CN1378595A - 作为zalpha受体之配体的人细胞因子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及zalpha11配体多肽和多肽分子。zalpha11配体是新的细胞因子。该多肽可用于刺激造血细胞的体外和体内增殖和/或发育的方法中。本发明还涉及生产蛋白质的方法,其应用及抗体。

Description

作为zalpha受体之配体的人细胞因子及其用途
发明背景
多细胞生物体细胞的增殖与分化是受激素和多肽生长因子控制的。这些可扩散的分子使细胞彼此联系并协同作用形成细胞、组织和器官，并修复受损的组织。激素和生长因子的例子包括类固醇激素(如雌激素、睾酮)、甲状旁腺素、促卵泡激素、白介素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、红细胞生成素(EPO)和降钙素。
激素和生长因子通过与受体结合影响细胞代谢。受体可以是与细胞内信号途径如第二信使系统结合的整合膜蛋白。其它类别的受体是可溶性分子，如转录因子。
细胞因子一般都刺激造血谱系细胞的增殖或分化或参与机体的免疫和炎性反应机制。影响造血的细胞因子的例子包括刺激红血细胞发育的促红细胞生成素(EPO)、刺激巨核细胞谱系细胞发育的血小板生成素(TP0)，以及刺激嗜中性细胞发育的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)。这些细胞因子可用于恢复贫血、血小板减少和中性白细胞减少病人，或接受肿瘤化疗病人体内的正常血细胞水平。
白介素是一个介导包括炎症在内的免疫学反应的细胞因子家族。白介素介导各种炎症病理学过程。对免疫反应极为重要的是T细胞，其产生许多细胞因子并产生针对抗原的适应性免疫。已将T细胞产生的细胞因子分为1型和2型两大类型(Kelso，A.Immun.Cell Biol.76：300-317，1998)。1型细胞因子包括IL-2、IFN-γ、LT-α，并参与炎性反应、病毒免疫、细胞内寄生虫免疫和同种异体移植排斥。2型细胞因子包括IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，并参与体液反应、蠕虫免疫和过敏反应。1型和2型共有的细胞因子包括IL-3、GM-CSF和TNF-α。有某些证据提示产生1型和2型的T细胞群体优先迁移到不同类型的发炎组织中。
可以用抗原或其它刺激物激活成熟的T细胞，以产生进一步影响T细胞群体命运的细胞因子、生化信号分子或受体。
可通过其细胞表面上的受体，包括B细胞受体及其它辅助分子活化B细胞，以完成如生产细胞因子等辅助细胞功能。
天然杀伤(NK)细胞与T细胞和B细胞有共同的始祖细胞，并且在免疫监视中发挥作用。占血淋巴细胞约15％的NK细胞并不表达抗原受体，因此不利用MHC识别作为与靶细胞结合的条件。NK细胞参与识别和杀伤某些肿瘤细胞及病毒感染的细胞。在体内，据信NK细胞需要活化，但在体外，已证明NK细胞不经活化即可杀死某些类型的肿瘤细胞。
已证明的细胞因子家族的体内活性说明了其它细胞因子、细胞因子激动剂及细胞因子拮抗剂的许多临床潜能及对这些分子的需要。本发明提供一种刺激造血细胞谱系细胞的新细胞因子及相关的组合物和方法，以满足这些需要。
本发明提供了这类适合于这些和本领域技术人员显而易见的其它用途的多肽。
附图简要说明
图1举例显示人IL-2、人IL-15、zalpha11配体(SEQ ID NO：2)、人IL-4、小鼠IL-2、人GM-CSF和小鼠GM-CSF的多重序列对比。
发明的详细描述
在详细陈述本发明之前，明确下列术语的定义可能是有帮助的：
术语“亲和标记物”在本文中是指可连接到第二个多肽上以便为纯化或检测第二个多肽，或者为将第二个多肽连接到底物上而提供位点的多肽片段。原则上，抗体或其它特异性结合剂可利用的任何肽或蛋白质均可用作亲和标记物。亲和标记物包括多组氨酸序列、蛋白A(Nilsson et al.，EMBO J.4：1075，1985；Nilsson et al.，MethodsEnzymol.198：3，1991)、谷胱甘肽S转移酶(Smith and Johnson，Gene67：31，1988)、Glu-Glu亲和标记物(Grussenmeyer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：7952-4，1985)、物质p、FlagTM肽(Hopp etal.，Biotechnology 6：1204-10，1988)、链霉抗生物素结合肽，或其它抗原表位或结合区(总地参见Ford et al.，Protein Expressionand Purification 2：95-107，1991)。编码亲和标记物的DNA可从供应商(如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)处购得。
本文所使用的术语“等位变异体”是指占据同一染色体基因座的有任何两个或多个可替换形式的基因。等位变异是通过突变天然产生的，并可导致群体内的表型多态性。基因突变可能是沉默的(未改变所编码的多肽)，或者可编码已改变了氨基酸序列的多肽。术语等位变异体还用于代表由基因等位变异体编码的蛋白质。
本文所使用的术语“氨基末端”和“羧基末端”代表多肽内的氨基酸位置。当文中的这些术语参照多肽的特定序列或其部分使用时可表示邻近的或相对的位置。例如，多肽内某个位于参照序列羧基末端的序列是定位于参照序列羧基末端的附近，但不一定是在完整多肽的羧基末端。
术语“补体/抗补体对”表示在适当条件下形成非共价结合的，稳定配对的不完全相同部分。例如，生物素和抗生物素(或链霉抗生物素)就是补体/抗补体对的原型成员。其它可举例的补体/抗补体对包括受体/配体对、抗体/抗原(或半抗原或表位)对、有义/反义多核苷酸对等。当希望继后解离补体/抗补体对时，该补体/抗补体对最好有＜109M-1的结合亲和力。
术语“多核苷酸分子的互补体”是指与参照序列相比较，具有互补碱基序列和相反方向的多核苷酸分子。例如，序列5′ATGCACGGG 3′互补于5′CCCGTGCAT 3′。
术语“简并核苷酸序列”表示包括一个或多个简并密码子(与编码多肽的参照多核苷酸分子相比较)的核苷酸序列。简并密码子含有不同的核苷酸三联体，但编码相同的氨基酸残基(即，GAU和GAC三联体均编码Asp)。
术语“表达载体”是用于表示线性或环状的DNA分子，其包括编码有用多肽的片段，其中所说的片段可与其转录所需的附加片段可操作地连接。这样的附加片段包括启动子和终止子序列，并且还可包括一个或多个复制原点、一个或多个选择标记、增强子、多聚腺苷酸化信号等。表达载体一般是衍生于质粒或病毒DNA，或者可含有两种元件。
当术语“分离的”用于多核苷酸时，是表示该多核苷酸已从其天然遗传环境中除去并因而没有其它额外的或不需要的编码序列，而且是以适用于遗传工程化蛋白质生产系统的形式存在。这种分离的分子是从其天然环境中分离的，并包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子没有与之常规联系的其它基因，但可包括天然存在的5′和3′非翻译区如启动子和终止子。鉴定相关区域的方法是本领域技术人员已知的(如参见Dynan and Tijan，Nature 316：774-78，1985)。
“分离的”多肽或蛋白质是见于其天然环境以外的情况下的，如从血液和组织中分离出的多肽或蛋白质。在一优选形式中，分离的多肽基本上没有其它多肽，特别是动物来源的其它多肽。优选的是提供高度纯化形式的，即纯度大于95％，更优选的是纯度大于99％的多肽。当用于本文时，术语“分离的”并不排除有另外物理形式的如二聚体或另外糖基化或衍生化形式的同种多肽存在。
术语“赘生”用于表示细胞时，是指经历新的和异常增生的细胞，特别是在增生为无控制的或进行性的，进而导致赘生物的组织中。赘生性细胞可以是恶性的，即侵入性的和转移的，或良性的。
术语“可操作地连接的”是指DNA片段的排布使其功能与预期的目的相一致，例如转录在启动子中起始并通过编码片段进行到终止子。
术语“直向同源物”表示从一个种中得到的多肽或蛋白质是从不同种生物体中得到的多肽或蛋白质的功能对应物。直向同源物间的序列差异是物种形成的结果。
“共生同源物”是由生物体制得的不同但结构相关的蛋白质。据信共生同源物是通过基因复制产生的。例如，α-球蛋白、β-球蛋白，和肌红蛋白是彼此的共生同源物。
“多核苷酸”是从5′到3′末端读出的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。多核苷酸包括RNA和DNA，并可以是从天然来源分离的，体外合成的，或从天然和合成分子的结合体制备的。多核苷酸的大小以碱基对(“bp”)表示，可以是核苷酸数(“nt”)或千碱基数(“kb”)。在上下文允许的情况下，后两个术语可描述单链或双链的多核苷酸。当该术语用于双链分子时，其可代表总长度并将被理解为等同于术语“碱基对”。本领域技术人员应意识到，双链多核苷酸的两条链长度可以稍有不同，并且因受到酶切割而可使其末端是错开的；因此双链多核苷酸分子内的所有核苷酸可以是不配对的。
“多肽”是由肽键连接的氨基酸残基的聚合物，并且可以是天然产生的或合成产生的。少于约10个氨基酸残基的多肽通常称为“肽”。
术语“启动子”是指含有DNA序列的基因的一部分，其用于结合RNA聚合酶并启动转录。启动子序列通常但不总是见于基因的5′非编码区。
“蛋白质”是包含一个或多个多肽链的大分子。蛋白质还可包括非肽成分，如糖基团。其中产生蛋白质的细胞可将糖和其它非肽取代基加到蛋白质上，并将随细胞类型而变化。本文中蛋白质是依赖它们的氨基酸主链结构定义的；取代基如糖基团一般不是特定的，但却可以是存在的。
术语“受体”是指与生物活性分子(即配体)结合并介导配体对细胞作用的细胞结合蛋白。膜结合受体的特征是有多个肽结构，包括细胞外配体结合区和通常参与信号转导的细胞内效应区。配体与受体的结合导致受体的构象改变，引起效应区与细胞内其它分子间的相互作用。这种相互作用本身又导致细胞代谢的改变。与受体-配体相互作用相联系的代谢过程包括基因转录、磷酸化、去磷酸化、cAMP产生增加、细胞钙转移、膜脂质转移、细胞粘着、肌醇脂水解和磷脂水解。一般说来，受体可以是膜结合的、胞质的或核的；单体的(如甲状腺刺激激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚的(如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体和IL-6受体)。
术语“分泌信号序列”是指编码多肽(“分泌肽”)的DNA序列，所说的多肽为较大多肽的一个组分，其指引较大多肽通过合成该多肽的细胞的分泌途径。在瞬时通过分泌途径期间，较大多肽常常被裂解以去除分泌肽。
本文使用的术语“剪接变异体”是指从基因转录的另外形式的RNA。剪接变异是通过使用在转录的RNA分子内的或不太常见的是在单独转录的RNA分子之间的可变剪接位点天然产生的，并且可产生几个从同一基因转录的mRNA。剪接变异体可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。术语剪接变异体在本文中也用于表示由从基因转录的mRNA的剪接变异体编码的蛋白质。
用不精确的分析方法(如凝胶电泳)测得的聚合物分子量及长度应被理解为近似值。当这些值用“大约”X或“近似”X表示时，应理解为X的值精确到±10％。
文中所引用的所有文献均全文用作参考。
本发明部分地基于发现了一个新的DNA序列，该序列编码具有四螺旋束细胞因子结构的蛋白质。通过本文详细描述的克隆、增殖测定和结合研究，已鉴定出一个编码新的配体多肽的多核苷酸序列，所说的配体对以前描述的孤独受体zalpha11有高度特异性。这种称为zalpha11配体的多肽配体从活化的人外周血细胞(hPBC，用于筛选CD3)的产生cDNA文库中分离的。CD3是淋巴样来源细胞，特别是T细胞所特有的细胞表面标记。
在下列实施例中，使用在没有其它生长因子情况下依赖zalpha11孤独受体相关联的存活和生长途径的细胞系，筛选编码zalpha11配体的cDNA源。用于转染和表达zalpha11受体的优选的生长因子依赖性细胞系是BaF3(Palacios and Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevot et al.，Mol.Cell Biol.，6：4133-4135，1986)。然而，FDC-P1(Hapel et al.，Blood 64：786-790，1984)和MO7e(Kisset al.，Leukemia 7：235-240，1993)等其它生长因子依赖性细胞系也适用于这一目的。
zalpha11受体的氨基酸序列表明，所编码的受体属于1类细胞因子受体亚族，其中包括但不只限于IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、EPO、TPO、GM-CSF和G-CSF等的受体(参见Cosman，“The HematopoietinReceptor Super family”，Cytokine 5(2)：95-106，1993)。共同拥有的PCT专利申请US99/22149中充分描述了zalpha11受体。分析zalpha11受体mRNA的组织分布显示，其在淋巴结、外周血白细胞(PBL)、脾、骨髓和胸腺中均有表达。另外，mRNA在衍生于伯基特淋巴瘤的Raji细胞系(ATCC No.CCL-86)中很丰富。受体的组织分布提示预期的zalpha11配体的靶是造血谱系细胞，特别是淋巴样始祖细胞和淋巴样细胞。作用于淋巴样细胞的其它已知四螺旋束细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7和IL-15(有关综述可参见Nicola et al.，Advancesin Protein Chemistry 52：1-65，1999；Kelso，A.，Immunol.CellBiol.76：300-317，1998)。
CD3+选择的、PMA/离子霉素刺激的人外周血细胞的条件培养基(CM)支持BaF3细胞的生长(后者表达zalpha11受体并依赖于IL-3)。1)未经PMA/离子霉素刺激的细胞或2)未经CD3选择(有或没有PMA/离子霉素刺激)的细胞的条件培养基不支持BaF3/zalpha11受体细胞的生长。对照实验证明，这种增殖活性并不是由于其它已知的生长因子所致，而且这些条件培养基刺激zalpha11受体表达细胞增殖的能力可被可溶形式的受体中和。
用肉眼观察培养物和/或用增殖测定法鉴定与CD3+选择的、PMA/离子霉素刺激的人外周血细胞的CM接触的表达zalpha11受体的BaF3细胞的增殖。许多适用的增殖测定法都是本领域已知的，并且包括还原染料如alamarBlueTM(AccuMed International，Inc.Westlake，Ohio)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑鎓(Mosman，J.Immunol.Meth.65：55-63，1983)、3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5，3-羧甲氧基苯基-2H-四唑鎓、2，3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-氢氧化四唑鎓，以及氰二甲苯基-氯化四唑鎓(其可购自Polysciences，Inc.，Warrington，PA)的测定法；细胞分裂测定法(如检测3H-胸苷的掺入)；染料排除测定法(例如使用萘黑和锥虫蓝)；染料摄入法(使用二乙酰荧光素)；以及铬释放法(一般来说，参见Culture of Animal Cells：A Manual of Basic Technique，3rd.ed.，Wiley-Liss，1994，该文献引入本文作为参考)。
从CD3+选择的、PMA-和离子霉素刺激的初级人外周血细胞制备cDNA文库。将CD3+选择的，PMA-和离子霉素刺激的人外周血细胞cDNA文库分成含有多个cDNA分子的集合体，并转染到宿主细胞系如BHK570细胞(ATCC登记号10314)中。在不含外源生长因子的培养基中培养被转染的宿主细胞并收集条件培养基。测定条件培养基刺激被zalpha11受体转染的BaF3细胞的增殖。产生条件培养基的cDNA集合体可刺激BaF3/zalpha11受体细胞，因而可据此鉴定所说的cDNA集合体。将此汇集的质粒DNA电穿孔送到大肠杆菌中。从单个菌落分离cDNA并分别转染到BHK570细胞中。根据BaF3/zalpha11受体增殖测定中的阳性结果鉴定阳性克隆，并使用可溶性zalpha11受体中和增殖以测试特异性。
分离阳性克隆后，序列分析结果表明质粒DNA内所含有的多核苷酸序列是新的。分泌信号序列由氨基酸残基1(Met)至31(Gly)组成，并且成熟的多肽由氨基酸残基32(Gln)至162(Ser)组成(如SEQ IDNO：2所示)。
一般说来，推测细胞因子具有四α螺旋结构，其中螺旋A、C和D在配体-受体相互作用中是最重要的，而且在家族成员间是更高度保守的。参照SEQ ID NO：2中所示的人zalpha11配体氨基酸序列，对人zalpha11配体、人IL-15、人IL-4和人GM-CSF氨基酸序列进行对比后推测zalpha11配体螺旋A是由氨基酸残基41-56限定的，螺旋B是由氨基酸残基69-84限定的，螺旋C是由氨基酸残基92-105限定的，并且螺旋D是由氨基酸残基135-148限定的(参见SEQ ID NO：2)。结构分析提示A/B环是长的，B/C环是短的，并且C/D环同样是长的。该环结构导致一个上-上-下-下螺旋组织结构。如图1中所示，半胱氨酸残基在zalpha11配体和IL-15间是绝对保守的。在IL-15和zalpha11配体之间保守的半胱氨酸残基相当于SEQ ID NO：2的氨基酸残基71、78、122和125。某些半胱氨酸残基的保守情况也见于IL-2、IL-4、GM-CSF和zalpha11配体中(相当于图1所示SEQ ID NO：2的氨基酸残基78和125)。始终一致的半胱氨酸方位进一步证实了四螺旋束结构。如图1中所示，如SEQ ID NO：2中所示的Glu-Phe-Leu序列(残基136-138)在包括IL-15、IL-2、IL-4、GM-CSF和zalpha11配体的家族中也是高度保守的。
基于多重序列对比(如图1所示)对zalpha11配体所作的进一步分析预示，氨基酸残基44、47和135(如SEQ ID NO：2中所示)在zalpha11配体与其相关受体的结合中发挥重要作用。此外，预计的鼠zalpha11配体的氨基酸序列与预计的人蛋白质有57％相同。基于人和鼠zalpha11配体序列之间的比较，发现预计编码α螺旋A和D的区域中有充分保守的残基。SEQ ID NO：1中显示了本文所描述的编码zalpha11配体多肽区域、结构域基元、残基的相应多核苷酸。
对IL-4和IL-2(两者都是与zalpha11配体高度相关的)进行了详细的突变分析。分析小鼠IL-2(zurawski et al.，EMBO J.12：5113-5119，1993)显示，螺旋A和C中的残基对于与IL-2Rβ结合是重要的；关键的残基是Asp34、Asn99和Asn103。鼠IL-2环A/B和螺旋B内的多个残基对于IL-2Rα结合是重要的，而螺旋D中只有单个残基Gln141是与IL-2Rα结合所必需的。同样，螺旋A和C是IL-4和IL-4Rα(结构上相似于IL-2Rα)间相互作用的位点，并且螺旋D内的残基对IL-2Rα和IL-2相互作用是非常重要的(Wang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：1657-1662，1997；Kruse et al.，EMBO J.11：3237-3244，1992)。具体地说，人IL-4中的突变Tyr124至Asp产生一种拮抗剂，其与IL-4Rα但不与IL-2Rα结合，因而不能产生信号(Kruse et al.，文献同上，1992)。
虽然人和鼠zalpha11配体间螺旋A是相对充分保守的，但螺旋C却有较大差异。两个种的该区域尽管具有占优势的酸性氨基酸，但也有体现zalpha11配体与其“β”型受体间相互作用方面的种特异性的序列差异。zalpha11配体环A/B和螺旋B在种间是充分保守的；尽管尚未鉴定出相当于IL-2Rα的受体亚单位，但贯穿该区域的保守性提示其在功能上是重要的。人和鼠zalpha11配体的D螺旋也是高度保守的。可以通过zalpha11配体螺旋D内的突变来设计zalpha11受体拮抗剂。这些突变可以包括从残基Gln145(SEQ ID NO：2)截短蛋白质，或者将Gln145或Ile148(SEQ ID NO：2的；相当于人IL-4中的Tyr124)突变成诸如Ala或Asp的残基。破坏zalpha11配体螺旋结构的任何突变均可消除与其受体的结合，并因而抑制信号转导。
也根据其组成螺旋的长度对四螺旋束细胞因子进行分组。“长螺旋”形式的细胞因子一般由24-30残基的螺旋组成，其中包括IL-6、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)和人生长激素(hGH)。“短螺旋”形式的细胞因子一般由18-21残基的螺旋组成，其中包括IL-2、IL-4和GM-CSF。据信zalpha11配体是短螺旋形式细胞因子组的新成员。使用CNTF和IL-6进行的研究证明，可以将CNTF螺旋换成IL-6中的等同螺旋，使嵌合体具有CNTF结合性质。为此，可基于结构同源性确定四螺旋细胞因子的功能区，而不必考虑序列同一性，并且可保持嵌合体内的功能完整性(Kallen et al.，J.Biol.Chem.274：11859-11867，1999)。因此，可将zalpha11配体的螺旋区用于制备嵌合融合分子(特别是与其它短螺旋形式的细胞因子融合)，以确定并调节受体结合特异性。其中特别感兴趣的是用螺旋A和/或螺旋D改造的融合蛋白，以及结合其它短形式细胞因子如IL-2、IL-4、IL-15和GM-CSF的螺旋和环区域的融合蛋白质。表1中显示包括zalpha11配体、IL-2、IL-4、IL-15和GM-CSF的螺旋A、B、C和D，以及环A/B、B/C和C/D的氨基酸残基。表1
螺旋A  A/B环 螺旋B  B/C环 螺旋C  C/D环 螺旋D
zalpha11配体残基 41-56  57-68  69-84  85-91  92-105 106-134 135-148  SEQIDNO：2
IL-2残基 36-46  47-52  53-75  76-86  87-99 100-102 103-121  SEQIDNO：111
IL-4残基 29-43  44-64  65-83  84-94  95-118 119-133 134-151  SEQIDNO：112
IL-15残基 45-68  69-83  84-101  102-106  107-119 120-133 134-160  SEQIDNO：113
GM-CSF残基 30-44  45-71  72-81  82-90  91-102 103-119 120-131  SEQIDNO：114
本发明提供编码本文所公开的zalpha11配体多肽的，包括RNA和DNA分子在内的多核苷酸分子。本领域技术人员很容易意识到，由于遗传密码的简并性，这些多核苷酸分子中可能有相当大的序列变异。SEQ ID NO：3是包括编码SEQ ID NO：2的zalpha11配体多肽的所有DNA的简并DNA序列。本领域技术人员将会认识到，用U取代T后SEQID NO：3的简并序列也提供编码SEQ ID NO：2的所有RNA序列。因此，本发明包括其中含有SEQ ID NO：3的核苷酸1或97至核苷酸486的编码zalpha11配体多肽的多核苷酸及其RNA等同物。表2列出用于表示SEQ ID NO：3内简并核苷酸位置的一字母代码。“分辨”是给出由代码字母表示的核苷酸。“补码”表示互补核苷酸的代码。例如，代码Y代表C或T，其补码R代表A互或G，其中A互补于T，而G互补于C。
                           表2
           核苷酸    分辨     补码      分辨
           A          A         T         T
           C          C         G         G
           G          G         C         C
           T          T         A         A
           R         A|G        Y        C|T
           Y         C|T        R        A|G
           M         A|C        K        G|T
           K         G|T        M        A|C
           S         C|G        S        C|G
           W         A|T        W        A|T
           H        A|C|T       D       A|G|T
           B        C|G|T       V       A|C|G
           V        A|C|G       B       C|G|T
           D        A|G|T       H       A|C|T
           N        A|C|G|T     N       A|C|G|T
用于SEQ ID NO：3中的简并密码子包括所给出的氨基酸的所有可能的密码子(如表3所示)。
                    表3氨基酸     一字母代码             密码子                简并密码子Cys        C            TGC TGT                            TGYSer        S            AGC AGT TCA TCC TCG TCT            WSNThr        T            ACA ACC ACG ACT                    ACNPro        P            CCA CCC CCG CCT                    CCNAla        A            GCA GCC GCG GCT                    GCNGly        G            GGA GGC GGG GGT                    GGNAsn        N            AAC AAT                            AAYAsp        D            GAC GAT                            GAYGlu        E            GAA GAG                            GARGln        Q            CAA CAG                            CARHis        H            CAC CAT                            CAYArg        R            AGA AGG CGA CGC CGG CGT........    MGNLys        K            AAA AAG                            AARMet        M            ATG                                ATGIle        I            ATA ATC ATT                        ATHLeu        L            CTA CTC CTG CTT TTA TTG            YTNVal        V            GTA GTC GTG GTT                    GTNPhe        F            TTC TTT                            TTYTyr        Y            TAC TAT                            TAYTrp        W            TGG                                TGGTer        .            TAA TAG TGA                        TRRAsn|Asp    B                                               RAYGlu|Gln    Z                                               SAR任何       X                                               NNN
本领域技术人员将会认识到，在确定代表编码每个氨基酸的所有可能密码子的简并密码子时引入某种双关性。例如，丝氨酸的简并密码子(WSN)在某些情况下可编码精氨酸(AGR)，并且精氨酸的简并密码子(MGN)在某些情况下可编码丝氨酸(AGY)。编码苯丙氨酸和亮氨酸的密码子之间也存在相似的关系。因此，由简并序列所包括的某些多核苷酸可编码变异的氨基酸序列，但本领域技术人员可以参照SEQ IDNO：2的氨基酸序列很容易地鉴别这样的变异序列。如本文所述可以很容易地试验变异序列的功能性。
本领域普通技术人员也会认识到，不同的种可展示“优先密码子选择”(总地参见Grantham，et al.，Nuc.Acids Res.8：1893-912，1980；Haas，et al.，Curr.Biol.6：315-24，1996；Wain-Hobson，et al.，Gene 13：355-64，1981；Grosjean and Fiers，Gene18：199-209，1982；Holm，Nuc.Acids Kes.14：3075-87，1986；Ikemura，J.Mol.Biol.158：573-97，1982)。本文使用的术语“优先密码子选择”或“优先密码子”是一个有关蛋白质翻译密码子的术语，所说的密码子最常用于某些种的细胞中，因此偏爱编码各氨基酸的可能的密码子之一或几个代表(参见表3)。例如，苏氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT编码，但在哺乳动物细胞中最常使用的密码子是ACC；在其它物种中，如在昆虫细胞、酵母、病毒或细菌中可优选不同的Thr密码子。可以用各种已知的方法将特定种的优先密码子引入到本发明的多核苷酸中。例如，在重组DNA中引入优先密码子序列可使特定细胞类型或物种内的蛋白质翻译更为有效，从而提高蛋白质的生产。因此，SEQ ID NO：3中公开的简并密码子序列可用作在本领域中常用的和本文中所公开的各种细胞类型和物种中最佳化表达多核苷酸的模板。可以按照本文所述方法试验含有优先密码子的序列并优化在各种生物体中的表达，然后试验其功能性。
如上文提到的，本发明的分离的多核苷酸包括DNA和RNA。制备DNA和RNA的方法是本领域已知的。一般说来，从大量产生zalpha11配体RNA的组织或细胞中分离RNA。用Northern印迹法(Thomas，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5201，1980)或根据对靶细胞或组织的活性筛选各种类型细胞的条件培养基，以鉴定这样的组织和细胞。一旦鉴定了RNA生产细胞或组织的活性，即可使用异硫氰酸胍提取和其后的CsCl梯度离心分离方法(Chirgwin et al.，Biochemistry 18：52-94，1979)制备总RNA。使用Aviv和Leder(Proc.Natl.Acad.Sci.USA69：1408-12，1972)的方法从总RNA中制备poly(A)+RNA。使用已知方法从poly(A)+RNA制备互补DNA(cDNA)。或者，也可以分离基因组DNA。然后鉴定编码zalpha11配体多肽的多核苷酸并用杂交或PCR等方法分离之。
可以用常规克隆方法得到编码zalpha11配体的全长度克隆。制备互补DNA(cDNA)，但对某些应用(如在转基因动物中表达)来说使用基因组克隆，或者修饰cDNA克隆使之包括至少一个基因组内含子可能是优选的。制备cDNA和基因组克隆的方法是已知的并且是在本领域普通技术水平之内，并包括使用本文公开的用于探查或引导文库的序列或其部分。可以用抗zalpha11受体片段的抗体或其它特异性结合配偶体探查表达文库。
也可以使用本文公开的zalpha11配体多核苷酸序列作为克隆zalpha11配体基因的5′非编码区的探针或引物。鉴于就zalpha11配体所观察到的组织特异性表达，希望该基因区提供造血和淋巴样细胞特异性表达。为此可使用zalpha11配体基因的启动子元件指导外源基因例如在转基因动物或待进行基因治疗的病人中的组织特异性表达。5′侧翼序列的克隆也通过如美国专利5,641,670中公开的“基因活化”而有利于产生zalpha11配体蛋白质。简单地说，可将至少含有导向序列、调节序列、外显子和未配对剪接供体位点的DNA构建物导入zalpha11配体基因座，以改变内源zalpha11配体基因在细胞中的表达。导向序列是允许构建物与内源zalpha11配体基因座同源重组的zalpha11配体5′非编码序列，因而构建物内的序列即可与内源zalpha11配体编码序列可操作地连接。以这种方式，可用其它调节序列置换或补充内源zalpha11配体启动子，从而提供增强的，组织特异的或受到其它方面调节的表达。
本发明进一步提供来自其它种的对应物多肽和多核苷酸(直向同源物)。这些物种包括但不只限于哺乳动物、鸟、两栖动物、爬行动物、鱼、昆虫及其它脊椎动物和无脊椎动物。特别令人感兴趣的是来自其它种哺乳动物如鼠、猪、绵羊、牛、狗、猫、马及其它灵长类的zalpha11配体多肽。可以使用本发明提供的信息和组合物连同常规克隆技术克隆人zalpha11配体的直向同源物(orthologs)。例如，可使用本文所述的得自表达zalpha11配体的组织或细胞类型的mRNA克隆cDNA。可以用根据本文所述序列设计的探针探查Northern印迹，以鉴定mRNA的适当来源。然后从阳性组织或细胞系的mRNA制备文库。用各种方法例如用完整的或部分的人cDNA或用一组或多组基于已公开序列的简并探针探查，以分离编码zalpha11配体的cDNA。也可以使用根据本文公开的代表性人zalpha11配体序列设计的引物，利用聚合酶链反应(PCR)(Mullis，美国专利4,683,202)克隆cDNA。在附加的方法中，可以使用cDNA文库转化或转染宿主细胞，并用抗zalpha11配体多肽的抗体、结合研究或活性测定法检测令人感兴趣的cDNA的表达。也可用相似的技术分离基因组克隆。
已鉴定了zalpha11配体的小鼠直向同源物的多核苷酸序列并示于SEQ ID NO：55中，相应的氨基酸序列则示于SEQ ID NO：56中。在相当于zalpha11配体的SEQ ID NO：2中的残基30-153和SEQ ID NO：56中的残基23-146的124个氨基酸区域内，小鼠和人序列之间有62％同一性。小鼠zalpha11配体的成熟序列推测开始于His18(如SEQ IDNO：56中所示)，其相当于人序列中的His25(如SEQ ID NO：2中所示)。因为截短形式的人多肽是有活性的，所以小鼠zalpha11配体的等价多肽(即没有SEQ ID NO：56的残基His18-Pro22)很可能也是有活性的。组织分析表明，小鼠zalpha11配体的表达见于睾丸、脾和胸腺中。
本领域技术人员将会认识到，SEQ ID NO：1中公开的序列代表人zalpha11配体的单个等位基因，并可望发生等位基因突变和可变剪接。可按照标准方法探查来自不同个体的cDNA或基因组文库，以克隆序列的等位基因变异体。SEQ ID NO：1所示DNA序列的等位基因变异体，包括含有沉默突变的变异体和其中突变导致氨基酸序列改变的变异体均在本发明范围内，SEQ ID NO：2的作为等位基因变异体的蛋白质也在本发明范围内。由可变剪接的mRNA产生的cDNA(其保留zalpha11配体多肽的性质)及由这些cDNA和mRNA编码的多肽包括在本发明范围内。可以用本领域已知的标准方法探查不同个体的cDNA或基因组文库，以克隆这些序列的等位基因变异体和剪接变异体。
已针对IL-2构架标志SHGC-12342绘制了zalpha11配体基因图，其中zalpha11配体距IL-2标志约180Kb。使用周边标志将zalpha11配体基因定位于整合的LDB染色体4图谱上的4q27区中(The GeneticLocation Database，University of Southhampton)。本发明还提供可用于诊断目的的试剂。例如，可使用zalpha11配体基因、包含zalpha11配体DNA或RNA的探针或其亚序列确定zalpha11配体基因是否存在于人染色体(如染色体4)上，或确定是否发生了基因突变。基于含有部分zalpha11配体基因组DNA的人基因组DNA片段(Genbank登记号AC007458)的注释，zalpha11配体定位于染色体4的4q27区。zalpha11配体基因基因座的可检测染色体畸变包括但不只限于非整倍性、基因拷贝数改变、异质性丢失(LOH)、易位、插入、缺失、限制性位点改变以及重排。可以使用本发明的多核苷酸，以限制性片段长度多态性(PFLR)分析、利用PCR技术的短串联重复(STR)分析和本领域已知的其它遗传连锁分析技术(Sambrook et al.，文献同上；Ausubelet al.，文献同上；Marian，Chest 108：255-65，1995)等分子遗传学技术检测这些畸变。
有关基因位置的确切知识可用于许多目的，其中包括1)检测某序列是否为已有重叠群的一部分，并获得各种形式的附加周边遗传序列，如YAC、BAC或cDNA克隆；2)提供与同一染色体区相联系的遗传病可能的候选基因；3)交叉参考可能有助于确定特定基因会有什么功能的模型生物，如小鼠。
如前所述，人zalpha11配体基因位于IL-2基因附近，其存在于已证明与在某些家族中炎性肠道疾病(IBD)(包括Crohn氏病(CD)和溃疡性结肠炎)易感性有联系的染色体4q区域中(Hampe et al.，Am.J.Hum.Genet.64：808-816，1999；Cho et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.95：7502-7507，1999)。另外，zalpha11受体基因定位于与CD易感性有关的另一个基因组区域-16p11(Hugot et al.，Nature 379：821-823，1996；Ohmen et al.，Hum.Mol.Genet.5：1679-1683，1996)。CD是一种常常有全身症状发生的慢性肠道炎症；虽然有关的确切病因学尚不明了，但已知包括对普通肠道抗原没有耐受性在内的免疫调节功能异常是一个主要方面(如参见Braegger et al.，Annals Allergy72：135-141，1994；Sartor，Am.J.Gastroenterol.92：5S-11S，1997)。一些研究发现，CD病人的NK活性异常(如参见Egawa et al.，J.Clin.Lab.Immunol.20：187-192，1986；Aparicio-Pagés et al.，J.Clin.Lab.Immunol.29：119-124，1989；van Tol et al.，Scand.J.Gastroenterol.27：999-1005，1992)，并且缺损记忆B细胞形成已有文献记载(Brogan et al.，J.Clin.Lab.Immunol 24：69-74，1987)。因为zalpha11配体在免疫调节中发挥作用，并且受体和配体的基因都位于CD易感性区域内，所以受体和配体都是确定Crohn氏病遗传诱因的候选基因。
可以用几种方法来确定zalpha11受体和/或zalpha11配体在IBD病理学中的卷入情况。如可以对cDNA测序一样，测定基因组DNA中外显子的序列可以揭示编码序列的突变(包括错义、无义和移码突变)。测定基因组DNA序列的再一个优点是测序的片段内也含有剪接点，并且可揭示剪接异常(例如，如果误剪接的RNA被迅速降解，则剪接点不可能出现于cDNA样品中)。已确定了zalpha11配体的基因组结构。分析IBD病人体内zalpha11配体和受体的其它方法包括：(1)估测由病人的活化T细胞的配体产生并与正常对照组比较(即通过生物测定)；(2)zalpha11受体或zalpha11配体RNA与IBD病人的发炎肠组织切片进行原位杂交，并与正常对照组的相似切片相比较；(3)对IBD病人的切片进行免疫组织化学分析，并与正常对照组比较；(4)用细胞分裂测定法估测病人的外周血B细胞对zalpha11配体的反应性。
诊断可有助于医师确定疾病类型和适当的相关治疗方案，或者可有助于提供遗传咨询。本发明的抗zalpha11配体抗体、多核苷酸和多肽可用于检测zalpha11配体多肽、mRNA或抗zalpha11配体抗体，从而作为标记物并使用本领域已知的和本文所述的方法，将其直接用于检测遗传病或癌症。此外，可以使用zalpha11配体多核苷酸探针检测涉及本文所述染色体4q27的异常。这些异常可能与人类疾病，或肿瘤发生、自发流产或其它遗传病有关。因此，可使用zalpha11配体多核苷酸探针检测与异常或这些缺陷有关的基因型。
如上所述，zalpha11配体基因本身的缺陷可能导致人的可遗传疾病。本发明的分子，如本发明的多肽、拮抗剂、激动剂、多核苷酸和抗体将会有助于检测、诊断、预防和治疗与zalpha11配体遗传缺陷有关的疾病。另外，可使用zalpha11配体多核苷酸探针检测zalpha11配体染色体基因座上患病或未患病个体间的等位基因差异。这样，即可使用zalpha11配体序列作为法医学DNA分布型分析的诊断试剂。
一般说来，用于遗传连锁分析，以检测病人遗传异常和畸变的诊断方法是本领域已知的。大多数诊断方法包括以下步骤：(i)从潜在患病病人、患病病人或隐性疾病等位基因的潜在未患病携带者得到遗传样品；(ii)将遗传样品与zalpha11配体多核苷酸探针一起温育以产生第一反应产物，其中例如在RFLP分析中多核苷酸将与互补多核苷酸序列杂交，或者于适当的PCR反应条件下使遗传样品在PCR反应中与有义和反义引物一起温育；(iii)以凝胶电泳法和/或其它已知的方法显现第一反应产物，例如用zalpha11配体多核苷酸探针显现第一反应产物，其中多核苷酸将与第一反应的互补多核苷酸序列杂交；以及(iv)将显现的第一反应产物与来自正常或对照个体的遗传样品的第二对照反应产物相比较。第一反应产物和对照反应产物间的差异即指示患病或潜在患病病人有遗传异常，或存在未患病病人的杂合隐性携带者表型，或存在患病病人的肿瘤遗传缺陷，或存在胎儿或植入前胚胎的遗传异常。例如，限制性片段图形、PCR产物长度、zalpha11配体遗传基因座上重复序列的长度等的差异都是遗传异常、遗传畸变的指征，或者显示有不同于正常对照的等位基因差异。依据试验和样品可利用性的不同，对照样品可得自未受影响的家族成员或无关的个体。本发明中使用的遗传样品包括从病人的组织或其它生物学样品例如血液、唾液、精液、胚胎细胞、羊水等分离的基因组DNA、mRNA和cDNA。多核苷酸探针或引物可以是RNA或DNA，并将包括SEQ ID NO：1的一部分(SEQ ID NO：1的互补体)，或其RNA等同物。这些显示对人疾病表型进行遗传连锁分析的方法是本领域已知的。有关基于PCR的诊断方法一般可参见Mathew(ed.)，Protocols in Human MolecularGenetics(Humana Press，Inc.1991)，White(ed.)，PCR Protocols.Current Methods and Applications(Humana Press，Inc.1993)，Cotter(ed.)，Molecular Diagnosis of Cancer(Humana Press，Inc.1996)，Hanausek and Walaszek(eds.)，Tumor Marker Protocols(Humana Press，Inc.1998)，Lo(ed.)，Clinical Applications ofPCR(Humana Press，Inc.1998)，和Meltzer(ed.)，PCR inBioanalysis(Humana Press，Inc.1998))。
可按照直接突变分析的标准方法，例如限制性片段长度多态性分析法、利用PCR技术的短串联重复分析法、扩增不应突变系统分析法、单链构象多态性检测法、RNA酶切割法、变性梯度凝胶电泳法、荧光辅助的错配分析法以及本领域已知的其它遗传分析技术(如参见Mathew(ed.)，Protocols in Human Molecular Genetics(humanaPress，Inc.1991)；Marian，chest 108：255(1995)，Coleman andTsongalis，Molecular Diagnostics(Human Press，Inc.1996)；Elles(ed.)Molecular Diagnosis of Genetic Diseases(HumanaPress，Inc.1996)；Landegren(ed.)，Laboratory Protocols forMutation Detection(Oxford University Press 1996)；Birren etal.(eds.)，Genome Analysis，Vol.2：Detecting Genes(ColdSpring Harbor Laboratory Press 1998)；Dracopoli et al.(eds.)，Current Protocols in Human Genetics(Tohn Wiley & Sons 1998)，以及Richards and Ward，“Molecular Diagnostic Testing，”inPrinciples of Molecular Medicine，pages 83-88(Humana Press，Inc.1998))，使用本发明的核酸分子检测与zalpha11配体基因座有关的突变。可使用受试者的基因组DNA直接分析zalpha11配体基因的突变。扩增例如从外周血淋巴细胞得到的基因组DNA的方法是本领域技术人员已知的(如参见Dracopoli et al.(eds)，Current Protocolsin Human Genetics，page 7.1.6-7.1.7(John Wiley & Sons，1998))。
鉴定基因组克隆，然后测定内含子/外显子接点的序列，以确定zalpha11配体基因中内含子的位置。第一个内含子位于SEQ ID NO：2中氨基酸残基56(Leu)和残基57(Val)之间，长度为115个碱基对。第二个内含子最长，位于SEQ ID NO：2中氨基酸残基68(Glu)和残基69(Thr)之间，长度为4.4千碱基。第三个内含子位于SEQ ID NO：2中氨基酸残基120(Leu)和残基121(Thr)之间，长度为2.6千碱基。最后一个内含子位于SEQ ID NO：2中氨基酸残基146(Lys)和残基147(Met)之间，长度为89个碱基对。完整基因跨越约8Kb。
zalpha11配体基因的结构相似于IL-2基因的结构(Fujita et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.80：7437-7441，1983)，但zalpha11配体基因含有一个附加内含子(内含子4)。虽然IL-2基因的总长度稍小(约6Kb)，但短的第一内含子和长的第二与第三内含子的模式在两基因之间是保守的。另一方面，IL-15基因由8个外显子组成并跨越至少34Kb(Anderson et al.，Genomics 25：701-706，1995)。因此，zalpha11配体基因在结构上更相似于IL-2基因，然后才是相似于IL-15基因。
在本发明的实施方案中，编码分离的zalpha11配体的核酸分子在严格条件下可与具有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的核酸分子杂交，与具有SEQ ID NO：1所示核苷酸47-532的核苷酸序列的核酸分子杂交，或与具有互补于SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子杂交。一般说来，所选择的严格条件是在限定的离子强度和pH下，比特定序列的热熔点(Tm)大约低5℃。Tm是50％的靶序列与完全匹配的探针相杂交的温度(在限定的离子强度和pH下)。
如果核苷酸序列有某种程度的互补性，则一对核酸分子如DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA即可杂交。杂合体可以耐受双螺旋中的错配碱基对，但杂合体的稳定性受到错配程度的影响。每1-1.5％碱基对错配，错配杂合体的Tm降低1℃。改变杂交条件的严格性可以控制存在于杂合体中的错配的程度。严格性程度随着杂交温度升高和杂交缓冲液的离子强度降低而增加。
