UA66339C2 - Зрізаний нейротрофічний фактор, що походить з лінії гліальних клітин (gdnf), молекула днк, яка кодує gdnf, вектор, що містить зазначену молекулу днк, клітина-хазяїн, спосіб виготовлення зрізаного gdnf, фармацевтична композиція та спосіб лікування - Google Patents
Зрізаний нейротрофічний фактор, що походить з лінії гліальних клітин (gdnf), молекула днк, яка кодує gdnf, вектор, що містить зазначену молекулу днк, клітина-хазяїн, спосіб виготовлення зрізаного gdnf, фармацевтична композиція та спосіб лікування Download PDFInfo
- Publication number
- UA66339C2 UA66339C2 UA98031545A UA98031545A UA66339C2 UA 66339 C2 UA66339 C2 UA 66339C2 UA 98031545 A UA98031545 A UA 98031545A UA 98031545 A UA98031545 A UA 98031545A UA 66339 C2 UA66339 C2 UA 66339C2
- Authority
- UA
- Ukraine
- Prior art keywords
- truncated
- protein
- sequence
- zeo
- zome
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims description 131
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 77
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 47
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 title claims description 27
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 title claims description 26
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 title claims description 26
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims description 25
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 10
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 title claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 17
- 101150082979 gdnf gene Proteins 0.000 title 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 68
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 51
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 40
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 36
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 36
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 34
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 claims description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 33
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 21
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 18
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 13
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 10
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 9
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 9
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 claims description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 7
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 6
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 37
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 abstract description 5
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 abstract description 3
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 abstract description 2
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 abstract 2
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 441
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 403
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 399
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 108
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 102
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 100
- 239000000047 product Substances 0.000 description 69
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 53
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 40
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 37
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 37
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 27
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 25
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 25
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 25
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 21
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 21
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 21
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 20
- 241000894007 species Species 0.000 description 19
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 18
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 description 16
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 15
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 15
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 15
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 13
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 13
- 230000028436 dopamine uptake Effects 0.000 description 13
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 13
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 12
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 11
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 11
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 11
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 11
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 10
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 10
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 10
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 9
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 9
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- 238000005932 reductive alkylation reaction Methods 0.000 description 9
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 8
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 8
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 6
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 6
- -1 amino- Chemical class 0.000 description 6
- 239000002585 base Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 6
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 5
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 5
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 5
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 4
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 description 4
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 4
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 4
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 3
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 3
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 3
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 3
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 3
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 3
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 3
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 3
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 3
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 3
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 3
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 3
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 3
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000002474 noradrenergic effect Effects 0.000 description 3
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 3
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 3
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 3
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 3
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 3
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 3
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000170545 Iago Species 0.000 description 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N Metrizamide Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(=O)N[C@@H]2[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)OC2O)O)=C1I BAQCROVBDNBEEB-UBYUBLNFSA-N 0.000 description 2
- OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M N,N,N-Trimethylmethanaminium chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)C OKIZCWYLBDKLSU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000028389 Nerve injury Diseases 0.000 description 2
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 2
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 2
- 102100033857 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 2
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005864 Sulphur Substances 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 2
- 108010018927 conglutinin Proteins 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 2
- QCUFYOBGGZSFHY-UHFFFAOYSA-N depsidomycin Chemical compound O=C1C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(NC=O)C(C)CC)C(C)OC(=O)C2CCCNN2C(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C2CCCNN21 QCUFYOBGGZSFHY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 2
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010085617 glycopeptide alpha-N-acetylgalactosaminidase Proteins 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 2
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008764 nerve damage Effects 0.000 description 2
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 description 2
- 229920002714 polyornithine Polymers 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 101150024950 sstT gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- REAWNMHCBIUKLZ-ZYHUDNBSSA-N (3R,4R)-4-(hydroxymethyl)-3-(6-methylheptanoyl)oxolan-2-one Chemical compound CC(C)CCCCC(=O)[C@H]1[C@H](CO)COC1=O REAWNMHCBIUKLZ-ZYHUDNBSSA-N 0.000 description 1
- WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxolane Chemical compound C1COCO1 WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYVRVRFVLRNJLY-KTKRTIGZSA-N 1-oleoyl phosphatidylethanolamine Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(O)COP(O)(=O)OCCN PYVRVRFVLRNJLY-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroethanesulfonyl chloride Chemical compound FC(F)(F)CS(Cl)(=O)=O CXCHEKCRJQRVNG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004042 4-aminobutyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 1
- MCNQUWLLXZZZAC-UHFFFAOYSA-N 4-cyano-1-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methoxyphenyl)-n-piperidin-1-ylpyrazole-3-carboxamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C1=C(C#N)C(C(=O)NN2CCCCC2)=NN1C1=CC=C(Cl)C=C1Cl MCNQUWLLXZZZAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 208000032484 Accidental exposure to product Diseases 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 241000713842 Avian sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 102000040350 B family Human genes 0.000 description 1
- 108091072128 B family Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M Carbamate Chemical compound NC([O-])=O KXDHJXZQYSOELW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 108090000056 Complement factor B Proteins 0.000 description 1
- 102000003712 Complement factor B Human genes 0.000 description 1
- 108010026206 Conalbumin Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100256026 Drosophila melanogaster meigo gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N Ethyl urethane Chemical compound CCOC(N)=O JOYRKODLDBILNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical class C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 1
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102000003967 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 101000634196 Homo sapiens Neurotrophin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000766306 Homo sapiens Serotransferrin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 102000004058 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 1
- 108090000581 Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 1
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001190694 Muda Species 0.000 description 1
- 101100496087 Mus musculus Clec12a gene Proteins 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 208000002740 Muscle Rigidity Diseases 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 1
- 108010049586 Norepinephrine Plasma Membrane Transport Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 description 1
- DPWPWRLQFGFJFI-UHFFFAOYSA-N Pargyline Chemical compound C#CCN(C)CC1=CC=CC=C1 DPWPWRLQFGFJFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 241001505332 Polyomavirus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 208000028017 Psychotic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 241000219492 Quercus Species 0.000 description 1
- 102000015097 RNA Splicing Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039259 RNA Splicing Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 239000012891 Ringer solution Substances 0.000 description 1
- 239000002262 Schiff base Substances 0.000 description 1
- 150000004753 Schiff bases Chemical class 0.000 description 1
- 229940125377 Selective β-Amyloid-Lowering Agent Drugs 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102100033929 Sodium-dependent noradrenaline transporter Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 235000018087 Spondias lutea Nutrition 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N Zalcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 WREGKURFCTUGRC-POYBYMJQSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 231100000818 accidental exposure Toxicity 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 102000034337 acetylcholine receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020000715 acetylcholine receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 229940025084 amphetamine Drugs 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 108010051210 beta-Fructofuranosidase Proteins 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 229940088623 biologically active substance Drugs 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- VDTVZBCTOQDZSH-UHFFFAOYSA-N borane N-ethylethanamine Chemical compound B.CCNCC VDTVZBCTOQDZSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 1
- VEWFZHAHZPVQES-UHFFFAOYSA-N boron;n,n-diethylethanamine Chemical compound [B].CCN(CC)CC VEWFZHAHZPVQES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N boron;pyridine Chemical compound [B].C1=CC=NC=C1 NNTOJPXOCKCMKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000005587 bubbling Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000011748 cell maturation Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 229920006176 crosslinked polyethyleneglycol Polymers 0.000 description 1
- DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N ctk1a3526 Chemical compound NP(N)(N)=O DMSZORWOGDLWGN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L disodium selenite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Se]([O-])=O BVTBRVFYZUCAKH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002825 dopamine reuptake Effects 0.000 description 1
- 239000000221 dopamine uptake inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000004002 dopaminergic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M ethanesulfonate Chemical compound CCS([O-])(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000001033 ether group Chemical group 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000003325 follicular Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010026195 glycanase Proteins 0.000 description 1
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- 230000000749 insecticidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000000185 intracerebroventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 239000001573 invertase Substances 0.000 description 1
- 235000011073 invertase Nutrition 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 description 1
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N maleic anhydride Chemical compound O=C1OC(=O)C=C1 FPYJFEHAWHCUMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000554 metrizamide Drugs 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- HOEFWOBLOGZQIQ-UHFFFAOYSA-N morpholin-4-yl morpholine-4-carbodithioate Chemical compound C1COCCN1C(=S)SN1CCOCC1 HOEFWOBLOGZQIQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000032405 negative regulation of neuron apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000001640 nerve ending Anatomy 0.000 description 1
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000944 nerve tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 1
- 229940097998 neurotrophin 4 Drugs 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 1
- 238000002638 palliative care Methods 0.000 description 1
- 229960001779 pargyline Drugs 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000001935 peptisation Methods 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001583 poly(oxyethylated polyols) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108010054442 polyalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000003234 polygenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 1
- 238000003345 scintillation counting Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012279 sodium borohydride Substances 0.000 description 1
- 229910000033 sodium borohydride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 229960001471 sodium selenite Drugs 0.000 description 1
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 description 1
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002330 subarachnoid space Anatomy 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000015883 synaptic transmission, dopaminergic Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007885 tablet disintegrant Substances 0.000 description 1
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124788 therapeutic inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012749 thinning agent Substances 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000006032 tissue transformation Effects 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000002227 vasoactive effect Effects 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
- 229930195727 α-lactose Natural products 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
- A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Psychology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Запропоновано нові білки зрізаного нейротрофічного фактора, що походить з лінії гліальних клітин (GDNF), які стимулюють поглинання дофаміну дофамінергічними клітинами і, разом з тим, виживання нервових клітин, а також способи виготовлення зрізаних GDNF білків за допомогою рекомбінантної генної інженерії.
Description
Опис винаходу
У цілому винахід стосується білків, які звуться гліоцитопохідними нейротрофічними факторами (СОМЕ), які 2 характеризуються своєю спроможністю активувати поглинання дофаміну дофамінергічними нейронами і підтримувати виживання нейронів, які гинуть при хворобі Паркінсона, Більш конкретно, винахід стосується нових зрізаних ГНФ-білків.
Передумови до створення винаходу
Нейротрофічні фактори являють собою білки, які знаходяться у нервовій системі або в ненервових тканинах, 70 іннервованих нервовою системою, і функцією яких є активувати виживання і підтримання фенотипічної диференціації нервових і/або гліальних клітин (гліоцитів) Магоп еї аІ,, Апп. Кем, Мецгозсіепсе 1:327, 1979;
Тпоепеп еї аїЇ., Зсіепсе 229:238, 1985), Завдяки цій фізіологічній ролі, нейротрофічні фактори можна застосовувати при лікуванні дегенерації нервових клітин і втрати диференційованої функції внаслідок різного роду нейродегенеративних захворювань. 12 Для того щоб той чи інший нейротрофічний фактор був потенціально придатним у лікуванні нервових розладів, пошкоджені нервові клітини даного класу або класів повинні бути чутливими до цього фактора. Різні нейротрофічні фактори, як правило, діють на класи нервових клітин, що суттєво різняться один від одного,
Таким чином, було б корисним мати у розпорядженні різноманітні нейротрофічні фактори для лікування пошкоджених нейронів будь-якого класу, що може стати потрібним у різних випадках захворювать або травмувань.
Нейротрофічні фактори спроможні захищати чутливі нейрони від різноманітних неспоріднених інсультів.
Наприклад, фактор росту нервової тканини (ФРН) дозволяє врятувати значну частину чутливих нейронів від смерті, зумовленої відрізанням їхніх аксонних процесів |Кісп еї аїЇ., 9. МеийгосуїсІ. 16:261, 1987; ОКО еї а).
У. Мецйговзсі. 83:156, 1987), від онтогенетичної смерті під час ембріонального розвитку |Натригдег еї аї., 9. с
Мецговсі. 4:767, 1984) і від смерті, зумовленої введенням таксолу або цисплатіну (АріеїЇ. ес а, Апп. Меиго). Ге) 29: 87,7 1991). Ця очевидна універсальність захисту привела до концепції, згідно з якою якщо нейротрофічний фактор захищає чутливі нейрони від пошкоджень в експериментах, він може бути корисним і при лікуванні захворювань, які викликають пошкодження цих нейронів у пацієнтів, навіть якщо етіологія захворювання є невідома. Ме.
Даний нейротрофічний фактор повинен, окрім правильності своєї нейронної специфічності, знаходитися у со кількості, достатній для використання його у якості фармацевтичного засобу. Оскільки нейротрофічні фактори, як правило, наявні в тканинах у малих кількостях, див., наприклад, (Ноїег еї Вагде, Майте 331:261; Оп еї Ше аІ.,, Зсіепсе 246:1023, 1989), виготовляти їх у фармацевтичних кількостях безпосередньо із тканин тварин було Ге) б незручно. У якості альтернативи для виробу потрібного білка бажано застосовувати рекомбінантну експресію. 3о Раніше Гіп еї аЇ. описали спосіб скринінгу біологічних зразків за нейротрофічною дією на ембріональні ее, попередники дофамінергічних нейронів чорної субстанції |Заявка на патент США Мо08/182183 від 23 травня 1994р. та її родові заявки; РСТ/0О592/07888 від 17 вересня 1992р. (МО 9306116); і заявка на Європейський патент Мо92921022.7 (публікація МЕЕР 610254)), розкриття яких введене у даному опису посиланням. Цей біотест « можна застосовувати для ідентифікації нейротрофічних факторів, які можуть бути використані у лікуванні З 50 хвороби Паркінсона (Егіедтап еї аЇ., Мейгозсі. Гей. 79:65-72, 1987), оскільки ця хвороба характеризується с дегенерацією дофамінергічних нейронів середнього мозку, який іннервує смугасте тіло.
Із» ШІп еї а). також дали характеристику нового нейротрофічного фактора, очищеного від одного такого джерела - кондиційованого культурного середовища від клітинної линії гліобластоми 849 |Зспцирегі еї аї., Маїшге 249:224-27, 1974). Як повідомлялось раніше, кондиційоване середовище із цієї клітинної лінії виказує дофамінергічну нейротрофічну активність |Вопп еї аїЇ.,, бос. Меийговзсі. Аре. 15:277, 1989). Раніше, до цього б відкриття, зробленого Оп еї аї., гліоцитопохідний нейротрофічний фактор (ЗОМЕ) не був ідентифікований як
Ге») дискретна, біологічно активна речовина або як виділений, практично чистий білок. Крім того, Її іп еї аї. описали способи клонування кодуючих СОМЕ людських генів, нуклеїнокислотної послідовності коюодуючих СОМЕ о людських генів, і амінокислотних послідовностей СОМЕ білка. Ген ООМЕ було субклоновано в вектор експреси, со 20 який було використано для експресії біологічно активного ЗОМЕ. (ЗОМЕ білок є гомодимером, який складається з двох 134 амінокислотних (масою 22 КОа) субодиниць, об'єднаних дисульфідною в'яззю. Описане також с використання СОМЕ для попередження і лікування нервових розладів і таких, пов'язаних з нервами захворювань, як хвороба Паркінсона.
СОМЕ терапія є ефективною при лікуванні нервових розладів, викликаних умовами, які ставлять під загрозу 22 виживання і/або власну функцію одного або більше типів нервових клітин. Таке нервове ураження може
ГФ) виникати внаслідок найрізноманітніших причин. Нервове ураження може виникати в одному і більше типах нервових клітин внаслідок: (1) фізичного травмування, яке викликає дегенерацію аксонних процесів і/або тіл о нервових клітин поблизу місця травмування; (2) тимчасового або постійного припинення кровотоку до частин нервової системи, наприклад, при ударі; (3) навмисного або випадкового піддання дії нейротоксинів, таких як 60 гемотерапевтичні агенти (наприклад, цисплатін) при лікуванні раку, або дідеоксицитидіну (ддЦ) при лікуванні
СНІДУ; (4) хронічних метаболічних хвороб, таких як діабет або ниркова дисфункція; (5) нейродегенеративних хвороб, таких як хвороба Паркінсона, хвороба Альцгеймера і бічний аміотрофічний склероз (А! 5), які виникають внаслідок дегенерації специфічних нейронних популяцій.
СОМЕ терапія є особливо ефективною при лікуванні нейродегенеративних станів, такіх як хвороба бо Паркінсона, які викликають дегенерацію дофамінергічних нейронів чорної субстанції. Єдиними на сьогоднішній день способами лікування хвороби Паркінсона є паліативні способи, які спрямовані на підвищення рівнів дофаміну у смугастому тілі. Ефект, що очікується від СОМЕ- терапії полягає не просто у підвищенні дофамінергічної нейротрансмісії на дофамінергічних нервових закінченнях у смугастому тілі (результатом чого є полегшення симптомів), але також у сповільненні і навіть зупинці розвитку дегенеративних процесів, і відновленні подшкодженого чорносмугастого шляху та його функції. СОМЕ може бути також використаний у лікуванні інших форм розладів або невідповідності функціонування дофамінергічних нервових клітин у людей.
Такі розлади або погане функціонування можуть виникати при шизофренії та інших формах психозу. Для лікування таких станів у розпорядженні нині є лише симптоматичні способи, які потребують ліків, діючих на /о рецептори або центри поглинання дофаміну, відповідно до тієї точки зору, що невластиве функціонування дофамінергічних нейронів, іннервуючих ці нейронні популяції-носії рецепторів, може бути притягнуте до процесу розладу.
Сутність винаходу
Згідно з одним із варіантів винаходу пропонуються нові зрізані білкові продукти, які є гліоцитопохідним нейротрофічним фактором (ЗОМЕ білки). В одному з варіантів практичного втілення зрізані ЗОМ білки виробляються методами рекомбінантної генної інженерії. В альтернативному варіанті зрізані СОМЕ білки синтезуються хімічними методами або комбінацією рекомбінантних і хімічних методів.
До числа зрізаних СОМЕ білкових продуктів за винаходом входять білки, представлені амінокислотною послідовністю Х-ІСув?!-Сув391-У, На Фіг.1 наведена схема переліку амінокислотних залишків (ЗЕО ІЮ МО:2), призначена до полегшення порівняння зі зрілим СОМЕ білком. Формула |Сув 71-Сув7331| виражає амінокислотну послідовність від Суз?! до Сув!ЗЗ, як показано на Фіг.1 (ЗЕ І МО:2). М виражає карбоксильну кінцеву групу
Сувз1з33 або карбоксикінцевий амінокислотний залишок Не!34, Х виражає метіонільовану або неметіонільовану аміногрупу Сув"! або амінокінцевий амінокислотний залишок (чи залишки), вибраний (чи вибрані) із групи: сч щі 6) (о) (зе) (зе) (Се) (Се) - . и? (о) (о) (95) (95) 3е) іме) 60 б5 с т
Мо 9 кмвс (ЗЕО 0 МО:3) екмво (ЗЕО І МО:4) вокмво (ЗЕ О МО:5) онскмна 5ЕО ІЮ МО:б) совскнкс (5ЕО 1 МО:7) ксовскнко (ЗЕС ИЮ МО:8) вЕсонокмАис (5ЕО 10 МО:9) с вАисовокнко (ЗЕ ОО МО: 10) кс вАсОовВокнве (ЗЕО О МО) ско ввоОвоКМво (ЗБОЮ МО г) " вска кясовскмас (5ЕО О МОЗ) : БЕСКо ВвоОвокМАо (ЗБОЮ МО:14)
МмЕвВскс внсовскнко (БО 10 МО:15)
ЕМБВСКа ВЕСОВсКМве (ЗЕ ОО МО-16)
РЕМеЯВСКсС весонакмно (5ББО ОО МОС17)
МРЕМЕВОКС ВЕСОВСЕМНе (БО ЮО МОСТІВ) сч "АМРЕНЕВСОКО ВВсОоКОоКнНВо (5БОЙО МО:19)
А АМРЕЮБЕСКО ВВсОВСскМАО (ЗБОЮ МО:20) о
АА АМРЕМБЕСКС вЕСсОВСКкМКо (ЗЕ ІЮ МО21) що ААА АМРЕМЕКОКО ВВООВоКкМКа (5ЕО 10 МО:22) Ф зо ОААА АМРЕМЯНОКС ВнсОВоКкМко (ЗБОЮ МО:23)
БЕОААА АМРЕМБНОКС ВАСсОВсЕМНО (560 0 МО:24) Шк
МВОАДА АМРЕМБВСКС ВВСсОВоКМАС (ЗБОЮ МО:25) (зе)
ЕМВОААА АМРЕМЗВОКИ ЕВСОВСсКкМВо (ЗБОЮ МО:26) Ге) зе ЕВМРОААА АМРЕМЗНСКС КЕСОВСЮТАС (ЗБОЮ МО:27) со
ВЕКНКОААА АМРЕНОКОКО ЕКсОВоКМво (ЗБОЮ МО:28)
ВВЕВМЕОААА АМРЕМОВСКО вВсОБСсКкМАС (БЕО Ю МО:29)
Р АНЕКМВАОААА АМРЕМОВСКС ВВАСсОВсКМВс (ЗБОЮ МО:30) « 20 ПР БКЕВНМВОААА АКРЕМсВОКС ВНАСсСОВоКМКа (ЗБОЮ МО:З1) - с ч.р ВВЕВЕМКОЛАА АМРЕМБВСКС вКСсОВсСКкМНо (БЕ ИО МО:32) ц АУР ВВЕКМВОААА АМРЕМОНСКО вЕСОВОКМКо (ЗБОЮ МОЗ)
МАЛ? ВНЕВМВОААА АМРЕМУВСКС ВАСОВСскМАЄ (ЗБОЮ МО:34)
ОМАР ВБЕВМВОААА АМРЕМ5КОКО КАСОВОКМВО (ЗБОЮ МО:З5)
Ф 75 КОМАУПР ВБЕВМКОААА АМРЕМ5ВСКО КВСОВСКМВс (ЗБОИО МО:ЗБ)
ОКОМАУтР ВБЕВМЕОААА АМРЕМ5ВОКО весовскМНОа (5БЕСИО МО:З7)
Ф РІЖОМАУБР БВЕВМНВОДАА АМРЕМБВОКО ВАСОБСКМАЄ (ЗБОЮ МО:ЗВ) 9 50 Вважається, що такі зрізані ЗОМЕ білкові продукти включають у себе зрізаний СОМЕ білок з амінокислотною о послідовністю, вираженою формулою Х-ІСув"!-Сув!39|-уУ, його варіанти і похідні. Таким чином, зрізані ЗОМЕ (Че) білкові продукти за винаходом включають у себе також варіанти з добавками, заміщеннями і внутрішніми делеціями, а також похідні амінокислотних послідовностей, виражених формулою Х-ІСуз 71-Сув!99|-У, Крім того, зрізані СОМЕ білкові продукти включають у себе метіонільовані або неметіонільовані, а також глікозильовані або неглікозильовані форми зрізаного ЗОМЕ білка.
Типовими зрізаними ЗОМЕ білками за винаходом є: зрізані метіонільовані або неметіонільовані ЗОМЕ білки о ІАго 15-Пе 7943, (Дзп22- Це!34), (Рго23- ПЦе!З43, (Зег?б-Це!99, (АгаЗ2-Це!З9, (еіуЗЗ- Це! (увеїт ї (ДвпЗ8- Це 734) ко або їхні варіанти і похідні. До числа кращих на сьогоднішній день зрізаних ЗОМЕ білків за винаходом належать: зрізані метіонільовані або неметіонільовані СОМЕ білки (Сув?7- Пе!З4 і (Двп8- Це!З43, їхні варіанти і похідні. 60 Типовими варіантами заміщень є зрізані СОМЕ білки (Азп22А Зег2-Це 734) і |Рго23-| увЗт А АвпЗ7-Це!341, Типовим варіантом добавлень є зрізаний СОМЕ білок Зег-| Рго23-Ї увЗ" А АвпЗ!- Це 343,
Згідно з іншим аспектом даного винаходу зрізані ЗОМЕ білки можуть бути виготовлені у глікозильованій або неглікозильованій формі. Одержання похідних зрізаного ЗОМЕ білка, як правило, пов'язане з приєднанням ЗОМЕ 65 білка до водорозчинного полімера. Наприклад, зрізаний СОМЕ білок може бути кон'югований за однією і більше молекулами поліетиленгліколю для зниження преципітації зрізаного СОМЕ білкового продукту у водному середовищі.
Винаходом пропонуються також різноманітні полінуклеотиди, які кодують зрізані СЗОМЕ білки. Ці нуклеїнокислотні послідовності, взагалі, вживаються для експресії зрізаного ЗОМЕ в еукаріотичній або прокаріотичній клітині-хазяїні де продукт експресії або його похідна характеризується спроможністю підвищувати поглинання дофаміну дофамінергічними клітинами. Полінуклеотиди можна використовувати також в клітинній або генній терапії. Відповідні до цього амінокислотні послідовності можуть бути такі, як показано на фігурах, що додаються, так само, як додаткові вироджені послідовності і виникаючі природним шляхом алельні варіанти. 70 Ще один аспект винаходу залучає вектори, які містять полінуклеотиди, що кодують зрізані ЗОМЕ білки, операбельно зв'язані з послідовностями регулювання ампліфікації і/або експресії. Як прокаріотичні, так і еукаріотичні клітини-хазяїни можуть стабільно трансформуватися або трансфектуватися такими векторами для експресії зрізаного гліоцитопохідного нейротрофічного фактора. Крім того, винахід включає у себе рекомбінантне вироблення зрізаного ЗОМЕ білка, де такі трансформовані або трансфектовані клітини-хазяїни /5 ростуть у живильному середовищі, а експресований цими клітинами зрізаний СОМЕ за необхідністю відділяється від клітин-хазяїнів і/або живильного середовища. Далі, винахід включає у себе використання полінуклеотидів, кодуючих зрізаний СОМЕ, і векторів, які містять такі полінуклеотиди, у генній або клітинній терапії.
Згідно з ще одним своїм аспектом, даний винахід передбачає залучення виготовленої рекомбінантним методом СОМЕ композиції, яка містить суміш зрілого ЗОМЕ білка з одним або більше виведених із нього зрізаних ЗОМЕ білків, де зрілий СОМЕ білок має молекулярну масу приблизно 44КОСа, а зрізаний СОМЕ білок має молекулярну масу приблизно 36-40кОа.ЗОМЕ композиція може містити принаймні два види зрізаного СООМЕ, де перший вид має молекулярну масу приблизно З3бКкОа, а другий вид має молекулярну масу приблизно 40Кра.
Зрізаний СОМЕ вид з молекулярною масою приблизно 40КкОа є гетеродимером СОМЕ мономера з молекулярною масою приблизно 22Кба і зрізаного ЗОМЕ мономера з молекулярною масою приблизно 18КкОа. Передбачається сч об також, що один або більше зрізані ЗОМЕ види можуть бути відділені від такої суміші для використання у терапії.
Ще один аспект даного винаходу включає у себе фармацевтичні композиції, які містять зрізаний СОМЕ і) білковий продукт. До складу зрізаного СОМЕ білкового продукту, зазвичай, входить також фармацевтично прийнятний носій. Можуть вживатися також різноманітні фармацевтичні матеріали з метою полегшення процесів вироблення, зберігання, вантажно-розвантажувальних робіт, постачання і терапевтичної дії. Згідно з винаходом, Ге! зо Зрізані СОМЕ білкові продукти підвищують засвоєння дофаміну і виживання дофамінергічних нейронів. Таким чином, зрізані СОМЕ білкові продукти є особливо ефективними для лікування розладів нервової системи, о обумовлених травмами або захворюваннями, такими як хвороба Паркінсона. со
Решту характерних ознак і переваг даного винаходу буде з'ясовано у подальшому описі з докладним розгляданням його практичного аспекту. ісе)
Стислий опис ілюстрацій со
Характерні ознаки і переваги даного винаходу стають очевидними при розгляді наступних ілюстрацій, що додаються.
Фиг.1: нуклеїнокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО:1), яка кодує зрілий гліоцитопохідний нейротрофічний фактор людини (СОМ). Показана також амінокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО:2) зрілого СОМЕ білка «
ЛЮДИНИ. шщ с Фіг.2: діаграма плазмідної конструкції, виготовленої для експресії рекомбінантних зрізаних ЗОМЕ білків.
Фіг.3: рестрикційна карта альтернативної нуклеїнокислотної послідовності (ЗЕО ІЮ МО:39), що кодує СОМРЕЇ ;» зрізані ООМЕ полінуклеотиди.
Фіг.4: рестрикіційна карта ще однієї нуклеїнокислотної послідовності (ЗЕСО ІЮ МО:40), кодуючої іЗОМЕЇ
Зрізані СОМЕ полінуклеотиди. б Фіг.5: нуклеїнокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО:41), яка кодує заміщений варіант зрізаного ОЮОМЕ білка о І(Рго23-1увЗ7А АвпЗ"е!ЗЯ(5ЕС 0 МО:42). Цей білок може бути описаний також як варіант з добавленням/заміщенням зрізаного ЗОМЕ білка Меї-Зег-| Рго23-Ї увЗ" А АвпЗ!"-Це 913, о Фіг.6: нуклеїнокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО:43), яка кодує зрізаний СОМЕ білок (Аго 22-Це 343 (ЗЕС 10 о) 70 Моаа).
