ES2295019T3 - Nueva citocina ligando del zalpha11. - Google Patents

Nueva citocina ligando del zalpha11. Download PDF

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ES2295019T3
ES2295019T3 ES00916164T ES00916164T ES2295019T3 ES 2295019 T3 ES2295019 T3 ES 2295019T3 ES 00916164 T ES00916164 T ES 00916164T ES 00916164 T ES00916164 T ES 00916164T ES 2295019 T3 ES2295019 T3 ES 2295019T3
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ligand
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Julie E. Novak
Scott R. Presnell
Cindy A. Sprecher
Donald C. Foster
Richard D. Holly
Jane A. Gross
Janet V. Johnston
Andrew J. Nelson
Stacey R. Dillon
Angela K. Hammond
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Abstract

Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es: (a) al menos, un 90% idéntica a los residuos 41 (Gln) a 148 (Ile), como se muestra en la SEC. ID. N.° 2, donde el residuo en la posición 44 es Asp, el residuo en la posición 47 es Asp y el residuo en la posición 135 es Glu; o (b) al menos, un 90% idéntica a los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser), como se muestra en la SEC. ID. N.° 2, donde el polipéptido se une a un receptor zalpha11, como se muestra en la SEC. ID. N.° 115.

Description

Nueva citocina ligando del zalpha11.
Antecedentes de la invención
La proliferación y la diferenciación de las células de los organismos multicelulares son controladas por hormonas y factores de crecimiento polipeptídicos. Estas moléculas difusibles permiten que las células se comuniquen entre sí y actúen en forma conjunta para formar células, tejidos y órganos, y para reparar el tejido dañado. Los ejemplos de hormonas y factores de crecimiento incluyen las hormonas esteroideas (p. ej. estrógeno, testosterona), la hormona paratiroidea, la hormona folículo estimulante, las interleucinas, el factor de crecimiento der ivado de las plaquetas (platelet derived growth factor, PDGF), el factor de crecimiento epidérmico (epidermal growth factor, EGF), el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF), la eritropoyetina (EPO) y la calcitonina.
Las hormonas y los factores de crecimiento influyen en el metabolismo celular uniéndose a los receptores. Los receptores pueden ser proteínas integrales de membrana que están ligadas a vías de señalización dentro de la célula, como los sistemas de segundo mensajero. Otras clases de receptores son moléculas solubles, como los factores de transcripción.
Generalmente, las citocinas estimulan la proliferación o diferenciación celular del linaje hematopoyético o participan en los mecanismos de respuesta inmunitaria e inflamatoria del cuerpo. Algunos ejemplos de citocinas que afectan la hematopoyesis son la eritropoyetina (EPO), que estimula el desarrollo de glóbulos rojos; la trombopoyetina (TPO), que estimula el desarrollo de células del linaje megacariocítico; y el factor estimulante de colonias de granulocitos (granulocyte-colony stimulating factor, G-CSF), que estimula el desarrollo de neutrófilos. Estas citocinas ayudan a recuperar los niveles normales de células sanguíneas en pacientes que tienen anemia, trombocitopenia y neutropenia o que reciben quimioterapia para el cáncer.
Las interleucinas son una familia de citocinas que median las respuestas inmunitarias, incluida la inflamación. Las interleucinas median diversas patologías inflamatorias. La célula T es fundamental para la respuesta inmunitaria, ya que produce muchas citocinas e inmunidad adaptativa a los antígenos. Las citocinas producidas por la célula T se han clasificado en tipo 1 y tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). Las citocinas tipo 1 incluyen: IL-2, IFN-\gamma y LT-\alpha, y participan en las respuestas inflamatorias, la inmunidad a los virus, la inmunidad a los parásitos intracelulares y el rechazo de los aloinjertos. Las citocinas tipo 2 incluyen: IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, y participan en las respuestas humorales, la inmunidad a los helmintos y la respuesta alérgica. Las citocinas que pertenecen tanto al Tipo 1 como al Tipo 2 incluyen: IL-3, GM-CSF y TNF-\alpha. Existen evidencias que sugieren que las poblaciones de células T que producen el Tipo 1 y el Tipo 2 migran preferentemente a diferentes tipos de tejido inflamado.
Las células T maduras pueden activarse, es decir, mediante un antígeno u otro estímulo, para producir, por ejemplo, citocinas, moléculas de señalización bioquímica, o receptores que influyen también en el destino de la población de células T.
Las células B pueden ser activadas a través de los receptores que se encuentran en la superficie celular, incluidos el receptor de células B y otras moléculas accesorias, para que realicen funciones celulares accesorias, como la producción de citocinas.
Los linfocitos citolíticos naturales (natural killer, NK) tienen la misma célula precursora que las células T y B, y cumplen una función en la vigilancia inmunitaria. Las células NK, que forman hasta el 15% de los linfocitos de la sangre, no expresan los receptores de antígenos y, por lo tanto, no usan el reconocimiento del complejo mayor de histocompatibilidad (major histocompatibility complex, MHC) como requisito para unirse a una célula diana. Las células NK participan en el reconocimiento y la eliminación de determinadas células tumorales y células infectadas con virus. In vivo, se considera que las células NK necesitan activación; sin embargo, in vitro, se ha demostrado que las células NK matan algunos tipos de células tumorales sin activación.
Las actividades in vivo demostradas de la familia de las citocinas ejemplifican el enorme potencial clínico de otras citocinas, agonistas de citocinas y antagonistas de citocinas, y la necesidad que existe de contar con ellos. La presente invención aborda estas necesidades proporcionando una nueva citocina que estimula las células del linaje de células hematopoyéticas, así como composiciones y métodos afines.
Descripción breve de los dibujos
La Figura 1 es una ilustración de un alineamiento múltiple de la IL-2 humana, la IL-15 humana, el Ligando del zalpha11 (SEC. ID. N.º 2), la IL-4 humana, la IL-4 de ratón, el GM-CSF humano y el GM-CSF de ratón.
Descripción detallada de la invención
Antes de presentar la invención en forma detallada, puede ser útil definir los siguientes términos para su posterior comprensión:
El término "etiqueta de afinidad" se utiliza en la presente para denotar un segmento de un polipéptido que se puede unir a un segundo polipéptido para permitir la purificación o detección del segundo polipéptido o brindar sitios para la unión del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína para los cuales haya disponibles un anticuerpo u otro agente de unión específico, se puede utilizar como etiqueta de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen un tracto de polihistidina, la proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutatión S transferasa (Smith y Johnson, Gene 67:31, 1988), etiqueta de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), sustancia P, péptido Flag^{TM} (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), péptido de unión a la estreptavidina u otro epítopo antigénico o dominio de unión. Véase, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Los ADN que codifican etiquetas de afinidad se pueden obtener de proveedores comerciales (p. ej. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
El término "variante alélica" se utiliza en la presente para denotar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge de manera natural a través de la mutación y puede tener como consecuencia el polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (sin cambios en el polipéptido codificado) o pueden codificar polipéptidos con una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante alélica también se usa en la presente para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen.
Los términos "amino terminal" y "carboxilo terminal" se utilizan en la presente para denotar posiciones dentro de los polipéptidos. Cuando el contexto lo permita, dichos términos se usan con referencia a una secuencia o porción en particular de un polipéptido para denotar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una determinada secuencia en posición carboxilo terminal con respecto a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido está ubicada en posición proximal al carboxilo terminal de la secuencia de referencia, pero no necesariamente se encuentra en el carboxilo terminal del polipéptido completo.
El término "par de complemento/anticomplemento" denota fracciones no idénticas que forman un par estable asociado en forma no covalente en las condiciones adecuadas. Por ejemplo, la biotina y la avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par de complemento/anticomplemento. Otros ejemplos de pares de complemento/
anticomplemento incluyen pares de receptor/ligando, antígeno/anticuerpo (o hapteno o epítopo), pares de polinucleótidos codificantes/no codificantes y similares. Cuando la posterior disociación del par de complemento/anticomplemento
resulta deseable, el par de complemento/anticomplemento preferentemente tiene una afinidad de unión <10^{9} M^{-1}.
El término "complementos de una molécula de polinucleótido" denota una molécula de polinucleótido que tiene una secuencia de bases complementaria y orientación inversa en comparación con una secuencia de referencia. Por ejemplo, la secuencia 5' ATGCACGGG 3' es complementaria de la 5' CCCGTGCAT 3'.
El término "secuencia de nucleótidos degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (en comparación con una molécula de polinucleótido de referencia que codifica un polipéptido). Los codones degenerados contienen diferentes tripletes de nucleótidos, pero codifican el mismo residuo de aminoácidos (es decir, los tripletes GAU y GAC codifican Asp).
El término "vector de expresión" se utiliza para denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica un polipéptido de interés ligado operablemente a segmentos adicionales que permiten su transcripción. Dichos segmentos adicionales incluyen secuencias de promotores y terminadores, y también pueden incluir uno o más orígenes de replicación, uno o más marcadores seleccionables, un potenciador, una señal de poliadenilación, etc. Generalmente, los vectores de expresión provienen de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos.
El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido ha sido extraído de su medio genético natural y, por lo tanto, no contiene otras secuencias codificantes extrañas o indeseadas, y está en una forma adecuada para su uso dentro de sistemas de producción de proteínas mediante genomanipulación. Dichas moléculas aisladas son aquellas separadas de su medio natural, e incluyen los clones de ADNc y genómicos. Las moléculas de ADN aisladas de la presente invención no contienen otros genes con los que se las asocia comúnmente, pero pueden incluir las regiones naturales 5' y 3' no traducidas, como los promotores y los terminadores. La identificación de las regiones asociadas será evidente para una persona con conocimientos generales de la materia (véase, por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316:774-78, 1985).
Un polipéptido o proteína "aislado" es un polipéptido o una proteína que se encuentra en una condición distinta de su entorno original, como por ejemplo, separado de la sangre y el tejido animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado no contiene sustancialmente otros polipéptidos, en particular otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, es decir, con una pureza mayor del 95%; más preferentemente, mayor del 99%. Al usarlo en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como dímeros o, como alternativa, en formas glucosiladas o derivatizadas.
El término "neoplásicas", al referirse a las células, indica células que experimentan una proliferación nueva y anormal, especialmente en un tejido donde dicha proliferación es descontrolada y progresiva, lo que provoca una neoplasia. Las células neoplásicas pueden ser malignas, es decir, invasivas y metastásicas, o benignas.
El término "ligados operablemente", al referirse a los segmentos de ADN, indica que los segmentos están distribuidos de modo tal que funcionan en forma conjunta para alcanzar sus fines, p. ej. la transcripción se inicia en el promotor y avanza por el segmento codificante hasta el terminador.
El término "ortólogo" denota un polipéptido o una proteína obtenidos de una especie que es la contraparte funcional de un polipéptido o una proteína de una especie diferente. Las diferencias de secuencias entre los ortólogos son el resultado de la especiación.
Los "parálogos" son proteínas diferentes pero estructuralmente relacionadas producidas por un organismo. Se cree que los parálogos surgen por duplicación génica. Por ejemplo, la \alpha-globina, la \beta-globina y la mioglobina son parálogos entre sí.
Un "polinucleótido" es un polímero monocatenario o bicatenario de bases de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos leídas desde el extremo 5' hasta el 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizarse in vitro o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos se expresan como pares de bases (cuya abreviatura es "pb"), nucleótidos ("nt") o kilobases ("kb"). Cuando el contexto lo permita, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son monocatenarios o bicatenarios. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias, se utiliza para denotar la longitud total y se entenderá que es equivalente al término "pares de bases". Los especialistas en la materia reconocerán que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir levemente en cuanto a su longitud, y que sus extremos pueden estar escalonados como resultado de una segmentación enzimática; por ende, pueden no estar apareados todos los nucleótidos dentro de una molécula de polinucleótido bicatenaria.
Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por uniones peptídicas, sea producido en forma natural o sintética. Los polipéptidos de menos de alrededor de 10 residuos de aminoácidos se conocen comúnmente como "péptidos".
El término "promotor" se utiliza en la presente por su significado reconocido en la especialidad para denotar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que permiten la unión de la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción. Comúnmente, pero no siempre, las secuencias de promotores se encuentran en las regiones no codificantes 5' de los genes.
Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas de polipéptidos. Una proteína también puede comprender componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidrato. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser agregados a una proteína por la célula en la cual se produce dicha proteína y varían según el tipo de célula. Las proteínas se definen en la presente en función de la estructura de sus esqueletos de aminoácidos; en general, los sustituyentes tales como los grupos carbohidrato no se especifican, aunque pueden estar presentes.
El término "receptor" denota una proteína asociada a una célula que se une a una molécula bioactiva (es decir, un ligando) y media el efecto del ligando en la célula. Los receptores unidos a la membrana se caracterizan por una estructura de múltiples péptidos que comprende un dominio extracelular de unión a ligandos y un dominio efector intracelular que habitualmente participa en la transducción de las señales. La unión del ligando al receptor tiene por consecuencia un cambio en la conformación del receptor que provoca una interacción entre el dominio efector y las demás moléculas de la célula. Esta interacción, a su vez, lleva a una alteración del metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que se vinculan con las interacciones receptor-ligando incluyen transcripción génica, fosforilación, desfosforilación, aumentos en la producción de AMP cíclico, movilización del calcio celular, movilización de los lípidos de membrana, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos. En general, los receptores pueden estar unidos a la membrana, ser citosólicos o nucleares; monoméricos (p. ej. receptor de la hormona estimuladora de la tiroides, receptor adrenérgico beta) o multiméricos (p. ej. receptor del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (platelet-derived growth factor, PDGF), receptor de la hormona de crecimiento, receptor de la IL-3, receptor del GM-CSF, receptor del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), receptor de la eritropoyetina y receptor de la IL-6).
El término "secuencia señal de secreción" denota una secuencia de ADN que codifica un polipéptido (un "péptido de secreción") que, como componente de un polipéptido mayor, dirige al polipéptido mayor a través de una vía de secreción de una célula en la que es sintetizado. Comúnmente, el polipéptido mayor es segmentado para eliminar el péptido de secreción durante el tránsito por la vía de secreción.
El término "variante de empalme" se usa en la presente para denotar formas alternativas de ARN transcrito de un gen. La variación de empalme surge naturalmente a través del uso de sitios de empalme alternativos dentro de una molécula de ARN transcrita o, menos comúnmente, entre moléculas de ARN transcritas por separado, y puede tener como consecuencia varios ARNm transcritos del mismo gen. Las variantes de empalme pueden codificar polipéptidos con una secuencia de aminoácidos alterada. El término variante de empalme también se usa en la presente para denotar una proteína codificada por una variante de empalme de un ARNm transcrito de un gen.
Se entenderá que los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros determinados mediante métodos analíticos imprecisos (p. ej. electroforesis en gel) son valores aproximados. Cuando uno de dichos valores se expresa como "alrededor de" X o "aproximadamente" X, se entenderá que el valor X expresado tiene una exactitud de \pm10%.
Todas las referencias citadas en la presente se incorporan por referencia en su totalidad.
La presente invención se basa en parte en el descubrimiento de una nueva secuencia de ADN que codifica una proteína que tiene la estructura de una citocina con haz de cuatro hélices. A través de los procesos de clonación, las valoraciones de la proliferación y los estudios de unión descritos en detalle en la presente, se ha identificado una secuencia de polinucleótido que codifica un nuevo polipéptido ligando, que es un ligando de alta especificidad para el receptor zalpha11 anteriormente huérfano. Este ligando polipeptídico, denominado Ligando del zalpha11, se aisló a partir de una genoteca de ADNc generada a partir de células de sangre periférica humanas (human peripheral blood cell, hPBC) activadas, que se seleccionaron por el CD3. El CD3 es un marcador de superficie celular exclusivo de las células de origen linfoide, particularmente células T.
En los ejemplos que siguen, se utilizó una línea celular dependiente de la vía ligada al receptor huérfano zalpha11 para la supervivencia y el crecimiento en ausencia de otros factores de crecimiento, a fin de cribar una fuente del ADNc que codifica el Ligando del zalpha11. La línea celular dependiente del factor de crecimiento preferida que se usó para la transfección y la expresión del receptor zalpha11 fue la BaF3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). Sin embargo, otras líneas celulares dependientes del factor de crecimiento, como la FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984) y la MO7e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240, 1993) son adecuadas para este propósito.
La secuencia de aminoácidos para el receptor zalpha11 indicó que el receptor codificado pertenece a la subfamilia de receptores de citocinas de Clase I, que incluyen, a modo de ejemplo, los receptores de IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF y G-CSF (para consultar una revisión, véase Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" en Cytokine 5(2): 95-106, 1993). El receptor zalpha11 se describe detalladamente en la Solicitud de patente N.º US99/22149 de PCT, de propiedad común. El análisis de la distribución tisular del ARNm del receptor zalpha11 reveló expresión en los ganglios linfáticos, en los leucocitos de sangre periférica (peripheral blood leukocyte, PBL), el bazo, la médula ósea y el timo. Además, el ARNm se hallaba en abundancia en la línea celular Raji (ATCC N.º CCL-86) derivada de un linfoma de Burkitt. La distribución tisular del receptor sugiere que un objetivo para el Ligando del zalpha11 predicho son las células de linaje hematopoyético, en particular, las células precursoras linfoides y las células linfoides. Otras citocinas con haz de cuatro hélices conocidas que actúan en las células linfoides incluyen la IL-2, la IL-4, la IL-7 y la IL-15. Para consultar una revisión de las citocinas con haz de cuatro hélices, véanse Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 52:1-65, 1999 y Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76:300-317, 1998.
El medio acondicionado (conditioned media, CM) de células de sangre periférica humanas estimuladas con forbol miristato acetato (PMA)/Ionomycin seleccionadas por CD3+ permitió el crecimiento de células BaF3 que expresaban el receptor zalpha11 y, por lo demás, eran dependientes de la IL-3. El medio acondicionado de las células que no fueron: 1) estimuladas con PMA/Ionomycin; o no fueron: 2) seleccionadas por CD3 (con o sin estimulación con PMA/Ionomycin) no permitió el crecimiento de células BaF3/con receptores zalpha11. Los experimentos de control demostraron que esta actividad proliferativa no era atribuible a otros factores de crecimiento, y que la capacidad de dicho medio acondicionado para estimular la proliferación de células que expresan el receptor zalpha11 podía ser neutralizada por una forma soluble del receptor.
La proliferación de células BaF3 que expresan el receptor zalpha11 expuestas al CM de células de sangre periférica humanas estimuladas con PMA/Ionomycin seleccionadas por CD3+ se identificó mediante inspección visual de los cultivos y/o valoración de la proliferación. Se conocen muchas valoraciones de la proliferación adecuadas en la especialidad, que incluyen valoraciones para la reducción de un colorante como Alamar Blue^{TM} (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), tetrazolio; y cloruro de cianoditolil-tetrazolio (disponibles comercialmente a través de Polysciences, Inc., Warrington, PA); valoraciones de mitogénesis, como medición de la incorporación de 3H-timidina; valoraciones de exclusión del colorante mediante el uso de, por ejemplo, negro de naftaleno o azul de tripán; captación de colorante mediante el uso de diacetilo fluoresceína; y liberación de cromo. Véase, en general, Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3.ª ed., Wiley-Liss, 1994, que se incorpora a la presente por referencia.
Se preparó una genoteca de ADNc a partir de células de sangre periférica humanas primarias estimuladas con PMA e Ionomycin seleccionadas por CD3+. La genoteca de ADNc de células de sangre periférica humanas estimuladas con PMA e Ionomycin seleccionadas por CD3+ se dividió en agrupamientos que contenían múltiples moléculas de ADNc y se transfectó a una línea celular huésped, por ejemplo, células BHK 570 (ATCC N.º de acceso 10314). Las células huésped transfectadas se cultivaron en un medio que no contenía factores de crecimiento exógenos, y se recolectó el medio acondicionado. El medio acondicionado se analizó para determinar la capacidad de estimular la proliferación de células BaF3 transfectadas con el receptor zalpha11. Se identificaron los agrupamientos de ADNc que produjeron el medio acondicionado que estimuló las células BaF3/con receptores zalpha11. Este ADNc plasmídico agrupado se electroporó en E. coli. Se aisló el ADNc a partir de colonias simples y se transfectó individualmente en células BHK 570. Se identificaron los clones positivos mediante la obtención de un resultado positivo en la valoración de la proliferación de células BaF3/con receptores zalpha11, y se evaluó la especificidad mediante la neutralización de la proliferación utilizando el receptor zalpha11 soluble.
Se aisló un clon positivo, y el análisis de secuencia reveló que la secuencia de polinucleótido contenida en el ADN plasmídico era nueva. La secuencia señal de secreción está formada por los residuos de aminoácidos 1 (Met) a 31 (Gly), y el polipéptido maduro está formado por los residuos de aminoácidos 32 (Gln) a 162 (Ser) (como se muestra en la SEC. ID. N.º 2).
En general, se predice que las citocinas tendrán una estructura de cuatro hélices alfa, en la que las hélices A, C y D serán las más importantes en las interacciones ligando-receptor, y que se encontrarán más altamente conservadas entre los miembros de la familia. En cuanto a la secuencia de aminoácidos del Ligando del zalpha11 humano que se muestra en la SEC. ID. N.º 2, el alineamiento de las secuencias de aminoácidos del Ligando del zalpha11 humano, la IL-15 humana, la IL-4 humana y el GM-CSF humano, se predice que la hélice A del Ligando del zalpha11 está definida por los residuos de aminoácidos 41-56; la hélice B por los residuos de aminoácidos 69-84; la hélice C por los residuos de aminoácidos 92-105; y la hélice D por los residuos de aminoácidos 135-148; como se muestra en la SEC. ID. N.º 2. El análisis estructural sugiere que el asa A/B es larga, el asa B/C es corta y el asa C/D es larga y paralela. Esta estructura de asas tiene por consecuencia una organización helicoidal ascendente-ascendente-descendente-descendente. Los residuos de cisteína se conservan absolutamente entre el Ligando del zalpha11 y la IL-15, como se muestra en la Figura 1. Los residuos de cisteína que se conservan entre la IL-15 y el Ligando del zalpha11 corresponden a los residuos de aminoácidos 71, 78, 122 y 125 de la SEC. ID. N.º 2. La conservación de algunos de los residuos de cisteína también se encuentra en la IL-2, la IL-4, el GM-CSF y el Ligando del zalpha11 correspondientes a los residuos de aminoácidos 78 y 125 de la SEC. ID. N.º 2, como se muestra en la Figura 1. La localización uniforme de cisteína es una confirmación aún mayor de la estructura con haz de cuatro hélices. La secuencia Glu-Phe-Leu también se encuentra altamente conservada en la familia que comprende la IL-15, la IL-2, la IL-4, el GM-CSF y el Ligando del zalpha11, como se muestra en la SEC. ID. N.º 2, en los residuos 136-138, según la Figura 1.
La realización de más análisis del Ligando del zalpha11 en función de los alineamientos múltiples (como se muestra en la Figura 1) predice que los residuos de aminoácidos 44, 47 y 135 (como se muestra en la SEC. ID. N.º 2) cumplen una función importante en la unión del Ligando del zalpha11 a su receptor cognado. Además, la secuencia de aminoácidos predicha del Ligando del zalpha11 murino muestra una identidad del 57% con la proteína humana predicha. Sobre la base de la comparación entre las secuencias del Ligando del zalpha11 humano y murino, se encontraron residuos bien conservados en las regiones que se predijo que codifican las hélices alfa A y D. Los correspondientes polinucleótidos que codifican las regiones, los dominios, los motivos, los residuos y las secuencias del polipéptido del Ligando del zalpha11 descritos en la presente se muestran en la SEC. ID. N.º 1.
Se ha realizado un análisis mutacional detallado para la IL-4 y la IL-2, que están altamente relacionadas con el Ligando del zalpha11. El análisis de la IL-2 murina (Zurawski et al., EMBO J. 12:5113-5119, 1993) indica que los residuos en las hélices A y C son importantes para la unión al IL-2R\beta; los residuos fundamentales son Asp_{34}, Asn_{99} y Asn_{103}. Múltiples residuos dentro del asa A/B y la hélice B de la IL-2 murina son importantes para la unión al IL-2R\alpha, mientras que un solo residuo, el Gln_{141} en la hélice D, es fundamental para la unión con el IL\alpha. De manera similar, las hélices A y C son sitios de interacción entre la IL-4 y el IL-4R\alpha estructuralmente similar al IL-2R\alpha), y los residuos dentro de la hélice D son vitales para la interacción con el IL-2R\alpha (Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:1657-1662, 1997; Kruse et al., EMBO J. 11:3237-3244, 1992). En particular, la mutación Tyr_{124} a Asp en la IL-4 humana crea un antagonista, que se une al IL-4R pero no al\betaIL-2R\alpha y, por lo tanto, no puede producir una señal (Kruse et al. ibid. 1992).
Mientras la hélice A se conserva relativamente bien entre el Ligando del zalpha11 humano y el murino, la hélice C es más divergente. Si bien ambas especies tienen aminoácidos ácidos predominantes en esta región, las diferencias pueden explicarse por la especificidad de las especies en la interacción entre el Ligando del zalpha11 y su receptor tipo "beta", zalpha11. El asa A/B y la hélice B del Ligando del zalpha11 se conservan bien entre las especies; a pesar de que aún no se ha identificado ninguna subunidad de receptor correspondiente al IL-2R\alpha, la conservación a través de esta región sugiere que es funcionalmente significativo. Las hélices D del Ligando del zalpha11 humano y murino también se encuentran altamente conservadas. Pueden diseñarse antagonistas del receptor zalpha11 a través de mutaciones en la hélice D del Ligando del zalpha11. Esto puede incluir el truncamiento de la proteína desde el residuo Gln_{145} (SEC. ID. N.º 2), o mutaciones del Gln_{145} o del Ile_{148} (de la SEC. ID. N.º 2; correspondiente al Tyr_{124} en la IL-4 humana) hasta residuos como Ala o Asp. Toda mutación que altere la estructura helicoidal del Ligando del zalpha11 puede suprimir la unión con su receptor y, por ende, inhibir la señalización.
Las citocinas con haz de cuatro hélices también se agrupan por la longitud de las hélices que las componen. Las citocinas de "hélice larga" generalmente están formadas por hélices de entre 24 y 30 residuos, e incluyen la IL-6, el factor neurotrófico ciliar (ciliary neurotrophic factor, CNTF), el factor inhibidor de la leucemia (leukemia inhibitory factor, LIF) y la hormona de crecimiento humana (human growth hormone, hGH). Las citocinas de "hélice corta" generalmente están formadas por hélices de entre 18 y 21 residuos, e incluyen la IL-2, la IL-4 y el GM-CSF. Se considera que el Ligando del zalpha11 es un nuevo miembro del grupo de citocinas de hélice corta. Estudios en los que se utilizó el CNTF y la IL-6 demostraron que puede intercambiarse una hélice del CNTF por la hélice equivalente de la IL-6, y de esta forma se brindan a la quimera propiedades de unión al CTNF. Por ende, esos dominios funcionales de citocinas de cuatro hélices se determinan en función de la homología estructural, independientemente de la identidad de secuencias, y pueden mantener la integridad funcional en una quimera (Kallen et al., J. Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999). Por lo tanto, los dominios helicoidales del Ligando del zalpha11 serán de utilidad para la preparación de moléculas quiméricas de fusión, en particular con otras citocinas de hélice corta, para determinar y modular la especificidad de unión a los receptores. Resultan de particular interés las proteínas de fusión genomanipuladas con la hélice A y/o la hélice D, y las proteínas de fusión que combinan los dominios helicoidales y de asas de otras citocinas de forma corta, como la IL-2, la IL-4, la IL-15 y el GM-CSF. Los residuos de aminoácidos que comprenden las hélices A, B, C y D, y las asas A/B, B/C y C/D para el Ligando del zalpha11, la IL-2, la IL-4, la IL-15 y el GM-CSF se muestran en la Tabla 1.
TABLA 1
1 
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La presente invención proporciona moléculas de polinucleótidos, incluidas moléculas de ADN y ARN, que codifican los polipéptidos del Ligando del zalpha11 divulgados en la presente. Los especialistas en la materia reconocerán fácilmente que, en vista de la degeneración del código genético, es posible que exista una variación considerable en las secuencias entre estas moléculas de polinucleótidos. La SEC. ID. N.º 3 es una secuencia de ADN degenerada que abarca a todos los ADN que codifican el polipéptido del Ligando del zalpha11 de la SEC. ID. N.º 2. Los especialistas en la materia reconocerán que la secuencia degenerada de la SEC. ID. N.º 3 también proporciona todas las secuencias de ARN que codifican la SEC. ID. N.º 2, sustituyendo T por U. Por ende, la presente invención contempla los polinucleótidos que codifican los polipéptidos del Ligando del zalpha11 que comprenden desde el nucleótido 1 ó 94 hasta el nucleótido 486 de la SEC. ID. N.º 3, y sus equivalentes de ARN. La Tabla 2 presenta los códigos de una sola letra utilizados dentro de la SEC. ID. N.º 3 para denotar posiciones de nucleótidos degenerados. Las "resoluciones" son nucleótidos denotados con una letra del código. El "complemento" indica el código del (de los) nucleótido(s) complementario(s). Por ejemplo, el código Y denota C o T y su complemento R denota A o G, siendo A complementario de T y siendo G complementario de C.
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TABLA 2
2
Los codones degenerados utilizados en la SEC. ID. N.º 3, que abarcan todos los codones posibles de un aminoácido dado, se presentan en la Tabla 3.
TABLA 3
3
Una persona con conocimientos generales de la materia apreciará que se introduce cierta ambigüedad al determinar un codón degenerado, representativo de todos los codones posibles que codifican cada aminoácido. Por ejemplo, el codón degenerado para serina (WSN) puede, en ciertas circunstancias, codificar arginina (AGR) y el codón degenerado para arginina (MGN) puede, en ciertas circunstancias, codificar serina (AGY). Existe una relación similar entre los codones que codifican fenilalanina y leucina. Por ende, algunos polinucleótidos abarcados por la secuencia degenerada pueden codificar variantes de secuencias de aminoácidos, pero una persona con conocimientos generales de la materia puede identificar fácilmente dichas variantes de secuencias por referencia a la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.º 2. La funcionalidad de las variantes de las secuencias se puede probar fácilmente según se describe en la presente.
Una persona con conocimientos generales de la materia también apreciará que diferentes especies pueden mostrar el "uso de codones preferenciales". En general, véanse Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8:1893-912, 1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-64, 1981; Grosjean y Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Tal como se los usa en la presente, los términos "uso de codones preferenciales" o "codones preferenciales" constituyen una expresión de la materia que hace referencia a codones de traducción de proteínas que se utilizan más frecuentemente en las células de una especie determinada, favoreciendo de ese modo a uno o a unos pocos representantes de los posibles codones que codifican cada aminoácido (véase la Tabla 3). Por ejemplo, el aminoácido treonina (Thr) puede ser codificado por ACA, ACC, ACG o ACT, pero en las células de los mamíferos, ACC es el codón usado más comúnmente; en otras especies, por ejemplo, células de insectos, levaduras, virus o bacterias, es posible que sean preferenciales otros codones de Thr distintos. Los codones preferenciales para una especie en particular pueden introducirse en los polinucleótidos de la presente invención mediante una serie de métodos conocidos por los especialistas en la materia. La introducción de secuencias de codones preferenciales en el ADN recombinante puede, por ejemplo, potenciar la producción de la proteína haciendo que la traducción de la proteína sea más eficiente dentro de un tipo o especie celular en particular. Por lo tanto, la secuencia de codones degenerados divulgada en la SEC. ID. N.º 3 sirve como plantilla para optimizar la expresión de polinucleótidos en diversos tipos y especies celulares que se usan habitualmente en la especialidad y se divulgan en la presente. Las secuencias que contienen codones preferenciales pueden probarse y optimizarse para su expresión en diversas especies, y su funcionalidad puede probarse según se divulga en la presente.
Como se señaló anteriormente, los polinucleótidos aislados de la presente invención incluyen ADN y ARN. Los métodos para preparar ADN y ARN son bien conocidos por los especialistas en la materia. En general, el ARN se aísla a partir de un tejido o una célula que produce grandes cantidades de ARN del Ligando del zalpha11. Dichos tejidos y células se identifican mediante el análisis Northern blot (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5201, 1980) o cribando el medio acondicionado de diversos tipos celulares para detectar la actividad en las células o el tejido diana. Una vez identificada la actividad o la célula o el tejido que produce el ARN, el ARN total puede prepararse extrayendo el isotiocianato de guanidinio, y realizando luego el aislamiento mediante centrifugación en un gradiente de CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). Se prepara ARN poli(A)+ a partir del ARN total utilizando el método de Aviv y Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972). Se prepara ADN complementario (ADNc) a partir del ARN poli(A)+ utilizando los métodos conocidos. Como alternativa, puede aislarse el ADN genómico. Luego, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos del Ligando del zalpha11 se identifican y aíslan mediante, por ejemplo, hibridación o reacción en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction, PCR).
Puede obtenerse un clon de longitud completa que codifica el Ligando del zalpha11 mediante los procedimientos de clonación convencionales. Se prefieren los clones de ADN complementario (ADNc), aunque para algunas aplicaciones (p. ej. expresión en animales transgénicos) puede ser preferible usar un clon genómico, o modificar un clon de ADNc para que incluya, al menos, un intrón genómico. Los métodos para preparar clones de ADNc y genómicos son bien conocidos para quienes cuentan con conocimientos generales de la materia, e incluyen el uso de la secuencia divulgada en la presente, o partes de ella, para sondar o cebar una genoteca. Las genotecas de expresión pueden sondarse con anticuerpos contra los fragmentos del receptor zalpha11, u otros elementos de unión específicos.
Las secuencias de polinucleótidos del Ligando del zalpha11 divulgadas en la presente también pueden usarse como sondas o cebadores para clonar regiones 5' no codificantes de un gen del Ligando del zalpha11. En vista de la expresión específica para un tejido observada para el Ligando del zalpha11, se prevé que la región de este gen proporcione una expresión específica para tejido hematopoyético y linfoide. Por ende, los elementos promotores de un gen del Ligando del zalpha11 podrían usarse para dirigir la expresión específica para un tejido de genes heterólogos en, por ejemplo, animales transgénicos o en pacientes tratados con terapia génica. La clonación de las secuencias que flanquean a 5' también facilita la producción de las proteínas del Ligando del zalpha11 por "activación génica", según se divulga en la Patente de EE. UU. N.º 5.641.670. En resumen, la expresión de un gen del Ligando del zalpha11 endógeno en una célula se altera introduciendo en el locus del Ligando del zalpha11 un constructo de ADN que comprende, al menos, una secuencia de acceso, una secuencia reguladora, un exón y un sitio donante de empalme no apareado. La secuencia de acceso es una secuencia 5' no codificante del Ligando del zalpha11 que permite la recombinación homóloga del constructo con el locus endógeno del Ligando del zalpha11, por la cual las secuencias dentro del constructo se ligan operablemente a la secuencia codificante endógena del Ligando del zalpha11. De esta manera, un promotor endógeno del Ligando del zalpha11 puede reemplazarse o suplementarse con otras secuencias reguladoras para proporcionar una expresión potenciada, específica para un tejido o regulada de alguna otra manera.
En otras especies, existen polipéptidos y polinucleótidos que representan contrapartes (ortólogos). Estas especies incluyen especies de mamíferos, aves, anfibios, reptiles, peces, insectos y otras especies de vertebrados e invertebrados. Resultan de particular interés los polipéptidos del Ligando del zalpha11 de otras especies de mamíferos, incluidos los polipéptidos murinos, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos y de otros primates. Los ortólogos del Ligando del zalpha11 humano se pueden clonar utilizando información y composiciones provistas por la presente invención en combinación con las técnicas de clonación convencionales. Por ejemplo, un ADNc puede clonarse utilizando ARNm obtenido de un tejido o tipo celular que exprese el Ligando del zalpha11, según se divulga en la presente. Pueden identificarse fuentes adecuadas de ARNm por sondaje de Northern blot con sondas diseñadas a partir de las secuencias divulgadas en la presente. Luego se prepara una genoteca a partir de ARNm de un tejido o una línea celular positivos. Luego, puede aislarse un ADNc que codifica el Ligando del zalpha11 con diversos métodos, por ejemplo, el sondaje con un ADNc humano completo o parcial, o con uno o más conjuntos de sondas degeneradas sobre la base de las secuencias divulgadas. Un ADNc también puede clonarse mediante la reacción en cadena de la polimerasa, también denominada PCR (Mullis, Patente de EE. UU. N.º 4.683.202), con cebadores diseñados a partir de la secuencia representativa del Ligando del zalpha11 humano divulgada en la presente. Dentro de un método adicional, la genoteca de ADNc puede utilizarse para transformar o transfectar células huésped, y la expresión del ADNc de interés puede detectarse con un anticuerpo contra el polipéptido del Ligando del zalpha11, estudios de unión o valoraciones de la actividad. Pueden aplicarse técnicas similares para el aislamiento de clones genómicos.
Se ha identificado la secuencia de polinucleótido para el ortólogo de ratón del Ligando del zalpha11 y se muestra en la SEC. ID. N.º 55, y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en la SEC. ID. N.º 56. Existe una identidad del 62% entre las secuencias de ratón y humana en la región de 124 aminoácidos que corresponde a los residuos 30 a 153 en la SEC. ID. N.º 2 y los residuos 23 a 146 de la SEC. ID. N.º 56 del Ligando del zalpha11. La secuencia madura para el Ligando del zalpha11 de ratón comienza putativamente en His_{18} (como se muestra en la SEC. ID. N.º 56), que corresponde a His25 (como se muestra en la SEC. ID. N.º 2) en la secuencia humana. Dado que una forma truncada del polipéptido humano es activa, es probable que un polipéptido equivalente del Ligando del zalpha11 de ratón (es decir, sin los residuos His_{18} a Pro_{22} de la SEC. ID. N.º 56) también sea activo. El análisis tisular reveló que la expresión del Ligando del zalpha11 de ratón se encuentra en los testículos, el bazo y el timo.
Los especialistas en la materia reconocerán que la secuencia divulgada en la SEC. ID. N.º 1 representa un único alelo del Ligando del zalpha11 humano y que se prevé que se produzcan variación alélica y empalmes alternativos. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden clonarse sondando genotecas de ADNc o genómicas de diferentes individuos según los procedimientos estándar. Existen variantes alélicas de la secuencia de ADN que se muestra en la SEC. ID. N.º 1, incluidas las que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las cuales las mutaciones tienen por consecuencia cambios en la secuencia de aminoácidos, así como también variantes alélicas de la SEC. ID. N.º 2. Los ADNc generados a partir de ARNm empalmados en forma alternativa, que conservan las propiedades del polipéptido del Ligando del zalpha11 están incluidas dentro del alcance de la presente invención, al igual que los polipéptidos codificados por dichos ADNc y ARNm. Las variantes alélicas y las variantes de empalme de estas secuencias pueden clonarse por sondaje de genotecas de ADNc o genómicas de diferentes individuos o tejidos según los procedimientos estándar conocidos en la especialidad.
El gen del Ligando del zalpha11 se ha localizado por mapeo en el marcador de marcos de la IL-2 SHGC-12342, que ubica al Ligando del zalpha11 aproximadamente a 180 kb del marcador de la IL-2. El uso de marcadores circundantes posiciona el gen del Ligando del zalpha11 en la región 4q27 del mapa del cromosoma 4 integrado de la base de datos de ubicación (Location Database, LDB) (The Genetic Location Database, University of Southhampton). La presente invención también proporciona reactivos, que serán de utilidad en aplicaciones de diagnóstico. Por ejemplo, el gen del Ligando del zalpha11, una sonda que comprende ADN o ARN del Ligando del zalpha11, o una subsecuencia de estos, puede utilizarse para determinar si el gen del Ligando del zalpha11 está presente en un cromosoma humano, como el cromosoma 4, o si se ha producido una mutación génica. Sobre la base de la anotación de un fragmento de ADN genómico humano que contiene una parte del ADN genómico del Ligando del zalpha11 (Acceso a la genoteca N.º AC007458), el Ligando del zalpha11 se ubica en la región 4q27 del cromosoma 4. Las aberraciones cromosómicas detectables en el locus del gen del Ligando del zalpha11 incluyen, a modo de ejemplo, aneuploidía, cambios en la cantidad de copias del gen, pérdida de heterogeneidad (loss of heterogeneity, LOH), translocaciones, inserciones, deleciones, cambios en los sitios de restricción y rearreglos. Dichas aberraciones pueden detectarse utilizando los polinucleótidos de la presente invención empleando técnicas de genética molecular, como el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism, RFLP), el análisis de las repeticiones cortas en tándem (short tandem repeat, STR) con técnicas de PCR, y otras técnicas de análisis de enlaces genéticos conocidas en la especialidad (Sambrook et al., ibid.; Ausubel et al., ibid.; Marian, Chest 108:255-65, 1995).
El conocimiento preciso de la posición de un gen puede ser útil para diversos fines, entre los que se incluyen: 1) determinar si una secuencia es parte de una contig existente y obtener secuencias genéticas circundantes adicionales en diversas formas, como clones de YAC, BAC o ADNc; 2) proporcionar un posible gen candidato para una enfermedad heredable que muestre una conexión con la misma región cromosómica; y 3) usar como referencia cruzada organismos modelo, como el ratón, que puedan ayudar a determinar qué función puede tener un gen en particular.
Como se mencionó anteriormente, el gen del Ligando del zalpha11 humano reside cerca del gen de la IL-2, que es una región del cromosoma 4q que se ha demostrado que tiene un enlace con la susceptibilidad a la enfermedad inflamatoria intestinal (inflammatory bowel disease, IBD) (incluidas la enfermedad de Crohn [Crohn's disease, CD] y la colitis ulcerosa) en algunas familias (Hampe et al. Am. J. Hum. Genet. 64:808-816, 1999; Cho et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:7502-7507, 1998). Además, según el mapa, el gen del receptor zalpha11 se encuentra en el 16p11, otra región genómica que está asociada con la susceptibilidad a la CD (Hugot et al., Nature 379:821-823, 1996; Ohmen et al., Hum. Mol. Genet. 5:1679-1683, 1996). La CD es una inflamación crónica del intestino, con compromiso sistémico frecuente; si bien se desconoce la etiología exacta, la disfunción inmunorreguladora que implica la imposibilidad de tolerar los antígenos intestinales comunes es un componente principal (para consultar revisiones, véase (Braegger et al., Annals Allergy 72:135-141, 1994; Sartor, Am. J. Gastroenterol. 92:5S-11S, 1997)). En varios estudios, se detectó actividad anormal de los NK en pacientes con CD (véanse, por ejemplo, (Egawa et al., J. Clin. Lab. Immunol. 20:187-192, 1986; Aparicio-Pagés et al. J. Clin. Lab. Immunol. 29:119-124, 1989; van Tol et al., Scand. J. Gastroenterol. 27:999-1005, 1992)), y también se documentó la formación de células B de memoria defectuosa (Brogan et al., J. Clin. Lab. Immunol. 24:69-74, 1987). Dado que el Ligando del zalpha11 cumple una función en la regulación inmunitaria, y dado que los genes tanto para el receptor como para el ligando yacen en las regiones de susceptibilidad de la CD, el receptor y el ligando son genes candidatos para la predisposición genética a la enfermedad de Crohn.
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La determinación de la intervención del receptor zalpha11 y/o del Ligando del zalpha11 en la patología de la IBD puede lograrse por varios métodos. El secuenciamiento de exones a partir del ADN genómico puede revelar mutaciones codificantes (incluidas mutaciones de aminoácido, terminadoras y de cambio del marco de lectura), de la misma manera que el secuenciamiento de ADNc. Una ventaja adicional del secuenciamiento a partir del ADN genómico es que las uniones empalmadas también están contenidas en los fragmentos secuenciados y pueden revelar anomalías del empalme, que pueden no aparecer en las muestras de ADNc si, por ejemplo, el ARN no empalmado se degrada rápidamente. Se ha determinado la estructura genómica del Ligando del zalpha11. Otros métodos para análisis del Ligando del zalpha11 y del receptor en pacientes con IBD incluyen: (1) evaluación de la producción de ligando a partir de células T activadas de pacientes, en comparación con controles normales (es decir, mediante bioanálisis); (2) hibridación in situ del ARN del receptor zalpha11 o del Ligando del zalpha11 en secciones del intestino inflamado de pacientes con IBD, en comparación con secciones similares de controles normales; (3) inmunohistoquímica en secciones de pacientes con IBD, en comparación con controles normales; y (4) evaluación de la respuesta de las células B periféricas de los pacientes al Ligando del zalpha11, medida mediante valoraciones de mitogénesis.
Un diagnóstico podría ayudar a los médicos a determinar el tipo de enfermedad y el tratamiento asociado adecuado, o podría ayudar en el asesoramiento genético. Como tales, los polinucleótidos, polipéptidos y anticuerpos contra el Ligando del zalpha11 de la invención pueden utilizarse para la detección del polipéptido del Ligando del zalpha11, el ARNm o los anticuerpos contra el Ligando del zalpha11, y así servir como marcadores, y pueden usarse directamente para la detección de enfermedades genéticas o distintos tipos de cáncer, como se describe en la presente, mediante métodos conocidos en la especialidad y descritos en la presente. Asimismo, las sondas de polinucleótidos del Ligando del zalpha11 pueden utilizarse para detectar anomalías que implican el cromosoma 4q27, según se describe en la presente. Estas anomalías pueden estar asociadas con enfermedades humanas, tumorigénesis, aborto espontáneo u otros trastornos genéticos. Por ende, las sondas de polinucleótidos del Ligando del zalpha11 pueden utilizarse para detectar anomalías o genotipos asociados con estos defectos.
Como se analizó anteriormente, los defectos en el gen del Ligando del zalpha11 en sí pueden tener por consecuencia un estado de enfermedad humana hereditaria. Las moléculas de la presente invención, como los polipéptidos, polinucleótidos y anticuerpos de la presente invención, podrían ayudar en la detección, la prevención por diagnóstico y el tratamiento de enfermedades asociadas con un defecto genético del Ligando del zalpha11. Además, las sondas de polinucleótidos del Ligando del zalpha11 pueden utilizarse para detectar las diferencias alélicas entre los individuos que tienen la enfermedad y los que no la tienen en el locus cromosómico del Ligando del zalpha11. Como tales, las secuencias del Ligando del zalpha11 pueden usarse para diagnóstico en la creación de perfiles de ADN para uso forense.
En general, los métodos de diagnóstico utilizados en los análisis de enlaces genéticos para detectar una anomalía o aberración genética en un paciente son conocidos en la especialidad. La mayoría de los métodos de diagnóstico comprenden los siguientes pasos: (i) obtener una muestra genética de un paciente posiblemente enfermo, un paciente enfermo o un posible portador no enfermo del alelo de una enfermedad recesiva; (ii) producir un primer producto de reacción incubando la muestra genética con una sonda de polinucleótidos del Ligando del zalpha11 donde el polinucleótido se hibridará con una secuencia de polinucleótido complementaria, como en el análisis del RFLP, o incubando la muestra genética con cebadores codificantes y no codificantes en una reacción PCR en condiciones de reacción PCR adecuadas; (iii) visualizar el primer producto de reacción mediante electroforesis en gel y/u otro método conocido, como visualizar el primer producto de reacción con una sonda de polinucleótidos del Ligando del zalpha11 donde el polinucleótido se hibridará con la secuencia de polinucleótido complementaria de la primera reacción; y (iv) comparar el primer producto de reacción visualizado con un segundo producto de reacción de control de una muestra genética de un individuo normal o de control. Una diferencia entre el primer producto de reacción y el producto de reacción de control indica una anomalía genética en el paciente enfermo o posiblemente enfermo, o la presencia de un fenotipo portador recesivo heterocigota para un paciente no enfermo, o la presencia de un defecto genético en un tumor de un paciente enfermo, o la presencia de una anomalía genética en un feto o embrión antes de la implantación. Por ejemplo, una diferencia en el patrón de fragmentos de restricción, la longitud de los productos de la PCR, la longitud de las secuencias repetitivas del locus genético del Ligando del zalpha11, y otros similares, indican una anomalía genética, una aberración genética o una diferencia alélica en comparación con el control normal genéticamente intacto. Los controles pueden ser de miembros no afectados de la familia, o de personas que no tienen un parentesco, dependiendo de la prueba y la disponibilidad de las muestras. Las muestras genéticas pueden incluir ADN genómico, ARNm y ADNc aislados de cualquier tejido u otra muestra biológica de un paciente, como por ejemplo, sangre, saliva, semen, células embrionarias, líquido amniótico y similares. La sonda o el cebador de polinucleótidos pueden ser ARN o ADN, y comprenderán una porción de la SEC. ID. N.º 1, el complemento de la SEC. ID. N.º 1, o un equivalente de ARN de estos. Dichos métodos para mostrar el análisis de enlaces genéticos con fenotipos de enfermedad humana son bien conocidos por los especialistas en la materia. Como referencia sobre los métodos basados en la PCR utilizados en el diagnóstico, véanse, en general, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek y Walaszek (ed.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998) y Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)).
Las mutaciones asociadas con el locus del Ligando del zalpha11pueden detectarse utilizando moléculas de ácido nucleico de la presente invención con métodos estándar para el análisis de mutación directo, tales como análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción, análisis de las repeticiones cortas en tándem con técnicas de PCR, análisis del sistema de mutaciones resistentes a la amplificación, detección de polimorfismo de la conformación monocatenaria, métodos de segmentación por RNasa, electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante, análisis de faltas de coincidencia con fluorescencia y otras técnicas de análisis genético conocidas en la especialidad (véanse, por ejemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman y Tsongalis, Molecular Diagnostics (Human Press, Inc. 1996), Elles (ed.) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, Inc. 1996), Landegren (ed.), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren et al. (ed.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli et al. (ed.), Current Protocols in Human Genetics (John Wiley & Sons 1998), y Richards y Ward, "Molecular Diagnostic Testing", en Principles of Molecular Medicine, páginas 83-88 (Humana Press, Inc. 1998)). El análisis directo de un gen del Ligando del zalpha11 en relación con una mutación puede realizarse utilizando el ADN genómico de un sujeto. Los métodos para amplificar el ADN genómico obtenido, por ejemplo, de linfocitos de sangre periférica, son bien conocidos por los especialistas en la materia (véase, por ejemplo, Dracopoli et al. (ed.), Current Protocols in Human Genetics, en las páginas 7.1.6 a 7.1.7 (John Wiley & Sons 1998)).
Las posiciones de los intrones en el gen del Ligando del zalpha11 se determinaron mediante la identificación de clones genómicos, seguida del secuenciamiento de las uniones de intrones/exones. El primer intrón yace entre el residuo de aminoácidos 56 (Leu) y el residuo 57 (Val) en la Sec. ID. N.º 2, y tiene 115 pares de bases de longitud. El segundo intrón es el más grande, de 4,4 kilobases, y yace entre el residuo de aminoácidos 68 (Glu) y el residuo 69 (Thr) en la Sec. ID. N.º 2. El tercer intrón es de 2,6 kilobases, y yace entre el residuo de aminoácidos 120 (Leu) y el residuo 121 (Thr) en la Sec. ID. N.º 2. El intrón final, de 89 pares de bases, yace entre el residuo de aminoácidos 146 (Lys) y el residuo 147 (Met) en la Sec. ID. N.º 2. El gen completo abarca alrededor de 8 kb.
La estructura del gen del Ligando del zalpha11 es similar a la del gen de la IL-2 (Fujita et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 80:7437-7441, 1983), aunque el gen del Ligando del zalpha11 contiene un intrón adicional (intrón 4). El patrón de un primer intrón corto, y de un segundo y un tercer intrón largos se conserva entre los dos genes, aunque el gen de la IL-2 es levemente más pequeño en general (alrededor de 6 kb). Por otra parte, el gen de la IL-15 consiste en 8 exones y abarca, al menos, 34 kb (Anderson et al. Genomics 25:701-706, 1995). Por ende, el gen del Ligando del zalpha11 es más similar en su estructura al gen de la IL-2 que al gen de la IL-15.
Las moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el Ligando del zalpha11 pueden hibridarse en condiciones rigurosas con moléculas de ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. N.º 1, a moléculas de ácido nucleico con la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 47 a 532 de la SEC. ID. N.º 1, o a moléculas de ácido nucleico con una secuencia de nucleótidos complementaria a la SEC. ID. N.º 1. En general, las condiciones rigurosas se seleccionan para ser alrededor de 5\betaºC inferiores al punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica a una concentración iónica y un pH definidos. El Tm es la temperatura (a una concentración iónica y un pH definidos) a la cual el 50% de la secuencia de acceso se hibrida con una sonda que coincide perfectamente.
Un par de moléculas de ácido nucleico, por ejemplo, ADN-ADN, ARN-ARN y ADN-ARN, puede hibridarse si las secuencias de nucleótidos tienen cierto grado de complementariedad. Los híbridos pueden tolerar pares de bases con faltas de coincidencia en la doble hélice, pero la estabilidad del híbrido se ve influenciada por el grado de falta de coincidencia. El Tm del híbrido no coincidente disminuye 1ºC por cada 1 a 1,5% de falta de coincidencia en los pares de bases. Variar la rigurosidad de las condiciones de la hibridación permite controlar el grado de falta de coincidencia que se presentará en el híbrido. El grado de rigurosidad aumenta a medida que aumenta la temperatura de hibridación y disminuye la concentración iónica de la solución amortiguadora de hibridación.
Un especialista en la materia cuenta con la capacidad suficiente para adaptar estas condiciones para usarlas con el híbrido de un polinucleótido en particular. El T_{m} para una secuencia de acceso específica es la temperatura (en condiciones definidas) a la cual el 50% de la secuencia de acceso se hibridará a una secuencia de sondas que coincide perfectamente. Las condiciones que influyen en el T_{m} incluyen el tamaño y el contenido de pares de bases de la sonda de polinucleótidos, la concentración iónica de la solución de hibridación y la presencia de agentes desestabilizantes en la solución de hibridación. Se conocen en la especialidad numerosas ecuaciones para calcular el T_{m}, y estas son específicas para híbridos de ADN, ARN y ADN-ARN y secuencias de sondas de polinucleótidos de longitud variable (véanse, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel et al., (ed.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Inc. 1987); Berger y Kimmel (ed.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academic Press, Inc. 1987); y Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227 (1990)). Existe software para análisis de secuencias, por ejemplo, OLIGO 6.0 (LSR; Long Lake, MN) y Primer Premier 4.0 (Premier Biosoft International; Palo Alto, CA), así como sitios en internet, para analizar una secuencia dada y calcular el T_{m} en función de criterios definidos por el usuario. Dichos programas también analizan una secuencia dada en condiciones definidas e identifican secuencias de sondas adecuadas. Habitualmente, la hibridación de secuencias de polinucleótidos más largas, >50 pares de bases, se realiza a temperaturas de alrededor de entre 20 y 25ºC por debajo del T_{m} calculado. Para sondas más pequeñas, <50 pares de bases, la hibridación habitualmente se lleva a cabo al T_{m} o entre 5 y 10ºC por debajo del T_{m} calculado. Esto brinda la máxima tasa de hibridación para híbridos de ADN-ADN y ADN-ARN.
Después de la hibridación, las moléculas de ácido nucleico pueden lavarse para eliminar las moléculas de ácido nucleico no hibridadas en condiciones rigurosas o en condiciones muy rigurosas. Las condiciones de lavado rigurosas habituales incluyen lavado en una solución de 0,5x-2x SSC con dodecil sulfato de sodio (sodium dodecyl sulfate, SDS) al 0,1% a 55-65ºC. A manera de ejemplo, las moléculas de ácido nucleico que codifican una variante del polipéptido del Ligando del zalpha11 se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. N.º 1 (o su complemento) en condiciones de lavado rigurosas, en las cuales la rigurosidad del lavado es equivalente a 0,5x-2x SSC con SDS al 0,1% a 55-65ºC e incluye 0,5x SSC con SDS al 0,1% a 55ºC, o 2x SSC con SDS al 0,1% a 65ºC. Un especialista en la materia puede fácilmente idear condiciones equivalentes, por ejemplo, sustituyendo SSC por SSPE en la solución de lavado.
Las condiciones de lavado muy rigurosas habituales incluyen el lavado en una solución de 0,1x-0,2x SSC con dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1% a 50-65ºC. En otras palabras, las moléculas de ácido nucleico que codifican una variante del polipéptido del Ligando del zalpha11 se hibridan con una molécula de ácido nucleico que consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. N.º 1 (o su complemento) en condiciones de lavado muy rigurosas, en las cuales la rigurosidad del lavado es equivalente a 0,1x-0,2x SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC e incluye 0,1x SSC con SDS al 0,1% a 50ºC o 0,2x SSC con SDS al 0,1% a 65ºC.
La presente invención también proporciona polipéptidos del Ligando del zalpha11 aislados que tienen una identidad de secuencias sustancialmente similar a los polipéptidos de la SEC. ID. N.º 2, donde el polipéptido se une a un receptor zalpha11 como se muestra en la SEC. ID. N.º 115. El término "identidad de secuencias sustancialmente similar" se utiliza en la presente para denotar polipéptidos que comprenden una identidad de secuencias de, al menos, un 90%; al menos, un 95% o del 100% con las secuencias que se muestran en la SEC. ID. N.º 2. La presente invención también incluye polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencias de, al menos, un 90% o, al menos, un 95% con las secuencias de los residuos de aminoácidos 32 a 162 de la SEC. ID. N.º 2, donde el polipéptido se une a un receptor zalpha11 como se muestra en la SEC. ID. N.º 115. La presente invención también incluye moléculas de ácido nucleico que codifican dichos polipéptidos. A continuación se describen métodos para determinar el porcentaje de identidad.
Las variantes de las moléculas de ácido nucleico del Ligando del zalpha11 pueden identificarse aplicando dos criterios: una determinación de la similitud entre el polipéptido codificado con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.º 2 y/o una valoración de hibridación, según lo descrito anteriormente. Dichas variantes del Ligando del zalpha11 incluyen las moléculas de ácido nucleico: (1) que se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. N.º 1 (o su complemento) en condiciones de lavado rigurosas, en las cuales la rigurosidad del lavado es equivalente a 0,5x-2x SSC con SDS al 0,1% a 55-65ºC; o (2) que codifican un polipéptido que tiene una identidad de secuencias de, al menos, un 70%; al menos, un 80%; al menos, un 90%; al menos, un 95% o mayor del 95% con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.º 2. Como alternativa, las variantes del Ligando del zalpha11 pueden caracterizarse como moléculas de ácido nucleico: (1) que se hibridan con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. N.º 1 (o su complemento) en condiciones de lavado muy rigurosas, en las cuales la rigurosidad del lavado es equivalente a 0,1x-0,2x SSC con SDS al 0,1% a 50-65ºC; y (2) que codifican un polipéptido que tiene una identidad de secuencias de, al menos, un 70%; al menos, un 80%; al menos, un 90%; al menos, un 95% o mayor del 95% con la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.º 2.
El porcentaje de identidad de secuencias se determina por métodos convencionales. Véanse, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48:603 (1986), y Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992). En resumen, dos secuencias de aminoácidos se alinean para optimizar los puntajes de alineamiento utilizando una penalización por apertura de gap de 10, una penalización por extensión de gap de 1 y la matriz de puntuación "blosum62" de Henikoff y Henikoff (ibid.) como se muestra en la Tabla 4 (los aminoácidos se indican con códigos estándar de una sola
letra).
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Cantidad total de coincidencias idénticas\+\cr 
-------------------------------------------------------------------------------------------------
\+ x 100\cr  [longitud de la secuencia más larga más cantidad de
gaps introducidos\+\cr  en la secuencia más larga para alinear las
dos
secuencias]\+\cr}
TABLA 4
4
Los especialistas en la materia apreciarán que existen muchos algoritmos establecidos para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método de alineamiento de proteínas adecuado para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos divulgada en la presente y la secuencia de aminoácidos de una variante putativa del Ligando del zalpha11. El algoritmo FASTA ha sido descrito por Pearson y Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), y por Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).
En resumen, el FastA primero caracteriza la similitud entre secuencias identificando las regiones compartidas por la secuencia de consulta (p. ej. SEC. ID. N.º 2) y una secuencia de prueba que tienen la mayor densidad de identidades (si la variable ktup es 1) o pares de identidades (si ktup=2), sin tener en cuenta sustituciones, inserciones o deleciones conservadoras de aminoácidos. Luego, se vuelven a puntuar las diez regiones con la mayor densidad de identidades comparando la similitud de todos los aminoácidos apareados mediante una matriz de sustitución de aminoácidos, y se "recortan" los extremos de las regiones para incluir únicamente aquellos residuos que contribuyan a la mayor puntuación. Si hay varias regiones con puntajes mayores que el valor de "corte" (calculado mediante una fórmula predeterminada en función de la longitud de la secuencia y el valor de ktup), las regiones iniciales recortadas se examinan para determinar si pueden unirse para formar un alineamiento aproximado con gaps. Finalmente, las regiones con la mayor puntuación de las dos secuencias de aminoácidos se alinean mediante una modificación del algoritmo de Needleman-Wunsch-Sellers (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26:787 (1974)), que permite las inserciones y deleciones de aminoácidos. Los parámetros preferidos del análisis por el método FASTA son: ktup=1, penalización por apertura de gap=10, penalización por extensión de gap=1 y matriz de sustitución=blosum62. Estos parámetros pueden introducirse en un programa FASTA modificando el archivo de la matriz de puntuación ("SMATRIX"), como se explica en el Anexo 2 de Pearson, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).
El FASTA también puede utilizarse para determinar la identidad de secuencias de moléculas de ácido nucleico utilizando una relación, tal como se ha divulgado más arriba. Para las comparaciones de secuencias de nucleótidos, el valor de ktup puede variar entre uno y seis; preferentemente entre tres y seis; más preferentemente tres, con los demás parámetros fijados como predeterminados.
Las variantes de los polipéptidos del Ligando del zalpha11, o los polipéptidos con una identidad de secuencias sustancialmente similar, se caracterizan por tener una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferentemente de una naturaleza menor, es decir, sustituciones conservadoras de aminoácidos (véase la Tabla 5) y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegamiento ni la actividad del polipéptido; deleciones pequeñas, habitualmente de entre aproximadamente uno y 30 aminoácidos; y extensiones amino o carboxilo terminales, como un residuo de metionina amino terminal, un péptido ligador pequeño de aproximadamente 20-25 residuos como máximo, o una etiqueta de afinidad. Por lo tanto, la presente invención incluye polipéptidos que comprenden una secuencia que es, al menos, un 90% o, al menos, un 95% idéntica a la región correspondiente de la SEC. ID. N.º 2, donde el polipéptido se une a un receptor zalpha11, como se muestra en la SEC. ID. N.º 115. Los polipéptidos que comprenden etiquetas de afinidad también pueden comprender un sitio de segmentación proteolítica entre el polipéptido del Ligando del zalpha11 y la etiqueta de afinidad. Dichos sitios incluyen sitios de segmentación de trombina y sitios de segmentación del factor Xa.