适用于特定多核苷酸杂合体的杂交条件是本领域技术人员能够掌握的。特定靶序列的Tm是50％靶序列与完全匹配的探针序列杂交的温度(在限定的条件下)。影响Tm的条件包括多核苷酸探针的大小和碱基对含量、杂交溶液的离子强度，以及杂交溶液中去稳定剂的存在。计算Tm的许多公式是本领域已知的，并且对于不同长度的DNA，RNA和DNA-RNA杂合体及多核苷酸探针序列是特异的(如参见Sambrook etal.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition(Cold Spring Harbor Press 1989)；Ausubel et al.，(eds.)，CurrentProtocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，Inc.1987)；Berger and Kimmel(eds.)，Guide to Molecular Cloning Techniques，(Academic Press，Inc.1987)；和Wetmur，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.26：227(1990))。OLIGO 6.0(LSR：Long Lake，MN)和PrimerPremier 4.0 (Premier Biosoft International；Palo Alto，CA)等序列分析软件，以及互联网上的站点是分析给定的序列和基于使用者限定的标准计算Tm的可利用的工具。这些程序也可以在限定的条件下分析给定的序列并鉴定适当的探针序列。一般说来，在低于计算的Tm大约20-25℃的温度下进行较长多核苷酸序列(＞50个碱基对)的杂交。对于较小的探针(＜50个碱基对)，一般在Tm或低于计算的Tm约5-10℃的温度下进行杂交。这样可使DNA-DNA和DNA-RNA杂合体有最大杂交率。
杂交后，可在严格或高度严格条件下洗涤核酸分子，以除去未杂交的核酸分子。典型的严格洗涤条件包括于55-65℃在含有0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)的0.5×-2×SSC溶液中洗涤。也就是说，在严格洗涤条件下编码变异体zalpha11配体多肽的核酸分子与具有SEQ IDNO：1所示核苷酸序列(或其补码)的核酸分子杂交，其中洗涤严格性相当于55-65℃下含有0.1％SDS的0.5×-2×SSC，包括55℃下含有0.1％SDS的0.5×SSC，或65℃下含有0.1％SDS的2×SSC。本领域技术人员可以很容易地设计等同的条件，例如用SSPE取代洗涤溶液中的SSC。
典型的高度严格洗涤条件包括于50-65℃在含有0.1％SDS的0.1×-0.2×SSC溶液中洗涤。换句话说，编码变异体zalpha11配体多肽的核酸分子在高度严格洗涤条件下与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列(或其补码)的核酸分子杂交，其中洗涤严格性相当于50-65℃下含有0.1％SDS的0.1×-0.2×SSC，包括50℃下含0.1％SDS的0.1×SSC，或65℃下含0.1％SDS的0.2×SSC。
本发明还提供具有与SEQ ID NO：2的多核苷酸基本上相似序列同一性的分离的zalpha11配体多肽，或它们的直向同源物。本文使用的术语“基本上相似序列同一性”是指包括与SEQ ID NO：2中所示序列至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或大于95％序列同一性的多肽，或它们的直向同源物。本发明还包括含有与SEQ ID NO：2中氨基酸残基1-162或33-162序列有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或大于95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。本发明进一步包括编码所说多肽的核酸分子。确定百分同一性的方法如下文所述。
本发明还包括可使用下列两个标准鉴定的变异体zalpha11配体核酸分子：确定被编码的多肽与SEQ ID NO：2的氨基酸序列之间的相似性，和/或如上所述的杂交测定。所说的zalpha11配体变异体包括这样一些核酸分子：(1)在严格洗涤条件与具有SEQ ID NO：1核苷酸序列(或其补码)的核酸分子杂交，其中洗涤严格性相当于55-65℃下含有0.1％SDS的0.5×-2×SSC，或(2)编码与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或大于95％序列同一性的多肽。或者，zalpha11配体变异体也可表征为这样的核酸分子：(1)在高度严格洗涤条件下与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列(或其补码)的核酸分子杂交，其中洗涤严格性相当于50-65℃下含有0.1％SDS的0.1×-0.2×SSC，以及(2)编码与SEQ ID NO：2的氨基酸序列有至少70％，至少80％，至少90％，至少95％或大于95％序列同一性的多肽。
用常规方法确定百分序列同一性(例如参见Altschul et al.，Bull.Math.Bio.48：603，1986；和Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915，1992)。简单地说，如表4中所示，使用缺口开放罚10，缺口延伸罚1，和Henikoff和Henikoff(文献出处同上)的“BLOSUM62”评分矩阵对比两个氨基酸序列，以最佳化序列对比评分(氨基酸以标准的一字母代码表示)。
Figure A0080687400331
                        表4
A  R  N  D  C  Q  E  G  H  I  L  K  M  F  P  S  T  W  Y  VA   4R  -1  5N  -2  0  6D  -2 -2  1  6C   0 -3 -3 -3  9Q  -1  1  0  0 -3  5E  -1  0  0  2 -4  2  5G   0 -2  0 -1 -3 -2 -2  6H  -2  0  1 -1 -3  0  0 -2  8I  -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3  4L  -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3  2  4K  -1  2  0 -1 -3  1  1 -2 -1 -3 -2  5M  -1 -1 -2 -3 -1  0 -2 -3 -2  1  2 -1  5F  -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1  0  0 -3  0  6P  -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4  7S   1 -1  1  0 -1  0  0  0 -1 -2 -2  0 -1 -2 -1  4T   0 -1  0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1  1  5W  -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1  1 -4 -3 -2 11Y  -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3  2 -1 -1 -2 -1  3 -3 -2 -2  2  7V   0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3  3  1 -2  1 -1 -2 -2  0 -3 -1  4
本领域技术人员认识到有许多已建立的算法可用于对比两个氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性检索算法是用于检查本文所公开的氨基酸序列和推断的变异体zalpha11配体氨基酸序列共享的同一性水平的适宜的蛋白质序列对比方法。有关FASTA算法可参见Pearson and Limpman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444(1988)和Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)。
简单地说，FASTA首先在不考虑保守性氨基酸取代、插入或缺失的情况下，鉴定由询问序列(如SEQ ID NO：2)和具有最高密度同一性(如果Ktup变量是1)或部分同一性(如果Ktup＝2)的试验序列所共享的区域。然后使用氨基酸取代矩阵比较所有成对氨基酸的相似性，并“修整”区域的末端以只包括对最高评分有贡献的那些残基，对有最高密度同一性的十个区域重新评分。如果有几个分数大于“截止”值(基于序列长度和Ktup值，用预定的公式计算的)的区域，则检查经修整的起始区域以确定这些区域是否可以连接形成带有缺口的近似的顺序。最后，使用改良的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman andWunsch，J.Mol.Biol.48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math.26：787(1974))对比两个氨基酸序列的最高评分区域(其允许氨基酸插入和缺失)。FASTA分析的优选参数是：Ktup＝1，缺口开放罚＝10，缺口延伸罚＝1，取代矩阵＝BLOSUM62。如Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)附录2中所述，经改良评分矩阵存储器(“SMATRIX”)可将这些参数引入FASTA程序中。
也可按上述比例，使用FASTA确定核酸分子的序列同一性。为了进行核苷酸序列比较，可使Ktup值定在1-6，优选3-6，最优选3，其它参数定为不存在。
变异体zalpha11配体多肽或有基本上相似序列同一性的多肽的特征为带有一个或多个氨基酸取代、缺失和加入。这些改变最好是不重要性质的，即不显著影响多肽折叠或活性的保守氨基酸取代(见表5)及其它取代；小的缺失，一般为1-30个氨基酸的缺失；以及氨基或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基、多达约20-25个残基的小的接头肽，或亲和标记。因此本发明包括有大约108-216个氨基酸残基的多肽，其包含一个与SEQ ID NO：2的相应区域有至少70％，优选至少90％，最优选95％或更高同一性的序列。含有亲和标记的多肽可在zalpha11配体多肽和亲和标记之间进一步包括蛋白酶剪切位点。优选的这类位点包括凝血酶剪切位点和因子Xa剪切位点。
                        表5
                  保守氨基酸取代
          碱性：          精氨酸
                          赖氨酸
                          组氨酸
          酸性：          谷氨酸
                          天冬氨酸
          极性：          谷氨酰胺
                          天冬酰胺
          疏水：          亮氨酸
                          异亮氨酸
                          缬氨酸
          芳香：          苯丙氨酸
                          色氨酸
                          酪氨酸
          小的：          甘氨酸
                          丙氨酸
                          丝氨酸
                          苏氨酸
                          蛋氨酸
可以确定含有对于维持结构完整性十分重要的区域或结构域的氨基酸残基。在这些区域内，可确定对于改变和维持分子的整体四级结构有较大或较小耐受性的特定残基。分析序列结构的方法包括但不只限于有高氨基酸或核苷酸同一性、二级结构倾向、二进制模式、互补卷曲和隐蔽极性相互作用的多重序列的对比(Barton，Current Opin.Struct. Biol. 5：372-376，1995和Cordes et al.，Current OpinStruct.Biol.，6：3-10，1996)。一般说来，当设计对分子的修饰或鉴定特定片段时，可以通过估计被修饰分子的活性来确定结构。
在zalpha11配体多肽中造成氨基酸序列改变，从而尽量减小对维持生物学活性必不可少的高级结构的破坏。例如，当zalpha11配体多肽包括一个或多个螺旋时，将造成氨基酸残基的改变，以便不破坏螺旋几何结构及分子的其它组成成分(构象改变可消除某些重要功能，例如，分子与其结合对象如A和D螺旋、SEQ ID NO：2的残基44、47和135的结合)。例如可用如上所公开的计算机模型设计来推测或通过分析晶体结构(如参见Lapthorn et al.，Nat.Struct.Biol.2：266-268，1995)来确定氨基酸序列改变所造成的影响。本领域已知的其它技术是将变异体蛋白质的折叠与标准分子(如天然蛋白质)相比较。例如，可以将变异体中的半胱氨酸模式与标准分子相比较。质谱和使用还原及烷基化的化学修饰方法可用于确定与二硫键有关联或没有这种关联的半胱氨酸残基(Bean et al.，Anal.Biochem.201：216-226，1992；Gray，Protein  Sci.2：1732-1748，1993；和Patterson et al.，Anal.Chem.66：3727-3732，1994)。一般认为，如果被修饰的分子没有与标准分子相同的半胱氨酸模式，则折叠就会受到影响。检测折叠的另一个已知的和公认的方法是园二色性(CD)。检测和比较由修饰的分子和标准分子产生的CD谱属于常规技术(Johnson，Proteins 7：205-214，1990)。晶体学是分析折叠和结构的另一种已知方法。核磁共振(NMR)、消化肽作图和表位作图也是分析蛋白质和多肽之间的折叠和结构相似性的已知方法(Schaanan et al.，Science 257：961-964，1992)。
可以产生如SEQ ID NO：2中所示zalpha11配体蛋白质序列的Hopp/Woods亲水性分布图(Hopp et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.78：3824-3828，1981；Hopp，J.Immun，Meth.88：1-18，1986和Triquier et al.，Protein Engineering 11：153-169，1998)。该分布型是基于滑动6残基窗口。不考虑隐蔽的G、S和T残基以及暴露的H、Y和W残基。例如，在zalpha11配体中，亲水区域包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基114-119、101-105、126-131、113-118和158-162。
本领域技术人员将会意识到，当按照设计对zalpha11配体多肽的氨基酸序列进行修饰时应考虑到亲水性和疏水性问题，以便不破坏总体结构和生物学分布型。特别感兴趣的取代是选自Val、Leu和Ile，或选自Met、Gly、Ser、Ala、Tyr和Trp的疏水残基。例如，对取代有耐受能力的残基可包括SEQ ID NO：2中所示的残基100和103。SEQID NO：2中位置71、78、122和125上的半胱氨酸残基相对地不耐受取代。
可以分析IL-15、IL-2、IL-4和GM-CSF与zalpha11配体之间的序列相似性，以推导出必需氨基酸的同一性。使用如前所述的“FASTA”分析等方法，鉴定蛋白质家族内的高度相似性区域并用于分析保守区的氨基酸序列。基于结构来鉴定变异体zalpha1l配体多核苷酸的另一种可代用方法是如上所讨论的，确定编码潜在变异体zalpha11配体基因的核苷酸分子是否可与具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列的核酸分子杂交。
鉴定本发明的多肽中必需氨基酸的其它方法是本领域已知的，例如位点特异性诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham and Wells，Science 244：1081(1989)；Bass et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：4498(1991)；Coombs  and Corey，“Site-DirectedMutagenesis and Protein Engineering”，in Proteins：Analysisand Design，Angeletti(ed.)，pp.259-311(Academic Press，Inc.，1998))。在后一种技术中，在分子的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并按下述方法试验所得到的突变分子的生物学或生物化学活性，以鉴定对于分子的活性必不可少的氨基酸残基(也参见Hilton etal.，J.Biol.Chem.271：4699(1996))。
本发明还包括zalpha11配体多肽的功能性片段和编码这些功能性片段的核酸分子。本文所限定的“功能性”zalpha11配体或其片段的特征在于其增殖或分化活性、其诱导或抑制特化的细胞功能的能力，或其与抗zalpha11配体抗体或zalpha11受体(可溶性的或固定化的)特异性结合的能力。如上文所述，zalpha11配体的特征在于包括与SEQ ID NO：2中所示的螺旋A(氨基酸残基41-56)、螺旋B(氨基酸残基69-84)、螺旋C(氨基酸残基92-105)和螺旋D(氨基酸残基135-148)的四螺旋束结构。因此，本发明进一步提供包括：(a)含有一个或多个上述螺旋的多肽分子；和(b)含有一个或多个上述螺旋的功能性片段的融合蛋白质。该融合蛋白质的其它多肽部分可来源于另一种四螺旋束细胞因子如IL-15、IL-2、IL-4和GM-CSF，或者来源于有利于融合蛋白质分泌的非天然的和/或无关的分泌信号肽。
因此本发明提供至少包括四个多肽的融合蛋白质，其中从N端至C端多肽的顺序是：包括选自下列一组中的氨基酸的第一个多肽：(a)SEQ ID NO：111的IL-2螺旋A氨基酸残基36-46，(b)SEQ ID NO：112的IL-15螺旋A氨基酸残基29-43，(c)SEQ ID NO：113的IL-4螺旋A氨基酸残基45-68，(d)SEQ ID NO：114的GM-CSF螺旋A氨基酸残基30-44，和(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基41-56；6-27个氨基酸的第一个间隔区；包括选自下列一组的氨基酸残基的第二个多肽：(a)SEQ ID NO：111的IL-2螺旋B氨基酸残基53-75，(b)SEQ IDNO：112的IL-4螺旋B氨基酸残基65-83，(c)SEQ ID NO：113的IL-15螺旋B氨基酸残基84-101，(d)SEQ ID NO：114的GM-CSF螺旋B氨基酸残基72-81，和(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基69-84；5-11个氨基酸残基的第二个间隔区；包括选自下列一组中的氨基酸残基的第三个多肽：(a)SEQ ID NO：111的IL-2螺旋C残基87-99，(b)SEQ IDNO：112的IL-4螺旋C残基95-118，(c)SEQ ID NO：113的IL-15螺旋C残基107-119，(d)SEQ ID NO：114的GM-CSF螺旋C残基91-102，和(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基92-105；3-29个氨基酸残基的第三个间隔区；以及包括选自下列一组氨基酸残基的第四个多肽：(a)SEQID NO：111的IL-2螺旋D氨基酸残基103-121，(b)SEQ ID NO：112的IL-15螺旋D氨基酸残基134-157，(c)SEQ ID NO：113的IL-4螺旋D氨基酸残基134-160，(d)SEQ ID NO：114的GM-CSF螺旋D氨基酸残基120-131，和(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基135-148，其中四个多肽中的至少一个来自zalpha11配体。在其它实施方案中，间隔肽将选自如表1中所示的zalpha11配体、IL-2、IL-4、IL-15或GM-CSF的A/B、B/C和C/D环。
可以进行核酸分子的常规缺失分析以得到编码zalpha11配体多肽的核酸分子的功能性片段。例如，可以用Bal31核酸酶消化具有SEQID NO：1的核苷酸序列或其片段的DNA分子，以得到一系列嵌套缺失。然后将这些DNA片段插入到表达载体的适当读框中，分离所表达的多肽并试验zalpha11配体活性，或与抗zalpha11配体抗体或zalpha11受体结合的能力。核酸外切酶消化的一种可代用方法是使用寡核苷酸特异性诱变导入缺失或终止密码子，以指导产生所需的zalpha11配体片段。或者，也可使用聚合酶链反应合成zalpha11配体基因的特定片段。
鉴定功能区域的标准方法是本领域技术人员已知的。例如，Horisberger和Di Marco(Pharmac.Ther.66：507，1995)总结了在干扰素的任一个或两个末端进行平截研究的结果。此外，有关蛋白质功能分析的标准技术例如可参见Treuter et al.，Molec.Gen.Genet.240：113(1993)；Content et al.，“Expression and preliminarydeletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by humaninterferon，”in Biological Interferon Systems，Proceedings ofISIR-TNO Meeting on Interferon Systems，Cantell(ed.)，pp.65-72(Ni jhoff 1987)；Herschman，“The EGF Receptor，”in Controlof Animal Cell Proliferation 1，Boynton et al.，(eds.)pages169-199(Academic Press 1985)；Coumailleau et al.，J.Biol.Chem.270：29270(1995)；Fukunaga et al.，J.Biol.Chem.270：25291(1995)；Yamaguchi et al.，Biochem.Pharmacol.50：1295(1995)；和Meisel et al.，Plant Molec.Biol.30：1(1996)。
可造成多重氨基酸取代并使用诱变和筛选方法进行试验(如参见Reidhaar-Olson and Sauer，Science 241：53(1988)或Bowie andSauer，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152(1989))。简单地说，这些作者公开了同时随机化设定多肽中的两个或多个位置，选择功能性多肽，然后测定被诱变多肽的序列以确定各位置上可容许的取代的范围。可使用的其它方法包括噬菌体显示(如Lowman et al.，Biochem.30：10832(1991)；Ladner et al.，美国专利No.5,223,409；Huse，国际专利申请公开号WO 92/06204)，和区域特异性诱变(Derbyshireet al.，Gene 46：145(1986)；和Ner et al.，DNA 7：127(1988))。
也可通过Stemmer(Nature 370：389(1994)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：10747(1994))和国际专利申请公开号WO 97/20078所公开的DNA改组产生已公开的zalpha11配体核苷酸和多肽序列的变异体。简单地说，随机切断亲代DNA，然后使用PCR重新组装，导致随机导入的点突变，经体外同源重组产生变异体DNA分子。使用亲代DNA分子家族如不同种的DNA分子或等位基因变异体改进这一技术，以在此过程中引入附加的变异性。选择或筛选所需的活性，然后再次重复诱变和测定，通过选择所期望的突变同时淘汰不利的改变提供迅速的序列“演化”。
可将本文所述的诱变方法与高通量自动筛选方法联合使用以检测宿主细胞中克隆的、诱变的多肽。可以从宿主细胞中回收编码生物活性多肽或与抗zalpha11配体抗体或可溶性zalpha11受体结合的多肽，并使用先进的装置快速测序。这些方法允许迅速确定个别氨基酸残基在感兴趣的多肽中的重要性，并可应用于未知结构的多肽。
此外，可以将本发明的蛋白质(或其多肽片段)连接到其它生物活性分子，特别是其它细胞因子上，以提供多功能分子。例如，可以将zalpha11配体的一个或多个螺旋连接到其它细胞因子上，以提高其生物学活性或生产效率。
因此本发明提供一系列新的，其中含有一个或多个zalpha11配体螺旋的片段被融合到另一个多肽上的杂合分子。融合时优选在DNA水平上剪接，以允许在重组生产系统中表达嵌合分子。然后测定所得分子的这类性质，如改善的溶解度、改善的稳定性、延长的清除半衰期、改善的表达和分泌水平，以及药物动力学。这样的杂合分子可进一步在组成蛋白或多肽之间包含附加的氨基酸残基(如多肽接头)。
非天然存在的氨基酸包括但不只限于反式-3-甲基脯氨酸、2，4-亚甲基脯氨酸、顺式-4-羟脯氨酸、反式-4-羟脯氨酸、N-甲基甘氨酸、别-苏氨酸、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基同型半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、同型谷氨酰胺、2-吡啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸。将非天然存在的氨基酸残基掺入到蛋白质中的几种方法是本领域已知的。例如，可使用化学上氨酰基化的抑制性tRNA抑制无义突变，以此作为体外掺入系统。合成氨基酸和氨酰基化tRNA的方法是本领域已知的。一般可在含有大肠杆菌S30提取物和商品酶及其它试剂的无细胞体系中进行含有无义突变的质粒的转录和翻译。用层析法纯化蛋白质(如参见Robertson et al.，J.Am.Chem.Soc.113：2722(1991)；Ellman et al.，Methods Enzymol.202：301(1991)；Chung et al.，Science 259：806(1993)和Chung et al.，Proc.Natl.Acad.SciUSA 90：10145(1993))。
第二种方法包括，在非洲爪蟾卵母细胞中微量注射突变的mRNA和化学上氨酰基化的抑制性tRNA以进行翻译(Turcatti et al.，J.Biol.Chem.271：19991(1996))。在第三种方法内，将大肠杆菌细胞培养在没有待取代的天然氨基酸(如苯丙氨酸)但存在所需的非天然存在的氨基酸(如2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的培养条件下。将非天然存在的氨基酸掺入到蛋白质中以代替其天然对应的氨基酸(Koide et al.，Biochem.33：7470(1994))。可用体外化学修饰方法将天然存在的氨基酸转化成非天然存在的氨基酸。化学修饰可以与位点特异性诱变联合使用以进一步扩展取代的范围(Wynn and Richards，Protein Sci.2：395(1993))。稳定zalpha11配体以延长分子的半衰期，特别是延长活性状态下的代谢持久性可能是有利的。为了延长半衰期，可以使用本文所述的方法化学修饰zalpha11配体分子。PEG化就是一种常用方法并已证明可增加血浆半衰期、提高溶解度和降低抗原性及免疫原性(Nucci et al.，Advanced Drug Delivery Reviews 6：133-155，1991和Lu et al.，Int.J.Peptide Protein Res.43：127-138，1994)。
有限数目的非保守氨基酸、不是由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸以及非天然氨基酸均可取代zalpha11配体上的氨基酸残基。
本发明还提供含有本文所述的zalpha11配体多肽的带有表位的部分的多肽片段或肽。这样的多肽片段或肽可包含构成蛋白质的一部分并当将整个蛋白质用作免疫原时引发抗体反应的“免疫原性表位”。可以使用标准方法(如参见Geysen et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：3998(1983))鉴定带有免疫原性表位的肽。
相反，多肽片段或肽可包含“抗原表位”，其为蛋白质分子上的抗体能与之结合的区域。某些表位是由线性的或一段连续的氨基酸组成的，而且这样的表位的抗原性不被变性剂所破坏。在本领域中已知可以使用可模拟蛋白质表位的相对短的合成肽刺激抗该蛋白质的抗体的产生(如参见Sutcliffe et al.，Science 219：660(1983))。因此，本发明的带有抗原表位的肽和多肽可用于产生与本文所述的多肽结合的抗体。可使用Hopp/Woods亲水性分布图来确定可能最具抗原性的区域(Hopp et al.，1981，上述文献和Hopp，1986，上述文献)。zalpha11配体中的这些区域包括：SEQ ID NO：2的氨基酸残基114-119、101-105、126-131、113-118和158-162。
带有抗原性表位的肽和多肽优选含有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：56的至少4-10个，至少10-14个，或大约14-30个氨基酸。可以按本文所述的方法分割zalpha11配体多肽或以肽化学合成方法制得这样的带有表位的肽和多肽。此外，可以根据随机肽文库的噬菌体展示(如参见Lane and Stephen，Curr.Opin.Immunol.5：268(1993)和Cortese et al.，Curr.Opin.Biotechnol.7：616(1996))选择表位。例如可按照Mole，“ Epitope Mapping”，in Methods in MolecularBiology Vol.10，Manson(ed.)，pp.105-116(The Humana Press，Inc.，1992)；Price“Production and Characterization  ofSynthetic Peptide-Derived  Antibodies”，in  MonoclonalAntibodies：Production，Engineering，and Clinical Application，Ritter and Ladyman(eds.)，pp.60-84 (Cambridge UniversityPress，1995)，和Coligan等人(eds.)Current Protocols inImmunology，pp.9.3.1-9.3.5和9.4.1-9.4.11(John Wiley & Son，1997)中所述的标准方法鉴定表位并从含有表位的小肽生产抗体。
不管变异体zalpha11配体多核苷酸的特定核苷酸序列是什么，该多核苷酸总是编码具有增殖或分化活性、能够诱导或抑制特化的细胞功能，或能够与抗zalpha11配体抗体或zalpha11受体特异性结合的多肽。更具体地说，变异体zalpha11配体多核苷酸将编码表现有SEQID NO：2所示多肽的至少50％，优选大于70％，80％或90％活性的多肽。
对于包括变异体和融合蛋白在内的任何zalpha11配体多肽，本领域普通技术人员很容易使用上面表1和表2中所列出的信息产生编码变异体的全简并多核苷酸序列。
本发明进一步提供各种其它的多肽融合体(以及包括一个或多个多肽融合体的相关多聚蛋白)。例如，可以按照美国专利5,155,027和5,567,584中所述的方法作为与二聚蛋白的融合体制备zalpha11配体多肽。在这方面，优选的二聚蛋白包括免疫球蛋白恒定区。可在遗传工程改造的细胞中表达免疫球蛋白-zalpha11配体多肽融合体(以产生各种多聚zalpha11配体类似物)。可将辅助区与zalpha11配体多肽融体以将其导向特定的细胞、组织或大分子。例如，可以使zalpha11配体多肽与特异性结合靶细胞表面上的受体结合的配体融合，以将zalpha11配体多肽或蛋白质导向预定的细胞类型。按这种方式，可将多肽和蛋白质定向用于治疗或诊断目的。可以使zalpha11配体多肽与两个或多个部分如亲和标记(用于纯化)和导向区域融合。多肽融合体也可包括一个或多个切割位点，特别是结构域间切割位点(参见Tuan et al.，Connective Tissue Research 34：1-9，1996)。
使用本文讨论的方法，本领域普通技术人员可以鉴定和/或制备各种与SEQ ID NO：2的残基1-162或33-162有基本上相似序列同一性的多肽，或其功能性片段或融合体，其中这样的多肽或片段或融合体保留有野生型蛋白质的性质，如能够刺激增殖和分化，诱导特化的细胞功能或结合zalpha11受体或zalpha11配体抗体。
可以在遗传工程化宿主细胞中，按照常规技术生产本发明的zalpha11配体多肽，包括全长度多肽、功能性片段及融合多肽。适当的宿主细胞是可以被外源DNA转化或转染的并可在培养物中生长的细胞，包括细菌、真菌细胞及培养的高等真核细胞。优选的是真核细胞，特别是来自多细胞生物体的培养的细胞。操纵克隆的DNA分子和将外源DNA导入各种宿主细胞的技术可参见Sambrook et al.，MolecularCloning：A Laboratory Mannual，2nd ed.，Cold  Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989和Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley andSons，Inc.，NY，1987。
一般说来，将编码zalpha11配体多肽的DNA序列，在表达载体内，可操作地连接到其表达所需的，如转录启动子和终止子等其它遗传元件上。载体一般还将含有一个或多个选择标记及一个或多个复制原点，但本领域技术人员可认识到，在某些系统中，选择标记可在分立的载体上提供，并且可通过整合到宿主细胞基因组中来提供外源DNA的复制。本领域技术人员可以常规选择启动子、终止子、选择标记、载体及其它元件。文献中已描述了这些可从市场上购得的元件。
为了引导zalpha11配体多肽进入宿主细胞的分泌途径，须在表达载体中提供一个分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列或前序列)。分泌信号序列可以是zalpha11配体的序列，或者可衍生于另一种分泌蛋白(如t-PA)，或者是从头合成的。分泌信号序列被可操作地连接到zalpha11配体DNA序列上，即两个序列按正确读框连接并且其定位足可引导新合成的多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码感兴趣的多肽的DNA序列的5′端，但有些分泌信号序列也可位于感兴趣的DNA序列中(如参见Welch et al.，美国专利5,037,743；Holland et al.，美国专利5,143,830)。
另外，也可使用包含在本发明多肽中的分泌信号序列引导其它多肽进入分泌途径。本发明提供这样的融合多肽。可使用本文公开的方法和已知方法将衍生于SEQ ID NO：2的氨基酸残基1-31的分泌信号序列可操作地连接到编码另一种多肽的DNA序列上，以制得信号融合多肽。包含在本发明融合多肽中的分泌信号序列优选的是将氨基末端融合到一个附加肽上，以指导附加肽进入分泌途径。这样的构建物具有本领域已知的许多用途。例如，这些新的分泌信号序列融合构建物可指导正常非分泌蛋白的活性成分的分泌。这些融合体可用于体内或体外指导肽通过分泌途径。
培养的哺乳动物细胞是本发明中适用的宿主。将外源DNA导入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler et al.，Cell14：725，1978；Corsaro and Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603，1981；Graham and Van der Eb，Virology 52：456，1973)、电穿孔(Neumann et al.，EMBO J.1：841-5，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel et al.，文献同上)，以及脂质体介导的转染(Hawley-Nelson et al.，Focus 15：73，1993；Ciccarone et al.，Focus 15：80，1993)和病毒载体(Miller and Rosman，BioTechniques 7：980-90，1989；Wang and Finer，Nature Med.2：714-6，1996)。例如Levinson等人的美国专利4,713,339，Hagen等人的美国专利4,784,950、Palmiter等人的美国专利4,579,821和Ringold的美国专利4,656,134公开了在培养的哺乳动物细胞中生产重组多肽的方法。适用的培养的哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK 570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No.CRL 1573；Graham et al.，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)及中国仓鼠卵巢(如CHO-K1；ATCC No.CCL 61)细胞系。其它适用的细胞系都是本领域已知的并可从公共保藏机构如美国典型培养物保藏中心(Manassas，VA)得到。一般说来，优选强的转录启动子如SV-40或巨细胞病毒的启动子(如参见美国专利4,956,288)。其它适用的启动子包括得自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。
一般将药物选择用于选择其中已插入了外来DNA的培养的哺乳动物细胞。这类细胞通常被称为“转染子”。已在选择剂存在下培养并能够将其有用基因传给它们的子代的细胞被称为“稳定的转染子”。优选的选择标记是编码抗新霉素抗性的基因。在新霉素类药物如G-418等存在下进行选择。也可使用选择系统以一种“扩增”方法提高有用基因的表达水平。可在低水平选择剂的存在下培养转染子，然后增加选择剂的量以选择产生高水平该导入基因的产物的细胞，从而进行扩增。优选的可扩增选择标记是提供抗氨甲喋呤抗性的二氢叶酸还原酶。也可使用其它的药物抗性基因(如潮霉素抗性、多药物抗性、喋呤霉素乙酰转移酶)。可借助如FACS分选法或磁珠分离技术等手段，使用可导入改变的表型的可变标记物如绿色荧光蛋白，或CD4、CD8、I类MHC、胎盘碱性磷酸酶等细胞表面蛋白区分被转染的细胞与未被转染的细胞。
也可使用植物细胞、昆虫细胞及鸟类细胞等其它高等真核细胞作为宿主。Sinkar等人(J.Biosci.(Bangalore)11：47-58，1987)综述了使用毛根农杆菌作为载体在植物细胞中表达基因。Guarino等人的美国专利5,162,222和WIPO公开WO 94/06463公开了转化昆虫细胞和在其中生产外源多肽的方法。可以用通常衍生于苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒感染昆虫细胞(参见King，L.A.andPossee，R.D.，The Baculovirus Expression System：A LaborotoryGuide，London，Chapman & Hall；O’Reilly，D.R.et al.，Baculovirus Expression Vectors：A Laboratory Manual，NY，OxfordUniversity Press，1994；Richardson，C.D.，Ed.，BaculovirusExpression Protocols.Methods in Molecular Biology，Totowa，NJ，Humana Press，1995)。制造重组杆状病毒的第二种方法利用Luckow(Luckow，V.A.et al.，J.Virol.67：4566-79，1993)所述的基于转座子的系统。该系统作为Bac-to-Bac试剂盒(Life Technologies，Rockville，MD)出售的。该系统利用一个含有Tn7转座子的转移载体pFastBaclTM(Life Technologies)使编码zalpha11配体多肽的DNA进入作为大质粒(称为“杆粒”)保留在大肠杆菌中的杆状病毒基因组内。pFastBaclTM转移载体利用AcNPV多角体启动子驱动有用基因(在本案中为zalpha11配体)的表达。然而，可在很大程度上修饰pFastBaclTM。可以除去多角体启动子并换成在杆状病毒感染中较早表达的，并已证明有利于表达分泌蛋白的杆状病毒碱性蛋白启动子(也称为Pcor，p6.9或MP启动子)(参见Hill-Perkins，M.S.and Possee，R.D.，J.Gen.Virol.71：971-6，1990；Bonning，B.C.et al.，J.Gen.Virol.75：1551-6，1994；Chazenbalk，G.D.and Rapoport，B.，J.Biol.Chem.270：1543-9，1995)。在这些转移载体构建物中，可使用碱性蛋白启动子的短或长译本。另外，可以构建其中用衍生于昆虫蛋白质的分泌信号序列取代天然zalpha11配体分泌信号序列的转移载体。例如，可以将蜕皮甾类葡糖转移酶(EGT)、蜜蜂蜂毒肽(Invitrogen，Carlsbad，CA)或杆状病毒gp67(PharMingen，SanDiego，CA)的分泌信号序列用于构建物中以取代天然zalpha11配体分泌信号序列。此外，转移载体可包括一个与编码已表达zalpha11配体多肽的C或N末端表位标记如Glu-Glu表位标记(Grussenmeyer，T.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci 82：7952-4，1985)的DNA的框内融合。使用本领域已知的技术，将含有zalpha11配体的转化载体转化到大肠杆菌中并筛选含有表明重组杆状病毒的被中断的laz基因指示物的杆粒。使用通用技术分离含有重组杆状病毒基因组的杆粒DNA并用于转化草地夜蛾细胞如Sf9细胞。然后产生表达zalpha11配体的重组病毒。按照本领域的常用方法制备重组病毒原种。
用重组病毒感染宿主细胞，特别是衍生于草地夜蛾的细胞系(总地参见Glick and Pasternak，Molecular Biotechnology：Principlesand Applications of Recombinant DNA，ASM Press，Washington，D.C.，1994)。其它适用的细胞系是衍生于粉纹夜蛾的High FiveOTM细胞系(Invitrogen)(美国专利5,300,435)。
本发明中也可使用包括酵母细胞的真菌细胞。其中特别感兴趣的酵母种是酿酒酵母、巴斯德毕赤酵母和甲醇毕赤酵母。例如美国专利4,599,311(Kawasaki)、美国专利4,931,373(Kawasaki et al.，)、美国专利4,870,008(Brake)、美国专利5,037,743(Welch et al.，)和美国专利4,845,075(Murray et al.)公开了用外源DNA转化酿酒酵母细胞并在其中生产重组多肽的方法。根据由选择标记所确定的表型(通常为药物抗性)或在没有特殊营养素(如亮氨酸)条件下生长的能力选择被转化的细胞。用于酿酒酵母的优选载体系统是Kawasaki等人(美国专利4,931,373)公开的POT1载体系统，其允许根据在含葡萄糖培养基中生长的能力选择被转化的细胞。用于酵母中的适当的启动子和终止子包括来自糖酵解酶基因(如参见美国专利4,599,311、4,61 5,974和4,977,092)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子(也参见美国专利4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454)。包括多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母和麦芽糖假丝酵母等其它酵母的转化系统是本领域中已知的(如参见Gleeson et al.，J.Gen.Microbiol.132：3459-65，1986和Cregg的美国专利4,882,279)。可以按照美国专利4,935,349(McKnight等人)中所述的方法使用曲霉属细胞。Sumino等人的美国专利5,162,228公开了转化Acremonium chrysogenum的方法。Lambowitz的美国专利4,486,533公开了转化链孢霉的方法。
WIPO公开WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO 98/02565中公开了使用甲醇毕赤酵母作为宿主以生产重组蛋白质的方法。通常用于转化甲醇毕赤酵母的DNA分子都是作为双链球状质粒制备的，优选在转化前将其线性化。为了在甲醇毕赤酵母中生产多肽，质粒中的启动子和终止子优选是来自甲醇毕赤酵母基因如甲醇毕赤酵母醇利用基因(AUG1或AUG2)的启动子和终止子。其它有用的启动子包括二羟丙酮合酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)及过氧化氢酶(CAT)基因的启动子。为了利于DNA整合到宿主染色体中，优选有被宿主DNA序列侧接在两末端的整个质粒表达片段。用于甲醇毕赤酵母的优选的选择标记是编码磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC 4.1.1.21)，允许ade2宿主细胞在没有腺嘌呤的条件下生长的甲醇毕赤酵母ADE2基因。在大规模工业化生产中，优选使用其中缺失了两个甲醇利用基因(AUG1和AUG2)的宿主细胞，以尽可能地减少甲醇的用量。为了生产分泌蛋白质，优选使用液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)有缺陷的宿主细胞。使用电穿孔方法以利于将含有编码有用多肽的DNA的质粒导入甲醇毕赤酵母细胞中。优选使用场强度为2.5-4.5kV/cm，优选的是大约3.75kY/cm，并且时间常量(Ω)为1-40毫秒，最优选的是大约20毫秒的指数衰减的脉冲电场，以电穿孔法转化甲醇毕赤酵母细胞。
在本发明中，包括大肠杆菌、杆菌属及其它属的菌株在内的原核宿主细胞也是有用的宿主细胞。转化这些宿主细胞并在其中表达克隆的外源DNA序列的技术是本领域已知的(如参见Sambrook等人，上述文献)。当在细菌如大肠杆菌中表达zalpha11配体多肽时，该多肽可以作为不溶性颗粒保留在胞质中，或者被细菌分泌序列引入壁膜间隙中。在前一种情况下，可裂解细胞，然后回收颗粒并用异硫氰酸胍或尿素等变性处理。然后可稀释变性剂以使变性的多肽重新折叠和二聚化，例如通过对尿素溶液并联合使用还原态和氧化态谷胱甘肽透析，然后再对缓冲盐溶液透析。在后一种情况下，可以破碎细胞(如通过声处理或渗透压休克)以释放壁膜间隙的内容物并回收蛋白质，以从壁膜间隙中回收可溶性和功能性形式的多肽，从而不必经过变性和重折叠过程。
在含有营养素和所选的宿主细胞生长所需的其它成分的培养基中按常规方法培养被转化或转染的宿主细胞。各种适用的培养基，包括已知成分培养基和复杂成分培养基都是本领域已知的，并且一般都包含碳源、氮源、必需氨基酸、维生素及矿物质。如果需要，培养基也可含有诸如生长因子或血清等成分。一般是使用培养基来选择含有外加DNA的细胞，例如利用可由携带于表达载体上或共转染到宿主细胞中的选择标记补偿的药物选择或基本营养素不足进行这种选择。在大约25-35℃的温度下，将甲醇毕赤酵母细胞培养在包含足够碳源、氮源和微量营养素的培养基中。按照常规方法，例如振荡小的培养瓶或用压缩空气经过喷雾器搅动发酵罐为液体培养物提供足够的通气。甲醇毕赤酵母的优选培养基是YEPD培养基(2％D-葡萄糖、2％BactoTM蛋白胨(Difco Laboratories，Detroit M1)、1％BactoTM酵母提取物(Difco Laboratories)、0.004％腺嘌呤和0.006％L-亮氨酸)。
就污染的大分子，特别是其它蛋白质和核酸来说，优选的是将本发明的多肽纯化到≥80％纯度，优选≥90％纯度，更优选≥95％纯度，特别优选的是达到药物纯，即纯度大于99.9％，而且没有感染性和热原性因子。优选地，纯化的多肽基本上没有其它多肽，特别是其它动物来源的多肽。
可使用分级分离和/或常规纯化方法及介质纯化已表达的重组zalpha11配体多肽(或嵌合zalpha11配体多肽)。可使用硫酸铵沉淀和酸或离液剂提取法分级分离样品。纯化步骤例如可包括羟基磷灰石、尺寸排阻、FPLC和反相高效液相色谱法。适用的色谱介质包括衍生化的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特制硅石等。优选的是PEI、DEAE、QAE和Q衍生物。色谱介质例如包括用苯基、丁基或辛基基团衍生化的介质，如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearlbutyl 650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等；或聚丙烯树脂，如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。适用的固体载体包括在其使用条件下不溶的玻璃珠、硅石基树脂、纤维素树脂、琼脂糖球、交联的琼脂糖球、聚苯乙烯球、交联的聚丙烯酰胺树脂等。可用反应性基团修饰这些载体，以借助氨基、羧基、硫氢基、羟基和/或糖部分连接蛋白质。偶联化学的例子包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、硫氢基活化、酰肼活化，以及用于碳化二亚胺偶联化学的羧基和氨基衍生物。这些及其它固体介质都是本领域中已知的和广泛使用的，并且可从市场上购得。将受体多肽结合到载体介质上的方法是本领域中已知的。具体方法的选择是常规设计的问题并且可部分地根据所选用载体的性质来确定(如参见Affinity Chromatography：Principles & Methods，Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala，Sweden，1988)。
