HU229148B1 - Human cytokine as ligand of the zalpha receptor and uses thereof - Google Patents

Description

A többsejtes szervezetek sejtjeinek szaporodását és reneíálódását hormonok és polipeptid növekedési faktorok szabályozzák, Ezek a diffundálő molekulák lehetővé teszik a sejteknek, hogy egymással kommunikáljanak, és összehangolva hassanak, ezzel sejteket és szerveket hozva létre, valamint kijavítsák a károsodott szöveteket. A hormonok és növekedési faktorok közé tartoznak például a szteroiő hormonok (azaz például az ösztrogén, a tesztoszteronk a paraiiroíd hormon, a tüszőserkentő hormon, az mterleukinok, a vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF), az epidermálís növekedési faktor |EGF), a .granuloeita-makrofág telepser kentő faktor (GM-CSF1, az eritropoíetin (EPO) és a kalcitorhn.

A hormonok és növekedési faktorok úgy befolyásolják a ceiluláris mefabolízmnsf, hogy receptorokhoz kötődnek. A receptorok lehetnek integrális. membránfehórjék, amik a sejten belül a jeladó bioszintézis utakhoz, azaz a szekunder messenger rendszerekhez kapcsolódnak. A receptorok más osztályai oldható molekulák, azaz például a transzkripciós faktorok,

A citokmék általában stimulálják a hematopoietíkus leszármazási sorba tartozó sejtek szaporodását vagy differenciálódását, vagy a test immun- és gyulladásos reakció-mechanizmusaiban vesznek részt, A hematopolézist befolyásoló citokin lehet például az eritropoíetin (EPO), ami serkenti a vörös vérsejtek kifejlődését: a trombopoie tin Π'ΡΟ), ami a megakax'iocita leszármazási vonalba tartozó sejtek fejlődését segíti elő; valamint a granulocita telepφφ « φ >

« ΦΦ serkentő faktor (G-CSF), ami a nentrofitek fejlődését segíti elő.

Ezek a citokinek jól használ! helyreállításában anéx szexivé vagy a normális vorösvérselt-szi , es r

lést kapó betegeknél.

Az ínterleukinok a citokinek olyan családját képezik, amik befolyásolják az immunválaszokat, beleértve a gyulladást. Az interleukinok számos különböző gyulladásos kórformát okoznak.

Az immunválasz központjában a T-sejt áll, ami sok különböző cltökint termel, és az antigének ellen adaptív immunitást eredményez. A T-sejtek' által termelt citokineket 1-es és 2-es csoportra osztották [Kelsö,_: A.: Immun, Cell Bioi, 76, 800-317 (1998)). l-es típusú cl tokin az mterlcukin-2, ínferferon-y, az LT-o, ezek a gyulladásos reakciókban, a virális immunitásban, az intracdluláris parazita immunitásban és az allograít kilökődésben játszanak szerepet. 2-es típusú ciiokín az toterleukin-4, az ínterleukin-5, az lnterleukin-6, az interleukin-10 és az lnterleukín-13, ezek a humorálís válaszokban, a bélférgek elleni immunitásban és az aUergiás válaszokban játszanak szerepet. Vannak olyan bizonyítékok, amik azt. sugallják, hogy az I-es és 2-es típusú eitokineket termelő T-sejt populációk különböző típusú gyulladásos szövetbe vándorolnak.

Az érett T-sejtek aktiválhatok, például egy antigénnel vagy más stimulussal, hogy például citokineket, biokémiai jeladó molekulákat vagy' receptorokat termeljenek, amik tovább befolyásolják a T-sejt populáció sorsát,

A B-sejtek a felszínükön levő receptorokon keresztül aktiválhatók, beleértve a B-sejt receptort és más kiegészítő molekuο* *

Iákat, amik kiegészítő sejt-funkciókat végeznek, azaz például citokineket termelnek.

A természetes ölősejtek (NK) a T-sejtek és a B-sejtek közös őssejtjei, és az ímmunfelügyélethen van szerepük, Az NK sejtek, amik a vér limfociíáínak 15%-át képezik, nem expresszálnak antigén receptorokat,, ennek következtében nem használják az MBC felismerést, a megcélzott sejthez való kötődés előfeltételeként Az NK sejtek bizonyos tumorsejtek és vírusfertozott sejtek felismerésében és elpusztításában játszanak szerepet, Ügy gondolják, hogy az NK sejteknek in vívó aktiválásra van szükségük, azonban az NK sejtekről ín oüro kimutatták, hogy bizonyos típusú tumorsejteket aktiválás nélkül ís elpusztítanak.

Ezeknek a citoktneknek a demonstrált ín oííro aktivitásait illusztrálja az abnormális klinikai potenciál, és a más citokínek, citokín antagonisták és eítokin agonísták irányában megnyilvánuló igény. A jelen találmányban ezt az igényt akarjuk kielégíteni, űj hemopoietikus citokín receptorok, valamint ezekkel rokon készítmények és módszerek biztosításával.

A jelen találmány tárgyát az ilyen említett, valamint, más felhasználási célokra, amiknek a szakterületen jártas szakember számára nyüvánvalőaknak keli lenniük a leírásban, található kitanításbób

Az 1. ábrán a humán interleukín-2, humán ínterleukiri-15, a zalphall lígandum. (2. számú szekvencia), a humán ínterlenkin-4, az egér mterleukin-4, a humán GM-CSF és egér GM-CSF többszörös illesztése látható.

A találmány részletes ismertetése előtt előnyős lehet, ha az alábbi szakkifejezéseket definiáljuk.

.«*♦·* «·*· φ * φ** *-♦ ·» «

Az „affinitás jelölés szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy olyan polipeptid szegmens, ami egy második polipepfídhez kapcsolható·, hogy ezzel a 2. polipeptid tisztítását vagy kimutatását tudjuk biztosítani, vagy a 2. polipeptldnek egy kapcsolódási helyet biztosít egy szubsztráthoz. Elsősorban olyan pepiid vagy fehérje használható affinitás jelölésként, amihez egy ellenanyag, vagy más specifikus kötő ágens hozzáférhető. Affinitás jelölés lehet egy polihisztidin szegmens (Nilsson és mtsai: EMBO Journal 4, 1075 (198-5); Nilsson és mtsai: Methods in

Enzymology 198, 3 (1991): a glutation S transzferáz (Smith and Johnson: Gene 67, 31 (1988)1; a Glu-Glu affinitás jelölés IGrussenmeyer és mtsai; Froceedíngs of the National Aeademy of Sciences, USA 82, 7952-7954 (1985)1; a substance P, a Flag^

ÍHop és mtsai: Eiotechnoiogy 6, 1204-1210- (1988)1, a sztreptavidínt kötő fehérje, vagy más antigén epitop vagy kötő dómén (Ford és mtsai: Protein Expression and Purifieafion 2, 95107 C l 991 )1. Az affinitás jelölést kódoló DNS~ek kereskedelmi Forgalomban vannak (lásd például Pharmacia Biotech, Píscataway, NJ).

Az „allélvariáns” szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy génnek két vagy több alternatív formája, amik ugyanazt a kromoszómálís fókuszt foglalják el. Az allélvariácló természetes körülmények között mutációból származik, vágj/ származhat a populáció fenotípusos polimorfizmusából is. A génmutációk lehetnek csendesek (amikor a kódolt pepiidben nincs változás), vagy kódolhatnak megváltozott aminosav szekvenciával rendelkező polípeptídeket Az allélvariáns szakkifejezést a továbbiakban olyan fehérje leírására is használjuk, amit egy gén allélvariánsa

X ♦* φ #.9

Az „N-terminális” vagy X-terminális’’ szakkifejezés a továba polipé ptidekhen különböző pozíciókat jelöl. Ahol a szövegkörnyezet megengedi, ott ezeket a szakkifejezéseket. egy polipeptid egy bizonyos szekvenciájára vagy részére való hivatkozásként használjuk, hogy ezzel közelséget, vagy relatív pozíciót jelöljünk meg. Ha például egy adott szekvencia egy pepiidben Cterminális pozícióban van egy referencia szekvenciához viszonyitva, akkor ez azt jelenti, hogy közel van a referencia S2 zenein C~terminálisához, de nem szükséges, hogy a Lid. C-terminálisán legyen,

A „komplement/anti-kompiement pár” szakk zes tése nem-azonos egységek, amik megfelelő körülmények között

3.

nem kovalens kötéssel kapcsolódó stabil pás és az avidin (vagy sztreptavídínl prototípusos. tagjai egy kon ment/anti-komplemenl párnak. Más ment/antí-komplement párok például a receptor/ligandum párok, az. ellenanyag/antigén (vagy haptén, vagy epitop) párok, az értelmes / antis zen sz polinukleotid párok és hasonlók. Ahol a komplement/anti-komplement pár ezt követő disszociációjára van szükség, ott a komplement/antí-komplement pár kötési nitása előnyösen <l,0⁹/mói.

Az „egy polinukleotid molekula komplementjei” szak zés jelentése égy olyan polinukleotid molekula, ami k tér bázispár szekvenciával rendelkezik, és a referencia szekvenciához viszonyítva fordított az orientációja. Például az 5' ATGCACGGG 3' szekvencia komplementer az 5 CCCGTGCAT 3' szekvenciával,

A „degenerált nukleotid szekvencia” szakkifejezés jelentése egy olyan nukleotid szekvencia, ami egy vagy több degenerált

« * »⁵

kodont tartalmaz la pollpepiídet kódoló, referencia polinukleotid molekulával összehasonlítva), A degeneráll kodonok eltérő nukleotid tripletteket tartalmaznak, de ugyanazt az aminosav csoportot kódolják (azaz például a GAU és a GAC trlplett is Asp-t kódol).

Az „expressziős vektor szakkifejezést olyan DNS molekula jelölésére használjuk, legyen az lineáris vagy cirkuláris, amiben van egy olyan szegmens, ami egy számunkra érdekes poiipeptídet kódol, működés szempontjából további olyan szegmensekhez kapcsolva, amik biztosítják a transzkripcióját. Ilyen további szegmens lehet promoter és terminátor szekvencia, és tartalmazhat egy vagy több replikációs origót, egy vagy több szelekciós markért, fokozol, egy poliadenilezési szignált, stb. Az expressziós vektorok általában plazmld vagy vlrális DNS-bőI származnak, vagy tartalmazhatják mindkettőnek az elemeit.

Az „izolált”' szakkifejezés, ha egy polinukleotidra. alkalmazzuk, akkor azt jelenti, hogy a polínnkleotidot eltávohtottuk eredeti genetikai környezetéből, és így mentes más külső vagy nemkívánt kódoló szekvenciától, és olyan alakban van, hogy használható fehérjék génsebészeti úton való előállítására alkalmas- rendszerekben való felhasználásra. Az ilyen izolált molekulák olyanok, amiket eltávolítottunk a természetes környezetükből, és tartalmaznak cDNS, valamint genomiális kiónokat. A jelen találmány .szerinti izolált DNS molekulák mentesek más, olyan génektől, amikkel normális körülmények között kapcsolatban állnak, de tartalmazhatnak természetben előforduló 5 és 3”, nem-transzlálódő régiókat, azaz például promotereket és terminátorokat. A kapcsolódó régiók azonosítása a szakterületen

X*** * ♦ * φφφ φ* ♦ φφφ φ * φ<*

átlagos jártassággal rendelkező szakember számára evidens ÍDynan és Tfian: Natúré .316, 774-778 (1985)1

Egy „izolált” polipeptíd vagy fehérje egy olyan polipeptíd vagy fehérje, ami a természetes .környezetétől eltérő környezetben található, azaz főleg más, állati nem vérben vagy állati szövetben. Egy előnyben, részesített megvalósítást mód szerint az izolált pölipeptid lényegében mentes más polípeptide eredetű polipep Üdéktől. Az az előnyös, ha a pollpeptideket erősen tisztított formában biztosítjuk, azaz 95%-nál nagyobb tisztaságban, még előnyösebben 99%-ná.l nagyobb tisztaságban. Ha a szövege tggesöen használjuk, akkor az „Izolált” szakkifejezés nem zárja, ki, hogy ugyanaz a polipeptíd alternatív fizikai formában, azaz például dimerek formájában, allernatíve gllkozilezett formában, vagy valamilyen származék formájában legyen

A „neoplasztikus” szakkifejezés, ha sejtekre vonatkozik, olyan sejteket jelent, amik új és abnormális szaporodáson mennek át, főleg abban a szövetben, amiben a szaporodás szabályozatlan és progresszív, ez neoplazmát eredményez, A neoplasztikus sejtek lehetnek rosszíndulatúak, azaz például Invazivak vagy metasztatikusak, vagy lehetnek jóidnlatúak,

A „működés szempontjából kapcsolt” szakkifejezés, ha DNS szegmensekre vonatkozik, akkor azt jelzi, hogy a szegmensek úgy vannak elrendezve, hogy céljuk eléréséhez Összehangoltan működnek, azaz például a transzkripció a promoterben inieiálódik, majd a kódoló szegmensen keresztül a termínátorig folytatódik.

Az „ortológ” szakkifejezés olyan, egy fajhői származó polipepiidet vagy fehérjét jelöl, ami funkcionális megfelelője egy * *

Φ ΦΦ>> Xú. Az. ortomásik fajból származó polipepfidnek vagy lógok közötti szekvencia-eltérések a speciáeíő következményei.

A „párologok” egy szervezet által termelt eltérő, de szerkezetileg rokon fehérjék, A paralógokről azt gondolják, hogy géndupkkáeíőböl származnak. Például az alía-globim a bétaglobín és a mioglobln. egymás paralógjai.

Egy „pali.nukleotid” dezoxíribonukleotid vagy ríbonukleotíd bázisok egyszálú vagy kéfszálú polimerje, az 5' iránytól a 3 irányban leolvasva. A pollnukleotldok lehetnek RNS-ek és DNSek, és izolálhaíók természetes forrásokból, szintetizálhatok in o/íro, vagy előállíthatok természetes és szintetikus molekulák kombinációjaként. A polmukleotidok méretét bázispáí (rövidítve ni an {„ntl vagy („kb”) fejezhetjük ki. Ahol a. szövegkörnyezet lehetővé teszi, ott az utóbbi két szakkifejezés olyan poilnukleotidokat. is leírhat, amik egyszálúak vagy kétszálúak, Ha a szakkifejezést kétszálú molekulákra alkalmazzuk, akkor a teljes hosszúságot jelenti, és megállapodás szerint ekvivalens a „bázispárok” szakkifejezéssel, A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy egy kétszálű polinukleotid két szálának a hossza enyhén el térhet egymástól, és a végeik az enzimatikus hasítás következtében egyenetlenek; ezért egy kétszálű poiinukleoiid molekulában nem mindegyik nukleoüdnal ária.

A „polipeptld” szakkifejezés jelentése aminosav polimerje, amit peptídkötések tartanak össze, függetlenül hogy természetes közegből izoláljuk, vagy szintetikusan állítji elő, A körülbelül 10 aminosav csoportnál rövídebb polípeptldeket nevezzük általában „pepiidéin

A „promoter” szakkifejezést a továbbiakban a szakterületen, általánosan használt értelmében használjuk, azaz egy gén egy részét jelöljük vele, ami olyan DNS szekvenciákat tartalmaz., amik biztosítják: az RNS pollmeráz kötődését és a transzkripcióinicíáeióját. A promoter szekvenciák általában, de nem mindig, a gének 5 ' nem kódoló régióiban találhatók.

A „fehérje' egy makromolekula, ami egy vág tíd láncot tartalmaz. A fehérje tartalmazhat neninenseket is, azaz például szénhidrát csoportokat. A szénhidrátokat és egyéb, nem-peptid komponenseket a sejt adhatja a fehérjéhez a fehérje előállítása során, és ez a sejt típusától függően változik, A fehérjéket a továbbiakban, az aminosav csoportjaik által meghatározott gerinc-struktúra alapján definiáljuk; az olyan szubsztituenseket, mint például a szénhidrát csoportokat, általában nem definiáljuk, de azért jelen lehetnek,

A „receptor szakkifejezés jelentése a továbbiakban egy sejthez kapcsolódó fehérje, vagy egy ilyen fehérje polipeptid alegysége, ami egy biológiailag aktív molekulához (a „ligándonihoz”} kötődik, és befolyásolja a ligandumnak a sejtre gyakorolt hatását. A ligandumnak a receptorhoz- való kötődése a receptor konformációs változását eredményezi (és néhány esetben a receptor multímerizáclóját, azaz az azonos vagy eltérő receptor alegységek asszociációját), ami kölcsönhatásokat okoz a sejtben az effekfor domén(ck) és más molckulafák). között. Ezek a kölcsönhatások viszont a sejt metabolizmusának változását eredményezik. A metabolizmus események közé, amik a receptor-ligándum kölcsönhatásokhoz kapcsolódnak, tartozhat a gén transzkripció, a foszforílezés, a defoszforiiezés., a seifszaporodás, a ciklikus. AMP termelés, a sejt kalciumtartaímának mobilizálása, a

ΙΟ #99 » * membrán lipldek. mobilizálása, a. sejttapadás, az toozit hidrolízise és a foszfolipídek hidrolízise. A sejtfelszíni citokin receptorokat multi-domén struktúra jellemzi, amint azt az alábbiakban részletesebben tárgyaljuk. Ezek a receptorok a sejtmembránban egy transzmembrán dom-énnel vannak rögzítve, amit hidrofób amínosav csoportok szekvenciája jellemez (tipikusan, körülbelül 21-25 csoport), .amit általában pozitív töltésű csoportok (kys vagy Arg) határolnak, A récéi lehetnek általában membránhoz kötöttek, citoszólosok vagy sejtmagosok; lehetnek monomerek (azaz például tír old serkentő hormon receptor, bétaadrenerg receptor) vagy multimerek (azaz például PDGF receptor, növekedési hormon receptor, ínterleukln-3 receptor, GM-CSF receptor, G-CSF receptor, eritropoletín receptor és ínterleukin-8 receptor),

A „szekréciós szignálszekvencia” szakkifejezés jelentése egy olyan DNS szekvencia, ami egy polipeptidet kódol (egy „szekréciós pepiid), ami, egy nagyobb polipeptid komponenseként, a nagyobb polipeptidet keresztülvezérli annak a sejtnek a szekréciós bioszintézis utján, amely sejtben megszintetizálődotk A. nagyobb pepiid általában lehasad, hogy a szekréciós pepiid eltávolítődjon a szekréciós bioszintézis úton való tranzit során.

Az „illesztési variáns” szakkifejezést a továbbiakban az egy génről átíródott RNS alternatív formáinak jelölésére használjuk. Az illesztési variáció természetes eredetű, egy átírt RNS molekulában levő, vagy kevésbé általánosan külön átírt RNS molekulákban levő alternatív illesztési helyek működésének eredménye, és ugyanarról a génről több különböző niRNS-t eredményez. Az illesztési variánsok eltérő amínosav szekvenciával rendelkező polipepbdeket kódolhatnak. Az illesztési variáns szakkifejezést arra >«** **♦* * * « φ » * * # Φ

5«.*. ♦.»·* * * t * * * * *'*ί ** ** is használjuk a továbbiakban, hogy egy génről átíródott mRNS •illesztési variánsai által kódolt fehérjét jelöljük vele .

A polimerek pontatlan analitikai módszerekkel (azaz- például gélelek troforézisseh meghatározott molekulasúlya és hossza nyilvánvalóan hozzávetőleges érték, Ha egy ilyen értéket úgy fejezünk ki, hogy „körülbelül X”, vagy „hozzávetőleg” X, akkor az X deklarált értéke ± 10%-os pontosságú.

Az összes idézett publikációt teljes egészében referenciának tekintjük.

A jelen találmány részben egy olyan új DNS szekvencia felfedezésén alapul, ami egy olyan fehérjét kódol, aminek a struktúrája egy négy hélixet tartalmazó köteghől álló cítokiné, Azalábbiakban részletesen ismertetett klónozást eljárások, szaporodási vizsgálatok és kötési vizsgálatok alkalmazásával egy új .11ganduni polipeptidet kódoló poliuukleotid szekvenciát azonosítottunk, aminek nagy a speeihtása a korábbi árva zalphall receptorhoz. Ezt a poiipeptid ligandumot, amit zalphall. ligándumnak nevezünk, CD3-ra szelektált, aktivált humán perifériális vérsejtekből (hPBC-k) készített cDNS· könyvtárból izoláltuk. A CDS egy sejtfelszíni rn.ar.ker, ami egyedileg jellemző a limfoid eredetű, főleg T-sej lekre.

Az· alább következő példákban egy olyan sejtvonalat, ami életben maradásához és növekedéséhez a zalphall árva. receptor bioszintézis úttól függ más növekedést faktorok távollétében, használtunk a zalphall ligandumot kódoló cDNS forrásának keresésére. Az előnyben részesített növekedési faktor dependens sejtvonal, amit a zalphall receptor transzfektálására és expresszálására használunk, a BaF3 sejtvonal íPalacios és Steínmetz: Cell 41, 727-734 (1985); Mathey-Prevot és mtsai:

*# ♦

χ * *· * ♦ X φ ί ♦.

Φ *« » .ecular <& Ceilular Biology 6, 4133-4135 (1986)). Azonban más növekedési faktor depenöens sejtvonal, azaz például az PDC-P1 (Hapel és mtsai: Blood 64» 786-790 (1984)1, és az MO7 (Kiss és mtsai: Leukémia 7, 235-240 (1993)) is alkalmas erre a célra.

A zalpha 11 receptor aminosav szekvenciája azt mutatja, hogy a kódolt receptor az I-es osztályba tartozó receptor alcsaládba tartozik» ami. tartalmazza, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az ixiterieukin-2, az interleukín-4, interlenkín-7» EPO, TPÖ, GM-CSF és G-CSF receptorokat [Cosniam „The

Hematopoietin Receptor Superfamíly”, Citokine 5(2), 95-106 (1993)). Á zalphall receptort az US99./22149 számú Amerikai Egyesült ÁMamok-bell szabadalmi leírásban ismertetik, A zalphal 1 receptor m.RNS~ének szöveteloszlásából kiderült, hogy a nyirokcsomóban, a perifériális vér leukocitákban (PBL-ek), a lépben, a csontvelőben és a csecsemőmirigyben expresszálódík. Emellett a mRNS bőségesen fordul elő a Burkitt limfómából származó Raji sejtvonalban (ATCC No. CCL-86). A receptor szöveteloszlása azt sugallja, hogy a megjósolt zalphal 1 ligandum célpontjai hematopoietikus eredetű sejtek, pontosabban limfoid elosejtek és limfoid sejtek. Más ismert négy-hélix-köteges citokin, ami a limfoid sejtekre hat, az interleukín-2, az interleukín-4, az iriterieukm-7 és az intedeukín-15. A négy-hélix-köteges citokínek összefoglaló leírása megtalálható a szakirodalomban [Nicola és mtsai:. Advances in Protein Chemístry 52, 1-85 (1999); Kelso, Az Immun. Cell Biot 76, 300-317 (1998)).

A CD3e szelektált, PMA/Ionomicinnel stimulált kondicionált táptalajok (CM) támogatják a zalphall receptort expresszálo BaF3 sejtek növekedését, amik egyébként az interleukín-3-től függenek. Az azokból a sejtekből származó kondicionált tápta» «··♦·** * *

χ* * φ:

* X * » » 4 »

♦ *

Φ « i

lajok, amely sejtek: 1) vagy PMA/ionomieinnel vannak stimulálja; vagy nem: 2} C.D3-mai vannak szelektálj íPMA-ionomicm stlmulálással vagy anélkül) nem támogatják a BaF3/zalp.hal I receptor sejtek növekedését, A kontroll kísérletek azt demonstrálják, hogy ez a szaporodást elősegítő aktivitás nem tulajdonítható más ismert növekedési faktoroknak, és az ilyen kondicionált táptalajnak az a képessége, hogy elősegíti a zalphall receptort exp~ resszáló sejtek szaporodását, semlegesíthető a receptor oldható formájával.

A CD3+ szelektált, PkLA/ionom.icln.-stimuIált humán perifériális vérsejtekkel érintkező, a zalphall receptort expresszáló BaK3 sejteket a tenyészetek vizuális Inspekciójával és/vagy szaporodási vizsgálattal azonosítjuk.. Számos megfelelő szaporodási esszé ismert a szakterületen, és ide tartoznak egy festék, azaz például az Alymar Blue™ (Accumed International, Westlake, öhioj, vagy a 3-(4,5-dímet.ilt.iazol-2-il)-2,5 tetrazőlium hromid ÍMTTj íMosrnan: ,

65, 55-63 (1983}]: a 3-(4,5-dimetiI-fiazol~2-ll)-5-3-karboximetoxtíenil-2II-tetrazókum; a 2,3-bisz(2 ~rn etoxi-4-m tro- 5 -sznlfofenil)~5-íléniIam.ín.olkarbonlÍl~2H~tctrazólíum hidrcedd; és a cianoditolil-tetrazőhum klorid (kereskedelmi forgalomban beszerezhető lmmunologica.1 Methods a Polyscienoes, Inc.-tői, Warringten, PA) redukcióján alapuló esszék, a miiogenezis esszé azaz sének mérése; a festékkízárásos esszék, amikben például naftalin-feketét vagy- tripánkéket használunk; a festék felvételén alapuló esszék, azaz. például amikben díacetil-fluoreszceínt használunk; és a króm felszabadulásán alapuló esszék (Freshuey: Culture of Animál Cells; A Manual of Basic Technique, 3« kiadás ♦·»*♦ ***'· $ · _{Λ β} *** * Wíley-tiss (19941, amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk!

cDNS könyvtárat készítünk CDS-r szelektált, PMA-val és ionomicinnel stimulált primer humán perifériális vérsejtekbő! A CD3+ szelektált, PMA-val és ionomicinnel stimulált primer humán perifériális vérsejtekből készített cDNS könyvtárat több cDNS molekulát tartalmazó pool-okra osztjuk, majd egy gazdasejt-vonalba transzfektáljuk, azaz például BHK 570 sejtekbe (ATCC letéti szám 10314), A transzfektált gazdasejteket olyan közegben tenyésztjük, ami nem tartalmaz exogén növekedési faktorokat, és összegyűjtjük a kondicionált táptalajt. Vizsgáljuk, hogy a kondicionált táptalaj képes-e stimulálni a zalphall receptorral transzfektált haF3 sejtek szaporodását. Azonosítjuk azokat a. cDNS pool-okat, amik a BaF3? zalphall receptor sejteket stimuláló kondicionált táptalajt termelnek. Ezt a pool-ozott plazmid cDNS-t Eschenchia cofí-ba elektroporáljuk. Az egyedi telepekből cDNS-t izolálunk, majd egyenként transzfektáljuk BHK570 sejtekbe. A pozitív kiónokat a BaF3/zalphall receptor szaporodási vizsgálatban adott pozitív eredmény alapján azonosítjuk, majd a speeifitást a szaporodásnak az oldható zalphall receptor felhasználásával való neutralizálása alapján azonosítjuk,

Bgy pozitív Mont izoláltunk, és a szekvencia-elemzésből kiderült, hogy a plaziuid ÖNS-ben levő polínukleotid szekvencia új. A szekréciós szignálszekvencia tartalmazza az 1-es (Meí) aminosavtól a 31-es (Gly) aminosavig terjedő szakaszt, és az érett polipeptid a 32-es (Gin), aminosav csoporttól a 162-es (Ser) aminosav csoportig terjedő szakaszt tartalmazza (a 2. számú szekvencia. alapján).

* *

íS ·#«» *

* ' >

*«$ * talánosságban a cítofcinekről azt tartják, hogy négy alfahéiixes struktúrával rendelkeznek, ezek közül az A, C és D hélix a legfontosabb a ligandum-receptor kölcsönhatásokban, és sokkal erősebben konzerválódott a család tagjaiban. A 2. számú szekvenciavázlaton bemutatott humán zalphall ligandum aminosav szekvenciára hivatkozva a humán zalp humán interleukin-15, a. humán inferleukin-4 és a humán ligandum, a

CSF amínosav szekvencia illesztéséből az zalphal 1 ligandum A héllxét a 2. számú szekvenciavázlat alapján a 41-58-os axninosavak definiálják; a B hélixet a 69-84-es aminosavak definiálják; a C hélixet a 92-105 amlnosavak definiálják és a D hélixet a 135-148-as amínosav csoportok definiálják, A strukturális elemzés azt sugallja, hogy az A/B hurok hosszú, a B/C hurok rövid, és a. C/D hurok párhuzamosan hosszú. Ez a hurok-struktúra egy fel-fel-le-Ie helikális szervez eredményez. A cisztein esoportok teljesen konzerválódnak a zalphall ligandum és az interleukln-15 között, amint az az Ϊ. ábrán látható. Az filterleukin-15 és a zalphall ligandum kozott konzerválódott eiszteín csoportok a 2. számú szekvencia 71-es,

78-as, 122-es és 125-ös arninosav csoportjainak felelnek, meg, A cisztein csoportok konzerválódása megfigyelhető az interleukin2-ben, az mterieukm-4-hen, a GM-CSF-ben és a zalphall ligandum 78-125 amínosav csoportjaiban (2. számú szekvenciavázlat.), amint az az Ί, ábrán látható. A ciszteinek következetes •elhelyeződése a négy héiixes struktúra további igazolását jelenti. Az interleukin-15-öt, az interleukin-2-t. interleukín-4-el, GMCSF-et és a zalphall. ligandumot tartalmazó családban erősen konzerválódott meg a Glu-Phe-beu szekvencia is (lásd a 2. számú

«**·» » —Ί»»’» «

>ν *

•X szekvenciavázlaton a 136-138-as csoportokat, valamint az 1. ábrát},

A zalphall ligandum többszörös illesztések alapján végzett további elemzése (amint azt az 1. ábrán bemutatjuk) azt jósolja, hogy a 2. számú szekvencia 44-es, 47-es és 135-ös aminosav csoportjai fontos szerepet játszanak a .zalphall. ligandumnak a közös receptorhoz való kötődésében. Emellett a zalphall ligándum megjósolt aminosav szekvenciája 57%-os azonosságot mutat a megjósolt humán fehérjével. A humán, és rágcsáló zalpha i 1 ligandum szekvenciái közötti összehasonlítás alapján jól konzerválódott csoportokat találtak azokban a régiókban, amikről azt jósolták, hogy az A és D beiteket kódolják. A zalphai 1 polipeptid itt ismertetett régióit, doménjeit, motívumait·, csoportjait kódoló, megfelelő polinukleotidokat az 1. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

Részletes mutációs elemzést végeztek az interieukin-4-en és az ínterleukin-2-n, amik mind erős rokonságban állnak a zalphall ligandummal. A rágcsáló interleukin-2 elemzése [Zurawsky és mtsaí: EMBO Journal 12, 5113-5119 (1993) azt mutatja., hogy az A és C hőitekben levő csoportok fontosak az interIeukín~2Rj3 kötődésében; a kritikus csoportok az Asps*, az Asnss. és az Asnws. A rágcsáló interleukin-2 A/B hurkában és a B hélixében levő több csoport fontos az interíeukin-2Ra kötődésében, míg a D héllxben csak egyetlen csoport, a. Glmn létfontosságú az mterleukin-2Ro kötődésében, Hasonlóan, az A és C hőitek az interleukin-4 és az interleukin-4Ra közötti kölcsönhatás pontjai fa strukturálisan az interleukin-2Ra-hoz hasonlít), és a D héllxben levő csoportok létfontosságúak az interIeukin-2^:Ra kölcsönhatáshoz (Wang és mtsai: Froecedings of fhe National * » « * * « X X »«-« X « 4«4 X X ♦ * X * X * 9 * ♦ *

XX * #** Λ φ» ««

Academy of Sciences, USA 94, 1657-1662 (1997); Kruse és mtsai; BMBO Journal 11, 3237-3244 (199211. Pontosabban,, a humán ínterleukin-4-ben a Tyr 5 24 Asp-re való mutációja egy an~ tagonistát hoz létre, ami kötődik az lnterleukin-4Ra.-hoz, de nem kötődik az interleukin-2Ra~hoz, és ennek következtében nem képes jelet adni [Kru-se és mtsab E.MBO Journal 11, 3237-3244 il992.it

Míg az A hélix viszonylag jól konzerválódott a humán és rágcsáló zalphall ligandumok között, a C hélix divergensebb. Míg mindkét régió predomináns savas aminosavakat tartalmaz, a különbségek lehetnek felelősek a fajspecifitásért a zalphal l ligandum és „béta” típusú receptora közötti kölcsönhatásért. A. zalphall ligandum AZB hurka és B hélixe jól konzerválódott a fajok között; bár még nem azonosítottak az mterleukin~2Ro.~nak megfelelő· receptor alegységet, az ezen a régión keresztül megvalósuló konzerválódás azt. sugallja, hogy funkcionálisan szignifikáns. A humán és rágcsáló zalphall ligandum D hélixeí is erősen konzerválódtak. A zalphal l receptor antagonístákat a zalphall ligandum D héhxében végzett mutációkon keresztül tervezhetjük meg, Ezek közé tartozik a fehérje csonkítása a Gln.M5»ös csoporttól (2. számú szekvenciái, vagy a Glni4s vagy J1cí48 mutációi (2. számú szekvencia; a humán int.erIeukin-4-ben a Tyrm-nek felei meg) Alá vagy Asp csoportokra. Bármilyen mutáció, ami elrontja a zalphall ligandum helíkális struktúráját, eltörölheti a receptorához való kötődést, és ezzel megakadályozhatja a jeladást.

A négy hélixes· kötegel tartalmazó citoktaeket is csoportosíthatjuk a. komponens hélixeik hossza alapján. A „hosszú hélix” formájú cítokinek 24-30 csoportból álló hclixeket tartalmaznak,

Φ »Χ * φ * * Φ φ V

ΦΧ* ΦΦΧ φ φ ΦΜχ X Φ

Φ '* ΦΦφΧ ♦ Φ φ * «♦Μ Φ*Φ Φ ΦΦ φ!Φ ide tartozik az- interÍeukín-6, a ciliáris neurotróí faktor (CNTFk a leukémia inhibitor faktor (L.IF) és a. humán növekedési hormon (h.GH). A „rövid hélix” formájú citokinek általában 18-21 csoportból állő hélíxeket tartalmaznak, ide tartozik az hiterleukin-2, az interleukin-4 és a GM-CSF. Ügy gondoljuk, hogy a zalphal 1 lígandurn a. rövid hélix formájú ci tokín csoport egy új tagja. A CNTF-et és ínterleukin-6-ot használó vizsgálatokban igazolták, hogy a CNTF hélix kicserélhető az interleukin-8-ban levő ekvivalens hélixre, a kimérának CNTF-et. kötő tulajdonságokat biztosítva. Tehát úgy tűnik, hogy a négy-hélixes citokíneket a strukturális homogenitás alapján lehet meghatározni, függetlenül a szekvencia-azonosságtól, és képesek a kírnérában fenntartani a funkcionális integritást [Kálién és mtsai: Journal of Bíologieal Chcmístry 274, 11859-11867 (1999)]. Ennek következtében a zalphal 1 ligandum helikális doménjeí jól használhatók lehetnek a kiméra fúziós molekulák készítése során, főleg más rövid-hélixes cítokínekkel, hogy meghatározzuk és befolyásoljuk a receptorkötődés specifitását Különösen érdekesek azok a fúziós fehérjék, amiket az A hélix és/vagy a D hélix kombinációjával állítunk elő, valamint azok a fúziós fehérjék, amik kombinálják más rövid formájú citokinek, mint például az interleukín-2, az interleukin-4, az mterleukln-íb és a GM-CSF helikális és hurok dóménjeit. Az 1. táblázatban azokat az aminosav szekvenciákat mutatjuk be, amik az A, B, C és D hélixeket, valamint az A/B, B/C és C/D hurkokat tartalmazzák a zalphal 1 ligandumhoz, az mterteukin-2-höz, az mterleukin-4-.hez, az Interleukin-15-höz és a GM-CSF:Q

* »:«« H ·) $ ♦ « « » « < »»♦ * > x .» í x ♦ » m* «

<o m

*»» ♦ X »♦ * * < X χ φ **♦ β χ ♦ « ♦ * » χ ι, φ

X* Λ -J, Φφ φ φ φ χφ

A jelen találmány tárgyát polinukleotid molekulák képezik, beleértve azokat a DNS és RNS molekulákat, amik az itt ismertetett zalphal 1 ligandum polipeptideket kódolják. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a genetikai kód degenerációjának fényében jelentős szekvencia variáció lehetséges ezek között a polinukleotid molekulák között. A 3. számú szekvencia egy degenerált DNS szekvencia, ami magában foglalja az összes olyan DNS-t, ami a 2. számú szekvencia szerinti zalphal 1 ligandum poüpeptidet kódolja. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a 3, számú degenerált szekvencia szintén biztosítja az összes olyan RNS szekvenciát, amik a 2, számú szekvenciát kódolják, a T-t U-val helyettetídokat, amik a 3. számú szekvencia I-től vagy97-től az 1614-es nukleotidig terjedő csoportjait tartalmazzák, valamint ezek RNS ekvivalenseit is megfontoljuk a i, A 2, táblazatban a 3, számú szekvenciában használt egybetűs kódok láthatók, a degenerált nukleotid pozíciók jelölésére. A „feloldások az egy kődbe tűvel jelzett nukieotidok, A „komplement” szakkifejezés a komplementer nukleotldtok). kódját jelzi. Például az Y kód vagy Ctt, vagy Ttt. jelök és komplementje, R, A-t vagy Gtt jelöl, ahol A komplementer a T-vek valamint G komplementer a C-vel.

2, Táblázat

Nukleotid Feloldás Komplement Feloldás

A

C

G

T

ATT C G G G C C T A A * # **** gr n ♦ φ >

;· « .»· >«» « « * * ♦ ♦ ♦ «*

R Y	A/G C/T	Y R	C/T A/G
M	A/C	K	G/T
K	G/T	M	A/C
s	C/G	S	C/G
w	AZT	W	A/T
H	A/C/T	D	A /G/T
B	C/G/T	V	A/C/G
V	A/C/G	B	C/G/T
D	A/GZT	H	A/C/T
N	A/C/G/T	N	A/C/G/'

A 4. számú szekvenciában használt de,generált kodonokat amik egy adott aminosav összes lehetséges kodonjaít tartalmazzák, a 3. táblázatban mutátink be.

3, Táblázat

Amíno- sav	Egybetüs kód	Kodonok	! E	Regenerált kodon
Cys	C	TGC TGT	i	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TGG TCT		WSN
| Thr	T	ACA ACC ACG ACT	5	ACN
		CCA CCC CCGA3CT		.......CCN
1 Alá		GCA GCC GCG GCT	......p. ..	.......GCA
Glv 1.................../....-......	G	GGA GGC GGG GGT		GGN
[ Asn !	N	AAC AAT		AAY
Asp	D	GAC GAT		GAY
Glu	E	GAA GAG	1	GAR

* X « « *♦

V ** ♦ * *♦ **9

Gin His	Ö ............................H	j CAA CAG | CAC CAT	CÁR ____
Ár£	R	1 AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	ί AAA AAG	AAR
Met:	M	I ATG	ATG I
Ile	I	j ATA ATC ATI'	ATH
Leu	L	) CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	1 GTA GTC GTG GTT	GIN
Phe	F	1 TTC TTT	TTY
	_____	I TAC TAT
		•
Trp	W | TGG	TGG
Tér	| TAA TAG TGA	TRR
Asn/Asp	B 1	Ray
Glu/Gin	Z |	SÁR
Bármi	X		NNN

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló:, hogy egy degenerált kodon meghatározásakor, ami az egyes aminosavakat kódoló összes lehetséges kodont képviseli, bizonyos kétértelműség kerül a rendszerbe. Például a szerin degenerált kodonja ÍWSN) bizonyos körülmények között kódolhat arginlnt (AGR|, és az arginin degenerált kodonja (MGN) bizonyos körülmények között szerint: kódol (AGY). Hasonló kapcsolat létezik a nini. és leueint kódoló kodonok között. Tehát néhány, a degenerált szekvenciában levő polinukleotíd kódolhat variáns aminosav szekvenciákat, de a szakterületen jártas szakember könnyen azonosíthat Ilyen szekvenciákat, a 2, számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvencia alapján, A variáns

Φ y χ Φ

ΦΦ* Φ

Φ * szekvenciák funkcionalitása könnyen tesztelhető az alábbiakban ismertetett, módon.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló az is, hogy különböző fajoknak különböző a „kodonhasznosítása” (Grandiam és mtsai: Nucleic Acids Research 8, 1893-1912 (1980); Haas és mtsai; Curr. Bioi. 6, 315-324 (1996); WainHobson és mtsai: Gene 13, 355-364 (1981); Grosjean és Fiers: Gene 18, 199-209 (1982): Hóim: Nucleic Acids Research 14, 3075-3087 (1986); Ikemnra: Journal of Moleeular Biology 153, 573-597 (1982)L A továbbiakban a „kodonhasznosi'tás” vagy' „előnyben részesített kodonok szakkifejezés azokra a fehérje transzlációs kodonokra. vonatkozik, amiket egy adott faj sejtjei a leggyakrabban használnak, azaz az. egyes aminosavakat kódold lehetséges kodonok közül egyet: vagy néhányat favorizálnak (lásd a 3. táblázatot). Például a treonin amtnosavat (Thr) az AGA, az ACC, az ACG vagy az ACT kodon kódolhatja., de az emlős sejtekben, az ACC a leggyakrabban használt kodon; más fájok, azaz például a rovarsejtek, élesztők, vírusok vagy baktériumok más és más Thr kodonokat részesítenek előnyben. Egy adott faj előnyben részesített kodonjai a szakterületen ismert különböző módszerek közül bármelyikkel befuttathatók a jelen találmány szerinti polinukíeotidokba. .Az előnyben részesített kodonok bejuttatása a rekombináns DNS-be például fokozhatja a fehérje termelődését, a fehérje transzlációját hatékonyabbá téve egy adott sejttípusban vagy fajban. Ennek következtében a 3. számú szekvencia\íázlaton bemutatott degenerált: kodonszekvencia szolgál templátként a. polanukleotidok a szakterületen általánosan használt, és az alábbiakban ismertetett különböző sejttípusokban és fajokban való expressziójának »Φ*Χ «Χ»« « _χψ φφ » * * Μ * « ··),! Φ*Χ *** Φ « » « ς$·< * *♦♦*«·«♦♦ φ *«» Φ»Φ ♦ */» φφφ optimalizálására. Az előnyben részesített kodonokat tartalmazó szekvenciák tesztelhetek, és optimalizálhatok, hogy miképpen expresszálódnak a különböző fajokban, és az alábbiakban, ismertetett módon vizsgálhatjuk a funkcionalitásukat

Amint azt az előzőkben megjegyeztük, a jelen találmány szerinti izolált polinukleotidok lehetnek DNS-ek és RNS-ek is. A

DNS és RNS izolálási módszerei iól ismertek a szakterületen. Az

RNS-t általában olyan szövetből vagy sejtből izolálják, ami nagymennyiségű zaíphal 1 lígandum RNS-t termet Az ilyen szöveteket és sejteket Northern blottal lehet azonosítani íThomas; Proeeedings of the National Aeademy of Sciences, USA 77, 5201 (1980)1, vagy különböző sejttípusokból származó kondicionált táptalajok átvizsgálásával, aminek során a megcélzott sejtekre vagy szövetekre gyakorolt hatásokat vizsgáljuk. Az Össz~RNS~t guanidíum-izotíoeianátos extrakcióval· majd CsCl gradiensen való centrifugálással állíthatjuk elő [Chirgwin és mtsai: Biochemlstry 18, 52-94 ( 19791). A poIi(Ak RNS-t Aviv és Peder módszerével izoláljuk az össz-RNS-ből [Aviv és heder: Proeeedings of the National Aeademy of Sciences, USA 89, 1408-1412 (1972)) A komplementer DNS-t (cDNS) a poli(A}⁺ RNS-höl izoláljuk ismert módszerekkel· Egy másik változat, szerint genomiális DNS izolálható, A zaiphall polipeptidet kódoló polinukleotidokat azután például hibridizációval vagy polimeráz láncreakcióval (PCR) azonosítjuk és izoláljuk.

Egy teljes hosszúságú, zaiphall ligandnmot kódoló kiónt hagyományos klónozást eljárásokkal állíthatunk elő. A komplementer DNS (cDNS) klőnokat részesítjük előnyben, bár néhány alkalmazásban. (azaz például transzgenikus állatokban való expressziőban) előnyösebb a genomiális klón alkalmazása, vagy a * ♦ * φ * φ χ ♦** *** X * *** * » ζ,Ο * * « * » * φ ♦ .· ♦

XX# .**♦ * φφ, «Κ eDNS klón olyan módosítása, hogy legalább egy genomiálls intront tartalmazzon. A cDNS és genomiális kiónok előállítási módszerei jól ismertek a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember számára, és ide tartozik az ismertetett .szekvencia, vagy annak egy részének használata egy könyvtár átvizsgálásához próbaként vagy primerként Az expressziős könyvtárak a zalphall receptor fragmensek elleni ellenanyagokkal vagy más specifikus- kötő partnerekkel vizsgálhatók át

Az itt ismertetett zalphal 1 ligandum polinukleotid szekvenciák próbákként vagy primerekként is használhatók a zalphall ligandum gén 5' nem-kódoló régióinak klónozására. A .zalphall ligandum meggyeit szövet-specifikus expresszíöjának fényében ez a génrégió várhatóan hematopoiedkus- és llmfoid-specifikus expressziót biztosit. A zalphall ligandum génből származó promoter elemek tehát arra használhatók, hogy a heterolog gének, szövet-specifikus expresszióját vezéreljék, például transzgenikus állatokban vagy génterápiával kezelt betegekben. Az 5' határoló szekvenciák klónozása is megkönnyíti a zalphall ligandum fehérjék rlválással (5,641,670 számú Amerikai

Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás). Röviden, egy endogén zalphall. ligandum gén expressziója megváltoztatható, ha a zalphal 1. lígandum lókuszba egy olyan DNS konstrukciót juttatunk be, ami tartalmaz legalább egy célzó szekvenciát, egy szabályozó-szekvenciát, egy exont. és egy pár nélküli illesztési donor szekvenciát. A célzó szekvencia nemkódoló szekvencia, ami lehetővé teszi a konstrukció homológ rekombinációját az endogén zalphal 1 ligandum lókusszal, miáltal a konstrukcióban levő szekvenciák működés szempontjából az endogén zalphal 1 ligandum kódoló szekvenciához kapcsolódnak.

* ·* 9 * **** * * * »«♦ Φ*# » <

>·«·* ♦ <

*

X ♦♦ Φ φ * * ·κ <

** «&Γ

Ilymódon egy endogén zalphal! ligandum promoter helyettesíthető vagy kiegészíthető más szabályozó-szekvenótákkal, hogy fokozott, szövet-specifikus, vagy más módon szabályozott expressziét biztosítsunk..

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a más fajokból származó megfelelő poiipeptidek és polinukleotidok (az ortológok).. Ezek: a fajok az alábbiak lehetnek, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat: emlősök, madarak, kétéltűek, hüllők, halak, rovarok valamint más gerinces és gerinctelen fajok. Különösen fontosak a más emlős fajokból származó zalphall ligandum poiipeptidek, beleértve a rágcsáló, a sertés, a birka, a szarvasmarha., a kutyaféle, a macskaféle,a lovak és más főemlős polipeptideket. A humán zalphall ligandum ortológiait a jelen találmányban biztosított információk alapján és a jelen találmányban használt készítményekkel lehet előállítani, a hagyományos klónozás! technikákkal kombinálva. Például egy cDNS olyan mRNS felhasználásával klónozható, amit olyan szövetből vagy sejttípusból kapunk, ami az itt ismertetett módon expresszálja a zalphall ligandúrnőt. A megfelelő mRNS forrásokat Northern blottal lehet azonosítani, az Itt Ismertetett szekvenciák alapján tervezett próbák felhasználásával, Azután egy pozitív szövetből vagy sej (vonalból m'RNS-t izolálunk. Egy zalphal Ί-et kódoló cDNS-t azután számos különböző módszerrel izolálhatunk, például egy komplett vagy részleges humán cDNS-sel, vágj?· az ismertetett szekvenciákra alapuló, egy vagy több sorozat degenerált próbával való átvizsgálással. Egy cDNS polimeráz láncreakcióval is klónozható (Mullis, 4,683,202 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírási, olyan primerek használatával, amiket az itt ismertetet t reprezentatív humán zalphal 1 ligandum « .* » φ »««* φ «

ί * « **» « X ·*»Χ.

* ««χφ « « »*« * «X* X* szekvenciák alapján terveztünk.. Egy további módszer szerint a cDNS könyvtár használható gazdasejtek transzfekcíőjára vagy transzformációjára, majd a számunkra érdekes cDNS expresszi óját a zalpha 11. ligandum polipeptid elleni ellenanyaggal lehet, kimutatni. Hasonló technikák használhatók genomiális kiónok izolálására is.

Azonosítottuk a zalpha 11 ligandum egér ortoiógfának nukleotid szekvenciáját, ezt az 55-, számú szekvenciavázlaton mutatjuk he, az ennek megfelelő aminosav szekvenciát az 56. számú szekvencia vázlaton mutatjuk be. Egy 124 amin-osavból álló régióban 62%-os azonosság van .az egér és a humán szekveneger za ciák között, ami a zalphaii ligandum 2. számú .szekvenciavázlaton bemutatott szekvenciájában a 30- 153-as aminosav csoportoknak felel meg, és a zalpha 11 ligandum 56. számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvenciájában a 23-146-os aminosav csoportoknak felel meg. Az egér zalpha 11 ligandum érett szekvenciája feltehetően a Hisis-cal kezdődik (amint az az 56. számú, szekvenciavázlaton látható}, ami a humán szekvenciában a Hisznek felel meg (amint az a 2. számú szekvenciavázlaton látható). Mivel a humán polipeptid csonkított formája aktív, ezért valószínű, hogy hogy az egér zalpha 11 ligandum egy ekvivalens polipeptidje (azaz nem tartalmazza az 56. számú szekvencia HísisProzz csoportjait) is aktív. A szövet elemzéséből kiderült, hogy az ligandum megtalálható a herékben, a iépben és a csecsemőmirigyben,

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy’ az 1, számú szekvenciavázlaton bemutatott szekvencia a humán zalpha 11 ligandum egyetlen allélját reprezentálja, és várhatóan allélvariánsok valamint alternatív Illesztések jönnek létre. Ennek a szekvenciának az allélvariánsait úgy klónozhatjuk, hogy standard eljárásokkal átvizsgáljuk a különböző egyedekből származó cDNB vagy genomiális könyvtárakat. Az 1. számú székvenciavázlaton bemutatott DNS szekvencia, allélvanánsai, beleértve azokat, amik csendes mutációkat tartalmaznak, valamint azokat, amikben a mutációk amínosav szekvencia változásokat okoznak, a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak, ugyanúgy, mint azok a fehérjék, amik a 2, számú szekvencia allélvariánsai. Az alternatív módon illesztett mRNS-ekről készült eDNS-ek, amik megtartják a zaiphall ligandum polipeptid tulajdonságait, a jelen találmány oltalmi körébe tartoznak, ugyanúgy, mint az ilyen cDNS-ek és niRNS-ek által kódolt polipeptidek. Ezeknek a székvenciáknak az allélvariánsai és illesztési variánsai

klónozhatok, hogy a különböző egyedekből vagy szövetekből származó eDNS vagy genomiális könyvtárakat standard módszerekkel klónozzuk.

A zaiphall ligandum gént az SHGC-12342 interleukin-2 keret markerhez térképeztük, a zaiphall ligandumot azinterleukin-2 markertöl körülbelül 180 kilobázis távolságra helyezve el« A környező markerek használata a zaiphall ligandum gént az integrált LDB 4-es kromoszóma térképén a 4q27 pozícióba helyezte el (The Gene tíc Locatlon Database, Uníversity of Southhampton). A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a reagensek, amik a diagnosztikai alkalmazásokban használhatók. Például a zaiphall ligandum gén, egy próba, ami zaiphal l ligandum DNSt vagy RNS-t, vagy annak alszekveneiáját tartalmazza, használható annak meghatározására, hogy a zaiphall ligandum gén jelen van-e egy humán kromoszómán, azaz például a 4-es kromoszómán, vagy mutáció jött létre a génben, A zalphal 1 ligandum

Φ!ίχ« β »46 »·#« ΦΦΦ φ * * Φ' »9 9 ΦΧφ **

X «, φ φ ΦΦΦ Φ β ί Φ· Φ X φ _φ »οί φφ genonüális DNS egy részét tartalmazó humán genomiális DNS (Genba-nk letéti szám AC0Ö7453) egy fragmensének annotációja alapján a zalpha Π ligandum a 4~es kromoszóma 4q27-~es régiójában található. A zalpha 11 ligandum gén fókusz kimutathatókromoszómális aberrációi közé tartozik anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, az aneuploidia, a génkópia szám változása, a heterogenitás elvesztése (tOHK a transzlokácíók, az inszerolók, a deléciők, a restrikciós hasítási helyek megváltozása és az átrendeződések. Az ilyen aberrációkat a jelen találmány szei polinukleotidokkal lehet kimutatni, molekuláris genetikai nikák alkalmazásával, azaz például a restrikciós fragmens hossz polimorfizmus -ÍRFLP) elemzés, rövid tandem ismétlődés (STR) elemzés polimeráz láncreakció technikákkal, valamint más, a szakterületen jól ismert génkapcsolási technikákkal [Samhrook és mtsai: Moleeular Cloníng: A Lafooratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harfoor Press, Cold Spring Harhor, N.Y. (1989); Current Protocols in Moleeular Bíoiogy, szerk.: Ausubel és mtsai, Greene Publishing és Wiley-Interseienee: New York (1987); Marian: Chest 108, 255-265 (1995)1.

Egy gén pozíciójának pontos ismerete számos különböző: célra jól használható lehet, beleértve a következőket; 1) annak meghatározása, hogy egy szekvencia részét, képezi-e egy létező, egybefüggő résznek, és további környező genetikai szekvenciákat lehet különböző formában megkapni, azaz például YAC, BAC vagy cDNS kiónok formájában; 2) lehetséges jelölt gén biztosítása egy öröklődő betegséghez, ami ugyanahhoz a kromoszómális régióhoz mutat kapcsolódást; és 31 keresztreferencia modell szervezetek, azaz például egér, ami segítheti annak meghatározását, hogy egy adott génnek ml lehet a funkciója.

«*·»* fe φ *

Φ Φ fe Λ»Φ φ Φ «Φι« *ΦΦ * *' * φ ΦΦ«

Amint azt korábban deklaráltuk, a humán, zalphal! ligandum gén az interleukin-2 gén közelében van, ami a 4q kromoszóma egy régiója, amiről kimutattak, .hogy néhány családban kapcsolatban áll a gyulladásos vastagbél betegséggel (IBD1 (beleértve a Crohn. betegséget (CD) és a fekétyes kolítiszt) (Hampe és mtsai: Am. J. Huni. Génét. 64, 808-816 (19991; Cho és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95, 75027507 (199811. Emellett a zalphal 1 receptor gént a 16pl 1-be lehet térképezni, ez egy másik genomlális régió, ami a CD-re való érzékenységhez kapcsolódik (Hugó és mtsai; Natúré 879, 821-823 (19981; Ohmén és mtsai: Huni. Moh Généi. 5, 1679-1683 (1998)).

fakort szisztémás változás bél antigének d

A CD a bél krónikus gyulladása, bár a pontos kórokion nem ismert, a tolerancia kudarcát magában foglaló immunszabályozó díszfánk cíó egy fö komponens (B-raegger és mtsak Annals Allergy 72, 135 141 (1994b Sartor: Am. J, Gastroenterok 92, SS-11S (.1997)1

Számos vizsgálatban találtak abnormális NE aktivitást a CD betegekben (Egawa és mtsai: J. Clin. Láb. Immunok 20, 187-192 (1988); Áparício-Pagés és mtsai: J, Clin. Láb. Immunok 29, 119124 (1989); van 1005 (1992)1, és

Tol és mtsai: Scand. d. Gastroenterok 27, 999a defektív memória B-seH képződését is kímutatták (Brogan és mtsai: J. Clin. Láb. Immunok 24, 69-74 (19871). Mivel a zalphal 1 ligandum az ímmunszabályozásban. játszik szerepet, és mivel mind a receptor, mind a ligandum génjei a CD érzékenységi régiókban találhatók, mind a receptor, mind a ligandum a Crohn betegség genetikai prediszpozíciőjára jelölt kén.

A zalphal 1 receptornak és/vagy a zalpha l I liga az IBD patológiájában való részvételét számos különböző mód31 ««í«e >

Jf * β>

’·?* ·„-

szerrel lehet meghatározni, A genomíálís DNS-hőI származó exonok szekvenálása kódolási mutációkat fedhet fel (beleértve a misszensz, nonszensz és frameshift mutációkat), ugyanúgy, mint a cDNS-ek szekvenálása. A genomiális DNS szekvenálásának egy további előnye az, bogy az illesztési pontok Is benne vaunak a szekvenált fragmensekben, és ez felfedhet illesztési abnormalifásokat, amik nem jelennek meg a cDNS mintákban, ha például a rosszul illesztett RNS-ek gyorsan lebomlanak.. A zalphall ligandum genomiális struktúráját meghatározták. A zalphal 1 ligandum. és receptor elemzésének más módszere az betegekben a következő: 1) a ligandum termelődésének becslése a betegekből származó aktíváit T-sejtekböl, a normális kontrollokkai összehasonlítva (azaz biológiai esszé); 2) a zalphall receptor vagy a zalphall ligán ín sün hí az

IBD betegek gyulladásos· belének szekcióihoz, a normál kontroll >nlö szekcióival összehasonlítva; 3) az IBD betegekből vett szekciók immunbisztokémiája, a normálisakkal Összehasonlítva; és (4) a betegek perifériális B-sejtjeinek a zalphal 1 lígandumra adott válaszadó képessége, amit mitogenezis esszével lehet mérni.

Bgy diagnoszta képes segíteni az orvosoknak a betegség típusának meghatározásában és a megfelelő, kapcsolódó terápia meghatározásában, vagy segíthet a genetikai tanácsadásban. A találmány szerinti anti-zalphal 1 ligandum ellenanyagokat, polinnkleotidokat és polipeptideket használhatjuk a zalpha 11 ligándum poiipeptid, mRN'S vagy az anti-zalphal 1 ligandum ellenanyagok .kimutatására, ezzel markerként szolgálnak, és az .alábbiakban ismertetett módon közvetlenül használhatók a genetikai betegségek vagy rákok kimutatására, a szakterületen ismert és «« X * χ * fr

M * S * φ. y <X*« *** V _v * *

V * 4«»4t * Af # _Λ »♦.< «TJt ,> -a vtf $f'..

az alábbiakban ismertetett módszereket használva. Emellett a zalphal 1 ligandum polínukleotid próbák az alábbiakban ismertetett módon használhatók a 4q27 kromoszóma rendellenességeinek kimutatására. Ezek az abnormalitások kapcsolódhatnak humán betegségekhez, vagy tumorigenezíshez, spontán abortuszhoz vagy más genetikai rendellenességhez. Tehát a zalphall ligándum próbák használhatok az ezekhez a detékt:ekhez kapcsolódóabnormalitások vagy genotípusok kimutatására.

Amint azt az előzőkben tárgyaltuk, a zalphall ligandum génnek magának a hibái is eredményezhetnek örökölhető kóros humán állapotot. A jelen találmány szerinti molekulák, azaz a jelen találmány szerinti polípeptidek, antagonísták, agonisták, polínukleotidok és ellenanyagok segíthetik a zalphal 1 ligandum genetikai hibájához kapcsolódó betegségek kimutatását, diagnosztizálását, megelőzését és kezelését. Emellett a zalphal 1 11gandum polínukleotid próbák használhatók a beteg vagy nembeteg egyedek között a zalphall ligandum fókuszban levő alléitkus különbségek kimutatására.

Általánosságban, a genetikai kapcsoltsági elemzésben használt diagnosztikai módszerek, amiket egy betegben levő genetikai abnormahtás vagy aberráció kimutatására lehet használni, a szakterületen ismertek. A legtöbb diagnosztikai módszer az alábbi lépéseket tartalmazza: (i) genetikai minta vétele egy potenciálisan megbetegedett páciensből, beteg páciensből vagy egy recesszív betegség alléit potenciálisan hordozó, nem beteg hordozóból: (ii) előállítunk egy első reakcióterméket, a genetikai mintát egy zalphall ligandum polínukleotid próbával mkubálva, amely polínukleotid hibrídizálódík a komplementer polínukleotid szekvenciához, azaz RFLP elemzésben, vagy úgy, hogy a genetikai ♦

***** mintát egy polimeráz láncreakcióban értelmes és antiszensz prlmerekkel inkubáljuk, a megfelelő polimeráz láncreakeiős körülmények között; (íííj az első reakcióterméket gélelektroíorézissel és/vagy más ismert módszerrel tesszük láthatóvá, azaz az első reakcióterméket egy zr

próbával tesszük láthatóvá, aholis a polinukleotid híbridizálódik az első reakció komplementer polinukleotid szekvenciájához,· és (iv) a láthatóvá, tett első reakcióterméket egy második kontroll reakciótermékkel hasonlítjuk Össze, amit egy normális, vagy kontroll egyedfeól származó genetikai mintából kaptunk. Az első reakcfótermék és a kontroll reakciótermék közötti különbség a genetikai abnormalítást jelzi a megbetegedett vagy potenciálisan megbetegedő páciensben, vagy egy heterozigőta recesszív hordozófenotípu-s jelenléte egy nem-beteg páciensben, vagy egy genetikai normalitás jelenléte egy magzatban vagy pre-implantációs embrióban is ezt jelzi. Például a restrikciós fragmens' hossz polimorfizmusban, a polimeráz láncreakció termékeinek hosszában, a zalphal 1 ligandum genetikai fókusznál az ismétlődő szekvenciák hosszában, és a hasonlókban a normális kontrolihoz viszonyítva megfigyelt különbség a genetikai abnormalltásra, a genetikai aberrációra vagy alléi-differenciára utalnak. A kontrollok származhatnak az érintetlen családtagokból, vagy semmilyen rokonságban nem levő egyedekből, a teszttől és a minták 'hozzáférhetőségétől függően, A jelen találmányban használható genetikai minták közé tartozik az egy beteg bármilyen szövetéből vagy más biológiai mintájából, azaz például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a vérből, nyálból, ondóból, embrionális sejtekből, .magzatvízből és hasonlókból

Izolált genomiáiis DNS, a « ♦ » X « A ««« φ φ » _φ « *«»«»««> φ *** * (.« φ* mRNS, és cDNS. A polinukleotíd' próba vagy primer lehet RNS vagy DNS. ami tartalmazza az 1. számú szekvencia egy részét az· 1, számú szekvencia komplementerének egy részét, vagy ezek egy RNS ekvivalensét. A humán betegség fenotípusokhoz való genetikai kapcsoltságot mutató ilyen módszerek jól ismertek a szakterületen. A polimeráz· láncreakció alapú módszerek diagnosztikai alkalmazását a szakirodalomban ismertetik (Mathew (szerkó: Frotocols in Humán Molecular Genetics, Humana Press, Inc. (1991 k White (szerkó: PCR Frotocols: Current. Mefhods and Applications, Humana Press, Inc. {1993}: Cotter (szerkó: Molecular Diagnosis of Cancer, Humana Press, Inc. (1996); Hanausek és Walaszek (szerkó: Tumor Marker Frotocols, Humana Press, Inc. (1998); Lo (szerkó: Clíníeal Applications of PCR, Humana Press, Inc. (19981: Meltzer (szerkó: PCR in Bioanalysls, Humana Press, Inc. (1998)),

A zalphall lígandum fókuszhoz kapcsolódó mutációkat a jelen találmány -szerinti nukleinsav molekulákkal mutathatjuk ki, standard módszereket használva a közvetlen mutációs elemzéshez, azaz például a restrikciós fragmens hossz polimorfizmus elemzéshez, a rövid tandem ismétlődés elemzéshez polimeráz láncreakció technikával, amplífikácíónak ellenálló mutációs rendszer elemzéshez, egyláncú konformáció polimorfizmus kimutatáshoz, RNáz hasítási módszerekhez, denaturáló gradiens gél elektroíórézlshez, fluoreszcenciával támogatott rossz Illeszkedési elemzéshez, és más, a szakterületen ismert genetikai elemzés technikákhoz (Mathew (szerkó: Frotocols In Humán Molecular Genetics, Humana Press, Inc. {1991}: Marian: Chest 108, 255 (1995): Coleman és Tsongalis: Molecular Díagnostics, Humana Press, Inc. (1996); Elles (szerkó·: Molecular Diagnosis of Genetle

X Φ » X Φ Φ ΦΦΦΧ «

Φ Φ X « » * « ♦ ♦ φ «

ΦΦΧΦ X Φ « φ 9 φφ yüC

DIseases. Humana Press, Inc. (1996): Landegren (szerk.): Laboratory Protocols fór Mutatta .Detecöon, Oxford Unlversity Press (1996); Birren és mtsai (szerk.): Genome Analysís 2, Deteetíng Genes, Cold Spríng Harbor Laboratory Press (1998); Dracopoií és mtsai (szerk,): Current Protocols In Humán Genetícs, John Wiley and Sons (1998); RIchard és Ward: «Moiecular Diagnostie Testing”, in: Prineiples of Moiecular Medícine, 83-88. oldal, Humana Press, Inc. (1998)], Egy zalphall ligandum gén mutációra vonatkozó direkf elemzését az alany genomiális DN'S-évei lehet, végrehajtani. A genomiális DNS ~ amit perifériális vér limfocitákból lehet kinyerni - ampli.fikálásának módszerei jól ismertek a szakterületen jártas .szakéinszámára (Dracopoií és mtsai: Current Protocols in Humán

Genetícs 7.1.8-7.1.7 oldat John Wiley and Sons (1998)).

A zalphall lígandumban az íntronok pozícióját a. genomiális kiónok azonosításával határoztuk meg, majd az íntron/exon kapcsolódások szekvenálása következik. Az első intron a 2.

számú szekveneíavázlat 58-os (Leu) aminosav csoportja és 57~es (Vall ammosav csoportja között van, hossza 115 bázispár. A második intron a legnagyobb,, mérete 4,4 kilóbázis, és a 2. számú szekveneíavázlat 88-as (Glu) aminosav csoportja és 69-es (Thr) aminosav csoportja között van. A harmadik intron mérete 2,8 kilobázís, a 2, számú -szekveneíavázlat 1.20-as (Leu) ammosav csoportja és 121-es (Thr) aminosav csoportja között van. A végső intron, mérete 89 bázispár a 2. számú szekvenciavázlat 146~os (Lys) aminosav csoportja és 147-es (Met) aminosav csoportja között van. A teljes gén mérete körülbelül 8 kilofoázis.

A zalphal I ligandum gén struktúrája hasonlít az interleukin-2 struktúrájára (Fujita. és mtsai: Proeeedings of the National «β»ί ΦΦΦ» φ **♦ > φ φφφ φ φ « β Φ χ g-Φ χ χ φ >

♦ *Φ ΧΦΦ Φ φΧ φ*

Academy of Sciences, USA 80, 7437-7441 (1983)), bár a zalphal 1 Hgandum gén tartalmaz még egy további in trónt (4-es intron). A mintázat a következő; egy rövid első intron és egy hosszú második és harmadik intron konzerválódik a két gén között, bár az interleukin-2 gén valamivel kisebb (körülbelül 6 kilobázis). Az interleukin- IS gén viszont 8 exont tartalmaz, és mérete legalább 34 kílobázis (Andersen és mtsab Genomlcs 25, 701-706 (19953. Tehát a zalphall ligandum gén struktúrája sokkal jobban hasonlít az taterleukln-2 gén struktúrájára mint az interleukln-15 gén struktúrájára.

A jelen találmány megvalósítási módjai szerint az izolált zalphall ligandumot kódoló nuklelnsav molekulák képesek szigorú körülmények között hibridizálódnl az 1. számú szekvenciájú nukleotid szekvenciával rendelkező nuklelnsav molekulákhoz, az 1. számú szekvencia 47-532-es nukleoüdjait tartalmazó nuklelnsav molekulákhoz, vagy az 1. számú szekvencia komplementerének nukleotid szekvenciájával rendelkező nuklelnsav molekulákhoz. Általánosságban a szigorú körülményeket úgy választjuk meg, hogy körülbelül 5 X-szal alacsonyabbak legyenek mint az adott szekvencia olvadáspontja (T_m), adott ionerösségnél és pH-nál. A T_n-_S az a hőmérséklet, (adott ionerösségnél és pH-nálk aminél a kiválasztott szekvencia 50%-a hibridizálódik egy >en illeszkedő próbához.

nuklelnsav molekula pár, azaz például egy DNS-DNS, és DHS-RNS pár hibridizálódik., ha a

Egy venciákhan van valamilyen mértékű komplementaritás. A dek képesek tolerálni rosszul illeszkedő párokat a kettős lixben, de a hibrid stabilitását befolyásolja a rossz mértéke. A rosszul illeszkedő hibrid T_rf! értéke minden 1-1,5%-os

X φφ

XX rossz bázispár illeszkedésnél 1 ⁰C-szal csökken. A hibridizációs körülmények különböző szigorúsága lehetővé teszi a hibridben levő rossz illeszkedések mértékének szabályozását. A szigorúság mértéke nő, -ahogy a hibridizációs hőmérséklet nő, és a hibridizációs puffer ionerőssége csökken.

Bőven a szakterületen jártas szakember Ismereteihez tartozik, hogy ezeket a körülményeket egy adott poimukleotíd hibridhez adaptáljuk. Egy megcélzott szekvencia esetében a T_m az a hőmérséklet (meghatározott körülmények között), aminél a megpróba szekvenciához. A T_ra-et befolyásoló körülmények közé tartozik például a polinukleotid próba mérete és bázispár összetétele. a hibridizációs oldat ionerossége. és a destabilizáló ágensek jelenléte a hibridízáló oldatban. A szakterületen a Tm számítására számos egyenlet ismert, és ezek specifikusak a DNS-re, RNS-re, DNS-RNS hibridekre, valamint a különböző hosszúságú polinnkleotid próba szekvenciákra íSambrook és mtsab Molecular CIoníng: A Laboramry Marsnak 2. kiadás, Cold Sprlng Harbor Press, Cold Spríng Harbor, N.Y, (1989); Current Protocols ín Molecular B-iol-ogy, szerk.: Ausubel és mtsai, Greene Publishing és Wiley-lnterselenee: New York (1987); Berger és Kimmel (szerk,); Guide to Molecular CIoníng Techniqu.es Academic Press, Inc, (1987); Wetmur; Crlt. Rév. Bioehem. Moh Bioi. 28, 22-7 (1990)). A szekvencia-analitikai szoftverek,, azaz például az OLIGO 8.0 (bSR; Long Make, MN) és a Primer Premier 4.Ö (Premier Biosoft International; Palo AIto, CA), valamint az Internet különböző honlapjain levő szoftverek hozzáférhető eszközök egy adott szekvencia elemzéséhez és a Tm kiszámításához, a felhasználó által definiált kritériumok alapján. Az ilyen prog3S * Φ V φ Φ χ «

Φ φ X φ φ Λ <

Φ 9 Φ jy» ramok képesek egy adott szekvenciát elemezni meghatározott körülmények között, és képesek, azonosítani a megfelelő próbaszekvenelákat, Tipikus esetben a hosszabb (azaz >50 bázispár) polinukleotid szekvenciák hibridizációját, körülbelül 20-25 °C-szal a kiszámított Tm alatt végezzük et A kisebb próbák esetében (azaz <50 bázispári a hibridizációt tipikus esetben 5-10 °C-szal a Tm alatt hajtjuk végre. Ez adja a maximális hibridizációs arányt a DNS-DNS valamint DNS-RNS hibridekre.

A hibridízálást követően a nukleinsav molekulák moshatók,, hogy eltávolítsák a. szigorú körülmények között, vagy nagyon erősen szigorú körülmények között nem-hibrldizáiódő nukleinsav molekulákat, A tipikus szigorú mosási körülmények közé tartozik a mosás 0,1% nátrium-dodeeil-szulfátot tartalmazó Ö,5x -2x SSC oldattal 55-65 °C-on. Azaz, a. variáns zalphai 1 ligandum poiipeptídet kódoló nukleinsav molekulák szigorú. körülmények között egy olyan nukleinsav molekulához hibrídizálódnak, amik az I. számú szekvenciának (vagy annak komplementerének) megfelelő nukleotid szekvenciával rendelkeznek, és a mosás szigorúsága ekvivalens 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó O,5x~2x SSC oldattal 55-65 X-on, beleértve a 0,1% nátriumdodeeil-szulfátot tartalmazó 0,5x SSC-t 55 X-on, vagy a 0,1% nátrium.-dodecil-szulfátot tartalmazó 2x SSC-t 85 X-on. A szakterületen jártas szakember könnyen tud ekvivalens körülményeket tervezni, ha például a mosó oldatban az SSC-t SSFEvel helyettesíti.

A tipikus erősen szigorú mosási körülmények közé tartozik a mosás 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó ö,ix - ö,2x SSC-vel 50-65 X-on, Más-szóval, a variáns zalphall ligandum polipeptidet kódoló nukleinsav molekulák erősen szigorú körülφ * 5ί Φ ΦΦΦν φ φ χ

Φ ^χ * Φ X » *φφ φ*» X χ «φφ Φ χ φ φ »«»* φ φ * φ *** »♦'» · φΦ ytt mények között hibrídizálódnak az 1. számú, szekvencia .(v annak komplementere) nukleotid szekvenciájával rendelkező nukleinsav molekulával, aholis a mosás szigorúsága ekvivalens 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó 0,lx - Ö,2x SSC-vel 50-65 X-on, beleértve a 0,1% nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó^ 9, Ix SSC-t 50 X-on, vagy a 0,1% nátrium-dodecü-szulfátot tartalmazó 0,2x SSC 65 X-on.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok az izolált, zalphal 1 ligandum polipeptidek, amik lényegében hasonlóak a 2, számú szekvenelavázlaton bemutatott pölipeptidekhez, valamint ezek ökológiaihoz. A „lényegében hasonló szakkifejezést a továbbiakban olyan polipeptídek jelölésére használjuk, amik legalább

70%-os, legalább 80%-os, legalább 90%-os, még előnyösebb legalább 95%-os, vagy nagyobb mint 95%-os szekvencia azonosgot mutatnak a 2. számú szekvenciaváz jutatott szekvenciákkal, vagy azok ortológjaival. A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a polipeptídek, amik olyan ammosav venciát tartalmaznak,, amik legalább legalább 70%-os,

8Ö%~os, legalább 90%-os, még előnyösebben legalább 95%-os vagy nagyobb mint 95%-os szekvencia azonosságot mutatnak a 2. számú szekvenciavázlaton bemutatott, szekvencia 1-182-es vagy 33-162-es ammosav csoportjaival, A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az ilyen polípeptideket kódoló nukleinsav molekulák, A százalékos azonosság eljárásait, az alábbiakban ismertetjük,

A jelen találmányban megfontoltuk azokat a zalphal 1 ligandum variáns nukleinsav molekulákat, amiket két kritérium alkalmazásával lehet azonosítani: a hasonlóság meghatározása a polipeptid és a 2. számú szekvencia aminosav szekvenφ*φ* φ-φφφ φ

40· „ ** φ * φ < φ φ

ΦΦ» ΦΦΦ .χ ΧΦΦ φ φ

Φ * Φ* φφ φ Φ. V Φ φφφ φφφ X φφ «Φ ciája között, és/vagy egy hibridizációs esszé, az előzőkben ismertetett módon.. Az ilyen zalphall ligandum variánsok közé tartoznak azok a nukleinsav molekulák, amelyek: 1) hibridizálódnak az 1. számú szekvenciának megfelelő hükleotid szekvenciával (vagy annak komplementerével) rendelkező nukleinsav molekulához, szigorú mosási körülmények között, amik során a mosási szigorúság ekvivalens 0,1% nátríum-dodecö-szulfátot tartalmazó 0,5x-2x SSC oldattal 55-65 ’C-on; vagy (2) olyan polipeptidet kódolnak, amik legalább 70%-ös, legalább 80%-os, legalább 90%-os, még előnyösebben legalább 95%-os, vagy nagyobb mint.

95%-os szekvencia azonosságot mutatnak a 2, számú szekvenclavázlaton bemutatott amínosav szekvenciával. Bgy másik változat szerint a zalphall liganduniokat. olyan nukleinsav molekulákként lehet jellemezni, amelyek: (1) hibridizálódnak az 1. számú .szekvenciának megfelelő nukleotld szekvenciával (vagy annak komplementerével) rendelkező nukleinsav molekulához, szigorú mosási körülmények között, amik során a mosási szigorúság ekvivalens 0,1% nátrium-dodeed-szulfátot tartalmazó

0,lx-0,2x SSC ’C-on; vagy ( an legalá %-os.

legalább íVo-05,

90%-os, még előnyösebben legalább 95%-os, vagy nagyobb mint 95%-os szekvencia azonosságot mutatnak a 2, számú szekvenciavázlaton bemutatott amínosav szekvenciával

A százalékos szekvencia-azonosságot hagyományos módszerekkel határozzuk meg (Altschul és mtsai; Bull Maih. Bio. 46, 603-616 (.1986); Henikoff és Henikoff: Froeeedíngs of the National Academy of Sciences, USA 89, 10915-10919 (1992)], Röviden, két amínosav szekvenciát egymáshoz illesztünk, hogy optimalizáljuk az illesztési értékeket, 10-es résnyíiási büntetést.

«·*'♦♦ Φ*** » φΧ <« » ♦ Φ Φ * ♦ .<·} ♦»* *#ί Φ φ. »** φ * ** X * ♦ *» *-* φ 4 φ Λ

ΦΦΦ Φ<Χ« Φ χ* φ<Φ >es réstágulási büntetést használva, valamint. Henikoff és Herükoff “blosum 62” értékelési mátrixát használva íKenikoff és

Henikoff: Proceedings· of the National Academv of Sciences, USA

Λ.7 m

89, 10915-10919 (1992)], a 4. táblázatban látható módon] az aminosavakat standard egybetüs kódokkal jelöljük. A %-os azonosságot az alábbiak szerint számítjuk ki:

Az azonos illeszkedések összes száma

-------------------------------------------------- χ 100 la hosszabb szekvencia hossza, plusz a hosszabb szekvenciába a két szekvencia illesztése céljából bevitt rések száma]

1Á

R

Ν

D

C

4

Ε

G ί Π ................Λ...............

1

L

κ

Τ

F

ρ 1 s

τ

W !: ί;

Υ

ί ν

A j 4

!

. .........Α...............Λ...............

R

4

5

ί

Ά ' [. !

Ν

-2

0

6

ί

D

•2

2·

I

6

!

................

1

C

0

•3

•3

3

9

1...........

................

-1

1

0

h

’3

5

, —

Ε

•1

0

Ö

9 ώ

4

2

Ί

* .....

, 1.

G

ο

•2

0

4

-3

2

•2 ϊ 6 j:

-

Η

Uw^w...ww...

Τ

Τ

Τ

-3

Τ

0

ΠΓ

Τ

1

4

•3

•3

•3'

4

-3

-3

4

•3 i <

! ,. i ί

§ ί : j,

;.............Ί L

-1

2 .

-3

4

4

-2

•3

4

•3 | 2

4

ί 1 _1_

Γ----

κ

•1

2 .

Ö

4

•3

I

1

-2

4

-3

•2

δ

................

.........

. . .

Μ

4

4' •

•2

3

4

0

•2

•3

•2

ί

2 1

4

5

.{ i

Α

R

Ν

D

C

9

Ε

G

Η

1

Κ

Μ

F ί Ρ (

§

τ

W

Υ

ν

F

•2

•3

•3

•3 , .

·2ί·3

•3

4

4

Ö

Ö

•3

0

6 j V

1

« Μ * < ♦ i Μ » * * ti* » > χ « » » ♦ ♦ «««« «

»

ÍXX ϊ » X ’ » 4

* >

P	r -1 _	•2	•2	•l	-3	4	4	•2	-2	•3	•3	4	-2	*4	/
s 11	-1	1 Ö	•1	0	ö	0	4	•2	-2] Ö	-1	-2	4	4
T	0	4	0	-1	4	4	4	•2	•2	4	4	4	4.	•2	4	1	5			J
w	•3	-3	•4	4	•2	•2	-3	J/	-2	-3	•2	-3	4	1 -4	•3	-2	11
Y	: ?? ώ	-2	-2	-3	•2	4	•2	-3	2	4	4	•2	4	3	1	-2	-2	2	?
V	Ö	0	•3	•3	-1	-2	•2	-3 L	•3	3	1 -2	1	4	-2	•2	0	•3	4	4

S » m « *« » »« ♦ <

♦ ♦ * X ♦ » X » ♦ *

» »

m

ΦΦΦ* φ ♦ » * Φ: X Φ

ΦΦΦ Φ-ΦΦ χ φ ΦΦΦ φ jf χ * »φ κφ α φ φ » «ΦΦ ΦΦΧ * φφ φ*

A szakterületen jártas szakember számára nyálvánvalő, hogy számos kidolgozott algoritmus létezik két aminosav szekvencia illesztésére. Pearson és Lipman „FASTA” hasonlóságot kereső algoritmusa egy megfelelő fehérje-illesztési módszer arra, hogy vizsgáljuk egy itt ismertetett aminosav szekvencia és egy feltételezett zalphall ligandum variáns közötti azonosságot. A FASTA algoritmust Pearson és Lipman publikálta [Pearson és Lipman: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 2444 (1968); Pearson: Methods in Enzymology 183, 83 (1990)}.

a rASiA először jellemzi a szekvencia-azonosságot, a szűrei-szekvenciában (azaz például a 2, számú szekvencia) és a teszt-szekvenciában is előforduló régiók azonosításával, amikben a legnagyobb az azonosság sűrűsége (azaz a ktup változó értéke 1) vagy az azonosság-párok sűrűsége (ha ktup~2), anélkül hogy megfontolná a konzervatív aminosav helyettesítéseket, ínszerciókat vagy deléeiókat A tíz legmagasabb azonossági sűrűséget mutató régiót azután újra értékeli, összehasonlítva az összes párosított aminosav hasonlóságát, és a régiók végeit „trimmeli”, hogy csak azok a csoportok legyenek benne, amik hozzájárulnak a legmagasabb értékhez. Ha több olyan régió van, amiknek az értéke magasabb a „vágási” értéknél (amit egy előre meghatározol:! képlet alapján lehet számítani, a szekvencia hossza és a. ktnp érték alapján), akkor a trimmelt régiókat megvizsgáljuk, hogy meghatározzuk, hogy a régiók összekapcsolhatók-e, hogy egy hozzávetőleges illesztést adjanak résekkel. Végezetül a két aminosav szekvencia, legmagasabb értékszámú régióit illesztjük, a Needleman-Wnnsch-Sellers algoritmus alkalmazásával fNeedlem&n és Wunsch: Journal of Molecular Biokw φ φΧ Κ-Φ

Φ * Φ Φ β φ φφφ ΦΦ·» « χ, ΦΦ» φ » * Φ «?*« φ φ φ s *ΦΦ *«» φ φ» 90t

48, 444 (1970); Sellers: SIAM J. Appl Math. 26, 787 (1974)) ami lehetővé teszi az aminosav inszerciókat és deléeiökat. A FASTA elemzés előnyben részesített paraméterei: ktup~i, résnyílás büntetés-10, résnövekedés büntetés-1, és a helyettesítési mátrlx^BLOSUM62, a többi paramétert alapértéken tartva. Ezeket a paramétereket az értékelési mátrix fiié („SMATRIX”) módosításával vihetjük be a FASTA programba, amint azt Pearson cikkének 2. mellékletében láthatjuk (Pearson; Methods In

Enzymology 183, 83 (19901)

A FÁSTA arra is használható, hogy meghatározzuk a nukieinsav molekulák szekvencia-azonosságát, az előzőkben ismertetett arány használatával, A nükíeoiíd szekvenciák: összehasonlításához a ktup érték egy és hat között változhat, előnyösen három és hat között, a legelőnyösebb, ha három, a többi paramétert alapértéken tartva.

A variáns zaiphal l lígandum polipeptideket vagy a lényegében homológ zaiphall polipeptideket az jellemzi, hogy egy vagy aminosav helyettesítést, deléeiót vagy addíciőt tartalmaznak. Ezek: a változások előnyösen rnlnor természetűek, azaz konzervatív helyettesítések (lásd az 5. táblázatot), és más olyan helyettesítések, amik nem érintik lényegesen a polipeptid térszerkezetét vagy aktivitását; kis deléciók, tipikus esetben 1-30 aminosav méretűek; és kis N-terminális vagy C-terminális extenziók, azaz például egy N-terminális metionin csoport, egy kis, maximum körülbelül 20-25 csoportból álló linket peptid, vagy egy affinitás jelölés. A jelen találmány tárgyát képezik továbbá azok a körülbelül 108-218 aminosavbol tidek, amik egy olyan szekvenciát tartalmaznak, ami legalább 70%-os, legalább 80%-os, legalább 90%-os, még előnyösebben

Φ φφ φ φ««φ φ φ«'* φφ* φ« ** ♦ φ φ

ΧΦΦ φ φ

X * X φ ** φ» legalább 95%~os, vagy nagyobb mint 95%-os szekvencia azonosságot mutat a 2. számú szekvenciavázlaton bemutatott aminosav szekvenciával. Az affinitás-jelölést tartalmazó polípepiidek tartalmazhatnak még egy proteolitikns hasítási helyet a zalpha 11. ligandum polipeptid és az .affinitás-jelölés között. Az ilyen, előnyben részesített hasítási helyek közé tartoznak, a trombin hasítási helyek és a Xa hasítási helyek.

4. Táblázat

Konzervatív aminosav helyettesítések. Bázíkus: arginin llzin

Savas:

Poláros:

Hídrofób:

glntaminsav aszparagínsav gluíamin izolenein valín

Aromás lamn

Bázíkus:

tripioían tirozin arginin alanín szerin treonín metíonin χ Φ Φ 4 «' φ φ Φ *

Μ* Φ φ 4SX 4 ΦΦφΧ φ:

φ· X Φ 9 Φ«Φ

Meghatározhatok azok az aminosav csoportok, amik a szerkezeti integritás megtartása szempontjából kritikus régiókban vagy doménekben vannak. Ezekben a régiókban meghatározhatjuk azokat a specifikus csoportokat, amik többé kevésbé toleránsak a változással szemben, és megtartják a molekula általános harmadlagos struktúráját. A szekvencia struktúrájának elemzési módszerei közé tartozik, többek között, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, több, magas aminosav- vagy nukleotídazonosságot mutató aminosav szekvencia egymáshoz illesztése, és a borított poláris kölcsönhatások [Barton: Current Opinion ín Structural Biology 5, 372-376 11995): Cordes és mtsai: Current Opinion. ín Structural Biology 6, 3-10 (1996)]. Általában, ha a molekulák módosítását tervezzük, vagy specifikus fragmenseket azonosítunk, akkor a struktúra meghatározását kíséri a módosított molekulák aktivitásának kiértékelése,

A zalphal 1 ligandum polípeptidekben úgy hajtjuk végre az aminosav cseréket, hogy minimalizáljuk a biológiai aktivitáshoz esszenciális magasabbrendű struktúra roncsolódását. Ha például a zalpha l 1 ligandum polipeptid egy vagy több hélixet tartalmaz, akkor az aminosav csoportokat úgy változtatjuk meg, hogy ne rontsák el a hélix geometriáját, valamint a molekula más komponenseit, amiknél a konformáció megváltozása néhánv kritikus funkciót csökkent, azaz például csökkenti a molekulának a kötő partnereihez, úgymint az A és D hélixekhez, és a 2, számú szekvencia 44-es, 47-es és 135-ös aminosav csoporthoz való kötődését. Az aminosav szekvencia cserék hatásai megjósolhatok, például az előzőkben ismertetett számitógépes ;zés alapján, vagy a kristály szerkezetének elemzése

Χ««4ί w * * * » * ♦•r alapján (Lapthorn és mtsai: Nat Struet, (1995)].

