10⁸ 단위/mg인 것으로 측정되었다.

본 실시예에서는 Charles River Laboratories로부터 수득되는 28마리의 WKY 쥐에서 NTN을 유발하였다. 4마리의 쥐를 기저선 조직학을 위하여 14일째에 죽이고 나머지는 복강 내로 (i.p.) 일일 3 x 10⁵ 단위의 IFN-β, i.p.로 일일 6 x 10⁵ 단위의 IFN-β 또는 비히클 단독을 랜덤하게 넣었다. 주사는 1주 당 6일 주어졌으며 처리는 30일까지 계속하였다. 단백뇨를 7일째에 측정하고 이어서 주 1회 측정하였다. 쥐를 14일, 28일째 및 희생시에 채혈하였다. 죽일 때에 신장, 폐, 간 및 비장을 포르말린에서 고정시키고 신장을 스냅 냉동시켰다.

본 실시예 및/또는 후속 실시예에서 분석하는 기능적 파라미터는 하기와 같이 평가하였다:

알부민뇨/단백뇨: 이는 사구체 누출, 더 적은 정도로는 여과된 단백질의 세뇨관 신진 대사의 부전을 반영한다. 상기가 2개의 독립 변수의 산물이기 때문에 이러한 데이터의 해석은 어려울 수 있는데, GBM 투과성 증가에 의해 단백뇨가 더욱 많아지지만 사구체 여과율 감소는 사구체 단백뇨를 감소시킨다.

소변은 수확하기 24시간 전에 대사 케이지에 수집하였다. 소변 중 알부민의 농도를 로켓 면역전기영동으로 측정하였다. 소변 중 단백질의 농도를 설포살리실산 침전법으로 측정하였다.

혈청 크레아티닌 및 크레아티닌 제거율 (CrCI): Olympus 시약 및 Olympus AU600 분석기 (Olympus, Eastleigh, U.K.)를 사용하여 혈중 크레아티닌 농도의 측정을 위한 수확시에 말초 혈액을 채취하였다. 소변 중 크레아티닌의 농도도 측정하여 (Bayer RA-XT, Newbury, U.K.) 크레아티닌 제거율을 계산하였다.

생존률: 이 연구의 종점은 급사이거나 고통의 경감을 위하여 죽이는 것이다. 동물을 눈을 가린 독립적인 관찰자로 하여금 매일 보게 하고, 죽어가는 동물은 제삼자가 필요하다고 판단시 죽였다. 실제, 생존 연구에 있어서 동물 중 약 절반이 "죽임" 종점에 도달하였다.

헤마톡실린 및 에오신 염색 절편 (section)을 임의적인 점수화 규모를 사용하여 사구체 반흔, 세뇨관 이탈, 간질성 염증 침윤 및 간질성 섬유증의 조악한 (crude) 평가를 위하여 얻었다.

사구체 섬유증: 신장 내에서의 콜라겐 "로드"를 평가하는 방ㅂㅂ을 제공하는 Masson-Trichrome 조직 화학적 방법에 의해 녹색으로 염색되는 신장 피질 지역의 %를 컴퓨터로 개산하였다. 개개의 사구체를 특정 사구체 섬유증의 계산을 위하여 목적 지역으로 또한 선택할 수 있다. 사구체 내에서의 간질성 섬유증의 정량화를 위하여 파라핀에 묻힌 신장 절편을 표준 트라이크롬 방법 (마티우스 옐로우 (Martius Yellow), 브릴리언트 크리스탈 스칼렛 (Brilliant Crystal Scarlet) 및 아닐린 블루 (Aniline Blue))을 사용하여 염색하였다. 사구체 섬유소 침착 (예를 들어 섬유소양 괴사)을 정량화하기 위하여 파라핀에 묻힌 신장 절편을, 섬유소를 적색/오렌지색으로 염색시키는 마티우스 옐로우를 사용하여 염색하였다. 절편을 Photonic 디지털 카메라 (Photonic Science, East Sussex, U.K.)가 장착된 Olympus BX40 현미경 (Olympus Optical, London, U.K.)을 사용하여 200배 배율로 조사하였다. 이미지를 캡처하고 Image-ProPlus^TM 소프트웨어 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD)를 사용하여 분석하였다.

