EA009938B1 - ЛЕЧЕНИЕ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ С ПРИМЕНЕНИЕМ ИНТЕРФЕРОНА-β - Google Patents

Abstract

В настоящем изобретении предлагаются способы лечения и фармацевтические агенты для применения в лечении млекопитающих субъектов, имеющих гломерулонефрит, или хроническую почечную недостаточность, или риск их развития. Способы включают введение терапевтических агентов, содержащих ИФН-β.

Description

Уровень техники изобретения

Хроническая почечная недостаточность (ХПН) может быть определена как прогрессирующее, перманентное и существенное снижение скорости клубочковой фильтрации (СКФ), обусловленное значительной и продолжающейся потерей нефронов. Хроническая декомпенсированная почечная недостаточность обычно начинается с того момента, когда хроническая почечная недостаточность (т.е. перманентное снижение функции почек, по меньшей мере, на 50-60%), ведет к некоему повреждению почечной ткани, что вызывает существенную потерю нефронов. Исходное повреждение может быть связано или не связано с эпизодом острой почечной недостаточности, или оно может быть связано с любым количеством почечных нарушений, включая, но не ограничиваясь этим, конечную стадию почечного заболевания, хроническую диабетическую нефропатию, диабетическую гломерулопатию, диабетическую почечную гипертрофию, гипертензивный нефросклероз, гипертензивный гломерулосклероз, хронический гломерулонефрит, наследственный нефрит, почечную дисплазию и хроническое отторжение после трансплантации почечного аллотрансплантата. Независимо от природы исходного повреждения хроническая декомпенсированная почечная недостаточность проявляется в виде «общих конечных проявлений» признаков и симптомов в результате прогрессирующей потери нефронов и прогрессивного снижения ХПН. Данное прогрессирующее ухудшение функции почек является медленным, обычно продолжающимся у больных людей многие годы или десятилетия, но, по-видимому, неизбежным.

У человека при прогрессировании декомпенсированной почечной недостаточности и продолжении снижения СКФ до менее 10% от нормы (например, 5-10 мл/мин) субъект входит в конечную стадию почечного заболевания (Ε8ΚΌ). В течение данной фазы неспособность оставшихся нефронов адекватно удалять отходы жизнедеятельности из крови при удержании полезных продуктов и поддержании баланса жидкости и электролитов ведет к ухудшению состояния, при котором может быстро развиться недостаточность многих систем органов и особенно сердечно-сосудистой системы. С этого момента почечная недостаточность будет быстро прогрессировать, приводя к смерти, пока субъект не начнет подвергаться почечной заместительной терапии (т.е. хроническому гемодиализу, постоянному перитонеальному диализу или трансплантации почки).

Одним почечным заболеванием, которое может вести к ХПН, является гломерулонефрит. Гломерулонефрит характеризуется воспалением и возникающим в результате этого увеличением клубочков, что обычно обусловлено образованием иммунных комплексов. Аккумуляция иммунных комплексов в клубочках ведет к воспалительным ответам, вовлекающим, среди прочего, гиперплазию клеток, которая может вызывать полную или частичную блокаду клубочковой фильтрации, среди других факторов, сужая просветы капилляров. Одним из результатов данного процесса является ингибирование нормальной фильтрационной функции клубочка. Блокада может возникать в большом числе клубочков, непосредственно ухудшая функцию почек и часто вызывая аномальное отложение белков в стенках капилляров, входящих в состав клубочка. Такое отложение может, в свою очередь, вызывать повреждение базальных мембран клубочков. В тех клубочках, которые не заблокированы, развивается повышенная проницаемость, позволяющая большому количеству белка поступать в мочу, состояние, обозначаемое как протеинурия.

Во многих случаях тяжелого гломерулонефрита в пространстве Боумена образуются патологические структуры, называемые серповидными, дополнительно препятствуя клубочковой фильтрации. Данные структуры могут быть обнаружены только при микроскопическом исследовании образцов ткани, полученных при биопсии или некропсии, и, таким образом, не всегда выявляются у тех больных, у которых они существуют. Серповидные структуры являются проявлением гиперплазии клеток и, как считается, возникают из-за экстенсивной аномальной пролиферации пристеночных эпителиальных клеток, клеток, которые образуют внутреннюю выстилку капсулы Боумена. Клиническое исследование показало, что существует приблизительная корреляция между процентом клубочков с серповидными структурами и тяжестью заболевания и, таким образом, прогнозом для больного. При присутствии в большом количестве серповидные структуры являются плохим прогностическим признаком.

Приблизительно 600 больных на миллион в США находятся на хроническом диализе каждый год при средней стоимости, приближающейся к 60000-80000$ на больного в год. Из новых случаев конечной стадии почечного заболевания каждый год приблизительно 28-33% обусловлено диабетической нефропатией (или диабетической гломерулопатией или диабетической почечной гипертрофией), 24-29% обусловлено гипертензивным нефросклерозом (или гипертензивным гломерулосклерозом) и 15-22% обусловлено гломерулонефритом. 5-летний коэффициент выживаемости для всех больных на хроническом диализе составляет приблизительно 40%, но для больных старше 65 лет коэффициент снижается до приблизительно 20%. Следовательно, существует потребность в лечении, которое должно предотвратить прогрессирующую потерю почечной функции, которая заставляет почти двести тысяч больных только в США становиться зависимыми от хронического диализа и которая ведет к преждевременной смерти десятков тысяч больных каждый год.

Сущность изобретения

В одном из воплощений изобретение представляет собой способ лечения гломерулонефрита или хронической почечной недостаточности у млекопитающего, у которого имеется гломерулонефрит или

- 1 009938 вероятность развития гломерулонефрита, включающий введение млекопитающему терапевтически эффективного количества ИФН-β-содержащего терапевтического агента. В изобретении также предлагается применение ИФН-в-содержащего терапевтического агента для производства лекарственного средства для лечения или профилактики гломерулонефрита. Гломерулонефрит может быть выбран из группы, состоящей из фокального гломерулосклероза, коллабирующих гломерулопатий, заболевания с минимальными изменениями, серповидного гломерулонефрита, нефритического синдрома, нефротического синдрома, первичного гломерулонефрита, вторичного гломерулонефрита, пролиферативного гломерулонефрита, мембранозного гломерулонефрита, мембранопролиферативного гломерулонефрита, иммунокомплексного гломерулонефрита, гломерулонефрита с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-ОВМ), олиго-иммунного гломерулонефрита, диабетического гломерулонефрита, хронического гломерулонефрита и наследственного гломерулонефрита. ИФН-β может быть зрелым или незрелым и может быть лишен начального метионина. ИФН-β может представлять собой ИФН-β человека, например, ИФН-в-1а и ИФН-β-Ιό. ИФН-β может быть белком, который является, по меньшей мере, приблизительно на 95% идентичным полноразмерному зрелому ИФН-β человека, имеющему 8ЕО ΙΌ N0: 4. ИФНβ может быть полноразмерным зрелым ИФН-β человека, включающим или состоящим из 8Е0 ΙΌ N0: 4. ИФН-β может быть гликозилированным или не гликозилированным. Терапевтический агент ИФН-β может также быть полноразмерным зрелым ИФН-β человека, включающим 8Е0 ΙΌ N0: 4, соединенную с константной областью молекулы иммуноглобулина человека, например, с тяжелой цепью 1дС1. Например, терапевтический агент ИФН-β может включать 8Е0 Ш N0: 14. Терапевтический агент ИФН-β может также включать пэгилированный ИФН-β.

Терапевтический агент ИФН-β может включать стабилизирующий агент, который может представлять собой кислую аминокислоту. Он также может представлять собой аргинин. Терапевтический агент ИФН-β может иметь рН между приблизительно 4,0 и 7,2. В предпочтительном осуществлении терапевтический агент ИФН-β представляет собой ΑV0NЕX®.

Терапевтический агент ИФН-β может вводиться парентерально, например, внутривенно (в.в.), подкожно и внутримышечно (в.м.). Способ может включать введение млекопитающему нескольких доз терапевтического агента ИФН-β. Терапевтический агент ИФН-β можно вводить в течение нескольких дней. Например, его можно вводить еженедельно в дозе 6 М1И. Его можно также вводить три раза в неделю в дозе 3, 6 или 12 М1И. Введение терапевтического агента ИФН-β может снизить, например, протеинурию, пролиферацию клеток клубочков или воспаление клубочков у млекопитающего.

В предпочтительном осуществлении млекопитающим является человек. Человек может являться пациентом. Млекопитающим может быть млекопитающее, которое предрасположено к развитию гломерулонефрита, что выявляется, например, по признакам развития воспаления по меньшей мере одного клубочка. Млекопитающим может быть млекопитающее, которое предрасположено к развитию хронической тяжелой почечной недостаточности или иметь хроническую тяжелую почечную недостаточность, что выявляется, например, по наличию хронической почечной недостаточности. Млекопитающее идентифицируется как имеющее гломерулонефрит по присутствию воспаления по меньшей мере одного клубочка; гипертрофии клубочков; гипертрофии трубочек; гломерулосклероза; или тубулоинтерстициального склероза. В определенных осуществлениях млекопитающее в данном контексте не означает млекопитающее, которое является носителем вируса, например, вируса гепатита, такого как гепатит В или С, вызывающего гломерулонефрит, или млекопитающее, у которого гломерулонефрит был вызван вирусом. В других воплощениях млекопитающее не страдает конечной стадией тяжелой почечной недостаточности или почечно-клеточной карциномой.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлены последовательности нуклеотидов (8Е0 ΙΌ N0: 11) и аминокислот (8Е0 ΙΌ N0: 12) гибридного белка, состоящего из сигнальной последовательности VСΑМ, соединенной со зрелым полноразмерным ИФН-β человека (8Е0 ΙΌ N0: 3 и 4), в котором глицин в аминокислоте 162 8Е0 ΙΌ N0: 4 заменен на цистеин, соединенный с шарнирными СН2 и СН3 доменами Ι§01Εο человека (ΖΕ5107).

На фиг. 2 представлены последовательности нуклеотидов (8Е0 ΙΌ N0: 13) и аминокислот (8Е0 ΙΌ N0: 14) гибридного белка, состоящего из сигнальной последовательности VСΑМ, соединенной со зрелым полноразмерным ИФН-β человека (8Е0 ΙΌ N0: 3 и 4), в котором глицин в аминокислоте 162 8Е0 ΙΌ N0: 4 заменен на цистеин, соединенный с линкером 048, который соединен с шарнирными СН2 и СН3 доменами Ιβ01Εο человека (ΖΤ6206).

На фиг. 3 представлен уровень протеинурии на 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни у крыс, страдающих нефротоксическим небритом (№ТЫ), получавших 3х10⁵ единиц ИФН-β крыс в день, 6х10⁵ единиц ИФН-β крыс в день или только вектор («контроль») 6 дней в неделю, начиная со дня 0.

На фиг. 4 представлен уровень протеинурии на 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни у крыс, страдающих нефротоксическим нефритом (№ТЫ), получавших 6х10⁵ единиц ИФН-β крыс в день или только вектор («контроль») 6 дней в неделю, начиная со дня 0.

- 2 009938

На фиг. 5 представлено количество пролиферирующих клеток клубочков крыс, страдающих нефротоксическим нефритом (ΝΤΝ), получавших 6х10⁵ единиц ИФН-β крыс в день или только вектор («К8А») 6 дней в неделю со дня 0 до 7-го дня.

На фиг. 6 представлен уровень протеинурии на 7-й и 10-й дни у крыс, страдающих гломерулонефритом ТЬу 1, получавших 6х10⁵ единиц ИФН-β крыс в день или только вектор («К8А») 6 дней в неделю, начиная со дня 0 до 10-го дня.

На фиг. 7 представлен уровень клиренса креатина на 7-й и 10-й дни у крыс, страдающих гломерулонефритом Т11у 1, получавших 6х10⁵ единиц ИФН-β крыс в день или только вектор («К8А») 6 дней в неделю, начиная со дня 0 до 10-го дня.

На фиг. 8 представлена шкала пролиферации клубочков на 10-й день у крыс, страдающих гломерулонефритом ТЬу 1, получавших 6х10⁵ единиц ИФН-β крыс в день или только вектор («К8А») 6 дней в неделю, начиная со дня 0 до 10-го дня.

На фиг. 9 представлен уровень протеинурии на 7-й и 14-й дни у крыс, страдающих пуромицинаминонуклеозидной нефропатией (ΡΑΝ), получавших 6х10², 6х10³, 6х10⁴ или 6х10⁵ единиц ИФН-β крыс в день или только вектор («контроль»).

Подробное описание изобретения

Изобретение, по меньшей мере, частично основывается на открытии того, что, по меньшей мере, определенного рода симптомы гломерулонефрита у млекопитающего могут быть облегчены введением ИФН-β млекопитающему. В частности, обнаружено, что протеинурия, пролиферация клеток клубочков и воспаление значительно снижаются при введении ИФН-β. Соответственно, в изобретении предлагаются способы и композиции для лечения гломерулонефрита у млекопитающих.

1. Определения

Для более ясного и краткого указания предмета обсуждения, заявленного в изобретении, предлагаются следующие определения специфических терминов, применяемых в описании и прилагаемой формуле изобретения.

Применяемые в описании и прилагаемой формуле изобретения единственные формы включают множественные упоминания, если в контексте ясно не указано иначе.

«Скорость клубочковой фильтрации» или «СКФ» пропорциональна скорости клиренса в мочу вещества, находящегося в плазме, которое не связано с белками сыворотки, свободно фильтруется клубочками и не секретируется или не реабсорбируется почечными трубочками. СКФ (ОРК) предпочтительно определяется следующим уравнением

где и_сопс представляет собой концентрацию маркера в моче, Р_СОПс представляет собой концентрацию маркера в плазме и V представляет собой скорость тока мочи в мл/мин. Необязательно СКФ корректируют на площадь поверхности тела. Следовательно, применяемые здесь величины СКФ могут быть рассмотрены как находящиеся в единицах мл/мин/1,73м². Предпочтительным измерением СКФ является клиренс инсулина, но из-за трудности измерения концентраций данного вещества в клинической практике обычно применяют клиренс креатинина. Например, для здорового мужчины среднего размера (70 кг, 20-40 лет) типичная СКФ, измеренная по клиренсу креатинина, как ожидается, составляет приблизительно 12 5 мл/мин при концентрации креатинина в плазме 0,7-1,5 мг/дл. Для сравнения у женщины среднего размера типичная СКФ, измеренная по клиренсу креатинина, как ожидается, составляет приблизительно 115 мл/мин при уровне креатинина 0,5-1,3 мг/дл. В период хорошего самочувствия величины СКФ человека являются относительно стабильными до возраста приблизительно 40 лет, когда СКФ обычно начинает возрастное снижение. Для субъектов, выживших к возрасту 85 или 90 лет, СКФ может быть снижена до 50% по сравнению с величинами в возрасте 40 лет. Может быть предложено определение «ожидаемой СКФ» или ОРК_ехр (СКФ_{ожидаемая}) на основе учета возраста субъекта, массы, пола, площади поверхности тела и степени развития мускулатуры, а также концентрации в плазме некоего маркерного соединения (например, креатинина), определяемого по тестированию в крови. Таким образом, в качестве примера, ожидаемая СКФ или СКФ_ехр может быть определена как _ (140 - возраст)* масса(кг)

72хР_С0ИС(л4г/дл)

Данное определение не принимает в расчет такие факторы, как площадь поверхности, степень развития мускулатуры или процент жировой ткани в организме. Однако при применении уровня креатинина в плазме в качестве маркера данная формула применялась для мужчин в качестве недорогого способа определения СКФ. Так как креатинин продуцируется почечно-полосатыми мышцами, ожидаемая СКФ или ОРК_ехр женщин определяется с помощью того же уравнения, умноженного на 0,85 для учета ожидаемых различий в мышечной массе. (См. Решать е! а1., (1990) Ат. I. КМпеу ΏΪ8. 16 (3):2236-243.) «Гломерулонефрит», «нефрит», «острый нефрит» и «гломерулярный нефрит» применяются здесь как взаимозаменяемые термины.

- 3 009938 «ИФН-β-Ια» относится к молекуле ИФН-β, имеющей аминокислотную последовательность ИФН-β человека дикого типа и гликозилированной.

«ИФН-β-ΙΒ» относится к молекуле ИФН-β, имеющей аминокислотную последовательность ИФН-β дикого типа, в которой цистеин в положении 17 заменен серином; метионин в положении 1 («начальный метионин») отсутствует и молекула не гликозилирована.

«Вариант ИФН-β» относится к белку ИФН-β дикого типа, имеющему одну или более модификаций, например делеций аминокислот, добавок, замен, посттрансляционную модификацию или введение одного или более не существующих в природе аминокислотных остатков или линкеров между ними. Части ИФН-β включаются в термин «вариант ИФН-β. «Биологически активный вариант ИФН-β» представляет собой вариант ИФН-β, который имеет, по меньшей мере, некоторую активность при лечении почечных нарушений, например, гломерулонефрита. Вариант ИФН-β может быть существующим в природе ИФНβ, имеющим, например, вставку, делецию или замену одной или более аминокислот по отношению к ИФН-β дикого типа, т.е. существующим в природе мутантом или полиморфным вариантом, или он может быть не существующим в природе ИФН-β.

«Выделенный» (применяемый взаимозаменяемо с «по существу чистый») при применении к полипептидам обозначает полипептид, который в силу своего происхождения или манипуляций: (ί) присутствует в клетке-хозяине в качестве продукта экспрессии части экспрессионного вектора; (ίί) связан с белком или другой химической частью, отличной от той, к которой он присоединен в природе; или (ίίί) не существует в природе, например белок, который химически модифицирован путем привешивания или добавки по меньшей мере одной гидрофобной части к белку, так что белок находится в форме, не существующей в природе. Под «выделенным» дополнительно подразумевается белок, который: (ί) синтезируется химически или (ίί) экспрессируется в клетке-хозяине и очищается от связанных или загрязняющих белков. Термин обычно обозначает полипептид, который отделен от других белков и нуклеиновых кислот, с которыми он сосуществует в природе. Предпочтительно, чтобы полипептид был также отделен от веществ, таких как антитела или матриксы геля (полиакриламид), которые применяют для его очистки. «Выделенный» (применяемый взаимозаменяемо с «по существу чистый») при применении к нуклеиновым кислотам относится к полинуклеотиду РНК или ДНК, части геномного полинуклеотида, кДНК или синтетическому полинуклеотиду, который в силу своего происхождения или манипуляций: (ί) не связан с полным полинуклеотидом, с которым он связан в природе (например, присутствует в клетке-хозяине в качестве экспрессионного вектора или его части); или (ίί) связан с нуклеиновой кислотой или другой химической частью, отличной от той, к которой он присоединен в природе; или (ίίί) не существует в природе. Под «выделенной» дополнительно подразумевается полинуклеотидная последовательность, которая (ί) амплифицируется ίη νίΐτο с помощью, например, полимеразной цепной реакции (ПЦР); (ίί) синтезируется химически;

(ΐϊί) продуцируется рекомбинантно путем клонирования или (ίν) очищается, как, например, путем отщепления и разделения на геле.

Нуклеиновая кислота является «оперативно связанной» с другой нуклеиновой кислотой, когда она размещена в функциональной взаимосвязи с последовательностью другой нуклеиновой кислоты. Например, ДНК для препоследовательности лидера секреции (например, сигнальной последовательности сигнального пептида) оперативно связана с ДНК, кодирующей полипептид, если ДНК экспрессируется в виде пребелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; и связывающий сайт рибосомы оперативно связан с кодирующей последовательностью, если он расположен так, что способствует трансляции. Обычно «оперативно связанные» обозначает, что последовательности ДНК, будучи связанными, являются соприкасающимися и в случае, например, лидера секреции соприкасаются в процессе считывания. Связывание сопровождается лигированием в подходящих сайтах рестрикции. Если таких сайтов не существует, могут быть использованы синтетические олигонуклеотидные адаптеры или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

«Процент идентичности» или «процент сходства» относится к сходству последовательностей двух полипептидов, молекул или двух нуклеиновых кислот. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занято одной и той же мономерной единицей основания или аминокислоты, то соответствующие молекулы являются идентичными по данному положению. Процент идентичности двух последовательностей является функцией числа соответствующих или идентичных положений, имеющихся в двух последовательностях, разделенного на число сравниваемых положений х 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях соответствуют или идентичны, то две последовательности гомологичны на 60%. В качестве примера последовательности ДНК СТСЛСТ и СЛССТТ проявляют 50% гомологию (3 из суммарных 6 положений соответствуют). Обычно сравнение делают, когда две последовательности выровнены для получения максимальной идентичности. Такое выравнивание может быть обеспечено при применении, например, способа Кат1ш и Л115с1ш1. описанного ниже более подробно. В отношении нуклеиновой кислоты «процент гомологии» и «процент идентичности» приме

- 4 009938 няется взаимозаменяемо, в то время как в отношении полипептида «процент гомологии» относится к степени сходства, когда аминокислоты, представляющие консервативные замены других аминокислот, рассматриваются как идентичные этим другим аминокислотам. «Консервативная замена» остатка в базовой последовательности представляет собой замену аминокислотой, которая физически или функционально сходна с соответствующим базовым остатком, например, имеет сходный размер, конфигурацию, электрический заряд, химические свойства, включая способность образовывать ковалентные или водородные связи, или тому подобное. Особенно предпочтительными консервативными заменами являются те, которые удовлетворяют критериям, определенным для «принятых точечных мутаций» в ЭаукоГГ е! а1., 5: Абак оГ Рто!еш 8ес.|иепсе апб 81тис!ите, 5: 8ирр1. 3, скар!ег 22: 354-352, ΝαΙ. Вюшеб. Кек. Роипбабоп, ХУабипдЮп. Ό.Ο. (1978). Процент гомологии или идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух последовательностей нуклеиновых кислот может быть определен с применением алгоритма выравнивания Катки и А1!кски1 (Ргос. Ναι. Асаб. 8с1. И8А 87: 2264 (1990), модифицированного Катки и А1!кски1 (Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А 90: 5873 (1993). Такой алгоритм включен в программы ΝΒΤΑ8Τ или ХВЬА8Т у А1!кски1 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 215: 403 (1990). ВЬА8Т поиски выполняются с помощью программы ПВЬА8Т, балльная оценка = 100, длина последовательности = 12, для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных нуклеиновой кислоте изобретения. ВЬА8Т поиски белков выполняются с помощью программы ХВЬА8Т, балльная оценка = 50, длина последовательности = 3, для получения аминокислотных последовательностей, гомологичных базовому полипептиду. Для получения выравниваний с пропусками для сравнений применяется ВЬА8Т с пропусками, как описано в А1!кски1 е! а1., Νυс1ею Ас1б Кек., 25: 3389 (1997). При применении ВЬА8Т и ВЬА8Т с пропусками применяются параметры соответствующих программ (ХВЬА8Т и ПВЬА8Т) по умолчанию. См. к!ίр://ννν/исЬ^.и1т.шк.доν.