TABLA 5 Sustituciones conservadoras de aminoácidos
Básica:
arginina
\quad
lisina
\quad
histidina
Ácida:
ácido glutámico
\quad
ácido aspártico
Polar:
glutamina
\quad
asparragina
Hidrófoba:
leucina
\quad
isoleucina
\quad
valina
Aromática:
fenilalanina
\quad
triptófano
\quad
tirosina
Pequeña:
glicina
\quad
alanina
\quad
serina
\quad
treonina
\quad
metionina
\vskip1.000000\baselineskip
Puede realizarse una determinación de los residuos de aminoácidos que comprenden regiones o dominios que son fundamentales para mantener la integridad estructural. Dentro de estas regiones, se pueden determinar los residuos específicos que serán más o menos tolerantes al cambio y mantendrán la estructura terciaria general de la molécula. Los métodos para analizar la estructura de la secuencia incluyen, a modo de ejemplo, el alineamiento de múltiples secuencias con alta identidad de aminoácidos o nucleótidos, propensiones de estructura secundaria, patrones binarios, compactación complementaria e interacciones polares ocultas (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995 y Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6:3-10, 1996). En general, al diseñar modificaciones a moléculas o identificar fragmentos específicos, la determinación de la estructura estará acompañada por la evaluación de la actividad de las moléculas modificadas.
Se realizan cambios en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos del Ligando del zalpha11, a fin de minimizar la alteración de la estructura de orden superior esencial para la actividad biológica. Por ejemplo, cuando el polipéptido del Ligando del zalpha11 comprende una o más hélices, se realizarán cambios en los residuos de aminoácidos, de forma tal de no alterar la geometría de las hélices y otros componentes de la molécula donde los cambios en la conformación disminuyan alguna función fundamental, por ejemplo, la unión de la molécula a sus elementos de unión, p. ej. las hélices A y D, los residuos 44, 47 y 135 de la SEC. ID. N.º 2. Los efectos de los cambios en la secuencia de aminoácidos pueden predecirse, por ejemplo, mediante el uso de modelos de ordenador como se divulga más arriba, o pueden determinarse mediante el análisis de la estructura de cristales (véase, p. ej. Lapthorn et al., Nat. Struct. Biol. 2:266-268, 1995). Otras técnicas bien conocidas por los especialistas en la materia comparan el plegamiento de una variante de proteína con una molécula estándar (p. ej. la proteína originaria). Por ejemplo, puede realizarse una comparación del patrón de cisteínas en una variante de las moléculas y en moléculas estándar. La espectrometría de masas y la modificación química que utilizan la reducción y la alquilación proporcionan métodos para determinar residuos de cisteína asociados con las uniones disulfuro o libres de dichas asociaciones (Bean et al., Anal. Biochem. 201:216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2:1732-1748, 1993; y Patterson et al., Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). Generalmente, se cree que si una molécula modificada no tiene el mismo patrón de cisteínas que la molécula estándar, el plegamiento podría verse afectado. Otro método bien conocido y aceptado para la medición del plegamiento es el dicroísmo circular (circular dichrosism, CD). La medición y comparación del espectro del CD generado por una molécula modificada y una molécula estándar es el procedimiento de rutina (Johnson, Proteins 7:205-214, 1990). La cristalografía es otro método bien conocido para el análisis del plegamiento y la estructura. La resonancia magnética nuclear (nuclear magnetic resonance, NMR), el mapeo de péptidos digestivos y el mapeo de epítopos también son métodos conocidos para el análisis de las similitudes en cuanto al plegamiento y la estructura entre las proteínas y los polipéptidos (Schaanan et al., Science 257:961-964, 1992).
Puede generarse un perfil de hidrofilicidad de Hopp/Woods de la secuencia de proteínas del Ligando del zalpha11 como se muestra en la SEC. ID. N.º 2 (Hopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88:1-18, 1986 y Triquier et al., Protein Engineering 11:153-169, 1998). El perfil se basa en una ventana desplazable de seis residuos. Se ignoraron los residuos ocultos G, S y T, y los residuos expuestos H, Y y W. Por ejemplo, en el Ligando del zalpha11, las regiones hidrófilas incluyen los residuos de aminoácidos 114-119 de la SEC. ID. N.º 2, los residuos de aminoácidos 101-105 de la SEC. ID. N.º 2, los residuos de aminoácidos 126-131 de la SEC. ID. N.º 2, los residuos de aminoácidos 113-118 de la SEC. ID. N.º 2 y los residuos de aminoácidos 158-162 de la SEC. ID. N.º 2.
Los especialistas en la materia reconocerán que la hidrofilicidad o hidrofobicidad se tomarán en cuenta al diseñar modificaciones en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido del Ligando del zalpha11, de forma tal de no alterar el perfil estructural y biológico general. De particular interés para el reemplazo son los residuos hidrófobos seleccionados del grupo que consiste en Val, Leu e Ile, o el grupo que consiste en Met, Gly, Ser, Ala, Tyr y Trp. Por ejemplo, los residuos tolerantes a la sustitución podrían incluir los residuos 100 y 103, como se muestra en la SEC. ID. N.º 2. Los residuos de cisteína en las posiciones 71, 78, 122 y 125 de la SEC. ID. N.º 2 serán relativamente intolerantes a la sustitución.
Las identidades de aminoácidos esenciales también pueden inferirse a partir del análisis de la similitud de secuencias entre la IL-15, la IL-2, la IL-4 y el GM-CSF y el Ligando del zalpha11. Mediante el uso de métodos como el análisis "FASTA" descrito anteriormente, se identifican regiones de alta similitud dentro de una familia de proteínas y se las utiliza para analizar la secuencia de aminoácidos a fin de detectar las regiones conservadas. Un enfoque alternativo a la identificación de una variante del polinucleótido del Ligando del zalpha11 en función de la estructura es determinar si una molécula de ácido nucleico que codifica una posible variante del gen del Ligando del zalpha11 puede hibridarse con una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. N.º 1, como se analizó anteriormente.
Otros métodos para identificar los aminoácidos esenciales de los polipéptidos de la presente invención son los procedimientos conocidos en la especialidad, como la mutagénesis sitio dirigida o mutagénesis por cribaje de alanina (Cunningham y Wells, Science 244:1081 (1989), Bass et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 88:4498 (1991), Coombs y Corey, "Site-Directed Mutagenesis and Protein Engineering", en Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En esta última técnica, se introducen mutaciones únicas de alanina en cada residuo de la molécula y se prueban las moléculas mutantes resultantes a fin de determinar su actividad biológica o bioquímica como se divulga a continuación, para identificar residuos de aminoácidos que resultan fundamentales para la actividad de la molécula. Véase también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271:4699 (1996).
Existen fragmentos funcionales de los polipéptidos del Ligando del zalpha11 y moléculas de ácido nucleico que codifican dichos fragmentos funcionales. Un Ligando del zalpha11 "funcional", o un fragmento de este, según lo definido en la presente, se caracteriza por su actividad proliferativa o de diferenciación, por su capacidad de inducir o inhibir funciones celulares especializadas, o por su capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo contra el Ligando del zalpha11 o un receptor zalpha11 (ya sea soluble o inmovilizado). Como se describió previamente en la presente, el Ligando del zalpha11 se caracteriza por una estructura con haz de cuatro hélices que comprende la hélice A (residuos de aminoácidos 41-56), la hélice B (residuos de aminoácidos 69-84), la hélice C (residuos de aminoácidos 92-105) y la hélice D (residuos de aminoácidos 135-148), como se muestra en la SEC. ID. N.º 2. Por ende, las proteínas de fusión pueden abarcar: (a) moléculas de polipéptidos que comprenden una o más de las hélices descritas anteriormente; y (b) fragmentos funcionales que comprenden una o más de estas hélices. A la otra porción de polipéptidos de la proteína de fusión se le puede agregar otra citocina con haz de cuatro hélices, como la IL-15, la IL-2, la IL-4 y el GM-CSF, o un péptido señal de secreción no originaria y/o no relacionado que facilite la secreción de la proteína de fusión.
Por ende, las proteínas de fusión pueden comprender, al menos, cuatro polipéptidos, donde el orden de los polipéptidos desde el N terminal hasta el C terminal es el siguiente: un primer polipéptido comprende aminoácidos seleccionados de un grupo que consiste en: (a) los residuos de aminoácidos 36-46 de la hélice A de la IL-2 de la SEC. ID. N.º 111; (b) los residuos de aminoácidos 29-43 de la hélice A de la IL-15 de la SEC. ID. N.º 112; (c) los residuos de aminoácidos 45-68 de la hélice A de la IL-4 de la SEC. ID. N.º 113; (d) los residuos de aminoácidos 30-44 de la hélice A del GM-CSF de la SEC. ID. N.º 114; y (e) los residuos de aminoácidos 41 a 56 de la SEC. ID. N.º 2; un primer espaciador de 6-27 aminoácidos; y un segundo polipéptido que comprende residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: (a) los residuos de aminoácidos 53-75 de la hélice B de la IL-2 de la SEC. ID. N.º 111; (b) los residuos de aminoácidos 65-83 de la hélice B de la IL-4 de la SEC. ID. N.º 112; (c) los residuos de aminoácidos 84-101 de la hélice B de la IL-15 de la SEC. ID. N.º 113; (d) los residuos de aminoácidos 72-81 de la hélice B del GM-CSF de la SEC. ID. N.º 114; y (e) los residuos de aminoácidos 69-84 de la SEC. ID. N.º 2; un segundo espaciador de 5-11 residuos de aminoácidos; un tercer polipéptido que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: (a) los residuos 87-99 de la hélice C de la IL-2 de la SEC. ID. N.º 111; (b) los residuos 95-118 de la hélice C de la IL-4 de la SEC. ID. N.º 112; (c) los residuos 107-119 de la hélice C de la IL-15 de la SEC. ID. N.º 113; (d) los residuos 91-102 de la hélice C del GM-CSF de la SEC. ID. N.º 114; y (e) los residuos de aminoácidos 92-105 de la SEC. ID. N.º 2; un tercer espaciador de 3-29 residuos de aminoácidos; y un cuarto polipéptido que comprende residuos de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: (a) los residuos de aminoácidos 103-121 de la hélice D de la IL-2 de la SEC. ID. N.º 111; (b) los residuos de aminoácidos 134-157 de la hélice D de la IL-15 de la SEC. ID. N.º 112; (c) los residuos de aminoácidos 134-160 de la hélice D de la IL-4 de la SEC. ID. N.º 113; (d) los residuos de aminoácidos 120-131 de la hélice D del GM-CSF de la SEC. ID. N.º 114; y (e) los residuos de aminoácidos 135-148 de la SEC. ID. N.º 2, donde, al menos, uno de los cuatro polipéptidos es del Ligando del zalpha11. En otras aplicaciones, los péptidos espaciadores se seleccionarán de las asas A/B, B/C y C/D del Ligando del zalpha11, la IL-2, la IL-4, la IL-15 o el GM-CSF, como se muestra en la Tabla 1.
Se pueden realizar análisis de deleción de rutina de moléculas de ácido nucleico para obtener fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del Ligando del zalpha11. A manera de ejemplo, las moléculas de ADN con la secuencia de nucleótidos de la SEC. ID. N.º 1 o fragmentos de esta pueden digerirse con Bal31 nucleasa para obtener una serie de deleciones anidadas. Estos fragmentos de ADN se insertan luego en vectores de expresión en un marco de lectura adecuado, y los polipéptidos expresados se aíslan y se prueban para determinar la actividad del Ligando del zalpha11, o para determinar la capacidad de unirse a anticuerpos contra el Ligando del zalpha11 o al receptor zalpha11. Una alternativa a la digestión con exonucleasas es usar mutagénesis oligonucleótido dirigida para introducir deleciones o codones de terminación para especificar la producción de un fragmento deseado del Ligando del zalpha11. Como alternativa, pueden sintetizarse fragmentos particulares de un gen del Ligando del zalpha11 utilizando la reacción en cadena de la polimerasa.
Los métodos estándar para identificar dominios funcionales son bien conocidos por los especialistas en la materia. Por ejemplo, los estudios del truncamiento en cualquiera de los terminales de los interferones han sido resumidos por Horisberger y Di Marco, Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Además, las técnicas estándar para el análisis funcional de las proteínas han sido descritas, por ejemplo, por Treuter et al., Molec. Gen. Genet. 240:113 (1993); Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon", en Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.), páginas 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor", en Control of Animal Cell Proliferation 1, Boynton et al., (ed.) páginas 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270:25291 (1995); Yamaguchi et al., Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995); y Meisel et al., Plant Molec. Biol. 30:1 (1996).
Se pueden realizar múltiples sustituciones de aminoácidos y probarlas utilizando métodos conocidos de mutagénesis y cribaje, como los divulgados por Reidhaar-Olson y Sauer (Science 241:53 (1988)) o Bowie y Sauer (Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:2152 (1989)). En resumen, estos autores divulgan métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionar el polipéptido funcional y, luego, secuenciar los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones admisibles en cada posición. Otros métodos que se pueden utilizar incluyen la exhibición de fagos (p. ej. Lowman et al., Biochem. 30:10832 (1991), Ladner et al., Patente de EE. UU. N.º 5.223.409, Huse, publicación internacional N.º WO 92/06204), y la mutagénesis región dirigida (Derbyshire et al., Gene 46:145 (1986) y Ner et al., DNA 7:127, (1988)).
También pueden generarse variantes de las secuencias de nucleótidos y polipéptidos del Ligando del zalpha11 divulgadas a través de la transposición de secuencias de ADN, según lo divulgado por Stemmer, Nature 370:389 (1994), Stemmer, Proc. Natl Acad. Sci. USA 91:10747 (1994) y la publicación internacional N.º WO 97/20078. En resumen, se generan variantes de moléculas de ADN por recombinación homóloga in vitro por fragmentación aleatoria de un ADN progenitor, seguida de reensamblaje mediante PCR, lo cual da como resultado mutaciones puntuales introducidas al azar. Esta técnica puede modificarse utilizando una familia de moléculas de ADN progenitoras, por ejemplo, variantes alélicas o moléculas de ADN de diferentes especies para introducir variabilidad adicional en el proceso. La selección o el cribaje para la actividad deseada, seguidos de repeticiones adicionales de mutagénesis y valoración, proporcionan la "evolución" rápida de las secuencias seleccionando las mutaciones deseables y, a la vez, seleccionando contra los cambios perjudiciales.
Los métodos de mutagénesis divulgados en la presente pueden combinarse con métodos de cribaje automatizados de alta productividad para detectar la actividad de polipéptidos mutagenizados clonados en células huésped. Las moléculas de ADN mutagenizado que codifican polipéptidos biológicamente activos o polipéptidos que se unen a anticuerpos contra el Ligando del zalpha11 o al receptor zalpha11 soluble se pueden recuperar de las células huésped y secuenciar rápidamente con equipos modernos. Estos métodos permiten determinar rápidamente la importancia de residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.
Además, las proteínas de la presente invención (o los fragmentos de sus polipéptidos) pueden unirse a otras moléculas bioactivas, particularmente a otras citocinas, para proporcionar moléculas multifuncionales. Por ejemplo, una o más hélices del Ligando del zalpha11 pueden unirse a otras citocinas para potenciar sus propiedades biológicas o la eficiencia de la producción.
Puede crearse una serie de nuevas moléculas híbridas en las que un segmento que comprende una o más de las hélices del Ligando del zalpha11 se fusiona con otro polipéptido. La fusión puede realizarse mediante empalme a nivel del ADN para permitir la expresión de moléculas quiméricas en sistemas de producción recombinante. Las moléculas resultantes pueden luego analizarse para determinar propiedades tales como la mejora de la solubilidad, la mejora de la estabilidad, la prolongación de la vida media de la depuración, la mejora de la expresión y los niveles de secreción, y la farmacodinamia. Dichas moléculas híbridas pueden además comprender residuos de aminoácidos adicionales (p. ej. un ligador polipeptídico) entre las proteínas o polipéptidos componentes.
Los aminoácidos no naturales, incluyen, a modo de ejemplo, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, tiazolidina, ácido carboxílico, deshidroprolina, 3- y 4-metilprolina, 3,3-dimetilprolina, ter-leucina norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4-fluorofenilalanina. En la especialidad, se conocen varios métodos para incorporar residuos de aminoácidos no naturales a las proteínas. Por ejemplo, puede utilizarse un sistema in vitro donde se supriman las mutaciones terminadoras utilizando ARNt supresores químicamente aminoacilados. Los métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt son conocidos en la especialidad. La transcripción y la traducción de plásmidos que contienen mutaciones terminadoras habitualmente se realizan en un sistema sin células que comprende un extracto de E. coli S30 y enzimas y otros reactivos disponibles comercialmente. Las proteínas se purifican por cromatografía. Véanse, por ejemplo, Robertson et al.,J. Am. Chem. Soc. 113:2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301 (1991), Chung et al., Science 259:806 (1993) y Chung et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:10145 (1993).
En un segundo método, la traducción se realiza en ovocitos de Xenopus por microinyección de ARNm mutado y ARNt supresores químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991 (1996)). Dentro de un tercer método, se cultivan células de E. coli en ausencia de un aminoácido natural, que debe ser reemplazado (p. ej. fenilalanina), y en presencia de los aminoácidos no naturales deseados (p. ej. 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina o 4-fluorofenilalanina). El aminoácido no natural se incorpora a la proteína en lugar de su contraparte natural. Véase Koide et al., Biochem. 33:7470 (1994). Los residuos de aminoácidos naturales pueden convertirse en especies no naturales mediante modificación química in vitro. La modificación química puede combinarse con mutagénesis sitio dirigida para ampliar aún más la gama de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2:395 (1993). Es posible que sea ventajoso estabilizar el Ligando del zalpha11 para extender la vida media de la molécula, particularmente para extender la persistencia metabólica en un estado activo. Para lograr una vida media más extensa, las moléculas del Ligando del zalpha11 pueden modificarse químicamente utilizando los métodos descritos en la presente. La PEGilación es un método usado comúnmente que se ha demostrado que aumenta la vida media plasmática, aumenta la solubilidad, y disminuye la antigenicidad y la inmunogenicidad (Nucci et al., Advanced Drug Delivery Reviews 6:133-155, 1991 y Lu et al., Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138, 1994).
Los residuos de aminoácidos del Ligando del zalpha11 pueden sustituir a una cantidad limitada de aminoácidos no conservadores, aminoácidos no codificados por el código genético, aminoácidos no naturales y aminoácidos contranaturales.
Los fragmentos de polipéptidos o los péptidos pueden comprender una porción portadora de epítopos de un polipéptido del Ligando del zalpha11 descrito en la presente. Dichos fragmentos o péptidos pueden comprender un "epítopo inmunógeno", que es parte de una proteína que produce una respuesta de anticuerpos cuando se utiliza toda la proteína como inmunógeno. Los péptidos portadores de epítopos inmunógenos pueden identificarse con métodos estándar (véase, por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:3998 (1983)).
En contraposición, los fragmentos de polipéptidos o péptidos pueden comprender un "epítopo antigénico", que es una región de una molécula proteica a la cual se puede unir específicamente un anticuerpo. Determinados epítopos consisten en un tramo lineal o contiguo de aminoácidos, y la antigenicidad de dichos epítopos no es alterada por los agentes desnaturalizantes. Se sabe en la especialidad que pueden utilizarse péptidos sintéticos relativamente cortos capaces de imitar los epítopos de una proteína para estimular la producción de anticuerpos contra la proteína (véase, por ejemplo, Sutcliffe et al., Science 219:660 (1983)). En consecuencia, los péptidos y polipéptidos antigénicos portadores de epítopos de la presente invención resultan útiles para cultivar anticuerpos que se unan a los polipéptidos descritos en la presente. Los perfiles de hidrofilicidad de Hopp/Woods pueden utilizarse para determinar las regiones que tienen el mayor potencial antigénico (Hopp et al., 1981, ibid. y Hopp, 1986, ibid.). En el Ligando del zalpha11, estas regiones incluyen: los residuos de aminoácidos 114-119, 101-105, 126-131, 113-118 y 158-162 de la SEC. ID. N.º 2.
Los péptidos y polipéptidos antigénicos portadores de epítopos pueden contener, al menos, entre cuatro y diez aminoácidos; al menos, entre diez y catorce aminoácidos; o entre alrededor de catorce y alrededor de treinta aminoácidos de la SEC. ID. N.º 2 o la SEC. ID. N.º 56. Dichos péptidos y polipéptidos portadores de epítopos pueden producirse fragmentando un polipéptido del Ligando del zalpha11, o por síntesis química de péptidos, tal como se describe en la presente. Además, los epítopos pueden seleccionarse por exhibición de fagos de bibliotecas de péptidos al azar (véanse, por ejemplo, Lane y Stephen, Curr. Opin. Immunol. 5:268 (1993); y Cortese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7:616 (1996)). Los métodos estándar para identificar epítopos y producir anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epítopo son descritos, por ejemplo, por Mole, "Epitope Mapping", en Methods in Molecular Biology, vol. 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies", en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (ed.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995) y Coligan et al. (ed.), Current Protocols in Immunology, páginas 9.3.1-9.3.5 y páginas 9.4.1-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997).
Independientemente de la secuencia de nucleótidos específica de una variante del polinucleótido del Ligando del zalpha11, el polinucleótido codifica un polipéptido que se caracteriza por su actividad proliferativa o de diferenciación, por su capacidad de inducir o inhibir funciones celulares especializadas, o por la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo contra el Ligando del zalpha11 o un receptor zalpha11. Los polinucleótidos de variantes del Ligando del zalpha11 pueden codificar polipéptidos que muestran, al menos, un 50% y, preferentemente, mayor del 70%, 80% ó 90% de la actividad del polipéptido, como se muestra en la SEC. ID. N.º 2.
Para cualquier polipéptido del Ligando del zalpha11, incluidas las variantes y las proteínas de fusión, una persona con conocimientos generales de la materia puede generar fácilmente una secuencia de polinucleótido totalmente degenerada que codifica dicha variante utilizando la información presentada en las Tablas 1 y 2 más arriba.
Existen varias otras fusiones de polipéptidos (y proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones de polipéptidos). Por ejemplo, un polipéptido del Ligando del zalpha11 puede prepararse como fusión con una proteína dimerizante, según se divulga en las patentes de EE. UU. N.º 5.155.027 y 5.567.584. Las proteínas dimerizantes preferidas en tal sentido incluyen dominios de regiones constantes de inmunoglobulina. Las fusiones de inmunoglobulina-polipéptido del Ligando del zalpha11 pueden expresarse en células producidas por genomanipulación (para producir una variedad de análogos multiméricos del Ligando del zalpha11). Los dominios auxiliares pueden fusionarse con los polipéptidos del Ligando del zalpha11 para dirigirlos a células, tejidos o macromoléculas específicos. Por ejemplo, un polipéptido o proteína del Ligando del zalpha11 podría ser dirigido a un tipo celular predeterminado mediante la fusión de un polipéptido del Ligando del zalpha11 con un ligando que se une específicamente a un receptor que se encuentra en la superficie de esa célula diana. De esta manera, los polipéptidos y las proteínas pueden ser dirigidas con fines terapéuticos o de diagnóstico. Un polipéptido del Ligando del zalpha11 puede fusionarse con dos o más fracciones, tales como una etiqueta de afinidad para purificación y un dominio de acceso. Las fusiones de polipéptidos también pueden comprender uno o más sitios de segmentación, en particular entre dominios. Véase Tuan et al., Connective Tissue Research 34:1-9, 1996.
Mediante el uso de los métodos analizados en la presente, una persona con conocimientos generales de la materia puede identificar y/o preparar una serie de polipéptidos que tengan una identidad de secuencias sustancialmente similar a los residuos 32-162 de la SEC. ID. N.º 2, o fragmentos funcionales y fusiones de estos, donde dichos polipéptidos, o fragmentos o fusiones, conservan las propiedades de la proteína genéticamente intacta, como la capacidad de estimular la proliferación y la diferenciación, inducir la función celular especializada, o unirse al receptor zalpha11 o a los anticuerpos contra el Ligando del zalpha11.
Los polipéptidos del Ligando del zalpha11 de la presente invención, pueden producirse en células huésped producidas por genomanipulación de acuerdo con las técnicas convencionales. Las células huésped adecuadas son aquellos tipos celulares que pueden transformarse o transfectarse con ADN exógeno y hacerse crecer en medio de cultivo, e incluyen células bacterianas, células fúngicas y células eucariotas superiores cultivadas. Se prefieren células eucariotas, particularmente, las células cultivadas de organismos multicelulares. Las técnicas para manipular moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en diversas células huésped han sido divulgadas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2.a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.
En general, una secuencia de ADN que codifica un polipéptido del Ligando del zalpha11 se liga operablemente a otros elementos genéticos necesarios para su expresión, entre los que generalmente se incluyen un promotor y un terminador de la transcripción, dentro de un vector de expresión. Por lo general, el vector también contendrá uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque los especialistas en la materia reconocerán que dentro de determinados sistemas pueden proporcionarse marcadores seleccionables en vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede proporcionarse mediante la integración dentro del genoma de la célula huésped. La selección de promotores, terminadores, marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es una cuestión de diseño de rutina dentro de los conocimientos generales de la materia. Muchos de estos elementos se describen en la bibliografía y están disponibles a través de proveedores comerciales.
Para dirigir un polipéptido del Ligando del zalpha11 hacia la vía de secreción de una célula huésped, se proporciona una secuencia señal de secreción (también conocida como secuencia líder, secuencia prepro o presecuencia) en el vector de expresión. La secuencia señal de secreción puede ser la del Ligando del zalpha11, o puede derivarse de otra proteína segregada (p. ej. t-PA) o sintetizarse de novo. La secuencia señal de secreción está ligada operablemente a la secuencia de ADN del Ligando del zalpha11, es decir, ambas secuencias están unidas en el marco de lectura adecuado y posicionadas para dirigir el polipéptido nuevo sintetizado hacia la vía de secreción de la célula huésped. Las secuencias señal de secreción comúnmente están en posición 5' con respecto a la secuencia de ADN que codifica el polipéptido de interés, aunque determinadas secuencias señal de secreción pueden estar posicionadas en otro lugar de la secuencia de ADN de interés (véanse, p. ej. Welch et al., Patente de EE. UU. N.º 5.037.743; Holland et al., Patente de EE. UU. N.º 5.143.830).
Como alternativa, la secuencia señal de secreción contenida en los polipéptidos de la presente invención se usa para dirigir otros polipéptidos hacia la vía de secreción. Puede crearse un polipéptido señal de fusión en el cual una secuencia señal de secreción derivada de los residuos de aminoácidos 1-31 de la SEC. ID. N.º 2 se liga operablemente a una secuencia de ADN que codifica otro polipéptido mediante métodos conocidos en la especialidad y divulgados en la presente. La secuencia señal de secreción contenida en los polipéptidos de fusión puede fusionarse en la región amino terminal con un péptido adicional para dirigir dicho péptido adicional hacia la vía de secreción. Dichos constructos tienen numerosas aplicaciones conocidas en la especialidad. Por ejemplo, estos constructos de fusión de secuencia señal de secreción pueden dirigir la secreción de un componente activo de una proteína no segregada normalmente. Dichas fusiones pueden usarse in vivo o in vitro para dirigir los péptidos por la vía de secreción.
Las células cultivadas de mamíferos son huéspedes adecuados dentro de la presente invención. Los métodos para introducir ADN exógeno en células huésped de mamíferos incluyen la transfección mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981: Graham y Van der Eb, Virology 52:456, 1973), la electroporación (Neumann et al., EMBO J. 1:841-5, 1982), la transfección mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid.) y la transfección mediada por liposomas (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993, y vectores virales (Miller y Rosman, BioTechniques 7:980-90, 1989; Wang y Finer, Nature Med. 2:714-6, 1996). La producción de polipéptidos recombinantes en células cultivadas de mamíferos ha sido divulgada, por ejemplo, por Levinson et al., Patente de EE. UU. N.º 4.713.339; Hagen et al., Patente de EE. UU. N.º 4.784.950; Palmiter et al., Patente de EE. UU. N.º 4.579.821; y Ringold, Patente de EE. UU. N.º 4.656.134. Las células cultivadas de mamíferos adecuadas incluyen las líneas celulares COS-1 (ATCC N.º CRL 1650), COS-7 (ATCC N.º CRL 1651), BHK (ATCC N.º CRL 1632), BHK 570 (ATCC N.º CRL 10314), 293 (ATCC N.º CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977) y líneas celulares de ovario de hámster chino (p. ej. CHO-K1, ATCC N.º CCL 61). Existen otras líneas celulares adecuadas conocidas en la especialidad y que pueden obtenerse a través de depósitos públicos como la Colección Estadounidense de Cultivos de Tipos (American Type Culture Collection), Manassas, VA. En general, se prefieren los promotores de la transcripción fuertes, como los promotores obtenidos del SV-40 o del citomegalovirus. Véase, p. ej. la Patente de EE. UU. N.º 4.956.288. Otros promotores adecuados incluyen los genes de la metalotioneína (Patentes de EE. UU. N.º 4.579.821 y 4.601.978) y el principal promotor tardío del adenovirus.
Generalmente, se utiliza la selección por fármaco a fin de seleccionar células cultivadas de mamíferos en las que se ha introducido ADN extraño. Dichas células suelen denominarse "transfectantes". Las células que han sido cultivadas en presencia del agente selectivo y pueden pasar el gen de interés a su progenie se denominan "transfectantes estables". Un marcador seleccionable preferido es un gen que codifica la resistencia al antibiótico neomicina. La selección se realiza en presencia de un fármaco del tipo de la neomicina, por ejemplo, el G-418 o un fármaco similar. Los sistemas de selección también pueden usarse para aumentar el nivel de expresión del gen de interés, proceso conocido como "amplificación". La amplificación se realiza cultivando transfectantes en presencia de un nivel bajo del agente selectivo y luego aumentando la cantidad de agente selectivo para seleccionar las células que producen altos niveles de los productos de los genes introducidos. Un marcador seleccionable amplificable preferido es la dihidrofolato reductasa, que confiere resistencia al metotrexato. También pueden utilizarse otros genes de resistencia a fármacos (p. ej. resistencia a la higromicina, resistencia a múltiples fármacos, puromicina acetiltransferasa). Los marcadores alternativos que introducen un fenotipo alterado, como la proteína fluorescente verde o las proteínas de superficie celular, como los CD4, los CD8, el MHC de Clase I y la fosfatasa alcalina placentaria, pueden utilizarse para diferenciar las células transfectadas de las no transfectadas por medios tales como la clasificación FACS o la tecnología de separación con perlas magnéticas.
También pueden utilizarse como huéspedes otras células eucariotas superiores, incluidas células de origen vegetal, células de insectos y células aviares. El uso de la Agrobacterium rhizogenes como vector para expresar los genes en las células de origen vegetal ha sido analizado por Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. La transformación de células de insectos y la producción de polipéptidos extraños en dicho documento han sido divulgadas por Guarino et al., Patente de EE. UU. N.º 5.162.222 y Publicación de la WIPO WO 94/06463. Pueden infectarse células de insectos con baculovirus recombinante, comúnmente derivados del virus de la poliedrosis nuclear múltiple de la Autographa californica (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, AcNPV). Véanse King, L.A. y Possee, R.D., The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Londres, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R. et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Nueva York, Oxford University Press, 1994; y Richardson, C. D., ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. El segundo método para hacer baculovirus recombinantes utiliza un sistema basado en transposones descrito por Luckow (Luckow, V.A, et al., J Virol 67:4566-79, 1993). Este sistema se vende en el equipo Bac-to-Bac (Life Technologies, Rockville, MD). Este sistema utiliza un vector de transferencia, pFastBac1^{TM} (Life Technologies) que contiene un transposón Tn7 para trasladar el ADN que codifica el polipéptido del Ligando del zalpha11 a un genoma de baculovirus mantenido en E. coli como un gran plásmido denominado "bácmido". El vector de transferencia pFastBac1^{TM} utiliza el promotor de la poliedrina AcNPV para dirigir la expresión del gen de interés, en este caso, el Ligando del zalpha11. Sin embargo, el pFastBac1^{TM} puede modificarse en un grado considerable. El promotor de la poliedrina puede eliminarse y sustituirse con el promotor de la proteína básica del baculovirus (conocido también como promotor Pcor, p6.9 o MP), que se expresa más temprano en la infección por baculovirus y se ha demostrado que es ventajoso para expresar proteínas segregadas. Véanse Hill-Perkins, M.S. y Possee, R.D., J. Gen. Virol. 71:971-6, 1990; Bonning, B.C. et al., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994; y Chazenbalk, G.D., y Rapoport, B., J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995. En tales constructos de vectores de transferencia, puede utilizarse una versión corta o larga del promotor de la proteína básica. Además, pueden construirse vectores de transferencia que reemplacen las secuencias señal de secreción originarias del Ligando del zalpha11 con secuencias señal de secreción derivadas de proteínas de insectos. Por ejemplo, puede utilizarse una secuencia señal de secreción de la ecdisteroide glucosiltransferasa (Ecdysteroid Glucosyltransferase, EGT), la melitina de abeja melífera (Invitrogen, Carlsbad, CA) o el baculovirus gp67 (PharMingen, San Diego, CA) en constructos para reemplazar la secuencia señal de secreción originaria del Ligando del zalpha11. Además, los vectores de transferencia pueden incluir una fusión dentro del marco con ADN que codifica una etiqueta de un epítopo en el C terminal o N terminal del polipéptido del Ligando del zalpha11 expresado, por ejemplo, una etiqueta de un epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer, T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82:7952-4, 1985). Utilizando técnicas conocidas en la especialidad, un vector de transferencia que contiene el Ligando del zalpha11 se transforma en E. coli, y se criba para detectar bácmidos, que contienen un gen lacZ interrumpido que indica baculovirus recombinante. El ADN del bácmido que contiene el genoma del baculovirus recombinante se aísla utilizando las técnicas habituales, y se lo utiliza para transfectar las células de Spodoptera frugiperda, p. ej. las células de Sf9. Posteriormente, se produce el virus recombinante que expresa el Ligando del zalpha11. Se elaboran lotes de virus recombinante mediante métodos utilizados comúnmente en la especialidad.
El virus recombinante se utiliza para infectar las células huésped, habitualmente una línea celular derivada del gusano cogollero de otoño, Spodoptera frugiperda. Véase, en general, Glick y Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant ADN, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Otra línea celular adecuada es la línea celular High FiveO^{TM} (Invitrogen) derivada de Trichoplusia ni (Patente de EE. UU. N.º 5.300.435).
Las células fúngicas, incluidas las células de levaduras, también pueden utilizarse dentro de la presente invención. Las especies de levaduras de interés en tal sentido incluyen Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris y Pichia methanolica. Los métodos para transformar células de S. cerevisiae con ADN exógeno y producir polipéptidos recombinantes a partir de ellas son divulgados, por ejemplo, por Kawasaki, Patente de EE. UU. N.º 4.599.311; Kawasaki et al., Patente de EE. UU. N.º 4.931.373; Brake, Patente de EE. UU. N.º 4.870.008; Welch et al., Patente de EE. UU. N.º 5.037.743; y Murray et al., Patente de EE. UU. N.º 4.845.075. Las células transformadas se seleccionan por fenotipo determinado por el marcador seleccionable, comúnmente la resistencia a los fármacos o la capacidad de crecer en ausencia de un nutriente en particular (p. ej. leucina). Un sistema de vectores preferido para usar en Saccharomyces cerevisiae es el sistema de vectores POT1 divulgado por Kawasaki et al. (Patente de EE. UU. N.º 4.931.373), que permite seleccionar las células transformadas por cultivo en un medio que contenga glucosa. Los promotores y terminadores adecuados para usar en levaduras incluyen los genes de enzimas glucolíticas (véanse, p. ej. Kawasaki, Patente de EE. UU. N.º 4.599.311; Kingsman et al., Patente de EE. UU. N.º 4.615.974; y Bitter, Patente de EE. UU. N.º 4.977.092) y genes de la alcohol deshidrogenasa. Véanse también, las Patentes de EE. UU. N.º 4.990.446, 5.063.154, 5.139.936 y 4.661.454. En la especialidad, se conocen sistemas de transformación para otras levaduras, incluidas Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii y Candida maltosa. Véanse, por ejemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-65, 1986 y Cregg, Patente de EE. UU. N.º 4.882.279. Pueden utilizarse células de Aspergillus según los métodos de McKnight et al., Patente de EE. UU. N.º 4.935.349. Los métodos para transformar Acremonium chrysogenum han sido divulgados por Sumino et al., Patente de EE. UU. N.º 5.162.228. Los métodos para transformar Neurospora son divulgados por Lambowitz, Patente de EE. UU. N.º 4.486.533.
El uso de Pichia methanolica como huésped para la producción de proteínas recombinantes se divulga en las Publicaciones de la WIPO WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 y WO 98/02565. Comúnmente, las moléculas de ADN para uso en la transformación de P. methanolica se preparan como plásmidos circulares bicatenarios que, preferentemente, se linealizan antes de la transformación. Para la producción de polipéptidos en P. methanolica, se prefiere que el promotor y el terminador del plásmido sean de un gen de P. methanolica, por ejemplo, el gen de utilización de alcohol de P. methanolica (AUG1 o AUG2). Otros promotores útiles incluyen los genes de la dihidroxiacetona sintasa (dihydroxyacetone synthase, DHAS), la formato deshidrogenasa (formate dehydrogenase, FMD) y la catalasa (CAT). Para facilitar la integración del ADN al cromosoma huésped, se prefiere tener la totalidad del segmento de expresión del plásmido flanqueado en ambos extremos por secuencias de ADN del huésped. Un marcador seleccionable preferido para su uso en Pichia methanolica es un gen P. methanolica ADE2, que codifica fosforribosil-5-aminoimidazol carboxilasa (AIRC; EC 4.1.1.21), que permite que las células huésped de ade2 crezcan en ausencia de adenina. Para procesos industriales en gran escala, en los que resulta aconsejable minimizar el uso de metanol, se prefiere utilizar células huésped en las cuales se haya procedido a la deleción de ambos genes de utilización del metanol (AUG1 y AUG2). Para la producción de proteínas segregadas, se prefieren las células huésped con deficiencia de los genes de la proteasa vacuolar (PEP4 y PRB1). Se utiliza la electroporación para facilitar la introducción de un plásmido que contiene ADN que codifica un polipéptido de interés en las células de P. methanolica. Se prefiere transformar las células de P. methanolica por electroporación utilizando un campo eléctrico pulsado con atenuación exponencial con una potencia de campo de entre 2,5 y 4,5 kV/cm; preferentemente, alrededor de 3,75 kV/cm y una constante de tiempo (\Omega) que varía entre 1 y 40 milisegundos; m\alphas preferentemente, alrededor de 20 milisegundos.
Las células huésped procariotas, incluidas las cepas de las bacterias Escherichia coli, Bacillus y de otros géneros, también son células huésped útiles dentro de la presente invención. Las técnicas para transformar estos huéspedes y expresar las secuencias de ADN extraño clonadas en dichos huéspedes son bien conocidas en la especialidad (véase, p. ej. Sambrook et al., ibid.). Cuando se expresa un polipéptido del Ligando del zalpha11 en bacterias, por ejemplo, E. coli, el polipéptido puede ser retenido en el citoplasma, habitualmente en forma de gránulos insolubles, o puede ser dirigido al espacio periplásmico por una secuencia de secreción bacteriana. En el primer caso, las células se lisan, se recuperan los gránulos y se los desnaturaliza con, por ejemplo, isotiocianato de guanidina o urea. El polipéptido desnaturalizado luego puede replegarse y dimerizarse diluyendo el desnaturalizante, por ejemplo, por diálisis contra una solución de urea y una combinación de glutatión reducido y oxidado, seguida de diálisis contra una solución salina amortiguada. En el último caso, el polipéptido puede recuperarse del espacio periplásmico en una forma soluble y funcional alterando las células (por ejemplo, por sonicación o choque osmótico) para liberar el contenido del espacio periplásmico y recuperar la proteína, obviando así la necesidad de desnaturalizar y replegar.
Las células huésped transformadas o transfectadas se cultivan de acuerdo con los procedimientos convencionales en un medio de cultivo que contiene nutrientes y otros componentes necesarios para el crecimiento de las células huésped elegidas. Se conocen en la especialidad diversos medios adecuados, incluidos los medios definidos y medios complejos, que generalmente incluyen una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios también pueden contener componentes tales como factores de crecimiento o suero, según sea necesario. El medio de crecimiento generalmente selecciona células que contienen el ADN agregado en forma exógena por, a modo de ejemplo, selección por fármaco o por deficiencia en un nutriente esencial, que es complementado por el marcador seleccionable transportado en el vector de expresión o cotransfectado en la célula huésped. Las células de P. methanolica se cultivan en un medio que comprende fuentes adecuadas de carbono, nitrógeno y nutrientes traza a una temperatura de alrededor de 25ºC a 35ºC. Se proporciona suficiente aireación a los cultivos líquidos a través de medios convencionales, como la agitación de matraces pequeños o la agitación con aire de fermentadores. Un medio de cultivo preferido para la P. methanolica es el extracto de levadura, dextrosa y peptona (Yeast Extract Peptone Dextrose, YEPD) (D-glucosa al 2%, peptona Bacto^{TM} al 2% (Difco Laboratories, Detroit, MI), extracto de levadura Bacto^{TM} al 1% (Difco Laboratories), adenina al 0,004% y L-leucina al 0,006%).
Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención hasta una pureza \geq80%; más preferentemente, \geq90%; aún más preferentemente, \geq95%; y particularmente se prefiere un estado farmacéuticamente puro, que es una pureza mayor del 99,9% con respecto a las macromoléculas contaminantes, en particular, otras proteínas y ácidos nucleicos, y sin agentes infecciosos y pirogénicos. Preferentemente, un polipéptido purificado no contiene sustancialmente otros polipéptidos, en particular otros polipéptidos de origen animal.
Los polipéptidos del Ligando del zalpha11 recombinante expresados (o polipéptidos del Ligando del zalpha11 quiméricos) pueden purificarse utilizando fraccionamiento y/o métodos y medios de purificación convencionales. Pueden utilizarse la precipitación con sulfato de amonio y la extracción con ácido o iones caotrópicos para fraccionar las muestras. Los ejemplos de pasos de purificación pueden incluir hidroxiapatita, exclusión por tamaño, cromatografía líquida de rápido rendimiento (fast performance liquid chromatography, FPLC) y cromatografía líquida de alto rendimiento con inversión de fases. Los medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, sílices especiales y similares. Se prefieren los derivados polietilenimina (polyethyleneimine, PEI), dietilaminoetanol (diethylaminoethanol, DEAE), aminoetanol cuaternario (quaternary aminoethanol, QAE) y cuaternarios (quaternary, Q). Los ejemplos de medios cromatográficos incluyen los medios derivatizados con grupos fenilo, butilo u octilo, por ejemplo, Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) y similares; o resinas poliacrílicas, por ejemplo, Amberchrom CG 71 (Toso Haas) y similares. Los soportes sólidos adecuados incluyen perlas de vidrio, resinas a base de sílice, resinas celulósicas, perlas de agarosa, perlas de agarosa entrecruzada, perlas de poliestireno, resinas de poliacrilamida entrecruzada y similares, que son insolubles en las condiciones en las que se los utilizará. Estos soportes pueden modificarse con grupos reactivos que permiten la unión de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo, grupos hidroxilo y/o fracciones de carbohidratos. Los ejemplos de las químicas de acoplamiento incluyen activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo, activación con hidrazida y derivados carboxilo y amino para las químicas de acoplamiento con carbodiimidas. Estos y otros medios sólidos son bien conocidos, su uso está ampliamente difundido en la especialidad y se pueden adquirir a través de proveedores comerciales. Los métodos para la unión de polipéptidos del receptor al medio de soporte son bien conocidos en la especialidad. La selección de un método en particular es una cuestión de diseño de rutina y está determinada, en parte, por las propiedades del soporte elegido. Véase, por ejemplo, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suecia, 1988.
Los polipéptidos de la presente invención pueden aislarse mediante explotación de sus propiedades físicas o bioquímicas. Por ejemplo, la cromatografía por adsorción a iones metálicos inmovilizados (immobilized metal ion adsorption, IMAC) puede utilizarse para purificar las proteínas ricas en histidina, incluidas las que comprenden etiquetas de polihistidina. En resumen, primero se carga un gel con iones metálicos divalentes para formar un quelado (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Las proteínas ricas en histidina son adsorbidas en esta matriz con diferentes afinidades, según el ión metálico utilizado, y serán eluidas por elución competitiva, reduciendo el pH o utilizando agentes quelantes fuertes. Otros métodos de purificación incluyen la purificación de proteínas glucosiladas por cromatografía de afinidad a la lectina y cromatografía de intercambio iónico (Methods in Enzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp.529-39) y el uso del receptor zalpha11 soluble. Puede construirse una fusión del polipéptido de interés y una etiqueta de afinidad (p. ej. proteína de unión a maltosa, un domino de la inmunoglobulina) para facilitar la purificación.
Además, mediante el uso de los métodos descritos en la especialidad, pueden construirse fusiones de polipéptidos o proteínas del Ligando del zalpha11 híbridas utilizando las regiones o los dominios del Ligando del zalpha11 de la invención, en combinación con los de proteínas humanas de la familia de las citocinas (p. ej. interleucinas o GM-CSF), o proteínas heterólogas (Sambrook et al., ibid., Altschul et al., ibid., Picard, Cur. Opin. Biology, 5:511-5, 1994, y referencias incluidas en dicho documento). Estos métodos permiten la determinación de la importancia biológica de dominios o regiones mayores en un polipéptido de interés. Dichos híbridos pueden alterar la cinética de la reacción, unir, estrechar o expandir la especificidad del sustrato, o alterar la localización tisular y celular de un polipéptido, y pueden aplicarse a polipéptidos de estructura desconocida.
Las proteínas de fusión pueden prepararse con métodos conocidos por los especialistas en la materia preparando cada componente de la proteína de fusión y conjugándolos químicamente. Como alternativa, se puede generar un polinucleótido que codifique ambos componentes de la proteína de fusión en el marco de lectura adecuado mediante técnicas conocidas y expresado por los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, una parte o la totalidad de una hélice que confiere una función biológica puede intercambiarse entre el Ligando del zalpha11 de la presente invención con las hélices funcionalmente equivalentes de otro miembro de la familia, como la IL-15, la IL-2, la IL-4 o el GM-CSF. Dichos componentes incluyen, a modo de ejemplo, la secuencia señal de secreción; las hélices A, B, C, D; las asas A/B, B/C, C/D; de citocinas con haz de cuatro hélices. Se prevé que dichas proteínas de fusión tengan un perfil de función biológica igual o similar al de los polipéptidos de la presente invención o al de otras proteínas de la familia de citocinas con haz de cuatro hélices conocidas, según la fusión construida. Además, dichas proteínas de fusión pueden mostrar otras propiedades, tal como se divulga en la presente.
Las técnicas estándar de clonación y de biología molecular pueden utilizarse para intercambiar los dominios equivalentes entre el polipéptido del Ligando del zalpha11 y aquellos polipéptidos con los que se fusionan. Generalmente, un segmento de ADN que codifica un dominio de interés, p. ej. desde la hélice A hasta la D del Ligando del zalpha11, u otro dominio descrito en la presente, está ligado operablemente en el marco a, al menos, otro segmento de ADN que codifica un polipéptido adicional (por ejemplo, un dominio o región de otra citocina, como la IL-2 u otra similar), y está insertado en un vector de expresión adecuado, según se describe en la presente. Generalmente, los constructos de ADN están creados de tal manera que los varios segmentos de ADN que codifican las regiones correspondientes de un polipéptido están ligados operablemente en el marco para crear un único constructo que codifica toda la proteína de fusión, o una porción funcional de esta. Por ejemplo, un constructo de ADN codificaría desde el N terminal hasta el C terminal una proteína de fusión que comprende un polipéptido señal seguido de una proteína madura de fusión de citocinas con haz de cuatro hélices que contiene la hélice A, seguido de la hélice B, seguido de la hélice C, seguido de la hélice D. Dichas proteínas de fusión pueden expresarse, aislarse y analizarse para determinar su actividad, según se describe en la presente.
Los polipéptidos del Ligando del zalpha11, o fragmentos de este, también pueden prepararse mediante síntesis química. Los polipéptidos del Ligando del zalpha11 pueden ser monómeros o multímeros, glucosilados o no glucosilados, pegilados o no pegilados y pueden o no incluir un residuo de aminoácido metionina inicial. Por ejemplo, los polipéptidos pueden prepararse mediante síntesis de péptidos en fase sólida, por ejemplo, según lo descrito por Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963.
La actividad de las moléculas de la presente invención puede medirse utilizando una serie de valoraciones que miden la proliferación de células que expresan el receptor zalpha11 y/o la unión a dichas células. Resultan de particular interés los cambios en las células dependientes del Ligando del zalpha11. Las líneas celulares adecuadas para ser genomanipuladas para que sean dependientes del Ligando del zalpha11 incluyen la línea de células BaF3 dependiente de la IL-3 (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986), FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64: 786-790, 1984), y MO7e (Kiss et al., Leukemia 7: 235-240, 1993). Las líneas celulares dependientes del factor de crecimiento pueden establecerse según los métodos publicados (p. ej. Greenberger et al., Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter et al., en Baum et al. ed., Experimental Hematology Today, 8th Ann. Mtg. Int. Soc. Exp. Hematol. 1979, 145-156, 1980).
Las proteínas de la presente invención son útiles para estimular la proliferación, activación, diferenciación y/o inducción o la inhibición de la función celular especializada de las células que participan en la homeostasis de la hematopoyesis y la función inmunitaria. En particular, los polipéptidos del Ligando del zalpha11 son útiles para estimular la proliferación, activación, diferenciación, inducción o inhibición de las funciones celulares especializadas de las células de los linajes hematopoyéticos, que incluyen, a modo de ejemplo, las células T, las células B, las células NK, las células dendríticas, los monocitos y los macrófagos, así como las células epiteliales. La proliferación y/o la diferenciación de las células hematopoyéticas pueden medirse in vitro utilizando células cultivadas, o in vivo mediante la administración de las moléculas de la invención reivindicada al modelo animal adecuado. Las valoraciones que miden la proliferación o diferenciación celular son bien conocidas en la especialidad. Por ejemplo, las valoraciones que miden la proliferación incluyen valoraciones tales como la quimiosensibilidad al colorante rojo neutro (Cavanaugh et al., Investigational New Drugs 8:347-354, 1990, que se incorpora a la presente por referencia), la incorporación de nucleótidos marcados radiactivamente (Cook et al., Analytical Biochem. 179:1-7, 1989, que se incorpora a la presente por referencia), la incorporación de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) en el ADN de células proliferantes (Porstmann et al., J. Immunol. Methods 82:169-179, 1985, que se incorpora a la presente por referencia), y el uso de sales de tetrazolio (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley et al., Cancer Res. 48:589-601, 1988; Marshall et al., Growth Reg. 5:69-84, 1995; y Scudiero et al., Cancer Res. 48:4827-4833, 1988; incorporados en la presente por referencia). Las valoraciones que miden la diferenciación incluyen, por ejemplo, la medición de marcadores de superficie celular asociados con la expresión específica para un estadio de un tejido, una actividad enzimática, una actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; incorporados en la presente por referencia).
Las moléculas de la presente invención pueden analizarse in vivo utilizando sistemas de entrega virales. Los ejemplos de virus para este fin incluyen el adenovirus, virus herpes, retrovirus, virus vaccinia y virus adenoasociado (adeno-associated virus, AAV). El adenovirus, un virus de ADN bicatenario, es actualmente el vector de transferencia génica mejor estudiado para la entrega de ácido nucleico heterólogo (para consultar una revisión, véanse T.C. Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994; y J.T. Douglas y D.T. Curiel, Science & Medicine 4:44-53, 1997).
Como ligando, la actividad del polipéptido del Ligando del zalpha11 puede medirse mediante un microfisiómetro biosensor con base de sílice, que mide la tasa de acidificación extracelular o la excreción de protones asociada con la unión a receptores y las respuestas fisiológicas celulares posteriores. Un ejemplo de dicho dispositivo es el microfisiómetro Cytosensor^{TM} fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Con este método es posible medir una serie de respuestas celulares, por ejemplo, proliferación celular, transporte iónico, producción de energía, respuesta inflamatoria, activación de la regulación y de los receptores, y similares. Véanse, por ejemplo, McConnell, H.M. et al., Science 257:1906-1912, 1992; Pitchford, S. et al., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S. et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde, I. et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998.
Además, el Ligando del zalpha11 puede utilizarse para identificar células, tejidos o líneas celulares que responden a una vía estimulada con el Ligando del zalpha11. El microfisiómetro, descrito anteriormente, puede utilizarse para identificar rápidamente las células que responden al ligando, como las células que responden al Ligando del zalpha11 de la presente invención. Las células pueden cultivarse en presencia o en ausencia del polipéptido del Ligando del zalpha11. Aquellas células que producen un cambio que se puede medir en la acidificación extracelular en presencia del Ligando del zalpha11 responden al Ligando del zalpha11. Dichas células o líneas celulares, pueden utilizarse para identificar antagonistas y agonistas del polipéptido del Ligando del zalpha11, según lo descrito anteriormente.
En vista de la distribución tisular observada para el receptor zalpha11, los agonistas (incluido el Ligando/el sustrato/el cofactor/etc. del zalpha11 naturales) y/o los antagonistas tienen un enorme potencial en las aplicaciones tanto in vitro como in vivo. Los compuestos identificados como agonistas del Ligando del zalpha11 son útiles para la expansión, proliferación, activación, diferenciación y/o inducción o la inhibición de las funciones celulares especializadas de las células que participan en la homeostasis de la hematopoyesis y la función inmunitaria. Por ejemplo, el Ligando del zalpha11 y los compuestos agonistas son útiles como componentes del medio de cultivo celular definido, y pueden utilizarse solos o en combinación con otras citocinas y hormonas para reemplazar el suero que se usa comúnmente en cultivo celular. Los agonistas son, por ende, útiles para promover en forma específica el crecimiento y/o el desarrollo de las células T, células B, células NK, linfocitos citotóxicos y otras células de los linajes linfoides y mieloides en cultivo.
Los antagonistas también son útiles como reactivos de investigación para caracterizar los sitios de interacción ligando-receptor. Los antagonistas son útiles para inhibir la expansión, proliferación, activación y/o diferenciación de las células que participan en la regulación de la hematopoyesis. Los inhibidores de la actividad del Ligando del zalpha11 (antagonistas del Ligando del zalpha11) incluyen anticuerpos contra el Ligando del zalpha11 y receptores del Ligando del zalpha11 soluble, así como otros agentes peptídicos y no peptídicos (incluidas las ribocimas).
El Ligando del zalpha11 también puede usarse para identificar inhibidores (antagonistas) de su actividad. Se agregan compuestos de prueba a las valoraciones divulgadas en la presente para identificar los compuestos que inhiben la actividad del Ligando del zalpha11. Además de las valoraciones divulgadas en la presente, las muestras pueden analizarse para determinar la inhibición de la actividad del Ligando del zalpha11 en una serie de valoraciones diseñadas para medir la unión a los receptores, la estimulación/inhibición de las respuestas celulares dependientes del Ligando del zalpha11 o la proliferación de células que expresan el receptor zalpha11.
Un polipéptido del Ligando del zalpha11 puede expresarse como una fusión con una región constante de cadena pesada de una inmunoglobulina, habitualmente, un fragmento Fc, que contiene dos dominios de regiones constantes y carece de la región variable. Los métodos para preparar dichas fusiones se divulgan en las patentes de EE. UU. N.º 5.155.027 y 5.567.584. Dichas fusiones son segregadas habitualmente como moléculas multiméricas, en las que las porciones Fc se unen entre sí mediante uniones disulfuro, y dos polipéptidos no Ig se ubican en posiciones muy próximas entre sí. Las fusiones de este tipo pueden usarse, por ejemplo, para la dimerización, el aumento de la estabilidad y la vida media in vivo, para un ligando purificado por afinidad, como herramienta para valoración in vitro o como antagonista. Para el uso en valoraciones, las quimeras se unen a un soporte a través de la región Fc y se usen en un formato de ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA).
Un polipéptido que se une al Ligando del zalpha11 también puede usarse para la purificación del ligando. El polipéptido se inmoviliza en un soporte sólido, como perlas de agarosa, agarosa entrecruzada, vidrio, resinas celulósicas, resinas a base de sílice, poliestireno, poliacrilamida entrecruzada o materiales similares que son estables en las condiciones de uso. Los métodos para ligar polipéptidos a soportes sólidos son conocidos en la especialidad, e incluyen química de aminas, activación con bromuro de cianógeno, activación con N-hidroxisuccinimida, activación con epóxido, activación con sulfhidrilo y activación con hidrazida. El medio resultante se encuentra, en general, configurado en forma de columna, y los líquidos que contienen el ligando se pasan a través de la columna, una o más veces, para permitir que el ligando se una al polipéptido del receptor. Luego, el ligando se eluye utilizando los cambios en la concentración de sales, agentes caotrópicos (guanidina HCl) o pH para romper la unión ligando-receptor.
Un sistema de valoración que usa un receptor de unión a ligandos (o un anticuerpo, un miembro de un par de complemento/anticomplemento) o un fragmento de unión a este, y un instrumento biosensor disponible comercialmente (BIAcore, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) pueden usarse de manera ventajosa. Dicho receptor, anticuerpo, miembro de un par de complemento/anticomplemento o fragmento se inmoviliza sobre la superficie de un chip de receptores. El uso de este instrumento ha sido divulgado por Karlsson, J. Immunol. Methods 145:229-40, 1991 y Cunningham y Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Un receptor, anticuerpo, miembro o fragmento se unen en forma covalente, mediante química de aminas o sulfhidrilos, a fibras de dextrano que se sujetan a una película de oro dentro de una celda de flujo. Se hace pasar una muestra de prueba por la celda. Si hay un ligando, epítopo o miembro opuesto del par de complemento/anticomplemento presentes en la muestra, se unirán al receptor inmovilizado, anticuerpo o miembro, respectivamente y producirán un cambio en el índice de refracción del medio, que es detectado como un cambio en la resonancia del plasmón de superficie de la película de oro. Este sistema permite la determinación de las tasas de encendido y apagado, a partir de las cuales se puede calcular la afinidad de unión, y la evaluación de la estequiometría de unión. Como alternativa, la unión a los ligandos/receptores puede analizarse utilizando la tecnología SELDI(TM) (Ciphergen, Inc., Palo Alto, CA).
Los polipéptidos del receptor de unión a ligandos también pueden utilizarse en otros sistemas de valoración conocidos en la especialidad. Dichos sistemas incluyen el análisis de Scatchard para la determinación de la afinidad de unión (véase Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) y valoraciones calorimétricas (Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821-25, 1991).
Los polipéptidos del Ligando del zalpha11 también pueden utilizarse para preparar anticuerpos que se unen a los epítopos, péptidos o polipéptidos del Ligando del zalpha11. El polipéptido del Ligando del zalpha11, o un fragmento de este, sirve como antígeno (inmunógeno) para inocular a un animal y producir una respuesta inmunitaria. Una persona con conocimientos de la materia puede reconocer que los polipéptidos antigénicos portadores de epítopos contienen una secuencia de, al menos, 6 residuos contiguos de aminoácidos de un polipéptido del Ligando del zalpha11 (p. ej. SEC. ID. N.º 2). Los polipéptidos podrían comprender una porción mayor de un polipéptido del Ligando del zalpha11, es decir, entre 30 y 100 residuos hasta toda la longitud de la secuencia de aminoácidos. Los antígenos o epítopos inmunógenos también pueden incluir etiquetas, adyuvantes y vehículos adjuntos, según se describe en la presente. Los antígenos adecuados incluyen el polipéptido del Ligando del zalpha11 codificado de la SEC. ID. N.º 2 desde el aminoácido número 32 hasta el aminoácido número 162, o un fragmento de este. Otros antígenos adecuados incluyen el Ligando del zalpha11 maduro y el de longitud completa, las hélices A-D, y las hélices A, B, C y D individuales o múltiples de la estructura del Ligando del zalpha11 con haz de cuatro hélices, según se describe en la presente. Los péptidos preferidos para usar como antígenos son los péptidos hidrófilos, como los predichos por una persona con conocimientos de la materia a partir de un diagrama de hidrofobicidad, según se describe en la presente.
Los anticuerpos de una respuesta inmunitaria generada al inocular estos antígenos a un animal pueden aislarse y purificarse, según se describe en la presente. Los métodos para preparar y aislar anticuerpos policlonales y monoclonales son bien conocidos en la especialidad. Véanse, por ejemplo, Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (ed.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; y Hurrell, J. G. R., ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1982.
Como será evidente para una persona con conocimientos generales de la materia, pueden generarse anticuerpos policlonales al inocular a diversos animales de sangre caliente, como los caballos, las vacas, las cabras, las ovejas, los perros, los pollos, los conejos, los ratones y las ratas, un polipéptido del Ligando del zalpha11 o un fragmento de este. La inmunogenicidad de un polipéptido del Ligando del zalpha11 puede aumentarse mediante el uso de un adyuvante, como el alum (hidróxido de aluminio) o el adyuvante completo o incompleto de Freund. Los polipéptidos útiles para la inmunización también incluyen polipéptidos de fusión, tales como fusiones del Ligando del zalpha11 o de una porción de este con un polipéptido de inmunoglobulina o con una proteína de unión a maltosa. El inmunógeno del polipéptido puede ser una molécula de longitud completa o una porción de esta. Si la porción del polipéptido es de "tipo hapteno", dicha porción puede unirse o ligarse ventajosamente a un vehículo macromolecular (como la hemocianina de lapa californiana (keyhole limpet hemocyanin, KLH), la albúmina de suero bovino (bovine serum albumin, BSA) o el toxoide tetánico) para inmunización.
Tal como se lo usa en la presente, el término "anticuerpos" incluye anticuerpos policlonales, anticuerpos policlonales purificados por afinidad, anticuerpos monoclonales y fragmentos de unión a antígenos, como los fragmentos proteolíticos F(ab')2 y Fab. También están incluidos los anticuerpos intactos o los fragmentos producidos por genomanipulación, como los anticuerpos quiméricos, los fragmentos Fv, anticuerpos de una sola cadena y similares, así como péptidos y polipéptidos sintéticos de unión a antígenos. Pueden humanizarse anticuerpos no humanos injertando regiones determinantes de complementariedad (complementarity-determining region, CDR) no humanas en regiones marco y constantes humanas, o incorporando la totalidad de los dominios variables no humanos (opcionalmente "rodeándolos" con una superficie similar a la humana mediante el reemplazo de los residuos expuestos, donde el resultado es un anticuerpo "revestido"). En algunos casos, los anticuerpos humanizados pueden retener residuos no humanos dentro de los dominios marco de la región variable humana, a fin de aumentar las características de unión adecuadas. A través de la humanización de los anticuerpos, puede aumentarse la vida media biológica, y se reduce la posibilidad de que se produzcan reacciones inmunitarias adversas en la administración a seres humanos. Además, pueden producirse anticuerpos humanos en animales no humanos transgénicos genomanipulados para contener genes de inmunoglobulina humana según lo divulgado en la Publicación de la WIPO WO 98/24893. Se prefiere que los genes de inmunoglobulina endógenos de estos animales estén inactivados o se eliminen, por ejemplo, mediante recombinación homóloga.