파이브로넥틴의 ED(A) 도메인에 있어서 신장 절편의 면역퍼옥시다제 염색 후 갈색으로 염색되는 신장 피질 면적의 %의 정량화에 의해 상이한 기능적 중증도의 CRF가 구별되는 것으로 나타났다. 이와 유사하게 제III형 콜라겐의 면역 조직 화학적 특성은 염색되는 신장 피질 면적의 %의 계산을 가능하게 한다.

사구체 알파-평활근 액틴 (SMA) 발현은 면역형광법에 의해 측정하였다. 상기 단백질은 사구체 내에서 사구체 섬유증에서 주요한 역할을 하는 것으로 생각되는 "근섬유아세포성" 세포 집단을 규정한다. 알파-SMA에 있어서의 면역 형광 염색의 정량화는 Masson-트라이콤 섬유증 점수와의 관련성이 우수하다.

도 3에 도시된 결과에 의하면 두 용량의 IFN-β로 처리한 동물에 있어서 21일 및 28일에서 단백뇨가 확연히 감소된다는 것이 나타났다. 혈청 크레아틴, 크레아틴 제거율, 가린 H&E 절편 상에서 순위를 매긴 사구체 또는 세뇨관 간질성 반흔 (즉, 조직학적 반흔); 사구체 마크로파지 또는 CD8의 갯수; 또는 사구체 ED(A) 파이브로넥틴 또는 제IV형 콜라겐의 침착률에서의 차이는 없었다.

실시예 2: IFN-β는 급성기의 신장 상해 동안 단백뇨도 유의하게 감소시킨다

본 실시예는 더욱 후기의 신부전증에서의 단백뇨 감소 외에도 IFN-β가 급성기의 신장 상해에서 단백뇨를 또한 감소시킨다는 것을 예시한다.

본 실시예에 있어서, 상기한 바와 같이 0.1 ml의 NTS를 i.v. 주사함으로써 32마리의 쥐에서 NTN을 유발하였다. 8마리의 쥐를 0일 내지 14일 동안 주당 6일간 일일 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β로 처리하였다. 8마리의 쥐를 0일 내지 14일 동안 주당 6일간 RSA로 i.p. 처리하였다. 8마리의 쥐를 0일 내지 28일 동안 주당 6일간 일일 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β로 i.p. 처리하였다. 8마리의 쥐를 0일 내지 28일 동안 주당 6일간 RSA로 i.p. 처리하였다. 단백뇨 및 크레아티닌의 측정을 위하여 7일, 14일, 21일 및 28일에 소변을 대사 케이지에 수집하였다. 모든 쥐를 혈청 크레아티닌을 위하여 14일째에, 그리고 희생시에 채혈하였다. 각각의 군의 쥐의 절반을 14일에 죽이고 절반을 28일에 죽인다. 28일에 쥐를 죽이기 1시간 전에 BrdU를 세포 증식의 평가를 위하여 주사하였다. 하기의 신장, 폐, 간 및 비장 조직을 조직학적 특성화를 위하여 포르말린에서 고정시켰다. BrdU 염색을 위한 Carnoy 고정제에서 신장 절편을 고정시켰다. 신장을 또한 스냅 냉동시켰다. 사구체 반흔, 세뇨관 위축증 및 섬유증을 H&E 염색 절편에서 반정량적으로 평가하였다.

도 4에 도시한 결과에 의하면 IFN-β가 14일, 21일 및 28일에 단백뇨를 현저하게 감소시켰음이 나타났다. 14일과 28일에서의 혈청 크레아틴 및 크레아틴 제거율에서의 차이는 전혀 없었다. 조직학적으로는 14일에 사구체 마크로파지 (ED1+ 세포) 및 CD8+ 세포가 유의하게 감소되었지만 28일에는 더 많은 수가 있었다. 28일에는 사구체 알파-평활근 액틴이 또한 유의하게 감소하였다. 따라서 INF-β 처리는 단백뇨, 염증 감소에는 영향을 주지만 반흔에는 명백한 영향을 전혀 주지 못한다.

