EA001204B1

EA001204B1 - Усеченный нейротрофический фактор глиальной клеточной линии, днк, кодирующая указанный фактор, вектор, содержащий указанную днк, способ получения фактора, фармацевтическая композиция и способ лечения

Info

Publication number: EA001204B1
Application number: EA199800301A
Authority: EA
Inventors: Шоу-Фен Сильвия Ху
Original assignee: Амген Инк.
Priority date: 1995-09-28
Filing date: 1996-09-16
Publication date: 2000-12-25
Also published as: DK0920448T3; IL123761A; KR19990063825A; CN1197461A; CZ297326B6; EA199800301A1; AU7074696A; NO981430L; IL218336A0; WO1997011964A1; US6184200B1; CN1283659C; CA2232749A1; ZA968087B; JP4909843B2; HUP9802262A2; MX9802278A; CA2232749C; NZ318697A; KR100334739B1

Abstract

Заявляются новые белки, названные усечёнными белками нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (GDNF), которые стимулируют поглощение дофамина дофаминэргическими нейронами и выживаемость нервных клеток. Также заявляются способы получения усечённых GDNF-белков методом рекомбинантных ДНК и способы лечения заболеваний нервной системы, в частности, болезни Паркинсона.

Description

Область, к которой относится изобретение

В целом настоящее изобретение относится к белкам, называемым ниже нейротрофическими факторами глиальной клеточной линии (также называемыми глиальным нейротрофическим фактором или ΟΌΝΕ), которые характеризуются способностью стимулировать поглощение дофамина дофаминэргическими нейронами и поддерживать жизнеспособность нейронов, которые отмирают при болезни Паркинсона.

Предпосылки создания изобретения

Нейротрофические факторы представляют собой белки, находящиеся в нервной системе и не нервных тканях, иннервированных нервной системой, функцией которых является стимулирование выживания и поддержание фенотипической дифференцировки нервных и/или глиальных клеток (Уагоп е! а1., Апп. Реу. Νοιποδοίепсе 1:327, 1979; Тйоепеп е! а1., 8с1епсе 229:238, 1985). Вследствие этой физиологической роли нейротрофические факторы полезны при лечении дегенерации нервных клеток и утраты функции дифференцировки, которая наблюдается при ряде нейротрофических заболеваний.

Чтобы конкретный нейротрофический фактор являлся потенциально пригодным для лечения нервных заболеваний, класс или классы поражённых нервных клеток должны быть чувствительны к этому фактору. Обычно различные нейротрофические факторы действуют на заметно отличающиеся классы нервных клеток. Следовательно, полезно иметь ряд различных нейротрофических факторов для лечения каждого класса поражённых нейронов, которые могут встречаться при различных формах заболевания или поражения.

Нейротрофические факторы могут защищать чувствительные нейроны от ряда нежелательных поражений (травм). Например, фактор роста нервной ткани (ΝΟΕ) может спасти значительную часть сенсорных нейронов от отмирания, вызванного прекращением процессов в их аксонах (Ктсй е! а1., 1. №итосу!о1 16:261, 1987; О!!о е! а1., 1. №иго8ск 83:156, 1987), от онтогенетической смерти во время развития эмбриона (НатЬитдет е! а1., 1. №иго8с1. 4:767, 1984), и от поражения, вызванного введением таксола или цисплатина (АрГе1 е! а1., Апп. №ито1. 29:87, 1991). Эта наблюдаемая общность защиты привела к теории, что, если нейротрофический фактор защищает чувствительные нейроны от экспериментального поражения, то он может быть применим при лечении заболеваний, при которых поражаются эти нейроны у больных, даже если этиология может быть неизвестна.

Данный нейротрофический фактор, кроме того, что он обладает корректной нейронной специфичностью, может в достаточном количестве применяться в качестве фармацевтического препарата. Так как нейротрофические факторы обычно находятся в тканях в малых количествах (например, НоГег апб Ватбе Ыа!иге 331:261, 1988:

Ьт е! а1., 8с1епсе 246:1023, 1989), неудобно получать фармацевтические количества нейротрофических факторов непосредственно из тканей животных. В качестве альтернативы для продуцирования заданного белка желательно использовать систему рекомбинантной экспрессии.

Ьт е! а1. ранее описали способ скрининга биологических образцов на нейротрофическую активность на примере эмбриональных предшественников дофаминэргических нейронов черного вещества (см. патентную заявку США № 08/182,183, поданную 23 мая 1994 г. и заявку РСТ/ϋδ 92/07888, поданную 17 сентября 1992 г. (АО 93/06116); и Европейскую заявку № 92921022.7 (публикация № ЕР 610254), которые приведены здесь в качестве ссылок). Эта биопроба применима для идентификации нейротрофических факторов, которые могут быть использованы для лечения болезни Паркинсона (Епебтап е! а1., №ито. 8ск Бей. 79:65-72, 1987), так как заболевание характеризуется дегенерацией дофаминэргических нейронов среднего мозга, которые иннервируют полосатое тело.

Ьт е! а1. далее дали характеристику нового нейротрофического фактора, который был выделен чистым из одного такого источника, кондиционированной культуральной среды из клеточной линии глиобластомы. В49 (8с1шЬег1 е! а1., №1Шге 249:224-27, 1974). Кондиционированная среда из этой клеточной линии, как ранее сообщалось, обладает дофаминэргической нейротрофической активностью (Войп е! а1., 8ос. №иго8с1, АЬ§. 15:277, 1989). До открытия Ьш е! а1., нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (ΟΌΝΕ) не идентифицировался в виде отдельного биологически активного вещества или в виде практически чистого белка. Кроме того, Ып е! а1. описали процессы клонирования генов человека, кодирующих ΟΌΝΕ последовательность генов человека, которые кодируют ΟΌΝΕ, и аминокислотные последовательности белка ΟΌΝΡ. ΟΌΝΕ-ген был субклонирован в экспрессирующий вектор, и вектор применяли для экспрессии биологически активного ΟΌΝΕ. Белок ΟΌΝΕ представлял собой гомодимер, состоящий из 134 аминокислот, 22 кПа, субъединицы были соединены дисульфидными связями. Описание далее содержало применение ΟΌΝΕ для профилактики и лечения нервного поражения и нервных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона.

ΟΌΝΡ-терапия полезна при лечении нервного поражения, вызванного условиями, которые ставят под угрозу выживание и/или функционирование одного или более типов нервных клеток. Такое нервное поражение может происходить вследствие большого ряда различных причин. Нервное поражение может вызываться в одном или более типах нервных клеток: (1) физическим повреждением, которое вызывает дегенерацию аксонных процессов и/или телец нервных клеток рядом с местом (сайтом) по вреждения; (2) временным или полным прекращением кровотока к отделам нервной системы, как при ударе; (3) намеренной или случайной экспозицией нейротоксинов, таких как химиотерапевтические агенты (такие как цисплатин) для лечения рака или дидезоксицитидин (ббС) для лечения СПИД'а; (4) хроническими метаболическими заболеваниями, такими как диабет или почечная дисфункция; или (5) нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера и боковой амиотрофический склероз (АЬ8), возникающий вследствие дегенерации специфических популяций нейронов.

ΟΌΝΤ-терапия может быть особенно полезна при лечении нейродегенеративных состояний, включающих дегенерацию дофаминэргических нейронов черного вещества, например, болезнь Паркинсона. Единственные на сегодня способы лечения паркинсонизма являются паллиативными, имеющими цель увеличить уровень дофамина в полосатом теле. Ожидаемый эффект ΟΌΝΤ-терапии представляет собой не просто увеличение дофаминэргической нейротрансмиссии на концах дофаминэргических нервов в полосатом теле (что приводит к ослаблению симптомов), но также ослабление или даже прекращение развития дегенеративных процессов и восстановление пораженного (нигростратиального) пути через черное вещество полосатого тела и его функции. ΟΌΝΤ также может применяться для лечения других форм поражения или несоответствующей функции дофаминэргических нервных клеток у больных людей. Такое поражение или неадекватная функция могут возникать при шизофрении и других формах психоза. Единственные на сегодня способы лечения таких состояний являются симптоматическими и требуют лекарств, которые действуют на рецепторы дофамина или места поглощения дофамина, из-за того, что неадекватное функционирование дофаминэргических нейронов, которые иннервируют эти несущие рецепторы популяции нейронов, присуще заболеванию.

Сущность изобретения

В одном аспекте данное изобретение представляет усеченные белки нейротрофического фактора глиальной клеточной линии (ΟΌΝΤ). В одном варианте воплощения изобретения усеченные ΟΌΝΤ-белки получают техникой рекомбинантной ДНК. В альтернативном варианте воплощения изобретения усеченные ΟΌΝΤбелки синтезируют химическими способами или сочетанием методов рекомбинантной ДНК и химических способов.

Усеченные ΟΌΝΡ-белки по данному изобретению представляют собой белки, представляемые аминокислотной последовательностью Х-[Суз⁴¹-Суз¹³³]А. Для того чтобы облегчить сравнение со зрелым ΟΌΝΤ-белком, используют аминокислотную схему нумерации фиг. 1 (8ЕС

ΙΌ N0:2). [Суз⁴¹-Суз¹³³] представляет собой аминокислотную последовательность от Суз до Суз¹³³, как изображено на фиг. 1 (8ЕС ΙΌ N0:2). Υ представляет собой концевую карбоксильную группу Суз¹³³ или карбоксиконцевой участок аминокислотного остатка 11е¹³⁴. Х представляет собой метионилированную или неме41 тионилированную аминогруппу Суз или аминоконцевой участок аминокислотного остатка или аминоконцевые последовательности, выбранные из группы

НС с КС

СКВ кокс звскс №КСКС кино (ЗЕО ГО N0:3) скине (ЗЕО ГО N0:4) нскмкс (ЗЕО ГО N0:5) аксита (ЗЕО 10 N0:6) сонскмна (ЗЕО ГО N0:7) нссвсгатв (ЗЕО ГО N0:3) ккоднакынс (ЗЕО ГО N0:9) няс-знсютас (ЗЕО щ N0:10) вксонскинс (ЗЕО ГО N0:11) вксонскывс (ЗЕО Ю N0:12) нвсснскыкс (ЗЕО ГО N0:13) кявв.я.скжс (ЗЕО ГО N0:14) нксснскшгс (ЗЕО ГО N0:15) £№кскс ннсонсклна (ЗЕО ГО N0:16)

РЕЫЗнвкс вноднскинс (ЗЕО ГО N0:1 η ыреызнскс кксонсютс (ЗЕО Ι0 N0:13) АМРЕМЗКСКС КНО5НСКЫНС (ЗЕО ГО N0:19) аотензкскс ннсонсккка (ЗЕО ГО N0:20) анрекзкскс несокскннс (ЗЕО ГО N0:21)

А

АА

	ААА	ΑΝΡΞ№Ε<3Κ3	Ηχαςκ<3ΚΝΚ<3 (ЗЕО Ю N0:22)
	ОААА	ΆΝΡΕ№Ρ.αΚ<3	яяаояскыяа (ЗЕО Ю N0:23)
	ЙОААА	АЫРЕЫЗЯСХС	яясояскияс (ЗЕО 10 N0:24)
	ΝΒΟΑΑΑ	ΑΝΡΕΝ5ΗΟΚΟ	йНСОКСКжа (ЗЕО Ю N0:25)
	ΚΝΗΟΆΑΑ	ΑΝΡΕΝ5ΕΟΧΟ	«ΗΟΟΗΟΚΝΒΟ (ЗЕО ΙΟ N0:26)
	ЕЯКЯОААА	ΑΝΡΕΝ3Κ<3Κ<3	ΗκαοκακΝΗΟ (ЗЕО 10 N0:27)
	ВЕЯМЯОААА	ΑΝΡΞΝ5Χακα	рясонскмнс (ЗЕО Ю N0:28)
	ΗΚΞΗΝΚΟΑΑΑ	АЫРЕ№Я(ЗХС	кяоонскняс (ЗЕО 10 N0:29)
₽	ЯКЕЯЖОААА	ΑΝΡΞΝ3Κ0Κ0	яксокакмвс (ЗЕО ГО N0:30)
ьг	ЯЯЕВЖОААА	ΑΝΡΕΝ3Η0Χσ	кясонскыяс (ЗЕО Ι0 N0:31)
УЬР	ЯЯЕЯЖОААА	ΑΝΡΞΝ3Β0Κ0	нясояскжс (ЗЕО ГО N0:32)
АУЬР	ΚΚΕΚΝΗΟΑΑΑ	ΑΝ₽ΕΝ3Ε<3Κ<3	ЕКООНСКИЯС (ЗЕО Ю N0:33)
МАУЬР	КЯЕН№(2ААА	ΆΝΡΕΝΗΚακα	яясюкскляс (ЗЕО ГО N0:34)
ОМАУЬ Р	ЯЯЕКМЯОААА	ΑΝΡΕΝ3Κακα	ΗΗοςΗακΝκσ (ЗЕО Ι0 N0:35)
КОМАУЪР	ΗΗΞΗΝΚΟΑΑΑ	ΑΝΡΞΝ3Ε0Κ0	вясояскмяс (ЗЕО ГО N0:36)
□КОМАУЬР	ΚΚΕΚΝΚΟΑΑΑ	ΑΝΡΕΝ3Ρ<3Κα	ΗΗβ(2Η<3ΚΝΡσ (ЗЕО Ι0 N0:37)
ΡΌΚΟΜΑνΤΡ	ΗΚΞΡΝΗΟΑΑΑ	ΑΝΡΕΝ3Ε<3Κ<3	няоэяакыяс (ЗЕО Ю N0:38)
Предполагается, что	такие усечённые

ΟΌΝΤ-белки включают усечённый ΟΌΝΤ-белок с аминокислотной последовательностью, представляющей собой Х-[Суз⁴¹-Суз¹³³]А, а также её варианты и производные. Таким образом, процессированный ΟΌΝΤ-белок по данному изобретению также включают варианты с введением (прибавлением), заменой и внутренней делецией и производные аминокислотной последовательности, представленной как Х-[Суз⁴¹Суз¹³³]А. Усечённый ΟΌΝΤ-белок также включают метионилированные и неметионилированные формы, а также гликозилированные и негликозилированные формы процессированного ΟΌΝΤ-белка.

Примеры усечённого ΟΌΝΡ-белка по данному изобретению включают [Агд¹⁶-Пе¹³⁴], [Акп²²-Пе¹³⁴], [Рго²³-11е¹³⁴], [8ег²⁶-Не¹³⁴], [Агд³²11е¹³⁴], [О1у³³-Пе¹³⁴], [Ьу8³⁷-Пе¹³⁴] и [А₅п³⁸-Пе¹³⁴] процессированные ΟΌΝΡ-белки как метионилированные, так и неметионилированные, и их варианты и производные. Предпочтительные процессированные ΟΌΝΡ-белки по данному ОО 1 ОД оо изобретению включают [Ьук -Не ] и [Аки Не¹³⁴] усечённые ΟΌΝΡ-белки как метионилированные, так и неметионилированные, и их варианты и производные. Примерами вариантов с заменой являются [А5п²²А8ег²²-Пе¹³⁴] и [Рго²³ОО ОО 1 од

Ьук ААки -Не ] усечённые ΟΌΝΡ-белки. Примером варианта с введением является 8ег[Рго²³-11е¹³⁴] усечённый ΟΌΝΡ-белок.

В другом аспекте данного изобретения усечённые ΟΌΝΡ-белки могут быть получены в гликозилированной или негликозилированной формах. Производные процессированного ΟΌΝΡ-белка обычно включают присоединение (связывание) усечённого ΟΌΝΡ-белка к водорастворимому полимеру. Например, процессированный ΟΌΝΡ-белок может связываться с одной или более молекул лолиэтиленгликоля с целью уменьшения осаждения продукта усечённого ΟΌΝΡ-белка в водной среде.

Еще один аспект данного изобретения включает различные полинуклеотиды, кодирующие усечённые ΟΌΝΡ-белки. Эти нуклеотидные последовательности обычно применяются при экспрессии усечённой ΟΌΝΡ в эукариотической или прокариотической клеткехозяине, в которой продукт экспрессии или его производное характеризуется способностью повышать усвоение дофамина дофаминэргическими клетками. Полинуклеотиды также можно использовать в клеточной терапии или генной терапии. Соответствующие нуклеотидные последовательности включают те, которые изображены на фигурах, а также дополнительные вырожденные последовательности и природные аллельные варианты.

Еще один аспект данного изобретения включает векторы, содержащие полинуклеотиды, кодирующие усечённые ΟΌΝΡ-белки, функционально связанные с последовательностями, контролирующими амплификацию и/или экспрессию. Как прокариотические, так и эукариотические клетки-хозяева могут устойчиво трансформироваться или трансфицироваться такими векторами, при этом экспрессируется усечённый нейротрофический фактор глиальной клеточной линии.

Данное изобретение далее включает получение усечённого ΟΌΝΡ-белка техникой рекомбинантной ДНК, при которой такие трансформированные или траснфицированные клеткихозяева выращиваются в соответствующей питательной среде, и процессированный ΟΌΝΡ, экспрессированный клетками, по возможности, отделялся от клеток-хозяев и/или питательной среды. Данное изобретение дополнительно включает применение полинуклеотидов, кодирующих усечённый ΟΌΝΡ, и векторов, содержащих такие полинуклеотиды, в генной или клеточной терапии.

В другом аспекте данное изобретение включает гетеродимер, содержащий полную и усеченную молекулу ΟΌΝΡ, и димер, содержащий две усеченные молекулы ΟΌΝΡ.

Другой аспект данного изобретения включает фармацевтические композиции, содержащие усечённый ΟΌΝΡ-белок. Обычно белковый продукт усечённого ΟΌΝΡ готовят вместе с фармацевтически приемлемым носителем. Ряд других веществ может применяться в рецептуре для того, чтобы упростить производство, хранение, обработку, доставку и/или эффективность. Усечённый ΟΌΝΡ-белок повышает усвоение дофамина и выживание дофаминэргических нейронов. Таким образом, усечённый ΟΌΝΡбелок особенно подходит для лечения поражения нервной системы, вызванного повреждением или заболеванием, например, болезнью Паркинсона.

Дополнительные аспекты и преимущества данного изобретения будут очевидны специалистам в данной области после рассмотрения последующего описания, которое подробно излагает данное изобретение.

Краткое описание фигур

Многочисленные особенности и преимущества данного изобретения станут очевидными после рассмотрения фигур, на которых

Фиг. 1 изображает нуклеотидную последовательность (8Е(3 ΙΌ N0:1), кодирующую зрелый нейротрофический фактор глиальной клеточной линии человека (ΗΟΌΝΕ). Также изображена аминокислотная последовательность (8Е0 ΙΌ N0:2) зрелого человеческого ΟΌΝΡбелка;

фиг. 2 изображает карту плазмиды, полученную для экспрессии рекомбинантных усечённых ΟΌΝΡ-белков;

фиг. 3 изображает рестрикционную карту альтернативной нуклеотидной последовательности (8Е0 ΙΌ N0:39), кодирующей полинуклеотиды ΟΌΝΡ и усечённого ΟΌΝΡ;

фиг. 4 изображает рестрикционную карту еще одной нуклеотидной последовательности (8Е0 ΙΌ N0:40), кодирующей полинуклеотиды ΟΌΝΡ и усечённого ΟΌΗΡ;

фиг. 5 изображает нуклеотидную последовательность (8Е0 ΙΌ N0:41), кодирующую [Рго²³-Ьу8³⁷АА8п³⁷-11е¹³⁴] вариант с заменой усечённого ΟΌΝΡ-белка (8Е0 ΙΌ N0:42). Этот белок можно также описать как Ме!-8ег-[Рго²³Ьу8³⁷АА8п³⁷-Пе¹³⁴] вариант усечённого ΟΌΗΡбелка с введением/заменой;

фиг. 6 изображает нуклеотидную последовательность (8Е0 ΙΌ N0:43), кодирующую

Ί [Лгд³²-11е¹³⁴] усечённый 6ΌΝΡ-белок (8ЕО ГО N0:44);

фиг. 7 изображает нуклеотидную последовательность (8Е0 ГО N0:45), кодирующую [С1у³³-11е¹³⁴], усечённый 6ΌΝΕ-белок (8Е0 ГО N0:46);

фиг. 8 изображает аминокислотную последовательность зрелого 110ΩΝΕ (8Е0 ГО N0:47) по сравнению с несколькими примерами усечённых ΟΌΝΕ-белков: Ме!-[Агд³²-11е¹³⁴] (8Е0 ГО N0:48), Ме!-[С1у³³-11е¹³⁴] (8ЕО ГО N0:49) и Ме1§ег-[Рго²³-Ьу8³⁷АА8п³⁷-11е¹³⁴] (НЕС) ГО N0:50).

Подробное описание изобретения

Человеческий фактор глиальной клеточной линии (11СЭ№) синтезируют в виде предшественника, который процессирует и секретирует в виде зрелого белка из 134 аминокислот. Ранее было отмечено, что зрелый человеческий СЛ№ имеет аминокислотную последовательность, изображенную на фиг. 1 (8Е0 ГО N0:2).

Данное изобретение основано на неожиданном открытии, что зрелый ΟΌΝΕ-белок может быть уменьшенным в размере (усечённым СЛ№-белком) и при этом сохранять свою биологическую активность. Усеченный белок был впервые открыт при получении методом рекомбинантной ДНК в клетке яичников китайского хомячка (СНО). Рекомбинантный человеческий СЭЖ (гйСЛ№) был получен следующим образом. Нуклеотидную последовательность, кодирующую полную открытую рамку считывания зрелого человеческого ΟΌΝΕ-белка, клонировали в экспрессирующую плазмиду. Нуклеотидная последовательность, корректность которой была подтверждена (секвенированием ДНК как эквивалента ЛСЛ№последовательности, депонированной в Сепе Вапк), была транслирована в аминокислотную последовательность, идентичную опубликованной последовательности зрелого человеческого СЛ№ (Ып е! а1., 8аепее 260, 1130-1132, 1993). Плазмида ДНК была переведена в линейную форму и трансфицирована в СНО-клетки с дефицитом дигидрофолатредуктазы (СНОб^-клетки) путем осаждения фосфатом кальция. Трансфицированные клетки были культивированы в селективную среду и те колонии, которые выживали в процессе отбора, отбирались для индивидуального анализа экспрессии ЙСЛ№.

Бессывороточные кондиционированные среды из индивидуальных клонов собирали и анализировали с помощью вестерн-блоттинга, используя иммунную сыворотку, специфичную к ЙСЛ№. Иммунная сыворотка содержала антитела кроличьей поликлональной сыворотки из кроликов иммунизированных рекомбинантным ЙСЛ№, экспрессируемым ЕксйепсЫа со11. В восстанавливающих условиях ЙСЛКЕ, который присутствовал в этих образцах, распадался на две главные полосы с молекулярными весами примерно 22 и 18 кЛа. Каждая полоса состояла из близко расположенного дублета, примерно 22+22,5 кЛа и 18+17,5 кЛа соответственно (для простоты эти дублеты обозначаются как 22 кЛа и 18 кПа полосы или виды).

Как сообщалось ранее, СЭЖ существует в виде димера с дисульфидной связью, состоящего из двух идентичных субъединиц зрелого СЛ№ с молекулярным весом примерно от 20 до 22 кЭа. Когда СЛ№ анализировали не в восстанавливающих условиях, сообщалось, что идентифицировали широкую полосу от 32 до 42 кЛа (Ып е! а1., 8с1епсе 260, 1130-1132, 1993) или от 33 до 44 кЛа (Ып е! а1., 1. №игосйет. 63(2), 758-768, 1994). Существование зоны (области распространения) объясняли гетерогенностью гликозилирования зрелых мономеров и подтверждали дополнительно экспериментами по дегликозилированию.

Хотя имеющаяся 22 кЛа полоса соответствует зрелому ΟΟΝΕ-белку. описанному в литературе, о полосе 18 кЛа ранее не сообщали. Относительные количества белков 22 кПа и 18 кЛа менялись в образцах отдельных клонов. Кроме того, найдено, что многие урожаи клеток одного и того же клона показывают переменное соотношение двух полос. Более того, было найдено, что хранение СНО-экспрессируемого СЛ№белка часто приводило к увеличению полосы 18 кЛа при одновременном уменьшении полосы 22 кЛа.

Когда кондиционированную среду из трансформированных СНОб^--клеток анализировали не в восстанавливающих условиях с помощью Вестерн-блоттинга, наблюдали три хорошо разрешенных полосы с примерными молекулярными весами 36, 40 и 44 кЛа. Это наблюдение также противоречило предыдущим сообщениям. Относительная интенсивность этих полос менялась, но она хорошо коррелировалась с соотношением мономерных полос 22 и 18 кЛа, присутствующих в каждом образце. После дополнительного анализа с помощью моноклональной иммунной сыворотки было найдено, что три полосы в невосстановленном геле соответствуют трем возможным димерам, состоящим из двух мономеров. Наибольший 44 кЛа белок является димером из двух зрелых СЛКЕбелков 22 кПа, как сообщалось ранее. Промежуточный 40 кЛа белок состоит из димера, в котором один зрелый белок уменьшил молекулярный вес до 18 кЛа формы. Наименьший димер 36 кПа, по-видимому, состоит из двух 18 кПа белков, т.е. обе 22 кЛа формы уменьшились по молекулярному весу. Эти данные показали в первый раз не только наличие новой формы мономера СЛ№, но также наличие усеченного 6Л№-белка в димерной конфигурации. Также было найдено, что при хранении мономерная композиция образцов сдвигалась к композиции усеченной формы и соответствующих димерных видов, т. е. наблюдалось увеличение количества 36 кЛа белка.

Были проведены исследования по определению того, какая часть белка элиминировала или изменялась, вызывая уменьшение молекулярного веса по сравнению с ранее описанным зрелым ΟΠΝΕ-белком. Впервые было определено, что уменьшение молекулярного веса происходило не вследствие изменения при гликозилировании.

СЛЯБ содержит два потенциальных Νсвязанных сайта гликозилирования, и сообщалось, что он был гликозилирован. Усеченный белок, однако, является не просто негликозилированной или неполностью гликозилированной формой зрелого СЛЯБ. Это было показано в экспериментах по дегликозилированию, в которых образцы обрабатывали Ν-гликаназой, Огликаназой и нейраминидазой. На восстанавливающих гелях 18 кЛа белок при расщеплении Ν-гликаназой восстанавливался (уменьшался) до полосы 13,5 кЛа, что указывает на наличие Ν-связанного сахара, эквивалентного 4,5 кЛа. Обработка нейраминидазой и О-гликаназой вызвала небольшой сдвиг полосы 18 кЛа к 17 кЛа. Это указывает на наличие О-связанных сахаров в белке. Полоса зрелого 22 кЛа белка, как сообщалось, гликозилировалась и также уменьшалась до 18 кЛа (т.е. также на 4,5 кЛа) Νгликаназой. Это было дополнительно подтверждено при использовании антитела моноклональной иммунной сыворотки, специфичного к белку с полосой 22 кЛа в геле. Образец, полученный расщеплением гликаназой невосстановленного (неуменьшенного) димера, был более сложным, но интерпретируемым и согласовывался с первоначальным утверждением о трёх формах.

В результате уменьшение молекулярного веса белка на 4,5 кЛа рассматривали скорее как результат делеции примерно 30-35 аминокислотных остатков, нежели как результат изменений при гликозилировании. По следующим причинам наиболее вероятно было ожидать, что делеция происходила по аминоконцу зрелого ΟΟΝΕ-белка. Зрелый СЛЯБ содержит всего семь остатков цистеина. Если бы делеция происходила по карбоксильному концу, от 2 до 4 из семи цистеиновых остатков было бы утрачено и это, по-видимому, привело бы к неактивному белку. Однако, когда испытуемый образец, состоящий преимущественно из усеченной формы, подвергли биоанализу с целью определения нейротрофической активности дофаминэргических нейронов, образец проявил активность, сравнимую с таковой образца, содержащего больше зрелой формы СЛЯБ.

