CN1240479A - 截短的可溶性肿瘤坏死因子i－型和ii－型受体 - Google Patents

截短的可溶性肿瘤坏死因子i－型和ii－型受体 Download PDF

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CN1240479A CN97197728A CN97197728A CN1240479A CN 1240479 A CN1240479 A CN 1240479A CN 97197728 A CN97197728 A CN 97197728A CN 97197728 A CN97197728 A CN 97197728A CN 1240479 A CN1240479 A CN 1240479A
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E·F·菲舍尔
C·K·爱德华兹三世
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Abstract

公开调节肿瘤坏死因子的活性被称作肿瘤坏死因子结合蛋白的蛋白质。还公开了通过重组遗传工程技术获得肿瘤坏死结合蛋白的方法。

Description

截短的可溶性肿瘤坏死因子 I-型和II-型受体
                       发明领域
本发明涉及炎症领域，更确切地，本发明涉及截短的肿瘤坏死因子受体(sTNFRs)。
                       发明背景
炎症是身体对那些由机械损伤、感染或抗原刺激引起的伤害而产生的一种防御反应。当炎症由不适当的刺激如自身抗原引起时，炎症反应可病理性地表达，当有害物去除后，炎症过度或持续表达。这些炎症反应还包括一些细胞因子的产生。
尽管炎症的病原学还不十分清楚，但最近已获得了有关炎症的分子方面的大量信息。这项研究导致被认为在炎症传递中起显著作用的一些细胞因子的鉴定。细胞因子是细胞外蛋白质，调节细胞的行为，尤其是那些处于细胞因子合成和释放的接近领域的细胞。肿瘤坏死因子(TNFs)是一族由数目众多的细胞类型，包括单核细胞和巨噬细胞产生的细胞因子。
至少两种TNFs已被描述，特别是TNF-α和TNF-β(TNF-β或淋巴细胞毒素)，每一种作为三聚体分子是有活性的，被认为通过交联受体而起动细胞信号。(Engelmann等，(1990)，J.Biol.Chem.，265：14497-14504)。
一系列证据表明TNF-α和TNF-β是主要的炎症性细胞因子。这些已知的TNFs对许多不同的靶细胞具有重要的生理作用，这些靶细胞包含在多种刺激如感染或损伤而引起的炎症反应中。这些蛋白引起成纤维细胞和滑液细胞分泌潜在的胶原酶和前列腺素E2，引起骨细胞刺激骨吸收。这些蛋白增加了内皮细胞对嗜中性白细胞的表面粘附特性。它们还引起内皮细胞分泌促凝剂活性和降低它们溶解血块的能力。另外，它们通过抑制脂蛋白脂肪酶的表达除去脂肪细胞贮积脂肪类物质的活性。TNF还引起肝细胞合成一族名为“急性期反应物”的蛋白质，它们可作为热原作用于下丘脑(Selby等，(1988)，Lancet，1(8583)：483；Stames，Jr等，(1988)，J.Clin.Invest.，82：1321；Oliff等(1987)，Cell，50：555；和Waage等，(1987)Lancet，1(8529)：355)。此外，各种炎症，包括类风湿性关节炎的预测动物模型的临床前结果表明，TNF的抑制作用对疾病的发展和严重程度能够起主要影响(Dayer等，(1994)，European细胞因子Network，5(6)：563-571和Feldmann等，(1995)，纽约科学院年鉴，66：272-278)。而且，最近用TNF抑制剂作用于风湿性关节炎的初步人体临床实验结果显示了前景看好的结果(Rankin等，(1995)，英国风湿病学杂志，3(4)：4334-4342；Elliott等，(1995)，Lancet，344：1105-1110；Tak等，(1996)，关节炎和风湿病，39：1077-1081；和Paleolog等，(1996)，关节炎和风湿病，39：1082-1091)。
TNF的蛋白抑制剂在本领域被公开。EP 308 378报导从发热病人尿中得到的蛋白具有TNF抑制活性。这种蛋白作用可能由于受体水平的竞争机制。EP 308 378公开了一个足够纯的通过其N-末端来鉴定的蛋白质。然而，参考并未教授任何DNA序列或重组产生的TNF抑制剂。
本领域已经教授了重组产生的TNF抑制剂。例如，EP 393 438和EP 422 339提及成熟的重组人“30kDa TNT抑制剂”(也被称为p55受体和sTNFR-I)和成熟的重组人“40kDa抑制剂”(也被称为p75受体和sTNFR-II)的氨基酸和核苷酸序列，以及其修饰型，例如，片段，功能性衍生物和变异体。EP 393 483和EP 422 339还公开了分离编码抑制剂基因，将基因克隆到适当的载体和细胞类型并表达产生抑制剂的方法。成熟的重组人30kDa TNF抑制剂和成熟的重组人40kDaTNF抑制剂已被证明能够抑制TNF(EP 393 438，EP 422 339，PCT公开号WO 92/16221和PCT公开号WO 95/34326)。
sTNFR-I和sTNFR-II是神经生长因子/TNF受体超家族中的成员，这一家族受体包括神经生长因子受体(NGF)，B细胞抗原CD40，4-1BB，大鼠T-细胞抗原MRC OX40，Fas抗原和CD27，CD30抗原(Smith等，(1990)，Science，248：1019-1023)。这一族细胞表面受体最保守的特性是细胞外配体结合区富含半胱氨酸，它可分为大约有40个氨基酸的4个重复基元，在非常保守的位置含有4-6个半胱氨酸残基(Smith等，(1990)，上文)。
EP 393 438还提及40kDa TNF抑制剂△51和40kDa抑制剂△53，是全长重组40kDa TNF抑制剂蛋白在成熟蛋白羧基末端分别去除51或53个氨基酸残基后的截短的形式。相应地，技术人员会理解，每一30kDaTNF抑制剂和40kDa抑制剂的第四个区对TNF抑制作用不是必需的。实际上，许多不同的家族均已证实了这一认识。30kDa和40kDa TNF抑制剂的区域缺失衍生物已经产生，那些没有第四区的衍生物保留着完全的TNF结合活性，而那些分别缺少第一、第二和第三区的衍生物则不能保留TNF结合活性。(Corcoran等，(1994)，Eur.J.Biochem.，223：831-840；Chih-Hsueh等，(1995)，生物化学杂志，270(6)：2874-2878；和Scallon等(1995)，细胞因子，7(8)759-770)。
由于30kDa TNF抑制剂和40kDa TNF抑制剂所表现的对细胞毒性相对较低的抑制作用(Butler等，(1994)，细胞因子，6(6)：616-623)。许多的家族(groups)已产生TNF抑制蛋白的二聚体(Butle等(1994)，Supra；和Martin等，(1995)，Exp.Neurol.131：221-228)。然而，二聚体可以产生抗体反应(Martin等，(1995)，上文；和Fisher等，(1996)，新英格兰医学杂志，334(26)：1697-1702)。
本发明的目的之一是提供功能性活性的截短的sTNFRs。本发明的这一目的以及其他目的在以后的描述中会越来越明显。
                     发明概述
本发明涉及sTNFR-I和sTNFR-II的功能性活性的截短形式，在此指“截短的sTNFR(s)”。截短的sTNFRs是sTNFR-I和sTNFR-II的修饰形式，它们不含第四区(sTNFR-I的氨基酸残基Thr127-Asn161和sTNFR-II的氨基酸残基Pro141-Thr179)，第三区的一部分(sTNFR-I的氨基酸残基Asn111-Cys126和sTNFR-II的氨基酸残基Pro123-Lys140)；以及，任选的不含第一区的一部分(sTNFR-I的氨基酸残基Asp1-Cys19和sTNFR-II的氨基酸残基Leu1-Cys32)。这些TNF(例如TNF-α和/或TNF-β)的新的抑制剂具有普遍的适用性。
本发明的截短的sTNFRs包括那些以通式R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32-Cys115]-R5表示的蛋白。这些蛋白分别是sTNFR-I和sTNFR-II的截短形式。
R1-[Cys19-Cys103]-R2表示一个或多个蛋白或其变异体，其中[Cys19-Cys103]表示sTNFR-I的残基19到103。图1(SEQ ID NO：2)提供了氨基酸残基序号图解以便于比较。其中R1表示Cys19或从下组中选择的氨基末端氨基酸残基的一个甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化的氨基基团。
                            C
                           IC
                          SIC
                         NSIC (SEQ ID NO：15)
                        NNSIC (SEQ ID NO：16)
                       QNNSIC (SEQ ID NO：17)
                      PQNNSIC (SEQ ID NO：18)
                     HPQNNSIC (SEQ ID NO：19)
                    IHPQNNSIC (SEQ ID NO：20)
                   YIHPQNNSIC (SEQ ID NO：21)
                  KYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：22)
                 GKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：23)
                QGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：24)
               PQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：25)
              CPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：26)
             VCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：27)
            SVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：28)
           DSVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：29)；其中R2表示Cys103或从下组中选择的羧基末端氨基酸残基的一个羧基基团。
               F
              FC
             FCC
            FCCS (SEQ ID NO：30)
           FCCSL (SEQ ID NO：31)
          FCCSLC (SEQ ID NO：32)
         FCCSLCL (SEQ ID NO：33)；但前提条件是当R1表示氨基酸序列为VCPQGKYIHPQNNSIC或其N-末端从1-15残基的截短体的甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化的氨基基团，那么R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白不是一个含通式R1-[Cys19-Cys103]-FCCSLCL-R3的插入变异体，其中R3表示图1的氨基酸序列Asn111-Asn161或其羧基末端截短体的羧基基团。
本发明的典型的截短sTNFR-I包括以下分子及其变异体或衍生物：NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH(也被称作sTNFR-I 2.6D/C105)；NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也被称作sTNFR-I 2.6D/C106)；NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH(也被称作sTNFR-I2.6D/N105)；NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也被称作sTNFR-I 2.3D/d8)；NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也被称作sTNFR-I 2.3D/d18)；和NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也被称作sTNFR-I 2.3D/d15)，或甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化。
用“R4-[Cys32-Cys115]-R5”表示一个或多个蛋白质及其变异体，其中[Cys32-Cys115]表示sTNFR-I的残基Cys32至Cys115。图8(SEQ ID NO：35)提供了其氨基酸残基序号图解，便于比较；其中R4表示Cys32或下组中氨基末端氨基酸残基的甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化的氨基基团：
                              C
                             MC
                            QMC
                           AQMC (SEQ ID NO：36)
                          TAQMC (SEQ ID NO：37)
                         QTAQMC (SEQ ID NO：38)
                        DQTAQMC (SEQ ID NO：39)
                       YDQTAQMC (SEQ ID NO：40)
                      YYDQTAQMC (SEQ ID NO：41)
                     EYYDQTAQMC (SEQ ID NO：42)
                    REYYDQTAQMC (SEQ ID NO：43)
                   LREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：44)
                  RLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：45)
                 CRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：46)
                TCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：47)
               STCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：48)
              GSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：49)
             PGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：50)
            EPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：51)
           PEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：52)
          APEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：53)
         YAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：54)
        PYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：55)
       TPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：56)
      FTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：57)
     AFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：58)
    VAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：59)
   QVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：60)
  AQVAFTPYAPEpGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：61)
 PAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：62)
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：63)；其中R5表示Cys115或下组中羧基末端氨基酸残基的羧基基团：
          A
         AP
        APL
       APLR (SEQ ID NO：64)
      APLRK (SEQ ID NO：65)
     APLRKC (SEQ ID NO：66)
    APLRKCR (SEQ ID NO：67)但前提条件是，当R4表示氨基酸序列为TCRLREYYDQTAQMC或其N-末端从1-15残基的截短体的甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化的氨基基团时，则R4-[Cys32-Cys115]-R5不是含通式R4-[Cys32-Cys115]-APLRKCR-R6的插入变异体，其中R6表示图8中Pro123-Thr179或其羧基末端截短体的氨基酸序列的羧基基团。
本发明的一个方面，截短的sTNFRs可以以糖基化或非糖基化形式制备。截短的sTNFRs由重组遗传工程技术产生。在另一可替换的实施方案中，截短的sTNFRs可通过化学技术或重组和化学技术的结合而产生。
本发明的另一方面，截短的sTNFRs可通过将截短的sTNFRs结合到一水溶性聚合物上衍生而来。例如，截短的sTNFRs可连接到一个或多个聚乙二醇分子上，通过增加其表观分子量来改善其药物动力学行为。
本发明的另一方面包括编码截短的sTNFRs的各种各样的多核苷酸。适当的核酸序列包括，例如那些在图中明确描述的以及简并序列和其自发等位变异体。这样的核酸序列可在真核或原核宿主细胞中表达截短的sTNFRs，其特征在于表达产物或其衍生物可调节TNF活性。
本发明再一方面包括编码截短的sTNFRs多核苷酸并有效地连接到扩增和/或表达控制序列的载体上。这些载体可稳定地转化或转染原核和真核宿主细胞并表达截短的sTNFRs。本发明还包括截短的sTNFRs重组产物，其中含有此多核苷酸的宿主细胞在适宜的营养培养基中生长，细胞表达的截短的sTNFRs任选地从宿主细胞和/或营养培养基中得到分离。
本发明的另一方面包括含有截短的sTNFRs或其衍生物的药学组合物。典型地，截短的sTNFRs或其衍生物可与药学可接受的赋形剂结合制成制剂可以使用各种各样其他制剂物质以便于截短的sTNFRs或其衍生物的大量制造、储存、处理、运输和/或功效。
本发明的另一方面涉及调节TNF活性的方法，确切地说，TNF介导的疾病(例如，由TNF-α和/或TNF-β介导的疾病)可通过给病人服用治疗有效剂量的截短的sTNFRs或其衍生物进行治疗。
编码截短的sTNFRs的多核苷酸亦可用于细胞治疗或基因治疗中。
本发明的截短的sTNFRs尤其适于大规模蛋白的大量生产。例如，sTNFRs-I在111-126(氨基酸Asn111-Gly126)氨基酸序列有一个脱氨基位点。这一位点的缺失被认为能增加纯化蛋白的生化稳定性，降低产物降解的可能，得到更能稳定储存的蛋白质。截短的sTNFRs与以前公开的TNF抑制蛋白相比有较少的二硫键。例如，sTNFR-I在氨基酸序列111至126有2个二硫键，在氨基酸序列127至161有3个二硫键；sTNFR-II在氨基酸序列Cys121与Cys139，Cys142与Cys157，和Cys163与Cys178之间有一个二硫键。二硫键减少的数目非常重要，因为这些联接的数目较多会使蛋白重折叠过程变得复杂。奇怪的是，截短的sTNFRs具有比其他原先公开的TNF抑制剂蛋白较少的抗原表位(例如，具有第一个三区的sTNFR-I的短的形式由于某些残基的暴露而产生的新表位，见实施例III)，由此导致相对减少的抗原性及反复服药后清除率没有明显降低。截短的sTNFRs减少的免疫原性被认为适宜治疗TNF介导的疾病，尤其包括慢性炎性疾病。
考虑到以下对实施本发明的详细描述后，本发明另外的方面和优势对本领域的技术人员来说就很显而易见了。
                   附图简述
在重温这些图后，本发明的许多方面和优势会很明显。
图1描述了编码Asp1-Asn161，全长重组人sTNFR-I的核酸序列(SEQ ID NO：1)，还描述了Asp1-Asn161的氨基酸序列(SEQ IDNO：2)。
图2描述了编码NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH(也称作sTNFR-I 2.6D/C105)的核酸序列(SEQ ID NO：3)(也称作sTNFR-I 2.6D/C105)，还描述了NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。
图3描述了编码NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也称作sTNFR-I 2.6D/C106)的核酸序列(SEQ IDNO：5)，还描述了NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。
图4描述了编码NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH(也指sTNFR-I 2.6D/N105)的核酸序列(SEQ ID NO：7)，还描述了NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
图5描述了编码NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也称作sTNFR-I 2.3D/d8)的核酸序列(SEQ ID NO：11)，还描述了NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH的氨基酸序列(SEQ ID NO：12)。
图6描述了编码NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也称作sTNFR-I 2.3D/d18)的核酸序列(SEQ ID NO：9)，还描述了NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。
图7描述了编码NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也称作sTNFR-I 2.3D/d15)的核酸序列(SEQ ID NO：13)。还描述了NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)。
图8描述了编码Leu1-Thr179，成熟重组人sTNFR-II的核酸序列(SEQ ID NO：34)。还描述了Leu1-Thr179的核酸序列(SEQ ID NO：35)。
图9描述了在链球菌细胞壁诱导再激活模型中诱导肿胀的(Swelling)的数量，如实施例II中所述。
图10描述了在健康狒狒中的两次微小静脉内灌注0.2mg/kgsTNFR-I 4D/C105db后的血浆图，如实施例III所述。
图11描述了在健康狒狒中的两次微小静脉内灌注0.2mg/kgsTNFR-I 3D/C105db后的血浆图，如实施例III中所述。
图12描述了在健康狒狒中的两次微小静脉内灌注0.2mg/kgsTNFR-I 2.6D/C105db后的血浆图，如实施例III中所述。
图13描述了不同的二聚体sTNFR-I构建物的剂量与清除率的关系，如实施例III所述。
                       发明详述
本发明以意外的发现为基础，这一发现是sTNFR-I和sTNFR-II每一种均可在大小上有所减少，它们不仅排除了第四区，而且还有第三区的一部分，以及任选的第一区的一部分，但仍然保持其生物学活性并降低了其抗原性。由于至少以下原因，生产这些有生物活性的截短的sTNFRs或其衍生物被认为是有利的。第一，这些分子可以少一个潜在不稳定的脱氨基作用位点。第二，这些分子含有较少的二硫键，潜在地使重折叠和纯化变得容易。第三，这些分子含有减少的潜在的抗原表位位点。
其中使用的术语“截短的sTNFR(s)”包括一个或更多的具有生物活性的通式为R1-[Cys19-Cys103]-R2或R4-[Cys32-Cys115]-R5的合成的或重组分子及其变异体(包括插入、替换和缺失变异体)，如下所述。
其中使用的术语“生物学活性的”指截短的sTNFR表现相似的TNF抑制特性。但不必是与sTNFR-I和/或sTNFR-II完全相同的特性和相同的程度。一般地来说，截短的sTNFRs和其衍生物具有抑制TNF的能力。截短的sTNFRs的生物检定将在实施例II中进一步描述。感兴趣的TNF的特殊抑制特性的选择取决于截短的sTNFR的目的用途。
本发明的一个方面，截短的sTNFRs通过细菌、哺乳动物或昆虫细胞系统的重组技术生产比较有利，可以蛋白的糖基化或非糖基化形式产生。或者，截短的sTNFRs可以化学合成。目前优选的生产方法会在以后详述。
每一截短的sTNFRs可典型地被分离、纯化至基本上不存在其它蛋白质物质(即非截短的sTNFRs)。优选地，截短的sTNFR大约80％不含有由于大量生产截短的sTNFR的技术而产生的其他蛋白质。更优选地，截短的sTNFR大约有90％不含其他蛋白质。尤其优选地，95％无其他蛋白，最优选地，大于98％无其他蛋白。然而，可以理解，目的蛋白可与其他活性成分、化学组合物和/或在施用前与适当的药物制剂原料结合，这些在以后详述。
                    截短的sTNFRs
在一个基本的实施方案中，本发明的截短的sTNFRs可以是用以下通式表示的一个或多个蛋白及其变异体：
                    R1-[Cys19-Cys103]-R2，其中[Cys19-Cys103]表示sTNFR-I的19至103残基，图1(SEQ ID NO：2)提供了其氨基酸残基的序号图解，便于比较。其中R1表示Cys19或选自下组的氨基末端氨基酸残基的一个甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化的氨基基团：
                           C
                          IC
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          DSVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：29)；其中R2表示Cys103或选自下组的羧基末端氨基酸残基的一个羧基基团：
                           F
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                        FCCS (SEQ ID NO：30)
                       FCCSL (SEQ ID NO：31)
                      FCCSLC (SEQ ID NO：32)
                     FCCSLCL (SEQ ID NO：33)；但条件是，当R1表示氨基酸序列为VCPQGKYIHPQNNSIC或1至15残基的N末端截短体的一个甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化的氨基基团，则R1-[Cys19-Cys103]-R2不是一个含有通式R1-[Cys19-Cys103]-FCCSLCL-R3的插入变异体。其中R3表示图1中氨基酸序列为Asn111-Asn161或其羧基末端截短体的一个羧基基团。
在另一基本实施方案中，本发明的截短的sTNFRs可用以下通式表示一个或多个蛋白及其变异体：
                     R4-[Cys-Cys115]-R5其中[Cys32-Cys115]表示sTNFR-II的残基Cys32至Cys115，图8(SEQ IDNO：35)提供了其氨基酸残基序号图解，以便比较；其中R4表示Cys32或选自下组的氨基末端氨基酸的一个甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化的氨基基团：
                             C
                            MC
                           QMC
                          AQMC (SEQ ID NO：36)
                         TAQMC (SEQ ID NO：37)
                        QTAQMC (SEQ ID NO：38)
                       DQTAQMC (SEQ ID NO：39)
                      YDQTAQMC (SEQ ID NO：40)
                     YYDQTAQMC (SEQ ID NO：41)
                    EYYDQTAQMC (SEQ ID NO：42)
                   REYYDQTAQMC (SEQ ID NO：43)
                  LREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：44)
                 RLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：45)
                CRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：46)
               TCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：47)
              STCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：48)
             GSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：49)
            PGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：50)
           EPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：51)
          PEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：52)
         APEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：53)
        YAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：54)
       PYAPEpGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：55)
      TPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：56)
     FTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：57)
    AFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：58)
   VAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：59)
  QVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：60)
 AQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：61)
PAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：62)
LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：63)；其中R5表示Cys115或选自下组的羧基末端氨基酸残基的一个羧基基团：
          A
         AP
        APL
       APLR (SEQ ID NO：64)
      APLRK (SEQ ID NO：65)
     APLRKC (SEQ ID NO：66)
    APLRKCR (SEQ ID NO：67)但条件是，当R4表示氨基酸序列为TCRLREYYDQTAQMC或其从1-15残基的N末截短体的一个甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化的氨基基团，则R4-[Cys32-Cys115]-R5不是含有通式为R4-[Cys32-Cys115]-APLRKCR-R6的插入变异体，其中R6表示图8的氨基酸残基Pro123-Thr179或其羧基末端截短体的一个羧基基团。
本发明的另一方面包括R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32-Cys115]-R5的一个或多个变异体，甲硫氨酰化的或非甲硫氨酰化的。术语“截短的sTNFR(s)”这样就包括R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32-Cys115]-R5的一个或多个自发型等位变异体，以及一或多个其他的变异型蛋白，在这些变异型蛋白的R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32-Cys115]-R5的氨基酸序列中可以有氨基酸被缺失(“缺失变异体”)，被插入(“插入变异体”)或被替换(“替换变异体”)。
氨基酸序列缺失典型的变化范围约为20个氨基酸残基，更典型地1至10个残基，最典型地1至5个残基，以致不破坏蛋白折叠。N-末端，C-末端和内部序列的缺失也经过了考虑。为保持蛋白受影响区的三级结构，将要选择全部缺失和/或连续缺失的数目，例如，半胱氨酸的交联。
可以在R1-[Cys19-Cys103]-R2氨基酸序列和R4-[Cys32-Cys115]-R5氨基酸序列内部区域造成缺失，该区域与细胞表面膜蛋白家族中NGF/TNF受体家族其他成员的序列的同源性低。
在R1-[Cys19-Cys103]-R2氨基酸序列和在R4-[Cys32-Cys115]-R5氨基酸序列内部的缺失可在如下区域进行，该区域与NGF/TNF受体家族的其他成员基本同源，并且，该缺失极有可能显著调节生物学活性。特别地，NGF/TNF受体家族成员的序列相似性在对应于第1个区的前两个二硫环，整个2区，3区的第一个二硫环的区域尤其高(Banner等，(1993)，Cell，73：431-445)。例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2的两个典型的缺失变异体是R1-[Cys19(△Thr20)-Cys103]-R2和R1-[Cys19(△Cys19-Lys21)-Cys103]-R2，其中R1和R2定义如上。例如，R4-[Cys32-Cys115]-R5的三个典型的缺失变异体是R4-[Cys32-(△Cys115)Cys115]-R5，R1-[Cys19(△Cys115-Lys115)-Cys103]-R2和R4-[Cys32-(△Cys115-Arg113)-Cys115]-R5，其中R1和R2定义如上。
氨基酸序列添加还包括氨基和/或羧基末端融合，长度从1-100或更多的残基，以及序列内插入1个或多个氨基酸残基。内部插入长度变化典型地是从1至10个氨基酸残基，更典型从1至5个氨基酸残基，最典型从1至3个氨基酸残基。
氨基末端添加变异体包括添加一个甲硫氨酸(例如，在细菌重组细胞培养基中作为人为构造以直接表达蛋白质)或一个添加的氨基酸残基或序列。氨基末端插入的进一步的例子包括融合一个信号序列，以及或与其他前原蛋白(pre-pro)序列一起，便于蛋白从重组的宿主细胞中分泌出来。对原核宿主细胞来说，它不识别和加工天然的sTNFR-I或sTNFR-II信号序列，其信号序列可被一个选择的单核信号序列替换，例如从碱性磷酸酶，青霉素酶或热稳定肠毒素II组成的族前导序列(leaders)中选择。对酵母细胞来说，信号序列可从例如酵母转化酶、α因子或酸性磷酸酶的前导序列中选择。sTNFR-I或sTNFR-II的天然信号序列(EP 393 438和EP 422 339)在哺乳动物细胞中的表达是较理想的，尽管其他哺乳动物的信号序列也可能合适，(例如，来自其他NGF/TNF受体家族成员的序列)。
羧基末端添加变异体不包括添加分别导致sTNFR-I或sTNFR-II重建的1个或多个氨基酸残基。可以理解羧基末端添加变异体不包括添加可导致第三区或第四区重建的一个或多个羧基酸(carboxy acid)残基。一个羧基末端添加变异体的例子包括嵌合蛋白质，此嵌合蛋白包括R1-[Cys19-Cys103]-R2或R4-[Cys32-Cys115]-R5与人免疫球蛋白重链或轻链的全部或部分恒定区融合。这种嵌合蛋白是优选的，其中每者的免疫球蛋白部分包括除了人免疫球蛋白重键恒定区第一区的所有区域，如IgG、IgA、IgM或IgE，尤其是IgG，例如，IgG1或IgG3。技术人员会理解每个免疫球蛋白部分的任一个氨基酸可被缺失或被一个或多个氨基酸替换或添加一个或多个氨基酸，只要TNF结合部分仍能结合TNF，免疫球蛋白部分能表现其一个或更多个特征性质。
变异体的另一族是氨基酸替换变异体。这些变异体每个在R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32-Cys115]-R5中至少有一个氨基酸被去除，且有一个不同的残基插入其位置。替换变异体包括等位变异体，其特征是，种群中自发的核酸序列变化可能或可能不导致氨基酸的改变。本领域的技术人员可利用多肽结合位点或活性位点的任何熟知的信息来选择可能的突变位点。
确定一个蛋白加以诱变的氨基酸残基或区域部位的方法称为“丙氨酸扫描诱变”(Cunningham和Wells(1989)，Science，244.：1081-1085，其内容在此引入作为参考)。这一方法中，蛋白靶残基的一个氨基酸残基或基团被鉴定，(例如，带电荷残基Arg，Asp，His，Lys和Glu)被一中性或带负电荷氨基酸代替(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)来影响氨基酸与细胞内或外水环境的相互作用。那些对替换表现为功能敏感性的残基通过在替换位点引入添加的或替换的残基而被优化。这样，引入氨基酸序列修饰的位点可预先决定，可使在给定位点的突变行为尽可能完善，可进行丙氨酸扫描或随机诱变，为得到目的活性和活性程度的最佳结合，得到的变异体多肽需被筛选。
替换诱变的目标位点包括在R1-[Cys19-Cys103]-R2或R4-[Cys32-Cys115]-R5中发现的氨基酸的位点，在侧链大小，电荷和/或疏水性方面，与sTNFR样蛋白诸如其他多种sTNFRs或NGF/TNF受体家族的其他成员的sTNFRs基本上不同。
其它目标位点包括那些特殊残基和sTNFR-I样蛋白和sTNFR-II样蛋白相似或一致的位点。这些位点对蛋白的生物活性一般很重要。例如，技术人员可能已领会在本发明之前，截短sTNFR-I和sTNFR-II对各自的三维结构的作用是不可预测的。然而，假如有了在此公开的结果，技术人员会理解发展制备变异体策略的第一个原理可部分地依赖于先前说明的全长sTNFR-I和sTNFR-II信息。相应地，以下关于sTNFR-I的信息已说明(Banner等(1993)，Supra，和Fu等，(1995)，ProteinEngineering，8(12)：1233-1241)。残基Tyr9，Thr39，His55在1区，残基Phe49，Ser63，Asp82在2区，残基Tyr92和Ser107在3区已被鉴定出具有分别稳定1，2，3区结构的潜在重要性。残基Pro12和His55已被鉴定具有与TNFα的C亚基Ser86-Tyr87的潜在相互作用。残基Glu45-phe49已被鉴定在一个具有与TNFαA亚基的残基Leu29-Arg32潜在相互作用的环中。残基Gly48已被鉴定与TNFα的A亚基Asn19-Pro20有潜在相互作用。残基His58-Leu60已被鉴定在一个延伸链构象中(extended strandconformation)，侧链与TNFαA亚基Arg31-Ala33残基的相互作用已被潜在地鉴定是TNFα的残基Arg31特异性地与sTNFR-I的残基His58的相互作用。残基Lys64-Arg66已被鉴定在一个延伸链构象中，并已被鉴定含有侧链和主链的相互作用，相互作用发生在TNFα A亚基的残基Ala145-Glu146和残基Glu46之间。残基Met69已被鉴定与TNFαA亚基的残基Tyr115有潜在的相互作用。残基His94-Phe101已被鉴定形成一个与TNFα的C亚基残基Thr72-Leu75和Asn137相互作用的环，sTNFR-I的残基Trp96特异性地与TNFα的C亚基残基Ser71-Thr72相互作用，sTNFR-I的Leu100与TNFα的C亚基残基Asn137紧密相邻，sTNFR-I的残基Gln102特异地与TNFα的A亚基残基Pro113相互作用。相应地，技术人员会理解起初这些位点应以相对保守方式的替换进行修饰。
这些保守的替换见题为“优选替换”的表1。如果这些替换导致生物学活性的改变，那么更基本的改变(典型替换)可被引入和/或进行其它添加/缺失并筛选结果产物。表1：氨基酸替换
原始残基    优选替换        典型替换
Ala (A)       Val         Val；Leu；Ile
Arg (R)       Lys         Lys；Gln；Asn
Asn (N)       Gln         Gln；His；Lys；
                          Arg
Asp (D)       Glu         Glu
Cys (C)       Ser         Ser
Gln (Q)       Asn         Asn
Glu (E)       Asp         Asp
Gly (G)       Pro         Pro
His (H)       Arg         Asn；Gln；Lys；
                          Arg
Ile (I)       Leu         Leu；Val；Met；
                          Ala；Phe；
                          norleucine
Leu (L)       Ile         norleucine；
                          Ile；Val；Met；
                          Ala；Phe
Lys (K)       Arg         Arg；Gln；Asn
Met (M)       Leu         Leu；Phe；Ile
Phe (F)       Leu         Leu；Val；Ile；
                          Ala
Pro (P)       Gly         Gly
Ser (S)       Thr         Thr
Thr (T)       Ser         Ser
Trp (W)       Tyr         Tyr
Tyr (Y)       Phe         Trp；Phe；Thr；
                          Ser
Val (V)       Leu         Ile；Leu；Met；
                          Phe；Ala；
                          norleucine
为产生相当性质的改变，应考虑氨基酸的亲水指数。每一氨基酸以其疏水性和电荷特性为基础被确定一个亲水指数。这些是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/甘氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天门冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；和精氨酸(-4.5)。
亲水性氨基酸指数在讨论一个蛋白的相互作用的生物学功能是很重要的，这一重要性在本领域中一般是能够理解的(Kyte和Doolittle(1982)，J.Mol.，Biol.，157：105-131，其内容在此引入作为参考)。众所周知，一定的氨基酸可被其它具有相似亲水指数或比数(score)的氨基酸所替换，仍然可以保持相似的生物学活性。进行基于亲水指数的改变，氨基酸的替换，其亲水指数在±2的被优选，那些亲水指数在±1的特别优选，那些在±0.5的甚至更加特别优选。
本领域中也能领会，以亲水性为基础的相似氨基酸的替换会更有效，特别是由此产生的生物学功能相当的蛋白质或多肽，欲用于免疫实施方案，如本例的情况。
美国专利4,554,101，其内容在此引入作为参考，陈述一个蛋白的最大的局部平均亲水性是由其邻近氨基酸的亲水性支配，与其免疫原性和抗原性相关，即和蛋白的一种生物学特性有关。
以下是美国专利4,554,101详述的氨基酸残基的亲水性值，已被赋予氨基酸残基：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰氨(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5+1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。
以相似疏水性值作为改变的基础，替换氨基酸的亲水值在±2的被优选，在±1的尤其优选，在±0.5的甚至更优选。
美国专利4,554,101还提及以亲水性为基础，从原始氨基酸序列对表位的鉴定和制备。通过美国专利4,554,101公开的方法，本领域的一个技巧是能够从氨基酸序列如其中公开的sTNFRs序列中鉴定表位。这些区也被称为“抗原核心区”。
大量科学出版物致力于从氨基酸序列分析来对二级结构进行预测和表位鉴定(Chou和Fasman(1974)，Biochemisry，13(2)：222-245；Chou和Fasman，Biochemistry，113(2)：211-222；Chou和Fasman(1978)，Adv.Enzymol.Relat，Areas Mol.Biol.，47：45-148；Chou和Fasman，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276和Chou和Fasman(1979)，Biophys.J.，26：367-384，其内容在此引入作为参考)。而且，计算机程序目前也被应用于辅助预测蛋白的抗原部位和表位核心区。实施例包括那些以Jameson-Wolf分析为基础的程序(Jameson和Wolf(1998)，Comput.Appl.Biosci，4(1)：181-186和Wolf等(1988)，Comput.Appl.Biosci，4(1)：187-191，其内容在此引入作为参考)。程序PepPlot(Brutlag等)(1990).CABS，6：237-245和Weinberger等.(1985)，Science，228：740-742，其内容在此引入作为参考)，和其他蛋白质三级结构预测的新程序(Fetrow和Bryant(1993)，BIOTECHNOLOGY，11：479-483，其内容在此引入作为参考)。
R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32-Cys115]-R5的氨基酸序列的保守修饰(编码核酸序列的相应修饰)被认为可产生含与修饰蛋白相似功能性和化学特性的蛋白质。
对比之下，R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32-Cys115]-R5的功能性和/或化学特性的基本修饰是通过选择替换作用来完成的。替换作用在保持以下几方面时它们的作用差异显著：(a)替换区域的多肽骨架的结构，例如：片层或螺旋构象，(b)蛋白靶位点的电荷或疏水性或(c)侧链体积。天然存在的残基根据其一般侧链特性被分为以下几组：1)疏水的：正亮氨酸，Met，Ala，Val，Leu，Tle；2)中性亲水的：Cys，Ser，Thr；3)酸性的：Asp，Glu；4)碱性的：Asn，Gln，His，Lys，Arg；5)影响链走向的残基，Gly，Pro和6)芳香族的：Trp，Tyr，Phe。
非保守替换可包括这些组中的一个成员与另一个进行交换。这些替换残基可被引入R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32-Cys115]-R5区域，与其它NGF/TNF受体家族或同源或非同源。
R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32-Cys115]-R5的特异突变体可包括在蛋白的N-末端、C-末端或任一位点替换-非天然氨基酸，通过添加一个N-连接或O-连接的糖类而得到修饰。这些修饰可能非常有用，例如添加一个氨基酸(如Cys)，它对一个水溶性聚合物连接形成一个衍生物很有利，如下所述。例如，参见图5，其中天然发生的sTNFR-I的Asn105其中被变成Cys，便于与聚乙二醇分子的附着(实施例I)。
更进一步，R1-[Cys19-Cys103]-R2和R4-[Cys32-Cys115]-R5的序列可通过添加糖基化位点或缺失N-连接或O-连接的糖基化位点来得到修饰。天冬酰氨连接的糖基化识别位点包括一个被相应的细胞糖基化酶特异识别的三肽序列。这些三肽序列或是Asn-Xaa-Thr或是Asn-Xaa-Ser，Xaa是除Pro外的任一氨基酸。sTNFR-I已被证明或预测的天冬酰氨残基存在于14、105和111位。sTNFR-II的已被证明或预测的天冬酰氨残基存在于149和171位。可以制备一系列氨基酸替换或缺失来修饰或添加IV-连接或O-连接的糖基化位点，导致一糖基化改变的蛋白质。
在一个具体的实施方案中，变异体基本上与R1-[Cys19-Cys103]-R2或R4-[Cys32-Cys115]-R5的氨基酸同源。这里使用的“基本同源：意味着一定程度的同源性，优选地超过70％，较优选地超过80％，更优选地超过90％，最优选超过95％，其中所说的同源性百分比计算的是两个序列中较短者里边和比较的序列中特定的氨基酸残基相一致的氨基酸残基的百分比，为了辅助比较，使其一致性可以充分体现，每100个氨基酸长度中可引入4个空隙。见Dayhoff(1972)发表，在蛋白序列和结构图谱，5：124，国立生物化学基金，D.C.，其内容在比引入作为参考。也作为基本上同源而包括在内的是这样的截短的sTNFRs，可以由于分别与氨基酸序列为SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：35的抗体的交差反应性而得到分离，或者可通过与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：34或其片段的DNA杂交而使其基因得到分离。
本发明典型的sTNFRs包括以下分子：NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH(也称作sTNFR-I 2.6D/C105)；NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-C-COOH(也称作sTNFR-I 2.6D/C106)；NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH(也称作sTNFR-I 2.6D/C105)；NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也称作sTNFR-I 2.3D/d8)；NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也称作sTNFR-I 2.3D/d18)；以及NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(也称作sTNFR-I 2.3D/d15)，甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化的，和其变异体或衍生物。
截短的sTNFR的变异体的生产在以后进一步详述。这些变异体可通过在编码截短sTNFRs的DNA中引入适当的核苷酸变化或通过体外化学合成目的截短sTNFRs来制备。本领域的技术人员将能理解，假如最终截短的sTNFRs是有生物活性的则可以进行缺失、插入和替换的多种组合。
本领域的技术人员熟知替换、插入或缺失一个或多个选择的氨基酸残基的诱变技术(例如，美国专利号4,518,584，其内容在此引入作为参考)。每个氨基酸序列变异体在构建中有两个主要变量，突变位点的位置和突变的性质。设计每个变异体的过程中，每个突变位点的位置和突变性质依赖于将要修饰的系生化特性。每个突变位点可单一修饰或做一系列修饰，例如，通过(1)首先替换保守氨基酸选项，之后依赖于获得的结果进行更加根本的选择。(2)缺失靶氨基酸残基或(3)邻近选定位点插入氨基酸残基。
截短的sTNFRs的化学修饰衍生物可由本领域的技术人员制备，假如有其中公开的内容。用糖基化，非糖基化或去糖基化的截短的sTNFRs可制备结合物。典型地，非糖基化截短的sTNFRs将被利用。修饰截短的sTNFRs的合适的化学部分包括水溶性多聚物。
水溶性聚合物比较理想，因为附着在其上的蛋白在水环境中不会发生沉淀，生理环境中就是这样的水环境。优选地，多聚物是药理学上可接受的能用于制备治疗产物或组合物。本领域的技术人员能够选择理想的多聚物，是基于以下考虑的，即：多聚物/蛋白质结合体能否应用于药学，如果能，还应考虑理想的剂量、循环时间和抗蛋白水解作用。
适宜的、临床可接受的水溶性聚合物包括，但不局限于聚乙二醇(PEG)，聚乙二醇丙醛、乙二醇/丙二醇共聚物，单甲氧基-聚乙二醇、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇(PVA)，聚乙烯吡咯烷酮，聚-1，3-二氧戊环，聚-1，3，6-三噁烷，乙烯/顺丁烯二酸酐共聚物，聚(β-氨基酸)(或同聚物或随机共聚物)，聚(n-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，pro-丙二醇(propropylene glycol)同聚物(PEG)和其它聚烷基氧化物，聚丙烯氧化物/乙烯氧化物共聚体。聚氧乙烯化多元醇(POG)(例如，甘油)和其它聚氧乙烯化多元醇，聚氧乙烯化山梨(糖)醇或聚氧乙烯化葡萄糖，结肠酸(colonic acids)或其它糖类聚合物，Ficoll或葡聚糖和其混合物。
这里所用的PEG表示包括已用于衍化其它蛋白的任何形式。例如单一(C1-C10)、烷氧基或芳氧基-聚乙二醇。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性使它在生产上很有利。
每一水溶性聚合物可以是任何分子量的，可以是分枝或不分枝的。每一水溶性聚合物典型地具有平均分子量大约2kDa-100kDa(术语“大约”表示在水溶性聚合物的制剂中，与所说的分子量相比，有些重一些，有些轻一些)。每一水溶性聚合物的平均分子量优选地在大约5kDa-50kDa，更优选地在大约12kDa-40kDa，最优选地在20kDa-35kDa。
一般地，分子量越大或分枝越多，聚合物与蛋白质的比率越高，其它大小的也可使用，决定于要求的治疗状况(例如，持续释放的持续时间；效果，如果有的话，指在生物学活性方面的处理上的难易；抗原性的缺失或程度和其他已知的水溶性聚合物作用于治疗蛋白的效应)。
每一水溶性聚合物附着到蛋白质上并考虑到作用于蛋白质功能性或抗原性区域的效果。一般来说化学修饰可在任何适宜于将蛋白质与一激活的聚合物分子反应的条件下进行。激活基团可将水溶性聚合物与一个或多个蛋白相连，这些基团包括以下：磺基，顺丁烯二酰亚胺，疏基，硫醇，triflate，tresylate，azidirine，环氧乙烷和5′吡啶基。
每一水溶性聚合物一般在氨基酸的α-或ε-氨基基团或反应性硫醇基与蛋白质相连，但也考虑了水溶性基团能附着到蛋白的任一反应性基团上，这一蛋白在适宜反应条件下有足够的反应性连接到水溶性基团上。这样，通过一反应性基团如自由氨基或羧基基团，水溶性聚合物共价地连接到蛋白质上。含自由氨基基团的氨基酸残基可以包括赖氨酸残基和N-末端氨基酸残基。那些含自由羧基基团的可包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C-末端氨基酸残基。含反应性硫醇基的包括半胱氨酸残基。
制备连接蛋白与水溶性聚合物的方法一般包括以下几步：(a)在蛋白可与一个或多个水溶性聚合物结合的条件下，将蛋白与一种水溶性聚合物反应，(b)获得反应产物。每种结合反应条件可从那些本领域已知的任意一种或那些持续发展的条件中选择，但应避免或限制暴露于使要修饰的蛋白失活的如温度、溶剂和pH值等反应条件下，一般来说，此反应的最佳反应条件由具体情况决定，取决于已知参数和期望目的结果。例如，水溶性聚合物：蛋白结合物的比率越大，结合的产物百分比越高，最佳比率(考虑到反应效率，即没有多余的未反应蛋白或聚合物)可由例如衍生作用的期望水平(例如，单一-，双-，三-，等)，选择的聚合物的分子量；聚合物是否分枝和使用的反应条件等因素来决定。水溶性聚合物(例如PEG)与蛋白质的比率一般变化范围是1∶1-100∶1，一个或多个纯化的结合体可通过标准的纯化技术从每个混合物中制备，这些技术包括透析，盐析，超滤，离子交换，层析，凝胶过滤层析和电泳。
可以特异性地获得一个N-末端化学修饰的蛋白。选择一个水溶性聚合物可以通过分子量、分枝情况等，水溶性聚合物与蛋白质(或多肽)分子在反应混合物中的比例，进行的反应类型，获得选择的N-末端化学修饰蛋白质的方法。获得N-末端化学修饰蛋白质制剂的方法(即，如有必要，而从其它单一衍化部分分离这一部分)可通过从大量化学修饰蛋白分子中纯化N-末端化学修饰蛋白。选择的N-末端化学修饰可通过还原烷基化来完成，它采用不同类型的可获得的原始氨基基团(N-末端的赖氨酸)的不同反应性来实现特殊蛋白质中的衍化作用。在适当的反应条件下，基本上可获得选择性的蛋白衍生物，在其N-末端有一包含聚合物的羧基基团。例如，可以选择性地将一水溶性聚合物连接到蛋白的N-末端，通过在一个可以利用赖氨酸残基的ε-氨基基团与蛋白质N-末端残基的α-氨基基团的pKa差异的pH值下进行反应。通过这样选择性的衍化作用，可以控制水溶性聚合物与蛋白质的附着，与聚合物的结合主要发生在蛋白质的N-末端，其它反应基团没有发生显著的修饰，例如，赖氨酸侧链氨基基团。利用还原烷基化，水溶性聚合物可以是上述类型并应会有一个用来连接蛋白的单一反应醛。聚乙二醇丙醛，含有一个单一反应性醛，可被利用。
本发明特别考虑到包括单一—或多聚—(例如2-4)PEG部分的化学衍生蛋白。聚乙二醇化可按本领域中已知的任一聚乙二醇化反应进行。制备-聚乙二醇化蛋白的方法一般包括以下步骤：(a)在蛋白可与一个或多个PEG基团连接的条件下，将蛋白产物与PEG反应(例如PEG的反应性酯或醛衍生物)。(b)获得反应产物。一般来说最佳反应条件依具体情况取决于已知参数和期望的结果。
本领域的技术人员可获得许多连接方法。例如，参见EP0401384，其内容在此引入作为参考；还可参见，Malik等，(1992)，Exp.Hematol，20：1028-1035；Francis(1992)，Focus on Growth Factors 3(2)：4-10，(Mediscript，Mountain Court，Friern Barnet，Lane London N20 OLD，UK出版)；EP0154316；EP0401384；WO 92/16221；WO 95/34326；和其它涉及聚乙二醇作用在此引用的出版物，其内容在此引入作为参考。
聚乙二醇化尤其可通过反应性的PEG分子的酰化作用和烷化反应进行。这样，按照本发明的蛋白产物包括聚乙二醇化的蛋白，其中PEG基团与苯酰基或烷基基团相连接。这些产物可以是单一—聚乙二醇化的或多聚-聚乙二醇化的(例如，含2-6，及优选地2-5，PEG基团)。PEG基团一般通过氨基酸的α-或ε-氨基基团处连接到蛋白质，但也仔细考虑了在适宜反应条件下，PEG基团能够连接到蛋白质的任何氨基基团，此蛋白具有足够的反应性连接到一个PEG基团上。