Фіг.7: нуклеїнокислотна послідовність (ЗЕО ІЮ МО:45), яка кодує зрізаний СОМЕ білок (Су 33-Це!34 (ЕС І
Фо МО:46). 9 Фіг.8: амінокислотна послідовність зрілого НЗОМЕ(ЗЕО ІЮ МО:47) у порівнянні з ря кількома типовими зрізаними СОМЕ білками: Ме-(АгоаЗ2-Пе!94, (ЗЕСО 10 Мо:48), МенІсІу"-Пе!9 (ЗЕ 10
МО:49) і Меї-Зег-| Рго23-Ї увЗ"д АвпЗ"-ПЦе 31) (ЗЕО ІЮ МО:50).
Ф) Докладний опис винаходу ка Гліоцитопохідний нейротрофічний фактор людини ПООМЕ) синтезується як попередник, який піддається обробці і секреції у якості зрілого білка із 134 амінокислот. Вище було визначено, що зрілий ЗОМЕ людини має бо амінокислотну послідовність, зображену на Фіг.1 (ЗЕС І МО:2).
Даний винахід оснований на відкритті того факту, що зрілий СОМЕ білок може бути зменшеним у розмірі (і зватися "відсіченим" або "зрізаним"), але при цьому зберігати свою біологічну активність. Уперше зрізаний білок було відкрито при рекомбінантному виробленні СОМЕ в клітинах яєчника китайського хом'яка (СНО).
Коротко, рекомбінантний СОМЕ людини (пООМЕ) приготовляли наступним чином. Нуклеїнокислотну б5 послідовність, кодуючу повну, відкриту рамку зчитування зрілого ЗОМЕ білка людини, було клоновано у плазміду експресії. Після підтвердження правильності нуклеїнокислотної послідовності (секвенуванням білка як еквівалента послідовності гСОМЕу генному банку) її було трансльовано в амінокислотну послідовність, ідентичну опублікованій послідовності зрілого СЗОМЕ людини (іп ей ап, Зсіепсе 260, 1130-1132, 1993).
Плазмідна ДНК була піддана лінеаризації і трансфектуванню у дефіцитні за дигідрофолатредуктазою клітини
СНО (клітини СНО) методом преципітації фосфатом кальцію. Трансфектовані клітини піддали культивуванню у селективному середовищі, і колонії, які виживали у процесі селекції, відбиралися для індивідуального аналізу експресії НОМЕР.
Безсироваточні кондиційовані середовища від індивідуальних клонів відбиралися і аналізувалися за допомогою вестерн-блотінгу, використовуючи імунні сироватки, специфічні до ЯИЗОМЕ, Імунні сироватки залучали 7/0 Кролячі поліклональні антитіла, витягнуті у кролів, імунізованих рекомбінантним ПООМЕ, експресованим в
ЕзсНегіснпіа соїї. В умовах відновлення, ПЗОМІ| наявний в цих зразках, був відокремлений по двох головних смугах з уявними молекулярними масами приблизно 22КОа і 18кОСа. Кожна смуга складалася із близько розташованого дублету приблизно 22422,5КОа і 18-4-18,5КкОа відповідно (для спрощення ці дублети помічаються як смуги або види 22КОа і 18кОа).
Як повідомлялось раніше, СОМЕ існує як гомодимер з дисульфідною в'яззю, який складається з двох ідентичних субодиниць зрілого ЗОМЕ білка з молекулярною масою приблизно 20-22КОа. Повідомлялося, що при аналізі СОМЕ у невідновлюючих умовах ідентифікувалася широка смуга 32-42кКОа | іп еї аїЇ., Зсіепсе 260, 1130-1132, 1993)| або 33-45кКОа | іп еї аїЇ., У. Мейгоспет. 63(2), 758-768, 1994). Існування цього діапазону інтерпретувалося як зумовлене гетерогенністю глікозилювання на зрілих мономерах і у подальшому одержало підтвердження експериментами з деглікозилювання.
У той час як дана смуга 22кКОа відповідає зрілому СОМЕ білку, про який повідомлялося в літературі, про смугу 18кОа в літературі жодні повідомлення відсутні. Відносні кількості білків 22кОа і 18кОа в зразках, зібраних від індивідуальних клонів, помітно варіювали. Крім того, було знайдено, що багато врожаїв від того ж самого клону показували різні величини співвідношення цих двох смуг. Більш того, було знайдено, що зберігання сч білка, експресованого у СНО, часто приводить до збільшення смуги 14кО0а при одночасному зменшенні смуги 22кОа. о
Аналіз кондиційованого середовища від трансформованих клітин СНО! вестерн-блотам и у невідновлюючих умовах показав три добре виокремлених смуги з уявними молекулярними масами 36, 40 і 44кОа. Це спостереження також йшло усупереч з попередніми повідомленнями. Відносна інтенсивність цих смуг б зо Змінювалась, але добре корелювали з мономерними смугами 22 і 18кОСа, наявними у кожного зі зразків.
Подальший аналіз з використанням моноклональної імунної сироватки визначив, що ці три смуги у о невідновлюючому гелі відповідають трьом можливим димерам, що складаються з двох мономерів. Як с доповідалось раніше, найбільший білок 44кОа являє собою димер двох зрілих СООМЕ білків з молекулярною масою 22КОа. Проміжний білок 40КОа складається із димера, в якому один зрілий білок був відновлений за ре) зв Молекулярною масою у форму 18кОа. Найменший димер З3бКкОа містить, очевидно, два білки 18КОа, тобто «о обидві форми 22кКОа у ньому були відновлені у молекулярній масі. Ці дані уперше показали не тільки наявність нової форми СОМЕ мономеру, але також наявність зрізаного ЗОМЕ білка у димерній конфігурації. Було знайдено також, що при. зберіганні мономерна композиція зразків зміщується у напрямку композиції зі зрізаною формою і відповідного димерного виду, тобто кількість білка З6КОа у неї виказує збільшення. «
Далі, були проведені дослідження з метою визначення того, яка частина білка була елімінована або змінена з с для того, щоб викликати зменшення молекулярної маси порівняно з масою зрілого ЗОМЕ білка, про який повідомлялося раніше. Було уперше визначено, що зменшення молекулярної маси було зумовлене не змінами у ;» глікозилюванні.
СОМЕ містить два потенціальних М-зв'язаних сайти глікозилювання і, згідно з повідомленнями, піддавався
Глікозилюванню. Проте, зрізаний білок не є простою неглікозильованою або недоглікозильованою формою
Ге» зрілого СООМЕ. Це було продемонстровано в експериментах з деглікозилювання, де зразки піддавалися обробці
М-гліканазою, О-гліканазою і нейрамінідазою. На відновлюючих гелях білок 18кО0а внаслідок перетравлення
Ме, М-гліканазою зменшувався до 13,5КОа, вказуючи на наявність еквівалентності М-зв'язаного цукру 4,5К0а. 2) Обробка нейрамінідазою і О-гліканазою викликала невелике зміщення смуги 18кКОа до 17КкОа. Це вказує на 5р Наявність О-зв'язаних цукрів у білку. Доповідалося, що зріла смуга 22КОа піддавалася глікозилюванню і також і відновлювалася до 18КкОа (тобто також на 4,5КкОа) М-гліканазою. Потім це було підтверджено за допомогою
Ге) моноклонального антитіла, специфічного до смуги 22КОа на гелі. Картина перетравлення невідновленого димеру гліканазою була більш складною, але піддавалася інтерпретації і збігалася з первинним розподіленням цих трьох форм.
У результаті цього, зменшення молекулярної маси білка на 4,5КкОа далі розглядалося як таке, що виникає внаслідок делеції приблизно 30-35 амінокислотних залишків, а не як зумовлене змінами у глікозилюванні.
Ф) Вважалося найбільш правдоподібним, що делеція відбувається на амінокінці зрілого ЗОМЕбілка з наступних ка причин. Зрілий СОМЕ містить у цілому 7 цистеїнів. Якщо б делеція відбувалася на карбоксильному кінці, то втрачалося б від 2 до 4 з 7 цистеїнів, наслідком чого, з очевидністю, була б інактивація білка. Проте, во біовипробування зразка, який складався переважно із зрізаної форми, з метою вимірення їхнього нейротрофічної активності дофамінергічних нейронів, показали, що активність Їхнього зрівнюється з активністю зразка, який містив пропорційно більші кількості зрілої форми СОМЕ.
Далі, шляхом аналізу амінокислотної послідовності очищеного білка був визначений сайт розщеплення.
Зразки піддавалися секвенуванню згідно з інструкціями виробника за допомогою секвенатора білків Арріїєд 65 Віозувіетз 494А протягом 10 циклів. Оскільки техніка і методика секвенування добре відомі фахівцям у даній галузі, більш докладне ознайомлення з секвенуванням білків можна отримати в літературі (Бацйзвеї еї аї.,
ЕІесігорпогезів 12:22-27, 1991; заявка на Патент США Мо576316 від 24 серпня 1990р. (заявка на европейский патент Мо90310899, публікація МоЕР 423980 від 4 жовтня 1990Р під назвою "Зіет Сеї| Расіог' - "Фактор стовбурових клітин")), розкриття яких введене у даному опису посиланням. Цей аналіз показав, що амінокінець
Зрізаного білка мав послідовність "КООКОК" або Аго-Сіу-сІп-Аго-С1Іу-І ув. Таким чином, перші 31 амінокислота були видалені із зрілого білка у кондиційованому середовищі. Решта амінокислотної послідовності зрізаного білка, починаючи від амінокислоті Аго?2, іншим чином співпадала з амінокислотною послідовністю зрілого ООМЕ, зображеною на фіг.1 (ЗЕО ІЮ МО 2).
Зрізаний СОМЕ білок (Агда?2-Це 24) виявляв активність (на якісній основі) у випробуваннях дофамінергічних 70 нейронів. Випробування активності дофамінергічних нейронів використовувалися для визначення нейротрофічних факторів, які можуть бути корисними при лікуванні хвороби Паркінсона. Базуються вони на випробуваннях, описаних раніше в (Егіедтап еї аЇ., Мейго. Зсі. ей. 79:65-72, 1987, розкрите у даному опису посиланнямі, і можуть включати у себе модифікації, описані І іп еї а. |(Заявка на Патент США Мео08/182183 від 23 травня 1994 та її родові заявки; РСТ/О592/07888 від 17 вересня 1992р. (М/О 93/06116); і заявка на европейский 75 патент Мо92921022.7 (публікація МЕЕР 610254)). Докладний опис цих випробувань наданий нижче у Прикладі 5.
Процедура очищення з наступним амінокислотним секвенуванням привели до винайдення іншого білка, у якого з М-кінця зрілого ЗОМЕ були видалені перші 36 амінокислотних залишків: зрізаний СЗОМЕ білок
ІСув27-Ме 7943) з М-кінцевою послідовністю КМАС(СМІ --. Тут також решта амінокислотних залишків зрізаного білка іншим чином співпадала з рештою амінокислотної послідовності зрілого СООМЕ людини. Біовипробуванням на засвоєння дофаміну був підданий також зрізаний СОМЕ білок | ув 37-Пе1341, Його активність з ЕО5О становила приблизно Б5Опг/мл і, таким чином, була подібною до активності очищеного рекомбінантного зрілого СОМЕ, експресованого в Е. Соїї.
Далі було знайдено, що бактеріально експресований зрілий СОМЕ може бути замінений на зрізану форму.
Зрілий ЗОМЕ, експресований в трансформовану Е. Соїї, як описано в (іп еї аі., заявка на Патент США с 29 Ме08/182183, див. вище), був інкубований у кондиційованому середовищі, одержаному із клітин СНО. (У
Рекомбінантний ЗОМЕ із Е Соїї мав уявну рекомбінантну масу 17КОа на відновлюючому гелі. Коли матеріал змішували з кондиційованим середовищем клітин СНО і інкубували на протязі 5 днів при 4"С, білок зрізувався повністю до 12,5КОа. Це зрізання було менш повним при інкубації на протязі 1 години або 24 годин, що вказує на залежність процесу від часу у цих умовах. Було також знайдено, що проста інкубація рекомбінантного ЗОМЕ б із Е. Сої на протязі ночі у середовищі з 0,195 фетальної бичачої сироватки не дає зрізаної форми. Таким со чином, для того щоб відбувався процес зрізання, очевидно, необхідною є наявність живих клітин в культурі.
Отже, можливо, що подія зрізання може також виникати у певних тканинах іп мімо. о
Крім того, було знайдено, що похідні зрілого лОбМЕ, експресованого в Е Соїі, такі як пегильований СОМЕ Ге) (описані також в |"іп еї аІ., Заявка на Патент США Ме08/182183, див. вище)), можуть бути процесовані у зрізану
Зо форму при наявності кондиційованого середовища, виведеного із СНО. Зрілий СОМЕ може бути пегильований о на амінокінці з тим, щоб збільшити час виведення при кровообігу. Петлювання збільшує розмір білка, і модифікований зрілий СОМЕ мігрує при масі біля 45кКОа у відновлених умовах. Як і з непегильованою зрілою формою, інкубація пегильованого ЗОМЕ із Е Соїї у кондиційованому (нетрансфектованому) середовищі клітин «
СНО дає смугу 12,5КОа. В обох випадках вид 12,5КОа був наявним у якості дисульфідно зв'язаного димеру, як - 70 показано на невідновлюючих гелях. Генерація цієї зрізаної форми із пегильованого на М-кінці зрілого білка с Асвідчить також про те, що подія зрізання відбувається на М-кінці білка, оскільки пегильований залишок під
Із» час процесу зрізання втрачався.
Виходячи з цих фактів і з того, що подія зрізання може виникати також іп мімо, зрізана форма СОМЕ білка може бути остаточною формою ПООМЕ, процесованою природним шляхом у фізіологічних умовах. Отже, було визнане за корисне виробляти зрізаний СОМЕ білок або його похідну для використання у терапевтичних цілях.
Ме, Н и 5 арі и : и 32 .Це134 априклад, безпосередньо експресований або синтезований зрізаний СЗОМЕ білок, такий як Ага 7--Пе"97, (о) повинен бути стійким до вищеописаної протеолітичної активності. Більш того, якщо бажано виробляти зрізану с СОМЕ похідну, таку як пегильований зрізаний СОМЕ білок (Агу 32-МПе"34, похідна, що у результаті цього 5р одержується, не повинна бути легкопіддатливою до специфічного зрізання, що спостерігалося на зрілий СОМЕ (65) похідній.
Ге) Додаткові переваги можна очікувати також від зрізаних СОМЕ білкових продуктів. По-перше, рі зрізаного білка, такого як зрізаний СОМЕ білок (Ага 32-Це"34, буде зменшуватися від 10 до приблизно 8,0-8,5. Це робить білок значно менш основним, що, у свою чергу, може давати цілий ряд корисних ефектів, включаючи краще ов рецепторне зв'язування і зменшення цитотоксичності у місці введення медикаменту, наприклад, у місці інтратикальної ін'єкції. По-друге, у межах перших 26 амінокислот послідовності зрілого ОЮМЕ знаходяться два
Ф) сайти деамідування; Аго-Азп-Ага (амінокислоти 14-16) і сІй-Авзп-Зег (амінокислоти 24-26). Відсутність одного ка або обох з цих сайтів у зрізаному СООМЕ білку повинна була 6 підвищити стабільність білка.
Зрізані ЗОМЕ білкові продукти во В основному варіанті практичного втілення зрізані ЇОМЕ білки за винаходом можуть бути представлені наступною амінокислотною послідовністю, де для полегшення порівняння зі зрілим СОМЕ білком використовується схема нумерації амінокислотних залишків, наведена на Фіг. 1:
Х-ІСув"!-Сув!39-у де (Сув"!-Сув 193) є послідовністю амінокислот від Суз"! до Сув 133, як зображено на Фіг.1 (ЗЕО ІЮ МО:2); 65 У - карбоксильна кінцева група Суз 133 або амінокислотний залишок Пе 37 на карбоксильному кінці;
Х - метіонільована або неметіонільована аміногрупа Суз"! або амінокінцевий амінокислотний залишок (чи залишки), який вибирається із групи: с ва й Мво ко (5ЕО О МО:3) скнко (5БО Ю МО:4) вокМмне (ЗЕ ТО МО:5) то овскмко (36010 МО) совсЕмво (50 О МО?)
Есовскмно (ЗЕО 10 МО:8) васовокМмас (ЗЕО ОО МО:9) с ввсовокмко (БОЮ МОГО) ко ввсокоКкнко (ЗБОЮ МО:11) ско ввсОовокмЕо (ЗЕО І МОл2) вскс АВсОВсккВе (БОЮ МОЗ) 5вокс ВАсоВскМВо (560 Ю МО 14)
МБВОКО ВдсоВокнно (ЗЕ ОО МО 15)
ЕН5ВОКсС ВесОКеКМНо (5ЕО О МОЄ)
РЕМЕНСКО ВясовоКМНо (ЕС О МО:17) Га - МРЕМЕВСКС вводвокМко (5БО Ю МО 18) о
АМРЕМЕНСКИ ВнСсОовВокМво (ЕС Ю МО:19)
А АМРЕМ5ЕСКО ВВСсОБсКМеЄ (ЕС ЮО МО:20)
АА АМРЕМсВСКС ВиСсОвекМАС (ЗЕО 10 МО:21) Фу зо ААА ММРЕМЗЕСКС ВВСОБСКМАЄ (ЗБОЮ МО:22) д
ОААА АМРЕМЗВОКСО ВАсОБсКМВо (5ЕО ІЮ МО:23) со
ВОДАА АМРЕМСВСКС ВЕСсОВсКМКОо (ЗЕО 10 МО:24)
МВОААА АШРЕМБНОКО КЕСОВСКМВО (5ЕО І МОС25) іш
ВМВОААА АМРЕМНБКОКС вВСсОКСсКкМВо (ЗЕО О МО:26) (Се)
ЕВМВОААА АМРЕМБАСКО ВеСсОВСКМАЄ (ЗБОЮ МО:27)
ВЕВМКОААА АМРЕМНОВОКо ВВсОБОКНАС (БЕ ІО МОС28)
ВБКЕВЕМВОДАА АМРЕМБНОКС ВЕСсОВсКМАо (ЗЕО ОО МО:29) «
Р ВБЕВМВОАДАА АМРЕМЕВОКС ВВСсОДсКМВа (ЗЕО ЮО МО:30) - с ІВ ВЕЕВМВОААЛА АМРЕМБНОКО кдоОВскМАо (5ЕО МО МО:31) :з» МР ВВАЕВМКОАЛА АМРЕМЕНСКСО ВВСОВСсКМНКОо (ЗЕО ІЮ МО:Зг)
АЧЬР ВНЕВМАОААА АМРЕМОВСКО ВЕсОВоКМКо (БЕ ОО МО:33)
МАМР БВЕВМКОААА АМРЕМОНОКо ВВсОНоКМВо (5ЕО ОО МО:34)
Ме, ОМАУТР ВВЕВМКОДАА АМРЕМЕКОКС ВЕСсОВСсЕМНО (ЗЕОИО МО:35) (22) КОМАР ВРЕЕВМВОААА АМРЕМОВОКО КЕсОВоКнКо (5БО О МО:З6) с РКОМАУСР ВНЕВМКОАЛА АМРЕМЕВСКС БЕСОВСКМВО (5ЕО О МО:37) с» 70 РОКОМАУТР НЕЕВМКОААА АМРЕМНОКО КЕСОВСКМАС (ЗБОЮ МО:З8)
Терміном "зрізаний ЗОМЕ білковий продукт", що використовується у даному описі, охоплюються біологічно с активні, синтетичні або рекомбінантні зрізані (ОМ білки, зрізані ЗОМЕ білки, одержані із зрілого ЗОМЕ, біологічно активні зрізані ЗОМЕ варіанти (включно вставки, заміщення і делеції) і їхні хімічно модифіковані похідні. Цей термін стосується також зрізаних ЗОМЕ білків, які є по суті гомологічними ЗОМЕ білку людини з 29 амінокислотною послідовністю, встановленою далі в (5ЕО ІЮ МО:2).
ГФ) Термін "біологічно активний", який використовується у даному опису, означає, що зрізаний ЗОМЕ білок демонструє подібні нейротрофічні властивості, але не обов'язково усі ті ж самі властивості і не обов'язково о того ж самого ступеню, що й СОМЕ білок, який має амінокислотну послідовність, встановлену далі в (ЗЕО ІЮ
МО:2). Вибір потрібних нейротрофічних властивостей залежить від тієї терапевтичної цілі, з якою вводиться 60 даний зрізаний СОМЕ білковий продукт. Зрізаний СОМЕ білкові продукти є біологічно активними і демонструють характеристики виживання дофамінергічних нейронів, подібні до тих, що демонструються зрілим ЗОМЕ білком при оцінці за поглинанням дофаміну і експресією тирозингідроксилази (ТГ), як у типових біовипробуваннях, описаних у нижченаведених прикладах.
Термін "по суті гомологічний", який використовується у даному описі, означає ступінь гомології з людським бо ОМЕ, що має амінокислотну послідовність, встановлену далі в (ЗЕО ІЮ МО:2), і який складає не менш як 7095,
краще, якщо більше 8095, і найкраще, якщо більше 9095 або навіть 9595. Ступінь гомології розраховувався як відсоток амінокислотних залишків, що знаходяться у меншій з двох послідовностей, які вишиковуються у ряд з ідентичними амінокислотними залишками у послідовності, що порівнюється, коли для надання допомоги у цьому порівнянні можуть бути введені чотири розриви завдовжки 100 амінокислотних залишків, як це встановлено в
Іауйої, іп АйЙШав ої Ргоївеіп Зедцепсе апа Зігисішге Мої.5, р.124, 1972, Майопа! Віоспетіса! Кезеагсі
Еошйпаайоп, УуУазпіпдіоп, О.С), введене у даному опису посиланням. Під термін "по суті гомологічний" підпадає будь-який зрізаний СОМЕ білок, який може бути виділений завдяки перехресній реактивності з антитілами проти
СОМЕ за послідовністю (ЗЕО ІЮ МО:2) або гени якого можуть бути виділені шляхом гибридизації з геном або 7/0 сегментами гена, кодуючими СОМЕ за послідовністю (5ЕО ІЮ МО:1).
Фахівцям у даній галузі зрозуміло, що по суті гомологічні білки можуть містити одну і більше делецій, добавлень і заміщень в амінокислотних залишках зрізаного СОМЕ білка, вираженого формулою
Х-ІСув"!-Сув!39 у, Виготовлення таких варіантів білків докладно описано нижче. Із нижчевикладеного можна буде побачити, що оскільки даний винахід чітко адресований до "зрізаних" ЗОМЕ білків, то варіанти з 75 амінокінцевими добавленнями розглядаються як такі, що включають добавлення метіонінового залишку або іншого ніж СОМЕ амінокислотного залишку чи послідовності, але не включають добавлення амінокислотного залишку чи залишків, яке б призвело до реконструкції зрілого ЗОМЕ білка. Об'ємом даного винаходу охоплюються також зрізані (ЇОМЕ білки, основані на виникаючих природним шляхом алельних мутантах чи варіантах. Виготовлення варіантного зрізаного ЗОМЕ білка докладно описане нижче.
Лін та ін. (Сп еї аі., Заявка на Патент США Мо08/182183, див. вище| описують зрізання зрілого СОЮОМЕ на карбоксильному кінці шляхом протеолітичного процесінгу залишків І увз-Аго, які є відповідно шостим і п'ятим залишками від карбоксильного кінця зрілого СОМЕ (тобто І ув 129-Агуд!30 згідно з нумерацією амінокислотних залишків на Фіг.1, також як в (ЗЕО ІЮ МО:1) або (5ЕО ІЮО МО:2). Таке зрізання видалило би із зрілого СООМЕ білка два цистеїнових залишки. Це б, з очевидністю, призвело до неприйнятної складчастості білка і, таким с 29 чином, до утворення неактивного білка. У протилежність цьому, зрізані СОМЕ білкові продукти г)
Х-ІСув"!-Сув!39) У за винаходом утримують залишки Сув'"! і Сув!бЗ3 і за результатами випробувань на поглинання дофаміну є активними білками.
В одному з варіантів практичного втілення даного винаходу кращі зрізані СОМЕ білкові продукти є дефіцитними за одним і більше сайтами деамідування. Результатом такого дефіциту є, очевидно, підвищення о біохімічної стабільності очищеного білка і зменшення можливих продуктів деградації, що дозволяє виробляти со білок, більш стабільний при зберіганні. Типовим зрізаним СОМЕ білковим продуктом є зрізаний СОМЕ білок
ІБег26 |е!341 з дефіцитом сайтів, наявність яких могла б привести до деамідування зрілого білка. В о альтернативному варіанті зрізаний СОМЕ білок Ага 9- Пе!"34, не має принаймні першого сайту деамідування, який є у зрілому білку. со
Кращим на сьогоднішній день зрізаним ЗОМЕ білковим продуктом є зрізаний СОМЕ білок (Агда?2-Пе!34, У цьому білку відсутній сайт, в якому або поблизу якого відбувається протеолітичне зрізання зрілого білка.
Отже, цей СОМЕ білок повинен бути стійким до події процесінгу, яка може відбуватися також іп мімо. ІншИМ прикладом кращого зрізаного ЗОМЕ білкового продукту є зрізаний СОМЕ білок |(Гуг?"-Це!З4, Це зрізання ще « більше зменшує рі зрізаного білка, що спостерігалося і при інших зрізаннях, при яких залишки до Су 79 і Не", - с а також вони самі, видалялися відповідно із М- і С-кінців. Найкращі на сьогоднішній день зрізані ЗОМЕ білкові и продукти утримують усі цистеїнові залишки, які знаходяться у зрілому СОМЕ білку, проте не мають жодних є» відрізнених сайтів для швидкого протеолітичного процесінгу зрізаного ЗОМЕ білка під час експресії і вироблення або після введення іп мімо. До цих кращих варіантів білків належать зрізані ЗОМЕ білкові продукти 45. |АгдЗ24іе! ЗУ, (еуЗЗДе3, (уз іеЗА, ІАгрЗ5-ПетЗ, (еузе- Це, (ув Де, (АвпЗ8-ПЦе94 і (ДгаЗ9-Це 7943, (2) Подібно результатам, описаним раніше для зрілого ЗОМЕ п еї аіІ., Заявка на Патент США Мо07/855413, див.
Ф вище), зрізані СОМЕ білки за винаходом виявляють спроможність до підвищення поглинання дофаміну ембріональними попередниками дофамінергічних нейронів чорної субстанції. Біовипробування зрізаних СООМЕ о білків описані нижче у Прикладі 4. с 50 Нові зрізані ЗОМЕ білки, як правило, виділяються і очищуються для утворення зрізаних ОМЕ білків, які є по суті вільними від інших (не-СОМЕ)білкових матеріалів. Краще, якщо зрізані ЗОМЕ білкові продукти є приблизно
Ме) на 8095 вільними від інших білків, які можуть бути наявними в них завдяки технології, що використовується при виготовленні зрізаних ЗОМЕ білкових продуктів. Більш прийнятно, якщо зрізані ЗОМЕ білкові продукти є вільні від інших білків приблизно на 9095, а ще краще - на 9595, і найкраще, якщо більше ніж на 98905. Крім того, го винахід несе з собою унікальну перевагу при одержанні полінуклеотидних послідовностей для вироблення
ГФ! гомогенних зрізаних СОМЕ білків. Наприклад, використання полінуклеотидної послідовності, кодуючої зрізаний
СОМЕ білок (Ага?2-Пе"343, дозволяє здійснювати рекомбінантне вироблення зрізаного СОМЕ білка в Е. Соїї і о інших відповідних системах експресії. Іншими словами, нові полінуклеотиди дозволяють виробляти зрізані СОМЕ білки, які є несприйнятливі до протеолітичного процесінгу або які мають знижену чутливість до такого 60 процесінгу чи інших біохімічних технологічних ефектів, як описано вище. Таким чином, нові полінуклеотиди дозволяють легко виготовляти і/або відділяти зрізані ЗОМЕ білки одиничного виду і, отже, зрізані сОМЕбЦККА іабо їхні продукти не містять або містять у знижених кількостях вищезгадані суміші гетеро- і гомодимерів.
Проте, зрозуміло, що кінцеві зрізані ЇОМЕ білкові продукти можуть бути скомбіновані з іншими факторами, хімічними композиціями і/або відповідними матеріалами фармацевтичної рецептури до медикаментозного 62 введення, як докладно описано нижче.
Згідно з одним з аспектів даного винаходу, зрізані СОМЕ білки вигідно виробляти за рекомбінантною технологією, оскільки вона дозволяє одержувати порівняно великі кількості білка високої чистоти.
Рекомбінантні зрізані СОМЕ білкові форми включають у себе глікозильовані і неглікозильовані форми білка та білка, експресованого у бактеріальних, ссавцевих або інсектицидних клітинних системах. В альтернативному варіанті зрізані ЗОМЕ білки можуть бути синтезовані хімічним шляхом. Кращі на сьогоднішній день способи виробництва докладно описані нижче.