Más, a szakterületen jól ismert technikákban egy variáns fehérjének a térszerkezetét hasonlítják ősszé egy standard molekuláéval (azaz például a természetes fehérjéjével).

a cisztein mintázat egy variáns és egy standard molekulában. A tömegspektrometria és a kémiai módosítás, aminek során redukciót és alkftezést használnak, módszert hiztosit azoknak a cisztein csoportoknak a meghat ár ozásához, amik kapcsolatban állnak a diszulíid-hidakkal, vagy mentesek az ilyen asszociációktól (Beán és mtsai: .Analytlcal Bíochemistry 201, 216226 (1992); Gray: Protein Science 2, 1732-1748 (1993); Patterson és mtsai: Anal, Chem. 66, 3727-3732 (1994)]. Az elterjedt vélemény szerint, ha egy módosított molekulának nem ugyanolyan a diszulfid-hid mintázata, mint a standard molekulának, akkor ez befolyásolja a térszerkezetét. A térszerkezet mérésének egy másik jól ismert és elfogadott módszere a cirkuláris dikroizmus (CD). A módosított molekula és a standard molekula

CD spektrumának megmérése és összehasonlítása rutinszerű eljárás (Johnson: Proteins 7, 205-214 (1990)1 A térszerkezet és a struktúra vizsgálatának a krísztallográfía Is egy másik jól ismert módszere. A magmágneses rezonancia (NMR), az emésztéses peptid-térképezés és az epitop térképezés is Ismert módszere a fehérjék és polipeptidek térszerkezetének és strukturális hasonlóságainak elemzésére (Schaanan és mtsai; Science 257, 961964 (1992)1.

A 2. számú szekvencíavázlaton bemutatott zalphall fehérjeszekvenciának elkészíthető a Hopp/Woods hidrofOitási profilja (Hopp és mtsai: Proceedings of the National Acaderay of Sciences, USA 78, 3824-3828 (1981); Hopp: J, lmmunologica.1 Methods 88, #* *

Φ »♦ * X * Φ

1-18 (1988): Trlquíer és mtsal: Protein Engmeering. 11, 1.58-169 (1998)1, A profil egy csúszó, hatcsoportos ablakon alapul. A. fedett G, S és T csoportokat, valamint az érintkező Η, Y és W csoportokat kihagxduk- A zaiphall ligandumban például a hidrofil régiók közé tartoznak a 2, számú szekvencia 114-119~es amínosav csoportjai, a 2, számú szekvencia 1.01-105-ös csoportjai, a 2. számú szekvencia 139-144-es csoportjai a 2. számú szekvencia 126- 131-es amínosav csoportjai, a 2. számú szekvencia 113-1.18as amínosav csoportjai és a 2. számú szekvencia 188-162-es amínosav csoportjai.

A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy ^a hidrofilítást vagy hidrofobitást akkor vesszük figyelembe, ha a zaipha.11 ligandum polipeptid amínosav szekvenciájában módosításokat tervezünk, hogy ne rontsuk el az általános strukturális és biológiai profilt. A helyettesítés szempontjából különösen érdekesek a hidrofőb csoportok, amiket az alábbi csoportbőt választhatunk ki: Val, Leu és He, vagy a Met, Giy, Ser, Alá, Tyr és Trp csoport, A helyettesítéssel szemben toleráns csoportok köze tartozhat például a 2, számú szekvencia 100-as és 1.03-as csoportja. A 2, számú szekvencia 71-es, 78-as, 122-es és 125-ös pozícióiban levő ciszteüs csoportok azonban viszonylag intoleránsak a helyettesítéssel szemben.

Az esszenciális aminosavakat az ínterleu.kin-15, az in tértenkín-2, az interleukin-4 és a GM-GSF és a zaiphall ligandum közötti hasonlóság elemzése alapján azonosíthatjuk, .Az olyan módszerek, mint az előzőkben Ismertetett „FA.STA” elemzés, használatával az erős hasonlóság régióit azonosítjuk egy fehérjecsaládon beiül, és arra használjuk, hogy elemezzük az amínosav szekvenciát, konzerválódott régiókat keresve. Egy variáns '♦^ν* *♦*.* * <.·♦· * * V * Φ » *Φ»· „ » φ « <?,-'> * χ $$»« * » Í « .JV χ*' **9 ²⁵ &· «.

zalphall ligandum polinukleotídnak a struktúra alapján való: azonosítására egy alternatív megközelítési mód annak meghatározása, hogy egy potenciális variáns zalphal I ligandum polinukieotídot kódoló nukieinsav molekula képes-e hihrídízálódni egy olyan nukieinsav molekulához, aminek az aminosav szekvenciája megtalálható az előzőkben ismertetett, I. számú szekvenciában,.

A jelen találmány szerinti polipeptídekben az esszenciális aminosavak azonosításának más módszerei a. szakterületen jól

Ismert eljárások, azaz például a helyspecífikus mutagenezis, vagy az alaxnn-leíapoga tásos mutagenezis [Cunningham és Wells: Science 244, 1081 (1989): Bass és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 88, 4498 (1991); Coombs és Corey: „Slte-Directed Mutagenesis and Protein Eglneering’', In: Froteíns: Analysls and Design, 259-311. oldal, szerkó Angelettk Academie Press, Inc. (19981). Ez utóbbi technikában egy-egy alanín mutációt viszünk be a molekula minden egyes csoportja helyére, majd a kapott mutáns molekuláknak az alábbiakban ismertetett módon vizsgáljuk a biológiai aktivitását, hogy azonosítsuk azokat az aminosav csoportokat, amik kritikusak a molekula aktivitása szempontjából [Hilton és mtsai; Journal of Biologica.1 Chemistry 271, 4699 (1996)),

A jelen találmány tárgyát képezik még a zalphal 1 ligandum pohpepfidek funkcionális fragmeusei, valamint az ezeket kódoló nukieinsav molekulák . Egy „funkcionális” zalpha l 1 ligandum fehérjét, vagy annak az alábbiakban definiált, fragmensét a szaporodási vagy differenciálódási kásával lehet jellemezni, azzal a. képességével, hogy speciális sejtfunkciőkat indukál vagy gátol, vagy azon képesség alapján, hogy specifikusan kötődik egy anti-zalphalI ligandum ellenanyaghoz vagy zalphall. recep51 ν

*' $« ί».

torhoz (oldható vagy immobilízált). Amint azt az előzőkben leírtuk, a zalpha,ll~et ligandumot egy négy-hélixes kőteg struktúrával lehet leírni., ami tartalmazza az A hélixet (41-56-os aminosav csoportok), a B hélixet (69-84-es aminosav csoportok), a C hélixet (92-105-ös aminosav csoportok) és a D hélixet (135-148as aminosav csoportok), a 2. számú szekvenciavázlaton bemutatott módon. Tehát a jelen találmány tárgyát képezik továbbá az alábbi fúziós fehérjék; (a). polipeptid molekulák, araik egy vagy több itt ismertetett hélixet tartalmaznak; és (b) funkcionális fragmensék, amik ezek közül a hélíxek közül -egyet vagy többet tartalmaznak. A fúziós fehérje másik polipeptid részét adhatja egy másik, négy-hélixes kötegel tartalmazó oítokin, például az interleukín- IS, az interleukin-2, az ínterleukin-4· és a GM-CSF, vagy egy nem-természetes és/vagy nem rokon szekréciós szignálpeptid, ami megkönnyíti a fúziós fehérje szekrécióját.

A jelen találmány tárgyát képezik továbbá az olyan fúziós fehérjék, amik legalább négy pollpeptidet tartalmaznak, és a polipeptidek sorrendje a következő, az N ~ terminális tol a C-terminálisig; egy első polipeptid, ami az alábbi csoportból választható aminosavakat tartalmaz; a) az. interleukin-2 A héltx 36-46-os aminosav csoportjai (Ili. számú szekvencia); b) az interleukin15 A hélix 29-43-as· aminosav csoportjai (112, számú szekvencia); c) az interleukIn-4 A hélix 45-68-as aminosav csoportjai (113. számú szekvencia); d) a GM-CSF A hélix 30-44-es aminosav csoportjai (114. számú szekvencia); és el a 2, számú szekvencia 41-58-os aminosav csoportjai; egy első, 6-27 aminosavból álló térkitöltő; és egy második polipeptid, ami az alábbi csoportból választható- aminosav csoportokat tartalmazza; a) az mterleukiu-2 B hélix 53-75-ös aminosav csoportjai (111. számú szekvencia); b)

ΦΧΧ az ínterleukin-4 B hélix 65-83-as aminosav csoportjai (113. számú szekvencia! c) az ínterleuköa-15 B hélix 84-101-es· aminosav csoportjai (112, számú szekvencia); d) a GM-CSF B hélix 7281-es aminosav csoportjai (114. számú szekvencia); és e) a 2. .számú szekvencia. 63-84-es aminosav csoportjai; egy második, 511 aminosavat tartalmazó térkitöltő; egy harmadik polipeptíd, ami az alábbi csoportból választható aminosav csoportokat tartalmazza; a) az int.crleukm-2 C hélix 53-75~ös aminosav csoportjai Ilik számú szekvencia); b) az mterleukin-4 € hélix 95118-as aminosav csoportjai (112. számú szekvencia); c) az interleukin-15 C hélix lö7-119-es aminosav csoportjai (113. számú, szekvencia); d) a GM-CSF C hélix 91-102-es aminosav csoportjai (i 14. számú szekvencia); és e) a 2. számú szekvencia 92- 105-ös aminosav csoportjai; egy harmadik, 3-29 aminosavat tartalmazó térkitöltő; és egy negyedik polipeptíd, ami az alábbi csoporthói választható aminosav csoportokat tartalmazza: a) az interleukin2 D hélix !Ö3-I22~es aminosav csoportjai (111, számú szekvencia); b) az interÍeukin-4 D hélix 134-157-es aminosav csoportjai (112. számú szekvencia); c) az interleukin-15 D hélix 134-160-as aminosav csoportjai (113. számú szekvencia); d) a GM-CSF D hélix 120131-es aminosav csoportjai (114, számú szekvencia); és e) a 2. számú szekvencia 135-148-as aminosav csoportjai, aholis a hegy polipeptíd .közül legalább az egyik, egy zalphall ligandum. Más megvalósítási módok szerint a térkitöltő peptideket az alábbiak közül választhatjuk ki: a zalphal l ligandum, az inierleukín-2, az ínterleukin-4, az interleukin-15 vagy a GM-CSF A/B, B/C és C/D hurkai, amint azt az 1. táblázatban bemutatjuk.

5:3 «ΦΦΧ φ φ φ » *

Φ * ♦ Φ ΦΦ

Φ «

Φ Φ: Φ « φ

Φ *

Elvégezhetjük -a nukleinsav molekulák rutinszerű dcléciős elemzését, hogy megkapjuk egy nukleinsav molekula olyan funkcionális- fragmenseít, amik zalpha 11 ligandum polipeptidet kódolnak. Illusztrációként az 1, számú szekvencia vagy annak fragmensei szekvenciájával rendelkező

DNS molekulák Bal31 nukleázzal emészthetek.

ezzel hálózatos deléciók állíthatók elő.

Ezeket a DNS fragmenseket azután megfelelő leolvasási keretben beillesztjük expressziős vektorokba, majd az expresszáll polipeptideket izoláljuk, és vizsgáljuk zalphal 1 ligandum aktivitásukat, vagy azt a .képességüket, hogy megkötik-e az antl-zalphal 1 ligandum ellenanyagokat vagy a zalphal 1 receptort, Az exonukleázos emésztés -egy másik alternatívája az oligonukleotlddal vezérelt mutagenezis alkalmazása deléciók vagy stopkodonok bevitelére, hogy ezzel specifikáljuk egy kívánt zalpha 11 ligandum fragmens termelődését. Egy másik változat szerint a zalphal I ligandum. polipeptld kiválasztott fragmensei polimeráz láncreakcióval szintetízálhatók meg.

A funkcionális domének azonosításának standard módszerei jól ismertek a szakterületen jártas szakember számára. Például az interferonok valamelyik, vagy mindkét végének a csonkítását Horisherger és Di Marco foglalta össze (Horisherger és Dl Marco: Pharmac. Ther. 66, 507 (1995)1 Emellett a fehérjék

KXdonálís elemzésének standard technikáit is publikálták a szakirodalomban ÍTreuter és mtsai: Moleeular and General

Genetics 240, 113- (1993); Coritení és mtsai: „Expresslon and prelxmmary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase Induced. hy humán interferon”, ín: Biologicál interferon Systems, Proceedings of 1SIR-TNO Meeting on Interferon Systems, 85-72, szerk,; Cahtell, Nphoff (1987); Herschman: „The

Φ

Λ hn Control of Animál Ceil Proliferation 1 oldal, szerk.; Boynton és munkatársai, Academic Press (1985); Coumaiheau és mtsaí; Journal of Blologlcal Chemísíry 270, 29270 (1995); Pukunaga és mtsaí; Journal of Blologlcal Chemistry 270, 25291 (1995); Yamaguchi és mtsai; Biochem. Pharmacot 50, 1295 {1995}; Meisel és mtsaí; Plánt Molecular BíologySO, 1. (1996)}.

A mutagenezis és szűrővizsgálat ismert módszereinek alkalmazásával többszörös aminosav helyettesítések végezhetők el és vizsgálhatók le, például a Reidhaar-Olson és Sauer, vagy a Bowie és Sauer által leírt módszerekkel (Reidhaar-Olson és Sauer; Science 241, 53-57 (1988); Bowie és Sauer; Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 88, 2152-2156 (1939)1, Röviden, ezek a szerzők olyan módszereket írtak le, amikkel egyszerre lehet randomlzální két vagy több pozíciót egy polipeptldben, funkcionális polípeptidet szelektálva, majd szekvenálva a mutagenizált polipeptideket, hogy meghatározzák a megengedhető helyettesítések spektrumát az egyes pozíciókban. Más, szintén használható módszer a fág display módszer (Löwman és mtsaí; Biochem. 30, 10832-10837 (1991); Ladner és mtsai: .5,223,409 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Huse, WIPO Pubhcatlon WO 92/082045} valamint a régióba Irányított mutagenezis (Derbyshire és mtsai; Gene 46, 145 (1988); Ner és mtsai; .DNA 7, 127 {1938}].

Az Ismertetett zalphal 1 ligandum nukleotid és szekvenciák variánsai. Stemmer leírása szerint előállíthatok keveréssel (Stemmer; Natúré 370, 389-391 (1994); Stemmer; Proceedíngs of the National Academy of Sciences, USA 91, 10747-10751 (1994); WIPO Publicatin WO 97/20078). Röviden, a

«♦♦♦ ΦΦΦj Φ X ♦ +♦ « Φ χ

Φ X variáns DNS-eket in tetro homológ rekombinációval generáljuk, egv kiindulási DNS véletlenszerű fragmeniálásával, majd PCR-rel való újbóli összeállításával, ami véletlenszerűen bevitt pontmutáeiókat eredményez. Ezt a technikát módosíthatjuk kiindulási DNS-ek családjának, azaz például allélvariánsok, vagy különböző fajokból származó DNS-ek használatával, hogy az eljárásba további variabilitást vigyünk be. A kívánt aktivitás szelekciója vagy szűrővizsgálata, amit a mutagenezls és vizsgálatok további iterációja követ, a szekvenciák gyors „evolúcióját” eredményezi, a kívánt mutációkat kiválasztva, miközben ezzel egyidőben a káros változásokat kiszelektáljuk.

Az alábbiakban ismertetett mutagenezls módszerek kombinálhatők nagy áteresztőképességű, automatizált szűrővizsgálati módszerekkel, hogy kimutassuk a klónozott, mutagenizált polipeptideket a gazdasejtekben. Á biológiailag aktív polipeptideket vagy az antí-zalpha'l 1 ligandum ellenanyagokhoz vágj? az oldható zalpha 11 receptorhoz kötődő kódoló mutagenizált DNS molekulák kinyerhetők a gazdasejtekhőL és modern berendezésekkel gyorsan szekvenálhatok. Ezek a módszerek lehetővé teszik az egyes aminosav csoportok fontosságának meghatározását egy számunkra érdekes polipeptidben, és ismeretlen struktúrájú polipeptidekre is használhatók.

Emellett, a jelen találmány szerinti fehérjék (vagy azok polipeptid íragmenseil összekapcsolhatók más biológiailag aktív molekulákkal, főleg más citoklnekkel, ezzel multifunkciós. molekulákat állítva elő. Például a zalpha 11 ligandum. egy vagy több hélíxe hozzákapcsolható más ciiokinekhez, hogy ezzel javítsuk biológiai tulajdonságaikat vagy termelődésük hatékonyságát.

Tehát a jelen találmány tárgya egy sorozat új, hibrid molekula, amikben a zalphal 1 ligandum egy vagy több hélixét tartalmazó szegmenst más polipeptiddel fuzionáltatunk, A fúziót előnyösen úgy hajtjuk végre, hogy a DNS szintjén végezzük el az illesztést, úgy, hogy lehetővé tegyük a kiméra molekulák expresszióját rekombináns termelési rendszerekben. A kapott molekuláknak azután vizsgáljuk az olyan tulajdonságait, mint például a megnövekedett oldhatóság, a meghosszabbodott kiürülés! féléletidő, a javult expressziős és szekréciós szintek és farmakodinámia. Az ilyen hibrid molekulák tartalmazhatnak még további aminosav csoportokat (például polipeptíd linkért) a molekulát alkotó fehérjék vagy polipeptidek között.

A jelen találmány szerinti fehérjék tartalmazhatnak a természetben elő nem forduló aminosav csoportokat is. Nem-természetes aminosav lehet, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a transz-3-metílprolin, a 2,4-metanoprolin, a cisz-4hidroxiprolm, a transz-hldroxiproim, az N-metil-giiein, az allotreonin, a metiltreonm, a hidroxíetil-cisziein, a hidroxieülhomoeiszieín, a nitroglutanün, a homoglutamin, a. pipekolsav, a tiazolidin-karhonsav, a delúdroprolin, a 3- és 4-metílprolin, a 3,3-dírnetílproiíru a terc-leucm, a norvalin, a 2-aza-fenílalanin, a

3-aza~fenilalanin, a 4-aza-íenilaÍanin és a 4-fluor-fenilalanin. Számos módszer ismert a szakterületen arra, hogy nem természetes aminosavakat építsünk be fehérjékbe. Például használható egy in ohm rendszer, amiben a nonszensz mutációkat, kémiailag acllezett szuppresszor tRNS-ek használatával nyomják el. Az aminosavak és a tRNS aminoaeilezésének módszerei ismertek a szakterületen. A nonszensz mutációkat tartalmazó plazmidok transzkripcióját és transzlációját sejtmenfes rendszerben hajtjuk φΦ

Φ*X« *·»φ φ * φ φ** Φ4>.φ.

* * φ * * φ φ '*·.* X φ végre, ami tartalmaz egy Eseheríehfe colt S3Ö kivonatot, valamint kereskedelmi forgalomban beszerezhető enzimeket és más reagenseket. A fehérjéket kromatográfiával tisztítjuk (Robertson és mtsai: Journal of the American Chemical Society 113, 2722 (1991);BIlman cs mtsai; Mefhods in Enzymology 202, 301 (1991); Chung. és mtsai:. Science 259, 806-899 (1993); Chung és mtsai; Proceedings of the National Academv of Sciences, USA 99, 19145-10149 (1993)),

Egy második módszer szerint a transzlációt Xenopus oociiákban hajtjuk végre, a mutáns mRNS és a kémiailag aminoacilezett szuppresszorok mikroinjekcíózásával (Turcatti és mtsai; Journal of Biological Chemistry 271, 19991-1998 (1996)1, Egy harmadik módszer szerint az Escheridtía coli sejteket a helyettesítendő természetes aminosav (azaz· például fenilalanin) távollétében, de a. kívánt nem-természetes aminosav) ak) jelenlétében (azaz például 2-aza-fenÜ.alanín, 3-aza-fenilalanin, 4-aza-fenilalanín vagy 4-fluor-fenilalanin) tenyésztjük. A természetben elő nem forduló aminosavakat a természetes megfelelőjük helyett építi be a sejt a fehérjébe (Kőidé és mtsai: Bíochemísíry 33, 7470-7478 (1994)). A természetben előforduló aminosav csoportok in vitro kémiai módosítással természetben elő nem forduló aminosavakká konvertálhatók. A kémiai módosítást kombinálhatjuk helyspecifikus· mutagenezlssel, hogy ezzel még jobban kiterjesszük a helyettesítések tartományát [Wynn és .Richards; Protein Science 2, 395-403 (1993)), Előnyös lehet a zalphal 1 ligandum molekulák stabilizálása, főle,:

molekula fél-életidejének rne sszahbítására.

A megnövekedett fél-éle eléréséhez a zalphal 1 ligandum molekulákat kémiailag módosíthatjuk. az alábbiakban ismertetett módszerekkel, A pegilezés az egyik álla» X ♦ ♦ * ♦

Χβί

X ·>

lánosan használt módszer, amiről igazolták, hogy megnöveli a plazma fél-életidőt, megnöveli az· oldhatóságot, és csökkenti az antígenitást és immunogenitást (Nucci és mtsai; Advanced Drog

Dellvery Reviews 8, 133-155 (19911; Lu és mtsai: International Journal of Protein and Peptide Research 43, 127-138 (1994)1

Korlátozott számú nem-konzervatív aminosav, a genetikai köd által nem kódolt aminosav, néni természetes aminosav, és a természetben elő nem forduló aminosav helyettesíthető a zalpball llgandum aminosav csoportok helyére.

A jelen találmány tárgyát képezik olyan poiipeptld fragmensek vagy peptidek, amik az itt ismertetett zalpball lígandum polípepticlnek egy epitopot hordozó részét tartalmazzák. Az ilyen íragmensek vagy peptidek tartalmaznak egy „immunogén epítopot”, ami egy olyan fehérjének egy része, ami antigén választ kelt, ha a teljes fehérjét használjuk immunogénként. Az Immunogén epitopot hordozó peptideket standard módszerekkel azonosíthatjuk IGeysen és mtsai: Procéedings of the National Academy of Sciences, USA 81, 3998 (1983)1.

Ezzel ellentétben a poiipeptld íragmensek vagy peptidek tartalmazhatnak egy „antigén epitopot”, ami egy fehérjemolekula egy olyan régiója, amihez egy ellenanyag képes specifikusan kapcsolódni. Néhány epitop aminosavak lineáris vagy egybefüggő részét tartalmazza, és egy ilyen epitopnak az antigenítását nem. rontják el a denaturáló ágensek. A szakterületen ismert, hogy viszonylag rövid szintetikus peptidek, amik képesek utánozni egy fehérje epitopjait, képesek stimulálni a fehérje elleni ellenanyagok; termelődését [Sutdiffe és mtsai; Science 219, 680 (1983)1. Ennek megfelelően a jelen találmány szerinti, antigénhordozó peptidek és polipepödek jól használhatók olyan ellena♦ «·.

**» Χφφ χ>

»»♦ ΦΦΦ ‘ * f * *x* Φ

Φ Φ χ Φ φτ φ * »6 nyagok készítésére, amik kötődnek az itt ismertetett polipeptídekhez. Hopp/Woods hidrofilitásl profilok használhatók azoknak a. régióknak a meghatározására, amiknek a legnagyobb az antigén potenciálja (Hopp és mtsai; Proeeechngs of the National Academy of Sciences, USA 78, 3824-,3828 (1984); Hopp: J, Immunologícal 'Methods 98, 1-18 (1988)1. A zalphall ligándurnban ezek a régiók a következők: a. 2. számú szekvencia Π4119-es, 101- 105-ös, 126-13l~es, 113-118-as és 158-162-es. aminosav csoportjai.

Az antigén epitopot hordozó peptidek és poiipeptidek a 2. számú szekvenciából vagy az 56. számú szekvenciából előnyösen legalább négy-tíz aminosavab legalább fiz-tizennégy aminosavat, vagy körülbelül tizennégy-harmine aminosavat tartalmaznak. Az ilyen epitopot hordozó peptideket és polipeptideket egy zalphal 1 ligandum polipeptid fragmentálásávak vagy kémiai pepfidszintézissel állíthatjuk elő, az alábbiakban ismertetett módon.. Emellett az epitopokat random pepiid-könyvtárak fágbemntatásával szelektálhatjuk (Lane és Stephen: Curr, Opin, Immunok 5, 288 (1993); Cortese és mtsai; Curr. Opinion. Biotechnoi. 7, 818 (199611. Az epitopoknak egy epitopot. tartalmazó kis pepiitekből való azonosítására és ellenanyagok előállítására szolgáló standard eljárásokat a szakirodalomban ismertették (Mole: „Epftope

Mapping”, Methods in Molecuiar Biology 10, 105-118. oldal, szerk.: Marison, The Humana Press, Inc, (1992); Price; „Producbon and Charactcrization of Synthetic Peptide-Dérivé d Antibodies”, ín: Monodonal Antíbodies: Produetion, Engineering, and Cfinicaí Application, 60-84. oldal szerk.; Rittman és Ladyman, Cambridge Ihüversíty Press (1.995); Coligan és mtsai (szerk.):: Current Protocols in ímmunology 9,3.1-9.3.5 és 9.4.19.4,11 oldal John Wiley and Sons (1997)L

BgY variáns zalphall ligandum nukleotid szekvenciájától függetlenül a poiinukleotid egy olyan polipeptidet kódol, amit a szaporodási vagy differenciálódási aktivitásával lehet jellemezni, vagy azzal a képességével, hogy speciális sejtfunkelőkat indukál vagy gátol, vagy azon képesség alapján, hogy specifikusan kötődik egy an.ii-zalpha 11 ligandum ellenanyaghoz vagy zalphal 1 receptorhoz. Még pontosabban, a variáns zalphall ligandum polinukleotidok olyan polipeptideket kódolnak, amik legalább 50%-os, előnyösebben a 2.számú szekvenciavázlaton bemutatott polipepfidnél nagyobb mint 70%-os, 80%-os vagy 90%-os aktivitást mutatnak.

Bármelyik zalphal l ligandum polipeptid esetében, beleértve a variáns és fúziós fehérjéket is, a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember az 1. és 2. táblázatban közölt információk alapján könnyen elő tud állítani egy teljesen degenerált, a variánst kódoló poiinukleotid szekvenciát

A jelen találmány tárgyát számos különböző polipeptid fúzió, valamin t a rokon multimer fehérjék képezik, amik egy vagy több polipeptid fúziót tartalmaznak, Például a zalphall ligandum. polipeptid elkészíthető egy dimerizálö fehérjével való fúzió- formájában, az 5,1-55,027 és 5,567,584 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetett módon. Ebből a szempontból az előnyben részesített dimerizálö fehérjék közé tartoznak az immunglobulin konstans régió domének. Az irnmunglobulin-zalpha 11 ligandum polipeptid fúziókat génsebészeti úton módosított sejtekben expresszáltathatjuk, ezzel számos különböző multimer zalphal I ligandum. analógot lehet elóál* X ♦·* ói φ Χ'φ. φ φ *φφ φφφ * * * Φ X φ

Utáni, Kiegészítő domének is fúzionáltathatők a zalphall ligándum polipeptidekhez, hogy specifikus sejtekbe, szövetekbe vagy makromolekulákba (azaz például kollagénbe) irányítsuk őket. Bgy zalphal 1 ligandum polipeptíd vagy fehérje egy előre meghatározott sejttípusba irányítható, a zalphall polipeptidet -egy olyan Ugandámhoz fuzionál tatva, ami specifikusan kötődik a megcélzott sejt. felszínén levő· receptorhoz. Egy zalphall polipeptid két vagy több egységhez kapcsolható, azaz például tisztításcéljából egy affinitás jelöléshez, és egy célzó doménhez. A polipeptíd fúziók emellett tartalmazhatnak egy vagy több .hasítási helyet, főleg a domének között (Tuan és mtsai: Connective Tissue

Az itt ismertetett módszerek alkalmazásával a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember azonosíthatja és/vagy előállíthatja, a polipeptídeknek azokat a variánsait, amik lényegében hasonló szekvencia azonossággal rendelkeznek a. 2.

számú szekvencia 1-162-es vagy '33-162-es amínosav csoportjaihoz, vagy azok fragmenseit és fúzióit, aholís az ilyen polipeptidek vágy fragmensek vagy fúziók megtartják a vad-típusú óságait, azaz például a szaporodás, a dífferenciálólenerje tuis dás s tímulálásának, alizált sejtú.mkeíök ;\c!

vagy a z

a.

receptor vagy zalphall

A jelen találmány szerinti zalphall ligandum polipeptidefc, beleértve a teljes hosszúságú polípeptideket. biológiailag aktív fragmenseket és fúziós polipepíideket, hagyományos technikákkal előállíthatok génsebészetlleg módosított gazdasejtekben. Azok a sejttípusok a megfelelő- gazdasejtek, amik külső DNS-sel transzformálfiatők és transzfektálhatók, majd tenyészetben sza* * ♦ίφ ΦΧ«

X' »*·♦ φφφ poríthatok, ide értve a baktériumokat, a gombasejteket, és a tenyésztett magasabbrendű eukarióta sejteket. Előnyben részesítjük az eukarióta sejteket, különösen a többsejtes szervezetek, tenyésztett sejtjeit. A klónozott DNS molekulák manipulálás! technikái és a külső DNS különböző gazdasejtekbe való bejuttatás! technikái a szakirodalomban szakkönyvekben publikálva vannak (Samhrook és mtsai: Molecular Cloníng; A Laboratory Manual; 2, kiadás, Coki Spring Harbor Press, Cold Spríng Harbor, N,¥. 11989}; Current Frotocols in Molecular Btology, szerkó Ausubel és mtsai, Greene Publishmg és WileyInterscicnce; New York (1987)1

Általánosságban, a zalphall ligandum polipeptidet kódoló DNS szekvenciát működés .szempontjából az expresszióhoz szükséges más genetikai elemekhez kapcsoljuk, ami általában lehet transzkripciós promoter és termínátor e-gy expressziős vektoron belül. A vektor emellett általában tartalmaz egy vagy több szelekciós markért, és egy vagy több replikációs origót, bár a .szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy bizonyos rendszerekben a szelekciós markert külön vektorral kell biztosítani, és az exogén DNS replikációját a gazdasejt genomjába. való integrálódással lehet biztosítani, A p-ro-moterek, terminálotok, szelekciós markerek, vektorok és más elemek kiválasztása rutin dolga.

és a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember ismeretei közé tartozik. Számos ilyen elemet írtak le a szakirodalomban, és kereskedelmi forgalomban beszerezhetők.

Ahhoz, hogy' egy zalpha i 1 ligandum polipeptidet egy gazdasejt szekréciós bíoszintézis útjára irányítsunk, egy szekréciós szignálszekvenciát (ami vezérszekvencia, prepro szekvencia vagy pre szekvencia néven is ismert) biztosítunk, az expressziős ·*«♦ X**» χ ♦ * χ· *** η« φ ♦ ♦

Φ4* «»«

ΦΦ « Φ*Φ * * « Φ ·' ΦΦ vektorban, A szekréciós- szignálszekvenoia lehet a zalphall ligandum szekréciós szígnálszekveneiáia, de származhat más .székretálódó fehérjéből is (azaz például tPa-ből), vagy de nouo színtetizálödhat. A szekréciós szignálszekvencia működés szempontjából a zalphall ligandum DNS szekvenciához kapcsolódik, azaz a. két szekvencia egymáshoz képest helyes leolvasási fázisban helyezkedik el, hogy az újonnan színtetizálődott polipeptidet a gazdasejt szekréciós bioszintézis útjára irányítsa. A szekréciós szígnálszekvenciák a számunkra érdekes polipeptidet kódoló DNS szekvenciához viszonyítva általában 5 ' irányban találhatók, bár néhány szekréciós szlgnálszekvencia a számunkra érdekes DNS szekvenciában máshol is elhelyezkedhet (lásd például Welch és munkatársai: beli szabadalmi

037,743 számú Amerikai ás. Holland és munkatársai: 5, számú Amerikai Egyesült ÁUamok-beli szabadalmi leírású

Egy másik változat szerint a jelen találmány szerinti polipeptidekhen található szekréciós szignálszekvenciát arra használjuk, hogy más polipeptideket a szekréciós bioszintézis útba irányítsunk. A jelen találmányban biztosítunk ilyen fúziós polipeptídcket. Egy olyan fúziós polipeptid készíthető, amiben a 2, számú szekvencia t-es amínosavától a 31-es aminosaváig. terjedő szekréciós szignálszekvencia működés szempontjából egy másik pobpcptidhez kötődik, a szakterületen ismert, és az alábbiakban ismertetett módszerek használatával. A jelen találmány szerinti fúziós polipeptidekheu levő szekréciós szignál szekvencia előnyösen N-terminális módon fúziónál a további pepiidhez, hogy ezzel a további pepiidet a szekréciós bioszintézis útba irányítsa. Az ilyen konstrukcióknak a szakterületen számos ismert alkalmazásuk van. Például ezek az új szekréciós szignálszefcveneía fúziós konstrnkci zott nem-sze Az ilyen fe noeket átvezess irányíthatják egy normális körülmények köéhérje aktív komponensének szekrécióját, asználhatjuk ín oíoo vagy In oiíro, hogy a pepszekréciós fotoszintézis úton.

A tenyésztett emlős sejtek megfelelő gazdaszervezetek a jelen találmányban. Az- exogén DNS emlős gazdasejtekbe való bejuttatásának módszerei közé tartozik a kafcium-foszfátos transzfekeió (Wigler és mtsai: Cell 14, 725 (1978); Corsaro és Pearson; Somatíc Cell Genetícs 7, 803 (1981): Graham és Van dér Eb:

Vírology 52, 456 (1973)], az elektroporácíó (Neumann és mtsai; RMBO Journal Jfo 841-845 (1982)), a DBAF-dextrános transzfekcio i ín Moiecular Biology, szerk.; Ausubel és Víley-hiierscíence: New York (1987)], és a Ilposzómás transzfekciö [Hawley-Nelson és mtsai: Focus 15, 73 (1993); Ciccarone és mtsai: Focus 15, 80 (1993)1, és a virális vektorok (Miller és Rosman: BíoTechnlques 7, £ (1989): Wang és Finer: Natúré Med, 2, 714-718 (19981). A ix bináns polipeptidek előállítását tenyésztett emlőssejt* ismertetik a szakirodalomban (Levtnson es mtsai: 4,713,339 számú Amerikai Egyesült Államok-béli szabadalmi leírás; és mtsai: 4,784,950 számú Amerikai Egyesült Államokszabadalmi leírás; Palmítcr és mtsai: 4,579,821 számú Amerikai mtsai, Grcene Publishing és

Egye mok-belí szabadalmi leírás;

x V-v.

számú Amerikai Egyesült Áilamok-belí szabadalmi leírás). A megfelelő, tenyésztett emlős scitek közé tartozik a COS-1 (A

CRL 1850), a COS-7 (ATCC No. CRL 1851), a BHK (ATCC No. CRL 1832), a BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), a 293 (ATCC No. CRL 1573) (Graham és mtsai; J, Gén. Virol, 38, 59-72 (1977)1, valamint az aranyhörcsög petefészek sejtvonalak (azaz például a

Φ *♦ * * φ -χ * $ « φ φ φ * φ » φ φ φ

ΦΦΦ φ-vx J φ * »

φ φφ * Φ «Φ

CHO-KI; ATCC No. CCL 61). A szakterületen további sejtvonalak ismertek, és beszerezhetők a nyilvános letéti helyeken, mint például az American Tvoe Cuiiure Coilection-től (Rockvüle, Marylandi, Általában az erős transzkripciós promotereket. részesítik előnyben, mint például az SV4Ö vagy eítomegalovírus promotereket (4,956,288 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). Más használható promoterek származhatnak a metallotlonein génekből (4,579,821 és 4,601.,978 számú

Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), és ilyen lehet az adenovírus fő késői promoter.

Általában gyógyszer hatóanyaggal végzett szelekciót használnak azoknak a tenyésztett emlős sejteknek a kiválasztására, amikbe az idegen DNS-t beépítették. Az ilyen sejteket általában mint „transzíektánsokat”emhtik. Azokat a sejteket, amiket egy szelekciós ágens jelenlétében tenyésztünk, és a számunkra érdekes gént képesek továbbadni utódaiknak, „stabil transzfektánsoknak” nevezik. Egy előnyben részesített szelekciós marker a neomlcin-rezisztenciát kódoló gén. A szelekciót egy neomicin-típusú. hatóanyag·, azaz például G-418, vagy hasonló jelenlétében hajtjuk végre. A szelekciós rendszereket arra is használhatjuk, hogy fokozzuk a számunkra, érdekes gén expresszióját, amely eljárást „amplífikáciő” néven említenek. Az amplifíkálást úgy hajtjuk végre, hogy a transzfektánsokat. a szelekciós ágens alacsony szintje jelenlétében tenyésztjük, majd elkezdjük növelni a szelekciós ágens mennyiségét, hogy kiválasszuk azokat a sejteket, amik a bevitt gének termékeit nagy mennyiségben termelik. Egy előnyben részesített, amplifíkálható szelekciós marker a dihidrofolát-reduktáz, ami metotrexát rezisztenciát biztosít.

Más gyógyszer-rezisztencia gének (mint például a higromicin re66 zisztencia, multidrog rezisztencia, puromicin acetíltranszíeráz) is használhatók. Az alternatív markerek. amik egy megváltoztatott fenotípust, mint például a zöld fluoreszcencia fehérjét, vagy sejtfelszíni fehérjéket, mint például a CD4-et, a CD8-at, az I-es osztályba tartozó MHC-t, méhlepény alkalikus íoszfatázt visznek be, arra használhatók, hogy a transzfektált sejteket elválasszuk a nem-fcranszfektált sejtektől, például KACS osztályozással vagy mágneses gyöngy elválasztási technológiával.

Más, magasahbrendű eukarióta sejtek is használhatók gazdaszervezetként, beleértve a növénysejteket, rovarsejteket és a madársejteket. Az Ágrobacterium rhizogenes vektorként való használatát gének növénysej lekben való expressziójához Slnkar és munkatársai foglalták össze I Sínkar és mtsai: J. Bioscí. (Bangalore) Π, 47-58 (1987)1· A rovarsejtek transzformációját, bennük idegen polipeptidek előállítását Guarino és munkatársai írták le (5,182,222 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás, WO 94/08463 számú WIPÖ publikációk A rovarsejtek fertözhetők rekombináns bakulovírusokkal, amik általában az Áutoprapha .caöfömien nukleáris poíihedrózis vírusból származnak IKing, L. A, és Possee, R.D.: The Baculovirus Expression Systems: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; G'Reilly, D.R. és mtsai: Baculovirus Expression Vectors; A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press (19941; Richardson, C.D. íszerk.i: Baculovirus Expression Protocols. Methods in Moiecuiar Biology, Totowa, Nd, Humana Press (1995)L A rekombináns bakulovírus előállításának második módszere alkalmazza a Luckow által leírt transzpozon-aíapú rendszert (Luckow, V.A. és mtsai: J. VíroL. 87, 4568-4579 (1993)], Ezt a rendszert, ami transzfer vektorokat tartalmaz, a Bac~t.o-.Bac™ •X φ *·*·« κ χ ·' kittel szerezhetjük be (Life Technologies, Rockyille, MD), Ez a rendszer egy transzfer vektort, a pFasfBacl™-et (Life Technologies) alkalmaz, ami egy T7 transzpozont használ arra, hogy' a zalphall ligandum polipeptidet kódoló DNS-t egy Esehen'chia eok-ban egy nagy plazmidon (neve „bacmid”) fenntartott bakulovírus genomba juttassa be. A pFastBacl™ transzfer vektor az AcNPV polihedrin promotert használja a számunkra érdekes gén, ebben az esetben a zalphall ligandum gén meghajtására. Azonban a pFastBacl™ jelentős mértékben módosítható. A polihedrin promoter eltávolítható és egy bakulovírus alap fehérje promoterrel helyettesíthető (ami Pcor, p6.9 vagy MP promoter néven is ismert, és amiről kimutatták, hogy előnyös a szekretált fehérjék expresszálásához (Hül-Perkins, M.S, és

Possee, R.D.; J, Gén. Virol. 74, 971-976 (1990); Bonning, B.C és mtsai: d. Gén. Virol. 75, 1551-1556 (1994); Chazenbalk, G.D. és

Rapoport, B.; Journal of Biologfeal Chemistry 270, 1543-1549 (1995)). Az. ilyen transzfer vektor konstrukciókban az alap fehérje rövid vagy hosszú verziója használható. Továbbá olyan transzfer vektorok készíthetők, amik a természetes zalphall ligandum szekréciós szígnálszekvenciáját rovarfehérjékből származó szekréciós szígnálszekvencíával helyettesítik. Például az Ekdiszteroid Glükozíltranszferázból (EGT), a méh Melittinhol (Invitrogen, Carlsbad, CA) vagy a bakulovírus gp67-hdl (Fharmíngen, San Diego, CA) származó szekréciós szignálszekvencia használható a természetes zalpha 11 ligandum szekréciós szignálszekveneia helyettesítésére. Emellett a transzfer vektorok tartalmazhatnak leolvasási fázisban levő fúziót egy epitop jelölést (például GluOlu jelölés) kódoló DNS és az expresszált zalphal 1 polipeptíd Ctermináhsa vagy H-terminálísa között (Grussenmeyer, T. és φ Λ **·«· . Ί

-··-·<

mtsal·. Proeeedtngs of the National Academy of Sciences, USA 82, 7952-7954 (1985)]. A szakterületen ismert technika használatával egy zalphal 1 ligandum gént tartalmazó transzfer vektort Escheríchfei eoO-ba transzformálunk, majd. olyan bacmidokat keresünk, amik a rekombínáns bakulovlrusra jellemző, megszakított laeZ géni tartalmaznak, A rekombínáns bakulovírus genomot tartalmazó baeniid DHS-t izoláljuk, szokásos technikák alkalmazása val, majd sejtek transzfektálására használjuk. Ezt követően előállítjuk a zaiphall ligandumot expresszáio rekombínáns vírust. A rekombináns vírus törzsállományokat a szakterületen általánosan használt módszerekkel állítjuk elő.

A rekombínáns vírust használjuk a gazdasejtek, tipikus esetben a sereghernyóból, a Spodoptern/rapiperdö-ból származó sejtvonal fertőzésére í Glick és Pasternak; Molecular

Bioleehnology': Principles and Applications of Reeombinant DNA, ASM Press, Washington D.C. (199411. Egy másik megfelelő .sejtvonal a Tnchoplusin ní-bol származó High Fivcö™ sejtvonal (Invitrogen.) (5,300,435 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás].

A jelen találmány szerinti eljárásban gombasejtek - beleértve az élesztősei teker is - is használhatók. Az ebből a szempontból különösen érdekes élesztőíajok közé tartozik a .Snccharomyces ecrefestae, a Piehia posfens, és a Píchí'a meihano&a. A Söechuromt/ces cereaisloe exogén DNS-sel való transzformálásának, és az így transzformáit sejtekkel rekombínáns polipeptidek előállításának módszereit a szakirodalomban leírták (Kawasaki; 4,599,311 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Kawasaki és mtsai: 4,931,373 számú Amerikai Egyesült «»«« * ** * Φ * 0 » * *

0<0 ·».0 0: 0 »Χ· * *

0 «*#» * 0 * * 0 X * « 0 * * * * ·*

Államok-beli szabadalmi leírás; Brake; 4,870,008 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás: Weleh és mtsai: 5,037,743 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Murray és mtsai: 4,845,875 szánni Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), A transzformált sejteket a szelekciós marker, általában gyógyszer-rezisztencia, vagy egy adott tápanyag (leuein) hiányában való növekedési képesség által megbatározott fenotípus alapján szelektáljuk. A Saceharomyces eerevíslae-ben előnyben részesített vektorrendszer a Kawasaki és munkatársai által ismertetett POTI vektorrendszer (Kawasaki és mtsai: 4,931,373 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), ami lehetővé teszi, bogy a transzformált sejtek a glükóz tartalmú táptalajon legyenek szelektálhatók. Az élesztőben való használatra alkalmas promoterek és termínátorok közé tartoznak a glikolitikus génekből származó promoterek és termlnátorok (Kawasaki és mtsai; 4,931,373 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Kingsman és mtsai: 4,815,974 szánul Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Bittér: 4,977,092 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás), valamint az alkohol-dehidrogenáz génekből származó promoterek és termínátorok (4,990,448; 5,063,154:5,139,938 és 4,681,454 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás). Más élesztőkhöz. mint például a Hnnsenukx poíymorphahoz, a Sobizosacchnrompces pombe-hoz, a jFÜnyoeröm&ces kxcdshoz, a KIní|ueromyees J'ragíüs-hez, az Usó'fopo maydís-hoz, a Piekia pusfons-hoz, a Piehm meíhunokeu-hoz, a Piehki guJfermondá-hoz és a Candída mákosa-hoz használható transzformációs rendszereket leírták a szakirodalomban (Gleeson és mtsai: Journal of General Microblology 132, 3459-3465 (1988);

φ φφ * φ * φ X ♦ * φ»φ ΧΦ* * φ Φ*Χ * Φ β » * φ φ φ φ Φ χ φ φφ* * ♦* **

Cregg: 4,882,279 számú Amerikai Egyesült Allamok-belí szabadalmi leírást Az Aspergíte sejteket MeKnight és munkatársai módszerével használhatjuk (4.935,349 számú. Amerikai Egyesült Álla.mok-foeli szabadalmi leírás). Az Áeremonfom chrj/sog?enum transzformálási módszereit Sumitomo és munkatársai publikálták (5,182,228 számú Amerikai .Egyesült Allamok-bell szabadalmi leírás). A Neurospora transzformálási módszereit, üambowitz írta le (4,486,533 számú Amerikai Egyesült Államokbeli szabadalmi leírás).

A Píchte metiianoifoci gazdaszervezetként való használatát rekombínáns fehérjék előállításában a WO 97/17450, WO

97/17451, WO 98/02536 és WO 98/02565 számú WIPO íáoiőkban írták le. A Piehin methunodea transzformálására használt molekulákat .általában kétszálú, cirkuláris formájában álltjuk elő, amiket a transzformáció előtt előnyösen linearizálunk. A Píchfo meíkanokea-ban való polipeptid termelés során az az előnyös, ha a piazmídban a promoter és a terminátor egy Ptchín meíhunohca génből, azaz például a Pichfo methanoücn alkohol-hasznosító génből (AUGl vagy AUG2) származik. Más használható promoter lehet a dihidroxiaceton-szlntetáz (DITAS1, a formát-dehidrogenáz (FMD) és a kataláz (CAT) gének promotere. Abból a célból, hogy megkönnyítsük a DNS-nek a gazdaszervezet kromoszómájába való integrációját, az az előnyös, ha a plazmid teljes expressziós rendszerét mindkét végén a gazdaszervezet DNS szekvenciái határolják. Picbiu méthánölícá-ban az előnyben.

részesített szelekciós marksr a Pkhia meíhnnolíca ADE2 génje, ami a íaszíorihözll-S-amlnoímidazöI karfooxiláz (AIRC: EC

4,1.1.21) enzimet kódolja, és lehetővé teszt, hogy az adc2 gazdasejtek adenin távoliétében növekedjenek. A nagyméretű, ipari alX φ φ

V ' Φ

X Φ φ X- Φ

X* ·* φ

«* kalmacásokban, amikor kívánatos a metanol á minimalizálása.,, az az előnyös-, ha olyan nálunk, amikből mindkét metanolt hasznosító gént (AUG1 és

ÁG G2) etált fehérjék előállításához- a vakuoláris protcáz génekben (PEF4 és PRB1) defíciens gazc nálata az előnyös, Elektroporációt használunk egy olyan midnak a Pfchía methonohca sejtekbe való bejuttatására, ami a számunkra érdekes polipeptidet kódoló DNS-t tartalmazza. Az az előnyös, ha a. Píchía methanoöca sejteket elektr-opor-ációval transzformáljuk, exponenciális lecsengésű, pulzáló elektromos mezőt használva, aminek az- erőssége 2,5-4,5 kV/cm, előnyösen körülbelül 3,75 kV/cm. és az időállandó 1-40 milliszeku legelőnyösebben körülbelül 20 mllllszekundum.

A prokariota gazdasejtek, beleértve az Dscheríchía colt baktérium., a öncOlus és más nemek törzseit, szintén jól használható gazdasejtek a jelen találmány gyakorlatában. Ezeknek a gazdaszervezeteknek a transzformációja és a bennük klónozott idegen DNS szekvenciák expressziója jól ismert a szakterületen (Samhrook és mtsai: Moleeular Cloning: A taboratory Manna!; 2, kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989)]. Ha egy zalphal 1 ligandum polipeptidet. baktériumokban, például Eschertó-ía cok-ban expresszálunk, akkor a polipeptld maradhat a citoplazmában, tipikus esetben oldhatatlan szemcsék formájában, vagy a periplazmatikus térbe irányíthatók egy bakteriális szekréciós szekvenciával. Az előző esetben a sejteket lizáltatfuk, majd a szemcséket kinyerjük és ráljuk, például guanidín-izocianát vagy karbamid nálásával. A denaturált polipeptidnek azután újra kialakítjuk a. térszerkezetét, majd a denaturáló szer hígításával dimerizálp « Φ Φ> Φ « ν szembeni díalízálás révén, ezt követi a dialízis puffereit sóoldattal szemben. Az utóbbi esetben a polipeptid a sejtek elroncsolásávaí (például ultrahangos besugárzással vagy ozmotikus sokkal) oldható és funkcionális formában kinyerhető a períplazmatikus térből, aminek során a períplazmatikus tér tartalma kiszabadul, és a fehérjét kinyerjük, aminek az az eredménye, hogy nincs .szükség a denaturálásra és a térszerkezet kialakítására.

A transzformáit vagy transzfektált .sejteket hagyományos módszerekkel tenyésztjük tápanyagokat és a kiválasztott gazdasejt növekedéséhez szükséges más komponenseket tartalmazó táptalajban.. Számos különböző, megfelelő táptalaj, beleértve a definiált táptalajokat és a komplex táptalajokat is, ismert a szakterületen, ezek általában szénforrást, nitrogénforrást esszenciális aminosavakat vitaminokat és ásványi anyagokat tartalmaznak. A táptalajok, ha szükséges, akkor tartalmazhatnak még olyan komponenseket is, mint például szérum. A szaporító táptalaj általában szelektálja a kívülről bevitt DNS-t tartalmazó sejteket, például valamilyen hatőanyagos szelekcióval, vagy egy esszenciális tápanyagban való deíicieneia. alapján, amit komplementéi az expressziös vektoron levő, vagy ko-transzformált szelekciós markor. A Picéin mefhanokca sejteket olyan táptalajban tenyésztjük, arni megfelelő szénforrásokat, nitrogénforrásokat és nyomelemeket tartalmaz, 25-35 X közötti hőmérsékleten. A folyadék tenyészeteket hagyományos módszerekkel levegőztettük, azaz például kis lombikok rázatásával, vagy a fermenterok. levegőztetésével, A Picüki metfoanoltca előnyben részesített táptalaja az YEPD (2% D-glökőz, 2% Bacto™ Peptone íDífeo

Φ*«« ΦΦ'

Φ * • φφ *♦» β* φ φ * *

Laboratories, Detroít, ΜΠ, 1% Bacto™ élesztőkivonat ÍDlfco Laboratories), 0,004% adenin és 0,006% leucin.

Az az előnyös, ha a jelen találmány szerinti polipeptideket a80%-os tisztaságban, még előnyösebben &90%~os tisztaságban, és még ennél is előnyösebben &95%-os tisztaságban, és legelőnyösebben gyógyászatilag tiszta állapotban, azaz nagyobb mint 9'9,9%-os tisztaságban állítjuk elő, a szennyező makromolekulák, főleg más fehérjék és nukleinsavak szempontjából, és mentesek a fertőző és pirogén ágensektől. Egy tisztított poiipeptld előnyösen lényegében mentes más polipeptidektői, főleg más, állati ere de tű polipeptidektői.

Az expresszált rekombináns zalpball lígandum poiipeptld {vagy zalpball lígandum kánéra vagy fúziós poiipeptld) frakciónálással és/vagy hagyományos tisztítási módszerekkel és közegekkel tisztítható. Az ammónium-szulfátos kicsapás és a savas vagy kaotróp extrakciő használható minták frakclonálására. A példaként megadott tisztítási lépések közé tartozik a hidroxiapafiíos, méretkizárásos, FPLC és fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiás módszer. A megfelelő kromatográfiásanyagok közé tartoznak a öexhán-származékok, az agáróz-, a cellulóz, a poliakrilamid, a különböző szilikátok és hasonlók. A PEI, DEAE, QAE és- Q származékokat részesítjük előnyben. A kromatográfiás anyagok közé tartoznak például a fenil-, butll- vagy okt.il--csoportokkal készített származékok, azaz például a PhenylSepharose FF (Pharmacia^, a Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryvilié, PA), az Octyl-Sepharose (Pharmacia) és a hasonlók, vagy a poliakril gyanták, azaz például az Amberclirom CG7I (Toso Haas) és hasonlók.. A megfelelő szilárd hordozók közé tartoznak az üveggyöngyök, a szilikátalapú gyanták, a celluX X ·*· » X ”ϊ

lőzgyanták, az agarózgyöngyök, a kereszfkötéses agarózgyöngyök, a polisztirol gyöngyök, a keresztkötéses políakrilamíd gyanták és hasonlók,, amik a használandó· körülmények között oldhatatlanok, Ezeket a hordozókat módosíthatjuk reakcióképes· csoportokkal, amik lehetővé teszik a fehérjék kapcsolódását aminocsoportokon, karhoxícsoportokon, szulíhidrO csoportokon, hídroxícsoportokon és/vagy szénhidrát egységeken keresztül. Ezek, valamint más szilárd közegek a szakterületen jól ismertek és széles körben használtak, kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, A receptor polípeptidek hordozóhoz való kötésének módszerei jól ismertek a szakterületen. Egy adott módszer kiválasztása rutinszerű tervezés dolga, és ezt részben meghatározza a kiválasztott hordozó íAffinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Svédország

A jelen találmány szerinti polipeptideket biokémiai, .szerkezeti és biológiai tulajdonságaik kihasználásával izolálhatjuk. Például az immobilizált fémion-adszorpció (IMAC) kroíxiatográfia használható hisztidinben gazdag fehérjék tisztítására, beleértve azokat is, amik polihisztidln. jelöléseket tartalmaznak. Röviden Összefoglalva, először egy gélt feltöltünk kétértékű fémionokkal, hogy kelátot képezzenek (Sulkowski: Trends in Biochem, 3, 1-7 (1935)1. A hisztidinben gazdag fehérjék a használt fémiontól függően, különböző affinitással adszorheálódnak ehhez a hordozóhoz, és kompetitiv elúctóval eluálhatók, csökkentve a pH-t, vagy erős kelátképző ágensek! használva. Más tisztítási módszer lehet a glikozilezett fehérjék lektm-afímitási kromatográfíával és ioncserélő kromatográfíával való tisztítása. [Methods in Enzymology· 182, “Guíde to Protein Puríficatioü', 529-539. oldal, szerk.; M, ♦ «* * ♦♦ 5 φ Φ

ΧΦΦ ♦** « « *** » Φ

Deutscher, Academíc Press San Diego (1990)1. A jelen találmány további megvalősítási módjai szerint a számunkra érdekes polipeptid és egy affinitás-jelölés (azaz például maltőzkötő fehérjék, egy immunglobulin donién) fúziója állítható eiö a tisztítás megkönnyítésére.

Emellett, a szakirodalomban ismertetett módszerekkel polipeptid fúziók, vagy hibrid zalpha 11 ligandum fehérjék készíthetők, a találmány szerint zalpha 11 ligandum régióinak vagy doménjeinek, és más humán citokin reeeptorcsalád fehérjék (azaz például interleukinok vagy GM-CSF) vagy heterolőg fehérjék régióinak vagy doménjeinek felhasználásával [Sambrook és mtsai: Moleeular Cloning: A Laboratory Mannal; 2. kiadás, Cold Spring. Harhor Press, Cold Spring Harhor, N.Y. (1989); (Altsehul és mtsai; Bull. Math, Bio·. 48, 603-616 (1986); Picard, Curr.

on.

gy 5, 511-515 (1994), valamint az idézett

referenciák). Ezek a módszerek lehetővé teszik a nagyok domének vagy régiók biológiai fontosságának meghatározását egy számunkra érdekes polipeptidbem Az ilyen hibridek inéi toztathatják a reakciókinetikát, a kötődést, a szubsztrát-sj tás szűkülését vagy tágulását, vagy megváltoztatják egy fid szöveti vagy celluláris lokalizációját, és ismeretlen struktúrájú

A fúziós polípeptldeket vagy fehérjéket a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel lehet előállítani, például úgy, hogy előállítjuk a fúziós fehérje komponenseit., majd kémiailag konjugáljuk őket, Egy másik változat szerint a fúziós fehérje egy vagy több komponensét a helyes leolvasási keretben kódoló polinukleotíd ismert technikákkal előállítható, majd az ismertetett módszerekkel expresszálható. Például egy biológiai ι* «

Φ φ φ * φ ♦

-» * φ φ φ *** * * « φ «»»» φ φ X _φ «*♦ *♦· funkciót biztosító hélixet kicserélhetünk a jelen találmány szerinti zalphall ligandum és egy másik cftokmcsalád (azaz például inferleukin-15, interleukin-2, interleukin-4 vagy GM-CSF) egyik tagja funkcionálisan ekvivalens hélixével. Ilyen komponens lehet például· anélkül· hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a szekréciós szignál szekvencia, az A, B, C, D héltek; a négy-héfixes kötegel tartalmazó eitokinekből, Az ilyen fúziós fehérjéktől az várható, hogy biológiai funkciós profilja, ugyanaz, vagy hasonlít a jelen találmány szerinti polipeptidekére, vagy más ismert, négybélíxes kötegel tartalmazó citokin család egy másik, ismert polipeptidjére, az -elkészített fúziós konstrukciótól függően.. Emellett az ilyen fúziós fehérjék más tulajdonságokkal is rendelkezhetnek, az alábbiakban ismertetett módon.

-Standard molekuláris biológiai és klónozás! technikák használhatók arra. hogy az ekvivalens doméneket kicseréljük a zalphall ligandum polipeptid és azok között a polípeptidek között, amikhez fúzíonáltatva van. Általában, a számunkra érdekes domént kódoló, azaz például egy itt ismertetett zalpba 11 iigandurn A-D hélixeket, vagy más itt ismertetett doméneket kódoló DNS szegmens, működés szempontjából legalább egy másik DNS- szegmenshez kapcsolódik, ami egy másik polipeptidet (például egy másik citokin receptorból, azaz például az interleukin-2 receptorból származó domént vagy régiót) kódol, majd egy megfelelő expressziós vektorba építjük be, az ismertetett módon. A DNS konstrukciókat általában ágy állítjuk elő, hogy a több DNS szegm-enst, amik -egy polipeptid megfelelő régióit tartalmazzák, működés szempontjából leolvasási keretben kapcsoljuk, hogy egyetlen konstrukciót állítsunk elő, ami a teljes fúziós fehérjét, vagy annak egy funkcionális részét, kódolja. Például egy DNS

9 9*4 * konstrukció az N-termlnáÖstól a €~terrmnálísig kódolhat egy fúziós fehérjét, ami tartalmaz egy szignálpeptidet, ezt követi egy érett négy-héllxes kötegel: tartalmazó citokin fúziós fehérje, ami tartalmazza az A hélixet, ezt követi a B hélix, ezt követi a C hélix és ezt követi a D hélix. Az ilyen fúziós fehérjék az alábbiakban ismertetett módon expresszáltathatök, izolálhatok és aktivitásuk mérhető.

A zalphall ligandum pollpeptídeket vágj/ fragmenseiket előállíthatjuk kémiai szintézissel is, A zalphall ligandum polípeptidek lehetnek monomerek vagy multímerek; glikoziiezettek:, vagy nem-gbknzdezettek; pegilezettek, vagy nem-pegílezettek; és vagy tartalmaznak induló metíonint, vagy nem. A polípeptidek például előállíthatok szilárd fázis· peptld-szlntézissei (Merrifield, Journal of the American Chemical Socieiy 85, 2149 (1963)!

A jelen találmány szerinti molekulák aktivitása számos különböző módszerrel mérhető, amik mérik a sejt szaporodását és/vagy kötődését: olyan sejtekhez, amik a zalphall receptort expresszayak. Ki sek a ζε kg a de· pendens sejtek változásai. A zalphal 1 ligandum dependenctáia megváltoztatható, megfelelő sejtek közé tartozik az lnterleukín-3 dependens BaF3 sejtvonal (Palaeios és Steínmetz; Cell 41, 727734 (1985); Mathey-Prevot és mtsai: Moleeular & Cellular Siology 8, 4133-4135 (1986)], az FDC-P'l [Hapel és mtsai; Blood 64,. 786790 (1984)], és az MO7 (Kiss és mtsai: Leukémia 7, (1993)(. A növekedési faktor dependens sejtvonalakat ismert módszerekkel alakíthatjuk, ki (Greeuberger és mtsai; Leukémia Rés, 8, 363-375 (1984); Dexter és mtsai, In; Experimental Hematölogy Today 8th Ann. Mtg. int, Soc. Exp. Hemaíol. 145'156. oldal, szerk.: Baum és mtsai (1979)

ΦΦ» Χ*ΦΦ * xse* »«·ν ♦ X *φ » ««« φ φ φ φ φφ \·

A jelen, találmány szerinti vegyöletek jól használhatók a szaporodás, aktiválás, differenciálódás és/vagy a specializált sejtfunkciók indukciójára vagy gátlására azoknál a sejteknél, amik részt vesznek a homeosztázisban vagy hematopoiézisben és önmunfunkcióban. Fontosabban, a zalphal 1 ligandum- poiipeptidek jól használhatók a hematopoietikus leszármazási, vonalba tartozó sejtek szaporodásának, aktiválásának, differenciálódásának stímnlálásáb-an, specializált sejtfunkciőinak indukciójában vagy gátlásában, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat a T-seifekef, a B-seiteket, az NK sejteket, a sejteket, a monocítákat és makrofágokat, valamint az sejteket. A hematopoietikus sejtek szaporodását, és/vagy differenciálódását. mérhetjük in nitro, tenyésztett sejtek használatával, vagy in oioo, a jelen találmány igénypontjaiban igényelt molekulákat a megfelelő állatmodellhe beadva. A sejtszaporodás vagy differenciálódás mérésére szolgáló esszék jól ismertek a szakterületen. Például a sejtszaporodás mérésére szolgáló esszék közé tartoznak az olyan esszék, mint például a neutrálvörössel szemben mutatott kemos.z-enzitivitás [Cavanangh és mtsaí; Investígátlónál New Drugs 8, 347-354 (1990), amely publikációt a továbbiakban referenciaként kezelünk}, a radioaktív izotóppal jelzett nukleotidok beépülése [Cook és mtsai: Analytical Biochemistry 179, 1-7 (1989), amely publikációi a továbbiakban referenciaként, kezelünk}, az 5-bróm~2'-dezoxiuridín (BrdU) beépülése a szaporodó sejtek DNS-ébe [Porstmann és mtsaí; J, ímmunological Methods 82, 189-179 (1985), amely pi továbbiakban referenciaként kezelünk}, és a tetrazőlium sók használata (Mosmarm; d. ímmunological Methods 65. 55-63 (1983); Alley és mtsaí; Cancer Rés. 48, 589-801 (1.988); Marshall

Φ * <ΦΦ ΦΦΦ* :$τ χ φ <· * · ♦ φ Φ *Φ< Φ X ··» * ·♦♦*♦ * * Φ , χ_4<* φΛΚ φ >ί*φ X és mtsai: Growth Reg. 5, 69-84 (1995); Seudiero és mtsai: Cancer Rés. 48, 4827-4633 (1988), amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk), A differenciálódást mérd esszék közé tartozik például egy szövet, enzimaklivítás, funkcionális aktivitás vagy morfológiai változások egy fejlődési fok specifikus expressziójához kapcsolódó sejtfelszíni markerek mérése (Watt: FASEB 5, 281-284 (1991); Francís; Dífíerentiatíon 57, 6375 (1994); Raes.; Adv. Aním. Cell Bioi, Technoi, Bioproeesses 161171 (1989), amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk],

A jelen, találmány szerinti molekulák ín oibo vizsgálhatók, virális bejuttató rendszerekkel. Erre a célra használható vírusok lehetnek például az adenovírus, a herpeszvírus, a retrovirusok, a vakefnia vírus, és az adeno-asszocíált vírus (ÁAV). Az adenovírus, egy kétszálú DNS vírus jelenleg a legjobban tanulmányozott géntranszfer vektor a heterológ nukleinsav bejuttatására (T.C. Beeker és mtsai; Meth. Cell Bioi, 43, 161-189 (1994); J, T. Douglas és .D, T. Curiel; Science & Medieine 4, 44-53 (1997)].

Ligandumként a zalphal 1 ligandum polipeptid aktivitása szilikon-alapú bioszenzor mikroffzíométerrel mérhető, ami a receptor megkötéséhez és az azt. követő fiziológiás celluláris válaszhoz kapcsolódó extracellulárís savasodási sebességet, vagy proton exkréciór méri. Ilyen berendezés például a Cyíosensor™ Microphysiometer, amit a Moleeular Devices, Sunnyvale, CA cég gyárt. Számos különböző celluláris válasz, azaz például a sejtszaporodás, iontranszport, energiatermelés, gyulladásos válasz, szabályozó és receptor aktiválás és hasonlók, mérhető ezzel a módszerrel [McConnelI, 11. M, és mtsai: Science 257, 1906-1912 (1992); Pitchford, 8. és mtsai: Methods in Enzymology 228, 84χ··'

Φ * # * . * * .· «<· ψ«· ♦ φ φ * ί > φ * X- ·?.*♦* * ~ *· „ * «,< »·χ * Λί*» *

108 (1997); Árimílí, S. és mtsai: d. Immunological Methods 212, 49-59 (1998); Van Liefde, L és mtsai; Eur. J. Pharmacoi. 348, 87-95 {1998)].

Emellett a zalphal l lígandum használható olyan sejtek, szövetek vagy sejtvonaíak azonosítására, amik reagálnak egy zalphall ligandummal stimulált bioszíntézls útra. Az előzőkben Ismertetett míkrofíziométer használható ligandumra reagáló sejtek, azaz például a jelen találmány szerinti zalpha l 1 Ugandámra reagáló sejtek gyors- azonosítására. A sejteket a zalphal. 1 ligandum polipeptíd jelenlétében vagy távollétében tenyészthetjük, Azok a sejtek, amiknél a zalphall ligandum jelenlétében mérhető a változás az extracellulárls savasodéiban, azok reagálnak a zalphall ligandumra. Az ilyen sejtek vagy sejtvonalak használhatók az előzőkben ismerteteti zalphall lígandum poklái azonosítására.

peptid antagonistá! és

A zalphal l Ugandámnál megfigyelt szöveteloszlás fényében az agonísták (beleértve a természetes zalphal. 1 llgandumot/szufosztrátot/kotáktorí/stb,) és/vagy antagonísták hatalmas potenciállal rendelkeznek mind az in okro, mind az in oiuo alkalmazásokban, A zalphal l ligandum agonistaként ismert vegyületek jól használhatók a szaporodás, aktiválás, difíerenciálódás é-s/'vagy a specializált, sejtfunkciők indukciójára vagy gátlására azoknál a sejteknél, amik részt vesznek a homeosztáztsban vagy hematopoiézisben és fcnmunfunkcíófean. Például a zalphall ligandum és agonísta vegyületek hasznos komponensei a definiált összetételű sejttenyészíő táptalajoknak, és használhatók önmagukban, vagy más ehokinekkel és hormonokkal együtt, a sejttenyészetben általánosan használt szérum helyettesítésére. Tehát az agonísták jól használhatók a. T-sejtek, B-sejtek, és más, llm*·*· φ * »

főid, valamint mieloíd eredetű vonalak növekedésének és Zva fejlődésének specifikus elősegítésére.

Az: .antagonisták emellett jól használhatók kutatási reagensekként is, a ligandum -receptor kölcsönhatás helyeinek jellemzésére. Az- antagonisták jól használhatók a hematopolézis szabályozásában szerepet játszó sejtek expanziójának, szaporoiasc €S/V£

A zalphall ligandum aktivitás inhibitorai (zalphall ligandum antagonisták) közé tartoznak az antí-zalphal 1 ligandum ellenanyagok és oldható zalphall ligandum receptorok, valamint más pepiid és nem-pepiid reagensek (beleértve a rihozimeket is),

A zalphall ligandum emellett használható az aktivitása inhibitorainak (antagonistáínak) azonosítására is. A vizsgált vegyületeket hozzáadjuk az itt ismertetett esszékhez, hogy .azonosítsuk azokat a vegyületekeí, amik gátolják a zalphal 1 ligandum aktivitását. Az itt ismertetett esszék mellett a minták vizsgálhatók, hogy gátolják-e a zalphal 1 ligandum aktivitását számos különböző esszében, amiket úgy terveztek meg, hogy mérjék a receptor-kötődést, a zalphal l lígandum dependens cellulárís válaszok stímuiálását/gátlását, vagy a zalphall receptort expresszálo sejtek szaporodását.

Egy zalphall lígandum polipeptíd expresszáltatható egy immunglobulin nehéz lánc konstans régióval, tipikus esetben egy Fc fragmenssel, való fúzióban, ami két konstans régió domént tartalmaz, és hiányzik belőle a variábilis régió. Az ilyen fúziók előállítási módszereit az Ó, 155,027' és az 5,567,584 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírásban ismertetik.

Az ilyen fúziók tipikus esetben multimer molekulák formájában szekretálódnak, amikben az Fc részek díszulfid-hidakkal vannak « « φ χ Φφφχ X χ * ♦» ♦ * κ egymáshoz kötve, és a két receptor polipeptid egymás szoros közelségében van elhelyezve. Az ilyen típusú fúziók használhatók például, dimcrizácíóra, a stabilitás és az ín vivő fél-életidő növelésére, lígandum tisztítására, ín nitro esszé eszközként vagy antagonistakénü Áz ezekben az esszékben való használathoz a kimérák az Fc régiön keresztül kötődnek egy hordozóhoz, és EtíSA-ban használják őket.

Egy zaiphall ligandnmot kötő polipeptid használható ligándoni tisztítására, is. A polipeptidet ímmobilizáljuk a szilárd hordozóra, azaz például agaróz gyöngyökre, keresztkőtéses agarőzra, üvegre, cellulóz gyantákra, szilikát. alapú gyantákra, polisztirolra, keresztkőtéses poliakhlamidra vagy hasonló anyagokra, amik a felhasználás körülményei között stabilak. A pohpeptidck szilárd hordozóhoz való kötésének módszerei a szakterületen ismertek, ide tartozik az aminkémía, a brómciános aktiválás, az N-hidroxiszukcinímid aktiválás, epoxld aktiválás, szulfhídril aktiválás és hidrazid aktiválás. A kapott közeget általában oszlop formájában használják, és á hgandumot tartalmazó folyadékokat egyszer vagy többször átbocsátjuk az oszlopon, hogy a lígandum a receptor polípeptidhez tudjon kötődni. A ligandnmot azután a. sókoncentráeíó változtatásával, kaotróp ágensekkel (guanídin HClk a változtatásával eluáljuk, a ligán dum-receptor kötődés

Egy vizsgáló rendszer, ami lígandum-kötő receptort (vagy egy ellenanyagot, egy komplement/antí-komplement párt), vagy annak egv kötő iragmensét használja, valamint előnyösen egy kereskedelmi forgalomban levő bioszenzor berendezést alkalmaz (azaz például BIAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)„ .Az ilyen receptort, ellenanyagot, egy komplement/antl-kompleφ

Φ ♦ X Φ φ * ♦♦ *

ΦΦΦ φ

Φ χ * X ·χ Φφφφ φ ♦ 1

ment párt vagy annak fragmensét egy receptor chip-re immobüizárjuk. Ennek a berendezésnek a használatát Karlsson valamint

Cunningharn és Wells publikálta (Karlsson: J. hnxnunological Methods 145» 229-240 (1991); Cunningharn és Wells: Journal, of Molecuiar Biology 234, 554-583 (19931). Egy receptort, ellenanyagot, tagot vagy fra.gmen.st kovalens kötéssel kapcsolunk, amin- vagy szulfhidrü kémiát használva., dextránfonalakhoz, amik egy áramlási cellában aranytűmhez vannak kapcsolva. Egy teszt-mintát bocsátunk át a cellán. Ha egy ligandum, epitop vagy a komplement/anti-komplement pár másik tagja van jelen a mintában., akkor kötődik az kmnohüizált receptorhoz, ellenanyaghoz vagy taghoz, ami a közeg reír aktív indexének változását okozza, ami az aranyfilm felszíni plasmon rezonanciájának változásával mutatható ki. Ez a rendszer lehetővé teszi az on~ és offarányok meghatározását, amiből a kötési affinitás kiszámítható, és megbecsülhető a kötés sztőehiometriája. Egy másik változat szerint a ligandum/receptor kötés SELDI™ technológia.

icrgen, Inc., Palo Alfex CA) segítségével elemezhető,

A lígandum-kőtö receptor poiipeptidek a szakterületen.

ismert más vizsgáló rendszerekben is használhatók. Ilyen rendszer például a Scatchard elemzés a kötési affinitás meghatározásához (Scatchard: Ann, NY Acad, Sci. 51, 660-672 (1949)], valamint a kalorimetriás elemzések (Cunningharn és mtsai:

Science 253, 545-548 (1991): Cunningharn és mtsai: Science 245, 921-825 (1991)1.

A zalphall ligandum poiipeptidek arra is használhatók, hogy olyan ellenanyagokat állítsunk elő, amik kötődnek a zalphall ligandum epitopokhoz, peptidekhez vagy polípeptidekhez. A zalphal 1 ligandum polipeptid, vagy annak fragmense

* antigénként íimmunogénként) szolgál ahhoz, hogy egy állatot inokuláljunk vele és immunválaszt váltsunk ki benne. A szakterületen jártas szakember számára, nyilvánvaló, hogy az antigéneket vagy epitopokat hordozó polipeptld egy zalphall Uganda® pokpeptid (például a 2. számú szekvencia) körülbelül 6 aminosavából áll, előnyösen legalább 9 aminosavából áll, még előnyösebben körülbelül 15-30 egybefüggő aminosavából all. A zalpha 11 polipeptidből nagyobb részt tartalmazd polipeptidek nagysága 39-100 aminosavtól a teljes polípeptid hosszáig terjedhet. Az antigén vagy immunogén epitopok tartalmazhatnak csatolt jelöléseket, adjuvánsokat és hordozókat, az itt ismertetett módon. A megfelelő antigének közé tartozik a 2. számú, szekvencia által kódolt zalphall ligandum pokpeptid 32-as aminosav csoportjától, a 182-es aminosav csoportjáig terjedő szakasz, vagy annak egy egybefüggő, 9-131-es aminosav fragmense. Más megfelelő antigén lehet még a teljes hosszúságú és az érett zalphal 1 ligandum, a zalphal 1 ligandum négy-hélixes köteg struktúra A-D hélixei valamint az egyes hélixek és több hélix az A, B, € és D hélixek közül, az itt ismertetett módon. Az antigénként használható, előnyben, részesített peptídek közé tartoznak a hidrofil peptídek, például azok, amiket a szakterületen jártas szakember egy hidrofohieitásí görbéből görbéből megjósolhat, az itt ismertetett módon, például a 2. számú szekvencia .114-11.9-es aminosaval,

-105-ös amínosavaí, 128-131-es amínosavaí., 113-118-as aminosaval és 158-162-es aminosavaL

Egy állatnak ezeknek a beoltásából származó immunválaszából eredő ellenanyagok az itt ismertetett módon izolálhatok. A poliklonálís és monoklonáhs ellenanyagok előállításának és tisztításának módszerei jól ismertek a szakterületen (Current « X

Protocols in Inununoíogy, szerk.; Cooligan és munkatársai, National Institute of Health, John Wiley and Sons, Inc. (1995); Sambrook és mtsai; Moiecuiar Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Barbár, H.Y, (1989); Hurrell, J.R.G. (szerkó; Monoclonal Hvbridoma

Antíbodies; Techniqu.es and Applications, CRC Press, Boea Raton, FL (1982)].

Amint az a szakterületen jártas szakember számára nvüvánvaló, a políklonális ellenanyagok úgy állíthatók elő, hogy különböző melegvérű állatokat, azaz például lovakat, szarvasmarhákat, kecske birkákat, kutyákat, cs:

at.

egereket és patkányokat oltunk be zalphal ! ligandum po.ti.peptiddel, vagy annak egy fragmenséveL Egy zalphal 1 ligandum polipeptid immunogenitása fokozható egy adjuváns, azaz például tímsó (alummíum-hidroxidi, vagy Freund féle komplett vagy inkomplett adjuváns használatával. Az immunizálásban használható polipeptidek közé tartoznak a fúziós polipeptidek, azaz például a zalphal 1 ligandum, vagy annak egy részének fúziói egy immunglobulin polipeptiddel, vagy egy maltőzkötő polipeptiddel· A polipeptid immunogén lehet egy teljes hosszúságú molekula, vagy annak egy része, Ha a polipeptid rész „haptén-szerű”, akkor ez a rész az immunizáláshoz előnyösen kapcsolható vagy köthető egy makromolekulár.is hordozóhoz (azaz például fúrócsíga hemoeianinhoz (ELB), szarvasmarha szérum-albunúnhöz (BSA) vagy tetanusz toxoidhoz).

A továbbiakban az „ellenanyagok” szakkifejezés jelentése políklonális ellenanyagok, affinitás-tisztított políklonális ellenanyagok, monoklonális ellenanyagok és antigén-kötő fragmensek, azaz például az E(at/h proteolítikus fragmensek. A génsebészeti φφφ φ

Φ X « úton előállított intakt ellenanyagok vagy fragmensek közé tartoznak például a kiméra ellenanyagok, Fv fragmensek, egyszálú ellenanyagok és hasonló, valamint szintetikus antigén-kötő peptidek és polipeptidek. A nem-humán ellenanyagok humanizálhatők, oly módon, hogy humán keretre és konstans régiókra graftoljuk a nem-humán CDR-eket, vagy úgy, hogy az. összes nem-humán variábilis domént (adott esetben egy humán-szerű felszínnel „leplezve” őket, oly módon, hogy az exponált csoportokat kicseréljük, aminek az eredménye egv „burkolt” ellenanyag). Néhány esetben a humanizált ellenanyagok megtarthatnak nem-humán csoportokat a humán variábilis régió keretben, hogy ezzel fokozzuk a helyes kötő tulajdonságaikat Az ellenanyagok humanizálásán keresztül a biológiai fél-életidő növelhető, és az embereknek való beadáskor jelentkező káros immunreakciók veszélye csökkenthető. Emellett a humán ellenanyagok előálííthatók trauszgenikus, nem-humán állatokban, amiket úgy változtattak meg, hogy humán immunglobulin géneket tartalmazzanak (WO 98/24893 számú WIPO szabadalmi leírás). Az az előnyös, ha ezekben az állatokban az endogén immunglobulin gének inaktiválva vagy elimüiálva vannak, például homológ rekombinációval.

Az ellenanyagokról akkor állapítható meg, hogy specifikusan kötnek, ha: 11 a kötési aktivitásuknak van egy küszöbértéke, és/vagy 2} nem adnak szignifikáns keresztreakciót a rokon polipeptid molekulákkal. Először is, az itt ismertetett ellenanyagok akkor kötődnek specifikusán, ha legalább tízszer nagyobb affinitással kötik meg a zalphal 1 ligandum polipeptidet, pepiidet vagy epitopot, mint amekkora a kontroll (nem-zalphal 1 ligandum) polipeptid kötési affinitása. Az az előnyös, ha az ellen** ¢9.

8?

»» anyagok kötési affinitása (Κ») 10«/mol, vagy nagyobb, előnyösen !Ö⁷/mol, vagy nagyobb, előnyösebben 10«/mól vagy nagyobb, és legelőnyösebben 10^a/mol vagy nagyobb. Egy ellenanyag kötési affinitását a szakterületen jártas szakember könnyen meghatározhatja, például Seatehard elemzéssel (Seatehard: Ann. NY Acad, Sci, 51, 660-672 (19<9j), kosán kötődnek, ha nem adnak szignifikáns keresztreakciót a rokon polipeptidekkel, Az ellenanyagok nem adnak szignifikáns keresztreakeiőt a rokon polipeptid molekulákkal, ha például standard Western biot elemzéssel (Current Protocols in Molecular

Biology, szerkó Ausubel és mtsai, Greene Publishlng és WileyInferscience: New York {1987)1 a zaiphall ligandum polipeptidet kimutatják, de az ismert rokon pokpeptideket nem. Ismert rokon polipeptidek a szakterületen ismertek, mint például az ortológok és a paralőgok, amik egy fehérjecsalád Ismert tagjai. Emellett az ellenanyagok „vizsgálhatók ismert, rokon polipeptidekkel szemben”, hogy olyan populációt izoláljunk, ami specifikusan kötődik ligana zaiphall liganem,,.,.

dum ellen készített ellenanyagok adszorbeálodnak az hordozóra; a. zaiphall Ugandáimra specifikus ellenanyagok megfelelő puffer-körülmények között átfolynak a hordozón. Az ilyen szűrővizsgálat lehetővé teszi olyan poliklonális és monoklonális ellenanyagok izolálását, amik nem adnak keresztreakeiőt a közeli rokon polipeptidekkel {Harlow és mtsai: „Antihodies; A Laboratory Marinai, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (19881: Cooligan és munkatársai (szerk.) National Instanté of Health, John Wiley and Sons,

Inc, (1995)1 A specifikus szuroviz és * ** Φ« ψ * * * ΧΧ«« *** »♦« X izolálása jól ismert a szakterületen [Fundamental immunology, .szerka Paul Raven Press (1993); Getzoff és mtsai; Adv, in Immunoi. 43, 1-98 (1988): Benjámin és mtsai: Ann, Rév, immunoi, 2, 67-101(1984)], A specifikusan kötődő anti-zalphall ligandum ellenanyagok a szakterületen ismert számos különböző módszerrel kimutathatók.

Számos különböző, a szakterületen jártas szakember számára Ismert esszé használható olyan ellenanyagok kimutatására, amik specifikusan kötik a zalphal. 1 ligandum fehérjéket vagy peptideket A használható esszékre adott példák megtalálhatók a szakirodalomban (Harlow és mtsai; „Antibodíes; A Lab-oratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor hahóratory Press, Cold ig Harbor, New York (1988)]. Az ilyen esszék reprezentatív a következők; egyidejű immunelektroforézis, radioimmunesszé, rádió-ímmunprecípítáeíó, gátlás! vagy kompetíciós esszé és szendvics esszé. Emellett .az ellenanyagokat vizsgálhatjuk, hogy kötődnek-e a vad-típushoz, a mutáns zalphal l ligandum fehérjével vagy polipeptíd dél összehasonlítva.

A zalphall ligandum elleni ellenanyagok használhatók arra, hogy a zalphall ligandumót expresszáló sejteket jelt vele: hogy a zalphall ligandumót affinitás-tisztítással iz>

diagnosztikai ess en, a za keringési szintjének meghatározására: az oldható zalphal 1 ligandum marker kimutatására vagy mennyiségének meghatározására, egy korállapot vagy betegség alátámasztására; FACS-ot alkalmazó analitikai módszerekben; expressziós könyvtárak átvizsgálására; antiddiotípusös ellenanyagok generálására; valamint neutralizálö ellenanyagokként vagy antagonistákként, a zalpha 11 ligandum aktivitás in vitro vagy ín oioo blokkolására. A * φ *ΦΦ· «φφ* ♦φφ φφ* φ

Κ** ΦφΓΚ megfelelő jelölések vagy jelzések közé tartoznak a radioaktív izotópok, az enzimek, szubsztrátok, kofáktorok, inhibitorok, fluoreszcencia markerek, kemilumineszcens markerek, mágneses részecskék és hasonlók. A közvetett jelölések vagy jelzések intermedierként biotin-avidm vagy más komplement/anti-komplement párokat használhatnak. Az itt említett ellenanyagok emellett közvetlenül vagy közvetve konjiigálhatók gyógyszer hatóanyagokhoz, toxinokhoz, radioaktív izotópokhoz és hasonlókhoz, és ezek a konjugátumok használhatók ín vívó diagnosztikai vagy terápiás alkalmazásokban, Emellett, a zalpha 11 ligandum vagy annak fragmensei ellen készített ellenanyagok használhatók in tóiro, hogy a vizsgálatokban, azaz például Western, blotban vagy más, a szakterületen ismert vizsgálatban kimutassuk a denaturált zalpha 11 ligandumot vagy annak fragmenseit.

A megfelelő kimutatható molekulák közvetlenül vagy közvetve kapcsolhatók a polipeptidhez vagy ellenanyaghoz, ide tartoznak a radioaktív izotópok, az enzimek, a szubsztrátok,· kofakíorok, inhibitorok, fluoreszcens markerek, kemilumineszcens markerek, mágneses részecskék és hasonlók, A megfelelő cítotoxikus molekulák közvetlenül vagy közvetve kapcsolhatók a polipeptidhez vagy ellenanyaghoz, ide tartoznak a bakteriális vagy növényi, toxinok (azaz például a diftéria toxin, a Pseudomonus toxrn, a nem, az abrin es a nasontokj, valamint a terápiás ra aktív izotópok, mint például a ⁱ³h, a ^iS8Rh vagy a ^9öY (akár közvetlenül a polipeptidhez vagy ellenanyaghoz kapcsolva, akár közvetve kapcsolva, például egy kelátképző egységen keresztül). A kötő polipeptidek vagy ellenanyagok emellett eítotoxtkus gyógyszer hatóanyagokhoz, például aöriamicinhez is kopj ágálhatok, ö vagy eitotoxikus molekula indirekt .kapcsolá90 * Χ«φφ * * **Φ «φφ * Φ ;

»*· «ΦΦ

sához a kimutatható vagy eitotoxikus molekula konjugálható egy komplemen tér Zanti-komplementer pár egyik tagjával, aholis a másik tag a kötő polipepiidhez vagy ellenanyag-részhez kötődik. Ebből a szempontbői a. btotin/sztreptavkhn egy példája a komplementer / antbkomplementer párnak.

A kötő polípeptidek zalphal 1 ligandum „antagonístaként” Is hathatnak, hogy blokkolják a zalphal 1 ligandum kötődését, és a jelátvitelt in uííro és ín oíoo, Ezek az anthz-alphal 1 ligandum kötő polipepüdek jói használhatók lehetnek a zalphal 1 ligandum aktivitás vagy fehérje-kötődés gátlására..

A polipeptld - toxin fúziós fehérjék vagy ellenanyag-toxin fúziós fehérjék használhatók arra, hogy célzott, sejteket vagy szöveteket gátoljunk vagy eltávolítsunk velük (például rákos sejtek vagy szövetek kezelése céljából}. Egy másik változat szerint, ha a kötő polipeptld több funkcionális doménnel rendelkezik, (azaz például egy .aktiváló; dómén vagy egy ligandumkötő dómén, plusz egy célzó dómén), akkor egy olyan fúziós fehérje, ami csak a célzó domént. tartalmazza, alkalmas lehet egy kimutatható molekula, egy eitotoxikus molekula vagy egy komplementer molekula egy számunkra érdekes sejtbe vagy szövettípusba való irányítására. Azokban az esetekben, amikor a csak egy domént tartalmazó fúziós fehérje tartalmaz egy komplementer molekulát, az antlkomplementer molekula konjugálható egy kimutatható vagy eitotoxikus molekulához. Az ilyen donién-komplementer molekula fúziós .fehérjék tehát egy generikus célzó hordozót reprezentálnak a generikus anti-komplementer-kimutatható /-eitotoxikus mole kula konjugátumok szővet-speeifíkus bejuttatásához.