Se considera que los anticuerpos se unen específicamente si: 1) exhiben un nivel umbral de actividad de unión, y 2) no tienen reacciones cruzadas significativas con moléculas de polipéptidos relacionados. Un nivel umbral de unión se determina si los anticuerpos contra el Ligando del zalpha11 de la presente se unen a un polipéptido, péptido o epítopo del Ligando del zalpha11, con una afinidad, al menos, 10 veces mayor que la afinidad de unión al polipéptido de control (no Ligando del zalpha11). Se prefiere que los anticuerpos muestren una afinidad de unión (Ka) de 10^{6} M^{-1} o mayor; preferentemente, 10^{7} M^{-1} o mayor; más preferentemente, 10^{8} M^{-1} o mayor; y muy preferentemente, 10^{9} M^{-1} o mayor. La afinidad de unión de un anticuerpo puede ser determinada fácilmente por una persona con conocimientos generales de la materia, por ejemplo, mediante el análisis de Scatchard (Scatchard, G., Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949).
El hecho de que los anticuerpos contra el Ligando del zalpha11 no tienen reacciones cruzadas significativas con moléculas de polipéptidos relacionados se muestra, por ejemplo, cuando el anticuerpo detecta el polipéptido del Ligando del zalpha11, pero no detecta los polipéptidos relacionados conocidos, mediante un análisis Western blot estándar (Ausubel et al., ibid.). Los ejemplos de polipéptidos relacionados conocidos se divulgan en documentos anteriores a la presente, como ortólogos y parálogos conocidos, y miembros similares conocidos de una familia de proteínas. El cribaje también puede realizarse utilizando un Ligando del zalpha11 no humano y polipéptidos mutantes del Ligando del zalpha11. Además, los anticuerpos pueden ser "cribados contra" polipéptidos relacionados conocidos, a fin de aislar una población que se une específicamente a los polipéptidos del Ligando del zalpha11. Por ejemplo, los anticuerpos cultivados para el Ligando del zalpha11 son adsorbidos en polipéptidos relacionados adheridos a una matriz insoluble; los anticuerpos específicos para el Ligando del zalpha11 fluirán a través de la matriz en condiciones adecuadas de amortiguación. El cribaje permite el aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales que no tienen reacciones cruzadas con polipéptidos conocidos estrechamente relacionados (Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan, et al. (ed.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995). El cribaje y el aislamiento de anticuerpos específicos son bien conocidos en la especialidad. Véanse Fundamental Immunology, Paul (ed.), Raven Press, 1993; Getzoff et al., Adv. in Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J.W. (ed.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin et al., Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101, 1984. Los anticuerpos contra el Ligando del zalpha11 que se unen específicamente pueden detectarse mediante una serie de métodos de la especialidad, que se divulgan a continuación.
Pueden utilizarse diversas valoraciones conocidas para los especialistas en la materia para detectar anticuerpos que se unen a los polipéptidos del Ligando del zalpha11. Se describen detalladamente ejemplos de valoraciones en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane (ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de dichas valoraciones incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA), ensayo de transferencia puntual, análisis Western blot, valoración de inhibición o competencia, y ensayo tipo sándwich. Además, los anticuerpos pueden ser cribados para detectar uniones a una proteína o un polipéptido del Ligando del zalpha11 genéticamente intacto, en comparación con uno mutante.
Los anticuerpos contra el Ligando del zalpha11 pueden utilizarse para etiquetar las células que expresaban el Ligando del zalpha11; para aislar el Ligando del zalpha11 mediante purificación por afinidad; para valoraciones de diagnóstico para determinar los niveles circulantes de polipéptidos del Ligando del zalpha11; para detectar o cuantificar el Ligando del zalpha11 soluble como marcador de la patología o enfermedad subyacente; en métodos analíticos que emplean FACS; para cribar genotecas de expresión; para generar anticuerpos antiidiotípicos; y como anticuerpos neutralizantes o como antagonistas para bloquear la actividad del Ligando del zalpha11 in vitro e in vivo. Los marcadores o etiquetas directos adecuados incluyen: radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares; los marcadores o etiquetas indirectos pueden incluir el uso de biotina-avidina u otros pares de complemento/anticomplemento como intermediarios. Los anticuerpos de la presente también pueden conjugarse directa o indirectamente con fármacos, toxinas, radionúclidos y similares, y estos conjugados pueden utilizarse para aplicaciones diagnósticas o terapéuticas in vivo. Además, los anticuerpos contra el Ligando del zalpha11, o fragmentos de este, pueden utilizarse in vitro para detectar el Ligando del zalpha11 desnaturalizado, o fragmentos de este, en valoraciones, por ejemplo, Western blot u otras valoraciones conocidas en la especialidad.
Las moléculas detectables adecuadas pueden unirse directa o indirectamente al polipéptido o al anticuerpo, e incluyen radionúclidos, enzimas, sustratos, cofactores, inhibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, partículas magnéticas y similares. Las moléculas citotóxicas adecuadas pueden unirse directa o indirectamente al polipéptido o al anticuerpo, e incluyen toxinas bacterianas o de origen vegetal (por ejemplo, difteria, toxina, saporina, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrín y similares), así como radionúclidos terapéuticos, como el yodo-131, el renio-188 o el itrio-90 (ya sea unidos directamente al polipéptido o al anticuerpo, o unidos indirectamente por medio de una fracción quelante, por ejemplo). Los polipéptidos o anticuerpos también pueden conjugarse con fármacos citotóxicos, como la adriamicina. Para la unión indirecta de una molécula detectable o citotóxica, la molécula detectable o citotóxica puede conjugarse con un miembro de un par complementario/ anticomplementario, donde el otro miembro se une a la porción del polipéptido o del anticuerpo. Para este fin, la biotina/estreptavidina es un ejemplo de par complementario/anticomplementario.
Los polipéptidos de unión también pueden actuar como "antagonistas" del Ligando del zalpha11 para bloquear la unión del Ligando del zalpha11 y la transducción de las señales in vitro e in vivo. Estos polipéptidos de unión contra el Ligando del zalpha11 serían útiles para inhibir la actividad o la unión a proteínas del Ligando del zalpha11.
Las proteínas de fusión polipéptido-toxina o las proteínas de fusión anticuerpo-toxina pueden utilizarse para la inhibición o ablación de las células o los tejidos diana (por ejemplo, para tratar células o tejidos cancerosos). Como alternativa, si el polipéptido tiene dominios funcionales múltiples (es decir, un dominio de activación o un dominio de unión a los receptores, más un dominio de acceso), una proteína de fusión que incluye solo el dominio de acceso puede ser adecuada para dirigir una molécula detectable, una molécula citotóxica o una molécula complementaria a un tipo de célula o tejido de interés. En los casos en que la proteína de fusión que contiene solo el dominio incluye una molécula complementaria, la molécula anticomplementaria puede conjugarse con una molécula detectable o citotóxica. Dichas proteínas de fusión dominio-molécula complementaria, por ende, representan un vehículo de acceso genérico para la entrega específica a una célula/un tejido de conjugados genéricos de moléculas anticomplementarias-detectables/citotóxicas.
Las proteínas de fusión de citocinas del Ligando del zalpha11 o las proteínas de fusión anticuerpo-citocina pueden utilizarse para mejorar la eliminación in vivo de tejidos diana (por ejemplo, cáncer de sangre y de médula ósea), si el polipéptido del Ligando del zalpha11 o el anticuerpo contra el Ligando del zalpha11 se dirige a la célula hiperproliferativa de la sangre o de la médula ósea (véase, en general, Hornick et al., Blood 89:4437-47, 1997). Las proteínas de fusión descritas permiten que una citocina se dirija a un sitio de acción deseado y, de esta manera, proporcionan una concentración local elevada de citocina. Los polipéptidos del Ligando del zalpha11 o los anticuerpos contra el Ligando del zalpha11 adecuados se dirigen a una célula o a un tejido no deseados (es decir, un tumor o una leucemia), y la citocina fusionada media la mejora de la lisis de las células diana por parte de las células efectoras. Las citocinas adecuadas para este fin incluyen la interleucina 2 y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), por ejemplo.
La diferenciación es un proceso progresivo y dinámico, que comienza con células progenitoras pluripotentes y finaliza con células diferenciadas terminalmente. Las células progenitoras pluripotentes que pueden regenerarse sin compromiso con un linaje expresan una serie de marcadores de diferenciación que se pierden cuando se produce el compromiso con un linaje celular. Las células precursoras expresan una serie de marcadores de diferenciación que pueden continuar o no siendo expresados a medida que las células avanzan por la vía del linaje celular hacia la maduración. Los marcadores de diferenciación que son expresados exclusivamente por células maduras son generalmente propiedades funcionales, como productos celulares, enzimas para producir productos celulares y receptores. El estadio de la diferenciación de una población de células se monitorea mediante la identificación de marcadores presentes en la población de células.
Existe evidencia que sugiere que los factores que estimulan tipos celulares específicos para que avancen por una vía hacia la diferenciación o desdiferenciación terminal afectan a toda la población de células que se originan de un precursor o de una célula progenitora en común. Por ende, es posible estimular o inhibir la proliferación de células linfoides, células hematopoyéticas y células epiteliales.
Se aisló el Ligando del zalpha11 a partir de tejido que se sabe tiene una función inmunitaria importante y que contiene células que cumplen una función en el sistema inmunitario. El Ligando del zalpha11 se expresa en células de sangre periférica activadas seleccionadas por CD3+, y se ha demostrado que la expresión del Ligando del zalpha11 aumenta después de la activación de las células T. Además, los resultados de los experimentos descritos en la sección de Ejemplos de la presente demuestran que los polipéptidos de la presente invención tienen un efecto en el crecimiento/la expansión y/o el estado diferenciado de las células NK o las precursoras de NK. La evidencia adicional demuestra que el Ligando del zalpha11 afecta la proliferación y/o la diferenciación de las células T y B in vivo. Los factores que estimulan la proliferación de precursoras hematopoyéticas y activan las células maduras son generalmente conocidos. Las células NK responden solo a la IL-2, pero la proliferación y la activación generalmente necesitan factores de crecimiento adicionales. Por ejemplo, se ha demostrado que se necesita la IL-7 y el Factor Steel (ligando del c-kit) para la formación de colonias de precursoras de NK. La IL-15 + IL-2, en combinación con IL-7 y Factor Steel, fue más efectiva (Mrózek et al., Blood 87:2632-2640, 1996). Sin embargo, es posible que se necesiten citocinas no identificadas para la proliferación de subconjuntos específicos de células NK y/o de precursoras de NK (Robertson et al., Blood 76:2451-2438, 1990). Una composición que comprende el Ligando del zalpha11 y la IL-15 estimula las precursoras de NK y las células NK, y existe evidencia de que esta composición es más potente que los factores y las combinaciones de factores descritos anteriormente.
Las valoraciones que miden la diferenciación incluyen, por ejemplo, la medición de marcadores celulares asociados con la expresión específica para un estadio de un tejido, una actividad enzimática, una actividad funcional o cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5:281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol. Technol. Bioprocesses, 161-171, 1989; incorporados en la presente por referencia). Como alternativa, el polipéptido del Ligando del zalpha11 en sí puede servir como marcador de superficie celular o segregado adicional asociado con la expresión específica para un estadio de un tejido. Como tal, la medición directa del polipéptido del Ligando del zalpha11, o su pérdida de expresión en un tejido a medida que se diferencia, puede servir como marcador de la diferenciación de tejidos.
De manera similar, la medición directa del polipéptido del Ligando del zalpha11, o su pérdida de expresión en un tejido, pueden determinarse en un tejido o en células mientras sufren la progresión tumoral. Los aumentos de la invasión y motilidad de las células, o el aumento o la pérdida de la expresión del Ligando del zalpha11 en una condición precancerosa o cancerosa, en comparación con el tejido normal, pueden servir como diagnóstico de la transformación, invasión y metástasis en la progresión tumoral. Como tal, el conocimiento del estadio de progresión o metástasis de un tumor ayudará al médico a elegir el tratamiento más adecuado, o la intensidad del tratamiento, para un paciente con cáncer en particular. Los métodos para medir el aumento y la pérdida de expresión (del ARNm o la proteína) son bien conocidos en la especialidad, se describen en la presente, y pueden aplicarse a la expresión del Ligando del zalpha11. Por ejemplo, la aparición o desaparición de polipéptidos que regulan la motilidad celular pueden utilizarse para contribuir al diagnóstico y pronóstico del cáncer de próstata (Banyard, J. y Zetter, B.R., Cancer and Metast. Rev. 17:449-458, 1999). Como efector de la motilidad celular, el aumento o la pérdida de la expresión del Ligando del zalpha11 pueden servir como diagnóstico para el cáncer linfoide, de células B, epitelial, hematopoyético y de otro tipo.
Además, la actividad y el efecto del Ligando del zalpha11 en la progresión tumoral y la metástasis pueden medirse in vivo. Se han desarrollado varios modelos de ratones singénicos para estudiar la influencia de los polipéptidos, compuestos u otros tratamientos en la progresión tumoral. En estos modelos, células tumorales desarrolladas por pasaje en cultivo se implantan en ratones de la misma cepa que el donante del tumor. Las células se convertirán en tumores con características similares en el ratón receptor, y también se producirá metástasis en algunos modelos. Los modelos tumorales adecuados para nuestros estudios incluyen el carcinoma pulmonar de Lewis (ATCC N.º CRL-1642) y el melanoma B16 (ATCC N.º CRL-6323), entre otros. Estos dos modelos son líneas tumorales que se utilizan habitualmente, singénicas respecto del ratón C57BL6/J, que se cultivan y manipulan fácilmente in vitro. Los tumores resultantes de la implantación de cualquiera de estas líneas celulares pueden hacer metástasis al pulmón en los ratones C57BL6/J. El modelo de carcinoma pulmonar de Lewis se ha utilizado recientemente en ratones para identificar un inhibidor de la angiogénesis (O'Reilly MS, et al. Cell 79: 315-328,1994). Se tratan ratones C57BL6/J con un agente experimental a través de una inyección diaria de una proteína, un agonista o un antagonista recombinantes, o una inyección por única vez de adenovirus recombinante. Tres días después de este tratamiento, se implantan entre 10^{5} y 10^{6} células debajo de la piel dorsal. Como alternativa, las células pueden infectarse con el adenovirus recombinante, como por ejemplo, uno que exprese el Ligando del zalpha11, antes de la implantación, de forma tal que la proteína se sintetice en el sitio tumoral o intracelularmente, en lugar de sistémicamente. Normalmente, los ratones desarrollan tumores visibles en el término de 5 días. Los tumores se dejan crecer durante un período de hasta 3 semanas, durante el cual pueden alcanzar un tamaño de entre 1.500 y 1.800 mm^{3} en el grupo que recibe el tratamiento de control. El tamaño del tumor y el peso corporal se monitorean minuciosamente durante todo el experimento. Al momento del sacrificio, el tumor se extirpa y pesa junto con los pulmones y el hígado. Se ha observado que el peso del pulmón se correlaciona bien con la masa tumoral metastásica. Como medida adicional, se contabilizan las metástasis en la superficie del pulmón. El tumor, los pulmones y el hígado resecados se preparan para el examen histopatológico, la inmunohistoquímica y la hibridación in situ, utilizando los métodos conocidos en la especialidad y descritos en la presente. De esta forma, puede evaluarse la influencia del polipéptido expresado en cuestión, p. ej. el Ligando del zalpha11, en la capacidad del tumor de reclutar vasculatura y sufrir metástasis. Además, aparte de utilizar adenovirus, las células implantadas pueden transfectarse con el Ligando del zalpha11 en forma transitoria. El uso de transfectantes estables del Ligando del zalpha11, así como el uso de promotores inducibles, para activar la expresión del Ligando del zalpha11 in vivo son conocidos en la especialidad y pueden utilizarse en este sistema para evaluar la inducción de metástasis por parte del Ligando del zalpha11. Además, pueden inyectarse directamente Ligando del zalpha11 purificado o medio acondicionado con el Ligando del zalpha11 en este modelo de ratón, y así utilizarlos en este sistema. Para uso como referencia general, véanse O'Reilly MS, et al. Cell 79:315-328, 1994; y Rusciano D, et al. Murine Models of Liver Metastasis. Invasion Metastasis 14:349-361, 1995.
El Ligando del zalpha11 será de utilidad en el tratamiento de la tumorigénesis y, por lo tanto, será útil en el tratamiento del cáncer. El Ligando del zalpha11 inhibe la proliferación estimulada con IL-4 de células B normales estimuladas con anti-IgM, y se observa un efecto similar en las líneas de tumores de células B, lo que sugiere que es posible que exista un beneficio terapéutico en el tratamiento de pacientes con el Ligando del zalpha11, a fin de inducir las células de tumores de células B a un estado menos proliferativo. El ligando podría administrarse en combinación con otros agentes que ya se utilizan, incluidos los agentes quimioterápicos convencionales y los inmunomoduladores como el interferón alfa. Se ha demostrado que los interferones alfa/beta son efectivos en el tratamiento de algunas leucemias y modelos de enfermedad en animales, y los efectos inhibidores del crecimiento del interferón-alfa y el Ligando del zalpha11 son aditivos para, al menos, una línea celular derivada de tumores de células B.
Un método para reducir la proliferación de una célula B o T neoplásica comprende la administración a un mamífero con neoplasia de células B o T de una cantidad de una composición del Ligando del zalpha11 suficiente para reducir la proliferación de las células B o T neoplásicas. La composición puede comprender, al menos, otra citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando Flt3 o factor de células progenitoras.
Otro método para reducir la proliferación de células B o T neoplásicas comprende la administración a un mamífero con neoplasia de células B o T de una cantidad de una composición del antagonista del Ligando del zalpha11 suficiente para reducir la proliferación de las células B o T neoplásicas. La composición puede comprender, al menos, otra citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando Flt3 o factor de células progenitoras. Además, el antagonista del Ligando del zalpha11 puede ser una proteína de fusión ligando/toxina.
Puede utilizarse una toxina de fusión Ligando del zalpha11-saporina contra un conjunto similar de leucemias y linfomas, lo que ampliará la gama de leucemias que pueden tratarse con el Ligando del zalpha11. La activación del receptor zalpha11 mediada por una toxina de fusión proporciona dos formas independientes de inhibir el crecimiento de las células diana: la primera es idéntica a los efectos observados a través del ligando solo, y la segunda se debe a la entrega de la toxina a través de la internalización del receptor. El patrón de expresión restringido linfoide del receptor zalpha11 sugiere que el conjugado ligando-saporina puede ser tolerado por los pacientes.
Cuando el tratamiento para tumores malignos incluye alotrasplantes de médula ósea o de células progenitoras, el Ligando del zalpha11 puede ser valioso para el fortalecimiento del efecto injerto contra tumor. El Ligando del zalpha11 estimula la generación de células NK líticas de precursoras de la médula y estimula la proliferación de células T después de la activación de los receptores de antígenos. Por lo tanto, cuando los pacientes reciben alotrasplantes de médula, el Ligando del zalpha11 aumenta la generación de respuestas antitumorales, con o sin la infusión de linfocitos de donante.
La distribución tisular de un receptor para determinada citocina ofrece una fuerte indicación de los posibles sitios de acción de dicha citocina. Los análisis Northern blot del receptor zalpha11 revelaron transcritos en el bazo, el timo, los ganglios linfáticos, la médula ósea y los leucocitos de sangre periférica humanos. Se identificaron tipos celulares específicos que expresan receptores zalpha11, y se observaron fuertes señales en una reacción mixta de linfocitos (mixed lymphocyte reaction, MLR) y en el linfoma de Burkitt Raji. Las dos líneas celulares monocíticas, THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Cancer 26:171-176, 1980) y U937 (Sundstrom et al., Int. J. Cancer 17:565-577, 1976), fueron negativas.
El receptor zalpha11 se expresa a niveles relativamente altos en la MLR, en la que se mezclan las células mononucleares de sangre periférica (peripheral blood mononuclear cell, PBMNC) de dos individuos, lo que provoca una activación mutua. La detección de altos niveles de transcrito en la MLR, pero no en las poblaciones de células T o B en reposo, sugiere que la expresión del receptor zalpha11 puede ser inducida en uno o más tipos celulares durante la activación. La activación de poblaciones aisladas de células T y B puede lograrse artificialmente mediante la estimulación de células con PMA e ionomicina. Cuando se sometieron células clasificadas a estas condiciones de activación, los niveles de transcrito de receptor zalpha11 disminuyeron en ambos tipos celulares, lo que respalda la existencia de una función para este receptor y para el Ligando del zalpha11 en las respuestas inmunitarias, especialmente en las expansiones autocrinas y paracrinas de células T y B durante la activación. El Ligando del zalpha11 también puede cumplir una función en la expansión de precursoras más primitivas que participan en la linfopoyesis.
Se halló que el receptor zalpha11 estaba presente en bajos niveles en las células T y B en reposo, y que se regula por adición durante la activación en ambos tipos celulares. Cabe destacar que las células B también regulan disminuyendo el mensaje más rápidamente que las células T, lo que sugiere que la amplitud de la señal y el plazo para la inhibición de la señal son importantes para la regulación adecuada de las respuestas de las células B.
Además, una gran proporción de células de la lámina propia del intestino muestran señales de hibridación positiva con el receptor zalpha11. Este tejido consiste en una población mixta de células linfoides, incluidas células T CD4+ activadas y células B activadas. La disfunción inmunitaria, en particular la activación crónica de la respuesta inmunitaria de la mucosa, cumple una función importante en la etiología de la enfermedad de Crohn; la respuesta anormal a las citocinas proinflamatorias y/o la producción de estas es también un presunto factor (Braegger et al., Annals Allergy 72:135-141, 1994; Sartor RB Am. J. Gastroenterol. 92:5S-11S, 1997.) El Ligando del zalpha11, en forma conjunta con la IL-15, expande las células NK de las precursoras de médula ósea y aumenta la función efectora de las células NK. El Ligando del zalpha11 también coestimula las células B maduras estimuladas con anticuerpos contra el CD40, pero inhibe la proliferación de células B para las señales a través de la IgM. El Ligando del zalpha11 aumenta la proliferación de células T, en forma conjunta con una señal a través del receptor de células T, y la sobreexpresión en ratones transgénicos produce linfopenia y una expansión de los monocitos y granulocitos. Estos efectos pleotrópicos del Ligando del zalpha11 sugirieron que este ligando puede proporcionar una utilidad terapéutica para una amplia variedad de enfermedades que surgen a causa de defectos en el sistema inmunitario, que incluyen (a modo de ejemplo) el lupus eritematoso sistémico (systemic lupus erythematosus, SLE), la artritis reumatoidea (rheumatoid arthritis, RA), la esclerosis múltiple (multiple sclerosis, MS), la miastenia grave y la diabetes. Es importante tener en cuenta que estas enfermedades son el resultado de una compleja de red de disfunciones inmunitarias (el SLE, por ejemplo, es la manifestación de defectos en las células T y B), y que los inmunocitos son dependientes de la interacción entre sí para producir una respuesta inmunitaria potente. Por lo tanto, el Ligando del zalpha11 (o un antagonista del Ligando) que puede utilizarse para manipular más de un tipo de inmunocito es un candidato terapéutico atractivo para la intervención en varios estadios de la enfermedad.
Los polipéptidos y las proteínas de la presente invención también pueden utilizarse ex vivo, como en el cultivo de médula autóloga. En resumen, se extrae la médula ósea de un paciente antes de la quimioterapia o el trasplante de órgano y se trata la médula con el Ligando del zalpha11, de manera opcional, en combinación con una o más citocinas distintas. La médula tratada se regresa al paciente después de la quimioterapia, a fin de acelerar la recuperación de la médula, o después del trasplante, a fin de evitar la enfermedad injerto contra huésped. Además, las proteínas de la presente invención también pueden utilizarse para la expansión ex vivo de células de la médula o de células precursoras de la sangre periférica (peripheral blood progenitor cell, PBPC). Antes del tratamiento, la médula puede ser estimulada con el factor de células progenitoras (stem cell factor, SCF) para que libere células precursoras en forma temprana en la circulación periférica. Estas precursoras pueden recolectarse y concentrarse a partir de sangre periférica y, luego, tratarse en cultivo con el Ligando del zalpha11, de manera opcional, en combinación con una o más citocinas distintas, que incluyen, a modo de ejemplo, el SCF, la IL-2, la IL-4, la IL-7 o la IL-15, para que se diferencien y proliferen en cultivos linfoides de alta densidad, que luego pueden regresarse al paciente después de la quimioterapia o el trasplante.
La presente invención proporciona un método para la expansión de células hematopoyéticas y precursoras de células hematopoyéticas que comprenden cultivar células de médula ósea o de sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de Ligando del zalpha11 suficiente para producir un aumento en la cantidad de células linfoides en las células de médula ósea o de sangre periférica, en comparación con células de médula ósea o de sangre periférica cultivadas en ausencia del Ligando del zalpha11. En otras aplicaciones, las células hematopoyéticas y las células precursoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra aplicación, las células linfoides son células NK o células T citotóxicas. Asimismo, la composición también puede comprender, al menos, otra citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando Flt3 y factor de células progenitoras.
Como alternativa, el Ligando del zalpha11 puede activar el sistema inmunitario, lo que sería importante para reforzar la inmunidad contra enfermedades infecciosas, tratar pacientes inmunocomprometidos, como los pacientes VIH+, o mejorar las vacunas. En particular, la estimulación o la expansión de células NK con el Ligando del zalpha11, o sus precursoras, proporcionaría un valor terapéutico en el tratamiento de una infección viral y como factor antineoplásico. Se cree que las células NK cumplen una función principal en la eliminación de células tumorales metastásicas, y los pacientes que tienen tanto metástasis como tumores sólidos tienen los niveles de actividad de las células NK disminuidos (Whiteside et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230:221-244, 1998). De manera similar, la estimulación de la respuesta inmunitaria con Ligando del zalpha11 contra agentes patógenos virales y no virales (incluidos bacterias, protozoos y hongos) proporcionaría un valor terapéutico en el tratamiento de dichas infecciones a través de la inhibición del crecimiento de dichos agentes infecciosos. La determinación directa o indirecta de los niveles de un patógeno o de un antígeno, como una célula tumoral, presentes en el cuerpo puede obtenerse mediante una serie de métodos conocidos en la especialidad y descritos en la presente.
La presente invención proporciona el uso de una composición para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero expuesto a un antígeno o a un patógeno, que comprende los siguientes pasos: (1) determinar directa o indirectamente el nivel de antígeno o patógeno presente en dicho mamífero; (2) administrar una composición que comprende el polipéptido del Ligando del zalpha11 en un vehículo farmacéutico aceptable; (3) determinar directa o indirectamente el nivel de antígeno o patógeno en dicho mamífero; y (4) comparar el nivel de antígeno o patógeno del paso 1 con el nivel de antígeno o patógeno del paso 3, donde un cambio en el nivel es indicativo de estimulación de una respuesta inmunitaria. En otra aplicación, la composición del Ligando del zalpha11 se vuelve a administrar. En otras aplicaciones, el antígeno es un tumor de células B; un virus; un parásito o una bacteria.
En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de una composición para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero expuesto a un antígeno o a un patógeno que comprende: (1) determinar el nivel de un anticuerpo específico contra un antígeno o un patógeno; (2) administrar una composición que comprende el polipéptido del Ligando del zalpha11 en un vehículo farmacéutico aceptable; (3) determinar el nivel posterior a la administración de un anticuerpo específico contra un antígeno o un patógeno; (4) comparar el nivel de anticuerpo del paso (1) con el nivel de anticuerpo del paso (3), donde un aumento en el nivel de anticuerpos es indicativo de estimulación de una respuesta inmunitaria.
Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos del Ligando del zalpha11 son útiles en las aplicaciones de terapia génica en las que se desea aumentar o inhibir la actividad del Ligando del zalpha11. Si un mamífero tiene un gen del Ligando del zalpha11 mutado o ausente, el gen del Ligando del zalpha11 puede ser introducido en las células del mamífero. En una aplicación, un gen que codifica un polipéptido del Ligando del zalpha11 se introduce in vivo en un vector viral. Dichos vectores incluyen un virus con ADN atenuado o defectuoso, como, a modo de ejemplo, el virus herpes simple (herpes simplex virus, HSV), virus del papiloma, virus de Epstein Barr (Epstein Barr virus, EBV), adenovirus, virus adenoasociado (AAV) y similares. Se prefieren, los virus defectuosos, que carecen de genes virales en forma total o casi total. Un virus defectuoso no es infeccioso después de la introducción en una célula. El uso de vectores virales defectuosos permite la administración a células de un área localizada en particular, sin preocuparse de que el vector pueda infectar otras células. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, a modo de ejemplo, un vector del virus herpes simple 1 (HSV1) defectuoso (Kaplitt et al., Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30, 1991); un vector del adenovirus atenuado, como el vector descrito por Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90:626-30, 1992; y un vector del virus adenoasociado defectuoso (Samulski et al., J. Virol. 61:3096-101, 1987; Samulski et al., J. Virol. 63:3822-8, 1989).
Un gen del Ligando del zalpha11 puede introducirse en un vector retroviral, p. ej. como se describe en Anderson et al., Patente de EE. UU. N.º 5.399.346; Mann et al. Cell 33:153, 1983; Temin et al., Patente de EE. UU. N.º 4.650.764; Temin et al., Patente de EE. UU. N.º 4.980.289; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120, 1988; Temin et al., Patente de EE. UU. N.º 5.124.263; Publicación de patente internacional N.º WO 95/07358, publicado el 16 de marzo de 1995 por Dougherty et al.; y Kuo et al., Blood 82:845, 1993. Como alternativa, el vector puede introducirse mediante lipofección in vivo utilizando liposomas. Pueden utilizarse lípidos catiónicos sintéticos para preparar los liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7, 1987; Mackey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8027-31, 1988). El uso de la lipofección para introducir genes exógenos en órganos específicos in vivo tiene determinadas ventajas prácticas. La dirección molecular de liposomas a células específicas representa una de las áreas de beneficio. Más particularmente, la dirección de la transfección a células específicas representa una de las áreas de beneficio. Por ejemplo, la dirección de la transfección a tipos celulares específicos sería particularmente ventajosa en un tejido con heterogeneidad celular, como el sistema inmunitario, el páncreas, el hígado, el riñón y el cerebro. Los lípidos pueden acoplarse químicamente a otras moléculas a los fines de conferir la dirección. Los péptidos dirigidos (p. ej. las hormonas o los neurotransmisores), las proteínas, por ejemplo, los anticuerpos, o las moléculas no peptídicas pueden acoplarse químicamente a los liposomas.
Es posible extraer las células diana del cuerpo, introducir el vector como plásmido de ADN desnudo y, luego, implantar nuevamente las células transformadas en el cuerpo. Los vectores de ADN desnudo para terapia génica pueden introducirse en las células huésped deseadas mediante métodos conocidos en la especialidad, p. ej. transfección, electroporación, microinyección, transducción, fusión celular, DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, uso de una pistola génica o uso de un transportador de vectores de ADN. Véanse, p. ej. Wu et al., J. Biol. Chem. 267:963-7, 1992; Wu et al., J. Biol. Chem. 263:14621-4, 1988.
La metodología no codificante puede utilizarse para inhibir la transcripción génica del Ligando del zalpha11 y, por ejemplo, para inhibir la proliferación celular in vivo. Se diseñan polinucleótidos complementarios a un segmento de un polinucleótido que codifica el Ligando del zalpha11 (p. ej. un polinucleótido como el presentado en la SEC. ID. N.º 1), para que se unan al ARNm que codifica el Ligando del zalpha11 y para que inhiban la traducción de dicho ARNm. Dichos polinucleótidos no codificantes se utilizan para inhibir la expresión de los genes que codifican el polipéptido del Ligando del zalpha11 en cultivo celular o en un sujeto.
También pueden generarse ratones genomanipulados para que expresen el gen del Ligando del zalpha11, denominados "ratones transgénicos", y ratones que exhiben una ausencia completa de la función del gen del Ligando del zalpha11, denominados "ratones knockout" (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature 366:740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244: 1288-1292, 1989; Palmiter, R.D. et al. Annu Rev Genet. 20: 465-499, 1986). Por ejemplo, los ratones transgénicos que sobreexpresan el Ligando del zalpha11, ya sea de manera ubicua o bajo un promotor específico para un tejido o restringido a un tejido, pueden utilizarse para determinar si la sobreexpresión causa un fenotipo. Por ejemplo, la sobreexpresión de un polipéptido, un fragmento de polipéptido o un mutante del Ligando del zalpha11 genéticamente intacto puede alterar los procesos celulares normales, y provocar un fenotipo que identifica un tejido en el que la expresión del Ligando del zalpha11 es funcionalmente relevante, y puede indicar un objetivo terapéutico para el Ligando del zalpha11, sus agonistas o antagonistas. Por ejemplo, un ratón transgénico que se prefiere para la genomanipulación es aquel que sobreexpresa el Ligando del zalpha11 (residuos de aminoácidos 32-162 de la SEC. ID. N.º 2). Además, dicha sobreexpresión puede tener por consecuencia un fenotipo que muestra similitud con las enfermedades humanas. De manera similar, los ratones knockout con el Ligando del zalpha11 pueden utilizarse para determinar dónde el Ligando del zalpha11 es absolutamente necesario in vivo. El fenotipo de los ratones knockout predice los efectos in vivo que puede tener un antagonista del Ligando del zalpha11, como aquellos descritos en la presente. Puede utilizarse ADNc del Ligando del zalpha11 humano o de ratón para generar ratones knockout. Estos ratones pueden emplearse para estudiar el gen del Ligando del zalpha11 y la proteína codificada por este en un sistema in vivo, y pueden utilizarse como modelos in vivo para las enfermedades humanas correspondientes. Además, la expresión en ratones transgénicos de polinucleótidos no codificantes del Ligando del zalpha11 o de ribocimas dirigidas contra el Ligando del zalpha11, descrita en la presente, puede usarse en forma análoga a los ratones transgénicos descritos anteriormente. Los estudios también pueden llevarse a cabo mediante la administración de proteína del Ligando del zalpha11 purificada.
Las proteínas de la presente invención pueden formularse para administración parenteral, en particular intravenosa o subcutánea, de acuerdo con los métodos convencionales. Los conjugados bioactivos de los polipéptidos o los anticuerpos descritos en la presente pueden administrarse por vía intravenosa, intraarterial o intracanalicular, o pueden introducirse en forma local en el sitio de acción deseado. La administración intravenosa se realizará mediante inyección o infusión en bolo durante un período típico, que durará entre una y varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán un polipéptido del Ligando del zalpha11 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, como solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa al 5% en agua, o similares. Las formulaciones también pueden incluir uno o más excipientes, conservantes, solubilizantes, agentes amortiguadores, albúmina para prevenir la pérdida de proteínas en las superficies de los viales, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la especialidad y han sido divulgados, por ejemplo, por Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19.a ed., 1995. Las dosis terapéuticas se encuentran, en general, en el rango de entre 0,1 y 100 \mug/kg de peso del paciente por d\mua, preferentemente, 0,5-20 \mug/kg por día, con la dosis exacta determinada por el médico clínico según los estándares aceptados, teniendo en cuenta la naturaleza y severidad de la condición tratada, las características del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro de los conocimientos generales de la materia. Las proteínas pueden administrarse para el tratamiento agudo, durante una semana o menos, a menudo durante un período de uno a tres días, o pueden utilizarse en el tratamiento crónico, durante varios meses o años. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva del Ligando del zalpha11 es una cantidad suficiente para producir un cambio significativo desde el punto de vista clínico en la función hematopoyética o inmunitaria.
Se ejemplifica aún más la invención a través de los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de la quimera polipéptido MPL-zalpha11: dominio extracelular y TM del MPL fusionado con el dominio de señalización intracelular del zalpha11
Se aislaron dominios extracelulares y transmembrana del receptor MPL murino a partir de un plásmido que contenía el receptor MPL murino (plásmido PHZ1/MPL) mediante PCR con los cebadores ZC17,212 (SEC. ID. N.º 5) y ZC19,914 (SEC. ID. N.º 6). Las condiciones de la reacción fueron las siguientes: 95ºC durante 1 min; 35 ciclos a 95ºC durante 1 min, 45ºC durante 1 min, 72ºC durante 2 min; seguidos de 72ºC a los 10 min; luego, un remojo a 10ºC. El producto de la PCR se pasó por agarosa al 1% con una baja temperatura de fusión (Boerhinger Mannheim, Indianapolis, IN) y se aisló el fragmento del receptor MPL de aproximadamente 1,5 kb utilizando el equipo de extracción con gel Qiaquick^{TM} (Qiagen), según las instrucciones del fabricante.
Se aislaron dominios intracelulares del zalpha11 humano a partir de un plásmido que contenía el ADNc del receptor zalpha11 mediante PCR con los cebadores ZC19,913 (SEC. ID. N.º 8) y ZC20,097 (SEC. ID. N.º 9). La secuencia de polinucleótido correspondiente a la secuencia codificante del receptor zalpha11 se muestra en la SEC. ID. N.º 7, y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestra en la SEC. ID. N.º 115. Las condiciones de la reacción fueron las descritas anteriormente. El producto de la PCR se pasó por agarosa al 1% con una baja temperatura de fusión (Boerhinger Mannheim) y se aisló el fragmento de zalpha11 de aproximadamente 900 pb utilizando el equipo de extracción con gel Qiaquick, según las instrucciones del fabricante.
Cada uno de los fragmentos aislados descritos anteriormente se mezcló a una relación volumétrica de 1:1 y se usaron en una reacción PCR utilizando ZC17,212 (SEC. ID. N.º 5) y ZC20,097 (SEC. ID. N.º 9) para crear la quimera MPL-zalpha11. Las condiciones de la reacción fueron las siguientes: 95ºC durante 1 min; 35 ciclos a 95ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, 72ºC durante 2 min; seguidos de 72ºC a los 10 min; luego, un remojo a 10ºC. Todo el producto de la PCR se pasó por agarosa al 1% con una baja temperatura de fusión (Boehringer Mannheim) y se aisló el fragmento de la quimera MPL-zalpha11 de aproximadamente 2,4 kb utilizando el equipo de extracción con gel Qiaquick (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. El fragmento de la quimera MPL-zalpha11 se digirió con EcoRI (BRL) y XbaI (Boerhinger Mannheim), según las instrucciones del fabricante. Todo el resultado de la digestión se pasó por agarosa al 1% con una baja temperatura de fusión (Boehringer Mannheim) y se aisló la quimera MPL-zalpha11 segmentada utilizando el equipo de extracción con gel Qiaquick^{TM} (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. La quimera MPL-zalpha11 segmentada resultante se insertó en un vector de expresión, según se describe a continuación.
El vector de expresión pZP-5N receptor se digirió con EcoRI (BRL) y HindIII (BRL) según las instrucciones del fabricante, y se purificó con gel según lo descrito anteriormente. Este fragmento vector se combinó con la quimera MPL-zalpha11 segmentada con EcoRI y XbaI que se aisló anteriormente y con un fragmento ligador XbaI/HindIII en una reacción de ligadura. La ligadura se pasó utilizando la T4 ligasa (BRL), a 15ºC, de un día para el otro. Una muestra de la ligadura se electroporó en células de E. coli electrocompetentes DH10B ElectroMAX^{TM} (25 \muF; 200 \Omega; 2,3 V). Los transformantes se sembraron en placas con LB+ampicilina, y las colonias simples se cribaron mediante PCR para detectar la presencia de la quimera MPL-zalpha11 utilizando ZC17,212 (SEC. ID. N.º 5) y ZC20,097 (SEC. ID. N.º 9), en las condiciones de la PCR descritas anteriormente.
La confirmación de la secuencia de la quimera MPL-zalpha11 se realizó mediante análisis de secuencia, utilizando los siguientes cebadores: ZC12,700 (SEC. ID. N.º 10), ZC5,020 (SEC. ID. N.º 11), ZC6,675 (SEC. ID. N.º 12), ZC7,727 (SEC. ID. N.º 13), ZC8,290 (SEC. ID. N.º 14), ZC19,572 (SEC. ID. N.º 15), ZC6,622 (SEC. ID. N.º 16), ZC7,736 (SEC. ID. N.º 17) y ZC9,273 (SEC. ID. N.º 18). El inserto tenía aproximadamente 2,4 pb y era de longitud completa.
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Ejemplo 2 Proliferación basada en la quimera MPL-zalpha11 en la valoración de BAF3 con Alamar Blue A. Construcción de células BaF3 que expresan la quimera MPL-zalpha11
La BaF3, una línea celular prelinfoide dependiente de la interleucina-3 (IL-3) derivada de la médula ósea murina (Palacios y Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986) se mantuvo en medio completo (medio RPMI (JRH Bioscience Inc., Lenexa, KS) suplementado con suero fetal de ternero inactivado por calor al 10%, 2 ng/ml de IL-3 murina (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), L-glutaMax-1^{TM} (Gibco BRL) 2 mM, piruvato de sodio (Gibco BRL) 1 mM y antibióticos PSN (GIBCO BRL)). Antes de la electroporación, se preparó el ADN plasmídico del pZP-5N/MPL-zalpha11 (Ejemplo 1) y se purificó utilizando un equipo Maxi Prep de Qiagen (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Las células BaF3 para electroporación se lavaron una vez en medio RPMI y, luego, se resuspendieron en medio RPMI a una densidad celular de 10^{7} células/ml. Se mezcló un ml de células BaF3 resuspendidas con 30 \mug del ADN plasmídico del pZP-5N/MPL-zalpha11 y se transfirió a cámaras de electroporación desechables separadas (GIBCO BRL). Después de una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente, las células recibieron dos choques seriados (800 lFad/300 V.; 1180 lFad/300 V.) administrados por un aparato de electroporación (CELL-PORATOR^{TM}; GIBCO BRL). Después de un tiempo de recuperación de 5 minutos, las células electroporadas se transfirieron a 50 ml de medio completo y se colocaron en una incubadora durante 15-24 horas (37ºC, con 5% de CO_{2}). Luego, se centrifugaron las células y se resuspendieron en 50 ml de medio completo que contenía una selección de Geneticin^{TM} (Gibco) (500 \mug/ml G418) en un matraz T-162 para aislar el agrupamiento resistente al G418. Los agrupamientos de las células BaF3 transfectadas, en adelante denominadas células BaF3/MPL-zalpha11, se analizaron para determinar su capacidad de señalización, según se describe a continuación.
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B. Evaluación de la capacidad de señalización de las células BaF3/MPL-zalpha11 mediante valoración de la proliferación con Alamar Blue
Se centrifugaron las células BaF3/MPL-zalpha11 y se lavaron en el medio completo, descrito anteriormente, pero sin mIL-3 (en adelante denominado "medio sin mIL-3"). Las células se centrifugaron y se lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de la mIL-3. Luego, las células se contaron con un hemocitómetro. Las células se sembraron en placas en un formato de 96 pocillos a razón de 5.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul por pocillo utilizando el medio sin mIL-3.
La proliferación de las células BaF3/MPL-zalpha11 se evaluó utilizando trombopoyetina murina (mTPO) diluida con un medio sin mIL-3 hasta alcanzar concentraciones de 500 ng/ml; 250 ng/ml; 125 ng/ml; 62 ng/ml; 30 ng/ml; 15 ng/ml; 7,5 ng/ml; 3,75 ng/ml; 1,8 ng/ml; 0,9 ng/ml; 0,5 ng/ml; y 0,25 ng/ml. Se agregaron 100 \mul de la mTPO diluida a las células BaF3/MPL-zalpha11. El volumen total de la valoración es 200 \mul. Los controles negativos se pasaron en paralelo utilizando un medio sin mIL-3 únicamente, sin la adición de mTPO. Las placas para valoración se incubaron a 37ºC, con 5% de CO_{2}, durante 3 días, en cuyo momento se agregó Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 \mul/pocillo. El Alamar Blue proporciona una lectura fluorométrica basada en la actividad metabólica de las células y, por ende, es una medición directa de la proliferación celular, en comparación con un control negativo. Las placas se volvieron a incubar a 37ºC, con 5% de CO_{2}, durante 24 horas. Las placas se leyeron en la lectora de placas Fmax^{TM} (Molecular Devices Sunnyvale, CA) utilizando el programa SoftMax^{TM} Pro, a las longitudes de onda de 544 (Excitación) y 590 (Emisión).
Los resultados confirmaron la capacidad de señalización de la porción intracelular del receptor zalpha11, ya que la trombopoyetina indujo la proliferación a un nivel aproximadamente 10 veces mayor que la proliferación de fondo, a concentraciones de mTPO de 62 ng/ml y mayores.
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Ejemplo 3 Construcción del vector de expresión que expresa el zalpha11 de longitud completa
Se aisló todo el receptor zalpha11 a partir de un plásmido que contenía el ADNc del receptor zalpha11 (SEC. ID. N.º 7) mediante PCR con los cebadores ZC19,905 (SEC. ID. N.º 19) y ZC19,906 (SEC. ID. N.º 20). Las condiciones de la reacción fueron las siguientes: 95ºC durante 1 min; 35 ciclos a 95ºC durante 1 min, 55ºC durante 1 min, 72ºC durante 2 min; seguidos de 72ºC a los 10 min; luego, un remojo a 10ºC. El producto de la PCR se pasó por un gel de agarosa al 1% con una baja temperatura de fusión (Boerhinger Mannheim) y se aisló el ADNc del zalpha11 de aproximadamente 1,5 kb utilizando el equipo de extracción con gel Qiaquick^{TM} (Qiagen), según las instrucciones del fabricante.
El ADNc del zalpha11 purificado se digirió con BamHI (Boerhinger Mannheim) y EcoRI (BRL), según las instrucciones del fabricante. Todo el resultado de la digestión se pasó por un gel de agarosa al 1% con una baja temperatura de fusión (Boerhinger Mannheim) y se purificó el fragmento de zalpha11 segmentado utilizando el equipo de extracción con gel Qiaquick^{TM}, según las instrucciones del fabricante. El fragmento de zalpha11 segmentado resultante se insertó en un vector de expresión, según se describe a continuación.
El vector de expresión pZP-5N receptor se digirió con BamHI (Boerhinger Mannheim) y EcoRI (BRL) según las instrucciones del fabricante, y se purificó con gel según lo descrito anteriormente. Este fragmento vector se combinó con el fragmento de zalpha11 segmentado con BamHI y EcoRI que se aisló anteriormente en una reacción de ligadura utilizando T4 ligasa (BRL). La ligadura se incubó a 15ºC, de un día para el otro. Una muestra de la ligadura se electroporó en células de E. coli electrocompetentes DH10B ElectroMAX^{TM} (25 \muF; 200 \Omega; 2,3 V). Los transformantes se sembraron en placas con LB+ampicilina, y las colonias simples se cribaron mediante PCR para detectar la presencia de la secuencia del zalpha11 utilizando ZC19,905 (SEC. ID. N.º 19) y ZC19,906 (SEC. ID. N.º 20), en las condiciones de la PCR descritas anteriormente.
La confirmación de la secuencia del zalpha11 se realizó mediante análisis de secuencia, utilizando los siguientes cebadores: ZC12,700 (SEC. ID. N.º 10), ZC5,020 (SEC. ID. N.º 11), ZC20,114 (SEC. ID. N.º 21), ZC19,459 (SEC. ID. N.º 22), ZC19,954 (SEC. ID. N.º 23), y ZC20,116 (SEC. ID. N.º 24). El inserto tenía aproximadamente 1,6 kb y era de longitud completa.
Ejemplo 4 Proliferación basada en el zalpha11 en la valoración de BAF3 con Alamar Blue A. Construcción de células BaF3 que expresan el receptor zalpha11
Se construyeron células BaF3 que expresan el receptor zalpha11 de longitud completa, según el Ejemplo 2A mencionado anteriormente, utilizando 30 \mug del vector de expresión del zalpha11, descrito en el Ejemplo 3 mencionado anteriormente. Las células BaF3 que expresan el ARNm del receptor zalpha11 se denominaron BaF3/zalpha11. Estas células se utilizaron para cribar el Ligando del zalpha11, según se describe a continuación en los Ejemplos 5 y 6.
Ejemplo 5 Cribaje para el Ligando del zalpha11 utilizando las células BaF3/zalpha11 mediante valoración de la proliferación con Alamar Blue A. Activación de esplenocitos de mono primarios para detectar la presencia del Ligando del zalpha11
Los esplenocitos de mono se estimularon in vitro para producir un medio acondicionado para detectar la presencia de la actividad del Ligando del zalpha11, según se describe a continuación. Se obtuvieron bazos de mono M. nesestrian hembra de 8 años. Los bazos se separaron para producir una suspensión unicelular. Se aislaron las células mononucleares mediante el gradiente de densidad Ficoll-Paque® PLUS (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Las células mononucleares se sembraron a razón de 2 x 10^{6} células/ml en medio RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal (fetal bovine serum, FBS) al 10% y se activaron con 5 ng/ml de forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) (Calbiochem, San Diego, CA) y 0,5 mg/ml de Ionomycin^{TM} (Calbiochem) durante 48 h. El sobrenadante de las células de bazo de mono estimuladas se utilizó para analizar la proliferación de las células BaF3/zalpha11, según se describe a continuación.
B. Cribaje para el Ligando del zalpha11 utilizando las células BaF3/Zalpha11 mediante valoración de la proliferación con Alamar Blue
Se centrifugaron células BaF3/Zalpha11 y se lavaron en un medio sin mIL-3. Las células se centrifugaron y se lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de la mIL-3. Luego, las células se contaron con un hemocitómetro. Las células se sembraron en placas en un formato de 96 pocillos a razón de 5.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul por pocillo utilizando el medio sin mIL-3.
La proliferación de las células BaF3/Zalpha11 se evaluó utilizando un medio acondicionado con bazo de mono activado (véase el Ejemplo 5A). El medio acondicionado se diluyó con el medio sin mIL-3 hasta alcanzar concentraciones al 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,125%; 1,5%; 0,75%; y 0,375%. Se agregaron 100 \mul de medio acondicionado diluido a las células BaF3/Zalpha11. El volumen total de la valoración es 200 \mul. Las placas para valoración se incubaron a 37ºC, con 5% de CO_{2}, durante 3 días, en cuyo momento se agregó Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) a 20 \mul/pocillo. Las placas se volvieron a incubar a 37ºC, con 5% de CO_{2}, durante 24 horas. Las placas se leyeron en la lectora de placas Fmax^{TM} (Molecular Devices), según lo descrito anteriormente (Ejemplo 2).
Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa de las células BaF3/Zalpha11 a un factor presente en el medio acondicionado con bazo de mono activado. La respuesta, según las mediciones, fue aproximadamente 4 veces mayor que la respuesta de fondo a la concentración del 50%. Las células BaF3 no transfectadas no proliferaron en respuesta a este factor, lo que demuestra que este factor es específico para el receptor Zalpha11.
C. Fuente primaria humana utilizada para aislar el Ligando del zalpha11
Se realizaron extracciones de sangre de 100 ml cada una a seis donantes. La sangre se extrajo utilizando 10X tubos Vacutainer de 10 ml que contenían heparina. La sangre se agrupó a partir de seis donantes (600 ml), se diluyó en una proporción 1:1 en solución salina amortiguada con fosfato (phosphate buffered saline, PBS), y se separó utilizando Ficoll-Paque® PLUS (Pharmacia Biotech). La producción de células humanas primarias aisladas después de la separación mediante el gradiente de Ficoll fue de 1,2X10^{9} células.
Las células se suspendieron en 9,6 ml de solución amortiguadora MACS (PBS, EDTA al 0,5%, EDTA 2 mM). Se extrajeron 1,6 ml de la suspensión celular y se agregaron 0,4 ml de microperlas CD3 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). La mezcla se incubó durante 15 min a 4ºC. Estas células marcadas con perlas CD3 se lavaron con 30 ml de solución amortiguadora MACS y, luego, se resuspendieron en 2 ml de solución amortiguadora MACS.
Se preparó una columna VS+ (Miltenyi) según las instrucciones del fabricante. Luego, la columna VS+ se colocó en un campo magnético VarioMACS^{TM} (Miltenyi). La columna se equilibró con 5 ml de solución amortiguadora MACS. Luego, se aplicaron las células humanas primarias aisladas a la columna. Se permitió que pasaran las células CD3 negativas. La columna se enjuagó con 9 ml (3 X 3 ml) de solución amortiguadora MACS. Luego, se retiró la columna del magneto y se colocó sobre un tubo Falcon de 15 ml. Se eluyeron las células CD3+ agregando 5 ml de solución amortiguadora MACS a la columna, y las células unidas se retiraron a presión utilizando el émbolo proporcionado por el fabricante. La incubación de las células con las perlas magnéticas CD3, los lavados y los pasos de la columna VS+ (incubación hasta elución) descritos anteriormente se repitieron cinco veces más. Se agruparon las fracciones de CD3+ resultantes de las seis separaciones de la columna. La producción de células humanas seleccionadas por CD3+ fue de 3X10^{8} células en total.
Se extrajo una muestra de las células humanas seleccionadas por CD3+ agrupadas para su tinción y clasificación mediante un clasificador de anticuerpos activados por fluorescencia (fluorescence-activated cell sorter, FACS) para evaluar su pureza. Las células humanas seleccionadas por CD3+ fueron células CD3+ en un 91%.
Las células humanas seleccionadas por CD3+ se activaron mediante incubación en RPMI + FBS al 5% + PMA 10 ng/ml e Ionomycin (Calbiochem) 0,5 \mug/ml durante 13 horas a 37ºC. Se evaluó el sobrenadante de estas células humanas activadas seleccionadas por CD3+ para evaluar la actividad del Ligando del zalpha11, según se describe a continuación. Además, las células humanas activadas seleccionadas por CD3+ se utilizaron para preparar una genoteca de ADNc, como se describe en el Ejemplo 6, a continuación.
D. Evaluación del sobrenadante de las células humanas activadas seleccionadas por CD3+ para evaluar el Ligando del zalpha11 mediante el uso de células BaF3/Zalpha11 y la valoración de la proliferación con Alamar Blue
Se centrifugaron células BaF3/Zalpha11 y se lavaron en un medio sin mIL-3. Las células se centrifugaron y se lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de la mIL-3. Luego, las células se contaron con un hemocitómetro. Las células se sembraron en placas en un formato de 96 pocillos a razón de 5.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul por pocillo utilizando el medio sin mIL-3.
La proliferación de las células BaF3/Zalpha11 se evaluó utilizando un medio acondicionado de células humanas activadas seleccionadas por CD3+ (véase el Ejemplo 5C) diluido con un medio sin mIL-3 hasta alcanzar concentraciones al 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,125%; 1,5%; 0,75%; y 0,375%. Se agregaron 100 \mul de medio acondicionado diluido a las células BaF3/Zalpha11. El volumen total de la valoración es 200 \mul. Las placas para valoración se incubaron y se analizaron como se describe en el Ejemplo 5B.
Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa de las células BaF3/Zalpha11 a un factor presente en el medio acondicionado de células humanas activadas seleccionadas por CD3+. La respuesta, según las mediciones, fue aproximadamente 10 veces mayor que la respuesta de fondo a la concentración del 50%. Las células BaF3 no transfectadas no proliferaron en respuesta a este factor, lo que demuestra que este factor es específico para el receptor Zalpha11. Además, el receptor alpha11 soluble bloqueó esta actividad proliferativa en las células BaF3/Zalpha11 (véase el Ejemplo 11).
Ejemplo 6 Clonación del Ligando del zalpha11 humano a partir de una genoteca de células humanas seleccionadas por CD3+
El cribaje de una genoteca de ADNc de células humanas activadas primarias seleccionadas por CD3+ reveló un ADNc aislado que es un nuevo miembro de la familia de citocinas con haz de cuatro hélices. Este ADNc codificó el Ligando del zalpha11. Se identificó el ADNc mediante cribaje para la actividad del Ligando del zalpha11 utilizando el receptor zalpha11.
A. Vector para construcción de la genoteca seleccionada por CD3+
El vector para construcción de la genoteca seleccionada por CD3+ fue el pZP7NX. Se construyó el vector pZP7NX de la siguiente manera: la región codificante para el marcador selectivo de DHFR en el vector pZP7 se retiró mediante digestión de ADN con las enzimas de restricción NcoI y PstI (Boehringer Mannheim). El ADN digerido se pasó por gel de agarosa al 1%, se cortó y se purificó con gel utilizando el equipo de extracción con gel Qiagen (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. Se amplificó un fragmento de ADN que representa la región codificante del marcador selectivo de Zeocin mediante el método de PCR con los cebadores ZC13,946 (SEC. ID. N.º 25) y ZC13,945 (SEC. ID. N.º 26), y pZeoSV2(+) como plantilla. Existen sitios de restricción PstI y BclI adicionales en el cebador ZC13,946 (SEC. ID. N.º 25), y sitios NcoI y SfuI adicionales en el cebador ZC13,945 (SEC. ID. N.º 26). El fragmento obtenido mediante PCR se cortó con las enzimas de restricción PstI y NcoI y se clonó en el vector pZP7 preparado mediante segmentación con las mismas dos enzimas y posterior purificación con gel. Este vector se denominó pZP7Z. Luego, la región codificante de Zeocin se retiró mediante digestión de ADN del vector pZP7Z con las enzimas de restricción BclI y SfuI. El ADN digerido se pasó por gel de agarosa al 1%, se cortó y se purificó con gel y, luego, se ligó con un fragmento de ADN de la región codificante de neomicina cortada del vector pZem228 (depositado en la Colección Estadounidense de Cultivos de Tipos (ATCC), Manassas, VA; ATCC Deposito N.º 69446) con las mismas enzimas de restricción (BclI y SfuI).
Este nuevo vector se denominó pZP7N, en el que la región codificante para el marcador selectivo de DHFR fue reemplazado por la región codificante para un marcador selectivo de neomicina del vector pZem228. Se agregó un fragmento de relleno que incluye un sitio Xho1 al pZP7N para crear un vector adecuado para la clonación direccional de alta eficiencia del ADNc; este nuevo vector se denominó pZP7NX. Para preparar el vector para ADNc, se digirieron 20 \mug de pZP7NX con 20 unidades de EcoR1 (Life Technologies Gaithersberg, MD) y 20 unidades de Xho1 (Boehringer Mannheim Indianapolis, IN) durante 5 horas a 37ºC y, luego, a 68ºC durante 15 minutos. La digestión se pasó por un gel de agarosa al 0,8% 1XTAE con una baja temperatura de fusión para separar el relleno del vector. Se extrajo la banda del vector y se digirió con "beta-Agarase" (New England Biolabs, Beverly, MA), siguiendo las recomendaciones del fabricante. Después de la precipitación con etanol, el vector digerido se resuspendió en agua a 45 ng/ml para preparar la ligadura de la genoteca de ADNc seleccionada por CD3+ descrita a continuación.
B. Preparación de la genoteca de ADNc de células humanas activadas primarias seleccionadas por CD3+
Se aislaron aproximadamente 1,5X10^{8} células humanas primarias seleccionadas por CD3+ estimuladas en ionomicina/PMA mediante centrifugación después de cultivarlas a 37ºC durante 13 horas (Ejemplo 5C). Se aisló el ARN total a partir del sedimento celular utilizando el equipo "RNeasy Midi" de Qiagen, Inc. (Valencia, CA). Se aisló el ARNm a partir de 225 microgramos de ARN total utilizando el "equipo de purificación de ARNm MPG" de CPG Inc. (Lincoln Park, NJ). Se aislaron 3,4 microgramos de ARNm y se convirtieron en ADNc bicatenario utilizando el siguiente procedimiento.
El ADNc de la primera cadena obtenido de las células humanas seleccionadas por CD3+ estimuladas se sintetizó de la siguiente manera. Se mezclaron nueve \mul de ARN CD3+ poli(A) seleccionado por Oligo d(T) a una concentración de 0,34 \mug/\mul con 1,0 \mul de 1 \mug/\mul de cebador de primera cadena ZC18,698 (SEC. ID. N.º 27) que contiene un sitio de restricción XhoI; se calentó la mezcla a 65ºC durante 4 minutos y se enfrió en hielo. La síntesis del ADNc de la primera cadena se inició mediante la adición de 9 \mul de solución amortiguadora de primera cadena (5x solución amortiguadora SUPERSCRIPT® (Life Technologies)), 4 \mul de ditiotreitol 100 mM y 2 \mul de una solución de desoxinucleótido trifosfato que contiene 10 mM cada uno de dATP, dGTP, dTTP y 5-metil-dCTP (Pharmacia Biotech Inc.) a la mezcla de ARN-cebador. La mezcla de reacción se incubó a 45ºC durante 4 minutos, seguido de la adición de 8 \mul de transcriptasa inversa RNasa H SuperscriptII® (Life technologies) 200 U/\mul. La reacción se incubó a 45ºC durante 45 minutos, seguido de un aumento gradual de la temperatura de incubación de 1ºC cada 2 minutos hasta alcanzar 50ºC, punto en el que la reacción se mantuvo durante 10 minutos. Para desnaturalizar cualquier estructura secundaria y permitir una extensión adicional del ADNc, la reacción se calentó a 70ºC durante 2 minutos y, luego, se disminuyó la temperatura a 55ºC durante 4 minutos, luego de lo cual, se agregaron 2 \mul de transcriptasa inversa (reverse transcriptase, RT) SuperscriptII® y se incubó durante 15 minutos adicionales, seguido de un aumento gradual de la temperatura hasta alcanzar los 70ºC a razón de 1 minuto/1ºC. Los nucleótidos no incorporados se eliminaron del ADNc realizando un precipitado dos veces en presencia de 2 \mug de vehículo de glucógeno, acetato de amonio 2,0 M y etanol de 2,5 volúmenes, seguido de un lavado con 100 \mul de etanol al 70%. El ADNc se resuspendió en 98 \mul de agua para su uso en la síntesis de la segunda cadena.
La síntesis de la segunda cadena se realizó sobre el ADNc de la primera cadena en condiciones que promovieron que se cebe la primera cadena de la síntesis de la segunda cadena, lo que provocó la formación de una horquilla de ADN. La reacción de la segunda cadena contenía 98 \mul del ADNc de la primera cadena, 30 \mul de 5x solución amortiguadora de polimerasa I (Tris:HCl 100 mM, pH 7,5, KCl 500 mM, MgCl_{2} 25 mM, (NH4)2SO4 50 mM), 2 \mul de ditiotreitol 100 mM, 6 \mul de una solución que contiene 10 mM de cada desoxinucleótido trifosfato, 5 \mul de b-NAD 5 mM, 1 \mul de ligasa de ADN de E. coli 3 U/\mul(New England Biolabs Inc.), y 4 \mul de polimerasa I de ADN de E. coli 10 U/\mul(New England Biolabs Inc.). La reacción se preparó a temperatura ambiente y se incubó a temperatura ambiente durante 2 minutos, seguido de la adición de 4 \mul de RNasa H 3,8 U/\mul (Life Technologies). La reacción se incubó a 15ºC durante dos horas, seguido de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente. Se agregaron 10 \mul de TRIS 1 M pH 7,4 a la reacción y se extrajo dos veces con fenol/cloroformo y una vez con cloroformo; las fases orgánicas se volvieron a extraer con 50 \mul de TE (TRIS 10 mM pH 7,4; EDTA 1 mM), agrupado con el otro precipitado acuoso y de etanol en presencia de acetato de sodio 0,3 M. El sedimento se lavó con 100 \mul de etanol al 70%, se secó al aire y se resuspendió en 40 \mul de agua.