Терапевтический агент ИФН-β, как указывается, обладает «терапевтической эффективностью», и количество терапевтического агента ИФН-β, как указывается, является «терапевтически эффективным», если введение данного количества терапевтического агента ИФН-β достаточно для индукции клинически значимого улучшения стандартных маркеров функции почек при введении субъекту (например, на животной модели или человеку), страдающему или относящемуся к группе риска развития гломерулонефрита или хронической почечной недостаточности. Такие маркеры почечной функции хорошо известны в медицинской литературе и включают, не ограничиваясь этим, скорости увеличения уровней азота мочевины βϋΝ, скорости увеличения креатинина сыворотки, статические измерения ВЦП, статические измерения креатинина сыворотки, скорости клубочковой фильтрации (СКФ), отношения ВЦП/креатинин, сывороточные концентрации натрия (№+), отношения моча/плазма для креатинина, отношения моча/плазма для мочевины, осмотическое давление мочи, суточную продукцию мочи и тому подобное (см., например, Вгеппег апб Ьа/атик (1994) ш Нагпкоп'к Рппс1р1ек оГ 1п!ета1 Мебюше, 13!к ебйюп, 1кке1Ьаскег е! а1., ебк., МсСга\у НШ Тех!, №\ν Уотк; Ьике апб 81тош (1994), ш 1п!ета1 Мебкше, 4111 Ебкюп, 1.Н. 8!еш, еб., МокЬу-Уеат Воок, 1пс. 8!. Ьошк.). В предпочтительном осуществлении введение терапевтически эффективного количества терапевтического агента ИФН-β ведет к снижению протеинурии, пролиферации клеток клубочков или к снижению присутствия воспалительных клеток, например, СГО8' Т-клеток и макрофагов в клубочках.

2. Терапевтические агенты ИФН-β

Терапевтические агенты ИФН-β, которые могут быть применены по изобретению, включают ИФНβ дикого типа и их биологически активные варианты, например, существующие в природе и не существующие в природе варианты. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности существующего в природе человеческого ИФН-β дикого типа представлены в 8ЕО ГО ΝΟ: 1 и 2, соответственно, которые идентичны номерам доступа ОепВапк ΝΟ: М28622 и ААА36040, соответственно. Данные ИФН описываются также, например, в 8едка1 (1985) 1. Iи!е^Ге^ои Кек. 5:521. Полноразмерный белок ИФН-β человека составляет в длину 187 аминокислот, и кодирующая последовательность 8ЕО ГО ΝΟ: 1 соответствует нуклеотидам 7 6-639. Сигнальная последовательность соответствует аминокислотам с 1 по 21. Аминокислотная последовательность зрелой формы данного ИФН-β соответствует аминокислотам 22-187 (нуклеотиды 139-639 8ЕО ГО ΝΟ: 1). Зрелый белок ИФН-β человека и кодирующая его нуклеотидная последовательность представлены в 8ЕО ГО ΝΟ: 4 и 3, соответственно.

ИФН-β, продуцируемый клетками млекопитающих, гликозилирован. Существующий в природе ИФН-β дикого типа гликозилирован по остатку 80 (Акп 80) зрелого полипептида 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4 или остатку 101 (Акп 101) незрелого полипептида 8ЕО ГО ΝΟ: 2.

Терапевтические агенты ИФН-β также включают ИФН-β, не относящийся к человеку, например позвоночного, такого как млекопитающее, например, не человекообразных приматов, бычий, овечий, свиной, лошадиный, кошачий, собачий, крысиный и мышиный; или птиц, или амфибий. Последовательности ИФН-β данных видов могут быть получены из СепВапк и/или публикаций, или они могут быть определены из нуклеиновых кислот, выделенных при мягких условиях гибридизации с геном ИФН-β других видов.

Варианты белков ИФН-β дикого типа включают белки, имеющие аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 70, 80, 90, 95, 98 или 99% идентична или гомологич

- 5 009938 на ИФН-β дикого типа, например ИФН-β человека, имеющему 8ЕО Ш N0: 2 или 4. Варианты могут иметь одну или более замен аминокислот, делеций или добавок. Например, могут быть применены биологически активные фрагменты белков ИФН-β дикого типа. Такие фрагменты могут иметь 1, 2, 3, 5, 10 или 20 аминокислот, удаленных, добавленных или замененных на С- или Ν-конце белка. Варианты могут также иметь 1, 2, 3, 5, 10 или 20 аминокислотных замен, делеций или добавок. Некоторые варианты могут иметь менее чем приблизительно 50, 40, 30, 25, 20, 15, 10, 7 или 5 аминокислотных замен, делеций или добавок. Замены могут быть существующими в природе аминокислотами или их аналогами, например, Ό-стереоизомерными аминокислотами.

В объем изобретения также входят варианты ИФН-β, кодируемые нуклеиновыми кислотами, которые гибридизуются в строгих условиях с нуклеиновой кислотой, кодирующей существующий в природе ИФН-β, например, представленный последовательностями 8ЕО Ш N0: 1 или 3, или комплементарными им. Подходящая строгость условий, которые способствуют гибридизации ДНК, например, 6,0 х хлорид натрия/цитрат натрия (88С) при приблизительно 45°С с последующим промыванием 2,0х88С при 50°С, известны специалистам в данной области техники или могут быть найдены в Сштеи! Рго1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду, 1ойп ^йеу & 8опк, Ν.Υ. (1989), 6.3.1-6.3.6. Например, концентрация соли на стадии промывки может быть выбрана от мягких условий гибридизации - приблизительно 2,0х88С при 50°С до строгих условий - приблизительно 0,2х88С при 50°С. Кроме того, температура на стадии промывки может быть увеличена от мягких условий - при комнатной температуре приблизительно 22°С, до очень строгих условий - при приблизительно 65°С. Как температуру, так и соль можно варьировать, или температуру и концентрацию соли можно поддерживать постоянными при изменении другой переменной. В предпочтительном осуществлении нуклеиновая кислота, кодирующая вариант ИФН-β, будет гибридизоваться с одной из 8Е0 Ш N0: 1 или 3 или комплементарных им в умеренно строгих условиях, например, и, включая промывку при приблизительно 2,0х88С и приблизительно 40°С. В особенно предпочтительном осуществлении нуклеиновая кислота, кодирующая вариант ИФН-β, будет связываться с одной из 8Е0 Ш Νο: 1 или 3 или комплементарных им в очень строгих условиях, например, и включая промывку при приблизительно 0,2х88С и приблизительно 65°С.

Примерами модификаций являются консервативные модификации, которые оказывают минимальный эффект на вторичную и третичную структуру белка. Примеры консервативных замен включают описанные ЭауНоГГ в Абак оГ Рго1ет 8едиепсе апб 81гисШге 5 (1978) и Агдок в ЕМВ0 1., 8, 779-785 (1989). Например, аминокислоты, принадлежащие к одной из следующих групп, представляют собой консервативные замены: а1а, рго, д1у, д1п, акп, кег, Иг. сук, кет, !уг, ΐ!τ; уа1, бе, 1еи, те!, а1а, р1е, 1ук, агд, Ык; и р1е, !уг, ίτρ, Ык.

Другие модификации включают замену одной аминокислоты другой аминокислотой, что может необязательно представлять собой консервативную замену. Например, могут быть сделаны замены, которые существенно не влияют на трехмерную структуру ИФН-β. Трехмерная структура не гликозилированного ИФН-β человека описана, например, в РабНакпкйпап е1 а1. (1996) 81гисШге 4: 1453, и трехмерная структура гликозилированного ИФН-β описана, например, в Кагрикак е1 а1. (1997) ΡΝΑ8 94:11813). Существенно, что ИФН-β включает пять спиралей: спираль А, которая состоит из приблизительно аминокислот 2-22 8Е0 Ш N0: 4; спираль В, которая состоит из приблизительно аминокислот 51-71 8Е0 Ш N0: 4; спираль С, которая состоит из приблизительно аминокислот 80-107 8Е0 Ш N0: 4; спираль Ό, которая состоит из приблизительно аминокислот 118-136 8Е0 Ш N0: 4; и спираль Е, которая состоит из приблизительно аминокислот 139-162 8Е0 Ш N0: 4 (Кагрикак е1 а1., выше). Спирали А, В, С и Е образуют закрученную влево четырехспиральную связку типа 2. Существует длинная петля в виде клеверного листа, петля АВ, которая связывает спирали А и В, и три более короткие петли (обозначаемые ВС, СО и ΌΕ), которые связывают оставшиеся спирали (Кагрикак е1 а1., выше). Предшествующие исследования показали, что ^концевая, С-концевая и гликозилированная области спирали С молекулы ИФН-β не лежат в пределах связывающего сайта для рецептора (см. \У0 00/23472 и υ88N 09/832659). Соответственно, мутации в данных областях не должны особенно неблагоприятно сказаться на биологической активности молекулы ИФН. Ранее также было показано, что мутации в спирали С (аминокислоты 81, 82, 85, 86 и 8 9 зрелого ИФН-β человека) ведут к молекуле, имеющей более высокую противовирусную активность по сравнению с ИФН-β дикого типа (см. \У0 00/23472 и υ88N 09/832659). Сходно, было показано, что мутанты по спирали А (аминокислоты 2, 4, 8 и 11 зрелого ИФН-β человека) и по петле СО (аминокислоты 110, 11, 113, 116 и 119) имеют более высокую связывающую активность в отношении рецептора и более высокую противовирусную и антипролиферативную активности по сравнению с существующим в природе человеческим ИФН-β дикого типа (см. \У0 00/23472 и υ88N 09/832659).

Другие предпочтительные модификации или замены устраняют сайты межмолекулярных поперечных сшивок или образование неправильных дисульфидных мостиков. Например, ИФН-β, как известно, имеет три остатка сук в диком типе в положениях 17, 31 и 141 8Е0 Ш N0: 4. Один вариант ИФН представляет собой ИФН, в котором сук (С) в положении 17 заменен на кег (8), как описано в патенте США № 4588585. Другие варианты ИФН-β включают варианты ИФН-β, имеющие, например, один или более

- 6 009938 кег (Б), замещающих сук (С) в положении 17 и уа1 (V) в положении 101, замещенный рйе (Е) , 1гр (XV) , 1уг (Υ) или й1к (Н) , предпочтительно рйе (Е) при нумерации в соответствии с ИФН-β дикого типа, имеющего, например, БЕЦ ΙΌ N0: 4, такого как описанный, например, в патенте США 6127 332. Другие предпочтительные варианты включают полипептиды, имеющие последовательность ИФН-β дикого типа, например, БЕЦ ΙΌ N0: 4, где уа1 (V) в положении 101 при нумерации в соответствии с ИФН-(3 дикого типа замещен на рйе (Е), 1ут (Υ), 1тр (V), 1нк (Н) или рйе (Е), так же, как описано, например, в патенте США 6127332.

Другими вариантами ИФН-β являются зрелые молекулы ИФН-β с отсутствием начального метионина, например, метионина 1 БЕЦ ΙΌ N0: 4. Иллюстративные варианты ИФН-β не имеют начального метионина и имеют, по меньшей мере, одну аминокислотную замену, например, в положении 17 зрелой формы, как описано в патенте США № 4588585.

Молекулы ИФН-β могут также быть модифицированы путем замены одной или более аминокислот одной или более дериватизированными аминокислотами, которые являются природными или не природными аминокислотами, в которых существующая в норме боковая цепь или концевая группа модифицирована с помощью химической реакции. Такие модификации включают, например, гаммакарбоксилирование, бета-карбоксилирование, пэгилирование, сульфатирование, сульфонирование, фосфорилирование, амидирование, эстерификацию, Ν-ацетилирование, карбобензилирование, тозилирование и другие модификации, известные в данной области техники.

Другие модификации включают применение аналогов аминокислот или дериватизированных аминокислот, в которых боковая цепь удлинена или укорочена при все еще сохраняющемся обеспечении карбоксильной, амино- или другой функциональной группой-предшественником для кристаллизации, а также аналогов аминокислот, имеющих вариантные боковые цепи с подходящими функциональными группами. Например, целевое соединение может включать аминокислотный аналог, такой как, например, цианоаланин, канаванин, дъенколевая кислота, норлейцин, 3-фосфосерин, гомосерин, дигидроксифенилаланин, 5-гидрокситриптофан, 1-метилгистидин, 3-метилгистидин, диаминопимелиновая кислота, орнитин или диаминомасляная кислота. Другие существующие в природе метаболиты или предшественники аминокислот, имеющие подходящие здесь боковые цепи, должны быть известны специалистам в данной области техники и включаются в объем настоящего изобретения.

Другие варианты ИФН-β включают обратные или ретропептидные последовательности. «Обратной» или «ретро» пептидной последовательностью обозначают ту часть полной последовательности ковалентно связанных аминокислотных остатков (или их аналогов или миметиков), в которой образование пептидной связи в нормальном направлении от карбоксила к амино в аминокислотном остове реверсировано так, что при считывании в общепринятом направлении слева направо аминочасть пептидной связи предшествует карбонильной части (а не следует за ней). См., обычно, Сообтап, М. апб Сйотеу, М. Ассоип1к о£ Сйет. Кек. 1979, 12, 423. Описанная здесь обратная ориентация пептидов включает (а) такую, когда один или более аминоконцевых остатков переведен в обратную (теу) ориентацию (с получением, таким образом, второго «карбоксильного конца» в самом левом положении молекулы), и (й) такую, когда один или более карбоксильных концевых остатков переведен в обратную (теу) ориентацию (с получением второго «аминоконца» в самом правом положении молекулы). Пептидная (амидная) связь не может быть образована на границе между остатком с нормальной ориентацией и остатком с обратной ориентацией. Следовательно, определенные обратные полипептиды изобретения могут быть образованы с помощью применения подходящего компонента в виде аминокислотного миметика для связи двух соседних частей последовательностей, использующих обратную пептидную (амидную) связь. В случае (а), представленном выше, центральный остаток дикетосоединения может быть легко применен для связи структур с двумя амидными связями с достижением структуры пептидомиметика. В случае (й), представленном выше, центральный остаток диаминосоединения будет также пригоден для связи структур с двумя амидными связями с образованием структуры пептидомиметика. Обратное направление связей в таких полипептидах должно обычно дополнительно требовать инверсии энантиомерной конфигурации обратных аминокислотных остатков для поддержания пространственной ориентации боковых цепей, которая сходна с таковой не обратного пептида. Конфигурация аминокислот в обратном положении пептидов представляет собой предпочтительно (Ό), и конфигурация не обратного положения представляет собой предпочтительно (Ь). Противоположные или смешанные конфигурации приемлемы, когда подходят для оптимизации связывающей активности. Модификации полипептидов дополнительно описаны, например, в патенте США № 6399075.

Терапевтические агенты ИФН-β включают также белки ИФН-β и их варианты (например, зрелый белок), соединенные с гетерологичным пептидом. Гетерологичный пептид может быть добавлен, например, с целью увеличения полупериода жизни белка ИФН-β или улучшения его продукции. Примеры гетерологичных пептидов включают молекулы иммуноглобулинов (1д) или их части, например, константный домен легкой или тяжелой цепи молекулы 1д. В одном осуществлении белок ИФН-β или его вариант присоединяют (или иным образом соединяют) ко всей или части шарнирной и константной областей легкой цепи иммуноглобулина, тяжелой цепи или к обеим. Таким образом, в данном изобретении оха

- 7 009938 растеризована молекула, которая включает: (1) часть белка ИФН-β (т.е. ИФН-β или его вариант), (2) второй пептид, например, такой, который увеличивает растворимость или длительность жизни ίη νίνο части ИФН-β, например, член суперсемейства иммуноглобулинов или его фрагмент, или часть, например, часть или фрагмент Ι§6, например, константную область тяжелой цепи 1дС 1 человека, например, СН2, СН3 и шарнирные области. Конкретно «ИФН-рДд гибрид» представляет собой белок, включающий биологически активную часть ИФН-β, соединенную с Ν-концом цепи иммуноглобулина. Виды ИФН-рДд гибрида представляют собой «ИФН-β/Εο гибрид», который является белком, включающим часть ИФН-β, соединенную с, по меньшей мере, частью константной области иммуноглобулина. Предпочтительный гибрид Ре включает часть ИФН-β, соединенную с фрагментом антитела, содержащего С-концевой домен тяжелых цепей иммуноглобулина.

Соответственно, в одном осуществлении гибридный белок имеет общую формулу Χ-Υ-Ζ, где X представляет собой полипептид, имеющий аминокислотную последовательность ИФН-β или ее часть или вариант; Υ представляет собой необязательный линкерный остаток, Ζ представляет собой полипептид, включающий по меньшей мере часть полипептида, отличную от части X интерферона бета. В других осуществлениях гибридный белок имеет общую формулу Ζ-Υ-Χ, в которой полипептид, не являющийся ИФН-β, соединен с Ν-концевой частью линкера, который соединен с Ν-концевой частью полипептида ИФН-β или его частью или вариантом. Часть Ζ может быть частью полипептида, который содержит иммуноглобулиноподобные домены. Примеры таких других полипептидов включают ί.Ό1. СЭ2. СЭ4 и члены класса I и класса II антигенов главного комплекса гистосовместимости. См. патент США 5565335 (Сароп с1 а1.) для примеров таких полипептидов.

Часть Ζ может включать, например, множество гистидиновых остатков или, предпочтительно, Рс область иммуноглобулина, Рс определяется здесь как фрагмент антитела, содержащий С-концевой домен тяжелых цепей иммуноглобулина.

Часть Υ может быть любым линкером, который позволяет части ИФН-β сохранять свою биологическую активность. Часть Υ может быть длиной в одну аминокислоту или по меньшей мере в две аминокислоты. Υ может также составлять от приблизительно 2 до приблизительно 5 аминокислот; от приблизительно 3 до приблизительно 10 аминокислот в длину или 10 или более аминокислот. В предпочтительном осуществлении Υ состоит из или включает 61у61у61у61у8ег (8Е6 Ш N0: 6), которая кодируется, например, нуклеотидной последовательностью 66С66Т66Т66СА6С (8Е6 ΙΌ N0: 5). Υ может также состоять из или включать сайт узнавания энтерокиназой, например, АйрАкрАйрАйрЬуй (8Е6 ΙΌ N0: 8), который кодируется, например, 6АС6АТ6АТ6АСАА6 (8Е6 ΙΌ N0: 7). В другом осуществлении Υ состоит из или включает 8ег8ег61уА8рА5рА8рА8рЬу8 (8Е6 ΙΌ N0: 10), которая кодируется, например, А6СТСС66А6АС6АТ6АТ6АСАА6 (8Е6 ΙΌ N0: 9).

Кроме того, на соединение между частью ИФН-β (X) и второй не-ИФН-β частью Ζ (например, областью Рс иммуноглобулина) можно также повлиять с помощью любой химической реакции, которая должна связывать две молекулы вместе так, чтобы части X и Ζ сохраняли свои соответствующие активности. Данное химическое связывание может включать многие химические механизмы, такие как ковалентное связывание, аффинное связывание, интеркалирование, координационное связывание и комплексирование. Примеры соединяющих агентов (т.е. линкеров Υ в общей формуле) для создания ковалентного связывания между частью ИФН-β и частью Ζ могут включать органические соединения, такие как тиоэфиры, карбодиимиды, сукцинимидные эфиры, диизоцианаты, такие как толилен-2,6-диизоцианат, глутеральдегиды, диазобензолы и гексаметилендиамины, такие как бис-(п-диазоний-бензоил)этилендиамин, бифункциональные производные имидоэфиров, такие как диметиладипимидат, и биоактивные соединения фтора, такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол. Данное перечисление не рассматривается: как исчерпывающее для различных классов химических присоединяющих агентов, известных в данной области техники. Многие из них имеются в продаже, такие как №сукцинимидил-3-(2пиридилдитио)пропионат (8ΡΌΡ), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (ЕОС); 4-сукцинимидилоксикарбонил-альфа-метил-альфа-(2-пиридилдитио)-толуол (8МРТ: Р1егсе Сбет. Со., Са1. # 215586).

Предпочтительный гибридный белок ИФН-β/Ι^ состоит из или включает 8Е6 ΙΌ N0: 12, которая содержит полноразмерную зрелую форму ИФН-β человека, т.е. 8Е6 ΙΌ N0: 4, соединенную с 1д61Рс человека (Ζ65107) (см. XV0 00/23472 и υ88N 09/832659) (см. фиг. 1). Соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в 8Е6 ΙΌ N0: 11. ДНК, кодирующая ИФН-β человека, заканчивается нуклеотидным триплетом 568-570 (ААС, кодирующим аргинин), и ДНК, кодирующая константную область 1д61 человека, начинается с триплета (6АС, кодирующего аспарагиновую кислоту), начинающегося с нуклеотидного номера 574 8Е6 ΙΌ N0: 11.