Затем был определён сайт расщепления анализом аминокислотной последовательности очищенного белка. Образцы были секвенированы в соответствии с рекомендациями производителя, с применением белкового секвенатора Аррйей Вю8у81еш8 494А в течение десяти циклов. Хотя аналитическая техника секвенирова ния хорошо известна специалистам в данной области, более подробное описание секвенирования белков приведено в Раи55с1 е! а1., Е1ес1гор1югс515 12:22-27, 1991 и патентной заявке США № 08/576316, поданной 24 августа 1990 г. (Европейской заявке № 90310899, опубликованной под № ЕР 423980, поданной 4 октября 1990 г., название Фактор стволовых клеток), которые приведены здесь в качестве ссылок. Анализом было определено, что аминоконцы усеченного белка представляют собой ΒΟςΒΟΚ или АгдС1у-С1п-Агд-С1у-Ьуб. Следовательно, первые 31 аминокислоты были удалены из зрелого белка в кондиционированной среде. Остающаяся аминокислотная последовательность усеченного белка, начиная с аминокислоты Агд³², в остальном согласуется с аминокислотной последовательностью зрелого СЛЯБ, изображенного на фиг. 1 (δΕΟ 1Л N0:2).

Анализом дофаминэргических нейронов было найдено, что [Агд³²-11е¹³⁴] усечённый СЛЯБ является активным. Анализ дофаминэргической нейротрофической активности применяется для определения нейротрофических факторов, которые могут быть полезны при лечении болезни Паркинсона. Анализ основан на ранее описанном способе (Епейпап е! а1., Яеиго. 8сг Бей. 79:65-72, 1987, который приведён здесь в качестве ссылки) и может модифицироваться, как описано Ып е! а1. (см. патентную заявку США № 08/182,183, поданную 23 мая 1994 г. и заявку, из которой она выделена; РСТ/υδ 92/07888, поданную 17 сентября 1992 г. (№0 93/06116); и Европейскую заявку № 92921022.7 (№ публикации ЕР 610254). Подробное описание анализа приведено в примере 5.

Последующий процесс очистки и секвенирования аминокислот привел к открытию другого белка, в котором первые 36 аминокислотных остатков были удалены на Ν-конце зрелого СЛЯБ: [ЬуА-Пе¹³⁴] усечённый ΟΟΝΕ-белок, с Ν-концевой последовательностью КЯВС(С) УБ--. Оставшиеся аминокислотные остатки усеченного белка в остальном соответствовали аминокислотной последовательности зрелого человеческого СЛЯБ. Биопроба [ЬуА-Пе¹³⁴] усечённого ОЛ№-белка также была проанализирована для определения усвоения (поглощения) дофамина. Было найдено, что активность этого усечённого ОЛ№-белка в отношении ЕЛ50 составляет, примерно, 50 пг/мл, подобно активности очищенного рекомбинантного экспремированного Е.соИ зрелого СЛЯБ.

Далее было найдено, что экспрессируемый бактериями зрелый СЛЯЕ может быть заменён усечённой формой. Зрелый СЛЯБ, экспрессированный в трансформированных Е.соИ (как описано в Ып е! а1. в заявке США № 08/182,183, см. выше), термостатировали с полученными из клеток СНО кондиционированными средами. Рекомбинантный Е.соИ СЛЯБ имел примерный молекулярный вес 17 кЛа в геле в восстанавли вающих условиях. Когда материал смешали с кондиционированными средами из клеток СНО и термостатировали в течение пяти дней при 4°С, белок был усечен до 12,5 кЭа. Это расщепление было менее полным при термостатировании в течение одного часа или 24 часов, что предполагает зависимость процесса от времени в данных условиях. Было также найдено, что простое термостатирование рекомбинантного Е.соБ ΟΌΝΕ в течение ночи со средой, содержащей 0,1% эмбриональной бычьей сыворотки, не даёт усеченную форму. Таким образом, наличие живых клеток в культуре, по-видимому, необходимо для того, чтобы происходило усечение. Возможно, следовательно, чтобы усечение осуществлялось также ίη νίνο в определенных тканях.

Кроме того, было найдено, что производные зрелого Е.сой-экспрессируемого ΙιΟΩΝΕ. такие как пэгированный ΟΌΝΕ (также описанный Ьт е! а1., в заявке США № 08/182,183, см. выше), могут быть процессированы до усечённой формы в присутствии кондиционированных сред из СНО-клеток. Зрелый ΟΌΝΕ может быть пэгирован по аминному концу для того, чтобы увеличить скорость выведения из кровообращения. Пэгирование увеличивает размер белка, и модифицированный зрелый ΟΌΝΕ в восстановительных условиях достигает, примерно, 45 кЭа. Также как с непэгированной зрелой формой, термостатирование пэгированного Е.со11 ΟΌΝΕ с кондиционированными средами из СНО-клеток (нетрансфицированных) дало полосу 12,5 кПа. В обоих случаях формы 12,5 кОа присутствовали в виде димера с дисульфидной связью, как показано в геле в невосстанавливающих условиях. Образование такой усеченной формы из пэгированного по Ν-концу зрелого белка дополнительно показало, что усечение происходило на Ν-конце белка, так как пэгированный остаток был утрачен при усечении.

Исходя из этих открытий и из-за того, что усечение может также происходить ίη νίνο, усечённая форма ΟΌΝΡ-белка может быть последней процессируемой в естественных физиологических условиях формой ΗΟΌΝΕ. Следовательно, полезно получить усечённый ΟΌΝΕбелок или его производное для применения в терапии. Предполагалось, что непосредственно экспрессированный или синтезированный усечённый СЭ№-белок, такой как [Агд³²-11е¹³⁴] усечённый СЭ№-белок, является устойчивым к вышеописанной протеолитической активности. Более того, было желательно получить усечённый СЭ№-белок, например, пэгированный [Агд³²-11е¹³⁴] усечённый ΟΌΝΡ-белок, так как образующееся производное, как ожидалось, не является чувствительным к специфическому усечению, что наблюдалось у производного зрелого ΟΌΝΡ.

Ожидалось, что продукты усечённого СЭ№-белка обладают и другими преимущест вами. Во-первых, р1 усечённого белка, например, [Агд³²-11е¹³⁴] усечённого ΟΌΝΡ-белка, уменьшается с 10 до примерно 8,0-8,5. Это делает белок значительно менее основным, что, в свою очередь, оказывает положительное действие, включая лучшее рецепторное связывание и пониженную цитотоксичность в месте введения, например, при инъекции в подоболочечную область. Во-вторых, у первых 26 аминокислот аминокислотной последовательности зрелого ΟΌΝΕ имеется два сайта деамидирования: АгдАкп-Агд (аминокислоты 14-16) и С1и-Акп-8ег (аминокислоты 24-26). Ожидается, что отсутствие одного или обоих этих сайтов в усечённом СЭ№-белке повышает устойчивость белка.

Продукты усечённого СБЭТ-белка

В основном варианте изобретения усечённые СЭ№-белки по данному изобретению могут быть представлены следующей аминокислотной последовательностью, в которой для облегчения сравнения со зрелым СЭ№-белком используется схема нумерации аминокислотных остатков, применяемая на фиг. 1

Х-[Су8⁴¹-Су8¹³³]в которой [Сук⁴¹-Сук¹³³] представляет собой амино/~5 41 кислотную последовательность от Сук по Сук¹³³, как изображено на фиг. 1 (8ЕО Ш ΝΟ:2);

Υ представляет собой концевую карбоксильную группу Сук¹³³ или карбоксильный конец аминокислотного остатка 11е¹³⁴; и

Х представляет собой метионилированную или неметионилированную аминогруппу Сук или аминный конец аминокислотного(ых) остатка(ов), выбранного(ых) из группы

ВС

ЫНС

ЬР

УЬР

АЩ-Р

МАУЬР

ОМАУЪ?

АД

ААА

САДА

ВОААА

ΝΒΟΑΑΑ

ΚΝΗ0ΑΑΑ

ΕΚΝΒ0ΑΑΑ

КЕНКВОААА

ΒΒΕΒΝΒΟΑΑΑ

ΒΚΕΚΝΒΟΑΑΑ

ΚΗΕΚΝΒΏΑΑΑ

ΒΒΕΒΝΒΟΑΑΑ

ΒΚΕΒΝΗΟΑΑΑ

ΒΒΕΒΝΒΰΑΑΑ

ΒΒΕΒΝΒΟΑΑΑ

С

КС скс веке 5ВСКС ызвехе ЕЫЗНСКС РЕЫЗКСКС ΝΡΞΝεηακσ

АИРЕИЗВСКС

ΑΝΡΕΝ5ΒΟΚα

АИРЕЫЗПСКС

АМРЕИЗВСКС

АМРЕЫЗВСКС

АЫРЕЫЗВСКС

АЛРЕНЗВСКС

ΑΝΡΕΝ3ΒΟΚΟ

АМРЕИЗВСКС

ΑΝΡΕΝ8Β3Κ3

АЫРЕЫЗНСКС

АМРЕИЗВСКС

АНРьКЗКСКС

АИРЕМЗВСКС

АОТЕИЗКСКС

АИРЕЛЗПСКС

АМРЕИЗВСКС

ΚΝΗ3 (δΕΟ ΙΟ N0:3) скмнс (δΕΟ ΙΟ N0:4) вскжс (δΕΟ (О N0:5) ' овскивс (δΕΟ ΙΟ N0:6) савскывс (δΕΟ 10 N0:7) вссяскывс (δΕΟ 10 N0:8) ΗκαςΗακΝΒΟ (δΕΟ 10 N0:9) вкссвскмнс (δΕΟ ΙΟ N0:10) ввсовскикс (δΕΟ ΙΟ N0:11) ВКСОВСККВС (δΕΟ ΙΟ N0:12) вяссвскивс (δΕΟ ΙΟ N0:13) авсовскывс (δΕΟ ΙΟ N0:14) ВВСОВСККВС (δΕΟ [Ο N0:15) ввссаскмвс (δΕΟ ΙΟ N0:16) авс<2вскывс (δΕΟ ΙΟ N0:17) явсовскмнс (δΕΟ ΙΟ N0:18) ввсовскикс (δΕΟ ΙΟ N0:19) ВВС0ВСЮ4ВС (δΕΟ ΙΟ N0:20) ввс<эаскмас (δΕΟ ΙΟ N0:21) ВНСОВСКЫЯС (δΕΟ ΙΟ N0:22) ΗΗαςρακΝΗα (3ΕΟ ΙΟ N0:23) ВКСОВСКНВС (δΕΟ Ю N0:24) ΒΒαςβσκΝΒΟ (δΕΟ Ю N0:25) вксовскмвс (δΕΟ Ю N0:26) ВВСОВСКМВС (δΕΟ ΙΟ N0:27) ρβοοβοκνηο (δΕΟ ΙΟ N0:28) кясовскыас (δΕΟ ΙΟ N0:29) ВВСОВСКЫВС (δΕΟ ΙΟ N0:30) ВВССКСКИВС (5Ε0!0Ν0:31) ΒΒοςΒΟΚΝΒΟ (δΕΟ Ю N0:32) ВВСОВСККНС (δΕΟ ΙΟ N0:33) ΗΒΟςΒΟΚΝΗΟ (δΕΟ 10 N0:34) ВВСОВСКЫВС (δΕΟ Ю N0:35)

КОМАУЬ? КЯЕЯМНОААА АНРЕЫЗКСКС ΚΗΟςΚΟΚΝΚΟ (ЗЕО Ю N0:36) ОКОМАУЪР ΧΗΕΗΝΗςΑΑΑ ΑΝΡΕ№Κ<3Κ6 ЕлС^лСКЖО (5ЕО Ю N0:37) ΡΌΚΟΜΑνίΡ НЯЕКМНОААА ΑΝΡΕΝ5Κ0Κα РНС<2НСКЫЯС (5ЕО 10 N0:38)

Употребляемый ниже термин усечённый ΟΌΝΤ-белок включает биологически активные синтетические или рекомбинантные усечённые ΟΌΝΤ-белки, усечённые ΟΌΝΡ-белки, полученные из зрелого ΟΌΝΕ. биологически активные усечённые ΟΌΝΤ-варианты (включая варианты с инсерциями, заменами или делециями) и их химически модифицированные производные. Также включены усечённые ΟΌΝΤ-белки, которые практически гомологичны человеческому ΟΌΝΤ-белку с аминокислотной последовательностью, представленной на 8Е0 ГО N0:2.

Термин биологически активный, употребляемый в тексте, означает, что усечённый ΟΌΝΤ-белок проявляет нейротрофические свойства, но не обязательно все те же самые свойства и не обязательно в той же степени, что и свойства ΟΌΝΤ-белка с аминокислотной последовательностью, изображенной на 8Е0 ГО ΝΘ:2. Выбор конкретных нейротрофических свойств, представляющих интерес, зависит от того, для чего применяется вводимый усечённый ΟΌΝΤ-белок. Усечённые ΟΌΝΤ-белки являются биологически активными и проявляют свойства способствовать выживанию дофаминэргических нейронов, подобные таковым, проявляемым зрелым ΟΌΝΤ-белком, если применять оценку поглощения (усвоения) дофамина и экспрессии тирозингидроксилазы (ТН) в качестве примера биоанализа, как описано в нижеприведенных примерах.

Термин практически гомологичный. употребляемый ниже, означает степень гомологии человеческому ΟΌΝΕ с аминокислотной последовательностью, изображенной на 8Е0 ГО ΝΘ:2, которая (степень гомологии) составляет предпочтительно более 70%. более предпочтительно более 80% и еще более предпочтительно свыше 90% и даже 95%. Процент гомологии, как описано в тексте, рассчитывается как процентное содержание аминокислотных остатков, найденных в меньшей из двух последовательностей, которые совмещаются с идентичными аминокислотными остатками в сравниваемой последовательности, когда при длине 100 аминокислот может быть введено четыре щели (гэпа) для того, чтобы способствовать совмещению, как описано Ό;·ιν1ιοΓΓ. в А11ах οΓ Ρτοΐθίη 8есщепсе аиб 81гнс1нге Уо1. 5. р. 124 (1972). Να1юпа1 Вюсйеш1са1 ИехеагсБ ЕонпбаОоп. \Уах11ίημίοη. Ό.Ο.. который приведен здесь в качестве ссылки. Также в понятие практически гомологичный включается любой усечённый ΟΌΝΕбелок, который может быть выделен с помощью перекрестно реагирующих антител к ΟΌΝΕ. изображенному на 8Е0 ГО N0:2. или гены которого могут быть выделены гибридизацией с геном или с сегментами гена, кодирующего ΟΌΝΕ. изображенный на 8Е0 ГО N0:1.

Как станет очевидным специалистам в данной области из настоящего описания, практически гомологичные белки содержат одну или более делеций из, или добавления к, или замены аминокислотных остатков усечённого ΟΌΝΕбелка, изображенного как Х-[Сух⁴¹-Сух¹³³]-У. Получение таких вариантов описано ниже в деталях. Понятно, что так как данное изобретение направлено на усечённые ΟΌΝΤ-белки, то сюда включаются варианты с добавлением аминного конца как содержащие прибавление метионинового остатка или не-ΟΌΝΤ аминокислотный остаток или последовательность, но не включают прибавление (введение) аминокислотного(ых) остатка(ов), который(ые) приводит(ят) к реконструкции зрелого ΟΌΝΤ-белка. Усечённые ΟΌΝΤ-белки на основе природных аллельных мутантов или вариантов также входят в объём данного изобретения. Получение варианта усечённого ΟΌΝΤ-белка дано в деталях ниже.

Ыи е! а1. (заявка США № 08/182.183. см. выше) описали усечение зрелого ΟΌΝΕ по карбоксильному концу путем протеолиза Бух-Агд остатков, которые представляют собой шестой и пятый остаток, соответственно, от карбоксильного конца зрелого ΟΌΝΕ (т.е. Бух¹²⁹-Атд¹³⁰ в соответствии с нумерацией аминокислотных остатков на фиг. 1 (так же как на 8Е0 ГО Ν0:1 или 8Е0 ГО Ν0:2). Такое усечение освобождает два цистеиновых остатка из зрелого ΟΌΝΕбелка. Это, по-видимому, приводит к неуместному скручиванию белка и, следовательно, к образованию неактивного белка. Напротив, продукты Х-[Сух⁴¹-Сух¹³³]-У усечённого ΟΌΝΕбелка по данному изобретению удерживают остатки Сух¹³¹ и Сух¹³³ и с помощью анализа поглощения дофамина обнаруживаются активные белки.

При одной форме воплощения данного изобретения в предпочтительных усечённых ΟΌΝΤ-белках отсутствуют один или более сайтов деамидирования. Такая нехватка сайтов деамидирования может привести к повышенной биохимической устойчивости очищенного белка и уменьшению возможных продуктов распада, что дает белок, более устойчивый при хранении. Примером усечённого ΟΌΝΤ-белка является [8ег²⁶-11е¹³⁴] усечённый ΟΌΝΡ-белок, у которого не хватает сайтов, которые иначе могли бы привести к деамидированию зрелого белка. Или же в [Агд¹⁶-11е¹³⁴] усечённом ΟΌΝΤ-белке не хватает, по меньшей мере, первого сайта деамидирования, имеющегося в зрелом белке.

В настоящее время предпочтительным усечённым ΟΌΝΤ-белком является [Агд³²-11е¹³⁴] усечённый ΟΌΝΤ-белок. У этого усечённого ΟΌΝΤ-белка отсутствует сайт в или рядом с местом протеолитического усечения зрелого белка. Следовательно, ожидается, что этот усе чённый ΟΌΝΕ-белок будет устойчив к процессингу, который может происходить ίη νΐνο. Другим предпочтительным усечённым 6ΌΝΕбелком является [Ьук³⁷-11е¹³⁴] усечённый ΟΌΝΕбелок. Это усечение дополнительно снижает р1 усечённого белка, как и другие усечения, при которых остатки до и включая С1у⁴⁰ и 11е¹³⁴ удаляются с Ν- и О-концов соответственно. В настоящее время наиболее предпочтительные усечённые ΟΌΝΕ-белки сохраняют все цистеиновые остатки, обнаруженные в зрелом 6ΌΝΕбелке, но у них отсутствует какой-либо заметный сайт быстрого протеолитического процессинга усечённого ΟΌΝΕ-белка во время экспрессии, или получения или последующего введения ίη νΐνο. Эти предпочтительные белки включают [Агд³²-11е¹³⁴], [61у¹³³-11е¹³⁴], [61η³⁴11е¹³⁴], [Агд³⁵-11е¹³⁴], [61у³⁶-11е¹³⁴], [Ьук³⁷-11е¹³⁴], [Акп³⁸-11е¹³⁴] и [Агд³⁹-11е¹³⁴] усечённых 6ΌΝΕбелков.

Подобно результатам, ранее описанным для зрелого ΟΌΝΕ-белка Ып е1 а1. (заявка США № 08/182,183, см. выше), усечённые 6ΌΝΕбелки по данному изобретению проявили способность повышать поглощение дофамина эмбриональными предшественниками черного вещества дофаминэргических нейронов. Биоанализы усечённых ΟΌΝΕ-белков далее описаны в примере 4.

Новые усечённые бЭИР-белки обычно выделяли и очищали, чтобы получить усечённые бЭИР-белки, которые практически свободны от присутствия других (не-ОИОТ¹) белковых материалов. Предпочтительно, чтобы усечённые ΟΌΝΡ-белковые продукты были примерно на 80% свободны от других белков, которые могли бы присутствовать, благодаря способу получения, применяемому при производстве усечённого 6И№-белкового продукта. Более предпочтительно, чтобы усечённые ΟΌΝΕ-белковые продукты были на 90% свободны от других белков, особенно предпочтительна чистота от других белков на около 95% и наиболее предпочтительна >98% чистота от других белков. Кроме того, данное изобретение предоставляет уникальную возможность получения полинуклеотидных последовательностей для производства гомогенных усечённых 6ΌΝΕ-белков. Например, применение полинуклеотидной последовательности, кодирующей [Агд³²-11е¹³⁴] усечённый ΟΌΝΡ-белок, делает возможным получение усечённого ΟΌΝΡ-белка в Е.соБ и других подходящих экспрессирующих системах методом рекомбинантной ДНК. Другими словами, новые полинуклеотиды позволяют получать усечённые ΟΌΝΡ-белки, которые нечувствительны к протеолитическому процессингу или имеют пониженную чувствительность к такому процессингу, или действию других биохимических процессов, как описано выше. Таким образом, новые полинуклеотиды облегчают процесс получения и/или выделения единичного вида усе чённых 6^NБ-белков и, следовательно, усечённые белки и/или их продукты не содержат или содержат небольшое количество вышеописанной смеси гетеро- и гомодимеров. Нужно понимать, однако, что конечные усечённые 6ΌΝΡбелки могут комбинироваться с другими факторами, химическими композициями и/или соответствующими фармацевтическими добавками до их введения, как описано подробно ниже.

При одном варианте данного изобретения усечённые 6ΌΝΕ-белки преимущественно получали методами рекомбинантной ДНК, так как они способны давать сравнительно большие количества белка большей чистоты. Рекомбинантные усечённые ΟΌΝΡ-белковые формы включают гликозилированные и негликозилированные формы белка и белка, экспрессируемого в клеточных системах бактерий, млекопитающих или насекомых. Или же усечённые бЭИР-белки могут быть химически синтезированы. Предпочтительные на сегодня способы получения описаны ниже более детально.

Усечённые СБХЕ-варианты и производные

А. Усечённые 6Э№-варианты.

Другой аспект данного изобретения включает варианты усечённого ΟΟΝΕ-белка. Термин усечённые ΟΟΝΡ-белки. употребляемый ниже, включает варианты белков, в которых аминокислоты были делетированы из (варианты с делецией), введены в (варианты с прибавлением/введением), заменены на (варианты с заменой) остатки аминокислотной последовательности природного 6ΌΝΕ. Такие варианты получают введением соответствующих нуклеотидных изменений в ДНК, кодирующую белок, или химическим синтезом ίη νίίτο заданного белка. Специалисты в данной области поймут, что можно осуществить много комбинаций делеций, инсерций и замен при условии, что конечный белок будет обладать 6ΌΝΕ-биологической активностью.

Методы мутагенеза для замены, инсерции или делеции одного или более отобранных аминокислотных остатков хорошо известны специалистам в данной области (например, патент США № 4,518,584, который приведен здесь в качестве ссылки). Есть две основных переменных в конструкции вариантов аминокислотной последовательности: расположение сайта мутации и природа мутации. При конструировании вариантов усечённого 6ΌΝΕ расположение сайта мутации и природа мутации будет зависеть от биохимической(их) характеристики(ик), которая должна быть изменена. Сайты мутации можно модифицировать индивидуально или по порядку, например, (1) заменяя, во-первых, набором из консервативных аминокислот, а затем более радикальным отбором в зависимости от достигнутых результатов, (2) делетируя нацеленные аминокислотные остатки, или (3) вводя (инсерция) аминокислотные остатки, прилегающие к определенному сайту.

Делеции аминокислотных последовательностей, в основном, содержат примерно от 1 до 30 аминокислотных остатков, более обычно примерно от 1 до 10 остатков и, как правило, примерно от 1 до 5 остатков. Например, делеции в части X аминокислотных остатков, расположенных Ν-терминально по отношению к Сук⁴¹, могут быть в размере от примерно 1 до 30 остатков, тогда как делеции между остатками цистеина [Сук⁴¹-Сук¹³³] обычно содержат от примерно 1 до 5 остатков, в зависимости от расположения, так, чтобы не нарушать скручивание (свертывание) белков. Делеции в усечённых белках ΟΌΝΕ могут быть сделаны на участках с низкой гомологией с представителями семейства активинов (трансформирующими βфакторами роста (ТСЕ-β). Делеции из усечённых ΟΌΝΕ-белков в областях практической гомологии с другими последовательностями семейства ТСЕ-β, по-видимому, в более значительной степени изменяют биологическую активность. Общее число делеций и/или последовательность делеций выбирается так, чтобы сохранить третичную структуру усечённого ΟΌΝΕ-белка в подвергаемой воздействию области, например, (перекрестное) сшивание цистеиновых остатков.

Введения (прибавления) в аминокислотную последовательность могут включать аминои/или карбоксилконцевые сшивки, содержащие от одного остатка до ста или более остатков, а также инсерции из одного или многих аминокислотных остатков внутри последовательности. Внутренние введения (прибавления) могут содержать от примерно 1 до 10 аминокислотных остатков, более типично от примерно 1 до 5 аминокислотных остатков и обычно от примерно 1 до 3 аминокислотных остатков. Как описано выше, предполагается, что варианты по данному изобретению с введениями (прибавлениями) на аминном конце включают введение (прибавление) метионина (например, как артефакт непосредственной экспрессии СО№ в бактериальной рекомбинантной клеточной культуре) или не-ΟΌΝΕ аминокислотный остаток или последовательность. Варианты с введениями на аминном конце не включают введения аминокислотных остатков, которые приводят к реконструкции зрелого ΟΌΝΕ-белка. Дополнительный пример концевой инсерции включает присоединение гетерологичной Ν-концевой сигнальной последовательности к Ν-концу с целью облегчить секрецию белка из рекомбинантной клетки-хозяина. Такие сигнальные последовательности обычно получают из заданных видов клеток-хозяев и поэтому они им гомологичны. Инсерции или введения могут также включать аминокислотные последовательности, образованные из последовательности других нейротрофических факторов.

Другая группа вариантов представляет собой варианты замещения аминокислот. В этих вариантах, по меньшей мере, один аминокислотный остаток удален, и на его место введен другой остаток. См., например, фиг. 5, на которой природный Лтд²² был заменен на 8ет с целью облегчить дальнейшее удаление (снятие) Ме!-остатка. Если взять в качестве примера последовательность Х-[Сук⁴¹-Сук¹³³]-У и применить данное определение усечённого СЭ№белка, то усечённым ΟΌΝΕ-белком мы можем называть как вариант с заменой - Ме![Акп²²А8ет²²-11е¹³⁴] усечённого ΟΌΝΕ-белка, так и вариант с введением - Ме!-8ет-[Рто²³-11е¹³⁴] усечённого ΟΌΝΕ-белка. Варианты с заменой включают аллельные варианты, которые характеризуются изменениями в природной нуклеотидной последовательности или не могут вызвать изменения в аминокислотной последовательности.

Специфические мутации последовательностей усечённых СЭ№-белков могут включать модификации сайта гликозилирования (например, серин, треонин или аспарагин). Отсутствие гликозилирования или только частичное гликозилирование могут быть вызваны заменой или делецией аминокислоты по любому, связанному с аспарагином, сайту белка, который модифицирован введением О-связанного углевода. Аспарагин-связанный сайт распознавания гликозилирования содержит трипептидную последовательность, которая специфически распознается соответствующими клеточными фрагментами гликозилирования. Эти трипептидные последовательности представляют собой или Акп-ХааТ11Г или Акп-Хаа-8ет, где Хаа может быть любой аминокислотой, отличной от Рго. Ряд аминокислотных замен или делеций в одном или обоих первом или третьем положении аминокислоты сайта гликозилирования (и/или делеция аминокислоты во втором положении) не приводит к гликозилированию в модифицированной трипептидной последовательности. Таким образом, экспрессия соответствующим образом измененных нуклеотидных последовательностей дает варианты, негликозилированные по этому сайту. Или же последовательность может быть модифицирована для того, чтобы прибавить (ввести) сайты гликозилирования к усечённому ΟΌΝΕ-белку.