El ADN monocatenario de la estructura de horquilla se segmentó utilizando nucleasa Mung Bean. La mezcla de reacción contenía 40 \mul de ADNc de la segunda cadena, 5 \mul de 10x solución amortiguadora de nucleasa Mung Bean (Life technologies), 5 \mul de nucleasa Mung Bean (Pharmacia Biotech Corp.) diluida a 1 U/\mul en 1X solución amortiguadora de nucleasa Mung Bean. La reacción se incubó a 37ºC durante 45 minutos. La reacción se terminó mediante la adición de 10 ll de Tris:HCl 1 M pH 7,4; seguido de extracciones secuenciales con fenol/cloroformo y cloroformo, según lo descrito anteriormente. Después de las extracciones, el ADNc se precipitó con etanol en presencia de acetato de sodio 0,3 M. El sedimento se lavó con 100 \mul de etanol al 70%, se secó al aire y se resuspendió en 38 \mul de agua.
Al ADNc resuspendido se le crearon extremos romos con ADN polimerasa T4. El ADNc, que se resuspendió en 38 \mul de agua, se mezcló con 12 \mul de 5x solución amortiguadora de ADN polimerasa T4 (Tris:HCl 250 mM, pH 8,0; KCl 250 mM; MgCl_{2} 25 mM); 2 \mul de ditiotreitol 0,1 M; 6 \mul de una solución que contiene 10 mM de cada desoxinucleótido trifosfato; y 2 \mul de ADN polimerasa T4 1 U/\mul (Boehringer Mannheim Corp.). Después de una incubación de 45 minutos a 15ºC, la reacción se terminó mediante la adición de 30 \mul de TE, seguido de extracciones secuenciales con fenol/cloroformo y cloroformo, y se realizó una reextracción con 20 \mul de TE, según lo descrito anteriormente. El ADN se precipitó con etanol en presencia de 2 \mul del vehículo Pellet Paint^{TM} (Novagen) y acetato de sodio 0,3 M, y se resuspendió en 11 \mul de agua.
Los adaptadores Eco RI se ligaron a los extremos 5' del ADNc descritos anteriormente para permitir la clonación en un vector de expresión. Se mezclaron 11 \mul de ADNc con 4 \mul de 65 pmol/\mul del adaptador hemifosforilado Eco RI (Pharmacia Biotech Corp) con 5 \mul de 5x solución amortiguadora de ligasa (Life Technologies), 2 \mul de ATP 10 mM y 3 \mul de T4 ADN ligasa 1 U/\mul (Life Technologies), 1 \mul de 10X solución amortiguadora de ligadura (Promega Corp), 9 \mul de agua. La dilución adicional con 1X solución amortiguadora se realizó para evitar que el Pellet Paint precipite. La reacción se incubó durante 9 horas a baño María con un aumento de temperatura de 10ºC a 22ºC durante 9 horas, seguido de 45 minutos a 25ºC. La reacción se terminó mediante incubación a 68ºC durante 15 minutos.
Para facilitar la clonación direccional del ADNc en un vector de expresión, el ADNc se digirió con XhoI, lo que provoca que un ADNc tenga un extremo cohesivo 5' Eco RI y un extremo cohesivo 3' XhoI. El sitio de restricción XhoI en el extremo 3' del ADNc ha sido introducido anteriormente utilizando el cebador ZC18698 (SEC. ID. N.º 27). La digestión con las enzimas de restricción se llevó a cabo en una mezcla de reacción que contenía 35 \mul de la mezcla de ligadura descrita anteriormente, 6 \mul de 10x solución amortiguadora de H (Boehringer Mannheim Corp.), 1 \mul de BSA (Biolabs Corp.) 2 mg/ml, 17 \mul de agua y 1,0 \mul de XhoI 40 U/\mul (Boehringer Mannheim). La digestión se llevó a cabo a 37ºC durante 1 hora. La reacción se terminó mediante incubación a 68ºC durante 15 minutos, seguido de precipitación con etanol, lavado y secado, según lo descrito anteriormente, y resuspensión en 30 \mul de agua.
El ADNc resuspendido se calentó a 65ºC durante 5 minutos y se enfrió en hielo, se agregaron 4 \mul de 5X colorante de carga de gel (Research Genetics Corp.), el ADNc se cargó en un gel de agarosa al 0,8% 1XTAE con una baja temperatura de fusión (gel de agarosa con una baja temperatura de fusión Sea Plaque GTG^{TM}; FMC Corp.) y se sometió a electroforesis. Los adaptadores contaminantes y el ADNc de menos de 0,6 Kb de longitud se extrajeron del gel. Se invirtieron los electrodos, se agregó la agarosa derretida para llenar los pocillos, se cargó la solución amortiguadora y el ADNc se sometió a electroforesis hasta que se concentró cerca del origen de la hilera. El área del gel que contenía el ADNc concentrado se extrajo y se colocó en un tubo Microfuge, y la agarosa se fundió mediante calentamiento a 65ºC durante 15 minutos. Después de la equilibración de la muestra a 45ºC, se agregaron 2 \mul de beta-Agarase I 1 U/\mul (Biolabs, Inc.), y la mezcla se incubó durante 90 min a 45ºC para digerir la agarosa. Después de la incubación, se agregó 1 décimo del volumen de acetato de Na 3 M a la muestra, y la mezcla se incubó en hielo durante 15 minutos. La muestra se centrifugó a 14.000 x g durante 15 minutos a temperatura ambiente para eliminar la agarosa no digerida, el ADNc se precipitó con etanol, se lavó en etanol al 70%, se secó al aire y se resuspendió en 40 \mul de agua.
Para determinar la proporción óptima de ADNc al vector, se prepararon varias ligaduras y se electroporaron. En resumen, se mezclaron 2 \mul de 5X solución amortiguadora de T4 ligasa (Life Technologies), 1 \mul de ATP 10 mM, 1 \mul de pZP7NX digerido con EcoRI-XhoI, 1 ll de T4 ADN ligasa diluida a 0,25 u/\mul de agua (Life Technologies) a 10 \mul y 0,5; 1,2 ó 3 \mul de ADNc en 4 ligaduras preparadas, se incubó a 22ºC durante 4 horas, a 68ºC durante 20 minutos, se precipitó con acetato de sodio-etanol, se lavó, se secó y se resuspendió en 10 ll. Se electroporó un solo microlitro de cada ligadura en 40 \mul de bacterias DH10b ElectroMax^{TM} electrocompetentes (Life Technologies) utilizando una cubeta de 0,1 cm (Biorad) y un Genepulser, pulse controller^{TM} (Biorad) programado a 2,5 KV, 25 lF, 200 ohmios. Estas células fueron inmediatamente resuspendidas en 1 ml de caldo SOC (Manniatis, et al. supra), seguido de 500 ll de glicerol-SOC al 50% como conservante. Estos "lotes con glicerol" se congelaron en varias alícuotas a -70ºC. Se descongeló una alícuota de cada uno y se sembraron en serie en placas con LB-agar suplementadas con ampicilina a 100 \mug/ml. Las cantidades de colonias indicaron que la proporción óptima de CD3+ ADNc al vector pZP7NX fue de 1 \mul a 45 ng; dicha ligadura produjo 4,5 millones de clones primarios.
A fin de cribar esta genoteca utilizando una valoración de la proliferación basada en BaF3-zalpha11 (Ejemplo 5), los lotes con glicerol mencionados se diluyeron en cultivos líquidos de 100 ó 250 clones por agrupamiento en placas de microtitulación de pocillos profundos, se cultivaron durante 24 horas a 37ºC con agitación, y se aisló el plásmido utilizando un equipo Qiagen, según las instrucciones del fabricante. Dicho ADN se transfectó posteriormente en células BHK, se mantuvo en un medio acondicionado durante 72 horas, se cosechó y se colocó en 5.000 células BaF3-zalpha11 durante 72 horas, luego de lo cual, la proliferación se evaluó utilizando una valoración de fluorescencia con "Alamar blue" (Ejemplo 5B y Ejemplo 2B)
A fin de cribar la genoteca mediante clonación de trampa de secreciones, se necesitaba una forma amplificada y compleja de la genoteca para transfectar las células COS-7. Se sembraron alrededor de 4,8 millones de clones en 110 placas con LB-agar de 15 cm suplementado con ampicilina 100 \mug/ml, meticilina 10 \mug/ml. Después de cultivar las placas de un día para el otro a 37ºC, se cosecharon las bacterias mediante raspado y se sedimentaron. El ADN plasmídico se extrajo de las bacterias sedimentadas utilizando un Nucleobond-giga^{TM} (Clonetech), según las instrucciones del fabricante. Este plásmido se utilizó para transfectar células COS-7 (ATCC N.º CRL 1651) en portaobjetos y se lo cribó utilizando la técnica de trampa de secreciones descrita a continuación (Ejemplo 12).
Ejemplo 7 Clonación de la expresión del Ligando del zalpha11 humano
Los lotes con glicerol de la genoteca de células humanas activadas seleccionadas por CD3+ (Ejemplo 6) se agregaron a Super Broth II^{TM} (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) + ampicilina (amp) 0,1 mg/ml a una concentración de 250 células por 800 microlitros. Se permitió que las E. coli se equilibraran durante 24 horas a temperatura ambiente. En el momento de la inoculación, se sembraron 400 microlitros en placas con LB + amp para determinar el título real de la inoculación. Después de 24 horas, se contaron las placas y, luego, se ajustó la concentración final de SuperBrothII^{TM} + E. coli para que la concentración final fuera de 250 células por 1,2 ml. Se inocularon tres veces 2 litros, es decir, un total de 6 litros. El medio se sembró en bloques de placas de 96 pocillos profundos (Qiagen). El sembrado se realizó en el dispensador Q-Fill2^{TM} de 8 canales (Genetix, Christchurch, Dorset, Reino Unido). Se cultivaron las E. coli de un día para el otro, a 37ºC, con agitación a 250 rotaciones/min en un agitador de entorno de capas múltiples New Brunswick Scientific Innova 4900. Se centrifugaron las E. coli a 3.000 rpm para separarlas de la solución, utilizando una centrifugadora Beckman GS-6KR. Estos sedimentos de E. coli se congelaron a -20ºC o se utilizaron frescos antes de minipreparar el ADN plasmídico. Cada sedimento contiene aproximadamente 250 clones de ADNc de la genoteca de células humanas seleccionadas por CD3+.
Estos agrupamientos de 250 clones de ADNc se miniprepararon utilizando el equipo QIAprep^{TM} 96 Turbo Miniprep (Qiagen). El ADN plasmídico se eluyó utilizando 125 \mul de TE (TRIS 10 mM pH 8, EDTA 1 mM). Este ADN plasmídico se utilizó para transfectar células BHK.
Transfección de BHK
Se sembraron células BHK en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a una densidad de 12.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul por pocillo. El medio de cultivo fue DMEM (GibcoBRL), suero bovino fetal inactivado por calor al 5%, L-glutamina (GibcoBRL) 2 mM, 1X PSN (GibcoBRL), piruvato de Na (GibcoBRL) 1 mM.
Al día siguiente, las células BHK se lavaron una vez con 100 \mul de SFA. El SFA es un medio sin suero compuesto de DMEM/F12 (Gibco/BRL), GlutaMax^{TM} (Gibco/BRL) 2 mM, piruvato de Na 1 mM, 10 \mug/ml de transferrina, 5 \mug/ml de insulina, 10 \mug/ml de fetuina, 2 \mug/ml de selenio, HEPES (Gibco/BRL) 25 mM, 100 \muM de aminoácidos no esenciales (Gibco/BRL).
Se prepara una mezcla ADN/Lipofectamine^{TM} de la siguiente manera: se combinan 2,2 \mul del reactivo
Lipofectamine^{TM} (Gibco/BRL) con 102,8 \mul de SFA a temperatura ambiente; se agregan aproximadamente 5 \mul del ADN plasmídico (200 ng/\mul) a la combinación Lipofectamine^{TM}/SFA para formar la mezcla ADN/Lipofectamine^{TM}, que se incuba a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se eliminó el SFA de las células BHK y las células se incubaron con 50 \mul de la mezcla ADN/Lipofectamine^{TM} durante 5 horas a 37ºC, con 5% de CO_{2}. Se agregaron cincuenta \mul de la mezcla ADN/Lipofectamine^{TM} a cada uno de dos pocillos de las células BHK, a fin de que las transfecciones se realicen por duplicado.
Después de que las células BHK se incubaron con la mezcla ADN/Lipofectamine^{TM} durante 5 horas, se extrajo la mezcla ADN/Lipofectamine^{TM} y se agregaron 100 \mul de medio de cultivo. Las células se incubaron de un día para el otro, se extrajo el medio y se reemplazó con 100 \mul de medio de cultivo. Después de cultivar las células durante 72 horas, se extrajo el medio acondicionado, las células se congelaron a -80ºC durante un mínimo de 20 minutos, se descongelaron y, luego, se analizaron 50 \mul en la valoración de la proliferación zalpha11/BaF3, descrita en el Ejemplo 2B y el Ejemplo 5, a fin de identificar los agrupamientos de 250 clones con actividad del ligando.
Se cribaron treinta y cinco placas de 96 pocillos en una sola valoración. Esto representó aproximadamente 250 ADNc/pocillo, es decir 840.000 ADNc en total. De estos, el medio acondicionado de 54 pocillos (que representaban 250 ADNc por pocillo) tuvo resultado positivo en la valoración de la proliferación. El medio acondicionado de estos agrupamientos positivos se volvió a analizar en una segunda valoración (trampa de secreciones) con el receptor soluble y sin él (véase el Ejemplo 12). El receptor soluble zalpha11CEE (Ejemplo 10A) se utilizó a una concentración final de alrededor de 1 \mug/ml. Para la totalidad de los 54 agrupamientos positivos, prácticamente toda la actividad se neutralizó mediante la adición del receptor zalpha11 soluble, lo que indica que estos agrupamientos contenían un ADNc del Ligando del zalpha11. Se eligieron cuatro de estos agrupamientos positivos para degradarlos y aislar un único ADNc que codificaría el Ligando del zalpha11. Estos agrupamientos fueron 45C5, 46G11, 40H12 y 60A1.
Para cada uno de estos 4 agrupamientos, se utilizó 1 \mul de ADN para transformar células DH10B ElectroMax^{TM} (Gibco/BRL) mediante electroporación. Los transformantes se sembraron en placas con LB + amp (100 \mug/ml) + meticilina (10 \mug/ml) para obtener colonias simples. Para cada grupo electroporado, se trasladaron 960 colonias individuales utilizando escarbadientes a diez placas de 96 pocillos que contenían 1,2 ml de SuperBrothII^{TM} por pocillo. Estas placas se numeraron del 1 al 10 para cada uno de los agrupamientos de degradación (45C5, 46G11, 40H12 y 60A1). Estas placas se cultivaron de un día para el otro, y el ADN plasmídico se minipreparó como se describió anteriormente. Para 46G11, 40H12 y 60A1, el ADN plasmídico de las placas de degradación se transfectó en células BHK como se describió anteriormente.
Para 45C5, se utilizó un protocolo de "vía rápida" para acelerar la identificación del ADNc del Ligando del zalpha11. Las células BHK se transfectaron con ADN plasmídico de las placas de degradación como se describió anteriormente, la mezcla ADN/Lipofectamine^{TM} se extrajo después de 5 horas de incubación, y se agregó medio de cultivo. Dado que las transfecciones se realizaron por duplicado, el medio de cultivo se cosechó al día siguiente, después de 24 horas, de una de las placas de BHK transfectadas, y al día siguiente, después de 48 horas, se cosechó de la placa transfectada restante. El medio acondicionado de 24 horas se analizó, como se describió anteriormente, para evaluar la actividad del Ligando del zalpha11 utilizando la valoración de la proliferación según se describe en la presente.
El ADN plasmídico se agrupó de las placas de degradación 45C5 n.º 1-4, y se analizó para determinar la unión del receptor soluble zalpha11 a su ligando mediante el protocolo de "trampa de secreciones" (véase el Ejemplo 12 a continuación). Se identificaron ocho clones positivos de un total de 384 secuencias. Los resultados de la valoración de la proliferación confirmaron la actividad del Ligando del zalpha11 y estuvieron correlacionados con los resultados del ensayo de trampa de secreciones (véase el Ejemplo 12). En forma concurrente, se secuenció el ADN plasmídico minipreparado de las placas n.º 1-4 de la degradación del agrupamiento 45C5 para determinar la secuencia de ADN de cada uno de los 384 clones.
Varios clones que se identificaron positivamente en los ensayos de proliferación y de trampa de secreciones también se secuenciaron utilizando los siguientes cebadores: ZC14,063 (SEC. ID. N.º 28), ZC7,764a (SEC. ID. N.º 38), ZC7,764b (SEC. ID. N.º 39), ZC22,034 (SEC. ID. N.º 40) y ZC22,035 (SEC. ID. N.º 41). La secuencia de polinucleótido del Ligando del zalpha11 era de longitud completa (SEC. ID. N.º 1), y se muestra su correspondiente secuencia de aminoácidos (SEC. ID. N.º 2).
Ejemplo 8 Construcción de vectores de expresión en mamíferos que expresan receptores solubles zalpha11: zalpha11CEE, zalpha11CFLG, zalpha11CHIS y zalpha11-Fc4 A. Construcción del vector de expresión del zalpha11 de mamíferos que contiene zalpha11CEE, zalpha11CFLG y zalpha11CHIS
Se preparó un vector de expresión para la expresión del dominio extracelular soluble del polipéptido del zalpha11, pC4zalpha11CEE, donde el constructo está diseñado para expresar un polipéptido del zalpha11 formado por la metionina inicial predicha y truncada junto al dominio transmembrana predicho, y con una etiqueta Glu-Glu C terminal (SEC. ID. N.º 29).
Un fragmento de ADN de 700 pb del zalpha11 generado por PCR fue creado utilizando ZC19,931 (SEC. ID. N.º 30) y ZC19,932 (SEC. ID. N.º 31) como cebadores para PCR para agregar sitios de restricción Asp718 y BamHI. Se utilizó un plásmido que contenía el ADNc del receptor zalpha11 (SEC. ID. N.º 7) como plantilla. La amplificación por PCR del fragmento zalpha11 se realizó de la siguiente manera: veinticinco ciclos a 94ºC durante 0,5 minutos; cinco ciclos a 94ºC durante 10 segundos, a 50ºC durante 30 segundos, a 68ºC durante 45 segundos, seguidos de un mantenimiento a 4ºC. La reacción se purificó mediante extracción con cloroformo/fenol y precipitación con isopropanol, y se digirió con Asp718 y BamHI (Gibco BRL) siguiendo el protocolo del fabricante. Se visualizó una banda del tamaño predicho, 700 pb, mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, se extrajo, y se purificó el ADN utilizando un sistema de purificación QiaexII^{TM} (Qiagen), según las instrucciones del fabricante.
El ADN extraído se subclonó en el plásmido pC4EE, que se había cortado con BamHI y Asp718. El vector de expresión pC4zalpha11CEE utiliza el péptido señal originario del zalpha11 y une la etiqueta Glu-Glu (SEC. ID. N.º 29) al C terminal de la porción extracelular de la secuencia de polinucleótido que codifica el polipéptido del zalpha11. El plásmido pC4EE es un vector de expresión en mamíferos que contiene un casete de expresión que tiene el promotor de la metalotioneína-1 de ratón, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificantes, un codón de terminación y un terminador de la hormona de crecimiento humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcadores seleccionables de mamíferos que tiene un promotor, un potenciador y un origen de replicación del SV40, un gen DHFR y el terminador del SV40.
Alrededor de 30 ng del inserto del zalpha11 digerido con enzimas de restricción y alrededor de 12 ng del vector digerido se ligaron de un día para el otro a 16ºC. Se electroporó independientemente un microlitro de cada reacción de ligadura en células DH10B competentes (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) según las indicaciones del fabricante y se sembraron en placas con LB que contenían ampicilina 50 mg/ml, y se incubaron de un día para el otro. Las colonias se cribaron mediante análisis de restricción del ADN preparado con 2 ml de cultivos líquidos de colonias individuales. La secuencia del inserto de los clones positivos se verificó mediante análisis de secuencia. La preparación de plásmidos en gran escala se realizó utilizando un equipo Maxi Prep de QIAGEN® (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
Se utilizó el mismo proceso para preparar los receptores solubles zalpha11 con una etiqueta His C terminal, compuesta por 6 residuos His en fila; y una etiqueta Flag C terminal (SEC. ID. N.º 37), zalpha11CFLAG. Para preparar estos constructos, el vector mencionado tiene la etiqueta HIS o FLAG® en lugar de la etiqueta Glu-Glu (SEC. ID. N.º 29).
B. Constructo de la expresión en mamíferos del receptor zalpha11 soluble zalpha11-Fc4
Mediante recombinación homóloga, se construyó un plásmido de expresión que contenía la totalidad o parte de un polinucleótido que codifica el zalpha11. El dominio extracelular del receptor zalpha11 se fusionó con la región Fc derivada de la IgG humana, denominada "Fc4" (SEC. ID. N.º 33), que contiene una mutación para que ya no se una al receptor Fc. Se aisló un fragmento de ADNc del zalpha11 mediante PCR que incluye la secuencia del polinucleótido del dominio extracelular del receptor zalpha11. Los dos cebadores utilizados en la producción del fragmento zalpha11 fueron: (1) Cada uno de los cebadores para PCR incluyen, del extremo 5' al 3': 40 pb de la secuencia flanqueante del vector (5' del inserto) y 17 pb que corresponden al extremo 5' del dominio extracelular del zalpha11 (SEC. ID. N.º 32); y (2) 40 pb del extremo 5' de la secuencia del polinucleótido Fc4 (SEC. ID. N.º 33) y 17 pb que corresponden al extremo 3' del dominio extracelular del zalpha11 (SEC. ID. N.º 34). El fragmento Fc-4 para la fusión con el zalpha11 se generó mediante PCR de manera similar. Los dos cebadores utilizados en la producción del fragmento Fc4 fueron: (1) un cebador 5' que consiste en 40 pb de la secuencia del extremo 3' del dominio extracelular del zalpha11 y 17 pb del extremo 5' del Fc4 (SEC. ID. N.º 35); y (2) un cebador 3' que consiste en 40 pb de la secuencia del vector (3' del inserto) y 17 pb del extremo 3' del Fc4 (SEC. ID. N.º 36).
La amplificación por PCR de cada una de las reacciones descritas anteriormente se realizó de la siguiente manera: un ciclo a 94ºC durante 2 minutos; veinticinco ciclos a 94ºC durante 30 segundos, a 60ºC durante 30 segundos, a 72ºC durante 1 minuto; un ciclo a 72ºC durante 5 minutos; seguidos de un mantenimiento a 4ºC. Se pasaron diez \mul de los 100 \mul de la reacción PCR por un gel de agarosa al 0,8% con una baja temperatura de fusión (low melting point, LMP) (Seaplaque GTG) con 1 x solución amortiguadora TBE para su análisis. Los 90 \mul restantes de la reacción PCR se precipitan con la adición de 5 \mul de NaCl 1 M y 250 \mul de etanol absoluto. El vector de expresión utilizado se derivó del plásmido pCZR199 derivado del pZP9 (ATCC Depósito N.º 98668), y se cortó con SmaI (BRL). El vector de expresión se derivó del plásmido pCZR199, y es un vector de expresión en mamíferos que contiene un casete de expresión que tiene el promotor temprano inmediato del CMV, un intrón consenso de la región variable del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificantes, un codón de terminación y un terminador de la hormona de crecimiento humana. El vector de expresión también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcadores seleccionables de mamíferos que tiene un promotor, un potenciador y un origen de replicación del SV40, un gen DHFR y el terminador del SV40. El vector de expresión utilizado se construyó a partir del pCZR199 mediante el reemplazo del promotor de la metalotioneína por el promotor temprano inmediato del CMV.
Se combinaron independientemente cien microlitros de células de levadura competentes (S. cerevisiae) con 10 \mul que contenían aproximadamente 1 \mug del inserto del zalpha11 y del inserto del Fc4, y 100 ng del vector de expresión digerido con SmaI (BRL), y la mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Las mezclas de levadura/ADN se electropulsaron a 0,75 kV (5 kV/cm), ohmios "infinitos", 25 \muF. Se agregaron a cada cubeta 600 \mul de sorbitol 1,2 M, se sembró la levadura en dos alícuotas de 300 \mul en dos placas de URA-D y se incubó a 30ºC.
Después de aproximadamente 48 horas, los transformantes de levadura Ura+ de una sola placa se resuspendieron en 1 ml de H_{2}O y se los centrifugó brevemente para obtener un sedimento de células de levadura. Luego, se resuspendió el sedimento celular en 1 ml de solución amortiguadora de lisis (Triton X-100 al 2%; SDS al 1%; NaCl 100 mM; Tris 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM). Se agregaron 500 microlitros de la mezcla de lisis en un tubo Eppendorf que contenía 300 \mul de perlas de vidrio lavadas con ácido y 200 \mul de fenol-cloroformo, se los mezcló en vórtex dos o tres veces en intervalos de 1 minuto, y se los centrifugó durante 5 minutos en una centrifugadora Eppendorf a la velocidad máxima. Se transfirieron trescientos microlitros de la fase acuosa a un tubo nuevo y se precipitó el ADN con 600 \mul de etanol (EtOH), seguido de centrifugación durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento de ADN se resuspendió en 100 \mul de H_{2}O.
Se realizó la transformación de células de E. coli electrocompetentes (DH10B, GibcoBRL) con 0,5-2 ml de preparación de ADN de levadura y 40 \mul de células DH10B. Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 mF y 400 ohmios. Después de la electroporación, se sembraron 1 ml de SOC (triptona Bacto^{TM} al 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM) en alícuotas de 250 \mul, en cuatro placas con LB AMP (caldo de LB (Lennox), agar Bacto al 1,8% (Difco), ampicilina 100 mg/L).
Se identificaron mediante digestión de restricción los clones individuales que albergaban el constructo de expresión correcto para el zalpha11-Fc4, a fin de verificar la presencia del inserto de zalpha11-Fc4 y confirmar que las diversas secuencias de ADN se habían unido entre sí en forma correcta. Se realizó el análisis de secuencia del inserto de los clones positivos. Se aisló el ADN plasmídico en gran escala utilizando el equipo Qiagen Maxi (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
Ejemplo 9 Transfección y expresión de polipéptidos del receptor soluble zalpha11 A. Expresión en mamíferos del receptor zalpha11 soluble zalpha11CEE, zalpha11CFLG y zalpha11CHIS
Se sembraron células BHK 570 (ATCC N.º CRL-10314), pasaje 27, a razón de 1,2X10^{6} células/pocillo (placa de 6 pocillos) en 800 \mul de medio DMEM sin suero (serum free, SF) (DMEM, Gibco/BRL High Glucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Las células se transfectaron con plásmidos de expresión que contenían zalpha11CEE, zalpha11CFLG o zalpha11CHIS, descritos anteriormente (véase el Ejemplo 8), utilizando Lipofectin^{TM} (Gibco BRL), en DMEM sin suero (SF). Se diluyeron por separado tres microgramos de zalpha11CEE, zalpha11CFLG o zalpha11CHIS, cada uno en tubos de 1,5 ml hasta alcanzar un volumen final total de 100 \mul de DMEM SF. En tubos por separado, se mezclaron 15 \mul de Lipofectin^{TM} (Gibco BRL) con 100 \mul de DMEM SF. La mezcla de Lipofectin^{TM} se incubó a temperatura ambiente durante 30-45 minutos; luego, se agregó la mezcla de ADN y se la dejó incubar aproximadamente 10-15 minutos a temperatura ambiente.
Toda la mezcla de ADN:Lipofectin^{TM} se agregó a las células sembradas en placas y se distribuyó de manera uniforme sobre dichas células. Las células se incubaron a 37ºC durante aproximadamente cinco horas; luego se transfirieron a placas MAXI de 150 mm en un volumen final de 30 ml de DMEM/suero bovino fetal (FBS) al 5% (Hyclone, Logan, UT). Las placas se incubaron a 37ºC, con 5% de CO_{2}, de un día para el otro, y la mezcla ADN:Lipofectin^{TM} se reemplazó con medio de selección (FBS al 5%/DMEM con 1 \muM de metotrexato (MTX)) al día siguiente.
Aproximadamente, 10-12 días después de la transfección, las placas se lavaron con 10 ml de DMEM SF. Se aspiró el medio de lavado y se reemplazó con 7,25 ml de DMEM sin suero. Se colocaron mallas estériles de Teflon (Spectrum Medical Industries, Los Ángeles, CA) previamente mojadas en DMEM SF sobre las colonias de células clonales. Se colocó un filtro estéril de nitrocelulosa previamente mojado en DMEM SF sobre la malla. Las marcas de orientación sobre la nitrocelulosa se transfirieron a la placa de cultivo. Las placas se incubaron durante 5-6 horas en una incubadora a 37ºC, con 5% de CO_{2}.
Después de la incubación, se quitaron los filtros/las mallas, y el medio se aspiró y se reemplazó con FBS al 5%/DMEM con 1 \muM de MTX. Se bloquearon los filtros en solución amortiguadora con leche desnatada en polvo al 10%/Western A (Western A: TRIS 50 mM pH 7,4; EDTA 5 mM; NP-40 al 0,05%; NaCl 150 mM; y gelatina al 0,25%) durante 15 minutos a temperatura ambiente, en un agitador giratorio. Los filtros se incubaron con conjugados HRP-anticuerpo anti-Glu-Glu, anti-FLAG® o anti-HIS, respectivamente, en solución amortiguadora con leche desnatada en polvo al 2,5%/Western A durante una hora a temperatura ambiente, en un agitador giratorio. Luego, los filtros se lavaron tres veces a temperatura ambiente con Western A durante 5-10 minutos por lavado. Los filtros se revelaron con el reactivo ultra ECL (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) según las indicaciones del fabricante y se visualizaron con Lumi-Imager (Roche Corp.).
Las colonias clonales de expresión positiva se colocaron en forma mecánica en placas de 12 pocillos, en un ml de FCS al 5%/DMEM con 5 \muM de MTX; luego, se dejaron crecer hasta la confluencia. Las muestras del medio acondicionado se evaluaron para determinar los niveles de expresión a través de análisis SDS-PAGE y Western. Se eligieron los tres clones de mayor expresión para cada constructo; dos de los tres clones se congelaron para conservarlos como reserva, y uno de los clones se expandió para realizar análisis de micoplasma y para realizar siembras en fábricas en gran escala.
B. Expresión en mamíferos del receptor zalpha11 soluble zalpha11-Fc4
Se sembraron células BHK 570 (ATCC N.º CRL-10314) en placas de cultivo tisular de 10 cm y se las dejó crecer hasta alcanzar aproximadamente una confluencia de entre un 50 y un 70%, de un día para el otro, a 37ºC, con 5% de CO_{2}, en medio DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, suero bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, UT), L-glutamina (JRH Biosciences, Lenexa, KS) 1 mM, piruvato de sodio (Gibco BRL) 1 mM). Las células se transfectaron con el plásmido que contenía zalpha11-Fc4 (véase el Ejemplo 8), utilizando Lipofectamine^{TM} (Gibco BRL), en una formulación de medio sin suero (SF) (DMEM, 10 mg/ml de transferrina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina, L-glutamina al 1% y piruvato de sodio al 1%). El plásmido que contenía zalpha11-Fc4 se diluyó en tubos de 15 ml hasta alcanzar un volumen final total de 640 ml con medio SF. Se mezclaron 35 ml de Lipofectamine^{TM} (Gibco BRL) con 605 ml de medio SF. La mezcla de Lipofectamine^{TM} se agregó a la mezcla de ADN, y se la dejó incubar durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron cinco mililitros de medio SF a la mezcla ADN:Lipofectamine^{TM}. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de medio SF, se aspiraron y se agregó la mezcla de ADN:Lipofectamine^{TM}. Las células se incubaron a 37ºC durante cinco horas y, luego, se agregaron a cada placa 6,4 ml de medios DMEM/FBS al 10%, PSN al 1%. Las placas se incubaron a 37ºC de un día para el otro, y la mezcla de ADN:Lipofectamine^{TM} se reemplazó por un medio nuevo FBS al 5%/DMEM al día siguiente. El día 2 después de la transfección, las células se dividieron en medio de selección (el medio DMEM/FBS mencionado, con la adición de metotrexato 1 \muM (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)) en placas de 150 mm a 1:10, 1:20 y 1:50. El medio de las células se reemplazó con un medio de selección fresco el día 5 después de la transfección. Aproximadamente, 10 días después de la transfección, se tripsinizaron dos placas de cultivo de 150 mm de colonias resistentes al metotrexato de cada transfección, se agruparon las células, se sembraron en un matraz T-162 y se transfirieron a un cultivo en gran escala.
Ejemplo 10 Purificación de receptores solubles zalpha11 a partir de células BHK 570 A. Purificación del polipéptido zalpha11CEE a partir de BHK 570
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se utilizó para purificar el polipéptido del zalpha11 que contenía etiquetas GluGlu (EE) C terminales. Se concentraron treinta litros de medio acondicionado para fábricas celulares hasta alcanzar 1,6 litros con un cartucho espiral Amicon S10Y3 en un ProFlux A30. Se agregó una solución de inhibidores de la proteasa a los 1,6 litros de medio acondicionado concentrado para fábricas celulares a partir de células BHK 570 transfectadas (véase el Ejemplo 9) hasta alcanzar concentraciones finales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) 2,5 mM, leupeptina (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) 0,003 mM, pepstatina (Boehringer-Mannheim) 0,001 mM y Pefabloc (Boehringer-Mannheim) 0,4 mM. Se extrajeron muestras para análisis, y el volumen aparente se congeló a -80ºC hasta que se inició la purificación. Las concentraciones totales de proteína diana del medio acondicionado concentrado para fábricas celulares se determinaron a través de análisis SDS-PAGE y Western blot con el anticuerpo conjugado anti-EE HRP.
Se vertió una columna de 100 ml de G-sefarosa anti-EE (preparada según se describe a continuación) en una columna de vidrio Waters AP-5 de 5 cm x 10 cm. La columna se envasó con sistema flow pack y se equilibró en un BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a pH 7,4. Se descongeló el medio acondicionado concentrado para fábricas celulares, se filtró utilizando filtros estériles de 0,2 micrones, se ajustó el pH a 7,4, y se cargó en la columna de un día para el otro con un caudal de 1 ml/minuto. Se lavó la columna con 10 volúmenes de columna (column volumes, CV) de solución salina amortiguada con fosfato (PBS, pH 7,4), y se eluyó con tapón con 200 ml de PBS (pH 6,0) que contenía péptido EE (Anaspec, San José, CA) 0,5 mg/ml a 5 ml/minuto. El péptido EE utilizado tiene la secuencia EYMPME (SEC. ID. N.º 29). Se lavó la columna por 10 CV con PBS, y se eluyó con 5 CV de glicina 0,2 M, pH 3,0. El pH de la columna eluida con glicina se ajustó a 7,0 con 2 CV de 5X PBS, y se equilibró en PBS (pH 7,4). Se recolectaron fracciones de cinco ml durante toda la cromatografía de elución y se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM; también se guardaron y se analizaron los agrupamientos de fluidos de pasaje y lavado. Las fracciones pico de elución del polipéptido EE se analizaron para detectar la proteína diana a través de la tinción de plata SDS-PAGE y análisis Western blot con el anticuerpo conjugado anti-EE HRP. Se agruparon las fracciones de elución del polipéptido de interés y se concentraron de 60 ml a 5,0 ml utilizando un concentrador para centrifugado con membrana de corte de 10.000 Dalton de peso molecular (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante.
Para separar el zalpha11CEE de otras proteínas copurificadoras, las fracciones agrupadas concentradas de la elución del polipéptido se sometieron a una POROS HQ-50 (resina de intercambio aniónico fuerte de PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) a pH 8,0. Se vertió una columna de 1,0 x 6,0 cm y se envasó con sistema flow pack en un BioCad Sprint. La columna se cargó con contraiones y se equilibró en TRIS 20 mM pH 8,0 (Tris (hidroximetil aminometano)). La muestra se diluyó a 1:13 (para reducir la concentración iónica de la PBS), y se cargó en la columna Poros HQ a 5 ml/minuto. Se lavó la columna por 10 CV con TRIS 20 mM pH 8,0, y se eluyó con un gradiente de 40 CV de TRIS 20 mM/cloruro de sodio (NaCl) 1 M a 10 ml/minuto. Se recolectaron fracciones de 1,5 ml durante toda la cromatografía, y se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones pico de elución se analizaron a través de la tinción de plata SDS-PAGE. Se agruparon las fracciones de interés y se concentraron a 1,5-2 ml utilizando un concentrador para centrifugado con membrana de corte de 10.000 Dalton de peso molecular (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante.
Para separar el polipéptido zalpha11CEE del péptido EE libre y de cualquier proteína copurificante contaminante, las fracciones concentradas agrupadas se sometieron a una cromatografía en una columna de 1,5 x 90 cm de Sephadex S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada y cargada en PBS con un caudal de 1,0 ml/min utilizando un BioCad Sprint. Se recolectaron fracciones de 1,5 ml durante toda la cromatografía, y se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones pico se caracterizaron a través de la tinción de plata SDS-PAGE, y se agruparon únicamente las fracciones más puras. Este material representó el polipéptido zalpha11CEE purificado.
Este material purificado se sometió finalmente a una columna de 4 ml de ActiClean Etox (Sterogene) para eliminar cualquier endotoxina restante. La muestra se pasó cuatro veces por la columna de gravedad equilibrada con PBS y, luego, se lavó la columna con un único volumen de 3 ml de PBS, que se agrupó con la muestra "limpia". El material se filtró utilizando filtros estériles de 0,2 micrones y se almacenó a -80ºC hasta que se dividió en alícuotas.
En los geles con tinción de plata SDS-PAGE y Coomassie Blue, y análisis Western blot, el polipéptido zalpha11CEE fue una banda principal de un peso molecular aparente de alrededor de 50.000 Dalton. La movilidad de esta banda fue la misma con geles de reducción y de no reducción.
La concentración de proteína del material purificado se realizó mediante análisis con ácido bicinconínico (bicinchoninic acid, BCA) (Pierce, Rockford, IL), y la proteína se dividió en alícuotas y se almacenó a -80ºC según nuestros procedimientos estándar. Con geles de enfoque isoeléctrico (isoelectric focusing, IEF), la proteína pasa con un pI de menos de 4,5. La concentración del polipéptido zalpha11CEE fue de 1,0 mg/ml.
Para preparar sefarosa anti-EE, se lavó un volumen del lecho de 100 ml de la proteína G-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, NJ) 3 veces con 100 ml de PBS que contenía azida sódica al 0,02%, utilizando una unidad de filtro de 0,45 micrones Nalgene de 500 ml. El gel se lavó con 6,0 volúmenes de trietanolamina 200 mM, pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO), y se agregó un volumen igual de solución de anticuerpo EE que contenía 900 mg de anticuerpo. Después de una incubación de un día para el otro a 4ºC, el anticuerpo no unido se extrajo mediante el lavado de la resina con 5 volúmenes de TEA 200 mM según lo descrito anteriormente. La resina se resuspendió en 2 volúmenes de TEA, se transfirió a un envase adecuado y se agregó dimetilpimilimidato-2HCl (Pierce, Rockford, IL) disuelto en TEA a una concentración final de 36 mg/ml de gel de proteína G-sefarosa. Se meció el gel a temperatura ambiente durante 45 min, y se extrajo el líquido utilizando la unidad de filtro, según lo descrito anteriormente. Se bloquearon los sitios no específicos del gel mediante incubación durante 10 min a temperatura ambiente con 5 volúmenes de etanolamina 20 mM en TEA 200 mM. El gel se lavó con 5 volúmenes de PBS que contenía azida sódica al 0,02% y se almacenó en esta solución a
B. Purificación del polipéptido zalpha11CFLAG a partir de BHK 570
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se utilizó para purificar el polipéptido del zalpha11 que contenía etiquetas FLAG® (FLG) (Sigma-Aldrich Co.) C terminales. Se concentraron treinta litros de medio acondicionado para fábricas celulares hasta alcanzar 1,7 litros con un cartucho espiral Amicon S10Y3 en un ProFlux A30. Se agregó una solución de inhibidores de la proteasa a los 1,7 litros de medio acondicionado concentrado para fábricas celulares a partir de células BHK 570 transfectadas (véase el Ejemplo 9) hasta alcanzar concentraciones finales de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO) 2,5 mM, leupeptina (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) 0,003 mM, pepstatina (Boehringer-Mannheim) 0,001 mM y Pefabloc (Boehringer-Mannheim) 0,4 mM. Se extrajeron muestras para análisis, y el volumen aparente se congeló a -80ºC hasta que se inició la purificación. Las concentraciones totales de proteína diana del medio acondicionado concentrado para fábricas celulares se determinaron a través de análisis SDS-PAGE y Western blot con el anticuerpo conjugado anti-FLAG® (Kodak) HRP. Se vertió una columna de 125 ml de gel de afinidad M2-agarosa anti-FLAG® (Sigma-Aldrich Co.) en una columna de vidrio Waters AP-5 de 5 cm x 10 cm. La columna se envasó con sistema flow pack y se equilibró en un BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a pH 7,4. Se descongeló el medio acondicionado concentrado para fábricas celulares, se filtró utilizando filtros estériles de 0,2 micrones, se ajustó el pH a 7,4, y se cargó en la columna de un día para el otro con un caudal de 1 ml/minuto. Se lavó la columna con 10 volúmenes de columna (column volumes, CV) de solución salina amortiguada con fosfato (PBS, pH 7,4), y se eluyó con tapón con 250 ml de PBS (pH 6,0) que contenía péptido FLAG® (Sigma-Aldrich Co.) 0,5 mg/ml a 5 ml/minuto. El péptido FLAG® utilizado tiene la secuencia DYKDDDDK (SEC. ID. N.º 37). Se lavó la columna por 10 CV con PBS, y se eluyó con 5 CV de glicina 0,2 M, pH 3,0. El pH de la columna eluida con glicina se ajustó a 7,0 con 2 CV de 5X PBS, y se equilibró en PBS (pH 7,4). Se recolectaron fracciones de cinco ml durante toda la cromatografía de elución, y se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM; también se guardaron y se analizaron los agrupamientos de fluidos de pasaje y lavado. Las fracciones pico de elución del polipéptido FLAG® se analizaron para detectar la proteína diana a través de la tinción de plata SDS-PAGE y análisis Western blot con el anticuerpo conjugado anti-FLAG HRP. Se agruparon las fracciones de elución del polipéptido de interés y se concentraron de 80 ml a 12 ml utilizando un concentrador para centrifugado con membrana de corte de 10.000 Dalton de peso molecular (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante.
Para separar el zalpha11CFLG de otras proteínas copurificadoras, las fracciones agrupadas de la elución del polipéptido se sometieron a una POROS HQ-50 (resina de intercambio aniónico fuerte de PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) a pH 8,0. Se vertió una columna de 1,0 x 6,0 cm y se envasó con sistema flow pack en un BioCad Sprint. La columna se cargó con contraiones y se equilibró en TRIS 20 mM pH 8,0 (Tris (hidroximetil aminometano)). La muestra se diluyó a 1:13 (para reducir la concentración iónica de la PBS), y se cargó en la columna Poros HQ-50 a 5 ml/minuto. Se lavó la columna por 10 volúmenes de columna (CV) con TRIS 20 mM pH 8,0, y se eluyó con un gradiente de 40 CV de TRIS 20 mM/cloruro de sodio (NaCl) 1 M a 10 ml/minuto. Se recolectaron fracciones de 1,5 ml durante toda la cromatografía, y se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones pico de elución se analizaron a través de la tinción de plata SDS-PAGE. Se agruparon las fracciones de interés y se concentraron a 1,5-2 ml utilizando un concentrador para centrifugado con membrana de corte de 10.000 Dalton de peso molecular (Millipore, Bedford, MA) según las instrucciones del fabricante.
Para separar el polipéptido zalpha11CFLG del péptido FLAG® libre y de cualquier proteína copurificante contaminante, las fracciones concentradas agrupadas se sometieron a una cromatografía en una columna de 1,5 x 90 cm de Sephacryl S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ) equilibrada y cargada en PBS con un caudal de 1,0 ml/min utilizando un BioCad Sprint. Se recolectaron fracciones de 1,5 ml durante toda la cromatografía, y se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones pico se caracterizaron a través de la tinción de plata SDS-PAGE, y se agruparon únicamente las fracciones más puras. Este material representó el polipéptido zalpha11CFLG purificado.
Este material purificado se sometió finalmente a una columna de 4 ml de ActiClean Etox (Sterogene) para eliminar cualquier endotoxina restante. La muestra se pasó cuatro veces por la columna de gravedad equilibrada con PBS y, luego, se lavó la columna con un único volumen de 3 ml de PBS, que se agrupó con la muestra "limpia". El material se filtró utilizando filtros estériles de 0,2 micrones y se almacenó a -80ºC hasta que se dividió en alícuotas.
En los geles con tinción de plata SDS-PAGE y Coomassie Blue, y análisis Western blot, el polipéptido zalpha11CFLG fue una banda principal de un peso molecular aparente de alrededor de 50.000 Dalton. La movilidad de esta banda fue la misma con geles de reducción y de no reducción.
La concentración de proteína del material purificado se realizó mediante análisis con ácido bicinconínico (bicinchoninic acid, BCA) (Pierce, Rockford, IL), y la proteína se dividió en alícuotas y se almacenó a -80ºC según nuestros procedimientos estándar. Con geles de IEF (enfoque isoeléctrico), la proteína pasa con un pI de menos de 4,5. La concentración del polipéptido zalpha11CFLG fue de 1,2 mg/ml.
C. Purificación del polipéptido zalpha11-Fc4 a partir de células BHK 570 transfectadas
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se utilizó para purificar el polipéptido del zalpha11 que contenía la fusión del C terminal con la IgG/Fc humana (zalpha11-Fc4; Ejemplos 8 y 9). Se filtraron 12.000 ml de medio acondicionado de células BHK 570 transfectadas con zalpha11-Fc4 (Ejemplo 9) a través de un filtro esterilizante de 0,2 mm y, luego, se suplementaron con una solución de inhibidores de la proteasa, hasta alcanzar las concentraciones finales de leupeptina (Boerhinger-Mannheim, Indianapolis, IN) 0,001 mM, pepstatina (Boerhinger-Mannheim) 0,001 mM y Pefabloc (Boerhinger-Mannheim) 0,4 mM. Una proteína G sefarosa (6 ml de volumen del lecho, Pharmacia Biotech) se envasó y se lavó con 500 ml de PBS (Gibco/BRL). El medio acondicionado suplementado se pasó por la columna con un caudal de 10 ml/minuto, seguido de un lavado con 1.000 ml de PBS (BRL/Gibco). El zalpha11-Fc4 se eluyó de la columna de glicina 0,1 M pH 3,5, y se recolectaron fracciones de 2 ml directamente en 0,2 ml de Tris 2 M pH 8,0, a fin de ajustar el pH final a 7,0 en las fracciones.
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Las fracciones eluidas se caracterizaron mediante SDS-PAGE y análisis Western blot con anticuerpos Fc antihumano (Amersham). Los análisis Western blot de geles de SDS-PAGE de reducción revelaron la presencia de una proteína inmunorreactiva de alrededor de 80.000 KDa en las fracciones 2-10. Los geles de SDS-PAGE con tinción de plata también revelaron la presencia de un polipéptido zalpa11:Fc de 80.000 KDa en las fracciones 2-10. Se agruparon las fracciones 2-10.
La concentración de proteína de las fracciones agrupadas se realizó mediante análisis con BCA (Pierce, Rockford, IL) y el material se dividió en alícuotas, y se almacenó a -80ºC según nuestros procedimientos estándar. La concentración de las fracciones agrupadas fue de 0,26 mg/ml.
Ejemplo 11 Valoración con el uso de los receptores solubles zalpha11 zalpha11CEE, zalpha11CFLG y zalpha11-Fc4 (mutante) Receptores solubles en la valoración de la inhibición competitiva
Se centrifugaron células BaF3/zalpha11 y se lavaron en un medio sin mIL-3. Las células se centrifugaron y se lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de la mIL-3. Luego, las células se contaron con un hemocitómetro. Las células se sembraron en placas en un formato de 96 pocillos a razón de 5.000 células por pocillo en un volumen de 100 \mul por pocillo utilizando el medio sin mIL-3.
Tanto los medios acondicionados de la activación de las células de bazo de mono como las células humanas seleccionadas por CD3+, descritos en el Ejemplo 5, se agregaron en experimentos por separado en concentraciones al 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,125%; 1,5%; 0,75%; y 0,375%, con receptores solubles zalpha11 (constructos CEE, C-flag y Fc4; véanse los Ejemplos 9 y 10) o sin ellos, a 10 \mug/ml. El volumen total de la valoración fue de 200 \mul.
Las placas para valoración se incubaron a 37ºC, con 5% de CO_{2}, durante 3 días, en cuyo momento se agregó Alamar Blue (Accumed) a 20 \mul/pocillo. Las placas se volvieron a incubar a 37ºC, con 5% de CO_{2}, durante 24 horas. Las placas se leyeron en la lectora de placas Fmax^{TM} (Molecular Devices), como se describe en el Ejemplo 2. Los resultados demostraron una inhibición completa del crecimiento celular de cada uno de los distintos constructos del receptor soluble zalpha11 a 10 \mug/ml, lo que confirma que el factor presente en cada muestra era específico para el receptor zalpha11.
Las curvas de titulación, que diluyeron los receptores solubles, también se realizaron utilizando la valoración mencionada anteriormente. Los receptores zalpha11 solubles zalpha11CEE y zalpha11CFLG pudieron inhibir por completo el crecimiento a concentraciones tan bajas como 20 ng/ml. El receptor zalpha11 soluble zalpha11 mutante-Fc4 solo fue igual de efectivo a 1,5 \mug/ml.
Ejemplo 12 Ensayo de trampa de secreciones
Se utilizó un ensayo de trampa de secreciones para identificar el ADNc para el Ligando del zalpha11. Los agrupamientos de ADN positivos obtenidos a partir del intento de clonación de la expresión se describen en el
Ejemplo 7.
Los agrupamientos de ADN de 250 clones se transfectaron en células BHK en un formato de 96 pocillos, y el medio acondicionado se colocó en la valoración de la proliferación utilizando las células BaF3/zalpha11 descritas en el Ejemplo 4 y el Ejemplo 5. Varios agrupamientos de ADN dieron actividades positivas, que se repitieron y se neutralizaron con los receptores solubles zalpha11 (véase el Ejemplo 11).
Uno de los agrupamientos de ADN positivos, 45C5, se transfectó en células COS en un formato de 12 pocillos, utilizando el método con Lipofectamine^{TM} descrito a continuación. Se realizó un ensayo de trampa de secreciones utilizando receptores solubles zalpha11 (con etiqueta Glu-Glu C terminal, ya sea con biotinilación o sin ella; con etiqueta FLAG C terminal; o fusiones del receptor soluble zalpha11 con Fc4) (Ejemplo 9) para evaluar la unión directa entre el posible ligando del receptor zalpha11 en el agrupamiento 45C5 y el receptor soluble zalpha11 (consultar a continuación). El resultado fue positivo. Por ende, el ADN del agrupamiento 45C5 se electroporó en E. coli, y las colonias simples se colocaron en diez placas de 96 pocillos. Las placas se agitaron a 37ºC durante 24 horas y, luego, se realizaron minipreparaciones de ADN (equipo QiaPrep^{TM} 96 Turbo Miniprep; Qiagen) en un formato de 96 pocillos utilizando un TomTech Quadra 9600. El ADN plasmídico se agrupó en un formato de hileras y columnas, se transfectó en células COS y, luego, los agrupamientos positivos se determinaron mediante trampa de secreciones, según se describe a continuación.
Transfecciones de células COS
La transfección de células COS se realizó de la siguiente manera: se mezclaron 3 \mul de ADN agrupado y 5 \mul de Lipofectamine^{TM} en 92 \mul de medio DMEM sin suero (55 mg de piruvato de sodio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de insulina, 1 \mug de selenio y 5 mg de fetuina en 500 ml de DMEM), se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos y, luego, se agregaron 400 \mul de medio DMEM sin suero. Se agrega esta mezcla de 500 \mul en 1,5x10^{5} células COS/pocillo sembradas en una placa de cultivo tisular de 12 pocillos, y se incuba durante 5 horas a 37ºC. Se agregan 500 \mul de medio DMEM FBS al 20% (100 ml de FBS, 55 mg de piruvato de sodio y 146 mg de L-glutamina en 500 ml de DMEM) y se incuba de un día para el otro.
Ensayo de trampa de secreciones
La trampa de secreciones se realizó de la siguiente manera: el medio se enjuagó con PBS para retirar las células y, luego, se fijaron durante 15 minutos con formaldehído al 1,8% en PBS. Las células se lavaron con TNT (Tris-HCL 0,1 M, NaCl 0,15 M y Tween-20 al 0,05% en H_{2}O), se impregnaron con Triton-X al 0,1% en PBS durante 15 minutos y se lavaron nuevamente con TNT. Se bloquearon las células durante 1 hora con TNB (Tris-HCL 0,1 M, NaCl 0,15 M y reactivo bloqueante al 0,5% (equipo NEN Renaissance TSA-Direct) en H_{2}O) y se lavaron nuevamente con TNT. Si se utilizó la proteína biotinilada, se bloquearon las células durante incubaciones de 15 minutos con avidina y, luego, con biotina (Vector Labs) lavándolas entre medio con TNT. En función del receptor soluble utilizado, las células se incubaron durante 1 hora con: (A) receptor soluble zalpha11, proteína de fusión zalpha11-Fc4 1-3 \mug/ml (Ejemplo 10); (B) 3 \mug/ml de receptor soluble zalpha11 con etiqueta FLAG C terminal, zalpha11CFLG (Ejemplo 10); (C) 3 receptor soluble zalpha11 con etiqueta GluGlu C terminal, zalpha11CEE \mug/ml (Ejemplo 10); o (D) 3 \mug/ml de receptor soluble zalpha11 biotinilado, zalpha11CEE en TNB. Las células se lavaron con TNT. En función del receptor soluble utilizado, las células se incubaron durante una hora más con: (A) Ig-HRP antihumano de cabra diluido en una proporción 1:200 (específico para Fc); (B) M2-HRP diluido en una proporción 1:1.000; (C) anticuerpo-HRP anti-GluGlu diluido en una proporción 1:1.000; o (D) estreptavidina-HRP (equipo NEN) diluido en una proporción 1:300 en TNB. Nuevamente, las células se lavaron con TNT.
Se detectó unión positiva con el reactivo fluoresceína tiramida diluido en una proporción 1:50 en una solución amortiguadora de dilución (equipo NEN), se incubó durante 4-6 minutos y se lavó con TNT. Las células se preservaron con el medio de montaje Vectashield (Vector Labs Burlingame, CA) diluido en una proporción 1:5 en TNT. Las células se visualizaron utilizando un filtro FITC en microscopio fluorescente.
Ejemplo 13 Asignación cromosómica y localización del gen para el Ligando del zalpha11
El gen para el Ligando del zalpha11 se localizó por mapeo en el cromosoma 4, utilizando la versión disponible comercialmente del "panel Stanford G3 de mapeo de híbridos de radiación (Radiation Hybrid, RH)" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). El "panel Stanford G3 de RH" contiene ADN de cada uno de los 83 clones híbridos de radiación de todo el genoma humano, más dos ADN de control (el donante RM y el receptor A3). Un servidor web disponible para el público (http://shgc-www.stanford.edu) permite la localización cromosómica de marcadores.
Para el mapeo del gen del Ligando del zalpha11 con el "panel Stanford G3 de RH", se prepararon reacciones de 20 \mul en una placa de microtitulación de 96 pocillos (Stratagene, La Jolla, CA) y se utilizaron en un variador térmico "RoboCycler Gradient 96" (Stratagene). Cada una de las 85 reacciones PCR consistió en 2 \mul de 10X solución amortiguadora de reacción PCR KlenTaq (CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA), 1,6 \mul de mezcla de dNTP (2,5 mM cada uno, PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1 \mul de cebador codificante, ZC22,050 (SEC. ID. N.º 42), 1 \mul de cebador no codificante, ZC22,051 (SEC. ID. N.º 43), 2 \mul de "RediLoad" (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), 0,4 \mul de 50X mezcla de polimerasa Advantage KlenTaq (Clontech Laboratories, Inc.), 25 ng del ADN de un clon híbrido individual o de control y ddH_{2}O para un volumen total de 20 \mul. Las reacciones se cubrieron con una cantidad igual de aceite mineral y se sellaron. Las condiciones del variador de PCR fueron las siguientes: 1 ciclo inicial de 5 minutos de desnaturalización a 94ºC, 35 ciclos de 45 segundos de desnaturalización a 94ºC, 45 segundos de apareamiento a 60ºC, y 1 minuto Y 15 segundos de extensión a 72ºC, seguidos de 1 ciclo final de extensión de 7 minutos a 72ºC. Las reacciones se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 2% (Life Technologies, Gaithersburg, MD).
Los resultados mostraron el enlace entre el gen del Ligando del zalpha11 y el marcador de marcos de la IL2 SHGC-12342 con un puntaje LOD >12 y a una distancia de cR_10000 (aproximadamente 180 kb) del marcador. El uso de marcadores circundantes posiciona el gen del Ligando del zalpha11 en la región 4q27 del mapa del cromosoma 4 integrado de la LDB (The Genetic Location Database, University of Southhampton, servidor web: http://cedar.genetics. soton.ac.uk/public_html/).
Ejemplo 14 Identificación y clonación del Ligando del zalpha11 murino Uso de una secuencia de la EST para obtener el Ligando del zalpha11 murino de longitud completa A. Secuencia de la EST del Ligando del zalpha11 de ratón
Mediante la búsqueda en la base de datos con la secuencia de ADNc del Ligando del zalpha11 humano (SEC. ID. N.º 1) como consulta, se identificó una etiqueta de secuencia expresada (Expressed Sequence Tag, EST) de ratón (EST1483966) como posible secuencia parcial para el Ligando del zalpha11 de ratón. La EST1483966 representa un fragmento genómico de ratón, en el que una secuencia peptídica derivada de dos posibles exones compartía una identidad de secuencias alta con un segmento de péptido del Ligando del zalpha11 humano (aminoácido 13 (Ile) a aminoácido 80 (Gln) de la SEC. ID. N.º 2).
B. Cribaje mediante PCR del panel de ADNc de ratón obtenido por el método Marathon
Se cribaron once muestras de ADNc de ratón obtenidas por el método Marathon (Clontech) mediante la PCR descrita a continuación. Las muestras de ADNc de ratón obtenidas por el método Marathon se prepararon a partir de tejidos del cerebro, el páncreas, el riñón, la placenta, la glándula salival, la piel, los testículos, el útero, el embrión y el bazo. Se realizaron internamente utilizando un equipo de amplificación (Clontech) de ADNc obtenido por el método Marathon^{TM}, según las instrucciones del fabricante. Sobre la base de la secuencia de la EST, se utilizaron dos cebadores para PCR, ZC22,056 (SEC. ID. N.º 44) y ZC22,057 (SEC. ID. N.º 45) para identificar una fuente del Ligando del zalpha11 de ratón mediante PCR. Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 94ºC durante 2 min; 35 ciclos a 94ºC durante 30 s, a 68ºC durante 2 min; seguidos de 68ºC durante 4 min; luego, un remojo a 10ºC. Se pasaron los productos de la PCR por un gel de agarosa al 1%. Se visualizó una fuerte banda de 150 pb que representaba un fragmento de ADNc amplificado. Esto indicó que el ADNc obtenido por el método Marathon del bazo de ratón es la fuente para la clonación del ADNc del Ligando del zalpha11 de ratón. El ADNc obtenido por el método Marathon del bazo de ratón contenía un ADNc positivo que posteriormente se identificó mediante análisis de secuencia como ADNc parcial para el Ligando del zalpha11 de ratón.
C. Una secuencia compuesta para el ADNc de longitud completa de ratón se generó por RACE 5' y 3'
Se obtuvieron las secuencias que flanquean los extremos 5' y 3' de la secuencia de ADNc parcial del Ligando del zalpha11 de ratón mediante amplificación rápida de los terminales del ADNc (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE) 5' y 3'. Se realizaron dos vueltas de amplificación por PCR anidadas con los cebadores adicionales oligo específicos para genes ZC22,205 (SEC. ID. N.º 46) y ZC22,206 (SEC. ID. N.º 47), ZC22,056 (SEC. ID. N.º 44) y ZC22,057 (SEC. ID. N.º 45), y dos cebadores oligo adaptadores ZC9,739 (SEC. ID. N.º 48) y ZC9,719 (SEC. ID. N.º 49). Las reacciones PCR se realizaron de la siguiente manera: 94ºC durante 2 min; 35 ciclos a 94ºC durante 30 s, 68ºC durante 2 min; seguidos de 68ºC durante 4 min; luego, un remojo a 10ºC. Se pasaron los productos de la PCR por un gel de agarosa al 1%, y se identificaron un producto de la RACE 5' de aproximadamente 300 pb y un producto RACE 3' de aproxima-
damente 800 pb. Se aislaron estos fragmentos utilizando el equipo de extracción con gel Qiaquick^{TM} (Qiagen).
Los productos de la PCR purificados se secuenciaron utilizando los siguientes cebadores: ZC9,719 (SEC. ID. N.º 49), ZC22,205 (SEC. ID. N.º 46) y ZC22,206 (SEC. ID. N.º 47). Se identificó una secuencia del Ligando del zalpha11 de ratón de longitud completa compuesta preliminar mediante la combinación de los fragmentos 5' y 3' RACE. Se aisló el clon de ratón de longitud completa, como se describe en el Ejemplo 15 a continuación.
Ejemplo 15 Aislamiento del clon del ADNc del zalpha11 de ratón a partir de una genoteca de bazo de ratón activada A. Fuente primaria murina utilizada para aislar el Ligando del zalpha11 de ratón
Se recolectaron los bazos de ratones Balb/C y se aplastaron entre portaobjetos de extremos esmerilados para crear una suspensión celular. La producción de células de ratón primarias aisladas fue de 6,4X10^{8} células antes de la selección descrita a continuación.
Las células del bazo se suspendieron en 9,6 ml de solución amortiguadora MACS (PBS, EDTA al 0,5%, EDTA 2 mM). Se extrajeron 1,6 ml de la suspensión celular y se agregaron 0,4 ml de microperlas CD90 (Thy1.2) (Miltenyi Biotec). La mezcla se incubó durante 15 min a 4ºC. Estas células marcadas con perlas CD90 se lavaron con 30 ml de solución amortiguadora MACS y, luego, se resuspendieron en 2 ml de solución amortiguadora MACS.