Другой предпочтительный гибридный белок ИФН-β/Ι^ представлен в 8Е6 ΙΌ N0: 14 и кодируется 8Е6 ΙΌ N0: 13 (см. ν0 00/23472 и υ88N 09/832659). Данный последний гибридный белок состоит из человеческого ИФН-β, соединенного с линкером 648, который сам соединен с !д61 Ес человека (Ζ66206). Линкер 648 (кодируемый нуклеотидами с 571 по 585 8Е6 ΙΌ N0: 7) состоит из аминокислотной последовательности 66668 (8Е6 Ш N0: 9). Способы получения данных белков описаны в ν0

- 8 009938

00/23472 и υ88Ν 09/8212659.

В предпочтительном осуществлении полипептид ИФН-β соединяют через его С-конец с по меньшей мере частью области Рс иммуноглобулина. ИФН-β образует аминоконцевую часть, а область Рс образует карбоксиконцевую часть. В данных гибридных белках область Рс предпочтительно ограничена шарнирным участком константного домена и доменами СН2 и СН3. Область Рс в данных гибридах может быть также ограничена частью шарнирного участка, причем часть способна образовывать межмолекулярные дисульфидные мостики, и доменами СН2 и СН3 или их функциональными эквивалентами. Данные константные области могут происходить от любого вида млекопитающего (предпочтительно человека) и могут происходить из любого подходящего класса и/или изотипа, включая 1дА, Ι§Ό, 1дМ, 1дЕ и Ι§Ο1, Ι§Ο2, ΙβΟ3 и Ι§Ο4.

Рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют гибриды 1д, могут быть получены любым способом, известным в данной области техники (МашаИк е! а1., 1982, Мо1еси1аг С1ошпд; А ЬаЬога1огу Мапиа1, Со1б 8рпп§ НагЬог ЬаЬогаЮгу. Со1б 8рпп§ НагЬог, Ν.Υ.) или получены из клонов, имеющихся в открытом доступе. Способы получения генов, которые кодируют константные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, указаны, например, ВоЫпкоп, В. е! а1., заявка РСТ, публикация № \νθ87/02671. Последовательность кДНК, кодирующая молекулу или фрагмент интерферона, может быть прямо соединена с кДНК, кодирующей константные области тяжелых цепей 1д, или может быть присоединена через линкерную последовательность. В дополнительных осуществлениях изобретения может быть создана система рекомбинантных векторов для адаптации последовательностей, кодирующих интерферон бета, к правильной рамке считывания с синтетическим шарнирным участком. Дополнительно может быть желательно включить в виде части рекомбинантной векторной системы нуклеиновые кислоты, соответствующие 3'-фланкирующей области гена иммуноглобулина, включая сайты расщепления РНК/полиаденилирования и нижележащие последовательности. Более того, может быть желательно сконструировать сигнальную последовательность выше последовательностей, кодирующих иммуноглобулиновый гибридный белок, для облегчения секреции гибридной молекулы из клетки, трансформированной рекомбинантным вектором.

В настоящем изобретении предлагаются димерные гибридные молекулы, а также мономерные или мультимерные молекулы, включающие гибридные белки. Такие мультимеры могут быть созданы с применением областей Рс или их частей, молекул 1д, которые обычно мультивалентны, таких как пентамеры 1дМ или димеры 1дА. Понятно, что для образования и стабилизации пентамеров 1дМ и димеров 1дА может быть необходима цепь 1 полипептида. Альтернативно, мультимеры гибридных белков ИФН-β могут быть образованы с применением белка с аффинностью к области Рс молекул 1д, такого как протеин А. Например, множество гибридных белков ИФН-в/иммуноглобулин может быть привязано к шарикам протеин А-агарозы.

Данные поливалентные формы полезны, так как они содержат множество интерферонсвязывающих сайтов для рецептора. Например, двухвалентный растворимый ИФН-β может состоять из двух тандемных повторов аминокислот с 1 по 166 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 4 (или кодируемых нуклеиновыми кислотами под номерами с 1 по 498 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 3) (часть X в общей формуле), разделенных линкерной областью (часть Υ), повторы связаны, по меньшей мере, с частью константного домена иммуноглобулина (часть Ζ). Могут быть также сконструированы альтернативные поливалентные формы, например, с помощью химического присоединения гибридов ИФН-β/Ι^ к любой клинически приемлемой молекуленосителю, полимеру, выбранному из группы, состоящей из фиколла, полиэтиленгликоля или декстрана с применением общепринятых способов присоединения. Альтернативно, ИФН-β может быть химически присоединен к биотину, и затем биотин-интерферон бета-Рс конъюгату дают связаться с авидином, что дает четырехвалентные молекулы авидин/биотин/интерферон бета. Гибриды ИФН-β/Ι^ могут быть также ковалентно присоединены к динитрофенолу (ΌΝΡ) или тринитрофенолу (ΤΝΡ), и полученный конъюгат осажден анти-Э№-или анти-ТОТ-ЦМ с образованием декамерных конъюгатов с валентностью 10 для связывающих сайтов рецепторов интерферона бета.

Производные белков изобретения также включают различные структурные формы первичного белка, которые сохраняют биологическую активность. Благодаря присутствию ионизируемых амино- и карбоксильных групп, например, белки ИФН-β и их варианты могут быть в форме солей кислоты или основания или могут быть в нейтральной форме. Индивидуальные аминокислотные остатки можно также модифицировать с помощью окисления или восстановления. Кроме того, первичную аминокислотную структуру (включая Ν- и/или С-концевые части) или гликан ИФН-β можно модифицировать («дериватизировать») с помощью образования ковалентных или агрегатных конъюгатов с другими химическими частями, такими как гликозильные группы, полимеры полиалкиленгликоля, такие как полиэтиленгликоль, липиды, фосфат, ацетильные группы и тому подобное, или с помощью создания мутантных аминокислотных последовательностей.

Другие производные интерферона бета/Ι^ включают ковалентные или агрегатные конъюгаты интерферона бета или его фрагментов с другими белками или полипептидами, такими как дополнительные Ν-концы или С-концы, полученные синтезом в рекомбинантной культуре. Например, конъюгированный

- 9 009938 пептид может быть сигнальной (или лидирующей) полипептидной последовательностью Ν-концевой области белка, который котрансляционно или посттрансляционно направляет перенос белка из места его синтеза к месту его функции внутри или снаружи клеточной мембраны или стенки (например, дрожжевой лидер-альфа-фактор). Например, сигнальный пептид может быть от ИФН-β, т.е. аминокислоты с 1 по 21 8Еф ΙΌ N0: 2, соответствующие нуклеотидам 1-138 8Еф ΙΌ N0: 1. Сигнальный пептид может быть также от УСАМ, т.е. аминокислоты 1-24 8Еф ΙΌ N0: 12, которые кодируются нуклеотидами 1-72 8Еф ΙΌ N0: 11.

Гетерологичный полипептид (например, пептид) или другая молекула может также быть использована в качестве метки или для помощи в очистке терапевтического агента ИФН-β. Такие пептиды хорошо известны в данной области техники. Например, полинуклеотид настоящего изобретения может быть соединен в рамке считывания с маркерной последовательностью, обозначаемой здесь также как Тадкесщепсе («таг-последовательность»), кодирующая «таг-пептид», что позволяет маркировать и/или очищать полипептид настоящего изобретения. В предпочтительном осуществлении маркерная последовательность представляет собой гексагистидиновый таг, например, поставляемый вектором РфЕ-9. Имеются в продаже другие многочисленные таг-пептиды. Другие часто применяемые таги включают эпитопы тус (например, см. ЕШкоп е! а1. (1991) 1. ΒίοΙ. Сйет. 266:21150-21157), которые включают последовательность из 10 остатков от с-тус, систему рЕЬАС (1п1етпа1юпа1 Вю1есйпо1од1ек, 1пс.), систему ρΞΖΖпротеин А (Рйаттааа, N1) и часть из 16 аминокислот от белка гемагглютинина НаеторЫ1и§ шПиепха. Более того, любой пептид может быть использован в качестве тага при условии, что реагент, например, антитело, взаимодействующее специфически с таг-полипептидом, имеется в наличии или может быть получено или идентифицировано.

В одном осуществлении белок ИФН-β или его вариант соединяют на N или С-конце с одним из следующих пептидов: ΗίδΗίδΗίδΗίδΗίδΗίδ (8Еф ΙΌ N0: 16), который может кодироваться нуклеотидной последовательностью САТСАТСАТСАТСАТСАТ (8Еф ΙΌ N0: 15); 8е^С1уС1уΗ^кΗ^кΗ^кΗ^кΗ^кΗ^к (8Еф ΙΌ N0: 18), который может кодироваться нуклеотидной последовательностью ТСССССССССАТСАТСАТСАТСАТСАТ (8Еф ΙΌ N0: 15) и 8е^61у61уΗ^кΗ^кΗ^кΗ^кΗ^кΗ^к8е^8е^61уАкрАкрАкрАкр^ук (8Еф ΙΌ N0: 20), который может кодироваться нуклеотидной последовательностью ТСССССССССАТСАТСАТСАТСАТСАТАССТССССАСАССАТСАТСАСААС (8Еф ΙΌ N0: 19) .

Аминокислотная последовательность интерферона бета может быть также присоединена к пептиду АкрТутБукАкрАкрАкрАкрБук (ΌΎΚΌΌΌΌΚ) (8Еф ΙΌ N0: 21) (Норр е! а1., Вю/Тесйпо1оду 6: 1204, 1988). Последняя последовательность является высоко антигенной и обеспечивает эпитопом, обратимо связываемым специфическим моноклональным антителом, позволяя быстро тестировать и легко очищать экспрессируемый рекомбинантный белок. Данная последовательность также специфически расщепляется энтерокиназой слизистой быка по остатку, следуемому сразу после пары Акр-Бук.

В другом осуществлении терапевтический агент ИФН-β включает белок ИФН-β или его вариант, соединенный с белком альбумином, его вариантом или частью. Такой гибридный белок может быть создан, как описано, например, в \У0 01/77137.

Терапевтический агент ИФН-β может также включать молекулу, которая не является полипептидом. Например, белок ИФН-β или его вариант могут быть присоединены ковалентно или не ковалентно к полимеру, например, биодеградируемому полимеру. Например, белок ИФН-β или его вариант могут быть пэгилированы, например, присоединены к полиэтиленгликолю (ПЭГ), как описано в \У0 00/23114.

В широких рамках настоящего изобретения единственная молекула полимера может быть применена для конъюгации с ИФН-β, хотя также предусматривается, что может быть присоединено также более одной полимерной молекулы. Должно быть понятно, что при конъюгации полимера могут применяться любые группы, части или другие варианты конъюгирующихся агентов, которые подходят для конечного использования при применении. В качестве примера, в некоторых применениях может быть пригодно ковалентное привязывание к полимеру функциональной части, придающей устойчивость к УФдеградации или антиоксидантной, или имеющей другие свойства или характеристики. В качестве дополнительного примера, в некоторых применениях может быть выгодно функционализировать полимер, придавая ему реакционную способность или способность к поперечной сшивке, для усиления различных свойств или характеристик всего конъюгированного материала. Соответственно, полимер может содержать любую функциональную часть, повторяющиеся группы, связи или другие постоянные структуры, которые не препятствуют эффективности композиции конъюгированного ИФН-β в предназначенных для него целях.

ИФН-β конъюгируют наиболее предпочтительно через концевую реакционноспособную группу полимера, хотя конъюгации могут также быть ответвлены от не концевых реакционноспособных групп. Полимер с реакционноспособной(ными) группой(ами) обозначают здесь как «активированный полимер». Реакционноспособная группа избирательно взаимодействует со свободными амино- или другими реакционноспособными группами на белке. Активированный(ые) полимер(ы) взаимодействует(ют) так, что присоединение может осуществляться к любой доступной аминогруппе ИФН-β, такой как альфааминогруппы или эпсилон-аминогруппы лизинов. Свободные карбоксильные группы, подходящим обра

- 10 009938 зом активированные карбонильные группы, гидроксил, гуанидил, окисленные углеводные части и меркаптогруппы ИФН-β (если они доступны) также могут быть использованы в качестве сайтов присоединения.

Хотя полимер может быть присоединен где угодно на молекуле ИФН-β или его варианте, или других аминокислотах, присоединенных прямо или непрямо к молекуле ИФН-β, наиболее предпочтительный сайт для присоединения полимера представляет собой Ν-конец молекулы ИФН-β. Вторичный(ые) сайт(ы) находится(ятся) у или около С-конца и присоединены через остатки сахаров. Таким образом, изобретение охватывает в качестве своих наиболее предпочтительных осуществлений: (ί) конъюгаты ИФН-β или его варианта, соединенные с полимером по Ν-концу; (ίί) конъюгаты ИФН-β или его варианта, соединенные с полимером по С-концу; (ш) соединенные с сахарами конъюгаты полимерных конъюгатов; (ίν) а также конъюгаты белков ИФН-β или их вариантов, соединенные с полимером по Ν-, Сконцам и по сахарам.

Обычно применяют от приблизительно 1,0 до приблизительно 10 моль активированного полимера на моль белка в зависимости от концентрации белка. Конечное количество представляет собой баланс между максимализацией степени реакции при минимализации неспецифических модификаций продукта и при определении в то же время химического состава, который должен поддерживать оптимальную активность, наряду с этим при оптимизации в то же время, если это возможно, полупериода жизни белка.

Предпочтительно, чтобы сохранялось, по меньшей мере, приблизительно 50% биологической активности белка, и наиболее предпочтительно, чтобы сохранялось 100%.

Реакции можно осуществлять с помощью любого подходящего метода, применяемого для взаимодействия биологически активных материалов с инертными полимерами, предпочтительно приблизительно при рН 5-7, если реакционноспособные группы находятся на альфа-аминогруппе на Ν-конце. Обычно процесс включает получение активированного полимера (который может иметь по меньшей мере одну концевую гидроксильную группу) и после этого взаимодействие белка с активированным полимером для получения растворимого белка, подходящего для состава. Модификации указанной выше реакции могут быть проведены несколькими способами, которые могут включать одну или более стадий.

Как указывалось выше, в наиболее предпочтительных осуществлениях изобретения в качестве линкера к полимеру применяется Ν-концевой участок ИФН-β. Одним иллюстративным способом является способ восстановительного алкилирования, в котором используется дифференциальная реакционная способность различных типов первичных аминогрупп (эпсилон-аминогрупп на лизине в сравнении с аминогруппами Ν-концевого метионина), доступных для дериватизации на ИФН-β. При подходящих избирательных условиях может быть достигнута по существу избирательная дериватизация ИФН-β по Νконцу карбонильной группой, содержащей полимер. Реакцию проводят при рН, который позволяет достичь преимущества в различиях рКа между эпсилон-аминогруппами остатков лизина и альфааминогруппой Ν-концевого остатка ИФН-β. Данный тип химических превращений хорошо известен специалистам в данной области техники.

Например, может быть использована реакционная схема, в которой данная избирательность поддерживается с помощью проведения реакций при низком рН (обычно 5-6) при условиях, когда полимер ПЭГ-альдегид вводят в реакцию с ИФН-β в присутствии цианоборгидрида натрия. После очистки ПЭГ ИФН-β и анализа с помощью ДДС-Να ПААГЭ, масс-спектрометрии ΜΆΕΌΙ и пептидного секвенирования/картирования это дает ИФН-β, чей Ν-конец специфически помечен частью ПЭГ.

Кристаллическая структура ИФН-β указывает на то, что Ν- и С-концы локализованы близко друг к другу (см. Кагризаз с1 а1., 1997, Ргос. Ναίί. Лсаб. 8с1. 94: 11813-11818). Таким образом, модификации Сконцевого участка ИФН-β также должны иметь минимальный эффект на активность. Так как не существует простой химической стратегии для целевого присоединения полиалкиленгликолевого полимера, такого как ПЭГ, к С-концу, следует прибегнуть прямо к генной инженерии сайта, который может быть применен в качестве мишени для полимерной части. Например, включение Суз в сайт, который находится у или около С-конца, должно позволить создать специфическую модификацию с применением малеимида, винилсульфона или галогенцетат-активированного полиалкиленгликоля (например, ПЭГ). Данные производные могут быть специфически применены для модификации сконструированных цистеинов, благодаря высокой избирательности данных реагентов для Суз. Другие стратегии, такие как включение гистидинового тага, который может быть мишенью (Раису с1 а1., (1996) Сйсш. & Βίοί. 3: 551), или добавочного сайта гликозилирования, представляют собой другие альтернативы для модификации С-конца ИФН-β.

Гликан на определенном ИФН-β находится также в положении, которое позволяет сделать дополнительную модификацию без изменения активности. Способы целевых сахаров как сайтов для химической модификации также хорошо известны и, следовательно, возможно, чтобы полиалкиленгликолевый полимер был добавлен прямо и специфично к сахарам на ИФН-β, которые были активированы окислением. Например, может быть создан полиэтиленгликоль-гидразид, который образует относительно стабильные гидразоновые связи путем конденсации с альдегидами и кетонами. Данное свойство было ис

- 11 009938 пользовано для модификации белков через окисленные олигосахаридные связи. См. Лпбгс5/. Н. е! а1., (1978), Макгото1. СНст. 179: 301. В частности. обработка ПЭГ-карбоксиметилгидразида нитритом дает ПЭГ-карбоксиметилазид, который представляет собой электрофильно активную группу. реакционноспособную в отношении аминогрупп. Данная реакция может быть использована также для получения белков, модифицированных полиалкиленгликолем. См. патенты США 4101380 и 4179337.

Химические модификации, опосредованные тиоловым линкером, могут дополнительно способствовать поперечным сшивкам белков. Это может быть выполнено, например, путем создания реакционно способных альдегидов на углеводных частях с помощью периодата натрия с образованием цистаминовых конъюгатов через альдегиды и индукцией поперечных сшивок через тиоловые группы на цистаминах (см. Рершкку, В. е! а1., (1991), 1. ΒίοΙ. Сйет., 266: 18244-18249 и Сйеп, Ь.Ь. е! а1., (1991) 1. ΒίοΙ. Сйет., 266: 18237-18243). Соответственно, данный тип химических превращений, как ожидается, будет подходить для модификации полиалкиленгликолевыми полимерами, когда линкер включается в сахар и полиалкиленгликолевый полимер присоединяется к линкеру. Тогда как содержащие аминотиол или гидразин линкеры способны допускать присоединение единичной полимерной группы, структура линкера может варьироваться так, чтобы присоединялось множество полимеров и/или чтобы пространственная ориентация полимера в отношении ИФН-β изменялась.

Примеры полимеров включают растворимый в воде полимер, такой как полиалкиленгликолевый полимер. Не ограничивающийся перечень таких полимеров включает другие полиалкиленоксидные гомополимеры, такие как полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные полиолы, их сополимеры и их блок-сополимеры. Другие примеры подходящих растворимых в воде и не пептидных полимерных остовов включают поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(гидроксипропилметакриламид), поли(а-гидрокси кислоту), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолин, поли (Ν-акрилоилморфолин) и их сополимеры, триполимеры и смеси. В одном осуществлении полимерный остов представляет собой поли(этиленгликоль) или монометоксиполиэтиленгликоль (мПЭГ), имеющие среднюю молекулярную массу от приблизительно 200 Да до приблизительно 400000 Да. Должно быть понятно, что другие родственные полимеры также подходят для применения при осуществлении данного изобретения и что применение термина ПЭГ или поли(этиленгликоль) рассматривается как включающее, а не исключающее в данном отношении. Термин ПЭГ включает поли(этиленгликоль) в любой из его форм, включая алкоксиПЭГ, бифункциональный ПЭГ, многорукий ПЭГ, раздвоенный ПЭГ, разветвленный ПЭГ, подвешенный ПЭГ или ПЭГ с деградируемыми связями в нем.

В одном осуществлении полиалкиленгликолевые остатки С1-С4 алкилполиалкиленгликолей, предпочтительно полиэтиленгликоля (ПЭГ), или поли(окси)алкиленгликолевые остатки таких гликолей включаются в интересующие полимерные системы. Таким образом, полимер, к которому присоединяется белок, может быть гомополимером полиэтиленгликоля (ПЭГ) или представлять собой полиоксиэтилированный полиол, предлагаемый во всех случаях так, что полимер является растворимым в воде при комнатной температуре. Не ограничивающие примеры таких полимеров включают полиалкиленоксидные гомополимеры, такие как ПЭГ или полипропиленгликоли, полиоксиэтиленированные гликоли, их сополимеры и их блок-сополимеры, предлагаемые так, что поддерживается растворимость в воде блоксополимера. Примеры полиоксиэтилированных полиолов включают, например, полиоксиэтилированный глицерин, полиоксиэтилированный сорбит, полиоксиэтилированную глюкозу или тому подобное. Глицериновый остов полиоксиэтилированного глицерина представляет собой тот же остов, что и существующий в природе, например, у животных и человека в моно-, ди- и триглицеридах. Следовательно, данное ветвление не должно обязательно рассматриваться как чужеродный агент в организме.

В качестве альтернативы полиалкиленовым оксидам могут быть применены декстран, поливинилпирролидоны, полиакриламиды, поливиниловые спирты, полимеры на основе углеводов и тому подобное. Специалист в данной области техники должен знать, что предшествующий перечень является только иллюстративным и что охватываются все полимерные материалы, имеющие описываемые здесь качества.

Необязательно, чтобы полимер имел какую-либо конкретную молекулярную массу, но предпочтительно, чтобы молекулярная масса была между приблизительно 300 и 100000, более предпочтительно между 10000 и 40000. В частности, размеры 20000 или более являются наилучшими для предотвращения потери белка из-за фильтрации в почках.

