CZ302921B6

CZ302921B6 - Izolovaný polypeptid, fúzní protein, polynukleotid, expresní vektor, hostitelská bunka, protilátka, zpusob prípravy proteinu, protilátky, množení hematopoetických bunek, redukce proliferace neoplastických T a B bunek, stimulace imunitní odpovedi u sa

Info

Publication number: CZ302921B6
Application number: CZ20013184A
Authority: CZ
Inventors: E. Novak@Julia; R. Presnell@Scott; A. Sprecher@Cindy; C. Foster@Donald; D. Holly@Richard; A. Gross@Jane; V. Johnston@Janet; J. Nelson@Andrew; R. Dillon@Stacey; K. Hammond@Angela
Original assignee: Zymogenetics, Inc.
Priority date: 1999-03-09
Filing date: 2000-03-09
Publication date: 2012-01-18
Also published as: PL207350B1; DE60036930T2; WO2000053761A3; WO2000053761A2; EP1881070B1; CZ20013184A3; DK1165791T3; RU2004126135A; CN101575377A; PL351160A1; IL145288A0; EP1165791A2; HU229148B1; RU2346951C2; NO20014364L; BR0008772A; PT1165791E; DE60036930D1; CA2366921A1; AU777842B2

Abstract

Rešení popisuje polynukleotidové a polypeptidové molekuly zalpha11 Ligandu. Zalpha11 Ligand je nový cytokin. Popisované polypeptidy mohou být užity pro stimulaci proliferace a/nebo vývoje hematopoetických bunek in vitro a in vivo. Soucástí rešení jsou také zpusoby prípravy proteinu a protilátek proti nim. Zalpha11 Ligand lze dále použít pro prípravu léciva pro lécení nemocí spojených s poruchou imunitního systému.

Description

Oblast techniky

Proliferace a diferenciace buněk mnohobuněčných organismů je kontrolována hormony a polyio peptidovými růstovými faktory. Tyto molekuly jsou schopné difúze a umožňují buňkám komunikovat mezi sebou ve vzájemném souladu, tvořit tkáně a orgány a dále také opravovat poškozené tkáně. Příklady hormonů a růstových faktorů zahrnují steroidní hormony (jako je estrogen, testosteron), hormon pří štítných tělísek, folikulostimulační hormon, interleukiny, růstový faktor odvozený z krevních destiček (PDGF), epídermální růstový faktor (EGF), faktor stimulující gra15 nulocyto-makrofágové kolonie (GM-CSF), erytropoetin (EPO) a kalcitonin.

Dosavadní stav techniky

Hormony a růstové faktory ovlivňují buněčný metabolismus pomocí vazby na receptory. Receptory mohou být integrální membránové proteiny, které jsou propojeny se signálními metabolickými drahami v buňce jako sekundárním přenosným systémem. Další třídy receptorů jsou rozpustné molekuly, jako jsou transkripční faktory.

Cytokiny obecně stimulují proliferaci nebo diferenciaci buněk hematopoetického původu nebo se účastní v imunitních odpovědích či při zánětlivých mechanismech těla. Příklady cytokinů, které ovlivňují hematopoézu jsou erytropoetin (EPO), který stimuluje vývoj červených krvinek; trombopoetin (TPO), který stimuluje vývoj buněk megakaiyotického původu a granulocytové kolonie stimulující faktor (G-CSF). který stimuluje vývoj neutrofilů. Tyto cytokiny působí také při obnovování normální úrovně krevních buněk u pacientů trpících anemií, trombocytopenií a neutropenii, nebo prodělali chemoterapii při léčbě rakoviny.

Interleukiny jsou skupiny cytokinů, které zprostředkovávají imunologickou odpověď, zahrnující i odpověď při zánětech. Interleukiny zprostředkovávají i reakce při různých zánětlivých procesech.

Hlavní úlohu při imunitních reakcích hrají T buňky, které produkují mnoho cytokinů a adaptují imunitní odpověď podle antigenů. Cytokiny produkované T buňkami lze klasifikovat jako typu 1 a typu 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998), Typ 1 cytokinů zahrnuje IL-2, IFN-gama, LR-alfa a účastní se při zánětlivých odpovědích, virové imunitní odpovědi, imunitní odpovědi na vnitrobuněčné parazity a při odmítání cizích transplantátů. Cytokiny typu 2 zahrnují

4o IL—4, IL—5, IL-6, IL-10 a IL—13. Účastní se humorálních odpovědí, imunitních reakcí na helmínty a při alergických reakcích. Skupina obsahující cytokiny, které svými vlastnostmi sdílejí jak charakteristiky typu 1, tak 2, obsahuje IL-3, GM-CSF a TNF-alfa. Existují důkazy, které potvrzují předpoklady, že typ 1 a 2 je produkován populací T buněk, které přednostně migrují do různých typů zánětlivých tkání.

Zralé T buňky mohou být aktivovány například antigenem, Či jiným stimulem k tomu, aby začaly produkovat cytokiny, biochemické signální molekuly, nebo receptory, které dále opět ovlivní osud populace T buněk.

B buňky mohou být aktivovány přes receptory na svém povrchu, včetně B buněčných receptorů a dalších prídatných molekul, čímž vznikne dodatečná další buněčná funkce, jako je produkce cytokinů.

Přirození zabijáci (natural killer cell- NK- lymfocyt schopný hubit nádorové buňky) mají většinou společný původ s buňkami T a B a hrají roli imunitního dozoru. NK buňky, které tvoří

-1 CZ 302921 B6 až 15 % krevních lymfocytů, neexprimují antigenní receptory a nepoužívají proto rozpoznávání pomocí MHC pro vazbu k cílové buňce. NK buňky jsou zapojeny do procesu rozpoznávání a zabíjení jistých tumorových buněk a virově infikovaných buněk. Předpokládá se, že in vivo NK buňky vyžadují aktivaci, avšak in vitro se prokázalo, že NK buňky hubí určitý typ nádorových buněk bez aktivace.

Aktivity demonstrované u rodiny cytokinů in vivo ilustrují velký klinický potenciál v nich skrytý a dále také potřebu dalších cytokinů, antagonistů cytokinů a i jejich agonistů. Předkládaný vynález reaguje právě na tyto potřeby přípravou nových cytokinů, které stimulují buňky hematopoetického původu, ale zahrnuje i příbuzné sloučeniny a způsoby jejich přípravy a použití.

Podstata vynálezu

Podle předloženého vynálezu se připraví takové polypeptidy pro následné využití, které splňují nároky drive vytýčené ajejich užití je zjevné odborníkům v daném oboru.

Nárokovaným předmětem vynálezu je izolovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je

a) alespoň z 90 % identická se sekvencí SEKV.ID.č: 2 pro zbytky od 41 (Gin) do 148 (Ile), kde zbytek v pozici 44 je Asp, zbytek v pozici 47 je Asp a zbytek v pozici 135 je Glu, nebo

b) alespoň z 90 % identická se sekvencí SEKV.ID.č: 2 pro zbytky od 32 (Gin) do 162 (Ser), kde polypeptid váže zalphal 1 receptor, jak je uveden v SEKV. ID. č. 115.

Termín „affinity tag - afinitní značka“, se používá pro polypeptidový segment, který může být připojen k druhému polypeptidů za účelem snadnější purifikace či detekce druhého polypeptidů, či vytváří místa pro uchycení druhého polypeptidů k substrátu. V principu, každý peptid nebo protein, proti kterému je k dispozici protilátka či jiné specifické vazebné činidlo, může být užit jako afinitní značka. Afinitní značky zahrnují úseky polyhístidinu, protein A (Nilsson a další, EMBO J.4:1075,1985; Nilsson a další, Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutathion S transferázu (Smith a Johnson, Gene 67:31,1988), Glu-Glu afinitní značku (Grussenmeyer a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7952 4, 1985), látku P, Flag™ peptid (Hopp a další, Biotechnology 6: 1204 - 10,1988), streptavidin vazný peptid nebo další antigenní epitop nebo vaznou doménu.

Na přehled uvedené problematiky se lze podívat do Ford a další, Protein Express ion and Purification 2: 95-107,1991. DNA kódující afinitní značky jsou dostupné u komerčních dodavatelů (například Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Termín „allelic variant - alelická varianta“ se zde používá k označení kterékoli ze dvou, či více forem genu, zaujímajícího stejný chromozomální lokus. Alelické varianty vznikají přirozeně mutací a mohou v rámci populace vyústit do fenotypového polymorfismu. Genové mutace mohou být tiché (neprojeví se změnou v kódovaném polypeptidů) nebo mohou kódovat polypeptid se změněnou aminokyselinovou sekvencí. Termín alelická varianta je ve vynálezu užíván také pro označení proteinu kódovaného alelickou variantou genu.

Termín „aminokoncová“, N-koncová či karboxykoncová, C-koncová“je ve vynálezu používán k určení pozice uvnitř polypeptidů. Jestliže to umožňuje kontext, tyto termíny jsou používány v popisu Částečných sekvencí nebo Částí polypeptidů k označení blízkosti či relativní polohy. Například, je-li určitá sekvence umístěna na karboxykonci vzhledem k referované sekvenci polypeptidu, je lokalizována proximálně ke karboxykonci referované sekvence, ale nikoli nezbytně na karboxykonci celého polypeptidů.

-2CZ 302921 Β6

Termín „pár komplemenťVanti-komplement“ označuje neidentické částí, které, jsou-li nekovalentně spojeny, tvoří za daných podmínek stabilní pár. Například, biotin a avidin (nebo střep tavidin) jsou prototypovými členy páru komplement/anti-komplement. Další příklady párů komplement/anti-komplement tvoří páry receptor-ligand, protilátka/antigen (nebo hapten nebo epitop), sense/antisense polynukleotidové páry a tak podobně. Tam, kde je výhodné použít pár komplement/antikomplement, je výhodné, aby vazebná afinita tohoto páru byl nižší než ΙΟ⁹ M¹.

Termín „komplement polynukleotidové molekuly“ označuje polynukleotidovou molekulu mající komplementární sekvenci bází a opačnou orientaci ve srovnání s referovanou sekvencí. Například, sekvence 5'ATGCACGGG 3' je komplementární k 5'CCCGTGCAT 3'.

Termín „degenerovaná nukleotidová sekvence“ označuje sekvenci nukleotidů, která zahrnuje jeden nebo více degenerovaných kodónů (ve srovnání k uvedené sekvenci polynukleotidové molekuly, která kóduje polypeptid). Degenerované kodony obsahují různé triplety nukleotidů, ale kódují stejný aminokyselinový zbytek (např. GAU a GAC triplety oba kódují Asp).

Termín „expresní vektor“ se používá k označení molekuly DNA, lineární nebo cirkulámí, která obsahuje části kódující žádaný polypeptid funkčně připojený k dalším částem, které zajišťují jeho transkripci. Ty3o dodatečnc časti zahrnuji sekvence promotoru a terminátoru a mohu také zahrnovat jeden nebo více počátků replikace, jeden nebo více selekčních markérů, zesilovač, polyadenylační signál, a tak dále. Expresní vektory jsou obecně odvozeny od plazmidů nebo virové DNA, nebo mohou obsahovat oba elementy.

Termín „izolovaný“, je-li aplikován na polynukleotid, označuje, že polynukleotidy jsou vyjmuty z jejich přirozeného genetického prostředí a tak jsou odstraněny vlivy externích nebo nechtěných kódujících sekvencí. To je forma vhodná k využití pro produkční systém při přípravě proteinů pomocí metod genetického inženýrství. Takovéto izolované molekuly jsou takové, že jsou odděleny od jejich přirozeného prostředí a obsahují cDNA a genomové klony. Izolované molekuly DNA podle vynálezu jsou takové, že neobsahují volné další geny, které jsou většinou přidruženy, ale mohou obsahovat přirozené 5' a 3' nepřekládané oblasti jako promotory a terminátory. Identifikace přidružených oblastí je pro odborníky daného oboru zřejmá (viz Dynan a Tijan, Nátuře 316: 774—78, 1985).

„Izolovaný“ polypeptid nebo protein je polypeptid nebo protein, který se nachází v podmínkách jiných, než jsou podmínky jeho přirozeného výskytu, jako mimo krev a živočišné tkáně. Ve výhodném užití, izolovaný polypeptid je zcela bez přítomností dalších polypeptidů ve vysokém stupni přečištění, to znamená v čistotě více než 95%, v ještě výhodnějším provedení v čistotě vyšší než 99 %. Použito v tomto kontextu, tedy termín „izolovaný“ nevylučuje přítomnost nějakého polypeptidu v alternativních fyzikálních formách, jako jsou dimery nebo případné glykosylované, či derivát i zované formy.

Termín „neoplastický“, týká-li se buněk, indikuje buňky vykazující novou a abnormální proliferaci, zvláště pak ve tkáních, kde je proliferace nekontrolovaná a progresivní, jejímž výsledkem je nádor-novotvar. Neoplastické buňky mohou být buď maligní, to znamená invazní a metastatické, nebo benigní.

Termín „funkčně spojený“, vztahuje-li se kDNA segmentům, indikuje, že části DNA jsou uspořádány tak, že mohou vyústit ve funkční komplex pro jejich zamýšlené užití, to znamená transkripci iniciovanou promotorem a následné procesy ukončené segmentem kódujícím terminátor.

Termín „ortolog“ označuje polypeptid nebo protein získaný z jednoho druhu, který tvoří funkční protějšek polypeptidu nebo proteinu získaných z různých druhů. Sekvenční rozdíly mezi ortology jsou výsledkem specifikace.

-3 CZ 302921 B6 „Paralogy“ jsou jiné, ale strukturálně podobné proteiny, vytvářené jedním organismem. Existuje hypotéza, že paralogy vznikají z důvodu genové duplikace. Například, ct-globin, p-globin a myoglobin jsou vzájemnými paralogy.

„Polynukleotid“ je jednovláknový či dvouvláknový polymer deoxyribonukleových Či ribonukleových bází čtených od 5' konce k 3' konci. Polynukleotidy včetně RNA a DNA lze izolovat z přirozených zdrojů, syntetizovat in vitro, nebo připravit kombinací přirozených a syntetických molekul. Velikosti polynukleotidů jsou vyjádřeny počtem párů bází (zkráceno „bp“), nukleotidů („nt“) nebo v kilobasích („kb“). Kde to kontext vyžaduje, používají se k popisu polynukleotidů ještě termíny jednovláknový a dvouvláknový. Je-li tento termín aplikován na dvouvláknové molekuly, užívá se k označení celkové délky a bude mu rozuměno jako ekvivalentu výrazu „páry bází“. Odborníkům v daném oboru je známo, že vlákna v dvouvláknové molekule polynukleotidů se mohou lehce lišit v délce a také jejich konce mohou být pozměněny jako výsledek enzymatického štěpení; z toho plyne, že ne všechny nukleotidy v dvouvláknovém polynukleotidů musí být nutně párovány.

„Polypeptid“ je polymer aminokyselinových zbytků spojených peptidovými vazbami, ať je produkovaný přirozeně, nebo synteticky. Polypeptid s nižším počtem aminokyselinových zbytků než deset se nazývá obvykle jako „peptid“.

Termín „promotor“ je používán odborníky vdaném oboru pro označení části genu obsahující DNA sekvence, které jsou nezbytné pro vazbu RNA polymerázy a iniciaci transkripce. Sekvence promotoru se vyskytují běžně, ne však vždy, v 5' konci nekódujících oblastí genů.

„Protein“ je makromolekula obsahující jeden nebo více polypeptídových řetězců. Peptid může obsahovat také nepeptidové komponenty, jako skupiny karbohydrátů. Karbohydráty a další nepeptidové substituenty mohou být přidány k proteinu buňkou, ve které je protein produkován a mohou se lišit podle typu buňky. Proteiny jsou ve vynálezu definovány pomocí složení jejich aminokyselinové základní struktury; substituenty, jako jsou cukerné složky, nejsou většinou specifikovány, i když mohou být přesto přítomny.

Termín „reeeptor“ označuje protein asociovaný s buňkou, který váže bioaktivní molekulu (například ligand) a zprostředkovává vliv ligandu na buňku. Membránově vázané receptory jsou charakterizovány multipeptidovou strukturou obsahující extracelulámí vazebnou doménu ligandu a intracelulámí efektorovou doménu, která je v typických příkladech zapojena do signální transdukce. Vazba ligandu k receptoru vyústí v konformační změnu receptoru, která způsobí interakci mezi efektorovou doménou a další molekulou, či molekulami v buňce. Tato interakce vede ke změně metabolismu buňky. Metabolické změny spojené s interakcemi receptor-ligand zahrnují genovou transkripci, fosfory láci, defosforylaci, zvýšení produkce cyklického AMP, mobilizaci buněčného kalcia, mobilizaci membránových lipidů, buněčné adhese, hydrolýzy inositolových lipidů a hydrolýza fosfolipidů. Obecně, receptory mohou být membránově vázané, cytosolické nebo jaderné; monomemí (jako jsou reeeptor pro hormon stimulující štítnou žlázu, beta-andrenergní reeeptor) nebo multimemí (jako je reeeptor pro PDGF, reeeptor pro růstový hormon, IL-3 reeeptor, GM-CSF reeeptor, G-CSF reeeptor, reeeptor pro erythropoetin a IL—6).

Termín „sekreční signální sekvence“ označuje sekvenci DNA, která kóduje polypeptid („sekreční peptid“), který jako součást většího polypeptidu, provází větší polypeptid sekreční drahou buňky, ve které je syntetizován. Větší polypeptid je obvykle během průchodu sekreční drahou štěpen, čímž se odstraní sekreční peptid.

Termín „sestřihová varianta“ se používá k popisu alternativních forem RNA transkribované z genu. Sestřihová varianta vzniká přirozenou cestou využitím alternativních míst sestřihů v transkribované molekule RNA, či méně často mezi samostatně se transkribujícími molekulami RNA a může vyústit ve vytvoření několika mRNA přepisovaných z téhož genu. Sestříhové varianty mohou kódovat polypeptidy mající pozměněné aminokyselinové složení. Termín

-4CZ 302921 B6 sestřihová varianta se také používá k označení proteinu kódovaného sestrihovou variantou mRNA přepisovanou z genu.

Molekulové hmotnosti a délky polymerů určené pomocí nepřesných analytických metod (jako je s například elektroforéza) se chápou jako přibližné hodnoty. Je-li takováto hodnota vyjádřena jako „okolo“ X či „přibližně“ X, skutečná hodnota X se pohybuje v přesnosti ± 10 %.

Všechny reference citované v předloženém patentu jsou citovány v celém svém rozsahu.

io Předkládaný vynález je založen částečně na objevu nové sekvence DNA kódující protein mající spirálovitou (helixovou) strukturu čtyř svazků cytokinů. Procesem klonování, proliferačních stanovení a vazebných studií popsaných podrobně v předkládaném vynálezu, byla identifikována nová sekvence polynukleotidu kódujícího nový polypeptidový ligand, který byl identifikován jako ligand s vysokou specifitou pro drive nalezený receptor zalphall. Tento polypeptidový is ligand označený jako zalphall Ligand, byl izolován z cDNA knihovny generované zaktivovaných lidských periferních krevních buněk (hPBCs), které byly selektovány na CD3. CD3 je povrchový buněčný markér unikátní pro buňky lymfatického původu, zvláště potom pro T buňky.

i; _y.l IJ..L -------1-------Λ1---- 1,*--Λ „Á „ 1 ~ J,.!U. ,1„ ____k___

V pilixiaucvil piVWUVIll vynaiv^u, imaivuuji, 17J iu (JUUZ.UU uuiis.vu« min

J^VJ· závislé na metabolické dráze spojené s daným receptorem zalphal l a dále se používal růst za nepřítomnosti dalších růstových faktorů. Tato linie byla zkoumána jako zdroj cDNA kódujících zalphal 1 Ligand. Buněčná linie dávající přednost tomuto růstovému faktoru BaF3 (Palacios a Steimetz, Cell 41: 727 - 734, 1985; Mathey-Prevot a další, Mol.Cell.Biol. 6: 4133—4135. 1986) byla užita pro transfekci a expresi zalphal 1 receptorů. Avšak pro tyto pokusy byly vhodné i další buněčné linie závislé na dalších růstových faktorech, jako je FDC-Pl (Hapel a další, Blood 64: 786-790, 1984) a MO7e (Kiss a další, Leukemia 7: 235-240, 1993).

Aminokyselinové sekvence pro zalphall receptor ukazují, že indikovaný receptor patří do skupiny subrodiny cytok i nových receptorů třídy 1, která obsahuje, ale nikoli jenom, receptory pro

3o IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF a G-CSF (pro přehled se lze podívat do Cosman: „The Gematopoietin Receptor Superfamily“ v Cytokine 5(2): 95-106, 1993). Receptor zalphal 1 je zcela popsán v běžně dostupné patentové přihlášce PCT Patent Application No.LS99/22149. Analýza distribuce mRNA pro receptor zalphall ve tkáni prokázala expresi v lymfatických uzlinách, periferních krevních leukocytech (PBLs), slezině, kostní dřeni a brzlíku. Co více, mRNA byla prokázána v nadbytku v buněčné linii Ráji (ATCC No. Ccl-86) odvozené z Burkittova lymfomu. Distribuce receptorů v tkáních naznačuje, že cílem pro navržený zalphal 1 Ligand jsou buňky hematopoetického původu, zvláště potom předchůdci lymfatických buněk a lymfatické buňky. Další známé cytokiny tvořící čtyřsvazkový helix, které působí na lymfatické buňky zahrnují IL-2, IL-4, IL-7 a IL-15. Pro přehledné informace týkající se čtyrsvazkových cytokinů se strukturou helixu se lze podívat do Nicola a další, Advances in Protein Chemistry 52: 1-65, 1999 ado Kelso, Immunol. Cell Biol. 76: 300-317, 1998.

Kondiciovaná média (CM) získaná zCD3+, PMA/Ionomycin- stimulovaných lidských periferních krevních buněk podporovala růst BaF3 buněk, které exprimují zalphal 1 receptor a jsou ijinak závislé na IL-3. Kondiciovaná média zbuněk, které nebyly: 1) PMA/Ionomycin-stimuiované; nebo nebyly: 2) CD3 selektované (s či bez PMA/Ionomycin stimulace), nepodporovaly růst BaF3/zalphal 1 receptorových buněk. Kontrolní pokusy prokázaly, že tato proliferační aktivita není projevem každého známého růstového faktoru a že tato schopnost takto kondiciovaného média stimulovat proliferaci zalphal l receptor exprimují cích buněk může být neutralizována rozpustnou formou tohoto receptorů,

Proliferace buněk BaF3 exprimujících receptor zalphall vystavených vlivu CM z lidských periferních krevních buněk vystavených selekci CD3+ a stimulaci PMA/Ionomycinem, byla identifikována vizuálním prohlížením kultur a/nebo pomocí proliferačního testu. Odborníkům daného oboru je známo mnoho způsobů provedení proliferačního testu, včetně testů založených

-5 CZ 302921 Β6 na redukci barviv, jako je Alamar Blue (AccuMed International, lne. Westalake, Ohio), 3-(4,5 dimethylthiazol 2 y]) 2,5 diíenyltetrazoliumbromid (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983); 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl>-3-3-karboxymethoxyfenyl-2H-tetrazoliumhydrochlorid; a kyanoditolyltetrazoliumchlorid (kterýje komerčně dodáván od firmy Polyscinces, lne., Warrington, Pa); mitogenní testy, jako jsou měření zabudování ³H—thymidinu; testy založené na exkluzi barvy, jako je naftalenová čerň a trypanová modř; příjmu barvy za užití diacetylfluoresceinu; a uvolnění chrómu. Pro podrobnosti se podívejte do Freshney, Culture of animal Cells: Manual of Basic Technique, 3. Vydání, Wíley-Liss, 1994).

cDNA knihovna byla připravena zCD3+ selektovaných, PMA a Ionomycinem stimulovaných primárních lidských periferních krevních buněk. Knihovna cDNA odvozená zCD3+ selektovaných a PMA/lonomycinem stimulovaných primárních lidských periferních krevních buněk se dělila na části obsahující mnohočetné cDNA molekuly a byla transfekována do hostitelské buněčné linie, například BHK 570 (ATCC přístupové číslo 10314). Transfekované hostitelské buňky byly kultivovány v médiu, které neobsahovalo exogenní růstové faktory a sbíralo se kondiciovane médium. Kondiciovaná média byla zkoumána na schopnost stimulovat proliferaci BaF3 buňky transfekované receptorem zalphall. Identifikovaly se cDNA, které vytvářeny kondiciované médium, které stimulovalo Ba F 3/zalphal I receptorové buňky. Tato zásobní plazmidová cDNA byla elektroporaci vložena do E.coli. Z jednotlivých kolonií se izolovala cDNA a byla přenesena individuálně do buněk linie BHK 570. Pozitivní klony byly identifikovány pomocí pozitivních výsledků v BaF3/zalphal 1 receptorovém proliferačním testu. Specifícita byla testována neutralizací proliferace pomocí rozpustného receptoru zalphal 1.

Pozitivní klony byly izolovány a sekvenční analýza potvrdila, že polynukleotídové sekvence obsažené v plazmidové DNA jsou nové. Signální sekvence pro sekreci je tvořena aminokyselinovými zbytky 1 (Met) až 31 (Cíly) a maturovaný peptid je tvořen aminokyselinovými zbytky 32 (Gin) až 162 (Ser), jak je zobrazeno v SEK V. ID. Č.: 2.

Všeobecně se předpokládá, že cytokiny mají tetra-alfa-helixovou strukturu, s helixy A, B,C a D, které jsou nejdůležitější pro interakci ligand—receptor ajsou více konzervované mezi členy této rodiny. Vezmeme-li do úvahy aminokyselinovou sekvenci lidského zalphal 1 Ligandu uvedenou v SEKV.ID.Č.:2, z porovnání aminokyselinových sekvencí lidského zalphall Ligandu, lidského IL— 15, lidského IL^4 a lidského GM-CSF lze vyvodit, že helix A zalphal 1 Ligandu je definován aminokyselinovými zbytky 41-56; helix B aminokyselinovými zbytky 69-84; helix C aminokyselinovými zbytky 92-105; a helix D aminokyselinovými zbytky 135-148; tak, jak je ukázáno v SEKV.ID.Č.:2. Strukturní analýza předpokládá, že smyčka A/B je dlouhá, smyčka B/C je krátká a C/D smyčka je paralelně dlouhá. Tyto výsledky struktury smyček vyústily v „up-up~down-down“ helikální organizaci. Cysteinové zbytky jsou mezi zalphal 1 ligandem a IL—15 zcela konzervované, tak jak je to znázorněno na obrázku 1. Cysteinové zbytky, které jsou konzervovány mezi ÍL-15 a zalphal 1 Ligandem, odpovídají aminokyselinovým zbytkům 71,78, 122 a 125 podle SEKV.ID.Č.:2, tak jak ukazuje obrázek 1. Konzistentní umístění cysteinů je dalším potvrzením tetrahelixové svazkové struktury. Dalšími vysoce konzervovanými zbytky v rodině obsahující IL—15, 1L-2, IL—T GM-CSF a zalphal 1 Ligand je sekvence Glu-Phe-Leu, tak je to uvedeno v SEKV.ID.Č.:2 a u zbytků 136-138 na obrázku 1.

Další analýza zalphal 1 Ligandu založená na mnohočetném porovnání (jak je ukázáno na obrázku 1) ukazuje, že aminokyselinové zbytky 44, 47 a 135 (tak jak je ukázáno v SEKV.ID.Č.:2) hrají také důležitou roli při vazbě zalphall Ligandu kjeho příbuznému receptoru. Co více, odvozená aminokyselinová sekvence myšího zalphall Ligandu vykazuje 57% identitu s odvozeným lidským proteinem. Na základě srovnání mezi sekvencemi pro lidský a myší zalphal 1 Ligand se výrazně konzervované oblasti nalézají v oblastech s předpo vězený mi alfa helixy A a D. Odpovídající polynukleotidy kódující polypeptidovou oblast pro zalphal 1 Ligand, domény, motivy, zbytky a sekvence zde popsané, naleznete v SEKV.ID.Č.:!.

-6CZ 302921 B6

Pro IL—1 a IL-2 byla provedena detailní mutační analýza, obě látky jsou velmi podobné zalphal l ligandu. Analýza myšího IL—2 (Zurawski a další, EMBO J. 12: 1513-5119, 1993) ukázala, že zbytky v helixech A a C jsou důležité pro vazbu k lL-2Rp; kritickými zbytky jsou Asp₃₄, Asn₉₉a Asnioj. Více zbytků je důležitých ve smyčce A/B IL-2 a helixu B pro vazbu IL~2Ra, zatímco pouze jeden zbytek, Glni_4t v helixu D, je zapotřebí pro vazebnou interakci s IL-2Rot. Podobně, helixy A a C jsou místem interakce mezi IL—4 a OIL—4Ra (strukturně podobných ÍL-2Ra) a zbytků v helixu D pro vazebnou interakci IL-2Ra (Wang a další, Proč. Nati. Acad. Sci. (JSA 94: 1657- 1662, 1997; Kruše a další, EMBOJ. 11:3237-3244, 1992). Zvláště pak mutace Tyr_l24na Asp v lidském IL-4 utváří antagonistu, který se váže s IL-4Rct, ale nikoli s IL-2Ra, a proto nemůže dojít k přenosu signálu (Kruše a další, citace 1992).

Zatímco helix A je relativně dobře konzervovaný mezi lidským a myším zalphal 1 Ligandem, helix C vykazuje větší různorodost. Zatímco v obou druzích jsou v této oblasti dominantní kyselé aminokyselinové zbytky, rozdíly se podílejí na specifitě interakce mezi zalphal 1 Ligandem ajeho „beta“ typem receptoru, zalphal 1. Smyčka A/B a helix B zalphal 1 Ligandu jsou dobře mezidruhově konzervované; ačkoli doposud nebyla identifikována podjednotka receptoru odpovídající IL-2Rct, konzervace v této oblasti napovídá, zeje funkčně významná. D helixy lidského a myšího zalphal 1 Ligandu jsou také vysoce konzervované. Antagonisté zalphal 1 receptoru mohou být navrženi pomocí mutací v D helixu zalphal 1 Ligandu. Tyto mutace zahrnují zkrácení proteinu od zbytku Gln_)4S (SEKV.ID.Č.:2), nebo pomocí mutace Gln_!45 nebo Ileus (v SEKV.1D.Č.:2); odpovídá to Tyr_t34 v lidském IL-4) na zbytky jako jsou Ala nebo Asp. Jakákoli mutace, která vede k rozdělení heíixové struktury zalphal 1 Ligandu, může zničit vazbu s receptorem a tak inhibuje signalizaci.

Tetrahelixové svazky cytokinú jsou také zařazovány do skupin podle délky komponent jejich helixů. „Dlouhý helix je tvořen cytokiny obecně sestávajících zobou helixů tvořených zbytky 24-30. Do této skupiny patří IL-6, ciliámí neurotrofní faktor (CNTF), leukemický inhibiční faktor (LIF) a lidský růstový hormon (hGH). „Krátký helix“ tvoří cytokiny sestávající z helixů tvořených mezi 18 a 21 zbytky a tato skupina zahrnuje IL-2, IL-4 a GM-CSF. Předpokládá se, že zalphal 1 Ligand je nový člen cytokinové skupiny tvořící krátké helixy. Studie pomocí CNTF a IL-6 prokázala, že CNTF helix může být zaměněn za ekvivalentní helix v IL-6, což dokazuje CNTF-vazebné vlastnosti k chimérám. Tak je zjevné, že funkční domény tetrahelixových cytokinú jsou určeny na základě strukturní homologie, bez ohledu na jejich sekvenční identitu, a tak mohou zachovávat funkční integritu v chimérách (Kallen a další, J. Biol. Chem. 274:1185911867, 1999). Z tohoto důvodu jsou heíixové domény zalphal 1 Ligandu užitečné pro přípravu chimérických fúzních molekul, zvláště pak s dalšími cytokiny tvořícími krátké helixy. Lze jejich pomocí určit a modulovat receptorovou vazebnou specifitu. Zvláštní důraz je kladen na fúzní proteiny tvořené z helixu A a nebo helixu D a fúzní proteiny, které kombinují he li kál ní a smyčkové domény z dalších cytokinú tvořících krátké helixy, jako jsou IL-2, IL-4, IL—15 a GM-CSF. Aminokyselinové zbytky obsahující helixy A, B, C a D a smyčky A/B, B/C a C/D pro zalphal 1 Ligand, IL-2, IL—4. IL—15 a GM-CSF jsou zobrazeny v tabulce 1.

- 7 CZ 302921 B6 tabulka 1

	Helix A	Smyčka Λ/Β	Helix B	Smyčka B/C	Helix C	Smyčka (7D	Helix D
Zbytky Zalphal 1 Ligand	41-56	57-68	69-84	85-91	92-105	106-134	135-148	SEKV. ID.Č:2 —i
Zbytky IL-2	36-46	47-52	53-75	76-86	87-99 1	100-102	103-121	SEKV. \| ID.Č: \| 111
Zbytky JL-4	29-43	44-64	65-83	84-94	95-118	119-133	134-151	SEKV. ID.Č: 112
Zbytky IL-15	45-68	69-83	84-101 1	102-107	107-119	120-133	134-160	sÉkv“ ID.Č: 113
Zbytky GM-CSF	30-44	45-71	72-81	82-90	91-102	103-119	120-131	SEKV. ID.Č: 114

Předkládaný vynález zahrnuje polynukleotidové molekuly, včetně DNA a RNA molekul, které kódují polypeptid objevený uvnitř zalphal 1 Ligandu. Odborníkům v daném oboru je známo, že genetický kód je degenerovaný, hlavně potom vědí, jaké jsou možné variace mezi jednotlivými molekulami polynukleotídu. SEKV.JD,Č:3 je degenerovaná DNA sekvence, která zahrnuje všechny DNA sekvence kódující zalphal 1 Ligandový polypeptid, jehož sekvence je uvedena v SEKV.ID.Č:2. Odborníci dále vědí, že zdegenerované sekvence SEKV.ID.Č:3 také mohou vzniknout všechny RNA sekvence, které kódují SEKV.ID.Č:2, a to záměnou U za T. Z toho ío plyne, že polypeptid zalphal 1 Ligandu kódují polynukleotidy obsahující nukleotid 1 nebo 94 až k nukleotidu 486 v SEKV.ID.Č:3 a jejich RNA ekvivalenty. Všechny tyto polynukleotidy jsou součástí vynálezu. Tabulka 2 vysvětluje a označuje v jednopísmenném kódu použitém v SEKV.ID.Č:3 degenerované pozice nukleotidů. „Rozlišení“ označuje v jednopísmenném kódu nukleotidy. „Komplement“ ukazuje kód pro komplementární nukleotid(y). Například, kód Y označuje buď C nebo T, a jeho komplement R označuje buď A nebo G, kde Aje komplementární k T a G je komplementární k C.

-8 CZ 302921 B6

Tabulka 2.

Nukleotid	Rozlišení { i	Komplement	Rozlišení
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A/G	Y	C/T
Y	C/T	R	A/G
M	A/C	K	G/T
K	G/T	M	A/C
s	C/G	S	C/G
w	A/T	W	A/T
H	A/C/T	D	A/G/T
B	C/G/T	V	A/C/G
V	Á/C/G	B	C/G/T
D	A/G/T	II	A/C/T
N	A/C/G/T	N	.A/C/G/T

Degenerované kodony použité v SEKV.1D.Č:3; zahrnují všechny možné kodony pro danou aminokyselinu. Kodony pro jednotlivé aminokyseliny udává tabulka 3.

-9 CZ 302921 B6

Tabulka 3

Aminokyselina	Jednopísmenný kód	Kodony	Degenerované kodony
Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	s	AGC AGT TCA I CC TCG TCT	WSN
Thr	T	ACA ACC ACG ACT J	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAA GAG	GAR
Gin	Q	CAA CAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAA AAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	I	ATAATCATT	ΑΊΉ
Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	TTY
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
Ter		ΤΛΑ TAG TGA	TRR
Asn/Asp	B		ŘAY
Glu/Gln	Z		SAR
jakákoli	X		NNN

-10 CZ 302921 B6

Jedním z běžných úkonů pro odborníky v daném oboru je určení, je-li v sekvenci přítomen degenerovaný kodon a které aminokyseliny jím mohou být kódovány, určení všech možných kodonů pro každou aminokyselinu. Například, degenerovaný kodon pro serin (WSN) může, za určitých okolností, kódovat arginin (AGR), degenerovaný kodón pro arginin (MGN) může, za určitých okolností, kódovat serin (AGY), Podobné vztahy existují mezi kodóny kódujícími fenylalanin a leucin. Tak některé polynukleotidy obsahující degenerované sekvence mohou kódovat různé aminokyselinové sekvence. Odborník v daném oboru však lehce takovéto sekvence identifikuje ve vztahu k aminokyselinové sekvenci SEKV.ID.Č:2. Variantní sekvence lze také testovat na jejich funkci, a to způsobem, jak je popsáno v tomto vynálezu.

Odborníkům je také známo, že různé druhy mohou vykazovat preferenční užití určitých kodonů. Pro obecné závěry se lze podívat do: Grantham a další, Nuc. Acids Res. 8: 1893 -912, 1980; Haas a další, Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-hobson a další. Gene 13:355-64, 1981; Grosjean a Fiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc, Acids Res. 14:3075-85, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982. V tomto dokumentu se bude termín „preferenční užití kodonů“ užívat v terminologii pro translaci kodonů, kde bude označovat kodony, které nej častěji užívá buňka určitého druhu, tak budou vybráni jeden nebo více kodonů kódujících určitou aminokyselinu (viz tabulka 3). Například, aminokyselina threonin (Thr) může být kódována kodony ACA, ACC, ACG nebo ACT, aie v savčích buňkách je nejčastěji využíván kodón ACC; v jiném druhu, například v hmyzích buňkách, kvasinkách, virech nebo bakteriích, jsou preferovány jiné kodony pro Thr. V předloženém vynálezu je pravidlo preferenčního výběru kodonů jednotlivými druhy buněk zohledněno a je zahrnuto v jednotlivých sekvencích. Zavedení preferenčních kodonů do rekombinantní DNA může, například, zvýšit produkci proteinu, a to učiněním translace proteinu účinnější užitím jiného typu buněk, nebo druhu. Z tohoto důvodu degenerované kodony uvedené v SEKV.ID.Č:3 slouží jako tem plát pro optimalizaci exprese polynukleotidů v různých typech buněk a druzích běžně užívaných v tomto oboru a zahrnutých ve vynálezu. Sekvence obsahující preferenční kodony mohou být testovány a optimalizovány pro expresi v různých druzích a testovány na funkčnost, tak jak je to popsáno ve vynálezu.

Jak bylo již dříve uvedeno, izolované polynukleotidy podle vynálezu zahrnují DNA a RNA. Způsoby přípravy DNA a RNA jsou dobře známé odborníkům daného oboru. Obecně, RNA se izolovala z tkání nebo buněk produkujících velké množství RNA pro zalphal 1 Ligand. Tato pletiva se určovala pomoct Northnem blottu (Thomas, Proč. Nati. Acd. Sci. USA 77:5201, 1980) nebo prozkoumáním kondiciovaného média z různých typů buněk na aktivitu na cílové buňky nebo tkáně. Byla-li jednou aktivita či RNA produkující buňky identifikovány, byla připravena celková RNA pomocí extrakce za užití guanidiniumisothiokyanátu, po níž následovala izolace centrifugaci v gradientu CsCl (Chirgwin a další, Biochemistry 18:52-94,1979). Poly(A)+ RNA je připravena z celkové RNA pomocí postupu Aviva a Ledera (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972). Komplementární DNA (cDNA) se připraví zpoly(A)!- RNA pomocí známých postupů. Alternativně se může izolovat genomová DNA. Polynukleotidy kódující polypeptid pro zalphal 1 Ligand jsou potom identifikovány a izolovány, například hybridizaci či PCR.

Klon o úplné délce kódující zalphal 1 Ligand lze získat pomocí konvenčních klonovacích pokusů. Jsou upřednostňovány klony komplementární DNA (cDNA), ačkoli pro nějaké další aplikace (například expresi v transgenních zvířatech) je lépe použít genomové klony, nebo modifikovat cDNA klon, aby zahrnoval alespoň jeden genomový intron. Způsoby přípravy cDNA a genomových klonů jsou obecně známy odborníkům v oboru a jsou použity pro přípravu sekvencí uvedených ve vynálezu, jejich částí, pro přípravu sond nebo primerů pro knihovnu. Expresní knihovny jsou zkoumány pomocí protilátek proti zalphal 1 receptorovým fragmentům, nebo pomocí specificky se vázajících partnerů.

Polynukleotidové sekvence pro zalphal 1 Ligand uvedené ve vynálezu mohou být také užity jako sondy nebo primery ke klonování 5'nekódující oblasti genu pro zalphal 1 Ligand. Z hlediska tkáňově specifická exprese pozorované pro zalphal 1 Ligand se předpokládá, že tato část genu je zodpovědná za hematopoetickou a lymfaticky specifickou expresi. Elementy promotoru z genu

- 11 CZ 302921 B6 pro zalphall Ligand tak mohou být využity k nasměrování tkáňově specifické exprese heterologních genů, například u transgenníeh zvířat, čí pacientů ošetřených pomocí genové terapie. Klonování 5' krajních koncových sekvencí také umožňuje produkci proteinů zalphal 1 Ligandu pomocí „genové aktivace”, tak jak je to popsáno v Patentu US 5 641 670. Ve zkratce lze vysvětlit tento princip následovně: expresi endogenního genu pro zalphal 1 Ligand v buňce lze změnit zavedením alespoň jedné cílové sekvence, regulační sekvence, exonu a nepárujícího se zkráceného donorového místa. Cílová sekvence je pro zalphal 1 Ligand 5'nekódující sekvence, která umožní homologní rekombinaci konstruktu s endogenním lokusem zalphal 1 Ligandu, pomocí níž jsou sekvence konstruktu funkčně svázány s endogenní sekvencí kódující zalphall Ligand. Tímto postupem, endogenní promotor pro zalphal 1 Ligand může být nahrazen nebo doplněn dalšími regulačními sekvencemi, které mohou zvýšit expresi, změnit její tkáňovou speciíltu, čiji dalšími způsoby regulovat.

Doplňkové polypeptidy a póly nukleotidy existují v jiných druzích (orthology). Tyto druhy zahrnují mimo jiné například druhy savců, ptáků, obojživelníků, plazů, ryb, hmyzu a další druhy obratlovců a bezobratlých. Zvláštní význam je kladen na polypeptidy pro zalphal 1 Ligand z dalších savčích druhů, včetně hlodavců, prasat, ovcí, hovězího dobytka, psovitých a kočkovitých šelem, koní a dalších polypeptidů primátů. Orthology lidského zalphal 1 Ligandu lze klonovat pomocí informací a sloučenin uvedených ve vynálezu v kombinaci s konvenčně užívanými klonovacími technikami. Například, cDNA může být klonována pomocí mRNA získané z tkáně nebo určitého typu buněk, které exprimují zalphal 1 Ligand, tak je to ve vynálezu popsáno. Vhodné zdroje mRNA lze identifikovat pomocí Northern blotu se sondami navrženými podle sekvencí uvedených ve vynálezu. Po té se připraví z mRNA pozitivních tkání nebo buněk knihovna. Pomocí široké škály postupů, jako je užití sond s úplnou či částečnou lidskou cDNA, či pomocí degenerovaných sond založených na uvedených sekvencích, se izoluje cDNA pro zalphal 1 Ligand. cDNA může být klonována také pomocí polymerázové řetězové reakce, neboli PCR (Mullis, patent US 4 683 202), pomocí primeru navržených podle sekvencí reprezentujících lidský zalphal 1 Ligand, které jsou uvedené ve vynálezu. Dalším způsobem je užití cDNA knihovny k transformaci nebo transfekci hostitelských buněk a expresi požadované cDNA, která se detekuje pomocí protilátky proti polypeptidu zalphal 1 Ligandu, vazebných studií či určení aktivity. Podobné techniky lze použít i pro izolaci genomových klonů.

Byla určena polynukleotidová sekvence pro myší ortholog zalphal 1 Ligandu a je uvedena v SEKV.ID.Č:55, odpovídající aminokyselinová sekvence je uvedena v SEKV.ID.Č: 56. Mezi lidskou a myší sekvencí existuje 62% identita v oblasti 124 aminokyselin, která odpovídá zbytkům 30 až 153 v SEKV.ID.Č:2 a zbytkům 23 až 146 v SEKV.ID.Č:56 pro zalphal 1 Ligand. Úplná sekvence maturovaného myšího zalphal 1 Ligandu údajně začíná His_!8 (jak je to uvedeno v SEKV.ID.Č:56), který odpovídá His₂₅ (jak je to uvedeno v SEKV.ID.Č:2) v sekvenci pro lidský ligand. Jelikož zkrácená forma lidského polypeptidu je aktivní, je pravděpodobné, že ekvivalentní polypeptid myšího zalphal 1 Ligandu (to znamená bez zbytků Hisis až Pro₂2 v SEKV.ID.Č:56) je aktivní také. Analýza tkání prokázala expresi myšího zalphall Ligandu ve varlatech, slezině a thymu.

Odborníkům v oboru je známo, že sekvence uvedená v SEKV.ID.Č: 1 reprezentuje jednu alelu lidského zalphall Ligandu a že se dá předpokládat výskyt alelických variant a alternativních zkrácení. Alelické varianty této sekvence lze klonovat pomocí sond cDNA nebo genomových knihoven z různých původů pomocí standardních postupů. Existují alelické varianty DNA sekvence ukázané v SEKV.ID.Č:!, včetně těch, které obsahují tiché mutace a těch, u kterých se mutace projeví změnou aminokyselinového složení, stejně jako alelické varianty SEKV.ID.Č:2. cDNA odvozené z alternativně sestřižených mRNA, které sí uchovávají vlastnosti polypeptidu zalphall Ligandu, jsou také předmětem tohoto vynálezu, stejně jako polypeptidy kódované těmito cDNA a mRNA kyselinami. Alelické varianty a sestřihové varianty těchto sekvencí mohou být klonovány pomocí sond cDNA nebo genomových knihoven odvozených z různých druhů nebo tkání podle standardních postupů, známých z oboru.

- 12CZ 302921 B6

Gen pro zalphal 1 Ligand byl zmapován vzhledem k IL-2 markéru čtecího rámce SHGC-12342. Poloha zalphall Lígandu je přibližně 180 kb od IL-2 markéru, což bylo určeno pomocí užití markérů ohraničujících polohu genu pro zalphall Ligand v oblasti 4q27 na integrované LDB mapě chromozomu 4 (The Genetic Location Database, University of Southampton). Vynález také zahrnuje užití reagencií, které jsou použity v diagnostických aplikacích. Například, gen zalphal ILigandu, sondu obsahující DNA nebo RNA pro zalphal 1 Ligand nebo subsekvence těchto, které mohou být užity k určení přítomnosti genu pro zalphal 1 Ligand na lidském chromozomu, jako je chromozom č, nebo k určení, zda se vyskytuje v tomto genu mutace. Na základě uvedení fragmentu genomové lidské DNA obsahující část genomové DNA pro zalphal 1 Ligand io (Genebank, přístupové číslo: AC007458), zalphall Ligand se nachází v oblasti 4q27 chromozomu 4. Detekované chromozomáíní aberace v lokusu genu pro zalphal 1 Ligand zahrnují mimo jiné například: aneuploidie, změnu počtu kopií genu, ztrátu heterogenity (LOH), translokace, inserce, delece, změnu restrikčních míst a změnu uspořádání. Tyto aberace lze detekovat pomocí polynukleotidů podle vynálezu za užití technik molekulární biologie, jako je analýza polymorfis15 mu délky restrikčních fragmentů (RFLP), analýza krátkých tandemových opakování (STR) za užití PCR technik a dalších technik spojených s genetickou analýzou, jak jsou známy odborníkům v oboru (Sambrook a další, tamtéž; Ausubel a další, tamtéž; Marian, Chest 108:255-65, 1995).

Znalost přesné polohy genu je velmi užitečná z mnoha důvodů, které zahrnují: 1) určení sekvence části existujícího kontigu a získání dodatečných sousedních genetických sekvencí v různých formách, jako je YAC, BAC nebo cDNA klony; 2) výběr možných kandidátů genů pro dědičné nemoci, které se vztahují ke stejné oblasti chromozomu; 3) výběr referenčního organismu, jako je myši, který může pomoci v rčení funkce, kterou by gen mohl plnit.

Jak bylo uvedeno drive, lidský gen pro zalphal 1 Ligand je umístěn blízko IL-2 genu. který je v oblasti chromozomu 4q, která, jak bylo prokázáno, má spojitost s náchylností kzánětlivých chorobám vnitřností (fBD) (včetně Crohnovy nemoci (CD) a vředové kolitidy) u některých rodin (Hampe a další, Am. J. Hum. Genet. 64:808-816, 1999; Proč. Nati. Acad. Sci. 95:7502-7507,

1998). Navíc, gen pro receptor zalphall byl určen na 16pl 1, v jiné oblasti genomu, která je spojována s náchylností k CD (Hugot a další, Nátuře 379:821-823, 1996.; Ohmen a další, Hum. Mol. Genet 5:1679-1683, 1996). CD je chronický zánět střeva s častými systémovými dopady; zatímco přesná etioiogie je neznámá, předpokládá se, že hlavní příčinou je imunoregulační disfunkce zahrnující selhání tolerance k běžným střevním antigenům (pro detaily se podívejte do:

Braegger a další, Annals Allergy 72: 135-141, 1994; Sartor, Am. J. Gastroenterol. 92:5S-1 IS, 1997). Některé studie odhalily abnormální aktivitu NK u pacientů sCD nemocí (viz, například, (Egawa a další, J, Clin. Lab. Immunol. 20:187-192, 1986; Aparacio- Pagés a další, J. Clin, Lab. lmmunol. 29: 119-124, 1989; van Tol a další, Scand. J. Gastroenterol 27:999-105, 1992)) a byla také dokumentována tvorba defektní paměti B buněk (Brogan a další, J. Clin. Lab. lmmunol.

24:69-74, 1987). Jelikož zalphal 1 Ligand hraje roli v regulaci imunity a protože gen jak pro receptor, tak pro ligand, leží v oblasti způsobující náchylnost k CD, lze vyvodit, že jak receptor, tak ligand jsou kandidáty na genetickou predispozici ke Crohnově nemoci.

Určení zapojení zalphal 1 Lígandu a receptoru do patologie IBD lze uskutečnit pomocí několika postupů. Sekvenováním exonů z genomové DNA lze určit přítomnost kódujících mutací (včetně missens mutací, nonsens mutací a mutací ve čtecím rámci), stejně jako při sekvenování cDNA. Další výhodou sekvenování genomové DNA je, že v sekvenovaných fragmentech se vyskytují také „místa sestřihu“ a ty se mohou projevit v sestrihových abnormalitách, které se nemusí projevit ve vzorcích cDNA, protože například, chybně sestřižené RNA jsou velmi rychle degra50 dovány. Genomová struktura zalphall Lígandu byla stanovena. Další metody pro analýzu zalphal l lígandu a receptoru u pacientů s IBD zahrnují:!) určení produkce lígandu z aktivovaných T buněk u pacienta v porovnání s normální kontrolou (to znamená biotest); 2) in šitu hybridizace RNA pro zalphal 1 Ligand nebo receptor k sekcím z střeva v zánětu u pacientů s IBD, ve srovnání se stejnými sekcemi normální kontroly; 3) imunohistochemie v sekcích z IBD pacientů

- 13 CZ 302921 B6 oproti srovnání s normální kontrolou a 4) určení odpovědi pacientových periferních B buněk na zalphal 1 Ligand, což se provádí pomocí mitogenního testu.

Diagnostika může pomoci lékaři v určení typu nemoci a ve volbě správné terapie, či může pomá5 hat v genetickém inženýrství. Z tohoto důvodu se vytvořené protilátky proti zalphal 1 Ligandu, polynukleotidy a polypeptidy používají pro detekci polypeptidů zalphal 1 Ligandu, mRNA nebo protilátek proti zalphal l ligandu, a tak tyto slouží jako markéry a budou přímo užity k detekci genetických vad nebo rakoviny, tak jak je popsáno ve vynálezu, za užití postupů známých odborníkům vdaném oboru. Dále polynukleotidové sondy pro zalphal 1 Ligand mohou být užity io k detekci abnormalit na chromozomu 4q27, tak jak je uvedeno ve vynálezu. Tyto abnormality mohou být spojeny s lidskými nemocemi, genezí tumoru, samovolnými potraty nebo dalšími genetickými vadami. A tak tedy polynukleotidové sondy pro zalphal 1 Ligand mohou být využity k detekci abnormalit, či genotypu spojeného s těmito defekty.

Jak bylo vysvětleno výše, defekty v samotném genu pro zalphal 1 Ligand mohou vést ke stavu dědičné choroby. Molekuly dle vynálezu, jako jsou polypeptidy, polynukleotidy a protilátky mohou pomoci v detekci, diagnostice, prevenci a léčení nemocí spojených s genetickými defekty v zalphal 1 Ligandu. Navíc, polynukleotidové sonda pro zalphal 1 Ligand může být použita pro detekci alelických rozdílů v ehromozomálntm lokusu pro zalphal 1 Ligand mezi nemocnými a zdravými jedinci. Z tohoto důvodu může být sekvence zalphal 1 Ligandu použita pro soudní diagnostiku určení DNA profilů.

Obecně, diagnostické postupy užívané v genetických analýzách, které lze využít k detekci genetických abnormalit nebo aberací u pacienta, jsou odborníkům zjevné. Nejvíce postupů zahrnuje kroky: (i) získání genetického vzorku z potenciálně nemocného pacienta, nemocného pacienta nebo potenciálního nosiče recesivní alely spojené s nemocí; (ii) příprava prvního produktu reakce inkubací genetického vzorku s póly nukleotidovou sondou pro zalphal 1 Ligand, kde polynukleotid bude hybridizovat ke komplementární polynukleotidové sekvenci, jako je tomu v RFLP analýze nebo inkubací genetického vzorku se sense a antisense primery v PCR reakci za určitých přesných podmínek PCR reakce; (iii) vizualizace prvního reakčního produktu pomocí gelové elektroforézy a/nebo dalších známých metod jako je vizualizace prvního reakčního produktu s polynukleotidovou sondou pro zalphal 1 Ligand, kde polynukleotid bude dále hybridizovat s komplementární polynukleotidovou sekvencí první reakce; a (iv) srovnání vizualizovaného prvního reakčního produktu s druhým reakěním produktem z genetického vzorku z normálního nebo kontrolního jedince. Rozdíl mezi prvním reakěním produktem a produktem kontrolní reakce jsou měřítkem případné genetické abnormality u nemocného, či potenciálně nemocného pacienta, nebo se určí přítomnost fenotypu heterozygotního recesivního nosiče u zdravého pacienta, či se určí přítomnost genetického defektu v tumoru od nemocného pacienta, či se určí přítomnost genetických abnormalit v zárodku plodu či preinplantovaném

4o embryu. Například, rozdíl ve výsledcích RFLP, či v produktech PCR, délce repetitivních sekvencí v lokusu pro zalphal 1 Ligand, a tak podobně, je indikací genetických abnormalit, genetických aberací nebo alelických rozdílů ve srovnání s normální kontrolou. Kontroly mohou být odebrány od nepostižených členů rodiny, nebo od nepříbuzných jedinců, záleží to na testu a dostupnosti vzorků. Genetické vzorky mohou zahrnovat genomovou DNA, mRNA a cDNA izolované z tkání nebo jiných biologických vzorků od pacienta, jako jsou, krev, sliny, semeno, zárodečné buňky, amniotická kapalina a tak dále. Polynukleotidové sondy či primery mohou být RNA nebo DNA, a obsahují část SEKV.ID.Č:!, komplement SEKV.ID.Č: 1 a/nebo jejich RNA ekvivalent. Postupy používané v genetických analýzách fenotypu lidských nemocí jsou obecně známy v daném oboru. Na přehled diagnostických metod založených na PCR se lze podívat do Mathew (ed.),

Protocols in Human Molecuiar Genetics (Humana Press, lne. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, lne. 1993), Cotter(ed.), Molecuiar Dtagnosis of Cancer (Humana Press, lne. 1996), Hanausek a Walaszek (eds.), Tumor Markér Protocols (Humana Press, lne. 1998), Lo(ed.), Clinical applications of PCR) Humana Press, lne., 1998) a Melzer(ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, lne. 1998)).

- 14CZ 302921 B6

Mutace spojené s lokusem pro zalphal 1 Ligand mohou být podle vynálezu detekovány pomocí molekul nukleových kyselin za užití standardních metod pro přímou mutační analýzu, jako je analýza pomocí RFLP, analýza krátkých tandemových repetic pomocí PCR technik, analýza pomocí amplifíkace refrakčních mutačních systémů, detekce jednovláknového konformačního polymorfismu, metody štěpení pomocí Rnasy, denaturační gradientova elektroforéza, analýza založená na missmatchi s fluorescenčním značením a další známé techniky, běžné pro daný obor. (viz například, Mathew(ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, lne. 1991), Marian, Chest 108:255 (1995), Coleman a Tsongalis, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press. Inc. 1996), Elles (ed,), Molecular Diagnosis of Genetic Diseases (Humana Press, lne. 1996) Landegren (ed,), Laboratory Protocols for Mutation Detection (Oxford University Press 1996), Birren a další, (eds.), Genome Analysis, Vol. 2: Detecting Genes (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1998), Dracopoli a další (eds.) Current Protocols in Human Genetics (John Wiley a synové 1998) a Richards a Ward „Molecular Diagnostric Testing“ v Principles of Molecular Medicíně, strany 83 - 88 (Humana Press, Inc. 1998). Přímá analýza mutace genu pro zalphal 1 Ligand může být provedena pomocí genomové DNA subjektu. Postupy pro amplifikaci genomové DNA, získané například z periferních krevních lymfocytů, jsou dobře známy odborníkům v oboru, (viz například, Dracopoli a další (eds.) Currenet Protocols in Human Genetics,

Ί 1 r «X Η 1 -7 Z1~L« mnow

OH t i t * tV O-í- G I ^Vllll TT livj £1 DJIIUVV, k S SVJJ.

Pozice intronů v genu pro zalphal 1 Ligand byla určena pomocí identifikace genomových klonů, následnou sekvenací oblastí styku intron/exon. První intron leží mezi aminokyselinovými zbytky 56(Leu) a zbytkem 57(VaI) v SEKV.ID.Č:2 a má délku 115 párů bází. Druhý intron je největší, má 4,4 kilobází a leží mezi aminokyselinovým zbytkem 68(Glu) a zbytkem 69(Thr) v SEKV.ID.Č:2. Třetí intron má velikost 2,6 kilobází a leží mezi aminokyselinovými zbytky 120(Leu) a zbytkem 121 (Thr) v SEKV.ID.Č:2. Poslední intron, mající velikost 89 párů bází, leží mezi aminokyselinovým zbytkem 146 (Lys) a zbytkem 147(Met) v SEKV.ID.Č:2. Kompletní gen zahrnuje asi 8kb.

Struktura genu pro zalphal 1 Ligand je podobná genu pro IL-2 (Fujima a další, Proč. Nati. Acad. Sci 80: 7437-7441, 1983), ačkoli gen pro zalphal 1 Ligand obsahuje jeden dodatečný intron (intron 4). Schéma pro krátký první intron a dlouhý druhý intron a třetí intron vykazuje konzervováno st mezi těmito dvěma geny, ačkoli gen pro IL-2 je v celku mírně menší (okolo 6kb). Gen pro 11-15, na jedné straně se skládá z osmi exonů a zaujímá rozsah nejméně 34 kb (Anderson a další, Genomics 25: 701-706, 1995). Z toho vyplývá, že gen pro zalphal ILigand je podobnější strukturou genu pro IL-2 než genu pro IL-15.

Izolované molekuly nukleové kyseliny pro zalphal 1 Ligand mohou hybridizovat za přesné stanovených podmínek s nukleovou kyselinou mající nukleotidovou sekvenci SEKV.ID.Č: 1, s molekulami nukleové kyseliny mající nukleotidové složení od nukleotidu 47 k nukleotidu 532 v SEKV.ID.Č:!, nebo s nukleovou kyselinou mající nukleotidovou sekvenci komplementární k SEKV.ID.Č:!. Obecně se striktní podmínky volí tak, aby teplota byla asi o 5 °C nižší, než je teplotní bod tání (T_m) určený pro specifickou sekvenci ze definované iontové síly a pH. T_!n je teplota (za definované iontové síly a pH), při které 50 % cílové sekvence hybridizuje s perfektně sedící sondou.

Pár molekul nukleových kyselin, jako je DNA-DNA, RNA-RNA a DNA-RNA, může hybridizovat, jestliže nukleotidové sekvence mají určitý stupeň komplementarity. Hybridy mohou tolerovat sobě neodpovídající (mismatched) páry bází v dvojitém helixu, ale stabilita hybridu je ovlivněna stupněm neodpovídajících si bází. T_m těchto hybridů klesá o I °Cna každé 1 až 1.5 % nesprávného párování bází. Měnící se striktnost podmínek hybridizace dovoluje kontrolu stupně neodpovídajících si bází, které jsou přítomny v hybridu. Požadavek na stupeň striktních podmínek stoupá, jestliže teplota hybridizace stoupá a iontová síla hybridizačního pufru klesá.

- 15CZ 302921 B6

Pro odborníka v daném oboru je možné adaptovat tyto podmínky pro jakýkoli polynukleotidový hybrid. T_m pro specifickou cílovou sekvenci je teplota (za definovaných podmínek) při které je 50 % cílové sekvence hybridizováno se sondou s plně odpovídající sekvencí. Podmínky, které ovlivňují T_m zahrnují: velikost a obsah párů bází v polynukleotidové sondě, iontovou sílu hybrid izačního roztoku a přítomnost destabi li zujících komponent v hybridizačním roztoku. Je známo mnoho rovnic pro výpočet T_tn a jsou specifické pro DNA, RNA a DNA-RNA hybridy a sondy, které se skládají z polynukleotidovýeh sekvencí o různé délce (viz například Sambrook a další, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, druhé vydání (Cold Spring Harbor Press 1989); Ausubel a další, (eds.), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley a synové, io lne. 1987); Berger a Kimmel (eds.), Guide to Molecular Cloning Techniques, (Academie Press, lne. 1987); a Wetmur, Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 26:227, 1990)). Účinné prostředky pro analýzu dané sekvence a stanovení T_m založené na různě definovaných kriteriích jsou dány v softwaru pro sekvenční analýzu, jako je OLIGO 6.0 (LSR, Long Lake, MN) a Primer Premier 4.0 (Premier Biosofit International; Palo Alto, CA), dále také na internetových stránkách. Tyto programy mohou také analyzovat dané sekvence za definovaných podmínek a identifikovat vhodné sekvence sond. Typické je, že hybridizace delších polynukleotidovýeh sekvencí, více než párů bází, se provádí při teplotách o 20 až 25 °C nižších, než je vypočítaná hodnota pro T_m. Pro menší sondy, mající méně než 50 párů bází, se hybridizace provádí obvykle za teplot nižších o 5 až 10 °C než je vypočítaná T_m. Toto umožňuje maximální rychlost hybridizace pro

DNA-DNA a DNA-RNA hybridy.

Po hybridizaci se molekuly nukleové kyseliny promyjí, aby se odstranily molekuly nukleových kyselin, které nehybridizovaly za těchto striktních podmínek, či za vysoce striktních podmínek. Typické promytí za striktních podmínek zahrnuje promytí roztokem 0,5 x 2x SSC s 0,1% dodecylsulfátu sodného (SDS) při 55 až 65 °C. To znamená, že molekuly nukleové kyseliny kódující varianty polypeptidu zalphal 1 Ligandu hybridizují s molekulami nukleové kyseliny mající sekvenci nukleotidů ze SEKV.ID.Č:! (nebo k ní komplementární) za striktních promývacích podmínek, kde striktnost promytí spočívá v ekvivalentu 0,5 x - 2x SSC s 0,1 % SDS za teploty 55 až 65 °C, včetně 0,5x SSC s 0,1 % SDS při 55 °C, nebo 2x SSC s 0,1 % SDS při

65 °C. Kdokoli znalý oboru je schopen navrhnout ekvivalentní podmínky, například substituováním SSPE místo SSC v promývacím roztoku.

Typické vysoce striktní promývací podmínky zahrnují promytí v roztoku 0,lx až 0,2x SSC s 0,1 % dodecylsulfátu sodného (SDS) při 50 až 65 °C. Jinými slovy řečeno, molekuly nukleové kyseliny kódující varianty polypeptidu zalphal 1 Ligandu hybridizují s molekulami nukleové kyseliny mající sekvenci nukleotidů ze SEKV.ID.Č:! (nebo k ní komplementární) za vysoce striktních promývacích podmínek, kde striktnost promytí spočívá v ekvivalentu 0,1 x - 0,2x SSC s 0,1 % SDS za teploty 50 až 65 °C, včetně 0,lx SSC s 0,1 % SDS při 50 °C, nebo 0,2x SSC s 0,1 % SDS při 65 °C.

Vynález dále poskytuje izolovaný polypeptid zalphal 1 Ligandu, který má vysoce podobnou sekvenční identitu s polypeptidem SEKV.ID.Č:2, kde polypeptid váže zalphall receptor, jak je uveden v SEKV.ID.č.l 15. Termín „vysoce podobná sekvenční identita“ je ve vynálezu užíván k označení polypeptidu obsahujících alespoň 90%, alespoň 95% nebo 100% sekvenční identitu se sekvencí SEKV.ID,Č:2. Vynález dále poskytuje polypeptidy, které obsahují aminokyselinovou sekvenci mající alespoň 90% nebo alespoň 95% sekvenční identitu se sekvencí aminokyselinových zbytků 32 až 162 v SEKV.ID.Č:2, kde polypeptid váže zalphal 1 receptor, jak je uveden v SEKV.ID.č.l 15. Vynález dále zahrnuje molekuly nukleové kyseliny, které kódují tento polypeptid. Způsoby určení procentuálních hodnot identity jsou popsány níže.

