JP2000500015A

JP2000500015A - メチロトロープ性酵母におけるｇａｄ６５の生成

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Publication number: JP2000500015A
Application number: JP9518364A
Authority: JP
Inventors: ケー．レイモンド，クリストファー; アール．ブコウスキー，トーマス; ディー．ビショップ，ポール
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1995-11-09
Filing date: 1996-11-08
Publication date: 2000-01-11
Also published as: CA2237039A1; AU7673796A; WO1997017451A3; AU1158297A; EP0889966A1; US5965389A; WO1997017450A3; WO1997017450A2; AU712650B2; WO1997017451A2; EP0862640A2; CA2237120A1; JP2000500014A; CA2237120C

Abstract

(57)【要約】メチロトローフ性酵母が、産業規模でのGAD65 の生成を実施可能にするGAD65の高レベル発現のために使用される。たとえば、アルコールオキシダーゼ遺伝子、たとえばピチアパストリス AOX１からのメタノール−誘発性プロモーターが、GAD65 の発現を調節するために使用される。組換えGAD65 は、高い比活性を有し、そして免疫学的アッセイ及び治療プロトコールに不可欠である、生来の分子の抗原性特徴を保持する。

Description

【発明の詳細な説明】メチロトロープ性酵母におけるGAD65 の生成発明の背景Ｌ−グルタミン酸デカルボキシラーゼ(GAD)は、哺乳類脳において主要な阻害性神経伝達物質として広く認められているγ−アミノ酪酸（GABA）の合成を触媒する。GADの１つのイソフォームが、脾臓のランゲルハンス島における65KDのβ 細胞自己抗原として同定されている。Ｉ型（インシュリン依存性）真性糖尿病（ IDDM）は、脾臓のβ−細胞の破壊を導く自己免疫疾患である。IDDMの進行は、65 KDのGAD酵素(GAD65)に対する自己抗体の存在に関連している。天然に存在するGAD65 は、有意な量及び純度で脾臓のランゲルハンス島細胞から単離することは困難であり、そして精製されたGADは微量でのみCOS細胞から単離されて来た。Tuomiなど、Diabetes 42 : 359-362(1993)。ヒトランゲルハンス島細胞GAD65 のクローニングは、IDDM感受性個体におけるGAD自己抗体を測定するための定量アッセイにおいて抗原として有用な組換えタンパク質の獲得を理論的に可能にする。GAD65 は、細菌(たとえば、Atkinsonなど、Lancet 339 : 458- 459(1992))、哺乳類（たとえば、Hagopianなど、Diabetes 42 : 1-3(1993)）及び昆虫細胞(たとえば、Christgauなど、J ．Cell．Biol. 118 : 309-320(1992)) において発現されている。それらの方策は、自己抗体の検出のための部分精製された材料を小規模で供給する。しかしながら、発現のレベルが低く、精製を困難にし、酵素活性が減じられ、又はGAD65 は、分子のGAD65 部分の免疫活性を変更する融合タンパク質として発現されるので、それらは精製されたGAD の源として十分に好都合なものではなかった。たとえば、BHK 細胞から発現されるGAD65 の量は、アフィニティクロマトグラフィーによる精製を不可欠なものにする約600μｇ／ｌであった（Moodyなど、Diabetologia 38 : 14-23(1995)）。 GAD65 は、15個のシステイン残基及び２個のパルミトイル化された部位を含む複合分子である(Shiなど、J ．Cell．Biol. 124 : 927-934(1994))。溶液中で、G AD65 は急速に凝集し、低下した酵素活性及び抗体と反応する低下した能力を有する共有及び非共有結合されたオリゴマーを形成する。それらの特徴は、組換え GAD65 の精製を困難にする。前記材料は、不可逆的に凝集するその固有の傾向が不用な沈殿物の形成を導く条件下で、高濃度でしばしば精製される。