Создание производных полиалкиленгликолей дает ряд выгодных свойств для состава конъюгатов полимер-ИФН-β при осуществлении настоящего изобретения, связанных со следующими свойствами производных полиалкиленгликолей: улучшение растворимости в воде при отсутствии в то же время антигенного или иммуногенного ответа; высокая степень биосовместимости; отсутствие биодеградации производных полиалкиленгликолей ίη νίνο; и свободная экскреция живыми организмами.

Более того, в другом аспекте изобретения можно применять ИФН-β, ковалентно связанный с полимерным компонентом, в котором природа конъюгации включает расщепляемые химические ковалентные связи. Это позволяет осуществлять контроль в плане течения времени, за которое полимер может быть

- 12 009938 отщеплен от ИФН-β. Данная ковалентная связь между лекарством ИФН-β и полимером может быть расщеплена путем химической или ферментативной реакции. Продукт полимер-ИФН-β сохраняет приемлемый уровень активности. Одновременно части полиэтиленгликоля присутствуют в конъюгирующем полимере для наделения конъюгата полимер-ИФН-β высокой растворимостью в воде и увеличенной способностью к циркуляции в кровотоке. В результате данных улучшенных характеристик изобретение охватывает парентеральную, интраназальную и пероральную доставку обоих активных видов полимераИФН-β и, после гидролитического расщепления, биодоступность ИФН-β рег 5С при применении ίη νίνο.

Взаимодействие полимера с ИФН-β для получения конъюгатов, например, Ν-концевых конъюгированных продуктов, может быть легко осуществлено с применением широкого спектра реакционных схем. Активность и стабильность конъюгатов ИФН-β может варьироваться несколькими способами с помощью применения полимера с различным размером молекулы. Растворимость конъюгатов может варьироваться путем изменения пропорции и размера фрагмента полиэтиленгликоля, включенного в полимерную композицию.

В одном осуществлении конъюгаты по настоящему изобретению получают путем взаимодействия белка с активированным полиалкиленгликолевым соединением (РСС) . Например, ИФН может быть введен в реакцию с ПЭГ-альдегидом в присутствии восстанавливающего агента (например, цианоборгидрида натрия) с получением через восстановительное алкилирование конъюгата ПЭГ-белок, соединенных через аминную связь. См., например, европейский патент 0154316 В1 и международную патентную заявку № РСТ/и803/01559.

В определенных осуществлениях изобретения ИФН-β человека пэгилирован со следующими активированными полиалкиленгликолями: 20 кДа мПЭГ-О-2-метилпропиональдегидом, 20 кДа мПЭГ-О-пметилфенил-О-2-метилпропиональдегидом, 20 кДа мПЭГ-О-м-метилфенил-О-2-метилпропиональдегидом, 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом, 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилпропиональдегидом и 20 кДа мПЭГ-О-м-фенилацетальдегидом, с получением ИФН-β, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-2метилпропиональдегидом, ИФН-Р, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-п-метилфенил-0-2метилпропиональдегидом, ИФН-β, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-м-метилфенил-О-2метилпропиональдегидом, ИФН-β, модифицированного 20 кДа мПЭГ -О-п-фенилацетальдегидом, ИФНβ, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилпропиональдегидом, и ИФН-β, модифицированного 20 кДа мПЭГ-О-м-фенилацетальдегидом, соответственно. Подробное описание получения и характеристика человеческого ИФН-β, модифицированного 20 кДа мПЭГ-Ο-2-метилпропиональдегидом и 20 кДа мПЭГ О-п-фенилацетальдегидом, представлено ниже и также предлагается в международной патентной заявке Νο. РСТ/и803/01559.

В одном осуществлении пэгилированный ИФН-β получают следующим образом. ИФН-β, например, сыпучий промежуточный продукт ИФН^-1а (клиническая партия сыпучего лекарства, которая проходит все тесты для применения у человека) в концентрации 250 мкг/мл в 100 мМ фосфате натрия, рН 7,2, 200 мМ №С1, разводят равным объемом 100 мМ МЕ8, рН 5,0, и рН доводят до 5,0 с помощью НС1. Образец наносят на колонку РР 8Р-Сефарозы® (Рйаттае1а, Рйеайпуау. N1) при 6 мг ИФН^/мл смолы. Колонку промывают 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ №С1, и продукт элюируют 30 мМ фосфата натрия, рН 6,0, 600 мМ №С1. Фракции элюата могут быть проанализированы на их величины поглощения при 280 нм, и концентрацию интерферона в образцах, определенную по поглощению с применением коэффициента экстинкции 1,51 для раствора 1 мг/мл.

К раствору ИФН-β 1 мг/мл из элюата 8Р добавляют 0,5 М фосфат натрия, рН 6,0, до 50 мМ, цианоборгидрид натрия (Л1йпсй, Мйтаикее, XVI) добавляют до 5 мМ и 20К ПЭГ альдегида (811еаг\\'а1ег Ро1утегк, Нип1етШе, ЛЬ) добавляют до 5 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 20 ч. Пэгилированный интерферон очищают от продуктов реакции с помощью последовательных хроматографических стадий на колонке для РРЬС Суперозы® 6 (Рйатташа), делящей по размеру, 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 150 мМ №1С1 в качестве подвижной фазы, и на 8Р-Сефарозе® РР. Использование делящей по размеру колонки ведет к базисной линии разделения модифицированного и не модифицированного ИФН-β. Пул элюата с гель-фильтрации, содержащий ПЭГ-интерферон бета, разводят 1:1 водой и наносят на колонку 8Р-Сефарозы® 2 мг интерферона бета/мл смолы. Колонку промывают 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 75 мМ №С1, и затем пэгилированный интерферон бета элюируют с колонки 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 800 мМ №С1. Фракции элюата анализируют на содержание белка по поглощению при 280 нм. Концентрацию пэгилированного интерферона представляют в эквивалентах интерферона, так как часть ПЭГ не вносит вклад в поглощение при 280 нм. Данный способ и характеристика полученного пэгилированного ИФН-β дополнительно описаны в νΟ 00/23114. Конъюгация ПЭГ с ИФН-β, очевидно, не изменяет его противовирусной активности. Кроме того, было обнаружено, что специфическая активность пэгилированного ИФН-β является более высокой (приблизительно в 10 раз), чем таковая не пэгилированного ИФН-β (νΟ 00/23114).

ИФН-β может быть также пэгилирован частью 5К ПЭГ, которая может быть приобретена, например, у Р1ика, 1пс. (С’а1. № 75936, Копкопкотап, ΝΥ), следуя тому же протоколу, что и описанный выше

- 13 009938 для 20К ПЭГ альдегида.

ИФН-β, модифицированный 20 кДа мПЭГ -О-2-метилпропиональдегидом, может быть получен следующим образом. 10 мл сыпучего промежуточного продукта ИФН-β-Ιη (клиническая партия сыпучего лекарства, которая проходит все тесты для применения у человека), 250 мкг/мл, в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 200 мМ ЫаС1, разводят 12 мл 165 мМ МЕ8, рН 5,0, и 50 мл 5 н НС1. Образец наносят на 300 мкл колонку ЕЕ 8Р-Сефарозы (Рйаттас1а). Колонку промывают 3x300 мкл 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ №1С1. и белок элюируют 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 600 мМ ЫаС1. Фракции элюата анализируют на их поглощение при 280 нм, и концентрацию ИФН-β в образцах, определенную с применением коэффициента экстинкции 1,51 для раствора 1 мг/мл. Фракции пика объединяют, что дает концентрацию ИФН-β 3,66 мг/мл, разводимую затем до 1,2 мг/мл водой.

К 0,8 мл ИФН-β из разведенного пула элюата с 8Р-Сефарозы добавляют 0,5 М фосфат натрия, рН 6,0, до 50 мМ, цианоборгидрид натрия (А1бпс11) добавляют до 5 мМ и 20 кДа мПЭГ-О-2метилпропиональдегид добавляют до 5 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 16 ч в темноте. ПЭГилированный ИФН-β очищают из реакционной смеси на колонке ЕЕ 8РСефарозы, 0,5 мл, следующим образом: 0,6 мл реакционной смеси разводят 2,4 мл 20 мМ МЕ8, рН 5,0, и наносят на колонку 8Р-Сефарозы. Колонку промывают фосфатом натрия, рН 5,5, 75 мМ ЫаС1, и затем ПЭГилированный ИФН-β элюируют с колонки 25 мМ МЕ8, рН 6,4, 400 мМ ЫаС1. ПЭГилированный ИФН-β дополнительно очищают на колонке для ЕРЬС Суперозы 6 НК 10/30, делящей по размеру, 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 150 мМ ЫаС1 в качестве подвижной фазы. Скорость тока через делящую по размеру колонку (25 мл) составляет 20 мл/ч, и собирают фракции по 0,5 мл. Фракции элюата анализируют на содержание белка по поглощению при 280 нм, объединяют и определяют концентрацию белка пула.

Концентрацию ПЭГ илированного ИФН-β представляют в эквивалентах ИФН, так как часть ПЭГ не вносит вклад в поглощение при 230 нм. Образцы пула отбирают для анализа, и оставшаяся часть может разводиться до 30 мкг/мл буфером состава, содержащим Н8А, аликвотироваться по 0,25 мл/флакон и храниться при -70°С.

ИФН-β, модифицированный 20 кДа мПЭГ-О-п-фенилацетальдегидом, может быть получен следующим образом. 20 мл сыпучего промежуточного продукта ИФН-β® (клиническая партия сыпучего лекарства, которая проходит все тесты для применения у человека), 250 мкг/мл, в 100 мМ фосфата натрия, рН 7,2, 200 мМ ЫаС1, разводят 24 мл 165 мМ МЕ8, рН 5,0, 100 мкл 5 н НС1 и 24 мл воды. Образец наносят на 600 мкл колонку ЕЕ 8Р-Сефарозы (Рйаттааа). Колонку промывают 2x900 мкл 5 мМ фосфата натрия, рН 5,5, 75 мМ ЫаС1, и белок элюируют 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 600 мМ ЫаС1. Фракции элюата анализируют на их поглощение при 280 нм, и концентрацию ИФН-β в образцах определяют с применением коэффициента экстинкции 1,51 для раствора 1 мг/мл. Фракции пика объединяют, что дает концентрацию ИФН-β 2,3 мг/мл. К 1,2 мл ИФН^Иа из пула элюата с 8Р-Сефарозы добавляют 0,5 М фосфат натрия, рН 6,0, до 50 мМ, цианоборгидрид натрия (А1бпс11) добавляют до 5 мМ и 20 кДа мПЭГО-п-фенилацетальдегид добавляют до 10 мг/мл. Образец инкубируют при комнатной температуре в течение 18 час в темноте. Пэгилированный ИФН-β может быть очищен из реакционной смеси на колонке ЕЕ 8Р-Сефарозы, 0,75 мл, следующим образом: 1,5 мл реакционной смеси разводят 7,5 мл 20 мМ МЕ8, рН 5,0, 7,5 мл воды и 5 мкл 5 н НС1 и наносят на колонку 8Р-Сефарозы. Колонку промывают фосфатом натрия, рН 5,5, 75 мМ ЫаС1, и затем ПЭГилированный ИФН-β элюируют с колонки 20 мМ МЕ8, рН 6,0, 600 мМ №1С1. ПЭГилированный ИФН-β дополнительно очищают на колонке для ЕРЬС Суперозы 6 НК 10/30, делящей по размеру, 5 мМ фосфатом натрия, рН 5,5, 150 мМ №1С1 в качестве подвижной фазы. Скорость тока через делящую по размеру колонку (25 мл) составляет 20 мл/ч, и собирают фракции по 0,5 мл. Фракции элюата анализируют на содержание белка по поглощению при 280 нм, объединяют и определяют концентрацию белка пула. Концентрацию ПЭГилированного ИФН-β представляют в эквивалентах ИФН после учета вклада ПЭГ (20 кДа мПЭГ-О-п-фенилацетальдегид имеет коэффициент экстинкции при 280 нм 0,5 для раствора 1 мг/мл) в поглощение при 280 нм с применением коэффициента экстинкции 2 для раствора ПЭГилированного ИФН-β 1 мг/мл. Образцы пула могут быть отобраны для анализа, и оставшаяся часть может разводиться до 30 мкг/мл буфером состава, содержащим Н8А, аликвотироваться по 0,25 мл/флакон и храниться при -70°С.

В способах изобретения может быть применен гликозилированный ИФН-β, соединенный с не существующим в природе полимером. Полимер может включать полиалкиленгликолевую часть. Полиалкиленгликолевая часть может быть присоединена к интерферону-бета с помощью группы, выбранной из альдегидной группы, малеимидной группы, винилсульфоновой группы, галогенацетатной группы, множества гистидиновых остатков, гидразиновой группы и аминотиоловой группы. ИФН-β может быть присоединен к полиэтиленгликолевой части, где ИФН-β присоединяют к полиэтиленгликолевой части с помощью лабильной связи, где лабильная связь расщепляется путем биохимического гидролиза и/или протеолиза. Полимер может иметь молекулярную массу от приблизительно 5 до приблизительно 40 кДа. Другой ИФН-β, который может быть применен, представляет собой физиологически активную компози

- 14 009938 цию интерферона-бета, включающую физиологически активный гликозилированный интерферон-бета, связанный на Ν-конце с полимером, включающим полиалкиленгликолевую часть, где физиологически активный интерферон-бета и полиалкиленгликолевая часть организованы так, что физиологически активный интерферон-бета в физиологически активной композиции интерферона-бета имеет по существу сходную активность по сравнению с физиологически активным интерфероном-бета, не имеющим указанной части, при тестировании на противовирусную активность.

Гетерологичные полипептиды или другие молекулы могут быть ковалентно или нековалентно связаны с белком ИФН-β или его вариантом. «Ковалентно связаны» означает, что различные остатки согласно изобретению либо прямо ковалентно связаны друг с другом, либо иначе непрямо ковалентно соединены друг с другом через промежуточную часть или части, такие как мостик, спейсер или линкерная часть или части. Промежуточная часть или части называют «присоединяющей группой». Термин «конъюгированный» применяют взаимозаменяемо с «ковалентно связанным».

ИФН-β для применения в изобретении может быть гликозилированным или не гликозилированным (или без гликозилирования). Не гликозилированные ИФН-β могут быть получены, например, в прокариотических клетках-хозяевах. Белки ИФН-β или их варианты также могут быть модифицированы путем присоединения полисахаридов, которые не присутствуют на ИФН-β в нормальных условиях.

3. Способы получения терапевтических агентов ИФН-β

Терапевтические агенты ИФН-β настоящего изобретения могут быть получены любыми подходящими способами, такими как способы, включающие конструирование нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический агент ИФН-β, и экспрессию данной нуклеиновой кислоты в подходящем трансформированном хозяине. Данный способ будет давать рекомбинантные терапевтические агенты ИФН-β. Терапевтические агенты ИФН-β могут также быть получены с помощью химического синтеза или сочетания химического синтеза и технологии рекомбинантной ДНК.

В одном осуществлении нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтический агент ИФН-β, конструируют путем выделения или синтеза последовательности ДНК, кодирующей ИФН-β или его вариант. Например, гибридный белок ИФН-β может быть получен, как описано, например, здесь. Существующая в природе нуклеиновая кислота ИФН-β может быть получена в соответствии с методами, хорошо известными в данной области техники. Например, нуклеиновая кислота может быть выделена с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с применением РНК, полученной из клетки, известной как экспрессирующая ИФН-β, например лейкоцита, и праймеров на основе последовательности гена ИФН-β, например, 8ЕС Ш N0: 1. Нуклеиновые кислоты, кодирующие белки ИФН-β, могут также быть выделены с помощью скрининговых библиотек, например библиотек кДНК, созданных от клеток, экспрессирующих ИФН-β, с зондом, например, олигонуклеотидом, включающим часть последовательности ИФН-β.

Альтернативно, может быть использована полная аминокислотная последовательность для конструирования гена по обратной трансляции. Может быть синтезирован олигомер ДНК, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую терапевтический агент ИФН-β. Например, можно синтезировать несколько небольших олигонуклеотидов, кодирующих части желаемого пептида, и затем связать их вместе. Индивидуальные нуклеотиды обычно содержат 5' или 3' выступающие концы для комплементарного объединения.

Изменения в нуклеиновые кислоты, кодирующие белки ИФН-β, могут быть введены способами, хорошо известными в данной области техники. Например, изменения могут быть сделаны с помощью сайт-направленного мутагенеза, как описано, например, в Магк с! а1., 8йе-8ресгГ1с Мшадепемх 0Г Тйе Нитап НЬгоЫай 1п1егГегоп Сепе, Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8ск И8А, 81, рр. 5662-66 (1984) и в патенте США № 4588585.

Другой способ конструирования нуклеиновой кислоты, кодирующей терапевтический агент ИФН-β, заключается в химическом синтезе. Например, ген, который кодирует желаемый терапевтический агент ИФН-β, может быть синтезирован химическими способами с применением олигонуклеотидного синтезатора. Такие олигонуклеотиды создаются на основе аминокислотной последовательности желаемого терапевтического агента ИФН-β.

При выборе нуклеиновой кислоты для экспрессии в экспрессионной системе может быть желательным отбор тех кодонов, которые благоприятны для клетки-хозяина или экспрессионной системы, в которой рекомбинантный агент ИФН-β будет продуцироваться. Известно, например, что определенные кодоны экспрессируются предпочтительно по сравнению с другими в прокариотических клетках («предпочтение кодонов»).

Последовательность ДНК, кодирующая терапевтический агент ИФН-β, может также включать или не включать последовательность ДНК, которая кодирует сигнальную последовательность. Такая сигнальная последовательность, если она присутствует, должна быть такой, чтобы узнаваться клеткой, выбранной для экспрессии терапевтического агента ИФН-β. Сигнальная последовательность может быть прокариотической, эукариотической или сочетанием их двух. Сигнальные последовательности хорошо

- 15 009938 известны в данной области техники, и несколько различных представителей описано в данной области техники. Сигнальная последовательность может быть таковой от нативного (т.е. существующего в природе) ИФН-β. Включение сигнальной последовательности зависит от того, является ли желательным получение терапевтического агента ИФН-β, секретируемого рекомбинантными клетками, в которых он продуцируется. Если выбранные клетки являются прокариотическими, обычно предпочтительно, чтобы последовательность ДНК не кодировала сигнальную последовательность. Если выбранные клетки являются эукариотическими, обычно предпочтительно, чтобы сигнальная последовательность кодировалась, и наиболее предпочтительно, чтобы применялась сигнальная последовательность ИФН-β дикого типа.

Уже скомпонованную (с помощью синтеза, сайт-направленного мутагенеза или другого способа) нуклеиновую кислоту, кодирующую терапевтический агент ИФН-β, вставляют в экспрессионный вектор, в котором она оперативно связана с контролирующей экспрессию последовательностью, подходящей для экспрессии терапевтического агента ИФН-β в желаемом трансформированном хозяине. Правильность компоновки может быть подтверждена с помощью секвенирования нуклеотидов, рестрикционного картирования и экспрессии биологически активного полипептида в подходящем хозяине или клеткехозяине. Как хорошо известно в данной области техники, для того, чтобы получить высокие уровни экспрессии трансфицированного гена в хозяине или клетке-хозяине, ген должен быть оперативно связан с последовательностями, осуществляющими экспрессионный контроль транскрипции и трансляции, которые функционируют в выбранном экспрессионном хозяине.

Выбор последовательности, контролирующей экспрессию, и экспрессионного вектора должен зависеть от выбора клетки-хозяина. Может быть применено широкое разнообразие сочетаний хозяина экспрессии/вектора. Пригодные экспрессионные векторы для эукариотических хозяев, например, эукариотических клеток-хозяев, включают, например, векторы, включающие последовательности, контролирующие экспрессию, от 8У40, вируса папилломы быка, аденовируса и цитомегаловируса, например, следующие векторы: векторы, происходящие от ροΩΝΑΙ/αιηρ. ροΩΝΑΙ/ηοο. рВс/СМУ, р8У2др!, р8У2иео, р8У2-б11Гг. рТк2, рВ8Уиео, рМ8С, р8УТ7, рко-иео и рНуд. Альтернативно, производные вирусов, таких как вирус папилломы быка (ВРУ-1) или вирус Эпштейна-Барра (рНЕВо, происходящие от рВЕР и р205) могут быть применены для временной экспрессии белков в эукариотических клетках. Различные способы, применяемые для получения плазмид и трансформации организмов-хозяев, хорошо известны в данной области техники. По поводу других экспрессионных систем см. Мо1еси1аг С1ошид Α ЬаЬогаФгу Маииа1, 2'¹ Еб., еб. Ьу 8ашЬтоок, ЕтШкск аиб Машабк (Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота1огу Ргекк: 1989) главы 16 и 17.

Пригодные для бактериальных хозяев экспрессионные векторы включают известные бактериальные плазмиды, такие как плазмиды от Е. со11, включая Е1, рСВ1, рВВ322, рМВ9 и их производные, широкий диапазон хозяйских плазмид, таких как ВР4, ДНК фагов, например многочисленные производные фага лямбда, например, ЯМ989, и другие ДНК фагов, такие как М13 и односпиральные ДНК нитчатых фагов. Пригодные экспрессионные векторы для дрожжевых клеток включают плазмиду 2.ши. и ее производные. Пригодные векторы для клеток насекомых включают рУЪ 941. См. также Са1е е! а1., 1ко1а1юи ОГ Т1е Воуше Аиб Нишаи Оеиек Еот Ми11епаи IηЫЬ^ΐ^ид 8иЬ81аисе Аиб Ехртеккюи ОГ Т1е Нишаи Оеие 1и Ашша1 Се11к, Се11, 45, рр. 685-98 (1986).