Варіанти і похідні зрізаного ЗОМЕ
А. Варіанти зрізаного ООМЕ 70 Ще один аспект даного винаходу стосується варіантів- зрізаного СООМЕ білка. Термін "зрізані СООМЕ білкові продукти", який використовується у даному опису, охоплює собою варіанти білків, у яких амінокислоти були видалені із залишків ("делеційні варіанти"), вставлені до залишків ("адитивні варіанти") або заміщені залишками ("субститутивні варіанти") у межах амінокислотної послідовності природно виникаючого СОМЕ. Білки за такими варіантами виробляються шляхом введення відповідних нуклеотидних змін у ДНК, кодуючий білок, або 7/5 шляхом хімічного синтезу іп Уйго бажаного білка. Фахівцеві у даній галузі зрозуміло, що реалізувати можна багато комбінацій делецій, вставок і заміщень за умов, що кінцевий білок буде мати біологічну активність ЗОМЕ,
Фахівцям у даній галузі добре відомі способи мутагенезу при здійсненні заміщень, вставок або делецій одного чи більше вибраних амінокислотних залишків, наприклад, (Патент США Мо4518584)|, розкриття якого введене у даному опису посиланням. Існують дві принципові змінності у конструюванні варіантів амінокислотних послідовностей: розміщення сайта мутації і природа мутації. У розробленні варіантів зрізаних СОМЕ білків розміщення сайта мутації і природа мутації залежать від біохімічних характеристик, що підлягають зміні. Сайти мутації можуть модифікуватися індивідуально або групами, наприклад, (1) заміщенням спочатку консервативним добіром амінокислот і потім більш радикальною селекцією, залежно від досягнутих результатів; (2) делецією амінокислотного залишку-мішені і (3) вставкою амінокислотних залишків, що прилягають до розміщеного у сч ов певному місці сайта.
Делеції амінокислотних послідовностей зазвичай охоплюють проміжки від 1 до 30 амінокислотних залишків, а (8) частіше - від 7 до 10 залишків, і найчастіше - від 17 до 5 залишків. Наприклад, делеції "Х"-ділянки амінокислотних залишків, розміщених на М-кінці до Суз"!", можуть простягатися приблизно від 1 до 30 залишків, у той час як делеції між цистеїновими залишками |Сувз7!- Сув!З3), як правило, охоплюють від 1 до 5 залишків, (о) залежно від Їхнього місця знаходження, так, щоб не пошкодити складчастості білка. Делеції в зрізаних ЗОМЕ білках можуть бути здійснені на ділянках низької гомології з членами родини трансформуючого В-фактора росту о (ТОБ-В ). Делеції із зрізаних СОМЕ білків в зонах значної гомології з іншими послідовностями родини ТОБ-В со будуть, очевидно, змінювати біологічну активність у більш значній мірі. Кількість повних і/або послідовних с делецій вибирається так, щоб зберегти третинну структуру зрізаного СОМЕ білка на зачепленій ділянці, наприклад, цистеінову перехресну зшивку. (Се)
Добавлення амінокислотних послідовностей можуть включати у себе аміно-. і/або карбокси-кінцеві злиття, що простягаються на довжині від 1 до 100 і більше залишків, а також внутрішні вставки поодиноких або багатьох амінокислотних залишків усередині послідовностей. Внутрішні добавлення можуть, у загальному випадку, « складати від 1 до 10, а частіше - від 1 до 5, і найчастіше - від 17 до З амінокислотних залишків. Як зазначалось вище, варіант з амінокінцевою добавкою за винаходом розглядається як такий, що включає у себе - с добавку метіоніну (наприклад, як артефакт прямої експресії СООМЕ у бактеріальній рекомбінантній клітинній а культурі) або не СОМЕ амінокислотного залишку чи послідовності. Варіанти з амінокінцевими добавками не "» включають у себе добавлення амінокислотних залишків, яке б могло викликати реконструкцію зрілого ЗОМЕ білка. Серед інших прикладів кінцевих вставок можна назвати злиття гетерологічної М-кінцевої сигнальної послідовності з М-кінцем для полегшення секреції білка із рекомбінантних клітин-хазяїнів. Такі сигнальні
Ге) послідовності у загальному випадку повинні одержуватися із призначених видів клітин-хазяїнів і, таким чином, б бути їм гомологічні. Вставки або добавлення можуть бути також амінокислотними послідовностями, виведеними із послідовності інших нейротрофічних факторів. (95) Іншою групою варіантів є білки з амінокислотними заміщеннями. В цих варіантах зрізаних СОМЕ білків о 50 принаймні один амінокислотний залишок видалений, а на його місце вставлений інший, відмінний від нього залишок. Наприклад, на Фіг.5 показано як утворений природним шляхом Азп 22 був замінений на Зег для того,
Ме) щоб полегшити подальше видалення залишку Меї. Використовуючи представлення амінокислотної послідовності Х-(Сув"!-Сув 1931-х і нинішнє визначення зрізаних ЗОМЕ білкових продуктів, такий зрізаний СОМЕ білок можна відносити як до варіанта з заміщенням Мей-(Авп 224 Зег22-Це!З13, так і до варіанта з добавленням 22 МевечрРго23-Це/34 зпені бі : : : еі-Зег-ІРго-У-Пе""7. Заміщені білки включають у себе алельні варіанти, які характеризуються природно (Ф) виникаючими замінами нуклеотидних послідовностей у популяції виду, які як можуть, так і не можуть приводити
Ге до заміни амінокислот.
Специфічні мутації послідовностей зрізаних ЗОМЕ білків можуть включати у себе модифікації сайта во глікозилювання (наприклад, серін, треонін або аспарагін). Відсутність глікозилювання або тільки часткове глікозилювання можуть викликатися заміщенням або делецією амінокислот у будь-якому сайті узнавання аспарагін-зв'язаного глікозилювання або у будь-якому сайті білка, модифікованого добавленням О-зв'язаного вуглеводу. Сайт узнавання аспарагін-зв'язаного глікозилювання містить трипептидну послідовність, яка специфічно розпізнається відповідними клітинними ферментами глікозилювання. Цими трипептидними послідовностями є Азп-Хаа-Тиг або Азп-Хаа-5ег, де Хаа може бути будь-якою амінокислотою, відмінною від Рго. б5 Багато заміщень або делецій амінокислот в одному чи обох з перших чи третіх амінокислотних положень сайта узнавання глікозилювання (і/або делеції амінокислоти у другому положенні) дають неглікозильований стан у модифікованій трипептидній послідовності. Таким чином, експресія відповідним чином змінених нуклеотидних послідовностей дає варіанти білків, неглікозильованих у такому сайті В альтернативному варіанті послідовність може бути модифікована таким чином, щоб добавити сайти глікозилювання до зрізаного ЗОМЕ білка.
Один з методів ідентифікації зрізаних СОМЕ амінокислотних залишків або ділянок для мутагенезу зветься "аланіно-скануючий мутегенез" |Сиппіпоайат апа УМеїЇв, Зсіепсе, 244: 1081-1085, 1989). Згідно з цим методом ідентифікується амінокислотний залишок або група залишків-мішеней (тобто заряджені залишки, такі як Аго, Авр, 7/0. Нів, Гув, 91), які потім заміщуються нейтральними або негативно зарядженими амінокислотами (у найкращому варіанті - аланіном або поліаланіном) з тим, щоб провести взаємодію амінокислот з водяним оточенням в клітині або зовні неї. Ті домени, які демонструють функціональну чутливість до заміщень, потім очищуються введенням додаткових або альтернативних залишків до сайтів заміщення. Таким чином, тут спочатку визначається сайт для введення модифікації амінокислотної послідовності, а для оптимізації здійснення мутації у даному сайті можуть /5 проводитися аланінові сканування, або випадковий мутагенез і варіанти можуть відбиратися за оптимальною комбінацією бажаної активності і ступеню активності.
Сайти, які являть собою найбільший інтерес для заміщувального мутагенезу, включають до свого числа такі, де амінокислоти, знайдені в ЗОМЕ білках від різних видів, суттєво відрізняються за об'ємом бічних ланцюгів, зарядом і/або гідрофобністю; Цікавими сайтами є також такі в яких Ідентичними є окремі залишки
СОМЕ-подібних білків, одержаних із різних видів. Такі положення мають загальну важливість для біологічної активності білка. Спочатку ці сайти модифікуються заміщеннями порівняно консервативним шляхом. Такі консервативні заміщення показані у колонці "Кращі заміщення" Табл. Якщо такі заміщення дають зміни біологічної активності, то тоді проводяться більш суттєві зміни (типові заміщення) і/або можуть бути зроблені інші добавлення і/або делеції, а одержані продукти піддані відбору. сч щі о
Ф зо
Фо не
Ф зв Ф « во 117160 норлеяуих не уві Мек лі; рію. но) с з :
Ф
Ф
(95) о 50 Передбачається, що консервативні модифікації амінокислотних послідовностей (і відповідні модифікації кодуючих амінокислотних послідовностей) дозволять виробляти зрізані ЗОМЕ білки з функціональними і іЧе) хімічними характеристиками, подібними до характеристик зрізаних СООМЕ білків, описаних у Прикладах нижче. У протилежність цьому, суттєві зміни функціональних і/або хімічних характеристик зрізаних СОМЕ білків можуть бути здійснені відбором заміщень, які значно відрізняються одне від одного за своїм ефектом щодо підтримання (а) структури поліпептидного остову у зоні заміщення, такої, наприклад, як складчаста або спіральна конформація, (б) заряду або гідрофобності білка в сайті-мішені, (в) об'єму бічного ланцюга. Залишки, що о виникають природним шляхом, діляться на наступні групи за загальними властивостями бічних ланцюгів: ко 1. гідрофобні: норлейцин, Меї, Аа, Маї, І ей, Пе; 2. нейтральні гідрофільні: Сув, Зег, ТАг; 60 З. кислотні: Авр, Сім; 4. основні: Авп, Сп, Нів, Гув, Аго; 5. залишки, які впливають на зорієнтування ланцюгів; Су, Рго; 6. ароматичні: Тгр, Туг, Рпе.
Неконсервативні заміщення можуть залучати взаємозаміну членів цих класів. Такі заміщені залишки можуть 65 бути введені у ділянки зрізаних ЗОМЕ білків, які є гомологічними іншим ТОЕ-В білкам, або у негомологічні ділянки білків.
Б. Зрізані СООМЕ похідні
Хімічно модифіковані похідні зрізаних СОМЕ або варіантів зрізаних ЗОМЕ можуть бути приготовлені фахівцем у даній галузі за наданим нижче описом. Серед хімічних компонентів, найбільш прийнятних для одержання похідних зрізаних ЗОМЕ білків знаходяться водорозчинні полімери. Бажаність використання водорозчинного полімеру пояснюється тим, що білок, до якого він приєднується, не випадає до осаду у водному, тобто фізіологічному середовищі. Краще, якщо полімер є фармацевтично прийнятним для приготування терапевтичного продукту або композиції. Фахівець у даній галузі буде у спромозі вибрати потрібний полімер, виходячи з того, чи буде даний полімер - білковий кон'югат терапевтично корисним і, якщо так, то які будуть 70 потрібні дози, час циркуляції, стійкість до протеолізу і под. Ефективність дериватизації може бути підтверджена введенням даної похідної пацієнту у потрібній формі (тобто шляхом осмотичного насосу або краще ін'єкції чи інфузії, або ж приготуванням рецептів для перорального прийому, прийому крізь органи дихання та іншими шляхами введення) і оцінкою її ефекту.
До прийнятних водорозчинних полімерів належать, але без будь-яких обмежень, наступні: поліетиленгліколь 7/5 ХПЕГ), співполімери етиленгліколю і пропіленгліколю, монометоксиполіетиленгліколь, карбоксиметилцелюлоза, декстран, полівініловий спирт, полівінілпіролідон, полі-1,3-диоксолан, полі-1,3,6-триоксан, співполімер етилену і малеїнового ангідриду, поліамінокислоти (як гомополімери, так і випадкові співполімери), полі(н-вінілпіролідон)-поліетиленгліколь, гомополімери поліпропіленгліколю, співполімери оксидів поліпропілену і етилену, поліоксиетильовані поліолі (наприклад, гліцерол), пропіональдегід поліетиленгліколю го та їхні суміші. У даному опису терміном "поліетиленгліколь" (ПЕГ)охоплюються усі форми ПЕГ, такі як моно(С1-С10)алкокси- або арилокси-поліетиленгліколь, які були використані для дериватизації інших білків.
Більших переваг у виробництві може надавати пропіональдегід поліетиленгліколю завдяки його стабільності у воді. Цей полімер може мати будь-яку молекулярну вагу і бути як розгалуженим, так і нерозгалуженим.
Винахід, зокрема, стосується зрізаних ЗОМЕ білкових продуктів і, у тому числі, зрізаного СОМЕ білка, сч ов Зв'язаного принаймні з однією молекулою ПЕГ. В іншому своему аспекті винахід стосується зрізаного СОМЕ білка, приєднаного принаймні до однієї молекули ПЕГ крізь ацильний або алкільний зв'язок. і)
Пегилювання можна проводити шляхом будь-якої відомої реакції пегилювання, див,, наприклад, (Босив оп
Сгоуй Расіоге 3(2); 4-10, 1992; ЕР 0154316; ЕР 0401384; МаїїкК еї аїІ., Ехр. НетаїйоїІ. 20: 1028-1035, 1992 (повідомляє про пегилювання ЗМ-С5Е за допомогою трезилхлориду)). Краще, якщо пегилювання здійснюється Ге! зо шляхом реакції ацилювання або реакції алкілювання реакційно спроможним водорозчинним полімером. Ці засоби дериватизації, що пропонуються як кращі, докладно розглянуто нижче. Для реакції ацилювання о відбираються переважно полімери, у яких єдиною реакційно спроможною групою є ефірна група. Для с відновлюючих реакцій алкілювання відбираються переважно полімери, в яких єдиною реакційно спроможною є альдегідна група. Крім того, відібраний полімер може бути модифікований у форму з однією реакційно ісе) з5 спроможною групою, таку як активний ефір для ацилювання або альдегід для алкілювання, таким чином, щоб со можна було контролювати ступінь полімеризації. У загальному випадку, водорозчинний полімер не вибирається серед глікозилевих залишків, які утворюються природним шляхом, оскільки зазвичай їх більш спідручно одержувати за допомогою рекомбінантних експресорних систем ссавців.
Ацилювання «
Згідно з винаходом, пегилювання шляхом ацилювання у загальному випадку включає у себе здійснення в с реакції активної ефірної похідної поліетиленгліколю зі зрізаним СОМЕ білком. Для здійснення процесу пегилювання може використовуватися будь-яка відома або ще невідкрита реакційно спроможна молекула ПЕГ, ;» Кращим активованим ПЕГ-ефіром є ПЕГ, етерифікований на М-гідроксисукцинимід (МН). Термін "ацилювання", який використовується у даному описі, включає у себе без обмежень наступні типи зв'язку між зрізаним СОМЕ білюом і водорозчинним полімером, таким як ПЕГ: амідний, карбаматний, уретановий і под. ІВіосопічдае Спет,
Ге» 5: 133-140, 1994). Умови реакції можуть бути вибрані серед будь-яких відомих у техніці петлювання умов, або ще невідомих умов, які можуть бути розроблені, але при цьому потрібно виключати або обмежувати такі умови
Ме, реакції -температури, розчинники і рівні рН, - які можуть викликати інактивацію зрізаного 3ОМЕ білка, що 2) модифікується.
Петлювання шляхом ацилювання у загальному випадку дає поліпегильований зрізаний СОМЕ білок, у якому о Е-аміногрупи лізину пегильовані групою ацильного зв'язку. Краще, якщо зв'язок є амідним. Краще також, якщо
Ге) вироблений продукт є переважно (наприклад, » 95905) тільки моно-, ди- або три-пегильований. Проте, можуть бути утворені також деякі кон'югати з більш високими ступенями пегилювання, у кількостях, які залежать від специфічних умов реакції, що використуються. У разі необхідності можуть бути приготовлені більш очищені, пегильовані кон'югати із сумішей за допомогою стандартних способів очищення, у тому числі, діалізу, висолювання, надфільтрації, іонообмінної хроматографії, гель-фільтрації і електрофорезу. іФ) Алкілювання ко Згідно з даним винаходом, пегилювання шляхом алкілювання у загальному випадку включає у себе реакцію кінцевої альдегідної похідної ПЕГ зі зрізаним ЗОМЕ білком при наявності відновлюючого агента. Пегилювання бо шляхом алкілювання може також давати поліпегильований зрізаний СОМЕ білок. Крім того, можна варіювати умовами реакції для сприяння пегилюванню практично тільки на А-аміногрупі М-кінця білка (тобто монопегильований вид). Як при монопегилюванні, так і при поліпегилюванні краще, якщо ПЕГ-групи приєднуються до білка крізь групу -СН 2-МН-. Зокрема, щодо групи -СНо-, то цей тип зв'язку у даному опису зветься "алкільним". 65 Селективна М-кінцева хімічна модифікація може бути виконана шляхом відновлюваного алкілювання, при якому використовується диференціальна реактивність різних типів первинних аміногруп (лізину відносно
М-кінця), доступних для дериватизації у певному білку. У відповідних умовах реакції досягається по суті селективна дериватизація білка на М-кінці полімером з карбонільною групою. Наприклад, можна здійснити селективне М-кінцеве пегилювання білка шляхом реакції при величині рН, яка дозволяє використовувати різницю
В рКа між Е-аміногрупами лізинових залишків і А-аміногрупою М-кінцевого залишку білка. Така селективна дериватизація дозволяє контролювати приєднання водорозчинного полімеру до білка: кон'югація з полімером відбувається, головним чином, на М-кінці білка, ії при цьому не виникає значних змін інших реакційних груп, таких як аміногрупи бічного ланцюга лізину. При використанні відновлюваного алкілювання краще, якщо водорозчинний полімер має один реакційно спроможний альдегід для зв'язування з білком. Може бути 70 використаний поліпропіональдегід поліетиленгліколю, який містить один реакційно спроможний альдегід.
Винахід включає у себе пегильовані зрізані ЗОМЕ білки, в яких група або групи ПЕГ приєднані крізь ацильні або алкільні групи. Як згадувалось вище, такі зрізані ЗОМЕ білкові продукти можуть бути як монопегильованими, так і поліпегильованими (наприклад, містити 2-6, краще - 2-5 груп ПЕГ). Групи ПЕГ зазвичай приєднуються до білка на А- або Е-аміногрупах амінокислот. Проте необхідно також розглядати можливість приєднання груп ПЕГ 75 ДО реакційної групи білка, яка має реакційну спроможність, достатню для того, щоб приєднатися до групи ПЕГ у відповідних умовах реакції. Таким чином, поліетиленгліколь може бути ковалентно зв'язаний з білком за посередництвом реакційної групи, такої як вільна аміно- чи карбоксильна група. Реакційні групи є такими, з якими може зв'язуватися активована молекула ПЕГ. Амінокислотними залишками з вільною аміногрупою можуть бути лізинові залишки і М-кінцевий амінокислотний залишок. До числа тих, які мають вільну карбоксильну групу, го Можуть входити залишки аспарагінової кислоти, залишки глутамінової кислоти і С-кінцевий амінокислотний залишок. Для приєднання молекули (чи молекул) ПЕГ можуть у якості реакційної групи використовуватися також сульфогідрильні групи. У терапевтичних цілях, як правило, більш прийнятним є приєднання до аміногрупи, таке як приєднання на М-кінці або лізиновій групі. Приєднання на залишках, які є важливими для рецепторного зв'язування, слід уникати, якщо рецепторне зв'язування є бажаним. с
Згідно з одним зі своїх аспектів, даний винахід пропонує по суті гомогенне вироблення кон'югату типу "моно-полімер/зрізаний СОМЕ білок", в якому молекула полімеру приєднується практично (тобто на » 9595) лише і) в одному місці. Більш конкретно, у випадку використання ПЕГ винахід пропонує пегильований зрізаний
СОМЕ-білок, дефіцитний за можливими антигенними зв'язуючими групами, що мають молекулу ПЕГ, безпосередньо зв'язану зі зрізаним СОМЕ білком. Ге»)
Крім того, похідні можуть бути одержані і з глікозильованих, неглікозильованих або деглікозильованих зрізаних СОМЕ білків. Як правило, використовуються неглікозильовані зрізані ЗОМЕ білки. Наприклад, і. прокаріотично експресований зрізаний СОМЕ білок |Агуа?2-Це!ЗЯ. може бути хімічно дериватизований до «з включення у нього, наприклад, 2-4 моно- або полічастин ПЕГ, приєднаних ацильною або алкільною групою.
У загальному випадку хімічна дериватизація може здійснюватися у будь-яких відповідних умовах, що шо використовуються для реагування біологічно активних субстанцій з активованою полімерною молекулою. (Се)
Способи вироблення пегильованих зрізаних ЗОМЕ білків у загальному випадку включають у себе етапи (а) реагування зрізаного СОМЕ білка з поліетиленгліколем (таким, як реакційно-спроможний ефір або альдегід, похідний від ПЕГ) в умовах, в яких зрізаний СОМЕ білок приєднується до однієї і більше груп ПЕГ, і (б) « одержання реакційного продукту. Взагалі, оптимальні умови реакції для адилювання визначаються для кожного випадку окремо, виходячи із відомих параметрів і потрібних результатів. Наприклад, чим більше співвідношення пед с ПЕГ:білок, тим більше відсотковий вміст поліпегильованого продукту. Оптимальне (з огляду на ефективність ц реакції, в якій відсутній надлишок непрореагованого білка або полімеру) співвідношення може бути визначено ,» такими факторами як потрібний ступінь дериватизації (наприклад, моно-, ди-, три- і т.д.), молекулярна маса вибраного полімеру, розгалуженість полімеру, тобто чи є полімер розгалужений чи нерозгалужений, і даними умовами реакції. (є) Відновлювальне алкілювання для одержання по суті гомогенної популяції кон'югату "моно-полімер/зрізаний
СОМЕ білок" у загальному випадку складається з наступних етапів: (а) реагування зрізаного ЗОМЕ білка з
Ф реакційно спроможною молекулою ПЕГ в умовах відновлювального алкілювання при величині рн, відповідній до (95) потрібного забезпечення можливостей здійснення селективної модифікації ос-аміногрупи на амінокінці зрізаного с 50 СОМЕ білка; (6) одержання продукту реакції.
Для практично гомогенної популяції кон'югату "моно-полімер/зрізаний СОМЕ білок' умови реакції (Че) відновлювального алкілювання є такими, які дозволяють селективне приєднання водорозчинної полімерної частини до М-кінця зрізаного ЗОМЕ білка. Такі умови реакції у загальному випадку дають різницю в рКа між аміногрупами лізину і А-аміногрупою на М-кінці (де рКа є рН, при якій 5095 аміногруп протонизується, а 5095 - ні). Величина рН впливає також на співвідношення полімеру до білка, що використовується, У загальному випадку, чим нижчою є рН, тим більший потрібен бути надлишок полімеру відносно білка (тобто, чим меншою є
ІФ) реактивність М-кінцевої А-аміногрупи, тим більше потрібно полімеру для досягнення оптимальних умов). Якщо ко рН підвищується, то потреби у такому великому співвідношенні полімер/білок немає (тобто, чим більше є реакційних груп, тим менше потрібно молекул полімеру). Для цілей даного винаходу рн, зазвичай, знаходиться у 60 межах 3-9, і краще - у межах 3-6.
Іншим фактором є молекулярна маса полімеру. Взагалі, чим більше молекулярна маса полімеру, тим менша кількість його молекул зможе приєднатися до білка. Подібним чином, при оптимізації цих параметрів до уваги треба приймати розгалуження полімеру. У загальному випадку, чим більшою є молекулярна маса (або чим більшим є розгалуження), тим більшим є співвідношення полімер/білок. Як правило, для реакцій пегилювання, 65 які тут розглядаються, краще, якщо середня молекулярна маса знаходиться у межах приблизно від 2кОа до 100Ккба (термін "приблизно" означає, що при приготуванні поліетиленгліколю деякі молекули мають масу, більшу або меншу за встановлену). Краще, якщо середня молекулярна маса становить приблизно від 5КкОа до 5ОКОа, і ще краще, якщо приблизно від 12КОа до 25КОа. Співвідношення водорозчинного полімеру до зрізаного ЗОМЕ білка у загальному випадку знаходиться у межах від 1:11 до 1001, краще - від 1:11 до 20:11 (для поліпегилювання) і від 1:1 до 5:1 (для монопегилювання).
При використанні вищезазначених умов відновлювальне алкілювання дає селективне приєднання полімеру до зрізаного ООМЕ білка, який має А-аміногрупу на амінокінці, і дозволяє практично гомогенне приготування кон'югату "моно-полімер/зрізаний (ЗОМЕ білок". Терміном "кон'югат моно-полімер/зрізаний СОМЕ білок" тут називається похідна, яка містить одну молекулу полімеру, приєднану до зрізаного СОМЕ білка. Кон'югат 70 "моно-полімер/зрізаний СОМЕ білок" у кращому варіанті має полімерну молекулу, розміщену на М-кінці, а не на боці аміногруп лізину. Краще, якщо одержаний продукт містить більше 9095 кон'югату "моно-полімер/зрізаний
СОМЕ білок" і ще краще, якщо він містить більше 9595 кон'югату" "моно-полімер/зрізанийсОМЕ білок", у той час як решта білків, що спостерігаються, залишається непрореагованою (тобто, білок з дефіцитом полімерної частини).
При відновлювальному алкілюванні відновлюючий агент повинен бути стійким у водному розчині, і краще, якщо він є спроможний відновлювати тільки основу Шіффа, що утворилася у початковому процесі відновлювального алкілювання. Типові відновлюючі агенти можуть бути вибрані із групи, яка складається із боргідриду натрію, цианоборгідриду натрію, борану диетиламіну, борану триетиламіну і борану піридину. Серед відновлюючих агентів особлива перевага віддається ці аноборгідриду натрію. Решта параметрів реакції, таких як 2о розчинник, тривалість реакції, температура та ін., а також засоби очищення продуктів можуть визначатися у кожному випадку окремо, виходячи із загальної інформації щодо дериватизації білків водорозчинними полімерами.
За допомогою методів ацилювання і/або алкілювання можна готувати також суміші полімер-білкових кон'югатів, використовуючи при цьому нову можливість вибирати потрібну частину кон'югату моно-полімер/білок сч ов для введення до суміші. Таким чином, якщо потрібно, можна приготовляти суміш білків, що мають різні кількості приєднаних до них молекул полімеру (тобто ди-, три-, тетра-, і т.д.), і комбінувати її з матеріалом кон'югату і) моно-полімер/білок, виготовленого за допомогою даних способів, і в результаті одержати суміш з заданою пропорцією моно-полімер/білкового кон'югату.
Полінуклеотиди, що кодують зрізані ЗОМЕ білки. Ге! зо У відповідності з даним винаходом, пропонуються нові полінуклеотиди, які кодують зрізані СОМЕ білки.
Нуклеїнокислотна послідовність, якщо її використовують у якості зонда гибридизаци або праймера ампліфікації, о повинна бути практично вільною від усіх інших амінокислотних послідовностей. Для того, щоб використовувати с нуклеїнокислотну послідовність у рекомбінантній експресії білків, вона у загальному випадку не повинна мати нуклеїнокислотних послідовностей, кодуючих інші білки, якщо метою процесу не є одержання злитого білка, ісе)
Користуючись даним описом і універсальною кодовою таблицею, фахівець зможе легко визначити усі «о нуклеїнокислотні послідовності, які кодують амінокислотні послідовності зрізаних СОМЕ білків. На сьогоднішній день перевага віддається нуклеїнокислотним послідовностям, які містять полінуклеотиди, які кодують зрізані
СОМЕ білки (Ага 5-ПЦе 7343, (Зег29-Це1343, (АгдЗ2-Це 94 і ( ув37-Це!34, Ряд прикладів полінуклеотидів наведений на «
Фіг. 5, 6 і 7, а їхних частин, які кодують зрізані СОМЕ білки, - на Фіг.1, З і 4. Фахівцеві зрозуміло також, що нові полінуклеотиди, що кодують зрізані ФОМЕ білки, включають у себе нуклеїнокислотні послідовності, Які й с кодують різні зрізані ОМЕ білки, які можуть бути одержані як штучним, так і природним шляхом. ц Для виготовлення таких полінуклеотидів і експресії різноманітних зрізаних СОМЕ білків можна вживати и"? рекомбінантні методи експресії відповідно до наданого нижче опису. Наприклад, інсерцією нуклеїнокислотної послідовності, яка кодує зрізаний СОМЕ білок, до відповідного вектора фахівець може легко продуктувати великі
Кількості потрібної нуклеотидної послідовності. Ці послідовності можуть потім бути використані для генерації
Ге») детекторних зондів або ампліфікаційних праймерів. Полінуклеотид, який кодує зрізаний СОМЕ білок, можна ввести до вектора експресії. Введенням вектора експресії до відповідного хазяїна можна потрібний зрізаний б СОМЕ білок продукувати у великих кількостях. о Як описано нижче, існує багато систем хазяїн/вектор, які можна використовувати для вирощування Ннуклеїнокислотних послідовностей і/або вироблення зрізаних ЗОМЕ білків. До них зараховуються без будь-якого о обмеження плазмідні, вірусні і інсерційні вектори, прокаріотичні і еукаріотичні клітини-хазяїни. Фахівцеві у (Че) даній галузі нескладно буде адаптувати систему хазяїн/вектор, спроможну до культивування або експресії змішаних ДНК для вироблення або експресії послідовностей за винаходом.