可以利用其物理或生物化学性质分离本发明的多肽。例如，可使用固相化金属离子吸附(IMAC)色谱法纯化富组氨酸蛋白质，包括含有多聚组氨酸标记的蛋白质。简单地说，首先使凝胶中饱含二价金属离子以形成螯合物(Sulkowski，Trends，in Biochem.3：1-7，1985)。富组氨酸蛋白质将依据所用金属离子的不同，以不同的亲和力吸附到这种基质上，并通过竞争性洗脱，降低pH或使用强螯合剂进行洗脱。纯化的其它方法包括用凝集素亲和层析法和离子交换层析法(Methodsin Enzymol.Vol.182，“Guide to Protein Purification”，M.Deutscher(ed.)，Acad.Press，San Diego，1990，pp.529-39)并使用可溶性zalpha11受体纯化糖基化蛋白质。在本发明的另外的实施方案中，可以构建感兴趣的多肽和亲和标记(如麦芽糖结合蛋白，免疫球蛋白结构域)的融合体以利于纯化。
此外，借助本领域所述的方法，结合使用本发明的zalpha11配体的区域或结构域和其它人细胞因子家族蛋白质(如白介素或GM-CSF)或异源蛋白质的区域或结构域，构建多肽融合体或杂合zalpha11配体蛋白质(Sambrook et al.，上述文献；Altschul et al.，上述文献；Picard，Cur.Opin.Biology 5：511-5，1994及其中引述的参考文献)。这些方法可用于确定感兴趣的多肽中较大区域或结构域的生物学重要性。这些杂合体可改变多肽的反应动力学、结合性、减小或扩大其底物特异性，或改变多肽的组织和细胞定位，并且可以应用于未知结构的多肽。
可以按照本领域技术人员已知的方法，通过制备融合蛋白质的各组成成分并化学缀合这些组成成分以制备融合蛋白。另外，也可使用已知技术产生处于适当读框中的编码融合蛋白两种组成成分的多核苷酸，然后用本文所述的方法表达之。例如，可以在本发明的zalpha11配体与另一个家族成员如IL-15、IL-2、IL-4或GM-CSF的功能等同螺旋间交换部分或全部提供生物学功能的螺旋。这些组成成分包括但不只限于四螺旋束细胞因子的分泌信号序列；螺旋A、B、C、D；环A/B、B/C、C/D。预计这些融合蛋白依据所构建的融合体的不同，具有与本发明的多肽或其它已知的四螺旋束细胞因子家族蛋白质相同或相似的生物学功能分布型。再者，这些融合蛋白质也可表现有本文所述的其它性质。
可使用标准分子生物学和克隆技术交换zalpha11配体多肽和它们所融合的多肽间的等同结构域。一般说来，可将编码某个感兴趣的区域，如zalpha11配体螺旋A至D或本文所述的其它区域的DNA片段可操作地框内连接到至少一个编码附加多肽(例如另一细胞因子如IL-2等的结构域或区域)的其它DNA片段上，并插入到如本文所述的适当的表达载体中。在制备DNA构建物时，通常是将编码多肽的相应区域的几个DNA片段可操作地连接在读框内，以制得编码完整融合蛋白质或其功能性蛋白质的单一构建物。例如，DNA构建物从N末端至C末端应编码包括信号多肽，其后依次含有螺旋A、B、C和D的成熟四螺旋束细胞因子的融合蛋白质。可以按本文所述方法表达、分离这些融合蛋白质，并测定其活性。
也可通过化学合成方法制备zalpha11配体多肽或其片段。zalpha11配体多肽可以是单体或聚合物、糖基化或非糖基化的、聚乙二醇化的或非聚乙二醇化的，并且可以包括或不包括起始蛋氨酸残基。例如，可以用固相肽合成方法制备该多肽(如参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149，1963)。
可使用检测细胞增殖和/或与表达zalpha11受体的细胞结合的各种测定方法检测本发明分子的活性。其中特别感兴趣的是zalpha11配体依赖性细胞的变化。将工程化改造成zalpha11配体依赖性细胞的适宜细胞系包括IL-3依赖性BaF3细胞系(Palacios and Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevot et al.，Mol.Cell.Biol.6：4133-4135，1986)、FDC-P1(Hapel et al.，Blood 64：786-790，1984)和MO7e(Kiss et al.，Leukemia 7：235-240，1993)。可以按照已公开的方法建立生长因子依赖性细胞系(如参见Greenberger et al.，Leukemia Res.8：363-375，1984；Dexter et al.，in Baum et al.，Eds.，Experimental Hematology Today，8th Ann.Mtg.Int.Soc.Exp.Hematol.1979，145-156，1980)。
本发明的蛋白质可用于刺激那些参与造血和免疫功能的体内稳态的细胞的增殖、活化、分化和/或诱导或抑制其特化的细胞功能。具体地说，zalpha11配体多肽可用于刺激造血谱系细胞(包括但不只限于T细胞、B细胞、NK细胞、树突细胞、单核细胞、和巨噬细胞)以及上皮细胞的增殖、活化、分化、诱导或抑制其特化的细胞功能。可以在体外使用培养的细胞或在体内给适当的动物模型投用本发明所涉及的分子以检测造血细胞的增殖和/或分化。检测细胞增殖或分化的测定方法是本领域已知的。例如，检测增殖的测定方法包括对中性红染料的化学敏感性方法(Cavanaugh et al.，Investigational New Drugs8：347-354，1990，在此引用作为参考)、放射标记核苷酸掺入法(Cooket al.，Analytical Biochem.179：1-7，1989，在此引用作为参考)、5-溴-2′-脱氧尿嘧啶(BrdU)在增殖细胞的DNA中的掺入法(Porstmann et al.，J.Immunol.Methods 82：169-179，1985，在此引用作为参考)以及使用四唑鎓盐的方法(Mosmann，J.Immunol.Methods 65：55-63，1983；Alley et al.，Cancer Res.48：589-601，1988；Marshall et al.，Growth Reg.5：69-84，1995；和Scudieroet al.，Cancer Res.48：4827-4833，1988；所有这些文献引入本文作为参考)。检测分化的测定方法包括，例如，检测与组织的阶段特异性表达有关的细胞表面标记、酶促活性、功能活性或形态学改变(Watt，FASEB 5：281-284，1991；Francis，Differentiation 57：63-75，1994；Raes，Adv.Anim.Cell Biol.Technol.Bioprocesses，161-171，1989；所有这些文献引入本文作为参考)。
可以使用病毒递送系统体内测定本发明的分子。用于这个目的的典型病毒包括腺病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、痘苗病毒及腺相关病毒(AAV)。其中腺病毒为双链DNA病毒，是目前研究最多的用于递送外源核酸的基因转移载体(参见T.C.Becker et al.，Meth.Cell Biol.43：161-89，1994；和J.T.Douglas and D.T.Curiel，Science &Medicine 4：44-53，1997)。
可以使用检测与受体结合和继后生理性细胞反应有关的细胞外酸化率或质子排泄的硅基生物传感器小型生理仪来检测zalpha11配体多肽(作为一种配体)的活性。例如可使用Molecular Devices(Sunnyvale，CA)制造的CytosensorTM小型生理仪。可以用这种方法检测多种细胞反应，如细胞增殖、离子运输、能量产生、炎性反应、调节和受体活化等(例如参见McConnell，H.M.et al.，Science257：1906-12，1992；Pitchford，S.et al.，Meth.Enzymol.228：84-108，1997；Arimilli，S.et al.，J.Immunol.Meth.212：49-59，1998；Van Liefde，I.et al.，Eur.J.Pharmacol.346：87-95，1998)。
此外，可以使用zalpha11配体鉴定对zalpha11配体刺激的途径有反应的细胞、组织或细胞系。可使用上述小型生理仪快速鉴定配体反应性细胞，如对本发明的zalpha11配体有反应的细胞。可以在有或没有zalpha11配体多肽存在下培养细胞。那些可在zalpha11配体存在下引发细胞外酸化可检测的改变的细胞对zalpha11配体有反应性。可使用这样的细胞或细胞系鉴定如本文所述的zalpha11配体多肽的拮抗剂和激动剂。
鉴于所观察到的zalpha11受体的组织分布，激动剂(包括天然zalpha11配体/底物/辅助因子等)和/或拮抗剂在体外和体内可能有许多潜在应用。例如，可将鉴定为zalpha11配体激动剂的化合物用于那些参与造血和免疫功能的体内稳态的细胞的扩充、增殖、活化、分化，和/或诱导或抑制特化的细胞功能。例如，zalpha11配体及激动剂化合物可用作确定成分的细胞培养基的组成成分，并可单独或与其它细胞因子和激素联合使用，以代替细胞培养基中通常使用的血清。因此激动剂可用于特异地促进T细胞、B细胞、NK细胞、细胞毒性淋巴细胞，以及淋巴样和髓样谱系的其它细胞的生长和/或发育。
拮抗剂也可用作鉴定配体-受体相互作用位点的研究试剂。拮抗剂可用于抑制那些参与调节造血的细胞的扩充、增殖、活化，和/或分化。zalpha11配体活性的抑制剂(zalpha11配体拮抗剂)包括抗zalpha11配体抗体和可溶性zalpha11配体受体，以及其它肽和非肽因子(包括核酶)。
可以使用zalpha11配体鉴定其活性抑制剂(拮抗剂)。将试验化合物加到本文所公开的测定体系中，以鉴定抑制zalpha11配体活性的化合物。除本文所公开的那些测定方法外，还可以设计各种用于检测受体结合，刺激/抑制zalpha11配体依赖性细胞反应或zalpha11受体表达细胞的增殖的测定法，以测试样品对zalpha11配体活性的抑制作用。
可以作为与免疫球蛋白重链恒定区(典型地为Fc片段，其含有两个恒定区并缺少可变区)形成的融合体蛋白来表达zalpha11配体多肽。美国专利5,155,027和5,567,584中公开了制备这种融合体的方法。通常这类融合体是作为多聚分子被分泌的，其中Fc部分靠二硫键相互连接并且两个非Ig多肽以彼此接近的方式排列。例如可使用这种类型的融合体二聚化，以提高稳定性和体内半衰期，亲和纯化配体，作为体内测定工具或拮抗剂。为了用于测定法中，可通过Fc区使嵌合体结合到载体上，并用于ELISA程式。
也可使用zalpha11配体的结合多肽来纯化配体。将多肽固定在固相载体如琼脂糖小球、交联琼脂糖小球、玻璃珠、纤维素树脂、硅石基树脂、聚苯乙烯、交联的聚丙烯酰胺或者在使用条件下稳定的类似材料上。将多肽连接到固相载体上的方法是本领域已知的，并包括胺化学、溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、硫氢基活化和酰肼活化。一般将所得到的介质装成柱形，并使含有配体的液体一次或多次通过柱，以使配体结合到受体多肽上。然后改变盐浓度或使用离液剂(盐酸胍)或改变pH以中断配体-受体结合，从而洗脱配体。
可以优先利用的测定系统中，使用了与配体结合的受体(或抗体，补体/抗补体对的一个成员)或其结合片段，以及市售的生物传感器(BIAcore，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)。可将这样的受体、抗体、补体/抗补体对的成员或片段固定在受体芯片的表面上。Karlsson(J.Immunol.Methods 145：229-40，1991)和Cunningham与Well s(J.Mol.Biol.234：554-63，1993)公开了这种仪器的使用。使用胺或硫氢基化学法，使受体、抗体、补体/抗补体对的成员或片段共价连接到与流动池内的金膜相连的葡聚糖纤维上。使试验样品通过流动池。如果样品中存在配体、表位或补体/抗补体对的相反成员，它将分别结合到固定化的受体、抗体或成员上，引起介质折射率的改变，进而可作为金膜表面胞质团振动的改变被检测到。该系统允许测定正常或不正常速率，从中可计算出结合亲和性，并估计结合的化学计量。或者，也可使用SELDI(TM)技术(Ciphergen，Inc.，Palo Alto，CA)分析配体/受体结合。
也可将配体结合的受体多肽用于本领域已知的其它测定系统中。这样的系统包括检测结合亲和性的Scatchard分析(参见Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660-72，1949)和量热测定法(Cunningham etal.，Science 253：545-48，1991；Cunningham et al.，Science245：821-25，1991)。
也可使用zalpha11配体多肽制备与zalpha11配体表位、肽或多肽结合的抗体。用zalpha11配体多肽或其片段作为抗原(免疫原)接种动物并引发免疫反应。本领域技术人员应认识到，抗原性、携带表位的多肽含有zalpha11配体多肽的至少6个，优选至少9个，更优选至少15-30个连续氨基酸残基的序列(例如，SEQ ID NO：2)。所说的多肽可含有zalpha11配体多肽的一个较大部分，即含有30至100个残基，甚至是全长度氨基酸序列。如本文所述，抗原或免疫原表位也可包括连接的标记、佐剂和载体。适用的抗原包括由SEQ ID NO：2编码的zalpha11配体多肽，即从氨基酸12至氨基酸162，或其连续的9至131个氨基酸的片段。其它适用的抗原包括如本文所述的全长度和成熟zalpha11配体，zalpha11配体四螺旋束结构的螺旋A-D，以及个别或多个螺旋A、B、C和D。如本文所述，用作抗原的优选肽是亲水肽，例如本领域技术人员根据疏水性曲线图推测的肽序列，例如SEQ IDNO：2的氨基酸残基114-119、101-105、126-131、113-118和158-162。
可以按照本文所述方法分离并纯化用这些抗原接种动物所产生的免疫反应中的抗体。制备和分离多克隆和单克隆抗体的方法是本领域已知的。例如参见Current Protocols in Immunology，Cooligan，etal.(eds.)，National Institutes of Health，John Wiley and Sons.Inc.，1995；Sambrook et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Second Edition，Cold Spring Harbor，NY，1989；Hurrell，J.G.R.，Ed.，Monoclonal Hybridoma Antibodies：Technioues andApplications，CRC Press，Inc.，Boca Raton，FL，1982)。
本领域技术人员可以看出，可以用zalpha11配体多肽或其片段接种马、牛、山羊、绵羊、狗、鸡、兔、小鼠和大鼠等各种温血动物，以产生多克隆抗体。可以通过使用明矾(氢氧化铝)、完全或不完全弗氏佐剂等佐剂来增加zalpha11配体多肽的免疫原性。可用于免疫的多肽还包括融合多肽，例如zalpha11配体或其部分与免疫球蛋白多肽或与麦芽糖结合蛋白形成的融合体。多肽免疫原可以是全长度分子或其部分。如果多肽部分是“半抗原样的”，则可将这些部分有利地连接到大分子载体(如钥孔血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破伤风类毒素)上用于免疫。
本文所使用的术语“抗体”包括多克隆抗体、亲和纯化的多克隆抗体、单克隆抗体及抗原结合片段，如F(ab’)2和Fab蛋白水解片段。还包括遗传工程化的完整抗体或片段，如嵌合抗体、Fv片段、单链抗体等，以及合成的抗原结合肽和多肽。可以将非人CDR嫁接到人构架和恒定区上，或掺入完整的非人可变区(选择性地通过取代暴露的残基以便用人样表面“掩饰”它们，从而得到“镶饰的”抗体)，以使非人抗体人源化。在某些情况下，人源化抗体可在人可变区构架区域内保留非人残基，以增强适当的结合特性。可通过人源化提高抗体的生物学半衰期，并降低用于人体后的不良免疫反应的可能性。此外，可按照WO 98/24893中所公开的方法，在已经过遗传工程改造从而含有人免疫球蛋白基因的转基因非人动物体内产生人抗体。在这些动物中，内源性免疫球蛋白基因优选的是被失活的，或通过同源重组而被除去的。
如果抗体1)表现有阈值水平的结合活性，和2)与相关的多肽分子没有明显地发生交叉反应，则该抗体被认为是特异结合的。如果本发明的抗zalpha11配体抗体以大于对照组(非zalpha11配体)多肽至少10倍的结合亲和力与zalpha11配体多肽、肽或表位结合，即确定为阈值水平的结合。抗体表现的结合亲和力(Ka)一般为106M-或更大，优选为107M-或更大，更优选为108M-或更大，最优选为109M-或更大。例如，本领域技术人员可以使用Scatchard分析法(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci.51：660-672，1949)很容易地确定抗体的结合亲和力。
例如，使用标准Western印迹分析(Ausubel et al.，上述文献)由检测zalpha11配体多肽而非已知的相关多肽的抗体可显示抗zalpha11配体抗体是否没有与相关多肽分子显著地发生交叉反应。已知相关多肽的例子是现有技术中已公开的多肽，例如已知的直向同源物和共生同源物，以及蛋白质家族的相似的已知成员。也可以使用非人zalpha11配体，和zalpha11配体突变多肽进行筛选。另外，可以筛选抗已知的相关多肽的抗体，以分离特异性结合zalpha11配体多肽的群体。例如，将抗zalpha11配体的抗体吸附到与不溶性基质相粘着的相关多肽上；在适当的缓冲条件下，对zalpha11配体特异的抗体将流过该基质。筛选允许分离出与已知密切相关的多肽不发生交叉反应的多克隆和单克隆抗体(Antibodies：A Laboratory Manual，Harlowand Lane(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988；Current Protocols in Immunology，Cooligan et al.，(eds.)，National Institutes of Health，John Wiley and Sons，Inc.，1995)。特异性抗体的筛选和分离方法是本领域已知的(参见Fundamental Immunology，Paul(eds.)，Raven Press，1993；Getzoffet al.，Adv.in Immunol.43：1-98，1988；Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，Goding，J.W.(eds.)，Academic PressLtd.，1996；Benjamin et al.，Ann.Rev.Immunol.2：67-101，1984)。可用本领域已知的和下面所公开的许多方法检测特异性结合的抗zalpha11配体抗体。
可利用本领域已知的各种测定法检测与zalpha11配体蛋白或多肽结合的抗体。典型的测定法详述于Antibodies：A LaboratoryManual，Harlow and Lane(Eds.)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1988。有代表性的这类测定法例如包括：并发免疫电泳、放射免疫测定法、放射免疫沉淀、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、点印迹或Western印迹测定法、抑制或竞争测定法，以及夹心测定法。另外，可根据与野生型对突变型zalpha11配体蛋白或多肽的结合来筛选抗体。
抗zalpha11配体抗体可用于标记表达zalpha11配体的细胞、用于经亲和纯化分离zalpha11配体、用于诊断测定以确定zalpha11配体多肽的循环水平、用于检测或定量分析作为疾病或病理改变标志的可溶性zalpha11配体、用于利用FACS的分析方法中、用于筛选表达文库、用于产生抗同种异型抗体，以及作为体外和体内阻断zalpha11配体活性的中和抗体或拮抗剂。适当的直接标记或标记物包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光标志、化学发光标志、磁性颗粒等；间接标记或标记物可使用生物素/抗生物素或其它互补体/抗互补体对作为中间体。本文所说的抗体也可以是与药物、毒素、放射性核素等直接或间接缀合的，而且这些缀合物可用于体内诊断或治疗。此外，可使用抗zalpha11配体或其片段的抗体体外检测变性的zalpha11配体或其片段，例如用于本领域已知的Western印迹法或其它测定法中。
适当的可检测分子可以是与多肽或抗体直接或间接连接的，并包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光标记、化学发光标记、磁性颗粒等。适当的细胞毒性分子可以是与多肽或抗体直接或间接连接的，并包括细菌或植物毒素(例如白喉毒素、皂草素、假单胞菌外毒素、蓖麻毒素、相思豆毒蛋白等)，以及治疗性放射核素如碘131、铼188或钇90(例如可直接连接，或通过螯合部分间接连接到多肽或抗体上)。多肽或抗体也可以与细胞毒性药物(如阿霉素)缀合。为了实现与可检测的或有细胞毒性的分子的连接，可以将可检测的或有细胞毒性的分子与互补体/抗互补体对的一个成员连接，而另一个成员则连接到多肽或抗体部分上。为此目的，可使用生物素/链霉抗生物素作为典型的互补体/互补体对。
结合的多肽也可作为zalpha11配体“拮抗剂”，以阻断zalpha11配体结合和体外与体内信号转导。这些抗zalpha11配体结合多肽可用于抑制zalpha11配体活性或蛋白质结合。
可使用多肽-毒素融合蛋白或抗体-毒素融合蛋白定向抑制或消灭细胞或组织(例如处理肿瘤细胞或组织)。另外，如果多肽具有多个功能性区域(即活化区或受体结合区，加上导向区)，则只包括导向区的融合蛋白质可能适于将可检测分子，细胞毒性分子或互补分子引向特定的细胞或组织。例如，当融合蛋白只包括互补分子时，可以将抗互补分子缀合到可检测分子或细胞毒性分子上。因此这样的区域-互补分子融合蛋白质代表了向细胞/组织特异性递送种属抗互补体可检测/细胞毒性分子缀合物的种属导向载体。
如果zalpha11配体多肽或抗zalpha11配体抗体导向高增殖性血液或骨髓细胞，即可使用zalpha11配体细胞因子融合蛋白或抗体-细胞因子融合蛋白提高对靶组织(如血液和骨髓癌)的体内杀伤能力(参见Hornick et al.，Blood 89：4437-47，1997)。所描述的融合蛋白质能够将细胞因子导向期望的作用位点，从而提高细胞因子的局部浓度。适当的zalpha11配体多肽或抗zalpha11配体抗体瞄准不良的细胞或组织(即肿瘤或白血病)，并且融合的细胞因子介导效应细胞对靶细胞的更有效溶解。用于这一目的的细胞因子包括IL-2和GM-CSF。
分化是一个以多潜能干细胞开始并以终末分化的细胞结束的渐进性动态过程。在没有定型为谱系的情况下可以再生的多潜能干细胞介入谱系当定型为细胞谱系时丢失的分化标记。始祖细胞表达一组随着细胞沿细胞谱系途径向成熟发展可能或不可能被继续得到表达的分化标记。由成熟细胞排他性表达的分化标记通常是表现有功能特性的，如细胞产物、产生细胞产物的酶，以及受体。通过鉴定存在于细胞群体中的标记来监测细胞群体分化的阶段。
有证据表明，刺激特定的细胞类型的因子会沿有利于终末分化或去分化的途径影响来源于共同前体或干细胞的整个细胞群体。因此，本发明包括刺激或抑制淋巴样细胞、造血细胞及上皮细胞的增殖。
从已知具有重要免疫学功能并含有在免疫系统中起作用的细胞的组织中分离zalpha11配体。在CD3+选择的，活化的外周血细胞中表达zalpha11配体，并已显示当T细胞活化后zalpha11配体表达增加。此外，在本文实施例部分中描述的实验结果证明本发明的多肽对NK细胞或NK始祖细胞的生长/扩充和/或分化的状态有影响。其它证据证明，zalpha11配体可在体内影响T细胞和B细胞的增殖和/或分化。刺激造血始祖细胞增殖和活化成熟细胞的因子是公知的。NK细胞是对单一IL-2有反应性的，但增殖与活化一般还需要有附加的生长因子。例如，已证明IL-7和Steel因子(c-kit配体)是NK始祖细胞的集落形成所需要的。IL-15+IL-2再联合IL-7和Steel因子更为有效(Mrózek et al.，Blood 87：2632-2640，1996)。然而，一些未鉴定的细胞因子也可能是NK细胞和/或NK始祖细胞的特定亚组增殖所需要的(Roberson et al.，Blood 76：2451-2438，1990)。含有zalpha11配体和IL-15的组合物刺激NK始祖细胞和NK细胞，同时有证据表明该组合物比以前描述的因子和因子的组合具有更强的能力。
检测分化的测定方法包括，例如，检测与组织的阶段特异性表达、酶促活性、功能活性或形态学改变有关的细胞标记(Watt，FASEB5：281-284，1991；Francis，Differentiation 57：63-75，1994；Raes，Adv.Anim.Cell Biol.Technol.Bioprocesses，161-171，1989；所有这些文献引入本文作为参考)。或者，zalpha11配体多肽本身也可作为与组织的阶段特异性表达有关的附加细胞表面标记或分泌标记。因此，直接检测zalpha11配体多肽，或检测因其分化所致的在组织中表达的丢失，可作为组织分化的标记。
同样，在当经历肿瘤发展的组织或细胞中可直接检测zalpha11配体多肽，或可检测到组织中的其表达的丢失。与正常组织比较，细胞侵袭力和迁移率增加，或在癌前或癌症状况下zalpha11配体表达的增加或丧失，可以作为肿瘤发展中转化、侵入和转移的指征。因此，有关肿瘤发展或转移阶段的知识将有助于医生选择最适当的治疗方法，或对特定的个别肿瘤病人采取有效的处理。检测(mRNA或蛋白质的)表达的增加或丧失的方法是本领域已知的，并可应用于zalpha11配体表达。例如，可以利用调节细胞迁移率的多肽的出现或消失来帮助诊断和预后前列腺癌(Banyard，J.and Zetter，B.R.，Cancer andMetast.Rev.17：449-458，1999)。作为细胞迁移率的效应物，zalpha11配体表达的增加或丧失可作为淋巴样细胞、B细胞、上皮癌、造血及其它癌症的一个诊断依据。
再者，可以在体内检测zalpha11配体对肿瘤发展和转移的活性及影响。已建立了几种同系小鼠模型以研究多肽、化合物或其它治疗对肿瘤发展的影响。在这些模型中，将传代培养的肿瘤细胞肿瘤供体植入到作为同品系的小鼠体内。细胞将在受体小鼠中发展成具有相似特征的肿瘤，并且也将在某些模型中发生转移。适于本发明研究的适当肿瘤模型包括Lewis肺癌(ATCC No.CRL-1642)和B16黑素瘤(ATCC No.CRL-6323)。这二者均为与C57BL6/J小鼠同基因的，并易于在体外培养和操作的常用肿瘤细胞系。植入这些细胞系之任一个所得到的肿瘤能够转移到C57BL6/J小鼠的肺中。最近已在小鼠中使用Lewis肺癌模型鉴定血管生成的抑制剂(O’Reilly MS，et al.，Cell 79：315-328，1994)。通过每天注射重组蛋白质、激动剂或拮抗剂或一次注射重组腺病毒，用实验剂治疗C57BL6/J小鼠。此治疗后三天，于背部皮下植入105-106个细胞。或者，还可以在植入前用例如表达zalpha11配体的重组腺病毒感染细胞本身，从而在肿瘤部位或细胞内而不是全身合成该蛋白质。小鼠一般在5天内长出可见的肿瘤。使肿瘤生长至多3周，这期间对照治疗组小鼠的肿瘤尺寸可达到1500-1800mm3。整个实验过程中细心监测肿瘤大小和体重。处死动物时，摘除肿瘤并同肺和肝一起称重。已显示肺重量与转移瘤负荷密切相关。另外，还检查肺表面转移瘤的数目。用本领域已知的和本文所述的方法对切除的肿瘤、肺和肝进行组织病理学检查、免疫组织化学检查，并进行原位杂交。因此可估计已表达的该多肽如zalpha11配体对肿瘤恢复血管系统和经历转移的能力的影响。另外，除了使用腺病毒外，还可以用zalpha11配体瞬时转染被植入的细胞。使用稳定的zalpha11配体转染子以及使用可诱导的启动子活化zalpha11配体的体内表达是本领域已知的，并可用该系统来估计zalpha11配体对转移的诱导作用。再者，可以将纯化的zalpha11配体或zalpha配体条件培养基直接注射到该小鼠模型体内，并因而用于这一系统(总地参见O’Reilly MS，et al.，Cell79：315-328，1994；和Rusciano D.et al.，Murine Models of liverMetastasis，Invasion Metastasis 14：349-361，1995)。
zalpha11配体可用于治疗肿瘤发生，因此可用于治疗癌症。zalpha11配体抑制抗IgM刺激的正常B细胞的IL-4刺激的增殖并可在B细胞肿瘤细胞系中观察到相似的作用，因而提示zalpha11配体在治疗病人中可诱导B细胞肿瘤细胞进入较低的增殖状态，从而产生有利的治疗作用。可将该配体与已经使用的常规化学治疗剂及免疫调节剂如α-IFN等其它药剂联合使用。已表明α/β干扰素在治疗某些白血病和动物疾病模型中是有效的，并且α-干扰素和zalpha11配体的生长抑制作用对于至少一种B细胞肿瘤衍生的细胞系是作用相加的。
本发明提供一种降低恶性B或T细胞增殖的方法，包括给带有赘生性B或T细胞的哺乳动物投用足以降低恶性B或T细胞增殖量的zalpha11配体的组合物。在其它实施方案中，该组合物可包括选自IL-2、IL-15、IL-4、GM-CSF、Flt3配体或干细胞因子的至少一种其它细胞因子。
在另一个方面，本发明提供一种降低恶性B或T细胞增殖的方法，包括给带有赘生性B或T细胞的哺乳动物投用足以降低恶性B或T细胞增殖量的zalpha11配体拮抗剂的组合物。在其它实施方案中，该组合物可包括选自IL-2、IL-15、IL-4、GM-CSF、Flt3配体或干细胞因子的至少一种其它细胞因子。再者，zalpha11配体拮抗剂可以是配体/毒素融合蛋白。
可利用zalpha11配体-皂草素融合毒素对抗一组可用zalpha11配体治疗的宽范围的白血病和淋巴瘤。融合毒素介导的zalpha11受体活化提供两个独立的抑制靶细胞生长的手段，第一个手段是相同于单用配体时见到的作用，第二个手段是通过受体内在化递送毒素所产生的效果。淋巴样细胞限制zalpha11受体的表达模式表明病人可以耐受配体-皂草素缀合物。
当对恶性肿瘤的治疗包括同种异体骨髓或干细胞移植时，zalpha11配体在增强移植物抗肿瘤作用中可能是有价值的。zalpha11配体刺激由骨髓始祖细胞产生溶胞性NK细胞，并且在活化抗原受体后刺激T细胞增殖。因此，当病人接受同种异体骨髓移植物时，无论有或没有供体淋巴细胞灌输，zalpha11配体均将增强抗肿瘤反应的产生。
特定细胞因子的受体的组织分布为该细胞因子作用的可能位点提供一个很明显的指征。zalpha11受体的Northern分析揭示了人脾、胸腺、淋巴结、骨髓和外周血白细胞中的转录物。因表达zalpha11受体而鉴定为特殊类型的细胞，而且在混合的淋巴细胞反应(MLR)中和在伯基特氏淋巴瘤Riji细胞中见有强的信号。THP-1(Tsuchiya et al.，Int.J.Cancer 26：171-176，1980)和U937(Sundstrom et al.，Int.J.Cancer 17：565-577，1976)这两个单核细胞系是阴性的。
在由两个个体的外周血单核细胞(PBMNC)相混合，导致相互活化的MLR中，以相对高的水平表达zalpha11受体。在MLR中检测到高水平转录物但休眠T或B细胞群体中则没有，提示活化期间可在一种或多种细胞类型中诱导zalpha11受体表达。可以用PMA和离子霉素刺激细胞以人为地活化分离的T和B细胞群体。在这些活化条件下，分选的两种类型细胞中zalpha11受体转录物水平增加，表明这种受体和zalpha11配体在免疫反应中，特别是在活化期间自分泌和旁分泌T和B细胞扩充中的作用。zalpha11配体也可能在参与淋巴细胞生成的多种原始细胞的扩充中起作用。
发现zalpha11受体以低水平存在于休眠T和B细胞中，并且在两种细胞中活化期间受到向上调节。有趣的是，B细胞也以比T细胞更快的速度下调信息，提示信号的幅度和信号猝灭定时对于B细胞反应的适当调节是重要的。
此外，大部分肠的固有层细胞显示与zalpha11受体的阳性杂交信号。该组织由混合的淋巴样细胞群体组成，包括活化的CD4+T细胞和活化的B细胞。免疫功能失调，特别是粘膜免疫反应的慢性激活，在Crohn氏病的病因学中起着重要作用；对炎症前细胞因子的异常反应和/或其产生也是一个可疑因素(Braegger et al.，Annals Allergy72：135-141，1994；Sartor RB Am.J.Gastroenterol.92：5S-11S，1997)。zalpha11配体与IL-15协同由骨髓始祖细胞扩充NK细胞并放大NK细胞效应器功能。zalpha11配体也共同刺激用抗CD40抗体刺激的成熟B细胞，但通过IgM抑制B细胞增殖。zalpha11配体与通过T细胞受体的信号协同增加T细胞增殖，并且在转基因小鼠中的过表达导致淋巴细胞减少和单核细胞与粒细胞的扩充。zalpha11配体的这些多效性作用提示其可为由免疫系统缺陷引起的多种疾病，包括(但不限于)系统性红瘢狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、多发性硬化(MS)、重症肌无力和糖尿病等提供治疗用途。应注意的是，这些疾病都是多种免疫功能失调间复杂交织作用的结果(例如SLE就是T和B细胞两者的缺陷的表现形式)，而且免疫细胞引发强力免疫反应要依赖于彼此间相互作用。因此，可用于操纵一种以上类型免疫细胞的zalpha11配体(或该配体的拮抗剂)是在疾病的多个阶段发挥干预作用的有吸引力的候选治疗剂。
本发明的多肽和蛋白质也可用于体外处理后体内回输治疗，如用于自体骨髓培养物。简单地说，在化学治疗或器官移植前从病人体内得到骨髓并用zalpha11配体处理，可选择性地联合使用一种或多种其它细胞因子。然后再将经过处理的骨髓在化疗后回输到病人体内以加速骨髓的恢复或在移植后回输到病人体内以抑制移植物抗宿主疾病。另外，本发明的蛋白质也可用于体外扩充骨髓或外周血前体(PBPC)细胞，然后用于体内回输。在治疗前，可用干细胞因子(SCF)刺激骨髓以释放早期前体细胞进入外周循环。可以从外周血中收集并浓缩这些前体细胞，然后在培养物中用zalpha11配体，可选择性地合用SCF、IL-2、IL-4、IL-7或IL-15等一种或多种其它细胞因子处理之，以使之分化和增殖成高密度淋巴样细胞培养物，然后可在化疗或移植后将其回输给病人。
本发明提供扩充造血细胞和造血细胞前体的方法，包括用含有足以引起骨髓或外周血细胞中淋巴样细胞数目增加(与在没有zalpha11配体情况下培养的骨髓或外周血细胞相比)量的zalpha11配体的组合物培养骨髓或外周血细胞。在其它实施方案中，造血细胞和造血前体细胞是淋巴样细胞。在另一个实施方案中，淋巴样细胞是NK细胞或细胞毒性T细胞。此外，组合物也可包括选自IL-2、IL-15、IL-4、GM-CSF、Flt3配体和干细胞因子的至少一种其它细胞因子。
或者，zalpha11配体也可激活在加强抗传染病免疫、治疗无免疫应答病人(如HIV+病人)中或在改良疫苗中很重要的免疫系统。具体地说，可刺激或扩充NK细胞或其前体细胞的zalpha11配体将在治疗病毒感染中发挥治疗作用，并可用作抗肿瘤因子。一般认为NK细胞在消除转移瘤细胞中发挥主要作用，而且发现有转移瘤和实体瘤的病人NK细胞活性降低(Whiteside et al.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.230：221-244，1998)。同样，zalpha11配体可刺激抗病毒和非病毒病原因子(包括细菌、原生动物和真菌)的免疫反应，因而可通过抑制这些感染因子的生长在治疗这类感染中发挥治疗作用。可以使用本领域已知的和本文所述的许多方法直接或间接测定体内存在的病原体或抗原如肿瘤细胞的水平。
本发明包括刺激与抗原或病原体接触的哺乳动物的免疫反应的方法，其包括以下步骤：(1)直接或间接测定存在于所说的哺乳动物体内的抗原或病原体水平；(2)投用含有zalpha11配体多肽连同可接受的药用载体的组合物；(3)直接或间接测定所说哺乳动物体内的抗原或病原体水平；和(4)将步骤1中的抗原或病原体水平与步骤3中的抗原或病原体水平相比较，其中所说水平的改变即为刺激免疫反应的指征。在另一个实施方案中，再次投用zalpha11配体组合物。在其它实施方案中，抗原是B细胞肿瘤、病毒、寄生虫或细菌。
另一个方面，本发明提供刺激与抗原或病原体接触的哺乳动物的免疫反应的方法，其包括：(1)测定抗原或病原体特异性抗体的水平；(2)投用含有zalpha11配体连同可接受的药用载体的组合物；(3)测定用药后的抗原或病原体特异性抗体的水平；(4)将步骤1中测得的抗体水平与步骤3中测得的抗体水平相比较，其中抗体水平的增加即为刺激免疫反应的指征。
可将编码zalpha11配体多肽的多核苷酸用于希望增加或抑制zalpha11配体活性的基因治疗中。如果哺乳动物有突变的zalpha11配体基因或没有zalpha11配体基因，可将zalpha11配体基因导入哺乳动物细胞内。在一个实施方案中，将编码zalpha11配体多肽的基因体内导入病毒载体中。这样的载体包括减毒的或有缺陷的DNA病毒，例如包括但不只限于单纯性疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、EP病毒(EBV)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)等。优选的是缺少全部或几乎全部病毒基因的有缺陷的病毒。有缺陷的病毒在导入细胞后是没有感染性的。使用有缺陷的病毒载体可以在特定的局部区域投用于细胞，而不必担心载体可感染其它细胞。具体载体的例子包括但不只限于缺陷性单纯性疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt et al.，Molec.CellNeurosci.2：320-30，1991)、减毒腺病毒载体(如参见Strafford-Perricaudet et al.，J.Clin.Invest.90：626-30，1992)，以及缺陷性腺相关病毒载体(Samulski et al.，J.Virol.61：3096-101，1987；Samulski et al.，J.Virol.63：3822-8，1989)。
可以将zalpha11配体基因导入逆转录病毒中(如参见美国专利5,399,346(Anderson et al.)；Mann et al.，Cell 33：153，1983；美国专利4,650,764(Temin et al.)；美国专利4,980,289(Temin etal.)；Markowitz et al.，J.Virol.62：1120，1988；美国专利5,124,263(Temin et al.，)；国际专利申请公开号WO95/07358(Dougherty et al.，1995年3月16日公开)；以及Kuo etal.，Blood 82：845，1993)。或者，也可以使用脂质体以体内脂质转染法导入载体。可以使用合成的阳离子脂质制备用于体内转染编码标志物的基因的脂质体(Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7413-7，1987；Mackey et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：8027-31，1988)。使用脂质转染法将外源基因体内导入特定器官的技术具有某些实际优点。其中一个有利的方面就是利用脂质体可将分子导向特定细胞。更有利的一个方面是定向转染到特定细胞中。例如，在有细胞异质性的组织如免疫系统、胰、肝、肾和脑等组织中，对特定类型细胞的定向转染是特别有利的。可将脂质化学偶联到用于导向目的的其它分子上。可以将导向肽(如激素或神经递质)、蛋白质(如抗体)或非肽类分子化学偶联到脂质体上。
有可能从体内移除靶细胞；向其中导入作为裸DNA质粒的载体；然后将被转化的细胞重新植入体内。可以使用本领域已知的方法将用于基因治疗的裸DNA载体导入预期的宿主细胞中，所说的方法例如包括转染、电穿孔、微量注射、转导、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪或使用DNA载体转运体(如参见Wu et al.，J.Biol.Chem.267：963-7，1992；Wu et al.，J.Biol.Chem.263：14621-4，1988)。
可以使用反义方法学抑制zalpha11配体基因转录，如抑制体内细胞增殖。设计与zalpha11配体编码多核苷酸(例如SEQ ID NO：1中列出的多核苷酸)的片段互补的多核苷酸，以与编码zalpha11配体的mRNA结合并抑制这种mRNA的翻译。可使用这样的反义多核苷酸抑制细胞培养物中或受试者体内zalpha11配体多肽编码基因的表达。
也可产生经遗传工程改造后表达zalpha11配体基因的小鼠即所谓“转基因小鼠”，和表现完全没有zalpha11配体基因功能的小鼠，即所谓“剔除小鼠”(Snouwaert et al.，Science 257：1083，1992；Lowell et al.，Nature 366：740-42，1993；Capecchi，M.R.，Science244：1288-1292，1989；Palmiter，R.D.et al.，Annu.Rev.Genet.20：465-499，1986)。例如，可使用过表达zalpha11配体的转基因小鼠(普遍存在地或处于组织特异性或组织限制性启动子控制下)了解是否过表达可引起表型改变。例如，野生型zalpha11配体多肽、多肽片段或其突变体的过表达可改变正常细胞过程，产生可借以鉴定某个组织的表型，所说组织中zalpha11配体表达在功能上与zalpha11配体或其激动剂或拮抗剂的治疗靶相关或可指示该治疗靶。例如，优选的转基因小鼠是经遗传工程改造后过表达zalpha11配体(SEQ ID NO：2的氨基酸残基32-162)的小鼠。另外，这样的过表达可导致与人疾病显示有相似性的表型。同样，可使用剔除zalpha11配体的小鼠来确定zalpha11配体是否为体内绝对需要的。剔除小鼠的表型可用于预示zalpha11配体拮抗剂的体内作用。可使用人或小鼠zalpha11配体cDNA产生剔除小鼠。可以利用这些小鼠在体内系统中研究zalpha11配体基因和由其编码的蛋白质，并可用作体内研究相应人疾病的动物模型。再者，可以类似于上述转基因小鼠，使用转基因小鼠表达zalpha11配体反义多核苷酸或抗zalpha11配体的核酶。也可以投用纯化的zalpha11配体蛋白质以进行研究。
为了作为药物使用，可以按照常规方法将本发明的蛋白质配制成适于胃肠道外特别是静脉内或皮下给药的制剂。可以通过静脉内、动脉内或管腔内递送途径将本文所述的生物活性多肽或抗体缀合物导入预期的作用位点。可以在一至几个小时内经大团注射或灌注实现静脉内投用。一般说来，药物配方将包括zalpha11配体蛋白质，以及与之联合使用的药用载体如盐水、缓冲盐水、5％葡萄糖水溶液等。配方可进一步包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂、防止蛋白质在小瓶表示上丢失的白蛋白等。配制方法是本领域已知的(例如参见Remington：The Science and Practice of Pharmacy，Gennaro，ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA，19th ed.，1995)。治疗剂量一般为每天每公斤病人体重0.1至100μg，优选为0.5至20μg/Kg/天，确切的用药剂量将根据待治疗的病症的性质和严重性，以及病人状况等由临床医生确定。剂量的确定属于本领域技术人员的水平。该蛋白质可用于急性治疗，用药时间为一周左右，常常用药1至3天；或可用于慢性治疗，用药几个月或几年。一般说来，zalpha11配体的治疗有效量是足以使造血或免疫功能发生明显的临床改变所需要的量。
下列非限制性实施例将进一步举例说明本发明。
                        实施例
                        实施例1
        MPL-zalpha11多肽嵌合体的构建：MPL细胞外和
             TM区与zalpha11细胞内信号区融合
采用以ZC17，212(SEQ ID NO：5)和ZC19，914(SEQ ID NO：6)为引物的PCR从含有小鼠MPL受体的质粒(PHZI/MPL质粒)中分离小鼠MPL受体的细胞外和跨膜区域。反应条件是：95℃ 1分钟；95℃ 1分钟、45℃ 1分钟和72℃ 2分钟共进行35次循环；然后是72℃ 10分钟，再于10℃浸泡。PCR产物在1％低熔点琼脂糖(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)上跑电泳后，按照产品说明书使用QiaguickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离约1.5Kb MPL受体片段。
使用引物ZC19，913(SEQ ID NO：8)和ZC20，097(SEQ ID NO：9)，以PCR方法从含有zalpha11受体cDNA的质粒上分离出人zalpha11的细胞内区域。SEQ ID NO：7中显示相当于zalpha11受体编码序列的多核苷酸序列，SEQ ID NO：115中显示了相应的氨基酸序列。PCR反应条件如上所述。在1％低熔点琼脂糖(Boehringer Mannheim)上电泳分离PCR产物，并按照产品说明书使用Qiaquick凝胶提取试剂盒从中分离出大约900bp长的zalpha11片段。
按1∶1体积比混合上述各分离片段，并用于以ZC17,212(SEQ IDNO：5)和ZC20,097(SEQ ID NO：9)为引物的PCR反应，以产生MPL-zalpha11嵌合体。反应条件是：95℃ 1分钟；于95℃ 1分钟、55℃ 1分钟、72℃ 2分钟条件下循环35次；然后72℃ 10分钟；再于10℃浸泡。将整个PCR产物在1％低熔点琼脂糖(BoehringerMannheim)上电泳后，按照产品说明书使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离出约2.4kb的MPL-zalpha11嵌合体片段。按照产品说明书用EcoRI(BRL)和XbaI(Boehringer Mannheim)消化MPL-zalpha11嵌合体片段。整个消化产物加在1％低熔点琼脂糖(Boehringer Mannheim)上电泳并使用上述同样试剂盒分离出裂解的MPL-zalpha11嵌合体。将所得到的裂解的MPL-zalpha11嵌合体插入到下述的表达载体中。
按照产品说明书用EcoRI(BRL)和HindIII(BRL)消化受体表达载体pZP-5N，并按上述方法进行凝胶纯化。将此载体片段与如上分离的EcoRI和XbaI切割的MPL-zalpha11嵌合体及XbaI/HindIII接头片段混合成连接反应混合物。使用T4连接酶(BRL)于15℃下连接过夜。将连接样品电穿孔打入DM10B ElectroMAXTM电感受态大肠杆菌细胞中(25μF，200Ω，2.3V)。将转化体平铺在LB+氨苄青霉素的平板上并用PCR筛选单个菌落，以上述PCR条件并使用ZC17,212(SEQ ID NO：5)和ZC20,097(SEQ ID NO：9)检测MPL-zalpha11嵌合体。
使用下列引物，经序列分析进一步证实MPL-zalpha11嵌合体序列：ZC12,700(SEQ ID NO：10)，ZC5,020(SEQ ID NO：11)，ZC6,675(SEQ ID NO：12)，ZC7,727(SEQ ID NO：13)，ZC8,290(SEQ ID NO：14)，ZC19,572(SEQ ID NO：15)，ZC6,622(SEQ ID NO：16)，ZC7,736(SEQID NO：17)，和ZC9,273(SEQ ID NO：18)。该插入段约为2.4Kb，并且是全长度。
                        实施例2
    以使用阿拉码蓝(Alamar blue)的BAF3检测法检测基于
                MPL-zalpha11嵌合体的增殖A.表达MPL-zalpha11嵌合体的BaF3细胞的构建
将衍生于小鼠骨髓的白介素-3(IL-3)依赖性前淋巴样细胞系BaF3(Palacios and Steinmetz，Cell 41：727-734，1985；Mathey-Prevot等，Mol.Cell.Biol.6：4133-4135，1986)维持在添加有10％热-灭活胎牛血清、2ng/ml小鼠IL-3(mIL-3)(R&D，Minneapolis，MN)、2mM L-glutaMax-1TM(Gibco BRL)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)和PSN抗生素(GIBCO BRL)的完全RPMI培养基(JRHBioscience Inc.，Lenexa，KS)中。电穿孔前，制备pZP-5N/MPL-zalpha11质粒DNA(实施例1)并按照产品说明书使用Qiagen MaxiPrep试剂盒(Qiagen)纯化之。在RPMI培养基中将电穿孔的BuF3细胞洗一次，然后以107个细胞/ml的细胞密度重新悬浮在RPMI培养基中。将1ml重新悬浮的BaF3细胞与30μg pZP-5N/MPL-zalpha11质粒DNA混合并转移到分离的一次性电穿孔小室内(GIBCO BRL)。室温下温育15分钟后，用电穿孔装置(CELL-PORATORTM；GIBCO BRL)对细胞发送两次连续电击(800 1Fad/300V；1180 1Fad/300V.)。经5分钟恢复后，将电穿孔的细胞转移到50ml完全培养基内并放在培养箱中温育15-24小时(37℃，5％ CO2)。然后离心分离细胞并重新悬浮在T-162培养瓶内的含GeneticinTM(Gibco)选择剂(500μg/ml G418)的50ml完全培养基中，以分离G418抗性集合体。按下述方法检测被转染的BaF3细胞集合体即所谓BaF3/MPL-zalpha11细胞的信号发生能力。B.使用Alamar Blue增殖试验检测BaF3/MPL-zalpha11细胞的信号发生能力