通过酰化作用的聚乙二醇化一般包括PEG的一个活性酯衍生物与蛋白反应。对酰化作用来说，选择的聚合物应具有单一的反应性酯基团。任何已知的或相继发现的反应性PEG分子可用以进行聚乙二醇化反应。一个优选的活化PEG酯是PEG酯化成N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。这里所用的“酯化作用”考虑包括，但不局限于以下治疗蛋白与水溶性聚合物如PEG连接的类型：酰胺，氨基甲酸酯，氨基甲酸乙酯等(参见Chamow(1994).Bioconjugate Chem.5(2)：133-140，其内容在此引入作为参考)。反应条件可从聚乙二醇作用领域中已知的任意一个或那些相继发展的条件中选择，但应避免使要修饰的蛋白失活的条件，如温度，溶剂和pH。
通过酰化作用的聚乙二醇化一般会导致多聚-聚乙二醇化的蛋白。优选地，连接键是酰胺。同样优选地，结果产物基本上只有(例如，＞95％)，单-，双-或三-聚乙二醇化。然而，一些聚乙二醇作用程度较高的种类可大量形成，依赖于所用的特定反应条件。如果地较理想，通过标准的纯化技术，更纯的聚乙二醇化种类可从混合物中得到分离，这些纯化技术包括透析，盐析，超滤，离子交换层析，凝胶，过滤层析、电泳和其它一些技术。
通过烷基化作用的聚乙二醇化一般包括将PEG的一个末端乙醇衍生物在还原剂存在下与蛋白反应。对还原性的烷基化反应来说，选择的聚合物应具有单一反应性的醛基。一个典型的反应性PEG醛是PEG丙醛，它是水稳定性，或其单一C1-C10烷氧基或芳香基衍生物，(参见，美国专利5,252,714，其内容在此引入作为参考)。
通过烷基化作用的聚乙二醇化还能够导致多聚-聚乙二醇化蛋白。另外，可以控制反应条件基本上利于聚乙二醇作用只在蛋白的N-末端的α-氨基基团上(即：单一聚乙二醇化蛋白)。在平聚乙二醇或多聚乙二醇作用的情况下，PEG基团优选地通过一个-CH2-NH-基团与蛋白质附着。对-CH2-基团的特别说明，这里指的连接键类型是“烷基”键。
还原烷基化产生基本同源的一批单一聚合物/蛋白质产物一般包括以下步骤：(a)在还原熔化条件下，在适合该蛋白的氨基末端α-氨基基团的选择性修饰的pH条件下，将一蛋白与一反应性PEG分子反应，(b)获得反应产物。采用赖氨酸氨基基团和N-末端α-氨基基团的pKa差异(pKa指的是这样的pH条件，50％的氨基基团是质子化的，50％则否)，通过还原烷基化的衍生作用产生单一聚乙二醇化的产物。
反应在一定pH下进行，这pH可使利用赖氨酸残基的ε-氨基基团与蛋白质N-末端残基的α氨基基团的pKa差异，一般来说，如果pH偏低，则对于蛋白质有大量多余的聚合物将是比较的理想的(即，N末端α-氨基基团越不活跃，达到最佳条件需要的聚合物越多)。如果pH偏高，则聚合物：蛋白质的比率不需那么大(即，获得的活性基团越多，需要的聚合物越少)。对本发明的目的来说，pH一般落在3-9，优选的则在3-6。对还原烷基化作用，还原剂在水溶液中应是稳定的，可优选地只减少在还原烷化作用的初始步骤中形成的希夫碱。适宜的还原剂可从硼烷钠，氰基硼烷钠，二甲胺甲硼烷，三甲胺甲硼烷和吡啶甲硼烷中选择、特别合适的还原剂是氰基硼烷钠。其它反应参数例如溶剂、反应时间、温度和产物纯化方式可依具体情况决定，基于发表的涉及用水溶性聚合物衍化蛋白质的信息。
通过这样选择性的衍生作用，水溶性聚合物(包括反应性基团的醛与蛋白质的连接是被控制的：与聚合物的连接主要发生在蛋白质的N-末端，其它反应性基团无显著修饰作用发生，例如赖氨酸侧链氨基基团。制剂中单一聚合物/蛋白质连接物典型地超过90％，更典型地超过95％单一聚合物/蛋白质连接物，还有未反应的可观察到的分子的残余(即缺少聚合物部分的蛋白质)。
本发明的一个具体的实施方案是不分枝的含平均分子为大约为20kDa或33kDa(例如，30kDa-35kDa)/单甲氧基-PEG醛分子或含分子量约为33kDa(例如，30kDa-35kDa)叔丁基PEG醛通过还原烷化作用与sTNFR-I 2.6D/N105相连。
聚乙二醇化也可以特异性地完成通过含至少一个反应性羟基基团(例如PEG)的水溶性聚合物与含一个反应性羰基、腈或磺基基团的试剂反应，将羟基基团转变为一个反应性Micheel受体，由此形成一个在修饰各种各样蛋白质中有用的“活性连接肽”来提供改进的生物学活性的结合物。“反应性羰基、腈或或磺基”表示一个羰基、腈或磺基基团上连接一个二碳基团，在羰基、腈或磺基的第二个碳上含一个巯基特异性反应位点(WO 92/16221)。
活性连接肽可以是单功能、双功能或多功能的。含一反应性磺基基团的有用试剂可被用于有关方法中，包括，但不局限于，氯磺基、乙烯基磺基和二乙烯基磺基的方法。
一个具体的实施方案中，水溶性聚合物被一Michael受体激活。WO 95/13312描述，尤其是，水溶性磺基活化的PEGs高度选择性地与分子的和表面的巯基部分而非氨基部分相连。这些PEG衍生物在持久的时间内在pH为11左右或更低的水环境对水解作用是稳定的，能与分子连接形成结合物也具有水解稳定性。PEG与生物学活性分子的连接包括磺基部分与疏基部分相连，具有PEG-SO2-CH2-CH2-S-W结构，其中W表示生物学活性分子，其中磺基部分是乙烯磺基或一活性乙基磺基。两个特别有用的同源双功能衍生物是PEG-双-氯磺基和PEG-双-乙烯磺基。
PCT国际申请号US 96/19459，其内容在此引入作为参考，提及制备磺基-活化连接肽的方法，通过获得一个含反应性羟乙基基团的组合物并将羟乙基转变为一个反应性Michael受体，以形成一个活性连接肽，应用四氢呋喃(THF)作为转变反应的溶剂。PCT国际申请号US96/19459，其内容在此引入作为参考，提及纯化活性的连接肽的方法，它采用疏水相互作用层析，依赖于其大小和末端基团功能来分离连接肽。
特别地，本发明考虑了下述原核表达分子经化学修饰以包括单一或多聚(例如2-4)PEG部分：sTNFR-I 2.6D/C105，sTNFR-I2.6D/C106，sTNFR-I 2.6D/N105，sTNFR-I 2.3D/d8，sTNFR-I2.3D/d18和sTNFR-I 2.3D/d15，甲硫氨酰化或非甲硫氨酰化的以及其变异体和衍生物。
                       多价形式
可构建多价形式，即，分子包括多于一个的活性部分。在一个实施方案中，分子可拥有多个TNF配体的TNF结合位点(例如，截短的sTNFR产物的结合)。另外，此分子还可有至少一个TNF结合位点，以及取决于多价形式的目的特性，至少还有另一分子的结合位点(例如，至少一个截短的sTNFR产物和至少一个白细胞白介素-1受体拮抗物(“IL-1a”)的结合，如下所述)。
在一个实施方案中，多价形式可被构建，例如，通过化学连接至少一个截短的sTNFR产物和另一部分，优选地和另一截短的sTNFR产物，通过与任一临床上可接受的连接肽相连接。(例如，水溶性聚合物，如上所述)。原则上，连接肽不应给予新的免疫原性或由于新的氨基酸残基改变结构的疏水性和电荷平衡，导致对其生物分布和清除的有害影响。
这种聚合物当作连接肽用时可以是同源聚合物、随机或嵌段共聚物和三聚物，以上面所列的单体为基础，可能是直链或分枝，替换或非替换。聚合物可以是任何长度和分量的，但这些特征可影响其生物学特性。在药学应用中，对降低清除率尤其有用的聚合物平均分子量在2,000-35,000道尔顿之间。另外，聚合物的长度可变化以优化或授予所期望的生物学活性。
活化的基团可被用于将水溶性聚合物连接到2个或多个蛋白质上，这些活化基团包括：磺基，马来酰亚胺，疏基，硫醇基，triflate，tresylate，azidirine，环氧乙烷和5-吡啶基。
在一个具体的实施方案中，含至少一个反应性Michael受体的一个双功能或多功能活化连接肽可按照美国专利申请号08/473,809制备，按照美国专利申请号08/611,918纯化。
活性部分可用常规连接技术连接(参见PCT出版号WO 92/16221和PCT出版号WO 95/34326，其内容在此引入作为参考)。而且，PCT出版号WO 92/16221描述了各种各样二聚化的sTNFR-I抑制剂分子的制备，例如二聚化的C105 sTNFR。含通式(sTNFR-I 2.6D/C106)2-(20kDaPEG)的典型的多价肿瘤坏死因子结合蛋白，在例I中公开。
或者，一个双价分子可由两个一前一后重复排列的截短的sTNFR产物组成，两个截短的sTNFR产物由一多肽连接区间隔开。多肽连接肽的设计在设计上和与从头设计的蛋白质区域中间插入短环序列的情况相似。(Mutter(1988)，TIBS，13：260-265和Regan及DeGrado(1988)，Science，241：976-978，其内容在此引入作为参考)。已表明，适合单链抗体的连接肽能有效地产生一个二聚体形式的重组人sTNFR-II(Neve等(1996)，细胞因子，8(5)：365-370，其内容在此引入作为参考)。几个不同的连接肽构建物已被装配并显示对抗体有用；最具功能性的连接肽长12-25个氨基酸(含有不反应的侧链基团，例如丙氨酸、丝氨酸和甘氨酸)，一起构成一个亲水序列，具有一些电荷性质相反的残基以增加可溶性，这些连接肽是柔韧的(Whitlow和Filpula(1991)，Methods：A Companion to Methods in enzymology，2：97-105和Brigido等(1993)，J.Immunol.150：469-479，其内容在此引入作为参考)。
在另一实施方案中，截短的sTNFRs可化学结合生物素，生物素/截短的sTNFRs结合之后可结合亲和素，导致四价的亲和素/生物素/截短的sTNFR分子。截短的sTNFRs还可共价结合二硝基苯酚(DNP)或三硝基苯酚(TNP)，得到的结合物与抗-DNP或抗-TNP-IgM发生沉淀形成十价的(decameric)结合物，对TNF结合位点的效价是10。
在再一实施方案中，还可产生含有截短的sTNFR的重组融合蛋白，其中每一重组嵌合分子含有sTNFR序列，如上所述，替换免疫球蛋白分子的轻链和重链的一个或两者的可变区，并含有人免疫球蛋白重链或轻链的全部或部分恒定区，但至少一个恒定区。例如，每一个这样的嵌合截短的sTNFR/IgG1融合蛋白可由两个嵌合基因产生：截短的sTNFR/人K轻链嵌合体(截短的sTNFR/CK)和截短的sTNFR/人γ-1重链嵌合体(截短的sTNFR/Cg-1)。随着两个嵌合基因的转录和翻译，如下所述，基因产物可排列成一个含呈二价截短的sTNFR的单一嵌合分子。
涉及这些嵌合分子构建的其余的细节在美国专利5,116,964中公开，PCT出版号WO 89/09622，PCT出版号WO91/16437和EP315062，其内容在此引入作为参考。
再进一步的实施方案，也可产生被含截短的sTNFR的重组融合蛋白，其中每一重组嵌合分子含一sTNFR序列，如上所述，至少有osteoprotegerin(OPG)的186-401区域的一部分，如欧洲专利申请号96309363.8中描述的那样。
                      多核苷酸
本发明还提供编码截短的sTNFRs多核苷酸。以本描述为基础，使用通用的密码子表，本领域一个普通的技巧能够很容易地确定编码截短的sTNFRs的所有核酸序列。目前优选的核酸序列包括那些编码sTNFR-I 2.6D/C105，sTNFR-I 2.6D/C106，sTNFR-I 2.6D/N105，sTNFR-I 2.3D/d8，sTNFR-I 2.3D/d18和sTNFR-I 2.3D/d15的多核苷酸。各种多核苷酸的实施例在图2，3，4，5，6和7中描述。
可以按下面公开的叙述进行的重组表达技术生产这些多核苷酸并表达编码的蛋白质。例如，通过将一编码截短的sTNFR的核酸序列插入到一合适的载体，本领域的技术人员可容易地生产出大量的目的核酸序列。这些序列之后被用作产生检测探针或扩增引物。或者，编码截短的sTNFR的多核苷酸能插入一表达载体。通过将表达载体引入合适的宿主就可大量产生想要的截短sTNFR。
其中进一步描述，可获得极多的宿主/载体系统用于目的核酸序列的增殖和/或截短的sTNFRs的生产。这些包括但不局限于质粒，病毒的和插入的载体及原核和真核宿主。本领域的技术人员可采用能够增殖或表达异源DNA的宿主/载体系统来产生或表达本发明的序列。
而且，本领域的技术人员应当理解，关于本发明的内容，新的核酸序列包括含有在图中发表的编码截短的sTNFRs的简并核酸序列和那些杂交(优选地在严格的杂交条件下)以互补于这些核酸序列的序列(Maniatis等(1982)，Molecular Cloning(实验室手册)冷泉港实验室，387-389页)。典型的严格的杂交条件是4×SSC在62-67℃进行杂交，在0.1×SCC，62-67℃漂洗约1小时。或者，典型的严格的杂交条件是在45％-55％甲酰胺，4×SSC 40-45℃进行。还包括在内的是在放宽的杂交条件下与公开在图1和9的核酸序列杂交的DNA序列，并且它编码截短的sTNFRs。这种严格程度放宽的杂交条件的实施例是4×SSC，45-45℃或在含30％-40％甲酰胺，于40-45℃下杂交。
本发明也提供了包含了载体DNA以及编码截短的sTNFRs的DNA序列的DNA构建物。在每个这样的DNA构建物中，编码截短的sTNFRs(有或无信号肽)的核酸序列与一合适的表达调控序列有效相连，这一调控序列在选择的宿主中引导复制和/或表达截短的sTNFRs。重组表达
多核苷酸的制备
编码截短的sTNFRs的核酸序列通过各种方法很容易地获得，这些方法包括，但不局限于，化学合成，cDNA或基因组文库筛选，表达文库筛选和/或cDNA的PCR扩增。这些和其它用于分离这种核酸序列的方法发表在Sambrook等Molecular Cloning：A laboratory Manual，冷泉港，纽约(1989)；Ausubel等编Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols Press，(1994)；Berger和Kimmel著，Methods inEnzymology：Guide to Molecular Cloning Teehniques，Vol.152，AcademicPerss，Inc.，San Diego，CA，(1987)，其内容在此引入作为参考。
编码截短的sTNFRs核酸序列的化学合成可用本领域中熟知的方法来完成。如Engels等发表的那些，Engels等(1989)，Angew Chem.Intl.Ed.，28：716-734及Wells等(1985)，Gene，34：315，其内容在此引入作为参考。这些方法包括，尤其是，核酸序列合成的亚磷酸三酯，亚磷酰胺和H-膦酸酯方法。大的核酸序列，例如那些长度大于100核苷酸，可分为几个片段合成。这些片段可连接到一起形成编码截短的sTNFRs的核酸序列。一个优选的方法是聚合物支持的合成，应用标准亚磷酰胺化学。
或者，可通过筛选适当的cDNA文库来获得合适的核酸序列，(即，来源于一个或多个认为表达此蛋白的组织制备的文库)或一个基因组文库(从全部基因组DNA制备的文库)。cDNA文库的来源典型的情况是来自任一物种的组织，此组织被认为表达适量的目的蛋白。基因组文库的来源可以是任何组织或者是来自任何哺乳动物或被认为包含编码截短的sTNFRs基因的其它物种的组织。
为了筛选看杂交基质中是否存在编码截短sTNFR的DNA，可以使用1个或多个核酸探针(寡核苷酸、cDNA或与cDNA或将要克隆的基因有可接受水平的同源性的基因组DNA片段)，探针会选择性地与文库中的cDNA(s)或基因(s)杂交。典型地用于这种筛选的探针编码与制备文库的物种相同或相似物种中的一小部分DNA序列。或者，如这里所讨论的，探针可以是简并的。
通过寡核苷酸探针与克隆的cDNA退火可典型地完成杂交。杂交在严格条件下进行，其可以阻止非特异性结合但允许与探针或引物具有显著水平同源性的克隆与之结合。典型的杂交和漂洗的严格条件部分取决于cDNA或寡核苷酸的大小(即核苷酸的长度)和探针是否简并。鉴定一个克隆的可能性也被考虑进杂交介质的设计中(例如，是否筛选一cDNA或基因组文库)。
一DNA片段(例如cDNA)被用作探针，典型的杂交条件包括那些公开于Ausubel等(1994)，编，上文。杂交后，杂交介质在一合适的严格条件下漂洗，严格的程度依赖于几个因素，例如，探针大小，探针与克隆期望的同源性，要筛选的杂交介质、筛选的克隆数等。严格的漂洗溶液的例子，一般离子强度低，在相对高的温度下应用如下所述：一个这样严格的漂洗是0.015M NaCl、0.005M柠檬酸钠和0.1％SPS在55-65℃；另一严格的漂洗是1mM Na2EDTA，40mM NaHPO4，pH 7.2和1％SDS在约40-50℃；另一个严格的漂洗是0.2×SSC和0.1％SDS在约50-65℃。
还有典型的严格漂洗的方案，寡核苷酸探针用于筛选杂交介质。例如，第一个方案用6×SSC，0.05％焦磷酸钠，温度在35-63℃，取决于探针的长度。例如，14个碱基的探针在35-40℃漂洗，17个碱基探针在45-50℃，20个碱基探针在52-57℃，23碱基探针在57-63℃。当背景非特异结合较高时，温度可升高2-3℃。第二方案使用氯化四甲胺(TMAC)漂洗。一个这样严格的漂洗溶液是3MTMAC，50mM Tris-HCl，pH 8.0和0.2％SDS。
获得一适当氨基酸序列的另一方法是多聚酶链式反应(PCR)。这一方法中，cDNA由poly(A)+RNA或总RNA使用反转录酶制备。两个引物典型地与编码截短的sTNFR的cDNA的两端互补，随后加入到cDNA和聚合酶，例如Taq聚合酶，则聚合酶扩增两引物之间的cDNA区。
选作探针或引物的寡核苷酸应该足够长，足够明确以减少可能发生在筛选或PCR扩增中的非特异结合。探针或引物的实际序列一般依赖于保守的或高同源性的序列或部位。任选的，探针或引物可全部或部分简并，即可包含探针/引物的混合物，均编码相同的氨基酸序列但利用不同的密码子。一个替代方案制备简并探针是将一个次黄嘌呤核苷放置在一些或全部随物种而改变的密码子位置上。寡核苷酸探针或引物通过DNA的化学合成方法制备，如上所述。
如上所述，变异体序列是天然(例如，一个等位的变异)或合成序列，包括一个或多个核苷酸的替换、缺失和/或插入正如图2，3，4，5，6和7中的序列，并导致比之于野生型氨基酸序列的氨基酸序列变异体的合成变异体序列的制备在本领域中众所周知，并已被描述，例如，Sambrook等的著述(1989)，如前述和Wells等(1985)，Gene，34：315，其发现其中引用作为参考。载体
编码截短的sTNFR的DNA可以插入到载体中以备进一步克隆(DNA的扩增)或表达。合适的载体可以从市场上买到，亦或专门构建。一个合适载体的筛选或构建将取决于(1)是否它将用于DNA扩增或DNA表达，(2)将要插入到载体的DNA的大小，以及(3)将要转化此载体的宿主菌。
这些载体每个包括一段核苷酸序列，该序列编码一个目的蛋白，此序列有效地连接到一个或多个如下的表达控制或调控序列，这些序列能够引导、控制或者影响用所选择的宿主细胞对一个目的蛋白的表达。每个载体包括不同的组分，决定于它的功能(DNA的扩增或DNA的表达)和它与所选用的宿主细胞的兼容性。载体组分通常包括但不局限于一或多个下列组分：一个信号序列，一个复制起点，一或多个选择或标记基因，启动子，增强子，一个转录终止序列或其类似物。这些组分可以从自然资源中获得或用已知方法合成。
合适的原核克隆载体的例子包括噬菌体例如λ衍生物，或来自大肠杆菌的质粒(如pBR322，colEl，pUC，F因子和Bluescript质粒衍生物)Stratagene，LaJolla，CA)。其他合适的表达载体其中无数类型是本领域人员知晓的，对如下所述的宿主细胞适用，也可用作其中之目的。信号序列
编码信号序列的核酸可插到编码截短的sTNFR序列的5′端，例如，它可以是一个载体的一个组分，或者可以是编码截短的sTNFR的核酸的一部分。编码sTNFR-I和sTNFR-II的天然信号序列的核酸是已知的(EP 393 438及EP 422 339)。复制起点
表达和克隆载体每者一般包括一个核酸序列，可使载体在所选择的一或多种宿主细胞中复制。在一个克隆载体中，此序列是一典型序列，可使载体独立于宿主染色体DNA而复制，还包括复制起点或自主复制序列。类似序列众所周知。自质粒pBR 322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，许多起点(例如，SV40，多形瘤，腺病毒，VSV或BPV)对哺乳动物细胞的克隆载体有用。一般而言，复制起点对哺乳动物表达载体而言并不必要(例如，SV40起点通常被用，仅仅因为它包含早期启动子)。选择基因
表达和克隆载体每个通常包含一个选择基因。此基因编码一个“标记”蛋白，此蛋白对生长于选择性培养基上的转化宿主细胞的存活和生长是必需的，未转化此载体的宿主细胞将不包含此选择基因，因此，它们将不会在此培养基上存活。典型选择基因编码的蛋白将(a)带有对抗生素或其他毒素，如，氨苄青霉素，新霉素，氨甲蝶呤或四环素的耐受性；(b)补充营养缺陷的不足或(c)提供不能自培养基获得的重要的营养。
其他选择性基因可用以扩增将要表达的基因。扩增是这样一种过程。其间的基因对生产一种对生长极其重要的蛋白来说，存在很大的需求，这些基因在相继几代的重组细胞的染色体中重复串联。哺乳动物细胞合适的选择性标记的例子包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸腺嘧啶核苷激酶。细胞转化子被放到选择压力之下，这种情况下仅有转化子由于载体中存在标记发生专一性地改变故而能存活。选择压力是这样施加的，把转化子细胞培养在这样的条件下：其中培养基中选择性药剂的浓度持续改变，因此导致选择性基因和编码截短的sTNFRs基因二者的扩增，作为结果，从扩增的DNA合成了数量增加的截短sTNFRs。
例如，用DHFR选择基因转化的细胞第一步的鉴定是把所有的转化子培养于含有氨甲蝶呤的培养基中，氨甲蝶呤是DHFR的竞争性拮抗剂，当用野生型DHFR时一个合适的宿主细胞是缺失DHFR活性的中国仓鼠卵巢细胞系(Urlaub和Chasin(1980)，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77 (7)：4216-4220，其内容在此引作参考)。转化细胞此启暴露于增高水平的氨甲蝶呤中。这导致多拷贝DHFR基因的合成，同时，也合成了表达载体中出现的其他DNA，例如编码截短的sTNFR的DNA。启动子
表达和克隆载体每个将典型地包含一个启动子，它被宿主微生物所识别，可操纵地连接到编码一个截短的sTNFR的核苷酸序列。启动子是一段位于结构基因的起始密码子(通常在约100～1000 bp)上游(5′)的不翻译序列，它控制一个特定核苷酸序列的转录和翻译，例如编码一个截短的sTNFR。启动子传统上可以归为两类当中之一，诱导型启动子和组成型启动子。当培养条件发生变化时，诸如存在或缺失一种营养或温度发生变化，诱导型启动子可针对这些变化发生反应，使其控制下的DNA转录水平增加，可被许多可能的宿主细胞识别的很大数量的启动子，已经众所周知。一个启动子可以可操纵地连接到编码一个截短sTNFR的DNA，方法是用限制性内切酶消化将启动子从源DNA中移出，而后将此目的启动子序列插入。天然的sTNFR-I启动子序列或sTNFR-II启动子序列可以用来指导编码截短sTNFR的DNA的扩增和/或表达。与天然启动子相比，如果异源启动子允许表达蛋白有更多的转录和更高的产量的话，且与所选择使用的宿主细胞系统相容，那么，优先选用异源启动子，例如，NGF/TNF的其他家族成员中任何一种天然启动子序列皆可用于指导编码截短sTNFR DNA的扩增和/或表达。
适合和原核宿主一起应用的启动子包括β-内酰胺和乳糖启动子系统；碱性磷酸酶，一个色氨酸(trp)启动子系统；细菌发光基因(luxR)系统和杂合启动子如tac启动子。其他已知的细菌启动子也适合，它们的核苷酸序列已经发表，因此使得本领域的技术人员可通过连接物或能提供所需要的任何酶切位点的接头将它们连到目的DNA序列。
与酵母宿主一起使用的合适的启动序列在本领域内也是众所周知的。与哺乳动物宿主细胞一起使用的合适启动子也是众所周知，包括那些从病毒基因组中获得者，例如多形瘤病毒，乌痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2)，牛乳头瘤病毒，乌肉瘤病毒，细胞肥大病毒，逆病毒，乙肝病毒，以及，最多提及的，猴病毒40(SV40)。其他合适的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如，热休克启动子和肌动蛋白启动子。增强子
表达和克隆载体每个通常都包含一个增强子序列，以增加较高级的真核细胞对编码截短的sTNFR的DNA序列的转录。增强子是DNA的顺式作用成分，长度通常为10～300 bp，作用于启动子以增加其转录。相对来说增强子是方向和位置非依赖性的。已发现它们可位于转录单位的5′及3′端。酵母增强子与酵母启动子合用比较有利。已知有许多增强子序列可从哺乳动物基因获得(例如，球蛋白，弹性蛋白酶，白蛋白，甲胎蛋白和胰岛素)。另外，病毒增强子例如SV40增强子，细胞肥大病毒早期启动基因增强子，多形瘤增强子和腺病毒增强子，是典型的激活真核细胞启动子的增强成分。当一个增强子可以拼接到载体中编码截短的sTNFR的DNA的5′或3′端的位置时，它通常被置于该启动子的5′的某个位置。转录终止子
真核宿主细胞中应用的表达载体每个通常都将包含一段对转录的终止和稳定mRNA必需的序列。类似序列通常可自真核DNAs或cDNAs的5′端、偶或3′端的未翻译区域中得到。这些区域包含的核苷酸片段，在编码截短的sTNFR的mRNA的不翻译部分被转录成多聚腺苷酸片段。载体构建
构建一个合适的载体，包含上述一或多种成分(包括编码截短的sTNFR的编码序列)的载体，可通过标准的连接技术完成。分离出的质粒或DNA片段被切割、剪切、按期望的顺序重新连接以产生所需要的载体。为了证实构建的序列正确，连接混合物可用以转化大肠杆菌，成功的转化子可通过上述已知的技术筛选。从转化子中得到的大量载体如此就可以制备出来，通过限制性内切核酸酶消化和/或序列分析以证实所期望构建的存在。
也可以用在哺乳动物细胞中瞬间表达编码截短的sTNFR DNA的载体。一般来说，瞬间表达包括应用能够在宿主细胞中有效复的表达载体，于是，宿主细胞积累了表达载体的许多拷贝，然后，合成表达载体编码的高水平的目的蛋白。每一种瞬时表达系统，包括一个合适的表达载体和一种宿主细胞，要考虑到克隆DNAs编码蛋白的方便的阳性鉴定，以及对这种蛋白所期望的生物学和生理学性质的快速甄别，即，鉴定一种生物学活性的截短sTNFR。宿主细胞
种种重组宿主细胞当中的任何一种，每一种都包含有一段核酸序列用以表达期望的蛋白质，这在本发明中也提供了。典型的原核和真核宿主细胞包括细菌的，哺乳动物的，真菌的，昆虫的，酵母的或植物的细胞。
原核宿主细胞包括但不局限于真细菌例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物(例如，大肠杆菌(HB101，DH5a，DH10和MC1061)；杆菌例如枯草杆菌；假单孢种，例如铜绿色假单孢菌；链霉菌类；鼠伤寒沙门氏菌；或粘质沙雷菌。作为一种特异的体现，期望的蛋白质可以在大肠杆菌中表达。
在原核宿主细胞之外，真核微生物例如丝状真菌或酵母可用作表达截短的sTNFRs的合适宿主。酿酒酵母，或普通的啤酒酵母，最常用于较低等的真核宿主微生物，但是许多其他属，种和株也是众所周知，垂手可得。
截短的sTNFR可以糖其化形式用一系列从多细胞生物衍化而来的合适的宿主细胞中的任何一种进行表达。这些宿主细胞能够进行复杂的处理过程以及具有糖基化作用活性。原则上，可以应用任何较高等的真核细胞培养物，不管这些培养物包括脊椎还是无脊椎动物细胞，也包括植物和昆虫细胞，作为一种特异的体现，目的蛋白也可以在杆状病毒细胞中表达。
脊椎动物细胞可以应用，由于脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖是一个众所周知的步骤。有用的哺乳动物宿主细胞系的例子包括但不局限于猴肾CVI细胞系用SV40(COS-7)转化者，人胚肾系(293细胞或293细胞亚克隆以生长于悬浮培养中)，婴儿仓鼠肾细胞和中国仓鼠卵巢细胞。其他合适的哺乳动物细胞系包括但不局限于Hela，鼠L-929细胞，Swiss衍化而来的3T3细胞系，Balb-c或NIH鼠，和BHK或HaK仓鼠细胞系。作为一种特异的体现，目的蛋白可以在COS细胞中表达。
宿主细胞可以在容许核酸表达的适宜条件下用目的核酸进行转染，当然更可取地是进行转化。选择合适的宿主细胞和方法进行转化，培养，扩增，筛选和产物生产及纯化在专业领域是众所周知的(Gething和Sambrook(1981)，自然，293.：620-625或，Kaufman等(1985)细胞分子生物学，5(7)：1750-1759，或美国专利号4,419,446，其内容在此引作参考)。例如，对没有细胞壁的哺乳动物细胞，可以用磷酸钙沉淀法。电穿孔，显微注射和其他已知技术也可以应用。
截短的sTNFRs也可能这样生产：通过同源重组，或通过用控制要素导入已经包含编码截短sTNFRs的DNA的细胞的重组产物技术。同源重组是样一种技术：起源于基因打靶以诱导或校正转录活性基因上的突变(Kucherlapati(1989)，核酸研究进展和分子生物学，36：301，其内容在此引作参考)。基本的技术被发展成一种将特定的突变导入哺乳动物基因组的特定区域的方法(Thomas等(1986)，细胞，44：419-428；Thomas和Capecchi(1987)，细胞，51：503-512和Doetschman等(1988)，国家自然科学进展，85：8583-8587，其内容在此引作参考)或去修正缺陷基因内部的特异突变(Doetschman等，(1987)，自然，330：576-578，其内容在此引作参考)。典型的技术在美国专利号5,272,071；WO 92/01069；WO 93/03183；WO 94/12650和WO 94/31560中有描述，其内容在此引作参考。
通过同源重组，插入基因组的DNA序列可以通过与靶向DNA相连而将其导向目的基因的特定区域，靶向DNA是与基因组DNA的区域互补(同源)的DNA。与基因组特定区域互补的小片段靶向DNA在DNA复制过程中与母体线段相接触。被插入细胞的DNA的一个共同性质是杂交，因而通过共同的同源区域与其他片段的内源DNA重组。如果此互补线段等包含有一个突变或一个不同的DNA序列的寡核苷酸相连，它也将作为重组的结果组合进新合成的线段内。作为校读功能的结果，新DNA序列有可能被当成模板。这样，转移的DNA就被整合进了基因组。
如果一个特定基因的序列已知，例如截短sTNFR的核酸序列，表达控制序列(一段互补到基因的选择性区域的DNA)可以合成或通过其他方式获得，例如通过对天然DNA在邻接目的区域的特异识别位点处进行适当的限制。此片段作为插入细胞的导向序列将会杂交到它在基因组中的同源区域。如此杂交发生在DNA复制期间。此DNA片段，以及连接其上的任何额外序列，将作为冈崎片段，将会反向缝合进新合成的子代DNA链中。
连接到这些靶向DNA片段的是可以与截短sTNFR的表达相互作用的DNA。例如，一个启动子/增强子，一个抑制子或一个外源的转录调节元素，插入到想要的宿主细胞的基因组中，在方向和远近上足以影响编码所需的截短sTNFR的DNA的转录。那些控制成分并不编码截短的sTNFR，但它控制出现于宿主细胞基因组中的一部分DNA。如此，截短sTNFR的表达并非通过编码截短sTNFR DNA的转染而达到，而是通过应用靶向DNA(包含目标内源基因的同源区域)与DNA调节片段的配对，此DNA调节片段提供带有转录截短的sTNFR的可识别信号的内源基因序列。培养宿主细胞
培养生产目的蛋白的一或多种重组宿主细胞的方法基于多种因素和多种考虑而变化；在给定条件下，对本领域的技术人员而言，理想的生产程序可通过最少的尝试而轻易获得。这些重组宿主细胞培养于合适的培养基中，然后通过本领域中的技术人员所知道的理想办法，表达的截短sTNFR选择性地自培养基中回收，分离和纯化(如果是细胞内表达，就从细胞中回收)。