Кроме того, любая из широкого разнообразия последовательностей, контролирующих экспрессию, может быть применена в данных векторах. Такие пригодные последовательности, контролирующие экспрессию, включают контролирующие экспрессию последовательности, связанные со структурными генами указанных выше экспрессионных векторов. Примеры пригодных последовательностей, контролирующих экспрессию, включают, например, ранние и поздние промоторы 8У40 или аденовируса, систему 1ас, систему !гр, систему ТАС или ТВС, области главного оператора и промотора фага лямбда, например РЬ, контролирующие области оболочечного белка Гб, промотор 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например, Р1ю5, промоторы α-сопрягающей системы дрожжей и другие последовательности, известные как контролирующие экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток, или их вирусов и их различные сочетания.

Для получения терапевтических агентов ИФН-β может быть применен любой подходящий хозяин, включая бактерии, грибы (включая дрожжи), растение, насекомое, млекопитающее или другие подходящие клетки животных или клеточные линии, а также трансгенные животные или растения. Примеры хозяев включают штаммы Е. со11, Ркеибошоиак, ВасШик, 81тер1ошусек, грибы, дрожжи, клетки насекомых, таких как 8робор1ета Гтиа1регба (8Е9), клетки животных, такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО), и клетки мышей, такие как N8/0, клетки африканской зеленой мартышки, такие как СО8 1, СО8 7, В8С 40 и ВМТ 10, и клетки человека, а также клетки растений в тканевой культуре. Такие клетки могут быть получены из американской коллекции типовых культур (АТСС). Предпочтительные клеткихозяева для экспрессии в клетках животных включают клетки СНО и клетки СО8 7 и особенно клеточную линию СНО-ΌΌυΚΥ-β 1.

Должно быть, конечно, понятно, что не все векторы и последовательности, контролирующие экспрессию, будут функционировать одинаково хорошо в отношении экспрессии описанных здесь последо

- 16 009938 вательностей ДНК. Не все хозяева функционируют одинаково хорошо с той же самой экспрессионной системой. Однако специалист в данной области техники может сделать отбор среди данных векторов, последовательностей, контролирующих экспрессию, и хозяев без чрезмерных экспериментов. Должны также рассматриваться число копий вектора, способность контролировать данное число копий и экспрессия любых других белков, кодируемых вектором, таких как маркеры антибиотиков. Например, предпочтительные векторы для применения в данном изобретении включают те, которые позволяют ДНК, кодирующей терапевтический агент ИФН-β, амплифицироваться в ряд копий. Такие амплифицируемые векторы хорошо известны в данной области техники. Они включают, например, векторы, способные к амплификации с помощью амплификации ΌΗΕΚ (см., например, КаиЕтаи, патент США № 4470461, КаиЕтаи апб 8йагр, ί’οηδίΓΐιοΙίοη 0Е А Мойи1аг Όίΐινάηίοΐαίο КебиЛаке сЬХЛ Сспс: Лпайъй 0Е 81дпак ЬиК/ей Еог ЕГПаегИ Ехрге55юп. Мо1. Се11. Βίο1., 2, рр. 1304-19 (1982)), или амплификации глутаминсинтетазы (08) (см., например, патент США № 5122464 и европейскую опубликованную заявку 338841).

При выборе последовательности, контролирующей экспрессию, должны быть рассмотрены разнообразные факторы. Они включают, например, относительную прочность последовательности, ее контролируемость и совместимость с действующей последовательностью ДНК, кодирующей терапевтический агент ИФН-β, особенно в отношении потенциальных вторичных структур. Хозяева должны быть выбраны при рассмотрении их совместимости с выбранным вектором, токсичности кодируемого продукта для последовательностей ДНК данного изобретения, характеристик их секреции, их способности правильно укладывать белки, требований к их ферментации или культивированию и легкости очистки продуктов, кодируемых последовательностями ДНК.

В рамках данных параметров специалист в данной области техники может выбрать различные сочетания вектор/контролирующая экспрессию последовательность/хозяин, что приведет к экспрессии желаемых последовательностей ДНК при ферментации или в крупномасштабной животной культуре, например, с применением клеток СН0 или клеток С08. Применение клеточной линии СН0 СН0-КИКХВ1 8ир для экспрессии вариантов ИФН-β дополнительно описано в патенте США № 6127332.

Терапевтический агент ИФН-β может быть также получен в системе ίη νίίτο, например, в трансляционной системе ίη νίίτο, например, клеточном лизате, например, лизате ретикулоцитов. Термин «трансляционная система ίη νίίτο», который применяется здесь взаимозаменяемо с термином «бесклеточная трансляционная система» относится к трансляционной системе, которая представляет собой бесклеточный экстракт, содержащий, по меньшей мере, минимум элементов, необходимых для трансляции молекулы РНК в белок. Трансляционные системы ίη νίίτο обычно включают макромолекулы, такие как ферменты, факторы трансляции, инициации и элонгации, химические реагенты и рибосомы. Например, трансляционная система ίη νίίτο может включать, по меньшей мере, рибосомы, ^тРНК, инициирующую метионил-^тРНК^мет, белки или комплексы, вовлеченные в трансляцию, например, еГЕ₂, еГЕз, кепсвязывающий (СВ) комплекс, включающий кеп-связывающий белок (СВР) и эукариотический фактор инициации 4Е (еЕЕ_4Е). Множество трансляционных систем ίη νίίτο хорошо известно в данной области техники, и они включают имеющиеся в продаже наборы. Примеры трансляционных систем ίη νίίτο включают эукариотические лизаты, такие как лизаты ретикулоцитов кролика, лизаты ооцитов кролика, лизаты клеток человека, лизаты клеток насекомых и экстракты зародышей пшеницы. Лизаты имеются в продаже у производителей, таких как Рготеда Сотр., Маά^8οη, \νίδ.; 8^03^^, Ьа ФИа, Са11Е.; Лтйегбат, Λτ1ίη§1οη НещйК Ι11.; и ΟΙΒΓΌ/ΒΡΗ Οτηηά Ι51ηηΗ, N. Υ. РНК для применения в трансляционных системах ίη νίίτο может быть получена ίη νίίτο, например, с применением промоторов 8Р6 или Т7, в соответствии со способами, известными в данной области техники.

В другом способе терапевтический агент ИФН-β экспрессируется эндогенным геном клеткихозяина. Данный способ может включать введение гетерологичного промотора выше кодирующей области гена ИФН-β, например индуцируемого промотора, экспрессию эндогенного гена ИФН-β и открытие продуцируемого ИФН-β. Гетерологичный промотор может быть введен в клетки с помощью «нокинга» в соответствии со способами, известными в данной области техники или альтернативно путем введения промотора в ген ИФН-β.

Терапевтический агент ИФН-β, полученный по настоящему изобретению, может быть гликозилированным или не гликозилированным в зависимости от организма хозяина, применяемого для продукции терапевтического агента. Если в качестве хозяина выбраны бактерии, то продуцируемый терапевтический агент ИФН-β будет не гликозилированным. С другой стороны, эукариотические клетки будут гликозилировать терапевтические агенты ИФН-β.

Терапевтический агент ИФН-β, продуцируемый трансформированным хозяином, может быть очищен в соответствии с любым подходящим способом. Для очистки ИФН-β известны различные способы. См., например, патент США № 4289689, 4359389, 4172071, 4551271, 5244655, 4485017, 4257938, 4541952 и 6127332. В предпочтительном осуществлении терапевтический агент ИФН-β очищают иммуноаффинным способом, как описано, например, в 0катига еί а1., Ηитаη ΕίότοόΕ-ΐδΙοίά ΙηΦΗοτοη: Iттиηο8Ο^Ьеηί Сο1итη СйготаЮдгарйу Ληά №Тегтта1 Λιηίηο Λαά 8е^иеηсе. Вюсйет., 19, рр. 3831-35 (1980).

- 17 009938

Например, белки ИФН-β и их варианты могут быть выделены и очищены в соответствии с общепринятыми условиями, таким как экстракция, преципитация, хроматография, аффинная хроматография, электрофорез или тому подобное. Например, белки и фрагменты интерферона могут быть очищены путем пропускания их раствора через колонку, имеющую иммобилизованный на ней рецептор интерферона (см. патент № 4725669). Связавшуюся молекулу интерферона можно затем элюировать путем обработки хаотропной солью или путем элюции водным раствором уксусной кислоты. Гибридные белки с иммуноглобулином могут быть очищены путем пропускания раствора, содержащего гибридный белок, через колонку, которая содержит иммобилизованный протеин А или протеин С, которые селективно связывают Ес часть гибридного белка. См., например, Ке18, К. 1., е! а1., 1. 1ттипо1. 132:3098-3102 (1984); заявку РСТ ν087/00329. Гибридное антитело может быть затем элюировано путем обработки хаотропной солью или путем элюции водным раствором уксусной кислоты.

Альтернативно, белки интерферона и гибридные молекулы с иммуноглобулином могут быть очищены на колонках с антителами против интерферона или на колонках с антителами против иммуноглобулина с получением по существу чистого белка. Под термином «по существу чистый» подразумевается, что белок свободен от загрязнений, которые связаны с ним в природе. Доказательством существенной чистоты может быть одна полоса на электрофорезе.

ИФН-β, который был получен и очищен, может быть охарактеризован, например, с помощью пептидного картирования. Например, образец терапевтического агента ИФН-β может быть гидролизован эндопротеиназой Ьук-С и проанализирован на ВЭЖХ с обращенной фазой, как описано, например, в патенте США № 6127332.

В предпочтительном осуществлении терапевтический агент ИФН-β является по существу свободным от другого клеточного материала, например, белков. Термины «очищенные препараты терапевтического агента ИФН-β» относятся к препаратам терапевтического агента ИФН-β, имеющим менее чем приблизительно 20% (по сухой массе) загрязняющего клеточного материала, например, нуклеиновых кислот, белков и липидов, и предпочтительно имеющим менее чем приблизительно 5% загрязняющего клеточного материала. Предпочтительные препараты терапевтического агента ИФН-β имеют менее чем приблизительно 2% загрязняющего клеточного материала; даже более предпочтительно менее чем приблизительно 1% загрязняющего клеточного материала и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 0,5; 0,2; 0,1; 0,01; 0,001% загрязняющего клеточного материала.

Предпочтительные композиции терапевтического агента ИФН-β являются также по существу свободными от других клеточных белков (также обозначаемых здесь как «загрязняющие белки»), т.е. композиции имеют менее чем приблизительно 20% (по сухой массе) загрязняющего белка, и предпочтительно имеют менее чем приблизительно 5% загрязняющего белка. Предпочтительные препараты целевых полипептидов имеют менее чем приблизительно 2% загрязняющего белка; даже более предпочтительно менее чем приблизительно 1% загрязняющего белка и наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 0,5; 0,2; 0,1; 0,01; 0,001% загрязняющих белков.

Чистота и концентрация препаратов ИФН-β может быть определена в соответствии со способами, известными в данной области техники, например, путем гель-электрофореза образцов, и, как описано, например, в КоЬей К. 8сорек, Рго1ет РштГюайоп, Рг1пс1р1ез апб Ртасйсе, ТЫтб Е6.. 8ргшдет Ует1ад Ыете Уотк, 1993, и цитируемых там ссылках.

Биологическую активность терапевтических агентов ИФН-β можно проанализировать с помощью любого подходящего способа, известного в данной области техники, например по нейтрализации антителами противовирусной активности, по индукции протеинкиназы, по активностям в отношении олигоаденилат 2,5-А синтетазы или фосфодиэстеразы, например, как описано в патенте ЕР-В1-41313 и XVО 00/23472. Такие тесты также включают оценки иммуномодуляторной активности (см., например, патент США № 4753795), тесты на торможение роста и измерение связывания с клетками, экспрессирующими рецепторы интерферона. Примеры противовирусных тестов дополнительно описаны в патенте США 6127332 и νθ 00/23472.

Способность терапевтических агентов ИФН-β лечить гломерулонефрит может быть также оценена на животных моделях, например тех, которые описаны здесь далее в примерах. Тестирование может быть проведено, например, как описано в примерах.

Терапевтические агенты ИФН-β могут быть также приобретены коммерчески под следующими торговыми марками: ΑνΟΝΕΧ® (ИФН^Ла) (Вюдеп, 1пс., СатЬпбде, МА); КЕВ1Е® (ИФН^Ла) (8егопо, 8. А., Сеηеνа, 8\\з1хег1ап6); ВЕТАЕЕВО№‘ или В£етоп (ИФН^ЧЬ) (8сйегшд АкйепдекеПксйай, Вет1ш, Сегтапу); и ВЕТА8ЕЕО№‘ или Вкегоп (Вег1ех, МопМ11е, N1, ИФН^ЧЬ). ΑνΟΝΕΧ® и КЕВ1Е® являются рекомбинантным гликозилированным ИФН-β человека, продуцируемым в клетках яичника китайского хомячка. ВЕТАЕЕЕО№‘ и ВЕТА8ЕЕО№‘ продуцируются в бактериях.

4. Способы лечения с помощью терапевтических агентов ИФН-β

В изобретении предлагаются способы лечения гломерулонефрита или хронической почечной недостаточности у субъекта, имеющего или имеющего предположительно развивающийся гломерулонефрит, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества терапевтического агента

- 18 009938

ИФН-β. Субъектом может быть субъект с выявленными гломерулонефритом или хронической почечной недостаточностью.

Гломерулонефрит, обозначаемый также как «острый нефрит» или «острый гломерулонефрит», представляет собой острый, но преходящий воспалительный процесс, затрагивающий клубочки, приводящий к острым реакциям СКФ, в результате чего возникает дисбаланс жидкости и отклонение от нормы электролитов. Симптомы гломерулонефрита включают: протеинурию; сниженную скорость клубочковой фильтрации (СКФ); изменения электролитов сыворотки, включая азотемию (уремия, избыточный азот мочевины в крови - ΒϋΝ) и задержку соли, что ведет к задержке воды, приводящей к гипертензии и отеку; гематурию и аномальные осадки мочи, включающие сгустки эритроцитов; гипоальбуминемию; гиперлипидемию; и липидурию.

Ряд заболеваний, например приводимые ниже, включают гломерулонефрит. При достаточной тяжести острый гломерулонефрит может вызывать острую или быстро развивающуюся почечную недостаточность. Острый гломерулонефрит, ассоциированный с быстро развивающейся почечной недостаточностью, является обычным сценарием, который может быть назван быстро развивающимся гломерулонефритом из-за его клинического проявления. Поскольку повреждение стенки клубочка представляет собой постоянный фактор при остром гломерулонефрите, эритроциты и альбумин обычно проникают в пространство Боумена и поступают в мочу. Сочетание наличия эритроцитов в моче, почечной недостаточности и аномалий гомеостаза жидкости называют нефритическим синдромом. Массивная потеря белков плазмы может вести к состоянию, называемому нефротическим синдромом, когда потеря белков с мочой ведет к нарушению белкового баланса сыворотки, что сопровождается низким уровнем альбумина в сыворотке, аномалиями липидов и отеком. Таким образом, для диагноза острого гломерулонефрита требуются лабораторные данные, свидетельствующие о протеинурии (альбуминурии) и гематурии, обычно со сгустками эритроцитов, в то время как отсутствие таких данных указывает на иной диагноз. Например, тубулоинтерстициальный нефрит включает преходящее острое воспаление почечных канальцев и интерстиция, не затрагивающее капилляры клубочков. Как и при остром гломерулонефрите, имеют место гематурия, сгустки эритроцитов и снижение СКФ, но протеинурия менее выражена и включает преимущественно низкомолекулярные белки вместо альбумина.

За синдром острого гломерулонефрита может быть ответственен ряд составляющих заболевания. Обычно для оценки больных с острым гломерулонефритом требуется почечная биопсия, независимо от степени и наличия почечной недостаточности. Диагноз, прогноз и терапия определяются точными гистологическими и ультраструктурными особенностями, выявленными на материале почечной биопсии. Более того, биопсийные ткани могут быть подвергнуты анализу для определения типов иммунных комплексов, иммуноглобулинов и других веществ, вовлеченных в конкретный гломерулонефрит, причем обычно проводят иммунофлуоресцентный анализ. Заболевания, повреждающие почки, могут быть разделены на категории в соответствии с их патогенезом, независимо от того, приводят ли они к повреждению нефрона, достаточному для нарушения скорости клубочковой фильтрации, вызывая тем самым появление некоторых типов почечной недостаточности.

Для описания различных особенностей заболевания клубочков разработана традиционная номенклатура. В литературе могут применяться взаимозаменяемо заболевание клубочков, гломерулопатия и гломерулонефрит, хотя термин “гломерулонефрит” часто подразумевает воспалительный процесс, как обсуждалось выше. Заболевания клубочков классифицируют как первичные, когда патология возникает в почках и отсюда вызывает системные проявления; заболевания клубочков называют вторичными, когда они возникают в результате некоторого другого, мультисистемного расстройства. Патологические особенности, видимые при световой микроскопии, обеспечивают дополнительную характеристику типа заболевания клубочков. Повреждение, затрагивающее часть структуры клубочков, называют сегментарным, а повреждение, затрагивающее почти всю структуру клубочков, называют глобальным. Аномалии, характеризуемые увеличением количества клеток в клубочке, называют пролиферативными, независимо от того, обусловлено ли увеличение количества клеток инфильтрацией лейкоцитов или пролиферацией резидентных клеток клубочков. Клеточную пролиферацию, включающую клетки капсулы Боумена, называют экстракапиллярной; пролиферацию, включающую эндотелиальные или мезангиальные клетки, называют интракапиллярной или эндокапиллярной. Скопление клеток, собирающихся в пространстве Боумена, и имеющее серповидную форму, называют серповидной структурой, и обычно оно состоит из пролиферирующих париетальных эпителиальных клеток и инфильтрованных моноцитов. Серповидный гломерулонефрит представляет собой тип острого гломерулонефрита, отличающегося образованием серповидных структур в клубочках. Поскольку данное состояние часто ассоциировано с быстро прогрессирующей почечной недостаточностью, термин “серповидный гломерулонефрит” может применяться взаимозаменяемо с быстро прогрессирующим гломерулонефритом. Если заболевание клубочков отличается утолщением базальной мембраны клубочка за счет иммунных отложений, то его называют мембранозным. Сочетания указанных выше терминов применяют для описания составных частей заболевания клубочков на основании их основных патологических особенностей. Пролиферативные гломерулопатии, называемые также воспалительными гломерулопатиями, включают такие состояния, как фокальный пролиферативный гломерулонефрит, диффузный пролиферативный гломерулонефрит, мезангиальный про

- 19 009938 лиферативный гломерулонефрит и серповидный гломерулонефрит, причем каждый термин предполагает локализацию и/или тип пролиферирующих клеток. Данные состояния отличаются наличием клеток крови и белков в осадке мочи, но отсутствием потери белков, которая могла бы вызывать нефротический синдром, так называемую «нефритическую» картину. Мембранозные гломерулопатии включают изменение в клубочковом фильтрационном барьере для белков, включающем базальную мембрану клубочков и висцеральные эпителиальные клетки. Данные нарушения, включая мембранную гломерулопатию, болезнь с минимальным изменением и фокальный и сегментарный гломерулосклероз, ведут к тяжелой потере белка и могут приводить к нефротическому синдрому. Как предполагается названием, мембранопролиферативный гломерулонефрит представляет собой смешанное заболевание с клиническими особенностями, предполагающими как клеточную пролиферацию, так и повреждение барьера клубочковой фильтрации. Данные заболевания, отличающиеся выраженным внесосудистым отложением белкового или фибриллярного вещества, называют болезнями клубочкового отложения. Они могут включать как нефритические, так и нефротические компоненты, что, таким образом, перекрывается с имеющим место при пролиферативных или мембранозных заболеваниях. К последней категории заболеваний, затрагивающих почки, относятся тромботические микроангиопатии, заболевания, при которых свертывание происходит внутри почечной сети микрососудов. Каждая из данных категорий обладает особым типом этиологии.

Существует спектр пролиферативных гломерулопатий, что предполагает то, что разные гистопатологические особенности возникают в результате различных воспалительных процессов. Например, диффузный пролиферативный гломерулонефрит может представлять собой острый иммунный ответ на неожиданное мощное поступление антигена. Серповидный гломерулонефрит может включать менее драматичный иммунный ответ на меньшее поступление антигена у презентированных индивидуумов. Фокальный пролиферативный или мезангиальный пролиферативный гломерулонефрит представляют собой последнюю агрессивную форму спектра, когда больные могут страдать лишь от медленно прогрессирующей почечной недостаточности.

Иммунофлуоресцентные исследования биопсийного материала почек помогают различать основные причины пролиферативной гломерулопатии. Существуют три широкие диагностические категории, каждая из которых связана с конкретной особенностью отложения иммуноглобулинов, обнаруживаемого по иммунофлуоресценции в сочетании с сильной клеточной пролиферацией. Гранулярные отложения иммуноглобулина отличают первую категорию: иммунокомплексный гломерулонефрит. Линейное отложение иммуноглобулина вдоль базальной мембраны клубочка отличает вторую категорию: болезнь анти-СВМ. Минимальное отложение иммуноглобулина отличает третью категорию: олиго-иммунный гломерулонефрит. Иммунокомплексный гломерулонефрит может представлять собой ответ на известный антигенный стимул (например, постстрептококковый гломерулонефрит) или может образовывать часть мультисистемного заболевания с иммунными комплексами (например, волчанки, криоглобулинемии или бактериального эндокардита); в некоторых случаях причину не удается установить, и заболевание рассматривается как идиопатическое. Болезнь анти-СВМ является редким заболеванием, при котором образуются антитела, атакующие коллаген типа IV. У большинства больных болезнью анти-СВМ имеется также геморрагия легких, состояние, называемое синдромом Гудпасчера. Олиго-иммунный гломерулонефрит отличается аномальным уровнем антител в кровяном русле против цитоплазмы нейтрофилов, что подразумевает некоторую дисрегуляцию гуморального иммунитета.