离心分离BaF3/MPL-zalpha11细胞并在不含mIL-3的上述完全培养基(称为“无mIL-3培养基”)中洗涤。离心细胞并洗3次以确保除去mIL-3。然后在血细胞计数器中计数细胞。使用无mIL-3培养基将细胞铺敷在96孔平板上，5000细胞/100μl/孔。
使用已用无mIL-3培养基稀释到浓度为500、250、125、62、30、15、7.5、3.75、1.8、0.9、0.5和0.25ng/ml的小鼠血小板生成素(mTPO)估测BaF3/MPL-zalpha11细胞的增殖。向BaF3/MPL-zalpha11细胞中加入100μl稀释的mTPO。总试验体积为200μl。使用未加mTPO的单纯无mIL-3培养基作为平行的阴性对照。将试验平板于37℃，5％ CO2条件下温育3天，同时每孔加入Alamar Blue(Accumed，Chicago，IL)。基于细胞的代谢活性，(Alamar Blue)给出荧光读数，因此可与阴性对照比较后直接测出细胞增殖水平。将平板再次于37℃，5％ CO2条件下温育24小时。使用SoftMaxTM Pro程序于544(激发)和590(发射)波长下在FmaxTM平板读数器(Molecular Devices Sunnyvale，CA)上读出试验结果。
在62ng/ml和更大mTPO浓度下，血小板生成素诱导高于本底约10倍的增殖，从而证明zalpha11受体细胞内部分的信号发生能力。
                    实施例3
        表达全长zalpha11的表达载体的构建
使用引物ZC19,905(SEQ ID NO：19)和ZC19,906(SEQ ID NO：20)，以PCR方法从含有zalpha11受体cDNA(SEQ ID NO：7)的质粒中分离整个zalpha11受体。反应条件如下：95℃ 1分钟；之后95℃ 1分钟，55℃ 1分钟和72℃ 2分钟重复35次循环，然后72℃ 10分钟；再于10℃浸泡。将PCR产物在1％低熔点琼脂糖(Boehringer Mannheim)凝胶上电泳，并按照产品说明书使用QiaquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离出约1.5Kb zalpha11 cDNA。
按照产品说明书用BamHI(Boehringer Mannheim)和EcoRI(BRL)消化纯化的zalpha11 cDNA。在1％低熔点琼脂糖(Boehringer Mannheim)凝胶上电泳分离整个消化产物并使用QiaquickTM凝胶提取试剂盒纯化经切割的zalpha11片段。将所得到的裂解zalpha11片段插入到下述表达载体中。
按照产品说明书用BamHI和EcoRI消化受体表达载体pZP-5N并按上述方法进行凝胶纯化。在使用T4连接酶(BRL)的连接反应中使该载体片段与如上分离的BamHI和EcoRI切割的zalpha11片段连接。将连接反应混合物于15℃温育过夜。将连接反应样品电穿孔到DH10BelectroMAXTM电感受态大肠杆菌细胞中(25μF，200Ω，2.3V)。将转化体平铺在LB+氨苄青霉素平板上，在上述反应条件下，使用ZC19,905(SEQ ID NO：19)和ZC19,906(SEQ ID NO：20)引物以PCR方法筛选单个菌落以检测zalpha11序列。
使用引物：ZC12,700(SEQ ID NO：10)、ZC5,020(SEQ ID NO：11)、ZC20,114(SEQ ID NO：21)、ZC19,459(SEQ ID NO：22)、ZC19,954(SEQ ID NO：23)和ZC20,116(SEQ ID NO：24)进行序列分析，以证实zalpha11序列。该插入段约为1.6Kb，并且是全长。
                    实施例4
以使用Alamar Blue的BAF3试验检测基于zalpha11的增殖A.表达zalpha11受体的BaF3细胞的构建
使用30μg上述实施例3中的zalpha11表达载体，按实施例2A所述方法构建表达全长zalpha11受体的BaF3细胞。将表达zalpha11受体mRNA的BaF3细胞称为BaF3/zalphall。使用这些细胞筛选zalpha11配体(参见下列实施例5和6)。
                    实施例5
     使用BaF3/zalpha11细胞以Alamar Blue
           增殖试验法筛选zalpha11配体A.活化原代猴脾细胞以检测zalpha11配体的存在
按下述方法体外刺激猴脾细胞来产生条件培养基，以检测zalpha11配体活性的存在。从8岁雌性猴(M.nesestrian)体中得到脾脏并由之制备单细胞悬液。以Ficoll-PaquePLVS(PharmaciaBiotech，Uppsala，Sweden)密度梯度分离单核细胞。以2×106细胞/ml的密度将单核细胞接种在加有10％ FBS的RPM1-1640培养基中，并用5ng/ml佛波醇-12-肉豆蔻酸-13-乙酸酯(PMA)(Calbiochem.SanDiego，CA)和0.5mg/ml离子霉素TM(Calbiochem)活化48小时。使用经刺激的猴脾细胞的上清液检测BaF3/zalpha11细胞的增殖。B.使用BaF3/zalphall细胞，以Alamar Blue增殖试验法筛选zalpha11配体
离心分离BaF3/zalpha11细胞并在无mIL-3培养基中洗涤细胞。再次离心细胞并洗3次以彻底除去mIL-3。然后用血细胞计数器计数细胞。借助无mIL-3培养基将细胞平铺在96孔平板上，5000细胞/100μl/孔。
使用活化的猴脾细胞的条件培养基(见实施例5A)估测BaF3/zalpha11细胞的增殖。用无mIL-3培养基将条件培养基稀释到50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、0.75％和0.375％浓度。取100μl稀释的条件培养基加到BaF3/zalpha11细胞中。总试验体积为200μl。将试验平板于37℃，5％CO2条件下温育3天后，加入AlamarBlue(Accumed，Chicago，IL)20μl/孔。再次将平板于37℃，5％CO2条件下温育24小时。在上述FmaxTM平板读数器(Molecular devices)上读出结果(实施例2)。
结果进一步证实了BaF3/zalpha11细胞对存在于活化的猴脾细胞条件培养基中的因子的增殖反应。如所测知的，当50％浓度时反应约为本底的4倍。未转染的BaF3细胞没有在对该因子的反应中发生增殖，表明该因子对zalpha11受体是特异的。C.用于分离zalpha11配体的人原代细胞来源
从6个供体各取100ml血。将血液收集到含有肝素的10×10ml真空管中。合并6个供体的血液(600ml)，用PBS按1∶1稀释，并使用Ficoll-PaquePLUS(Pharmacia Biotech)分离细胞。在ficoll梯度上分离后得到的人原代细胞产率为1.2×109细胞。
将细胞悬浮在9.6ml MACS缓冲液(PBS，0.5％EDTA、2mM EDTA)中。取1.6ml细胞悬液并加入0.4ml CD3微球(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)。将混合物于4℃温育15分钟。用30ml MACS缓冲液洗涤经CD3小球标记的这些细胞，然后重新悬浮在2ml MACS缓冲液中。
按照生产商的说明制备VS+柱(Miltenyi)。然后将VS+柱放在VarioMACSTM磁场(Miltenyi)中。用5ml MACS缓冲液平衡柱。然后将分离的原代人细胞加到柱上。使CD3阴性细胞通过。用9ml(3×3ml)MACS缓冲液洗柱。将柱从磁体上除掉并放在15ml falcon管上方。向柱内加入5ml MACS缓冲液以洗脱CD3+细胞，并使用生产商提供的滑阀彻底清洗结合的细胞。将细胞与CD3磁性小珠一起温育、洗涤和VS+柱层析步骤(通过洗脱温育)重复5次以上。合并从六个柱上得到的CD3+部分。CD3+选择性人细胞的得率为总共3×108个细胞。
除去合并的CD3+选择的人细胞样品，在荧光抗体细胞分选仪(FACS)上进行染色和分选，以估计其纯度。人CD3+选择的细胞为91％CD3+细胞。
在RPM1+5％FBS+PMA 10ng/ml和离子霉素0.5μg/ml(Calbiochem)中37℃温育13小时，以活化人CD3+选择的细胞。按下述方法检测这些激活的CD3+选择的人细胞上清液的zalpha11配体活性。另外，按下列实施例6中所述，使用激活的CD3+选择的人细胞制备cDNA文库。D.使用BaF3/zalpha11细胞和Alamar Blue增殖试验法检测激活的CD3+选择的人细胞上清中的zalpha11配体
离心BaF3/zalpha11细胞并用无mIL-3培养基洗。离心细胞并洗3次以确保去掉mIL-3。然后在血细胞计数器中计数细胞。将细胞平铺在96孔平板的小孔内，5000个细胞/100μl无mIL-3培养基/孔。
使用无mIL-3培养基稀释到50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、0.75％和0.375％浓度的激活的CD3+选择的人细胞(参见实施例5C)的条件培养基估测BaF3/zalpha11细胞的增殖。将100μl稀释的条件培养基加到BaF3/zalpha11细胞中。总试验体积为200μl。温育试样平板并按实施例5B中所述方法检测。
结果进一步证实了BaF3/zalpha11细胞对存在于活化的CD3+选择的人细胞条件培养基中的因子的增殖反应。如已检测到的，在50％浓度时反应约为本底的10倍。在对因子的反应中，未转染的BaF3细胞并没有增殖，表明该因子是对zalpha11受体特异的。另外，可溶性zalpha11受体阻断了BaF3/zalpha11细胞中的这种增殖活性(见实施例11)。
                    实施例6
      从人CD3+选择的细胞库克隆人zalpha11配体
筛选原代人活化的CD3+选择的细胞cDNA文库揭示了一种分离的cDNA代表四螺旋束细胞因子家族的一个新成员。该cDNA编码zalpha11配体。使用zalpha11受体筛选zalpha11配体的活性以鉴定该cDNA。A.用于构建CD3+选择的文库的载体
用于CD3+选择的文库构建的载体是pZP7NX。按下述方法构建pZP7NX载体：用限制酶NcoI和Pst1(Boehringer Mannheim)进行DNA消化，以除去载体pZP7中的DHFR选择标记的编码区。在1％琼脂糖凝胶上电泳分离消化的DNA，切下并用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照产品说明书纯化凝胶。使用引物ZC13,946(SEQ ID NO：25)和ZC13,945(SEQ ID NO：26)并以pZeoSV2(+)作为模板，以PCR方法扩增代表Zeocin选择标记之编码区的DNA片段。引物ZC13,946(SEQID NO：25)有附加的PstI和Bc1I限制性位点，引物ZC13,945(SEQ IDNO：26)中有附加的NcoI和SfuI位点。用PstI和NcoI限制酶切割PCR片段并克隆到用同样两种酶切割并经凝胶纯化而制备的pZP7载体中。该载体被命名为pZP7Z。然后用BclI和SfuI酶消化载体pZP7Z的DNA，以除去Zeocin编码区。在1％琼脂糖凝胶上电泳，切下凝胶并纯化经消化的DNA，然后将其连接到用同样限制酶(BclI和SfuI)从pZem228载体(ATCC No.69446)上切下来的新霉素编码区DNA片段上。
此新的载体称为pZP7N，其中DHFR选择标记的编码区被来自pZem228载体的新霉素选择标记的编码区所取代。将包括Xho1位点的填充片段加到pZP7N上，以产生适于高效率定向克隆cDNA的载体；该载体称为pZP7NX。为了制备cDNA的载体，用20单位EcoRI(LifeTechnologies Gaithersberg，MD)和20单位XhoI(BoehringerMannheim)将20μg pZP7NX 37℃消化5小时，然后68℃消化15分钟。在0.8％低熔点琼脂糖1XTAE凝胶上电泳分离消化产物，以从载体中分离出填充片段。切下载体带并按照厂商建议的方法用“β-琼脂糖酶”(New England Biolabs，Beverly，MA)消化。乙醇沉淀后，将经过消化的载体重新悬浮在水中，达到浓度45ng/ml，用以连接下述CD3+选择的cDNA文库。B.原代人活化的CD3+选择的细胞cDNA库的制备
37℃培养13小时(实施例5C)后，离心分离在离子霉素/PMA中刺激的大约1.5×108个原代人CD3+选择的细胞。使用“RNeasy Midi”试剂盒(Qiagen Inc.，Valencia，CA)自细胞沉淀饼中分离总RNA。使用“MPG mRNA纯化试剂盒”(CPG Inc.，Lincoln Park，NJ)从225μg总RNA中分离mRNA。分离出3.4μg mRNA并使用下述方法转化成双链cDNA。
按下述方法合成来自刺激的人CD3+选择的细胞的第一条cDNA。将9μl 0.34μg/μl的Oligo d(T)选择的poly(A)CD3+RNA与1.0μl的1μg/μl含有XhoI限制位点的第一条链引物ZC18,698(SEQ IDNO：27)混合，于65℃加热4分钟后再在冰上冷却。通过向RNA-引物混合物中加入9μl第一链缓冲液(5×SUPERSCRIPT缓冲液，LifeTechnologies)、4μl 100mM二巯基乙醇和2μl含有各10mM dATP、dGTP、dTTP和5-甲基-dCTP(Pharmacia Biotech Inc.)的三磷酸脱氧核苷酸溶液来启动第一条cDNA链的合成。将反应混合物于45℃温育4分钟，然后加入8μl的200U/μl Superscript II，RNase H反转录酶(Life Technologies)。反应于45℃温育45分钟，然后每隔2分钟升温1℃直到50℃，并在此维持10分钟。然后将反应加热到70℃维持2分钟，再降到55℃维持4分钟，然后加入2μl的SuperscriptIIRT并再温育15分钟，其后再以1℃/1分钟的速度升温到70℃，以使二级结构变性并使cDNA再次延伸。于2μg糖原载体、2.0M乙酸铵和2.5体积的乙醇存在下沉淀两次，然后用100μl 70％乙醇洗，以从cDNA中除去未掺入的核苷酸。将cDNA重新悬浮于98l水中，用于第二条链合成。
在促进第一条链引导第二条链合成导致DNA发卡形成的条件下，在第一条cDNA链上合成第二条链。第二链反应混合物含有98μl第一链cDNA、30μl 5X聚合酶I缓冲液(100mM Tris-HCl，pH7.5，500mMKCl，25mM MgCl2、50mM(NH4)2SO4)，2μl 100mM二巯基乙醇、6μl含有各10mM三磷酸脱氧核苷酸的溶液，5μl 5mM b-NAD，1μl 3U/μl大肠杆菌DNA连接酶(New England Biolabs Inc.)和4μl 10U/μl大肠杆菌DNA聚合酶I(New England Biolabs Inc.)。反应在室温下进行并温育2分钟然后加4μl  3.8U/μl RNase H(LifeTechnologies)。反应混合物于15℃温育2小时，然后再室温下温育15分钟。向反应中加入10μl 1M TRIS pH7.4，用苯酚/氯仿提取两次再用氯仿提取1次，然后用50μl TE(10mM TRIS pH7.4，1mM EDTA)回提有机相，与其它水相合并并于0.3M乙酸钠存在下用乙醇沉淀。用100μl 70％乙醇洗沉淀物，干燥并重新悬浮在40μl水中。
用绿豆核酸酶切割发卡结构的单链DNA。在1X绿豆核酸酶缓冲液中将含有40μl第二链cDNA，5μl 10X绿豆核酸酶缓冲液(LifeTechnologies)，5μl绿豆核酸酶(Pharmacia Biotech Corp.)的反应混合物稀释到1U/μl。将反应于37℃温育45分钟。加入10μl 1MTris-HCl，pH7.4终止反应，然后如上所述依次进行苯酚/氯仿和氯仿提取。提取后，于乙酸钠存在下用乙醇沉淀cDNA。用100μl 70％乙醇洗淀沉物，干燥并重新悬浮在38μl水中。
用T4 DNA聚合酶修平悬浮cDNA的末端。将重悬于38μl水中的cDNA与12μl 5×T4 DNA聚合酶缓冲液(250mM Tris-HCl，pH8.0，250mM KCl，25mM MgCl2)，2μl 0.1M二巯基乙醇，6μl含有各10mM四种三磷酸脱氧核苷酸的溶液和2μl 1U/μl T4 DNA聚合酶(Boehringer Mannheim Corp.)混合。15℃温育45分钟后，加入30μl TE终止反应，然后依次进行苯酚/氯仿和氯仿提取，并如上所述用20μl TE反向提取。在2μl Peuet PaintTM(Novagen)载体和0.3M乙酸钠存在下用乙醇沉淀DNA，并重新悬浮在11μl水中。
将EcoRI接头连接到上述cDNA的5′端，以使之能够克隆到表达载体中。将11μl cDNA和4μl 65pmole/μl的EcoRI半磷酸化接头(Pharmacia Biotech Corp)与5μl 5X连接酶缓冲液(LifeTechnologies)，2μl 10mM ATP和3μl 1U/μl T4 DNA连接酶(LifeTechnologies)，1μl 10X连接缓冲液(Promega Corp)，9μl水混合。用1X缓冲液准确稀释以防止因沉淀出现小的沉淀物。在温度由10℃升至22℃的水浴中将反应温育9小时，然后于25℃温育45分钟。68℃温育15分钟以终止反应。
为了将cDNA定向克隆到表达载体中，用XhoI消化cDNA，得到带有5′EcoRI粘端和3′Xho粘端的cDNA。在先已使用ZC18698(SEQ IDNO：27)引物引入了cDNA 3′末端的XhoI限制性位点。在含有35μl上述连接混合物，6μl 10X H缓冲液(Boehringer Mannheim)，1μl2mg/ml BSA(Biolabs Corp.)，17μl水和1.0μl 40U/μl XhoI(Boehringer Mannheim)的反应混合物中进限制性酶消化。37℃消化1小时。68℃温育15分钟以终止反应，然后用乙醇沉淀，洗涤，干燥并重新悬浮在30μl水中。
将悬浮的cDNA加热到65℃ 15分钟和在冰中冷却，加入4μl 5X凝胶装载染料(Research Genetics Corp.)，将cDNA加样到0.8％低熔点琼脂糖1X TAE凝胶(SEA PLAQUE GTGTM低熔点琼脂糖，FMC Corp.)上进行电泳。从凝胶上切掉污染的接头和长度低于0.6Kb的cDNA。倒置电极，加入熔融的琼脂糖以充满小孔，改变缓冲液并电泳cDNA直到浓集在泳道原点附近。切下含有浓缩的cDNA的凝胶并放入离心管中，65℃加热15分钟以熔化琼脂糖。将样品平衡到45℃后，加入2μl 1U/μl β-琼脂糖酶I(Biolabs，Inc.)，将混合物于45℃温育90分钟以消化琼脂糖。温育后，向样品中加入1/10体积的3M乙酸钠，将混合物在冰上保持15分钟。将样品在室温下以14,000xg离心15分钟以除去未消化的琼脂糖，用乙醇沉淀cDNA，用70％乙醇洗涤，风干并重新悬浮在40μl水中。
为了确定cDNA对载体的最佳比例，配制几种不同的连接混合物并进行电泳分析。简单地说，将2μl 5X T4连接酶缓冲液(LifeTechnologies)，1μl 10mM ATP，1μl EcoRI-XhoI消化的pZP7NX，1μl T4 DNA连接酶(0.25μ/μl)(Life Technologies)，10μl水和0.5，1，2或3μl cDNA混合成4份分立的连接混合物，于22℃温育4小时，68℃温育20分钟，然后用乙酸钠-乙醇沉淀，洗涤，干燥并重新悬浮在10μl水中。使用0.1cm小池(Biorad)和基因脉冲器(Genepulser)，定在2.5KV，251F，200ohm的脉冲控制器(pulsecontrollerTM，Biorad)，将1μl各连接反应混合物电穿孔到40μlDH10b ElectroMaxTM电感受态细菌(Life Technologies)中。将这些细胞立即重悬于1ml SOC浴中(Manniatis等，上述文献)，然后加入500μl 50％的甘油-SOC作为防腐剂。将这些“甘油原液”分几等份冷冻于-70℃。融化各一等份并加在一系列添加有100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂板上。菌落数表明CD3+cDNA对pZP7NX载体的最佳比例为1μl至45ng；这样一个连接反应产生4.5×106个原始克隆。
为了使用基于BaF3-zalpha11的增殖试验法筛选该文库(实施例5)，将上述甘油原液稀释成在深孔微量滴定板中每个集合池含100或250个克隆的液体培养物，振荡下37℃培养24小时，并使用Qiagen试剂盒分离质粒。然后将这些DNA转染到BHK细胞中，限制培养72小时，收获细胞并放在5K BaF3-zalpha11细胞上温育72小时，然后使用“Alamar Blue”荧光检测法估测细胞增殖水平(实施例5B和实施例2B)。
为了用分泌诱捕克隆法筛选文库，须用一个复杂的，扩增形式的文库转染COS-7细胞。将大约4.8×106个克隆铺敷在110个15cm加有100μg/ml氨苄青霉素，10μg/ml二甲氧基苄青霉素的LB-琼脂平板上。37℃生长过夜后通过刮下收获并沉淀细菌。使用Nucleobond-gigaTM(Clonetech)从离心收集的细菌中提取质粒DNA。然后使用该质粒转染玻片上的COS-7细胞(ATCC No.CRL1651)，并使用下述分泌诱捕技术筛选之(实施例12)。
                        实施例7
                人zalpha11配体的表达克隆
将得自活化的人CD3+选择的细胞文库的甘油原液(实施例6)以每800μl 250个细胞的浓度加到Super Broth IITM(Becton Dickinson，Cockeysville，MD)+0.1mg/ml氨苄青霉素(amp)中。使大肠杆菌在室温下平衡24小时。接种后，将400μl铺敷在LB+amp平板上，以确定接种的真实滴度。24小时后计数平板细胞数并将SuperBroth IITM+大肠杆菌的终浓度调到每1.2ml含250个细胞。接种3×2升，达到总共6升。然后将培养基铺敷到96孔深孔板(Qiagen)中。铺板是用8道Q-Fill2TM分散器(Genetix，Christchurch，Dorset，UK)完成的。在New Brunswick Scientific Innova 4900多层面环境振荡器上以每分钟250圈的速度，使大肠杆菌37℃振荡下生长过夜。使用BeckmanGS-6KR离心机以3000rpm离心大肠杆菌。将这些大肠杆菌沉淀物于-20℃冻藏并在操作质粒DNA之前新鲜取用。每个沉淀饼约含有人CD3+选择的细胞库中的250个cDNA克隆。
然后使用QIAprepTM 96 Turbo Miniprep试剂盒(Qiagen)小量制备这些含250个cDNA克隆的集合体。使用125μl TE(10mM Tris pH8，1mM EDTA)洗脱质粒DNA。然后使用该质粒DNA转染BHK细胞。BHK转染
将BHK细胞按12,000个细胞/100μl/孔的密度铺敷在96孔组织培养板中。培养基是含有5％热灭活的胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺(GibcoBRL)，1×PSN(Gibco BRL)，1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)的DMEM培养基(Gibco BRL)。
第二天，用100μl SFA洗BHK细胞一次。SFA是含有2mM GlutaMaxTM(Gibco/BRL)、1mM丙酮酸钠、1μg/ml转铁蛋白，5μg/ml胰岛素，10μg/ml胎球蛋白、2μg/ml硒，25mM HEPES(Gibco/BRL)，100μM非必需氨基酸(Gibco/BRL)的无血清DMEM/F12培养基(Gibco/BRL)。
按下述方法制备DNA/LipofecfamineTM混合物：室温下将2.2μlLipofectamineTM试剂(Gibco/BRL)与102.8μl SFA合并然后加入约5μg质粒DNA(200ng/μl)以形成DNA/LipofectamineTM混合物，并于室温下温育30分钟。从BHK细胞中除去SFA，并在37℃和5％ CO2条件下将细胞与50μl DNA/LipofectamineTM混合物温育5小时。向BHK细胞的两个孔中各加入50μl DNA/LipofectamineTM混合物，从而以一式两份进行转染。
BHK细胞与DNA/LipofectamineTM混合物温育5小时后，除去DNA/LipofectamineTM混合物并加入100μl培养基。将细胞温育过夜，除去培养基并换成100μl培养基。将细胞培养72小时后，除去条件培养基，-80℃冷冻最少20分钟，融解后取50μl进行zalpha11/Baf3增殖试验(参见实施例2B和5)，以鉴定有配体活性的250个克隆集合体。
在一次试验中筛选35个96孔平板。这代表每孔大约250个cDNA和总共840,000个cDNA。其中，在增殖试验中有54个小孔的条件培养基(每孔250个cDNA)为阳性。然后在加有或没有可溶性受体(见实施例2)的第二个试验(分泌诱捕)中再次试验这些阳性集合体的条件培养基。所用zalpha11 CEE可溶性受体(实施例10A)的终浓度为大约1μg/ml。对于所有54个阳性集合体来说，基本上所有的活性均因加入可溶性zalpha11受体而被中和，表明这些集合体含有来自zalpha11配体的cDNA。选择其中四个阳性集合体进行溶解并分离可编码zalpha11配体的单一cDNA。这些集合体是45C5、46G11、40H12和60A1。
四个中的每个集合体使用1μl DNA以电穿孔法转化Electro MaxTMDH10B细胞(Gibco/BRL)。将转化体铺敷在LB+amp(100μg/ml)+二甲氧基苄青霉素(10μg/ml)平板上以得到单个菌落。对于每个电穿孔的集合体，挑出960个单菌落移入10个含有1.2ml SuperBroth IITM/孔的96孔平板中。针对每个破碎的集合体(45C5、46G11，40H12和60A1)将这些平板编号为1-10号。将其培养过夜并按上述方法小量制备质粒DNA。对于46G11、40H12和60A1，将得自各击穿平板的质粒DNA转染到上述BHK细胞中。
对于45C5，使用“快速追踪”方法加速对zalpha11配体cDNA的鉴定。用上述击穿平板上得到的质粒DNA转染BHK细胞，温育5小时后除去DNA/LipofectamineTM混合物，并加入培养基。因为转染是以一式两份进行的，所以在24小时后从一个被转化BHK细胞平板中收获培养基，并在48小时后从其余的被转化细胞平板上收获培养基。使用本文所述的增殖试验法检测24小时条件培养基的zalpha11配体活性。
从45C5分解(击穿)平板1-4号合并质粒DNA，并以“分泌诱捕”方法(参见实施例12)检测zalpha11可溶性受体与其配体的结合。从总共384个序列鉴定8个阳性克隆。增殖试验的结果进一步证实zalpha11配体的活性并且与分泌诱捕试验(见实施例12)的结果相关。同时，测定从45C5穿孔破坏集合体1-4号板小量提取之质粒DNA的序列，以确定384个克隆中每个克隆的DNA序列。
也使用下列引物测定在增殖和分泌诱捕试验中鉴定为阳性的几个克隆的序列：ZC14,063(SEQ ID NO：28，ZC7,764a(SEQ ID NO：38)，ZC7,764b(SEQ ID NO：39)，ZC22,034(SEQ ID NO：40)和ZC22,035(SEQ ID NO：41)。zalpha11配体的多核苷酸序列是全长度的(SEQ IDNO：1)，其相应的氨基酸序列则如SEQ ID NO：2中所示。
                        实施例8
         表达zalpha11可溶性受体：zalpha11 CEE、
         zalpha11 CFLG、zalpha11 CHIS和zalpha
            11-Fc4的哺乳动物表达载体的构建A.含有zalpha11 CEE、zalpha11 CFLG和zalpha11 CHIS的zalpha11哺乳动物表达载体的构建
制备用于表达zalpha11多肽的可溶性细胞外区域的表达载体，pC4zalpha11 CEE，其中设计表达zalpha11多肽的构建物，使之含有推测的起始蛋氨酸和截短的预期跨膜区的相邻部分以及C末端Glu-Glu标记(SEQ ID NO：29)。
使用ZC19,931(SEQ ID NO：30)和ZC19,932(SEQ ID NO：31)作为加入Asp718和BamHI限制位点的PCR引物，产生构成zalpha11DNA片段的700bp PCR产物。使用含有zalpha11受体cDNA(SEQ ID NO：7)的质粒作为模板。zalpha11片段的PCR扩增的条件如下：94℃ 0.5分钟进行25次循环；94℃ 10秒钟，50℃ 30秒钟和68℃ 45秒钟反复5次循环，然后保持在4℃。用氯仿/苯酚提取和异丙醇沉淀纯化反应产物，然后按照厂商建议用Asp718和BamHI(Gibco BRL)消化。经1％琼脂糖凝胶电泳显现预定大小700bp的带，切割后并按照使用说明书用QiaexllTM纯化试剂盒(Qiagen)纯化DNA。
将切下的DNA亚克隆到已用BamHI和Asp718酶切的质粒pC4EE中。pC4zalpha11 CEE表达载体使用天然zalpha11信号肽并有Glu-Glu标记(SEQ ID NO：29)连接到zalpha11多肽之编码多核苷酸序列细胞外部分的C末端。哺乳动物表达载体，质粒pC4EE的表达盒含有小鼠金属硫蛋白-1启动子、插入编码序列所需的多限制性位点、终止密码子和人生长激素终止子。质粒还有大肠杆菌复制原点，哺乳动物选择标记，表达单位具有SV40启动子、增强子和复制原点、DHFR基因和SV40终止子。
16℃下使大约30ng限制性消化的zalpha11插入段与大约12ng消化的载体连接过夜。按照厂商的建议将各1μl连接反应混合物单独电穿孔到DH10B感受态细胞中，并铺敷在含有50mg/ml氨苄青霉素的LB平皿上，然后温育过夜。经限制性酶切分析从个别菌落的2ml液体培养物制备的DNA，以筛选菌落。阳性克隆的插入序列经序列分析得到证实。按照生产商的说明书使用QIAGENMaxi Prep试剂盒(Qiagen)大规模制备质粒。
使用同样方法制备有C末端his标记(由一列6个组氨酸组成)的，和有C末端flag(SEQ ID NO：37)标记的(zalpha11 CFLAG)的zalpha11可溶性受体。为了制备这些构建物，使用其中以HIS或FLAG标记取代glu-glu标记(SEQ ID NO：29)的上述载体。B.可溶性zalpha11受体zalpha11-Fc4的哺乳动物表达构建物
通过同源重组构建含有编码zalpha11之全部或部分多核苷酸的表达质粒。使zalpha11受体的细胞外区域与人IgG的Fc区域融合，其中称为“Fc4”(SEQ ID NO：33)的Fc区域含有突变从而不再与Fc受体结合。使用PCR分离zalpha11 cDNA的片段，其包括zalpha11受体之细胞外区域的多核苷酸序列。用于生产zalpha11片段的两个引物是：(1)PCR引物，从5′至3′端各包括：40bp的载体侧接序列(插入段的5′端)和相当于zalpha11细胞外区域之5′端的17bp(SEQ IDNO：32)，和(2)40bp的Fc4多核苷酸序列的5′端(SEQ ID NO：33)和相当于zalpha11细胞外区域之3′端的17bp(SEQ ID NO：34)。以相似的PCR方法产生与zalpha11融合的Fc4片段。在生产Tc4片段中所使用的引物是：(1)由zalpha11细胞外区域的3′端40bp序列和17bp Fc4的5′末端组成的5′引物(SEQ ID NO：35)；以及(2)由40bp载体序列(插入段的3′端)和17bp Fc4的3′端组成的3′引物(SEQID NO：36)。
上述各PCR反应的条件如下：94℃ 2分钟循环一次；94℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 1分钟，如此进行25次循环；72℃ 5分钟循环一次；然后保持于4℃。从100μl PCR反应混合物中取10μl在0.8％ LMP琼脂糖凝胶与用于分析的1×TBE缓冲液(Seaplague GTG)上进行电泳分析。其余90μl则加入5μl 1M NaCl和250μl无水乙醇沉淀。所使用的表达载体是由最初衍生于pZP9(ATCC No.98668)的质粒pCZR199制得并用SmaI(BRL)消化过的。该表达载体衍生于质粒pCZR199的哺乳动物表达载体，其表达盒中具有CMV直接早期启动子、小鼠免疫球蛋白重链基因座可变区的共有内含子、便于插入编码序列的多限制性位点、终止密码子和人生长激素终止子。表达载体还具有大肠杆菌复制原点，含有SV40启动子、增强子和复制原点、DHFR基因和SV40终止子的哺乳动物选择性标记表达单位。用CMV直接早期启动子取代金属硫蛋白启动子以从pCZR199构建所使用的表达载体。
将100μl感受态酵母细胞(酿酒酵母)与10μl含有各约1μlzalpha11和Fc4插入物，以及100ng SmaI BRL消化的表达载体相混合，并转入0.2cm电穿孔小池内。酵母/DNA混合物的电脉冲条件是0.75kV(5kV/cm)、“无限的”ohms，25μF。向各小池内加入600μl1.2M山梨糖醇，并将酵母铺敷在两个URA-D平板上(各300μl)并30℃温育。
大约48小时后，将各平板上的Ura+酵母转化体悬浮在1ml H2O中并简单离心以沉淀出酵母细胞。将酵母细胞沉淀饼重新悬浮在1ml溶解缓冲液(2％ Triton X-100，1％ SDS、100mM NaCl、10mM Tris，pH 8.0，1mM EDTA)。将500μl裂解混合物加到含有300μl酸洗的玻璃球和200μl苯酚-氯仿的Eppendorf管中，以1分钟间隔涡旋振动2-3次，然后在Eppendorf离心管中以最大速度离心5分钟。将300μl水相移入新鲜试管并用600μl乙醇(EtOH)沉淀DNA，然后4℃离心10分钟。将DNA沉淀饼重新悬浮在100μl水中。
用0.5-2ml酵母DNA小量制备物和40μl DH10B细胞转化电感受态大肠杆菌(CH10B，Cibco/BRL)。以2.0kV、25mF和400ohms对细胞施加电脉冲。电穿孔后，将1ml SOC(2％ BactoTM胰胨(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)以250μl等份铺敷在4个LB AMP平板(LB肉汤(Lennox)、18％ Bacto琼脂(Difco)、10mg/L氨苄青霉素)。
经限制性消化鉴定携带zalpha11-Fc4的正确表达构建物的个别克隆，以证实zalpha11-Fc4插入段的存在，并证实各个DNA序列已彼此正确连接。对阳性克隆的插入段进行序列分析。使用Qiagen Maxi试剂盒(Qiagen)大量分离质粒DNA。
                        实施例9
           zalpha11可溶性受体多肽的转染和表达A.可溶性zalpha11受体zalpha11 CEE、zalpha11 CFLG，和zalpha11CHIS的哺乳动物表达
将第27代BHK 570细胞(ATCC No.CRL-10314)以1.2×106细胞/孔(六孔板)的浓度铺敷在800μl无血清(SF)DMEM培养基(DMEM，Gibco/BRL高葡萄糖)(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中。用上述含有zalpha11 CEE、zalpha11 CFLG，或zalpha11 CHIS的表达质粒(见实施例8)，借助LipofectinTM(Gibco/BRL)在无血清DMEM中转染细胞。将各3μg zalpha11 CEE、zalpha11 CFLG或zalpha11 CHIS分别稀释到1.5ml试管中，达到100μl SF DMEM的总体积。在分离的试管中，将15μl LipofectinTM(Gibco BRL)与100μl SF DMEM混合。将LipofectinTM混合物室温温育30-45分钟，然后加入DNA混合物并再次于室温下温育约10-15分钟。
将整个DNA：LipofectinTM混合物加到铺板的细胞上并均匀散布之。将细胞于37℃温育约5小时，然后转移到分离的150mm MAXI平板上，终体积为30ml DMEM/5％FBS(Hyclone，Logan，UT)。在37℃，5％ CO2条件下将平板温育过夜，并于第二天将DNA：LipofectinTM混合物换成选择培养基(5％ FBS/DMEM+1μM氨甲喋呤(MTX))。
转染后大约10-12天，用10ml SF DMEM洗平板。吸出洗涤培养基并换成7.25ml无血清DMEM。然后将在SF DMEM中预浸泡的无菌特弗隆筛(Spectrum Medical Industries，Los Angeles，CA)放在克隆的细胞集落上。再将在SF DMEM中预浸泡的硝酸纤维素滤膜放在筛网上。将硝酸纤维素膜上的定向记号转移到培养皿中。然后在37℃，5％ CO2温育箱中将平皿温育5-6小时。
温育后，去掉滤膜/筛网，吸出培养基并换成含1μM MTX的5％FBS/DMEM。然后在10％脱脂奶粉/Western A缓冲液(Western A：50mMTris pH7.4，5mM EDTa，0.05％ NP-40，150mM NaCl和0.25％明胶)中将滤膜室温旋转振荡下封闭15分钟。然后在旋转振荡器上，将滤膜分别与抗Glu-Glu、抗FLAG或抗HIS抗体-HRP结合物在2.5％脱脂奶粉/Western A缓冲液中室温温育1小时。然后用Western A将滤膜室温下洗3次，每次5-10分钟。按照产品说明书使用Ultra ECL试剂(Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)使滤膜显影，并在Lumi-Imager(Roche，Corp.)上观察之。
将阳性表达克隆集落机械挑取到12孔平板上，该平板处在含5μMMTX的1ml 5％FCS/DMEM中，然后使之生长汇合。通过SDS-PAGE和Western分析检测条件培养基样品的表达水平。就每种构建物挑选三个最高表达的克隆；其中两个冷冻备用，一个经扩展后进行支原体试验和大规模工业接种。B.可溶性zalpha11受体zalpha11-Fc4的哺乳动物表达
将BHK 570细胞(ATCC No.CRL-10314)铺敷在10cm组织培养皿中，并使之在DMEM/FBS培养基(DMEM Gibco/BRL High Glucose(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)、5％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)，1mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，1mM丙酮酸钠(Gibco BRL))中，于37℃，5％ CO2条件下过夜生长至大约50-70％汇合。然后在无血清培养基配方(DMEM，10mg/ml转铁蛋白、5mg/ml胰岛素、2mg/ml胎球蛋白、1％ L-谷氨酰胺和1％丙酮酸钠)中，借助LipofecticmineTM(Gibco BRL)使用含有zalpha11-Fc4的质粒(见实施例8)转染细胞。用SF培养基将含有zalpha11-Fc4的质粒稀释到15ml试管中达到640ml总终体积。将35ml LipofectamineTM与605ml SF培养基混合。将LipofectamineTM混合物加到DNA混合物中并于室温下温育约30分钟。向DNA：LipofectamineTM混合物中加入5ml SF培养基。用5ml SF培养基将细胞洗一次，吸干并加入DNA：LipofectamineTM混合物。将细胞37℃温育5小时，然后向各平板中加入6.4ml DMEM/10％FBS，1％PSN培养基。将平板37℃温育过夜并将DNA：LipofectamineTM混合物换成新鲜的5％ FBS/DMEM培养基。转染后第2天，将细胞以1∶10、1∶20和1∶50分到150mm平板内选择培养基(加有1μM氨甲喋呤(SigmaChemical Co.)的上述DMEM/FBS培养基)中。转染后第5天将细胞培养基换成新鲜的选择培养基。转染后大约10天，胰酶消化各次转染得到的两个150mm培养皿中的氨甲喋呤抗性菌落，合并细胞后接种到T-162培养瓶中并转入大规模培养。
                        实施例10
          从BHK570细胞中纯化zalpha11可溶性受体A.从BHK 570中纯化zalpha11 CEE多肽
除非另外指出，所有操作均在4℃下完成。使用下列方法纯化含有C末端GluGlu(EE)标记的zalpha11多肽。用ProFlux A30上的Amicon S10Y3螺旋柱体将30升细胞工厂条件培养基浓缩到1.6升。向得自被转染BHK 570细胞(实施例9)的浓缩的1.6升细胞工厂条件培养基中加入蛋白酶抑制剂溶液，使终浓度达到2.5mM EDTA(SigmaChemical Co.)、0.003mM亮抑酶肽、0.001mM抑胃酶肽和0.4mMPefabloc(均为Boehringer-Mamnkeim公司生产)。取样品进行分析并将其余大部分于-80℃冷冻以待纯化。通过SDS-PAGE和Western印迹分析(使用抗EE HRP结合的抗体)测定浓缩的细胞条件培养基中的总目的蛋白浓度。
将100μl体积的抗EE G-Sepharose按照下述方法制备倒入Waters AP-5(5×10cm)玻璃柱中。在含有PBS(pH7.4)的BioCadSprint(PreSeptive BioSystems，Framingham，MA)上流动装柱并平衡。融化浓缩的细胞工厂化条件培养基，通过0.2μm膜无菌过滤，将pH调到7.4，然后以1ml/分流速上柱过夜。用10倍柱体积的PBS(pH7.4)洗柱，然后用含有0.5mg/ml EE肽(Anaspec，San Jose，CA)的200mlPBS(pH6.0)以5ml/分流速洗脱。EE肽具有序列EYMPME(SEQ ID NO：29)。用10个柱体积的PBS洗柱，然后用5个柱体积的0.2M甘氨酸(pH3.0)洗脱。用2个柱体积的5×PBS将甘氨酸洗脱后的柱pH调到7.0，然后用PBS(pH7.4)平衡。整个洗脱层析中收集样品每管5ml，并监测280和215nm的吸光率。也保留并分析流过和洗出的集合物。通过银染色的SDS-PAGE和利用抗EE HRP结合抗体的Western印迹法分析EE-多肽洗脱峰值部分的目的蛋白。合并感兴趣的洗脱部分并使用截留分子量为10,000道尔顿的膜旋转浓缩器(Millipose，Bedford，MA)将其从60ml浓缩到5.0ml。
为了将zelpha CEE与其它共纯化的蛋白质分离开，在pH8.0条件下对浓缩的洗脱合并部分的多肽进行POROS HQ-50(强阳离子交换树脂，ReSeptive BioSystems，Framingham，MA)层析。将Biolad Sprint倒入1.0×6.0cm柱并进行流动装柱。然后在20mM TRIS pH8.0(羟甲基氨基甲烷)中平衡带反离子的柱。将样品稀释到1∶13(以降低PBS的离子强度)，然后以5ml/分的速度装柱(Poros HQ)。用10倍柱体积(10CVs)的20mM Tris pH8.0洗柱，然后再用40倍柱体积(40CVs)20mMTris/1M NaCl梯度以10ml/分的流速洗脱柱。整个层析期间每管收集1.5μl，并监测280和215nm吸光率。通过SDS-PAGE银染色分析洗脱峰部分。使用截留分子量为10,000道尔顿的膜旋转浓缩器(Millipore，Bedford，MA)将所需的部分浓缩到1.5-2ml。
为了将zalpha11 CEE多肽与游离的EE肽和任何纯化的污染蛋白质分离开，将合并的浓缩的部分用已用PBS平衡过的1.5×90cmSephadex 5200(Pharmocia Piscataway，NJ)柱(使用Biocad Sprint，以流速1.0ml/分在PBS中装柱)进行层析。整个层析过程每管收集1.5ml，并监测280和215nm吸光率。通过SDS-PAGE银染色鉴定各峰值部分，并合并具有最大纯度的部分。该材料代表纯化的zalpha11 CEE多肽。
最后使该纯化的材料过4ml ActiClean Etox(Sterogene)柱，以除去任何残留的内毒素。使样品通过PBS平衡的重力柱四次，然后用3ml PBS洗柱，再与“清洁的”样品合并。然后对材料进行0.2μm无菌过滤并储存于-80℃备用。
在Western印迹分析后，考马斯蓝和银染色的SDS-PAGE凝胶显示出zalpha11 CEE多肽为一条表观分子量约为50,000道尔顿的主要带。该带的迁移率在还原和非还原凝胶中是同样的。
按照我们的标准方法用BCA分析(Pierce，Rockford，IL)方法检测纯化材料的蛋白质浓度，等分后于-80℃保存。在IEF(等电聚焦)凝胶上，测得蛋白质的p1小于4.5。zalpha11 CEE多肽的浓度为1.0mg/ml。
为了制备抗EE Sepharose，使用500ml Nalgene 0.45μm除菌滤器以100ml含有0.02％叠氮钠的PBS将100ml柱床体积的蛋白质G-Sepharose(Pharmacia Piscataway，NJ)洗3次。用6.0体积200mM三乙胺，pH8.2(TEA，Sigma)洗凝胶，并加入等体积含有900mg抗体的EE抗体溶液。4℃温育过夜后，用5体积上述200mM TEA洗树脂，以除去未结合的抗体。将树脂重新悬浮在2体积TEA中，转移到适当的容器内，并加入溶于TEA的dimethylpimilimidate-2HCl(Pierce，Rockford，IL)至蛋白G-Sepharose凝胶的终浓度为36mg/ml。将凝胶于室温下振动45分钟，并使用上述过滤器除去液体。然后将凝胶与5体积20mM乙醇胺(在200mM TEA中)室温温育10分钟以封闭凝胶上的非特异位点。然后用5体积含有0.02％叠氮钠的PBS洗凝胶，并在该溶液中储存之。B.从BHK 570中纯化zalpha11 CFLAG多肽
除特别指出者外，所有操作均在4℃下完成。使用下述方法纯化含有C末端FLAG(FLG)(Sigma-Aldrich Co.)标记的zalpha11多肽。在ProFlux A30上用Amicon S10Y3螺旋柱体将30升细胞工厂条件培养基浓缩到1.71，其中加入蛋白酶抑制剂溶液，达到终浓度2.5mM EDTA(Sigma)、0.003mM亮抑酶肽，0.001mM抑胃酶肽和0.4mM Pefabloc(三者均由Boehringer Mannheim生产)。取少量样品进行分析并将大部分置于-80℃冷冻备纯化使用。使用抗FLAG(Kodak)HRP结合的抗体，以SDS-PAGE和Western印迹分析确定细胞工厂条件培养基的总目的蛋白质浓度。将125ml柱的抗FLAGM2-琼脂糖亲和凝胶(Sigma-AldrichCo.)倾入Waters AP-5，5cm×10cm玻璃柱中。用带有PBS(pH 7.4)的BioCad Sprint(PreSeptive BioSystems，Framingham，MA)流动装填并平衡柱。融化浓缩的细胞条件培养基，0.2μm无菌过滤，将pH调到7.4，然后以1ml/分流速上柱过夜。用10倍柱体积(CVs)的PBS(pH7.4)洗柱，并用250ml含有0.5mg/ml FLAG肽的PBS(pH6.5)以5ml/分流速活塞式洗脱。所使用的FLAG肽具有序列DYKDDDDK(SEQ IDNO：37)。用PBS洗柱(10CVs)，然后用5CVs 0.2M甘氨酸(pH3.0)洗脱。用2CV的5×PBS将甘氨酸洗脱的柱的pH调到7.0，然后在PBS(pH7.4)中平衡。整个层析过程中以5ml部分收集洗脱物并监测280和215nm吸光率。也收集通过柱和洗出的集合物并分析之。通过SDS-PAGE银染色和使用抗FLAG HRP结合的抗体进行的Western印迹分析来检测FLAG多肽洗脱峰值部分的目的蛋白质。合并感兴趣的多肽洗脱部分并使用截留分子量为10,000道尔顿的膜旋转浓缩器(Millipore，Bedford，MA)将其由80ml浓缩到12ml。
为了将zalpha11 CFLG与其它共纯化的蛋白质分开，在pH 8.0下对多肽洗脱的合并部分进行POROS HQ-50(强阳离子交换树脂，PerSeptive BioSystems)层析。倒入1.0×6.0cm柱内容并流动堆积在BioCad Sprint上。然后在20mM TRIS pH8.0(Tris)中平衡其所带的反离子。将样稀释到1∶13(以降低PBS的离子强度)，然后以5ml/分流速上样到Pros HQ-50柱。用20mM Tris(pH8.0)以10个柱体积洗柱(10CVs)，再用40个柱体积的20mM Tris/1M NaCl梯度洗脱，洗脱速率为10ml/分。整个层析过程中按每管1.5ml收集洗脱物并监测280和215nm的吸光率。通过SDS-PAGE银染色分析洗脱的峰值部分。合并有用的部分并使用截留分子量为10,000道尔顿的膜旋转浓缩器(Millipore，Bedford，MA)浓缩到1.5-2ml。
为了将zalpha11 CFLG多肽与游离FLAG肽和污染的共纯化蛋白质分开，在使用BioCad Sprint以1.0ml/分流速在PBS中平衡并装柱的1.5×90cm Sephacryl S200(Pharmacia，Piscataway，NJ)柱上层析分离合并的浓缩部分。整个层析过程中每管收集1.5μl并监测280和215nm吸光率。通过SDS-PAGE银染色鉴定峰值部分并且只合并最纯的部分。该材料代表纯化的zalpha11 CFLG多肽。