特别地，每一种用于生产期望的截短sTNFR的重组细胞可培养于这样的培养基，适合于启动子的诱导，筛选合适的重组宿主细胞或扩增编码期望的截短sTNFR的基因。此培养基必须补充激素和/或其他生长因子(诸如胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子)，盐(诸如氯化钠，钙，镁和磷酸)，缓冲液(诸如HEPES)，核苷(如腺嘌呤和胸腺嘧啶)，抗生素(庆大霉素)，微量元素(定义为无机复合物，终浓度通常在μM范围)，及葡萄糖或另一种能源。也可以包括其他补充成分，以满意的浓度，这在本领域的技术人员获得满意结果。合适的培养条件，诸如温度，pH及类似条件，与所选择的宿主细胞一起应用，这对专业领域的技术人员来说也是众所周知的。
生成的表达产物然后可以用本专业所知的方法纯化至近乎均一。典型的纯化技术在EP 393 438和EP422 339中已有交待，其内容在此引作参考。药物组合物
药物组合物中每者通常包括有效治疗剂量的截短sTNFRs和截短sTNFRs的化学修饰衍生物(统称为，“截短的sTNFR产物”)另一种赋形剂相混合。赋形剂最好包括一或多种药剂学和生理学上可接受的制剂材料，和截短的sTNFR产物及释放控制物质相混合。
赋形剂中的初级溶剂在质地上可以是水溶性的或非水溶性的。另外，此胶囊可包含其他的药学上可接受的赋形剂以修饰或保持pH尽可能在5～6.5，更好是在5.5～6.0(例如，缓冲液如柠檬酸，磷酸和氨基酸如甘氨酸)；为冻干制剂使用的膨化试剂(例如甘露糖醇和甘氨酸)；渗透性(例如甘露糖醇和氯化钠)，表面活性剂(例如聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80，triton，及pluronics)，粘度；澄明度；颜色：无菌性；稳定性(例如蔗糖和山梨糖醇)；抗氧化剂(例如亚硫酸钠和氢化亚硫酸盐)；防腐剂(例如安息香酸和水杨酰基酸)；制剂的气味；调味和稀释剂；溶解率(例如溶剂和增溶剂如酒精，聚乙烯二醇和氯化钠)；释放速率；乳化剂；悬浮剂；溶剂；填充剂；传送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药学佐剂。其他有效的给药形式例如不经肠缓慢释放制剂，吸入性雾剂，口服活性制剂或者栓剂也在预想当中。其成分也可包括聚合成分的颗粒制剂例如块蚀型(bulk erosion)聚合物(例如，多聚(乳酸-乙二醇酸)(PLGA)共聚物，PLGA共聚体混合物，PEG，及乳酸和乙二醇酸的嵌段共聚物，多聚氰基丙烯酸酯)；表面腐蚀性聚合物(例如，多聚酐和多聚正酯)；水凝胶酯(例如普卢兰尼克多元醇，聚乙烯基乙醇，聚乙烯基吡咯烷酮，马来酐烷乙烯基醚共聚物，纤维素，透明质酸衍生物，藻酸盐，胶原，明胶，白蛋白，及淀粉和葡聚糖)及其组成系统；或脂质体或微球体制剂。这些组分可以影响该蛋白及其衍生物的物理状态，稳定性，体内释放效率和体内清除率。目标蛋白理想的药物制剂可按给药途径和所需剂量由本专业的技术人员决定。典型的药物组合物披露于Remington药学科学，18版(1990)，Mack出版公司，Easton，PA 18042，1435-1712页；Gombotz和Pettit(1995)，生物结合物化学，6：332-351；Leone-Bay，等(1995)，医药化学杂志，38：4263-4296；Haas，等，(1995)，临床免疫学和免疫病理学，76(1)：93：WO 94/06457；WO 94/21275；FR 2606772和WO 94/21235；其内容在此引作参考。
特异性的持续释放组分可从下述供应商获得：Depotech(PepofoamTM，一种多泡性脂质体)：Alkermes(ProleaseTM，一种PLGA微球体)。其中所应用的，透明质(hyaluronan)准备包括hyaluronan，透明质酸，它们的盐(例如透明质酸钠)，酯，醚，酶的衍生物和透明质酸的交联胶，以及透明质酸的化学交联衍生物(例如)例如hylan)。透明质(hyaluronan)的典型形式在Peyron和Balazs(1974)中有披露，病理生物学，22(8)：731-736；Isdale等(1991)，Drug Dev杂志，4(2)：93-99；Larsen等(1993)，生物医学材料研究杂志，27：1129-1134；Namiki等(1982)，临床药理学，治疗学和毒理学国际杂志，20(11)：501-507；Meyer等(1995)，控制释放导志，35：67-72；Kikuchi等(1996)，骨关节炎和软骨，4：99-100；Sakakibara等(1994)，临床矫形外科学和相关研究，299：282-292；Meyers和Brandt(1995)，22(9)：1732-1739；Laurent等(1995)，Acta Orthop Scand，66(266)：116-120；Cascone等(1995)，生物材料，16(7)；569-574；Yerashalmi等(1994)，生物化学和生物物理档案，313(2)：267-273；Bematchez等(1993)，生物医学材料研究杂志，27(5)：677-681；Tan等(1990)，澳大利亚生物技术杂志，4(1)：38-43；Gombotz和Pattit(1995)，生物结合物化学，6：332-351；美国专利号4,582,865，4,605,691，4,636,524，4,713,448，4,716,154，4,716,224，4,772,419，4,851,521，4,957,774，4,863,907，5,1 28,326，5,202,431，5,336,767，5,356,883；欧洲专利申请号0 507 604 A2和0 718 312 A2；和WO 96/05845，其内容在此引作参考。特异的hyaluronan组分可从下列供应商获得：BioMatrix，Inc.Ridgefreld，NS(SynViscTM，hylan液体和hylan凝胶90∶10混合物)；Fidia S.P.A.，Abano Terme，意大利(HyalganTM，公鸡冠衍生的透明质酸的钠盐(～500,000～～700,000MW))；Kaken药学公司，Ltd，东京，日本(ArtzTM，公鸡冠衍生的透明质酸的1％溶液，～700,000 MW))；Pharmacia AB，Stockholm，瑞典(HealonTM，一种公鸡冠来源的透明质酸，～4×106MW)；Genzyme公司，剑桥，MA(SurgicoatTM，一种重组透明质酸)；Pronova Biopolymer，Portsmouth公司，NH(透明质酸FCH，从兽疫链球菌培养物中制备的一种高分子量(例如，～1.5-2.2×106MW)透明质酸；透明质酸钠MV，-1.0-1.6×106MW和透明质酸钠LV，～1.5-2.2×106MW)；Calbiochem-Novabiochem AB，Lautelfingen，瑞士(透明质酸，钠盐(1997公司目录编号385908)，自链球菌制得)；Intergen公司，Purchase，NY(一种公鸡冠来源的透明质酸，＞1×106MW)；Diosynth公司，芝加哥，IL；Amerchol公司，Edison NJ和Kyowa Hakko Kogyo公司，Ltd，东京，日本。
一旦制备了药物组合物，它可以作为一种溶液、悬浮液，胶，乳剂，固体，或一种脱水或冻干的粉末贮存于无菌小玻璃瓶中。这些制剂可以以一种现成的形式或在给药前需要重新配制的形式(例如，冻干)贮存。
在一种具体的实施方案中，本发明被做成试剂盒以生产一种单一剂量的给药单位。每个试剂盒可包含两个容器，第一个容器有干蛋白，第二个容器有水剂。本发明的范围内包括的试剂盒是单腔和多腔预灌注的注射器；典型的预灌注注射器(例如，液体注射器，和溶解注射器例如Lyo-Ject，一个二腔预灌注液体注射器)可从德国Ravensburg的VatterGmbH公司获得。应用
截短的sTNFR产物可用作研究药剂和治疗及诊断试剂。如此，截短的sTNFRs可用于体外和/或体内的诊断分析以定量组织或器官样品中天然sTNFR-I或sTNFR-II的量，或含鉴定和/或分离表达TNF的细胞(Scallon等，(1995)，Supra)。在组织或器官的分析中，与125I-截短的sTNFRs的标准结合曲线相比，结合到TNF的125I-截短的sTNFRs将会有较低的放射活性，由于未标记的天然sTNFR-I或结合到TNF的sTNFR-I。同样地，125I-截短的sTNFRs可用以检测不同细胞类型中TNF的存在。
本发明也仔细考虑了截短sTNFR产物在生产抗体和合成抗体(尤其包括那些也结合到天然sTNFR-I或sTNFR-II)中的应用。可以发展结合到截短sTNFRs的抗体，例如结合到R1-[Cys19-Cys103]-R2氨基酸序列内部或R4-[Cys32-Cys103]-R5氨基酸序列内部表位。本专业的一个普通技巧，可用已发表的众所周知的方法去获得单克隆或多克隆抗体，或重组抗体，它们特异地识别和结合到本发明的氨基酸序列编码的不同蛋白质。这些抗体然后可以用来纯化和定性全长的，成熟的30kDa TNF抑制剂和全长的、成熟的40kDa TNF抑制剂。
本发明也涉及治疗由TNF介导的某些疾病和疾病状态(其中许多可定性为炎性疾病)的方法。一种疾病或疾病状态会被造看成是：TNF-介导疾病：，如果自发或试验性疾病与体液中或病灶邻近组织中或身体内显示的TNF水平升高相联系的话，下列两种状况也会被看成是TNF-介导的疾病：(1)一种疾病相关的病原学发现可通过注射TNF而在动物试验上模拟出来以及(2)该疾病的试验动物模型中诱导出的病原学可以通过用抑制TNF作用的试剂处理而得到抑制或消除。许多TNF-介导疾病满足这三种条件中的两种，其他的则满足所有三种条件。一系列非唯一性的TNF-介导疾病，以及伴随的有关后遗症和症状，每个都可参照本发明的方法处理，它们是成人呼吸窘迫综合征；恶病质/厌食症；癌(例如，白血病)；慢性疲劳综合征；移植物与组织相互排斥反应；过敏听觉；炎症性肠病；神经炎性疾病；局部缺血/再灌注损伤，包括大脑局部缺血(由于创伤，癫痫，出血或中风造成的大脑损伤，其中每一种都可导致神经变性)；糖尿病(例如，幼年起始的I型糖尿病)；多发性硬化症；视觉疾病；疼痛；胰腺炎；肺纤维化；风湿性疾病(例如风湿病样的关节炎，骨关节炎，幼年(风湿病样的)关节炎，阴性血清多发性关节炎，关节强硬性脊椎炎，莱特尔氏综合症和反应性关节炎，牛皮癣性关节炎，肠病性关节炎，多肌炎，皮肤肌炎，硬皮病，系统性硬化病，血管炎，大脑性血管炎，斯耶格伦氏病，风湿热，多软骨炎和多肌痛风湿和巨细胞动脉炎)；败血病休克；放射治疗的副反应；系统性红斑狼疮；聂下颌骨关节疾病；甲状腺炎和组织移植。
每种截短的sTNFR产物都可以用有效治疗剂量注射给病人，以治疗TNF-介导的疾病，如上所述，包括诸如风湿性疾病)例如，莱姆病，幼年(风湿样的)关节炎，骨关节炎，牛皮癣性关节炎，风湿病样关节炎和葡萄球菌-诱导的(“败血病性”)关节炎)。术语“病人”打算包括动物(例如，猫，狗和马)以及人。
一种截短的sTNFR产物可通过局部的，经肠或肠外的给药方式，包括，但并不局限于，静脉内的，肌肉内的，动脉内的，鞘内的，囊内的，眶内的，心内的，真皮内的，腹膜内的，经气管的，皮下的，表皮下的关节内的，被膜下的，蛛网膜下的脊柱内的，心室内的和胸骨内的注射和输注。一种截短的sTNFR产物也可以经口给药或经粘膜给药，也即，经鼻内，经舌下，自颊地或经直肠地进行系统性释放。
截短的sTNFR产物比较好的给药方式是通过关节内的，皮下的，肌肉内的或静脉内的注射。另外，截短的sTNFR产物可以经持续的灌注方式给药(例如，稳定的或间歇性的植入的或外在灌注流量调节装置)以在给药期间持续性地提供血液中截短sTNFR产物的理想水平。这是通过如下方式较好地完成的：持续性灌注，通过，例如，微泵诸如渗透性微泵。通过这些分法，可以保证药物的量保持在需要的水平，可以取血样，监测血流中的药物量。可从下列供应商买到多种泵，例如MiniMed公司，Sylmar，CA(例如MT507)和Alza公司，Palo Alto，(例如，Alzet渗透性泵，2MLI式样)。
其他形式的持续性或近持续性给药也在期望得到实践。例如，化学衍生物可导致该蛋白的持续释放形式，它在血流中有持续存在的效应，基于一种既定的剂量方案以可预计的量出现。
应用截短的sTNFR产物治疗TNF介导疾病的方式，已在欧洲专利申请567566中提出，其内容在此引作参考。TNF介导疾病包括一个关节的各种炎症状况(例如，骨关节炎，牛皮癣关节炎，风湿病样的关节炎)。举例来说，但并不局限于例子，在一具体的实施方案中，截短的sTNFR产物可经关节内给药以治疗风湿病样的关节炎和骨关节炎。举例来说，但并不局限于例子，在另一具体的实施方案中，截短的sTNFR产物可经皮下或肌肉内的给药以治疗风湿病样的关节炎，炎症性肠病，恶病质/厌食症或多发性硬化症。举例来说，但并不局限于例子，在再一具体的实施方案中，截短的sTNFR产物可以静脉内给药以治疗创伤、癫痫、出血或卒中引起的大脑损伤；或经心室内给药以治疗创伤引起的脑损伤。治疗关节炎的比较好的方式包括：(1)一种截短的sTNFR产物的单一性动脉内注射，如果需要定期地阻止或治疗关节炎的发作的话及(2)定期皮下注射一种截短的sTNFR产物。败血病性休克的起始治疗应该在上败血病或败血病的机会被诊断之后尽可能早地开始。例如，治疗可以在外科手术或一次事故或其他任何可能携带启动败血病性休克危险性的事件之后立即开始。治疗成人呼吸窘迫综合征的较好方式包括：(1)一种截短的sTNFR产物的单一或多次气管内给药和(2)一种截短的sTNFR产物的集合药团或持续性静脉内灌注。
在另一种实施方案当中，细胞治疗，例如，植入产生截短sTNFR的细胞，也是所期望的。本发明的此具体化当中可以包括将能合成和分泌一种生物活性形式的截短sTNFR的细胞植入病人体内。这些生产一种截短sTNFR的细胞可能是这样的细胞；它通常不生产截短的sTNFR，但已被修改来生产截短的sTNFR，或者是这样的细胞；其生产截短sTNFR的能力已通过适合截短的sTNFR表达和分泌的聚核苷酸的转化而得到了加强。为了使病人由于注射了别种截短sTNFR而可能产生的免疫学反应减到最小，较好的方法是细胞和病人属于同一物种(例如，人)或者细胞用可提供针对免疫识别的屏障的材料包裹，或者将细胞置入免疫赦免的解剖位点，例如睾丸，眼睛或中枢神经系统。
人或非人动物细胞置入生物相容性的，半通透性的聚合壳或膜以允许截短sTNFR的释放，但可阻止病人的免疫系统或邻近组织其他有害因素对细胞的破坏，这些细胞可以植入病人体内。另一种选择，病人自己的细胞，经过体外转化的生产截短的sTNFR，可不经过如此包裹而直接植入病人体内。膜包裹活细胞的方法学对专业领域内掌握了普通技巧的那些人来说是很熟悉的，制备包被细胞和将它们植入病人的工作可以完成。
在另外一种实施方案中，体内基因治疗也可以预想，该种情况下一种编码截短sTNFR的核酸序列被直接导入病人体内。例如，一种编码截短sTNFR的核酸序列通过局部注射一种核酸构建物，伴随或不伴随一种适当的传送载体，例如一种腺联合病毒载体，而导入靶细胞中。另外的病毒载体包括但不局限于转录病毒，腺病毒，单纯性疱疹病毒和乳头病毒载体。物理性转移的获得可通过体内局部注射希望的核酸构建物或其他包含希望的核酸序列的适当的传递载体，脂质体介导的转移，直接注射(裸DNA)，受体介导的转移(配基-DNA复合物)或微颗粒轰击(基因枪)。
典型的细胞和基因治疗技术揭示于美国专利号4,892,538；美国专利号5,011,472；美国专利号5,106,627；DE 4219626，WO 942/20517和96/22793，其内容在此引作参考。
不管给药的方式如何，TNF-介导疾病的治疗需要截短sTNFR的单个剂量或总体剂量的摄取足以有效地减少或缓和疾病的症状。决定适当剂量的其他因素可以包括将要治疗或防止的疾病或状况，疾病的严重性，给药的途径，以及年龄、性别和病人的医疗状况。决定适当剂量所必需的、对仔细分析结果的进一步精炼通常由专业领域的那些技术人员来做，尤其是在根据其中透露的分析所提供的剂量信息的帮助下。也可以通过与适当的剂量反应资料结合使用的确定剂量的已知分析方法来确定剂量。具体的剂量可依据病人近似的体重或体表面积进行计算。
给药的频率取决于配分中应用的截短sTNFR的药物动力学参数。截短的sTNFR可以一次性地给药，在病情严重或迁延的情况下，以较不常用的剂量每天给药或者给予一个最初的大剂量而后是持续剂量或持续释放。当为非肠道使用时，非肠道单位剂量，举例来说，每种可达10mg，通常达15mg，更常用的是20mg。如果注射到关节腔内，更倾向于将药物组分以单一性注射的形式给药。例如，包含一个剂量的3～10ml注射器，这一个剂量，举例而言，是溶解于等渗磷酸缓冲盐溶液的截短sTNFR，浓度在约5mg/ml到10mg/ml之间。该制剂可以如下频率注射到关节腔，举例而言，每7到10天一次。按此种方法进行，进行持续给药，例如，用4到5次，必要时剂量可以变化。
在一些情况下，截短的sTNFR产物可作为其他治疗的辅助措施，也可以和适合被处理的适应症的其他药物处方一起使用。截短的sTNFR产物可以和传统的或新的抗炎药物中的一种或多种分开或联合使用。
截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)可以和传统的或新的。抗炎药物中的一种或多种分开或联合使用。关于以下的组合物的信息可以在Merck诊断和治疗手册中找到，第十六版，Merck，Sharp及Dohme研究实验室，Merek及公司，Rahway，NJ(1992)及在药物设计中找到，PJB出版有限公司。
TNF介导疾病，如上所述，包括急性和慢性炎症，例如风湿性疾病(例如莱姆病，幼稚性(风湿病样的)关节炎，骨关节炎，牛皮癣关节炎，风湿病样的关节炎及葡萄球菌诱导的(“败血病性”关节炎)，这些疾病的现有治疗包括在分类上是非胸骨性，抗炎药物(NSAIDS)的一线药物，用以控制疼痛和炎症。二级治疗包括皮质类固醇，慢反应抗风湿性药物(SAARDs)或疾病修饰(DM)药物。
在一种具体的实施方案中，本发明涉及应用截短sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)以及NSAIDs中的一种或几种治疗如上所述的TNF介导疾病，包括急性和慢性炎症，例如风湿性疾病(例如莱姆病，幼稚性(风湿病样的)关节炎，骨关节炎，牛皮癣关节炎，风湿病样的关节炎和葡萄球菌诱导的(“败血病性”关节炎；及移植物与宿主间疾病。NSAIDs的抗炎作用，至少一部分，是依靠它对前列腺素合成的抑制作用(见Goodman和Gilman“治疗学的药理学基础，”MacMillan，第七版(1985))。NSAIDs按特性可划分为9组：(1)水杨酸衍生物；(2)丙酸衍生物；(3)乙酸衍生物；(4)灭酸衍生物；(5)羧酸衍生物；(6)丁酸衍生物；(7)奥昔康；(8)吡唑和(9)吡唑啉酮。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与一种或多种水杨酸衍生物，药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用。这些水杨酸衍生物，药物前体酯和其药理学上可接受的盐包括：乙酰氨基水杨酸苯酯，阿洛泼林，阿斯匹林，benorylate，溴水杨醇(bromosaligenin)，乙酰水杨酸钙，胆碱镁三水杨酸(cholinemagnesium trisalicylate)，二氟苯水杨酸，etersalate，fendosal，龙胆酸，水杨酸酰乙二醇，水杨酸酰咪唑，乙酰水杨酸赖氨酸，mesalamine，水杨酸酰吗啡，1-萘基水杨酸盐，olsalazine，parsalmide，苯基乙酰水杨酸盐，苯基水杨酸盐，Salacetamide，水杨酰胺O-乙酸，salsalabe和sulfasalazine。结构上相关的有类似的止痛和抗炎特性的水杨酸衍生物也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种二乙酮酸衍生物，药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前、治疗后或治疗中)联合应用。二乙酮酸衍生物、药物前体酯和其药理学上可接受的盐包括：阿明洛芬，苯噁洛芬，布氯酸，卡洛芬，右吲哚洛芬，非诺洛芬，氟诺洛芬，氟洛芬，氟比洛芬，呋洛芬，布洛芬，布洛芬铝盐，异丁普生，吲哚洛芬，异洛芬，酮洛芬，氯素洛芬，咪洛芬，萘普生，噁丙秦，吡酮洛芬，匹美辛洛芬，舒洛芬，噻洛芬酸和硫噁洛芬。结构上相关的有类似的止痛和抗炎特性的二乙酮酸衍生物也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种乙酸衍生物、药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前、治疗后或治疗中)联合应用。乙酸衍生物，药物前体酯及其药理学上可接受的盐包括：阿西美辛，阿氯芬酸，氨芬酸，丁苯羟酸，桂美辛，氯吡酸，地美辛，双氯芬酸钠，依托度酸，联苯乙酸，芬氯酸，苯克洛酸，芬克洛酸，芬替酸，呋罗芬酸，葡美辛，异丁芬酸，吲哚美辛，三苯唑酸，伊索克酸，氯那唑酸，甲嗪酸，奥沙美辛，奥平酸，吡美辛，丙谷美辛，舒林酸，他美辛，噻拉米特，硫平酸，托美丁，齐多美辛和佐美酸。结构上相关的有类似的止痛和抗炎特性的乙酸衍生物也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种灭酸衍生物、药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前、治疗后或治疗中)联合应用。灭酸衍生物，药物前体酯及其药理学上可接受的盐包括：恩芬那酸，依托芬那酯，氟芬那酸，异尼辛，甲氯芬那酯，甲氯芬那酯钠盐，美多芬那酸，甲芬那酸，尼氟灭酸，他尼氟酯，特罗芬那酯，托芬那酸和乌芬那酯。结构上相关的灭酸衍生物有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种羧酸衍生物、药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前、治疗后或治疗中)联合应用。羧酸衍生物、药物前体酯或其药理学上可接受的盐包括：环氯茚酸，二氟尼柳，氟苯柳、伊诺立定，酮咯酸和替诺立定。结构上相关的羧酸衍生物有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种丁酸衍生物、药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用。丁酸衍生物、药物前体酯或其药理学上可接受的盐包括：布马地家，布替布芬，芬布芬和联苯丁酸。结构上相关的羧酸衍生物有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种奥昔康、药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用。奥昔康、药物前体酯或其药理学上可接受的盐包括：屈噁昔康，依诺利康，伊索昔康，吡罗昔康，舒多昔康，替诺昔康和4-羟基-1，2-苯并噻嗪-1，1-二氧化物-4-(N-苯基)-羧酰胺。结构上相关的奥昔康衍生物有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种吡唑、药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用。吡唑衍生物、药物前体酯或其药理学上可接受的盐包括：二苯酰胺吡唑和甲嘧啶唑。结构上相关的吡唑衍生物有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种吡唑啉酮、药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用。吡唑啉酮、药物前体酯或其药理学上可接受的盐包括：炎爽痛(apazone)，炎爽痛(azapropazone)，苄哌立隆，非普拉宗，莫非布宗，吗拉宗，羟布宗，保泰松，哌布宗，异丙安替比林，雷米那酮，琥布宗和噻唑利诺布来宗。结构上相关的吡唑啉酮有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种如下的NSAIPS(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用。ε-乙酰氨基己酸，S-腺苷甲硫氨酸，3-氨基-4-羟基丁酸，阿米西群，阿尼扎芬，安曲非宁，苄达酸，苄达酸赖氨酸，苄达明，beprozin，溴哌莫，布可隆，丁苯唑酸，环丙喹宗，cloximate，达齐胺，地波沙美，地托米定，联苯吡胺，difenpyramide，difisalamine，双苯唑醇，依莫地宗，德奈替唑甲磺酸盐，芬氟咪唑，夫洛非宁，氟咪唑，氟尼辛，氟丙喹宗，fopirtoline，磷柳酸，呱粪柳，愈创蓝油烃，异尼辛，lefetamine HCl，来氟米特，洛非咪唑，氯替法唑，lysin clonixinate，美西拉宗，萘丁美酮，尼克吲哚，尼美舒利，奥左蛋白，奥帕诺辛，奥沙西罗，奥沙帕朵，端尼托林，哌立索唑，哌立索唑柠檬酸，哌福肟，piproxen，吡拉唑酸，吡非尼酮，普罗喹宗，普罗沙唑，thielavin B，替氟咪唑，替美加定，甲苯酰吡，托帕朵，tryptamid及那些被设计成公司编号如下的产品：480156S，AA861，AD1590，AFP802，AFP860，AI77B，AP504，AU8001，BPPC，BW540C，CHINOIN 127，CN100，EB382，EL508，F1044，FK-506，GV3658，ITF182，KCNTEI6090，KME4，LA2851，MR714，MR897，MY309，ONO3144，PR823，PV102，PV108，R830，RS2131，SCR152，SH440，SIR133，SPAS510，SQ27239，ST281，SY6001，TA60，TAI-901(4-苯甲酰基-1-阴丹羧酸)，TVX2706，U60257，UR2301和WY41770。结构上相关的NSAIDs有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种皮质类固醇，药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用以治疗TNF-介导疾病，如上所述，包括急性和慢性炎症例如风湿性疾病(例如，莱姆病，幼稚性(风湿病样的)关节炎，骨关节炎，牛皮癣关节炎，风湿病样的关节炎和葡萄球菌诱导的(“败血病性”关节炎)；及多发性硬化病。皮质类固醇，药物前体酯及其药理学上可接受的盐包括氢化考的松及从氢化考的松衍生而来的组合物，例如，21-乙酰氧基孕烯醇酮，阿氯米松，阿尔孕酮，安西萘德，倍氯米松，倍他米松，倍他米松戊酸酯，布地萘德，氯泼尼松，氯倍他索，氯倍他索丙酸酯，氯倍他松、氯倍他松丁酸酯，氯氟吐龙，氯地氢可松，皮质固醇，考的松，可的伐唑，地夫唑康，地萘德，去羟米松，地塞米松，二氟拉松，二氟可龙，二氟泼尼酯，甘草次酸，氟扎可特，氟氯萘德，氟地塞米松，特戊酸氟地塞米松，α去氟肤轻松，醋酸肤轻松(flucinoloneacetonide)，醋酸肤轻松(fluocinonoide)，氟轻松，丁基氟可丁，氟可龙，氟可龙已酸酯，二氟可龙戊酸酯，氟甲龙，醋酸甲氟龙，醋酸氟甲叉龙，氟强的松龙，丙酮缩氟氢羟龙，氟甲酰龙，氯氟松，卤米松，卤泼尼松乙酸酯，氢可松氨酯，氢化可的松，氢化可的松乙酸酯，氢化可的松丁酸酯，氢化可的松磷酸酯，氢化可的松21-钠琥珀酸酯，氢化可的松特丁醋酸酯，mazipredone，6α-甲-11β-羟孕酮，甲泼尼松，莫米松呋罗酯，帕拉米松，泼尼卡酯，泼尼松龙，21-diedryaminoacetate，泼尼松龙磷酸钠，泼尼松龙琥珀酸钠，泼尼松龙21-m-磺基苯甲酸钠，泼尼松龙21-硬酯酸甘醇酸钠，泼尼松龙特丁醋酸酯，泼尼松龙21-三甲基乙酸酯，泼尼松，prednival，泼尼立定，泼尼立定21-二乙基氨基乙酸酯，替可的松，曲安西龙，曲安萘德，苯曲安萘德和己曲安萘德。结构上相关的皮质类固醇有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种长效抗风湿药(SAARDs)或缓解疾病的抗风湿性药物(DMARDS)，药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前、治疗后或治疗中)联合应用，以治疗TNF-介导疾病，如上所述，包括急性和慢性炎症例如风湿性疾病(例如，莱姆病，幼稚性(风湿病样的)关节炎，骨关节炎，牛皮癣关节炎，风湿病样的关节炎和葡萄球菌诱导的(“败血病性”关节炎)；及多发性硬化病。SAARDs或DMARDS，药物前体酯及其药理学上可接受的盐包括：别铜硫脲钠，醋硫葡金，金硫葡萄糖，金硫乙酰苯胺，硫唑嘌呤，brequinar钠，布西拉明，3-亚金硫-2-丙醇-1-磺酸钙，苯丁酸氮芥，氯喹，氯丁扎利，喹磺铜二乙胺，环磷酰胺，环胞霉素，氨苯砜，15-去氧spergualin，双醋瑞因，葡糖胺，金盐(例如，环喹金盐，金硫代苹果酸钠，金硫代硫酸钠)，羟氯喹，羟基脲，酮保泰松，左咪唑，罗苯扎利，蜂毒肽，6-巯基嘌呤，氨甲蝶呤，咪唑立宾，mycophenolate mofetil，金硫乙酸钙，氮芥，D-青霉胺，吡啶并咪唑诸如SKNF86002和SB203580，雷帕霉素，巯基化合物，促胸腺生成素和长春新碱。结构上相关的ASSRDs或DMARDs有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种COX2抑制剂，其药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用，以治疗TNF-介导疾病。COX2抑制剂，药物前体酯或其药理学上可接受的盐的例子包括，例如，celecoxib。结构上相关的COX2抑制剂有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种抗菌剂，药物前体酯或其药理学上可接受的盐(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用，以治疗TNF-介导的疾病。如上所述，包括急性和慢性炎症。抗菌剂包括，例如氨苄西林，阿莫西林，金霉素，杆菌肽，头孢他啶，头孢曲松，头孢噻肟，cephachlor，头孢氨苄，头孢雷定，环丙贝特，克拉维酸，氯唑西林，双氯西林，红霉素，氟氯西林，庆大霉素，短杆菌肽，甲氧西林，新霉素，苯唑西林，盘尼西林及万古霉素。结构上相关的抗菌剂有类似的止痛和抗炎特性者也打算包括在此列。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任意一种或多种下述组合物(在治疗前、治疗后或治疗中)联合应用，以治疗TNF-介导的疾病。如上所述，包括急性或慢性炎症：粒细胞集落刺激因子；反应停；BN 50730；tenidap；E 5531；tiapafant PCA 4248；尼美舒利；panavir；咯利普兰；RP 73401；多肽T；MDL 201，449A；盐酸(1R，3S)-顺-1-[9-(2，6-二氨基嘌呤基)]-3-羟基-4-环戊烯；盐酸(1R，3R)-反-1-[9-(2，6-二氨基)嘌呤]-3-乙酸基环戊烷；(1R，3R)-反-1-(9-腺嘌呤基)-3-叠氮基环戊烯和(1R，3R)-反-1-(6-羟基-嘌呤-9-基)-3-叠氮基环戊烯。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与一种或多种另外的TNF抑制剂(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用，以治疗TNF-介导的疾病。如上所述，包括急性或慢性炎症。TNF抑制剂包括那些阻止TNF的体内合成或细胞外释放的组合物和蛋白，包括下述组合物。