Se preparó una columna VS+ (Miltenyi) según las instrucciones del fabricante. Luego, la columna VS+ se colocó en un campo magnético VarioMACS^{TM} (Miltenyi). La columna se equilibró con 5 ml de solución amortiguadora MACS. Luego, se aplicaron las células de ratón primarias aisladas a la columna. Se permitió que pasaran las células CD3 negativas. La columna se enjuagó con 9 ml (3 X 3 ml) de solución amortiguadora MACS. Luego, se retiró la columna del magneto y se colocó sobre un tubo Falcon de 15 ml. Se eluyeron las células CD90+ agregando 5 ml de solución amortiguadora MACS a la columna, y las células unidas se retiraron a presión utilizando el émbolo proporcionado por el fabricante. La incubación de las células con las perlas magnéticas CD90, los lavados y los pasos de la columna VS+ (incubación hasta elución) descritos anteriormente se repitieron una vez más. Se agruparon las fracciones de CD90+ resultantes de las 2 separaciones de la columna. La producción de células de bazo de ratón seleccionadas por CD90+ fue de 1X10^{8} células en total.
Se extrajo una muestra de las células de ratón seleccionadas por CD90+ agrupadas para su tinción y clasificación mediante un clasificador de anticuerpos activados por fluorescencia (FACS) para evaluar su pureza. Se utilizó un anticuerpo CD3\varepsilon antirratón de hámster conjugado con PE (PharMingen) para la tinción y clasificación de las células seleccionadas por CD90+. Las células de ratón seleccionadas por CD90+ fueron células CD3+ en un 93%, lo que sugiere que las células eran células T en un 93%.
Las células murinas seleccionadas por CD90+ se activaron mediante incubación de 3X10^{6} células/ml en RPMI + FBS al 5% + PMA 10 ng/ml e Ionomycin (Calbiochem) 0,5 \mug/ml, de un día para el otro, a 37ºC. Se evaluó el sobrenadante de estas células de ratón activadas seleccionadas por CD90+ para evaluar la actividad del Ligando del zalpha11, según se describe a continuación. Además, las células de ratón activadas seleccionadas por CD90+ se utilizaron para preparar una genoteca de ADNc, como se describe en el Ejemplo 16, a continuación.
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Ejemplo 16 Clonación del Ligando del zalpha11 de ratón a partir de una genoteca de células de ratón seleccionadas por CD90+
El cribaje de una genoteca de ADNc de células de ratón activadas primarias seleccionadas por CD90+ reveló un ADNc aislado que es un nuevo miembro de la familia de citocinas con haz de cuatro hélices. Este ADNc codificó el ortólogo de ratón del Ligando del zalpha11 humano. Se identificó el ADNc mediante cribaje por hibridación.
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A. Vector para construcción de la genoteca seleccionada por CD90+
El vector pZP7N se utilizó para la construcción de la genoteca seleccionada por CD3+ (véase el Ejemplo 6A).
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B. Preparación de la genoteca de ADNc de células de ratón activadas primarias seleccionadas por CD90+
Se aislaron aproximadamente 1,5X10^{8} células de ratón seleccionadas primarias por CD90+ estimuladas en ionomicina/PMA (Ejemplo 15) mediante centrifugación. Se aisló el ARN total a partir del sedimento celular y se convirtió en ADNc bicatenario, como se describe en el Ejemplo 6B. Este ADN se transfectó posteriormente en células BHK, como se describe en el Ejemplo 6B, y la proliferación se evaluó utilizando una valoración de fluorescencia con "Alamar blue" (Ejemplo 2B).
A fin de cribar la genoteca mediante clonación de trampa de secreciones, se necesitaba una forma amplificada y compleja de la genoteca para transfectar las células COS-7. Se sembraron 4,8 millones de clones en 110 placas con LB-agar de 15 cm suplementado con ampicilina 100 \mug/ml, meticilina 10 \mug/ml. Después de cultivar las placas de un día para el otro a 37ºC, se cosecharon las bacterias mediante raspado y se sedimentaron. El ADN plasmídico se extrajo de las bacterias sedimentadas utilizando un Nucleobond-giga^{TM} (Clonetech), según las instrucciones del fabricante. Este plásmido se utilizó para transfectar células COS-7 en portaobjetos, y se lo cribó utilizando la técnica de trampa de secreciones descrita a continuación (Ejemplo 17).
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C. Cribaje de la genoteca de ADNc de ratón activada
Se sembraron aproximadamente 5X10^{5} clones en placas Maxi de 10 LB/Amp. Las colonias se levantaron, desnaturalizaron, neutralizaron y entrecruzaron utilizando el procedimiento estándar (Sambrook, J. et al. supra). Se marcaron cincuenta nanogramos del fragmento obtenido mediante PCR de la RACE 5' de 300 pb (Ejemplo 14) con ^{32}P utilizando el equipo para marcación de cebadores aleatorios Prime-Itr RmT (Stratagene). Se hibridaron 10 filtros con esta sonda marcada a 65ºC, de un día para el otro, utilizando la solución de hibridación ExpressHyb^{TM} (Clontech). Los filtros se lavaron en forma secuencial a 60ºC durante 1 hora tres veces con 0,2x SSC (NaCl 30 mM, citrato de sodio 3 mM, pH 7,0), SDS al 0,1%; y, luego, a 65ºC durante 1 hora. Los filtros se expusieron a -80ºC, de un día para el otro, y se revelaron películas radiográficas. Se extrajeron los tapones de agar que contenían las colonias positivas, y los clones se sembraron en placas con LB/Amp de 10 cm. Las colonias se levantaron con un filtro y se hibridaron nuevamente siguiendo el mismo procedimiento descrito anteriormente.
Se aisló un clon de ADN, denominado M11L/pZP7, y se lo secuenció utilizando los siguientes cebadores: ZC14,063 (SEC. ID. N.º 50), ZC5,020 (SEC. ID. N.º 51), ZC22,421 (SEC. ID. N.º 52), ZC22,604 (SEC. ID. N.º 53) y ZC22,641 (SEC. ID. N.º 54). La secuencia del polinucleótido de este clon es el Ligando del zalpha11 de ratón de longitud completa (SEC. ID. N.º 55) y es compatible con la secuencia compuesta obtenida a partir de los productos de la RACE 5' y 3'. La secuencia de aminoácidos correspondiente del Ligando del zalpha11 de ratón se muestra en la SEC. ID. N.º 56.
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Ejemplo 17 El Ligando del zalpha11 de ratón se une al receptor soluble zalpha11 humano en un ensayo de trampa de secreciones
El ADN para el clon de ratón M11L/pZP7 se transfectó en células COS, y se evaluó la unión del receptor soluble zalpha11 humano zalpha11-Fc4 (Ejemplo 10C) con las células COS transfectadas, mediante un ensayo de trampa de secreciones (Ejemplo 12). El ensayo confirmó que el Ligando del zalpha11 de ratón se une al receptor soluble zalpha11 humano.
La transfección de células COS se realizó según el Ejemplo 12, utilizando 0,7 \mug de ADN de M11L/pZP7 (Ejemplo 16) en 3 \mul.
La trampa de secreciones se realizó según el Ejemplo 12, utilizando el receptor soluble de la proteína de fusión zalpha11-Fc4 1 \mug/ml (Ejemplo 10C) en TNB, e Ig-HRP antihumano de cabra diluido en una proporción 1:200 (específico para Fc) en TNB para el anticuerpo detectable. Se detectó unión positiva del receptor zalpha11 humano soluble a las células fijadas preparadas con el reactivo fluoresceína tiramida, según el Ejemplo 12. Las células se preservaron y se visualizaron según el Ejemplo 12.
El resultado positivo indicó que el Ligando del zalpha11 de ratón se une al receptor soluble zalpha11 humano.
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Ejemplo 18 Expresión del Ligando del zalpha11 de ratón en células de mamíferos A. Construcción del vector de expresión M11L/pZP9
Se preparó un vector de expresión para la expresión del Ligando del zalpha11 de ratón en células de mamíferos. Se creó un fragmento del ADN de Ligando del zalpha11 de 500 pb generado por PCR utilizando ZC22,283 (SEC. ID. N.º 57) y ZC22,284 (SEC. ID. N.º 58) como cebadores para PCR para amplificar la región codificante del Ligando del zalpha11 de ratón y agregar sitios de restricción XhoI y XbaI. El clon del Ligando del zalpha11 de ratón M11L/pZP7 (Ejemplo 16) se usó como plantilla. Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 94ºC durante 2 min; 25 ciclos a 94ºC durante 30 s, 68ºC durante 2 min; seguidos de 68ºC durante 4 min; luego, un remojo a 10ºC. Se visualizó una banda del tamaño predicho, alrededor de 500 pb, mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%, se extrajo, y se purificó el ADN utilizando un sistema de purificación QiaexII^{TM} (Qiagen), según las instrucciones del fabricante. El ADN purificado se digirió con XhoI y XbaI (Boehringer Mannheim) a 37ºC durante 2 horas. El ADN se aisló con gel y se purificó siguiendo el procedimiento descrito anteriormente.
El ADN extraído se subclonó en el plásmido pZP9, que se cortó con XhoI y XbaI (Boehringer Mannheim). El plásmido pZP9 es un vector de expresión en mamíferos que contiene un casete de expresión que tiene el promotor de la metalotioneína-1 (MT-1) de ratón, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificantes y un terminador de la hormona de crecimiento humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcadores selectivos de mamíferos que tiene un promotor, un potenciador y un origen de replicación del SV40, un gen DHFR y el terminador del SV40.
Alrededor de 30 ng del fragmento del Ligando del zalpha11 de ratón digerido con enzimas de restricción y alrededor de 10 ng del vector digerido pZP9 se ligaron a temperatura ambiente durante 2 horas. Se transformaron dos \mug de la reacción de ligadura en células competentes INVaF' (Invitrogen) según el protocolo del fabricante, se sembraron en placas con LB que contenían ampicilina 50 \mug/ml, y se incubaron a 37ºC, de un día para el otro. Las colonias se cribaron mediante análisis de restricción utilizando XhoI y XbaI (Boerhinger Mannheim) de ADN preparado a partir de cultivos líquidos de colonias individuales. Mediante análisis de secuencia, se verificó que la secuencia del inserto de los clones positivos es la secuencia del Ligando del zalpha11 de ratón. La preparación de plásmidos en gran escala se realizó utilizando un equipo Maxi Prep de Qiagen® (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. El vector de expresión que contiene el Ligando del zalpha11 de ratón se denominó M11L/pZP9.
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B. Expresión en mamíferos del Ligando del zalpha11 de ratón
Las células BHK 570 (ATCC N.º CRL-10314) se sembraron en placas de cultivo tisular de 10 cm y se las dejó crecer hasta alcanzar aproximadamente una confluencia del 20%, de un día para el otro, a 37ºC, con 5% de CO_{2}, en medio DMEM/FBS (medio DMEM, Gibco/BRL High Glucose; Gibco BRL, Gaithersburg, MD), suero bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, UT), L-glutamina (JRH Biosciences, Lenexa, KS) 1 mM, piruvato de sodio (Gibco BRL) 1 mM). Las células se transfectaron con el plásmido M11L/pZP9 (Ejemplo 18A) utilizando un equipo de transfección con CaPO_{4} estable de mamífero (Stratagene), según las instrucciones del fabricante.
Un día después de la transfección, las células se dividieron en una proporción 1:10 y 1:20 en medio de selección (medio DMEM/FBS con la adición de metotrexato 1 \muM (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)) en placas de 150 mm. El medio de las células se reemplazó con un medio de selección fresco el día 5 después de la transfección. Aproximadamente, 10 días después de la transfección, se tripsinizaron las colonias resistentes al metotrexato y se agruparon las células y se sembraron en matraces de cultivo en gran escala. Una vez que las células se cultivaron hasta alcanzar una confluencia de aproximadamente un 90%, se enjuagaron con PBS tres veces y se cultivaron con medio acondicionado ESTEP2 sin suero (DMEM (Gibco BRL), 0,11 g/l de piruvato de Na, 3,7 g/l de NaHCO_{3}, 2,5 mg/l de insulina, 5 mg/l de transferrina, pH 7,0). El medio acondicionado se recolectó a los tres días, y se le realizó una valoración de la proliferación de BaF3 con Alamar Blue, descrita en el Ejemplo 19 a continuación.
Ejemplo 19 El Ligando del zalpha11 de ratón activa el receptor zalpha11 humano en la valoración de BAF3 con Alamar Blue
La proliferación de las células BaF3/zalpha11 (Ejemplos 4 y 5B) se evaluó utilizando un medio acondicionado sin suero de células BHK que expresaban el Ligando del zalpha11 de ratón (Ejemplo 18).
Se centrifugaron células BaF3/zalpha11, se lavaron y se sembraron en placas con un medio sin mIL-3, como se describe en el Ejemplo 5B.
La proliferación de las células BaF3/zalpha11 se evaluó utilizando un medio acondicionado sin suero de células BHK que expresaban el Ligando del zalpha11 de ratón (Ejemplo 18). El medio acondicionado se diluyó con el medio sin mIL-3 hasta alcanzar concentraciones al 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,125%; 1,5%; 0,75%; y 0,375%. La valoración de la proliferación se realizó según el Ejemplo 5B.
Los resultados confirmaron la respuesta proliferativa de las células BaF3/Zalpha11 al Ligando del zalpha11 de ratón. La respuesta, según las mediciones, fue aproximadamente 5 veces mayor que la respuesta de fondo a la concentración del 50%.
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Ejemplo 20 El Ligando del zalpha11 activa el receptor zalpha11 humano en la valoración con luciferasa A. Construcción de la línea de células BaF3/KZ134/zalpha11
Se construyó el plásmido KZ134 con los oligonucleótidos complementarios ZC12,749 (SEC. ID. N.º 59) y
ZC12,748 (SEC. ID. N.º 60) que contienen elementos de unión de los factores de transcripción de transductores de señal y activadores de transcripción (Signal Transducer and Activator of Transcription, STAT) de 4 genes: un elemento inducible c-fos Sis modificado (m67SIE o hSIE) (Sadowski, H. et al., Science 261:1739-1744, 1993), el p21 SIE1 del gen p21 WAF1 (Chin, Y. et al., Science 272:719-722, 1996), el elemento de respuesta de la glándula mamaria del gen de la \beta-caseína (Schmitt-Ney, M. et al., Mol. Cell. Biol. 11:3745-3755, 1991) y un elemento inducible por STAT del gen Fcg RI, (Seidel, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 92:3041-3045, 1995). Estos oligonucleótidos contienen extremos compatibles con Asp718-XhoI, y se ligaron utilizando métodos estándar en un vector indicador de luciferasa Firefly con un promotor c-fos (Poulsen, L.K. et al., J. Biol. Chem. 273:6229-6232, 1998) digerido con las mismas enzimas y que contiene un marcador seleccionable de neomicina. El plásmido KZ134 se utilizó para transfectar de manera estable las
células BaF3, utilizando métodos estándar de transfección y selección, para producir la línea de células BaF3/KZ134.
Se construyó una línea celular indicadora BaF3/KZ134 estable, que expresa el receptor zalpha11 de longitud completa, según el Ejemplo 2A, utilizando alrededor de 30 \mug del vector de expresión del zalpha11, descrito en el Ejemplo 3. Los clones se diluyeron, se sembraron en placas y se seleccionaron utilizando técnicas estándar. Los clones se cribaron mediante valoración con luciferasa (véase el Ejemplo 20B a continuación), utilizando el medio acondicionado de Ligando del zalpha11 humano como inductor. Se seleccionaron los clones con la respuesta más alta a la luciferasa (a través de la luciferasa de STAT) y la respuesta de fondo más baja. Se seleccionó una línea celular transfectante estable. La línea celular se denominó BaF3/KZ134/zalpha11.
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B. El Ligando del zalpha11 humano y de ratón activa el receptor zalpha11 humano en la valoración con luciferasa para BaF3/KZ134/zalpha11
Las células BaF3/KZ134/zalpha11 se centrifugaron y se lavaron en un medio sin mIL-3. Las células se centrifugaron y se lavaron 3 veces para asegurar la eliminación de la mIL-3. Luego, las células se contaron con un hemocitómetro. Las células se sembraron en placas en un formato de 96 pocillos a razón de alrededor de 30.000 células por pocillo, en un volumen de 100 \mul por pocillo, utilizando el medio sin mIL-3. Se usó el mismo procedimiento para las células BaF3/KZ134 no transfectadas para utilizarlas como control en la valoración posterior.
La activación de STAT de las células BaF3/KZ134/zalpha11 se evaluó utilizando un medio acondicionado de (1) células BHK570 transfectadas con el Ligando del zalpha11 humano (Ejemplo 7) o (2) células BHK570 transfectadas con el Ligando del zalpha11 de ratón (Ejemplo 18), o (4) un medio sin mIL-3 para medir la respuesta de control con medios solamente. El medio acondicionado se diluyó con el medio RPMI sin mIL-3 hasta alcanzar concentraciones al 50%; 25%; 12,5%; 6,25%; 3,125%; 1,5%; 0,75%; y 0,375%. Se agregaron 100 \mul de medio acondicionado diluido a las células BaF3/KZ134/zalpha11. La valoración con el medio acondicionado se realizó en paralelo en células BaF3/KZ134 no transfectadas, como control. El volumen total de la valoración fue de 200 \mul. Las placas para valoración se incubaron a 37ºC, con 5% de CO_{2}, durante 24 horas, en cuyo momento se sedimentaron las células mediante centrifugación a 2.000 rpm durante 10 min, se aspiró el medio, y se agregaron 25 \mul de solución amortiguadora de lisis (Promega). Después de 10 minutos a temperatura ambiente, las placas se midieron para la activación del constructo indicador de STAT mediante la lectura con un luminómetro (Labsystems Luminoskan, modelo RS), que agregó 40 \mul del sustrato de la valoración con luciferasa (Promega) a una integración de cinco segundos.
Los resultados confirmaron la respuesta del indicador de STAT de las células BaF3/KZ134/zalpha11 al Ligando del zalpha11 humano. La respuesta, según las mediciones, fue aproximadamente 50 veces mayor que la del control con medios solamente, a la concentración del 50%. La activación de STAT en respuesta al Ligando del zalpha11 humano estuvo ausente en las células de control BaF3/KZ134 no transfectadas, lo que demuestra que la respuesta es mediada a través del receptor Zalpha11.
Los resultados también confirmaron la respuesta del indicador de STAT de las células BaF3/KZ134/zalpha11 al Ligando del zalpha11 de ratón. La respuesta, según las mediciones, fue aproximadamente 40 veces mayor que la del control con medios solamente, a la concentración del 50%. Además, la activación de STAT en respuesta al Ligando del zalpha11 de ratón fue evidente (alrededor de 5 veces mayor) en las células de control BaF/KZ134 no transfectadas, lo que sugiere que es posible que las células BaF3 murinas tengan un receptor de ratón endógeno.
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Ejemplo 21 El Ligando del zalpha11 de ratón se mostró activo en la valoración de médula ósea de ratón A. Aislamiento de las células de médula no adherentes de baja densidad
Se obtuvo una aspiración (de médula) de fémur de ratón fresca de ratones Balb/C o C57BL/6 macho de 6-10 semanas. La médula se lavó con RPMI+FBS al 10% (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT) y se suspendió en RPMI+FBS al 10% como suspensión celular de médula entera. La suspensión celular de médula entera se sometió a un gradiente de densidad (Nycoprep, 1.077, Animal; Gibco BRL) para enriquecer las células de baja densidad, en su mayoría mononucleares, de la siguiente manera: se agregó cuidadosamente con una pipeta la suspensión celular de médula entera (alrededor de 8 ml) y se agregó sobre alrededor de 5 ml de solución de gradiente Nycoprep en un tubo cónico de 15 ml y, luego, se centrifugó a 600 X g durante 20 minutos. La capa de la interfaz, que contenía las células mononucleares de baja densidad, se extrajo, se lavó con el exceso de RPMI+FBS al 10% y se sedimentó mediante centrifugación a 400 X g durante 5-10 minutos. Este sedimento se resuspendió en RPMI +FBS al 10% y se sembró en placas en un matraz T-75 a aproximadamente 10^{6} células/ml, y se incubó a 37ºC, con 5% de CO_{2}, durante aproximadamente 2 horas. Las células resultantes en suspensión fueron células de médula no adherentes de baja densidad (non-adherent low-density, NA LD).
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B. Valoración en placas de 96 pocillos
Se sembraron células de médula de ratón NA LD a razón de entre 25.000 y 45.000 células/pocillo en placas de cultivo tisular de 96 pocillos en RPMI+FBS al 10% + 1 ng/mL de factor de células progenitoras de ratón (mouse Stem Cell Factor, mSCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN), más un medio acondicionado al 5% de alguno de los siguientes: (1) células BHK 570 que expresaban el Ligando del zalpha11 de ratón (Ejemplo 18), (2) células BHK 570 que expresaban el Ligando del zalpha11 humano (Ejemplo 7), o (3) células BHK 570 de control que contienen el vector y que no expresan ninguno de los dos Ligandos. Estas células se sometieron a una serie de tratamientos con citocina para analizar la expansión o la diferenciación de las células hematopoyéticas de la médula. Para la prueba, las células de médula de ratón NA LD sembradas en placas se sometieron a la interleucina-15 humana (hIL-15) (R&D Systems) o a una citocina de un panel de otras citocinas (R&D Systems). La dilución seriada de la hIl-15, o de las otras citocinas, se evaluó con una dilución seriada dos veces mayor desde alrededor de 50 ng/ml hasta alcanzar una concentración de 6025 ng/ml. Después de 8 a 12 días, las valoraciones en placas de 96 pocillos se puntuaron en cuanto a la proliferación celular mediante valoración con Alamar Blue, como se describe en el Ejemplo 5B.
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C. Resultados de la valoración de la médula de ratón NA LD en placas de 96 pocillos
El medio acondicionado de las células BHK que expresaban el Ligando del zalpha11 de ratón y humano actuó de manera sinérgica con la hIL-15 para promover la expansión de una población de células hematopoyéticas en la médula de ratón NA LD. Esta expansión de células hematopoyéticas no se mostró con el medio acondicionado de BHK de control más IL-15. La población de células hematopoyéticas expandidas por el Ligando del zalpha11 de ratón con la hIL-15, y las células hematopoyéticas expandidas por el Ligando del zalpha11 humano con la hIL-15, se siguieron propagando en cultivo celular. Estas células hematopoyéticas se tiñeron con un anticuerpo contra las células Pan NK marcado con ficoeritrina (Pharmingen) y se sometieron a un análisis citométrico de flujo, que demostró que las células expandidas tuvieron resultado positivo en la tinción para este marcador de linfocitos citolíticos naturales (NK).
Se realizó la misma valoración en placas de 96 pocillos, utilizando células de médula humanas frescas compradas a Poietic Technologies, Gaithersburg, MD. Nuevamente, junto con la IL-15, el Ligando del zalpha11 de ratón y humano expandió una población de células hematopoyéticas que tuvieron resultado positivo en la tinción para el marcador de células NK que utiliza el anticuerpo divulgado más arriba.
Ejemplo 22 Constructos para generar ratones transgénicos con Ligando del zalpha11 humano A. Constructo para expresar el Ligando del zalpha11 humano a partir del promotor MT-1 específico para el hígado
Se diseñaron oligonucleótidos para generar un fragmento por PCR que contuviera una secuencia Kozak consenso y la región codificante del Ligando del zalpha11 humano. Estos oligonucleótidos se diseñaron con un sitio FseI en el extremo 5' y un sitio AscI en el extremo 3' para facilitar la clonación en (a) pMT12-8, nuestro vector transgénico estándar, o (b) pKFO51, un vector transgénico específico para tejido linfoide (Ejemplo 22B).
Las reacciones PCR se llevaron a cabo con 200 ng de la plantilla del Ligando del zalpha11 humano (Ejemplo 7) y los oligonucleótidos ZC22,143 (SEC. ID. N.º 61) y ZC22,144 (SEC. ID. N.º 62). Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 95ºC durante 5 minutos, donde se agregó la polimerasa de ADNc Advantage^{TM} (Clontech); 15 ciclos de 95ºC durante 60 segundos, 60ºC durante 60 segundos y 72ºC durante 90 segundos; y 72ºC durante 7 minutos. Los productos de la PCR se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa y se purificaron utilizando un equipo de extracción con gel QiaQuickä (Qiagen). El fragmento de ADN de 488 pb aislado se digirió con FseI y AscI (Boerhinger-Mannheim), se precipitó con etanol y se ligó en pMT12-8 previamente digerido con FseI y AscI. El plásmido pMT12-8, diseñado para expresar un gen de interés en el hígado y en otros tejidos de ratones transgénicos, contiene un casete de expresión flanqueado por 10 kb de ADN de MT-1 5' y 7 kb de ADN de MT-1 3'. El casete de expresión comprende el promotor MT-1, el intrón de insulina II de rata, un poliligador para la inserción del clon deseado y la secuencia poli A de la hormona de crecimiento humana (hGH).
Alrededor de un microlitro de cada reacción de ligadura se electroporó en células competentes DH10B ElectroMaxä (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) según las indicaciones del fabricante y se sembraron en placas con LB que contenían ampicilina 100 mg/ml, y se incubaron de un día para el otro. Las colonias se eligieron y se cultivaron en un medio de LB que contenía ampicilina 100 mg/ml. Se preparó el ADN de la minipreparación a partir de los clones elegidos y se realizó el cribaje para detectar el inserto del Ligando del zalpha11 humano mediante digestión de restricción con EcoRI solo, o FseI y AscI combinados, y posteriormente se realizó una electroforesis en gel de agarosa. Se realizaron maxipreparaciones del pMT-Ligando del zalpha11 humano correcto. Se preparó un fragmento SalI que contenía secuencias que flanquean los extremos 5' y 3', el promotor MT-1, el intrón de insulina II de rata, el ADNc del Ligando del zalpha11 humano y la secuencia poli A de la hGH para ser usado en la microinyección de ovocitos murinos fertilizados. La microinyección y la producción de ratones transgénicos se realizaron como se describe en Hogan, B. et al. Manipulating the Mouse Embryo, 2.ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994.
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B. Constructo para expresar el Ligando del zalpha11 humano a partir del promotor E\muLCK específico para el tejido linfoide
Se diseñaron oligonucleótidos para generar un fragmento por PCR que contuviera una secuencia Kozak consenso y la región codificante del Ligando del zalpha11 humano. Estos oligonucleótidos se diseñaron con un sitio FseI en el extremo 5'y un sitio AscI en el extremo 3' para facilitar la clonación en pKFO51, un vector transgénico específico para tejido linfoide.
Las reacciones PCR se llevaron a cabo con 200 ng de la plantilla del Ligando del zalpha11 humano (Ejemplo 7) y los oligonucleótidos ZC22,143 (SEC. ID. N.º 61) y ZC22,144 (SEC. ID. N.º 62). Se realizó una reacción PCR utilizando la polimerasa de ADNc Advantage^{TM} (Clontech) bajo las siguientes condiciones: 95ºC durante 5 minutos; 15 ciclos de 95ºC durante 60 segundos, 60ºC durante 60 segundos y 72ºC durante 90 segundos; y 72ºC durante 7 minutos. Los productos de la PCR se purificaron según lo descrito anteriormente. El fragmento de ADN de 488 pb aislado se digirió con FseI y AscI (Boerhinger-Mannheim), se precipitó con etanol y se ligó en pKFO51 previamente digerido con FseI y AscI. El vector transgénico pKFO51 se deriva del p1026X (Iritani, B.M., et al., EMBO J. 16:7019-31, 1997) y contiene el promotor proximal lck específico para células T, el potenciador de cadena pesada de inmunoglobulina \mu específica para células B/T, un poliligador para la inserción del clon deseado y un gen de hGH mutado que codifica una proteína de la hormona de crecimiento inactiva (que proporciona intrones 3' y una señal de poliadenilación).
Se electroporó alrededor de un microlitro de cada reacción de ligadura, se sembró en placas, y los clones se eligieron y se cribaron para detectar el inserto del Ligando del zalpha11 humano mediante digestión de restricción, según lo descrito anteriormente. Un clon correcto del pKFO51-Ligando del zalpha11 se verificó mediante secuenciamiento, y se realizó una maxipreparación de este clon. Se preparó un fragmento NotI, que contiene el promotor proximal lck y el potenciador de la inmunoglobulina \mu (E\muLCK), el ADNc del Ligando del zalpha11 y el gen de hGH mutado para ser usado en la microinyección en ovocitos murinos fertilizados.
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Ejemplo 23 Distribución tisular del Ligando del zalpha11 de ratón
Se sondaron los Northern blot de tejidos múltiples murinos (ratón, embrión de ratón, Clontech; MB1010, MB1012 Origene) para determinar la distribución tisular de la expresión del Ligando del zalpha11 murino. Se amplificó una sonda derivada de la PCR de aproximadamente 484 pb utilizando el plásmido M11L/pZP7 (Ejemplo 16) como plantilla y los oligonucleótidos ZC22283 (SEC. ID. N.º 57) y ZC22284 (SEC. ID. N.º 58) como cebadores. La amplificación por PCR se llevó a cabo de la siguiente manera: 1 ciclo a 94ºC durante 1,0 minutos; 35 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos; seguidos de 1 ciclo a 72ºC durante 10 minutos. Los productos de la PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa y el producto de la PCR de aproximadamente 484 pb se purificó utilizando un equipo de extracción con gel (Qiagen) según las instrucciones del fabricante. La sonda se marcó radiactivamente utilizando el equipo para marcación REDIPRIME^{TM} (Amersham) según las instrucciones del fabricante. La sonda se purificó utilizando una columna de empuje NUCTRAP^{TM} (Stratagene). La solución EXPRESSHYB^{TM} (Clontech) se utilizó para la prehibridación y como solución de hibridación para los Northern blot. La hibridación se llevó a cabo de un día para el otro a 65ºC, utilizando 10^{6} cpm/ml de la sonda marcada. Los blot se lavaron tres veces en 2X SSC y SDS al 0,1% a temperatura ambiente, seguido de 2 lavados en 0,1X SSC y SDS al 0,1% a 55ºC. Se observaron dos transcritos de aproximadamente 1,2 y 3,5 kb en los testículos. El transcrito superior se observó solo en el timo.
También se sondó un análisis de transferencia puntual de ARN murino Master (Clontech) que contenía ARN de varios tejidos que se normalizaron a 8 genes de mantenimiento celular, y se hibridó según lo descrito anteriormente. La expresión se observó en los testículos.
Ejemplo 24 Purificación del Ligando del zalpha11 humano y murino sin etiqueta a partir de BHK 570
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se utilizó para purificar el Ligando del zalpha11 humano y murino a partir de medio acondicionado de células BHK 570 transfectadas con un constructo que expresa el Ligando del zalpha11 humano (Ejemplo 25) o el Ligando del zalpha11 de ratón (M11L/pZP9) (Ejemplo 18). El medio acondicionado se concentró mediante técnicas estándar. El medio acondicionado (CM) concentrado se filtró utilizando filtros estériles de 0,45 y 0,22 micrones. El medio se diluyó para disminuir la concentración iónica (\leq2 mS) en HEPES 0,01 M (JRH Biosciences, Lenexa, KS) a pH 7,0. El CM diluido de concentración iónica baja se cargó en una columna Poros HS 50 (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) de 10 X 66 mm (6 ml), de un día para el otro, a 4 ml/min, utilizando un BioCad SPRINT (Perceptive BioSystems). Se lavó la columna por 10-20 volúmenes de columna (CV) con HEPES 0,01 M pH 7,0. Las proteínas unidas se eluyeron gradualmente con NaCl 1 M (Mallinckrodt, París, KY) en HEPES 0,01 M pH 7,0, a 5 ml/min; se recolectaron fracciones de dos ml durante toda la cromatografía, y se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones de absorbancia pico se analizaron mediante bioanálisis y tinción de plata SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO) y Coomassie (Sigma, St. Louis, MO). Se agruparon las fracciones pico, se filtraron utilizando filtros estériles, y se diluyeron a \leq19 mS con solución salina amortiguada con fosfato (PBS, Gibco BRL) a pH 7,2.
La muestra diluida se cargó a 2 ml/min utilizando un BioCad SPRINT, en una columna Poros AL de 0,8 ml que tenía el receptor soluble zalpha11CFLAG (Ejemplo 10B) o el receptor soluble de la fusión zalpha11-Fc4 (Ejemplo 10C) inmovilizado en la resina (consultar a continuación). Se lavó la columna con, al menos, 20 CV de PBS a 10 ml/min La columna se eluyó rápidamente con una inyección de 600 \mul de glicina 0,1 M (ácido aminoacético; glicocola, Spectrum, Gardena, CA) pH 2,5, con un caudal de 10 ml/min, con PBS, en un BioCAD 700E. Se recolectaron fracciones de 1 ml durante 6 segundos cada una, y el pH se neutralizó inmediatamente con 55 \mul de TRIS 2 M (Tris (hidroximetil) aminometano, EM Science, Gibbstown, NJ) pH 8,8. Se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM durante toda la cromatografía.
Las fracciones pico se analizaron mediante bioanálisis y tinción de plata SDS-PAGE (Geno Technology) y Coomassie (Sigma). Se observaron dos bandas, de aproximadamente 24 kD y 18 kD, tanto con el gel de plata como con el gel de Coomassie, para el Ligando del zalpha11 de ratón. Se observó una sola banda, de aproximadamente 18 kD, tanto con el gel de plata como con el gel de Coomassie, para el Ligando del zalpha11 humano.
Inmovilización de los polipéptidos del receptor soluble zalpha11 humano en medio POROS AL
Se prepararon las columnas Poros AL con receptor soluble zalpha11CFLAG (Ejemplo 10B) o receptor soluble de la fusión zalpha11-Fc4 (Ejemplo 10C) inmovilizados. Se utilizaron aproximadamente 3 mg del receptor soluble zalpha11CFLAG y aproximadamente 10 mg del receptor soluble de la fusión zalpha11-Fc4. Todas las operaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente en un BioCAD 700E. Una columna de 4,5 X 50 mm con el medio POROS AL se envasó con sistema flow pack en NaCl 2 M, según las especificaciones del fabricante. La columna se equilibró en Na_{2}SO_{4} 1,1 M/fosfato de Na 50 mM pH 7,2. El receptor se concentró a 4 mg/ml utilizando un concentrador para centrifugado MWKO Millipore de 30 y, luego, se diluyó en una proporción 1:1 en Na_{2}SO_{4} 1,1 M/fosfato de Na 50 mM pH 7,2. La columna se dejó fluir a 2 ml/min en Na_{2}SO_{4} 1,1 M/fosfato de Na 50 mM pH 7,2, y se aplicaron inyecciones de 100 \mul del ligando diluido cada 9 CV hasta que se alcanzó un estado estable de saturación o se lo superó. Se pasó un gradiente de 62 CV de Na_{2}SO_{4} 1,1 M/fosfato de Na 50 mM pH 7,2 a Na_{2}SO_{4} 550 mM/fosfato de Na 50 mM pH 7,2/cianoborohidruro de sodio 5 mg/ml. La columna se mantuvo durante alrededor de 2 horas para completar la química de la inmovilización. La columna se equilibró en TRIS 0,2 M pH 7,2/cianoborohidruro de sodio 5 mg/ml y se la dejó en reposo durante alrededor de 1 hora para tapar la columna. Finalmente, se equilibró la columna en PBS/azida sódica al 0,02%, y se almacenó a 4ºC hasta el momento necesario. Antes de ser usada, la columna se preeluyó con glicina 0,1 M para asegurar que se eliminaran las proteínas no específicas y que la columna no estuviera filtrando el receptor inmovilizado soluble zalpha11 humano.
Ejemplo 25 Expresión del Ligando del zalpha11 humano en células de mamíferos A. Construcción del vector de expresión PZMP11/zalpha11Lig
Mediante recombinación homóloga, se construyó un plásmido de expresión que contenía la totalidad o parte de un polinucleótido que codifica el Ligando del zalpha11 humano. Se aisló un fragmento del ADNc del Ligando del zalpha11 humano (SEC. ID. N.º 63) mediante PCR. Se utilizaron dos cebadores en la producción del fragmento del Ligando del zalpha11 humano en una reacción PCR: (1) el cebador ZC22,052 (SEC. ID. N.º 64), que contiene 40 pb de la secuencia flanqueante del vector y 17 pb correspondientes al amino terminal del Ligando del zalpha11 humano, y (2) el cebador ZC22,053 (SEC. ID. N.º 65), que contiene 40 pb del terminal del extremo 3' correspondientes a la secuencia flanqueante del vector y 17 pb correspondientes al carboxilo terminal del Ligando del zalpha11 humano. Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 1 ciclo a 94ºC durante 2,0 minutos; 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos; seguidos de 1 ciclo a 72ºC durante 5 minutos; remojo a 4ºC. Se pasaron diez \mul de los 100 \mul de la reacción PCR por un gel de agarosa al 0,8% con LMP (Seaplaque GTG) con 1 x solución amortiguadora TBE para su análisis, y se observó el fragmento previsto de aproximadamente 560 pb. Los 90 \mul restantes de la reacción PCR se precipitaron con la adición de 5 \mul de NaCl 1 M y 250 \mul de etanol absoluto para ser utilizados en la recombinación del vector receptor pZMP11, según se describe a continuación. El plásmido receptor pZMP11 se cortó previamente con SmaI.
El plásmido pZMP11 se derivó del plásmido pCZR199 (descrito en la presente, p. ej. en el Ejemplo 8). El plásmido pCZR199 es un vector de expresión en mamíferos que contiene un casete de expresión que incluye el promotor temprano inmediato del CMV, un intrón consenso de la región variable del locus de la cadena pesada de la inmunoglobulina de ratón, múltiples sitios de restricción para la inserción de secuencias codificantes, un codón de terminación y un terminador de la hormona de crecimiento humana. El plásmido también tiene un origen de replicación de E. coli, una unidad de expresión de marcadores seleccionables de mamíferos que tiene un promotor, un potenciador y un origen de replicación del SV40, un gen DHFR y el terminador del SV40. El vector pZMP11 se construyó a partir de pCZR199 e incluye el reemplazo del promotor de la metalotioneína por el promotor temprano inmediato del CMV y las secuencias Kozac en el extremo 5' del marco de lectura abierto.
Se combinaron independientemente cien microlitros de células de levadura competentes (S. cerevisiae) con 10 \mul de una mezcla que contenía aproximadamente 1 \mug del inserto del Ligando del zalpha11 humano y 100 ng del vector pZMP11 digerido con SmaI, y se transfirió la mezcla a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. Las mezclas de levadura/ADN se electropulsaron a 0,75 kV (5 kV/cm), ohmios infinitos, 25 \muF. Se agregaron a cada cubeta 600 \mul de sorbitol 1,2 M, se sembró la levadura en dos alícuotas de 300 \mul en dos placas de URA-D y se incubó a 30ºC.
Después de aproximadamente 48 horas, los transformantes de levadura Ura+ de una sola placa se resuspendieron en 1 ml de H_{2}O y se los centrifugó brevemente para obtener un sedimento de células de levadura. Luego, se resuspendió el sedimento celular en 1 ml de solución amortiguadora de lisis (Triton X-100 al 2%; SDS al 1%; NaCl 100 mM; Tris 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM). Se agregaron quinientos microlitros de la mezcla de lisis en un tubo Eppendorf que contenía 300 \mul de perlas de vidrio lavadas con ácido y 200 \mul de fenol-cloroformo, se los mezcló en vórtex dos o tres veces en intervalos de 1 minuto, y se los centrifugó durante 5 minutos en una centrifugadora Eppendorf a la velocidad máxima. Se transfirieron trescientos microlitros de la fase acuosa a un tubo nuevo y se precipitó el ADN con 600 \mul de etanol (EtOH), seguido de centrifugación durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento de ADN se resuspendió en 100 \mul de H_{2}O.
Se realizó la transformación de células de E. coli electrocompetentes (DH10B, GibcoBRL) con 0,5-2 ml de preparación de ADN de levadura y 40 \mul de células DH10B. Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 mF y 400 ohmios. Después de la electroporación, se sembraron 1 ml de SOC (triptona Bacto^{TM} al 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM) en alícuotas de 250 \mul, en cuatro placas con LB AMP (caldo de LB (Lennox), agar Bacto^{TM} al 1,8% (Difco), ampicilina 100 mg/L).
Se identificaron mediante digestión de restricción los clones individuales que albergaban el constructo de expresión correcto para el Ligando del zalpha11 humano, a fin de verificar la presencia del inserto y confirmar que las diversas secuencias de ADN se habían unido entre sí en forma correcta. Se realizó el análisis de secuencia del inserto de los clones positivos. Se aisló el ADN plasmídico en gran escala utilizando el equipo Qiagen Maxi (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.
B. Expresión en mamíferos del Ligando del zalpha11 humano
Se sembraron células BHK 570 (ATCC N.º CRL-10314) en placas de cultivo tisular de 10 cm y se las dejó crecer hasta alcanzar aproximadamente una confluencia de entre un 50 y un 70%, de un día para el otro, a 37ºC, con 5% de CO_{2}, en medio DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), suero bovino fetal al 5% (Hyclone, Logan, UT), L-glutamina (JRH Biosciences, Lenexa, KS) 1 mM, piruvato de sodio (Gibco BRL) 1 mM). Las células se transfectaron con el PZMP11/zalpha11Lig plasmídico (Ejemplo 25A), utilizando Lipofectamine^{TM} (Gibco BRL), en una formulación de medio sin suero (SF) (DMEM, 10 mg/ml de transferrina, 5 mg/ml de insulina, 2 mg/ml de fetuina, L-glutamina al 1% y piruvato de sodio al 1%). El zalpha11-Fc4/pZMP6 (Ejemplo 8B) se diluyó en tubos de 15 ml hasta alcanzar un volumen final total de 640 \mul con medio SF. Se mezclaron 35 \mul de Lipofectamine^{TM} (Gibco BRL) con 605 \mul de medio SF. La mezcla de Lipofectamine^{TM} se agregó a la mezcla de ADN, y se la dejó incubar durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron cinco mililitros de medio SF a la mezcla ADN:Lipofectamine^{TM}. Las células se enjuagaron una vez con 5 ml de medio SF, se aspiraron y se agregó la mezcla de ADN:Lipofectamine^{TM}. Las células se incubaron a 37ºC durante cinco horas y, luego, se agregaron a cada placa 6,4 ml de medios DMEM/FBS al 10%, PSN al 1%. Las placas se incubaron a 37ºC de un día para el otro, y la mezcla de ADN:Lipofectamine^{TM} se reemplazó por un medio nuevo FBS al 5%/DMEM al día siguiente. El día 5 después de la transfección, las células se dividieron en un matraz T-162 en medio de selección (DMEM/FBS al 5%, L-GLU al 1%, NaPyr al 1%). Aproximadamente 10 días después de la transfección, se tripsinizaron dos placas de cultivo de 150 mm de colonias resistentes al metotrexato de cada transfección, se agruparon las células, se sembraron en un matraz T-162 y se transfirieron a un cultivo en gran escala. El medio acondicionado del cultivo en gran escala se utilizó para purificar el polipéptido del Ligando del zalpha11 humano, como se describe en el Ejemplo 24.
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Ejemplo 26 Constructo para generar ratones transgénicos con el Ligando del zalpha11 de ratón A. Constructo para expresar el Ligando del zalpha11 de ratón a partir del promotor E\muLCK específico para el tejido linfoide
Se diseñaron oligonucleótidos para generar un fragmento por PCR que contuviera una secuencia Kozak consenso y la región codificante del Ligando del zalpha11 de ratón. Estos oligonucleótidos se diseñaron con un sitio FseI en el extremo 5'y un sitio AscI en el extremo 3' para facilitar la clonación en: (a) pKFO51, un vector transgénico específico para tejido linfoide, o (b) pTG12-8, nuestro vector transgénico estándar.
Las reacciones PCR se llevaron a cabo con 200 ng de la plantilla del Ligando del zalpha11 de ratón (SEC. ID. N.º 55; Ejemplo 16) y los oligonucleótidos ZC23,115 (SEC. ID. N.º 66) y ZC23,116 (SEC. ID. N.º 67). Se realizó una reacción PCR utilizando la polimerasa de ADNc Advantage^{TM} (Clontech) en las condiciones de la PCR descritas en el Ejemplo 22B. Se aisló el producto de la PCR, como se describe en el Ejemplo 22B. El fragmento de ADN de 440 pb aislado se digirió y se ligó en pKFO51 previamente digerido con FseI y AscI, como se describe en el
Ejemplo 22B.
Se electroporó alrededor de un microlitro de cada reacción de ligadura, se sembró en placas, y los clones se eligieron y se cribaron para detectar el inserto del Ligando del zalpha11 humano mediante digestión de restricción, como se describe en el Ejemplo 22. Un clon correcto del pKFO51-Ligando del zalpha11 se verificó mediante secuenciamiento, y se realizó una maxipreparación de este clon. Se preparó un fragmento NotI, que contiene el promotor proximal lck y potenciador de la inmunoglobulina \mu, el ADNc del Ligando del zalpha11 y el gen de hGH mutado para ser usado en la microinyección en ovocitos murinos fertilizados.
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B. Constructo para expresar el Ligando del zalpha11 de ratón a partir del promotor MT-1 específico para el hígado
Este mismo inserto del Ligando del zalpha11 de ratón del Ejemplo 26A, se subclonó en el vector pTG12-8, como se describe en el Ejemplo 22A. Para este constructo, alrededor de 10 mg del ADN de la maxipreparación pKFO51-Ligando del zalpha11 se digirieron con FseI y AscI combinados, se precipitaron con etanol, y el fragmento del Ligando del zalpha11 de ratón se purificó como se describe en el Ejemplo 22. Este fragmento se ligó en pTG12-8 que había sido previamente digerido con FseI y AscI, como se describe en el Ejemplo 22A. Se realizaron la electroporación, el cribaje de los clones y una maxipreparación como se describe en el Ejemplo 22. Se preparó un fragmento SalI que contenía secuencias que flanquean los extremos 5' y 3', el promotor MT-1, el intrón de insulina II de rata, el ADNc del Ligando del zalpha11 de ratón y la secuencia poli A de la hGH para ser usado en la microinyección de ovocitos murinos fertilizados.
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Ejemplo 27 Anticuerpos policlonales del Ligando del zalpha11 de ratón
Se prepararon anticuerpos policlonales mediante la inmunización de 2 conejos blancos de Nueva Zelanda hembra con la proteína recombinante purificada muzalpha11L/MBP-6H (Ejemplo 32). Cada uno de los conejos recibió una inyección intraperitoneal (IP) inicial de 200 mg de proteína purificada en Adyuvante completo de Freund, seguida de inyecciones IP de refuerzo de 100 mg de péptido en Adyuvante incompleto de Freund cada tres semanas. De siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones en total), se sangraron los animales y se recolectó el suero. Los animales recibieron un refuerzo y se sangraron cada tres semanas.
Se preadsorbieron los anticuerpos anti-MBP del suero de conejo específicos para muzalpha11L/MBP-6H utilizando una columna de proteína CNBr-SEFAROSA 4B (Pharmacia LKB) que se preparó con 10 mg de proteína de unión a maltosa (maltose binding protein, MBP) recombinante purificada por gramo de CNBr-SEFAROSA. Se preparó la MBP recombinante y se purificó en una columna de amilosa, en forma interna, utilizando métodos bien conocidos en la especialidad. Los anticuerpos policlonales para el ligando del muzalpha11 se purificaron por afinidad a partir del suero de conejo utilizando una columna de proteína CNBr-SEFAROSA 4B (Pharmacia LKB) que se preparó con 10 mg de proteína recombinante purificada de antígeno específico muzalpha11L/MBP-6H (Ejemplo 32), seguido de 20X diálisis en PBS de un día para el otro. Los anticuerpos para el ligando del muzalpha11 se caracterizaron mediante ELISA utilizando 1 \mug/ml de las proteínas recombinantes purificadas muzalpha11L/MBP-6H (Ejemplo 32) o huzalpha11L-MBP/6H (Ejemplo 32) como objetivos del anticuerpo. El límite inferior de detección (lower limit of detection, LLD) del anticuerpo purificado por afinidad anti-muzalpha11L de conejo/MBP-6H es de 100 pg/ml sobre su antígeno recombinante purificado específico muzalpha11L/MBP-6H y de 500 pg/ml sobre el huzalpha11L-MBP/6H recombinante purificado.
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Ejemplo 28 Construcción del vector de expresión en mamíferos y la expresión en gran escala del Ligando del zalpha11 humano en células CHO DG44
Se construyó un vector de expresión en mamíferos para el Ligando del zalpha11 humano (SEC. ID. N.º 1) diseñado para agregar un sitio SalI en el extremo 5' y un sitio PmeI en el extremo 3' del ADNc a través de la amplificación por PCR a partir de un plásmido que contenía el Ligando del zalpha11 humano (Ejemplo 7) con los cebadores oligonucleótidos, ZC22,054 (SEC. ID. N.º 70) y ZC22,055 (SEC. ID. N.º 71). Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 94ºC durante 4 min; 25 ciclos de 94ºC durante 45 s, 50ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 3 min; y 72ºC durante 10 minutos. Se aisló el producto de la PCR según se describe en la presente, se cortó con SalI y PmeI y, luego, se ligó al plásmido pDC312 previamente cortado en los sitios de restricción adecuados en el poliligador, utilizando los métodos estándar descritos en la presente. El plásmido pDC312 se describe en Morris, A. et al., "Expression Augmenting Sequence Element (EASE) isolated from Chinese Hamster Ovary Cells", en Animal Cell Technology, Carrondo, MJT et al (ed.) (1997) Kluwer Academic Publishers, Países Bajos, p. 529-534.
El vector ligado se transfectó en células CHO DG44 adaptadas a la suspensión (en forma interna, Novo Nordisk, Dinamarca) mediante lipofección, utilizando el reactivo LipofectaminePlus^{TM} (Gibco/BRL) según las instrucciones del fabricante. Los transfectantes se seleccionaron en medio PFCHO (JRH, Lenexa, Kansas) sin timidina ni hipoxantina, seguido de una selección en metotrexato (Sigma, St. Louis, MO) 200 nM. Las células resistentes al metotrexato se clonaron mediante dilución, y se analizaron para determinar la producción del Ligando del zalpha11 mediante una valoración de la actividad de BaF3 (Ejemplo 5B).
Se produjo en escala un clon productivo y se cultivó en un biorreactor de 7 a 20 litros (Applikon Bioreactors, Schiedam, Países Bajos) en medio PFCHO para producir material para la purificación (Ejemplo 29).
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Ejemplo 29 Purificación en gran escala del Ligando del zalpha11 humano y murino sin etiqueta a partir de líneas celulares de expresión en mamíferos BHK y CHO A. Ligando del zalpha11 humano expresado en CHO
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se utilizó para purificar el Ligando del zalpha11 humano a partir de, al menos, 30 litros de medio acondicionado CHO (véase el Ejemplo 28). El medio acondicionado (CM) concentrado o no concentrado se filtró utilizando filtros estériles de 0,45 y 0,22 micrones. Se agregó solución amortiguadora MES 0,01 M (Fluka BioChemika, Suiza) al medio acondicionado, se ajustó el pH a 6,0 y, luego, se cargó en una columna Poros 50 HS (potente intercambiador de cationes de PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) de 50 X 100 mm (196 ml), de un día para el otro, a 4-10 ml/min, utilizando un BioCad SPRINT (Perceptive BioSystems). Se lavó la columna por 10-20 volúmenes de columna (CV) con MES 0,01 M/NaCl 0,130 M (Mallinckrodt, París, KY) pH 6,0. Las proteínas unidas se eluyeron con un gradiente de 10 CV de 0,130 M a NaCl 1 M en MES 0,01 M pH 6,0 a 30 ml/min; se recolectaron fracciones de 25 ml durante toda la cromatografía, y se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones de absorbancia pico se analizaron mediante tinción de plata SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO), Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) y análisis Western blot inmunológico utilizando anticuerpos contra el Ligando del zalpha11 humano (Ejemplo 33 y Ejemplo 34).
Se agruparon las fracciones pico y se concentraron en un concentrador de celdas agitadas sobre una membrana YM10 (Millipore/Amicon, Bedford, MA) hasta alcanzar un volumen nominal (1-10 ml). La muestra se cargó en una columna de exclusión por tamaño de alta resolución Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) adecuada (52-600 ml) equilibrada en PBS (Gibco BRL), a caudales de 1-2 ml/ml; se recolectaron fracciones de 1-2 ml durante toda la cromatografía, y se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones pico se analizaron mediante tinción de plata SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO), y Coomassie (Sigma, St. Louis, MO).
Se agruparon las fracciones de interés y se concentraron con concentradores para centrifugado MWKO Millipore de 5 kD hasta alcanzar un volumen mínimo. El producto final se analizó mediante tinción con SDS PAGE Coomassie (Sigma, St. Louis, MO), análisis Western blot inmunológico, secuenciamiento del N terminal, análisis de aminoácidos y BCA (Pierce, Rockford, Illinois) para evaluar la pureza y concentración de la proteína.
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B. Ligando del zalpha11 murino expresado en BHK 570
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se utilizó para purificar el Ligando del zalpha11 murino a partir de medio acondicionado de BHK (Ejemplo 18). El medio acondicionado (CM) concentrado o no concentrado se filtró utilizando filtros estériles de 0,45 y 0,22 micrones. Se agregó solución amortiguadora MES 0,01 M (Fluka BioChemika, Suiza) al medio, y se ajustó el pH a 6,0. El CM se analizó, se cargó y se eluyó en una columna AS, como se describe en el Ejemplo 29A.
Se agruparon las fracciones de interés y se concentraron en un concentrador de celdas agitadas, como en el Ejemplo 29A, hasta alcanzar un volumen de 20-30 ml. El pH se ajustó a 7,0; luego, la muestra se cargó en una columna Poros AL de 0,8 ml que contenía alrededor de 3 mg de receptor soluble con etiqueta zalpha11CFLAG (Ejemplo 10B) o con alrededor de 10 mg de receptor de la fusión zalpha11-Fc4 (Ejemplo 10C) inmovilizado en la resina (véase el método a continuación), a 1 ml/min, en un BioCAD SPRINT. Se lavó la columna con, al menos, 20 CV de NaCl/PBS 0,3 M (Gibco BRL)/MES 0,01 M, a 10 ml/min. La columna se eluyó rápidamente con una inyección de 600 \mul de glicina 0,1 M (ácido aminoacético; glicocola, Spectrum, Gardena, CA) pH 2,5, con un caudal de 10 ml/min, con PBS, en un BioCAD SPRINT. Se recolectaron las fracciones de 1 ml durante 6 segundos cada una, y el pH se neutralizó inmediatamente con 55 \mul de TRIS 2 M pH 8,8 (Tris (hidroximetil) aminometano, EM Science, Gibbstown, NJ). Se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM durante toda la cromatografía. Las fracciones pico se analizaron mediante tinción de plata SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO), Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) y análisis Western blot inmunológico, como se describió anteriormente.
Se agruparon las fracciones pico y se concentraron en un concentrador de celdas agitadas, como en el Ejemplo 29A, hasta alcanzar un volumen mínimo (1-10 ml). La muestra se cargó, se equilibró y se analizó como en el Ejemplo 29A, en una columna de exclusión por tamaño de alta resolución Sephacryl S-200 (Pharmacia) adecuada. Las fracciones pico se analizaron mediante tinción de plata SDS-PAGE (Geno Technology, St. Louis, MO) y Coomassie (Sigma, St. Louis, MO). Se agruparon las fracciones de interés, se concentraron y se analizaron, como en el Ejemplo 29A.
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C. Inmovilización de proteínas en medio POROS AL
Todas las operaciones se llevaron a cabo a temperatura ambiente en un BioCAD 700E. Una columna de 4,5 X 50 mm con el medio POROS AL se envasó con sistema flow pack en NaCl 2 M, según las especificaciones del fabricante. La columna se equilibró en Na_{2}SO_{4} 1,1 M y fosfato de Na 50 mM pH 7,2. El receptor se concentró a 4 mg/ml utilizando un concentrador para centrifugado MWKO Millipore de 30 kD y, luego, se diluyó en una proporción 1:1 en Na_{2}SO_{4} 1,1 M y fosfato de Na 50 mM pH 7,2. La columna se dejó fluir a 2 ml/min en Na_{2}SO_{4} 1,1 M y fosfato de Na 50 mM pH 7,2, y se aplicaron inyecciones de 100 \mul del ligando diluido cada 9 CV hasta que se alcanzó o se sobrepasó un estado de saturación estable. Se pasó un gradiente de 62 CV de Na_{2}SO_{4} 1,1 M y fosfato de Na 50 mM pH 7,2 a Na_{2}SO_{4} 550 mM y fosfato de Na 50 mM pH 7,2 con cianoborohidruro de sodio 5 mg/ml. La columna se mantuvo durante 2 h para completar la química de la inmovilización. La columna se equilibró en TRIS 0,2 M pH 7,2 con cianoborohidruro de sodio 5 mg/ml, y se la dejó en reposo durante 1 h. Finalmente, se equilibró la columna en PBS con azida sódica al 0,02%, y se almacenó a 4ºC hasta el momento necesario. Antes de ser usada, la columna se preeluyó con glicina 0,1 M para asegurar que se eliminaran las proteínas no específicas y que la columna no estuviera filtrando el receptor inmovilizado.
Ejemplo 30 Construcción, expresión y purificación del vector de expresión del Ligando del zalpha11 humano y murino no marcado a partir de baculovirus A. Constructo para expresar el Ligando del zalpha11 humano en baculovirus
Se preparó un vector de expresión, pzalpha11L, para expresar polipéptidos del Ligando del zalpha11 humano en células de insectos. Se generó un fragmento de 517 pb que contenía la secuencia para el Ligando del zalpha11 humano y que codificaba los sitios de restricción BamH1 y XhoI en los extremos 5' y 3' respectivamente, mediante amplificación por PCR a partir de un plásmido que contenía el ADNc del Ligando del zalpha11 humano (Ejemplo 7), utilizando los cebadores ZC23,444 (SEC. ID. N.º 74) y ZC23,445 (SEC. ID. N.º 75). Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 1 ciclo de 94ºC durante 4 minutos, seguido de 25 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, 50ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 min; seguidos de un remojo a 4ºC. El fragmento se visualizó mediante electroforesis en gel (SeaPlaque al 1%/NuSieve al 1%). La banda se extrajo, se diluyó a agarosa al 0,5% con MgCl_{2} 2 mM, se fundió a 65ºC, se digirió con BamH1 y XhoI (Boerhinger Mannheim) y se ligó en un vector de expresión del baculovirus digerido con BamH1/XhoI, el pZBV3L. El vector pZBV3L es una modificación del vector de expresión pFastBac1ä (Life Technologies), donde el promotor de la poliedrona se ha extraído y reemplazado con el promotor de la proteína básica de activación tardía. Alrededor de 14 nanogramos del inserto del Ligando del zalpha11 digerido con enzimas de restricción y alrededor de 40 ng del vector correspondiente se ligaron de un día para el otro a 16ºC.
La mezcla de ligadura se diluyó 3 veces en TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y EDTA 1 mM) y alrededor de 4 fmol de la mezcla de ligadura diluida se transformaron en células competentes de eficiencia de genoteca DH5\alpha (Life Technologies), según las indicaciones del fabricante, mediante choque térmico durante 45 segundos, a baño María a 42ºC. El ADN y las células transformadas se diluyeron en 450 ml de medio de SOC (triptona Bacto^{TM} al 2%, extracto de levadura Bacto al 0,5%, NaCl 1 M 10 ml, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y glucosa 20 mM) y se sembraron en placas con LB que contenían ampicilina 100 mg/ml. Los clones se analizaron mediante digestiones de restricción, y 1 ml de clon positivo se transformó en 20 ml de células competentes de máxima eficiencia DH10Bac (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD), según las indicaciones del fabricante, mediante choque térmico, de acuerdo con lo descrito anteriormente. Las células transformadas se diluyeron en 980 ml de medio de SOC (triptona Bacto^{TM} al 2%, extracto de levadura Bacto^{TM} al 0,5%, NaCl 1 M 10 ml, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y glucosa 20 mM) cultivados en una incubadora de agitación a 37ºC durante cuatro horas y se sembraron en placas de agar Luria que contenían 50 mg/ml de kanamicina, 7 mg/ml de gentamicina (Life Technologies), 10 mg/ml de tetraciclina, IPTG (Pharmacia Biotech) y Bluo-Gal (Life Technologies). Las células sembradas en placas se incubaron durante 48 horas a 37ºC. Se utilizó una selección por color para identificar las células que tienen el inserto del donante que codifica el Ligando del zalpha11 humano que se había incorporado en el plásmido (denominado "bácmido"). Esas colonias, de color blanco, se eligieron para su análisis. Se aisló el ADN del bácmido del Ligando del zalpha11 humano a partir de colonias positivas utilizando el sistema QiaVac Miniprep8 (Qiagen), según las indicaciones del fabricante. Los clones se cribaron para detectar el inserto correcto mediante la amplificación del ADN con cebadores del elemento transposable en el bácmido a través de la PCR, utilizando los cebadores ZC447 (SEC. ID. N.º 76) y ZC976 (SEC. ID. N.º 77). Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 35 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, 50ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 5 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 min; seguidos de un remojo a 4ºC. El producto de la PCR se pasó por un gel de agarosa al 1% para evaluar el tamaño del inserto. Los clones que tenían el inserto correcto se utilizaron para transfectar las células de Spodoptera frugiperda (Sf9).
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B. Expresión y generación de material para la purificación del Ligando del zalpha11 humano a partir de baculovirus
Las células de Sf9 se sembraron a razón de 5 x 10^{6} células por placa de 35 mm y se dejaron unir durante 1 hora a 27ºC. Se diluyeron cinco microlitros de ADN del bácmido del Ligando del zalpha11 humano (mencionado anteriormente) con 100 \mul de Sf-900 II SFM (Life Technologies). Se diluyeron seis \mul de reactivo CellFECTIN (Life Technologies) con 100 \mul de Sf-900 II SFM. El ADN del bácmido y las soluciones lipídicas se mezclaron suavemente y se incubaron durante 30-45 minutos a temperatura ambiente. Se aspiró el medio de una placa de células, las células se lavaron 1X con 2 ml de medio de Sf-900 II SFM fresco. Se agregaron ochocientos microlitros de Sf-900 II SFM a la mezcla de lípidos-ADN. Se aspiró el medio de lavado y se agregó la mezcla de ADN-lípidos a las células. Las células se incubaron a 27ºC durante 4-5 horas. Se aspiró la mezcla de ADN-lípidos y se agregaron 2 ml de medio de Sf-900 II a cada placa. Las placas se incubaron a 27ºC, con una humedad del 90%, durante 96 horas, luego de lo cual, se cosechó el virus.
Para la amplificación primaria, las células de Sf9 se cultivaron en 50 ml de Sf-900 II SFM en un matraz de agitación de 125 ml hasta alcanzar una densidad aproximada de 0,41-0,52 x 10^{5} células/ml. Dichas células se infectaron con 150 ml de lote de virus mencionado y se incubaron a 27ºC durante 3 días; luego de dicho tiempo, se cosechó el virus según los métodos estándar conocidos en la especialidad. Se analizó una muestra de 500 \mul para evaluar la actividad mediante una valoración de BAF3 (Ejemplo 5) y mostrar que era biológicamente activa.
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Para la amplificación secundaria, las células de Sf9 se cultivaron en 1 L de Sf-900 II SFM en un matraz de agitación de 2.800 ml hasta alcanzar una densidad aproximada de 0,5 x 10^{5} células/ml. La muestra se infectó con 500 \mul del lote de virus primario mencionado y se incubaron a 27ºC durante 4 días; luego de dicho tiempo, se cosechó el virus según los métodos estándar conocidos en la especialidad. El virus se tituló y se cultivó en gran escala para la purificación del Ligando del zalpha11 humano producido por el baculovirus (huzalpha11L-Bv), como se describe en el Ejemplo 30C y el Ejemplo 30D a continuación.