多量のGAD65 の生成は、イムノアッセイの開発のために、及びＩ型糖尿病に対する感受性について多数の個体をスクリーニングし、そしてモニターするのに使用するために潜在的に抗原の源として求められる。しかしながら、多量の組換え GAD65 は、その分子の生物学的特徴、たとえば抗原性及び酵素活性が損なわれる場合、ほとんど有益ではない。つい最近、GAD65 がバキュロウィルスベクターを用いて、昆虫細胞、たとえばスポドプテラフルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(Sfa)細胞において発現されている。Moodyなど、前記；Mauchなど、J ．Biochem．113 : 699-704（1993）；及びChristgauなど、J. Cell ．Biol. 118 : 309-320（1992）。うわさによれば、組換えGAD65 が昆虫細胞から多量に得られており（50mg／Ｌまで）、そして有意な酵素及び抗原反応性を保持しながら95％の純度まで精製され得た。Moody など、前記。しかしながら、昆虫細胞発現系は、産業規模でのタンパク質発現のために使用される場合、多くの欠点を有する。たとえば、昆虫細胞は、産業的に利用できる量を製造するために必要とされる量で操作することが困難である。また、昆虫細胞は、（１）培養するのに高価であり；（２）異種性タンパク質の発現のためにバキュロウイルスによる感染を必要とし、このため連続的製造方法のためには不適切であり；（３）再現性がわるく、それらを正確に確認することが困難であり；そして（４）全体的に低い生産速度を有する。当業界において必要とされることは、ひじょうに多くの量の生物学的に活性な組換えGAD65 の便利な発現のための手段である。発現系から単離されたタンパク質調製物は、高レベルの酵素及び抗原活性を保持しながら、比較的均質に容易に精製されるべきである。ひじょうに驚くべきことには、本発明は、それらの及び他の関連する必要性を満たしている。発明の要約１つの態様において、本発明は、GAD65 の発現のためのメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物を提供する。前記酵母は、炭素源及びエネルギー源としてメタノールで増殖することができ、そしてメタノール−誘導性転写プロモーター、GAD65 ポリペプチドをコードする DNAセグメント、転写ターミネーター及び選択マーカーの作用可能に連結された要素を含んで成る DNA構造体により形質転換される。メチルトローフ性酵母は、ピチア(Pichia)、ハンセヌラ(Hansenula) 、トルロプシス（Torulopsis）又はカンジダ(Candida)から選択され、そして好ましくは、ピチア・パストリス(Pichia pastoris)又はピチア・メタノリカ（Pic hia methanolica）である。形質転換 DNA構成体のメタノール誘導性プロモーター及び転写ターミネーターは、アルコールオキシダーゼ遺伝子のたとえばＰ．パストリス AOX１遺伝子からであり得る。好ましくは、GAD65 ポリペプチドは、ヒトGAD65 である。もう１つの態様において、本発明は、メチロトローフ性酵母においてGAD65 を発現するための DNA構造体を供給する。前記構造体は、たとえばアルコールオキシダーゼ遺伝子、たとえばＰ．パストリス AOX１からのメタノールー誘導性転写プロモーター；GAD65 ランゲルハンス島細胞ポリペプチド、好ましくはヒトGAD6 5 ポリペプチドをコードする DNAセグメント；たとえばアルコールオキシダーゼ遺伝子、たとえばＰ．パストリス AOX１からの転写ターミネーター；及び選択マーカーの作用可能に連結された要素を含んで成る。さらにもう１つの態様において、本発明はメチロトローフ性酵母細胞の培養により発現されるGAD65 を精製するための方法を提供する。前記方法は、還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液において酵母細胞培養物からGAD65-含有細胞画分を単離し（たとえば、酵母細胞を溶解することによって）；前記GAD65-含有細胞画分を、GAD65-含有界面活性剤相及び水性相に相分割し；GAD65 アニオン交換画分を生成するために、還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液においてアニオン交換クロマトグラフィーにより前記GAD65-含有界面活性剤相からGAD65 を分離し；わずかに酸性のpHでカチオン交換媒体を含むカラムに第１のGAD65 