다른 실시예에 있어서, 16마리의 WKY 쥐에서 NTN을 유발하였는데, 이중 8마리는 0일 내지 7일 동안 주당 6일간 일일 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β로 i.p. 처리하고 다른 8마리는 0일 내지 7일 동안 주당 6일간 비히클 (쥐 혈청 알부민-RSA) 단독으로 i.p. 처리하였다. 쥐를 6일 및 7일째에 대사 케이지에 넣어 두었다. 모든 쥐를 7일에 죽였다. 쥐를 죽이기 1시간 전에 세포 증식의 평가를 위하여 쥐에 BrdU를 주사하였다. 죽일 때에 신장, 폐, 간 및 비장을 포르말린에서 고정시켰다. 신장을 BrdU 염색을 위하여 Carnoy 고정제에서 고정시키고 스냅 냉동시켰다. 결과에 의하면 단백뇨, 사구체의 조직학적 특성 또는 사구체 마크로파지 또는 CD8 세포의 갯수에서는 현저한 차이가 없는 것으로 나타남이 밝혀졌다. 그러나 7일에서의 섬유소양 점수는 대조 동물에 비하여 IFN-β로 처리된 동물에서 더 낮았다. 또한 사구체에서의 증식 세포의 갯수는 대조 동물에 비하여 IFN-β 처리 동물에서 유의하게 더 낮았다 (도 5 참조).

실시예 3: IFN-β는 신부전증 동물 모델의 Thy 사구체신염에서 단백뇨의 유의한 감소를 유발한다

본 실시예는 혈관 간질성의 증식성 사구체신염에 있어서 INF-β에 의해 단백뇨도 유의하게 감소된다는 것을 예시한다.

본 실시예에 있어서, Thy1 사구체신염 동물 모델을 사용하였다. 이는 혈관간질성의 증식성 사구체신염의 동물 모델이며, 증가된 단백뇨, 혈관간 세포 증식 및 혈관관 매트릭스의 축적을 그 특징으로 한다. 이 모델은 혈관 사이 세포가 Thy1 항원을 발현한다는 사실에 의존적이다. Lewis 쥐에게 단일클론 항-Thy1 항체를 1회 i.v. 주사하였다. 그에 의해 사구체 혈관간 세포의 급속하며 재현성인 보체-매개 괴사가 일어난다 (혈관간질 분해 (mesangiolysis)). 단백뇨는 24시간까지 관찰되며 10일 이상 동안 존속된다. 혈관간 세포가 증식되며 과도한 혈관간 매트릭스가 생성되는 복구 기가 혈관간질 분해에 이어진다. 이는 단백뇨 및 혈관간 세포 증식의 재현성 모델이다.

0.2 ml (2.5 mg/kg)의 항-Thy1 항체 ER4의 주사에 의해 Thy1 사구체신염을 16마리의 Lewis 쥐 및 4마리의 WKY 쥐에서 유발하였다. 8마리의 Lewis 쥐에 0일 내지 10일 동안 주당 6일간 일일 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β를 i.p.로 넣었다. 8마리의 Lewis 쥐에는 0일 내지 10일 동안 주당 6일간 비히클 (쥐 혈청 알부민-RSA) 단독을 i.p.로 넣었다. 4마리의 WKY 쥐에는 아무런 처리를 하지 않았으며 질환의 진행을 0일 내지 10일 동안 관찰하였다. 쥐를 6일 및 7일과 9일 및 10일째에 대사 케이지에 넣어 두었다. 모든 쥐를 10일에 죽였다. 쥐를 죽이기 1시간 전에 세포 증식의 평가를 위하여 쥐에 BrdU를 주사하였다. 죽일 때에 신장, 폐, 간 및 비장을 포르말린에서 고정시켰다. 신장을 BrdU 염색을 위하여 Carnoy 고정제에서 고정시키고 스냅 냉동시켰다.

도 6에 도시된 바와 같이, 결과에 의하면 단백뇨는 7일 및 10일에 유의하게 감소한다는 것이 나타났다. 혈청 크레아티닌은 전혀 차이가 없는 것으로 나타났지만 크레아티닌 제거율은 처리 군에서 더욱 낮은 경향을 나타내었다 (도 7). 사구체의 미세혈관류의 존재에 의해 평가되는 바와 같이 급성 사구체 상해에서는 차이가 전혀 없었다. 그러나 사구체의 과다 세포성은 INF-β로 처리된 쥐에서 유의하게 감소되었다 (도 8).