另外的TNF抑制剂包括抗-TNF抗体(例如，MAK 195F Fab抗体(Holler等(1993)，关于骨髓移植中的细胞因子第一次国际专题讨论会，147；CDP 571抗-TNF单克隆抗体(Rankin等(1995)，英国风湿病学杂志，34：334-342，其内容在此引作参考)；BAY X 1351鼠抗-肿瘤坏死因子单克隆抗体(Kieft等(1995)，临床微生物学和感染疾病第7届欧洲会议，9，其内容在此引作参考)；CenTNF cA2抗-TNF单克隆抗体(Elliott等(1994)，Lancet，344：1125-1127和Elliott等(1994)，Lancet，344：1105-1110，其内容在此引作参考)。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与可溶性重组人Fas抗原或其重组版本(WO 96/20206和Mountz等，免疫学杂志，155：4829-4837；及EP 510691)(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用，其内容在此引作参考。WO 96/20206发现分泌的人Fas抗原(天然和重组的，包括一种Ig融合蛋白)，分离编码可溶性重组人Fas抗原基因的方法，在合适载体和细胞型中克隆该基团的方法，表达该基因以生产抑制剂的方法。EP 510691教给编码人Fas抗原的DNAs，包括可溶性Fas抗原，表达上述DNAs的载体，及用此载体转染的转化子。当肠外给药时，每种Fas抗原融合蛋白的剂量通常从1mg/kg到100mg/kg。
在一种具体实施方案中，本发明被演绎成将截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)与任何一种或多种白介素-1抑制剂(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用，以治疗TNF-介导的疾病，如上所述，包括急性和慢性炎症，诸如风湿性的疾病(例如，莱姆病，幼稚性(风湿病样的)关节炎，骨性关节炎，牛皮癣性关节炎，风湿病样的关节炎和葡萄球菌诱导的(“败血病性的”)关节炎)；创伤，癫痫，出血或卒中导致的脑损伤；及多发性硬化症，白介素1-抑制剂的种类包括白介素-1受体激动剂(任何能够特异性地抑制IL-1细胞受体的激活的组合物)例如IL-1ra，如下所述；抗-IL-1受体单克隆抗体(例如，EP 623674，其内容在此引作参考)；IL-1结合蛋白诸如可溶性IL-1受体(例如，U.S.P.5,492,888，U.S.P.5,488,032，U.S.P.5,464,937，U.S.P.5,319,071和U.S.P.5,180,812，其内容在此引作参考)；抗-IL-1单克隆抗体(例如，WO 9501997，WO 9402627，WO 9006371，U.S.P.4935343，EP 364778，EP 267611和EP 220063，其内容在此引作参考)；IL-1受体辅助蛋白，例如，WO 96/23067(其内容在此引作参考)及可以阻断IL-1的体内合成或细胞外释放的其他组合物和蛋白。
白介素-1受体激动剂(IL-1ra)是一种人蛋白，作为白介素-1的一种自然抑制剂。更好的受体激动剂，以及制备的方法和其使用方法，在U.S.专利号5,075,222中有叙述(在此处称为′222专利)；WO91/08285；WO 91/17184；AU 9173636；WO 92/16221；WO 93/21946；PCT国际申请号US 97/02131，它教给一种药物组合物，包括(a)有效量的控制释放聚合物(例如，透明质酸)和(b)有效量的IL-1ra；WO94/06457；WO 94/21275；FR 2706772；WO 94/21235；DE 4219626，WO94/20517；和WO 96/22793，其内容在此引作参考。那些蛋白包括糖基化及非糖基化的IL-1受体激动剂。
特别地，三种IL-1ra的优选形式(IL-1raα，IL-1raβ和IL-1rax)，每一种均衍生于同样的DNA编码序列，已在U.S专利号5,075,222中被Hannum等发现和描述过，题目是“白介素-1抑制剂”。此U.S.专利，其中指作′222专利，其内容在此引作参考。所有这三种白介素-1抑制剂拥有类似的功能和免疫学活性。生产IL-1抑制剂的方法，尤其是IL-1ras，也在′222专利中披露。一种披露的方法包括从人单核细胞中分离该抑制剂(在其中它们自然地生产)。第二种披露的方法包括分离编码IL-1ras的基因，在合适的载体和细胞类型中克隆此基因，表达此基因以生产IL-1ras和收获此IL-1ras。后一种方法，总体说来是典型的重组DNA方法，是本发明优先选择的方法。在一种具体应用中，作为在大肠杆菌中表达的结果一种IL-1ra包含一个N-末端甲硫氨酰基团。本发明也包括经修饰的IL-1ras。经修饰的IL-1ras包括，例如，这些抑制剂的突变蛋白中一个半胱氨酸残基取代了自然发生的抑制剂的氨基酸序列中一个或多个位点的氨基酸。然后这些突变蛋白质就可以位点选择性地与功能化的聚乙二醇(PEG)单位或其他含巯基聚醚反应以生成IL-1ra PEG种类。PCT公开号WO 92/16221披露了许多经修饰的IL-1ra种类和制造这些PEG修饰抑制剂的方法。
另外种类的白介素-1抑制剂包括能够特异性地阻遏IL-1细胞受体激活的组合物。这些组合物包括IL-1结合蛋白，例如可溶性受体和单克隆抗体。这些组合物也包括针对受体的单克隆抗体。
再一类的白介素-1抑制剂包括阻遏IL-1体内合成和/或细胞外释放的组合物和蛋白。这些组合物包括影响IL-1基因转录或IL-1前体蛋白加工过程的药剂。
以上是作为举例，并不排除与这些抗炎组合物同时使用的其他治疗方法，这些方法是专业领域的技术人员所知道的，或者是那些通过使用本说明书中阐述的指导可使专业领域的技术人员可达到的方法。
将另外的抗炎组合物作为组分配制到剂量单位形式中以利于给药和促进剂量的均匀性，这样做特别有利。其中所用的“剂量单位形式”指的是适合作为被治疗的哺乳动物对象的单元剂量的物质性的分散单元，每个单元包含预定数量的另外的抗炎组合物，其数量统经计数可与必需的药物载体一起以产生所期望的治疗效果。其中所用的“药理学上可接受的药物载体”包括任意和全部溶剂，胶体溶液介质，包被，抗细菌和抗真菌药物，等渗的和延迟吸收药物以及诸如此类的那些和活性成分，给药方式和制剂中的其他成分相容的、对接受者无害的药物。这些介质和试剂的应用在本专业是熟知的(例如，见，Remington药物科学，18版(1990)，Mack出版公司，Easton，PA18042，1435-1712页，其内容在此引作参考)。补充的活性成分也可以掺入到组合物中。
对口服治疗给药法，另外的抗炎组合物可以与赋形剂混合，用以下形式使用：吞服片剂，口腔含片，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮液，糖浆，糯米纸囊剂及诸如此类的形式，或者它也可以和特种饮食中的食物直接混合。该片剂，锭剂，丸剂、胶囊等等也可以包含如下成分：一种粘合剂诸如西黄蓍胶，阿拉伯胶，玉米淀粉或白明胶；赋形剂诸如磷酸二钙磷酸盐；一种分解试剂诸如玉米淀粉，藻酸等等；一种润滑剂诸如硬脂酸镁；一种增甜试剂诸如蔗糖，乳糖或糖精；或者一种调味试剂诸如薄荷，冬青油或樱桃或橙子调味香料。当此剂量单元形式是一种胶囊，它可以包含，在上述类型的材料之外，一种液体媒介物。许多其他材料可以作为一种包被存在或者另外修饰该产剂量单位的物理形式。举例来说，片剂，丸剂或胶囊可以用虫胶、糖或两者包被。当然，用以制备任何剂量单元形式的材料应该是药物纯的，且所使用的数量实际上是无毒的。另外，其余的抗炎组合物可以掺入到持久释放的制品和制剂中。在这样一种治疗上有用的组合中，另外的抗炎组合物的数量是以获得一种合适的剂量为宜。
对肠外治疗给药而言，其余的每种抗炎组合物可以和一种无菌的可注射溶液相混合。无菌的可注射溶液的制备，可将混在适当的药理学上可接受载体中的必需数量的其余抗炎组合物，与下述的(必需的)多种其他成分相混合，而后经过滤除菌。就分散来说，每者均可以通过将其他的抗炎组合物掺入一种无菌媒介物中以制备，这种无菌媒介物含有基本的分散介质及上述必需的其他成分。至于无菌的可注射溶液，每者均可以通过将一种其余的抗炎组合物的粉剂，任意选择性地与任何另外的期望组分相混合，该组分来自其预先无菌过滤溶液，其中的粉剂是通过任何合适的技术制备(例如，真空干燥和冻干)。
其余的抗炎组合物的具体剂量是根据病人的大概体重或体表面积来计算的。决定适当剂量的其他因素可包括将要治疗或预防的急性或慢性炎症性疾病或状态，疾病的严重程度，给药的途径，及患者的年龄，性别和医疗情况。确定治疗的适当剂量所必须的对包括上述每一个公式的计算结果所做的进一步提炼通常由本专业的技术人员来完成。联合应用已知的决定所用剂量的分析试验和适当的剂量反应数据也可以决定剂量。
如此，举例来说，筛选来治疗一种特别的急性或慢性炎性疾病诸如风湿性疾病(例如，莱姆病，幼稚性(风湿病样的)关节炎，骨关节炎，牛皮癣关节炎，风湿病样的关节炎和葡萄球菌诱导的(“败血病性”)关节炎)的其余的抗炎组合物的剂量可以变化以达到一种理想的治疗效果，这也在本发明的范围之内。其余的抗炎组合物中的一种有副反应，它可以在联合治疗的交替处理期用于患者。例如，慢性氨甲蝶呤治疗伴有胃肠的，肝的，骨髓的和肺的毒性(Sandoval等(1995)，英国风湿病学杂志，34：49-56，其内容在此引作参考)。
监测一种疾病的好转的检测可以包括特异性的检测，例如，针对炎症的系统反应的测定，包括红细胞沉降率(ESR)和急性期反应物(APR)。针对被累及的机体部分的肿胀等做了一系列观察。强直的改善，紧咬(grip)(在能适用的地方)，以及病人疼痛的缓解也受到观察。如果病人的状况稳定，他就会每周受到同一剂量的重复治疗，每周进行评估。假如病人的情况稳定，则治疗可以继续。治疗6个月以后，骨骼的解剖学变化用放射显影测定，例如用X线放射照相术。
在每一时期的末尾，病人被重复评估。治疗前和治疗后放射学评价的对比，ESR和APR表明了治疗的功效。根据治疗的功效和病人的情况，在治疗期间剂量可以增加或保持恒定。
更可取地，本发明是针对一种方法，可自由选择地，用下列组合中的一种，治疗或阻止一种急性或慢性炎症疾病和情况，如上所述，例如风湿性疾病(例如，莱姆病，幼稚性(风湿病样的)关节炎，骨关节炎，牛皮癣关节炎，风湿病样关节炎和葡萄球菌诱导的(“败血病性的”)关节炎)：一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)和氨甲蝶呤；一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)，氨甲蝶呤和一种IL-1抑制剂，最好是IL-lra；一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)和一种或多种氨甲蝶呤，一种免疫抑制剂(例如，环胞霉素)，环丙沙星，Fas抗原和一种IL-1抑制剂，最好是IL-1ra；一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)和氨甲蝶呤和一种免疫抑制剂(例如，环胞霉素)；一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)和氨甲蝶呤和环丙沙星；以及一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)和氨甲蝶呤和一种IL-1抑制剂，最好是IL-1ra；一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)和任意一种或多种氨甲蝶呤，水杨酸偶氮磺胺吡啶(sulphasazine)和羟氯喹；一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白)，氨甲蝶呤和羟氯喹；以及一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白，氨甲蝶呤和水杨酸偶氮磺胺吡啶(sulphasazine)。
在一种特别优选的实施方案中，其方法包括一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白，可自由选择性地配制到一种持久释放的制剂中(例如，hyaluronan))给药(例如，关节内的，皮下的或肌肉的，可自由选择性地(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用氨甲蝶呤和/或一种IL-1抑制剂(例如，IL-1ra)和/或可溶性板重组人Fas抗原以治疗风湿性疾病，如上所述(例如，莱姆病，幼稚性(风湿病样的)关节炎，骨关节炎，牛皮癣关节炎，风湿病样的关节炎和葡萄球菌诱导的(“败血病样的”)关节炎以及相关的症状。
在一种特别优选的实施方案中，其方法包括一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白，可自由选择性地配制到一种持久释放的制剂中(例如，hyaluronan))给药(例如，静脉内的或心室内的)，可自由选择性地(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用组织纤维蛋白原激活剂和/或一种IL-1抑制剂(例如，IL-1ra)以治疗创伤、癫痫、出血或卒中引起的大脑损伤，这几种病因可以导致神经变性。
在一种特别优选的实施方案中，其方法包括一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白，可自由选择性地配制到一种持久释放的制剂中(例如，hyaluronan))的给药，(例如，皮下的或肌肉内的)，可自由选择性地(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用一种或多种皮质类固醇，环胞霉素，FK-506，或一种干扰素(例如，α-干扰素，β-干扰素，γ-干扰素或后续干扰素)和/或IL-1ra以治疗多发性硬化症。
在一种特别优选的实施方案中，其方法包括一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白，可自由选择性地配制到一种持久释放的制剂中(例如，hyaluronan))的给药，(例如，皮下的或肌肉内的)，可自由选择性地(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用G-CSF和/或IL-lra以治疗炎症性肠病。
在一种特别优选的实施方案中，其方法包括一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白，可自由选择性地配制到一种持久释放的制剂中(例如，hyaluronan))的给药(例如，皮下的或肌内的)，可自由选择性地(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用leptin，MarinolTM或MegaceTM以治疗恶病质/成人厌食症。
在一种特别优选的实施方案中，其方法包括一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白，可自由选择性地配制到一种持久释放的制剂中(例如，hyaluronan))的给药(例如，皮下的或肌内的)，可自由选择性地(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用一种NSAID(例如，吲哚霉素)和/或一种IL-1抑制剂(例如，IL-1ra)以治疗阿尔茨海默氏病。
在一种特别优选的实施方案中，其方法包括一种截短的sTNFR产物(例如，R1-[Cys19-Cys103]-R2蛋白，可自由选择性地配制到一种持久释放的制剂中(例如，hyaluronan))的给药(例如，皮下的，静脉内的或鞘内的)，可自由选择性地(在治疗前，治疗后或治疗中)联合应用一种可溶性重组人Fas抗原以治疗肿瘤(例如，白血病)；糖尿病(例如，青少年起病型I型糖尿病)；移植物抗宿主反应；肝炎；局部缺血的/再灌注损伤，包括脑缺血(外伤，癫痫，出血或卒中引起的大脑损伤，其中每种均可以导致神经变性)；神经炎性疾病；风湿性疾病，如上所述(例如，莱姆病，幼稚性(风湿病样的)关节炎，骨关节炎，牛皮癣关节炎，风湿病样的关节炎及葡萄球菌诱导的(“败血病样的”)关节炎及组织移植。
本发明的其他方面和好处在考虑了下述作为例证的实施例之后将会被理解。
                    实施例
下列示例中描述的许多操作的标准方法或其它可用来替代的方法在常用的分子生物学手册中都可找到。例如Sambrook等的著述(1989)如前述，和Ausubel等的著述(1990)，如前述。为了读者阅读方便，用ml指毫升，L指升。实施例I：
下面这个例子叙述了多种形式的截短的可溶性的重组TNFR-I的生产过程。这些形式包括：NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FC-COOH(sTNFR-I 2.6D/C105)；NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.6D/C106)；NH2-MDSVCPQGKYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FN-COOH(sTNFR-I 2.6D/N105)；NH2-MYIHPQNNSIC-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I2.3D/d8)；NH2-M-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.3D/d18)和NH2-MSIS-[Cys19-Cys103]-FNCSL-COOH(sTNFR-I 2.3D/d15)。A.DNA的制备：1.sTNFR-I 2.6D/C106
以λ-gt 107 ctnfbp(EP 422339)上克隆的cDNA作模板，以下列寡核苷酸作引物，PCR扩增sTNFR-I 2.6D/C106。5′OLIGO#1：(SEQ ID NO：68)
5′GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCC AA-3′3′OLIGO#2：(SEQ ID NO：69)
5′CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3′
OLIGO#1和OLIGO#2编码NdelI和HindIII位点，并且分别与已截短基因的5′，3′端互补。PCR扩增过程如下：共25个循环，每个循环包括94℃30秒进行变性，55℃15秒退火，72℃1分钟延伸[2400型热循环仪(PE Cetus，Norwalk，CT)]。PCR产物用QIAquickTM PCR纯化试剂盒(QIAGEN，Chatsworth CA)按操作指南进行纯化。纯化的PCR产物用NdeI和HindIII消化，然后用QIAquickTM凝胶回收试剂盒(QIAGEN Chatsworth，CA)按试剂盒说明进行胶纯化。从凝胶中回收的PCR产物连于载体pAMG11(WO 95/26746)转化大肠杆菌FM15(ATCC 55765)。2.sTNFR-I 2.6D/C105
sTNFR-I 2.6D/C105的PCR扩增以sTNFR-I 2.6D/C106质粒DNA为模板，下列寡核苷酸为引物：
OLIGO#3：(SEQ ID.NO：70)
5′ACTCGA GGATCCGCGGATAAATAAGTAACGATCCGGT
CCA-3′
OLIGO#4：(SEQ ID.NO：71)
5′-CAGGTCGGATCCTATCAGCAGAAGCACTGGAAA
AGGTTTTC-3′
OLIGO#3和OLIGO#4编码BamHI和突变N(105)C，其后紧跟一个终止密码子。这两个寡核苷酸设计的目的在于沿整个模板延伸，引入新的BamHI位点以便连接。PCR扩增有35个循环；前10个循环，每个循环包括92℃10秒变性，55℃30退火，68℃4分钟延伸，后25个循环，每个循环包括92℃10秒变性，55℃30秒退火，4分钟加20秒68℃延伸[Model 2400 thermocycler(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)]。PCR产物用QIAquickTM Gel Extraction Kit(QIAGEN，Chatsworth，CA)进行胶纯化，操作过程如操作手册进行，用BamHI消化，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。然后重悬，连接到pAMG11，转化大肠杆菌FM15细胞。3.sTNFR-I 2.6D/N105
sTNFR-I 2.6D/N105的PCF扩增以sTNFR-I 2.6D/C106质粒DNA作模板，以下列寡核苷酸作引物：
5′OLIGO#5(SEQ ID NO：72)
5′-GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3′
3′OLIGO#6(SEQ ID NO：73)
5′-CGCGGATCCCTATTAATTGAAGCACTGGAAAAGG-3′
OLIGO#5和OLIGO#6编码NdeI和BamHI位点，分别与截短基因的5′，3′端相互补。PCR扩增包括30个循环，每个循环包括95℃45秒的变性，65℃1分钟退火，72℃2分钟延伸[Model 2400 thermocycler(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)]。
PCR产物用WizardTM DNA Clean-Up System(Promega，Madison，WI)进行纯化，操作按操作手册说明进行。纯化的PCR产物用NdeI和BamHI消化，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀。然后重悬，与pAMG11连接，转化大肠杆菌FM15细胞。
基于上述本发明的描述，本领域中有普通常识的人能够理解多种方法和材料可以适用或改编后用于在宿主细胞中表达(例如，大肠杆菌和其他细菌)。4.sTNFR 2.3D/d18，sTNFR-I 2.3D/d8和sTNFR-I 2.3D/d15
PCR扩增sTNFR-I 2.3D/d18，sTNFR-I 2.3D/d8和sTNFR-I 2.3D/d15均以2.6D/C106质粒DNA为模板，下述寡核苷酸作引物：sTNFR-I 2.3D/d8 PCR引物：5′OLIGO#7：(SEQ ID NO：74)
5′-CCCCATATGTATATCCACCCTCAAAATAAT-3′3′OLIGO#8：(SEQ ID NO：75)
5′-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3′sTNFR-I 2.3D/d15 PCR引物：5′-OLIGO#9(SEQ ID NO：76)
5′-CCCCATATGTCGATTAGCTGTACCAAGTGCCACAAAGG-3′3′-OLIGO#10(SEQ ID NO：77)
5′-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3′sTNFR-I 2.3D/d18 PCR引物：5′OLIGO#11(SEQ ID NO：78)
5′-CCCCATATGTGTACCAAGTGCCACAAAGGA-3′3′OLIGO#12(SEQ ID NO：79)
5′-CCCAAGCTTTTACAGAGAGCAATTGAAGCACTG-3′
OLIGO#7，OLIGO#9，和OLIGO#11均编码NdeI，OLIGO#8，OLIGO#10和OLIGO#12编码HindIII。PCR扩增25个循环；每个循环包括95℃，45秒变性，65℃1分钟退火，72℃2分钟延伸[Model2400 thermocycler(Perkin-Elmer Cetus，Norwalk，CT)]。PCR产物用WizardTM DNA Clean-Up System(Promega，Madison，WI)纯化，按操作手册操作。PCR纯化产物用NdeI和HindIII消化，酚/氯仿抽提后用乙醇沉淀。重悬，与pAMG11连接，转化大肠杆菌FM15细胞。B.在大肠杆菌中生产：
首先，按如下方法制备各目的重组克隆的新鲜培养物，将含sTNFR-I 2.6D/N105，sTNFR-I 2.6D/C105，sTNFR-I 2.6D/C106，sTNFR-I 2.3D/d18，sTNFR-I 2.3D/d8和sTNFR-I 2.3D/d15重组质粒的大肠杆菌冻存甘油菌种(1.5ml)接种于含500ml LB培养基的2L培养瓶中。37℃，旋转震荡器中350rpm震荡培养。菌体浓度通过OD660确定。当种子浓度培养至O.D.660＞2.0时，无菌分装上述125ml培养液于含10L无菌生长培养基的15L生产发酵罐中。
大规模发酵的批量培养基及发酵条件按照科罗拉多州立大学Sniff论文“一种重组蛋白在大肠杆菌中过量表达的化学限定培养基”的复杂培养基发酵条件进行。一般而言，该参考文献使用一种复合培养基，它含有酪蛋白水解物，盐，甘油，消泡剂，这些都在发酵罐中进行了无菌处理。当发酵罐温度降至40℃以下，加入过滤除菌的微量矿物元素和盐酸硫胺素。
培养基温度稳定于37℃后，接种种子培养物。生长状况通过测量OD660来监测。整体培养物的酸碱度通过自动添加5M NaOH和5M HCl维持在pH6.0。当OD660达到9.5-10.5时，加入灭菌的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，IPTG的终浓度为0.50mM。培养至菌体生长停滞然后收获菌体。
除下述几点外，培养基及培养条件见Sniff(1993)，如前所述，补加硫酸铵(2.0g/L)和L-半胱氨酸盐酸-水合物(1.0g/L)于培养基中；培养基中省去盐酸四环素；pH使用NaOH和HCl稳定于pH6.0而使用NaOH保持于pH7.0；培养温度升至37℃；诱导物浓度从0.15mM升至0.50mM IPG；收获的标准以生长停滞为基础，而非诱导时间。
发酵终点时，细菌在500ml瓶中离心收获。10000rpm离心30′，离心收集。收获的细胞沉淀按15％固体悬浮于裂解缓冲液中(50mMTris，5mM EOTA pH8.0)。悬浮细胞通过匀浆器(APV Gaulin，Inc.，Evretl，MA)8000 psi三次裂解细胞。匀浆物通过离心10000rpm，30分钟收集包涵体(IBs)。包涵体用裂解液重新悬浮，10000rpm，30分钟第三次离心。包涵体用去离子水(1∶1)悬浮进行第二次洗涤，10000rpm30分钟离心收集。每种蛋白洗后回收的包涵体可用于下一步的溶解，复性和纯化。每次操作可获得200-250g包涵体。
在一个替代的实施方案中，截短的sTNFR-I也可采用如下方法发酵：
首先按如下方法制备培养用新鲜种子培养物；接种含sTNFR-I2.6D/N105或sTNFR-I 2.6D/C106质粒重组克隆的甘油冻存菌种于含500ml10g/L BBL酵母提取物(pH7.0)的2L烧瓶中，33℃，300rpm振荡培养。培养物的浓度通过检测600nm(OD600)时的光吸收测定。当种子培养物浓度≥2.0(OD600)时，无菌操作转移80ml于含7L无菌培养基的15L生产用发酵罐中。
生产发酵使用了一种分批饲喂方法(a fedbatch process)。批量培养基是一种包括酵母提取物、盐、消泡剂的复合培养基，这些在发酵罐中进行灭菌。当发酵罐温度降至40℃以下后，加入滤膜除菌的微量矿物质，葡萄糖，硫酸镁，和六甲基磷酸(hexametaphosphate)。用了两次饲喂，第一次是含碳养料(葡萄糖/硫酸镁)，第二次是含酵母提取物的氮养料。
当批量培养基的温度稳定在33℃时，在培养基中接入种子培养物。生长状况通过OD600监测。培养基的酸碱度通过自动添加氢氧化铵和48.7％的柠檬酸维持在pH7.0左右。当OD600处于8.0至12.0时，饲养I开始，以对数饲养率开始增殖。当O.D.600位于30至40时，饲养2以稳定生长率开始。当O.D.600达到67-83时，无菌加入灭菌的自动诱导物(高丝氨酸内酯)至终浓度0.6mg/L对培养物进行诱导。饲养I和饲养II的生长速率在诱导后均达到稳定速率。培养物在诱导后16±2hr收获。
发酵终止时，细胞收集后离心用500ml瓶子分装。细胞在10,000rpm离心30分钟，沉积成小球状。收获的细胞按15％比例悬浮于裂解缓冲液中(50mM Tris，5mM EDTA，pH8.0)。悬浮的细胞通过匀浆器进行裂解(APV.Gaulin，Inc.，Everett.MA)(条件，8000 psi，三次)。匀浆物10000rpm离心30分钟收集包涵体(IBs)。包涵体重新用裂解液悬浮，进行洗涤，然后10000rpm再离心30分钟回收。包涵体按1∶1比例重悬于动离子水中进行第二次洗涤，然后10000rpm再离心30分钟，进行收集。回收，洗涤后的包涵体就可以进行溶解，重折叠和纯化了。C.溶解/重折叠
每10L发酵物收集的包涵体洗涤后溶解于800ml溶解缓冲液中(50mM Tris，8M尿素，160mM半胱氨酸，pH9.5)。溶解混和物的pH值用10N NaOH调至pH9.5，室温搅拌2-3小时。每次操作大约可生产200-250g包涵体。
每份溶解混合物按1∶20比例稀释于冷的复性缓冲液中(50mMTris，1.1M尿素)。每份最终体积约16升。然后每份混和物用6N HCl调pH至9.7，4℃缓慢搅拌2-3天。
然后每份混合物的pH值用冰醋酸和6N HCl调至5.0。每份混合物都会形成沉淀，10000g离心去除沉淀物(Beckman Model.J2-HS离心机)。然后每份制品过滤通过5μm和0.22μm的滤膜。D.纯化
重折叠后的样品用IX-1 SP-Sepharose Big BeadTM 柱(PharmaciaBiotech，Inc.，Piscataway，NJ)。进行柱纯化。IX-1 SP-Sepharose Big BendTM柱(4.4cm×20cm)
缓冲液A      缓冲液B
25mM乙酸     25nM乙酸
50mM NaCl    375mM NaCl
pH5.0        pH5.0
每批重折叠样品上样前要对柱子用4-5倍体积的缓冲液A进行平衡。重折叠的样品要分别上样进行纯化。每次上样，上样量勿超过12克蛋白/升树脂。每次上样前用3-4倍柱体积的缓冲液A洗柱子(至紫外吸收回到基线)。每次上样，使用8倍柱床体积线性上升梯度使NaCl浓度从50mM→375mM将蛋白洗脱下来。每次上样一个完整的蛋白峰收集在一起。蛋白峰从紫外吸收达到最大紫外吸收的20％时开始收集。当紫外吸收达到最大峰值的50％或吸收值不再降低，按二者之先达到者停止。
流速：  7.5cv/hr    平衡，洗
        15cv/hr.    上样
        6cv/hr      洗脱柱纯化在4℃进行。
每次的IX-1收集组分可在Toyo PearlTM Butyl 650M HIC柱(TosoHaas，Philadelphia，PA)进行纯化。300ml-Toyo Pearl ButylTM 650M柱(4.4cm×200cm)缓冲液A             稀释缓冲液    缓冲液B20mM NaPO4         40mM Na NaPO4 Milli Q H2O1.8M NaCl，pH6.0                   4M NaCl pH6.0
每份IX-1组分上样前柱子用4-5倍柱体积缓冲液A进行平衡。每份IX-1组分用稀释缓冲液按1∶1稀释，pH调至6.0。每次上样，将稀释的IX-1组分加样于柱上。每次上样，上样量每升树脂不超过10克蛋白。每次上样，柱子要用3倍柱体积的缓冲液洗涤。每次上样，柱子用8倍柱床体积盐浓度线性降低从1.8M NaCl到H2O将蛋白洗脱下来。每个蛋白峰从紫外吸收达到最大吸收峰的15％20％。开始收集。紫外吸收达到最大峰高50％紫外吸收不再降低，以二者之先达到者停止收集。
流速- 6cv/hr.  平衡，上样，洗柱.