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C. Purificación en gran escala del Ligando del zalpha11 humano/murino expresado en baculovirus
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se utilizó para purificar el Ligando del zalpha11 humano (huzalpha11L-Bv) a partir de medio acondicionado de BV (baculovirus) (Ejemplo 30B). El medio acondicionado (CM) se filtró utilizando filtros estériles de 0,45 y 0,22 micrones, se agregó solución amortiguadora MES 0,01 M (Fluka BioChemika, Suiza) y se ajustó el pH a 6,0. El CM se cargó en una columna Poros 50 HS y se lo dejó pasar; se recolectaron las fracciones y se analizaron, como se describe en el Ejemplo 29A.
Se agruparon las fracciones pico mencionadas, se concentraron, se pasaron por una columna de exclusión por tamaño de alta resolución, y se analizaron como se describe en el Ejemplo 29A.
Se agruparon las fracciones de interés de la columna de exclusión por tamaño y se concentraron con concentradores para centrifugado MWCO Millipore de 5 de kD hasta alcanzar un volumen mínimo. El producto final se analizó mediante SDS-PAGE Coomassie (Sigma, St. Louis, MO), análisis Western blot inmunológico, secuenciamiento del N terminal, análisis de aminoácidos y CB (Pierce, Rockford, Illinois) para evaluar la pureza y concentración de la proteína, como se describe en el Ejemplo 29A. La proteína a granel se almacenó a -80ºC.
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D. Purificación a menor escala (<2 mg) del Ligando del zalpha11 humano/murino expresado en baculovirus
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se utilizó para purificar <2 mg del Ligando del zalpha11 humano o murino a partir de medio acondicionado de BV. Se filtró el CM, se agregó solución amortiguadora y se ajustó el pH, como en el Ejemplo 30C. El CM se cargó y se eluyó, y la cromatografía se analizó con POROS 50 HS, como en el Ejemplo 30C.
Se agruparon las fracciones y se concentraron a través de diafiltración en un concentrador de celdas agitadas sobre una membrana YM10 (MWCO de 10 kD) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) hasta alcanzar un volumen nominal (20-30 ml). El pH se ajustó a 7,0; luego, la muestra se cargó en una columna Poros AL de 0,8 ml que contenía alrededor de 3 mg de receptor soluble zalpha11CFLAG (Ejemplo 10B) o con alrededor de 10 mg de receptor soluble de la fusión zalpha11-Fc4 (Ejemplo 10C) inmovilizado en la resina (véase el método del Ejemplo 29C), a 1 ml/min, en un BioCad SPRINT. Se lavó la columna con, al menos, 20 CV de NaCl/PBS 0,3 M (Gibco BRL)/MES 0,01 M, a 10 ml/min. La columna se eluyó rápidamente con una inyección de 600 \mul de glicina 0,1 M (ácido aminoacético; glicocola, Spectrum, Gardena, CA) pH 2,5, con un caudal de 10 ml/min, con PBS, en un BioCAD SPRINT. Se recolectaron fracciones de 1 ml durante 6 segundos cada una, y el pH se neutralizó inmediatamente con 55 \mul de TRIS 2 M (Tris (hidroximetil) aminometano, EM Science, Gibbstown, NJ) pH 8,8. Se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM durante toda la cromatografía. Las fracciones se analizaron como se describió anteriormente.
Se agruparon las fracciones pico y se concentraron a través de diafiltración en un concentrador de celdas agitadas sobre una membrana YM10 (MWCO de 10 kD) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) hasta alcanzar 1-2 ml. La muestra se cargó en una columna de exclusión por tamaño de alta resolución Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) adecuada equilibrada en PBS (Gibco BRL) a un caudal óptimo; las fracciones se recolectaron durante toda la cromatografía, y se monitoreó la absorbancia a 280 y 215 nM. Las fracciones se analizaron como se describió anteriormente.
Se agruparon las fracciones de interés y se concentraron con concentradores para centrifugado MWCO Millipore de 5 Kd hasta alcanzar un volumen nominal. El producto final se analizó mediante SDS-PAGE Coomassie (Sigma, St. Louis, MO), análisis Western blot inmunológico, secuenciamiento del N terminal, análisis de aminoácidos y BCA (Pierce, Rockford, Illinois) para evaluar la pureza y concentración de la proteína. La proteína a granel se almacenó según lo descrito anteriormente.
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E. Constructo para expresar el Ligando del zalpha11 de ratón en baculovirus: pzalpha11lig.M
Se preparó un vector de expresión, pzalpha11LM, para expresar polipéptidos del Ligando del zalpha11 murino en células de insectos. Se generó un fragmento de 413 pb que contenía la secuencia para el Ligando del zalpha11 murino y que codificaba sitios de restricción BspE1 y Xba1 en los extremos 5' y 3', respectivamente, mediante amplificación por PCR a partir de un plásmido que contenía el ADNc del Ligando del zalpha11 murino (Ejemplo 16), utilizando los cebadores ZC25,970 (SEC. ID. N.º 109) y ZC25,969 (SEC. ID. N.º 110) con el sistema PCR Expand High Fidelity (Boerhinger Mannheim) según las instrucciones del fabricante. Las condiciones de la PCR fueron las siguientes: 1 ciclo de 94ºC durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 15 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 min; seguidos de un remojo a 4ºC. Una pequeña porción del producto de la PCR se visualizó mediante electroforesis en gel (agarosa NuSieve al 1%). El resto del fragmento se purificó utilizando el equipo de purificación de PCR de Qiagen, según las instrucciones del fabricante, y se eluyó en 30 \mul de H_{2}O. El fragmento se digirió con las enzimas de restricción Bspe1 y Xba1 (Boerhinger Mannheim) a 37ºC durante alrededor de 2 h, y se pasó por un gel de agarosa según lo descrito anteriormente. La banda se extrajo, se purificó y eluyó utilizando el equipo de extracción con gel Qiagen según las instrucciones del fabricante. El fragmento purificado se ligó en un vector de expresión del baculovirus digerido con Bspe1/Xba1, pZBV37L. El vector pZBV37L es una modificación del vector de expresión pFastBac1ä (Life Technologies), donde el promotor de la poliedrona ha sido eliminado y reemplazado por promotor de activación tardía de la proteína básica, seguido de la secuencia señal de secreción de la ecdisteroide UDP-glucosiltransferasa (EGT). Alrededor de 5 \mul del inserto del Ligando del zalpha11 murino digerido con enzimas de restricción y alrededor de 100 ng del vector cortado correspondiente se ligaron de un día para el otro, a 16ºC, en alrededor de 20 \mul. Cinco \mul de la mezcla de ligadura se electroporaron en 50 \mul de células bacterianas electrocompetentes DH12S de Life Technologies utilizando una cubeta de 2 mm con configuraciones de 2 kV, 25 \muF y 400 ohmios. Las células electroporadas se rescataron en 1 ml de medio de SOC (triptona Bacto^{TM} al 2%, extracto de levadura Bacto al 0,5%, NaCl 1 M 10 ml, KCl 1,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM y glucosa (Gibco BRL) 20 mM), se dejaron crecer a 37ºC durante alrededor de 1 h y se sembraron en placas con LB que contenían ampicilina 100 mg/ml. Se aisló el ADN de los clones y se analizó mediante digestiones de restricción para identificar los clones positivos. Alrededor de 5 ng de ADN de un clon positivo se transformaron en 20 ml de células competentes de máxima eficiencia DH10Bac (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) según las indicaciones del fabricante, mediante choque térmico durante 45 segundos, a baño María a 42ºC. Se diluyeron las células transformadas y se cultivaron como se describe en el Ejemplo 30A. Se identificaron bácmidos que contenían el inserto del Ligando del zalpha11 murino y se aislaron como se describe en el Ejemplo 30A. Los clones se cribaron para detectar el inserto correcto mediante la amplificación del ADN con cebadores del elemento transposable en el bácmido a través de la PCR, utilizando los cebadores ZC447 (SEC. ID. N.º 76) y ZC976 (SEC. ID. N.º 77). Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 35 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, 50ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 5 minutos; 1 ciclo a 72ºC durante 10 min; seguidos de un remojo a 4ºC. El producto de la PCR se pasó por un gel de agarosa al 1% para evaluar el tamaño del inserto. Los clones que tenían el inserto correcto se utilizaron para transfectar las células de Spodoptera frugiperda (Sf9).
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F. Expresión y generación de material para la purificación del zalpha11 de ratón a partir de baculovirus
Las células de Sf9 se sembraron a razón de 1 millón de células por placa de 35 mm y se dejaron unir durante 1 hora a 27ºC. El ADN del bácmido del Ligando del zalpha11 murino se transfectó como se describe en el Ejemplo 30B y se cosechó el virus.
Para la amplificación primaria, las células de Sf9 se sembraron como se describió anteriormente, se agregaron 500 \mul del sobrenadante obtenido 72 h después de la transfección, y se dejó que siguieran cultivándose durante 96 h; luego de dicho tiempo, se cosechó el virus según los métodos estándar.
Para la amplificación secundaria, las células de Sf9 se sembraron como se describió anteriormente, y se agregaron 200 \mul del lote de virus primario. Los cultivos se incubaron a 27ºC durante 72 h; luego de dicho tiempo, se cosechó el virus según los métodos estándar.
Para la amplificación terciaria, 10 \mul del lote de virus de la amplificación secundaria se colocaron en SF9s a razón de 500.000 células por pocillo en 50 ml de medio de SF900II en un matraz de agitación de 250 ml de vol. durante 6 días, y se cosechó el virus como se describió anteriormente. El virus se tituló y se cultivó en gran escala para la purificación del Ligando del zalpha11 murino producido por el baculovirus (muzalpha11L-Bv), como se describe en el Ejemplo 30C y el Ejemplo 30D.
La presencia de la proteína de peso molecular predicha en el sobrenadante se determinó mediante análisis Western blot utilizando un anticuerpo policlonal anti-muzalpha11L/MBP-6H (Ejemplo 27). El análisis de valoración de la proliferación basada en BaF3 (Ejemplo 5) también mostró que el ligando segregado era activo.
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Ejemplo 31 Expresión del Ligando del zalpha11 humano y de ratón en E. coli A. Construcción del vector de expresión de la fusión Ligando del zalpha11 humano-MBP, PTAP98/Ligando del zalpha11
Mediante recombinación homóloga, se construyó un plásmido de expresión que contenía un polinucleótido que codifica parte del Ligando del zalpha11 humano fusionado en el N terminal con la proteína de unión a maltosa (MBP). Se aisló un fragmento del ADNc del Ligando del zalpha11 humano (SEC. ID. N.º 1) mediante PCR. Se utilizaron dos cebadores en la producción del fragmento del Ligando del zalpha11 humano en una reacción PCR: (1) el cebador ZC22,128 (SEC. ID. N.º 78), que contiene 40 pb de la secuencia flanqueante del vector y 26 pb correspondientes al amino terminal del Ligando del zalpha11 humano, y (2) el cebador ZC22,127 (SEC. ID. N.º 79), que contiene 40 pb del extremo 3' correspondientes a la secuencia flanqueante del vector y 28 pb correspondientes al carboxilo terminal del Ligando del zalpha11 humano. Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto; seguidos de un remojo a 4ºC, realizado por duplicado. Se pasaron dos \mul de los 100 \mul de la reacción PCR por un gel de agarosa al 1,0% con 1 x solución amortiguadora TBE para su análisis, lo que mostró la banda prevista de aproximadamente 472 pb. Los 90 \mul restantes de la reacción PCR se combinaron con el segundo tubo de PCR precipitado con 400 \mul de etanol absoluto para ser utilizados para la recombinación con el vector receptor pTAP98 cortado con Sma1, a fin de producir el constructo que codifica la fusión MBP-Ligando del zalpha11, según se describe a continuación.
El plásmido pTAP98 se derivó de los plásmidos pRS316 y pMAL-c2. El plásmido pRS316 es un vector transportador de Saccharomyces cerevisiae (Hieter P. y Sikorski, R., Genetics 122:19-27, 1989). El pMAL-C2 (NEB) es un plásmido de expresión de E. coli. Transporta el promotor del tac que produce MalE (gen que codifica la MBP) seguido de una etiqueta His, un sitio de segmentación de trombina, un sitio de clonación, y el terminador rrnB. El vector pTAP98 se construyó mediante recombinación homóloga de levadura. 100 ng de pMAL-c2 cortado con EcoR1 se recombinaron con 1 \mug de pRS316 cortado con Pvu1, 1 \mug de ligador y 1 \mug pRS316 cortado con Sca1/EcoR1. El ligador consistía en los oligos ZC19,372 (SEC. ID. N.º 80) (100 pmol): ZC19,351 (SEC. ID. N.º 81) (1 pmol): ZC19,352 (SEC. ID. N.º 82) (1 pmol), y ZC19,371 (SEC. ID. N.º 83) (100 pmol) combinados en una reacción PCR. Las condiciones fueron las siguientes: 10 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 30 segundos; seguidos de un remojo a 4ºC. Los productos de la PCR se concentraron a través de precipitación con etanol al 100%.
Se combinaron independientemente cien microlitros de células de levadura competentes (S. cerevisiae) con 10 \mul de una mezcla que contenía aproximadamente 1 \mug del producto de la PCR del Ligando del zalpha11 humano y 100 ng del vector pTAP98 digerido con SmaI, y la mezcla se transfirió a una cubeta de electroporación de 0,2 cm. La mezcla de levadura/ADN se electropulsó a 0,75 kV (5 kV/cm), ohmios infinitos, 25 \muF. A cada cubeta, se agregaron 600 \mul de sorbitol 1,2 M. La levadura se sembró en placas, en dos alícuotas de 300 \mul, en dos placas de URA-D, y se incubó a 30ºC.
Después de aproximadamente 48 horas, los transformantes de levadura Ura+ de una sola placa se resuspendieron en 1 ml de H_{2}O y se los centrifugó brevemente para obtener un sedimento de células de levadura. Luego, se resuspendió el sedimento celular en 1 ml de solución amortiguadora de lisis (Triton X-100 al 2%; SDS al 1%; NaCl 100 mM; Tris 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM). Se agregaron quinientos microlitros de la mezcla de lisis en un tubo Eppendorf que contenía 300 \mul de perlas de vidrio lavadas con ácido y 200 \mul de fenol-cloroformo, se los mezcló en vórtex dos o tres veces en intervalos de 1 minuto, y se los centrifugó durante 5 minutos en una centrifugadora Eppendorf a la velocidad máxima. Se transfirieron trescientos microlitros de la fase acuosa a un tubo nuevo y se precipitó el ADN con 600 \mul de etanol (EtOH), seguido de centrifugación durante 10 minutos a 4ºC. El sedimento de ADN se resuspendió en 100 \mul de H_{2}O.
Se realizó la transformación de células de E. coli electrocompetentes (MC1061, Casadaban et al. J. Mol. Biol. 138, 179-207) con 1 \mul de preparación de ADN de levadura y 40 \mul de células MC1061. Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 \muF y 400 ohmios. Después de la electroporación, se sembraron 0.6 ml de SOC (triptona Bacto^{TM} al 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM) en una alícuota en placas con LB AMP (caldo de LB (Lennox), agar Bacto^{TM} al 1,8% (Difco), ampicilina 100 mg/L).
Se identificaron mediante digestión de restricción los clones individuales que albergaban el constructo de expresión correcto para el Ligando del zalpha11 humano. Las células se cultivaron en Superbroth II (Becton Dickinson) con 100 \mug/ml de ampicilina, de un día para el otro. Se utilizaron 50 \mul del cultivo de un día para el otro para inocular 2 ml de Superbroth II fresco +100 \mug/ml de ampicilina. Los cultivos se cultivaron a 37ºC, con agitación durante 2 horas. Se indujo 1 ml de cultivo con IPTG 1 mM. A las 2-4 horas, se mezclaron los 250 \mul de cada cultivo con 250 \mul de perlas de vidrio lavadas con ácido y 250 \mul de solución amortiguadora Thorner con bME al 5%\beta y colorante (urea 8 M, Tris 100 mM pH 7,0, glicerol al 10%, EDTA 2 mM, SDS al 5%). Las muestras se mezclaron en vórtex durante un minuto y se calentaron a 65ºC durante 5-10 minutos. Se cargaron 20 \mul por hilera en un gel de PAGE al 4%-12% (NOVEX). Los geles se pasaron en solución amortiguadora 1XMES. Los clones positivos se denominaron pTAP126 y se sometieron a un análisis de secuencia. La secuencia del polinucleótido de fusión MBP-Ligando del zalpha11 humano dentro del pTAP126 se muestra en la SEC. ID. N.º 84, y el polipéptido correspondiente, en la
SEC. ID. N.º 85.
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B. Expresión bacteriana del Ligando del zalpha11 humano
Se utilizó un microlitro del ADN de secuenciamiento para transformar la cepa W3110 (ATCC). Las células se electropulsaron a 2,0 kV, 25 \muF y 400 ohmios. Después de la electroporación, se sembraron 0.6 ml de SOC (triptona Bacto^{TM} al 2% (Difco, Detroit, MI), extracto de levadura al 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl_{2} 10 mM, MgSO_{4} 10 mM, glucosa 20 mM) en una alícuota en placas con LB AMP (caldo de LB (Lennox), agar Bacto^{TM} al 1,8% (Difco), ampicilina 100 \mug/mL).
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Se expresaron las colonias individuales. Las células se cultivaron en Superbroth II (Becton Dickinson) con 100 \mug/ml de ampicilina, de un día para el otro. Se utilizaron 50 \mul del cultivo de un día para el otro para inocular 2 ml de Superbroth II fresco +100 \mug/mlg/ml. Los cultivos se cultivaron a 37ºC, con agitación durante 2 horas. Se indujo 1 ml de cultivo con IPTG 1 mM. A las 2-4 horas, se mezclaron los 250 \mul de cada cultivo con 250 \mul de perlas de vidrio lavadas con ácido y 250 \mul de solución amortiguadora Thorner con bME al 5%\beta y colorante (urea 8 M, Tris 100 mM pH 7,0, glicerol al 10%, EDTA 2 mM, SDS al 5%). Las muestras se mezclaron en vórtex durante un minuto y se calentaron a 65ºC durante 10 minutos. Se cargaron 20 \mul por hilera en un gel de PAGE al 4%-12% (NOVEX). Los geles se pasaron en solución amortiguadora 1XMES. Los clones positivos se utilizaron para ser cultivados para la purificación de la proteína de fusión huzalpha11L/MBP-6H (Ejemplo 32 a continuación).
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C. Construcción del vector de expresión de la fusión Ligando del zalpha11 de ratón-MBP, PTAP98/Ligando del zalpha11 de ratón
Mediante recombinación homóloga, se construyó un plásmido de expresión que contenía un polinucleótido que codifica parte del Ligando del zalpha11 de ratón fusionado en el N terminal con la proteína de unión a maltosa (MBP), como se describe en el Ejemplo 31A. Se aisló un fragmento del ADNc del Ligando del zalpha11 de ratón (SEC. ID. N.º 55) mediante PCR. Se utilizaron dos cebadores en la producción del fragmento del Ligando del zalpha11 de ratón en una reacción PCR: (1) el cebador ZC22,849 (SEC. ID. N.º 86), que contiene 40 pb de la secuencia flanqueante del vector y 24 pb correspondientes al amino terminal del Ligando del zalpha11 de ratón, y (2) el cebador ZC22,850 (SEC. ID. N.º 87), que contiene 40 pb del extremo 3' correspondientes a la secuencia flanqueante del vector y 21 pb correspondientes al carboxilo terminal del Ligando del zalpha11 de ratón. Las condiciones de la reacción PCR fueron las descritas anteriormente. El fragmento de aproximadamente 450 pb se clonó en pTAP98, según lo descrito anteriormente. Los clones se transformaron, se identificaron y se cultivaron según lo descrito anteriormente. Los clones positivos se denominaron pTAP134 y se sometieron a un análisis de secuencia. La secuencia del polinucleótido de fusión MBP-Ligando del zalpha11 de ratón dentro del pTAP134 se muestra en la SEC. ID. N.º 88, y la secuencia del polipéptido correspondiente se muestra en la SEC. ID. N.º 89. Los clones positivos se utilizaron para ser cultivados en E. coli según lo descrito anteriormente para la purificación de la proteína de fusión muzalpha11L/MBP-6H
(Ejemplo 32).
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Ejemplo 32 Purificación del Ligando del zalpha11-MBP o del receptor zalpha11-MBP
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se utilizó para purificar las fusiones Ligando del zalpha11-MBP para el Ligando del zalpha11 humano-MBP (huzalpha11L/MBP-6H) o el Ligando del zalpha11 murino-MBP (muzalpha11L/MBP-6H) a partir de E. coli. Las fusiones del receptor zalpha11 humano o de ratón-MBP se llevaron a cabo utilizando el mismo método. Se descongeló una pasta de E. coli congelada precentrifugada y se diluyó en 2 litros de solución amortiguadora B (TRIS 0,02 M (EM Science); NaCl 0,2 M (Mallinckrodt); 2-mercapto-etanol 0,01 M (EM Science); pH 8,0; con pepstatina A 5 mg/l (Boerhinger Mannheim); aprotinina 5 mg/l (Boerhinger Mannheim); y PMSF 1 mg/l (Fluka)) más 1-2 ml de un reactivo antiespumante AF289 (Sigma). La mezcla se procesó en un homogeneizador celular French Press (Constant Systems LTD) previamente enfriado, con 20-30 kPSI.
El lisado se centrifugó a 18.000 x g durante 45 minutos a 4ºC; el sobrenadante se retuvo. Se agregó una lechada de 200 ml de resina de amilosa (New England BioLabs), preequilibrada en solución amortiguadora A (TRIS 0,02 M (EM Science); NaCl 0,2 M (Mallinckrodt); 2-mercapto-etanol 0,01 M (EM Science); pH 8,0) al sobrenadante lisado, y se incubó de un día para el otro en frascos rotativos de 2 l para que se produjera la máxima absorción por los lotes de la proteína de fusión con MBP. La resina se lavó en formato de columna de lote por \geq5 volúmenes de columna de solución amortiguadora A; se eluyó por lotes con solución amortiguadora C (solución amortiguadora A con maltosa 0,02 M (Sigma)). Se recolectaron las fracciones crudas y se monitorearon mediante la absorbancia a 280 nm.
La proteína eluida se analizó mediante tinción con SDS NuPAGE (NOVEX) Coomassie (Sigma). La muestra y la proteína a granel se almacenaron a -80ºC.
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Ejemplo 33 Anticuerpos policlonales del Ligando del zalpha11 humano
Los anticuerpos policlonales contra el Ligando del zalpha11 humano se prepararon mediante la inmunización de 2 conejos blancos de Nueva Zelanda hembra con la proteína recombinante purificada huzalpha11L/MBP-6H (Ejemplo 32) o la proteína recombinante de CHO purificada huzalpha11L-CHO (Ejemplo 29). Cada uno de los conejos recibió una inyección intraperitoneal (IP) inicial de 200 mg de proteína purificada en Adyuvante completo de Freund, seguida de inyecciones IP de refuerzo de 100 mg de proteína purificada en Adyuvante incompleto de Freund cada tres semanas. De siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones en total), se sangraron los animales y se recolectó el suero. Los animales recibieron un refuerzo y se sangraron cada tres semanas.
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El suero de conejo cultivado para huzalpha11L/MBP-6H se preadsorbió de anticuerpos anti-MBP utilizando una columna de proteína CNBr-SEFAROSA 4B (Pharmacia LKB) que se preparó con 10 mg de MBP recombinante purificada por gramo de CNBr-SEFAROSA (Pharmacia). Se preparó la MBP recombinante y se purificó en una columna de amilosa, en forma interna, utilizando métodos bien conocidos en la especialidad. Los anticuerpos policlonales para el ligando del huzalpha11 se purificaron por afinidad a partir del suero de conejo utilizando una columna de proteína CNBr-SEFAROSA 4B (Pharmacia LKB) que se preparó con 10 mg de proteína recombinante purificada de antígeno específico huzalpha11L/MBP-6H o 10 mg de la proteína recombinante de CHO purificada huzalpha11L-CHO por gramo de CNBr-SEFAROSA, seguido de 20X diálisis en PBS de un día para el otro. Los anticuerpos para el ligando del huzalpha11 se caracterizaron mediante ELISA utilizando 1 \mug/ml de las proteínas recombinantes purificadas huzalpha11L/MBP-6H (Ejemplo 32), Ligando del zalpha11 humano (huzalpha11L-CHO) (Ejemplo 29) o muzalpha11L-MBP/6H (Ejemplo 32) como objetivos del anticuerpo.
El límite inferior de detección (LLD) del anticuerpo purificado por afinidad anti-huzalpha11L de conejo/MBP-6H fue de 10 ng/ml sobre su antígeno recombinante purificado específico huzalpha11L/MBP-6H, de 500 pg/ml sobre el huzalpha11L-CHO recombinante purificado y de 100 pg/ml sobre el muzalpha11L/MBP-6H recombinante purificado (Ejemplo 32). El LLD del anticuerpo purificado por afinidad anti-huzalpha11L de conejo-CHO fue de 20 pg/ml sobre su antígeno recombinante purificado específico huzalpha11L-CHO, de 500 pg/ml sobre el huzalpha11L/MBP-6H recombinante purificado y de 50 ng/ml sobre el muzalpha11L/MBP-6H recombinante purificado.
Ejemplo 34 Anticuerpos antipeptídicos del Ligando del zalpha11 humano
Los anticuerpos antipeptídicos del Ligando del zalpha11 humano policlonales se prepararon mediante la inmunización de 2 conejos blancos de Nueva Zelanda hembra con el péptido del Ligando del zalpha11 humano, huzalpha11L-1 (SEC. ID. N.º 72) o huzalpha11L-3 (SEC. ID. N.º 73). Los péptidos se sintetizaron utilizando un sintetizador de péptidos modelo 431A de Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) según las indicaciones del fabricante. Los péptidos se conjugaron con una proteína vehicular, la hemocianina de lapa californiana (keyhole limpet hemocyanin, KLH), con activación por maleimida. Cada uno de los conejos recibió una inyección intraperitoneal (IP) inicial de 200 mg del péptido en Adyuvante completo de Freund, seguida de inyecciones IP de refuerzo de 100 mg de péptido en Adyuvante incompleto de Freund cada tres semanas. De siete a diez días después de la administración de la segunda inyección de refuerzo (3 inyecciones en total), se sangraron los animales y se recolectó el suero. Los animales recibieron un refuerzo y se sangraron cada tres semanas.
Los sueros de conejo cultivados para los péptidos del Ligando del zalpha11 humano se caracterizaron mediante la verificación de la titulación por ELISA con 1 \mug/ml del péptido respectivo utilizado para elaborar el anticuerpo (SEC. ID. N.º 72 o SEC. ID. N.º 73) como objetivo del anticuerpo. Los 2 sueros de conejo cultivados para el péptido huzalpha11L-1 tuvieron una titulación para su péptido específico a una dilución de 1:5.000.000 (1:5E6). Los 2 sueros de conejo cultivados para el péptido huzalpha11L-3 tuvieron una titulación para su péptido específico a una dilución de 1:5E6.
Los anticuerpos policlonales específicos para el péptido del Ligando del zalpha11 humano se purificaron por afinidad a partir del suero de conejo, utilizando columnas con proteína CNBr-SEFAROSA 4B (Pharmacia LKB) que se prepararon con 10 mg del péptido específico respectivo (SEC. ID. N.º 72 o SEC. ID. N.º 73) por gramo de CNBr-SEFAROSA, seguido de 20X diálisis en PBS de un día para el otro. Los anticuerpos para el ligando del huzalpha11 se caracterizaron mediante la verificación de la titulación por ELISA con 1 \mug/ml de antígeno peptídico purificado o proteínas de longitud completa recombinantes purificadas, según corresponda, como objetivos del anticuerpo.
El límite inferior de detección (LLD) del anticuerpo purificado por afinidad anti-huzalpha11L-1 de conejo es de 500 pg/ml sobre su antígeno peptídico específico (huzalpha11L-1; SEC. ID. N.º 72), de 500 pg/ml sobre el huzalpha11L/MBP-6H recombinante purificado (Ejemplo 32) y de 500 pg/ml sobre el huzalpha11L-CHO recombinante de CHO purificada (Ejemplo 29). No se observó reactividad cruzada al muzalpha11L/MBP-6H recombinante purificado (Ejemplo 32). El LLD del anticuerpo purificado por afinidad anti-huzalpha11L-3 de conejo es de 50 pg/ml sobre su antígeno peptídico específico (huzalpha11L-1; SEC. ID. N.º 73), de 50 pg/ml sobre su antígeno recombinante purificado específico huzalpha11L/MBP-6H, de 500 pg/ml sobre el huzalpha11L-CHO recombinante de CHO purificada (Ejemplo 29), y de 100 pg/ml sobre huzalpha11L-Bv recombinante de baculovirus purificado (Ejemplo 30). Se observó reactividad cruzada al muzalpha11L/MBP-6H recombinante purificado (Ejemplo 32) con un LLD de 5 ng/ml.
Ejemplo 35 Anticuerpos monoclonales del receptor zalpha11 humano
Se prepararon anticuerpos monoclonales del receptor zalpha11 mediante la inmunización de 5 ratones BalbC macho (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) con la proteína del receptor soluble recombinante purificado, zalpha11CEE (huzalpha11-CEE-BHK) (Ejemplo 10A). Cada uno de los ratones recibió una inyección intraperitoneal (IP) inicial de 20 mg de proteína purificada en Adyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL), seguida de inyecciones IP de refuerzo de 10 mg de proteína purificada en Adyuvante incompleto de Freund cada dos semanas. De siete a diez días después de la administración de la tercera inyección de refuerzo, se sangraron los animales y se recolectó el suero.
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Las muestras de suero de ratón cultivadas para el huzalpha11-CEE-BHK se caracterizaron mediante la verificación de la titulación por ELISA con la proteína huzalpha11-Fc de CHO recombinante purificada (Ejemplo 10C) como objetivo del anticuerpo. Una muestra de suero de ratón tuvo una titulación para el objetivo del anticuerpo específico a una dilución de 1:1.000.000 (1:1E6). Cuatro muestras de suero de ratón tuvieron una titulación para el objetivo del anticuerpo específico a una dilución de 1:100.000 (1:1E5).
Se cosecharon los esplenocitos de los 4 ratones de título alto y se fusionaron con células de mieloma SP2/0 murinas utilizando PEG 1500 (Boerhinger Mannheim, Reino Unido) en dos procedimientos de fusión por separado con una relación de fusión de 4:1 de esplenocitos a células de mieloma (Antibodies: A Laboratory Manual, E. Harlow y D. Lane, Cold Spring Harbor Press). Después de 10 días de crecimiento posterior a la fusión, se identificaron hibridomas productores de anticuerpos específicos -mediante ELISA, utilizando la proteína zalpha11 humano-Fc4 de BHK recombinante purificada (Ejemplo 10C) como objetivo del anticuerpo, y mediante FACS, utilizando células BaF3 que expresan la secuencia del huzalpha11 (Ejemplo 4 y Ejemplo 2) como objetivo del anticuerpo. Los 4 hibridomas resultantes positivos mediante ambos métodos se clonaron tres veces por dilución limitante. Los anticuerpos se denominaron: 249.28.2.1.2.2; 247.10.2.15.4.6; 249.19.2.2.3.5; y 249.15.2.4.2.7.
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Ejemplo 36 Ratones transgénicos con el Ligando del zalpha11 A. Generación de ratones transgénicos que expresaban el Ligando del zalpha11 humano y de ratón
Se prepararon fragmentos de ADN de vectores transgénicos (Ejemplo 22 y Ejemplo 26) que contenían las secuencias que flanquean los extremos 5' y 3' del promotor respectivo (promotor específico para el hígado MT-1, el Ligando del zalpha11 de ratón (Ejemplo 26B) o promotor LCK específico para el tejido linfoide), el Ligando del zalpha11 de ratón y humano (Ejemplos 26A y 22B), el intrón de insulina II de rata, el ADNc del Ligando del zalpha11 y la secuencia poli A de la hormona de crecimiento humana; y se utilizaron para microinyección en los ovocitos murinos fertilizados B6C3f1 (Taconic, Germantown, NY), utilizando un protocolo de microinyección estándar. Véase Hogan, B. et al., Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994.
Se identificaron ocho ratones transgénicos que expresaban el Ligando del zalpha11 humano a partir del promotor E\muLCK específico para el tejido linfoide entre 44 crías. Cuatro de estas crías murieron y 4 llegaron a la adultez. Los niveles de expresión fueron relativamente bajos en estos animales. Se identificaron veinte ratones transgénicos que expresaban el Ligando del zalpha11 de ratón a partir del promotor E\muLCK específico para el tejido linfoide entre 77 crías. Los 20 animales llegaron a la adultez. Los niveles de expresión fueron relativamente bajos en estos animales. Se identificaron tres ratones transgénicos que expresaban el Ligando del zalpha11 de ratón a partir del promotor MT-1 específico para el hígado entre 60 crías. Dos de estas crías murieron y 1 llegó a la adultez. Los niveles de expresión fueron relativamente bajos en estos animales. Se prepararon tejidos y se examinaron histológicamente según se describe a continuación.
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B. Evaluación microscópica de los tejidos de ratones transgénicos
Se recolectaron el bazo, el timo y los ganglios linfáticos mesentéricos de los animales transgénicos que expresaban el Ligando del zalpha11 humano y de ratón (Ejemplo 36A), y se prepararon para su examinación histológica. Entre los demás tejidos que se recolectaron de rutina, se incluyen los siguientes: hígado, corazón, pulmón, riñón, piel, glándula mamaria, páncreas, estómago, intestino delgado y grueso, cerebro, glándula salival, tráquea, esófago, glándula suprarrenal, pituitaria, aparato reproductor, glándulas sexuales masculinas accesorias, músculo esquelético, incluido el nervio periférico, y fémur con médula ósea. Se cosecharon los tejidos de una cría neonatal que murió inesperadamente, y de varios ratones transgénicos adultos, según se describe a continuación. Las muestras se fijaron en solución amortiguadora de formalina al 10%, se procesaron en forma rutinaria, se bañaron con parafina, se seccionaron en cortes de 5 micrones y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Un patólogo veterinario certificado por la junta sin conocimiento del tratamiento aplicado examinó los portaobjetos y les asignó un puntaje de acuerdo con la severidad de los cambios en los tejidos (0=ninguno, 1=leve, 2=moderado, 3=severo).
La cría y los 2 ratones adultos hembra que expresaban el Ligando del zalpha11 humano, y 3 de los 6 ratones adultos macho que expresaban el Ligando del zalpha11 de ratón mostraron infiltrados inflamatorios en muchos de los tejidos examinados. Los órganos afectados variaron en cierta medida de ratón a ratón. El infiltrado inflamatorio estaba compuesto principalmente de neutrófilos y macrófagos en cantidades y proporciones variables y, en general, su severidad era de grado leve a moderado. Además, estos animales mostraron cambios en órganos linfoides, incluida linfopenia de moderada a severa en el bazo y el timo (transgénicos del Ligando del zalpha11 humano y de ratón); y linfopenia severa (transgénicos del Ligando del zalpha11 humano), o linfadenitis de supurativa a piogranulomatosa, de leve a severa (transgénicos del Ligando del zalpha11 de ratón) en los ganglios linfáticos. Además, el aumento de la hematopoyesis extramedular fue evidente en los bazos. Estos cambios no se observaron en los ratones de control de la misma edad.
C. Análisis citométricos de flujo de tejidos de los ratones transgénicos que sobreexpresaban el Ligando del zalpha11
Los animales transgénicos que sobreexpresaban el Ligando del zalpha11 humano o de ratón (Ejemplo 36A) se sacrificaron para realizarles análisis citométricos de flujo de sangre periférica, el timo, los ganglios linfáticos, la médula ósea y el bazo.
Se realizaron suspensiones celulares con el bazo, el timo y los ganglios linfáticos mediante la separación del órgano con pinzas en medio de cultivo helado (500 ml de medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS); 5 ml 100x L-glutamina (Gibco BRL. Grand Island, NY); 5 ml 100x piruvato de Na (Gibco BRL); 5 ml 100X penicilina, estreptomicina, neomicina (PSN) (Gibco BRL) y, luego, las células se presionaron suavemente a través de un tamiz celular (Falcon, VWR Seattle, WA). Se recolectó sangre periférica (200 ml) en tubos heparinizados y se la diluyó a 10 ml con solución salina balanceada de Hank (Hank's Buffered Salt Solution, HBSS) que contenía 10 U de heparina/ml. Se eliminaron los eritrocitos del bazo y de las preparaciones de sangre periférica mediante lisis hipotónica. Se realizaron suspensiones de células de médula ósea enjuagando la médula de los fémures con medio de cultivo helado. Las células se contaron y se analizaron para determinar la viabilidad utilizando azul de tripán (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Las células se resuspendieron en medio de tinción helado (HBSS, suero bovino fetal al 1%, azida sódica al 0,1%) a una concentración de diez millones por mililitro. Se logró el bloqueo del receptor Fc y de las uniones no específicas de anticuerpos a las células agregando suero de cabra normal al 10% y un bloqueo de Fc (Pharmingen, La Jolla, CA) a la suspensión celular.
Las suspensiones celulares se mezclaron con volúmenes iguales de anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromo (PharMingen), se incubaron en hielo durante 60 minutos y, luego, se lavaron dos veces con una solución amortiguadora de lavado helada (PBS, suero bovino fetal al 1%, azida sódica al 0,1%) antes de ser resuspendidas en 400 ml de solución amortiguadora de lavado que contenía 7-AAD (Molecular Probes, Eugene, OR) 1 mg/ml como marcador de viabilidad en algunas muestras. Los datos de flujo se obtuvieron con un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems, San José, CA). Tanto la adquisición como el análisis se realizaron utilizando el software CellQuest (BD Immunocytometry Systems).
Los animales transgénicos que expresaban el Ligando del zalpha11 humano o de ratón a los niveles más altos tenían poblaciones de células drásticamente alteradas en todos los órganos linfoides analizados. Los cambios observados incluyeron pérdida total de la celularidad tímica, ausencia total de las células B CD45R positivas y aumento de tamaño y celularidad de los bazos. Tanto el bazo como la médula ósea presentaron aumentos en las cantidades de células de tamaño mieloide, cuya causa se explicó mediante aumentos tanto en los monocitos como en los neutrófilos. En muchas poblaciones, hubo un aumento del marcador de células Pan NK (DX5). Los fundadores de expresión moderada tuvieron cambios menos drásticos, pero aún así significativos, compatibles con el fenotipo observado en los de expresión alta. Los ratones con el nivel de expresión más bajo no habían experimentado un aumento significativo en las cantidades de células mieloides ni una disminución en las cantidades de células B. No obstante, se observaron cambios significativos en las poblaciones de timocitos con disminuciones en las células doble positivas para CD4+CD8+ y aumentos en las células simple positivas tanto para CD4 como para CD8.
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Ejemplo 37 Proteína humana recombinante purificada del Ligando del zalpha11 Estudio de respuesta de dosis en ratones normales A. Resumen
Se trataron ratones normales hembra de seis semanas C57Bl/6 (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) con una inyección intraperitoneal aplicada una vez por día durante cuatro u ocho días, con uno de los cuatro niveles de dosis del Ligando del zalpha11 humano recombinante purificado (Ejemplo 24) a 0,1; 0,5; 5 ó 50 \mug/ratón/día o con un vehículo como control. Se monitorearon los pesos y las temperaturas corporales en forma diaria. El día cuatro o el día nueve, se sacrificaron cuatro de los ocho ratones de cada grupo de tratamiento con proteína y cinco de los diez ratones del grupo de control con vehículo. Se cosecharon la sangre, la médula ósea y otros tejidos, y se analizaron. Se examinaron las posibles perturbaciones en los tejidos linfoides, así como los parámetros fisiológicos y toxicológicos generales.
No existieron evidencias de toxicidad de la proteína del Ligando del zalpha11 humano a cualquiera de las dosis evaluadas. No se presentaron cambios en los pesos ni en las temperaturas corporales. No se presentaron cambios evidentes en los parámetros químicos clínicos. Sin embargo, se produjeron hallazgos sistemáticos relacionados con el aumento en los porcentajes de las células de linaje mieloide en la médula ósea, el bazo y la sangre periférica en los ratones tratados con la dosis más alta del Ligando del zalpha11, en comparación con el control con vehículo. Se produjo un aumento significativo desde el punto de vista estadístico en las células de tamaño de linaje mieloide, que se identificó mediante análisis citométrico de flujo del bazo homogeneizado, en el grupo de dosis alta. Los bazos de los dos grupos de dosis más alta fueron significativamente más grandes desde el punto de vista estadístico que los de los otros grupos. Sin embargo, en el examen histopatológico, solo se observó un aumento marginal de la hematopoyesis extramedular en el grupo de la dosis más alta. Se produjo un aumento significativo desde el punto de vista estadístico en la proporción mieloides a eritroides de la médula ósea en el grupo de la dosis más alta, en comparación con los otros grupos. Finalmente, se observaron aumentos en la sangre periférica, tanto en los recuentos celulares de glóbulos blancos totales como en el porcentaje de monocitos en el mismo grupo.
B. Preparación de la solución de las dosis
El Ligando del zalpha11 humano recombinante purificado (Ejemplo 24) se diluyó en solución salina estéril amortiguada con fosfato (GibcoBRL, Grand Island, NY) hasta alcanzar concentraciones para administrar 50; 5; 0,5 ó 0,1 microgramos de proteína en 0,1 ml de vehículo de PBS. Las dosis para los primeros cuatro días se prepararon el día 0 y se congelaron en un congelador a -20ºC con escarcha antes de usarlas. Las dosis para los días cinco a ocho se prepararon el día cinco y se congelaron como se describió anteriormente. Se congelaron alícuotas de la misma PBS de manera similar para el grupo de control tratado con el vehículo. El día de la administración, se descongelaron las alícuotas correspondientes y se inyectó 0,1 ml de la solución por vía intraperitoneal en los ratones, todos los días, durante cuatro u ocho días.
C. Diseño del estudio
Los ratones tenían seis semanas al comienzo del estudio. Cada grupo de tratamiento consistía en ocho ratones, excepto el grupo de control con vehículo que incluía diez ratones. La mitad de los ratones de cada grupo de tratamiento se sacrificó después de cuatro días de tratamiento, y la otra mitad se sacrificó después de ocho días.
Todos los días antes de recibir el tratamiento, se registraba el peso y la temperatura corporales de cada ratón mediante el uso del sistema de ordenador portátil programable (BMDS, Inc, Maywood, NJ), realizando una exploración del ratón para detectar el número de identificación y la temperatura corporal a partir de los transpondedores implantados en forma subcutánea (IPTT-100, BMDS, Maywood, NJ).
Al momento del sacrificio, los tejidos cosechados para evaluar las poblaciones de glóbulos blancos mediante análisis citométrico de flujo incluyeron la médula ósea, el timo y el bazo. Los análisis con FACS de los órganos linfoides y la médula ósea se realizaron con FACSCalibur, (Becton Dickinson, Mansfield, MA). Los tejidos cosechados para la examinación histológica para detectar signos de toxicidad de la proteína incluyeron: el bazo, el timo, el hígado, el riñón, la glándula suprarrenal, el corazón y los pulmones. Todos los tejidos fijados para histología se mantuvieron a 4ºC, de un día para el otro, en solución salina normal (Normal Buffered Saline, NBF) al 10% (Surgipath, Richmond, IL). Al día siguiente, la NBF se reemplazó con etanol al 70%, y los tejidos volvieron a dejarse a 4ºC hasta el momento del proceso histológico.
Los tejidos se procesaron y se tiñeron con hematoxilina y eosina, en forma interna, y se enviaron a un patólogo contratado para los análisis histopatológicos. Se recolectó sangre para obtener recuentos celulares sanguíneos completos (complete blood cell count, CBC) y perfiles de química sérica. Los CBC se analizaron internamente con el analizador hematológico Cell Dyn 3500 (Abbott Diagnostics Division, Abbott Park, IL) y los recuentos celulares diferenciales de glóbulos blancos manuales se analizaron en Phoenix Central Laboratory, (Everett, WA). El suero se mantuvo congelado a -20ºC hasta que se envió a Phoenix Central Laboratory para realizar paneles de química sérica completos. Para evaluar las proporciones mieloides a eritroides, la médula ósea de un fémur se aplicó a los portaobjetos con CytoSpin (CITOCENTRÍFUGA CYTOSPIN 3 y PORTAOBJETOS CYTO, Shandon, Pittsburgh, PA) y se envió a Phoenix Central Laboratories para su análisis.
D. Resultados del estudio
No se presentaron indicios clínicos evidentes de efectos fisiológicos o de toxicidad del Ligando del zalpha11 humano a dosis de 50 \mug/día o menores. Los pesos corporales y las temperaturas permanecieron normales durante la totalidad de los tratamientos. Los parámetros de química sérica estaban dentro de los rangos normales. Los recuentos de glóbulos rojos y de plaquetas arrojaron resultados normales. En los ratones que recibieron 50 \mug/día durante 8 días, los recuentos celulares diferenciales de glóbulos blancos manuales mostraron que el porcentaje de monocitos era elevado en la sangre periférica, y se observó un aumento evidente en los recuentos celulares de glóbulos blancos totales. En la médula ósea enjuagada de un fémur, las proporciones mieloides a eritroides aumentaron en el grupo de dosis de 50 \mug y, en menor medida, en el grupo de dosis de 5 \mug correspondiente al conjunto que recibió dosis durante 8 días. En una comparación de columnas múltiples no paramétrica en la que se utilizó InStat (InStat MAC; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA), esta diferencia fue significativa desde el punto de vista estadístico (p=0,0049). La diferencia entre el grupo de la dosis más alta y el del vehículo también fue significativa, (p=0,0286). Por ende, es posible que el aumento de glóbulos blancos en la sangre periférica y el aumento significativo en los precursores mieloides en la médula estén relacionados.
La evaluación histológica de los siguientes tejidos no mostró ningún indicio evidente de cambios citológicos o estructurales, eventos mitóticos ni necrosis: timo, hígado, riñón, glándula suprarrenal, duodeno, páncreas, yeyuno, ciego, colon, ganglios linfáticos mesentéricos, útero, ovario, glándula salival, corazón, tráquea, pulmón y cerebro. No se presentaron diferencias evidentes entre los grupos de tratamiento en el peso del timo, el riñón, el hígado o el cerebro. De todos los tejidos examinados, solo los pesos del bazo se vieron significativamente afectados.
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El peso del bazo de cada ratón se normalizó a su peso del cerebro. En el grupo de tratamiento de 50 \mug/día, en comparación con los grupos de tratamiento con vehículo de 0,1 \mug y 0,5 \mug, el promedio de los pesos del bazo fue casi un 50% mayor después de cuatro días de tratamiento y casi un 100% mayor después de ocho días, en comparación con el promedio de los pesos del bazo de los otros tres grupos. En el conjunto que recibió dosis durante cuatro días, el grupo de 5 \mug/día también tuvo una tendencia a tener bazos más grandes que los de los grupos de control y de dosis bajas. La diferencia en los pesos del bazo/cerebro con los datos de los conjuntos que recibieron dosis durante cuatro y ocho días, combinados por grupo de tratamiento, fue significativa desde el punto de vista estadístico (p = 0,0072) según la prueba de comparación de columnas múltiples, análisis ANOVA no paramétrico Kruskall-Wallace, con el programa InStat (GraphPad Software).
Se observó un aumento marginal de la hematopoyesis extramedular, especialmente en la pulpa roja, en los bazos de ratones del grupo de la dosis más alta, incluso en los ratones tratados durante cuatro días. El análisis citométrico de flujo de los bazos mostró un aumento significativo en la proporción de células de tamaño mieloide del grupo de la dosis más alta (p=0,01, prueba t de Student), lo que representa aumentos tanto en los monocitos como en los neutrófilos. Este efecto puede estar relacionado con el aumento del porcentaje de células mononucleares de sangre periférica, así como con el aumento evidente en los precursores mieloides de la médula ósea, descrito anteriormente. Además, los ratones transgénicos derivados de la inserción del gen del zalpha11 humano habían presentado un aumento de la hematopoyesis extramedular en los bazos, en comparación con las camadas no transgénicas.
Se observaron varios cambios en el grupo de dosis de 50 \mug por día, en comparación con el grupo de control, que implican al Ligando del zalpha11 en la producción o el desarrollo de células del linaje mieloide. Tomando en cuenta todo lo antedicho, los cambios observados sugirieron que el zalpha11 puede ser útil como proteína terapéutica en las especialidades médicas como el cáncer y los trastornos inmunitarios descritos en la presente.
Ejemplo 38 Estudio preliminar de eliminación y distribución tisular de la proteína del Ligando del zalpha11 humano recombinante purificado A. Resumen
A fin de dilucidar la distribución tisular y los patrones de eliminación del Ligando del rhzalpha11 purificado, se llevó a cabo un estudio farmacocinético preliminar. Se administró la proteína del Ligando del zalpha11 humano recombinante purificado marcado con ^{111}Indio (^{111}In) (NEN, Boston, MA) en ratones C57Bl/6 macho de nueve semanas a través de una de las siguientes vías. Se administró una inyección única en bolo a cada ratón, ya sea por vía intravenosa (IV), intraperitoneal (IP) o subcutánea (SC). Los ratones inyectados por vía subcutánea o intraperitoneal se sacrificaron una o tres horas después de la inyección. Los ratones inyectados por vía intravenosa se sacrificaron después de diez minutos o una hora después de la inyección. Se cosecharon la sangre, el plasma y los tejidos seleccionados en varios puntos en el tiempo y se contaron en un contador gamma para estimar la vida media y la distribución tisular aproximadas de la proteína exógena marcada. Los tejidos que se cosecharon para el recuento, así como los intervalos de sacrificio, se seleccionaron en función de los informes de la distribución de otras citocinas marcadas con radionúclidos.
Al momento del sacrificio, los tejidos cosechados para el recuento de la radiactividad incluyeron el timo, el bazo, el riñón, un lóbulo del hígado, un lóbulo del pulmón y la vejiga urinaria. En el grupo que recibió la inyección por vía intraperitoneal, también se realizó un recuento del intestino para evaluar la incidencia de la inyección en el intestino y, en los ratones que recibieron las dosis por vía subcutánea, se realizó un recuento en la piel junto con las estructuras subyacentes en el área de la inyección. El recuento por minuto (count per minute, cpm) para todo el hígado y todo el pulmón se calculó a partir del corte que se contó y del porcentaje del peso de todo el órgano representado por dicho corte.
Después de finalizado el estudio, los tejidos recolectados, la sangre entera y el plasma se contaron en el contador gamma COBRA II AUTO-GAMMA (Packard Instrument Company, Meriden, CT). También se realizó el recuento de una alícuota de la solución de dosis marcada original al finalizar el estudio con los tejidos. Esto permitió calcular la radiactividad inyectada total porcentual para cada ratón y la corrección simultánea de todos los recuentos para el decaimiento radiactivo. Las aproximaciones del volumen de sangre y los pesos de los órganos restantes indicaron que la mayor parte de los recuentos administrados pudo contabilizarse y, por lo tanto, el porcentaje de recuentos por tejido fue una representación razonable de la distribución de los recuentos posterior a la administración del Ligando del zalpha11 marcado a través de cada vía.
B. Marcación del Ligando del zalpha11 con ^{111}Indio
El Ligando del zalpha11 humano recombinante purificado (Ejemplo 29) se conjugó con un exceso molar 10 veces mayor de ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) (Peirce, Rockford, Il) mediante incubación durante 30 minutos a temperatura ambiente en PBS. El DTPA que no reaccionó y los productos de la hidrólisis se extrajeron mediante intercambio de solución amortiguadora en un Biomax-5k NMWL (Ultrafree-15, Millipore, Bedford, MA). El pico de proteína de volumen vacío se concentró a 5 mg/ml, y se extrajo una alícuota para realizar evaluaciones de bioanálisis (estimulación con anti-CD40 de células B murinas (Ejemplo 44)). Una vez confirmado que el conjugado de DTPA aún presentaba bioactividad total, se diluyó el conjugado a 0,5 mg/ml con acetato de Na 1 M pH 6,0. Se captaron dos mCi de ^{111}Indio en 0,5 ml de acetato de Na 1 M pH 6,0 y se mezclaron con el DTPA-Ligando del zalpha11 humano durante 30 min a temperatura ambiente. El ^{111}Indio no incorporado se extrajo durante el intercambio de la solución amortiguadora a PBS en una columna PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ). El material marcado radiactivamente se diluyó con el Ligando del zalpha11 humano no marcado para darle una actividad específica de 100 mCi/mg, se filtró utilizando filtros estériles y se almacenó a 4ºC, de un día para el otro. El cien por ciento de la proteína marcada se retuvo en una membrana Biomax-5k NMWL (Millipore). El ^{111}In-Ligando del zalpha11 humano marcado se administró a ratones en los estudios de eliminación y farmacocinéticos. A cada animal, se le administraron cincuenta \mug de la proteína del Ligando del zalpha11 humano marcada con 5 \muCi del Ligando del zalpha11 humano marcado en 0,1 ml de vehículo de PBS.
C. Resultados del estudio preliminar de distribución
Una y tres horas después de la administración a través de las tres vías, la concentración más alta de ^{111}In-Ligando del zalpha11 humano se encontró en el riñón, y la segunda concentración más alta se encontró en la orina y la vejiga urinaria, como lo demuestran estos tejidos que tienen el cpm más alto. El promedio de los recuentos recuperados de los riñones fue de 3 a 8 veces más alto que los recuentos de todo el hígado, según la vía de inyección y el punto en el tiempo en que se produjo el sacrificio. Por ejemplo, el promedio del cpm de riñón a los 60 minutos después de la inyección IV fue 4,5 veces mayor que el promedio de los recuentos calculados para todo el hígado del mismo grupo. En el grupo que se sacrificó diez minutos después de la administración intravenosa, el cpm más alto se presentó nuevamente en el riñón, y la segunda acumulación más alta fue equivalente en el hígado, la vejiga urinaria y la orina.
D. Estudio farmacocinético preliminar
Las recolecciones de sangre y plasma se realizaron 10, 30 y 60 minutos después de la inyección a través de las tres vías. A los dos, cinco y diez minutos después de la inyección por vía IV, se extrajeron muestras de sangre y de plasma de un conjunto separado de ratones. Se recolectaron muestras de sangre de otro conjunto de ratones que recibió sus inyecciones por vía IP o SC después de una, dos y tres horas. Para consultar los grupos de tratamiento, véase la Tabla 6. Las recolecciones realizadas en plazos breves estiman el rango de la vida media informada de la IL-2 después de una inyección intravenosa. El T1/2 informado estaba en el rango de entre 2,5 y 5,1 minutos. Como referencia sobre la administración in vivo de la IL-2, véase Donohue JH y Rosenberg SA J Immunol, 130:2203, 1983. Los puntos en el tiempo prolongados se eligieron para definir la fase de eliminación prevista.
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TABLA 6
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Se ha demostrado que la IL-2 no marcada se elimina del suero con una vida media de aproximadamente tres minutos en los ratones, después de la inyección IV. Como referencia, véase Donahue, JH y Rosenberg supra. Después de la inyección IP y SC de cantidades similares de IL-2, la duración de la persistencia de la actividad de la IL-2 en suero se prolongó desde 2 unidades/ml durante menos de 30 minutos después de la inyección IV hasta más de 2 unidades/ml durante 2 horas después de la inyección IP y 6 horas después de la inyección SC. La principal vía de depuración de la IL-2 parece ser el riñón. Se ha demostrado que el Ligando del zalpha11 es estructuralmente similar a la IL-2, como se analiza en la presente. La evaluación preliminar de la eliminación del Ligando del zalpha11 parece ser compatible con la depuración aparente de la IL-2 mediante los riñones, en función de la acumulación del cpm predominantemente en los riñones, seguido de la vejiga urinaria y la orina, en el presente estudio.
Se realizaron estimaciones a partir de los parámetros farmacocinéticos en función de los análisis no compartimentales de los datos sobre cpm obtenidos del plasma, utilizando el programa para análisis de farmacocinética WinNonLin, Versión 1.1, (Scientific Consulting Inc., Cary, NC). Las vidas medias plasmáticas del Ligando del zalpha11 se estimaron utilizando las constantes de la tasa de eliminación terminal predichas para la administración intravenosa, subcutánea e intraperitoneal de una dosis de 50 \mug. Los resultados farmacocinéticos fueron estimaciones, debido a puntos de datos limitados en la región de eliminación terminal de los perfiles de concentración plasmática en comparación con tiempo. Además, la adaptación de la fase de eliminación terminal para las dosis SC e IP requirió el uso de datos de puntos en el tiempo, en los que la absorción del ^{111}In-Ligando del zalpha11 humano aparentemente continuaba produciéndose. Sin embargo, las estimaciones de las vidas medias después de las dosis intravenosa, subcutánea e intraperitoneal fueron 13,6 min, 18,8 min y 34,3 min, respectivamente. Dado que no se evaluó un rango de dosis, no se comprobó si se produjo eliminación saturable o activa (cinética de Michaelis Menten). Por lo tanto, estos cálculos de vida media son estimaciones.
Se realizaron estimaciones de la biodisponibilidad de la proteína marcada en función del área bajo la curva (area under the curve, AUC) después de las dosis subcutánea o intraperitoneal, en comparación con la de la dosis intravenosa. La biodisponibilidad estimada después de la inyección subcutánea e intraperitoneal fue del 35,8% y 63,9% respectivamente. Dado que se estudió solo una dosis de proteína, no se evaluó la biodisponibilidad en función de la dosis. La depuración y el volumen de distribución estimados (en función de los datos de la inyección intravenosa) fueron 0,48 ml/min y 6,1 ml, respectivamente.
Aunque los datos son preliminares, el destino del Ligando del zalpha11 administrado por vía IV fue similar al que se informó para la IL-2, otra citocina con haz de 4 hélices (Donahue, JH y Rosenberg, SA supra). Al igual que la IL-2, el Ligando del zalpha11 administrado por vía IV tuvo una vida media plasmática de solo unos minutos, con depuración principal en el riñón. Tres horas después de la inyección, la mayor parte del material marcado extraído del riñón seguía retenido en una membrana Biomax 5K NMLW (Millipore). Dado que se ha informado previamente que el indio permanece asociado con la proteína, incluso durante la degradación lisosomal (Staud, F. et al., J. Pharm. Sciences 88:577-585, 1999), el Ligando del zalpha11 se acumula y puede ser degradado en el riñón. El estudio actual también mostró, como se observó con varias otras proteínas, incluida la IL-2 (Donahue, JH y Rosenberg, SA, supra), que la administración IP y SC prolongó significativamente los niveles plasmáticos del Ligando del zalpha11.
Ejemplo 39 Aislamiento y expansión de una fracción CD34+ de células mononucleares (mononuclear cells, MNC) de médula ósea humana fresca mediante el uso del Ligando del zalpha11 para la evaluación de la actividad NK A. Selección y aislamiento de células CD34+ a partir de médula ósea humana
Se prepararon células mononucleares (MNC) de médula ósea humana fresca para enriquecer las células que presentaban actividad de células NK. Las MNC humanas frescas se obtuvieron de Poeitic Technologies (Gaithersburg, MD). Se agregaron 10 ml de alfa MEM (JRH, Lenexa, KS) que contenían HIA FBS al 10% (Hyclone, Logan, UT) y el antibiótico PSN al 1% (Gibco, BRL, Grand Island, NY) a la suspensión celular, y las células se pasaron por un tamiz de 100 \mum. Las células se contaron, se sedimentaron, se lavaron con 10 ml de PBS que contenía FBS al 2%, se sedimentaron nuevamente y se resuspendieron en 1 ml de PBS que contenía FBS al 2%. Las células que tenían un marcador de superficie celular CD34 (células CD34+) se separaron magnéticamente, utilizando un equipo Detachabead con Dynabeads M-450 CD34 ((Dynal, Oslo, Noruega), según las instrucciones del fabricante. Se siguieron analizando las fracciones, tanto de las células CD34+ como de las células CD34-, como se menciona a continuación.
B. Expansión de células CD34+ utilizando el Ligando del zalpha11
Se sembró una fracción de células CD34+ en cuatro pocillos, en una placa de 24 pocillos. En cada uno de los 4 pocillos (1-4), se sembraron 50.000 células seleccionadas positivamente suspendidas en 1 ml de alfa MEM (JRH) que contenía HIA FBS al 10% (Hyclone) y PSN al 1% (Gibco/BRL), más las varias citocinas que se describen a continuación. Se utilizaron varios reactivos para analizar la expansión inducida por el Ligando del zalpha11 de los MNC de médula ósea seleccionados por CD34+: los reactivos incluyeron el flt3 humano (R&D, Minneapolis, MN); el Ligando del zalpha11 humano purificado (Ejemplo 30C y Ejemplo 30D); la IL-15 humana (R&D). Los reactivos se combinaron de la siguiente manera el día 0: en el pocillo n.º 1, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano. En el pocillo n.º 2, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 15 ng/ml de Ligando del zalpha11 humano purificado. En el pocillo n.º 3, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 20 ng/ml de IL15 humana. En el pocillo n.º 4, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano, 15 ng/ml de Ligando del zalpha11 humano purificado y 20 ng/ml de IL15 humana. Después de una incubación de 18 días, se sedimentaron las células de la suspensión de cada pocillo y, luego, se resuspendieron en 0,5 ml de alfa MEM (JRH) que contenían HIA FBS al 10% (Hyclone) y PSN al 1% (Gibco/BRL), y se realizó un recuento para evaluar la proliferación de la fracción de células CD34+. Se observó un nivel bajo de proliferación en presencia de flt3 solo (pocillo de control n.º 1), pero la presencia de IL-15 o zalpha11 además de flt3 no tuvo un efecto significativo en la expansión (pocillos n.º 2 y n.º 3). Sin embargo, la expansión que excedía el control con flt3 fue evidente en el pocillo n.º 4, que contenía IL-15 y Ligando del zalpha11 además de flt3. Este resultado sugiere que el zalpha11 y la IL-15 actúan de manera sinérgica para expandir la población de células CD34+ humanas. Además, los resultados de este experimento apoyaron los resultados observados con el Ligando del zalpha11 de ratón en la valoración de médula ósea (bone marrow, BM) de ratón (Ejemplo 21).
Todas las poblaciones de células se analizaron para determinar la actividad NK y se sometieron a un análisis citométrico de flujo, como se muestra más abajo (Ejemplo 41).