アニオン交換画分を適用し、そしてそれらからのGAD65-含有画分をアルカリ性pHに調整し；還元剤（たとえば、ジチオトレイトール又は２−メルカプトエタノール）及び界面活性剤（たとえば、非イオン性界面活性剤、たとえばTriton X-114，Triton X-100又はｎ−オクチルグルコシド）を含む緩衝液においてアルカリ性pHで第２アニオン交換カラム上に前記GAD65 カチオン交換画分を負荷し、アルカリ性〜酸性pHグラジエント（たとえば約pH８〜約pH４）においてGAD65 を溶離し、そして前記GAD65 溶離物のpHをほぼ中性に調整し；そして還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液においてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより前記GAD65 アニオン交換溶出物を精製し、そして精製されたGAD65 を得る段階を含んで成る。GAD65 は、リン酸カリウムのグラジエントによりヒドロキシアパタイトから好ましくは溶離される。関連する観点においては、アニオン交換クロマトグラフィーによりGAD65-含有界面活性剤相からGAD65 を分離する前、前記方法はさらに、GAD65-含有界面活性剤相から酵母細胞粒状物を除去する段階を含んで成る。さらに、精製の段階の前、GAD6 5 第２アニオン交換溶離物が第四アンンモニウム交換カラム上でさらに分別され得る。他の方法においては、GAD65-含有酵母細胞画分の第１アニオン交換クロマトグラフィー段階が相分割の前に使用され、そしてカチオン交換段階が排除される。もう１つの観点においては、本発明は、GAD65 ポリペプチドを生成するメチロトローフ性酵母株の実質的に純粋な培養物を調製するための方法を提供する。メチロトローフ性酵母宿主は、メタノール−誘導性転写プロモーター、GAD65 ポリペプチドをコードする DNAセグメント、転写ターミネーター及び選択マーカーを、作用可能に連結される要として有する DNA構成体により形質転換される。次に、形質転換された細胞が、DNAセグメントが発現され、そしてGAD65 ポリペプチドが生成される条件下で培養される。形質転換された細胞の単離物により生成されたGAD65 ポリペプチドのレベルがアッセイされ、そして高レベルのGAD65 ポリペプチドを生成する単離物が選択的に培養される。図面の簡単な説明図１は、Ｐ．メタノリカのエレクトロポレーション効率に対する場の強さ及びパルス時間の効果を示す。図２は、プラスミドpCZR140 とＰ．メタノリカゲノム DNAとの間の組換え現象の図示である。図３は、プラスミドpCZR137 とＰ．メタノリカゲノム DNAとの間の組換え現象の図示である。特定態様の記載本発明は、メチロトローフ性酵母、すなわち炭素源及びエネルギーの単一源としてメタノールを利用することができる酵母において生産される組換えGAD65 を提供する。メタノール利用のために必要な生化学路を有する酵母の種は、ハンセヌラ、ピチア、カンジダ及びトルロプシスの４種の属に分類される。それらの属内で、ピチア、たとえばピチアパストリス及びピチアメタノリカがハンセヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）と同じように好ましい。商業規模のタンパク質生成のためには、メタノールの他に、第２の炭素源（たとえばグリセロール）を効果的に利用できる株を使用することが特に好ましい。メチロトローフ性酵母により生成されるGAD65 を単離し、そしてそのGAD65 を、生物学的に及び酵素的に活性的である形で実質的な純度に精製するための方法がまた、提供される。メチロトローフ性酵母は定義された最少培地上で高いバイオマスに急速に増殖し、そして遺伝子発現が厳格に調節された強いプロモーターにより駆動され得るメチロトローフ性酵母には多くのメタノール応答遺伝子が存在し、個々の発現は GAD65 の発現を調節するために使用され得るメタノール応答プロモーターにより調節される。最も通常には、メチロトローフ性酵母におけるGAD65 の発現は、アルコールオキシダーゼ構造遺伝子、たとえばＰ．パストリスの AOX １遺伝子、Ｐ．パストリスの AOX ２遺伝子（アメリカ特許第4,855,231 号、第5, 032,516 号及び第5,166,329 号、引用により本明細書に組込まれる）、ハンセヌラポリモルファ（Hansenula polymorpha）又はカンジダビオジニ（Candida biodinii）の MOX １遺伝子（アメリカ特許第5,389,525 号、引用により本明細書に組込まれる）、Ｐ．