Иммунологически опосредуемый гломерулонефрит составляет большую часть приобретенного заболевания почек. Обычно имеется отложение антител в клубочковом пучке, часто аутоантител. Механизмы клеточного иммунитета, вовлеченные в опосредуемый антителами гломерулонефрит, дополнительно модулируют образование антител и индуцируют зависимую от антител цитотоксичность. Большая часть гломерулонефрита у больных инициируется взаимодействием циркулирующих антител с аутоантигенами.

Антитела могут быть обнаружены в клубочке как результат нескольких различных процессов. Вопервых, циркулирующие аутоантитела могут взаимодействовать с внутренними аутоантигенами, которые являются компонентами нормального клубочка. Во-вторых, циркулирующие аутоантитела и внешние антигены, которые были отложены внутри клубочка, могут обеспечивать образование ίη кйи клубочковых иммунных комплексов. В-третьих, иммунные комплексы, образованные в системном кровяном русле, могут быть захвачены в клубочек. Локализация отложения антител обычно в значительной мере определяет клинические особенности заболевания клубочков. Острое отложение антитела в субэндотелиальном пространстве или мезангиуме может вызывать сильный нефритический ответ, отличающийся быстрым рекрутированием лейкоцитов и тромбоцитов из капилляров клубочков. Отложение антител в субэпителиальном пространстве обычно вызывает ответ нефротического типа, отличающийся протеинурией с менее выраженной инфильтрацией клеток воспаления.

Любой из данных иммунологических процессов может индуцировать каскад воспалительных реакций в клубочке, приводящих к повреждению клубочка и последующему восстановлению. Способность аутоантител к взаимодействию с внутренними антигенами или антигенами пересаженного клубочка ведет к образованию комплемента, хемоаттрактантов, хемокинов и цитокинов. Тем самым инициируются

- 20 009938 зависимые от комплемента и независимые от комплемента механизмы, приводящие к повреждению клеток клубочка. В клубочек рекрутируются также лейкоциты и тромбоциты, вызывая дополнительное повреждение. Устойчивое отложение иммунного комплекса на протяжении от месяцев до лет может также провоцировать значительное увеличение образования базальной мембраны. Процесс восстановления для любой иммунологически опосредуемой гломерулопатии не может произойти до тех пор, пока не прекратится локальная иммунная активность с прекращением дальнейшей продукции иммунного комплекса с удалением отложенных и циркулирующих иммунных комплексов, с предотвращением дальнейшего рекрутирования клеток воспаления, с удалением медиаторов воспаления в тканях почек и с нормализацией сосудистого тонуса и адгезивности эндотелия.

После повреждения клубочка может наступить выздоровление с рубцеванием. Выздоровление может быть полным без остаточного повреждения. Чаще рубцевание клубочка происходит более широко с нарушением функции почек. Было обнаружено, что трансформирующий фактор роста β (ТСР-β), цитокин, способствующий процессу заживления в клубочках, стимулирует образование внеклеточного матрикса и ингибирует синтез тканевых протеаз, которые разрушают белки матрикса, тем самым усиливая образование рубца после повреждения клубочка. Образование рубца после повреждения клубочка дополнительно повреждает оставшиеся жизнеспособные нефроны, что ведет к прогрессирующей потере нефронов. По мере утраты функционирующих нефронов оставшиеся нефроны их компенсируют, что, как описано выше, представляет собой процесс, разрушающий их самих. Конечным результатом может быть прогрессивное снижение функции почек, завершающееся хронической почечной недостаточностью с ее финальной стадией конечной стадии болезни почек.

Терапевтические агенты ИФН-β могут быть также применены для лечения фокального гломерулосклероза и коллапсирующих гломерулопатий, включая идиопатические и вторичные формы, обусловленные инфекцией ВИЧ. Коллапсирующий гломерулонефрит представляет собой быстро прогрессирующее заболевание, ведущее к почечной недостаточности, для которой нет эффективной терапии. Данное заболевание имеет место главным образом у больных ВИЧ. Поскольку при данных заболеваниях главную роль играет протеинурия, ожидается, что терапевтические агенты ИФН-β, которые значительно снижают протеинурию, должны оказывать значительное улучшающее влияние на данные заболевания. Другой болезнью, при которой протеинурия играет главную роль и при которой, как ожидается, пригодны терапевтические агенты ИФН-β, является болезнь с минимальным изменением, называемая также нефропатией с минимальным изменением (Μί'Ν) и нефротическим синдромом с минимальным изменением (МСЫ8).

Соответственно, терапевтические агенты ИФН-β могут применяться для лечения состояний почек, связанных с воспалением клубочков, например, любых из следующих состояний почек: фокальный гломерулосклероз и коллапсирующие гломерулопатии, болезнь с минимальными изменениями, острый гломерулонефрит, серповидный гломерулонефрит, нефритический синдром, нефротический синдром, первичный гломерулонефрит, вторичный гломерулонефрит, пролиферативный гломерулонефрит, мембранозный гломерулонефрит, мембранопролиферативный гломерулонефрит, иммунокомплексный гломерулонефрит, гломерулонефрит с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-ΟΒΜ), олигоиммунный гломерулонефрит, диабетическая гломерулопатия, хронический гломерулонефрит и наследственный нефрит. Любое заболевание или состояние, возникающее в результате заболеваний почек, таких как хроническая болезнь почек и болезнь почек конечной стадии, также может лечиться в соответствии со способами изобретения.

5. Субъекты для лечения

В целом способы настоящего изобретения могут быть применены к любому млекопитающему субъекту, имеющему гломерулонефрит, хроническую почечную недостаточность или имеющему риск их развития или риск вследствие почечной заместительной терапии (т.е. хронического диализа или трансплантации почки). «Субъектом, имеющим риск развития гломерулонефрита или хронической почечной недостаточности» является субъект, который, как обоснованно ожидается, будет страдать от прогрессирующей утраты функции почек, связанной с прогрессирующей утратой функциональных нефроновых единиц. Имеет ли субъект гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность, или имеет риск их развития, является предметом определения, которое может быть обычным образом произведено специалистом в соответствующей области медицинской или ветеринарной техники. Субъекты, имеющие гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или имеющие риск их развития (или риск вследствие необходимости почечной заместительной терапии), включают, но не ограничиваются этим, следующих: субъекты, которых можно рассматривать как страдающих хронической почечной недостаточностью, конечной стадией болезни почек, хронической диабетической нефропатией, гипертензивным нефросклерозом, хроническим гломерулонефритом, наследственным нефритом и/или почечной дисплазией; субъекты, имеющие протеинурию, изменения электролитов сыворотки, например, азотемию (уремию, т.е. избыточный азот мочевины в крови или ΒυΝ); задержку соли, приводящую к гипертензии и отеку, гематурию и аномальные осадки мочи, включающие сгустки эритроцитов; гипоальбуминемию, гиперлипидемию и липидурию; субъекты с биопсией, указывающей на гипертрофию клубочков, гипер

- 21 009938 трофию канальцев, хронический гломерулосклероз и/или хронический тубулоинтерстициальный склероз; субъекты, подвергнутые ультразвуковому, МШ, САТ сканированию или другому неинвазивному обследованию, указывающему на почечный фиброз или меньший по сравнению с нормой размер почек. Дополнительные указания на субъектов, имеющих гломерулонефрит или ХПН или риск их развития, хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, все следующее может служить критерием для определения того, имеет ли субъект гломерулонефрит или ХПН или риск их развития: субъекты с необычным количеством больших сгустков, находящихся в осадке мочи; субъекты с СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 50% и особенно менее приблизительно 40, 30 или 20% от ожидаемой СКФ для субъекта; субъекты-мужчины с массой по меньшей мере приблизительно 50 кг и имеющие СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 50 мл/мин и особенно менее приблизительно 40, 30 или 20 мл/мин; субъекты-женщины с массой, по меньшей мере, приблизительно 40 кг и имеющие СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 40 мл/мин и особенно менее приблизительно 30, 20 или 10 мл/мин; субъекты с количеством функциональных нефроновых единиц, составляющим менее чем приблизительно 50% и особенно менее приблизительно 40, 30 или 20% от количества функциональных нефроновых единиц, имеющегося у здорового, но в остальных отношениях сходного субъекта; субъекты, имеющие одну почку; и субъекты, являющиеся реципиентами почечного трансплантата.

Млекопитающие субъекты, которые могут быть подвергнуты лечению, включают, но не ограничиваются этим, субъектов-людей или пациентов. Кроме того, изобретение может быть применено для лечения одомашненных млекопитающих, которые содержатся в качестве компаньонов человека (например, собак, кошек, лошадей), которые имеют значительную коммерческую ценность (например, дойные коровы, мясной крупный рогатый скот, спортивные животные), которые имеют значительную научную ценность (например, плененные или свободные представители вымирающих видов), или которые имеют иную ценность. Субъекты для лечения не нуждаются в предоставлении показаний для лечения терапевтическими агентами ИФН-β, отличными от тех показаний, которые связаны с риском гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности и болезни почек конечной стадии, например, при необходимости заместительной почечной терапии. То есть, ожидается, что субъекты для лечения в прочих отношениях свободны от показаний для лечения терапевтическими агентами ИФН-β. В некоторых случаях, однако, могут существовать субъекты с другими симптомами (например, вирусным заболеванием, таким как инфекция гепатита), для которых лечение терапевтическими агентами ИФН-β могло бы быть показано. В таких случаях лечение должно быть соответствующим образом адаптировано с тем, чтобы избежать избыточной дозировки.

Специалист в области медицинской или ветеринарной техники обучен распознавать субъектов, которые могут иметь значительный риск гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности или значительный риск заместительной почечной терапии. В частности, клинические и неклинические испытания, а также накопленный опыт, касающиеся раскрытых здесь и других способов лечения, как ожидается, должны дать опытному профессионалу информацию при решении вопроса о том, имеет ли данный субъект гломерулонефрит, хроническую почечную недостаточность или риск их развития или риск необходимости заместительной почечной терапии, и того, является ли любое конкретное лечение наиболее соответствующим потребностям субъекта, включая лечение согласно настоящему изобретению.

В целом, млекопитающий субъект может рассматриваться как имеющий гломерулонефрит, хроническую почечную недостаточность или риск их развития, или риск необходимости заместительной почечной терапии, если у данного субъекта уже было диагностировано поражение, или если данного субъекта можно было бы рассматривать как пораженного состоянием, которое обычно ведет к прогрессирующей утрате функции почек, связанной с прогрессирующей утратой функциональных нефроновых единиц. Такие состояния включают, но не ограничиваются этим, болезнь почек конечной стадии, хроническую диабетическую нефропатию, диабетическую гломерулопатию, диабетическую почечную гипертрофию, гипертензивный нефросклероз, гипертензивный гломерулосклероз, хронический гломерулонефрит, наследственный нефрит, почечную дисплазию и хроническое отторжение после пересадки почечного аллотрансплантата и тому подобное. Данные и другие заболевания и состояния, известные в данной области техники, обычно ведут к прогрессивной утрате функциональных нефронов и наступлению хронической почечной недостаточности.

Часто специалист в области медицины или ветеринарии может обосновать прогноз, диагноз или решение о лечении на основании обследования биопсийного образца почек. Такие биопсии обеспечивают богатую информацию, полезную для диагностики заболеваний почек. Субъекты, имеющие гломерулонефрит, хроническую почечную недостаточность или риск их развития, или риск необходимости заместительной почечной терапии, могут быть выявлены по гистологическим показаниям на основе почечных биопсий, включая, но не ограничиваясь этим, наличие клеток воспаления, например, Т-клеток и макрофагов, в клубочках, клубочковой гипертрофии, канальцевой гипертрофии, гломерулосклероза, тубулоинтерстициального склероза и тому подобного.

Менее инвазивные способы оценки морфологии почек включают МШ, САТ и ультразвуковое ска

- 22 009938 нирование. Пригодны также способы сканирования, при которых применяют контрастирующие или формирующие изображение агенты (например, радиоактивные красители), однако следует отметить, что некоторые из них являются особенно токсичными для тканей и структур почек и, следовательно, их применение может быть неблагоразумным у субъектов, имеющих гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или риск их развития. Такие неинвазивные способы сканирования могут применяться для определения таких состояний, как почечный фиброз или склероз, фокальный почечный некроз, почечные кисты и почечная массивная гипертрофия, которые обычно имеются у субъекта, относящегося к категории имеющих риск развития гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности или риск необходимости заместительной почечной терапии.

Часто прогноз, диагноз и/или решения о лечении основываются на клинических показателях функции почек. Одним из таких показателей служит наличие в осадке мочи необычного количества «больших» или «связанных с почечной недостаточностью» сгустков, являющееся указанием на канальцевую гипертрофию и предполагающее компенсаторную почечную гипертрофию, которая типична для хронической почечной недостаточности. Другим показателем почечной функции язляется скорость клубочкового потока (СКФ), которая может быть измерена прямо путем количественного определения скорости клиренса конкретных маркеров, или которая может быть выведена из непрямых измерений.

Способы лечения согласно настоящему изобретению не должны быть ограничены субъектами, имеющими любые конкретные значения СКФ или любого другого конкретного маркера почечной функции. Действительно, нет необходимости в том, чтобы СКФ у субъекта или любой другой конкретный маркер почечной функции определялись до осуществления лечения в соответствии с настоящим изобретением. Тем не менее, измерение СКФ рассматривают как предпочтительный инструмент оценки почечной функции.

Как хорошо известно в данной области техники, СКФ отражает скорость клиренса референтного или маркерного соединения из плазмы в мочу. Рассматриваемое маркерное соединение обычно представляет собой соединение, которое свободно фильтруется клубочками, но которое не секретируется активно или реабсорбируется почечными канальцами и которое не связывается в значительной мере белками в кровеносном русле. Скорость клиренса обычно определяют по формуле, представленной выше, в которой соотносят объем мочи, образованной за двадцатичетырехчасовой период, и относительные концентрации маркера в моче и плазме. Для большей точности СКФ следует также откорректировать на площадь поверхности тела. Референтным соединением «золотого стандарта» служит инсулин благодаря его фильтрационным свойствам и отсутствию связывания в сыворотке. Однако трудно количественно измерить концентрацию данного соединения в крови или моче. Поэтому вместо инсулина часто используют скорости клиренса других соединений, включая креатинин. Кроме того, часто применяют формулы, в которых для упрощения определения действительной СКФ опускают рассмотрение действительных концентраций маркера в моче, действительных суточных объемов образованной мочи и действительной площади поверхности тела. Данные величины могут быть заменены величинами, основанными на других факторах, базовыми величинами, установленными для того же самого субъекта, или стандартными величинами для сходных субъектов. Данные величины, однако, следует применять с осторожностью, поскольку они могут вести к неоправданным заключениям, основанным на почечной функции нормальных или здоровых субъектов. Кроме того, для определения скорости почечного клиренса применяют паминогиппурат (РАН).

В данной области техники были разработаны разные способы и формулы, которые описывают ожидаемую величину СКФ у здорового субъекта с определенными показателями. В частности, имеются формулы, которые дают ожидаемую величину СКФ на основе уровня креатинина в плазме, возраста, массы и пола (см., например, раздел «Определения» здесь). Конечно, могут быть применены другие формулы, и могут быть созданы таблицы стандартных величин для субъектов данного возраста, массы, пола и/или концентрации креатинина в плазме. В настоящее время в данной области техники доступны также и более новые способы измерения или установления СКФ (например, с применением способов ЯМР или ММ), и они могут быть применены согласно настоящему изобретению (см., например, патенты США № 5100646 и 5335660).

В целом, независимо от способа измерения или установления СКФ, субъект можно рассматривать как имеющий гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или риск их развития или риск необходимости в заместительной почечной терапии, когда субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 50% от ожидаемой СКФ для данного субъекта. При большем снижении СКФ риск считается большим. Таким образом, субъект рассматривают как имеющий возрастающий риск, если субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 40, 30 или 20% от ожидаемой СКФ. Субъект-мужчина с массой, по меньшей мере, приблизительно 50 кг может рассматриваться как имеющий гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или риск их развития или риск необходимости в заместительной почечной терапии, когда субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 50 мл/мин. При большем снижении СКФ риск считается большим. Таким образом, субъект рассматривают как имеющий возрастающий риск, если субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 40, 30 или 20 мл/мин. Субъект-женщина с

- 23 009938 массой по меньшей мере приблизительно 40 кг может рассматриваться как имеющий гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или риск их развития или риск необходимости в заместительной почечной терапии, когда субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 40 мл/мин. При большем снижении СКФ риск считается большим. Таким образом, субъект рассматривают как имеющий возрастающий риск, если субъект имеет СКФ, которая хронически составляет менее приблизительно 30, 20 или 10 мл/мин. В целом, субъект может рассматриваться как имеющий гломерулонефрит или хроническую почечную недостаточность или их риск или риск необходимости в заместительной почечной терапии, если у субъекта количество функциональных нефроновых единиц составляет менее чем приблизительно 50% от количества функциональных нефроновых единиц, имеющегося у здорового, но в остальных отношениях сходного субъекта. Как указано выше, риск считается большим по мере дальнейшего снижения количества функциональных нефронов. Таким образом, субъект рассматривают как имеющий возрастающий риск, если субъект имеет количество функциональных нефронов, которое составляет менее чем приблизительно 40, 30 или 20% от количества у сходного, но здорового субъекта.

Наконец, следует отметить, что субъекты, имеющие одну почку, независимо от истории утраты второй почки (например, физической травмы, хирургического удаления, дефекта при рождении), могут рассматриваться как имеющие, в отсутствие доказательств в пользу противного, риск гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности или необходимости в заместительной почечной терапии. Это особенно верно в отношении тех субъектов, у которых одна почка была утрачена из-за заболевания или состояния, которое может повредить оставшуюся почку. Сходным образом, субъекты, которые уже являются реципиентами почечного трансплантата или которые уже подвергаются хроническому диализу (например, хроническому гемодиализу или продолжительному амбулаторному перитонеальному диализу), могут рассматриваться как имеющие риск гломерулонефрита, хронической почечной недостаточности или необходимости в дальнейшей заместительной почечной терапии.

Субъекты, которые могут лечиться согласно способам изобретения, включают также тех, которые имеют состояние или заболевание, которое, как известно, может лечиться ИФН-β, например рассеянный склероз и вирусные инфекции. Типичные вирусные инфекции включают гепатит, например, инфекции гепатита В. В таких ситуациях может быть разработан режим введения терапевтического агента ИФН-β, адаптированный для лечения обоих состояний. Субъектами могут быть также субъекты, у которых нет вирусной инфекции, которую можно лечить ИФН-β, или вирусной инфекции, вызывающей гломерулонефрит.

Соответственно, типичные примеры субъектов включают тех, которые не являются носителями вируса гепатита, например, вируса гепатита В или С, или тех, у которых гломерулонефрит не был вызван вирусом гепатита, например, вирусом гепатита В или С. Альтернативно, субъектом может быть также субъект, имеющий гломерулонефрит или имеющий вероятность его развития, вызванный вирусной инфекцией. В других осуществлениях у субъекта нет почечной недостаточности конечной стадии или почечно-клеточной карциномы.

6. Составы и способы лечения

Терапевтические агенты ИФН-β могут вводиться любым путем, который совместим с конкретным применяемым терапевтическим агентом для почек. Так, в качестве подходящего может быть пероральное или парентеральное введение, включая внутривенный, внутрибрюшинный или внутрикапсульный почечный пути введения. Кроме того, введение может производиться путем периодических инъекций болюса агента (агентов), описанных здесь (т.е. терапевтических агентов ИФН-β), или производиться более продолжительно путем внутривенного или внутрибрюшинного введения из резервуара, который является внешним (например, в.в. мешок) или внутренним (например, биоэродируемый имплантат или имплантированный насос). В способе согласно изобретению терапевтические агенты ИФН-β предпочтительно вводят парентерально. Применяемый здесь термин «парентеральный» включает аэрозольный, подкожный, внутривенный, внутримышечный, внутрисуставный, внутрисиновиальный, внутригрудинный, внутриоболочечный, внутрипеченочный, внутрь повреждения и внутричерепной способы инъекции или инфузии.

Агенты изобретения могут вводиться индивидууму с помощью любых подходящих средств, предпочтительно прямо (например, локально, в виде инъекции или местного нанесения на локус ткани) или системно (например, парентерально или перорально). Когда агент предназначен для парентерального введения, такого как внутривенное, подкожное или внутримышечное введение, агент предпочтительно включает часть водного раствора. Раствор является физиологически приемлемым, так что в дополнение к доставке желаемого агента субъекту раствор не оказывает в прочих отношениях неблагоприятного действия на электролитный и/или объемный баланс у субъекта. Водная среда для агента, таким образом, может включать нормальный физиологический солевой раствор (например, 0,9% ПаС1, 0,15 М, рН 7-7,4).

Терапевтические агенты ИФН-β предпочтительно вводят в виде стерильной фармацевтической композиции, содержащей фармацевтически приемлемый носитель, который может быть любым из множества хорошо известных носителей, таких как вода, солевой раствор, забуференный фосфатом солевой

- 24 009938 раствор, декстроза, глицерин, этанол и тому подобное, или их сочетанием. Терапевтические агенты ИФН-β могут быть получены в композиции, включающей один или более других белков, например, для стабилизации терапевтического агента ИФН-β. Например, терапевтические агенты ИФН-β могут быть смешаны с альбумином.

Фармацевтические композиции могут включать терапевтический агент ИФН-β вместе с любым фармацевтически приемлемым носителем. Применяемый здесь термин носитель включает приемлемые адъюванты и растворители. Фармацевтически приемлемые носители, которые могут применяться в фармацевтических композициях данного изобретения, включают, но не ограничиваются этим, ионообменники, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, белки сыворотки, такие как альбумин сыворотки человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси частичных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, динатрийфосфат, дикалийфосфат, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный оксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, карбоксиметилцеллюлоза натрия, полиакрилаты, воска, полиэтилен-полиоксипропилен-блок-полимеры, полиэтиленгликоль и жир шерсти.