Varianty nukleové kyseliny pro zalphal 1 Ligand, mohou být identifikovány pomocí dvou kriterií: určením podobnosti mezi kódovaným polypeptidem s aminokyselinovou sekvencí SEKV.ID.Č: 2 a/nebo pomocí hybrid izačního testu, tak jak bylo popsáno výše. Takovéto varianty zalphall Ligandu zahrnují molekuly nukleové kyseliny: (1) které hybridizují s molekulou nukleové kyseliny mající sekvenci nukleotidů SEKV.ID.č.l (nebo komplementární) za striktních

-16CZ 302921 B6 podmínek promývání, v nichž je striktnost podmínek dána užitím 0,5 x - 2 x SSC s 0,1 % SDS za teploty 55 až 65 °C; nebo (2) kódující polypeptid vykazující alespoň 70%, nebo alespoň 80%, či 90% a ve výhodném provedení více než 95% sekvenční identitu se sekvencí aminokyselinových zbytků v SEKV.ID.Č:2. Alternativně mohou být varianty zalphal 1 Ligandu charakterizovány s jako molekuly nukleové kyseliny (1) které hybridizují s molekulou nukleové kyseliny mající sekvenci nukleotidů ze SEKV.ID.č:l (nebo k ní komplementární) za vysoce striktních promývacích podmínek, kde striktnost promytí spočívá v ekvivalentu 0,1 x - 0,2x SSC s 0,1 % SDS za teploty 50 až 65 °C; (2) kódují polypeptid, který vykazuje alespoň 70%, nebo alespoň 80%, či

90%, či 95% a ve výhodném provedení více než 95% sekvenční identitu se sekvencí amino10 kyselinových zbytků v SEKV.ID.Č:2.

Procentuální hodnoty identity se určují pomocí konvenčních metod. Viz například, Altschul a další. Bull. Math. Bio. 48:603 (1986) a Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992). Ve zkratce, dvě aminokyselinové sekvence jsou porovnány a je optimalizováno is přiřazení 10 trestných bodů za vznik mezery a 1 trestného bodu za prodloužení mezery a

BLOSUM62 výpočetních matic podle Henikoff a Henikoff (viz výše), jak je znázorněno v tabulce 4 (aminokyseliny jsou označeny pomocí standardního jednopísmenných kódů).

Tabulka 4

	A	R	N	D	C	Q	E	G	H	I	L	K	M	F	P	S	T	w
A	4
R	-1	5
N	-2	0	6
D	-2	-2	1	6
C	0	-3	-3	-3	9
Q	-1	1	0	0	-3	S
E	-1	0	0	2	-4	2	5
G	0	-2	0	-1	-3	-2	-2	6
H	-2	0	1	-1	-3	0	0	-2	8
I	-1	-3	-3	-3	-1	-3	-3	-4	-3	4
L	-1	-2	-3	’4	-1	-2	-3	-4	-3	2	4
K	-1	2	0	-1	-3	1	1	-2	-1	-3	-2	5
M	-1	-1	-2	-3	-1	0	-2	-3	-2	1	2	-1	5
F	-2	-3	-3	-3	-2	-3	-3	-3	-1	0	0	-3	0	6
P	-1	-2	-2	-1	-3	-1	-1	-2	-2	-3	-3	-1	-2	-4	7
S	1	-1	1	0	-1	0	0	0	-1	-2	-2	0	-1	-2	-1	4
T	0	-1	0	-1	-1	-1	-1		-2	-1	-1	-1	-1	-2	-1	1	5
w	-3	-3	-4	-4	-2	-2	-3	-2	-2	-3	-2	-3	-1	1	-4	-3	-2	11
Y	-2	-2	-2	-3	-2	-1	*2	-3	2	-1	-1	-2	-1	3	-3	-2	-2	2
v	0	-3	-3	-3	-1	-2	-2	-3	-3	3	1	-2	1	-1	-2	-2	0	-3

Celkový počet identických přiřazení x 100 (délka delší sekvence + počet mezer zavedených do delší sekvence za účelem porovnání těchto dvou sekvencí)

- 17CZ 302921 B6

Odborníci z oboru vědí, že existuje mnoho algoritmů k porovnání dvou aminokyselinových sekvencí. Algoritmus hledající podobnosti „FASTA“ od Pearsona Lipmana je jedním z vhodných prostředků k porovnání úrovně identity sdílené aminokyselinovými sekvencemi uvedenými v patentu a aminokyselinovými sekvencemi domnělých sekvenčních variant zalphal 1 Ligandu.

Algoritmus FASTA je popsán v Pearson a Lipman, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988) a v Pearson, Meth. Enzymol 183:63 (1990).

Ve zkratce se dá FASTA charakterizovat takto: nejprve se charakterizují podobnosti sekvence pomocí identifikace oblastí sdílených s ověřenou sekvencí (to je SEKV.1D.Č:2) a testovanou io sekvencí, která má buď nejvyšší hustotu identit (jestliže ktup proměnná je 1) nebo párů identit (jestliže ktup = 2) bez toho, že by se braly do úvahy konzervované aminokyselinové substituce, inserce nebo delece. Deset oblastí s nejvyšší hustotou identit je potom započítáno pomocí porovnání podobností všech párových aminokyselin pomocí substituční matrice pro aminokyseliny a konce oblastí jsou upraveny tak, aby zahrnovaly pouze ty zbytky, které přispívají k nejvyššímu skóre. Jestliže zde je několik oblastí se skóre vyšším než hraniční hodnota (počítaná pomocí předem daného vzorce založeného na délce sekvence a hodnotě ktup), potom upravené počáteční oblasti jsou prozkoumány, zda mohou být použity pro aproximační porovnání s mezerami. Nakonec, oblasti s nejvyšším skóre oblastí patřících do dvou aminokyselinových sekvencí jsou porovnány pomocí modifikace Needleman-Wunsch-Sellersova algoritmu (Needleman a Wunsch, J. Mol. Biol. 48:444 (1970; Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787, 1974), který umožňuje vzít do úvahu aminokyselinové inserce a delece. Preferované parametry pro FASTA analýzu jsou: ktup = 1, trestné body pro zavedení mezery = 10, trestné body pro zvětšení mezery = 1 a substituční matice ~ BLOSUM62. Tyto parametry mohou být zavedeny do FASTA programu pomocí modifikace souboru pro výpočetní matici (SMATRIX), jak je vysvětleno v Dodatku 2 od Pearsona, Meth. Enzymol. 183:63 (1990).

FASTA lze využít také pro určení sekvenční identity molekul nukleových kyselin pomocí výpočtu popsaného výše. Pro porovnání sekvencí nukleových kyselin se pohybují hodnoty pro ktup v oblasti od 1 do 6, výhodně však od 3 do 6, v nej výhodnějším uspořádání je hodnota 3, další parametry dosahují již dříve uvedených hodnot.

Varianty polypeptidů zalphal 1 Ligandu nebo polypeptidů s výrazně podobnou sekvenční identitou jsou charakterizovány tak, že mají jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí. Tyto změny jsou ve výhodném uspořádání menšího významu, jako jsou konzervo35 vane substituce aminokyselin (viz tabulka 5) a další substituce, které neovlivňují významně skladbu nebo aktivitu polypeptidu; malé delece, typicky od jednoho do 30 aminokyselinových zbytků; malé amino-či karboxyl-terminální extense, jako je aminokoncový zbytek methioninu, krátký spojovací peptid do 20 až 25 aminokyselinových zbytků, nebo afinitní značka. Vynález tak zahrnuje polypeptidy, které zahrnují sekvence, které jsou alespoň z 90%, alespoň z 95 % identické s odpovídající oblastí SEKV.ID.C:2, kde polypeptid váže zalphal Ireceptor, jak je uveden v SEKV.ID.Č:! 15. Polypeptidy obsahující afinitní značku mohou dále obsahovat proteolytické štěpné místo mezí polypeptidem zalphal 1 Ligandu a afinitní značkou. Tato místa obsahují štěpná místa pro trombin a faktor Xa.

- 18CZ 302921 B6

Tabulka 5

Konzervativní substituce aminokyselin

Bazické	arginin
	lysin
	histidin
Kyselé	kyselina glutamová
	kyselina asparagová
Polární	glutamin
	asparagin
Hydrofobní	leucin
	isoleucin
	valin
	fenylalanin
	tryptoťan
	tyrosin
Malé	glycin
	alanin
	šeřin
	threonin
	methionin

Určení aminokyselinových zbytků, které jsou obsaženy v doméně nebo oblasti je kritickým krokem pro určení strukturní identity. V těchto oblastech lze detekovat specifické zbytky, které mohou být více či méně tolerantní ke změně a pomáhají udržet terciární strukturu molekuly. Postupy analýzy struktury sekvence zahrnují mimo jiné například následující přístupy: porovnání několika aminokyselinových sekvencí se sekvencemi aminokyselinovými, ěi nukleotidovými, io s vysokou identitou, nebo určenou sekundární strukturou, s binárními modely, komplementárními sekvencemi a lze určit i skryté polární interakce (Bartoň, Current. Opin. Struct. Biol. 5:372-376, 1995 a Cordes a další, Current, Opin. Struct. Biol. 6:3-10, 1996). Obecně lze shrnout, navrhujeme-li modifikace molekul nebo identifikujeme-li strukturu specifických fragmentů, je to vždy spojeno s hodnocením aktivity dané molekuly.

V zalphal 1 Ligandu byly provedeny změny aminokyselinové sekvence z důvodu minimalizace nestability struktur vyšších řádů, které jsou nezbytné pro udržení biologické aktivity. Například, obsahuje-li zalphal 1 Ligand jeden či více heiixů, změny v aminokyselinovém složení musí být provedeny tak, aby nedošlo k porušení geometrie heiixů a dalších komponent molekuly, kdy změny konformace by mohly zmírnit některé kritické funkce, například, vazbu molekuly k jejímu vazebnému partnerovi, to znamená AaD helixy, zbytky 44, 47 a 135 v SEKV.ID.Č:2. Vliv změn aminokyselinového složení může být predpovězen, například na základě počítačového modelování, jak bylo popsáno výše, nebo určeno pomocí analýzy krystalové struktury (viz, například Lapthom a další, Nat. Struct. Biol. 2: 266-268, 1995). Odborníkům v oboru jsou známy také další techniky, například porovnání skládání různých proteinů se standardní molekulou (to znamená nativním proteinem). Například, může být provedeno srovnání strukturní šablony pro cystein ve variantě a standardních molekulách. Pomocí hmotnostní spektroskopie a chemických

- 19 CZ 302921 B6 modifikací za užití redukčních a alkylačních činidel lze určit cysteinové zbytky, které se podílejí na tvorbě disulfidových můstku a které se těchto interakcí neúčastní (Beán a další, Anal. Biochem 20) :216 226, 1992); Cray, Protein Sci 2:1732-1748, 1993; Patterson adalší, Anal. Chem. 66:3727-3732, 1994). Obecně se předpokládá, že jestliže modifikovaná molekula nesplňuje tutéž strukturní šablonu pro cysteinové zbytky, jako molekula standardní, bude ovlivněno poskládání molekuly. Další velmi dobře známou a užívanou metodou je měření poskládání molekuly pomocí cirkulárního dichroismu (CD). Měření a porovnání CD spekter u modifikované a standardní molekuly je rutinní záležitost (Johnson, Proteins 7:205-214, 1990). Krystalografie je dalším velmi užívaným postupem pro analýzu skládání a struktury. Nukleární magnetická resonance (NMR), štěpení vedoucí k peptidovým mapám a mapování epitopújsou také známé postupy užívané při analýze skládání a odhalení strukturních podobností mezi proteiny a polypeptidy (Schaanan a další, Science 257:961-964, 1992).

Byl generován Hopp/Woodsův profil hydro fobieity proteinové sekvence zobrazené v SEKV.ID.Č:2 zalphal 1 Ligandu (Hoop a další, Proč. Nati. Acad. Sci. 78:3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 a Triquier a další, Protein Engineering 11:153-169, 1998). Prolil je založen na analýze okna se šesti zbytky. Skryté zbytky G, S a T a odkryté zbytky Η, Y a W jsou ignorovány. Například, v zalphal 1 Ligandu hydrofilní oblast zahrnuje aminokyselinové zbytky 114-119 v SEKV.ID.Č:2, aminokyselinové zbytky 101-105 v SEKV.ID.Č:2, aminokyselinové zbytky 126-131 v SEKV.ID.Č:2, aminokyselinové zbytky 1013-118 v SEKV.ID.Č :2 a aminokyselinové zbytky 158-162 v SEKV.ID.Č:2.

Odborníci daného oboru si uvědomují, že hydrofilita nebo hydrofobicita musela být vzata do úvahy pří návrhu modifikací aminokyselinové sekvence peptidu zalphal 1 Ligandu, aby nedošlo k porušení celého strukturního a biologického profilu molekuly. Zvláštní důraz byl položen na záměnu hydrofobních zbytků vybraných ze skupiny Val, Leu a Ile nebo skupiny sestávající z Met, Gly, Ser, Aia, Tyr a Trp. Například zbytky, které jsou tolerantní k substituci, jsou zbytky 100 až 103, jak je ukázáno v SEKV.ID.Č:2. Cysteinové zbytky v pozicích 71, 78, 122 a 125 v SEKV.ID.Č:?, mohou být relativně intolerantní k substituci.

Identity esenciálních aminokyselin lze odvodit také na základě podobnosti mezi IL-15, IL-2, IL—4 a GM-CSF se zalphal 1 Ligandem. Pomocí analýzy algoritmem FASTA, který byl popsán dříve, jsou identifikovány oblasti s vysokou podobností s rodinou uvedených proteinů a to lze využít pro analýzu sekvencí v konzervovaných oblastech. Další alternativou je identifikace variant polynukleotidového složení zalphal 1 Ligandu na bázi strukturní podobnosti se určí, zda nukleová kyselina kóduje potenciální variantu zalphal I Ligandu a zda tato varianta genu může hybridizovat s nukleovou kyselinou mající sekvenci SEKV.ID.Č: I, tak jak bylo uvedeno výše.

Další postupy identifikace esenciálních aminokyselinových zbytků v polypeptidů podle vynálezu zahrnují postupy, které jsou obecně známé odborníkům daného oboru, jsou to místně specifická mutagenese nebo alanin- vyhledávající mutagenese (Cunningham a Wells, Science 244:1081, 1989; Bass a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:4498, 1991; Coombs a Correy, „Site-Direceted Mutagenesis and Protein Engineering“ v Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), strany 259-311 (Academie Press, lne. 1998)). V poslední zmíněné technice, jsou zaváděny jednotlivé alaninové mutace za každý aminokyselinový zbytek v molekule a výsledná mutovaná molekula se testuje na biologickou či biochemickou aktivitu, jak je uvedeno níže. Tím se identifikují aminokyselinové zbytky nutné pro zachování aktivity molekuly Viz také, Hilton a další, J. Biol. Chem, 27:4699 (1996).

Existují polypeptidy odpovídající funkčním fragmentům zalphal 1 Ligandu a nukleové kyseliny tyto fragmenty kódující „Funkční fragment zalphal l Ligandu který je definován ve vynálezu je charakterizován svou proliferativní či diferenciační aktivitou, svou schopností indukovat či inhibovat specializované buněčné funkce, nebo svou schopností vázat specificky protilátku proti zalphal ILigandu, nebo receptor zalphal 1. (a to jak solubilizovaný, tak imobilizovaný). Jak bylo již dříve uvedeno zalphal 1 Ligand je charakterizován tetrahelixovou strukturou obsahujících

-20CZ 302921 B6 helix A (aminokyselinové zbytky 41-56) a helix B (aminokyselinové zbytky 69-84), helix C (aminokyselinové zbytky 92-105) a helix D (aminokyselinové zbytky 135-148), jak je ukázáno v SEKV.ID.Č:2. Takže fúzní proteiny mohou obsahovat: (a) polypeptidové molekuly obsahující jeden nebo více helixů, popsaných výše; (b) funkční fragmenty obsahující jeden nebo více helixů popsaných výše. Další součásti polypeptidové molekuly mohou být příspěvkem jiné tetrahelixové svazkové struktury cytokinů, jako je IL—15, IL-2, IL--4 a GM-CSF, nebo nenativního donoru a/nebo ne příbuzného sekrečního signálního peptid u, který usnadní sekreci fúzního proteinu.

Tedy fúzní proteiny mohou obsahovat alespoň čtyři polypeptidy, kde poradí polypeptidů od ίο N- konce k C-konci je: první polypeptid obsahující aminokyseliny vybrané ze skupiny: (a) IL-2 helix A - aminokyselinové zbytky 36-46 v SEKV.ID.Č:111; (b) IL—15 helix A - aminokyselinové zbytky 29^43 v SEKV.ID.Č: l 12; (c) IL-4 helix A - aminokyselinové zbytky 45-68 v SEKV.ID.Č:! 13; (d) GMCSF helix A - aminokyselinové zbytky 30-44 v SEKV.ID.Č: 114; a(e) aminokyselinové zbytky 41-56 v SEKV.ID.Č:2; první spacer velký 6-27 amino15 kyselinových zbytků a druhý polypeptid, který obsahuje aminokyselinové zbytky vybrané ze skupiny obsahující: (a) IL-2 helix B - aminokyselinové zbytky 53-75 v SEKV.ID.Č: 111; (b) IL-4 helix B - aminokyselinové zbytky 65-83 v SEKV.1D.Č.T 12; (c) IL—15 helix B - aminokyselinové zbytky 72-81 v SEKV.ID.Č:113; (d) GMCSF helix B - aminokyselinové zbytky /z—ňl v ĎC.K.V .iv.v: i in·; a aiiiiiiúkyšeíiiiúve zbytky 64—84 v SEKV,1D.Č:2; druhy spojovací peptid velký 5-11 aminokyselinových zbytků a třetí polypeptid, který obsahuje sekvence aminokyselinových zbytků vybrané ze skupiny obsahující: (a) IL-2 helix B - aminokyselinové zbytky 87-99 v SEKV.ID.Č: 111; (b) IL-4 helix C - aminokyselinové zbytky 95-118 v SEKV.ID.Č: 112; (c) IL—15 helix C - aminokyselinové zbytky 107-119 v SEKV.ID.Č:113; (d) GMCSF helix C aminokyselinové zbytky 91-102 v SEKV.ID.Č:114; a(e) aminokyselinové zbytky 92-105 v SEKV.ID.Č:2; třetí spojovací peptid velký 3-29 aminokyselinových zbytků a čtvrtý polypeptid, který obsahuje aminokyselinové zbytky vybrané ze skupiny obsahující: (a) IL-2 helix D aminokyselinové zbytky 103-121 v SEKV.ID.Č:111; (b) IL-15 helix D - aminokyselinové zbytky 134-157 v SEKV.ID.Č:! 12; (c) IL 4 helix D - aminokyselinové zbytky 134-160 v SEKV.ID.Č: 113; (d) GMCSF helix D- aminokyselinové zbytky 120-131 v SEKV.ID.Č: 114; a jo (e) aminokyselinové zbytky 135-148 v SEKV.ID.Č:2; kde alespoň jeden ze čtyř peptidů je z zalphal 1 Ligandu. Ve výhodném provedení jsou spojovací peptidy vybrány ze skupiny A/B, B/C nebo C/D smyček zalphall Ligandu, nebo IL-2, II—L IL-15 nebo GM-CSF, jak ukazuje tabulka 1.

Byla provedena rutinní deleční analýza molekul nukleových kyselin, čímž byly získány fragmenty nukleových kyselin kódujících polypeptid pro zalphal 1 Ligand. Pro ilustraci, molekula DNA mající nukleotidovou sekvenci SEKV.ID.Č:! nebo její fragmenty, mohou být štěpeny nukleázou Bal31, čímž se získala série detecí. Tyto DNA fragmenty byly poté vloženy do expresních vektorů v řádném čtecím rámci a exprimované polypeptidy byly vyizolovány a následně testová40 ny na aktivitu zalphal 1 Ligandu, nebo na schopnost vázat protilátku generovanou proti zalphal 1 Ligandu nebo reagovat se zalphall receptorem. Alternativou k exonukleázovému štěpení je použití na oligonukleotidy zaměřené mutageneze, čímž lze zavést delece či stop kodóny, a tak specifikovat produkci žádaného zalphal 1 Ligandu, který se potom syntetizuje pomocí PCR.

Odborníkům v daném oboru jsou dobře známy standardní metody pro identifikaci funkčních domén. Například to jsou studie zkrácených variant, a to na jednom či na obou koncích interferonů, které jsou shrnuty Horisbergerem a Di Marcem v Pharmac. Ther. 66:507 (1995). Další standardní techniky používané ve funkční analýze proteinů jsou uvedeny například vTreuter adalší, Molec. Gen, Genet. 240:113 (1993); Content a další, „Expression and preliminary deletion analysis of 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon, v Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting of Intereferon Systems, Cantell (ed.), strany 65-72 (Nijhoff 1987); Hershmann „The EGF Receptor“ vControl of Animal Cell Proliferation 1, Boynton a další, (eds.), strany 169-199 (Academie Press 1985); Coumailleau adalší, J. Biol. Chem. 270:29270 (1995); Fukunaga a další, J. Biol. Chem. 270:25291 (1995);

-21 CZ 302921 B6

Yamaguchi a další, Biochem. Pharmacol. 50:1295 (1995) a Meisel a další, Plant Molec. Biol. 30:1 (1996).

Byly provedeny vícenásobné substituce aminokyselinových zbytků a vzniklé produkty byly testovány mutagenizací a dalšími postupy, jako jsou například Reidhaar-Olson a Sauer Science 241: 53(1988) nebo Bowie a Sauer Proe. Nati. Acad. Sci USA 86: 2152 (1989). Ve zkratce, tito autoři vytvořily postupy pro simultánní randomizaci dvou čí více pozic v polypeptidu, selekci funkčních polypeptidů a potom sekvenaci mutagenizovaných polypeptidů, čímž zjistili spektrum možných substitucí na každé pozici. Další postupy, které lze použít, jsou například phage display io (viz Lowman a další, Biochem. 30:10832 (1991); Ladner a další, patent US 5 223409; Huse, mezinárodní publikace WO 92/06 204 a mutageneze oblastné směrovaná (Derbyshire a další,

Gene 46: 145 (1986) a Ner a další, DN A 7:127, 1988).

Varianty uvedených nukleotidových a aminokyselinových sekvencí pro zalphal 1 Ligand mohou být také generovány pomocí postupu „DNA shuffling— zpřeházení“, který je popsán Stemmerem, Nátuře 370: 389(1994), Stemmer, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 10747 (1994) a v mezinárodní publikaci WO 97/20 078. Stručně popsáno, molekuly DNA pro různé varianty se generují in vitro pomocí homologní rekombinaee s náhodnou fragmentací rodičovských DNA, potom následuje znovus ložení pomocí PCR, což má za výsledek náhodně zavedené bodové mutace. Tato technika může být modifikována pomocí užití rodičovských DNA patřících do jedné rodiny, jako jsou alelieké varianty nebo DNA molekuly z různých druhů, čímž se do tohoto procesu zavedou další proměnné. Selekce či průzkum na přítomnost požadované aktivity, následovaný přidanými opakováními mutagen i zace a testy, poskytují dohromady postup pro žádanou rychlou „evoluci“ sekvencí s požadovanými mutacemi, simultánně selektovanými proti škodlivým změnám.

Postupy mutagenizace uvedené ve vynálezu se mohou kombinovat s vysoce průkaznými automatizovanými postupy pomocí nichž lze určit aktivitu klonovaného mutagenně změněného polypeptidu v hostitelské buňce. Mutované molekuly DNA, které kódují biologicky aktivní polypeptidy, nebo polypeptidy, které se váží s protilátkou proti zalphal 1 Ligandu, nebo se vážou na rozpustný zalphal 1 receptor, mohou být pomocí moderního vybavení z hostitelských buněk získány a rychle sekvenovány. Tyto postupy umožňují rychlé určení důležitosti jednotlivých aminokyselinových zbytků v žádaném polypeptidu a mohou být aplikovány na polypeptidy o neznámé struktuře.

Navíc, proteiny podle vynálezu (nebo jejich polypeptidové fragmenty) se mohou spojit s další bioaktivní molekulou, zvláště jiným cytokinem, čímž vytvoří multifunkční molekuly. Například, jeden nebo více helixů ze zalphal 1 Ligandu může být spojeno s dalším cytokinem, čímž se zesílí jejich biologické vlastnosti nebo účinnost produkce.

Série nových hybridních molekul, ve kterých segment obsahuje jeden nebo více helixů zalphal 1 Ligandu fúzovaných k dalšímu polypeptidu může být připravena. Fúze může být prováděna na úrovni DNA, což umožňuje expresí chímémích molekul v rekombinantních produkčních systémech. Vzniklé molekuly mohou být potom testovány na takové vlastnosti, jako jsou zlepšená rozpustnost, vylepšená stabilita, prodloužený poločas vylučování, vylepšená expresní a sekreční hladina a farmakodynamika. Takovéto hybridní molekuly mohou dále obsahovat dodatečné aminokyselinové zbytky (to znamená polypeptidové linkety (spojovníky) mezi komponentami proteinu nebo polypeptidu.

Aminokyseliny, které se nevyskytují přirozeně, bez omezení, zahrnují trans-3-methvlprolin,

2,4-methanoprolin, cis-4-hydroxyprolin, trans-Λ-hydroxyprolin, /V-methylglycin, cz//a-threonin, methylthreonin, hydroxyethylcystein, hydroxyethylhomocystein, nitroglutamin, homoglutamin, kyselinu pipekolovou, kyselinu thiazolidinkarboxylovou, dehydroprolin, 3- a 4methylprolin, 3,3-dimethylprolín, /erc-leucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4azafenylalanin a 4—fluorofenylalanin. Je popsáno mnoho metod, kterými lze nepřirozeně se vyskytující aminokyseliny zabudovat do proteinů. Například, lze použít in vitro systém, kde jsou

-22CZ 302921 B6 potlačeny nonsense mutace pomocí chemicky aminoacylováných supresorových tRNA. Postupy syntézy aminokyselin a aminoacylovaných tRNA jsou obecně známé. Transkripce a translace piazmidů obsahujících nonsense mutace se provádí v bezbuněčném systému obsahujícím extrakt z E.coli S30 a pomocí komerčně dostupných enzymů a dalších reagencií. Proteiny se purifikují chromatografii. Pro podrobnosti se lze podívat do Robertson a další, J, Am. Chem. Soc., 113:2722 (1991); Chung a další, Science 259:806 (1993); a Chung a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 10145(1993).

V druhém používaném postupu se translace provádí v oocytech zXenopus mikroinjekcí io mutované mRNA a chemicky aminoacylovaných supresorových tRNA (Turcatti a další, J. Biol.

Chem. 271:1991, 1996). Ve třetím postupu se buňky E.coli pěstují za nepřítomnosti přirozených aminokyselin, které jsou nahrazeny (například fenylalanin) a v přítomnosti požadovaných nepřirozeně se vyskytujících aminokyselin (to znamená například 2-azafenylalaninu, 3-azafenylalaninu, 4-azafenylalaninu a 4~fluorfenylalaninu), kdy se nepřirozeně se vyskytující amino15 kyseliny zabudují do proteinu na místo svých přirozených protějšků. Viz Koide a další, Biochem. 33:7470, 1994). Přirozeně se vyskytující aminokyseliny se mohou změnit na nepřirozené se vyskytující aminokyseliny chemickou modifikací in vitro. Chemickou modifikaci lze kombinovat s místně specifickou mutagenezí, čímž se dále rozšíří oblast substitucí (Wynn a Richards, Protein Sci. 2:395, 1993).

Mohlo by být výhodné, stabilizovat zalphal 1 Ligand prodloužením poločasu rozpadu molekuly, zvláště pak prodloužit metabolickou persistenci molekuly v aktivním stavu. K dosažení prodloužení poločasu životnosti molekuly zalphal 1 Ligandu se může molekula chemicky modifikovat pomocí postupů už zde popsaných. Běžně užívaným postupem je PEGylace, která se projevuje zvýšením poločasu rozpadu plazmy, zvýšení rozpustnosti a snížení antigenicity a imunogen icity (Nucci a další, Advanced Drug Delivery Reviews 6:133-155, 1991; a Lu a další, Int. J. Peptide Protein Res. 43:127- 138, 1994).

Omezený počet nekonzervativních aminokyselin, aminokyselin, které nejsou kódovány geneticko kým kódem, nepřirozeně se vyskytujících aminokyselin a nepřirozených aminokyselin může být substituován do aminokyselinových zbytků v zalphal 1 Ligandu.

Polypeptidové fragmenty nebo peptidy mohou obsahovat část nesoucí epitop zalphal 1 Ligandu, která byla popsána dříve. Takovéto fragmenty nebo peptidy obsahují „imunogenní epitop“, který je částí proteinu, který vyvolává anti gen ní odpověď, je-li uvažovaný protein použit jako imunogen. Imunogenní peptidy nesoucí epitopy mohou být identifikovány pomocí standardních pokusů (viz například Geysen a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:3998, 1983).

Naopak, polypeptidové fragmenty a peptidy mohou obsahovat „anti gen ní epitop“, což je oblast proteinové molekuly, ke které se může specificky vázat protilátka. Určité epitopy sestávají z lineární nebo kontinuální rady aminokyselin, antigenicita takovýchto epítopů není zasažena denaturačními činidly. Je známo, že lze použít krátké syntetické peptidy, které napodobují epitopy přítomné v proteinu a že se jejich pomocí dá stimulovat produkce protilátek (viz, například Sutcliffe a další, 219:660, 1983). Podle tohoto závěru jsou peptidy a polypeptidy nesoucí antigenní epitopy podle vynálezu schopné vyvolat tvorbu protilátek, které jsou schopné se vázat na polypeptidy výše popsané. Pomocí metody určení Hopp/Woodsových hydrofilních profilů mohou být určeny oblasti, které vykazují nejvyšší antigenní potenciál (Hoop a další, 1981, již citováno a Hopp, 1986, již citováno). V zalphal 1 Ligandu tyto oblasti zahrnují: aminokyselinové zbytky 114—119, 101-105, 126-131, 113-118 a 158-162 v SEKV.ID.Č:2.

Peptidy a polypeptidy nesoucí epitopy mohou obsahovat alespoň 4 až 6 aminokyselin, alespoň 10 až 14 aminokyselin, nebo kolem 14 až 30 aminokyselin podle SEKV.ID.Č:2 nebo SEKV.ID.Č:56. Takovéto peptidy a polypeptidy nesoucí epitopy lze připravit pomocí fragmentace polypeptidů zalphal 1 Ligandu, nebo chemickou syntézou peptidů, tak jak bylo již uvedeno.

Co více, epitopy se mohou vybrat pomocí phage display nebo náhodné peptidové knihovny (viz

-23 CZ 302921 B6 například Lané a Stephen, Curr. Opin. Immunol 5: 268,1993; Cortese a další, Curr. Opin. Biotechnol 7:616, 1996). Postupy pro identifikaci epitopů a produkci protilátek proti malým peptidům, které obsahují epitop jsou popsány například v: Mole, „Epítope Mapping”, v Methods in Molecular Biology, svazek 10, Manson (ed.), strany 105-1116 (Humana Press, lne. 1992;

Price, „Production and Charaeterization of Synthetic Peptide-Derivcd Antibodies“ v Monoclonal Antibodies: Production, Enginnering and, Clinical Application, Ritter a Ladyman (eds.), strany 60-84 (Cambridge University Press 1995) a Coligan a další (eds.), Current Protocols in Immunology, strany 9.3.1.-9.3.5. a strany 9.4.1.-9.4.11 (John Wiley a synové 1997).

io Bez ohledu na konkrétní nukleotidovou sekvenci polynukleotidů zalphal 1 Ligandu tento polynukleotid kóduje polypeptid, který je charakterizován proliferační nebo diferenciální aktivitou, svou schopností indukovat nebo inhibovat specializované buněčné funkce, nebo schopností vázat specificky protilátku proti zalphal 1 Ligandu nebo zalphal 1 receptor. Varianty polynukleotidů zalphal 1 Ligandu mohou kódovat polypeptidy, které vykazují alespoň 50 % a výhodněji více než

70%, 80% nebo 90% aktivitu polypeptidů znázorněného SEKV.ID.Č: 2.

Pro všechny polypeptidy zalphal 1 Ligandu, včetně variant a fúzních proteinů, si může každý odborník daného oboru odvodit plně degenerované sekvence kódující varianty pomocí údajů uvedených v tabulce 1 a 2.

Existují varianty polypeptidových fúzí (a příbuzných multimemích proteinů obsahující jeden nebo více fúzních polypeptidů). Například, polypeptid zalphal 1 Ligandu může být připraven jako fúzní protein dimerizací s proteinem, jak je popsáno v patentech US 5 155 027 a 5 567 584. Preferovaný protein pro dimerizací zahrnuje v tomto případě konstantní oblast imunoglobulino25 vých domén. Fúzní polypeptid obsahující ímunoglobulin-zalphal 1 Ligand může být exprimován v geneticky pozměněných buňkách (aby produkoval varianty multimemích analogů zalphal 1 Ligandu). Pomocné domény mohou být fúzovány k polypeptidů zalphal 1 Ligandu, aby ho nasměrovaly do specifických buněk, tkání nebo makromolekul. Například, polypeptid nebo protein zalphal 1 Ligandu může být nasměrován do předem určeného typu buněk pomocí fúze polypeptidů pro zalphal 1 Ligand s ligandem, který se specificky váže na receptor, který je součástí povrchu cílové buňky. Tímto způsobem se dají polypeptidy a proteiny upravit pro terapeutické nebo diagnostické účely. Polypeptid zalphal 1 Ligandu může být fúzován se dvěma nebo více částmi, jako je afínitní značka pro purifikací a cílovou doménu. Polypeptidové fúze mohou obsahovat jedno nebo více štěpných míst, zvláště pak mezi doménami (viz, Tuan a další,

Connective Tissue Research 34: 1-9, 1996).

Použitím zde uvedených postupů, každý odborník může identifikovat a/nebo připravit varianty polypeptidů, které mají vysokou identitu se sekvencí zbytků 32 až 162 v SEKV.ID.Č;2, nebo funkční fragmenty a jejich fúze, kde takovéto polypeptidy nebo fragmenty nebo fúze si zachová40 vají vlastnosti divokého typu proteinu, jako je schopnost stimulovat proliferaci, diferenciaci, indukovat specializované funkce buněk nebo vazbu zalphal 1 receptorů nebo protilátek proti zalphal 1 Ligandu.

Polypeptidy zalphal 1 Ligandu podle vynálezu mohou být produkovány v geneticky modifiko45 váných hostitelských buňkách pomocí konvenčních technik. Vhodné hostitelské buňky jsou ty typy buněk, které mohou být transformovány nebo transfekovány exogenní DNA a mohou růst v kultuře. Do této skupiny patří bakterie, buňky hub a kultivované buňky vyšších eukaryot. Jsou preferovány eukaryotické buňky, zvláště pak kultivované buňky mnohobuněčných organismů. Techniky manipulace s klonovanými molekulami DNA a zavedení exogenní DNA do různých hostitelských buněk je popsáno Sambrookem a dalšími, Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2. Vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 a Ausubel a další, eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley a synové, lne. NY, 1987.

-24CZ 302921 Β6

Obecně, DNA sekvence kódující polypeptid zalphall Ligandu je funkčně spojena sdalšími genetickými elementy nutnými pro jeho expresi, zahrnuje transkripční promotor a terminátor v expresním vektoru. Vektor obvykle obsahuje jeden nebo více selektivních markérů a jeden nebo více počátků replikace, ačkoli odborníci z daného oboru vědí, že určité systémové selektivní markéry mohou být připraveny pomocí separátních vektorů a replikace exogenních DNA může být provedena integrací do genomu hostitelské buňky. Výběr promotorů, terminátorů, selekčních markérů, vektorů a dalších elementů je věcí rutinní praxe. Mnoho takovýchto elementů je popsáno v literatuře a je dostupné přes komerční dodavatele.

Pro nasměrování polypeptidů zalphall Ligandu do sekreční dráhy hostitelské buňky, je v expresním vektoru sekreční signální sekvence (také známá pod označením vedoucí sekvence, preprosekvence nebo presekvence). Sekreční signální sekvence může být tatáž, jako je v zalphal 1 Ligandu, nebo může být odvozena z dalších sekreto váných proteinů (například t-PA) nebo syntetizovaná de novo. Sekreční signál je funkčně spojen s DNA sekvencí pro zalphal 1 Ligand, to znamená, dvě sekvence jsou spojeny ve správném čtecím rámci a umístěny tak. že směřují nově syntetizovaný polypeptid do sekreční dráhy hostitelské buňky.

Sekreční sekvence je obvykle situována na 5'konci DNA sekvence kódující žádaný peptid, ale ítvfii ÍC prílVlwiC, 3igíio.i pFC SCKTCCi mUZC ují umí Sten kdekoli V Duí A RvuujiCi Zadaný pvptiu (viz například Welch a další, patent US 5 037743; Holland a další, patent US 5 143 830).

Obdobně lze sekvenci pro sekreční signál obsazenou v peptidech podle vynálezu užít k nasměrování dalších polypeptidů na sekreční dráhu. Vynález zahrnuje i tyto fúzní peptidy. Sekreční signál podle vynálezu je odvozen od aminokyselinové sekvence SEKV.ÍD.Č:2 a zahrnuje aminokyselinové zbytky 1-31; tento signální peptid je funkčně připojen kjakékoli DNA sekvenci kódující polypeptid, a to pomocí postupů známých odborníkům v daném oboru a ve vynálezu objevených. Sekreční signální sekvence obsažená ve fúzních polypeptidech může být fúzovaná na aminokonci k dalšímu peptídů, čímž nasměrují další peptid na sekreční dráhu. Jak je jasné odborníkům v daném oboru, takovéto konstrukty mají mnoho aplikací. Například, tato nová sekreční sekvence fúzních konstruktů může řídit sekreci aktivní komponenty normálně nesekretovaného proteinu. Takovéto fúze mohou být použity jak in vivo, tak in vitro k řízení sekrece peptídů pomocí sekreční dráhy.

Kultivované savčí buňky jsou vhodným hostitelem užívaným ve vynálezu. Metody zavedení exogenní DNA do savčích buněk zahrnují transfekci zprostředkovanou užitím fosforečnanu vápenatého (Wígler a další, Cell 14:725, 1978; Corsaro a Pearson, SOMATIC Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham a Van der Eb, Virology, 52:456, 1973), elektroporaci (Neumann a další, EMBO J.l: 841-5, 1982), DEAE dextranem (Ausubel a další, již citováno) a lipozomy zprostředkovanou transfekci (Hawley-Nelson a další, Focius 15:73, 1993; Ciccarone a další, Focus 15:80,1993) a pomocí virových vektorů (Miller a Rosman, BioTechniques 7:980—90, 1989; Wang a Fíner, Nátuře Med. 2: 714—6, 1996). Produkce rekombinantních polypeptidů v kultivovaných savcích buňkách je uvedena například Levínsonem a dalšími, patent US 4 713 339; Hagen a další, patent US 4784 950; Palmiter a další, patent US 4 579 821; aRingold, patent US 4 656 134. Vhodné kmeny savčích buněk zahrnují COS-1 (ATTCC ě. CRL 1650), COS-7 (ATTCC č. CRL 1651), BHK (ATCC č. CRL 1632), BHK 570 (ATTCC č. CRL 10314), 293 (ATTCC ě. CRL 1573); Graham a další, J. Gen Virol. 36:59-72, 1977) aovariální buňky čínského křečka, linie (CHO-K1; ATTCC ě. CCL 61). Odborníkům v oboru jsou známé ještě další buněčné linie, které jsou dostupné z veřejného depositu jako je American Type Culture Collection, Manassas, Va.

Obecně se používají silné transkripční promotory, jako je promotor z SV-40 nebo cytomegalovirus; viz patent US 4 579 821 a 4,601,978 a adenovirový hlavní pozdní promotor.

Pro selekci kultivovaných savčích buněk, do kterých je vložena cizorodá DNA, se obecné užívá selekce pomocí léku. Tyto buňky se běžně nazývají „transfektanty“. Buňky se kultivují v přitom-25CZ 302921 B6 nosti selektivního agens, ty kteréjsou schopné předat žádaný gen do svého potomstva se nazývají „stabilní trans fektan ty“. Preferovaný selekční markér je gen kódující resistenci k antibiotiku neomycinu. Selekce se provádí v přítomnosti léčiva na bázi neomycinu, jako je G—418 nebojiné. Selekční systémy mohou být také užity ke zvýšení expresní úrovně požadovaného genu, proces sc nazývá „amplifikace“. Amplifikace se provádí kultivací transfektantů v přítomnosti nízké hladiny selekčních činidel, potom se zvýšením hladiny selekčního činidla vyberou buňky, které produkují vysokou hladinu vloženého genu. Ve výhodném provedení se dá jako selekční markér použít dihydrofolátreduktáza, která je spojena s resistenci k methotrexátu. Mohou se užívat i další geny s resistenci k určitým činidlům (například hygromycinová resistence, multifunkcní io resistence, puromycinacetyltransferáza). Dalším postupem je zavedení markéru, který zavádí jiný fenotyp, jako je zelený fluorescenční protein nebo buněčné povrchové proteiny, jako je CD4, CD8, třída I MHC, placentální alkalická fosfatáza. Všechny tyto prostředky umožňují třídění transfekovaných buněk od netransfekovaných, a to pomocí například FACS nebo technologie využívající magnetických separačních mikročástic.

další buňky vyšších eukaryotických organismů lze využít jako hostitelské buňky, včetně buněk rostlinných, hmyzích a ptačích. Užití Agrobacierium rhizogenes jako vektoru pro expresí genů v rostlinných buňkách je popsáno například v Sinkar a další, J. Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. Transformace hmyzích buněk a produkce cizích polypeptidů je popsána v Guarino a další,

Patent US 5 162222 a WO 94/06463. Hmyzí buňky mohou být infikovány rekombinantními baču lov iry, běžně se užívají odvozené zAutographa californica nuclear polyhedrosis viru (AcNPV); viz King a Possee, The Baculovirus ExpressionSystem: A laboratory Guide, London, Chapman a Hill; O'Reilly a další, Baculovirus Express i on Vectors: A Laboratory Manual, NY, Oxford University Press, 1994; a Richardson (ed.) Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Druhá metoda přípravy rekombinantních baculovirů využívá systému založeného na transpozonech, postup je popsán v Luckowem (Luckow a další, J. Virol. 67: 4566-79, 1993). Tento systém se prodává jako Bac-to Bac kit (Life Technologies); obsahuje Tn7 transpozon, který byl užit kpřenosu DNA kódující zalphall Ligand polypeptid do bakulovirového genomu množeného v E.coli jako velký plazmid nazvaný „bacmid“. Transferový vektor pFastBacl™ využívá AcNPV polyhedrinový promotor křížení exprese žádaného genu, v tomto případě zalphall Lígandu. Polyhedrinový promotor může být vyjmut a nahrazen bacutovirovým základním proteinovým promotorem (známým jako Pcor,p6.9 nebo MP promotor), který se exprimuje při baculovirové infekci dříve a proto je výhodný pro expresi sekretovaných proteinů, viz Hill-Perkins a Possee, J. Gen. Virol 71:971-6, 1990;

Bonning a další, J. Gen. Virol. 75: 1551 -6, 1994) a Chazenbalk a Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. V takovýchto transferových virových konstruktech lze použít buď krátkou či dlouhou verzi základního proteinového promotoru. Co více, mohou být konstruovány transferové vektory, ve kterých je nahrazena sekvence sekrečního signálu pro nativní zalphal 1 Ligand sekvencí odvozenou z hmyzích proteinů. Například, sekreční signální sekvence z Ekdysteroíd

Glukózy itransferázy (EGT), včely medonosné Melittin (Invitrogen, Carlsbad, CA) nebo baculoviru gp67 (PharMingen, San Diego, CA) mohou být použity jako konstanty k nahrazení sekvence nativního sekrečního signálu pro zalphal l Ligand. Navíc, transferové vektory mohou zahrnovat ve čtecím rámci na C či N konci fúzní DNA kódující epitovou značku pro zalphal 1 Ligand polypeptid, například, Glu-Glu epitopovou značku (Grussenmeyer a další, Proč. Nati.

Acad. Sci 82: 7952—4, 1985). Pomocí standardních technik známých v oboru, byl transferový vektor obsahující zalphal 1 Ligand transformován do E.coli a testován na výskyt bacmidu, který obsahuje přerušený lacZgenjak indikátor rekombinantního baculoviru. Pomocí běžných technik byla izolována bacmidová DNA obsahující rekombinantní baculovírový genom, která byla transfekována do buněk Spodoptera jrugiperda, to znamená Sf9 buněk. Poté byl následně produkován rekombinantní virus exprimující zalphal 1 Ligand. Zásobní rekombinantní virus byl připraven postupy známými z oboru.

Rekombinantní virus byl použit k infekci hostitelských buněk, typicky do buněčné linie odvozené z nočního motýla Spodoptera jrugiperda. Pro přehled se podívejte do: Glick a Pastemak,

Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA ASM Press,

-26CZ 302921 B6

Washington, D.C.1994. Další použitelnou buněčnou linií je FiveO™ (Invitrogen) odvozená od Trichoplusia ni (Patent US 5 300 435).

V předloženém vynálezu mohou být také použity buňky hub, včetně kvasinek. Druhy kvasinek, které lze výhodně použít jsou Sacharomyces cerevisiae, Pichia pastoris a Pichia meihanolica. Postupy transformace buněk S.cerevisiae pomocí exogenní DNA a produkce rekombinantních polypeptidů je popsána například v Kawasaki, Patent US 4 599 311; Kawasaki a další, Patent US 4 931 373; Brake, Patent US 4 870 008; Wilch a další. Patent US 5 037 743; a Murray a další. Patent US 4 845 075.

Transformované buňky se vybírají určením fenotypu pomocí selekčních markérů, běžně je to resistence k určitým léčivům, či schopnost růstu v nepřítomnosti určité nutriční součásti (např. leucinu). Výhodně používaný systém pro užití v Saccharomyces cerevisiae je POTÍ vektorový systém popsaný Kawasakim a dalšími (Patent US 4 931 373), který umožňuje selekci transformovaných buněk na médiu obsahujícím glukózu. Vhodné promotory a terminátory používané v kvasinkách zahrnují promotory z genů pro glykolytické enzymy (viz Kawasaki, Patent US 4 977 092) a geny pro alkoholdehydrogenasu, viz také Patenty US 4 990 446; 5 063 154; 5 139 936 a 4 661454. Transformační systémy pro další kvasinky, včetně Hansenula

SpGi/ibč, KtityyerGGiycGS luclis,, Kh^yvcroniyccs β'αρύΐο, ccicry cíiS) Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii a Candida maltosa jsou obecně známé odborníkům daného oboru. Viz například Gleeson a další, J. Gen. Microbiol. 132:3459—65, 1986 a Cregg, Patent US 4 882 279. Buňky Aspergillus se dají použít podle postupu McKnighta a dalších (Patent US 4 935 349. Postup pro transformaci Acremonium chrysogenum je podán v Sumino a další, Patent US 5 162 228. Postup pro transformaci Neurospora je podán v Lambowitz, Patent US č. 4 486 533.

Užití Pichia methanolica jako hostitelského organismu pro produkci rekombinantních proteinů je popsáno v WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 a WO 98/02565. Molekuly DNA běžně užívané pro transformaci P. methanolica se obvykle připravují jako dvouvláknové cirkulámí plazmidy, které jsou ve výhodném provedení linearizovány až před transformací. Pro produkci polypeptidů v P.methanolica je výhodné, aby promotor a terminátor v plazmidu by! tentýž, jako v genu pro P. methanolica, jako jsou P.methanolica geny pro využití alkoholu (AUG1 nebo AUG2). Další vhodné promotory jsou založené na dihydroxyacetonsyntáze (DHAS), formátdehydrogenáze (FMD) a kataláze (CAT) geny. K usnadnění integrace DNA do hostitelského chromozomu, je preferováno, aby vlastní expresní segmenty plazmidu byly připojeny na oba konce sekvencí hostitelských DNA. Užívaným selekčním markérem pro Pichia methanolica je gen ADE2 z Pichia methanolica, který kóduje fosforibosyl-5-aminoimidazolkarboxylázu (AIRC; EC 4.1.1.21), který umožňuje ade2 hostitelským buňkám růst v absenci adeninu. Pro velkokapacitní průmyslové procesy, kde je nutné minimalizovat spotřebu methanolu, se ve výhodném uspořádání používají hostitelské buňky, ve kterých jsou oba geny pro využití methanolu (AUG1 a AUGZ) deletovány. Pro produkci sekretovaných proteinů se výhodně používají buňky deficientní na geny vakuolámích proteáz {PEP4 a PRB1). K usnadnění zavedení plazmidu obsahujícího DNA kódující žádaný polypeptid do buněk Pichia methanolica se užívá elektroporace. Je výhodné transformovat buňky Pichia methanolica elektroporací za užití exponenciálně se měnícího pulzujícího elektrického pole, které má sílu pole od 2,5 do 4,5kV/cm, výhodně potom 3,75 kV/cm a časovou konstantu (Ω) od 1 do 40 milisekund, nejvýhodněji pak okolo 20 milisekund.

Ve vynálezu se jako vhodné hostitelské buňky používají kmeny Escherichia coli, Bacillus a buňky dalších rodů. Techniky transformace těchto hostitelských a expresních sekvencí DNA klonovaných ve vynálezu, jsou běžně známé odborníkům z oboru (viz, například Sambrook a další, již citováno). Jestliže exprímujeme polypeptid zalphal 1 Ligandu v bakterii E.coli, polypeptid může zůstat v cytoplasmě, typicky ve formě nerozpustných granulí (inkluzí), nebo může být nasměrován do periplazmatického prostoru pomocí bakteriální sekreční sekvence. V prvním případě se buňky lyžují a získají se in kluže, které se oddělí a denaturují, například, pomocí

-27 CZ 302921 B6 guanidinisokyanátu nebo močoviny. Denaturovaný polypeptid může být potom poskládán a dimenzován pomocí ředění denatu rační ho činidla, což lze provést pomocí dialýzy proti roztoku močoviny a kombinaci redukovaného a oxidovaného glutathionu, následováno dialýzou proti pufrovanému fyziologickému roztoku. V posledním jmenovaném případě, se polypeptid získá z periplazmatického prostoru v rozpustné a funkční formě pomocí popraskání buněk (to lze učinit například, sonifikací nebo osmotickým šokem), čímž se uvolní periplazmatický obsah a získá se protein bez potřeby denaturace a renaturace.

Transformované anebo transfekované hostitelské buňky jsou kultivovány podle konvenčních to postupů v kultuře obsahující nutrienty a další komponenty požadované pro růst vybrané hostitelské buňky. Jsou používána různá média, která jsou obecně známa a obvykle obsahují zdroj uhlíku, dusíku, esenciálních aminokyselin, vitamínů a minerálů. Média mohou také obsahovat obecně vybrané růstové faktory nebo sérum, to podle potřeby. Růstové médium by mělo být obecně selekční pro buňky obsahující exogenně zavedenou DNA, například, selekce na léky nebo defícienci na nutriční složku, která je komplementární k selekčnímu markéru nesenému expresním vektorem nebo kotransfe kovaným do hostitelských buněk. Buňky Pichia methanoíica se kultivují v médiu obsahujícím adekvátní zdroj uhlíku, dusíku a stopových prvků při teplotě od 25 °C do 35 °C. Kapalná kultura je hojně provzdušňována, například třepáním u malých lahví nebo vzduchováním fermentorů. Preferované médium pro Pichia methanoíica je YEPD

2o (2% D-glukóza, 2% Bacto Pepton (Difco Laboratories, Detroit, Ml), 1% Bacto yeast extract (Difco Laboratories), 0,004% adenin a 0,006% L-leucin).

Ve výhodném provedení vynálezu se polypeptidy purifikují do čistoty >80 %, v ještě výhodnějším provedení na > 95% čistotu a ve zvláště výhodném provedení s ohledem na farmaceuticky čistý stav na čistotu vyšší > 99,9 % vzhledem k obsaženým makromolekulám, zvláště pak dalším proteinům a nukleovým kyselinám, bez obsahu infekčních a pyrogenních agens. Ve výhodném provedení je purifikovaný peptid zcela bez dalších polypeptidů, zvláště pak dalších peptidů živočišného původu.

jo Exprimované polypeptidy zalphal 1 Ligandu (nebo jeho chimérické polypeptidy) lze purifikovat pomocí frakcionačního a/nebo konvenčního purifikačního postupu a média. Pro frakcionaci vzorků jsou používány přecipitace síranem amonným a kyselá či chaotropní extrakce. Příklady purifíkačních kroků zahrnují, hydroxyapatit, dělení podle velikosti molekul, FPLC a kapalinovou chromatografii s reverzní fází. Vhodná chromatografícká média zahrnují derivatizované dextrany, agarózu, celulózu, póly akry I amid, speciální silikáty a tak podobně. Jsou upřednostňovány PE1, DEAE, QAE a Q deriváty. Uvedená chromatografická média zahrnují média derivatizovaná fenylovou, butylovou nebo oktylovou skupinou, jako je Phenyl-Sepharóze FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharóze (Pharmacia) a tak podobně; nebo polyakrylové pryskyřice, jako je Amberchrom CG 71 (Toso

Haas) a tak podobně. Vhodné pevné nosiče zahrnují skleněné perly, silikagelové pryskyřice, celulosové pryskyřice, agarózové polštáře, zesíťované agarózové nosiče, polystyrénové nosiče, zesíťované polyakrylamidové pryskyřice a jím podobné, které jsou nerozpustné za podmínek svého užití. Tyto nosiče mohou být modifikovány reaktivními skupinami, které umožňují interakci proteinu pomocí aminoskupin, karboxy skupin, sulfhydrylových skupin, hydroxylových skupin a/nebo uhlíkových skeletů. Příklady vazebné chemie zahrnují užití kyanobromidové aktivace, aktivace N-hydroxysukcinimidem, epoxidovou aktivaci, sulfhydry lovou aktivaci, aktivaci hydrazidem a karboxy a amino deriváty pro karbodiimidovou vazebnou chemii. Tato a další pevná média jsou dobře známá odborníkům z oboru a jsou dostupná od komerčních dodavatelů. Postupy pro vazbu polypeptidů receptorů na média nosičů jsou také dobře známy.

Výběr jednotlivých postupů je věcí rutinního přístupu aje určen vlastnostmi vybraného nosiče. Viz, například Affinity Chromatography: Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden 1988.

Polypeptidy podle vynálezu se izolují pomocí využití jejich fyzikálních a biochemických vlastností. Například, chromatografie využívající ad sorpce na imobilizo váných kovových iontech

-28CZ 302921 B6 (IMAC) se používá k purifikaci proteinů bohatých na histidinové zbytky, včetně těch, které obsahují polyhistidinovou kotvu. Ve zkratce, gel se nejdříve obohatí dvojmocnými kovovými ionty, tím se vytvoří chelát (Sulkowski, Trends in Biochem 3:1-7, 1985). Hístidinem bohaté proteiny se adsorbují na tuto matrici s různou afinitou, která závisí na užitém kovovém iontu a jsou potom eluovány pomocí kompetitivní eluce, snižováním pH, nebo užitím silných chelatačních činidel. Další postupy purifikace zahrnují purifikaci gly kosy lo váných proteinů pomocí afinitní chromatografie za užití lektinů a iontové výměnné chromatografie (Methods in Enzymol., Vol. 182, „Guide to Protein Purification“, M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, strany 529—39) a pomocí rozpustného zalphall receptorů. Fúzní polypeptid a afinitní značka (např. maltózavazný protein, imunoglobulinová doména), mohou být konstruovány tak, aby usnadnily purifikaci.

Kromě toho, pomocí postupů popsaných ve vynálezu, mohou být konstruovány fúzní polypeptidy nebo zalphal 1 Ligandové proteiny, a to za využití oblastí nebo domén zalphal l Ligandu, který je předmětem vynálezu v kombinaci s proteiny ze skupiny lidských cytokinů (to znamená interleukiny nebo GM-CSF), nebo heterologními proteiny (Sambrook a další, již citováno), Altshuel a další, již citováno, Picard, Cur. Opin. Biology, 5:511-5,1994 a odkazy zde uvedené). Tyto postupy umožňují určení biologické důležitosti větších domén nebo oblastí v žádaném polypeptidu. Tyto hybridy mohou měnit reakční kinetiku, vazbu, zúžení nebo rozšíření substrátové specifity nebo změnu tkáňové a buněčné lokalizace polypeptidu, což může být aplikováno na polypeptidy neznámé struktury.

Fúzní proteiny se připravují postupy obecně známými odborníkům daného oboru, a to tak, že se nejprve připraví jednotlivé komponenty fúzního proteinu a chemicky se spojí. Alternativní postup zahrnuje tvorbu polynukleotidu zahrnujícího obě částí fúzního proteinu v jednom čtecím rámci a správném pořadí, což lze připravit pomocí obecně známých technik a potom dochází k expresi již popsané ve vynálezu. Například, část nebo celý helix odpovídající za biologickou funkci může být spojen podle vynálezu se zalphall Ligandem, takto lze připojit helixy i z jiné rodiny, jako jsou IL-15, IL-2, IL—4 nebo GM-CSF. Takovéto komponenty obsahují mimo jiné například sekreční signální sekvenci; helixy A, B, C D; smyčky A/B, B/C, C/D; z tetrahelixových svazků cytokinů. U takovýchto fůzních proteinů se předpokládá biologický funkční profil, který je tentýž nebo podobný polypeptidům podle vynálezu, či dalším známým tetrahelixovým proteinům cytokinové rodiny, v závislosti na fúzním konstruktu.

K výměně ekvivalentních domén mezi polypeptidem zalphal 1 Ligandu a těch polypeptidů, se kteiými byly fúzovány, byly užity standardní metody molekulární biologie. Obecně, segmenty DNA, které kódovaly požadované domény, to znamená helixy A až D zalphal 1 Ligandu nebo další domény zde popsané, se funkčně spojily v rámci s nejméně jedním dalším DNA segmentem kódujícím další polypeptid (například doménu nebo oblast z dalších cytokinů, jako je IL-2, a další) a byly vloženy do patřičného expresního vektoru, jak bylo popsáno dříve.

DNA konstrukty jsou připraveny tak, že několik DNA segmentů kódujících odpovídající oblasti polypeptidu bylo funkčně spojeno ve čtecím rámci tak, že tvoří jediný konstrukt, který kóduje vlastní fúzní protein, nebo jeho funkční část, například, DNA konstrukt, který kóduje N-konec nebo C-konec fúzního proteinu obsahujícího signální polypeptid následovaný maturovaným tetrahelixovým cytoklnovým fúzním proteinem obsahujícím helix A, následovaný helixem B, C a potom D. Takovéto fúzní proteiny mohou být exprimovány, izolovány a testovány na aktivitu tak, jak bylo popsáno dříve.

Polypeptidy zalphal 1 Ligandu nebo jeho fragmenty mohou být připraveny také chemickou syntézou. Polypeptidy zalphal 1 Ligandu mohou být monomemí nebo multimemí; glykosylované nebo neglykosylované; pegylované nebo nepegylované a mohou či nemusí obsahovat iniciační methionínový aminokyselinový zbytek. Například, mohou být polypeptidy připraveny pomocí syntézy peptidů na pevní fázi tak, jak je popsáno například Merrifteldem (J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963).

-29 CZ 302921 B6

Aktivita molekul předkládaného vynálezu může být měřena pomocí různých testů, měřením proliferace a/nebo vazbou buněk exprimujícím zalphal 1 reeeptor. Zvláštnímu zájmu se těší změny vyvolané v zalphal 1 Ligand- dependentních buňkách. Vhodné buněčné linie se učiní s zalphal 1 Ligand dependentní, patří sem IL-3-dependentní BaF3 buněčné linie (Palacios aSteínmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey-Prevot a další, Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135,

1986), FDC-P1 (Hapel a další, Blood 64: 786-790, 1984) a MO7e (Kiss a další, Leukemia 7: 235-240, 1993). Buněčné linie závislé na růstovém faktoru mohou být připraveny pomocí již publikovaných postupů (například, Greenberger a další, Leukemia Res. 8: 363-375, 1984; Dexter io a další, v Baum a další (eds.), Experimental Hematology Today, 8. Ann. Mtg. Int. Soc. Exp.

Hematol. 1979, 145-156, 1980).

Proteiny podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro stimulaci proliferace, aktivace, diferenciace a/nebo indukce nebo inhibice specializovaných buněčných funkcí buněk účastnících se homeostázy, hematopoézy a imunitních funkcí. Zvláště potom polypeptidy zalphal 1 Ligandu se účastní stimulace proliferace, aktivace, diferenciace, indukce či inhibice specializovaných buněčných funkcí buněk hematopoetických buněčných linií, včetně, ale nejen, T buněk, B buněk, NK buněk, dendritických buněk, monocytů a makrofágů, stejně tak epiteliálních buněk, Proliferace a/nebo diferenciace hematopoetických buněk může být měřena in vitro za užití buněčné kultury, nebo in vivo administrací molekul podle vynálezu do vhodného živočišného modelu. Testy měřící buněčnou proliferací nebo diferenciaci jsou obecně známé v daném oboru. Například, test pro měření proliferace zahrnuje takové testy, jako je chemická citlivost na neutrální červeň (Cavanaugh a další, lnvestigational New Drugs 8: 347-354, 1990, včetně lineárních odkazů tam uvedených), zabudování radioaktivně značených nukleotidů (Cook a další, Analytical Biochem

179: 1-7, 1989, včetně literárních odkazů tam uvedených), zabudování 5-bromo-2deoxyuridinu (BrdU) do DNA proliferujících buněk (Porstmann a další, J. Immunol. Methods 82: 169-179, 1985, včetně literárních odkazů tam uvedených) a užití tetrazoliových solí (Mosmann, J. Immunol. Methods 65:55-63, 1983; Alley a další, Cancer Res. 48: 589-601, 1988; Marshall a další, Growth Reg. 5: 69-84, 1995; a Scudiero a další, Cancer Res. 48:4827-4833, 1988; včetně literárních odkazů tam uvedených). Testy k měření diferenciace zahrnují například, měření buněčných povrchových markérů spojených se stádiem specifické exprese tkání, enzymatickou aktivitu, funkční aktivitu nebo morfologické změny (Watt, FASEB 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57:63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell. Biol Technol. Bíoprocesses 161-171, 1989; včetně literárních odkazů tam uvedených). Molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být testovány in vivo pomocí virových zaváděcích systémů. Například, viry užívané pro tyto účely zahrnují adenoviry, herpesviry, retroviry, virus neštovic a adeno-asociovaný virus (AAV). Adenovirus, dvouvláknový DNA virus, je běžně užívaný a dobře prostudovaný vektor pro transfer genu, pro zavedení heterologní nu kle ové kyseliny (pro přehled se podívejte do: Becker a další, Meth. Cell. Biol. 43: 161-89, 1994; a Douglas a Curiel, Science a Medicíně 4:

44-53, 1997).

Pro stanovení aktivity ligandu. byla zkoumána aktivita polypeptidu pro zalphal 1 Ligand pomocí biosensormikrofyziometru založeného na bázi silikonu, který měří vněbuněčnou rychlost acidifíkace nebo uvolnění protonů spojené s vazbou receptoru a následnými fyziologickými odpověďmi buňky. Příkladem takového přístroje je Cytosensor Microphysiometer vyrobený firmou Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Pomocí tohoto postupu lze měřit různé druhy buněčných odpovědí, jako je buněčná proliferace, iontový transport, produkce energie, zánětlivá odpověď, aktivace regulátorů a receptorů a další.

Pro detaily seje možno podívat do: McConnell a další, Science 257: 1906-1912, 1992; Pitchford a další, Meth. Enzymol. 228:84—108, 1997; Arimilli adalsí, J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde a další, Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998.

Co více, zalphal 1 Ligand může být užit k identifikaci buněk, tkání nebo buněčných linií, které odpovídají na stimulaci zalphal 1 Ligandem. Mikrofyziometr, popsaný výše, může být užit

- 30CZ 302921 B6 k rychlé identifikaci na ligand odpovídajících buněk, jako jsou buňky odpovídající na zalphal 1 Ligand podle vynálezu. Buňky mohou být kultivovány za přítomnosti a nepřítomnosti polypeptidu zalphal 1 Ligandu. Tyto buňky, které vyvolávají měřitelné změny v extracelulámí acidifikaci v přítomnosti zalphall Ligandu jsou na zalphal 1 Ligand reaguj ící-odpovídají na jeho příto5 mnost. Takovéto buňky či buněčné linie, mohou být užity k identifikaci antagonistů a agonistů polypeptidů zalphal 1 Ligandu popsaného výše.

Distribuce v tkáních, pozorovaná jak pro agonisty zalphal 1 receptoru (včetně přirozeného zalphall Ligandu/substrátu/kofaktoru, atd. a/nebo antagonisty má enormní význam jak pro io in vivo, tak i pro in vitro aplikace. Sloučeniny identifikované jako zalphal 1 Ligand agonisté jsou užitečné pro expanzi, proliferaci, aktivaci, diferenciaci a/nebo indukci nebo inhibici specializovaných buněčných funkcí buněk účastnících se homeostázy, hematopoézy a imunitních funkcí.