最后将该材料过4ml ActiClean Etox(Sterogene)柱以除去残留的内毒素。样品上PBS平衡的重力柱四次，然后用3ml PBS洗柱一次，其与一纯净的样品合并。然后对材料进行0.2μm无菌过滤并于-80℃保存待分配。
基于Western印迹，考马斯蓝和银染色的SDS-PAGE凝胶上显示zalpha11 CFLG多肽为一条表观分子量为50,000道尔顿的主带。该带在还原和非还原凝胶上的迁移率是一样的。
经BCA分析(Pierce，Rockford，IL)测定纯化材料的蛋白质浓度并等分后于-80℃储存之。在等电聚焦(IEF)凝胶上蛋白质显示其PI小于4.5。zalpha11 CFLG多肽的浓度为1.2mg/ml。C.从被转染的BHK 570细胞纯化zalpha11-Fc4多肽
除特别指出者外，所有操作均在4℃下完成。使用下述方法纯化含有与人IgG/Fc融合的C末端的zalpha11多肽(zalpha11-Fc4，实施例8和9)。通过0.2mm无菌滤膜过滤12,000ml用zalpha11-Fc4转染的BHK 570细胞的条件培养基(实施例9)，然后添加蛋白酶抑制剂溶液，至终浓度为0.001mM亮抑酶肽，0.001mM抑胃酶肽和0.4mMPefabloc(后三者均由Boehringer-Mannheim生产)。用蛋白GSepharose(6ml床体积，Pharmacia Biotech)装柱并用500ml PBS(Gibco/BRL)洗。添加的条件培养基以10ml/分的流速通过柱，然后用1000ml PBS洗柱。用0.1M甘氨酸(pH3.5)从柱上洗脱zalpha11-Fc4，并按每管2ml直接收集到0.2ml 2M Tris(pH8.0)中，以便将其最终pH调到7.0。
以SDS-PAGE方法和使用抗人Fc(Amersham)抗体的Western印迹方法鉴定洗脱的各部分。对还原SDS-PAGE凝胶的Western印迹分析表明，第2-10管的洗脱物为大约80,000KDa的免疫反应性蛋白质。银染色的SDS-PAGE凝胶也显示第2-10管中为80,000KDa的zalpha11：Fc多肽。合并第2-10管洗脱物。
经BCA分析(Pierce，Rockford，IL)测定合并部分的蛋白质浓度，等分这些合并的材料并按标准方法于-80℃保存。合并的洗脱物的浓度为0.26mg/ml。
                        实施例11
         以竞争抑制法使用zalpha11可溶性受体检测
          zalpha11 CEE，zalpha11 CFLG和zalpha
              11-Fc4(突变体)可溶性受体活性
离心沉淀BaF3/zalpha11细胞并在无mIL-3培养基中洗涤。再次离心沉淀细胞并洗3次以彻底除去mIL-3。然后在血细胞计数器中计数细胞。使用无mIL-3培养基将细胞铺敷在96孔平板中：5000细胞/100μl/孔。在加或不加10μg/ml zalpha11可溶性受体(CEE，C-flag和Fc4构建物，参见实施例9和10)的情况下，以50％，25％，12.5％，6.25％，3.125％，1.5％，0.75％和0.375％浓度向各分立的实验体系中加入如实施例5所述的来自猴脾细胞活化和人CD3+选择的细胞的条件培养基。总实验体积为200μl。
于37℃，5％CO2条件下，将试验平板温育3天，其间按20μl/孔加入Alamar Blue(Accumed)。再次将平板于37℃，5％CO2条件下温育24小时。如实施例2中所述，在FmaxTM平板读数器(Molecular Devices)上读出结果。结果显示，10μg/ml各种不同的zalpha11可溶性受体构建物完全抑制细胞生长，进一步证明各样品中的因子是对zalpha11受体特异的。
也使用上述检测法检测稀释的可溶性受体的滴定曲线。zalpha11CEE和zalpha11 CFLG可溶性zalpha11受体在低至20ng/ml的浓度下能够完全抑制生长。突变的zalpha11-Fc4可溶性zalpha11受体只在1.5μg/ml浓度即可有效。
                        实施例12
                      分泌诱捕试验
使用分泌诱捕试验法鉴定zalpha11配体的DNA。阳性DNA集合物得自于实施例7中所述的表达克隆。
将250个克隆的DNA集合物转染到96孔平板中的BHK细胞内，并将条件培养基放入使用实施例4和5中所述的BaF3/zalpha11细胞进行的增殖试验体系中。几份DNA集合物给出可重复的并可用zalpha11可溶性受体中和的阳性活性(见实施例11)。
使用下述LipofectamineTM方法将其中一个阳性DNA集合物45C5转染到12孔平板中的COS细胞内。然后使用zalpha11可溶性受体(有或没有生物素化的C末端Glu-Glu标记的；C末端Flag标记的，或Fc4zalpha11可溶性受体融合体)(实施例9)进行分泌诱捕试验，以检测45C5集合物中zalpha11受体的潜在配体与zalpha11可溶性受体间的直接结合(参见下文)。结果是阳性的。因此，将集合物45C5的DNA电穿孔到大肠杆菌中，并挑选单个集落接种到96孔平板中。将平板37℃振荡24小时，然后使用TomTech Quadra 9600以96孔板小量制备DNA(QiaPrepTM 96 Turbo Miniprep Kit；Qiagen)。然后以行和列的形式将质粒DNA合并，转染到COS细胞中，再使用下述分泌诱捕法检测阳性集合体。COS细胞转染
按下述方法进行COS细胞转染：室温下将3μl合并的DNA和5μl LipotectamineTM在92μl无血清DMEM培养基(55mg丙酮酸钠、146mgL-谷氨酰胺、5mg运铁蛋白，2.5mg胰岛素、1μg硒和5mg胎球蛋白，在500ml DMEM中)中的混合物温育30分钟，然后加入400μl无血清DMEM培养基。将此500μl混合物加到12孔组织培养板的1.5×105个COS细胞/孔上并于37℃温育5小时。再加入500μl 20％FBS-DMEM培养基(100ml FBS，55mg丙酮酸钠和146mg L-谷氨酰胺在500ml DMEM中)并温育过夜。分泌诱捕试验
按下述步骤进行分泌诱捕试验：用PBS洗去细胞中的培养基，然后用溶于PBS的1.8％甲醛固定15分钟。然后用TNT(0.1M Tris-HCl，0.15M NaCl和0.05％ Tween-20，溶于水中)洗细胞，用0.1％Triton-X(溶于PBS)渗透15分钟，并再次用TNT洗。用TNB(溶于水中的0.1M Tris-HCl、0.15M NaCl和0.5％封闭试剂(NEN RenaissanceTSA-Direct试剂盒))将细胞封闭1小时，并再次用TNT洗。如果使用生物素化的蛋白质，经与抗生物素蛋白和其后的生物素(Vector Labs)温育而将细胞封闭15分钟，中间再TNT洗细胞。根据所使用可溶性受体的不同，将细胞分别与下列材料温育1小时：(A)1-3μg/mlzalpha11可溶性受体zalpha11-Fc4融合体蛋白(实验例10)；(B)3μg/ml zalpha11可溶性受体C末端FLAG标记的，zalpha11 CFLG(实施例10)；(c)3μg/ml zalpha11可溶性受体C末端GluGlu标记的，zalpha11 CEE(实施例10)；或(D)3μg/ml生物素化的zalpha11可溶性受体zalpha11 CEE(溶于TNB)。然后用TNT洗细胞。依据所使用的可溶性受体，将细胞再与下列材料温育1小时：(A)1∶200稀释的羊抗人Ig-HRP(Fc特异的)；(B)1∶1000稀释的MZ-HRP；(C)1∶1000稀释的抗GluGlu抗体-HRP；或(D)1∶300稀释的链霉抗生物素-HRP(NEN药盒)(溶于TNB)。再次用TNT洗细胞。
用在稀释缓冲液中1∶50稀释的荧光素酪酰胺(tyramide)试剂(NEN药盒)检测阳性结合并温育4-6分钟，然后用TNT洗。用在TNT中1∶5稀释的Vectashield Mounting培养基(Vector Labs，Burlingame，CA)保存细胞。使用FITC滤膜在荧光显微镜下观察细胞。
                        实施例13
           zalpha11配体基因的染色体排布和位置
使用“斯坦福G3幅射杂种作图系列”(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)的商用版本将zalpha11配体基因定位于染色体4。“斯坦福G3 RH样板系列”含有整个人类基因组的83个放射杂种克隆的DNAs，加上两个对照DNAs(RM供体和A3接受体)。公众可得到的WWW服务器(http：//Shgc-WWW.Stanford.edu)允许作出标记的染色体定位。
为了用“斯坦福G3 RH样板系列”制图定位zalpha11配体基因，将各20μl反应混合物加到96孔微量滴定板(Stratagene，La Jolla，CA)中，并用于“RoboCycler Gradient 96”热循环仪(Stratagene)。85个PCR反应物各由2μl 10×KlenTag PCR反应缓冲液(CLONTECHLabs，Inc.，Palo Alto，CA)、16μl dNTPs混合物(各2.5mM，PERKIN-ELMER，Foster City，CA)、1μl有义引物ZC22,050(SEQ IDNO：42)、1μl反义引物ZC22,051(SEQ ID NO：43)、2μl“RediLoad”(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)、0.4μl 50X AdvantageKlenTag聚合酶混合物(Cloutech Laboratories，Inc.)、25ng个别杂交克隆的DNA或对照DNA，以及ddH2O组成，总体积为20μl。用等量矿物油覆盖并封闭反应混合物。PCR循环条件是：开始是94℃变性5分钟，然后94℃变性45秒，60℃退火45秒和72℃延伸1分15秒共反复循环35次；最后72℃延伸7分钟。在2％琼脂糖凝胶(LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)上电泳分离反应产物。
结果显示zalpha11配体基因与IL-2骨架标记SHGC-12342相互谱系，LOD记分＞12，并且距离标记为6cR 10000(大约180Kb)。使用周围标记将zalpha11配体定位于整合的LDB染色体4图谱(遗传定位数据库，Southhampton大学，www sever：http：//cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/)上的4q27区域。
                        实施例14
            使用EST序列鉴定和克隆鼠zalpha11
            配体以得到全长小鼠zalpha11配体A.小鼠zalpha11配体的EST序列
使用人zalpha11配体cDNA序列(SEQ ID NO：1)作为疑问点检索数据库，小库EST(EST 1483966)被鉴定为小鼠zalpha11配体的部分序列。EST 1483966代表小鼠基因组片段，其中衍生于两个潜在外显子的肽序列与人zalpha11配体的肽片段具有高度的序列同源性(SEQID NO：2的氨基酸13(Ile)至氨基酸80(Gln))。B.PCR筛选小鼠马拉松cDNA样板系列
以下述PCR方法筛选11份小鼠马拉松(Marathon)cDNA(Clontech)样品。由脑、胰、肾、胎盘、唾液腺、皮肤、睾丸、子宫、胚胎和脾组织中制备小鼠马拉松cDNA样品。按照产品说明书使用MarathonTMcDNA扩增试剂盒(Clontech)制备之。基于EST序列，使用ZC22,056(SEQ ID NO：44)和ZC22,057(SEQ ID NO：45)两个引物，以PCR方法鉴定小鼠zalpha11配体的来源。PCR反应条件是：94℃ 2分钟；94℃ 30秒，68℃ 2分钟重复35次循环；然后68℃ 4分钟；再于10℃浸泡。在1％琼脂糖凝胶上电泳分离PCR产物。可以看到一条相当于扩增的cDNA片段的强150bp带。表明小鼠脾马拉松cDNA是小鼠zalpha配体cDNA克隆的来源。小鼠脾马拉松cDNA含有可经序列分析鉴定的阳性cDNA(作为小鼠zalpha11配体的部分cDNA)。C.以5′和3′-RACE产生小鼠全长cDNA的复合序列
经5′和3′RACE扩增，得到小鼠zalpha11配体部分cDNA序列的5′和3′侧翼序列。用附加基因特异性寡核苷酸引物ZC22,205(SEQ ID NO：46)和ZC22,206(SEQ ID NO：47)，ZC22,056(SEQ ID NO：44)和ZC22,057(SEQ ID NO：45)，以及两个衔接子寡核苷酸引物ZC9,739(SEQ ID NO：48)和ZC9,719(SEQ ID NO：49)进行两轮嵌套式PCR扩增。PCR反应如下：94℃ 2分钟；然后94℃ 30秒，68℃ 2分钟重复35次循环；然后68℃ 4分钟，再于10℃浸泡。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，鉴定出约300bp 5′RACE产物和约800bp 3′RACE产物。使用QiaquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen)分离这些片段。
使用下列引物测序分析纯化的PCR产物：ZC9,719(SEQ IDNO：49)、ZC22,205(SEQ ID NO：46)和ZC22,206(SEQ ID NO：47)。组合5′和3′RACE片段鉴定初步复合的全长小鼠zalpha11配体序列。按下文实施例15所述方法分离全长小鼠克隆。
                        实施例15
      从活化的小鼠脾文库中分离小鼠zalpha11 cDNA克隆A.用于分离小鼠zalpha11配体的小鼠初级来源
收集Balb/C小鼠的脾脏，用磨砂玻片端边捣碎以产生细胞悬液。产生6.4×108个用于下述选择的分离初级小鼠细胞。
将脾细胞悬浮在9.6ml MACS缓冲液(PBS，0.5％EDTA，2mM EDTA)中。取1.6ml细胞悬液并加入0.4ml CD90(Thy1.2)微球(MiltenyiBiotec)。将混合物4℃温育15分钟。用30ml MACS缓冲液洗CD90小球标记的细胞，然后重新悬浮在2ml MACS缓冲液。
按照生产商的说明书制备VS+柱(Miltenyi)。然后将VS+柱放在VarioMACSTM磁场(Miltenyi)中。用5ml MACS缓冲液平衡柱。然后将分离的初级小鼠细胞加于柱上。使CD3阴性细胞通过。用9ml(3×3ml)MACS缓冲液洗柱。从磁场中取出柱并放在15ml falcon管上方。向柱上加入5ml MACS缓冲液以洗脱CD90+细胞，并使用生产商提供的冲杆(滑阀)冲掉结合的细胞。再重复一遍上述细胞与CD90磁珠的温育、洗涤和VS+柱分离步骤(洗脱温育过程中)。合并两次柱分离产生的CD90+部分。CD90+选择的小鼠脾细胞的得率为1×108个细胞。
取合并的CD90+选择的小鼠细胞样品用于染色，并在荧光抗体细胞分选器(FACS)上分选以确定其纯度。使用PE结合的仓鼠抗小鼠CD3ε抗体(PharMingen)染色和分选CD90+选择的细胞。小鼠CD90+选择的细胞为93％ CD3+细胞，提示该细胞为93％ T细胞。
在RPMI+5％ FBS+PMA(10ng/ml)和离子霉素(0.5μg/ml)(Calbiochem)中将细胞(3×106细胞/ml)37℃温育过夜，以活化小鼠CD90+选择的细胞。按下述方法检测活化的CD90+选择的小鼠细胞上清液的zalpha11配体活性。另外，按照下列实施例16中所述的方法使用活化的CD90+选择的小鼠细胞制备cDNA文库。
                        实施例16
    从小鼠CD90+选择的细胞文库中克隆小鼠zalpha11配体
筛选活化的CD90+选择的初级小鼠细胞cDNA文库的结果表明，分离的cDNA是代表四螺旋束细胞因子家族的一个新成员。该cDNA编码人zalpha11配体的小鼠直向同源物。以杂交筛选法鉴定cDNA。A.用于构建CD90+选择的文库的载体
使用载体pZP7N构建CD3+选择的文库(参见实施例6A)。B.初级小鼠活化的CD90+选择的细胞cDNA文库的制备
离心分离在离子霉素/PMA中刺激的大约1.5×108个初级小鼠CD90+选择的细胞(实施例15)。从细胞沉淀饼中分离总RNA，并按实施例6B中所述方法转化成双链cDNA。然后将此DNA转染到BHK细胞中(实施例6B)，并使用“阿拉玛蓝”(“Alamar blue”)荧光检测法估测细胞增殖水平(实施例2B)。
为了以分泌诱捕克隆法筛选文库，须用扩增形式的文库转染COS-7细胞。将4.8×106个克隆铺敷在添加100μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml二甲氧基苄青霉素的110个15cm LB-琼脂平板上。37℃生长过夜后通过刮取和沉淀收获细胞。按照产品说明书使用Nucleobound-gigaTM(Clonetech)从沉降的细菌中提取质粒DNA。然后用该质粒转染玻片上的COS-7细胞，并使用下述分泌诱捕技术(实施例17)筛选阳性细胞。C.筛选活化的小鼠cDNA文库
将大约5×105个克隆铺敷在10个LB/Amp Maxi平板上。挑取集落，变性、中和并使用标准方法(Sambrook，J.et al.，上述文献)交联。使用Prime-Itr RmT随机引物标记药盒(Stratagene)以32P标记50ng 300bp 5′RACE PCR片段(实施例14)。使用ExpressHybTM杂交溶液(Clontech)将10个滤膜与该标记的探针65℃杂交过夜。然后相继用0.2×SSC(30mM NaCl，3mM柠檬酸钠，pH7.0)+0.1％ SDS于60℃将滤膜洗3次(1小时)；再于65℃洗1小时。使滤膜于-80℃曝光过夜，并将X射线胶片显影。抽取含有阳性集落的琼脂栓，并将克隆铺敷在10cm CB/Amp平板上。然后用滤膜提起集落并再按上述方法杂交。
分离一个称为M11L/pZP7的DNA克隆并使用下列引物测序：ZC14,063(SEQ ID NO：50)、ZC5,020(SEQ ID NO：51)、ZC22,421(SEQID NO：52)、ZC22,604(SEQ ID NO：53)和ZC22,641(SEQ ID NO：54)。该克隆的多核苷酸序列是全长小鼠zalpha11配体(SEQ ID NO：55，并且与得自5′和3′RACE产物的复合序列一致。SEQ ID NO：56中显示了小鼠zalpha11配体的相应氨基酸序列。
                      实施例17
         在分泌诱捕试验中小鼠zalpha11配体与
               人zalpha11可溶性受体结合
将小鼠克隆M11L/pZP7的DNA转染到COS细胞中，并使用分泌诱捕法(实施例12)检测人zalpha11可溶性受体zalpha11-Fc4(实施例10C)与被转染的COS细胞的结合。试验进一步证实小鼠zalpha11配体与人zalpha11可溶性受体结合。
使用0.7μg(3μl)M11L/pZP7 DNA(实施例16)转化COS细胞(实施例12)。
使用1μg/ml zalpha11可溶性受体Fc4融合蛋白(在TNB中)(实施例10C)，和1∶200稀释的用作检测抗体的羊抗人Ig-HRP(Fc特异的)(在TNB中)完成分泌诱捕试验(实施例12)。使用荧光素酪酰胺试剂检测可溶性人zalpha11受体与制备的固定化细胞的阳性结合(实施例12)。按实施例12所述方法保存和观察细胞。
阳性结果表明小鼠zalpha11配体与人zalpha11可溶性受体结合。
                      实施例18
        小鼠zalpha11配体在哺乳动物细胞中的表达A.表达载体M11L/pZP9的构建
制备在哺乳动物细胞中表达小鼠zalpha11配体的表达载体。使用ZC22,283(SEQ ID NO：57)和ZC22,284(SEQ ID NO：58)作为PCR引物产生用于生成zalpha11配体DNA片段的500bp PCR产物，以扩增小鼠zalpha11配体的编码区并加入XhoI和XbaI限制性位点。使用小鼠zalpha11配体克隆M11L/pZP7作为模板。PCR反应条件如下：94℃2分钟，其后是94℃ 30秒，68℃ 2分钟重复25次循环，然后68℃ 4分钟，再于10℃浸泡。经1％琼脂糖凝胶电泳显示出一条长约500bp的带，切下后使用Qiaex IITM纯化系统(Qiagen)纯化DNA。用XloI和XbaI(Boehringer Mannheim)37℃消化2小时后，凝胶分离DNA并再次按上述方法纯化之。
将切下的DNA亚克隆到已用XhoI和XbaI切割的质粒pZP9中。质粒pZP9是含有其中包括小鼠金属硫蛋白-1(MT-1)启动子、插入编码序列所需的多限制性位点，及人生长激素终止子的表达盒的哺乳动物表达载体。该质粒还具有大肠杆菌复制原点，带有SV40启动子、增强子和复制原点、DHFR基因及SV40终止子的哺乳动物选择标记表达单位。
室温下，将大约30ng限制性消化的小鼠zalpha11配体片段和大约10ng消化的pZP9载体连接2小时。按照生产商推荐的方法将2μg连接反应产物转化到INVaF’感受态细胞(Invitrogen)中并铺敷在含5μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，然后37℃温育过夜。使用XhoI和XbaI限制分析由个别集落的液体培养物制备的DNA，以筛选阳性集落。经序列分析证实阳性克隆的插入序列是小鼠zalpha11配体序列。使用QiagenMaxi prep试剂盒(Qiagen)进行大批量质粒制备。将含有小鼠zalpha11配体的表达载体称为M11L/pZP9。B.小鼠zalpha11配体的哺乳动物表达
于37℃和5％CO2环境中，在含有5％胎牛血清(Hyclone)、1mM L-谷氨酰胺(JRH Biosciences，Lenexa，KS)、1mM丙酮酸钠(Gibco BRL)的DMEM/FBS培养基(DMEM，Gibco/BRL High Glucose media；Gibco BRL，Gaithersburg，MD)中，使铺敷在10cm组织培养皿中的BHK 570细胞(ATCC No.CRL-10314)生长至大约20％汇合。然后按照产品说明书借助哺乳动物稳定的CaPO4转染试剂盒(Stratagene)用质粒M11L/pZP9(实施例18A)转染细胞。
转染后一天，将细胞按1∶10和1∶20分配到150nm平皿中的选择培养基(加有1μM氨甲喋呤的DMEM/FBS培养基(Sigma ChemicalCo.)内。转染5天后，更换新鲜选择培养基。大约转染后10天，胰酶分散氨甲喋呤抗性集落，合并细胞并铺敷到大体积培养瓶中。当细胞生长至大约90％汇合后，用PBS将细胞洗3次，并用无血清ESTEPz培养基(含有0.11g/l丙酮酸钠、3.7g/l NaHCO3、2.5mg/l胰岛素、5mg/l转铁蛋白的DMEM培养盐，pH7.0)培养之。3天后收集条件培养基，按照下述实施例19使用Alamar Blue进行BaF3增殖试验。
                      实施例19
       在使用阿拉玛蓝的BaF3试验中小鼠zalpha11
               配体激活人zalpha11受体
使用表达小鼠zalpha11配体的BHK细胞的无血清条件培养基估测BaF3/zalpha11细胞的增殖(实施例4，和5B)。
离心分离BaF3/zalpha11细胞，洗涤后铺敷在上述(实施例5B)无mIL-3培养基中。
使用表达小鼠zalpha11配体的BHK细胞的无血清条件培养基估测BaF3/zalpha11细胞的增殖实施例18。用无mIL-3培养基稀释条件培养基至下列不同浓度：50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、0.75％和0.375％。按实施例5B所述方法进行增殖试验。
结果证实BaF3/zalpha11细胞对小鼠zalpha11配体发生增殖反应。在50％浓度下，反应约为本底的5倍。
                      实施例20
   在荧光素酶试验中zalpha11配体激活人zalpha11受体A.BaF3/KZ134/zalpha11细胞系的构建
用含有4个基因的STAT转录因子结合元件、修饰的c-fos Sis可诱导元件(m67SIE，或hSIE)(Sadowski，H.et al.，Science261：1739-1744，1993)、p21 WAF1基因的p21 SIEI(Chin，Y.et al.，Science 272：719-722，1996)、β-酪蛋白基因的乳腺反应元件(Schmitt-Ney，M.等，Mol.Cell.Biol.11：3745-3755，1991)，以及Fcg RI基因的STAT可诱导元件(Seidel，H.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.92：3041-3045，1995)的互补寡核苷酸ZC12,749(SEQ IDNO：59)和CZ12,748(SEQ ID NO：60)构建KZ134质粒。这些寡核苷酸含有Asp718-XhoI相适应的末端，并使用标准方法连接到用同样酶消化的并含有新霉素选择标记的带c-fos启动子的接受体荧光素酶报道载体(Poulsen.L.K.et al.，J.Biol.Chem.273：6229-6232，1998)中。使用标准的转染和选择方法用KZ134质粒稳定地转染BaF3细胞，以制得BaF3/KZ134细胞系。
按照实施例2A所述的方法并使用实施例3中所述30μg zalpha11表达载体，构建表达全长zalpha11受体的稳定的BaF3/KZ134指示细胞系。使用标准技术稀释克隆、铺板和选择。以荧光素酶法(实施例20B)，使用人zalpha11配体条件培养基作为诱导剂筛选克隆。选择表现有最高荧光素酶反应性(通过STAT荧光素酶)和最低本底的克隆。选择稳定的转染细胞系，并定名为BaF3/KZ134/zalpha11。B.在BaF3/KZ134/zalpha11荧光素酶试验中，人和小鼠zalpha11配体激活人zalpha11受体
离心沉降BaF3/KZ134/zalpha11细胞并在无mIL-3培养基中洗这些细胞。再次离心收集细胞并洗3次以完全除去mIL-3。然后在血细胞计数器中计数细胞。使用无mIL-3培养基，按30,000个细胞/100μl/孔将细胞铺敷在96孔板中。用同样方法制备未被转染的BaF3/KL134细胞，在继后试验中用作对照。
使用得自下列来源的条件培养基估测BaF3/KZ134/zalpha11细胞的STAT激活作用：(1)用人zalpha11配体(实施例7)转染的BHK 570细胞；或(2)用小鼠zalpha11配体(实施例18)转染的BHK 570细胞，或(3)检测单纯培养基对照反应的无mIL-3培养基。用无mIL-3 RPMI培养基将条件培养基稀释到50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、1.5％、0.75％和0.375％浓度。将100μl稀释的条件培养基加到BaF3/KZ134/zalpha11细胞中。利用条件培养基对作为对照的未被转染的BaF3/KZ134细胞进行平行的试验。总试验体积为200μl。在37℃，5％CO2条件下将平板温育24小时，然后以2000rpm离心10分钟沉降细胞，吸出培养基并加入25μl溶胞缓冲液(Promega)。室温下温育10分钟后，在加入了40μl荧光素酶底物(Promega)的发光计(Labsystems Luminoskan，RS型)上测得读数，借以检测STAT报道构建物的活化作用。
结果证实BaF3/KZ134/zalpha11细胞对人zalpha11配体的STAT报道分子反应。于50％浓度时，该反应大约是只加培养基对照组的50倍。在未被转染的BaF3/KZ134对照细胞中未见对人zalpha11配体的STAT活化反应，表明反应是通过zalpha11受体介导的。
结果还证实BaF3/KZ134/zalpha11细胞对小鼠zalpha11配体的STAT报道分子反应。在50％浓度时，所测得的反应约为只加培养基对照组的40倍。此外，在未被转染的BaF3/KZ134对照细胞可见对小鼠zalpha11配体反应的STAT活化作用(大约5倍)，提示小鼠BaF3细胞可能有内源性小鼠受体。
                      实施例21
      在小鼠骨髓试验中小鼠zalpha11配体是有活性的A.低密度非粘着骨髓细胞的分离
由6-10周龄雄性Balb/c或C57BL/6小鼠得到新鲜的小鼠股骨抽取物(骨髓)。然后用RPM1+10％FBS(JRH，Lenexa KS，Hyclone，LoganUT)洗骨髓细胞并悬浮于RPM1+10％ FBS得到全骨髓细胞悬液。然后按下述方法对全骨髓细胞悬液进行密度梯度(Nycoprep，1.077，Animal；Gibco BRL)离心来富集低密度的大多为单核的细胞：将全骨髓细胞悬液(约8ml)小心抽吸到15ml圆锥形管中的5ml Nycoprep梯度溶液的顶部，然后以600xg离心20分钟。然后取出含有低密度单核细胞的界面层，用过量的RPM1+10％ FBS洗并以400xg离心5-10分钟以沉降细胞。将沉淀的细胞重新悬浮在RPM1+10％ FBS中并以大106细胞/ml的密度铺敷在T-75培养瓶中，于37℃和5％ CO2条件下温育约2小时。所得到的悬浮细胞为非粘着的低密度(NA LD)骨髓细胞。B.96孔试验
在RPM1+10％FBS+1ng/ml小鼠干细胞因子(mSCF)(R&D Systems，Minneapolis，MN)中，加上下列来源之一的5％条件培养基中，接每孔25,000-45,000个细胞将小鼠NA LD骨髓细胞铺敷在96孔组织培养板中：(1)表达小鼠zalpha11配体的BHK 570细胞(实施例18)，(2)表达人zalpha11配体的BHK 570细胞(实施例7)，或(3)含有载体但不表达任何配体的对照BHK 570细胞。然后用各种细胞因子处理这些细胞，以试验骨髓造血细胞的扩充与分化。为了试验，使铺板的NA LD小鼠骨髓细胞经受人IL-15(hIL-15)(R&D Systems)，或其它细胞因子的处理。以从大约50ng/ml降到6025ng/ml的2倍系列稀释液，对IL-15或其它细胞因子的系列稀释液进行试验。8-12天后，用实施例5B中所述的阿拉玛蓝测定法检测96孔板内的细胞增殖水平。C.96孔NA LD小鼠骨髓试验的结果
表达小鼠和人zalpha11配体的BHK细胞的条件培养基与hIL-15协同作用，促进NA LD小鼠骨髓中造血细胞群体扩充。对照RHK条件培养基+IL-15没有显示造血细胞的这种扩充。小鼠zalpha11配体与hIL-15扩展的造血细胞群体，和人zalpha11配体与hIL-15扩展的造血细胞群体在细胞培养中进一步增殖。用藻红蛋白标记的抗Pan NK细胞抗体(Pharminger)着染这些造血细胞并进行流式细胞计量分析，证明扩展的细胞对这种天然杀伤(NK)细胞标记呈阳性染色。
使用得自Poietic Teehnologies(Gaitheerburg，MD)的新鲜人骨髓细胞进行同样的96孔试验。再次IL-15合用，可见小鼠和人zalpha11配体扩展了对上述利用抗体的NK细胞标记呈阳性染色的造血细胞群体。
                      实施例22
         产生人zalpha11配体转基因小鼠的构建物A.从肝特异性MT-1启动子表达人zalpha11配体的构建物
设计寡核苷酸以产生含有共有Kozak序列和人zalpha11配体编码区的PCR片段。所设计的这些寡核苷酸在5′端带有FseI位点并在3′端带有AscI位点，从而有利于克隆到(a)pMT12-8(我们的标准转基因载体)中，或(b)pKFO51(淋巴样细胞特异性转基因载体，实施例22B)中。
使用200ng人zalpha11配体模板和寡核苷酸ZC22,143(SEQ IDNO：61)和ZC22,144(SEQ ID NO：62)完成PCR反应(实施例7)。PCR反应条件如下：95℃ 5分钟，其中加入AdvantageTM cDNA聚合酶(Clontech)；然后95℃ 60秒，60℃ 60秒和72℃ 90秒共重复15次循环；再于72℃ 7分钟。经琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物并使用QiaQuickTM(Qiagen)凝胶提取试剂盒纯化之。用FseI和AscI消化分离的488bp DNA片段，乙醇沉淀并将其连接到已用同样酶消化的pMT12-8中。设计pMT12-8质粒使之可在转基因小鼠的肝和其它组织中表达所需基因，该质粒含有侧翼接有10Kb MT-15′DNA和7Kb MT-13′DNA的表达盒。表达盒包括MT-1启动子、大鼠胰岛素II内含子、插入所需克隆的多接头，以及人生长激素(hGH)polyA序列。
将大约1μl连接反应混合物电穿孔打入DH10B ElectroMaxTM感受态细胞(GIBCO BRL)中，并铺敷在含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，然后温育过夜。挑取细胞集落并使之生长在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中。从这些克隆中小量制备DNA，单独使用ECORI酶切或结合使用FseI和AscI酶切来筛选人zalpha11配体插入段，然后以琼脂糖电泳法分析之。完成正确的pMT-人zalpha11配体的小量制备。制备含有5′和3′侧翼序列、MT-1启动子、大鼠胰岛素II内含子、人zalpha11配体cDNA和hGH polyA序列的SalI片段，并将其微量注射到受孕的小鼠卵母细胞中。按照Hogan，B等人(Hogan，B.etal.，Manipulating the Mouse Embryo，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY，1994)所述的方法微量注射和生产转基因小鼠。B.从淋巴样细胞特异性EμLCK启动子开始表达人zalpha11配体的构建物
设计寡核苷酸以产生含有共有Kozak序列和人zalpha11配体编码区的PCR片段。所设计的这些寡核苷酸在5′端带有FseI位点并在3′端带有AscI位点，从而有利于克隆到淋巴样细胞特异转基因载体pKFO51中。
用200ng人zalpha11配体模板和寡核苷酸ZC22,143(SEQ ID NO：61)与ZC22,144(SEQ ID NO：62)完成PCR反应。使用AdvantageTM cDNA聚合酶(Clontech)进行的PCR反应的反应条件是：95℃ 5分钟后，以95℃ 60秒，60℃ 60秒和72℃ 90秒重复15次循环，然后72℃ 7分钟。按上述方法纯化PCR产物。用FseI和AscI消化分离的488bp DNA片段，乙醇沉淀并连接到已用FseI和AscI消化的pKFO51中。pKFO51转基因载体衍生于p1026X(Iritani，B.M.et al.，EMBO J.16：7019-31，1997)，并且含有T细胞特异性lck近端启动子、B/T细胞特异性免疫球蛋白μ重链增强子、用于插入所需克隆的多接头，以及编码无活性生长激素蛋白的突变的hGH基因(提供3′内含子和聚腺苷酸化信号)。
用大约各1μl连接反应混合物电穿孔转染细胞、铺板、挑取克隆并以上述限制性酶消化法筛选人zalpha11配体插入段。经测序分析进一步证实pKFO51-zalpha11配体的正确克隆后，小量制备其质粒DNA。制备含有lck近端启动子和免疫球蛋白μ增强子(EμLCE)、zalpha11配体cDNA，以及突变的hGH基因的NotI片段，并用以微量注射到受精的鼠卵母细胞中。
                      实施例23
               小鼠zalpha11配体组织分布
探查鼠多组织Northern印迹(小鼠，小鼠胚胎，Clontech；MB1010，MB1012 Origene)以确定鼠zalpha11配体表达的组织分布。使用质粒M11L/pZP7(实施例16)作为模板并以寡核苷酸ZC22,283(SEQ ID NO：57)和ZC22,284(SEQ ID NO：58)作为引物，扩增约484bp PCR衍生的探针。PCR扩增条件是：首先于94℃ 1分钟；然后按94℃ 30秒，50℃ 30秒，和72℃ 30秒重复35次循环；然后是72℃ 10分钟。经琼脂糖凝胶电泳显现PCR产物，并使用凝胶提取试剂盒(Qiagen)纯化约484bp的PCR产物。使用REDIPRIMETM标记试剂盒(Amersham)放射标记探针。使用NUCTRAPTM推进柱(Stratagene)纯化探针。使用EXPRESSHYBTM(Clontech)溶液进行预杂交并作为Northern印迹分析的杂交溶液。使用106cpm/ml标记的探针于65℃杂交过夜。然后将印迹放在2×SSC和0.1％SDS中室温洗3次，再于0.1×SSC+0.1％SDS中55℃洗2次。睾丸组织中可见到大约1.2和3.5Kb的两个转录物。上面一个转录物仅见于胸腺中。
也按上述方法探查含有从归一化为8个管家基因的各种组织得到的RNAs的鼠RNA Master Dot印迹(Clontect)，并进行杂交。可见睾丸组织中有表达。
                      实施例24
   从BHK 570细胞中纯化未加标记的人和鼠zalpha11配体
除特别指出者外，所有操作均在4℃下进行。使用下述方法从用表达人zalpha11配体(实施例25)或小鼠zalpha11配体(M11L/pZP9)(实施例18)的构建物转染的BHK 570细胞中纯化人和鼠zalpha11配体。用标准方法浓缩条件培养基。通过0.45和0.22μm滤膜过滤浓缩条件培养基。然后将培养基在0.01M HEPES(JRHBiosciences，Lenexa，KS)(pH7.0)中稀释到低离子强度(≤2mS)。然后使用BioCAD SPRINT(Perceptive BioSystems)，以4ml/分的流速将低离子强度稀释的CM上10×66mm(6ml)Poros HS 50柱(PerSeptive BioSystems，Framingham，MA)过夜。用10-20柱体积的0.01M HEPES pH7.0洗柱。然后含1M NaCl(Mallinckrodt，Paris，KY)的0.01M HEPES pH7.0以5ml/分的流速分步洗脱结合的蛋白质；层析中按每管2ml收集洗脱物并监测280和215nm吸光率。用生物检测法和SDS-PAGE银(Geno Technology，St.Louis，MO)与考马斯蓝(Sigma，St.Louis，MO)染色分析峰值吸收部分。合并峰值部分，无菌过滤并磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH7.2)稀释到≤19mS。
然后使用BioCad SPRINT以2ml/分的流速将稀释的样品过0.8mlPoros AL柱(已在树脂上固定了zalpha11 CFLAG可溶性受体(实施例10B)或zalpha11-Fc4融合体可溶性受体(实施例10C))。然后用至少20倍柱体积的PBS洗柱(10ml/分)。在BioCAD 700E上借助PBS以10ml/分流速经注射600μl 0.1M甘氨酸(氨基乙酸；Glycocol，Spectrum，Gardena，CA)(pH2.5)快速洗脱。每6秒钟收集1ml，并直接用55l2M TRIS(pH8.8)中和pH。整个层析过程中监测280和215nm吸光率。以生物检测法以及SDS-PAGE银和考马斯蓝染色法分析峰值部分。在银和考马斯蓝染色的凝胶上可看到小鼠zalpha11配体的两条约24kD和18kD带。在银和考马斯蓝染色的凝胶上可看到人zalpha11配体的一条约18kD带。
人zalpha11可溶性受体多肽在POROS AL介质上的固相化
制备有固相化的zalpha11 CFLAG可溶性受体(实施例10B)或zalpha11-Fc4融合体可溶性受体(实施例10C)的Poros AL柱。使用大约3mg zalpha11 CFLAG可溶性受体和大约10mg zalpha11-Fc4融合体可溶性受体。所有操作均在BioCAD 700E上室温下进行。根据产品说明书在2M NaCl中用POROS AL介质流动装柱(4.5×50mm)。然后用1.1M Na2SO4/50mM磷酸钠pH7.2中平衡柱。使用Millipore 30MWKO旋转浓缩器将受体浓缩到4mg/ml，然后以1.1M Na2SO4/50mM磷酸钠pH7.2按1∶1稀释。以2ml/分流速用1.1M Na2SO4/50mM磷酸钠pH7.2洗柱，以9倍柱体积注入100μl稀释的配体，一直达到稳定的饱和状态或渗漏。然后以62CV梯度洗脱：1.1M Na2SO4/50mM磷酸钠pH7.2至550mM Na2SO4/50mM磷酸钠pH7.2/5mg/ml氰基硼氢钠。然后将柱放置约2小时，以完成固相化。然后在0.2M TRIS pH7.2/5mg/ml氰基硼氢钠中平衡柱，并放置约1小时以复盖柱。最后在PBS/0.02％叠氮钠中平衡柱，并于4℃保存备用。使用前，用0.1M甘氨酸预洗脱，以确保从柱上除去非特异性蛋白质，并使柱不渗滤固定化的人zalpha11可溶性受体。
                      实施例25
        人zalpha11配体在哺乳动物细胞中的表达A.表达载体PZMP 11/zalpha11 Lig的构建
通过同源重组构建含有编码人zalpha11配体的全部或部分多核苷酸的表达质粒。使用PCR分离人zalpha11配体cDNA的片段(SEQ IDNO：63)。在PCR反应中用于生产人zalpha11配体片段的两个引物是：(1)引物ZC22,052(SEQ ID NO：64)，其含有40bp载体侧翼序列和相当于人zalpha11配体之氨基末端的17bp；以及(2)引物ZC22,053(SEQID NO：65)，其含有40bp相当于侧翼载体序列的3′末端和相当于人zalpha11配体之羧基末端的17bp。PCR反应条件是：94℃ 2分钟；然后94℃ 30秒，60℃ 30秒和72℃ 30秒共25轮循环；然后是72℃ 5分钟，再于4℃浸泡。100μl PCR反应混合物中取10μl进行0.8％ LMP琼脂糖凝胶(Seaplague GTG)(加1×TBE缓冲液)电泳分析，可见到约560bp的片段。其余90μl则加5μl 1M NaCl和250μl无水乙醇沉淀，用于重组在下述接受体载体pZMP 11上。接受体质粒pZMP 11是预先用SmaI酶切过的。
质粒pZMP11衍生于质粒pCZR199(实施例8)。质粒pCZR199是含有其中包括CMV直接早期启动子、小鼠免疫球蛋白重链基因座可变区的共有内含子、插入编码序列所需的多限制性位点、终止密码子和人生长激素终止子的表达盒的哺乳动物表达载体。该质粒还具有大肠杆菌复制原点、带有SV40启动子、增强子和复制原点、DHFR基因及SV40终止子的哺乳动物选择标记表达单元。由pCZR199构建载体pZMP11，并包括用CMV直接早期启动子和开放读框5′末端的Kozak序列取代金属硫蛋白启动子。
将100μl感受态酵母细胞(酿酒酵母)与10μl含有大约1μg人zalpha11配体插入段，和100ng SmaI消化的pZMP11载体的混合物合并，并转移到0.2cm电穿孔小杯内。对酵母/DNA混合物所施加的电脉冲条件是0.75kV(5kV/cm)、无限ohms、25μF。各个小杯内加入600μl 1.2M山梨糖醇，然后将酵母分两个300μl等份铺敷在两个URA-D平皿上，并于30℃温育。
约48小时后，将各单个平皿上的Ura+酵母转化体重新悬浮在1mlH2O中，并经简单离心沉淀酵母细胞。将细胞沉淀物重新悬浮在1ml溶胞缓冲液(2％ Triton X-100，1％ SDS，100mM NaCl，10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA)中。取500μl溶胞混合物加到含有300μl酸洗的玻璃珠和200μl苯酚-氯仿的微量离心管中，以2-3次间隔旋转1分钟，然后在Eppendorf离心管中以最大速度离心5分钟。将300μl液相移入新鲜管中，用600μl乙醇沉淀DNA，然后于4℃离心10分钟。将DNA沉淀物重新悬浮在100μl水中。
用0.5-2ml酵母DNA制备物和40μl DH10B细胞完成电感受态大肠杆菌细胞(DH10B)的转化。对细胞施加电脉冲的条件是2.0kV、25μF和400ohms。电穿孔后，按250μl等份将1ml SOC(2％ BactoTM胰蛋白胨(Difco)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mMMgCl2、10mM MgSO4、20mM葡萄糖)铺敷在四块LB AMP平皿(LB肉汤、1.8％ BactoTM琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)上。
以限制性酶切法鉴定携带人zalpha11配体的正确表达构建物的个别克隆，以证明插入物的存在，并进一步证实各DNA序列已彼此正确连接。对阳性克隆的插入物进行序列分析。使用Qiagen Maxi试剂盒大规模分离质粒DNA。B.人zalpha11配体的哺乳动物表达
将BHK 570细胞(ATCC No.CRL 10314)铺敷在10cm组织培养皿中，并使之在含有5％胎牛血清、1mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠的DMEM/FBS培养基中于37℃，5％ CO2条件下过夜生长至约50-70％汇合。然后在无血清(SF)培养基配制物(DMEM，10mg/ml运铁蛋白、5mg/ml胰岛素、2mg/ml胎球蛋白、1％ L-谷氨酰胺和1％丙酮酸钠)中，借助LipofectamineTM用质粒pZMP 11/zalpha11 Lig(实施例25A)转染细胞。用SF培养基将zalpha11-Fc4/pZMP6(实施例8B)稀释到15ml试管中，达到总终体积640μl。将35μl LipofectamineTM(Gibco BRL)与605μl SF培养基混合。将LipofectamineTM混合物加到DNA混合物中，并于室温下温育约30分钟。向DNA：LipofectamineTM混合物中加入5μl SF培养基。用5ml SF培养基将细胞淋洗一次，吸干并加入DNA：LipofectamineTM混合物。将细胞于37℃温育5小时，然后向各平板内加入6.4ml DMEM/10％ FBS+1％ PSN培养基。将平板于37℃温育过夜并于第2天用新鲜5％ FBS/DMEM培养基替换DNA：LipofectamineTM混合物。转染后5天，将细胞分配到含选择培养基(DMEM/5％ FBS，1％L-Glu，1％NaPyr)的T-162培养瓶中。转染后约10天，用胰酶消化各次转染所得的两个150mm培养皿的氨甲喋呤抗性集落，合并细胞后将其铺敷到T-162培养瓶中并转为大规模培养。使用从大规模培养物得到的条件培养基纯化人zalpha11配体多肽(参见实施例24)。
                      实施例26
      产生小鼠zalpha11配体转基因小鼠的构建物A.从淋巴样细胞特异性EμLCK启动子表达小鼠zalpha11配体的构建物
设计寡核苷酸以产生包括共有Kozak序列和小鼠zalpha11配体编码区的PCR片段。使这些寡核苷酸带有5′端FseI位点和3′端AscI位点，以便于克隆到(a)淋巴样细胞特异性转基因载体pKFO51，或(b)我们的标准转基因载体pTG12-8中。
用200ng小鼠zalpha11配体模板(SEQ ID NO：55；实施例16)，以及寡核苷酸ZC,23,115(SEQ ID NO：66)和ZC23,116(SEQ ID NO：67)完成PCR反应。在实施例22B中所述的PCR条件下使用AdvantageTMcDNA聚合酶(Clontech)完成PCR反应。按实施例22B中所述方法分离PCR产物。按实施例22B中所述，消化分离的440bp DNA片段，并连接到已用用FseI和AscI酶切的pKFO51中。
电穿孔导入大约1μl各连接反应混合物，铺板、挑选克隆并用限制性消化方法筛选人zalpha11配体插入物(实施例22)。测序证实正确的pKFO51-zalpha11配体克隆，并大量制备该克隆。制备含有lck近端启动子、免疫球蛋白μ增强子、zalpha11配体cDNA，和突变的hGH基因的NotI片段，将其微量注射到受精的鼠卵母细胞中。B.从肝特异性MT-1启动子表达小鼠zalpha11配体的构建物
按实施例22A中所述方法，将实施例26A的同样小鼠zalpha11配体插入物亚克隆到pTG12-8载体中。为得到该构建物，合用FseI和AscI消化大约10mg pKFO51-zalpha11配体最大制备量的DNA，用乙醇沉淀后，按实施例22所述方法纯化小鼠zalpha11配体片段。然后将此片段连接到先前已用FseI和AscI消化的pTG 12-8中(实施例22A)。电穿孔、克隆的筛选和DNA最大量制备均按实施例22所述方法完成。制备含有5′和3′侧翼序列、MT-1启动子、大鼠胰岛素II内含子、小鼠zalpha11配体cDNA及hGH polyA序列的SalI片段，并用于向受精的鼠卵母细胞内微量注射。
                      实施例27
             小鼠zalpha11配体多克隆抗体
用纯化的重组蛋白质mu-zalphal1 L/MBP-6H(实施例32)免疫2只雌性新西蓝白兔以产生多克隆抗体。最初每只兔腹腔内注射(ip)200mg加在完全弗氏佐剂中的纯化蛋白质，然后每隔3周ip加强注射100mg加在不完全弗氏佐剂中的肽。第二次加强注射(共3次)后7-10天，给动物放血并收集血清。然后每隔3周加强注射并放血。