C. Expansión de células CD34+ o CD34- utilizando el Ligando del zalpha11 con adición tardía de IL-15
Las fracciones de CD34 tanto positivas como negativas (CD34-) se sembraron por separado en seis placas de 12 pocillos (1-6). Cada uno de los seis pocillos contenía 100.000 células seleccionadas positiva o negativamente en 2 ml de alfa MEM que contenían HIA FBS al 10% y PSN, descritas anteriormente. Los reactivos utilizados fueron los descritos anteriormente. En el pocillo n.º 1, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano el día 0. En el pocillo n.º 2, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano el día 0 y, después de 5 días de incubación, 20 ng/ml de IL15 humana. En el pocillo n.º 3, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 15 ng/ml de Ligando del zalpha11 humano el día 0. En el pocillo n.º 4, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 15 ng/ml de Ligando del zalpha11 humano el día 0 y, después de 5 días de incubación, se agregaron 20 ng/ml de IL15 humana. En el pocillo n.º 5, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 20 ng/ml de IL15 humana el día 0. En el pocillo n.º 6, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano, 15 ng/ml de Ligando del zalpha11 humano y 20 ng/ml de IL15 humana el día 0. Después de una incubación de un total de 15 días desde el comienzo del experimento, se cosecharon las células de cada pocillo y se contaron.
En la población CD34+, se observó un nivel bajo de proliferación en presencia de flt3 solo (pocillo de control n.º 1), pero la presencia de IL-15 o zalpha11 agregados el día 0, además de flt3, no tuvo ningún efecto significativo en la expansión (pocillos n.º 3 y n.º 5). La adición de IL-15 después de 5 días, tuvo cierto efecto proliferativo, en comparación con el control con flt3 (pocillo n.º 2, en comparación con el pocillo n.º 1), y un efecto proliferativo en presencia del zalpha11 (pocillo n.º 4, en comparación con el pocillo n.º 3). Sin embargo, la mayor expansión se hizo evidente en el pocillo n.º 6, que contenía IL-15 y Ligando del zalpha11, además de flt3, el día 0.
En la población CD34-, no se observó ninguna proliferación en presencia de flt3 solo (pocillo de control n.º 1) y, de hecho, se hizo evidente una disminución en la población de células. La presencia del zalpha11 que se agregó el día 0, además del flt3, (pocillo n.º 3) fue similar al control con flt3. La presencia de IL-15 agregada el día 5 aumentó el efecto de proliferación de las células en presencia (pocillo n.º 4) o ausencia (pocillo n.º 2) del Ligando del zalpha11. Nuevamente, la mayor expansión se hizo evidente en el pocillo n.º 6, que contenía IL-15 y Ligando del zalpha11, además de flt3, el día 0.
Todas las poblaciones de células se analizaron para determinar la actividad NK y se sometieron a un análisis FACS, como se muestra más abajo (Ejemplo 41).
Ejemplo 40 Aislamiento y expansión de células de ratón frescas mediante el uso del Ligando del zalpha11 humano y de ratón para la evaluación de la actividad NK y los marcadores de células NK A. Aislamiento y expansión de células de médula ósea de baja densidad de ratón frescas mediante el uso del Ligando del zalpha11 humano y de ratón
Se aislaron células de médula de ratón frescas; para ello, se cortaron ambos extremos de los fémures de ratón, se enjuagó el interior del hueso con dos a tres mililitros de medio de crecimiento (consultar a continuación) y se colocó el líquido de enjuague en un tubo de recolección. El medio de crecimiento consistió en 500 ml de medio RPMI 1640 (JRH Biosciences. Lenexa, KS); 5 ml 100x L-glutamina (Gibco BRL. Grand Island, NY); 5 ml 100x piruvato de Na (Gibco BRL); 5 ml 100x penicilina, estreptomicina, neomicina (PSN) (Gibco BRL); y 50 ml de suero bovino fetal inactivado por calor (FBS) (Hyclone Laboratories. Logan, UT). Las células de médula se separaron, pipeteando el medio hacia arriba y hacia abajo varias veces. Se sedimentaron las células y se lavaron una vez con medio de crecimiento, y se pasaron por un tamiz de 70 micrones. Las células mononucleares de baja densidad se aislaron sometiendo las células de médula a un gradiente de densidad. Las células de médula que se encontraban en cinco a ocho mililitros de medio de crecimiento se agregaron cuidadosamente con una pipeta y se colocaron sobre alrededor de cinco a ocho mililitros de NycoPrep 1.077 Animal (Nycomed. Oslo, Noruega) en un tubo de centrifugado. Este gradiente se centrifugó a 600 X g durante 20 minutos. Se cosecharon las células mononucleares de baja densidad de la capa de la interfaz entre el NycoPrep y el medio. Estas células se diluyeron a aproximadamente 20 mililitros en medio de crecimiento, se sedimentaron y se lavaron. Las células se sembraron en placas a razón de aproximadamente 0,5-1,5x10^{6} células por mililitro en medio de crecimiento en un matraz estándar de cultivo tisular y se incubaron a 37ºC, con 5% de CO_{2} durante dos horas.
Se cosecharon las células de médula no adherentes de baja densidad (NA LD) y se sembraron en placas a razón de 0,5-2,0x10^{5} células por mililitro en medio de crecimiento, más 2,5 nanogramos por mililitro de flt3 de ratón (R and D Systems. Minneapolis, MN), más 25 a 50 nanogramos por mililitro de Interleucina 15 humana (IL-15) (R and D Systems) con o sin 50 a 150 nanogramos por mililitro de Ligando del zalpha11 humano; o con o sin 0,12 a 10 nanogramos por mililitro del Ligando del zalpha11 de ratón.
No se produjo ninguna expansión significativa sin la adición del Ligando del zalpha11 humano o de ratón. Las células no adherentes se expandieron en los cultivos que contenían el Ligando del zalpha11 de ratón a concentraciones tan bajas como 0,12 ng/ml y, en los cultivos que contenían Ligando del zalpha11 humano, a concentraciones tan bajas como 22 ng/ml. En los cultivos que contenían tanto el Ligando del zalpha11 humano como el de ratón, la expansión de células no adherentes aumentó con el aumento de la dosis de Ligando del zalpha11, con la respuesta de saturación del ligando de ratón en alrededor de 5-10 ng/ml, mientras que el ligando humano no alcanzó una respuesta de saturación ni siquiera con la dosis más alta de 200 ng/ml. El Ligando del zalpha11 humano pareció ser aproximadamente de 20 a 100 veces menos potente en las células de ratón que el Ligando del zalpha11 de ratón. Aproximadamente cinco a diez días después de la expansión con el Ligando del zalpha11, se cosecharon las células de ratón y se analizaron mediante citometría de flujo (FACSCalibur; Becton Dickinson, Mansfield, MA) para determinar el porcentaje de células positivas para el antígeno de células NK, que fue del 46% de células positivas para el marcador DX5 de células PanNK (Pharmingen).
B. Aislamiento y expansión de células de médula de ratón sin linaje frescas
Se aislaron células de médula sin linaje de ratón frescas (lin-) a partir de células de médula de ratón frescas mediante la incubación de las células con los siguientes anticuerpos: TER119, Gr-1, B220, MAC-1, CD3e e I-Ab (Pharmingen. San Diego, CA). Las células lin+ se eliminaron con IgG antirrata de oveja Dynabeads M-450 (Dynal, Lake Success, NY) según las instrucciones del fabricante.
Las células de médula lin- seleccionadas negativamente se sembraron en placas como se describió anteriormente en medio de crecimiento, más 2,5 ng/mL de flt3 (R&D Systems) y 25 ng/mL de IL-15 (R&D Systems); o flt3, IL-15 y Ligando del zalpha11 de ratón, medio acondicionado de Ligando del zalpha11 de ratón de BHK del 2 al 5%. Después de seis días de crecimiento, se cosecharon los cultivos, se contaron y se sometieron a una valoración de la actividad de las células NK (Ejemplo 41). Las células cultivadas con el Ligando del zalpha11 de ratón fueron aproximadamente de dos a tres veces más efectivas en la lisis de las células diana de las células NK (células YAC-1) que las células cultivadas sin el Ligando del zalpha11.
C. Aislamiento y expansión de timocitos CD4- CD8- (doble negativos o DN)
Se aislaron timocitos de ratón frescos cortando y tamizando los timos de ratones de tres a ocho semanas. Las células CD4- CD8- (DN) se seleccionaron negativamente mediante la incubación de los timocitos con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 (PharMingen), se eliminaron las células CD4+ CD8+ con IgG antirrata de oveja Dynabeads M-450 (Dynal) según las instrucciones del fabricante.
Los timocitos DN de ratón se cultivaron en medio de crecimiento, más 2,5 ng/mL de flt3 (R&D Systems), 25 ng/mL de IL-15 (R&D Systems) y 10 ng/mL de IL-7 (R&D Systems), con el Ligando del zalpha11 de ratón o sin él, como se describió anteriormente. A los seis días, se cosecharon las células, se contaron y se analizaron mediante citometría de flujo según lo descrito anteriormente, y también se sometieron a una valoración de la actividad de las células NK (Ejemplo 41).
El cultivo que creció con el Ligando del zalpha11 de ratón produjo aproximadamente 480.000 células, mientras que el cultivo sin el Ligando del zalpha11 produjo solo aproximadamente 160.000 células. Se determinó que el cultivo que creció con el Ligando del zalpha11 de ratón era aproximadamente un 16,2% positivo para el antígeno de células NK PanNK, DX5 (PharMingen). El cultivo que creció sin el Ligando del zalpha11 era un 14,6% positivo para DX5. Las células cultivadas con el Ligando del zalpha11 lisaron las células diana de las células NK, YAC-1, aproximadamente el doble que las células cultivadas sin el Ligando del zalpha11. Las células expandidas no lisaron significativamente una línea celular diana de control negativa, EL4. Estos resultados sugirieron que el Ligando del zalpha11 expande selectivamente las células NK líticas.
Ejemplo 41 Actividad de células expandidas por el Ligando del zalpha11 humano y de ratón, y células NK murinas maduras en las valoraciones de citotoxicidad de las células NK A. Valoración de las células NK
Se examinó la citólisis mediada por células NK mediante una valoración de liberación de ^{51}Cr estándar. Las células diana (células K562 (ATCC N.º CCL-243) en ensayos en humanos, y las células YAC-1 (ATCC N.º TIB-160) en ensayos en ratones) carecían de expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), lo que las hacía susceptibles a la lisis mediada por células NK. Una línea celular diana de control negativo en ensayos en ratones es el timoma EL4 MHC^{+} (ATCC N.º TIB-39). Se cultivaron células K562, EL4 y YAC-1 en medio de RP10 (RPMI 1640 estándar (Gibco/BRL, Grand Island, NY) suplementado con FBS al 10% (Hyclone, Logan, UT), así como glutamina (Gibco/BRL) 4 mM, 100 I.U./ml de penicilina+100 MCG/ml de estreptomicina (Gibco/BRL), 50 \muM de \beta-mercaptoetanol (Gibco/BRL) y solución amortiguadora HEPES (Gibco/BRL) 10 mM. El día de la valoración, se cosecharon 1-2x10^{6} células diana y se resuspendieron a 2,5-5x10^{6} células/ml en medio de RP10. Se agregaron 50-100 \mul de 5 mCi/ml ^{51}Cr-cromato de sodio (NEN, Boston, MA) directamente a las células y se incubaron durante 1 hora a 37ºC, se lavaron dos veces con 12 ml de PBS y se resuspendieron en 2 ml de medio de RP10. Después de contar las células en un hemocitómetro, las células diana se diluyeron a 0,5-1x10^{5} células/ml, y se mezclaron 100 \mul (0,5-1x10^{4} células) con las células efectoras, según se describe a continuación.
En ensayos en humanos, las células efectoras se prepararon a partir de células de BM CD34^{+} humanas seleccionadas y expandidas (Ejemplo 39B) que se cosecharon, se lavaron, se contaron y se mezclaron en varias concentraciones con las células diana marcadas con ^{51}Cr en placas de 96 pocillos de fondo redondo, y se incubaron durante 4 horas a 37ºC. Después de la coincubación de las células efectoras y las células diana marcadas, se recolectó la mitad del sobrenadante de cada pocillo y se contó en un contador gamma durante 1 min/muestra. El porcentaje de liberación de ^{51}Cr específica se calculó a partir de la fórmula 100 x (X-Y)/(Z-Y), donde X representa la liberación de ^{51}Cr en presencia de células efectoras, Y representa la liberación espontánea en ausencia de efectoras, y Z es la liberación de ^{51}Cr total de las células diana incubadas con Triton X-100 al 0,5%. Los datos se esquematizaron como % de lisis específica, en comparación con la proporción efectoras a diana en cada pocillo.
B. Actividad de células expandidas por el Ligando del zalpha11 humano
Se cosecharon HPC humanas CD34^{+} aisladas cultivadas con flt3 +/- Ligando del zalpha11 y flt3 +IL-15 +/- Ligando del zalpha11 (Ejemplo 39) el día 15 para evaluar su capacidad para lisar células K562 MHC^{-} en un ensayo de liberación de ^{51}Cr estándar, según lo descrito anteriormente, y para analizar su fenotipo de superficie mediante citometría de flujo. Como se había previsto a partir de informes previos (Mrozek, E et al., Blood 87:2632-2640, 1996; y Yu, H et al., Blood 92:3647-3657, 1998), la adición simultánea de IL-15 y flt3L indujo el crecimiento de una pequeña población de células CD56^{+}. Cabe destacar que, aunque las células de BM cultivadas simultáneamente con el Ligando del zalpha11 y el flt3L no se expandieron significativamente, hubo un aumento significativo en las cantidades totales de células en los cultivos que contenían una combinación de flt3L, Ligando del zalpha11 y IL-15 (véase el
Ejemplo 39).
Para una evaluación del fenotipo de superficie de estos cultivos de BM humana, se tiñeron pequeñas alícuotas de las células para análisis citométrico de flujo de 3 colores con anticuerpos monoclonales (monoclonal antibody, mAb) anti-CD3-FITC, anti-CD56-PE y anti-CD16-CyChrome (todos de PharMingen, San Diego, CA) y se analizaron en un FACSCalibur utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Este análisis citométrico de flujo confirmó que las células que crecían de estos cultivos eran células NK diferenciadas, ya que eran grandes y granulares y expresaban tanto el CD56 como el CD16, y eran CD3^{-} (Lanier, LL Annu. Rev. Immunol. 16:359-393, 1998). Asimismo, estas células exhibieron una función efectora significativamente más alta que las células cultivadas con IL-15 y flt3. Más específicamente, las células cultivadas en las tres citocinas lisaron más del 40% de las K562 diana, en una proporción efectoras a diana (E:T) de 1,5, mientras que las células cultivadas en IL-15+flt3L lisaron menos del 5% de las dianas en una proporción E:T de 2. Estos datos demuestran que, en combinación con la IL-15, el Ligando del zalpha11 estimula la diferenciación de las células NK a partir de células de BM CD34^{+}.
C. Actividad de células expandidas por el Ligando del zalpha11 de ratón
Para evaluar los efectos del Ligando del zalpha11 en las células precursoras hematopoyéticas murinas, las células de médula ósea negativas para linaje (Lin-) purificadas provenientes de ratones C57Bl/6 se expandieron en flt3+IL-15+/- Ligando del zalpha11, como se describe en el Ejemplo 40B. El día 6 del cultivo, se cosecharon las células ("efectoras") y se contaron, se resuspendieron en 0,4 ml de medio de RP10 (Ejemplo 41A). Se diluyeron dos alícuotas (0,15 ml cada una) de cada muestra expandida con el Ligando del zalpha11 o sin él (Ejemplo 41A) en serie 3 veces por duplicado en placas de 96 pocillos de fondo redondo, para un total de 6 pocillos de 100 \mul cada uno. Los 100 \mul restantes de células se tiñeron para marcadores de superficie de células NK con mAb FITC-anti-2B4 y PE-anti-DX5 (PharMingen) y se analizaron mediante citometría de flujo. Cada grupo de células expuesto a flt3+IL-15 con la presencia del Ligando del zalpha11 o sin ella tuvieron fracciones similares de células 2B4+DX5+, que eran positivas entre un 65 y un 75% para ambos marcadores de NK.
Para la valoración de la lisis de NK, se marcaron las células diana (YAC-1 y EL4) con ^{51}Cr según lo descrito anteriormente. Después de contar las células diana en un hemocitómetro, las células diana se diluyeron a 0,5-1x10^{5} células/ml, y se mezclaron con 100 \mul de YAC-1 o EL4 (0,5-1x10^{4} células) con 100 \mul de células efectoras y se incubaron durante 4 horas a 37ºC. Se determinó la lisis específica para cada pocillo según lo descrito anteriormente.
Se determinó que las células cultivadas en presencia de flt3+IL-15+Ligando del zalpha11 exhibían un aumento de la actividad lítica (aproximadamente el doble) contra las YAC-1 diana (pero no eliminaron la línea celular de control EL4 MHC^{+}). En una proporción efectoras a diana (E:T) de 5, las células NK generadas en presencia de las 3 citocinas (Ligando del zalpha11+flt3+IL-15) lisaron el 12% de las células YAC-1, mientras que las células NK expandidas con flt3+IL-15 lisaron el 6% de las YAC-1 diana. Los experimentos posteriores confirmaron esta tendencia.
En un segundo enfoque para determinar la actividad biológica del Ligando del zalpha11 en células NK murinas, se aislaron timocitos de ratón CD4^{-}CD8^{-} ("doble negativo", DN) inmaduros, como se describe en el Ejemplo 40C, y se cultivaron con IL-15+flt3+IL-7 o IL-15+flt3+IL-2, con el Ligando del zalpha11 o sin él. El día 6 del cultivo, se cosecharon las células y se analizaron para determinar la actividad lítica NK en las células YAC-1 y EL4, según lo descrito anteriormente. Se determinó que las células cultivadas en presencia del Ligando del zalpha11 tuvieron la mayor actividad lítica en esta valoración, con una mejor actividad lítica sobre las células cultivadas en presencia de las otras citocinas. Específicamente, los timocitos DN cultivados con IL-15+flt3+IL-7 eliminaron el 18% de las células YAC-1 en una proporción E:T de 24, mientras que las células cultivadas en presencia de IL-15+flt3+IL-7 más el Ligando del zalpha11 eliminaron el 48% de las dianas en la misma proporción E:T. Los timocitos DN cultivados en IL-15+flt3+IL-2 eliminaron el 15% de las YAC-1 diana en una proporción E:T de 6, mientras que las células cultivadas con estas 3 citocinas y el Ligando del zalpha11 eliminaron el 35% de las células YAC-1 en una proporción E:T de 9. Se realizó una citometría de flujo en las células cultivadas un día antes de la valoración de la lisis de NK. Así como sucedió con los cultivos de médula ósea, a pesar del efecto proliferativo del Ligando del zalpha11 (las cantidades de células aumentaron aproximadamente el doble cuando se agregó el Ligando del zalpha11), no aumentó significativamente la fracción de células DX5^{+} (el 17-20% del total de células en los cultivos con IL-7, y el 35-46% del total en los cultivos con IL-2). Estos datos implican que el Ligando del zalpha11, en combinación con IL-15 y flt3, aumenta la actividad lítica de células NK generadas a partir de la médula ósea o el timo murinos.
D. Actividad del Ligando del zalpha11 de ratón sobre las células NK murinas maduras
A fin de evaluar los efectos del Ligando del zalpha11 de ratón sobre las células NK maduras, se aislaron los bazos de cuatro ratones C57Bl/6 de 5 semanas (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) y se aplastaron con portaobjetos de extremos esmerilados para crear una suspensión celular. Los glóbulos rojos se extrajeron mediante lisis hipotónica de la siguiente manera: se sedimentaron las células, y el sobrenadante se extrajo mediante aspiración. Se alteró el sedimento mezclándolo suavemente en vórtex, se agregaron 900 \mul de agua estéril mientras se agitaba, y se agregaron rápidamente (en menos de 5 s después) 100 \mul de 10X HBSS (Gibco/BRL). Las células se resuspendieron en 10 ml de 1X HBSS y se extrajeron los restos pasando las células por un tamiz celular recubierto con una malla de nylon (Falcon). Estas células de bazos sin glóbulos rojos (red blood cell, RBC) se sedimentaron, se resuspendieron en solución amortiguadora MACS (PBS+BSA al 1%+EDTA 2 mM) y se contaron. Se tiñeron 300x10^{6} de las células con perlas magnéticas recubiertas de anti-DX5 (Miltenyi Biotec) y células NK DX5^{+} seleccionadas positivamente a través de una columna de separación con MACS VS+, según las instrucciones del fabricante, lo que provocó la recuperación de 8,4x10^{6} células DX5^{+} y 251x10^{6} células DX5^{-}. Cada uno de estos grupos de células se cultivaron en placas de 24 pocillos (0,67x10^{6} células/pocillo, 2 pocillos por condición de tratamiento) en medio de RP10 (Ejemplo 41A) solo o con 1) 30 ng/ml de Ligando del zalpha11 de ratón, 2) 30 ng/ml de IL-2 de ratón recombinante (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN), 3) 30 ng/ml de IL-15 humana recombinante (R&D), 4) 30 ng/ml de Ligando del zalpha11 de ratón y 30 ng/ml de hIL-15, o 5) 30 ng/ml de mIL-2 y 30 ng/ml de hIL-15. Se cosecharon las células después de 21 horas, se lavaron, se resuspendieron en medio de RP10 y se contaron. Las células se analizaron para determinar su capacidad de lisar las células YAC-1 diana o EL4 marcadas con ^{51}Cr, como se describe en el Ejemplo 41A.
En general, hubo poca actividad NK en los grupos DX5^{-} (células no NK), pero las células DX5^{-} cultivadas con el Ligando del zalpha11 y la hIL-15 lisaron el 25% de las células YAC-1 diana en una proporción E:T de 82. Por comparación, las células DX5^{-} cultivadas con hIL-15 sola lisaron el 14% de las YAC-1 diana en una proporción E:T de 110. Esto sugiere que el Ligando del zalpha11 y la IL-15 están actuando juntos sobre las células residuales NK NK1.1^{+} en esta preparación de células. En cuanto a la preparación de células DX5^{+}, el tratamiento con el Ligando del zalpha11 de ratón solo no aumentó significativamente su función efectora (su lisis de células YAC-1 fue similar a la del grupo no tratado). Como se había previsto, tanto la IL-2 como la IL-15 mejoraron significativamente la actividad NK. Sin embargo, el nivel más alto de lisis se detectó en el grupo tratado con el Ligando del zalpha11 y la hIL-15 (el 65% de lisis de células YAC-1 en una proporción E:T de 3,3, en comparación con el 45% de lisis en una proporción E:T de 4 para el grupo de tratamiento con hIL-15). Tomando en cuenta todo lo antedicho, estos resultados sugirieron que, aunque el Ligando del zalpha11 solo tal vez no aumente la actividad lítica NK, sí aumenta la actividad lítica NK de las células NK maduras, cuando se administra con IL-15.
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Ejemplo 42 Proliferación del Ligando del zalpha11 de células T humanas y de ratón en una valoración de la proliferación de células T A. Proliferación del Ligando del zalpha11 murino de células T de ratón
Se aislaron células T de ratones C57Bl/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) a partir de esplenocitos y linfocitos agrupados de ganglios linfáticos (lymph node, LN) axilares, braquiales, inguinales, cervicales y mesentéricos. Los bazos se aplastaron con portaobjetos de extremos esmerilados para crear una suspensión celular. Los LN se separaron con pinzas y se pasaron través de un tamiz celular para eliminar los desechos. Los esplenocitos y las células de LN agrupados se separaron en subconjuntos CD8^{+} y CD4^{+} utilizando dos columnas de separación magnética sucesivas con MACS, según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Se recolectaron timocitos enteros de los mismos ratones.
Se cultivaron células a razón de 3x10^{5} células/pocillo (timocitos) o 10^{5} células/pocillo (células T maduras) con concentraciones crecientes del Ligando del zalpha11 murino purificado (0-30 ng/ml) (Ejemplo 24 y Ejemplo 29) en placas de 96 pocillos de fondo plano prerrecubiertas, de un día para el otro, a 4ºC, con varias concentraciones de mAb anti-CD3 2C11 (PharMingen) durante 3 días a 37ºC. El anticuerpo anti-CD3 sirvió para activar las células T murinas a través del receptor de células T. Cada pocillo se pulsó con 1 \muCi de ^{3}H-timidina el día 2, y se cosecharon las placas y se contaron a las 16 horas para evaluar la proliferación.
Cuando se evaluó el Ligando del zalpha11 en las valoraciones de la proliferación de células T, se determinó que coestimuló los timocitos murinos activados por anti-CD3, lo que provocó un crecimiento acelerado de células CD8^{+}CD4^{-} (la mayoría de los timocitos cultivados con anti-CD3+Ligando del zalpha11 eran CD8^{+}CD4^{-} al día 3 del cultivo, mientras que las células cultivadas con anti-CD3 solo no se inclinaron significativamente a este fenotipo hasta el día 5). No se observaron niveles significativos de proliferación de timocitos con el Ligando del zalpha11 en ausencia de anti-CD3.
Cabe destacar que cuando se analizaron las células T murinas periféricas maduras para evaluar su capacidad de responder al Ligando del zalpha11+anti-CD3, se determinó que solo el subconjunto CD8^{+}, pero no el subconjunto CD4^{+}, respondió de manera dependiente de la dosis al Ligando del zalpha11. También se observó una proliferación de las células CD8^{+} (pero no de las células CD4^{+}) débil, pero reproducible, en respuesta al Ligando del zalpha11 solo. Cabe destacar que esto no se observó en las células T humanas (véase el Ejemplo 42B a continuación).
B. Proliferación del Ligando del zalpha11 humano de células T humanas
Se aislaron células T CD4+ y CD8+ humanas a partir de células mononucleares de sangre periférica (peripheral blood mononuclear cell, PBMC), como se describe en el Ejemplo 43 (a continuación). Se cultivaron células a razón de alrededor de 10^{5} células/pocillo con concentraciones crecientes del Ligando del zalpha11 humano purificado (0-50 ng/ml) (Ejemplo 24) en placas de 96 pocillos de fondo plano prerrecubiertas, de un día para el otro, a 4ºC, con varias concentraciones de mAb CD3 antihumano UCHT1 (PharMingen) durante 3 días a 37ºC. Cada pocillo se pulsó con 1 \muCi de ^{3}H-timidina el día 2, y se cosecharon las placas y se contaron a las 16 horas. A diferencia de los resultados con las células T de ratón, los datos preliminares sugirieron que el Ligando del zalpha11 humano coestimula las células T humanas CD4+, pero no las CD8+, de manera dependiente de la dosis.
Ejemplo 43 La PCR en tiempo real muestra la expresión del Ligando del zalpha11 en células CD4+ humanas A. Células T humanas purificadas como Fuente primaria utilizadas para evaluar la expresión del Ligando del zalpha11 humano
Se recolectó sangre entera (150 ml) de un donante humano sano y se mezcló en una proporción 1:1 con PBS en tubos cónicos de 50 ml. A treinta ml de la sangre diluida se le agregaron 15 ml de Ficoll Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Estos gradientes se centrifugaron durante 30 min a 500 g y se permitió que se detuvieran sin utilizar el freno. Se recolectaron células sin RBC en la interfaz (PBMC) y se lavaron 3 veces con PBS. La producción de PBMC humanas aisladas fue de 200x10^{6} antes de la selección descrita a continuación.
Las PBMC se suspendieron en 1,5 ml de solución amortiguadora MACS (PBS, EDTA al 0,5%, EDTA 2 mM), y se apartaron 3x10^{6} células para el ARN de control y análisis citométrico de flujo. A continuación, se agregaron 0,25 ml de microperlas de CD8 antihumano (Miltenyi Biotec), y la mezcla se incubó durante 15 min a 4ºC. Estas células marcadas con perlas CD8 se lavaron con 30 ml de solución amortiguadora MACS y, luego, se resuspendieron en 2 ml de solución amortiguadora MACS.
Se preparó una columna VS+ (Miltenyi) según las instrucciones del fabricante. Luego, la columna VS+ se colocó en un campo magnético VarioMAC (Miltenyi). La columna se equilibró con 5 ml de solución amortiguadora MACS. Luego, se aplicaron las células de ratón primarias aisladas a la columna. Se permitió que pasaran las células CD8 negativas. La columna se enjuagó con 9 ml (3 X 3 ml) de solución amortiguadora MACS. Luego, se retiró la columna del magneto y se colocó sobre un tubo Falcon de 15 ml. Se eluyeron las células CD8+ agregando 5 ml de solución amortiguadora MACS a la columna, y las células unidas se retiraron a presión utilizando el émbolo proporcionado por el fabricante. La producción de células T periféricas humanas seleccionadas por CD8+ fue de alrededor de 51x10^{6} células en total. Se recolectaron las células CD8 negativas que pasaron, se contaron, se tiñeron con perlas recubiertas de CD4 antihumano, se incubaron y se pasaron por una columna VS+ nueva en las mismas concentraciones, según lo descrito anteriormente. La producción de células T periféricas humanas seleccionadas por CD4+ fue de 42x10^{6} células en total.
Se extrajo una muestra de las células T humanas seleccionadas por CD8+ y de las seleccionadas por CD4+ para teñirlas y clasificarlas a través de un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) para evaluar su pureza. Se utilizaron un anticuerpo (antibody, Ab) CD4 antihumano conjugado con PE, un anticuerpo CD8-FITC antihumano y un anticuerpo CD19-CyChrome antihumano (todos de PharMingen) para teñir las células seleccionadas por CD8+ y CD4+. Las células seleccionadas por CD8 en este primer experimento fueron un 80% CD8+, y las células seleccionadas por CD4 fueron un 85% CD4+. En 2 experimentos posteriores (Ejemplo 43B), las células purificadas CD8+ presentaron una pureza del 84% y del 81%, y las células CD4+ presentaron una pureza del 85% y del 97%, respectivamente. En uno de los experimentos, se tiñeron las células que no se unieron (pasaron) con perlas recubiertas de CD19 antihumano (Miltenyi) y se pasaron por una tercera columna de perlas magnéticas para aislar las células B CD19+ (estas células presentaron una pureza del 92%).
Las células humanas seleccionadas por CD8+, CD4+ y CD19+ se activaron mediante la incubación de 0,5X10^{6} células/ml en RPMI + Ultraserum humano al 5% (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) + PMA 10 ng/ml e Ionomycin (Calbiochem) 0,5 \mug/ml durante alrededor de 4, 16 ó 24 horas a 37ºC. Las células T (2,5x10^{6}/pocillo) se estimularon, como alternativa, en placas de 24 pocillos prerrecubiertas, de un día para el otro, con 0,5 \mug/ml de mAb anti-CD3 UCHT1 (PharMingen) unido a la placa, con mAb anti-CD28 (PharMingen) soluble a 5 \mug/ml o sin él. En cada punto en el tiempo, se cosecharon las células, se sedimentaron y se lavaron una vez con PBS, y se sedimentaron nuevamente. Se extrajo el sobrenadante, y los sedimentos se congelaron rápidamente en un baño de hielo seco/etanol, y se almacenaron a -80ºC para la preparación del ARN en una fecha posterior.
Se realizó PCR en tiempo real en estas células humanas seleccionadas por CD8+, CD4+ y CD19+, como se describe en el Ejemplo 43B y 43C a continuación, para evaluar la expresión del Ligando del zalpha11 humano y de su receptor.
B. Cebadores y sondas para la RT-PCR cuantitativa para la expresión del Ligando del zalpha11 humano
La RT-PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el Sistema de detección de secuencias ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) ha sido descrita anteriormente (véanse Heid, CA et al., Genome Research 6:986-994, 1996; Gibson, UEM et al., Genome Research 6: 995-1001, 1996; y Sundaresan, S et al., Endocrinology 139:4756-4764, 1998). Este método incorpora el uso de una sonda específica para un gen, que contiene colorantes tanto indicadores como inhibidores. Cuando la sonda está intacta, se niega la emisión del colorante indicador debido a la proximidad del colorante inhibidor. Durante la extensión de la PCR utilizando cebadores directos e inversos específicos para el gen adicionales, la sonda se segmenta mediante la actividad de la 5' nucleasa de la polimerasa Taq, que libera el colorante indicador, lo que provoca un aumento de la emisión fluorescente.
Los cebadores y las sondas utilizadas para los análisis de RT-PCR cuantitativa en tiempo real se diseñaron utilizando el software para diseño de cebadores Primer ExpressTM (PE Applied Biosystems). Los cebadores para el Ligando del zalpha11 humano se diseñaron abarcando una unión intrón-exón para eliminar la amplificación del ADN genómico. El cebador directo, ZC22,281 (SEC. ID. N.º 90) y el cebador inverso, ZC22,279 (SEC. ID. N.º 91) se utilizaron a 300 nM de concentración para sintetizar un producto de 80 pb. La sonda TaqMan del Ligando del zalpha11 correspondiente, ZG32 (SEC. ID. N.º 92), fue sintetizada por PE Applied Biosystems. La sonda se marcó con un colorante fluorescente indicador (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) en el extremo 5' y con un colorante fluorescente inhibidor (6-carboxi-tetrametil-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems) en el extremo 3'. A fin de evaluar la integridad o la calidad de todas las muestras de ARN, se cribaron para detectar el ARNr, utilizando el conjunto de cebador y sonda pedido a PE Applied Biosystems (cat N.º 4304483). El colorante fluorescente indicador para esta sonda es VIC (PE Applied Biosystems). Los resultados de ARNr permitirán la normalización de los resultados del Ligando del zalpha11.
Se preparó ARN a partir de los sedimentos descritos en el Ejemplo 43A, utilizando el equipo RNeasy Miniprepä (Qiagen, Valencia, CA) según las instrucciones del fabricante. Se preparó el ARN de control a partir de alrededor de 10 millones de células BHK que expresaban el Ligando del zalpha11 humano.
C. Cebadores y sondas para la RT-PCR cuantitativa para la expresión del receptor zalpha11 humano
Se realizó PCR en tiempo real para evaluar la expresión del receptor zalpha11, según el Ejemplo 43B y el Ejemplo 43D, utilizando las células preparadas en las condiciones detalladas en 43A y las sondas específicas para el receptor zalpha11. Se utilizaron el cebador directo, ZC22,277 (SEC. ID. N.º 93) y el cebador inverso, ZC22,276 (SEC. ID. N.º 94) en una reacción PCR (descrita anteriormente) a alrededor de 300 nM de concentración para sintetizar un producto de 143 pb. La sonda TaqMan® del zalpha11 correspondiente, denominada ZG31 (SEC. ID. N.º 95) fue sintetizada y marcada por PE Applied Biosystems. El ARN de las células BaF3 que expresan el receptor zalpha11 humano se utilizó para generar el control adecuado para las curvas estándar para la PCR en tiempo real descrita en el Ejemplo 43D a continuación.
D. RT-PCR cuantitativa en tiempo real
Los niveles relativos de ARN del Ligando del zalpha11 se determinaron mediante el análisis de las muestras de ARN total utilizando el método de RT-PCR One-Step (PE Applied Biosystems). El ARN de las células BHK que expresaban el Ligando del zalpha11 humano se utilizó para generar una curva estándar. La curva consistía en diluciones seriadas que variaban entre 2,5 y 2,5x10^{-4} ng para el cribaje de ARNr, y entre 25 y 0,0025 ng para el cribaje del Ligando del zalpha11 con cada punto analizado por triplicado. Las muestras de ARN total también se analizaron por triplicado para detectar los niveles de transcrito del Ligando del zalpha11 humano y los niveles de ARNr, como control endógeno. Cada reacción de RT-PCR One-step consistió en 25 ng de ARN total en solución amortiguadora A (KCl 50 mM, Tris-HCl 10 mM y el colorante estándar interno, ROX (PE Applied Biosystems)), los cebadores adecuados (50 nM para las muestras de ARNr, 300 nM para las muestras de Ligando del zalpha11) y la sonda (50 nM para el ARNr, 100 nM para el Ligando del zalpha11), MgCl_{2} 5,5 mM, 300 \muM cada uno de d-CTP, d-ATP y d-GTP, y 600 \muM de d-UTP, transcriptasa inversa (0,25 U/\mul), ADN polimerasa AmpliTaq (0,025 U/\mul) e inhibidor RNasa (0,4 U/\mul) en un volumen total de 25 \mul. Las condiciones de ciclado térmico consistieron en un paso inicial con RT a 48ºC durante 30 minutos, un paso de activación con AmpliTaq Gold a 95ºC durante 10 minutos, seguido de 40 ciclos de amplificación durante 15 segundos a 95ºC y 1 minuto a 60ºC. Los niveles relativos de ARN del Ligando del zalpha11 se determinaron mediante el Método de curva estándar, como se describe en el Boletín para el usuario n.º 2 (PE Biosystems; User Bulletin n.º 2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, 11 de diciembre de 1997), utilizando las mediciones de ARNr para normalizar los niveles de Ligando del zalpha11. Las muestras se compararon en relación con el calibrador dentro de cada experimento. El calibrador se eligió en forma arbitraria en función del ARN de buena calidad y de un nivel de expresión con el que otras muestras se podían comparar significativamente. Los resultados de los experimentos que analizaron la expresión del Ligando del zalpha11 y del receptor zalpha en células estimuladas y no estimuladas (Ejemplo 43A) son los descritos en el Ejemplo 43E a continuación.
E. Expresión del receptor zalpha11 humano y su Ligando en células CD4+, CD8+ y CD19+
En el primer experimento, se utilizó el método RT-PCR, descrito anteriormente, para evaluar la expresión del receptor zalpha11 en muestras CD4+ y CD8+ no estimuladas y estimuladas con anti-CD3 en los puntos en el tiempo 0 h (células no estimuladas ("en reposo")), y 4 h, 15,5 h y 24 h después de la estimulación. La muestra CD4+ en reposo se eligió en forma arbitraria como calibrador y se le asignó un valor de 1,00. Hubo un aumento de aproximadamente 4 veces en la expresión del receptor en las células CD4+ no estimuladas, desde las 4 h hasta las 24 h de cultivo, y un aumento de alrededor de 8 veces en el mismo período en las células CD4+ estimuladas con anti-CD3. Las células CD8+ mostraron un aumento de 7 veces en la expresión del receptor zalpha11, que tuvo su pico a las 4 h y disminuyó a medida que transcurría el tiempo. Con la estimulación con anti-CD3, las células CD8+ presentaron un aumento constante de 8 veces en la expresión del receptor.
Este primer experimento también utilizó el método RT-PCR para evaluar la expresión del Ligando del zalpha11 en las mismas muestras CD4+ y CD8+ estimuladas con anti-CD3 y no estimuladas. La muestra CD8+ estimulada con anti-CD3 de 4 h se eligió en forma arbitraria como calibrador y se le asignó un valor de 1,00. Los resultados mostraron que las células CD4+ y CD8+ no estimuladas no expresan el Ligando del zalpha11. Se observó una elevación significativa de la expresión en las células CD4+ estimuladas con anti-CD3 a las 4 h, con un aumento de alrededor de 300 veces en la señal observada a las 15,5 h. Las células CD8+ expresaron una pequeña cantidad del ligando al recibir la estimulación con anti-CD3; sin embargo, esto se debe probablemente a la contaminación de la población CD8+ con una pequeña cantidad de células CD4+.
En el segundo experimento, se utilizó el método RT-PCR para evaluar la expresión del receptor zalpha11 en las muestras CD4+ y CD8+ estimuladas con anti-CD3, estimuladas con PMA + Ionomycin y no estimuladas, en los puntos en el tiempo 0 h, y 3,5 h, 16 h y 24 h después de la activación. La muestra CD8+ en reposo se eligió en forma arbitraria como calibrador y se le asignó un valor de 1,00. Las células CD4+ y CD8+ en reposo no presentaron cantidades significativas de la expresión del receptor. La expresión fue alrededor de 3 veces mayor en las muestras CD4+ estimuladas con PMA + Ionomycin a las 3,5 h, 16 h y 24 h después de la estimulación. La expresión en las células CD4+ activadas con anti-CD3 tuvieron su pico a un nivel 10 veces mayor que los niveles de fondo, a las 3,5 h después de la estimulación; luego, cayeron nuevamente a niveles 4 veces mayores que los de fondo, a las 16 h después de la estimulación. Las células CD8+ mostraron un aumento de 4 veces en la expresión a las 3,5 h después de la estimulación con PMA + Ionomycin, y la expresión disminuyó en los puntos en el tiempo posteriores. Como sucedió en el primer experimento, las células CD8+ estimuladas con anti-CD3 exhibieron nuevamente una inducción de la expresión del receptor 8 veces mayor que la de fondo.
Estas muestras del segundo experimento también se utilizaron para evaluar la expresión del Ligando del zalpha11. La muestra CD4+ estimulada con anti-PMA + Ionomycin de 24 h se eligió en forma arbitraria como calibrador y se le asignó un valor de 1,00. Los resultados mostraron nuevamente que ninguna de las células no estimuladas expresaba el Ligando del zalpha11. Hubo una inducción de la expresión del ligando alrededor de 30 veces mayor en las células CD4+ estimuladas con anti-CD3 a las 3,5 h, como se había observado en el experimento anterior (a las 4 h). Sin embargo, hubo una inducción solo 5 veces mayor con la estimulación con PMA + Ionomycin a las 3,5 h, que disminuyó en los puntos en el tiempo posteriores. Nuevamente, las células CD8+ expresaron una muy pequeña cantidad del Ligando, que probablemente se deba a la contaminación con células CD4+.
En el experimento final, se utilizó el método RT-PCR para evaluar la expresión del receptor zalpha11 en las muestras CD4+ y CD8+ estimuladas con anti-CD3- y anti-CD3/anti-CD28 y no estimuladas, en los puntos en el tiempo 0 h, y 2 h, 4 h y 16 h después de la estimulación. Las células CD19+ activadas con PMA + Ionomycin también se cribaron para detectar la expresión del receptor en los mismos intervalos de tiempo. La muestra CD4+ en reposo se eligió en forma arbitraria como calibrador y se le asignó un valor de 1,00. Las células CD4+ estimuladas con anti-CD3 de 2 h tuvieron una inducción del receptor solo 4 veces mayor, en comparación con la inducción 10 veces mayor observada a las 3,5 h en el experimento previo. La combinación de anti-CD3 y anti-CD28 aumentó la expresión del receptor zalpha11 a 8 veces más que los niveles de fondo. Las células CD8+ estimuladas con anti-CD3/anti-CD28 de 16 h tuvieron niveles muy bajos de expresión del receptor zalpha11, como se observó en las células CD8+ en los experimentos previos (descritos anteriormente). Las células CD19+ estimuladas con PMA + Ionomycin tuvieron la expresión del receptor zalpha11 más significativa, con un aumento de 19 veces a las 2 h, pero los niveles de expresión disminuyeron nuevamente a los niveles de las células en reposo a las 16 h.
Estas muestras del experimento final también se utilizaron para evaluar el Ligando del zalpha11 mediante RT-PCR. La muestra CD8+ estimulada con anti-CD3/anti-CD28 de 16 h se eligió en forma arbitraria como calibrador y se le asignó un valor de 1,00. Los resultados mostraron que las células CD4+ de 2 h tuvieron una inducción de la expresión del Ligando del zalpha11 dos veces mayor con la estimulación con anti-CD3 y una inducción 5 veces mayor con la estimulación con anti-CD3 más anti-CD28. Estas condiciones de estimulación indujeron la expresión del Ligando con el tiempo, y las células CD4+ estimuladas de 16 h exhibieron niveles de expresión 70 veces mayores que los de fondo. Las células CD8+ y CD19+ no mostraron la expresión del Ligando del zalpha11.
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Se previó una cierta cantidad de variación entre las extracciones de sangre (es decir, muestras múltiples en diferentes momentos del mismo paciente y entre múltiples pacientes). Por lo tanto, se analizaron las tendencias de los datos dentro de cada estudio o de una única muestra de sangre, y se compararon los tres experimentos mencionados para obtener una conclusión general. La tendencia de los experimentos de PCR en tiempo real descritos anteriormente es que, de todos los tipos celulares evaluados, las células B CD19+ activadas con PMA + ionomicina expresaron los niveles más altos de ARN del receptor zalpha11. Las células CD4+ y CD8+ también pueden ser estimuladas para que expresen el receptor, pero a niveles más bajos que en las células B. El Ligando del zalpha11 se expresó casi exclusivamente en las células T CD4+ estimuladas (y no en las células T CD8+ ni células B CD19+). Aunque la estimulación con PMA + Ionomycin indujo una buena señal del Ligando del zalpha11 en esta valoración, se obtuvo una señal significativamente más alta de las células T CD4+ estimuladas con el mAb anti-CD3 o con una combinación de los mAb anti-CD3 y anti-CD28, condiciones que imitan mejor un encuentro de antígenos in vivo.
Ejemplo 44 Proliferación dependiente del Ligando del zalpha11 de células B estimuladas con anti-CD40 o anti-IgM A. Purificación de células B humanas
Un vial que contenía 1 x 10^{8} células mononucleares de sangre periférica humanas (PBMC) congeladas y recolectadas por aféresis se descongeló a baño María a 37ºC, y las células se resuspendieron en 25 ml de medio de células B (medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS), suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, L-glutamina al 5%, Pen/Strep al 5%) (Gibco BRL)) en un tubo de 50 ml (Falcon VWR, Seattle, WA). Se evaluó la viabilidad de las células utilizando azul de tripán (Gibco BRL). Se dispuso una capa de diez mililitros de Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) bajo la suspensión celular, se centrifugó durante 30 minutos a 1.800 rpm y se permitió que se detuviera sin el freno. Se extrajo la interfaz y se la transfirió a un tubo Falcon de 50 ml fresco, se completó hasta alcanzar un volumen final de 40 ml con PBS y se centrifugó durante 10 minutos a 1.200 rpm con el freno. Se evaluó nuevamente la viabilidad de las células aisladas utilizando azul de tripán. Como alternativa, se diluyó sangre humana extraída fresca en una proporción 1:1 con PBS (Gibco BRL) y se dispuso sobre Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia), se centrifugó y se lavó como se describió anteriormente. Las células aisladas de las fuentes frescas o congeladas arrojaron resultados equivalentes.
Las células B se purificaron de las células de sangre periférica de donantes humanos normales que flotaban en Ficoll (descritas anteriormente) con perlas magnéticas de anti-CD19 (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), según las instrucciones del fabricante. La pureza de las preparaciones resultantes se monitoreó mediante análisis citométrico de flujo con Ab anti-CD22 FITC (Pharmingen, San Diego, CA). Las preparaciones de células B tuvieron habitualmente una pureza >90%.
B. Purificación de células B murinas
Se preparó una suspensión de esplenocitos murinos mediante la separación de bazos de ratón C57Bl/6 adulto (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) con agujas curvadas en medio de células B. Los RBC se extrajeron mediante lisis hipotónica. Las células CD43 positivas se extrajeron con perlas magnéticas de CD43 (Miltenyi Biotec), según las instrucciones del fabricante. La pureza de las preparaciones resultantes se monitoreó mediante análisis citométrico de flujo con Ab anti-CD45R FITC (Pharmingen). Las preparaciones de células B tuvieron habitualmente una pureza >90%.
C. Proliferación de células B estimuladas con anti-CD40 en presencia del Ligando del zalpha11 humano o murino
Las células B de origen humano o de ratón se resuspendieron a una concentración final de 1 x 10^{6} células/ml en medio de células B y se sembraron en placas a razón de 100 \mul/pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo en U (Falcon, VWR) que contenía varias condiciones de estimulación para obtener un volumen final de 200 \mul/pocillo. Para la estimulación con anti-CD40, los cultivos humanos se suplementaron con 1 \mug/ml de CD40 antihumano (Genzyme, Cambridge, MA) y los cultivos de ratón se suplementaron con 1 \mug/ml de anti-CD40 murinos (Serotec, Reino Unido). Se agregó el Ligando del zalpha11 humano o murino a diluciones que variaban entre 1 pg/ml y 100 ng/ml. La especificidad del efecto del Ligando del zalpha11 se confirmó mediante la inhibición del Ligando del zalpha11 con 25 mg/ml de zalpha11CEE humano soluble (Ejemplo 10A). Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. Las células se incubaron a 37ºC en una incubadora humidificada durante 120 horas (humanas) o 72 horas (de ratón). Dieciséis horas antes de la cosecha, se agregó 1 \muCi de ^{3}H-timidina (Amersham, Piscataway, NJ) a todos los pocillos para evaluar si las células B habían proliferado. Se cosecharon las células en una placa de 96 pocillos con filtro (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT) utilizando una cosechadora celular (Packard) y se recolectaron según las instrucciones del fabricante. Las placas se secaron a 55ºC durante 20-30 minutos y el fondo de los pocillos se selló con un sellador de placas opaco. En cada pocillo, se agregaron 0,25 ml de líquido de centelleo (Microscint-O, Packard) y la placa se leyó utilizando un contador de centelleo para microplacas TopCount (Packard).
La incubación con Ligando del zalpha11 a concentraciones de 3 ng/ml o mayores aumentó hasta 30 veces la proliferación inducida por anti-CD40 soluble de una manera dependiente de la dosis en las células B murinas y humanas. Las células B murinas y humanas respondieron de la misma manera también a su respectivo Ligando del zalpha11. En ambas especies, la estimulación fue específica para el Ligando del zalpha11, ya que fue revertida por la presencia del receptor zalpha11 soluble en el cultivo.
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D. Proliferación de células B estimuladas con anti-IgM en presencia del Ligando del zalpha11 humano o murino
Las células B de origen humano o de ratón descritas anteriormente (Ejemplo 44A y Ejemplo 44B) se sembraron según lo descrito anteriormente (Ejemplo 44C). Para la estimulación con anti-IgM de células humanas, las placas se prerrecubrieron, de un día para el otro, con 10 mg/ml de Ab IgM antihumano F(ab')_{2} (Southern Biotech Associates, Birmingham, Alabama) y se lavaron con medio estéril inmediatamente antes de su uso. Los cultivos se suplementaron con 0-10 ng/ml de hu rIL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Para la estimulación con anti-IgM de células murinas, se agregó anti-IgM soluble (Biosource, Camarillo, CA) a los cultivos a razón de 10 mg/ml. A cada una de las condiciones anti-IgM/IL-4 precedentes, se agregó el Ligando del zalpha11 humano o murino a diluciones que variaban entre 1 pg/ml y 100 ng/ml, según lo descrito anteriormente. La especificidad del efecto del Ligando del zalpha11 se confirmó mediante inhibición con el receptor zalpha11 humano soluble, según lo descrito anteriormente (Ejemplo 44C). Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. Las células se incubaron, se marcaron con ^{3}H-timidina, se cosecharon y se analizaron como se describe en el Ejemplo 44C.
La incubación con Ligando del zalpha11 a concentraciones de 0,3 ng/ml o mayores inhibió la proliferación inducida por anti-IgM insoluble (de ratón) o anti-IgM e IL-4 (humano) de manera dependiente de la dosis. Esta inhibición fue específica para el Ligando del zalpha11, ya que fue revertida por la presencia del receptor zalpha11 soluble en el cultivo.
Ejemplo 45 Expresión del receptor soluble zalpha11 humano en E. coli A. Construcción del vector de expresión pCZR225 que expresa el polipéptido de fusión huzalpha11/MBP-6H
Mediante recombinación homóloga, se construyó un plásmido de expresión que contenía un polinucleótido que codifica un receptor soluble zalpha11 humano fusionado en el C terminal con la proteína de unión a maltosa (MBP). Se aisló un fragmento del ADNc del zalpha11 humano (SEC. ID. N.º 7) mediante PCR. La secuencia del polinucleótido para el polipéptido de fusión MBP-receptor soluble zalpha11 se muestra en la SEC. ID. N.º 96. Se utilizaron dos cebadores en la producción del fragmento de zalpha11 humano en una reacción PCR: (1) el cebador ZC20,187 (SEC. ID. N.º 98), que contiene 40 pb de la secuencia flanqueante del vector y 25 pb correspondientes al amino terminal del zalpha11 humano, y (2) el cebador ZC20,185 (SEC. ID. N.º 99), que contiene 40 pb del extremo 3' correspondientes a la secuencia flanqueante del vector y 25 pb correspondientes al carboxilo terminal del zalpha11 humano. Las condiciones de la reacción PCR fueron las siguientes: 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos, 50ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minuto; seguidos de un remojo de 4ºC, realizado por duplicado. Se pasaron dos \mul de los 100 \mul de la reacción PCR por un gel de agarosa al 1,0% con 1 x solución amortiguadora TBE para su análisis, y se observó el fragmento previsto de aproximadamente 660 pb. Los restantes 90 \mul de la reacción PCR se combinaron con el segundo tubo de PCR precipitado con 400 \mul de etanol absoluto. El ADN precipitado se utilizó para la recombinación con el vector receptor pTAP98 cortado con Sma1 (Ejemplo 31) para producir el constructo que codifica la fusión MBP-zalpha11. Los clones se transformaron, se identificaron y se cultivaron, como se describe en el Ejemplo 31. Los clones positivos se denominaron pCZR225y se sometieron a un análisis de secuencia. La secuencia del polinucleótido para el polipéptido de fusión MBP-receptor soluble zalpha11 se muestra en la SEC. ID. N.º 96, y la secuencia del polipéptido correspondiente se muestra en la SEC. ID. N.º 97. Los clones positivos se utilizaron para ser cultivados en E. coli, como se describe en el Ejemplo 31, para la purificación de la proteína de fusión huzalpha11/MBP-6H (Ejemplo 46, a continuación).
Ejemplo 46 Purificación del receptor soluble huzalpha11/MBP-6H a partir de la fermentación de E. coli
A menos que se indique lo contrario, todas las operaciones se llevaron a cabo a 4ºC. El siguiente procedimiento se utilizó para purificar el polipéptido del receptor soluble huzalpha11/MBP-6H. Las células de E. coli que contenían el constructo pCZR225 y que expresaban receptor soluble huzalpha11/MBP-6H (Ejemplo 45) se cultivaron en SuperBroth II (caseína 12 g/L, extracto de levadura 24 g/L, fosfato dipotásico 11,4 g/L, fosfato monopotásico 1,7 g/L; Becton Dickinson, Cockeysville, MD), y se congelaron en glicerol al 0,5%. Se utilizaron veinte gramos de las células congeladas en SuperBroth II + glicerol para purificar la proteína. Se descongelaron las células congeladas y se diluyeron en una proporción 1:10 en una solución de inhibidores de la proteasa (solución amortiguadora de extracción) antes de la lisis de las células y de la liberación de la proteína del receptor soluble huzalpha11/MBP-6H. Las células diluidas contenían las concentraciones finales de TRIS (JT Baker, Philipsburg, NJ) 20 mM, cloruro de sodio (NaCl, Mallinkrodt, París, KY) 100 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 0,5 mM, leupeptina (Fluka, Suiza) 2 \mug/ml, y aprotinina (Sigma) 2 \mug/ml. Se utilizó un sistema de degradación celular French Press (Constant Systems Ltd., Warwick, Reino Unido) con una temperatura de entre -7 y -10C y 30K PSI para lisar las células. Se controló la degradación de las células diluidas mediante lecturas A_{600} antes del French Press y después de él. Las células lisadas se centrifugaron a 18.000 G durante 45 minutos para eliminar los desechos de células degradadas, y el sobrenadante se utilizó para purificar la proteína. Las concentraciones totales de proteína diana del sobrenadante se determinaron a través de una valoración de proteínas con BCA (Pierce, Rockford, IL), según las instrucciones del fabricante.
Se vertió una columna de 25 ml de resina de afinidad con metales Talon (Clontech, Palo Alto, CA) (preparada según se describe a continuación) en una columna de vidrio de 2,5 cm D x 10 cm H Bio-Rad. La columna se envasó y se equilibró por gravedad con 10 volúmenes de columna (CV) de solución amortiguadora de equilibrio Talon (TRIS 20 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0). El sobrenadante se cargó por lotes a la resina de afinidad con metales Talon y se meció de un día para el otro. La resina se volvió a verter en la columna y se lavó con 10 CV de solución amortiguadora de equilibrio Talon por gravedad, se eluyó por gravedad con 140 ml de solución amortiguadora de elusión (solución amortiguadora de equilibrio Talon + 200 mM imidazol-Fluka Chemical). La columna Talon se limpió con 5 CV de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico 20 mM pH 5,0 (MES, Sigma), 5 CV de H_{2}O destilada, se almacenó en etanol al 20%/azida sódica al 0,1%. Se recolectaron fracciones de catorce ml durante toda la cromatografía de elusión, y las fracciones se leyeron con absorbancia a 280 y 320 nM y con valoración de proteínas con BCA; también se guardaron y se analizaron los agrupamientos de fluidos de pasaje y lavado. Se agruparon las fracciones de elusión de la proteína de interés y se cargaron directamente en la resina de amilosa (New England Biolabs, Beverly, MA).
Para obtener un polipéptido huzalpha11/MBP-6H más puro, las fracciones agrupadas de la elusión de afinidad Talon se sometieron a resina de amilosa (22 ml) a pH 7,4. Se vertió una columna de 2,5 cm D x 10 cm H Bio-Rad, se envasó y se equilibró en 10 CV de solución amortiguadora de equilibrio de amilosa-TRIS (JT Baker) 20 mM, NaCl (Mallinkrodt) 100 mM, PMSF (Sigma) 1 mM, beta-mercaptoetanol (BME, ICN Biomedicals Inc., Aurora, OH) 10 mM pH 7,4. La muestra se cargó por gravedad con un caudal de 0,5 ml/min. Se lavó la columna por 10 CV con solución amortiguadora de equilibrio de amilosa, y se eluyó con alrededor de 2 CV de solución amortiguadora de equilibrio de amilosa + maltosa (Fluka Biochemical, Suiza) 10 mM por gravedad. Se recolectaron fracciones de 5 ml durante toda la cromatografía, y se leyó la absorbancia a 280 y 320 nM. La columna de amilosa se regeneró con 1 CV de H_{2}O destilada, 5 CV de SDS al 0,1% (peso/vol.) (Sigma), 5 CV de H_{2}O destilada y, luego, 5 CV de solución amortiguadora de equilibrio de amilosa.
Se agruparon las fracciones de interés y se dializaron en un Slide-A-Lyzer (Pierce) con 4 x 4 L de PBS pH 7,4 (Sigma) para eliminar los contaminantes de bajo peso molecular, se intercambió la solución amortiguadora y se desalinizaron. Después de los cambios de PBS, el material cosechado representó el polipéptido huzalpha11/MBP-6H purificado. El polipéptido huzalpha11/MBP-6H purificado se analizó a través de la tinción SDS-PAGE Coomassie y el análisis Western blot con el anticuerpo conjugado HRP anticonejo (Rockland, Gilbertsville, PA). La concentración del polipéptido huzalpha11/MBP-6H fue de 1,92 mg/ml, como se determinó mediante análisis con BCA.
Se preparó el polipéptido huzalpha11/MBP-6H purificado para la inyección en conejos y se envió a R & R Research and Development (Stanwood, WA) para la producción de anticuerpos. Se inyectaron los conejos para que produzcan suero contra el anti-huzalpha11/MBP-6H (Ejemplo 47 a continuación).
Ejemplo 47 Anticuerpos policlonales del receptor zalpha11
Se prepararon anticuerpos policlonales mediante la inmunización de dos conejos blancos de Nueva Zelanda hembra con el polipéptido huzalpha11/MBP-6H purificado (Ejemplo 46), o el receptor soluble zalpha11CEE recombinante purificado (Ejemplo 10A). Los anticuerpos policlonales correspondientes se denominaron anti-huzalpha11 de conejo/MBP-6H y anti-huzalpha11 de conejo-CEE-BHK, respectivamente. Cada uno de los conejos recibió una inyección intraperitoneal (IP) inicial de 200 mg de proteína purificada en Adyuvante completo de Freund (Pierce, Rockford, IL), seguida de inyecciones IP de refuerzo de 100 mg de proteína purificada en Adyuvante incompleto de Freund, cada tres semanas. De siete a diez días después de la administración de la tercera inyección de refuerzo, se sangraron los animales y se recolectó el suero. Los conejos recibieron un refuerzo y se sangraron cada tres semanas.
Los anticuerpos policlonales específicos para el zalpha11 se purificaron por afinidad a partir de suero de conejo, utilizando una columna de proteína CNBr-SEFAROSA 4B (Pharmacia LKB) que se preparó con 10 mg de polipéptido huzalpha11/MBP-6H purificado (Ejemplo 32) por gramo de CNBr-SEFAROSA, seguido de 20X diálisis en PBS, de un día para el otro. Los anticuerpos específicos para el zalpha11 se caracterizaron mediante la verificación de la titulación por ELISA con 1 mg/ml del antígeno adecuado para la proteína como objetivo del anticuerpo. El límite inferior de detección (LLD) del anticuerpo purificado por afinidad anti-huzalpha11 de conejo/MBP-6H es una dilución de 500 pg/ml. El LLD del anticuerpo purificado por afinidad anti-huzalpha11 de conejo-CEE-BHK es una dilución de 50 pg/ml.
Ejemplo 48 Distribución del receptor zalpha11
Para evaluar la distribución del receptor zalpha11 en varios tipos celulares, se generaron anticuerpos policlonales de conejo y anticuerpos monoclonales (mAb) de ratón dirigidos contra el receptor humano (Ejemplo 35 y Ejemplo 47) y se conjugaron estos anticuerpos con biotina para su uso en la citometría de flujo. Inicialmente, se utilizaron los anticuerpos policlonales, que eran de afinidad relativamente baja, para teñir un panel de líneas celulares: células BaF3 genéticamente intactas de la línea celular pre-B murina dependiente de la IL-3 (Palacios y Steinmetz, ibid.; Mathey-Prevot et al., ibid.); células BaF3 transfectadas con el zalpha11 humano (Ejemplo 4); líneas celulares del linfoma de Burkitt humanas Raji (ATCC N.º CCL-86), Ramos (ATCC N.º CRL-1596), RPMI 8226 (ATCC N.º CCL-155) y Daudi (ATCC N.º CCL-213); línea celular de leucemia de células T humanas Jurkat (ATCC N.º TIB-152); líneas celulares de leucemia mielomonocítica humanas Thp-1 (ATCC N.º TIB-202) y UT937 (ATCC N.º CRL-1593.2); células promielomonocíticas humanas HLT60 (ATCC N.º CCL-240); línea celular de linfoma de células B murinas A20 (ATCC No TIB-208); y línea celular de timoma humana EL4 (ATCC N.º TIB-39).
Se cosecharon las células, se lavaron una vez con solución amortiguadora de lavado con suero (wash buffer with serum, WBS) FACS. La WBS consistió en solución salina balanceada de Hank (Gibco/BRL) + HEPES (Gibco/BRL) 10 mM + BSA al 1% (Sigma) + suero de cabra normal al 10% (Gemini Bioproducts, Woodland, CA) + suero de conejo normal al 10% (Sigma). La solución amortiguadora de lavado (wash buffer, WB) fue idéntica a la WBS, salvo que no contenía suero. Después del lavado, las células se resuspendieron en 100 \mul de WB que contenía 10 \mug/ml de anticuerpos policlonales anti-zalpha11 de conejo (Ejemplo 47). Las células se mantuvieron en hielo con Ab durante 20 min, se lavaron con WB y se resuspendieron en WB que contenía FITC anticonejo de cabra (BioSource, International), se incubaron durante otros 20 min en hielo, se lavaron y se resuspendieron en 400 \mul de WB para análisis en un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson). Las muestras de control se tiñeron con el Ab FITC anticonejo de cabra secundario únicamente. La tinción positiva se definió como un cambio por encima de la tinción con el anticuerpo secundario solo. Aunque los anticuerpos policlonales eran de baja afinidad, se detectó con seguridad la expresión del zalpha11 en el transfectante de BaF3/zalpha11, en los cuatro linfomas de Burkitt humanos (Raji, Ramos, Daudi y RPMI 8226) y en células T Jurkat. Las células HL-60 en reposo (no diferenciadas) no se unieron a los anticuerpos anti-zalpha11, pero se detectó una señal positiva en las células HL-60 activadas durante 24 horas con PMA (Calbiochem, La Jolla, CA), que induce la diferenciación de las células HL-60 en una célula de tipo monocito. También se observó una señal positiva en las células UT937 y Thp-1, aunque es posible que esta señal se haya debido a uniones no específicas. Los anticuerpos policlonales presentaron una débil reacción cruzada en la línea de células B de ratón A20, pero no se observó tinción del timoma murino EL4.