실시예 4: IFN-β는 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드 신경병증 (PAN) 동물 모델에 있어서 단백뇨의 유의한 감소를 유발한다

PAN을 각각 200 g인 4마리의 웅성 Wistar 쥐에서 유발하였다. 2마리의 쥐에는 0일에 20 mg의 퓨로마이신 아미노뉴클레오시드 (PA)를 복강내로 (i.p.) 넣고 2마리의 쥐에는 0일에 20 mg의 PA를 정맥내로 (i.v.) 넣었다. 쥐를 3-4일 및 7-8일에 대사 케이지에 넣었다. 모든 쥐를 8일에 죽였다. 결과에 의하면 i.p. 주사한 쥐에서는 4일 및 8일에 단백뇨의 평균 값이 각각 46 (mg/24시간) 및 287이었으며, i.v. 주사한 쥐에서는 4일 및 8일에 각각 122 및 194이었다.

본 동물 모델에서의 IFN-β의 효과를 하기와 같이 나타내었다. PAN은 상기한 바와 같이 쥐에서 유발하였다. 쥐에게 6 x 10² 단위, 6 x 10³ 단위, 6 x 10⁴ 단위 또는 6 x 10⁵ 단위의 쥐 IFN-β 또는 완충제 단독을 주었다. 도 9에 도시된 결과에 의하면 IFN-β의 투여에 의해 심지어 IFN-β의 가장 낮은 용량에서도 7일 및 14일에 단백뇨가 유의하게 감소된다는 것이 나타났다.

따라서 본 실시예 및 전술한 실시예의 결과에 의하면, 단백뇨 및 사구체 증식의 감소와, 염증 세포, 예를 들어 사구체 마크로파지 및 CD8+ 세포의 감소에 의해 입증되는 바와 같이 신장 질환에서 INF-β가 염증을 감소시킨다는 것이 나타났다. 따라서 IFN-β는 사구체신염, 급성 및 만성 신부전증의 치료, 예를 들어 예방에 사용될 수 있다.

등가물

당 업계의 숙련자라면 단지 일상적인 실험을 이용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시 형태의 다수의 등가 실시 형태를 인지하거나 확인할 수 있다. 이러한 등가 실시 형태는 하기의 청구의 범위에 포함시키려 한다.