メタノリカのメタノール利用遺伝子 AUG１及び AUG２、又は同様のもののプロモーターにより駆動される。 AOX １mRNAの発現レベルは、炭素源に関して強く調節され、そして AOX １プロモーターは、GAD65 の発現のための厳格に調節された強いプロモーターである。他のメチロトローフ性酵母のアルコールオキシダーゼ遺伝子の配列は知られており（Creggなど、Mol ．Cell．Biol . 9 : 1316-1323（1989）; Ellis など、Mol ．Cell．Biol.5 : 1111〜1121（198 5）; 及びLedeboerなど、Nucleic Acids Res.13 : 3063-3082（1985）、それぞれは引用により本明細書に組込まれる）、そしてそれらの遺伝子は本体の明確な領域を共有する。他のメチロトローフ性酵母は、たとえばピチア・セロビオサ(P ichia cellobiosa)、カンジダ・ビオジニ（Candida biodinii）、カンジダ・カリオシリグニコラ（Candida cariosilignicola）、カンジダ・スクシフィラ（Ca ndida succiphila）、トルロプシス・モリスチアナ（Torulopsis molischiana）及びハンセヌラ・カプスラタ（Hansenula capsulata）を包含する（Lee and Kom agata，J ．Gen．Appl．Microbiol. 26 : 133-158(1980)）。他の種又は株のアルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター／ターミネーター部分をクロン化するためには、PCR プライマーが、 AOX １，AOX ２又は他の関連する遺伝子の記載される配列に基づいてメチロトローフ性酵母の所望する種又は株からのゲノムセグメントを増幅するために使用される。PCR 増幅されたフラグメントが配列決定され、そしてアルコールオキシダーゼコード配列をコードするクローンが同定される。それらは、興味ある種又は株のゲノムクローンバンクからのアルコールオキシダーゼ遺伝子の十分な長さのゲノムクローンを同定するためにハイブリダイゼーションプローブとして使用される。完全なアルコールオキシダーゼ遺伝子が配列決定され、そしてプロモーター／ターミネーター領域が同定される。Ｐ．パストリス AOX １調節領域に対する類似性によれば、アルコールオキシダーゼ遺伝子のプロモーター、mRNA開始部位及び５′ 末翻訳領域がアルコールオキシダーゼATG 開始コドンの約１Kb上流以内の領域を占有し、そしてアルコールオキシダーゼ転写終結領域がアルコールオキシダーゼ停止コドンの約500bp 以内に見出される。特定部位の突然変異誘発又は同様のことが、アルコールオキシダーゼコード領域を排除するために、及びプロモーター／ターミネーター領域内にGAD65 をコードするcDNAを挿入するための有用なクローニング部位を生成するために使用される。アルコールオキシダーゼプロモーター／ターミネーターに代わるものとして、もう１つのメタノール応答性構造遺伝子生成物のプロモーターがクローン化され、そしてGAD65 の発現を駆動するために使用され得る。それらの遺伝子は、メタノール利用路において重要である他の酵素、たとえばジヒドロキシアセトンシンターゼ(DAS)、ギ酸デヒドロゲナーゼ(FMD)、ホルムアルデヒドデヒドロゲナーゼ、カタラーゼ、等をコードするものを包含する。Veenhuisなど、Adv ．Microbial ．Physiol ．24 : 1-82（1983）；アメリカ特許第5,389,525 号；Janowiczなど、Nuc ．Acids Res ．13 : 3043-3062（1985）；Tschopp など、Nuc ．Acids Res．15 : 3859-3876（1987）；Hollenberg and Janowicz，EPO特許公開0299108 号；Di dion and Roggenkamp, FEBS Lett．303 : 113(1992)を参照のこと。他のメタノール応答性遺伝子は、配列の活性に基づいてクローン化され得る（たとえば、PCR 又はハイブリダイゼーションによる）。メタノール応答遺伝子を同定し、そしてクローン化するためには、メタノール上で増殖される細胞において発現されるが、しかし他の炭素源（たとえばグルコース）上で増殖される細胞において発現されない遺伝子を同定するために特異な cDNAライブラリーを利用することが好都合である。