A zalpha 11 ligandum citokin. fúziós fehérjék vagy az ellenanyag-cítokin fúziós fehérjék arra használhatók, hogy fokozzuk a ♦«** 0««« * * »«* »*« 0 * « 0 ♦*« ««« * * « χ *« «

Γ \χ * ♦, szövet ín vivő pusztítását (azaz például vér., limfoid, vastagbél és csontvelő rákok); ha a zalphall ligandum poiipeptid vagy anti-zalphall ligandum ellenanyag a hiperproiiferatív vér- vagy csontvelő sejteket célozza meg (Hornick és mtsai: Blood 89, 4437-4447 (19971). Az ismertetett fúziós fehérjék lehetővé teszik, hogy egy cítokin a kívánt hatás egy pontjára eljusson, ezzel a citokln megnövelt, lokális koncentrációját biztosítva. A megfelelő anti-zalpha 11 ligandum ellenanyagok megcéloznak egy nemkívánt sejtet, vagy szövetet (azaz például tumort vagy leukémiát), segítségével befolyásolják 5 megfe2 és a majd a fuzionált cítokin a sejtlízis javított irányítását. / lelő cltokinek közé tartozik granulocita makrofág telep:

erre a célra használható megfe az interle itő faktor (GM-C

A differenciálódás egy progresszív és dinamikus folyamat, ami pluripotens őssejtekkel kezdődik és terminálisán differencíálódott sejtekkel végződik. A pluripotens őssejtek, amik anélkül képesek regenerálódni, hogy elköteleznék magukat egy leszármazási vonalhoz, ami egy sor differenciáciös markért expresszál, amik azután elvesznek, mintán megtörténik az elkötelezettség egy sejtvonalhoz.. Az őssejtek -egy sor differenciáciös markert expresszálnak, amik vagy tovább expresszálnak, vagy nem, ahogy a sejtek a. sejt leszármazási vonalán haladnak az érett állapot felé.

A kizárólag az érett sejtek által expresszált differenciáciös markerek általában funkcionális tulajdonságok, azaz például sejttermékek, sejttermékek előállításához szükséges enzimek és receptorok, A sejtpopuláció differenciálódásának állapotát: a sejtpopulációban levő markerek azonosításával követjük.

Van bizonyíték arra, hogy azok a faktorok, amik egy bioszintézis úton a terminális differenciálódás vagy β« * *** φ * ♦ ;

*** *·»* φ _ * ♦ *χ

Φ»χ φ φ χafferenciálódás irányába stimulálják a specifikus sejttípusokat, érintik a teljes sejtpopulációt, ami egy közös prekurzorbőt vagy őssejtből származik. Tehát a jelen találmány tárgyát képezi a timföld sejtek, hematopoietikus és epiteliális sejtek szaporodásának stimulálása vagy gátlása,

A zalphai 1 ligandumot olyan szövetből izoláltuk, amiről ismert, hogy fontos immunológiai funkciója van, és olyan sejteket tartalmaz, amik szerepet játszanak az immunrendszerben. A zalphall ligandum CD3a-szal szelektált, aktivált perifériális vérsejtekben expresszálódlk, és kimutatták,, hogy a zal li gán dum expressziója fokozódik a T-sejt aktiválás után. Emellett az ebben a leírásban a példákban Ismertetett kísérletek eredményei azt demonstrálják, hogy a: jelen találmány szerinti polípeptidek hatással vannak az NR sejtek vagy NK őssejtek növekedésére/expanziójára és/vagy differenciálódási állapotára, A további bizonyíték azt demonstrálja, hogy a zalphal l. ligandum befolyásolja a T-sejtek és B-sejtek in vivő szaporodását és/vágj cíálódását. Ismertek azok a faktorok, amik stimulálják a matopoiefikus sejtek szaporodását és aktiválják az érett sejtel is, Az NK sejtek reagálnak csak az interleukin-2-re, de a szaporodáshoz és aktiváláshoz általában további növekedési faktorokra van szükség. Azt például kimutatták, hogy az ini.erleuki.n~7 és a Steel Factor (e-kii ligandum) kellett az NK őssejtek telepképzéséhez. Az interleukin-15 * az inierleukln-2· interleukin-7-te! és Steel Fac.tor-r.al kombinálva hatékonyabb volt IMrózek és mtsai: Blood 87, 2632-2640 (1996)), Azonban azonosítatlan citoktnekre lehet szükség az NK. sejtek és/vagy NR őssejtek specifikus alcsoportjainak szaporodásához [Robertson és mtsai: Blood 76, 2451-2438 (1990)1 Egy készítmény, ami * φ * X

X χ β X «Λ §3 « X * β #*« φφ * ·» φφ * * *χ zalpball liganduniöt és interleukin-15-öt tartalmaz, stimulálja az NK őssejteket és NK sejteket, igazolva, hogy ez a készítmény sokkal haté konyább mint a korábban ismertetett faktorok és faktorok kombinációi.

A differenciáéin mérésére szolgáló módszerek közé tartozik például egy szövet, enzimaktivitás, funkcionális aktivitás vagy morfológiai változások egy fejlődési fok specifikus expressziójához kapcsolódó sejtfelszíni markerek mérése {Watt; FASEB 5, 281» 284 (1991): Franeis: Diffcrentlaiíon 57, 63-75 (1994): Raes: Adv. Antal, Cell Bioi. Technoi. Bioprocesses 161-171 (1989), amely publikációkat a továbbiakban referenciaként kezelünk). Egy másik változat szerint a zalphal 1 lígandum pollpeptid maga nem szolgálhat további sejtfelszíni vagy székrefált márkerként. ami s expressziójához kapcsolódik. Mint egy szövet szakaszos olyan, a zalpba l l lígandum polipepuu xozve ak elvesztése egy szövetben a mérése, vagy során, a szövetek differenciálódásának markereként szolgálhat, a zalpball lígandum mérése, vagy expresszlőjának elvesztése egy szövetben a differenciálódás- során meghatározható egy szövetben vagy sejtekben, amint tumor progresszión esnek át. A sejtek behatolöképességénefc és motilitásának növekedése, vagy a zalphal 1 lígandum expressziő megjelenése vagy elvesztése egy pre-rákos- vagy rákos állapotban, a normál szövettel összehasonlítva, a transzformáció.

az invázió és az áttét diagnosztizálására. szolgálhat a tumor ressziőja során. Mint olyan, a tumor progresszíós vagy áttét-állapotának ismerete segíti az orvost a leghelyesebb terápia, vagy a kezelés agresszivitása, megválasztásában egy adott rákos betegnél. Az expresszió (legyen az mRNS vagy fehérje) megjelenést ♦** XX* vagy elvesztésének mérési módszerei jól ismertek a szakterületen, ezeket az. alábbiakban ismertetjük, és ezek alkalmazhatok a zalphal! ligandum expressziójára. Például azoknak a polipeptídeknek. a megjelenése vagy eltűnése, amik szabályozzák a sejtek motihfását, használható a prosztatarák diagnosztizálására és prognosztizálására (Banvard, J, és Zeller, B.R.: Caneer and Metast Rév, 17, 449-458 {19991b A sejt motilitásának befolyásolójaként a .zalphal 1 ligandum expressziójának megjelenése vagy elvesztése szolgálhat diagnosztikámként a límfold, B-sejt, epitelíálís, hematopoietíkus és más rákok esetében.

Emellett a zalphal 1 ligandum aktivitása és hatása a tumor progressziójára és áttételére m aioo mérhető. Számos szingenikus egérmodellt fejlesztettek a polípeptidek, vegyületek vagy más kezelések befolyásának tanulmányozására a tumor progressziójában. Ezekben a modellekben a tenyészetben átoltott tumorsejteket ugyanolyan egerekbe ültetik be, mint amelyekből a tumor donor származik. A sejtek olyan tumorokká fejlődnek, amik hasonló tulajdonságokkal rendelkeznek a befogadó egerekben, és néhány modellben áttét is előfordul. A mi vizsgálatainkra alkalmas megfelelő tumor modellek közé tartozik többek között a Lewis tüdőkareinőma (ATCC No. CRL-1642) és a B18 melanőma (ATCC No. ÜRL-8323), Ezek mind általánosan használt tumorvonalak, szingeníkusak a C57BL8/ J egérrel, és könnyen tenyészthetők és manipulálhatok in adro, Akármelyik említett sejtvonal beültetéséből származó tumorok a C57BL8/J egerekben képesek tüdő áttétek létrehozására. A Lewis tüdökareinóma modellt nemrég használták egerekben, hogy' azonosítsák az angiogenezis egy inhibitorát (O'Reffiy MS és mtsai: Cell 79 315-328 (1994)1 A C57BL6/J egereket egy kísérleti ágenssel kezelik, vagy a rekomX

Χ« * χ. '»♦·* xíí ♦ X » X Xjfr* »*»» « '* *κ bináns fehérje, agonísta vagy antagonlsta napi injekeí ózásával vagy a rekombináns. adenovirus egyszeri injekeí ozásával Három nappal a kezelés után 10® - 10® sejtet ültetünk be a dorzális bér alá. Egy másik változat szerint a beültetés előtt a sejtek maguk fertőzhetek rekombináns adenovírussal, azaz például egy olyannak ami zalphall ligandumot expresszák oly módon, hogy a fehérje a tumor helyén szintetizálódik, vagy intraeellulárisan, inkább mint szisztémásán. Az egerekben normális körülmények között 5 napon belül látható tumorok fejlődnek ki. A tumorokat maximum 3 hétig hagyjuk növekedni, ezalatt a méretük a kontroll kezelt csoportban 1500-1800 mm³ értéket ér eh A kísérlet során a. tumor méretét és a testsúlyt gondosan követjük. A leölés időpontjában a tumort eltávolítjuk, és megmérjük, a tüdőkkel és a májjal együtt. A tudók súlyáról kimutattuk, hogy jól korrelálnak az áttétes tumorterheléssel. További lépésként a tüdő felszínén megjelenő áttéteket, is megszámláljuk. A kivágott tumort, tüdőket és májat előkészítjük a hísztopatologiai vizsgálathoz, immnnhisztokémiához és in sifa hibridizációhoz, a szakterületen ismert és az alábbiakban ismertetett módszerek alkalmazásával, Ezzel megbecsülhető a kérdéses expresszált pohpeptíd, azaz például a zalphall lígandum befolyása a tumornak arra a képességére, hogy vérerek alakulnak ki benne és áttéten megy át. Emellett, az adenovírus használata mellett a beültetett sejteket tranziensen tran-szfektálhatjuk zalphall lígandummal, A stabil zalphall ligandum transzfektánsok használata, valamint resszíó (n uíuo aktiválására ismert a szakterületen, és ebben a rendszerben arra használható, hogy megbecsüljük az áttét zalphal 1 hgandummal való indukciójára gyakorolt hatását.

Emellett a tisztított zalpha 11 ligandumot vagy a zalphal 1 ligándummal kondicionált, táptalajokat közvetlenül injekciózhatjuk ebbe az egérmodeOfoe, és ezért használhatók ebben a rendszerben [O'Reílly MS és mtsai; Cell 79, 315-328 (1994); Rusciano D. és mtsai: Murlne Models of kiver Metastasis hívásion

Metastasís 14. 349-361 (1995)

A zalpha 11 ligandum használható lehet a tumorigenezlsben, ezért használható lehet a rák kezelésében. A zalpha 11 ligándum gátolja az anti-lgM-mel stimulált normál B-sejtek interleukin-4-gyel stimulált szaporodását, és hasonló hatás figyelhető meg a B-sejf. tumorvonalakban, ami azt sugallja, hogy lehet terápiás előnye annak, ha a betegeket a zalpha 11 Ugandámmal kezeljük, azzal a céllal, hogy a B-sejt tumorsejteket kevésbé szaporodó állapotba indukáljuk. A ligandum beadható más ágensekkel kombinálva is, amely ágensek közé tartoznak mind a hagyományos kemoterápiás ágensek, mind az immunmodulátorok, azaz például az interferon alfa. Az alfa/béta interferonokról kimutatták, hogy hatékonyak néhány leukémia kezelésében és állati hetegségmodellben, és az interferon-alfa valamint a. zalpha 11 ligandum növekedést gátló hatásai additívak, legalább egy B-sejt tumor-eredetű sejtvonalban.

A jelen találmány tárgyát olyan eljárások képezik, amikkel csökkenteni lehet egy neoplasztikus B vagy T-sejt szaporodását.

amik abból állnak, hogy egy emlősnek egy B vagy T-sejt neoplazmát adunk be, egy zalpha 11 ligandum készítmény olyan mennyiségében, ami elegendő ahhoz, hogy csökkentse a neoplasztikus B vagy T-sejtek szaporodását. Más megvalósítási módok szerint a készítmény tartalmazhat legalább egy citokint, amit az alábbi *♦♦· *

9?

* <·* χ, csoportból választhatunk ki; interleukin-2, ínterlenkin-15, ínterukin-4. GM-CSF, Flt3 ligandum vagy őssejt faktor.

A jelen találmány tárgyát képezi

Se iá zgy olyan eljárás.

amivel -csökkenteni lehet egy neoplasztikus B vagy T-sejt sz; rodását, ami abból áll, hogy egy egy B vagy T-sejt neoplazmával rendelkező emlősnek egy zalphal l ligandum antagonísta készítmény olyan mennyiségét adjuk be, ami elég ahhoz, hogy csökkentsük a neoplasztikus B vagy T-sejtek szaporodását. Más megvalósítást módok szerint a készítmény tartalmazhat legalább egy citokint, amit az alábbi csoportból választhatunk ki; interleukín2, mterleukín-15, interleukin-4, GM-CSF, FI13 .ligandum vagy őssejt faktor.. Emellett a zalphall ligandum antagonísta lehet egy ligandum Ztoxin fúziós fehérje.

Egy zalphal l. ligandum-saporin fúziós toxin használható leukémiák és límfómák hasonló csoportjával szemben, kiterjesztve ezzel a zalphal 1 ligandummal kezelhető leukémiák tartományát. A zalphall ligandum. receptor fúziós toxin által közvetített aktiválása két független eszközt biztosit a megcélzott sejtek növekedésének gátlására, amikből az első azonos a csak a ligándummal látható hatásokkal, a második pedig a toxin bejuttatása a receptor mternalizáeíón keresztül. A zalphall receptor iimfoir a lídokra korlátozott expressziós mintázata azt sngal gandum-saporín konjugátumot elviselhetik a betegek.

Ha a rosszindulatú betegségek kezelése magában foglalja a csontvelő vagy őssejt átültetést, akkor a zalphal 1 ligandum értékes lehet a graít-versus-tumor hatás fokozásában. A zalphal 1 ligandum stimulálja a lltikus NK sejtek generálását csontvelő őssejtekből, és stimulálja a T-sejtek szaporodását, az antigén receptorok aktiválása után. Ennek következtében, ha a betegek $8

a.Ilogén csontvelő átültetésben részesülnek, akkor a zalphall ligandum fokozza az antí-tumor válaszokat, a donor limfociták infúziójával vagy anélkül.

káclója az adott citokin potenciális hatáspontjainak. A zalphall receptor Northern biot elemzéséből kiderült, hogy vannak transzkriptumok a humán léphen, csecsemőmirigyben, nyirokeso-

A zalpha 11 receptor viszonylag magas szinten expresszálódik az MLR-ben, amiben két. egyediből származó perifériális vér mononukleáris sejteket (PBMNC) kevertek össze, ami kölcsönös aktiválást eredményez. A transzkriptum magas szintjének kimutatása az MLR-ben, ami viszont hiányzik a pihenő T vagy B-sejt populációkban, azt sugallja, hogy az aktiválás során a zalphal 1. receptor expresszió indukálódhat egy vagy több sejttípusban. A T és B-sejtek izolált populációinak aktiválását mesterségesen is elérhetjük, ha a sejteket PMA-val és ionomicinnel stimuláljuk. Ha osztályozott sejteket vetünk alá ezeknek az aktiválási körülményeknek, akkor a zalphall receptor transzkriptum szintje megnőtt mindkét sejttípusban, ami alátámasztja, hogy ez a receptor és a zalphal 1 ligandum szerepet játszik az immunválaszokban, különösen az autokrln és parakrm T és B-sejt expanziókban az aktiválás során, A zalpha. 11 ligandum szerepet játsz\* * * * hat a limfopoíézishen szerepet játszó, primitívebb őssejtek expanziójában.

A zalphal I receptorról kiderült, hogy magas szinten vannak jelen a pihenő T és B-sejtekben, és mennyiségük megnőtt mhidkét sejttípus aktiválása során. Érdekes módon, a B-sejtek is gyorsabban csökkentik a transzkriptum mennyiségét mint a Τ'sejtek, azt sugallva ezzel, hogy a szignál amplitúdója, valamint, a szignál időzítése és kioltása fontos a B-sejt válaszok megfelelő szabályozásához.

Emellett a bél lamina: propria. sejtek nagy része pozitív hibridizációs szignálokat, ad a zalpha.il receptorral. Ez a szövet límfoid sejtek kevert populációját tartalmazza, beleértve az aktivált CD4+ sejteket és az aktivált B-sejteket. Az immunrendszer működési rendellenessége, főleg a nyálkahártya immunválasz krónikus aktiválása fontos szerepet játszik a Crohn betegség etiologíájában; a. pro-gyuiladásos cítokinekrc adott abnormális válasz, és/vagy ezeknek a termelődése szintén egy gyanúba vett faktor [Braegger és mtsai: Annals Allergy 72, 135-141 (1994); Sartor RB; Ara. d. Gastrocnterol. 92, SS-1IS {1997)). A zalphal 1 ligandum az interleukín-15-tel összhangban megnöveli a csontvelő őssejtekből származó NK sejtek mennyiségét, és erősíti az NK sejt ebek tor funkcióját. A zalphal 1 ligandum is ko~stímutálja az an.ií-CD4ö ellenanyagokkal stimulált érett B-sejteket, de gátolja a B-sejtek szaporodását az IgM-en keresztül jövő szignálokra. A zalphal 1 ligandum fokozza a. T-sejtek szaporodását, a T-sejt receptoron keresztül jövő· szignállal összhangban, és a transzgenikns egerekben való túlexpresszíó límfopéniáhöz vezet, és a mormolták valamint a granuloeíták expanzióját okozza. A zalphal 1 ligandumnak ezek a pleiotróp haλ *

Λ, * « £ * *5 *»* tásai azt sugallják, hogy terápiás felhasználhatósága is lehet a betegségek széles körében, amik az immunrendszer hibáiból származnak, beleértve, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a szisztémás lupus erythematosus-f (SLE), a reumás arthritist (RAK a szklerózis multiplexet (MS), az ízomgyengeséget és a cukorbetegséget. Fontos megjegyezni, hogy ezek a betegségek az immunrendszer működési rendellenessége komplex hálózatának eredményei (az ShE például a T és B~sejtekben is fellépő hibák megjelenési módja), és az immunsejtek függenek az egymással való kölcsönhatásoktól, egy erős immunválasz

kifejtése érdekében, Ennek következtében a zalphall liga (vagy a ligandum egy antagonistájaj, ami arra egy vagy több immunsejtet manipuláljunk, vonzó a betegség több különböző fázisában való beavs

A jelen találmány szerinti, polípeptidek és fehérjék ex oioo is használhatók, azaz például autológ csont velő tenyésí Röviden, a csontvelőt a kemoterápia vagy szervátültetés eltávolítjuk a betegből, majd zalphal 1 Ugandámmal kezeljük, tetszés .szerint egy vagy több más citokinnel kombinálva, A kezelt csontvelőt azután a kemoterápia után visszavisszük a betegbe, hogy felgyorsítsuk a csontvelő regenerálódását, vagy az átültetés után a graft-versus-bost betegség elnyomására. Emellett a jelen találmány szerinti fehérjék használhatók a csontvelő vagy perifériális vér őssejtek (PBPCl ex oico expanziójára. A kezelés előtt a csontvelőt stimulálhatjuk őssejt faktorokkal (SCF), hogy a korai őssejteket kijuttassuk a perifériális keringésbe. Ezeket az őssejteket összegyűlthetjük és föményíthetjük a perifériális vérből, majd tenyészetben zalphall ligandummal kezeljük, tetszés sze~ egy vagy több más citokinnel kombinálva, beleértve, anélkül, :01 hogy ezekre korlátoznánk magunkat, SCF-fel, interleukín-2-vek lnte.ricukin-4-gyel., interleukin-7-tel vagy ínterleukm~15~fel, hogy nagy sűrűségű limfoid tenyészetekké differenciálódjanak és szaporodjanak,amik azután a kemoterápia vagy a szervátültetés után visszavihetők a betegbe.

in találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás matopoíetikus sejtek és hematopoiefikns őssejtek expanziójára, ami abból all, hogy csontvelő- vagy perifériális vér sejteket tenyésztünk egy olyan készítménnyel, ami olyan mennyiségű zaiphall hgandumot tartalmaz, -ami elég ahhoz, hogy növelje a. limfoid sejtek számát a csontvelőben vagy a perifériális vérsejtekben a zaíphal 1 lígandum nélkül tenyésztett csontvelővel vagy a perifériális vérsejtekkel összehasonlítva, Egy másik megvalósítási mód szerint, a limfoid sejtek NK sejtek vas .s I-sejtek. Emellett, a készítmény tartalmazhat legalább egy' másik eltekint, amit az alábbi csoportból választhatunk ki: interleukin2, infericukin-15, interleukto-4. GM.-CSF, Flt3- ligandum és őssejt. faktor.

Egy másik változat szerint a zaiphall ligandum inaktiválhatja az immunrendszert, ami fontos lehet a fertőző betegségek elleni immunitás erősítésében, az ímniun-komprornittáit betegek, azaz például HÍV* betegek kezelésében, vagy vakcinák javításában, Pontosabban, áz NK sejtek vagy őssejtjeik zaiphall ligandu.rn.mal való stimulálása vagy expanziója terápiás értéket biztosíthat a vírális fertőzés kezelésében, valamint anti-neoplasztikus faktor is lehet. Az NK sejtekről azt gondolják, hogy fontos szerepet játszanak az áttétes tumor sejtek eliminálásában, -és azokban a betegekben, akikben mind áttétek mind szolid tumorok vannak, és csökkent bennük az NK sejt aktivitás

HU *·♦·* *

X « « «X <

hteside és mtsai: Curr. Top. Microbiot immunot 230, 221(1998)1, Hasonló módon, a virális és nem-vlrális patogén (beleértve a baktériumokat. protozoákat és gombákat) elleni immunválasz zalpha 11 líg&ndumma! való stimulálása terápiás értéket biztosíthat az ilyen fertőzések kezelésében, az ilyen fertőző ágensek növekedésének gátlásával, A testben egy patogén vagy antigén, azaz például egy tumorsejt, szintjének közvetlen vagy közvetett meghatározása számos, a szakterületen ismert módszerrel elvégezhető, ezeket az alábbiakban ismertetjük.

A jelen találmány tárgya, eljárás immunválasz stimulálására egy antigénnek vagy patogénnek kitett emlősben azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk: 1) az antigén vagy a patogén szintjének közvetlen vagy közvetett meghatározása az említett emlősben; 2) beadunk egy készítményt, ami zalphal 1 ligandum polipeptidet. tartalmaz egy elfogadható gyógyászati hordozóban; 3) az antigén vagy a patogén szintjének közvetlen vagy közvetett meghatározása az említett emlősben; és 4) az antigénnek vagy a patogénnek az első lépésben mért szintjét összehasonlítjuk az antigénnek vagy a patogénnek a második lépésben mért szintjével, és a szint változása az immunválasz stimukálásának jelzése, Egy másik megvalósítási mód szerint, a zalphal l ligandum készítményt újra beadjuk. Más megvalósítási módok szerint az antigén egy B-sejt tumor; -egy vírus; egy parazita vagy egy baktérium.

A jelen találmány tárgya továbbá eljárás immunválasz stímulálására egy antigénnek vagy patogénnek kitett emlősben azzal jellemezve·, hogy az alábbi lépéseket alkalmazzuk: 1) egy antigén- vagy patogén-speefflkus ellenanyag szintjének meghatározása; 2} beadunk egy készítményt, ami zalphal 1 ligandum po* X lipeptídet tartalmaz egy győgyászatilag elfogadható hordozó 3) meghatározzuk az antigén- vagy patogén-specüíkus ellenanyag beadás utáni szintjét; 4) összehasonlítjuk az l)-es lépésben mért ellenanyag szintjét a 3)-as lépésben mért ellenanyag szintjével, aholis az ellenanyag szintjének növekedése az· immunválasz stíl· mulálását mutatja.

A zalphall ligandum polipeptideket: kódoló polinukleotidok jól használhatók génterápiás alkalmazásokban is, amikor arra van szükség, hogy fokozzuk, vagy éppen gátoljuk a zalphall ligandum aktivitását. Ha egy emlősnek mutált zalphall ligandum génje van, vagy éppen hiányzik belőle a zalphal I ligandum gén, akkor a zalphal 1 ligandum gén bejuttatható az emlős sejtjeibe. Az egyik megvalósítási mód szerint egy zalphall ligandum poll· pepiidet kódoló gént in eteo lehet bejuttatni egy virális vektorba. Ilyen vektor lehet például egy attenuált vagy detektív DNS vírus, azaz például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat a herpes simplex vírus (HSV), a papillómavírus, az Epstein Barr vírus ÍEBVk az adenovírus, az adeno-asszoeiáb vírus (AAV) és a.

hasonlók. Előnyben részesítjük a detektív vírusokat, amikből a virális gének részben vagy hiányoznak. Egy detektív vírus nem. fertőzőképes a sejtbe való bejuttatás után. A detektív virális vektorok használata lehetővé teszt specifikus, lokalizált területen levő sejtekbe való beadást, anélkül hogy félnünk kellene, hogy a vektor megfertőzhet más sejteket Az adott vektorok közé tartoznak., anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, egy detektív herpes simplex vírus 1 (HSV1) vektor (Kaplítt és mtsai: Molec. Coll. Neuroseí, 2, 320-330 (1991)1» egy attenuált adenovírus vektor, azaz például a Stratford-Perrlcaudet és munkatársai által ismertetett vektor jStratford-Perrícaudet és mtsai.: J, Clmie,

W4 « « hívest 90, 626-630 (1992)1, valamint egy defektiv adeno-asszociált vírus vektor fSamulski és mtsai: d, Virol. 61, 3096-3101 (1987b Samulski és mtsai: J. Virol. 63, 3822-3828 (1989)1

Egy másik megvalósítási mód szerint egy zalphal l ligandum gént egy ölvén retrovtrális vektorba juttathatunk be, amilyet a szakirodalomban többen is leírtak (Andersen és mtsai; 5,399,346 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás: Maim és mtsai; Ceil 33, 153 (1983); Temín és mtsai: 4,850,784 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás: Temín és mtsai: 5,124,263 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; Markowítz és mtsai: J. Vírol. 62, 1120 {1988}: Temín és mtsai: 5,124,263 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírás; WO 95/07358 számú szabadalmi leírás (1995. március 18-án publikálva Dougherty és munkatársai által);

es mtsai: B ’ másik változat szerint a vektor lipofekcióval juttatható be in üíüo, líposzómák használatával. Szintetikus kationos lipidek használhatók liposzómák előállításához, egy markért kódoló gén in vívó iranszfekciójához (Felgner és mtsai: Proeeedings of the National Academy of Sciences, USA 84, 7413-7417 (1987); Mackey és mtsai: Proeeedings of the National Academy of Sciences, USA 85, 8027-8031 (1988)1.. A lípofekció alkalmazása exogén géneknek specifikus szervekbe való bejuttatására számos gyakorlati előnnyel rendelkezik. Az egyik előny a. liposzómák molekuláris célzása specifikus sejtekre. Pontosabban, az egyik előny a transzlekció adott sejtekbe való irányítása. A transzfekciő egy bizonyossejttípusba való irányítása különösen előnyős lehet egy celluláris heterogenitással rendelkező sző vei:, azaz például a hasnyálmirigy, a máj, a vese és az agy esetében. A lipidek kémiailag kap1Ű5 _Χφ»« φ**

φ.« φ *

4* csolhatők más molekulákhoz is, a célzás miatt. A bccélzott pép» üdék (azaz például hormonok vagy neurotranszmitterek), fehérjék, azaz például ellenanyagok, vagy nem-pepiid molekulák kémiailag kapcsolhatok a líposzómákhoz, .Az- lehetséges, hogy éitávohtsuk a megcélzott sejteket a testből; hogy a vektort puszta DNS plazmid formájában juttatjuk he; majd a transzformált sejteket visszaültetjük a testbe, A puszta DNS vektorok a génterápiához a szakterületen ismert módszerekkel, azaz például transzfekcíóval, elektroporációval, mikroinjekciőzással, transzdukciő val, sejtfúzióval, DEAE dextránnal, kalcium-foszfátos kicsapással, génpuska használatával, vagy egy DNS vektor transzportéi használatával juttathatok be a kívánt sejtekbe [Wu és mtsai: Journal of Bíologieal Chemistry 267, 983-967 (1992); Wu és mtsai: Journal of Bíologieal Chemistry 263, 14621-146.24 (1988)),

Az. antiszensz módszer arra használható, hogy gátoljuk a zalphal 1 ligandum gén transzkripcióját, például azzal a céllal, hogy' ín υίοο gátoljuk' a sejtszaporodást Egy zalphall ligandum polipeptidct kódoló polinnkleotid (azaz például az 1, számú szekvenciavázlaton bemutatott polinnkleotid) egy szegmensével komplementer polínukleotidokat úgy tervezzük meg, hogy kössék meg a zalphall ligandumot kódoló mRNS-t, és gátolják az ilyen mRNS transzlációját Áz ilyen, antiszensz polínukleotidokat arra használjuk, hogy sejttenyészetben vagy egy alanyban gátoljuk a zalphal 1 polipeptidct kódoló géneket.

Előállíthatok olyan egerek is, amik a zalphal! gént expresszálják (ezeket hívják „franszgenikus egereknek”), valamint olyan egerek, amikből a zalphall génfunkció teljes egészében hiányzik (ezeket nevezik „knockoutolt egereknek”) (Snouwaert és

106 φφ mtsai: Science 257, 1083 (1992); Lowell és mtsai: Natúré 366, 740-742 (1993); Capeechí, M.R.: Science 244, 1288-1292 (1939); Palmiter, R.D. és mtsai: Annual Rév. Génét. 20, 465-499 (1986)). Például egy zalphall ligandumót fűlexpresszáló (vagy általánosan, vagy egy szövetre korlátozódó vagy egy szövetre specifikus promoterrel,) transzgenikus egér arra használható, hogy kiderítsük, a tűlexpresszió okoz-e fénotípus változást. Például egy vad-típusú zalphall ligandum polipeptíd, polipeptíd fragmens, vagy annak mutánsának túlexpresszíója megváltoztathatja a normális ceiiuláris folyamatokat, ami olyan fenotípust eredményez, amivel azonosítani lehet egy olyan szövetet, amiben a zalphall ligandum expresszié funkcionálisan releváns, és a zalphall li~ gandum, annak agonistái vagy antagonistái terápiás célpontja lehet. Például egy előnyben részesitett, megváltoztatandó- transzgenikus egér az, amelyik tű'lexpresszálja a zalphall ligandumót (a 2. számú szekvencia körülbelül 32-162-es aminosav csoportja). Emellett, az ilyen túlexpressziő olyan fenotípust eredményezhet, ami hasonlóságot mutat az emberi betegségekkel. Hasonlóképpen, a knockoutolt zalphall egér arra is használható, hogy meghatározzuk, van-e abszolút szükség a zalphall ligándumra ín oíoo, A knockoutolt egér fenotípusa előre jelzi a zalphall ligandum antagonista in vivő hatásait, azaz például az itt ismertetetteket. Az egér vagy a humán zalphal 1 ligandum cDNS használható knockout egerek generálására. Ezek az egerek használhatók a zalphall ligandum gén és az· általa kódolt fehérje tanulmányozására egy ín vivő rendszerben, és használhatók a megfelelő emberi betegségek ín vívó modelljeiként. Emellett, a zalphall ligandum antiszensz polínukleotidok, vagy a zalphall ligandum elleni ribozimek transzgenikus egerekben való, itt.

* * «0« * ” »μ:« *** ismertetett expressziója azzal analóg módon használható, mint az előzőkben Ismertetett íranszgenikus egereknél elvégezhetjük tisztított zalphal 1 ligandum fehe Gyógyászati felhasználás céljából a jelen

A vtí^ö’í is, álrnány szerinti

8.Í fehérjék hagyományos módszerekkel kiszerelhetők parenteráiis, főleg intravénás vagy szubkután beadáshoz. Az itt ismertetett biológiailag aktív poiipeptid vagy ellenanyag konjugátuinok beadhatók intravénásán, antraarteriálisan vagy intraduktálísan, vagy bevihetők lokálisan is, a hatás kívánt helyére. Az intravénás beadás bolus injekció- vagy infúzió·, aminek tipikus időtartama egy vagy néhány óra, Általánosságban, a gyógyászati készítmények tartalmaznak egy zalphall ligandum fehérjét, egy gyógyászatilag elfogadható hordozóval, azaz: például sőoldaítal, puffereit sóoldattal, 5% vizes dextrőzzal vagy hasonlóval kombinálva. A készítmények tartalmazhatnak még egy vagy több töltöanyagöt konze.rválószert, szolubilizálót, pufferelő ágenst, albumínt (hogy megakadályozzuk az ampulla falára való tapadás miatti fehérjevesztéstk stb, A kiszerelési módszerek jól ismertek a szakterületen íRemington: The Science and Praeiíee of Pharmacy, szerkó Gennaro, Maek Puhkshíng Co,, Easlon,

19,kíadás (I995)j. A terápiás dózisok nagysága általában 0,1100 pg/a beteg testsúlya kilogrammban, előnyösen 0,5-20 mg/kg per nap, aholis a pontos dózist a gyakorló- orvosnak kell meghatározni az elfogadott standardok szerint, figyelembe véve a kezelendő állapot természetét és súlyossságáf, a. beteg tulajdonságait, stb. A dózis meghatározása, a szakterületen átlagos jártassággal rendelkező szakember ismereteihez tartozók. A fehérjéket beadhatjuk akut kezeléshez, egy hét, vagy rövídebb időtartam alatt, gyakran 1-3 nap alatt, vagy használhatjuk krónikus keze108 lésekben, több hónapig vagy évig, Által.ánosságfean, a zalphal 1 ligandum terápiásán elfogadható mennyisége az a mennyiség, .ami elegendő a klinikailag szignifikáns hatás előidézéséhez.

A találmányt az: alábbi, nem korlátozó jellegű példákkal tovább illusztráljuk.

PÉLDÁK

1. Példa

A humán MPL-zalpha 11 polipeptíd kánéra előállítása: MPL extraeelluláris és TM, dómén a zalpha 11 intraeeHuláns jeladó doménhez fűzlonáltatva

Az MPL receptor extracellulárls és transzmembrán doménjeít az MPL receptort tartalmazó plazmádból fPHZl/MPL plazmád) polimeráz láncreakcióval izoláljuk, a ZC 1.7,212 (5« számó. szekvencia) és a ZC 19,914 (6, számú szekvencia) primerek felhasználásával.. A reakciókörülmények az alábbiak: 95 °C 1 pere; 35 ciklusban 95 ^ÖC 1 perc, 45 *C 1 perc, 72 °C 2 perc, majd 72 *C 10 perc; ezután 10 ^c'C-os áztatás.. A polimeráz láncreakció termékét 1%-os alacsony olvadáspontéi gélen (Boehrínger Mannheím, Indianapolis) futtatjuk, majd a körülbelül 1,5 kilobázis méretű MPL receptor íragmensí a Qiaqulek™ gél-ekittel ÍQIAGEN) izoláljuk, a gyártó előírásai szerint.

A humán zalphall intraeelluláris. doménjeít egy receptor eDNA-t tartalmazó plazmidhől izoláljuk polimeráz reakcióval, a 2A19,913 (8. számú szekvencia) és a ZC20,ö számú szekvencia) primerek felhasználásával. A zalphall receptort kódoló szekvenciának megfelelő polinukleotid szekvenciát az

ff 1b

7. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be, a megfelelő amínosav szekvenciát a 115. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be. A reí'»** «

« 0» φφ« » ♦** * φφ φ φ * * akciókörülmények ugyanazok, mint az előzőkben. A polimeráz láncreakció termékét 1%-os alacsony olvadáspontú agar-őz gélen futtatjuk (Boehringer Mannheim.), majd izoláljuk a körülbelül 900 bázispár méretű zalpha 11 fragmenst (Qiaquick gél-extrakciős kit, a gyártó utasításai szerint).

Mindegyik, előzőkben ismertetett, izolált, fragmenst 1:1 térfogatarányban összekeverjük, és egy polimeráz láncreakcióban használjuk fel, amihez, a ZC17,2i.2-es (5. számú szekvencia) és a 2C20,Ö97~es (9. számú szekvencia) polinukleotidot használjuk primer&ént az MPt-zalpha 11 kíméra előállítása során. A reakciókörülmények az alábbiak: 95 °C 1 perc; majd 35 ciklusban 95 °C 1 pere, 55 °C 1 perc, 72 ^S'C 2 pere; majd 72 °C lö perc; 10 perc áztatás lö ’C-rn. A teljes polimeráz láncreakció terméket 1%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen futtatjuk (Boehringer Mannheim), majd a körülbelül 2,4 kiloházls méretű MPLzalphall kíméra fragraenst Qíaquick gél extrakciós kittel (QIAGEN) izoláljuk, a gyártó utasításai szerint. Az MPL-zalphal 1 kíméra fragraenst BeoRl (BRL) és Xbal (Boehringer Mannheim) restrikciós endonukleázokkal emésztjük, a .gyártó utasításai szerint. A teljes ernésztraényf 1%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen futtatjuk (Boehringer Mannheim), majd az elhasított MPL-zalphall kimérát Qíaquick™ génextrakciós kittel (Qiagen) izoláljuk, a gyártó utasításai szerint. A kapott, elhasított MPLzalphal 1 kimérát az alábbiakban ismertetett módon egy expressziós vektorba illesztjük be.

A befogadó p2P-5N expressziós vektort BeoRl (BRL) és BindlII (BRL) restrikciós endonukleázokal emésztjük, a. gyártóutasításai szerint, majd az előzőkben ismertetett módon gélen tisztítjuk. Ezt a vektor-fragmenst egy ligáid reakcióelegyben komno *·'

az előzőkben izolált, EcoRI és Xbal restrikciós enzimekkel hasított MPL-zalphall kimérával, valamint az Xbal/Hindii! línker fragmenssel, A ligáló elegybe T4 ligázt teszünk (BRL), és éjszakán át 15 °C-on tartjuk. A ligáló elegyból vett mintát elektroporáljuk DH 1ÖB ElectroMAX™ elektrokompetens Esehenchto colt seitekhe

2,3 V). A

LB+Ampicillín lemezekre szülész tjük, majd az egyedi telepeket pollmeráz láncreakcióval vizsgálunk át, hogy megkeressük az MPL-zalphall kimérát, a ZC17,212 (5. számú szekvencia) és ZC20,097 (9„ számú szekvencia) primerek felhasználásával, az előzőkben ismertetett pollmeráz láncreakció körülmények között.

Az MPL-zalphall kiméra szekvencia igazolását szekvenciaelemzéssel végezzük el, az alábbi primerek felhasználásával: ZC12,700 (10. számú szekvencia}, ZC5,Ö2Ö (Π. számú szekvencia), 2C8,875 (12. számú szekvencia), ZC7,727 (13, számú szekvencia), ZC8,290 (14. számú szekvencia), ZC19,572 (15. számú szekvencia), ZC6,622 (16, számú szekvencia), 2C7,738 (17, számú szekvencia) és ZC9,273 (18, számú szekvencia). Az inszert mérete körülbelül 2,4 kilobázis, teljes hosszúságú.

1AF3 esszében, Aiamar

A.

nérát exoresszáló BaF3 sejtek előállítása

A BáF3, egy interIeukin-3 (IL-3) dependens pre-limfoid sejtvonal rágcsáló csontvelőből származik (Palacios és Steínmetz: Cell 41, 727-734 (1985); Mathey-Prevot és mtsai: Molecular & Cellular Bioiogy 6, 4133-4135 (1988)1, és 10% hővel inaktívált borjúmagzat szérummal, 2 ng/ml rágcsáló ínlerleukin-3-mal (R

-Φ * »··*·* & D, Mínneapolis, MNK 2 mmol/l L-glutaMax-1 ™^: (Gibeo BRL·}, 1 mmot/1 nátrium-piruvát (Gibeo BEL) és PSN antibiotikumokkal (GIBCO BRL) kiegészített komplett táptalajokban tartjuk fenn (RPMI táptalaj (JRH Bioscíence Inc., Lenexa, KS}}. Az elektroporáció előtt p^F-SN/MFL-zalphal 1 DNS-t (1. példa) állítunk elő, majd Qíogen Maxi Prep kittel (QIAGEN) tisztítjuk, a gyártó utasításai szerint. Az elektroporációhoz a BaF3 sejteket egyszer mossuk RPMI táptalajjal, majd RPMI táptalajban reszuszpendáljuk 10⁷ sejt/ml sűrűségben. A reszuszpendált BaF3

Mg un /

-zalpba 11 plazmíd

-sel keverjük.

össze, majd külön-külön eldobható elektroporációs kamrákba visszük (GIBCO BRL). Szobahőmérsékleten inkubáljuk 15 percig, majd a sejteket egymás után kétszer sokkoljuk (800 lFad/300 V; 1180 lFad/300 V), egy elektroporációs berendezéssel (CBLLFORATOR™; GIBCO BRL). Ötperces regenerálódás! idő után az elektroporáit sejteket 50 ml komplett táptalajba visszük át, majd 15-24 órára egy inkubátorba tesszük (37 °C, 5% COz). A sejteket azután lecentrifugáljuk, és a G41.8 rezisztens poöl izolálására T182-es lombikban levő 50 ml komplett táptalajban szuszpendáljuk, ami Geneticín™ (Gibeo) szelekciós ágenst. (5ÖÖ· ng/ml G418) tartalmaz. A transzfektált BaF3 sejtek pool-jait, amiket ezután BaF3/MFL-záiphal 1 sejteknek nevezzük, az alábbiakban ismertetett módon vizsgáljuk a jeladó képességük szempontjából.

aessfcge Alamar szaporodási vizsgálattal

A BaFS/MPL’Zalphal 1 sejteket lecentrifugáljuk, majd az előzőkben ismertet komplett táptalajban mossuk, ami viszont nem ta r

HZ ζ-3-at (a továbbiakban „mIL-3 mentes tápraΦΦ «** Φ laf’-nak nevezzük); A sejteket leeentríhxgáljnk, majd háromszor mossuk, hogy biztosítsuk az mlk-3 eltávolítását, A sejteket egy hemocítométerrel számoljuk meg. A sejteket 96-lukas formában s-zélesztjük, 5000 sejt per luk, 1ÖÖ pl térfogatban, az mIL-3 mentes táptalaj felhasználásával.

A BaP3/MPL»zaIphaii sejtek szaporodását mlt~3 mentes táptalajjal 500 ng/ml-re, 250 ng/ml-re, 125 ng/ml-re, 62 ng/mire, 30 ng/'ml-re, 15 ng/ml-re, 7,5 ng/ml-re, 3,75 ng/ml-re, 1,8 ng/ml-re, 0,9 ng/ml-re, 0,5 ng/ml-re és 0,25 ng/ml-re hígít tromhopoietínnel ΓΓΡΟ) becsüljük meg, A hígított trombopoietmből 100 μΐ-ΐ adunk a BaF3/MPL-zalpha 11 sejtekhez. A teljes- reakeíőtérfogat 200 pl. Negatív kontroilokat futtatunk párhuzamosan, csak mlL-3 táptalaj felhasználásával, trombopoíetin hozzáadása nélkül, A vizsgáló lemezeket 3 napig 37 °C-on (5% CCh) inkubáljuk, ekkor 20 μΙ/luk Alamar Blue-t (Aeeumed, Chicago, 1L) adunk hozzá. Az Alamar Biue az élő sejtek száma alapján fluoromet-riás jelet ad, és így? a negatív kontrollal összehasonlítva a sejtszaporodás közvetlen mérésére alkalmas. A lemezeket ismét 37 C-on (5% €0z) Inkubáljuk, 24 óra hosszat. A lemezeket Fmax^w lemezleolvasőval olvassuk le (Moleeular Devices,

Sunnyvale, CA); a Softmax™ Pro program felhasználásával, 544 nm-es gerjesztő hullámhosszat és 590 mn-es emissziós hullámhosszat alkalmazva.

Az eredmények igazolták a zalphal 1 receptor intracelluláris részének jelátvivö képességét, mivel a trombopoíeto által indukált szaporodás körülbelül 10-szer akkora, mint a háttér, 62 ng/ml vagy több mTPO koncentrációnál.

3. Példa

Π3

Telles hosszúságú zalphai I -et expresszáió expressziós v szítése

A teljes hosszúságú zalphai 1 receptort egy zalphall receptor cDNS-t (7. számú szekvencia) tartalmazó plazmidből izoláljuk, a ZC 19,905 (19, számú szekvencia} és a ZC1.9,906 :(20-. számú szekvencia) primerek felhasználásával. A reakciókörülmények az alábbiak: 95 °C 1 perc; 35 ciklusban 95 °C 1 perc, 55 °C 1 perc, 72 “C 2 perc; majd 72 °C 10 perc; majd 10 *C-os áztatás, A pülimeráz láncreakció termékét 1%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen futtatjuk (Boehrínger Mannheim), és a körülbelül 1,5 kilóbázis méretű zalphall cDN'S-t Qiaquick™ gél-extrakciós kittel (QLAGEN) izoláljuk, a gyártó utasításai szerint.

A tisztított zalphai 1 cDNS-t BamHI (Boehrínger Mannheim) és EcoRI (BRL) restrikciós endonukleázzal emésztjük, a gyártó utasításai szerint, A teljes emésztményt 1%-os alacsony olvadáspontú agaróz gélen futtatjuk, a Qiaquick gél-extrakciós kittet a gyártó utasításai szerint használva. A kapott, elhasított .zalphall fragmenst az előzőkben ismertetett módon ínszertálj'uk egy exprcssziös vektorba.

A befogadó p.ZP~5N expressziós vektort BamHI (Boehrínger Mannheim) és EcoRI (BRL) restrikciós enzimekkel emésztjük a gyártó utasításai szerint, majd az előzőkben ismertetett módon gélen tisztítjuk. Ezt a. vekior-fragmenst egy ligálási reakcióban kombináljuk az előzőkben izolált, BamHI és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztett zalphall fragmenssel, A ligáid elegybe T4 ligázt (BRL) teszünk, majd éjszakán át 15 °C~on inkubáljuk. A ligáié elegyből vett mintát DH1ÖB electroMAX™ elekírokompetens Esehunehta coli sejtekbe elekfroporáljuk (25 mF, 200 Q, 2,3 V). A transzíormánsokat LBaAmpíeillin lemezekre szélesztjük, majd az ♦'*·

114 »

φ φφ φ *« egyedi telepeket polimeráz- láncreakcióval átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a zalphal 1 szekvenciát, a ZC19,905 (19. számú szekvencia) és 209,906 (20. számú szekvencia) primerek felhasználásával, az előzőkben ismertet polimeráz láncreakció körülményeit alkalmazva.

Az MPt-zalphall szekvencia Igazolását szekvenciaelemzéssel hajtjuk végre, az alábbi primerek felhasználásával: 202,700 (10. számú szekvencia), ZC5.02Ö (11, számú szekvencia), 2C2Ö,114 (21, számú szekvencia), 209,459 (22, számú cla), ZC 1.9,954 (23. számú szekvencia), és 2020,116 (24.

számú szekvencia). Az inszert mérete körülbelül 1,6 kilobázís.

teljes hosszúságú.

Zalpball alapú szaporodás BAF3^: esszében, Alamar Blue felhasználásával receptort expresszáló BaP3 sejtek készítése A teljes hosszúságú zalpball receptort expresszáló BaF3 sejteket a 2a. példa alapján állítjuk elő, 30 p.g, az előző, 3. példában ismertetett zalpball. expressziós vektort használva. A. zalphal 1 receptor m.RNS-t expresszáiő BaF3 sejtek jelölése Ba.F3/zalphal 1. Ezeket a sejteket arra használjuk, hogy megkeressük a zalphal 1 aktivitást, az alábbi, 5. és 8. példa alapján,

5. Példa

Blue felhasználásával

A._ Primer malom szplenocifák használata a zalphal 1 ligán115 « ♦< X χ >

««J ♦ » X * « * » XX*

9 x «

X X« :X*

Majom szplenodtákat stimulálunk kondicionált táptalajok előállítására, a zalphan ligandum aktivitás jelenlétének tesztelésére, az előzőkben ismertetett módon. A majomlépeket nyolcéves M. nesestrian majmokból vesszük. Á lépeket szétszedjük, hogy egysejt szuszpenziót kapjunk. A mononukleáris sejteket Pícoll-Plaque PLUS {Pharmacia Biotech, Uppsala, Svédország) sűrűséggradíenssd izoláljuk. A mononukleáris sejteket 2 x lö⁶ sejt/ml sűrűséggel oltjuk he 10% FBS-sel kiegészített RPMI-1.640 táptalajba, és 48 óra hosszat 5 ng/ml Phorhöl-12-mirísztát~I3~ acetáttal (PMA) (Calbiochem, San Diego, CA) és 0,5 ug/mi Ionomicin™-mel (Calbiochem) aktiváljuk. A serkentett majom lépsejlekből származó feiüiűszőt használjuk a BaF37zalphal 1 sejtek szaporodásának vizsgálatára, az előzőkben ismertetett módon.

B. A zalphal! ligandum keresése BaFS/zalphal 1 sejtekkeL Alamar Blue szaporodási vizsgálat alkalmazásával

A BaF3/zalpha!.i sejteket le centrifugáljuk, majd mIL-3nientes táptalajjal mossuk. A sejteket háromszor lecentrifugáljuk, hogy eltávolítsák az míL~3~at A sejteket egy hemacitométerrel számláljuk meg. A sejteket 96-lukas formában szélesztjük 5000 sejt/luk mennyiségben, 100 μ! per luk térfogatban, mit-3 mentes táptalajban.

A BaF3/zalphall sejtek szaporodását aktivált majom lép•sejtekből származó kondicionált táptalaj felhasználásával becsüljük meg' (lásd az előző, 5. A. példát), amit mIL-3 mentes táptalajjal 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% és 0,375% koncentrációra hígítunk. 100 μΐ hígított, kondicionált táptalajt adunk a BaF3/zalphal 1 sejtekhez. A re össztérfogata 200 μΐ. A vizsgáló lemezeket 3 napig 37 *C~on inkubáljuk (5% COa), ekkor 20 pl/luk mennyiségben Alamar Blue-t adunk hozzá (Accumed, Chicago, IL). A lemezeket 24 óra hosszat 37 °C~on inkuháljuk (5% COa). A lemezeket Fmax™ lemezleolvasóval olvassuk le

Ieeular Devices), az előzőkben Ismertetett módon (2.

Az eredmények Igazolták a BaF3/zalphal 1 sejteknek az aktivált majomlép kondicionált táptalajban levő faktorra adott szaporodási választ. A válasz, a mérések szerint, 50% koncentrációban körülbelül négyszer magasabb mint a háttér, A vad-típusú BaF3 sejtek nem szaporodnak a faktorra adott válaszként, jelezve e ? ez a faktor a z rec noum izoiaiasara h<

forrás

Hat donortól 100-100 ml vért veszünk. A vért 10X 10 ml-es, lieparint. tartalmazó vaoutainer csövekbe vesszük le, A hat donortól származó vért egyesítjük (600 ml), 1:1 arányban hígítjuk foszfáttal puffereit sőoldattal, majd Ficoll-Paque® PLUS (Pharmacia Bioteeh, Uppsala, Svédországi felhasználásával szeparáljuk. Az izolált primer humán sejtek kitermelése a FicoII gradiensen való elválasztás után 1,2X 1Ö⁹ sejt.

A sejteket 9,8 ml MACS púderben szuszpendáljuk .(foszfáttal puffereit sóoldat, 0,5% EDTA, 2 mmol/1 EDTA). A sejtszusz5ből 1,6 ml-t kiveszünk, és 0,4 ml CD3 mikrogyöngyöt fényi Biotec, Auburn, CÁ) adunk hozzá. Az elegyet 15 percig 4 °C-on inkuháljuk. Ezeket a sejteket CDS gyöngyökkel jelöljük, majd 30 ml MACS púderrel, mossuk, majd újra. szuszpendáljuk 2

Düheiben.

φ

X ΛΦΦ φ*

Egy VS* oszlopot (Mlltenyi) készítünk, a gyártó- utasításai szerint. A VS+ oszlopot azután egy VarioMACS™ mágneses mezőbe tesszük (Miltenyi), Az oszlopot 5 ml MACS pufiferrel hozzuk egyensúlyba. Az izolált primer humán sejteket visszük az oszlopra. Hagyjuk, hogy a CD3 negatív sejtek átmenjenek rajta. Az oszlopot 9 ml (3- x 3 ml) MACS pnfferrel mossuk. Az oszlopot azután eltávolítjuk a mágnesből, és 15 ml-es falcon csőbe tesszük. A CD3+ sejteket 5 ml MACS puffernek az oszlophoz való adásával eluáljuk, és a megkötött sejteket a gyártó- által biztosított szivattyúival mossuk ki. A sejteknek az előzőkben említett CDS mágneses gyöngyökkel inkubálását, a mosásokat és a VS+ oszlop lépéseket (mkuhálás elüción keresztül) még ötször megismételjük, A hat oszlop-elválasztásból kapott CD3+ frakciókat egyesítjük. A CD3a szelektált humán T-sejtek kitermelése 3 x

10^s Össz-sejt

Az egyesített CDSv-szál szelektált humán T-sejt sejtekből mintát veszünk, majd fluoreszcens ellenanyag sejtosztályozőval (FACSÍ osztályozzuk, hogy meghatározzuk a tisztaságukat. A CDS* szelektált humán T-sejtek 91%-ban CD3r sejtek,

A CD3+ szelektált humán T-sejteket úgy⁷ aktiváljuk, hogy óra hosszat, 37 °C-on

5% es pg/ml lonoinieint (Calbiochem) tartalmazó RPMI táptalajban tnkubáljuk. Ezeknek a CD3+ szelektált humán T-sejteknek a felülúszóit vizsgáljuk az előzőkben ismertetett módon. Emellett, az aktivált CD3v szelektált humán sejteket használjuk egy cDNS könyvtár előállításására, az alábbi, 8, példában ismertetett módon.

«

D. Az aktivált CD3+ iáit hurnán T-seitekböl származó fe lüiú szók vizs gálata, dv tartalmaznak-e za ligandnmot, ehhez BaFSZ zalphall .s<

t es egv mar vizsgálatot használva

A BaFSZzalphall sejteket lecentrifugáljuk, majd míb-3 mentes táptalajjal mossuk. A sejteket lecentrifugáljuk és háromszor mossuk, hogy biztosítsuk az mlL-3 eltávolítását. A sejteket egy hemacítométerrel számláljuk meg, A sejteket 96-lukas formában széles2tjük ki, Inkánként 5GÖ0 sejtet használva 100 μΐ/luk térfoga tban, az mIL-3 mentes táptalaj használatával,

A BaFSZ zalphall sejtek szaporodását úgy becsüljük meg, hogy aktivált CD3+ szelektált humán T-sejtekböl származó kondicionált táptalajt használunk (lásd az előző, 5C. példát), mlL-3 táptalajjal 50%-os, 25%-os, 12,5 %-os, 5,25%-os, 3,125%os, 1,5%-os, 0,75%-os és ö,375%~os koncentrációra, hígítva., A hígított kondicionált táptalajból 100 μΙ-t adunk a BaF3Zzalphall sejtekhez. Az esszé teljes térfogata 200 pl. Az esszé lemezeit az előző, SB. példában ismertetett módon inkubáljuk és vizsgáljuk meg.

Az eredmények igazolták a BaF3/zalphal 1 sejtek szaporodási válaszát az aktivált CD3+ szelektált humán T~sejt kondicionált táptalajában levő faktor jelenlétére. A válasz a. mérések szerint 50% koncentrációnál körülbelül 10-szer nagyobb, mint a háttér. A nem transzfektált BaF3 sejtek nem szaporodnak az erre a faktorra adott válaszként, jelezve ezzel, hogy ez a faktor a zalphal 1 receptorra specifikus. Emellett, az oldható zalphal 1. receptor blokkolja ezt a szaporodási aktivitást a BaF3/zalphal 1 sejtekben (lásd all, példát).

119 (φ« φ ** * φ

ΦΦΦ φ

X Φ « φ φ * φ φ φφ

6. Példa

A hunián zalphall ligandum klónozása, humán CDS·* szelektált könyvtárból

Primer humán aktivált CD3* szelektált sejt cDNS könyvtár átvizsgálásával kaptunk egy izolált cDNS-t, ami a négy-hélix köteges. citokin család egy új tagja. Ez a cDNS kódolja a zalphal 1 ligandumot, A cDNS-t úgy azonosítjuk, hogy⁷ a zalphal 1. receptor használatával vizsgáljuk a zalpha 11 ligandum aktivitását.

Aj__Vektor a CD3* szelektált könyvtár konstrukciójához

A CDS* szelektált könyvtár konstruálásához használt vektor a p2P7NX. A pZP7NX. vektort az alábbiak szerint állítjuk elő: A p2P7 vektorban levő DHFR szelektív markert Neoí és PstI restrikciós enzimekkel (Boehringer Mannheím) való emésztéssel távolítjuk el, Az emésztett DNS-t 1%-os agaróz gélen futtatjuk, majd kivágjuk, és a QIAGEN Gél Extraeöon Kit (QIAGEN) segítségéve! tisztítjuk, a gyártó utasításai szerint, A Zeooin szelektív marker kódoló régióját reprezentáló DNS fragmenst polímeráz láncreakcióval amplifikáljuk, a ZC13,946-os (25. számú szekvencia) valamint a ZC 13945-ös (26. számú szekvencia) primerek és terápiáiként a pZeoSV2(*l használatával, Van további PstI és Bell restrikciós hasítási hely a ZC 13,946-os (25. számú szekvencia) prímerben, és van további Ncol és Síül hasítási hely a 13»945~ös (26, számú szekvencia) prímerben, A polimeráz láncreakciós fragmenst PstI és Ncol restrikciós enzimekkel hasítjuk,, majd p.ZP7 vektorba klónozzuk, amit ugyanezzel a két enzimmel hasítottunk, majd gélen tisztítottunk. Ennek a vektornak a neve pZP7Z. Ezután eltávolítjuk a Zeoeínt kódoló régiót, a pZP7Z vekDNS-t Bell és Sful restrikciós enzimmel emésztve, Áz

120

S- Φ # emésztett DNS-t 1%-os agaróz gélen futtatjuk, kivágjuk, majd gélen tisztítjuk és a pZem.228 vektorból (letétbe helyezve az American Type Cuiíure Collectíon-nél (ATCC), Manassas, VA; ATCC letéti szám 69446) ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel (Bell és Sfui) kivágott, neonácin rezisztenciát kódoló régiót tartatmazo izem tragmenssei az új vektornak pZFN a jelzése, amiben a DHFR szelekciós marker kódoló régióját egy, a pZem288 vektorból .származó neornicin szelekciós markerrel helyettesítjük. A PZP7N-hez eev eltöltő íragmenst adunk, arai tartalmaz egy suasi er, agarázz.

azzal a céllal, hogy így egy olyan vektort hozzunk létre, ami alkalmas a cDNS nagyon hatékony, irányított klónozására; ennek az új vektornak pZF7NX a jelzése. Ahhoz, hogy a vektort előkészítsük a cDNS-hez 20 gg pZF7NX DNS-t emésztünk. 20 egység EcoRi restrikciós enzimmel {Lile Technologies Gailhersberg, MD) és 20 egység Xhol restrikciós enzimmel (Boehrlnger Mannheim Indianapohs, IN), először 37 °C-on 5 óra hosszat, majd 88 ^cC-on 15 percig. Az emésztett DNS-t: azután 0,8%-os alacsony olvadáspontú 1XTAE agarőz gélen futtatjuk, hogy a kitöltő íragmenst a vektortól. A vektor csíkját kivágjuk és „bétaew England Bioiabs, Beverly, MA) -emésztjük, a gyártó utasításai szerint. Az etanolos kicsapás után az emésztett vektort újra szuszpendáljuk vízben, 45 ng./mi koncentrációban, hogy ligáim lehessen az alábbiakban ismertetett €D3-e sz< cDNS könvvtárral.

B. Primer humán al:

szel szíté se

121 φΧ χφ * Αφ Φ * * «♦» 999

X » >».« »** » Φ* » Φ

9 ♦ '#'« *^κί’ V.

* * X ♦ ♦ ♦ S*

Körülbelül 1,5 χ lö^s primer, íonoraícín/MPA~foan stimulált, humán CD3+ sejteket izolálunk centrifugál ássál., miután 37 Χοή 13 óra hosszat tenyésztettük (5G< példa). Az üledékből osszRNS-t izolálunk, az „Rneasy Midi” kittel (QIAGEN, Inc., Valencia, CA). 225 ag össz-RNS-ből mRNS-t izolálunk, az „MPG mRNS purificatíon kit” (CFG Inc., Lincoln Fark, Nd) felhasználásával.

3,4 pg mRNS-t izolálunk, ezt alakítjuk át kétszálú cDNS-sé, az alábbi eljárás használatával,

A stimulált humán CD3* szelektált sejtekből származó első-szál cDNS-t az alábbiak szerint szintetizáljuk: Összekeverünk, kilenc μΐ, 0,34 pg/μΙ koncentrációjú oligö d(T)szelektált poli(A) CDS + RNS-t és 1,0 pl, 1,0 ug/μΐ első-szál primer! (2018,698, 27, számú szekvencia), ami tartalmaz Xhol restrikciós enzim hasítási helyet, és 4 percig 65 X-on tartjuk, utána jégbehűtjük. első-szál cDNS szintézist 9 pl első-szál puffernek (SxSüFERSCRIPT puffén (Life Technologies), 4 pl 100 mmol/'l ditiotreitol és 2 pl dezoxtoukleotid-trifoszfát oldat, ami 10-10 mmol/1-t tartalmaz a dATP-feől, dFTP-ből, dTTP-ből és 5metil-dCTP-ből (Pharmacia Biotech. Inc.)) az RNS-primer elegyhez való hozzáadásával ínicíáljuk, A reakcióelegyet 45 °C-on inkubáljuk 4 percig, majd 8 pl 200 EZ ml Supersenptll, RNáz Hreverz transzkriptázt (Life Technologies) adunk hozzá. A reakeiőelegyet 45 percig 45 X-on tartjuk, majd 50 ^&C-ra kétpercenként 1 X-szal emelve a hőmérsékletet, és 10 ezen a hőmérsékleten tartjuk. Ahhoz, hogy bármilyen szekunder struktúrát denaturáljunk, és a eDNS~t tovább hosszabbítsuk, a. reakcióelegyet azután 2- percig 70 X-on tartjuk, utána 4 percig 55 °C-cn tartjuk, 2 μΐ Superscriptíl reverz transzkriptázt adunk • ··>·

Φ * χ, »» Φ Φ * φ * φ φ φ φ ♦ φ “Γ * ·♦ hozzá és újabb 15 percig uikubáljuk, végül 1 *C/1 perc sebességgel 70 °C-ra emeljük a hőmérsékletét. A be nem épült nukleopjuk 2 ug glikogén hordozó, 2,0 mol/1 ammóníum-acelát és 2,5 térfogatmi etanol jelenlétében, majd 100 μΐ 70%-os etanolial mossuk. A cDNS-t 98 μ.Ι vízben reszuszpendáljuk a 2. szál szintéziséhez.

A második szál szintézisét az első cDNS szálon hajtjuk végre, olyan körülmények között, amik elősegítik, hogy az első szál megvezes.se a második szál szintézisét, egy DNS hajtű képződését ényezve, A 2, szál szintéziséhez használt reakcióelegy 98 pl eDNS-t, 30 pl 5x polimeráz 1 puffért flÖÖ mmol/1 TRI8HC1 pH=7,S; 500 m.mol/1 KC1, 25 mmol/1 MgCla, 50 mmol/1 (NHüeSCh, 2 pl 100 mmol/1 dltiotreitol, 6 μ.1 oldat, ami 10-10 mmol/1-t tartalmaz az egyes dezoxinukleotid tofoszfái 5 mmol/1 b-NAD, 1 pl 3 E/pl. Esehenchia coll DNS

England Biolafos Inc,} és 4 pl 10 E/ml Esederíchm coli. DNS polimeráz·. I (New England Biolahs Inc.). A reakciőelegyet szobahő mérsékleten rakjuk össze, majd 2 percig szobahőmérsékleten tartjuk, utána 4 pl, 3,8 E/pl RNáz H-t (Life Teehnologiesl adunk hozzá. A reakciőelegyet két óra hosszat 15 °C--on tartjuk, majd 15 percig szobahőmérsékleten tartjuk. 10 pl 1 mol/1 TRISZ-t (pH~7,4) adunk a reaketóelegyhez, majd kétszer extraháljuk fenol / kloroform eleggyel, majd egyszer kloroformmal, a szerves fázist azután vissza-extrahálfuk 50 pl TE-vei (10 mmol/1 TRISZ pH-7,4, 1 mmol/1 EDTA), egyesítjük a másik vizes fázissal, és etanolial kicsapjuk 0,3 mol/1 nátrium-aeetát jelenlétében. Az öle123 .*·♦** * φ.» ** φ < * * * * »«:« ΦΧ* ♦ * :*** X * φ φ βφΛ( Β Φ Λ >

ΦΦ* »♦« * »*' «* déket 100 μΐ 70%-os etanollal mossuk, majd légszárazra szárítjuk és 40 al vízben reszuszpendáljuk.

A hajtű-struktúrájü, egyszálú DNS-t mungőhab nukleázzal hasítjuk. A reakcióelegy 40 μΐ második szál cDNS-t, 5 pl lOx mungóhafo nukleáz puffért (Life Technologies), 5 μΐ mungőbab nukleázt (Pharmacia Blotech. Corp.}, amit 1 E/ml-re hígítunk lx mungóhafo nukleáz pufferben. A reakcíőelegyet 45 percig 37 Όση tartjuk. A reakciót 10 μΐ 1 mol/1 TR1SZ (pH=7,4} hozzáadásával .állítjuk le, majd egymás· után fenol/kloroform eleggyel és kloroformmal extraháljuk, az előzőkben ismertetett módon. Az extrakcíőkat követve a. eDNS-t etanollal kicsapjuk 0,3 mol/1 nátrlum-acetát jelenlétében. Az üledéket 100 μ,Ι 70%-os etanollal mossuk, majd légszárazra szárítjuk és 38 μ! vízben reszuszpendáljuk.

A reszuszpendált cDNS-t T4 DNS polimerázzal torapavégüvé alakítjuk. A eDNS-t, amit 38 μΐ vízben reszuszpendálunk, elegyítjük 12 μΐ 5x T4 DNS polimeráz puíferrel (250 mmol/1 TRIS-BC1 pH~8,.O, 250 mmol/1 kálium-klorid, 25 mmol/1 MgCbh 2 ul 0,1 mol/1 dltíotreítol, 8 ul oldat, and 10»lö mmol/l-t tart máz az egyes dezoxinukleotid trifoszfátokból, és 2 μ! 1 E Z μ DNS polimeráz (Boehrihger Mannheím Corp,). 45 percig 15 O-on tartjuk, majd a reakciót 30 pl TE hozzáadásával leállítjuk, majd egymás· után fenol/kloroform eleggyel és kloroformmal extraaz előzőkben ismerteteti módon. A DNS-t etanollal kicsapjuk 2 μΐ Pellet Falni ™ (Novagen) hordozó és 0,3 mol/1 nátrium-aeétát jelenlétében, majd 11 μΐ vízben szuszpendáljuk.

EcoRl adaptereket ligálunk az előzőkben ismertetett cDNS 5' végeihez, hogy ezzel lehetővé váljon az egy expressziós « *_Λ * * φ * Φ «·** vektorba való klónozás. 11 μΐ cDNS-t és 4 μ! 65 pmol/μΐ EeoRI hemifoszforílezett adaptert (Pharmacia Bíoteeh. Corp.) elegyítünk 4 μΐ 5x ligáz pufferrel (Life Technologies), 2 pl 10 m.mol/1 ATP-vel és 3 pl 1 E z pl T4 DNS ligázzal (Life Technologies), 1 pl lOx ligáié pufferrel (Promega Corp.) es 9 pl vízzel. Az Ix pufferrel végzett extra hígítás célja az, hogy megakadályozzuk a kicsapódást. A reákcióelegyet 9 óra hosszat vízfürdőben inkubáljuk, ezalatt a hőmérsékletet lö C-ről 22 °C~ra emeljük, majd 45 percig 25 °Con tartjuk. A reakciót 15 perces, 68 *C~os inkubálá'ssal állítjuk le.

Alihoz, hogy megkönnyítsük a eDNS irányított klónozását egy expressziős vektorba, a eDNS-t Xhol restrikciós enzimmel emésztjük, így kapunk egy olyan cDNS-ΐ, aminek 5' EeoRI tapadős vége és 3' Xhol tapadás vége van. A eDNS 3 végén levő Xhol restrikciós hasítási helyet korábban építettük be, a ZC18698 (27. számú szekvencia) primer használatával. A restrikciós enzimes emésztést egy olyan reakcióelegyben hajtjuk végre, ami tartalmaz 35 pl, előzőkben ismertetett ligáló elegyet, 6 pl löx H puffért (Boehrínger Mannheim Corp.), 1 pl 2 mg/ml BSA4 (Bíolabs Corpj, 17 pl vizet és 1,0 pl 40 E/pl Xhol restrikciós enzimet {Boehrínger Mannheim).. Az emésztést 37 °C-on 1 óra hosszat végezzük. A reakciót ügy állítjuk le, hogy 15 percig 68 °C~on inkubaijuk, majd etanollal kicsapjuk, az előzőkben ismertetett módon mossuk és szárítjuk, majd 30 pl vízben sznszpendáljnk.

A reszuszpendált eDNS-t 5 percig 65 °C-ou tartjuk, majd jégbehűtjük, 4 pl 5x gélre vivő festéket (Research Geneties Corp.) adunk, hozzá, a cDNS-t 0,8%-os alacsony olvadáspontú agarőz Ix TAE gélre visszük (SEAPtAQÜE GYG™ alacsony olvadáspontú agarőz; FMC Corp.), és elektroforetizáljuk. A szennyező *·*« ♦

φ ·* X

S »· .4 * « » ΧΦ· ♦’ί* adaptereket és a 0,6 kilobázisnál kisebb cBNS-t kivágjuk a gélből· Az elektródokat megfordítjuk, olvasztott agarőzzal töltjük fel a inkákat, a puffért kicseréljük, és a cDNS~f addig elekíroibretizáljuk, ameddig koncentrálódik az kiindulási pont közelében, A koncentrált cDNS-t tartalmazó gélterületet kivágjuk és egy nukroeentrifúga csőbe tesszük, és az agarózt 15 percig 65 °Oon tartva megolvasztjuk. A minta 45 °C-ra való állítása után 2 μί 1 E/μί béta agaráz bet (Biolabs, Inc.) adunk hozzá, majd az eiegyet 90 percig 45 °C-on tartjuk, az agaróz megemésztése céljából· Az inkubálás után 1/10 térfogatnyl 3 m.ol/1 nátriumacetátot adunk a mintához, majd az eiegyet 15 percig jégen tartjuk· A mintát 1400öxg-veI centrifugáljuk 15 percig, szobahőmérsékleten, az emésztetlen agaróz eltávolítása céljából, a eDNSt etanolial kicsapjuk, 70%-os etanolial mossuk, levegőn szárítjuk, és 40 μΐ vízben reszuszpendáljuk.

Ahhoz, hogy meghatározzuk. a cDNS-nek a vektorhoz viszonyított optimális arányát, számos különböző ligáié reakcióelegyet állítunk össze és eiektroporálunk. Röviden, 2 td 5x T4 ligáz puffért (Life Technologies), 1 μί 16 mmol/l ATF~t, 1 uh EcoR.l~Xh.oI restrikciós enzimekkel emésztett pZP7NX DNS~t, 1 μΐ T4 DNS ligázt (vízzel 0,25 B/μί-re, 10 μί térfogatra hígított DNS ligáz (Life Technologies)), és 05, 1,2 vagy 3 μ.Ι cDNS-t keverünk össze 4 különböző Iígálásban, ezeket 4 óra hosszat 22 °C-on tartjuk, maid 26 percig 68 °€~on tartjuk, nátrium-acélát - etanol eleggyel kicsapjuk, mossuk, majd megszárítjuk és 10 μΐ vízben reszuszpendáljuk. Az egyes Ügálásokból egyetlen míkroliterf dektroporálünk 40 al D.H.löb ElectroMax™ elektrokompetens baktériumokba (Life Technologies), 0,1 cm-es küvettákat és egy Genepnlser, pulse controller™ (Bíorad) használatával, amit 2,5

126 ' Λ *¹·.· * 0 **

Φ ♦ *χ· Φ kV, 251 μΕ, 200 ohm értékeket beállítva használunk. Ezeket a •sejteket azonnal reszuszpendáljuk 1 ml SOC táptalajban. (Sambrook és mtsai: Molecular Cloning; A Lahoratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)1, majd 50 μΐ 50% glicerin-SGC-t adunk, hozzá konzerválószerként. Ezeket a „glicerines törzsoldatokaF több alikvof részre osztva -70 ®C-on tároljuk. Mindegyikből egy-egy alíkvot részt megolvasztunk, majd sorozathigításban 100 pg/ml amplcíllint tartalmazó LB agarlemezekre szélesztjük. A telepszámok azt. mutatták, hogy a. CD3+ cDNS-nek a pZP7NX vektorhoz viszonyított optimális aránya 1 ml (.45 ng): egy ilyen ligálás 4,5 millió primer telepet eredményez.

Ennek a könyvtárnak szűrővizsgálatához, amihez BaF3zaíphall alapú szaporodási esszét (5. Példa) használunk, az előzőkben említett glicerines törzsoldatokat hígítjuk 100-250 klón per pool folyékony természetekbe, mélylukas mikrotiter lemezeken, majd 24 óra hosszat 37 °C«on szaporítjuk, és a plazmidot. egy QIAGEN kittel izoláljuk, a gyártó utasításai szerint. Az ilyen DNS-t ezt követően BHK .sejtekbe transzfektáljuk, táptalaj: kondicionálás 72 óra hosszat, majd 5K BaF3-zalphaI 1 sejtekre tesszük 72 órára, majd a szaporodást egy ,Alamar felue” fluoreszcencia esszével becsüljük meg (5B. és 2B. példák).

A könyvtár szekréciós csapda klónozással való átvizsgálásához a könyvtárnak egy komplex, araplífíkált formájára van szükség, hogy transzfektáljuk a CÖS-7 sejteket. Körülbelül 4,8 millió kiónt széleszíünk 11 ö db 1.5 cm-es LB agar lemezre, amik 100 pg/ml ampícillint és 10 pg/ml meticlllínt tartalmaznak. Miután a lemezeket éjszakán át 37 ^öC-on ínkubáltuk, a baktériumokat lekaparva .gyűjtjük össze. A plazmld DNS-t. Nucleobondφ* giga™ .((Clonfech, Palo AIto, CA) felhasználásával, a gyártó utasításai szerint. Ezt a plazmidot használjuk azután COS-7 sejtek transzféktálására (A.TCC No. CRL 1851) lemezeken, majd az alábbiakban ismertetett szekréciós csapda technikával átvizsgáljuk (12. Példa).

7. Példa

A humán zalphal 1 lígandum expressziás klónozása

Az aktíváit humán CD3a szelektált sejt könyvtár glicerines törzsoldatát (8. Példa) hozzáadjuk Super Broth™-h.ez {Becton

Dicklnson, Cockeysville, MD), ami 0,1 mg/ml ampícillínt (amp) tartalmaz, 250 sejtet oltva 800 mlkroliterbc. Hagyjuk, hogy az

Escbebdua co« 24 óra hosszat szobahőmérsékleten ekvilibrálódjon. Az inokulálás időpontjában 400 ralkroíitert teszünk LB+amp lemezekre, hogy meghatározzuk az inokulálás aktuális literét, 24 éra elteltével a lemezeket megszámláljuk, majd a SuperBrothll™ végkoncentráciőját úgy állítjuk he, a végkoncentráció 250 sejt per 1,2 ml legyen. Háromszor két litert ihokulátunk, összesen hat literhez, A táptalajokat azután 98 lukas mély blokkokba (QIAGEN) tesszük, A beoltást 8 csatornás Q-Pill diszpenzerrel (Genetix, Chrístchurch, Dorset, UK) hajtjuk végre. Az Escheríchfo. cok-t éjszakán át 37 °C-on rázatjuk, 250 per perc fordulatszámmal, -egy New Brunswick Seienfific Innova 4900 többrázóhelyes rázóberendezésben. Az Eschehehiu coliakat azután leeentrifugáljuk (300 per perc fordulatszám., Beckman GS-6KR centrifuga). Ezeket, az Eöchehcütó coli üledékeket azután 20 C-ra fagyasztjuk, vagy' frissen felhasználjuk a. plazmld DNS miniprep módszerrel való előállítása előtt. Mindegyik üledék körülbelül : 28

250 eDNS klőnt tartalmaz· a humán CD3+ szelektált sejt könyvtárból.

Ezeket a 250 eDNS kiónt tartalmazó pool-okat azután miniprep eljárásnak vetjük alá, QIAprep™ Turbo Miniprep kit (QiAGEN) felhasználásával. A plazmíd DNS-t azután eluáljuk, 125 ul TE felhasználásával (10 mmol/1 TRXSZ pH«8, 1 mmol/1

EDTA). Azután ezt a plazmád DNS-t használjuk BHK sejtek transzfektálásár a..

A BHK sejteket 98 lukas szövettenyésztő lemezekre szé1 észtjük, 12000 sejt per luk sűrűségben, 100 s,d-ben, A tenyésztő közeg DMEM (Glbco BEL), 5% hővel inaktiváll borjűmagzat szérum, .2 mmol/l L-glutamin (Glbco BRL), IX PSN (Glbco BRL), 1 mmol/1 nátrium-piruvát (Glbco BRL).

A kővetkező napon a BHK sejteket egyszer mossuk 100 μΐ SEA-vah Az SEA szérummentes táptalaj, ami DMEM/F12 (Glbco BRL), 2 mmol/1 GlutaMax™ (Glbco BRL), 1 mmol/1 nátriumpiruvát, 10 pg/ml transzferré, 5 ug/ml inzulin, 10 pg/nd fetuin, ug/ml szelén, 25 mmol/1 HEPES (Glbco BRL), 100 μπιοί./ΐ nemesszenciális amíhosavak (Glbco BRL).

DNS/Lípofectamine™ keveréket készítünk az alábbiak szerint: 2,2 pl Lípoíeetamine™ reagenst (Glbco BRL) kombinálunk 102,8 ul SFA-val szobahőmérsékleten; körülbelül 5 pl plazmid DNS-t (200 ng/μΐ) adunk a .Lipofectamée™/SFA-hoz, így kapjuk a DNS/Lípoíeetamine™ keveréket, amit azután 30 percig szobahőmérsékleten ínkubálunk, Az SFA-f eltávolítjuk a BHK sejtekből. és a sejteket 50 μΐ DNS/Ltpofectanune™ keverékkel ínkubáljuk 5 óra hosszat, 37 *C-on, 5% COa-t tartalmazó atmoszfé129 rábait. A DNS/Lipofectamine™ keverékből 50 μΐ-t. adunk a BHK sejtek két-két Inkához.

'Miután a BHK sejteket 5 óra hosszat mkubáltuk a

DNS/Lipofectamíne™ keverékkel, a DNS/Lipofectaminé™ keveréket eltávolítjuk, és 100 pl tenyésztő táptalajt adunk hozzá. A sejteket éjszakán át inkuháljuk, a közeget, eltávolítjuk, és 100 pl tenyésztő táptalajjal helyettesítjük. A sejteket 72 óra hosszat tenyésztjük, majd -a kondicionált táptalajt eltávolítjuk, minimum 20 percre -80 Tbra fagyasztjuk, megolvasztjuk, majd 50 μΙ-t meg a za a .1.

Sí

S3

2Β. és 5. példát), hogy azonosítsuk a ligandum aktivitással rendelkező 250 klóm tartalmazó pool-okat.

98 .lukas lemezt vizsgálunk át egyetlen esszében. Ez körülbelül 250 cDNS/luk, vagy összesen 840000 cDNS. Ezek közül 54 lukból származó kondicionált táptalaj (amik íukanként 250 cDNS-t reprezentálnak.) bizonyult pozitívnak a szaporodási vizsgálatban. Az ezekből a pozitív pool-okból származó kondicionált táptalajokat újra vizsgáljuk egy második esszében (szekréciós csapda), az oldható receptorral vagy anélkül (12, Példa), A zalphal 1CEE oldható receptort (10A. példa) használjuk körülbelül 1 pg/ml végkoncentrációban. Mind az 54 pozitív pool esetében lényegében a teljes aktivitás neutralizálodik az oldható zalphal I receptor hozzáadásával, jelezve, hogy ezek a pool-ok tartalmaznak zalphal 1 ligandum cDNS-t. Ezek közül a pozitív pool-ok közül négyet választottunk ki, hogy egyedi cDNS-eket izoláljunk belőlük, amik a zalphall ligandumot kódolják. Ezeknek a jelölése 45C5, 48G11, 40H12 és 60A1.

Mind a 4 pool-hól 1 μ! DNS-t .használunk ElectroMax™ ΌΗ10Β sejtek (Gibco BRL) transzformálására elektroporáclóval. A

130

transzformánsokat LB-i-amp flöö ug/mlj + methíciliin (IÖ ug/mll lemezekre szétosztjuk, hogy különálló telepeket kapjunk. Mindegyik elektroporált pool esetében 960 egyedülálló telepet izolálunk fógpiszkálőval, és 96-Iukas .lemezekre visszük, amik Inkánként 1,2 ml SuperBrothH™-et tartalmaznak. Ezeknek a lemezeknek a sorszáma #1-10 mindegyik szétbontott pool esetében Í45C5, 48G11, 4Ö.HI2 és 80A1), Ezeket éjszakán át tenyésztjük, és a plazmid DNS-t az előzőkben említett módon míníprep módszerrel izoláljuk. A 46G11, 40.H12 és 80A1 esetében a. szétbontott, lemezekről származó plazmid DNS-t az előzőkben, említett módon BHK sejtekbe transzfektáljnk.

A. 45C4 esetében egy „fást track” protokollt használunk a zalpha II ligandum cDNS azonosításának felgyorsítására, A BHK sejteket a lebontott lemezekről származó plazmid DNS-sel transzfektáljuk, az előzőkben ismertetett módon, a. DNS/Lii ne™ keveréket, ötórás inkubálás után eltávolítjuk, táptalajt adunk hozzá. Mivel a transzfekciókat két párhuzamosban. hajtottuk végre, a tenyésztő táptalajt a következő napon, 24 óra elteltével kinyerjük az egyik transzfektált BHK lemezről, majd a megmaradt lemezről a következő napon, 48 óra elteltével izoláljuk. A 24 őrás kondicionált táptalajt az előzőkben ismertetett módon vizsgáljuk a zalphall ligandum aktivitás szempontjából, az Itt ismertetett, szaporodási esszé használatával.

Plazmid DNS-t pool-ózunk a 45CS #1-4 lebontott lemezről, és vizsgáljuk a zalpha 11 oldható receptor kötődését a ligandumához, a „szekréciós csapda” protokoll alkalmazásával (lásd alább, a 12. példát), Nyolc pozitív kiónt azonosítottunk Összesen 384 szekvenciából. A szaporodási esszé eredményei igazolták a zalpha 11 ligandum aktivitását, és korrelálnak a szekréciós

Φ XX csapda esszével flásd 12. Példa), Ezzel egyldőben a 45C5 #1~4 lebontott lemezről származó, miniprep eljárással kapott plazmid DNS-i: sxekvenáljuk, hogy meghatározzuk mind a 384 klón DNS szekvenciáját.

Számos, a szaporodási és szekréciós csapda esszében pozitívnak bizonyult kiónt is szekvenálnnk, az alábbi primerek használatával: ZC 14,083 (28. számú szekvencia), 2C7,764a (38, számú szekvencia), ZC7,764b (39. számú szekvencia), 2022,034 (40, számú szekvencia) és ZC.22,035 (41. számú szekvencia). A zalphal 1 lígandum polinukleotíd szekvenciája teljes hosszúságú (1. számú szekvencia), az ennek megfelelő aminosav szekvenciát is bemutatjuk (2, számú szekvencia).

oldható receptorokat azaz	a zalphall ICEE-t. a z<	dohai 1
ICFLG-t, a zalphall 111	dlS-t és a zalphal l~Fc4-s	ű. exp-
resszálíák
& Δ t -n ___ -O.. A A	.IphalICFLG-t és a zalphal	ICHiS-t
tartalmazó zalphal 1 emlős e	xpressziós vektorok készítése

Expressziós vektort .készítünk az zalphal 1 tó, extraeelluláris doménjének, a pC4zaIphaI ICEE expresszálására, aholis a konstrukciót úgy tervezzük meg, hogy a zalphal 1 polipeptíd tartalmazza az előre megjósolt ínieláló metionínt és a megjósolt szomszédos transzmembrán dornenre legyen csonkítva, egy C-termináiis Glu-Glu jelöléssel (41, számú szekvencia).

Egy 700 bázispár méretű, polimeráz láncreakcióval generált .zalphall DNS fragmenst állítunk elő, a ZC 19,931 (42. számú

132

Φ ♦szekvencia) és a ZC 19,.932- (43. számú szekvencia) oligonuklcotídot használva primőrként, ezzel Asp718 és BamHI restrikciós hasítási helyeket adva hozzá, Templátként a zalphal 1 receptor cDNS-t tartalmazó plazmldot használjuk. A zalpha 11 fragmens pollmeráz- láncreakciós amplifikálását az alábbiak szerint hajtjuk végre: Huszonöt ciklusban 94 C 0,5 percig, 5 ciklus 94 ^aC 10 másodpercig, 50 °C 30 másodpercig, 68 °C 45 másodpercig, majd 4 °C-on állni hagyjuk. A reakcíóeiegyet fenol/kloroform extrákdóval és- fenoios ki-csapással tisztítjuk, majd Asp718 és BamHI (Gibco BRL) restrikciós endonukleázökkal emésztjük, a gyártó utasításai szerint, A várt méretű (700 bp) csíkot kapjuk, amit 1%-os agaróz gél elektrofcrézissel teszünk láthatóvá, majd kivágjuk, és a Qíaexll™ tisztítási rendszerrel (QIAGEN) tisztítjuk, a gyártó utasításai szerint.