SEQUENCE LISTING <110> <120> Therapies for renal failure using Interferon-봭 <130> BII-001.25 <160> 4 <170> PatentIn version 3.0 <210> 1 <211> 840 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (76)..(639) <400> 1 acattctaac tgcaaccttt cgaagccttt gctctggcac aacaggtagt aggcgacact 60 gttcgtgttg tcaac atg acc aac aag tgt ctc ctc caa att gct ctc ctg 111 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu 1 5 10 ttg tgc ttc tcc act aca gct ctt tcc atg agc tac aac ttg ctt gga 159 Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly 15 20 25 ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag tgt cag aag ctc ctg tgg caa 207 Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln 30 35 40 ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc aag gac agg atg aac ttt gac 255 Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp 45 50 55 60 atc cct gag gag att aag cag ctg cag cag ttc cag aag gag gac gcc 303 Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala 65 70 75 gca ttg acc atc tat gag atg ctc cag aac atc ttt gct att ttc aga 351 Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg 80 85 90 caa gat tca tct agc act ggc tgg aat gag act att gtt gag aac ctc 399 Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu 95 100 105 ctg gct aat gtc tat cat cag ata aac cat ctg aag aca gtc ctg gaa 447 Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu 110 115 120 gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc agg gga aaa ctc atg agc agt 495 Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser 125 130 135 140 ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg att ctg cat tac ctg aag gcc 543 Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala 145 150 155 aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc ata gtc aga gtg gaa atc cta 591 Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu 160 165 170 agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt aca ggt tac ctc cga aac tga 639 Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 175 180 185 agatctccta gcctgtgcct ctgggactgg acaattgctt caagcattct tcaaccagca 699 gatgctgttt aagtgactga tggctaatgt actgcatatg aaaggacact agaagatttt 759 gaaattttta ttaaattatg agttattttt atttatttaa attttatttt ggaaaataaa 819 ttatttttgg tgcaaaagtc a 840 <210> 2 <211> 187 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser 1 5 10 15 Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg 20 25 30 Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg 35 40 45 Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu 50 55 60 Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile 65 70 75 80 Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val 100 105 110 Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu 115 120 125 Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys 130 135 140 Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser 145 150 155 160 His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr 165 170 175 Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 180 185 <210> 3 <211> 501 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(501) <400> 3 atg agc tac aac ttg ctt gga ttc cta caa aga agc agc aat ttt cag 48 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 tgt cag aag ctc ctg tgg caa ttg aat ggg agg ctt gaa tac tgc ctc 96 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 aag gac agg atg aac ttt gac atc cct gag gag att aag cag ctg cag 144 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 cag ttc cag aag gag gac gcc gca ttg acc atc tat gag atg ctc cag 192 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 aac atc ttt gct att ttc aga caa gat tca tct agc act ggc tgg aat 240 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 gag act att gtt gag aac ctc ctg gct aat gtc tat cat cag ata aac 288 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 cat ctg aag aca gtc ctg gaa gaa aaa ctg gag aaa gaa gat ttc acc 336 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 agg gga aaa ctc atg agc agt ctg cac ctg aaa aga tat tat ggg agg 384 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 att ctg cat tac ctg aag gcc aag gag tac agt cac tgt gcc tgg acc 432 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 ata gtc aga gtg gaa atc cta agg aac ttt tac ttc att aac aga ctt 480 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 aca ggt tac ctc cga aac tga 501 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165 <210> 4 <211> 166 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln 1 5 10 15 Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu 20 25 30 Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln 35 40 45 Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln 50 55 60 Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn 65 70 75 80 Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn 85 90 95 His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr 100 105 110 Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg 115 120 125 Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr 130 135 140 Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu 145 150 155 160 Thr Gly Tyr Leu Arg Asn 165

Claims (138)