それにより、メタノール誘導される遺伝子は、メタノール調節されたプロモーター及び転写ターミネーターのための源として作用する。ピチアから得られたメタノール誘導性遺伝子の同定及びクローニングはまた、Stroman など、アメリカ特許第4,808,537 号（引用により本明細書に組込まれる）にも記載される。メチロトローフ性酵母におけるGAD65 の発現のためには、GAD65 又はGAD65 の所望のポリペプチドフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列（たとえば、cDNA）が、発現のために適切な発現ベクター中に挿入され、続いて、そのベクターが選択されたメチロトローフ性酵母、好ましくはＰ．パストリス又はＰ．メタノリカを形質転換するために使用され得る。本発明の実施への使用のための発現ベクターは、メタノール応答性プロモーター、たとえば AOX １プロモーター、又はクローン化されたGAD65 DNA に作用可能に連結され、そしてその転写を指図することができる他のメタノール誘発性プロモーター、及びGAD65 DNA に作用可能に連結される転写ターミネーターを含んで成る。（用語“作用可能に連結される”とは、セグメントが、それらの意図された目的のために正しく機能し、たとえば転写がプロモーターのもとで開始し、そしてターミネーターにそのコードセグメントを通して進行するよう配置されることを示す；Sambrookなど、前記を参照のこと）。メチロトローフ性酵母におけるGAD65 の発現のためには、好ましくは、プロモーター及びターミネーターは、宿主種の遺伝子からであり得る。発現ベクターは、追加の要素、たとえば複製の起点、他の宿主における増幅を可能にする１又は複数の選択マーカー、GAD65 コード遺伝子が挿入されるユニーク制限部位、たとえばEco RI、等を含むことができる。GAD65 ポリヌクレオチド配列の挿入及び発現のために適切な発現ベクターはまた、商業的供給者、たとえばInvitrogan，San Diego，CA により供給されるPichia Expression Kit から利用できる。特に好ましいメタノール−誘導プロモーターは、Ｐ．メタノリカアルコール利用遺伝子のプロモーターである。１つそのような遺伝子 AUG１の代表的なコード鎖配列は、配列番号２に示される。配列番号２内において、開始ATG コドンは、ヌクレオチド1355−1357に存在する。配列番号２のヌクレオチド１−23は、非 A UG１ポリリンカー配列である。追加の上流配列が含まれ得るが、配列番号２のヌクレオチド24−1354を含んで成るセグメントをプロモーターとして利用することは特に好ましい。Ｐ．メタノリカは、第２のアルコール利用遺伝子 AUG２を含み、この遺伝子のプロモーターが本発明内で使用され得る。１つの AUG２クローンの部分 DNA配列が、配列番号９に示される。本発明内で使用される AUG２プロモーターセグメントは一般的に、配列番号９のヌクレオチド91−169 を含んで成るが、但しその３′末端での小さな切断がプロモーター機能を無効にするとは思われない。メチロトローフ性酵母におけるGAD65 の発現のためのベクターは、酵母宿主中での選択及び維持のための選択マーカーを含むであろう。前記マーカーは一般的に、アミノ酸又はヌクレオチドの生合成を提供するものであろう。典型的な選択マーカー遺伝子は、Ｐ．パストリス及びＳ．セレビシアエからの ARG ４（アルギニノコハク酸リアーゼ遺伝子、Ｐ．パストリス及びＳ．セレビシアエからの HIS ４（ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ）遺伝子、ウラシル利用遺伝子(URA)、ロイシン又はアデニン合成のための能力を提供する遺伝子、及び同様のものを包含するが、但しこれらだけには限定されない。ピチア・メタノリカへの使用のための好ましい選択マーカーは、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ(AIRC ; EC4.1.1.21)をコードするＰ．メタノリカ ADE２遺伝子であり、そしてまた、継続出願USSN08／703,80 7 及び08／703,809（それらの全開示を引用により本明細書に組込む）にも記載される。ADE２遺伝子は、ade２宿主細胞を形質転換する場合、アデニンの不在下での細胞の増殖を可能にする。代表的なＰ．メタノリカ ADE２遺伝子配列のコード鎖は、配列番号１に示される。