Los cuatro anticuerpos monoclonales anti-zalpha11 (Ejemplo 35) se conjugaron con biotina, y un subconjunto de las células descritas anteriormente se cribó para detectar la expresión del receptor zalpha11 (BaF3, BaF3/zalpha11, Raji, Jurkat y HL-60 en reposo). Se cosecharon las células, se lavaron, se resuspendieron en 100 \mul de WB que contenían 15 \mug/ml de cada uno de los 4 mAb biotinilados. Las células se incubaron con mAb durante 20 min en hielo, se lavaron con 1,5 ml de WB y se sedimentaron en una centrífuga. El sobrenadante se extrajo mediante aspiración y los sedimentos se resuspendieron en 100 \mul de estreptavidina conjugadas con CyChrome (CyC-SA; PharMingen), se incubaron en hielo durante otros 20 min, y se lavaron y se sedimentaron como se describió anteriormente. Los tubos de control contenían células teñidas solo con CyC-SA. Los sedimentos se resuspendieron en 400 \mul de WB, y la citometría de flujo se realizó como se describió anteriormente. La tinción positiva se definió como una señal que excede el nivel de fondo de tinción con CyC-SA solo. Al utilizar el transfectante de BaF3/zalpha11 como control, se logró calificar los 4 mAb en cuanto a sus respectivas intensidades de fluorescencia media (mean fluorescence intensity, MFI), que puede reflejar la afinidad del anticuerpo y/o el grado de biotinilación de los mAb. Los mAb se calificaron de la siguiente manera, desde la MFI más alta hasta la más baja: 249.28.2.1.2.2, 247.10.2.15.4.6, 249.19.2.2.3.5 y 249.15.2.4.2.7. Las células Raji tuvieron resultado positivo en la tinción con los anticuerpos monoclonales contra el zalpha11. Las células Jurkat tuvieron resultado positivo en la tinción con los anticuerpos monoclonales contra el zalpha11, pero la tinción no fue tan fuerte como en las células B (Raji). Por ende, el receptor zalpha11 se expresó en estas líneas de células B y T. Los patrones de tinción en las células HL60 no activadas fueron idénticos para todos los mAb, y la señal fue muy débil. Se considera que esta señal no refleja una expresión real del zalpha11 por parte de las células HL-60, sino que es posible que la señal se deba a las uniones no específicas de los mAb de ratón a las células humanas, probablemente a través de los receptores Fc.
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Ejemplo 49 Efecto del Ligando del zalpha11 humano en las células B y fusión del Ligando del zalpha11 con la saporina tóxica
Se evaluaron los efectos del Ligando del zalpha11 humano en las siguientes líneas de células B humanas: líneas celulares del linfoma de Burkitt humanas Raji (ATCC N.º CCL-86) y Ramos (ATCC N.º CRL-1596); línea celular de linfoma de células B del EBV humanas RPMI 1788 (ATCC N.º CRL-156); línea celular de mieloma/plasmacitoma humana IM-9 (ATCC N.º CRL159); y línea de células B transformadas por el EBV humanas DAKIKI (ATCC N.º TIB-206), y células HS Sultan (ATCC N.º CRL-1484). Después de alrededor de 2-5 días de tratamiento con el Ligando del zalpha11, se encontraron cambios en la expresión del marcador de superficie en las líneas celulares IM-9, Raji, Ramos y RPMI1788, lo que demuestra que estas células pueden responder al Ligando del zalpha11. Las líneas de células B humanas tratadas con el Ligando del zalpha11 crecieron mucho más lentamente que las células no tratadas cuando se volvieron a sembrar en placas de cultivo celular. Estas células también presentaron un aumento en la expresión del ligando FAS, como se evaluó mediante la citometría de flujo (Ejemplo 49D y Ejemplo 49E), y un aumento moderado en la sensibilidad a un anticuerpo FAS de activación (Ejemplo 49A). Estos resultados indican que el Ligando del zalpha11 pudo controlar algunos tipos de neoplasias de células B al inducirlas a diferenciarse en un estado menos proliferativo y/o más sensitivo al ligando FAS. Además, el receptor zalpha11 se expresa en la superficie de varias de estas líneas celulares (véase el Ejemplo 48). Por ende, el Ligando del zalpha11 y el conjugado de la inmunotoxina Ligando del zalpha11 humano-saporina (Ejemplo 49B a continuación) u otra fusión Ligando del zalpha11-toxina podrían ser terapéuticamente útiles en las leucemias y los linfomas de células B.
A. Efecto del Ligando del zalpha11 humano en las líneas de células B
Las células IM-9 se sembraron a razón de alrededor de 50.000 células por ml +/- 50 \mug/ml de Ligando del zalpha11 humano purificado (Ejemplo 29). Después de 3 días de crecimiento, se cosecharon las células, se lavaron y se contaron; luego, se volvieron a sembrar a razón de alrededor de 2.500 células/ml en placas de 96 pocillos, con 0; 0,033; 0,1 ó 0,33 \mug/ml de anticuerpo anti-FAS (R&D Systems, Minneapolis). Después de 2 días, se realizó una valoración de fluorescencia con Alamar blue (Ejemplo 2B) para evaluar la proliferación de las células.
Las células IM-9 tratadas con el Ligando del zalpha11 crecieron hasta alcanzar solo el 27% de la densidad de las células no tratadas en ausencia del anticuerpo anti-FAS. En presencia de 0,33 \mug/ml de anticuerpo anti-FAS, las células tratadas con el Ligando del zalpha11 se inhibieron en un 52% adicional, mientras que las células no tratadas se inhibieron solo en un 30%. La inhibición general del crecimiento celular con el tratamiento con Ligando del zalpha11 y con 0,33 \mug/ml de anticuerpo anti-FAS fue de un 86%.
Cuando las células IM-9 se pretrataron durante tres días con el Ligando del zalpha11 o sin él y, luego, se volvieron a sembrar en placas a razón de 100 células por pocillo y se cultivaron con anticuerpos anti-FAS o sin ellos durante 6 días, el crecimiento de las células no tratadas evaluado mediante valoración con Alamar Blue (Ejemplo 2B) fue inhibido solo en un 25% por el anticuerpo anti-FAS, mientras que el crecimiento de las células tratadas con el Ligando del zalpha11 fue inhibido en un 95%, en relación con el crecimiento de las células no tratadas en cero anticuerpos anti-FAS.
B. Efecto de la inmunotoxina Ligando del zalpha11 humano-saporina en las líneas de células B
La construcción y la purificación del conjugado de la inmunotoxina Ligando del zalpha11 humano-saporina (zalpha11L-sap) se describen en el Ejemplo 50. El zalpha11L humano-sap fue mucho más potente que la saporina sola en la inhibición del crecimiento celular. Cuando las células tratadas se volvieron a sembrar en placas después de tres o cuatro días de tratamiento, las células tratadas con el zalpha11L humano-sap crecieron muy poco.
Las células IM-9, Ramos y K562 (ATCC N.º CCL-243) se sembraron a razón de alrededor de 2.500 células/pocillo en placas de 96 pocillos, con cero a 250 ng/ml de conjugado zalpha11L humano-sap o 0 a 250 ng/ml de saporina (Stirpe et al., Biotechnology 10,:405-412, 1992) solo como control. Las placas se incubaron durante 4 días, y se realizó la valoración de la proliferación con Alamar Blue (Ejemplo 5B). A la concentración máxima del conjugado zalpha11 humano-sap, el crecimiento de células IM-9 y células RAMOS se inhibió en un 79% y un 65%, respectivamente. Las células K562 que son bajas/negativas por flujo para la expresión del receptor zalpha11 no se vieron afectadas por el zalpha11-sap; por ende, muestran la especificidad del efecto del conjugado.
Las células IM-9 se sembraron a razón de 50.000 células/ml en placas de 6 pocillos, a razón de entre cero y 50 ng/ml de conjugado zalpha11L humano-sap. Después de 3 días, se cosecharon las células y se contaron, se volvieron a sembrar en placas, de 100 a 0,8 células por pocillo en diluciones seriadas dobles, y 12 pocillos por dilución de células en la inmunotoxina Ligando del zalpha11 humano-saporina. Después de 6 días, la cantidad de pocillos con crecimiento en cada dilución de células recibió un puntaje según los resultados de la valoración de la proliferación con Alamar Blue (Ejemplo 2B).
Al evaluar la cantidad de células, mediante valoración con Alamar Blue (Ejemplo 2B), después de 6 días de crecimiento, las células de control sembradas a alrededor de 12,5 y 6,25 células por pocillo tuvieron un crecimiento equivalente a las células tratadas con zalpha11-sap sembradas a 100 y 50 células/pocillo, respectivamente. Por ende, el crecimiento de las células IM-9 tratadas que sobrevivieron se deterioró considerablemente, incluso después de la eliminación de la inmunotoxina zalpha11-sap al sembrar nuevamente las células en placas.
La distribución tisular limitada del receptor zalpha11 humano (Ejemplo 48) y la especificidad de la acción del zalpha11-sap para las líneas celulares que expresan el receptor sugirieron que este conjugado puede ser tolerado in vivo.
C. Efecto de la inmunotoxina Ligando del zalpha11 humano-saporina en la viabilidad de las líneas de células B
Se sembraron células HS Sultan (ATCC N.º CRL-1484) a razón de alrededor de 40.000 células por ml en placas de 12 pocillos y se cultivaron durante cinco días, ya sea sin agregado de citocinas o con 40 ng/ml de Ligando del zalpha11 humano purificado (Ejemplo 29), o 25 ng/ml de conjugado zalpha11L humano-sap (Ejemplo 50, a continuación), o con 20 ng/ml de IFN-alpha (RDI) o Ligando del zalpha11 e IFN-alpha. El Ligando del zalpha11 inhibió el crecimiento de células HS Sultan en un 63%. El IFN-alpha inhibió el crecimiento en un 38%. El Ligando del zalpha11 más IFN-alpha inhibió el crecimiento en un 78%, lo que indica que los efectos inhibidores del crecimiento del Ligando del zalpha11 humano y del IFN-alpha pueden ser aditivos. El zalpha11L humano-sap inhibió el crecimiento de las células HS Sultan en un 92%.
Estos resultados respaldan el posible uso del Ligando del zalpha11 o del zalpha11L humano-sap en el tratamiento de tumores malignos u otras enfermedades que expresan el receptor zalpha11, particularmente aquellas enfermedades originadas en las células B. La combinación del Ligando del zalpha11 con IFN-alpha se recomienda específicamente por su efecto aditivo en la inhibición de las células HS Sultan. Es posible que algunos otros tipos de tumores malignos y enfermedades linfoides expresen el receptor zalpha11, ya que las células T activadas también expresan el ARNm del receptor (Ejemplo 48), y es posible que algunas de estas enfermedades también respondan al Ligando del zalpha11 de la terapia con la fusión Ligando del zalpha11-tóxico.
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D. La expresión de FAS (CD95) en líneas de células B humanas aumenta por la estimulación del Ligando del zalpha11 humano
Las líneas de células B humanas HS Sultan (ATCC N.º CRL-1484), IM-9 (ATCC N.º CRL159), RPMI 8226 (ATCC N.º CCL-155), RAMOS (ATCC N.º CRL-1596), DAKIKI (ATCC N.º TIB-206) y RPMI 1788 (ATCC N.º CRL-156), se trataron con 10 a 50 ng/ml de Ligando del zalpha11 humano purificado o sin él (Ejemplo 29) durante 2 a 8 días. Las células se tiñeron con el anticuerpo conjugado anti-CD95 PE (PharMingen, San Diego, CA), según el protocolo del fabricante, y se analizaron con un FACScalibur (Becton Dickinson, San José, CA). En todas las líneas celulares, aumentó la tinción con el anti-CD95 (FAS o APO-1) y, en algunos casos, más del doble, con el tratamiento con el Ligando del zalpha11 humano.
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E. La expresión de FAS (CD95) en células B de bazo de ratón primarias aumenta por la estimulación del Ligando del zalpha11 humano
Se obtuvieron esplenocitos de ratón primarios cortando los bazos de ratones C57/BL6 de 8 a 12 semanas. Para lisar los eritrocitos, se trató la preparación durante 5 segundos con agua y se pasó por un tamiz de 70 micrones. Los esplenocitos restantes se lavaron y se sembraron en placas en RPMI (JRH Bioscience) más HIA-FBS al 10% (Hyclone, Logan, UT), Interleucina 2 (IL-2) (R and D Systems) con el Ligando del zalpha11 humano o sin él, según lo descrito anteriormente. Luego, se cultivaron a 37ºC, con 5% de CO_{2}, durante 5 días. Se cosecharon los esplenocitos y se tiñeron con el anticuerpo conjugado anti-CD95 PE (PharMingen) y con el anticuerpo conjugado anti-CD19 FITC (PharMingen), según el protocolo del fabricante. Las células se analizaron mediante citometría de flujo en un FACScalibur (Becton Dickinson). Al aplicar impulsos activadores en las células B de ratón CD19+, se observó que la tinción con anti-CD95 aumentó en las células B tratadas con IL-2 más Ligando del zalpha11 humano, en comparación con las células tratadas con IL-2 sola. La tinción con anti-CD95 fue de 37 unidades fluorescentes relativas (relative fluorescent unit, RFU) en las células B en IL-2 sola, y de 55 RFU en las células B cultivadas en IL-2 y Ligando del zalpha11 humano.
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Ejemplo 50 Construcción y purificación de la fusión del Ligando del zalpha11 con un tóxico
En virtud de un contrato de suministro, se enviaron 10 mg del Ligando del zalpha11 humano (Ejemplo 29) a Advanced Targeting Systems (ATS, San Diego, CA) para la conjugación con la toxina saporina de origen vegetal (Stirpe et al., Biotechnology 10,:405-412, 1992). Zymogenetics recibió de ATS 1,3 mg de un conjugado proteico formado por 1,1 moléculas de saporina por molécula de Ligando del zalpha11 humano, formulado a una concentración de 1,14 mg/ml en fosfato de sodio 20 nM, cloruro de sodio 300 nM, pH 7,2.
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Ejemplo 51 Fusión del Ligando del zalpha11 con un tóxico in vivo A. Evaluación del conjugado zalpha11-saporina en ratones
El conjugado zalpha11-saporina (Ejemplo 49) se administró a ratones C57BL6 (hembras de 12 semanas, compradas a Taconic) a dos dosis diferentes: 0,5 y 0,05 mg/kg. La inyecciones se administraron por vía IV en un vehículo que consistía en BSA al 0,1% (ICN, Costa Mesa, CA). Se administraron tres inyecciones durante un período de una semana (días 0, 2 y 7). Se tomaron muestras de sangre de los ratones el día 0 (antes de la inyección) y los días 2 y 8 (después de la inyección). Se recolectó sangre en tubos heparinizados (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), y los recuentos celulares sanguíneos se determinaron utilizando un analizador hematológico automatizado (Abbot Cell-Dyn modelo N.º CD-3500CS, Abbot Park, IL). A los animales se les practicó la eutanasia y se les realizó una necropsia el día 8 después de la recolección de sangre. Se extrajeron el bazo, el timo, el hígado, el riñón y la médula ósea para histopatología. Se pesaron el bazo y el timo, y se recolectó una muestra de sangre adicional en tubos separadores para suero. El suero se envió a Pheonix Central Labs, Everett, WA, para realizar evaluaciones en un panel de química estándar. También se recolectaron muestras para análisis citométricos de flujo, según se describe en la presente.
Los recuentos celulares de la sangre en circulación y las mediciones de química sérica no difirieron significativamente entre los ratones tratados con el conjugado de zalpha11 y los ratones tratados con una dosis equivalente de toxina no conjugada (saporina). Los análisis histológicos de tejidos en los ratones tratados con zalpha11-saporina no mostraron ningún cambio significativo relacionado con los ratones tratados con una dosis equivalente de toxina no conjugada. Estos resultados indicaron que el conjugado de la saporina no era tóxico in vivo.
B. Evaluación de la fusión del Ligando del zalpha11 con la saporina tóxica en tumores derivados de células B in vivo
Los efectos del Ligando del zalpha11 humano y la fusión del Ligando del zalpha11 humano con la saporina tóxica (Ejemplo 50) en células tumorales humanas se evaluaron in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón, descrito en la presente. Los modelos de xenoinjerto se evaluaron inicialmente utilizando líneas celulares seleccionadas en función de experimentos in vitro, como los descritos en el Ejemplo 49. Estas líneas celulares incluyen, a modo de ejemplo: líneas celulares del linfoma de Burkitt humanas Raji (ATCC N.º CCL-86) y Ramos (ATCC N.º CRL-1596); línea celular humana RPMI 1788 (ATCC N.º CRL-156); línea celular de mieloma/plasmacitoma humana IM-9 (ATCC N.º CRL159); línea celular humana DAKIKI (ATCC N.º TIB-206), y células HS Sultan (ATCC N.º CRL-1484). Las células derivadas directamente de tumores humanos también pueden utilizarse en este tipo de modelo. De esta manera, la selección de muestras de pacientes para evaluar la sensibilidad al tratamiento con el Ligando del zalpha11 o con una fusión del Ligando del zalpha11 con la saporina tóxica pueden utilizarse para seleccionar las indicaciones óptimas para el uso del zalpha11 en la terapia antitumoral.
Después de la selección del modelo in vivo de xenoinjerto adecuado, descrito anteriormente, la actividad inducida por el Ligando del zalpha11 de los linfocitos citolíticos naturales y/o los efectos del Ligando del zalpha11 en los tumores derivados de células B se evalúa in vivo. El Ligando del zalpha11 humano se evalúa para determinar su capacidad de generar células efectoras citotóxicas (p. ej. células NK) con actividad contra los tumores derivados de células B, utilizando modelos de xenoinjerto de tumor de ratón, descritos en la presente. Además, pueden evaluarse los efectos directos del Ligando del zalpha11 humano en los tumores. Los modelos de xenoinjerto que se debían llevar a cabo se seleccionan según lo descrito anteriormente. Se desarrolla un protocolo en el que se utilizan células humanas estimuladas con el Ligando del zalpha11 y se realizan evaluaciones para determinar la eficacia para reducir las células tumorales y promover la supervivencia en ratones inoculados con líneas celulares o tumores primarios.
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Ejemplo 52 Identificación de clones de cromosomas artificiales P1 que contienen ADN del Ligando del zalpha11 humano genómico
El inserto del ADNc del Ligando del zalpha11 humano se amplificó mediante PCR, utilizando cebadores basados en vectores. El producto de la PCR se marcó con ^{32}P y se hibridó con filtros de alta densidad, lo que representa una genoteca de cromosomas artificiales P1 (P1 Artificial Chromosome, PAC). Los filtros y los lotes de genotecas congeladas se obtuvieron de Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, Nueva York; el segmento de la genoteca fue RPCI6, con una profundidad de cobertura cuatro veces mayor. Los filtros se hibridaron de un día para el otro a 65ºC en ExpressHyb (Clontech) y se lavaron según las sugerencias del fabricante. La descodificación de las señales positivas resultó en la identificación de cuatro clones de PAC, denominados 23H17, 34A9, 105G9 y 236H14. Los análisis de PCR con cebadores específicos para el extremo 5' (ZC22,452 (SEC. ID. N.º 100) y ZC22,451 (SEC. ID. N.º 101)) y el extremo 3' (ZC22,450 (SEC. ID. N.º 102) y ZC22,449 (SEC. ID. N.º 103)) de la región codificante mostraron que los PAC 34A9 y 105G9 contenían ambos extremos, mientras que los PAC 23H17 y 236H14 contenían el extremo 5' únicamente. El PAC 23H17 se digirió con Eco RI y Not I, y se identificó un fragmento de 9 kb, que se hibridó con la sonda del ADNc del Ligando del zalpha11. Se aisló y se subclonó este fragmento, utilizando los métodos descritos en la presente, en pBluescript II SK (+) (Stratagene) previamente digerido con Eco RI y Not I. El secuenciamiento reveló que este fragmento contenía alrededor de 380 pares de bases de la región promotora, los exones 1, 2 y 3, la totalidad de los intrones 1 y 2, y que terminaba con el intrón 3.
El extremo 3' del gen del Ligando del zalpha11 humano se obtuvo mediante PCR, utilizando ADN de PAC 34A9 como plantilla, con los cebadores ZC23,771 (SEC. ID. N.º 104) y ZC22,449 (SEC. ID. N.º 103). Se utilizó la ADN polimerasa Taq, con la solución amortiguadora proporcionada, con la adición de DMSO al 4%. Las condiciones de la reacción fueron las siguientes: 94ºC, 5 min; seguido de 35 ciclos de 94ºC durante 30 s, 52ºC durante 1 min, 72ºC durante 3 min; y 72ºC durante 7 min. Esto generó un fragmento de 2,9 kb que contenía parte del exón 3, la totalidad de los intrones 3 y 4, todo el exón 4, y la porción codificante del exón 5.
La estructura genómica del gen del Ligando del zalpha11 humano es de la siguiente manera, desde el 5' al 3': SEC. ID. N.º 105, que contiene alrededor de 240 pb del promotor, el exón 1 (números de nucleótido 240-455 de la SEC. ID. N.º 105), el intrón 1 (números de nucleótido 456-562 de la SEC. ID. N.º 105), el exón 2 (números de nucleótido 563-598 de la SEC. ID. N.º 105), y parte del intrón 2 que contenía 748 pares de bases del extremo 5' (números de nucleótido 599-1347 de la SEC. ID. N.º 105); un gap de aproximadamente 3 kb; SEC. ID. N.º 106, que contenía 718 pb del extremo 3' del intrón 2, el exón 3 (números de nucleótido 719-874 de la SEC. ID. N.º 106), y parte del extremo 5' del intrón 3 (números de nucleótido 875-1656 de la SEC. ID. N.º 106); un gap de menos de alrededor de 800 pb; SEC. ID. N.º 107, que contenía 644 pb del intrón 3; un gap de menos de alrededor de 800 pb; y la SEC. ID. N.º 108, que contenía 435 pb del extremo 3' del intrón 3, el exón 4 (números de nucleótido 436-513 de la SEC. ID. N.º 108), el intrón 4 (números de nucleótido 514-603 de la SEC. ID. N.º 108), y parte del extremo 5' del exón 5 (números de nucleótido 604-645 de la SEC. ID. N.º 108).
Ejemplo 53 Estudio de la unión del Ligando del zalpha11 humano marcado con I^{125} en líneas celulares
Se marcaron 25 microgramos del Ligando del zalpha11 humano purificado (Ejemplo 29) con 2 mCi ^{125}I, utilizando perlas iodo (Pierce, Rockford Illinois), según las instrucciones del fabricante. Esta proteína marcada se utilizó para evaluar la unión del Ligando del zalpha11 humano con las células humanas Raji (ATCC N.º CCL-86), utilizando la unión a células BaF3 murinas genéticamente intactas, y con las células BaF3 transfectadas con el receptor zalpha11 (células Baf3/hzalpha11) como controles. La unión del Ligando del zalpha11 con las células Baf3/hzalpha11 estaba prevista (control positivo), mientras que no estaba prevista ninguna unión a las células BaF3 genéticamente intactas (control negativo), en función de los resultados de la valoración de la proliferación (Ejemplo 5). Se sembraron alrededor de 5X10^{5} células Raji/pocillo, 1X10^{6} BaF3/hzalpha11 y 1X10^{6} células BaF3/pocillo en placas de 96 pocillos. Se agregaron diez ng/ml de Ligando del zalpha11 humano marcado, por duplicado, a los pocillos, con una serie de dilución del competidor del Ligando del zalpha11 humano no marcado que se agregó desde un exceso molar de 250 veces en diluciones 1:4 hasta un exceso molar de 0,061 veces. Cada punto se realizó por duplicado. Después de agregar el Ligando del zalpha11 humano marcado a los pocillos, se dejó incubar a 4ºC durante 2 h para permitir la unión del Ligando a las células. Las células se lavaron 3X en solución amortiguadora de unión (RPMI-1710 (JRH Bioscience) con BSA al 1% (Sigma)), y se contaron en el contador gamma COBRA II AUTO-GAMMA (Packard Instrument Company, Meriden, CT).
La unión del Ligando del zalpha11 marcado a las células fue evidente en las células Raji y Baf3/hzalpha11. Además, para las células Raji, un promedio de exceso molar de 250 veces del Ligando del zalpha11 no marcado disminuyó la unión 3 veces en presencia de un competidor no marcado no específico (Interferon Gamma de R&D Systems, Minneapolis, MN), y 3,7 veces, en comparación con la ausencia de competidor. La competencia se observó de manera dependiente de la dosis para el competidor no marcado específico, Ligando del zalpha11 humano. Por ende, la unión del Ligando del zalpha11 a las células Raji fue específica. De manera similar, para las células BaF3/zalpha11 de control positivo, el exceso molar de 250 veces del Ligando del zalpha11 no marcado disminuyó la unión 2 veces en relación con el competidor no específico, y 3,06 veces, en comparación con la ausencia de competidor. Por ende, la unión del Ligando del zalpha11 a las células BaF3/zalpha11 también fue específica. No se observaron uniones de competencia con las células BaF3 genéticamente intactas. Por ende, se mostró que el Ligando del zalpha11 se une específicamente a las células Raji y a las células Baf3/hzalpha11, pero no a las células BaF3 de control negativo.
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Ejemplo 54 Expresión del receptor zalpha11 en células sanguíneas humanas A. Preparación y cultivo de células de sangre periférica humanas
Se diluyó sangre humana extraída fresca en una proporción 1:1 con PBS (GIBCO BRL) y se dispuso sobre Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ), se centrifugó durante 30 minutos a 1.800 rpm y se permitió que se detuviera sin el freno. Se extrajo la capa de la interfaz y se la transfirió a un tubo Falcon (Falcon, VWR, Seattle, WA) de 50 ml fresco, se completó hasta alcanzar un volumen final de 40 ml con PBS y se centrifugó durante 10 minutos a 1.200 rpm con el freno. Se evaluó la viabilidad de las células aisladas utilizando azul de tripán (GIBCO BRL), y las células se resuspendieron a una concentración final de 1 x 10^{6} células/ml de medio celular (medio RPMI 1640, suero bovino fetal inactivado por calor al 10%, L-glutamina al 5%, Pen/Strep al 5%) (GIBCO BRL).
Se cultivaron células en placas de 6 pocillos (Falcon, VWR) durante 0, 4 ó 24 horas, con una serie de estímulos diferentes, descritos a continuación. Se realizó la estimulación con anti-IgM, anti-CD40 y anti-CD3, como en el Ejemplo 44 y el Ejemplo 42. Se agregaron forbol miristato acetato (PMA) e ionomicina (Sigma, St. Louis, MO) (Ejemplo 5C) a los pocillos correspondientes a 10 ng/ml y 0,5 mg/ml respectivamente. Las células se incubaron a 37ºC en una incubadora humidificada varias veces.
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B. Tinción y análisis de anticuerpos
Las células se extrajeron de las placas, se lavaron y se resuspendieron en medio de tinción helado (HBSS, suero bovino fetal al 1%, azida sódica al 0,1%) a una concentración de alrededor de diez millones de células por mililitro. Se logró el bloqueo del receptor Fc y de las uniones no específicas de anticuerpos a las células agregando suero de cabra normal al 10% (Gemini Bioproducts, Woodland, CA) y suero humano normal al 10% (Ultraserum, Gemini) a la suspensión celular. Se mezclaron alícuotas de las suspensiones celulares con un anticuerpo monoclonal marcado con FITC contra uno de los marcadores de linaje CD3, CD19 o CD14 (PharMingen, La Jolla, CA) y un anticuerpo monoclonal biotinilado contra el receptor zalpha11 humano (hu-zalpha11) (Ejemplo 35). La especificidad de la tinción se determinó mediante competencia, utilizando el receptor soluble zalpha11CEE (Ejemplo 10A) con un exceso de masa diez veces mayor. Después de la incubación en hielo durante 60 minutos las células se lavaron dos veces con medio de tinción helado y se resuspendieron en 50 ml de medio de tinción que contenía estreptavidina-PE (Caltag, Burlingame, CA). Después de 30 minutos de incubación en hielo, las células se lavaron dos veces con solución amortiguadora de lavado helada (PBS, suero bovino fetal al 1%, azida sódica al 0,1%) y se resuspendieron en solución amortiguadora de lavado que contenía 7-AAD (Molecular Probes, Eugene, OR) 1 mg/ml como marcador de viabilidad. Los datos de flujo se obtuvieron en células vivas, utilizando un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems, San José, CA). Tanto la adquisición como el análisis se realizaron utilizando el software CellQuest (BD Immunocytometry Systems).
Los resultados de la tinción mediante el anticuerpo anti-zalpha11 mostraron que el receptor zalpha11 humano se expresa en las células de sangre periférica humanas que expresan el CD3, CD19 o CD14. La tinción en células CD3 y CD19 fue específica, según lo evidenciado por la competencia absoluta con el receptor soluble zalpha11. La tinción en células CD14 mostró cierta especificidad para el Ligando, según lo evidenciado por la competencia parcial con el receptor soluble. La activación de las células T con anti-CD3 o de las células B con anti-CD40 produjo un aumento en el nivel del zalpha11 de la superficie celular a las 24 horas. No se observó ningún aumento en el nivel de expresión del zalpha11 a las 4 horas, con ninguno de los estímulos en ninguna de las poblaciones de células. El tratamiento de las células con el Ligando del zalpha11 produjo una disminución en la tinción del zalpha11 en las células CD3 positivas y CD19 positivas, pero no en las células CD14 positivas, tanto a las 4 horas como a las 24 horas.
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Ejemplo 55 Evaluación preliminar de la estabilidad de la solución acuosa del Ligando del zalpha11 humano
Se llevaron a cabo estudios preliminares para evaluar las características de la estabilidad de la solución acuosa del Ligando del zalpha11 humano en el apoyo del bioprocesamiento, la formulación y la administración in vivo. Los objetivos eran los siguientes: 1) verificar la estabilidad y la recuperación de minibombas Alzet, y el almacenamiento y manejo generales; 2) determinar la naturaleza que indica la estabilidad de varios métodos analíticos, que incluyen HPLC con intercambio de cationes (cation-exchange high performance liquid chromatography, CX-HPLC), HPLC con inversión de fases (reverse-phase high performance liquid chromatography, RP-HPLC), HPLC con exclusión por tamaño (size exclusion high performance liquid chromatography, SEC-HPLC) y bioanálisis (proliferación de BaF3/zalpha11R) (p. ej. Ejemplo 2 y Ejemplo 4); y 3) determinar las vías de degradación que limitan la estabilidad y sus dependencias cinéticas.
Se prepararon alícuotas del Ligando del zalpha11 humano purificado (Ejemplo 29) mediante dilución a 2 mg/mL en PBS (pH 7,4) y se almacenaron en crioviales de polietileno de baja densidad (low density polyethylene, LDPE) (Nalgene, 1,8 mL) a -80ºC (control), 5ºC, 30ºC y 37ºC. Las muestras se analizaron en forma intermitente durante 29 días mediante CX-, RP-, SEC-HPLC y bioanálisis. Las alícuotas también se almacenaron a -80ºC y se sometieron a ciclado de congelamiento/descongelamiento (freeze-thaw, f/t) (-80ºC/RT; 5X f/t, 10X f/t). La recuperación del Ligando del zalpha11 humano se determinó en relación con el control a -80ºC (1 f/t) en todas las valoraciones.
El resto de la solución del Ligando del zalpha11 humano de las muestras de control a -80ºC se congeló nuevamente (-80ºC) después de realizar análisis. Esta alícuota (2 f/t) se utilizó para evaluar la estabilidad térmica y conformacional del Ligando del zalpha11 humano en función del pH utilizando dicroísmo circular (circular dichroism, CD). La solución de 2 mg/mL se diluyó a 100 \mug/mL en soluciones amortiguadoras de PBS cuyo pH variaba entre 3,3 y 8,8. El espectro de CD de UV lejano se monitoreó en el rango de temperatura de 5 a 90ºC en intervalos de 5ºC (n=3/pH). El espectropolarímetro de CD utilizado fue un Jasco 715 (Jasco, Easton, MD). El desplegamiento térmico se monitoreó mediante los cambios en la elipticidad a 222 nm en función de temperatura. Se realizaron estimaciones de la T_{m} asumiendo un modelo de desplegamiento de dos estados. Los datos se adaptaron (sigmoide) utilizando SlideWrite Plus para Windows v4.1 (Advanced Graphics Software; Encinitas, CA).
Para evaluar la recuperación y la estabilidad de las minibombas Alzet (Modelo N.º 1007D; ALZA Corporation, Mountain View, CA), las bombas se llenaron con 100 \muL de la solución de Ligando del zalpha11 humano 2 mg/ml, se colocaron en 1,8 mL de LDPE que contenía 1 mL de PBS (pH 7,4), y se almacenaron a 37ºC. La liberación/recuperación del Ligando del zalpha11 humano de las minibombas se evaluó mediante CX-, RP- y SEC-HPLC los días 2, 4 y 7. La actividad se evaluó mediante bioanálisis el día 7. El estudio fue diseñado para evaluar la liberación de 3 bombas por tiempo de muestreo.
Los datos cromatográficos sugirieron que los métodos CX- y SEC-HPLC eran indicadores de estabilidad, mientras que el método RP-HPLC no lo era. Se observaron, al menos, 3 picos adicionales que indicaban la presencia aparente de productos de degradación mediante CX-HPLC. El método SEC-HPLC resolvió un aparente agregado del Ligando del zalpha11 humano, que se eluyó antes del Ligando del zalpha11 humano. Sin embargo, no se observó la elusión de picos adicionales significativos después del pico del Ligando del zalpha11 humano. Esto sugiere que lo más probable es que los productos de degradación observados mediante CX-HPLC se hayan producido a partir de modificaciones de aminoácidos, como la desamidación, y no por procesos de hidrólisis/proteólisis que originan variantes cortadas. Se observó cierto grado de formación de frentes y estelas mediante RP-HPLC (en relación con el control) en las muestras que habían mostrado una degradación significativa mediante SEC- y CX-HPLC. Sin embargo, los productos de degradación aparentes no se resolvieron mediante RP-HPLC. La degradación observada mediante CX-HPLC aumentó en función del tiempo-temperatura y se produjo después de la cinética de primer orden aparente. El % de Ligando del zalpha11 humano recuperado por CX-HPLC después de 29 días a 37ºC, 30ºC y 5ºC fue del 39%, 63% y 98%, respectivamente. La agregación también aumentó de manera dependiente del tiempo-temperatura. El % de agregado presente en las preparaciones almacenadas durante 29 días a 37ºC, 30ºC y 5ºC fue 7,4; 3,4 e inferior al límite detectable (below detectable limit, BDL), respectivamente. No se observaron diferencias significativas mediante bioanálisis en ninguna muestra, lo que sugiere que los productos de degradación tienen una actividad equivalente a la del Ligando del zalpha11 humano intacto. No se observó degradación mediante ninguna valoración en las muestras que se sometieron a hasta 10 ciclos de f/t.
La liberación del Ligando del zalpha11 humano de las minibombas Alzet fue compatible con la liberación volumétrica prevista teóricamente. Esto sugiere que la adsorción superficial significativa no impediría el suministro de Ligando del zalpha11 humano con el uso de minibombas Alzet con una concentración de llenado de 2 mg/mL. Se observó degradación compatible con la mencionada anteriormente. El % de pureza determinado mediante CX-HPLC del Ligando del zalpha11 humano liberado después de 2, 4 y 7 días fue del 96%, 90% y 79%, respectivamente. Se debe mencionar que la degradación también se produce después de que el Ligando del zalpha11 humano se libera en el medio de liberación o se diluye con él. Por lo tanto, el % de pureza dentro de la minibomba puede ser algo diferente del que se determine para el medio de liberación. La bioactividad de cada muestra fue compatible con la cantidad prevista de Ligando del zalpha11 humano liberado de las minibombas.
El espectro de CD de UV lejano del Ligando del zalpha11 humano, como se había previsto, fue compatible con las interleucinas, como los mutantes de IL-3 (J. Biochem., 23:352-360, 1991), IL-4 (Biochemistry, 30:1259-1264, 1991) e IL-6 (Biochemistry, 35:11503-11511, 1996). No se observaron cambios evidentes en el espectro de CD de UV lejano en función del pH. Los resultados mostraron que el pH de la estabilidad térmica/conformacional máxima fue \approxpH 7,4. Los análisis de las curvas de desplegamiento se realizaron en función de un mecanismo de desplegamiento de dos estados, a fin de permitir la comparación de la estabilidad térmica/conformacional en función del pH/la composición. Sin embargo, pueden existir uno o más intermediarios durante el proceso de desplegamiento, dado que la cooperatividad fue relativamente baja, en función de la profundidad de la curva de desplegamiento. Aunque los estudios no fueron diseñados específicamente para determinar si el Ligando del zalpha11 humano se repliega después del desplegamiento térmico a 90ºC, los datos preliminares sugirieron que se produce, al menos, un replegamiento parcial después de que la temperatura de la muestra desciende a 20ºC.
Estos estudios permiten la identificación de un paradigma analítico para evaluar la pureza y verificar la estabilidad del Ligando del zalpha11 humano. Por ejemplo, la SEC-HPLC puede utilizarse para caracterizar el grado y el índice de agregación en solución acuosa. Del mismo modo, la CX-HPLC puede utilizarse para caracterizar el grado y el índice de degradación del Ligando del zalpha11 humano mediante mecanismos distintos de la agregación. El bioanálisis puede utilizarse para verificar la actividad del Ligando del zalpha11 humano y sus productos de la degradación acuosa. Por ejemplo, las variantes del Ligando del zalpha11 humano generadas en solución acuosa y resueltas mediante CX-HPLC pueden ser útiles como agentes terapéuticos, dado que tienen una bioactividad equivalente. Además, el hecho de que el Ligando del zalpha11 humano se degrada mediante varios procesos diferentes (agregación, modificaciones de aminoácidos) sugiere que es posible que sea necesaria una formulación preferida o exclusiva que minimice el índice de cada proceso de degradación para lograr la estabilidad a largo plazo de un producto en solución.
La identificación de la naturaleza de los productos de la degradación acuosa y la determinación de sus dependencias cinéticas (pH, concentración, excipientes) está en proceso. La estabilidad del Ligando del zalpha11 humano en suero/plasma se determina para respaldar el diseño y la interpretación de los estudios in vivo.
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<110> ZymoGenetics, Inc.
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<120> NUEVA CITOCINA LIGANDO DEL ZALPHA11
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<130> 99-16PC
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<150> EE. UU. 09/264.908
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<151> 1999-03-09
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<150> EE. UU. 09/265.992
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<151> 1999-03-11
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<150> EE. UU. 60/142.013
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<151> 1999-07-01
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<160> 115
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<170> FastSEQ para Windows Versión 3.0
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<210> 1
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<211> 642
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Secuencia de polinucleótido degenerada para el Ligando del zalpha11 humano
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<221> misc_feature
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<222> (1)...(486)
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<223> n = A,T,C o G
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9 
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<213> Mus musculus 
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<220>
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<221> fuente
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<222> (0)...(0)
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<223> EST1483966; Acceso a la genoteca N.º AA764063
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<400> 4
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<223> Cebador oligonucleótido ZC20114
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<223> Cebador oligonucleótido ZC19459
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<220>
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<223> Cebador oligonucleótido ZC19954
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<220>
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<223> Cebador oligonucleótido ZC20116
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<400> 24
118 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC13946
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
119 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC13945
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<400> 26
120 
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<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC18698
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
121 
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<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC14063
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<400> 28
122 
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<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos de etiqueta Glu-Glu (CEE)
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<400> 29
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123 
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<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC19931
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<400> 30
124 
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<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC19932
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<400> 31
125 
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<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 66
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido que abarca la región flanqueante del vector y el extremo 5' del dominio extracelular del zalpha11
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
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13 
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<210> 33
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<211> 699
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 33
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14 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 62
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Primer cebador oligonucleótido que abarca el extremo 3' del dominio extracelular del zalpha11 y el extremo 5' del Fc4
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<400> 34
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15 
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<210> 35
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<211> 61
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Segundo cebador oligonucleótido que abarca el extremo 3' del dominio extracelular del zalpha11 y el extremo 5' del Fc4
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<400> 35
16 
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<210> 36
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<211> 67
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido que abarca el extremo 3' del Fc4 y la región flanqueante del vector
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<400> 36
17 
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<210> 37
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<211> 8
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia de aminoácidos con etiqueta FLAG C terminal
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
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126 
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<210> 38
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC7764a
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<400> 38
127 
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<210> 39
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<211> 26
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
\newpage
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC7764b
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<400> 39
128 
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<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 19
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22034
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<400> 40
129 
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<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22035
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<400> 41
130 
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<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22050
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<400> 42
131 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22051
\newpage
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<400> 43
132 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22056
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133 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22057
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
134 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22205
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
135 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22206
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
136 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC9739
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<400> 48
137 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC9719
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
138 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC14063
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
139 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC5020
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 51
140 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22421
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
141 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22604
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
142 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22641
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
143 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3072
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (54)...(491)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
18
19
20 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 146
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
21 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22283
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
144 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22284
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
145 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> oligonucleótido ZC12749
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
22 
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<210> 60
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Oligonucleótido ZC12748
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23 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleótido ZC22143
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146 
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleótido ZC22144
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147 
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<210> 63
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<212> ADN
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<400> 63
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<223> Cebador oligonucleótido ZC22052
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148 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleótido ZC22053
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<212> ADN
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<223> Cebador oligonucleótido ZC23116
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<212> ADN
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<212> ADN
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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154 
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Péptido huzalpha11L-1
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Péptido huzalpha11L-3
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26 
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleótido ZC23444
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleótido ZC23445
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleótido ZC447
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleótido ZC976
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\vskip0.400000\baselineskip
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22128
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<211> 68
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Cebador oligonucleótido ZC22127
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<210> 80
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<211> 40
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC19372
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<400> 80
160 
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<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC19351
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\vskip0.400000\baselineskip
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29 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC19352
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\vskip1.000000\baselineskip
30 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC19371
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\vskip1.000000\baselineskip
161 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1560
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)...(1560)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido de fusión MBP-Ligando del zalpha11 humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\vskip1.000000\baselineskip
31
32
33
34 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 519
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> MBP-human zalpha11 Ligand fusion polypeptide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
35
36 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22849
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
37 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 87
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22850
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
38 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1533
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polinucleótido de fusión MBP-Ligando del zalpha11 de ratón
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1533)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 88
39
40
41 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 510
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Polipéptido de fusión MBP-Ligando del zalpha11 de ratón
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 89
\vskip1.000000\baselineskip
42
43 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22281
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
162 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22279
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
163 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda TaqMan del Ligando del zalpha11 humano correspondiente, ZG32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
164 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22277
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 93
165 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 94
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22276
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 94
166 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 95
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda TaqMan del zalpha11 humano, ZG31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
167 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1821
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(1821)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del polinucleótido MBP-receptor soluble zalpha11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
44
45
46
47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 97
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 606
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia del polipéptido MBP-receptor soluble zalpha11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
48
49 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC20187
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC20185
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
\vskip1.000000\baselineskip
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22452
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
\vskip1.000000\baselineskip
168 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22451
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
169 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22450
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
170 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC22449
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
171 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC23771
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 104
\vskip1.000000\baselineskip
172 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 105
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1347
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 105
\vskip1.000000\baselineskip
53
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 106
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1656
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 106
55
56 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 644
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
\vskip1.000000\baselineskip
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 108
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 645
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> misc_feature
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)...(645)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = A,T,C o G
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
59 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 109
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC25970
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 109
173 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 110
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador oligonucleótido ZC25969
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 110
174 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 111
60
61 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 112
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 153
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 112
\vskip1.000000\baselineskip
62 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 113
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 162
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 113
\vskip1.000000\baselineskip
63
64 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 114
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 144
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 114
\vskip1.000000\baselineskip
65 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 115
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 538
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 115
\vskip1.000000\baselineskip
66
67

Claims (35)

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos que es:
(a) al menos, un 90% idéntica a los residuos 41 (Gln) a 148 (Ile), como se muestra en la SEC. ID. N.º 2, donde el residuo en la posición 44 es Asp, el residuo en la posición 47 es Asp y el residuo en la posición 135 es Glu; o
(b) al menos, un 90% idéntica a los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser), como se muestra en la SEC. ID. N.º 2,
donde el polipéptido se une a un receptor zalpha11, como se muestra en la SEC. ID. N.º 115.
2. Un polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 1a, donde los residuos de aminoácidos 71, 78, 122 y 125 son cisteína.
3. Un polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 1a, donde la secuencia de residuos de aminoácidos es, al menos, un 95% idéntica a la SEC. ID. N.º 2, desde el residuo 41 (Gln) hasta el 148 (Ile).
4. Un polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 3, donde la secuencia de residuos de aminoácidos es 100% idéntica a la SEC. ID. N.º 2, desde el residuo 41 (Gln) hasta el 148 (Ile).
5. Un polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 1b, donde la secuencia de residuos de aminoácidos es, al menos, un 95% idéntica a los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser), como se muestra en la SEC. ID. N.º 2.
6. Un polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 5, donde la secuencia de residuos de aminoácidos es como se muestra en la SEC. ID. N.º 2, desde el residuo 32 (Gln) al residuo 162 (Ser).
7. Un polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 6, donde la secuencia de residuos de aminoácidos, como se muestra en la SEC. ID. N.º 2, es el residuo 1 (Met) al residuo 162 (Ser).
8. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de residuos de aminoácidos, como se muestra en la SEC. ID. N.º 56, desde el residuo 23 (Gln) hasta el residuo 146 (Ser), donde el polipéptido se une a un receptor zalpha11, como se muestra en la SEC. ID. N.º 115.
9. Un polipéptido aislado de acuerdo con la Reivindicación 8, donde la secuencia de residuos de aminoácidos, como se muestra en la SEC. ID. N.º 56, es el residuo 1 (Met) al residuo 146 (Ser).
10. Una molécula de polinucleótido aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9.
11. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la Reivindicación 10, donde los nucleótidos son como se muestra en la SEC. ID. N.º 1, desde el nucleótido 167 hasta el nucleótido 490 o, como se muestra en la SEC. ID. N.º 3, desde el nucleótido 121 hasta el nucleótido 444.
12. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la Reivindicación 10, donde los nucleótidos son como se muestra en la SEC. ID. N.º 1, desde el nucleótido 140 hasta el nucleótido 532 o, como se muestra en la SEC. ID. N.º 3, desde el nucleótido 94 hasta el nucleótido 486.
13. Una molécula de polinucleótido aislada de acuerdo con la Reivindicación 10, donde los nucleótidos son como se muestra en la SEC. ID. N.º 1, desde el nucleótido 47 hasta el nucleótido 532 o, como se muestra en la SEC. ID. N.º 3, desde el nucleótido 1 hasta el nucleótido 486.
14. Un vector de expresión que comprende los siguientes elementos ligados operablemente:
(a) un promotor de la transcripción;
(b) un segmento de ADN que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9; y
(c) un terminador de la transcripción.
15. Una célula cultivada que comprende un vector de expresión de acuerdo con la Reivindicación 14.
16. Un método para producir una proteína que comprende:
el cultivo de una célula de acuerdo con la Reivindicación 15, en condiciones donde se exprese el segmento de ADN; y
la recuperación de la proteína codificada por el segmento de ADN.
17. Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido del Ligando del zalpha11, donde el polipéptido se selecciona entre:
(a) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.º 2, desde el aminoácido número 41 (Gln) hasta el aminoácido número 148 (Ile);
(b) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.º 2, desde el aminoácido número 32 (Gln) hasta el aminoácido número 162 (Ser);
(c) un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEC. ID. N.º 2, desde el aminoácido número 1 (Met) hasta el aminoácido número 162 (Ser).
18. El uso de una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9 para la fabricación de un medicamento para tratar enfermedades que surgen a causa de defectos en el sistema inmunitario.
19. El uso de una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9 para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero expuesto a un antígeno o un patógeno, donde con el uso del medicamento, se compara el nivel de antígeno o patógeno presente en dicho mamífero antes y después de la administración del medicamento; donde un cambio del nivel es indicativo de la estimulación de una respuesta inmunitaria.
20. El uso de acuerdo con la Reivindicación 19, donde el antígeno es un tumor de células B, un virus, un parásito o una bacteria.
21. Un método por expansión de células hematopoyéticas y precursoras de células hematopoyéticas que comprende cultivar células de médula ósea o de sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9 suficiente para producir un aumento en la cantidad de células linfoides en las células de médula ósea o de sangre periférica, en comparación con células de médula ósea o de sangre periférica cultivadas en ausencia de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9.
22. Un método de acuerdo con la Reivindicación 21, donde las células hematopoyéticas y las células precursoras hematopoyéticas son células linfoides.
23. Un método de acuerdo con la Reivindicación 22, donde las células linfoides son células NK o células T citotóxicas.
24. Un método de acuerdo con la Reivindicación 21, donde la composición también comprende, al menos, otra citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando Flt3 y factor de células progenitoras.
25. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9 para la fabricación de un medicamento para tratar una neoplasia de células B o T, mediante la reducción de la proliferación de células B o T neoplásicas.
26. El uso de acuerdo con la Reivindicación 25, donde el medicamento también comprende, al menos, otra citocina seleccionada del grupo que consiste en IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, ligando Flt3 o factor de células progenitoras.
27. El uso de una composición que comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9 para la fabricación de un medicamento para estimular una respuesta inmunitaria en un mamífero expuesto a un antígeno o a un patógeno, donde con el uso del medicamento, se compara el nivel de un anticuerpo específico contra un antígeno o un patógeno presente en dicho mamífero antes y después de la administración del medicamento; donde un aumento en el nivel de anticuerpos es indicativo de la estimulación de una respuesta inmunitaria.
28. Un método para detectar la presencia del ARN del Ligando del zalpha11 en una muestra biológica, que comprende los siguientes pasos:
(a) el contacto de una sonda del ácido nucleico del Ligando del zalpha11 en condiciones de hibridación con (i) moléculas de ARN de prueba aisladas de la muestra biológica o (ii) moléculas de ácido nucleico sintetizadas a partir de moléculas de ARN aisladas, donde la sonda tiene una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido de acuerdo con la Reivindicación 7 o la Reivindicación 9, o su complemento, y
(b) la detección de la formación de híbridos de la sonda de ácido nucleico y sus moléculas de ARN de prueba o las moléculas de ácido nucleico sintetizadas,
donde la presencia de los híbridos indica la presencia de ARN del Ligando del zalpha11 en la muestra biológica;
y donde dicho Ligando del zalpha11 es un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9.
29. El método para detectar la presencia de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9 en una muestra biológica, que comprende los siguientes pasos:
(a) el contacto de la muestra biológica con un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo, de acuerdo con la Reivindicación 17, donde el contacto se lleva a cabo en condiciones que permiten la unión del anticuerpo o el fragmento de anticuerpo a la muestra biológica, y
(b) la detección de cualquier cantidad de anticuerpo unido o fragmento de anticuerpo unido.
30. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.
31. El uso de acuerdo con la Reivindicación 30, donde dicho polipéptido tiene una identidad de, al menos, un 95% con una secuencia de residuos de aminoácidos que comprende la secuencia que se muestra en la SEC. ID. N.º 2, desde el residuo 32 hasta el 162.
32 El uso de acuerdo con la Reivindicación 31, donde el polipéptido comprende una secuencia de residuos de aminoácidos como se muestra en la SEC. ID. N.º 2, desde el residuo 32 hasta el 162.
33. El uso de acuerdo con las Reivindicaciones 31-32, para reducir la proliferación de células B o T neoplásicas.
34. El uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 30-32, para el tratamiento de la leucemia, donde dicho polipéptido se encuentra en la forma de una proteína de fusión con saporina.
35. El uso de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 30-32, para el tratamiento del linfoma, donde dicho polipéptido se encuentra en la forma de una proteína de fusión con saporina.
36. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las Reivindicaciones 1-9 para uso con fines médicos.
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ZA (1) ZA017370B (es)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7198789B2 (en) 1998-03-17 2007-04-03 Genetics Institute, Llc Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity
US6057128A (en) 1998-03-17 2000-05-02 Genetics Institute, Inc. MU-1, member of the cytokine receptor family
US7189400B2 (en) 1998-03-17 2007-03-13 Genetics Institute, Llc Methods of treatment with antagonists of MU-1
MXPA01009074A (es) * 1999-03-09 2002-03-27 Zymogenetics Inc Nuevo ligando zalfa11 de citocina.
WO2003028630A2 (en) 2001-10-04 2003-04-10 Genetics Institute Llc. Methods and compositions for modulating interleukin-21 receptor activity
AU2002336676A1 (en) 2001-11-05 2003-05-19 Zymogenetics, Inc Il-21 antagonists
AU2003243415A1 (en) * 2002-06-07 2003-12-22 Zymogenetics, Inc. Use of il-21 in cancer and other therapeutic applications
MXPA05000655A (es) 2002-07-15 2006-02-22 Harvard College Metodos y composiciones para modular el desarrollo y la funcion de las celulas t helper (th).
CA2501807A1 (en) * 2002-10-11 2004-04-22 Novo Nordisk A/S Treatment of allergic conditions by use of il 21
RU2005113992A (ru) * 2002-10-11 2005-10-27 Ново Нордиск А/С (DK) Лечение аллергических состояний с использованием il-21
RU2354703C2 (ru) * 2002-12-13 2009-05-10 Займодженетикс, Инк. Продуцирование il-21 в прокариотических клетках-хозяевах
RU2005131852A (ru) 2003-03-14 2006-04-20 Уайт (Us) Антитела против человеческого рецептора il-21 и их применение
US20050124044A1 (en) * 2003-06-19 2005-06-09 Cunningham Mark R. Interleukin-21 analogs
DE602004031341D1 (de) 2003-07-21 2011-03-24 Transgene Sa Multifunktionelle cytokine
DE602004031681D1 (de) 2003-07-21 2011-04-14 Transgene Sa Multifunktionelle Cytokine
CA2538083A1 (en) * 2003-09-25 2005-04-07 Zymogenetics, Inc. Methods of treating autoimmune diseases using il-21
US20060228331A1 (en) * 2003-10-10 2006-10-12 Novo Nordisk A/S IL-21 Derivatives and variants
CN102516386A (zh) * 2003-10-10 2012-06-27 诺沃挪第克公司 Il-21衍生物
ES2428358T3 (es) 2003-10-17 2013-11-07 Novo Nordisk A/S Terapia de combinación
EP1708737A2 (en) * 2004-01-15 2006-10-11 Novo Nordisk A/S Use of interleukin-21 for the treatment of autoimmune diseases and allograft rejection
EP2033662B1 (en) 2004-01-21 2012-10-17 Novo Nordisk Health Care AG Transglutaminase mediated conjugation of peptides
GT200600148A (es) 2005-04-14 2006-11-22 Metodos para el tratamiento y la prevencion de fibrosis
RU2412199C2 (ru) 2005-04-18 2011-02-20 Ново Нордиск А/С Варианты ил-21
PL1963369T3 (pl) * 2005-11-28 2013-10-31 Zymogenetics Inc Antagoniści IL-21
CA2666426A1 (en) 2006-10-26 2008-05-02 Novo Nordisk A/S Il-21 variants
EP2109620B1 (en) 2006-12-21 2012-08-22 Novo Nordisk A/S Interleukin-21 variants with altered binding to the il-21 receptor
EP3103813A1 (en) 2007-12-07 2016-12-14 ZymoGenetics, Inc. Anti-human il-21 monoclonal antibodies
AR071885A1 (es) 2008-05-23 2010-07-21 Wyeth Corp Proteinas de union al receptor de interleuquina 21
JP2011520989A (ja) 2008-05-23 2011-07-21 ワイス・エルエルシー インターロイキン−２１受容体の結合性タンパク質を利用する治療法
CA2739357A1 (en) 2008-09-23 2010-04-08 Wyeth Llc Methods for predicting production of activating signals by cross-linked binding proteins
CN102021196B (zh) * 2009-11-20 2013-06-26 上海杰隆生物工程股份有限公司 毕赤酵母生产重组人白细胞介素21的方法
CA2877933A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Yuri Bushkin Rapid assays for t-cell activation by rna measurements using flow cytometry
WO2015110930A1 (en) 2014-01-24 2015-07-30 Pfizer Inc. Modified interleukin 21 receptor proteins
EP2982693A1 (en) * 2014-08-07 2016-02-10 Affimed Therapeutics AG CD3 binding domain
EP4149539A4 (en) * 2020-05-14 2024-06-12 Metaclipse Therapeutics Corporation COMPOSITIONS AND METHODS FOR DETECTION AND TREATMENT OF SARS-COV-2 INFECTION
US12012441B2 (en) 2020-10-26 2024-06-18 Neptune Biosciences Llc Engineered human IL-21 cytokines and methods for using the same
CN112662694A (zh) * 2020-12-25 2021-04-16 康九生物科技(长春)有限公司 一种麦芽糖结合蛋白、麦芽糖结合蛋白表达载体、重组工程菌及其应用
US20250000946A1 (en) * 2021-09-26 2025-01-02 WuXi Biologics Ireland Limited Il-2 variants and fusion proteins thereof

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4615974A (en) 1981-08-25 1986-10-07 Celltech Limited Yeast expression vectors
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US4650764A (en) 1983-04-12 1987-03-17 Wisconsin Alumni Research Foundation Helper cell
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
EP0184576B1 (en) 1984-12-06 1990-06-27 Fina Research S.A. Promoters for the expression of foreign genes in yeast, plasmids comprising them, and uses thereof for the production of polypeptides
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
GB8611832D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
US4980289A (en) 1987-04-27 1990-12-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Promoter deficient retroviral vector
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
ATE140963T1 (de) 1988-01-22 1996-08-15 Zymogenetics Inc Verfahren zur herstellung von sekretierten rezeptoranalogen
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5124263A (en) 1989-01-12 1992-06-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Recombination resistant retroviral helper cell and products produced thereby
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
US5162222A (en) 1989-07-07 1992-11-10 Guarino Linda A Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
US5298418A (en) 1991-09-16 1994-03-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Cell line isolated from larval midgut tissue of Trichoplusia ni
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
CA2144651A1 (en) 1992-09-14 1994-03-31 Timothy J. Miller Immortalized cells and uses therefor
WO1995007358A1 (en) 1993-07-30 1995-03-16 University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey Efficient gene transfer into primary lymphocytes
RU2220979C2 (ru) * 1993-08-12 2004-01-10 Иммьюнекс Корпорейшн ПОЛИПЕПТИД ЛИГАНДА flt3 (ВАРИАНТЫ), ПОЛИНУКЛЕОТИД(ВАРИАНТЫ), ЭКСПРЕССИРУЮЩИЙ ВЕКТОР(ВАРИАНТЫ), ЛИНИЯ КЛЕТОК СНО (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ПОЛИПЕПТИДА ЛИГАНДА flt3 (ВАРИАНТЫ), ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ)
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
US5795966A (en) * 1995-02-22 1998-08-18 Immunex Corp Antagonists of interleukin-15
AU1158297A (en) 1995-11-09 1997-05-29 Zymogenetics Inc. Production of gad65 in methylotrophic yeast
WO1998002565A1 (en) 1996-07-17 1998-01-22 Zymogenetics, Inc. TRANSFORMATION OF $i(PICHIA METHANOLICA)
IL128072A0 (en) 1996-07-17 1999-11-30 Zymogenetics Inc Preparation of pichia methanolica auxotrophic mutants
JP4215172B2 (ja) 1996-12-03 2009-01-28 アムジェン フレモント インク． 複数のＶ▲下Ｈ▼およびＶ▲下κ▼領域を含むヒトＩｇ遺伝子座を有するトランスジェニック哺乳動物、ならびにそれから産生される抗体
IL122818A0 (en) * 1997-07-10 1998-08-16 Yeda Res & Dev Chimeric interleukin-6 soluble receptor/ligand protein analogs thereof and uses thereof
US6057128A (en) * 1998-03-17 2000-05-02 Genetics Institute, Inc. MU-1, member of the cytokine receptor family
MXPA01009074A (es) * 1999-03-09 2002-03-27 Zymogenetics Inc Nuevo ligando zalfa11 de citocina.
US9418201B1 (en) 2015-11-19 2016-08-16 International Business Machines Corporation Integration of functional analysis and common path pessimism removal in static timing analysis

Also Published As

Publication number Publication date
PL351160A1 (en) 2003-03-24
NZ514708A (en) 2005-01-28
EP1165791A2 (en) 2002-01-02
JP4405686B2 (ja) 2010-01-27
CN1927883A (zh) 2007-03-14
DE60036930D1 (de) 2007-12-13
EP1165791B1 (en) 2007-10-31
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JP2002537839A (ja) 2002-11-12
IL145288A0 (en) 2002-06-30
HUP0200418A3 (en) 2003-12-29
RU2004126135A (ru) 2006-02-10
WO2000053761A2 (en) 2000-09-14
AU2005200240A1 (en) 2005-02-17
EP2295577A2 (en) 2011-03-16
NO20111085L (no) 2001-11-09
CN101575377B (zh) 2012-12-26
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PL207350B1 (pl) 2010-12-31
CN101575377A (zh) 2009-11-11
IL145288A (en) 2010-11-30
BR0008772A (pt) 2002-05-07
IL207424A (en) 2013-04-30
ZA017370B (en) 2002-06-26
PT1165791E (pt) 2008-01-16
CN1927883B (zh) 2011-09-21
AU3731200A (en) 2000-09-28
IL195713A (en) 2010-11-30
EP1881070A3 (en) 2008-03-05
MXPA01009074A (es) 2002-03-27
KR20010103794A (ko) 2001-11-23
UA84387C2 (ru) 2008-10-27
EP1881070A2 (en) 2008-01-23
DE60036930T2 (de) 2008-10-09
EP1881070B1 (en) 2012-10-03
AU777842B2 (en) 2004-11-04
CN100500846C (zh) 2009-06-17
HU229148B1 (en) 2013-09-30
ATE377076T1 (de) 2007-11-15
CA2366921A1 (en) 2000-09-14
IL207403A (en) 2012-03-29
HUP0200418A2 (hu) 2002-05-29
NO20014364L (no) 2001-11-09
NO331551B1 (no) 2012-01-23
EP2295577A3 (en) 2012-08-08
CZ302921B6 (cs) 2012-01-18
RU2346951C2 (ru) 2009-02-20
WO2000053761A3 (en) 2000-12-21
CN1827639A (zh) 2006-09-06
BR0008772B1 (pt) 2011-11-01
CN1378595A (zh) 2002-11-06
DK1165791T3 (da) 2008-02-11

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