Například, zalphall Ligand a sloučeniny agonistů se používají jako součásti kultivačních médií pro určité typy buněk, mohou se používat samostatné, nebo v kombinaci s dalšími cytokiny a hormony k náhradě séra běžně užívaného v buněčných kulturách. Agonisté jsou tak užiteční ve specifické podpoře růstu a/nebo vývoji T-buněk, B-buněk, NK-buněk, cytotoxických lymfocytů a dalších buněk lymfatického nebo myeloidního původu v kultuře.

AiitagOiuste jsou uúlviiíc laiky pro výzkum míst interakce ligand—receptor, Antagonístc jsou 20 užitečné látky pro výzkum inhibíce expanze, aktivace proliferace, diferenciace buněk účastnících se regulace hematopoézy. Inhibitory aktivity zalphal 1 Ligandu (zalphal 1 Ligand antagonisté) zahrnují anti-zalphal 1 Ligand protilátky a rozpustné receptory zalphal 1 Ligandu, stejně tak další peptidové a nepeptidové látky (včetně ribozymů).

Zalphal 1 Ligand lze také použít k identifikaci inhibitorů (antagonistů) jeho aktivity. Testované sloučeniny jsou zařazeny do testů zde popsaných k identifikaci sloučenin, které inhibují aktivitu zalphall Ligandu. K testům popsaným v patentu lze přiradit ještě testování vzorků na inhibici aktivity zalphal 1 Ligandu pomocí různých postupů měření vazby k receptoru, stimulaci/inhibici zalphal 1 Ligand — dependentních buněčných odpovědí nebo proliferaci buněk exprimují cích zalphal 1 receptor.

Zalphal 1 Ligand lze exprimovat jako fúzní protein s konstantní oblastí imunoglobulinového těžkého řetězce, většinou F_c fragmentem, který obsahuje dvě konstantní domény a chybí mu variabilní oblast. Postupy přípravy takovýchto fúzních proteinů jsou podány v Patentech

US 5 155 027 a 5 567 584. Takovéto fúzní proteiny jsou obvykle sekretovány jako multimemí molekuly, kde jsou částí F_c vázány k sobě pomocí disulfidových můstků a dva polypeptidy, které nejsou součástí imunoglobulinu jsou přidruženy v blízké vzdálenosti od sebe. Fúze tohoto typu jsou užívány například, pro dimerizaci, zvýšení stability a in vivo poločasu, k přípravě afinitnich ligandů pro purifíkaci a in vitro jako testovací látka nebo antagonista. K užití v testech se používají chiméry vázané na nosič pomocí Části F_c a lze je tak využít v ELISA testech.

Pro purifíkaci ligandu lze použít rovněž všechny zalphal 1-vázající polypeptidy. Polypeptid se ímobilizuje na pevném nosiči, jako je agaróza, zesíťovaná agaróza, sklo, celulosové pryskyřice, polystyren, zesíťovaný polyakrylamid nebo další materiály, které jsou za podmínek užití stabilní.

Způsoby vazby polypeptidů k pevnému nosiči jsou obecně známy a zahrnují aminovou chemii, aktivaci bromkyanem, aktivaci N-hydroxysukcinimidem, epoxidovou aktivaci, aktivaci sulfhydrylů a aktivaci hydrazidy. Výsledné médium je obvykle uspořádáno ve formě sloupce, kapalina obsahující ligand se prolévá sloupcem jednou, či vícekrát, čímž se naváže ligand na receptorový polypeptid. Ligand je potom eluován pomocí změn koncentrace soli, chaotropními činidly (guanidin hydrochlorid) nebo pH, Čímž se uvolní vazby ligand-receptor.

Testovací systém využívající ligand-vazebný receptor (nebo protilátka, jeden z členů páru komplement/antikomplement) Či jeho vazebný fragment, jsou komerčně dostupné v biosenzorickém přístroji (BIAcore, Pharmacia Biosenzor, Piscataway, NJ) a lze je proto s výhodou užívat. Daný receptor, protilátka, součást páru komplement/antikomplement nebo fragment se

-31 CZ 302921 B6 ímobilizují na povrchu receptorového čipu. Použití tohoto přístroje je popsáno v Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-40, 1991 a Cuningham a Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-563, 1993. Receptor, protilátka či fragment jsou kovalentně navázány pomocí postupů amino či sulfhydrylové chemie k dextranovým vláknům, která jsou přichycena ke zlatému filmu v průtokové cele. Testovaný vzorek prochází celou. Jestliže je ve vzorku přítomen ligand, epitop nebo opačný člen v páru komplement/antikomplement, váží se na i mobilizovaný receptor, protilátku či odpovídající element, čímž se změní index lomu média, který se detekuje jako změna v povrchové plazmonové rezonanci zlatého filmu. Tento systém umožňuje určení vazebných a odvazovacích rychlostí, ze kterých se vypočítá stech iometrie vazby. Alternativním postupem pro analýzu io interakcí ligand/receptor je SELD1 technologie (Ciphergen, lne. Palo Alto, CA).

Polypeptidy vázající receptor mohou být užity i v dalších testovacích systémech, které se užívají v daném oboru. Jsou to například Scatchardova analýza pro určení vazebné afinity (viz Scatchard, Ann. NY Acad Sci. 51: 660-72, 1949) a kalorimetrické testy (Cunningham a další,

253:545—48, 1991).

Polypeptidy zalphal 1 Ligandu jsou také použity pro přípravu protilátek, které vážou epitopy zalphal 1 Ligandu, peptidy nebo polypeptidy. Zalphal 1 Ligand či jeho fragmenty slouží jako antigeny (imunogeny), jimiž se imunizují zvířata a tím se vyvolá imunitní odpověď. Odborníci zdaného oboru vědí, že antigenní, či antigen nesoucí polypeptidy obsahují alespoň 6 spojitých aminokyselinových zbytků z polypeptidu pro zalphal l Ligand (např. SEKV.ID.č: 2). Polypeptidy mohou obsahovat rozsáhlou část polypeptidu zalphal 1 Ligandu, to znamená od 30 do 100 zbytků z celkové délky aminokyselinové sekvence. Antigeny nebo imunogenní epitopy mohou zahrnovat připojené značky, adjuvanty nebo nosiče, tak jak je zde popsáno. Vhodné antigeny obsahují polypeptid pro zalphal 1 Ligand kódovaný sekvencí SEKV.ID.Č:2 nebo aminokyselinami začínajícími číslem 32 a končícími číslem 162, ěi fragmentem téhož. Dalšími vhodnými antigeny jsou zalphal 1 Ligand, helixy A—D a jednotlivé nebo násobné kombinace helixů A,B, C, a D, odvozené z tetrahelixové struktury, tak, jak je popsána výše. Ve výhodném provedení se jako antigeny užívají hydrofilní peptidy, které byly určeny postupy obecně známými v oboru z vynesení hydrofobicity, tak jak je zde popsáno.

Protilátky získané popsaným způsobem imunizací zvířat těmito antigeny jsou izolovány a purifikovány, tak je popsáno dále. Postupy přípravy a izolace polyklonálních a monoklonálních protilátek jsou obecně známé, viz. například Current Protocols in Immunology, Cooligan a další (eds.), National Institutes of Health, John Wiley a synové, lne., 1995; Sambrook a další,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989; a Hurrell, J. G. R., Ed„ Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications, CRC Press, lne., Boča Raton, FL, 1982.

Je obecně známo odborníkům z obru, že polyklonální protilátky mohou být generovány imunizací širokého spektra teplokrevných zvířat, jako jsou koně, krávy, ovce, kozy, psi, kuřata, králíci, myši a krysy polypeptidem zalphal 1 Ligandu nebo jeho částmi. Imunogenita polypeptidu pro zalphal 1 Ligand může být zvýšena užitím adjuvans, jako je alum (hydroxid hlinitý) nebo Freundovým kompletním Či nekompletním adjuvans. Polypeptidy vhodné pro imunizaci zahrnují fúzní polypeptidy, jako je fúzní peptid zalphal 1 Ligandu, nebo jeho části s imunoglobulinovým polypeptidem nebo maltóza vazným peptidem. Polypeptidové imunogeny mohou být molekuly polypeptidu o úplné délce, či jejich Části. Má-li polypeptidová část charakter haptenu, tak takováto část může být výhodně pro účely imunizace navázána na makromolekulám! nosič, jako je keyhole limpet hemokyanin (KLH), hovězí sérový albumin (BSA) nebo tetanový toxin.

Termín „protilátky“ užívaný v tomto dokumentu zahrnuje polyklonální protilátky, afinitně čištěné polyklonální protilátky, monoklonální protilátky a antigen vazné fragmenty, jako je F(ab)' a Fab proteolytické fragmenty. Genetickým inženýrstvím připravené intaktní protilátky nebo jejich fragmenty, zahrnují také chimérické protilátky, F_v fragmenty, jednořetězcová protilátky a jím >5 podobné, stejně tak syntetické antigen vázající peptidy a polypeptidy. Protilátky nehumánního

- 32 CZ 302921 Β6 původu lze humanizovat pomocí roubování nehumánních CDR na humánní systémy či konstantní oblasti, nebo inkorporací vlastní lidské variabilní domény (obecně „přikrýt“ ji jakoby lidským pláštěm, náhradou exponovaných zbytků, čímž vznikne „opláštěná“ protilátka). V některých případech humanizované protilátky mohou obsahovat nehumánní zbytky v rámci domény pro lidskou variabilní oblast, čímž se zvýší žádaná vazebná charakteristika. Humanizací protilátek se může zvýšit biologický poločas, zatímco potenciál pro nepříznivé imunitní reakce následující po podání lidem se tak redukuje. Co více, lidské protilátky tak mohou být připraveny v transgenních, nehumánních živočiších, kterým mohou být zavedeny geny pro lidské imunoglobuliny tak, jak je to popsáno v WO 98/24893. Je výhodné, aby endogenní imunoglobulínové geny v těchto živočiších mohly být aktivovány či eliminovány pomocí homologní rekombinace.

Protilátky se považují za specificky vazné, jestliže: 1) vykazují prahovou vazebnou aktivitu a 2) a významně křížově nereagují s podobnými molekulami polypeptidu. Jako prahová hladina vazby se definuje, jestliže protilátka proti zalphal 1 Ligandu se váže k polypeptidu peptidu nebo epitopu zalphall Ligandu s afinitou alespoň desetkrát vyšší než ke kontrole (polypeptidu, který není příbuzný zalphal 1 Ligandu). Ve výhodném provedení vykazují protilátky vazebnou afinitu (K_a) ΙΟ⁶ M¹ nebo vyšší, v ještě výhodnějším provedení 10⁸M’' nebo větší, v nej výhodnějším provedení 10⁹ M“¹ nebo větší. Vazebná afinita protilátky se určí například pomocí Scatchardova vynesení (Scaicnard, Ann. NY Acad. Sci 51 :660-672, 1949).

To, že protilátky proti zalphal 1 Ligandu nevykazují signifikantní křížovou reakci s příbuznou polypeptidem, lze prokázat například proti látkovou detekcí polypeptidu zalphal 1 Ligandu pomocí standardní Western blotové analýzy (Ausubel a další, již citováno). Příklady známých příbuzných polypeptidu jsou uvedeny ve vynálezu, jsou to známé orthology a paralogy a další známí členové proteinové rodiny. Test se dá rovněž udělat pomocí nehumánních a mutantních polypeptidů pro zalphal 1 Ligand. Navíc, protilátky mohou být „testovány proti“ známým příbuzným polypeptidům, aby byly izolovány populace protilátek specificky reagujících s polypeptidy pro zalphal 1 Ligand. Například, protilátky generované proti zalphall Ligandu se adsorbují na příbuzné polypeptidy navázané na nerozpustnou matrici; protilátky specifické pro zalphall Ligand se za správných pufračních podmínek na koloně nezachytí. Testy umožňují izolaci polyklonálních i monoklonálních protilátek nevykazujících křížovou reakci s blízce příbuznými polypeptidy (Antibodies: A laboratory Manual, Harlow a Lané (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols ín Immunology, Cooligan a další (eds.), National Institutes of Health, John Wiley a synové, lne., 1995). Testování a izolace specifických protilátek je dobře známa odborníkům daného oboru. Viz, Fundamental Immunology, Paul (eds., Raven Press, 1993; Getzoff a další, adv. ín. Immunol. 43: 1-98, 1988; Monoclonal antibodies: Principles and Practice, Goding, J. W, (eds.), academie Press Ltd., 1996; Benjamin a další, Ann. Rev. Immunol 2: 67-101, 1984. Specifické protilátky proti zalphall Ligandu lze detekovat pomocí celé řady postupů, které jsou v oboru obecně známé a popsané dále v textu.

K určení protilátek, které se specificky vážou na proteiny či polypeptidy zalphal 1 Ligandu se užívá mnoho postupů. Například, tylo testy jsou detailně popsány v knize Antibodies: A laboratory Manual, Harlow a Lané (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Reprezentativními příklady jsou například: konkurenční imunoelektroforéza, radioimuno test, radioimunoprecipitace, imunoenzymatický test na pevné fázi (ELISA), dot blot či Western blot, inhibiční či kompetitivní testy a sandwichové testy. Kromě toho, protilátky mohou být testovány na vazbu k přirozeně se vyskytujícímu typu versus mutantnímu typu proteinu či polypeptidu zalphal 1 Ligandu.

Protilátky generované proti zalphal 1 Ligandu lze použít pro označení buněk exprimujících zalphall Ligand; pro izolaci polypeptidu zalphall Ligandu afinitní purifikaci; pro diagnostické účely k určení hladiny cirkulujících polypeptidů zalphal 1 Ligandu; pro detekci nebo kvantifikaci rozpustných zalphal 1 Ligandu, jako markér pro patologické podklady či pro určení nemoci; v analytických postupech zahrnujících FACS; pro testování expresních knihoven; pro generování anti-idiotypických protilátek a jako neutralizační protilátky nebo jako antagonisté k blokování

-33CZ 302921 B6 aktivity zalphal 1 Ligandu in vitro i in vivo. Vhodné značky nebo markéry zahrnují rad ion úklidy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční markéry, chem i luminiscenční markéry, magnetické částice a tak podobně; nepřímé značky nebo markéry mohou zahrnovat biotin-avidin nebo další páry pro komplement/antikomplement jako intermediáty. Protilátky zde popsané mohou být také přímo či nepřímo konjugovány k lékům, toxinům, rad ion úklidům a tak podobně a tyto konjugáty lze užít pro in vivo diagnostiku nebo terapeutické aplikace. Navíc protilátky proti zalphal 1 Ligandu nebo jeho fragmentům lze použít in vitro k detekci denaturovaného zalphal 1 Ligandu nebo jeho fragmentů v testech, například ve Western blotu nebo dalších testech běžných v daném oboru, io

Vhodné detekční markéry mohou být buď přímo, nebo nepřímo navázány k polypeptidů či protilátce, a zahrnují: radionuklidy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční markéry, chemi luminiscenční markéry, magnetické částice a tak podobně. Vhodné cytotoxické molekuly mohou být buď přímo, nebo nepřímo ukotveny k polypeptidů či protilátce a zahrnují: bakteriální či rostlinné toxíny (například toxín záškrtu, saporin, Pseudomonas exotoxin, ricin, abrin a tak podobně), stejně tak terapeutické radionuklidy, jako jod—131, rhenium -188 nebo ytrium-90 (buď přímo ukotveny k polypeptidů či protilátce, či nepřímo vázané například chelátovou částí). Polypeptidy nebo protilátky mohou být také konjugovány k cytotoxickým lékům, jako je adriamycin. Pro nepřímou vazbu detekované nebo cytotoxické molekuly, detekovaná Či cyto20 toxická molekula je konjugována s členem páru komplement/antikomplement, kde zbývající člen je vázán k polypeptidů nebo části protilátky. Pro tyto příklady je příkladem komplementárního/antikomplementámího páru biotin/streptavidin. Vazebné polypeptidy mohou být použity též v roli antagonistů pro zalphal 1 Ligand. Zablokování vazby polypeptidů ligandu je užitečné pro inhibici zalphal 1 Ligandu nebo vazby proteinu.

Fúzní proteiny polypeptid — toxin nebo protilátka - toxin mohou být užity pro cílové buňky nebo tkáňovou inhibici nebo ablaci (například k léčbě rakovinných buněk nebo tkání). Podobně, obsahuje-li polypeptid mnohočetné funkční domény (to znamená aktivační doménu nebo receptorovou doménu, plus cílovou doménu), potom je fúzní protein, který obsahuje pouze cílovou doménu, vhodný pro nasměrování detekované molekuly, cytotoxické molekuly nebo komplementární molekuly k buňce či tkáni, která je předmětem zájmu. V případě, že funkční doména fúzního proteinu obsahuje pouze komplementární molekulu, anti komplementární molekula může být konjugována k detekované cytotoxické molekule. Takovéto molekuly fúzních proteinů obsahujících domény komplementárních molekul tak reprezentují obecně použitelný cílený prostře55 dek dodávky obecně užívaných antikomplementámích/detekovatelných konjugátů cytotoxických molekul pro určitou buňku (tkáň).

Fúzní proteiny cytokinů zalphal 1 Ligandu nebo protilátka-cytokin fúzní proteiny se tak dají využít pro in vivo zesílení ničení cílových tkání (například, při rakovině krve a kostní dřeně), jestliže polypeptid či protilátka proti zalphal 1 Ligandu jsou nasměrovány do hyperproliferativních krevních buněk, či buněk kostní dřeně (viz, obecně, Homick a další, Blood, 89: 4437—47, 1997). Popsané fúzní proteiny umožňují cílení cytokinů na určená místa jejich aktivity, čímž se zvýší koncentrace cytokinů vdaném místě. Vhodné polypeptidy zalphal 1 Ligandu či protilátek proti zalphal 1 Ligandu jsou zaměřeny proti nežádoucím buňkám či tkáním (to znamená tumoro45 vých či leukemických) a fúzovaný cytokin zprostředkovává zvýšenou cílenou lýzi buňky pomocí efektorových buněk. Vhodnými cytokiny pro tyto účely se jeví například interleukin 2 a faktor stimulující kolonie granulocyto-makrofágy (GM CSF).

Diferenciace je progresivní a dynamický proces, který začíná pluripotentními zárodečnými buňkami a končí terminál ně diferenciovanými buňkami. Pluripotentní buňky, které regenerují bez závislosti na počáteční linii, exprimují radu diferenčních markérů, které se ztrácejí, jakmile se ustanoví příslušnost k určité linii. Zárodečné buňky exprimují řadu diferenčních markérů, které mohou či nemohou být exprimovány, jakmile buňky projdou celý proces vedoucí k jejich zralostí. Diferenční markéry, které se exprimují výlučně ve zralých buňkách, jsou většinou funkční jako buněčné produkty, enzymy potřebné k produkci těchto buněčných produktů a receptory.

-34CZ 302921 Β6

Stadium diferenciace buněčné populace se dá monitorovat identifikací markérů přítomných v buněčné populaci.

Existují důkazy podporující fakt, že tyto faktory stimulují na cestě kterminální diferenciaci či dediferenciaci určité buněčné typy vlivem na celou buněčnou populaci pocházející z běžného prekurzoru či kmene zárodečných buněk. Tak je možné stimulovat či inhibovat proliferaci lymfatických buněk, hematopoetických buněk a epiteliálních buněk.

Zalphal 1 Ligand byl izolován z tkáně, která má důležitou imunologickou funkci a která obsahuje buňky, které hrají roli v imunitním systému. Zalphal 1 Ligand se exprimuje v CD3+ selektovaných, aktivovaných periferních krevních buňkách a bylo prokázáno, že exprese zalphal 1 Ligandu se zvýší po aktivaci T buněk. Co více, výsledky pokusů popsaných v části příklady vynálezu prokázaly, že polypeptidy podle vynálezu mají vliv na růst/expanzi a/nebo stav diferenciace NK buněk či předchůdců NK buněk. Další důkaz demonstruje, že zalphal 1 Ligand ovlivňuje proliferaci a/nebo diferenciaci T buněk a B buněk in vivo. Obecně známé jsou faktory, které jak stimulují proliferaci hematopoetických zárodečných buněk, tak aktivují zrání buněk. NK buňky jsou citlivé na samotný IL-2, ale proliferace a aktivace vyžaduje obvykle další růstové faktory. Například, bylo ukázáno, že IL—7 a Steel Faktor (c-kit ligand) jsou nezbytné pro tvorbu

1.^1___: * j - í-Λ j - a \rtz t_____ti i z- i ii . t____i_i___: „ 11 „ cu__i :__..

NUIUKIII JJICUUUUUVU ΠΛ UUI1CIL· JLL·“ IJ -r ILí—v PkUIllUHltlVI SlU-ř d OLCC1 raMUlUII jauu JWW efektivnější (Mrózek a další, Blood 87: 2632 - 2640, 1996). Avšak pro proliferaci specifických podmnožin NK buněk a/nebo jejich předchůdců jsou nutné ještě dalším zatím nedefinované cytokiny (Robertson a další, Blood 76:2451-2438, 1990), Sloučeniny obsahující zalphal 1 Ligand a IL-15 stimulují předchůdce buněk NK a NK buňky, což je důkazem, že tato kompozice je účinnější než dříve popsané faktory a kombinace těchto faktorů.

Testy určující diferenciaci zahrnují například: měření buněčných markérů spojených se stadium specifickou expresí ve tkáni, enzymatickou aktivitu, funkční aktivitu nebo morfologické změny (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; raes, Adv. Anim. Cell. Biol. Technol, Bioprocesses, 161-171, 1989; a všechny zde uvedené reference). Navíc, polypeptid zalphal 1 Ligandu sám může sloužit jako dodatečný buněčný povrchový nebo sekretovaný markér, který je spojený s pro dané stadium specifickou expresí tkáně. Tak takovéto přímé měření polypeptidů zalphal 1 Ligandu, či ubývání jeho exprese ve tkáni v průběhu diferenciace, může sloužit jako markér pro diferenciaci tkání.

Podobně, přímé měření polypeptidů zalphal 1 Ligandu, nebo ztráty jeho exprese vtkáni, může být určeno v buňkách či tkáních procházejících vývojem nádoru. Zvýšení agresivity a mot i lity buněk, nebo nárůstu či snížení exprese zalphal 1 Ligandu v prekancerogenních či kancerogenních podmínkách ve srovnání s normální tkání, může sloužit jako diagnostický prostředek pro určení transformace, invaze a metastáze pri vývoji nádorů. Stejně tak, znalost vývojového nádorového stadia nebo metastáz pomáhá lékaři pri léčení ve výběru nej vhodnější terapie či agresivity léčby pro jednotlivé pacienty. Způsoby měření nárůstu Či úbytku exprese (buď mRNA, či proteinu) jsou odborníkům dobře známé a jsou zde popsané a mohou být aplikovány na expresi zalphal 1 Ligandu. Například, vznik či zánik hladiny polypeptidů, které regulují motilitu buňky se užívá v diagnostice a prognóze rakoviny prostaty (Banyard a Zetter, Cancer and Metast. Rev. 17: 449-458, 1999). Jako efektor buněčné motility může sloužit snížení či zvýšení hladiny exprese zalphal 1 Ligandu v diagnostice lymfoidů, rakoviny B-buněk, epiteliálních buněk, hematopoetíckých buněk a dalších druhů rakoviny. Co více, aktivita a vliv zalphal 1 Ligandu na progresu tumoru a metastaze mohou být měřeny in vivo. Pro studium vlivu polypeptidů, sloučenin či dalších léčiv na vývoj nádoru bylo vyvinuto několik syngenních myších modelů. V těchto modelech, nádorové buňky pasážované v kultuře se implantují do myši stejného kmene, jako byl donor nádorových buněk. Buňky se vyvinou v recipientních myších v nádory mající podobné vlastnosti, v některých modelech se vyvinou i metastázy. Vhodný model pro naše studia zahrnuje mimo jiných Lewisův karcinom plic (ATCC č. CRL -1642) a B16 melanom (ATCC č:CRL6323). Obě tyto běžně používané nádorové linie, syngenní sC57BL6/J myšmi, lze kultivovat a manipulovat s nimi in vitro. Tumory, vznikající implantací některé z těchto buněčných linií, jsou

-35 CZ 302921 B6 schopné metastázovat v plicích myší C57BL6/J. Model Lewisova karcinomu plic byl již v myším modelu užit k identifikaci inhibitoru angiogenese (Oreilly a další, Cell 79: 315-328, 1994), C57BL6/J myši byly ošetřeny experimentálním agens buď¹ pomocí každodenních injekcí rekombinantního proteinu, ago ni sty, či antagonisty, či jednorázovou injekcí rekombinantního adenoviru. Po tři následující dny bylo podkožně dorsálně aplikováno 10⁵ až 10⁶ buněk. Jiný postup zahrnoval infekci buněk rekombinantním adenovirem, takovým, který exprimoval rekombinantní zalphal 1 Ligand, ještě před aplikací, čímž docházelo k syntéze proteinu v místě nádoru nebo intracelulárné, spíše než systémově. Do 5 dnů myši normálně vyvinuly viditelný tumor. Tumory se nechaly růst po dobu tří týdnů, do té doby dosáhly velikosti 1500 až 1800 mm³to v kontrolně léčené skupině. Velikost tumoru a hmotnost těla byly pečlivě během pokusu zaznamenávány. V době usmrcení byl tumor vyňat a zvážen, spolu s plícemi a játry. Hmotnost plic vykazovala dobrou korelaci s vývojem metastáz během zatížení tumorem. Jako další ukazatel bylo prováděno měření počítání metastáz na povrchu plic. Vyjmutý tumor, plíce a játra byly připraveny na histopatologícký výzkum, imunohistochemícká vyšetření, in šitu hybridizaci, to vše pomocí metod obecné známých v oboru, či zde popsaných. Zkoumal se vliv exprimovančho polypeptidů, v tomto případě zalphal I Ligandu, na schopnost nádoru získat vaskulaturu a vytvořit metastázy. Navíc, mimo užitého adenoviru, implantované buňky byly transientně transfekovány zalphal 1 Ligandem. Užití stabilních transfektantů zalphal 1 Ligandu, stejně tak inducibilních promotorů k aktivaci exprese zalphal I Ligandu in vivo, bylo provedeno postupy obecně známými odborníkům daného oboru a byly použity v tomto systému k ovlivnění tvorby metastáz zalphal 1 Ligandem. Dále byl purifikovaný zalphal 1 Ligand nebo zalphal 1 Ligandem kondicionované médium i nj i kováno do myšího modelu, a tak byly využívány v tomto systému. Pro obecný přehled seje možno podívat do Oreilly a další, Cell 79:315—328, 1994 a Rusciano a další, Murine Models of Liver Metastatis. Invasion Metastasis 14: 349-361, 1995.

Zalphal 1 Ligand se osvědčil při léčení vývoje nádoru a proto je užitečný při léčbě rakoviny. Zalphal 1 Ligand inhibuje IL—4 stimulovanou proliferaci normálních anti-IgM stimulovaných B buněk a byl pozorován i obdobný efekt u B-buněk tumorových linií, z čehož se dá usuzovat, že by mohl být pozorovaný úspěch při léčbě pacientů zalphal 1 Ligandem. Tato léčba by zajistila indukci tumorových B-buněk do méně proliferativního stadia. Ligand může být podáván v kombinaci s dalšími běžně podávanými látkami, a to jak konvenčními chemoterapeutiky, tak i imunitními modulátory, jako je ínterferon alfa. Interferony alfa/beta jsou účinné při léčbě některých leukémií a u některých zvířecích modelů se prokázal inhibiční vliv na růst u interferonu alfa a zalphal 1 Ligandu, a to alespoň u jedné nádorové buněčné linie B-buněk.

Způsob redukce proliferace neoplastických B nebo T buněk obsahuje podávání množství sloučeniny zalphal I Ligandu, které je schopno redukovat proliferaci neoplastických B a T buněk u savců s novotvary B a T buněk. Sloučenina může obsahovat přinejmenším jeden další cytokin vybraný ze skupiny sestávající z IL-2, IL—15, IL-^4, GM-CSF, Flt3 ligandu či faktoru kmeno4« vých buněk.

Další způsob redukce proliferace neoplastických T a B buněk spočívá v podání takového množství sloučeniny antagonisty zalphal 1 Ligandu, které je schopno redukovat proliferaci neoplastických B a T buněk u savců s novotvary u B a T buněk. Sloučenina může obsahovat přinejmenším jeden další cytokin vybraný ze skupiny sestávající z IL-2, IL—15, IL—4, GM-CSF, Flt3 ligandu či faktoru kmenových buněk. Navíc může být antagonista zalphal 1 Ligandu fúzní protein skládající se z ligand/toxin.

Fúzní toxin zalphal 1 Ligandu se saporinem se užívá proti podobnému spektru leukémií a lymfo50 mů, rozšiřuje tak spektrum leukemít, které mohou být léčeny pomoc zalphal 1 Ligandu. Fúzní protein zprostředkovává aktivaci receptorů zalphal 1 Ligandu pomocí dvou nezávislých pochodů inhibice růstu cílových buněk, první je identický podávání zalphal 1 Ligandu samotnému, druhý potom je dodávka toxinu pomocí recept ořové intemalizace. Lymfoid vykázal restrikci v expresním spektru zalphal 1 receptorů, což naznačuje, že konjugát ligand-saporin je dobře snášen pacienty.

-36 CZ 302921 B6

Zahrnuje-li léčba malignit transplantaci alogenní kostní dřeně nebo buněčnou transplantaci kmenových buněk, zalphal 1 Ligand by mohl být užitečný v uchycení implantátu versus tumorový efekt. Zalphal 1 Ligand stimuluje generaci lytických NK buněk z buněčných předchůdců kostní dřeně a stimuluje proliferaci T-buněk následnou aktivací receptoru antigenu. Proto, když pacient dostane transplantát alogenntch buněk kostní dřeně, zalphal 1 Ligand stimuluje generaci antinádorových odpovědí, a to jak s infuzí, tak bez infuze donorových lymfocytů.

Rozložení receptorů pro dané cytokiny nabízí širokou škálu potenciálních míst pro akci cytokinů. Northern analýza zalphal 1 receptorů odhalila transkripty v lidské slezině, brzlíku, lymfatických uzlinách, kostní dřeni a periferních krevních leukocytech. Byly identifikovány specifické buňky, které exprimovaly zalphal 1 receptory, a byl pozorován silný signál ve smíšené reakci lymfocytů (MLR) a v Burkitově lymfomu Ráji. Byly identifikovány dvě negativní monocytické buněčné linie, THP-1 (Tsuchiya a další, Int. J. Cancer 26: 171-176, 1980) a U937 (Sundstrom a další, Int. J. Cancer 17: 565-577, 1976).

Zalphal 1 receptor se exprímuje na relativně vysokých úrovních v MLR, ve které se smíchají periferní krevní monocyty (PBMNC) ze dvou jedinců, což vyústí ve vzájemnou aktivaci. Detekce vysokých hladin íiaiiskiiptu v MLR, ale íiíkoli ve zbývajících T nebo B buňkách populace napovídá, že exprese zalphal 1 receptoru je indukována během aktivace v jednom či více buněčných typech. Aktivace izolovaných populací T nebo B buněk může být uměle dosaženo stimulací buněk pomocí PMA a lonomycinu. Byly-li podrobeny aktivaci tříděné buňky, hladina transkriptu zalphal 1 receptoru stoupla v obou buněčných typech, čímž se podpořila jejich role pro tento receptor a zalphal 1 Ligand v buněčné odpovědi, zvláště potom při autokrynní a parakrynní expanzi T a B buněk během aktivace, Zalphal 1 Ligand hraje tak také důležitou roli pri expanzi primitivnějších zárodečných buněk účastnících se lymfopoezy.

Ve zbývajících T a B buňkách byl zalphal 1 receptor prokázán v nižších koncentracích a jeho obsah nebyl regulován během aktivace obou buněčných typů. Bylo zajímavé, že B buňky mohou pomocí regulace snížit signál daleko rychleji, než je tomu u buněk T. Z tohoto zjištění vyplývá, že amplituda signálu a načasování jeho vyhasnutí jsou důležité pro řádnou regulaci buněčné odpovědi B-buněk.

Kromě toho, velká část střevních buněk lamina propria vykazuje pozitivní hybridizační signál s receptorem pro zalphal 1. Tato tkáň je tvořena smíšenou populací lymfatických buněk, včetně CD4+ aktivovaných T buněk a aktivovaných B buněk. Imunitní dysfunkce, zvláště pak chronická aktivace mukózní imunitní odpovědi, hraje důležitou roli v etiologii Crohnovy nemoci; abnormální odpověď na produkci prozánětlivých cytokinů je také jedním z podezřelých faktorů (Braegger a další, annals allcrgy 72: 135-141, 1994; Sartor, Am. J. Gastroenterol. 92:5S-11S, 1997).

Zalphal 1 Ligand spolu s IL— 15 pomáhá expanzi NK buněk z kostní dřeně a rozšiřuje efektorovou funkci NK buněk. Zalphal 1 Ligand se také účastní stimulace dozrávání B buněk stimulovaných pomocí protilátky generované proti CD-40, ale inhibuje proliferaci B buněk stimulovanou signálem z IgM. Zalphal 1 Ligand zvyšuje proliferaci T buněk spolu se signálem produkovaným přes T receptor a vysoká exprese v transgenních myších vede k lymfopatií a expanzi monocytů a granulocytů. Tyto pleiotropní efekty zalphal 1 Ligandu dávají tušit, že mohou vyústit v terapeutický prostředek pro široký okruh nemocí majících svůj původ v defektech imunitního systému, včetně (ale nejen) systémového lupus erythematosus (SLE), revmatické artritidy (RA), sklerózy multiplex (MS), těžké myasténie a diabetů. Je důležité poznamenat, že tyto nemoci jsou výsledkem celé řady imunitních dysfunkcí (SLE, například způsobují defekty jak u B, tak u T buněk) a že imunitní buňky jsou závislé na interakci jedné s druhou, teprve potom mohou vytvořit imunitní odpověď. Protože zalphal 1 Ligand (nebo jeho antagonista) může být použit k ovlivnění více než jednoho druhu imunitních buněk, je proto dobrým terapeutickým kandidátem pro užití v mnoha stadiích nemoci.

-37CZ 302921 B6

Polypeptidy a proteiny podle vynálezu mohou být užity také in vivo, například ve vlastní kultuře kostní dřeně. Ve zkratce, kostní dřeň se získá od pacienta před chemoterapií nebo transplantací orgánu a ošetří se zalphal 1 Ligandem, výhodně v kombinaci s jedním či více dalšími cytokiny,

Ošetřená kostní dřeň se vrátí pacientovi po chemoterapii, Čímž se urychlí znovunavrácení funkce kostní dřeně po transplantaci a potlačí se obrana organismu proti transplantátu. Kromě toho, jsou proteiny podle vynálezu užívány pro ex vivo expanzi kostní dřeně nebo předchůdců periferních krevních buněk (PBPC). Před léčením, dřeň může být stimulována SCF, tím se uvolní časné rodičovské buňky do periferní cirkulace. Tyto rodičovské buňky se shromáždí koncentrací periK) ferní krve a potom ošetří v kultuře zalphal 1 Ligandem, výhodně v kombinaci s jedním nebo více dalšími cytokiny, včetně, ale nejen SCF, IL-2, 1L~4, IL—7 nebo IL—15. Tím se přivedou k diferenciaci a proliferaci v lymfoidní kultuře o vysoké hustotě, která může být potom vrácena pacientovi po chemoterapii či transplantaci.

Předkládaný vynález uvádí způsob expanze hematopoetických buněk a buněčných předku hematopoetických buněk zahrnující kultivaci kostní dřeně nebo periferních krevních buněk s prostředkem obsahujícím určité množství zalphal 1 Ligandu, které je dostatečné pro zvýšení počtu lymfatických buněk v kostní dřeni nebo periferních krevních buňkách, ve srovnání s kostní dření nebo periferními krevními buňkami kultivovanými za nepřítomnosti zalphal 1 Ligandu. Ve výhodném provedení jsou hematopoetické buňky a předchůdci hematopoetických buněk lymfatické buňky. V ještě výhodnějším provedení jsou lymfatické buňky NK buňky nebo cytotoxické buňky. Kromě toho, kompozice může ještě obsahovat alespoň jeden cytokin vybraný ze skupiny obsahující IL-2, IL-15, IL-4, GM-CSF, Flt3 ligand a faktor kmenových buněk.

Alternativně zalphal 1 Ligand může být užit k aktivaci imunitního systému, která může být důležitá ve vytvoření imunity k infekčním nemocem, léčení pacientů majících oslabený imunitní systém, jako jsou nemocí HIV+, nebo ho lze použít k vylepšení vakcín. Zvláště pak stimulace zalphal 1 Ligandem nebo expanze NK buněk, či jejich buněčných předchůdců, poskytne cenné terapeutické možnosti v léčbě virových infekcí a jako faktor proti tvorbě novotvarů. Předpokládá se, že NK buňky hrají hlavní roli v eliminaci metastatických nádorových buněk a pacienti jak s metastázami, tak pevnými nádory, mají sníženou funkci NK buněk (Whiteside a další, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 230:221-244, 1998). Podobně stimulace imunitní odpovědi na virovou infekci a nevirovou infekci (včetně bakterií, protozoí a hub) pomocí zalphal 1 Ligandu, poskytuje cenou terapeutickou pomůcku pro léčbu takovýchto infekcí, a to inhibici růstu takovýchto infekč35 nich agens. Přímé či nepřímé určení hladiny patogenu nebo antigenů, stejně tak nádorových buněk, které jsou přítomné v organismu lze učinit pomocí mnoha způsobů známých odborníkům daného oboru a popsaných v patentu.

Předkládaný vynález poskytuje použití sloučeniny pro výrobu léčiva pro stimulaci imunitní odpovědi u savců vystavených působení antigenů či patogenu, což zahrnuje následující kroky: (1) Přímé či nepřímé určení hladiny patogenu nebo antigenů v daném savci; (2) podávání směsi obsahující polypeptid v přijatelné farmaceutické kompozici; (3) přímé či nepřímé určení hladiny patogenu nebo antigenů v daném savci; a (4) srovnání hladin antigenů a patogenu z kroku 1 s hladinami v kroku 3, zda pozorovaná změna svědčí o stimulaci imunitní odpovědi. Ve výhodném provedení je směs zalphal 1 Ligandu podávána opakovaně. V ještě výhodnějším provedení, antigenem je nádorová B buňka; virus, parazit nebo bakterie,

V dalším provedení vynález uvádí použití sloučeniny pro výrobu léčiva pro stimulaci imunitní odpovědi u savců exponovaných působením antigenů či patogenu, který se skládá: (1) určení hladiny antigen-specifické či patogen- specifické protilátky; (2) podávání směsi obsahující polypeptid zalphal 1 Ligandu v přijatelné farmaceutické formě; (3) určení hladiny antigen- či patogen-specifických protilátek po podání směsi; (4) srovnání hladin protilátek z kroku (1) a (3), zda pozorované změny svědčí o stimulaci imunitní odpovědi.

-38CZ 302921 Β6

Polynukieotidový kódující polypeptidy zalphal 1 Ligandu jsou využitelné pro aplikaci v genové terapii, kdy je požadováno zvýšení nebo inhibice aktivity zalphal 1 Ligandu. Jestliže savec má mutovaný, či nemá gen pro zalphall Ligand, může být gen pro zalphall Ligand zaveden do buněk savce. Ve výhodném provedení, je gen kódující polypeptid zalphal 1 Ligandu zaveden in vivo do virového vektoru. Takovéto vektory obsahují oslabený či defektní DNA virus, jako jsou, ale nikoli pouze, herpes simplex virus (HSV), paptllomavirus, virus Epstein-Baarové (EBV), adenovirus, adeno-asociovaný virus (AAV) a další. Ve výhodném provedení se používá takový defektní virus, jemuž úplně, či částečně chybí virové geny. Defektní virus není po zavedení do buňky infekční. Užití defektních virových vektorů umožňuje administraci do buněk ve specifické, lokalizované oblasti, bez ohledu na to, zda vektor může infikovat další buňky. Příklady virových vektorů zahrnují mimo jiné například defektní herpes simplex virus 1(HSV1) vektor (Kaplitt a další, Molec. Cell. Neurosci, 2. 320-30, 1991); zeslabený adenovirový vektor, jako je vektor popsaný Stratford-Perricaudetem a dalšími, J. Virol. 61: 3096 - 101, 1987; Samulski a další, J. Virol. 63:3822-8, 1989).

Gen pro zalphal 1 Ligand může být uložen do retrovirového vektoru, to znamená jak popsal Anderson a další, patent US 5 399 346; Mann a další, Cell 33: 153, 1983; Temin a další, patent US 4 650 764; Temin a další, patent US 4 980 289; Markowitz a další, J. Virol. 62:1120, 1988; Temin a další, patent US 5 124 263; WO 95/07 358, publikováno 16. března, i995 Dughbertym a dalšími; a Kuo a další, Blood 82: 845, 1993. Obdobně, vektor může být zaveden lipofekcí in vivo pomocí liposomů. K případě liposomů pro in vivo transfekci genů kódujících markéry si užívají syntetické kationtové lipidy (Felgner a další, Proč. Nati. Acad, Sci. USA 84: 7413 - 7, 1987;

Mackey a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:8027-31, 1988). Užití lipofekce k zavedení exogenních genů do specifických orgánů in vivo má určité praktické výhody. Molekulární nasměrování liposomů do specifických buněk je jednou z nich. Například, nasměrování liposomů do specifických typů buněk je výhodné ve tkáních s vysokou buněčnou heterogenitou, jako je imunitní systém slinivka, játra, ledviny a mozek. Lipidy se mohou za účelem cíleného působení chemicky vázat na další molekuly. Cílové peptidy (to znamená například hormony nebo neurotransmitery), proteiny, jako jsou třeba protilátky nebo nepeptidové molekuly, mohou být k liposomů vázány chemicky.

Je možné cílové buňky vyjmout z organismu; zavést vektor jako nahý DNA plazmid; a potom transformované buňky reinplantovat do těla. Nahý DNA vektor pro genovou terapii může být zaveden do uvažované hostitelské buňky některou ze standardních metod, jako jsou transfěkce, elektroporace, mi kro injekce, transdukce, buněčná fúze, pomocí DEAE dextranu, precipitace fosforečnanem vápenatým, užitím genového děla nebo pomocí DNA vektorových přenašečů. Pro detaily se podívejte do: Wu a další, J. Biol. Chem. 267: 963-967, 1992; Wu a další, J. Biol. Chem. 263: 1426W, 1988.

K inhibicí genu pro transkripci zalphal 1 Ligandu se užila metodologie antisense, takový postup, jako pro inhibicí buněčné proliferace in vivo. Byly navrženy polynukleotidy, které jsou komplementární k části polynukleotidu zalphall Ligandu (to znamená polynukleotid uvedený dříve v SEKV.ID.Č: 1), které se váží ke kódující mRNA a inhibují tak translaci této mRNA. Takovéto antisense polynukleotidy byly použity k inhibicí exprese genů kódujících polypeptid zalphall Ligandu v buněčné kultuře nebo v daném subjektu.

Byly připraveny myši exprimující gen zalphal 1 Ligandu, označované zde „transgenní myši a myši, které vykazovaly úplnou absenci genu pro zalphall Ligand, označované zde jako „knockoutované myši*⁴ (Snouwaert a další, Science 257:1083, 1992; Lowel a další, Nátuře 366: 740-742, 1993; Capecchi, Science 244; 1288-1292, 1989; Palmiter a další, Annu Rev Genet 20:465-499, 1986). Například, pro zodpovězení otázky, zda exprese ovlivňuje fenotyp, byly použity myši, které exprimují zalphall Ligand, bud’ ubiquitovaný, nebo pod tkáňově specifickým či tkáňově restrikčním promotorem. Například, exprese přirozeného typu polypeptidu

-39CZ 302921 B6 zalphal 1 Ligandu, polypeptidového fragmentu nebo jeho mutanty, může změnit normální buněčné pochody, což se projeví fenotypem, který identifikuje tkáně, ve kterých je exprimovaný zalphal 1 Ligand dostatečně funkční a mohly by tak být užity jako terapeutický cíl pro zalphal 1 Ligand, jeho antagonisty či agonisty. Například, mezi geneticky upravenými myšmi se ve výhodném provedení užívá mys, ve které dochází k expresi zalphal 1 Ligandu (aminokyselinové zbytky 32-162 v SEKV.ID.Č:2). Co více, takováto exprese může vyústit do fenotypu, který vykazuje jisté podobnosti s lidskými nemocemi. Podobně, zalphal 1 Ligand knockoutované myši mohou sloužit k výzkumu, zda zalphal 1 Ligand je in vivo absolutně nezbytný. Fenotyp knockoutovaných myší je předurčen ke zkoumání vlivů antagonistu zalphal 1 Ligandu, které jsou io popsány ve vynálezu, in vivo. Ke generování knockoutovaných myší lze použít buď lidskou či myší cDNA po zalphal 1 Ligand. Tyto myši jsou potom určeny k in vivo studiu genu pro zalphal 1 Ligand a proteinu jím kódovaného. Slouží tedy jako živý model pro studium odpovídajících lidských nemocí. Kromě toho, v transgenních myších probíhající expresi antisense polynukleotidu pro zalphal 1 Ligand nebo ribozymy působící proti zalphal 1 Ligandu, které jsou ve i5 vynálezu popsané, lze užít analogicky i v myších popsaných výše. Studie může probíhat také podáváním purifikovaného proteinu zalphal 1 Ligandu.

Proteiny podle vynálezu mohou být upraveny pro parenterální, zvláště pak pro intravenózní nebo subkutánní podávání podle běžně užívaných postupů. Bioaktivní polypeptid nebo konjugáty protilátek ve vynálezu popsané mohou být podávány intravenózně, intraarteriálně nebo intraduktálně, nebo mohou být zavedeny lokálně přímo do místa působení. Intravenózní aplikace injekcí či infuzí trvají od jedné až po několik hodin. Obecně, farmaceutické formy zahrnují proteiny zalphal 1 Ligandu v kombinaci s farmaceuticky přijatelným agens, jako je fyziologický roztok, pufrovaný fyziologický roztok, 5% dextrosa ve vodě a podobně. Farmaceuticky přijatelná forma může dále zahrnovat jednu či více inertních substancí k přenosu látky, konzervační Činidla, rozpouštědla, pufrační substance, albumin, který snižuje ztráty navázání proteinu na stěny zkumavek, a tak dále. Postupy vytvoření farmaceuticky přijatelné kompozice jsou obecně dobře známé a jsou shrnuty například v: Remington: The Science and Practice o f Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 19. vydání, 1995. Terapeutické dávky se pohybovaly jo obvykle v rozsahu 0,1 až 100pg/kg pacientovy váhy a den, ve výhodném provedení 0,5 až 20 pg/kg na den, přesná dávka byla určena klinicky podle přijatých standardů, kdy byla vzata do úvahy povaha a závažnost onemocnění, které bylo léčeno, pacientův stav , a tak dále. Určení dávky je pro odborníky v daném oboru rutinní záležitostí. Proteiny mohou být podávány pro akutní léčbu, po dobu jednoho týdne, či méně často po dobo jednoho až tří dnů, nebo mohou být podávány k léčení chronických stavů, a to po dobu několika měsíců až let. Obecně, terapeuticky účinné množství zalphal 1 Ligandu je takové množství, které je schopno vyvolat klinicky signifikantní změny v hematopoetických či imunitních funkcích.

Přehled obrázku na výkrese

Obrázek 1 je ilustrací vzájemného srovnání lidského IL—2, lidského IL—15, zalphal 1 Ligandu (SEKV.1D.Č:2), lidského IL-4, lidského GM-CSF a myšího GM-CSF.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Konstrukce chimérického polypeptidu zalphal 1 Ligandu: Fúze MLP extracelulámí a TM domény za vzniku zalphal 1 intracelulámí signální domény

Extracelulámí a transmembránové domény myšího MLP receptoru byly izolovány z plazmidu obsahujícího myší MLP reeeptor (PHZ1/MLP plazmid) pomocí PCR s příměry ZC17212 (SEKV.ID.Č:5) a ZC119 914 (SEKV.ID.Č:6). Reakční podmínky byly následující: 95 °C po dobu 1 min; 35 cyklů při 95 °C po dobu 1 min, 45 °C po dobu 1 min, 72 °C po dobu 2 min;

-40CZ 302921 B6 následovalo 72 °C po dobu 10 min; potom při 10°C cyklus pro uchovávání. PCR produkt byl analyzován na 1% agaróze s nízkým bodem tání (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a byl izolován fragment MLP receptorů o přibližné molekulové hmotnosti 1,5 kb pomocí Qiaquick gel extrakčního kitu (Qiagen) podle instrukcí výrobce.

Intracelulámí domény lidského zalphal 1 byly izolovány zplazmidu obsahujícího zalphal 1 receptor cDNA pomoci PCR s příměry ZC19913 (SEKV.ID.Č:8) a ZC20097 (SEKV.ID.Č:9). Sekvence polynukleotidu odpovídající kódující sekvenci pro zalphal 1 Ligand jsou znázorněny vSEKV.ID.Č:7 a odpovídající aminokyselinová sekvence je znázorněna v SEKV.ID.Č: 115. Reakční podmínky byly tytéž, jako výše uvedené. PCR produkt byl analyzován na 1% agaróze s nízkým bodem tání (Boehringer Mannheim, indianapolis, IN) a byl izolován fragment zalphal 1 o přibližné molekulové hmotnosti 900 bp pomocí Qiaquick gel extrakčního kitu (Qiagen) podle instrukcí výrobce.

Každý z vyizolovaných fragmentů popsaných výše byl smíchán v poměru objemů 1:1 a směs byla podrobena PCR reakci za užití ZC17212 (SEKV. ID. Č: 5) a ZC20097 (SEKV.ID.Č:9). Takto byl vytvořen chimérický MLP-zalphal 1. Reakční podmínky byly následující: 95 °C po dobu 1 min; 35 cyklů při 95 °C po dobu 1 min, 55 °C po dobu 1 min, 72 °C po dobu 2 min; násíedovaio 72 °C po dobu 10 min; poiom při 10 °C namáčení. rCR prudukí uyi analyzován ňa 1% agaróze s nízkým bodem tání (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a byl izolován fragment MLP -zalphal 1 chiméry o přibližné molekulové hmotnosti 2,4 kb pomocí Qiaquick gel extrakčního kotu (Qiagen) podle instrukcí výrobce. MLP-zalphal 1 chimérický fragment byl štěpen pomocí EcoRI (BRL) a Xbal (Boehringer Mannheim) podle instrukcí výrobce. Vlastní digest byl analyzován na 1% agaróze s nízkým bodem tání (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a byl izolován naštěpený produkt MLP -zalphal lchiméry pomocí Qiaquick gel extrakčního kitu (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Vzniklý naštěpený produkt MLP-zalphal 1 chimérické sloučeniny byl po té vložen do expresního vektoru, tak jak je popsáno níže.

Recipientní expresní vektor pZP-5N byl štěpen EcoRI (BRL) a HindllI (BRL) podle instrukcí výrobce a přečištěn na gelu, jak bylo popsáno drive. Tento fragment vektoru byl kombinován s EcoRI a Xbal štěpenou MLP-zalphal 1 chimérou, která byla izolována v předchozím kroku a Xbal/H indlll spojovacím fragmentem v ligační reakci. Ligace probíhala přes noc za užití T4 Ligázy (BRL) při 15 °C. Vzorek ligační směsi byl pomocí elektroporace vložen do DH10B ElectroMAX elektrokompetentních E.coli buněk (25 pF, 200 Ω, 2,3 V). Transformanty byly vysety na plotny s LB + ampicilin a pomocí PCR byly testovány jednotlivé kolonie na výskyt MLP-zalphal 1 chiméry, užité primery byly ZC17,212 (SEKV. ID. Č: 5) a ZC20,097 (SEKV.ID. Č: 9). Podmínky PCR reakce byly tytéž, jako výše.

Potvrzení sekvence MLP-zalphal 1 chiméry byly potvrzeno sek ve načni analýzou za užití následujících primerů: ZC12 700 (SEKV.ID.ČHO), ZC5020 (SEKV.ID.Č: 11), ZC6675 (SEKV.ID.Č: 12), ZC7727 (SEKV.ID.Č: 13), ZC8290 (SEKV.ID.Č:14), ZC19572 (SEKV.ID.Č: 15), ZC6Ó22 (SEKV.ID.Č: 16), ZC7736 (SEKV.ID.Č:17) a ZC9273 (SEKV.ID.Č: 18). Insert měl velikost přibližně 2,4 bp a měl úplnou délku.

Příklad 2: Proliferace MPL-zalphal 1 chiméry v BAF3 založená na testu s Alamar modří A. Konstrukce BAF3 buněk exprimujících MLP-zalphal 1 chiméru

BAF3 je prelymfatická buněčná linie závislá na interleukinu-3 (IL-3) odvozená od buněk kostní dřeně myší (Palacios a Steinmetz, Cell 41: 727-734, 1985; Mathey- Prevot a další, Mol. Cell. Biol. 6: 4133-4135, 1986). Buňky byly množeny v kompletním médiu (RPMI médium (JRH Bioscience lne., Lenexa, KS) obohaceném 10% tepelně inaktivovaným fetálním telecím sérem, 2 ng/ml myším IL—3 (mIL-3) (R & D, Minneapolis, MN), 2mM L-glutaMax-lTM (Gibco BRL), ImM- pyruvátem sodným (Gibco BRL) a PSN antibiotiky (GIBCO BRL)), Před elektro-41 CZ 302921 B6 porací byla připravena plazmidová DNA pZP-5N/MLP-zalphal 1 (příklad 1) a byla purifikována pomocí Qiagen Maxi Prep kit (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Buňky BAF3 pro elektroporaci byly promyty jedenkrát RPM1 médiem a poté resuspendovány v RPMI na buněčnou hustotu 10⁷buněk/ml. Jeden ml resuspendovaných buněk se smíchal s 30 pg pZP- 5N/MLP—zalphal 1 plazmidové DNA a byl přenesen do elektroporaění cely najedno použití (GIBCO BRL). Během následujících 15 minut inkubace při pokojové teplotě byly buňky podrobeny sérii šoků ((800 1 Fad/300 V.; 1180 lFad/300 V.) a to v elektroporacním přístroji (CELL-PORATOR; GIBCO BRL). Po pěti minutách trvajícím zotavení byly elektroporované buňky přeneseny do 50 ml kompletního média a uloženy do inkubátoru na dobu 15 až 24 hodin (37 °C, 5% CO₂). Po io této době byly buňky centrifugovány a resuspendovány v 50 ml kompletního média obsahujícího selekční Geneticin (Gibco) (500 pg/ ml G418) v T-162 láhvi; tím se získala zásoba rezistentních buněk. Tyto BaF3 transfekované buňky, dále nazývané BaF3/MLP-zalphal 1 buňky, byly testovány na signální schopnost tak, jak je to popsané níže.

B. Testování signální schopnosti BaF3/MLP-zalphal 1 buněk pomocí proliferačního testu s Alamar modří

BaF3/MLP-zalphal 1 buňky byly centrifugovány a pomyty kompletním médiem, tak jak to bylo popsáno výše, ale bez mlL-3 (médium se nazývá „mIL-3 free)· Buňky byly promyty acentrifu20 govány celkem třikrát, čímž se zaručila nepřítomnost mIL-3. Potom byly buňky spočítány v hematocytometru. Buňky byly vysety na destičky s 96 jamkami, a to po 5000 buňkách na jamku v objemu 100 pl na jamku v mIL-3 free médiu.

Proliferace BaF3/MLP-zalphal 1 buněk se určila pomocí m trombopoetinu (mTPO) zředěného na koncentrace 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62 ng/ml, 30 ng/ml, 15 ng/ml, 7,5 ng/ml, 3,75 ng/ml; 1,8 ng/ml, 0,9 ng/ml, 0,5 ng/ml a 0,25 ng/ml. K BaF3/MLP-zalphal 1 buňkám bylo přidáno 100 pl ředěného mTPO. Celkový reakční objem byl 200 pl. Negativní kontroly byly připraveny paralelně pomocí mIL-3 free média bez přidání mTPO. Testovací desky byly inkubovány při 37 °C, 5% CO₂ po dobu 3 dnů. Po této době byla přidána Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) po 20 pl na jamku. Alamar Blue poskytuje fluorimetricky odečitatelnou hodnotu založenou na metabolické aktivitě buněk, která je v přímé souvislosti s buněčnou proliferaci. Srovnání poskytují negativní kontroly. Plotny se opět ponechají ínkubovat pří 37 °C, 5% CO₂ po dobu 24 hodin. Hodnoty fluorescence v jamkách desky se odečítají na readeru pro mikrotitracní desky Fmax (Molecular Devices Sunnyvale, CA) za užití programu Soft Max Pro při vlnové délce 544 (excitace) a 590 (emise).

Výsledky potvrdily signální schopnost íntracelulámí části receptorů zalphall, jelikož tromopoetinem indukovaná proliferace za koncentrací mTPO62 ng/ml a vyšších, přibližně desetkrát překročila hodnotu pozadí.

Příklad 3: Konstrukce expresního vektoru exprimujícího zalphal 1 úplné délky

Vlastní zalphall receptor byl izolován z plazmidu obsahujícího cDNA pro receptor zalphall (SEKV. ID. Č: 7) pomocí PCR sprimery ZC19905 (SEKV. ID.Č:19) a ZC 19906 (SEKV.ID.Č:20). Reakční podmínky byly následující: 95 °C po dobu 1 min; 35 cyklů při 95 °C po 1 min; 55 °C po dobu 1 min, 72 °C po dobu 2 min; následuje 72 °C po dobu 10 min+ potom při 10 °C uchovávání. PCR produkt byl analyzován na gelu z 1% nízkotající agarózy (Boehringer Mannheim) a byla izolována zalphal 1 cDNA o velikosti přibližně 1,5 kb pomocí Qiaquick™ gel extrakční ho kitu (Qiagen) podle instrukcí výrobce.

Purifikovaná zalphal 1 cDNA byla štěpena BamHI (Boehringer Mannheim) a EcoRI (BRL) podle instrukcí výrobce. Vlastní digest byl analyzován na gelu z 1% nízkotající agarózy (Boehringer Mannheim) a byl izolován naštěpený zalphal 1 fragment pomocí Qiaquick gel extrakčního kitu

-42CZ 302921 B6 (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Vzniklý naštěpený fragment zalphall byl vložen do expresního vektoru tak, jak je popsáno dále.

Recipientní expresní vektor pZP-5a byl naštěpen BamHI (Boehringer Mannheim) a EcoRI (BRL) podle instrukcí výrobce a přečištěn na gelu, jak bylo popsáno dříve. Fragment vektoru byl zkombinován s BamHI a EcoRI štěpeným fragmentem zalphal 1 izolovaným v předchozím kroku v ligační reakci za užití T4 Li gázy (BRL). Ligace se nechala inkubovat přes noc při 15 °C. Vzorek ligační směsi byl pomocí elektroporace vložen do DH10B ElectroMAX elektrokompetentních E.coli buněk (25 pF, 200 Ω, 2,3 V). Transformanty byly vysety na plotny s LB + ampicilinem; pomocí PCR byly testovány jednotlivé kolonie na výskyt MLP-zalphal 1 sekvence; užité primery byly ZC19905 (SEKV. ID. Č: 19) a ZC19906 (SEKV.ID. Č: 20). Podmínky PCR reakce byty tytéž, jako výše.

Potvrzení sekvence zalphal 1 bylo provedeno sekvenační analýzou za užití následujících příměrů: ZC12700 (SEKV.ID.Č: 10), ZC5020 (SEKV.ID.Č: 11), ZC20114 (SEKV.ID.Č:21), ZC19459 (SEKV.ID.Č:22), ZC19954 (SEKV.ID.Č:23) a ZC20116 (SEKV.1D.Č:24). Insert měl velikost přibližně 1,6 kb a měl úplnou délku.

Příklad 4: Proliferace zalphal 1 v BAF3 založená na testu s Alamar Blue

Konstrukce BEF3 buněk exprimujících MLP-zalphal 1 receptor

BaF3 buňky exprimující zalphal l receptor úplné délky byly konstruovány stejně jako v příkladu 2A, za užití 30 pg zalphall expresního vektoru, popsaného v příkladu 3 výše. Buňky BaF3 exprimující mRNA pro zalphal l receptor byly označeny jako BaF3/zalphal 1. Tyto buňky byly použity pro testování přítomnosti zalphal 1 Ligandu, tak jak to popisuje příklad 5 a 6.

Příklad 5: Testování přítomnosti zalphal 1 Ligandu pomocí BaF3/zalphal 1 buněk proliferačním testem za užití Alamar Blue

A. Aktivace primárních opičích splenocytů pro testování zalphal 1 Ligandu

Opičí splenocyty byly stimulovány k in vitro produkci kondiciovaného média pro testování výskytu aktivity zalphall Ligandu tak, jak je to popsáno níže. Opičí sleziny byly získány od 8 starých samic opic M. nesestrian. Sleziny byty rozmačkány a připravena suspenze jednotlivých buněk. Jednojademé buňky byly izolovány pomocí hustotního gradientu Ficoll-Paque PLUS (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Mononukleámí buňky byly vysety v koncentraci 2 x l O⁶ buněk/ml v médiu obsahujícím RPMI-1640 obohaceném 10% FBS a aktivovaném 5 ng/ml forbol-12-myristat-l3-acetátem (PMA) (Calbiochem, San Diego, CA) a 0,5 mg/ml lonomycinu™ (Calbiochem) na dobu 48h. Supematant ze stimulovaných opičích splenocytů byl použit pro proliferační test BaF3/zalphal 1 buněk, popsaný níže.

B. Testování přítomnosti zalphal 1 Ligandu pomocí BaF3/zalphal 1 buněk proliferačním testem s Alamar Blue

BaF3/zalphal 1 buňky byly centrifugovány a promyty mIL-3 free médium. Buňky byly promyty a centrifugovány celkem třikrát, čímž se zaručila nepřítomnost mIL-3. Potom byly buňky spočítány v hematocytometru. Buňky byly vysety na destičky s 96 jamkami, a to po 5000 buňkách najamku v objemu 100 gl najamku v mIL-3 free médiu.

Proliferace BaF3/zalphal 1 buněk se určila pomocí kondiciovaného média z aktivovaných opičích slezin (viz příklad 5A). Kondiciované médium bylo ředěno pomocí mIL-3 free média na koncentrace 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% a 0,375%. K BaF3/zalphal 1

-43CZ 302921 B6 buňkám bylo přidáno 100 μΐ ředěného kondiciovaného média. Celkový reakční objem byl 200 μΙ. Testovací desky byly inkubovány při 37 °C, 5% CO₂ po dobu 3 dnů. Po této době byla přidána Alamar Blue (Accumed, Chicago, IL) po 20 μΙ na jamku. Plotny se opět ponechaly inkubovat při 37 °C, 5% CO₂ po dobu 24 hodin. Hodnoty fluorescence v jamkách desky se odečítaly na readeru pro mikrotitrační desky Fmax (Molecular Devices Sunnyvale, CA) tak, jak je popsáno v příkladu 2.

Výsledky potvrdily proliferační odpověď BaF3/zalphal 1 buněk způsobenou přítomností aktivačního kondiciovaného média z opičích slezin. Měřená odpověď dosahovala přibližně čtyřnásobku hodnoty pozadí při 50% koncentraci. Netransfekované BaF3 buňky nevykázaly jako odpověď na tento faktor proliferaci, což je důkaz pro to, že tento faktor je specifický pro zalphal 1 receptor. Lidský primární zdroj pro izolaci zalphal 1 Ligandu

Každému ze šesti dárců bylo odebráno 100 ml krve. Krev byla odebírána do 10 x 10 zkumavek obsahujících heparin. Krev nashromážděná od 6 dárců (600 ml), byla zředěna 1 : 1 PBS a byla separována pomocí Ficoll-Paque^ PLUS (Pharmacia Biotech). Výtěžek lidských primárních buněk po separaci na gradientu ficolu byl 1,2 x 10⁹.

Buňky byly resuspendovány v 9,6 ml MACS pufru (PBS, 0,5% EDTA, 2mM EDTA). Bylo odebráno 1,6 ml buněčné suspenze a k ní bylo přidáno 0,4 ml CD3 mikročástic (Miltenyi Biotec, Aubum, CA). Směs byla inkubována 15 min při 4 °C. Buňky označené CD3mikročásticemi byly třikrát promyty 30 ml MACS pufru a potom resuspendovány ve 2 ml MACS pufru.

Sloupec VS+ (Miltenyi) byl připraven podle instrukcí výrobce. VS+ sloupec byl potom umístěn do magnetického pole generovaného VarioMACS (Miltenyi). Sloupec byl ekvilibrován 5 ml MACS pufru. Potom byly na sloupec aplikovány izolované primární lidské buňky. Buňky, které byly negativní na CD3, sloupcem prošly. Sloupec byl promyt 9 ml (3 x 3 ml) MACS pufru. Sloupec byl potom vyjmut z magnetického pole a náplň přemístěna do 15ml falkonky. CD3+ buňky byly eluovány přidáním 5 ml MACS pufru na sloupec a navázané buňky byly vytlačeny pomocí pístu dodávaného výrobcem. Inkubace buněk s CD3 magnetickými částicemi, promývání a kroky spojené s užitím VS+ sloupce se opakovaly pětkrát či vícekrát. Byly shromážděny výsledné CD3+ frakce ze šesti sloupcových separací. Celkový výtěžek CD3+ selektovaných lidských buněk byl 3 x 10⁸.

Ze shromážděných CD3+ lidských buněk byl odebrán vzorek pro barvení a testování buněk na dělícím fluorescenčním zařízení pro protilátky (FACS), čímž byl určena jejich Čistota. Z testovaných lidských buněk na CD3+ bylo 91 % na CD3+ pozitivních.