ИФН-β или его варианты можно также вводить в форме липосомных систем доставки, таких как малые однослойные пузырьки, большие однослойные пузырьки и многослойные пузырьки. Липосомы могут быть образованы из множества фосфолипидов, содержащих холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины. В некоторых осуществлениях пленку из липидных компонентов гидрируют водным раствором лекарства с образованием липидного слоя, заключающего лекарство в капсулу, как описано в патенте США № 5262564.

ИФН^к или их варианты могут быть также присоединены к растворимым полимерам в качестве направляемых носителей лекарства. Такие полимеры могут включать поливинилпирролидон, пирановый сополимер, полигидроксипропилметакриламидфенол, полигидроксиэтиласпанамидфенол или полиэтиленоксидполилизин, замещенный пальмитоильными остатками. ИФН^к или их варианты могут быть также присоединены к белкам, таким как, например, рецепторные белки и альбумин. Более того, ИФН^к или их варианты могут быть также присоединены к классу биодеградируемых полимеров, пригодных для достижения контролируемого высвобождения лекарства, например, полимолочной кислоте, полиэпсилон-капролактону, полигидроксимасляной кислоте, полиортоэфирам, полиацеталям, полидигидропиранам, полицианоакрилатам и поперечно-сшитым или амфипатическим блок-сополимерам гидрогелей.

Согласно изобретению фармацевтические композиции могут находиться в форме стерильного препарата для инъекций, например стерильной водной или маслянистой суспензии для инъекций. Данная суспензия может быть составлена согласно способам, известным в данной области техники, с применением подходящих диспергирующих или увлажняющих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может быть также стерильным раствором или суспензией для инъекций в нетоксичном, парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например в виде раствора в 1,3бутандиоле. Среди приемлемых носителей и растворителей, которые могут быть применены, находятся вода, раствор Рингера и изотоничный раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды традиционно применяют стерильные, твердые масла. Для данной цели может быть применено любое мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Для получения препаратов для инъекций пригодны такие жирные кислоты, как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, а также природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, в особенности в их полиоксиэтилированном варианте. Данные масляные растворы или суспензии могут также содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергирующий агент.

Фармацевтические композиции, включающие терапевтические агенты ИФН-β, можно также вводить перорально. Например, их можно вводить в любой перорально приемлемой лекарственной форме, включая, но не ограничиваясь этим, капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для перорального применения носители, которые обычно применяют, включают лактозу и кукурузный крахмал. Обычно также добавляют смазывающие агенты, такие как стеарат магния. Для перорального введения в форме капсул подходящие разбавители включают лактозу и высушенный кукурузный крахмал. Когда для перорального применения необходимы водные суспензии, активный ингредиент соединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При желании, могут быть также добавлены некоторые подсластители, отдушки или красители. Могут применяться также местные чрескожные пластыри.

В предпочтительном осуществлении ИФН-β или его вариант вводят в виде жидкой композиции, включающей стабилизирующий агент. Стабилизирующий агент может находиться в количестве от 0,3 до 5% от массы ИФН-β или его варианта. Стабилизирующий агент может представлять собой аминокислоту, такую как кислая аминокислота (например, глутаминовая кислота и аспарагиновая кислота), или аргинин или глицин. Если стабилизирующий агент представляет собой аргинин-НС1, его концентрация должна предпочтительно находиться в диапазоне от 0,5% (мас./об.) до 5%, и наиболее предпочтительно

- 25 009938

3,13% (эквивалентно 150 мМ аргинин-НС1). Если стабилизирующий агент представляет собой глицин, его концентрация должна предпочтительно находиться в диапазоне от 0,5% (мас./об.) до 2,0%, и наиболее предпочтительно 0,52% (эквивалентно от 66,7 до 266,4 мМ, и наиболее предпочтительно 70 мМ). Если стабилизирующий агент представляет собой глутаминовую кислоту, его концентрация должна предпочтительно находиться в диапазоне от 100 до 200 мМ, и наиболее предпочтительно 170 мМ (что эквивалентно мас./об.% в диапазоне от 1,47 до 2,94%, и наиболее предпочтительно 2,5% мас./об.). Предпочтительный диапазон концентраций ИФН-β или его варианта в жидких составах составляет от приблизительно 30 до приблизительно 250 мкг/мл. Предпочтительный диапазон концентраций составляет от 48 до 78 мкг/мл, и наиболее предпочтительной концентрацией является приблизительно 69 мкг/кг. В терминах Международных Стандартных величин внутренний стандарт Вюдеп был стандартизован по отношению к Международному Стандарту νΗ0 для интерферона, Природный #66-23-902-531, так что диапазон концентраций в Ιυ (для 0,5 мл объема для инъекции) составляет от приблизительно 6 до 50 ΙΜυ, и наиболее предпочтительная концентрация равна 12 ΙΜυ.

Предпочтительно, чтобы аминокислотным стабилизирующим агентом был аргинин, который включают в его кислотной форме (аргинин-НС1) в растворах с рН приблизительно 5,0.

Соответственно, предпочтительны полиионные наполнители.

Предпочтительно, чтобы жидкая композиция находилась в сосуде, например шприце, в котором сосуд имеет поверхность, находящуюся в контакте с жидкостью, которая покрыта веществом, инертным в отношении ИФН-β, например, силиконом или политетрафторэтиленом. Еще более предпочтительны композиции, имеющие рН от 4,0 до 7,2. Предпочтительно чтобы раствор, включающий стабилизирующий агент, не был лиофилизован и не подвергался действию содержащего кислород газа во время получения и хранения.

Буферы органических кислот и фосфата для применения в настоящем изобретении для поддержания рН в диапазоне от приблизительно 4,0 до приблизительно 7,2 и предпочтительно от приблизительно 4,5 до приблизительно 5,5 и наиболее предпочтительно 5,0, могут быть традиционными буферами органических кислот и их солей, такими как цитратные буферы (например, смесью мононатрийцитратдинатрийцитрат, смесью лимонная кислота-тринатрийцитрат, смесями лимонная кислотамононатрийцитрат и т.д.), сукцинатные буферы (например, смесью янтарная кислотамононатрийсукцинат, смесью янтарная кислота-гидроксид натрия, смесью янтарная кислотадинатрийсукцинат и т.д.), тартратные буферы, фумаратные буферы, глюконатные буферы, оксалатные буферы, лактатные буферы, фосфатные буферы и ацетатные буферы, как дополнительно раскрыто в ν0 98/28007.

Типичные составы, которые могут быть получены, как описано в ν0 98/38007, включают:

(ί) 20 мМ ацетатный буфер с рН 5,0, буфер, который предпочтительно ранее не лиофилизовали, где буфер включает ИФН-β и по меньшей мере один ингредиент, выбранный из (а) 150 мМ аргинин-НС1; (6) 100 мМ хлорида натрия и 70 мМ глицина; (с) 150 мМ аргинин-НС1 и 15 мг/мл альбумина сыворотки человека; (б) 150 мМ аргинин-НС1 и 0,1% Р1итошс Е-68; (е) 140 мМ хлорида натрия; (ί) 140 мМ хлорида натрия и 15 мг/мл альбумина сыворотки человека; и (д) 140 мМ хлорида натрия и 0,1% Р1итошс Е-68;

(ίί) жидкость с рН 5,0, которая включает ИФН-β или его вариант, 170 мМ Ь-глутаминовую кислоту и 150 мМ гидроксид натрия, жидкость, которая предпочтительно ранее не была лиофилизована; и (ίίί) 20 мМ фосфатный буфер с рН 7,2, причем буфер предпочтительно ранее не был лиофилизован, где буфер включает ИФН-β и по меньшей мере один ингредиент, выбранный из: (а) 140 мМ аргинин-НС1 и (6) 100 мМ хлорида натрия и 70 мМ глицина.

Предпочтительные композиции также включают полисорбат, например 0,005% полисорбат 20.

ИФН-β могут быть составлены в форме сухого порошка, который может быть, но может и не быть солюбилизирован или суспендирован перед введением субъекту. В частности, было показано, что ИФНβδ, присоединенные к полимеру, например ПЭГ, особенно стабильны в сухой форме (см., например, ν0 00/23114 и РСТ/и8/95/06008).

Фармацевтические композиции данного изобретения могут также вводиться с помощью назального аэрозоля или ингаляции с применением распылителя, ингалятора сухого порошка или ингалятора с отмеряемой дозой. Такие композиции получают согласно способам, хорошо известным в области техники фармацевтических составов, и могут быть получены в виде растворов в солевом растворе с применением бензилового спирта или других подходящих консервантов, стимуляторов абсорбции для повышения биологической доступности, фторуглеродов и/или других традиционных солюбилизирующих или диспергирующих агентов. Согласно другому осуществлению композиции, содержащие соединение данного изобретения, могут также включать дополнительный агент, выбранный из группы, состоящей из кортикостероидов, противовоспалительных агентов, иммуносупрессорных агентов, агентов, тормозящих метаболизм, и иммуномодуляторов. Соединения внутри каждого из данных классов могут быть выбраны из любых, перечисленных в соответствующих групповых рубриках в Сотртебепзгуе Меб1сша1 СбетШту, Регдатоп Ргезз, РхГотб, рр. 970,986 (1990), раскрытие которых включено здесь в качестве ссылки. Конкретными соединениями являются теофиллин, сульфасалазин и аминосалицилаты (противовоспалитель

- 26 009938 ные агенты); циклоспорин, РК-506 и рапамицин (иммуносупрессорные агенты); циклофосфамид и метотрексат (агенты, тормозящие метаболизм); стероиды (для ингаляции, перорального или местного применения) и другие интерфероны (иммуномодуляторы).

Подходящие для парентерального введения растворы могут быть получены любыми способами, хорошо известными в области фармацевтической техники, описанными, например, в КепипдШп'х Рйагтасеийса1 8с1епсе§ (Сеппаго, А., еб), Маск РиЬ., 1990.

Парентеральное введение в виде инъекции обычно применяют для подкожных, внутримышечных или внутривенных инъекций и инфузий. Например, когда применяют подкожную инъекцию для доставки 0,01-100 мкг/кг, или более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг ИФН-β, например, пэгилированного ИФНβ, в течение одной недели можно вводить две инъекции по 0,005-50 мкг/кг или более предпочтительно 0,005-5 мкг/кг, соответственно, через 0 и 72 ч. Кроме того, в одном подходе для парентерального введения применяют имплантацию системы с медленным высвобождением или постоянным высвобождением, которая обеспечивает поддержание постоянного уровня дозы, согласно патенту США № 3710795, включенному здесь в качестве ссылки.

Как должно быть понятно специалисту в данной области техники, составленные композиции содержат терапевтически эффективные количества терапевтических агентов ИФН-β. То есть, они содержат количества, которые обеспечивают подходящие для тканей почек или других подходящих тканей концентрации терапевтического агента ИФН-β на протяжении времени, достаточного для профилактики, торможения, задержки или смягчения постоянной или прогрессирующей утраты функции почек, или обеспечивают терапевтическую эффективность другим образом. Как это должно быть ясным для специалиста в данной области техники, концентрация соединений, описанных в терапевтической композиции настоящего изобретения, должна варьировать в зависимости от ряда факторов, включая биологическую эффективность выбранного агента, химические свойства (например, гидрофобность) применяемых соединений, состав наполнителей для соединения, путь введения и предполагаемое лечение, включая то, будет ли активный ингредиент вводиться прямо в почку или почечную капсулу, или он будет вводиться системно. Предпочтительная доза для введения, очевидно, также должна зависеть от таких переменных, как состояние тканей почек, степень утраты почечной функции и общее состояние здоровья конкретного субъекта. Дозы можно вводить непрерывно или ежедневно, но в настоящее время предпочтительно, чтобы дозы вводились один, два или три раза в неделю столько времени, сколько продолжается удовлетворительный ответ (измеряемый, например, по стабилизации и/или улучшению почечной функции с помощью подходящих медицинских показателей и/или по показателям качества жизни). Могут применяться также менее частые дозы, например, ежемесячные дозы. Для субъектов, для которых в других условиях требовались бы постоянные, дважды или трижды в неделю сессии гемодиализа, постоянные, дважды или трижды в неделю внутривенные или внутрибрюшинные инфузии нельзя рассматривать как чрезмерно неудобные. Кроме того, для облегчения постоянных инфузий может быть целесообразной имплантация полуперманентного стента (например, внутривенного, внутрибрюшинного или внутрикапсулярного).

Режим доз с применением ИФН-β выбирают в соответствии с множеством факторов, включая тип, вид, возраст, массу, пол и медицинское состояние больного; тяжесть подлежащего лечению состояния; путь введения; функцию почек и печени больного; применяемое конкретное соединение или его соль. Учитывают также активность соединений изобретения и чувствительность больного к побочным эффектам. Опытный врач или ветеринар может легко определить и прописать эффективное количество лекарства, требующееся для профилактики, преодоления или остановки прогрессирования состояния.

Пероральные дозы настоящего изобретения, предпочтительно для пэгилированных терапевтических агентов ИФН-β, обычно находятся в диапазоне между приблизительно 0,01-100 мкг/кг/день перорально, или более предпочтительно 0,01-10 мкг/кг/день перорально. Композиции предпочтительно предлагаются в форме таблеток с насечками, содержащими 0,5-5000 мкг, или более предпочтительно 0,5-500 мкг активного ингредиента. Для любого пути введения можно применять разделенные или единичные дозы. Например, соединения настоящего изобретения можно вводить ежедневно или еженедельно в единичной дозе, или суммарную дозу можно вводить в виде дозы, разделенной на две, три или четыре части.

Любая из приведенных выше фармацевтических композиций может содержать 0,1-99,9%, 1-70% или, предпочтительно, 1-50% активных соединений изобретения в качестве активных ингредиентов.

Течение болезни и ее ответ на лечение лекарством могут быть отслежены с помощью клинического обследования и лабораторных данных. Эффективность терапии изобретения определяют по степени, в которой смягчаются ранее описанные признаки и симптомы состояния, например хронического гепатита, и по степени, в которой исключаются или существенно снижаются обычные побочные эффекты интерферона (т.е. сходные с гриппом симптомы, такие как лихорадка, головная боль, озноб, миалгия, утомление и т.д., и симптомы, связанные с центральной нервной системой, такие как депрессия, парестезии, нарушенное внимание и т. д.).

Терапевтические агенты ИФН-β можно вводить отдельно или в сочетании с другими молекулами с известным благоприятным действием в лечении описанных здесь состояний, например, противовоспалительными лекарствами. При применении в сочетании с другими агентами может возникнуть необходи

- 27 009938 мость соответствующего изменения доз терапевтических агентов ИФН-β.

Количество активного ингредиента, которое может быть соединено с веществами-носителями для получения единицы лекарственной формы, обычно варьирует в зависимости от подвергаемого лечению хозяина и конкретного способа введения. Следует понимать, однако, что конкретная доза и режим лечения для каждого конкретного больного обычно зависят от множества факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения, скорости экскреции, сочетания лекарств и решения лечащего врача и тяжести подлежащего лечению конкретного заболевания. Количество активного ингредиента может также зависеть от терапевтического или профилактического агента, с которым, если это имеет место, совместно вводят ингредиент.

Эффективная доза и скорость введения дозы терапевтических агентов ИФН-β обычно зависят от множества факторов, таких как природа ингибитора, размеры больного, цель лечения, природа патологии, подлежащей лечению, конкретная фармацевтическая композиция и решение лечащего врача. Пригодны уровни дозы между приблизительно 0,001 и приблизительно 100 мг/кг массы тела в день, предпочтительно между приблизительно 0,1 и приблизительно 50 мг/кг массы тела соединения активного ингредиента. Наиболее предпочтительно, чтобы терапевтический агент ИФН-β вводился в дозе между приблизительно 0,1 мг/кг массы тела и приблизительно 20 мг/кг массы тела, предпочтительно в диапазоне между приблизительно 1 мг/кг массы тела и приблизительно 3 мг/кг массы тела с интервалами каждые 1-14 дней. Предпочтительные дозы состоят из инъекции приблизительно 6 М1И в неделю или три раза в неделю. Оптимизация дозировки может быть определена, например, путем введения терапевтических агентов ИФН-β с последующей оценкой концентрации терапевтического агента ИФН-β в кровеносном русле или локально.

В наиболее предпочтительном осуществлении нуждающимся в этом субъектам вводят ΑνΟΝΕΧ®. ΑνΟΝΕΧ® имеется в продаже в виде лиофилизованного порошка, состоящего из следующего:

Состав на 1 мл дозы:

мкг интерферона-Ь-1а (6 млн международных единиц (МГО)) мМ фосфата натрия

100 мМ хлорида натрия мг альбумина сыворотки человека рН 7,2

Удельная активность ΑνΟΝΕΧ® интерферона составляет 2х10⁸ единиц/мг, т.е. 200 МИ антивирусной активности на миллиграмм белка ИФН-Ь-1а. Больной добавляет к порошку стерильную воду перед внутримышечной инъекцией 1 мл один раз в неделю. ΑνΟΝΕΧ® можно также получать в виде жидкого состава, состоящего из следующего:

мкг ИФН-Ь-1а (6 миллионов международных единиц (М1И)) мМ ацетата (ацетата натрия и уксусной кислоты)

150 мМ аргинина НС1

0,005% полисорбата 20 воды для инъекций рН 4,8

Данный состав может быть помещен в предварительно наполненный шприц. Больной может применять шприц либо вручную, либо с помощью автоинжектора. Режим дозировки составляет 6 МЫ (т.е. 30 мкг) внутримышечно один раз в неделю.

В другом осуществлении ИФН-β представляет собой КеЬгГ, который поставляется в виде лиофилизованного порошка и в виде жидкого состава. Лиофилизованный порошок состоит из следующего:

Состав на дозу 2,0 мл:

М1и ИФН-Ь-1а маннит

ЧСА

Ацетат натрия рН 5,5

Удельная активность КеЬгГ интерферона составляет 2,7х10⁸ единиц/мг, т.е. 270 МИ антивирусной активности на миллиграмм белка ИФН-Ь-1а. Больной добавляет к порошку раствор хлорида натрия (0,9% №1С1) перед подкожной инъекцией три раза в неделю.

Состав жидкого КеЬгГ является следующим:

или 12 М1и ИФН-Ь-1а или 2 мг ЧСА

27,3 мг маннита

0,4 мг ацетата натрия вода для инъекций

Жидкий состав может быть помещен в предварительно наполненный шприц и введен с применением аутоинжекторного устройства (КеЬуес!) или без него 3 раза (6 или 12 МШ, соответствующих 66

- 28 009938 мкг/неделю или 132 мкг/неделю, соответственно) в неделю подкожно.

В еще одном осуществлении ИФН-β представляет собой ΒΕΊΑΒΕΚΟΝ® (от Вег1ех), ИФН-β, содержащий мутацию сук-17 вместо кег, полученный в Е. сой. Данный негликозилированный ИФН-β является менее активным по сравнению с ΑνΟΝΞΧ® или КЕВ1Е®, оба которых продуцируются в клетках СН0. Дозы продаются в вице доз 250 мкг (8 МТО) как в лиофилизованных, так и в жидких составах для подкожной инъекции через каждые два дня. Другим имеющимся в продаже ИФН-β является ВЕТАЕЕК0№, который можно вводить подкожно в соответствии с инструкциями производителя.

ИФН-β или его вариант может также вводиться вместе с растворимым рецептором ИФН типа I или его частью, такой как ИФН-связывающая цепь рецептора, как описано, например, в патенте США № 6372207. Как описано в патенте, введение ИФН типа I в форме комплекса с ИФН-связывающей цепью рецептора улучшает стабильность ИФН и увеличивает эффективность ИФН. Комплекс может быть нековалентным комплексом или ковалентным комплексом.

Терапевтические агенты ИФН-β могут быть тестированы на моделях гломерулонефрита у животных. Модели гломерулонефрита у млекопитающих, например, у мышей, крыс, морских свинок, кошек, собак, овец, коз, свиней, коров, лошадей и отличных от человека приматов, могут быть получены путем индукции прямого или непрямого повреждения или инсульта тканей почек животного. Модели гломерулонефрита у животных могут быть получены, например, путем инъекции антител против базальной мембраны клубочков, как в случае животной модели нефротоксичного нефрита (ΝΤΝ) у крыс, описанной в примерах. Другие животные модели могут быть получены путем инъекции антител против Тйу1, как дополнительно описано в примерах. Еще один тип животных м:оделей получают иммунизацией аутологичной базальной мембраной клубочков или односторонней обструкцией уретры (ии0).

Терапевтические агенты ИФН-β можно оценивать по их терапевтической эффективности в индукции клинически значимого улучшения стандартного маркера почечной функции при введении млекопитающему субъекту (например, больному человеку), имеющему риск развития гломерулонефрита или хронической почечной недостаточности. Такие маркеры почечной функции хорошо известны в медицинской литературе и включают, но не ограничиваются этим, скорость повышения протеинурии, уровень ВШ, скорость повышения креатинина сыворотки, статические измерения ВИУ статические измерения креатинина сыворотки, скорость клубочковой фильтрации (СКФ), отношение ВЦН/креатинин, концентрацию натрия (№+) в сыворотке, отношение креатинина в плазме/моче, отношение мочевины в плазме/моче, осмолярность мочи, суточное образование мочи и тому подобное (см., например, Вгеппег апб йа/агик (1994), ίη Наткоп'к Ргтар1ек оГ 1п1егпа1 Мебкше, 13111 ебйюп.

Настоящее изобретение дополнительно иллюстрируется следующими примерами, которые не следует толковать как ограничивающие каким-либо образом. Содержание всех цитированных источников (включая литературные ссылки, изданные патенты, опубликованные патентные заявки в качестве цитированных посредством этого заявок) ясно включены здесь в качестве ссылки.