1. 포유류의 사구체신염의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 IFN-β 치료제의 용도.
2. 제1항에 있어서, 사구체신염이 국소 사구체 경화증, 쇠약성 (collapsing) 사구체병증, 미세 변화 질환, 반월상 사구체신염, 신염 증후군, 신장병 증후군, 원발성 사구체신염, 이차성 사구체신염, 증식성 사구체신염, 막성 사구체신염, 막 증식성 사구체신염, 면역 복합체성 사구체신염, 항-사구체 기저막성 (항-GBM) 사구체신염, 면역 복합체가 거의 없는 (pauci-immune) 사구체신염, 당뇨성 사구체병증, 만성 사구체신염, 및 유전성 신장염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 용도.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, IFN-β 치료제가 성숙형 IFN-β를 포함하는 것인 용도.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제에 첫번째 메티오닌이 결여된 것인 용도.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 인간 IFN-β인 용도.
6. 제5항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 4의 서열을 갖는 전장의 성숙형 인간 IFN-β와 약 95% 이상 동일한 것인 용도.
7. 제6항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 4의 서열을 포함하는 것인 용도.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 글리코실화된 것인 용도.
9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 글리코실화되지 않은 것인 용도.
10. 제5항에 있어서, IFN-β가 IFN-β-1a인 용도.
11. 제5항에 있어서, IFN-β가 IFN-β-1b인 용도.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 면역글로불린 분자의 불변 도메인에 융합된 IFN-β를 포함하는 것인 용도.
13. 제12항에 있어서, 면역글로불린 분자가 인간 면역글로불린 분자인 용도.
14. 제13항에 있어서, 면역글로불린 분자가 IgG1의 중쇄인 용도.
15. 제14항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 14의 서열을 포함하는 것인 용도.
16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 페길화 (pegylated) IFN-β를 포함하는 것인 용도.
17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 안정화제를 포함하는 것인 용도.
18. 제17항에 있어서, 안정화제가 산성 아미노산인 용도.
19. 제18항에 있어서, 안정화제가 아르기닌인 용도.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제의 pH가 약 4.0 내지 7.2인 용도.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 정맥내 (i.v.) 투여되는 것인 용도.
22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 근육내 (i.m.) 투여되는 것인 용도.
23. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 피하 투여되는 것인 용도.
24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 수회 용량의 IFN-β 치료제를 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 용도.
25. 제24항에 있어서, IFN-β 치료제를 약 6 MIU의 용량으로 주 1회 투여하는 것인 용도.
26. 제24항에 있어서, IFN-β 치료제를 약 3 MIU의 용량으로 주 3회 투여하는 것인 용도.
27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 포유류에서 단백뇨를 감소시키는 것인 용도.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 사구체 세포 증식을 감소시키는 것인 용도.
29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 사구체 염증을 감소시키는 것인 용도.
30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 인간인 용도.
31. 제30항에 있어서, 포유류는 하나 이상의 사구체의 다가오는 염증의 징후에 의해 나타내어지는 바와 같이 사구체신염의 발병 가능성이 있는 포유류인 용도.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류는 사구체신염을 야기하는 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나, 또는 사구체신염이 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 것인 용도.
33. 제32항에 있어서, 포유류는 간염 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나, 또는 사구체신염이 간염 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 것인 용도.
34. 제33항에 있어서, 포유류는 B형 또는 C형 간염 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나, 또는 사구체신염이 B형 또는 C형 간염 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 것인 용도.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 말기 신부전증 또는 신장 세포 암종에 걸리지 않은 것인 용도.
36. 포유류의 만성 신부전증의 치료 또는 예방용 의약의 제조에 있어서의 IFN-β 치료제의 용도.
37. 제36항에 있어서, IFN-β 치료제가 성숙형 IFN-β를 포함하는 것인 용도.
38. 제36항 또는 제37항에 있어서, IFN-β 치료제에 첫번째 메티오닌이 결여된 것인 용도.
39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 인간 IFN-β인 용도.
40. 제39항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 4의 서열을 갖는 전장의 성숙형 인간 IFN-β 와 약 95% 이상 동일한 것인 용도.
41. 제40항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 4의 서열을 포함하는 것인 용도.
42. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 글리코실화된 것인 용도.
43. 제36항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 글리코실화되지 않은 것인 용도.
44. 제39항에 있어서, IFN-β가 IFN-β-1a인 용도.
45. 제39항에 있어서, IFN-β가 IFN-β-1b인 용도.
46. 제36항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 면역글로불린 분자의 불변 도메인에 융합된 IFN-β를 포함하는 것인 용도.
47. 제46항에 있어서, 면역글로불린 분자가 인간 면역글로불린 분자인 용도.
48. 제47항에 있어서, 면역글로불린 분자가 IgG1의 중쇄인 용도.
49. 제48항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 14의 서열을 포함하는 것인 용도.