За допомогою таких рекомбінантних методів можна дуже легко виробляти зрізані ЗОМЕ білки за винаходом у промислових кількостях. Більш того, зрозуміло, що з огляду на даний опис, до числа нових нуклеїнокислотних послідовностей входять вироджені нуклеїнокислотні послідовності, які кодують зрізані СОМЕ білки, конкретно
Ф, визначені нижче на ілюстраціях, варіанти таких зрізаних СОМЕ білків і такі нуклеїнокислотні послідовності, ко які гібридизуються, причому переважно у жорстких умовах, з комплементами цих нуклеїнокислотних послідовностей (|Мапіайвз еї аїЇ., МоіІесшаг Сіоппіпда (А Іарогаїгу МапиаЇ); Соїй Ббргіпд Нагброг Іарогайгу, бо раде 387-389, 1982). Типовими жорсткими умовами гибридизації є наступні: гибридизація у 4 х З5С при 62-677С з наступним промиванням у 0,1 х 55 при 62-67"7С на протязі 1 години. У якості альтернативних типових умов можуть використовуватися; гибридизація у 45-5595 формаміді, 4 х 55С при 40-457С. Сюди включаються також
ДНК послідовності, які гибридизуються у послаблених умовах з послідовностями, комплементарними зрізаному
СОМЕ білку, і кодують зрізаний СОМЕ білок за винаходом. Такими послабленими умовами гібридизації можуть 65 бути, наприклад: 4 х 552 при 45-557С або гибридизація у 30-4095 формаміді при 40-4576.
Винаходом пропонуються також рекомбінантні ЗОМЕ конструкції, куди входить вектор ДНК разом з ДНК послідовністю, кодуючою зрізаний ЗОМЕ білок. У такій ДНК конструкції нуклеїнокислотна послідовність, що кодує зрізаний СОМЕ білок (з сигнальними пептидами або без них), знаходиться в оперативній сукупності з відповідною послідовністю контролю чи регулювання експресії, спроможною скеровувати реплікацію і/або експресію ЗрізаНогосОМЕбтка у вибраному хазяїні.
Рекомбінантна експресія зрізаного СОМЕ білка
Одержання полінуклеотидів, кодуючих зрізаний СООМЕ
Нуклеїнокислотну послідовність, кодуючу зрізаний СОМЕ; або зрілий первинний СОМЕ матеріал, можна легко одержати найрізноманітнішими способами, і у тому числі, без обмежень, шляхом хімічного синтезу, скринінгу 7/0 ДНК або геномної бібліотеки, скринінгу бібліотеки експресії і/або ампліфікації ДНК за допомогою полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР). Ці та інші способи, прийнятні для виділення таких нуклеїнокислотних послідовностей, описані, наприклад, в (Затрьгоок еї аїі., МоїІесшаг Сіоппіпд: А І арогаїогу Мапиаї, Соїа Зргіпа
Нагрог Іарогаїгу Ргевзв, СоЇй Зргіпд Нагрог, Мем МогкК, 1989; А!йвире! еї аїЇ., едвз Ситепі Ргофосоїв іп
Моїіесціаг Віоіоду, Сигепі Ргоїосоіїз Ргез5, 1994; Вегдег апіа Кіттеї, Мейоз іп Еплутоіоду: Сціде ю 7/5 Моїесшаг Сіоппіпд Тесипідцез, МоІ.152, Асадетіс Ргезв, Іпс., Зап Оіедо, СА, 1987), При цьому кращими нуклеїнокислотними послідовностями, кодуючи ми СОМЕ, є послідовності ссавців.
Хімічний синтез нуклеїнокислотної послідовності, кодуючої зрізаний СОМЕ білок, може бути здійснений також за допомогою добре відомих способів, наприклад, описаного в (Епдеїв еї аЇ,, Апдему. Спет. Іпі. Еа. 28: 716-734, 1989), До числа цих способів, поряд з іншими, належать фосфотриефірний, фосфорамідний і
Н-фосфонатний способи синтезу нуклеїнокислотних послідовностей. Нуклеїнокислотна послідовність, що кодує зрізаний СОМЕ білок, має довжину, яка вимірюється кількома сотнями основних пар (Бр) або еуклеотидів. Великі нуклеїнокислотні послідовності, наприклад, довжиною більше ніж 100 нуклеотидів можуть бути синтезовані кількома фрагментами. Ці фрагменти потім можуть бути об'єднані разом і утворювати нуклеїнокислотну послідовність, кодуючу зрізаний СОМЕ білок При цьому кращим є полімерно-підтримуваний синтез за сч ов стандартною фосфорамідітною хімічною технологією.
Потрібна нуклеїнокислотна послідовність може бути одержана також шляхом скринінгу відповідної бібліотеки і)
КДНК (тобто бібліотеки, приготовленої із одного або більше джерел тканин, спроможних експресувати білок) або геномної бібліотеки (бібліотеки, виготовленої із повністю геномних ДНК). Джерелом бібліотеки кДНК, як правило, є тканина від будь-якого біологічного виду, спроможна експресувати ЗОМЕУу потрібних кількостях. Ге!
Джерелом геномної бібліотеки може бути будь-яка тканина або тканини ссавця або іншого біологічного виду, в котрій може знаходитися ген, кодуючий ЗОМЕ або гомолог СООМЕ. Така бібліотека може бути піддана скринінгу і на наявність КДНК/гена СОМЕ, з використанням одного і більше нуклеїнокислотних зондів (олігонуклеотидів, с
КДНК або геномних ДНК фрагментів, які мають прийнятний рівень гомологічності ЗЗОМЕ або гомолопчних ЗОМЕ
КДНК чи гена, що клонуються), які селективно гибридизуються з ООМЕ або гомологічними ЗОМЕ кДНК чи генами, ісе) зв НВаЯВНИМИ В бібліотеці. Зонди, які знаходять використання для такого скринінгу, зазвичай кодують малі ділянки «о
ДНК послідовності ЇЗОМЕ від виду, того ж самого або подібного тому, із якого була утворена бібліотека. В альтернативному варіанті зонди можуть бути вироджені, як розглянуто нижче.
Скринінг бібліотеки, зазвичай, здійснюється шляхом відпалювання олігонуклеотидного зонда або кКДНК у клони в бібліотеці у жорстких умовах, які запобігають неспецифічному зв'язуванню, але дозволяють зв'язування «
Тих клонів, які мають значний рівень гомології з зондом або праймером. Типові умови гибридизації і промивання п») с залежать частково від розміру (тобто кількості нуклеотидів по довжині) кКДНК олігонуклеотидного зонда, а також від того, чи є зонд вироджений. При розробці розчину гибридизації до уваги приймається також імовірність ;» одержання клону або клонів (тобто те, яка бібліотека повинна бути піддана скринінгу - КДНК чи геномна?; якщо це бібліотека кДНК, то високою є імовірність наявності потрібної кДНК).
Там, де використовуються фрагменти ДНК (такі як кКДНК), типові умови гибридизації включають у себе такі,
Ге» які зазначені в І(Аизибеї еї аї., див. вище). Після гибридизації, блот, який містить бібліотеку, промивається з ретельністю, яка залежить від кількох факторів, таких як розмір зонда, очікувана гомологія зонда з клоном, ме) тип бібліотеки, що піддається скринінгу, кількість клонів, що піддаються скринінгу, і под. У якості розчинів 2) ретельної промивки (які зазвичай є низькоіонізованими і вживаються при відносно високих температурах) можуть 5р Використовуватися наступні: 0,015 М Масі, 0,005 М Ма-цитрат і 0,190 5О5 при 55-657С; буфер 1мМ Ма2ЕОТА, о 40мМ МанРо,, рН 7,2 і 19060 505 при приблизно 40-50"С; промивочний розчин 0,2 Х ЗЗС і 0,196 505 при
Ге приблизно 50-607С.
Існуюють також типові протоколи для умов ретельної промивки, де олігонуклеотидні зонди використовуються для скринінгу КДНК- або геномних бібліотек. Наприклад, згідно з першим протоколом використовується 6 Х 55 ов З 0,0570 пірофосфату натрію при температурі у межах приблизно від 35 до 62"С залежно від довжини зонда.
Наприклад, 14 основних зондів промиваються при 35-40"С, 17 основних зондів - при 45-507С, 20 основних зондів
Ф) - при 52-57" і 23 основних зонди - при 57-63"С. Температура може бути підвищена на 2-3 градуси там, де ка фонове неспецифічне зв'язування видається високим. Згідно з іншим протоколом, для промивання використовується хлорид тетраметиламонію (ТМАС). Одним з таких розчинів ретельної промивки є З М ТМАС, бо 5ОММ Ттіз-НСІ, рН 8,0, і 0,296 БО.
Іншим прийнятним способом одержання нуклеїнокислотної послідовності, кодуючої СОМЕ білок, є полімеразно-ланцюгова реакція (ПЛР). Згідно з цим способом, із тканини, що експресує СОМЕ, екстрагується полі(А)-РНК або повна РНК. Потім із РНК одержують кДНК за допомогою зворотньої транскриптази. Далі, до
КДНК разом з полімеразою, такою як ТАС, добавляються 2 праймери, як правило, комплементарні до двох 65 окремих ділянок кКДНК (олігонуклеотидів) ООМЕ.У) і полімераза ампліфікує ділянку КДНК між двома праймерами.
Там, де спосіб вибору для приготування нуклеїнокислотної послідовності, кодуючої потрібний зрізаний ЗОМЕ білок, потребує використання олігонуклеотидних праймерів або зондів (наприклад, полімеразно-ланцюгова реакція, скринінг КДНК або геномної бібліотеки), олігонуклеотидні послідовності, вибрані у якості зондів або праймерів, повинні мати адекватну довжину і бути достатньо недвозначні, щоб звести до мінімуму кількість неспецифічного зв'язування, яке виникає під час скринінгу бібліотеки або ПЛР ампліфікації. Фактична послідовність зонда або праймера зазвичай базується на консервованих або високогомологічних послідовностях або ділянках від того самого або подібного йому гена із іншого організму. При необхідності, зонди або праймери можуть бути повністю або частково вироджені, тобто містити суміш "зонди/праймери", кожен з яких кодує одну й ту ж саму амінокислотну послідовність, але за допомогою різних кодонів. У якості альтернативного 70 способу одержання вироджених зондів можна помістити інозин у деякі або усі ті кодонові позиції, що у різних видів є різними. Олігонуклеотидні зонди або праймери можуть бути приготовлені методами хімічного синтезу
ДНК, як описано вище.
Зрізані СООМЕ білки, основані на цих кодуючих ЗОМЕ нуклеїнокислотних послідовностях, а також їхні мутантні або варіантні послідовності також охоплюються об'ємом даного винаходу. Як указувалось вище, мутантною або варіантною послідовністю, є така, яка містить одне або більше нуклеотидних заміщень, делецій і/або вставок порівняно з послідовністю дикого типу, і яка приводить до експресії варіантів амінокислотних послідовностей порівняно з амінокислотною послідовністю дикого типу. У деяких випадках можуть існувати амінокислотні мутанти або варіанти СОМЕ, які виникають природним шляхом завдяки наявності природної алельної варіації.
Зрізані СЗОМЕ білки, основані на таких виникаючих природним шляхом мутантах або варіантах, також 2о охоплюються об'ємом даного винаходу. Способи приготування штучних мутантних послідовностей також добре відомі фахівцям у даній галузі і описані, наприклад, в (ММеїЇв еї аІ., Сепе 34:315, 1985; Затьгоок еї а!., див. вище).
Вектори
Комплементарна ДНК або геномна ДНК, яка кодує зрізаний СОМЕ білок, вставляється у вектор для подальшого клонування (ампліфікації ДНК) або експресії. Відповідні вектори виробляються серійно, і їх можна сч придбати на ринку, або ж потрібний вектор може бути сконструйований окремо. Селекція або конструювання відповідного вектора залежить від (1) того, для чого він призначений - для ампліфікації ДНК або експресії і)
ДНК; (2) розміру ДНК, яка вставляється до вектора; і (3) клітини-хазяїна (наприклад, клітини ссавців, комах, дріжджові клітини, грибкові клітини, рослинні та бактериальні клітини), яка трансформується даним вектором.
Кожний вектор містить різноманітні компоненти залежно від його функції (амплфікація або експресія ДНК) і Ге!
Зо бумісності з даною клітиною-хазяїном. До числа компонентів вектора у загальному випадку включаються, без обмеження, сигнальна послідовність, ориджин реплікації, один або більше селективних або маркерних генів, і підсилюючі елементи, промотори, послідовність завершення транскрипції і под. Ці компоненти можуть бути с одержані із природних джерел або синтезовані відомими способами. До числа векторів за винаходом включається нуклеїнокислотна послідовність, яка кодує потрібний зрізаний СОМЕ білок, операбельно зв'язаний з ісе) однією або більше із наступних послідовностей контролю або регулювання експресії, спроможних скеровувати, «о контролювати або іншим чином впливати на експресію зрізаного ЇОМЕ білка вибраною клітиною-хазяїном.
Сигнальна послідовність
Сигнальна послідовність може бути компонентом вектора або частиною ДНК СОМЕ, яка вставляється до вектора. Нативна ДНК СОМЕ кодує сигнальну послідовність на амінокінці білка, який під час посттрансляційного « процесінгу білка розщеплюється з утворенням зрілого ЇЗОМЕ білка. Об'ємом винаходу охоплюються зрізані з с СОМЕ полінуклеотиди з нативною сигнальною послідовністю та іншими послідовностями-попередниками, а також зрізані ЗОМЕ полінуклеотиди, в яких нативна сигнальна послідовність видалена і заміщена гетерологічною ;» сигнальною послідовністю. Вибраною гетерологічною сигнальною послідовністю повинна бути така, яка розпізнається і піддається процесінгу клітиною-хазяїном, тобто розщеплюється сигнальною пептидазою. У
Випадку прокаріотичних клітин-хазяїнів, які не розпізнають і не піддають процесінгу нативну сигнальну
Ге» послідовність СОМЕ, сигнальна послідовність заміщується прокаріотичною сигнальною послідовністю, вибраною, наприклад, із групи лідерних послідовностей лужної фосфатази, пеніцилінази або термостійкого
Ме, ентеротоксину Ії. У випадку дріжджевої секреції нативна сигнальна послідовність СООМЕ може бути заміщена 2) лідерами дріжджевої інвертази, А-фактора або кислої фосфатази. При експресії в клітинах ссавця достатньою є 5р Нативна сигнальна послідовність, хоч прийнятними можуть бути також інші сигнальні послідовності ссавців. о Ориджин реплікації
Ге) Вектори експресії і клонування зазвичай включають у себе нуклеїнокислотну послідовність, яка робить вектор спроможним до реплікації в одній або більше вибраних клітинах хазяїнах. У векторах клонування ця послідовність є, зазвичай, такою, яка дозволяє вектору реплікацію незалежно від хромосомної ДНК хазяїна і ов Включає у себе ориджини реплікації або автономно реплікуючі послідовності. Добре відоме існування таких послідовностей в численних видах бактерій, дріжджів і вірусів. Ориджин реплікації із плазміди рВК322 є (Ф) підходящим для більшості грам-негативних бактерій, а різноманітні ориджини (наприклад, 5М40, поліома, ка аденовірус, МОМ і ВРМ) можна використовувати для векторів клонування в клітинах ссавців. У загальному випадку, для векторів експресії ссавців ориджин компонента реплікації не потребується (наприклад, ориджин бо /ЗМ40 часто використовується тільки тому, що він містить ранній промотор).
Ген селекції
Вектори експресії і клонування, як правило, містять ген селекції. Цей ген кодує "маркерний" білок, необхідний для виживання або росту трансформованих клітин-хазяїнів при рості у селективному культурному середовищі. Клітини-хазяїни, які не були трансформовані цим вектором, не містять ген селекції і, отже, не 65 виживуть у культурному середовищі. Типові гени селекції кодують білки, які (а) надають стійкості антибіотикам та іншим токсинам, наприклад, ампіциліну, неоміцину, метотрексату, тетрацикліну; (б) поповнюють ауксотропну недостатність; (в) постачають критичні живильні речовини, відсутні у культурному середовищі.
Інші гени селекції можуть бути використані для ампліфікації гена, призначеного до експресії. Ампліфікація є процес, в якому гени, які є дуже потрібні для вироблення критичного для росту білка, багаторазово повторюються в тандемі у хромосомах послідовних генерацій рекомбінантних клітин' У якості прикладів прийнятних селективних маркерів для клітин-хазяїнів можна назвати дигідрофолатредуктазу (ДГФР) і тимідинкіназу. Клітинні трансформанти ссавців піддаються тиску селекції, під яким можуть вижити тільки дані трансформанти завдяки маркеру, наявному у векторі. Застосування тиску селекції входить у програму культивування трансформованих клітин в умовах, в яких концентрація агента селекції у середовищі послідовно 70 змінюється, приводячи тим самим до ампліфікації як гена селекції, так і ДНК, яка кодує зрізаний СОМЕ. У результаті, із ампліфікованої ДНК синтезуются підвищені кількості зрізаного СОЮОМЕ,
Наприклад, клітини, трансформовані геном селекції ДГФР, спочатку ідентифікуються культивуванням всіх трансформантів в культурному середовищі, яке містить метотрексат - конкурентний антагоніст ДГФР. При використанні ДГФР дикого типу відповідною клітиною-хазяїном є дефіцитна за активністю ДГФР клітинна лінія /5 яєЧчЧНнИКа китайського хом'яка, див., наприклад |ОгпацЬ апа Спазіп, Ргос. Май. Асай. Зсі, О5БА 77(7) 4216-4220, 1980). Трансформовані клітини потім піддаються дії підвищених рівнів метотрексату. Це веде до синтезу численних екземплярів гена ДГФР і, водночас, численних екземплярів інших ДНК, присутніх у векторі експресії, таких як ДНК, кодуючих зрізаний СОМЕ білок.
Промотор
Вектори експресії і клонування за винаходом, як правило, містять промотор, який розпізнається організмом-хазяїном і операбельно зв'язаний з нуклеїнокислотною послідовністю, кодуючою зрізаний СОМЕ білок. Промотори є нетрансльованими послідовностями, розміщеними у зворотному напрямку (5) до стартового кодона структурного гена (у загальному випадку, у межах приблизно 1000-1000 рр), які контролюють транскрипцію і трансляцію особливої нуклеїнокислотної послідовності, яка кодує зрізаний СОМЕ, Промотори умовно групують сч ов за одним або двома класами: індуцибельні промотори і конститутивні промотори. Індуцибельні промотори ініціюють підвищені рівні транскрипції від ДНК під їхнім контролем у відповідь на деякі зміни в умовах і) культури, таких як наявність або відсутність живильної речовини, або на зміну температури. Добре відомою є велика кількість промоторів, які розпізнаються різноманітними потенціальними клітинами-хазяїнами. Ці промотори операбельно зв'язані з ДНК, кодуючими зрізаний ЗОМЕ, шляхом видалення промотора із ДНК Ге! зо джерела рестрикційним ферментативним розщепленням і вставлення потрібної промоторної послідовності у вектор. Нативна промоторна послідовність СОМЕ може бути використана для скерування ампліфікації і/або о експресії ДНК зрізаного СОМЕ. Проте, кращим є гетерологічний промотор, якщо він дозволяє більшу с транскрипцію і більш високий вихід експресованого білка порівняно з нативним промотором, і якщо він є сумісний з системою клітини-хазяїна, яка була вибрана для використання. ісе)
До числа промоторів, придатних до використання з прокаріотичними і хазяїнами, належать бета-лактамазні і «о лактозні промоторні системи; лужнофосфатазні і триптофанові (ТРП) промоторні системи, а також гібридні системи, такі як ТАС промотори. Прийнятними також є інші відомі бактеріальні промотори. їхні нуклеотидні послідовності були опубліковані що дозволяє фахівцеві зшивати їх з потрібною ДНК послідовністю (або послідовностями), використовуючи для цього лінкери або адаптори, необхідні для утворення потрібних сайтів « 70 рестрикції. з с Відомі також відповідні промоторні послідовності для використання з дріжджевими хазяїнами. Дріжджеві енхансери головним чином використовуються з дріжджевими промоторами. Добре відомі відповідні промотори ;» для використання з клітинами-хазяїнами ссавців, що включають до свого числа такі промотори, які одержуються із геномів вірусів, таких як вірус поліоми, вірус пташиної оспи, аденовірус (наприклад, аденовірус ІІ), вірус бичачої папіломи, вірус пташиної саркоми, цитомегаловірус, ретровірус, вірус гепатиту В і, найкраще,
Ге» мавп'ячий вірус 40 (5М40). До інших прийнятних промоторів ссавців належать гетерологічні промотори, наприклад, теплошокові і актинові системи. Сьогодні у виробництві («ЗОМЕ білків в клітинах СНО
Ме, використовується промотор ЗКА |ТаКере еї аї., Мої. СеїЇ. Віої. 8(1): 466-472, 1988). Підходящим вектором 2) експресії є РОЗКА?2, який буде описано нижче.
Енхансерний елемент о Енхансерна послідовність може бути вставлена у вектор для підвищення транскрипції ДНК послідовності,
Ге) кодуючої зрізаний СОМЕ білок за винаходом більш високими еукаріотами. Енхансерами є Суз-діючі елементи
ДНК завдовжки приблизно 10-300 рр, які діють на промотор, підвищуючи його транскрипцію. Енхансери оріентаційно і позиційно є відносно незалежні. Вони були знайдені у положеннях 5' і 3 до транскрипційної одиниці. Відомо декілька енхансерних послідовностей від генів ссавців (наприклад, глобін, еластаза, альбумін, альфа-фето-протеїн і інсулін). Проте, як правило, використовується енхансер від віруса. Типовими
Ф) підсилюючими елементами для активації еукаріотичних промоторів є енхансер 5М40, цитомегаловірусний ранній ка промоторний енхансер, поліомний енхансер і аденовірусні енхансери. Оскільки енхансер може бути підданий сплайсінгу у вектор у положенні 5 або 3' до ДНК зрізаного СОМЕ, він зазвичай розміщується у сайті 5' від бо промотора.
Термінація транскрипції
Вектори експресії що використовуються в еукаріотичних клітинах-хазяїнах (клітинах дріжджей, грибків, комах, рослин, тварин, людини або маючих ядра клітинах інших багатоклітинних організмів), також містять послідовності, необхідні для термінації транскрипції і стабілізації мРНК. Такі послідовності, зазвичай, можна 65 одержати із нетрансльованих ділянок 5 і можливо 3 еукаріотичних ДНК або кДНК. Ці ділянки містять нуклеотидні сегменти, транскрибовані як поліаденильовані фрагменти в нетрансльованій частині мРНК,
кодуючої зрізанийсОМЕ
Конструювання підходящих векторів, які містять один або більше вищеперелічених компонентів разом з потрібною послідовністю, кодуючою зрізаний СЗОМЕ, здійснюється за стандартною технологією лігування.
Виділені плазміди або фрагменти ДН(С відщеплюють, кроять і знову зшивають у бажаному порядку для утворення потрібних плазмід. Для підтвердження того, що у результаті цих операцій були сконструйовані правильні послідовності, суміші лігування можуть бути використані для трансформування Е Соїї, і одержані трансформанти можуть бути відібрані відомими способами, використовуючи стійкість до ампіціліну або тетрацикліну, як описано вище. Далі, із трансформантів приготовляють плазміди. які потім аналізують 7/0 розщепленням ендонуклеазою рестрикції і/або піддають секвенуванню для підтвердження наявності бажаної конструкції.
Можуть бути використані також вектори, які забезпечують перехідну експресію ДНК, кодуючих зрізаний
СОМЕ. У загальному випадку перехідна експресія потребує використання вектора експресії, який спроможний ефективно реплікувати в клітині-хазяїні так, що клітина-хазяїн акумулює багато копій вектора експресії і, У /5 вою чергу, синтезує високі рівні бажаного білка, кодованого цим вектором. Системи перехідної експреси, які містять підходящий вектор експресії і клітину-хазяїна, забезпечують прийнятну позитивну ідентифікацію білків, кодованих клонованими ДНК, а також швидкий скринінг таких білків за бажаними біологічними або фізіологічними властивостями. Таким чином, системи перехідної експресії є особливо корисними при ідентифікації варіантів білка.
Відбір і трансформація клітин-хазяїнів
Даним винаходом пропонуються також клітини-хазяїни (наприклад, клітини бактерій, ссавців, комах, дріжджів, рослин), трансформовані нуклеїнокислотними послідовностями для використання в експресії рекомбінантного зрізаного СОМЕ білка. Трансформована клітина-хазяїн культивується у відповідних умовах, дозволяючих експресію нуклеїнокислотної послідовності. Вибір відповідних клітин-хазяїнів і способів сч ов трансформації, культивування, ампліфікації, скринінгу, вироблення продукту і очищення добре відомі фахівцям у даній галузі |Сеїйіпд апа ЗатгооК, Маїшге 293: 620-625, 1981; або Кацїтап еї аїЇ.,, Мої. Сей. Віої., 5(7): (8) 1750-1759, 1985; Ноулу еї аІ., Патент США Мо4419446)|. Зрізаний СОМЕ може бути експресований в Е. Сої відповідно до опису і іп еї аі., (Заявка на патент США Мо07/855413; заявка МОРСТ/О592/07888; УМО 93/061161, де згадується експресія зрілого СОМЕ. Інші типові матеріали і способи описані більш докладно нижче. Ге! зо Трансформована клітина-хазяїн культивується у відповідному середовищі, а експресований фактор потім може бути відновлений, виділений і очищений від культурного середовища (або від клітини, якщо експресія була о внутрішньоклітинною) за допомогою відомих фахівцям відповідних засобів. с
Відповідними клітинами-хазяїнами для клонування або експресії в них векторів, як зазначалося вище, є прокаріотичні, дріжджеві або більш еукаріотичні клітини. До числа прокаріотичних клітин відносяться без ісе) обмеження еубактерії, такі як грамнегативні або грампозитивні організми, наприклад, Е Соїї, Васійї, такі як «о
В. Бибіів, види Рзейдотопазвг, такі як Р. аегидіпоза, ЗаІтопейа Урпітигішт або Зегтайа тагсезсап5е. Можуть бути використані також способи клонування іп міо, наприклад, ПЛР або інші полімеразні реакції синтезу нуклеїнових кислот.
Окрім прокаріотичних клітин-хазяїнів, підходящими хазяїнами для експресії зрізаних ЗОМЕ білків можуть « бути еукаріотичні мікроби, такі як ниткоподібні грибки або дріжджі. Серед найнижчих еукаріотичних в с мікроорганізмів-хазяїнів найбільш уживаними є Засспаготусевз сегемізіае і звичайні пекарські дріжджі. Крім . того, добре відомі і широко застосовуються також інші роди, види і штами. и? Клітини-хазяїни, придатні для експресії глікозильованого зрізаного (СОМЕ білка, виводяться із багатоклітинних організмів. Такі клітини-хазяїни спроможні до складних видів активності у процесінгу і Глікозилюванні. Принципово можно використовувати більш високоеукаріотичні клітинні культури, незалежно від
Ге» того, містять такі культури клітини хребетних або безхребетних, включно клітини рослин і комах. Добре відомо, що клітини хребетних використовуються для їх розмноження в культурах (тканин). У якості прикладів
Ме, використання ліній клітин-хазяїнів ссавців можна назвати лінію СМ1 нирки мавпи, трансформовану вірусом 5М40 оо (СО5-7), лінію ембріональної нирки людини (клітини 293 або 293, субклоновані для росту в суспензійній Культурі), клітини нирки дитинчати хом'яка і клітини яєчника китайського хом'яка. До числа інших підходящих і клітинних ліній ссавців належать, без обмеження, такі, як Неї! а, клітини 1-929 миші, лінії ЗТЗ із мишей Зм/ізв,
Ге ВаїБ-с або МІН, клітинні лінії ВНК або НакК хом'яка.
Подібним чином використовувати у якості клітин-хазяїнів згідно з винаходом можна також бактеріальні клітини. Наприклад, у галузі біотехнології добре відоме використання у якості клітин-хазяїнів різноманітних штамів Е. Соїї (наприклад, НВІ1О1, ЮОНБА, ОНІТО і МС1061). Можна вживати також різноманітні штами
Зігеріюотусез зрр. і под. На сьогоднішній день кращими клітами-хазяїнами для вироблення зрізаних СОМЕ білків
Ф) вважаються бактеріальні клітини (наприклад, ЕзсПпегіспіа соїї) і клітини ссавців, такі як клітини яєчника ка китайського хом'яка, клітини СОЗ5 і под.