      3cv/hr.  洗脱
每次柱纯化在室温进行。
每份HIC收集组分可进行浓缩/渗滤。浓缩/渗滤：(C/D〕
1平方英尺PLCCTM再生的纤维素截流量为500MW.的膜(Millipore，Bedford，MA)用于每份HIC组分的浓缩/渗滤。每份HIC组分浓缩至200ml，然后对6-7体积的20mM NaPO4 pH6.0进行渗滤，直至电导率＜4mm小时。
每步浓缩/渗滤在室温进行。
每份C/D收集物可用于IX-2-365ml与P-Sepharose HpTM柱(Pharmacia，Biotech，Inc.Piscataway，NJ)进行纯化。
IX-2-365 mL SP-Sepharose HPTM柱(5cm×18.5cm)
平衡缓冲液      缓冲液A         缓冲液B
20mM Na NaPO4 20mM NaPO4      20mM NaPO4
pH6.0         pH6.0 50mM NaCl   pH6.8
每份C/D收集组分上样前用4倍柱体积平衡缓冲液平衡。每份收集组分上样量不超过每升树脂8克蛋白。每次上样柱子要先用3倍柱床体积平衡缓冲液再用3倍柱体积缓冲液A进行洗涤。每次上样，蛋白洗脱要用8倍柱床体积线性梯度，pH梯度从6.3-6.8，盐梯度从0-50mM NaCl(缓冲液B)。峰的收集从峰的前侧达到1.0 O.D.时开始，峰的后侧达到最大峰值的50％停止收集。
在一种替代的实施方案中，截短的sTNFR-I可用下述方法溶解，重折叠和纯化：C.1溶解/重折叠：
洗涤后的包涵体用8M尿素，60mM Tris，100mM半胱氨酸溶解，使终浓度达到6.5M尿素，50mM Tris，80mM半胱氨酸，pH 9.4，5-10mg/ml截短sTNFR-I。(后者是基于以g/L为基础而确定以洗后的包涵体中截短sTNFR-I的量)。这份样品室温搅动90分钟，然后1∶10稀释于冷(4-8℃)0.85M尿素，50mM Tris，pH 9.8(pH测量于4-8℃进行)进行重折叠。
重折叠混合物4-8℃，搅拌24-72小时。结束时加入冰醋酸(～20mM)，调pH至5.0。形成的沉淀通过离心去除，上清保留上第一个柱子。D.1纯化
澄清的酸沉淀组分上样于已经用20mM醋酸钠，75mM NaCl，pH5.0缓冲液平衡的SP-Sepharose Big BeadTM柱(Pharmacia Biotech，Inc.，Piscataway，NJ)。这个柱子的上样量不超过15g突变sTNFR-I每升床体积。上样后，柱子用3倍体积的20 M醋酸钠，75mM NaCl，pH5.0缓冲液洗涤，用9倍柱床体积线性上升的盐梯度，即从75mM至450mMHaCl(20mM NaAc)洗脱。
整个SP-Sepharose Big BeadTM Column(SP-BB)步骤在4-8℃进行。SP-BB收集组分按1∶1比例稀释于含2M NaCl，60mM乙酸，pH4.5的缓冲液，如必要将pH调于4.5。稀释的SP-BB组分上样于已用1M NaCl，30mM乙酸pH4.5缓冲液平衡好的ToyopearlTM Butyl 650M柱(Toso Haas，Philadelphia，PA)。这个柱子的上样量约为10-13克截短的sTNFR-I每升床体积。上样后，柱子用3倍柱床体积的含1MHaCl，30mM乙酸，pH 4.5的缓冲液进行洗涤，用8倍柱床体积的线性下降梯度(NaCl 1M-0M，30mM乙酸，PH4.5)进行洗脱。
从Butyl 650M柱纯化的截短sTNFR-I部分收集后，用水按1∶5稀释，上样于已用30mM乙酸，pH4.5平衡好的SP-Sepharose HighPerformanceTM 柱(SP-HP)(Pharmacia Biotech，Inc.Pitscataway，NT)(上样量要小于15g/L柱床体积)。柱子用3倍体积30mM乙酸，pH4.5洗涤，用12倍柱床体积的线性梯度即从100mM到400mM的NaCl，30mM醋酸，pH 4.5进行洗脱。纯化的截短sTNFR-I收集，然后用NaOH调pH至5.0。C.PEG化：
1.sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)的制备
向一个冷(4℃)搅拌的sTNFR-2.6D/N105(3.5mg/mL 50mMNaAc.pH4)溶液中加入3倍摩尔过量的t-BuPEG(单一叔丁氧基聚乙二醇，平均分子量＝33kDa，Shearwater Polymers，Inc.)。加入NaCNBH3至终浓度20mM，反应混和物7℃，搅拌18-24小时。
整个反应过程中蛋白修饰程度可用SEC HPLC监测。使用TSKG 3000SWXL柱(Toso Haas，Montgomeryoille，PA)用0.1M磷酸钠，pH6.9，0.5MNaCl，10％乙醇0.7ml/min洗脱。(Toso Haas，Montgomeryville，PA)。
反应混合物pH值用1M HCl调至3.5左右，用水稀释至蛋白终浓度至1.5mg/ml。
sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)与剩余的t-BuPEG和其它反应副产物用SP Sepharose HP16/10TM离子交换层析进行分离(PharmaciaBiotech，Inc.，Piscafaway，NJ)。
反应混和物上样后，未反应的t-BuPEG用3倍柱体积的起始缓冲液A(20mM NaAc，pH4.0)洗脱掉。sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)用20倍柱体积线性梯度0-30％缓冲液B(1M NaCl于20mM乙酸中，pH4.0)洗脱下来。洗脱物在280nm处监测。每个含sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)的组分用SDS-PAGE 4-20％预装梯度胶(Novex，San，Diego.CA)进行分析。根据SDS-PAG分析结果，收集组分，浓缩，灭菌过滤。每份最终纯化sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG 33kDa收集物再用SDS-PAGE和SECHpLC分析。这种蛋白贮存于10mM磷酸钠，pH6.5和20mM NaCl中。
2.sTNFR-I 2.6D/N105-33kDa(Me PEG)的制备
向(7℃)边搅拌的冷sTNFR 2.6D/N105(4mg/ml)溶液中加入10％醋酸至pH5.0。向这溶液中加入15mM NaCNBH3和2-倍摩尔过量的叔丁氧基PEG(叔丁氧基)聚乙二醇，平均MW＝33kDa，Shearwater Polymers，Inc.)。在同一温度下稍微搅拌一下这个反应混和物，然后在该温度下孵育18小时。
18小时后，反应混和物中的蛋白浓度用柠檬酸调至pH3.0。
用SP Sepharose HPTM柱(Pharmacia Biotech，Inc.Piscataway，NJ)进行离子交换层析，将sTNFR-I 2.6D/N105-t-MePEG(33kDa)与剩余的MePEG和其他反应副产物分离开。
反应混和物上样(上样量不大于8mg/ml树脂)，未反应的MePEG用3倍柱体积的起始缓冲液A(20mM柠檬酸钠，pH3.0)洗脱。sTNFR-I 2.6D/1N05-t-MePEG(33kDa)用16倍柱体积线性上升梯度(NaCl0.1-0.5M于20mM柠檬酸溶液中，pH3.0)洗脱。洗脱液用280nM监测。每个含sTNFR-I 2.6D/N105-Me PEG(33kDa)的组分用4-20％预装梯度胶(Novex，San Diego，CA)进行SDS-PAGE分析。基于SDS-PAGE分析结果收集各组分，浓缩，无菌过滤。纯化的sTNFR-I2.6D/N105-t-MePEG(33kDa)的每一个最终收集组分再用SDS-PAGE分析。纯化的sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)浓缩至5-20mg/ml，然后溶解于PBS，pH6.5(10mM磷酸钠，35-100mM NaCl)或20mM乙酸，100mM NaCl，pH5.0。
3.sTNFR-I 2.6D/N105-t-Me PEG (20kDa)的制备。
除了MePEG(单-甲氧基-聚乙二醇，平均分子量＝20kDa，Shearwater Polymers，Inc.)代替了MePEG(单-甲氧基-聚乙二醇，平均分子量＝33kDa，Shearwater Polymers，Inc.)外本品制备相当部分与制备sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(33kDa)的步骤A的程序都相同。这种蛋白溶解于含10mM磷酸钠，pH6.5和20mM NaCl的缓冲液中。4.其他结合物的制备
sTNFR-I 2.6D/N105的其他结合物的制备除了使用下列类型的PEG醛(Shearwater Polymers，Inc.)之外，相当部分程序都和制备sTNFR-I2.6D/N105-MePEG(33kDa)相同。
直链单官能—MW 5kDa，6kDa和57kDa；
支链单官能—MW 10kDa，20kDa和40kDa；
直链双官能—MW 8kDa，20kDa；
支链三官能—MW 10kDa。
这些蛋白溶解于10mM磷酸钠，pH6.5，20mM NaCl。5.可选择的PEG化方法
在另一个实施方案中，截短的sTNFR-I分子可以用下列方法进行PEG修饰、纯化：
SP-HP洗脱物(3-5mg/ml，pH调至5.0)按2摩尔聚乙二醇(即MePEG或t-BuPEG)每摩尔sTNFR-I 2.6D/N105(～5克t-BuPEG/克sTNFR-I 2.6D/N105)比例进行反应。聚乙二醇溶解后，加入10～20mM碳酸氢钠，溶液于7-15℃孵育过夜。PEG反应结束时(约18小时)加入10mM甘氨酸终止反应。
PGE化混和物用4倍体积50mM，pH4.0醋酸稀释，如果必要调pH4.0的话，然后上样于已用pH4.0的50mM醋酸平衡好的SP-HP柱。上样量勿大于8g sTNFR-I 2.6D/N105/升柱床体积。上样后，柱子用3倍柱体积的平衡缓冲液洗涤，用0-0.3M NaCl(于50mM乙酸pH4.0中)的线性梯度进行洗脱。收集sTNFR-I 2.6D/N105-30kDa单PEG化组分，调pH至5.0，浓缩，超滤至等渗的制剂溶液中。所有纯化步骤都在室温进行。蛋白按制剂配置到PBS，pH6.5(10mM磷酸钠，35-100mMNaCl)或20mM乙酸，100mM NaCl，pH5.0中。6.sTNFR-I 2.6D/N105哑铃(dumbbell)和sTNFR-I 2.6D/N106哑铃的制备
砜活化的聚乙二醇[PEG-20，000-双-乙烯基砜](按美国专利申请No.08/473，809，1995年7月7日备案和美国专利申请No.08/611,918，1996年三月六日备案制备纯化)用于二聚化蛋白，这个方法除了还原条件和反应条件外大部分根据PCT出版物No.WO 95/34326进行。蛋白与PEG结合前先按摩尔DTT/摩尔蛋白的比例在5-6℃，pH7.6条件下进行还原反应。所有的反应体系均含有30％甘油。二聚化的蛋白称做sTNFR-I 2.6D/C105db和sTNFR-I 2.6D/C106db。每种蛋白按制剂配制剂PBS，pH6.5(10mM磷酸钠，35-100mM NaCl)或20mM醋酸，100mM NaCl pH5.0中。7.sTNFR-I对比分子的制备
(i).sTNFR-I 4D/N105如EP 422339所述进行制备。sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)通过sTNFR-I 4D/N105 PEG化制备，主要按照上述PEG化sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)的步骤进行。sTNFR-I 4D/N105-t-MePEG(33kDa)通过sTNFR-I 4D/N105 PEG化制备，主要参照上述sTNFR-I 2.6D/N105-t-MePEG(33kDa)PEG化的步骤进行。sTNFR-I 4D/C105和sTNFR-I 4D/C105db如PCT出版物No.WO95/34326所述进行制备。这种蛋白按制剂配制到10mM磷酸钠，pH6.5，20mM NaCl中。
(ii).sTNFR-I 4D/C105-33kDa-(MePEG)通过4D/C105 PEG化制备，主要按照上述PEG化sTNFR-I 2.6D/C105-33kDa-(MePEG)的方法进行，除了下述不同：反应条件如下，pH7.5，1.3 mol DTT/1mol sTNFR-I反应5-6小时，然后用SP-SepharoseTM FF柱子去除DTT，1.5-3摩PEG/摩尔蛋白PEG化室温反应至少15小时。蛋白按制剂配制到PBS，pH6.5[10mM磷酸钠，35-100mM NaCl)或20mM乙酸，100mM NaCl，pH5.0。
(iii).sTNFR-I 3D/N105(sTNFR-I 4D/N105 C端34aa平截物)如下制备。PCR扩增以sTNFR-I 4D/N105为模板，OLIGO#13和OLIGO#14(分别编码NdeI，HindII)分别与截短基因5′，3′端退火。PCR扩增25个循环；每个循环包括94℃30秒变性，60℃155秒退火，72℃1分钟延伸[Model 2400 thermocycler(PE Cetus，Norwalk，CT)]。PCR产物用QIAquickTMPCR纯化试剂盒(QIAGEN Chatsworth，CA)进行纯化。纯化的PCR产物用NdeI和HindIII酶切，然后用QIAquickTM胶纯化试剂盒(QIAGEN，Chatsworth，CA)从胶中回收。胶中分离的PCR产物连入pAMG11，转化大肠杆菌FM15细胞。5′OLIGO#13(SEQ ID NO：80)
5′GGTTAGCCATATGGACAGCGTTTGCCCCCAA-3′3′OLIGO#14(SEQ ID NO：81)
5′CCCAAGCTTTTAGGTGCACACGGTGTTCTGTTT-3′
这种蛋白按制剂配制到10mM磷酸钠，pH6.5，20mM NaCl中。
(iv).sTNFR-I 3D/C105(一种sTNFR-I 4D/C105 C端34aa平截物)的制备方法基本上与sTNFR-I 3D/N105相同，除了模板是sTNFR-I4D/C105。sTNFR-I 3D/C105按制剂配制到PBS，pH6.5(10mM磷酸钠，35-100mM NaCl)或20mM醋酸，100mM NaCl，pH5.0中。
(v).sTNFR-I 3D/C105db制备方法基本上与sTNFR-I 4D/C105db相同，除了以sTNFR-I 3D/C105代替sTNFR-I 4D/C105作为起始材料。sTNFR-I 3D/C105db按制剂配制到PBS，pH6.5(10mM磷酸钠，35-100mM NaCl)或20mM醋酸，100mM NaCl，pH5.0中。实施例II
评价了各种截短及重组形式的可溶性TNFR-I抑制TNF活性的能力。A.WEHI细胞毒性分析：
WEHI是一种体外细胞增殖分析方法。(Edwards等(1991)，Endocrinology.128：989-996)。细胞系对TNF-α敏感(也就是说，TNF-α是细胞毒性的)。在TNF-α抑制因子存在下，细胞可免受细胞毒效应影响并因此而能够增殖。方案：
TNF敏感的WEHI 164克隆13细胞(ATCC，Rockville，MD)，以20×104细胞/毫升浓度悬浮于补加5％FCS(胎牛血清)(Hyclone，Ogden，UT)、50U/ml青霉素及50mg/ml链霉素的RPMI培养基中(Gibco，Grand Island，NY)。在96孔细胞培养板的每个孔中加入100μl细胞悬液，可以使细胞在37℃、5％CO2下粘附4至6小时。于每孔中加入10μl 0.0060mg/ml放线菌素D(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。再于每孔中加入10μl 50ng/ml的重组人TNF-α(终浓度5ng/ml)。各种形式的sTNFR(sTNFR-I 2.6D/C106，sTNFR-I 4D/C105及sTNFR-I4D/C105db)用PBS连续2倍浓度稀释，然后加入重复孔中(10μ/孔)，该孔中包含加入重组人TNF-α后的粘附WEHI 164细胞。WEHI-164克隆13细胞在37℃，5％CO2下孵育18小时。之后加入2mg/ml的有机染料MTT四唑溶液10μl(3-[4.5-二甲基硫唑-2-基]2，5-二苯基四唑溴化物；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)，继续孵育4-6小时。细胞用50μl DMF/SDS溶液溶解(20％SDS和50％N，N-二甲基甲酰胺，pH4.7)。DMF/SDS溶液用吸管反复吹吸数次，直到全部的MTT晶体溶解。继续孵育细胞2-22小时，于570nm，Vmax读数器上测吸光率(abs)。特定细胞毒性百分率用以下公式，从吸光度中计算得来，该公式为％特定细胞毒性＝100％×[abs(细胞+培养基)-abs(细胞+样品)]/[abs(细胞+培养基)-abs(细胞+TX-100)]。每一样品中单位TNF量由以前所述的鼠源特定细胞毒性百分率标准来判断。
WEHI分析结果整理如下表2。
表2：WEHI分析之体外活性。
化合物                           IC50(ng/ml)
sTNFR-I 2.6D/C106                   208
sTNFR-I 4D/C105                     238
sTNFR-I 4D/C105db                   N/A
基于WEHI分析结果，就体外生物效能来讲，sTNFR-I 2.6D/C106与sTNFR-I 4D/C105间没有显著差别。B.L929细胞毒性分析：
L929细胞毒性分析是一种体外细胞增殖分析方法(Parmely等(1993)，J.Immunol.，151：389-396)，该方法也同样用来评价TNF-α敏感杀伤的细胞毒性。细胞系对TNF-α敏感(也就是说TNF-α是细胞毒性的)。在可溶性TNF-α抑制因子存在下，细胞可以被保护，免除细胞毒影响，并由此能够增殖。方案：
L929细胞系从American Type Culture Colection(目录号CCL 1，NCTC克隆929，鼠结缔组织，L株克隆)。用于传代的培养基为RPMI1640，补加10％胎牛血清(FBS)，1％Gln溶液，1％青霉素-链霉素溶液。
用96孔微量滴定板(Corning)进行分析，并且仅用内部60个孔。标准品和试验品于同一板上三次重复试验。
用于分析的TNFα来源于R & D系统(Minneapolis，MN)。在每一分析孔中TNFα终浓度为1ng/ml。
此分析中所用稀释液是L929生长培养基，加10ng/ml TNFα，10μg/ml放线菌长素D(Sigma，Chemical，Co.，St，Louis，MO)。
培养板用XTT/MEN溶液收获(1.5mg/ml XTT+75mM MEN)。
第一天，细胞种于分析板中。用胰酶消化制备细胞悬液，并以3.33×104细胞每毫升重悬浮。在分析板的内部60个孔中，每孔加入上述细胞悬液180μl。外部36孔中加入200μl生长培养基以避免分析中由于蒸发所造成的误差(artifacts)。该板避风，用箔纸覆盖，在室温下放置约1小时。后将板放入37±2℃，5±1％CO2，高湿度培养箱中。在加入sTNFR-I系列稀释液前培养约20-22小时。
第二天，准备sTNFR-I 4D/N105标准品及试验样品：将sTNFR-I4D/N105标准品及试验样品稀释到终浓度近似为2.0mg/ml(或其它合适浓度)。制备系列浓度稀释液，从1.0×106 ng/ml至1.0×10-3ng/ml梯度变化，共10个点。包括一个0 ng/ml点(仅为分析稀释)。如果其它浓度适合，也可以使用。加1000μl每种稀释液于三次重复的分析板中。当转移系列稀释部分到分析板中后，在37℃±2℃，5±1％CO2，高湿度培养箱中培养20±1小时。
第三天，在分析板内部60孔中，每孔加入XTT/MEN液50μl。继续培养24+0.5小时，培养条件为37±2℃，5±1％CO2，高湿度培养箱中(Falcon，New York，New Tork)。
第四天，于ELISA仪(ELISA板读数器)(Spectra MAX，BeckmanInstruments，Inc.，Fullerton，CA)上450nm减650nm测出O.D.值，如果板孔在此波长下读出4.000 O.D.值，则该板应立即重新于490nm减650nm之处读数。并且490nm减650nm所得数据将用于计算。
制作四参数增加对数曲线拟合剂量-反应对数标准曲线，从标准曲线中计算未知样品起始浓度，并计算标准的ED50以及标准曲线拟合的相关系数。结果：
L929细胞毒性分析结果整理于表3：
表3：体外L929细胞毒性活性分析：化合物                          浓度(mg/ml)  ED50(ng/ml)sTNFR-I 4D/C105db                    7.8       1.0±0.1sTNFR-I 2.6D/C105db                  2.6       1.1±0.0sTNFR-I 2.6D/C106db                  2.2       1.0±0.1sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)       2.0       229.2±8sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)       1.1       325.5±147sTNFR-I 2.6D/C105-t-BuPEG(33kDa)     1.7       210.2±9内部标准sTNFR-I 4D/C105                      3.5       314.8±188.1
以上数据表明，sTNFR-I 4D/C105db，sTNFR-I 2.6D/C105db及sTNFR-I 4D/C106db是有作用的，当与标准样品比较时具有可比的剂量反应性。以上数据也表明，sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)及sTNFR-I 2.6D/C105-t-BuPEG(33kDa)活性近乎低于2个对数值(Logs)但在本分析中，当与sTNFR-I 4D/C105db相比时，具有作用。栏(RUN)#2：
sTNFR-I 3D/C105db     0.2    2.27±0.3
sTNFR-I 3D/C105db     0.2    2.0*
sTNFR-I 3D/C105db     1.9    1.8*
sTNFR-I 3D/N105       2.4    413.3*
内部标准：
sTNFR-I 4D/C105       3.5    115.9±42.1
*示单一数据点
这些数据表明，sTNFR-I 3D/C105db是有作用的，ED50值在sTNFR-I 4D/C105db(栏#1)，sTNFR-I 2.6D/C105db(栏#1)、sTNFR-I2.6D/C106db(栏#1)内变动。以上数据也表明，与内部标准sTNFR-I4D/C105比，sTNFR-I 3D/N105活性低。C.链球菌的细胞壁诱导再活化模型：
大鼠关节炎链球菌细胞壁诱导再活化模型分析用已知方案完成(Esser等.(1985)，Arthritis And Rheumatism，28：1402-1411及Makarov等(1996)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：402-406)。方案：
雌性Lewis鼠(Charles River Laboratories，Inc.Wilmington，MA)，每只175到185克，于右踝关节以每一关节1.5mg/10mg剂量节间注射无菌的，包含肽聚糖-多糖(SCW)(Lee Laboratory，Grayson，GA)的链球菌细胞壁悬浮液，对侧关节注射盐水做为对照。节间注射SCW引起相对短时间的急性关节炎，其关节肿胀高峰期在注射后1到2天。在以后的20天内，急性炎性反应缓解，SCW再次以200mg/200ml每只的剂量静脉注射。第二次的SCW剂量足以再次活化第一次注射踝关节时引起的炎症反应，且对盐水注射的踝关节影响微小。评价静脉内注射SCW后72小时期内炎性反应的程度，用踝测经器，在炎性反应重活化后0、24、36、48及72小时测量了后部踝关节直径，收取对侧后肢做组织学研究。(例如，炎症，血管翳结构，软骨损伤及骨损伤)。结果：
当注射后，测试了在关节炎再活化期间的关节进行性肿胀时sTNFR-I 2.6D/C106db的效应。在注射SCW再活化关节炎前24小时分别单次静脉内注射抑制剂或赋形剂。
通过对再活化后第二天及第三天所有4种剂量及第一天除外一种剂量(1.5mg/kg)的所有剂量进行方差分析Fisher's post-hoc检验(Statview)，sTNFR-I 2.6D/C106db显示出在减轻关节肿胀方面具有统计学显著性功效。这种肿胀减轻比得上阳性对照，阳性对照为从再活化前一天开始以0.5mg/kg每天也就是8，8nM剂量注射sTNFR-I4D/C105db到再活化后3天。当从整体上考虑三天的肿胀数量，sTNFRs也显示了显著效能(性)。曲线下面积(AUC)在所有给药剂量下都显示了一种剂量-响应关系。(见图9，其中sTNFR-I 2.6D/C106db表示为“sTNFR-I 2.6D”，sTNFR-I 4D/C105db表示为“sTNFR-I 4D”)。
在模型中，当与疾病对照组比较，sTNFR-I 2.6D/N105-t-BupEG(33kDa)可使踝关节宽度及组织学指数显著减少。D.D-半乳糖胺/脂多糖模型：
D-半乳糖胺(D-GalNH2)/脂多糖(LPS)模型(Parmely等(1993)，如前所述)，是一种活体内，对TNF-α高依赖性的动物致死率模型。另外，MRL-lpr/lpr自身免疫鼠已被证明对LPS-或SEB-诱导的TNF-α极度敏感。(Mountz等(1995)，J.Immunol.，155：4829-4837)。方案：
禁食过夜，6-8周龄雌性MRL-lpr/lpr鼠(Jackson Laboratoru，BarHarbor，ME)，用以下药理学试剂接受I.P.动员(Challenge)，试剂包括：25mg D-GalNH2(Sigma Chemical Co.，St，Louis，MO)溶于Hank’s平衡盐溶液中，(Gibco Laboratories，Inc.，Grand Island，NY)(50mg/ml)；从大肠杆菌(E.coli)血清型0127：B8(Sigma Chemical Co.，St，Louis，M0)所获LPS溶于灭菌，去除内毒素的磷酸盐缓冲液(PBS)(25mg/鼠)或SEB(Toxin Technologies，Sarasota，FL)于正常盐溶液中(50mg/鼠)。制备各种形式的sTNFR系列2-倍稀释液(mg/kg剂量)以便用MacIntosh(Statview)统计软件获得ED50曲线。致死性在动员后48小时产生。结果：
如下表4所示，当sTNFR-I 2.6D/C106db如上所述给予，LPS/DGalNH2动员前1小时，ED50(也就是，50％保护所需要的sTNFR-I 2.6D/C106db剂量)在48小时约为50μg/kg(N＝8只鼠)。此种形式与sTNFR-I 4D/C105db比较在阻止致死率(ED50≈50μg/kg；N＝8只鼠)方面无显著差异(p＞0.05)。表4：LPS/DGalNH2模型中sTNFR及最适sTNFR截短形式比较：试剂                                 ED100            ED50sTNFR-I 4D/C105db                 ～100μg/kg       ～50μg/kgsTNFR-I 2.6D/C106db               ～100μg/kg       ～50μg/kgsTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)  ～2mg/kg          ～400μg/kgsTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kDa)    ～800-1000μg/kg  ～1mg/kgsTNFR-I 2.6D/N105-MePEG             2mg/kg          ～1-1.5mg/kg
             (20kDa支链)sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG             1.5mg/kg        ～1mg/kg
             (40kDa支链)
表中数据表明，sTNFR-I 2.6D/C106db与sTNFR-I 4D/C105db比较，有相同活性，但在本模型中，sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)活性很小，其ED50为约400μg/kg(n＝5只鼠)。另外，在本模型中，sTNFR-I 2.6D/N105-MePEG(20kDa)及2.6D/N105-MePEG(40kDa支链)活性很小。E.佐剂诱导关节炎模型：
佐剂诱导的大鼠风湿病样关节炎风湿病样关节炎有许多相似性。本实验目的是证明全身给予各种截短的sTNFRs在佐剂诱导的鼠关节炎发病机理中有缓和效果。方案：
雄性lewis鼠(5-7只/组)(Charles River Laboratories，Inc.，Wilmington，MA)至少重200克，用SQ导管插套管并让其恢复几天，在用盐水灌注前放入灌注笼中适应一周。
第0天，所有鼠均注射100μl费氏完全佐剂(Sigma Chemical Co.，St，Louis，MO)，在佐剂中加入合成的N，N-二辛基癸基癸基-N′，N-双(2-羟基-乙基)丙烷二胺50mg/ml。第8天，不同组鼠通过连续SQ灌注给予sTNFR-I 4D/C105及sTNFR-I 2.6D/N105，结果示于表5。
表5：佐剂诱导关节炎化合物             剂量    曲线下面积    爪重        炎症        骨反应
                         (AUC)                 组织病理学  (Bone Res.)