A kivágott DNS-t a pC4EE plazmidba szubklónozzuk, amit előzőleg BamHI és Asp7l8 restrikciós enzimekkel emésztettünk., A pC4zaiphal 1CE expressziós vektor a természetes zalpha 11 s-zignáipeptidet használja, és a Gin- Glu jelölést (41, számú szekvencia) a zalpha l 1 polípeptidet kódoló polmnkleöüd szekvencia C-terminálisához kapcsolja. A pC4EE egy emlős expressziós vektor, ami egy olyan expressziős kazettát tartalmaz, ami tartalmazza a metallotionein-l promotert, több restrikciós hasítási helyet a kódoló szekvenciák inszerdájához, egy stopkodont és egy humán növekedési hormon terminátort A plazmidban van egy Esehenchía coll replikácíós origó, egy SV4Ö promoterrek fckozóval és replikácíós origóval rendelkező emlős -szelekciós markor expressziós egységgel, egy DHFR génnel és az SV4Ö términátorral.

φφ * *

133

A restrikciós enzimmel emésztett zalphai 1 inszerthől körülbelül 30 ng-ot és az emésztett vektorból körülbelül 12 ng-ot éjszakán át 16 *C-on kgálunk. Az egyes ligálási reakcióélegyekfeől egy-egy mikroiitert egymástól függetlenül elektroporálunk

DH10B kompetens sejtekbe (GIBCO BRL·, Gaíthersburg, MD). a gyártó utasításai szerint, majd 5-0 mg/ml ampiclllint tartalmazó LB lemezekre szélesítjük, és éjszakán át inkubáljuk. Áz egyes telepekből készített 2 ml-es folyadék -tenyészetből származó DNS restrikciós enzimes elemzésével vizsgáljuk át, A pozitív kiónok ínszert szekvenciáját szekvencia-elemzéssel igazoljuk. Nagymennyiségű plazmid készítményt állítunk elő a Q1AGBN® Maxi prep kittel (QIAGENk a gyártó utasításai szerint.

Ugyanazt az eljárást használjuk a C-terminális his jelölést (ami hat His csoportot tartalmaz -egymás után), és egy C-tcrmínáiis ílag-et (49, számú szekvencia) tartalmazó, oldható zalphall receptorok, -a zalphai icrLAU előállítására. Ezeknek a konstrukcióknak az előállításához az előzőkben említett vektor vagy a HIS, vagy a FLAG® jelölést tartalmazza a giu-glu jelölés h elye tt (41. számú szekvencia).

B. A zalphai 1 - Fc oldható zalphai 1 receptor emlős expressziős vektor konstrukció

Egy zalphai l~et kódoló polinukleotidoi, vagy annak egy részét tartalmazó expressziós plazmidot homológ rekombinációval állítunk elő. Egy zalphall cDNS fragmenst polímeráz láncreakcióval izolálunk, ami tartalmazza a zalphai 1 receptor extracelluláris doménjéből származó polinukleotid. szekvenciát A zalphall fragmens előállításában használt két primer az alábbi: (1) a polímeráz láncreakcióhoz való primerek közé a következők

134 és (2) 40 bázispár .az Fc/ szekvenciák és 17 lárxs aomen 3 végenex való fúzióhoz az Fc-4 tartoznak, 5'~3' irányban: 40 bázispár a vektor határoló szekvenciájából (az ín-szert 5' részek és 17 bázispár, ami a zalpha 11 extracelhiláris dómén 5' végének felel meg (44. számú. szekvenciák ínukleotid szekvenciából {45. számú, ami megfelel a zalpha 11 extracellnszámú szekvencia). A zalphal 1-gyel st hasonló módon, polimeráz láncreakcióval állítjuk elő. Az Fc4 fragmens előállításában használt két primer a következő: :{!.}: egy 5 primer, ami 40 bázispárt tartalmaz. a zalphal 1 extracelluláris dómén 3'* végén levő szekvenciából, és 17 bázispárt tartalmaz az Fc4 5' végéből (47. számú szekvencia); és (2) egy 3 primer, ami 40 bázispárt tartalmaz a vektor szekvenciájából (az inszert 3 része), és 17 bázispárt az Fe4 3' végéből (48. számú szekvencia).

Mindegyik előzőkben említett reakcíőelegy polimeráz láncreakcióval való smplifikálását az alábbiak szerint hajtjuk végre: egy ciklus 94 *C 2 percig; huszonöt ciklus 94 ®C 30 másodpercig, 80 30 másodpercig, 72 °C 60 másodpercig; egy ciklus 72 °C 5 percig; ezt követi egy 4 ^öC-on való állás. Az elemzéshez a 100 pl térfogatú polimeráz láncreakció reakcióelegyből 10 pl-t 0,8%-os LMP agaróz gélen futtatunk (Seaplaque GTG) 1.x TBE pufferben. A polimeráz láncreakció reakeióelegy többi 90 μΙ-ét 5 ul 1 mol/1 nátrium-klorid és 250 μΐ abszolút etanol hozzáadásával kicsapjuk. A használt expressziős vektor a pCZR199 plazmidból származik, és egy emlős expressziős vektor, amiben olyan expressziós kazetta van, ami tartalmazza a citomegalovírus közvetlen korai promoterét, egy konszenzus intront az egér immunglobulin nehéz lánc fókusz variábilis régiójából, több restrikciós hasítási helyet a kódoló szekve ncia inszer tálasához, egy stopkodon t és egy humán növekedési hormon termlnátort Az expressziös vektor tartalmaz egy Esefrehchin coli repiíkációs origót, egy emlős szelekciós markér expressziös egységet, amiben van egy SV40 promoter, fokozó és repiíkációs origó, egy dihidrofolát-reduktáz gént és az 8V40 termlnátort. A használt expressziős vektort a pCZR.199 plazmádból állítjuk: elő, a nietallotíonem promotert a eitornegalovirus közvetlen korai promoterévei helyettesítve.

Kompetens élesztősejtekből (Sacchnroinyces cerevisíoe) 100 ul-t kombinálunk 10 μΐ oldattal, ami körülbelül 1-1 pg-ot tartalmaz a zalphall és az Fc4 ínszertből, valamint tartalmaz 100 ng, Smal restrikciós enzimmel emésztett (BRL) expressziös vektort, majd egy 0,2 cm-es elektroporációs küvettába visszük át, Az élesztő/DNS keveréket elektroporáljuk 0,75 kV feszültséggel (5 kV/cm), „végtelen” ohm mellett, 25 uF-dal. Mindegyik küvettához 600 μΐ, .1,2 mol/1 koncentrációjú szerbitől adunk, majd az élesztőt két 300 μΐ-es alikvot részben két URA-D lemezre szélesztjük, és 30 *C-on inkubáljuk.

Körülbelül 48 órával később az Ura* élesztő transzfermánsókat egyetlen lemezről 1 ml vízben szuszpendálluk, ms röviden centrifugáljuk, az

lsük. A

9.

sejtüledéket 1 ml lizis pufiérben reszuszpendáljuk (2% Triton X100, 1% SDS, 100 mmol/1 nátríum-klorid, 10 mmol/I TRIS pH~8,0, I mmol/1 EDTA). A Kzis-elegyhöl 500 míkrolítert hozzáadjuk egy Eppendorf esőhöz, ami 300 pl savval mosott üveggyöngyöt és 200 al fenol/kloroformot tartalmaz, majd kétszer-háromszor 1 percig vortexeljük, utána 5 percig centrifugáljuk Eppendorf centrifugában, maximális sebességgel. A vizes fázisból 300 míkrolítert friss esőbe teszünk át, maid a DNS-t 600 al

136 etanoM kicsapjuk, utána 10 percig 4 °€-on centrifugáljuk. A

Az elektrokompetens Escherichía coli sejtek (DH10B, Gíbco BRL) transzformációját 0,5-2 ml élesztő DNS készítmémiyel es 40 μΐ DHIÖS sejttel hajtjuk végre. A sejteket elektropulzáljuk (2,0 kV, 25 niF és 400 ohm). Az elektroporáció· után 1 ml SOC-t (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit. MI), 0,5% élesztőkivonatot (Difco), 10 mniol/1 nátrium-kloríd, 2,5 mmol/I kálium-klond, 10 mmol/1

M'gCh, lö mmol/1 MgSO^, 20 mmol/1 glükóz) szélesztünk 250 μ! alikvot részekben négy LB AMP lemezen (LB táptalaj (Lennox), 1,8% Bacto Agár (Difcoi, 100 mg/1 ampieülin).

A zalpha Il-Fc4 megfelelő expresszíós konstrukcióját hordozó egyedi klánokat .restrikciós enzimmel emésztve azonosítjuk,, hogy igazoljuk a zalphal 1-Fc4 ínszert jelenlétét, és hogy igazoljuk, hpgy az egyes DNS szekvenciákat helyesen kapcsoltuk egymáshoz. Nagyobb mennyiségű plazmid DNS~t izolálunk a Qíagen Maxi. Kittel (QIAGEN), a gyártó utasításai szerint.

BHK 570 sejteket (ATCC No. CRL-1G314K 27 átoltás után, 1,2 x IÖ⁶ sejt/luk (hatlukas lemez) koncentrációban szélesztünk

SÖO μΐ szérummentes (SF) Gibco/BRL High. Glucose) (

zal sejteket az előzőkben Ismertetett (lásd például, a 9. példát) al ICEE/CFLG/CHIS-t tartalmazó expresszíós plazmáddal

137 *'♦*'*' * x* φ

φφ * tra.nszfektáljuk, ehhez Lipofectm ™-et (Gibeo BRL) használva szérummentes (SF). DMEM-ben. A zalphal ICEE/CPLG/CHIS-höl három-három mikrogrammot külön-külön 1ÖO :μ! SF DMEM. végtérfogatban hígítunk 1,5 ml-es csövekben. Külön csövekben 15 μΐ Lipoíéetin ™-eí (Gibeo BRL) keverünk össze 100 μΐ SF DMEMmel.. A Lípofectín™ keveréket szobahőmérsékleten 30-45 percig ínkubáljuk, majd a DNS elegyet hozzáadjuk, és körülbelül 10-15 percig hagyjuk ínkubálni szobahőmérsékleten.

A teljes DNS:Lipoíéetin™ elegyet hozzáadjuk a szélesztett sejtekhez, majd egyenletesen eloszlatjuk fölöttük. A sejteket körülbelül 5 őrá hosszat 37 °C-on ínkubáljuk, majd külön 150 mmes MAXI lemezekre visszük át, 30 ml DMEM, 5% borjűmagzat szérum. (FBS) (Hyclone. Logan, UT) végtérfogatban. A lemezeket éjszakán át 37 ^cC~on ínkubáljuk (5% CO2K majd a kővetkező napon az DNS:Lipoíéetin™ elegyet szelekciós táptalajjal helyettesítjük (5% FBS/DMEM 1 gmol/l metotrexáttai,{MTX)).

Körülbelül 10-12 nappal a transzfekció után a lemezeket 10 ml SF DMEM-mei mossuk. A mosó közeget leszívjuk, majd 7,25 ml szérummentes DMEM-mel helyettesítjük. Steril teflonszitákat (Spectrum Medícal Industries, Los Angeles, CA), amiket előre beáztattunk SF DMEM-be, a klonálís sejttelepekre teszünk. Ezután az SF-DMEM-be előre beáztatott steril nitroeelszúrőlapot a szitára tesszük. A nltroeellnlözon levő orientációs jelöléseket: .átvisszük a tenyésztő lemezekre, Á lemezeket azután 5-8 óra hosszai ínkubáljuk 37 *C-on, 5% COa-t tartalmazó inkubátorban.

Az inkubálást követően a szűr olapokat/szitákat eltávolítjuk, majd a közeget leszívjuk, és 1 pmol/l metoirexátoi tartalmazó 0% mel helyettesítjük, A szűrőlapokat 15

A** percig szobahőmérsékleten 10%-os zsírmentes tejpor/Western A puffer oldattal (Western A; 50 mmol/1 TRIS pli~?,4, 5 mmol/1 EDTA, 0,05% NP-40, 150 mmol/1 nátrium-klorid és 0,25% zselatin), rázógépen rázatva blokkoljuk. A szűrölapokat azután egy óra hosszat szobahőmérsékleten anti-Glu-GIu, anti-FLAG® vagy antbHIS ellenanyag-tormaperoxidáz konjugátummal inkubáljuk, 2,5%-os zsírmentes tejpor/Western A pufferben, rázatás közben. A szűrölapokat azután háromszor 10-1.5 percig mossuk szobahőmérsékleten Western A pufferrel. A szűrölapokat ultra ECL reagenssel (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) hívjuk elő, a gyártó utasításai szerint, majd Lumi-Imager-rel (Roche Corp.) tesszük láthatóvá;

A pozitív expressziót mutató klonáhs telepeket mechanikailag izoláljuk 12-lukas lemezekbe, egy ml, 5 urnol/l metotrexátot tartalmazó 5%FCS/DMEM oldatban, majd egybenövésig szaporítjuk. A kondicionált táptalajból vett mintáknak azután SDSFAGE-val és Western biot elemzéssel megvizsgáljuk az expressziős szintjét. Az egyes konstrukciókból a három legmagasabb szintű expressziét mutató kiónt izoláljuk; a háromból kettőt lefagyasztunk (tartalék), és egyet elszaporítunk a mlkoplazma vizsgálathoz és a nagymennyiségben való előállításhoz oltóanyagként.

emlősben

BHK 570 sejteket (ATCC No: CRL-10314) szélesztíuik 10 cm-es szövettenyésztő lemezekre, majd éjszakán át, 37 °C-on, 5% C0₂ atmoszférában, DMEM/FBS táptalajban (DMEM,

Gfbeo/BEL High Glucose Γ⁴ , Gaifhersburg, MD), 5% t #··*·» **

Λ* borjúmagzat szérum (Hycloue, Logan, UT), 1 mmol/1 L-glutamín (JRH Biosciences, Lenexa, KS). 1 mmol/1 nátrium-piruyát (Gibco BRL)) körülbelül 50-70%-os egybenövésig hagyjuk szaporodni. A sejteket azután a zalphall -Fc4-et tartalmazó plazmáddal (lásd például a 8. Példát) transzfektáljuk, npofectamine™-et használva (Gibco BRL), szérummentes (SF) táptalajban ÍDMEM 10 mg./ml transzferrin, 5 mg/ml inzulin, 2 mg./ml fetuin, 1% L-glutamin és 1% nátnum-piruvát). A zalphal I-Fc4-et tartalmazó piazmidot SF táptalajban 15 ml-es csövekben hígítjuk, összesen 640 rnl térfogatban. A Lipofectamine™ keveréket hozzáadjuk a DNS keverékhez, majd körülbelül 30 percig szobahőmérsékleten hagyjuk ínkubálódnt Öt milliliter SF táptalajt adunk a DNSLipofectanime™ Hegyhez, A sejteket egyszer öblítjük 5 ml SF táptalajjal, majd leszívjuk róluk, és a DNS:hípofectamine™ eiegyet hozzáadjuk. A sejteket öt óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk, majd

8,4 ml DMBM/10% FBS, 1% PSN táptalajt adunk minden egyes lemezhez. A lemezeket éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk, majd másnap a DNS:Llpofeetamme™ elegye! friss FS/DMEM táptalajjal helyettesítjük. 2 nappal a transzfekciö után a sejteket a szelekciós táptalajba osztjuk szét (a fenti DMBM/FBS táptalaj, 1 mmol/1 metotrexát (Sigma Chemical Co,, St. Louis, Mo.) hozzáadásával), 150 mm-es lemezeken, 1:10, 1-:20- és 1:50 hígításban. A sejteken levő táptalajt a transzfekciö utáni 5. napon friss szelekciós táptalajjal helyettesítjük. A transzfekciö után körülbelül 10 nappal az egyes transzfekciőkhől származó rezisztens telepek, két 150 mm-es lemezét tripszímzáljuk, majd a sejteket egyesítjük, és egy T-82 lombikba szélesztjük, majd visszük át.

Hö »«»« **-» , <

« ί,» ΐ « '·»% ·» -»♦·» V **

*.:·?· ·*·»·*

: tisztítása ΒΗΕ570 sejtekből tisztítása BHK570-bd!

Hacsak külön nem említjük, akkor minden műveletet 4 °Con hajtunk végre. Az alábbi eljárást alkalmazzuk a C-terminális Glu Glu (BE) jelölést tartalmazó zaiphall polipeptid tisztítására. Harminc liter kondicionált sejttenyészet közeget 1,6 literre fóményítünk egy Amícon S10Y3 spirális töltettel egy ProFlux A30on. Proteáz. Inhibitor oldatot adunk a ΒΉΚ570 sejtekből származó készített, 1,6 liter töményített oldathoz, ami végkoneentrációbao

2,5 mmol/1 etiléndiamín-tetraecetsavat (EDTA, Sigma Chemical Go., St. houis, ΜΌ), 0,003 mmol/1. leupeptínt -«Boehringer Mannhelm, Indianapohs, IN), 0,00.1 mmol/1 pepsztatint (Boehringer Mannheim) és 0,4 mmol/1 Pefabloc-ot (Boehringer Mannhéim) tartalmaz. Az elemzéshez mintákat veszünk, és a fö tömeget -80 ^cC~ra fagyasztjuk, ameddig a tisztítást megkezdjük, A töményített sejttenyészet táptalaj összes célfehérje koncentrációját SDS-PAGE-val és Western biot elemzéssel meghatározzuk (ez utóbbihoz az anti-EE H.RP konjugált ellenanyagot használjuk}.

Egy 10Ö ml-es antí-ΕΕ G-S se oszlopot íkészí leírását lásd az előzőkben) egy Waters AP-5, 5 cm x 10 cm-es üvegoszlopba töltünk. Áz oszlopot áramlással töltjük meg, majd BíoCad Sprint-tél hozzuk egyensúlyba (PerSeptive BíoSystems, Pramingham, MA) pH~4 foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS). A töményített sejttenyészet kondicionált táptalajt megolvasztjuk, 0,2 mikronos szűrőn sterilre szűrjük, pH-ját 7,4-re állítjuk, majd éjszakán át az oszlopra visszük, .1 mi/pere áramlási sebességgel. Az oszlopot 10 oszloptérfogatnyl foszfáttal pufíerelt sóoldattal φ ««# > X 9 * »

·..·'**

Φ* (PBS, ρΗ~7,4} mossuk, majd 5 ml/perc sebességgel dugő-elúcíót hajtunk: végre 200 ml foszfáttal púdereit sóoldattal ípH-6.0). ami (5,5 mg/ml EE pepiidet tartalmaz (Anaspec, San dose, CA}:.. A használt EB pepiid szekvenciája EYMFME (29. számú szekvencia). Az. oszlopot 10 oszloptérfogatnyi foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, majd 5 oszloptérfogat 0,2 mol/1 gliein (pH-3,0) oldattal eluáljuk, A glicinnel eluált oszlop pH-ját 7,0-ra állítjuk 2 oszloptérfogat 5X FBS-sel, majd FBS-sel ípH-7,4) hozzuk egyensúlyba. Ot ml-es frakciókat szedünk a teljes elúeiós kromatográfía során, közben mérjük a 280 nm-es és 215 nm-es elűciőt: az egyesített átfolyó és mosófolyadékot .is megőrizzük és elemezzük. Az EE-polipeptíd elúeiós csúcs frakciókat SDS-PAGE ezüstfestéssel és Western blottal (anti-EE HRP konjugált el nyaggal} elemezzük, hogy tartalmazzák-e megcélzott fehérjét. A számunkra érdekes polipeptid elúeiós frakciókat egyesítjük, majd 60 rnl-ről 5,0 milliliterre koncentráljuk, egy 10000 Dal ionos vágási értékű membrán spin koncentrátorral (Míllípore,

MA), a gyártó utasításai szerint.

Alihoz, hogy a zalphalICEE-t elválasszuk a vele együtt tisztuló fehérjéktől, az egyesített, koncentrált polipeptid elúeiós frakciókat egy POROS HQ-50-re visszük (erős aníoncserélö gyanta a PerSeptive BioSystems-töt Framingham MA), pH.~8,0, Egy 1,0 x 8,0 cm-es oszlopot, töltünk, majd egy BíoCad Sprint-en áramlással töltjük meg. Az oszlopot ellenionnal töltjük, majd 20 mmol/1. TRISZ-szel (pH~3,ö) (trisz-hidroximetíl-ammometáii) hozzuk. egyensúlyba, A mintát 1:13 arányban hígítjuk (hogy csökkentsük a foszfáttal puffereit söoldat ionerősségét), majd 5 ml/ perc sebességgel a POROS HQ oszlopra visszük. Az oszlopot 10 oszloptérfogat 20 mmol/1 TRISZ-szel |pH~8,ö'} mossuk, majd χ # ♦ X » <

142 oszloptérfogat gradienssel (20 mmol/1 TRISZ/1 mol/1 nátríum-kloridj eluáljuk, lö ml /perc sebességgel, 1,5 ml-es frakciókat szedünk a teljes kromatográfiás lépés során, közben mérjük a 280 nrn-es és 215 nm-es elnyelést. Az elűciós csúcsokat SDSPAGE ezüsffestéssel elemezzük. A számunkra érdekes frakciókat egyesítjük,, és 1,5-2 ml-re töményítjük, egy I00ÖÖ Daltonos vágási értékű membrán spin koncentrátorral (Miliipore,. Bedforck MA), a gyártó utasításai szerint.

A zalpha 11CEE polxpeptidnek a szabad EE pepiidtől, és bármilyen szennyező, együtt tisztuló választásához az egyesített frakciókat egy 1 ,5 x 90 crn-es Sephadex S2Ö0 oszlopon (Pharmacia, Piscataway, Nd) kromatografáljuk, amit foszfáttal puffereit sóoldatban hoztunk egyensúlyba és abban töltöttünk meg, 1,0 ml/perc sebességgel, egy BloCad Sprint felhasználásával. A teljes kromatográfiás lépés során 1,5 ml-es frakciókat szedünk, és az elnyelést 280 valamint 215 nmen mérjük. A csúcs-frakciókat SDS-PAGE ezüstfestéssel jellemezzük, majd csak a tiszta frakciókat jellemezzük. Ez a tiszta anyag a tisztított zalphal 1.CEE pofi pepiid.

Ezt a tiszta anyagot végül 4 ml AetiClean Etox (Sterogene) oszlopra visszük, hogy minden visszamaradt endotoxínt eltávolítsa nk. A foszfáttal puffereit sóoldattal egyensúlyba hozott gravitációs oszlopon négyszer bocsátjuk át a mintát, majd az oszlopot egyetlen 3 ml-es foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, amit a .„tisztított” mintával egyesítünk. Az anyagot azután 0,2 mikronos szűrön sterilre szűrjük, majd az alikvot részekre való szétosztásig -80 ^öC-o.n tartjuk.

A Western blottolt, Cooinassie Blu.e-val és ezüsttel festett SDS-PAGE géleken a zalphal 1CEE polípeptid egy fő csík, aminek φ X Λ Φ a látszólagos molekula súlya 5ÖÖ0G Daltön. Ennek a. csíknak a mobilitása ugyanaz, mind redukáló, mind nem-redukálő géleken.

A tisztított anyag fehérje-koncentrációjának meghatározását BCA elemzéssel hajtjuk végre (Pierce, Rockford, ILI majd a fehérjét alikvot részekre osztjuk és saját standard eljárásunk szerint. -80 ®C-on tartjuk. IEF (izoelektromos fókuszáló) géleken a fehérje kevesebb mint 4,5-os FI értékkel fut. A zalphal 1CEE polipeptid koncentrációja 1,0 ing/ml.

Az anti-EE Sepharose készítéséhez 100 ml agytérfogatú Protein-G Sepharose-1 (Pharmacia, Plscataway, NJ) mosunk háromszor 100 ml foszfáttal puffereit sóoldattal, ami 0,02% nátr.1um-azidot tartalmaz, egy 500 ml-es Nalgene 0,45 mikronos szűrőegységet használva. A gélt. 6,0 térfogat 200 mmol/1 trietanolamínnai ípH~8,2) (TEA, Sígma, St. Lous, MO) mossuk, majd azonos térfogatú EE ellenanyag oldatot adunk hozzá., ami 900 mg ellenanyagot tartalmaz. Éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk, majd a niegköteflen ellenanyagot eltávolítjuk, oly módon, hogy a gyantát 5 térfogat 200 mmol/1 TEA-val (leírását lásd az előzőkben) mossuk. A .gyantát 2 térfogai TEA-han reszuszpendáljuk, megfelelő tárolóba visszük át, majd TEA-han oldott dimetilpimtlimídát2HC1-Í (Pierce, Rockford, IL) adunk hozzá a fehérje G-Sepharose gél 36 mg/ml végkoncentrációjában. A gélt szobahőmérsékleten rázatju'k 45 percig, majd a folyadékot eltávolítjuk, az előzőkben ismertetett szűrőegység használatával, A gélen levő aspeeihkus helyeket azután blokkoljuk, oly módon, hogy 10 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk 5 térfogat 20 mmol/1 etanolaminnal, 200 mmol/1 TEA-ban. A gélt azután 5 térfogat foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, ami 0,2% nátrium-azkiot. tartalmaz, majd ebben az oldatban tároljuk 4 *C-on.

» ** ♦ ♦ ο * *

Β. A zalphal 1CFLAG poli

Lid tisztítása zoHa.cs.ak külön nem említjük, akkor minden műveletet 4 °Con hajtunk végre. Az alábbi eljárást használjuk a C-terminális FLAG® (Sigma-Aldrieh Oo.) jelöléseket tartalmazó zalphall polipeptid tisztítására. A kondicionált sejttenyészet táptalajból harminc litert 1,7 literre töményítünk egy Ámieon S10Y3 spirálistöltettel egy ProPlux A3O-on, Proteáz inhibitor oldatot adunk a transzfektált BHK 570 sejtekből származó, 1,7 liter töményített kondicionált sejttenyészet táptalajhoz (lásd a 9, példát), ami végkoncentrációban 2,5 mmol/1 etiléndiamin-tetraecetsavat. (EDTA, Sigma. Chemical Cg., St. Louis, MO), 0-,003 mmol/1 leupeptint .«Boehrínger Mannheím, Indianapolis, ÍN), 0,001 mmol/1 pepsztatint (Boehrínger Mannheím) és 0,4 mmol/1 Pefabloc-ot (Boehrínger Mannheím) tartalmaz. Az elemzéshez mintákat veszünk, és a fő tömeget -80 °C-ra fagyasztjuk, ameddig a tisztítást megkezdjük. A töményített sejttenyészet táptalaj összes célfehérje koncentrációját SDS-PAGE-val és Western biot elemzéssel meghatározzuk (ez utóbbihoz az anti-FLAG® (Kodak) HRF konjugált ellenanyagot használjnk), 125 ml-es anti-FLAG® M2-Agaróz affinitás gélt (Sigma-Aldrich -Co.) töltünk egy Waters AP 5,5x10 cín-es üvegoszlopba. Az oszlopot áramlással töltjük meg, majd BioCad Sprint-tel hozzuk egyensúlyba (PerSeptive BíoSystems., Eramingham, MA) pH~7,4 foszfáttal puffereit sóoldattal (PBS). A töményített sejttenyészet kondicionált táptalaj megolvasztjuk, 0,2 mikronos szűrőn sterilre szűrjük, pH-ját 7,4re állítjuk, majd éjszakán át. az oszlopra visszük, 1 ml/perc áramlási sebességgel. Az oszlopot 10 oszloptérfogatnyi foszfáttal puffereit sóoldaítal (PBS, pH~7,4) mossuk, majd 5 ml/perc seA * Φ »** * * • X Φφφ φ * * * # Φ Φ* ** bességgel dugó-elúciót hajtunk, végre 250 ml foszfáttal pi sóoldattal (pH~6,0), ami 0,5 mg/ml FLAG® pepiidet tartalmaz (Sigma-Aldrich. Co.|. A használt FLAG® peptid szekvenciája DYKDDDDS (37. számú szekvencia). Az oszlopot Lö oszloptérfogat 0,2 mol/1 glícin ípH~3,0i oldattal eluáljuk. A glícinnel eiuált oszlop pH-ját 7,0~ra állítjuk 2 oszloptérfogat. 5X PBS-sel, majd PBS-sel (pH=7,4) hozzuk egyensúlyba, öt ml-es frakciókat szedünk a teljes elúcíós kromat-ográfla során, közben mérjük a

280 nm-es és 215 nm-es elúcíőt; az egyesített átfolyó és mosófolyadékot is megőrizzük és elemezzük. Az FLAG® -polípepelúeiós csúcs frakciókat SDS-PAGE ezüstfestéssel és Western yaggal) elemezzük, 1

.arfalmazzák-e megcélzott fehérjét. A számunkra érdekes pollelúcíós frakciókat egyesítjük, majd 80 inl-ről 12 ;rre koncentráltuk, e&v 10-000 Daltonos vágási értékű membrán spin koncentrátorral (Millipore, Bedford, MA), a gyártó utasításai szerint.

Ahhoz, hogy a zalphal ICFLG-t elválasszuk a vele együtt tisztuló fehérjéktől, az egyesített, koncentrált polipeptíd elúcíós frakciókat egy POROS HQ-50-re visszük (erős anioncserélö gyanta a PerSeptive BioSystems-töl, Framíngham MA), pFl-8,0, Egy 1,0 κ 6,0 cm-es oszlopot töltünk, majd egy BioCad Sprínt-en áramlással töltjük meg. Az oszlopot elleníonnal töltjük, majd 20 mmol/l TRISZ-szel ípH=8,0) (trisz-hidrofomefíl-aminomeián) hozzuk egyensúlyba. A mintát 1:13 arányban hígítjuk (hogy csökkentsük a foszfáttal puffereit sóoldat ionerösségéf, majd 5 ml/perc sebességgel a POROS HQ oszlopra visszük. Az oszlopot 10 oszloptér fogat 20 mmol/l TRISZ-szel ip-H~-3,Ö) mossuk, majd

ΦΦ

146 φφ φ oszloptérfogat gradienssel (20 romol/1 TR1SZ/1 mol/1 nátrium~klorid) eluáijuk, 10 ml/perc sebességgel 1,5 ml-es frakciókat szedünk a teljes kromatográfiás lépés során, közben mérjük a 280 nm-es és 215 nm-es elnyelést. Az elúeiós csúcsokat SDSPAGE ezüs [festéssel elemezzük. A számunkra érdekes frakciókat egyesítjük, és 1,5-2 rn.l-re töményítjük, egy 10000 Daltouos vágási értékű membrán spin. koncentrátorral íMillipore, Bedford, MA), a gyártó utasításai szerint,

A zalphal 1CFLG polipeptidnek a szabad FLAG® pepiidtől, és bármilyen szennyező, együtt tisztuló fehérjétől való elválasztásához az egyesített frakciókat egy 1,5 x 90 em-es Sephadex. S200 oszlopon (Pharmacia, Píscataway, Nd) kromatografáljuk, amit foszfáttal puffereit sóoldatban hoztunk egyensúlyba és abban töltöttünk meg, 1,0 ml/perc sehességgeL egy BioCad Sprint felhasználásával. A teljes kromatográfiás lépés során 1,5 ral-es frakciókat szedünk, és az elnyelést 280 valamint 215 nmen mérjük. A csúcs-frakciókat. SDS-PAGE ezüstfestéssel jellemezzük, majd csak a legtisztább frakciókat jellemezzük. Ez a tiszta anyag a tisztított zalphal 1.CFLG poiipeptld.

Ezt a tiszta anyagot végül 4 ml ActiClean Etox (Sterogene) oszlopra visszük, hogy minden visszamaradt endotoxint eltávolítsunk. A mintát a foszfáttal puffereit sóoldattal egyensúlyba hozott gravitációs oszlopon négyszer bocsátjuk át a mintát, majd az oszlopot, egyetlen 3 ml-es foszíáttal puffereit sóoldattal mossuk, amit a „tisztított mintával egyesítünk. Az anyagot azután 0,2 mikronos szűrőn sterilre szűrjük, majd az alikvot részekre való szétosztásig -80 ^cC-on tartjuk,

A Western bl-ottolt, Coomassie Bhie-val és ezüsttel festett

K.

φφφφ φφ** φ ♦

Φ φ * X * Φ **

X

Φ-* * aminek a látszólagos molekulasúlya 50000 Dalion. Ennek a csíknak a mobilitása ugyanaz, mind redukáló, mind nemredukáló géleken, .A tisztított anyag fehérje-koncentrációjának meghatározását BCA elemzéssel hajtjuk végre ÍHerce, Roekford, IL), majd a fehérjét alíkvot részekre osztjuk és saját standard eljárásunk szerint -80 °C-on tartjuk. IEF (izoelektromos fókuszáló) géleken a fehérje kevesebb mint 4,5-ös Pl értékkel fut, A zalpha 1 polipeptid koncentrációja 1,2 mg/1

C. A zalpha 11CFLAG polipeptid tisztítása BBEö?0-böI

Hacsak külön nem említjük, akkor minden műveletet 4 *C~ on hajtunk végre. Az alábbi eljárást használjuk a humán IgG/Fcvel C-terminális fúziói tartalmazó zalphall polipeptid (zalphallFc4; 8. és 9, Példa) tisztítására. A zalphal!~Pc4~gyel (9. példa) transzíektálf BHK 570 sejtek 12,000 ml kondicionált, táptalaját 0,2 ram-es sterilre szűrő szűrőn szűrjük át, majd proteáz inhibitorokkal egészítjük ki, amiknek végkoncení rációja 0,001 mmol/1 leupeptin ((Boehringer Mannheim, índíanapolis, IN), 0,001 mmol/1 pepsztatín (Boehringer Mannheim) és 0,4 mmol/1 Peíahloc (Boehringer Mannheim). Proton G Sepharose-t (6 ml agytérfogat, Pharmacia Biotech) oszlopot töltünk, majd 500 ml foszfáttal pufiereit söoldattal ÍGibco BRL, Gaifhcrshurg, MD1 mossuk. A kiegészített kondicionált táptalajt átbocsátjuk az oszlopon, 10 ml/perc áramlási sebességgel, majd 1000 ml foszfáttal puffereit sóoldattal (Gíbco BRL, Gaíthersburg, MD) mossuk. A zalpha 11-Pc4~et az oszlopról 0,1 mol/1 gkdnnel (pH~3,5) eluáljuk, majd 2 ml~es frakciókat, szedünk közvetlenül 0,2 ml 2

0XX0 φφφφ * » # «00 000 Φ

Í4S

Φ») » » «φ mol/1 TRISZ-he íp.H~8;0L hogy a frakció végső pH-ját 7,0-ra állítsuk.

Az eluált frakciókat SDS-PAGE-val és Western blattal (amihez anti-h umán Fe (Amersham) ellenanyagokat használunk) jellemezzük. A redukáló SDS-PAGE gélek Western biot elemzése egy 80000 Daltön molekulasűhm immunreaktív fehérjét mutat ki a 2-10-es frakcióban. Az ezüsttel festett SDS-PAGE· gélek is egy 80000 Dalion molekulasúlyú zalphal DFc polipeptidet mutatnak ki a 2-10, frakciókban. A 2-10-es frakciókat egyesítjük.

A tisztított anyag fehérje-koncentrációjának meghatározását BCA elemzéssel hajtjuk végre (Pieree, Rockford, IL), majd a fehérjét, alíkvot részekre osztjuk és saját standard eljárásunk szerint -80 ^eC-on tartjuk. A zalphal ICELG poiipeptid koncentrációja 0,26 mg/ml.

(mutáns) receptorok használata kompétitiv inhlbiciós vizsgálatokban

A BaF3 / zalphal 1 sejteket lecentrifugáljuk és mIL-3 mentes táptalajjal mossuk. A sejteket háromszor lecentrifugáljuk, az mit-8 eltávolítására. A sejteket egy hemaeitom éterrel számláljuk meg. A sejteket. 96-iukas formában szélesztjük 50ÖÖ sejt/luk. mennyiségben, 1ÖÖ pl per luk térfogatban, mit-3 mentes táptaMind a majomlép sejt aktiválásából mind a CD3* szelektált sejtekből származó kondicionált táptalajt (lásd az 5. példát) adunk külön kísérletekben 50%, .25%, 12,5%, 8,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% és 0,375% koncentrációban, 10 μΑ/ml oldható

149

Φ * «-* *** * * « * * Χ*Φ *

X * * #x« ΦΧ* φ’ φ *

Φ Φ*« * *

ΛΑ φ Φ Λ » ? _βφ *» mii receptorokkal (CEE, C~ílag és Fc4 konstrukciók. Lásd a 9« és 10. példát) vagy azok nélkül. A re&kcióelegy térfogata 200 u.L

A vizsgáló lemezeket 3 napig 37 ^öC-on inkubáljuk (5% COs), ekkor 20 μΐ/luk mennyiségben Aiamar Blue-t adunk hozzá (Accumed, Chicago, II), A lemezeket 24 óra hosszat 37 ®C-on inkubáljuk (3% CO2). A lemezeket Fmax™ lemezleolvasóval olvassuk le (Moleeular Devices), az előzőkben Ismertetett módon (2. példa). Az eredmények igazolták, hogy mindegyik oldható zalphal 1 receptor konstrukció 10 pg/'ml koncentrációban teljesen. gátolja a sejtek növekedését, igazolva, hogy az egyes mintákban levő faktor a zalphal! receptorra specifikus,

A bírálási görbéket, az oldható receptorok kihlgítását is az előzőkben említett esszével hajtjuk végre. Mind a zalphal ICEE mind a zalphal 1CFLG oldható zalpha 11 receptor képes teljesen gátolni a növekedést, már 20 ng/ml koncentrációban.. A mutáns zalphal I-Fe4 oldható zalphal 1 receptor csak 1,5 pg/ml koncentrációban hatékonv.

.......<'

12. Példa

Szekréciós csapda esszé

Egy szekréciós csapda esszét használunk a zalphal 1 ligandum cDNS azonosítására. A pozitív DNS poübokat a 7. példában ismertetett expressziós klónozásí erőfeszítésekkel kaptuk.

A 250 kiónt tartalmazó DNS poci-okai BHK sejtekbe transzíektáljuk, 96 lukas formátumban,, majd a kondicionáló táptalajt a szaporodási esszébe visszük be, a 4. és 5. példában ismertetett BaF3/ zalpha 11 sejtek felhasználásával, Számos DNS pool ad po**♦* ****

150

«

Φ Φ X

Φ « χ*φ »φφ« « * ♦* zitív aktivitást, amik meglsmételbetők és semlegesíthetők az oldható zalphal 1 receptorokkal (11, Példa).

A pozitív DNS pool-ok közül az egyiket, a 45C5-Ö1 Cos sejtekbe transzfektáltuk 12 lukas formátumban, az előzőkben ismertetett Lipofectamée™ módszerrel. Ezután egy szekréciós csapda esszét hajtunk végre, oldható zalphall receptorok használatával (C-terminális Glu-Olu jelezve, blotinílezve vagy nem bioünilezve; C-terminális Flag jelölés; vagy Fc4 oldható zalphall receptor fúziók) (9. Példa), hogy vizsgáljuk a közvetlen kötődést a zalphal 1 receptornak, a 45C5 pool-ban levő potenciális lígandum és az oldható zalphal 1 receptor között (lásd az alábbiakban).. Az eredmény pozitív. Ezután a 4505 poci DNS-ét Escherichte cofí-ba elektropor áljuk, majd a különálló telepeket 96-lukas lemezekre visszük. A lemezeket 37 °C-on rázatjuk 24 óra hosszat, majd DNS minipreparátumokat készítünk 96-lukas formátumban, egy TomTech Quadra. 9800 használatával. A plazmid DNS-f azután sorok és oszlopok formájában pool-ozzuk, COS sejtekbe transz-fekiáljuk, majd a pozitív pool-okat az alábbiakban ismertetett módon szekréciós csapdával határozzuk meg.

COS sejt transzfekciók

A COS sejt transzfekciót az alábbiak szerint bájtjuk végre: 3 ul pool-ozolt DNS-t és S ul Llpofecfaminc™-et keverünk össze 92 ul szérummentes DMEM táptalajban (55 mg nátrium-piruvát, 148 mg L-glutamin, 5 mg transzferrin, 2,5 mg inzulin, 1 ug szelén és 5 mg fetuin 500 ml DMEM-hen), .30 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd. 400 ml szérummentes DMEM táptalajhoz adjuk. Ezt az 508 ul-es elegyet i,5xl0^s COS sejthez adjuk egy lukban, 12 lukas lemez használatával, majd 5 óra hosszat 37

151

Φ * « « χ ♦♦ * Φ X φ*φ ΦΦ* °C-on inkubáljuk. 580 μΐ 20%-os FBS DMEM táptalajt adunk hozzá (100 ml FBS, 55 ag nátriurn-piruvát és 146 mg L-glutamin 500 ml DMEM-ben), majd éjszakán át mkubáljuk.

Szekréciós csapda esszé

A szekréciós csapdát a következők szerint hajijuk végre; A közegei foszfáttal puffereit sóoldattal öblítjük le a sejtekről, majd 15 percig foszfáttal puffereit sóoldatban készített 1,8% formaldehiddel fixáljuk. A sejteket azután TNT-vel mossuk (0,2 mol/1 TRIS-HCI, 0,1.5 mol/1 nátrium-klorid és Ö,ÖS% Tween-20 vízben), majd 15 percig foszfáttal pufferelt sóoldatban készített 0/1% Triton-X-szel permeáltatjuk, majd ismét mossuk TNT-vel. A sejteket Ϊ óra hosszat TNB-vel blokkoljuk (0,1 mol/1 TRIS-HCI, 0,15 mol/1 nátrium-klorid és 0,5% blokkoló reagens (New England Nuclear Renalssance TSA-Dírecí Kit) vízben), majd ismét, mossuk TNT-vel. Ha a bíotinilezeti fehérjét használjuk, a sejteket 15 perces ínkubálással blokkoljuk Avídinnel és Biotinnal (Vector Labs), közben TNT-vel mosva. Attól függően, hogy melyik oldható receptort használjuk, a sejteket a következőkkel ínkubá.ljuk 1 óra hosszat: (A) 1-3 pg/ml oldható zalphal 1 receptor zalphal 1-Fc4 fúziós fehérje (10. példa), (B) 3 pg/ml oldható zalphal 1 receptor C-terminális FLAG jelölt, zalphalICFLG (10. példa): (C) 3 pg/ml oldható zalphal 1 receptor C-terminális GluGlu jelölt, zalphal 1C.EE- (10, példa); vagy (D) 3 pg/ml bíotinilezeti oldható zalphal 1 receptor zalphal 1CEE TNB-ben. A sejteket azután TNT-vel mossuk. Attól függően, hogy melyik oldható receptort használjuk, a sejteket a következőkkel inkubáljuk még egy óra hosszat: (A) 1:200 arányban hígított kecske-antl-humán Ig-HRP (Fe specifikus). (B) 1:1000 arányban hígított M2-.HRP; (C)

152

φ. *φ« ♦ * * < *

X* φ«χ ΦΦΧ φ «Φ· ♦ί»

1:1000 arányban hígított anti Glu Glu elkmanyag-HRP; vagy (D) 1 ;300 arányban hígított sztreptavldin-HRP (New England Nnciear kit) TNB-ben. A sejteket ismét TNB-vel mossuk,

A pozitív kötődést hígítást púderben 1:50 arányban hígított íluoreszcein tlramid reagenssel (New England Muelear kit) mutatjuk ki, 4-6 percig inkubáljuk, majd TNT-vel mossuk. A sejteket TNT-ben 1:5 arányban hígított Vectashíeld Mounttng Media-v&I (Vector Labs Burlingame, CA) konzerváljuk. A sejteket FÍTC szűrőlappal tesszük láthatóvá, fluoreszcencia mikroszkóp alatt.

A zalphai 1 ligandum gén kromoszómálís hozzárendelése és elhelyezése

A zalphai 1 ligandumot kódoló gént a 4-es kromoszómára térképeztük, a „Stanford G3 Radiation Hyhrid Mappáig Panel”' kereskedelmi forgalomban beszerezhető verziójával (Research Genetícs, Inc,, Huntsville, AL). A „Stanford G3 Radiation Hyhrid Mappáig Panel’” a teljes humán genomnak mind a 83 radiációs hibrid kiónból tartalmaz DNS-t, plusz tartalmaz kontroll DNSeket Is (az RM donor és az A3 recipiensj.. A bárki számára hozzáférhető WWW szerver (http://shgc-www.stanford.edu) lehetővé teszi a markerek kromoszómálís lokalizálását;

A zalphall ligandum génnek a „Stanford G3 Radiation Hyhrid Mapping Panel” a térképezéséhez .20 sl-es reakcíóelegyeket. állítunk, elő 96 lukas míkrotiter lemezen (Sfralagene, La Jolla, CA) majd egy „RohoCyder Gradíent 96”' PC.R berendezésben használjuk (Stratagene), Mind a 85 polímeráz láncreakció összetétele a következő; 2 μΐ lOx KlenTaq polímeráz láncreakció puífer (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA), 1,6 μΐ dNTP keverék φ * # ♦ *

153 (mindegyik 2,5 mmol/I, Perkto Elmer, Foster City, CA), 1 μ! értelmes primer, ZC22,Ö5O (42. számú szekvencia}, 1 μ.1 antiszensz primer, ZC 22,051 (43, számú szekvencia), 2 pl „Redíload” {Research Genetics, Inc., Huntsvüle, Ah), 0,4 pl 50x Advantage KlenTaq Polymerase Mix (Clontech Laboratories, Faló Alto,

Natúré Genetics DNS az egyes hibrid kiónból vagy a azonos térfogatú ásványolajjal ré tegezzük le, majd lezárjuk. A polimeráz láncreakció körülményei a következők: egyperces induló ciklusban 5 pere denaturálás 9-4 °€-on, 35 ciklusban 45 másodperc denaturálás 94 ^öC-on, 45 másodperc illesztés 60 °Con és 1 perc ES 15- másodperc exíenzió 72 °C~on, majd egy végső hétperces extenzlős ciklus 72 °C~om A reakeióelegyek termékét elektroforézíssel választjuk szét 2%~es agaröz gélen (Life Technologies, Galthershurg, MDL

Az eredmények azt mutatják, hogy a zalphall ligandum génje az SHGC-12342 inierieukin keret marker génhez kapcsolódik, LÓD értéke >12, és 6 cR_10000 távolságra (körülbelül 180 kilobázis) a markertőh A környező markerek használata a zalphall ligandum gént az integrált 4-es kromoszóma térkép 4q27-es régiójába helyezi el (The Genetle Location Datahase, Universiíy of Southhampton), WWW szerver; http; Z Zcedar. ge netics. soton, ac. uk / puhlic Jóim! Z),

1.4. Példa

A. Az egér zalphal 1 ligandum EST szekvenciája

154 * * .

Az adatbázist a humán zalphal 1 ligandum cDNS szekvenciával (1, számú szekvencia) mint szűrővel átvizsgálva egy egér EST-t (EST 1483966) azonosítottunk az egér zalphall ligandum potenciális részleges szekvenciájaként. Az EST 1483966 egy egér genomiális íragmenst reprezentál, amiben egy peptid-szekvencia két potenciális exonból származik, és ez nagy szekvencia azonosságot mutat a humán zalphall ligandum egy pepiid szegmensével (13-as aminosav (Ile) a 80-as aminosavig (Gin) a 2, számú szekvenciában.

B, Az egér maradion cDNS panel polímeráz láncreakciós szűrővizsgálata

Tizenegy' egér Marathon cDNS (Clontech, Faló Alim CA) mintát vizsgálunk át az alábbiakban ismertetett polímeráz láncreakcióval. Az egér marathon cDNS mintákat agyból, hasnyálmirigyből, veséből, méhlepényből, nyálmirigyből, bőrből, herékből, méhbök embrióból és lépszövetből állítjuk elő. Ezeket saját laboratóriumunkban állítjuk eló egy Maradion™ cDNA amplifikáciős kittet (Clontech, Faló Aho, CA) használva, a. gyártó utasításai szerint. Az EST szekvencia alapján két polímeráz láncreakció- prímért, a ZC22,056-ot (44. számú szekvencia) és a ZC22,057~et (45. számú szekvencia) használjuk az egér zalphall ligandum forrás polímeráz láncreakcióval való azonosítására. A polímeráz láncreakció körülményei az alábbiak; 94 °C 2 percig, 35 ciklusban 94 °C 30 másodpercig, 68 °C 2 percig; majd 68 °C 4 percig; végül áztatás 10 X-on. A polímeráz láncreakció- termékeit 1%-os agarőz gélen futtatjuk. Egy erős 150 bázispár méretű csíkot teszünk láthatóvá, ami egy amplífikált cDNS Íragmenst reprezentál. Ez arra utak hogy az egér lép marathon cDNS a

155

V Φ * Φ

Χ*Φ φ * φ

X Λ Φ X*. * **** * * ' ί forrása az egér zalphall ligandum cDNS klónozáshoz. Az egér lép maradion cDNS tartalmaz egy pozitív cDNS-t amit azután szekvencia-elemzéssel úgy azonosítottunk, mint az egér zalphal 1 ligandum részleges cDNS-ét

C, Az egér teljes hosszúsá vegyes szekvenciáját 5~ és

Az egér zalphal 1 ligandum részleges eDNS szekvencia 5 és 3 határoló szekvenciáit 5' és 3' RACE amplifikálással kapjuk meg. Kétfordulós hálós pohmeráz láncreakció amplifikálást végzünk további génspeeifíkus oligonukleotíd primerekkeh azaz a ZC22;205-tel (46. számú szekvencia) és a ZC22,296-tal (47.

számú szekvencia), a ZC22,ÖS6-taI (44. számú szekvencia) és a ZC22,O57-tel (45, számú szekvencia), valamint két adapter oligonukleotid primerrel, a ZC9,739-eel (48. számú szekvencia) és a ZC9,719-cel (49. -számú szekvencia). A pohmeráz láncreakciókat az alábbiak szerint futtatjuk: 94 °C 2 perc; 35 ciklusban 94 °C 30 másodperc, 88 °C 2 perc, majd 88 °C 4 perc; végűi áztatás 10 °C«on. A pohmeráz láncreakció termékeit. 1%-os agaróz gélen futtatjuk, majd egy körülbelül 300 bázispár méretű 5 RACE terméket és egv körülbelül 809 bázíspár méretű 3' RACE terméket azonosíthatunk. Ezeket a fragmenseket Oiaoniek™ gélextrakeíös kittel (QIAGEN) izoláljuk.

A tisztított pohmeráz láncreakció termékeket az alábbi prlmerekkel szekvenáljuk; ZC9,719 (49. számú szekvencia),

ZC22.20S (48, számú szekvencia) és EC22,2Ö6 (47. számú szekvencia). Egy előzetes, vegyes, teljes hosszúságú egér zalphall ligandum szekvenciát azonosítunk az 5' és a 3 “ RACE tragmensek « * « 9

kombinálásával· A teljes hosszúságú egér klőnt az alábbi, 15. példában ismertetett módon Izoláljuk.

tárból

A. Az egér zalpha l 1 ligandum izolálására használt primer rágcsáló forrás

A Balb/C egerekből származó egérlépeket összegyűjtjük, és maratott felületű lemezek között eldörzsöljük, sejtszúszpenzió előállítása céljából. Az izolált primer egérsejtek száma 6,4x10® sejt, az alábbiakban ismertetett szelekció előtt.

A lépsejteket 9,6 ml MACS pufferben szuszpendáljuk (foszfáttal puffereit sóoldat, 0,5% EDTA, 2 mmol/1 EDTA), 1,6 ml sejtszuszpenziót eltávolítunk., és 0,4. ml CD90 (Thyl,2) mlkrogyöngyöt (Miitenyi Bíotee) adunk hozzá. Az elegyet 15 percig 4 AAon inkubáljuk. Ezeket a CD96-nel jelzett sejteket 30 ml MACS pufferrei mossuk, majd 2 ml MACS pufferben reszuszpendáljuk.

Egy VS* oszlopot (Miitenyi) készítünk a gyártó utasításai szerint. A VS* oszlopot azután egy VarioMACS™ mágneses térbe (Miitenyi) tesszük. Az oszlopot 5 ml MACS pufferrel hozzuk egyensúlyba. Az izolált primer egérsejteket azután felvisszük az oszlopra. Hagyjuk, hogy a CD3 negatív sejtek átcsorogjanak az oszlopon. Az oszlopot 9 ml (3x3 ml) MACS pufferrel mossuk. Az oszlopot azután eltávolítjuk a mágnesből, és 15 rnl-es falcon csőbe tesszük, ACD9Ö+ sejteket eluáljuk, 5 ml MACS puffért adva az oszlophoz, és a megkötött sejteket kimossuk, a gyártó által biztosított dugattyút használva erre a célra, A sejteknek a CD90 mágneses gyöngyökkel való ínkubálását, a. mosásokat és a

357

VSv oszlop lépéseket, (inkubálás .az elűción keresztül) még egyszer megismételjük, A két oszlop-elválasztással kapott CD9Ö+ frakciót egyesítjük, A CD90+ szelektált egérlép sejtek őssz-száma 1 χ 10⁸ össz-sejtszám,

A CD90+ szelektált egérsejtek egy részét eltávolítjuk festés és szétválasztás céljából, ehhez egy fluoreszcens ellenanyag sejtosziályozót (FACS) használva, tisztaságuk megbecsülésére. Egy PE-vai konjugált hörcsög anti-egér €D3e ellenanyagot .(PharMíngen)· használunk a festéshez és a CD90+ szelektált sejtek osztályozásához. A CD90-r szelektált egersejtek 93%-a CD3r sejt, sugallva ezzel, hogy a sejtek 93%-a T-scjt.

A rágcsáló CD90+ szelektált sejteket úgy aktiváljuk, hogy éjszakán át 37 *C-on inkuhálunk 3κΙO⁶ sejtet 1 ml RPMI + 5% FBS + l ö ng/ml PMA és 0,5 ug./nil lonomicin (Calbioehem) összetételű oldatban. Az ezekből az aktíváit CD90+ szelektált egérsejtekból származó felülúszőnak vizsgáljuk a zalphal I Ugandám aktivitását, az alábbiakban ismertetett módon. Emellett, az aktivált CD90+ szelektált egérsejteket arra használjuk» hogy egy cDNS könyvtárat készítsünk, az alábbi, 16. példában ismertetett módon.

16. Példa

Egy primer egér aktíváit CD9Ö+ szelektált sejt eDNS könyvtárának átvizsgálásából izoláltunk egy cDNS-t ami a négy-hélíx köteges citokin család egy új tagja. Ez a cDNS a humán zalphal 1 ligandum egér ortológját kódolja, A cDNS-t hibridizációs szűrővizsgálattal azonosítói tűk.

♦ **« φ

158

A, A vektor a CD9ö-f szelektált könyvtár készítéséhez

A pZP7N vektort használjuk a CD3+ szelektált könyvtár készítéséhez (lásd a 6A. példát).

szelektált cDNS könyvtár készítése

Körülbelül I,Sxlö^s primer egér CD9-Ö4- szelektált sejtet, amiket lonomicm/PMA-ban stimuláltunk (15. Példáé centrífuhálással izolállak, Össz-RNS-t izoláltunk a seítüledékhöl, majd a

6B. példában ismertetett módon kétszálú cDNS-sé konvertáljuk. Ezt a DNS-t ezt kővetően BHK sejtekbe transzfektáljuk, a 6B, példában Ismertetett módon, majd a szaporodást egy „Álamat blue” fluoreszcencia esszével (2B. Példa) becsüljük meg.

Ahhoz, hogy a könyvtárat szekréciós csapda klónozással vizsgáljuk át, a könyvtár aniplifikált formájára van szükség a COS-7 sejtek transzfektálására. 4,8 millió klónt szélesztünk 110 darab 15 em-es LB~agar lemezekre, amik 1ÖÖ jxg/ml ampicillrnt, 10 pg/ml methícillint tartalmaznak.. Miután a lemezeket éjszakán át 37 *C-on szaporítottuk, a baktériumokat, letakarással és ülepítéssel gyűjtjük össze. Plazmid DNS-t extrahálunk az ülepített baktériumokból., Nueleobond-giga™ (Clontech, Palo Alto, C.Á) felhasználásával, a .gyártó utasításai szerint.. Ezt a piazmidot azután lemezeken COS-7 sejtek transzfektálására használjuk, majd átvizsgáljuk, az alábbiakban ismertetett szekréciós csapda technika használatával (lásd 17. példa).

C. Az aktivált egér cDNS könyvtár átvizsgálása

159 φ* * *

Φ X Φ

Φ ΦΦΧ φ χ φφφφ X φ _Λ * φ» φφ

Körülbelül 5x10⁵ kiónt szülész tünk 10 LB/Axnp Maxi lemezekre. A te e semlegesítjü d leemeljük, den majd standard eljárások használatával keresztkötéseket hozunk létre (Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Mannal; 2. kiadás, Cold Spríng 1

Harbor, N.Y. (1989)1, A 300 bázispár méretű 5 láncreakció fragmensböl 50· nanogrammot (14. Példa) ³²P~vel jelöljük, a Primedtr Rm'T random primer jelölő kittet használva (Stratagenek A 10 szórólapot ezzel a jelzett próbával hibridizáljuk éjszakán át, 65 ^öC-on, BxpressHyh™ hibridizációs oldatban (Clontech, Faló Aito, CA). A szórólapokat azután 60 °C-on egymás után háromszor mossuk 1 óra hosszat 0,2xSSC (3-0 mmol/1 mátríum-klond, 3 mmol/1 nátrlum-citrát pH~?,0), 0,1% oldattal, majd 1 óra hosszat 65 °C-on.. A szórólapokat éjszaát. -80 °€~on exponáljuk, majd a rontgenfilmet előhívjuk. A pozitív telepeket tartalmazó agardugőkat kivágjuk, és a kiónokat 10 cm-es LB/Axnp lemezekre szélesztjük, A telepekről szórólap lenvomatot készítünk, és az előzőkben ismertetett eljárással blhEgy MUL/pZP7 jelű DNS kiónt izolálunk és szekvenálunk, az alábbi primerek alkalmazásával: 2C 14,063 (50. számú szekvencia}, ZC5,02Ö (51. számú szekvencia}, 2022,421 (52. számú szekvencia}, ZC22,6Ö4 (53. számú szekvencia) és ZC22.641 (54. számú szekvencia). Ennek a kiónnak a polinukleotid szekvenciája teljes hosszúságú egér zaiphall ligandum (55, számú szekvencia), és ez összhangban van az 5^Z és 3' RACE termékekből kapott vegyes szekvenciával. Az egér zaíphal 1 ligandum megfelelő aminosav szekvenciáiét az 56, számú szekvencíavázlaton •60 *♦** ♦ »

Φ * Φ φ 5» * φ ♦ φ

ΛρΛ «Χ

Φ *** φ*«

17. Példa

Az egér zalphall ligandum az oldható humán zalphall receptorhoz kötődik a szekréciós csapda esszében

Az egér MllL/pZP7 klón DNS-ét COS sejtekbe transzfektáljuk, és a zalphal!-Fc4 oldható humán zalphall receptor (10C. példa) kötődését a transzfektálf COS sejtekhez egy szekréciós csapda esszével vizsgáljuk (12, Példa). Az esszé igazolta, hogy az egér zalphal l ligaudum kötődik az oldható humán zalphall receptorhoz.

A COS sejt traaszfekeiőját a 12. példában ismertetett módon hajtjuk végre, 0,7 μ-g MllL/p2P7 DNS 3 μΐ térfogatban való használatával (6. példa).

A szekréciós csapdát a 12. példában Ismertetett módon hajtjuk végre, 1 ug/m.l oldható zalphal 1 receptor Fc4 fúziós fehérjét használva (10C. példa) TNB-ben, és 1:200 hígított kecskeanti-humán Ig-HRP-t (Fc-specifíkus) TNB-ben kimutatható ellenanyagként. Az oldható humán zalphal 1 receptor pozitív kötődését az elkészített fixált sejtekhez a 12. példában ismertetett módon fluoreszcein tyrarnid reagenssel mutatjuk ki. A sejteket a 12, példában ismertetett módon konzerváljuk és tesszük láthatóvá.

A pozitív eredmény azt sugallja, hogy az egér zalphall lígandum kötődik, az oldható humán zalpha 11 receptorhoz,

18. Példa

Az egér zalphal 1 ligandum. expresszióla emlős sejtekben

A, Az Μ11 hz pZP9 expressziös vektor készítése

Expresszíós vektort készítünk az egér zalphall ligandum emlős sejtekben való expresszálásához. Egy 500 bázispár

X «1» X χ.

* X

161 méretű, poíimeráz láncreakcióval generált zalpha 11 ligandum DNS fragmenst hozunk léire a ZC22_s268~as {57, számú szekvencia) és a ZC22,284-es (58, számú szekvencia) oligonukleotídokkal mint poíimeráz láncreakció prímerekkel, hogy amplifikáljuk az egér zalphal 1 ligandum kódoló régióját és Xhoí és Xbal restrikciós hasítási helyeket adjunk hozzá. Az egér MllL/pZP? zalphall ligandum klőnt (16. Példa) használjuk terápiáéként. A poíimeráz láncreakció körülményei az alábbiak: 94 °C két perc, 25 ciklusban 94 ^CC 30 másodperc, 68 °C 2 pere, majd 88 °C 4 pere; végű áztatás lö ^cC-on. A várt (körülbelül 500 bázispár) méretű csíkot 1%-os agaróz gélelektroforézíssel tesszül láthatóvá, majd kivágjuk, és a DNS-t Qiaexfí™ tisztítási rendszerrel (QíAGEN) tisztítjuk, a gyártó utasításai szerint, A tisztított DNS-t Xhol és Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük. (Boehrlnger Mannheim), 37 °C-on, 2 óra hosszat. Azután a DNS-t izoláljuk a gélből, és az előzőkben ismertetett eljárással tisztítjuk.

A kivágott DNS-t a pXF9 plazmádba szubklónozzuk, amit előzőleg Xhol és Xbal restrikciós enzimekkel emésztettünk (Boehrlnger .Mannheim). A pZP9 plazmid egy emlős expressziós vektor, ami tartalmaz égy expressziós kazettát, ami. tartalmazza az egér metallotíoneln-1 (MT-1) proraotert, több restrikciós hasítási helyet a kódoló szekvencia beépítéséhez, és egy humán növekedési hormon termínátort. A plazmidnak van egy Eschertchfa cok replikációs origója, egy emlős szelektív marker expressziós egysége, amiben van egy SV4Ö promoter, fokozó és replikációs origó, egy DHFR gén és az SV4Ö terminátor.

A restrikciós enzimekkel ernésztet egér zalphall ligandum fragrnensből körülbelül 30 ng-ot és az emésztett pZP9 vektorból körülbelül 10 ng-ot ligáknak szobahőmérsékleten, 2 óra hosszat.

* ♦ φ φ φ* «

ÍŐ2

Φ «X φφ φ ♦ * * *** * Φ ΧΦ ”ί· *„

A ligáló reakcióelegybol két μ-g-ot transzformálunk INVaP' kompetens sejtekbe ilnvítrogen), a gyártó utasításai szerint, majd 50 ng/ml amplcillint tartalmazó LB lemezekre, szélesztjük, majd éjszakán át 37 °C-on inkubáljuk. A telepeket restrikciós enzimes emésztéssel átvizsgáljuk (Xhol és Xbal, Boehringer Mannheím.}, amihez az egyedi telepek szuszpenziós tenyészetéből készített DNS-t használjuk, A pozitív kiónok inszert szekvenciájáról szekvencia elemzéssel igazoljuk, hogy egér zalphal 1 ligandum szekvenciák. Nagyméretű plazmid készítményt készítünk egy QíAGEN Maxi prep kittet (QIAGEN), a gyártó utasításai szerint. Az egér zalphal! ligandumot tartalmazó- expressziős vektor jelzése

570 sejteket (ATCC No: CRL-10314) szélesztünk 10 cm-es- szövet tenyésztő lemezekre, majd hagyjuk, hogy éjszakán át, 37 ^öC-on, 3%-os €02 atmoszférában DMEM/FB-S- tápig (DMEM, Gibco BRL Thgh Glueose táptalaj; Gibco Gaithersburg, MD), 5% borjűmagzat szérum (Hyclone, Logan, UT), I mmol/Ι t~glutamm (JRH Bioscieoces, Lenexa, KS), 1 mmol/1 nátrium-piruvát (Gibco BRL)), 20%-os összenövésig szaporodjanak. A sejteket azután az MIlL/pZP9 plazmiddal (18A. példa) transzfektáljuk, egy stabil CaFCU transzfekciós· kit (Stratagene) használatával, a gyártó utasításai szerint.

A. transzfekeio után egy nappal a- sejteket 1:10 és 1-20 arányban kettéosztjuk a szelekciós táptalajba (DMEM/FBS táptalaj, 1 ml metotrexát hozzáadásával (Signia Chemical Co., St. Éouis, MQ)b 150 mm-es lemezeken. A sejteken levő táptalajokat friss szelekciós táptalajjal helyettesítjük a transzfekeio után 5 is:

* φ «φφ φφ* φ

Φ*Α φ XX

XK0 Φ*.«φ χ φ«· ΦΦ * X φ Φ φ * ΧΦΦ φ » * *φφ φ # φ φ

X ΑΦ» Φ* napig. Körülbelül lö nappal a transzfekdő után a rnctotrexát rezísztens telepeket tripszinizáljuk, és a sejteket egyesítjük, majd nagyméretű tenyésztő palackokba tesszük. Amikor a sejtek körülbelül 90%-os összenövésig szaporodtak., foszfáttal puffcrelt sóoldattal háromszor öblítjük, majd szérummentes BSTEP2 kondicionált táptalajjal tenyésztjük. (DMEM (Gibco BRL), 0,11 g/1 nátrium-píruváf, 3,7 g/'l NaHCÖs, 2,5 mg/1 inzulin, 5 mg/1 transzferrin pH~7,0k A kondicionált táptalajt három nappal később összegyűjtjük, majd egy Alamar Biue-t alkalmazó BaF3 szaporodási esszében használjuk (lásd alább, 19. példa).

19. Példa

Az egér zalphal 1 lígandum aktiválta a humán zalphal 1 receptort az Alamar Blue-t használó BaF3 esszében

A BaF3/zalphal 1 sejtek (4. és 5B. példa) szaporodását egér zalpball lígandnmot. expresszáló BHK sejtekből származó szérummentes kondicionált táptalajjal (1.8, példa) becsüljük meg,

A SaF3/zalphal 1 sejteket lecentrifugáljuk, mossuk, majd ml.L-3 mentes táptalajra szélesztjük, az 5B. példában ismertetett dumot expresszáló BHK sejtekből származó szérum mentes kondicionált táptalajjal (18. példa] becsüljük meg. A kondicionált táptalajt mIb-3 mentes táptalajjal 50%-ra, 25%-ra, 12,5%-ra,

6,25%-ra, 3,125%-ra, 1,5%-ra, 0,75%-ra és 0,375%-ra

A szaporodási vizsgálatot az 5B, példában ismertetett módon, hajtjuk végre.

Az eredmények igazolják, hogy a. BaF3/zalpball sejtek szaporodással reagálnak az egér zalphal 1 ligandunira, A válasz

164 nagysága a mérések szerint körülbelül 5~3~szor magasabb, mint az 50%-os háttérszínt

20. Példa

A, A BaP3 / KZ 134 / zalpha 11 sejtvonal készítése

A KZ134 plazmidot a ZC12,749-es· (59. számú szekvencia} és a ZC12,748-as (60. számú szekvencia) komplementer nukleotidokkal hozzuk létre, amik tartalmazzák 4 génből a STAT transzkripciós faktort: kötő elemeket, egy módosított c-fos Sis indukálható elemet (m67SIE, vagy hSTE) (Sadowski, H, és mtsaí: Science 261, 1739-1744 (1993)1, a p21 W.APt génből származó p21 SIE1et {Chili, Y. és mtsai: Science 272, 719-722 (1998)), a β-kazein gén emlőmirigy válasz-elemet (Sehmitt-Ney, M. és mtsaí: Molecular & Cellular Biology IL 3745-3755 (1991)1, és az Fe RÍ gén STAT-tal indukálható etemet (Seidel, H, és mtsai; Proceedings of tbc National Academy of Sciences, USA 92, 30413045 (X99o)}. Ezek az oligonukleotidok tartalmaznak Asp718rompatíbms vegeket, es standard módszerekkel ligaljuk egy befogadó szentjánosbogár riporter vektorba, ami c-fos promotert tartalmaz (Poulsen, L.K. és mtsai: Journal of Bíologícal Cbemistry 273, 8229-6232 (1998)1, és amit az előzőkben említett enzimekkel emésztettünk, valamint tartalmaz egy neonácin szelekciós markért, A KE 134 plazmidot használjuk a BaF3 sejtek stabil transzfektálására.

standard transzfekciós és szelekciós módszerek használatával.

BaF3/K2134 előállítása ί»Χ* « Φ

1Ő5

Egy stabil BaF3/K2134 indikátor sejtvonalat, ami a teljes rali receptort expresszálja, a. 2.A. példában ismertetett módon készítjük el, körülbelül 30 yg, a 3. példában ismertetett zalphall expressziős vektort használva. A kiónokat feiés standard technikákkal szelektáltuk. A klőnokat. íuciferáz esszével vizsgáljuk át (lásd az alábbiakban a 2ÖB. példát) indukálhatószerként a humán zalphall ligandum kondicionált táptalajt használva. A legmagasabb Íuciferáz választ adó (az STAT lúciferázon keresztül), és a legalacsonyabb háttérszintet adó klőnokat választjuk ki. Eav stabil transzfektáns .sejtet szelektálunk. A sejtvonal jelzése BaF3/KZ 134/zalphall.

B. A humán és egér zalphall ligandum aktiválja a humán zalphal 1 receptort a BaF3/KZ 134/zalphal 1 Íuciferáz esszében

A Ba.F3/EZ'134/zalpha 11 sejteket lecentrifugáljuk, majd míh-3 mentes táptalajban mossuk. A sejteket tocentriíh góljuk és háromszor mossuk, hogy eltávolítsuk az mIL-3-at, A sejteket azután egy hemaeitométerreí számláljuk meg. A sejteket 98lukas formában szétosztjuk ki, körülbelül 30000 sejt per luk mennyiségben, Inkánként 100 ul térfogatban, mIk-3 mentes táptalaj használatával. Ugyanazt az eljárást használjuk a nénitranszfektált: BaF3/KZ134 sejtekhez is, amiket kontrollként használunk a következő vizsgálatban,

A BaF3/KZ 134/zalpha 11 sejtek STAT aktiválását az alábbiakból .származó: kondicionált táptalajokkal becsüljük meg: (1) BHK570 sejtek, a humán zalphall ligandummal transzfektálva (7, példa), vagy (21 BKE570 sejtek, az egér zalphall ligandummal transzfektálva. (18, példa), vagy (4) mlL-3 mentes táptalajok, hogy mérjük a csak a táptalaj által adott kontroll választ A < φ - φ kondicionált táptalajt mlL-3 mentes táptalajjal 50%~ra, 25%-ra,

majd a táptalajt leszívjuk, és 25 μΐ lízis puffért (Promega) adunk hozzá, 10 percig szobahőmérsékleten tartjuk, majd a lemezeknek mérjük STAT riporter konstrukció aktiválását, egy luminométérén leolvasva (Labsystems Lumlnoskan, RS modell, ami ötmásodperces integrálásnál 40 μΐ lucíferáz esszé szubsztrátot alkalmaz (Promega).

Az eredmények igazolták, hogy a BaF3/RZ4 34/zalpha!. 1 sejtek a humán zalphal 1 ligandumra STAT riporter választ adnak. A mérések szerint a válasz 50% koncentrációnál körülbelül 50-szer magasabb, mint a táptalaj kontroll. A humán zalphall ligandumra adott STAT aktiválási válasz hiányzott a nem-transzfektéit Ba.F3/E2134 kontroll sejtekből, mutatva, hogy a választ a zalpha 11 receptor befolyásolja.

Az eredmények igazolták a BaP3/EZ 134/zalphal! sejteknek az egér zalphal 1 ligandumra STAT riporter választ is. A mérések szerint a válasz 50% koncentrációnál körülbelül 40szer magasabb, mini a. táptalaj kontroll Emellett az egér zalphall ligandumra adott STAT aktiválás evidens volt (körülbelül ötszörös) a nem-transzfektált BaF/KZl34 kontroll sejteknél

9» Φ

sugallva, hogy a rágcsáló BaF3 -sejtek endogén egér receptorral rendelkezhetnek.

21. Példa

A____A nem-letapadó·, kis- sűrűségű csontvelő sejtek izolálása

Friss egér combcsont csontvelőt 6-10 hetes hím Balb/C vagy C57BL/8 egerekből nyerjük ki. A csontvelőt azután RPMI-s-10% FBS táptalajjal mossuk (JRH, Lenexa KS; Hyelone, bogán UT), majd RFMI+10% FBS-ben szuszpendáljuk, teljes csontvelő sejtszuszpenzíőként. A teljes csontvelő szuszpenziót azután sűrűség-gradiensre visszük (Nycoprep, 1.077, Annnal; Gibco BRL), hogy dúsítsuk az alacsony sűrűségű, leginkább mononukleárís sejteket, az alábbiak szerint: A teljes csontvelő sejtszuszpenziót (körülbelül 8 ml) óvatosan körülbelül 5 ml Nycoprep gradiens oldatra pipettázzuk egy 15 ml-es, kúpos csőben, majd 20 percig 800xg-vel centrifugáljuk. Eltávolítjuk az határréteget, ami az alacsony sűrűségű mononukleáris sejteket tartalmazza, majd mossuk fölöslegben levő RPMUl.0% FBS táptalajjal, és eentriíugálással ülepítjük (400xg, 5-10 perc). Ezt az üledéket RPMI+10% FBS táptalajban resznszpendáljuk, majd egy T-75 lombikba szélesztjük, körülbelül I0⁶ sejt/ml koncentrációban, majd 2 óra hosszat 37 °C-on, 5% COa-t tartalmazó atmoszférában- inkubáljnk, A kapott sejtsznszpenziő nem-letapadó, alacsony sűrűségű (NA LD) csontvelő sejteket tartalmaz.

B. 96-Iukas esszé

NA LD egér csontvelő sejteket 25000-45000 sejt/ml sűrűségben szélesztünk 96-lukas szövettenyésztő lemezeken, RFMD10% FBS s 1 ng/ml egér őssejt faktor fmSCF) íR&D « 0

168 ♦ * 0 * 0 X

0X0 X 0 0. 0 0 X*» « 0 * 0 0> 0 * * * X 0

X*« 0 0 X * «* 00

Systems, Mínneapolís, MN) táptalajban, ami tartalmaz még 5%, az. alábbiakból származó kondicionált táptalajt is: (1) BHK 570 sejtek, amik az egér zalphal I ligandumot expresszálják (18, példák (2; BHK570 sejtek, amik humán zalphall ligandumot expresszálnak: (7. Példa), vagy (3) kontroll BHK 570 sejtek, amik tartalmazzák, a vektort, de egyik ligandumot sem expresszálják. Ezeket a sejteket azután számos különböző eitokín kezelésnek vetjük alá, hogy vizsgáljuk származó hematopoietikus sejtek expanzióját vagy differenciálódását a csontvelőből. A vizsgálathoz a szélesztett NA. LD egér csontvelő sejteket humán interleukin15-nek (ML-15) CR&D Systems) vetjük alá, vagy más cltokinek panelje közül egynek (R&D Systems), A humán lnterleukin-15 vagy más cltokinek sorozathigítását vizsgáljuk kétszeres sorozathígításban, körülbelül 50 ng/ml-töl körülbelül 6025 ng/ml koncentrációig. 8-12 nap elteltével a 96-iukas esszéket Alamar Blueval értékeljük, a sejtszaporodás szempontjából, az 5B. példában ismertetett módon.

C, A 96-lukas NA LD csontvelő vizsgálat eredményei

A mind az egér, mind a humán zalphal 1 ligandumot expresszáió BHK sejtekből származó kondicionált táptalajok szinergíkusan hatnak a humán interleukin-15-tel, hogy elősegítsék az NA. LD egér csontvelőben levő hematopoietikus sejtek egy populációjának expanzióját. A hematopoietikus sejteknek ezt az expanzióját, nem lehetett kimutatni kontroll BHK kondicionált táptalaj plusz humán interleukin-15 kombinációjával. A hematopoietikus sejtek populációja expandált az egér zalphall 11gandurnma.l humán interleukin-15 jelenlétében, és azokat a hematopoietikus sejteket, amik a humán zalphall ligandum ha169

X «♦ ♦ * XX* * χ ♦ Ο * 4 Λ 4 X χ

5» ♦♦♦ 0 χ »«J0 X χ

X ♦ 00 0« * # # χ

0*0 0*0 0. 0 0 010 tására, míerleukin~15 jelenlétében expandálnak, tovább szaporítjuk sejttenyészetben. Ezeket a hematopoíetikus sejteket egy Phyeoerythrin-nel jelzett anti-Pan NK sejt ellenanyaggal festjük (Fharmíngen), áramlási citometria elemzésnek vetjük alá, ami demonstrálja, hogy az expandált sejtek pozitívan festődnek ezzel a természetes ölösejt (NK) markerrel.

Ugyanezt a 96-lukas esszét, futtatjuk friss humán csontvelő sejtekkel (a. Poietic Technologies, Galthersburg, Mp-től vásároltuk). Itt is az a helyzet, hogy az lnterIeukín-15-tel az egér és humán zalphal 1 ligandum expandál egy hematopoieökus sejtpopulációt, ami pozitívan festődlk az NK sejt markerrel, az előzőkben ismertetett ellenanyag használatával.

22. Példa

Konstrukciók humán zalphall ligandum transzgenikns egerek

A, Konstrukció a humán zalphall ligandum expresszálására a májspeeifikns MT-1 promptéiról

Oligonukleotidokat terveztünk, hogy olyan polímeráz láncreakció íragmenst generáljunk, ami tartalmaz egy konszenzus Kozák szekvenciát és a humán zalphall ligandum kódoló régióját. Ezeket az oligonukleoiídokat az 5 végen egy Fsel hasítási hellyel és a 3' végen egy Ásd hasítási hellyel terveztük meg, hogy megkönnyítsük a klónozást ia) a standard transzgenikns vektorunkba, a pMTI2~8~ba, vagy (b) egy límfoid specifikus transzgenikus vektorba, a pKFOSl-be (22B. Példa).

A polímeráz láncreakciókat 2Ö0 ng humán zalphal 1 ligandum templáttal hajtjuk végre (7. Példa), valamint, a ZC22,143-as (61. számú szekvencia) és a ZC22,1.44~es (62. számú szekvencia)

170 * φφ

Φ φ * χ«» φ»β 5 * « β » « χ

ΦΦ » χ « φ » »

φφφ » φ

oligonnkleotidokkat A polimeráz láncreakció körülményei az alábbiak: 95 °C 5 percig, aholis Advantage™ cDNS polimerázt íClontech, Faló Alto, CA) adtunk; 15 ciklusban 95 *C~gh 6(5 másodpercig. 80 °C 80 másodpercig és 72 *€ 90 másodpercig; és 72 ^ÖC 7 percig, A polimeráz láncreakció termékeit agaróz gélélekiroforézisse! választjuk szét, majd QiaQuick™ (QIAGEN) gél extrakciós kittel tisztítjuk. Az izolált 488 bázispár méretű DNS fragmenst Fsel és Ascl restrikciós enzimekkel, emésztjük (Boehringer Mannheim), etanollal kicsapjuk és korábban Fsel és Ascl restrikciós enzimekkel emésztett pMT12~8 plazmidba li~ gáljuk. A pMT12-8 plazmid, amit egy számunkra érdekes gén tra.nszgen.ikus egerek májában és más szöveteiben való expresszióhoz terveztünk, tartalmaz egy expressziós kazettát, amit ázis méretű MT~I 5 DNS és 7 kilobázis méretű MT-1 3'

DNS határol. Az expressziős kazetta tartalmazza az MT~1 promotert, a patkány inzulin II intront, egy polllihkeft, a kívánt klón inszertálásához, valamint a .humán növekedési hormon (hGH) polí A szekvenciáját.

Az egyes ligálási reakeíőelegyekből körülbelül 1-1 mikrolítert elektroporálunk DH10B EleetroMax™ kompetens sejtekbe (Gíbco BRL, Gaíthersburg, MD), a gyártó utasításai szerint, majd 100 pg/ml ampícillint tartalmazó LB lemezekre szélesítjük, és éjszakán át inkubáljuk, A telepeket izoláljuk és 100 ag/ml ampícillint tartalmazó LB táptalajban, szélesztjük. Az izolált klőnokből míníprep DNS-t izolálunk, majd vagy csak BeoRl restrikciós enzimmel, vagy Fsel és Ascl enzimek kombinációjával végzett emésztéssel és azt követő agaróz gélelektrolbrézissel átvizsgáljuk, .hogy tartalmazza-e a humán zalphal 1 ligandum inszeriet. A korrekt pMT-humán zalphal 1 ligandumhől nagymennyiségű * * * * 9

X 9 9 9 « * χ

X * X * * 9 * * ♦ 9 * 9*

DNS-t izolálunk. Elkészítünk egy Saö fragmenst - ami tartalmaz 5' és 3 határoló szekvenciákat, az MT-1 promotert, a patkány inzulin Π in tront, a humán zalphall ligandum cDNS-t és a hGH poli A szekvenciát - hogy megtermékenyített rágcsáló oocitákba juttassuk be mlkroírgekciőzással. Á mikroinfekciózást és a transzgenikus egerek előállítását Hogan. és munkatársai leírása szerint hajtjuk végre (Hogan, B, és mtsai.: Manlpulaílng the Mouse Embryo 2. kiadás, Cold Spring Harbor kaboratory Press NY 0994)1

B, Konstrukció a humán zalphall ligandum expresszálására

Olígonukleotidokat terveztünk, hogy olyan polimeráz láncreakció fragmenst generáljunk, ami tartalmaz egy konszenzus Kozák szekvenciát és a humán zalphall ligandum kódoló régióját. Ezeket: az olígonukleotidokat az 5' végükön egy Esel hasítási hellyel és a 3' végükön egy Ásd hasítási hellyel terveztük, hogy megkönnyítsük a pKFOSl plazmádba, egy timföld-specifikus· transzgenlkus vektorba való klónozást.

A polimeráz láncreakciókat 200 ng humán zalphall ligandum templáttal hajtjuk végre (7. Példa), valamint a 2C22,143-as (61, számú szekvencia) és a Z€22,144-es (62. számú szekvencia) ohgonukieot.idokkal, A polimeráz láncreakció körülményei az alábbiak: 95 °C 5 percig, aholis Advantage™ cDNS polimeráz! (Clontech, Faló Alto, CA) adtunk; 15 ciklusban 95 ^öC~on 60 másodpercig, 60 °C 60 másodpercig és 72 °C 90 másodpercig; és 72 °C 7 percig. A polimeráz láncreakció termékeit agaróz gélelektroforézissei választjuk szét, m •TM extra :eí tiszt

Az izolált 488 bázlspár- méretű DNS * * < -♦ *»

X * X * * *

ΦΦΦ ΦΦ* « V «ΦΦ Φ «

Φ * ΦΚ-?Φ » * φ Φ

ΦΦ. Λ φ φ * * φ * íragmenst Fsel és Ascl restrikciós enzimekkel emésztjük (Boehringer Mannheim), etanollal kicsapjuk és korábban Fsel és Ascl restrikciós enzimekkel emésztett pKFObl plazmádba 11« gáljuk. A pKFOSl transzgenikus vektor a pl()26X vektorból származik (Iritani, B.M, és mtsai: EMBO Journal 16, 7019-7031 (1997)], és tartalmazza a T-sejt specifikus lek proximális promotcrt, a B/T sejt-specifikns immunglobulin μ nehéz- lánc fokozok egy polílínkert a kívánt klón inszer tálasához, valamint egy mutált hGH gént, ami egy inaktív növekedési hormon fehérjét kódol (3* intronokai és egy poliadenilezésí szignált biztosit).

Az egyes ligálási reakcíóelegyekből körülbelül 1 mikrolitert elektroporáiunk, szélesztünk, kiónokat izolálunk, és az előzőkben ismertetett módon, restrikciós emésztéssel vizsgáljuk, hogy tartalmaznak-e humán zalphall ligandumot. A pKFOS 1 -zalphal 1 ligandum egy korrekt klőnját szekvenálással igazoljuk, majd ebből a klánból nagymennyiségű plazmid DNS-t készítünk. Egy Not.I íragmenst készítünk, ami tartalmaz egy lek proximális promotert és immunglobulin μ fokozó! (ΕμΒΟΚ), zalphall ligandum cDNS-t, és a mutált hGH gént, azzal a céllal, hogy megtermékenyített rágcsáló oocítákba juttassuk be mikroínjekcíózással.

23, Példa

Az egér zalphall ligandum szöveti eloszlása

Rágcsáló többszörös szöveti Northern biottokat (Egér, egér embrió (Clontech. Palo Alto, CAlk MB10IÖ, MB1012 (Origene)l vizsgálunk át, hogy meghatározzuk a rágcsáló zalphal l ligandum expresszió szöveti eloszlását. Egy körülbelül 484 bázispár méretű, polimeráz láncreakció eredetű próbát ampiifikálunk, terápiáiként az MllL/pZP7 plazmidok prínierként a ZC22283-as « φ « « «V #

173

X Φ X * Φ ♦

ΦΧΦ ΦΦ* φ χ ΦΦχ. φ * * χ Φ Φ φ φ Φ Φ φ φ

ΦΦ Α > Φ Φ * Φ Φ ΦΦ (57. számú szekvencia) és a 2C2228'4-es (58. számú szekvencia) oligonukleotídot használva. A polímeráz láncreakció aniplifikálást az alábbiak szerint hajtjuk végre: 1 ciklus 94 °C 1 percig; 35 ciklusban 94 ^eC 30 másodpere, 50 °C 30 másodpere és 72 ®C 30 másodpere; majd 1 ciklusban 72 °C 10 percig. A polímeráz láncreakciót agarőz gélelektroforézissel tesszük láthatóvá., és a körülbelül 484 bázispár méretű polímeráz láncreakció terméket Gél Extraction Kit-tel (Q1AGEN) tisztítjuk, a gyártő utasításai szerint, A próbát radioaktív izotóppal jelöljük, a REDIPRIME™ jelző kit (Amersham) használatával, a gyártó utasításai szerint. A próbát egy NUCTRAF™ nyomott oszlopon tisztítjuk (Stratagene). EXPRESSHYB™ (Clontech, Palo Alto, CA) oldatot használunk a prehibridtzáláshöz, valamint a Northern bioitok bíbrídizáló taként is. A hibridizációt éjszakán át 65 °O-on hajtjuk végr cpm/ml jelzett próba használatával, A bioitokat azután három szór mossuk 2x SSC, 0,1% SDS összetételű oldattal., szobahő mérsékleten, majd kétszer mossuk 0,lx SSC és 0,1% SDS összetételű oldattal 55 °C-on. Két, körülbelül 1,2 és 3,5 kilobázis méretű transzkriptumot láthatunk a berekben. A felső transzkríptum csak a csecsemőmirigyben látható.

Egy rágcsáló RNA Master Dót Blot-ot (Clontech, Palo Alto, CA), and különböző szövetekből származó RNS-eket tartalmaz, amiket 8 háztartási génekre normalízáltunk, szintén átvizsgálunk az előzőkben említett próbákkal, az előzőkben ismertetett módon hibridizáltatva. Expresszié a herékben volt látható.