Клітини-хазяїни трансфікуються і краще трансформуються вищеописаними векторами експресії або бо Клонування і культивуються у відповідному живильному середовищі. Це середовище може бути модифіковане під відповідне для індукування промоторів, селектуючих трансформантів, або під ампліфікацію генів, кодуючих бажані послідовності. Трансфікування і трансформація здійснюються добре відомими стандартними методами, які підбираються відповідно до певних клітин-хазяїнів. Наприклад, для клітин ссавців без клітинних стінок може бути використаний метод преципітації фосфатом кальцію. Вживати можна також такі добре відомі методи, 65 ЯК електропорація, мікроін'єкція та ін.
Культивування клітин-хазяїнів
Трансформовані клітини, що використовуються для продукування зрізаних ЗОМЕ білків за винаходом, культивуються у відповідному середовищі. Це середовище при необхідності може бути доповнене гормонами або іншими факторами росту (такими, як інсулін, трансферін, фактор епідермального росту та ін.), солями (такими як хлориди натрію, кальцію, магнію і фосфати), буферами (такими як НЕРЕЗ5), нуклеозидами (такими як аденозин і тимідін), антибіотиками (такими як гентаміцин), мікроелементами (що визначаються як неорганічні сполуки, зазвичай наявні у мікромолярних кінцевих концентраціях), а також глюкозою та іншими джерелами енергії. Можуть бути введені також інші добавки у відповідних концентраціях, як це добре відомо фахівцям у даній галузі. Відповідні умови культивування відібраних клітин-хазяїнів, такі як температура, рН та ін., /0 також добре відомі фахівцям.
Зрізані ЗОМЕ білки виробляти можна також за допомогою способів гомологічної рекомбінації або рекомбінантної технології з використанням регулюючих елементів, введених у клітини, які вже містять ДНК, що кодують СОМЕ. Спосіб гомологічної рекомбінації первісно був розроблений для націлювання генів з метою індукування або корекції мутацій у транскрипційно активних генах ІКиспегіараїї, Ргод, Іп Мисі. Асі Кевз. Апа 7/5 Мої. Віої. 36301, 1989). У якості базового був розроблений спосіб введення специфічних мутацій до специфічних ділянок генома ссавця | Потаз еї аї., СеїЇ. 44:419-428, 1986; Тотаз апа Сарессні, Сеї). 51:503-512, 1987; Юоеєїзсптап еї аІЇ., Ргос. Май. Асай. Зсі. 85:8583-8587, 1988) або для корекції специфічних мутацій у дефективних генах |Ооеєізсптап еї аїЇ.,, Маїшге 330:576-578, 1987). Типові способи гомологічної рекомбінації описані в (05 5272071 (ЕР 91 90 3051, Публікація ЕР Мо505500; РСТ/О590/07642, Міжнародна публікація МОМУО 91/09955), розкриття яких введене у даному опису посиланням.
Шляхом гомологічної рекомбінації ДНК послідовність, яка повинна бути введена до генома, може бути спрямована у специфічну ділянку певного гена приєднанням її до націлюючої ДНК. Націлюючою є ДНК, комплементарна (гомологічна) ділянці геномної ДНК. Малі частки націлюючої ДНК, комплементарні до специфічної ділянки генома, вводяться у контакт з батьківською ниткою під час реплікації ДНК. Це є загальною сч властивістю ДНК, введеною до клітини для гибридизації, а отже й для рекомбінації з іншими частками ендогенної
ДНК крізь спільні гомологічні ділянки. Якщо ця комплементарна нитка приєднана до олігонуклеотиду, який і) містить мутацію або відмінну послідовність ДНК, то внаслідок рекомбінації вона також вводиться до новосинтезованої нитки. Завдяки функції корекції зчитування нова послідовність ДНК може служити у якості темплата. Таким чином, перенесена ДНК вводиться у геном. Ге! зо Якщо послідовність конкретного гена є відомою і являє собою, наприклад, нуклеїнокислотну послідовність
СОМЕ пре-про-послідовність або послідовність регулювання експресії то частина ДНК, комплементарна о вибраній ділянці гена, може бути синтезована або одержана іншим чином, наприклад, шляхом відповідної с рестрикції нативної ДНК в специфічних сайтах узнавання, межуючих з даною ділянкою. Ця частина служить як націлююча послідовність після вставки в клітину і гибридизується з її гомологічною ділянкою у геномі. Якщо ця ісе) гибридизація виникає під час реплікації ДНК, то ця частина ДНК і будь-які додаткові зв'язані з нею «о послідовності будуть діяти як фрагмент ОКа?акі і будуть вшиті до новосинтезованої дочірньої нитки ДНК.
Згідно з винаходом, до цих частин націлюючої ДНК приєднуються ділянки ДНК, які можуть взаємодіяти з експресією СОМЕ білка. Наприклад, промотор/енхансер, супресор або модуляторний елемент екзогенної транскрипції вставляється у геном даної клітини-хазяїна у просторовій близкості і з орієнтацією, достатніми « для впливання на транскрипцію ДНК, кодуючої бажаний зрізаний СОМЕ. Регулюючий елемент не кодує зрізаний пт») с СОМЕ; а здійснює регулювання частини ДНК, яка знаходиться у геномі клітини-хазяїна. Таким чином, експресія зрізаних ЗОМЕ білків може досягатися не трансфікуванням ДНК, яка кодує сам ген зрізаного СОМЕ, а з використанням націлюючої ДНК (яка містить ділянки, гомологічні з даним ендогенним геном), зв'язаної з ДНК регулюючими сегментами, які забезпечують послідовність ендогенного гена з розпізнаваними сигналами для транскрипції зрізаного ЗОМЕ білка.
Ге» Згідно з винаходом, способи гомологічної рекомбінації можуть також використовуватися для модифікації клітини, яка містить транскрипційно німий у нормальному стані СООМЕ ген для вироблення клітини, яка експресує
Ме, СОМЕ. СОМЕ білок потім може бути процесований для утворення зрізаного ФЗОМЕ білка (чи білків). 2) Фармацевтичні композиції зрізаного ООМЕ
Фармацевтичні композиції зрізаного ЗОМЕ білкового продукту, як правило, включають у себе терапевтично о ефективну кількість зрізаного СООМЕ білка у суміші з одним і більше фармацевтично і фізіологічно прийнятними
Ге) допоміжними матеріалами рецептури. У якості допоміжних матеріалів можуть використовуватися, але не обмежуються цим, наприклад, антиоксиданти, консерванти, забарвлюючі, смакові і розріджуючі агенти, емульгатори, суспендуючі агенти, розчинники, наповнювачі, об'ємонарощуючі агенти, буфери, достачаючі носії, в розріджувачі, ексципієнти і фармацевтичні ад'юванти. Наприклад, у якості носія можуть бути використані вода для ін'єкцій, фізіологічний розчин, штучна цереброспінальна рідина (ЦСР), можливо доповнені іншими (Ф, матеріалами, які, зазвичай, вживаються у композиціях для парентерального введення. Широке застосування у ка якості носіїв знаходять також нейтральний забуферений фізіологічний розчин і фізіологічний розчин, змішаний зі сироваточним альбуміном. во Первинний розчинник у носії за своєю природою може бути як водним, так і неводним. Крім того, носій може містити також інші фармацевтично прийнятні ексципієнти для модифікації або підтримання рН, осмотичних властивостей, в'язкості, світлості, кольору, стерильності, стабільності, швидкості розчинення, запаху фармацевтичного препарату. Подібним чином, носій може містити також інші фармацевтично прийнятні ексципієнти для модифікації або підтримання стабільності, швидкості розчинення або швидкості виведення 65 зрілого СООМЕ білкового продукту, або для стимулювання поглинання чи пенетрації зрізаного ОМЕ білкового продукту крізь гематоенцефалічний бар'єр. Такими ексципієнтами є речовини, які зазвичай вживаються для готування доз препаратів для парентерального введення як в одиничній, так і багатодозовій формі, або для прямої інфузії в ЦСР безперервною чи періодичною інфузією від імплантованого насосу.
Приготовлену терапевтичну композицію можна зберігати в стерильних посудинах у формі розчину, суспензії"
Телю, емульсії, твердого тіла або зневодненого чи ліофілізованого порошку. Такі препарати можуть зберігатися як у формі, готовій до вживання, так і у формі, що потребує відновлення перед введенням, наприклад ліофілізованій формі.
Оптимальна форма фармацевтичного препарату визначається фахівцем і залежить від шляху введення та потрібної дози, див., наприклад, (Кетіпдіоп'є РІагтасеціїса! Зсіепсев, 18 З. (1990, Маск Рибіїзпіпуд Со., 70 Еавіоп, РА 18042), радез 1435-1712), розкриття якої введене у даному опису посиланням. Композиція може . бути приготовлена також у формі порошкових препаратів полімерних сполук, таких як полімолочна кислота, полігліколева кислота і под., або у ліпосомах. Може бути використана також гілауронова кислота, яка надає ефект затримки препарату у кругообізі. Такі композиції можуть справляти вплив на фізичний стан, стабільність, швидкість виділення іп мімо і швидкість виведення іп мімо вданих білків та їхніх похідних.
Передбачено також інші ефективні форми введення препаратів, такі як парентеральні препарати пролонгованої дії, інгаляційні аерозолі, орально активні препарати і свічі. Готуються також препарати звичайних фармацевтичних композицій зрізаного (3ОМЕ білкового продукту для парентерального введення, наприклад, шляхом інтрацеребровентрикулярної ін'єкції. Такі фармацевтичні композиції, зазвичай, мають форму апірогенного, парентерально прийнятного водного розчину, який містить зрізаний ЗОМЕ білковий продукт у Ффармацевтично прийнятному носії. Одним з кращих носіїв є фізіологічний розчин.
До уваги приймається також те, що деякі препарати, що містять зрізаний СОМЕ білковий продукт, повинні вводитися перорально. Для цього даний продукт можна заключати у капсулу і готувати із нього препарат як з застосуванням носіїв, що зазвичай вживаються для приготування твердих фармацевтичних форм, так і без них.
Капсула може бути розрахована на вивільнення активної долі фармацевтичного препарату у місці Га гастроінтестенального тракту, коли його біодоступність буде максимальною, а предсистематична деградація - мінімальною. Додаткові ексципієнти можуть бути включені також для полегшення поглинання зрізаного СООМЕ і9) білкового продукту. Можуть використовуватися також розріджувачі, смакові добавки, легкорозтопний віск, рослинні масла, змазуючі агенти, суспендуючі агенти, агенти дезінтеграції таблеток і зв'язуючі агенти.
Введення зрізаного ЗОМЕ білкового продукту Ге»!
Зрізаний ЗОМЕ білковий продукт може вводитися парентеральним шляхом підшкірно, внутрішньом'язово, внутрішньовенно, крізь легені, трансдермапьно і інтратекально або інтрацеребрально. Білкові фактори росту, о які не пройшли крізь гематоенцефалічний бар'єр, можуть бути введені безпосередньо інтрацеребральним со шляхом або ж разом з іншими елементами, які транспортують їх крізь цей бар'єр. Вважається за краще, якщо зрізаний СОМЕ білковий продукт вводиться інтрацеребровентрикулярно або до субарахноїдального простору о
Зз5 головного чи спинного мозку. Зрізаний СОМЕ білковий продукт можна вводити також інтрацеребрально «о безпосередньо до паренхіми мозку. Постачати зрізаний СЗОМЕ білковий продукт можуть також повільно секретуючі імпланти у мозку, в яких нейротрофічний фактор заключений у біорозчинній полімерній матриці.
Зрізаний ЗОМЕ білковий продукт можна вводити також екстрацеребрально у формі, модифікований хімічно або « упакованій таким чином, що цей продукт проходить крізь гематоенцефалічний бар'єр, або ж він може вводитися
У поєднанні з одним і більше агентами, спроможними співдіяти пенетрації зрізаного ЗОМЕ білкового продукту с крізь цей бар'єр. Наприклад, було показано, що кон'югат МОРЕ і моноклональних антитіл проти трансферінових й рецепторів транспортується у мозок шляхом зв'язування рецепторами трансферту. Для введення зрізаного "» СОМЕ білкового продукту у бажаних дозах можна використовувати щоденні або з більшим періодом ін'єкції, або ж цей продукт може вводитися шляхом безперервної чи періодичної інфузії із імплантованого насосу з постійним або програмованим потоком. Частота введення доз препарату із зрізаного СОМЕ білкового продукту буде
Ге») залежати від його фармакокінетичних параметрів і шляху введення.
Незалежно від способу введення, питома доза, зазвичай, розраховується відносно маси або площі поверхні б тіла. У випадку захворювань, зачіплюючих мозок, питома доза, зазвичай, розраховується відносно приблизної о маси мозку пацієнта, яка може бути оцінена також за масою тіла або площею його поверхні. Уточнення розрахунків, необхідне для визначення правильного дозування при лікуванні з використанням будь-якого з о вищерозглянутих препаратів, на практиці здійснюється фахівцями з прийняттям до уваги наданої тут інформації (Че) щодо дозування і випробувань. Упевнитися у правильності дозування можна шляхом встановлених випробувань для визначення доз, а також відповідних даних щодо ефекту дози. Остаточний режим дозування, який використовується при лікуванні конкретного захворювання, визначається лікарем з урахуванням різноманітних факторів, впливаючих на дію ліків, у тому числі, віку, загального стану, маси тіла, статі і дієти пацієнта, ступеня інфекування, часу введення ліків та інших клінічних факторів,
Ф, Зрізаний СОМЕ білковий продукт за винаходом, один або у комбінації з іншими факторами росту, може бути ко також використаний для., лікування нервових захворювань. Наприклад, його можна вживати при лікуванні деяких форм нервового розладу у комбінації з фактором росту нервів. Крім того, разом зі зрізаним ЗОМЕ білковим бо продуктом можуть вживатися також інші фактори або молекули і, у тому числі хімічні композиції. При лікуванні хвороби Паркінсона зрізаний СОМЕ білковий продукт може вживатися один або разом з введенням леводофи (Гемодора), де зрізаний ЗОМЕ підсилює вироблення ендогенного дофаміну і нейронне сприйняття його підвищених концентрацій.
Як указувалось вище, передбачається також, що для лікуючої дії на деякі популяції нейронних клітин або 65 деякі типи травм чи захворювань корисними або необхідними будуть додаткові нейротрофічні або нейронно-живлячі фактори. Серед інших факторів, які можуть бути використані разом зі зрізаним СОМЕ, можна назвати без будь-якого обмеження наступні: мітогени, такі як інсулін, інсуліноподібні фактори росту, епідермальний фактор росту, вазоактивний фактор росту, активуючий гіпофітарну аденілциклазу поліпептид, інтерферон і соматостатін; нейротрофічні фактори, такі як одержані з мозку нейротрофін-3, нейротрофін-4/5, нейротрофін-б, інсуліноподібний фактор росту, віковий нейротрофічний фактор, кислий і основний фактори росту фібробластів, фактор-5 росту фібробластів, трансформуючий фактор-В росту, САКТ - транскрипт, регульований кокаїнамфетаміном, і зрілий СЗОМЕ; інші фактори росту, такі як епідермальний фактор росту, фактор гальмування лейкемії, інтерлейкіни, інтерферони і колонієстимулюючі фактори; а також молекули і матеріали, які є функціонально еквівалентними цим факторам. 70 Передбачається, що для певного лікування ефективним було б безперервне введення або підтримуване достачання зрізаного ЗОМЕ білкового продукту. Оскільки безперервне введення може здійснюватися за допомогою механічних засобів, таких як інфузійний насос, до уваги приймається також можливість застосування на практиці інших способів цілююм або майже безперервного введення. Наприклад, хімічна дериватизація може давати підтримано секретуючі форми білка, які мають ефект безперервної їх наявності у кровотоці у /5 прогнозованих кількостях згідно з визначеним режимом дозування. Таким чином, до числа зрізаних СОМЕ білкових продуктів входить також зрізаний СОМЕ білок, дериватизований для здійснення такого безперервного введення.
Передбачається також клітинна терапія за допомогою зрізаного СЗОМЕ білка. Наприклад, шляхом інтрацеребральної імплантації клітин, виробляючих зрізаний ЗОМЕ білок. У цьому варіанті здійснення винаходу 2о пацієнтам можуть імплантуватися клітини, спроможні синтезувати і секретувати біологічно активну форму зрізаного ЗОМЕ білка. Такі клітини, які виробляють зрізаний СОМЕ білок, можуть бути такими, що у нормальному стані не виробляють нейротрофічний фактор, але були модифіковані так, щоб бути у спромозі виробляти зрізаний СОМЕ, або ж спроможність їхня виробляти ЗОМЕ була підвищена трансформацією полінуклеотидом, підходящим для експресії і секреції зрізаного СОМЕ білка. Для того, щоб звести до мінімуму потенціальну сч ов Їмунологічну реакцію у пацієнтів на введення СОМЕ стороннього виду, перевагу слід віддавати клітинам людського походження, які б виробляли зрізаний ЗОМЕ білок людини. (8)
Клітини, що імплантуються, можуть бути заключені у капсули для запобігання інфільтрації їх у мозкову тканину. Клітини людини або тварини можуть бути імплантовані пацієнтам у біологічно сумісних, напівпроникних полімерних оболонках або мембранах, які б дозволяли виділяти зрізаний СОМЕ білковий продукт, алепри цьому ду зо запобігати деструкції клітин імунною системою пацієнта або іншими шкідливими факторами із навколишньої тканини. В альтернативному варіанті пацієнтові можуть бути імплантовані безпосередньо, без такого заключення о у капсулу, його власні клітини, трансформовані ех мімо для продукування зрізаного ЗОМЕ. с
Методи мембранного інкапсулювання живих клітин добре відомі фахівцям у даній галузі і дозволяють без будь-яких утруднень заключати клітини у капсули і імплантувати їх пацієнтам, див., наприклад, |(Патенти США ісе)
МоМо4892538; 5011472 і 5106627, розкриття яких введене у даному опису посиланням)|. Система для Ге інкапсулювання живих клітин описана також у заявці І|АебрізснНег еї аі., Заявка РСТ МО 91/10425, розкриття якої введене у даному опису посиланням); див. також |Аерізснег еї аі., Заявка РСТ УУО 91/10470; М/іпп еї а!., Ехрег.
Меийгої.,, 113:322-329, 1991; Аерізспег еї аїЇ.,, ЄЕхрег. МеийгоїЇ., 111:269-275, 1991; Тгезсо еї аї., АЗБАЮ, 38:17-23,19921, розкриття яких введене у даному опису посиланням. «
Передбачена також генна терапія іп мімо за допомогою зрізаних СОМЕ білків, де пацієнтові безпосередньо з с вводиться нуклеїнокислотна послідовність, яка кодує зрізаний СЗОМЕ білок. Наприклад, така послідовність вводиться клітинам-мішеням шляхом локальної ін'єкції нуклеїнокислотної конструкції з відповідним вектором ;» доставки, таким як аденоасоційований вірусний вектор. Можуть використовуватися також інші, але без обмежень, вірусні вектори, такі, наприклад, як ретровірусний вектор, аденовірусний вектор, вектори на основі
Вірусів простого герпеса і папіломи. Фізичне перенесення може здійснюватися іп мімо шляхом локальної ін'єкції
Ге» потрібної нуклеїнокислотної конструкції або іншого відповідного вектора доставки, які містять бажану амінокислотну послідовність, або ж шляхом ліпосомо-опосередненого переносу, прямої ін'єкції
Ме, (депротеінізованої ДНК), рецепторно-опосередненого переносу (комплексом ліганд-ДНК) або ж бомбардуванням 2) мікрочастками (генною гарматою).
Слід зауважити, що описані тут фармацевтичні препарати на основі зрізаного СОМЕ білкового продукту о можуть використовуватися як у ветеринарії, так і для лікування людей, і що термін "пацієнт" не несе з собою
Ге) будь-якого обмежуючого розуміння. При застосуванні у ветеринарії діапазони дозування повинні бути такими ж самими, як указано вище.
У якості засобів подальшої характеризації зрізаних ЗОМЕ білків за винаходом можуть бути розроблені антитіла, що зв'язуються зі зрізаним СОМЕ білком, такі як епітопи з амінокислотною послідовністю о Х-ІЇСуви. був!331-у, За допомогою добре відомих з публікацій способів можна одержувати моноклональні і поліклональні антитіла або рекомбінантні антитіла, які спроможні специфічно розпізнавати і зв'язуватися з іме) різними білками, що кодуються амінокислотними послідовностями за винаходом. Такі антитіла можна потім використовувати для, очищення і характеризації зрізаного ЗОМЕ білка. Антитіла можна вживати також у якості бо терапевтичних інгібіторів білків, на які вони спрямовані.
Інші особливості і переваги даного винаходу буде з'ясовано при розгляді наданих нижче прикладів практичного втілення винаходу, маючих виключно ілюстративне спрямування. Приклад 1 стосується експресії зрілого СООМЕ в клітинній системі ссавця і приготування зрілого ОМЕ білка. Приклад 2 стосується експресії зрілого ООМЕ у бактеріальній клітинній системі. У Прикладі З розглянута експресія різних зрілих СОМЕ білків у 65 бактеріальній клітинній системі. У Прикладі 4 порівнюється біологічна активність зрілого СЗОМЕ білка і зрізаного ЗОМЕ білка в випробуваннях на нейротрофічну активність дофамінергічних нейронів.
Приклади
Приклад 1
Експресія зрілого ООМЕ людини в клітинах СНО і очищення зрізаного ЗОМЕ білка, одержаного із клітин СНО
Матеріали
Для експресії ЗОМЕ людини в дефіцитних за дигідрофолатредуктазою клітинах СНО (наприклад, в клітинах
СНО, як описано в |(Опацр апа Спазт, Ргос. Май. Асай. 5сі.,, ОБ 77(7):4216-4220, 19801) використовували наступні матеріали.
Середовище СНО містило: модифіковане способом Дульбеко середовище Ігла (ОМЕМ) з високим вмістом 7/0 глюкози (іБкКо/ВКІ); 590 ембріональну бичачу сироватку (НуСіопе); замінні амінокислоти мінімального підтримуючого середовища (196) (сірко/вкі); гіпоксантин/тимідин (196) (сірко/вкі); глутамін/пеніцилін/стрептоміцин (1905) (Ігміпе Зсіепійіс).
Селективне середовище містило: середовище ОМЕМ (вискокоглюкозне); 595 діагнзовану ембріональну бичачу сироватку (НусСіопе); замінні амінокислоти мінімального підтримуючого середовища; 7/5 Глутамін/пеніцилін/стрептоміцин.
Фізіологічний розчин, буферизований 2Х НЕРЕЗ (НВ5) містив: 280мМ Масі; 10мММ КСІ; 1,5мММ Ма»НРО,; 12мМ декстрози; БХОММ НЕРЕЗ.
Трис-буферизованмій фізіологічний розчин плюс Тмееп (ТВ5Т) містив: 137мМ Масі; 20мМ трис/НСІ, рН 7,5; 0,195 Тмееп-20.
Методика
Трансфікування і селекція
Клітини СНО (пасаж 20) висівали у бОмм чашки Петрі (Баісоп) з густиною 8х10? клітин на чашку у культурному середовищі СНО". Наступного дня приблизно за три години до трансфекції середовище на клітинах було замінено свіжим середовищем. Га
Добре відомими методами були приготовлені плазмідні конструкції, які містили відповідні КДНК ЗОМЕ.
Наприклад, плазмідну конструкцію рОЗКА2 готували за методикою, описаною в одночасній Заявці, що є і9) співвласністю Заявка на Патент США Мо501904 від 29 березня 1990р. (див. також Заявку на Европейский патент
Мо90305433, Публікація МОЕР 398753 від 18 травня 1990р. і УУМО 90/14363, 1990)), розкриття яких введене у даному описі посиланням. Типова плазмідна карта, яка ілюструє структурну організацію вектора, показана на Ге»! Фіг2. Зрозуміло, що можуть бути використані також інші, найрізноманітніші нуклеїнокислотні послідовності, які кодують зрілий СОМЕ білок, тобто такі як показано на Фіг.1, З і 4. і.
Фрагмент ДНК Ніпаї-Хваї з послідовностями, кодуючими СОМЕ людини, і консенсусними послідовностями со
Козака ССАСС(АТО) реабілітували перетравленням фрагментом рестрикції із вектора експресії, основаного на роДНКЗ (Іпуйгодеп, Зап Оіедо, СА). Цей фрагмент ДНК був безпосередньо клонований у рОзКА? розрізу о
Ніпай/Хваї. Плазміда, що утворилася, була названа реМуУ5. Плазмідна ДНК рЗУУ5 перед трансфекцією була Ге) лінеаризована на сайті Римі. роОЗКА2 (Фіг.2) є похідною плазміди рСО (ОКауата апа Вего, Мої. СеїІ. Віої. 3:280-289, 1983) з трьома головними модифікаціями: (1) сигнал поліаденилювання ЗМ40 був заміщений сигналом від А-субодиниці « бичачого фолікулярного стимулюючого гормону А-БЕЗН |Соодм/іп еї а!., Мисівіс Асідз Кез. 11:6873-6882, 19831; (2) мишачий дигідрофолатредуктазний мініген |Саззег еї а!., Ргос. Май. Асад. Зсі. 79:6522-6526, 1982| був Щ-8д с вставлений у прямому напрямку від полігенного експресуючого кластера, для того щоб дозволити селекцію і ц ампліфікацію трансформантів; (3) 267 Бр фрагмент, з "К-елементом' і частиною послідовностей "5" "» довгокінцевого повтору (ІТК) вірусу людського Т-клітинного лейкозу типу | (НТІМ-І) був клонований і вставлений між промотором 5М40 і факторами сплайсінгу, як описано вище |Такере еї аї., Мої. СеїІ. Віо). 5 8:466-472, 19881.
Ге») Були приготовлені розчини ДНК з кінцевим вмістом ЗОМЕ плазмідної ДНК З,Омкг/чашка, ДНК геномного носія мишиної нирки (Сіопіесі) 7 ,Омкг/чашка, 2,5 М СасСі» 25мкл/чашка і стерильної дистильованої води до кінцевого б об'єму 250мкл/чашка. З метою позитивного і негативного контролю були приготовлені розчини ДНК, які містили оз відповідно ДНК вектора роОБКА?2 і ДНК носія. Ці розчини по краплям добавляли до однакового об'єму 2Х НЕРЕЗ-буферизованого фізіологічного розчину при барботуванні його повітрям. Розчини ДНК/НВ5 було піддано о інкубуванню при кімнатній температурі на протязі 30 хвилин. (Че) Живильне середовище із СНО клітинних культур було видалено, і до кожної чашки було добавлено 500мкл розчинів ДНК. Чашки піддали інкубуванню при кімнатній температурі на протязі ЗО хвилин, після чого до кожної з них було добавлено середовище СНО (5,Омл). Потім чашки інкубували при 37"С на протязі ночі.
Наступного дня середовище в чашках було замінено свіжим середовищем СНО". Ще через день, коли клітини досягли конфлюентного стану, культури піддали трипсинізації і переклали до 10О0мл чашок (Раїсоп) зі іФ) співвідношенням: їхбОмм чашка на 8х100мм чашок. Клітини були перекладені до селективного середовища. ко Кожні 2-3 дня середовище культур поновлювалося.
Через 15 днів колонії трансфектованих клітин виділили за допомогою скляних циліндрів для клонування, бо піддали трипсинізації і переклали до 24 ямочних планшетів (РаЇсоп). Усі 40 колоній було ізольовано від
ІСОМЕ/рЗМУ5- трансфектованих клітин. Решту клітин на планшетах піддали трипсинізації, об'єднали у пули і переклали до двох 100мм чашок (1 пул на кожну ДНК конструкцію).
Скринінг трансфектованих клітин 24 ямочні і згруповані у пули культури піддали культивуванню до конфлюентного стану, по досягненню якого 65 Культурне середовище було видалено і замінено на безсироваточне середовище (400мкл/ямка або 4мл/чашка).
Клітини інкубувалися на протязі 48 годин, після чого кондиційоване середовище було зібране. Зразки кондиційованого середовища були проаналізовані вестерн-блотінгом на експресію СОМЕ білка. Аліквоти (2Омкл і 4Омкл) кондиційованого середовища розрідили буфером для зразків електрофорезу (з В-меркаптоетанолом і без нього). Зразки, які містили В-меркаптоетанол, кип'ятили на протязі З хвилин (умови відновлення). Як відновлені, так і невідновлені зразки вилили на 1695 Трис-гліцинові гелі (Момех). Гелі піддали електроблотінгу на мікроцелюлозних фільтрах (Зспіеіснег апа Зспцеї! ВА-83, 0,2мкм). Блоти промили розчином ТВ5Т і потім інкубувапи у блокуючому розчині із 595 сухого молока (Сагпайоп) в ТВ5Т на протязі ЗО хвилин при кімнатній температурі. Потім блоти обробили антисироваткою проти СОМЕ (кроляча поліклональна антисироватка, індукована проти Е. Соїї - похідного СОМЕ; 1:1000 у 595 молоко/ТВ5Т) на протязі 1 години при кімнатній 7/0 температурі. Блоти потім ополоснули розчином ТВ5Т і промили 1 раз 10 хвилин і 2 рази по 5 хвилин розчином 1956 молока/ТВ5Т. Далі їх піддали обробці на протязі 20 хвилин вторинним протикролячим антитілом, кон'югованим з пероксидазою Ід-хріна (1:15000 в 195 молоко/ТВ5Т). Блоти ополоснули і промили розчином ТВЗТ 1 раз 20 хвилин і 2 рази по 10 хвилин, а потім піддали обробці реагентами ЕСІ (Атегеспат) на протязі 1 хвилини і гіперплівкою Нурепі!т-ЕСІ (Атегеспат).