使用按照每克CNBr-SEPHAROSE 10mg纯化的重组麦芽糖结合蛋白(MBP)的比例制备的CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱(Phamacia LKB)使mu-zalpha11 L/MBP-6H特异性兔血清预吸附抗MBP抗体。使用本领域已知的方法，制备重组MBP并且直链淀粉柱上纯化。使用以10mg特异性抗原纯化的重组蛋白质mu-zalpha11/MBP-6H(实施例32)制备的CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱(Pharmacia LKB)，从兔血清中亲和纯化mu-zalpha11配体特异性多克隆抗体，然后在PBS中20X透析过夜。使用1μg/ml纯化的重组蛋白质mu-zalpha11 L/MBP-6H(实施例32)或hu-zalpha11 L-MBP/6H(实施例32)作为抗体靶，以ELISA方法鉴定mu-zalpha11-配体特异性抗体。在其特异性纯化的重组抗原mu-zalpha11 L/MBP-6H上，兔抗mu-zalpha11 L/MBP-6H亲和纯化的抗体的检测下限(LLD)为100pg/ml，而在纯化的重组hu-zalpha11-MBP/6H上为500pg/ml。
                      实施例28
        哺乳动物表达载体的构建和人zalpha11
         配体在CHO DG44细胞中的大批量表达
使用寡核苷酸引物ZC22,054(SEQ ID NO：70)和ZC22,055(SEQID NO：71)，经PCR扩增从含有人zalpha11配体的质粒(实施例7)构建设计在cDNA的5′端加入SalI位点并在3′端加入PmeI位点的人zalpha11配体(SEQ ID NO：1)的哺乳动物表达载体。PCR反应条件是：94℃ 4分钟；然后是94℃ 45秒，50℃ 45秒，和72℃ 3分钟重复25轮循环；最后是一次72℃ 10分钟。分离PCR产物并用SalI和PmeI消化，然后连接到在先已在多接头的适当限制性位点酶切过的质粒pDC312上。有关质粒pDC312的描述参见Morris，A.等，“ExpressionAugmenting Sequence Element(EASE)isolated from ChineseHamster Ovary Cells，”摘自Cell Technology，Carrondo，MJT等(eds.)(1997)Kluwer Academic Publishers，The Netherlands，p.529-534。
按照产品说明书使用Lipofectamine PlusTM试剂(Gibco/BRL)，以脂转染法将连接的载体转染到悬浮适应的CHO DG44(Novo Nordisk，Denmark自存)中。在没有胸苷和次黄嘌呤的PFCHO培养基(JRH，Lenexao kansas)上，然后再在20nM氨甲喋呤(Sigma，St.Louis，MO)上选择转染子。以稀释法克隆氨甲喋呤抗性细胞并以BaF3活性检测法(实施例5B)检测zalpha11配体的产生。
放大生产性克隆，使之在含有PECHO培养基的7-20升生物反应器(Applikon Bioreactors，Schiedam，The Netherlands)中生产，以产生待进一步纯化的材料(实施例29)。
                      实施例29
          从BHK和CHO哺乳动物表达细胞系中
       大规模纯化未标记的人和鼠zalpha11配体A.CHO表达人zalpha11配体
除特别指出者外，所有操作均在4℃下完成。使用下述方法从至少30升CHO条件培养基(见实施例28)中纯化人zalpha11配体。通过0.45和0.22μm滤膜过滤浓缩的或未浓缩的条件培养基(CM)。用0.01MMES(Fluka BioChemika，Switzerland)缓冲条件培养基并将pH调到6.0，然后使用BioCAD SPRINT(Perceptive BioSystems)以4-10ml/分的流速上50×100mm(196ml)Poros 50HS(perSeptive Biosystems，Framingham，MA的强阳离子交换柱)柱过夜。用10-20倍柱体积(CV)的0.01M MES/0.130M NaCl(Mallinckrodt，Paris，KY)pH6.0洗柱。然后用溶于0.01M MES pH6.0中的0.130M-1M NaCl 10CV梯度以30ml/分的流速洗脱结合的蛋白质。每管收集25ml，并在整个层析中监测280和215nm吸光率。经SDS-PAGE银和考马斯蓝染色，以及Western免疫印迹(使用抗人zalpha11配体抗体)分析峰值吸收部分。
合并峰值部分后在搅拌的浓缩器中于YM10膜(Millipore/Amicon，Bedford，MA)上浓缩到标称体积(1-10ml)。然后将样品以1-2ml/分的流速上适当的用PBS平衡过的Sephacryls-200(Pharmacia，Uppsala，Sweden)高分辨率大小排阻柱(52-600ml)；每管收集1-2ml并在整个层析过程中监测280和215nm吸光率。以SDS-PAGE银和考马斯蓝染色法分析峰值部分。
合并有用的部分并用Millipore 5kD MWKO离心旋转浓缩器浓缩到最小体积。以SDS PAGE考马斯蓝染色法、Western免疫印迹、N末端测序、氨基酸分析，以及BCA(Pierce，Rockford，Illinois)蛋白质纯度和浓度分析法鉴定终产品。B.BHK570表达的鼠zalpha11配体
除特别指出者外，所有操作均在4℃下进行。使用下述方法从BHK条件培养基中纯化鼠zalpha11配体。通过0.45和0.22μm滤膜无菌过滤浓缩或未浓缩的条件培养基(CM)。然后用0.01M MES(FlukaBioChemika，Switzerland)缓冲培养基并将pH调到6.0。按实施例29A中所述方法分析CM、上AS柱和洗脱。
合并所需的洗脱部分并用实施例29A所述的搅拌浓缩器浓缩到20-30ml。将样品pH调到7.0后，在BioCAD SPRINT上以1ml/分的流速上样到具有3mg zalpha11 CFLAG标记的可溶性受体(实施例10B)或大约10mg zalpha11-Fc4融合受体(固定在树脂上的)(实施例10B)的0.8ml Poros AL柱。然后用至少20CV的0.3M NaCl/PBS/0.01M MES以10ml/分流速洗柱。然后在BioCAD SPRINT上经注入600μl 0.1M甘氨酸用PBS以10ml/分的流速快速洗脱。每6秒钟收集1ml并用55μl 2M TRIS(pH8.8)直接进行pH中和。整个层析中监测280和215nm吸光率。按上述SDS-PAGE银、考马斯蓝染色法和Western免疫印迹法分析峰值部分。
合并峰值部分后在搅拌的筛网浓缩器中浓缩到最小体积(1-10ml)。然后将样品上预平衡的Sephacryl s-200(Pharmacia)高分辨率大小排阻柱。以SDS-PAGE银和考马斯蓝染色法分析峰值部分。合并有用的部分并按实施例29A中所述浓缩并分析。C.蛋白质在POROS AL基质上的固相化
所有操作均在BioCAD 700E上室温下完成。按照生产商的使用说明书用2M NaCl中的POROS AL培养基流动装柱(4.5×50mm)。用1.1MNa2SO4和50mM磷酸钠pH7.2平衡柱子。采用Millipore 30kD MWKO离心旋转浓缩器将受体浓缩到4mg/ml，然后用1.1M Na2SO4和50mM磷酸钠pH7.2按1∶1稀释。然后在1.1M Na2SO4和50mM磷酸钠pH7.2中以2ml/分的流速洗柱，并每9CV注入100μl稀释的配体，直到稳态饱和状态和透过整个柱。然后用1.1M Na2SO4+50mM磷酸钠pH7.2到550mMNa2SO4+50mM磷酸钠pH7.2和5mg/ml氰基硼氢化钠的62CV梯度洗柱。将柱静止2小时以完成固定化。然后在0.2M TRIS pH7.2中用5mg/ml氰基氢硼化钠平衡柱并放置1小时。最后，在PBS中用0.02％叠氮钠平衡柱后保存于4℃备用。使用前，用0.1M甘氨酸预洗脱柱以确保除去非特异性结合的蛋白质而且不会从柱上漏出固定化的受体。
                      实施例30
       表达载体构建，从杆状病毒表达并纯化未标记
                的人和小鼠zalpha11配体A.在杆状病毒中表达人zalpha11配体的构建物
制备用于在昆虫细胞中表达人zalpha11配体多肽的表达载体zalpha11 L。使用引物ZC23，444(SEQ ID NO：74)和ZC23,445(SEQID NO：75)从含有人zalpha11配体cDNA的质粒(实施例7)，经PCR扩增产生5′和3′末端分别带有BamHI和XhoI限制性位点，并且含有人zalpha11配体的序列的517bp片段。PCR反应条件如下：94℃ 4分钟循环一次；然后是94℃ 45秒，50℃ 45秒和72℃ 2分钟共循环25次；再于72℃ 10分钟循环一次，最后4℃浸泡。经凝胶电泳(1％SeaPlaque/1％ NuSieve)显现片段。切掉需要的带，用2mM MgCl2稀释到0.5％琼脂糖，于65℃熔解，用BamHI和XhoI消化，并连接到BamHI/XhoI消化的杆状病毒表达载体pZBV3L上。pZBV3L载体是由pFastBaclTM(Life Technologies)表达载体衍生得到的，其中多角体启动子已被除去并代之以晚期活化碱性蛋白启动子。于16℃下将大约1ng限制消化的zalpha11配体插入段与大约40ng相应的载体连接过夜。
用FE(10mM Tris-HCl，pH7.5和1mM EDTA)将连接混合物稀释3倍，并将大约4fmal稀释的连接混合物以热休克法(42℃水浴，45秒)转化到DH5α感受态细胞(Life Technologies)中。将转化的DNA和细胞稀释到450μl SOC培养基(2％ BactoTM胰蛋白胨、0.5％ Bacto酵母提取物、10ml 1M NaCl、1.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4和20mM葡萄糖)中，并铺敷在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，以限制性消化法分析克隆按上述热休克法将1μl阳性克隆转化到20μlDH10Bac最大效率感受态细胞中(GIBCO-BRL，Gaithersburg，MD)。然后将被转化的细胞稀释在980μl SOC培养基中，37℃振荡培养4小时并铺敷在含有50μg/ml卡那霉素、7μg/ml庆大霉素(LifeTechnologies)、10μg/ml四环素、IPTG(Pharmacia Biotech)和Bluo-Gal(Life Technologies)的Luria Agar平板上。将铺板的细胞37℃温育48小时。以颜色选择法鉴定那些带有供体的人zalpha11配体编码序列并已掺入到质粒(“杆粒”)中的插入段的细胞。挑取那些白色集落进行分析。使用QiaVac Miniprep8系统(Qiagen)从阳性集落中分离人zalpha11配体杆粒DNA。使用引物ZC447(SEQ ID NO：76)和ZC976(SEQ ID NO：77)以PCR方法将杆粒中的DNA扩增成转座因子以筛选有正确插入段的克隆。PCR反应条件如下：90℃ 45秒，50℃ 45秒和72℃ 5分钟条件下循环35次；再于72℃ 10分钟，然后4℃浸泡。1％琼脂糖电泳以检查PCR产物中插入段的大小。使用带有正确插入段的克隆转染草地夜蛾(S89)细胞。B.表达和产生用于从杆状病毒中纯化人zalphha11配体的材料
将S89细胞接种到微量滴定板中(5×106个细胞/板)并使之27℃接触1小时。用100μl Sf-900 II SFM(Life Technologies)稀释5μl人zalpha11配体杆粒DNA。用100μl Sf-900 II SFM稀释6μlCellFECTIN试剂(Life Technologies)。将杆粒DNA和脂质溶液轻轻混合并于室温下温育30-45分钟。吸去一块细胞平板上的培养基，用2ml新鲜Sf-900 II SFM培养基洗细胞。向脂质-DNA混合物中加入800μl Sf-900 II SFM。吸掉洗涤培养基并向细胞上加入DNA-脂质混合物。27℃温育4-5分钟。吸掉DNA-脂质混合物并向平板内加入2mlSf-900 II培养基。27℃，90％湿度下将平板温育96小时，然后收获病毒。
为初级扩增，使Sf9细胞在含有50ml Sf-900 II SFM的125ml摇瓶中生长至0.4-0.52×105细胞/ml的密度。然后用150μl如上得到的病毒原液感染细胞并于27℃温育3天，然后按已知方法收获病毒。取500μl样用BaF3试验法进行活性鉴定(实施例5)。
为进行次级扩增，使Sf9细胞在含有1l Sf-900 II SFM的2800ml摇瓶中生长至大约0.5-105细胞/ml的密度。用500μl初级病毒原液感染细胞并于27℃温育4天，然后按已知方法收获病毒。搅拌病毒并按下述(实施例30C和30D)方法大规模纯化产生人zalpha11配体的杆状病毒(zalpha11L-Bv)。C.大规模纯化表达人/鼠zalpha11配体的杆状病毒
除特别说明者外，所有操作均在4℃下完成。使用下述方法从BV条件培养基中纯化人zalpha11配体(huzalpha11L-Bv)。通过0.45和0.22μm滤膜过滤条件培养基(CM)，用0.01M MES缓冲并将pH调到6.0。然后按实施例29A中所示方法将CM上柱(POROS 50HS)、层析、收集和分析。
合并上述峰值部分、浓缩(在高分辨率大小排阻柱上)并分析之(实施例29A)。
合并从大小排阻柱上收集的有用部分，用5kD MWCO Millipore旋转浓缩器浓缩到最小体积。然后以SDS-PAGE法分析终产物。以Western免疫印迹、N末端测序、氨基酸分析及CB等方法检测蛋白质纯度及浓度。将大部分蛋白质于-80℃保存。D.小量(＜2mg)纯化表达人/鼠zalpha11配体的杆状病毒
除特别说明者外，所有操作均在4℃下完成。使用下述方法从BV条件培养基中纯化＜2mg的人或鼠zalpha11配体。过滤CM，加缓冲液缓冲并调pH。然后将CM上柱(POROS 50HS)，洗脱并分析活性(实施例30C)。按实施例30C中所述方法将CM上柱(POROS 50HS)、洗脱并分泌洗脱物。
合并各洗脱部分后，通过在搅拌网筛浓缩器中渗滤(YM10滤膜，10kD MWCO)(Millipore/Amicon，Bedford，MA)将其浓缩到标称体积(20-30ml)。将pH调到7.0后，在BioCad SPRINT上1ml/分流速将样品上样到树脂上已固定了大约3mg zalpha11 CFLAG可溶性受体或大约10mg zalpha11-Fc4融体的可溶性受体的0.8ml Poros AL柱。然后用至少20CV的0.3M NaCl/PBS/0.01M MES以10μl/分洗柱。在BioCADSPRINT上以10ml/分流速用PBS洗脱(注射600μl 0.1M甘氨酸pH2.5)柱。每6秒钟收集1ml并用直接用55μl 2M TRIS pH8.8中和整个层析中监测280和215nm吸光率。按上述方法分析洗脱部分。
合并峰值部分并通过YM10膜(10kD MWCO)渗滤浓缩到1-2ml。将样品上已在PBS中平衡的适当的Sephacryl s-200(Phermacia，Uppsala，Sweden)高分辨率大小排阻层析柱，以最适流速洗脱并监测280和215nm吸光率，按上述方法分析各洗脱部分。
收集有用的部分并用5kD MWCO Millipore离心旋转浓缩器浓缩到标称体积。然后用SDS-PAGE考马斯蓝染色、Western免疫印迹分析、N末端测序、氨基酸分析和BCA等方法分析终产物的蛋白质纯度和浓度。大量蛋白质按上述条件储存。E.在杆状病毒中表达小鼠zalpha11配体的构建物：pzalpha11 Lig.M
制备表达载体pzalpha11 LM，以在昆虫细胞中表达鼠zalpha11配体多肽。利用Expand High Fidelity PCR系统(BoehringerMannheim)，以ZC25,970(SEQ ID NO：109)和ZC25,969(SEQ ID NO：110)作为引物，从含有鼠zalpha11配体cDNA的质粒(实施例16)PCR扩增产生含有鼠zalpha11配体和5′与3′端BspEI与XbaI限制性位点之编码序列的413bp片段。PCR条件如下：94℃ 2分钟一次循环；然后是94℃ 15秒、50℃ 30秒和72℃ 2分钟共循环35次；再于72℃ 10分钟，然后4℃适应。经凝胶电泳(1％ NuSieve agarose)显现PCR产物的一小部分。片段的其余部分则使用Qiagen PCR纯化试剂盒纯化并洗脱到30μl H2O中。然后用BspeI和XbaI(BoerhingerMannheim)限制性酶于37℃将片段消化2小时，然后进行琼脂糖凝胶电泳。切下所需的带，使用Qiagen凝胶提取试剂盒纯化并洗脱。将纯化的部分连接到Bspe/XbaI消化的杆状病毒表达载体pZBV37L上。pZBV37L是由pFastBacITM(Life Technologies)表达载体经修饰得到的，其中已除去了多角体启动子并换成了晚期活化的碱性蛋白启动子，然后是衍生于蜕皮类固醇UDP-葡糖基转移酶(EGT)的分泌信号序列。16℃下，将大约5μl限制性酶消化的鼠zalpha11配体插入段与大约100ng相应酶切的载体以大约20μl体积连接过夜。利用2kV、25μF和400ohms的设定条件，将5μl连接混合物电穿孔到50μlDH12S电感受态细菌细胞(life Technologia)中。使电穿孔的细胞在1ml SOC培养基(2％BactoTM胰蛋白胨、0.5％ Bacto酵母提取物、10ml1M NaCl、1.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4和20mM葡萄糖(GibcoBRL))中37℃突出生长1小时并铺敷于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上。从细菌克隆中分离DNA并以限制性消化法鉴定阳性克隆。在热水浴中热休克45秒钟，以将大约5ng DNA转化到20μl DH10BacMax Efficiency感受态细胞中。然后稀释并培养被转化的细胞(实施例30A)。鉴定含有鼠zalpha11配体插入段的杆粒并按实施例30A所述方法分离之。使用引物ZC447(SEQ ID NO：76)和ZC976(SEQ ID NO：77)通过PCR扩增杆粒中相当于转座因子的DNA，以筛选带有正确插入段的克隆。PCR反应条件是：94℃ 45秒，50℃ 45秒和72℃ 5分钟共循环35次；然后是72℃ 10分钟一次；再于4℃浸泡。以1％琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物中插入段。使用有正确插入段的片段转化草地夜蛾(Sf9)细胞。F.从杆状病毒中纯化小鼠zalpha11的材料的表达和产生
将Sf9细胞接种到35mm平板上(106细胞/板)并于27℃保持1小时。转染小鼠zalpha11配体杆粒DNA并收获病毒。
为了初级扩增，接种Sf9细胞，加入500μl转染后72小时上清液并继续培养96小时，然后收获病毒。
为了次级扩增，接种Sf9细胞并加入200μl初级病毒原液。将培养物于27℃温育72小时，然后按标准方法收获病毒。
为了进行三级扩增，将10μl次级扩增的病毒原液加在Sf9细胞上(500,000个细胞/孔)，在含有50ml SF900 II培养基的250ml摇瓶中培养6天后收获病毒。滴定病毒并大量培养后用以纯化杆状病毒产生的鼠zalpha11配体(muzalpha11L-Bv)(实施例30C和30D)。
使用抗muzalpha11L/MBP-6H多克隆抗体(实施例27)以Western分析法确定上清液中有预期分子量的蛋白质的存在。基于BaF3的增殖试验(实施例5)也表明，分泌的配体是有活性的。
                      实施例31
      人和小鼠zalpha11配体在大肠杆菌中的表达A.人zalpha11配体-MBP融合表达载体PTAP98/zalpha11配体的构建
通过同源重组构建含有N末端与麦芽糖结合蛋白质(MBP)融合之部分人zalpha11配体之多核苷酸编码序列的表达质粒。使用PCR方法分离人zalpha11配体cDNA(SEQ ID NO：1)的片段。所说的PCR反应中使用两个引物：(1)引物ZC22,128(SEQ ID NO：78)，其含有40bp载体侧翼序列和相当于人zalpha11配体之氨基末端的26bp，以及(2)引物ZC22,127(SEQ ID NO：79)，其含有40bp相当于侧翼载体序列的3′末端和相当于人zalpha11配体之羧基末端的28bp。PCR反应条件是：94℃ 30秒，50℃ 30秒和72℃ 1分钟循环25次；然后4℃浸泡，反复两次。取100μl PCR反应产物中的2μl进行电泳(1.0％琼脂糖，1×TBF缓冲液)分析，显示出一条约472bp的预期的带。其余90μl PCR反应产物与400μl无水乙醇沉淀的第二管PCR反应产物合并，并用于重组到SmaI切割的接受体载体pTAP98中，以产生编码MBP-zalpha11配体融合体的构建物。
质粒pTAP98衍生于质粒pRS316和pMAL-c2。质粒pRS316是酿酒酵母穿梭载体(Hieter P.and Sikorski，R.，Genetics 122：19-27，1989)。pMAL-c2(NEB)是大肠杆菌表达质粒，其携带tac启动子驱动的MalE(编码MBP的基因)，然后是His标记，凝血酶切割位点、克隆位点和rrnB终止子。使用酵母同源重组方法构建载体pTAP98。将100ngEcoRI切割的pMAL-c2与1μg Pvul切割的pRS316、1μg接头和1μg Scal/EcoRI切割的pRS316重组。接头由PCR反应中合用的寡核苷酸ZC19,372(SEQ ID NO：80)(100pmol)；ZC19,351(SEQ ID NO：81)(1pmol)；ZC19,352(SEQ ID NO：82)(1pmol)，和ZC19,371(SEQID NO：83)(100pmol)组成。反应条件是：94℃ 30秒，50℃ 30秒和72℃ 30秒反复10轮循环；然后于4℃下适应。通过100％乙醇沉淀浓缩PCR产物。
将100μl感受态酵母细胞(酿酒酵母)与10μl含有约1μg人zalpha11配体PCR产物和100ng SmaI消化的pTAP98载体的混合物合并，并转化到0.2cm电穿孔小池中。电脉冲条件是0.75kV(5kV/cm)、无穷ohms，25μF。小池内各加入600μl 1.2M山梨糖醇。然后按两等份(各300μl)将酵母铺敷在两个URA D平板上并于30℃温育。
约48小时后，将单个平板上的Ura+酵母转化体重新悬浮在1ml H2O中，并经简单离心沉淀出酵母细胞。将细胞沉淀物重新悬浮在1ml溶胞缓冲液(2％ Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris，pH8.0，1mM EDTA)中。将500μl溶胞混合物加入到含有300μl酸洗玻璃球和200μl苯酚-氯仿的Eppendorf管中，涡旋2-3次(间隔1分钟)，然后以最大速度离心5分钟。将100μl水相转移到新鲜试管中，并用600μl乙醇沉淀DNA，然后4℃离心10分钟。将DNA沉淀物重新悬浮在100μl H2O中。
用1μl酵母DNA制备物和40μl MC1061细胞完成电感受态大肠杆菌细胞(MC1061，Casadaban et al.，J.Mol.Biol.138：179-207)的转化。于2.0kV、25μF和400ohms条件下对细胞施加电脉冲。电穿孔后，将0.6ml SOC铺敷在LB AMP平板(LB肉汤(Lennox)、0.8％ BactoTM琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)。
根据表达产物鉴定携带正确的人zalpha11配体表达构建物的个别克隆。使细胞在Superbroth II(Becton Dickinson)+100μg/ml氨苄青霉素中生长过夜。使用50μl过夜培养物接种2ml新鲜的Superbroth II+100μg/ml氨苄青霉素。使培养物于37℃振荡下生长2小时。1ml培养物加1mM IPTG诱导基因表达。2-4小时后将各250μl培养物与250μl酸洗的玻璃珠及250μl含5％βME和染料的Thorner缓冲液(8M尿素，100mM Tris pH7.0，10％甘油，2mM EDTA，5％SDS)混合。将样品搅动1分钟并加热到65℃维持5-10分钟。在1×MES缓冲液中跑4-12％凝胶电泳(NOVEX)，每泳道上样20μl。将阳性克隆定名为pTAP126并进行序列分析。SEQ ID NO：84中示出pTAP126内编码MBP-人zalpha11配体融合体的多核苷酸序列，其相应的多肽序列则如SEQ ID NO：85中所示。B.人zalpha11配体的细菌表达
使用1μl测序的DNA转化菌株W3110(ATCC)。以2.0kV、25μF和400ohms条件对细胞施加电脉冲。电穿孔后，将0.6ml SOC作为一份铺敷在LB AMP平板上。
单体被表达使细胞在Superbroth II(Becton Dickinson)+100μg/ml氨苄青霉素中生长过夜。使用50μl过夜培养物接种2ml新鲜的Superbroth II+100μg/ml氨苄青霉素。使培养物于37℃振荡下生长2小时。1ml培养物加1mM IPTG诱导基因表达。2-4小时后将各250μl培养物与250μl酸洗的玻璃珠及250μl含5％ βME和染料的Thorner缓冲液(8M尿素，100mM Tris pH7.0，10％甘油，2mM EDTa，5％SDS)混合。将样品搅动1分钟并加热到65℃维持5-10分钟。在1×MES缓冲液中跑4-12％凝胶电泳(NOVEX)，每泳道上样20μl。培养阳性克隆并表达待进一步纯化的huzalpha11L/MBP-6H融合蛋白质(实施例32)。C.小鼠zalpha11配体-MBP融合表达载体，TAP98/小鼠zalpha11配体的构建
按照实施例31A中所述，通过同源重组构建含有编码N末端与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合之部分小鼠zalpha11配体的多核苷酸的表达质粒。使用PCR方法分离小鼠zalpha11配体cDNA的片段(SEQ ID NO：55)。在PCR反应中使用下列两个引物生产小鼠zalpha11配体片段：(1)引物ZC22,849(SEQ ID NO：86)，其含有40bp载体侧接序列和相当于小鼠zalpha11配体之氨基末端的24bp；(2)引物ZC22,850(SEQID NO：87)，其含有相当于侧接载体序列的40bp 3′末端和相当于小鼠zalpha11配体之羧基末端的21bp。PCR反应条件同前。将大约450bp的片段克隆到pTAP98中。按上述方法转化、鉴定和培养克隆，将阳性克隆定名为pTAP134并进行序列分析。pTAP134内的MBP-小鼠zalpha11配体的多核苷酸编码序列及其相应的多肽序列分别如SEQ IDNO：88和SEQ ID NO：89中所示。培养携带阳性克隆大肠杆菌，以表达并进一步纯化muzalpha11/MBP-6H融合体蛋白(实施例32)。
                      实施例32
      zalpha11-MBP配体或zalpha11-MBP受体的纯化
除非另外指出，所有操作均在4℃下进行。使用下述方法从大肠杆菌中纯化人zalpha11-MBP配体(huzalpha11L/MBP-6H)或小鼠zalpha11-MBP配体(muzalpha11L/MRP-6H)的zalpha11-MBP配体融合体。使用同样方法纯化人或小鼠zalpha11-MBP受体融合体。融化预冷冻的大肠杆菌糊并稀释到2l缓冲液B(0.02M TRIS(EM Science)，0.2MNaCl(Mallincrodt)，0.01M 2-巯基乙醇(EM Science)，pH8.0，5mg/l抑胃酶肽A(Boerhinger Mannheim)，5mg/l抑酶肽(BoerhingerMannheim)和1mg/l PMSF(Fluka))加1-2ml消泡剂AF289(Sigma)中。在预冷的French Press细胞破碎器(Constant Systems LTD)中以20-30kPSI处理含细胞混合物。
然后以18,000xg离心(4℃，45分钟)细胞裂解物；保留上清。将200μl在缓冲液A(0.02M TRIS，0.2M NaCl，0.01M 2-巯基乙醇，pH8.0)中预平衡的Amylose树脂(New England Biolabs)淤浆加到上述上清液中，并在21个旋转瓶中温育过夜以得到MBP融合蛋白的最大吸附。用≥5柱体积的缓冲液洗树脂，然后用缓冲液C(含0.02M麦芽糖的缓冲液A)洗脱。收集粗提部分并监测280nm吸光率。
以SDS PAGE(NOVEX)考马斯蓝染色法分析洗脱的蛋白质。将大部分的蛋白质保存于-80℃。
                      实施例33
              人zalpha11配体多克隆抗体
用纯化的重组蛋白质huzalpha11L/MBP-6H(实施例32)或纯化的CHO重组蛋白质huzalpha11L-CHO(实施例29)免疫两只雌性新西蓝大白兔，以制备抗人zalpha11配体的多克隆抗体。每只兔最初腹腔内(ip)注射200mg纯化的蛋白质+完全弗氏佐剂，然后每三周加强注射(ip)100mg纯化的蛋白质+不完全弗氏佐剂。第二次加强注射后(共3次)7-10天，给动物放血并收集血清。然后每三周加强注射并放血。
使用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱(Pharmacia-LKB)(其为使用10mg纯化的重组MBP/克CNBr-SEPHAROSE制备的)从兔血清中纯化预先吸附了抗MBP抗体的huzapha11L/MBP-6H。制造重组MBP并使用已知方法在直链淀粉柱上纯化。使用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱(按每克CNBr-SEPHAROSE 10mg特异性抗原纯化的重组蛋白质huzalpha11L/MBP-6H或10mg纯化的CHO重组蛋白质huzalpha11L-CHO比例制备的)，从兔血清中亲和纯化然后在PBS中20×透析过夜得到huzalpha11-配体特异性多克隆抗体。使用1μg/ml纯化的重组蛋白质huzalpha11L/MBP-6H(实施例32)、人zalpha11配体(huzalpha11L-CHO)(实施例29)，或muzalpha11L-MBP/6H(实施例32)作为抗体靶，以ELISA法鉴定huzalpha11配体特异性抗体。
兔抗huzalpha11L/MBP-6H亲和纯化的抗体对其特异性纯化的重组抗原huzalpha11L/MBP-6H的检测下限(LLD)为10ng/ml，对纯化的重组huzalpha11L-CHO为500pg/ml，对纯化的重组muzalpha11L/MBP-6H(实施例32)为100pg/ml。兔抗huzalpha11L-CHO亲和纯化的抗体对其特异性纯化的重组抗原huzalpha11L-CHO的LLD为20pg/ml，对纯化的重组huzalpha11L/MBP-6H为500pg/ml，对纯化的重组muzalpha11L/MBP-6H为50ng/ml。
                      实施例34
               人zalpha11配体抗肽抗体
用人zalpha11配体肽，huzalpha11L-1(SEQ ID NO：72)式huzalpha11L-3(SEQ ID NO：73)免疫2只雌性新西蓝白兔，以制备多克隆人zalpha11配体抗肽抗体。使用Applied Biosystems 431A型肽合成仪(Applied Biosystems，Inc.，Foster City，CA)合成肽。然后借助马来酰亚胺活化使肽连接到载体蛋白钥孔血蓝蛋白(KLH)上。首先每只兔腹腔内(ip)注射200mg肽加完全弗氏佐剂，然后每三周以100mg肽加不完全弗氏佐剂ip加强注射。第二次加强注射(共三次)后7-10给动物放血并收集血清。然后每隔三周加强注射并放血。
使用1μg/ml用于制造抗体的各个肽(SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73)作为抗体靶，以ELISA方法鉴定抗人zalpha11配体肽的兔血清。两份抗huzalpha11L-1肽的兔血清对其特异性肽的滴度均为1∶5,000,000(1∶5E6)。两份抗huzalpha11L-3肽的兔血清对其特异性肽的滴度均为1∶5E6稀释度。
人zalpha11配体肽特异性多克隆抗体是使用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白柱(Pharmacia-LKB)(其为按每克CNBr-SEPHAROSE使用10mg各特异性肽(SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：73)，然后在PBS中20×透析过夜而制备的)，从兔血清中纯化的。使用1μg/ml适当纯化的肽抗原或纯化的重组全长蛋白作为抗体靶，以ELISA方法检测huzalpha11-配体特异性抗体。
兔抗huzalpha11L-1亲和纯化的抗体对其特异性肽抗原(huzalpha11L-1；SEQ ID NO：72)的检测下限(LLD)为500pg/ml；对纯化的重组huzalpha11L/MBP-6H(实施例32)为500pg/ml；对纯化的CHO重组huzalpha11L-CHO(实施例29)为500pg/ml。未见与纯化的重组muzalpha11L/MBP-6H有交叉反应性(实施例32)。兔抗huzalpha11L-3亲合纯化的抗体对其特异性肽抗原(huzalpha11L-1；SEQ ID NO：73)的LLD为50pg/ml；对纯化的重组huzalpha11L/MBP-6H为50pg/ml；对纯化的CHO重组huzalpha11L-CHO为500pg/ml；对纯化的杆状病毒重组huzalpha11L-Bv为100pg/ml。观察到与纯化的重组muzalpha11L/MBP-6H有交叉反应(实施例32)，同时对该融合蛋白的LLD为5ng/ml。
                      实施例35
              人zalpha11受体单克隆抗体
用纯化的重组可溶性受体蛋白质zalpha11 CEE(huzalpha11-CEE-BHK)(实施例10A)免疫5只雄性BalbC小鼠，以制备zalpha11受体单克隆抗体。开始时每只小鼠各腹腔内注射20mg纯化的蛋白质加完全弗氏佐剂，然后每两周加强注射10mg纯化的蛋白质加不完全弗氏佐剂。第三次加强注射后7-10天，给动物放血并收集血清。
使用纯化的重组CHO huzalpha11-Fc蛋白(实施例10C)作为抗体靶，以ELISA方法滴定抗huzalpha11-CEE-BHK的小鼠血清样品。一份小鼠血清样品对特异性抗体靶的滴度为1∶1,000,000(1∶1E6)稀释度。四份小鼠血清样品对特异性抗体靶的滴度为1∶100,000(1∶1E5)稀释度。
从4只高滴度小鼠收获脾细胞，并在两个不同的融合操作中按照4∶1融合比例(脾细胞∶骨髓瘤细胞)，借助PEG 1500与小鼠SP2/0骨髓瘤细胞融合(Antibodies：A Laboratory Manual，E.Marlow andD.Lane.Cold Spring Harbor Press)。融合后培养10天，然后使用纯化的重组BHK人zalpha11-Fc4蛋白质(实施例10C)作为抗体靶以ELISA方法和使用表达huzalpha11序列的Baf3细胞(实施例4，和2)作为抗体靶以FACS方法鉴定产生特异性抗体的杂交瘤。用有限稀释法将所得到的4个阳性杂交瘤克隆三次。抗体被定名为：249.28.2.1.2.2；247.10.2.15.4.6；249.19.2.2.3.5和249.15.2.4.2.7。
                      实施例36
               zalpha11配体转基因小鼠A.表达人和小鼠zalpha11配体的转基因小鼠的产生
从含有各自启动子MT-1肝特异性启动子(小鼠zalpha11配体)或淋巴样组织特异性LCK启动子(小鼠和人zalpha11配体)之5′和3′侧接序列、大鼠胰岛素II内含子、zalpha11配体cDNA及人生长激素polyA序列的转基因载体(实施例22和26)制备DNA片段，并微量注射到受精的B6C3f1(Taconic，Germantown，NY)鼠卵母细胞中(参见Hogan，B.et al.，Manipulating the Mouse Embryo，A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1994)。
在44只小动物间鉴定从淋巴样组织特异性EμLCK启动子表达人zalpha11配体的8只转基因小鼠。其中4只死亡，4只长到成年。这些动物中的表达水平相当低。在77只幼小动物间鉴定出20只从淋巴样细胞特异性EμLCK启动子表达小鼠zalpha11配体的转基因小鼠。所有20只动物都长到成年。这些动物中的表达水平都相当低。在60只幼小动物鉴定出了三只从肝特异性MT-1启动子表达小鼠zalpha11配体的转基因小鼠。其中两只死亡，1只长到成年。这些动物中的表达水平相当低。按下述方法制备组织并进行组织学检查。B.转基因小鼠组织的显微镜检查
从表达人和小鼠zalpha11配体(实施例36A)的转基因动物收集和制备用于组织学检查的脾、胸腺和肠系膜淋巴结。常规收获的其它组织包括：肝、心脏、肺、肾、皮肤、乳腺、胰、胃、小肠和大肠、脑、唾液腺、喉、食管、肾上腺、垂体、生殖道、雄性性腺、骨骼肌包括外周神经，和带骨髓的股骨。从偶然死亡的新生小动物和几只成年转基因小鼠收获组织。在10％缓冲的甲醛中固定样品，大体加工、石腊包埋、按5μm切片，并用苏木精和伊红染色。由有资格的兽医病理学家盲法处理检查切片并记录组织改变的严重程度(0＝无，1＝轻度，2＝中度，3＝重度)。
在幼小动物和2只表达人zalpha11配体的雌性成年小鼠，以及6只表达小鼠zalpha11配体的雄性成年小鼠中的3只中可见在许多组织中有炎性浸润。器官受影响的程度在各小鼠间有所不同。炎性浸润主要包括不同数目和比例的中性细胞与巨噬细胞浸润，并且严重程度为轻度至中度。此外，这些动物表现有淋巴样器官的改变，包括脾和胸腺中的中至重度淋巴细胞减少(人和小鼠zalpha11配体转基因)、严重的淋巴细胞减少(人zalpha11配体转基因)，或淋巴结中的轻至重度脓性肉芽性淋巴结炎(小鼠zalpha11配体转基因)。再者；可见脾脏中髓外造血活跃。在年龄相配的对照动物则未见这些改变。C.过表达zalpha11配体的转基因小鼠组织的流式细胞分析
处死表达人或小鼠zalpha11配体的转基因动物(实施例36A)，以准备对外周血、胸腺、淋巴结、骨髓和脾细胞进行流式细胞计量分析。冰冷的培养基(500ml RPMI 1640培养基(JRH Biosciences.Lenexa，ks)；5ml 100×L-谷氨酰胺、5ml 100×丙酮酸钠、5ml 100×青霉素、链霉素、新霉素)中，用镊子剥离脾、胸腺和淋巴结器官，然后通过细胞滤过器轻轻挤压细胞以制备细胞悬液。在肝素化试管中收集外周血(200ml)并用含有10U肝素/ml的HBSS稀释到10ml。以低渗压溶胞法除去脾和外周血制剂中的红细胞。用冰冷的培养基从股骨中冲出骨髓以制备骨髓细胞悬液。计数细胞并使用锥虫蓝试验存活性。以10×106细胞/ml的浓度将细胞重新悬浮在冰冷的染色培养基(HBSS，1％胎牛血清，0.1％叠氮化钠)中。向悬浮液中加入10％正常羊血清和Fc Block(Pharmingen，La Jolla，CA)以阻断Fc受体和抗体与细胞的非特异性结合。
将细胞悬液与等体积荧光标记的单克隆抗体(PharMingen)混合，在冰上温育60分钟后用冰冷的洗涤缓冲液(PBS，1％胎牛血清，0.1％叠氮钠)洗两次，然后再悬浮于400ml含有1mg/ml 7-AAD(MolecularProbes，Eugene，OR)(作为某些样品中的存活性标记)的洗涤缓冲液中。使用FACS Calibur流式细胞仪(BD Immunocytometry Systems，SanJose，CA)获得流式细胞计量数据。使用CellQuest软件(BDImmunocytometry System)完成数据的获取和分析。
在所分析的所有淋巴样器官中，以最高水平表达人或小鼠zalpha11配体的转基因动物均已显著地改变了细胞群体。这些改变包括完全丧失胸腺细胞极性、完全没有CD45R阳性B细胞，以及增大了脾的大小和细胞极性。脾和骨髓已增加了髓样大小细胞的数目(其为根据单核细胞和嗜中性细胞的增加而计数的)。许多细胞群增加了全NK细胞标记(D×5)中度表达的原始细胞仍有较明显的与高表达者的表型相一致的改变。有最低表达的小鼠的髓样细胞数没有明显增加，B细胞数也没有降低。它们显示胸腺细胞群体的显著改变：CD4+CD8+双阳性细胞降低，CD4和CD8单阳性细胞增加。
                      实施例37
         正常小鼠中的zalpha11配体纯化的重组人
                 蛋白质剂量反应性研究A.概要
以0.1、0.5、5或50μg/小鼠/天的不同剂量给正常六周龄雌性C57B1/6小鼠(Harlan Sprague Dawley，Indianapolis，IN)腹腔内注射纯化的重组人zalpha11配体(实施例24)，每天1次共4或8天。用载体作为对照。每天监测体重和体温。于第4或第9天，杀死蛋白质处理组8只小鼠中的4只，和载体对照组10只小鼠中的5只。收获并分析血液、骨髓和组织。检查淋巴样组织中可能存在的干扰，以及一般性生理和毒理学参数。
在所试验的任何剂量下，均没有见到人zalpha11配体的毒性证据。体重和体温没有改变。临床化学参数没有可见的改变。然而与对照组相比，发现用最大剂量zalpha11配体处理的小鼠的骨髓、脾和外周血中增大了髓样谱系细胞的百分比。用流式细胞计量分析法鉴定高剂组动物的脾匀浆，可见髓样谱系大小细胞有统计学上明显的增加。两个最高剂量组的脾在其它组统计学上的明显增大但组织病理学检查可见，在最高剂量组只有髓外造血的边缘增加。与其它组相比，最高剂量组骨髓中髓样细胞对类红细胞的比例显著增大。最后，在同一组织可见外周血中的总白血细胞计数和单核细胞的比例增加。B.剂量溶液制备
以0.1ml PBS载体递送50、5、0.5或0.1μg蛋白质的浓度，将纯化的重组人zalpha11配体稀释到无菌磷酸盐缓冲盐水中。于第0天制备前4天的剂量单位并于-20℃冷冻备用。于第5天制备用于第5-8天的剂量单位。同样等分PBS作为载体对照组。用药当天融化适当的样品并将0.1ml溶液腹腔内注射给小鼠(每天一次，共4或8天)。C.研究设计
开始研究时小鼠为6周龄。每组8只小鼠，载体对照组包括10只小鼠。治疗后4天各治疗组杀死一半动物，另一半在治疗后8天杀死。
每天用药前，对每只小鼠称重并使用Portable ProgrammableNoteboou系统(BMDS，Inc.，Maywood，NJ)记录其体温，通过扫描小鼠由皮下包埋的脉冲转发器鉴定小鼠的数量和体温(IPTT-100，BMDS，Maywood，NJ.)。
处死时，用流式细胞计量法分析骨髓、胸腺和脾组织的白细胞群体。用FACSCalibur(Becton Bickinson，Mansfield，MA)对淋巴样器官和骨髓进行FACS分析。进行组织学检查以分析蛋白质毒性的组织包括：脾、胸腺、肝、肾、肾上腺、心和肺。所有固定的组织均放在10％生理缓冲盐水(NBF)(Surgipath，Richmond，IL)中4℃过夜。第二天将NBF换成70％乙醇并将组织放回4℃待用。
处理组织并用苏木精和伊红染色，然后交给病理学家进行组织病理学分析。收集血液进行全血细胞计数(CBC)和血清化学分析。使用Cell Dyn 3500血液学分析仪(Abbott Diagnostics Division，AbbottPark，IL)进行CBC分析。手工差分白血细胞计数则在Phoenix中心实验室(Everett，WA)进行。将血清保存于-20℃，并交由Phoenix中心实验室进行全血化学分析。分析骨髓细胞：类红细胞的比例。将骨髓涂于玻片上(CYTOSPIN 3，CYTOCENTRIFUGE and CYTOSIIDES)并送交Phoenix中心实验室分析。D.研究结果
50μg/天或更低剂量时，人zalpha11配体未见有明显的毒性临床指征和生理效应。治疗期间体重和体温保持正常。血清化学参数在正常范围。红细胞和血小板计数正常。在接受50μg/天共8天的小鼠中，手动差分白血细胞计数显示外周血单核细胞的百分比升高，而且总白血细胞计数明显增加。在从股骨洗出的骨髓中，50μg剂量组的髓样细胞对类红细胞比例增加，而且连续8天给药的5μg剂量组则增加程度较小。在使用InStat(InStat MAC；GraphPad Software，Inc.，SanDiego，CA)进行的非参数多栏比较中，这些差异具有统计学上的显著性(p＝.0049)。最高剂量组与载体组之间的差异也是显著的(p＝.0286)。因此外周血中白血细胞增加可能与骨髓中髓样前体细胞的显著增加有关。
对下列组织的组织学评价未发现有细胞学或结构改变、有丝分裂或坏死的明显证据：胸腺、肝、肾、肾上腺、十二指肠、胰、空肠、盲肠、结肠、肠系膜淋巴结、子宫、卵巢、唾液腺、心、气管、肺和脑。各治疗组的胸腺、肾、肝和脑重量没有明显差别。检查的所有组织中，只有脾重量改变较大。
使每只小鼠的脾重量与其脑重量取准。50μg/天处理组与载体组、0.1μg和0.5μg治疗组相比，4天后平均脾重差不多大50％，8天后差不多大100％。就4天治疗而言，5μg/天组的脾重量似乎也比对照组和小剂量组大。使用InStat程序(GraphPad Software)进行Kruskall-Wallace非参数ANOVA多栏比较试验，可见4和8天治疗后各治疗组的脾/脑重量差异有统计学显著性(p＝.0072)。
在最高剂量组中，甚至4天治疗的小鼠脾脏特别是红髓中可见有髓外造血的临界增加。脾细胞的流式细胞分析表明，最高剂量组的髓样大小细胞群体(单核细胞和嗜中性细胞)显著增加(p＝0.01，Student’s试验)。这样的效果可能与外周血单核细胞百分比增加以及骨髓中髓样前体细胞的明显增加有关。另外，与非转基动物相比，经插入人zalpha11基因而得到的转基因小鼠增加了其脾组织中的髓外造血。
与对照组相比，在50μg/天剂量组中观察到的几种改变暗示zalpha11配体与髓样谱系细胞的产生和发育有关。所观察到的改变进一步提示可在肿瘤和免疫学疾病中使用zalpha11作为治疗蛋白。
                      实施例38
           纯化的重组人zalpha11配体蛋白质
              的初步排除和组织分布研究A.概要
进行初步药代动力学研究，以阐明纯化的rhzalpha11配体的组织分布和排除模式。以三种途径之一给9周龄雄性C57B1/6小鼠投用111铟(NEN，Boston，MA)标记的纯化的重组人zalpha11配体蛋白。以静脉内(iv)、腹腔内(IP)和皮下(SC)途径给每只小鼠作一次大团注射。注射后1或3小时杀死皮下或腹腔内途径注射的小鼠。注射后5分钟或1小时杀死静脉内注射的小鼠。在不同的时间点收集血液、血浆和选择的组织，以r计数器计数来估计外源性标记的蛋白质的大约半衰期和组织分布。用于计数的组织以及杀死的间隔时间都是基于已报导的放射性核素标记之其它细胞因子分布而选定的。
处死时，为放射活性计数而收获的组织包括胸腺、脾、肾、肝叶、肺叶和膀胱。在腹腔内注射组，计数分析的组织还包括肠；在皮下注射组，还计数注射部位的皮肤组织。根据所计数的切片计算出整个肺和肺的cpm，并以切片代表整个器官重量的百分比。
在研究了所收集的组织之后，在COBRA II AUTO-GAMMA r计数器(Packard Instrument Company，Meriden，CT)上计数全血和血浆的cpm。也在组织研究结束时计数原来标记的定量溶液的等分样品。从而得以计算出每只小鼠所注射的百分放射活性，同时就放射活性衰变校正所有的计数。余留的血液体积和器官重量的近似值表明，所投用的大部分计数都计算在内了，因而每种组织的百分计数有理由代表以不同途径投用标记的zalpha11配体后的计数分布。B.zalpha11配体的111铟标记
在PBS中室温温育30分钟，以使纯化的重组人zalpha11配体与10倍摩尔过量的DTPA结合。在Biomax-5K NMWL(Ultrafree-15，Millipore，Bedford，MA)上经缓冲液交换除去未反应的DTPA和水解产物。将外水体积蛋白质峰值部分浓缩到5mg/ml并取等分样品进行生物学试验(小鼠B细胞抗CD40刺激作用(实施例44))。在证实DTPA结合物仍具有全部生物活性后，用1M乙酸钠(pH6.0)将结合物稀释到0.5mg/ml。取2mCi111铟加在0.5ml 1M乙酸钠pH6.0中，并于室温下与DTPA-人zalpha11配体混合30分钟。在PD-10柱上将缓冲液换成PBS，以除去未掺入的111铟。用未标记的人zalpha11配体稀释放射标记的材料以达到100mCi/mg的比活性，无菌过滤并于4℃下储存过夜。100％标记的蛋白质均保留在Biomax-5k NMWL膜上。在清除和药式动力学研究中给小鼠投用111铟标记的人zalpha11配体。每只动物投用在0.1ml PBS载体中用5μCi(标记的人zalpha11配体)标记的50μg人zalpha11配体蛋白质。C.初步分布研究的结果
以三种途径用药后1和3小时，发现肾脏中的111铟-人zalpha11配体的浓度最高，其次是尿和膀胱(这些组织有最高的cpm数)。依据注射途径和处死时间的不同，从肾脏中回收的平均计数比全肝计数高3-8倍。例如，IV注射后60分钟的平均肾组织cpm值比全肝组织高4.5倍。在IV给药后10分钟处死的动物中，最高cpm还是在肾脏，其次是肝、膀胱和尿液。D.初步药物动力学研究
以三种途径注射后10、30和60分钟收集血液和血浆。IV途径注射后2、5和10分钟从不同组小鼠采集血液和血浆样品。于1，2和3小时自IP和SC途径注射的小鼠体采集血样。治疗组见表6。短的采集时间包括在已报导的静脉注射后的IL-2半衰期内。已报导的T1/2为2.5-5.1分钟(参考体内投用IL-2，详见Donohue JH and RosenbergSA，J.Immunol.130：2203，1983)。选择长的时间点以概括占先的排除期。
                表6
注射途径 放血时间(分) 处死时间
静脉内1  2，5，10  10min.