Lidské na CD3+ selektované buňky byly aktivovány inkubací v médiu o složení RPMI + 5%

FBS + PMA 10 ng/ml a lonomyctn 0,5 μΙ/ml (Calbiochem) po dobu 13 h při 37 °C. Supernatant z těchto CD3+ aktivovaných selektovaných buněk byl testován na aktivitu zalphall Ligandu postupem popsaným níže. Kromě toho CD3+ aktivované selektované lidské buňky byly použity k přípravě cDNA knihovny tak, jak je to popsáno v příkladu 6 dále.

B. Testování supematantu z aktivovaných CD3+ selektovaných lidských buněk na přítomnost zalphal 1 Ligandu pomocí BaF3/zalphal 1 buněk a testu s užitím Alamar Blue

BaF3/zalphal 1 buňky byly centrifugovány a promyty mIL-3 free médiem. Buňky byly promyty a centrifugovány celkem třikrát, čímž se zaručila nepřítomnost mIL—3. Potom byly buňky spo50 čítány v hematocy to metru. Buňky byly vysety na destičky s 96 jamkami, a to po 5000 buňkách na jamku v objemu 100 μΐ na jamku v mIL-3 free médiu. Proliferace buněk BaF3/Zalphal 1 byla posuzována pomocí kondiciovaného média zaktivovaných CD3+ selektovaných lidských buněk (viz příklad 5 C) ředěného mIL-3 free médiem na koncentrace 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% a 0,375%, K BaF3/zalphal 1 buňkám bylo přidáno 100 μΐ ředěného

-44CZ 302921 B6 kondiciovaného média. Celkový reakční objem byl 200 μΐ. Testovací desky byly inkubovány stejně, jako v příkladu 5B.

Výsledky potvrdily proliferační odpověď BaF3/zalphal 1 buněk způsobenou přítomností faktoru z aktivovaných CD3+ selektovaných buněk v kondiciovaném médiu. Měřená odpověď, byla-li měřena, dosahovala přibližně desetinásobku hodnoty pozadí při 50% koncentraci. Netransfekované BaF3 buňky nevykázaly jako odpověď na tento faktor proliferaci, což je důkaz pro to, že tento faktor je specifický pro zalphal 1 receptor. Kromě toho, rozpustný receptor zalpha 11 blokoval tuto proliferační aktivitu BaF3/zalphal 1 buněk (viz příklad 11).

Příklad 6: Klonování lidského zalphal 1 Ligandu z knihovny vytvořené z lidských CD3+ selektovaných buněk

Výzkum cDNA knihovny vytvořené z primárních lidských aktivovaných CD3+ selektovaných buněk přinesl isolovanou cDNA, která je novým členem rodiny cytokinů se strukturou skládající se ze svazku čtyř helixů. Tato cDNA kóduje zalphal 1 Ligand. cDNA byla identifikována pomocí testu na aktivitu zalphal l Ligandu provedeného pomocí zalphal 1 receptoru.

A. Vektor pro konstrukci knihovny z CD3+ selektovaných buněk

Vektorem pro konstrukci knihovny zCD3+ selektovaných buněk byl pZP7NX. Vektor pZP7NX byl konstruován následovně: Kódující oblast pro DHFR selekční markér ve vektoru pZP7 byla odstraněna Štěpením DNA Ncol a Pstl restrikčními enzymy (Boehringer Mannheim). NaŠtěpená DNA byla analyzována na gelu 1% agarózy, odpovídající produkt vyříznut a purifikován z gelu pomocí Qiagen Gel extrakčního kitu (Qiagen) podle instrukcí výrobce. DNA fragment, představující kódující oblast pro Zeocin selektivní markér, byl amplifikován pomocí PCR za užití primerů ZC13946 (SEKV,ID.Č:25) a ZC13945 (SEKV.ID.Č:26) a pZeoSV2(+) jako templátu. V primeru ZC13946 (SEKV.ID.Č:25) jsou další přidaná restrikční místa pro Pstl a Bell a v primeru ZC13945 (SEKV.ID.Č:26) jsou přidána místa pro restrikční enzymy Ncol a Sful. PCR fragment byl štěpen restrikčními enzymy Pstl a Ncol a klonován do vektoru pZP7 připraveného štěpením pomocí těch samých enzymů a následnou purifikaci z gelu. Tento vektor byl nazván pZP7Z. Potom byla z vektoru pZP7Z vyšte pěna pomocí Bell a Sful restrikčních enzymů oblast DNA kódující Zeocin. Vyštěpená DNA byla analyzována na 1% agaróze, odpovídající produkt vyříznut, purifikován a ligován s DNA fragmentem kódujícím oblasti pro Neomycín získaným štěpením vektoru pZem228 (uložen v American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Va; ATCC č. 69446) stejnými restrikčními enzymy (Bell a Sful).

Tento nový vektor byl označen pZP7N. V tomto vektoru je oblast kódující DHFR selekční markér nahrazena kódující oblastí pro Neomycín selekční markér z vektoru pZem228. Do vektoru pZP7a byl přidán fragment obsahující Xhol štěpné místo, čímž se vytvořil vektor vhodný pro účinné přímé klonování cDNA; tento nový vektor byl nazván pZP7NX. K přípravě vektoru pro cDNA bylo 20 pg pZP7NX štěpeno pomocí 20 jednotek EcoRl (Life Technologies Gaithersberg, MD) a 20 jednotkami Xhol (Boehringer Mannheim, Indianopolis, IN) po dobu 5 hodin pri teplotě 37 °C , potom 15 min inaktivaci restrikčních enzymů při teplotě 68 °C. NaŠtěpená směs se analyzovala na 0,8% gelu nízkotající agarózy IXTAE, čímž se oddělil přidaný fragment od vektoru. Proužek odpovídající vektoru byl vyříznut a naštěpen beta-Agarasou (New England Biolabs, Beverly, Ma) podle instrukcí výrobce. Po precipitaci ethanolem byl štěpený vektor resuspendován ve vodě v koncentraci 45 ng/ml a připraven tak pro li gac i CD3+ selektované knihovny popsané dále.

B. Příprava cDNA knihovny z primárních lidských aktivovaných CD3+ selektovaných buněk

Přibližně 1,5 x 10⁸ primárních lidských CD3+ selektovaných buněk stimulovaných ionomycin/PMA bylo izolováno centrifugaci následující po kultivaci při 37 °C po dobu 13 hodin (příklad

-45 CZ 302921 B6

5C). Z peletu byla izolována celková RNA pomocí Rneasy Midi kitu od Qiagenu, lne. (Valencia, CA). Dále byla izolována mRNA, a to z 225 mikrogramů celkové RNA pomocí MPG mRNA puriflkačního kitu od CPG lne. (Lincoln Park, NY). Bylo získáno 3,4 mikrogramů mRNA, ty byly převedeny na cDNA pomocí následujícího postupu.

První vlákno cDNA ze simulovaných lidských CD3+ selektovaných buněk bylo syntetizováno následovně: devět μΐ Oligo d(T)-selektované poly(A) CD3+ RNA v koncentraci 0,34 Bg/μΙ a 1,0 gg/μΐ primerů pro první vlákno ZC18698 (SEKV.ID.Č:27) obsahující restrikční místo Xhol bylo smícháno a zahřáto na 65 °C po dobu 4 minut a ochlazeno na ledu. Syntéza prvního vlákna io cDNA byla iniciována přidáním 9 μΐ pufru pro první vlákno (5 x SUPERSCRIPT pufr; Life

Technologies), 4 μΐ lOOmM dithiotreitolu a 2 μΙ roztoku deoxynukleotidtrifosfátů obsahujících lOmM koncentraci každého z dATP, dGTP, a dTTP a 5-methyl-dCTP (Pharmacia Biotech lne.) do směsi obsahující RNA-primer, Reakční směs se inkubovala při 45 °C po dobu 4 minut, poté následovalo přidání 8 μΙ 200 U/μΙ Superscriptll, Rnase H-reverzní transkriptázy (Life Technolo15 gies). Reakce byla inkubována při 45 °C po dobu 45 minut, poté následovala inkubace za postupně se zvyšující teploty (1 °C každé 2 min) do 50 °C, při které byla reakce ponechána po dobu 10 minut. K denaturaci možných sekundárních struktur a k umožnění dalšího prodlužování cDNA, reakční směs byla zahřívána na 70 °C po dobu 2 minut, potom ochlazena na 55 °C po dobu 4 minut. Potom byly přidány 2 μΐ SuperscriptllRT a reakce se nechala inkubovat dalších

15 minut, po kterých následovala další 15 min inkubace za postupně se zvyšující teploty (1 °C každou 1 min) do 70 °C. Nezabudované nukleotidy byly odstraněny z cDNA pomocí dvojnásobné přecipitace v přítomnosti 2 pg glykogenového nosiče, 2,0M octanu amonného a 2,5 objemu ethanolu. Následně byla cDNA promyta 70% ethan o lem. cDNA byla resuspendována v 98 μΙ vody, čímž byla připravena k syntéze druhého vlákna.

Druhé vlákno bylo syntetizováno na prvním vlákně cDNA za podmínek, které podporovaly užití prvního vlákna jako primerů pro vlákno druhé. Výsledkem syntézy bylo vytvoření vlásenkové formace. Reakce pro syntézu druhého vlákna obsahovala 98 μΐ cDNA prvního vlákna, 30 μΙ 5 x polymerázové ho pufru I (lOOmM Tris: HC1, pH 7,5; 500mM KCI; 25mM MgCL; 50mM (NH^SGO, 2 μΙ lOOmM dithiothreitolu, 6 μΙ roztoku obsahujícího lOmM koncentraci každého z deoxynukleotidtrifosfátů, 5 μΐ 5mM b-NAD, 1 μΐ 3 U/μΙ E. coli DNA ligázy (New England Biolabs lne.) a 4 μΐ 10 U/ml E. coli DNA polymerázy 1 (New England Biolabs lne.). Reakce byla připravena i probíhala za pokojové teploty po dobu 2 min, poté byly přidány 4 μΙ 3,8 U/μΙ RnaseH (Life Technologies). Reakce byla inkubována po dobu dvou hodin při teplotě 15 °C a potom 15 minut při teplotě pokojové. Do reakční směsi bylo potom přidáno 10 μΐ 1M TRIS pH 7,4 a směs byla dvakrát extrahována směsí fenol/chloroform. Organická fáze byla potom ještě znovu extrahována 50 μΐ TE (lOmM TRIS pH 7,4; lmM EDTA) a výtěžek přidán k ostatní látce získané z vodních frakcí a následovala precipitace za užití ethanolu v přítomnosti 0,3M octanu sodného. Pelet byl promyt 100 μΐ 70% etanolu a usušen na vzduchu, poté resuspendován ve vodě. Jedno vláknová DNA s vlásenkovou strukturou byla štěpena nukleasou z Phaseolus aureus. Reakční směs obsahovala 40 μΐ druhého vlákna cDNA, 5 μΐ 10 x koncentrovaného pufru pro nukleasu z Phaseolus aureus (Life Technologies), 5 μΙ nukleasy z Phaseolus aureus (Pharmacia Biotech Corp.), nareděné na IU/μΙ v lx koncentrovaném pufru pro nukleasu z Phaseolus aureus. Reakce probíhala 45 min při teplotě 37 °C. Reakce byla ukončena přidáním 10 μΐ 1 M Tris: HC1, pH 7,4. Potom následovala extrakce pomocí směsi fenol/chloroform a poté jen užitím chloroformu, jak je to popsané výše. Následně po extrakcích, cDNA byla precipitována ethanolem v přítomnosti 0,3M octanu sodného. Pelet byl promyt 100 μΙ 70% ethanolu a usušen na vzduchu, poté resuspendován v 38 μΐ vody. Resuspendovaná cDNA byla žatu pěna pomocí T4 DNA polymerázy. cDNA rozpuštěná v 38 μΐ vody byla smíchána s 12 μΐ 5 x koncentrovaného T4 DNA polymerázového pufru (250mM Tris:HCl, pH 8,0; 250mM KC1, 25mM MgCt₂), 2 μΐ 1 U/μΙ T4 DNA polymerázy (Boehringer Mannheim). Po inkubaci trvající 45 min při teplotě 15 °C byla reakce ukončena přidáním 30 μΙ TE pufru, potom následovala extrakce pomocí směsi fenol/chloroform a poté jen užitím chloroformu, a zpětná extrakce s 20 μΙ TE, jak je to popsané

-46CZ 302921 B6 výše. DNA by ta precipitována ethanolem v přítomnosti 0,3 M octanu sodného a 2 μΙ nosiče Pel let Paint (Novagen) a pelet byl resuspendován ve vodě.

Na 5'konce cDNA popsané výše byly ligovány EcoRl adaptéry, které usnadnily klonování do expresního vektoru. 11 μΐ cDNA a 4 μΐ 65 pmol/μΙ EcoRl hemifosforylovaného adaptéru (Pharmacia Biotech) byly smíchány s 5 μΐ 5 x koncentrovaného ligačního pufru (Life Technologies), 2 μΐ lOmM ATP a 3 μΐ HJ/μΙ T4 DNA ligázy (Life Technologies), 1 μΐ 10 x koncentrovaného ligačního pufru (Promega), 9 μΐ vody. Ředění v 1 x koncentrovaném pufru bylo použito proto, aby se zabránilo vymizeni barvy peletu získané při precipitaci. Reakce se inkubovata 9 hodin na vodní lázni v rozsahu 10 až 22 °C, potom ještě 45 min při 25 °C. Reakce se ukončila inkubací při 68 °C po dobu 15 min.

K usnadnění přímého klonování cDNA do expresního vektoru byla cDNA štěpena Xhol, čímž vznikla cDNA mající na 5 konci EcoRl kohesivní konec a na 3' konci Xhol kohesívní konec. Xhol restrikční místo na 3‘konci cDNA byla zavedeno pomocí primeru ZC18698 (SEKV:ID:Č:27). Štěpení pomocí restrikčních enzymů bylo provedeno v reakční směsi obsahující 35 μΙ ligační směsi popsané výše, 6 μΐ 10 x H pufru (Boehringer Mannheim Corp.), 1 μΐ BSA o koncentraci 2 mg/ml (Biolabs Corp.), 17 μΐ vody a 1,0 μΙ Xhol (Boehringer Mannheim) o koncentraci 40 U/μΙ. Štěpení trvalo 1 h při 37 °C. Reakce se ukončila inkubací při 68 °C po dobu 15 min, následovalo srážení ethanolem popsané výše, promytí a sušení a nakonec resuspendace v 30 μΐ vody.

Re suspendovaná cDNA se zahřívala na 65 °C po dobu 5 minut a ochladila se v ledu. Potom se přidaly 4 μΐ 5 x koncentrované nanášect barvy (Research Genetics Corp.) a cDNA se nanesla na 0,8% nízkotající agarózový 1 x TAE gel (SEA PLAQLE GTG™ low melt agaróze; FMC Corp.) a podrobila se elektroforéze. Kontaminující adaptéry a cDNA velikosti pod 0,6 kb se vyřízly z gelu. Elektrody byly přepólovány, dírky v gelu byly zality roztavenou agarózou, byl vyměněn pufr a cDNA se elektroforézovala, až se zakoncentrovala blízko počáteční nanáŠecí linie. Oblast gelu obsahující cDNA se vyřízla a vložila do mikrozkumavky, agaróza se roztavila zahřátím na 65 °C po dobu 15 minut. Následnou ekvilibrací vzorku zahřátého na 45 °C s 2 μΐ Beta—agarózy I o koncentraci. HJ/μΙ (Biolabs, lne.) a další inkubací po dobu 90 min pří 45 °C se rozložila agaróza. Po inkubaci se přidala ke vzorku jedna desetina objemu 3M octanu sodného a směs se nechala inkubovat na ledu po dobu 15 min. Vzorek se centrífugoval při 14000 x g po dobu 15 min při pokojové teplotě, tím se odstranila nerozložená agaróza. cDNA se presrážela ethanolem, promyta 70% ethanolem, usušila na vzduchu a resuspendovala ve 40 μΐ vody.

K určení optimálního poměru cDNA a vektoru bylo provedeno několik ligací a elektroporaci. Ve zkratce, 2 μΐ 5 x koncentrovaného ligačního pufru (Life Technologies), 1 μΐ 10mM ATP, 1 μΙ pZP7NX Štěpeného pomocí EcoRl—Xhol, 1 μΙ DNA ligázy ředěné na 0,25 L/μΙ (Life Technologies) vody do 10 μΐ a 0,5, 1,2 nebo 3 μί cDNA se smíchalo ve 4 jednotlivých ligacích, inkubovalo se při 22 °C po dobu 4 hodin, 68 °C po dobu 20 minut, sráželo acetát-ethanolem, promylo, sušilo a resuspendovalo se do 10 pL. Jeden mikrolitr každé ligace se elektroporovaí do 40 μΙ DH10B ElectroMax™ elektrokompetentních bakterií (Life Technologies) pomocí 0,1 em kyvety (Biorad) a přístroje Genepulser, pulse controllerT (Biorad) snastavením 2,5 KV, 25IF, 200 ohmů. Tyto buňky byly ihned resuspendovány v 1 ml SOC média (Manniatis a další, již citováno), následovalo přidání 500 μΐ 50% glycerol-SOC jako uchovávacího média. Tyto g lyce rol ové zásobní konzervy byly zmraženy v několika alikvótech při - 70 °C. Alikvót každých buněk byl roztaven a vyset postupně na LB-agarové plotny s ampici línem v koncentraci 100 pg/ml. Počet kolonií indikoval nejlepší poměr CD3+ cDNA k pZP7NX vektoru. Tento poměr byl 1 μί ku 45 ng; tato ligace poskytla 4,5 milionů primárních klonů.

Za účelem výzkumu této knihovny pomocí BaF3-zalphal 1 proliferačního testu (příklad 5) byla glycerinová konzerva popsaná výše naředěna do tekutých kultur po 100 až 250 klonech na jamku v mikrotitračních deskách s hlubokými jamkami, buňky se nechaly růst 24 hodin při 37 °C za

-47 CZ 302921 B6 třepání a potom byl plazmid izolován pomoct Qiagen kitu podle instrukcí výrobce. Takto získaná DNA byla potom transfekována do BHK buněk, média se nechala kondiciovat po dobu 72 h, sklidila se a aplikovala na 5K BaF3-zalphal 1 buňky. Po 72 hodinách se odečítala proliferace pomocí fluorescenčního testu s užitím Alamarské modři (příklad 5B a příklad 2B).

K výzkumu knihovny pomocí klonování sekreční pasti, byl komplex vzniklý amplifikaci knihovny transfekován do COS-7 buněk. Na 110 ploten o průměru 15 cm s LB-agarem + ampicilin (100 pg/ml) + methicilinem (10 pg/ml) bylo vyseto 4,8 milionů klonů. Po kultivaci ploten přes noc při 37 °C se bakterie sklidily pomocí škrabky a peletovaly se. Z peletovaných bakterií byla extrahována plazmidová DNA pomocí kitu Nucleobond-giga (Clontech) podle instrukcí výrobce. Plazmid byl potom použit na transfekci COS-7 buněk (ATCC. č. CRL 1651) na destičkách a tyto byly testovány pomocí techniky sekreční pasti popsané dále v textu (příklad 12).

Příklad 7: Expresní klonování lidského zalphal 1 Ligandu

Glycerolové konzervy z knihovny aktivovaných lidských CD3+ selektovaných buněk (příklad 6) byly přidány k bujónu Super Broth II (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) + 0,1 mg/ml ampicilinu (amp) v koncentraci 250 buněk na 800 mikrolitrů. E. coli byly ponechány ekvilibrovat po dobu 24 h při pokojové teplotě. Během inokulace bylo vyseto 400 mikrolitrů na plotny s LB + amp, tím se zjistil aktuální titr inokulace. Po 24 h byly buňky na plotnách spočítány a potom se určila konečná koncentrace SuperBrothlI™ + E. coli. Finální koncentrace byla upravena na 250 buněk na 1,2 ml. Celkový objem pro inokulaci byl 6 l, byly inokulovány 3x21. Média byla potom vyseta na 96jamkové bloky s hlubokými jamkami (Qiagen). Vysetí buněk se dělo pomocí osmikanálového dávkovače Q-Fil 12T (Genetix, Christchurch, Dorset, UK). Buňky E.coli byly kultivovány přes noc při teplotě 37 °C a třepání při 250 otáček/min na třepačce New Brunswick Scientific Innova 4900 multi-tíer environment shaker. E. coli byly eentrifugovány při 3000 rpm v centrifuze Beckman GS-6KR. Tyto pelety z E. coli byly zamraženy při -20 C nebo se použily čerstvé pro izolaci (miniprepů) plazmidu DNA. Každý pelet obsahuje přibližně 250 cDNA klonů odvozených z knihovny lidských CD3+ selektovaných buněk.

Z této množiny 250 cDNA klonů byly izolovány kitem QIAprep™ 96 Turbo Miniprep kit (Qiagen). Plasmidová DNA se eluovala 125 μΙ TE pufru (lOmM Tris pH 8, ImM EDTA). Tato plazmidová DNA byla potom použita k transfekci BHK buněk.

Transfekce BHK

BHK buňky byly vysety na 96jamkové kultivační desky v hustotě 12 000 buněk na jamku v objemu 100 μΐ na jamku. Kultivační médium bylo DMEM (GibcoBRL), 5% tepelně inaktivované fetální hovězí sérum, 2 mM L-glutamin (GibcoBRL), lx PSN (GibcoBRL), ImM pyruvát sodný (GibcoBRL). Následující den byly BHK buňky jednou promyty 100 μΐ SFA. SFA je bezsérové médium, které se skládá zDMEM/F12 (GibcoBRL), 2mM GlutaMax™ (GibcoBRL), ImM pyruvátu sodného, 10 μg/ml transferinu, 5 μg/ml insulinu, 10 μg/ml fetuinu, 2 μg/ml selenu, 25mM HEPES (Gibco/BRL), 100μΜ neesenciálních aminokyselin (GibcoBRL).

Směs DNA/Lipofectamine™ se připravila následovně: 2,2 μΐ Lipofectamine™ reagencie (GibcoBRL) se smíchalo s 102,8 μΙ SFA za pokojové teploty; přibližně 5 μΐ plazmidové DNA (200 ng/μΙ) bylo potom přidáno do směsi Lipofectamine™/SFA, čímž se vytvořila směs DNA/Lipofectamine™, která se nechala inkubovat při pokojové teplotě po dobu 30 minut SFA médium bylo z BHK buněk odstraněno a buňky se inkubovaly s 50 μ| směsi DNA/Lipofectamine™ po dobu 5 hodin při teplotě 37 °C s 5% CO₂. Padesát μΐ směsi DNA/Lipofectamine™ bylo přidáno do každé jamky z dvojice jamek obsahujících BHK buňky, to znamená, že transfekce byla prováděna v duplikátech.

-48CZ 302921 B6

Po 5h inkubaci BHK buněk ve směsi DNA/Lipofectamine™ se směs odstranila a přidalo se 100 μΐ kultivačního média. Buňky se inkubovaly přes noc, médium bylo odstraněno a doplněno bylo 100 μΙ čerstvého kultivačního média.

Po kultivaci buněk trvající 72 hodin, byla odebrána kondiciovaná média a zmražena na -80 °C minimálně po dobu 20 minut, potom se nechala rozmrznout a testovaly se 50μ1 alikvoty v zalphal l/BaF3 proliferačním testu, který byl popsán v příkladu 2B a příkladu 5, čímž se identifikovaly ze zásobních 250 klonů ty, které vykazovaly ligandovou aktivitu. V jednotlivých io testech bylo prozkoumáno třicet pět 96-jamkových desek. Tyto testy reprezentovaly přibližně

250 cDNA/jamku nebo celkově 840 000 cDNA. Z tohoto počtu bylo v 54 jamkách nalezeno kondicíované médium pozitivně reagující v proliferačním testu. Kondiciovaná média z těchto pozitivních jamek byla ještě jednou otestována v druhém testu (sekreční past) v přítomnosti a bez rozpustného receptoru (viz příklad 12), Zalphal 1CEE rozpustný receptor (příklad 10A) byl použit v konečné koncentraci okolo 1 pg/ml. Ve všech pozitivně reagujících jamkách se podařilo neutralizovat aktivitu přidáním rozpustného zalphal 1 receptoru. Toto je důkaz, že tyto jamky obsahují cDNA pro zalphal 1 Ligand. Pro další analýzy byly vybrány čtyři pozitivní jamky a z nich byly izolovány jednotlivé cDNA, které by mohly kódovat zalphal 1 Ligand. Byly to následující vzorky 45C5, 46G11, 40H12, a ÓOAL

Pro každý z těchto čtyř vzorků se provedla transformace 1 μΐ DNA do ElectroMax™ DH 10B buněk (GibcoBRL) pomocí elektroporace. Transformanty byly vysety na plotny s LB+ amp (100 pg/ml) + methicillin (10 pg/ml) tak, aby vytvořily jednotlivé kolonie. Z každé elektroporované dávky bylo vypíchnuto 960 kolonií do 96jamkové desky obsahující 1,2 ml

2? SuperBrothlI™ na jamku. Tyto desky byly očíslovány #1 až 10 pro každý zkoumaný vzorek (45C5, 46G11, 40H12, a 60A1). Desky byly kultivovány přes noc a pomocí tniniprepů, postupu izolace DNA v malém měřítku popsaném výše, byla získána plazmidová DNA. Z vybraných následujících vzorků 45C5, 46G11, 40H12 a 60A1 byla plazmidová DNA transfekována do BHK buněk, jak bylo popsáno dříve. Pro vzorek 45C5 byl aplikován fast track protokol, který umožňuje urychlit identifikaci cDNA zalphal 1 Ligandu. BHK buňky byly transfekovány plazmidovou DNA ze zkoumané desky tak, jak bylo popsáno dříve. Směs DNA/Lipofectamine ^Mbyla odstraněna po pěti hodinách inkubace a k buňkám bylo přidáno kultivační médium. Jelikož transfekce byly dělány v duplikátech, kultivační média se sklízela následující den po 24 hodinách kultivace z jedné transfekované BHK desky a následující den po 48 hodinách inkubace ze zbývající desky. Kondiciovaná média odebraná po 24 h inkubace byla testována na aktivitu zalphal 1 Ligandu pomocí proliferačního testu, tak jak bylo popsáno dříve.

Izolovaná plazmidová DNA z 45CS zkoumaného vzorku - desek očíslovaných #1-4 byla shromážděna a testována na možnost vazby rozpustného zalphal 1 receptoru kjeho ligandům postupem již dříve uvedené sekreční pasti (viz příklad 12, dole). Z celkového množství 384 sekvencí bylo identifikováno osm pozitivních klonů. Výsledky z proliferačních testů, které potvrdily výskyt aktivity zalphal 1 Ligandu, byly v dobré shodě s výsledky získanými postupem sekreční pasti (viz příklad 12). Vedle těchto postupů byla plazmidová DNA z minipreparací vzorků z desek 1 až 4 připravených ze vzorku 45C5 sekvenována a byla určena DNA sekvence každého z 384 klonů.

Několik klonů, které byly identifikovány jako pozitivní v proliferačním testu a testu sekreční pasti bylo rovněž sekvenováno pomocí následujících primerů: ZC 14063 (SEKV.ID.Č:28), ZC7764a (SEKV.ID.Č:38), ZC7764b (SEKVTD.Č:39), ZC22034 (SEKV.ID.Č40) a ZC22035 (SEKV.ID.Č :41). Polynukleotidová sekvence zalphal 1 Ligandu byla úplné délky (SEKV.ID.Č: 1) ají odpovídající aminokyselinová sekvence je znázorněna v (SEKV.ID.Č:2).

-49CZ 302921 B6

Příklad 8: Konstrukce savčího expresního vektoru, který exprímuje zalphal 1 rozpustné receptory: zalphal 1 CEE, zalphal 1 CFLG, zalphal 1 CHIS a zalphal 1 -Fc4

A. Konstrukce savčího expresního vektoru, který obsahuje zalphal 1 CEE, zalphal 1 CFLG, zalphal 1 CHIS

Byl připraven expresní vektor rozpustné extracelulámí domény zalphal 1 polypeptidu, pC4zalphal 1CEE, ve kterém byl nalezen konstrukt odpovídající za expresi zalphal 1 polypeptidu obsahujícího předpokládaný iniciační methionin a zkrácenou sousední předikovanou transmembránovou doménu a C-koncovou značku Glu-Glu (SEKV.1D.Č:29).

Fragment o velikosti 700 bp byl připraven PCR metodou. Tento zalphal 1 DNA fragment byl vytvořen užitím primerů o následujících sekvencích: ZC19931 (SEKV.ID.Č:30) a ZC19932 (SEKV.ID.Č:31). Pomocí těchto primerů byla do konstruktu přidána Asp718 a BamHI restrikční místa. Plazmid obsahující zalphal 1 receptor cDNA (SEKV.ID.Č:7) byl použit jako templát. PCR amplifikace zalphal 1 fragmentu byla provedena podle následujícího schématu: dvacet pět cyklů při 94 °C po dobu 0,5 minuty; pět cyklů pri teplotě 94 °C po dobu 10 sekund, 50 °C po 30 sekund, 68 °C po 45 sekund, následováno uchovávací teplotou 4 °C. Reakční směs byla purifikována postupem ehloroform/fenolové extrakce a isopropanolové precipitace a poté naštěpena Asp718 a BamHI (Gibco BRL) podle instrukcí výrobce. Na agarózové elektroforéze byl vizualizován proužek předpokládané velikosti 700 bp, po vyříznutí tohoto proužku z něj byla izolována DNA pomocí Qiaexll™ purifikačního systému (Qiagen) podle instrukcí výrobce.

Takto získaná DNA byla subklonována do plazmidů pC4EE, který byl štěpen BamHI a Asp718. pC4zalphal 1CEE expresní vektor využívá nativní zalphal 1 signální peptid a přidává k němu značku Glu-Glu (SEKV.ID.Č:29) na C konec extracelulámí části polynukleotidové sekvence kódující zalphal 1 polypeptid. Plazmid pC4EE je savčí expresní vektor obsahující expresní kazetu mající myší metallothionein-1 promotor, mnohočetné restrikční klonovací místo pro vložení kódujících sekvencí, stop kodon a terminátor z lidského růstového hormonu. Plazmid dále také obsahuje počátek replikace pro E. coli, savčí selekční expresní markér obsahující SV40 promotor, zesilovač a počátek replikace, gen DHFR a SV40 terminátor.

Přibližně 30 ng restrikčními enzymy štěpeného zalphal 1 inzertu a přibližně 12 ng štěpeného vektoru bylo Hgováno přes noc při 16 °C. Jeden mikrolitr z každé ligační reakce byl samostatně elektroporován do DH10B kompetentních buněk (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) postupem podle instrukcí výrobce. Buňky byly vysety na LB plotny obsahující 50 mg/ml ampicilinu a byly inkubovány přes noc. Kolonie byly testovány restrikční analýzou DNA připravené ze 2 ml tekuté kultury jednotlivých kolonií. Inserce sekvence do pozitivních klonů byla ověřena sekvenační analýzou. Izolace plazmidů ve velkém měřítku byla provedena pomocí QIAGEN® Maxi prep kitu (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Stejný proces byl použit k přípravě rozpustného zalphal 1 receptoru s C—koncovou histidinovou značkou (his tag, skládající se ze šesti His zbytků ve spojité sekvenci) a nebo mající C-koncovou značkou (FLAG) obsahující SEKV.ID.Č:37), zalphal 1CFLAG. K přípravě těchto konstruktů se použil drive zmíněný vektor mající buď HIS či FLAG značku na místě značky Glu-Glu (SEKV. 1D.Č:29).

B. Konstrukce savčího expresního vektoru, kteiý obsahuje rozpustný zalphal 1 receptor zalphal 1-Fc4

Expresní plazmid obsahující všechny části polynukleotidu kódujícího zalphal 1 byl sestrojen cestou homologní rekombinaee. Extracelulámí doména zalphal 1 receptoru byla fúzována k Fc oblasti odvozené z lidského IgG, která je označena jako Fc4 (SEKV.ID,Č:33), která obsahuje mutaci, jež zabraňuje vazbě na Fc receptor. Fragment zalphal 1 cDNA byl izolován pomocí PCR, která zahrnovala polynukleotidové sekvence z extracelulámí domény zalphal 1 receptoru. Dva primery, které byly použity k přípravě zalphal 1 fragmentu byly: (1) primery pro PCR, kde každý žních obsahoval ve směru 5' k 3'konci: 40 bp kvektoru přidané sekvence (5' konec inzertu)

-50CZ 302921 Β6 a 17 bp odpovídajících 5' konci zalphal 1 extracelulámí domény (SEKV.ID.Č;32) a (2) 40 bp 5' konce polynukleotidové sekvence odpovídající Fc4 (SEKV.ID.Č:33) a 17 bp odpovídajících 3'konci zalphal l extracelulámí domény (SEKV.ID.Č:34). Fragment Fc-4 pro fúzi byl připraven obdobným způsobem. Dva primery užité pro přípravu Fc-4 fragmentu byly: (1) 5 primer obsahující 40 bp sekvence ze 3'konce zalphal l extracelulámí domény a 17 bp z 5' konce Fc4 (SEKV.ID.Č:35); a (2) 3' primer obsahující 40 bp z vektorové sekvence (3' inzertu) a I7bp z 3' konce Fc4 (SEKV.ID.Č:36).

PCR amplifikace všech reakcí popsaných výše probíhala dle následujícího reakčního schématu: jeden cyklus při 94 °C po dobu 2 minut; dvacet pět cyklů při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund, 60 °C po 30 sekund, 72 °C po dobu 1 minuty; jeden cyklus při 72 °C po dobu 5 minut; následováno uchovávacím cyklem při 4 °C. Deset mikrolitrů ze 100 μΙ PCR reakční směsi bylo analyzováno na 0,8% LMP agarózovém gelu (Seaplaque GTG) v 1 x TBE pufru. Zbývajících 90 μΐ PCR reakce bylo precipitováno přidáním 5 μΐ 1M NaCI a 250 μΙ absolutního ethanoíu. Použitý expresní vektor byl odvozen od plazmidu pCZR199 odvozeného od pZP9 (ATCC Deposit č. 98668). Plazmid byl štěpen Smál (BRL). Expresní vektor byl odvozen od plazmidu pCZR199 a je to savčí expresní vektor obsahující expresní kazetu mající CMV okamžitý časný promotor, konsenzuální intron z lokusu pro variabilní oblast myšího imunoglobulinu těžkého řetězce, mnohočetné kionovací místo pro viožení klonovaných sekvencí, stop kodon a termiriátor z lidského růstového hormonu. Plazmid dále také obsahoval počátek replikace pro E. coli, savčí selekční expresní markér obsahující SV40 promotor, zesilovač a počátek replikace, gen DHFR a SV40 terminátor. Expresní vektor byl konstruován z pCZR199 náhradou metallothioneinového promotoru za CMV ihned působící časný promotor.

Sto mikrolitrů kompetentních kvasinkových buněk. (5. cerevisiae) bylo smícháno s 10 μΐ obsahujícími přibližně 1 μg každého ze zalphal 1 a Fc4 inzertů a 100 ng restrikčním enzymem Smál (BRL) štěpeného expresního vektoru bylo přenášeno do 0,2 cm elektroporační kyvety. Na směs kvasinek/DNA bylo působeno elektrickými pulzy o parametrech 0,75 kV (5 kV/cm), maximální hodnotě ohmů, 25 pF. Do každé kyvety se přidalo 600 μΐ 1,2M sorbitolu a kvasinky byly vysety ve dvou 300 μΙ alikvotech na dvě URA-D plotny a ponechaly se inkubovat při 30 °C.

Po 48 hodinách inkubace byly Ura+ kvasinkové transformanty z jednotlivých ploten resuspendovány v 1 ml vody a rychle cen tri fugo vány, aby byl získán pelet. Buněčný pelet byl resuspendován v 1 ml lysačního pufru (2% TritonX-100, 1% SDS, lOOmM NaCI, lOmM TRIS, pH 8,0, ImM EDTA). Pět set mikrolitrů lyzační směsi bylo dáno do Eppendorfcvy zkumavky (eppendorfky) obsahující 300 μΙ kyselinou promytých skleněných kuliček a 200 μΐ směsi fenol/chloroform, směs byla podrobena vortexování v jednom i nutových intervalech, dvakrát či třikrát, následovala centrifugace po dobu 5 minut v centrifuze na eppendorfky při maximální rychlosti. Tři sta mikrolitrů vodné fáze bylo přemístěno do čisté zkumavky a DNA se přec i pito val a pomocí 600 μΐ ethanoíu (EtOH), potom byla centrifugována po dobu 10 minut při 4 °C. DNA pelet byl resuspendován ve 100 μΙ vody.

Transformace elektrokompetentních E. coli buněk (DH10B, GibcoBRL) byla provedena s 0,5-2 ml kvasinkové DNA a 40 μΐ DH10B buněk. Buňky byly podrobeny působení elektrického pulzního pole při 2,0 kV, 25 mF a 400 ohmech. Po elektroporaci byly buňky vysety v 1 ml SOC (2% Baqcto™ Trypton (Difco, Detroít, MI), 0,5% kvasničný extrakt (Difco), lOmM NaCI, 2,5mM KC1, lOmM MgCl₂, 10 mM MgSO₄, 20mM glukóza) v 250μΙ alikvotech na čtyři LB AMP plotny (LB bujón (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/L ampicilin.

Jednotlivé kmeny obsahující správné expresní konstrukty zalphal ! Fc4 byly testovány pomocí restrikčního štěpení, a tak byla ověřena přítomnost zalphal 1-Fc4 inzertu a potvrzeno, že jednotlivé různé části DNA sekvencí jsou správně propojeny jedna s druhou. Inzerty pozitivních klonů byly podrobeny sekvenční analýze. Izolace plazmidových DNA byla učiněna pomocí Qiagen Maxi kit (Qiagen) podle instrukcí výrobce.

-51 CZ 302921 Β6

Příklad 9: Transťekce a exprese polypeptidu zalphal 1 rozpustného receptorů

A. Savčí exprese rozpustného zalphall receptorů zalphal 1CEE, zalphal 1CFLG a zalphal ICHIS

Buňky BHK 570 (ATCC No. CRL-I0314), pasáž 27, byly vysety v hustotě 1,2 x 10^Ď buněk/jamka (6-jamkové desky) v 800 μΙ bezsérového (SF) DMEM média (DMME, Gibco/BRL High Glucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Buňky byly transfekovány expresními plazmidy obsahujícími zalphal 1CEE, zalphal 1CFLG nebo zalphal ICHIS popsanými výše (viz příklad 8), za užití Lipofectin'* (Gibco BRL), v bezsérovém médiu (SF) DMEM. Tři mikrogramy zalphal 1CEE, zalphal 1CFLG nebo zalphall CHIS zalphall CHIS byly jednotlivě naředěny do 1,5 ml zkumavek na celkový objem 100 μΐ v SF DMEM. V jiné zkumavce byla připravena následující směs: 15 μΐ Lipofectin™ (Gibco BRL), 100 μΐ SF DMEM. Směs Lipofectin™ se inkubovala pri pokojové teplotě po dobu 30-45 minut. Potom byla přidána směs DNA a nechala se inkubovat při pokojové teplotě asi 10-15 minut.

Celá směs DNA: Lipofectin™ byla přidána k vysetým buňkám a byla přes ně rovnoměrné distribuována. Buňky byly inkubovány pri 37 °C přibližně pět hodin, potom byly přeneseny na jednotlivé plotny o průměru 150 mm (MAXI plates) v celkovém objemu 30 ml DMEM/ 5% fetální hovězí sérum (FBS) (Hyclone, Logan, LT). Plotny byly inkubovány při 37 °C, 5% CO₂, přes noc a směs DNA: Lipofectin byla nahrazena následující den selekčním médiem (5% FBS/DMEM s 1 μΜ methotrexátem (MTX)).

Přibližně 10 až 12 dní po transfekci byly plotny promyty 10 ml SF DMEM. Promývací média byla odsáta a nahrazena 7,25 ml bezsérového DMEM. Sterilní teflonová síťka - tkanina (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) předvlhěená v SF DMEM byla položena na klonované buněčné kolonie. Sterilní nitrocelulosový filtr predvlhčený v SF-DMEM byl potom položen na tkaninu. Orientačními značkami opatřené nitrocelulosové membrány byly potom přeneseny na kultivační misku. Misky se potom inkubovaly po dobu 5 až 6 hodin pri 37 °C, 5% CO₂v inkubátoru.

Po inkubaci byly filtry/tkanina vyjmuty a média odsáta a nahrazena 5% FBS/DMEM s 1 μΜ MTX. Filtry byly potom zablokovány roztokem 10% netučného mléka/Westem A pufrem (Western A: 50mM Tris pH 7,4, 5mM EDTA, 0,05% NP-40, 150mM NaCl a 0,25% želatina) po dobu 15 minut při pokojové teplotě na třepačce. Filtry byly potom inkubovány s anti-Glu-Glu, anti-FLAG¹**, nebo anti-HIS protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP konjugáty), ředěnou v 2,5% netučném mléku/Western A pufru. Inkubace trvala jednu hodinu při pokojové teplotě na třepačce. Filtry byly potom pro mývány třikrát za pokojové teploty Western A pufrem po dobu 5 až 10 minut najedno promývání. Filtry byly potom vyvolány pomocí ultra ECL reagencie (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) podle návodu výrobce a vizualizovány na přístroji Lumi-Imager (Roche Corp.).

Pozitivní exprimující klonované kolonie byly mechanicky vypíchány do 12jamkové desky v jednom mililitru 5% FCS/DMEM s 5 μΜ MTX a nechaly se vyrůst do shluků.

Vzorky kondicíovaného média byly potom testovány na úroveň exprese pomocí SDS-PAGE a Western analysy. Pro každý konstrukt byly vybrány tři klony s nejvyšší hladinou exprese. Dva klony z vybraných tří byly zamrazeny jako záloha a jeden byl namnožen pro zkoušku na obsah mykoplazmat a pro testování možnosti napěstování ve velkém průmyslovém měřítku.

-52 CZ 302921 B6

B. Savčí exprese rozpustného zalphal 1 receptoru zalphal 1-Fc4

Buňky BHK 570 (ATCC No. CRL-10314) byly vysety na tkáňové kultivační misky o průměru 10 cm a nechaly se narůst přibližně do 50 až 70% hustoty. Kultivace probíhala přes noc při 37 °C v atmosféře s 5% CO₂ v DMEM/FBS médiu (DMEM, GibcoBRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) s 5% fetálním hovězím sérem (Hyclone, Logan, UT), lmM L-glutaminem (JRH Biosciences, Lenexa, KS), lmM pyruvátem sodným (Gibco BRL)). Buňky byly transfekovány postupem popsaným v příkladu 8 plazmidem obsahujícím zalphal 1Fc4 (viz příklad 8), za užití Lipofectaminu * (Gibco BRL), v bezsérovém médiu (SF) o složení (DMEM, io 10 mg/ml transferrin, 5 mg/ml insulin, 2 mg/ml fetuin, 1 % L-glutamin a 1 % pyruvát sodný). Plazmid obsahující zalphal 1-Fc4 byl naředěn do 15 ml zkumavek na celkový objem 640 ml pomocí SF média. 35 ml Lipofectaminu™ (Gibco BRL) bylo smícháno se 605 ml SF média. Připravený roztok Lipofectaminu™ byl přidán ke směsi DNA a vše se nechalo inkubovat při pokojové teplotě přibližně 30 min. Do směsi DNA : Lipofectamin bylo přidáno pět mililitrů SF média. Buňky byly promyty jednou 5 ml SF média, potom bylo médium odsáto a byla přidána směs DNA: Lipofectin™, která byla přes ně rovnoměrně distribuována. Buňky byly inkubovány při 37 °C přibližně pět hodin, potom bylo přidáno na každou plotnu 6,4 ml DMEM/10% FBS, 1% PSN. Plotny se inkubovaly přes noc při 37 °C a roztok DNA:Lipofectamin byl následující den nahrazen čerstvým 5% FBS/DMEM. Dva dny po transfekci byly buňky převedeny do selekčního média (DMEM/FBS média popsaného výše s přídavkem ΙμΜ methotrexátu (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)) a vysety na plotny o průměru 150 mm v ředění 1:10, 1:20 a 1:50. Pátý den po transfekci byla média na buňkách vyměněna za čerstvé selekční médium. Přibližně 10 dnů po transfekci byly vybrány z každé transfekce dvě misky pro tkáňové kultury o průměru 150 mm s koloniemi resistentními na methotrexát, byly trypsinizovány a buňky shromážděny a vysety do kultivační láhve T-162 a převedeny do kultury vhodné pro využití ve velkém měřítku.

Příklad 10: Purifikace zalphal 1 rozpustných receptorů z BHK 570 buněk

A. Purifikace polypeptidu zalphal 1 CEE z BHK 570

Není-li uvedeno jinak, všechny operace byty prováděny při 4 °C. K purifikaci polypeptidu zalphal 1 obsahujícího na C konci GIu-Glu(EE tag) byly použity následující postupy. Třicet litrů ve velkém měřítku (průmyslově) připraveného kondiciovaného média bylo zakoncentrováno na 1,6 litru užitím Amicon S10Y3 spirální náplně v ProFlux A30. Do zakoncentrované kapaliny vzniklé z kondicionovaného média BHK 570 buněk byl přidán roztok inhibitoru proteáz (viz příklad 9) do konečné koncentrace 2,5mM ethylendiamintetraoctové kyseliny (EDTA, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO), 0,003 mM leupeptinu (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN),

0,001mM pepstatinu (Boehringer-Mannheim) a 0,4mM Pefablocu (Boehringer-Mannheim).

Byly odebrány vzorky na analýzu a zbytek byl zamražen při -80 °C a byl takto uchován až do začátku purifikace. Celková koncentrace proteinu z koncentrovaného ve velkém měřítku připraveného kondiciovaného média byla určena pomocí SDS-PAGE a Western blotové analýzy santi-EE HRP konjugovanou protilátkou. 100 ml náplně sloupce anti-EE G-Sepharózy (připravená postupem popsaným dále) byla nalita do skleněného sloupce Waters AP-5, 5 cm x 10 cm. Bylo vyzkoušeno, zdaje sloupec průtočný a potom byl ekvilibrován pomocí systému BioCad Sprint (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS) pH 7,4. Zakoncentrované kondiciované médium připravené z kultivace buněk ve velkém bylo necháno roztát, potom bylo přefiltrováno přes sterilizační filtr o velikosti pórů

0,2 mikrony, bylo upraveno pH na hodnotu 7,4. Potom bylo médium přes noc nanášeno na sloupec, průtoková rychlost byla 1 ml/minutu. Sloupec byl promyt deseti svými objemy (Cvs) PBS, pH 7,4 a potom začala eluce 200 ml PBS (pH 6,0) obsahujícího 0,5 mg/ml EE peptídu (Anaspec, San Jose, CA) při rychlosti 5 ml/minutu. Použitý EE peptid měl sekvenci EYMPME (SEKV.ID.Č:29). Sloupec byl dále promyt deseti svými objemy CVs pomocí PBS, potom nastala eluce 5 CVs 0,2M glycinem, pH 3,0. pH glycínem eluovaného sloupce bylo upraveno na 7,0

- 53 CZ 302921 B6 pomocí 2 CVs 5 x PBS, dále byl sloupec ekvilibrován PBS (pH 7,4). Během celého průběhu chromatografie byly sbírány pětimililitrové frakce a byla měřena absorbance při 280 a 215 nm; veškerá kapalina procházející sloupcem, i promývací, byla schraňována a analyzována. Eluční vrchol EE polypeptidů byl analyzován na přítomnost žádaného proteinu pomocí SDS—PAGE s barvením stříbrem a Western Blottingem s anti-EE HRP konjugovanou protilátkou. Eluované frakce s žádaným polypeptidem byly shromažďovány a zákon centrovány z 60 ml na 5,0 ml pomocí membrány s propustností molekul do velikosti 10 000 Daltonů v membránovém centrifugačním koncentrátu (Millipore, Bedford, MA), podle návodu výrobce.

io K oddělení zalphal 1CEE od dalších společně purifikovaných proteinů byly eluované zakoncentrované shromážděné frakce podrobeny dělení na POROS HQ-50 (silný aniontový měnič vyráběný PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) při pH 8,0. Byl připraven sloupec o rozměrech 1,0 x 6,0 cm a jeho průtok byl upraven na BioCad Sprint. Ionty náplně sloupce byly nabity a potom byl sloupec ekvilibrován 20mM Tris pH 8,0 (Tris Hydroxymethyl Amino15 methane)). Vzorek byl naředěn 1 : 13 (čímž se snížila iontová síla PBS), potom byl vzorek nanesen na sloupec Poros HQ s průtokovou rychlostí 5 ml/minutu. Sloupec byl promyt 10 CVs 20mM Tris pH 8,0 a potom nastala eluce 40 CVs gradientem 20mM Tris/IM chlorid sodný (NaCl) při průtoku 10 ml/minutu. Byly sbírány l,5ml frakce z celého průběhu chromatografie a byla měřena absorbance při 280 a 215 nm. Frakce elučního vrcholu byly analyzovány na přítomnost žádaného proteinu pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem. Eluované frakce s žádaným produktem byly shromažďovány a zakoncentrovány na 1,5 až 2,0 ml pomocí membrány s propustností molekul do velikosti 10 000 Daltonů v membránovém centrifugačním koncentrátoru (Millipore, Bedford, MA), podle návodu výrobce.

K oddělení polypeptidů zalphal 1CEE od ostatního volného EE peptidu a všech dalších kontaminujících společně purifikovaných proteinů, byly shromážděné koncentrované frakce podrobeny chromatografii na sloupci 1,5 x 90 cm Sephadexu 5200 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Sloupec byl ekvilibrován a vzorky nanášeny v PBS při průtokové rychlosti 1,0 ml/min pomocí BioCad Sprint. Během celé chromatografie byly sbírány l,5ml frakce a byla měřena absorbance při 280 a 215 nm. Frakce elučního vrcholu byly analyzovány na přítomnost žádaného proteinu pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem. Jen nejčistší frakce byly shromážděny. Tento materiál representuje purifikovaný zalphal 1CEE polypeptid.

Takto purifikovaný materiál se ještě podrobil chromatografii sloupci 4 ml ActiClean Etox (Sterogene), kde byly odstraněny všechny zbývající endotoxiny. Vzorek byl potom nanesen čtyřikrát za sebou na PBS ekvi libro váný koncentrační gravitační sloupec, potom byl sloupec promyt jedenkrát 3 ml PBS, ve kterém byl shromážděn vyčištěný vzorec. Materiál byl potom sterilně přefiltrován přes filtr s póry o velikosti 0,2 mikronu a byl uložen do -80 °C, do doby, než byl rozdělen na alikvóty.

Na Western biotech i na SDS-PAGE gelech barvených pomocí Coomassie Blue a barvení stříbrem, tvořil zalphal 1CEE polypeptid jeden větší pruh o zdánlivé molekulové hmotnosti okolo 50 000 Daltonů. Mobilita tohoto pruhu byla stejná na redukujícím i neredukujícím gelu.

Koncentrace proteinu v purifíkovaném materiálu byla určena pomocí BCA analýzy (Pierce, Rockford, IL) a protein byl rozdělen na alikvóty a uložen při -80 °C podle našich standardních pochodů. Na gelech IEF (isoelektrická fokusace) protein vykazuje PI nižší, než 4,5. Koncentrace zalphal 1CEE polypeptidů byla 1,0 mg/ml.

K přípravě anti-EE Sepharózy bylo 100 ml protein G—Sepharózy (Pharmacia, Piscataway, NJ) třikrát promyto 100 ml PBS obsahujícího 0,02% azid sodný za použití filtrační cely 500 ml Nalgene o velikosti pórů 0,45 mikronů. Gel byl promyt 6,0 objemy 200mM triethanolaminu pH 8,2 (TEA, Sigma, St. Louis, MO) a byl přidán stejný objem roztoku protilátky EE, obsahující 900 mg protilátky. Po inkubaci trvající přes noc při teplotě 4 °C, byly odstraněny nenavázané protilátky pomocí promytí nosiče 5 objemy 200mM TEA tak, jak bylo popsáno výše. Nosič byl

-54CZ 302921 B6 resuspendován ve 2 objemech TEA, byl přenesen do požadované nádoby (sloupce) a promyt di methy lpi mi limidatem-2 HCI (Pierce, Rockford, IL) rozpuštěném v TEA, který byl do pufru přidán do konečné koncentrace 36 mg/ml proteinu G-Sepharóze gelu. Gel se nechal na třepačce při pokojové teplotě po dobu 45 min a kapalina se odstranila pomocí filtrační jednotky, tak jak to bylo popsáno výše. Nespecifická vazná místa na gelu se odstranila inkubací trvající 10 minut při pokojové teplotě s 5 objemy 20mM ethanolaminu v 200mM TEA.

Gel byl poté promyt 5 objemy PBS obsahujícího 0,02% azid sodný a byl v tomto roztoku uskladněn.

B. Purifikace polypeptidů zalphal IFLAG z BHK 570

Není-li uvedeno jinak, všechny operace byly prováděny při 4 °C. K purifikaci polypeptidů zalphal 1 obsahujícího na C konci terminální FLAG značku (FLG) (Sigma- Aldrich Co.) byly použity následující postupy. Třicet litrů ve velkém měřítku (průmyslově) připraveného kondiciovaného média bylo zakoncentrováno na 1,7 litru užitím Amicon S10Y3 spirální náplně v ProFlux A30. Do zakoncentrované kapaliny vzniklé z kondiciovaného média BHK 570 buněk byl přidán roztok inhibitoru proteáz (viz příklad 9) do konečné koncentrace 2,5mM ethylendiamintetra. Λ i-----ι:_~ π'ητΛ -----: — i c* i un\ a nn? μ i-----ULtUVa MICIIIKI KjIglllA viivillivai < «V- ivivjj, u,uujiiii»i t«.upvpLin ^UUVIU

Mannheim, Indianapolis, IN), Ο,ΟΟΙτηΜ pepstatin (Boehringer-Mannheim) a0,4mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim). Byly odebrány vzorky na analýzu a zbytek byl zamražen při -80 °C a byl takto uchován až do začátku purifikace. Celková koncentrace proteinu z koncentrovaného ve velkém měřítku připraveného kondiciovaného média byla určena pomocí SDS-PAGE a Western blotové analýzy s anti-FLAG (Kodak) HRP konjugovanou protilátkou.

125 ml náplň sloupce anti-FLAG M2-Agarózového afinitního gelu (Sigma-Aldrich, Co.) byla nalita do skleněného sloupce Waters AP-5, 5 cm x 10 cm. Bylo vyzkoušeno, zdaje sloupec průtočný a potom byl ekvilibrován pomocí systému BioCad Spring (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) fosfátem pufrovaným fyziologickým roztokem (PBS) pH 7,4. Zakoncentrované kondiciované médium připravené z kultivace buněk ve velkém bylo necháno roztát, potom bylo sterilně přefiltrováno, bylo upraveno pH na hodnotu 7,4. Potom bylo médium přes noc nanášeno na sloupec, průtoková rychlost byla 1 ml/minutu. Sloupec byl promyt deseti svými objemy (Cvs) PBS, pH 7,4 a potom začala eluce 200 ml PBS (pH 6,0) obsahujícího 0,5 mg/ml FLAG (Sigma-Aldrich, Co.) pri rychlosti 5 ml/minutu. Použitý FLAG peptid měl sekvenci DYKDDDK (SEKV.ID.Č:37). Sloupec byl dále promyt deseti objemy CVs PBS, potom nastala eluce 5 CVs 0,2M glycinem, pH 3,0. pH glycinem eluovaného sloupce bylo upraveno na 7,0 pomocí 2 CVs 5 x PBS, dále byl sloupec ekvilibrován PBS (pH 7,4). Během celého průběhu chromatografie byly sbírány pětimililitrové frakce a byla měřena absorbance při 280 a 215 nm; veškerá kapalina procházející sloupce, i promývací, byla schraňována a analyzována. Eluční vrchol FLAG-polypeptidu byl analyzován na přítomnost žádaného proteinu pomocí SDS-PAGE s barvením stříbrem a Western blotováním s anti-FLAG HRP konjugovanou protilátkou. Eluované frakce s žádaným polypeptidem byly shromažďovány a zakoncentrovány z 80 ml na 12,0 ml pomocí membrány s propustností molekul do velikosti 10 000 Daltonu v membránovém centrifugačním koncentrátoru (Millipore, Bedford, MA), podle návodu výrobce.

K oddělení polypeptidů zalphal 1CFLG od všech dalších kontaminujících společně purifikovaných proteinů, byly shromážděné koncentrované frakce podrobeny ehromatografií na sloupci na POROS HQ-50 (silný aniontový měnič vyráběný PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) při pH 8,0. Byl připraven sloupec o rozměrech 1,0 x 6,0 cm a jeho průtok byl upraven na BioCad Sprint. Ionty náplně sloupce byly nabity a potom byl sloupec ekvilibrován 20mM TRIS pH 8,0 (Tris(hydroxymethyl)aminomethan). Vzorek byl naředěn 1:13 (čímž se snížila iontová síla PBS), potom byl vzorek nanesen na sloupec Poros HQ s průtokovou rychlostí 5 ml/minutu. Sloupec byl promyt 10 CVs 20mM Tris pH 8,0 a potom nastala eluce 40 CVs gradientem 20mM Tris/IM chlorid sodný (NaCI) pri průtoku 10 ml/minutu. Byly sbírány l,5ml frakce z celého průběhu chromatografie a byla měřena absorbance při 280 a 215 nm. Frakce elučního vrcholu

-55CZ 302921 B6 byly analyzovány na přítomnost žádaného proteinu pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem. Eluované frakce s žádaným produktem byly shromažďovány a zákon centrovány na 1,5 až 2,0 ml pomocí membrány s propustností molekul do velikosti 10 000 Daltonů v membránovém centrifugačním koncentrátoru (Millipore, Bedford, MA), podle návodu výrobce.

K oddělení polypeptidů zalphal 1CFLG od ostatního volného FLAG peptidu a všech dalších kontaminujících společně purifí kovaných proteinů, byly shromážděné koncentrované frakce podrobeny chromatografií na sloupci 1,5 x 90 cm Sephadexu S200 (Pharmacia, Piscataway, NJ). Sloupec byl ekvilibrován a vzorky nanášeny v PBS při průtokové rychlosti 1,0 ml/min pomocí BioCad Sprint. Během celé chromatografie byly sbírány l,5ml frakce a byla měřena absorbance při 280 a 215 nm. Frakce elucního vrcholu byly analyzovány na přítomnost žádaného proteinu pomocí SDS-PAGE a barvení stříbrem. Jen nej čistší frakce byly shromážděny. Tento materiál representuje purifikovaný zalphal 1CFLG polypeptid.

Takto purifikovaný materiál se ještě podrobil chromatografii sloupci 4 ml ActiClean Etox (Sterogene), kde byly odstraněny všechny zbývající endotoxiny. Vzorek byl potom nanesen čtyřikrát za sebou na PBS ekvilibrovaný sloupec, potom byl sloupec promyt bez použití tlaku jedenkrát 3 ml PBS, ve kterém byl shromážděn vyčištěný vzorek. Materiál byl potom sterilně přefiltrován přes filtr s póry o velikosti 0,2 mikronu a byl uložen do -80 °C, do doby, než byl rozdělen na alikvóty.

Na Western blotech i na SDS-PAGE gelech barvených pomocí Coomassie Blue a barvení stříbrem, tvořil zalphal 1CFLG polypeptid jeden větší pruh o zdánlivé molekulové hmotnosti okolo 50 000 Daltonů. Mobilita tohoto pruhu byla stejná na redukujícím i neredukujícím gelu.

Koncentrace proteinu v purifikovaném materiálu byla určena pomocí BCA analýzy (Pierce, Rockford, IL) a protein byl rozdělen na alikvóty a uložen při -80 °C podle našich standardních pochodů. Na gelech IEF (isoelektrická fokusace) protein vykazuje Pl nižší, než 4,5. Koncentrace zalphal 1CFLG polypeptidů byla 1,2 mg/ml.

C. Purifikace polypeptidů zalphal 1-Fc4 z transfekovaných BHK 570 buněk

Není-li uvedeno jinak, všechny operace byly prováděny při 4 °C. K purifikaci polypeptidů zalphal 1 obsahujícího na C-konct terminální fúzní protein lidského IgG/Fc (zalphal 1-Fc4; příklad 8 a 9) byly použity následující postupy. Dvanáct litrů ve velkém měřítku (průmyslově) připraveného kondiciovaného média z BHK buněk transfeko váných zalphal 1-Fc4 (příklad 9) bylo filtrováno přes sterilizační filtr s velikostí pórů 0,2 mm. Do filtrované kapaliny vzniklé z kondiciovaného média BHK 570 buněk byl přidán roztok inhibitoru proteáz do konečné koncentrace 0,001mM leupeptinu (Boehringer-Mannheim, lndianapolis. IN), 0,001mM pepstatinu (Boehringer—Mannheim) a 0,4mM Pefabloc (Boehringer-Mannheim). Byl připraven sloupec protein G-Sepharózy (6 ml prázdný objem, Pharmacia Biotech), sloupec byl promyt 500 ml PBS (Gibco/BRL). Obohacené kondiciované médium bylo filtrováno přes sloupec průtokovou rychlostí 10 ml/min, potom následovalo promytí sloupce 1000 ml PBS (Gibco/BRL). Zalphal 1-FC4 byl eluován ze sloupce pomocí 0,lM glycinu pH 3,5 a byly sbírány 2ml frakce přímo do 0,2 ml 2M Tris pH 8,0, čímž se upravilo konečné pH frakcí na hodnotu 7,0.

Eluované frakce byly analyzovány na SDS PAGE a Western blotovou analýzou s protilátkami připravenými proti lidskému Fc (Amersham). Western blotové analýzy SDS-PAGE redukujících gelů poskytly imunoreaktivní protein o molekulové hmotnosti okolo 80 000 kDa, a to ve frakcích 2 až 10. Stříbrem barvená SDS-PAGE také prokázala 80 000 kDa polypeptid zalphal 1-Fc4 ve frakcích 2 až 10. Frakce 2 až 10 byly shromážděny.

Koncentrace proteinu v purifikovaném materiálu byla určena pomocí BCA analýzy (Pierce, Rockford, IL) a protein byl rozdělen na alikvóty a uložen při -80 °C podle našich standardních pochodů. Koncentrace zalphal 1-Fc4 polypeptidů byla 0,26 mg/ml.

- 56CZ 302921 B6

Přikladli: Test užívající zalphall rozpustný receptor zalphall CEE, zalphal 1CFLG a zalphal 1-Fc4 (mutant) v kompetitivním inhibičním testu

BaF3/Zalphal 1 buňky byly centrifugovány a promyty mIL-3 free médiem. Tento postup se třikrát opakoval, aby se zaručilo odstranění mIL-3. Buňky byly potom spočítány v hemacytometru a vysety do 96-jamkové desky po 5000 buňkách na jamku v celkovém objemu 100 μΐ míL-free média na jamku.

io Obě kondiciovaná média, jak z opicích aktivovaných splenocytů, tak z lidských CD3+ selektovaných buněk, popsaných v příkladu 5, byly zařazeny do jednotlivých pokusů v koncentracích 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% a 0,375% sa bez zalphall rozpustného receptoru (CEE, CFLAG a Fc4 konstrukty; viz příklad 9 a 10), který byl v koncentraci 10pg/ml. Celkový reakční objem byl 200 μΐ.

Testované desky byly inkubovány při 37 °C, 5% CO? po dobu 3 dnů, potom byla do jamek přidána Alamar Blue (Accumed) v množství 20 μΙ/jamka. Desky byly opět inkubovány při 37 °C, 5% CO₂ po dobu 24 h. Desky byly vyhodnoceny na Fmax™ readeru (Molecular Devices), tak jak popsáno v příkladu 2. Výsledky potvrdily kompletní inhibici buněčného růstu každým z různých konstruktů zalphall rozpustného receptoru v koncentraci 10 pg/ml, což potvrzuje, že faktor v každém vzorku byl specifický pro zalphal 1 receptor.

Byly naměřeny také titrační křivky vypracované na základě ředění rozpustného receptoru, pomocí testů popsaných výše. Oba konstrukty, jak zalphal 1CEE, tak zalphal 1CFLG konstrukt rozpustného zalphall receptoru jsou schopné kompletně inhibovat růst buněk v koncentracích nižších než 20 ng/ml. Mutant zalphal-Fc4 rozpustného zalphall receptoru byl účinný pouze v koncentraci 1,5 pg/ml.

Příklad 12: Test sekreční pasti

Test sekreční pasti se použil k identifikaci cDNA pro zalphal 1 Ligand. Zásobní pozitivní DNA se získala z expresního klonování popsaného v příkladu 7.

Tato DNA obsahující 250 klonů byla transfekována do BHK buněk v desce s 96 jamkami a kondiciované médium bylo podrobeno proliferaěnímu testu v BaF3/zalphal l buňkách, popsanému v příkladech 4 a 5. Několik klonů DNA poskytlo pozitivní reakci i v opakovaných testech. Tato pozitivní reakce byla neutralizována zalphal 1 rozpustnými receptory (viz příklad 11).