Нижче описаний процес очищення СНоО-експресованого СОМ Рі СНоО-похідного, вирізаного ЗОМЕ гомодимеру із одного літра кондиційованого середовища. У зв'язку із сильною дією протеази у СНО середовищі, що вирізає ланцюг на залишку 31, цей процес може включати у себе використання інгібітора протеази під час очищення.
Етап 1. Хроматографія на біогранулах
Було приготовлене безсироваточне кондиційоване середовище із 20мМ 2(|М-морфоліно|етансульфонату (МЕ5), рН 6,0, добавленням 1/5ч4(06.) 1 М МЕЗ5, рН 6,0. До середовища добавили 25мл великогранульної смоли
ЗР сефарози (Рпапгтасіа), зрівноваженої 20ММ МЕ, рН 6,0, і перемішували при 47С на протязі 1 години. Смолу зібрали, надаючи їй можливості осісти і зціджуючи кондиційоване середовище. Зціджене середовище було перепущене крізь фільтр на спечених дисках для відновлення неосадженої смоли. Осаджена смола і смола, сч ов Відновлена фільтрацією, були піддані повторному суспендуванню і вилиті до колонки діаметром 2,5см і промиті буфером А із 0,15 М Масі, 20ММ МЕЗ5, рН 6,0, у кількості З об'ємів колонки (ОК). Білок був елюйований із і) буфера А з З0Омл градієнтом у 1,0 М Масі, 20ММ МЕ, рН 6,0, (буфер В) при швидкості потоку 0,2ОК/хв з моніторінгом спектральної поглинаючої спроможності на 28Онм. Були зібрані фракції, які містили 1,10К.
Наявність ЗОМЕ у фракціях визначали за допомогою вестерн-блотінга. Фракції, які містили ЗОМЕ, були Ге! зо згруповані для подальшого очищення. ЗОМЕелюювали з градієнтом між 0,3 і 0,6 М масі.
Етап 2. Рідинна хроматографія високої розрізнювальної спроможності (НРІ СС4) о
Пул з етапу 1 був оброблений трифтороцтовою кислотою (ТФК) у кількості 0,195(06.), перепущений у вакуумі су крізь 0,45мкм фільтр і поміщений до колонки Мудас С4 (0,46х25см), кондиційованої водним 1095 ацетонітрилом і 0,195 ТФК (буфер А). Білок елюювали з лінійним градієнтом 29б5/хв на протязі 50 хвилин із буфера А до водного ісе) 9090 ацетонітрилу, 0.195 ТФК (буфер В) при вимірюванні спектральної поглинаючої спроможності на 280нм. Була «о зібрана Тмм фракція, а наявність ФЗОМЕ визначали за домогою вестерн блотінгу. ЗОМЕ елюювапи між 4595 і 5590 ацетонітрилу. Фракції просушували у вакуумі.
Етап 3. 5 хроматографія високої розрізнювальної спроможності
Фракції із етапу 2, які містили СОМЕ, були піддані пептизації в їмл 0,15 М масі, 10мМ Трис, рН 8,0, |і « поміщені до З колонки 0,75х7,5см ТЗК-се! 5МУР високої розрізнювальної спроможності (Тово Нааз). Лінійний ще с градієнт 0,4965/хв проходив від 0,15 М Масі, 10мММ Трис, рН 8,0, (буфер А) до 1,0 М Масі, 10мММ Трис, рН 8,0, . (буфер В), на протязі 50 хвилин за швидкістю потоку Тмл/хв. 1 хвилинні фракції були зібрані при вимірюванні и?» спектральної поглинаючої спроможності на 280нм. При 3095 буфері В градієнт було змінено на 6,59б/хв х 10 хвилин. Вестерн-блотінг фракцій показав 4 головних СОМЕ компоненти. Три з цих компонентів елюювапи з градієнтом 0,49в/хв, а четвертий - з градієнтом 6б,5Уб/хв. Зі схожих компонентів були утворені пули, які було
Ге» піддано секвенуванню. Секвенування дозволило ідентифікувати пул приблизно 29-36КО як зрізаний СОМЕ білок
ІАгаЗ2-МЦе 7343, Компонент приблизно 38-40КО був ідентифікований як гетеродимер зрізаного ЗОМЕЇ зрілого ЗОМЕ
Ме, 32 .Це134 : и : и
ІАга7--Ме "7 | нарешті, компонент приблизно 41-44КО, який був виділений при останньому з цих двох (95) градієнтів, був ідентифікований секвенуванням як гомодимер зрілого ЗОМЕ
Приклад 2 ЗрілийсОМЕлюдини, продукований в Е Соїї (95) . . й не .
Бактеріальну експресію зрілого ЗОМЕ людини можна здійснювати способом, описаним в (іп еї аі!., Заявка на іЧе) Патент США Мо08/182183 від 23 травня 1994р. та родові заявки; РСТ/ЛУЗ 92/07888 від 17 вересня 1992р. (МО 93/06116); і заявка на Европейський патент Мо92921022.7 (Публікація МОЕР 610254)), розкриття яких введене у даному опису посиланням. Із опису до даного винаходу з очевидністю слідує, що для експресії в Е Соїї та інших бактеріях можна без будь-яких утруднень використовувати або адаптувати найрізноманітніші матеріали і способи. Інші варіанти полінуклеотидів, які можна вживати для експресії, показані, наприклад, на Фіг.1, З і 4. о Повторна укладка і очищення експресованого зрілого ЗОМЕ іме) Трансформовані клітини були оброблені при температурі 5"С (якщо не зазначено іншого) наступним чином: клітинна паста (З0Ог) була суспендована у кінцевому об'ємі 200мл у розчині 25мММ Трис, рН 8,5, який містив 5ХмМ 6о ЕОТА, у результаті чого була одержана кінцева клітинна пульпа у кількості 1595 (06.). Клітини були ретельно дисперговані за допомогою ручного гомогенізатора з низьким зсувом Віозрес. Пульпу двічі перепустили крізь мікрофлюїдайзер під тиском 1450Офунтів/кв. дюйм (1015кгс/см?) для розриву клітин і вивільнення тіл включень. Потім одержаний гомогенат було піддано центрифугуванню на протязі ЗО хвилин при 16000хг.
Утворений внаслідок центрифугування дебріс тіл включень промили шляхом ресуспендування у холодній воді 65 до кінцевого об'єму 240мл за допомогою гомогенізатора Віозрес, як вище, з утворенням пульпи. Зразок цієї пульпи було взято на НРІ С аналіз рівня експресії СООМЕ. Решта пульпи була піддана центрифугуванню на протязі ЗО хвилин при 16000хг. Супернатант злили, а до посудини центрифугування добавили трохи холодної води і обережно перемішали для видалення вільно утвореного мембранного шару на поверхні дебрісу з тіл включень. Дебріс суспендовали повторно гомогенізатором Віозрес з об'ємом холодної води, достатнім для одержання концентрації СООМЕ 2мг/мл. Потім тіла включень були розчинені перемішуванням кінцевої суспензії тіл включень (25мл) з 8 М гуанідін-НСІ (25мл), який містив 180мММ цистеїн-НСІ і 50мМ Трис-НСЇІ, рН 8,7. Розчинену суміш перемішували при 25"7С на протязі 60-90 хвилин, після чого її при помішуванні вилили до 2 М сечовини (45Омл) при 5"7С, яка містила 20мМ Трис-НСЇ, рН 8,75, і 0,2 М гуанідін-НСІ. Одержану суміш повторної укладки поволі перемішали при 5"7С на протязі 72 годин. 70 Повторно укладений СОМЕ був частково очищений наступним чином: 20мММ натрій-ацетатний буфер (25Омл,
РН 5) при 5"С був добавлений при швидкому перемішуванні до суміші повторної укладки, і рН була доведена до 5 льодяною оцтовою кислотою. Одержаний преципітат був видалений шляхом центрифугування при 13600хг на протязі 45 хвилин при 5"С. Супернатант, одержаний після центрифугування, було вжито у якості завантажувального розчину для наступного етапу очищення із залученням катіонообмінної хроматографії з 75 грубогранульованою 5Р-смолою (РІаптасіа). У колонці при 57С у якості? буферного розчину зрівноваження, промивки і елюції використовувався 20мММ ацетат натрію (рН 5). Смоляний шар (мл) був промитий 5 об'ємами колонки (ОК) 0,2 М Маон і потім зрівноважений ацетатним буфером 5ОК. Завантажувальний розчин (190мл) залили до колонки зі швидкістю 0,5ОК/хв з наступною промивкою 10ОК ацетатного буфера з тією ж самою швидкістю потоку. Далі ЗПОМЕ елюювали із смоли 200ОК лінійним градієнтом Масі від 0,3 М до 0,9 М в ацетатному буфері зі швидкістю потоку 0,1ОК/хв. Елюат колонки контролювали за спектральним поглинанням на 28Онм і збирали у формі фракцій, які піддавали ЗО5-РАСЕ аналізу (аналіз методом електрофорезу у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію). Фракції, які містили ЗОМЕ)/ були згруповані від переднього фронту піка СЗОМЕ на 1095 висоті піка до заднього фронту піка на 1095-й його висоті. Білок у цьому пулі був повністю СОМЕ і, залежно від вжитого продукційного штаму, містив від 3295 до 1295 забруднень у вигляді модифікованих форм Га
СЗОМЕ. Потім пул піддавали діалізу проти РВ5 та інших препараторних буферів і у деяких випадках концентрували шляхом суперфільтрування до 25мг/мл. Обидві форми СОМЕ, дикого типу і аналогова, очищені і9) цією процедурою піддавались аналізу методами обернено-фазової НРІ С хроматографії, катіонообмінної НРІ С хроматографії, масспектрометрії, і вимірювали рівні ендотоксину з метою порівняння чистоти препаратів з чистотою відповідних продукційних штамів. Ге»!
Приклад З
Рекомбінантне продукування зрізаного ЗОМЕ в Е. Соїї о
Типові зрізані СООМЕ білки виробляли згідно зі способами, описаними в (іп еї аІ., Заявка на Патент США со
Мо08/182183 від 23 травня 1994, див. вище). Можуть бути використані також інші матеріали і способи бактеріальної експресії, наприклад, такі як описано вище. Експресовані в Е Соїї зрізані ЗОМЕ білки включають о у себе білки (Рго23- Це!З43, ІАгаЗ2-Це 94 і (еІуЗЗДе!31), показані відповідно на Фіг.5, б і 7. Полінуклеотиди, «О які кодують ці типові зрізані СОМЕ білки, мали конструкції, показані на Фіг.5, б і 7. Але можуть використовуватися також інші відповідні полінуклеотиди, такі як показано на Фіг.1, З і 4. Полінуклеотиди були сконструйовані стандартними ПЛР способами, описаними в (|РСК Тесппоіоду, Ргіпсіріеєз апа Арріїсайопз ог ОМА «
Атрійісайоп, Непгу А., Епісп, ейд., ЗіосКОп Ргезз, МУ, 1989 (Спаріег б, Овіпд РСК о Епдіпеег ОМА), розкриття яких введене у даному описі посиланням. - с Приклад 4 а Біологічні випробування на нейротрофічну активність дофамінергічних нейронів » Експресовані в Е Соїї зрізані ЗОМЕ білки (Рго23-Це!943, ІАгаЗ2-Це 943, Г(еуЗ3-Це943 і (І увЗ7-Це!34) за Прикладом
З і СНО-похідний зрізаний СОМЕ білок (Ага?2-Це!94) за Прикладом 1 були якісно оцінені щодо їх спроможності стимулювати поглинання дофаміну дофамінергічними нейронами чорної субстанції.
Ме. Матеріали
Ге» У випробуваннях для оцінки виживання дофамінергічних нейронів при наявності зрізаних СОМЕ білків використовувалися наступні матеріали. о Клітинне культурне середовище 2) 20 Високоглюкозне, модифіковане способом Дульбеко середовище Ігла (ОМЕМ; каталог Мо11965-092), середовище Е12 Хема (Б, Мо11765-021), середовище І 15 Лейбовица без бікарбонату натрію (Мо41300-039), ср культурний конглютинін середовища 827 (Мо17504-010), пеніцилін/стрептоміцин (Ме15070-014), І-глютамін (мМо25030-016), фосфат-буферизований фізіологічний розчин Дульбеко (0О-РВ5, Мо14190-052, збалансований солевий розчин Хенка з солями кальцію і магнію (нв55, Мо24020-026), 99 М-2-гідроксиетилпіперазин-М'-2-етансульфокислота (НЕРЕ5, Мо15630-015), мишачий ламінін (Мо23017-015) і
ГФ) альбумінова фракція М бичачої сироватки (Ме110-18-017) - всі ці матеріали були виробами фірми СІВСО, Сгапа
ІвІапа, МУ. Крім того, використовувалися термодезактивована кінська сироватка фірми НусСіопе, І одап, (Хай; де кональбумін (С-7786), гідробромід полі-І-орнітину (Р-3655), бичачий інсулін (І-5500), людський трансферін (т1-2252), путресцин (Р-6024), прогестерон (Р-6149), селеніт натрію (5-9133), метризамід (М-3383) виробництва 60 фірми бідта СНетісаї Сотрапу, Заїпі-Їоців5, МО; папаїн, дезоксирибонуклеаза | і овальбумін (продукт диссоціації папаїну) виробництва фірми Ууогіпіпдіоп Віоспетіса!з5, Егеепоїд, М.
Були також використані стерильні 96 ямочні мікропланшети РаїЇсоп (Мо3072), пластмасовий посуд для культивування тканин і поліпропіленові пробірки для центрифуги виробництва фірми Весіоп-Оіскіпзоп, Охпага,
СА; покривне скло для камер культивування тканин Мипс І аб-Тек (Мо136439) фірми Вахіег, Ігміпе, СА; 20мкм бо нейлонові сита (Мо460) фірми Теїко, ЕІтвіога, МУ; 4 дюймові щипці і ножиці для розсічення м'яких тканин фірми
Кобог Зигаіса!, М/азпіпдіоп, ОС.
Антитіла і відповідні реагенти
Використовувалися поліклональні антитіла кроля проти тирозингідроксилази (ТЕ101) фірми Ецдепе Теспі,
Кіадейеід Рагк, Му; поліклональні антитіла кроля проти нейроспецифічної енолази (М5Е, АВОБ1) фірми
Спетісоп, Тетесціа, СА; авідинбіотиновий комплекс, кон'югований з біотинильованим козячим Ідс проти кроля і пероксидазою (АВС ЕІШе; комплект Месіазіаїй РК-6100) фірми Месіог ІіаБрогайюгіев, Вигіпдате, СА; 3-3-діамінобензидін фірми Сарреї! І арогаюгіез, УУеві Спезіег, РА; суперблокуючий буфер в РВ5 (Мо37515) фірми
Ріегсе Спетіса! Сотрапу, Косктога, І; Топ Х-100 (Х100), Мопідеє Р-40 (М6507) і перекис водню (3090, об.; 70. НІ1009) фірми 5ідта; інгібітор поглинання дофаміну ЗВК-12909 (0-052) фірми КВІ, МаїйскК, МА; ЗН-дофамін (дофамін, мічений тритієм, МЕ-131; 21 Сі/моль) фірми Мем Епдіапа Мисіеаг, Вовіоп, МА; сцинтиляційний коктейль
Оріїрпазе Зирегтіх фірми УмМаїїас, ТигКи, Ріпіапа; білі мікропланшети МіемРіІаїе-96 (Моб6005182) фірми Раскага
Іпвігитепів Согрогайоп, Мегідеп, СТ; у разі відсутності інших даних, решта компонентів - від фірми бідта
Спетіса! Сотрапу.
Приготування середовища
Базальне культурне середовище являло собою суміш ЮОМЕМ і середовища Е12 у співвідношенні 1:1, доповнену конглютиніном середовища В27, який вводився у формі 50-кратно концентрованого розчину.
Ї-глютамін добавляли з кінцевою концентрацією приблизно 2мМ, пеніцилін - приблизно 100 ІШ/л (ІШ - імунізуюча одиниця), і стрептоміцин - приблизно 100мг/л. Термодезактивовану кінську сироватку добавляли до кінцевої концентрації приблизно 1595. Після перемішування рН доводили до 7,3, а середовища витримували при температурі 4"С. Середовища приготовляли свіжими, безпосередньо перед використанням, з тим щоб звести до мінімуму розходження між експериментами. В усіх експериментах використовувалися пластмасові піпетки і контейнери для того, щоб зробити мінімальним адсорбцію білка.
Субстрат культури с
Для забезпечення оптимального прикріплення нейронів і нейритних відростків субстрату, поверхні титраційного мікропланшету (субстрат культури) були модифіковані послідовним покриттям полі-І -орнітином і і9) ламініном наступним шляхом. Поверхні планшету були повністю покриті стерильним 0,1мг/мл розчином полі-І-орнітину у 0,1 М борній кислоті (рН 8,4) на протязі принаймні год. при кімнатний температурі з наступною стерильною промивкою водою Зирег-с) надвисокої якості. Потім промивочну воду відсмоктали, Ге»! добавили 1,0 мкг/мл розчин мишачого ламініну в РВЗ і термостатували при 37"7С на протязі 2 год. Ці процедури проводили безпосередньо перед використанням планшетів з метою забезпечення відтворюваності результатів. о
Приготування культур чорної субстанції ембріонального щура со
У якості джерела дофамінергічних нейронів чорної субстанції був використаний мозок ембріона щура. Для цього брали самок щурів Зргадое-Оажміеу з розрахованою у часі вагітністю на 15-й день віку ембріона. Для о експерименту було підготовлено максимум 36 ембріонів (приблизно три приплоди). Вагітних самок щурів «о умертвляли газом СО». Їхні черевні порожнини розтинали хірургічними ножицями, і ембріони виймали із утроб.
Мозок ембріонів розсікали і очищали від крові і оболонок, і за чіткими анатомічними орієнтирами розсікали вентральну оболонкову ділянку, яка містила чорну субстанцію (Айтап апа Вауег, АНаз ої Ргепаїйа! Каї Вгаїп «
ОемеІортепі, СКС Ргезв, Воса Каїоп, РІ, 1995). Тканини збирали до охолодженого на льоду розчину О-РВ5, переносили до 1Омл дисоціаційного середовища (120 одиниць папаїну і 2000 одиниць дезоксирибонуклеази в 0 Ше) с НВ5ЗЗ5) і потім інкубували на протязі 45хв. при 377"С на шейкер-платформі, що оберталася з частотою приблизно ц 200об/хв. Потім клітини диспергували гомогенізацією крізь оплавлені на вогні піпетки Пастера, просіяли крізь "» 20мкм сита Міех для відділення недисоційованої тканини, і піддали центрифугуванню на протязі 5хв. при 200хг на клінічній центрифузі ІЕС. Утворений дебріс знову піддали суспендуванню в НВ5З5 з овальбуміном і 500 одиницями дезоксирибонуклеази, з поверхневим шаром 495-го розчину овальбуміну (в НВ) і центрифугували
Ге») на протязі приблизно 10 хвилин при 500хг. Одержаний дебріс був знову суспендований у повному культурному середовищі (див. вище), відрегульований приблизно до 2800Оклітин/мл і висіяний аліквотами (9Омкл) до бмм б ямок 9б-ямочних мікропланшетів, перед тим покритих поліорнітином і ламініном. Прикріплення клітин оз відбувалося швидко, а ефективність культивування складала приблизно 75965.
Імуногістохімія дофамінергічних нейронів о Для визначення властивостей дофамінергічних нейронів в культурах чорної субстанції був використаний
Ге) трохи змінений, непрямий імунопероксидазний спосіб, описаний Луїсом Ц(оців еї аїЇ., 9. РНагтасої. Ехр.
Тпегар., 262:1274-1283, 1992; Зсіепсе, 259:689-692, 1993). Культури піддали закріпленню на протязі ЗОхв. при кімнатній температурі 495 параформальдегідом в О-РВ5, рН 7,4, з трьома наступними промивками в О-РВ5 (200мкл на бмм ямку). Потім фіксовані культури інкубували у блокуючому буфері З!ирегріоск в РВЗ з 195 МР-40 для підвищення пенетрації антитіл. Потім до них добавили розріджені у тому ж самому буфері, у співвідношенні
Ф, 1:2000, первинні кролячі антитіла проти тирозингідроксилази і інкубували на протязі Ігод. при 377"С на ко обертаному шейкері. Після трьох промивок буфером О-РВ5 були визначені зв'язані антитіла за допомогою біотинільованого (ДС коза проти кролика при розрідженні 1:500. Ці вторинні антитіла піддали інкубуванню з бо Клітинами на протязі приблизно год. при 37"С. Потім клітини промили З рази буфером О-РВ5, вторинні антитіла визначили авідін-біотин-пероксидазним комплексом, розрідженим у співвідношенні 1:500, і клітини інкубували на протязі 4 хв. при 37"С, Після З і більше промивок буфером О-РВ5 культури реагували на протязі 5-20хв. у розчині 0,1 М Трис-НСІ, рН 7,4, який містив 0,04905 3'-3'-діамінобензидин-(НСІ), 0,069о МіСІ» і 0,0295 перекису водню. 65 Визначення виживаності нейронів
Культури чорної субстанції були закріплені і піддані імунному забарвленню так, як описано вище, і потім досліджені під просвітленою оптикою при 200 кратному збільшенні. По всіх бмм ямках 96б-ямочних мікропланшетів була підрахована кількість нейронів, забарвлених тирозингідроксилазою. Життєздатні нейрони мали тіло клітини правильної форми з головним аксоноподібним відростком і кількома дендритоподібними відростками. Нейрони, що мали ознаки виродження, такі як неправильної форми вакуольовані перикарії або фрагментовані нейрити, були виключені із підрахунку (проте більшість вироджених нейронів була відділена від субстрату культури). Кількості клітин дофамінергічних нейронів були виражені або числом ТН позитивних нейронів на бмм ямку, або зміною укладки відносно густини контрольних дофамінергічних нейронів.
Визначення поглинання дофаміну 70 Поглинання дофаміну визначали в культурах нейронів чорної субстанції 15 добового ембріону щура, які були одержані в білих мікропланшетах МіежРіІаїе-96. Культури промивали підігрітим буфером для поглинання (приблизно 10Омкл), який складався із модифікованого розчину Кребса-Рінгера, рН 7,4, що містив приблизно 120мМ Масі, 4,7мМ КСІ, 1,8мМ Сасі», 1,2мМ М495О,, 32мМ МанРо,, 1,3мММ ЕОТА і 5,6мМ О-глюкози. Буфер для поглинання також містив їмМ аскорбінової кислоти і 5 мкМ паргіліну для запобігання окислення дофаміну. 7/5 Клітини були піддані попередньому інкубуванню при 37"С на протязі приблизно 10хв. у буфері для поглинання.
Потім до культур чорної субстанції був добавлений мічений тритієм дофамін (ЗН-ОА, 21 Сі/мм) з концентрацією приблизно 5ОНМ у 75мкл буфера для поглинання, і культури піддані інкубуванню на протязі бОхв. при 377С.
Неспецифічне поглинання дофаміну визначали шляхом інкубування культур з буфером для поглинання, який містив інгібітор поглинання дофаміну СВК-12909 (1мкМ). Неспецифічне поглинання складало менше ніж 195 від 2о загального поглинання. Випробування на поглинання зупиняли висмоктуванням культурного середовища з наступними трьома швидкими промивками охолодженим на льоду буфером поглинання (приблизно 120Омкл).
Потім клітини піддали лізісу доданням сцинтиляційного коктейлю Оріїрпазе Зирегтіх (200мкл), і була визначена радіоактивність за допомогою сцинтиляційного спектрометра з лічильником на 9б-ямочному мікропланшеті
УуаНйас Місгорейа Різ (тобто поглинання дофаміну вимірювали шляхом підрахування сцинтиляції тритію, що Га утримувався в культурах). Результати вимірювань виражали в одиницях арт/бмм ямка або як зміну укладки відносно контрольних культур. і)
Випробування
Виживання дофамінергічних нейронів і морфологічний розвиток
Для демонстрації ефекту зрізаних ЗОМЕ білків щодо виживання дофамінергічних нейронів були використані Ге»!
Культури збагаченої на дофамінергічні нейрони чорної субстанції 15 денного ембріонального щура. Культури вирощувались на покритих поліорнітином і ламініном 96-ямочних мікропланшетах на протязі 6 днів без білків і о при наявності наступних видів білків з різними концентраціями: (в діапазоні від Тпг/мл до 1Онг/мл): зрілий со лом, експресований в Е Соїї, зрізані СОМЕ білки (Рго22- Пе!З4, ІАгуЗ2-Пе "94, (су. Це і (ув. Це!945, со експресовані в Е Соїї, зрілий лООМЕ, експресований в клітинах СНО; зрізаний СОМЕ білок |Ага?2-Це!З13, виведений із клітин СНО. Культурне середовище складалося із ЮОМЕМ/Е12, доповненого 1595 (се) термодезактивованої кінської сироватки (культури Е15) або 2,595 термодезактивованої кінської сироватки,
О-глюкозою, розчином НЕРЕЗ5, інсуліном і трансферіном (культури Рб). У якості маркера для дофамінергічних нейронів використовували імунне забарвлення на тирозингідроксилазу (ТГ) - обмежуючий швидкість фермент у « біосинтезі дофаміну. Оскільки норадренергічні нейрони у ромбовидному мозку також позитивно забарвлюються на ТГ, було вжито чималих застережних заходів до того, щоб розсічення обмежувалося вентральною оболонкою т с середнього мозку і щоб не зачепити більш каудальні ділянки, де містяться тіла норадренергічних клітин. Через ч 6 днів культури Е15, як правило, складалися приблизно із 7095 нейронів, ідентифікованих імунним забарвленям ни на нейроноспецифічну енолазу (як описано вище) і 3095 ненейронних клітин (які мали сплощений, фазово-темний зовнішній вигляд); дофамінергічні нейрони складали приблизно 10-1595 нейронної популяції.
Через 6 днів культури були закріплені параформальдегідом і імунно забарвлені на тирозингідроксилазу - (2) маркер, який ідентифікує дофамінергічні нейрони в цих культурах. Всі позитивні на тирозингідроксилазу б нейрони, наявні у бмм ямці, підраховувались під просвітленою оптикою. Було проаналізовано від З до 6 різних ямок для кожної з умов експерименту. Одержані результати були виражені у відсотках кількості позитивних на о тирозингідроксилазу нейронів, знайдених в контрольних культурах. о 20 Культури чорної субстанції Е15, оброблені 1,Онг/мл СОМЕ, СОНЕ, експресованим в клітинах СНО, і ЗОМЕ, експресованим в клітинах Е СоїіЇ, містили ТГ імунореактивні нейрони відповідно на 3895 і 2795 більше, ніж
Ме) необроблені контрольні культури, вказуючи на те, що обидва види СОМЕ стимулюють життєздатність дофамінергінних нейронів. Культури чорної субстанції Е15, оброблені 1,Онг/мл зрізаного ЗОМЕ білка, показали такий самий зріст кількості в них ТГ-позитивних нейронів через 6 днів іп міго: 4295 для зрізаного ООМЕ білка 22 |Аг932- Це!34), виведеного із клітин СНО; 26965 і 1795 для зрізаних СОМЕ білків відповідно (Ага З2-Пе!З4 ії
ГФ) ІСТУЗЗ Це 134), експресованих в Е Соїї. 7 Порівняння контрольних культур з культурами, обробленими зрілими і зрізаними СОМЕ білками, також виявляє виразний ефект всіх ЗОМЕ білків на морфологічну диференціацію дофамінергічних нейронів. Ефект від до Зрізаних ЗОМЕ білків ІАгаЗ2-Пе!З4 ії |СІуЗЗ-Це!34, був ідентичним до їхніх аналогів зрілого СЗОМЕ білка.
ТГ-імунореактивні нейрони у всіх оброблених СОМЕ культурах мали значно більш складну і широку древовидність нейритної структури, а також більший ступінь нейритного розгалуження і більший загальний розмір, ніж ТГ-позитивні нейрони в контрольних культурах.