静脉内2  10，30，60  60min.
腹腔内1  10，30，60  60min.
腹腔内2  60，120，180  180min.
皮下1  10，30，60  60min.
皮下2  60，120，180  180min.
已显示未标记的IL-2在IV注射后以大约3分钟的半衰期从小鼠血清中被清除。IP和SC注射相同量的IL-2后，IL-2活性在血清中保留的时间从IV注射后(2单位/ml)少于30分钟延长到(大于2单位/ml)IP注射后2小时和SC注射后6小时。IL-2清除的主要途径似乎是肾。已显示zalpha11配体与IL-2具有结构相似性。根据cpm主要积聚在肾中，然后是在膀胱和尿中这一研究结果，初步估计zalpha11配体的排除似乎是与肾脏清除IL-2是一致的。
使用PK分析程序WinNonLin1.1版本(Scientific ConsultingInc.，Cary，NC)对得自血浆的cpm数据进行非分隔分析，以进行药物动力学参数评价。根据静脉内、皮下或腹腔内投用50μg后的终末清除率常数，估计zalpha11配体的血浆半衰期。由于血浆浓度对时间作图所表示的终末清除区的数据点有限，所以药物动力学研究的结果只是粗略的估计。此外，为使终末清除期适应于SC和IP给药，须使用得自仍发生111铟-人zalpha11配体吸收的时间点的数据。然而，静脉内、皮下和腹腔内给药后的半衰期估计值分别为13.6分、18.8分和34.3分钟。由于没估计剂量范围，所以是否发生饱和或活性排除(米-曼氏动力学)尚不明确。因此，这些半衰期只是初步估算的。
基于与静脉内给药相比，皮下或腹腔内给药后的曲线下面积(AVC)估计标记的蛋白质的生物可利用性。皮下和腹腔内注射后估测的生物可利用性分别为35.8％和63.9％。因为只研究一种蛋白质剂量，所以生物可利用性不是作为剂量的函数估计的。所估计的清除率和分布体积(基于静脉内注射数据)分别为0.48ml/分和6.1ml。
虽然这些数据是初步的，但从中可以看出IV投用的zalpha11配体的运命与已报导的另一种4螺旋细胞因子IL-2十分相似(Donahue，JH and Rosenburg，SA上述文献)。如IL-2一样，IV投用的zalpha11配体也只有几分钟的血浆半衰期，而且主要在肾脏除排。注射后3小时，由肾脏提取的大部分标记的材料仍留在Biomax 5K NMLW膜(Millipore)中。因为以前曾报导甚至在溶酶体降解期间铟仍与蛋白质联系在一起(Staud，F.et al.，J.Pharm.Sciences 88：577-585，1999)，所以zalpha11配体很可能是在肾脏中积聚并降解的。如用包括IL-2在内的许多其它蛋白质观察到的，最近的研究还显示IP和SC给药显著地延长了zalpha11配体的血浆水平。
                      实施例39
         使用zalpha11配体分离和扩展新鲜人骨髓
               MNC CD34+部分以估计NK活性A.从人骨髓选择和分离CD34+细胞
制备新鲜的人骨髓单核细胞(MNC)以富集具有NK细胞活性的细胞。从Poeitic Technologies得到新鲜的人MNC。将含有10％ HIA FBS(Myclone，Logan，UT)和抗生素1％ PSN(Gibco/BRL，Grand Island，NY)的10ml α-MEM(JRH，Lenexa，KS)加到细胞悬液中并使细胞通过100μm筛网。然后计数细胞，离心沉淀，并用10ml含有2％FBS的PBS洗，再次离心沉淀细胞后重新悬浮在1ml含有2％FBS的PBS中。使用带有Dynabeads M-450 CD34的Detachabead试剂盒(Dynal，Oslo，Norway)磁力分离具有CD34细胞表面标记的细胞(CD34+细胞)。按下述方法进一步分离CD34+细胞和CD34-细胞。B.使用zalpha11配体扩展CD34+细胞
将CD34+细胞铺敷到24孔平板的4个孔中。将悬浮于1ml含有10％HIA FBS(Hyclone)和1％ PSN，加下述各种细胞因子的αMEM(JRH)中的50,000个阳性选择的细胞铺敷在4个不同的孔(1-4)中。使用各种试剂试验zalpha11配体诱导的CD34+选择之骨髓MNC的扩展：诱导人flt3的试剂(R&D，Minneapolis，MN)；纯化的人zalpha11配体；人IL-15(R&D)。第0天将试剂作如下结合：1号孔中加入2ng/ml人flt3。2号孔中加入2ng/ml人flt3和15ng/ml纯化的人zalpha11配体。第3号孔中加入2ng/ml人flt3和20ng/ml人IL-15。4号孔加入2ng/ml人flt3，15ng/ml纯化的人zalpha11配体，以及20ng/ml人IL-15。温育18天后，离心沉淀各孔中的悬浮细胞并重新悬浮在0.5ml含有10％ HIA FBS和1％PSN的αMEM中，然后计数以判定CD34+细胞的增殖。在单纯flt3存在下(对照孔1)可见有低水平增殖，但同时还加有IL-15或zalpha11时则对细胞扩展没有明显影响(2和3号孔)。但在除flt3外还同时含有IL-15和zalpha11配体的4号孔中可见有明显的扩展。这一结果表明zalpha11和IL-15协同作用扩展人CD34+细胞群体。此外，这一实验结果与小鼠BM试验(实施例21)中所出现的小鼠zalpha11配体的结果相符。
然后试验所有细胞群体的NK活性，并进行流式细胞计量分析(实施例41)。C.使用zalpha11配体连同延迟加入的IL-15扩展CD34+或CD34-细胞
将CD34阳性和阴性部分分别铺敷在12孔平板的6个孔(1-6)中。6个孔各含有悬浮于2ml αMEM(其中含有上述10％HIA FBS和NSP)中的100,000个阳性或阴性选择的细胞。所使用的试剂如上所述。1号孔中在第0天加入2ng/ml人flt3。2号孔第0天加入2ng/ml人flt3，温育5天后加入20ng/ml人IL-15。3号孔于第0天加入2ng/ml人flt3和15ng/ml人zalpha11配体。4号孔于第0天加入2ng/ml人flt3和15ng/ml人zalpha11配体，温育5天后加入20ng/ml人IL-15。5号孔于第0天加入2ng/ml人flt3和20ng/ml人IL-15。6号孔于第0天加入2ng/ml人flt3、15ng/ml人zalpha11配体和20ng/ml人IL-15。从实验开始时总共温育15天后，从各孔中收获细胞并计数。
在CD34+群体中，在单独flt3存在下可见有低水平增殖，但除flt3外还有IL-15或zalpha11存在时则未见对细胞扩展有明显影响(3和5号孔)。与flt3对照相比，5天后加入IL-15可见有某些增殖作用(2号孔与1号孔相比较)，而且有zalpha11存在时也有增殖作用(4号孔与3号孔比较)。但最大的扩展是在除含有flt3外还有IL-15和zalpha11配体的6号孔。
在CD34-群体中，单独存在flt3未见增殖现象，而且事实上细胞群体是减少的。除flt3外第0天还加有zalpha11时(3号孔)的情况与flt3对照相似。第5天存在所加入的IL-15，增加了有(4号孔)没有(2号孔)zalpha11配体时的细胞增殖作用。另外，在除flt3外，第0天还含有IL-15和zalpha11配体的6号孔可见有最大扩展。
然后试验所有细胞群体的NK活性，并进行下述FACS分析(实施例41)。
                      实施例40
       使用人和小鼠zalpha11配体分离和扩展新鲜
          的小鼠细胞以估值NK活性和NK细胞标记A.使用人和小鼠zalpha11配体分离和扩展新鲜小鼠低密度骨髓细胞
剪断小鼠股骨两端，用2-3ml生长培养基(见下文)冲洗骨内部并使之流入收集管，以分离新鲜的小鼠骨髓细胞。生长培养基是500ml含有5ml 100×L-谷氨酰胺、5ml 100×丙酮酸钠、5ml 100×青霉素、链霉素、新霉素(PSN)(Gibco BRL)及50ml热灭活的胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基。然后上下抽吸培养基几次以分散骨髓细胞。离心沉淀细胞并用生长培养基洗一次，然后通过70μm筛网。然后对骨髓细胞进行密度梯度离心以分离低密度单核细胞。从离心管中的5-8mlNycoPrep 1.077 Animal(Nycomed，Oslo，Norway)顶部小心吸出5-8ml生长培养中的骨髓细胞悬浮液。然后将此梯度以600xg离心20分钟。从NycoProp与培养基之间的交面层收获低密度单核细胞。然后在生长培养基中将这些细胞稀释到大约20ml。然后再将细胞铺敷在标准组织培养瓶中(大约0.5-1.5×106个细胞/ml生长培养基)，并于37℃，5％CO2条件下温育2小时。
然后收获非粘着的低密度(NALD)骨髓细胞，并铺敷(0.5-2.0×105细胞/ml)在加有2.5ng/ml小鼠flt3(R&D，Minneapolis，MN)，25-50ng/ml人IL-15，并且有或没有50-150ng/ml人zalpha11配体和0.12-10ng/ml不鼠zalpha11配体的生长培养基中。
没有加入人或小鼠zalpha11配体时，未见有明显的扩展。可见非粘着细胞可在含有低至0.12ng/ml的小鼠zalpha11配体的培养物中，和含有低至22ng/ml的人zalpha11配体的培养物中扩展。在含有人和小鼠zalpha11配体的培养物中，非粘着细胞的扩展随着zalpha11配体剂量的增加而增加，其中小鼠配体饱和反应是在大约5-10ng/ml，而人配体甚至在200ng/ml的最高剂量还未达到饱和反应。人zalpha11配体对小鼠细胞的作用效力似乎比小鼠zalpha11配体低20-100倍。大约5-10天后，收获zalpha11配体扩展的小鼠细胞并进行流式细胞分析，以确定有多大百分比的细胞是NK细胞抗原阳性的，其中46％为PanNK细胞标记DX5(Pharmingen)阳性。B.新鲜的谱系耗尽的小鼠骨髓细胞的分离和扩充
首先将新鲜小鼠骨髓细胞与下列抗生素一起温育以从中分离新鲜小鼠谱系耗尽的(lin-)骨髓细胞：TER119、Gv-1、B220、MAC-1、CD3e和1-Ab(Pharmingen，San Diago，CA)。然后用Dynabeads M-450羊抗大鼠IgG(Dynal，Lake Success，NY)除去lin+细胞。
然后将阴性选择的lin-骨髓细胞铺敷在加有2.5ng/ml flt3和25ng/ml IL-15，或flt3、IL-15和小鼠zalpha11配体，即2-5％BHK小鼠zalpha11配体条件培养基的生长培养基中。生长6天后，收获培养物，计算细胞并送交进行NK细胞活性试验(实施例41)。在有小鼠zalpha11配体条件下生长的细胞在裂解NK细胞靶细胞(YAC-1细胞)的效力上约为没有zalpha11配体条件下生长之细胞的2-3倍。C.CD4-CD8-(双阴性或DN)胸腺细胞的分离和扩充
切碎并过筛处理3-8周龄小鼠的胸腺，以分离新鲜的小鼠胸腺细胞。然后将胸腺细胞与抗CD4和抗CD8抗体(PharMingen)一起温育以负向选择CD4-CD8-(DN)细胞，然后用Dynabeads M-450羊抗大鼠IgG(Dynal)除去CD4+CD8+细胞。
然后使DN小鼠胸腺细胞生长在含有2.5ng/ml flt3、25ng/mlIL-15和10ng/ml IL-7并加有或没有小鼠zalpha11配体生长培养基中。6天后收获细胞，计数，进行流式细胞分析，并送交NK细胞活性试验(实施例41)。
加小鼠zalpha11配体生长的培养物产生了大约480,000个细胞，而未加zalpha11配体的培养物只产生了大约160,000个细胞。发现在含小鼠zalpha11配体条件下生长的细胞培养物约有16.2％是NK细胞Pan NK，DX5阳性的，而未加zalpha11配体生长的培养物为14.6％ DX5阳性。加zalpha11配体条件下生长的细胞溶解NK细胞靶细胞(YAC-1)的能力要比未加zalpha11配体时好两倍。扩充的细胞并没有明显地裂解阴性对照靶细胞系EL4。这些结果提示zalpha11配体选择性地扩充溶胞性NK细胞。
                      实施例41
       人和小鼠zalpha11配体扩充的细胞和成熟的
       小鼠NK细胞在细胞毒性试验中所表现的活性A.NK细胞试验
以标准的51Cr释放试验法检查NK细胞介导的靶细胞溶解。靶细胞(人试验中使用K562细胞(ATCC No.CCL-243)，小鼠试验中使用YAC-1细胞(ATCC No.TIB-160)不足以表达主要组织相容性复合物(MHC)分子，故使之对NK细胞介导的溶解很敏感。小鼠试验中的阴性对照靶细胞系是MHC+胸腺瘤EL4细胞(ATCC No.TIB-39)。我们在添加有10％FBS、4mM谷氨酰胺、100I.U./ml青霉素+100MCG/ml链霉素、50μMβ-巯基乙醇和10mM HEPES缓冲液的标准RPMI 1640培养基(RP10培养基)中培养K562.EL4和YAC-1细胞。我们直接向细胞中加入50-100μl 5mCi/ml 51Cr-铬酸钠(NEN，Boston，MA)并于37℃温育1小时，然后用12ml PBS洗两次并重新悬浮在2ml RP10培养基中。在血细胞计数器上计数细胞后，将靶细胞稀释0.5-1×105细胞/ml，并取100μl(0.5-1×104细胞)与效应细胞混合。
在人试验中，收获从选择的扩充的人CD34+BM细胞制备的效应细胞，洗涤，计数，并在96孔圆底滴定板中与51Cr-标记的靶细胞按不同浓度混合，然后于37℃温育4小时。效应细胞与标记的靶细胞共温育后，收集各孔中的一半上清并在r计数器中计数1分钟/样品。按照公式100×(X-Y)(Z-Y)计算特异性51Cr释放的百分数，其中X是在效应细胞存在下的51Cr释放，Y是没有效应细胞时的自发释放，Z是与0.5％ Triton X-100温育的靶细胞的总51Cr释放。将数据作为％特异性溶解对各孔中的效应/靶细胞比例作图。B.人zalpha11配体扩充之细胞的活性
收获在flt3+/-zalpha11配体和flt3+IL-15+/-zalpha11配体条件下培养的分离的CD34+人HPCs，第15天以前述的标准51Cr释放法估测其溶解MHC- K562细胞的能力，并以流式细胞计量法分析其表面表型。如根据以前的报导(Mrozek，E et al，Blood 87：2632-2640，1996；Yu，H et al.，Blood 92：3647-3657，1998)推测到的，同时加入IL-15和flt3L诱导CD56-细胞小群体的过度生长。令人感兴趣的是，虽然同时加zalpha11配体和flt3L培养的BM细胞没有显著地扩展，但在同时含有flt3L、zalpha11配体和IL-15的培养物中的总细胞数却明显增加。
为了估价这些人BM培养物的表面表型，我们用抗CD3-FITC、抗CD56-PE和抗CD16-Cychrome mAb(均购自PharMingen)着染小等份用于三色流式细胞分析的细胞，并使用CellQuest软件在FACSCalibur上分析之。该流式细胞分析结果证实这些培养物长出的细胞有别于NK细胞，因为它们大并有颗粒，而且表达CD56和CD16，还都是CD3-(Lanier，LL.，Annu.Rev.Immonol.16：359-393，1998)。此外，这些细胞比加IL-15和flt3培养的细胞表现有明显强的效应细胞功能。更具体地说，在效应/靶比例(E∶T)为1.5时，这些在所有三种细胞因子存在下生长的细胞可溶解40％以上的K562靶细胞，而生长在IL-15+flt3L中的细胞当E∶T为2时只溶解＜5％的靶细胞。这些数据证明，与IL-15合用时，zalpha11配体刺激CD34+BM细胞中NK细胞的分化。C.小鼠zalpha11配体扩充之细胞的活性
为了试验zalpha11配体对鼠造血前体细胞的作用，按实施例40B中所述在flt3+IL-15+/-zalpha11配体中扩增得自C57B1/6小鼠的纯化的谱系阴性(lin-)骨髓细胞。培养的第6天，收获并计数细胞，然后重新悬浮在0.4ml RP10培养基中(实施例41A)。将加或不加zalpha11配体扩充的两等份(各0.15ml)各样品3倍系列稀释在96孔圆底平板中(一式两份)，每孔100μl共6孔。用FITC-抗2B4和PE-抗DX5 mAb(PharMingen)着染其余100μl细胞的NK细胞表面标记，并用流式细胞计量法分析之。无论有或没有zalpha11配体存在，与flt3+IL-15接触的各组细胞均具有相似的2B4+DX5+细胞部分，其中65-75％为两种NK标记阳性。
为了进行NK溶解试验，按上述方法用51Cr标记靶细胞(YAC-1和EL4)。在血细胞计数器上计数靶细胞后，将靶细胞稀释到0.5-1×105细胞/ml，将100μl YAC-1或EL4(0.5-1×104个细胞)与100μl效应细胞混合并于37℃温育4小时。检测各孔的特异性细胞溶解。
我们发现在flt3+IL-15+zalpha11配体存在下培养的细胞提高了抗YAC-1靶细胞的溶胞活性(大约2倍)(但没有杀死MHC+对照细胞系EL4)。效/靶比例(E∶T)为5时，于三种细胞因子存在下产生的NK细胞溶解12％的YAC-1细胞，而在flt3+IL-15存在下扩充的那些NK细胞则只溶解6％的YAC-1靶细胞。继后的实验进一步证实了这种趋向。
在确定zalpha11配体对鼠NK细胞之生物学活性的第二项研究中，我们分离了未成熟的CD4-CD8-(“双阴性”，DN)小鼠胸腺细胞，并在加或不加zalpha11配体的情况下将它们与IL-15+flt3+IL-7或IL-15+flt3+IL-2一起培养。培养的第6天，收获细胞并检测其对YAC-1和EL4细胞的NK溶胞活性。我们发现在zalpha11配体存在下培养的细胞在本试验中比在其它细胞因子存在下培养的细胞表现有更大的溶胞活性。具体地说，用IL-15+flt3+IL-7一起培养的胸腺细胞当E∶T为24时可杀死18％的YAC-1细胞，而在IL-15+flt3+IL-7再加zalpha11配体条件下培养的细胞在同样效应/靶比例时则可杀死48％的靶细胞。生长在IL-15+flt3+IL-2中的DN胸腺细胞在效应/靶比例为6时杀死15％的YAC-1靶细胞，而在加这三种生长因子和zalpha11配体培养的细胞当效应/靶比例为9时则杀死35％的YAC-1细胞。在NK溶胞试验前1天对培养的细胞进行流式细胞计数。正如骨髓细胞培养物一样，尽管有zalpha11配体的增殖效应(当加入zalpha11配体时细胞数约增加2倍)，但并没有显著地增加DX5+细胞部分(为加IL-7之培养物中总细胞数的17-20％，并且是加IL-2之培养物中总细胞数的35-46％)。这些数据暗示zalpha11配体与IL-15和flt3合用时提高由小鼠骨髓或胸腺产生之NK细胞的溶胞活性。D.小鼠zalpha11配体对成熟的鼠NK细胞的活性
为了试验小鼠zalpha11配体对成熟NK细胞的影响，我们从四只5周龄C57B1/6小鼠(Jackson Loboratories)中分离脾脏，用磨砂边玻璃片压碎以得到细胞悬液。经低渗溶胞除去红血细胞：离心沉淀细胞并吸去上清。轻轻搅动以破坏细胞沉淀，然后于振荡下加入900μl无菌水，再快速(5秒钟内)加入100μl 10×HBSS(Gibco/BRL)。然后将细胞重新悬浮在10ml 1×HBSS中，并使细胞通过尼龙衬网的细胞滤过器以除去碎片。然后离心分离出这些排除了RBC的脾细胞，重新悬浮在MACS缓冲液(PBS+1％BSA+2mM EDTA)中并计数。我们用抗DX5包被的磁性小珠(Miltenyi Biotec)着染300×106个细胞并使阳性选择的DX5+NK细胞通过MACS VS+分离柱，以回收8.4×106个DX5+细胞和251×106个DX5-细胞。将各组细胞培养在含有单独的或加有下列细胞因子的RP10培养基(实施例41A)的24孔平板中(0.67×106个细胞/孔，每种处理条件占2孔)：1)30ng/ml小鼠zalpha11配体，2)30ng/ml重组小鼠IL-2，3)30ng/ml重组人IL-15，4)各30ng/ml人zalpha11配体和hIL-15；或5)各30ng/ml mIL-2和hIL-15。21小时后收获细胞，洗涤，重新悬浮在RP10培养基中并计数。然后检测细胞溶解51Cr-标记的YAC-1或EL4靶细胞的能力。
一般说来，DX5-(非NK细胞)组的细胞只有很小的NK活性，但有zalpha11配体和IL-15存在下培养的DX5-细胞当效/靶比例为82时溶解了25％的YAC-1靶细胞。相比之下，只加hIL-1 5培养的DX5-细胞在效/靶比例为110时则溶解了14％的YAC-1靶细胞。这一结果提示zalpha11配体和IL-15一起作用于该细胞制剂中的残留的NK1.1+NK细胞。如DX5+细胞制剂一样，单用小鼠zalpha11配体处理并没有显著增加其效应细胞功能(其对YAC-1细胞的溶胞作用与未处理组相似)。如所预期的，IL-2和IL-15显著地改善了NK活性。但在zalpha11配体和hIL-15处理的细胞组中可测得最高溶胞水平(效/靶比例为3.3时65％YAC-1细胞溶解，相反hIL-15处理组则在效/靶比例为4时有45％溶胞活性)。这些结果总地提示，虽然单独使用zalpha11配体可能不会提高NK细胞溶胞活性，但当其与IL-15一起投用时，则可提高成熟NK细胞的NK溶胞活性。
                      实施例42
          zalpha11配体在T细胞增殖试验中对
             人和小鼠T细胞的增殖作用A.鼠zalpha11配体增殖小鼠T细胞
从得自腋窝、臀部、腹股沟、颈部及肠系膜淋巴结(LN)的合并的脾细胞和淋巴细胞中分离C57B1/6小鼠的T细胞。用磨砂玻璃片的边缘压碎脾脏制成脾细胞悬液。用剪刀剥离LN和通过细胞滤过器以除去细胞碎片。使用两个连续的MACS磁分离柱(Miltenyi Biotec，Auburn，CA)将合并的脾细胞和LN细胞分离成CD8+和CD4+亚组。从同一小鼠收集整个胸腺细胞。
在用各种不同浓度的抗CD3 mAb2C11(Pharmingen)4℃预包被过夜的96孔平底板中，于渐增浓度的纯化的鼠zalpha11配体(0-30ng/ml)存在下，将3×105细胞/孔(胸腺细胞)或105细胞/孔(成熟T细胞)37℃培养3天。使用抗CD3抗体活化鼠T细胞直至T细胞受体。第2天对各孔施加1μCi 3H-胸苷并于16小时后收集细胞和计数，以估价增殖。
当在T细胞增殖试验中试验zalpha11配体时，我们发现其可共刺激抗CD3活化的鼠胸腺细胞，导致加速CD+CD4-细胞的突出生长(培养第3天时大部分加抗CD3+zalpha11配体培养的胸腺细胞为CD8+CD4-，而只加抗CD3培养的细胞到第5天时仍未明显地偏向这种表型)。在没有抗CD3的情况下，我们未观察到zalpha11配体对胸腺细胞增殖的明显诱导作用。
令人感兴趣的是，当我检测成熟的鼠外周血T细胞对zalpha11配体+抗CD3的反应能力时，发现只有CD8+而不包括CD4+的亚组细胞以剂量依赖方式对zalpha11配体发生反应。我们还观察到，在对单一zalpha11配体的反应中，可见有弱的但可再生的CD8+细胞(不是CD4-细胞)增殖。然而，这种现象并未见于人T细胞(参见实施例42B)。B.人zalpha11配体对人T细胞增殖的影响
从PBMC中分离人CD4+和CD8+ T细胞(实施例43)。在用各种不同浓度的抗人CD3 mAb UCHT1(PharMingen)4℃预包被过夜的96孔平底板中，于渐增浓度的纯化的人zalpha11配体(0-50ng/ml)存在下按105个细胞/孔37℃培养细胞3天。第二天各孔加入1μCi 3H-胸苷，16小时后收获并计数平板。与我们用小鼠T细胞获得的结果不同，我们的初步数据提示人zalpha11配体以剂量依赖方式共刺激CD4+而不是CD8+人T细胞。
                      实施例43
             实际时间PCR显示人CD4+细胞中
                 的zalpha11配体表达A.纯化的人T细胞作原始来源用于估测人zalpha11配体表达
从健康人供体收集全血(150ml)并在50ml锥形管中与PBS按1∶1混合。将15ml Ficoll Pague Plus(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)铺放在30ml稀释的血液下面。将该梯度以500g离心30分钟并不经刹车而使之停止。收集界面上除去了RBC的细胞并用PBS洗3次。在进行下述的选择前，分离的人PBMC产率为200×106个。
将PBMC悬浮在1.5μl MACS缓冲液(PBS，0.5％EDTA，2mM EDTA)中，并取3×106个细胞制备对照RNA并进行流式细胞分析。然后加入0.25ml抗人CD8微球并将混合物4℃温育15分钟。用CD8微球标记这些细胞，用30ml MACS缓冲液洗细胞后重新悬浮在2ml MACS缓冲液中。
将按照生产商的说明书制备的VS+柱(Miltenyi)放在VarioMACS磁场中。用5ml MACS缓冲液平衡柱。然后将分离的原代小鼠细胞加于柱上，并使CD8阴性细胞通过。用9ml(3×3ml)MACS缓冲液洗柱。然后将柱移离磁体并放在15ml falcon管上。往柱内加入5ml MACS缓冲液洗脱CD8+细胞，并使用制造商提供插杆挤出结合的细胞。CD8+选择的人外周血T细胞的总得率约为51×106个细胞。收集流过的CD8-阴性细胞，计数，用抗人CD4包被的小球着染，然后温育并以上述同样浓度过新的VS+柱。CD4+选择的人外周血T细胞的得率总共为42×106个细胞。
取CD8+和CD8+选择的人T细胞样品进行染色并在荧光激化细胞分选仪(FACS)上分选，以估测其纯度。使用PE结合的抗人CD4抗体、抗人CD8-FITC Ab，和抗人CD19-CyChrome Ab着染CD8+和CD4+选择的细胞。这些第一个实验中CD8选择的细胞为80％ CD8+，CD4+选择的细胞为85％ CD4+。在两个继后的实验中(实施例43B)，CD8+纯化的细胞分别是84％和81％纯，并且CD4+细胞分别为85％和97％纯。在一项实验中，我们用抗人CD19包被的小球着染未结合的(流过的)细胞，并使之通过第三个磁珠柱以分离CD19+ B细胞(92％纯)。
在含有5％人超血清(Gemini Bioproducts，Calabasas，(A)、10mg/ml PMA和0.5μg/ml离子霉素(Calbiochem)的RPMI中将细胞(0.5×106细胞/ml)37℃温育约4、16或24小时，以激活人CD8+、CD4+和CD19+选择的细胞。另外也可在含有或不含可溶性抗CD28 mAb(5μg/ml)，并0.5μg/ml平板结合的抗CD3 mAb UCHTI预包被过夜的24孔平板中刺激T细胞(2.5×106个/孔)。在每个时间点上收获细胞，用PBS洗涤1次并再次离心沉淀之。除去上清并在干冰/乙醇浴中迅速冷冻沉淀物，然后于-80℃保存以备提取RNA。
按实施例43B和43C中所述方法对人CD8+、CD4+和CD19+选择的细胞进行实时PCR，以估价人zalpha11配体和受体表达。B.用于分析人zalpha11配体表达的定量RT-PCR的引物和探针
以前曾描述过使用ABI PRISM 7700序列检测系统(PE AppliedBiosystems，Inc.，Foster City，CA)进行的实时定量RT-PCR(参见Heid，CA et al.，Genome Research 6：986-994，1996；Gibson，UEMet al.，Genome Research 6：995-1001，1996；Sundaresan，S.et al.，Endocrinology 139：4756-4764，1998)。该方法中使用含有报导染料和猝灭剂染料的基因特异性探针。当探针是完整的时，由于接近猝灭剂染料，所以报导染料发照是无效的。在使用其它基因特异性正向和反向引物进行PCR延伸时，由Taq聚合酶的5′核酸酶活性裂解探针，放出报导染料而导致荧光发照增加。
使用引物设计软件Primer ExpressTM(PE Applied Biosystems)设计用于实时定量RT-PCR分析的引物和探针。设计人zalpha11配体的引物使之跨越由含子-外显子接合部以避免扩增基因组DNA。为合成80bp产物所需的正向引物ZC22,281(SEQ ID NO：90)和反向引物ZC22,279(SEQ ID NO：91)的浓度均为300nM。用PE AppliedBiosystems合成相应的zalpha11配体TaqMan探针ZG32(SEQ ID NO：92)。在5′端用报导荧光染料(6-羧基-荧光素)(FAM)并在3′端用猝灭荧光染料(6-羧基-四甲基-罗丹明)标记探针。为了试验所有RNA样品的完整性和质量，使用订购自PE Applied Biosystems(批号为4304483)的引物和探针筛选rRNA。用于该探针的报导荧光染料是VIC。rRNA筛选结果允许规范zalpha11配体筛选结果。
使用RNeasy MiniprepTM试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)从实施例43A提供的细胞沉淀物制备RNA。从大约106个表达人zalpha11配体BHK细胞制备对照RNA。C.用于对人zalpha11受体表达进行定量RT-PCR分析的引物和探针
使用在实施例43A所述条件下制备的细胞和对zalpha11受体特异的探针进行真实时间PCR(参见实施例43B和D)，以评价zalpha11受体的表达。为合成143bp产物，在上述PCR反应中使用的正向引物ZC22,277(SEQ ID NO：93)和反向引物ZC22,276(SEQ ID NO：94)的浓度为大约300nM。使用PE Applied Biosystems合成并标记称为ZG31(SEQ ID NO：95)的相应的zalpha11 TaqMan探针。使用得自表达人zalpha11受体的BaF3细胞的RNA产生适当的对照，以制作实施例43D中实时PCR的标准曲线。D.实时定量RT-RCR
使用一步骤RT-PCR方法(PE Applied Biosystems)分析总RNA样品，以确定zalpha11配体RNA的相对水平。使用从表达人zalpha11配体的BHK细胞提取的RNA产生标准曲线。该曲线包括用于rRNA筛选的2.5-2.5×10-4ng范围的系列稀释液，以及用于zalpha11配体筛选的25-0.0025ng范围的系列稀释液。也按一式三份分析总RNA样品的人zalpha11配体转录物水平和rRNA水平(作为内源对照)。各次一步骤RT-PCR反应包括使用加在缓冲液A(50mM KCL、10nM Tris-HCL和内部标准引物ROX)中的25ng总RNA、适当的引物(用于rRNA样品为50nM，用于zalpha11配体样品为300nM)和探针(分别为50nM(rRNA)和100nM(zalpha11配体))、5.5 MgCl2、各300μM dCTP、d-ATP和d-GTP以及600μM dUTP、反向转录酶(0.25U/μl)、AmpliTaq DNA聚合酶(0.025U/μl)和RNA酶抑制剂(0.4U/μl)，总体积为25μl。热循环条件包括开始RT步骤为48℃ 30分钟，AmpliTaq Cold激活步骤为95℃ 10分钟，然后是40轮的95℃ 15秒和60℃ 1分钟的扩增。使用rRNA检测校准zalpha11配体水平，以使用者手册No.2(PEBiosystems；User Bulletin #2：ABI Prism 7700 Seguence DetectionSystem，Relative Quantitation of Gene Expression，December 11，1997)中使用的标准曲线方法确定相对zalpha11配体RNA水平。每次实验内都将样品与“校准物”进行相对比较。“校准物”是基于质量良好的RNA和能明显地比较出其它样品的表达水平而随意选择的。分析受刺激和未受刺激的细胞中zalpha11配体和zalpha受体之表达的实验结果(实施例43A)如下文实施例43E中所述。E.人zalpha11受体和配体在CD4+、CD8+和CD19+细胞中的表达
首先使用RT-PCR方法估价未受刺激的和抗CD3刺激的CD4+和CD8+样品中在刺激后0、4、15和24小时时间点上zalpha11受体的表达。随意选择“静止”CD4+(未受刺激的)样品作为校准物并标定为1.00。培养4-24小时未受刺激的CD4+细胞中的受体表达增加约4倍，而同时在抗CD3刺激的CD4+细胞中则增加大约8倍。CD8+细胞中zalpha11受体表达增加7倍并于4小时达到高峰，此后表达水平降低。用抗CD3刺激时，CD8+细胞的受体表达水平有一个恒定的8倍增加。
该第一次实验也使用RT-PCR估测同样抗CD3刺激的和未刺激的CD4+和CD8+样品中的zalpha11配体表达。随意选择4小时抗CD3刺激的CD8+样品作为校准物并标定为1.00。结果显示未受刺激的CD4+和CD8+细胞并不表达zalpha11配体。我们观察到4小时时抗CD3刺激的CD4+细胞中的表达水平明显提高，而在15.5小时时信号约增强300倍。抗CD3刺激后，CD8+细胞表达了小量配体，但这可能是由于CD8+群体中有小量CD4+细胞污染。
第二项实验使用RT-PCR估测抗CD3刺激的、PMA+离子霉素刺激的和未刺激的CD4+和CD8+样品在激活后0、3.5、16和24小时几个时间点上zalpha11受体的表达。随意选择静止的CD4+和CD8+细胞作校正物是给出数值1.00。静止的CD4+和CD8+细胞没有显著量的受体表达。刺激后3.5、16和24小时，PMA+离子霉素刺激的CD4+样品中的表达约提高3倍。刺激后3.5小时，抗CD3激活的CD4+细胞中的表达高于本底水平10倍，然后在刺激16小时时回降到本底水平的4倍。PMA-离子霉素刺激后3.5小时CD8+细胞显示表达水平提高4倍，然后表达水平逐渐降低。如第一次实验中一样，抗CD3刺激的CD8+细胞再次表现出高于本底诱导8倍的受体表达。
也使用第二次实验的这些样品评价zalpha11配体表达。随意选择24小时PMA+离子霉素刺激的CD4+样品作为校正物并给出标定值为1.00。结果再次显示未受刺激的细胞均未表达zalpha11配体。如以前的实验中所见到的(4小时)，在抗CD3刺激的CD4+细胞中于3.5小时有高出30倍的配体表达。但用PMA+离子霉素刺激于3.5小时只有5倍表达诱导作用，而且继后逐渐下降。另外，可能是由于污染了CD4+细胞，可见CD8+细胞群体表达了很小量的配体。
最后的实验是使用RT-PCR估测抗CD3-和抗CD3/抗CD28-刺激的和未刺激的CD4+和CD8+样品在刺激后0、2、4和16小时几个时间点上的zalpha11受体表达。也以同样的时间间隔筛选PMA+离子霉素激活的CD19+细胞的受体表达水平。随意选择静止的CD4+样品作为校正物并给出标定值1.00。与以前实验中在3.5小时见到的10倍诱导作用相比，2小时抗CD3刺激的CD4+细胞只有4倍受体表达诱导作用。合用抗CD3和抗CD28使zalpha11受体表达较本底增加8倍。如以前实验的在CD8+细胞中看到的，16小时抗CD3和抗CD28刺激的CD8+细胞只有很低的zalpha11受体表达水平。PMA+离子霉素刺激的CD19+细胞有最明显的zalpha11受体表达，刺激后2小时增加19倍；但到16小时表达水平又降低到静止细胞的水平。
也使用最后一次实验的这些样品以RT-PCR方法估价zalpha11配体表达。随意选择16小时抗CD3/抗CD28刺激的CD8+样品作为校正物，并给出标定值1.00。结果显示抗CD3刺激后2小时，CD4+细胞约使zalpha11配体表达水平增加2倍，而且用抗CD3加抗CD28刺激后则增加5倍。这些刺激条件诱导了配体表达，16小时刺激的CD4+细胞表现配体表达水平高出本底70倍。CD8+和CD19+细胞则没显示有zalpha11配体表达。
期望各次抽血间有某些量的变化(即在不同时间从同一病人和从多个病人间得到多份样品)。因此，在每次研究中或从单一血样分析数据趋向，并比较上述三个实验的结果以得出一个总的结论。从上述真实时间PCR实验得出的总趋势是代表所试验的所有细胞类型，即PMA加离子霉素激活的CD19+细胞表达了最高水平的zalpha11受体RNA。受到刺激后，CD4+和CD8+细胞也可以表达受体，但表达水平比在B细胞中低。zalpha11配体几乎是无例外地在受刺激的CD4+T细胞(不是CD8+T细胞或CD19+B细胞)中表达的。虽然在该试验中用PMA加离子霉素刺激诱导了良好的zalpha11配体信号，但明显更强的信号则是由抗CD3 mAb或抗CD3加抗CD28 mAb联合刺激(此条件更好地模拟了体内抗原遭遇)的CD4+T细胞发出的。
                      实施例44
             抗CD40或抗IgM刺激的B细胞的
               zalpha11配体依赖性增殖A.人B细胞的纯化
在37℃水浴中快速融化含有1×108冷冻的单成分采集的人外周血单核细胞(PBMC)并重新悬浮在25ml B细胞培养基(RPMI 1640培养基加10％热灭活胎牛血清+5％L-谷氨酰胺+5％ Pen/Strep)(Gibco/BRL)中。使用锥虫蓝试验细胞的存活性。将10ml Ficoll/Mypaque Plus(Pharmacia-LKB Biotechnology Inc.，Piscataway，NJ)铺层在细胞悬浮之下，以1800rpm离心30分钟并使之不制动自然停止。然后将界面层取出并移到新鲜50ml Falcon管中，用PBS将终体积调到40ml并以1200rpm离心10分钟。再次使用锥虫蓝检测分离的细胞的存活性。或者用PBS按1∶1稀释新抽出的人血并铺敷在Ficoll/HypaquePlus上，如上所述离心并洗涤。从新鲜的或冷冻的来源分离的细胞给出同样的结果。
用抗CD19磁性小珠从Ficoll浮集的正常人供体外周血细胞中纯化B细胞。用抗CD22 FITC Ab以流式细胞仪监测所得制品的纯度。B.鼠B细胞的纯化
用弯针剥脱成年C57B1/6小鼠的脾脏，并在B细胞培养基中制备小鼠脾细胞悬液。经低透压溶解除去RBC。用CD43磁珠除去CD43阳性细胞。使用抗CD45R FITC Ab，以流式细胞计量法监测所得制品的纯度。B细胞制品的纯度一般＞90％。C.抗CD40刺激的B细胞在人或鼠zalpha11配体存在下的增殖
以1×106个细胞/ml的终浓度将人或小鼠来源的B细胞悬浮在B细胞培养基中，并按100μl/孔铺敷在含有各种刺激因子的96孔U型底平板中(Falcon，VWR)，达到200μl/孔的终体积。为了用抗CD40刺激，在人培养物中添加1μg/ml抗人CD40(Genzyme，Cambridge，MA)，并在小鼠培养物中添加1μg/ml抗小鼠CD40(Serotec，UK)。以1pg-100ng/ml的稀释度加入人或小鼠zalpha11配体。用25mg/ml可溶性人zalpha CEE抑制zalpha11配体(实施例10A)以证实zalpha11配体作用的特异性。所有处理均按一式三份进行。然后于37℃在湿温育箱中将细胞温育120小时(人)或72小时(小鼠)。收获前16小时向所有孔中加1μCi 3H-胸苷，以估测B细胞是否已发生增殖。使用细胞收集器(Packard)将细胞收获到96孔滤板中(UniFilterGF/c，Packard，Meriden，CT)。并按生产商的说明书收集之。在55℃将平板干燥20-30分钟，用不透明的平板密封器封闭孔的底部。向各孔内加入0.25ml闪烁液(Microscint-O，Packard)并使用TopCountMicroplate闪烁计数器(Packard)读出平板各孔的r计数。
加3ng/ml或更高浓度的zalpha11配体温育后，使可溶性抗CD40诱导的鼠和人B细胞增殖以剂量依赖方式提高达30倍。鼠和人B细胞对其各自的zalpha11配体有同样好的反应。在两个种中，刺激是对zalpha11配体特异的，培养物中存在可溶性zalpha11受体则起相反作用。D.在人或鼠zalpha11配体存在下抗IgM刺激的B细胞的增殖
将上述人或小鼠来源的B细胞按上述方法铺板。为了用抗IgM刺激人细胞，首先用10mg/ml F(ab’)2抗人IgM Ab(Southern BiotechAssociates，Birmingham，Alabama)将平板预包被过夜，并在使用前用无菌培养基洗涤。培养物添加0-10ng/ml hu rIL-4(R&D Systems)。为了用抗IgM刺激小鼠细胞，以10mg/ml的浓度向培养物中加入可溶性抗IgM(Biosource，Camarillo，CA)。在预先用抗IgM/IL-4刺激的条件下，按1pg-100ng/ml的稀释度范围加入人或鼠zalpha11配体。根据用可溶性人zalpha11受体产生的抑制，进一步证实zalpha11配体作用的特异性。所有处理均按一式三份进行。按实施例44C中所述温育细胞、用3H-胸苷标记、收获并分析。
与0.3ng/ml或更高浓度的zalpha11配体温育以剂量依赖方式抑制了可溶性抗IgM(小鼠)或抗IgM加IL-4(人)诱导的B细胞增殖。这种抑制作用是zalpha11配体特异的，因为培养物中存在可溶性zalpha11受体时可使这种抑制发生逆转。
                      实施例45
      人zalpha11可溶性受体在大肠杆菌中的表达A.表达huzalpha11/MBP-6H融合多肽的表达载体pCZR225的构建
通过同源重组构建含有C末端与麦芽糖结合蛋白(MBP)融合之人zalpha11可溶性受体编码多核苷酸的表达质粒。使用PCR方法分离人zalpha11 cDNA的片段(SEQ ID NO：7)。SEQ ID N0：96中显示编码MBP-zalpha11可溶性受体融合多肽的多核苷酸序列。在生产人zalpha11片段的PCR反应中使用下列两个片段：引物ZC20，187(SEQ IDNO：98)，其含有40bp载体侧接序列和相当于人zalpha11之氨基末端的25bp；(2)引物ZC20，185(SEQ ID NO：99)，其含有40bp相当于载体侧翼序列的3′末端和相当于人zalpha11之羧基末端的25bp。PCR反应条件如下：94℃ 30秒、50℃ 30秒和72℃ 1分钟的反应共进行25轮循环，然后4℃适应(一式两份)。100μl PCR反应混合物中2μl进行1％琼脂糖凝胶电泳分析(1×TBE缓冲液)，并可看到约660bp的片段。将其余的90μl PCR反应混合物与用400μl无水乙醇沉淀的第二个PCR管合并。将沉淀的DNA重组到SmaI切割的接受体载体pTAP98(实施例31)中，以产生编码MBP-zalpha11融合体的构建物。按实施例31中所述方法转化、鉴定并培养所需的克隆。将阳性克隆定名为pCZR225并进行序列分析。SEQ ID NO：96中显示编码MBP-zalpha11可溶性受体融合多肽的多核苷酸序列，相应的多肽序列则如SEQ ID NO：97中所示。在大肠杆菌中扩增阳性克隆用以从中纯化huzalpha11/MBP-6H融合蛋白质。
                      实施例46
 发酵培养大肠杆菌以从中纯化huzalpha11/MBP-6H可溶性受体
除另外指出外，所有操作均在4℃下完成。使用下述方法纯化huzalpha11/MBP-6H可溶性受体多肽。在SuperBroth II(12g/L酪蛋白，24g/L酵母提取物，11.4g/L磷酸氢二钾，1.7g/L磷酸二氢钾)(Becton Dickenson)中培养含有pCZR225构建物并表达huzalpha11/MBP-6H可溶性受体的大肠杆菌，并在0.5％甘油中冻存。使用20g在SuperBroth II+甘油中冷冻的细胞纯化蛋白质。融化冷冻的细胞并按1∶10稀释在蛋白酶抑制剂溶液(提取缓冲液)中，然后溶解细胞并释放出huzalpha11/MBP-6H可溶性受体蛋白质。稀释的细胞裂解产物中含有20mM Tris、100mM NaCl、0.5mM苯甲磺酰氟、2μg/ml亮抑酶肽和2μg/ml抑胃酶肽。使用温度为-7至-10℃和30k PSI的弗氏细胞压碎系统(Constant Systems Ltd.，Warwick，UK)破碎细胞。在压碎处理前后测A600读数以检查稀释的细胞的破裂程度。将溶解的细胞以18,000×G离心45分钟以除去细胞碎片，并将上清液用于纯化蛋白质。通过BCA蛋白质检测法确定上清中总靶蛋白质的浓度。
将25ml体积的Talon金属亲和树脂(Clontech，Palo Alto，CA)倒入2.5cm D×10cm H玻璃(Bio-Rad)柱中。装柱并用10倍柱体积(CV)的Talon平衡缓冲液(20mM Tris，100mM NaCl，pH8.0)平衡之。将上清液分批加到上述Talon金属亲和树脂上并振荡过夜。将树脂倒回柱中并用10CV Talon平衡缓冲液洗，然后用140ml洗脱缓冲液(Talon平衡缓冲液+200mM Imidazole-Fluka Chemical)重力洗脱。用5CV 20mM2-(N-吗啉代)乙磺酸pH 5.0(MES，Sigma)，5CV蒸馏水清洗talon柱，然后储存于20％乙醇/0.1％叠氮钠中。整个洗脱中按每管14ml收集，监测280和320nm吸光率并进行BCA蛋白质检测；也收集并分析洗涤液。合并有用的洗脱部分并直接上直链淀粉树脂(New EnglandBiolabs，Beverly，MA)。
为了得到更纯的huzalpha11/MBP-6H多肽，进一步用淀粉树脂(22ml，pH7.4)纯化上述talon亲和洗脱的部分。倾倒2.5×10cm柱(Bio-Rad)、充填并用10CV淀粉平衡缓冲液-20mM Tris、100mM NaCl、1mM PMSF、10mM β-巯基乙醇(pH7.4)平衡。将样品以0.5ml/分通过重力上柱。用10CV Amylose平衡缓冲液洗柱，用大约2CV Amylose平衡缓冲液+10mM麦芽糖洗脱。每管收集5ml并监测280和320nm吸光率。用1CV蒸馏水、5CV 0.1％(W/V)SDS、5CV蒸馏水，再用5CV Amylose平衡缓冲液再生Amylose柱。