Один способ определения аминокислотных остатков или (участков) зон усечённого СЭ№ на мутагенез называется аланинсканирующий мутагенез, как описано Сипшпдйат апб №е11к (8е1епее, 244:1081-1085, 1989). По этому способу аминокислотный остаток или группа нацеленных остатков определяется (например, заряженные остатки, такие как Агд, Акр, Н1к, Ьук и С1и) и заменяются на нейтральную или отрицательно заряженную кислоту (наиболее предпочтителен аланин или полиаланин), чтобы вызвать взаимодействие аминокис лот с окружающей водной средой в или вне клетки. Домены, проявляющие функциональную чувствительность к заменам, очищаются введением дополнительных или измененных остатков по сайтам замены. Таким образом, сайт для введения модификации аминокислотной последовательности определяется заранее, и чтобы оптимизировать мутацию по данному сайту, можно провести сканирование аланином или случайный мутагенез и скрининг вариантов на оптимальную комбинацию заданной активности и степени активности.

Сайты, представляющие наибольший интерес для заместительного мутагенеза, включают сайты, в которых аминокислоты, обнаруженные в СЭИЕ-белках из различных видов, практически отличны по объёму боковой цепи, заряду и/или гидрофобности. Другие сайты, представляющие интерес, включают таковые, в которых специфические остатки ΟΌΝΤподобных белков, полученных из различных видов, идентичны. Такие положения вообще важны для биологической активности белка. Сначала эти сайты модифицируются относительно консервативной заменой. Такие консервативные замены показаны на табл. 1 в графе Предпочтительные замены. Если такие замены приводят к изменению биологической активности, тогда вводят более существенные изменения (Примеры замен) и/или могут быть проведены другие введения/делеции, и образующийся продукт подвергают скринингу.

Таблица1

Аминокислотные замены

Первоначальный остаток	Предпочтительные замены	Примеры замен
А1а (А)	να1	να1; Ееи; 11е
Агд (К)	Еук	Еук; СЕп; Акп
Акп (Ν)	С1п	С1п; Н1к; Еук; Агд
Акр (Ώ)	С1и	С1и
Сук (С)	8ег	8ег
С1п (Ω)	Акп	Акп
С1и (Е)	Акр	Акр
С1у (С)	Рго	Рго
Ик (Η)	Агд	Акп; С1п; Еук; Агд
11е (I)	Ееи	Ееи; \ а1; Ме1; А1а; Нре; норлейцин
Ьеи (Ь)	11е	норлейцин; 11е; Vа1; МеТ; А1а; Р1е
Ьук (К)	Агд	Агд; С1п; Акп
Ме! (М)	Ееи	Ееи; Р1е; 11е
Р1е (Е)	Ееи	Ееи; Vа1; 11е; А1а
Рго (Р)	С1у	С1у
8ег(8)	ΊΊ1Γ	Тйг
ТЪг (Т)	8ег	8ег
Тгр (ТС)	Туг	Туг
Туг (Υ)	Р1е	Тгр; Р1е; Т11г; 8ег
Уа1 (V)	Ееи	11е; Ееи; МеТ; Р1е; А1а; норлейцин

Предполагается, что консервативные модификации аминокислотной последовательности (и соответствующие модификации кодирующих нуклеотидных последовательностей) продуцируют усечённые СЭИЕ-белки с функциональными и химическими характеристиками, подобными таковым усечённых ΟΌΝΕ белков, описанных в примерах, данных ниже. Напротив, существенные изменения функциональных и/или химических характеристик усечённых ΟΌΝΕ-белков могут быть достигнуты отбором замен, которые значительно отличаются по своему действию на сохранение (а) структуры полипептидного остова (каркаса) в области замены, такой как, например, складчатая или спиральная конформация, (Ь) заряда или гидрофобности белка в нацеленном сайте или (с) объёма боковой цепи.

Природные остатки делят на группы в соответствии с общими свойствами боковой цепи:

1) гидрофобные: норлейцин, Ме1, А1а, Уа1, Ьеи, 11е;

2) нейтральные гидрофильные: 8ук, 8ег, Т1п;

3) кислые: Акр, С1и;

4) основные: Акп, С1и, Ηίκ, Ьук, Агд;

5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: С1у, Рго; и

6) ароматические: Тгр, Туг, Р1е.

Неконсервативные замены могут вызвать переход представителя одного из этих классов в другой класс. Такие замещающие остатки могут вводиться в области усечённых ΟΌΝΡ-белков, которые гомологичны с другими белками ТСЕβ, или в негомологичные области белка.

В. Производные усечённых ΟΩΝΡ

Химически модифицированные производные усечённого СЭ№ или усечённых ΟΩΝΡвариантов могут быть получены специалистами в соответствии с данным ниже описанием. Химические остатки, наиболее пригодные для получения производных усечённых ΟΌΝΡ-белков, содержат водорастворимые полимеры. Водорастворимый полимер желателен, так как белок, к которому он присоединяется, не осаждается в водной среде, например, физиологической среде. Предпочтительно, чтобы полимер был фармацевтически приемлем для получения терапевтического продукта или композиции. Специалисты в данной области смогут отобрать желаемый полимер, принимая во внимание то, будет ли конъюгат полимер/белок применяться терапевтически, и если да, то какова необходимая доза, время выведения из организма, устойчивость к протеолизу и др. Эффективность образования производных может быть подтверждена введением производного в нужной форме (например, с помощью осмотического насоса или более предпочтительно инъекцией или инфузией, или в виде препаратов для орального, лёгочного или других путей введения) и определяя их эффективность.

Соответствующие водорастворимые полимеры включают, но не ограничиваются указанными: полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоль/пропиленгликоль, монометоксиполиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6 триоксан, сополимер этилен/малеиновый ангидрид, полиаминокислоты (как гомополимеры, так и случайные сополимеры), поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры полиэтиленгликоля, сополимеры полипропиленоксид/этиленоксид, полиоксиэтилированные спирты (например, глицерин), полиэтиленгликольпропионовый альдегид и их смеси. Употребляемый ниже полиэтиленгликоль охватывает любую из форм ПЭГ, которая используется для дериватизации других белков, например, моно(С₁-С₁₀)-алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль. Полиэтиленгликоль-пропионовый альдегид может быть удобен в промышленности из-за устойчивости в воде. Полимер может иметь любой молекулярный вес и может быть разветвленным или неразветвленным.

Данное изобретение, в частности, относится к усечённому ΟΌΝΓ-белку, связанному, по меньшей мере, с одной молекулой ПЭГ. В другом аспекте данное изобретение относится к усечённому ΟΌΝΕ-белку, соединенному с, по меньшей мере, одной молекулой ПЭГ ацильной или алкильной связью.

Пэгирование можно проводить любой реакцией пэгирования, известной из уровня техники. См., например, Еосик оп Сго\\И1 Рас!ога 3(2):4-10 (1992); ЕР 0 154 316; ЕР 0 401 384; и Майк е! а1., Ехр. Нета!о1. 20:1028-1035 (1992) (сообщает о пэгировании 6М-С8Е с помощью трезилхлорида). Предпочтительно, чтобы пэгирование проводили реакцией ацилирования или алкилирования реакционноспособным водорастворимым полимером. Эти предпочтительные способы дериватизации обсуждаются ниже более подробно. Для реакций ацилирования предпочтительно выбираемый(ые) полимер(ы) содержит(ат) одну реакционноспособную эфирную группу. В случае реакций восстановительного алкилирования, предпочтительно выбираемый (ые) полимер(ы) содержит(ат) одну реакционноспособную альдегидную группу. Кроме того, выбранный полимер может быть модифицирован так, чтобы иметь одну реакционноспособную группу, например активную эфирную для ацилирования или альдегидную для алкилирования, так, что можно контролировать степень полимеразации. Вообще водорастворимый полимер не следует выбирать из природных гликозильных остатков, так как их обычно получают более удобным путем при помощи систем рекомбинантной экспрессии млекопитающих.

Ацилирование

Согласно данному изобретению, пэгирование ацилированием обычно включает обеспечение реакции активного эфирного производного полиэтиленгликоля с усечённым ΟΌΝΕ-белком. Любая известная или открытая впоследствии реакционноспособная молекула ПЭГ может быть применена для процесса пэгирования. Предпочтительным активированным ПЭГ эфиром является ПЭГ, этерифицированный с получением Ν-гидроксисукцинимида (ΝΗ8). Так, как употребляется ниже, термин ацилирование включает без ограничения следующие типы связывания между усечённым ΟΌΝΕбелком и водорастворимым полимером, таким как ПЭГ: амид, карбамат, уретан и тому подобное. См. Вюсои)ида!е Сйет. 5:133-140 (1994). Условия реакции можно выбрать из любых, известных в технике пэгирования, или тех, которые откроют позже, но следует избегать или ограничивать такие условия реакции, как такой температуры, таких растворителей и таких величин рН, которые инактивируют усечённый ΟΌΝΕ-белок, который должен модифицироваться.

Пэгирование с помощью ацилирования обычно даёт полипэгированный усечённый ΟΌΝΕ-белок, в котором е -аминогруппы лизина пэгированы за счет связывания ацильной группой. Предпочтительно, чтобы связь была амидной. Также предпочтительно, чтобы образующийся продукт был практически только (например, >95%) моно-, ди- или трипэгированным. Однако некоторые конъюгаты с более высокими степенями пэгирования могут образовываться в количествах, зависящих от конкретных условий реакции. Если нужно, из смесей могут быть получены более чистые пэгированные конъюгаты стандартными методами очистки, включая, среди прочих, диализ, высаливание, ультрафильтрацию, ионообменную хроматографию, гельфильтрацию и электрофорез.

Алкилирование

Согласно данному изобретению пэгирование алкилированием обычно включает обеспечение реакции производного ПЭГ с концевым альдегидом с усечённым ΟΌΝΕ-белком в присутствии восстановителя. Пэгирование с помощью алкилирования может также дать полипэгированный усечённый ΟΌΝΕ-белок. Кроме того, можно изменять условия реакции, чтобы предпочтительно пэгирование шло по αаминогруппе Ν-конца белка (т.е. монопэгирование). Как в случае монопэгирования, так и в случае полипэгирования группы ПЭГ предпочтительно соединяются с белком через -СН₂-ЛНгруппу. Отдавая предпочтение старшинству -СН₂-группы, этот тип связи называют ниже алкильная связь.

Селективные химические модификации по Ν-концу могут быть осуществлены путем восстановительного алкилирования, которое использует различную реакционную способность разных типов первичных аминогрупп (лизин относительно Ν-концевого), способных к дериватизации в конкретном белке. В соответствующих условиях реакции достигается практически селективная дериватизация белка по Νконцу полимером, содержащим карбонильную группу. Например, можно селективно пэгиро вать белок по Ν-концу, проводя реакцию при рН, который позволяет использовать различия между рК_а е -аминогруппой остатков лизина и таковым α-аминогруппы Ν-концевого остатка белка. Такой селективной дериватизацией контролируется присоединение водорастворимого полимера к белку: конъюгация с полимером происходит преимущественно по Ν-концу белка и никакой существенной модификации других реакционноспособных групп, таких как аминогруппы боковой цепи, не происходит. При применении восстановительного алкилирования водорастворимый полимер имеет единственную реакционноспособную альдегидную группу для соединения с белком. Можно использовать полиэтиленгликоль пропиональдегид, содержащий одну реакционноспособную альдегидную группу.

Данное изобретение включает полипэгированные усечённые ΟΌΝΡ-белки. в которых ПЭГ-группа(ы) соединена(ены) через ацильную или алкильную группы. Как обсуждалось ранее, такие усечённые ΟΌΝΡ-белковые продукты могут быть монопэгированными или полипэгированными (например, содержащими 2-6, предпочтительно 2-5 групп ПЭГ). Обычно ПЭГгруппы соединены с белком по α- или е аминогруппам аминокислот, но также полагается, что ПЭГ-группы могут быть соединены по любой реакционноспособной группе белка, которая достаточно реакционноспособна, чтобы соединиться с ПЭГ-группой в соответствующих условиях реакции. Так, полиэтиленгликоль может быть ковалентно связан с белком через реакционноспособную группу, такую как свободная амино- или карбоксильная группа. Реакционноспособными группами являются такие, с которыми может быть связана активированная молекула ПЭГ. Аминокислотные остатки, содержащие свободную аминогруппу, могут включать остатки лизина и Ν-концевой остаток аминокислоты. Аминокислотные остатки, содержащие свободную карбоксильную группу, могут включать остатки аспартиковой кислоты, глутаминовой кислоты и С-концевой остаток аминокислоты. В качестве реакционноспособной группы для связывания с молекулой(ами) ПЭГ могут быть использованы сульфгидрильные группы. Для терапевтических целей обычно предпочтительно присоединение по аминогруппе, например присоединение по Ν-концу или группе лизина. Присоединения по остаткам, важным для рецепторного связывания, надо избегать, если требуется рецепторное связывание.

В одном аспекте данное изобретение предлагает практически гомогенный препарат конъюгата монополимер/усечённый ΟΌΝΡ-белок, в котором молекула полимера присоединена практически только (т.е. >95%) в единственном месте. Более конкретно, если применяется ПЭГ, данное изобретение также предоставляет пэгированный усечённый белок с недостатком предполагаемых антигенных связывающих групп, в котором молекула ПЭГ непосредственно связана с усечённым ΟΌΝΡ-белком.

Кроме того, могут быть получены производные при использовании гликозилированных, негликозилированных или дегликозилированных усечённых ΟΌΝΡ-белков. Обычно применяются негликозилированные усечённые ΟΏΝΡбелки. Например, экспрессируемый клетками прокариот [Агд³²-11е¹³⁴] усечённый ΟΌΝΡ-белок можно дериватизировать так, чтобы он содержал моно- или поли-, например, 2-4 частицы ПЭГ, соединенные через ацильную или алкильную группу.

В основном, химическую дериватизацию можно проводить в соответствующих условиях, применяемых для реакций биологически активного вещества с активированной молекулой полимера. Способы получения пэгированных усечённых ΟΌΝΡ-белков обычно содержат стадии (a) реакции усечённого ΟΌΝΡ-белка с полиэтиленгликолем (таким как реакционноспособное эфирное или альдегидное производное ПЭГ) в условиях, при которых усечённый ΟΌΝΡ-белок связывается с одной или более группами ПЭГ, и (b) получения продукта(ов) реакции. В целом оптимальные условия реакций ацилирования определяются постепенно, исходя из известных параметров и желаемого результата. Например, чем больше соотношение ПЭГ: белок, тем выше процент полипэгированного продукта. Оптимальное соотношение (с точки зрения эффективности реакции, в которой нет (избытка) непрореагировавшего белка или полимера) может определяться факторами, такими как заданная степень дериватизации (например, моно-, ди-, три- и т.д.), молекулярный вес выбранного полимера, является ли полимер разветвленным или линейным, и применяемыми условиями реакции.

Восстановительное алкилирование для получения практически гомогенного конъюгата монополимер/усечённый ΟΌΝΡ-белок, как правило, включает стадии: (а) реакцию усечённого ΟΌΝΡ-белка с реакционноспособной молекулой ПЭГ в условиях восстановительного алкилирования при рН, делающим возможным селективную модификацию α-аминогруппы по аминному концу усечённого ΟΌΝΡ-белка, и (Ь) получение продукта(ов) реакции.

Для получения практически гомогенного конъюгата монополимер/усечённый ΟΟΝΡбелок условия реакции являются такими, чтобы было возможно селективное присоединение частицы водорастворимого полимера к Ν-концу усечённого ΟΌΝΡ-белка. Такие условия реакции обычно выявляют разницу между рК., аминогруппы лизина и α-аминогруппы на Ν-конце (рК_а представляет собой рН, при котором 50% аминогрупп протонируется и 50% не протонируется). рН также влияет на то, какое соотношение полимер/белок надо использовать. В целом, если рН ниже, нужно брать больший избыток полимера по отношению к белку (т.е. чем менее реакционноспособна Ν-концевая α-аминогруппа, тем больше полимера нужно для получения оптимальных условий). Если рН выше, соотношение полимер/белок не должно быть таким большим (т.е. чем более реакционноспособны применяемые группы, тем меньше молекул полимера требуется). Для целей данного изобретения рН обычно составляет 3-9, предпочтительно 3-6.

Другим важным фактором является молекулярный вес полимера. В целом, чем выше молекулярный вес полимера, тем меньшее число полимерных молекул может присоединиться к белку. Подобным образом разветвлённость полимера надо принимать во внимание при оптимизации этих параметров. Обычно, чем выше молекулярный вес полимера (или большая разветвлённость), тем выше соотношение полимер/белок. В целом, для реакций пэгирования, рассматриваемых в описании, предпочтителен средний молекулярный вес от примерно 2 кЭа до примерно 100 кОа (термин примерно, около указывает, что в препаратах полиэтиленгликоля некоторые молекулы имеют больший молекулярный вес, чем указано, а некоторые - меньший). Предпочтителен средний молекулярный вес от около 5 кПа до около 50 кПа, особенно предпочтителен от около 12 кЭа до около 25 кПа. Соотношение водорастворимого полимера и усечённого ΟΌΝΕ-белка находится обычно в интервале от 1:1 до 100:1, предпочтительно (для полипэгирования) от 1:1 до 20:1 и (для монопэгирования) от 1:1 до 5:1. При применении вышеуказанных условий восстановительное алкилирование обеспечивает селективное присоединение полимера к любому усечённому ΟΌΝΕ-белку с α-аминогруппой на аминном конце и практически гомогенный препарат конъюгата монополимер/СЭНР-белок. Термин конъюгат монополимер/усечённый ΟΌΝΕбелок применяется здесь для обозначения производного, содержащего одну полимерную молекулу, соединенную с усечённым ΟΌΝΕбелком. Конъюгат монополимер/усечённый СИНЕ-белок предпочтительно содержит полимерную молекулу, расположенную на Ν-конце, а не в аминных группах лизина. Препарат предпочтительно содержит более 90% конъюгата монополимер/усечённый СЭНР-белок и более предпочтительно выше 95% конъюгата монополимер/усечённый СЭНР-белок. при этом остается непрореагировавший белок (т.е. белок без полимерной частицы).

Для восстановительного алкилирования восстанавливающий агент должен быть устойчив в водном растворе и предпочтительно дол жен восстанавливать только основание Шиффа, первоначально образующееся при восстановительном алкилировании. Примеры восстановителей можно выбрать из группы, состоящей из натрийборгидрида, натрийцианборгидрида, диметиламинборана, триметиламинборана и пиридинборана. Особенно предпочтительным восстановителем является натрийцианборгидрид. Другие условия реакции, такие как растворитель, время реакции, температура и т. д. и способы очистки продуктов, можно определить, исходя из имеющихся данных о дериватизации белков водорастворимыми полимерами.

По выбору смесь конъюгатов полимер/белок можно получать алкилированием или ацилированием, и преимуществом является то, что можно регулировать соотношение монополимер/белок в конъюгате. Так, если нужно, можно получить белок с различным числом соединенных с ним полимерных молекул (т.е. ди-, три-, тетра- и т.д.) и объединить с конъюгатом монополимер/белок, полученным с применением данных способов, и получить смесь с заведомым соотношением монополимер/белок в конъюгате.

Полинуклеотиды, кодирующие усечённые СБЭТ-белки

Далее данное изобретение предлагает нуклеотиды, которые кодируют усечённые ΟΌΝΕбелки. Если используют зонд для гибридизации или праймер для амплификации, нуклеотидная последовательность практически свободна от других нуклеотидных последовательностей. При применении для экспрессии рекомбинантных белков нуклеотидная последовательность должна быть, как правило, практически свободна от нуклеотидных последовательностей, кодирующих другие белки, если не нужен слитый белок. Исходя из данного описания и применяя таблицу универсальных кодов, обычный специалист в данной области может легко определить все нуклеотидные последовательности, которые кодируют аминокислотные последовательности усечённых СИНЕ-белков. В настоящее время предпочтительные нуклеотидные последовательности включают полинуклеотиды, кодирующие [Агд¹⁶-11е¹³⁴], [8ег^2б-11е¹³⁴], [Агд³²-11е¹³⁴] и |Пуз³⁷-11е¹³⁴| усечённые ΟΌΝΕбелки. Примеры разных полинуклеотидов изображены на фиг. 5, 6 и 7, а также на тех частях фиг. 1, 3 и 4, где кодируют усечённые ΟΌΝΕбелки. Специалисты также поймут, что новые полинуклеотиды, которые кодируют усечённые СПНЕ-белки, включают также нуклеотидные последовательности, которые кодируют варианты усечённых СИНЕ-белков, как искусственно полученных человеком, так и природных.

Методами экспрессии рекомбинантной ДНК, осуществляемыми в соответствии с описаниями, данными ниже, можно получать эти полинуклеотиды и экспрессировать различные усечённые СИНЕ-белки. Например, встраивая нуклеотидную последовательность, которая кодирует усечённый ΟΌΝΕ-белок в соответствующий вектор, специалист в данной области может легко получать большие количества заданной нуклеотидной последовательности. Последовательности затем могут быть использованы для генерирования детекторных зондов и праймеров амплификации. Или же, полинуклеотид, кодирующий усечённый ΟΌΝΕ-белок, может быть встроен в экспрессирующий вектор. Введением вектора экспрессии в соответствующего хозяина можно получить заданный усечённый белок в больших количествах.

Как далее здесь описано, есть много систем хозяин/вектор, пригодных для получения нуклеотидных последовательностей и/или получения усечённых ΟΌΝΕ-белков. Таковые включают, но не ограничиваются указанными, плазмидные, вирусные и инсерционные векторы и клетки-хозяева прокариот и эукариот. Специалисты в данной области могут адаптировать систему хозяин/вектор, способную воспроизводить (размножать) или экспрессировать последовательности по данному изобретению.

С помощью таких методов рекомбинантной ДНК усечённые СЛЯБ-белки в соответствии с настоящим изобретением легко получают в промышленных количествах. Более того, специалисты в данной области поймут, что в свете настоящего описания, новые нуклеотидные последовательности содержат вырожденные нуклеиновые кислоты, кодирующие усечённые СЛ№-белки, конкретно представленные на фиг., варианты таких усечённых ΟΟΝΕ-белков и такие нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются, предпочтительно в жестких условиях гибридизации, с комплементами этих нуклеотидных последовательностей (см. МашаФ е! а1., Мо1еси1аг С1ошпд (А БаЬогаЮгу Мапиа1); Со1й δικιι^ НагЬог ЬаЬога!огу, рр. 387389, 1982). Примерные жесткие условия гибридизации представляют собой гибридизацию в 4 х δδС при 62-67°С с последующим промыванием в 0,1 х δδС при 62-67°С, примерно, в течение часа. Или же, примерными условиями гибридизации являются гибридизация в 45-55% формамиде, 4 х δδС при 40-45°С. Последовательности ДНК, которые гибридизуются с последовательностями, комплементарными усечённому СЛОТ-белку, в мягких условиях гибридизации и которые кодируют усечённый СЛЯБ-белок, по данному изобретению, также включены сюда. Примером таких мягких условий гибридизации являются 4 х δδС при 45-55°С или гибридизация в 30-40% формамиде при 40-45°С.

Также данное изобретение относится к конструкциям рекомбинантных ДНК, включающих вектор вместе с последовательностью ДНК, кодирующей усечённый ΟΟΝΕ-белок. В таких конструкциях нуклеотидная ДНКпоследовательность, кодирующая усечённый СЛ№-белок (с сигнальным пептидом или без него), функционально связана с соответствующей контролирующей или регуляторной последовательностью экспрессии, способной направлять репликацию и/или экспрессию усечённого ΟΟΝΕ-белка в выбранном хозяине.

Рекомбинантная экспрессия усечённого СБЭТ-белка

Получение полинуклеотидов, кодирующих усечённый СЛЯБ.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая усечённый ΟΟΝΕ-белок или исходный материал для зрелого СЛЯБ, может быть легко получена рядом способов, включая, без ограничения, химический синтез или скрининг кДНКовой библиотеки или геномной библиотеки, скрининг библиотеки экспрессии и/или РСВ амплификацию кДНК. Эти способы и другие, пригодные для выделения таких нуклеотидных последовательностей, представлены, например, δатЬ^оок е! а1., (Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога!огу Мапиа1, Со1й δικιι^ НагЬог ЬаЬога!огу Рге§8, Со1й δικιι^ НагЬог, ЯУ, 1989) и Лн5нЬе1 е! а1., ей§. (Сиггеп! Рго!осоИ т Мо1еси1аг Вю1оду, Сиггеп! РгоФсоИ Рге§8, 1994) и Вегдег апй К1тте1 (Мс!ЬоЙ8 т Епхуто1оду: Сшйе !о Мо1еси1аг С1оп1пд Тес11пк.|ие5. уо1. 152, Асайетк Рге§8, 1пс., δап Л1едо, СА, 1987). Предпочтительными нуклеотидными последовательностями, кодирующими СЛЯБ, являются последовательности млекопитающих.

Химический синтез нуклеотидной последовательности, которая кодирует усечённый ΟΠΝΕ-белок, может быть осуществлен с применением хорошо известных способов, таких как описанные ЕпдеИ е! а1., (Апдете. С1ет. 1п!1. Ей., 28:716-734, 1989). Эти способы включают т!ег а11а, фосфотриэфирный, фосфорамидитный и нфосфонатный способы синтеза нуклеотидной последовательности. Нуклеотидная последовательность, кодирующая усечённый СЛЯБбелок, будет иметь протяжённость в несколько сот пар оснований (Ьр, п.о.) или нуклеотидов. Протяжённые нуклеотидные последовательности, например, такие, длина которых более 100 нуклеотидов, можно синтезировать в виде нескольких фрагментов. Фрагменты можно лигировать друг с другом с образованием нуклеотидной последовательности, кодирующей усечённый ОЛЕГЕ-белок. Предпочтительным способом является синтез на полимерной подложке с применением стандартной химии фосфамидитов.

Соответствующая нуклеотидная последовательность может быть получена и скринингом библиотеки надлежащей кДНК (т.е. библиотеки, полученной из одного или более источника ткани, предположительно экспрессирующей белок) или геномной библиотеки (библиотеки, полученной на основе тотальной геномной ДНК). Источником кДНК-овой библиотеки обычно является ткань любого образца, предположительно экспрессирующая СЛЯБ в приемлемых количествах. Источником геномной библиотеки может быть любая ткань или ткани любого млекопитающего или других видов, где предположительно находится ген, кодирующий СЛ№ или гомолог СЛ№. Можно провести скрининг библиотеки на наличие кДНК/гена СЛ№, применяя один или более нуклеотидных зондов (олигонуклеотиды, фрагменты кДНК или геномной кДНК, которые имеют приемлемую степень гомологии с кДНК или клонируемого гена СЛ№, или СЛ№), которые селективно гибридизуют с кДНК(ами) или геном(генами) СЛ№ или гомолога СЛ№, присутствующими в библиотеке. Зонды, обычно применяемые для такого скрининга библиотек, как правило, кодируют малую область последовательности ДНК СЛ№ того же вида или вида подобного тому, из которого была приготовлена библиотека. Или же зонды могут быть вырожденными, как здесь обсуждается.

Скрининг библиотек, как правило, осуществляется гибридизацией олигонуклеотидного зонда или кДНК с библиотечными зондами в условиях, степень жёсткости которых предотвращает неспецифическое связывание, но позволяет связывание тех клонов, которые имеют значительный уровень гомологии, с зондом или праймером. Типичные условия гибридизации и отмывания зависят частично от размера (т.е. числа нуклеотидов) кДНК или нуклеотидного зонда и того, является ли зонд вырожденным. Возможность получения клона(ов) тоже принимается во внимание при конструировании (подборе) раствора для гибридизации (т.е. ведётся скрининг кДНК-овой библиотеки или геномной библиотеки; если это кДНК-овая библиотека, возможность того, что присутствует интересующая кДНК, высока).