Поглинання дофаміну ве Поглинання дофаміну є мірою кількості і активності високоспоріднених сайтів повторного поглинання і транспорту дофаміну і відзеркалює функціональну диференціацію дофамінергічних нейронів. Поглинання дофаміну вимірювали на культурах чорної субстанції Е15 щурів через 6 днів іп міо зі зрілими або зрізаними
СОМЕ білками і без них. В цих культурах поглинання дофаміну мало фармакологічний профіль, характерний для дофамінергічних нейронів, тобто він був майже цілком блокований (більше, ніж на 9890) 1мкМ інгібітору овКк-12909 транспортування дофаміну, специфічного для дофамінергічних нейронів (І050-2ОнМ). Це свідчить про те, що вимірювання поглинання дофаміну не віддзеркалюють наявності забруднюючих норадренергічних нейронів, які можуть поглинати дофамін крізь транспортери норепінефріну, але не є чутливі до гальмування інгібітором ЗВК-12909. Ефект від зрілого СООМЕ, експресованого в клітинах СНО, і від зрізаного СООМЕ білка
ІАго 32. Це!341, виведеного із клітин СНО, був ідентичний: приблизно 6595-й зріз при ЕОБО близько 2Опг/мл. 70 Зрізаний СОМЕ білок |Рго2З-І івЗ'дАзпЗ"- Це!З1), експресований в Е Соїі, показаний на Фіг.5, дає 6596-й зріст при ЕОБО близько 40пг/мл. Вплив на поглинання дофаміну з боку зрілого білка, експресованого в Е Сої, і з боку зрізаних оОМЕЄтків (АгаЗ2-Пе!94, ГеуЗЗДе!З4 і ( увЗ"-Це!343, експресованих в Е. Соїї, був однаковий: близько 50905-й зріст при ЕОБ5О приблизно 5Омкг/мл.
Одержані результати вказують на те, що зрізані ЗОМЕ білки діють як сильні, стимулюючі виживаність і 75 викликаючі, диференціацію фактори для дофамінергічних нейронів чорної субстанції. У зв'язку з цим, вони розглядаються як особливо корисні у лікуванні хвороби Паркінсона - нейрологічного розладу, який характеризується зниженою емоціональністю, сповільненням як навмисного, так | ненавмисного м'язового руху, м'язовою ригідністю і тримором. Такі симптоми зв'язуються з прогресивним виродженням виробляючих дофамін нейронів, розміщених у чорній субстанції. Виродження цих нейронів ("дофамінергічних нейронів") приводить до зниження дофаміну в суміжній ділянці мозку, яка називається смугастим тілом.
Перелік послідовностей (1) Загальна інформація (Ї) Заявник: Хью, Сильвія (ії) Назва винаходу: Зрізаний гліоцитопохідний нейротрофічний фактор. с (ії) Кількість послідовностей: 50 о (ІМ) Поштова адреса: (А) Адресат: Амген Інк. (В) Вулиця: 1840 ДеХевіпенд Драйв (С) Місто: Таусенд Оукс (2) (С) Штат: Каліфорнія со (Е) Країна: США (Є) Поштовий індекс: 91320 о (М) Форма для зчитування комп'ютером «о (А) Тип носія: гнучкий диск
Зо (В) Комп'ютер: сумісний з ЕОМ фірми ІВМ ісе) (С) Операційна система: РО-ЮОБ/М5-БО5 (Ю) Програмне забезпечення: Раїепі Іп КеІеазе Я1, Мегвіоп Я1.25 (мі) Дані про заявку: « (А) Номер заявки: (В) Дата подання: З с (С) Класифікація: "» (мії) Інформація щодо патентного повіреного/агенства: " (А) Им'я та прізвище: Каррі, Даніель Р. (В) Реєстраційний номер: 32, 727 (С) Номер діла: А-357
Ме, (їх) Інформація щодо телекомунікації:
Ф (А) Телефон: 805-447-8102 (В) Телефакс: 805-499-8011 о (С) Телекс: о 50 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:1: (Ї) Характеристики послідовності:
Ме; (А) Довжина: 402 основних пари (В) Тип: нуклеїнокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: білок о (їх) Особливості: (А) Найменування/ключ; СО5 о (В) Місцезнаходження: 1...402 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:1: 60 б5
ТСА ССА САТ ААА САА АТО ОСА СТО СТТ ССТ АСА АбА САС ССО ААТ соб 48 бек Рхо А5р Був сіп Ме Аза Уаї Пец Рхко Ахуд Аку бі Ак Авп АгО 1 5 10 15
САС ОСТ ОСА ССТ ССС ААС ССА САС ААТ ТОС АСА ОСА ААА ССТ соб АбА 96 сФ1іп А13 А1а Аа Аїа Авп о Рко біз Азп о Бег Агод б1у Мує с1у Акд4 АгФ 20 25 30
СОС САС Со ССО АДА ААС ССО СОТ ТОТ СТО ТТА АСТОССА АТА САТ ОТТА 144 сіу бій АкЯ б1у цуз Азп Ах б1у Суб Маї ШСец Тік А1а ї1е Ні Бей 35 40 45
ААТ СТО АСТ САС ТТО оСТ СТО СОС ТАТ САА ДСС ААб САС САЛА СТО АТТ о 192
АБпоМа1! ТБЕ АБр цец су Гаш біу Тух бі ТЕ о цув б1ч біз цем Ге 50 58 60
ТТТ АбС ТАС ТОС АбС СОС ТСТ ТОС САТ ОСА ОСТ САС АСА АСО ТАС ОсСАС 0240
Бре АкоЯ Тут Суз бек Сіу бек Суз Азр Аїа А1а сі ТЕ ТіК Тут Ар 65 70 75 80
АЛЛА АТА ТТО ААА ААС ОТТА ТОС АСА ААТ АСА АСО СТО СТО АСТ САС ААА 0288 цуз І1е Пец Гуз Азп о беш бек Агу Ап Агу Агу Бей Уаї бек Ар Гу 85 90 95
СТА ССО САС ОСА ТОТ ТОС АбА СОС АТС СОС ТТТ САТ САТ САС сто тоб 0336
Уа1 біу сіп Аза Су Сує Агу Рго І1е Аїа Ріе Азр Аб5р Авр Пец бек 100 105 110
ТТТ ТТА САТ САТ ААС СТО СТТ ТАС САТ АТТ СТА АСА ААС о САТ ТОС ост о 384
Рпе Пец Ар Авр Аєп Геч Уаї Тут Нів І1е Пец Ат пу Ніє Бег Аїа с 115 120 125 щі 6)
АМА АСа ТТ ОА ТОТ АТС 402
Був Агу Су біу Суз Іїє 130 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:2: б зо (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 134 амінокислоти о (В) Тип: амінокислотний с (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок ісе) (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:2: со
Авп Ма! ТвтЕ Ар оБбеч Сіу без Сіу Тук біп ТБтх бує бі біч без Те 20 55 БО
Ре Аг Тук Су Бек біу Бех Суб Авр А18 А1а Сі Тс Тбі Тут Ар « 55 70 75 во цуз І19 Пеб Гуз Абп о рей Зег Аг Авп о Аку Аку Пец Чаї бет Аєр цу о, с 85 90 й 95 "з Чаї сіу біп А1їа Суз Суз Ага Рго І1е А1їа Ріе Авр Ар Азр о Печ Бех " 100 105 110
Ре беч Азр Азр АвпоГеш Уаї Тут Нів І11є Пес АкЯ4 Гуз Ні бек Аїа 115 120 125 (о)
Туз Ак Сув б1іу Суз І1є ме) 130 (95) (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:З: с 50 (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина; 4 амінокислоти іЧе) (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули; пептид о (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:3:
Гуз Азп Аго Су іме) (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО 4: (Ї) Характеристики послідовності: 60 (А) Довжина: 5 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид 65 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:4:
Сіу Гуз Азп Ага Су 1 5 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:5: 95 (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: Є амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна то (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:5: дико Оу Гуз Азп Ага сіу 1 5 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:6: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 7 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: пептид (хї) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:6
Сіл Аго Сіу Гуз Азп Аго бу 1 5 сч (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:7: і) (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 8 амінокислот (В) Тип: амінокислотний Ге! зо (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна о (ії) Тип молекули: пептид с (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:7:
Сім ап Аго сіу Гув Авп Аго Сіу (Се) 1 5 (Се) (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:8: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 9 амінокислот « (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна З с (Юр) Топологія: лінійна "» (ії) Тип молекули: пептид " (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:8:
Ага ау Сіп Ага Сіу Гуз Асп Аго су б 1 5 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:9:
Ме, (Ї) Характеристики послідовності: 2) (А) Довжина: 10 амінокислот (В) Тип: амінокислотний о (С) Кількість ниток: одна
Ге (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:9:
Ага Ага Су біІп Аг Сіу Гуз Авп Агу бу о 1 5 . 10 (2) Інформація щодо послідовності БЕО ІЮ МО:10: де (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 11 амінокислот 6о (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:10: б5 Су Агу Ага Сіу Сіп Аго спу Гуз Ап Агу Спу 1 5 10
(2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:11: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 12 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:11: 70 Гуз Су Ага Ага ЯМ біп Аго СУ ув Авп Агу спіу 1 5 10 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:12: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 13 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:12: бу ув Сіу Аг Аго Сіу Сіп Агоу Су Гуз Азп Ага Су
Н 5 10 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:13: (Ї) Характеристики послідовності: с (А) Довжина: 14 амінокислот о (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид Ме (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:13: со
Аго Су Гуз СіІу Аго Агу Су Сіп Аго Су Гуз Азп Аго Су со 1 5 10 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:14: ї-о (Ї) Характеристики послідовності: (Се) (А) Довжина: 15 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток; одна « (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид - с (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:14: ц Бег Аг ЗУ Гуз Сіу Аго Ага (у Сіл Агу Су Гу Авп Агуо Су
Б 1 5 10 15 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:15: б 15 (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 16 амінокислот (о) (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (95) им (О) Топологія: лінійна (95) 20 (ї) Тип молекули: пептид с (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:15:
Авп Зег Ага Сіу Гуз Сіу Ага Ага Сіу Сп Аго Су Гуз Азп Ага Сіу 1 5 10 15 5Б (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:16: (Ї) Характеристики послідовності:
Ф) (А) Довжина: 17 амінокислот ка (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна 60 (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:16: сін Азп Зег Аго Су Гуз Су Аго Аго Сіу біп Аго Сіу ув Ап Аго Су 1 5 10 15 65 (2) Інформація щодо послідовності БЕО ІЮ МО:17: (Ї) Характеристики послідовності:
(А) Довжина: 18 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:17:
Рго Сім Азп Зег Агуо СІу ув сіу Агу Ага Сіу Сіп Ага Су Губ Авп 1 -5 10 15 70 Ага СІУ (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:18: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 19 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:18:
Авп Рго Сім Аєп Зег Ага Сім (уз Су Ага Ага Сіу Сп Аго СУ Гуз Ап 1 5 10 15
Аго ау (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:19: (Ї) Характеристики послідовності: с (А) Довжина: 20 амінокислот о (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид Ме (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:19: со
Ага Авп Рго Сіш Азп Зег Аго Сіу Гуз СіІуУ Аго Аго Су Сіп Аго Спу Гуз 1 5 10 15 о
Азп Аго СІу (Се) 20 (се) (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:20: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 21 амінокислоту « (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна - с (ОБ) Топологія: лінійна а (ії) Тип молекули: пептид "» (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:20:
Аа Ага Азп Рго Сію Ап Зег Аг аїйу Гуз Сіу Агд Агд Сіу СіІп Аго СУ 1 5 10 15 іа Цув Авп Ага Су (о) 20 оо (2) Інформація щодо послідовності БЕО ІЮ МО:21: (Ї) Характеристики послідовності: о (А) Довжина: 22 амінокислоти
Ге) (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:21: (Ф) Аа Аа Аіа Ап Рего Оіш Авп бег Аго СІуУ Гуз Сіу Агу Аго ау сій Ага ко 1 5 10 15
СІМ Гуз Авп Ага Су 60 20 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:22: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 23 амінокислоти (В) Тип: амінокислотний бо (С) Кількість ниток: одна
(ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:22:
Аа Ага Аіа Аіа Азп Рго Сію Ап бег Аго Спу Гуз Су Аго Аго СУ біп 1 5 10 15.
Ага ВІу Гуз Азп Ага Су 20 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:23: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 24 амінокислоти (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:23:
Сіп Аа Аа Аа Аа Азп Рго Сім Азп бег Агу Сіу Гуз С1у Агу Агу Сіу 1 5 10 15
Зіп Аку СУ Гуз Азп Аго біу 20 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:24: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 25 амінокислот (В) Тип: амінокислотний сч 29 (С) Кількість ниток: одна Ге) (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:24:
Аг Сіп Аа Ага Аа Аа Азп Рго Сім Авп 5ег Ага Сіу Гуз Сіу Ага Аго б» 1 5 10 15 Гео)
Сіу біп Агу СіУ Туз Азп Аго Су С со 20 25 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:25: ї-о (Ї) Характеристики послідовності: (Се) (А) Довжина: 26 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна « (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид - с (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:25: ц Азп Агу Сп Аа Аа Ага Аа Авп Рго Січ Авп 5ег Аго Су Гуз Сіу Ага я 1 5 10 15
Ага Сіу Сіп Аго Су Гуз Азп Аго су
Ф 20 25 (2) Інформація щодо послідовності БЕО ІЮ МО:26:
Ме, (Ї) Характеристики послідовності: 2) (А) Довжина: 27 амінокислот (В) Тип: амінокислотний о «лькі . (С) Кількість ниток: одна
Ге (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:26:
Ага Авп Ага сіп Аа Ага Аа Аа Авп Рго Сіи Аєп баг Аго Су Гуз СІУ 1 5 10 15 о Ага Аго біу сій Аго Су Гуз Азп Ага ау іме) 20 25 (2) Інформація щодо послідовності БЕО ІЮ МО:27: 6о (ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 28 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна бо (ї) Тип молекули: пептид
(хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:27:
Сію Агу Азп Аго Сп Аа Аа Аа Аа Азп Рго сію Авп бег Агу Су Гув 1 5 10 15
Сіу Ага Аго Сіу Сіп Аго Сіу Гуз Ап Аго Сіу 20 25 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:28: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 29 амінокислот 70 (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:28:
Аго Сіш Ага Азп Аго сСіп Аїа Аа Аа Аа Авп Рго Січ Азп бег Аго Счу 1 5 10 15
Туз Сіу Аго Аго Су Сіп Аго СУ Гуз Азп Аго Су (2) інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:29; 20 (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 30 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна с 25 (ії) Тип молекули: пептид о (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:29:
Агу Аго сін Агу Авп Аго Сіп Ага Аа діа Аа Азп Рго Сі Авп бег Ага і 5 1 15
Су Гуз Спу Аго Аку СУ бій Аго Су Гуз Або Ага СУ (22) 20 25 зо со (2) Інформація щодо послідовності зБЕО ІЮ МО:З30: со (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 31 амінокислота ісе) (В) Тип: амінокислотний «о (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:30: «
Рго Аго Аго Сію Ага Авп Аго Сіп діа Аа Аа Аіа Авп Рго Си Авп Зег -о 0 5 10 15 с
Аго Сіу Гуз Сіу Аго Аго Сіу Сіп Аго Су Гуз Абп Ага Сіу :з» го 25 зо (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:31: (Ї) Характеристики послідовності:
Ге» (А) Довжина: 32 амінокислоти (В) Тип: амінокислотний
Ме, (С) Кількість ниток: одна оо (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид о (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:31:
Ге) ви Рго Ага Аго би Агу Ап Аго сСіп Аа Аза Аіа Аа Азп Рго Сію Аби і 5 10 15
Зег Агу Спу Гуз Сіу Аг Аго Сіу Сіп Аго Сіу Гуз Авп Аго Сіу 20 25 80 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:32: о (Ї) Характеристики послідовності: іме) (А) Довжина: 33 амінокислоти (В) Тип: амінокислотний 60 (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:32: б5
Ха! ви Рго Ас Аго Сі Аго Азп Аго Сп Аа Аа Аа Аа Азп Рго сій 1 5 10 15
Авп Зег Ага сіу Гуз Сіу Ага Аго Сіу Сіп Ага сіу Гуз Ап Аго Су 20 25 зо (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:33: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 34 амінокислоти (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:33:
Аа Ма! Геи Рго Аго Аго Сім Аку Авп Аго біп-Аїа Аа Аа Аа Азп Рго ті 5 1о 15
Сім Асп Бег Аго Сту Гуз Сіу Аго Агу Сіу Сіп Агу Сіу Гуз Азп Ако сіу зо (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:34: 20 (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 35 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна с 25 (ії) Тип молекули: пептид о (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:З4:
Меї Аа Ма! І еи Рго Агу Аго Сім Аго Азп Аго ап Аа Аа Аа Аіа Ап 1 5 10 15
Рео Сіш Азп бег Аго Су Гуз Сіу Аго Аго Сіу Сіп Аго ау Гуз Азп Ага Ме. 20 | 25 зо со су со
Ш те) (2) Інформація щодо послідовності зБЕО ІЮ МО:З35: (Ї) Характеристики послідовності: (Се) (А) Довжина: 36 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна « (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид - с (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:З5: и біп Меї Аа ма! ем Рго Агу Аго Си Аго Авп Ага Сіп Аа Аїа Аіа Аа «» 1 5 10 15
Авп Рго СіІц Авп Бег Ага Су Гуз Сіу Ага Аго Сіу Сіп Аго Сіу Гу Авп 20 25 зо
Ме. Ага сіу (22) 35 о (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:З36: (Ї) Характеристики послідовності: (95) (А) Довжина: 37 амінокислот с (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:36: (ФІ Гуз Сіп Меї Ага Ма! І ем Рго Аго Аго сім Аго Деп Аго біп Аа Аа Аа 1 Б 10 15 іме)
Аа Авп Рго Січ Авп Бег Аго Сіу Гув СУ Аго Ага Су сп Аго Су Гуз во 20 25 30
Авп Ага су 35 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:37: в (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 38 амінокислот
(В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:37:
Азр Гуз Сіп Меї Аїа Ма! І еу Рго Аго Агу сім Агу Авп Агу Сп Аа Аа 1 5 10 15
Аа Аіа Ап Рго Сію Азп Зег Аго су Гуз Сіу Аго Аг Сіу Сіп Ага су 70 20 25 о
Цув А5п Ага су 35 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО Ю МО:З8: (Ї) Характеристики послідовності: т (А) Довжина: 39 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ії) Тип молекули: пептид (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:З8:
Рго Ар Гуз Сіп Меї Аа Ма! І. еи Рго Аго Агу Сію Аго Авп Ага Сп Аа 1 5 10 15
Аа Аа Аіа Азп Рго Сі Авп Бег Аго Сіу Тув Сіу Аго Аго Сіу Сіп Аго Ге 20 25 зо су Гуз Азп Ага су о (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:39: (Ї) Характеристики послідовності: Ф 3о (А) Довжина: 417 основних пар со (В) Тип: нуклеїнокислотний (С) Кількість ниток: одна о (ОБ) Топологія: лінійна (се) (ії) Тип молекули: ДНК 35 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:39: ї-о
САТАТСТСТС СОСАТАЛАСА ААТОССТСТТ СТТОСАСОТО СТОААССТАА состсАсСсосо 60
ОСССОСТОСТА АСССССАСАА ТТССОСТОСТ АААСОТСЯтТо СТОСТоАСоС ТОСТАААААС 120
СбОССТТОСо ТТСТОАССОС ТАТОСАССТО ААССТТАССС АССТСОСТСТ СОСТТАССАА 180 «
ВАССАААСААС ВАТТААТСТІ СОСТТАСТОС ТОСОСТТОСТ СССАСОСТОС ТСАААССАСо 240
ТАССАСАААА ТОСТОАЛАЛА ССТСТОСОСТ ААСоСТоСТо ТОСТТТСССА САААСТТОСТ 300 - с СААССТТОСТ ССССТСССАТ СОСТТТССАС САССАССТОТ ССТТОСТОСА ССАСААССТо 360 . СТГТАССАСА ТОСТОСОТАА АСАСТССОСТ АЛОСОТТОСО СТТОСАТСТА АСОАТОС 491 "» (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:40: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 417 основних пар (о) (В) Тип: нуклеїнокислотний (С) Кількість ниток: одна (22) им (О) Топологія: лінійна (95) (ї) Тип молекули; ДНК о 50 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:40:
САТАТСАССС СОСАСАААСА САТОССАСТА СТТССАССТС СТОААССТАА ТСОССАСОСА 50 « о) ССАССТОСАА АСССОСАЛАА СТССССТОСТ АЛАСОТСОСС СТООССАССО СОССАААААС 120
СсТоСТІСТо ТТСТОАСТОС ААТОСАССТО ААССТТАСТО АССТООСТСТ ССОСТАССАА 180
ВССАААСААС ААСТСАТСТТ ССОСТАСТОС АССОССТСТТ СССАСОСАСС ТСАААССАСТ 240 5. 5 ТЬССАСАААА ТОСТОААААА ССТОТСССОТ ААССОССОТС ТООТАЛОССА САААСТАОСТ 300
САСССАТОСТ ССОСТОССАТ СОСАТТССАС САТСАССТОА ССТТОСТОСА ТСАСААССТо 360
ГФ) СТТТАССАСА ТОСТОССТАА АСАСТОСОСТ АААСОСТОСО СТТССАТСТА АОСАТСС 417 іме) (2) Інформація щодо послідовності БЕО ІЮ МО:41: (Ї) Характеристики послідовності: 60 (А) Довжина: 345 основних пар (В) Тип: нуклеїнокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок 65 (їх) Особливості: (А) Найменування/ключ: СО5
(В) Місцезнаходження: 1...342 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:41:
АТО ТСС ССА САА ААТ ТСТ ССТ ОСТ ААА ОСТ СстТ ост ссТ САС сот сстТ 48
Мес Бек Рго бі Ап Зек Агуд біу Гуз С1у Агд Агу біу біп Агуд сіу 135 140 145 150
АКТ ААС СОС ОСТ ТОоС сТТ СТО АСС ССТ АТС САС СТО ААСОСТТ АСС САС 96
Азп Авп о Аку біу Суз Маї рец Ту Аза І1їе Ніз цез Азп Маї Трг Азр 155 160 165
Сто ост Сто ССТ ТАС САА АСС ОААА САА САА ТТА АТС ОТТО сот ТАС тосСо 144
Бїеш біу пеш С1у Тук б1іш ТВг Пуз бі б1ч Беш І1е Рре Агу Тук Сув 170 115 180 Й тТСС ост ТоС ТОоС САС ОСТ ОСТ САА ДСС АСО ТАС САС ААА АТС СТО ААА 192
Бек Сіу бек Суз Авр А1а А1їа Січ Тпг Тпг Тук Авр цуз І11е Гей Гуз 185 190 195
ААС СТО ТоС СОТ ААС ССТ СОТ Сто СТІ ТОС САС ААА СТТ ОСТ САА ОСТ 240
АБп Пец бег Аку Азп Агу Аго Геш Маї Бек Авр цуз Маї с1у біп діа 200 7 205 210
ТОоС тТосС СстТ ССС АТС ОСТ ТТС САС САС САС сто ТОоС о ТТС СТО САС САС о 288
Суз Сує Аку Рго І1е Аїа Рце Азр Авр Азр Бей Бек Рпе Пцеч Азр Азр 215 220 225 230
ААС СТО СтТТ ТАС САС АТС СТО СОТ ААА САС ОТОС ОСТ ААС о сстТ ТосС ст 336
Авп печ Уаї Тук Нів І1е це Аго Цуз Нів бек Аза Цуз Ахоа Су5 Сіу 235 240 245
ТОС АТС ТАА 345
Суз І1е (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:42: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 114 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок с (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:42: о
Мес бек рРто Сіл Азпобет Аг Сіу Цуз біу Агу Аг б1у бій втя ч«1Іу ії З 10 «АБп Авп Агу біу Суз Ма1 цеш ТІ А1іа І1е Ніз їз АзпоУаї ТБг о Авр 29 25 . зо їеч б1у реч б1у Тух 01 ТІ цу Січ бій Пец 116 Рпе Аку Ту Суз Ге) 35 40 45
Бег б1іу Бех Суз Азр Аїа діа сій ТВх ТБх Тук Ар ув І1е йей Цув со 50 55 60 Й
Аєп пцец бек Аго Авп Аго Агу Печ Уаї бег Азр Гуз Хаї б1У біп А1а Гео) 55 70 75 80 . (Се)
Суз Суб Аку Рго І1е А1їа Рре Азр Авр Ар Гей 5ег Рпе ем Азр Ар 85 90 95 (Се)
Авпореч уаї Тук нів І1є Пец Агу ув Нів бек Аіа ПЦув Ак9 Суз сіу 100 105 110 сСуз ї1є (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:43: « (Ї) Характеристики послідовності: - (А) Довжина: 315 основних пар с (В) Тип: нуклеїнокислотний "» (С) Кількість ниток: одна п Н НК Я (О) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (і) Особливості:
Ме. (А) Найменування/ключ: СО5
Ге» (В) Місцезнаходження: 1 ...312 (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:43: (9) АТО СОТ ССТ САА сот ССТ ААА ААС ОСС о ссСТ ТоС СТІ СТО АСТ ОСА АТС 48
Меє Акд Сіу біп Акуд б)у Бцуз АБпоАго с1у Суз Ма1 Пец Тіг Аїа І1е 115 120 125 130 (95)
САС СТО ААС ОСТІ АСТ САС СТО обТ Сто ОС ТАС бАА АСС ААА САА САА 96
Нів це Авп Маї ТБг Азр Пец С1Уу Пец біу Туг біш ТБг уз біц б1ч (Че) 135 140 145
СТО АТО ТС СОС ТАС ТОС о АССО СОС ТСТ ТОС САС ОСА ОСТ САА АССОАСТ 144 їеч І1е Рпе Агу Тух Суз Бег біу Зег Сув Авр Аза Аза Січ Тих ТБх 150 155 160
ТАС САС ААА АТС СТО ААА ААС СТО ТОС СОТ ААС СОС сот СТО СТА АС О 192
Тух Авр Пув І1е цеп цув Азп рес бег Аг АБп АхЯ Агд реч Уаї бет .
Ге! 165 170 115.