            (mg/kg/hr) (％抑制率)  (％抑制率)  (％抑制率)   (％抑制率)研究#1sTNFR-I 4D/C105     5          61         46           37           89
                1          49         45           26           855
                0.2        33         40           14           34sTNFR-I 2.6D/N105   1          55         53           33           51研究#2sTNFR-I 2.6D/N105   5          42         ND           19           67
                1          38         ND           13           49研究#3sTNFR-I 2.6D/N105-  9          50         40           13           27MePEG(20kDa)        3          35         34           9            22
                1          36         30           0            0sTNFR-I 2.6D/N105-  9          43         37MePEG(33kDa)        3          38         33
                1          24         20
出人意料地，尽管sTNFR-I 4D/C105db在WEHI-164及L929体外细胞毒性分析，以及LPS/GaLNH2模型分析中具有相当潜在活性。但在抗佐剂诱导的Lewis关节炎鼠的关节炎活性中，sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)及sTNFR-I 4D/C105db具有可比性。F.胶原诱导的关节炎模型：
II型胶原诱导的鼠关节炎模型与人类风湿病样关节炎有很多相似性。本实验的目的是证明全身给予各种截短的sTNFRs在II型胶原诱导的大鼠及小鼠关节炎发病机理中具有减缓效果。大鼠方案：
雌性Lewis大鼠(Charles River Laboratories，Inc.，Wilmington，MA)植入SQ导管并对连续灌注的束缚予以适应。随之用含牛II型胶原的弗氏不完全佐剂免疫，在免疫后的第13，14，15天，已诱导出关节炎的鼠随机以8只每组分成若干组。试验组灌注赋形剂(vehicle)或如表6所述的各种剂量sTNFR-I7天。爪炎性通过每天用测经器测量踝关节评价。第7天，动物无痛处死(euthanized)，收集瓜并测重量作为炎性指数，收集踝及膝关节作关节炎参数的组织病理学评价。
结果列于表6A。表6A：胶原诱导关节炎化合物                  剂量      曲线下面积    爪重       炎症      骨反应
                                 (AUC)               组织病理学
                  (mg/kg/hr)   (％抑制率) (％抑制率) (％抑制率) (％抑制率)研究#1sTNFR-I 4D/C105           5            65        81          ND         ND
                      1            35        34          ND         ND
                      0.2          19        22          ND         NDsTNFR-I 2.6D/N105         1            39        41          ND         ND研究#2                (mg/kg/day)sTNFR-I 2.6D/N105-        3            50        60          76         46MePEG(33kDa)sTNFR-I 4D/N105-          3            47        50          ND         NDMePEG(33kDa)研究#3                (mg/kg/day)sTNFR-I 2.6D/N105-        9            25        44          ND         NDMePEG(33kDa)sTNFR-I 2.6D/N105-        3            25        37          ND         NDMePEG(33kDa)sTNFR-I 2.6D/N105-        9            35        52          ND         NDMePEG(20kDa)sTNFR-I 2.6D/N105-        3            35        37          ND         NDMePEG(20kDa)
令人感兴趣的是，对建立的鼠胶原模型，所有处理组效能(efficacy)几乎一样(例如，曲线形状，AUC抑制百分率、在30-50％范围内变动，爪重量抑制率变化范围为40-64％)。在这一模型中，未处理组在统计学上比其它任何关节炎模型都具差异。小鼠方案：
雄性DBA/1小鼠(Jackson Laboratories，Inc.，Bar Harbor，ME)用含有牛II型胶原(Sigma Chemical Co.，St，Louis，MO)的弗氏不完全佐剂免疫。在免疫后第24，25，26天，已建立起关节炎的小鼠随机每8只一组分成若干组。试验组通过IP路线连续3天(第+27，+28，+29天)每天2次给予盐水或sTNFR-I 2.6D/N105 MePEG(33kDa)。爪炎性通过测经器每天测量踝关节评价。在第34天，动物无痛处死。收集爪并测重量作为炎症指标，收集踝及膝关节作关节炎参数的组织病理学评价。
结果列于表6B中。
表6B：胶原诱导关节炎化合物                      剂量      曲线下面积      总计
                                       (AUC)      组织病理学
                        (mg/kg/2D)   (％抑制率)   (％抑制率)研究#1sTNFR-I 4D/C105db              5            49          39sTNFR-I 2.6D/N105-t-           3            63          55
  MePEG(33kDa)研究#2sTNFR-I 2.6D/N105-             9            73          ND
MePEG(33kDa)sTNFR-I 2.6D/N105-             3            75          ND
MePEG(33kDa)G.LPS诱导TNF-α产生的连续灌注大鼠模型：
根据使用手册指导，于鼠IV颈静脉植入AlzetTM微泵(Alza Corp.，Palo Alto，CA)，并连续给鼠灌注sTNFR-I 2.6D/C105db，sTNFR-I2.6D/C106db，sTNFR-I 2.6D/N105及sTNFR-I 4D/N105 48小时(1mg/kg)。用ELISA(Genzyme，Cambridge，MA)检测血清TNF-α水平，经2小时高剂量LPS攻击后与对照相比显著下降。实施例III：免疫原性研究
在许多动物模型中，评价了各种截短、重组的可溶性TNFR-I形式的免疫原性。A.啮齿动物：
在实验第1及第5天，对雌性Sprague Dawley大鼠(Charles RiversLabs，Wilmington，MA)(n＝6-8/组)经皮下注射sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)及sTNFR-I 4D/C105db(对照)4mg/kg体重。从起始注射后21天内，每周一次收集眼眶后血样本，样本用于检测IgM及IgG抗体的产生。表7：啮齿动物免疫原性时间[天]           0.01     7        14       21组+动物#          效价IgM  效价IgM  效价IgM  效价IgMsTNFR-I 2.6D/N105-33kDa PEG1                   NEG     0        0        02                   NEG     0        0        03                   NEG     0        0        04                    NEG    0        0        06                   NEG     0        0        0sTNFR-I 2.6D/N105-t-0       0.00     0.00     0.00BuPEG(33kDa)SEM                 0       0.00     0.00     0.00对照7                   0       0        50       08                   0       0        50       03                   0       0        100      09                   0       0        0        010                  0       0        100      5011                  0       0        100      012                  0       0        100      013                  0       0        0        0对照                0       0        62.5     6.3SEM                 0       0        15.7     6.3
时间[天]           0.01     7        14       21
组+动物#          效价IgM  效价IgM  效价IgM  效价IgM
sTNFR-I 2.6D/N105-t-
BuPEG(33kDa)
1                   NEG      NEG      0        0
2                   NEG      NEG      0        0
3                   NEG      NEG      0        0
4                   NEG      NEG      0        0
6                   NEG      NEG      0        0
sTNFR-I 2.6D/N105-t-0.00     0.00     0.00     0.00
BuPEG(33kDa)
SEM                 0.00     0.00     0.00     0.00
对照
7                   NEG      NEG      0        200
8                   NEG      NEG      0        200
9                   NEG      NEG      0        0
10                  NEG      NEG      0
11                  NEG      NEG      200      400
12                  NEG      NEG      0        200
13                  NEG      NEG      200      800
14                  NEG      NEG      0        50
对照                0        0        50       231.3
SEM                 0        0        32.7     94.0
如表7所见，第1及5天，经皮下注射(SC)sTNFR-I 4D/C105 db后。经过21天比sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)记录到较高的鼠抗-sTNFR-I IgG抗体效价，而sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)即使有一些，也是非常弱小抗体效价。相同的免疫性趋势也在经过21天的鼠进行性鼠抗-sTNFR-I IgM抗体中发生。经21天，sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)不产生鼠抗sTNFR-I IgM抗体。B.狒狒(Papio anubis)：
本研究第1部分A阶段目的是，通过对健康狒狒两次活体(IV)给药，21天之后分别测定sTNFR-I 4D/C105db(0.2 mg/kg体重(BW))，sTNFR-I 3D/C105db(0.2mg/kg BW)或sTNFR-I 2.6D/C105 db(0.2mg/kg BW)的药代动力学及免疫原性。
研究部分1被分成两阶段。1部分A阶段目的是测定不同sTNFR-I结构形式在健康狒狒，对两种注射液反应的药物动力学及免疫原性。12只狒狒分成三组。麻醉后，每组接受0.2mg/kg BW的sTNFR-I4D/C105db，sTNFR-I 3D/C105db或sTNFR-I 2.6D/C105db。每一时期(each session)对三只狒狒进行研究。动物处理21天后，接受第二次同一的IV蛋白注射、继续研究21天。药物动力学及免疫原性在其后间歇期内测定。
第1部分，B阶段研究，目的是在一个已建立好的TNF-α介导的致死性模型中(Espat等.，J.Surg，Res，59：153-158，1995)评价这些制品的效能。通过给予5-10×106cfu/kg活的大肠杆菌，在4组共16只动物中诱导了致死的大肠杆菌细菌血症。与狒狒比较的安慰剂组，用sTNFR-I 4D/C105db(0.2 mg/kg体重)经IV予处理，或者用sTNFR-I3D/C105db(0.2 mg/kg体重)或sTNFR-I 2.6D/C105db 1mg/kg体重。
在研究1部分的两个阶段，有活力的成年雄性及雌性狒狒(6-11kg)(Biomedical Research Foundation，San Antonio，TX)禁食过夜。动物用开他敏(Ketamine)(10mg/kg i.m)麻醉，并且头部静脉经皮下插套管。麻醉的维持是起始给戊巴比妥(Pentobarbital)盐达到35mg/kg，后来再反复注射3～5mg/kg·hr的代巴比妥。上呼吸道通过放置气管内套管而保持畅通且动物可以维持自由呼吸。一导管经皮下插入股动脉，它可以允许反复全身动脉血采样并且也能通过一个Datascope2000麻醉监测器(Datascope，San Antonio，TX)心脏监视仅连续监测心率和主动脉血压。动脉血样在间期采集，用EDTA或肝素抗凝，取出后立即放于冰上冷却。血浆碎片用离心机4℃条件下分离，于-70℃保存直到进行分析。核心温度通过直肠探针监测。一个内置埋藏的Foley-型尿导管，用于允许尿采集及监测尿产量和肌酸酐廓清率。血液动力学参数每隔15分钟监测一次。所有动物接受0.9％NaCl(4ml/kg)作为维持i.v液体。B阶段研究中，如果遇到以下两种生理学标准：1)平均动脉血压降低超过30％；2)心率升高超过30％；3)尿产；出量降至小于1ml/kg体重/小时，动物接受额外的液体(10μl/kg每隔15分钟)。当血液样本达到基线并且允许至少1小时的平衡等待期后开始灌注蛋白质。
本研究1部分A阶段的系列研究中，重组蛋白经头侧颈灌注且动物经8小时的一段观察期后，移去所有导管，把动物放回笼中21天。在24及48小时，以及第3，5，8，11，16，21天，动物用IM开他敏(IMketamine)(10mg/kg)短暂麻醉，并采集静脉血样。在第21天，动物重新麻醉并接受第2次蛋白注射。在第0天实施的整个方案于另外的21天重复进行。此时动物无痛处死。
在研究1部分B阶段，灌注大肠杆菌前1小时，四只动物随机安排了接受安慰剂或一种前面提到的构建物。动物经8小时的一段观察期后，移去所有导管，动物返回笼中，随后观察处死的细菌血症的幸存者。特别不舒适的动物无痛处死。特别不舒适通过IACUC确定：D：不能支持坐或直立姿势超过前12小时，2)在前12小时内不能进食，饮水，3)导管处出血不能控制，或4)对外部之刺激无反应。静脉血标本在-1，0，0.5，1，1.5，2，2.5，3，4，5，6，7，8，24，48小时及第3，5，8，1 1，16，21天采集。在第21天，幸存的动物无痛处死。
狒狒对给予重组蛋白而出现的抗体通过夹心ELISA测定，非常简单地，sTNFR-I构建物包被在ELISA板(1μg/ml)，并且加入100μl的稀释狒狒血浆(1∶50到1∶00,000)。样本洗后，加入一种辣根过氧化物酶(HRP)结合蛋白A(0.5μg/ml)，此分析用TMB显影。结果(I部分)：
血浆半衰期在三个构建物中显著不同。用模型非依赖方法测量消失曲线，且在8-17小时间总体评价明显的半衰期。在初次试验(naive)的动物，在用4.0结构域构建物处理的狒狒中，血浆半衰期最长(29小时)，当在狒狒中用sTNFR-I 3D/C105db(24.7小时)及sTNFR-I2.6D/C105db(21.5hrs)处理后，半衰期连续下降。这种差异，尽管统计上显著，也仅有26％。
出人意料地，随着第二次给予各个狒狒各种蛋白质，血浆半衰期趋于非常短暂，表示有一个非常迅速的清除。这种半衰期降低在狒狒接受sTNFR-I 4D/C105db后最明显，可以减少48％(p＜0.01)[图10]。狒狒给予sTNFR-I 3D/C105db(31％)处理，半衰期降低处于中间位置(31％)[图11]，而给予sTNFR-I 2.6D/C105db，其半衰期降低最少(14％)[图12]。用sTNFR-I 2.6D/C105db处理狒狒，半衰期降低没有统计学上的差异。
在狒狒中，所有制剂都是致免疫的。然而对狒狒来说免疫原性发生率为用sTNFR-I 4D/C105db处理最大，用sTNFR-I 3D/C105db处理居中，用sTNFR-I 2.6D/C105db处理最低(表8)。
表8：抗体反应峰1
    第一个21天     第二个21天
  中值 25％-75％ 中值 25％-75％
sTNFR-I 4D/C 105db(n＝4)   3.20 3.20  3.20   3.95  3.50   4.40
 sTNFR-I 3D/C105db(n＝4)   1.60 0.00  3.65   3.50  1.30   4.75
 sTNFR-I 2.6D/C105db(n＝4)   0.00* 0.00  1.75   1.45  0.00   3.50
1.对数尺度(用夹心ELISA法产生半-最大吸收必需的血浆反
向稀释；见实验方法)。
*P＝0.056，通过Kouskal-wallis two-way方差分析(ANOVA)(标准化检测不合格的对数转化值)。
抗体反应普遍形成在随着给予构建物的第八天，并且在21天的研究期内都存在。在第二次注射蛋白构建物期内，抗体反应性趋于变强。
所有4只接受sTNFR-I 4D/C105db的狒狒产生抗体，4只动物接受sTNFR-I 3D/C105db，其中两只产生抗体，接受sTNFR-I 2.6D/C105 db的4只动物，有1只产生抗体。通过Kruskall-Wallis方差分析，从时间效应来说，三组动物抗体反应的大小(对数转换值)显著不同(p＜0.05)。Post-hoc分析表明，这种抗体反应的显著差异主要在接受sTNFR-I 4D/C105db及sTNFR-I 2.6D/C105db处理的狒狒间，用sTNFR-I3D/C105db处理的狒狒呈的中间反应(没有显著性)。
在2个21天的研究中，观察，抗体产生及廓清率变化的相关关系(P＜0.01)。非出人意料地，在那些第1次给予构建物的产生强的抗体反应的动物中，当第二次给药后蛋白质清除迅速得多。在产生抗体反应(n＝7)和那些未产生抗体反应(n＝5)[图13]的动物间比较了第一次注射及第二次注射后清除率的变化。
评价了狒狒血浆中观察到的抗体，该检测用一定数量的挑选的动物，分析对ME-180细胞系的直接细胞毒性并且用L929分析中和能力。对于三种构建物中任一一种产生的抗体，发现既没有细胞毒性也没有中和能力。
在1部分A阶段狒狒研究中，产生最强抗体反应的动物，在第二次给药时，构建物清除率也最大速度升高。由此，该发现提示抗体反应可能降低生物半衰期，这样，(就影响)该构建物治疗效能，所以剂量调整就是需要的，然而当第二次给予那些构建物时，对存在的抗体没有产生相反的治疗反应。在疗法上下力气修饰这些构建物以降低免疫原性，而不明显影响半衰期或治疗效能，主要是想减小增加剂量的必要性，而不是着眼于避免副反应的风险。第1部分B阶段研究结果：
最终，对于初次用于试验的狒狒，当以1.0mg/kg体重的剂量给药，所有三种构建物在避免大肠杆菌细菌血症之后的细胞因子介导的损伤方面有几乎均等效应。4只安慰剂处理狒狒中有一只存活；4只sTNFR-I 4D/C105db及sTNFR-I 3D/C105db处理的狒狒全部存活。4只sTNFR-I 2.6D/C105db处理的狒狒中有3只存活。所有三种结构物都阻止TNF-α的生物活性及提供了富余的中和效能。II部分：
在狒狒中第二部分研究的特殊目的是，是否动物重复暴露(也就是3次单独注射)于各种形式的sTNFR-I构建物导致更进一步的致免疫性及降低半衰期。另外，本研究也设计比较几种sTNFR-I构建物：包括sTNFR-I 2.6D/C105db、sTNFR-I 4D/C105db、sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)及sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)的；至免疫性及药物动力学。最后，本研究也将评价抗体反应的临床意义及随之而来的对TNF-α介导损伤动员(大肠杆菌细菌血症)反应的变更清除率。
在第0，21，42天，狒狒给予I.V 0.2mg/kg各种形式的构建物(分别为sTNFR-I 4D/C105db，sTNFR-I 2.6D/C105db，sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)或sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)。在第63天，狒狒接受2.0mg/kg BW(体重)的各自的构建物。在第65天(也就是48小时后)，狒狒用如上述I部分指出的致死剂大肠杆菌动员。第II部分主要结果如下：结果(II部分)：
总的来讲，不考虑结构域数量，在初次用于试验的狒狒中，sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)及sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)比sTNFR-I 4D/C105db，sTNFR-I 2.6D/C105db有较长的半衰期。对于单PEG化形式的sTNFR-I其半衰期变化范围为30-35小时，与之比较，二聚PEG化形式的sTNFR-I半衰期变化范围为10-20小时。另外，在初次用于试验的动物中，sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)及sTNFR-I 4D/C105db比2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)、sTNFR-I2.6D/C105db有更长的半衰期。
sTNFR-I 4D/C105db及sTNFR-I 2.6D/C105db也是致免疫的，sTNFR-I 2.6D/C105db以一种温和的趋势减少至免疫性。然而仅仅sTNFR-I 4D/C105db当反复给予时显示了降低的清除率。sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)及2.6D/N105-t-BuPET(33kDA)反复给予时，既非抗原的，其清除率也不显著变化。
在每一只用不同组合物处理的狒狒(n＝3)的第21天、42天、61天获得的血清在体外进行对其它结构物的免疫反应性评价(通过夹心捕获ELISA法)通过用不同结构物做捕获抗原。例如，从给予2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)第21天的狒狒中获得血清(表9)，并不与sTNFR-I 4D/C105db或者sTNFR-I 4D/N105“反应”，当这些复合物用作ELISA板中的包被抗原时。
                        表9：狒狒抗体反应
                       IgG(≥1∶400效价)21天
  所用的动物n＝3     sTNFR-I2.6D/C105db     sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)     sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)     sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/C105db  sTNFR-I4D/N105
    sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3阴性 3/3阴性 3/3阴性
    sTNFR-I2.6D/C105db   3/3阴性 3/3阴性 3/3阴性
    sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3阴性 3/3阴性 3/3阴性
    sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)
    sTNFR-I4D/C105db   1/3反应(400) 3/3阴性
阳性反应指抗体反应大于1∶400(＞1∶400)效价。从第42天到62天的数据显示于表10、11。重要地，当测试针对sTNFR-I 4D/C105db捕获抗原时(表11)，从1只以前用2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)处理的狒狒中获得的血清，在体外有一个阳性反应。
                        表10：狒狒抗体反应
                      IgG(≥1∶400效价)42天
  所用的动物n＝3   sTNFR-I2.6D/C105db     sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)     sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)     sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa) sTNFR-I4D/C105db  sTNFR-I4D/N105
    sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3阴性 3/3阴性 3/3阴性
    sTNFR-I2.6D/C105db   1/3反应(1600) 3/3阴性 3/3阴性
    sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3阴性 3/3阴性 3/3阴性
    sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)
    sTNFR-I4D/C105db  2/3反应(3200) 2/3反应(800)
                     表11：狒狒抗体反应
                    IgG(≥1∶400效价)61天
  所用的动物n＝3     sTNFR-I2.6D/C105db     sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)     sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)     sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)   sTNFR-I4D/C105db  sTNFR-I4D/N105
    sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3阴性   1/3反应(1600) 3/3阴性
    sTNFR-I2.6D/C105db   2/3反应(204800)   1/3反应(1600) 1/3反应(3200)
    sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3阴性   1/3反应(6400) 1/3反应(6400)
    sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)
    sTNFR-I4D/C105db   1/3反应(6400) 3/3反应(12800)
在以前暴露于这些与构建物三次的狒狒中，在以下几种情况：(1)sTNFR-I 4D/C105db，(2)sTNFR-I 2.6D/C105db，(3)sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)及(4)2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)(例如通过存活、多系统器官衰竭(MSOF)，血清IL-6水平，及WBC反应测定的)，对TNFα介导的损伤反应的效能是最大的。是本研究不考虑不同构建物的TNF中和能力的差别。C.黑猩猩(Chimpanzee)
本研究的目的是评价不同sTNFR-I形式的免疫原性，当这些sTNFR-I形式通过I.V.路径，超过一个月时期重复注射给黑猩猩。在研究中用于测试的sTNFR-I形式有：sTNFR-I 2.6D/C105db，sTNFR-I4D/C105db，sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)，sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)及sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)。每个处理组共有3只黑猩猩。
本研究的剂量/参数如下：每只黑猩猩接受测试样品，以0.1mg/kg剂量作静脉内浓缩药团注射，每周二次，在周一及周五共4周给药(共8个剂量)。剂量体积依据供应的测试品浓度而变化。在处理前的第0天，从每只动物抽取5ml血样本。另外的血样本则刚好在第7，14，21，28天的给药前采集。
黑猩猩免疫原性原始数据列于表12。
                      表12：抗体结果IgG效价(黑猩猩数量)
    第0天(治疗前)   第7天(2个剂量)     第14天(4个剂量)     第21天(6个剂量)     第28天(8个剂量)
    sTNFR-I2.6D/C106db     100(1)     400(1)1600(1)3200(1)     800(1)3200(2)
    sTNFR-I4D/C105db     3200(1)     400(1)1600(1)     800(2)12800(1)
  sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)
sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)
  sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)     200(1)*1600(1)     100(1)*400(1)
*注：观察效价用sTNFR-I 4D/C105db作捕获抗原。
到第28天，所有用sTNFR-I 4D/C105db或sTNFR-I 2.6D/C105db处理的动物(n＝3)记录一个阳性反应(用ELISA测量)，其各自地观察到的最高效价为1：12,800或1：3200(表12)(注：本实验部分、所有“免疫”抗原用作相应的捕获抗原固定于ELISA板上)。一只用sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)处理的动物于第+21天，及+28天有阳性抗体反应(表12)。重要的是，在整个实验过程中，没有观察利用sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)或sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)处理的动物产生抗-sTNFR-I抗体(表12)。
像以上狒狒实验部分所描述的那样，在第28天从每只用不同形式sTNFR-I处理的黑猩猩中获得的血清样本，通过用sTNFR-I形式?捕获抗原在体外评价对其它构建物的免疫原性(用ELISA法)。阳性反应为抗体反应＞1∶400效价。重要的是，从给予sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)的黑猩猩中获得的血清样本，与sTNFR-I 4D/C105db及sTNFR-I 4D/N105无“反应”，当用这些复合物作为捕获抗原包被于ELISA板上时(表13)：
                          表13：黑猩猩抗体结果
                          IgG(≥1∶400效价)
    所用的动物n＝3     sTNFR-I2.6D/N105db     sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)     sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa)     sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)   sTNFR-I4D/C105db  sTNFR-I4D/N105
    sTNFR-I2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3阴性 3/3阴性 3/3阴性
    sTNFR-I2.6D/C105db   3/3反应(3200)   2/3反应(3200) 1/3反应(400)
    sTNFR-I4D/N105-t-BuPEG(33kDa) 3/3阴性   2/3反应(1600) 2/3反应(3200)
    sTNFR-I4D/C105-t-BuPEG(33kDa)   1/3反应(400) 3/3阴性
    sTNFR-I4D/C105db   3/3反应(12800) 3/3反应(6400)
这些也在用sTNFR-I 4D/C105db，sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)或sTNFR-I 4D/N105-t-BuPEG(33kDa)处理的动物中观察到(表13)。实施例IV
EAE是一种急性或慢性复发的中枢神经系统(CNS)炎性脱髓鞘疾病，源于神经抗原(neuroantigens)例如髓磷脂碱性蛋白(MBP)对遗传易感性敏感动物的致敏作用。EAE是一种本专业公认的经常用作急性人多发性硬化(MS)的动物模型。
雌性Lewis大鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)在第0天麻醉并于左后肢脚掌用一种乳剂以0.1ml量免疫，该乳剂在弗氏完全佐剂中含有MBP含有5mg/ml的结核分枝杆菌H37Ra(Difco，Lab MI)的CFA溶于等体积的PBS中。对照组于左后肢脚掌注射没有MBP的0.1ml PBS/CFA乳剂。
临床疾病评价基于一种方便的0-5分体系。等级系列如下：0，正常；0.5，尾部知觉(tail tone)部分丢失；1，尾部知觉完全丢失；2，一后脂拖曳而行；3，双后肢麻痹；4，病态的；5，死亡。从免疫后第9天起，所有sTNFR-I构建物或赋形剂注射到以1mg/kg S.C.的量隔日给药。所有动物于第21天终止试验。结果用两种形式表示：临床严重程度分数作为时间的涵数，每只鼠整个疾病过程中整体(完全)临床分数用于计算作为每天临床分数针对时间的曲线下面积。处理组完整临床得分的值用Mann-Whitney检验与对照组进行统计上的比较。
赋形剂处理组动物在第10天附近开始发病，疾病出现峰值在第16天然后逐渐减退。与赋形剂处理的动物比较，sTNFR-I 4D/C106db减轻临床症状约73％。sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)也减轻临床症状约85％。sTNFR-I 4D/C105-t-BuPEG(33kDa)及sTNFR-I 2.6D/N105-t-BuPEG(33kDa)在减缓临床症状方面有相等的潜力(分别为64％及57％)。
结论为：在这种MS动物模型中，似乎各种截短的sTNFRs对减缓一些临床后遗症是有效的。
而以上从总体上及优选实施方案中描述的本发明，可以理解为，根据以上所述，本领域的技术人员能够得到其它变异型及修饰型。
                          序列表(1)一般信息：(i)  申请人：  AMGEN公司(ii)发明的题目：截短的可溶性肿瘤坏死因子
I-型和-II型受体(iii)序列数：81(iv)联系地址：
(A)联系人：AMGEN公司
(B)街道：1840 De Havilland Drive
(C)城市：千橡城
(D)州：加里弗尼亚
(E)国家：美国
(F)邮区号：91320-1789(v)计算机可读形式：
(A)媒体类型：软盘
(B)计算机：IBM兼容性PC机
(C)操作系统：PC-DOS/MC-DOS
(D)软件：Patent In Release#1.0，版本#1.30(vi)现有的申请数据：
(A)申请号：
(B)申请日期：
(C)分类：(vii)先前的申请数据：
(A)申请号：US 60/021,443
(B)申请日期：1996-07-09(vii)先前的申请数据：
(A)申请号：US 60/032,534
(B)申请日期：1996-12-06(vii)先前的申请数据：
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(B)申请日期：1997-01-23(vii)先前的申请数据：
(A)申请号：US 60/039,314
(B)申请日期：1997-02-07(vii)先前的申请数据：
(A)申请号：US 60/039,792
(B)申请日期：1997-05-04(viii)代理机构/代理人信息：
(A)姓名：Zindrick，Thomas D.