При осуществлении настоящего изобретения обычно используют, если это не указано иначе, традиционные способы клеточной биологии, клеточных культур, молекулярной биологии, трансгенной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые находятся в рамках данной области техники. Такие способы полностью объяснены в литературе. См., например, Мо1еси1аг С1ошпд А Ьайога1огу Мапиа1, 2^пб Еб., еб. йу Батйгоок, Егйксй апб Матайк (Со1б Брппд Нагйог Ьайога1огу Ргекк: 1989); ΌΝΑ С1ошпд, ^1итек I апб II (Ό.Ν. С1оуег еб., 1985); 0йдопис1ео11бе Буп1йек1к (М.1. Сай еб., 1984); МиШк е! а1. и.Б. Ра1еп1 № 4683195; Шскк Ас1б НуЬпб|/аРоп (В.Э. Натек & Б.Е Н1цц1пк ебк. 1984); Тгапкспрбоп Апб Тгапк1айоп (В.Э. Натек & Б.1. Н1цц1пк ебк., 1984); СиЙиге 0Г Ашта1 Се11к (К.Е Егекйпеу, А1ап К. Ь1кк, Шс., 1987); [ттоЬШхеб Се11к Апб Епхутек (ЩЕ Ргекк, 1986); В. Регйа1, А Ргасйса1 Сшбе То Мо1еси1аг С1ошпд (1984) ; !йе 1геабке, Ме!йобк Й1 Епхуто1о§у (Асабетк Ргекк, Шс., Ν.Υ.); Сепе ТгапкГег Vесΐо^к Еог Маттайап Се11к (ЕН. МШег апб М.Р. Са1ок ебк., 1987, Со1б Брппд Нагйог Ьайога1огу); Ме!йобк Ш Епхуто1оду, ^1к. 154 и 155 (VII е! а1. ебк.), Iттиηосйет^са1 Ме!йобк Ш Се11 Апб Мо1еси1аг Вю1оду (Мауег апб νη^τ ебк., Асабетк Ргекк, Ьопбоп, 1987); Напбйоок 0Г Ехрептеп1а1 Iттиηо1о§у, ^1итек Ην (Ό. М. Vе^^ и С. С. В1аскте11, ебк., 1986); Матри1а1тд !йе Мойке Етйгуо, (Со1б Брппд Нагйог Ьайога1огу Ргекк, Со1б Брппд Нагйог, Ν.Υ., 1986).

Примеры

Пример 1. ИФН-β вызывает значительное снижение протеинурии при почечной недостаточности.

В данном примере описывается то, что ИФН-β значительно снижает протеинурию на животной модели NΤN (нефротоксичного нефрита) у крыс, которая представляет собой модель воспаления, которая гистологически близка к серповидному гломерулонефриту человека, ведущему к хронической почечной недостаточности.

Заболевание индуцируют у крыс с помощью в. в. инъекции нефротоксичной (№ТБ) сыворотки, которую получают иммунизацией кроликов препаратом лиофилизированной базальной мембраны клубочков (СВМ). №ТБ быстро связывается с СВМ, что ведет к энергичному внутриклубочковому воспалительному ответу с повышением уровня провоспалительных цитокинов и молекул адгезии. Происходит приток лейкоцитов в клубочек. Затем в клубочках развиваются области некроза с отложением фибрина и

- 29 009938 разрушением капиллярных петель. Это ведет к развитию серповидных структур - аккумуляции клеток воспаления и пролиферирующих эпителиальных клеток клубочка в пространстве Боумена. Данное пространство воспаления отличается потерей большого количества белка с мочой. В клубочках развивается прогрессирующее рубцевание с накоплением коллагена в пучке и фиброзной трансформацией серповидных структур. Затем у крыс развивается конечная почечная недостаточность. Таким образом, при данной модели крысы отвечают на антитела против СВМ острым, но преходящим заболеванием почек, и затем 100% животных прогрессирует до ХПН четко определенным образом. Разные линии крыс обладают варьирующей подверженностью данной форме повреждения почек, причем чрезвычайно чувствительными являются крысы ХУМга-КуоЮ (\УКУ). Данная животная модель дополнительно описана, например, в Тат е! а1. (1999) ЫерЬго1. Όί;·ι1. Тгаи8р1аи1. 14:1658 и А11еп е! а1. (1999) I. 1ттипо1. 162:5519.

Примененный в данном исследовании ИФН-β представлял собой ИФН-β крысы, соответствующий аминокислотам 22-184 из СепВапк с регистрационным № Р70499. ИФН-β экспрессировали в клетках 832 яичников китайского хомячка (СНО), адаптированных к росту в суспензии и осуществляющих секрецию в среду. Клетки выращивали в среде, содержащей сыворотку, в ферментерных культурах. ИФН-β очищали из стандартизованной культуральной среды с применением последовательной хроматографии на Р11агтас1а 8Р-сефарозе, голубой сефарозе и смолах супероза 12, Вюгаб Вю-8са1е керамическом гидроксилапатите и смолах Вю-8са1е 8. После этого ИФН-β интенсивно диализовали против 25 мМ цитрата/150 мМ ЫаС1 (рН 4,5) и стерилизовали фильтрацией (0,2 мкм) . Препарат ИФН-β имел >99% чистоту по данным денситометрии окрашенных кумасси невосстанавливающих ДДС-Νη ПАГЭ гелей. По результатам измерения на клетках КАТЕС крысы было определено, что удельная активность составляет приблизительно 3х10⁸ единиц/мг.

В данном примере ΝΤΝ индуцировали у 28 крыс ^КУ, полученных от СЬабек К1уег ЬаЬога1опе5. Четыре крысы забивали на 14-й день для базовой гистологии, а остальных рандомизировали для получения или ИФН-β 3х10⁵ единиц/день внутрибрюшинно (в.б.), или ИФН-β 6х10⁵ единиц/день в.б., или только растворителя. Инъекции производили 6 дней в неделю, и лечение продолжали до 30-го дня. Протеинурию измеряли на 7-й день и затем еженедельно. У крыс брали кровь на 14-й день, 28-й день и при забое. При забое почки, легкие, печень и селезенку фиксировали в формалине, а почки быстро замораживали.

Оценивали следующие функциональные параметры, определенные в данном и/или последующих примерах.

Альбуминурию/протеинурию: данный показатель отражает утечку в клубочках и, в меньшей степени, недостаточность канальцевого метаболизма фильтрованных белков. Интерпретация таких данных может быть затруднена, поскольку они являются результирующей двух независимых переменных; повышенная проницаемость СВМ ведет к большей протеинурии, но пониженная скорость клубочковой фильтрации снижает клубочковую протеинурию.

Мочу собирали в метаболических клетках за 24 ч до забоя. Концентрацию альбумина мочи определяли рокетным иммуноэлектрофорезом. Концентрацию белка мочи определяли осаждением сульфосалициловой кислотой.

Сывороточный креатинин и клиренс креатинина (СгС1): Периферическую кровь получали при забое для определения концентрации креатинина сыворотки с применением реактивов О1утри§ и анализатора О1утри8 АИ600 (О1утри8, Еа8(1е1цЬ, и.К.). Измеряли также концентрацию креатинина в моче (Вауег КАХТ, №4·Βυ^, и.К.) для осуществления расчетов клиренса креатинина.

Выживание. Конечной точкой данных исследований является либо неожиданная смерть, либо забой для выявления дистресса. Животные осматриваются ежедневно непосвященным, независимым наблюдателем, и погибающих животных забивают по решению третьей стороны. На практике приблизительно половина животных в исследованиях на выживание достигала конечной точки забоя.

Для грубой оценки рубцевания клубочков, выпадения канальцев, интерстициальных воспалительных инфильтратов и интерстициального фиброза с применением условных балльных шкал получали срезы, окрашенные гематоксилином и эозином.

Фиброз клубочков: с помощью компьютера устанавливали % площади коры почек, окрашенной в зеленый цвет с помощью гистохимии Маккоп-ТпсЬготе, которая предполагает способ оценки «нагрузки» коллагеном в почках. Для количественной оценки интерстициального фиброза в клубочках заключенные в парафин срезы почек окрашивали с помощью стандартного трехцветного способа (Магйик Уе11о\\\ Вгб1ί;·ιηΙ Сгуйа1 8саг1е! и Аш1ше В1ие). Для количественной оценки отложения фибрина в клубочках (например, фибриноидного некроза) заключенные в парафин срезы почек окрашивали с помощью Магйик Уе11о\\\ который окрашивает фибрин в красный/оранжевый цвет. Срезы исследуют при увеличении Х200 с помощью микроскопа О1утри§ ВХ40 (О1утри§ Орйса1, Ьопбоп, и.К.), соединенного с цифровым фотонным фотоаппаратом (РНоЮшс 8с1епсе, ЕаЧ 8и55ех, и.К.). Изображения фиксировали и анализировали с помощью программы 1таде-Рго Р1и8™ (Меб1а СуЬетебск, 8буег 8рг1пц, МИ).

Количественное определение % площади коры почек, окрашенной коричневым цветом после иммунопероксидазного окрашивания домена ЕИ(А) фибронектина на срезах почек, по-видимому, обеспе

- 30 009938 чивает различение ХПН с различной функциональной тяжестью. Сходным образом иммуногистохимия коллагена типа ΙΙΙ позволяет рассчитать % окрашенной площади коры почек.

Экспрессию альфа-гладкомышечного актина (8NА) в клубочках измеряли с помощью иммунофлуоресценции. Данный белок определяет популяцию «миофибробластных» клеток в клубочках, которые, как полагают, занимают ведущее место в фиброзе клубочков. Количественное определение окрашивания альфа-(8МА) хорошо коррелирует с показателями фиброза клубочков Маккоп-1пс1юте.

Результаты, которые показаны на фиг. 3, указывают на значительное снижение протеинурии на 21-й и 28-й дни у животных, подвергнутых лечению обеими дозами ИФН-β. Не обнаружено различий в сывороточном креатинине, клиренсе креатинина, клубочковом или тубулоинтерстициальном рубцевании по отношению к слепому срезу Н&Е (т.е. гистологическому рубцеванию); в количестве макрофагов или СЭ8 в клубочках; или отложении фибронектина ЕЭ(А) или коллагена типа ГУ в клубочках.

Пример 2. ИФН-β значительно снижает протеинурию в острой фазе почечной недостаточности.

Данный пример показывает, что в дополнение к снижению протеинурии на более поздних стадиях почечной недостаточности ИФН-β также снижает протеинурию в острой фазе почечной недостаточности.

Для данного примера NТN индуцировали у 32 крыс с помощью инъекции 0,1 мл N1’8 в.в., как описано выше. Восемь крыс лечили ИФН-β крысы 6х10⁵ единиц/день в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 14-й день. Восемь крыс лечили К8А в.б. 6 дней в неделю с 0-го по 14-й день. Восемь крыс лечили ИФН-β крысы 6х10⁵ единиц/день в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 28-й день. Восемь крыс лечили К8А в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 28-й день. Мочу собирали в метаболических клетках на 7-й, 14-й, 21-й и 28-й дни для измерения протеинурии и креатина. У всех крыс брали кровь на 14-й день и при забое для определения креатина сыворотки. Половину крыс каждой группы забивали на 14-й день и половину - на 28-й день. За час до забоя крыс на 28-й день вводили ВтйИ для оценки клеточной пролиферации. Для гистологии в формалине фиксировали следующие ткани: почки, легкие, печень и селезенку. Срезы почек фиксировали в фиксаторе Сагпоу для окрашивания ВтйИ. Почки также быстро замораживали. Рубцевание клубочков, атрофию канальцев и фиброз оценивали полуколичественно на окрашенных Н&Е срезах.

Результаты, представленные на фиг. 4, указывают на то, что ИФН-β вызывает значительное снижение протеинурии на 14-й, 21-й и 28-й дни. Не было различий в креатинине сыворотки и клиренсе креатинина на 14-й и 28-й дни. Гистологически имелось значительное снижение макрофагов клубочков (клетки ЕЭ1+) и клеток СЭ8+ на 14-й день, но большее количество - на 28-й день. Происходило также значительное снижение гладкомышечного актина в клубочках на 28-й день. Таким образом, лечение ИФН-β оказывало влияние на протеинурию, вызывало снижение воспаления, но не оказывало выраженного действия на рубцевание.

В другом примере №№ индуцировали у 16 крыс ΧΥΚΥ, восемь из которых лечили ИФН-β крысы 6х 10⁵ единиц/день в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 7-й день, а других восемь крыс лечили лишь носителем (альбумином сыворотки крысы - К8А) в.б. 6 дней в неделю с 0-го по 7-й день. Крыс содержали в метаболических клетках на 6-й и 7-й дни. Всех крыс забивали на 7-й день. За один час до забоя крысам вводили ВтйИ для оценки клеточной пролиферации. При забое в формалине фиксировали почки, легкие, печень и селезенку. Почки фиксировали в фиксаторе Сагпоу для окрашивания ВтйИ и быстро замораживали. Результаты показывают отсутствие значительных различий в протеинурии, гистологии клубочков или количестве макрофагов или СЭ8 клеток в клубочках. Однако показатель фибриноида на 7-й день у животных, лечившихся ИФН-β, был ниже, чем у контрольных животных. Кроме того, количество пролиферирующих клеток в клубочках было значительно ниже у лечившихся ИФН-β животных по сравнению с контрольными животными (см. фиг. 5).

Пример 3. ИФН-β вызывает значительное снижение протеинурии при почечной недостаточности на животной модели Т1у гломерулонефрита.

Данный пример показывает, что протеинурия также значительно снижается под действием ИФН-β при мезангиальном пролиферативном гломерулонефрите.

Для данного примера применяли животную модель Т1 у1 гломерулонефрита. Она представляет собой модель мезангиального пролиферативного гломерулонефрита, который отличается повышенной протеинурией, пролиферацией мезангиальных клеток и накоплением мезангиального матрикса. Данная модель зависит от того, что мезангиальные клетки экспрессируют антиген Т1у1. Крысам Ее\\зк вводят однократную в. в. инъекцию моноклонального антитела против Т1у1. Это ведет к быстрому и воспроизводимому опосредуемому комплементом некрозу мезангиальных клеток клубочков (мезангиолизису). Протеинурия становится явной к 24 ч и продолжается по меньшей мере в течение 10 дней. Мезангиолизис сменяется фазой репарации, в которой мезангиальные клетки пролиферируют, и происходит образование избытка мезангиального матрикса. Это представляет собой модель протеинурии и пролиферации мезангиальных клеток.

Т1у1 гломерулонефрит индуцировали у 16 крыс Ее\\зк и 4 крыс ΧΥΚΥ путем инъекции 0,2 мл (2,5 мг/кг) антитела ЕК4 против Т1у1. Восемь крыс Ее\\зк получали ИФН-β крысы 6х10⁵ единиц/день в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 10-й день. Восемь крыс Ье^гк получали носитель (альбумин сыворотки крысы

- 31 009938

Κ8Α) в. б. 6 дней в неделю с 0-го по 10-й день. Четыре крысы \УКУ не получали лечения, и прогрессирование заболевания отслеживали с 0-го по 10-й день. Крыс содержали в метаболических клетках на 6-й и 7-й и 9-й и 10-й дни. Крыс забивали на 10-й день. За один час до забоя крысам вводили Вгби для оценки клеточной пролиферации. При забое в формалине фиксировали почки, легкие, печень и селезенку. Почки фиксировали в фиксаторе Сагпоу для окрашивания Вгби и быстро замораживали.

Результаты, показанные на фиг. 6, указывают на то, что протеинурия значительно снижалась на 7-й и 10-й дни. Не выявлено каких-либо различий в креатинине сыворотки, однако клиренс креатина проявлял тенденцию к снижению в группе, подвергнутой лечению (фиг. 7). Не было различий в повреждении клубочков, оцениваемом по наличию микроаневризмов клубочков. Однако гиперклеточность клубочков была значительно снижена у крыс, лечившихся ИФН-β (фиг. 8).

Пример 4. ИФН-β вызывает значительное снижение протеинурии на животной модели пуромицинаминонуклеозидной нефропатии (ΡΑΝ).

ΡΑΝ индуцировали у 4 самцов крыс ^У1з1аг по 200 г каждая. Две крысы получали 20 мг пуромицинаминонуклеозид (ΡΑ;) внутрибрюшинно (в.б.) на 0-й день, и две крысы получали 20 мг ΡΑ внутрисосудисто (в.в.) на 0-й день. Крыс содержали в метаболических клетках на 3-4-й и 7-8-й дни. Всех крыс забивали на 8-й день. Результаты показали, что средняя величина протеинурии составляет 46 (мг/24 ч) и 287 на 4-й и 8-й дни, соответственно, у крыс, инъецированных в.б., и 122 и 194 на 4-й и 8-й дни, соответственно, у крыс, инъецированных в. в.

Действие ИФН-β на данной животной модели было показано следующим образом. ΡΑΝ индуцировали у крыс, как указано выше. Крысы получали 6х10², 6х10³, 6х10⁴, 6х10⁵ единиц ИФН-β крысы или только буфер. Результаты, которые показаны на фиг. 9, указывают на то, что введение ИФН-β значительно снижает протеинурию на 7-й и 14-й дни, даже при наименьшей дозе ИФН-β.

Таким образом, результаты данного примера указывают на то, что ИФН-β снижает воспаление при заболевании почек, о чем свидетельствует снижение протеинурии и пролиферации клубочков, а также снижение клеток воспаления, например, макрофагов и СЭ8+ клеток в клубочках. Таким образом, ИФН-β может быть применен для лечения, например, профилактики гломерулонефрита, острой и хронической почечной недостаточности.

Эквиваленты

Специалисты в данной области техники должны понимать или быть способны убедиться с применением лишь обычного экспериментирования, что имеется много эквивалентов конкретных осуществлений описанного здесь изобретения. Подразумевается, что такие эквиваленты охватываются следующей формулой изобретения.

Claims (26)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Применение терапевтического агента ИФН-β для производства лекарственного средства для лечения или профилактики гломерулонефрита у млекопитающего, где ИФН-β является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.
2. 2. Применение по п.1, где гломерулонефрит выбран из группы, состоящей из фокального гломерулосклероза, коллабирующих гломерулопатий, болезни с минимальными изменениями, серповидного гломерулонефрита, нефритического синдрома, нефротического синдрома, первичного гломерулонефрита, вторичного гломерулонефрита, пролиферативного гломерулонефрита, мембранозного гломерулонефрита, мембранопролиферативного гломерулонефрита, иммунокомплексного гломерулонефрита, гломерулонефрита с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-СВМ), олиго-иммунного гломерулонефрита, диабетической гломерулопатии, хронического гломерулонефрита и наследственного нефрита.
3. 3. Применение по любому из пп.1-2, где ИФН-β представляет собой ИФН-β человека.
4. 4. Применение по п.3, где ИФН-β по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН-β человека, имеющему 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:4.
5. 5. Применение по п.3, где ИФН-β представляет собой ИФН^-1а.
6. 6. Применение по п.3, где ИФН-β представляет собой ИФН^-Ш
7. 7. Применение по любому из пп.1-6, где млекопитающее представляет собой человека.
8. 8. Применение терапевтического агента ИФН-β для производства лекарственного средства для лечения или профилактики хронической почечной недостаточности у млекопитающего, где ИФН-β является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.
9. 9. Применение по п.8, где ИФН-β представляет собой ИФН-β человека.
10. 10. Применение по п.8, где ИФН-β по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН-β человека, имеющему 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ:4.
11. 11. Применение по п.9, где ИФН-β представляет собой ИФН^-1а.
12. 12. Применение по п.9, где ИФН-β представляет собой ИФН^-Ш
13. 13. Применение по любому из пп.8-12, где млекопитающее представляет собой человека.

    - 32 009938
14. 14. Способ лечения гломерулонефрита у млекопитающего, включающий выявление млекопитающего, имеющего гломерулонефрит, и введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества терапевтического агента ИФН-β, где ИФН-β является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.
15. 15. Способ по п.14, где гломерулонефрит выбран из группы, состоящей из фокального гломерулосклероза, коллабирующих гломерулопатий, болезни с минимальными изменениями, серповидного гломерулонефрита, нефритического синдрома, первичного гломерулонефрита, вторичного гломерулонефрита, пролиферативного гломерулонефрита, мембранозного гломерулонефрита, мембранопролиферативного гломерулонефрита, иммунокомплексного гломерулонефрита, гломерулонефрита с антителами против базальной мембраны клубочков (анти-ОВМ), олиго-иммунного гломерулонефрита, диабетической гломерулопатии, хронического гломерулонефрита и наследственного нефрита.
16. 16. Способ по п.14 или 15, где ИФН-β представляет собой ИФН-β человека.
17. 17. Способ по п.14 или 15, где ИФН-β по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН-β человека, имеющему 8Еф ΙΌ N0:4.
18. 18. Способ по п.16, где ИФН-β представляет собой ИФН^-1а.
19. 19. Способ по п.16, где ИФН-β представляет собой ИФН^ИЬ.
20. 20. Способ по любому из пп.14-19, где млекопитающее представляет собой человека.
21. 21. Способ лечения хронической почечной недостаточности у млекопитающего, включающий выявление млекопитающего, имеющего хроническую почечную недостаточность, и введение данному млекопитающему терапевтически эффективного количества терапевтического агента ИФН-β, где ИФН-β является зрелым, а указанное млекопитающее не имеет волчанки или гепатита В.
22. 22. Способ по п.21, где ИФН-β представляет собой ИФН-β человека.
23. 23. Способ по п.21, где ИФН-β по меньшей мере приблизительно на 95% идентичен полноразмерному зрелому ИФН-β человека, имеющему 8Еф ΙΌ N0:4.
24. 24. Способ по п.22, где ИФН-β представляет собой ИФН^-1а.
25. 25. Способ по п.22, где ИФН-β представляет собой ИФН^ИЬ.
26. 26. Способ по любому из пп.21-25, где млекопитающее представляет собой человека.