Когда фрагменты ДНК (так же, как кДНК) применяются в качестве зондов, типичные условия гибридизации включают такие, которые описаны в Аи§цЬе1 е! а1., еб§., см. выше. После гибридизации содержащий библиотеку блот промывают в условиях соответствующей жёсткости, зависящей от нескольких факторов, таких как размер зонда, ожидаемая гомология зонда, который должен быть клонирован, тип библиотеки, скрининг которой проводят, число клонов, которые подвергают скринингу и тому подобное. Примеры растворов для отмывания в жёстких условиях (у которых обычно низкая ионная сила и которые применяются при относительно высоких температурах) следующие. Один такой жёсткий раствор для отмывания содержит 0,015 М №С1, 0,005 М Να-цитрат и 0,1% 8Ό8 (55-65°С). Другой такой жёсткий буфер содержит 1 мМ №₂ЕЛТА, 40 мМ №НР0₄, рН 7,2, и 1% 8Ό8 (примерно 40-50°С). Еще один буфер содержит 0,2 х 88С и 0,1% 8Ό8 (примерно 50-65°С).

Имеются также примерные методики отмывания в жёстких условиях, где применяют олигонуклеотидные зонды для скрининга кДНК-овых или геномных библиотек. Например, первая методика использует 6 х 88С с 0,05% пирофосфата натрия при температуре между примерно 35 и 62°С в зависимости от длины зонда. Например, зонды с 14 основаниями отмывают при 35-40°С, зонды с 17 основаниями при 45-50°С, зонды с 20 основаниями при 52-57°С и зонды с 23 основаниями при 57-63°С. Температуры могут быть повышены на 2-3°С, где фоновое неспецифическое связывание, повидимому, высоко. Вторая методика подразумевает использование для промывания тетраметиламмонийхлорида. Один такой раствор для промывания в жёстких условиях содержит 3 М ТМАС, 50 мМ ТГ18-НС1, рН 8,0 и 0,2% 8Ό8.

Другой удобный способ получения нуклеотидной последовательности, кодирующей усечённый 6ΌΝΕ-белок, представляет собой полимеразную цепную реакцию (РСВ). По этому способу ро1у (А) + РНК или тотальная РНК извлекаются из ткани, которая экспрессирует СЛ№. кДНК далее получают на основе РНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы). Затем к кДНК добавляют два олигонуклеотидных праймера, обычно комплементарных двум отдельным областям кДНК СЛ№, вместе с полимеразой, например, полимеразой Тад.

Если выбранный способ получения нуклеотидной последовательности, кодирующей заданный усечённый 6ΌΝΕ-белок, требует применения олигонуклеотидных праймеров или проб (например, РСВ, скрининг кДНК-овых или геномных библиотек), олигонуклеотидные последовательности, выбранные в качестве зондов или праймеров, должны быть адекватной длины и достаточно однозначны для того, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание, которое происходит при библиотечном скрининге или РСВ-амплификации. Основу действительной последовательности проб или праймеров обычно составляют консервативные или высокогомологичные последовательности или области того же или подобного гена из другого организма. По возможности, зонды или праймеры могут быть полностью или частично вырожденными, т. е. содержать смесь зондов/праймеров, которые кодируют ту же самую аминокислотную последовательность, но используют для этого различные кодоны. Альтернативой получению вырожденных зондов является помещение инозина в некоторые или все те положения кодона, которыми отличаются различные виды. Олигонуклеотидные зонды или праймеры можно получить химическими методами синтеза, описанными выше для ДНК.

Усечённые ΟΌΝΕ-белки на основе этих нуклеотидных последовательностей, кодирующих СЛ№, а также мутантные последовательности и варианты последовательностей также входят в объём данного изобретения. Как описано выше, мутантная последовательность или вариант последовательности представляет собой последовательность, которая содержит одну или более нуклеотидных замен, делеций и/или инсерций по сравнению с последовательностью дикого типа и которая приводит к экспрессии вариантов аминокислотной последовательности по сравнению с аминокислотной последовательностью дикого типа. В некоторых случаях могут существовать природные СО№аминокислотные мутанты или варианты вследствие существования природного аллельного варианта. Усечённые ΟΌΝΕ-белки на основе таких природных мутантов или вариантов также входят в объём данного изобретения. Получение синтетических мутантных последовательностей также хорошо известно из уровня техники и описано, например, ^е11к е! а1. (Сепе, 34:315, 1985) и ЗатЬтоок е! а1., см. выше.

Векторы кДНК или геномную ДНК, кодирующую усечённый ΟΌΝΕ-белок, встраивают в вектор для дальнейшего клонирования (амплификация ДНК) или для экспрессии. Соответствующие векторы коммерчески доступны, или вектор может быть специально сконструирован. Выбор или конструкция соответствующего вектора будет зависеть от того, 1) будет ли он применяться для амплификации или для экспрессии ДНК, 2) размера ДНК, которую нужно встроить в вектор, и 3) природы клетки-хозяина (например, является ли она клеткой млекопитающего, насекомого, дрожжей, грибов, растений или бактерий), которая трансформируется вектором. Каждый вектор содержит различные компоненты в зависимости от его функции (амплификация ДНК или экспрессия ДНК) и его совместимости с заданной клеткой-хозяином. Векторы обычно содержат, но не ограничиваются перечисленными, один или более из следующих элементов: сигнальную последовательность, ориджин репликации, один или более селективный или маркерный ген, энхансер, промотор, последовательность терминации транскрипции и тому подобное. Эти элементы могут быть получены из природных источников или синтезированы известными способами. Векторы по данному изобретению включают нуклеотидную последовательность, которая кодирует интересующий усечённый ΟΌΝΕ-белок, функционально связанный с одной или более контролирующих или регулирующих экспрессию последовательностей, способных направлять, контролировать или по-иному воздействовать на экспрессию усечённого ΟΌΝΕ-белка выбранной клеткой-хозяином.

Сигнальная последовательность

Сигнальная последовательность может быть компонентом вектора или это может быть частью ДНК СЭЖ. которая внедрена в вектор. ДНК природного СО№ кодирует сигнальную последовательность на аминном конце белка, которая отщепляется во время посттрансляци онного процессинга белка с образованием зрелого ΟΌΝΕ-белка. В объём данного изобретения включены усеченные ΟΌΝΕ-полинуклеотиды с природной сигнальной последовательностью и другие пре-про-последовательности, так же как и усечённые ΟΌΝΕ-полинуклеотиды, у которых природная сигнальная последовательность делетирована и заменена гетерологичной сигнальной последовательностью. Выбранная гетерологичная сигнальная последовательность должна быть такой, чтобы её распознала и процессировала, т.е. отщепила сигнальной пептидазой клетка-хозяин. Для прокариотических клетокхозяев, которые не распознают и не процессируют сигнальную последовательность природного СО№, сигнальную последовательность заменяют сигнальной последовательностью прокариот, выбранной, например, из группы лидерных последовательностей щелочной фосфатазы, пенициллиназы или термостойкого энтеротоксина 11. Для секреции в дрожжах сигнальная последовательность природного СО№ может быть заменена последовательностью дрожжевой инвертазы, альфа-фактора или кислой фосфатазы. Для экспрессии клетками млекопитающих пригодна природная сигнальная последовательность, хотя могут быть использованы и другие сигнальные последовательности белков млекопитающих.

Ориджин репликации

Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно включают аминокислотную последовательность, которая делает вектор способным к репликации в одной или более выбранных клеток-хозяев. В клонирующих векторах эта последовательность обычно обеспечивает репликацию вектора независимо от хромосомной ДНК, клетки-хозяина и включает ориджин репликации или автономно реплицирующиеся последовательности. Такие последовательности хорошо известны для многих бактерий, дрожжей и вирусов. Ориджин репликации из плазмиды рВК322 пригоден для большинства грамотрицательных бактерий, и различные ориджины (например, ориджин 8У40, вируса полиомы, аденовируса, У8У или ВРУ) применимы для клонирующих векторов в клетках млекопитающих. Обычно ориджин репликации не требуется для экспрессирующих векторов млекопитающих (например, ориджин 8У40 часто применяют только потому, что он содержит ранний промотор).

Селективный ген

Экспрессирующие и клонирующие векторы обычно содержат селективный ген. Этот ген кодирует маркерный белок, необходимый для выживания или роста трансформированных клеток-хозяев при выращивании в селективной культуральной среде. Клетки-хозяева, которые не были трансформированы вектором, не будут содержать селективный ген и, следовательно, не выживут в культуральной среде. Типичные се лективные гены кодируют белки, которые а) придают устойчивость к антибиотикам или другим токсинам, например, ампициллину, неомицину, метотрексату или тетрациклину; б) восполняют ауксотрофную недостаточность или в) снабжают необходимыми питательными веществами, не поступающими из культуральной среды.

Другие селективные гены могут быть использованы для амплификации гена, который будет экспрессироваться. Амплификация представляет собой процесс, при котором гены, более нужные для получения необходимого для роста белка, многократно тандемно повторяются в хромосомах эффективно растущих рекомбинантных клеток. Примеры соответствующих селективных маркеров для клеток млекопитающих включают дигидрофолатредуктазу (ΌΗΕΚ) и тимидинкиназу. Клеточные трансформанты млекопитающих подвергают давлению, которое могут пережить только те трансформанты, которые вследствие действия маркера приспособлены к выживанию. Давление отбора проводят, культивируя трансформированные клетки в условиях изменения концентрации селективного агента в среде, что, таким образом, приводит к амплификации как селективного гена, так и ДНК, кодирующей усечённый ΟΌΝΕ. В результате на основе амплифицированной ДНК синтезируется повышенное количество усечённого ΟΌΝΕ.

Например, клетки, трансформированные селективным геном ΌΗΕΚ, отбирают при выращивании всех трансформантов в культуральной среде, которая содержит метотрексат, конкурентный антагонист ΌΗΕΚ. Подходящей клеткой-хозяином, если используют ΌΗΕΚ. дикого типа, является линия клеток яичника китайского хомячка с дефицитом ΌΗΕΚ-активности (см., например, иг1аиЬ апб Сйайп. Ргос. №111. Асаб. 8сЕ, И8А 77(7): 4216-4220 (1980)). Трансформированные клетки затем экспонируют с повышенным количеством метотрексата. Это приводит к синтезу множественных копий ΌΗΕΚ-гена и, соответственно, многочисленных копий другой ДНК, в составе экспрессирующего вектора, например, ДНК, кодирующей усечённый ΟΌΝΕбелок.

Промотор

Экспрессирующие и клонирующие векторы по данному изобретению обычно содержат промотор, который распознаётся клетками хозяина и функционально связывается с нуклеотидной последовательностью, кодирующей усечённый ΟΌΝΕ-белок. Промоторы представляют собой нетранслируемые последовательности, расположенные выше (ирйтеаш) (5') относительно инициирующего кодона структурного гена (обычно между примерно от 100 до 1000 п. о.), который контролирует транскрипцию и трансляцию конкретной нуклеотидной последовательности, например, кодирующей усечённый

ΟΌΝΕ. Промоторы условно делят на два класса: индуцибельные промоторы и конститутивные промоторы. Индуцибельные промоторы инициируют повышенный уровень транскрипции ДНК под их контролем в ответ на некоторое изменение в среде, например, наличие или отсутствие питательного вещества или изменение температуры. Большое количество промоторов, распознаваемых потенциальными клеткамихозяевами, хорошо известно. Эти промоторы функционально связывают с ДНК, кодирующими усечённый ΠΌΝΕ, удаляя промотор из источника ДНК расщеплением рестриктазой и вводя заданную последовательность промотора в вектор. Последовательность нативного (природного) ΠΌΝΕ-промотора можно применять для непосредственной амплификации и/или экспрессии ДНК усечённого ΟΌΝΕ. Гетерологичный промотор предпочтителен, однако, если он обеспечивает более эффективную транскрипцию и более высокие выходы экспрессируемого белка по сравнению с нативным промотором и если он совместим с выбранной системой клетки-хозяина.

Промоторы, пригодные для применения в случае прокариотических хозяев, включают бета-лактамазную и лактозную промоторные системы; щелочную фосфатазу, промоторную систему триптофана (1гр); гибридные промоторы, такие как промотор 1ас. Также применимы другие известные бактериальные промоторы. Их нуклеотидные последовательности были опубликованы, что, таким образом, позволяет специалистам в данной области лигировать их с нужной(ыми) последовательностью(ями) ДНК, используя линкеры или адаптеры, как необходимые для восполнения любых требуемых сайтов рестрикции.

Соответствующие промотирующие (стимулирующие) последовательности для применения с дрожжевыми клетками-хозяевами также хорошо известны из уровня техники. Дрожжевые энхансеры преимущественно применяются с дрожжевыми промоторами. Соответствующие промоторы для применения с клеткамихозяевами млекопитающих хорошо известны и включают таковые, которые получены из генома вирусов, например, вируса полиомы, вируса оспы птиц, аденовируса (например, аденовируса 2), вируса бычьей папилломы, вируса саркомы птиц, цитомегаловируса, ретровируса, вируса гепатита В и наиболее предпочтительно вируса зелёной мартышки (8У40)). Другие промоторы, применимые в клетках-хозяевах млекопитающих, включают гетерологичные промоторы, например, промоторы теплового шока и промотор астмы. В настоящее время для получения ΟΌΝΕ-белков в клетках СНО применяется промотор 8Κα. См. ТакеЬе е1 а1., Мо1. Се11. ΒίοΙ. 8(1):466-472 (1988). Применимым экспресси рующим вектором является ρΌ8Κα2, который дополнительно описан ниже.

Энхансер

Энхансерную последовательность можно встраивать в вектор для усиления транскрипции последовательности ДНК, кодирующей усечённый ΟΌΝΡ-белок по данному изобретению, в клетках высших эукариот. Энхансеры представляют собой цис-действующие элементы ДНК, обычно около 10-300 п.о. в длину, которые воздействуют на промотор, повышая его транскрипционную активность. Энхансеры имеют различную локализацию и ориентацию. Они были найдены на 5'- и 3'-участках по отношению к транскрипционной единице. Известно несколько полезных энхансерных последовательностей генов млекопитающих (например, глобина, элактазы, альбумина, альфа-фето-белка и инсулина). Обычно, однако, используют вирусный энхансер. Энхансер 8У40, энхансер раннего промотора цитомегаловируса, энхансер вируса полиомы и энхансеры аденовирусов являются примерами элементов, усиливающих активацию промоторов эукариот. Хотя энхансер можно сплайсировать в вектор в положения 5'или 3'-ДНК усечённого СЭХР. он обычно располагается в положении 5'-промотора.

Терминация транскрипции

Экспрессирующие векторы, используемые в эукариотических клетках-хозяевах (клетках дрожжей, грибов, насекомых, растений, животных, человека или содержащих ядро клетках других многоклеточных организмов), должны включать последовательности, необходимые для терминации транскрипции и стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно получают из 5'- и иногда 3'-нетранслируемых областей ДНК или кДНК эукариот. Эти области содержат нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов на нетранслируемом участке мРНК, кодирующей усечённый ОИОТ.

Конструирование соответствующих векторов, содержащих один или более вышеперечисленных элементов вместе с кодирующей последовательностью заданного усечённого ОИОТ, осуществляется стандартными методами лигирования. Выделенные фрагменты плазмид или ДНК отщепляют, шьют на заказ и снова лигируют в заданном порядке с образованием нужной плазмиды. Чтобы подтвердить получение должным образом ориентированных последовательностей, смеси для лигирования можно использовать для трансформации Е. со11, и трансформанты можно отобрать известными способами, например, по устойчивости к ампициллину, как описано выше. Затем из трансформантов выделяли плазмиды, анализировали их расщеплением рестриктазами и/или секвенировали, подтверждая наличие заданной конструкции.

Векторы, которые обеспечивают временную экспрессию ДНК, кодирующей усечённый

СЭХР в клетках млекопитающих, могут также быть использованы. В общем, временная экспрессия включает применение экспрессирующего вектора, который может эффективно реплицироваться в клетке-хозяине, так что в клетке-хозяине накапливаются многочисленные копии экспрессирующего вектора и, в свою очередь, синтезируется в высокой степени заданный белок, кодируемый экспрессирующим вектором. Временные системы экспрессии, представляющие собой соответствующий вектор экспрессии и клетку-хозяина, обеспечивают возможность удобной идентификации белков, кодируемых клонированными ДНК, а также быстрый скрининг таких белков на биологические или физиологические свойства. Таким образом, временные системы экспрессии особенно полезны при определении вариантов белка.

Отбор и трансформация клеток-хозяев

Клетки-хозяева (например, клетки бактерий, млекопитающих, насекомых, дрожжей или растительные клетки), трансформированные нуклеотидными последовательностями для экспрессии рекомбинантного усечённого СЭХРбелка также входят в объем данного изобретения. Трансформированную клетку-хозяин культивируют в соответствующих условиях, обеспечивающих экспрессию нуклеотидной последовательности. Соответствующие клетки-хозяева и способы трансформации, выращивания, амплификации, скрининга и получения и очистки продукта хорошо известны из уровня техники. См., например, Ое!Ыпд апб 8атЬгоок, №11иге 293:620-625 (1981), или же Каиктап е! а1., Мо1. Се11. Бю1., 5(70:1750-1759 (1985) или НоМеу е! а1., патент США № 4,419,446. Усечённые ОИОТ могут экспрессироваться в Е. со11 в соответствии с описанием Ып е! а1. (патентная заявка США № 07/855,413; заявка № РСТ/И8 92/07888; XV0 93/06116, которые относятся к экспрессии зрелого СЭХР. Другие примеры материалов и способов обсуждаются дополнительно ниже. Трансформированную клетку-хозяин культивируют в соответствующей среде и экспрессируемый белок затем, по возможности, выделяют и очищают от культуральной среды (или от клеток, если экспрессия внутриклеточная) подходящими способами, известными специалистам в данной области.

Подходящие клетки-хозяева для клонирующих или экспрессирующих векторов в соответствии с данным изобретением представляют собой клетки прокариот, дрожжей или высших эукариот, описанные выше. Прокариотические клетки-хозяева включают, но не ограничиваются указанными клетками эубактерий, грамотрицательных или грам-положительных организмов, например, Е. со11, бацилл таких как В. киЬННк, Ркеиботопак, например, Р. аегидтока, 8а1топе11а 1урЫтигшт или 8еггаНа тагсексапк. Или же применимы способы клонирования т νίΐΓΟ, например РСК или другие реакции полимераз нуклеиновых кислот.

Кроме прокариотических клеток-хозяев, подходящими хозяевами для экспрессии усечённых ΟΌΝΡ-белков могут быть, например, нитевидные грибы или дрожжи. 8ассйаготусе5 ссгс^'Ыас. или обычные пекарские дрожжи, наиболее широко используются среди низших эукариотических хозяев-микроорганизмов, но ряд других родов, видов и штаммов хорошо известны и общедоступны.

Соответствующие клетки-хозяева для экспрессии гликозилированного усечённого ΟΌΝΡбелка получают из многоклеточных организмов, такие клетки-хозяева способны к сложному процессингу и гликозилированию. В принципе, можно использовать культуру любых высших эукариотических клеток как культуру клеток позвоночных, так и беспозвоночных, в том числе клеток растений и насекомых. Применение клеток позвоночных для их размножения в культуре (тканевая культура) является хорошо известной. Примеры подходящих линий клетокхозяев млекопитающих включают, но не ограничиваются этим, клеточную линию почки зеленой мартышки СУ1. трансформированную СУ40 (СО8-7). зародышевую линию человеческой почки (293, или 293 клетки, субклонированные для выращивания в суспендированной культуре), клетки почки детеныша хомяка и клетки яичника китайского хомячка. Другие подходящие клеточные линии включают, но не ограничиваются указанным, НеЬа. клетки мыши Ь-929. 3Т3-клетки линий мышей 8\νίδ5. Ва1Ь-с или ΝΙΗ. линии клеток хомяка ВНК или НаК.

Подобным образом применимы в качестве клеток-хозяев по данному изобретению бактериальные клетки. Например, различные штаммы Е. со11 (например, НВ101, ΌΗ5α. ΌΗ10 и МС1061) хорошо известны в качестве клетокхозяев в биотехнологии. Различные штаммы 81гер1отусе5 5рр. и тому подобные могут также применяться. Предпочтительными в настоящее время клетками-хозяевами для получения усечённых ΟΠΝΡ-белков являются бактериальные клетки (например, ЕксйепсШа сой) и клетки млекопитающих (такие как клетки яичника китайского хомячка, СО8-клетки и т.д.).

Клетки-хозяева трансфицируются и предпочтительно трансформируются вышеописанными экспрессирующими или клонирующими векторами и выращиваются в традиционной питательной среде. Среду можно модифицировать, сделав пригодной для индуцирования промоторов, отбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих заданные последовательности. Трансфекцию и трансформацию осуществляют с применением стандартных методик, которые хорошо известны специалистам в данной области и выбор которых зависит от природы клеток-хозяев. Например, для клеток млекопитающих, не имеющих клеточных оболочек, может быть использован способ осаждения фосфатом кальция. Электропорация, микроинъекция и другие известные способы также могут быть использованы.

Культивирование клеток-хозяев

Трансформированные клетки, применяемые для получения усечённых ΟΌΝΡ-белков в соответствии с данным изобретением, выращиваются в соответствующих средах. Среды могут быть при необходимости дополнены гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), солями (такими как хлористый натрий, кальций, магний или фосфат), буферами (например, НЕРЕ8). нуклеозидами (например, аденозином и тимидином), антибиотиками (такими как гептамицин), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных составах в микромолекулярных концентрациях) и глюкозой или другими источниками энергии. Могут быть включены другие добавки в соответствующих концентрациях по усмотрению специалистов в данной области. Соответствующие условия культивирования, такие как температура, рН и тому подобное для выбранных клетокхозяев, также хорошо известны специалистам в данной области.

Усечённые ΟΌΝΡ-белки могут быть получены и гомологичной рекомбинацией или в соответствии со способами рекомбинантного продуцирования с использованием контролирующих элементов, введенных в клетки, уже содержащие ДНК, кодирующую ΟΌΝΕ. Гомологичная рекомбинация представляет собой метод, первоначально предназначенный для того, чтобы заставить гены вызвать или скорректировать мутации в транскрипционно активных генах (Кисйег1ара11. Ргод. ίη №с1. Ас1б Ке5. аиб Мо1. Вю1. 36:301 (1989)). Первоначально указанный способ был предложен для введения специфических мутаций в специфические области генома млекопитающих (Тйотак е! а1.. Се11. 44:419428. 1986; Тйотак аиб СарессЫ. Се11. 51:503512. 1987; Эое15с11тап е1 а1.. Ргос. №11. Асаб. 8с1. 85:8583-8587. 1988) или корректировки специфических мутаций в дефектных генах (Эое15с11тап е1 а1.. №1иге. 330:576-578. 1987). Примеры методов гомологичной рекомбинации описаны в патенте И8 5.272.071 (ЕР 91903051. опубликованной под № 505500; заявке РСТ/И8 90/07642. опубликованной под № \¥О 91/09955). которые приведены здесь в качестве ссылок.

С помощью гомологичной рекомбинации последовательность ДНК, которая должна быть встроена в геном, может быть направлена в конкретную область интересующего гена за счет присоединения к целевой ДНК. Целевая ДНК представляет собой ДНК, комплементарную (гомологичную) участку геномной ДНК. Небольшие участки целевой ДНК, которые комплементарны специфической области гено ма, вступают в контакт с родительской нитью в ходе процесса репликации ДНК. Это общее свойство ДНК, которая была внедрена в клетку, с целью гибридизации и, следовательно, рекомбинации с другими частями эндогенной ДНК через общие гомологичные области. Если эта комплементарная нить соединена с олигонуклеотидом, который содержит мутацию или отличающуюся последовательность ДНК, она также внедряется во вновь синтезированную нить в результате рекомбинации. В результате функционирования системы исправления ошибок новая последовательность ДНК может служить в качестве матрицы. Таким образом, перенесенная ДНК внедряется в геном.

Если последовательность конкретного гена известна, например, нуклеотидная последовательность ΟΌΝΡ, пре-про-последовательность или последовательность, контролирующая экспрессию, то часть ДНК, которая комплементарна выбранной части гена, можно синтезировать или получить другим способом, например соответствующей рестрикцией нативной ДНК на специфических (сайтах) участках распознавания, расположенных вокруг интересующей области. Эти части служат в качестве последовательностей-мишеней при инсерции в клетку и будут гибридизоваться с гомологичной областью в геноме. Если гибридизация происходит во время репликации ДНК, этот участок ДНК и любая дополнительная последовательность, соединенная с ним, будет вести себя как фрагмент Оказаки и будет вшит во вновь синтезированную дочернюю нить ДНК.

В соответствии с настоящим изобретением к частям ДНК-мишени присоединяют области ДНК, которые могут взаимодействовать с экспрессией ΟΌΝΡ-белка. Например, промотор/энхансер, супрессор или элемент, модулирующий экзогенную транскрипцию, встраивается в геном клетки-хозяина в такой пространственной близости и ориентации, чтобы влиять на транскрипцию ДНК, кодирующей заданный усечённый ΟΌΝΕ. Контролирующий элемент не кодирует усечённый ΟΌΝΕ, а контролирует часть ДНК, присутствующую в геноме клеткихозяина. Таким образом, экспрессия усечённых ΟΌΝΡ-белков может быть достигнута не трансфекцией ДНК, которая кодирует сам усечённый ΟΌΝΡ-ген, но скорее применением целевой ДНК (содержащей области гомологии с интересующим эндогенным геном), объединённой с регуляторными сегментами ДНК, которые обеспечивают последовательность эндогенного гена распознаваемыми сигналами для транскрипции усечённого 6Э№-белка.

В соответствии с данным изобретением могут быть использованы также способы гомологичной рекомбинации для модификации клетки, которая содержит транскрипционно молчащий в нормальном состоянии ΟΌΝΕген, чтобы получить клетку, экспрессирующую

ΟΌΝΡ. ΟΌΝΡ-белок затем можно процессировать с образованием усечённого(ых) 6ΌΝΕбелка(ов).

Фармацевтические композиции на основе усечённого ΟϋΝΕ

Фармацевтические композиции на основе усечённых ΟΌΝΡ-белков обычно содержат терапевтически эффективное количество продукта усечённого ΟΌΝΡ-белка в смеси с одной или более фармацевтически и физиологически приемлемыми добавками. Соответствующие добавки включают, но не ограничиваются перечисленными, антиоксиданты, консерванты, красители, вкусовые добавки и агенты для разведения, эмульгаторы, суспендирующие вещества, растворители, наполнители, вещества, увеличивающие объем, буферы, средства доставки (наполнители), разжижители, носители и/или фармацевтические адъюванты. Например, соответствующим растворителем может быть вода для инъекций, физиологический раствор или искусственная спиномозговая жидкость, возможно, дополненные другими веществами, обычными для композиций для парентерального введения. Нейтральный забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином, также являются примерами носителей (наполнителей).

Основной растворитель в носителе может быть водным или неводным по природе. Кроме того, носитель может содержать другие фармацевтически приемлемые наполнители для изменения или сохранения рН, осмотического давления, вязкости, прозрачности, цвета, стерильности, устойчивости, скорости растворения или запаха лекарственного средства. Подобным образом носитель может содержать другие фармацевтически приемлемые наполнители для изменения или сохранения стабильности, скорости растворения или скорости высвобождения усечённого ΟΌΝΡ-белка или для стимулирования всасывания или проникновения усечённого ΟΌΝΡ-белка через гематоэнцефалический барьер. Такие наполнители представляют собой вещества, традиционно применяемые для приготовления дозированных препаратов для парентерального введения, содержащих как однократные, так и многократные дозы, или для непосредственного вливания в спинномозговую жидкость путем непрерывной или периодической инфузии из имплантированного насоса.

Будучи приготовлена терапевтическая композиция может храниться в стерильных сосудах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или дегидратированного или лиофилизированного порошка. Такие препараты могут храниться в форме, готовой к применению, или в форме, например, лиофилизированной, требующей растворения перед введением.