例示される配列は、５′側の非コード配列の10 06個のヌクレオチド及び３′側の非コード配列の442 個のヌクレオチド、並びにヌクレオチド1007−1009での開始 ATGコドンを含む。本発明の好ましい態様にいおては、ヌクレオチド 407−2851を含んで成る DNAセグメントが選択マーカーとして使用されるが、但しより長いか又はより短いセグメントは、そのコード部分がプロモーター及びターミネーター配列に作用可能に連結されている限り使用され得る。当業者は、本明細書に供給されるこの及び他の配列がそれぞれの遺伝子の１個の対立遺伝子を表わし、そして対立遺伝子のバリエーションが存在すると思われることを認識するであろう。いづれかの機能的 ADE２対立遺伝子が本発明内で使用され得る。本発明内で使用され得る他の栄養マーカーは、それぞれアデニン、ヒスチジン及びセイシンの不在下での選択を可能にする、Ｐ．メタノリカ ADE１,HIS３及び LEU２遺伝子を含む。異種遺伝子、たとえば他の菌類からの遺伝子もまた、選択マーカーとしても使用され得る。メタノールの使用を最少にすることが所望される大規模産業工程のためには、両メタノール利用遺伝子(AUG１及び AUG２ )が欠失されている宿主細胞を使用することが好ましい。 DNA構造体はさらに、追加の要素、たとえば複製起点、及び他の宿主（たとえばＥ．コリ）においての DNAの増幅及び維持を可能にする選択マーカーを含むことができる。宿主染色体中への DNAの組込みを促進するためには、宿主 DNA配列を両端で有する、プロモーター対象の遺伝子−ターミネーター及び選択マーカーを含んで成る完全な発現セグメントを有することが好ましい。これは、便利には、発現セグメントの下流末端で３′末翻訳 DNA配列を包含し、そして５′末端でのプロモーター配列に依存することによって達成される。線状 DNAを用いる場合、発現セグメントは、分子の線状化及び他の配列（たとえば、複製及び選択マーカーの細菌起点）からの発現セグメントの分離を可能にするために切断部位を端に有するであろう。好ましい切断部位は、DNA配列内でまれに切断する制限エンドヌクレアーゼ、たとえば８−塩基の標的配列（たとえば NotＩ）を認識するエンドヌクレアーゼにより認識されるものである。 GAD65 及びその相同タンパク質をコードするcDNA配列は、たとえばPCT 公開WO 92／20811 号（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。“GAD65”とは、組換えランゲルハンス島細胞GAD65 ポリペプチド、すなわち組換え発現系により生成され、そして生来の内因性物質を典型的には有さないポリペプチドを意味する。“ポリペプチド”とは、前記PCT 公開92／20811 号の図２に示されるように少なくとも約10〜25個のアミノ酸、100〜200 個までのアミノ酸、又は完全なまでのランゲルハンス島GADタンパク質の配列を包含することを意味する。ポリペプチドが完全なGAD タンパク質を含んで成る場合、そのポリペプチドは、PC T 公開WO92／20811 号の図２に開示されるような完全なランゲルハンス島細胞GAD 配列に対して実質的に相同であろう。好ましくは、GAD65 配列はヒト起源のものであるが、しかし他の種のGAD65 配列もまた使用され得る。実質的に相同のポリペプチドとは、ヒトランゲルハンス島GAD 配列のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85％の相同性、好ましくは少なくとも90％及びより好ましくは少なくとも約95％又はそれ以上の相同性を有し、そして生来のGAD の少なくともいくらかの生物学的活性をまだ保持しているそれらの配列を包含することを意味する。生物学的特性とは、Ｌ−グルタミン酸の脱炭酸を触媒し、生来のヒトランゲルハンス島細胞GAD タンパク質に結合する抗体（すなわちヒトランゲルハンス島細胞GAD に対する自己抗体）を特異的に結合し、そして／又は生来のタンパク質にまた結合する抗体を誘発する能力を意味する。本発明のポリペプチドが完全なGAD タンパク質よりも少ないタンパク質を含んで成る場合、そのポリペプチドは好ましくは、GAD65 タンパク質の所望する領域の少なくとも約10個、より通常には少なくとも約15個のアミノ酸の部分に対して実質的に相同であろう。たとえば、一定の配列ドメインは可変的であり、他の組織及び／又は種のGAD の類似領域から少なくとも約15％、より典型的には少なくとも約20％異なり、ところがランゲルハンス島細胞GAD の他の領域は他のGAD に対して同一であるか又はほぼ同一であり、そして従って、保存された領域を表わす。