Jeden z pozitivních vzorků DNA, 45C5, byl transfekován do COS buněk v desce s 12 jamkami postupem s Lipofectaminem™ popsaným dříve. Potom byl aplikován postup sekreční pasti využívající rozpustné zalphal 1 receptory (C-koncová Glu-Glu značka s nebo bez biotinylace; C-koncová Flag značka; nebo Fc4 zalphal l rozpustný fúzní receptor) (příklad 9) k otestování přímé vazby mezi potenciálním ligandem zalphall receptoru ve vzorku 45C5 a zalphall rozpustným receptorem (viz níže). Výsledky byly pozitivní. Proto byla DNA ze vzorku 45C5 elektroporována do E. coli. Do 96 jamkové desky byly vypíchány jednotlivé kolonie. Desky byly potom třepány při 37 °C po dobu 24 hodin a potom byly udělány minipreparace DNA (QiaPrep ^M96 Turbo Multiprep Kit; Qiagen) v 96 jamkovém formátu pomocí TomTech Quadra 9600. Píazmidová DNA byla ponechána ve formátu řad a sloupců, byla transfekována do COS buněk a pozitivní klony určeny metodou sekreční pasti popsanou níže.

-57CZ 302921 B6

Transfekce COS buněk

Transfekce COS buněk byla provedena následovně: Byly smíchány 3 μΙ DNA a 5 μΐ Lipofeetaminu'^M v 92 μΙ bezsérového DMEM média (55 mg pyruvátu sodného, 146 mg L-glutaminu, 5 mg transferinu, 2,5 mg insulinu, 1 pg selenu a 5 mg Fetuinu v 500 ml DMEM), směs se inkubovala při pokojové teplotě po dobu 30 minut a potom bylo přidáno 400 μΐ bezsérového DMEM média. Směs těchto 500 μΙ se přidala k 1,5 x 10⁵ COS buněk/jamka vysetých na 12 jamkové kultivační desce. Desky se inkubovaly po dobu 5 h pri 37 °C. Potom bylo přidáno 500 μΙ 20% FBS DMEM média (100 ml FBS, 55 mg pyruvátu sodného a 146 mg L-glutaminu v 500 μΐ DMEM) a vzorky se inkubovaly do rána.

Test sekreční pasti (Secretion Trap Assay)

Test sekreční pasti byl proveden následovně: Média získaná z promytí buněk PBS se fixovala 15 minut, 1,8% forma!dehydem. Buňky byly potom promyty TNT (0,1 M Tris-HCl, 0,15 NaCI a 0,05% Tween-20 v H₂O) byly syceny roztokem 0,1 % Triton-X v PBS po dobu 15 minut a znovu promyty TNT. Buňky byly blokovány po 1 h v TNB (0,lM Tris-HCl, 0,15M NaCI a 0,5% blokační roztok (NEN Renaissance TSA-Direct Kit) v H₂O) a znovu promyty TNT. Byl-li použit biotinylovaný protein, buňky se blokovaly 15 minutovou inkubací sAvidinem a potom s Biotinem (Vector Labs), mezitím byly buňky promyty TNT. V závislosti na použitém rozpustném receptoru byly buňky potom inkubovány podobu 1 h s: (A) 1-3 pg/ml zalphal 1 rozpustného fúzního proteinu receptoru zalphal 1—Fc4 (příklad 10); (B) 3 pg/ml zalphall rozpustného receptoru v C-terminální FLAG značkou, zalphal 1CFLG (příklad 10); (C) 3 pg/ml zalphall rozpustného receptoru sC-terminální Glu-Glu značkou, zalphal 1CEE (příklad 10); nebo (D) 3 pg/ml b i oti nyl ováným zalphall rozpustným receptorem, zalphal 1CEE v TNB. Buňky byly opět promyty TNT. V závislosti na užitém receptoru, byly buňky dále inkubovány: (A) 1:200 ředěným kozím anti-lidským Ig-HRP (Fc specifickým); (B) 1:1000 ředěným M2-HRP; (C) 1:1000 ředěnou antiGluGlu protilátkou konjugovanou s HRP; nebo (D) 1:300 ředěným streptavidin-HRP (NEN kit) v TNB. Buňky byly opět promyty TNT.

Pozitivní navázání bylo detekováno fluorescein tyramidovým činidlem ředěným 1:50 v ředícím pufru (NEN kit) a inkubace po dobu 4 až 6 minut a poté promytí pomocí TNT. Buňky byly zakonzervovány pomocí Vectashield Mouriting Média (Vector Labs Burlingame, CA) ředěného 1:5 v TNT. Buňky byly vizualizovány pomocí FITC filtru na fluorescenčním mikroskopu.

Příklad 13: Označení chromozomu a umístění genu pro zalphal 1 Ligand

Gen pro zalphal 1 Ligand byl zmapován na chromozomu 4 pomocí komerčně dostupné verze „Stanford G3 Radiation Hybrid Mapping Panel“ (Research Genetics, lne., Huntsville, AL). „Stanford G3 RH Panel“ obsahuje DNA pro každý z 83 radiačních hybridních klonů celého lidského genomu, plus dvě kontrolní DNA (RM donor a A3 recipient). Veřejně dostupný WWW server (http://shgc-www.stanford.edu) umožňuje chromozomáíní lokalizaci markérů.

Pro mapování genu zalphal 1 Ligandu pomocí „Stanford G3 RH Panel“, byly připraveny 20 μΙ reakce v 96-jamkových mikrotitracních deskách (Stratagene, La Jolla, Každá z 85 PCR reakcí sestávala ze 2μ1 10 x KlenTaq PCR reakční pufr (CLONTECH Laboratories, lne., Palo Alto, CA), 1,6 μΐ dNTP směsi (2,5mM každý, PERKÍN-ELMER, Foster City, CA), 1 μΐ sense primeru, ZC 22050 (SEKV.ID.Č:42), 1 μΐ antisense primeru, ZC 22051 (SEKV.ID.Č:43), 2 μΐ RediLoad (Research Genetics, lne., Huntsville, AL), 0,4 μΐ 50 x KlenTaq Polymerázový Mix-(Clontech Laboratories, lne.), 25 ng DNA z jednotlivých hybridních klonů nebo kontrol a dH₂O do celkového objemu 20 μΐ. Reakční směs byla překryta stejným objemem minerálního oleje a uzavřena. Podmínky nastavené na PCR cyklátoru byly následující: počáteční cyklus -5 minut denaturace pri 94 °C, 35 cyklů po 45 s denaturace při 94 °C, 45 s (přisedání) annealing

-58CZ 302921 B6 při 60 °C a 1 min a 15 s prodlužování (extense) při 72 °C, následoval konečný 1 cyklus finální extense 7 min při 72 °C. Reakční směsi byly podrobeny separaci elektroforézou na 2% agarózovém gelu (Life Technologies, Gaithersburg, MD).

Výsledky prokázaly připojení genu pro zalphall Ligand ke čtecímu rámci pro IL2 markér SHGC-12342 s LOD skóre >12 a ve vzdálenosti 6 cR- 10000 (přibližně 180 kb) od markéru. Užití okolních markérů určilo pozici genu zalphal l Ligandu v oblasti 4q27 na integrované LDB chromozomové 4 mapě (The Genetic Location Database, University of Southhampton, WWW server: http://cedar.genetics. soton;ac.uk/public html/).

Příklad 14: Identifikace a klonování myšího zalphal l Ligandu pomocí EST sequence k získání myšího zalphal 1 Ligandu úplné délky

A. Test sekvence myšího zalphal 1 Ligandu

Studiem database cDNA sekvence lidského zalphall Ligandu (SEKV.ID.Č: 1) se ukázala podobnost myší sekvence EST (EST1483966), jako částečné sekvence pro myší zalphal 1 Ligand _ i:j_i -τλχτα ι_ι_-ΐ i τ :____i rcTi tOTDZZ________r ___ iJUMtuu LUim μιu Δαιριιαι i L^igaiiu, ljl nujzuu ivpitz-tmujv iiagiuviu kterém je sekvence peptidu odvozena od dvou potenciálních exonů, které sdílejí velkou sekvenční identitu s peptidovým segmentem pro lidský zalphal 1 Ligand (od aminokyseliny 13 (Ile) do aminokyseliny 80 (Gin) v SEKV. ID.Č:2).

B. PCR testování myšího marathonu cDNA panelu 1

Jedenáct myších vzorků Marathon cDNA (Clontech) bylo testováno pomocí PCR popsané dále v textu. Myší marathon cDNA vzorky byly připraveny z tkáně mozku, slinivky, ledvin, placenty, slinné žlázy, klouzavého varlete, dělohy, embrya a sleziny. Vzorky byly připraveny v laboratoři za užití MarathonT™ cDNA Amplification Kit (Clontech) podle návodu výrobce. Na základě EST sekvence, byly k identifikaci zdroje myšího zalphal 1 Ligandu pomocí PCR použity dva PCR primery, ZC22056 (SEKV.ID.Č:44) a ZC22057 (SEKV.ID.Č;45). Podmínky PCR reakce byly následující: 94 °C po 2 min.; 35 cyklů při 94 °C po 30 s, 68 °C po 2 min; následovalo 68 °C po 4 min; poslední cyklus byl uchovávací při 10 °C. PCR produkty byly elektroforézovány na 1% agarózovém gelu. Byl vizualizován silný pruh o velikostí 150 bp, který reprezentoval amplifikovaný cDNA fragment. Tím byl dán důkaz, že marathon cDNA z myší sleziny je zdrojem myší cDNA pro klonování zalphal 1 Ligandu. Myší marathon cDNA ze sleziny obsahovala pozitivní cDNA, které byly následně pomocí sekvenační analýzy identifikovány jako části cDNA myšího zalphal 1 Ligandu.

C. Složená sekvence pro myší cDNA úplné délky byla připravena pomocí 5' A 3'RACE

5' a 3' sekvence obklopující částečnou cDNA sekvenci pro myší zalphall Ligand byly získány pomocí 5' a 3' RACE amplifikace. Byly uskutečněny dva běhy PCR amplifikace s následujícími doplňkovými gen-specifickými oligo primery: ZC22205 (SEKV.ID.Č:46) a ZC22206 (SEKV.ID.Č:47), ZC22056 (SEKV.ID.Č:46:44) a ZC22057 (SEKV.ID.Č:45) a dva adaptorové oligo primery ZC9739 (SEKV.ID.Č:48) a ZC9719 (SEKV.ID.Č:49). Podmínky PCR reakce byly následující: 94 °C po 2 min; 35 cyklů při 94 °C po 30 s, 68 °C po 2 min; následovalo 68 °C po 4 min; poslední cyklus byl uchovávací při 10 °C. PCR produkty byly elektroforézovány na 1% agarózovém gelu. Byly vizualizovány pruhy o velikosti přibližně 300 bp (5' RACE produkt) a přibližně 800 bp (3' RACE). Tyto fragmenty byly izolovány Qiaquick™ gelové extrakce kitem (Qiagen).

Purifikované PCR produkty byly sek ve no vány pomocí následujících primeru: ZC9719 (SEKV.ID.Č:49), ZC22205 (SEKV.ID.Č:46) a ZC22206 (SEKV.ID.Č:47). Byla identifikována předběž- 59 CZ 302921 Β6 ná složená sekvence pro myší zalphal 1 Ligand úplné délky kombinací 5' a 3' RACE fragmentů. Myší klon o úplné délce byl izolován postupem popsaným v příkladu 15.

Příklad 15: Isolace myšího zalphal 1 cDNA klonu z knihovny vytvořené zaktivovaných buněk sleziny

A. Jako primární zdroj používaný k izolaci myšího zalphal 1 Ligandu byly myší sleziny.

byly shromážděny myší sleziny z Balb/C myší a byla z nich vytvořena buněčná suspenze rozdrcením mezi zmrazenými sklíčky. Výtěžek isolovaných primárních myších buněk byl před selekcí popsanou dále 6,4 x 10* buněk,

Slezinné buňky byly resuspendovány v 9,6 ml MACS pufru (PBS, 0,5% EDTA, 2mM EDTA). Bylo odebráno 1,6 ml buněčné suspenze a kní přidáno 0,4 ml CD90 (Thyl,2) mikročástic (Miltenyi Biotec). Směs byla inkubována po dobu 15 minut při 4 °C. Tyto buňky označené částicemi CD90 byly promyty 30 ml MACS pufru a poté resuspendovány ve 2 ml MACS pufru.

Sloupec VS+ (Miltenyi) se připravil podle instrukci výrobě. VS+ sloupec se potom umístil do magnetického pole v přístroji VarioMACSTM (Miltenyi). Sloupec se ekvilibroval 5 ml MACS pufru. Na sloupec se potom aplikovaly primární myší buňky. CD3 negativní buňky se na sloupci nezachytily. Sloupec se promyl 9 ml (3 x 3 ml) MACS pufru. Sloupec byl potom vyjmut z magnetického pole a umístil se nad 15 ml falkonku. CD90+ buňky byly eluovány přidáním 5 ml MACS pufru na sloupec a navázané buňky byly vytlačeny pomocí pístu dodávaného výrobcem. Inkubace buněk sCD90 magnetickými kuličkami, promytí a kroky s VS+ sloupcem (inkubací počínaje a elucí konče) tak, jak je popsáno výše, se opakovalo ještě jednou.

Byly shromážděny výsledné frakce D90+ z obou separací na sloupci. Výtěžek CD90+ selektovaných myších slezinných buněk byl 1 x 10⁸.

Vzorek shromážděných CD90+ selektovaných myších buněk byl odebrán za účelem barvení a třídění pomocí protilátek s fluorescenčním značením na přístroji (FACS), čímž byla určena jejích čistota. K barvení a třídění CD90+ selektovaných buněk se užívá PE-konjugovaná křečci anti-myší CD3 protilátka (PharMingen). Myší CD90+ selektované CD90+ selektované buňky byly aktivovány inkubací 3 x 10⁶ buněk/ml v RPMI + 5% FBS + PMA 10 ng/ml a lonomycin 0,5 pg/ml (Calbiochem) přes noc při 37 °C. Supernatant z těchto aktivovaných CD90+ selektovaných myších buněk byl testován na aktivitu zalphal 1 Ligandu tak, jak je popsáno níže. Kromě toho byly aktivované CD90+ selektované myší buňky použity k přípravě cDNA knihovny, jak je popsáno dále v příkladu 16.

Příklad 16: Klonování myšího zalphal 1 Ligandu z knihovny vytvořené z myších CD90+ selektovaných buněk

Testování cDNA knihovny z primárních myších aktivovaných CD90+ selektovaných buněk vyústilo v izolovanou cDNA, která je novým členem skupiny cytokinů majících svazeitou strukturu složenou ze čtyř heiixů. Tato cDNA kóduje myší ortholog lidského zalphal 1 Ligandu. cDNA byla určena hybridizačními testy.

Vektor pro konstrukci knihovny z CD90+ selektovaných buněk

Pro konstrukci knihovny z CD3+ selektovaných buněk byl použit vektor, pZP7N (viz příklad 6A) Příprava cDNA knihovny z primárních myších buněk aktivovaných CD90+ selektovaných buněk

-60CZ 302921 B6

Přibližně 1,5 x 10⁸ primárních myších CD90+ selektovaných buněk stimulovaných ionomycín/PMA (příklad 15) bylo isolováno centrifugách Celková RNA byla isolována z buněčného peletu a převedena na dvouvláknovou cDNA tak, jak je to popsáno v příkladu 6. Takto připravená DNA byla následně transfekována do BHK buněk, jak bylo popsáno v příkladu 6B. Proliferace byla testována pomocí fluorescenčního testu pomocí Alamar Blue (příklad 2B).

Pro účely testování knihovny pomocí klonování metodou sekreční pasti, bylo nutno vytvořit amplifikovanou formu knihovny a tu transfekovat do COS-7 buněk. 4,8 miliónů klonů bylo vyseto na 1 10 15cm LB-agarové plotny obohacené 100 pg/ml ampicilinu, 10 pg/ml methicillinu. io Po kultivace ploten do rána při teplotě 37 °C byly bakterie sklizeny pomocí buněčné škrabky a peletovány. Z peletovaných bakterií byla extrahována plazmidová DNA pomocí NucleobondgigaTM (Clonetech) podle instrukcí výrobce. Tento plazmid byl potom užit k transfekci COS-7 buněk na sklíčkách a testován pomocí techniky sekreční pasti, popsané níže (příklad 17).

Průzkum aktivované myší cDNA knihovny

Přibližně 5 x 10⁵ klonů bylo vyseto na 10 LB/Amp Maxi ploten. Kolonie byly vypíchnuty, denaturovány, neutralizovány a kříženy podle standardních postupů (Sambrook a další, již citováno). Padesát nanogramů fragmentu o velikosti 300 up z 5' RACE PCR (příklad 14) bylo označeno ’²P pomocí Prime-ltr RmT náhodných (random) příměrů ze značícího kitu (Strategene). 10 filtrů bylo hybridizováno s touto značenou sondou při 65 °C přes noc v ExpressHyb Hybridization Soíution (Clontech). Filtry byly potom třikrát postupně promývány při 60 °C po dobu 1 h v 0,2 x SSC (30mM NaCl, 3mM citrát sodný, pH 7,0), 0,1% SDS a potom při 65 °C po dobu 1 h. Filtry byly uloženy do rána v -80 °C a potom byly vyhodnoceny pomocí filmu citlivého na rentgenové záření. Agar s pozitivními koloniemi byl vyříznut a klony vysety na LB/Amp plotny o průměru 10 cm. Kolonie byly potom opět přeneseny na filtr a hybridizovány tak. jak to bylo popsáno v předchozím příkladě. Byl vyizolován a sekvenován jeden DNA klon, označený MllL/pZP7. Užité primery byly následující: ZC 14063 (SEKV.ID.Č:50), ZC5020 (SEKV.JD:Č:51), ZC22421 (SEKV.ID.Č:52), ZC22604 (SEKV.ID.Č:53) a ZC22641 (SEKV.ID.Č:54). Polynukleotidové sekvence tohoto klonu odpovídala klonu úplné délky myšího zalphal 1 Ligandu (SEKV.ID.Č:55) a byla konzistentní se sekvencí získanou složením produktů 5' a 3' RACE. Odpovídající aminokyselinová sekvence myšího zalphal 1 Ligandu je uvedena v SEKV.ID.Č:56.

Příklad 17: Myší zalphal 1 Ligand váže lidský rozpustný zalphal 1 receptor v testu sekreční pasti

DNA myšího klonu MllL/pZP7 byla transfekována do COS buněk a byla testována vazba lidského rozpustného receptorů zalphal 1-Fc4 (příklad 10C) k transfekovaným COS buňkám postupem sekreční pasti (příklad 12). Test potvrdil, že myší zalphal 1 Ligand se váže k lidskému rozpustnému zalphal 1 receptorů. Transfekce COS buněk byla provedena postupem popsaným v příkladu 12 užitím 0,7 pg Ml !L/pZP7 DNA (příklad 16) ve 3 pl. Sekreční past byla provedena jako v příkladu 12 pomocí 1 pg/ml zalphal 1 rozpustného receptorů Fc4 fúzního proteinu (příklad 10C) v TNB a 1:200 ředěného kozího-antilidského Ig-HRP konjugátu (Fc specifického) v TNB, kterým se detekovala navázaná protilátka. Positivní vazba rozpustného lidského zalphal 1 receptorů k připraveným fixovaným buňkám byla detekována fluorescein tyramidem tak, jako v příkladu 12. Buňky byly uchovávány a vizualizovány podle příkladu 12.

Pozitivní výsledky indikovaly vazbu myšího zalphal 1 Ligandu k lidskému rozpustnému receptoru pro zalphal 1 Ligand.

-61 CZ 302921 B6

Příklad 18: Exprese myšího zalphal 1 Ligandu v savčích buňkách

A. Konstrukce expresního vektoru Μ1 1 L/pZP9

Byl připraven expresní vektor pro expresi myšího zalphal 1 Ligandu v savčích buňkách. Metodou PCR. připravený fragment DNA o velikosti 500 bp zalphal 1 Ligandu byl připraven pomocí primerů ZC22283 (SEKV.ID.Č:57) a ZC22284 (SEKV.1D.Č:58), které byly užity k amplifikaci kódující oblasti zalphal 1 Ligandu a k zavedení restrikčních míst pro Xhol a Xbal. Jako templát byl použit klon zalphall Ligandu MllL/pZP7 (příklad 16). Podmínky PCR reakce byly io následující: 94 °C po 2 min.; 25 cyklů při 94 °C po dobu 30 s 68 °C po 2 min; následovaly 4 min při 68 °C; potom uchovávací cyklus pří 10 °C. Na agarózové elektroforéze (1%) byl vizualizován proužek předpokládané velikosti 500 bp, po vyříznutí tohoto proužku z něj byla izolována DNA pomocí Qiaexll™ purifikačního systému (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Purifikovaná DNA byla štěpena Xhol a Xbal (BoehringerMannheim) při 37 °C po dobu dvou hodin. Potom byla

DNA izolována z gelu výše popsaným postupem.

Takto získaná DNA byla subktonována do plazmidu pZP9, který byl štěpen Xhol a Xbal (Boehringer Mannheim). Plazmid pZP9 je savčí expresní vektor obsahující expresní kazetu mající myší metallothionein-1 (MT-1) promotor, mnohočetné restrikční klonovací místo pro vložení kódujících sekvencí a terminátor z lidského růstového hormonu. Plazmid dále také obsahuje počátek replikace pro E. coli, savčí selekční expresní markér obsahující SV40 promotor, zesilovač a počátek replikace, gen DHFR a SV40 terminátor.

Přibližně 30 ng restrikčními enzymy štěpeného zalphal 1 fragmentu a přibližně 10 ng štěpeného vektoru pZP9 bylo ligováno dvě hodiny při pokojové teplotě. Dva mikrolitiy z ligační reakce byly transformovány do INVaF kompetentních buněk (Invitrogen) postupem podle instrukcí výrobce. Buňky byly vysety na LB plotny obsahující 50 pg/ml ampici linu a byly inkubovány přes noc při 37 °C. Kolonie byly testovány restrikční analýzou DNA připravené z tekutých kultur jednotlivých kolonií pomocí Xhol a Xbal (Boehringer Mannheim).

3(1

Inserce sekvence v pozitivních klonech byla ověřena sekvenaČní analýzou myšího zalphal 1 Ligandu. Izolace plazmidu ve velkém měřítku byla provedena pomocí QIAGEN* Maxi prep kitu (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Expresní vektor, který obsahoval myší zalphal 1 Ligand byl nazván Μ11 L/pZP9.

B. Savčí exprese myšího zalphal 1 Ligandu

Buňky BHK 570 (ATCC No. CRL-10314) byly vysety na tkáňové kultivační misky o průměru 10 cm a nechaly se narůst přibližně do 20% konfluence. Kultivace probíhala pres noc při 37 °C v atmosféře s 5% CO₂ v DMEM/FBS médiu (DMEM, GibcoBRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) s 5% fetálním hovězím sérem (Hyclone, Logan, UT), lmM L-glutaminem (JRH Biosciences, Lenexa, KS), lmM pyruvátem sodným (Gibco BRL)). Buňky byly transfekovány plazmidem Ml lL/pZP9 (viz příklad 18A), za užití savčího stabilního CaPO₄ transfekčního kitu (Stratagene) podle instrukcí výrobce. Jeden den po transfekci byly buňky rozděleny 1:10 a 1 : 20 do selekčního média (DMEM/FBS média popsaného výše s přídavkem 1 μΜ methotrexátu (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.)) a vysety na plotny o průměru 150 mm. Pátý den po transfekci byla média na buňkách vyměněna za čerstvé selekční médium. Přibližně 10 dnů po transfekci byly na methotrexát resistentní kolonie trypsinizovány a buňky shromážděny a poté vysety do velkokapacitních kultivačních lahví. Jakmile buňky narostly do přibližně 90% konflu50 ence, byly promyty třikrát PBS a kultivovány dále v bezsérovém ESTEP kondiciovaném médiu (DMEM (Gibco BRL), 0,11 g/I pyruvát sodný, 3,7 g/l NaHCO₃, 2,5 mg/ml insulin, 5 mg/1 transferin, pH 7,0). O tři dny později byla kondiciovaná média shromážděna a testována v BaF3 proliferačním testu pomocí Alamar Blue tak, jak je to popsáno v příkladu 19 dále.

-62CZ 302921 B6

Příklad 19: Důkaz aktivace lidského receptoru pro zalphal 1 Ligand myším zalphal 1 Ligandem v BaF3 pomocí proliferačního testu s Alamar Blue

Proliferace BaF3/zalphal 1 buněk (příklad 4 a 5B) byla určena pomocí bezsérového kondiciovaného média z BHK buněk exprimujících myší zalphal 1 Ligand (příklad 18). BaF3 buňky byly promyty a centrifugo vány a poté vysety v míL-3 bezsérovém médiu tak, jak je to popsáno v příkladu 5B.

Proliferace BaF3/zaIphal 1 buněk se určila pomocí bezsérového kondiciovaného média z BHK buněk exprimujících myší zalphal 1 Ligand (viz příklad 18). Kondiciovaného médium bylo ředěno pomocí mlL~3 free média na koncentrace 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%, 0,75% a 0,375%. Proliferační test byl proveden podle postupu popsaného v příkladu 5B.

Výsledky potvrdily proliferační odpověď BaF3/zalphal 1 buněk na myší zalphal 1 Ligand. Byl a-li odpověď kvantifikována, při 50% koncentraci média dosahovaly hodnoty přibližně pětinásobku hodnoty pozadí.

i i '-ΐζν _ i .κ - i i τ :____i i.*t,i i rriMdu ζ^αιμιιαι i uigauu umivuj^ «upuei i iwvpui

A. Konstrukce BaF3/KZ134/zalphal 1 buněčné linie

Plazmid KZ134 byl konstruován pomocí komplementárních oligonukleotidů ZC12749 (SEKV.ID.Č:59) a ZC12748 (SEKV.ID.Č:60), které obsahovaly STÁT vazebné elementy ze 4 genů pro transkripční faktor. Modifikovaný inducibilní element c-fos Sis(m67SIE, nebo hSIE) (Sadowski a další, Science 261:1739-1744, 1993), p2l S1E zp21 WAF1 genu (Chin a další, Science 272: 719-722, 1996), element z mléčné žlázy z genu pro β-kasein (Schmitt-Ney a další, Mol. Celí. Biol. 11:3745-3755, 1991) a STÁT inducibilní element z genu Fcg Rí (Seidel a další. Proč. Nati. Acad. Sci. 92:3041-3045, 1995). Tyto oligonukleotidy obsahovaly Asp718-Xhol kompatibilní konce a byly ligo vány pomocí standardních postupů do reci pientn ího luciferázového reportérového vektoru ze světlušky obsahujícího c-fos promotor (Poulsen a další.. J. Biol. Chem. 2: 6229-6232, 1998), který byl štěpený týmiž enzymy a obsahoval neomycin jako selekční markér. Plazmid KZ134 byl použit k stabilní transfekci BaF3 buněk; k vytvoření buněčné linie BaF3/KZ134 byly použity standardní postupy transfekce a selekce.

Stabilní buněčná indikátorová linie BaF3/KZ134 exprimující zalphal 1 receptor úplné délky byla konstruována podle příkladu 2A, za užití asi 30 pg zalphal 1 expresního vektoru, popsaného v příkladu 3. Klony byly naředěny, vysety a selektovány pomocí standardních postupů. Klony byly testovány luciferázovým testem (viz příklad 20B, níže) s lidským kondiciovaným médiem se zalphal 1 Ligandem jako induktorem, Byly vybrány klony s největší odpovědí luciferázy (via STÁT lucíferáze) a s nejnižším pozadím. Byla vybrána také stabilní transfekovaná buněčná linie. Buňky této linie byly označeny jako BaF3/KZ134/zalphal 1.

B. Lidský a myší zalphal 1 Ligand aktivují lidský zalphal 1 receptor v BaF3/KZ134/Zalphal l luciferázovém testu

BaF3/zalphal 1 buňky byly centrifugovány a promyty mIL-3 free médiem. Buňky byly promyty a centrifugovány celkem třikrát, čímž se zaručila nepřítomnost mIL-3. Potom byly buňky spočítány v hematocytometru. Buňky byly vysety na destičky s 96 jamkami, a to po 30 000 buňkách na jamku v objemu 100 μ! na jamku v mIL-3 free médiu. Tentýž postup byl použit pro netransfekované BaF3/KZ134 buňky, které byly v testu použity jako kontrola. STÁT aktivace BaF3/KZ134/Zalphal l byla provedena pomocí kondiciovaného média z (1) BHK570 buněk transfekovaných lidským zalphal 1 Ligandem (příklad 7 nebo (2) BHK570 buněk transfekovaných myším zalphal 1 Ligandem (příklad 18) nebo (3) mIL-3 free média k měření odpovědi vyvolané pouze médiem v koncentracích 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,5%,

-63CZ 302921 B6

0,75% a 0,375%. K buňkám BaF3/KZ134/Zalphal 1 bylo přidáno 100 μΐ ředěného kondiciovaného média. Test s užitím kondiciovaného média byl proveden v paralele s netransfekovanými BaF3/KZ134 buňkami jako kontrolou. Celkový reakční objem byl 200 μΐ. Desky byly ínkubovány při 37 °C, 5% CO₂ po dobu 24 hodin, po této době byly buňky peletovány centrifu5 gací při 2000 rpm po dobu 10 min, poté bylo médium odsáto a bylo přidáno 25 μΙ lyzačního pufru. Po deseti minutách při pokojové teplotě byly desky proměřeny na aktivaci STÁT reportérového konstruktu pomocí odečítání hodnot na luminometru (Labsystems Lumínoskan, model RS), který přidával po 40 μΐ substrátu pro luciferázový test (Promega) v pěti vteřinových intervalech.

io Výsledky potvrdily odpověď^ STÁT receptoru v BaF3/KZ134/zalphal 1 buňkách na lidský zalphal 1 Ligand. Byla-li odpověď kvantifikována, při 50% koncentraci média hodnoty dosahovaly přibližně padesátinásobku hodnoty pozadí. STÁT aktivace jako odpověď na lidský zalphal 1 Ligand nebyla zaznamenána u netransfekovaných kontrolních buněk BaF3/KZ134, Čímž bylo prokázáno, že odpověď je opravdu zprostředkována zalphal 1 receptorem.

Výsledky dále potvrdily odpověď* STÁT reportéru v BaF3/KZl34/zalphal 1 buňkách na myší zalphal 1 Ligand byla zřejmá i u netransfekovaných kontrolních BaF/KZ134 buněk (přibližně pětinásobek hodnoty pozadí), což nasvědčuje tomu, že myší BaF3 buňky mají endogenní myší receptor.

Příklad 21: Test na aktivitu myšího zalphal 1 Ligandu v myších buňkách kostní dřeně

A. Isolace neadherentních buněk kostní dřeně o nízké denzitě:

Čerstvé buňky kostní dřeně byly získány ze stehenních kostí 6 až 10 týdnů starých myších samců Balb/C nebo samic C57BL/6. Kostní dřeň byla promyta RPM 1+10% FBS (JRL, Lenexa „KS; Hyclone, Logan LÍT) a rozpuštěna vRPMl+10% FBS jako celková buněčná suspenze buněk kostní dřeně. Tato suspenze byla podrobena centrifugací v hustotním gradientu (Nycoprep, 1,007,

Animal; Gibco BRL), aby se získala obohacená frakce o nízké hustotě, většinou jednojademých buněk. Celá buněčná suspenze buněk kostní dřeně (okolo 8 ml) byla opatrně nanesena na vrchol asi 5 ml Nycoprep gradientového roztoku v 15ml kónických zkumavkách. Potom byla centrifugo vána při 600 x g po dobu 20 min. Byla odebrána vrstva na rozhraní, obsahující nízkomolekulámí jednojademé buňky, ta byla promyta nadbytkem RPMI+10% FBS a peletována při

400 x g po dobu 5 až 10 minut. Pelet byl resuspendován v RPMI + 10% FBS a vyset do lahví

T-75 v přibližné hustotě asi 10⁶ buněk/ml. Kultury byly inkubovány při 37 °C, 5% CO₂ po dobu přibližné 2 hodin. Buňky vzniklé v suspenzi byly non-Adheren Low Densíty (NA LD) buňky kostní dřeně.

B. 96-jamkový test

NA LD myší buňky kostní dřeně byly vysety v koncentraci 25 000 až 45 000 buněk/jamku do 96 jamkové kultivační desky RPMI + 10% FBS + 1 ng/ml myší faktor kmenových buněk (mSCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN), plus 5% kondiciované médium odebrané z následu45 jících kultur: (1) BHK 570 buněk exprimujících myší zalphal 1 Ligand (příklad 18), (2) BHK 570 buněk exprimujících lidský zalphal 1 Ligand (příklad 7), nebo (3) kontrolních buněk BHK 570 buněk obsahujících vektor, ale neexprimujících vlastní Ligand. Tyto buňky byly potom podrobeny působení různých cytokinu, aby se otestoval jejich vliv na expanzi nebo diferenciaci hematopoetických buněk kostní dřeně. V testu byly vyseté NA LD z myší kostní dřené

5u podrobeny působení lidského Interleukinu-15 (hIL-15) (R&D Systems), nebo jinému z panelu dalších cytokinů (R&D Systems). Interleukin-15 (hIL-15), Čí další cytokiny byly testovány v sériovém ředění, s dvojnásobným sériovým ředěním v koncentracích od 50 ng/ml dolů až po 6025 ng/ml. Po 8 až 12 dnech byly 96-jamkové desky odečteny a prokázána případná proliferace pomocí testu s Alamar Blue tak, jak je to popsané v příkladu 5B.

-64CZ 302921 B6

C. Výsledky testů na 96-jamkové desce s NA LD myšími buňkami kostní dřeně

Kondiciovaná média z BHK buněk exprimuj ících jak myší, tak lidský zalphal 1 Ligand působily synergicky shIL-15 ve zvýšení expanze populace he máto poetických buněk v NA LD myší kostní dřeni. Tato expanze hematopoetických buněk nebyla prokázána u kontrolního kondiciovaného média z BHK buněk plus IL—15.

Populace hematopoetických buněk expandovaných myším zalphal 1 Ligandem a hlL-15 a hematopoetických buněk expandovaných lidským zalphal 1 Ligandem a hIL-15 byla io namnožena v buněčné kultuře. Tyto hematopoetické buňky byly obarveny fykoeritrinem označenou protilátkou proti Pan NK buňkám (Pharmingen) a podrobeny cytometrícké analýze, která prokázala, že expandované buňky vykazují pozitivitu pro markéry vyskytující se na buňkách přirozených zabijáků (NK cell markéry),

Tentýž test byl proveden s čerstvými buňkami lidské kostní dřeně koupenými u Poietic Technologies, Gaithersburg, MD, Opět ve spojení shlL-15, myší a lidský zalphall Ligand rozšířil populaci hematopoetických buněk, které se barvily pozitivně na NK buněčné markéry pomocí protilátek popsaných výše.

Příklad 22: Konstrukty pro tvorbu transgenníeh myší nesoucích lidský zalphal 1 Ligand

A. Konstrukt pro expresi lidského zalphal 1 Ligand s jatemím specifickým MT-1 promotorem

Pro tvorbu PCR. produktů byly navrženy oligonukíeotidy obsahující konsenzuální Kozákovu sekvenci a kódující oblast pro lidský zalphal 1 Ligand. Tyto oligonukíeotidy byly navrženy tak, že obsahovaly Fseí místo na 5' konci a AscI místo na 3' konci k usnadnění klonování do (a) pMT12-8, našeho standardně užívaného transgenního vektoru nebo (b) pKFOSl, lymfatického specifického transgenního vektoru (příklad 22B).

PCR reakce byly prováděny s 200 ng templátu lidského zalphal 1 Ligand (příklad 7) a oligonukíeotidy ZC22143 (SEKV.ID.Č:61) a ZC22144 (SEKV.ID.Č:62). Podmínky PCR reakce byly následující: 95 °C po 5 minut, potom byla přidána Advantage™ cDNA polymeráza (Clontech); 15 cyklů při 95 °C po 60 s, 60 °C po 60 s a 72 °C po 90 s; a 72 °C po 7 minut. PCR produkt byl analyzován na agarózovém gelu (Boehringer Mannheim) a purifikován pomocí Qiaquick™ gel extrakční ho kitu (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Izolovaný DNA fragment o velikosti 488 bp byt štěpen Fseí a AscI (Boehringer Mannheim), precipítován ethanolem a ligován do pMT12-8, který byl předtím naštěpen Fseí a AscI. Plazmid pMT12-8 určený pro expresi žádaného genu v játrech a dalších tkáních v transgenníeh myších, obsahuje expresní kazetu ohraničenou 10 kb MT-1 DNA na 5' a 7 kb MT-1 DNA na 3' konci.

Expresní kazeta obsahuje MT-1 promotor, krysí insulinový II intron a polylínker pro inserci žádaného klonu a póly A sekvenci z lidského růstového hormonu (hGH).

Asi jeden mikrolitr každé ligační směsi byl elektroporován do DH10B ElectroMax™ elektrokompetentních buněk (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) podle instrukcí výrobce a vysety na LB plotny obsahující 100 pg/ml ampicilinu a nechaly se inkubovat do rána. Kolonie byly vypíchnuty a nechaly se růst v LB médiu obsahujícím 100 pg/ml ampicilinu. Byla provedena minipreparace DNA u vypíchnutých klonů a tyto klony byly zkoumány na přítomnost insertu zalphal 1 Ligandu pomocí restrikce EcoRI samotným, nebo Fseí a AscI kombinovaně a potom byla provedena elektroforéza na agarózovém gelu. Dále byla preparace ve velkém u klonů obsahujících pMT-lidský zalphall Ligand. Fragment Sáli, obsahující 5' a 3' hraniční sekvence, MT-1 promotor, krysí intron II pro insulin, cDNA pro lidský zalphall Ligand a hGH polyA sekvenci byl připraven za účelem mikroinjekcí do oplodněných myších oocytů. Mikroinjekce a produkce

-65 CZ 302921 B6 transgenních myší byla provedena tak, jak je popsáno v Hogan a další, Manipulating the Mouše Embryo, 2. Vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1994.

B. Konstrukt pro expresi lidského zalphal 1 Ligandu ze specifického lymfatického promotoru

EpCK

Pro tvorbu PCR produktů byly navrženy oligonukleotidy obsahující konsenzuální Kozákovu sekvenci a kódující oblast pro lidský zalphal 1 Ligand. Tyto oligonukleotidy byly navrženy tak, že obsahovaly Fseí místo na 5' konci a AscI místo na 3' konci k usnadnění klonování do io pKF051, lymfatického specifického transgenního vektoru.

PCR reakce byly prováděny s 200 ng templátu lidského zalphal 1 Ligand (příklad 7) a oligonukleotidy ZC22143 (SEKV.ID.Č:61) a ZC22144 (SEKV.ID.Č:62) PCR byla provedena pomocí Advantagc¹ cDNA polymerázy (Clontech). Podmínky PCR reakce byly následující: 95 °C po 5 minut, 15 cyklů při 95 °C po 60 s, 60 °C po 60 s a 72 °C po 90 s; a 72 °C po 7 minut. PCR produkty byly purifíkovány postupem popsaným výše.

Izolovaný DNA fragment o velikosti 488 bp byl Štěpen Fseí a AscI (Boehringer Mannheim), precipitován ethanolem a ligován do pKF051 předtím naštěpeného pomocí Fsel a AscI.

Transgenní vektor pKF051 byl odvozen od plO26X (Iritani a další, EMBO J. 16: 7019-31, 1997) a obsahuje pro T-buňky specifický proximální promotor, B/T buněčně specifický zesilovač pro μ těžký řetězce imunoglobulinu, mnohočetné klonovací místo pro usnadnění vložení požadovaného klonu a mutovaný hGH gen, který kóduje inaktivní růstový hormon (poskytuje 3' introny a polyadenylační signál).

Asi jeden mikrolitr každé ligační směsi byl elektroporován, buňky vysety, klony vypíchnuty atestovány na přítomnost inertu pro lidský zalphal 1 Ligand pomocí restrikčního štěpení popsaného výše. Správnost klonu pKF051-zalphal 1 Ligandu byla ověřena sekvenováním a byly připraveny mini a max i preparace tohoto klonu. Notl fragment, obsahující lek proximální promotor a immunoglobulin-μ zesilovač (ΕμΛίΧ), zalphal 1 Ligand cDNA a mutovaný hGH, gen byl připraven pro užití v mikroinjekcích do myších oplodněných oocytů.

Příklad 23: Distribuce myšího zalphal I Ligandu ve tkáni

Pro určení tkáňové distribuce exprese myšího zalphal 1 Ligandu byly vyzkoušeny Murine Multiple Tissue Northern Blots (Mouše, Mouše Embryo, Clontech; MB 1010, BM 1012 Origene). Sonda o přibližné velikosti 484 bp odvozená PCR byla amplifikována pomocí plazmidu M11L/pZP7 (příklad 16) jako templátu a oligonukleotidu ZC22283 (SEKV.ID.Č:57) aZC22284 (SEKV.1D.Č:58) jako primerů. PCR amplifíkace probíhala podle následujícího schématu: 1 cyklus při 94 °C po 1,0 minutu; 35 cyklů při 94 °C po 30 s, 50 °C po 30 s a 72 °C po 30 s; následováno 1 cyklem při 72 °C po dobu 10 minut. PCR produkt byl analyzován na agarózovém gelu (Boehringer Mannheim) a byl izolován PCR produkt o přibližné velikosti 484 bp z gelu užitím extrakčního kitu (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Sonda byla radioaktivně označena REDIPRIME™ značícím kitem (Amersham) podle instrukcí výrobce. Sonda byla purifi kována pomocí NUCTRAP™ sloupce (Stratagene). Pro prehybridizaci byl použit roztok EXPRESS HYB™ (Clontech) a jako hybridizační roztok pro Northern bloty, Hybridizace se prováděla pres noc při teplotě 65 °C pomocí 10⁶ cpm/ml značené sondy. Bloty byly poté třikrát promyty při pokojové teplotě v 2 x SSC a 0,1% SDS, následovalo dvojí promytí v 0,1 x SSC a 0,1% SDS při 55 °C. Ve varlatech byly pozorovány dva transkripty o velikosti přibližně 1,2 a 3,5 kb. V brzlíku byl pozorován jen transkript o vyšší velikosti.

Byla rovněž vyzkoušena a provedena hybridizace s kitem pro myší RNA Master Dot Blot (Clontech), který obsahuje RNA z různých tkání a který byl normalizován pro 8 samostatných genů. Exprese byla patrná ve varlatech.

-66CZ 302921 B6

Příklad 24: Purifikace neznačeného lidského myšího zalphal 1 Ligandu z BHK 570

1«

Není-li uvedeno jinak, všechny reakce probíhaly pri 4°C. K purifikací lidského a myšího zalphal 1 Ligandu z kondiciovaného média BHK 570 buněk transfekovaných konstrukty exprimujícími buď lidský zalphal 1 Ligand (příklad 25) nebo myší ligand (Ml lL/pZP9) (příklad 18) byly užívány následující postupy. Kondiciovaná média byla koncentrována obvyklými postupy. Koncentrovaná kondiciovaná média (CM) byla sterilně filtrována přes filtry s velikostí pórů od 0,45 a 0,22 mikronů. Média byla potom ředěna na nižší iontovou sílu, menší než 2 mS v 0,01 M HEPES (JRH Biosciences, Lenexa, KS) o pH 7,0. Média upravená na nízkou iontovou sílu byla potom nanášena na sloupec 10 x 66 mm (6 ml) Poros HS-50 (PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) přes noc při průtokové rychlosti 4 ml/min pomocí BioCAD SPRINT (Perceptive BioSystems). Sloupec byl promyt 10 až 20 svými objemy (CV) 0,01M HEPES pH 7,0. Navázané proteiny byly vymývány krokovou elucí za užití 1M NaCl (Mallinckroft, Paris, KY) v 0,01 M HEPES pH 7,0 při průtokové rychlosti 5 ml/min; sbíraly se 2ml frakce v průběhu celé chromatografie a měřila se absorbance pri 280 a 215 nm. Frakce vrcholů vykazujících absorbanci byly analyzovány biotesty a SDS-PAGE s barvením stříbrem (Geno Technology, St. Louis, MO) a Coomassie (Sigma, St. Louis, MO). Vrcholové frakce byly sbírány, sterilně filtrovány a ředěny ud ιϋιιΐϋνϋϋ sílu íiiŽŠí než 19 mS pomoci PBS (Gibco BRL) pfi pH 7,2.

Ředěný vzorek byl potom nanesen rychlostí 2 ml/min pomocí BioCad SPRINT buď na sloupec s 0,8 ml Poros AL, který obsahoval zalphal 1 rozpustný receptor zalphal 1CFLAG (příklad 10B) nebo zalphal 1 rozpustný receptor zalphal 1-Fc4 fúzní protein (příklad 10C) imobilizovaných na pryskyřice (viz dále). Sloupec byl potom promyt alespoň 20 CV PBS při rychlosti 10 ml/min. Potom se sloupec rychle eluoval 600μ1 injekcí 0,lM glycinu (Aminoacetic Acid; Glycocol, Spectrum, Gardena, CA) pH 2,5 při nízké rychlosti 10 ml/min pomocí PBS na BioCAD 700E. Každých 6 s byly sbírány lml frakce a ihned se v nich neutralizovalo pH pomocí 55 μΐ 2 M TRIS (Tris (hydroxymethyl)aminomethan, EM Science, Gibbstown, NJ) pH 8,8, Po celou dobu trvání chromatografie se měřila absorbance při 280 a 215 nm. Vrcholové frakce se analyzovaly biotesty a SDS-PAGE s barvením stříbrem (Geno Technology, St. Louis, MO) a Coomassie barvením (Sigma, St. Louis, MO). Na obou gelech s myším zalphal 1 Ligandem, jak barvených stříbrem, tak Coomassie byly patrné dva pruhy o velikosti přibližně 24 kD a 18 kD. Pouze jeden pruh byl patrný na obou gelech, jak barvených stříbrem, tak Coomassie, pro lidský zalphal 1 Ligand.

Imobilizace lidského rozpustného polypeptidu pro zalphal 1 receptor na POROS AL nosič

Byly připraveny sloupce Poros AL s imobil izovaným zalphal 1 CFLAG rozpustným receptorem (příklad 10B) nebo zalphal 1-Fc4 fúzním rozpustným receptorem (příklad 10C). Bylo užito přibližně 3 mg zalphal 1 CFLAG rozpustného receptoru a přibližně 10 mg zalphal 1-Fc4 fúzního rozpustného receptoru. Všechny operace byly prováděny při pokojové teplotě na BioCAD 700E. Podle instrukcí výrobce byl připraven sloupec s 4,5 x 50 mm s POROS AL médiem v 2 M NaCl. Sloupec byl potom ekvilibrován v 1,1M Na₂SO₄/50mM fosfát sodný pH 7,2. Pomocí Millipore 30 MWKO centrifugačního koncentrátoru byl receptor zakoncentrován na 4 mg/ml a potom naředěn na 1:1 v 1,1M Na₂SO₄/50mM fosfát sodný pH 7,2. Sloupec byl promýván rychlostí

2 ml/min v 1,1 M Na₂SO₄/50mM fosfát sodný pH 7,2. Když byl sloupec promyt asi 9 CV daného pufru a byl uveden do ekvilibrovaného stavu, bylo na něj pomocí injekční stříkačky naneseno 100 μΐ ředěného ligandu, to se opakovalo až do stavu nasycení. Byl připraven 62 CV gradient od 1,1M Na₂SO₄/50mM fosfát sodný pH 7,2 do 550mM Na₂SO4/50mM fosfát sodný pH 7,2/5 mg/ml kyanoborohydrid sodný. Sloupec se potom nechal stát asi 2 h, což je čas k dokončení reakcí imobilizační chemie. Sloupec byl potom ekvilibrován v 0,2M TRIS pH 7,2/5 mg/ml kyanoborohydrid sodný a opět se sloupec nechal stát l h k dokončení ekvilibrace. Nakonec se sloupec převedl do PBS/0,02% azid sodný a uchovával se při 4 °C dokud nebyl upotřeben. Před upotřebením byl sloupec preeluován 0,lM glycinem, čímž bylo zajištěno, že na sloupci se nenachází žádná další nespecificky vázaná bílkovina a nedojde tak k nespecifickému vytěsňování imobilizovaného lidského zalphal 1 rozpustného receptoru

-67CZ 302921 B6

Příklad 25: Exprese lidského zalphal 1 Ligandu v savčích buňkách

A. Konstrukce expresního vektoru PZMP11/zalphal 1 Lig

Expresní plazmid obsahující všechny části polynukleotidu kódující lidský zalphal 1 Ligand byl konstruován cestou homologní rekombinace. Pomocí PCR byl izolován fragment cDNA lidského zalphall Ligandu (SEKV.1D.Č:63). Při přípravě fragmentu lidského zalphall Ligandu pomocí PCR byly užity dva primery: (1) Primer ZC22052 (SEKV.1D.Č:64), obsahující 40 bp hraniční vektorové sekvence a 17 bp odpovídajících aminokonci lidského zalphal 1 Ligandu a (2) primer ZC22053 (SEKV.ID.Č;65), obsahující 40 bp hraniční vektorové sekvence z 3' konce a 17 bp odpovídající karboxykonci lidského zalphal 1 Ligandu. PCR amplifikace reakce popsané výše probíhala dle následujícího reakčního schématu: jeden cyklus při 94 °C po dobu 2 minut; dvacet pět cyklů při teplotě 94 °C po dobu 30 sekund, 60 °C po 30 sekund, 72 °C po dobu 1 minuty; jeden cyklus při 72 °C po dobu 5 minut; následovalo uchovávacím cyklem při 4 °C. Deset mikrolitrů ze 100 μΙ PCR reakční směsi bylo analyzováno na 0,8% LMP agarózovém gelu (Seaplaque GTG) v 1 x TBE pufru, kdy byl vizualizován produkt o velikosti 560 bp. Zbývajících 90 μΐ PCR reakce bylo precipitováno přidáním 5 μΐ 1M NaCl a 250 μΐ absolutního ethanolu a bylo použito k rekombinaci do recipientního vektoru pZMPl 1, který je popsán dále. Recipientní plazmid pZMPl 1 byl předtím naštěpen Smál.

Použitý plazmid pZMPl 1 byl odvozen od plazmidu pCZR199 (popsán v příkladu 8). Plazmid pCZRI99 je savčí expresní vektor obsahující expresní kazetu mající CMV okamžitý časný promotor, konsenzuální intron z lokusu pro variabilní oblast myšího imunoglobulinu těžkého řetězce, mnohočetné klonovací místo pro vložení klonovaných sekvencí, stop kodon a terminátor z lidského růstového hormonu. Plazmid dále také obsahoval počátek replikace pro A. coli, savčí selekční expresní markér obsahující SV40 promotor, zesilovač a počátek replikace, gen DHFR a SV40 terminátor. Expresní vektor byl konstruován z pCZR199 náhradou metallothioneinového promotoru za CMV ihned působící časný promotor a Kozákovu sekvenci na 5' konci otevřeného čtecího rámce.

Sto mikrolitrů kompetentních kvasinkových buněk (5, cerevisiae) bylo smícháno s 10 μΐ obsahujícími přibližně 1 pg inzertu zalphall Ligandu a lOOng restrikčním enzymem Smál (BRL) štěpeného expresního vektoru pZMPl 1 bylo přeneseno do 0,2 cm elektroporaění kyvety. Na směs kvasinek/DNA bylo působeno elektrickými pulzy o parametrech 0,75 kV (5 kV/cm), maximální hodnotě ohmů, 25 pF. Do každé kyvety se přidalo 600 pl 1,2M sorbitolu a kvasinky byly vysety ve dvou 300μ1 alikvótech na dvě URA-D plotny a ponechaly se inkubovat při 30 °C.

Po 48 hodinách inkubace byly Ura+ kvasinkové transformanty z jednotlivých ploten resuspendovány v 1 ml vody a rychle centrifugovány, aby byl získán pelet. Buněčný pelet byl resuspendován v 1 ml lyzačního pufru (2% TritonX-100, 1% SDS, lOOmM NaCl, lOmM TRIS, pH 8,0; ImM EDTA). Pět set mikrolitrů lyzační směsi bylo dáno do Eppendorfovy zkumavky (eppendorfky) obsahující 300 pl kyselinou promytých skleněných mikročástic a 200 pl směsi fenol/chloroform, směs byla podrobena vortexování v jednominutových intervalech, dvakrát či třikrát, následovala centrifugace po dobu 5 minut v centrifuze na eppendorfky při maximální rychlosti. Tri sta mikrolitrů vodné fáze bylo přemístěno do čisté zkumavky a DNA se precipitovala pomocí 600 pl ethanolu (EtOH), potom byla centrifugována po dobu 10 minut pří 4 °C. DNA pelet byl resuspendován ve 100 μΐ vody.

Transformace elektrokompetentních E. coli buněk (DB10B, GibcoBRL) byla provedena s 0,5 až 2 ml kvasinkové DNA a 40 μΐ DH10B buněk. Buňky byly podrobeny působení elektrického pulzního pole při 2,0 kV, 25 mF a 400 ohmech. Po elektroporaci byly buňky vysety v 1 ml SOC (2% Bacto™ Trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5% kvasničný extrakt (Difco), lOmM NaCl, 2,5mM

-68CZ 302921 B6

KC1, lOmM MgCL, lOmM MgSO₄, 20mM glukóza) v 250 μΐ alikvótech na čtyři LB AMP plotny (LB médium (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/1 ampicilin).

Jednotlivé klony, obsahující správné expresní konstrukty zalphal 1-Fc4, byly testovány pomocí restrikčního štěpení a tak byla ověřena přítomnost inzertu a potvrzeno, že jednotlivé různé části DNA sekvencí jsou správně propojeny jedna s druhou. Inzerty pozitivních klonů byly podrobeny sekvenční analýze. Izolace plazmidových DNA ve větším měřítku byla učiněna pomocí Qiagen Maxi kit (Qiagen) podle instrukcí výrobce.

io A. Savčí exprese lidského zalphal 1 Ligandu

Buňky BHK 570 (ATCC No. CRL-10314) byty vysety na kultivační misky o průměru 10 cm a nechaly se narůst do hustoty 50 až 70 % přes noc při 37 °C v 800 μί bezsérového (SF) DMEM média (DMEM, Gibco/BRL High Glucose) (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), Buňky byly i5 transfekovány expresními plazmidy obsahujícími zalphal 1CEE, zalphal 1CFLG nebo zalphal 1CHIS, popsanými výše (viz příklad 8), za užití Lipofectin™ (Gibco BRL), v bezsérovém médiu (SF) DMEM. Tri mikrogramy zalphal 1CEE, zalphal 1CFLG nebo zalphal 1 CHIS zalphal 1 CHIS byly jednotlivě naředěny do l,5ml zkumavek na celkový objem 100 μΐ v SF

DMEM. V jiné zkumavce byla připravena následující směs: 15 μί Lipofectin™ (Gibco, BRL),

1 00 μί SF DMEM, Směs Lipofectin™ se inkubovala při pokojové teplotě po dobu 30 až 45 minut.

Potom byla přidána směs DNA a nechala se inkubovat při pokojové teplotě asi 10 až 15 minut.

Celá směs DNA: Lipofectin™ byla přidána k vysetým buňkám a byla přes ně rovnoměrně distribuována. Buňky byly inkubovány při 37 °C přibližně pět hodin, potom byly přeneseny na jednotlivé plotny o průměru 150 mm (MAXI plates) v celkovém objemu 30 ml DMEM/5% fetální hovězí sérum (FBS) (Hyclone, Logan, UT). Plotny byly inkubovány při 37 °C, 5% CCL, přes noc a směs DNA: Lipofectin™ byla nahrazena následující den selekčním médiem (5% FBS/DMEM s 1 μΜ methotrexátem (MTX)).

Přibližně 10 až 12 dní po transfekci byly plotny promyty 10 ml SF DMEM. Promývací média byla odsáta a nahrazena 7,25 ml bezsérového DMEM. Sterilní teflonová tkanina (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) předvlhčená v SF DMEM byla položena na klonované buněčné kolonie. Sterilní nitrocelu losový filtr před vlhčený v SF-DMEM byl potom položen na tkaninu. Orientačními značkami opatřené nitrocelulosové membrány byly přeneseny na kulti35 vační misku. Misky se inkubovaly po dobu 5 až 6 hodin při 37 °C, 5% CO₂ v inkubátoru.

Po inkubaci byly filtry /tkanina vyjmuty a media odsáta a nahrazena 5% FBS/DMEM s 1 μΜ MTX. Filtry byly potom blokovány roztokem 10% netučného mléka /Western A pufrem (Western A: 50mM Tris pH 7,4, 5mM EDTA, 0,05% NP-40, l50mM NaCl a 0,25% želatina) po dobu 15 minut při pokojové teplotě na třepačce. Filtry byly potom inkubovány s anti-Glu-Glu, anti-FLAG¹®, nebo anti-HIS protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP konjugáty), ředěnou v 2,5% netuěném mléku/Westem A pufru. inkubace trvala jednu hodinu při pokojové teplotě na třepačce. Filtry byly potom promývány třikrát za pokojové teploty Western A pufrem po dobu 5 až 10 minut najedno promývání. Filtry byly potom vyvolány pomocí ultra

ECL reagencie (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) podle návodu výrobce a vizualizovány na přístrojí Lumi-Imager (Roche Corp.).

Pozitivní exprimující klonované kolonie byly mechanicky vypíchány do 12-jamkové desky do jednoho mililitru 5%FCS/DMEM s 5 μΜ MTX a nechaly se vyrůst do shluků.

Vzorky kondiciovaného média byly testovány na úroveň exprese SDS-PAGE a Western analysou. Pro každý konstrukt byly vybrány tři kmeny s nejvyšší hladinou exprese. Dva kmeny z vybraných tří byly zamrazeny jako záloha a jeden byl namnožen pro zkoušku na obsah mykoplazmy a pro testování možnosti napěstování ve velkém průmyslovém měřítku.

-69CZ 302921 B6

C. Savčí exprese rozpustného zalphal 1 receptorů zalphal 1-Fc4

Buňky BHK 570 (ATCC No. CRL-10314) byly vysety na tkáňové kultivační misky o průměru 10 cm a nechaly se narůst přibližně do 50 až 70% konfluence. Kultivace probíhala přes noc při 37 °C v atmosféře s 5% CO₂ v DMEM/FBS médiu (DMEM, GibcoBRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) s 5% fatálním hovězím sérem (Hyclone, Logan, UT), ImM L-glutaminem (JRH Biosciences, Lenexa, KS), ImM pyruvátem sodným (Gibco BRL)). Buňky byly transfekovány plazmidem PZMP/zalphal ILig (příklad 25A) za užití Lipofectaminu™ (Gibco BRL), v bezsérovém médiu (SF) o složení (DMEM, 10 mg/ml transfarin, 5 mg/ml insulin, 2 mg/ml fatuin, 1 % L-glutamin a 1 % pyruvát sodný). Plazmid zalphal ]-Fc4/pZMP6 (příklad8) byl nareděn do 15 ml zkumavek na celkový objem 640 μΐ SF médiem. 35 μΐ Lipofectaminu™ (Gibco BRL) bylo smícháno se 605 μΙ SF média. Připravený roztok Lipofectaminu™ byl přidán ke směsi DNA a vše se nechalo inkubovat při pokojové teplotě přibližně 30 min. Do směsi DNA:Lipofectamin™ bylo přidáno pět mililitrů SF média.

Buňky byly promyty jednou 5 ml SF média, potom bylo médium odsáto a byla přidána směs DNA: Lipofectín ™. Buňky byly inkubovány při 37 °C přibližně pět hodin, potom bylo přidáno na každou plotnu 6,4 ml DMEM/10% FBS, 1% PSN. Plotny se inkubovaly přes noc při 37 °C a roztok DNA:Lipofactamin byl následující den nahrazen čerstvým 5%FBS/DMEM. Pátý den po transfekci byly buňky převedeny do selekčního média (DMEM/5%FBS, 1% L-GLU, 1% NaPyr) a rozděleny do kultivační láhve T-162. Přibližně 10 dnů po transfekci byly vybrány z každé transfakce dvě misky pro tkáňové kultury o průměru 150 mm s koloniemi resistentními na methotrexát a trypsinizovány. Buňky byly shromážděny a vysety do kultivační láhve T-162 a převedeny do kultury vhodné pro využití ve velkém měřítku. Kondiciované médium z kultury pěstované ve velkém bylo použito k purifikací lidského zalphal 1 Ligandu, tak je to popsáno v příkladu 24.

Příklad 26: Konstrukt pro přípravu transgenních myší nesoucích myší zalphal 1 Ligand

A. Konstrukt pro expresi myšího zalphal 1 Ligandu pomocí specifického lymfatického promotoru EpLCK

Byly navrženy oligonukleotidy, pomocí kterých se v PCR reakci generovaly fragmenty obsahující ozakovu sekvenci a kódující oblast pro myší zalphal 1 Ligand. Tyto oligonukleotidy byly navrženy tak, že obsahovaly Fsel místo na 5' konci a AscI místo na 3' konci k usnadnění klonování do (a) pKF051, lymfatického specifického transgenního vektoru a (b) našeho standardně užívaného transgenního vektoru pTG12-8.

PCR reakce byly prováděny s 200 ng templátu myšího zalphal 1 Ligandu (SEKV.ID.Č:55, příklad 16) a oligonukleotidy ZC23115 (SEKV.ID.Č :66) a ZC23116 (SEKV.ID.Č:67). Podmínky PCR reakce byly popsány v příkladu 22B. PCR reakce byla provedena s Advantage™ cDNA potymerázou (Clontech). Správnost klonu pKF051-zalphal l Ligandu byla ověřena sekvenovánim a byla provedena maxipreparace tohoto klonu. Notl fragment, obsahující lek proximální promotor a immunoglobulin-μ zesilovač, zalphal 1 Ligand cDNA a mutovaný hGH, gen byl připraven pro mi kro injekce do myších oplodněných oocytů.

B. Konstrukt pro expresi myšího zalphal 1 Ligandu s jatém ím specifickým promotorem MT-1

Tentýž inzert myšího zalphal 1 Ligandu jako v příkladu 26A byl subklonován do vektoru pTG12-8, tak, jak je popsáno v příkladu 22A. Pro přípravu tohoto konstruktu bylo 10 mg DNA z maxipreparace pKF051-zalphal 1 Ligandu naŠtěpenou kombinací Fsel a AscI, precipitováno ethanolem a dále byl fragment myšího zalphal 1 Ligandu purifikován tak, jak je to popsáno v příkladu 22. Tento fragment byl potom ligován do pTG12-8, který byl předtím také naštěpen

-70CZ 302921 B6 kombinací Fsel a AscI, jak je to popsáno v příkladu 22A. Elektroporace, testování klonů a maxipreparace, byly provedeny tak, jak je popsáno v příkladu 22. Byl připraven fragment vzniklý štěpením Sall, obsahující hraniční sekvence 5' a 3', MT-1 promotor, intron 11 pro krysí insulin, myší cDNA pro zalphal 1 Ligand a hGH polyA sekvenci. Tento fragment byl použit pro mikroinjekce do oplodněných myších oocytů.

Příklad 27: Polyklonální protilátky proti myšímu zalphal 1 Ligandu io Polyklonální protilátky byly připraveny imunizací 2 samic novozelándských bílých králíků purifikovaným rekombinantním proteinem muzalphal 1L/MBP-6H (příklad 32). Králíci dostali jednu iniciační intraperitoneální (ip) injekci 200 mg purifikované ho proteinu v kompletním Freundově adjuvans, potom každé tři týdny následovaly další dávky formou ip injekcí po 100 mg peptidu v nekompletním Freundově adjuvans. Sedm až deset dní po podání druhé dávky (celkem byly tři dávky), byla zvířatům odebrána krev a připraveno sérum. Zvířata byla takto částečně vykrvována každé tři týdny.

Specifické králičí sérum generované proti muzalphal 1L/MBP-6H bylo preadsorbováno santiMBF protilátkou na CNBr-Sepnaróze 4B nosiči (ruarmacia KLB), který byl připraven pomocí zo 10 mg purifikovaného rekombinantního maltóza-vazného proteinu (MBP) na gram CNBrSEPHARÓZy. Rekombinantní MBP byl připraven a purifikován na amy lóžovém sloupci, připraveném v naší laboratoři, pomocí běžně užívaného postupu, Muzalphal lígand-specifické polyklonální protilátky byly afinitně purifikovány z králičího séra pomocí sloupce CNBr-SEPARHOSE 4B (Pharmacia LKB), který byl připraven užitím 10 mg specifického anti25 genu - čistého rekombinantního proteinu muzalphallL/MBP-6H (příklad 32), potom následovala dialýza proti 20-násobnému objemu PBS pres noc. Muzalphal 1-1 igand-specifická protilátka byla charakterizována ELISA postupem užitím 1 pg/ml purifikovaného rekombinantního proteinu muzalphal IL/MBP-6H (příklad 32) nebo huzalphal IL-MBP/6H (příklad 32) jako antigenů. Spodní hranice detekce (LLD) králičích anti-muzalphalIL/MBP—6H afinitně purifiko30 váných protilátek byla 100 pg/ml specifického afinitně purifikovaného rekombinantního antigenu muzalphal 1L/MBP-6H a 500 pg/ml purifikovaného rekombinantního huzalphal 1 L-MBP/6H.

Příklad 28: Konstrukce savčího expresního vektoru a exprese lidského zalphal 1 Ligandu v

CHO DG44 buňkách ve velkém

Savčí expresní vektor pro lidský zalphal 1 Ligand (SEKV.ID.Č: 1) s přidanými restrikčními místy pro Sall na 5' konci a Pmel na 3' konci cDNA byl konstruován cestou PCR amplifikace a zplazmidu obsahujícího lidský zalphal 1 Ligand (příklad 7) s oligonukleotidovými primery

ZC22054 (SEKV.ID.Č:70) a ZC22055 (SEKV.ID.Č;71), Podmínky PCR reakce byly následující:

°C po 4 min; 25 cyklů při 94 °C po 45 s, 50 °C po 45 s a 72 °C po dobu 3 min; a 72 °C po dobu 10 min. PCR produkty byly izolovány jak bylo již dříve popsáno a naštěpený Sall a Pmel, potom ligovány do plazmidu pDC312 předtím naštěpeným vhodnými restrikčními enzymy v místě mnohočetného klonovacího místa postupy ve vynálezu již popsanými. Plazmid pDC312 je popsán v Morris a další, Expression Augmenting is Sequence Element (EASE) isolated from Chinese Hamster Ovary Cel Is v knize Animal Cell Technology, Carrondo, MJT a další (eds.) (1997) Kluwer Academie Publishers, The Netherlands, strana 529-534.