Оптимальная фармацевтическая рецептура определяется специалистом в данной области в зависимости от способа введения и заданной дозировки. См., например, ^ιηίηφοη'κ РНагшасеибса1 З^еисек. 18111 Еб. (1990, Маск РиЫЫшщ Οο., ЕаБФщ РА 18042) рр. 1435-1712 (руководство приведено здесь в качестве ссылки). Композиция может также содержать корпускулярные препараты полимерных соединений, такие как полиактиновая кислота, полигликолевая кислота и т.д. Может также применяться гиалуроновая кислота, которая может обеспечивать пролонгированное действие при введении препарата в кровоток. Такие композиции могут влиять на физические параметры, устойчивость, скорость ίη νΐνο выделения и скорость ίη νΐνο выведения данных белков и их производных.

Другие эффективные формы введения, например, парентеральные препараты пролонгированного действия, аэрозоли для ингаляции, препараты, активные при пероральном приёме или суппозитории также предусмотрены. Фармацевтические композиции на основе усечённого ΟΌΝΡ-белка могут приготовляться для парентерального введения, например, для интрацеребровентрикулярной инъекции. Такие парентерально вводимые терапевтические композиции обычно находятся в форме апирогенного, водного раствора, содержащего усечённый ΟΌΝΡ-белок в фармацевтически приемлемом носителе. Предпочтительным носителем является физиологический раствор.

Также фармацевтическая композиция, содержащая усечённый ΟΌΝΡ-белок, может вводиться перорально. Усечённый ΟΌΝΡ-белок, который вводится таким образом, может быть заключен в капсулу и может быть приготовлен с применением или без тех носителей, которые обычно применяются в приготовлении твердых дозированных препаратов. Капсулы могут быть изготовлены таким образом, чтобы высвобождать активную часть препарата в желудочнокишечном тракте, когда биологическая доступность максимальна, а предварительный распад препарата минимален. Дополнительные носители могут быть включены в препарат для облегчения всасывания усечённого ΟΌΝΡ-белка. Разбавители, вкусовые добавки, низкоплавкие воски, растительные масла, смазывающие вещества, суспендирующие агенты, дезинтегрирующие вещества и связывающие агенты также могут применяться.

Введение усечённого СБЭТ-белка

Усечённый 6ΌΝΕ-белок можно вводить парентерально путем подкожного, внутримышечного, внутривенного, внутрилёгочного, трансдермального, подоболочечного и интрацеребрального введения. Белковые ростовые факторы, которые не проходят через гематоэнцефалический барьер, могут вводиться непосредственно интрацеребральным или иным путем вместе с другими веществами, которые переносят их через барьер. Предпочтительно, чтобы усечённый ΟΌΝΡ-белок вводили интрацеребровен трикулярно или в субарахноидальное пространство головного или спинного мозга. Усечённый ΟΌΝΡ-белок можно также вводить интрацеребрально непосредственно в паренхиму мозга. Усечённый 6ΌΝΕ-белок можно также вводить путем освобождения из имплантата пролонгированного действия в мозгу, содержащего нейротрофический фактор, помещённый в матрицу из биологически разлагаемого полимера. Усечённый ΟΌΝΡ-белок можно вводить экстрацеребрально в форме, которая была химически модифицирована или так упакована, что она проходит через гематоэндефалический барьер или может быть введена вместе с одним или более агентами, способными стимулировать проникновение усечённого 6ΌΝΕ-белка через указанный барьер. Например, конъюгат Ν6Ε и моноклональных антител к рецепторам антитрансферрина, как было показано, переносится в мозг за счет связывания с рецепторами трансферрина. Чтобы обеспечить заданную дозу усечённого 6ΌΝΕ-белка, можно осуществлять повторные инъекции ежедневно или менее часто, или усечённый белок может вливаться непрерывно или периодически из имплантированного насоса с постоянными или программируемыми инъекциями. Частота инъекций будет зависеть от фармакокинетических параметров усечённого 6ΌΝΕ-белка в составе препарата и способа введения.

Независимо от способа введения конкретную дозу обычно рассчитывают в соответствии с весом тела и площадью поверхности тела. В случае заболеваний мозга, конкретную дозу вычисляют в соответствии с приблизительным весом мозга больного, который также можно оценить, исходя из веса тела или площади поверхности тела. Дальнейшее уточнение расчетов, необходимое для определения примерной дозы для лечения, включающее каждую из вышеупомянутых составляющих, обычно проводят специалисты в данной области, особенно на основе информации о дозе и методах анализа, раскрытых в настоящем описании. Соответствующие дозировки могут быть подтверждены с помощью установленных методов анализа для определения доз в сочетании с соответствующими данными о реакции на дозу. Окончательный порядок приёма препарата, являющийся частью способа лечения специфического состояния, будет определяться лечащим врачом, исходя из различных факторов, которые влияют на действие лекарств, например, возраст, состояние, вес тела, пол и диета больного, тяжесть любой инфекции, время введения и другие клинические факторы.

Усечённый 6ΌΝΕ-белок по данному изобретению также может применяться, сам по себе или в сочетаниях с другими факторами роста, для лечения заболеваний нервной системы. Например, усечённый 6ΌΝΕ-белок может быть применён для лечения некоторых форм таких заболеваний в сочетании с фактором роста нервов. Кроме того, другие ростовые факторы или другие вещества, включая химические композиции, могут применяться вместе с усечённым ΟΌΝΡ-белком. При лечении болезни Паркинсона принимается во внимание, что усечённый ΟΌΝΡ-белок будет применяться как самостоятельно, так и в сочетании с Ь-дофамином, когда усечённый ΟΌΝΡ повышает продукцию эндогеного дофамина и поглощение нейронами дофамина.

Как сказано выше, также принимается во внимание, что дополнительные нейротрофические или нейронные факторы будут полезны или необходимы для обработки некоторых типов клеточных популяций нейронов или лечения определенных поражений или заболеваний. Другие факторы, которые можно использовать в сочетании с усечённым ΟΌΝΕ, включают, но не ограничиваются указанными: митогены, такие как инсулин, инсулиноподобные факторы роста, эпидермальный фактор роста, вазоактивный фактор роста, полипептид, активирующий аденилатциклазу гипофиза, интерферон и соматостатин; нейротрофические факторы, например, нейротрофический фактор роста мозгового происхождения, нейротрофин-3, нейротрофин-4,5, нейротрофин-6, инсулиноподобный фактор роста, цилиарный нейротрофический фактор, кислый и основный фактор роста фибробластов, фактор роста фибробластов-5, β-трансформирующие факторы роста (активины), кокаинамфетаминный регуляторный транскрипт (САВТ) и зрелый 6ΌΝΕ, и другие факторы роста, например эпидермальный фактор роста, фактор, ингибирующий лейкоз, интерлейкины, интерфероны, колониестимулирующие факторы; а также молекулы и вещества, функционально эквивалентные этим факторам.

Можно также предвидеть, что непрерывное введение или пролонгированное высвобождение усечённого ΟΌΝΡ-белка может быть благоприятным для данной процедуры лечения. Хотя непрерывное введение может быть выполнено механическими способами, например, с помощью инфузионного насоса, предполагается, что можно на практике применять другие способы непрерывного или почти непрерывного введения. Например, химическая дериватизация может обеспечить получение форм белка с пролонгированным действием, что приводит к постоянному их наличию в кровотоке, в заданных количествах, в зависимости от определённого режима введения. Таким образом, усечённый ΟΌΝΡ-белок представляет собой и ΟΌΝΡ-белок, который модифицирован с целью осуществления непрерывного введения.

Клеточная терапия с помощью усечённого ΟΌΝΡ-белка, например, интрацеребральная имплантация клеток, продуцирующих усечённый ΟΌΝΡ-белок, также включена в объем изобретения. Она может включать имплантацию боль ным клеток, которые способны синтезировать и секретировать биологически активную форму усечённого ΟΩΝΕ-белка. Такие клетки представляют собой продуцирующие ΟΌΝΡ-белок клетки, которые в нормальном состоянии не синтезируют нейротрофический фактор, но модифицируются для продуцирования усечённого ΟΌΝΡ, или клетки, способность которых продуцировать ΟΌΝΡ повышена в результате трансформации полинуклеотидом, обеспечивающим экспрессию и секрецию усечённого ΟΌΝΡ-белка. Чтобы свести к минимуму потенциальную иммунологическую реакцию больных на введение чужеродного ΟΌΝΡ других видов, предпочтительно, чтобы клетки были человеческого происхождения и продуцировали усечённый ΟΌΝΡ-белок человека.

Имплантированные клетки могут быть помещены в капсулы, чтобы избежать проникновения клетки в ткани мозга. Клетки человека или животного могут быть имплантированы больным в биосовместимой полупроницаемой полимерной оболочке или мембране, которая делает возможным транслокацию усечённого ΟΟΝΕ-белка. но предотвращает разрушение клеток иммунной системой больного или другими факторами окружающей ткани. Или же собственные клетки больного, трансформированные ех у1уо, чтобы продуцировать усечённый ΟΌΝΡ, могут быть имплантированы больному непосредственно без такой оболочки.

Методология инкапсулирования в мембрану живых клеток известна специалисту в данной области и, следовательно, приготовление инкапсулированных клеток и их имплантация больному могут быть легко осуществлены. См., например, патенты США №№ 4,892,538,

5,011,472 и 5,106,627, которые приведены здесь в качестве ссылки. Способ инкапсулирования живых клеток также описан в опубликованной заявке АО 91/10425 (АеЫксйет е! а1.), которая приведена здесь в качестве ссылки. См. также опубликованную заявку АО 91/10470 (АеЫксйет е! а1.), Аши е! а1., Ехрег. №ито1., 113:322-329, 1991; АеЫксйет е! а1., Ехрег. №ито1., 111:269275, 1991; Тгексо е! а1., А8А1О, 38:17-23, 1992, которые приведены здесь в качестве ссылки.

Возможна также генная терапия т у1уо на основе усечённого ΟΌΝΡ-белка, при этом нуклеотидная последовательность, кодирующая усечённый ΟΌΝΡ-белок, вводится непосредственно больному. Например, нуклеотидная последовательность, кодирующая усечённый ΟΌΝΡ-белок, вводится в клетку-мишень с помощью местной инъекции конструкции нуклеиновой кислоты с или без соответствующего вектора-переносчика, например, адено-ассоциированного вируса. Альтернативные вирусные векторы включают, но не ограничиваются указанными: векторы ретровируса, аденовируса, вируса герпеса и папилломы. Физический перенос может быть осуществлен т у1уо с помощью местной инъекции заданной конструкции нуклеиновой кислоты или другого подходящего вектора-переносчика, содержащего нужную нуклеотидную последовательность; переносом, опосредованным липосомой; непосредственной инъекцией (депротеинизированная ДНК); переносом, опосредованным рецептором (комплекс лиганд-ДНК); или бомбардировкой микрочастицами (генное ружьё).

Описанные препараты усечённого ΟΌΝΡбелка можно применять также и в ветеринарии, и термин больной надо понимать в широком смысле. При применении в ветеринарии интервалы между инъекциями должны быть такими же, как описано выше.

В качестве средства дополнительной характеристики усечённых ΟΌΝΡ-белков по данному изобретению могут применяться антитела, которые связываются с усечённым ΟΌΝΡбелком так, как с эпитопами в Х-[Су8⁴¹-Сук¹³³]Υ аминокислотной последовательности. Специалист в данной области может при помощи известных способов получить антитела моноклональной или поликлональной сыворотки, или рекомбинантные антитела, которые специфически распознают и связываются с различными белками, кодируемыми аминокислотными последовательностями по данному изобретению. Такие антитела можно затем применять для очистки и определения природы усечённого ΟΌΝΡ-белка. Или же антитела можно применять в качестве терапевтических ингибиторов белков, на которые они направлены.

Другие аспекты и преимущества данного изобретения будут понятны после рассмотрения следующих примеров. Пример 1 иллюстрирует экспрессию зрелого ΟΌΝΡ в клеточной системе млекопитающего и получение усечённого ΟΌΝΡ-белка. Пример 2 относится к экспрессии зрелого ΟΌΝΡ в бактериальной клеточной системе. Пример 3 касается экспрессии различных усечённых ΟΌΝΡ-белков в бактериальной клеточной системе. В примере 4 сравнивается биологическая активность зрелого ΟΌΝΡ-белка и усечённого ΟΌΝΡ-белка в анализе на нейротрофическую активность дофаминэргических нейронов.

Примеры

Пример 1. Экспрессия зрелого человеческого ΟΌΝΡ в клетках СНО и очистка полученного из клеток СНО усечённого ΟΌΝΡ-белка.

Материалы.

Следующие материалы использовались при экспрессии человеческого ΟΌΝΡ в СНОклетках с дефицитом дигидрофолатредуктазы (СНОб^- клетки; например, как описано иг1аиЬ аиб Сйаыи, Ргос. №111. Асаб. 8ск, И8А 77(7):4216-4220 (1980)).

СНОб^--среда содержала: модифицированную по способу Дульбекко среду Игла (ΌΜΕΜ)с высоким содержанием глюкозы (Οί^ο/ΒΚΌ); 5% эмбриональная бычья сыворотка (НуС1опе);

заменимые аминокислоты ΜΕΜ (1%) (Οί^ο/ΒΚΌ); гипоксантин/тимидин (1%) (Οί^ο/ΒΚΌ); и глутамин/пенициллин/стрептомицин (1%) (1гу1пе 8с1епбйс).

Элективная избирательная среда содержала: ΌΜΕΜ (с высоким содержанием глюкозы); 5% диализованную эмбриональную бычью сыворотку (НуС1опе); ΜΕΜ заменимые аминокислоты; и глутамин/пенициллин/стрептомицин.

2Х ΗΕΡΕδ-буферизованный физиологический раствор (НБ8) содержал: 280 мМ №С1; 10 мМ КС1; 1,5 мМ №-ьНРО₄; 12 мМ декстрозы; и 50 мМ НЕРЕ8.

Т ^-буферизованный физиологический раствор плюс Т\гееп (ТБ8Т) содержал: 137 мМ №С1; 20 мМ Тгй/НС1 рН 7,5; и 0,1% Рмееп-20.

Способы.

Трансфекция и отбор.

Клетки СНОб^- (пассаж 20) засевали в 60 миллиметровые плашки с культурой ткани (Ра1соп) при плотности 8· 10⁵ клеток на плашку в СНОб^--питательной среде. На следующий день примерно за три часа до трансфекции среду в клетках заменяли свежей.

Плазмидную конструкцию, содержащую к ДНК соответствующую ΟΌΝΡ, получали хорошо известными методами. Например, плазмидная конструкция ρΌ8Ρα2 была приготовлена в соответствии со способом, описанным в заявке США № 08/501,904, поданной 29 марта 1990 г. (см. также европейская патентная заявка № 90305433, № публикации ЕР 398753, подана 18 мая 1990 г. и АО 90/14363 (1990), которые приведены здесь в качестве ссылок. Пример плазмидной карты, которая иллюстрирует структурную организацию вектора, изображена на фиг. 2. Специалистам в данной области будет понятно, что также могут быть использованы многие нуклеотидные последовательности, кодирующие зрелый ΟΌΝΡ-белок, например, последовательности, изображённые на фиг. 1, 3 и 4.

НшбШ-ХЬа1 ДНК-фрагмент, содержащий кодирующие последовательности человеческого ΟΌΝΡ и консенсусные последовательности трансляции Козака, ССАСС(АТС), был получен расщеплением рестриктазой из экспрессирующего вектора на основе рсОХА3 (1пуЦгодеп. 8ап О1едо, СА). Фрагмент ДНК непосредственно клонировали в ρΌ8Κα2, усеченную Нтб111/ХЬа1. Образовавшуюся плазмиду обозначили р8А5. Перед трансфекцией плазмидную ДНК р8А5 перевели в линейную форму по сайту ΡυνΙ.

ρΌ8Ρα2 (фиг. 2) представляет собой производную от плазмиды рСО (Окауата апб Бегд, Μο1. Се11 Бю1. 3:280-289, 1983) с тремя основными модификациями: (ί) сигнал полиаденилирования 8У40 заменили сигналом αсубъединицы бычьего фолликулярного стимулирующего гормона α-ЬΡ8Н (СообдШ е! а1., №.1с1е1с Ас1б§ Кек. 11:6873-6882, 1983); (ίί) мы47 шиный миниген дигидрофолатредуктазы (Саххег е! а1.. Ргос. Асаб. 8ск 79:6522-6526. 1982) внедрили ниже (бοтеихί^еат) кассеты экспрессии, чтобы были возможны отбор и амплификация трансформанта; и (ш) фрагмент протяжённостью 267 п.о., содержащий К-элемент и часть и5 последовательностей длинного концевого повтора (ЬТК) вируса человеческого Тклеточного лейкоза типа I (НТЬУ-Ι) был клонирован и внедрен между промотором 8У40 и сигналами сплайсинга, как описано ранее (ТакеЬе е! а1.. Μο1. Се11 Вю1. 8:466-472. 1988).

Были приготовлены растворы ДНК с конечной концентрацией ΟΌΝΕ-плазмидной ДНК 3.0 мг/плашка, носитель геномной ДНК мышиной почки (ί,Ίοη^Ιι) 7.0 мг/плашка, 2.5 М СаС1₂25 мкл/плашка и стерилизованная дистиллированная вода до конечного объема 250 мкл/плашка. Растворы ДНК, содержащие рО8Иа.2-вектор ДНК или только носитель ДНК, были подобным образом приготовлены в качестве положительного и отрицательного контроля соответственно. Растворы ДНК добавляли по каплям к равному объему к 2Х НЕРЕ8буферизованному физиологическому раствору при пропускании воздуха (в виде пузырьков) через раствор. Растворы ДНК/НВ8 термостатировали при комнатной температуре в течение 30 мин.

Среду удаляли из клеточных культур СН0б^- и в каждую плашку добавляли 500 мкл раствора ДНК. Плашки термостатировали при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего в каждую плашку добавляли СН0б^--среду (5.0 мл). Затем плашки термостатировали при 37°С в течение ночи.

На следующий день среду заменяли свежей СНОб^--средой. На следующий день, когда клетки достигли состояния монослоя, культуры обрабатывали трипсином и перенесли в 100 миллиметровые плашки (ΕηΕοη) при соотношении 1 Х 60 мм плашка к 8 Х 100 мм плашек. Клетки поместили в селективную среду. Подпитку культур свежей средой повторяли каждые два-три дня.

Через 15 дней колонии трансфицированных клеток выделяли, используя стеклянные цилиндры для клонирования, обрабатывали трипсином и переносили в 24-луночные планшеты (ΕηΕοη). В целом 40 колоний было выделено из ООМР/р8^5-трансфицированных клеток. Оставшиеся в плашках клетки обрабатывали трипсином, объединяли и переносили в 100 миллиметровые плашки (один пул для каждой конструкции ДНК).

Скрининг трансформированных клеток.

Культуры в 24-луночных планшетах и пулах выращивали до состояния монослоя, в это время питательную среду удаляли и заменяли на бессывороточную среду (400 мк/лунка или 4 мл/плашка). Клетки термостатировали в течение 48 ч и кондиционированную среду собирали.

Образцы кондиционированной среды анализировали на экспрессию ΟΌΝΕ-белка вестернблоттингом. Аликвоты кондиционированной среды (20 мкл или 40 мкл) разбавляли буфером для нанесения электрофоретического образца (с или без β-меркаптоэтанола). Образцы, содержащие β-меркаптоэтанол, кипятили три минуты (условия восстановления). Как восстановленные, так и невосстановленные образцы делили на 16% гелях трис-глицина (Νο\όχ). Гели электроосаждались на нитроцеллюлозных фильтрах (8сЫе1сйег аиб 8с11ие11 ВА-83. 0.2 мк). Их промывали ТВ8Т и затем термостатировали в блокирующем растворе 5% сухого молока (Сагпаίίοη) в ТВ8Т в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем фильтры обрабатывали ΟΌΝΕ антисывороткой (кроличьи поликлональные антисыворотки, специфичные к ΟΌΝΕ из Е. ^1ί; 1:1000 в 5% молоке/ТВ8Т) в течение одного часа при комнатной температуре. Затем фильтры промывали с помощью ТВ8Т и далее 1% молока/ТВ8Т (1 Х 10 мин и 2 X 5 мин). Далее обрабатывали конъюгатом вторичного антитела антикроличьей 1д-лошадиной сыворотки с пероксидазой хрена (1:15.000 в 1% молоко/ ТВ8Т) в течение 20 мин. Фильтры промывали ТВ8Т 1 Х 20 мин и 2 Х 10 мин с последующей обработкой реагентами ЕСЬ (Ашегхйаш) в течение одной минуты и экспозицией с НурегШшЕСЬ (Ашегхйаш).

Следующий процесс описывает очистку СНО-экспрессируемого ΟΌΝΕ и обрезанного ΟΌΝΕ-гомодимера из СНО из одного литра кондиционированных сред. Из-за значительного воздействия в СНО-среде протеазы, разрезающей цепь при остатке 31. методика может включать применение ингибитора протеазы в процессе очистки.

Стадия 1. Гель-фильтрация.

Бессывороточную кондиционированную среду готовили с содержанием 20 мМ 2-[Νморфолино]этансульфоната (МЕ8). рН 6.0. добавляя одну пятую объема 1-молярного МЕ8. рН 6.0. Двадцать пять миллилитров гранулированной смолы 8Р 8ег11агохе В1д Веаб (Рйагшас1а). уравновешанную с 20 мМ МЕ8. рН 6.8. добавляли и перемешивали при 4°С в течение одного часа. Смолу собирали, декантируя после отстаивания кондиционированную среду. Декантированную среду фильтровали через дисковый фильтр из фритты (стеклянный фильтр) для регенерации всей неосажденной смолы. Осажденную смолу и смолу, регенерированную фильтрованием, вновь суспендировали и выливали в колонку диаметром 2.5 см, промывали тремя объёмами колонки 0.15 М №С1. 20 мМ МЕ8. рН 6.0 (А-буфер). Белок элюировали 300 мл в градиенте от А-буфера до 1.0 М №С1. 20 мМ МЕ8. рН 6.0 (В-буфер) при скорости потока 0.2 объёма колонки/минута при мониторинге поглощения при 280 нм. Собирали фракции, содержащие 1,1 объёма колонки. Наличие ΟΏΝΕ во фракции определяли вестернблоттингом. Фракции, содержащие ΟΏΝΕ, собирали для дополнительной очистки (пул). ΟΏΝΕ элюировали в градиенте концентраций от 0,3 до 0,6 М ЫаС1.

Стадия 2. ВЭЖХ С4 хроматография.

В объединённые фракции с ΟΏΝΕ (пул) из стадии 1 добавляли трифторуксусную кислоту (ТЕА) так, чтобы её концентрация была 0,1% (ν/ν по объему), фильтровали в вакууме через фильтр 0,45 микрон и помещали на колонку Ууйас С4 (0,46 Х 25 см), кондиционированную с 10% водным ацетонитрилом, 0,1% ТЕА (Абуфер). Белок элюировали в линейном градиенте концентрации 2%/минута в течение 50 мин от А-буфера до 90% водного ацетонитрила, 0,1% ТЕА (В-буфер) с измерением поглощения при 280 нм. Собирали фракции один миллилитр и наличие ΟΏΝΕ определяли вестерн-блоттингом. ΟΏΝΕ элюировали в градиенте концентрации между 45% и 55% ацетонитрила. Фракции сушили в вакууме.

Стадия 3. Высокоэффективная 8 хроматография.

Фракции, содержащие ΟΏΝΕ из стадии 2, растворяли в одном миллилитре 0,1 М №С1. 10 мМ Тпк, рН 8,0 и наносили на колонку Т8К-Ое1 5\УР высокого разрешения 8 (Токо Наак) размером 0,75 X 7,5 см. Разделение проводили в градиенте концентрации 0,4%/минута от 0,15 М ЫаС1, 10 мМ Тпк, рН 8,0 (А-буфер) до 1,0 М ЫаС1, 10 мМ Тпк, рН 8,0 (В-буфер) в течение 50 мин при скорости тока 1 мл/мин. Одноминутные фракции собирались при измерении абсорбции при 280 нм. При 35% В-буфера градиент изменяли до 6,5%/минута через 10 мин. Вестерн-блоттинг фракций показал наличие четырёх главных СОНР-компонентов. Три из компонентов элюировали в градиенте 0,4%/минута и четвёртый элюировал в градиенте 6,5%/минута. Делали пулы сходных компонентов и подвергали секвенированию. Анализ секвенированием определил пул примерно 29-36 кО как [Агд³²11е¹³⁴] усечённый СЭНР-белок. Компонент при примерно 38-40 кО был идентифицирован как гетеродимер [Агд³²-11е¹³⁴] усечённый

СЭНР/зрелый СЭНР. Наконец, компонент около 41-44 кЭ, выделенный с последней порцией градиента, был определен секвенированием как гомодимер зрелого ΟΏΝΕ.

Пример 2. Зрелый человеческий ΟΏΝΕ, продуцированный в Е. со11.

Экспрессию зрелого человеческого ΟΏΝΕ бактериальными клетками можно достичь в соответствии со способом, описанным Ып е1 а1. в заявке США № 08/182,183, поданной 23 мая 1994 г. и РСТ/И8 92/07888, поданной 17 сентября 1992 г. (№0/92/10227), а также ЕР 610 254, которые приведены здесь в качестве ссылок. На основании описания настоящего изобретении специалист в данной области поймёт, что мно жество материалов и методов можно использовать или адаптировать для соответствующей экспрессии Е. со11 или другими бактериальными клетками. Например, в процессе экспрессии могут быть использованы чередующиеся полинуклеотиды, такие как изображены на фиг. 1, 3 и 4.

Повторное скручивание (разупорядочивание) и очистка экспрессированного зрелого ΟΏΝΕ.

Трансформированные клетки процессировали при 5°С (если не указано иначе) следующим образом: клеточную пасту (30 г) суспендировали в конечном объёме 200 мл, используя 25 мМ Трис, рН 8,5, содержащий 5 мМ БОТА, получая в результате 15%-ную (по объёму) клеточную кашицу. Клетки тщательно диспергировали, используя ручной гомогенизатор Вюкрес с низким сдвигом. Кашицу дважды пропускали через микрофлюидизатор при 14,500 рк1 с целью разрушить клетки и выделить тельца включения. Образовавшийся гомогенат затем центрифугировали в течение 30 мин при 16,000хд. Осадок телец включения, образовавшийся в результате центрифугирования, промывали повторным суспендированием в охлаждённой воде до конечного объёма 240 миллилитров, используя гомогенизатор Вюкрес, как и ранее, с образованием кашицы. Образцы этой кашицы оставляли для ВЭЖХ-анализа уровня экспрессии ΟΏΝΕ. Оставшуюся кашицу центрифугировали в течение 30 мин при 16,000хд. Надосадочную жидкость сливали и добавляли небольшое количество холодной воды в сосуд для центрифугирования и осторожно перемешивали, чтобы удалить независимо образованный мембранный слой на поверхности осадка телец включения. Осадок снова суспендировали с помощью гомогенизатора Вюкрес с количеством воды, достаточным, чтобы получить концентрацию ΟΏΝΕ 2 ммл. Затем тельца включения растворяли, смешивая конечную суспензию телец включения (25 мл) с 8 М гуанидин НС1 (25 мл), содержащим 180 мМ цистеина НС1 и 50 мМ Тпк НС1, рН 8,7. Смесь для растворения перемешивали при 25°С от 60 до 90 мин, после чего её выливали при перемешивании в 2 М мочевину (450 мл, при 5°С), содержащую 2 мМ Тпк НС1, рН 8,75 и 0,2 М гуанидин НС1. Эта смесь для разупорядочивания медленно перемешивалась при 5°С в течение 72 ч.