24. Példa

A jelöletlen humán és rágcsáló zaiphall ligandum tisztítása BHK :♦ * X·'

ΦΦ ♦ *

Γ74 φ X Φ X * X ««φ ΦΦ* X φ *Χφ β φ φ ♦ * *· · φ φΧΦ φφ* Φ X* *»

Hacsak külön nem említjük, akkor minden műveletet 4 °C« on hajtunk végre. Az alábbi eljárást használjuk humán és rágcsáló zalphal 1 ligandum tisztítására olyan BHK570' sejtek kondicionált táptalajából, amely sejteket egy olyan, konstrukcióval transzferáltunk, ami vagy a humán zalphall lígandumot (25. példa) vagy az egér zalphall lígandumot. (Ml l.L/pZF9) (18. példa) tartalmazza. A kondicionált táptalajt standard technikákkal töményítjük. A töményített kondicionált táptalajt (CM) 0,45 és 0,22 mikronos szűrökön sterilre szűrjük. A táptalajokat azután alacsony ionerősségre hígítjuk (s 2 mS) Ö,Ö1 mol/1. HEPES-ben (JRH Bioseiences, Lenexa, KS), pH~?,0 értéken. Az alacsony ionerósségre hígított CM-et azután 10x86 mm-es (6 ml) Poros 50 szakán át, 4 mi/perc. sebességgel, egy BioCAD SPRINT íPerceptive BioSystems) használatával. Az oszlopot azután .1.0-20 oszloptéribgatnyl (CV) 0,01 mol/1 HEFES-sel (pH^ 7,0) mossuk, A megkötőit fehérjéket azután lépésekben eluáljuk 0,01 mol/1 HEPES-ben (pH~7,Ö) készített 1 mol/1 nátrium-kloríddal (Mallínekrodt, Párizs, KY), δ ml /perc sebességgel; két. milliliteres frakciókat gyűjtünk a teljes kromatográfía során, és a 280 és a 215 nm-es elnyelést, monitorozzuk, A csúcs elnyelést, adó frakciókat azután biológiai esszével és

SDS-PAGE Sílver-rel (Geno Technology, St. Louís, MO), valamint Coomassie festéssel (Sigma, St. Louís, MO) elemezzük. A csücsök frakcióit egyesítjük, sterilre szűrjük, majd ss.19 mS-re hígítjuk foszfáttal pufferelt .sóoldattal (PBS, Gibco B.RL), pH~7,2-n<

A hígított mintát azután 2 ml/pere sebességgel (egy

SPRINT felhasználásával) visszük egy oldható zalphal 1CFLAG receptort ílöB. példa), vagy az oldható zalpha ll ~Fc4 fúziós recepl?s5 * ♦» * φ φ « φφ* *·♦*·♦ Φ ««<

tort tartalmazó 0,8 milliliteres Poros AL oszlopra (IOC. példa), ami a gyantára van immobilizálva (lásd az alábbiakban). Az oszlopot azután legalább 20 oszlopté-rfogatnyí foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, 10 ml/perc sebességgel. Az oszlopot azután gyorsan eluáljuk 0,1 mol/1 glicin (Aminoaeetic acid; Glycocok Spectrum, Gardena, CA) 600 μΐ-es injekciójával (pH-2,51, 10 ml /perc sebességgel foszfáttal puffereit sóoldatban, egy BioCAD 70-0'E-n. A hatmásodpercenként szedett l ml-es frakciók pH-ját azonnal semlegesre állítjuk 55 pl 2 mol/1 TRISZ-szel (Triszhidrcodinetil-aminometán, EM Science, Gibbstown,· NJ) (p'H~8,8).. A teljes kromatográfia során monitorozzuk a 280 és 215 nm-es elnyelést, A csúcs- elnyelést adó frakciókat, azután biológiai esszével és SDS-PÁGE -Silver-rel (Geno Technology, St. Louis, MO), valamint Coomassie festéssel (Sigma, St, Louis, MO) elemezzük. Az egér zalphal 1 ligandum esetében két csík, az egyik körülbelül 24 kDa, a másik 18 kDa, látható mind az ezüsttel, mind a Coomassie-val festett géleken. A humán zalphall Ugandám esetében, egyetlen 18- kDa méretű csík látható mind az ezüsttel, mind a Coomassie-val festett géleken.

Az oldható humán zalphal 1 receptor poUpcptldek imxnohilizálása

POROS Ah hordozóra

Poros AL oszlopokat készítünk, amik immobikzált zalphallCFLAG oldható .receptort (10B. példa) vagy zalphal I-Fe fúziós oldható receptort. (10C. példa) tartalmaznak. Körülbelül 3 mg zalphallCFLAG oldható receptort és körülbelül 10 pg zalphall-Fc4 fúziós oldható receptort használunk.

műveletet szobahőmérsékleten hajtunk végre, egy BioC/ berendezésen. A POROS- AL közeget tartalmazó, 4,5x50 mm-es ♦ * «φφχ φ >6 9 9 6 V £ »«♦ « «χ# » *

X « »«ί« ♦ < «. χ.

499 *9* ♦ «* «» oszlopot, áramlással töltjük fék 2 mol/1 xxátríum-kloridban, a. gyártó utasításai szerint, Az oszlopot azután 1,1. mol/1 NaaSCWSO mmol/1 nátriumfoszfát (pH~7,2) oldattal hozzuk egyensúlyba. A receptort 4 mg/ml-re töményitjük egy Miöipore 30 MWKO forgatott, loményítöben, majd 1:1 arányban hígítjuk

1.1 mol/1 NaaSO-j/SO mmol/1 nátriumfoszfát <pH~7,2j oldattal. .Az oszlopon 2 ml/perc sebességgel 1.1 mol/1 NazSCb/SO mmol/1 nátriumfoszfát (pH~7₅2) oldatot áramoltatunk át, majd a hígított Ugandámból 100 μΐ-es injekciókat adunk he minden 9 oszloptérfogat után, ameddig elérjük az egyensúlyi telítést vagy az áttörést.- Ezután 62 oszloptérfogatnyl gradienst futtatunk, arai

1.1 mol/1 Na^SCM/SÖ mmol/1 nátriumfoszfát (pH-7,2)-tői 550 mol/1 NasSOWSO mmol/1 nátriumfoszfát fpH~7,2/5 mg/nü nátrium-eianoborhídrid) összetétel között változik. Az oszlopot azután körülbelül 2 óra hosszat, állni hagyjuk, hogy az inunohlllzácíós kémia teljesen lejátszódjon, Az oszlopot azután 0,2 mol/1 TRISZ (pH-?,2)/5 mg/ml nátrium-cianobőrhidrid összetételű oldattal hozzuk egyensúlyba, majd újabb 1 óra hosszat hagyjuk állni, az oszlop lezárása céljából. Végezetül az oszlopot foszfáttal puffereit sóoldat./ 0,2% nátrium-azid -összetételű oldattal hozzuk egyensúlyba, és felhasználásig 4 °C-on tartjuk. A felhasználás előtt az oszlopon elő-elúciőt hajtunk végre 0,1. mol/1 glícinnel, hogy biztosítsuk, hogy az aspeclfíkus fehérjék el vannak távolítva. és az oszlop nem ereszti az immobilizált oldható humán zalphal 1 receptort.

25. Példa.

A humán za'

A. A

□ressziós vektor h

Í77 φφφφ φφφφ χ. >Φ +* φ φ φ φ * * φφχ χ« φ φ χ «»«♦ χ φ

Φ φ φφχφ φ φ « * φφ φ φ * φ φ φφ ·φφ

Egy zalphall ligandumot kódoló poiinukleotídot, vagy annak egy részét tartalmazó expressziós plazmidot homológ rekombinációval állítunk elő. Egy zalpha 11 ligandum cDNS fragmenst polímeráz· láncreakcióval izolálunk. A zalphall ligandum fragmens előállításában használt polímeráz láncreakcióban a két primer az alábbi; CD A ZC22,052 -es (64. számú szekvencia) primer, ami 40 bázispárt tartalmaz a vektor határoló szekvenciájából, és 17 bázispárt tartalmaz ami a zalpha 11 ligandum Ctermínálisának felel meg; és (2) a ZC22.053-as (65. számú szekvencia) primer, ami 40 bázispárt; tartalmaz a határoló vektor szekvenciának megfelelő 3' végből, és 17 bázispárt tartalmaz a humán zalphai I ligandum C-terminálisából. A polímeráz láncreakcióval való amplifíkálást az alábbiak szerint hajtjuk végre·. egy ciklus 04 ^eC 2 percig; huszonöt ciklus 94 °C 30 .másodpercig, 60 °C 30 másodpercig, 72 ^eC 60 másodpercig; egy ciklus 7:2 ^CC 5 percig; ezt követi egy 4 ^cC-on való állás. Az elemzéshez a 100 μί térfogatú polímeráz láncreakció reakcióé légyből 10 μΐ-t 0,8%-os LMP agaróz gélen futtatunk (Seaplaque GTG) Ix TBE pufferhen. A polímeráz láncreakció reakcíóelegy többi 90 al-ét 5 μΐ 1 moi/1 nátrium-kloríd és 250 μΐ abszolút etanoí hozzáadásával kicsapjuk, hogy az előzőkben ismertetett pZMPll befogadó vektorba való rekouibmáláshoz használjuk. A befogadó pZMPi 1 plazmidot előzőleg Smal restrikciós enzimmel emésztjük.

A pZMPi 1 plazmid az itt ismertetett (lásd 8.

plazmidből származik, A pZCR199 plazmid egy emlős expressziós vektor, amiben olyan expressziós kazetta van, ami tartalmazza a citomegalovirus közvetlen korai promoterét, egy konszenzus latron! az egér immunglobulin nehéz lánc lókusz va~ «φφ

178 * Φ φΤ * φ φ «φφ

Φ*« φ χ φ V Φ φ *Φ φβ* riábílis régiójából, több restrikciós hasítást helyet a kódoló szekvencia inszer tálasához, egy s topkodon t és egy humán növekedési hormon terminátort. Az expressziós vektor tartalmaz egy Esehenchía coK replikáeiős origót, egy emlős szelekciós markor expressziős egységet, amiben van egy SV4Ö promoter, fokozó és replikáeiős origó, egy dihidrofolát-rednktáz gént és az SV4Ö terminátort. A pZMPl 1 vektort a. pCZR.l99 plazmádból állítjuk elő, a meiallotionein promoter t a citomegalovirus közvetlen korai promoterével helyettesítve, valamint tartalmaz Kozák szekvenciákat a nyitott leolvasási keret 5' végén.

Kompetens éiesztősejtekből (Sacchurompees cerevtside) 100

μ.]-1 k al ann

Pg-ot tartalmaz a humán zalphall ligandum inszerfbői és az Fc4 mszertből, valamint. tartalmaz 100 ng, Smaf restrikciós enzimmel emésztett pZMPl 1 vektort, majd egy 0,2 cm-es eiektroporációs küvettába visszük át, Az élesztő/DNS keveréket elektropor áljuk 0.,75 kV feszültsé (5 kV/cm.}, „végtelen ohm mellett, 25 μΡ-dai.

Mindegyik küvettához 600 pl, 1,2 mol/1 koncentrációjú szerbitől adunk, majd az élesztőt két 300 μΙ-es alikvot részben két URA-D lemezre szélesztjük, és 30 ”C-on inkubáljuk.

Körülbelül 48 órával később az Urav élesztő transzformánsokat egyetlen lemezről 1 ml vízben sznszpendáljnk, majd röviden centrifugáljuk., hogy az élesztőseiteket ülepítsük. A sejtüledéket 1 ml lízis pufferben reszuszpendáljuk (2% Triton X100, 1% SDS, 100 mmol/1 xiátrium-klorid, 10 mmol/1 TRIS pH=8,0, 1 mmol/1 EDTÁL A lízis-elegyhől 500 míkrolitert hozzáadjuk egy Eppendorf esőhöz, ami 300 al savval mosott üveggyöngyöt és 200 al fenol/kloroformot tartalmaz, majd kétszer-háromszor 1 percig vortexeljüfc, utána 5 percig centrifugáljuk φφ

1.79 φ « φ Φ X Φ

Χφφ ΦΦΦ » « ΦΦφ X χ

X Φ Χ<φΦ« Φ β φ χ φφφ #ΦΦ * φ* «Λ

Eppendorf centrifugában, maximális sebességgel. A vizes 300 mikrolitert friss esőbe teszünk át, majd a DNS-t

etanollal kicsapjuk, utána 10 percig 4 Tkon centrifugáljuk. A DNS csapadékot 100 al vízben reszuszpendáljuk.

Az elektrokompetens Eschenehm colt sejtek (DHI0B, GibcoBRL) transzformációját 0,5-2 ml élesztő DNS készítménnyel és 40 ul DH10B sejttel hajtjuk végre. A sejteket elektropulzáljuk (2,0 kV, 25 m'F és 400 ohm). Az elektroporáció után. 1 ml SOC-t (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, élesztőkivonat

ö), (Difco), 10 mmol/1 nátrínm-klorid, 2,5 mmol/1 kálium-klorid, 10 mmol/1 MgCD, 10 mmol/1 MgSCü, 20 mmol/1 glükóz.) szélesztünk 250 μΐ alíkvot részekben négy LB AMP lemezen |LB táptalaj (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/l ainpicülin).

A humán zalphall ligandum megfelelő expressziős konstrukcióját hordozó egyedi kiónokat restrikciós enzimmel emésztve azonosítjuk, hogy igazoljuk az inszert jelenlétét, és hogy igazoljuk, hogy az egyes DNS szekvenciákat helyesen kapcsoltuk egymáshoz. A pozitív klónak inszertjeít szekvencia-elemzésnek vetjük alá. Nagyobb mennyiségű plazmid DNS-t izolálunk a Qiagen Maxi Kittel (Q1AGEN), a gyártó utasításai szerint,

BHK 570 sejteket (ATCC No. CRL-10314) szélesztünk 10 cm-es szövettenyésztő lemezekre, majd éjszakán át, 37 ^:°C-on, 5% CO^-t tartalmazó atmoszférában, DMEM/FBS táptalajban iDMEM, Gibco/BRL High Glucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% borjúmagzat szérum (Hyclone, bogán, ÜT), 1 mmol/I L.glutamin (JEH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mmol/1 nátriumpírnvát (Gibco BRL)) 50-70%-os egybenövésig szaporítjuk. A sejteket azután a pZMPU/zalphal ILig (25A. példa) plazmiddal transzferáljuk, ehhez Lipoíeclin ™-et (Gibco BRL) használva φΦ*Φ «*-*» Φ

ISO φ φ φ * « « φφφ φ#φ φ φ φ *φ β φ

Φ Φ φ Φ Φ φ « X # -φ

XX « φ Φ* * Φ* J* szérummentes (SF> DMEM-ben transzferrin, δ mg/ml ínzulm, 2 mg/ml fetuin, 1% L-glutamín és 1% nátriumpiruvát). A zaiphall~Fc4/pZMP6 plazmidoi 15 ml-es csövekben hígítjuk, 640 μί össztériógatú SF táptalajban. 35 μί Lipofectín ™et (Gíhco BRL) keverünk össze 605 μΐ SF Lipofectín™ keveréket hozzáadjuk a DNS ele

3öpercig szobahőmérsékleten ínkubáljuk. A DNSddpofectamlne™ keverékhez 5 milliliter SF táptalajt adunk. A sejteket egyszer öblítjük 5 ml SF táptalajjal, leszívjuk, majd hozzáadjuk a DNS:Lípofectamtne™ keveréket, A sejteket 5 öra hosszat 37 °Con Ínkubáljuk, majd 6,4 ml DMEM/10% FBS, 1% PSN táptalajt adunk minden egyes lemezhez.. A lemezeket éjszakán át 37 °C-on ínkubáljuk, majd másnap a DNSddpofectamíne ™ elegyet friss F5/DMEM táptalajjal helyettesítjük, A transzfekció után 5 nappal a sejteket T-162 lombikokba osztjuk szét, szelekciós táptalajban 1DMEM/ 5% FBS, 1% L-Gln, 1% nátrmm-píruvát). A transzfekció után körülbelül lö nappal az egyes transzfekeíőkból származó rezisztens telepek két 150 mm-es lemezét tripszínizáljuk, majd a sejteket egyesítjük, és egy T-82 lombikba szélesztjük, majd nagyobb tenyésztő edénybe visszük át. A nagyméretű tenyészetből származó kondicionált táptalajt használjuk a humán zaiphall ligandum polipeptid tisztítására, a 24. példában ismertetett módon.

26. Példa

Konstrukció egér zaíphal 1 ligandum transzgenikus egerek késztléséhez

A. Konstrukció a zaiphal l ligandum expresszálására a limfo181

X* Φ'* φ φ φ « φ φ

Φ«χ ΦΦφ Φ χ 4Φ« Φ Φ

Φ Φ ΦΦαΦ -χ Φ Φ φ

ΦμΧ φφφ -» *Φ «Λ

Oligonukleotidokat terveztünk, hogy egy konszenzus Kozák szekvenciát és az egér zalpball ligandumot kódoló régiót tartalmazó polimeráz láncreakció fragraenst generáljunk. Ezeket az oligorrakleofidokaí úgy terveztük meg, hogy egy Fse'I hasítási helyet tartalmazzanak az 5' végükön, és egy Ascl hasítási helyet tartalmazzanak a 3' végükön, hogy megkönnyítsük az alábbiakba való klónozást a) pKFOSl, egy limfoid-specifikus transzgenikus vektor, vagy b) pTGl2-8, a saját standard transzgcnfkus vektorunk,

A polimeráz láncreakciót 200 ng egér zalphal 1 lígandum templáttal hajtjuk végre (55. számú szekvencia, 16. példa), valamint a ZC23,115-ös (66, szánni szekvencia) és a ZC23,116-os (67, számú szekvencia) olígonukleotiddal A polimeráz láncreakciót Advantage™ cDNS polimerázzal (Clonteeb, Palo AIto, CA) hajtjuk végre a 22B. példában, ismertetett polimeráz láncreakció körülmények között. A polimeráz láncreakció termékét a 22B. példában ismertetett módon izoláljuk. Az izolált 440 bázispár méretű fragmenst megemésztjük, majd á pKFOSI vektorba ligáljuk, amit előzőleg a 22B. példában ismertetett módon Fsel és Ascl restrikciós enzimekkel emésztettünk,

Az egyes lígálási reakcíóelegyekbol körülbelül 1 mikroliiert elektroporálunk, szélesztünk, klánokat izolálunk, majd a 22. példában ismertetett módon restrikciós enzimmel emésztve áivízsgáljuk. A korrekt pKFOSl-zalphal 1 lígandum. kiónt szekvenálással igazoljuk, mejd ebből a kiónból nagymennyiségű plazmld DJNS-t izolálunk. Egy NotI fragmenst készítünk, ami tartalmazza az lek proximálls promotert. az immunglobulin μ fokozó szekvenciát, a zalpball lígandum eDNS~t és a mutált hGH gént, .*·*# φφφφ * » « » Φ * Φ

Λ _C>..K Φ>* φ « Χ*>© χ: X : λ > * * #«$« « φ ♦ y φφ·; χ*φ ? χ.* «Α amit azután megtermékenyített egér oocitákba való mikro ozásra használunk.

B. Konstrukció az egér zalphal I liga resszálására a terror a 2.2A. példában ismertetett módon szubklónozzuk a pTG12~8 vektorba. Ehhez a konstrukcióhoz körülbelül 10 mg, maxiprep módszerrel készített pKFOő 1-zalpha 11 ligandum DNS-t emésztünk Esel és Ascl restrikciós enzimek kombin e tan óllal kicsapjuk, majd a zalphal 1 ligandum fragmenst a 22, példában ismertetett módon tisztítjuk. Ezt a fragmenst azután a pTG12-8 vektorba klónozzuk, amit előzőleg a 22A, példában, ismertetett módon Fsel és Ascl restrikciós enzimekkel emésztünk. Az elektröporáciőt, a klőnok szűrővizsgálatát és a maxiprep DNS izolálást a 22, példában ismertetett módon hajtjuk végre. Egy Sah fragmenst készítünk, ami tartalmazza az 5' és 3' határoló szekvenciákat az MT-1 promotert, a patkány proinzuliu H intront, az egér zalpha l 1 ligandum cDNS-t és a h.GH poii A szekvenciát, amit azután megtermékenyített egér oocitákba való mikroínjekciózásra használunk.

27. Példa poliklonálís ellenanyagokat úgy állítjuk elő, nőstény New Zeeland fehér nyalat immunizálunk a tisztított muzalphal 1 /MBP-6H polipeptíddel (32. Példa). Mindegyik nyúlnak adunk egy induló mfraperitoneálís (IP) injekciót, ami 200 mg tisztított fehérjét tartalmaz Freund féle adjuvánshan « <M * o

18' *

* * < Φ

Xrf,* * » *** * 4 <*#φ -> * 4 9* _wv<

(Pierce, Rockford, IL), majd háromhetente erősítő intrapentoneálís injekciókat adunk be, amik 100 mg tisztított fehérjét tartalmaznak Inkomplett Freund féle adjuvánsban. Hét-tíz nappal a második erősítő injekció beadása, után (összesen 3 injekció) az állatokat megvéreztetjük, és a szérumot összegyűjtjük. Az állatoknak azután háromhetente adunk erősítő injekciókat, és meg is véreztetjük.

A muzalphal 1L/MBP-8.H. specifikus nwlszérumot előadszorbeáltatjuk anti-MBP ellenanyagokra, CNBr-Sepharose 4.B fehérje-oszlop (Pharmacia) használatával, amit 10 mg tisztított rekombináns maltózkötő fehérje (MBP) per gramm CNBr-Sepharose felhasználásával készítettünk, A rekombináns MBP-t a saját laboratóriumunkban egy amilőz oszlopon készítettük és tisztítottuk, a szakirodalomban jól ismert módszerekkel. A muzalpha 11 Ldígandum .specifikus políkionális ellenanyagokat affinitás-tisztítjuk a nyülszérumból, egy CNBr-Sepharose 4B fehérje oszlop felhasználásával (Pharmacia LKB), amit 10 mg specifikus antigén-tisztított rekombináns muzalpha 11L/MBP-6H 'polipeptid (32. példa) készítünk, majd éjszakán át 20.X dialízist hajtunk végre foszfáttal puffereit sóoldattal szemben, A muzalphal 1-ligandum specifikus ellenanyagokat ELISA liter ellenőrzéssel jellemezzük, 1 pg/ml tisztított rekombináns muzalpha 11L-MBF-6H (32, példa.) vagy huzalphal IL-MBP/őH (32. példa) tisztított rekombináns fehérje antigént használva ellenanyag célpontként. A nyúl anti- muzalphal LL/MBP-6H affinitás-tisztított ellenanyag kimutatásának alsó szintje (LLD) iöö pg/ml a specifikus tisztított muzalphal 1L/MBP-8H rekombináns antigénjén, és 500 pg/ml a tisztított rekombináns huzalphal IL-MBP/OH-n,

IS4

ΦΦ*·* * *·« Λ* * * * * * *:>··· Φ $ Λ*Λ * « * * ·<*$·* Λ .« 9 <

Λλ> * «-·· ,y-^s- jfc.

28. Példa

Emlős expressziós vektor készítése,, és a humán zalphal 1 ligán.dum nagymennyiséghen való expresszálása CHO DG44 sejtekben

A humán zalpha 11 ligandum. (I. számú szekvencia) emlős sejtben való expressziójához vektort terveztünk, amivel egy Sah hasítási helyet adunk a cDNS 5' végéhez és egy Pmel hasítási helyet adunk a cDNS 3 végéhez. A vektort polimcráz láncreakcióval állítjuk elő, a humán zalpha 11 ligandumot tartalmazó plazmidból (7. példa), a ZC22,054-es (70, számú szekvencia) és a ZC22.Ö.55-ÖS (71. számú szekvencia) oligonukleotld primerek használatával. A. pollmeráz láncreakció körülményei a következők: 94 °C 4 perc; 25 ciklusban 94 X 45 másodperc, 50 ®C 45 másodperc, és 72 °C 3 perc; végül 72 °C 10 perc. A pollmeráz láncreakció termékéi: az alábbiakban ismertetett módon izoláljuk, majd Sáli és Pmel restrikciós enzimekkel emésztjük és a ppC3.12 plazmidba iígáljuk, amit előzőleg a benne levő polílínker megfelelő hasítási helyein hasítottunk, az itt ismertetett standard módszerek alkalmazásával A pDC312 plazmid leírása megtalálható a szakirodalomban (Morris és mtsai; „Expression Augmentmg Seqpenee Element .(EASE) isolated írom Chínese Bamster Ovary CellsG in Animál Cell Technology, 529-534. oldal, szerkó Carrondo MJT és munkatársai, Kíuywer Academic Publishers, Hollandia (1997)).

A ligáit vektort szuszpenziöhoz adaptált CHO DG44 (ín house Növő Nordísk, Dánia) sejtekbe transzfektáljuk Upofekclövat LipofectaminePlus^ reagensei (Gibco BRL), a .gyártó· utasításai szerint. A transzfektánsokat fimídint és hipoxantint nem tartalmazó PPCHO táptalajban szelektáljuk ♦

* 0 *♦* 0««y 0

185

(JRH, Lenexa, Kansas), majd 200 nM metotrexáton szelektáljuk (Sigrna, St Lotus, MÓL A metotrexát rezisztens sejteket hígítással klónozzuk, majd egy BaF3 aktivitási esszével vizsgáljuk a zalphall ligandum termelődését (5B, Példa),

Egy termelő klánt méretoagyítunk és szaporítunk egy 7-20 literes bioreaktorban (Appkkon Bioreaefors, Schiedam,

Hollandia), PFCHO táptalajban, hogy a. tisztításhoz anyagot állítsunk elő (29. Példa).

29. Példa

A jelöletlen humán és rágcsáló zalphal l ligandum nagy mennyiségben való tisztítása BHK és CHO emlős expresszios seltvo-

Hacsak külön nem jelezzük az eltérést, akkor minden műveletet 4 °C-on hajtunk végre. Az alábbi eljárást használjuk humán zalphall ligandum. legalább 30 liter CHO kondicionált táptalajból tisztítására (lásd a 28. példát), A toményiielt vagy nem-töményhett kondicionált táptalajt (CM) 0,45 és 0,22 mikronos szűrökön sterilre szűrjük. A kondicionált táptalajt azután

0,01 mol/1 MBS-sel (Fluka öioehemíka, Svájc) puííereljük, majd a pH-t 8,0-ra állítjuk, és éjszakán át egy 50x100 mm-es (196 ml) Poros 50 HS oszlopra (erős katíoneserélö a PerSeptive BioSystems-től, Framingham, MA) töltjük, 4-10 ml/pere sebességgel, BíoCAD SPRINT (Ferceptive BioSystems) használatával. Az oszlopot 10-20 oszloptérfogatnyi (CV) Ö,Ö1. mol/1 MBS/0,130 mol/1 nátrium-klorid (Malinckrodt, Párizs, KY) oldattal (pH-6,0) mossuk. A megkötött fehérjéket azután IÖ oszloptérfogatnyi, 0,01 mol/1 MES-ben (pH~8,ö) készített 0,130 - 1 mol/1 nátriumX *V* X 00 0 0 X *00 00 0 » * X

Χ«

klorid oldattal eíuáljuk, 30 ml/perc sebességgel; a teljes kromatográfia. során 25 ml-es frakciókat szedünk, és követtük a 280 és 215 ηπι-es abszorpciót. Az elnyelési csúcsokat mutató frakciókat SDS-FAGE Silver-rel (Geno Technology, St. Louis, Coomassie festéssel (Sigma St. Louis, MO) és Western elemezzük, a humán zalphall ligandum elleni ellenanyagok (33. és 34. példa) felhasználásával.

A csúcs-frakciókat, egyesítjük majd egy kevertetett cella koncentrátorban koncentráljuk YMW membránon (Mülipore/Amicon, Bedford, MA) 1-10 ml minimális térfogatra. A mintát azután egy megfelelő Sephacryl S-200 (Pharmacia., Uppsala, Svédország) nagy felbontóképességű, méretkizárásos oszlopra visszük (52-600 ml), amit foszfáttal puffereit sóoldatban ekvíiibráltunk (Glbco BRL), 1-2 ml/ml áramlási sebességgel; 1-2 ml-es frakciókat szedünk a teljes kromatográfia során, majd követjük a 280 és 215 nni-es elnyelést. A csúcs-frakciókat SDSPAG.E Silver-rel (Geno Technology, St. Louis, MO) és Coomassie festéssel (Sigma, St. Louis, MO) elemezzük.

A számunkra érdekes frakciókat egyesítjük, majd Mílllpore 5 kDa. MWKO centrifugális koncentrátorokkal minimális térfogatra töményítjük. A végi érmékét azután SDS PAGE Coomassie festéssel (Sigma, St. Louis, MO), Western hlottolással, N-terminálís szekvenálással, aminosav elemzéssel és BCA-val (Pierce Rockford, Illinois) elemezzük a fehérje tisztaságának és koncentrációjának elemzésére.

Hacsak külön nem jelezzük az eltérést, akkor minden műveletet 4 °O-on ··?

φ

-»·* * * * φ φ * V ΦΦφ φ φ

Φ·ΦΚ Φ ί « φ

Φ 4« φΦ rágcsáló zalphall ligandum ΒΗΚ kondicionált táptalajból való tisztítására (lásd a 18. példát). A tőményítetí vagy nem-töményített kondicionált táptalajt (CM) 0,45 és 0,22 mikronos szűrőkön sterilre szűrjük. A kondicionált táptalajt azután 0,01 mol/1 MES-se! (Pinka Bxochemika, Svájc) puffereljük, majd a pHt 6,0-ra állítjuk. A kondícionáltt táptalajt elemezzük, egy AS oszlopra visszük és azon elemezzük, a 29A. példában ismertetett módon.

A csúcs-frakciókat egyesítjük majd a 29A. példában ismertetett xnődon egy kevertetett cella koncentrátorban, koncentráljuk 2(.)-30 ml térfogatra. A pH-t 7,0-ra állítjuk, majd a mintát vagy egy 0,8 ml~es Poros AL oszlopra visszük, ami körülbelül 3 mg zalphal ICFLAG jelölt oldható receptor tartalmaz (I0B. példa), vagy egy olyanra, ami körülbelül 10 mg zalphal 1-Fc4 fúziós receptort (1OC. Példa) tartalmaz, a gyantára immobüizálva (lásd az alábbiakban ismertetett módszert), I ml/perc

BioCAD SPRINT berendezésen. Az oszlopot azután legalább 20 CV 0,3 mol/1 nátrium-kloríd/lőszfáttal puffereit sóoldat (Gibco

BRL)/Ö,Öl mol/1 MES összetételű oldattal mossuk, 10 ml/perc sebességgel. Az oszlopot azután gyorsan eluáljuk 0,1 mol/1 glícin {Amínoaceüc acid: Glyeocol, Spectrum, Gardena, CA) 600 μί-es injekciójával ípH=2,5L 10 ml/perc sebességgel, foszfáttal puffereit sőöldaiban, egy BioCAD SPRINT berendezésen. A hatmásodpercenként szedeti 1 ml-es frakciók pH-ját azonnal semlegesre állítjuk 55 μί 2 mol/1 TRISZ-szel (Trlsz-hldroxímetilaminometán, EM Science, Gibhstown, NO) (pH-8,8). A teljes kromatográfia. során monitorozzuk a 280 és 21.5 nm-es elnyelést. A csúcs elnyelést adó frakciókat azután biológiai esszével és

SDS-PAGE Silver-rel

Geno ec

Logy ♦ ♦*9* «

Ϊ88 **** * * ♦ ♦'»·»·

Coomassie festéssel (Sigma, St, Louis, MO) és Western bloítal elemezzük, az előzőkben ismertetett módon.

A csúcs-frakciókat egyesítjük majd a 29. példában ismertetett módon egy keverte tett cella koncentrátorban koncentráljuk 1-10 ml xninímálís térfogatra, A mintát azután egy megfelelő Sephaeryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Svédország) nagy felbontóképességű, méretkizárásos· oszlopra visszük. A csúcsfrakciókat SÖS-PAGE Silver-rel föeno Technology, St. Louis, MO) és Coomassie festéssel (Sigma, St. Louis, MO) elemezzük. A számunkra érdekes frakciókat egyesítjük és koncentráljuk, majd a 29A, példában ismertetett módon elemezzük.

C, Fehérje immobihzálása POROS AL közegre

Minden műveletet szobahőmérsékleten hajtunk végre egy

BioCAD 700E berendezésen. A. gyártó utasításai szerint áramlással töltünk fel egy 4,5x50 mm-es oszlopot a POROS AL közegben, 2 mol/1 nátríum-klorid oldatban. Az oszlopot, azután

1,1 m.ol/1 Na-sSOé· és SO mmol/1 nátríumfoszfat (pH~7,2) összetételű oldattal hozzuk egyensúlyba. A. receptort 4 xng/ml~re koncentráljuk, egy Millípore 30 kDa MWKO centrifugális koncentrátorban, majd 1:1 arányban hígítjuk 1,1 mol/1 NazSCU és 50 mmol/1 nátriumfoszfát (pH~7,2) összetételű oldatban. Az oszlopon azután 2 ml/perc sebességgel 1,1 mol/1 NaaSO.-i és 50 mmol/1 nátríumfoszfat tpH~7,2) összetételű oldatot áramoltatunk át majd a hígított hgandumbói 100 ul-es injekciókat adunk be minden 9 oszloptérfogat után, ameddig elérjük az egyensúlyi telítést vagy az áttörést. Ezután 62 oszlopíérfogatnyi gradienst, futtatunk, ami 1,1 mol/1 Na2S0</50 mmol/1 nátriumfoszfát fpH~?,2HőI 50 mol/1 NaaSOuSO mmol/1 nátriumfoszfát

X * χ ♦«« χ «

(pH~7,2/S mg/ml' nátrium-cianobórhidrid) összetétel között változik. Az oszlopot azután körülbelül 2 őrá hosszat állni hogy az ímmobllizációs kémia teljesen lejátszódjon. Az azután 0,2 mol/i TRISZ (pH~7,2)/5 mg/ml cíanobórhidrid összetételű oldattal hozzuk e,s újabb 1 óra hosszat hagyjuk állni, az oszlop lezárása :tül az oszlopot foszfáttal puffereit sóoldat/0,2%. nátrium-

ősszetételü oldattal ho?

egyens a, és iá 4

X~on tartjuk. A felhasználás előtt az oszlopon eló-elűciót haji végre 0,1 mol/i glicinnel, hogy biztosítsuk, hogy az aspeeifikus fehérjék el vannak távolítva, és az oszlop nem ereszti az lízáit oldható humán zalphal 1 receptort.

A. A humán zalphal 1 ligandum bakulovírusban való expresszálására szolgáló konstrukció

Egy pzalphalll, expressziős vektort állítunk elő a humán zalphall lígandum polipeptidek rovarsejtekben való előállítására. A humán zalpha 11 ligandum szekvenciáját, tartalmazó 517 bázispár méretű fragmenst ami az 5 és 3 végén BarnHl és Xhol restrikciós hasítási helyet tartalmaz, polimeráz láncreakció araplifikálással állítjuk elő egy humán zalphall lígandum cDNS-t (7. példa) tartalmazó plazmidról, a ZC23_?444-es (74, számú szekvencia.) és a ZC23,445-ös (75, számú szekvencia) használva primerként.. A polimeráz láncreakció körülményei az alábbiak: 1. ciklusban 94 X, 4 perc; majd 25 ciklusban 94 °C 45 másodperc, 50 X 45 másodperc, és 72 X 2 percig; 1 ciklusban 72 X 10 * φ

190 ♦ *

ΦΦΧ «,

Φ X * * ♦ « φ * φ φ » * * χφ »9 percig; majd áztatás 4 ^cC-on, A fragmenst géielektroíorézissel tesszük láthatóvá (1% SeaPlaque/1% NuSieve). A csíkot kivágjuk, 2 mmol/1 MgCb-dal 0,5% agarozra. hígítjuk, 65 °C~on megolvasztjuk, BarnHI és Xhol restrikciós enzimekkel emésztjük (Boehringer Mannheim), majd egy BamHI/XhoI restrikciós enzimekkel emésztett pZBV3L bakulovírus expressziős vektorba rigaijuk. A pZBVSL vektor a pFastBac™ (Life Technologies) expressziós vektor módosítása, amiből a polihedron promotert eltávolítottuk, és helyettesítettük a késői aktiváló Basic Protein Promoter-rei, A restrikciós enzimmel emésztett zalphal l llgandum inszertből körülbelül 14 nanogrannnot, és körülbelül 40 ngot a megfelelő vektorból éjszakán át 16 °C~on. lígáljuk.

A ligáié elegyet háromszorosra hígítjuk TE-ben (10 mmol/1 TRIS-HCl pH-7,5 és 1 mmol/1 EDTAk majd a hígított ligáid elegyből a gyártó utasításai szerint körülbelül 4 fmol-t transzformálunk DH5a Library Efficiency kompetens sejtekbe {Life Technologies), 45 másodpercig 42 °C-os vízfürdőben tartva létrehozott hősokkal, A transzformált DNS-t és a sejteket 450 pl SOC táptalajban, hígítjuk {2% Bacto Tryptone™ {Difco, Detroit, MI),

0,5% élesztökivonatot (Difco), 10 mniol/1 náf r inm-.klór id, 2,5 mmol/1 kálium-klorid, 10 mmol/1 MgCb, 10 mmol/1 MgSCh. 20 mmol/1 glükóz), majd 100 ug/ml ampicíllínt tartalmazó LB lemezekre szélesztjük. A Hónokat restrikciós emésztéssel elemezzük, majd a pozitív kiónból 1 μΐ-t 20 pl DHlOBac Max Effíoieney kompetens sejtekbe ÍGibco BRL, Gaíthersburg, MD) transzformálunk, a gyártó utasításai szerint, az előzőkben ismertetett hösokk alkatmazásávaL A transzformált sejteket azután 980 μΐ SOC táptalajban (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% élesztökivonatot (Difco), 10 mmol/1 nátrium- klorid, 2,5 mrnol./l

Jt 9 Φ φ

X'

5.93 káliuni-klorid, 10 mmol/l MgCb, lö mmol/l MgSO-4, 20 mmol/l glükóz), 4 óra hosszat rázó Inkubátorban 37 C-on szaporítjuk, majd 50 pg/ml kanamicint, 7 pg/ml gentamicint (Life Technologies), 10 pg/ml ietraeiklint, izopröpíl-p-tíogalaktopiranözidot (Pharmacia Biotech) és Bluo-Gal-t (Life Technologies) tartalmazó turia agademezre szélesztjük. A szélesztett sejteket 48 óra hosszat 37 C-on ínkubáljuk, Szín-szelekciót használunk azoknak a sejteknek az azonosítására, amik humán zaiphall 11gandumot kódoló donor inszertet tartalmaznak, a. plazmídha beépítve (ezt nevezzük „bacmid^-nakl. A fehér színű telepeket választjuk ki elemzéshez, A humán zaiphal l ligandum Bacmid DNS-t Izoláljuk a pozitív telepekből, a QiaYac MiníprepS rendszerrel (Q.1Á.GEN), a .gyártó utasításai szerint. A klánokat átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a korrekt inszertet, oly módon, hogy a DNS-t amplifíkáljuk, a bacmidban levő átugró elemeknek megfelelő primereket használva polímeráz láncreakcióban, a ZC447es (76. számú szekvencia) és a ZC976-os (77. számú szekvencia) primerek használatával. A polímeráz láncreakció körülményei a következők: 35 ciklusban 94 C 45 másodperc, 50 °C 45 másodperc, és 72 C 5 perc; 1 ciklusban 72 °C lö perc; majd áztatás 4 °C-on. A polímeráz láncreakció termékét 1%-os agarőz gélen futtatjuk., hogy ellenőrizzük az inszeri méretét. A korrekt inszertet tartalmazó klánokat használjuk a Spotíopfera/ruptperdn tf9) sejtek transzfektálására.

B, ;sszióia és generálása bakulovírushől a humán zalpba .11 lía'andiun tisztítására

Az- Sí9 sejteket δχΙΟ⁶ sejt per 35 mm-es lemez sűrűségben szélesztjük, majd hagyjuk, hogy 1 óra hosszat 27 ^öC~on megta*»φφ

192 ♦ *φ φ φ * V ♦ ** φ φ φ' φ φ φ * *φ φ padjanak. A humán zalpha 11 ligandum haemíd DNS-t (lásd fent) 100 pl Sf-900 Π SFM oldattal (Life Technologies) hígítjuk. 6 pl CELLFECTIN reagenst .(Life Technologies) hígítunk 100 pl Sf-900 Π SFM-meL A haemíd DNS-t és a lipid oldatokat óvatosan összekeverjük, majd 30-45 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk. Az egyik lemezen levő táptalajt, leszívjuk, majd a sejteket Ix mossuk 2 ml friss Sf-900 Π SFM táptalajjal, 800 mlkrollter Sf-900 II SFM közeget adunk a lípid-DNS keverékhez. A mosó közeget leszívjuk, majd a DNS-lipid elegyet hozzáadjuk a sejtekhez. A sejteket 27 °C-on inkubáljuk 4-5 óra hosszat. A DNS-lipid elegyet leszívjuk, majd 2 ml Sf-900 II közeget adunk az egyes· lemezekhez. A lemezeket 96 óra hosszat 27 ^f’C~on inkubáljuk, 90%-os légnedvesség mellett, ami után a vírust begyújtjuk.

A primer amplífikáláshoz az Sf9 sejteket 125 ml-es rázott lombikban 50 ml Sf-900 II SFM táptalajban szaporítjuk, körülbelül 0,41-0,52x1. ö⁵ sejt/ml sűrűségben. Ezeket azután 150 pl, fent említett vírus lorzstenyészettel fertőzzük, majd 3 napig 27 ^öC~on inkubáljuk, majd a vírust a szakterületen ismert standard módszerekkel gyűjtjük össze. Egy 500 ul-es mintának egy BaF3 esszé megvizsgáljuk az aktivitását (5, példa), hogy kimutassuk, hogy biológiailag aktívak,

A szekunder amplífikáláshoz az Sf9 sejteket 1 liter Sf-900 II SFM közegben szaporítjuk egy 2800 milliliteres palackban, körülbelül Ö.SxNF sejt/mi sűrűségben, 500 uh az előzőkben ismertetett primer virális törzstenyészettel fertőzzük, majd 4 napig 27 ^cC-on inkubáljuk, utána pedig a vírust a szakterületen ismert standard módszerekkel gyűjtjük össze. A vírus literét meghatározzuk, és nagy mennyiségre szaporítjuk, a báknlovírusban előállított humán zalphai I hganduni (huzalphal. IL-Bv) nagy mennyiΦ * Φ Φ φ φφτ 4 ív mer te tett módon,

C, A bakulpvíruában expresszált humán/rágcsáló zalphall IIHaesak külön nem jelezzük, akkor minden műveletet 4 °O on hajtunk végre. Az alábbi eljárást használjuk a humán zalphall ligandum (huzalphal IL-Bv) tisztítására BV kondicionált táptalajból (30B. példa), A kondicionált táptalajt (CM) 0,45 és 0,22 mikronos szűrőkön sterilre szűrjük, A kondicionált táptalajt azután 0,01 mol/1 MES-sel ÍFluka Biochennka, Svájc) puffereljük, majd a pH-t 6,0-ra állítjuk. A kondicionált táptalajt egy POROS 50 HS oszlopra, visszük és futtatjuk, frakciókat szedünk, elemzőnk, a 29A. példában ismertetett módon.

A fenti csűcs-frakciókat egyesítjük, töményítjük, majd nagyfelbontású, méretkizárásos oszlopon futtatjuk, és a 29A, példában Ismertetett módon elemezzük.

A méretkizárásos oszlopról kapott, számunkra érdekes frakciókat egyesítjük, majd SkDa MWCO Millipore centrifugális koncentrátorban minimális térfogaira töményítjük. A végterméket azután a 29. példában ismertetett módon SDS FAGE Coomassie festéssel (Sigma, St. Louís, MG), Western blottolással, N-terminális szekvenálással, aminosav elemzéssel és BCA-val ÍPíerce Roekford, Illinois) elemezzük a fehérje tisztaságának és koncentrációjának elemzésére. A nagymennyiségű fehérjét -80 ®C-on tároljuk.

D. Kis mennyiségű {< 2 mg), bákulovírusban expresszált. humán/ tisztítása

194 *♦♦<! * φφ X *

X χ * **> *«χ χ * **Φ ΧΦ» ί

Hacsak külön nem jelezzük, akkor minden műveletet 4 °Con hajtunk végre. Az alábbi eljárást használjuk a < 2 mg humán vagy rágcsáld zalphall ligandum tisztítására BV kondicionált táptalajból. A kondicionált táptalajt a 30C, példában ismertetett módon megszűrjük, pnffereljük, és pH~ját beáhtjnk. A kondicionált táptalajt a 3OC. példában ismertetett módon POROS 50 HS kromatográfiás oszlopra visszük, eluáljuk, és elemezzük.

A frakciókat egyesítjük, majd diaszűréssel 20-30 ml minimális térfogatra koncentráljuk egy kevertetett cella koncentrátorban, YM10 membránon (10 kDa MWCO): (kíiilipore/Arnicon, Bedíórd, MA). A p-H-t 7,0-ra állítjuk, majd a mintát vagy egy 0,8ml-es Poros AL oszlopra, visszük, ami körülbelül 3 mg zalphal lCFLAG jelölt oldható receptort tartalmaz (10B, példa), vagy egy olyanra, ami körülbelül 10 mg zalphal 1-Fc4 fúziós receptort (IOC. Példa) tartalmaz, a gyantára immobilizálva. (lásd a 29. példában Ismertetett módszert), 1 ml/perc sebességgel, egy BioCAD' SPRINT berendezésen. Az oszlopot azután legalább 20 CV 0,3 mol/1 nátríum-klorid/foszfáttal puffereit sóoldat (Gibeo BRL)/0,0-1 mol/1 MBS összetételű oldattal mossuk, 10 ml/perc sebességgel. Az oszlopot azután gyorsan eluáljuk 0,1 mol/1 glicin (Aminoaeetic acid: Glycocol, Spectrum. Gardena, CA) 600 μΐ-es injekciójával (pH-2,5), 10 ml/perc sebességgel, foszfáttal pufféí, egy BioCAD SPRINT berendezésen. A hatniapercenként szedett I ml-es frakciók pfí-ját aze semlegesre állítjuk 55 μί. 2 mol/1 TRISZ-szcl (Trisz-bidroximefílaminometám EM Science, Gibbstown, NJ) (pH-8,3). A teljes kromatográfia során monitorozzuk a 280 és 215 nm-es elnyelést

A frakciókat azután az előzőkben ismertetett módon elemezzük.

V φ φ* «φ * χ** φ χ Φ » φ φ

A csúcs-frakciókat egyesítjük majd a 29. példában, ismertetett módon egy kevertetett cella, koncentrátorban ΫΜ10 membránnal (lOkDa MW'CO) koncentráljuk 1-2 ml minimális térfogatra. A mintái azután optimális áramlási sebességgel egy megfelelő Sephaeryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Svédország) nagy felbontóképességű, méretkizárásos oszlopra visszük, amit foszfáttal pufferelt sóoldattal (Gibco BRL) hoztunk egyensúlyba; a teljes kromatográfía során frakciókat szedünk, és monitorozzuk a 280 és 215 nm-es elnyelést. A frakciókat azután az előzőkben ismertetett módon elemezzük,

E Konstrukció az egér zalphall ligandum expressz&Iására haknlövirusban: pszalphal ílig.M

Egy expresszíos vektort készítünk (pzalphalILM) a rágcsáló zalphall ligandum polipeptld rovarsejtekben való expresszalására. Egy 413 bázispár méretű fragmenst állítunk elő polimeráz láncreakcióval, ami tartalmazza a rágcsáló zalphall. lígandumot.

és az 5', valamint a 3' végén BspEl valamint Xbal restrikciós hasítási helyet tartalmaz, egy olyan plazmáiról -ami a rágcsáló zalphall ligandum cDNS-t (16. Példa) tartalmazza, a 22325,970es (109. számú szekvencia) cs a ZC25,969-es (110, számú szekvencia) primerek használatával, az E;

ígh Fidelity PCR

System (Boehrínger Mannheim) alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint, A polimeráz láncreakció körülményei a következők: 1 ciklus 94 °C 2 perc, majd 35 ciklusban 94 ®C, 1.5 másodperc, 50 ^a€ 30 másodperc és 72 °C 2 perc; 1 ciklusban °C 10 percig; majd áztatás 4 *C~on. A polimeráz láncreakció termékének egv kis részét gélelektroferézissel láthatóvá tesszük (1% NuSieve agaróz). A fragmens megmaradt részét QIAGEN poli«« mersz láncreakció n:ei rísz

9 **♦ ·»χ . * * «49 9*9

Φ»

X #

** szerint, majd 30 μΐ vízbe eiuáljuk. A fragmenst azután 37 ^cC~on körülbelül 2 óra hosszai. Bspel és Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük (Boefaringer Mannheim), majd az előzőkben ismertetett módon agarőz gélen futtatjuk. A csíkot kivágtuk, tisztítjuk és a QIAGEN gél extrakciós kittel eiuáljuk, a gyártó- utasításai szerint. A tisztított fragmenst egy Bspel/Xhal restrikciós enzimekkel emésztett bakulovírus expresszíós vektorba ípZBV37b) ligáljuk. A pZBV37fa vektor a pFastBac™ (Life Technologies) expresszíós vektor .módosítása, amiből a políhedron proniotert eltávolítottuk, és helyettesítettük a késői aktiváló Basic Protein Promoter-rel, amit az Bkáiszteroid UDPgiükoziltranszterázból (FGT) származó szekréció szignálszekvencia követ, A restrikciós enzimmel emésztett rágcsáló zalphal 1. ligandum ínszertből körülbelül 5 μΐ-t, és körülbelül 100 ng-ot a megfelelően hasított vektorból éjszakán át 18 ''C-on ligáljuk, 20 μΐ térfogatban. A ligáié elegybol 5 mikroliterl: elektroporálunk 50 μΐ Life Technologies DH12S elektrokompetens- bakteriális sejtekbe, ehhez 2 mm-es küvettát használva, 2 kV, 25 uF és 400 ohm beállítással. Az elektroporált sejteket kimentjük 1 ml SOC táptalajba (2% B-acto Tryptone (Dífco, Detroit, MI), 0,5% élesztőkivonatot (Dlfco), 10 mmol/1 nátrium-klorid, 2,5 mmol/1 káliumklorid, 10 mmol/1 MgCb, 10 mmol/1 MgSO4, 20 mmol/1 glükóz), 1 óra hosszat 37 °C-on hagyjuk szaporodni, majd 100 ttg/ml ampieillint tartalmazó tartalmazó LB lemezekre szélesztjük. A kiónokból DNS-t izolálunk, és restrikciós enzimmel emésztve elemzőnk, hogy azonosítsuk a pozitív klánokat. Egy pozitív kiónból körülbelül 5 ng DNS-t transzformálunk 20 μΐ DH20Baemax nüieiency Kompetens sejtekbe (Gibco bk.l, caitnersnur

397 * * $ 0 * * ♦ * **Λτ ««0 * x χ '* * *’ » 0 0 0 φ » X * 0 « -«

4 «00 .MD), a gyártó utasításai szerint, az előzőkben ismertetett 45 másodperces, 42 ^cC-os vízfürdőt alkalmazó hősokk alkalmazásával. A transzformált sejteket azután hígítjuk, és a 30A. példában ismertetett módon szaporítjuk, A rágcsáló zalphall ligandum inszertet tartalmazó bacmldokaf a 30A, példában ismertetett módon azonosítjuk és izoláljuk, A klőnokat átvizsgáljuk, hogy tartalmazzák-e a korrekt inszertet, oly módon, hogy a DNS-t polimeráz láncreakcióval amplifikáljuk, a bacmidban levő mozgó elemekre specifikus primereket használva, a ZC447~es (76, számú szekvencia) és a ZC976~os (77. számú szekvenciái primerek használatával. A polímeráz láncreakció körülményei a kővetkezők; 35 ciklusban 94 ^ÖC 45 másodperc, 50 °C 45 másodperc, és 72 ’C 5 perc; 1 ciklusban 72 ^aC 10 perc; majd áztatás 4 °C-on> A polímeráz láncreakció termékét 1%-os agarőz gélen futtatjuk, hogy ellenőrizzük az inszert méretét, A korrekt inszertet tartalmazó klőnokat használjuk a Spodoptera/rupíperdo. (Si9) sejtek transzfcktálására.

sssziója és generálása bakuiovírusból a humán nandura tisztítására

Az Sf9 sejteket SxiO⁶ sejt per 35 mm-es lemez sűrűségben szélesztjük, majd hagyjuk, hogy⁵' 1 óra hosszat 27 °C-on megtapadjanak, A rágcsáló zalphal 1 ligandum baernid DNS-t a 3013, példában ismertetett módon transzferáljuk, és a vírust összegyűjtjük.

A primer amplífikáláshoz az Sf9 sejteket az előzőkben ismertetett módon oltjuk le, majd 500 pl, a transzfekció után 72 órás körű felülűszót adunk hozzá, és a tenyészeteket hagyjuk 96 §8 **»·*·« * X *Φ ΦΛΦ J, » ·Χ ΦΦ <

* X φóra hosszat szaporodni, majd a vírust standard .módszerekkel gyűjtjük össze,

A szekunder amplifíkáláshoz az Sf9 sejteket az előzőkben ismertetett módon szaporítjuk., majd 200 pl, az előzőkben ismertetett primer vlrális törzstenyészettel fertőzzük. A tenyészeteket 3 napig 27 °C-on. ínkubáljuk, utána pedig a vírust a szakterületen ismert standard módszerekkel gyűjtjük össze,

A tercier amplifíkáláshoz 10 ul szekunder amplifíkált vírus törzstenyészetet SF9 sejtekre visszük, 500,000 sejt per luk sűrűségben 50 ml 5F900.il táptalajban, 250 ml-es rázott lombikban, 6 napig, majd a vírust az előzőkben, említett módon gyűjtjük össze. A vírus literét meghatározzuk, majd nagy mennyiségben elszaporítjuk, a. bakulovírus által termelt rágcsáló zalphal 1 lígandum (muzalphallt-Sv) tisztítására, a 30C, és 3ÖD. példában ismertetett módon.

A várt molekulasúlya fehérje jelenlétét a felülúszóban Western biot elemzéssel határozzuk meg, egy antimuzalphallb/MBP-6H poliklonális ellenanyag használatával (27, példa). A Ba.F3 alapú szaporodási esszé elemzés (5. példa) szintén azt mutatja, hogy a székre iáit lígandum aktív.

Humán és egér zalphal 1 lígandum expresszióla Esehehchla colibán

A. A humán zalphal 1. ligandnm-MBF fúzió PTAP93/zalphal 1 lígandum expressziós vektor konstrukciója

Homológ rekombinációval egy expressziós vektort készítünk, ami a humán zalphal 1 lígandum egy részét N-terminálisán a maltózkötő fehérjéhez (MBP) fúzionáltatva tartalmazó- fehérjét

Χ'ΦΦΑ «·*>>>

199 kódoló polinukleotidoi tartalmaz. A humán zalphal 1 ligandum cDNS (1. számú szekvencia) egy fragmensét poíimeráz láncreakcióval izoláljuk. A poíimeráz láncreakcióban két prímért használunk a humán zalphall ligandum fragmens előállításához: 1) a ZC22,128-as (78, számú szekvencia) prímért, ami 40 bázispárt tartalmaz a vektor határoló szekvenciájából és 28 bázispárt a humán zalphall ligandum N-terminálisáhők és 2) a Z€22,127-es (79. számú szekvencia) primer, ami 40 bázispárt tartalmaz a határoló vektor szekvencia 3' végéből, és 28 bázispárt tartalmaz a humán zalphall ligandum. C-ferminálisából, A poíimeráz láncreakció körülményei a következők: 25 ciklusban 94 °C 30 másodpercig, 50 °C 30 másodpercig és 72 °C 1 percig: majd áztatás 4 °C-on, két. párhuzamosban futtatva. A 100 μΐ-es poiimeráz láncreakció elegyból 2 μΙ-t futtatunk egy 1%-os agaróz gélen IxTBE pufferben az elemzéshez, amin látható a. várt, körülbelül 472 bázispár méretű csík. A megmaradt 90 ul poíimeráz láncreakció reakcióelegyet kombináljuk a 2. poíimeráz láncreakció cső tartalmával, 400 pl abszolút etanollal kicsapjuk, majd arra használjuk, hogy a Smal restrikciós enzimmel emésztett pTAP98 befogadó vektorba építsük be, egy olyan konstrukciót állítva elő, ami az előzőkben ismertetett MBP-zalphall ligandum fúziót tartalmazza.

A pTAP98 plazmid a pRS318 és pMAL-c2 pkizmidokből származik. A pRS316 plazmid egy Saecharompees eerevískxe ingázó vektor IHieter, P. és Sikorskí, R.: Genetícs 122, 19-27 (1989)). A pMAL-C2 (New Engíand Biolabs) egy Esctofchkx coli expressziós plazmid, Tartalmazza a tac promotert, ami a MalE-t (az MBP-t kódoló gén) hajtja meg, ezt követi egy His jelölés, egy trombin hasítási hely, egy klónozó hely és az rmB terminátor. A

200 pTAP98 vektort élesztő homológ rekombinációval állítjuk elő. 100 ng EcoRI restrikciós enzimmel emésztett pMAL-c2 plazmidot kombinálunk i pg Pvul-gyel hasított pRS36~tal, I ug linkerrel, és 1 pg Seal/EeoRI restrikciós enzimmel emésztett pRS316-tak A linkerek a kővetkező oligonukleotídok voltak: ZC19,372 (80, számú szekvencia) (100 pmol); ZC 19,351 (81.. számú szekvencia) (1 pmol), ZC19352 (82. számú szekvencia); és ZC19,371 (83. számú szekvencia) (100 pmol) egy polimeráz láncreakcióban, kombinálva. A pólón eráz láncreakció körülményei a következők: 10 ciklusban 94 °C 30 másodpercig. 50 °C 30 másodpercig, és 72 °C 30 másodpercig; ezt követi a 4 *C~os áztatás. A polimeráz láncreakció termékeit. 100%-os etanollal való kicsapással töményítjük.

Kompetens élesztőse] lekből (Saccharomyces ccrcoistaa) 100 μΙ-t kombinálunk 10 pl eleggyel,: ami tartalmaz hozzávetőleg .1 pg fenti, humán zalphall ligandum polimeráz láncreakció terméket, valamint 100 ng, Small restrikciós enzimmel emésztett pTAPSS vektort, majd egy 0,2 cm-es eiektroporációs küvettába visszük át. Az élesztö/DNS keveréket elektropulzáljuk (0,75 kV (5 kV/cm), végtelen ohm, 25 μ.Ρ. Mindegyik küvettához 600 ul 1,2 mol/1 koncentrációjú szorbitot adunk, majd az élesztőt két 300 ,ul-es részletben két URA D lemezre szélesztjük, és 30 ^öC-on inkuháljuk.

Körülbelül 48 óra elteltével egy lemezen levő összes Ura* élesztő transzformánst 1 ml vízben reszuszpendáljuk, máj röviden centrifugáljuk, az élesztősejtek útépítésé céljából, sejtüledéket 1 mi lízispufferben szuszpendáljuk (2% oz

SDS, 100 mmol/1 nátrium-klorid, 10 mmol/1 TRISZ pH»8, 1 mmol/1 EDTA), A lizáló élegyből 500 míkrolitert

201 « « ν Φ Φ « « «»* *

Φ « * χ « « * y

Φ φφ ** egy Eppendorf esőhöz., ami 300 μ] savval mosott üveggyöngyöt és # 200 μΐ fenol /kloroformot tartalmaz, majd két-háromszor 1 percig vortexeijük, majd 5 percig centrifugáljuk maximális sebességgel egy Eppendorf centrifugában. A vizes fázisból 300 mikrolitert teszünk egy friss csőbe, majd a DNS-t 600 ul etanollal (EtöH) kicsapjuk, majd 10 percig 4 °C-on centrifugáljuk, A DNS üledéket

100 nükroliter vízben reszuszpendáljuk.

Az elektrofeompetens Escherichía cod MCI061 sejteket í'Casadaban és mtsai: Journal of Molecular Biology 138/179-2071 1 ul élesztő DNS készítménnyel, 40 μ.1 MCI081 sejt felhasználásával transzformáljuk, a sejteket elektropuizáltatjuk (2,0 kV, 25 wP, 400 ohm). Az elektroporációt követően 0,8 ml SOC-ot (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, Ml), 0,5% élesztőkivonatot (Difco), 10 mmol/1 nátrium-klorid, 2,5 mmol/l kálium-klorid, 10 mmol/1 MgCh, .10 mmol/1 MgSO^, 20 mmol/1 glükóz) szélesztünk egy alikvot részben MM/CA-rAMP 100 mg/l lemezekre (LB táptalaj .(Lennox), 1,8% Bacto™ Agár (Difco), 100 mg/l ampicillin).

A humán zalphall ligandum helyes expressziős konstrukcióját hordozó sejteket az expresszíő alapján azonosítjuk... A sejteket, éjszakán át 100 pg/ml. ampícillint tartalmazó Superbroth Π-ben szaporítjuk. A éjszakán át növesztett tenyészetből 50 μΐ-ί: oltunk be friss Superbroth 11 ·* 100 ug/ml ampicillin összetételű táptalajba. A tenyészeteket két óra hosszat 37 °C-on rázatva szaporítjuk. A tenyészetből 1 ml-t 1 mmol/1 izopropil-p-tiogalaktopiranoziddal (ÍPTG) indukálunk. 2-4 órával később az egyes tenyészetekből vett 250 μΐ-ί 250 ul savval mosott üveggyönggyel és 250 gk 5% jl-raerkaptoetanolt és festéket tartalmazó Thorner pufférrel (összetétele: 8 mol/1 karbamid, 100 mmol/1 TR1SZ, pH~7, 10% glicerin, 2 mmol/1 EDTA, 5% SDS) keverjük össze, A **

205

0*0 * * *

X 00 * *

0 0 »

0*0 0 0 ** mintákat egy percig vortexeljük, majd 10 percig 85 ^eC-on tartjuk. Sávonként 20 μΙ-t viszünk fel 4-12%-os PAGB gélre (Novex). A géleket tatjuk, A pozitív jelöléssel látjuk el, majd szekvencia-elemzésnek vetjük alá. A pTAP 126-ban lévő MBP-zalphal 1 ligandum fúzió poiínukleotid szekvenciáját a 84, számú szekvenciavázlaton mutatjuk, be, a megfelelő poiipeptid szekvenciáját a 85. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be.

B . A humán huzalpball ligandum bakteriális expresszióia

Egy mikroliter szekvenálandő DNS-sel transzformáljuk a W3110 törzset (ATCC). A sejteket eíektropulzáljuk (2,0 kV, 25 μ,Ρ, 400 ohm). Az elekt.roporáció után 0,6 ml ml SOC-ot (2% Baeto Tryptone (Difeo, Detroít, MI), 0,5% élesztőkivonatot (Difeol, 10 mmol/1 nátrium-klorid, 2,5 mmol/1 kálium-klorid, 10 mmol/1

MgCb, 10 romol/1 MgSCh, 20 mmol/1 glükóz) széle sz tünk egy alíkvot részben LB AMP lemezekre (LB táptalaj (Lennox), 1,8% Baeto™ Agar (Difco), 100 mg/l ampleillin).

A különálló sejteket expresszáltatjuk. A sejteket éjszakán át 100 yg/ml ampícillint tartalmazó Superbroth 11 (Becton Dickínson) táptalajban szaporítjuk. Az éjszakán át szaporított tenyészetből 50 μΙ-t használunk 2 ml friss Superbroth H + !ÖG pg/ml ainpíeülín összetételű táptalaj beoltására. A sejteket két óra. hosszat szaporítjuk 37 °C-on rázaiva. A tenyészetből 1 millilitert. 1 mmol/1 izc^propih|l-flogalaktopíranoziddal Indukálunk. 2-4 órával később az egyes tenyészetekből vett 250 μΙ-t 250 μΐ savval mosott üveggyönggyel és 250 uh 5% p-merkaptoetanolt és festéket tartalmazó Thorner pufferrel (összetétele: 8 mol/1 karbamld, 100 mmol/1 TRISZ, pH-?» 10% glicerin, 2 mrnol/1 « «

ΦΧ** ♦

EDTA, 5% SDS) keverjük össze. A mintákat egy percig vortexeijük., majd 10 percig 65 °€-on tartjuk. Sávonként 20 μΐ-t viszünk fel 4-12%-os PAGE gélre (Novex). A géleket IxMES puíferben futtatjuk, A pozitív kiónokat használjuk arra, hogy elszaporítva a huzalphallL/MBP-6H fúziós fehérjét tisztítsuk belőlük (lásd a,

32. példát).

C. Az egér zalpha 11 Hgandum-MBP fúzió pTAP98/egér zalphal 1. itgandum expressziós vektor készítése

Homológ rekombinációval egy expressziós vektort készítünk, ami az egér zalpha 11 ligandum egy részét N- terminálisán a. maltőzkötő fehérjéhez (MBP) fúzlonáltatva tartalmazó fehérjét kódoló polinukleotidot tartalmaz. Az egér zalphal 1 ligandum cDNS (55. számú szekvencia) egy fragmensét pollmeráz láncreakcióval izoláljuk. A pollmeráz láncreakcióban két prímért használunk az egér zalphal 1 ligandum fragmens előállításához: 1) a ZC22,849~ es (86, számú szekvencia) prímért:, ami 40 bázispárt tartalmaz a vektor határoló szekvenciájából és 24 bázispárt az egér zalphal 1 ligandum N-terminálisából, és 2) a ZC22,850-es (87, számú í

vencia) primer, ami 40 bázispárt, tartalmaz a határoló vektor szekvencia 3' végéből, és 21. bázispárt tartalmaz az egér zalphal 1 ligandum C-terminálisáhót A pollmeráz láncreakció körülményei a következők: 25 ciklusban. 94 ^ÖC 30 másodpercig, 50 °C 30 másodpercig és 72 ^QC i percig: majd áztatás 4 ^öC-on, két párhuzamosban futtatva. A körülbelül 450 bázispár méretű fragmenst pTAP98 plazmidba klónozzuk, az előzőkben ismertetett módon. A kiónokat az előzőkben ismertetett módon transzformáljuk, azonosítjuk és szaporítjuk, A pozitív klónak jelzése pTAF134, ezeket szekvencia-elemzésnek vetjük alá. A pTAF 134-ben az MBP-egér

Φ *·».

zaiphall ligandum fúzió polinukleotid szekvenciáját a 88, számú szekvencíavázlaton mutatjuk he. a megfelelő polipeptid szekvenciát a 89. számú .szekvenciavázlaton mutatjuk be. A pozitív kiónokat használjuk az előzőkben ismertetett mődon, Escheríchia coli-bán való szaporításra, a muzalphallt/MBP~8H fúziós fehérje tisztítására (32. példa).

82. Példa

A zaíphal 1-MBP ligandum vagy a zalphall-MBP receptor tiszti•fása

Hacsak külön nem említjük, akkor minden eljárást 4 °C-on hajtunk végre. Az· alábbi eljárást használjuk a humán zalphallMBP ligandum (huzalphal 1L/MBP-8H) vagy rágcsáló zaíphal 1MBP ligandum (muzalphal 1L/MBP-8H} .zalphall-MBP Mgandum fúziók Eschcrichia coú-ből való tisztítására, A humán vagy egér zaíphal 1-MBP receptor fúziókat ugyanazzal a módszerrel hozzuk létre. Az- előre leeenírifugált, lefagyasztott Escheríchfe coli pasztát megolvasztjuk, majd 2 liter B puíferbe hígítjuk (0,02· mol/1 TRISZ (EM Science); 0,2 mol/1 nátrium-klorid (Mallinckrodt); 0,01 mol/1 β-merkapioetanol (EM Science); pH~8_sÖ; 5 mg/1 Pepstatin A (Boehringer Mannheim); 5 mg/1 Aprotinm (Boehringer

Mannheim); és 1 rng/1 PMSF (Fluka)), plusz 1-2 ml hafozásgátló ágens (AF2.89 antifoam, Sigma), A keveréket előre behűtött

French Press sejtroncsolőhan (Constant Systems LTD) dolgozzuk fel, 138-207 kPa nyomással

A kzátumot azután centrifugáljuk (ISÖOOxg, 45 perc, 4 °Ck és a feiülúszöt megtartjuk. 200 ml Amylose gyanta (New England Biolahs) A pnfferhen (0,02 mol/1 TRÍSZ (EM Science); 0,2 mol/1 v -é

20:

Science); pH~8,0) készített szuszpenzióját adjuk a lizátum felül· úszójához, majd éjszakán át kétliteres forgatott palackban inkuháljuk, ami lehe tővé teszi az MBF fúziós fehérje maximális sarzs abszorpcióját A gyantát sarzs oszlop formában mossuk a 5 oszloptérfogatnyi A pufferrel, majd sarzs eluáljuk C pufferrel (A puffét, 0,02 mol/1 maltózzal (Sigma)). A nyers frakciókat összegyűjtjük és követjük a 280 nm-es abszorpcióját xúz cluált fehérjét SDS NuPAGE ÍNOVEX) Coomassie (Sigma) festéssel elemezzük, A mintát és a nagymennyiségű fehérjét -30 °C-on tároljuk,

33, Példa

Humán zalphall ligandum poiiklonális ellenanyagok

A poiiklonális ellenanyagokat ügy állítjuk elő, hogy két nőstény New Zeelarid fehér nyulat immunizálunk a tisztított huzalphal 1L/MBP-6H polipeptiddel (32. Példa), vagy a tisztított CHO huzalphal 1L-CHO rekombináns fehérjével (29, példa). Mindegyik nyúlnak adunk egy induló intraperitoneális (IP) injekciót, ami 200 mg tisztított fehérjét tartalmaz Freund féle adjuvánshan (Pieree, Rockford, IL), majd háromhetente erősítő inéraperitoneáiis injekciókat adunk be, amik 100 mg tisztított fehérjét tartalmaznak inkomplett Freund féle adjuvánsban. Hét-tíz nappal a harmadik erősítő injekció beadása után az állatokat megvéreztetjük, és a szérumot összegyűjtjük. A nyulaknak azután háromhetente adunk erősítő injekciókat, és meg is véreztetjük.

A huzalphal 1 /MBP-6H elleni nyúlszőrömet elö-adszorbeáljuk antí-MBP ellenanyagokra, egy CNBr-Sepharose 4B fehérje oszlop felhasználásával (Pharmacia), amit 10 mg tisztított MBF ;06

hogy 10 mg specifikus antigén-tisztított rekombináns

komhináns huzalphal 1L-CHO fehérjét használunk egy gramm CNBr Sephárosé-hoz, majd éjszakán át 20x dialízist hajtunk végre foszfáttal puíferelt sóoldatban. A huzalphal 1-ligandum.

példa), humán zalphall ligandumot (huzalphal. 1L-CHÖ) (29.

anyag célpontként.

A nyúl antűhuzalphal IL/MBP-6H affinitás-tisztított ellenanyag kimutatásának'alsó szintje (LLD) 10 ng/ml a neki megfelelő specifikus tisztított, rekombináns huzalphal 1L/MBP-6H antigénen, 500 pg/ml a tisztított rekombináns muzalphal !L/MBP6H-n (32. példa). A nyúl anti-huzaiphal 1L-CHO affinitás-tisztított ellenanyag LLD értéke 50 pg/ml a neki megfelelő specifikus tisztított rekombináns huzalphal IL/MBP-6H. antigénen, 50 ng/ml a tisztított rekombináns muzalphal IL/MBP-OH-n

34. Példa

Humán zalphall ligandum anti-peptld ellenanyagok

Políkionális humán zalphall ligandum anti-peptíd ellenanyagokat állítunk elő, 2 nőstény New Zealand fehér nyulat. im~ ♦ X'

20' munizálva a humán zalphall lígandum pepiiddel. a huzalphal IL-l-gyel (72. számú szekvencia) vagy a huzalphallL3-mai (73. számú szekvencia). A peptideket Applied Blosystems Model 431A peptid szintetizátorral (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), a gyártó utasításai szerint. A peptideket azután fűrőcsiga hemocíanln (KLH) hordozó fehérjéhez konjugáltaijuk, maleimíd aktiválással, neális (IP) injekciót, ami Freund féle adjuvánsban hetente erősítő dériét tart, mg tisztított gyik nyúlnak egy⁷ induló intraperito30 mg tisztított fehérjét tartalmaz erce, Roekford, Ib), majd háromíkciőkat adunk be, amik 100 aznak Inkomplett Freund féle adjuvánsban, Hét-tíz nappal a harmadik erősítő injekció beadása után az állatokat megyérezíetfük, és a szérumot összegyűjti dk, A uyuiaknak azután háromhetente adunk erősítő injekciókat, és meg ís véreztetjük.

A huzalphal 1-ligandum peptidek ellen készített nyúlszérumokat BLISA tífer ellenőrzéssel jellemezzük, I mg/ml megfelelő, az ellenanyag készítésére használt pepiidet (72. számú szekvencia vagy 73. számú szekvencia) használva ellenanyag célpontként. A huzalphal lL-peptid elleni 2 nyúlszérumnak van litere a specifikus peptídje ellen 1:5,000,000 (1:5126) hígításban. A tzalphal 1L- 3 pepiid elleni 2 nyúlszérumnak Is van litere spécihús peptidjuk ellen, 1:5B6 hígításban.

A humán zalphal 1-ligandum-specifikus poliklonális ellenanyagokat egy CNBr-Sepharose 4B fehérje oszloppal (Pharmacia ás-tisziítjuk a nyúiszérumből, amely oszlopot úgy á tünk. elő, hogy 10 mg megfelelő specifikus pepiidet (72. számú szekvencia vagy 73. számú szekvencia) használunk egy gramm. CNBr Sepharose-hoz, majd éjszakán át 2öx dialízist hajtunk ₅«>* » **

208 végre foszfáttal puffereit sóoldatban. A huzalphal!-ligandum specifikus ellenanyagokat ELISA titer ellenőrzéssel jellemezzük, I mg/ml tisztított megfelelő pepiid antigént vagy tisztított teljes hosszúságú rekombináns fehérjéket használva ellenanyag célpontként.

A nyúl anti-huzalph&l 1L~1 affinitás-tisztított ellenanyag kimutatásának alsó szintje (LED) 500 pg/ml a neki megfelelő specifikus pepiid antigénen (huzalphal 1L-1, 72, számú szekvencia), 500 pg/ml a tisztított rekombináns huzalphal 1L/MBP8H-.n (32. példa), és 500 pg/ml a tisztított CHÖ rekombináns huzalphal IL-CHO-n (29. példa). Nem figyelhető meg keresztreaktivitás a tisztított rekombináns muzalphal IL/MBP-OH-val szemben (32. példa), A nyúl antí-huzalphalIE-3 affinitás-tisztított ellenanyag LED értéke 50 pg/ml a neki megfelelő specifikus tisztított pepiid antigénen (huzalphal IL-l: 73. számú szekvencia), 50 pg/ml a tisztított rekombináns huzalphal 1Ε-ΜΒΡ-6Η-Π, 500 pg/ml a tisztított. CHO rekombináns huzalphal IL-CHO-n (29, példa), és 100 pg/ml a tisztított bakulovírus rekombináns huzalphal IL-Bv-n (30. példák Keresztreaktivitás figyelhető meg a tisztított rekombináns muzalphal 1L/MBF-6H-val (32, példa), az LED érték 5 ng/ml.

mii receptor monoklunális ellenax

Zalphall receptor monokfouáiis ellenanyag úgy állítunk elő, hogy 5 BalbC egeret (Harlan Sprague Dawley, Indianapolís, IN) immunizálunk a tisztított rekombináns oldható receptor fea.l vei (búza vei a.

egérnek 20 mg tisztított fehérjét adunk he komplett φ X φ » «*«♦ ί09

Freuúd féle adjuvánsfoan (Pierce, Rockford, ILI kiindulási intraperítoneális (IP) injekció formában, majd kéthetente erősítő iniraperítoneális injekciókat adunk be, amik 10 mg tisztított fehérjét tartalmaznak inkomplett Freund féle adjuvánsban. A harmadik erősítő injekció· után hét-tíz nappal az állatokat megvéreztetjak, majd szérumot gyűjtünk.

A huzalphal l-CEE-BHK ellen készített egér szérummíntákát ELISA titer ellenőrzéssel jellemezzük, tisztított rekombináns CHO huzalpha 11 -Fc fehérjét - lOC. példa) használva ellenanyag célpontként. Egy szérummintának volt titere a specifikus ellenanyag célpont ellen 1:1,000,000 hígításban (1:1Ε6)< Négy egér szernmrníniának volt titere a specifikus ellenanyag célpont ellen 1:100,000 hígításban (DIESk

A négy magas litert adó egérből szplenocitákat gyűjtünk, és rágcsáló SP2/G mielőma sejtekkel fúzionáltatjuk, PEG 1500 alkalmazásával (B-oehringer Mannheim, Nagy-Britannia), két külön fúziós eljárásban, a szplenoeiták és a mielőma sejtek közötti 4:1 fúziós arány felhasználásával (Antibodíes: A Laboratory Manual, E, Harlow és D. barié, Cold Spring Harbor Press). A fúzió utáni IÖ. napon a specifikus ellenanyagot termelő hibridómákat ELISA-val azonosítjuk, tisztított rekombinál zalphal 1-Fc fehérjét (lOC. példa) használva célpontként, valamint FACS-szal, a huzalphal! resszáló BaF3 sejteket alkalmazva (4. és 2. példa) ellenanyag célpontként. A kapott 4 híbrídőmát, amik mindkét módszerre pozitívnak bizonyultak, háromszor klónozzuk határ hígítással. Az ellenanyagok jelölése: 249.28.2.1.2.2, 247.10.2.15.4,6,

249,19.2.2.3.5 és 249.15.2.4.2.7.

X * * [♦ *

210

X

X ΦΦ *

φ*» « * * * φ «φ »* φ φ «*

36. Példa

Zalpha 11 ligandum transzgénikus egerek

A transzgénikus vektorokból (22. és 26, Példa) származó DNS fragmenseket amik a megfelelő promoter (MT-1 máj-speciflkos promoter (egér zalphall ligandum (268. példa) vagy a limfoíd-speeifikns LCK promoter (egér és humán zalphall ligandum (28A,és 228, példák), a patkány Inzulin II i.ntron, a zalpha 11 ligandum cDNS és a humán növekedési hormon poli A szekvenciája 5‘ és 3‘ határoló szekvenciáját tartalmazzák, használjuk megtermékenyített B6C3fl (Taconic, Germantown, NY) rágcsáló oocitákba való mikroinjekciózásra, standard mikroinjekciőzási protokoll alkalmazásával (Hogan, B. és munkatársai; Manipulatíng the Mouse Embryo,. A Laboratory Manual Cold Spríng Harbor Laboratory Press! 1994)),

A 44 utód közül nyolc olyan transzgénikus egeret találtunk, amelyek a llmfoid-specífikus EuLCK promoterről humán zalphall ligandumot expresszálnak. Ezek közül az egerek közül 4 elpusztult, 4 elérte a felnőtt kort. Az expresszió szintje meglehetősen alacsony volt ezekben az állatokban. 77 utódból húsz transzgénikus egeret .azonosítottunk» amik a limfoidspecifikus EpLCK promoterről expresszálták az egér zalphall ligandumot. Mind a húsz elérte a felnőttkort. Az expresszíó szintje meglehetősen alacsony volt ezekben az állatokban. 66 egér közül három transzgénikus egeret azonosítottunk, amik a májspecííikus MT-1 promoterről expresszálták az egér zalphall ligandumot. Ezek közűi az egerek közül kettő elpusztult, 1 elérte a felnőtt kort. Az expresszié szintje meglehetősen alacsony volt

ΦΦ φφ

211 φ *

ΦΦΧ **' φ

ΦΦ* ΧΦ χ -Φ Φ ·* X * * φ« ezekben, az állatokban, Szőveleket izoláltunk, és az alábbiakban ismertetett módon hísztológiailag vizsgáltuk,

B._A transzgenikus egerekből származó szövetek

A humán és egér zaiphall ligandumot expresszáio transzgenikus egerekből (36A. példa.) lép, csecsemőmirigy és nicsen feric nyirokcsomókat gyűjtünk, és előkészítjük hisztológiai vizsgálatra. Más, rutinszerűen gyűjtött szövetek a következők: máj, szív, tüdő, vese, bőr, emlőmirigy, hasnyálmirigy, gyomor, vékony- és vastagbél, agy, nyálmirigy, hörgő, nyelőcső, mellékvese, hipofízis, szaporító szervek, kiegészítő hím ivarmirigyek, vázizom, beleértve a perifériális idegeket, valamint a comb-csontot a csontvelővel. A szöveteket váratlanul elpusztult újszülöttekből, valamint néhány felnőtt transzgenikus egérből vesszük, az előzőkben ismertetett módon, A mintákat 10%-os puffereit íbrmalinban fixáljuk, rutinszerűen feldolgozzuk, paraffinba ágyazzuk, 5 mikronos metszeteket: készítünk, majd hematoxilinnel és eozínnal festjük, A lemezeket megvizsgáljuk, és a szövetek elváltozásának súlyossága alapján értékeljük •fO-nincs, 1 -enyhe, 2~közepes, 3-súlyos}, tapasztalt állatorvosi patolőgusok csoportját kérve fel erre a. feladatra, akik feladatukat

A humán zalphal 1 ligandumot expresszálő kölykök és a 2 felnőtt egér, valamint a 6 felnőtt, egér zalphal 1 ligandumot expresszálő egér közül 3 gyulladásos beszűrőd esek et mutatott számos vizsgált szövetben. Az érintett szövetek valamennyire változtak egérről egérre, A gyulladásos beszürődés elsődlegesen különböző számú és arányú neutrofílekct és makrofá.<okat

212 φ Φ«Χ* *

Φ: Φ Φ ν Φ

ΦΦ* Φ * * ♦ φφ tartalmazott, súlyosságuk a közepes és erős között változott. Emellett ezeknél az állatoknál a limfoíd -szervekben is volt változás, beleértve a közepes-súlyos llmfopéniát a lépben és a csecsemőmirigyben (humán és egér zalphal 1 transzgeniknsok}; és a súlyos limfopéníát (humán zalphall ligandum transzgenikusok), vagy a közepes vagy súlyos gennyesedést okozó pyogrannlomatous limphoadenitíst (egér zalphal 1 ligandum transzgeniknsok) a nyirokcsomókban. Emellett a lépőkben a megnövekedett extramedulláris hematopoíézís is evidens volt. Ezek a változások nem figyelhetők meg az azonos korú kontroll

C. A zalphall ligandumot túlexpresszálö transzgenikus egerekből származó szövetek áramlási eitometriás elemzése

A humán vagy az egér zalphall ligandumot tűlexpresszáló transzgenikus állatokat (36A. Példa) a perifériális vér, csecsemőmirigy, nyirokcsomó, csontvelő és lép áramlási eitometriás elemzéséhez leöljük.

A lépből, a csecsemőmirigyből és a nyirokcsomóból sejtszuszpenziókat készítünk, oly módon, hogy a szerveket jéghideg tenyésztő táptalajban (5ÖÖ ml RPMI 1640 Médium (JRH BiOvSCiences, Lenexa, KS); 5 ml lööx L-glntamín (Gibeo BRL, Grand Island, NY); 5 ml lööx nátrium-piruvát (Gíbco BRL, Grand Island, NY); 5 ml lOÖx penicillin, sztreptomicin, neomicin (PSN) (Gíbco BRL, Grand Island, NY)), csipesszel szétszedjük, majd a sejteket óvatosan átnyomjuk egy sejt „szitán” (Falcon, VWR Seattle.WA). A perifériális vért (200 ml} heparinozott csövekbe gyűjtjük, majd 10 milliliterekre hintjük lö E/ml heparint tartalmazó HBSS-sel. Az eritrocitákat hipotóniás lízisscl ψφφ» *

Λ»

213

Φ *♦.*

Φ * *** ΦΦΧ

Φ * *ΦΧ χφφ χφφ φ Φ eltávolítjuk a lépböl és a perifériális vérkészítményekből. A csontvelő sejtszuszpenziókat úgy állítjuk elő, hogy a combcsontokból jéghideg tenyésztő táptalajjal kimossuk a csontvelőt. Á sejteket megszámláljuk, majd Tripan Blue-val (Gib ters te’ ) vizsgáljuk az jéghideg festő közegben (HBSS, 1% borjúmagzat szérum, 0,1% nátriumazid'j újra sznszpendáljuk, tíz millió sejt per milliliter koncentrációban, Az Fc receptornak és az ellenanyagoknak a sejtekhez való aspeciíikus kötődését űgv érjük el, hogy 10% normál kecskeszérumot és Fc Block-ot (Pharmingen,. La doha, CA) adunk a sejtszuszpenziuhuz.

A sejtszuszpenziókat azonos térfogatú, Suorokrőmmai jelzett. monoklonális ellenanyaggal (Pharmingen) keverjük össze, majd 60 percig jégen tartjuk, utána kétszer mossuk jéghideg mosópufferrel (PBS, 1% borjűmagzat szérum, 0,1% nátrium.azid), mielőtt összekeverjük 400 milliliter mcsőpuílérret ami 1 mg/ml 7-AAD>t tartalmaz (Molecuiar Probes, Eugene, OR), ami néhány mintában az életképesség markere. Az áramlásiadatokat egy FACSCalibur áramlási citométerrel (BD íntmunocytometry Systems, San Jose, CA). kapjuk meg. Az adatuk előállításához és elemzéséhez a CellQuest programot használjuk (BD Immonocytometry Systems).

A humán vagy az egér zalphall ligandumot a legmagasabb szinten expresszálo transzgenikus állatok drasztikusan megváltozott sejtpopulációkat tartalmaznak az összes elemzett limfoid szervükben, A megfigyelt változások közé tartozik a timnszus céllularítás, a CD45R. pozitív B-sejtek teljes hiánya, valamint a lép megnövekedett mérete és ceüularitása. Mind a lépben, mind a csontvelőben megnőtt a mieloid méretű sejtek száma, ami mind a

214 ** ; φ * *

ΦΧΧ 0«* * * 0*0 φ 0 0 0 J * *

X*X X00 * ♦* * * 0 .0 w* monociták, mind a nentrofilek száma növekedésének számlájára írható. A működd NK sejt marker (DX5) számos populációban megnőtt. A közepesen expresszáló alapítókban kevésbé drasztikus, de még szignifikáns változások figyelhetők meg, amik összhangban vannak a magasan expresszálőknál megfigyelt fenotípussal. A legalacsonyabb expressziét mutató egerekben sem a mieloid sejtek száma nem nő meg szignifikánsam sem a B-sejtek száma nem csökken szignifikánsan. Ezek valóban szignifikáns változásokat mutatnak a fímocifa populációkban, amikben csökken a CD4+CD8-r dupla pozitív sejtek száma, és növekszik mind a CD4 mind a CDS egyszeresen pozitív sejtek száma.

Tisztított rekombináns humán zalphall ligandum fehérje dózisválasz vizsgálat egerekben

A._Összefoglalás

Normális hathetes nőstény C57B1/8 (Harlan Sprague Dawley, Indianapohs, IN) egereket kezelünk naponta egyszer intraperitoneális injekcióval, négy vagy nyolc napig, a tisztított rekombináns humán zalphall ligandum (24. Példa) fehérje négy· dózisszintjéből egygyel, 0,1, 0,5, 5 vagy 50 pg/egér/nap dózissal, vagy csak. hordozóval mint kontrollal. A testsúlyokat és a testhőmérsékleteket naponta meghatározzuk.. A negyedik vagy kilencedik napon mindegyik fehérje kezelési csoport esetében a nyolc egérből négyet, és a hordozó kontrollt képező tíz egérből ötöt leülünk. A vért, csontvelőt és a szöveteket összegyűjtjük és elemezzük, Vizsgáljuk a potenciális zavarokat a límfoid szövetekben, valamint vizsgáljuk a generális fiziológiás és toxikológiai paramétereket.