(B)登记号码：32,185
(C)参考/文档号码：A-415E(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特性：
(A)长度：483碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS
(B)位点：1...483(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GAT AGT GTG TGT CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCG            48Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Ash Asn Ser1               5                  10                  15ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT            96Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
        20                   25                  30CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC           144Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
    35                  40                  45TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA           192Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys
50                   55                  60TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC           240Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp65                  70                  75                  80CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG           288Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp
             85                  90                  95AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC AGC CTC TGC CTC AAT GGG           336Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu Cys Leu Asn Gly
        100                 105                 110ACC GTG CAC CTC TCC TGC CAG GAG AAA CAG AAC ACC GTG TGC ACC TGC           384Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys
    115                 120                 125CAT GCA GGT TTC TTT CTA AGA GAA AAC GAG TGT GTC TCC TGT AGT AAC           432His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn
130                 135                 140TGT AAG AAA AGC CTG GAG TGC ACG AAG TTG TGC CTA CCC CAG ATT GAG           480Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu145                 150                 155                 160AAT                                                                       483Asn(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特性：
(A)长度：  161氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser1               5                  10                  15Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
         20                 25                  30Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
     35                  40                  45Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys
 50                  55                  60Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Iie Ser Ser Cys Thr Val Asp65                   70                  75                 80Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp
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        100                 105                 110Thr Val His Leu Ser Cys Gln Glu Lys Gln Asn Thr Val Cys Thr Cys
    115                 120                 125His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu Asn Glu Cys Val Ser Cys Ser Asn
130                 135                 140Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr Lys Leu Cys Leu Pro Gln Ile Glu145                 150                 155                 160Asn(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特性：
(A)长度：332碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS
(B)位点：4...324(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CAT ATG GAC AGC GTT TGC CCC CAA GGA AAA TAC ATC CAC CCT CAA AAT          48
Met Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn
 1               5                  10                  15AAT TCG ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT           96Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn
             20                  25                 30GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC          144Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser
        35                   40                  45GGC TCC TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC          192Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys
     50                  55                  60TCC AAA TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA          240Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gin Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr
 65                  70                  75GTG GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT          288Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His80                  85                  90                  95TAT TGG AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC TGC TGA TAGGATCC                 332Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Cys  *
            100                 105(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特性：
(A)长度：107氨基酸
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(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：Mer Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn1               5                  10                  15Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp
         20                  25                  30Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly
     35                  40                  45Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser
 50                  55                  60Lys Cys Arg Lys Glu Mer Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val65                  70                  75                  80Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr
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        100                 105(2)SEQ ID NO：5的信息：(i)序列特性：
(A)长度：339碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
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Met Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn
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         35                  40                  45GGC TCC TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC           192Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys
     50                  55                  60TCC AAA TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA           240Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr
 65                  70                  75GTG GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT           288Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His80                  85                  90                  95TAT TGG AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC TCT CTG TAA               333Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu  *
            100                 105                 110AAGCTT                                                                    339(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特性：
(A)长度：110氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Met Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn1               5                  10                  15Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp
         20                  25                  30Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly
     35                  40                  45Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser
 50                  55                  60Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val65                  70                  75                  80Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr
             85                  90                  95Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu  *
        100                 105                 110(2)(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特性：
(A)长度：333碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS
(B)位点：4...324(xi)序列描述： SEQ ID NO：7：CAT ATG GAC AGC GTT TGC CCC CAA GGA AAA TAT ATC CAC CCT CAA AAT           48
Met Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn
  1               5                  10                  15AAT TCG ATT TGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT           96Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn
             20                  25                  30GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC        144Asp Cys pro Gly pro Gly Gin Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser
         35                  40                  45GGC TCC TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC        192Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys
     50                  55                  60TCC AAA TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA        240Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr
 65                  70                  75GTG GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGT TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT        288Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gin Tyr Arg His80                  85                  90                  95TAT TGG AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TAA TAGGGATCC              333Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn  *
            100                 105(2)(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特性：
(A)长度：107氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Met Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn1               5                  10                  15Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp
         20                  25                  30Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly
     35                  40                  45Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser
 50                  55                  60Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val65                  70                  75                  80Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr
             85                  90                  95Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn  *
        100                 105(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特性：
(A)长度：285碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS
(B)位点：4...279(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：CAT ATG TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT          48
Met Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys
  1               5                  10                  15CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC          96Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser
             20                  25                  30TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA         144Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys
         35                  40                  45TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC         192Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp
     50                  55                  60CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG         240Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp
 65                  70                  75AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC TCT CTG TAA AAGCTT              285Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu  *80                  85                  90(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特性：
(A)长度：92氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白(xi)序列描述：  SEQ ID NO：10：Met Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro1               5                  10                  15Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe
         20                  25                  30Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys
     35                  40                  45Arg Lys Glu Met Giy Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg
 50                  55                  60Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser65                  70                  75                  80Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu  *
             85                  90(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特性：
(A)长度：315碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS
(B)位点：4...309(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：CAT ATG TAT ATC CAC CCT CAA AAT AAT TCG ATT TGC TGT ACC AAG TGC          48
Met Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys
  1               5                  10                  15CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC AAT GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT          96His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp
             20                  25                  30ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG AGC GGC TCC TTC ACC GCT TCA GAA AAC         144Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn
         35                  40                  45CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC TGC TCC AAA TGC CGA AAG GAA ATG GGT         192His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly
     50                  55                  60CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC ACA GTG GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC         240Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly
 65                  70                  75TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG CAT TAT TGG AGT GAA AAC CTT TTC CAG         288Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln80                  85                  90                  95TGC TTC AAT TGC TCT CTG TAA AAG CTT                                     315Cys Phe Asn Cys Ser Leu  *
            100(2)SEQ ID NO：12的资料：(i)序列特性：
(A)长度：102氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO 12：Met Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys Cys Thr Lys Cys His1               5                  10                  15Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr
         20                  25                  30Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His
     35                  40                  45Leu Arg His Cys Leu Ser Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln
 50                  55                  60Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys65                  70                  75                  80Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys
             85                  90                  95Phe Asn Cys Ser Leu   *
        100(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特性：
(A)长度：294碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS
(B)位点：4...288(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：CAT ATG TCG ATT AGC TGT ACC AAG TGC CAC AAA GGA ACC TAC TTG TAC           48
Met Ser Ile Ser Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr
  1               5                  10                  15AAT GAC TGT CCA GGC CCG GGG CAG GAT ACG GAC TGC AGG GAG TGT GAG           96Asn Asp Cys Pro Giy Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu
             20                  25                  30AGC GGC TCC TTC ACC GCT TCA GAA AAC CAC CTC AGA CAC TGC CTC AGC         144Ser Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser
         35                  40                  45TGC TCC AAA TGC CGA AAG GAA ATG GGT CAG GTG GAG ATC TCT TCT TGC          192Cys Ser Lys Cys Arg Lys Glu Mer Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys
     50                  55                  60ACA GTG GAC CGG GAC ACC GTG TGT GGC TGC AGG AAG AAC CAG TAC CGG          240Thr Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg
 65                  70                  75CAT TAT TGG AGT GAA AAC CTT TTC CAG TGC TTC AAT TGC TCT CTG TAA          288His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu  *80                  85                  90                  95AAGCTT                                                                   294(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特性：
(A)长度：95氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Ser Ile Ser Cys Thr Lys Cys His Lys Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn1               5                  10                  15Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gln Asp Thr Asp Cys Arg Glu Cys Glu Ser
         20                  25                  30Gly Ser Phe Thr Ala Ser Glu Asn His Leu Arg His Cys Leu Ser Cys
     35                  40                  45Ser Lys Cys Arg Lys Glu Met Gly Gln Val Glu Ile Ser Ser Cys Thr
 50                  55                  60Val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg Lys Asn Gln Tyr Arg His65                  70                  75                  80Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gln Cys Phe Asn Cys Ser Leu  *
             85                 90                   95(2)SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特性：
(A)长度：4氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知  (ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
Asn Ser Ile Cys
1(2)SEQ ID NO：16的信息：(i)序列特性：
(A)长度：5氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
Asn Asn Ser Ile Cys
1               5(2)SEQ ID NO：17的信息：(i)序列特性：
(A)长度：6氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
Gln Asn Asn Ser Ile Cys
1               5(2)SEQ ID NO：18的信息：(i)序列特性：
(A)长度：7氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys
1               5(2)SEQ ID NO：19的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：8氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys
1               5(2)SEQ ID NO：20的信息：(i)序列特性：
(A)长度：4氨基酸
(A)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys
1                5(2)SEQ ID NO：21的信息：(i)序列特性：
(A)长度：1O氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
Tyr Ile His pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys
1               5                   10(2)SEQ ID NO：22的资料：
(i)序列特性：
(A)长度：11氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys
1               5                   10(2)SEQ ID NO：23的资料：
(i)序列特性：
(A)长度：12氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys1               5                   l0(2)SEQ ID NO：24的资料：(i)序列特性：
(A)长度：13氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys
1               5               10(2)SEQ ID NO：25的资料：(i)序列特性：
(A)长度：14氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys1               5                   10(2)SEQ ID NO：26的资料：(i)序列特性：
(A)长度：15氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys1                5                  10                  15(2)SEQ ID NO：27的资料：(i)序列特性：
(A)长度：16氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile Cys
1               5                   10                  15(2)SEQ ID NO：28的资料：(i)序列特性：
(A)长度：17氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser Ile1               5                   10                  15Cys(2)SEQ ID NO：29的资料：(i)序列特性：
(A)长度：18氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：Asp Ser Val Cys Pro Gln Gly Lys Tyr Ile His Pro Gln Asn Asn Ser1               5                   10                  15Ile Cys(2)SEQ ID NO：30的资料：(i)序列特性：
(A)长度：4氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：Phe Cys Cys Ser1(2)SEQ ID NO：31的资料：(i)序列特性：
(A)长度：5氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：
Phe Cys Cys Ser Leu
1               5(2)SEQ ID NO：32的资料：(i)序列特性：
(A)长度：6氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(XI)序列描述：SEQ ID NO：32：Phe Cys Cys Ser Leu Cys1               5(2)SEQ ID NO：33的资料：(i)序列特性：
(A)长度：7氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：  SEQ ID NO：33：
Phe Cys Cys Ser Leu Cys Leu
1               5(2)SEQ ID NO：34的信息：(i)序列特性：
(A)长度：705碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(ix)特征：
(A)名称/关键：CDS
(B)位点：4...705(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：TTG CCC GCC CAG GTG GCA TTT ACA CCC TAC GCC CCG GAG CCC GGG AGC          48Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser1                 5                  10                  15ACA TGC CGG CTC AGA GAA TAC TAT GAC CAG ACA GCT CAG ATG TGC TGC          96Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
         20                  25                  30AGC AAG TGC TCG CCG GGC CAA CAT GCA AAA GTC TTC TGT ACC AAG ACC         144Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
     35                  40                  45TCG GAC ACC GTG TGT GAC TCC TGT GAG GAC AGC ACA TAC ACC CAG CTC         192Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
 50                  55                  60TGG AAC TGG GTT CCC GAG TGC TTG AGC TGT GGC TCC CGC TGT AGC TCT         240Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser65                  70                  75                  80GAC CAG GTG GAA ACT CAA GCC TGC ACT CGG GAA CAG AAC CGC ATC TGC         288Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
             85                  90                  95ACC TGC AGG CCC GGC TGG TAC TGC GCG CTG AGC AAG CAG GAG GGG TGC         336Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
        100                 105                 110CGG CTG TGC GCG CCG CTG CGC AAG TGC CGC CCG GGC TTC GGC GTG GCC         384Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
    115                 120                 125AGA CCA GGA ACT GAA ACA TCA GAC GTG GTG TGC AAG CCC TGT GCC CCG          432Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130                 135                 140GGG ACG TTC TCC AAC ACG ACT TCA TCC ACG GAT ATT TGC AGG CCC CAC          480Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His145                 150                 155                 160CAG ATC TGT AAC GTG GTG GCC ATC CCT GGG AAT GCA AGC AGG GAT GCA          528Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala
            165                 170                 175GTC TGC ACG TCC ACG TCC CCC ACC CGG AGT ATG GCC CCA GGG GCA GTA          576Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
        180                 185                 190CAC TTA CCC CAG CCA GTG TCC ACA CGA TCC CAA CAC ACG CAG CCA ACT          624His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
    195                 200                 205CCA GAA CCC AGC ACT GCT CCA AGC ACC TCC TTC CTG CTC CCA ATG GGC          672Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210                 215                 220CCC AGC CCC CCA GCT GAA GGG AGC ACT GGC GAC                              705Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp225                 230                 235(2)SEQ ID NO：35的资料：(i)序列特性：
(A)长度：235氨基酸
(B)类型：氨基酸
(D)拓扑学：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser1               5                  10                  15Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys Cys
         20                  25                  30Ser Lys Cys Ser Pro Gly Gln His Ala Lys Val Phe Cys Thr Lys Thr
     35                  40                  45Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp Ser Thr Tyr Thr Gln Leu
 50                  55                  60Trp Asn Trp Val Pro Glu Cys Leu Ser Cys Gly Ser Arg Cys Ser Ser65                  70                  75                  80Asp Gln Val Glu Thr Gln Ala Cys Thr Arg Glu Gln Asn Arg Ile Cys
             85                  90                  95Thr Cys Arg Pro Gly Trp Tyr Cys Ala Leu Ser Lys Gln Glu Gly Cys
        100                 105                 110Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg Pro Gly Phe Gly Val Ala
    115                 120                 125Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val Cys Lys Pro Cys Ala Pro
130                 135                 140Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr Ser Ser Thr Asp Ile Cys Arg Pro His145                 150                 155                 160Gln Ile Cys Asn Val Val Ala Ile Pro Gly Asn Ala Ser Arg Asp Ala
            165                 170                 175Val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser Met Ala Pro Gly Ala Val
        180                 185                 190His Leu Pro Gln Pro Val Ser Thr Arg Ser Gln His Thr Gln Pro Thr
    195                 200                 205Pro Glu Pro Ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser Phe Leu Leu Pro Met Gly
210                 215                 220Pro Ser Pro Pro Ala Glu Gly Ser Thr Gly Asp225                 230                 235(2)SEQ ID NO：36的资料：(i)序列特性：
(A)长度：4氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：
Ala Gln Met Cys
1(2)SEQ ID NO：37的资料：(i)序列特性：
(A)长度：5氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：
Thr Ala Gln Met Cys
l               5(2)SEQ ID NO：38的资料：(i)序列特性：
(A)长度：6氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
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(A)长度：7氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：
Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
1               5(2)SEQ ID NO：40的资料：(i)序列特性：
(A)长度：8氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：
Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
1               5(2)SEQ ID NO：41的资料：(i)序列特性：
(A)长度：9氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys1               5(2)SEQ ID NO：42的资料：(i)序列特性：
(A)长度：10氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys1               5                   10(2)SEQ ID NO：43的资料：(i)序列特性：
(A)长度：11氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：  SEQ ID NO：43：Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys1               5                   10(2)SEQ ID NO：44的资料：(i)序列特性：
(A)长度：12氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
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(A)长度：13氨基酸
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(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys1               5                   10(2)SEQ ID NO：46的资料：(i)序列特性：
(A)长度：14氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：  SEQ ID NO：46：Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys1               5                   10(2)SEQ ID NO：47的资料：(i)序列特性：
(A)长度：15氨基酸
(B)类型：氨基酸
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(A)长度：16氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
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(A)长度：17氨基酸
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(C)链型：未知
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(A)长度：18氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：50：Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln1               5                   10                  15Met Cys(2)SEQ ID NO：51的资料：(i)序列特性：
(A)长度：19氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：51：Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala1               5                   10                  15Gln Met Cys(2)SEQ ID NO：52的资料：(i)序列特性：
(A)长度：20氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：52：Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr1               5                   10                  15Ala Gln Met Cys
        20(2)SEQ ID NO：53的资料：(i)序列特性：
(A)长度：21氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
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        20(2)SEQ ID NO：54的资料：(i)序列特性：
(A)长度：22氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：54：Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp1               5                   10              15Gln Thr Ala Gln Met Cys
        20(2)SEQ ID NO：55的资料：(i)序列特性：
(A)长度：23氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：55：Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr1               5                   10                  15Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
        20(2)SEQ ID NO：56的资料：(i)序列特性：
(A)长度：24氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：56：Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr1               5                   10                  15Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
        20(2)SEQ ID NO：57的资料：(i)序列特性：
(A)长度：25氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
  (D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：57：Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu1               5                   10                  15Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
        20                  25(2)SEQ ID NO：58的资料：(i)序列特性：
(A)长度：26氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：58：Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg1               5                   10                  15Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
        20                  25(2)SEQ ID NO：59的资料：(i)序列特性：
(A)长度：27氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：59：Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu1               5                   10                  15Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
        20                  25(2)SEQ ID NO：60的资料：(i)序列特性：
(A)长度：28氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：60：Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg1               5                   10                  15Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
        20                  25(2)SEQ ID NO：61的资料：(i)序列特性：
(A)长度：29氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：61：Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys1               5                   10                  15Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
        20                  25(2)SEQ ID NO：62的资料：(i)序列特性：
(A)长度：30氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：62：Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr1               5                   10                  15Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
        20                  25                  30(2)SEQ ID NO：63的资料：(i)序列特性：
(A)长度：31氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：63：Leu Pro Ala Gln Val Ala Phe Thr Pro Tyr Ala Pro Glu Pro Gly Ser1               5                   10                  15Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gln Thr Ala Gln Met Cys
        20                  25                  30(2)SEQ ID NO：64的资料：(i)序列特性：
(A)长度：4氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：64：Ala Pro Leu Arg1(2)SEQ ID NO：65的资料：(i)序列特性：
(A)长度：5氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质  (xi)序列描述：SEQ ID NO：65：
Ala Pro Leu Arg Lys
1               5(2)SEQ ID NO：66的资料：(i)序列特性：
(A)长度：6氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：66：
Ala Pro Leu Arg Lys Cys
1               5(2)SEQ ID NO：67的资料：(i)序列特性：
(A)长度：7氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：67：
Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg
1               5(2)SEQ ID NO：68的信息：(i)序列特性：
(A)长度：31碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：68：GGTTAGCCAT ATGGACAGCG TTTGCCCCCA A                                   31(2)SEQ ID NO：69的信息：
(i)序列特性：
  (A)长度：33碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：未知
  (D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：69：CCCAAGCTTT TACAGAGAGC AATTGAAGCA CTG                                  33(2)SEQ ID NO：70的信息：(i)序列特性：
(A)长度：40碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：70：ACTCGAGGAT CCGCGGATAA ATAAGTAACG ATCCGGTCCA                      40(2)SEQ ID NO：71的信息：
(i)序列特性：
   (A)长度：41碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：71：CAGGTCGGAT CCTATCAGCA GAAGCACTGG AAAAGGTTTT C              41(2)SEQ ID NO：72的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：31碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：72：GGTTAGCCAT ATGGACAGCG TTTGCCCCCA A                          31(2)SEQ ID NO：73的信息：
(i)序列特性：
(A)长度：34碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：73：CGCGGATCCC TATTAATTGA AGCACTGGAA AAGG                        34(2)SEQ ID NO：74的信息：
(i)序列特性：
  (A)长度：30碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：未知
  (D)拓扑学：未知
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：74：CCCCATATGT ATATCCACCC  TCAAAATAAT                     30(2)SEQ ID NO：75的信息：
(i)序列特性：
  (A)长度：33碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型：未知
  (D)拓扑学：未知
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：75：CCCAAGCTTT TACAGAGAGC AATTGAAGCA CTG                     33(2)SEQ ID NO：76的信息：(i)序列特性：
(A)长度：38碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：76：CCCCATATGT CGATTAGCTG TACCAAGTGC CACAAAGG                38(2)SEQ ID NO：77的信息：(i)序列特性：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：77：CCCAAGCTTT TACAGAGAGC AATTGAAGCA CTG                      33(2)SEQ ID NO：78的信息：(i)序列特性：
(A)长度：30碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：78：CCCCATATGT GTACCAAGTG CCACAAAGGA                       30(2)SEQ ID NO：79的信息：(i)序列特性：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：79：CCCAAGCTTT TACAGAGAGC AATTGAAGCA CTG                       33(2)SEQ ID NO：80的信息：(i)序列特性：
 (A)长度：31碱基对
 (B)类型：核酸
 (C)链型：未知
 (D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：80：GGTTAGCCAT ATGGACAGCG TTTGCCCCCA A                        31(2)SEQ ID NO：81的信息：(i)序列特性：
(A)长度：33碱基对
(B)类型：核酸
(C)链型：未知
(D)拓扑学：未知(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：81：cCCAAGCTTT TAGGTGCACA CGGTGTTCTG TTT                       33

Claims (31)

1.有以下通式的截短的sTNFR及其变异体和衍生物：
R1-[Cys19-Cys103]-R2其中[Cys19-Cys103]表示sTNFR-I的残基19到103，其氨基酸残基序号图解在图1(SEQ ID NO：2)中给出以便于对比；其中R1表示一个甲硫氨酰基化的或非甲硫氨酰基化的Cys19或选自下组的氨基酸残基氨基末端的氨基基团：
                     IC
                    SIC
                   NSIC (SEQ ID NO：15)
                  NNSIC (SEQ ID NO：16)
                 QNNSIC (SEQ ID NO：17)
                PQNNSIC (SEQ ID NO：18)
               HPQNNSIC (SEQ ID NO：19)
              IHPQNNSIC (SEQ ID NO：20)
             YIHPQNNSIC (SEQ ID NO：21)
            KYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：22)
           GKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：23)
          QGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：24)
         PQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：25)
        CPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：26)
       VCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：27)
      SVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：28)
     DSVCPQGKYIHPQNNSIC (SEQ ID NO：29)；其中R2表示CyS103或选自下组的氨基酸残基羧基末端的羧基基团：
           F
          FC
         FCC
        FCCS  (SEQ ID NO：30)
       FCCSL  (SEQ ID NO：31)
      FCCSLC  (SEQ ID NO：32)
     FCCSLCL  (SEQ ID NO：33)；但前提条件是，当R1表示一个甲硫氨酰基化或非甲硫氨酰基化的氨基酸序列VCPQGKYIHPQNNSIC或其N-末端1到15残基平截的氨基基团，则R1-[Cys19-Cys103]-R2不再是通式为R1-[Cys19-Cys103]-FCCSLCL-R3的插入变异体，其中R3表示图1中氨基酸残基Asn111-Asn161或图1中Asn111-Asn161中的羧基末端平截的羧基基团。
2.根据权利要求1的肿瘤坏死结合蛋白或其变异体或衍生物，选自sTNFR-I 2.6D/C105，sTNFR-I 2.6D/C106，sTNFR-I 2.6D/N105，sTNFR-I 2.3D/d8，sTNFR-I 2.3D/d18和sTNFR-I 2.3D)/d15。
3.有下列通式的截短的sTNFR及其变异体：
         R4-[Cys32-Cys115]-R5其中[Cys32-Cys115]表示成熟，全长40kDa TNF抑制剂的Cys32到Cys115残基，其氨基酸残基的编号图解在图8(SEQ ID NO：35)中绘出以便于对比；其中R4表示Cys32或选自下组氨基末端氨基酸残基的甲硫氨酰化的或非甲硫氨酰化的氨基基团：
                                C
                               MC
                              QMC
                             AQMC (SEQ ID NO：36)
                            TAQMC (SEQ ID NO：37)
                           QTAQMC (SEQ ID NO：38)
                          DQTAQMC (SEQ ID NO：39)
                         YDQTAQMC (SEQ ID NO：40)
                        YYDQTAQMC (SEQ ID NO：41)
                       EYYDQTAQMC (SEQ ID NO：42)
                      REYYDQTAQMC (SEQ ID NO：43)
                     LREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：44)
                    RLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：45)
                   CRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：46)
                  TCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：47)
                 STCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：48)
                GSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：49)
               PGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：50)
              EPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：51)
             PEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：52)
            APEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：53)
           YAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：54)
          PYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：55)
         TPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：56)
        FTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：57)
       AFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：58)
      VAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：59)
     QVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：60)
    AQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：61)
   PAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：62)
  LPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMC (SEQ ID NO：63)；其中R5表示Cys115或选自下组的羧基末端氨基酸残基的一个羧基基团：
                 A
                AP
               APL
              APLR (SEQ ID NO：64)
             APLRK (SEQ ID NO：65)
            APLRKC (SEQ ID NO：66)
           APLRKCR (SEQ ID NO：67)但前提条件是，当R4表示氨基酸序列TCRLREYYDQTAQMC或其从1到15残基的一种N-末端平截物的氨基基团时，则R4-[Cys32-Cys115]-R5不是通式R4-[Cys32-Cys115]-APLRKCR-R6插入变异体，其中R6表示图8中氨基酸残基Pro123-Thr179或图8中Pro123-Thr179的羧基末端平截物的羧基基团。
4.根据权利要求1到3任一项的肿瘤坏死结合蛋白，其中所说的氨基酸序列是非糖基化的。
5.根据权利要求1到3任一项的肿瘤坏死结合蛋白，其中所说的氨基酸序列是糖基化的。
6.根据权利要求1到3任一项的肿瘤坏死结合蛋白，其中的蛋白是结合到一个水溶性聚合物上的。
7.多价的肿瘤坏死结合蛋白，包括至少一种根据权利要求1-6任一项的肿瘤坏死结合蛋白。
8.通式为R1-X-R2的多价的肿瘤坏死结合蛋白，其中：X包括一种连接物，其中所说的连接物是一种水溶性多聚物，R1和R2是共价连接到上述水溶性多聚物的生物活性分子，其中至少R1和R2的其中之一是权利要求1到6任一项的肿瘤坏死结合蛋白。
9.权利要求8的多价肿瘤坏死结合蛋白，其中的水溶性多聚物是聚乙二醇。
10.权利要求9的多价肿瘤坏死结合蛋白，其中的蛋白选自sTNFR-I 2.6D/C105db和sTNFR-I 2.6D/C106db。
11.权利要求1到10任一项的肿瘤坏死结合蛋白在治疗TNF介导疾病中的应用。
12.权利要求1-10任一项的肿瘤坏死结合蛋白在治疗关节炎中的应用。
13.编码权利要求1到3任一项的肿瘤坏死结合蛋白的多核苷酸。
14.一种核酸序列，包括一由选自如下的核苷酸序列所编码的肿瘤坏死结合蛋白：
(a)图2所示的cDNA序列；
(b)图3所示的cDNA序列；
(c)图4所示的cDNA序列；
(d)图5所示的cDNA序列；
(e)图6所示的cDNA序列；
(f)图7所示的cDNA序列；
(g)：(a)，(b)，(c)，(d)，(e)和(f)的编码区或其部分发生简并而得到的序列；
(h)与(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)和(g)杂交的序列；以及
(i)与(a)，(b)，(c)，(d)，(e)，(f)，(g)和(h)互补的序列，但前提条件是，该核酸不编码通式为R1-[Cys19-Cys103]-FCCSLCL-R3的蛋白质，其中[Cys19-Cys103]表示sTNFR-I的19到103的蛋白质残基，其氨基酸残基的编号图解在图1(SEQ ID NO：2)中给出以便于对比；其中R1表示包括NNSIC的氨基酸序列的甲硫氨酰化的或非甲硫氨酰化的氨基基团，R3表示图1中氨基酸残基Asn111-Asn161中或图1中Asn111-Asn161的羧基末端平截物的羧基基团。
15.一种多核苷酸，有图2，3，4，5，6或7所示的序列，或其一部分。
16.载体，包括可操纵地连接到一表达调控序列上的权利要求13至15中任一项的核苷酸。
17.一种原核或真核宿主细胞，包含权利要求13至15中任一项的多核苷酸。
18.一种方法，包括在一种合适的营养培养基中培养权利要求17中的宿主细胞以及任选的从上述细胞或上述营养培养基分离上述截短的sTNFR。
19.生产权利要求18的肿瘤坏死结合蛋白的方法，其中上述宿主细胞是大肠杆菌。
20.生产依据权利要求18的肿瘤坏死结合蛋白的方法，其中上述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
21. 一种方法，包括下述步骤：
(a)培养权利要求17的原核或真核宿主细胞；
(b)保持上述宿主细胞处于允许其表达截短sTNFR的条件下，以及(c)任选地分离由上述宿主细胞表达的截短sTNFR。
22.一种肿瘤坏死结合蛋白，它是一种原核或真核宿主细胞的重组表达产物，该宿主细胞包括了权利要求13到15当中任一项的外源多核苷酸。
23.一种药物组合物，包括根据权利要求1到10任一项的肿瘤坏死因子结合蛋白，与一种药学上可接受的赋形剂联合使用。
24.一种药物组合物，包括依据权利要求18生产的肿瘤坏死因子结合蛋白，与一种药学上可接受的赋形剂联合使用。
25.一种药物组合物，包括依据权利要求21生产的肿瘤坏死因子结合蛋白，与一种药理学上可接受的赋形剂联合使用。
26.一种治疗TNF-介导疾病的方法，包括给病人施用权利要求23到25的药物组合物。
27.权利要求26的方法，其中TNF-介导疾病是关节炎。
28.一种制备药物组合物的方法，其中有效治疗剂量的权利要求1到10任一项的肿瘤坏死因子结合蛋白被与一种或多种药学上可接受的赋形剂相混合。
29.权利要求1到10当中任一项的肿瘤坏死因子结合蛋白在治疗TNF介导疾病中的应用。
30.权利要求29的肿瘤坏死因子结合蛋白在治疗关节炎中的应用。
31.一种制备水状蛋白制剂的试剂盒，包括权利要求1到10任一项肿瘤坏死结合蛋白和另外一个含有生理学上可接受溶剂的容器。
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