Разупорядоченный ΟΏΝΕ частично очищали следующим образом: 20 мМ буфера ацетата натрия (250 мл, рН 5) при 5°С добавляли при быстром перемешивании к разупорядоченной смеси и рН доводили до 5 ледяной уксусной кислотой. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием при 13,000хд в течение 45 мин при 5°С. Надосадочную жидкость от центрифугирования применяли в качестве загружаемого (наносимого) раствора на следующей стадии очистки, включающей катионообменную хроматографию с 8Р-смолой в виде крупных гранул (Ркагтата). Колонка функционировала при 5°С с 20 мМ раствором ацетата натрия в качестве буферной системы для уравновешивания, промывания и элюирования. Смола для насадки (5 мл) была дезинфицирована (промыта) 5 объёмами колонки (Ον) 0,2 Ν ΝηΘΗ и затем уравновешена с ацетатным буфером (5 Ον). Загружаемый раствор (190 мл) наносили на колонку при 0,5 СУ/минута с последующим промыванием с помощью 10 Ον ацетатного буфера при той же скорости потока. Затем ΟΌΝΕ элюировали со смолы 20 Ον №1С1 в линейном градиенте концентрации от 0,3 М до 0,9 М в ацетатном буфере при скорости потока 0,1 СУ/минута. Элюат с колонки проверяли (проводили мониторинг) при 280 нм и собирали фракции, которые анализировали с помощью 8Э8-РЛСЕ. Фракции, содержащие ΟΌΝΕ, объединяли, начиная от фронта ΟΌΝΕ-пика при 10% от веса пика до хвоста пика при 10% от веса пика. Белок в этом пуле был исключительно ΟϋΝΕ и в зависимости от используемого в процессе штамма содержал от 34 до 12% примесей в виде модифицированных форм Ο9ΝΕ. Пул затем подвергали диализу против буфера РВ8 или буфера другого состава и в некоторых случаях уменьшали объём ультрафильтрацией до 25 мг/мл. Как ΟΌΝΕ дикого типа, так и его аналоговые формы, очищенные таким способом, были охарактеризованы ВЭЖХ с обратной фазой, катионообменной (хроматографией) ВЭЖХ, масс-спектрометрией и уровнями эндоксина для сравнения частоты препарата в зависимости от соответствующих применяемых для его получения штаммов.

Пример 3. Получение усечённого ΟΌΝΕ в Е. сок методом рекомбинантной ДНК.

Образцы усечённых ΟΌΝΕ-белков были получены практически в соответствии с методами, описанными в Ьт е1 а1. (заявка США № 08/182,183, поданная 23 мая 1994 г., см. выше). Также могут быть использованы другие бактериальные материалы и способы экспрессии, как описано выше. Е. со11-экспрессированные усечённые ΟΌΝΕ-белки включали [Рго²³-11е¹³⁴], [Агд³²-11е¹³⁴] и [С1у³³-11е¹³⁴] усечённые ΟΟΝΕбелки. как изображено на фиг. 5, 6 и 7 соответственно. Полинуклеотиды, кодирующие эти иллюстрированные примеры усечённых ΟΌΝΕбелков, были построены так, как изображено на фиг. 5, 6 и 7, но также можно использовать такие полинуклеотиды, как изображенные на фиг. 1, 3 и 4. Полинуклеотиды конструировали стандартными РСВ-методами, как описано в РСК Тескпо1оду, Рпс1р1ек апб Аррксабопк Гог ^NЛ Лтр1^Πса1^оп. Нету А. Егкск, еб., 81оск1оп Ргекк, ΝΥ, 1989 (СкарТег 6, Иктд РСК 1о Епдтеег ^NЛ), которое приведено здесь в качестве ссылки.

Пример 4. Биоанализ на дофаминэргическую нейронную нейротрофическую активность.

Е. сок-экспрессируемые [Рго²³-11е¹³⁴], [Агд³²-11е¹³⁴], [С1у³³-11е¹³⁴] и [Ьук³⁷-11е¹³⁴] усечённые ΟΌΝΕ-белки по примеру 3 и полученный из СНО [Агд³²-11е¹³⁴] усечённый ΟΌΝΕ по примеру 1 оценивались качественно по их способности стимулировать усвоение (поглощение) дофамина черным веществом дофаминэргических нейронов.

Материалы.

Следующие материалы использовали при анализе оценки выживаемости дофаминэргических нейронов в присутствии усечённых ΟΌΝΕбелков:

Клеточная культуральная среда.

Модифицированная по Дульбекко среда Игла с высоким содержанием глюкозы (ПМЕМ; № в каталоге 11965-092), Среда Хэма (Нат, Ε12; № 11765-012), Среда Лейбовица Ь-15 без карбоната натрия (№ 41300-039), добавка к среде В27 (№ 17504-010), пенициллин/ стрептомицин (№ 15070-014), Ь-глутамин (№ 25030-016), физиологический раствор, буферизованный фосфатом Дульбекко (Э-РВ8; № 14190-052), сбалансированный солевой раствор Хэнка (Напк) с солями кальция и магния (НВ88; № 24020-026), Ν-2-гидроксиэтилпиперазин-Ы'2-этансульфоновая кислота (НЕРЕ8; № 15630015), мышиный ламинин (№ 23017-015) и альбумин бычьей сыворотки фракция V (№ 110-18017) все от С1ВСО, Сгапб 1к1апб, ΝΥ. Термоинактивированная лошадиная сыворотка от НуС1опе, Бодап, Шак. Сопа1Ьитт (С-7786), полиЬ-орнитингидробромид (Р-3655), бычий инсулин (1-5500), человеческий трансферрин (Т2252), путресцин (Р-6024), прогестерон (Р6149), селенит натрия (8-9133), метризамид (М3383) поставлены 81дта Скет1са1 Сотрапу, 8а1п1-Ьошк, МО. Папаин, дезоксирибонуклеаза I (ДНК-аза) и овальбумин (диссоциациирующая система папаина) поставлялись \Уог11ипд1оп Вюскетка1к, Ει^ΗΜ, Ν6.

Стерильные 96-луночные микропланшеты Εа1сои (№ 3072), пластмассовая посуда для тканевых культур и полипропиленовые пробирки для центрифуги поставлены Вес1оη-^^ск^ηκоη. Охпагб, СА. Мшс ЬаЬ-Тек покровные стекла для камер для тканевых культур (культуральных камер) (№ 136439) были от Вах1ег, 1гуте, СА; 20 рм (№ 460) нейлоновые сита от Те1ко, Е1ткЕогб, ΝΥ; и 4 препаровальные пинцеты и 4 анатомические ножницы были от ВоЬох 8игд1са1, \Vаκ11^ηд1оη. ОС.

Антитела и сопутствующие реагенты.

Поликлональные кроличьи антитела, специфичные к антитирозингидроксилазе (ТЕ101) были от Еидепе Теск, К1бдейе1б Рагк, Ν1; поликлональные кроличьи антитела, специфичные к антинейронспецифичной енолазе (Ν8Β, АВ951) были от Скеткоп, Тетеси1а, СА; и биотинили рованный козий антикроличий 1дС и пероксидаза, конъюгированная с комплексом авидин/биотин (АВС Е11!е; набор Уес!ак!ат РК6100) были от Уес!ог ЬаЬога!опек, ВшЕпдате, СА. 3,3'-диаминобензидин был от Сарре1 ЬаЬота!опек, \Уек( Сйек!ег, РА. 8ирегЬ1оскблокирующий буфер - в РВ8 (№ 37515) - был от Р1егсе Сйет1са1 Сотрапу, ЕоскЕогб, 1Ь. Тритон Х-100 (Х100), нонидет Р-40 (№ 6507) и перекись водорода (30% по объёму; Н1009) были от 81дта. Ингибитор поглощения дофамина СВЕ12909 (0-052) от ЕВ1, ХаПск, т. ³Н-дофамин (тритированный дофамин, ΝΕ-131; 21 О/ммол) от Νον Епд1апб ШЛеаг, Вок!оп, МА. Орбрйаке 8ирегт1х сцинтилляционный коктейль от \Уа11ас, Тигки, Е1п1апб. Белые микропланшеты У1е\\!а1е-96 (№ 6005182) от Раскагб 1и8!гитеп!к Сотрота!юп, Мепбеп, СТ. Все другие реагенты получены от 81дта Сйет1са1 Сотрапу, если не указано иначе.

Приготовление питательной среды.

Основную питательную среду готовили в виде смеси 1:1 ОМЕМ и среды Е12 и дополняли добавкой В27, добавляемой в виде исходного раствора 50-кратной концентрации. Ь-глутамин добавляли до конечной концентрации около 2 мМ, пенициллин около 100 мед/л и стрептомицин около 100 мг/л. Термоинактивированную лошадиную сыворотку добавляли до конечной концентрации около 15%. После смешения рН доводили примерно до 7,3 и питательную среду хранили при 4°С. Свежую среду готовили непосредственно перед употреблением, чтобы свести к минимуму межэкспериментальные расхождения. Для уменьшения до минимума адсорбции белка применяли пластиковые пипетки и контейнеры.

Подложка для культивирования.

Чтобы способствовать оптимальному связыванию образовавшегося субстрата нейронов и нейритов, поверхности микропланшетов (подложка для культивирования) модифицировали, последовательно покрывая пленкой поли-Ьорнитина и ламинина следующим образом. Поверхности планшетов целиком покрывали стерильным раствором поли-Ь-орнитина с концентрацией 0,1 мг/мл в 0,1 М борной кислоте (рН 8,4) в течение, по меньшей мере, одного часа при комнатной температуре с последующим стерильным промыванием водой Бирет-Ц. Промывную воду отсасывали, добавляли раствор мышиного ламинина в РВ8 с концентрацией 1,0 мкг/мл и термостатировали при 37°С в течение двух часов. Эти процедуры проводили непосредственно перед применением микропланшетов, чтобы быть уверенным в воспроизводимости результатов.

Приготовление эмбриональных культур черного вещества крысы.

В качестве источника дофаминэргических нейронов черного вещества использовали мозг эмбрионов крыс. Использовали крыс 8ргадие

Эа\\!еу в определенный момент беременности при возрасте эмбриона 15 дней. В эксперименте участвовало максимум 36 зародышей (около трёх пометов). Беременных крыс убивали, экспонируя с СО2, их брюшную полость вскрывали анатомическими ножницами и зародыши извлекали из матки. Мозг зародыша вскрывали, очищали от крови и оболочек и, используя хорошо известные анатомические ориентиры, рассекали вентральный оболочечный участок, содержащий чёрное вещество (А1!тап апб Вауег, А!1ак о£ Ргепа!а1 Еа! Вташ Оеуе1ортеп!, СЕС Ргекк, Воса Еа!оп, ЕЬ, 1995). Ткани собирали в охлажденный льдом О-РВ8, переносили в 10 миллилитров среды для диссоциации (120 единиц папаина и 2000 единиц ДНК-азы в НВ88) и затем термостатировали в течение 45 мин примерно при 37°С на роторной качалке, примерно при 200 грт (об/мин). Клетки затем диспергировали, растирая оплавленными на огне пастеровскими пипетками, просеивали через 2 мкм сито №!ех, отделяя недиссоциированные ткани и центрифугировали в течение пяти минут при 200хд на медицинской центрифуге 1ЕС. Образовавшийся клеточный осадок снова суспендировали в НВ88, содержащем овальбумин и около 500 единиц ДНК-азы, находящегося в виде слоя на поверхности 4% раствора овальбумина (в НВ88), и центрифугировали в течение 10 мин при 500хд. Конечный осадок снова суспендировали в питательной культуральной среде полного состава (см. выше), доводили примерно до 28000 клеток/мл и засевали в виде аликвот (90 мкл) в 6 миллиметровые лунки 96-луночных планшетов, предварительно покрытых плёнкой полиорнитина и ламинина. Прикрепление клеток происходило быстро, и эффективность засевания составляла примерно 75%.

Иммуногистохимия дофаминэргических нейронов.

Был применен непрямой иммунопероксидазный способ, описанный Ьошк е! а1. (1. Рйаттасо1. Ехр. Тйетар., 262:1274-1283, 1992; 8аепсе, 259:689-692, 1993) с небольшими изменениями, представленными ниже, для того, чтобы охарактеризовать дофаминэргические нейроны в культурах чёрного вещества. Культуры фиксировали около 30 мин при комнатной температуре с 4% параформальдегида в О-РВ8, рН 7,4 с последующим трёхкратным промыванием в ΌРВ8 (200 мкл на 6 миллиметровую лунку). Фиксированные культуры затем термостатировали в 8ирегЬ1оск-блокирующем буфере в РВ8, содержащем 1% ΝΓ-40 для повышения проникающей способности антител. Затем вводили первичные кроличьи антитела, специфичные к антитирозингидроксилазе в разведении примерно 1:2000 в том же буфере и термостатировали в течение одного часа при 37°С на роторной качалке. После трёх промываний О-РВ8 связанные антитела определяли, применяя козий-антикроличий биотинилированный 1дС в разведении примерно

1:500; эти вторичные антитела термостатировали с клетками в течение примерно одного часа при 37°С. Затем клетки промывали трижды ΌРВ8 и вторичные тела определяли комплексом авидин-биотин-пероксидаза, разбавленным

1:500, и клетки термостатировали в течение примерно 45 мин при 37°С. После еще трех промываний Ό-ΡΒ8 культуры реагировали в течение 5-20 мин в растворе 0,1 М ΤΠ5-ΗΟ1. рН 7,4, содержащем 0,04% 3,3'-диаминобензидин (НС1)4, 0,06% ΝίΟ1₂ и 0,02% перекиси водорода.

Определение выживаемости нейронов.

Культуры черного вещества фиксировали и окрашивали с использованием иммунной метки, как описано выше, а затем исследовали с помощью просветлённой оптики при 200 х увеличении. Число нейронов, окрашенных тирозингидроксилазой, считали во всех 6 миллиметровых лунках 96-луночных планшетов. Жизнеспособные нейроны характеризовались, как имеющие правильной формы клеточное тельце с главным аксоноподобным отростком и несколькими дендритоподобными отростками. Нейроны, проявляющие признаки вырождения, такие как неправильные перикарионы с вакуолями или (разорванные) фрагментированные нейриты, не учитывались (большинство вырожденных нейронов, однако, отделялись от подложки для культивирования). Число дофаминэргических нейронов выражали либо в виде ТНположительных нейронов/6 мм-вая лунка или в виде отношения плотности дофаминэргических нейронов с измененной четвертичной структурой к плотности контрольных дофаминэргических нейронов.

Определение поглощения дофамина.

Поглощение дофамина определяли в культурах чёрного вещества 15-дневных эмбрионов крыс, которые помещались в белых микропланшетах У1е\\Р1а1е-96. Культуры промывали предварительно нагретым буфером для поглощения (около 100 мкл), который состоит из модифицированного раствора Кребса-Рингера, рН 7,4, содержащего около 120 мМ ЫаС1, 4,7 мМ КС1, 1,8 мМ СаС1₂, 1,2 мМ М§80₄, 32 мМ ЫаΗΡ0₄, 1,3 мМ ΕΌΤΑ и 5,6 мМ Ό-глюкозы. Буфер для поглощения также содержал 1 мМ аскорбиновой кислоты и 5 мкМ паргилина для предотвращения окисления дофамина. Клетки предварительно термостатировали при 37°С в течение 10 мин в буфере для поглощения. Затем добавляли тритированный дофамин (³Η-ΌΑ, 21 С1/ммол) к культурам чёрного вещества при концентрации примерно 50 нм в 75 мл буфера для поглощения, и культуры термостатировали в течение примерно 60 мин при 37°С. Неспецифическое поглощение дофамина определяли, термостатируя культуры с буфером для поглощения, содержащим ингибитор поглощения дофамина ΟΒΚ-12909 (1 мкМ). Неспецифическое поглощение составляло примерно менее одного процента общего поглощения. Опреде ление поглощения прекращали отсасыванием термостатируемой среды с последующими тремя быстрыми промываниями ледяным буфером для поглощения (около 120 мкл). Затем клетки лизировали, добавляя Орйрйаке 8ирегш1х сцинтилляционный коктейль (200 мкл), и определяли радиоактивность сцинтилляционной спектрометрией, используя счётчик Аа11ас для МюгоЬе1аР1и8 96-луночного планшета (т.е. поглощение дофамина, считая сцинтилляции трития, оставшегося в культурах). Результаты выражали либо в виде брт/6 мм-вая лунка, или в виде отношения культур с изменением скручивания к контрольным культурам.

Анализы.

Выживаемость (жизнеспособность) и морфологическое развитие дофаминэргических нейронов Культуры чёрного вещества эмбрионов крыс на 15 день развития (Е15), обогащённые дофаминэргическими нейронами, применяли для демонстрации действия усечённых ΟΌΝΕбелков на жизнеспособность дофаминэргических нейронов. Культуры выращивали в 96луночных планшетах с покрытием из полиорнитина и ламинина до шести дней в отсутствие или в присутствии различных концентраций (в интервале от примерно 1 нг/мл до примерно 10 нг/мл) следующих белков: Е. сой-экспрессированный зрелый Η6ΌΝΕ; Е. сой-экспрессированные [Рго²³-11е¹³⁴], [Агд³²-11е¹³⁴], [С1у³³-11е¹³⁴] и [Ьу8³⁷-11е¹³⁴] усечённые ΟΌΝΕ-белки; экспрессированный СНО-клетками зрелый 11ΟΌΝΕ; и [Агд³²-11е¹³⁴] усечённый ΟΌΝΕ-белок из СНОклеток. Культуральная среда состояла из ΌΜΕΜ/Ε12, дополненных 15% термоинактивированной лошадиной сывороткой (Е15 культуры) или 2,5% термоинактивированной лошадиной сывороткой, Ό-глюкозой, ΗΕΡΕ8, инсулином и трансферрином (Р6 культуры). В качестве маркера для дофаминэргических нейронов использовали иммунологическое окрашивание тирозингидроксилазой (ТН), скоростьлимитирующий фермент при биосинтезе дофамина. Так как норадренэргические нейроны первичного заднего мозга (третьего мозгового пузыря) также окрашиваются ТН (ТНпозитивные), были предприняты большие предосторожности, чтобы вскрыть (рассечь) область, ограниченную вентральной оболочкой среднего мозгового пузыря и чтобы избежать нижних участков, содержащих тельца норадренэргических клеток. Через шесть дней Е15культуры обычно содержали около 70% нейронов, как определено специфическим иммунологическим окрашиванием нейронов енолазой (описанным выше) и 30% не нейронных клеток (которые на вид были уплощённые, темнофазные); дофаминэргические нейроны составляли около 10-15% популяции нейронов.

Через шесть дней культуры фиксировали формальдегидом и окрашивали иммунологически тирозингидроксилазой, маркером, который идентифицирует дофаминэргические нейроны в этих культурах. Все тирозин-гидроксилазпозитивные нейроны, присутствующие в 6 ммвой лунке, считали с помощью просветленной оптики. Для каждых экспериментальных условий анализировали от трёх до шести различных 6 миллиметровых лунок. Результаты выражали в процентах от числа тирозин-гидроксилазпозитивных нейронов в контрольных культурах.

Культуры Е15 чёрного вещества обрабатывали 1,0 нг/мл ΟΌΝΡ, ΟΌΝΡ, экспрессируемого клетками СНО или Е. сой, содержащим примерно на 38% и 27% больше ТН-иммунореактивных нейронов соответственно, чем непрореагировавшие контрольные культуры; это указывает, что оба вида ΟΌΝΡ стимулируют выживание дофаминэргических нейронов. Культуры Е15 чёрного вещества, обработанного усечённым ΟΌΝΡ-белком с концентрацией 1,0 нг/мл, показали подобное увеличение числа ТНпозитивных нейронов в культурах через шесть дней ίη νίΐΓο: 42% для [Агд³²-11е¹³⁴] усечённый ΟΌΝΡ-белка из СНО-клеток; и 26% и 17% для Е. сой-экспрессируемого [Агд³²-11е¹³⁴] и [О1у³³11е¹³⁴] усечённых ΟΌΝΡ-белков соответственно.

Сравнения контрольных культур и культур, обработанных зрелым и усечёнными ΟΌΝΡ-белками, также показали явное влияние всех ΟΌΝΡ-белков на морфологическую дифференцировку дофаминэргических нейронов. Действие [Агд³²-11е¹³⁴] и [О1у³³-11е¹³⁴] усечённых ΟΌΝΡ-белков было идентично действию соответствующих аналогов зрелого ΟΌΝΡ-белка. ТН-иммунореактивные нейроны во всех ΟΌΝΡобработанных культурах имели значительно более сложную и обширную аксонную арборизацию, так же как более высокую степень разветвления аксонов и больший общий размер тела, чем проявляют ТН-позитивные нейроны в контрольных культурах.

Поглощение дофамина.

Поглощение дофамина измеряет число и активность сайтов транспорта с высоким сродством к повторному поглощению дофамина и отражает функциональную дифференцировку дофаминэргических нейронов. Поглощение дофамина измеряли в культурах Е15 чёрного вещества крыс через шесть дней ίη νίίτο с или без зрелого ΟΌΝΡ или усечённых ΟΌΝΡ-белков. В этих культурах поглощение дофамина имело характеристику фармакологического профиля дофаминэргических нейронов, т.е. оно было почти полностью блокировано (более чем на 98%) 1,0 мкМ ОВК-12909 ингибитором транспорта дофамина, специфичным к дофаминэргическим нейронам (ΙΌ50 = 20 нМ). Это указывает на то, что измерения поглощения дофамина не отражают наличия примесей норадренэргических нейронов, которые могут поглощать дофамин с помощью переносчиков норапинэфрина, но не чувствительны к ОВР-12909ингибированию. Действие зрелого ΟΌΝΡ, экс прессируемого клетками СНО и [Агд³²-11е¹³⁴] усечённого ΟΌΝΡ-белка из СНО было идентичным: увеличение примерно 65% с ΕΌ50 с концентрацией около 20 пг/мл. Е. сойэкспрессируемый [Рго -Ьу5 ΔΑδη -11е ] усечённый ΟΌΝΡ-белок, как изображено на фиг. 5, показал увеличение 65% с ΕΌ50 около 40 пг/мл. Действие на поглощение дофамина Е. сойэкспрессируемого зрелого белка и Е. сойэкспрессируемых [Агд³²-11е¹³⁴], [О1у³³-11е¹³⁴] и [Ьу5³⁷-11е¹³⁴] усечённых ΟΌΝΡ-белков было таким же: увеличение около 50% с ΕΌ50 около 50 пг/мл.

Результаты показывают, что усечённые ΟΌΝΡ-белки ведут себя как потенциальные стимулирующие выживаемость и индуцирующие дифференцировку факторы в отношении дофаминэргических нейронов чёрного вещества. В таком качестве они особенно полезны для лечения болезни Паркинсона и неврологического расстройства, характеризуемого пониженной остротой эмоций, замедленностью как произвольных, так и непроизвольных движений мышц, мышечной ригидностью и тремором. Такие симптомы относятся к прогрессирующему вырождению дофамин-продуцирующих нейронов, расположенных в чёрном веществе. Вырождение этих нейронов (дофаминэргических нейронов) приводит к уменьшению дофамина в прилегающей области мозга, называемой полосатым телом.

Список последовательностей (1) СЕМЕНА! ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ:

(Ϊ) АРРШСАМТ: Ни, δγίνί* (ϋ) ΤΙΤΟΕ ОГ ΙΝνΕΝΤΙΟΝ: Тгипсасей (ЗНаХ Св11 Ι,ίηβ-ϋβΓχνβ4 Ыеигоегоркхс Гасхог (ίϋ) ΝϋΜΒΕΗ ОЕ ЗЕОиЕМСЕЗ: 50 (XV) СОКВЕЗРООТЕИСЕ АООКЕЗЗ:

(А) АООВЕЗЗЕЕ: АМСЕМ ΙΝΟ.

' (В) ЗТНЕЕТ: 1840 Ое-Цг/хИапД Οχΰ,νβ (С) ΟΙΤΥ: ТНоизапа Оакз

- (О) 5ТАТЕ: Са1х£©тха (Е) ΟΟϋΝΤΒ.Υ: ϋηίεβά З&асез ©£ Атегхса (Г) ΖΙΡ: 91320 (V) СОМРОТЕН КЕАОАВЬЕ РОНИ:

(A) ΜΕΟΙϋΜ ТУРЕ; Р1орру йхзк (B) СОМРЦТЕН: Ι3Μ РС согорасхЫе (C) ΟΡΕΗΑΤΙΝΟ 3Υ3ΤΕΜ: РС-ОСЗ/МЗ-ООЗ (О) ЗОРТМАНЕ: РасепсХп Не1еазе #1.0, Уегзхоп #1.25 (νί) ΟϋΗΚΕΝΤ ΑΡΡΜΟΑΤΙΟΝ ВАТА:

(A) ΑΡΡΕΙΟΑΤΙΟΝ ΝϋΜΒΕΗ:

(B) РТЫМС ВАТЕ:

(C) С1А331Р1САТХОЫ:

(νίϋ) ΑΤΤΟΗΝΕΥ/ΑΟΕΝΤ ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ:

(A) ΝΑΜΕ: Сиггу, Оапхе! Н.

(B) ΗΕ0Ι3ΤΉΑΤΙ0Ν ΝϋΜΒΕΗ: 32,727 (C) ΗΕΓΕΗΕΝΟΕ/ϋΟΟΚΕΤ ΝϋΜΒΕΗ: А-357 (XX) ΤΕΟΕΟΟΜΜϋΝΙΟΑΤΙΟΝ ΣΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ:

(A) ΤΕϋΕΡΗΟΝΕ: 805-447-8102 (B) ТЕВЕРАХ: 805-499-8011 (C) ТЕЬЕХ:

<2) ΣΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ΓΟΗ 3Ε0 ΙΟ N0:1:

(1) ЗЕОЦЕМСЕ СНАНАСТЕН15Т1СЗ:

(A) ΟΕΝΟΤΗ: 402 Ьазе рахгз (B) ТУРЕ: писХехс аагй (C) 3ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ33Зхпд1е (О) ΤΟΡΟΕΟΟΥ: Ипеаг (ϋ) МООЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ргоеехп (XX) ГЕАТОНЕ:

(A) ΝΑΜΕ/ΚΞΥ: СОЗ (B) ЬОСАТЮЫ: 1. .402 (χχ) ЗЕОЦЕНСЕ 0Е2СЯ1ТТТСМ: 3Ξς ΙΟ N0:1

ТСА

ССА

САТ

ААА

САД

АТС

ССА

СТС

СТТ

сст

АСА

САС

ССС

ААТ

ССС

48

Зег

Ргэ

Азр

Ьуз

С1п

Мес

А1а

Уа1

Ьеи

Рго

Агд

С1и

Агд

Азп

Агд

-

⁵

10

15

САЗ

ССТ

ССА

ОСТ

ссс

ААС

ССА

САС

ААТ

ТСС

АСА

ССА

ААА

сст

ССС

АСА

95

31п

А1а

Азп

Рго

С1и

АЗП

Зет

Агд

С1у

Ьуз

С1у

Агд

20

25

30

ссс

САС

АСС

ссс

ААА

ААС

ССС

сот

ТСТ

СТС

ТТА

АСТ

ССА

АТА

САТ

ТТА

144

01у

С1п

Агд

С1у

Ьуз

Азп

Агд

С1у

Суз

Уа1

Ьеи

Ткг

А1а

Не

ΗΪ3

Ьеи

35

40

45

ААТ

ото

АСТ

САС

ТТС

СОТ

СТС

ССС

ТАТ

САД

АСС

ААС

САС

САА

СТС

АТТ

192

Азп

Уа1

Т.Чг

Азр

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Тут

С1и

ТНг

Ьуз

С1и

Ьеи

Не

50

55

60

ттт

АСС

ТАС

ТСС

АСС

ССС

ТСТ

тсс

САТ

ССА

ССТ

САС

АСА

АСС

ТАС

САС

240

РЬе

Агд

Тут

Суз

Зег

С1у

Зет

Суз

Азр

А1а

С1и

ТЪг

ТЬг

Тут

Азр

65

70

75

80

ААЛ

АТА

ТТС

ААА

ААС

ТТА

ТСС

АСА

ААТ

АСА

АСС

СТС

АСТ

САС

ААА

288

Ьуз

Не

Ьеи

Ьуз

Азп

Ьеи

Зет

Агд

Азп

Агд

Ьеи

Уа1

Зет

Азо

Ьуз

35

90

95

СТА

003

САС

ССА

ТСТ

ТСС

АСА

ССС

АТС

ССС

ттт

САТ

САС

СТС

ТСС

335

Уа1

01у

С1п

А1а

Суз

Агд

Рго

Не

А1а

РПе

Азр

Азп

Ьеи

Зег

100

105

НО

ТТТ

ТТА

САТ

ААС

СТС

СТТ

ТАС

САТ

АТТ

СТА

АСА

ААС

САТ

ТСС

ССТ

384

Рке

Ьеи

Азр

Азп

Ьеи

V»!