Sí* * > *Φ “ί φ*

Nincs bizonyíték arra, hogy a zalphall ligandum fehérje toxikus lenne akármelyik vizsgált dózisban.. A testsúlyok és a testhőmérsékletek nem változtak. Nincs látható változás a klinikai kémiai paraméterekben. Azonban nincsenek konzisztens megfizeti egerekben a hordozó kontrolihoz viszonyítva a mieloid sejtvonalak megnőtt százalékára utalnának a csontvelőben, a lépben és a perifériális vérben, A magas dőzísű csoportnál a léphoniogenízátum áramlási eltörne inai elemzésével azonosított mieloid származásra, utaló méretű sejtek statisztikailag szignifikáns növekedése figyelhető meg. A két legmagasabb csoport lépje! statisztikailag szignifikánsan nagyobbak, mint a többi csoportban., A h.isztopatológiai vizsgálatok során azonban a legmagasabb dóziscsoportban az extrám eduüáris faematopoiézisnek csak marginális növekedése, figyelhető meg. Statisztikailag szignifikáns növekedés volt a csontvelő mieloid-eritroid arányában a legmagasabb dóziscsoportban, a többi csoporttal összehasonlítva. Végezetül, a perifériális vérben a fehér vérsejtek össz-számának és a monoeiták százalékának növekedése figyelhető meg, ugyanabban a csőik Dozírozó oldat készítése

A tisztított rekombináns humán zalphal 1 hgandumot (24. példa) steril foszfáttal pufferelt sóoldatban (Gibco BRL, Gaithersburg, M.D) hígítjuk, olyan koncentrációban, hogy 50, 5, 0.5 vagy 0,1 mikrogramm fehérjét vigyünk be 0,1 ml foszfáttal pufferelt sóoldat hordozóban. Ezeket az első négy nap alatt használandó dózisokat a 0, napon készítjük el, és -70 °C-os mélyhűtőben tároljuk felhasználás előtt. Az 5-8. napon használandó dó2:6 χ χχ X X· Φ Φ♦

X *

Φ«φ *»*

X * φΧ·* «ί» y ΦΧ

X- * φ X Φ** « X X Φ Φ * X·*

X X * * X * χΑ zisokat az 5. napon, készítjük el, és az előzőkben ismertetett módon lefagyasztjuk. Ugyanabból a foszfáttal puffereit sóoldatból .alikvot részeket, fagyasztunk le, a hordozóval kezelt .kontroll csoporthoz. A beadás napján a megfelelő alikvot részeket megolvasztjuk, és az oldatból naponta 0,1 millilitert intraperiioneálisan injekciózunk az egerekbe, négy vagy nyolc napig.

C. Kísérleti terv

A kísérlet kezdetén az egerek hathetesek voltak. Mindegyik kezelési csoportban nyolc egér van, a hordozó kontroll kivételével, amiben 10 egér van. Minden kezelési csoportban az egerek felét négynapí kezelés után leöljük, a másik felüket pedig nyolcnapi kezelés után.

testhőmérsékletüket, feljegyezzük egy Porfahfe Notebook Systemmel (BMDS, Inc. Maywood, NJ), a szubkntán beépített transzponderekbol kiolvasva az egerek azonosítási számát, és testhőmérsékletét (IPTT-WG, BMDS, Mavwood, Nd),

A leölésnél szöveteket gyűjtünk, hogy áramlási cítornetriás elemzéssel megállapítsuk a fehér vérsejt populációt, beleértve a csontvelőt, a csecsemőmirigyet és a lépet. A timföld szervek és a csontvelő PACS elemzését FACSCalibnr-ral hajtíuk végre (Becton

Díckinson, Mansfield, MA). A fehérje toxícitása jeleinek hísztoiógíaí vizsgálatához a következő szöveteket gyűjtjük: lép, csecsemőmirigy, máj, vese, mellékvese, szív és tüdők. Mindegyik, hisztolőgiához fixált szövetet éjszakán át 4 ^s€~on tartunk 10% normál puffereit sóoldatfoan (NBF) (Surgipath, Richmond, ILI. Á következő napon az NBF-et. 70% etanollal helyettesítjük, és a szöveteket a hisztológiai feldolgozásig visszatesszük 4 ^öC~ra.

ί ί4 * **« ♦ * χ·** *

»*♦ <

♦« ♦♦ «

A szöveteket feldolgozzuk, majd laboratóriumunkban Hcmaioxllinnel és Eozinnal festjük, azután egy szerződéses patológwshöz küldjük, hisztopatológiai elemzésre. Vért veszünk, hogy meghatározzuk a teljes vérsejt számot (CBC) és a szérumkémia profilokat. A CBC-ket saját laboratóriumunkban elemezzük a Cell Dyn 3500 Hematölogy Analyzerrel (Abbott Diagnostics Divísion, Abbott Park, IL), majd a manuális differenciális fehér vérsejt számokat a Phoenix Central Laboratory-ban (Evezett, WA) elemzik, A szérumot -20 °C-on tartjuk, amíg a Phoenix Central Laboratory-ba nem szállítjuk komplett szérumkémiai elemzésre. A mieloidreritroid arányok meghatározásához az egyik combcsontból származó csontvelőt CytoSpin lemezekre visszük (CYTOSPIN 3 CYTOCENTRIFUGE and CYTO SLiDES, Shandon,

Pittsburgh, PA), majd elemzésre a Phoenix Central LaboratoriesA humán zalphal 1 ligandum 50 pg/nap, vagy alacsonyabb dózisaiban nincs látható klinikai jele a fiziológiás hatásoknak vagy a toxieitásnak. A testsúlyok és a testhőmérsékletek a kezelés során normális értéken maradnak. A szérumkénüaí paraméterek a normális tartományban maradnak, A vörös vérsejtek száma és a vérlemezkék száma normálisnak tűnik. A 8 napig 50 pg/nap dózist kapó egerekben a monociták száma megnőtt a perifériális vérben, és nyilvánvaló növekedés látható a fehér vérsejt számokban. Az egy’' eombesontből kimosott csontvelőben a míeloid: eritroid. arányok megnőttek az 50 ug dőzisesoportban, és kisebb mértékben az 5 ug-os dóziscsoportban, a nyolcnapos dőzíscsoportban. Az InSiat használatával egy nem-paraméteres

218 φ φ φφφ Φ φ φ * ♦ ΦΦ φφφ φ

φφφ Φ»Φ

ΦΦ φ » Φ ♦ Φ*φ X *

X Αφ φ φ Φ * Φ *4C Φ* oszlopos összehasonlításban (InStat MAC; GraphPad Software, Inc, San Díego, CA) ez a. különbség statisztikailag szignifikáns volt (p~0,Q049). A legmagasabb dóziscsoport és a hordozó közötti különbség is szignifikáns (p-0,236), A perifen.ális vérben a niegnövekedeit fehér vérsejt szám és a csontvelőben a míeloid prekurzorok szignifikáns növekedése tehát kapcsolatban állhat.

Az alábbi szövetek hisztológiai kiértékelése nem mutat nyilvánvaló bizonyítékot a citológiai vagy strukturális változásokra, mitotikus eseményekre vagy nekrőzlsra: csecsemőmirigy, máj, vese, mellékvese, patkóbél, hasnyálmirigy, éhbél, vakbél, vastagbél, bélfodor nyirokcsomók, méh., petefészek, nyálmirigy, szív, hörgők, tüdő és agy. Nincs nyilvánvaló különbség a csoportok között a csecsemőmirigy, a. vese, a máj vagy az súlyában. Az összes vizsgált szövet közül csak a lépek v< szignifikánsan érintettek.

Mindegyik iépsúlyt az adott egér agyának súlyára normákzáljuk. Az 5(3 pg/nap kezelési csoportban, a hordozóval, a 0,1 pg és 0,5 pg kezelési csoporttal összehasonlítva a iépsnly közel 50%-kai nagyobb a kezelés négy napja után, és köz 100%-kai nagyobb a nyolcnapos kezelés után. mint a másik három csoport átlagos lépsúlyai. A négynapos kezelési csoportban az 5 pg/nap csoport is hajlamos volt arra, hogy nagyobb legyen a lépe, mint a kontroll és alacsony dóztsű csoportoknak, A lép/'agy súlyok különbsége a négynapos és nyolcnapos kezelési csoportok adataival kombinálva a kezelési csoporttal, statisztikailag szignifikáns volt íp~O,0O72) a Kruakail-Waliace nem-páráméteres ANOVA-val, több oszlopos összehasonlításban, az InStat program használatával (GraphPad Software), atiaga

219 ♦ φ» χφ* *>}* »»#* «ί* »

X β **

X * * *

Az extramedulláris hematopoiézis marginális növekedése, különösen a vörös pulpában, látható a legmagasabb dóziscsoportba. tartozó egerek lépében, még a négy napig kezelt egerek esetében is. A lépek áramlási eitometriai elemzése szignifikáns növekedést .mutatott a mielold méretű sejtek arányában a legmagasabb dóziscsoportban (pxö_s01, Student tele t-teszt), ami mind a monociták, mind a neutrofilek számának növekedését h isolalban állhat a megnövekedett perifériális

Ez a mononukleárís sejt százalékával, valamint az előzőkben ismertetett, a mieloid prekurzorok nyilvánvaló növekedésével a csontvelőben.. Emellett a humán zalphall gén inszerelójával kapott franszgenikus egerek növelték a gerincvelőn kívüli (extramedulláris) hematopoiézist a. lépekben, a nem-transzgemkus alomba tartozó egerekkel összehasonlítva.

Számos eltérés volt. megfigyelhető az 50 ug per nap dózis csoport esetében a kontroll csoporttal összehasonlítva, ami azt mutatja., hogy a zalphall ligandum szerepei játszik a mieloid leszármazási vonalba tartozó .sejtek termelésében vagy ben. Összegezve, a megfigyelt változások azt sí

zalphall hasznos terápiás fehérje lehet az olyan olyan orvosi problémákban, mint például a rák és az itt Ismertetett Immuno38, Példa

A tisztított rekombináns humán zalphall ligandum fehérje előzetes elimínálásl és szöveteloszlási vizsgálata

A, Összefoglalás

Ahhoz, hogy kiderítsük a tisztított rhzalphall ligandum szöveti eloszlását és eliminálása mintázatát, egy előzetes fannako220

I * * * Ο·:*.

* » * ·*·*|· « X X $9·$ « * » * * <- * »« *» kinetikai vizsgálatot végeztünk. Kiienchetes hím C37B1/8 egereknek ^H1Indiummal PⁿIn) (New Bngland Nuclear, Boston, MA) jelzett, tisztított rekombináns humán zalphall ligandum fehérjét adunk be, a három kiválasztott beadási mód közül az egyik alkalmazásával. Egyetlen feolus injekciót adunk minden egyes egérnek, vagy intravénásán (IV), intraperitoneállsan (IP), vagy szubkután (SC). A szubkután vagy intraperl.toneális· injekciót kapott egereket az injekcíőzás után vagy 10 perccel vagy egy órával leöljük. Vért, plazmát és kiválasztott szöveteket gyűjtünk' a különböző időpontokban, majd gamma számlálóval mérjük, hogy megbecsüljük a kívülről bevitt, jelzett fehérje hozzávetőleges felezési ideiét és szövetelosztását. A ;

szöveteket, valamint a leölés időpontját azon az alapon választjuk ki, hogy más, radioaktív izotóppal jelzett citokmék eloszlásáról mát publikáltak.

A leöléskor a radioaktivitás megmérésére kiválasztott szövetek, közé tartozik a csecsemőmirigy, a lép, a vese, egy májlebeny, egy tüdőlebeny, valamint a húgyhólyag. Az intraperitoneális Injekciót kapó csoportban a belet is megszámláljuk, hogy megbecsüljük a hétbe való injekciózás gyakoriságát, valamint a szubkután injekciózott egerek esetében az injekciózás területén a bőrt és az alatta levő struktúrákat, is megszámláljuk. A teljes máj és tudó cpm-et egv olyan metszetből számítjuk ki, amit megszámláltunk, beszámítva a metszet által reprezentált teljes szerv teljes súly százalékát.

Az összegyűjtött. szövetek vizsgálatának befejezése után a teljes vért és a plazmát COBRA 11 AUTÓ-GAMMA gamma-számlálóval (Packard Instrumcnt Company, Merlden, CT): számláljuk meg. Az eredeti jelzett dozírozö oldat egy alikvot részét is megt *

Χ4« « * * * «»£» számláljuk a szövetek vizsgálatának végén. Ebből kiszámíthatjuk az egyes egerekbe injekciózott összes radioaktivitás százalékát, és az összes beütésszám egyidejű korrekcióját, ami a radioaktív bomlásból következik.. A megmaradt vér térfogatának és szervsüIvóknak a becslése azt mutatja, hogy a beadott beütésszám többségével el lehet számolni, és ennek következtében a szövet per beütésszám ésszerű reprezentációja, a beütésszám eloszlásának, a jelzett zalphal 1 ligandumnak az egyes különböző utakon

B. A zalphal 1 ligandum jelzése ^u Ondiammal

A tisztított rekombínáns humán zalpha Π ligandumot (29.

Példa) tízszeres mólfölöslegben levő DTPA-val (Plerce, Rockford, IL) konjugálfcatjuk, 30 percig foszfáttal púdereit sóoldatban inkubálva szobahőmérsékleten. A nem reagált DTPA-t és a hidrolizátumokat pufferesercvel távolítsuk el egy Biomax-ök NMWL-en (üllraíree-15, MÜlipore, Bedford, MA). Az üres térfogatban levő fehérjecsúcsot 5 mg/ml-re koncentráljuk, majd ebből egy alikvot részt veszünk kp hogy egy bioesszében megvizsgáljuk (rágcsáló B-sejtek anti-CD40 stimulálása (44. példa)). Annak igazolása után, hogy a DTPA konjugátumnak még megvan a teljes biológiai aktivitása, a konjugátumot 0,5 mg/ml-re hígítjuk 1 mol/1 nátrium-aeetáttal (pH-6,0). Két mCl * ⁿIodium-oí veszünk fel 0,5 ml 1 mol/1 nátrium-acetátban (pH~6,0)_t majd 20 percig szobahőmérsékleten DTPA-humán zalphal 1 ligán dummal keverjük -össze. A be nem épült ^míndíumot eltávolítjuk. egy foszfáttal pufíerelt sóoldatra való pnffercserével íPD-10 oszlop, Pharmacia, Piseataway, NJ). A radioaktív izotópoal jelzett anyagot meghigitjuk jelöletlen humán- zalphal 1 Hgan-dummat. hogy 100 mCl/mg specifikus ak* * «*** e *

Λ * * 'Φ $ *

Φ * *·♦* * ΛΦ ♦*$·<

φτ φ

fivítást kapjunk, sterilre szúrjuk, majd éjszakán át 4 °C-on tartjuk. A jelzett fehérje 100 százaléka fennmarad a Blomax~5k NMWL membránon (Milliporef A jelzett ⁿhndinm-zalphall ligandnmot adjuk be egereknek az elímináciős és farmakokinetikai vizsgálatok során. 50 pg humán zalphall ligandum fehérjét jelzünk 5 «.Ci jelzett humán zalphai 1 ligandummal 0,1 ml foszfáttal puffereit sóoldatban, és ezt adjuk be az egyes állatoknak.

C. Az előzetes eloszlási vizsgálat eredményei

A mindhárom beadási úton elvégzett beadás után egy-három órával a ¹¹ dndíum-humán zalphall ligandum legmagasabb koncentrációját a vesében találtuk, a második legmagasabb koncentrációt a vizeletben és a húgyhólyagban találtuk, amit az igazol, hogy ezeknél a szöveteknél legmagasabb a cpm. A vesékből kinyert átlagos beütésszám S-8~szor magasabb mint a má|han mért teljes beütésszám, az injekció beadási módjától és a leölés időpontjától függően. Például intravénás injekciózás után 60 perccel az átlagos vese beütésszám 4,5-ször magasabb mint az ugyanebbe a csoportba tartozó teljes májakra számított átlagos beütésszámok. Abban, a csoportban, amit az intravénás beadás után öltünk le, a legmagasabb cpm ismét a vesében mérhető, és a második legmagasabb felhalmozódás egyforma a májban, a húgyhólyagban és a vizeletben,

Vért és plazmát gyűjtünk a mindhárom beadási úton végzett injekciózás után 10,. 30 és 60 perccel. Az intravénás injekciózási út után egy külön egércsoportból vér- és plazmamintákat veszünk két, öt és tíz pere elteltével· Egy másik β»« β * « » *.,_β» ’«ί> » «ί *.

egércsoportből, amelyik intraperitoneális vagy szubkután Injekciót kapott egy, két és három óra elteltével vérmintát veszünk, A kezelési csoportokat lásd a 8. táblázatban. A rövid mintavételi idők zárójelbe teszik .az interleukin-2 publikált felezési idejét az intravénás injekció után. A publikált TI/2 2.5-5,1 perc. Az- interleu.kin-2. in orno beadásával kapott eredmények a szakirodalomban megtalálhatók {Donohue, JH és Rosenherg SÁ: J. of Immunoi. 130, 2203 (198311. A hosszabb időtartamokat választjuk ki, hogy körvonalazzuk a várt eliminációs fázist.

6. Táblázat

Az injekció beadási módja	A vérvétel időponttá (perc)	A leölés időpontja
1, intravénás csoport	2, 5, 10	10 perc
2. intravénás csoport	10, 30, 80	80 perc
1. íntraperitoneálís csoport	18, 30, 60	60 perc
2. intraperitoneális csoport	60, 120, 180	ISO perc
1. szubkután csoport	10, 30, 60	60 perc
1 2. szubkután ( csoport	60, 120. 180	180 perc

A jelöletlen mierleukm-2-röl kimutatták, hogy egerekben intravénás injekció után a szérumból körülbelül háromperces felezési idővel eliminálódik (Donohue, JH és Rosenherg SA: J. of φφφΧ »Χ*Ψ * φφ

ΦΧΦΦ Φ Φ Φ <

Immunoi. 130, 2203 (1.983)t Α intraperitoneálís és szubkután injekciózás után az interleukin2 aktivitás fennmaradásának időtartama a szérumban 2 egység/ml-ről 30 percnél rövídebb, az intravénás injekciózást követően nagyobb mint 2 egység/ml-ről 2 óra, és szubkután infekcíózást követően 6 óra. Úgy tűnik., hogy az interleufcto-2 kiürülésének fő útvonala a vese. A zaiphall lígandumről kimutattuk, hogy szerkezetileg hasonlít az interIeukin-2-re, amint azt az alábbiakban tárgyaljuk. A zaiphall előzetes kiértékelése konzisztensnek tűnik az interleukin-2veséken keresztül való kiürülésével, annak alapján, hogy ebben a vizsgálatban a cpm főleg a vesékben halmozódik fel, ezt követi a húgyhólyag és a vizelet.

Megbecsültük a farmakokinetikai paramétereket, a plazmából kapott, cpm adatok k.ompartmentális elemzése alapján, a WinNonLin PK elemzési program 1,1-es verziójának használatával (Scientífic Consulting Inc., Cary, NC). A zaiphall ligandum plazmában való felezési idejét egy 50 ug-os dózis intravénás, szubkután és intraperitoneálís s;

meg terminális elimináciős sebességi konstans használatával becsüljük meg, A farmakokinetikai eredmények becslések, mivel korlátozott számú mérési pont van a plazma koncentráció versus idő profilok terminális elimináciős régiójában. Emellett, a szubkután és az intraperitoneálís beadás terminális elimináciős fázisa illesztéséhez, szükség van az azokból az időpontokból származó adatokra, amiknek során a * ^In-humán zaiphal l ligandum abszorpciója még láthatóan fennáll. Azonban az intravénás, szubkután és intraperitoneálís dózisok után a felezési idők becsült értéke 13,6 perc, 18,8 perc és 34,3 perc. Mh a előz is* * φ χ » φ * φ « * * * *

Λ.χ ΦΧΦ Φ φ «ΧΦ X Φ ' .·· φ Φ ΦΦ«Φ φ Φ φ Φ ν’Φ'·. ΧΦΦ φ X* ** tartományt nem értékeltük ki, ezért nem telítési vagy aktív elimináció (Michaelis elő. Ezért ezek a felezési idő számítások csak anvaío, hogy a fordult

A jelzett fehérje biológiai elérhetőségét a görbe alatti terület alapján becsüljük meg, a szubkután vagy íntraperitoneálls beadást hasonlítva össze az intravénás beadással. A szubkután és íntraperitoneálls injekeiózás után becsűit biológiai elérhetőség 35,8% illetve 63,9%, Mivel csak egyetlen fehérjét tanulmányoztunk, ezért a biológiai hozzáférhetőséget nem értékeltük ki a dózis függvényébern A becsült kiürülés és eloszlási térfogat (az intravénás injekeiózás adatai alapján.) 0,48 ml/perc és 6,1 ml.

Bár az adatok csak előzetesek, az intravénásán beadott zalphall lígandum sorsa hasonló ahhoz, mint amit az interleukin-2-rc publikáltak, ami szintén egy 4-hélix koteges citokin (Donohue, JH és Rosenherg SA: d. of Immunok 130, 2203 (1983)1, Az ínterleukín-2-höz hasonlóan az intravénásán beadott zalphal 1 ligandum felezési ideje a plazmában csak percekre tehető, és a kiürülés fő helye a vese. Az injekeiózás után három, órával a veséből extrahált jelzett legnagyobb része még fennmarad egy Biomix 5K NMLW (Millipore Corp., Bedford, MA) membránon. Mivel korábban már leírták, hogy az indíurn a fehérjéhez kapcsolódva marad még. a lizoszómális degradáció során is (Stand, F. és mtsai: 3. Pharmaceutical Sciences 88, 577-585 (1999)1, a zalphall lígandum akkumulálódik és lebomolhat a vesében. A jelenlegi vizsgálat azt is kimutatta, hogy a számos más fehérjénél - beleértve az interleukín-2-t is - megfigyelt módon az intraperítoneális és a szubkután beadás szignifikánsan megnöveli a zalphall ligandum plazmaszintjét.

«««* X 00 00

Μ 0 * 0 « <

0*0 0 00 ♦ χ Χ 00 0 X « 0 0 0 X « X 0 « 0

0 0 X X 0 0 « 0 «0

A friss humán, csontvelő MNC CD34+ frakció izolálása és álása zalphall ligandum alkalmazásával, az NK aktivitás sere

A -CD34* sejtek szeiekcíóia és izolálása humán csontvelőből

Friss humán csontvelő mononukleáris sejteket (MNC) készítünk, hogy dúsítsuk az NK sejt aktivitással rendelkező sejteket. A friss humán MNC-ket a Poíetíc Technologies-től (Gaithersburg, MD) kaptuk. 10 ml alfa MBM-et (JRH, Lenexa, KS), ami 10 % HIA FBS-t (Hydone, Logan, OT és 1% FSN antibiotikumot (Gibco BRL, Grand Island, NY). tartalmaz, adunk a sejíszuszpenzióhoz, majd a sejteket egy 100 am-es szitán bocsátjuk át. A sejteket azután megszámláljuk, ülepítjük,, mossuk 10 ml, 2% FBS-t. tartalmazd foszfáttal puffereit, sóoldattal, majd ismét ülepítjük, és 1. ml, 2% FBS-t tartalmazó foszfáttal puffereit sőoldatban szuszpendáljuk, A CD34 sejtfelszíni markerrel rendelkező sejteket (CD34+ sejtek) mágnesesen választjuk szét, egy Detachahed kit használatával, Dynabeads M-45Ö CD34gyei (Dynal, Oslo, Norvégia), a gyártó- utasításai szerint. Mind a CD34->-, mind a CD34- sejtek frakcióját tovább elemezzük az alábbiakban.

B.

val .^x., ligandum használataBgy CD34a frakciót szélesztünk e.gy 24-lu.kas lemez négy Inkába. 500ÖÖ pozitívan szelektált sejtet szuszpendálunk i ml Alpha MEM-ben (JRH, Lenexa, KS), ami 10 % HJA FBS-t (Hyclone, Logan, UT) és 1% RSN antibiotikumot (Gibco BRL, Grand Island, NY), plusz az alábbiakban ismertetett különböző φ * ΧΦ χφ φ ♦ * Φ χ * Φ

ΦΦ» ΧΦΦ φ φ φΛΧ φ Φ φ φ φφφφ φ φ φ φ «« Φ Φ Α Φ φ χ φ φφ citokineket tartalmazza, és a négy lukba szétosztjuk (1-4). Különböző- reagenseket használunk a CD34+ szelektált csontvelő MNCk zaiphal l ligandummal Indukált expandálásának vizsgálatára: A reagensek közé tartozik a humán fit3 (R&D, Minneapoiis, MN); tisztított humán zaiphal l lígandum (30C. és 30D. példa); humán mterleukín-15 (RND). A Ö. napon a reagenseket az alábbiak szerint kombináljuk: A #1 lukba 2 ng/ml humán íltS-at adunk. A #2. 2 ng humán flt.3-at és 15 ng/ml tisztított humán zaiphall ligándumot adunk.. A #3 lukba 2 ng/ml humán fltS-at és 20 ng/ml humán interleukin-15-öt adunk, A #4 lukba 2 ng humán ílt3-at, 15 ng/ml tisztított humán zaíphal 1 Hgandumot, és 20 ng/ml humán interleukin-15-öt adunk. 18 napig ínkubáljuk, majd az egyes lukakban levő sejtszuszpenziőkat ülepítjük, majd Ö/S rnl Alpha MEM-hen (JRH, Lenexa, KS) - ami 10 % HIA FBS-t (Hyclone, Logan, UT) és 1% FSN antibiotikumot (Gibeo BRL, Grand Island, NY) tartalmaz ~ szuszpendáJjuk, majd megszámláljuk, hogy megbecsüljük a CD34e sejtfrakció szaporodását. Alacsony szintű szaporodás figyelhető meg csak ft!3 jelenlétében (#1 kontroll luk), de az mterlenkin-15 vagy a zaiphall jelenléte az flí3 mellett nincs szignifikáns hatással az expanzióra (#2 és #3 lukakj. Azonban az fit3 kontrolinál magasabb expanzió evidens a #4 lukban, ami az flt3- mellett tnterleukin-15~Öt és zaiphall ligandumoí Is tartalmaz. Ezek az eredmények azt sugallják, hogy, hogy a zaiphall ligandum és az interleukin-15 szlnergikusanhat a humán CD34+ sejtpopuláció expandálására. Emellett, ennek a kísérletnek az eredményei alátámasztják azokat az eredményeket, amiket az egér zaiphall ligandummal kaptunk az egér BM esszében (21. példa).

φ φ φ X Φ X * Φ φ X X· φ Φ φ X » φ «φφ« φ φ .· « φ«φ φφ* * Φ* ** yik sejtpopulációnak vizsgáljuk az NK aktivitását, és az alábbiakban ismertetett módon áramlási citometriás elemzésnek vetjük alá (41, Példa),

Φ dum használatával, és az mter.ieu.kin~ 15 késleltetett hozzáadásával

Mind a CD34 pozitív, mind a CD3-4 negatív (CD34-) frakciót külön-külön 12-lukas lemez hat Inkába osztjuk szét (1-6). Mind a hat luk 1OOÖÖO pozitívan vagy negatívan szelektált sejtet tartalmaz 2 ml Alpha. MEM-ben URH, Lenexa, KS), ami 10 % H1A FBSt (Hycione, bogán, UT) és 1% PSN antibiotikumot (Gíbco BRL, Grand Island, NY), A használt reagensek ugyanazok, mint amiket az előzőkben ismertettünk. A #1 lukba a 0. napon 2 ng/ml humán Öt3~at adunk. A #2 lukba a 0. napon 2 ng/ml humán Ílt3-at adunk, majd Ötnapos inkubálás után 20 ng/ml humán ínterieukín-15-öt adunk. A #3 lukba a 0. napon 2 ng/ml humán íltS-aí és 15 ng/ml humán zalphal 1 ligandumot adunk, A #4 lukba a 0. napon 2 ng/ml humán ílt3-aí és 15 ng/ml humán zalphal 1 .11gandumot adunk, majd ötnapos inkubálás után 20 ng/ml humán írderleukm-15-öí adunk. A #5 lukba a 0. napon 2 ng/ml humán fltS-at és 20 ng/ml humán inierieukin-15-öt adunk. A #6 lukba a 0. napon 2 ng/ml humán flt3-at, 15 ng/ml humán zalphall ligandumot és 20 ng/ml humán inierieukin-15-öt adunk. A kísérlet kezdetétől számított 15 napig inknbáljuk, majd az egyes Inkákban levő sejteket összegyűjtjük és megszámláljuk.

A CD34+ populációban alacsony szintű szaporodás látható csak az 1113 jelenlétében (#1 kontroll luk), de az Üt3 mellett a 0. napon hozzáadott íníerleukin-15 vagy zalphall jelenléte nincs

229 « X « X «β

X 0 Λ 0 V

Χ«« »#Χ V 4 ♦»« X 0

X « X 44 X 0 * X « φ*β χ«Α X χ* «0 szignifikáns hatással az expanzióra (#3 és #5 iukak), Ha 5 nappal később ínterleukin-15-öt adunk hozzá, akkor ennek az ílt3 kontrollal összehasonlítva van valamennyi szaporodást elősegítő hatása (#2 luk a #1 lukkal összehasonlítva), és szaporodást elősegítő hatása van a zalphal. 1 jelenlétének (a #4 luk a #3 lukkal összehasonlítva). Azonban a legnagyobb expanzió nyilvánvalóan a #6 lukban van, ami az ílt3 mellett a O. naptól kezdődően tartalmaz inlerIeukín-15-Őt: és zalphal l Ilgandumot.

A CD34- populációban nem figyelhető meg szaporodás, csak az ílt3 jelenlétében (#1 kontroll luk), és tulajdonképpen a sejtpopuláció csökkenése figyelhető meg. Ha a 0. napon az fit3 melleit zalphal 1-et ís adunk a lukhoz, ennek hatása hasonló az fit3 kontroliéhoz. Az 5, napon hozzáadott interleukm-1.5 jelenléte növelte a sejtek szaporodási hatását a zalphall ligandum jelenlétében {#4 luki vagy távollétében (#2 luk), A legerősebb expanzió megint a #6 lukban volt nyilvánvaló, ami a 0. naptól kezdődően tartalmaz az fit.3 mellett mterleukin~l5~öt és zalphall ligándumot

Minden sejtpopulációnak vizsgáljuk az NK aktivitását, majd az alábbiakban ismertetett, módon FACS elemzésnek vetjük alá

40. Példa

Friss egérsejtek izolálása és expandálása humán, és egér zalphall ligandum. használatával, az NK aktivitás és az NK sejt marketek becslésére

A. Friss egér alacsony sűrűségű csontvelő sejtek izolálása és expandálása humán és egér zalphal 1 ligandum használatával

Φ » * * *♦♦X

230

Firss egér csontvelő sejteket izolálunk, oly módon, hogy az egér combcsont mindkét végét lecsípjük, majd 2-3 milliliter növesztő- táptalajjal (lásd az alábbiakban) belemossuk a eső belsejét egy gyűjtő-csőbe.. A nővesztő táptalaj 6Ö0 ml RPMI táptalaj (JRH Biosciences, Lenexa, KS); 5 ml lÖÖx L-glutamln (Gibco BRL, Grand. ísland, NY), 5 ml lOOx nátrium-piruvát (Gibco BRL): δ ml lOOx penicillin, sztreptomicm, neomicín (PSN) (Gibco BRL); és 50 ml hővel inaktivált borjúmagzat szérum (Hyelone lahoratoríes, Logan, UT). A csontvelő sejteket azután homogenizáljuk, a táptalajt töbször felszívva és leeresztve egy pipettával. A azutan ülepítjük es meg egyszer mossuk a növesztő táptalajjal, majd egy 70 mikronos szitán bocsátjuk át. Azután izoláljuk az alacsony sűrűségű mononukleáris sejteket, a csontvelő sejteket sűrűség-gradiens centrifugálásnak vetve alá, A. növesztő táptalaj 5-8 milliliterében levő csontvelő s· óvatosan 5-8 milliliter Nycoprep 1.077 Animál (Mycomed, Oslo, Norvégia) tetejére pipettázzuk egy cenfcrifugacsőben. Ezt a gradienst azután 6ööxg-vel centrifugáljuk 20 percig. Az alacsony sűrűségű mononukleáris sejteket azután a Nycoprep és a táptalaj határrétegéből gyűjtjük össze. Ezeket a sejteket azután körülbelül 20 milliliterre hígítjuk a szaporító táptalajban, majd ülepítjük és mossuk. A sejteket azután körülbelül -0,5-1,5 x lö⁶ sejt per milliliter sűrűségben szélesztjük szaporító táptalajban, egy standard szövettenyésztő palackban, majd 2 óra hosszat 37 ^eC-on inkubáljuk 5% COz-t tartalmazó atmoszférában.

Azután összegyűj tjük a le nem tapadó, alacsony sűrűségű (NA LD) csontvelő sejteket majd ö,5-2,öxlö⁵ sejt per milliliter sűrűségben szaporító táptalajban szélesztjük, ami 2,5 nanogramm per milliliter egér fítS-at (R&D Systems,

231

Φ*χΦ φ φΧ ΦΦ

Φ V Φ « Φ X

ΦΦ« X φ φΦφ Φ φ

Φ X χ*φφ « χ φ « φΧΧ ΦΦΦ * 99

Minneapolis, MN) egér í!i3-at plusz 25-50 nanogramm per milliliter humán interleukin-IS-öt (.0/-15} R&D Systems) tartalmaz, és vagy tartalmaz 50-150 nanogramm per milliliter humán zalphall ligandumot, vagy nem: és vagy tartalmaz 0,12-10 nanogramm per milliliter egér zalpha 11 ligandumot, vagy nem.

Nem volt szignifikáns expanzió a humán vagy egér zalphal 1 ligandum hozzáadása nélkül. A le nem tapadó sejtek expandáltak az egér zalphall ligandumot akár csak 0,1.2 ng/ml szinten tartalmazó tenyészetekben, valamint a humán zalphal l ligandumot akár csak 22 ng/ml szinten tartalmazó tenyészetekben. A mind a humán, mind az egér zalphal 1 ligánduniot tartalmazó tenyészetekben a le nem tapadó sejtek száma megnő a zalphal l ligandum növekvő dózisával, az egér ligandum telítési válasza körülbelül 5-10 ng/ml-nél van, a humán ligandum pedig nem éri el a telítési választ, még a legmagasabb, 200 ng/ml dózisban. Úgy tűnik, hogy a humán zalphall ligandum körülbelül 20-100-szor kevésbé hatékony az egérsejteken mint az egér zalphall ligandum. Körülbelül 5-10 nappal később a zalphal 1 ligandummal expandáltatok egérsejteket összegyűjtjük, és áramlási cítometríával elemezzük (FACSCalibur, Beeton Dickmson, Mansfield, MA), hogy meghatározzuk, hány százalékuk pozitív az NK sejt antigénekre, ahol 46% pozitív a PanNK DXS sertés markerre (Pharmingen).

Friss utódsejteket nem tartalmazó egér csontvelő sejteket (lin~) friss egér csontvelő sejtekből izolálunk, oly módon, hogy először a sejteket az alábbi ellenanyagokkal inkubáljuk: TERI 19, φ *φφ φφφ* φφ •η > \>

φ Φ Λ φ φ φ φφφ «ΦΦ Φ X ΦΦφ Φ Φ φ Φ Φ Φ £ Φ X Φ Φ * χΦΦ ΦΧ * > Χ'Φ **

Gr~l, B22Ö, MA.C-1, CD3e is Ι-Α igO, Ο

A Ηη* sejteket azután Dynabeads Μ-450 birka anti-patkány IgGvel (Dynal, Laké Suceess, NY) távolítjuk el, a gyártó utasításai szerint.

A negatívan szelektált Un- csontvelő sejteket azután az előzőkben ismertetett módon szélesítjük szaporító- táptalajban., ami vagy 2,5 ng/ml fít3-at (R&D Systems) és 25 ng/m interleukln-1.5-őí (R&D Systems); vagy fít3-at, interleukin-15-öt és egér zalphall. ligandum ligandumot tartalmaz, 2-15% BHK egér zalphall ligandum 'kondicionált táptalaj- Hatnapos növesztés után a tenyészeteket összegyűjtjük, majd NK sejt aktivitási esszében vizsgáljuk (41. Példa). Az egér zalphall ligandummal szaporodó sejtek körülbelül 2-3-szór hatékonyabban lizálják az NK sejt célsejteket (YAC-1 sejtek), mint a zalphall. ligandum nélkül szaporodó sejtek.

expandálása

Friss egér tímoeitákat izolálunk, hogy 3-8 hetes egerek csecsemőmirigyét feldaraboljuk és átnyomjuk egy szítán. A CD4CD8- ÍDN) sejteket azután negatív szelekciónak vetjük alá, a tímoeitákat anti-CD4 és anti~CD8 ellenanyagokkal (Pharmingen) inkubáljuk, majd a CD4tCD8+ sejteket DynaBeads M-450 birka anti-patkány IgG-vel (Dynal) eltávolítjuk, a gyártó utasításai szerint.

A DN egér tímoeitákat azután szaporító táptalajban szaporítjuk, ami tartalmaz még 2,5 ng/ml flr3-at (R&D Systems), 25 ng/ml interieukln-15-ot (R&D Systems) és 10 ng/ml interleukin7-et (R&D Systems), és vagy tartalmaz egér zalphal 1 ligandumot.

» * * ΦΦΦ φ

ΦΦ

U3 φ * Φ χ φ *

ΦΦΦ ΧΦΦ Φ « ««χ φ φ * Φ ΦΦφφτ φ * φ φ φ»φ ΦΦΦ ♦ φφ vagy nem, az előzőkben ismer teteit módon. Hat nappal később a sejteket összegyűjtjük, megszámláljuk, áramlási, eiíometnával elemezzük az előzőkben ismertetett módon, majd ezeket is alávetjük az NK sejt aktivitási esszének (41. Példa).

Az egér zalphall lígandummal szaporított tenyészet körülbelül 480,000 sejtet eredményezett, míg a zalphall ligandum nélküli tenyészet csak körülbelül 160,000 sejtet eredményezett, Az egér zalphall lígandummal szaporított tenyészetről kiderült, hogy 16,2%-a pozitív .a DX5 Fan NK. NK sejt antigénre (PharMingen). A zalphall ligandum nélkül szaporított tenyészet 14,6%-a volt pozitív a DXS sejtekre. A zalphall lígandummal szaporított sejtek körülbelül kétszer jobban lízálták az YAC- l NK sejt célsejteket, mint a zalphall ligandum nélkül szaporított sejtek. Az expandált sejtek nem lizáltatnak szignifikánsan egy negatív kontroll célsejt-vonalat., az BL~4~et, Ezek az eredmények azt. sugallják, hogy a zalphall ligandum szelektive expandálja a ktikus NK sejteket.

erett sebek aktivitása NK sejt citotoxicitási

A. NK se?t esszé

Az NK sejtek által közvetített célpont eitolízíst standard ⁵-*Cr-felszabadulási esszével vizsgáljuk. A megcélzott sejtekből ÍKS62 sejtek (ATCC No, CCL-243) a humán esszékben, és a YAC1 sejtek (ATCC No. ΤΪΒ-160) az. egér esszékben) hiányzik a fő hísztokompatibilitáis komplex (MHC) molekulák expressziója, ami érzékennyé feszi őket az. NK-sejtek által közvetített 'lízisre. Az.

φ X * Φ φ* * φ φ egér esszék egy negatív kon troll megcélzott sejtvonal az moraa EL4 (ATCC No. TlB-39). A K562, EL4 és YAC-1 sejti RP10 táptalajban szaporítjuk (standard RPM1 1640 (Gíbco BRL, Grand Island, NY), 10% PBS {Hyclonc, bogán, ÜT) valamint 4 mmol/1 glutamin (Gibeo BRL), 100 NE/ml penicillin + 100 MCG/mi sztreptomicin (Gibeo BRL), 50 μηιοί/ΐ β-merkaptoetanol (Gibeo BRL) és 10 mmol/1 HEPES pufiéi (Gibeo BRL), A vizsgálat napján 1-2χ10^δ megcélzott sejtet: gyűjtünk össze, majd 2,5-SxlO^s sejt/ml RP1Ö táptalajban szuszpendáijuk. 50-100 μΐ 5 mCi/ml ⁵'^!Cr-nátriumkromátot (New England Nuelear, Boston, MA) adunk közveüenül a sejtekhez, majd 1 óra hosszat 3? °C-on inkubáljuk, majd kétszer mossuk 12 ml PBS-sel, és 2 ml RPI0 táptalajban reszuszpendáljuk. Miután a sejteket egy hemocitométerrel megszámláltuk, a megcélzott sejteket 0,5-1.κ10^δ sejt/ml-re hígítjuk, és 100 u.I-t (0,5-1 xlO⁵ sejt) keverünk össze az efíéktor sej az alábbiakban ismerteteti módon.

A humán zalp sejtek aktlvitása íli3 +./- zalphall líg és flt3 + intcrleukine.Z zalphal 1 ligandummal tenyésztett izolált CD34+ humán HPC-ket gyűjtünk össze a 15. napon, hogy megbecsüljük azon kapacitásukat, hogy lízálják az MHC K562 sejteket standard ⁵¹Cr-felsza~ badítási esszében, az előzőkben ismertetett módon, majd áramlási citometriával elemezzük sejtfelszíni íeriotípusukat Amint azt a korábbi publikációk alapján vártuk ÍMrozek, E. és mtsai: Blood 87, 2632-2640 (1996); Yu, H. és mtsai: Blood 92, 3647-3057 (1998)), az íntedeukin~15 és az flt3 egyidejű adása indukálja a CDS8 sejtek kis populációjának túlnövését. Érdekes módon, bár κ«« χ φ ΧΧΦ X

X Φ « » φΧχ ΧΦΦ Φ φ φφχ φ * φ*φ « φ

».♦« Φνχ * ««» φφ φ φ X Φ * χ* * az egyidejűleg a zalphall lígandumnial és az OtS-mal tenyésztett sejtek nem expandálnak szignifikánsan, mégis szignifikáns növekedés van a sejtek össz-számáhan olyan tenyészetekben, amik •az íltS, a zalphal. 1 ligandum és az interleukin-IS kombinációját tartalmazzák (lásd a 39. példát).

Ezeknek a humán BM tenyészeteknek a sejtfelszíni fenotípasának a becslésekor a sejtek kis alikvot részeit háromszínü áramlási citometriás elemzéshez CD3-FITC, anti-C-D58-PE· és anti-CDI8-Cychrome monoklonális ellenanyaggal festjük {mindegyiket a Pharmingen állítja elő, San Diego, CA), majd egy FACSCalihur CellQuest szoftverrel (Becton Díckinson., Mountain View, CA) elemezzük. Ez az áramlási citometriás elemzés igazolta, hogy az ezekből a tenyészetekből kinövő sejtek differenciálódott NK sejtek, mivel nagyok és granulárisak, és mind a CD58-0Í, mind a CD16-ot expresszálják, és CD3- tulajdonságúak [Lanier, LL: Ann, Rév, Immunok. 16, 359-393 (1998)1. Emellett ezek a sejtek szignifikánsan magasabb effektor funkciót mutatnak, mint azok a sejtek, amik ínterleukin-15 és 013 jelenlétében szaporodtak. Pontosabban, a mindhárom cltokinben szaporodó sejtek több mint 40%-bán llzáíják a K562 célsejteket

1,5 ~ös effektor-célsejt arányban (E:T), míg az ínterleukin-15 * flt3-ban szaporodó sejtek kisebb mint 5%-bán Üzálják a megcélzott sejteket, 2~es effektor-célsejt arányban. Ezek az adatok azt demonstrálják, hogy az interleukin-15-tel kombinálva a .zalphall ligandum stimulálja az NK sejtek differenciálódását a CD34+ BM sejtekből.

€, Az egér zalphall Ugandámmal > « * * * ? νί> ·» * *»#* * * *_χ>* *♦* * ** β*

Ahhoz, hogy vizsgáljuk a zalphall ligandum hatásait a rágcsáló hematopoietikus őssejtekre, C57B1/6 egerekből származó, tisztított leszármazás-negatív (Lín-) csontvelő sejteket expandálta tünk fit3 +ínterleukln~ 15 e / - zalpha 11 ligandumot tartalmazó közegben, a 40B. példában ismertetett módon. A tenyésztés 8. napján a sejteket („effektorok”) összegyűjtjük, és megszámláljuk, majd 0,4 ml RP10 táptalajban (41 A, példa) reszuszpendáljuk, Mindegyik, zalphall ligandummal vagy anélkül expandáltaiott mintából 2 0,15 ml-es alikvofc részt (44 A. példa) sorozathígitásban háromszorosan hígítunk, két. párhuzamosban 98-lukas kerekfenekű lemezeken, mindegyik mintából 6, Iöö μΐ térfogatú lukat használva. A sejtek, megmaradt IÖÖ μΐ-es térfogatát FITC«antí-2B4 és PE-antí-DXo monoklonális ellenanyagokkal (FharMingeh) megfestjük az NK sejtfelszíni markerekhez, majd áramlási cítometríával elemezzük. Mindegyik sejtcsoport, amit :Öt3+ínterleukin~l5 tartalmú oldattal hoztunk érintkezésbe, zalphall ligandum jelenlétében vagy anélkül, a 2B4*DX^:5* sejtek hasonló frakcióját tartalmazza, ami 65-75% pozitívat tartalmaz mindkét NK markerre.

Az NK lízis esszéhez a megcélzott sejteket (YAC-1 és EL4) az előzőkben ismertetett módon ⁵ⁱCr-mal jelöljük.. A megcélzott sejteknek a hemaeitomé terrel való megszámlálása után a megcélzott sejteket 0,5-lxl0^s sejt/ml-re hígítjuk, és 100 μΐ YAC-1 vagy EL4 (0,5-lxlö⁴ sejt) sejteket keverünk össze 100 ul effektor sejttel,, majd 4 őrá hosszat 37 °C-on inkubáljuk. Az egyes Inkáknál az előzőkben ismertetett módon határozzuk meg a specifikus

Azt találtuk, hogy az üt3Mnterlenkm~15-zalphal 1 ligandum jelenlétében szaporított sejtek fokozott »** ΛΫΦφ φ * * * « »9

Χ«φ ΦΦΧ X χ χ *

Φ » βφχφ « φ X Λ

Φ Λ * X « * * φφ. χβ lítikus aktivitást mutatnak az YAC-1 célpontokkal ss •nem pusztítják el az EL4 MHC⁺ kontroll sejt vonalat). 5-ös eífekíor-eélsejt arány mellett mindhárom citokin (zalphal 1 ligandum*tlt3*íníerlenkí.n~15) í

;.O is

YAC-1 sejtek 12%-át lizáltatják, míg az ílt3*interleukín-15 jelenlétében expandáltatott sejtek az YAC-1 célsejtek 6%-át expand áltatják, A későbbi kísérletek igazolják ezt a trendet

Egy második megközelítési mód a zalpha 11 lígandumnak a rágcsáló NK sejtekra gyakorolt biológiai aktivitásának meghatározására, éretlen CD4CD8- („dupla negatív”, DNk a 40C, példában ismertetett egér tímocitákat izolálunk, majd íníerleukin-15*flt3*intérleukin~7 vagy interleukin- 15*flt3+interleukín-2 jelenlétében tenyésztjük, zalphal 1 ligandum jelenlétében vagy anélkül. A tenyésztés 6. napján a sejteket összegyűjtjük·, majd az előzőkben Ismertetett módon vizsgáljuk az NK lítikus aktivitásukat az YAC-1 és EL4 sejtekre. Azt találtuk, hogy ebben a vizsgálatban a zalphal 1 ligandum jelenlétében tenyésztett sejteknek a legnagyobb a lítikus aktivitásuk, és lítikus aktivitásuk erősebb, mint. azoké a sejteké, amiket más cítokinek jelenlétében tenyésztettünk. Pontosabban, a interleukin- 15*ílt3+mterleukin-7 jelenlétében tenyésztett DN tlmoeiták 24-es E:T mellett a YAC-1 sejtek 18%-át pusztítják el, míg az interleukinI5-idlt3+iuterIeukín-7 plusz zalphall ligandum jelenlétében tenyésztett sejtek a célsejtek 48%-át elpusztítják, azonos E:T arány mellett. Az interleukin-15*flt3*interleukin-2 jelenlétében szaporított DN tlmoeiták 6-os E:T érték mellett az YAC-1 sejtek 15% -át pusztítják el, míg az előzőkben említett 3 citokin plusz zalphal 1 ligandum jelenlétében szaporított sejtek 9-es E:T arány mellett az YAC-1 sejtek 35%-át pusztítják el. Az NK lízis esszé

X «ν« φ·

238 * » JA Φ * * ❖ « « « « φ < χ _β y * »Λ φ$ emu egy ns áramlási eitometríát végzünk a tenyésztett sejteken. Ugyanúgy, mint a csontvelő tenyészetek esetében,, a zalpha 11 ligandum szaporodást elősegítő hatása ellenére (a sejtszám. körülbelül kétszeresre nő, ha zalphall ligandnmot is adunk a tenyészethez) nem fokozta, szignifikánsan a DX5* sejtek frakcióját ía tenyészetben levő össz-sejt szám 17-20%-a az.interleukín-7-es tenyészetekben, és a tenyészetben levő össz-sejt szám 35-48% -a az íníerleukin-2-es tenyészetekben). Ezek az adatok azt foglalják magukban, hogy a z e az interleukixi-lS-tel és az ílt3-mal kombinálva fokozza a rágcsáló csontvelőből vagy csecsemőmirigyből generált NK sejtek lírikus aktivitását.

Alihoz, hogy vizsgáljuk az egér zalphal 1 ligandum hatásait az érett NK sejtekre, lépeket izolálunk öthefes C57B1/8 egerekből (Jaekson Laboratories, Bar Harbor, ME), majd maratott végű üveglemezek között eldőrzsöljük őket, hogy sejtszuszpenzíót hozzunk létre. A vörös vérsejteket az alábbiak, szerint, hipotóníás lízisse! távolitjuk el: a sejteket ülepítjük, majd a felülűszőt leszívással eltávolítjuk. Az üledéket enyhe vortexeléssel megbontjuk, majd rázatás közben 980 u.l steril vizet adunk hozzá, majd .gyorsan (kevesebb mint 5 másodperccel később) 100 ul ,10.x HBSS-t. (Gibco BRL) adunk hozzá. A sejteket azután 10 mi IxHBSS-ben reszuszpendáljuk, majd a törmeléket ügy távolítjuk el, hogy a sejteket egy nylon-hálós sejt-szitával (Falcon) távolítjuk el. Ezeket az RBC-ben szegériyített lépsejteket azután ülepítjük és MACS pufferfoen (foszfáttal puffereit sőoldat+l%BSAv2 mmol/1

Φ^-φφ: χ > * X

ΦΧχ χφφ φ φ ' * *$φ

S φ: X

EDTA) reszuszpendáljuk, majd megsza 300x10® sejtet anti-DXÓ-tel borított mágneses gyöngyökkel (Miltenyí Blotec) festünk, majd a DX5* sejteket egy MACS VS* szeparációs oszlopon pozitívan szelektáljuk, a gyártó utasításai szerint, ezzel 8,4x1 Q® DX5+ sejtet és 251x10® DX5· sejt kinyerni. A sejteknek mindegyik említett csoportját 24~Inkas lemezeken tenyésztjük [0,·67x10® sejt/luk, 2 luk per kezelési körülmény) RP10 táptalajban (41 A, példa), vagy önmagában, vagy 1} 30 n.g/ml egér zalpball lígandummal, 2) 3 ng/ml rekombináns '2 -vei

Svstems, Inc,,

O \

3j ng/m! rekombináns humán egér interleukin-15-tel (R&D Systems), 4) 30-30 ng/ml egér zalphal 1 lígandummal és hlL-15tel, vagy S) 30-30 ng/ml míL-2-vel és hIL-15-tel. A sejteket 21 óra elteltével összegyűjtjük, mossuk, majd RP10 táptalajban reszuszpendalj.uk és megszámláljuk. A sejteknek azután vizsgáljuk azt a képességüket, hogy a 41 A. példában ismertetett módon lízálják-e az ⁵ⁱCr~jelzett YAC-1 vagy EL4 célsejteket.

Általánosságban kevés NK aktivitás volt: a DX5- (nem.-NK sejtek) csoportban, de a zalpball lígandummal és hit-15-tel tenyésztett DX5* sejtek 82-es E:T érték mellett 25%-ban lizálták a YAC-1 célsejteket. Összehasonlításként megemlítjük, hogy a csak hit-15-tel tenyésztett DX5’ sejtek 110-es E:T arány mellett a YAC-1 célsejtek 14%-át lizáltatták. Ez azt sugallja, hogy a zalpha.il llgandum és az interleukin-15 együtt hat a reziduális NK1.P sejtekre ebben a sejtkészítményben. Ami a D.X5- készítményt illeti, a csak az egér zalpball lígandummal végzett kezelés nem növelte szignifikánsan effektor funkciójukat (a YAC-1 sejteket a kezeletlen csoporthoz hasonló módon lizálják), Amint az várható volt, mind az mterleukin-2, mind az interleukin-15 *

φφ φ* <· * * φφφ»» **·

X ν> >V

szignifikánsan javítja az NK aktivitását. Ennek a szintnek a legmagasabb szintjét azonban a zalphall ligandummal és hlL15-tel kezelt csoportban lehetett kimutatni (a YAC-1 sejtek 65%os lízise 3,3-as E:T értéknél; vs 45%-os lízis 4-es E:T éi hIL-15 kezelési csoportban). Ezek az eredmények együtt azt sugallják, hogy bár a zalphai 1 ligandum önmagában nem növeli az NK sejtek litikus aktivitását, de növeli az érett NK sejtek NK litikus aktivitását, ha interieukin- 1.5-tel együtt adjuk be.

gér T-seitek zalphall ligandum szg szaporodási esszében

A, Az egér sejtek rágcsáló zalpha 11 ligandum sz lása T-seit

C57B1./6 egerekből (dackson Laboratories, Bar Harbor, ME) származó T~sejteket Izolálunk egyesített szpeloncitákból és axilláris» kari, lágyéki, nyak! és bélfodri nyirokcsomókból. A lépeket maratott végű üveglemezek között dörzsöljük el, hogy sejtsen szpenziót kapjunk. A nyirokcsomókat csipesszel szedjük szét, majd egy sejt-szitán bocsátjuk át, hogy eltávolítsuk a maradékot. Az egyesített. szplenocitákat és nyirokcsomó sejteket CD8⁺ és CD4⁺ alcsoportokra bontjuk szét, két egymást követő MACS mágneses szeparációs oszlopozással, a gyártó utasításai szerint (Milfcenyí Biotec, Auburn, CA). Teljes timocitákat ís gyűjtünk ugyanazokból az egerekből.

A sejteket 3x1 Ö⁵ sejt/luk (tímoeíták) vagy 10® sejt/luk (érett

T-sejtek) sűrűségben 3 napig 37 °C~on tenyésztjük, növekvő koncentrációjú tisztított rágcsáló zalphall ligandum mellett (0-30 ng/ml) (24. és 29. példa), 98-lukas kerekfenekű lemezeken, amiket éjszakán át 4 X-on előre beborítottunk különböző kon9 * <

>41 « ·

Κ '9 9. *'

9 9 *.·' centráeiőjű anti~€D3 mAb 20 I-gyei (Fhai'Míngen), Az antí-CD3 arra szolgál, hogy a T-sejt receptorokon keresztül aktiváljuk a rágcsáló T-sejteket. Mindegyik Inkát 1 aCi ³H-timidmnel impulzus jelezzük a 2, napon, és a lemezeket 18 órával később összegyűjtjük és megszámláljuk.

Ha a zalphall ligandumot vizsgáljuk a T-sejt szaporodási esszékben, azt találtuk, hogy ko-stimuíálja az anü-CD3-aktivált rágcsáló timocítákat, ami a CD8*CXM” sejtek túlnövését (az anfíCD3*zalphal I ligandumm&t tenyésztett timociták többsége CD8’CD4 a tenyésztés 3. napján, mig a csak az anti-CD3~mal tenyésztett sejtek nem torzítja szignifikánsan ezt a fenoiípust az

5. napig) eredményezi. Nem figyeltük meg a timociták szaporodásának szignifikáns szintjét a zalphall ligandum hatására, anti-CD3 távoliétéhen.

Érdekes módon, ha az érett perifériális rágcsáló T-sejteket vizsgáljuk, hogy képesek-e reagálni a zalphall lígandum+antiCD3-ra, akkor azt találjuk, hogy csak a CD8⁺ alcsoport reagált dózísfüggö módon a zalphal 1 ligandumra, de a CD4* nem, A CD8* sejtek gyenge, de reprodukálható szaporodását is megfigyeltük (de a CD4~ sejtekét nem), a csak a zalphall ligandumra adott válaszként. Érdekes módon ez nem figyelhető meg a humán T-sejíek esetében (lásd az alábbiakban a 42B. példát).

B, Humán T-settek szaporodása humán zalphall ligandum hatására

A humán CD4* és CD8* T-sejteket a 43. példában ismertetett módon Izoláljuk PBMC-bőb A sejteket körülbelül lö⁵ sejt/luk .sűrűségben tenyésztjük növekvő koncentrációjú, tisztított humán zalphal. I ligandum. mellett (0-50 ng/ml) (24. példa), 96-lukas

242 »»» φ ΦΦ»Φ £ kerekfenekű lemezeken, amiket éjszakán át 4 °'C~on előre beborítottunk különböző koncentrációjú aníí-humán CD3 mAb UCHTl-gyel (PharMingen). Mindegyik Inkát 1 pCi ³H-timidinnel impulzus jelezzük a 2. napon, és a lemezeket 16 órával később összegyűjtjük és megszámláljuk. Az egér T-sejtekkel kapott: eredményekkel ellentétben az adatok azt sugallják, hogy a humán zalphal 1 lígandum dózisfüggő ko-stimulálja a CD4* humán T-sejteket, de a CD8* sejteket nem.

ressziólát mutatja. humán 004- sejte

A. Tisztított humán T-seitek mint zalpha l l ligandum expressziójának becslésére használunk

Teljes vért (150 ml) gyűjtünk egy egészséges humán donortól, majd 1:1 arányban összekeverjük foszfáttal puffereit sooldallal 50 ml-es kónuszos csőben, A hígított vérből 30 millilitert azután alulrétegzünk 15 ml Ficoll Paque Plus-szal (Amersham. Pharmacia Bíotech, Uppsala. Svédország). Ezeket a gradienseket 20 percig centrifugáljuk 5öt)xg-vel, majd fék nélkül hagyjuk leállni. A határrétegben, levő, RBC-ben szegényített sejteket (PBMC) összegyűjtjük, majd háromszor mossuk foszfáttal pufiereit sőoldattal. Az izolált humán PBMC hozam 200x10⁶ az alábbiakban ismertetett szelekció előtt.

A PBMC-ket 1,5 ml MACS pufferben (foszfáttal puffereit sódat, 0,5% EDTA, 2 mmol/1 EDTA) szuszpendáljuk, és 3x10® sejtet félreteszünk az RNS kontrolihoz és az áramlási cítometriás elemzéshez. Ezután 0,25 ml anti-humán CDS mikrogyöngyöt (Mütenyl Blotec) adunk hozzá, és a keveréket 15 percig 4 °C-on »»♦ φ »

φφ* *

X X » « X »♦ ubáljük.. Ezeket a CD8 gyöngyökkel jelzett sejteket 30 ml MACS pufíerrel mossuk, majd 2 ml MACS púderben resznszpendáljuk.

Egy VS r ősz (Miltenyi) állítunk elő a gyártó utasításai szerint. A VS+ oszlopot -azután egy VárioMACS mágneses mezőbe tesszük (Miltenyi). Az -oszlopot 5 ml MACS pufíerrel hozzuk egyensúlyba. Az izolált primer egérsejteket azután felvisszük az oszlopra. A CD8 negatív sejteket azután hagyjuk átfolyni. Az oszlopot 9 ml (3x3 ml) MACS pufíerrel öblítjük. Az oszlopot azután eltávolítjuk a mágnesből és egy 15 milliliteres falcon csőbe tesszük. A CD8M: ügy eluáljuk, hogy 5 ml MACS puffért adunk az oszlophoz, és a megkötött sejteket kimossuk, a gyártó által biztosított dugattyú segítségével. A CD8* szelektált humán perifériális T-sejtek. hozama körülbelül 51x10® össz-sejt. A CD8~negatív átfolyó sejteket összegyűjtjük, megszámláljuk, anti-humán CD4-gyel borított gyöngyökkel festjük, majd ínkubáljuk és egy új VS+ oszlopon bocsátjuk át az előzőkben ismertetett koncentrációban. A CD4-' szelektált humán perifériális T-sejtek hozama 42x I0⁶ össz-sejt, mintát eltávolítunk a festéshez, majd fluoreszcencia aktivált sejtosztályozővai (EACS) festjük és osztályozzuk., hogy megbecsüljük a tisztaságukat. Egy FE-vel konjugált anti-humán CD4 ellenanyagot., egy anti-humán CD8-FITC ellenanyaggal és -egy anti-humán CD 19-CyChrome ellenanyagot (mind a Pharmingen termékei használunk a CD8-^; és a CD4+ szelektált sejtek festésére. Ebben az első kísérletben a CD8-eal szelektált sejtek 80%-a CD8⁺, a CD4-~gyel szelektált sejtek 85%-a CD4*. Két következő kísérletben (43B. példa) a CD8* tisztított sejtek 84 és < «

81%-a tiszta, és a CD4* sejtek 85 és 97'%~a tiszta.. Az egyik kísérletben anti-humán CDi9-cel borított gyöngyökkel (Miltenyi) megfestjük a nem-kötődő (átfolyó} sejteket., majd átfolyatjuk egy harmadik mágneses gyöngy oszlopon, hogy Izoláljuk a CDI 9* Bsejteket fezek 92%~os tisztaságúk).

váljuk, hogy?' 0,5xl0⁶ sejt/ml-1 inkubálunk RPMI + 5% humán ultraszérum (Gemím Bioproducts, Calabasas, CA) + 10 ng/ml PMA. és 0,5 Hg/ml lonomicin összetételű oldatban (Calbiochem), 4, 16 vagy 25 óra hosszat, 37 °C-on. A T-sejteket (2,5x10⁶/luk) alternatíve stimuláljuk 24-lukas lemezeken, amiket éjszakán át előre borítottunk 0,5 ug/rnl lemezhez kötött LíCHTI anti-CD3 monoklonális ellenanyaggal (Pharmmgen), 5 ug/ml oldható antiCD28 monoklonális ellenanyaggal (Pharmingen), vagy .anélkül. Az egyes időpontokban a. sejteket összegyűjtjük,, ülepítjük, még egyszer mossuk foszfáttal puffereit sóoldaítab majd Ismét ülepítjük. Azután eltávolítjuk a felülüszót, és az üledéket gyorsan lefagyasztjuk szárazjég/etanol fürdőben, majd -80 °C-on tároljuk, hogy később RNS-t készítsünk belőle.

Valós idejű poiimeráz láncreakciót hajtunk végre ezeken a humán CD8ü CDk és CD 19* szelektált sejteken, a 43B. és 43C. példában ismertetett módon, hogy megbecsüljük a humán zalpha l 1 ligandum és receptor expresszíóját.

B. Primerek és próbák a kvantitatív reverz transzkripfáz polímeraz láncreakcióhoz a humáii zalphall ligandum expresszióA valós idejű RT-PCR-i az ABI PR1SM 7700 Sequence Deletíon System-mel (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City,

0

245 * * φ X 0 ♦ Φ

A 0 ♦ ♦♦ <0< ♦

0

0

0«

CA) már korábban leírták 6, 986-994 (1998); Gtbson

Beid, C.A. és mtsai: Genome Research U.E.M. és mtsai: Genome Research. 8,

995-1001 (1996); Sundaresan, S. és mtsai: Endocrinology 139, 4756-4764 {1998)1. Ebben az eljárásban egy génspecifikus próbát használunk, ami mind a .riporter, mind a kioltó fluoreszcens festékeket tartalmazza.. Ha a próba intakt, akkor a riporter festék negálódik, a kioltó festék szoros közelsége miatt. A polímeráz láncreakciós extenzió során, amikor további génspecifikus előrevivő és reverz prímereket használunk, a próbát Taq pofiméráz 5' nukleáz akthatásával hasítjuk, ami felszabadítja a riporter festéket a próbából, ami a fluoreszcenciás emisszió növekedését okozza.

A zalphall valós idejű RT-PCR elemzésekhez használt prímereket és próbákat a Primer Express™ primer-tervező szoftverrel (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) tervezzük meg. A humán zalphal 1-hez a prímereket úgy tervezzük meg, hogy lefedjenek egy intron-exon kapcsolódást, hogy elímmáljuk a genomiális DNS ampfifikálódását Az előrevivő prímért, a 2C22,281-et (9ö. számú szekvencia) és a reverz prímért, a

ZC22,279~et (91. számú szekvencia) használjuk az alábbi pofiméráz láncreakcióban, körülbelül 300 nmol/1 koncentrációban, hogy megszintetizáljuk a 80 bázispár méretű terméket.. A megfelelő zalphall TaqMan® próbát, aminek a jelzése ZG32 (92. számú szekvencia), a PE Applied Biosystems-szel szintetizáljuk és jelöljük meg. A ZG31 próbát az 5 végén egy riporter fluoreszcens festékkel (6-karboxi~fiuoreszcein) (FÁM) (PE Applied Biosystems) jelöljük, a 3' végén pedig egy kioltó fluoreszcens festékkel (6-karboxí-tetranief0~rödamm) (TAMRA) (PE Applied Biosystems). A vizsgált mRNS minták integritásának és a minőségének ellenőrzéséhez kontrollként az összes RNS mintát (az alábbiakban) átvizsgáljuk, hogy van-e bennük rRNS, a FE Applied Biosystems-től rendelt primer és próba készlet felhasználásával (katalógus-szám: 4304483). Ehhez· a próbához a riporter fluoreszcens próba a V1C (FE Applied Biosystems). Az rRNSsel kapott eredmények lehetővé teszik a. zalphall mRNS expressziós eredmények normalizálását a vizsgált mintákban.

RNS-t készítünk a. 43A. példában megadott üledékekből, az Rneasy Miniprep™ (QIAGEN, Valencia, CA) kittet használva, a gyártó- utasításai szerint. Kontroll RNS-t készítünk körülbelül 10 millió, humán zalphal 1 lígandumot expresszáló BHK sejtből.

C.

nerek és próbák a kvantitatív rever;

rneráz láncreakcióhoz a humán

A 43B. és 43D, példákban ismertetett, módon valós idejű láncreakciót hajtunk végre, a zalphal 1 receptor expressziójának megbecslésére, a 43A. példában megadottak szerint készített sejteket, valamint a zalphall receptorra specifikus próbák használatával. Az előreviő prímért, a ZC22,27?~et (93. számú szekvencia) és a fordított prímért, a ZC22,276 (94. számú szekvencia) használjuk egy polimeráz láncreakcióban (lásd az előzőkben), körülbelül 300 nmol/l koncentrációban, hogy megszintetizáljunk egy 143 bázispár méretű terméket. A megfelelő TaqMan próbái., jele ZG31 (95, számú szekvencia) a PE Applied Síösystems-szel szintetizáljuk és jelezzük. A humán zalphal l receptort expresszáló BaF3 sejtekből származó arra, hogy megfelelő kontrollt állítsunk elő az

24' φ** Φ χ ♦

Κφφ Φ **·* * » * -

példában ismertetett valós idejű pollmeráz láncreakció standard nnez.

D. Valós idejű kvantitatív reverz transzkriptáz - polli láncreakció

A zalphal 1 ligandum RNS relatív szintjeit osszelemzésével határozzuk meg, az egylépéses RT-FCR módszerrel <PE Applied Biosystems). A humán zalphal 1 ligandumot expresszáló BaF3 sejtekből származó RNS~t használjuk, hogy standard görbét készítsünk. A görbe tízszeres sorozathigításokat tartalmaz, 2,5-2,5x 10-⁴ ng/ul között az rRNS szűrővizsgálathoz, és 25-0-0,025 ng/μΙ között a zalphal 1 ligandum szűrővizsgálathoz, a görbe mindegyik pontját három párhuzamosban meghatározva, Az ossz-RNS mintákat szintén három párhuzamosban elemezzük, a humán zalphal I ligandum transzkriptumok szintje, valamint endogén kontrollként az rRNS szintjei szempontjából. 25 μ! össztérfogatban mindegyik RNS mintát One-S-tep reverz transzkriptáz -pollmeráz láncreakciónak vetjük alá, aminek az összetétele az alábbi: körülbelül 25 ng ossz-RNS A pufferben (50 mmol/1 kálium-klorid, 10 mmol/1 TRlS-HClk a belső standard festék, a karhoxi-x-rodamin (ROX) (PE Applied Biosystems); a megfelelő primerek (körülbelül 50 nM rRNS minták, 300 nM a zalphal ! ligandum mintákhoz); a megfelelő próba (körülbelül 5-0 nM rRNS 100 nM zalphal 1 ligandumh 5,5 mmol/1 MgCh; 300-300 μΜ d-€TF, d-ATP és d-GTP, reverz transzkriptáz (0,25 E/μΙ); 0.,025 E/μΙ AmpliTaq DNS pollmeráz; és 0,4 E/μΙ Rnáz inhibitor, .25 μΐ össztéríógatban. A pollmeráz láncreakció ciklusainak a körülményei az alábbiak; indító reverz transzkripciós (RT) lépés -egy ciklusban, 48 ^eC 30 percig; ezután.

X ΦΦ *

248

Φ ♦♦ ·· φφ* ΦΧ φ X ♦·ί

ΦΧ* φ « egy AmplITaq Goid™ (PE Applied Biosystems) aktiváló lépés egy ciklusban, 95 ^eC IÖ perc; majd 40 amp.liíikálási ciklus, 95 °C 15 másodperc, 60 ^CC 1 perc, A relatív zalphall ligandum RNS szintekei a User Bulletin No. 2-ben (PE Biosvstems; User

Bulletin #2: A8I Prlsin 7700 Sequence Detection System, Relatíve Quantltation of Gene Expression, 1997. december 11.) ismertetett Standard. Curve Method segítségével határozzuk, meg, az rRNS méréseket arra használva, hagy normalizáljuk a zalphall ligandum szinteket, A mintákat mindegyik kísérletben a kálibrátorhoz viszonyítva hasonlítjuk össze, A kalibrátort tetszés szerint választjuk, meg, a jóminőségű RNS alapján, és egy expresszíós szint alapján, amihez más minták szignifikánsan hasonlíthatok. A zalphall ligandum és a zalphall receptor stimulált és nem-sthnulált sejtekben (43A. példa.) való expresszióját elemző kísérletek eredményeit az alábbi, 43E, példában ismerteE. A hűmán zalpha 11 liáandum és receptor expresszió) a

Az e reverz

láncreakciót használunk, hogy megbecsüljük a zalphal l receptor expresszióját stimnlálatlan és antí-CB3~nial stimulált CD4+ és CD8+ mintákban a 0, 4, 15,5 és 24 órás mintákban, a stimulálás után.

A pihenő CD4-e mintát választjuk ki (önhatalmúlag) kallbrátornak, ez kapja az LÖ0 értéket. Körülbelül négyszeres növekedés van a receptor expressziőjában a nem-stlmulált CD4+ sejtekben a 4 vagy 24 órás tenyészetben, és körülbelül nyolcszoros növekedés van ugyanezekben az időpontokban az a.nti~CD3~mal stimulált CD4+ sejtekben, A CD8a sejtek hétszeres növekedést φ

Φ X Φ «

X φ # mutatnak a zalphal 1 receptor expresszi ójában, ami a négyórás mintában éri el a csúcsértéket, majd időben csökken. Az antiCD3 stimulálással a CD8+ sejtekben a receptor expressziójának egy konstans, nyolcszoros növekedése figyelhető meg.

Az első kísérletben arra is reverz transzkriptáz - polimeráz láncreakciót használunk, hogy megbecsüljük a zalphal 1 receptor expresszióját ugyanazokban az aoil-CD3-mai stimulált és stexlálatlan és CD4* és CD8* mintákban. A négyórás, anti~CD3-mal stimulált CDS* mintát választjuk ki (önhatalmúlag)' kalíbrátornak, ez kapja az 1,00 értéket. Az eredmények azt mutatják, hogy a nem-stimulált CD4* és CDS* sejtek nem expresszálják a zalphal 1 ligandumót. Az expresszió szignifikáns növekedését figyeltük meg a négyórás mintákban, az anfi~CD3-mal stimulált CD4* sejtekben, és a jel körülbelül 300-szoros növekedése volt megfigyelhető- a 15,5 órás Időpontban. A CD8+ sejtek kismennyiségű ligandumót expresszálnak az anti-CD3 stimulálás hatására, ez azonban valószínűleg annak a következménye, hogy a CD8+ populációt kismemiyíségű CD4* sejtek szennyezik,

A 2. kísérletben reverz transzkriptáz - polimeráz láncreakciót használunk a zalphall receptor expressziójának megbecslésére anti-CDv-mai stimulált, PMA * ionomieinnel stimulált és nem-stimulált CD4* és CD8* mintákban, 0, 3,5, 16 és 24 órával az aktiválás után. A pihenő CD8* mintát választjuk ki (önhatalmúlag) kalibrátornak, ez kapja az 1,00 értéket. A pihenő CD4* és CD8* sejtek nem mutatják a receptor szignifikáns mennyiségű expresszíóját, Az expresszió körülbelül háromszoros a PMA * ionomícinnel stimulált CD4+ mintákban a stimulálás után 3,5, 18 és 24 órával. Az anti»CD3-mal aktivált CD4+ sejtekben az expresszió csúcsértéke körülbelül tízszer magasabb a háttér értéknél a. stímulálás után 3,5 órával, majd visszaesik a háttér szintjének négyszeresére a .stímulálás után 18 órával. A CDS·?· sejtek négyszeres expressziős színt növekedést mutatnak

3,5 órával a PMA + ionomícínnel végzett stímulálás után, a későbbi időpontokban az expresszió szintje csökkent. Ugyanúgy, mint az első kísérletekben, az anti-CD3-:mal sejtek ismét a receptor expressziő indukciójának nyolcszoros növekedését. mutatják a háttérhez viszonyítva.

Ezeket, a második kísérletből származó mintákat arra is használjuk, hogy megbecsüljük a zaíphal 1 lígandum expressziét, A 24 órás FMA + lonomícinnel stimulált CD4+ mintát választjuk (önhatalmúlag) kalibrátomak, ez kapja, az 1,00 értéket. Az eredmények ismét azt mutatják, hogy a nem-stímulált sejtek expresszálják a zaiphall Hgandumot, Körülbelül harmincszoros növekedés volt megfigyelhető- az anti-CDS-mal stimulált CD4v sejtekben a 3,5 órás időpontban, amint az a korábbi kísérletekben volt. látható (4 órás időpontban), Azonban csak körülbelül ötszörös indukció figyelhető meg a PMA + ionomícínnel végzett stimulálásnál (3,5 órás időpont), ami a későbbiekben lecsökken. A C.D8+ sejtek ismét expresszáltak egy kísmennyiségű zaíphal 1 ligandnmot, ami valószínűleg a szennyező CD4+ sejtek következménye.

A végső kísérletben reverz transzfcriptáz - polimeráz láncreakciót használunk a zaiphall receptor expressziojának becslésére anti«CD3-mal. és anh~CD3/anti«CD28«cal stimulált, és nemstímulált CD4+ és CD8+ mintákban, 0, 2, 4 és 18 órával a síimulálás után. A FMA +- ionomieínuel aktivált CDI9+ sejteket is átvizsgáljuk, hogy ugyanzokban az időpontokban expr-esszálják-e a receptort. A pihenő CD4* mintákat választjuk ki (önhatalmúlag)

251 kalíhrátornak, ez kapja az 1,00 értéket. A kétórás anti-CB3-mal stimulált CD4* sejtekben a receptor csak négyszeresre indukálódott, a korábbi kísérletben a 3,5 órás időpontban mért lö-szeres indukcióval szemben. Az anti-CD3 és anti-€D28 kombinációja a zalphal 1 receptor expresszióját a háttér nyolcszorosára növeli. A 16 órás, anti”CD3/anti-€D28 kombinációval stimulált sejtekben nagyon alacsony a zalphall receptor expressziójának szintje, amint az a korábbi kísérletekben a CD9+ sejtekfoan. látható volt (lásd fent). A PMA * ionomicinnel stimulált CDI 9* sejtekben a a legszignifíkánsabb a zalphal 1 receptor expressziója, a kétórás időpontban 19-szeres a növekedés, de az expresszié szintje a 16 órás pihenő sejtekben mért szintre exik vissza,.

Ezeket, a végső kísérletből származó mintákat arra ís használjuk, hogy reverz iranszkriptáz - polimeráz .láncreakcióval megbecsüljük a zalphall ligandumot. A 16 órás, anti-CD3/ahíiCD28-cal stimulált CD8* mintát választjuk ki (önhatalmúlag) kahbrátornak, ez kapja az 1,00 értéket, Az eredmények azt. mutatják, hogy a kétórás időpontban a CD4+ sejtekben a zalphall ligandum expresszíója anti-CD3 stimulálással körülbelül kétszeres indukciót mutat, és ötszörös indukciót mutat az antí-CDS plusz antí-€D28 stimulálással. Ezek a stimulálási körülmények időben indukálják a ligandum expresszióját, a 18 óráig stimulált CD4+ sejtekben a zalphall ligandum expressziójának szintje a háttér 70-szerese, A CD8* és CD19v sejtek nem mutatnak zalphal 1 lígandum expressziót.

Bizonyos mértékű variáció várható a. vérvételek között (azaz ugyanabból a betegből különböző időpontokban vett minták és a különböző betegekből vett minták között), Ennek következtében minden vizsgálatban az adatok trendjét analizáljuk, vagy φφ X Φ φ

Φ » X φ

φφ Κ egyetlen vérmintából, és a fenti három kísérletet hasonlítjuk össze a végső következtetéshez. Az előzőkben ismertetett valós idejű polimeráz láncreakció kísérletekben látható trend az összes vizsgált sejttípusé, a PMA * ionomicinnel. aktivált CDI9a· B-sejtek expresszálják a legmagasabb szinten a zalphall receptor RNS-t A CD4-r és CD8+ sejtek is stimulálhatok, hogy expresszálják a receptort, de alacsonyabb szinten, mint a B-sejtek. A zalphall ligandum szinte kizárólag stimulált CD4* T-sejtekben expresszálódik (és nem expresszálóelík CD8+ T-sejtekben vagy CD 19+ B-sejtekben), Bár- a PMA -r ionomicinnel végzett stímulálás ebben a vizsgálatban jó zalphall ligandum szignált eredményez, egy szignifikánsan magasabb szignált kaptunk az anü-CD3 monoklonábs ellenanyaggal, vagy az anti-CD3- és antiCD28 monoklonálís ellenanyagok kombinációjával stimulált CD4+ T-sejtekkel, ezek olyan körülmények, amik jobban utánozzák, az antigénnel való in umo találkozást.

44. Példa

Az a.nti-CD4ö~nel vagy antí-lgM-mel stimulált B-sejtek zalphall ligandum dependens szaporodása

1x10« lefagyasztott, aferézises humán perifériális vér mononukleáris sejtet (FBMQ tartalmazó ampullát gyorsan. megolvasztunk 37 ^öC~os vízfürdőben, majd 25 ml B-sejt táptalaj (RPM1 médium 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KSk. 10% hővel ínaktivált borjúmagzat szérum, 5% L-glutamin, 5% Pen/Strep (Gibco BRL) összetételű oldatban szuszpendáljuk, egy 50 ml-es csőben (Falcon VWR, Seattle, WA|. A sejtek életképességét Trypan Blue-val megvizsgáljuk. lö milliliter Ficoll/Hypaqne- Plusφ * t (.Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Pis-cataway, NJ) rélegzünk

Eltávolítjuk a határréteget, majd friss 50 ml-es Falcon csőbe tesszük át, foszfáttal puffereit sóoldattal 40 ml végtérfogatot állítunk be, majd lö percig 1200 per perc fordulatszámmal' centrifugáljuk., a leállításnál léket használva. Az izolált sejtek életképességét ismét Trypan Blue-val vizsgáljuk meg. Egy másik változat szerint frissen vett humán vért hígítunk 1:1. arányban foszfáttal puffereit sooldattal (Gibco BRL), majd FicoII/Hypaque Plus-ra (Pharmacia) rétegezzük, centrifugáljuk és az előzőkben ismertetett módon mossuk. A friss és lefagyasztott forrásból izolált sejtek egyforma eredményt adtak.

Normál humán donorokból származó (lásd fent), Fícoll-ban lebegő perifériális vérsejtekből B-sejteket tisztítunk antí-€D19 mágneses gyöngyökkel (Miltenyi Biotec, Auburn, CA), a. gyártó utasításai szerint, A kapott készítmények tisztaságát áramlási ci•tometriás elemzéssel ellenőrizzük, antí~€D22 FITC ellenanyaggal (Pharmingen, San Dlego, CA), A B-sejt készítmények általában >9 0% - os tisztaságúnak.

Rágcsáló szplenociták szuszpenzióját állítjuk elő felnőtt

Charles Rivers Laboratories, Wilmington, MA)

254

9$ χ

χ. Λφ, *

«V · χ

*

Χ· X s **

Λ * ** ·*#'·* * * Α>

lenanyagot (Pharmingen használva. A B~sejt készítmények általán bán >9ö%~ös tisztaságnak.

Ck anli-CD4ö-nel stimulált Bsza lása humán

A humán vagy egér forrásból származó B-sejteket Ixlö⁶ sejt/ml koncentrációban reszuszpendáljuk 8-sejt táptalajban, majd 100 ul/luk mennyiségben szétosztjuk 96-lukas, kerekfenekű lemezre (Falcon, VWR)_S ami különböző stimuláló adalékanyagokat tartalmaz, 200 μΐ/luk végtérfogatra feltöltve. Az antiCD40 szimuláláshoz a humán tenyészeteket 1 pg/ml arái-humán CD4ö-nel (Genzyme, Cambridge, MA) egészítjük ki, a rágcsáló tenyészeteket pedig 1 ug/ml anti-rágesálő CD4Ö-neI .(Serotec, UK) egészítjük ki. A humán vagy rágcsáló zalphal 1 ligandumot 1 pg/ml - 100 pg/ml hígításban adjuk hozzá, A zalphall ligandum hatásának. speciOtását azzal, igazoljuk, hogy a zalphal 1 ligandumot 25 rng/ml oldható humán zalphal ICBE-ve! (10A. példa) gátoljuk. Minden kezelést három párhuzamosban hajtunk végre, A sejteket azután 120 óra hosszat, (humán) vagy 72 óra hosszat (egér) 37 °C-on inkubáljuk nedvesített inkubátorban. A begyűjtés előtt 1 uCí ³H~timidínt (Amersham, Piseataway, Nd) adunk az összes lukhoz, hogy megbecsüljük, hogy a 8-sejtek szaporodnake. A sejteket 98-lukas szűrőlemezre gyűjtjük (UniFílter GF/'C, Packard, Meriden), eel) harvester használatával (Packard), majd a gyártó utasításai szerint összegyűjtjük. A lemezeket 55 °C-on szárítjuk 20-30 percig, majd a. Inkák alját opálos lemezlezáróval lezárjuk. Minden egyes sejthez 0,25 μΐ szcmtilláeíós folyadékot adunk (Mierosemt-O, Paekard), majd a lemezt egy To

Microplate Semtiilatfon Counter-rel (Paekard) olvassuk le ng/ml, vagy magasabb koncentrációjú zalphall ligandummal való inkubálás fokozza az oldható antí-CD40 által indukált .szaporodást, dózisfüggő módon, mind a rágcsáló, mind a humán B-sejtekben, körülbelül 3Ö-szorosra. A rágcsáló és humán B-sejtek egyformán jól reagálnak a nekik megfelelő zalphall ligandumra. Mindkét fajban a stimulálás a zalphall 11gandumra specifikus, mivel az oldható zalphall receptor tenyészetben való jelenléte Visszafordítja,

Az előzőkben (44A. és 44B. példa) ismertetett humán vagy egér forrásból származó B-sej tehet az előzőkben, ismertetett módon (44C. példa) szélesztjük. A humán sejtek anti-IgM stimulátásához a lemezeket éjszakán, át 10 ng/ml P(abb anti-humán IgM eliena.nya.ggal (Southern Bloteeh Associates, Birmingham, /habarna) előre beborítjuk, majd közvetlenül felhasználás előtt steril közeggel mossuk. A tenyészeteket 0-10 ng/ml humán riL4-gyel (R&D Systems, Minneapolis, MN) egészítjük ki. A rágcsáló sejtekt anti-IgM stlmulálásához oldható anti-lgM-et (Biosouree, Camarillo» CA) adunk a tenyészetekhez, 10 mg/mi koncentrációban. Az előzőkben említett összes anti-IgM/IL-4 körülmény esetében humán vagy rágcsáló zalphal 1 ligandnmot adunk, az előzőkben ismertetett módon, 1 pg/ml - 100 ng/ml koncentrációban. A zalphall ligandum hatásának specifitását azzal igazoljuk, hogy a zalphal 1 ligandnmot oldható humán zalphall receptorral (44C, példa) gátoljuk. Minden kezelést három párhuzamosban hajtunk végre. A sejteket a 44C. példában ismertetett módon inkuháijnk, ³H-timídinnel jelöljük, gyűjtjük össze és elemezzük.

A zalphall ligandummal 0,3 ng/ml vagy magasabb koncentrációban való inkubálás- dózisfüggő módon gátolja az oldhatatlan anti-ígM-rael (egér) vagy anti-IgM és interlenkin-4 (humán) kombinációval indukált szaporodást. Ez a gátlás specifikus a zalphall lígandumra, mivel azt az oldható receptor jelenléte visszafordítja a tenyészetben.

45. Példa

A humán zalphal 1 oldható receptor expressziója Eschcnehfa coliban

A humán zalphall oldható receptort a €> terminálisán a maltőzkötő fehérjéhez (MBF) iuzionáltatva tartalmazó fehérjét kódoló polinukleotidot tartalmazó expressziós plazmídot készítünk homológ rekombinációval. A humán zalphal i cDNS ffagmensét (7. számú szekvencia) polimeráz láncreakcióval izoláljuk. Az MBP-zalphal 1 oldható receptor fúziós pollpeptidet a 96. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be. A humán zalphall polimeráz láncreakcióval való előállításához két prímért használunk: (1) A 2020,187 polinukleotidot (98. számú szekvencia), arai 40 bázispárt tartalmaz a vektor határoló szekvenciájából és 25 bázispárt a humán zalphal1 N-terminálísáből, és (2) a 2020,185 polinukleotídot (99. számú szekvencia), ami 3' végnek megfelelő 40 bázispárt tartalmaz a vektor határoló szekvenciából, és 25 bázispárt a humán zalphall C-terminálísának megfelelő szekvenciából. A polimeráz láncreakció körülményei az alábbiak: 25

X 9 9 χ»-»·. r * 9 * »

X 9 9»» * 9

XX9* 9 X « v * >9 «9 ciklusban 94 °C 30 másodpercig, 50 ^eC 30 másodpercig, és 72 °C 1 percig; majd 4 ^cC~os áztatás, két párhuzamosban futtatva, Az elemzéshez 100 μΐ-es polimeráz láncreakcióból két μΐ-t futtatunk

1,0%-os agaróz gélen, Ix TBB pufferben, ekkor a várt pár méretű fragmenst láthatjuk. A polimeráz láncreakció további 90 μΙ-ét kombináljuk a másik polimeráz láncreakció csövek majd 400 ul abszolút etanollai kicsapjuk, A kicsapott DNS-t használjuk a pTAPOS befogadó (31. példa) vektor Smal hasítási helyére való beillesztéshez, így kapjuk az MBP-zalphall fűzlót kódoló konstrukciót. A kiónokat a 31, példában ismertetett módon transzformáljuk, azonosítjuk és szaporítjuk . A pozitív kiónok' jelzése p€ZR225, ezt azután elemezzük. Az MBP-zalphal 1 oldható receptor fúziós polipeptid polinukleotid szekvenciáját a 96. számú szekvenciavázlaton mutatjuk be, és a megfelelő polipeptid szekvenciát a 97, számú szekvencia vázlaton mutatjuk be. A pozitív klón okát használjuk Eseheríchiu colí-han való szaporításra, a 34, példában ismertetett módom hogy a huzalphal 1/; ziós fehérjét megtisztítsuk (lásd az alábbi, 46. példát).