50. 제36항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 페길화 IFN-β를 포함하는 것인 용도.
51. 제36항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 안정화제를 포함하는 것인 용도.
52. 제51항에 있어서, 안정화제가 산성 아미노산인 용도.
53. 제52항에 있어서, 안정화제가 아르기닌인 용도.
54. 제36항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제의 pH가 약 4.0 내지 7.2인 용도.
55. 제36항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 정맥내 (i.v.) 투여되는 것인 용도.
56. 제36항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 근육내 (i.m.) 투여되는 것인 용도.
57. 제36항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 피하 투여되는 것인 용도.
58. 제36항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 수회 용량의 IFN-β 치료제를 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 용도.
59. 제58항에 있어서, IFN-β 치료제를 약 6 MIU의 용량으로 주 1회 투여하는 것인 용도.
60. 제58항에 있어서, IFN-β 치료제를 약 3 MIU의 용량으로 주 3회 투여하는 것인 용도.
61. 제36항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 포유류에서 단백뇨를 감소시키는 것인 용도.
62. 제36항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 사구체 세포 증식을 감소시키는 것인 용도.
63. 제36항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 사구체 염증을 감소시키는 것인 용도.
64. 제36항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 인간인 용도.
65. 제64항에 있어서, 포유류가 만성 신기능 불완전(chronic renal insufficiency)에 의해 나타내어지는 바와 같이 만성 신부전증의 발병 가능성이 있는 포유류인 용도.
66. 제36항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류는 만성 신부전증을 야기하는 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나, 또는 만성 신부전증이 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 것인 용도.
67. 제66항에 있어서, 포유류는 간염 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나, 또는 만성 신부전증이 간염 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 것인 용도.
68. 제67항에 있어서, 포유류는 B형 또는 C형 간염 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나, 또는 만성 신부전증이 B형 또는 C형 간염 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 용도.
69. 제36항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류는 말기 신부전증 또는 신장 세포 암종에 걸리지 않은 것인 용도.
70. 포유류에서의 사구체신염의 치료 방법으로서, 사구체신염에 걸린 포유류를 확인하는 단계 및 포유류에게 치료 유효량의 IFN-β 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
71. 제70항에 있어서, 사구체신염이 국소 사구체 경화증, 쇠약성 사구체병증, 미세 변화 질환, 반월상 사구체신염, 신염 증후군, 신장병 증후군, 원발성 사구체신염, 이차성 사구체신염, 증식성 사구체신염, 막성 사구체신염, 막 증식성 사구체신염, 면역 복합체성 사구체신염, 항-사구체 기저막성 (항-GBM) 사구체신염, 면역 복합체가 거의 없는 사구체신염, 당뇨성 사구체병증, 만성 사구체신염, 및 유전성 신장염으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
72. 제70항 또는 제71항에 있어서, IFN-β 치료제가 성숙형 IFN-β를 포함하는 것인 방법.
73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제에 첫번째 메티오닌이 결여된 것인 방법.
74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 인간 IFN-β인 방법.
75. 제74항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 4의 서열을 갖는 전장의 성숙형 인간 IFN-β와 약 95% 이상 동일한 것인 방법.
76. 제75항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 4의 서열을 포함하는 것인 방법.
77. 제70항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 글리코실화된 것인 방법.
78. 제70항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 글리코실화되지 않은 것인 방법.
79. 제74항에 있어서, IFN-β가 IFN-β-1a인 방법.
80. 제74항에 있어서, IFN-β가 IFN-β-1b인 방법.
81. 제70항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 면역글로불린 분자의 불변 도메인에 융합된 IFN-β를 포함하는 것인 방법.
82. 제81항에 있어서, 면역글로불린 분자가 인간 면역글로불린 분자인 방법.
83. 제82항에 있어서, 면역글로불린 분자가 IgG1의 중쇄인 방법.
84. 제83항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 14의 서열을 포함하는 것인 방법.
85. 제70항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 페길화 IFN-β를 포함하는 것인 방법.
86. 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 안정화제를 포함하는 것인 방법.
87. 제86항에 있어서, 안정화제가 산성 아미노산인 방법.
88. 제87항에 있어서, 안정화제가 아르기닌인 방법.
89. 제70항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제의 pH가 약 4.0 내지 7.2인 방법.
90. 제70항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제를 정맥내 (i.v.) 투여하는 것인 방법.
91. 제70항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제를 근육내 (i.m.) 투여하는 것인 방법.
92. 제70항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제를 피하 투여하는 것인 방법.
93. 제70항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 수회 용량의 IFN-β 치료제를 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
94. 제93항에 있어서, IFN-β 치료제를 약 6 MIU의 용량으로 주 1회 투여하는 것인 방법.