Тут

ΗΪ5

Не

Ьеи

Агд

Ьуз

Н1з

Зег

А1а

1X5

120

125

ААА

АСС

ТОТ

ССА

ТСТ

АТС

402

Ьуз

Агд

Суз

С1у

Суз

Не

130

(2)

ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ

ГОН

5Ξ0

ΙΡ 1

N0:2

(1) :

ЗЕСОЕКСЕ

СНАНАСТ

ЕЯТЗТ1СЗ

(А

) ЬЕИСТН

: 13

4 апхпо

асхйз

(В

) ΤΥΡΕ: .

элйп

о ас:

ίά

(0

) ТО'

РОЬОСУ:

Нпе.

аг

(

ϋ) ;

МОЬЕСЦЬЕ

ΤΥΡ

Е: р

топе:

1п

(:

XX)

ЗЕои:

ЕЖЕ

ΏΕ3

СК1Р

ΤΙ0Ν

: ЗЕ·

С Ю

N0:

2:

Зег

Рго

Азр

Ьуз

С1п

Мее

А1а

Уа1

Ьеи

Рго

Агд

С1и

Агд

Азп

Агд

1

5

10

15

С1п

А1а

Азп

Рго

С1и

Азп

Зет

Агд

С1у

Ьуз

С1у

Агд

20

25

30

С1у

<51п

Агд

С1у

Ьуз

Азп

Агд

• С1у

Суз

Уа1

Ьеи

. ТПг

А1а

Не

ΗΪ3

Ьеи

35

40

45

(ϋ) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ререхДе (хх) ΕΕΟϋΞΝΟΕ ΟΕΕΟΗΧΡΤΙΟΝ: 5Е$ 10 N0:5

Лтд <31у Пуз Азп Агд 01у

5 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ΓΟΗ 3Ες ΙΏ N0:6:

(ί) ΕΖςυΕΝΟΕ снаяастеяхзтхсз:

(A) ЬЕМОТН: 7 атхпо асх<1н (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхй (C) 2ΤΗΑΝΟΕ0ΝΕ53: зхпд1е (0) ТОРОЬООЕ: Ипеаг (ххУ МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: рерСхбе (хх). δΕςϋΕΝΟΕ ϋΕΕΟΗΙΡΤΙΟΝ: 5Ες ΙΟ N0:6

01п Агд 01у Ьуз Азп Агд <31у

5 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ΓΟΗ ЗЕ£ 10 N0:7:

(χ) 5Ξ0ϋΕΝΟΕ СЯАЙАСТЕВ15Т1С2: (Α) ЬЕМОТН: 8 атхпо асхйз (B) ΤΥΡΕ: атхпо ас14 (C) 3ΤΗΑΝ0Ε0ΝΕ33: зхпд1е (О) ΤΟΡΟΕΟΟΥ: Ипеаз (хх) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ререхСе (хх) ЗЕОиЖСЕ ОЕЗСЯХРТХОК: 5Е0 10 N0:7

Оху С1п Агд 01у Ьуз Азп Агд 01у

5

Азп

Уа1 50

ТЬг

Азр

Ьеи

<31у

Ьеи 55

С1у

Туг

<31и

Т11Г

Ьуз 60

С1и

(31и

Ьеи

Не

РЬе 65

Агд

Туг

Суз

Зег

<31у 70

Зег

Суз

Азр

А1а

А1а 75

С1и

ТПг

ТЬг

Туг

Азп 80

Ьуз

Не

Ьеи

Ьуз

Азп 85

Ьеи

Зег

Агд

Азп

Агд 90

Агд

Ьеи

ν&ι

Зег

Азп 95

Ьуз

Уа1

С1у

<31п

А1а 100

Суз

СуЗ

Агд

Рго

11е 105

А1а

РЬе

Азр

Азп 110

Ьеи

Зег

РЬе

Ьеи

Азр 115

Азр

Азп

Ьеи

Уа1

Туг 120

Нхз

Не

Ьеи

Агд

Ьуз 125

Нхз

5ег

А1а

(2) ΙΝΓ0ΗΜΑΤΙ0Ν ГОЯ ЗЕО 10 N0:8:

(х) ЗЕООЕНСЕ СНАЯАСТЕНХ5ТХС5: (Α) ΟΞΝΟΤΗ: 9 атхпо асхйз (3) ΤΥΡΕ: атхпо асзД (С) 5Τ5ΑΝ0Ε0ΝΕ33: зхпдХе (О) ТОРОЬООУ: Ипеаг (ϋ) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: рерсхбе (хх) ЗЕОПЕЫСЕ ΟΕ50ΗΧΡΤΧΟΝ: 520 I© N0:8

Агд 01у 01п Агд 01у Ьуз Азп Агд О1у

5 (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОН 5Е<2 10 N0:9:

(х) ЗЕОЦЕИСЕ СНАЯАСТЕНХЗТ1С5

Ьуз Агд Суз С1у Суз Не

130 - (2) ΙΝΓ0ΒΜΑΤΙ0Ν ?ОЯ 3Ξ0 10 N0:3:

(х) ЗЕОЦЕНСЕ СНАЙАСТЕЯХЗТ’СЗ:

(А) оагсТН: 4 атхпо асхйз (3) ΤΥΡΕ: атхпо асх<5 (С) 3ΤΒΛΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е (О) ТОРОЬОСУ: Нг.еаг (хх) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ρβρείάβ (XX) 32ςϋΕΝΟΞ 0Ε30ΗΙΡΤΙ0Ν: 3Ε0 ΙΟ N0:3

Ьуз Азп Агд <31у (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ΓΟΗ 3Ε<3 ΙΟ N0:4:

(χ) ЗЕфЦЕМСЕ СЯАНАСТЕЯ15Т1СЗ: (Α} ΟΞΝΟΤΗ: 5 ал±ао асх<5з (3) ΤΥΡΕ: атхпо асх<5 (Ο 3Τ5ΑΝΟΞΟΝΕ33: Зхпд1е (О) ТОРОЬССТ: Ххпеаг (хх) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ρβρηχάβ (XX) 3ΞΰϋΕΝ0Ε 0Ε30ΗΙΡΤΙ0Ν: 5Е<0 10 N0:4

С1у Ьуз Аза Агд <31у

5 (2) ΙΝΓΟΚΜΑΤΙΟΝ ΓΟΗ 5Е0 10 N0:5:

(1) 3ΞΏϋΕΝ02 СНАНАСТЕЗ.ХЗТ1СЗ: (Α) ΕΕΝΟΤΗ: б атхпо асхаз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхй (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпдХе (О) ΤΟΡΟΟΟΟΥ: Нпеаг (Α) ЬЭКЗТН: 10 атхпо асх4з (3) ΤΥΡΞ: атхпо асзД (С) ЗтаАКЛЕЗЫЕЗЗ: зхпд1е (О) ТОРОЬОСУ: 1хпеаг (хх) МОЬЗСиЬЕ ΤΥΡΞ: рерСхйе (хх) ЗЕОиШСЕ ϋΕΒΟΗΙΓΤΙΟΝ: 3Ξ0 10 N0:9:

Агд Агд С1у <31п Агд С1у Ьуз Азп Агд О1у 15 10 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОН ЗЕ<2 10 N0:10:

(х) ЗЕООЕЫСЕ СНАНАСТЕН15Т1СЗ:

' (А) ΟΕΝΟΤΗ: 11 атхпо асхйз (3) ΤΥΡΕ: атхпо асх<5

- (С) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е (О) ΤΟΡΟΙΌΟΥ: Ипеаг (ϋ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ререхйе (хх) ЗЕОиШСЕ ΌΕ3ΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕ<2 10 N0:10:

<51у Агд Агд <31у <31п Агд С1у Ьуз Азп Агд <31у 15 10 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕ<2 1Р N0:11;

(х) ЗЕОЦЕЫСЕ СНАКАСТЕН15Т1СЗ:

(A) ЬЕМСТН: 12 атхпо асхйз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхй (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е (О) ТОРОЬООТ: Ипеаг (ϋ) МОЕЕСШ-Е ΤΥΡΕ: рерНйе (хх) 8Е<2ЦЕКСЕ ОЕЗСНХРТЮЫ: ЗЕО 10 N0:11:

Ьуз С1у Агд Агд О1у <31п Агд С1у Ьуз Азп Агд О1у 15 10 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ΓΟΗ ЗЕО Ю N0:12:

(х) ЗЕООЕЫСЕ СНАНАСТЕН13ТХСЗ:

(A) ΟΞΝΟΤΗ: 13 атхпо асхдз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхй (C) 3ΤΗΑΝ0Ε0ΝΕ33: 8хпд1е (О) ΤΟΡΟΙ*ΟΟΥ: Ипеаг (ϋ) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: рерй!ве (χί) ΒΕΰϋΕΝΟΕ ΟΕ30ΗΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО 10 N0:12:

С1у 1»уз С1у Агд Агд <31у О1п Агд О1у Ьуз Азп Агд С1у 15 10 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОЯ ЗЕф 10 N0:13:

(ί) 5Ε0ϋΕΝΟΕ СЯАКАСТЕН13Т1СЗ:

(А) ΧΕΝΟΤΗ: 14 атхпо асх<1з (3) ΤΥΡΕ: атхпо асхй (С) 3ΤΚΑΝΏΕ2Ν333: зхпд1е (О) ТОРОЬООУ: Ипеаг (XX) моьзсиьз ΤΥΡΕ: ререхйе (хх) ЗЕфиЮГСЕ 0ЕЗСЯ1РТЮЫ: 530 10 N0:13:

Агд <31у Ьуз <31у Агд Агд 01у С1п Агд (31у Хуз Азп Агд С1у 15 10 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОН ЗЕО 10 N0:14:

(ί) ззаизысз СЯАНАСТЕН13Т1С5:

(А) ΕΕΝΟΤΚ: 15 атхпо асхйз (3) ΤΥΡΕ: атхпо асхй (С) 5ΤΚΑΝ0Ε0ΝΕ23: зхпд!е (О) ТОРОЬООУ: Ипеаг (хх) МОХЕСТХЕ ΤΥΡΕ: рерсхйе (хх) 5ΞΟϋΕΝΟΕ 0Ε30ΚΙΡΤΙ0Ν: 530 10 N0:14:

Зег Агд С1у Хуз С1у Агд Агд С1у С1п Агд С1у Хуз Азп Агд С1у 15 10 15 (хх) ЗЗООЕИСЗ 0Ε50ΚΙ?ΤΙ0Ν: 330 » N0:16:

<31и Азп Зег Агд <31у Хуз 51у Агд Агд С1у О1п Агд <31у Хуз Азп Агд

5 .10 13

С1у (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОН 530 Ю N0:17:

(1) 5Ε0ϋΕΝ03 СНАЯАСТЕВ13Т1СЗ:

(А) ΧΕΝΟΤΗ: 19 атхпо асхйз (3) ΤΥΡΕ: атхпо асх<5 (С) 5ΤΗΑΝΟΕΒΝΕ35: зхпд1е . (О) ΤΟΡΟΧΟΟΥ: Ипеаг (хх) -МОХЕСиХЕ ΤΥΡΕ: рерсзЛе (хх) ЗЕОЦЕЫСЕ 0Ε30ΗΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО 10 N0:17:

Рго О1и Азп Зег Агд <31у Хуз С1у Агд Агд <31у О1п Агд <31у Хуз Азп 15 10 15

Агд <51у (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОН ЗЕО Ю N0:19:

(х) 5Ε0ϋΕΝ0Ε СНАНАСТЕН15Т1С5:

(A) ΧΕΝΟΤΗ: 19 атхпо асх£з (B) ΤΥΡΕ: атхпо асх<1 (C) 5ΤΗΑΝΒΕΟΝΕ33: зхпд1е (О) ΤΟΡΟΧΟΟΥ: Ипеаг (хх) ΜΟΧΕΟϋΧΕ ΤΥΡΕ: рерсхйе (XX) ЗЗОиЕНСЕ 0Ξ30ΗΙΡΤΙ0Ν: 530 10 N0:18:

Азп Рго С1и Азп Зег Агд О1у Хуз <31у Агд Агд <31у С1п Агд <31у Хуз 15 10 15

Азп Агд <31у (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОН 530 10 N0:19:

(х) ЗЕООЗКСЕ СНАЯАСТЕН15Т1С5:

(λ) ΧΕΝΟΤΗ: 20 атхпо асхвз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асх<3 (C) 5ΤΗΑΝ0Ε0ΝΕ35: зхпд!е (О) ΤΟΡΟΧΟΟΥ: Ипеаг (хх) ΜΟΧΕΟϋΧΕ ΤΥΡΕ: рарС14е (хх) ЗЕООЕМСЕ 0Ε50ΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО ГО N0:19:

А1а Азп Рго 01и Азп Зег Агд 01у Ьуз‘ С1у Агд Агд <31у О1п Агд 01у 15 10 15

Хуз Азп. Агд С1у (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОК 530 10 N0:20:

(X) ЗЕОиЗМСЕ СНАЯАСТЕН15Т1СЗ:

(A) ΧΕΝΟΤΗ: 21 атхпо асхйз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхс1 (C) 5ΤΗΑΝ0Ε0ΝΕ33: зхпд1е (О) ΤΟΡΟΧΟΟΥ: Ипеаг (хх) ΜΟΧΕΟϋΧΕ ΤΥΡ3: ререхйе (хх)- ЗЕООЕЫСЕ 0ЕЗСН1РТ10К: ЗЕО 10 N0:20:

А1а А1а Азп Рго <31и Азп Зег Агд 01у Ьуз 01у Агд Агд б1у οίη Агд 15 Ю 15

С1у Ьуз Азп Агд <31у (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОН 530 Ю N0:21:

(х) δΕΟΟΕΝΟΒ СНАКАСТЕЯХЗТ1СЗ:

(A) ЬЗПОТН: 22 атхпо асхйз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхй (C) 8ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е (О) ТОРОЬООУ: Ипеаг (хх) МОЬЕСиЕЕ ΤΥΡΕ: ререхйе (хх) δΕΟΟΕΝΟΞ 0Ε50ΗΙ?ΤΙ0Ν: 330 ΙΟ N0:21:

А1а А1а А1а Азп Рго С1и Азп Зег Агд О1у Ьуз С1у Агд Агд <31у 51п 15 10 15

Агд 01у Ьуз Азп Агд <31у (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ГОН ЗЕО 10 N0:15:

(х) 3Ε<5ϋΕΝΟΕ СНАЯАСТЕН15Т1СЗ:

(А) ΧΕΝΟΤΗ; 16 атхпо асхвз (3) ΤΥΡΕ; атхпо асхс!

(С) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е (О) ТОРОЬСО?: Ипеаг (XX) МОХЕСИХЗ ΤΥΡΕ: рерсхве (хх) δΕΟΟΕΝΟΕ ΟΕδΟΚΙΡΤΙΟΝ: 330 ΙΟ N0:15:

Азп Зег Агд <31у Хуз С1у Агд Агд С1у 31п Агд С1у Хуз Азп Агд 31у

10 15 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ΓΟΗ 5Е0 10 N0:22:

(X) ЗЕОХШГСЕ СЯАЯАСТЕМ15Т1СЗ:

(Ά) ΕΕΝΟΤΗ: 23 атхпо асх<3з (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхЗ (C) 3ΤΗΑΝ0Ε0ΝΕ33: зхпд1е (О) ТОРОЬОСУ: Ипеаг (хх) МОЬЕСШЕ ΤΥΡΕ: рерСХ<Зе (хх) 5Ξ0ϋΕΝΟΕ ΟΕδΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:22 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ ΓΟΗ ЗЕО ΙΟ N0:16:

(х) ЗЕООЕЛСЕ СНАЯАСТЕН15Т1СЗ:

(A) ΧΕΝΟΤΗ: 17 атхпо асхДз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхй (C) 5ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпдХе (ϋ) ТОРОЬССУ: Ипеаг (И) МОХЕСТХЕ ΤΥΡΕ: рерНЗе

Аза. Агд 51а А1а А1а А1а А1а Аза Рго 01и Аза Зег Агд 01у 1уз О1у 15 10 15

Агд Агд С1у <31п Агд О1у 1уз Азп Агд <31у

25 (2}

ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РСК 5Ε<2 ΙΟ N0:26:

(ί) 3Ε0ΟΕΝΟΞ СЯАКАСТЕЯ13Т1СЗ: 1ΞΝΟΤΗ: 27 авхпо асх^з ΤΥΡΕ: атхпо асх4 3ΤΗΑΝΠΕ0ΝΕ33: ЗХад1в ТОРОЬООУ: Наваг (Α) (Β) (Ο (Ο) (хх). МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ρβρεχάβ

Агд Аза Агд О1а А1а А1а А1а А1а Аза Рго О1и Аза Зег Агд 01у Ьуз

10 15

О1у Ьуз <31у Агд Агд О1у <31п Агд <31у Ьуз Аза Агд О1у

25 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ΡΟΗ 3Ξ0 10 N0:29:

(1} 3ΕΟΟΕΝΟΕ СНАЯАСТЕК15Т1СЗ:

(A) 1ΞΝΟΤΗ: 30 атхпо асхбз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхЗ (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е (ϋ) ΤΟΡΟΟΟΟΥ: Наваг (хх) МООЕСХЛ.Е ΤΥΡΕ: ρβρβχάβ (XX) 3Ε0υ£ΝΟΞ ΟΕ5ΟΗΙΡΤΙΟΝ: 3Ε0 ΙΟ N0:29:

Агд Агд 01и Агд Аза Агд С1а А1а А1а А1а А1а Аза Рго 01и Азп Зе: 1-5 10 15

Агд С1у Ьуз 01у Агд Агд О1у (31а Агд <31у 1уз Аза Агд 01у

25 30 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РОЯ 8Е<2 ΙΟ N0:30:

(х) ЗЕОтаГСН СЯАЯАСТЕЯХЗТЮЗ:

(Α) 1ΕΝΟΤΗ; 31 атхпо асхбз (31 ΤΥΡΕ: атхпо асхй (С) 5ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ53: зхпд1е (0) ΤΟΡΟΙΟΟΥ: Наваг (ίχ) МОЕЕСОТ.Е ΤΥΡΕ: ρβρεχάβ (хх) ЗЕООЕМСЕ 0Ε30ΗΙΡΤΙ0Ν: 3Ξ0 10 N0:30:

Рго Агд Агд 01и Агд Азп Агд 01п А1а А1а А1а А1а Азп Рго О1и Аз: 15 10 15

Зег Агд С1у Ьуз 01у Агд Агд С1у О1п Агд О1у Ьуз Азп Агд <31у

25 30 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РОЯ ЗЕО 10 N0:31:

(X) ЗЕООТЭГСЕ СНАВАСТЕН13Т1С5:

(Α) ЬЕМОТН: 32 атхпо асхЗз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асх<1 (C) 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: 8ХПд1в (ϋ) ΤΟΡΟΟΟΟΥ: Наваг (хх) МОЬЕСиЪЕ ΤΥΡΕ: ρβρηχάβ (XX) δΕΟΟΕΝΟΞ ΟΕ3ΟΗΙΡΤΙΟΝ: ЗЕО 10 N0:31:

Ови Рго Агд Агд <51и Агд Азп Агд <31п А1а А1а А1а А1а Азп Рго О1и 15 10 15

Азп Зег Агд С1у Оуз 31у Агд Агд 01у О1п Агд С1у Оуз Азп Агд <31у 20 25 30 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ΡΟΗ ЗЕО ΙΟ N0:32:

(х) 3Ε0ΟΕΝΟΕ СНАКАСТЕКХЗТГСЗ:

(A) 1ΕΝ3ΤΗ: 33 атхпо асхоз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхй (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1в (О) ΤΟΡΟΟΟΟΥ: Наваг (хх) МООЕСХЛЕ ΤΥΡΕ: рерсхйв (хх) 3ΕΟΟΕΝΟΕ 0Ε3ΟΗΙΡΤΙΟΝ: 3Ξ0 10 N0:32:

\Га1 Ьеи Рго Агд Агд 01и Агд Азп Агд 01п А1а А1а А1а А1а Азп Рго 15 10 15

О1и Аза Зег Агд С1у Ьуз <31у Агд Агд <31у С1п Агд 01у Ьуз Азп Агд 20 25 30

О1у

О1у Агд Агд О1у О1а Агд 01у 1»уз Аза Агд О1у

25 (2)

ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ΡΟΗ 5Ξ0 ΙΟ N0:27:

(ί)

3Ε<3ϋΕΝΟΕ СНАКАСТЕВ13Т1СЗ:

(А) (3) (С) (Г5)

ЬЕМОТН: 28 атхпо асхоз ΤΥΡΕ: атхпо асхй 5ΤΗΑΝΌΕΟΝΕ33: зхпд1е ΤΟΡΟΕΟΟΥ: Наваг (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕО 10 N0:33:

(X) 5ΕΟΟΕΝΟΕ СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ: (Α) ΟΕΝΟΤΗ: 34 атхпо асхйз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асхб (C) 3ΤΚΑΝ0Ε0ΝΕ33: зхпдке (О) ТОРОЬОСУ: Наваг (хх)

МОЬЕСТЬЕ ΤΥΡΕ: ρβρΧχάβ (хх) МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ: ρβρχχάβ (XX) 5Ε0ΟΕΝΟΕ ПЕЗСН1РТ10Ы: ЗЕО 10 N0:33:

(XX)

С1и

Агд Аза Агд 01а А1а А1а А1а

Ьуз <Э1у Агд Агд О1у 51а Агд О1у 20

Ьуз Αδη Агд С1у

А1а	Уа1 Ьеи	Рго	Агд Агд	61и	Агд	Азп	Агд	01п А1а	А1а А1а	А1а Азп
1			5				10			15
Рго	С1и Азп	Зег	Агд О1у	1уз	С1у	Агд	Агд	О1у <51п	Агд С1у	Ьуз Азп
		20				25			30
Агд	О1у

{2}

ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ РОК 5Ε0 Ю N0:28:

(ί)

3Ε0ΟΕΝΟΕ СНАВАСТЕЯ15Т1СЗ:

(A) (B) (C) (О)

ΙΕΝΟΤΗ: 29 атхпо асхбз ΤΥΡΕ: атхпо βοχά 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е Τ0Ρ01.00Υ: Наваг (Η)

МОЬЕСОЬЕ ΤΥΡΕ: ρβρεχάβ

ΕΕςΠΕΝΟΞ 0Ε30ΗΙΡΤΙ0Ν: 3Ε0 ΙΟ N0:28:

Агд

01и Агд Аза Агд 01а А1а А1а А1а А1а Аза Рго С1и Аза Зег Агд

10 15 (2) ΙΝΡΟΗΜΑΤΙΟΝ ΡΟΗ 5Ε<5 10 N0:34:

(X) ΒΕΟΟΕΝΟΕ СНАКАСТЕН13Т1С5:

(A) ЬЕ№ТН: 35 атхпо асхйз (B) ΤΥΡΕ: атхпо асх<1 (C) 3ΤΗΑΝΟΕΟΝΕ35: зхпд1е (ϋ) ТОРОШЗУ: Наваг (хх) М0ЕЕСШ.Е ΤΥΡΕ: рврсхое (XX) 3ΕΟΟΕΝΟΕ 0Ε50ΗΙΡΤΪ0Ν: ЗЕ<2 10 N0:34:

(2) (2) (2) (2)

Мес

Азп

А1а

Рго

УаГ

С1и

Ьеи

Азп

Агд

О1у

Рго Агд Агд С1и Агд Азп Агд

10

ΙΝΕ0ΗΜΑΤΙ0Ν РОК ЗЕО 10 N0:35:

< 1) (11) (χί)

А1а

Ьуз (2)

31п А1а

О1у О1а

А1а

Агд

А1а

О1у

Ьуз

ТАСОАСАААА ТССТОААААА ССТСТССССТ ААССОТСОТС ТОСТТТСССА САААСТТСОТ

СААССТТОСТ оссзтссоа:

(2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК 3Ες 13 N0:40:

(ΐ>

300

360

417

ΕΕΝΟΤΗ: 36 атахпо асх<1з ΤΥΡΕ: агахпо асхй 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΞ33: зхпд1е ΤΟΡΟΟΟΟΥ: Ипеаг

МОЬЕССЬЕ ΤΥΡΕ: рерсхйе

Мес

А1а

Ьеи Рго Агд Агд С1и Агд Азп

10

Ас? <31п

А1а

А1а (хх) (хх)·

Азп

Рго

01и

Азп Зег Агд О1у Ьуз О1у Агд

Агд О1у О1п

Агд

О1у

Агд

С1у

ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК ЗЕ<3 ΙΟ N0:36:

и) (11) (хх)

Ьуз

ЬЕМСТН: 37 агахпо асхйз ΤΥΡΕ: агахпо асх<1 5ΤΚΑΝ0Ε0ΝΕ33: зхпд!е ΤΟΡΟΟΟΟΥ: Ипеаг

МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: рерсх^е

О1п

Мес А1а

Уа1 Ьеи Рго Агд Агд О1и Агд Азп Агд О1п А1а А1а 5 10 15

А1а

А1а <31у

Оуз

Азп Рго

О1и Азп Зег Агд С1у Еуз О1у Агд Агд О1у О1п Агд

30

Азп Агд

О1у

ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК 5Е<2 10 N0:37:

(X) (XX) (хх)

Азр

А1а

ЗЕООЕЫСЕ СНАЯАСТЕК15Т1СЗ: (А) ЬЕЛОТН: 38 агахпо ас!·

ΤΥΡΕ: агахпо асх<3 5ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е ΤΟΡΟΕΟΟΥ: Ипеаг

МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: рерсхсе

Ьуз

А1а

Агд

О1п

А1а

О1у

Ьуз

МеС

А1а

Азп

Уа1 Ьеи Рго Агд Агд О1и Аг;

Азп Агд С1п А1а

Рго

Агд

О1и Азп Зег Агд С1у Ьуз С1у Агд Агд С1у О1п 25 30

О1у

ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ РОК 3Ξ0 10 N0:38:

(х) (XX) (хх)

Рго

А1а

ЗЕООЕКСЕ СНАЯАСТЕК13Т1СЗ:

(А) ' (3)

ГС) (О)

ΟΕΝΟΤΗ: 417 Ьазе рахгз ΤΥΡΕ: писЬехс асхй 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд1е ΤΟΡΟΕΟΟΥ: Ипеаг

САТАТСАОСС

СОСАСАААСА

САТОССАОТА

СТТССАСС

ОТОААССТАА

ССОССАОССА

ССАОСТОСАА

АССССОАААА сотооттсто

ТТСТСАСТСС

АССАААОААС

ТАСОАСАААА

СТССССТООТ

АААССТСОСС

ААТССАССТО

СТОСССАССС ССОСАААДАС

ААСОТТАСТС

АССТСООТСТ ОСОСТАССАА

120

180

ААСТОАТСТТ

АОССССТСТТ

ОССАСССАСС

ТОАААССАС·

240

ТССТСААААА

САОССАТОСТ оссотссоа')