合并有用的部分并用4×4L PBS(pH7.4)在Slide-A-Lyzer中透析，以除去低分子量污染物，然后进行缓冲液交换和脱盐。更换PBS后，所收获的材料即代表纯化的huzalpha11/MBP-6H多肽。通过SDS-PAGE考马斯蓝染色和Western印迹分析法(使用抗兔HRP结合的抗体)分析纯化的huzalpha11/MBP-6H多肽。用BCA分析法测得huzalpha11/MBP-6H多肽的浓度为1.92mg/ml。
用所制备的纯化的huzalpha11/MBP-6H多肽免疫动物(兔)并递交R&R Research and Development(Stanwood，WA)制备抗体。由被免疫的兔生产抗huzalpha11/MBP-6H抗血清(实施例47)。
                      实施例47
               zalpha11受体多克隆抗体
用纯化的huzalpha11/MBP-6H多肽，或纯化的重组zalpha11 CEE可溶性受体免疫两只雌性新西蓝白兔，以制备多克隆抗体。相应的多克隆抗体分别被定名为兔抗huzalpha11/MBP-6H和兔抗huzalpha11-CEE-BHK抗体。初次免疫每只兔腹腔内注射200mg纯化的蛋白质+完全弗氏佐剂，然后每隔3周ip加强注射100mg纯化的蛋白质+不完全弗氏佐剂。第3次加强注射后7-10天，给动物放血并收集血清。然后每隔3周加强注射并采血。
zalpha11特异性多克隆抗体是使用CNBr-SEPHAROSE 4B蛋白质柱(Phamacia-LKB)从兔血清中亲和纯化的。其中所说的4B柱是按每克CNBr-SEPHAROSE 10mg纯化的huzalpha11/MBP-6H多肽装柱，然后在PBS中20X透析过夜而制备的。使用1mg/ml适当的蛋白质抗原作为抗体靶以ELISA方法鉴定zalpha11特异性抗体的滴度。兔抗huzalpha11/MBP-6H亲和纯化的抗体的检测下限(LLD)为500pg/ml稀释度。兔抗huzalpha11-CEE-BHK亲和纯化的抗体的LLD为50pg/ml稀释度。
                      实施例48
                  zalpha11受体分布
为了估测zalpha11受体在各种类型细胞上的分布，我们产生了抗人受体的兔多克隆和小鼠单克隆抗体(mAb)，并将这些抗体与生物素结合用于流式细胞分析。我们最初使用有相对低亲和性的多克隆抗体着染一系列细胞系：IL-3依赖性鼠前B细胞系野生型BaF3细胞；人zalpha11转染的BaF3细胞(实施例4)；人伯基特淋巴瘤细胞系Raji(ATCC No.CCL-86)、Ramos(ATCC No.CRL-1596)、RPMI 8226(ATCCNo.CCL-155)和Daudi(ATCC No.CCL-213)；人T细胞白血病细胞系Jurkat(ATCC No.TIB-152)；人骨髓单核细胞白血病细胞系Thp-1(ATCC No.TIB-202)和UT937(ATCC No.CRL-1593.2)；人前骨髓单核细胞HLT60(ATCC No.CCL-240)；鼠B细胞淋巴瘤细胞系A20(ATCCNo.TIB-208)和鼠胸腺瘤细胞系EL4(ATCC No.TIB-39)。
收获细胞，用含血清的FACS洗涤缓冲液(WBS)洗一次。WBS含有Hank氏平衡盐溶液(Gibco/BRL)+10mM HEPES+1％ BSA+10％正常羊血清+10％正常兔血清。洗涤缓冲液(WB)除不含血清外，其它成分与WBS相同。洗涤后，将细胞悬浮在含有10μg/ml兔抗zalpha11多克隆抗体(实施例47)的100μl WB中。细胞加Ab在冰上放置20分钟，然后用WB洗涤并重新悬浮在含有羊抗兔FITC(BioSource，International)的WB中，在冰上继续温育20分钟，然后洗涤并重新悬浮在400μl WB中以便在FACS Calibur流式细胞仪上分析。只用第二羊抗兔FITC Ab着染对照样品。阳性着染被限定为移传到单用第二抗体染色位置以上。虽然多克隆抗体的亲和性低，但我们还是有把握地检测到BaF3/zalpla 11转化体、所有四株人伯基特氏淋巴瘤(Raji，Rasmos，Daudi和RPMI 8226)以及Jurkat T细胞上的zalpha11表达。静止的(未分化的)HL 60细胞并不与抗zalpha11抗体结合，但我们却在PMA(Calbiochem，La Jolla，CA)(其诱导HL-60细胞分化成单核细胞样细胞)激活24小时的HL-60细胞上检测到阳性信号。我们还在UT 937和Thp-1细胞看到阳性信号，但该信号可能是由于非特异性结合所致的。小鼠B细胞系A20上有微弱的多克隆抗体交叉反应，但我们没看到有EL4鼠胸腺瘤着染。
将四种抗zalpha 11单克隆抗体结合到生物素上，并筛选上述各亚组细胞的zalpha11受体表达(BaF3、BaF3/zalpha11、Raji、Jurkat和静止的HL-60)。收获细胞、洗涤，然后悬浮在100μl含有15μg/ml4种生物素化mAb之一的WB中。将细胞与mAb在冰上温育20分钟，然后用1.5ml WB洗涤并在离心沉淀之。吸除上清液并将细胞沉淀物重新悬浮在100μl CyChrome结合的链霉抗生物素蛋白(Cyc-SA；PharMingen)中，然后继续在冰上温育20分钟并离心分离细胞。对照管含有只用CyC-SA着染的细胞。将细胞沉淀悬浮在400μl WB中并进行上述流式细胞分析。阳性染色限定为信号超过单用CyC-SA染着之本底水平以上。使用BaF3/zalpha11转染子作为对照，我们能够按照其各自的平均荧光强度(MFI)排列出4种mAb的次序，借以反映抗体亲笔性和/或mAb的生物素化程度。从最高至最低MFI，四种mAb的排列次序是：249.28.2.1.2.2、247.10.2.15.4.6、249.19.2.2.3.5和249.15.2.4.2.7。Raji细胞为zalpha11单克隆抗体阳性染色。Jurkats细胞呈zalpha11单克隆抗体阳性染色，但没有样B细胞(Raji)那样强。因此，这些B和T细胞系上有zalpha11受体的表达。对于所有四种mAb来说，未活化的HL60细胞上的染色模式都相同，而且信号都很弱。我们相信该信号并不反映HL-60细胞对zalpha11的真实表达情况，而可能是由于小鼠mAb-与人细胞的非特异性结合(可能是通过Fc受体)。
                      实施例49
          人zalpha11配体对B细胞和zalpha11
             配体毒性皂草素融合体的影响
试验人zalpha11配体对下列人B细胞系的影响：人伯基特氏淋巴瘤细胞系Raji(ATCC No.CCL-86)和Rumos(ATCC No.CRL-1596)；人EBV B细胞淋巴瘤细胞系RPMI 1788(ATCC No.CRL-156)；人骨髓瘤/浆细胞瘤细胞系IM-9(ATCC No.CRL 159)；和人EBV转化的B细胞系DAKIKI(ATCC No.TIB 206)，以及HS Sultan细胞(ATCC No.CRL-1484)。用zalpha11配体处理约2-5天后，可见IM-9、Raji、Ramos和RPMI1788细胞系中有表达标记表达的改变，表明这些细胞可对zalpha11配体发生反应。当重新铺敷在细胞培养皿中时，可见zalpha11配体处理的人B细胞系与未处理的细胞生长更慢。如用流式细胞仪估测的，这些细胞也增加了FAS受体的表达(实施例49D和49E)，而且对活化的FAS抗体的敏感性有中度提高(实施例49A)。这一结果表明，zalpha11配体可诱导某些类型B细胞分化为低增殖状态或对FAS配体更敏感状态而控制B细胞恶性变。此外，有几个细胞系的表面上表达了zalpha11受体(参见实施例48)。因此，有可能使用zalpha11配体和人zalpha11配体-皂草素免疫毒素结合物(实施例49B)，或其它zalpha11配体-毒素融合体治疗白血病和淋巴瘤。A.人zalpha11配体对B细胞系的影响
以大约50,000个细胞/ml+/-50μg/ml纯的人zalpha11配体接种IM-9细胞(实施例29)。培养3天后收获细胞，洗涤并计数，然后按2500细胞/μl重新铺敷在含有0、0.033、0.1和0.33μg/ml抗FAS抗体(R&D Systems，Minneapolig)的96孔板的各孔中。2天后进行Alamar Blue荧光检测以估计细胞的增殖。
在没有抗FAS抗体的情况下，zalpha11配体处理的IM-9细胞仅为未处理之细胞密度的27％。在0.33％μg/ml抗FAS抗体存在下，zalpha11配体处理的细胞另有52％受到抑制，是未经处理的细胞则只30％受到抑制。zalpha11配体和0.33μg/ml抗FAS抗体处理对细胞生长的总抑制率为86％。
加或不加zalpha11配体的情况下将IM-9细胞预处理3天，然后重新铺板(100细胞/孔)，并在有或没有抗FAS抗体存在下生长6天。用Alamar Blue检测法估测未经处理的细胞的生长只有25％受到抗FAS抗体的抑制，而zalpha11配体处理的细胞的生长则相对于未经处理的细胞(在没有抗FAS抗体存在时)被抑制达95％。B.人zalpha11配体-皂草素免疫毒素对B细胞素的影响
按实施例50中所述方法构建并纯化人zalpha11配体-皂草素免疫毒素结合物(zalpha11 L-sap)。在抑制细胞生长中，人zalpha11 L-sap远比皂草素的能力更强。处理后3-4天重新将被处理的细胞铺板时，zalpha11 L-sap处理的细胞生长很差。
按2500个细胞/孔将IM-9、Ramos和K562(ATCC No.CLL-243)细胞接种在含0-250μg/ml人zalpha11 L-sap结合物或0-250μg/ml单纯皂草素(Stirpe et al.，Biotechnology 10：405-412，1992)作为对照的96孔平板中。温育4天后进行Alamar Blue增殖试验(实施例5B)。在最大浓度人zalpha11 L-sap结合物存在下，IM-9细胞和Ramos细胞的生长分别受到79％和65％抑制。K 562细胞的zalpha11受体表达没有受到zalpha11 L-sap的影响，因而表明结合物的作用是有特异性的。
将IM-9细胞接种(50,000细胞/ml)到含0和50μg/ml人zalpha11L-sap结合物的6孔滴定板各孔中。3天后收获细胞并计数，然后按100-0.8个细胞/孔并以2倍系统稀释度铺板，每个细胞稀释度(不含人zalpha11配体-皂草素免疫毒素)占12个孔。6天后按照Alamar blue增殖试验的结果，记录在各个细胞稀释下有细胞生长的孔数。
当以Alamar blue检测法估测细胞数时，生长6天后，分别以每孔12.5个和6.25个细胞接种的对照细胞的生长水平等同于分别按每孔100个和50个细胞接种的zalpha11 L-sap处理的细胞。因此，即使在重新铺板以除去zalpha11 L-sap免疫毒素后存活的被处理IM-9细胞的生长显著减弱。
人zalpha11受体的有限的组织分布(实施例48)，以及zalpha11L-sap对受体表达细胞系作用的特异性，均提示这种结合物是可以在体内被耐受的。C.人zalpha11配体-皂草素免疫毒素对B细胞系存活性的影响
按40,000细胞/ml的浓度将HS Sultan细胞(ATCC No.CRL-1484)接种到12孔平板中，并使细胞在未加入细胞因子或加入40ng/ml纯化的人zalpha11配体(实施例29)，或25ng/ml人zalpha11 L-sap结合物(实施例50)，或20μg/ml α-IFN(RDI)或zalpha11配体和α-IFN的条件下生长5天。zalpha11配体抑制HS Sultan细胞突出生长达63％。α-IFN的抑制率为38％。zalpha11配体加α-IFN对细胞生长抑制作用为78％，表明人zalpha11配体和α-IFN的生长抑制作用可能是相加的。人zalpha11 L-sap对HS Sultan细胞生长的抑制作用达92％。
上述结果表明，有可能使用zalpha11配体或人zalpha11 L-sap治疗表达zalpha11受体之细胞特别是B细胞来源的恶性疾病或其它相关疾病。特别是联合使用zalpha11配体和α-IFN的结果提示它们在抑制HS Sultan细胞中是作用相加的。有些其它类型的淋巴样细胞恶性疾病情况下也可能表达zalpha11受体，如活化的T细胞也表达受体mRNA，并其中有些疾病也可能对zalpha11配体-毒素融合体治疗有反应。D.人zalpha11配体刺激导致人B细胞系FAS(CD95)表达的增加
用或不用纯化的10-15ng/ml人zalpha11配体将人B细胞系HSSultan(ATCC No.CRL-1484)、IM-9(ATCC No.CRL 159)、RPMI 8226(ATCCNo.CCL155)、Ramos(ATCC No.CRL-1596)、DAKIKI(ATCC No.TIB 206)以及RPMI 1788(ATCC No.CRL 156)处理2至8天。然后用抗CD95 PE结合抗体(PharMingen，San Diago，CA)着染细胞，并在FACScalibur上分析之。用人zalpha11配体处理后，所有细胞系均表现抗CD 95(FAS或APO-1)染色增强，有的甚至达2倍以上。E.人zalpha11配体刺激导致原代小鼠脾B细胞上的FAS(CD95)表达增加
从8至12周龄的C57/BL6小鼠得到原代小鼠脾细胞。用水洗脾细胞制备物处理5秒钟，然后通过70μm筛网除溶解的红细胞。洗涤余留的脾细胞并铺敷在RPM1+10％HIA-FBS(Hyclone，Logan，UT)平板中。加入上述含或不含人zalpha11配体的白介素2(IL-2)(R&DSysems)。然后于37℃，5％ CO2环境中温育5天。收获脾细胞并用抗CD 95 PE结合抗体和抗CD 19 FITC结合抗体着染。使用FAC Scalibur对细胞进行流式细胞分析。选通CD 19+小鼠B细胞后，发现IL-2加人zalpha11配体处理的比单用IL-2处理的B细胞上增强了抗CD95着染。单用IL-2处理的B细胞上抗CD95着染为37相对荧光单位(RFU)，而在IL-2和人zalpha11配体中培养的B细胞上为55RFU。
                      实施例50
         zalpha11配体毒素融合体的构建和纯化
按照供货合同，委托Advanced Targeting Systems(ATS，SanDiago，CA)将10mg人zalpha11配体与植物毒素皂草素连接(Stirpe等，Biotechnology 10：405-412，1992)。Zymogenetics公司从ATS收到1.3mg在20nM磷酸钠+300nM NaCl(pH 7.2)中配制的浓度为1.14mg/ml的蛋白质结合物，其中每分子人zalpha11配体1.1分子皂草素。
                      实施例51
              zalpha11配体在体内毒性融合A.在小鼠体内试验zalpha11-皂草素结合物
以0.5和0.05mg/kg两种不同剂量以C57BL6小鼠(雌性，12周龄，购自Taconic)投用zalpha11-皂草素结合物。每周3次(第0、2和7天)加在含0.1％BSA的载体中静脉注射。第0、2和8天采血，收集到肝素化试管(Becfiu Dichenson，Franklin Lakes，NJ)中，使用自动血液学分析仪(Abbot Cell-Dyn)进行细胞计数分析。采血后第8天麻醉并解剖动物。收集脾、肝、胸腺、肾和骨髓进行病理检查。对脾和胸腺称重并将附加血样收集到血清分离管中。将血清送到Pheonix中心实验(Everett，WA)作化学分析。也收集样品进行流式细胞分析。
zalpha11结合物处理的小鼠与等剂量未结合的毒素(皂草素)处理的小鼠间在循环血细胞计数和血清化学检测上没有明显差异。相对于用等剂量未结合的毒素处理的小鼠来说，zalpha11-皂草素处理的小鼠的组织未见有明显的组织病理学改变。这些结果表明皂草素结合物在体内是无毒性的。B.体内试验zalpha11配体毒素融合物对B细胞肿瘤生长的影响
使用本文所述的小鼠肿瘤移植模型试验人zalpha11配体和人zalpha11配体毒性皂草素融合物对人肿瘤细胞的影响。首先使用基于体外实验选择的细胞系试验异种移植模型。这些细胞系包括但不只限于人Burkitt氏淋巴瘤细胞系Raji(ATCC No.CCL-86)和Ramos(ATCCNo.CRL-1596)，人细胞系RPMI 1788、人骨髓瘤/浆细胞瘤细胞系IM-9ATCC No.(RL 159)、人细胞系DAKIKI(ATCC No.TIB-206)和HS Sultan细胞(ATCC No.CRL-1484)。这种类型的模型中也可使用直接衍生于人肿瘤的细胞。用这种方法筛选对zalpha11配体或zalpha11配体毒性皂草素融合物治疗有敏感性的病人样品，用以选择在肿瘤治疗中使用zalpha11的最佳指证。
按上述方法选择适当的体内异种移植模型后，体内检测zalpha11配体诱导的NK细胞活性和/或zalpha11配体对B细胞肿瘤的影响。使用小鼠肿瘤异种移植模型试验人zalpha11配体产生细胞毒性效应细胞(如NK细胞)的能力及其抗B细胞肿瘤活性。而且，可估测人zalpha11配体对肿瘤的直接影响。按上述方法选择异种移植模型。建立一种其中使用zalpha11配体刺激的人细胞的方法并试验其在消除肿瘤细胞及增进接种细胞或原发肿瘤之小鼠存活性中效力。
                      实施例52
          鉴定含有人zalpha11配体之基因组
              DNA的PI人工染色体克隆
使用基于载体的引物扩增人zalpha11配体cDNA。PCR产物是用32P标记的，并与代表PAC(PI人工染色体)文库的高密度滤膜杂交。滤膜和冻结的文库原液得自Roswell Park Cancer Institute，Buffalo，New York，文库片段是有四倍复盖深度的RPC 16。滤膜在ExpressMyb(Clontech)中65℃杂交过夜并按照生产商的建议洗涤。解码阳性信号从而鉴定4个PAC克隆：23H17、34A9、105G9和236H14。使用对编码区的5′末端(ZC22,452(SEQ ID NO：100)和ZC22,451(SEQ IDNO：101))和3′末端(ZC22,450(SEQ ID NO：102)和ZC22,449(SEQID NO：103))特异的引物进行的PCR分析显示，PAC 34A9和105G9含有两末端，而PAC 23H17和236H/4只含有5′末端。用EcoRI和NotI消化PAC 23H17。并鉴定与zalpha11配体cDNA探针杂交的9Kb片段。使用本文所述的方法分离该片段并亚克隆到在先已用Eco KI和Not I消化的pBluescript II SK(+)(Stratagene)中。测序结果表明，该片段含有约380bp的启动子区，外显子1、2和3，所有内含子1和2，并终止在内含子3之内。
使用引物ZC23,771(SEQ ID NO：104)和ZC22,449(SEQ ID NO：103)并以PAC 34A9的DNA作为模板，以PCR反应扩增得到人zalpha11配体基因的3′末端。使用Taq DNA聚合酶和加有4％ DMSO的缓冲液。反应条件是：94℃ 5分钟，然后将94℃ 30秒、52℃ 1分钟和72℃ 3分钟的循环重复35轮；然后是72℃ 7分钟。如此。产生含有外显子3的一部分、整个内含子3和4，全部外显子4以及外显子5之编码部分的2.9kb片段。
人zalpha11配体基因从5′到3′端基因组结构如下：SEQ ID NO：105，含有约240bp启动子、外显子1(SEQ ID NO：105的核苷酸序号240-455)、内含子1(SEQ ID NO：105的核苷酸456-562)、外显子2(SEQID NO：105的核苷酸563-598)，含有5′748bp的内含子2的一部分(SEQ ID NO：105的核苷酸599-1347)；约3kb的缺口；SEQ ID NO：106，含有内含子2的3′718bp、外显子3(SEQ ID NO：106的核苷酸序号719-874)，和内含子3之5′端的一部分(SEQ ID NO：106)的核苷酸875-1656)；小于约800bp的缺口；SEQ ID NO：107，含有644bp的内含子3；小于约800bp的缺口；以及SEQ ID NO：108，含有内含子3的3′435bp、外显子(SEQ ID NO：108的核苷酸436-513)、内含子4(SEQ ID NO：108的核苷酸514-603)，和外显子5之5′端的一部分(SEQ ID NO：108的核苷酸604-645)。
                      实施例53
    125I标记的人zalpha11配体在细胞系中的结合研究
使用碘小球(Pierce，Rockford Illinois)以2mCi 125I标记25μg纯化的人zalpha11配体(实施例29)。使用该标记的蛋白质估测与人Raji细胞(ATCC No.CCL86)结合的人zalpha11配体，并以zalpha11受体转染的BaF3细胞(BaF3/hzalpha11细胞)作为对照。基于增殖试验结果(实施例5)，预料zalpha11配体与BaF3/hzalpha11细胞结合(阳性对照)，而不与野生型BaF3细胞结合(阴性对照)。分别按大约5×105Raji细胞/孔、1×106BaF3/hzalpha11和1×106BaF3细胞/孔铺板。向孔中一式两份加入10ng/ml标记的人zalpha11配体，并加入从250倍摩尔过量(1∶4稀释度)到0.61倍摩尔过量的未标记人zalpha11配体竞争物的系列稀释液。加入标记的人zalpha11配体后，4℃温育2小时以使配体与细胞结合。然后在结合缓冲液(含有1％BSA的RPM1-1710(JRH Bioscience))中洗3次，并在COBRA II γ计数器(Packard Instrument Company，Meriden，CT)上计数。
在Raji和BaF3/hzalpha11细胞中可见有标记的zalpha11配体与细胞的结合。另外，对于Raji细胞，平均250倍摩尔过量的未标记zalpha11配体使非特异性未标记竞争物(γ-IFN)存在下的结合降低3倍，并且相对没有竞争物时则降低3.7倍。观察到剂量依赖方式竞争未标记的特异竞争物，即人zalpha11配体。因此，zalpha11配体与Raji细胞结合是特异的。同样，对于阳性对照BaF3/zalpha11细胞，相对于非特异性竞争物250倍过量的未标记zalpha11配体使结合降低2部，而相对于没有竞争物时则使结合降低3.06倍。因此，zalpha11配体与BaF3/zalpha11细胞的结合也是特异性的。用野生型BaF3细胞未观察到可比较的结合。因此，显示zalpha11配体与Raji细胞和BaF3/hzalpha11细胞特异性结合，但不与阴性对照BaF3细胞结合。
                      实施例54
           zalpha11受体在人血细胞上的表达A.人外周血细胞的制备和培养
用PBS按1∶1稀释新鲜的人血后将其铺层在Ficoll/MypaguePlus上，以1800rpm离心30分钟并使转子非制动停止。收集界面层并移入新的50ml Falcon管中，用PBS补充40ml终体积并以1200rpm离心10分钟。使用锥虫蓝试验细胞的存活性并将细胞按1×106细胞/ml细胞培养基(RPMI 1640+10％热灭活胎牛血清+5％谷氨酰胺+5％Pen/Strep)的终浓度重新悬浮。
在下述各种不同刺激物存在下，将细胞在6孔平板(Falcon，VWR)中培养O、4或24小时。抗IgM、抗-CD40和抗CD3。分别按10ng/ml和O.5mg/ml的浓度向适当的孔中加入乙酸肉豆蔻佛波醇和离子霉素(实施例5C)。在湿气环境下将细胞37℃温育不同时间。B.抗体着染和分析
从培养板中收集细胞，洗涤并以大约107细胞/ml的浓度将细胞重新悬浮在冰冷的染色缓冲液(HBSS，1％胎中血清，O.1％叠氮钠)中。向细胞悬液中加入10％正常羊血清(Gemini Bioproducts，Woodland，CA)和10％正常人血清(Ultraserum，Gemini)以阻断Fc受体和抗体与细胞的非特异性结合，将等分的细胞悬液样品与FITC标记的抗谱系标记CD3、CD19或CD14之一的单克隆抗体，以及抗人zalpha11受体(hu-zalpha11)的生物素化单克隆抗体混合。使用10倍过量的zalpha11CEE可溶性受体竞争检测着染特异性。在冰上温育60分钟后，用冰冷的染色介质将细胞洗两次并重新悬浮在含有链霉抗生物素蛋白-PE(Caltag，Burlingame，CA)的50ml染色介质中。在冰上温育30分钟后，用冰冷的洗涤缓冲液(PBS，1％FBS，O.1％叠氮钠)洗细胞两次并将细胞重新悬浮在含有1μg/ml 7-AAD(Molecular Probes，Eugene，OR)(作为存活性标记)的洗涤缓冲液中。使用FACSCalibur流式细胞仪(BD Immunocyt ometry Systems，San Jose，CA)获取活细胞的流动数据。数据的获取和分析均使用CellQuest软件完成。
抗zalpha11抗体染色的结果显示，表达CD3、CD19或CD14的人外周血细胞上表达人zalpha11受体。如用zalpha11可溶性受体绝对竞争所证明的，对CD3和CD19细胞的染色是特异的。如用可溶性受体部分竞争所证明的，对CD14细胞的着染显示出某些配体特异性。用抗CD3激活T细胞或用抗CD40激活B细胞致使激活后24小时细胞表面zalpha11水平增加。对两个细胞群体施加任何刺激物后4小时均未见zalpha11表达水平增加。用zalpha11配体处理细胞导致第4和24小时CD3阳性和CD19阳性细胞上zalpha11染色增加，但CD14阳性细胞上则未见这种现象。
                      实施例55
       对人zalpha11配体水溶液稳定性的初步评价
对人zalpha11配体的水溶液稳定性进行初步研究，以作为在生物加工、配制和体内用药方面的考虑依据。主要目的是：1)弄清AlzetMinipumps(Alzet微型泵)和一般储存与操作的稳定性和回收率，2)确定包括阳离子交换HPLC(CX-HPLC)、反相HPLC(RP-HPLC)、大小排阻HPLC(SEC-HPLC)和生物分析(BaF3/zalpha11R增殖试验)在内的几种分析方法的稳定性指征性质，以及3)确定稳定性限制的降解途径及其动力学依赖性。
将纯化的人zalpha11配体在PBS(pH 7.4)中稀释到2mg/ml并于-80℃(对照)、5℃、30℃和37℃存储在低密度聚乙烯(LDPE)冷冻小瓶(Nalgene，1.8ml)中。在29天内以CX-、RP-、SE-HPLC和生物检测法间断性检测样品。也将等分样品储存于-80℃并进行反复冻融(f/t)(-80℃/RT；5×f/t，10×f/t)。所有试验中均确定相对于-80℃对照的人zalpha11配体的回收率。
分析后将-80℃对照样品的剩余人zalpha11配体溶液重新冻存于-80℃。使用该等份样品(2f/t)以园二色法(CD)估测人zalpha11配体在不同pH条件下的热和构象稳定性。在PBS(pH3.3-8.8)中将2mg/ml溶液稀释到100μg/ml。在5-90℃温度范围内以5℃间隔监测远紫外CD光谱(n＝3/pH)。所使用的CD旋光分光计是Jasco 715型的(Jasco，Easton，MD)。根据在不用温度下222nm处的椭园率的改变，监测热伸展。假设两状态伸展模型以估计TM的数值。使用Windows 4.1版本的SlideWrite Plus(Advanced Graphics Software；Encinitas，CA)调整数据(S型的)。
用100μl 2mg/ml人zalpha11配体溶液填泵，将泵放在含1mlPBS(pH 7.4)的1.8mlLDPE中并保存在37℃，以估测Alzet微型泵对其回收率和稳定性的影响。于第2、4和7天，用CX-、RP-和SEC-HPLC方法估测来自微型泵的人zalpha11配体的释放/回收率。第7天的生物检测法确定活性。评价每次取样从3个泵释放的样品。
层析数据提示，CX和SEC-HPLC方法是指示稳定的，而RP-HPCC则不是。用CX-HPLC观察到至少3个指示明显的降解产物的附加峰。SEC-MPLC方法分辨出一个在人zalpha11配体前洗脱的明显的人zalpha11配体聚集体。然而，在人zalpha11配体峰之后洗脱的材料未见有明显的附加峰。这就提示CX-HPLC所观察到的降解产物很可能是由于氨基酸修饰(如脱酰胺而不是造成剪切变异体的水解/蛋白水解加工)导致的。在已显示受到SEC-和CX-HPLC显著降解的样品中，用RP-HPLC法观察到较小程度的前拉/托尾。但RP-HPLC没有分辨出明显的降解产物。CX-HPLC所观察到的降解是作为时间一温度的函数增加的，之后是明显的一级动力学。29天后，于37℃、30℃和5℃以CX-HPLC回收的人zalpha11配体分别为39％、63％和98％。分子聚集程度也以时间-温度依赖方式增加。发现于37℃、30℃和5℃保存29天的制剂中的百分聚集度分别为7.4、3.4和检测下限(BDL)。所有样品的生物检测结果没有明显不同，提示降解产物与完整的人zalpha11配体有等同的活性。经受10次冻融循环的样品中未见有降解发生。
由Alzet微型泵释出的人zalpha11配体与理论上预期的释放体积相符。这提示明显的表面吸附不会对使用2mg/ml充填浓度的Alzet微型泵输送人zalpha11配体产生不利影响。可见降解与以前记录的结果一致。以CX-HPLC方法测得的2、4和7天后释放的人zalpha11配体的百分纯度分别为96％、90％和79％。应明确的是，在释放或稀释到介导中之后仍可发生人zalpha11配体的降解。因此，在微型泵内的百分纯度可能与在释放介质中测得的百分纯度稍有不同。各样品的生物活性与从微型泵中释出的人zalpha11配体的预期量相吻合。
如所预期的，人zalpha11配体远紫外CD光谱与白介素如IL-3(J.Biochem.23：352-360，1991)、IL-4(Biochemistry 30：1259-1264，1991)和IL-6突变体(Biochemistry 35：11503-11511，1996)相一致。作为pH的函数，未观察到远紫外CD光谱的显著改变。结果显示，有最大热/构象稳定性时的pH值约为7.4。对伸展曲线的分析是基于两状态伸展机制，以允许作为pH/组成的函数来比较热/构象稳定性。然而，由于其操作性相对较低(根据伸展曲线很浅)，所以伸展过程中可能存在一种或多种中间体。虽然研究中没有特别设计来确定人zalpha11配体再折叠是否在热伸展到90℃之后发生，但初步数据提示至少部分的再折叠是发生在样品被重新冷却到20℃之后。
这些研究使我们得以确定一个估测人zalpha11配体的纯度并证实其稳定性分析范例。例如，可使用SEC-HPLC鉴定在含水溶液中的聚集程度和速率。同样，可使用CX-HPLC以聚集以外的机制鉴定人zalpha11配体降解的程度和速率。可使生物检测法证实人zalpha11配体及其含水降解产物的活性。例如，在水溶液中产生的并通过CX-HPLC分辨的人zalpha11配体变异体本身具有等同的生物活性，所以也可用作治疗剂。另外，人zalpha11配体可经几种不同的过程(聚集、氨基酸修饰)而降解，所以提示为保持溶液态产品的长期稳定性，减低每种降解过程速率的优选或唯一方式是必需的。
鉴定含水降解产物的性质并检测其动力学依赖性(pH、浓度、赋形剂)的工作正在进行中。确定人zalpha11配体在血清/血浆中的稳定性，以使体内研究工作更加深入。
从上述内容可以理解到，虽然本文中为举例说明目的而描述了本发明的某些特定实施方案，但仍可以在不背离本发明精神和范围的前题下作出各种改动和改进。因此，本发明不只限于除所附权利要求以外的范围内。

Claims (42)

1.包括与SEQ ID NO：2中所示的残基41(Gln)至148(Ile)至少90％相同的氨基酸残基序列的分离的多肽，其中位置44的残基是Asp，位置47的残基是Asp，并且位置135的残基是Glu。
2.权利要求1的分离的多肽，其中氨基酸残基71、78、122和125是半胱氨酸。
3.权利要求1的分离的多肽，其中氨基酸残基序列与SEQ ID NO：2的残基41(Gln)至148(Ile)至少95％相同。
4.权利要求1的分离的多肽，其中氨基酸残基序列与SEQ ID NO：2的残基41(Gln)至148(Ile)至少100％相同。
5.权利要求1的分离的多肽，其中多肽结合如SEQ ID NO：115中所示的zalpha11受体。
6.包括如SEQ ID NO：2中从残基32(Gln)到残基162(Ser)或SEQID NO：56(小鼠)中从残基23(Gln)到残基146(Ser)所示的氨基酸残基序列的分离的多肽。
7.权利要求6的分离的多肽，其中SEQ ID NO：2中所示的氨基酸残基序列是残基1(Met)到残基162(Ser)，如SEQ ID NO：56(小鼠)中所示的氨基酸残基序列是残基1(Met)到残基146(Ser)。
8.包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：56的至少14个连续的氨基酸残基的分离的多肽。
9.权利要求8的分离的多肽，其中氨基酸残基选自于：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸残基41-56；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸残基69-84；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸残基92-105；
(d)SEQ ID NO：2的氨基酸残基135-148。
10.包括至少四个多肽的融合蛋白质，其中从N末端到C末端多肽的顺序是：
包括SEQ ID NO：2的第41-56位氨基酸残基序列的第一个多肽；
6-27个氨基酸残基的第一个间隔区；
包括选自下列一组中的氨基酸残基序列的第二个多肽；
(a)SEQ ID NO：111的IL-2螺旋B残基53-75；
(b)SEQ ID NO：112的IL-4螺旋B残基65-83；
(c)SEQ ID NO：113的IL-15螺旋B残基84-101；
(d)SEQ ID NO：114的GMCSF螺旋B残基72-81；
(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基69-84；
5-11个氨基酸残基的第二个间隔区；
包括选自下列一组中的氨基酸残基序列的第三个多肽：
(a)SEQ ID NO：111的IL-2螺旋C残基87-99；
(b)SEQ ID NO：112的IL-4螺旋C残基95-118；
(c)SEQ ID NO：113的IL-15螺旋C残基107-119；
(d)SEQ ID NO：114的GMCSF螺旋C残基91-102；
(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基92-105；
3-29个氨基酸残基的第三个间隔区；以及
包括选自下列一组中的氨基酸残基序列的第四个多肽：
(a)SEQ ID NO：111的IL-2螺旋D残基103-121；
(b)SEQ ID NO：112的IL-15螺旋D残基134-157；
(c)SEQ ID NO：113的IL-4螺旋D残基134-160；
(d)SEQ ID NO：114的GMCSF螺旋D残基120-131；
(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基135-148。
11.包括至少四个多肽的融合蛋白质，其中从N末端到C末端多肽的顺序是：
包括选自下列一组中的氨基酸序列的第一个多肽：
(a)SEQ ID NO：111的IL-2螺旋A残基36-46；
(b)SEQ ID NO：112的IL-4螺旋A残基29-43；
(c)SEQ ID NO：113的IL-15螺旋A残基45-68；
(d)SEQ ID NO：114的GMCSF螺旋A残基30-44；和
(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基41-56；
6-27个氨基酸残基的第一个间隔区；
包括选自下列一组中的氨基酸残基序列的第二个多肽；
(a)SEQ ID NO：111的IL-2螺旋B残基53-75；
(b)SEQ ID NO：112的IL-4螺旋B残基65-83；
(c)SEQ ID NO：113的IL-15螺旋B残基84-101；
(d)SEQ ID NO：114的GMCSF螺旋B残基72-81；
(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基69-84；
5-11个氨基酸残基的第二个间隔区；
包括选自下列一组中的氨基酸残基序列的第三个多肽：
(a)SEQ ID NO：111的IL-2螺旋C残基87-99；
(b)SEQ ID NO：112的IL-4螺旋C残基95-118；
(c)SEQ ID NO：113的IL-15螺旋C残基107-119；
(d)SEQ ID NO：114的GMCSF螺旋C残基91-102；
(e)SEQ ID NO：2的氨基酸残基92-105；
3-29个氨基酸残基的第三个间隔区；以及
包括来自SEQ ID NO：2的135-148的氨基酸残基序列的第四个多肽。
12.权利要求10的融合蛋白质，其中第四个多肽包括SEQ ID NO：2的氨基酸残基135-148。
13.包括编码权利要求1的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子。
14.权利要求13的分离的多核苷酸分子，其中核苷酸是如SEQ IDNO：1中所示的从核苷酸167至核苷酸490，或如SEQ ID NO：3中所示的从核苷酸121至核苷酸444。
15.包括编码权利要求8的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子。
16.包括编码如SEQ ID NO：2中从残基32到残基162或SEQ IDNO：56中从残基23到残基146所示的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子。
17.权利要求16的分离的多核苷酸分子，其中核苷酸是如SEQ IDNO：1中所示的核苷酸140至核苷酸532，或如SEQ ID NO：3中所示的核苷酸94至核苷酸486。
18.包括编码如SEQ ID NO：2中从残基1至残基162或如SEQ IDNO：56中从残基1至残基146所示的多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子。
19.权利要求18的分离的多核苷酸分子，其中核苷酸是如SEQ IDNO：1中所示的核苷酸47至核苷酸532，或如SEQ ID NO：3中所示的核苷酸1至核苷酸486。
20.包括下列可操作地连接的元件的表达载体：
(a)转录启动子；
(b)编码包括选自下列一组中的氨基酸残基序列的多肽的DNA片段：
(a)SEQ ID NO：2的氨基酸残基41-56；
(b)SEQ ID NO：2的氨基酸残基69-84；
(c)SEQ ID NO：2的氨基酸残基92-105；
(d)SEQ ID NO：2的氨基酸残基135-148；以及
(c)转录终止子。
21.包括下列可操作地连接的元件的表达载体：
(a)转录启动子；
(b)编码多肽的DNA片段，所说的多肽包括与SEQ ID NO：2中所示的残基41(Gln)至148(Ile)至少有90％同一性的氨基酸残基序列，其中位置44的残基是Asp，位置47的残基是Asp，且位置135的残基是Glu；以及
(c)转录终止子。
22.包括下列可操作地连接的元件的表达载体：
(a)转录启动子；
(b)编码包括SEQ ID NO：2中氨基酸残基32(Gln)至162(Ser)的多肽的DNA片段；以及
(c)转录终止子。
23.包含根据权利要求20、21或22中任一项的表达载体的培养的细胞。
24.生产蛋白质的方法，该方法包括：
在DNA片段可在其中表达的条件下培养根据权利要求23的细胞；并且
回收由该DNA片段所编码的蛋白质。
25.生产抗zalpha11配体多肽的抗体的方法，该方法包括：
用选自下列一组中的多肽接种动物：
(a)由9至131个氨基酸组成的多肽，其中多肽相同于SEQ ID NO：2中从氨基酸序号32(Glu)到氨基酸序号162(Ser)的氨基酸残基的连续序列；
(b)权利要求1的多肽；
(c)包括SEQ ID NO：2中从氨基酸序号41(Gln)到氨基酸序号148(Ile)的氨基酸序列的多肽；
(d)包括SEQ ID NO：2中从氨基酸序号41(Gln)到氨基酸序号56(Val)的氨基酸序列的多肽；
(e)包括SEQ ID NO：2中从氨基酸序号69(Thr)到氨基酸序号84(Leu)的氨基酸序列的多肽；
(f)包括SEQ ID NO：2中从氨基酸序号92(Asn)到氨基酸序号105(Arg)的氨基酸序列的多肽；
(g)包括SEQ ID NO：2中从氨基酸序号135(Glu)到氨基酸序号148(Ile)的氨基酸序列的多肽；
(h)包括SEQ ID NO：72的氨基酸序列的多肽；
(i)包括SEQ ID NO：73的氨基酸序列的多肽；
(j)包括SEQ ID NO：2从氨基酸序号32(Gln)到氨基酸序号162(Ser)的氨基酸序列的多肽；
(k)包括SEQ ID NO：2从氨基酸序号1(Met)到氨基酸序号162(Ser)的氨基酸序列的多肽；
(l)包括SEQ ID NO：2中从氨基酸序号114到氨基酸序号119的氨基酸序列的多肽；
(m)包括SEQ ID NO：2中从氨基酸序号101到氨基酸序号105的氨基酸序列的多肽；
(n)包括SEQ ID NO：2中从氨基酸序号126到氨基酸序号131的氨基酸序列的多肽；
(o)包括SEQ ID NO：2中从氨基酸序号113到氨基酸序号118的氨基酸序列的多肽；
(p)包括SEQ ID NO：2中从氨基酸序号158到氨基酸序号162的氨基酸序列的多肽；
其中多肽在动物体内引发免疫反应以产生抗体；并且
从动物体内分离抗体。
26.按权利要求25的方法生产的抗体，其中抗体与zalpha11配体多肽结合。
27.与权利要求1的多肽特异性结合的抗体。
28.刺激与抗原或病原体接触的哺乳动物的免疫反应的方法，其包括以下步骤：
(1)直接或间接测定存在于所说的哺乳动物体内的抗原或病原体的水平；
(2)投用包括加在可接受的药用载体中的zalpha11配体多肽的组合物；
(3)直接或间接测定所说哺乳动物体内的抗原或病原体水平；以及
(4)将步骤1中的抗原或病原体水平与步骤3中的抗原或病原体水平相比较，其中水平的改变即为刺激免疫反应的指征。
29.权利要求28的方法，其进一步包括：
(5)再次投用包括加在可接受的药用载体中的zalpha11配体多肽的组合物；
(6)直接或间接测定所说的哺乳动物体内的抗原或病原体水平；以及
(7)将步骤1中的抗原或病原体水平与步骤6中的抗原或病原体水平相比较，其中水平的改变即为刺激免疫反应的指征。
30.根据权利要求28或29的方法，其中抗原是B细胞肿瘤，病毒，寄生虫或细菌。
31.扩展造血细胞和造血细胞祖代的方法，该方法包括在含有一定量zalpha11配体的组合物存在下培养骨髓或外周血细胞，其中所说的量是与没有zalpha11配体存在时培养的骨髓或外周血细胞相比，其足以增加骨髓或外周血中的淋巴样细胞的数目。
32.权利要求31的方法，其中造血细胞和造血始祖细胞是淋巴样细胞。
33.权利要求32的方法，其中淋巴样细胞是NK细胞或细胞毒性T细胞。
34.权利要求31的方法，其中组合物还包含选自IL-2、IL-15、IL-4、GM-CSF、Flt3配体和干细胞因子的至少一种其它细胞因子。
35.减少恶性B或T细胞增殖的方法，该方法包括给患有B或T细胞肿瘤的哺乳动物投用含有足以降低恶性B或T细胞增殖量的zalpha11配体的组合物。
36.权利要求35的方法，其中组合物还包含至少一种选自IL-2、IL-15、IL-4、GM-CSF、Flt3配体或干细胞因子的其它细胞因子。
37.减少恶性B或T细胞增殖的方法，该方法包括给患有B或T细胞肿瘤的哺乳动物投用足以降低恶性B或T细胞增殖量的含有zalpha11配体拮抗剂的组合物。
38.权利要求37的方法，其中组合物还包含至少一种选自IL-2、IL-15、IL-4、GM-CSF、Flt3配体或干细胞因子的其它细胞因子。
39.权利要求37的方法，其中zalpha11配体拮抗剂是配体/毒素融合蛋白。
40.刺激与抗原或病原体接触的哺乳动物的免疫反应的方法，该方法包括：
(1)测定抗原或病原体特异性抗体的水平；
(2)投用含有加在可接受的药用载体中的zalpha11配体多肽的组合物；
(3)测定抗原或病原体特异性抗体的投药后水平；
(4)将步骤(1)的抗体水平与步骤(3)的抗体水平相比较，其中抗体水平的增加即为刺激免疫反应的指征。
41.检测生物样品中zalpha11配体RNA存在的方法，该方法包括如下步骤：
(a)在杂交条件下，使zalpha11配体核酸探针与(i)从生物样品中分离的试验RNA分子，或(ii)从分离的RNA分子合成的核酸分子接触，其中探针的核苷酸序列包含权利要求18的核酸分子的部分核苷酸序列，或其互补序列；以及
(b)检测核酸探针与试验RNA分子或合成的核酸分子间的杂合体的形成，
其中杂合体的存在即指示生物样品中存在zalpha11配体RNA。
42.检测生物样品中zalpha11配体存在的方法，该方法包括以下步骤：
(a)使生物样品与权利要求26或27的抗体或抗体片段接触，其中接触是在允许抗体或抗体片段与生物样品结合的条件下进行的，并且
(b)检测任何结合的抗体或结合的抗体片段。
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