Ligovaný vektor byl podle instrukcí výrobce transfekován do suspenze adaptovaných CHO

DG44 (Novo Nordisk, Denmark) buněk lipofekcí za užití LipofectaminePlusTM reagencie (GibcoBRL). Transfektanty byly selektovány pomocí PFCHO média (JRH, Lenexa, Kansas) bez thymidinu a hypoxanthinu, potom následovala selekce 200nM methotrexátem (Sigma, St. Louis, MO). Na methotrexát resistentní buňky byly klonovány ředěním a testovány na produkci zalphal 1 Ligandu pomocí určení aktivity BaF3 (příklad 5B).

-71 CZ 302921 B6

Produktivní kmen byl namnožen a napěstován v bioreaktoru v kultuře 7 až 20 litrů (Applikon Bioreactors, Schiedam, The Netherlands) PFCHO média za účelem získání dostatečného množství materiálu pro purifikaci (příklad 29).

Příklad 29: Velkokapacitní purifikace neznačeného lidského a myšího zalphal 1 Ligandu z BHK a CHO savčích expresních linií

A. CHO exprimovaný zalphal 1 Ligand

Není-li poznamenáno jinak, všechny operace probíhaly za teploty 4 °C. K produkci alespoň 30 I CH kondiciovaného média (příklad 28) pro purifikaci lidského zalphal 1 Ligandu byly použity následující postupy: Koncentrované či nekoncentrované kondiciované médium (CM) bylo sterilně přefiltrováno za použití filtrů s velikostí pórů 0,45 a 0,22 mikronů. Kondiciovaná média byla poté pufrována 0,01M MES (Fluka BioChemika, Switzerland) a hodnota pH upravena na 6,0 a potom nanášena přes noc na sloupec 50 x 100 mm (196 ml) Poros 50 HS (silný kationtový měníc od PerSeptive BioSystems, Framingham, MA) rychlostí 4 až 10 ml/min pomocí BioCAD SPRINT (Perceptive BioSystems). Sloupec byl promyt 10 až 20 objemy sloupce (CV) 0,01M MES/0J30M NaCl (Mallinckrodt, Paris, KY) pH 6,0. Navázané proteiny byly potom eluovány gradientem 0,130M až 1M NaCl, 10 CV v 0,01 M MES, pH 6,0 průtokovou rychlostí 30 ml/min; po celou dobu chromatografie byly sbírány 25ml frakce a měřena absorbance při 280 a 215 nm. Frakce vrcholů vykazujících absorbanci byly analyzovány SDS-PAGE s barvením stříbrem (Geno Technology, St., Louis, MO) a Coomassie (Sigma, St. Louis, MO) a Western ímmunologickým blotem za užití protilátek proti lidskému zalphal I Ligandu (příklad 33 a 34).

Vrcholové frakce byly zakoncentrovány v buněčném koncentrátoru na membráně YM10 (Millipore/Amicon, Bedford, MA) na objem asi 1 až 10 ml. Vzorek byl nanesen na vhodný sloupec Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) s vysokým rozlišením exkluze molekul (52600 ml) ekvilibrovaným v PBS (Gibco BRL) a za průtokové rychlosti 1 až 2 ml/min; během celé chromatografie byly sbírány 1 az 2ml frakce a měřena absorbance při 280 až 215 nm. Frakce vrcholů vykazujících absorbanci byly analyzovány SDS-PAGE s barvením stříbrem (Geno Technology, St. Louis, MO) a Coomassie (Sigma, St. Louis, MO.

Požadované frakce byly shromážděny a zakoncentrovány na centrifugačním koncentrátoru Millipore 5 kD MWKO na minimální objem. Finální produkt byl opět analyzován pomocí SDS PAGE s Coomassie barvením (Sigma, St. Louis, MO), Western blotem, sekvenací N-koncové části a BCA kitem (Pierce, Rockford, Illinois) na čištění a koncentraci proteinů.

B. Myší zalphal I Ligand exprimovaný v BHK 570

Není-li uvedeno jinak, všechny pochody byly prováděny za teploty 4 °C. K produkci BHK kondiciovaného média (příklad 18) pro purifikaci lidského zalphall Ligandu byly použity následující postupy; Koncentrované ěi nekoncentrované kondiciované médium (CM) bylo sterilně přefiltrováno za použití filtrů s velikostí pórů 0,45 a 0,22 mikronů. Kondiciovaná média byla poté pufrována 0,01M MES (Fluka BioChemika, Switzerland)) a hodnota pH upravena na 6,0. CM byla analyzována, nanesena na sloupec AS tak, jak to bylo popsáno v příkladu 29A.

Vrcholové frakce byly zakoncentrovány v buněčném koncentrátoru, tak, jak je popsáno v příkladu 29A na objem 20 až 30 ml. Hodnota pH byla upravena na 7,0 a potom byl vzorek nanesen na sloupec 0,8 ml Poros AL, kde bylo na pryskyřici imobilizováno okolo 3 mg zalphal 1CFLAG značeného rozpustného receptorů (příklad 10), nebo jeden az 10 mg zalphal 1Fc4 fúzního receptorů (příklad 10C) (viz postup dále). Průtoková rychlost byla 1 ml/min na BioCAD SPRINT. Sloupec byl poté promyt alespoň 20 CV 0,3M NaCl/PBS (Gibco BRL)/0,01M MES při průtoku 10 ml/min. Sloupec byl poté rychle promyt 600μΙ injekcí 0,lM glycinu (Aminoacetic Acid; Glycocol, Spectrum, Gardena, CA) pH 2,5 při průtokové rychlosti 10 ml/min

-72 CZ 302921 B6 pomocí PBS na BioCD SPRINT. Každých 6 s byly sbírány lml frakce a ihned se v nich neutralizovalo pH pomocí 55 μΐ 2M TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan, EM Science, Gibbstown, NJ) pH 8,8, Po celou dobu trvání chromatografie se měřila absorbance při 280 a215nm. Vrcholové frakce se analyzovaly SDS-PAGE s barvením stříbrem (Geno Technology, St. Louis,

MO) a Coomassie barvením (Sigma, St. Louis, MO) a Western blotem jako v předchozím případě.

Vrcholové frakce byly zákoncentrovány v buněčném koncentrátoru na membráně jako v příkladu 29A na objem asi 1 až 10 ml. Vzorek byl nanesen na vhodný sloupec Sephacryl S-200 (Pharmaio cia, Uppsala, Sweden) s vysokým rozlišením exkluze molekul. Frakce vrcholů vykazujících absorbanci byly analyzovány SDS-PAGE s barvením stříbrem (Geno Technology, St. Louis,

MO) a Coomassie (Sigma, St. Louis, MO). Žádané frakce byly shromážděny, koncentrovány a analyzovány jako v příkladu 29A.

C. Imobilizace na POROS AL médiu

Všechny operace byly prováděny za pokojové teploty a s použitím BioCAD 700E. Podle instrukcí dodavatele byl nalit sloupec 4,5 x 50 mm s POROS AL médiem v 2M NaCI. Sloupec byí ekvilibrován v LIM Na₂SO₄ a 50mivi fosfátem sodným pH 7,2. Receptor byl koncentrován na 4 mg/ml pomocí centriftigačního koncentrátoru Millipore 30 kD MWKO a potom naředěn 1:1 1,1M Na₂SO₄ a 50mM fosfátem sodným pH 7,2. Sloupec byl promýván LIM Na₂SO₄ a 50mM fosfátem sodným pH 7,2 rychlostí 2 ml/min a potom byl nanesen ředěný ligand v množství 100 μΙ a tento pochod se opakoval každých 9 CV, až bylo dosaženo rovnováhy, což se projevilo tím, že protein se už dále na sloupec nevázal, ale procházel jím. Potom se sloupec promýval

62 CVs gradientu, který byl vytvořen v rozmezí 1,1 M Na₂SO₄ v 50mM fosfátu sodném pH 7,2 až po 550mM Na₂SO₄ v 50mM fosfátu sodném pH 7,2 s 5 mg/ml kyanoborohydridu sodného. Aby byly dokončeny všechny procesy imobilizace, sloupec se nechal 2 h stát. Potom se sloupec promýval 0,2M TRIS pH 7,2 s 5 mg/ml kyanoborohydridu sodného a opět se nechal stát po dobu 1 h. Nakonec byl sloupec ekvilibrován PBS s 0,02% azidem sodným a potom byl uchováván při

4 °C. Před upotřebením sloupce se sloupec eluoval 0,lM glycinem pro ujištění, že na sloupci nejsou vázány žádné nespecifické proteiny a že se ze sloupce neuvolňuje imobilizovaný receptor.

Příklad 30: Konstrukce vektoru, exprese a purifikace neznačeného lidského a myšího zalphal 1

Ligandu z baculovirů

A. Konstrukt pro expresi lidského zalphal 1 Ligandu v baču lov irech

Pro expresi lidského zalphall Ligandu v hmyzích buňkách byl připraven expresní vektor zalphalIL. Fragment o velikosti 517 bp obsahující sekvenci polypeptidu lidského zalphall Ligandu a kódující navíc BaMHI a Xhol restrikční místa na 5' a 3'koncích, byl připraven PCR metodou. Z plazmidu obsahujícího cDNA pro lidský zalphal 1 Ligand (příklad 7) pomocí primerů o následujících sekvencích: ZC23444 (SEKV.ID.Č:74) a ZC23445 (SEKV.ID.Č:75). PCR amplifikace zalphal 1 fragmentu byla provedena podle následujícího schématu: 1 cyklus pri

94 °C, dvacet pět cyklů pri 94 °C po dobu 45 s; 50 °C po 45 s, 72 °C po 2 min; 1 cyklus při 72 °C po dobu 10 min, následováno uchovávací teplotou 4 °C. Fragment byl vizualizován elektroforézou (1% SeaPlaque/1% NuSieve). Odpovídající proužek byl vyříznut, naředěn na obsah 0,5% agarózy pomocí 2mM MgCl₂, roztaven při 65 °C, naštěpen BamHI a Xhol (Boehringer Mannheim) a ligován do BamHIXhol naštěpeného baculovirového expresního vektoru, pZBV3L.

Vektor pZBV3L je modifikací expresního vektoru pFastBacl™ (Life Technologies), kde byl polyhedron promotor odstraněn a nahrazen pozdně aktivovaným Basic Protein Promotorem. Do ligační směsi bylo vzato asi 14 ng restrikčními enzymy štěpeného inzertu zalphal 1 Ligandu a asi 40 ng odpovídajícího vektoru. Ligace probíhala přes noc pri 16 °C.

-73 CZ 302921 Β6

Ligační směs byla třikrát naředěna pomocí TE (lOmM Tris-HCl, pH 7,5 a ImM EDTA) a asi 4 fmol ředěné ligační směsi byly transformovány do DH5ct kompetentních buněk Library Efficienty (Life Technologies) podle instrukcí výrobce za užití teplotního šoku 45 s při 42 °C ve vodní lázni. Transformovaná DNA a buňky byly nareděny v 450 μΙ SOC média (2% Bacto , Tryptone, 0,5% Bacto Yeast Extract, 10 ml 1M NaCI, l,5mM KCl, lOmM MgCl₂, lOmM MgSO₄a 20mM glukóza) a vysety na LB plotny obsahující 100 pg/ml ampicilin. Klony byly analyzovány restrikčním štěpením a 1 μΐ pozitivního klonu byl transformován do 20 μΐ DHlOBac Max Efficiency kompetentních buněk (CdBCO-BRL, Gaithersuburg, MD) podle instrukcí výrobce a teplotního šoku, jak bylo popsáno výše. Transformované buňky byly naředěny v 980 μΙ SOC média (2% Bacto™, Tryptone, 0,5% Bacto Yeast Extract, 10 ml NaCI, l,5mM KCl, lOmM MgCl₂, lOmM MgSO₄ a 20mM glukóza) a ponechány růst za třepání v inkubátoru pri 37 °C po dobu 4 h a vysety potom na plotny s Luria Agarem obsahujícím 50 pg/ml kanamycinu, 7 pg/ml gentamicinu (Life Technologies), 10 pg/ml tetracyklinu, IPTG (Pharmacia Biotech) a Bluo- Gal (Life Technologies). Plotny byly inkubovány po 48 h při 37 °C K identifikaci buněk obsahujících inzert byl užita barevná selekce a tento plazmid s inertem byt nazván bacmid. Kolonie, které měly bílou barvu byly vypíchány a užity pro analýzu. Z pozitivních kolonií byla izolována DNA pro lidský zalphal 1 Ligand bacmid cestou QiaVac Miniprep8 systém (Qiagen) podle instrukcí výrobce. Klony byly na obsah správného inzertu testovány amplifikaci DNA pomocí příměrů komplementárních k transposabilnímu elementu v bacmidu cestou PCR pomocí primerů ZC447 (SEKV.1D.Č:76) a ZC976 (SEKV.ID.Č:77). Podmínky pro PCR reakci byly následující: 35 cyklů při 94 °C po dobu 45 s, 50 °C po 45 a 72 °C po dobu 5 min; 1 cyklus při 72 °C po dobu 10 min; následoval uchovávající krok při 4 °C. PCR byl charakterizován na 1% agarózovém gelu a byla zkontrolována velikost produktu. Klony mající správnou velikost inzertu byly použity k transfekci buněk Spodoptera frugiperda (Sf9).

B. Exprese a generace materiálu pro purifikaci lidského zalphal 1 Ligandu z baculoviru

Sf9 buňky byly vysety na plotny o průměru 35 mm v hustotě 5 x 10⁶ a nechány růst po dobu 1 h pri teplotě 27 °C. Pět mikrolitrů DNA bacmidu lidského zalphal 1 Ligandu (výše) bylo naředěno 100 μΐ média Sf-900 II SFM (Life Technologies). Šest mikrolitrů CellFECTIN Reagent (Life Technologies) bylo naředěno 100 μΙ Sf-900 11 SFM. Bacmidová DNA a lipidický roztok byly jemně míchány a inkubovány po dobu 30 až 45 minut při pokojové teplotě. Médium z každé plotny bylo odsáto a buňky promyty 1 x s 2 ml čerstvého Sf-900 II SFM. Do směsi lipid-DNA bylo přidáno pět set mikrolitrů Sf-900 II SFM. Promývací médium bylo odsáto a směs DNA-lipid byla přidána k buňkám. Buňky se nechaly inkubovat po dobu 4 až 5 h při teplotě 27 °C. Směs DNA-lipid byla odsáta a byly přidány 2 ml Sf-900 II média na každou plotnu. Plotny se inkubovaly pri 27 °C, 90% vlhkosti po dobu 96 h, po kterých byl virus sklizen.

Pro primární amplifikaci byly buňky Sf9 kultivovány v 50 ml Sf-900 II SFM ve 125 ml lahvích za třepání do přibližné hustoty 0,41 až 52 x 10⁵ buněk/ml. Potom byly buňky infikovány 150 μΐ virového agens popsaného výše a inkubovány při 27 °C po dobu 3 dnů, po tomto čase byl virus standardními postupy obvyklými v daném oboru sklizen. Pětiset mikrolitrový alikvót buněk byl podroben testu na biologickou aktivitu v BaF3 (příklad 5).

Pro sekundární amplifikaci byly Sř9 buňky kultivovány v 1 1 Sf-900 II SFM v 2800 ml lahvích za třepání do přibližně hustoty 0,5 x 105 buněk/ml. Buňky byly infikovány 500 μΐ primární virové kultury a ponechány inkubovat při 27 °C po dobu 4 dnů, po této době byl virus standardními postupy známými v oboru sklizen. Virus byl titrován a napěstován pro purifikaci bakuloviru produkujícího lidský zalphal 1 Ligand (huzalphal 1 L-Bv), prováděnou ve velkém měřítku, tak jak je popsáno v příkladu 30C a 30D dále.

-74CZ 302921 B6

C. Purifikace baculoviru exprimujícího lidský/myší zalphal 1 Ligand ve velkém

Není-li poznamenáno jinak, všechny operace probíhaly za teploty 4 °C. K produkci lidského zalphall Ligand (huzalphalÍL-Bv) z BV kondicíovaného média (příklad 30B) byly použity následující postupy: Kondiciované médium (CM) bylo sterilně přefiltrováno za použití filtrů s velikostí pórů 0,45 a 0,22 mikronů, kondiciovaná média byla poté pufrována 0,01 M MES (Fluka BioChemika, Switzerland) a hodnota pH upravena na 6,0 a CM potom nanášena na sloupec Poros 50 HS kde proběhla chromatografie popsaná v příkladu 29A. Vzorek byl nanesen na vhodný sloupec Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) s vysokým rozlišením io exkluze molekul a byl analyzován stejným postupem jako v příkladu 29A.

Požadované frakce byly shromážděny a zakoncentrovány na centrifugačním koncentrátoru Millipore 5 kD MWKO na minimální objem. Finální produkt byl opět analyzován pomocí SDS PAGE s Coomassie barvením (Sigma, St. Louis, MO), Western blotem, sekvenací N-koncové části a BCA kitem (Pierce, Rockford, Illinois) na čištění a koncentraci proteinů tak, jak je to popsáno v příkladu 29A. Zásobní protein byl skladován při teplotě-80 °C.

D. Purifikace baculoviru exprimujícího lidský/myší zalphal 1 Ligand v malém měřítku (<2 mg)

2o Není-li poznamenáno jinak, všechny operace probíhaly za teploty 4 °C. K produkci lidského zalphal 1 Ligand (huzalphal ÍL-Bv) z BV kondicíovaného média v množství menším než 2 mg byly použity následující postupy: Kondiciované médium (CM) bylo sterilně přefiltrováno a hodnota pH upravena tak, jak je popsané v příkladu 30C, stejně tak proběhlo nanesení na sloupec POROS 50 HS, chromatografie a analýza. Frakce byly sbírány a potom zakoncentrovány pomocí diafiltrace v koncentrátoru smícháním na membráně YM10 (10 kD MWCO) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) na nominální objem (20 až 30 ml). pH bylo upraveno na 7,0 a vzorky naneseny s průtokovou rychlostí 1 ml/min, na sloupec s 0,8 ml Poros AL, kde se získalo 3 mg rozpustného receptorů (příklad 10C) imobifizovaném na pryskyřicí (viz postup v příkladu 29C) na BioCad SPRINT. Sloupec byl potom promyt alespoň 20 CV 0,3M NaCI/PBS(Gibco

BRL)/0,0lM MES při průtoku 10 ml/min. Sloupec byl poté rychle promyt 600μ1 injekcí 0,lM glycinu (Aminoacetic Acid; Glycocol, Spectrum, Gardena, CA) pH 2,5 při průtokové rychlosti 10 ml/min pomoct PBS na BioCAD SPRINT. Každých 6 s byly sbírány lml frakce a ihned se v nich neutralizovalo pH pomocí 55 μί 2M TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan, EM Science, Gibbstown, NJ) pH 8,8. Po celou dobu trvání chromatografie se měřila absorbance při

280 a 215 nm. Frakce byly analyzovány tak, jako v předchozím příkladě.

Frakce byly sbírány a potom zakoncentrovány pomocí diafiltrace v koncentrátoru s mícháním na membráně YM10 (10 kD MWCO) (Millipore/Amicon, Bedford, MA) na nominální objem 1 až 2 ml. Vzorek byl nanesen na vhodný sloupec Sephacryl S-200 (Pharmacia, Uppsala, Sweden) s vysokým rozlišením exkluze molekul za vhodné průtokové rychlosti během celé chromatografie byly sbírány 1 až 2 ml frakce a měřena absorbance při 280 a 215 nm. Frakce vrcholů vykazujících absorbanci byly analyzovány jako v předchozím případě.

Požadované frakce byly shromážděny a zakoncentrovány na centrifugačním koncentrátoru

Millipore 5 kD MWKO na minimální objem. Finální produkt byl opět analyzován pomocí SDS PAGE $ Coomassie barvením (Sigma, St. Louis, MO), Western blotem, sekvenací N-koncové části a BCA kitem (Pierce, Rockford, Illinois) na čištění a koncentraci proteinů. Zásobní protein byl skladován jako v předchozím příkladě.

E. Konstrukt pro expresi myšího zalphal 1 Ligandu v baculovirech: pzalphal 1LM

Pro expresi polypeptidu myšího zalphal 1 Ligandu v hmyzích buňkách byl připraven expresní vektor pzalphal 1LM. Fragment o velikosti 413 bp obsahující sekvenci polypeptidu myšího zalphal 1 Ligandu a kódující navíc BspEI a Xbaí restrikční místa na 5' a 3' koncích, byl připra55 ven PCR. Amplifikaci z plazmidu obsahujícího cDNA pro myší zalphall Ligand (příklad 16)

-75CZ 302921 B6 pomocí primerů o následujících sekvencích: ZC25970 (SEKV.ID.Č: 109) a ZC25969 (SEKV.ID.Č: 110) s využitím Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim) podle instrukcí výrobce. PCR amplifikace zalphal fragmentu byla provedena podle následujícího schématu: 1 cyklus při 94 °C, po 2 min, 35 cyklů při 94 °C po dobu 15 s; 50 °C po 30 s, 72 °C po 2 min; 1 cyklus při 72 °C po dobu 10 min, následováno uchovávací teplotou 4 °C. Fragment byl vizualizován elektroforézou (1% NuSieve agaróza). Odpovídající proužek byl purifikován Qiagen kitem dle instrukcí výrobce a eluován do 30 μί vody. Fragment byl potom štěpen Bspel a Xbal (Boehringer Mannheim) při teplotě 37 °C po dobu 2h a analyzován elektroforeticky a ligován do Bspel/Xbal naštěpeného baculovirového expresního vektoru, pZBV37 L. Vektor pZBV3L je modifikací expresního vektoru pFastBacl™ (Life Technologies), kde byl polyhedron promotor odstraněn a nahrazen pozdně aktivovaným Basic Protein Promotorem následovaným sekrečním signálem pro ekdysteroid-UDP-glukózyltransferázu (EGT). Do ligační směsi bylo vzato asi 5 μΙ restrikčními enzymy štěpeného inzertu zalphal 1 Ligandu a asi 100 ng odpovídajícího vektoru. Ligace probíhala přes noc při 16 °C v asi 20 μί. Pět mikrolitrů ligační směsi bylo elektroporováno do 50 μΙ Life Technologies DH12S elektrokompetentních bakteriálních buněk za užití 2 mm kyvety a pole o parametrech 2 kV, 25 pF a 400 ohmů. Elektroporované buňky byly resustituovány v 1 ml SOC média (2% Bacto™ Tryptone, 0,5% Bacto Yeast Extract, 10 ml 1M NaCl, l,5mM KC1, lOmM MgCL, lOmM MgSO₄ a 20mM glukóza) (Gibco BRL)) a 37 °C po dobu I h a poté vysety na LB plotny obsahující 100 pg/ml ampicilinu.

DNA z klonů byla izolována a analyzována restrikční analýzou za účelem zjištění pozitivních klonů. Asi 5 ng DNA z pozitivního klonu bylo transformováno do 20 μΙ DHlOBac Max Efficiency kompetentních buněk (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD) podle instrukcí výrobce, za užití teplotního šoku 45 s při 42 °C ve vodní lázni. Transformované buňky byly naředěny a nechaly se kultivovat stejným postupem jako v příkladu 30A. Bacmidy obsahující inzert myšího zalphal 1 Ligandu byly identifikovány a izolovány tak, jak je popsáno v příkladu 30A. Klony byly na výskyt správného inzertu testovány PCR amplifikaci DNA za pomoci primerů proti transposibilnímu elementu bacmidu za užití primerů: ZC447 (SEKV.1D.Č:76) a ZC976 (SEKV.ID.Č:77). Podmínky pro PCR reakci byly následující: 35 cyklů při 94 °C po 45 s, 50 °C po 45 s a 72 °C po 5 min; 1 cyklus při 72 °C po 10 min.; následoval uchovávací cyklus pří 4 °C. PCR produkt byl elektroforezován na gelu z 1% agarózy a překontrolována velikost inzertu. Klony obsahující inzert správné velikosti byly transfekovány do buněk. Spodoptera frugiperda (SÍ9).

F. Exprese a generace materiálu pro purifíkaci myšího zalphal 1 Ligandu z baculoviru

Sf9 buňky byly vysety na plotny o průměru 35 mm v hustotě 1 x 10⁶ a nechány růst po dobu 1 h při teplotě 27 °C, DNA bacmidu obsahujícího myší zalphal 1 Ligand (výše) byla transfekována postupem popsaným v příkladě 30B a virus byl sklizen.

Pro primární amplifikaci byly buňky Sf9 vysety tak, jak bylo popsáno výše a přidalo se k nim 500 μ] supernatantu odebraného 72 h po transfekci a kultura se ponechala kultivovat 96 h. Potom se virus sklidil standardními postupy známými v oboru.

Pro sekundární amplifikaci byly Sf9 buňky kultivovány tak, jak bylo popsáno výše. Buňky byly infikovány 200 μί primární virové kultury a ponechány inkubovat při 27 °C po dobu 72 h, po této době byl virus sklizen standardními postupy známými v oboru.

Pro terciární amplifikaci bylo 10 μί sekundární zásobní amplifikované virové frakce přidáno k Sf9, které byly vysety v koncentraci 500 000 buňka/jamka v 50 ml SF900II média ve 250ml láhvích a ponechány kultivovat po dobu 6 dní. Virus byl sklizen tak, jak bylo popsáno výše. Virus byl titrován a napěstován pro purifíkaci baculoviru produkujícího myší zalphal 1 Ligand (muzalphal IL-Bv), prováděnou ve velkém měřítku, tak jak je popsáno v příkladu 30C a 30D výše.

-76CZ 302921 B6

Přítomnost proteinu o odpovídající molekulové hmotnosti v supematantu byla dokazována Western blotem za užití anti-muzalphal 1L/MBP-6H polyklonální protilátky (příklad 27). Byl také proveden test na proliferaci s BaF3 buňkami, jak je to popsáno v příkladu 5, čímž byla dokazována aktivita sekretovaného ligandu.

Příklad 31: Exprese lidského a myšího zalphal 1 Ligandu v E. coli

A. Konstrukce fúzního expresního vektoru pro lidský zalphal 1 Ligand a MBP fúzního expresního vektoru PZAP98/zalphal 1 Ligand

Cestou homologní rekombinace byl připraven expresní plazmid obsahující polynukleotid kódující část lidského zalphal 1 Ligandu fúzovaného N-koncem k proteinu vázajícímu maltózu (MBP). Fragment lidské cDNA pro zalphal 1 Ligand (SEKV.ID.Č: 1) byl izolován pomocí PCR. Pro přípravu fragmentu lidského zalphal l Ligandu byly použity dva PCR primery: (1) Primer ZC22128 (SEKV.ID.Č:78), obsahující 40 bp z vektor ohraničující sekvence a 26 bp odpovídajících aminokonci lidského zalphal 1 Ligandu a (2) primer ZC22127 (SEKV.ID.Č:79), obsahujícího 40 bp ze 3' konce odpovídajících hraniční vektorové sekvenci a 28 bp odpovídajících karboxykonci lidského zalphal 1 Ligandu. Podmínky PCR reakce byly následující: 25 cyklů při 94 °C po 30 s, 50 °C po 30 s a 72 °C po dobu 1 minuty; následováno uchovávacím cyklem při 4 °C. Reakce byly provedeny v duplikátech. Dva μί ze 100 μΐ PCR reakční směsi se analyzovaly na 1,0% agarózovém gelu v 1 x TBE pufru, byla prokázána přítomnost pruhu o předpokládané velikosti přibližně 472 bp. Zbývajících 90 μΐ PCR reakční směsi se spojilo s druhou odpovídající PCR zkumavkou, obsah se přeci pito val 400 μΐ absolutního ethanolu. Tato DNA byla použita pro rekombinaci s Smál naŠtěpeným recipientním vektorem pTAP98 k přípravě konstruktu kódujícího fúzní protein MBP-zalphal 1 Ligandu, jakje popsáno dále.

Plazmid pTAP98 byl odvozen od plazmidu pRS316 a pMAL-c2. Plazmid pRS3l6 je shuttle vektor pro Saccharomyces cerevisiae (Hieter a Sikorski, Genetics 122:19-27, 1989). pMAL-C2 (NEB) je E. coli expresní plazmid. Nese tac promotor řídící NíalE (gen kódující MBP) následovaný His značkou, a štěpným místem pro trombin, kíonovacím místem a rrnB terminátorem. Vektor pTAP98 byl konstruován za užití homologní rekombinace v kvasinkách. 100 ng EcoRl štěpeného pMAL-c2 bylo rekombinováno s 1 pg Pvul štěpeným pRS316, l pg linkeru a 1 pg Scal/EcoRI štěpeného pRS316. Linker se generuje z oligonukleotidů o sekvenci ZC 19372 (SEKV.ID.Č.80) (100 pmol): ZC19351 (SEKV.ÍD.Č:81) (1 pmol); ZC19352 (SEKV.ID.Č:82) (1 pmol) a ZC19371 (SEKV.ID.Č:83) (100 pmol) kombinovaných v PCR reakci. Podmínky pro PCR byly následující: 10 cyklů při 94 °C po 30 s, 50 °C po dobu 30 s a 72 °C po 30 s; následuje uchovávání při 4 °C. Produkty byly zakoncentrovány pomocí precípitace 100% ethanolem.

Sto mikrolitrů kompetentních kvasinkových buněk (S. cerevisiae} bylo spojeno s 10 pl směsi obsahující přibližně l pg PCR produktu lidského zalphal 1 Ligand a 100 ng Smál štěpeného pTAP98 vektoru a směs byla převedena do 0,2 cm elektroporační kyvety. Směs kvasinky/DNA byla podrobena elektrickému pulznímu poli o parametrech 0,75 kV (5 kV/cm), maximální hodnota ohmů, 25 pF. Do každé kyvety se přidalo 600 pl 1,2M sorbitolu a kvasinky byly vysety ve dvou 300pl alikvótech na dvě URA-D plotny a ponechaly se inkubovat při 30 °C.

Po 48 hodinách inkubace byly Ura+ kvasinkové transformanty z jednotlivých ploten resuspendovány v 1 ml vody a rychle eentrifugovány, aby byl získán pelet. Buněčný pelet byl resuspendován v l ml lysačního pufru (2% TritonX-100, 1% SDS, lOOmMNaCl, lOmM TRIS, pH 8,0, ImM EDTA). Pět set mikrolitrů ly začni směsi bylo dáno do Eppendorfovy zkumavky (eppendorfky) obsahující 300 pl kyselinou promytých skleněných kuliček a 200 pl směsi fenol/chloroformem, směs byla podrobena vortexování v jednominutových intervalech, dvakrát či třikrát, následovala centrifugace po dobu 5 minut v centrifuze na eppendorfky při maximální rychlosti.

-77 CZ 302921 B6

Tři sta mi kro litrů vodné táze bylo přemístěno do čisté zkumavky a DNA se precipitovala pomocí 600 μΙ ethanolu (EtOH), potom byla centrifugována po dobu 10 minut při 4 °C. DNA pelet byl resuspendován ve 100 μΐ vody.

Transformace elektrokomplementníeh E. coli buněk (MCI061, Casadaban a další, J. Mol. Biol. 138:179-207) byla provedena s 1 μΐ kvasinkové DNA a 40 μΙ MCI061 buněk. Buňky byly podrobeny působení elektrického pulzního pole při 2,0 kV, 25 mF a 400 ohmech. Po elektroporaci byly buňky vysety v 0,6 ml SOC (2% Bacto™ Trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5% kvasničný extrakt (Difco), lOmM NaCl, 2,5mM KC1, lOmM MgCL, lOmM MgSO₄, 20mM glukóza) v jednom alikvótu LB AMP plotny (LB bujón (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/l ampicilin).

Pomocí exprese byly identifikovány jednotlivé klony obsahující správný konstrukt pro lidský zalphal 1 Ligand. Buňky byly kultivovány přes noc v Superbroth II (Becton Dickinson) se 100pg/ml ampicilinu. 50 μΐ přesnoění kultury bylo použito jako inokulum do 2 ml čerstvého Superbroth II se l00pg/ml ampicilinu. Kultury byly kultivovány při 37 °C, třepání, po dobu 2 hodin. 1 ml kultury byl indukován 1 mM IPTG. O 2 až 4 hodiny déle, bylo 250 μΐ každé kultury smícháno s 250 μΙ kyselinou promytými skleněnými kuličkami a 250 μΐ Thomerova pufru s 5% βΜΕ a barvou (8M močovina, lOOmM Tris pH 7,0, 10% glycerol, 2mM EDTA, 5% SDS). Vzorky byly vortexovány po dobu 1 minuty a zahřívány na 65 °C po dobu 5 až 10 minut. 20 μΐ směsi bylo naneseno do jamky na elektroforéze na gradientovém PAGE gelu (NOVEX) 4% až 12%. Gely byly elektroforézovány v 1 x MES pufru. Positivní klony byl označeny pTAP126 a podrobeny sekvenační analýze. Polynukleotidová sekvence pro fúzní protein MBP— lidský zalphall Ligand vpTAP126 je zobrazena v SEKV.ID.Č:84 a odpovídající polypeptid v SEKV.ID.Č:85.

B. Bakteriální exprese lidského zalphal 1 Ligandu

K transformaci kmene W3110 (ATCC) byl použit jeden mikrolitr sekvenované DNA. Buňky byly podrobeny působení elektrického pulzního pole při 2,0 kV, 25 pF a 400 ohmech. Po elektroporaci byly buňky vysety v 0,6 ml SOC (2% Bacto™ Trypton (Difco, Detroit, MI), 0,5% kvasničný extrakt (Difco), lOmM NaCl, 2,5mM KC1, lOmMMgCL, lOmM MgSO₄, 20mM glukóza) v jednom alikvótu LB AMP plotny (LB bujón (Lennox), 1,8% Bacto Agar (Difco), 100 mg/l ampicilin).

Pomocí exprese byly identifikovány jednotlivé klony obsahující správný konstrukt. Buňky byly kultivovány přes noc v Superbroth II (Becton Dickinson) se 100 pg/ml ampicilinu. 50 μΐ kultury pěstované přes noc bylo použito jako inokulum do 2 ml čerstvého Superbroth II se 100pg/ml ampicilinu. Kultury byly kultivovány při 37 °C, třepání, po dobu 2 hodin. 1 ml kultury byl indukován lmM IPTG. O 2 až 4 hodiny déle, bylo 250 μΐ každé kultury smícháno s 250 μΙ kyselinou promytými skleněnými kuličkami a 250 μΙ Thomerova pufru s 5% βΜΕ a barvou (8M močovina, lOOmM Tris pH 7,0, 10% glycerol, 2mM EDTA, 5% SDS). Vzorky byly vortexovány po dobu 1 minuty a zahřívány na 65 °C po dobu 5 až 10 minut. 20 μΙ směsi bylo naneseno do jamky na elektroforéze na gradientovém PAGE gelu (NOVEX) 4% až 12%. Gely byly elektroforézovány v 1 x MES pufru. Positivní klony byly napestovány pro produkci a purifikaci fúzního proteinu huzalphal 1L/MBP-6H (příklad 32 níže).

C. Konstrukce fúzního expresního vektoru PTA98/myšt zalphall Ligand pro myší zalphall Ligand -MBP

Cestou homologní rekombinace byl připraven expresní plazmid obsahující polynukleotid kódující část myšího zalphal 1 Ligandu fúzovaného N-koncem k proteinu vázajícímu maltózu (MBP), tak jak je popsáno v příkladu 31 A. Fragment myší cDNA pro zalphal 1 Ligand (SEKV.ID.Č:55) byl izolován pomocí PCR. Pro přípravu fragmentu myšího zalphal 1 Ligandu byly použity dva

-78CZ 302921 B6

PCR primery: (1) Primer ZC22849 (SEKV.1D.Č:86), obsahující 40 bp z vektor ohraničující sekvence a 24 bp odpovídajících aminokonci myšího zalphall Ligandu a (2) primer ZC22850 (SEKV.ID.Č:87), obsahující 40 bp ze 3' konce odpovídajících hraniční vektorové sekvenci a 21 bp odpovídajícího karboxykonci myšího zalphal l Ligand. Podmínky PCR reakce byly stejné jako v předchozím kroku. Fragment velikosti přibližně 450 bp byl klonován do pTAP98 tak, jak bylo popsáno v předchozím textu. Klony byly transformovány, identifikovány a kultivovány tak, jak bylo popsáno v předchozím textu. Pozitivní klony byly označeny pTAP134 a podrobeny sekvenční analýze. Polynukleotidová sekvence pro fúzní protein MBP- myší zalphall Ligand v pTAP134 je zobrazena v SEKV.1D.Č:88 a odpovídající polypeptid v SEKV.ID.Č:89. Pozitivní klony byly napěstovány pro produkci a purifikaci fúzního proteinu muzalphal 1L/MBP-6H (příklad 32 níže).

Příklad 32: Purifikace zalphal 1-MBP Ligandu nebo zalphal 1-MBP Receptorů

Není-li poznamenáno jinak, všechny operace probíhaly za teploty 4 °C. K produkci fúzních ligandu pro lidský zalphall MBP-Ligand (huzalphal 1 L/MBP-óH) nebo myší zalhpal 1-MBP Ligand (muzalphal 1L/MBP 6H) z £. coli byly použity následující postupy, lidské nebo myší zalphal 1-MBP fúzní receptory byiy připraveny pomocí stejných postupů. Sediment z centrifugovaných a uchovaných buněk E. coli byl ponechán roztát a byl naředěn ve 2 litrech pufru B (0,02M TRIS (EM Science); 0,2M NaCl (Mallincrodt); 0,0ÍM 2-merkaptoethanol (EM Science); pH 8,0; s 5 mg/1 Pepstatinu- A (Boehringer Mannheim); 5 mg/1 Aprotininu (Boehringer Mannheim); and 1 mg/1 s PMSF (Fluka)) a bylo přidáno 1 až 2 ml odpěňovacího činidla AF289 (Sigma). Směs byla protlačena předchlazeným buněčným homogenizátorem (French Press cell disrupter (Constant Systems LTD)) při 20 až 0 kPSI.

Lyzát byl potom centrifugován při 18 000 x g po dobu 45 minut při 4°C; uschoval se supematant. 200 ml amylózové pryskyřice (New England BioLabs), která byla preekvilibrovaná v pufru A (0,2M TRIS (EM Science); 0,2M NaCÍ (Mallincrodt); 0,01 M 2-merkaptoethanol (EM Science); pH 8.0), se přidalo k supematantu lyzátu a nechalo se inkubovat přes noc ve 21 lahvích na roleru, aby se dosáhlo maximální absorpce MBP fúzního proteinu na náplni. Pryskyřice byla promyta na sloupci pufrem A, objemem 5 x větším, než je objem sloupce. Potom byl fúzní protein vymýván pufrem C (pufr A s 0,02M maltózou (Sigma)). Byl shromažďován surový extrakt a proměřována absorbance při 280 nm. Eluovaný protein byl analyzován na SDS NuPAGE (NOVEX) s barvením Coomassie (Sigma). Vzorek a zásobní matrix byly skladovány při -80 °C.

Příklad 33: Polyklonální protilátky proti lidskému zalphal 1 Ligandu

Polyklonální protilátky proti lidskému zalphall Ligandu byly připraveny imunizací 2 samic novozélandských bílých králíků purifikovaným rekombinantním proteinem huzalphal 1L/MBP6H (příklad 32) nebo purifikovaným CHO rekombinantním proteinem huzalphal 1LCHO (příklad 29). Králíci dostali jednu iniciační intraperitoneální (ip) injekci 200 mg purifi kovaného proteinu v kompletním Freundově adjuvans, potom každé tři týdny následovaly další dávky formou ip injekcí po 100 mg peptidu v nekompletním Freundově adjuvans. Sedm až deset dní po podání druhé dávky (celkem byly tři dávky), byla zvířatům odebrána krev a připraveno sérum. Zvířata byla takto částečně vykrvována každé tři týdny.

Specifické králičí sérum generované proti huzalphal 1L/MBP-6H bylo preadsorbováno s anti-MBP protilátkou na CNBr-Sepharóze 4B proteinovém nosiči (Pharmacia LKB), která byla připravena pomocí 10 mg purifikovaného rekombinantního maltóza-vazného proteinu (MBP) na gram CNBr-SEPHARÓZy. Rekombinantní MBP byl připraven a purifikován na amylóžovém sloupci, připraveném v naší laboratoři pomocí běžně užívaného postupu. Huzalphal 1 Ligand-specifické polyklonální protilátky byly afinitně purifikovány z králičího séra pomocí

-79CZ 302921 B6

CNBr-SEPHARÓZE 4B protein sloupce (Pharmacia LKB), který byl připraven užitím 10 mg specifického antigenů - čistého rekombínantního proteinu huzalphal 1L/MBP-6H (příklad 32) nebo 10 mg puntíkovaného CHO rekombínantního proteinu huzalphal 1 Ligandu na gram Sepharózy, potom následovala dialýza 20 x PBS přes noc. Huzalphal 1-ligand-specifická proti5 látka byla charakterizována ELISA postupem užitím 1 pg/ml purifikovaného rekombínantního proteinu huzalphal 1L/MBP-6H (příklad 32) nebo huzalphal 1L-CHO) (příklad 29) nebo muzalphal 1L-MBP/6H (příklad 32) jako antigenů.

Spodní hranice detekce (LLD) králičích anti-huzalphal 1L/MBP-6H afinitně purifikovaných io protilátek byla 10 ng/ml na jejich specifickém afinitně puriflkovaném rekombinantním antigenů huzalphal 1 L/MBP-óH a 500 pg/ml u puntíkovaného rekombínantního huzalphal 1 L-CHO a lOOpg/ml u rekombínantního huzalphal 1 L/MBP-6H a 50 ng/ml u purifikovaného rekombinantního muzalphal 1L/MBP-6H.

Příklad 34: Protilátky proti peptidu lidského zalphal 1 Ligandu

Polyklonální protilátky proti peptidu lidského zalphal 1 Ligandu byly připraveny imunizací 2 samic novozélandských bílých králíků peptidem lidského zalphal 1 Ligandu, huzalphal 1 L-l (SEKV.1D.Č:72) nebo huzalphal 1L—3 (SEKV.ID.Č:73). Peptidy byly syntetizovány na peptídovém syntetizátoru Applied Biosystems Model 431A (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA) podle instrukcí výrobce. Peptidy byly potom konjugovány k nosiči, kterým byl protein z přílepky (keyhole limpet hemocyanin (KLH)) aktivovaný maleimidem. Králíkům byla potom podána iniciační intraperitoneální (ip) injekce 200 mg peptidu v kompletním Freundově adjuvans. Potom každé tri týdny následovaly další dávky formou ip injekcí po 100 mg peptidu v nekompletním Freundově adjuvans. Sedm až deset dní po podání druhé dávky (celkem byly tri dávky), byla zvířatům odebrána krev a připraveno sérum. Zvířata byla takto částečně vykrvována každé tři týdny.

o Polyklonální protilátky připravené proti peptidům lidského zalphal 1 Ligandu byly charakterizovány pomocí ELISA. Titry byly kontrolovány pomocí peptidu, proti kterému bylo anti sérum připraveno, a to v koncentraci 1 pg/ml (SEKV.ID.Č:72 nebo SEKV.ID.Č:73), užitému jako antigen. Obě králičí séra proti huzalphal 1L-I peptidu vykázala titr měřený proti jejich specifickému peptidu v ředění 1 : 5 000 000 (1 : 5E6). Obě králičí séra proti huzalphal 1L-3 peptidu vykázala titr měřený proti jejich specifickému peptidu v ředění 1 : 5E6.

Polyklonální protilátky připravené proti peptidům lidského zalphal 1 Ligandu byly afinitně čištěny z králičího séra pomocí CNBR-SEPHARÓZE 4B proteinových sloupců (Pharmacia LKB), které byly připraveny pomocí 10 mg daného specifického peptidu (SEKV.ID.Č:72 nebo

SEKV.ID.Č:73) na gram CNBr-SEPHARÓZy, potom následovala dialýza 20 x v PBS přes noc. Huzalphal 1-Ligand specifické protilátky byly charakterizovány pomocí ELISA. Titry byly kontrolovány pomocí peptidu, proti kterému bylo antisérum připraveno, a to v koncentraci 1 pg/ml, nebo proti puriflkovanému rekombinantnímu proteinu úplné délky, užitými jako antigeny.

Spodní hranice detekce (LLD) králičích anti-huzalphal 1L-1 afinitně purifikovaných protilátek byla 500 pg/ml na jejich specifickém afinitně puriflkovaném rekombinantním antigenů huzalphal 1 L-l (SEKV.ID.Č:72); a 500 pg/ml u purifikovaného rekombínantního huzalphal 1 L/MBP-6H (příklad 32) a 500pg/ml u purifikovaného CHO rekombínantního huzalphal 1 L-CHO (příklad 29). Nebyla nalezena žádná krizová reakce s puntíkovaným muzalphal 1L/MBP-6H (příklad 32).

Spodní hranice detekce (LLD) králičích anti-huzalphal 1L—3 afinitně purifikovaných protilátek byla 50 pg/ml na jejich specifickém afinitně puriflkovaném rekombinantním antigenů huzalphal 1 L-l (SEKV.ID.Č:73); a 50 pg/ml u purifikovaného rekombínantního huzalphal 1

- 80CZ 302921 B6

L/MBP-6H a 500pg/ml u purifikovaného CHO rekombinantního huzalphal 1L-CHO (příklad 29) a 100 pg/ml u rekombinantního bakulovirového huzalphal IL-Bv (příklad 30). Byla nalezena křížová reakce s purifikovaným rekombinantním tnuzalphal 1L/MBP-6H (příklad 32) s LLD 5ng/ml.

Příklad 35: Monoklonální protilátky proti lidskému zalphal 1 receptoru

Monoklonální protilátky proti zalphal 1 receptoru byly připraveny imunizací 5 samců BalbC io myší (Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN) purifikovaným proteinem pro rekombinantní rozpustný receptor zalphal 1CEE (huzalphal 1-CEE-BHK) (příklad 10A). Myším byla dána jedna iniciační intraperitoneální (ip) injekce 20 mg purifikovaného proteinu v kompletním Freundově adjuvans (Pierce, Rockford, IL), potom každé dva týdny následovaly další dávky formou ip injekcí po 10 mg peptidu v nekompletním Freundově adjuvans (Pierce, Rockford, IL). Sedm až deset dní po podání třetí dávky byla zvířatům odebrána krev a shromážděno sérum.

Myší séra připravená proti huzalphal 1-CEE-BHK byla charakterizována pomocí ELIA. Titry byly kontrolovány pomocí rekombinantního CHO huzalphal 1-Fc proteinu (příklad 10C) užitému jako antigen. Jedno myší sérum titr pro specifický aiiíigeu i měla titr pro specifický antigen 1:100 000 (1 : 1E5).

-1 ΛΛΛ ΟΛΠ / 1 i υνυ νυν v i ΐΓ'ζτν ,x:___xí __ wu,. viyu uijai

Ze čtyř myší s nejvyššími titry byly odebrány slezinné buňky a fúzovány s SP2/0 myelomovou buněčnou linií užitím PEG 1500 (Boehringer Mannheim, UK) ve dvou nezávislých fúzích za užití poměru 4:1 slezinné buňky ku myelomovým buňkám (Antibodies: Laboratorní manuál, E.

Harlow and D. Lané, Cold Spring Harbor Press). Následujících 10 dní po fúzi byly identifikovány ELISA testem hybridom y produkující specifické protilátky proti purifi kovanému rekombinantnímu BHK lidskému zalphal 1-Fc4 proteinu (příklad 10C), který byl použit jako antigen a pomocí FACS s BaF3 buňkami exprimujícími huzalphal l sekvenci (příklady 4 a 2) jako antigenními molekulami. Výsledkem byly 4 pozitivně v obou postupech reagující hybridomy.

Tyto Čtyři hybridomy byly klonovány třikrát postupem nekonečného ředění. Protilátky byly označeny: 249.28.2.1.2.2; 247.10.2.15.4.6; 249.19.2.2.3.5; a 249.15,2,4.2.7.

Příklad 36: Zalphal 1 transgenní myši

A. Generace transgenních myší exprimujících lidský a myší zalphal 1 Ligand

Fragmenty DNA z transgenních vektorů (příklad 22 a 26) obsahující hraniční sekvence na 5'a3'konci daného promotoru (MT-l jatemí specifický promotor (myší zalphal 1 Ligand (příklad 26B) nebo lymfatický specifický promotor LCK (myší a lidský zalphal 1 Ligand (příklady 26 A a 22B), krysí II intron, zalphal l Ligand cDNA a lidská póly A sekvence růstového hormonu byly připraveny a použity k mikroinjekcím do oplodněných B6C3fl (Taconic, Germantown, NY) myších oocytů. Použil se standardní protokol pro mikroinjekce; viz Hogan a další, Manipulating the Mouše Embryo. Laboratorní manuál, Cold Spring Harbor Laboratory

Press, 1994.

Mezi 44 mláďaty bylo identifikováno 8 transgenních myší exprimujících lidský zalphal 1 Ligand z lymfatického specifického promotoru EpLCK. Čtyři z těchto mláďat uhynula, čtyři se dožila dospělosti. Expresní hladiny byly u těchto zvířat relativně nízké. Mezi 77 mláďaty bylo identifi50 kováno 20 transgenních myší exprimujících myší zalphal 1 Ligand z lymfatického specifického promotoru ΕμίυΚ. Všech 20 myší se dožilo dospělosti. Expresní hladiny byly u těchto zvířat relativně nízké. Mezi 60 mláďaty byly identifikovány 3 transgenní myši exprimující myší zalphal 1 Ligand z jatemího specifického promotoru ΜΤ-Ί. Dvě z těchto mláďat uhynula a jedno se dožilo dospělosti. Expresní hladina byla u tohoto zvířete relativně nízká. Z těchto myší byly připraveny vzorky tkání a histologicky prozkoumány, tak jak je popsáno níže.

-81 CZ 302921 B6

B. Mikroskopické hodnocení tkání z transgenních myší

Slezina, brzlík a mezenterické lymfatické uzliny byly odebrány z transgenních zvířat exprimujících lidský a myší zalphal 1 Ligand (příklad 36A) a připraveny na histologické prozkoumání. Mezi další tkáně, které byly rutinně odebírány patřily: játra, srdce, plíce, ledviny, kůže, mléčná žláza, slinivka, žaludek, tenké a tlusté střevo, mozek, slinná žláza, průdušníce, espohogus, nadledvinky, hypofýza, reprodukční ústrojí, přídatné samčí sexuální žlázy, kosterní svalstvo včetně periferních nervů a stehenní kost s kostní dření. Tkáně byly odebírány z čerstvě narozených mláďat, která neočekávaně uhynula a několika dospělých transgenních myší, jak je popsáno dále. Vzorky byly fixovány v 10% pufrovaném formalinu, rutinním postupem namočení do parafínu, nařezáním na sekce 5 micronů a barvením hematoxylínem a eosinem. Mikroskopické snímky byly zkoumány na poškození a zaznamenána vážnost vyskytujících se změn ve tkáni; (0=žádná, 1 “mírná, 2=střední, 3-vážná). Tento výzkum byl proveden zkušenými veterinárními patology.

Lf jednoho mláděte a 2 dospělých samic, které exprimovaly lidský zalphal! Ligand a u 3 až 6 dospělých samců, kteří exprimovaly myší zalphal 1 Ligand, byly prokázány v mnoha zkoumaných tkáních zánětlivé Ínfiltráty. Postižené orgány se u myší lišily. Zánětlivý infiltrat byl složen primárně z neutrofilů a makrofágů v různém počtu a zastoupení a projev byl hodnocen většinou stupněm mezi střední a vážný. Kromě toho, tato zvířata vykazovala změny v lymfatických orgánech, včetně střední až vážné lymfopenie v brzlíku a slezině (lidský a myší zalphal 1 Ligand) a vážná lymfopenie u lidské zalphal 1 Ligand transgeneze, či slabá až vážná hnisání (lymfadenitída) (myší zalphal 1 Ligand transgeneze) v lymfatických uzlinách. Dále byla také pozorována zvýšená mimodřeňová hematopoéza ve slezině. Tyto změny nebyly pozorovány u kontrolních myší stejného stáří.

C. Analýza tkání z transgenních myší exprimujících zalphal 1 Ligand pomocí průtokové cytometrie

Transgenní myši exprimující buď lidský či myší zalphal 1 Ligand (příklad 36) byly usmrceny a podrobeny cytometrické analýze periferní krve, brzlíku, lymfatických uzlin, kostní dřeně a sleziny.

Buněčná suspenze byla udělána ze sleziny, thymu a lymfatických uzlin odebráním těchto orgánů do kultivačního ledově chladného média (500 ml RPMI 1640 Médium (JRH Biosciences, Lenexa, KS); 5 ml 100 x L-glutamin (Gibco BRL. Grand Island, NY; 5 ml 100 x pyruvát sodný (Gibco BRL); 5 ml 100 x Penicilín, Streptomycin, Neomycin (PSN) (Gibco BRL). Potom byly orgány protlačeny přes buněčný homogenizátor (Falcon, VWR Seattle, WA). Periferní krev byla shromážděna v množství 200 ml v heparinizovaných zkumavkách a naředěna na 10 mililitrů pomocí HBSS obsahujícího 10U Heparin/ml. Erytrocyty byly ze sleziny a periferní krve připraveny hypotonickou lýzou. Buňky kostní dřeně byly připraveny vyplavením buněk kostní dřeně ze stehenní kosti ledově chladným kultivačním médiem. Buňky byly spočítány a byly otestovány na životaschopnost pomocí trypanové modři (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Buňky byly resuspendovány v ledově chladném barvícím médiu (HBSS, 1 % fetální hovězí sérum, 0,1 % azid sodný) v koncentraci deset milionů na mililitr. Zablokování Fc receptoru a nespecifické vazby protilátek na buňku bylo dosaženo přidáním 10% normálního kozího séra a Fc Block (Pharmingen, La Jolla, CA) do buněčné suspenze. Buněčné suspenze byly promíchány se stejnými objemy fluorochromem značenými monoklonálními protilátkami (PharMingen), inkubovány v ledu po dobu 60 minut a potom promyty dvakrát ledově chladným promývacím pufrem (PBS, 1% fetální hovězí sérum, 0,1% azid sodný), poté jsou resuspendovány ve 400 ml promývacího pufru obsahujícího 1 mg/ml 7-AAD (Molecular Probes, Eugene, OR) jako markéru pro životaschopnost buněk v některých vzorcích. Cytometrická data byla získána na FACSCalibur průtokovém cytometru (BD Immunocytometry Systems, SanJose, CA). Jak počet, tak analýza byly vyhodnoceny pomocí CellQuest software (BD Immunocytometry Systems).

-82CZ 302921 B6

Transgenní myši, které exprimovaly buď lidský, či myší zalphall Ligand v největších množstvích, měly dramaticky změněné populace buněk v analyzovaných lymfatických orgánech. Byly pozorovány změny vedoucí k úplné ztrátě thymové celularity (buněčnosti), kompletní absence CD45R positivních B buněk a zvýšená velikost a celularita sleziny. Jak slezina, tak kostní dřeň vykázaly zvýšený počet myeloidních buněk, což lze přičíst jak zvýšení počtu monocytů, tak neutrofilů. U mnoha populací také došlo ke zvýšení buněčného markéru pro NK buňky (DXS). Dále byly sledovány méně dramatické, ale stále průkazné změny související s fenotypem, hlavně u jedinců se silnou expresí. Myši s nejnižšími hladinami exprese neměly buď žádné, nebo zcela nesignifikantní změny ve zvýšení počtu myeloidních buněk, ani nebylo prokázáno snížení počtu B buněk. Buňky v populaci brzlíku vykázaly signifikantní snížení počtu buněk u CD4+CD8+ s dvojí pozitivitou a zvýšení počtu u jak CD4, tak CD8 buněk s jednoduchou pozitivitou.

Příklad 37: Purifikovaný rekombinantní protein pro lidský zalphal 1 Ligand

Studie vedoucí k určení dávek provedená u normálních myší

A. Souhrn

Normální, šest týdnů staré myší samice C57B1/6 (Harla Sprague Dawley, Indianopolis, IN) byly ošetřovány po dobu buď 4 nebo 8 dnů, jednou denně intraperitoneálními injekcemi jednou nebo čtyřmi dávkami purifikovaného lidského zalphall Ligandu (příklad 24) v dávkách 0,1, 0,5, 5 nebo 50 pg/myš/den nebo nosiče v případech kontrol. Denně byla sledována tělesná hmotnost a teplota. Buď čtvrtý nebo devátý den byly usmrceny čtyři nebo osm myší z každé skupiny proteinem ošetřených myší a pět nebo deset myší z kontrolní skupiny. Byla shromážděna krev, kostní dřeň a tkáně a všechen materiál byl analyzován. Byly prozkoumány pertubace i lymfatických tkání, stejně tak fyziologických a toxikologických parametrů.

Ani u jednoho z testovaných proteinů zalphal 1 Ligandu nebyla prokázána u testovaných dávek toxicita. Také tělesná hmotnost a teplota zůstaly nezměněny. Nebyly shledány ani změny v klinických parametrech. Avšak lze nalézt důkazy vztahující se k procentuálnímu zvýšení výskytu myeloidních buněčných linií kostní dřeně, sleziny a v periferní krvi u myší ošetřených nej vyšším i dávkami zalphal 1 Ligandu ve srovnání s kontrolními skupinami. Statisticky signifikantní zvýšení buněk myeloidní linie bylo prokázáno pomocí průtokové cytometrie v homogenátu ze sleziny u myší ošetřených nej vyšším i dávkami. Sleziny dvou skupin myší s nej vyšším dávkováním byly větší, než sleziny u dalších skupin. Avšak při histopatologickém průzkumu bylo u myší s nejvyšším dávkováním zjištěno pouze okrajové zvýšení extramedulámí hematopoézy. U myší ošetřených nej vyššími dávkami bylo zjištěno průkazné zvýšení poměru myeloidních ku erytroidním buňkám v kostní dřeni, ve srovnání s dalšími skupinami. Také bylo zjištěno zvýšení celkového počtu bílých krvinek v periferní krvi a zvýšené procento monocytů v té samé skupině zvířat,

B. Příprava dávkovacího roztoku

Purifikovaný rekombinantní lidský zalphal l Ligand (příklad 24) byl naředěn ve sterilním pufrovaném fyziologickém roztoku -PBS (GibcoBRL, Grand Island, NY) na koncentrace k podávání 50, 5, 0,5 nebo 0,1 mikrogramů proteinu v 0,1 ml PBS. Dávky pro první čtyři dny byly připraveny nultý den a zamraženy na -20 °C až do upotřebení. Dávky pro pátý až osmý den byly připraveny pátý den a zamraženy tak, jak bylo již uvedeno. Také alikvóty samotného PBS byly zamraženy obdobně, sloužily jako dávky pro kontrolní skupinu. V den podání byly jednotlivé dávky ponechány roztát a v množství 0,1 ml roztoku byly injekčně aplikovány intraperitoneálně myším každý den, bud' po dobu čtyř, či osmi dnů.

-83 CZ 302921 B6

C. Návrh provedení studie

V době provádění pokusu byly myši šest týdnů staré. Každá ošetřovaná skupina sestávala z osmi myší, pouze kontrolní skupina zahrnovala deset jedinců. Polovina myší v každé skupině byla usmrcena po čtyřech dnech ošetřování, druhá polovina byla usmrcena po osmi dnech podávání. Před podáním dávky byly myši každý den zváženy a změřena jejich tělesná teplota pomocí Portable Programmable Notebook System (BMDS, lne, Maywood, NJ), skenováním myši pro určení jejich počtu a tělesné teploty měřené čipem implantátem zavedeným podkožně (IPTT— 100, BMDS, Maywood, NJ).

Po usmrcení byly ihned odebrány tkáně na zjištění počtu populace bílých krvinek pomocí průtokové cytometrie, včetně kostní dřeně, thymu a sleziny. FACS analýza lymfatických orgánů a kostní dřeně byla provedena na e FACSCalibur, (Becton Dickinson, Mansfield, MA). Tkáně shromažďované pro histologická vyšetření, včetně znaků toxicity proteinu zahrnovaly: slezinu, thymus, játra, ledviny, nadledvinky, srdce a plíce. Všechny tkáně se pro histologická vyšetření fixovaly při 4°C přes noc v 10% Normál Buffered Salině (NBF) (Surgipath, Richmond, IL). Následující den byl NBF vyměněn za 70% ethanol a tkáně se uchovávaly při 4 °C až do provedení h i sto logických pokusů.

Tkáně se zpracovaly a obarvily Hematoxylinem a Eosinem přímo v našich laboratořích, potom byly odeslány sjednaným patologům na histopatologickou analýzu. Krev byla shromážděna pro kompletní počítání krevních buněk - (CBC) a pro provedení chemického profilu séra. CBC byl prováděn v naší laboratoři pomocí přístroje Celt Dyn 500 Hematology Analyzer (Abbott Diagnostics Division, Abbott Park, IL) a manuální diferenciál bílých krvinek byl analyzován v Phoenix Central Laboratory, (Everett, WA). Sérum bylo udržováno zmrazené na -20 °C, dokud nebylo předáno do Phoenix Central Laboratory na kompletní chemickou analýzu vzorků séra. Ke stanovení poměrů myeloid:erythroid, byla kostní dřeň z jedné stehenní kosti podrobena vyšetření na CytoSpin slidech (Cytospin 3 Cytocentrifuge a Cyto Slides, Shandon, Pittsburgh, PA) a poté byla zaslána na analýzu do Phoenix Central Laboratories.

D. Výsledky studií

Nebyly nalezeny žádné zjevné klinické indikace fyziologických vlivů nebo toxicity lidského zalphal 1 Ligandu v dávkách 50 pg/den nebo nižší. Také tělesná hmotnost a teplota zůstávaly během léčby stejné. Chemický rozbor parametrů séra byl také v mezích normálu. Počty červených krvinek a krevních destiček byly také normální. U myší, které obdržely dávku 50 pg/den po dob osmi dnů, manuální diferenciál počtu bílých krvinek ukázal, že byl zvýšen počet monocytů v periferní krvi a bylo patrné také zvýšení celkového počtu bílých krvinek. U skupiny myší s podávanou dávkou 50 pg byl v kostní dřeni vymyté ze stehenní kosti také zjištěn zvýšený poměr myeloidů: erythroidům a snížení poměru u skupiny myší s dávkou 5 pg u skupiny myší z osmi denní skupiny. V neparametrickém násobném porovnání sloupců pomocí InStat (InStat MAC; GraphPad, Software, lne., San Diego, CA), byl tento rozdíl statisticky významný (p=.O049). Rozdíl mezi myšmi, kterým byly podávány nejvysší dávky a kontrolní skupinou byl také statisticky významný (p=.O286). Zvýšení hladiny bílých krvinek v periferní krvi a průkazné zvýšení hladiny myeloidních prekurzorů v kostní dřeni může být tak v souvislosti.

Histologické hodnocení následujících tkání neprokázalo žádné cytologické a strukturální změny, mitotické pochody či nekrosy: brzlík, játra, ledviny, nadledvinky, dvanáctemík, lačník, slepé střevo, střevo, mesenterická lymfa, uzliny, děloha, vaječníky, slinné žlázy', srdce, průdušnice, plíce a mozek. Nebyly shledány žádné rozdíly mezi skupinou ošetřovanou a kontrolní v hmotnostech brzlíku, ledvin, jater či mozku. Ze všech zkoumaných tkání se změnila pouze hmotnost slezin.

- 84CZ 302921 B6

Každá hmotnost myší sleziny byla vztažena k hmotnosti jejího mozku. U myší s podávanou dávkou 50 pg/den ve srovnání s kontrolní, 0,1 pg a 0,5 pg dávkami ošetřených myší, byla průměrná hmotnost sleziny skoro o 50 % vyšší po čtyřech dnech ošetřování a téměř o 100 % vyšší u myší po podávání dávek po osm dní, než u tri zbývajících skupin. Ve skupině myší ošetřovaných čtyři dny dávkou 5pg/den se projevila rovněž tendence zvětšení sleziny v porovnání s myšmi ošetřenými nižšími dávkami. Rozdíly ve vahách slezina/mozek mezi skupinami ošetřovanými po čtyři dny a osm dní byly statisticky průkazné (p=.0072) pomocí Kruskall-Wallaceova neparametrického vynesení ANO V A, násobného porovnání sloupců pomocí InStat programu (GraphPad Software).

Bylo také sledováno nepatrné zvýšení v extramedulání hematopoéze, zvláště potom v červené dřeni u myší s nej vyšším i dávkami, dokonce i u myší ošetřovaných po dobu čtyř dnů. Průtoková cytometrická analýza slezin ukázala průkazné zvýšení množství buněk myeloidní velikosti u myší, kterým byla podávána nejvyšší dávka (p=0,01, Studentův test), toto zvýšení bylo reprezentováno oběma skupinami, monocyty i neutrofily. Tento efekt lze vysvětlit zvýšením procenta periferních krevních jednojademých buněk, stejně tak zvýšením zastoupení prekurzorů myeloidních buněk v kostní dřeni, které bylo popsáno výše. Navíc, transgenní myši odvozené inzercí lidského zalphal 1 genu, měly zvýšenou extramedulární hematopoézu ve slezinách, ve sioviiání s iičuáiisgčiinínií myšmi stejného vrhu.