95. 제93항에 있어서, IFN-β 치료제를 약 3 MIU의 용량으로 주 3회 투여하는 것인 방법.
96. 제70항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 포유류에서 단백뇨를 감소시키는 것인 방법.
97. 제70항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 사구체 세포 증식을 감소시키는 것인 방법.
98. 제70항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 사구체 염증을 감소시키는 것인 방법.
99. 제70항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
100. 제99항에 있어서, 포유류는 하나 이상의 사구체의 염증; 사구체 비대; 세뇨관 비대; 사구체 경화증; 또는 세뇨관간질성 경화증의 존재에 의해 사구체신염에 걸린 것으로 확인된 포유류인 방법.
101. 제70항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류는 사구체신염을 야기하는 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나, 또는 사구체신염이 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 것인 방법.
102. 제101항에 있어서, 포유류는 간염 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나, 또는 사구체신염이 간염 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 것인 방법.
103. 제102항에 있어서, 포유류는 B형 또는 C형 간염 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나, 또는 사구체신염이 B형 또는 C형 간염 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 것인 방법.
104. 제70항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류는 말기 신부전증 또는 신장 세포 암종에 걸리지 않은 것인 방법.
105. 포유류의 만성 신부전증의 치료 방법으로서, 만성 신부전증에 걸린 포유류를 확인하는 단계 및 포유류에게 치료 유효량의 IFN-β 치료제를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
106. 제105항에 있어서, IFN-β 치료제가 성숙형 IFN-β를 포함하는 것인 방법.
107. 제105항 또는 제106항에 있어서, IFN-β 치료제에 첫번째 메티오닌이 결여된 것인 방법.
108. 제105항 내지 제107항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 인간 IFN-β인 방법.
109. 제108항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 4의 서열을 갖는 전장의 성숙형 인간 IFN-β 와 약 95% 이상 동일한 것인 방법.
110. 제109항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 4의 서열을 포함하는 것인 방법.
111. 제105항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 글리코실화된 것인 방법.
112. 제105항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β가 글리코실화되지 않은 것인 방법.
113. 제108항에 있어서, IFN-β가 IFN-β-1a인 방법.
114. 제108항에 있어서, IFN-β가 IFN-β-1b인 방법.
115. 제105항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 면역글로불린 분자의 불변 도메인에 융합된 IFN-β를 포함하는 것인 방법.
116. 제115항에 있어서, 면역글로불린 분자가 인간 면역글로불린 분자인 방법.
117. 제116항에 있어서, 면역글로불린 분자가 IgG1의 중쇄인 방법.
118. 제117항에 있어서, IFN-β가 서열 번호 14의 서열을 포함하는 것인 방법.
119. 제105항 내지 제118항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 페길화 IFN-β를 포함하는 것인 방법.
120. 제105항 내지 제119항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제가 안정화제를 포함하는 것인 방법.
121. 제120항에 있어서, 안정화제가 산성 아미노산인 방법.
122. 제121항에 있어서, 안정화제가 아르기닌인 방법.
123. 제105항 내지 제122항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제의 pH가 약 4.0 내지 7.2인 방법.
124. 제105항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제를 정맥내 (i.v.) 투여하는 것인 방법.
125. 제105항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제를 근육내 (i.m.) 투여하는 것인 방법.
126. 제105항 내지 제123항 중 어느 한 항에 있어서, IFN-β 치료제를 피하 투여하는 것인 방법.
127. 제105항 내지 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 수회 용량의 IFN-β 치료제를 포유류에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법.
128. 제127항에 있어서, IFN-β 치료제를 약 6 MIU의 용량으로 주 1회 투여하는 것인 방법.
129. 제127항에 있어서, IFN-β 치료제를 약 3 MIU의 용량으로 주 3회 투여하는 것인 방법.
130. 제105항 내지 제129항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 포유류에서 단백뇨를 감소시키는 것인 방법.
131. 제105항 내지 제130항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 사구체 세포 증식을 감소시키는 것인 방법.
132. 제105항 내지 제131항 중 어느 한 항에 있어서, 치료가 사구체 염증을 감소시키는 것인 방법.
133. 제105항 내지 제132항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 인간인 방법.
134. 제133항에 있어서, 포유류가 만성 신기능 불완전의 존재에 의해 만성 신부전증에 걸린 것으로 확인된 포유류인 방법.
135. 제105항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 만성 신부전증을 야기하는 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나 만성 신부전증이 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 방법.
136. 제135항에 있어서, 포유류가 간염 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나 만성 신부전증이 간염 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 방법.
137. 제136항에 있어서, 포유류가 B형 또는 C형 간염 바이러스를 보유하는 포유류가 아니거나 만성 신부전증이 B형 또는 C형 간염 바이러스에 의해 야기된 포유류가 아닌 방법.
138. 제105항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 포유류가 말기 신부전증 또는 신장 세포 암종에 걸리지 않은 방법.