46. Példa

coli fermentlébői ztítása Dscheríchia

Hacsak külön nem említjük, akkor minden eljárást 4 °C-on hajtunk végre. Az alábbi eljárást használjuk a huzalphal 1/MBP6H oldható receptor polipeptid tisztítására. A pCZR225 konstrukciót tartalmazó, és a huzalphal 1/MBP-6H oldható receptort expresszáló (45. példa) EschenWüa coli sejteket SuperBroth Π-ben. (12 g./l Casein, 24 g/1 éiesztökívonat 11,4 g/1 di-kálium-foszfát, 1,7 g/1 mono-kálium-ibszfát, Becton Dickinson, Coekeysville, ♦ »*«

25Ζ

MD) szaporítjuk, majd 0,5% glicerinben lefagyasztjuk. A SuperBroth. II -r glicerin oldatban lefagyasztott sejtekből 20 grammot, használunk a fehérje tisztítására. A lefagyasztott sejteket megolvasztjuk, majd 1:10 arányban hígítjuk egy proteáz inhibitor oldatban (extrakciós puífer), mielőtt, a sejteket lízáltatnánk, és a. huzalphal l/MBP-6 oldható receptor fehérjét kiszabadítanánk. A hígított sejtek végkoneentráeíában 20 mmol/l TRISZ-t (JT Baker, Phílípsburg, Ndh 100 mmol/1 ná.trium-kloridot )NaCl, Mallmkrodt, Paris, MO). 0,5 mmol/Ι fenilmetilszuifonilíluoridot (FMSF), 2 ag/ml Leupeptínt (Fluka, Svájc) és 2 ug/ml Aprotínint (Sígma) tartalmaznak. A sejtek feltárására egy French Press sejtfeltáró berendezést (Constant Systems Ltd., Warwick, annia) használunk, -7 és

1.0 °C közötti hőmérsékleten,

207 MPa nyomáson, A hígított sejtekben ellenőrizzük a. feltárás mértékét, a French Press előtt és után meghatározva az Aeoo értéket. A lizált sejteket 45 percig centrifugáljuk körülbelül

18,000 g-vel, hogy eltávolítsuk a feltárt sejtek törmelékeit, majd a íeiülüszőhől tisztítjuk a fehérjét. A felülúszőban a kiválasztott fehérje teljes koncentrációját BOA Protein Assay-vel (Pierce, Rockford, II-) határozzuk meg, a gyártó utasításai szerint.

ml Talon Metál Affínity gyantát. (Clontech, Palo Alto, CA) (az előzőkben ismertetett módon előállítva) öntünk egy Bio-Rad,

2,5 cm x 10 cm-es üvegoszlopfoa. Az oszlopot gravitációs úton töltjük meg és hozzuk egyensúlyba 10 oszloptérfogat Talon, egyensúlyba hozó pufferrel (20 mmol/1 TRISZ, 100 mmol/1 nátrium-klorid p.H~8,0). A íelülnszoí sarzsonként töltjük a Talon íemaffinitásí oszlopra, majd éjszakán át. rázatjuk. A gyantát visszatöltjük az oszlopba, majd lö oszloptériogat Talon egyensúlyba hozó pufferrel mossuk, gravitációs úton, majd ugyanígy eluáljuk

X ♦ ♦ «

259

140 ml elúciós pufferrel (Talon egyensúlyba hozó puffer + 200 mmol/1 Imidazol-Fluka Chemical). A talon oszlopot 5 oszloptérfogat 20 mmol/1 2-íN~morfolíno)-etánszulfonsawaI (pH~5,0) (MBS, Sigina), majd 5 oszloptérfogat desztillált vízzel tisztítjuk, majd

20% etanoI/0,1% nátriumoldatban

k. Az matográíia során 14 milliliteres frakciókat szedünk, majd a frakcióknak meghatározzuk a 280 nm-es és 320 nm-es elnyelését, és elvégezzük a BOA fehérje-esszét; az átfolyó! és az egyesített mosőíolyadékokat is megőrizzük és megelemezzük, A számunkra érdekes fehérje-elúciós frakciókat egyesítjük, és egyenesen Amylose gyantára visszük (New

Több huzalphal 1 /MBP-6H polipeptíd előállításához az egyesített talon affinitás elúciós frakciókat 22 ml Amylose gyantával hozzuk össze pfí-7,4 értéken. Egy 2,5 cm x 10 cm-es Bio-Rad oszlopot öntünk, pakolunk és hozunk egyensúlyba 10 oszloptérfogat Amylose egyensúlyba hozó pufferrel (20 mmol/I TRISZ (J? Baker, Philipsbnrg, Ndk 100 mmol/l nátrium-klorid. (NaCh Mallinfcrodt, Paris, MÖ), 1,0 mmol/1 fenilmetilszulfonílíluoríd (PMSF), 10 mmol/1 p-merkaptoelanol (BME, ICN Biomedicais Inc., Aurora, OH), pH~7,4, A mintát gravitációs áramlással visszük fel, 0,5 ml/perc sebességgel. Az oszlopot 10 oszloptérfogat Amylose egyensúlyba hozó pufferrel mossuk, majd körülbelül 2 oszloptérfogat Amylose egyensúlyba hozó puffer r 10 mmol/1 maltóz (Fluka Biochemical, Svájc) összetételű pufferrel hozzuk egyensúlyba, gravitációs úton. A teljes kromatográfla során 5 mles frakciókat szedünk, majd mérjük a 280 és 320 nm-es elnyelési értéküket. Az Amylose oszlopot 1 oszloptérfogat desztillált vízzel, 5 oszloptérfogat 0,1 (tömeg/térfogati) SDS-sel ·?_? φφφφ φ φ φφ φ

X Φ φ ΦΦΧ X χ φ X » · » Φ X Φ φ φ

Φ Φ» φ χ « φ φφ «Φ (Sigmaí, 5 oszloptérfogat desztillált vízzel, majd 5· oszloptérfogat Amyfose egyensúlyba hozó pufíerrel regeneráljuk.

A számunkra érdekes frakciókat egyesítjük, maid egy SíidéA-Lyzer-ben (Píeree) 4 x 4 liter foszfáttal puffereit sóoldattal (pH=7,4) (Signta) szemben diallzáljuk, hogy eltávolítsuk az alacsony molekulasúlyú szennyezőket, puífercserével és sómentesítésset A foszfáttal puffereit sóoldat cseréje, után az összegyűjtött anyag a tisztított huzalphal 1ZMBP-6H polipeptidet reprezentálja. A tisztított huzalphal 1ZMBP-6H. polipeptidet SDS-PAGE Coomassie festéssel és Western biot elemzéssel (anti-nyúl HRPvel konjugált ellenanyaggal Rockland, Gilbertsville, PA) elemezptid koncentrációja a BCA zük. A hu zalpba 11ZM elemzés alapján 1,92' mg/mi, A tisztított huzalphal 1 / injekciőzáshoz készítjük az R & R

Developnient-hez (Stanwood, WA) küldjük ellenanyag előállítása sháhól. A nyulakat iní ann· iza

6H szérumot állítsunk elő (az alább következő 47. példa).

Zalphal .1 receptor poliklonális ellenanyagok

A poliklonális ellenanyagokat ügy állítjuk elő, hogy két nőstény New Zeelarid fehér nyulat immunizálunk a tisztított huzalphal 1/MBP-8H polipeptíddel (46, Példa), vagy a tisztított rekombínáns zalphal 1CEE oldható receptorral (10A. példa), A megfelelő poliklonális ellenanyagok jelölése nyűi antíhuzalpha.il/MBP-6H és antl-huzalphall-CEE-BHK. Mindegyik nyúlnak adunk egy induló intraperitoneálís (IP) injekciót., ami 200 mg tisztított fehérjét tartalmaz Freund féle adjuvánsban

X ♦'«' «« X

261.

***φ *« * * # Φ X

ΧΦ 4« (Pierce, Rockford, ΪΕ), majd háromhetente erősítő íntraperitoneális injekciókat adunk be, amik 100 mg tisztított fehérjét tartalmaznak Inkomplett Freund féle adjuvánsban, Hét-tíz nappal a harmadik erősítő injekció beadása után az állatokat megvéreztetjuk, és a szérumot összegyűjtjük. A nyulatoak azután háromhetente adunk erősítő injekciókat, és meg is vérezteijük.

A zalphall-specifikus políklonális ellenanyagokat aífinitástisztítjuk: a nyúlszérumból, egy CNBr-Sepharose 4B fehérje oszlop felhasználásával (Pharmacia), amit 10 mg tisztított huzalphal I/MBP-6H polipeptíd polipeptld. (32. példa) per gramm CnBr-Sepharose-ból készítünk, majd éjszakán át 20X dialízist hajtunk végre foszfáttal pufferelt sóoldattal szemben, A zalphal 1 -specifikus ellenanyagokat ELISA liter ellenőrzéssel jellemezzük, 1 mg/ml megfelelő fehérje antigént használva ellenanyag célpontként, A nyúl anti- huzalphal 1/MBP-6H affinitástisztított ellenanyag kimutatásának alsó szintje (ÉLD) 500 pg/ mi hígítás. A nyúl. anti- huzalphal l-CEE-BHK affinitás-tisztított ellenanyag LED értéke 50 pg/ml hígítás.

48, Példa

A zalpha l 1 receptor eloszlása

Ahhoz, hogy a zalphal 1 receptor különböző sejttípusokban való eloszlását megbecsüljük, mind nyúl poliklonálís mind egér monoklonáhs ellenanyagot, készítettünk a humán receptorral szemben (35. és 47, példa), majd ezeket az ellenanyagokat biotinnal konjugáltatjuk, hogy áramlási eltörnetriában lehessen őket használni. Először a políklonális ellenanyagokat használjuk, amiknek viszonylag kiesi az affinitásuk, hogy megfessük a sejtveX * φ Φ

262

Φ X * φ * φ

ΦΧΦ Φ Φ V X Φ φφφ Φ «

Φ χ χχ«φ φ χ φ « **» »»· * φ* φ» nalak egy paneljét: IL-dependens pre-B sejtvonal vad-típus BaF3 sejtek (Palacíos és Steinmetz: Cell 44, 727-734 (1985); MatheyFrevot és mtsai: Molecular & Cellular Biology 6, 4133-4135 (1936)4 humán zalphal 1-gyei transzfektált BaP3 sejtek (4. példa); humán Rurkitt limloma sejtvonaiak Raji (ATCC No. CCL86), Romos (ATCC No. CRL-1596), RPMI 8226 (ATCC No. CCL155) és Daudi (ATCC No. CCL-213); Jurkat humán T-sejt leukémia sejtvonal (ATCC No. TIB-I52); humán mielomonicita leukémí sejtvonalak Thp-i (ATCC No. TIB-202) és UT937 (ATCC No. CRL. 15932.2): humán pro-mielomonoeita sejtek HLT6Ö (ATCC No. CCL-240); rágcsáló B-sejt. limloma sejtvonal A20 (.ATCC No. TIB-208); és a rágcsáló tímóraa sejtvonal EL4 (ATCC No. T1B-39),

A sejteket összegyűjtjük, egyszer mossuk szérumot tartalmazó EACS mosőpufíérrel (WBS). A WBS összetétele Bank féle >zott sóoldat (Gibco BRL) v 10 mmol Ál HEPES (Gibco

BRL) i 1% BSA (Sigma Chemical Co.) + 10% normál kecskeszérum (Gemíni Bioproducts, Woodland, CA) *· 10% normál nyúlszérum (Sigma Chemical Co.), A mosópuffer (WB) ugyanaz mint a WBS, csak nem tartalmaz szérumot. Mosás után a and-zalphal 1 poliklonális ellenanyagot tartalmaz (47. Példa), A sejteket az ellenanyaggal 20 percig jégen tartjuk, majd kecske anti-nyűi-FITC-t (BioSource, International) tartalmazó WB-vel mossuk, űjahh 20 percig jégen Ínkubáljuk, majd mossuk és 400 μΐ WR-hen reszuszpendáljuk, hogy PACSCálihur áramlási cifcométeren (Becton Dickinson) elemezzük. A kontroll mintákat csak a szekunder kecske antt-nyúl-FITC ellenanyaggal festjük. A pozitív íestődést úgy definiáljuk, hogy az eltolódás az előző, csak a szekunder festéshez képest. Bár a poliklonális ellenanyagoknak φΧ0 0 «00

263 «φ «*« « « ΦΧφ » * «0 « X ♦ «

0« «00 ♦ 0« festőidést az FL4 rág* alacsony az affinitásuk, nyugodtan kimutattuk a zalphall ressziót a BaF3/zalphal 1 transzfektánsokon, mind a négy humán Burkitt límfömán (Raji, Ramos, Daudi és RPMI 8228),. és a Jurkat sejteken, A pihenő (nem differenciálódott) HL-60 sejtek nem kötődnek az auti-zalphal 1 ellenanyagokhoz, de pozitív jelet tudtunk kimutatni a 24 óra hosszat PMA-val (Calblochem, La Jolla, CA) aktivált HL-60 sejteken, ami a HL-60 sejt monocitaszerű sejtté való differenciálódását indukálja, Láttunk pozitív jelet az ÜT937 és Tlip-l sejteken, bár ez a jel lehet az aspecifikus kötődés következménye. A poliklonális ellenanyagok gyenge kereszti eakciót adnak az A20 egér B-sejívonalon, de nem láttunk imóraán.

kV anü-Zc sanyagoí (3o.

a) biotlnhoz konjugáltatjuk, majd a sejtek egy előzőkben Ismertetett alcsoportját átvizsgáljuk, hogy expresszálják-e a zalphall reeep(BaF3, BaF3/zalphal 1, Raju, Jurkat, és pihenő HL-60), A 100 ul \

-ben mossuk.

sejteket összegyűjtjük, mossuk.

ami 15 ug/ml-t tartalmaz a 4 biotinilezett monoklonális eh nyag mindegyikéből. A sejteket a monoklonális ellenanyaggal 20 percig jégen inkubáíjuk,majd 1,5 mi WB-vel mossuk, és egy centrifugában ülepítjük. A felülűszót leszívjuk, majd az üledéket 100 ul CyChrnme-ma.1 konjugált sztreptavtdínnel (CyC-SA; .Pharmingen) szuszpendáljuk, majd újabb 20 percig jégen, inkubáljuk, mossuk és ülepítjük, az előzőkben ismertetett módon. A kontroll csövek, olyan sejteket tartalmaznak, amik csak Cyc-SAval festődtek. Az üledékeket 400 ni WB-ben reszuszpendáljuk, majd az előzőkben ismertetett, módon áramlási, cítometríát hajtunk végre. Pozitív festődésnek azt tekintjük, ha a jel nagy me a csak a CyC-SA festéssel kapott φφφφ Φ**Φ X

264 φφ* Χ*Φ φ « Χ«« « φ ,φ Φ Φφφΐ φ Φ V φ »♦* «φφ * ΦΦΦ »φ háttérszintet. Kontrollként a BaFS/zalphal 1 transzfektánsokat használva képesek voltunk, hogy a 4 monoklonális ellenanyagot a megfelelő átlagos fluoreszcencia intenzitásuk (MFI| alapján •sorbaállítsuk, ami az ellenanyag affinitását és/vagy a monoklonálts ellenanyagok hiotinüezettségének mértékét tükrözi. A monoklonális ellenanyagok sorrendje az alábbi, a legmagasabbtol a legalacsonyabb MFI felé: 249.28.2.1.2,2, 247.10.2.15.4.8,

249.19,2.2,3.5 és 249.15.2.4.3,7, A Raji sejtek pozitívan festődnek a zalphall monoklonális ellenanyagokkal. A Jurkat sejtek pozitívan festődnek a zalphall monoklonális ellenanyagokkal, de nem olyan erősen, mint a B-sejteken (Raji), Tehát a zalphall receptor expresszálódott ezeken a B és Tsejt vonalakon, A nem-aktivált HL60 sejteken a festődési mintázat azonos mindegyik monoklonális ellenanyag esetében, és a jel nagyon gyenge. Azt gondoljuk, hogy ez a jel nem tükrözi a zalphall aktuális expresszióját a HL-60 sejtekben, ehelyett inkább az egér monoklonális ellenanyagnak a. humán sejtekhez való, valöszműleg az Fc receptorokon keresztül lejátszódó aspecifikus kötődésének következménye.

49. Példa

A humán zalphall ligandum hatása a B-seitekre, és a zalphall

A humán zalphal 1 ligandum hatásait az alábbi humán Bsejtvonalakon vizsgáljuk; és humán Burkitt limfóma sejtvonalakon Raji (ATCC No. CCL-86L és Romos (ATCC No. CRL1596b humán EBV B-sejt limfóma sejtvonal RFMI 1788 (ATCC No- CRL-156); humán rffielőma/plazmáéitóma sejtvonal iM-9 (ATCC No, CRL159); és humán EBV transzformált B-sejtvonal

265

X ΦΦ *♦«

X φ φ φ

DAKÍKI (ATCC No. TÍB-206K és HS Snltaxi sejtek (ATCC No. CRb1484). A zalphal 1 ligandummal végzett körülbelül 2-5 napos kezelés után a se marker expresss megfigyelhető az IM-9, Raji, Rarnos és RFM11788 sejtvonalakban, ami azt mutatja, hogy ezek a sejtek képesek reagálni a zalphall liganduuxra, A zalphall ligandummal kezelt humán B-sejtvonalak sokkal lassabban nőnek mint a kezeletlen, sejtek, ha sejttenyésztö lemezekre szélesztjük őket. Ezekben a sejtekben megnőtt a FÁS ligandum expressziója, áramlási citometriával.

megbecsülve (49D, és 49R, példa), és közepesen megnőtt az érzékenységük egy aktiváló FÁS ellenanyaggal szemben Í49A. példa). Ezek az eredmények' azt jelzik, hogy a zalphal 1 ligandum képes kontrollálni néhány B~sejt típusú neoplazmát, arra indukálva őket,, hogy differenciálódjanak egy kévédé szaporodóképes és egy vagy több FÁS ligandumra érzékenyebb állapottá, Emellett a zalphall receptor expresszálódík ezek közül a sejtvonalak közül számos különbözőnek a felszínén (lásd a 48. példát). Tehát a zalphal l ligandum és a humán zalpha 11 liganehim-saporín immunotoxln konjugátum (lásd a 49B.. példát, az alábbiakban), vagy más zalpha 11 ligándum-toxm fúzió használható terápiásán a B-sejt leukémiákban és limíomákban.

A. A humán zalpha 11 ligandum. hatása a B-sejtvonalakra

ΪΜ-9 sejteket oltunk le körülbelül 50000 sejt per mi ± 50 ug/m'i tisztított humán ligandum sűrűségben (29. példa). Háromnapos növesztés után a sejteket összegyűjtjük, mossuk és megszámláljuk, majd újra szélesztjük körülbelül 2500 sejt/ml sűrűségben. 96 lukas lemezekre, olyan lukakba, amik 0,033, 0,1 vagy 0,33 pg/ml antí-FAS ellenanyagot tartalmaznak (R&D

XX

Ζ§6

X* « φ Α * * * «*« Φ X *ΦΦ Φ X

Φ φ ΦΦ X Φ X « Φ Λ χφ* Φ»Φ * ** «*

Systems, Minneapolis). 2 nap elteltével Aiamar blüe fluoreszcencia esszét hajtunk végre (2B. példák hogy megbecsüljük a sejtek szaporodását.

A zalpha 11 Ugandámmal kezeit ΪΜ-9 sejtek anti-FAS ellenanyag távollétében a kezeletlen sejteknek csak 27%-os sűrűségéig szaporodnak. 0,33 ug/nü anti-FAS ellenanyag jelenlétében a zalpha 11 ligandummal kezelt sejtek további 52%-bán sejtek csak 30%-bán gátlodtak. A mind a zalphal! ligandummal.

gátlódtak, míg a kezeletlen sejtszaporodás teljes gátlás mind 0.33 tig/ml anti-FAS ellenanyaggal végzett kezelés esetében 86%.

az IM-9 sejteket három napig előkezeljük zalphal 1 Ital vagy anélkül majd 100 sejt per luk sűrűségben széztjük, majd 6 napig anti-FAS ellenanyag jelenlétében vagy távollétében szaporítjuk, akkor a kezeletlen sejtek Aiamar Blue esszével (2B. példa) becsült növekedése csak 25%-osan gátlödik az anti-FAS ellenanyaggal, míg a zalpha 11 ligandummal kezelt sejtek növekedése 95%-osan gátlödik, a kezeletlen sejtek antiFAS ellenanyag távollétében való szaporodásával összehasonlítva.

n immunotoxin hatása a A- se ii vonat axra

A humán zalpha 11 ligandum-saporin immunotoxin konjugátum (zalphal IL-sap) készítését és tisztítását az 50. példában ismertetjük. A sejtnövekedés gátlásában a humán zalphal lb~sap sokkal hatékonyabb mint a saporín önmagában. Ha a kezelt sejteket három -négynapos kezelés után újra szélesítjük, a humán zalphallh-sap-pal kezelt sejtek nagyon gyengén szaporodnak.

Φ ΦφΦ Φ φ * * φ φ χφφ φ 4 χ φ» φ 4 χ Φ Φ«φΦ φ φ φ «

Φ*Φ * Φ'Φ «*

ΙΜ-9, Ramos és Κ562 (ATCC No. CCL-243) sejteket körülbelül 2500 sejt/luk -sűrűségben szélesztünk 0-250 ng/ml humán zalphal IL-sap konjngátummal, vágj/ csak 0.2-50 ng/ml saporinnal jStirpe és mtsai: Bíotechnolögy 10, 405-412 (1992)1, ami csak kontroll. A lemezeket 4 napig inkubáljnk, majd Alamar Blue szaporodási esszét hajtunk végre (5B. példa). A humán zalphal IL-sap konjugátum maximális koncentrációjánál az IM-9 sejtek és a RAMOS sejtek növekedése 79%-han illetve 65%-bán gátlödott. A K562 sejteket, amik az áramlás szerűit alacsonyak/negatívak a zalphal l receptor expressziójára, nem érinti a zalphall-sáp, ezzel mutatva a konjugátum hatásának specífítását.

Az IM-9 sejteket 50000 sejt/ml sűrűségben oltjuk le hatlukas lemezekre, 0 vagy 50 ng/ml humán zalphall-sáp konjugátummal. Három nap elteltével -a sejteket összegyűjtjük, majd megszámláljuk és újra szélesztjük 100 - -0,8 sejt per luk sűrűségben, kétszeres sorozathígltásban, valamint 12 luk per sejt hígításban a humán, zalphall ligandum-saporin immunotedn nélkül. 8 nap elteltével az Alamar Blue szaporodási esszé használatával (2B, példa) meghatározzuk azoknak a Inkáknak a számát, amikben, az egyes hígításokban volt növekedés.

Amikor a sejtek számát Alamar Blue esszével megbecsültük (2B. példa), 6 nap után a körülbelül 12,5 -és 8,25 sejt per luk sűrűségben leoltott növekedési kontroli sejtek ekvivalens növekedést mutattak a zalpha 11-sap-pal kezelt, löö és 50 sejt/luk mennyiségben leoltott sejtekkel. Tehát az IL-9-cel kezelt sejtek túlélőinek növekedése lényegesen károsodott, még a zalphallsáp ímmunotoxin üjra-szélesztéssel való eltávolítása után is.

26S φφφφ φ»φ» φ φφ φφ

Φ V Φ β Φ φ φφφ *φφ φ « *«> * φ φ φ φφφφ φ φ φ φ *φφ φφφ * φ* »8·

A humán zaiphall receptor korlátozott szöveti eloszlása (48. példa), és a zaíphal 1-sap-nak a receptort expresszáló- sejtvonalakra való hatásának specifi-tása azt sugallja, hogy ez a konjugátum in uioo tolerálható.

C,___A humán zaiphall lígandum-saporin ímmunotoxto hatása a B-seftvonai életképességére

HS Suhan sejteket (ATCC No. CRL-1484) oltunk, le körülbelül 40000 sejt per ml sűrűségben 12 lukas lemezekre, majd 5 napig, növesztjük vagy anélkül hogy eltekint adnánk hozzá, vagy 40 ng/ml tisztított humán zaíphal I hgandumot (29. példa), vagy 25 n.g/rnl humán zaíphal IL-sap konjugátumo-t, vagy 20 ng/ml interferon alfát (EDI) vagy zaíphal 1 hgandumot és Interferon alfát adunk hozzá. A zaiphall ligandum 83%-ban gátolja a Hs Suhan- sejteket, .Az interferon alfa 38%-ban gátol. A zaiphall lígandum plusz az interferon alfa 78%-bán gátol, jelezve, hogy a humán zaiphall ligandum és az Interferon alfa gátló hatásai addítívek lehetnek, A humán zaíphalIt-sap 92%-bán gátolja a HS sultan-ok növekedését

A fenti eredmények alátámasztják a zaiphall lígandum vagy a humán zaíphal IL-sap lehetséges használatát rosszindulatú betegségekben vagy más betegségekben, amikben a zaiphall receptor expresszálódik, főleg a B~sejt eredetűekben. A zaiphall ligandumnak az interferon alfával való kombinációját specifikusan sugallja az -additív hatásuk, a HS suhan, sejtek gátlásában. A limfoid rosszindulatú betegségek más típusai is expresszálhatják a zaiphal l receptort, mivel az aktivált T-sejtek is expresszálják a receptor mKNS-t (48. példa), és ezek közül a *44 9 4 4-φ * -φ

Φ*

269

ΦΦ φ » φ φ φ *

Φ X φ Φ φ iS« Φ Φ φ Φ φφ φ φ φ χ * ·>

φΦ ν χ Φ φ φ λφ« 5ϋ5 betegségek, közül néhány reagálhat a zalphal í. lígandum vagy zalphal 1 lígandum-toxikus fúziós terápia.

D. A FÁS (CD95) humán B-sejteken való expressziólát növeli a humán zalphall lígandum stimulálása

A HS Sultan (ATCC No. CRL-1484L IM-9 (ATCC No. CRL159), RPMI 8226 (ATCC No. CCL-1551, RAMOS (ATCC No. CRL-1596), DAKÍKI (ATCC No, T1B-206) és RPMI 1788 (ATCC No. CRL-156) humán B-sejtvonalakat 2-8 napig kezeltük tisztított 10-50 ng./ml humán zalphall lígandummal (29, példa) vagy anélkül. A sejteket azután PE-vel konjugált anti~CD95 ellenanyaggal (PharMingeru San Díegö, CA) festjük, a gyártó utasításai szerint, majd egy FACSCalibur-on. (Becton Díekínsom San. dose, CA) elemezzük. Mindegyik sejtvonal esetében az anti~CD95 (FÁS vagy APÓ-11 festődés növekszik, néhány esetben több mint kétszeresére, a humán zalphall hgandummal való kezelés hatására,.

E. A humán zalphal l lígandum stiroulalás növeli a FÁS (CD95) expresszlólát a. primer egérléi

C57

Primer egér szplenocitákat úgy állítunk elő, hogy 8-12 hetes /BL6 egerekből származó lépeket darabolunk fel. Az. erifroeiunv hogy a készítményt 5 másodpercig vízzel kezeljük, majd egy 70 mikronos szitán nyomjuk át. A megmaradt szplenocitákat RPMI (JRH Bioselenee) plusz 10% HIA-FBS (Hycione, Logan, UT), interIenkín-2 (R&D Systems) összetételű oldatban mossuk és szélesztjük, ami vagy’· tartalmaz humán zalphal 1 ligandumot, vagy nem, az előzőkben ismertetett Ezeket 5 napig 37 °C-on inküfoáljuk, 5% COz-ot tartalmazó atχ X Φ φ Φ Φ ·}*?<; «*« φχ* * φ *«χ * φ

Χ/υ * * #·«·*» φ * * _Λ* _νΧΧ ΧΦι·$ * Λί*

Bioszférában, A szplenocitákat összegyűjtjük és PE-vel konjugált anti~CD95 ellenanyaggal (Pharmingen) és FITC-vel konjugált anti-CD19 ellenanyaggal (Pharmingen) festjük, a gyártó utasításai szerint, A sejteket áramlási citometriával elemezzük egy PACSCalifour-on (Becton Díckinson).. A CDI Öv egér B-sejtek kapuzásával kiderült, hogy az anti~CD9S festés megnő az interleukín-2 plusz humán zalphal l IigandurnmaJ kezelt B-sejteken, a. csak az ínterIeukín-2-vel kezelt sejtekkel összehasonlítva, Az anti-CD95 festés 37 relatív fluoreszcencia egység (RFU) a Bsejteken, csak interleukm-2-hen és 55 RFU az interleukin-2-ben és humán zalphall lígandumban tenyésztett B-sejtekem

50. Példa.

A zalpha 11 ligandum toxikus fúzió készítése és tisztítása

Egy szállítási szerződés alapján lö mg zalphall ligandumot (29, példa) küldünk az Advanced Targeting Syslems-hez (ATS, •San Dlego, CA) a saporín növényi toxlnnal való konjugálásra [Stirpe és mtsai: Biotechnology 10, 405-412 (1992)1 A

Zymogenetics· az ATS-tőI 1,3 mg fehérje .kónjugátumot kapott, ami 1,1 molekula saporlnt tartalmaz egy molekula humán zalphall lígandumra számítva, 1,14 mg/ml koncentrációban kiszerelve 20 nmol/1 náiríumíoszfák 300 nmol/1 nátríum-kloríd, pH«7,2 összetételű oldatban.

51. Példa ium toxikus fúzió in utuo ^tpimiá-saporin kordugátum. tesztelése egerekben A zalphall-saporín kónjugátumot (49, példa)

C57BL6 egereknek (nőstény, 12 hetes, a. Taconic-tól vásárol

271 * * * fc «0 0 *«-.· 0 « X'fcv

9 iOff « 0

Í^A* »*0 « .Μ»

0Λ * « * «' két különböző dózisban: 0,5 és 0,05 mg/'kg, Az injekciókat intravénásán adjuk be hordozóban, ami 0,1% BSA-t (ICN, Costa Mesa, CA) tartalmaz. Három injekciót adtunk be egy hét alatt (0., 2, és 7. nap). Vért veszünk az egerekből a 0. napon (az injekciózás előtt), valamint a 2. napon és a 8. napon (injekciózás után), A vért heparinozott csövekbe tesszük (Becton Dickínson,

Franklin Lakes, NJk majd a sejtszámokat automatizált hematológiai analizátorral határozzuk meg (Abbot Cell-Dyn modelNo. CD-35Ö0CS, Abbot Park, Ih). Az állatokat a vérvétel utáni 8. napon eutaxúzáljuk és felboncoljuk, Lépet, csecsemőmirigyet, májat, vesét és csontvelőt gyújtunk a hísztopatoiógiához. A lépet és a csecsemőmirigyet lemérjük, majd további vérmintát veszünk szérum-szeparátor csövekbe. A szérumot a Pheoníx Central Labs.-ba küldjük (Everett WA). hogy standard kémiai panelen teszteljük. Az áramlási eítometríaí elemzésekhez is mintát veszünk, az itt h át

A keringésben levő vérsejtek száma és a szérumkémiai mérések nem különböznek szignifikánsan a zalphal l konjugátummal. kezelt egerek és az ekvivalens dözisú, nem-konjugált toxinnal (saporm) kezelt egerek között, A zalphal 1-saporínnal kezelt egerek szöveteinek hlsztolőgiai elemzése azt. mutatja, hogy nincs szignifikáns változás az ekvivalens dózisú, nem-konjugált toxinnal kezelt egerekhez viszonyítva. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a saporin konj ugatom nem toxikus ín vívó,

B._A zalphal l ligandum toxikus saporin fűzló vizsgálata a Bsejt eredetű tumorokra ín vivő

A humán zalphall ligandum és a humán zalphall ligandum toxikus saporin fúziónak a humán tumorsejtekre gyakorolt » * φ »*ν ·* Φ

Φ .* « ·' *« «Φ ·>♦ * φ

φ.*··* hatásait (50, példa) in υίοο vizsgáljuk, egy itt ismertetett egér tumor xenograft modell felhasználásával. A xenograft modelleket először olyan sejtvonalakkal vizsgáljuk, amiket ín nitro kísérletek alapján szelektáltunk, azaz például azokat, amiket a 49. példában ismertettünk. Ezek közé a sejtek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a következők: humán Burkitt limloma sejtvonalak Raji ATCC No. CCL-86) és Ramos [ATCC No. CRL); humán sejtvonal RPM1 1788 (ATCC No. CRL158); humán míelóma/plazmaeítóxna sejtvonal IM-9 (ATCC No. CRL 159); humán sejtvonal DAK1KI (ATCC No. TÍB-208) és HS Sult.an sejtek (ATCC No. CRL-1484), Az ilyen típusú modellben a közvetlenül a humán tumorokból származó sejtek is használhatók. ÍIymődon a betegek mintáinak a zalphal 1 ligandummal vagy egy zalphall ligandum toxikus saporin fúzióval való kezelésre való érzékenységének átvizsgálása használható az optimális .indikáció kiválasztására, a zalphal 1 and-tumor terápiában való használatára.

A megfelelő xenograft ín οίνο modell kiválasztása után (lásd az előzőkben) a természetes ölősejtek zalphal l ligandum által indukált aktivitását és/vagy a zalphall ligandumnak a B-sejt eredetű tumorokra gyakorolt hatását in vioo becsüljük meg. A humán zalphall ligandumnak megvizsgáljuk azt a képességét, hogy képes-e olyan citotoxikus effektor sejteket (azaz például NK sejteket) generálni, amik aktívak B-sejt eredetű, tumorokkal szemben, az itt ismertetett tumor xenograft modellekben. Emellett, a humán zalphal 1 ligandumnak a tumorokra gyakorolt közvetlen hatásait megbecsülhetjük, A végrehajtandó xenograft modelleket az előzőkben ismerteteti, módon szelektáljuk. Egy olyan, protokollt fejlesztettünk ki és vizsgáltuk meg a hatékonyságát, a f »)«

ΦΦΦ φ tumors-ejtek eltávolításában és sejtvonalakkal vagy primer tumorokkal beoltott egerek túlélésének meghosszabbításáhan, amiben zalphall ligandummal stimulált humán sejteket használunk.

52, F

m DNS-t tartalmazó FI mesterséges kromoszóma klónok azonosítása

A humán zalphal 1 ligandum cDNS inszertet polimeráz láncreakcióval amplihkáljuk, vektor alapú primerek használatával. A polimeráz láncreakció termékét ³²P-vel jelezzük, majd nagy sűrűségű szürőlapokhoz hihridizáljuk, amiken PÁC (Pl mesterséges kromoszóma) könyvtár található, A szűrőlapokat, és- a lefa« gyasztott könyvtár törzsanyagot, a Roswell Park Center ínsütutetői (Buffalo, New York) kaptuk;, a könyvtár RPCI6 szegmens volt, négyszeres mélységű lefedéssel. A szürőlapokat. éjszakán át 65 °C-on inkubáljuk Expresshyb-ben ÍClontech, Faló Alto, CA), majd a gyártó utasításai szerint mossuk. A pozitív szignálok dekódolása négy PÁC klőnt azonosítását eredményezte, ezek jelzése 23H17, 34A9, 1Ö5G9 és 236H14. A kódoló régió 5 végére specifikus primerekkel (ZC22.452 (KXX számú szekvenciavázlat} és Z€22,451 (löl, számú szekveaeiavázlat) és a 3^Z végére specifikus primerekkel (ZC22,450 (102. száméi szekvenciavázlat) és ZC

22,499 (103. számú szekvenciavázlat) végzett polimeráz láncreakció elemzése azt mutatja, hogy a 34A9 és 105G9 PAC~k mindkét véget tartalmazzák, míg a 231117 és a 2-3H14 csak az 5' véget tartalmazza. A PÁC 231117-et EeoRI és NotI restrikciós enzimekkel emésztettük, és egy 9 kilobázis méretű azonosítottunk, amik a zalphall ligandum cDNS pr

«9* ♦»** »

274 * Φ * Φ: β «** X « ΦΦ» X φ Λ X » χ φ · * Φ ♦ ΦΦ ΧΦΦ « ·«♦ «· dizálódna a íra és korábban BcoRI és restrikciós enzimekkel emésztett pBlnescript 0 SK. (+> plazmidfoa (Stratagene) szubkíónozzuk, az itt ismertetett módszerek alkalmazásával.. A szekvenálásból kiderült, hogy ez a íragmens körülbelül 380 bázispárt tartalmaz a promoter régióból, és tartalmazza az 1-es, 2-es és 3-as exont, az 1-es és 2-es tatronokat teljes egészükben, és a 3-as tatomban végződik.

A humán zalphal 1 ligandum gén 3 végét polimeráz láncreakcióval állítjuk elő, a PÁC 34A9-böl származó- DNS-t. használva templátként, a ZC23,771-es (104. számú szekvenciavázlat) és a ZC22,448-es (103. számú szekvenciavázlat) primerek alkalmazásával. Taq pölimerázt használunk a biztosított pufferrel, 4% DMSO hozzáadásával. A reakciókörülmények az alábbiak voltak:

°C, 5 ^:C 1 perc, 72 ^ÖC 3 pere; majd 72 °C 7 perc. Ezzel az eljárással egy 2,9 kílobázis méretű fragmenst kaptunk, ami tartalmazza a 3-as exon egy részét, a 3-as és 4~es tatront teljes egészében, a teljes 4-es exont és az 5-ös exon kódoló részét.

A humán zalphall alábbi, az 5' vedtől a 3' vé ligandum genomiális struktúrája az lg: 195. számú szekvencia, ami tartalmaz körülbelül 249 bázispárt a promoierbőt tartalmazza az 1-es exont (a 105-ös szekvencia 240-455-ös számú nukleotidját), az 1es tatront (a 105. számú szekvencia 456-562. számú nukleotidjaí), a 2-es exont (a 105. számú szekvencia 563-598. számú nukleotidjai), valamint a 2-es húron egy részét, ami 748 5' bázispárt tartalmaz (a 105. számú szekvencia 599-1347. számú nukleotidjai); egy körülbelül 3 kílobázis méretű luk; 106. számú szekvencia, ami a 2-es húron 3' végéből 718 bázispárt tartalmaz, tartalmazza a 3-as exont (a 106. számú szekvencia 719-874., «9χ* χ««Α> « »» «« « 9 X < >

9 9 *4 » » 9 * *9

9 9 * 9 .> X * 9 9 9 * számú nukleotídjal), és a 3-as intron 5 végének egy része (a számú szekvencia 875-1656, számú nukleotidjai); egy kisebb mint körülbelül 800 bázispár méretű luk; 107. számú szekvencia, ami 644 bázispárt tartalmaz a 3-as íntroribőh egy körülbelül 800 bázispárnál kisebb luk; valamint a 108. számú szekvencia, ami a 3-as intron 3' végéből 435 bázispárt tartalmaz, valamint tartalmazza a 4-es exont, (a 108. számú szekvencia 435-513, számú nukleotkijai), a 4~es intront (a 103, számú szekvencia 514-603. számú nukleotidjai), és az 5-ös exon 5' végének egy részét fa 108. számú szekvencia 604-645. számú nukleotidiai).

53. Pél nalakban ug tisztított humán zalphall ligandumot (29. példa! 2 mCí ^12SI jódozott gyönggyel jelezzük (Pieree, Rockford, Illinois), a gyártó utasításai szerint, Ezt a jelzett fehérjét, használjuk a humán zalphall ligandum humán Raji sejtekhez (ATCC No, CC186) való kötődésének vizsgálatára, a vad-típusú rágcsáló BaF3 sejtekhez, és a zalphall receptorral (BaF3/hzalpha.il sejtek) transzfektált BaF3 sejtekhez való kötődést használva kontrollnak. A szaporodási eredmények alapján (5. példa) a zalphall ligandumnak a BaFS/hzalpha! I sejtekhez való kötődése várható volt (pozitív kontroll), míg a vad-típusú BaF3 sejtekhez való kötődés nem volt várható (negatív kontroll). Körülbelül 5x10⁵ Raji sejtet/lük, 1x108 BaF3/hzaiphall és lxlö® BaF3 sej tét/luk osztunk szét 96-lukas lemezekre. A jelzett humán zalphall ligandumhól 10 ng/ml-t adunk két párhuzamosban a lukakhoz, jelzetlen humán zalphall ligandum kompetltort higítási sorban

276

X * *

X *Φ «««.» β

hozzáadva, amely hígítás! sor 250-szőrös mőlfeleslegtől l:4-es hígításokban 0,061-szeres· mól-feleslegig terjed. Mindegyik kísérleti pontból kettő van. Miután a jelzett humán zalphall lígandumot. hozzáadtuk a Inkákhoz, hagyjuk, hogy 4 ^l>€~on ínkubálódjon 2 óra hosszat,ami lehetővé teszi a ligandumnak, hogy a sejtekhez kötődjön, A sejteket azután 3x kötő pufferben mossuk (RFMI1710 (JRH Bioseiences, Lenexa, KS), axní 1% SSA-t tartalmaz (Sigma Chemical CoJ, majd a COBRA II AüTÖ-GAMMA gamma.számlálóval megszámláljuk (Fackard Instrument Company, Meríden, CT).

A jelzett zalphall ligandum kötődése a sejtekhez evidens volt a Raji cs a BaF3/hzalphall sejtekben. Emellett a Raji sejtek esetében a jelzetlen zalphall ligandum körülbelül 250-szeres mólfölöslege a kötődést egyharmadára csökkenti, egy aspeeifikus, jelöletlen kompetitor (interferon Gamma az R&D Systemstöl {Mínneapolis, MN)) jelenlétében, és a kompetitort nem tartalmazó esethez viszonyítva 3,7-szeresen csökkenti. A kompelícíót dózisfuggőnek találtuk a specifikus jelzett kompetitorra, a humán zalphal 1 ligandurara. Tehát a zalphall ligandumnak a Raji sejtekhez való kötődése specifikus volt. Hasonló módon, a pozitív kontroll BaF3/zalpha 11 sejtek esetében a jelöletlen zalphall lígandum 250-szeres mólfölöslege a kötődést felére csökkentette az aspecifikus kompetitorra! összehasonlítva, és a kompetitort nem tartalmazó esethez viszonvitva 3,06-szorosan csökkenti.

Tehát a zalphall ligandumnak a RaF3/zalphall sejtekhez való kötődése is specifikus. Nincs megfigyelhető kötődés a vad-típusú BaF3 sejtek esetében. Tehát kimutattuk, hogy a zalphall ligandum specifikusan kötődik a Raji sejtekhez és a BaFS/hzalphal 1 sejtekhez, de nem kötődik a negatív kontroll Ba.F3 sejtekhez.

«««Φ *Λ*Φ X »« * Φ * ΦΦΦ

Φ Φ X ΦΦΦ Φ φ ΧΦφ φ φ φ φ φφφ « φ φ φ φ «ΦΦ φ«Φ * φΦ φ*.

54, Példa

A zalpha 11 receptor expressziója a humán vél

A, A humán perifériális verseitek készítése és tenyésztése

Frissen vett humán vért 1:1 arányban hígítunk foszfáttal puffereit sóoldattal (Gibco BRL)» majd Ficoil/Hypaque Plus-ra (Pharmacia LKB, Bioteehnology Inc., Plscataway, NJ) rétegezzük, és 30 percig 1800 per pere fordulatszámmal centrifugáljuk, és fékezés nélkül hagyjuk leállni, A határréteget eltávolítjuk, és friss ml-es Falcon csőbe visszük át (Falcon, VWR,. Seattle, WA), foszfáttal puffereit sóoldattal 40 ml végtérfogatot állítunk be, majd 10 percig 1.200 per perc fordulatszámmal centrifugáljuk, és bekapcsolt lékkel állítjuk le. Az izolált, sejtek életképességét Trypan Blue-val (Gibco BRL) vizsgáljuk, majd a sejteket IxlO⁶ sejt /ml végkoneentráeióban reszuszpendáljuk sejt közegben (RPMI 1640, 10% hővel ínaktíváit borjúmagzat szérum, 5% L-glutamin, 5%: Pen/Strep) (Gibco BRL),

A sejteket hatlukas lemezeken (Falcon, VWR, Seattle, WA) tenyésztjük 0, 4 vagy 24 óra hosszat, számos különböző, az alábbiakban ismertetett stímulálássat Az anti-lgM, anti-CD40 és anti-CD3 stimulálást a 44, és 42, példában ismertetett módon hajtjuk végre. Phorbol nűrisztát acetátot (PMA) és ionomicint (Signia, St, touis, ΜΌ) (5C. példa) adunk a megfelelő Inkákhoz, 10 ng/m.l illetve 0,5 mg/ml koncentrációban. A sejteket 37 ^aC-on nedvesített levegőjű inkubátorban inkubáljuk, különböző ideig.

B. Ellenanyag festés és elemzés

Sejteket gyűjtünk a lemezekről, mossuk, majd jéghideg festő közegben reszuszpendáljuk (HBSS, 1% borjúmagzaf szó278 χ # e « « * χ « v χ 9 χ # # x # * # # * * * φ«« XX# » ♦ # 99 rum, 0,1% náirium-azid), körülbelül tízmillió sejt per milliliter koncentrációban. Az Fe receptor blokkolását és az ellenanyagok aspeeifikus kötődését a sejtekhez úgy érjük el, hogy 10% normái kecskeszérumot (Gemini Bioproducts, Woodkmd, CA) és 10% normái humán szérumot (Ultraserum, Gemini) adunk a sejtszuszpenzióhoz, A sejtszuszpenzió alikvot részeit FITC-vel jelzett, a CD3, CD 19 vagy CD 14 leszármazási sor elleni monoklonális ellenanyaggal {Fharmíngen, La dolla, CA) és egy biotlnilezetl, a humán zalphall receptor (hu-zalphall) elleni monoklonális ellenanyaggal keverjük össze (35. példa), A festés speciOtását a zalphal 1CEE oldható receptort (IGA. példa) tízszeres tömegfölöslegben használva kapott kompetíció alapján határozzuk meg. Miután 60 percig jégen inkubáltuk, a sejteket kétszer mossuk jéghideg festő közeggel, majd 50 ml, sztreptavidin-PE~t (Galtag, Burlingame, CA) tartalmazó festő közegben szuszpendáljuk. 30 percig jégen tartjuk,majd a sejteket kétszer mossuk jéghideg mosópufferrel (foszfáttal puffereit sóoldat, 1% borjümagzat szérum, 0,1% nátnum-szid), majd éleiképességi markéiként 1 mg/ml 7-AAD-t (Molecular Probes, Eugene, OR) tartalmazó mosópníferben reszuszpendáljuk Az áramlási adatokat élő sejtekkel határozzuk meg, egy EACSCalihur áramlási eltométerrei (Beeton Díckinson ímmunocvtometry Systems, San dose, CA). Az adatok begyűjtését és elemzését is Cell0uest szoftverrel hajtjuk végre (Becton Díckinson Immunocytometry Systems, San dose, CA).

Az anti-zaiphal 1 ellenanyaggal végzett festés eredményei azt mutatják, hogy a humán zalphal 1 receptor expresszálődik a CD3-at, CD19-et vagy CD14~et expresszálő humán perifériális vérsejleken. A CDS es CD 19 sejteken a festődés specifikus volt, amit igazol az oldható zalphall receptorral való abszolút, kompé« X φφφ φφφ

279

Φ φ φ φ * X ♦ Φφ «Φ-Φ * φ ΦΧ» Φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ ♦ φφφ χ ♦ *♦ X* tícíó. A CDI 4 sejtek feslődése mutatott bizonyos -specifitást a .11gandumra, amit Igazol az oldható receptorral való részleges kompetíció. Akármelyik T-sejt ant-CD3~mal való aktiválása, vagy a Bsejíek antl-CD40-nel való aktiválása 24 óra elteltével a sejtfelszíni zaiphall megnövekedett szintjét eredményezi. 4 óra nem ügyelhető meg a zaíphal 1 expresszió megnövekedett szintje, semmilyen süniülus hatására, egyik sejtpopulációban sem. A sejtékt zaíphal 1 ligandummal való kezelése a zaiphall féstődés csökkenését eredményezi a CDS pozitív és CD 19' pozitív sejteken, de nem eredményezi a csökkenést a CD 14 sejteken, 4 és 24 óra elteltével.

55. Példa

A humán zaíphal I ligandum vizes stabilitásának előzetes értékelése

Előzetes vizsgálatokat végeztünk, hogy kiértékeljük a humán zaiphall ligandum vizes stabilitási jellemzőit a biológiai processzálás, a kiszerelés és in uíóo beadás segítésére. A célok a következők: 1) ellenőrizzük a stabilitást és a kinyerést Alzet Minipumpákből, valamint az általános tárolást és kezelést, 2): meghatározzuk számos analitikai módszer stabilitást jelző természetét, beleértve a kationcserélő HP'LC-t (CX-HPLCk a fordított fázisú HFLC-t ÍRP-HPLC), a méretkizárásos HFLC-t (SEC-HPLC) és a biológiai esszét (BaF3/zalphal ÍR szaporodás (azaz például 2. példa és 4. példái, és 3) meghatározzuk a stabilitást korlátozó bioszintézis utakat és kinetikai függőségeiket.

A tisztított humán zaiphall ligandum (29. példa) alikvot részeit úgy készítjük el, hogy 2 mg/'ml-re hígítjuk foszfáttal puffereit sóoldatban (pH-?<4), majd alacsony sűrűségű polietilén

2Β0

Φ X **φ φφ φ φ!φ φφ φ 6 φ φ « φ φφ·« > φ

X ΧΦΦ Φ Χφφ <' s-X 40Φ (LDPB) krioarapuUákban. (Nalgene, 1,8 ml} tároljuk -80 °C-on ikontroll), 5 ''C-on, 30 °C~ou és 37 *C~on, A mintákat 29 nap alatt időközönként vizsgáljuk, CX-szel, RP-vel, SEC-HPLC-vel és biológiai esszével. Az alikvot részeket is -80 °C-on tároljuk, majd fagyasztás-olvasztás ciklusnak (í/o) vetjük alá (-80 °C/RT; SX f/o, 10X f/o}, A humán zalphal l ligandum kinyerését a -80 °Cos kontrolihoz viszonyítva (1 f/o) határozzuk meg. az összes vizssaiaman.

°C-os kontroll mintákból zalphall ligandum oldatot elemzés után visszafagyasztjuk -80 °C-ra. Ezt az alikvot részt (2 f/o) használjuk a humán za ligandum termális és konformációs stabilitásának meghatározására a pH függvényében, cirkuláris dikroiznms (CD) alkalmazásával. A 2 mg/mi koncentrációjú oldatot 100 gg/ml-.re hígítjuk foszfáttal puffereit sóoldat pufferekben, amiknek a pH-ja 3,3-8,8 között van. A távoli UV CD-spck (rumot 5 °C-os intervallumokban ellenőrizzük 5-90 °C között (n~3/pH). A használt CD spektropolariméter a Jasco 715 (Jasco, Easton, MD). A háromdimenziós szerkezet hőmérséklet hatására való felbomlását úgy követjük, hogy a hőmérséklet függvényében rögzítjük; az ellipticitás 222 nrn-en mért változását. A T™ értékét a háromdimenziós szerkezet felbomlásának kétállapotú modellje alapján becsüljük meg. Az adatok SlideWrite Fiús fór Windows v4.1 programmal illesztjük (szigmoid) (Advanced Graphics Software; Encínitas, CA).

Az Alzet Mimpumpákböl (Model No. ÍÖÖ7D; ALZÁ Corporation, Mountain View, CA) való kinyerést és stabilitást úgy becsüljük meg, hogy a pumpákat 100 uh 2 mg/ml koncentrációjú humán zalphall ligandum oldattal töltjük fel, majd a pumpákat 1,8 ml-es LDPE-be tesszük, ami 1 ml foszfáttal'puffé♦ A » X < ,Φ

281

X φ “ί φφ φφ « φ « φ φ φ φ φ φ * φ V

Λ* relt sóoldatot (ρΗ“7,4) tartalmaz, majd 37 °C-on tároljuk. A zalphall ligan-dnmnak a minipunspákból való felszabadulását/kinyerését CX-szel, RP-vel -és SEC-HPLC~vel becsüljük meg, a 2., 4. és 7, napon. Az aktivitást a ?< napon biológiai esszével becsüljük meg. A vizsgálatot ágy terveztük, hogy -mintavételi időpontonként 3 pumpából való felszabadulást kiértékeljünk.

A kromatográfiás adatok azt sugallják, hogy CX- & SECHPLC eljárások stabilitásra jellemzőek, míg az RP-HPLC eljárás nem. Legalább 3 további csúcs figyelhető meg CX-HPLC-vel, amik a nyilvánvaló- lebomlási termékeket jelzik. A SEC-HPLC egy nyilvánvaló humán zalphall. ligandum aggregátumot különít -el, ami a zalphall. ligandum csúcs előtt eluálödík, Azonban nem figyeltünk meg további szignifikáns csíkokat, amik a humán zalphal l ligandum csík után eluálődnak. Ez azt sugallja, hogy a CX-HPLC-vel megfigyelt bomlási termékek legvalószínűbb, hogy amínosav módosításokból származnak, azaz például dezaminálásból, és kevésbé hidrolízis/proteolízis eljárásokból, amik rövidített variánsokat eredményeznek. RP-HFLC~vel kismértékű hosszabbítás figyelhető meg (elöl-hátui) olyan mintákban, amikről SEC-vel és CX-HPLC-vel kimutatták, hogy szignifikáns lebomláson, estek át. A CX-HPLC-vel megfigyeli bomlás az idő és a hőmérséklet függvényében nő, és elsőrendű kinetikát követ. 29 nap után a 37 °C~on, 30 °C-on és 5 “C-on CX-HPLC-vel kinyert humán zalphall ligandum százaléka 39%, 63% és 98%. Az aggregáeió is Időtől-hőmérséklettöl függően no. A 29 napig 3-7 °C~ on, 80 *C~on és S °C-on tárolt készítményekben az aggregátumok százaléka 7,4, 7,3, illetve a kimutatási korlát alatti Í.BDL), Biológiai esszével nem figyelhető meg szignifikáns különbség egyik ϊ\'$>

X Φ X Φ V Φ

ΛΟΛ ΦΦχ ♦ ♦♦ * χ φφφ * 9

Ζοχ. Φ Φ * Φ χ φ ί Φ Φ φ φφφ φχφ Φ *« Φ* mintában sem, azt sugallva, hogy a bomlástermékek az Intakt humán zalpha 11 ligandummal ekvivalens aktivitással rendela 10 f/o ciklusnak alávetett mintákban.

A humán zalphal 1 ligandum Alzet Mmipumpákból való felszabadulása összhangban van az elméletileg várt térfogatú felszabadulással, Ez azt sugallja, hogy a szignifikáns felszíni adszorpció nem gátolja a humán zalpha 11 ligandum bejuttatását az Alzet Minipumpákkal, 2 mg/ml töltési koncentrációban. A korábiakban megfigyelt bomlással konzisztenst bomlást figyeltünk meg. A 2, 4 és 7 nap után felszabadult humán zalphal 1 ligandum CX-HPLC-vel meghatározott százalékos tisztasága 96%, 90% és 79% volt. Fel kell Ismerni, hogy bomlás azután is előfordul, miután a humán zalphal 1 ligandum felszabadul, vagy megingni a kiszabaduló közeggel, Ennek következtében a minípumpában a százalékos tisztaság valamelyest eltérhet attól· amit a felszabadító közegben meghatároztunk. Az egyes mintáknak a biológiai aktivitása konzisztens a mini pumpákból felszabadult humán zalphal 1 ligandum várt mennyiségével.

A humán zalphal! ligandum távoli-UV CD· spektruma, amint az várható volt, konzisztens az íníerleuklnokéval, azaz például az mterleukm-3-mal (J. Bíoehem, 23, 352-360 (1991)], az irrterleukm-4-gyel ]Biochemistry 30, 1259-1264 (1991)) és az interleukin-6 mutánsokkal [Biochemist.ry 35, 11503-11511 (1996)), A távoli UV CD spektrumokban nem voltak nagy változások megfigyelhetők a pH függvényében. Az eredmények azt mutatták, hogy a termálig/konformációs stabilitás pH maximuma körülbelül pH~?,4, A térszerkezet elvesztését mutató görbék elemzése φφφφ «««φ

2S3

X * X φ Φ φ

ΦΧφΓ «φφ Φ » «Φφ Φ φ

Φ X *ΧφΦ « Φ φ. « «ΦΦ ΦΧΦ * φφ φ» egy kétállapotú- térszerkezet felbomlást mechanizmusra alapul, ami lehetővé teszi a termális/'konformációs stabilitás összehasonlítását a pH/összetétel függvényében, Azonban egy vagy több intermedier létezhet a térszerkezet lebomlási folyamata során.

mivel a kooperativítás viszonylag alacsony, a térszerkezet felbomlását mutató görbe lapossága alapján. Bár nem terveztünk olyan specifikus vizsgálatokat, amikkel meg lehet határozni, hogy a humán zalpha 11 ligandum újra felveszi-e a térszerkezetét a 90 °C-on való térszerkezet bomlás uts ez előzetes adatok azt miután a hőmérséklet visszahúlt 90 °C-ra,

Ezek a vizsgálatok lehetővé teszik azonosítását, amivel ki lehet értékelni a humán zalpha 111 ligs tisztaságát, és igazolni lehet a stabilitását. Például SEC-

tató a vizes oldatban való aggregáeiő mér' és sebességének meghatározására, Hasonlóképpen, CX-HPLC használható a zalphall ligandum aggregáeiótól eltérő mechanizmussal való lebomlása mértékének és sebességének jellemzésére. A biológiai esszé arra használható, hogy igazoljuk a humán zalphal l ligandum és vizes bomlástermékei aktivitását Például a zalphall ligandum vizes oldatban generált és CXHPLC-vei elválasztott variánsai maguk is jól használható terápiás ágensek lehetnek, mivel ekvivalens biológiai aktivitással rendelkeznek. Emellett az a tény, hogy a humán zalphall ligandum számos különböző folyamatban bomlik le (aggregáeiő, aminosav módosulások), egy előnyben részesített, vagy egyedi formulát sugall, ami minimalizálja az egyes degradáeíős folyamatok sebességét, ami szükséges lehet egy oldatban levő termék hosszútávé stabilitásához.

28· ♦ V » “

ΦΦΦ * * *** # φ φφφφ 4 » ♦ Φ Φ »♦ Φ **

Φ»

A vizes bomlástermékek: természetének azonosítása és kinetikai dependencíáinak (pH, koncentráció, töltőanyagok) meghatározása folyamatban van. A humán zalphall ligandum stabilitását a szérumban/plazmában azért határozzuk meg, hogy alátámasszuk az írt οίνο vizsgálatok tervezését és interpretálását.

Az előzőkből nyilvánvaló, hogy bár ebben a leírásban illusztrálás céljából ismertettük a jelen találmány specifikus megvalósítást módjait, tehetők különböző módosítások, anélkül hogy eltérnénk a jelen találmány szellemétől és oltalmi körétől. Ennek megfelelően, a jelen találmány oltalmi körét csak a csatolt igénypontok korlátozzák.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a leírásban említett szekvenciákat.

<1 lö> ZymoGenetics. Inc <l:20> NÖVEL CYTOKINB ZALPHA 11 LIGANDUM <130> 99-Í8PC <150> US 09/284,908 < 1.51 > 1999-03-09 <150> US 09/265.992 <I51> 1999-03-11 <150>

US 60/142.013 <151> 1999-07-01 «180» 115 <170> FastSEQ fór Windows Version 3.0 <210> 1 <2! 1> 642 <212> DNS <213> Homo sapiens <22O>

<221> CDS <222> (47).,.(532) <400> 1 gctgaagtg'a aaacgagacc aaggtctagc -tctactgttg gtactt atg aga tcc 55

Met Arg Ser

agc

ccr.

ggc

aac

atg

gag

agg

att

gtc

atc

tgt

ctg

atg

gtc

atc

b be

103

Ser

Pro

Glv

Asn

Siet

0 λ a

Arg

Ile

val

Ile

Cys

Lee

Met

Val

Ile

Phe

5

10

15

ttg

333

Λ., a

ctg

gtc

cac

s aa

age

tcc

caa

ggt

C3.SL

gat

ege

cac

151

Leu

Giy

Thr

Lee

val

His

Lys

Ser

Ser

Ser

G1 a

Giy

Gin

Asp

Arg

His

20

-ϊ s

30

35

atg

att

aga

atg

cgt

caa

ett

ata

gat

att

gtt

gat

cag

ctg

aaa

aat

199

Met

l re

Arg

Met

Arg

Gin

Lee

XI e

Asp

Xle

Val

Asp

Gin

Leu

Lys

Asn

40

45

50

tat.

gtg

aat

gac

ttg

gtc

cet

gaa

ttt

ctg

cca

get

cc&

g&§.

gat

gca

247

Tyr

Val

Asa

Asp

Lee

Val

Pro

k?4.U

Phe

Leu

Pro

Alá

Pro

Glu

Asp

Val

55

60

65

gag

aca

aac

tgt

gag

tgg

tea

get

ttt

tcc

tgt

ttt

cag

aac

gcc

caa

2 95

G1 c

Thr

Asn

cys

Glu

Trp

Ser

A*lc

Phe

Ser

Cys

Phe

Gin

Lys

A. 1 >5

Gin

80 φφφ φ*»« *

cta

aag

tea

gca

aat

aca

^<$3

aac

aat

gaa

agg

ats

atc

aat

gta

tea

343

Leu

Lys

Ser

Alá

Asn

ψ \ Φ»

Gly

Asn

Asn

Glu

Arg

,T..le

11«

Asn

Va 1

Ser

85

90

95

att

3.33

aag

ctg

agg

aaa

cet

tcc

aca

•aat

gca

ggg

aga

aga

391

ne

Lys

Lys

Leu

Lys

Arg

Lys

Pro

Pro

Ser

Thr

Asn

A la

Gry

Arg

Arg

150

155

115

2

. 15

cag

3&&

cac

333

cta

aca

tgc

cet

tea

tgt

gat

tet

tat

gag

aaa

aaa

439

Sin

Lys

His

Arg

Leu

Thr

Cys

Pro

Ser

Cys

Asp

Ser

*y *·

Glu

Lys

Lys

120

125

130

CC3

ccc

aaa

gaa

ttc

cta

gaa

aga

ttc

aaa

tea

ett

z*·

caa

aag

atg

~S?

Pl'O

Pro

Lys

Glu

Phe

Leu

eN ! , ,

Arg

Phe

Lys

Ser

Len

Leu

Gin

Lys

135

140

145

3t.t

est.

cag

cet

ctg

tcc

tet

3C33

aca

CSC

gga

agt

gaa

gat

φ- ,-* ,··χ VzVzZX·'

532

1' i.§

His

Gin

HÍ3

Leu

Ser

Ser

Arg

Thr

His

Gly

Ser

Glu

Asp

Ser

150

155

ISO

tgaggat·

cta

acttgcagtt ggacactat

g te

acat

sere

taa

tatagta

gtgaaagtca 592

tttcttigta ttecaegtgg- aggagcccta ttasattata taa&gaaata 642 <2!0>2 <211> 182

212> FEHÉRJE <213> Homo sapiens <400> 2

Mst	Arg	Ser	Ser Pro Gly Asn Met Gin	Arg	Ile	val	ΣΙφ Cys	Len
1			5	10				15
Val	x le	Phe	Leu Gly Thr Len Val His	JuV S	Ser		Ser Gin	Gly	Gin

Asp

Arg

His 35

Met

He

Arg

Met

Arg 40

Gin

Leu

Ile

Asp

I le 45

Val

Asp

Gin

.Leu

Lys

Tyr

Val

Asn

Asp

Leu

Val

Pro

Glu

Phe

Leu

Pro

Alá

Pro

50

S 5

§0

Glu

Asp

Val

Glu

Thr

Asn

Cys

Glu

Trp

Ser

Alá

Phe

Ser

Cys

Phe

Gin

SS

70

7 5

SS

Lys

Alá

Gin

Leu

Lys

Ser

Alá

Asn

Thr

Giy

Asn

Asn

Glu

Arg

Ile

Ile

35

90

35

Asn

Val

Ser

Ile

Lys

Lys

Leu

Lys

Arg

Lys

Pro

Pro

Ser

Thr

Asn

Alá

100

105

HO

Gxy

Arg

Arg

Gin

Lys

His

Arg

Leu

Thr

Cys

Pro

Ser

Cys

Asp

Ser

Tyr

115

120

r 2 U

Glu

Lys

Lys

Pro

Ώ ν'?*··, t: λ. K.’

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Arg

Phe

Lys

Ser

Leu

Leu

' 'íi'l

i ··· n

A s.í \?

:

Χ'βν

Gin

Lys

Mer.

Ile

HÍS

Gin

His

Leu

Ser

Ser

Arg

Thr

His

Giy

Ser

Glu

<210> 3 <211> 486 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <22í)>

<223> Degetierálí poLinukieoíid szekvencia, humán zaiphall

Ugandámhoz <221> vegyes tulajdonság

288

0»« 000 Φ » *00 0 *

Φ 0 *«»Φ 0 * 0 Λ

Η* 0 00 * ·** *· <222> (1). .(486) <223> η. = Α,Τ,Ο vagy G <400>3

atg~.grs%?sr;v •ggnacxayfcng	.saccnggnaa tncayaarwa	yatggarmgn awsnwsncar	afchgtnafcht ggnoargayi&	gyyfcnatggt gacayatgat	aathttyytn hsignatg&gn	60 120
caryhnatbg	ayathgtnga	ycarytnaar	a&ytaygtaa	aygayytngt	nccngartty	ISO
yfcaccngcnc	cagaxgaygt	ngaracnaay	tgygartggw	sngcattyws	ntgyttycar	24 Ö
aargcncary	tBaarwsKgc	aaayacngga	aayaaygarrs	gnathathaa	ygtawsnath	3Ö0
aaraarytna	armgnaarcc	nccawsaacn	a&ygcxiggsjB	gnatgnca-raa	rcaytagnyta	360
acntgyccw	satgygayws	ataygaraar	aaxc-cnccK&	argarttyyt	agarmgntfey	420
aarws ny tny	tacaraarat	gathcaycar	cayytnwsaw	snsagnacnca	yggnwsHgar	48 0

gaywsn 48» <210>4 <211> 535 <212> DNS <213> Mus musculus <220>

<221> forrás <222> (0).....(0) <223> ESTI483966 ; GcnBank Acc #ΑΑ764063 <400> 4

fcasacatgta	fccatafcaagg	afcafcgfccafca	afcaaggafcfca	afeafcfcafcafea	afcfcafcaaafca	SS
afcttataata	cfcfcafcaafcafc	cafcfcgfcfctgg	•fc-fccacfcaafca	aafcctatgga	fcacatggfcca	12.0
aaatggaaat	gaatatfcfcfcg	ccaafcfcafcfca	atccccaaag	fccatfcgaaaa	fcaagcsfcasc	180
cafctctactg	aefcfcgtfcaga	cfcctaaacta	acafcaaaata	cafcfcfcfccaga	aa'fcaa&fctca	240
accgatctfca	cc-fcfcfcacafcc	fcfcgfc-ggagsfc	gatagaagtt	caggafcccfca	agaaaafcfcaa	300
ccaaagsgta	ttagfctcfcga	gttggtgafca	caagfccaaaa	ggcfcccfcfcfct	gcafcfcaafefca	380
aaaaaafcafc-fc	afcfc-fcaaafcfcg	catfcgtgaca	aacafcggcct	fcaccaagtoa	fctfcfcoafcaga	420

#Χ 00 4Λ-* 0 <

289 « *

0 0 V <* * > , * 9 « ·«·$ ''ί⁴ ttttcagctg ttcaacaatg tcaataaggt gacgaagtct. aatcaggagg cgatctggcc 480· cttgggggct t-gatttatgg gccactgtcc ccaagaagat gactaccaga cagac 535 <2I0>5 <211> 33 <2!2> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonükleotíd primer ZC17212 <400>5 ggggaattcg aagccatgcc cgggcc ctc <210> 6 <211> 30 <212> DNS <2I3> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligönukleotid primer 2C19914 <40ö> 8 caat.ggatgg gtettfcagca gcagtaggcc

3Ö

290 ·# «φφ* φ X Φ <2Ι0>7 <211> 1814 <212> DNS <213> Homo sapiens <400> 7

atgcegcgtg	gctgggccgc	ccccttgctc	ctgctgctge	tccaggg&gg	etggggctge	60
ceegacetcg	tetgctaeac	cgattacetc	eagacggcea	tctgcatcct	ggaaatgtgg	120
aacctecaee	ccagcacget	cacccttacc	tggcaagacc	agtatgaaga	gctg&aggae	180
gaggccaect	ectgcagcct	ccaeaggtcg	geccaeaatg	ceacgcatgc	cacctacacc	240
tgccaeatgg	atgtattcca	cttcatggcc	gacgacattt	tcagtgtcaa	catcacagac	330
c&gfccfcggca	setaeteecs	ggagtgtgge	agctttctcc	tggctgagag	catcaagccg	300
getcceeett	tcaacgtgac	tgtgacctte	tcaggscagt	atastatete	qtgg.cgct.ca.	420
gattacgaag	aecctgcctt	ctacatgctg	aagg-geaagc	ttcagtstga.	getgeagtae	480
aggaaccggg	gagaeccctg	ggctgtg&gt	cega-ggagaa	agctga tete	agtggactca	54 0
agaagtgtcfc	ccctcctecc	cctggagttc	cgcaaagact	egagetatga	gctgcaggtg	SÖÖ
cgggcsgggc	ccatgcctgg	ctcctcctac	caggggacct	ggagtgaatg	gagtgacccg	060
gteatettte	agacccagte	agaggsgtta	aaggaagget	ggsaccctca	cctgctgctt	720
cteetcctgc	ttgtcatagt	cttcatccct	gccttetggs	gcctgaagac	ccatccattg	780
tggagge^at	ggaagaagat	atgggecgtc	cccagccctg	ageggttett	catgcccctg	840
tacaaggget	gcagcggaga	cttcaagaaa	tgggtgggtg	cacccttcac	tggctccagc	900
ctggagctgg	gaceetggag	ceeagaggtg	ccctccaccc	tggaggtgta	esgetgccae	9 60
ecaccsegga	gcccggccaa	gaggctgcag	ctcacggsgc	tacasgaacc	agcagagctg	1020
gtggagtetg	aeggtgtgee	caagcccagc	ttetggccga	cagcccagaa	ctcggggggc	1080
tcagettaca	gtgaggagag	ggatcggeca	tacggcctgg	tgtecattga	cacagtgact	114Ö
gtgetagatg	eagaggggcc	atgeacctgg	ccctgcagct	gtgaggatga	eggctaeeca	1200
gccefcggscc	tggstgctgg	cctggageec	agcccaggcc	tagaggaccc	aetcttggat	1260
gcagggacca	cagtcetgtc	ctgtggctgt	gtctcagctg	gcagccctgg	getaggaggg	132 ö
ceeetgggaa	gcctcctgga	cagactaaag	ccaccccttg	csgatgggga	ggactgggct	1380
ggggg&ctge	cctggggtgg	ccegteacct	ggaggggtet	cagagagtga	ggcgggctca	1440
cccctggccg	gcctggatat	ggacacgttt	gacagtggct	fctgtgggctc	tgactgcagc	1500
agccctgtgg	agtgtgsctt	caccagcccc	ggggacgaag	gacccccccg	gsgctaccte	1560
cgccagtggg	tggtcattec	teegccactt	tcgagccetg	gaeeccaggc	cagc 1614

<210> 8 * φ <211> 30 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligpnukleotíd primer ZC19913 ggcctactgc tgctaaagac ccatccafctg <210>9 <211> 33 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonükleotíd primer ZC20-097 <4ÜO>

acatctag-at tagctggcct ggggtccagg cgt <210> 10 <2H> 21 <212> DNS * *** * *** « Λ φ «φ * * Φ X φ. » •Λ0··) *** *** * * «*» » Φ zyz. ♦ φ ΦΦΦ« φ * * « * * « * * φ ♦ X* »Φ <223> Oügonnkleoíid primer ZC12700 <400> 10 gaggwtat afc&age&g&c· c 21 <210> 11 <211>21 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC5020 <400> 11 cactggagfcg gcaacfctcca g 21 <210> 12 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <22Ö>

<223> Oligonukleotid primer ZC6675 <400> 12

Χφφ «Α« «Χ« χ »« * ΧΦ

Φ Λ X 9* Φ Φ φ « «

Φ «Φ gtggatgccg aacccagtcc <210> 13 <2Π> 21 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleond primer ZC7727 <4ÖÖ> 13 tg-ttcacagc tacctgggct. c <21ί)> 14 <211> 26 <2·12> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligormkleolíd primer ZC8290 <400> 14 ccaccgagae tgcttggatc· accttg <210> 15 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<2·23> Ollgonukleotid primer ZC 19572 <40O> 15 g t c c t g t g g e fc g t g t c fcc ag <210> 16 <211> 21 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Olígonukleoüd primer ZC6622 <400> 16 ctgggctgga aactggcaca c <210> 17 <211> 13 <2i2> DNS <213> Mesterséges Szekvencia

295 ♦ * * * ♦ ♦*Φ Φ φ ΦΛφ φ *

Φ Φ Φ φ φ χ. Φ φ φ * X '*. « *4 φφ <220» <223» Olígonufeleoüd primer ZC7738 <400> 17 cactgt-caga aatggags· <210» 18 <211> 24 <212> DNS <213» <220» useges Szekvencia <223» OÜgonukleotíd primer ZC9273 <400» 18 ggtcccfeccc ogggcaccga gaga <210» 19 <211» 30 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» OiígöHukleodd primer ZC19905 <400» 19 ♦ 00 « * Λ

296 *

*0* 0 0χ acaggatccg teageatgec gcgfcggctgg gccgcs· <210> 20 <211> 33 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<2.23> Oligönukleotid. primer ZC199C <400> 20 acagaattc tagctggcct ggggtccagg cgt <210> 21 <211> 22 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligönukleotid primer ZC20114 <400> 21 cctgcettct acatgctga-a gg· ♦»** X φ φ X Φ *♦* ♦** * Φ χ,'?' Φ * «φφΧ **^Λ · *** »«« ♦ <210> 22 <21Χ> 21 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukieodd primer ZC19459 <400> 22 ctcctcctgc ttgtcatagt c 21 <2I0> 23 <211>18 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligpnukleotíd primer ZC19954 <400> 23 actgggc-fcgg gggactgc <210> 24 <211> 22 <212> DNS

Φ φ '««« φ

29« <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonuklieotid primer ZC20116 <400» 24 agcaeaatea ctgtgtcaat gg 22 <210> 25 <211> 40 <2!2> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Olígqnukfeotid primer ZC13946 <400» 25 ccctgcagtg atcaacafegg eca&gttgac c.agtgccgtt 40 <210» 26 <211» 45 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» OHgomikleotld primer ZC 13945

* φ

299 gcccafcggac t&gtttcgaa aggtcgagfcg tcagtcctgc t-ccfcc <210> 27 <211> 34 <2I2> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <22Q>

<223> Oligonukleotid primer ZC 18698 <400> 27 <2I0> 28 <2H> 25 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <22ö>

<223> Oligonukleotid primer ZC 14063 <40ö> 28 •caccagacat aatagetgac agact * χ <

*«Χ χφχ » φ * * V >φ λ φ* .

« <211> 6 <212> FEHÉRJE <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Glu-Glu (CEE) Tag amino sav szekvencia

Glu Tyr Met Pro Met <2lO> 30 <211> 36 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC 19931 ggttggt&cc gca-agatgcc gegtggctgg gccgo <210>31 £

XX

301 <211> 29 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukieotid primer ZC 19932 <400> 31 cgg&gg&te.c gtg-agggttc cagccttcc <210> 32 <211> 66 <2,13> Mesterséges Szekvencia.

<220>

<223> Oligonukieotid primer , ami a vektor határoló régióra és a zalphal 1 extraeelluláris doménre terjed ki <400> 32 tccactttgc ctttctctcc acaggtgtcc agggaat.tca fecgataatgc ogcgtggctg 60 ggccgc 66 <2I0> 33 <211> 699 <212>

50“ «213> Homo sapiens <400> 33 gagcceagat ettcagacaa aactcacac-a sgcccaccgt gcccagcacc tgaagccgag 60 ggggcaccgt eagtet-fcect ct-tcccccca aaacccaagg. acaccctcat gatatcccgg 120 aeccctgagg tcacatgcgt ggtggtggac gtgagccacg aagaccefcga ggtcaagttc ISO aactggtacg tggacggcgt ggaggtgcat aatgccaaga caaagccgcg ggaggagcag 240 tacaacagca cgtaccgtgt -ggtcagcgtc ctcaccgtcc tgc&ccagga ctggctgaafe 300 ggcaaggagt acaagtgcaa ggtctccaac aaagccctcc catcctccat cgagaaaaoc 360 atctccaaag ccaaagggca gccccgagaa· ccacaggtgt acaccctgcc cccatccc-gg OO gatgagctga ccaaga.acca ggtcagcctg acctgcctgg tcaaaggctt ctatcccagc 460 gacatcgecg tggagtggga gagcaatggg cagccggaga acaactacaa gaccacgcct 540 cccgtgctgg actccgacgg ctccttcttc ctctacagca ag-ctcaccgt ggacaagagc 600 aggtggcagc aggggaacgt cttctcatgc tccgtgatgc atgaggctct gcacaaccac 660 tacacgcaga agagcctctc cctgtctecg· ggtaaataa 69S <2.l0> 34 «211> 62 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Első olígonukleotid primer, ami a zalphal 1 extraeelluláris 3 végére és az Fc4 5' végére terjed ki <40O> 34 gcacggtggg cafcgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tcgtgagggt teoagecttc 60 et. 62 <210> 35

503 <211> 81 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <22O>

<223> Második ollgonukleotid primer, ami a zalphal l extracelluláris doménje 3 végére és az Kc4 5' végére terjed ki <4O0> 35 agacccagtc agaggagtta. aaggasggcfc ggaaccctca cgagcccaga tett

A tg aca SS <210> 38 <211> 87 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Ollgonukleotid primer, ami az Fc4 3' végét, és a vektor határold régióját tartalmazza <40O> 36 gtgggcctct gsggtgggta caaccccaga gctgttfctaa tvtagattat ttacccggag SS ac&ggga S?

<2I0> 37 < Φ9 * *♦** * 9 * *

X* <211> 8 «212» FEHÉRJE <213» Mesterséges Szekvencia «220» «223» C~terminális PLAG aminosav szekvencia «400» 37

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp .Asp Lys

3

«210» 38
«211» 26 «212» DNS
«213» Mesterséges «220»	í Szekvencia
«223» OHgonukieo «400» 38	tid primer ZC7764a

10» 39 <, «212» DNS

305 φ ΦΦ' <220>

<223> Oligonukleotíd primer ZC7764b <400> 39 <210> 40 <211> 1.9 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <22Ö>

<223> Oligonukleotíd primer ZC22034 <400> 40 ttcaaatcac ttctccaaa IS <210> 41 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oiigonukieoiid primer ZC22035

3Ö6

-X * <400> 41 fcfc ΐ fc gg a g a a g fc gafcfcfc g a a <210» 42 <211» 18 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» Oligonukleotíd primer ZC22050 <400> 42 ga&tgcgtca actfc&t <211» 16 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» Olígonukleotid primer ZC22051 <400» 43

307

Φ χχ» * ΦΦ * * φ « « φ * * *** * * χ φ φ*ΦΦ ♦ * *_* ί » » Φ X * * ** <210> 44 <2Π> 25 <2Ι2> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <22()>

<223> Oligonükleotíd primer ZC22Ö56 <400> 44 gtct-g'tctgg tagtcatctt cttgg 25 <210> 45 <211> 25 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonükleotíd primer ZC22057 <400> 45 cttg-feggagc tgatagaagt fcc agg <2

308 «ΦφΧ 4>

<212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC22205 <400> 46 agctgttoaa caatgtcaat aaggtc

L0> 47 <211> 24 <2I2> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleötíd primer ZC22206 <40O> 47 cctcctaatt agacttcgfcc acct <210> 48 <211> 27 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

Φ »*

309 ♦ ♦ φ Φ* W Φ * φ

χ ΦΦ φφφ φ φ Φ5φ <223> Oligonukleotid primer ZC9739 <400> 48 ccafccctaat a-cgactcact atagggc 27' <2I0> 49 <211> 23 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia.

<220>

<223.> Oligonukleotid primer ZC97 I9 <400> 49 actcactata gggctcgagc ggc 23 <210> 50 <21I> 25 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <223» Oligonukleotid primer ZC 14883 <400> 50 yaocagacat aatagctgac agas <210> 51 <211 >21

-f -{ r>w <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Olígonukleötid primer ZC5020 <400>δ 1 cactggagtg gcaactt-cca g <210> 52 <21i> 20 <2I2> DNS

<223> Olígonukleötid primer ZC22421 <4ÖO> 52 etaaaatggc tcctfccáaaa

2Θ <210> 53 »<»« Φ«

311 <211> 40 <212> DNS <213 > Mesterséges Szekvencia.

<220>

<223> Oligonukleotid primer 2C226Ö4 <400> 53 cacacaggcc ggccaccafcg ggctfcccagc ctccggccgc 40 <210> 54 <211> 20 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC22641 <40O> 54 <210> 55 <211> 3072 <212> DNS <2.13> mus musculus

312

Φ φφ * φ * * * * «XX * V

X « * <220>

<221> CDS <222> (54),, 4491) <400> 55 gagaaceaga co&aggccot gtcateaget ccfcggagatt cagttctggt ggc atg SS

Met

gag

agg

aec

ctt.

gtc

tgt

ctg

gta

gtc

atc

tt e

tig

399

aca

gtg

get

104

Gin

Arg

Thr

Leu

Val

Cys

leu

Var

Val

r le

3? ile

Len

Gly

Thr

Val

Alá

5

10

15

cat

aaa

tea

agc

ccc

caa

999

COA

gat

ege

etc

ctg

att

aga

ctt

ege

152

Kis

r,ys

Ssr 0Λ

Ser

Pro

Gin

Gly

Pro 25

Asp

Arg

sec

Leu

Ile %r«

Arg

Len

Arg

tac

Ott

fitt

gae

att

gtt

gaa

tag

ctg

aaa

atc

tat

ÓV gaa

aat

gac

ttg

200

Kis

Ile

Asp

Xls

Val

\2 -i. u.

Gin

ixíSU

Lys

Ile

Tyr

Gin

Asa

Asp

Len

35

40

45

gat

•cet

gaa

Ctt

cta

tea

get

cca

caa

gat

gta

ggg

cac

tgt

gag

24 8

Asp

Pro

Glu

Lee

wsu

Ser

Alá

Pro

Gin

Asp

v&l

Lys

Gry

His

Cys

GrU

50

55

60

65

cat

ges

get

ttt

góc

tgt

itt

tag

aee

geo

aaa

ctc

aag

coa

tea

aac

296

Kis

Λ-Χ <5.

Alá

Phe

Alá

Cys

Phe

ü?J, Π

Lys

Alá

Lys

Let

Lys

Pro

Ser

Asn

70

75

80

cet

•gga

aac

aat

&·&<?'

aca

4* 4» í» **- \»U·

atc

seb

geo

ctt

gtg

geo

cag

ctc

agg

344

Pro

Gly

Asn

Asn

TjV 2

Thr

Phe

T ': '·ί

Ile

Asp

Leu

val

Alá

Gin

Len

Arg

85

90

35

agg

agg

ctg

cet

gce

agg

agg

gga

gga

aag

&&&

cag

aag

tat

afea

got

392

Arg

Arg

Leu

Pro

Alá

2> x

Arg

C'iy

Gly

Lys

Lys

Gin

Lys

Kis

Xie

Alá

100 105 110

aaa

tgc

cet

tcc

tgt

gat

teg

tat

gag

aaa

agg

aca

CCC

aaa

gaa

tte

440

Lys

Cys

Pro

Ser

Cys

Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Arg

Thr

Pro

Lys

Glu

Phe

115

129

125

cta

gaa

aga

cta

aaa

tgg

ctc

ott

cas

aag

atg

att

est

cag

oat

ctc

483

Leu

Glu

Arg

Let

Lys

Trp

Leu

Leu

Sin

Lys

Met

Ile

H.ÍS

Gin

Kis

Leu

130

135

140

145

tcc tagaacacst aggacccgaa gattcctgag gatccgsgaa gstteccgag 541

Ser gactgaggag gggattgeaa ttaagatcct tgfecaacatg tgcttetcaa gaaaactaaa cctcttatga aáattgaagfe actcattacc gctttccaga gagggtcacc cttaagttgc agatggcaat tttcaagttt tccagcetca aaaageaatc aaatccaacc ttccagtttt gagcaaatag aagtetacaa aaatggatct ctgtacctca agactagtgt actfctaaaaa attatacsca tgctcgaaag gtctceatgt tgatttttat

acgccggacs	etatsgaege	tcacgaatgc	aggagtacafe	cttgcctctt	591
gtggagaagt	acgataegtt	atgataagaa	caactcagaa	aagetatagg	641
ttegcccatt	aactaagcag	acsttgtggt	tccctgcaca	gactceatgc	721
gaaaatctca	actcaacaag	agcccagctt	ccegtgtcag	ggafcttctgg	781
getgtggctt	catcttattg	cccaactgtg	acattcttcg	attggaaggg	841
gcttttagca	aaaatacagc	taggcaattt	gtegatetge	gagagtaaga	Söl
tcctaacgga	atgatgtaag	ctggaaata®	tsagcataag	átgaaattga	951
etttattett	taagaaaaac	fcttgtacttg	aaagcatgtc	tgaagagttt	1021
acaaacatefc	agcatattga	taactaacat	etttataete	tacaagagag	1981
taggtacagt	ttttettete	tattaggtet	afccaaaattt	aacctattat	1141
ccfeggctttc	actgttttic	taaagaggcs	agggtgtagt	aagaagcagg	12 Öl
cttcctccca	atgtcaagtt	cctttataag	ctaatagttt	satcttgtga	1251
gasagcecgt	ggsagtgcaa	acctcactat	ettetggage	caagtagaat	1321
gtagctctca	ectcaagtgg	ttatgggtgt	ectgtgatga	atetgetage	1381
gtctecfcetc	ccaeatcctt	fccctttcttfe	cctctttgaa	gettetaaga	1441
caaacaagtt	eagcacttaa	gacacattgc	atgcacactt	ttgata&gtt	1501
atetatttaa	aafccaaastc	aggagatgag	ccaagagacc	agaggttetg	1581
aaacagactt	ttactgaaca	fccccasfcctt	fctaaccacag	aggetaaatt	1621
tcttgccstt	tgatataatt	tccaacagta	tgtttcaatg	tcaagttaaa	1581
agctetttte	cctgg&gtgg	tatcatcgct	ttgagaattt	ettatggtta	1741
gagatccaag	catggcctgg	gggatggfctt	tg atc te agg	aaaaaggtgt	1801
cagtgccttt	aaaaca&gea	gagatcccgfc	gtaccgeccfc	aagatagcac	1881
taactgattc	c cagaaa ag t	gtcacaatca	gaaccaacge	attetettaa	1321
tatgtattgc	aaagaacttg	tgtaactgta	aatgfcgtgac	tgttgatgac	1981
catageecac	gtaagtgtcc	aatggtgcta	gcattggttg	cegagtttge	2041
etgaageaga	gatgcagtcc	ttcacaaagc	aafcgatggac	sgagaggggs	21 öl
tttattcttt	tgttgtttct	ggcfcgtgtaa	ctgttgactt	chtgacattg	2181
atttaagses	srgtstttat	fcttggtgtgfe	ttattgttct	ageettttaa	2221

<

314

atcac-fcgaca atttataat-c aagaagfcasa aafcaattcaa tgcagcaeag -gctaagag-ct 2281 t-gtat.cgfctt ggaaaagcta gtgaaggctt stccacta-gc cat-gggaa-ag ctacgcfctta 23-41 gagfcaaacta gacaaaattg ca-cagcagtc tfcgaaccfc-ct cfcgtgofccaa gacfccagcca 2401 gtcctfctgac afctattgfcfcc actgtgggtg ggaa.ca-cafcfc gga-cctgaca cactgfctgtg· 2481 tgfcccatgaa ggttgccact ggtgtaagct tttt-tfcggtt. ttcattctct tatctgtaga 2521 acaagaatgt. ggggctttcc ta-a-gtctatt cfcgfcatttta ttctgaacfct cgtatgtctg- 2581 a-gfcfcttaafcg tttt-gagtac fccttacagga acaccfcgacc aeactfcfcfcga gfctaaafcfcfct· 2841 atcccaag-tg fcgatafcfctag tt-gttcaaaa agggaaggga tatacataca tacatacata 27 01 catacataca tatatatafca tatatafcaca tatatatafca tatatatatg fcatatafcata. 2781 tatafcata.ga gagagagaga gagagagaga gagaaagaga gagaggttgt tgfcaggtc-afc. 2821 aggagttcag aggaaafceag ttafcggccgt ta-atactgfca gcfcgaaa-gfcg tttfcctttgfc 2881 g-aataa-attc at-agcattat -tg.atcfcat.gt fcafctgcfcctg ttttattta-c agtcacacat 2341 gagaattfcag tfcfctaatafcg aafcgatgtae tttafcaactt aatgafcfcatt fcattatgtat 3881 ttggtfcfctga. &tgfc.fcfcgtgt tcafcggctfcc ttatttaaga -cefcgatcafca ttaaa-tgcfca 3851 cccagtccgg a 3872 <2I0> 56 <211> 146 <212> FEHÉRJE <213> mus mnscuhis <400> 56

Met Glu Arg Thr

Alá Kis Lys Ser

Arg His Leu XIs

Leu Asp Pro Glu

Leu Val Cys Leu

Ser Pro Gin Gly

Asp Xle Val Glu

Leu Leu Ser Alá

Val Val Ile Phe

Pro Asp Arg Leu

Gin Leu Lys Xle

Pro Glu Asp Vei

Leu Gly Thr Val .Les Xle Arg Leu

Tyr Glu Asn Asp

Lys Gly His Cys

Glu His Alá Alá Phe Alá Cys Phe Glu Lys Alá Lys Leu Lys Pro Ser

Φ

65

70

t w

80

Asn

Pro

Asn

Asn

Lys

Thr

Phe

lie

Xle

Asp

Leu

Val

Alá

Glu

Leu

85

30

05

Arg

Ai? g

Arg

Leu

Pro

Alá

&£*£$

Arg

Gly

Giy

Lys

Lys

Gin

iu y ί»

His

lie

10Ö

105

·· ' n Λ Φ. v·'

Aia

Lys

Cys

Pro

Ser

Cys

Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Arg

?ro

Lys

Glu

125.