Některé změny byly pozorovány i u myší, kterým byla podávána dávka 50 pg zalphal 1 Ligandu na den. Ve srovnání s kontrolní skupinou byly prokázány změny v produkci nebo vývoji buněk myeloidních linií. Souhrnně řečeno, pozorované změny naznačují, že zalphal 1 Ligand by mohl být užitečný jako terapeutický protein u takových onemocnění, jako je rakovina, nebo imunologická onemocnění, jak bylo popsáno výše.

Příklad 38: Studie předběžné eliminace a tkáňové distribuce purifi kovaného proteinu rekombinantního zalphal 1 Ligandu

A. Souhrn

Za účelem objasnění tkáňové distribuce a eliminace purifikovaného rhzalphall Ligandu, byla provedena farmakokinetická studie. Devět týdnů starým myším samcům C57B1/6 byl podáván rekombinantní protein zalphal 1 Ligandu značený 'indiem ('in) (NEN, Boston, MA), a to jednou či třemi různými cestami. Jedna dávka byla dána myším injekčně, buď intravenózně (IV), intraperitoneálně (IP) nebo subkutánně (SC). Myši, které dostaly protein buď subkutánní či intraperitoneální injekci, byly usmrceny buď jednu nebo tři hodiny po injekci. Myši s intravenózní injekcí byly usmrceny po deseti minutách nebo jednu hodinu po injekci. Byla jim odebrána krev, plazma a vybrané tkáně, které byly podrobeny vyšetření v gama počítači, čímž byl přibližně určen poločas rozpadu a distribuce exogenně značeného proteinu. Tkáně, které byly odebrány pro měření, stejně tak intervaly usmrcení, byly vybrány na základě výsledků distribuce cytokinů značených radionuklidy.

U usmrcených zvířat se prováděl výzkum radioaktivně značených tkání brzlíku, sleziny, ledvin, laloku jater, laloku plic a močového měchýře. U skupiny, která dostávala peritoneální injekce se prováděl rovněž výzkum střeva a u myší se subkutánními injekcemi, také kůže s okolními strukturami v oblasti injekce. Cpm pro celá játra a plíce byla počítána ze sekcí, kde byla určena a podle procenta hmotnosti sekce k hmotnosti celého orgánu.

Po skončení studia se shromážděné tkáně, krev a plasma podrobily měření v COBRA II AUTO-GAMMA gamma počítači (Packard Instrument Company, Meriden, CT). Nakonec studie byl také podroben zkoumání alikvót původního značícího roztoku. To umožnilo výpočet procenta úplné dávky injikované radioaktivity pro každou myš a simultánní korekci na radioaktivní rozpad. Aproximace vztažené na zbývající krevní objem a celkovou hmotnost orgánu prokázaly.

-85CZ 302921 B6 že většina podaného množství dávky byla v organizmu absorbována, a proto procenta zjištěná ve tkáních, představují rozumnou reprezentaci distribuce podané dávky značeného zalphal 1 Ligandu pro všechny postupy administrace.

B. ‘indiem značený zalphal 1 Ligand

Purifikovaný rekombinantní lidský zalphal 1 Ligand (příklad 29) byl konjugován a desetinásobným mo lamím nadbytkem DTPA (Pierce, Rockford, 11) inkubací 30 minut při pokojové teplotě v PBS. Nezreagovaný DTPA a hydro lyzáty byly odstraněny výměnou pufrů na Biomaxio Sk NMWL (Ultrafree-15, Millipore, Bedford, MA). Mrtvý objem proteinového vrcholu byl koncentrován na 5 mg/ml a alikvót byl odebrán na testování v bioeseji (anti-CD40 stimulace myších B-buněk (příklad 44)). Po potvrzení, že DTPA-konjugát si uchoval plnou biologickou aktivitu, byl nareděn na 0,5 mg/ml v 1M octanu sodném pH 6,0. Do reakce bylo vzato množství dvou mCi “'india a toto množství bylo smícháno s 0,5 ml 1M octanu sodného pH 6,0 a přidáno ke konjugátu DTPA-lidský - zalphal 1 Ligand. Směs se nechala inkubovat po dobu 30 min při pokojové teplotě. Nezabudované ¹¹‘indium bylo odstraněno pomocí výměny pufrů na PBS na PD-10 sloupci (Pharmacia, Piscataway, NJ). Radioaktivně značený materiál byl naředěn neznačeným lidským zalphal l Ligandem tak, aby výsledná specifická aktivita byla 100 mCi/mg, potom byl sterilně přefiltrován a uchován do rána při 4 °C. Sto procent značeného proteinu io zůstalo na Biomax-Sk NMWL membráně (Millipore). Značený ^1HIn -lidský zalphal 1 Ligand byl podáván myším v eliminačních a farmakokinetických studiích. Každému zvířeti bylo podáno padesát pg proteinu lidského zalphal 1 Ligandu značeného 5 mCi značeného lidského zalphal 1

Ligandu v 0,1 ml PBS.

C. Výsledky předběžné distribuční studie

Jednu a tri hodiny následující po administraci všemi třemi cestami, byla nejvyšší koncentrace ^lllIn -lidského zalphal 1 Ligandu nalezena v ledvinách a druhá nejvyšší v moči a močovém měchýři. To je důkaz toho, že tyto tkáně mají nejvyšší cpm. Průměrná dávka odečtená v ledvinách byla tri až osmkrát vyšší, než v celých játrech, záleželo to ovšem na cestě podání a čase usmrcení. Například, průměrná hodnota cpm v ledvině za 60 min po IV injekci byla 4,5 větší, než dávka vypočítaná pro celá játra u té samé skupiny. Ve skupině, která byla usmrcena deset minut po intravenózní injekci, byla nejvyšší dávka nalezena opět v ledvinách a druhá nejvyšší hodnota cpm byla shodně nalezena v játrech, močovém měchýři a moči:

D. Předběžná farmakokinetická studie

Krev a plazma byly sbírány v intervalu 10, 30 a 60 minut následujících po injekci, která byla podána všemi třemi cestami. Po IV injekci byla vytvořena kolekce krve a plazmy v intervalech dvě, pět a deset minut. Další kolekce byla vytvořena u myší, které obdržely buď IP nebo SC cestou, kdy vzorky byly odebrány po jedné, dvou a třech hodinách. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 6. Jak byl krátký byl časový úsek po odebrání, tak tomu odpovídal poločas rozpadu IL-2 následující po intravenózní injekci. Uvedený T/2 byly rozmezí 2,5 až 5,1 minuty. Pro přehled in vivo administrace IL-2, se lze podívat do Donohue a Rosenberg, J. Immunol.

.130:2203, 1983. Délka Časových úseků byla vybírána tak, aby dobře vystihla průběh eliminační fáze.

-86CZ 302921 B6

Tabulka 6

Způsob podání injekce	Čas odběru krve (min.)	Čas usmrcení
Intravenosní Skupina 1	2, 5, 10	10 min.
Intravenosní Skupina 2	10, 30, 60	60 min.
Intraperitoneální Skupina 1	10, 30, 60	60 min.
Intraperitoneální Skupina 2	60, 120, 180	180 min.
Subkutánní Skupina 1	10, 30, 60	60 min.
Subkutánní Skupina 2	60, 120, 180	180 min.

Neznačený IL-2 byl eliminován ze séra s poločasem rozpadu přibližně 3 minuty, v myši po IV injekci. Informace lze získat v: Donahue a Rosen ber g supra. Po IP a SC injekci podobného množství IL-2, bylo trvání persistence aktivity IL-2 v séru prodlouženo ze 2 jednotek/mi po dobu kratší než 30 minut následující IV injekci, na hodnotu vyšší než 2 jednotky/ml po dobu dvou hodin následujících po IP a na 6 hodin následujících po SC injekcích. Hlavní cestou vyloučení IL-2 se jeví být ledviny. Jak bylo již v textu diskutováno, zalphal 1 Ligand se jeví být strukturně podobný IL-2. Předběžné hodnocení eliminace zalphall Ligandu se jeví být stejné, io jako je vylučování IL-2 ledvinami, což se potvrdilo v předchozí studii akumulací cpm hlavně v ledvinách, močovém měchýři a moči. Byly vypracovány odhady farmakokinetických parametrů založené na nekompartmentální analýze cpm dat získaných z plazmy, a to pomocí PK analýzy programu VinNonLin, Version 1,1, (Scientific Consulting lne., Cary, NC). Poločas rozpadu zalphal 1 Ligandu v plazmě byl odhadnut pomocí předpovědi rychlostních konstant eliminace pro intravenózní, intraperitoneální a subkutánní administraci dávek o velikosti 50 pg. Výsledky farmakokinetických dat byly odvozeny z hraničních datových bodů koncentrace plazmy pro koncovou oblast eliminace v porovnání proti časovému profilu. Kromě toho, přizpůsobení terminální časové fáze eliminace pro SC a IP dávkování vyžaduje užití dat získaných pří adsorpci ^,llIn-lidského zalphal 1 Ligandu, kdy se tato adsorpce ještě zjevně stále vyskytuje. Avšak odhady poločasu rozpadu následující po intravenózních, subkutánních a intraperitoneálních dávkách byly 13,6 min, 18,8, min a 34,3 min. Kdyby nebyl hodnocen rozsah dávek, nebylo by zřejmé, zda se jedná o saturační či aktivně eliminační kinetiku (kinetika Michael i s- Mentenové). Proto byly učiněny odhady poločasů rozpadu.

Odhady biodostupnosti značeného proteinu byly provedeny na základě oblasti pod křivkou (AUC) následující po subkutánní nebo intraperitoneální dávce ve srovnání s intravenózní dávkou. Odhadovaná biodostupnost po subkutánní a intraperitoneální injekci byla 35,8 % a 63,9 %. Protože byla studována pouze jedna dávka proteinu, biodostupnost se nedá hodnotit jako funkce dávky. Odhadnutá doba odstranění a objem distribuce (založeno na datech pro intravenózní injekce) byly 0,48 ml/min a 6,1 ml/min.

Ačkoli získaná data jsou předběžná, zdá se, že osud zalphall Ligandu administrovaného intravenózně je podobný tomu, jak bylo referováno pro IL-2, dalšího z cytokinů, majících molekulovou strukturu složenou ze svazku čtyř helixů (Donahue a Rosenberg, SA supra.). Stejně jako IL-2, IV administrovaný zalphall Ligand má poločas rozpadu v plazmě několik minut a hlavní cestu vylučování ledvinami. Tři hodiny po injekci většina značeného materiálu extrahovaného z ledvin zůstávala na Biomax SK NMLW membráně (Millipore). Ačkoli již dříve bylo uvedeno, že indium zůstává spojeno s proteiny dokonce i během lysosomální degradace (Staud a další, J. Pharm. Sciences 88:577-585, 1999), zalphal 1 Ligand se akumuluje a může být degradován v ledvinách. Uvedená studie také prokázala, to, co bylo popsáno u mnoha dalších

-87QL 302921 B6 proteinů, včetně IL-2, (Donahue a Rosenberg, SA, supra.), že IP a SC administrace významně prodlužuje hladinu zalphal 1 Ligandu v plazmě.

Příklad 39: Izolace a množení frakce MNC CD34+ čerstvé lidské kostní dřeně pomocí zalphal l Ligandu pro určení aktivity NK

A. Selekce a izolace CD34+ buněk z lidské kostní dřeně io K obohacení buněk majících NK buněčnou aktivitu byly připraveny jednojademé (MNC) buňky z čerstvé lidské kostní dřeně. Čerstvé lidské MNC byly získány z Poeitic Technologies (Gaithersburg, MD). 10 ml alpha MEM (JRH, Lenexa KS) obsahujícího 10% H1A FBS (Hyclone, Logan, Uf) a antibiotika 1% PSN (Gibco, BRL, Grand Island, NY) bylo přidáno k buněčné suspenzi a buňky byly prolity přes lOOprn síto. Buňky byty potom spočítány, peletovány, promyty 10 ml PBS obsahujícího 2% FBS, opět peletovány a resuspendovány v 1 ml PBS obsahujícím 2% FBS. Buňky mající CD34 povrchový markér (CD34+ buňky) byly podle instrukcí výrobce magneticky rozděleny pomocí Detachabead kitu s Dynabeads M—450 CD34 (Dynal, Oslo, Norsko). Obě frakce buněk, jak CD34+, tak CD34- byly analyzovány postupem popsaným níže.

B. Expanze CD34+buněk pomocí zalphal 1 Ligandu

CD34+ buněčná frakce byla vyseta do čtyř jamek ve dvacetičtyr jamkové desce. Bylo vybráno 50 000 pozitivních buněk a resuspendováno v 1 ml Alpha MEM (JRH) obsahující 10% HIA FBS

2? (Hyclone) a 1% PSN (Gibco BRL), plus různé cytokiny popsané níže. Jamky byly označeny 1 až 4. K výzkumu expanze buněk kostní dřeně MNC selektovaných na CD34+ vyvolané zalphal 1 Ligandem byly použity různé reagencie. Reagencie zahrnovaly: lidský flt3 (Ra D, Minneapolis, MN); purifikovaný lidský zalphall Ligand (příklad 30C 30D); lidský IL-15(RaD). Reagencie byly kombinovány následovně: 0 den: Do jamky č. 1 byly přidány 2 ng/ml lidského flt3. Do jamky č. 2: 2 ng/ml flt3 a 15 ng/ml purifikovaného lidského zalphall Ligandu. Do jamky č. 3 bylo přidáno 2 ng/ml lidského flt3 a 20 ng/ml lidského IL—15. Do jamky č. 4 bylo přidáno 2 ng/ml lidského flt3, 15 ng/ml purifikovaného zalphal 1 Ligandu a 20 ng/ml lidského IL—15. Po inkubaci trvající 18 dní byla buněčná suspenze z každé jamky peletována a resuspendována v 0,5 ml alpha MEM (JRH) obsahujícím 10% HIA FBS (Hyclone) a 1% PSN (Gibco BRL) a vyhodnocena proliferace CD34+ buněčné frakce. Nízká úroveň proliferace byla pozorována v přítomnosti flt3 samotného (kontrolní jamka č. 1), ale v přítomnosti IL—15 nebo zalphal 1, které byly přidány kflt3, nebyl zaznamenán signifikantní vliv na expanzi (jamky č. 2 a 3). Avšak expanze překračující hodnotu f1t3 kontroly byla průkazná v jamce 4, která obsahovala IL-15 a zalphall Ligand přidané kfll3. Tyto výsledky naznačují, že zalphall a IL-15 působí syner40 gicky na expanzi lidské CD34+ buněčné populace. Co více, výsledky těchto pokusů podporují výsledky získané se zalphal l Ligandem v testu s myšmi BM (příklad 21).

Všechny populace buněk byly potom testovány na NK aktivitu a podrobeny zkoumání průtokovou cytometrií, jak je popsáno v příkladu 41.

C. Expanze CD34+ nebo CD34- buněk pomocí zalphal 1 Ligandu a opožděného přidání IL-15

Obě buněčné frakce CD34 positivních a negativních (CD34-) buněk byly odděleně vysety do šesti jamek na dvanácti jamkové desce, označených 1 až 6. Každá ze šesti jamek obsahovala

100 000 pozitivně nebo negativně selektovaných buněk ve 2 ml alpha MEM obsahujícího

10%HIA FBS a PSN, jak bylo popsáno výše. Reagencie byly tytéž, jak bylo popsáno výše. 0 den: Do jamky č. 1 byly přidány 2 ng/ml lidského flt3. Do jamky ě. 2: v nultý den 2 ng/ml flt3 a pátý den inkubace 20 ng/ml purifikovaného lidského IL-15. Do jamky č. 3 bylo přidáno 2 ng/ml lidského flt3 a 15 ng/ml lidského zalphal 1 Ligandu v nultý den a po pěti dnech inkubace bylo přidáno 20 ng/ml lidského IL-15. Do jamky č. 4 bylo přidáno v nultý den: 2 ng/ml lidského ftl3,

-88CZ 302921 B6 ng/ml lidského zalphal 1 Ligandu a po pěti dnech inkubace bylo přidáno 20 ng/ml lidského IL-15. Do jamky č. 5 bylo v nultý den přidáno: 2 ng/ml lidského ftl3 a 20 ng/ml lidského IL-15. Do jamky č. 6 bylo přidáno v nultý den: 2 ng/ml lidského ftl3, 15 ng/ml lidského zalphal 1 Ligandu a 20 ng/ml lidského IL-15. Po inkubaci trvající 15 dní, byly buňky z každé jamky sklizeny a spočítány.

V populaci CD34+ buněk byla nalezena nízká proliferace v přítomnosti ft!3 samotného (kontrolní jamka č. 1), přítomnost IL-15 a zalphal 1 Ligandu od nultého dne spolu s ft!3 nemělo na expanzi buněk žádný vliv (jamky 3 a 5). Přidání IL—15 po pěti dnech mělo proliferativní účinek ve srovnání s ftl3 kontrolou (porovnání jamky 2 ku jamce 1) a proliferativní efekt v přítomnosti zalphal 1 Ligandu (porovnání jamka 4 k jamce 3). Avšak největší expanze byla viditelná v jamce č. 6, která obsahovala IL-15 a zalphal 1 Ligand přidané k ftl3 již nultý den. Přidání zalphal 1 Ligandu k ftl3 nultý den (jamka 3) mělo podobný výsledek jako kontrola. Přidání IL-15 pátý den inkubace zvýšilo proliferaci na buňky v přítomnosti (jamka č. 4) nebo nepřítomnosti (jamka č. 2) zalphal 1 Ligandu. Opět bylo nejvyšší expanze dosaženo v jamce č. 6, která obsahovala IL-15 a zalpha 11 Ligand přidané k ftl3 j iž od nultého dne.

Všechny buněčné populace byly potom testovány na aktivitu NK a podrobeny zkoumání pomocí i nvu ypiicviuvt ti

Příklad 40: Izolace a expanze čerstvých myších buněk pomocí lidského a myšího zalphal 1 Ligandu pro určení NK aktivity a NK buněčných markérů

A. Izolace a expanze čerstvých myších buněk kostní dřeně o nízké hustotě pomocí lidského a myšího zalphal 1 Ligandu

Čerstvé buňky myší kostní dřeně byly izolovány ze stehenních kostí následujícím postupem: upevnění obou konců myšího a protlačováním dvou až tri mililitrů růstového média (viz níže) kostí do zkumavky upevněné na spodní straně femuru. Kultivační médium se skládalo z 504 ml PM1 1640 Média (JRH Biosciences, Lenexa, KS); 5 ml lOOx L-glutamin (Gibco BRL. Grand Island, NY; 5 ml lOOx pyruvátu sodného (Gibco BRL); 5 ml 100 x Penicilín, Streptomycin, Neomycin (PSN) (Gibco BRL); a 50 ml tepelně inaktivované ho fetálního hovězího séra (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT). Buňky dřeně byly potom desintegrovány několikerým nasátím a vypuštěním média pipetou. Potom byly buňky peletovány a promyty jednou kultivačním médiem a přefiltrovány přes filtr s velikostí pórů 70 mikronů. Nízkohustotní frakce jednojademých buněk byla potom izolována z hustotního gradientu. Buňky kostní dřeně byly v objemu 5 až 8 ml kultivačního média naneseny na vrchol gradientu 8 ml gradientu NycoPrep 1.077 Animal (Nycomed, Oslo, Norway) navrstveného v centrifugační zkumavce. Tento gradient byl potom centrifugo ván při 600 x g po dobu 20 minut, Jednojademé buňky o nízké hustotě byly potom získány z mezifázové vrstvy mezi NycoPrep a médiem. Tyto buňky byly potom naředěny přibližně 20 ml kultivačního média, peletovány a promyty. Potom byly buňky vysety v hustotě přibližně 0,5 až 1,5 x 10⁶ buňky na ml kultivačního média ve standardních kultivačních láhvích pro tkáňové kultury a inkubovány při 37 °C, 5% CO₂ po dobu dvou hodin.

Neadherentní buňky kostní dřeně o nízké hustotě (NA LD) byly potom sklizeny a vysety v hustotě 0,5 až 2,0 x 10⁵ buněk na mililitr růstového média plus 2,5 ng/ml myšího flt3 (R and D Systems, Minneapolis, MN), plus 25 až 50 ng/ml lidského interleukinu 15 IL-15 (R and D Systems) s nebo bez 50 až 150 ng/ml lidského zalphal 1 Ligandu s nebo bez 0,12 až 10 ng/ml myšího zalphal 1 Ligandu.

Bez přídavku lidského nebo myšího zalphal 1 Ligandu nebyla shledána žádná expanze. Neadherentní buňky byly expandovány v kulturách obsahujících myší zalphal 1 Ligand alespoň v koncentraci 0,12 ng/ml nebo obsahující lidský zalphal 1 Ligand alespoň v koncentraci 22 ng/ml. V kulturách obsahujících jak lidský, tak myší zalphal 1 Ligand, expanze neadherent-89CZ 302921 B6 nich buněk vzrůstala se zvyšováním dávky zalphal 1 Ligandu, saturační odpověď naq myší ligand byla při koncentraci 5 až 10 ng/ml a lidského ligandu nebylo dosaženo saturační odpovědi, i když koncentrace dosáhly nejvyšší dávky 200 ng/ml. Lidský zalphal I Ligand se jeví přibližně 20 až 100 krát méně potentní v myších buňkách než myší zalphal 1 Ligand. Po pěti až deseti dnech byly myší buňky expandované zalphal l Ligandem sklizeny a podrobeny průtokové eytometrické analýze {FACSCalibur, Beeton Díckínson, Mansfíeld, MA), čímž se určilo procento buněk pozitivních k NK buněčným antigenům, kde 46 % bylo pozitivních pro PanNK buněčný markér DX5 (Pharmingen).

B. Izolace a množení čerstvých linií oslabených myších buněk kostní dřeně

Čerstvé linie myších depleted (lin-) buněk kostní dřeně byly izolovány z čerstvých buněk kostní dřeně inkubací buněk v následujících protilátkách: TERI 19, Gr-1, B220, MAC-1, CD3e a I-Ab (Pharmingen, San Diego, CA). Buňky linie + (lin+) byly potom odstraněny podle instrukcí výrobce pomocí užití Dynabeads M—450 ovčího - antikrysího IgG (Dynal, Lake Success, NY). Negativně selektované linie buněk kostní dřeně, značené lin-, byly potom vysety tak, jak je to popsáno výše do kultivačního media plus buď 2,5 ng/ml ťlt3 (R&D Systems) a 25 ng/ml IL-15 (R&D Systems); nebo flt3, IL-15 a myšího zalphal 1 Ligandu, 2 až 5% kondiciovaného média BHK myšího zalphal 1 Ligandu. Po šesti dnech inkubace byly kultury sklizeny, spočítány a podrobeny testu na aktivitu NK buněk (příklad 41). Buňky kultivované v přítomnosti myšího zalphal 1 Ligandu byly dvakrát až třikrát účinnější při lýze NK cílových buněk (YAC—1 cells), než buňky rostoucí bez zalphal 1 Ligandu,

C. Izolace a expanze CD4- CD8- (Dvakrát negativních -Double Negative nebo DN) thymocytů

Čerstvé myší thymocyty byly izolovány z thymu myší ve stáří 3 až 8 týdnů, které byly nakrájeny a přefiltrovány. CD4- CD8- (DN) byly potom negativně selektovány inkubací thymocytů s anti-CD4 a anti CD8 protilátkami (PharMingen), potom následným odstraněním CD4+ CD8+ buněk pomocí Dynabeads M^45O s ovčími-antikrysími IgG (Dynal) podle instrukcí výrobce.

Myší DN thymocyty byly potom kultivovány v kultivačním médiu plus 2,5 ng/ml flt3 (R&D Systems), 25 mg/ml IL-15 (R&D Systems) a 10 ng/ml IL-7 (R&D Systems) v přítomnosti či nepřítomnosti myšího zalphal 1 Ligandu, jak je popsáno výše. Po šesti dnech inkubace byly kultury sklizeny, spočítány a podrobeny testu na aktivitu NK buněk (příklad 41). Buňky kultivované v přítomnosti myšího zalphal 1 Ligandu poskytly přibližně 480 000 buněk, zatímco kultury bez zalphal 1 Ligandu poskytly pouze přibližně 160 000 buněk. Kultury rostoucí v přítomnosti myšího zalphal 1 Ligandu byly přibližně z 16,2 % pozitivní pro NK buněčný antigen Pan NK, DXS (PharMingen). Kultury rostoucí bez zalphal 1 Ligandu byly ze 14,6% pozitivní pro DXS. Buňky rostoucí se zalphal 1 Ligandem byly přibližně dvakrát účinnější při lýze NK cílových buněk YAC-1, než buňky rostoucí bez zalphal 1 Ligandu. Expandované buňky nelyžovaly významně buňky negativní cílové kontrolní linie EL4. Výsledky naznačují, že zalphal 1 Ligand selektivně expanduje lytické NK buňky.

Příklad 41: Aktivita buněk namnožených v přítomnosti lidského a myšího zalphal 1 Ligandu a zralých myších NK buněk v testu cytotoxicíty NK buněk

A. Test NK buněk

Cytolýza zprostředkovaná NK buňkami byla zkoušena pomocí standardního testu uvolňování ⁵¹ Cr. Cílové buňky (K562 buňky (ATCC č. CCL-243) užívané pro lidské testy a YAC-1 buňky (ATCC č. TIB-160) pro myší testy) neexprimují molekuly většího histokompatibilního komplexu (MHC), což je činí vnímavé pro lýzu zprostředkovanou NK buňkami. Negativní kontrolní cílová linie pro myší testy byla MHC+ thymoma EL4 (ATCC č. TIB-39). Buňky K562, EL4, a

-90CZ 302921 B6

YAC-1 byly kultivovány v RP10 médiu (standardní RPMI 1640 (GibcoBRL, Grand Island, NY) s přídavkem 10% FBS (Hyclone, Logan, UT), dále potom 4mM glutaminu (GibcoBRL), 100 IU/ml penicillinu+ 100 MCG/ml streptomycinu (GibcoBRL), 50μΜ β-merkaptoethanolu (GibcoBRL) a lOmM HEPES pufru (Gibco.BRL). V den testu bylo 1 až 2 x 10^ó cílových buněk sklizeno a re suspendováno v hustotě 2,5 až 5 x 10⁶ buněk/ml v RP10 médiu. Přímo do buněk bylo přidáno 50 až 100 μί 5 mCi/ml ^5,Cr-chromanu sodného (NEN, Boston, MA) a buňky se ponechaly inkubovat 1 h při 37 °C, potom byly dvakrát promyty 12 ml PBS a byly resuspendovány ve 2 ml RP10 média. Po spočítání buněk v hematocytometru, byly cílové buňky naředěny na 0,5 až l x 10⁵ buněk/ml a 100 μί (0,5 až 1 x 10⁴ buněk) bylo smícháno s efektorovými buňkami, jak je popsáno níže.

Pro lidské testy byly efektorové buňky připraveny ze selektovaných a namnožených lidských CD34+ BM buněk (příklad 39B), které byly sklizeny, promyty, spočítány a smíchány v různých koncentracích s ⁵¹Cr-značenými cílovými buňkami v 96-jamkové desce s kulatým dnem a ponechány inkubovat po dobu 4 h při 37 °C. Po společné inkubaci efektorových buněk a značených cílových buněk, byla odebrána polovina objemu jamky a proměřena na měřiči (počítači) gama záření 1 min/vzorek. Procento specifický uvolněného ^S!Cr se spočítalo ze vzorce 100 x (X-Y)/(Z-Y), kde X je uvolněné ⁵¹Cr v přítomnosti efektorových buněk, Y je spontánní uvolněni při absenci efektoru a Z je celkově množství ^5!Cr uvoiněné z cílových buněk inkubovaných s 0,5% Tritonu X-100. Data byla vynesena jako % specifické lýzy v poměru efektor: cílová buňka v každé jamce.

Aktivita buněk namnožených v přítomnosti lidského zalphal 1 Ligandu

Izolované CD34+ lidské HPC buňky kultivované s flt3 +/- zalphall Ligand a flt3 +IL-15 +/- zalphall Ligand (příklad 39), byly sklizeny 15. den kultivace, kdy byla proměřena jejich kapacita lyžovat MHC- K562 buňky ve standardním testu uvolňování ^5,Cr tak, jak je to popsáno výše a dále pro analýzu jejich povrchového fenotypu pomocí průtokové cytometrie, Jak bylo očekáváno podle předchozích pokusů (Mrožek a další, Blood 87:2632-2640, 1996; a Yu a další, Blood 92:3647-3657, 1998), současné přidání IL—15 a flt3L vyvolalo jako přímý důsledek malou populaci CD56+ buněk. Je zajímavé, že ačkoli byly BM buňky kultivované současně se zalphal 1 Ligandem a flt3L, nebyla jejich expanze výrazná, byl však signifikantní nárůst celkového počtu buněk v kulturách obsahujících kombinaci ftl3L, zalphal 1 Ligandu a IL-l5 (viz, příklad 39).

Pro posouzení povrchového fenotypu těchto lidských BM kultur, byly malé alikvóty buněk obarveny pro tříbarevnou průtokovou cytometrickou analýzu s anti- CD3-FITC, anti—CD56-PE a anti-CD16-CyChrome mAbs (všechny od PharMingen, San 5 Diego, CA) a analyzovány na FACSCalíbur pomocí CelIQuest software (Becton Dickinson, Mountain Víew, CA). Takto provedená cytometrická analýza potvrdila, že buňky vzniklé z těchto kultur byly diferencované NK buňky, ačkoli byly velké a granulámí a exprimovaly oba CD56 a CDI6 a byly CD3- (Lamer, Annu. Rev. Immunol. 16:359-393, 1998). Co více, tyto buňky vykazovaly průkazně vyšší efektorovou funkci, než buňky rostoucí v IL—15 a flt3. Kromě toho, buňky kultivované v přítomnosti všech tří cytokinů lyžovaly více než 40 % K562 cílových buněk při poměru efektor/cíl (E:T) rovnajícím se 1,5, zatímco, byly-li buňky pěstovány v IL—15 + flt3L, lyžovaly méně než 5 % cílových buněk při poměru E:T 2. Tato data demonstrují, že v kombinaci s IL—15, zalphal 1 Ligand stimuluje diferenciaci NK buněk z CD34' BM buněk.

Aktivita buněk namnožených v přítomnosti myšího zalphal 1 Ligandu

Pro testování vlivu zalphal 1 Ligandu na myší předchůdce hematopoetických buněk byly připraveny purifikované linie negativních buněk kostní dřeně (Lín-) z C57B1/6, které byly namnoženy v flt3+IL-15+/- zalphal 11 Ligand, tak, jak je popsáno v příkladu 40B. Šestý den kultivace byly buňky (efektory) sklizeny a spočítány, potom resuspendovány v 0,4 ml RP10 média (příklad 41 A). Dva alikvóty (0,15 ml každý) každého vzorku pěstované v přítomnosti či nepřítomnosti zalphal 11 Ligandu (příklad 41 A) byly naředěny sériově 3-krát v duplikátech v 96-jamkové

-91 CZ 302921 B6 desce s kulatými dny. Celkový počet byl 6 jamek po 100 μΐ. Zbylých 100 μΐ buněk bylo obarveno na přítomnost NK povrchových markérů pomocí FITC-anti-2B4 a PE-anti-DX5 mAbs (PharMingen) a bylo analyzováno průtokovou cytometrií. Všechny skupiny buněk, vystavených působení flt3+IL-15 v přítomnosti či nepřítomnosti zalphall Ligandu, poskytovaly obdobné frakce 2B4+DX5+ buněk, které byty pozitivní na oba NK markéry v rozsahu 65 až 75 %.

Pro test NK lýzy byly cílové buňky s (YAC-l a EL4) značeny pomocí ^MCr, tak jak je popsáno výše. Po stírání cílových buněk na hemacytometru, byly buňky naředěny na 0,5 až lxl0⁵ buněk/ml a 100 μΐ YAC-l nebo EL4 (0,5-1 xlO⁴ buněk) bylo smícháno se 100 μΙ efektorových buněk a ínkubováno po dobu 4 hodin při 37 °C. Specifická lýza se určovala pro každou jamku, jak bylo popsáno výše.

Shledali jsme, že buňky rostoucí v přítomnosti flt3+lL-l 5+zalphal 1 - Ligandu vykázaly zvýšenou lytickou aktivitu (zhruba 2—krát) oproti YAC-l cílovým buňkám (ale nezabíjely buňky kontrolní MHC+ buněčné linie EL4). V poměru efektor: cílové buňky (E:T) majícím hodnotu 5, NK buňky generované v přítomností všech tří cytokinů (zalphal 1 Ligand+flt3+lL-15) lyžovaly 12% YAC-l buněk, zatímco tyto NK buňky množené v flt3+IL-15 lyžovaly 6% YAC-l cílových buněk. Následné pokusy potvrdily tento vývoj,

Druhým přístupem k určení biologické aktivity zalphall Ligandu na myší NK buňky, byla izolace nezralých CD4-CD8- (dvojnásobně negativních, DN) myších thymocytů tak, jak je to popsáno v příkladu 40C a jejich kultivace s IL-15+flt3+IL-7 nebo IL-15+flt3+IL-2, v přítomnosti či nepřítomnosti zalphal 1 Ligandu. Šestý den kultivace byly buňky sklizeny atestovány na NK lytickou aktivitu s YAC-l a EL4, jak bylo popsáno výše. Shledali jsme, že buňky kultivované v přítomnosti zalphal 1 Ligandu měly v tomto testu největší lytickou aktivitu, vyšší, než měly buňky pěstované v přítomnosti ostatních cytokinů. Zvláště pak, DN thymocyty, které byly kultivovány v IL—l S+flt3+IL-7 usmrcovaly 18% YAC-l buněk při E:T hodnoty 24, zatímco buňky kultivované v přítomnosti IL—15+fIt3+IL-7+ zalphall Ligandu, usmrtily 48% cílových buněk při tomtéž E:T, DN thymocyty pěstované v !L-15+flt3+LT-2 usmrtily 15% YAC-l cílových buněk při hodnotě E:T - 6, zatímco buňky kultivované se všemi třemi cytokiny + zalphal 1 Ligandu usmrtily 35 % YAC-l buněk při hodnotě E:T = 9. Jeden den před NK lýzou byla s buňkami provedena analýza pomocí průtokové cytometrie. To, co bylo prokázáno pro kultury buněk kostní dřeně, přes existenci proliferační ho vlivu zalphal 1 Ligandu (počet buněk se zvýšil přibližně dvakrát, byl-li do kultury dodán zalphal 1 Ligand), to nebylo prokázáno pro zvýšení frakce DX5* buněk (17-20 % z celkového množství buněčné kultury s IL-7 a 35M6 % celkového počtu buněk v kulturách s IL-2). Tyto výsledky potvrzují, že zalphall Ligand, v kombinaci slL-15 a ftl3, zvyšuje lytickou aktivitu NK buněk generovaných z myší kostní dřeně nebo brzlíku.

Vliv myšího zalphal 1 Ligandu na aktivitu zralých myších NK buněk

Z důvodu testování vlivů myšího zalphal 1 Ligandu na zralé NK buňky, byly čtyřem myším C57B1/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) pět týdnů starým vyjmuty sleziny a byla z nich vytvořena buněčná suspenze jejich rozmačkáním pomocí zmraženého krycího sklíčka. Červené krvinky byly odstraněny následujícím postupem pomocí hypotonické lýzy: buňky byly pe letovány a supernatant odstraněn odsátím. Pelet byl rozrušen jemným vortexováním, potom bylo přidáno ze stálého třepání 900 μΐ sterilní vody, potom následovalo velmi rychlé (do 5 s) přidáním 100 μΙ lOx HBSS (GibcoBRL). Buňky byly potom resuspendovány v 10 ml 1 x HBSS a nerozpustný zbytek byl odstraněn pomocí filtrace přes nylonovou tkaninu (Falcon). Tyto RBC-zeslabené slezinné buňky byly potom opět peletovány a resuspendovány v MACS pufru (PBS+1% BSA+2mM EDTA) a spočítány. 300x10⁶ buněk bylo označeno anti-DX5-potaženými magnetickými částicemi (Miltenyi Biotec) a pozitivně selektované buňky DX5^ NK byly separované na sloupci MACS VS+ podle instrukcí výrobce. Tento postup vedl k zisku 8,4 x 10^h DX5⁺ buněk a 251 x 10⁶ buněk/jamka, 2 jamky / na jedny pokusné podmínky) v RP10 médiu (příklad 41A) samotném nebo s 1) 30 ng/ml myšího zalphall Ligandu, 2) 30 ng/ml rekombi-92CZ 302921 B6 nantního myšího IL-2 (R&D Systems, lne, Minneapolis, MN), 3) 30 ng/ml rekombinantního lidského IL—15 (R&D), 4) 30 ng/ml jak myšího zalphal 1 Ligandu, tak hIL-15 nebo 5) 30 ng/ml každého mIL-2 a hIL-15. Buňky byly sklizeny po 21 hodinách, promyty a resuspendovány v RP10 médiu a spočítány. Buňky byly potom testovány na schopnost lyžování ^5,CR značených YAC-1 nebo EL4 cílových buněk, jakje popsáno v příkladu 41 A.

Obecně vzato, u buněk za skupiny DX5' (non-NK buněk) byla nalezena velmi malá NK aktivita, avšak buňky DX5‘ kultivované s zalphal 1 Ligandem a hIL-15 lyžovaly 25 % YAC-1 cílových buněk při hodnotě poměru E:T = 82. Ve srovnání buňky DX5' kultivované pouze shlL-15 lyžovaly 14% YAC-l cílových buněk při E:T = 110. Z toho plyne, že zalphal 1 Ligand a IL—15 působily společně na zbylé NK1.1⁺ NK buňky v této buněčné preparaci. Co se týká připravených buněk DX5⁺, přidání myšího zalphal 1 ligandu samotného nezvýšilo významně jejich efektorovou funkci (jejich lýze YAC-1 buněk byla podobná jako ve skupině bez přidaného ligandu). Jak bylo předpokládáno, oba IL-2 a IL—15 významně vylepšily NK aktivitu. Největší úroveň lýzy byla ovšem pozorována ve skupině ošetřené zalphal 1 Ligandem a hlL-15 (65% lýza YAC-1 buněk při E:T= 3,3, oproti 45% lýze při E:T = 4 ve skupině buněk ošetřených hIL-15), Shrneme-lí dosažené výsledky můžeme říci, že ačkoli zalphal 1 Ligand sám nezvyšuje aktivitu NK buněčné lýzy, může zvýšit tutoNK lyzační aktivitu zralých NK, je-li podáván s L-15,

Příklad 42: Vliv zalphal 1 Ligandu na proliferaci lidských a myších T-buněk

A. Vliv myšího zalphal 1 Ligandu na proliferaci myších T-buněk

T buňky zC57Bl/6 kmene myší (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) byly izolovány za shromážděných solenocytů a lymfocytů z axilámích, podpažních a tříselných, krčních a mesenterických lymfatických uzlin (LNs). Sleziny byly rozmačkány mezí vymraženými sklíčky a byla vytvořena buněčná suspenze. LNs byty rozstříhány na kousky a protlačeny buněčným sítem, tak byly odstraněny ěásti tkání. Shromážděné splenocyty LN buňky byly rozděleny podle instrukcí výrobce a frakce CD8+ a CD4+ za užití dvou následných MACS magnetických separačních sloupců (Miltenyi Biotec, Aubum, CA). Thymocyty byly izolovány z týchž myší.

Buňky byly kultivovány v koncentraci 3 x 10⁵ buněk na jamku, (thymocyty) nebo 10⁵ buněk na jamku (zralé T buňky) se stoupající koncentrací puriftkovaného myšího zalphal 1 Ligandu (0 až 30 ng/ml) (příklady 24 a 29) v 96-jamkových deskách s plochým dnem, které byly předtím potaženy přes noc při 4 °C různými koncentracemi anti-CD3 mAb 2C11 (PharMingen) po 3 dny při 37 °C. Protilátka anti-CD3 sloužila k aktivaci myších T-buněk cestou T-buněčného receptorů. Do každé jamky bylo druhý den přidáno 1 pCi ³H-thymidinu a desky byly sklizeny a buňky spočítány o 16 hodin později, kdy byla hodnota proliferace.

Jestliže byl testován zalphal 1 Ligand v testu proliferace u T-buněk, bylo zjištěno, že stimuluje anti-CD3-aktivované myší thymocyty, což vede k urychlení růstu CD8⁺CD4 buněk (většina thymocytů kultivovaných s anti-CD3+zalphal 1 Ligandem, nesly už do tří dnů CD8+CD4fenotyp, zatímco buňky kultivované s anti~CD3 samotným, průkazně nevykazovaly tento fenotyp až do 5 dne). Také nebyly pozorovány průkazné hladiny proliferace thymocytů v přítomnosti pouze zalphal l Ligandu, bez anti-CD3. Je zajímavé, že když byly testovány zralé periferní myší T buňky na schopnost odpovědi na zalphal 1 Ligand+anti-CD3, bylo shledáno, že pouze CD8⁺, ale nikoli CD4⁺ frakce buněk vykázala odpověď na dávku zalphal 1 Ligandu. Také byla pozorována slabá proliferace frakce CD8* buněk (ale nikoli CD4⁺ buněk) jako odpověď na samotný zalphal 1 Ligand. Je zajímavé, že tento jev nebyl pozorován u lidských T - buněk (viz příklad 42B, dole).

-93CZ 302921 B6

B. Vliv lidského zalphal 1 Ligandu na proliferaci lidských T-buněk

Lidské CD4⁺ a CDB⁺ T buňky byly izolovány z PBMC postupem popsaným v příkladu 43 (níže). Buňky byly kultivovány v koncentraci l x 10⁵ buněk na jamku, se stoupající koncentrací puriftkovaného lidského zalphal 1 Ligandu (0 až 30 ng/ml) (příklad 24) v 96-jamkových deskách s plochým dnem, které byly předtím potaženy přes noc při 4 °C různými koncentracemi anti—lidských CD3 mAb 2C11 (PharmaMingen) po 3 dny při 37 °C. Do každé jamky bylo druhý den přidáno 1 pCi 'Hthymidinu a desky byly sklizeny a spočítány o 16 hodin později, kdy byly hodnocena proliferace. Na rozdíl od výsledků získaných s myšími T-buňkami. tato předběžná data naznačují, že lidský zalphall Ligand ko—stimuluje CD4⁺, ale nikoli CD8⁺ lidské T buňky. Tato stimulace je závislá na dávce.

Příklad 43: Důkaz exprese zalphal 1 Ligandu v lidských CD4⁺ buňkách pomocí PCR v reálném čase

A. Purifíkované lidské T buňky jako primární zdroj přístupu k expresi lidského zalphal 1 Ligandu.

Od zdravého lidského dárce bylo získáno 150 ml celé krve a ta byla smíchána v poměru 1:1 s PBS v 50ml kónických zkumavkách. Třicet mililitrů ředěné krve bylo podvrstveno 15 ml Fixoll Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Tyto gradienty byly centrifugovány 30 min při 500 g a běh centrifugy byl zastaven bez brzdění: byly odebrány RBC-oslabené buňky na rozhraní (PBMC). Buňky byly třikrát promyty PBS. Výtěžek izolovaných lidských PBMC byl 200 x 10⁶ před selekcí popsanou níže.

PBMC buňky byly resuspendovány v 1,5 ml MACS pufru (PBS, 0,5% EDTA, 2mM EDTA) a 3 x 10⁶ buněk bylo vyseto stranou, posloužily k získání kontrolní RNA a pro analýzu pomocí průtokové cytometrie. Potom bylo k buňkám přidáno 0,25 ml anti-lidských CD8 značených mikročástic (Miltenyi Biotec) a směs se nechala kultivovat po dobu 15 min při 4 °C. Tyto buňky označené CD8 mikročásticemi byly promyty 30 ml MACS pufru a potom resuspendovány ve 2 ml MACS pufru.

Sloupec VS+ (Miltenyi) byl připraven podle instrukcí dodavatele. VS+ sloupec byl potom vložen do magnetického pole VarioMACS (Miltenyi). Sloupec byl ekvilibrován 5 ml MACS pufru. Potom byly na sloupec naneseny izolované myší primární buňky. CD8 negativní buňky prošly sloupcem bez navázání. Sloupec byl potom promyt 9 ml (3 x 3 ml). MACS pufru. Sloupec byl potom vyjmut z magnetického pole a nastaven nad 15ml falkonku. CDB+ buňky byly eluovány přidáním 5 ml MACS pufru na sloupec a navázané buňky vymyty za užití pístu dodávaného výrobcem. Výtěžek CDB+ selektovaných lidských periferních T-buněk byl okolo 51xl0⁶celkem. CD8—negativní buňky, které prošly sloupcem, byly také shromážděny, spočítány a obarveny anti-lidským CD4 potaženými mikročásticemi, potom inkubovány a naneseny na nový VS+ sloupec ve stejné koncentraci, jaká je popsána výše. Výsledek CD4+ selektovaných lidských periferních T buněk byl 42x10⁶ celkem.

Vzorek obou druhů lidských selektovaných T buněk, jak CDB⁺, tak CD4⁺ byl odebrán na následné barvení a třídění fluorescenčně značených buněk na FAGS, čímž bylo dosaženo jejich Čistoty. PE-konjugované anti lidské CD4 protilátky, anti lidské CD8FITC protilátky a anti lidské CD 19-CyChrome protilátky (všechny od firmy PharMingen) byly užity k označení CDB' a CD4⁺ selektovaných buněk. CD8-selektované buňky patřily v tomto prvním pokusu z 80 % k CD8⁺ a k CD4-selektovaným buňkám patřilo 85 %. CD4⁺. V následných dvou pokusech (příklad 43B), CD8⁺ purifíkovaných buněk bylo 84 % a 81 % čistých a CD4⁺ buněk bylo 85 % a 97 %, čistých. V jednom z pokusů byly barveny buňky, které se nezachytily na sloupci, a to pomocí antílidského CD19-potažených partikulí (Miltenyi) a po průchodu třetím magnetickým sloupcem, který sloužil k izolaci CD19+ B buněk, se získaly tyto buňky z 92 % čisté.

-94CZ 302921 B6

Lidské selektované CDB⁺, CD4⁺ a CD19⁺ byly aktivovány inkubací v 0,5xl0⁶ buněk/ml RPMI + 5 % lidského ultraséra (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA)+ PMA 10 ng/ml a lonomycin 0,5 pg/ml (Calbiochem) po dobu 4, 16, nebo 24 hodin při 37 °C T buňky (2,5 x 10⁶/jamka) byly alternativně stimulovány ve 24 jamkové desce, která byla předem potažena přes noc 0.5 pg/ml anti-CD3 mAb (UCHTI (PharmMingen) v přítomnosti nebo nepřítomnosti rozpustné anti-CD28 mAb (PharmMingen) v koncentraci 5 pg/ml, V daný časový okamžik byly buňky sklizeny, peletovány, rozředěny jednou PBS a znovu peletovány. supematant byl odstraněn a pelety byly rychle zmrazený v lázni suchý led/ethanol a uchovávány při -80 °C pro přípravu RNA v pozdější io době.

S takto připravenými lidskými buňkami selektovanými na CDB⁺, CD4⁺ a D19⁺s, tak, jak bylo popsáno výše v příkladu 43B a 43C níže se provedla PCR v reálném čase a tím byla určena přítomnost exprese lidského zalphal 1 Ligandu a receptorů.

B. Primery a sondy pro kvantitativní RT-PCR pro expresi lidského zalphal I Ligandu Kvantitativní RT-PCR v reálném čase byla provedena na přístroji ABI PRISM 7700 Sequence __e___*__znr a__r>:_____*_____a \ ~ i___u _______

LZCltVLIVU O^3LVI11 (l U ZAppiltU UI 31V1113, 11IV», 1 U3LV1 Vil), a UVIUJlá (J1VUIHU pvpaaua

2o (viz Heid a další, Genome Research 6:986-994, 1996; Gíbson a další, Genome Research 6: 995-1001, 1996; Sundaresan a další, Endocrinology 139:4756—4764, 1998). Tento postup zahrnuje užití pro daný gen specifické sondy, obsahující jak reportérovou, tak zhášecí barvu. Je-li sonda intaktní, emise reportérové barvy je negována blízkostí zhášecí barvy. Během PCR extenze pomocí přídavných gen-specifických primerů (jak dopředného, tak zpětného), je sonda štěpena 5' nukleázovou aktivitou Taq polymerázy, která uvolní reportérovou barvu, což se projeví zvýšením fluorescenční emise.

Primery a sondy užité pro kvantitativní RT-PCR byly navrženy pomocí programu Primer ExpressTM (PE Applied Biosystems). Primery pro lidský zalphal 1 Ligand byly navrženy tak, že obsahovaly intron—exon křížení k eliminaci amplifikace genomové DNA. Dopředný primer, ZC22 281 (SEKV.ID. Č.: 90) a zpětný primer, ZC2 279 (SEKV. ID. Č: 91) byly oba užity v 300nM koncentraci; syntetizovaly 80 bp produkt. Odpovídající zalphal 1 Ligand TaqMon sonda, ZG32 (SEKV.ID.Č.:92) byla syntetizována na PE Applied Biosystems. Sonda byla označena reportérovou fluorescenční barvou (6-karboxyfluoresceinem) (FAM) (PE Applie Biosystems) na

5’ konci a zhášecí fluorescenční barvou (6-karboxytetramethylrhodaminem) (TAMRA) (PE

Applie Biosystems) na 3' konci. Z důvodu testování integrity anebo kvality všech RNA vzorků, byly vzorky zkoumány na přítomnost rRNA pomocí primerů a sond objednaných od PE Applied Biosystems (kat. č. 4304483). Reportérova fluorescenční barva pro tuto sondu byla VÍC (PE Applied Biosystems). Určení přítomnosti rRNA pomáhalo v normalizaci výsledků pro zalphal I

Ligand.

RNA byla připravena podle instrukcí výrobce z pelet připravených podle příkladu 43A, pomocí kttu RNeasy MiniprepT^MKít (Qiagen, Valencia, CA). Kontrolní RNA byla připravena z přibližně 10 milionů BHK buněk exprimujících lidský zalphal 1 Ligand.

C. Primery a sondy pro kvantitativní RT-PCR pro expresí lidského zalphal 1 receptorů

K důkazu exprese lidského zalphal 1 receptorů byla provedena kvantitativní PCR v reálném čase podle příkladu 43B a příkladu 43D, pomocí buněk připravených postupem podle příkladu 43A, a pomocí sond specifických pro receptor zalphal 1. Dopředný primer ZC22 277 (SEKV. ID.Č.93) a zpětný primer, ZC22 276 (SEKV. ID. Č. 94) byly použity v 300 nM koncentraci a syntetizovaly 143 bp produkt. Odpovídající zalphal 1 Ligand Taq Man sonda, ZG3I (SEKV. ID. Č: 95) byla syntetizována a značena u PE Applied Biosystems. Pro přípravu kontrol pro standardizační křivky popsané v příkladu 43D byla použita RNA z BaF3 buněk exprimujících lidský zalphal 1 receptor.

-95 CZ 302921 B6

Kvantitativní RT PCR v reálném čase (Real-time quantitative RT-PCR)

Relativní hladiny RNA pro zalphal 1 Ligand byly určeny analýzou vzorku celkové RNA pomocí jednokrokové RT-PCR metody (PE Applied Biosystems).

Pro tvorbu standardní křivky byla užita RNA z BHK exprimujících lidských zalphal 1 Ligand. Standardní křivka sestávala ze série ředění od 2,5 do 2,5.10⁴ ng pro průzkum přítomnosti RNA a 25-0.0025 ng pro průzkum přítomnosti zalphal 1 Ligandu, každý bod se analyzoval třikrát. Vzorky byly v triplikátech testovány také na hladinu tran skriptů zalphal 1 Ligandu a na hladinu výskytu exogenní rRNA, jako endogenní kontroly. Každá jednokroková PCR reakce se skládala z 25 ng celkové RNA v pufru A (50mM KC1, lOmM Tris-HCl, barvy pro vnitřní standard ROX (PE Applied Biosystems)), daných primerů (50 nM pro rRNA vzorky, 300nM pro vzorky zalphal 1 Ligandu) a sondy (50nM pro rRNA, lOOmM pro zalphal 1 Ligand), 5,5mM MgCL, 300μΜ každého d-CTP, d-ATP d-GTP a 600μΜ d-UTP, reverzní transkriptázy (0,25 U/μΙ), AmplíTaq DNA polymerázy (25 U/μΙ) a Rnase Inhibitoru (U/μΙ) v celkovém objemu 25 μΐ.

Podmínky pro RT-PCR byly následující: počáteční krok RT při 48 °C po dobu 30 minut, krok aktivace AmpliTaq Gold 95 C po dobu 10 min, následuje 40 cyklů amplifikace po 15 s při 95 °C a 1 minutě při 60 °C. Relativní hladiny RNA zalphal 1 Ligandu byly určeny pomocí metody standardní křivky, popsané v uživatelském bilténu č. 2 (PE Biosystems; User Bulletin #2: ABI Prism 7700 Sequence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, December 11, 1997) pro užití měření rRNA, čímž se normalizuje měření hladin zalphal 1 Ligandu. V každém pokusu byly naměřeny hodnoty pro vzorky porovnání s hodnotami kalibrace. Kalibrační roztok byl připraven z RNA dobré kvality a takové hladiny exprese, o které se předpokládalo, že ji dosáhnou i vzorky, aby je bylo možno s kalibračním roztokem porovnat. Výsledky pokusů analyzující expresi zalphal 1 Ligandu a zalpha receptoru ve stimulovaných a nestimulovaných buňkách jsou popsány v příkladech 43A a 43E níže,

Exprese lidského zalphal 1 Receptoru a ligandu v CD4⁺, CDB⁺ a CD19⁺ buňkách

První pokus, za pomocí RT-PCR popsané výše, zahrnoval získání dat z exprese zalphal 1 receptoru v nestimulovaných a pomocí anti lidské-CD3 protilátky stimulovaných CD4⁺ a CD8⁺vzorků v časových intervalech 0 h (nestimulované, odpočívající buňky); a po 4 h, 15,5 h a 24 h, po stimulaci. Vzorky odpočívajících CD4⁺ byla vzaty jako kalibrátor a byla jim přirazena hodnota 1,00. V pokusu byl shledán přibližně čtyřnásobný vzestup exprese receptoru v nestimulovaných buňkách CD4 v době od 4 h do 24 h kultivace a osminásobný vzestup v téže časové periodě u anti-CD3 stimulovaných CD4⁺ buněk. CD8⁺ buňky vykázaly sedminásobný nárůst exprese receptoru pro zalphal 1, jehož vrchol byl po 4 h a postupně během času klesal. U antiCD3 stimulace, CD8⁺ buňky měly osminásobný konstantní nárůst exprese receptoru.

Tento první pokus s RT-PCR byl také použit pro získání dat exprese zalphal 1 Ligandu v těchto stejných anti-CD3 stimulovaných a nestimulovaných CD4⁺ a CD8⁺ vzorcích. Čtyři hodiny inkubovány anti-CD3 stimulovaná vzorek CD8⁺ byl zvolen jako kalibrátor a byla mu přiřazena hodnota 1,00. Výsledky ukazují, že nestimulované, buňky CD4⁺ a CD8⁺ neexistují zalphal 1 Ligand. Bylo pozorováno však průkazné zvýšení exprese v anti-CD3 stimulovaných CD4⁺buňkách po 4 h kultivaci, s přibližně třistanásobným zvýšením signálu pozorovaným za 15,5 h. Buňky CD8⁺ exprimovaly malé množství ligandu po anti-CD3 stimulaci, avšak to bylo způsobeno pravděpodobně kontinuací CD8⁺ populace malým množstvím CD4⁺ buněk.

Druhý pokus s RT-PCR byl dále použit pro získání dat z exprese zalphal 1 receptoru v buňkách stimulovaných pomocí anti-CD3; PMA+ Ionomycinu a v buňkách nestimulovaných CD4 and CD8⁺ v Časových úsecích 0 h, a 3,5 h, 16 h a 24 h po aktivaci. Odpočívající buňky CD8^ byly zvoleny jako kalibrátor a byla jim přiřazena hodnota 1,00. Výsledky ukazují, že nestimulované, buňky CD4⁺ a CD8⁺ neexprimují zalphal 1 receptor. Ve vzorcích buněk CD4⁺ stimulovaných

-96CZ 302921 B6

PMA + lonomycinem byla zjištěna přibližně trojnásobná hladina exprese po 3,5 h, 16 h a 24 h po stimulaci. Exprese v anti-CD3 aktivovaných CD4⁺ buňkách dosáhla desetinásobku hodnoty pozadí po 3,5 h po stimulaci, potom opět klesla na čtyřnásobek hodnoty pozadí po 16 h po stimulaci. CD8⁺ buňky vykázaly čtyřnásobek zvýšení exprese po 3,5 h po stimulaci PMA + lonomycinem, avšak po této době opět hladina exprese klesla. Stejně jako v prvním pokuse, anti-CD3 stimulované CD8 buňky znovu vykázaly osminásobné zvýšení hladiny exprese receptoru.

Stejné vzorky jako v druhém pokusu byly použity pro zjištění exprese zalphal 1 Ligandu. 24 h PMA + lonomycinem stimulované vzorky CD4* byly zvoleny jako kalibrátor a byla jim přiřazena hodnota 1,00. Výsledky opět neprokázaly žádnou expresi zalphal 1 Ligandu v nestimulovaných buňkách. Exprese ligandu v anti-CD3 aktivovaných CD4⁺ buňkách dosáhla třicet i násob ku hodnoty pozadí 3,5h po stimulaci, obdobně jak to bylo určeno v minulém pokusu po 4 h. Avšak, u buněk indukovaných PMA + lonomycinem byl zjištěn pětinásobek hladiny indukce po 3,5 h, potom opět hladina klesla. Buňky CD8⁺ exprimovaly malé množství ligandu, avšak to bylo způsobeno pravděpodobně kontaminací CD8+ populace malých množstvích CD4 buněk.

Poslední pokus, ve kterém, byla užita RT-PCR, měl pomoci expresi zalphal 1 receptoru v antiCD3- a anti-CD3/anti-CD28-stimulovaných a nestimulovaných CD4^ a CD8⁺ vzorcích buněk

Λ Ví n O l·» A Vi o 1 Λ ta nn cřirrti i 1 πγί

W 11 LX II_Ť -Γ 11,

Ý£ii«'ί'/Γ’Ιη ÁGrAvvoli ínton/o ΙργΊί Pii/lt/

IVJI1J Vil VUJVT JV1I llll^l VJIJ c u s 0Vj/ c Fi také na expresi receptoru zkoumány buňky CD 19 aktivované PMA+ lonomycinem. Odpočívající buňky CD4^T byly zvoleny jako kalibrátor a byla jim přiřazena hodnota 1,00. 2 h anti-CD3 stimulované CD4⁺ buňky vykázaly čtyřnásobek indukce receptoru ve srovnání s deseti násobkem indukce viditelným po 3,5 h v předchozím pokusu. Kombinace stimulace anti-CD3 a anti-CD28 zvýšila expresi zalphal 1 receptoru osmkrát ve srovnání s předchozím pozadím. 16 h antiCD3/antiCD28 stimulované CD8⁺ buňky vykázaly velmi nízkou hladinu exprese zalphal 1 receptoru, tak jak bylo prokázáno již výše v CD8⁺ buňkách. CD19^T buňky stimulované PMA + lonomycinem vykázaly nejvyšší expresi zalphal 1 receptoru (desetinásobek) po dvou hodinách, ale po 16 h exprese klesla na původní hodnotu pozorovanou u ostatních buněk.

Vzorky z posledního pokusu byly použity také ke zkoumání hladiny exprese zalphal 1 Ligandu pomocí RT-PCR. 16 h anti—CD3/anti—CD28 stimulovaný vzorek CD8⁺ buněk bul zvolen za kalibrátor a byla mu přiřazena hodnota 1,00. Výsledky ukazují, že vzorky CD4⁺ buněk anti-CD3 stimulovaných po dobu 2 h vykázaly dvojnásobek hodnoty exprese zalphal 1 Ligandu a u stimulace anti-CD3 + anti-CD28, pětinásobek indukce.Tyto stimulace vyvolaly indukci exprese ligandu v průběhu neomezeném časem, 16 h stimulované CD4⁺ buňky vykázaly sedmdesátinásobné zvýšení exprese Ligandu oproti hodnotě pozadí. Očekával se jistý stupeň variability mezi různými odběry krve (to znamená, že byl uskutečněn odběr mnoha vzorků v různých časech od stejného pacienta a mezi různými pacienty). Proto byla data analyzována vždy v jedné studii, či v jednom vzorku krve a závěry výsledků ze tří uvedených pokusů byly vypracovány na základě porovnání jednotlivých výsledků. Výsledek všech tri uvedených pokusů s RT-PCR v reálném čase je, že ze všech typů testovaných buněk, CD 19⁺ B buňky aktivované PMA + lonomycinem vykazují nejvyšší hladinu exprese RNA pro zalphal 1 reeeptor. Také buňky CD4^T a CD8⁺ mohou být stimulovány k expresi receptoru, avšak na nižší úrovni, než buňky B. Zalphal 1 Ligand byl exprimován téměř výlučně ve stimulovaných CD4⁺ T buňkách (ale nikoli CD8⁺ T buňkách nebo CDI9* B buňkách). Stimulace indukce pomocí PMA + Ionomycin vyvolala při tomto stanovení dobrou odezvu při indukci signálu zalphal 1 Ligandu, průkazně nejvyšší signál byl získán u CD4⁺T buněk stimulovaných anti-CD3 mAb nebo v kombinaci anti-A2D3 a anti-CD28 mAbs, to jsou podmínky, které lépe napodobují setkání s antigenem in vivo.

-97CZ 302921 B6

Příklad 44: Proliferace B-buněk stimulovaných anti-CD40 nebo anti-lgM závislá na zalphal 1 Ligandu.

A. Purifikace lidských B buněk s

Zkumavka obsahující 1 x 10* zmrzlých monocytů získaných z lidské periferní krve (PBMC) byla rychle roztavena v 37 °C teplé vodní lázni a buňky byly resuspendovány ve 25 ml B buněčného média (RPMI Médium 1640 (JRH Biosciences. l.cnexa, KS), 10% tepelně inaktivované fetální hovězí sérum, 5% L-glutamin, 5%Pem/Strep) (Gibco BRL)) v 50 ml falkonce (Falcon VWR, io Seattle, WA). Buňky byly testovány na životnost pomocí Trypanové modři (Gibci BRL). Deset mililitrů Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology lne., Piscataway, NJ) bylo podvrstveno pod buněčnou suspenzi a centrifugováno po dobu 30 minut pri 1800 rpm a potom se centrifuga nechala doběhnout bez brzdění. Vrstva na rozhraní byla potom odsáta a přemístěna do čerstvé 50ml falkonky a obsah byl naředěn na objem 40 ml PBS a opět se buňky centrifugovály ts 10 minut pri 1200 rpm bez brzdění. Poté se buňky znovu testovaly na životaschopnost Trypanovou modří. Jiný postup vychází z čerstvě odebraných vzorků krve, ty byly naředěny 1:1 PBS (Gibco BRL) a opět navrstveny na Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia), centrifugovány a promyty, tak jako to je popsáno výše. Izolované buňky, ať již z čerstvého, či mraženého zdroje dávaly ekvivalentní výsledky.

B buňky byly purifikovány podle instrukcí výrobce z Ficolem dotovaných buněk periferní krve normálního lidského dárce (viz výše) pomocí anti-CD19 magnetických částic (Miltenyi Biotec; Auburn, CA). Čistota vzniklých buněk byla určena pomocí průtokové cytometrické analýzy santi-CD22 FITC Ab (Pharmingen, San Diego, CA). Připravené B buňky měly čistotu obvykle vyšší než 90 %.

B. Purifikace myších B buněk

Suspenze myších solenocytů byla připravena vymytím buněk ze sleziny dospělých myší C57B1/6

3o (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) pomocí dlouhé jehly do B buněčného média. RBC byly odstraněny pomocí hypotonické lýzy. CD43 pozitivní buňky byly odstraněny podle instrukcí výrobce pomocí CD43 magnetických částic (Miltenyi Biotec). Čistota vzniklých buněk byla určena pomocí průtokové cytometrické analýzy s anti-CD45R FITC Ab (Pharmingen, San Diego, CA). Připravené B buňky měly čistotu obvykle vyšší než 90 %.

C. Proliferace anti-CD40-stimulovaných B-buněk v přítomnosti lidského nebo myšího zalphal I Ligandu

B buňky, ať již lidského, nebo myšího původu byly resuspendovány v konečné koncentraci l x

10⁶ buněk/ml v B buněčném médiu a buňky byly vysety po 100 μΙ/jamka do 96 jamkové desky s dnem ve tvaru písmene U (Falcon, VWR) obsahujícími různé stimulační podmínky, a to ta, že konečný objem vzorkuje 200 μΙ/jamka. Proti anti-D40 stimulaci lidských kultur byl užit 1 μg/ml anti lidské CD40 (Genzyme, Cambridge, MA) a u myších kultur bylo přidáno 1 pg/ml antimyšího CD40 (Serotec, UK). Lidský nebo myší zalphal 1 Ligand byl přidán v ředěních od

1 pg/ml až 100 ng/ml. Specifita vlivu zalphal l Ligandu byla ověřena inhibicí zalphal 1 Ligandu s mg/ml rozpustného lidského zalpha CEE (příklad 10A). Všechny měření byla provedena v triplikátech. Buňky byly inkubovány pri 37 °C v inkubátoru se řízeno vlhkostí po dobu 120 hodin (lidské) nebo 72 hodin (myší). Šestnáct hodin před sklizením buněk bylo přidáno do všech jamek 1 pCi ³H-thymidinu (Amersham; Pscataway, NJ), což bylo provedeno kvůli zjištění proliferace Β-bunek. Buňky byly sklizeny do 96 jamkové filtrační desky (UniFilter GF/C, Parkared, Meriden, CT) podle instrukcí výrobce pomocí přístroje ke sklízení buněk (Packard) a byly shromážděny k dalšímu užití. Desky byly sušeny pří 55 °C po dobu 20-30 minut a potom byla dna jamek přelepena neprůhlednou páskou. Do každé jamky se přidalo 0,25 ml scintilační kapaliny (Microscint-O, Parkard) a deska byla analyzována na scintilačním počítači TopCoun

Microplate Scintillation Counter (Packard).