СТТТАССАСА

ТССТССОТАА

ССТСТСССЗТ

ААСССССОТС

300

СОСАТТСЗАС

САТОАССТСА

АСАСТССОСТ

АААСОСТССО (2) ΙΝΡΟΚΜΑΤΙΟΝ ГОК ЗЕ<2 10 N0:41:

(х) (11) (хх) (XX)

АТС ТСС

Мес Зег

135

ССТТССТООА ТСАСААССТО

360

417 δΕΟΟΕΝΟΕ СНАЯАСТЕК13Т1С5:

(А)

О) (С) (О)

ЬЕМСТИ: 3 45 Ьазе рахгз ΤΥΡΕ: писЬехс асх! 8ΤΚΑΝΕΕΟΝΕ33: зхпд!е ΤΟΡΟΕΟΟΥ: ’'

МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ:

ΡΕΑΤϋΚΕ:

(Α) ΝΑΜΕ/ΚΕΥ: (В) ΙΛΟΑΤΙΟΝ:

Ипеаг ргосехп

СОЗ

1..342

ЗЕООЕНСЕ ΟΕ3ΟΚΙΡΤΙ0Ν: ЗЕО 10 N0:41:

ССА Рго

САД

С1и

ААТ Азп

ТСТ Зег

140

СОТ СОТ Агд С1у

ААА ОСТ СОТ

Ьуз 31у Ахд

145

СОТ Агд

ОСТ САС <Э1у С1п

СОТ Агд

СОТ О1у 150

ААТ ААС Азп Азп

СОС Агд сот О1у

ТСС Суз 155

ОТТ

Уа1

СТО АСС

Ьеи ТЬ:

ОСТ АТС САС Ах а Не Бхз

160

СТО Ьеи

ААС ОТТ Азп Уа1

АСС Ткг 165

ОАО Азр

ЗЕОСгаГСЕ СНАНАСТЕК13Т1СЗ:

(А) (3) (С) (О)

ЬЕКОТН: 39 ага!по асх<5з ΤΥΡΕ: агахпо асхй 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд!е ΤΟΡΟΕΟΟΥ: Ипеаг

МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: рерСхйе

Азр

А1а

Ьуз

С1п

Мес

А1а

Уа1 Ьеи Рго Агд Агд С1и Агд Азп Агд О1п

15

Ах а

Агд

А1а

Азп

Рго

О1у

Ьуз

Азп

Агд

О1у

ΙΝΡ0ΒΜΑΤΙ0Ν РОК 5Ε0 ΙΟ N0:39:

ЗЕОЦЕМСЕ СНАКАСТЕЯ13Т1СЗ:

(А) ' (3) (С) (ϋ)

ΕΕΝΟΤΗ: 417 Ьазе рахгз ΤΥΡΕ: пис!ехс асхй 3ΤΚΑΝΟΕΟΝΕ53: зхпд1е ΤΟΡΟΕΟΟΥ: Ипеаг (хх) (хх)

САТАТСТСТС

ССОАТАААСА

ААТОССТОТТ

СТТССАСОТС

СТС-ААССТАА

ССОТСАСОСО

ОССОСТОСТА

АСССООАСАА

ТТССССТОСТ

АААОСТСОТС

ОТССТСАССО

ТОСТ ДАЛЛАС

120 сссооттосо

ТТСТОАССОС татссасотс

ААССТТАССО

АССТООСТСТ

СОСТТАСОАА

180

Азп

Агд

О1у 20

Суз

Уах

Ьеи

ТЬг

А1а 25

Не

Нхз

Ьеи

Азп

Уа! 30

ТЬг

Азр

Ьеи

С1у

Ьеи 35

С1у

Туг

О1и

ТЬг

Еуз 40

О1и

С1и

Ьеи

Не

РИе 45

Агд

Туг

Суз

Зег

С1у 50

Зег

Суз

Азр

А1а

А1а 55

О1и

ТЫ

Туг

Азр 60

ЬУЗ

Не

Ьеи

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Агд

Азп

Агд

Ееи

Уа1

Зег

Азр

Ьуз

Уа1

О1у

С1п

А1а

АССАААСААС

ААТТААТСТТ

ССОТТАСТОС тссосттсст

ОСОАСССТО(

ТСАААССАСС

240 (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΙΟΝ РОИ 3Ε<2 Ю N0:43:

<1} 32ςυΕΝ03 саАйлстЕахзтхсз:

(A) ЬЕКСТН: 315 Ьазе оахтз (B) ΤΥΡΕ: пис!ехс асхй (C) 3ΤΚΑΝΕΕ0ΝΕ33: зхпд!е (О) ТОРОЬООТ: 1хпеаг (ϋ) МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (ΐχ) ГЕАТЦКЕ:

(Α) ΝΑΜΕ/ΚΕΥ: СОЗ (В) ЬОСАТХОМ: 1..312 (Х1) ЗЕОПЕМСЕ 0Ε30ΒΖ?ΤΙ0Ν: зго ΙΟ N0:43

АТС СОТ МеС Агд 115

ССТ САА СОТ

ОТТ С1у 120

ААА Ьуз

ААС СОТ ОТТ ТОТ СТТ

СТС АСТ ССА АТС

48

С1у

С1п

Агд

Азп Агд С1у

0/8 125

Уа1

Ьеи

Ткт

А1а Не 130

САС

СТС

ААС

СТТ

АСТ

САС

СТС

ССТ

СТС

отс

ТАС

САА

АСС

ААА

САА

96

Нхз

Ьеи

Азп

Уа1

тйт

Азр

Ьеи

С1у

Ьеи

ОТу

Туг

С1и

ТЬх

Ьуз

С1и

135

140

145

СТС

АТС

ТТС

СОТ

ТАС

ТСС

АОТ

ссс

ТСТ

ТСС

САС

ССА

ССТ

ОДА

АСС

АСТ

144

Ьеи

Не

РНе

Агд

Туг

Суз

Зег

ОТу

Зег

Суз

Азр

А1а

Аха

С1и

ТНт

ТПт

150

155

160

ТАС

САС

ААА

АТС

СТС

ААА

ААС

СТС

ТСС

ССТ

ААС

ССС

СОТ

СТС

СТА

АОТ

192

Туг

Азр

Ьуз

Не

Ьеи

Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Агд

АЗП

Агд

Ьеи

Уа1

Зег

165

170

175

САС

ААА

СТА

ОТТ

САС

ОТА

ТОТ

ТСС

СОТ

ССС

АТС

ССА

ТТС

САС

САТ

САС

240

Азр

Ьуз

Уа1

ОТу

С1п

А1а

Суз

Агд

Рго

Не

А1а

РНе

Азр

180

185

190

СТС

АСС

ТТС

СТС

САТ

САС

ААС

СТС

СТТ

ТАС

САС

АТС

СТС

ССТ

ААА

САС

288

Ьеи

Зег

РЬе

Ьеи

Азр

АЗП

Ьеи

Уа1

Туг

Нхз

Не

Ьеи

Агд

Ьуз

Нхз

195

200

205

210

ТСС

ОСТ

ААА

СОТ

ТС-С

ОТТ

ТОТ

АТС

ТАА

31=

Зет

А1а

Ьуз

Агд

Суз

С1у

Суз

Не

215 (2) ΙΝΡΟΒΜΑΤΧΟΝ РОВ ЗЕ<Э ХО N0:44:

{1} 3ΕςϋΕΝ0Ε СНАЯАСТЕЯ13Т1СЗ:

(A) ЬЕЫСТН: 104 аяхпо асхвз (B) ΤΥΡΕ: ахпхпо ас£Д (П) ТОРОЬОСУ: Нпеаг (ϋ) МОЬЕОТЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп (XX) ЗЕОиЕПСЕ ϋΕ50ΒΤΡΤΙ0Ν: ЗЕО ХО N0:44

Мес Агд С1у С1П Агд С1у Ьуз Азп Агд С1у Суз Уа1 Ьеи Тйг А1а Не 15 10 15

Мес

С1у

С1п

Агд

С1у

Ьуз

Азп

Агд

С1у

Суз

Уа1

Ьеи

ТЬх

А1а

Не

Нхз

1

5

10

15

Ьеи

Азп

Уа.1

ТНт

Азр

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Тут

С1и

ТЬт

Ьуз

С1и

Ьеи

20

25

30

Не

РНе

Агд

Туг

Суз

Зег

С1у

Зег

Суз

Азр

А1а

С1и

ТЬт

ТНт

Туг

35

40

45

Азр

Ьуз

Не

Ьеи

ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Агд

Азп

Агд

Ьеи

ν31

Зег

Азр

Нхз

Ьеи

Азп Уа1 ТЙт Азр

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Тут

С1и

ТНт

Ьуз

С1и С1и

20

25

30

Ьеи

Не

РЬе Агд Туг Суз

Зег

С1у

Зег

Суз

Азр

А1а

С1и

ТЬг Ткт

35

40

45

Туг

Азр

Ьуз Не Ьеи Ьуз

Азп

Ьеи

Зег

Агд

Азп

Агд

Ьеи

ν<1 Зег

50

55

60

Азр

Ьуз

Уа1 С1у С1п А1а

Суз

Агд

Рго

Не

А1а

РЪе

Азр

Азр Азр

63

70

75

80

Ьеи

Зег

РЬе Ьеи Азр Азр

Азп

Ьеи

Уа1

Туг

Нхз

Не

Ьеи

Агд

Ьуз Нхз

' 85

90

95

Зег

А1а

Ьуз Агд Суз С1у

Суз

Не

100

(2)

ΙΝΡΌΒΜΑΤΙΟΝ ?ОВ ЗЕО

10 N0:45:

(X)

ЗЕСиЕМСЕ СНАВАСТЕЯХЗТХС5:

(А) ЬЕМСТН: 312 Ьазе рахгз

(В) ΤΥΡΕ: писЗехс

асхс

1

(С) 3ΤΒΑΝΒΕΟΝΕ33:

зхпд1е

(О) ТОРОЬСОТ:

1хпеаг

(XX)

МОЬЕСиЬЕ ΤΥΡΕ:

ргосехп

(XX)

ΡΕΑΤϋΒΕ:

(А) ΝΑΜΕ/ΚΕΥ:

СОЗ

(В) ЬОСАТХОИ:

1. .309

(XX)

ЗЕОиЕМСЕ 0Ε3<ΧΒΙΡΤΙ0Ν: 3Ξ0 1Ό Ж

>:45:

АТС

ОТТ

САА ССТ ОТТ ААА

ААС

ССТ

ТСТ

СТТ

СТС

АСТ

ССА

АТС САС

48

Мес

С1у

С1п Агд С1у Ьуз

Азп

Агд

С1у

Суз

Уа1

Ьеи

ТЬт

Аха

Не Нхз

105

110

115

120

СТС

ААС

ОТТ АСТ САС СТС

ОТТ

СТС

ОТС

ТАС

САА

АСС

ААА

САА

САА СТС

96

Ьеи

Азп

Уа1 ТПг Азр Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Тут

<Э1и

ТНт

Ьуз

С1и

С1и Ьеи

125

130

135

АТС

ТТС

ССС ТАС ТОТ АОТ

ОТС

ТСТ

ТСС

САС

ОТА

ССТ

САА

АСС

АСТ ТАС

144

Не

РЬе

Агд Туг Суз Зег

С1у

Зег

Суз

Азр

А1 а

А1а

С1и

ТЬг

ТЬг Тут

140

145

150

САС

ААА

АТС СТС ААА ААС

СТС

ТСС

ССТ

ААС

СОТ

ССТ

СТС

СТА

АОТ САС

192

Азр

Ьуз

Х1е Ьеи Ьуз Азп

Ьеи

Зег

Агд

АЗП

Агд

Ьеи

νβΐ

Зег Азр

155

160

165

ААА

СТА

ОТТ САС ОТА ТОТ

ТОТ

ССТ

ССС

АТС

ССА

ТТС

САС

САТ

САС СТС

240

Ьуз

Уа1

С1у С1п А1а Суз

Суз

Агд

₽го

Не

А1а

РПе

Азр

Азр Ьеи

170

175

180

АСС

ТТС

СТС САТ САС ААС

СТС

СТТ

ТАС

САС

АТС

СТС

СОТ

ААА

САС ТСС

288

Зег

РЬ.е

Ьеи Азр Азр Азп

Ьеи

УаХ

Туг

Нхз

Не

Ьеи

Агд

Ьуз

Нхз Зет

185

190

195

200

Ьеи

Азп

Уа1

Т?-г

Азр

Ьеи

С1у

Ьеи

С1у

Тут

С1и

ТЬг

Ьуз

С1и

Ьеи

50

55

60

Не

РЬе

Агд

Тут

Суз

Зет

С1у

Зет

Суз

Азр

А1а

С1и

ТПт

Тут

6 =

70

75

80

Азр

Ьуз

Не

Ьеи

Ьуз

Азп

Ьеи

Зет

•Агд

Азп

Агд

Ьеи

Уа1

Зег

Азр

9!

Ьуз

Уа1

С1п

100

Азп

Ьеи

Рго

105

11е

А1а РНе Азр

Азр

110

Азр

Зе:

РИе

Ьеи

115

Суз

Аха

Уа1

120

Не Ьеи

125

Нхз

Зег

А1а

Ьуз

130

Агд

(2) ΙΝΡΌΕΜΑΤΙΟΝ РОВ

(х)

Не

135

СНАВАСТЕВ13Т1СЗ: ЬЕОТТН: 104 агахпо асхсз ΤΥΡΕ: аихпо асхб 5ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ33: зхае ТОРОЬССУ: 1хпеаг (ϋ)

МОЬЕСЦЬЕ ΤΥΡΕ: ргосехп

С1у	Ьуз	Азп	Агд	С1у	Суз	Уа1	Ьеи	ТНт	А1а	Х1е
				10					15
Азр	Ьеи	С1у	Ьеи	С1у	Тут	Схи	ТЪт	Ьуз	С1и	С1и
			25					30
Суз	Зет	С1у	Зет	Суз	Азр	А1а	А1а	С1и	ТЬт	ТНг
		40					45
Ьуз	Азп	Ьеи	Зет	Агд	Азп	Агд	Агд	Ьеи	Уа1	Зет

100 (2) ΙΝΓΟΗΜΑΤΙΟΝ РОВ ЗЕО 10 N0:49:

(х) ЗЕОСЕМСЕ СНАЯАСТЕВ13ТХСЗ:

(A) ЬЕЙСТН: 103 атхпо асхйз (B) ΤΥΡΕ: аяхпо асхб (C) 5ΤΒΑΝΟΕΟΝΕ33: зхпд!е

(В) ТОРОЬОСТ: 1£пеат (11) МОЬЕСУЬЕ ΤΥΡΞ: ргасехп (х!) ЭЕаиЕМСЗ 1Ж5СЯ1РТХ0Н: 5ΕΏ ΙΒ N0:49 яс лас

Мес

Е1у

Е1п

Агд

О1у

Ьуз

А5П

Агд

Е1у

Суз

Уа1

Ьеи

ТЬг

А1а

Не

Н1з

1

5

10

15

Ьеи

АЗП

Уа1

ТЬг

Азр

Ьеи

01у

Ьеи

О1у

туг

С1и

ТЬх

Ьуз

<Э1и

С1и

Ьеи

20

25

30

11»

РЬе

Агд

Тух

Суз

Зег

<31у

Зег

Суз

Азр

А1а

О1и

ТЬг

ТЬх

Тух

35

40

45

Азр

ьуз

11«

Ьеи

Ьуз

АЗП

Ьеи

Зег

Ахд

Агп

Агд

Ахд

Ьеи

Уа1

Зег

Азр

50

55

60

Ьуз

Уа1

С1у

С1п

А1а

Суз

Ахд

Рго

Х1е

А1а

РЬе

Азр

Авр

Азр

Ьеи

55

70

75

80

Зег

РЬе

Ьеи

Азр

Азп

Ьеи

Уа1

Тут

Н1з

Не

Ьеи

Ахд

ьуз

Н1з

Зег

85

90

95

А1а

Ьуз

Агд

Суз

С1у

Суз

Не

100

КС кжс скжс кскжс окскмас соасккас асдаскмас аасоаскжс аас-саскяас кяс^аскяас аасоаскяас (2) ΙΝΓΟΒΜΑΤΤΟΝ ГОК ЗЕО Ш N0:50:

(ί> ЗЕООН’СЕ СНАйАСТЕКЭТКЗ:

(A) ЬЕМОТН; 114 агахпо асгйз (B) ΤΥΡΕ: ат1по асШ (C) ЗТЯАИПЕОЫЕЗЗ: $1пд1е (О) ТОРОЬОСУ: 11пеаг (11} МОЬЕСЦЪЕ ΤΥΡΕ: ρχοϋβΐη (х!) ЗЕОСЕМСЗ ОЕЗСВХЭТЮТГ: ЗЕО ΙΟ N0:50 кекс заскс ызаскс етзаскс

РЕМЗаСКС наосаскмнс (ЗЕО ГО ΝΟ:3)_χ(ЗЕО ГО N0:4), (ЗЕО 10 N0:5) (ЗЕО 10 N0:6), (ЗЕО 10 N0:7) (ЗЕО ГО N0:8) (ЗЕО 10 N0:9), (ЗЕО Ю N0:10) (ЗЕО ГО N0:11) (ЗЕО ГО N0:12/ (ЗЕО ГО N0:13)' (ЗЕО ГО N0:14)

МеС Зег Рто О1и Азп Зег Ахд Е1у Ьуз <31у Агд Агд С1у С1г. Агд С1у 15 1015

Азп Азп Агд <31у Суз Уа1 Ьеи ТЪх А1а Не Н1з Ьеи Азп Уа1 ТЬг Азр 20 2530

Ьеи О1у Ьеи О1у Туг С1и ТЬг Ьуз С1и С1и Ьеи Не РЬе Агд Туг Суз 35 4045

Зег С1у Зег Суз Азр А1а А1а С1и ТПг ТНх Туг Азр Ьуз Не Ьеи Суз 50 5550

Азп Ьеи Зег Агд Азп Агд Агд Ьеи Уа1 Зег Азр Суз Уа1 С1у С1пА1а

70 7580

Суз Суз Агд Рго Не А1а РМе Азр Азр Азр Ьеи Зег РЬе Ьеи АзоАзр

9095

Азп Ьеи Уа1 Туг Н1з Не Ьеи Агд Ьуз Нхз Зег А1а Суз Агд Суз С1у 100 105110

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Усечённый нейротрофический фактор глиальной клеточной линии (ΟΏΝΡ), имеющий следующую аминокислотную последовательность

Х-[Сук⁴¹-Сук¹³³]причем [Сук⁴¹-Сук¹³³] представляет собой аминокислотную последовательность от Сук⁴¹ до Сук¹³³ в соответствии с фиг. 1 (8Е9 ΙΌ ΝΟ:2);

Υ представляет собой концевую карбоксильную группу Сук¹³³ или карбоксиконцевой участок аминокислотного остатка 11е¹³⁴; а

Х представляет собой метионилированную или неметионилированную аминогруппу Сук⁴¹или аминоконцевой участок аминокислотного остатка или аминоконцевые последовательности, выбранные из группы, включающей нксоасютас (ЗЕО ГО N0:15) ' Ζ аасонскжс .(ЗЕО ГО N0:16) (ЗЕО ГО N0:17) (ЗЕО ГО N0:13) (ЗЕО ГО N0:19)' (ЗЕО ГО N0:20)' / (3ΞΟ !□ N0:21) (5=0 ГО N0:22) (3ΞΟ ГО N023)' (3=0 ΙΟ N024) (5ΞΟ ΙΟ N02«/ (ЗЕО Ю ЫО2б/ (ЗЕО ГО N027)' (3=0 10 N0:23/ (ЗЕО ГО N029)' (ЗЕО ГО N0:30) (3=0 (О N0:31)' (ЗЕО ГО N0:32)' (5=0 ГО N0:33/ (ЗЕО ГО N0:34) (5=0 ГО N0:35/ (5ЕО ГО N0:36}' (ЗЕО ГО N0:37) И (ЗЕО ГО N0:33)_; или аналог указанного фактора, обладающий такой же биологической активностью.

насоаскмас нясонскжс касоаскяас аасоаскяас

А АЦРЕЦЗЯСКС

ДА АНРЗОТЕЯСКС няс-ояскжс АДА АМ р 121 Ь ааода<зкнн.з ЧАДА АЯРЕЯЗЯСКС ЯР.С-ЗНСНТР.СЗ НОААА А№=2ТЗлОКО яясокскинс МНОААА АЖЗЙСК нясоксютс ΗΝΒ0ΑΑΑ АЯРЕМ5ИСКС яя&ааскжс ЕНЖОААА ΑΚ?Ξ2ί5ΚΟΚΟ аясокстаас ΗΞ3ΝΗ0ΑΑΑ АЯРЕЯЗЯСКС квсовохянс ’ ВЗаЭИКОААА АМРЕНЗЯСКС КЯСОЙСКННС 5 наиютоАдд АНР5ЯЗВСКС НЯСОЯСКИЙС ЬР НЗДЗатаЗАДА АИР5275?.СаЗ яясонсгиао УЬР ΗΗΞΜίΗΟΑΑΆ АЯРЕЯЗЯСКО аясоаскжс АУЬ? ЕЩЕЗЖ0ААА АЯРЕЯЗЯСКС няоансжялс МАУЬ? нагапЮАДА А№5ХТЗНЗКС яасонскжсз ОМАУЬ? ККННЖСААА АМЗЕЯЗаСКЗ яяаояскжс КОМАУЬ? НЯДЯИКСААД аяреязнскс НЯСОНСЮНС ПКСМАУЬ? НЯЗЗЩВСАДА АЯРЕХЗЖЖЗ нясакскзтр.с РОКОМАУЬ? няззотаоААА Аырзнзасхо АлСОНОКЯЯО

2. Усечённый ΟΏΝΡ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность РОЛЛА АМЕ^ИКС (8Е9 ΙΌ ΝΟ:24) или аналог указанного фактора.
3. Усечённый ΟΏΝΡ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность ΝΡΕΝ8Κ6ΚΟ ΡΡΑΟΡΑΚΑΡΑ (8Е9 ΙΏ ΝΟ:18) или аналог указанного фактора.
4. Усечённый ΟΏΝΡ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность ΡΕΝ8Κ6ΚΟ ΡΡΑΟΡΑΚΑΡΑ (8Е9 ΙΏ ΝΟ:17) или аналог указанного фактора.
5. Усечённый ΟΏΝΡ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность 8КОКО ΡΡΑΟΡΑΚΑΡΑ (8Е9 ΙΌ ΝΟ:14) или аналог указанного фактора.
6. Усечённый ΟΏΝΡ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность Κ69Κ6ΚΝΚ6 (8Е9 ΙΌ ΝΟ:8) или аналог указанного фактора.
7. Усечённый ΟΏΝΡ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последователь71 ность ΟΟΡΟΚΝΚΟ (8ЕО ΙΌ N0:7) или аналог указанного фактора.
8. Усечённый ΟΌΝΡ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность ΚΝΚΟ (8Е0 ΙΌ N0:3) или аналог указанного фактора.
9. Усечённый ΟΌΝΡ по п.1, отличающийся тем, что Х представляет собой последовательность ΝΚΟ или аналог указанного фактора.
10. Усечённый ΟΌΝΡ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что он гликозилирован.
11. Усечённый ΟΌΝΡ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что он негликозилирован.
12. Усечённый ΟΌΝΡ по п. 1, отличающийся тем, что он конъюгирован с водорастворимым полимером.
13. ДНК, кодирующая усечённый ΟΌΝΡ по п. 1.
14. ДНК по п. 13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 1.
15. ДНК по п. 13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 3.
16. ДНК по п. 13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 4.
17. ДНК по п.13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 5.
18. ДНК по п. 13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 6.
19. ДНК по п. 13, имеющая структуру, приведенную на фиг. 7.
20. Вектор, содержащий ДНК по п.13, функционально связанную с последовательностью, контролирующей экспрессию.
21. Штамм прокариотических клетокхозяев, трансформированных или трансфицированных ДНК по п.13.
22. Линия эукариотических клеток-хозяев, трансформированных или трансфицированных ДНК по п.13.
23. Способ получения усечённого ΟΌΝΡ, включающий выращивание штамма или линии клеток по любому из пп. 21-22 в соответствующей питательной среде, и выделение ΟΌΝΡ из клеток или питательной среды.
24. Способ по п.23, отличающийся тем, что штамм прокариотических клеток-хозяев представляет собой штамм Езс11спс1па со11.
25. Способ по п.23, отличающийся тем, что линия эукариотических клеток-хозяев представляет собой линию клеток яичника китайского хомячка.
26. Способ получения усечённого ΟΌΝΡ, включающий осуществление следующих стадий:

(а) культивирование линий прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, трансформированных или трансфицированных вектором по п.20 в соответствующей питательной среде в условиях, обеспечивающих экспрессию усечённого ΟΌΝΡ, и (б) возможное выделение усечённого ΟΌΝΡ, экспрессируемого указанными клетками-хозяевами.
27. Усечённый ΟΌΝΡ по п. 1, отличающийся тем, что представляет собой продукт рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах прокариотического штамма или эукариотической линии, трансформированных или трансфицированных ДНК по п. 13 или вектором по п. 20.
28. Фармацевтическая композиция, содержащая усечённый ΟΌΝΡ по п. 1 и, по крайней мере, один фармацевтически приемлемый носитель.
29. Фармацевтическая композиция, содержащая усечённый ΟΌΝΡ по п.27, и фармацевтически приемлемый носитель.
30. Способ лечения болезни Паркинсона, включающий введение больному фармацевтической композиции по п.28.
31. Способ лечения болезни Паркинсона, включающий введение больному ДНК по п.13 для обеспечения ίη νίνο экспрессии усечённого ΟΌΝΡ.
32. Способ лечения болезни Паркинсона, включающий имплантацию больному клеток, трансформированных ДНК по п.13, для обеспечения ίη νίνο экспрессии усечённого ΟΌΝΡ.
33. ΟΌΝΡ гетеродимер, включающий полную и усеченную молекулы ΟΌΝΡ по п. 1.
34. ΟΌΝΡ димер, включающий две усечённые молекулы ΟΌΝΡ по п. 1.
35. Усечённый ΟΌΝΡ по п. 1, отличающийся тем, что он является продуктом расщепления зрелого ΟΌΝΡ, рекомбинантно экспрессируемого клетками бактерий или млекопитающих.
36. Усечённый ΟΌΝΡ по п.35, отличающийся тем, что Х представляет собой аминоконцевой участок аминокислотного остатка или аминоконцевые последовательности, выбранные из группы, включающей ас мае

КЖС (2ЕО (□ N0:3) схжс (8=0 ГО N0:4) асзстас (3=0 ГО N0:5) ааскиас (3=0 10 N0:6) ссаскжс (3=0 ГО N0:7) ассаиоао (3=0 ГО N0:8) и аасчаскижз (3=0 10 N0:9).
37. Усечённый ΟΌΝΡ по п.35, отличающийся тем, что зрелый ΟΌΝΡ рекомбинантно экспрессируется модифицированными клетками бактерий ίη νίίΓο или ίη νίνο.
38. Способ приготовления фармацевтической композиции по п.28, заключающийся в том, что терапевтически эффективное количество усечённого ΟΌΝΡ по п.1 смешивают, по крайней мере, с одним фармацевтически приемлемым носителем.
39. Применение усечённого ΟΌΝΡ по п.1 для лечения заболеваний или повреждений нервной системы.
40. Применение усечённого ΟΌΝΡ по п.39, отличающееся тем, что заболевание нервной системы представляет собой болезнь Паркинсона.
41. Применение усечённого ΟΌΝΡ по п.1 для приготовления фармацевтической композиции для лечения заболеваний или повреждений нервной системы.