2 20

125

Phs

Lön

G 2. ti

Arg

Leu

Lys

Trp

Leu

Glu

Lys

T le

His

Gá-Γ:

HÍS

130

135

14 0

Ser

5 <2ίΟ> 57 <211> 34 <212> DNS

213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC22283 <400> 57 egcregagae cafcgg&gagg accctt-gtct gtct 34 <210> 58 <21I>31

316 <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotíd primer ZC22284 <40Q> 58 gctctagaat cttctcggat ccfccaggaat c

CO <210> 59 <211> 100 <212> DNS <218> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotíd ZC 12749 gtaccttcc-c gtasatccct ccccttcccg gaafctacaca cgcatattfcc ccaga&aagg 60 aactgtaga-b ttctaggaat -böaafcccttg gccacgcgtc <21 )> 100 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

y»** * ν * Φ * > » * * * * * '54 7 φ*φ ♦ * **♦ * ί· «. » «»♦« * * ♦ _Λ «»» ΦΦΧ * ♦* ** <223» OligonukleoUd ZC12748 <400» 60 tcgagacgcg tggccaagg-a ttgaattcct agaaaecxa-c agfctcctttt -etgggaaata S0 cgcgfeg-fegta afctccgggaa ggggagggat ttacgggaag 100 <210» 61 <211> 32 <212» DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220»

223» Oligonukleotld primer ZC22143 <210» 62 <•211» 32 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223> Ökgonukleotid primer ZC22144 <4ÖÖ> 62 φ* φ X ΦΦ X * cgtacgggsg egcctcaggá áta-tteactt ec 32 <210.» 63 <211» 433 <212» DNS <213» homo sapiens <400» 63 fcocagtccfcg gca&catgga gaggaítgtc atcfcgfccfcga. tggfccafccfct cttggggaca 60 ctggtccaca aatcaagctc ceaaggtcm gatcgccaca tg&fcfc&gaafc gcgtcaacfct Χ2Ό atagafcattg fctgatcagct gaaaaattat gtgaatgact fcggfcccctga afcttctgcca 180 gcfcccagaag a-t-gtagagac aaacfcgtgag tggtcagcfct ttfccctg-fctt t-cagaaggcc 249 caacfcaaagfc cagcaaafcac aggaaacaafc ga.aaggafcaa tc&atgtafcc aattaaaaag 300 cfcgaagagga aaocacctfcc eacaaatgca gggagaagac agaaacacag acfcaacafcgc 360 cctfccatgfcg atfccfcfc-atga gaaaaaacca cccaaagaafc· tcctagaaag attcaaatca 420 cttctccaaa agatgafcfcca tcagcafccfcg tccfccfcagaa cacacggaag. fc-gaagafcfccc 4 80 tga 483 <210» 64 <211» 57 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» Oligonukleotid primer 2022052 <400» 64 φφφ* ·>»** φ »

319 tcatataggc cggc &tg cccgggcgcc accatggatt ccagfccctgg caaca-t-g <2iO> 65 <211> 5?

<212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleodd primer ZC22053 <400> 65 gtaessccec agagctgttfc taaggcgcgc ctctagatca g-gaatctbca· ct-feccgt <21ö> 66 <211> 32 <212> DNS <2I3> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleodd primer ZC23115 <400> 66 gtatacggcc ggceaecatg gagaggasce <21ö> 67

320

ΑΦΦ* »»*♦ * ** .**.

ί ; ί « Φ φ X * ί * * φ» χ« * Ο* *9« <211> 32 <212> DNS

213> Mesterséges Szekvencia

220>

223> Oligonukleotíd primer 2

:40Ö> 67

cgtatcggcg cgccctagga ga-gatgctga tg 32 <210> 68 <21!> 35 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotíd primer ZC20892 <4Ö0> 68 gtafeacgttt aaacgccace &tgccgcgt.g gctgg 35 <Z c211> 32

12> DNS <21.3>

««0 * * »* * » * *

3?1 ««»»«« »«“♦«♦ •ν*·**·.* 4 0 Λ * *

A0Í0 *♦» * · <220>

<223> Oligonükleotíd primer ZC20893 <400> 89 cgtatcggcg cgcctta-caa. tggatgggtc tt 32 <21ö> 70 <211> 39 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonükleotíd primer ZC22034 <400> 70 cccggggtcg ac.accatgga ttccagtcct ggcaacafcg 39 <210> 71 <211> 32 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonükleotíd primer ZC22Ö55 <40ö> 71 tgcagtttas actcaggaat cttcactbcc gt <210> 72 <211> 40 <212> FEHÉRJE <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Huzalphal 1L-1 peptide <400> 72

Gin	Asp	Arc	Hús	Met ile	Arc		Arc	Gin Leu Ile iö	Asp	Ile Val 15	Asp
Gin	Leu	Lys	Asn	Tyr Val	Asn	As&	Leu	Val Pro Glu	; Phe	Leu Pro	AL&
			20				25			30
Pro	Glu	Asp	va i.	Glu Thr	Α;3Γί	Cys

40 <2 1O> 73 <21 !> 32 <212> FEHÉRJE <2Í3> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Huzalphal 1L~ 3 peptide φ φ * « · ♦ » φ * φφφ «♦» * φ _ν χ ΦΧΦΦ ® Φ φ φ Φ Φ * <400» 73

Cys Pro Ser Cys Asp Sex? Tyr Glu lys Lys Pro· Pro Lys Glu Phe Leu

5 10 15

Glu Arg Phe Lys Ser Leu Leu Glu Lys Me-t lle His -Gin. His Leu Ser

25 30 <210» 74 <211» 29 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» Oligonukleotid primer ZC23444 <400» 74 gcccgggcgg atccaiggat tccagtcct

Φ* ** <21.1» 32 <212» DNS

<223» Oligonukleotid primer 2C23445 * *·*

324 <400> 75 cgcg-ccctcg agtcaggaat cttcacttec gt 32:

<210» 76 <21I> 17 <212» DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» Okgonukleotid primer ZC447 <400» 76 taacaatttc acacagg <210» 77 <211» 18 <212> DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220>

<223» Ollgonukleotid primer ZC976 <400» 77 egttgtasaa cgacggcc ·->

325

ΦΒ ♦♦ φ φ ♦ ♦ » Φ φ ΦΧΜ * » φ φ Φ φ φ Φ Φ < ♦' φ φ * ** ** <210> 78 <2Ι1> 66 <212> DNS <2'13> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonnkleotid primer ZC22128 <400> 78 tcaccacgcg- aattcggtac cgctggttcc qcgt.ggst.ec caagafccgcc acatgattag Sö aatgcg SS <210> 79 <211> 68 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotíd primer ZC22127 <400> 79 •fcctgta-tcag gcfcgaaaatc gtgttcta ttatctcatc egccaaaaca fcsaggaatct. tcacttccgt 6·δ SS <210> 80 e»v* φχμ* *

326 * φφφ β φ y X φ X Λ φ ♦ Φ * * *

Φ * X* <211 > 40 <2Γ2> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC 19372 <400> 80 tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc <2!0> 81 <211> 80 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <223> Oligonukleotid primer ZC 19351 acgcgca gac t a attcgagc ecccáccátő accateacca. cgcgaatt-cg gtaccgctgg 6Θ <210> 82 <211> 6O <2i2> DNS <2I3> Mesterséges Szekvencia

Φ »·'♦♦♦ * *

327 “j* <220>

<223> Olígonukleötid primer ZC 19352 <400> 82 actcactata gggcga&ttg eccgggggat ©cacgcggaa ccagcggtac- egaattsgcg 6ö <210> 83 <211> 42 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Olígonukleötid primer ZC19371 <400> 83 acggccagtg aafct-gtsafca cgactcacta tagggcgaa.t fcg <210> 84 <211> 1560 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<221> CDS <222> (1)..41560) φφ** V#** * * φ <22·3> MBP-human zalphall Ligandum fúziós pollnukleotid <400> 84

atg

aaa

act

gaa.

gaa

ggt

&8.S

ctg gta

atc

tgg

att

aac

ggt

gat

&&&

48

Met

Lvs

Thr

Glu

Glu

Gly

Lys

Leu Val

4. Xs

Trp

Tle

Asn

Gly

Asp

Lys

1

1 π

*

χ U

X 3

ggc

tat

aac

gg t

ccc

cet

gaa

gtc ggt

aag

&&.&

ttc

vág

aaa

gat

acc

96

Gly

Tyr

Asn

Gly

Lee

Alá

Glu

Val Gly

Lys

Lys

Phe

Glu

Lys

Asp

-x- X »4i.

20

35

30

gga

att

aaa

gtc

acc

gtt

gag

cat ccg

gat

aaa

ctg

gaa

gag

aaa

ttc

144

Gly

lle

Lys

Val

Thr

Val

Glu

His Pro

Asp

T »v.v

Leu

Glu

Glu

Lys

Phe

35

40

45

cta

cag

gtt

gcg

gca

act

ggc

gat ggc

cet

att

stc

t: te

tgg

gca

192

T?ro

Gin

Val

Alá

Alá

Thr

> tv ^j.y

Asp Gly

Pro

Asp

Xle

lle

Phe

Trp

Ara

50

60

cac

gac

ege

ttt

ggt

ggc

tac:

get caa

tet

ggc

ctg

ttg

get

gaa

atc

240

His

Asp

Arg

Phe

-Gly

Gly

Tyr

Alá Gin

Ser

Gly

Leu

Let

Alá

Gm

He

65

7 0

75

80

acc

ccg

aaa

gcg

ttc

cag

gac aag

ccg

tat

ccg

ttt

acc

tgg

gat

288

Thr

Pro

Asp

Lys

Alá

Phe

Gin

Asp Lys

Leu

Tyr

Pro

Phe.

Thr

Trp

Asp

85

90

95

gcc

gca

C9X.

tac

aac

ggc

ctg att

get

tac

ccg

atc

get

gtt

gaa

335

Aia

Val

Arg

Tyr

Asn

Gly

Lys

Lee lle

Alá

Tyr

Pro

1 18

Ara

Val

Glu

100

105

110

g e g

cta

teg

ctg

sut. ti

tat

aaa gat

ctg

ctg

ccg

aac

ccg

cca

aaa

384

Ála

Len

Sor

Leu

He

Tyr

Asn

Lys Asp

Leu

Lsu

Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

IX 5

120

125

acc

tgg

gaa

gag

acc

ccg

rt Zs Z*

ctg gat

aaa

gaa

ctg

aaa,

gcg

aaa

ggt

432

♦♦♦♦

Thr	Trp	Glu	Glu	lle	Pro Alá	Len Asp Lys Glu Leu Lys Alá Lys Gly
	130				135	140
aag	agc	geg	ctg	atg	ttc aac	ctg csa gaa ccg tac ttc acc tgg ccg	4S0
Lys	Ser	Alá	Lee	?4«t	Phe Asn	Leu Gin Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro
14 5					1 Ε Λ A, xA -V	155 160
ctg	att	get	gca	cac	ggg ggt	tat gcg ttc aag tat gaa aac ggc aag	52 S
Leu	He	Alá	A.1&	Asp	Sly Gly	Tyr Alá Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lvs
				16 5		170 175
tac	gac	att	aaa	gac	gtg ggc	gtg gat aac got ggc gcg aaa gcg ggt	576
Tvr	Asp	lle	Lys	Asp	Var Gly	Val Asp Asn Alá Gly Alá Lys Alá Gly
			ISO			185 190
ctg	acc	ttc	ctg		gac ctg	alt aaa aac aaa cac atg aat gca gac	624
Lat	Thr	Phe	ueu	Val	Asp Lan	He Lys Asn Lys His Mefc Asn. Alá Asp
		195				200 205
acc	gat	tac	tcc	atc	gca gaa	get gcc ttt aat aaa ggc gaa aca gcg	672
Thr	Asp	Tvr	Ser	lle	Alá Glu	Alá Alá Phe Asn Lys Gly Gin Thr Alá
	210				215	2 20
atg	acc	atc	aac	ggc	ccg tgg	gca tgg tcc aac atc gac acc agc aaa	720
Met	?->·	lle	Asn	Gly	Pro Trp	Alá Trp Ser Asn He Asp Thr Ser Lys
225					230	235 240
gtg	aat	tat	gg t	gta	acg gta	ctg ccg acc ttc aag ggt caa cca tcc	768
vsi	Asn	Tyr		Val	Thr Val	Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gin Prc Ser
				245		250 255
aaa	ccg	ttc.	gtt	ggc	gtg ctg	agc gca ggt att aac gcc gcc agt ccg	816
Lys	Pro	p'd©	Val	Gly	Val. Leu	Ser Alá Gly He Asn Alá Alá Ser Pro
			260			265 270
aac	aaa	cag	ctg	gca	aaa gag	ttc ctc gaa aac tat ctg ctg act gat	864
Asn	Lys	GXu		Aid	Lys Glu	Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp
		77 £ζ				2-88 285

9* *

gaa

ggt

{'•(•Λ

gaa

gtt

aac

aaa

gac

&&&

ccg ctg ggt

gcc

gta

gcg

912

Glu

Gly

Leu

Glu

&Xs

Val

Asn

Lys

Asp

Lys

Pro Leu Gly

Alá

Val

Alá

290

295

300

ctg

aag

tct

tac

gag

€£&&

gag

ttg

gcg

s&a

gat cca cgt

att

ccc

gcc

968

Leu

Lys

Ser

Tyr

Glu

Gin

Leu

Alá

Lys

Asp Pro Arg

He

Alá

7¾. 2. <Λ

30 5

310

315

3

;20

acc

atg

gaa

áSC

gcc

cag

aaa

ggt

gaa

atc

atg ccg aac

atc

ccg

c&g

18ÖS

Thr

Met

Gin

Asn

Alá

G jL 13.

Lys

Gly

Glu

He

Met Pro Asn

He

Pro

Gin

325

330

335

®tg

tcc

get

ttc

tgg

tat

gcc

gtg

cgt

act

ccg gtg atc

aac

gcc

gcc

1056

Hst

Ser

Alá

Phe

Trp

Tyr

Alá

Val

Arg

Thr

Alá Val lis

Asn

Alá

340

345

350

agc

39

cgt

cag

íSOX

gtc

gat

gaa

gcc

ctg

aa.a gac gcg

cag

act

1104

Ser

Gly

Arg

Gin

Thr

Val

Asp

Gin

Alá

Leu

Lys Asp Alá

Gin

Thr

Ás Ja

3S5

360

3 SS

tcg

agc

tcc

CSC

cat

CSC

νφ>*

cac

cec

gcg

aat tcg gta

ccg

ctg

gtt

Ser

Ser «, **? z».

Ser

His

His

His

Hís

His

His

Alá

Asn Ser Val T 8 0

Pro

Leu

V*.x ' tf&.X

cc<$

U ? V cgt

gga

tcc

cas

gar

ege

cac

atg

att

X? ö V aga atg cgt

caa

ctt

ata

1200

Pro

Arg

Gly

Ser

Sin

Asp

Arg

His

Met

ile

Arc Met Arg

Gin

Len

Ile

3 SS

390

395

400

gat

SX v

gtt

gat

tag

ctg

aaa

3.8X

gtg

aat gac ttc

gtc

cet

gaa

124 0

Asp

Ile

t >* fi ‘v -v-S-x

Asp

Gin

tea

Lys

Tvr

Val

Asn Asp Len

Val

Pro

Glu

405

410

415

ttc

ctg

cca

get

cca

gaa

gat

gta

gag

aca

aac tgt gag

tgg

tea

got

1296

Phe

Leu

Pro

Alá

Pro

Gin

Asp

Val

Glu

Thr

Asn Cys Gru

Trp

Ser

Alá

420

425

438

ttt

tcc

tgt

ttt

cag

aag

gcc

caa

cta

aag

tea gca aat

aca

cga

aac

1344

Phe

Ser

Cys

Gin

Lys

Ar a

Gin

Xj&U

Lys

Ser Alá Asn

fWk\4. Xi4s

Gly

-Asn

♦ φφ φ

331

435 440 445

tat

gaa

agg

áss

atc

aat

tea

att

aaa

aag

ctg

aag

agg

aaa

cca

1303

Asu

GLU

Arg

1 rö

Hs

Asn

Val

Ser

1' le

Lys

Lys

Let

Lys

Arg

Lys

Pro

450

^55

480

cet

tcc

aca

aat

aca

ggg

is-\í a

aga

cag

aaa

cac

aga

eta

aca

tgc

cet

1440

ζϊν'''·

Ser

Thr

Asn

Alá

Gly

Arg

Arg

Gin

Lys

His

Arg

Leu

Thr

Cys

Pro

465

4 70

475

ISO

tea

tgt

gat

tct

tat

gag

aaa

Js£

&

ccc

&&&

gaa

ttc

eta

gaa

aga

14 SS

ser

Cys

Asp

Ser

Tvr

Glu

Lys

Pro

Pro

Lvs

Glu

Phe

Leu

Gr c

Arg

485

400

405

ttc

aaa

tea

ctt

ctc

caa

aag

atg

att

cat

c&p

cat

ctg

tcc

tct

aga

1538

Phe

Lys

Ser

Leu

Let

Gla

Lys

Met

Ile

Hís

Gin

His

Leu

Ser

Ser

Arg

500

505

519

aca

CSC

gga

agt

gaa

gat

tcc

tga

1580

Thr

Kis

Gly

Ser

vi a

Asp

Ser

515 <210» 85 <211» 519 <212» FEHERJE <213» Mesterséges Szekvencia <220>

fúziós polipeptid <400» 85 \,,.ν

Les ν&ΐ He Tre Xle Asn Glv Asr

Lvs ► ·*< Α * ** .φ ♦ · * ♦ V «ΦΦ *♦* * * *** * ^χ χ X ΚΧΦΦ ♦ * *_* _ΑχΦ « ** ** i Μ ΙΟ 13

Gly Tyr Asn Gly Leu Alá Glu Val Gly Lys Lys Phe Gin Lys Asp Thr

2:0 25 3ö

Gly lle Lys Val Thr val. Glu His Pro Asp Lys- Leu Glu Glu Lys Phe

v.< w

Pro Gin Val Alá· Alá Thr Gly Asp Gly Pro Asp He lle Phe Trp Alá

5Ö

His Asp Arg .Phe Gly Gly Tyr Ara Gin Ser Gly Leu Leu. Alá Glu lle

Thr Pro Asp Lys Alá Phe Gin Asp Lys· Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp

Alá Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu lle Alá Tyr Pro He Alá V&l Glu

100 ίδί

110

Alá Leu Ser Leu lle Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lvs

11, ö

125 ?hr Trp Glu Glu lle Pro Alá Leu Asp Lys Glu Leu Lys Alá Lys Gly

13ΰ 135 140 lys Ser Alá Leu Met. Phe Asn Leu Gin Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro

L<i 5

150

155

Leu lle Alá Alá. Asp Gly Gly Tyr Alá Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165

Tyr Asp He .Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Alá. Gly Alá Lys Alá Gly

180

185

L9Ö

Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu lle Lys Asn Lys Kis Met Asn Alá Asp .95

200

205

Thr Asp Tyr Ser lle Alá Glu Alá Alá Phe Asn Lys Gly Glu Thr Alá

210

Í15

220

Met Thr He Asn Gly Pro Trp Alá Trp ser Asn lle Asp Thr Ser Lys

225

230

235

240 «-*··*

Val

Asn.

Tyr

Gly

Val r 45

Thr

Val

Leu

Pro

HÜ’Y'í·' 2.50

Phe·

Lys

Gly Gin Pro 255

Ser

Lys

Pro

Phe

Val

Gly

Ver

Leu

Ser

Ala

Gly

ile

Asn

Ara Ala Ser

Pro

260

265

270

Asn

Lys

GúU

Leu

Ala

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Asn

Tyr

Leu Leu Thr

Asn

275

200

28 5

Glu

Gly

Leu

Glu

Ala

Vau

Asn

Lys

Asp

Lys

Pro

Leu

Gly Ala Val

Ala

290

295

300

leu

Lvs

Ser

Tyr

Glu

Glu

Gin.

Leu

Ala

Lys

ASp

Pro

Arg Lle Ala

Ala

305

310

315

320

Thr

Mst.

Glu

Asn

Ala

Gin

Lys

Gly

Glu

Σ Le

Hét

Pro

Asrx lle Pro

Gin

325

330

335

ffet

Ser

Ala

Phe

Trp

Tyr

Ala

Val

Arg

Thr

Ala

Val

Lle Asn Ala

Ala

340

345

35 0

Ser

Gly

Arg

Gin

Thr

Val

Asp

Glu

Ala

Leu

Lys

Asp

Ala Gin Thr

Asn

355

360

365

Ser

Ser

Ser

His

SÍ a

8 is

His

His

His

Ala

Asn

Ser

Val Pro Leu

Val

37 0

3 7 5

380

Pro

Arg

Gly

Ser

Glu

Asp

Arg

Has

Mer

lle

Arg

Met

Arg Gin Len

lle

3 SS

390

.395

400

Asp

Lle

Vei

Asp

Gin

Les

Lys

Asn

Tyr

Val

Asn

Asp

Leu Var Pro

Gin

405

410

415

Phe

Leu

Pro

Ala

Pro

Glu

Asp

Val

Glu

Thr

Asn

Cys

Glu Trp Ser

Ala

420

425

43 0

Phe

Ser

—jf

Phe

Gin

Lys

&Λ. &

Gin

Len

Lys

Ser

Ala

Asn Thr Gly

Asn

435

440

4 45

Asn

Arg

lle

lle

Asn

Ser

Lle

.Lys

Lys

Leu

Lys Arg Lys

Pro

450

4 5 5

460

Pro

Ser

mú ·.0 .Λ4.

Áss

Ala

Gly

Aj;'9

Arg

Gin

Lys

His

Arg

Leu Thr Cys

Pro

4 65				470					475	480
Ser Cys	Asp	Ser	Tyr	Glu	Lys	Lys	Pro	J->ro	Lys !	Glu Phe Leu Giu Arg
			485					490		495
Phe Lys	Ser	Leu	Len	Giu	Lys	Hét	Ile	Hís		His Leu Ser Ser Arg
		500					505			51G
Thr His	Gly	Ser	Glu	Asp	Ser
	515
<210>	86
<211>	64

<212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleodd primer ZC22849 <400> 88 tcac-cacgcg aaticggtac cg-ctggttcc gcgtggatcc ccagatcgcc tcctgattag 60 actr 64 <210> 87 <211> 64 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC2285Ö

XX <400> 87 fcc.tgtat.cag gcfcg&aaatc ttafccfccafcc cgccaaaac-a- cfcagga-gaga fcgcfcgatgaa 60 teát S4 <21ö> 88 <21)> 1533 <21.2> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <22Ö>

<223> MBF-egér zalphall Ligandum fúziós polinukleotid <221> CDS <222> (H. 41533) <40ö> 88

atg

aaa

act

gaa

gaa

ggt

aaa

ctg

gta

A* C

tgg

a t t

aac

ggc

gat

aa.a 48

Met

Lys

Άι. c

Öly

Lys

Lse

Val

il«

Trp

lie

Asn

GXy

Asp

1

5

10

15

ggc

tat

ggt

ctc

get

<£&αι

gtc

ggt

aag

aaa

ttc

gag

gat

acc 96

Giy

Asn

Sly

Löd

Alá

G Xn

Val

Giy

Lys

Lys

Phe

Sic

.Lys

Asp

Thr

2G

25

30

gga

afcfc

sas

gtc

&CC

gtt

cag

cat.

ccg

gat

aaa

ctg

gaa

aaa

i, 4- .χ, 5 Z A

V, I y

lie

X; y s

Val

val

Ζ*Ί VA <? m!» \a

His

Pro

Asp

Lys

Leu

Gl a

Glu

Lys

Fhs

35

40

45

cca

cag

gtt

<3<S

gca

act

ggc

gat

ggc

cet

gac

att

atc

chc

tgg

gca 192

Pro

SÍ a

Va 1

Alá

Thr

SÍ y

Asp

Sly

Pro

Asp

lie

Ile

PhC

Trp

Alá

336

X *♦

<· X 0 0 V » ♦ Φ*

0 0 « 0 *·«*

/* » »♦« * φ 0 0 Φ*

50

55

63

CSC

gac

ege

ttt

ggt

ggc

tac

get caa

tea

ggc ctg

ttg

get

gaa

atc

240

His

Asp

Arg

Phe

Gly

Gly

Tyr

Alá Gla

Ser

Gly r>su

Leu

Alá

Giu

rle

65

70

75

80

acc

ccg

gac

&&S

gcg

ttc

cag

gac aag

ctg

tat ccg

ttt

acc

tgc

gat

288

Pro

Asp

Lys

Alá

Phe

Gin

Asp Lys

Leu

Tyr Prc

Phe

Thr'

Trp

Asp

•3 E O s/

30

i5

gcc

gta

cgt

t&c

MC

qöo

aag

ctg att

get

tac ccg

atc

get

gtt

gaa

335

Val

Arg

Tyr

Asn

Gly

Lys

Leu Ile

Alá

Tyr Pro

Ile

Aia

Var

G Λ. <1

100

105

IlO

gcg

tta

teg

ctg

att

tat

aac

aaa gat

ctg

ctg ccg

aac

ecg

cca

&&&

3S4

Leu

Ser

Lat

Ile

Tyr

A Síi

Lys Asp

a

Leu Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

115

120

125

acc

t.g«

gaa

gag

atc

cc<§

gcg

ctg gat

aaa

gaa ctg

aaa

gcg

aaa

ggt

432

Thr

Trp

Glu

Gr u

Ile

Prc

Alá

Leu Asp

Lys

Giu usu

Lys

Alá

Lys

Gly

130

135

140

sag

agc

gcg

ctg

atg

·· ;· Λ

aac

ctg caa

gaa

ccg tac

ttc

3t\»'üí

tgg

ccg

430

Lys

Ser

Alá

r>eu

Mát

Phe

Asn

Lee Gin

/-1 í.

Prc Tyr

Phe

Thr

Trp

Pro

145

150

155

160

ctg

att

get

get

gac

ggg

ggt

tat gcg

ttc

aag tat

gaa

aac

ggc

aag

528

LöU

rle

Ara

Ara

Asp

Gly

Gly

Tyr Ara

Phe

Lys Tyr

Glu

Asn

Gly

Lys

165

170

175

tSC

gac

art

aaa

Cfí&C

gtg

,*c CSC

gtg gat

aac

get ggc

8tg

aaa

gcg

93‘t

575

’T'yr

Asp

Ile

Lys

Asp

Val

Gly

Var Asp

Asn

Aia Gly

Alá

Lvs

Aia

ciy

180

185

ISO

ctg

acc

ttc

ctg

gtt.

gac

ctg

att aaa

aac

CSC

atg

aat

gca

gac

624

Lee

Thr

Phe

Leu

Vs 1

Asp

Leu

Ile Lys

As n

Lys His

Met

Asn

Alá

Asp

135

200

205

acc

gst

tac

tcc

atc

gca

gaa

get gcc

ttt

aat aaa

ggc

gaa

aca

gcg

672

X *

Χ#Φ Φ*Χ φ X * *

Φ Φ φ.φχ * X

Φ. * ·«·♦*.* Φ * *^b*

ΦΦΧ χφφ * ν* - **

ΤΗ κ

Asp

Tyr

Sejr

n.s

Alá

Glu

Alá

Alá

Phe

Asn Lys Giy Gin

Thr Alá

210

215

220

atg

acc

atc

aac

ggc

ccg

tgg

gca

tgg

tcc

aac atc gac acc

agc aaa

?2'8

Met

Thr

Ile

Asn

Giy

Pro

Trp

Alá

Trp

Ser

Asn Ile Asp Thr

Ser Lys

225

230

235

24Ö

gtg

aat

tat

ggt

gts

acg

gta

ctg

ccg

acc

ttc aag ggt caa

cca tcc

768

Val

Asn

Tyr

Giy

Vsl

Thr

Val

Leu

Pro

Thr

Phe Lys Gry Gin

Pro Ser

245

250

? 5 S

aaa

ccg

É tic

g 11

ggc

gtg

ctg

agc

gca

ggt

att aac gcc gcc

agt ccg

316

LVS

Pro

Phe

Val

Giy

Val

Len

Ser

Alá

í- I * < 'Άί

Ile Asn Alá Alá

Ser Pro

265

265

270

aac

aaa

gag

ctg

gca

aaa

gag

ttc

ctc

gaa

aac tat ctg ctg

act gat

364

Asn

Lys

Glu

áu&V

Ara

Lys

Glu

Phe

Leu

Glu

Asn Tyr Leu Leu

Thr Asp

2 7 5

2S0

285

gaa

ggt

ctg

gaa

gcg

gtt

aat

aaa

gac

aaa

ccg ctg ggt gcc

gta gcg

91.2

Glu

Giy

Leu

Glu

Alá

V&X

Asn

Lys

Asp

Lys

Pro Leu Giy Alá

Val Alá

296

295

300

Ctg

aag

tct

tac

gag

£;&·&

gag

ttg

gcg

aaa

gat cos cgt att

gcc gcc

960

Leu

Lys

Ser

Tyr

Gru

Glu

hf-LU

Χφ<$<4

Ara

Lys

Asp Pro Arg Ile

Alá Alá

305

310

315

320

acc

atg

gaa

aac

gcc

cag

g«t

gaa

atc

atg ccg aac atc

ccg cag

1668

Thr

Met.

Glu

Asn

Alá

Gin

Lys

Giy

Gin

Xle

Met Pro Asn Ile

Pro Gin

32 5

330

335

atg

tcc

get

ttc

tgg

tat

gcc

9^-9

cgt

act

gcg gtg atc aac

gcc gcc

1056

Met

Ser

íí 1 a

Phe

ΊΧνον* 4 ír

Tyr

Alá

Vei

Arg

Thr

Alá Val Ile Asn

Alá Alá

340

345

350

agc

cgt

cag

&et

gtc

gat

gaa

gcc

ctg

aaa gac gcg cag

act aat

1164

Giy

Arg

Λ> 1 ,v

Val

Asp

r* T :> •sy il

Alá

Len

Lys Asp Alá G.r.

Thr Asn

355

Ο

365

teg

agc

tcc

C3C

cat

cac

cat

cac

cac

gcg

aat

teg

gta

Ser

S-β'Χ*

Ser

Kis

His

Ja X íS

His

His

His

Alá

Asn

Ser

Val

370

375

380

ccg

cgt

gga

vCC

cca

gat

ege

ctc

ctg

am

aga

ett

cgt

Pro

Arg

Gly

Pro

Asp

Arg

Leu

Len

He

Arg

Leu

Arg

355

350

335

gac

att

G't

gaa

cag

ctg

aaa

atc

tat

gaa

aat

gac

ttg

Asp

Ile

val

ki*

Gin

Leu

Lys

Ile

Tyr

v. U

Asn

Asp

Leu

405

4 1Ö

ott

cta

tea

get

cca

caa

gat

gta

aag

009

cac

tgt

gug

Leu

Ser

Alá

Pro

>' < AA

Asp

Val

V w/ő

Gly

His

Cys

Glu

420 425 χ«>0 V* ** * X * * 0 0

ΧΦΦ φί« 0 * 0 0« * »

00«	0 « «0Χ	·*«’	·«,* L»
ccg	ctg	gtt	1152
Pro	Leu	val
cac	w W	att	1200
His	Leu	He

400

gat	cet	gaa 1248
Asp	Pro	Glu
<	115
cat	go a	got 1296
’-j	ALu	Alá

30

ttt

C;CC

tgt

ttt

cag

aag gcc

aaa

ctc

aag cca tea

aac

cet

gga aac I

344

Phe

Ά1.&

Cys

Phe

Gin

oys Ara

Lys

XiíSxi

Lys Pro Ser

Asn

Pro

Gly Asn

435

4 40

445

aat

a.a g

aea

ttc

atc

afct gac

ctc

3tg

gcc cag ctc

agg

agg

agg ctg 1

392

Asn

Lys

Thr

Phe

Ile

He Asp

Leu

val

Alá Gin Len

Arg

Arg

Arg Leu

450

455

400

V»·» .0<- ·.- V-

gcc

agg

agg

gga

gga aag

aaa

cag

aag cac ata

get

tgc cet 1

440

Pro

Alá

Arg

Arg

Gly

Gly Lys

Lys

Gin

Lys His Ile

Alá

Lys

Cys Pro

4SS

470

475

480

«ν/'-.Λ-, v V \,·

ü <0 0

gat

teg

tat

gag aaa

agg

&C'&

ccc aaa gaa

ttc

cta

gaa aga 1

.488

Ser

Cys

Asp

Tyr

Glu Lys

Arg

Thr

Prc Lys Glu

Phe

Len

Glu Arg

485

430

495

cta

k.gg

ctc

ett

caa aag

atg

att

cat cag cat

ctc

tcc

tga 1533

Leu

Ly s?

Trp

Leu

Leu

Gin Lys

Hét

Ile

His Gin His

Ser

500

505

510

<21Ό> 89 •>·* «211> 510 «2Ι2> FEHÉRJE «213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> MBF-egér zalphal 1 Ligandum. fúziós polipeptíd <400> 89

Met 1

Lvs

Gin

Glu 5

Gly

Lys

Leu

Val

Lle 10

Trp

Xle

Asn

S.3.Í.V

Áss 15

Lys

Gly

Tyr

Asn

G.i.y

Leu

Alá

Glu

Val

Gly

Lys

Lys

Phe

η in

Lys

.Asp

Thr

20

25

30

Gly

Lie

Lys

Val

Thr

vei

Gru

Kis

Pro

Asp

Lys

Leu

Uí 1 n.

Glu

Lys

Phe

35

40

45

Pro

Gin

val

A1&

Ale

πϊ$. v. A κΛλ

Gly

Asp

Gly

Pro

Asp

Xle

Lle

Phe

Trs

Alá

50

£ £

60

Kis;

Asp

Arg

Phe

Gly

Gly

Tyr

Alá

Gin

Sí5I?

Gly

neu

Leu

Alá

Glu

Lle

65

70

75

SÖ

Thr

Pro

Asp

T ,v.v »

Ara

Phe

Gin

Asp

Lys

Leu

Tyr

Pro

Phe

Thr

Trp

Asp

85

90

35

Ars

Val

Arg

Tyr

Asn

Gly

Lys

Len

Le

AI®

Tyr

Pro

lle

Alá

Vsl

Glu

100

105

110

Alá

VSV

Ser

Li&u

Lle

Tyr

Asn

Lys

Asp

L&D

Len

Pro

Asn

Pro

Pro

Lys

115

120

125

W V»-, sk Φ. M

Gin

Glu

Lle

Pro

Alá

Leu

Asp

Lys

Gin

Len

Lys

Alá

Lys

Gly

130

135

140

Lys

Ser

Alá

Leu

Két

Phe

Asn

Leu

Gin

Glv

ΡϊΌ

Tyr

Phe-

Thr

Trp

Pro

ISO

160

145

155 φφ

340

Φ <· Λ * «χ ♦ ί * χ « β·** *** *

Leu Xle Alá Alá Asp Gly Gly Tyr Alá Phe .Lys Tyr Glu Asn Gly Lys

165 'Tyr Asp Xle Lys Asp Val Gly Val. Asp Asn Alá Gly Alá Lys Alá Gly

180

125

190

Leu Thr Phe Len Val Asp Leu lls Lys Asn. Lys His Met Asn Alá Asj

200

205

Thr Asp Tyr Ser Xle Alá Glu Alá Alá Phe Asn Lys Gly Glu Thr Alá .210

220

Met Thr Xle Asn Gly Pro Trp Alá Trp Ser Asn Xle Asp Thr Ser Lys

2.25

230

240

Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Len Pro Thr Phe Lys Gly Gin Pro Ss

245

/.3 3

Lys Pro Phe V.al Gly Val Leu Ser Alá Gly He Asn Alá Alá Ser Pro

260

26:

Asn Lys Glu 'Leu Alá Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp

275

280

285

Glu Gly Leu Glu Alá Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Alá Val Alá

290

295 i 00

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Alá Lys Asp Pro Arg Xle Alá Alá

305

31í .315

320

Thr Met Glu Asn Alá Gin Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn 'Xle Pro Gin

330

335

Mefc. Ser Alá Phe Trp Tyr Alá val Arg Thr Alá Val He Asn Alá Alá

340 >45

350

Ser Gly Arg Gin Thr Val Asp Glu Alá Leu Lys Asp. Alá Gin Thr Asn >55

560

365

Ser Ser Ser His· His His His His His Alá Asn Ser Val Pro Leu Val

375

380

Pro Arg Gly Ser Pro Asp Arg Len Len Xle Arg Leu. Arg His Leu Xle

385 33Ο 395 4Ö0

Asp He

Val

k> A 0·

Gin 405

Leu

Lys

Tvr

Glu 419

ÁSU

Ai>p'

Leu Asp

Pro 415

G iU

Leu Leu

Ser

Ara

Pro

Cin

Asp

Tál

Lys

Gly

His

uy »

Gru Hxs

Alá

Alá

42 0

425

430

Phe Alá

Cys

Phe

·* x viu

Lys

&X<a

Lys

neu

uys

Pro

Ser

Asn Pro

Gly

Asn

4.35

440

445

Asn Lys

Thr

Phe

íle

lle

Asp

Leu

val

Alá

Gin

Leu

Arg Arg

Arg

Leu

450

4 SS

450

Pro Alá

Arg

Ar g

Gly

Gly

Lys

Lys

Gin

Lys

His

Xle

Alá Lys

Cys

Pro

4 S 5

4?0

47 5

4SÖ

Ser Cys

Asp

Ser

Tyr

Glu

Lys

Arg

Thr

Píto

Lys

Glu

Phe Leu

SI.U

Arg

485

4 90

495

Leu Lys

Trp

,Le«

Len

Gls

Lys

Met

lle

His

Gin

Hűé

Leu Sor

590

505

510

<210>

90

<21 !>

22

<212>

DNS

>

<213>

Mestersége:

s Szekvencia

<220>

<22S> Olígonukleötid primer ZC2228I <400> 90

i.gtyaatgae tfcggtcoofcg sa.

342 * * * * <210>91 <211> 23 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukieotid primer ZC'22279 <400> 91 aacaggaaaa agetgaccac tea 23 <210> 92 <211> 3 .1 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Humán zaiphall Ligandum TaqMan próba, Z'G-32 <400> 92 •fcctgccagct ccagaagatg cagagacaaa c <21O> 93 <211> 20 <212> DNS * 4>#*** ·$*·* ’»♦'*· * * *** $ Ι

343 *♦»« ·«’*.*' <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC22277 <400> 93 ccaggagt.gt ggc&getttc 2Ö <2I0> 94 <211> 21 <2I2> DNS <213» Mesterséges Szekvencia <22Ö>

<223> Oligonukleotid primer ZC22276 <400> 94 gcttgcccfcfc csgcatotag a 21 <210> 95 <211> 23 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Humán zalphal 1 TaqMan próba, ZG31 e « * φ '

344

Φ * * φ φ * ♦ X Φ Λ

Λ φ Φ1 χ » # ♦ cggcteccce •fcttcaacgt.g act <210> 98 <211> 1821 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<221> CDS <222> (1)..41821) <223> MBP-zalphal 1 oldható receptor polinukleotid szekvenciája <400> 96

atg

&2bS

atc

gaa

ggt

ctg

gta

ö-t-C

tgg

att

aac

ggc

gat

aaa

48

Ser

Lys

Ha

<iu

Glu

lys

Leu

Va a

lla

ris

Asp

Gly

Asp

Lys

D

lö:

15

ggc

tat

aac

ggt

ctc

get

gaa

gtc

ggt

aag

&&&

ttc

gac

aaa

gac

acc

36

Gly

Tyr

Asn

Gly

r-au

Alá

Λ-7 s> VA v4

val

Gly

Oys

T.V4>

?h«

Giu

Lys

ASp

20

25

30

gga

act.

jS-33.

gtc

acc

gtt

g&g

£11

ccg

ccc

aaa

ctg

gaa

gag

aaa

ttc

144

J,'

lie

Lys

val

Thr

val

GaU

Hís

Pro

Asp

lys

Leu

Glu

Glu

lys

Phe

35

40

45

cag

gcg

gca

act

ggc

gat

ggc

cet

gac

att

atc

ttc

tgg

gca

192

Pro

Gin

Val

A1.&

-X ·> .. ni.«

Thr

Asp

Gly

Pro

Asp

lle

Ile

Phe

Trp

Alá

φ »«» ♦ * ♦ * * * «φ* ♦ 9 * Φ*Φ « *

Φ β φ » * φ * ® Φ *

φ.ΦΜ <♦♦ » *♦ ♦*

cac

gac

ege

títttt

ggt

ggc

tac

get

eaa

tét

ggc ctg ttg

get

gaa atc

240

Kis

Asp

Arg

Phe

Gly

Gly

Tyr

Alá

Gin

Ser

Gly Leu Leu

Alá

Glu lle

85

7ö

75

80

acc

ccg

gac

aaa

geg

ttc

cag

gac

aag

ctg

tat ccg fctt

sec

tgg gat

2 88

Thr

Prc

Asp

Lys

Alá

Phe

Gin

Asp

Lvs

CíkS u

Tyr Pro Phe

Thr

Trp Asp

85

90

95

gee

gta

cgt

tac

aac

ggc

aag

ctg

att

get

tac cég atc

get

gtt gaa

336

Alá

Val

Arc

Tyr

Asn

Gly

Lys

Leu

lle

Alá

Tyr Prc lle

Alá

Val Gru

00

105

110

gcg

tta

teg

ctg

att

tat

aac

&&.&

gat

ct.g

ctg ccg aac

ccg

cca aaa

384

Alá

Leu

Ser

Leu

11»

Tyr

Asn

Lys

Asp

La a

Leu Pro Asn

Prc

Prc Lys

115

120

125

6CC

tgg

gaa

gag

a te

ccg

gcg

ctg

gat

gaa ctg aaa

gcg

aaa ggt

432

Thr

Trp

*.:· la

G.. a

lle

Pro

Alá

Leu

Asp

.LVS

Glu Leu Lys

Alá

Lys Gly

130

135

14 0

aag

agc

gcg

ctg

atg

ttc

aac

ctg

c&&

ccg tac ttc

acc

tgg ccg

480

Lvs

Ser

Als

Leu

Met

Phe

Asn

Leu

Gitt

Glu

Prc Tyr Phe

Thr

Trp Prc

14 a

150

155

160

ctg

att

get

get

gac

ggg

ggt

tat

gcg

aag tat gaa

aac

ggc aag

528

Léu

lls

Τ' *í «% -k Cs·

Alá

Asp

Gly

Gly

Tyr

Als

Phe

Lys Tvr Glu

Asn

Gly .Lys

165

7 a

A /

tac

gac

att

aaa

gac

9 cg

ggc

gtg

g&t

aac

get ggc gcg

aaa

gcg ggt

576

Tyr

Asp

He

LVS

Asp

Val

Gly

Val

Asp

Asn

Alá Gly Alá

Lys

áls. Gly

130:

135

190

<·*> r· ,**< '-T3

acc

ttc

ctg

gtt

gac

att

aaa

&ac

aaa cac atg

aat

g,&c

624

Leu

Thr

Phe

Le a

Val

Asp

Leu

X le

Lys

Asn

Lys His Met

Asn

&X& Asp

195

200

205

acc

gat

tac

Í2-CC

atc

gca

get

gCC

X. yK> V, *K*

aat aaa ggc

gaa

ács. gcg

672

0Ί φφφ

Thr atg

Asp 210 acc

Tvr atc

Ser !a3C

Ile ggc

Ai® ccg

Gr u 215 tgg

Alá Alá gca tgg

Phe Asn Lys Gly Glu *> Λ4. A'V'

φ. -.14 age

tcc aac atc

gac acc

&&&

720

Met

-Thv’

r1c

Asn

Glv

Pro

Trp

Alá Trp

Ser Asn Ile

Asp Thr

Ser

Lys

225

230

235

240

gtg

tat

ggt

gta

acg

gta

ctg ccg

acc ttc aag

ggt caa

cca

‘fc-'C'C

785

Val

Asn

Tyr

Gly

Val

Thr

Val

Leu Pro

Thr Phe Lys

Gly Gin

Pro

Ser

2:45

250

255

ccg

+* h <**

gtt

ula-·

Gtg

age gca

ggt att aac

gcc gcc

agt

ccg

516

Lys

Pro

Phe

Val

Gly

Val

Leu

Ser Alá

Gly He Asn

Alá Alá

Sí-3X?

Pro

260

285

270

2LSC

aaa

gag

ctg

gca

aaa

gag

ttc ctc

gaa aac tat

ctg ctg

act

gat

S64

& <2 Ή í 'i

Lys

Glu

Leu

Al.a

Lys

Gru

Phe Leu.

Glu Asn Tvr

Leu Leu

Thr

ÁS:p

275

2SÖ

2 SS

gaa

ggt.

gaa

gcg

gtt

aat

aaa gac

aaa ccg ctg

ggt gcc

gta

gcg

912

glu

Gly

Leu

Glu

Val

Asn

Lys Asp

Lys Pro L‘öu

Gry Ála

val

Alá

290

295

300

ctg

aag

tct

tac

g&g

gaa

gag

ttg gcg

aaa gat cca

cgt att

gcc

gcc

960

Lsu

Lys

Ser

Tyr

Glu

Glu

Guu

Leu Ara

Lys Asp Pro

Arg Tle

Alá

Ara

305

310

315

320

acc

atg

gaa

aac

gec

cag

aaa

ggt gaa

atc atg ccg

aac atc

ccg

cag

1008

Met

Glu

Asn

Alá

Gin

Lys

Gly Glu

He Met Pro

Asn Ile

Pro

Gin

325

3 30

335

atg

tcc

get

ttc

tgg

tat

gcc

gtg cgt

act gcg gtg

atc aac

gcc

gcc

10 SS

Köt

S £ 1'

Alá

Phe

Tyr

Alá

Val Arg

Thr Ara Val

1le Asn

Alá

Alá

340

345

3,50

age

ggt

cgt

sag

act

gte

gat

gaa gcc

ctg aaa gac

gcg cag

íSCÉ

aat

1104

Ser

GXy

Arg

Gin

Val

Asp

Glu Alá

Leu Lys Asp

Alá Glu

As n

355 380

385

						347		* » » Φ X ΧΦΦ ΦΧΧ φ χ φφφ Φ * * V Φ Φ ♦ ΦΦ ΧΦΦ # Φ*
teg	&9’C	tcc	cac	est	cac cat cac	cac gcg	aat	teg gta ccg	ctg	gtt	1X S 2
Ser	Sár	Ser	His	His	His His His	His Alá	Asn	Ser Var Pro	Leu	Val
	37G				375		380
ccg	cgt	gga	tcc	tgc	ccc gac ctc	gtc tgc	tac	acc gat tac	ctc	cag	1200
Pro	Arg	G ;.y	Ser	Cys	Pro Asp Leu	Val Cys	Tyr	Thr Asp Tyr	Leu	Gin
> 0 £ U· 7					380		395		433
acg	gtc	atc	tgc	atc	ctg gaa atg	tgg aac	ctc	cac ccc agc	acg	ctc	1248
Thr	Val	Xle	Cys	lle	Leu Giu Sfet	Trp Asn	Leu	His Pro Ser	Λ 1 A A	Len
				405		410		415
acc	ott	acc	tgg	caa	gac cag tat	gaa gag	ctg	aag gac gag	gcc	acc	1296
Thr	Le<j		Trp	Gin	Asp· Gin Tyr	Gxu olu	Leu	Lys Asp Glu	Alá	Thr
			420			425		430
tcc	tgc	agc	ctc	cac	agg teg gcc	cac aat	gcc	acg cat gcc	acc	tac	1344
£>Ö X*	Cys	Ser	Leu	His	Arg Ser Alá	His Asn	Alá	Thr His Aia	Thr	Tyr
		TS Z X·'			443			44 5
acc	tgc	cac	atg	gat	gta ttc cac	tvC Q.ZÍJ	gcc	gac gac att	.i. ;J. . «Φ		1392
Thr	Cys	Hrs	Met	Asp	Val Phe His	Phe Méh	Alá	Asp Asp lle	Phe	Ser
	450				455			460
gtc	aac	a te	aca	gac	cag tet ggc	aac tac	tcc	cag gag tgt	ggc	agc	1440
Val	Asn	lle	Thr	Asp	Gin Ser Gly	Asn Tyr	Ser	Gin Glu Cys	Gly
465					470		4 75		489
ttt	ctc	c tg	get	gag	agc atc aag	ccg get	ccc	cet ttc aac	gtg	act	1488
Phe	Len	Leu	Alá	Glu	Ser lle Lys	Pro Aia	Pro	Pro Phe Asn	Val	Thr
				485		490			455
gtg	SCO	ttc	tea	gga	cag tat aat	atc tcc	tgg	ege tea gat	tac	gaa	1536
Val	Thr	T3 λ	Ser	siy	Gin Tyr Asn	He Ser	Trp	Arg Ser Asp		Glu
			500			535		510
gac	Ζ· Π	gcc	ttc	tac	atg ctg aag	ggc aag	ett	cag tat gag	ctg	cag	1584
Asp	Pro	Alá	Phe	Tyr	Méh Leu Lys	Gly Lys	Leu	Gin Tyr Gru	Leu	Gin

♦'·

515 520 525

tac

agg

S.S.C

egg

nga gac

ccc

tgg

get gtg

agt ccg

agg

aga aag ctg

7832

Tyr

Arg

Asn

Arg

Gly

Asp

Pro

Trp

Alá Val

Ser Pro

Arg

Arg Lys Leu

53Ό

535

540

arc

tea

gtg

gac

tea

aga

act

gtc

tcc ctc

ctc ccc

ctg

gag ttc ege

1630

Ile

Sör

Val

Asp

Ser

>' vs·

Ssr

Va 1

Ser Leu

Leu Pro

Leu

Slu Phe Arg

545

550

555

560

aaa

gac

tag

agc

tat

gag

ctc

cag

gtg egg

gca ggg

ccc

atg cet ggc

.1728

Lys

Asp

Ser

Ser

Tyr

Leu

Glu

Val Arg

Alá Gly

Pro

Met Pro Gly

565

57 0

575

tcc

tcc

tac

«g

ggg

acc

tgg

agt

gaa tgg

agt gac

ccg

gtc atc ttt

1776

Ser

Ser

Tyr

Gin.

Gly

Tb

Trp

Ser

Glu Trp

Ser Asp

Pro

Val Ile Phe

530

585

590

cag

acc

cag

tea

gag

pap

tta

aag

gaa ggc

t 'mj üt a.

cet

cac tag

187:1

Gin

THr

Gin

Ser

Glu

Gin

.iíőU

Lys

Glu Gly

Trp Asn

Pro

His

595 600 SOS <21ö> 97 <211> 606 <212> FEHÉRJE <213> Mesterséges Szekvencia «220» <223> MBP-zalphal 1 oldható receptor polipeptid szekvenciája <400> 97

Met Lys.

G X\

Gly Lys Löu Vsl Ijjs Trp Tls Asn Gly Asp Lys φ« Φ Φ ΦΦΦ * * > Φ Φ X * *♦* ΦΦ* Φ φ »»♦ Φ Φ φ χ « χ φ X

ΦΦΧ »ΦΦ κ ** ί*

10

	Tyr	Asn	Gly 20	Leu	Alá	Glu	Val Gly 25	Lys Lys Phe	Glu	Lys 30	Asp Thr
Gly	Ile	Lys	Val	•Ty, r	Val	Glu	His Pro	Asp Lys Leu	Gin	Glu	Lys Phe
		35					40		45
Pro	Gin	Var	Alá	Alá	i iii	Gly	Asp Gly	Pro Asp rle	Ile	Phe	Trp Ara
	50					SS		60
His	Asp	Arg	Phe	siy	Gly	Tyr	Alá Gin	Ser Gly Leu	Len	Alá	Glu Ile
65					•7 fs			75			SO
Thx'	Pro	Asp	Lys	Ara	Pi*S	Glu	Asp Lys	Leu Tyr Pro	Phe	Thr	Trp Asp
				85				30			95
Als.	Val	Arg	Tyr	Asn	Gly	Lys	.u<Sú x x O	Alá Tyr Pro	Ile	Ara	V al Glu
			100				105			110
Alá	juee	Ser	Lee	r r e	Tvr	Asn	Lys Asp	Leu Leu Pro	Asn	Pro	Pro Lys
		115					120		125
Thr	Trp	Glu	Gr U	Xle	Pro	Alá	Leu Asp	Lys Glu Leu	Lys	Alá	Lys Gly
	130					135		140
Lys	Ser	A1 a	Lee	Met	Phe	Asn	Leu Grn	Glu Pro Tyr	Phe	Thr	Trp Pro
x 4 5					150			155			160
Leu	Ile	Alá	Alá	” ***Ά	ciy	Gly	Tyr Alá	Phe Lys Tyr	G In	Asn	Gly Lys
				165				170			175
Tyr	Asp	Xle	Lys	Asp	Val	Gly	Var Asp	Asn Ara Gly	Alá	Lys	Alá Gr y
			180				1S5			190
Leu	rp'^S y	Phe	Lee	Vai	Asp	Leu	Ile Lys	Asn Lys His	Hét	Asn	Alá Asp
		195					200		205
T.L r	Asp	Tyr	Ser	Ile		Glu	Alá Ara	Phe Asn Lys	Gly	Gru	Thr Alá
	SÍ 0					215		220
Hét	rn ü vi lii.	Ile	Asn	Gly	Pro	Trp	Alá Trp	Ser Asn rle	Asp	Thr	Ser Lys

•χ· χ·..>

230

235

240

350

X X « Φ φ ΦΧ »*

X * « * * * *«φ φφ» » φ **» * * » χ χχ «« φ » -» *

Φφ» **♦ * ** **

Vai Asn Tvr Gly Val Thr Val Leu .Pro Thr Phe Lvs Glv Gin Pro Sex

250

255

3ys Pro Phe Val Gly Val Leu· Ser Alá Gly Ile Asn Alá .Alá. Ser Pro

2S<

265

270

Asn Lys Glu Leu Alá Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr leu Leu Thr Asp

5

ISO >85

Gla· Gly Leu Glu Alá Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Alá Vai Alá

290

295

300

Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu .Alá Lys Asp Pro· Arg Ile Alá Alá

315

320

Chr Met Glu Asn Alá Gin Lys Gly Glu Ile Két Pro Asn Ile Pro Gi:

325

330

335

Met Ser Alá Phe Trp Tyr Alá Val Arg Thr Alá Val Ile Asn Alá Alá

5

350

Ser Gly Arg Gin

355

J. 1 Λ Ja V Cí.

al Asp Glu Alá Leu Lys Asp Alá Gin Thr Asn

350

36;

Ser Ser Ser his His His His His Kis Alá Asn. Ser Val Pro Leu Va3

0

375

38(

Pro Arg Gly Ser Cys Pro Asp Leu Val Cys Tyr Thr Asp Tyr Leu Gin

355

390

395

400

Thr Vai lle Cys Ile Leu Glu Két Trp Asn Leu His Pro Ser Thr Leu

40;

415

Les Thr Trp Gin Asp Gin Tyr Gla Glu Lsu Lys Asp Glu Aia Thr

420

42;

30

Ser Cys Ser Leu His Arg Ser Aia His Asn Aia Thr Kis Alá Thr Tyr

435

445

Thr Cys His Met Asp Val Phe His Phe Két Alá Asp Asp Ile Phe Ser

5 ΟΙ 55

4S0

Val Asn He Thr Asp Gin Ser Gly Asn Tyr Ser Gin Glu Cys Gly Ser φ*0 *

Λ Φ Λ Φ * * ♦ *χ· Φ χ ♦♦♦ · ♦

Jff! « φ Φ«χ « X * * η?!. » »* «·

466	4 70	4 75	480
Phe Leu Leu	Ala Glu Ser	Jle Lys Pro Ala Pro Pro Phe	Asn val Thr
	4 85	491	485
val Thr phe	Ser Gly Gin	Tyr Asn lle Ser Trp Arg Ser	Asp Tyr Glu
	500	505	510
Asp Pro Alá	Phe Tyr Heh	Leu Lys Gly Lys Leu Gin Tyr	Glu Leu Gin
515		520 525
Tyr Arg Asn	Arg Gly Asp	Pro Trp Ala Vei Ser Pro Arg	Arg Lys Leu
530		535 540
lle Ser Val	Asp Ser Arg	Ser Val Ser Len Leu Pro Leu	Glu Phe Arg
545	550	555	5S0
Lys Asp Ser	Ser Tyr Glu	Leu Gin Val Arg Ala Gly Pro	Heh Pro Gly
	565	570	575
Ser Ser Tyr	Gin Gly Thr	Trp Ser Glu Trp Ser Asp Pro	Val lle Phe
	580	585	590
Gin Thr Gin	Ser Glu Glu	Leu Lys Glu Gly Trp Asn Pro	Hís
595		600 605
<210> 98
<2íI> 65
<212> DM	>

<213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonükleotíd primer ZC2Q187 «400> 98

35;

* » » ♦'♦·«. φ. ♦ **φ * φ*φφ ♦ ♦ ·,«. ♦ ♦>

tcaccacgcg aatfceggtac cgetggttcc gcgt-ggatcc caccg 65 gccccgacc t-cgtctgcta 60 <210> 99 <211> 68 <212> DNS <213» Mesterséges Szekvencia <220» <223» Oligonukleotid primer 2C20183 <400» 99 t c tat a t cag gc tga&aa te cctttaac 6§ ttatctcatc cgcc-aaaaca -ctagtgaggg txccagccfc <211» 21 <212» DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223» Oligonukleotid primer ZC22452 <400» 100 tctfccttggg gacactggtc c « Φ X * ^χ »χ> ΦΦ» Φ φ X Φφ Φ •Λ Φ Φ φ*«* Φ « * ,?h.Ő ΦΦ* * * Φ * ΦΦ <210> ΙΟΙ <21Ι>21 <212> DNS <.213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Olígonukleötid primer ZC22451 <400> ΙΟΙ aatcatgtgg -sgatcttcac c 21 <210> 102 <21!> 21 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleolíá primer 2C224SÖ <400> 102 cagactaaca tgcccttcat g 21 <2I1> 23 <212> DNS φ χ V.* Φ <Κ φ Xr > X <« « >.·«·« * Φ * *' X . Κ. , * Φ *^Λφ* Φ »*^Λ **·* ·> * <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer 2C22449 <4Üö> 103 ttcacttccg tgtgttet&ö agg 23 <2lO> 104 <211> 18 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC23771 <400> 104 se e ac e etc c ae aa a ege X δ <210> 105 <211> 1347 <212> DNS <213> Homo sapiens <400> 105 * ·> Φφ Φ φ

			355		♦ S* X-V· ν Φ *- X '«·*.♦,> ΦΧ* Φ’Χ ,:	* * Φ. * Φ X * - -· J
gaattcacee	aticictett	tttcctgtca	aagatgcaga	tggggeacat	ttegttgaet	60
ccatcaatcc	ctgecceeac	acattagcae	atgcacacgt	afcacctagcc	agtgg&aaag	120
aaaaaagagt	fcaefccacafct	catccattti	aeaasgattt	ccaggctgca	atgggagggc	180
tttacctctc	cctgaaggat	gaataaatag	giaccttaae	tgacaaectg	tteteagtea	240
agctgaagtg	aaaacgagac	eaaggtetag	ctetactgtt	ggtacttatg	agatccagte	300
ctggeaaeat	ggagagg&tt	gicatetgtc	tgatggtcat	cttcttgggg	acactcgtce	380
ae&aatcaag	ctcccaaggt	caagatcgce	acatgattag	aatgegtcaa	ettatagata	420
ttgttgatca	gctgaaaaat	tatgtgaatg	acttggtaag	actatstttg	tcaea&caaa	480
atctaaatca	tacttttcaa	tiaatataaa	aggagggttt	ggcttataaa	aataaetcag	540
aacaaatfctt	ettttgetet	aggtece-ga	atticigcea	gctccagaag	afcgtagaggt	600
aagaccagtt	gaatttattt	ctgaaaatac	attggacata	agttttt&aa	tccaafcaaga	860
aagacatfcag	catgattata	taggagtata	ctgaatttta	atgaaettag	eggtetaata	720
atfcgatgaaa	tatttattta	tattttggtt	aaattcattg	afcttaccaaa	aaeeaactaa	780
aaastgctat	attatattee	tcataasets	tgtttatett	caagaatete	taagagtact	840
cctaagtagt	attgttgaga	cagaataaca	aaactagaaa	cg&aatctat actctgatca	$00
gtttctgaac	aatgcacagc	tagttaetet	ttaagagecc	ttgggcatga	aagcttttga	960
geettetitg	ttatcctacc	gaagaaacat	agataeatac	agtaggaagc	agaattaacc	1020
ttttaataac	aaaettaaaa	aagaaagaaa	gaaagaatta	gafctacsggg	acagcatggs	1080
gaaatggfegg	tgtggaaate	aasgct.gtcc	ittsgaatai	aattcacata	baeciiggec	1140
teagtgsgte	ttgtetttgg	ccttccgtga	ggtcttttga	aagaaccatt	ttcaacaafct	1200
catcccgtct	ettsageeat	ttaaatccat	tagagttcca	ggaagaagag	gcctggcatg	1260
agtfccagagt	gctgtccegc	tgatettttt	etcagtaact	tctacgatct	gatettetgg	1320
tctggtaccc	tgaggt&taa	atgcaat			134?
<210> 106
<212> 1656
<212> DN	S
<213> Ho	iho sapiens
<400> 166
cctcaactgc	ttgatteagg	cagaatccta	ascciaaaet	gagetgggag	tatgaaaagg	60
gt tttagaaa.	agtcatggtg	tgatctatgg	caagtstsxi	aattettaga	tgtaaaatat	120
gctőteagsg	ggaggtaccc	acttcctttc	tscaaaggag	gggetttaat	tcattttett	ISO
catctgttsa	etttaeaaat	atatgttgat	cafctaactgg	caagacacta	tgcctggcge	240
tgtacagaat	aaaatgctgc	tsaagácsig	tcatgataga	t&e&tta&sa	gaaaccacaa	300

>'<·· * * * acsaatgaaa aa.tgfefesttc ateagactat. aacataatht acccaaagch gec&ctagtc 360· acagtgfeaag fetttaga-gcc fecataachca gc.aaafe.gtgt cctaaaccga actaacfectc 4 20 ctfcfeafeaaaa cacaaaggtc ttgtcc&cca cccagacafec a-aaafeggfec«í tcfegfegtagc 480 ateaggaaha aagcafefegtg aagaagfegag gcfecctfctcfe ctcttatctg cgaagcaggg 540· gafetgtoccfe tfefefecccafec ccaaa-gatta agtaggaggt gaaatcafeac cfecactc&tc SGÖ tgtfegaaaeg at.gh.aafe.gca cgacafefegca. gaagagahag aaafeagagga ttgggaaagc 660 fcatctfcfefe&c tttctgaata afegttfegtta acah-afeafeac aaa.fchgfefeha fecfettcagac 720 aaacfegtgag feggtcagcht fetfeccfegtht fecagaaggce caactaaagfe cagca&atae 788 aggaaacaat gaaaggafeaa taaafegfeafe-c aafefeaaaaag ctgaagagga aaccaccthc 840 cacaaafegca gggagaagac agaaacac&g achagfeaaga fefegtcafefetg tcatctctct '300 tattt.gta.ct hataaactat atafecfetgca fefeacahaaac· atacacacac accfeghagcc 968 agggctgctg gfegtctfeccfe taccfeafeagfe tatgccttat tatacatggfe gctttttttt 1020· tfetaagacag agtctcacfcc tgfecacccag gcfcggagfegc agtggcgtga tctetgcfeca 1080· ccgcaagatc cacctcccgg ttfccscgcca ttctcctcct acctcagccfc cctgagfeacc 1140 tgggacfeaca ggfegcccgcc accahgcccg gctaattttg tttttgtatt tttagtaaag 1200 .acagggtttc accafegttag ocaggahggt ctcgatctcc tgaccccgtg atccgcccge 1260 cttggcctcc caa-agtgtgg ggattac&gg catgagccac cgcacccggc ctatacgtgg 1320· tgcattttaa gaagtagggt cactctttta agcccacaga cttgaaagta ttcaaaaacc 1380 caattataat tfccctagtag hccttggcag ctggaatatg ttaatatagc ttcteaaggt 1448 gaggaagtca ttaggcagag aatecaactg tgattttgga gttaagaacfc atttcctctc 1500 atatggtcac agataacttg fcattcttath aacaggagct agatcchagc tthctaacaa 1560 gaaaagagcc tacaagaaga ctagggc&aa tcttaaactt tgcctectct ctaaatcata· .1620· ttact&tchg tacatc-agca gagtcagtat tga-aht 1456 <210» 107 <211» 644 <212» DNS <213» Homo sapiens <400» 107 agcfe&aaetfe etacaaagga aacgtatatc atgctaacta at.aaaet.aag agaactctcc ag-ttaagcat gtteatctta tagatgagga aaagtgagah 60 gttaagtcac tagccccaag tfcccahaaat agtgtcagaa tgagaattag 120 tactatcttt tagtgaaatg ctcfecactac aacatcacac tggeatfegag 180 ccaagcaatg gctfcggtgtt -tggat.c-fe.aaa tagggataaa gac-aaagagc .240 aaagcttttt aaaaatctaa ghgagcaatc catat&tgaa aaactgtfcca 300

357

Α««χ χ Φ X

X φ χ «

Φ φ Φ « ♦ χ Φ

Φ> X*

atctccctsg	taataacata	&a-tgcg&gt£.	aaaacaaggs	aatcctgttt	tttccaatta	360
aacattttaa	acaataccct	: a & £ $ $ £ & 3.	gaatgctcca	agtgasaaga	ggtaaaaccc	420
tttataatgt	atatcaaagc	C£ £ S & >S & £ £ fc	ttatcccttt	aatttagtaa	ttctactfect	4S0
aggaatatat	caaataagca		•£.gaaaaatha	tttac-agaga	tgttctttgg	540
agtaatgta-g	acaaaaafcaa	aaegttagat	acagctgggt	gtggtggctc	atgcctgtat	600
tcccagcact	ttgggaggcc	gaggcaggcg	gatcacctga	gafcc	644

<210> 108 <21 Χ> 645 <2Ι3> Homo sapiens <220>

<221> vegyes tulajdonság <222> (1). ,i645j <223> η = Α,Τ.Ο vagy G <400> 108

o. <3. Ö & ££ o 3.3. & cctatgtgga	aaaaaaaaaa aacagaccaa	gttagatgca ccactacatg	ccnttgggtc tcatattttt	caaaaafeagt gaagattatfc	aagagtgcat taacacttag	60 120
gaaatcctgt	gatatgttaa	gtgtgaaaaa	aaaaaagcaa	atcaccaact	ggtataaata	ISO
atgtaaatgc	acaataataa	ttaaaaatac:	ccaaaacaca	gagagaatat	acattaaaac	240
attgcagtgg	gattcctatc	tctgggaatg	ggattacaag	gactttttcc	attgttactt	300
tccaaacagt	tttatgtact	tctcgaatgt	ttttcagtga	acstaattta	tgtttttaat	360
gaaaaaaaat	tttaagaaac	atfettattac	ga&aaaa a11	ttaaagaaga	ctgttacttt	420
ttcattgatt	fcetagacatg	cccttcatgt	gattcttatg	agaaaaaacc	acccáaagaa	4S0
ttcetagaaa	gattcaaatc:	acttctceaa	aaggtatcta	ccttaagttt	catttgattt	540
tctgctttat	ctttacctat	ccagatttgc	ttcttagtta	ctcacggtat	actatttcca	δ 00
cagatgattc	atcagcatct	gtcctctaga	acacacggaa	gtgaa	645

<210> 109

358 <2 Π > 38 <212> DNS <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC25970 <400> 109 atgcattcta gactaggága gat.

ctgatg aatcat <210> 110 <211> 36 <213> Mesterséges Szekvencia <220>

<223> Oligonukleotid primer ZC25969 <400> 1 10 <210> 111 <211> 153 <212> FEHÉRJE <213> Homo sapiens

359

Φ* <4ÖO> 111

Méh	’Tvr	Arg	Mer	Sin	Leu	Leu Ser
				5
Val	Thr	Asn	Ser	Ala	Pro	Thr Ser
			20
G1 n	Leu	Glu	Hís	Leu	Leu	Len Asp
		35				4 0
Asn	Ash	Tyr	Lys	Asn	Pro	Lys Len
	V O
	J V					55
Tyr	Met	Pro	Lys	Lys	Ala	Thr Glu
δ 5					70
Λ*» νΛ aU	Glu	Leu	Lys	Pro	Leu	Gm Glu
Asn	Phe	His	Leu	Arg	Pro	Arg Asp
			100
V& x		ί» 2. U	,;.<ea	ny s	Gly	Ser Glu
		115				120
Asp	Gin	Thr	Ala	Thr	lle	Val Gin
	130					135
Cys	Gin	Ser	lle	lle	Sö-£	Thr Len
145					150

Cys lle Ala Leu Ser Leu Ala Leu

15

Ser Ser Thr 'Lys Lys Thr Gin Lan

30

Lan Gin Met lle Len Asn Gly lle

Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

Len Lys His Lan Gin Cys neu Glu

80

Val Leu. Asn Leu Ala Gin Ser Lys

Sö 95

Len lle Ser Asn lle Asn Val lle

105 110

Thr Thr Phe Hét Cys Glu Tyr Ala

125

Phe Leu Asn Arg Trp Lle Thr Phe

0

Thr <21Ö> Π 2 <211> 153 <213> Homo sapiens <2!2> FEHÉRJE

<4G0>

112

Met

Giy

Leu

Thr

Ser

Gin

Leu

Leu

Pro

Pro

Leu

Phe

Phe

Leu

Leu

Alá

1

5

lö

15

Cys

Alá

Giy

Áss

Phe

Val

His

Giy

His

χ»γ s

Cys

Asp

He

Thr

Leu

Gl s

20

25

30

Glu

i'le

x le

Lys

Thr

Leu

Asn

Ser

Len

CP ν'

Glu

Gin

.uy»

Thr

Leu

Cys

35

4 3

45

Thr

Glu

Leu

Thr

Vei

Thr

Asp

lie

Phe

Alá

Alá

Ser

Lys

Asn

Thr

Thr

50

55

60

Glu

Lys

Glu

Thr

Phe

Cys

Arg

ALa

Alá

j? C5?

Val

Leu

Arg

Glu

Pfee

Tyr

65

70

75

53

Ser

His

HXS

Glu

Lys

Asp

Thr

Arg

Cys

Leu

'a-V

Alá

Thr

Alá

Gin

Glu

85

30

35

Pne

His

Arg

His

Lys

Gin

Leu

Tis

Arg

Phe

Leu

Lys

Arg

Leu

Asp

Arg

100

135

110

Asn

Trp

Giy

Alá

Giy

Leu

Asn

Ser

Cys

Pro

Val

Lys

Glu

Alá

115

120

1.25

Asn

Gin

Ser

Thr

LíGU

Glu

Asn

Phe

Leu

Giu

Arg

Leu

Lys

Thr

He

Hét

130

135

14 ö

Arg

Giu

Lys

Tvr

Ser

Lvs

Cys

Ser

Ser

145 150 <210> 113 <211> 162 <212> FEHÉRJE <213> Homo sapiens φφ

361 * * , φ , *** * * **« Λ Λ ♦·»* ΦΦΦ* **?* %«. * *

400> 113

Met Arg He Ser Lys Pro His Leu Arg Ser He Ser Xlé Gin Cys Tyr

5 10 15

Leu Cys Leu Leu. Leu· Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Alá Gly l.le His

2G

Val Phe He Leu Gly Cys Phe Ser Alá Gly Leu Pro Lys Thr Glu Alá .35 áS

Asn. Trp Val Asn Val He Ser Asp Leu Lys Lys He Glu Asp Leu Xle

Gin Ser Met His He As© Alá Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

S0 ?r© Ser Cys Lys V'ai Thr Alá Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gin

Val He Ser Leu Glu Ser Gly Asp Alá Ser He His Asp Thr val Glu

100

105 iö

Asn Len Ha He Leu Alá Asa Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

120

12;

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Gin Glu Leu Glu Glu Lys Asn He

130

KÖ

Lys Glu Phe Len Gin Ser Phe Val His He Val Gin Met Phe He Asr

145

Thr Ser

150

ISO <2I0> 114 <211> 144 :2I2> FEHERJE

Φ X ««

362 <2Ι3> Homo sapiens <400» 114

Met

Trp

L<SU

GXn

Ser

Leu

Leu

Len

Leu

Gly

rph v«

Val

Alá

Cys

Ser

Ile

5

18

15

Ser

Alá

?ro

Alá

Arg

Ser

Pro

Ser

Pro

Ser

m u v* Á ÍA*.

Gm

Pro

Trp

ö-XU

His

20

25

30

Val

Asn

Alá

X Xfis

Gin

Glu

Alá

Arg

Arg

Leu

Len

Asn

Len

Ser

Arg

Asp

35

40

45

Thr

Alá

Alá

Hét

Asn

Glu

Thr

v&x

Gin

Val

Ile

Ser

Glu

Met

Phe

50

55:

60

Asp

Leu

Gin

Glü

Pro

Thr

Cys

LöU

Gin

Thr

Arg

Len

Gin

Len

íPví-r *.?£-

Lys

65

78

75

80

bfXii

Gly

Leu

Arg

Gly

Ser

Leu

Thr

Lys

Len

Lys

Λ·* Y «V ν·? xy

Pro

Leu

Thr

Set

85

$0

$5

Set

Ál a

Söx

His

Tyr

T.vs *

Gin

H Xs

Cys

Pro

Pro

πΉ >»·

Pro

Glu

Thr

Ser

100

185

118

Cys

Alá

Thr

Gin

x?ve

Ile

Thr

Phe

Gin

Sex:

Phe

ajV £5

Glu

Asn

Len

Lys

11.5

120

125

Asp

Phe

Leu

«3.

XXe

Pro

Phe

Asp

Cys

Trp

VxX/ti

Pro

Val

Gin

Glu

130 135 140

Claims (33)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK φ «Jt « ♦♦

   1. Izolált polipeptid; ami olyan amínosav szekvenciát tartalmaz, ami (a) legalább 90%-ban azonos a 2, számú szekvencia 41-es (Gin) és 148-as (He) csoportjai közötti szekvenciával, és a 44-es pozícióban levő csoport Asp, a 47~es pozícióban levő csoport Asp és a 135-ös pozícióban levő csoport Giu, és (b) legalább 90 %-ban azonos a 2. számú szekvencia 32-es (Gin) és 182~es (Ser) csoportjai közötti szekvenciával, amely polipeptid kötődik egy a 115. számú szekvenciának megfelelő zalphal 1 receptorhoz.
2. 2. Az 1. Igénypont szerinti izolált polipeptid, amiben a 71-es, 78-as, 122-es és 125-ös amínosav csoport cisztein.
3. 3. Az ί, igénypont szerinti izolált polipeptid, aminek az amínosav szekvenciája legalább 95%-ban azonos a 2. számú szekvencia 41 -es (Gin) és 148-as (He) csoportjai közötti szekvenciával,
4. 4. Az 1, igénypont szerinti izolált polipeptid, aminek az amínosav szekvenciája legalább 100%-ban azonos a 2, számú szekvencia 41-es (Gin) és 148-as (ile) csoportjai közötti szekvenciával.
5. 5. Az 1, Igénypont b) pontja szerinti izolált polipeptid, ahol az amínosav szekvencia: legalább 95 %-ban azonos a 2, számú szekvencia 32-es (Gin) és 182-as (Ser) csoportjai közötti szekvenciával.

   8. Az. 5. igénypont szerinti izolált polipeptid, ahol az amínosav szekvencia 2, számú szekvencia 32-es (Gin) és 152-es (Ser) csoportjai közötti szekvencia.
6. 7. Az 5. Igénypont szerinti izolált polipeptid, ahol az amínosav szekvencia 2. számú szekvencia 7 -es (Met)és 162-es (Ser) csoportjai közötti szekvencia.
7. 8. Izolált polipeptid, ami az 58. számú szekvencia 23-as (Gin) és 14S~os (Ser) amínosav csoportjai közötti szekvenciának megfelelő amínosav szekvenciával rendelkezik, és amely polipeptid kötődik egy a 115. számú szekvenciának megfelelő zalphall receptorhoz.

   367 ♦ * * * 0 X * 0 Φ X

   0 0* χ
8. 9. A 8, igénypont szerinti izolált polipeptid, aminek ez aminosav szekvenciája az 56. számú szekvencia 1-es (Met) és 146-os (Ser) aminosav csoportjai közötti szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciával rendelkezik.
9. 10. Izolált polinukieotid molekula, ami az 1 -9. igénypontok bármelyike szerinti poüpeptidet kódoló nukleotid szekvenciát tartalmaz,
10. 11. A 10, igénypont szerinti polinokleotid molekula, amiben a nukleofidök sorrendje az 1. számú szekvencia 1S?-49Ö-es nukfeotiöjainak, vagy a 3. számú szekvencia 121444-es nukleotidjalnak felél mag,
11. 12. A 10. igénypont szerinti izolált polinukieotid molekula, amiben a nukieotidok sorrendje az 1, számú szekvencia 14ü-532~es nukleotidjalnak, vagy a 3. számú szekvencia 94-586-os nukleotidjainak felel meg.
12. 13. A 10. Igénypont szerinti polinukieotid molekula, amiben a nukteotid szekvencia az 1. számú szekvencia 47-532-es, vagy a 3. számú szekvencia 1-486-os nukieotidjai közötti nukleotid szekvenciának felei meg.
13. 14. Expressziós vektor, ami az alábbi, működés szempontjából egymáshoz kapcsolt. elemeket tartalmazza:

    (a) agy transzkripciós promoter;

    (b) egy DNS szegmens, ami az 1-9, igénypontok bármelyike szerinti poilpeptldef kódolja; és (c) egy transzkripciós terminátor.
14. 15. Tenyésztett sejt, ami tartalmazza a 14. Igénypont szerinti expressziös vektort.

    mázzák:

    Eljárás fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy az alábbi lépéseket aikaia 15. igénypont szerinti sejtet olyan körülmények között tenyésztjük, amik között a szegmens expresszálódik; és a DNS szegmens által kódolt fehérjét kinyerjük,
15. 17. Antitest amely specifikusan kötődik a zalphal 1 ligandum polipeptid pcíipeptidhez, ahol a poilpeptldef az alábbi csoportból választjuk:

    (a) polipeptid, ami a 2. számú szekvencia 41-es (Gin) aminosav csoportjától a 148-as (ile) aminosav csoportjáig terjedő aminosav szekvenciát tartalmazza;

    368

    ΦΦ Χ·< X» (b) polipeptid, ami a 2, számú szekvencia 32-es (Gin) amínosav csoportétól a 162~es (Ser) amínosav csoportjáig terjedő amínosav szekvenciát tartalmazza; és (c) polipeptid, ami a 2, számú szekvencia 1~es (Met) smtnosav csoportjától a 182as (Ser) amínosav csoportjáig terjedő amínosav szekvenciát tartalmazza.
16. 18, Az 1-9, igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmazó készítmény alkalmazása az immunrendszer rend-ellenességeiböí fakadó betegségek kezelésére szolgáló gyógysze r előáll kására.
17. 19. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmazó készítmény alkalmazása antigénnek vagy patogénnek kitett emlős immunválaszának kiváltására szolgáló gyógyszer előállítására, ahol a gyógyszer alkalmazása során az említett emlősben az antigén- vagy patog én-szintet a gyógyszer beadása előtt és után összehasonlítjuk; és ahol a szintek változása az immunválasz kiváltását jelzi.
18. 20. A 19. Igénypont szerinti alkalmazás, ahol az antigén egy B sejt tumor, egy vírus, egy parazita vagy egy baktérium.
19. 21. Eljárás hemstopöíetíkus sejtek és hematopoíetikus őssejtek szaporítására, amelynek során a csontvelő vagy perifériális vér sejteket egy olyan készítménnyel tenyésztjük, amely az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid olyan mennyiségét tartalmazza, amely elegendő ahhoz, hogy növelje a limfold sejtek számát a csontvelőben vagy a perifériális vérsejtekben, a 1-9, igénypontok bármelyike szerinti polipeptid távoiléfében tenyésztett csontvelő vagy perifériális verseitekkel összehasonlítva.
20. 22. A 21. Igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hemefopoíeflkus sejtek és a hematopoíetikus Őssejtek timföld sejtek.
21. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a limfold sejtek NK sejtek vagy eltotoxikus T-sejtek,
22. 24. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítmény még legalább egy citokint tartalmaz, amit az alábbi csoportból választhatunk ki: interleukin-2, interleukln-15, ínferleukín-4, GM-CSF, FÍ13 ligandum és őssejt faktor.
23. 25, Az 1-9. Igénypontok bármelyike szerinti polipeptid alkalmazása 8- vagy Tsejíes naopiszmáknak a 8- vagy T-sejtek proilferáolőjának csökkentése útján történő kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására.

    369

    28. A 25.. igénypont szerinti alkalmazás< ahol a gyógyszer még legalább egy cifoklnt tartalmaz, amit az áléból csopohból választhatónk ki; ínterieukin-2, interieukin-18, interleukin-4, GM-CSF, Fit3 ligandum és őssejt faktor.
24. 27. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti polipeptidet tartalmazó készítmény alkalmazása antigénnek vagy paíogénnek kitett emlős immunválaszának kiváltására szolgáló gyógyszer előállítására, ahol a gyógyszer alkalmazása során az említett emlősben az antigén- vagy pafogén-spedíikus antitest-szintet a gyógyszer beadása előtt és után összehasonlítjuk; és ahol az antitest-szint emelkedése az immunválasz kiváltását jelzi.
25. 28. Eljárás a zalphal 1 ligandum RNS jelenlétének kimutatására egy biológiai mintában, amelynek során az alábbi lépéseket alkalmazzuk;

    (a) egy zalphall ligandum nuklelnsav próbát hibridizációs körülmények között érintkezésbe hozunk vagy (I) biológiai mintából izolált teszt RNS molekulákkal, vagy (ii) az izolált RNS molekulákból szintetizált nukiesnsav molekulákkal, amely próba nukleotid szekvenciája 7, vagy 9, igénypont szerinti polipeptidet vagy annak komplementjét kódolja; és (b) kimutatjuk a hibrid képződését a nuklelnsav próba és vagy a teszt RNS molekula, vagy a szintetizált nuklelnsav molekula között, aholis a hibridek jelenléte a zalphal 1 Ugandám RNS jelenlétére utal a biológiai mintában;

    és ahol az említett zalphall ligandum egy az 1-8. igénypontok bármelyike szerinti polipeptid.
26. 29. Eljárás a zalphal 1 ligandum jelenlétének kimutatására egy biológiai mintában, amelynek során az alábbi lépéseket alkalmazzuk;

    (a) a biológiai mintát egy, a 17. igénypont szerinti ellenanyaggal, vagy egy ellenanyag fragmenssei hozzuk érintkezésbe, amely érintkeztetésí olyan körülmények között hajtjuk végre, amik lehetővé teszik az ellenanyag vagy az ellenanyag fragmens kötődését a biológiai mintához, és (b) kimutatjuk a megkötött ellenanyag vagy ellenanyag fragmens jelenlétét.

    κ »

    Λ **?<’!

    J ?U
27. 30. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti poHpsptíd alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszerkészítmény előállítására.
28. 31. A 30. Igénypont szerinti alkalmazás, ahol az említett poiipeptld legalább 95 %bán azonos a 2. szemű szekvencia 32-es (Gin) és 162-as (Ser) csoportjai közötti szekvenciával.
29. 32. A 31, igénypont szerinti alkalmazás, ahol a poiipeptld tartalmazza a 2, számú szekvencia 3£~es (Gin) és 162-es (Ser) csoportjai közötti szekvenciát.
30. 33. A 31. vagy 32. Igénypont szerinti alkalmazás, neoplseztíkps B- vagy T-sejtek proí iterációjának csökkentésére.
31. 34. A 30-32. Igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás leukémia kezelésére, ahol az említett potipeptkt saporlnnal együtt fúziós fehérje formájában van jelen,
32. 35. A 30-32. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás limfóma kezelésére, ahol az említett pollpeptid saporlnnal együtt fúziós fehérje formájában van jelen.
33. 36. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti pollpeptid, gyógyászatban történő alkalmazásra.