САС ААА СТА СОТ САС ОСА ТОС ТОС ССТ ССО АТС ОСА ТТС САС САТ САС 240
Азр цуз Маї біу біп Аіїа Суз Суз Агуд Рто І1е Аїа Рпе Авр Авр Ар ко 180 185 190
СТО АС ТТ СТО САТ САС ААС о СТО СТІ ТАС САС АТС СТО СОТ ААА САС 288 цец бет Рбе цец Авр Азр Абп цем Уа! Тух Нів І1е Пец Акуд Цуз Нів во 195 200 205 210
ТСС ОСТ ААА СОС ТОС СОТ ТОоС АТС ТАХ 315
Бег Аїа цу Аху Суз С1у Суз Ії 215 (2) Інформація щодо послідовності БЕО ІЮ МО:44: (Ї) Характеристики послідовності: бо (А) Довжина: 104 амінокислоти
(В) Тип: амінокислотний (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:44:
Мес Аку біу Сіп Агу С1у Цуз Азп Аг Сіу Суз уаї Пцеп Тіт Аїа І1е 1 З 10 15
Нів цемш Азп Ма! ТІ Авзр Пец біу йеп біу Тук біч ТЬг цЦуз біз біз 20 25 30
Бец Іїе Рпе Агу Тут Суз бек біу Бек Сув Авр А1а Аза Сі Тіх ТК 35 40 45 70 Тут Авр Пуз Іїе Пец Пуз Авпоцец Бек Ах Ап Ах Агу цеч Уаї Бег 50 55 во
Ар цуз Маї сіу біп Аза Суз Суз Аг Ртго І1е А1ї1а Рпе Азр Азр Азр 65 70 75 8о
Пец Бех Рпе цей АБр Азр Азп о цец Маї Тук Ні І1е Пцеч Акгд цуз Нів 85 90 95
Бет Аїа цуз Ах Су сіу СуБ І1е 100 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:45: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 312 основних пар (В) Тип: нуклеїнокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (їх) Особливості: (А) Найменування/ключ: СО5 с (В) Місцезнаходження: 1...309 о (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:45:
АТС ССТ САА ССОТ ССТ ААА ААС ССТ ССТ ТСТ СсТтТ СТО АСТ ССА АТО САС 48
Мес сіу біп Акуд біу Цув Авп Аго Сіу Сує Уаї Цеч Тв Ліа І1е Ні 105 110 115 120
СТО ААСОСТТ АСТ САС СТО СбТ СТО СОС ТАС САА АСС ААА САА САА СТО 96
Пец Ап Уаї Так дер Печ С1у Гео С1у Тух С1а Твх Був біз бій Гем Ге) 125 130 135
АТС ТТС СОС ТАС ТОС АбС обоС ТСТ ТОС САС ОСА ОСТ САА АС АСТ ТАС 144 со
І1е Рре Аку Тук Суб Бех п1іу Зег Суз Абр Аїа А1їа бій Тк ТЕхг ТУуг 140 145 150
САС ААА АТС СТО ААА ААС СТО ТОС ССТ ААС СОС ССТ СТО СТА АбС САС 192 (зе)
Азр цЦуб І1е цей цу А5п Бе) бех Аку Аза Аг Ах це Маї бег Азр 155 160 165 (Те)
ААА СТА бсСТ САС ОСА ТоС ТоС сот ССо АТО ОСА ТТС САС САТ САС Сто 240
Туз Маї сіу біп А1а Суз Суз Агу Рко І1е А1а Рпе Азр Авр Ар Пец Ге) 170 1715 180
ВОС ТТ СТО САТ САС ААСОСТо ОТТО ТАС САС АТО Сто ССТ ААА САС ОТОС 288
Яек Ре Пец Ар Ар Азп Пей Уа! Туг Ніз І1е Пе АкЧ Пув Ні5 Бек 185 190 195 200
ОСТ ААА СОС ТоС ОСТ ТОС АТС ТА 312 «
Аїа уз Акуд Сув С1у Суз І1є 205 | | | - с (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:46: (Ї) Характеристики послідовності: ів . и?» (А) Довжина: 103 амінокислоти (В) Тип: амінокислотний (ОБ) Топологія: лінійна
Ге» (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:46: (о) Мес біу Сіп Аку Сім Губ Аєп Агу б1у Суб Уа1і Бе Тбг о Аїа І1е Ніє 1 5 10 15 (95) Беч Азп о Маї Тіт Ар оПбец біу Сеш біу Тут біз ТБі Гуз біз Сі Геч 20 25 30 о) 70
І1е Рпе Агу Тух Сувз Бех біу бег Суз Азр А1а Аза Сіц Тк ТЬх Тук 35 40 45 ще Аве цув Х1е Пеш Пув АБп ем бег Ага Азп Аго Агу Брец Маї Бек Авр 60
Туз Уаї біу б1іп А1а Сує Суз Аг Рго І12 А1їа Рре Авр Ар Ар Пец 65 70 75 80 55
Бек Рне Пец Авр Ар Азп Пцец Ма! Тук Ніз І16 Пец Аку Туз Ніз Бек
Ге) 85 90 95
А1їа цуз Аху Суз сіу Суз 11є ко 100 (2) Інформація щодо послідовності БЕО ІЮ МО:47: во (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 135 амінокислот (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна 65 (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:47:
Мес бек Рго Азр цЦуз біп Мес Аїа Уаї Ццец Рго Агу Аг9 Сі Агу Азп 1 5 10 15
Аха біп А1їа А1ї2а Аїа Аїа Ап Рго біц Азп бек Аку С1іу Гуз біу Агу 20 25 30
Акд с1у біп Аку біу Гуз Ап Агд бСіу Суз Маї цем Тпх Аїа ї1е Ні 35 40 45
Пе Азп о Маї Тпт Авроцей б1іу ей б1у Тук біз Тпг цуз бі б: пей 50 55 во
І1е РюБе Аку Тух Суз Бек біу Бег Суз Азр Аіа Аїа Са Тих ТБЕ Туг 65 70 75 80
Ар Цуз І1е цец ПЦуз Азп Пец Бех Ак Авзп Агу Ак Пе Ма1ї бек Азр 85 90 35 цувз Маї сбіу сіп А1а Су5 Суз Ак Рхто І1е А1а Рпе Ар Азр Азр Гей 100 105 - 110
Бек Ріре цец Авр Абр Агп йец УМа1ї Тук Нів І1е Пец Ако Пух Ні бек 115 120 125
Аіїа ув Агд Суз біу Сув І1е 130 135 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:48: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 104 амінокислоти (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна (ї) Тип молекули: білок (хі) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО:48:
Мес аку б1у біп Аку С1У Цув Авп Аг пу Суз Маї їеч ТЕ зв тіє 5 1 й і с
Ніз цем Авп Маї Твг Ар їем С1у ем С1у Тут Сі) Тпт Пув Січ 019 20 25 30 о
Без І1е Рве Агу Тутх Сує бех С1у Зек Су Ар Кіа Аза біз Ту ТБХ 35 40 45
Тух Авр цув Ії Пец Цуз Азп цеш бег Ак Авп Аг Аго рец Уаї бек 50 55 бо
Ар цуз Уа1ї біу біп Аза Суз Суз Агуд Рго І1е А1а Рпе Ар Азр Авр (о) 55 7о 75 80
Тец Бег Рне Пец Авр Дер Аєп Пец Уа! Тут Ніє Т1е Бе Агу Пцує Ніє со 85 90 95
Бех А1а Цуз Ага Суз Сіу Суз І1є со 160 (2) Інформація щодо послідовності ЗЕО ІЮ МО:49: ісе) (Ї) Характеристики послідовності: «о (А) Довжина: 103 амінокислоти (В) Тип: амінокислотний (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна « (ї) Тип молекули: білок з с (хї) Опис послідовності ЗЕО ІЮ МО :49:
Меє біу сіп Акд сіу Пув Авп Аку Сіу Суз Маі1ї цец Тік Аза Ії1є Нів 1 5 10 й 15 и ;» щі їем Азп Маї ТВк Авр це біу йецш Сіу Тут біц ТБг Гуз Січ біч Бей 20 25 30
І1е Рпе Аку Тук Суз Бек Сіу Бек Суз Азр Аіа Аїа сіц Тах Тпх Тук 35 40 45.
Ге) А5р пуз І1е цеч Пцув Азп Ге Бех Акд Азп Аку Аг Пец УМаї Бех Азр 60 (е)) йуз Маї сіу Сіп А1а Суз Сув Агу Рго І1е Аїа Рре Азр Ар Ар Цей 55 7о 15 80 і95) бек Рпе йец Азр Азр Азп Бен Уа1ї Тук Нів І1е цеп Аку Буз Ні Бех 85 90 95 о) 70
А1а Буз Ах Су5 СІіУу Сув5 І1е 100 ср (2) Інформація щодо послідовності зБЕО ІЮ МО:50: (Ї) Характеристики послідовності: (А) Довжина: 114 амінокислот 59 (В) Тип: амінокислотний
ГФ) (С) Кількість ниток: одна (ОБ) Топологія: лінійна де (ї) Тип молекули: білок
Claims (38)
1. Зрізаний нейротрофічний фактор, що походить з лінії гліальних клітин (ЗОМЕ), який являє собою поліпептид, що відповідає амінокислотній послідовності бо Х-ІСув"!-Сув!391 у, -До-
ІСув-Сув'ЗІ - амінокислотна послідовність від Сув"! до Сув!З3, показана на фіг. 1 (ЗЕО ІЮ МО:2); У - карбоксикінцева група Сув З або карбоксикінцевий амінокислотний залишок МПе!ч4; і Х - метіонільована або неметіонільована аміногрупа Суз"! або амінокінцевий амінокислотний залишок (чи залишки), вибраний (вибрані) із групи с ко Мко кмвс (ЗЕО ОО МО:3) скмво (5ЕО ІО МО:4) то вокмвс (5ЕО Ю МО:5) овскМмво (5БО ІЮ МО:6) сокскМмво (ЗЕО О МО:7) всовскМмВо (ЗЕ ОО МО:8) ввсОовскМАС (ЗЕ 0 МО:9) с ВЕСсОоВсКкМво (ЗБОЮ МО:10) сч кб ввсОовоКкМмно (5ЕО ІЮ МО:11) о ско ввсОвоКМВо (5Е2О Ю МО:12) воКкс ввсовВскМво (5ЕО ІЮ МО:13) Ф зо звоКкс весОоВскМес (5ЕО Ю МО:14) со М5ВсКкс ВвВвсОоВскМВо (560 Ю МО:15) с ЕМ5ВСКсС ВЕСсОВвсКМВо (ЗБОЮ МО:16) со зв РЕМ5НСКСсС ВВСОВСсКМо (5ЕО ІЮ МО:17) со МРЕМ5ВСКОо вВСсОоВоКкМВо (5ЕО ІО МО:18) АМРЕМ5НСКсС ВВСсОоВсКкМВо (ЕС ІО МО:19) А АМРЕМ5ВОКс ВВСсОВсКМВс (5Б6О 10 МО:20) ч в с ;»
(о) (о) і95) о 20 і3е) 25 Ф) іме) 60 бо -А1-
. АА АМРЕМ5ВСКо ВЕСсОВсКМВо (ЗБОЮ МО:21) АВАА АМРЕМ5ВСКо ВВСсОоВСсКкМАС (ЗЕО 1Ю МО:22) ОААА АМРЕМ5ВСКс ВВСсОоВсКкМмАС (5ЕСИІЮ МО:23) ВОААА АМРЕМОВСКс ВАСОВСсКМНс (БЕ ИО МО:24) МВОААА АМРЕМОВОКсо ВЕСсОВСсКкМАС (5ЕОЛО МО:25) 70 | ВМВОААА АМРЕМЗВСКС ВВСсОКСсКМВо (5ЕО ІО МО:26) ЕВМБОААА АМРЕМОВСКС ВВСсОВоКМВо (5ЕО ІЮО МО:27) ВЕВМВОААА АМРЕМОВСКоО ВВСсОВсКкМВо (5ЕО О МО:28) КВЕВМВОААА АМРЕМЗВОКсС ВеСсОВсКМНо (5ЕО Ю МО:29) Р ВАЕВМВОААА АМРЕМОВСКС ВВСОВскМАс (ЗЕО 1О МО:30) їв ВВЕВМВОАЛА. АМРЕМОВОКОо ВВсОоВсКкМАс (5ЕО ОО МО:31) 2 ЩІЬР ВВЕВМВОААА АМРЕМОВОКО ВВСсОВоКМВо (5ЕО Ю МО:32) АМУР ВВЕВМВОААА АМРЕМОВСКС КВСОВСсКМВо (ЗЕО ІЮ МО:33) - МАШМОР ВКЕВМКОААА АМРЕМОВСКСсС ВВСОВСсКМВС (5ЕО 1Ю МО:34) ОМАУТР ВЕЕВКМВОААА АМРЕМ5ВОКОо КВСсОоВсКМАО (ЗБОЮ МО:35) се КОМАУТР ВКЕВМВОААА АМРЕМОКСКо ВЕСсОВСсКМВС (560 ОО МО:36) і) ІКОМАУТБР ВВЕВМВОААА АМРЕМОВСКС ВВСсОоКоКМАС (ЕС О МО:37) РОКОМАУТР ВЕЕВМВОААА АМРЕМЗВСоКо ВяСсОоВоКкМАС (ЗЕБО 1О МО:38) б та консервативно заміщений варіант Х, більш ніж на 8095 гомологічний амінокислотній послідовності Х, ме) причому СОМЕ поліпептид здатен викликати нейротрофічний ефект в дофамінергічних нейронах. с
2. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що Х-КОААААМРЕМЗНОКО (5ЕО ІЮО МО:24) або його варіант. ісе)
З. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що Х-МРЕМЗКОКОККОСОКОКМКО (ЗЕО ІЮ со МО:18) або його варіант.
4. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що Х-РЕМНЗКОКОККСОКОКМКО (5ЕО ІЮ МО:17) або його варіант.
5. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що Х-ЗКОКОККОСОКОкКМКО (ЗЕО ІО МО:14) « або його варіант. в с
6. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що Х-КСОКОКМКО(ЗЕО ІЮО МО:8) або його . варіант. и?»
7. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що Х-ЗОКОКМКО(ЗЕО ІЮ МО:7) або його варіант.
8. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що Х-КМКО (ЗЕО ІЮО МО:3) або його варіант.
б 9. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що Х-МКО або його варіант.
10. Зрізаний СОМЕ поліпептид за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що є глікозильованим. ме)
11. Зрізаний СОМЕ поліпептид за будь-яким з пп. 1-9, який відрізняється тим, що є неглікозильованим. 2)
12. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що похідна представлена амінокислотною послідовністю Х-ІСув"!-Суз139|-Ж, кон'югованою з водорозчинним полімером. о
13. Молекула ДНК, яка кодує зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1. (Че)
14. Молекула ДНК за п. 13, яка відрізняється тим, що відповідає послідовності, показаній на фіг. 1.
15. Молекула ДНК за п. 13, яка відрізняється тим, що відповідає послідовності, показаній на фіг. 3.
16. Молекула ДНК за п. 13, яка відрізняється тим, що відповідає послідовності, показаній на фіг. 4.
17. Молекула ДНК за п. 13, яка відрізняється тим, що відповідає послідовності, показаній на фіг. 5.
18. Молекула ДНК за п. 13, яка відрізняється тим, що відповідає послідовності, показаній на фіг. 6. іФ)
19. Молекула ДНК за п. 13, яка відрізняється тим, що відповідає послідовності, показаній на фіг. 7. ко
20. Вектор, який містить молекулу ДНК за п. 13, функціонально зв'язану з послідовністю контролю експресії.
21. Прокаріотична або еукаріотична клітина-хазяїн, трансформована або трансфектована молекулою ДНК за бо п. 13.
22. Спосіб виготовлення зрізаного ЗОМЕ поліпептиду, який включає культивування клітин-хазяїв за п. 21 у відповідному поживному середовищі і виділення зрізаного СОМЕ із згаданих клітин або згаданого поживного середовища.
23. Спосіб виготовлення зрізаного ЗОМЕ поліпептиду за п. 22, який відрізняється тим, що клітинами-хазяями 6БЕ є Е. сої.
24. Спосіб виготовлення зрізаного ЗОМЕ поліпептиду за п. 22, який відрізняється тим, що клітинами-хазяями є клітини яєчника китайського хом'ячка.
25. Спосіб виготовлення зрізаного ЗОМЕ поліпептиду, який передбачає етапи: (а) культивування прокаріотичної або еукаріотичної клітини-хазяїна, трансформованої або трансфектованої вектором за п. 20; (б) витримування згаданої клітини-хазяїна в умовах, що дозволяють експресію зрізаного ЗОМЕ поліпептиду згаданою клітиною-хазяїном; (в) виділення зрізаного ООМЕ поліпептиду, експресованого згаданою клітиною-хазяїном.
26. Зрізаний СОМЕ поліпептид, який є продуктом рекомбінантної експресії в прокаріотичній або 70 еукаріотичній клітині-хазяїні, яка містить екзогенну молекулу ДНК за п. 13.
27. Фармацевтична композиція, яка містить зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1 разом з фармацевтично прийнятним носієм.
28. Спосіб лікування хвороби Паркінсона, який передбачає введення пацієнту фармацевтичної композиції за п. 27.
29. Спосіб лікування хвороби Паркінсона, який передбачає введення пацієнту молекули ДНК за п. 13 для продукування іп мімо згаданого зрізаного ОЮОМЕ поліпептиду.
30. Спосіб лікування хвороби Паркінсона, який передбачає імплантацію пацієнту клітини, трансформованої молекулою ДНК за п. 13, для продукування іп мімо згаданого зрізаного ЗОМЕ поліпептиду.
31. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що він є похідним від зрілого СОМЕ поліпептиду, експресованого рекомбінантно модифікованою клітиною бактерії або ссавця.
32. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 31, який відрізняється тим, що Х вибирають з групи, яка складається з (г;
хе . с Мо (8) кис (5ЕО О МО:3) скмво (5ЕО 0 МО:4) зо вокмво (5ЕО Ю МО:5) (2) овскмно (5ЕО ІО МО:6) Га) со совокМмаис (ЗБОЮ МО:7) с всодскмно (5ЕО О МО:8) , (Се) ввсОовокМно (5ЕБО ОО МО:9) та їх варіантів.
33. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 31, який відрізняється тим, що є продуктом розщеплення /7 м/с або /7 « Мо зрілого ФЗОМЕ поліпептиду, експресованого рекомбінантно модифікованою бактеріальною клітиною. з с
34. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що використовується для лікування розладів нервової системи, викликаних захворюванням або травмуванням. . и?»
35. Зрізаний ЗОМЕ поліпептид за п. 34, який відрізняється тим, що використовується для лікування хвороби Паркінсона.
36. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що використовується для виготовлення Ге» фармацевтичної композиції для лікування розладів нервової системи, викликаних захворюванням або травмуванням. ме)
37. Зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1, який відрізняється тим, що Х-ЧМРЕМЗКОКОККОСОКОКМКО або його 2) варіант.
38. Молекула ДНК, що кодує зрізаний СОМЕ поліпептид за п. 1. (95) іЧе) Ф) іме) 60 б5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/535,681 US6184200B1 (en) | 1995-09-28 | 1995-09-28 | Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor |
| PCT/US1996/014915 WO1997011964A1 (en) | 1995-09-28 | 1996-09-16 | Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| UA66339C2 true UA66339C2 (uk) | 2004-05-17 |
Family
ID=24135310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| UA98031545A UA66339C2 (uk) | 1995-09-28 | 1996-09-16 | Зрізаний нейротрофічний фактор, що походить з лінії гліальних клітин (gdnf), молекула днк, яка кодує gdnf, вектор, що містить зазначену молекулу днк, клітина-хазяїн, спосіб виготовлення зрізаного gdnf, фармацевтична композиція та спосіб лікування |
Country Status (25)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6184200B1 (uk) |
| EP (1) | EP0920448B1 (uk) |
| JP (3) | JP4153036B2 (uk) |
| KR (1) | KR100334739B1 (uk) |
| CN (1) | CN1283659C (uk) |
| AT (1) | ATE314389T1 (uk) |
| AU (1) | AU707528B2 (uk) |
| CA (1) | CA2232749C (uk) |
| CZ (1) | CZ297326B6 (uk) |
| DE (1) | DE69635675T2 (uk) |
| DK (1) | DK0920448T3 (uk) |
| EA (1) | EA001204B1 (uk) |
| ES (1) | ES2255713T3 (uk) |
| HK (1) | HK1021823A1 (uk) |
| HU (1) | HU226220B1 (uk) |
| IL (6) | IL144018A0 (uk) |
| MX (1) | MX9802278A (uk) |
| NO (1) | NO322521B1 (uk) |
| NZ (1) | NZ318697A (uk) |
| SI (1) | SI0920448T1 (uk) |
| SK (1) | SK288094B6 (uk) |
| TW (1) | TW570926B (uk) |
| UA (1) | UA66339C2 (uk) |
| WO (1) | WO1997011964A1 (uk) |
| ZA (1) | ZA968087B (uk) |
Families Citing this family (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6184200B1 (en) * | 1995-09-28 | 2001-02-06 | Amgen Inc. | Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor |
| US6677135B1 (en) | 1996-05-08 | 2004-01-13 | Biogen, Inc. | Ret ligand (RetL) for stimulating neutral and renal growth |
| DE19816186A1 (de) * | 1998-04-14 | 1999-10-21 | Univ Muenchen L Maximilians | GDNF-kodierende DNA, Teile davon und GDNF-Varianten |
| US20020055467A1 (en) * | 1998-07-06 | 2002-05-09 | Johansen Teit E. | Novel neurotrophic factors |
| US6507788B1 (en) * | 1999-02-25 | 2003-01-14 | Société de Conseils de Recherches et D'Applications Scientifiques (S.C.R.A.S.) | Rational selection of putative peptides from identified nucleotide, or peptide sequences, of unknown function |
| US6897061B1 (en) | 2000-06-16 | 2005-05-24 | Spinal Cord Society | Transdifferentiation of glial cells |
| US7442370B2 (en) | 2001-02-01 | 2008-10-28 | Biogen Idec Ma Inc. | Polymer conjugates of mutated neublastin |
| US7276580B2 (en) | 2001-03-12 | 2007-10-02 | Biogen Idec Ma Inc. | Neurotrophic factors |
| US8946151B2 (en) | 2003-02-24 | 2015-02-03 | Northern Bristol N.H.S. Trust Frenchay Hospital | Method of treating Parkinson's disease in humans by convection-enhanced infusion of glial cell-line derived neurotrophic factor to the putamen |
| US7245117B1 (en) | 2004-11-01 | 2007-07-17 | Cardiomems, Inc. | Communicating with implanted wireless sensor |
| US20060239966A1 (en) * | 2003-10-20 | 2006-10-26 | Tornoee Jens | In vivo gene therapy of parkinson's disease |
| RU2006117304A (ru) | 2003-10-20 | 2007-12-10 | Нсджин А/С (Dk) | Генная терапия болезни паркинсона iv vivo |
| AU2005277227B2 (en) | 2004-08-19 | 2011-10-06 | Biogen Ma Inc. | Refolding transforming growth factor beta family proteins |
| TWI501774B (zh) | 2006-02-27 | 2015-10-01 | Biogen Idec Inc | 神經性病症之治療 |
| EP2054074B8 (en) * | 2006-08-04 | 2014-11-12 | Prolong Pharmaceuticals, LLC | Modified erythropoietin |
| WO2008100966A1 (en) * | 2007-02-12 | 2008-08-21 | The Research Foundation Of State University Of New York | Gdnf-derived peptides |
| CA2685686A1 (en) | 2007-05-01 | 2008-11-13 | Biogen Idec Ma Inc. | Neublastin polypeptides for use increasing vascularization in a tissue |
| US8446454B2 (en) | 2007-05-21 | 2013-05-21 | Polycom, Inc. | Dynamic adaption of a continuous presence videoconferencing layout based on video content |
| FI20070808A0 (fi) | 2007-10-25 | 2007-10-25 | Mart Saarma | GDNF:n silmukointivariantit ja niiden käytöt |
| UA112981C2 (uk) | 2011-04-11 | 2016-11-25 | Елі Ліллі Енд Компані | Варіант людського gdnf |
| WO2014152511A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | The Jackson Laboratory | Methods for promoting wound healing and hair growth |
| RU2561050C2 (ru) * | 2013-08-28 | 2015-08-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики клетки Российской академии наук (ИБК РАН) | Применение белка yb-1 и его фрагментов для изготовления лекарственных средств при лечении болезни альцгеймера |
| AU2017357931A1 (en) | 2016-11-10 | 2019-06-20 | Keros Therapeutics, Inc. | GDNF fusion polypeptides and methods of use thereof |
| WO2021119827A1 (en) * | 2019-12-19 | 2021-06-24 | Transfert Plus, Société En Commandite | Use of glial cell line-derived neurotrophic factor (gdnf) for the treatment of enteric neuropathies |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4419446A (en) | 1980-12-31 | 1983-12-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector |
| US4518584A (en) | 1983-04-15 | 1985-05-21 | Cetus Corporation | Human recombinant interleukin-2 muteins |
| EP0154316B1 (en) | 1984-03-06 | 1989-09-13 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Chemically modified lymphokine and production thereof |
| US5158881A (en) | 1987-11-17 | 1992-10-27 | Brown University Research Foundation | Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments |
| US4892538A (en) | 1987-11-17 | 1990-01-09 | Brown University Research Foundation | In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells |
| US5106627A (en) | 1987-11-17 | 1992-04-21 | Brown University Research Foundation | Neurological therapy devices |
| US5011472A (en) | 1988-09-06 | 1991-04-30 | Brown University Research Foundation | Implantable delivery system for biological factors |
| ATE135370T1 (de) | 1988-12-22 | 1996-03-15 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
| WO1990014363A1 (en) | 1989-05-19 | 1990-11-29 | Amgen Inc. | Metalloproteinase inhibitor |
| US5229500A (en) | 1989-08-30 | 1993-07-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Brain derived neurotrophic factor |
| CA1332433C (en) | 1989-09-29 | 1994-10-11 | Robert L. Sutherland | Ski structure and binding therefor |
| EP1241258A3 (en) | 1989-10-16 | 2003-12-10 | Amgen Inc. | Stem cell factor |
| US5272071A (en) | 1989-12-22 | 1993-12-21 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line |
| WO1991010470A1 (en) | 1990-01-08 | 1991-07-25 | Brown University Research Foundation | Devices and methods for enhanced delivery of active factors |
| US5202428A (en) | 1990-06-20 | 1993-04-13 | The Salk Institute For Biological Studies | DNA encoding neurotropic growth factor |
| US5252714A (en) | 1990-11-28 | 1993-10-12 | The University Of Alabama In Huntsville | Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde |
| HU220795B1 (hu) | 1991-09-20 | 2002-05-28 | Amgen Inc. | Gliasejtvonal-eredetű neurotróf faktorfehérjék, továbbá berendezések és gyógyászati készítmények idegsejtkárosodás megelőzésére és kezelésére |
| AU1443095A (en) | 1993-12-22 | 1995-07-10 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Novel nucleic acid sequences isolated from glial cells |
| FR2717824B1 (fr) * | 1994-03-25 | 1996-04-26 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Virus recombinants, préparation et utilisation en thérapie génique. |
| US5733875A (en) * | 1994-11-15 | 1998-03-31 | Amgen Inc. | Methods of using GDNF as a neuroprotective agent |
| US5739307A (en) * | 1995-08-28 | 1998-04-14 | Washington University | Polynucleotide encoding neurturin neurotrophic factor |
| US6184200B1 (en) * | 1995-09-28 | 2001-02-06 | Amgen Inc. | Truncated glial cell line-derived neurotrophic factor |
| US5731284A (en) * | 1995-09-28 | 1998-03-24 | Amgen Inc. | Method for treating Alzheimer's disease using glial line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product |
| US5641750A (en) * | 1995-11-29 | 1997-06-24 | Amgen Inc. | Methods for treating photoreceptors using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product |
| US5641749A (en) * | 1995-11-29 | 1997-06-24 | Amgen Inc. | Method for treating retinal ganglion cell injury using glial cell line-derived neurothrophic factor (GDNF) protein product |
| US5837681A (en) * | 1996-02-23 | 1998-11-17 | Amgen Inc. | Method for treating sensorineural hearing loss using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product |
| US5929041A (en) * | 1996-02-23 | 1999-07-27 | Amgen Inc. | Method for preventing and treating sensorineural hearing loss and vestibular disorders using glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF) protein product |
| US5741778A (en) * | 1996-03-19 | 1998-04-21 | Amgen Inc. | Method for treating Huntington's disease using glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) protein product |
-
1995
- 1995-09-28 US US08/535,681 patent/US6184200B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-09-16 SI SI9630726T patent/SI0920448T1/sl unknown
- 1996-09-16 UA UA98031545A patent/UA66339C2/uk unknown
- 1996-09-16 EP EP96931618A patent/EP0920448B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-16 IL IL14401896A patent/IL144018A0/xx unknown
- 1996-09-16 AT AT96931618T patent/ATE314389T1/de active
- 1996-09-16 AU AU70746/96A patent/AU707528B2/en not_active Ceased
- 1996-09-16 IL IL14448896A patent/IL144488A0/xx active IP Right Grant
- 1996-09-16 NZ NZ318697A patent/NZ318697A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-09-16 DK DK96931618T patent/DK0920448T3/da active
- 1996-09-16 CN CNB961972335A patent/CN1283659C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-16 IL IL12376196A patent/IL123761A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-09-16 ES ES96931618T patent/ES2255713T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-16 CZ CZ0088298A patent/CZ297326B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-09-16 CA CA002232749A patent/CA2232749C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-16 EA EA199800301A patent/EA001204B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-09-16 KR KR1019980702293A patent/KR100334739B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-09-16 SK SK389-98A patent/SK288094B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1996-09-16 HU HU9802262A patent/HU226220B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-09-16 DE DE69635675T patent/DE69635675T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-09-16 WO PCT/US1996/014915 patent/WO1997011964A1/en active Application Filing
- 1996-09-16 JP JP51349497A patent/JP4153036B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-09-26 ZA ZA968087A patent/ZA968087B/xx unknown
- 1996-09-26 TW TW085111819A patent/TW570926B/zh not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-03-23 MX MX9802278A patent/MX9802278A/es active IP Right Grant
- 1998-03-30 NO NO19981430A patent/NO322521B1/no not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-12-09 HK HK99105788A patent/HK1021823A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-06-26 IL IL144018A patent/IL144018A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-07-23 IL IL144488A patent/IL144488A/en not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-01-07 US US10/753,592 patent/US7390781B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-05-25 US US10/853,930 patent/US20040214776A1/en not_active Abandoned
- 2004-05-26 US US10/855,820 patent/US7611865B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-09-05 JP JP2007229870A patent/JP4909843B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-06-21 JP JP2010140665A patent/JP5241037B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2011
- 2011-06-23 US US13/167,419 patent/US20110251267A1/en not_active Abandoned
-
2012
- 2012-02-27 IL IL218336A patent/IL218336A0/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| UA66339C2 (uk) | Зрізаний нейротрофічний фактор, що походить з лінії гліальних клітин (gdnf), молекула днк, яка кодує gdnf, вектор, що містить зазначену молекулу днк, клітина-хазяїн, спосіб виготовлення зрізаного gdnf, фармацевтична композиція та спосіб лікування | |
| UA73719C2 (en) | Human interleukin-2 mutant which activates preferably t-cells as compared with natural killer cells, pharmaceutical composition, polynucleotide, vector, procariotic cell, a method for the stimulation of immune system | |
| CZ288890B6 (cs) | MGDF polypeptid pro stimulaci růstu a diferenciaci megakaryocytů | |
| EP0909316B1 (en) | Glial cell line-derived neurotrophic factor receptor | |
| KR20050021502A (ko) | 인터페론-β를 이용한 신부전증의 치료법 | |
| JP2002536018A (ja) | グリコシル化レプチン組成物および関連する方法 | |
| KR20180042432A (ko) | 신규 인간 혈청 알부민 변이체 | |
| CA2291608C (en) | Neurotrophic factor receptors | |
| JP2001527402A (ja) | Ｎｇｆ変異体 | |
| KR20050059195A (ko) | 인터페론-β를 이용한 만성 염증성 탈수초성다발성신경병증의 치료 | |
| US7138251B1 (en) | Polynucleotides encoding a neurotrophic factor receptor | |
| WO2005058951A1 (ja) | 糖鎖欠損型肝細胞増殖因子 | |
| WO1999003999A1 (en) | Methods and compositions for inhibiting the proinflammatory response | |
| KR100409099B1 (ko) | 신경 손상 치료 기구 |