-98CZ 302921 B6

Inkubace se zalphal 1 Ligandem v koncentracích 3 ng/ml nebo vyšších zvyšovala proliferaci indukovanou rozpustnou anit-CD40 v závislosti na dávce, a to jak u lidských, tak myších B buněk více než třicetkrách. Myší a lidské B buňky rovnocenně odpovídaly na stimulaci svým zalphal 1 Ligandem. U obou druhů byla stimulace specifická a zalphal 1 Ligand. Stimulaci bylo možno zabránit přítomností rozpustného receptoru pro zalphal 1 v kultuře.

D. Proliferace anti-IgM-stimulovaných B-buněk v přítomnosti lidského nebo myšího zalphal 1 Ligandu.

B buňky, ať již lidského, nebo myšího původu, jak bylo popsáno výše (příklad 44C) byly vysety jak je popsáno v příkladu 44B. Proti anti-IgM stimulaci lidských kultur byl užit potah 10 mg/ml F(ab')₂ anti-lidských IgM ABs (Southern Biotech Associates, birmíngham, Alabama), Inkubace byla provedena přes noc a deska byla promyta před použitím sterilním médiem. Kultury byly obohaceny 0 až 10 ng/ml hu rIL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN), Pro stimulací myších buněk byl do kultur přidán rozpustný anti-IgM (Biosource, Camarillo, CA) v koncentraci 10 mg/ml. Do každé zmíněné kultivace s různými koncentracemi anti-IgM/IL-4 byl přidán lidský nebo myší zalphal 1 Ligand v ředěních od 1 pg/ml až 100 ng/ml, tak jak bylo popsáno v/ťStío ir1iT7ii -το 1 nli o 1 1 Ϊ innnJ inUiUiAi τλΙπΙαλ! 1 1 iťvoMj-ln r> lár-lo tjjv* tu tu i i^iguiiu vjiuvtvivuu juniuivi zAupnm r o i m nud^- kým receptorem, jak bylo popsáno v příkladu 44C. Všechny měření byla provedena v triplikátech. Buňky byly inkubovány, označeny ³H-thymÍdÍnem, sklizeny a analyzovány tak, jak je to popsáno v příkladu 44C.

Inkubace se zalphal 1 Ligandem v koncentracích 0,3 ng/ml nebo vyšších ínhibovala proliferace indukovanou nerozpustným anti-IgM (myší) nebo anti-IgM a IL-4 (lidským), a to v závislosti na koncentraci užitých látek. U obou druhů byla stimulace specifická na zalphal 1 Ligand. Stimulaci bylo možno zabránit přítomností rozpustného receptoru pro zalphal 1 v kultuře.

Příklad 45: Exprese lidského zalphal 1 rozpustného receptoru v E. coli

Konstrukce expresního vektoru pCZR225, který exprimuje huzalphal 1/MBP-6H fúzní polypeptid

Expresní plazmíd obsahující polynukleotid kódující lidský zalphal 1 rozpustný receptor fúzovaný na C-konci k maltóza vaznému proteinu (MBP) byl konstruován pomocí homologní rekombínace. Fragment lidské zalphal 1 cDNA (SEDV. ID. Č. 7) byl izolován pomocí PCR. Polynukleotidová sekvence fúzního polypeptidu pro MBP-zalphall rozpustný receptor je ukázán v SEKV. ID. Č. 96. Pro produkcí lidského zalphal 1 fragmentu v PCR reakci byly použity následující primeiy: (1) Primer CZ20187 (SEKV. ID. Č. 98), obsahující 40 bp hraniční sekvence vektoru a 25 bp odpovídajících aminokonci lidského zalphal 1 a (2) primer ZC20185 (SEKV. ID. Č. 99), obsahující 40 bp ze 3' konce odpovídajících hraniční sekvenci vektoru a 25 bp odpovídajících karboxy konci lidského zalphal 1. Podmínky PCR rekce byly následující: 25 cyklů pří 94 °C po s, 50 °C po 30 s a 72 °C po 1 min; následoval uchovávají cyklus při 4 °C, běh v duplikátech. Dva μΐ ze 100 μΐ PCR reakce byly analyzovány na 1,0% agarózovém gelu v 1 x TBE pufru a byl vizualizován očekávaný produkt o velikosti přibližně 660 bp. Zbylých 90 μΐ PCR reakční směsi bylo spojeno s druhou zkumavkou PCR, precipitováno 400 μΐ absolutního ethanolu. Precipitovaná DNA byla vložena rekombinací do Smál štěpeného vektoru pTAP98 (příklad 31), čímž vznikl produkt kódující MBP-zalphal 1 fúzní protein. Klony byly transformovány, identifikovány a napěstovány tak, jak je popsáno v příkladu 31. Pozitivní klony byly označeny pCZR225 a byla provedena sekvenční analýza. Polynukleotidová sekvence pro fúzní polypeptid MBP-zalphal 1 rozpustný receptoru je ukázán v SEKV. ID. Č. 96 a odpovídající polypeptidová sekvence je ukázána v SEKV. ID. C. 97. Pozitivní klony byly napěstovány v E. co//jak je popsáno v příkladu pro protein, purifikaci huzalphal 1/MBP-6H fúzního proteinu (příklad 46, dále).

-99CZ 302921 B6

Příklad 46: Purifikace huzalphal 1/MBP-6H rozpustného receptoru fermentací z £. coli

Pokud nebylo uvedeno jinak, všechny reakce probíhaly při 4 °C. Po purifikací huzalphal 1/MBP 6H polypeptidů rozpustného receptoru z buněk E. coli obsahujících pCZR225 konstrukcí a exprimujících huzalphal 1/MBP-6H rozpustný receptor (příklad 45) byly buňky pěstovány v SuperBroth II médiu (12g/kasein, 24 g/l kvasniční extrakt, 11,4 g/l hydrogenfosforečnanu draselného, 1,7 g/l fosforečnanu draselného; Becton Dickenson, Cockeysville, MD) a potom byly buňky zmrazený v 0,5% glycerolu. Dvacet gramů zmrzlých buněk v SuperBroth II + Glycerol bylo použito pro purifikací proteinu. Buňky se nechaly roztát, před vlastní lýzou se naredily se io v poměru 1:10 v roztoku inhibitorů proteáz (Extrakční pufr) a po lýze se uvolnil rozpustný protein huzalphal 1/MBP-6H receptoru.

Naředěné buňky obsahovaly ve finální koncentraci 20 mM Trus (JT Bajerm Philipsburg, NJ), 100 mM chlorid sodný (NaCl, Mallinkrodt, Paris, KY), 0,5 mM fenylmethylsulfonylfluorod i? (PMSF, Sigmě Chemical Co., St. Louis, MO), 2 pg/ml Leupeptinu (Fluka; Switzerland) a2gg/ml Aprotininu (Sigma). Pomocí French Press System na rozrušení buněk (Constant

Systems Ltd., Warwick, UK) byly podmínky pro lýzu buněk následující: teplota od -7 do -10 °C a 30K PS. Naředěné lyžované buňky byly zkontrolovány při absorbanci 600 nm, totéž bylo provedeno po homogenizaci pomocí Fresh Press. Lyžované buňky byly centrifugovány při 18 000 po dobu 45 min, čímž se odstranily zbytky buněk. Supematant byl použit pro čištění proteinu. Celkové koncentrace proteinu v supematantu byly určeny pomocí BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL), podle instrukcí výrobce.

ml sloupec Talon Metal Affinity pryskyřice (Clontec, Palo Alto, CA), připravené tak, jak je popsáno níže) bylo nalito do skleněného sloupce Bio-Rad, 2,5cm (průměr) x lOcm (výška). Sloupec se nechal ustat a byl ekvilibrován samospádem pomocí 10 objemů sloupce (10 CV). Talon ekvilibračním pufrem (20 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8,0). Supematant se smíchal s dávkou Talon metal affinity pryskyřice ze sloupce a nechal se na kývacím nástavci míchat přes noc. Pryskyřice se nalila zpět do sloupce a sloupec byl promyt 10 CV Talon ekvilibračního pufru samospádem, potom nastalo vymývání pomocí 140 ml elučního pufru (Talon ekvilibrační pufr + 200mM Imidazol-Fluka Chemical). Po užití byl sloupec vyčištěn 5 CV 20mM 2-(N-morfolino)ethansírové kyseliny pH 5,0 (MES, Sigma), 5 CV destilované vody, potom byl sloupec uschováván v roztoku 20 % ethanol/0,1% azid sodný. Během celé chromatografie byly sbírány čtrnáctimililitrové frakce, které byly analyzovány při absorbanci 280 a 320 nm a pomocí BCA protein assay. Byly analyzovány i frakce, které protekly Eluované frakce požadovaného proteinu byly sbírány a naneseny ihned na sloupec amylózového nosiče (New England Bíolabs, Beverly, MA).

K získání čistého huzalphal 1/MBP-6H polypeptidů, byly frakce poafinitní eluci podrobeny chromatografii na amylózovém nosiči (22 ml s) při pH 7,4. Byl nalit sloupec Bio-Rad (2,5 cm průměr x 10 cm výška), ekvilibrován 10 CV amylózového ekvilibračního pufru -20mM Tris (JT Baker), lOOmM NaCl (Millinkrodt), lmM PMSF (Sigma), lOmM betamerkaptoethanol (BMe, ICN Biomedicals INC. Aurora, OH) pH 7,4. Vzorky byly zapuštěny bez použití tlaku, průtokovou rychlostí 0,5 ml/min. Sloupec byl promyt 10 CV amylózového ekvilibračního pufru, potom promytí pokračovalo asi 2 CV amylózového ekvilibračního pufru + lOmM maltóza (Fluka

Biochemical, Švýcarsko), opět bez použití pumpy. Během celé chromatografie byly sbírány 5ml frakce a byly analyzovány při absorbanci 280 a 320 nm Amylózový sloupec byl regenerován pomocí 1 CV destilované vody, 5 CV 0,1% (w/v SDS (Sigma), 5 CV destilované vody a 5 CV amylózového ekvilibračního pufru.

Žádané frakce byly shromážděny a dialyzovány v Slide-A-Lyzeru (Pierece) proti 4x41 PBS pH 7,4 (Sigma), čímž se odstranily kontaminace o nízké molekulové hmotnosti, došlo k výměně pufru a odsolení frakcí. Po výměnách PBS byl shromážděn materiál reprezentující purifikovaný huzalphal 1/MBP-6H polypeptid. Pufirikovaný huzalphal 1/MBP-6H polypeptid byl analyzován pomocí SDS-PAGE s barvením Coomassie a potom Western blotem s anti—králičí protilátkou konjugovanou s HRP (Rockland, Gilbertsville, PA). Koncentrace huzalphal 1/MBP—6H poly- 100CZ 302921 B6 peptidu určená BCA analýzou byla 1,92 mg/ml. Purifikovaný polypeptid huzalphal 1/MBP-6H byl použit pro injekce do králíků a zaslán do R & R, Research and Development (Stanwood, WA), kde byla připravena antiséra. Králíci byli imunizováni za účelem produkce anti anti-huzalphal 1/MBP-6H séra (příklad 47, níže).

Příklad 47: Polyklonální protilátky proti zalphal 1 receptorů

Polyklonální protilátky byly připraveny imunizací dvou samic novozélandských bílých králíků pomocí purifikovaného huzalphal 1/MBP-6H polypeptidů (příklad 46), nebo purifikovaného rekombinantního zalphal 1 CEE rozpustného receptorů (příklad 10A).

Odpovídající polyklonální protilátky byly označeny jako králičí anti-huzalphal 1/MBP-6H A králičí anti-buzalphjal 1-CEE-BHK. Každý králík dostal počáteční intraperitoneální (IP) injekci 200 mg pufíkovaného proteinu v kompletním Freundově adjuvans (Pierce, Rockford, IL), potom následovaly další dávky IP injekcí po 100 mg purifikovaného proteinu v nekompletním Freundově adjuvans každé tri týdny. Sedm až deset dní po třetí injekci byla zvířatům odebrána krev a shromážděno sérum. Králíkům byla dána injekce každé tri týdny a vždy byla odebrána krev.

Ληήΐηί I Aibi r tq rům τ i c IzA ni r #ιΐϊ«»+»ιί ο+Λ/ττΌ'Ρί í rin t kij^wiiivn.v λι víiuuu jji νζιι uj Jvi u. ijr mmiLiii vmuuiutvgj uin nu sloupci CNBr-Sehparose 4B-protein column (Pharmacia LKB), který byl připraven pomocí 10 mg purifikovaného huzalphal 1/MBP-6H polypeptidů (příklad 32) na gram CNBr-SEPHARÓZY, následovala dialýza 20 x v PBS, přes noc. Zalphal 1-specifické protilátky byly charakterizovány ELISA testem a určen titr pomocí 1 mg/ml daného proteinového antigenů, jako substrátu protilátek. Nejnižší detekční limit (LLD) králičí anti-huzalphal l/MBP-6h afinitně čištěné protilátky bylo ředění 500 pg/ml LLD králičího anti-huzalphal 1-CEE—BHK afinitně čištěné protilátky bylo ředění 50 pg/ml.

Příklad 48: Rozložení zalphal 1 receptorů

K výzkumu rozložení zalphal 1 receptorů v různých buněčných typech byly připraveny jak králičí polyklonální, tak myší monoklonální protilátky (mAbs), které byly namířeny proti lidskému receptorů (příklad 35 a příklad 47). Tyto protilátky byly konjugovány s biotinem a byly používány v průtokové cytometrii. Také byly použity polyklonální protilátky o relativně nízké afinitě k označení buněčných linií: IL-3 závislé myší pre-B buněčné linie divokého typu BaF3 buněk (Palacios a Steinmetz, již citováno; Methey-Prevot a další, již citováno); BaF3 buňky transfekované lidským zalphal 1 (příklad 4); lidská buněčná linie Burkittova lymfomu Rají (ATCC č. CCl86), Ramos (ATCC č. CRL-1596), RPMI 8226 (ATCC č. CCL-155) a Daudi (ATCC č. CCL213); lidská T buněčná leukemická linie Jurkat (ATCC Č. TIB-152); lidské myelomonocytické leukemické buněčné linie Thp-1 (ATCC č. TlB-202) a UT937 (ATCC č. CRL-1593.2); lidské pro-myelomonocytické buňky HILT60 (ATCC č. CCL-240); myší B buněčná lymfomatická linie A20 (ATCC č. TIB-208) a myší thymoma buněčná linie EL4 25 (ATCC č. TIB-39).

Buňky byly sklizeny, promyty jednou FACS promývacím pufrem se sérem (WBS). WBS sestával z Hankova vyváženého solného roztoku (GíbcoRRL) + lOmM HEPES (GibroBRL) + 1% BSA (Sigma) + 10% normální kozí sérum (Gimini Bioproducts, Woodland, CA) + 10% normální králičí sérum (Sigma). Promývací pufr (WB) byl stejný s WBS mimo toho, že neobsahoval sérum. Po promytí byly buňky promyty WB a resuspendovány ve WB obsahujícím kozí antikráličí-FITC (BioSource, International), inkubovány dalších 20 min na ledu, potom promyty a resuspendovány ve 400 μΐ WB, po té byly buňky analyzovány na FACSCalibur průtokovém cytometru (Becton Dickinson). Kontrolní vzorky byly označeny jen pomocí sekundární kozíantikráličí-FITC protilátky.

Pozitivní barvení bylo definováno jako změna ve výše popsaném značení ve srovnání se vzorkem barveným pouze sekundární protilátkou. Ačkoli polyklonální protilátky měly nízkou afinitu,

- 101 CZ 302921 B6 přesto byla průkazně prokázána exprese zalphal 1 v BaF3/zalphal 1 transfekovaných buňkách, ve všech buňkách lidského Burkittova lymfomu (Ráji, Ramos, Daudi a RPMI 8226), vJurkat T buňkách. Zbývající (nedefinované) HL 10 60 buňky nevázaly anti—zalphall protilátky, ale byl detekován pozitivní signál v buněčné linii HL-60 buněk aktivovaných po dobu 24 hodin pomocí PMA (Calbiochem, La Jolla, CA), což indukovalo diferenciaci buněk HLóé v monocytickou buněčnou linii. Pozitivní signál byl také zaznamenán u buněk UT937 a Thp-1, ačkoli tento signál mohl být způsoben nespecifickou vazbou. Póly klonální protilátky slabě křížově reagovaly s myší B buněčnou linií A20, ale nebylo pozorována žádná reakce s EL4 myším thy moment.

Čtyři anti-zalphal 1 monoklonální protilátky (příklad 35) byly konjugovány s biotinem a byly použity k rozpoznání buněk popsaných výše, které exprimovaly zalphall receptor (BaF3, BaF3/zalphal 1, Ráji, Jurkat a zbývajících HL—60). Buňky byly sklizeny, promyty a resuspendovány ve 100 μΐ WB obsahujícího 15 μg/ml každé ze čtyř biotinylových mAb. Buňky byly inkubovány s mAb po dobu 20 min na ledu, promyty 1,5 ml WB a peletovány centrifugací. Supematant byl odstraněn odsátím a pelety byly resuspendovány ve 100 μΐ CyChrome konjugovaného streptavidinu (CyC-Sa; PharmMingen), následovala inkubace na ledu po dobu dalších 20 min a poté promytí a peletace tak, jak bylo popsáno výše. Kontrolní zkumavky obsahovaly buňky barvené pouze CyCSa. Pelety byly resuspendovány ve 400 μΐ WB a byla provedena průtoková cytometrie tak, jak bylo popsáno výše. Pozitivní značení bylo definováno jako signál převyšující hodnotu pozadí, která byla definována jako hodnota barvení pouze se samotným CyC-SA. Pomocí BaF3/zalphal 1 transfektantu jako kontroly bylo možno určit reaktivitu čtyř mAb a to v závislosti na jejich průměrech intenzity fluorescence (MFI), které přímo odrážely afinitu protilátky a/nebo rozsah biotinylace mAb. mAbs byly podle tohoto třídění seřazeny následně od nejnižší k nejvyšší MFI: 249.28.2.1.2.2, 247.10.2.15.4.6, 249.19.2.2.3.5 a 249.15.2.Č.2.7. Ráji buňky byly také pozitivně značeny pomocí zalphal 1 monoklonálních protilátek. Jurkat buňky se také pozitivně značily pomocí zalphall monoklonálních protilátek, ale méně intenzivně, než B buňky (Ráji). To znamená, že se zalphal 1 receptor exprimoval v obou těchto buněčných liniích B a T buněk. U neaktivovaných buněk HL60 byl zjištěn pro všechny mAB slabý signál. Tento signál si vysvětlujeme nikoli jako důkaz exprese zalphall v HL-60 buňkách, ale jako nespecifickou vazbu myších protilátek k lidským buňkám, pravděpodobně přes Fc-receptory,

Příklad 49: Lidský zalphall Ligand ovlivňuje růst B-buněk a toxická fúze zalphall Ligandu a saporinu

Vlivy lidského zalphal 1 Ligandu byly testovány na následujících lidských B-buněčných liniích: a lidských buněčných liniích Burkittova lymfomu Ráji (ATCC ě. CCL86), a Ramos (ATCC č. CRL-1596); lidských EBV B-buňkách, buněčné linie lymfomu RPMI 1788 (ATCC č. CR1-156); lidské myeloma/plasmacytoma buněčné linie e 1M-9 (ATCC ě. CRL 159); a lidské EBV transformované B-buněěné linii DAKIKI (ATCC č. TIB206), a HS Sultán buňkách (ATCC č. CRL-1484). Po přibližně 2 až 5 dnech ošetření kultury zalphal I Ligandem byly nalezeny změny v expresi povrchových markérů u IM-9, Ráji, Ramos a RPMI 1788 buněčných liniích, což prokázalo reakci těchto buněk na působení zalphal 1 Ligandu. Lidské B-buněčné linie ošetřené zalphal 1 Ligandem rostly po vysetí na plotny mnohem pomaleji, než linie neošetřené. Tyto buňky vykázaly také zvýšenou expresi FAS ligandu, což bylo prokázáno pomocí průtokové cytometrie (příklad 49A). Tyto výsledky naznačují, že by zalphall Ligand mohl kontrolovat některé typy B-buněČných neoplasem, a to ovlivněním jejich diferenciace vedoucí k nižší proliferaci a vyšší cytlivosti k FAS ligandu. Kromě toho zalphal 1 receptor je exprimován na povrchu některých těchto buněčných linií (viz příklad 48). Z tohoto zjištění plyne, že konjugáty zalphal 1 Ligandu a lidského zalphal 1 Ligandu s imunotoxinem saporinem (příklad 49B, níže) nebo další fúzní produkty zalphall Ligand-toxin, by mohly být terapeuticky využity pri léčení B-buněčných leukémií a lymfomů.

-102CZ 302921 B6

Vliv lidského zalphal 1 Ligandu na B-buněčné linie

IM-9 byly vysety v hustotě přibližně 50 OOObuněk na ml +/- 50 pg/ml purifikovaného lidského zalphal 1 Ligandu (příklad 29), Po třech dnech růstu se buňky sklidily, promyly, spočítaly a byly znovu vysety v hustotě asi 25 000 buněk/ml do 96 jamkových desek, kde v jamkách bylo 0; 0,033; 0,1 nebo 0,33 pg/ml anti-Fas protilátky (R&D System, Minneapolís). Po dvou dnech byla proměřena fluorescence v testu s Alamarskou modří (příklad 2B), čímž se hodnotila proliferace buněk. Zalphal 1 Ligand-ošetřené buňky IM-9 narostly pouze do hustoty dosahující 27 % ve srovnání s buňkami bez přidání anti-FAS protilátky. V koncentraci 0,33 pg/ml anti-FAS protilátky byly buňky ošetřené zalphal 1 Ligandem inhibovány ještě o dalších 52%, zatímco neošetřené buňky byly inhibovány pouze ze 30 %. Celková inhibice růstu buněk ošetřených oběma, tedy jak zalphal l Ligandem, tak s 0,33 pg/ml anti-FAS protilátkou byla 86%.

Byly-li buňky IM-9 po dobu tří dnů pěstovány s a bez přítomnosti zalphal I Ligandu a potom vysety v koncentraci 100 buněk na jamku a ponechány růst v přítomnosti Či nepřítomnosti anti-FAS protilátky po dobu 6 dnů, byl růst neošetřených buněk sledovaný pomocí testu s Alamarskou modří (příklad 2B) inhibován pouze z 25 % v přítomnosti protilátky anti-FAS, zatímco růst buněk ošetřených zalphal 1 Ligandem byl inhibován z 95 % ve srovnání s růstem učošeíičilých buněk při iíuiovc koncentraci anti—TAS protilátky.

Vliv imunotoxinu lidského zalphal 1 Ligand—saporinu na B-buněčné linie

Konstrukce a purifikace konjugátu lidského zalphal 1 Ligandu a imunotoxinu saporinu (zalphal IL-sap) je popsaná v příkladu 50. Lidský zalpha 11 L-sal byl mnohokrát účinnější, než saporí n sám, v inhibici růstu buněk. By ty-li buňky znovu vysety po inkubaci trvající tři až Čtyři dny s lidským zalphal IL-sap, rostly velmi špatně. IM-9, Ramos a K562 (ATCC Č. CCL-243) buňky byty vysety v hustotě 2500 buněk /jamka do 96-jakové desky s nulovou nebo 250 ng/ml koncentrací lidského zalphal IL-sap konjugátu, nebo 0až250ng/ml koncentrací saporinu (Stirpe a další, Biotechnology 10:405-412, 1992) jako kontrolou. Desky byly inkubovány po čtyři dny a potom byl proveden test s Alamarskou modří k určení proliferace (příklad 5B). V maximální koncentraci lidského zalphal 1-sap konjugátu, růst IM-9 buněk a RAMOS buněk byl inhibován z 79 % a 65 %. K562 buňky, které byly vyhodnoceny jako buňky s nízkou nebo žádnou schopností exprese zalphal 1 receptoru, nebyly působením zalphal 1-sap vůbec ovlivněny, což dokazuje specificitu vlivu konjugátu.

IM-9 buňky byly vysety v hustotě 50000 buněk/jamku do 6 jamkových desek s nulovou a 50 ng/ml koncentrací lidského zalphal IL-sap konjugátu. Po třech dnech se buňky sklidily a přepočítaly, poté se znovu vysely v hustotách od 100 do 0,8 buňky na jamku v dvojnásobném sériovém ředění, 12 jamek buněčného ředění bylo ponecháno bez lidského zalphal 1-Ligandsaporin ímmunotoxinu. Po šesti dnech byly spočítány jamky v každém ředění, kde byl prokázán růst pomocí testu proliferace s Alamarskou modří (příklad 2B). Po určení počtu buněk pomocí testu s Alamarskou modří (příklad 2B), po šesti dnech růstu kontrolních buněk, byly i tyto buňky vysety v koncentracích okolo 12,2 a 6,25 buněk na jamku, čímž se získal ekvivalent pro buňky rostoucí v médiu se zalphal 1-sap, vyseté v hustotě 100 až 50 buněk/jamka. Růst buněk IM-9, které přežily, byl výrazně oslaben i po vyjmutí a novém vysetí bez zalphal 1-sap ímmunotoxinu. Omezená distribuce lidského zalphal 1 receptoru (příklad 48) a specifíta působení zalphal 1-sap k buněčným liniím exprimujícím receptor podává důkaz o tom, že konjugát by byl tolerován in vivo.

C. Vliv imunotoxinu lidského zalphal 1 Ligand—saporinu na životaschopnost B-buněČné linie

HS Sultán buňky (ATCC Č. CRL-1484) byly vysety v hustotě okolo 40 000 buněk na jamku do 12 jamkových desek a byly kultivovány po dobu pěti dnů, buď s přídavkem, či bez přídavku cytokinů, nebo 40 ng/ml purifikovaného lidského zalphal 1 Ligandu (příklad 29) nebo 25 ng/ml lidského zalphal IL-sap konjugátu (příklad 50, níže) nebo s 20 ng/ml IFN-alpha (RDI) nebo

- 103 CZ 302921 B6 s zalphal 1 Ligandem a IFN-alpha. Zalphal 1 Ligand inhiboval růst Hs Sultán buněk na 63 %. IFN-alpha inhiboval růst na 38 %. Zalphal 11 ligand plus IFN-alpha inhiboval růst ze 78 %, což dokazuje, že inhibiční vliv na růst buněk se pro lidský zalphal 1 Ligand a IFN-alpha sčítá. Lidský zalphal 1 L-sap inhiboval růst buněk HS Sultán z 92 %.

Výše uvedené výsledky podporují možné užití zalphal 1 Ligandu nebo lidského zalphal l-sap pro léčení zhoubných nádorů, nebo při léčbě dalších nemocí závislých na expresí zalphal 1 receptorů, zvláště potom majících původ u B-buněk. Kombinace zalphal 1 Ligandu s IFN-alpha je zvláště výhodná pro své sčítající se vlivy pri inhibici HS Sultán buněk. Také u některých dalších ío lymfatických zhoubných nádorů a nemocí dochází k expresi zalphal 1 receptorů, tak je tomu například u aktivovaných T-buněk, které také exprimují receptorovou mRNA (příklad 48).

Některé tyto nemoci by také mohly být léčeny pomocí terapie se zalphal 1 Ligandem nebo zalphal 1 Ligand-toxínem.

D. FAS (CD95) exprese v lidských B-buněčných liniích je zvýšena pomocí stimulace lidských zalphal 1 Ligandem.

Lidské B-buněčné linie HS Sultán (ATCC č. CRL-1484), IM-9 (ATCC č. CRL159), RPMI 8226 (ATCC č. CCL-155), RAMOS (ATCC č. CRL-1596), DAKIKI (ATCC č. TIB-206) a RPMI 1788 (ATCC č. RCL-156), byly všechny kultivovány za přítomnosti a nepřítomnosti purifíkovaného lidského zalphal 1 Ligandu (příklad 29) v koncentracích 10 až 50 ng/ml po dobu 2 až 8 dnů. Buňky byly potom obarveny anti-CD95 PE-konjugovanou protilátkou (PharMingen, San Diego, CA), podle instrukcí výrobce. Buňky byly poté analyzovány na FACScalíbur (Beeton Dickinson, San Jose, CA). Ve všech buněčných liniích byla po působení lidského zalphal 1

Ligandu zvýšená hladina barvení pomocí anti-CD95 (FAS nebo APO-1), v některých případech více než dvakrát,

E. FAS (CD95) exprese v primárních myších slezínných B-buňkách se zvýšila stimulací pomocí lidského zalphal 1 Ligandu.

Primární myší splenocyty byly získány nakrájením sleziny z 8 až 12 týdnů starých myší C57BL6. Erytrocyty byly lyžovány propláchnutím vodou po dobu 5 a s potom pomocí molekulového filtru o velikosti pórů 70 mikronů. Zbývající splenocyty byly promyty a vysety v RPMÍ (JRH Btoscience) plus 10% HIA-FBS (Hyclone, Logan, UT). Interlekin 2 (IL-2) (R a D Systems)35 sabez lidského zalphal 1 Ligandu, jak je popsáno výše. Buňky byly inkubovány pri 37 °C v atmosféře 5% CO₂ po dobu 5 dnů. Splenocyty byly sklizeny a obarveny konjugovanou protilátkou anti~CD95 PE (PharmMingen) a anti-CD19 FIFT konjugovanou protilátkou (PharMingen) podle protokolu výrobce. Buňky byly analyzovány pomocí průtokové cytometrie na FACScalíbur (Beeton Dickinson). Při aplikaci na CD 19+ myší B-buňky bylo shledáno, že anti40 CD95 barvení bylo silnější u B-buněk ošetřených IL—2 plus lidský zalphal 1 Ligand ve srovnání s buňkami ošetřenými pouze IL-2 samotným. Barvení pomocí anti-CD95 dosahovalo hodnoty 37 relativních fluorescenčních jednotek (RFU) u B-buněk pouze se samotným IL-2 a 55 RFU u B-buněk kultivovaných s IL-2 a lidským zalphal 1 Ligandem.

Příklad 50: Konstrukce a purifikace toxického fúzního proteinu 2alphal 1 Ligandu.

Podle předem uzavřené dohody bylo 10 mg lidského zalphal 1 Ligandu (příklad 29) zasláno do Advanced Targeting Systems (ATS; San Diego, CA), kde byla provedena konjugace k rostlin50 nému toxinu saporinu (Stirpe a další, Biotechnology 10; 405412, 1992). Zymogenetici získali z ATS 1,3 mg proteinového konjugátu obsahujícího 1,1 molekuly saporinu na molekulu lidského zalphal 1 Ligandu, vyjádřeno pomocí koncentrace 1,14 mg/ml v 20nM fosfátu sodném, 300nM chloridu sodného, pH 7,2.

- 104CZ 302921 Β6

Příklad 51: Fúzní protein zalphal 1 Ligandu s toxinem in vivo

Testování konjugátu zalphal í-saporinu v myších

Konjugát zalphal 1-saporinu (příklad 49) byl podán C57BL6 myším (samice. 12 týdnů staré, zakoupené od Taconic) ve dvou různých dávkách: 0,5 a 0,05 mg/kg, Injekce byly dávány í.v. v roztoku obsahujícím 0,1 % BSA (ICN, Costa Mesa, CA). Během týdne byly podány tři injekce (den 0,2 a 7). Vzorky krve byly potom odebrány myším v den 0, (před injekcí) a v den 2 a 8 (post-injekčně). Krev se shromáždila v heparinem potažených zkumavkách (Bectin Dickenson, Franklin Lakes, NJ) a byl určen počet buněk na automatickém hematologickém analyzátoru (Abbot Cell-Dyn model č. CD-35OOCS, Aboot Park, IL). Zvířata byla osmý den po odběru krve usmrcena a byla provedena nekropsie. Slezina, brzlík, játra, ledviny a kostní dřen byly shromážděny pro histopatologické vyšetření. Slezina a brzlík byly zváženy a byly z nich přepraveny další vzorky krve pomocí separačních zkumavek. Sérum bylo popsáno do Pheonix Central Labs, Everett, WA, na testování standardního chemického panelu. Vzorky byly také odebrány pro testy průtokovou cytometrií tak, jak je popsáno výše.

Počty cirkulujících krevních buněk a chemické měření se výrazně nelišila mezi vzorky z myší ošetřených zalphal 1 kviyugáíčiii a myší ošetřených ekvivalentníiiii vzorky nekonjugovaného toxinu (saporin): Histologické analýzy tkání u myší ošetřených zalphal 1· saporinem také neukázaly rozdíly oproti myším ošetřeným ekvivalentní dávkou nekonjugovaného toxinu. Tyto výsledky naznačují, že konjugát saporinu není in vivo toxický.

B. Testování konjugátu toxinu zalphal 1 Ligand-saporin na tumory odvozené od B-buněk in vivo

Byly testovány vlivy lidského zalphal 1 Ligandu a fúzního produktu lidského zalphal 1 Ligandu— toxický saporin (příklad 50) na lidské nádorové buňky in vivo pomocí myších modelů nádorových cizorodých roubů — xenoroubů. Modely xenoroubů byly nejdříve testovány pomocí buněčných linií vybraných na bázi in vivo pokusů, takových, jaké byly popsány v příkladu 49. Buněčné linie zahrnovaly, ale neomezovaly se pouze na tento výčet: lidské buněčné linie Burkittova lymfomu Ráji (ATCC č. CCL-86) a Ramos (ATCC č. CRL-1596); lidská buněčná linie RPMI 1788 (ATCC č. CRL-156); Lidská myeloma/plasmacytoma buněčná linie IM-9 (ATCC č. CRL159); lidská buněčná linie DAKIKI (ATCC č. TIB 206) a HS Sultán buňky (ATCC č. CRL1484). V tomto modlu mohly být užity i buňky odvozené přímo z lidských nádorů. Touto cestou lze sledovat citlivost vzorků pacientů na podávání zalphal 1 Ligandu nebo fúzního produktu zalphal 1 Ligand - toxický saporin, lze tímto způsobem vybrat optimální případy pro nasazení léčby zalphal 1 v antinádorové terapii. Po výběru vhodného xenoroubu lze sledovat pro in vivo model, popsaný výše, zalphal 1 Ligandem indukovanou aktivitu buněk přirozených zabijáků a/nebo vlivy zalphal 1 Ligandu na nádory odvozené od B-buněk. Lidský zalphal 1 Ligand byl pomocí modelu xenoroubů testován na svou schopnost generovat cytotoxické efektorové buňky (např. NK buňky) s aktivitou naměřenou proti nádorům odvozeným od B-buněk. Mimoto byl sledován také přímý vliv lidského zalphal 1 Ligandu na nádory. Modely xenoroubů byly vybrány způsoby popsanými výše. Byl vyvinut protokol na užití zalphal 1 Ligandem stimulovaných lidských buněk a tento protokol byl testován na účinnost pro snížení výskytu nádorových buněk a zlepšení přežití myší očkovaných buněčných liniemi nebo přímo s primárními nádory.

Příklad 52: Identifikace P 1 umělých chromozomálních klonů obsahujících genovou DNA na lidský zalphal 1 Ligand

Inzert cDNA pro lidský zalphal 1 Ligand byl amplifikován pomoci PCR za užití primerů obsažených ve vektoru. PCR produkt byl označen ³²P a hybridizován na filtry o vysoké hustotě reprezentující PAC (PÍ umělý chromozom) knihovna. Filtry a zamražená zásobní knihovna byly získány z oswell Park Cancer Institute, Buťfalo, New York; segment knihovny byl RPC16. se

- 105 CZ 302921 B6 čtyřnásobnou hloubkou pokrytí. Filtry byly hybridizovány přes noc při teplotě 65 °C v ExpressHyb (Clontech) a byly promyty podle pokynů výrobce. Určení pozitivního signálu vedlo k identifikaci čtyř PAC klonů označených 23H17, 34A9, 105G9 a 236H14. PCR analýza kódující oblasti pomocí primerů specifických pro 5' konec ZC22452 (SEKV. ID. 4. 100) a ZC

22451 (SEKV. ID. Č: 101)) a 3’ konce (ZC 22450 (SEKV. ID. 4. 102) a ZC 22449 (SEKV. ID.

Č. 103)) ukázala, že PAC 34A9 a 105G9 obsahovaly oba konce, zatímco PAC23H17 a 236H14 obsahovaly pouze 5' konec. PAC 23H17 byl štěpen pomocí EcoRI a Notl a byl identifikován 9 kb fragment, který hybridizoval se sondou pro zalphal 1 Ligand cDNA. Tento fragment byl izolován a klonován pomocí zde již popsaných postupů do pBluescrípt II Sk (-t-) (Stratagene), dříve io štěpeného pomocí EcoRI a NotL Sekvenací se potvrdilo, že tento fragment obsahuje asi 380 párů bází z promotorové oblasti, exony, 1, 2 a 3, oba introny 1 a 2 a je zakončen íntronem 3. 3' konec genu pro lidský zalphal 1 Ligand byl získán pomocí PCR a užitím DNA z PAC 34A9 jako templátu, sprimery ZC23771 (SEKV. ID. Č: 104) a ZC22449. (SEKV. ID.Č.: 103). Byla použita Taq DNA polymeráza s dodávaným pufrem a s přídavkem 4% DMSO. Reakční podmínky byly následující: 94 °C po 5 min; následovalo 35 cyklů při 94 °C po dobu 30 s, 52 °C po dobu 1 min, 72 °C po 3 min; potom 72 °C po dobu 7 min. Takto byl připraven 2,9 kb fragment, který obsahoval část exonu 3, oba introny 3 a 4, celý exon 4 kódující část exonu 5.

Struktura genomu lidského genu pro zalphal 1 Ligand je následující - pořadí od 5' konce k 3' konci: SEKV. ID. Č.: 105, obsahující okolo 240 bp promotoru, exon 1 (nukleotidy číslo 240-455 ze sekvence SEKV. ID. Č. 105), infron 1 (nukleotidy číslo 456-562 ze SEKV. ID. Č. 105), exon 2 (nukleotidy číslo 563-598 ze SEKV. ID. Č: 105) a část intronu 2 obsahující 748 párů bází z 5' konce (nukleotidy číslo 599-1347 ze SEKV. ID.Č. 105); mezeru obsahující méně než 3 kb; SEKV. ID. Č.; 106, obsahující 718 bp z 3' konce pro intron 2, exon 3 (nukleotidy číslo

719-874 ze SEKV. ID. Č. 106) a část 5' konce intronu 3 (nukleotidy číslo 875-1656 ze SEKV.

ID. Č. 106), mezeru méně než přibližně 800 bp; a SEKV. ID. Č. 108, obsahující 435 bp z 3' konce intronu 3, exon 4 (nukleotidy číslo 436-513 a SEKV. ID. Č.; 108), intron 4 (nukleotidy číslo 514-603 ze SEKV. ID. Č. 108) a část 5' konce exonu 5 (nukleotidy číslo 604—645 ze SEKV. ID.Č.; 108).

Příklad 53: Vazebná studie ^l25I-značeného lidského zalphal 1 Ligandu v buněčné linií mikrogramů puriftkovaného lidského zalphall Ligandu (příklad 29) bylo označeno podle návodu výrobce pomocí partikulí nesoucích izotop jodu (2 m CI ^!25I (Pierce, Rockford Illinois)). Takto značený protein byl použit ke studii vazby lidského zalphall Ligandu k lidské buněčné linnii Ráji (ATCC č. CCL-86). Jako kontroly byly užity myší buňky přirozeně se vyskytující linie BaF3 a BaF3 transfekované zalphall receptorem (BaF3/hZalphal 1 buňky). Zalphall Ligand vázaný na BaF3/hzalphal 1 buňky byl zvolen jako pozitivní kontrola, zatímco přirozený typ BaF3 buněk jako negativní kontrola. Tato volba byla učiněna na základě proliferačního testu (příklad 5). Přibližně 5 x 10⁵ Ráji buněk/jamku, 1 x 10⁶ BaF3/hzalphal 1 a 1 x 10⁶ BaF3 buněk/jamku bylo vyseto na 96-jamkové desky. V duplikátech bylo do jamek přidáno deset ng/ml značeného lidského zalphall Ligandu. V jamkách byl neriově naředěn neznačený lidský zalphall Ligand jako kompletující agens v 250 násobném molámím nadbytku v sestavném ředění 1:4 až k molámímu přebytku 0,061. Každý bod ředění byl opět kapán v duplikátech. Poté byl přidán do každé jamky značený lidský zalphal 1 Ligand, desky byly nechány inkubovat při 4 °C po dobu 2 h, což umožnilo vazbu ligandu k buňkám. Buňky byly poté promyty 3 x vazebným pufrem (RPMI-1710 (JRH Bioescience) s 1 % BSA (Sigma)) a spočítány na COBRA II AUTOGAMMA detektoru gama záření (Packard Instrument Company, Meriden, CT).

Vazba značeného zalphall Ligandu k buňkám byla zřejmá pro Ráji a BaF3/hzalphal 1 buňky. Kromě toho u Ráji buněk bylo dokázáno, že v průběhu 250 násobek molámího nadbytku neznačeného zalphal 1 Ligandu sníží v přítomnosti neznačeného kompetitoru vazbu 3 krát (Interferon Gatnma from R&D Systems, Minneapolis, MN) a 3,7 krát není-li přítomen kompetitor.

Kompetice vykazovala průběh závislý na koncentraci specifického neznačeného kompetitoru.

- 106CZ 302921 B6 lidského zalphal 1 Ligandu, Toto je důkazem, že vazba zalphal l Ligandu k Ráji buňkám je specifická. Obdobně, pro pozitivní kontrolu baF3/zalphal 1 buňky, 250 násobek molámího nadbytku neznačeného zalphal 1 Ligandu sníží v přítomnosti neznačeného kompetitoru vazbu 2krát a 3,06krát není-li přítomen kompetitor. Toto je důkazem, že vazba zalphal 11 Ligandu k BaF3 buňkám je specifická. Nekompetitivní vazba byla pozorována pro divoký typ BaF3 buněk. Z toho plyne, že vazba zalphal 1 Ligandu je specifická pro Ráji a Baf3/hzalphal 1 buňky, ale nikoli pro negativní kontrolu BaF3 buněk.

Příklad 54: Exprese zalphal 1 receptorů v lidských krevních buňkách Příprava kultury lidských periferních krevních buněk

Čerstvě odebraná lidská krev byla naředěna 1:1 v PBS (G1BCO BRL) a navrstvena na Fícoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology lne., Piscataway; NJ) a byla centrifugován a po dobu 30 min při 18000 rpm a běh centrifugy byl zastaven bez použití brzdy. Byla odebrána vrstva rozhraní a přenesena do čerstvého 50mI falkonky (Falcon, VWR, Seattle, WA), naředěna na konečný objem 40 ml pomocí PBS a opět centrifugována 10 min při 1200 rpm bez brzdy.

L..K ___x_______r t-_________x___i-: //ίιιγι/'ά γ*γ>ι \ ií-viuvaii)vii vuiivn. ν^ια iwwvana pvmwi 1 Ijpaiiuve tlIUUll a buňky byly resuspendovány v konečné koncentraci lxlO⁶ buněk/ml buněčného média (RPMI Médium 1640, 10% tepelně inaktivované fetální hovězí sérum, 5% L-glutamin, 5% Pen/Streep) (GIBCO BRL).

Buňky byly kultivovány v šestijamkových deskách (Falcon, VWR), po dobu 0,4 až 24 hodin s různými přidanými stimulačními látkami, jakje popsáno dále. Byla použita stimulace pomocí anti-IgM, Anti—CD40 a anti-CD3, tak jak je popsáno v příkladu 44 a 42. Dále byl použit octan forbolmystátu (PMA) a Ionomycin (Sigma, St. Louis, MO) (příklad 5C). Tyto látky byly přidány do jamek v koncentraci 10 ng/ml a 0,5 mg/ml. Buňky byly inkubovány při 37 °C v inkubátoru se řízenou vlhkostí, po různě dlouhou dobu.

Značení protilátkami a analýza

Buňky byly sklizeny z desek, promyty a resuspendovány v ledově barvícím médiu (HBSS, 1% fetální hovězí sérum, 0,1 % azid sodný) v koncentraci okolo deseti milionů buněk na mililitr. Blokování Fc receptorů a nespecifických vazeb protilátky na buňky bylo provedeno přidáním 10% normálního kozího séra (Gemini Bioproducts, Woodland; CA) a 10% normálního lidského séra (Ultraserum, Gemini) do buněčné suspenze. Alikvóty buněčných suspenzí byly smíchány s FITC značenou monoklonální protilátkou proti spojovacím markérům v CD3, CD19 nebo CD14 (Pharm Mingen, La Jolla, CA) a biotinylovanou protilátkou proti lidskému zalphal I receptorů (hu-zalphal 1) (příklad 35) Specificita barvení byla prověřena v kompetítivních testech pomocí zalphal 1 CEE rozpustného receptorů (příklad 10A) v desetinásobném nadbytku. Po inkubaci na ledu po dobu 60 minut byly buňky dvakrát promyty v ledově chladném barvícím médiu a resuspendovány v 50 ml barvícího média obsahujícího streptavidin-PE konjugát (Caltag, Burlingame, CA).

Po třiceti minutách inkubace na ledu byly buňky opět dvakrát promyty ledově chladným promývacím pufřem (PBS, 1% fetální hovězí sérum, 0,10 azid sodný) a resuspendovány v promývacím pufru obsahujícím 1 mg/ml 7-AAD (Molecuiar Probes, Eugene, OR) jako markér pro určení životaschopnosti. Data týkající se živých buněk byla získána na průtokovém cytametru FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Vyhodnocení bylo provedeno pomocí CellQuest programu (BD Immunocytometry Systems).

Výsledky z barvení anti-zalphal 1 protilátkou prokázaly, že lidský zalphal 1 receptor se exprimuje v lidských periferních krevních buňkách, které exprimují buď CD3, CD109 nebo CDU. Barvení u buněk sCD3 a CD19 bylo specifické, což prokázala úplná kompetice

- 107CZ 302921 B6 s rozpustným zalphal 1 receptorem. barvení sCD14 buňkami vykázalo jistou specifitu pro Ligand, což dokazuje částečná kompetice s rozpustným receptorem. Aktivace jak T buněk pomocí anti-CD3, tak B buněk s anti-CD40 vykázala zvýšenou hladinu zalphal 1 na povrchu za 24 hodin. Nebyla prokázána zvýšená hladina exprese zalphal 1 po 4 hodinách inkubace při použití jakýchkoli stimulans ve vlastní buněčné populaci. Ošetření buněk zalphal 1 Ligandem vyústilo ve snížení zalphal 1 barvení vCD3 positivních a CD19 positivních buňkách, avšak nikoli v CD 14 positivních buňkách po 4 i 24 hodinách.

io Příklad 55: Předběžné stanovení stability lidského zalphal 1 Ligandu ve vodných roztocích.

Za účelem vypracování bioprocesů spojených s formou podávání a in vivo administrací byly provedeny předběžné studie k hodnocení stability lidského zalphal 1 Ligandu ve vodě. Cíle byly následující: 1) ověřit stabilitu a návratnost z Alzet Minipumps při běžném skladování a zacházení;

2) určit míru stability několika analytických metod včetně kation-výměn né HPLC (CX-HPLC),

HPLC s reverzní fází (RP-HPLC), HPLC sexkluzí molekul podle velikosti (SEC-HPLC) abiotesty (BaF3/zalphal IR proliferace (to znamená příklad 2 a příklad 4) a 3) určení stability nej důležitějších odbourávacích procesů a jejich kinetických závislostí.

Alikvoty purifikovaného lidského zalphal l Ligandu (příklad 29) byly připraveny v ředění 2 ml/ml v PBS (pH 7,4) a skladovány v nízkodenzitních polyethylenových zamrazovacích zkumavkách (LDPE) (Nalgene, 1,8 ml) při -80 °C (kontrola), 5 °C. 30 °C, a 37 °C. Vzorky byly v periodě 29 dnů několikrát testovány pomocí CX- RP-, SEC HPLC a biotesty. Alikvoty byly skladovány při -80 °C a byly podrobeny cyklickému zmrazování a tání (f/t cyklování) (-80 °C/RT; 5 x f/t, 10 x f/t). Stabilita lidského zalphal 1 Ligandu byla pozorována ve všech testech s kontrolou uloženou při -80 °C (1 f/t).

Zbývající roztok lidského zalphal 1 Ligandu z kontrol při -80 °C byl po provedení analýz opět zamražen (-80 °C). Tento alikvót (2 f/t) byl použit k hodnocení termální a konformační stability lidského zalphal 1 Ligandu při určení funkce při různých pH pomocí cirkulámího dichroismu (CD). Roztok o koncentraci 2 mg/ml byl ředěn na 100 pg/ml pomocí PBS pufrů o hodnotách pH pohybujících se od pH 3,3 a do 8,8. Byla zaznamenána spektra pořízená v daleké UV CD oblasti v teplotním rozsahu od 5° do 90 °C v intervalech po 5 °C (n-3/pH). CD spektropolarimetr, který se pro tato měření používal, byl Jasco 715 (Jasco, Easton, MD). Teplotní porušení terciární struktury (poskládání) molekuly bylo sledováno změnou elipticity při 222 nm jako funkce teploty. Odhady Tm byly provedeny pomocí dvou ne poskládaných modelů. Data splňující sigmoidální závislost byla vyhodnocena pomocí Slide Write Plus for Windows, v 4.1 (Advenced Graphics Software; Encinita, CA). Návratnost a stabilita z Alzep Minipumps, (Model č. 10007D; ALZA Corporation, Mountain View, CA) byly provedeny naplněním pumpy roztokem ΙΟΟμΙ

2 mg/ml lidského zalphal 1 Ligandu, umístěním pump v 1,8 ml LDPE obsahujícím 1 ml PBS (pH

7,4) a inkubací při 37 °C. Poměr uvolnění a návratnosti lidského zalphal 1 Ligandu z minipump byl určen pomocí CX-, RP-, SECHPLC, a to 2, č, a 7 den. Aktivita byla určena biotestem sedmý den. Studie byla založena na hodnocení uvolnění vzorku pouze tří pump v daném čase.

Chromatografická data potvrzují, že k hodnocení stability se hodí CX-&SEC-HPLC metody, zatímco RP-HPLC metoda je nevyhovující. Pomocí CX-HPLC byly nalezeny přinejmenším tři další píky, které indikovaly zjevné degradační produkty. Pomocí SEC-HPLC metody bylo určeno, že dříve než vlastní lidský zalphal 1 Ligand, se uvolňují agregáty.

Tyto závěry indikují, že degradační produkty pozorované pomocí CX-HPLC s největší pravděpodobností pocházejí z modifikace aminokyselin, jako je deaminace, spíše než jen z hydrolýzy, nebo proteolýzy vedoucí ke pozměněným variantám. Vzhledem ke kontrole byl u vzorků, kde byla potvrzena degradace pomocí SEC - & CX-HPLC, pozorován RP-HPLC také určit stupeň promytí při nástupu (čelo) a po ukončení chromatografíe (ocas). Degradace určená pomocí CX55 HPLC stoupla v závislosti na čase a teplotě a vykazovala kinetiku prvního řádu. Procentu

-108CZ 302921 B6 lidského zalphal 1 Ligandu zpětně získaného a určeného CX-HPLC po 29 dnech při 37 °C, 30 °C a 5 °C bylo 39 %, 63 % a 98 %. Agregace rovněž stoupá v závislosti na čase a teplotě. Procento (%) agregátů nalezené v preparátu po 29 dnech skladování při 37 °C, 30 °C a 5 °C bylo 7,4; 3,4 a pod detekčním limitem (BDL). V biotestech nebyly skladovány ve vzorcích žádné rozdíly, což potvrzuje, že agregáty vykazují stejnou biologickou aktivitu jako antaktní lidský zalphall Ligand. Ve vzorcích podrobených více než lOf/t cyklů nebyla pozorována žádná degradace.

Uvolňování lidského zalphall Ligandu z Alzet Minipump bylo v souladu steoreticky předkládanými objemy uvolnění. Toto naznačuje, že není výrazná adsorpce na povrchu nosiče a že io podávání lidského zalphall Ligandu pomocí Alzet Minipump splněním 2 mg/ml je vhodné.

Degradace byla pozorována stejným způsobem, jak již bylo uvedeno. Procento čistoty určené pomocí CX-HPLC pro lidský zalphall Ligand uvolněný po 2, 4 a 7 dnech bylo 96%, 90% a79%. Bylo pozorováno, že se degradace vyskytuje také po uvolnění lidského zalphall Ligandu, či po jeho naředění v uvolňovacím objemu. Proto je může % čistoty po uvolnění z min i pumpy trochu lišit, od % čistoty po uvolnění do média. Dále byla určena biologická aktivita vzorků obsahujících předpokládané množství lidského zalphall Ligandu uvolněného z minipump.

Γ L· Ι»λΙ/ι nrorlnrvL· ΙογΙοπλ I Ϊ\Ζ molz+ro nm 11/4 clrf/ Tnlnhnl 1 I irmnrl L· m γ’+λπ+τ-ι í

VU|JV1\1UUU11U^ UU1W1VU UJJV1\L1U |J1V UUiJlXJ 1 LU^UILU UJ IU I\U 11X. 1 J L VI11.1 11 «21 Ví spektry pro interleukiny, jako je IL-3 (J. Biochem. 23-352-360, 1991), IL-4 (Biochemistry, 30,:1259-1264, 1991) a IL—6 mutantů (Biochemistry, 35:11503-11511, 1996). Nebyly zjištěny ani velké odchylky v těchto spektrech v závislosti na pH. Výsledky ukazují, že hodnota pH promaximální termálně-konformační stabilitu byla pH 7,4. Analýza křivek pro zjištění poskládání molekuly byla provedena na základě dvou mechanismů, umožňujících určení termálně-konfor25 mační stability na základě dvou mechanismů, uvolňujících určení termálně-konformační stability na základě funkce pH a složení. V procesu rozkládání však existuje nejméně jeden, spíše však více intermediátů, proto je vypovídají hodnota testu relativně malá; je založená na nepřesném určení křivky pro neposkládání — rozložení. Ačkoli byly studie zaměřeny na zjištění, zda dojde k znovuposkládání lidského zalphall Ligandu po termálním rozložení zahřátím na 90 °C, předběžná data potvrzují, že dochází alespoň k částečnému návratu struktury po ochlazení vzorku na teplotu 20 °C.

Tyto studie potvrzují vhodnost užití těchto analytických přístupů pro identifikaci a hodnocení čistoty a ověření stability lidského zalphal 1 Ligandu. Například, SEC-HPLC mohou být užity k charakterizaci rozsahu a rychlosti agregace ve vodných roztocích

CX-HPLC může být použita kcharakterizaci rozsahu degradace lidského zalphall Ligandu mechanismem jiným, než je agregace. Aktivitu lidského zalphall Ligandu lze ověřit pomocí biotestů, stejně tak jako degradaci ve vodných roztocích. Například varianty lidského zalphal 1

Ligandu vznikající ve vodných roztocích, které byly izolované pomocí CX-HPLC, by mohly být užitečné jako terapeutická agens, protože vykazují izolované pomocí CX-HPLC, by mohly být užitečné jako terapeutická agens, protože vykazují ekvivalentní biologickou aktivitu. Také fakt, že se lidský zalphal 1 Ligand degraduje pomocí několika různých procesů (agregace, aminokyselinové modifikace), umožňuje navržení preferované či unikátní formy, která by minimalizo45 vala rychlost degradace a umožnila by dlouhotrvající stabilitu rozpuštěného produktu. Nyní se právě identifikují vlastnosti ve vodě rozpustných degradačních produktů a určují se kinetické závislostí (pH, koncentrace, excipienty). Také byla určena stabilita lidského zalphal 1 Ligandu v séru/plazmě, což umožní navržení a interpretaci studií in vivo.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

5 1. Izolovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, která je

a) alespoň z 90 % identická se sekvencí SEKV. ID. č. 2 pro zbytky od 41 (Gin) do 148 (Ile), kde zbytek v pozici 44 je Asp, zbytek v pozici 47 je Asp a zbytek v pozici 135 je Glu, nebo io b) alespoň z 90 % identická se sekvencí SEKV. ID. č. 2 pro zbytky od 32 (Gin) do 162 (Ser), kde polypeptid váže zalphal 1 receptor, jak je uveden v SEKV. ID. č. 115.
2. Izolovaný polypeptid podle nároku la, kde aminokyselinové zbytky 71, 78, 122 a 125 jsou

15 cysteiny.
3. Izolovaný polypeptid podle nároku la, kde sekvence aminokyselinových zbytků je alespoň z 95 % identická se sekvencí SEKV. ID. č. 2 od zbytku 41 (Gin) do zbytku 148 (Ile).

20
4. Izolovaný polypeptid podle nároku 3, kde sekvence aminokyselinových zbytků je 100% identická se sekvencí SEKV. ID. č. 2 od zbytku 41 (Gin) do zbytku 148 (Ile).
5. Izolovaný polepeptid podle nároku lb, kde sekvence aminokyselinových zbytků je alespoň z 95 % identická se sekvencí SEKV. ID. č. 2 od zbytku 32 (GLn) do zbytku 162 (Ser).
6. Izolovaný polypeptid podle nároku 5, kde sekvence aminokyselinových zbytků je, jak uvedeno v sekvenci SEKV. ID. č. 2, od zbytku 32 (Gin) do zbytku 162 (Ser).
7. Izolovaný polypeptid podle nároku 6, kde sekvence aminokyselinových zbytků je, jak

30 uvedeno v SEKV. ID. č.: 2, od zbytku 1 (Met) do zbytku 162 (Ser).
8. Izolovaný polypeptid obsahující sekvenci aminokyselinových zbytků, jak je uvedeno v SEKV. ID. č. 56, od zbytku 23 (Gin) do zbytku 146 (Ser), kde polypeptid váže zalphall receptor, jak je uveden v SEKV. ID. č. 115.
9. Izolovaný polypeptid podle nároku 8, kde sekvence aminokyselinových zbytků je, jak uvedeno v SEKV. ID. č.: 56, od zbytku 1 (Met) do zbytku 146 (Ser).
10. Izolovaná polynukleotidová molekula obsahující sekvenci nukleotidů, která kóduje poly40 peptid podle některého z nároků 1 až 9.
11. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 10, kde nukleotidy jsou, jak uvedeno v SEKV. ID. č: 1, od nukleotidu 167 do nukleotidu 490 nebo, jak uvedeno v SEKV. ID. č: 3, od nukleotidu 121 do nukleotidu 444.
12. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 10, kde nukleotidy jsou, jak uvedeno v SEKV. ID. č: 1, od nukleotidu 140 do nukleotidu 532, nebo, jak uvedeno v SEKV. ID. č: 3, od nukleotidu 94 do nukleotidu 486.

50
13. Izolovaná polynukleotidová molekula podle nároku 10, kde nukleotidy jsou, jak uvedeno v SEKV. ID. č: 1, od nukleotidu 47 do nukleotidu 532 nebo, jak uvedeno v SEKV. ID. č: 3, od nukleotidu 1 do nukleotidu 486.
14. Expresní vektor obsahující následující funkčně spojené části:

-110CZ 302921 Β6

a) transkripční promotor;

b) DNA segment kódující polypeptid podle některého z nároků 1 až 9, a

c) transkripční terminátor.
15. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 14.
16. Způsob přípravy proteinu, vyznačující se tím, že obsahuje kultivaci hostitelské buňky podle nároku 15 za podmínek, kdy exprimuje segment DNA; a získání proteinu kódovaného segmentem DNA.
17. Protilátka, která specificky váže polypeptid zalphal 1 Ligandu, kde polypeptid je vybrán z

a) polypeptidu sestávajícího z aminokyselinové sekvence SEKV. ID. č. kyselinového zbytku 41 (Gin) do aminokyselinového zbytku 148 (Ile),

2 od amino·

b) polypeptidu sestávajícího z aminokyselinové sekvence SEKV. D. Č.: 2 od amino____τί i\yoviihwviiv i/Vjutu uv ,i;«,λι,~ r,u. rU. ,,

1VM <4*^ Z-LJJf L1X.U I Ví \ ΟVl

c) polypeptidu sestávajícího z aminokyselinové sekvence SEKV kyselinového zbytku 1 (Met) do aminokyselinového zbytku 162 (Ser).

ID

č. 2 od amino
18. Použití prostředku obsahujícího polypeptid podle některého z nároků 1 až 9, pro přípravu léčiva pro léčení nemocí spojených s poruchou imunitního systému.
19. Použití prostředku obsahujícího polypeptid podle některého z nároků 1 až 9, pro přípravu léčiva pro stimulaci imunitní odpovědi v savci vystavenému vlivu antigenů nebo patogenu, kdy hladina antigenů nebo patogenu přítomná v savci je stanovena před a po podání léčiva přičemž změna hladiny je průkazná pro stimulaci imunitní odpovědi.
20. Použití podle nároku 19, kde antigenem je B nádorová buňka, virus, parasit nebo bakterie.
21. Způsob množení hematopoetických buněk a předchůdců hematopoetických buněk, vyznačující se tím, že se kultivuje kostní dřeň nebo periferní krevní buňky s prostředkem obsahujícím polypeptid podle některého z nároků 1 až 9 v množství dostatečném k vyvolání zvýšení počtu lymfatických buněk v kostní dřeni nebo periferních krevních buněk ve srovnání s kostní dření čí periferními krevními buňkami kultivovanými za nepřítomnosti polypeptidu podle některého z nároků 1 až 9.
22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že hematopoetické buňky a předchůdci hematopoetických buněk jsou lymfatické buňky.
23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že lymfatické buňky jsou NK buňky nebo cytotoxické T buňky.
24. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že prostředek dále obsahuje alespoň jeden další cytokin vybraný ze skupiny obsahující IL-2, IL-15, IL—4, GM-CSF, Flt3 ligand a faktor kmenových buněk.
25. Použití polypeptidu podle některého z nároků 1 až 9 pro přípravu léčiva pro léčení B nebo T buněčných nádorů redukcí proliferace neoplastických B nebo T buněk.

- 11J CZ 302921 B6
26. Použití polypeptidů podle nároku 25, kde léčivo dále obsahuje alespoň jeden další cytokin vybraný ze skupiny obsahující IL-2, IL-15, IL—4, GM-CSF, Flt3 ligand nebo faktor kmenových buněk.

5
27. Použití prostředku obsahujícího polypeptid podle některého z nároků 1 až 9 pro přípravu léčiva pro stimulaci imunitní odpovědi v savci vystaveného působení antigenů nebo patogenu, kdy hladina protilátky specifická pro antigen nebo patogen přítomná v savci je stanovena před a po podání léčiva, přičemž vzrůst hladiny protilátky je průkazný pro stimulaci imunitní odpovědi.
28. Způsob stanovení přítomnosti RNA zalphal 1 Ligandu v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

a) uvedení do kontaktu nukleokyselinové sondy pro zalphal 1 Ligand za hydridizačních podmí15 nek buď s (i) testovanými RNA molekulami izolovanými z biologického vzorku nebo (ii) molekulami nukleové kyseliny syntetizovanými z izolovaných molekul RNA, kdy sonda má molekulu nukleové kyseliny, která kóduje polypeptid podle nároku 7 nebo nároku 9 nebo molekulu, která je k ní komplementární, a jo b) stanovení tvorby hybridů nukleokyselinové sondy buď s testovanými molekulami RNA nebo se syntetizovanými molekulami nukleové kyseliny, kdy přítomnost hybridů indikuje přítomnost RNA zalphal 1 Ligandu v biologickém vzorku a kdy uvedený zalphal 1 Ligand je polypeptid podle některého z nároků 1 až 9.
29. Způsob stanovení přítomnosti polypeptidů podle některého z nároků 1 až 9 v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:

a) uvedení biologického vzorku do kontaktu s protilátkou, nebo jejím fragmentem podle náro
30 ku 17, kdy kontakt je učiněn za podmínek, které umožní vazbu protilátky nebo jejího fragmentu k biologickému vzorku, a

b) stanovení navázané protilátky nebo navázaného fragmentu protilátky.

35 30. Použití polypeptidů podle některého z nároků 1 až 9 pro přípravu léčiva pro léčení rakoviny.
31. Použití podle nároku 30, kde polypeptid je alespoň z 95 % identický se sekvencí aminokyselinových zbytků obsahující sekvenci SEKV. ID. č.: 2 od zbytku
32 do zbytku 162.

40 32. Použití podle nároku 31, kde polypeptid obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků

SEKV. ID. č.: 2 od zbytku 32 do zbytku 162.
33. Použití podle nároku 31 a 32 pro redukci proliferace neo plastických B nebo T buněk.

45
34. Použití podle nároků 30 až 32 pro léčení leukemie, kde polypeptid je ve formě fúzního proteinu se saporinem.

-112CZ 302921 B6
35. Použití podle nároku 30 až 32 pro léčení lymfomu, kde polypeptid je ve formě fúzního proteinu se saporinem.
36. Polypeptid podle některého z nároků 1 až 9 pro použití jako léčivo.

1 výkres