ヒトランゲルハンス島細胞GAD 及びその相同体の保存され、そして種々の配列領域は、当業者に知られている技法、たとえば配列整合（Dequen ce alignment）技法により決定され得る。当業者により認識されるであろうように、本発明の部分として発現されるGAD6 5 はまた、アミノ酸配列又は他の性質においてわずかなバリエーションを有するそれらのGAD65 ポリペプチドも包含する。そのようなバリエーションは、対立遺伝子バリエーション（たとえば遺伝子多型現象による）として天然に存在することができ、又はヒト介在（たとえばクローン化された DNA配列の突然変異誘発による）、たとえば誘発された点、欠失、挿入及び置換変異体により生成され得る。アミノ酸配列におけるマイナーな変更、たとえば保存性アミノ酸置換、小さな内部欠失又は挿入、及び分子の末端での付加又は欠失が一般的に好ましい。置換は、たとえばDayhoff など、(Atlas of Protein Sequence and Structure 1978, Nat'l Bromed．Res．Found.，Washingt on，D.C.)のモデルに基づいて企画され得る。それらの修飾は、アミノ酸配列の変化をもたらし、サイレント突然変異を付与し、制限部位を修飾し、又は他の特定の突然変異を付与することができる。ポリペプチドは、GAD65 の１又は複数の選択された抗原決定基を含んで成り、生来のGAD65 タンパク質により示される触媒活性を有し、又は他方では、そのような活性を欠いており、GAD65 結合領域を模倣し、又は同様のものであり得る。本発明においては、メチロトローフ性酵母においてGAD65 を発現するための発現ベクター又は DNA構造体は、メチロトローフ性酵母において機能的GAD65 ポリペプチドを発現するためにお互いと作用可能に連結されたセグメントを含んで成る。DNA構造体は、メタノール調節されたメチロトローフ性酵母プロモーターセグメント、GAD65 をコードするセグメント、及び転写ターミネーターを含んで成る。従って、GAD65 コードセグメントは、プロモーター領域の調節下で転写体に転写され翻訳に基づいて、所望のGAD65 ポリペプチドを提供することができる。 DNA構造体はまた、本明細書に記載されるように、細胞においてその複製を可能にする配列、及び選択マーカーも含むことができる。GAD65 は分泌され又は細胞内に存在し、そして好ましくは細胞内に存在する。分泌のためには、シグナル配列、たとえばアメリカ特許第5,324,639 号及びVedvick など、J ．Ind．Microbio l. 7 ; 197-201(1991)(引用により本明細書に組込まれる)に記載されるように、Ｓ．セレビシアエプレプロα複合因子（MFαプレプロ）リーダー配列が提供され得る。 GAD65 をコードする DNA配列を含む DNA構造体は、たとえば細胞壁の酵素消化により生成されたスフェロプラストを形質転換することによって、メチロトローフ性酵母細胞の実質的に純粋な培養物中に導入され得る。形質転換性DNAは、カルシウムイオン及びポリエチレングリコールの存在下でインキュベートされ、次に細胞壁が選択増殖培地において再生される。たとえば、Stroman など、アメリカ特許第4,879,231 号（引用により本明細書に組込まれる）を参照のこと。塩化リチウム又は硫酸リチウムの緩衝溶液におけるピチア属のメチロトローフ性種の完全な細胞の形質転換は、Cregg など、アメリカ特許第4,949,555 号（引用により本明細書に組込まれる）に記載されている。酵母細胞中にクローン化された D NA配列を導入するための他の技法、たとえばエレクトロポレーション(Neumann など、EMBO J．1 : 841-845，1982)がまた使用され得る。この後者の方法によれば、細胞は富化培地において増殖され、次に水により２度及び1.2 Ｍのソルビトールにより１度、洗浄される。次に、細胞は、1.2 Ｍのソルビトールにおいて約 100 倍に濃縮される。DNAがそれらの“コンピテント”細胞に添加され、次にこれが1.5 Ｖ，25μＦ及び200 Ωで、標準の２mmエレクトロポレーションキュベットにおいてパルスされる。Ｐ．メタノリカの形質転換のためには、エレクトロポレーションは驚くべきことには、細胞が2.5 〜4.5 KV／cmの場強さ及び１〜40ｍ秒の時定数（Ｊ）を有する指数的に減衰する、パルスされた電場に暴露される場合、効果的であることが見出された。時定数Ｊは、Voleの値に低下するために初期ピーク電圧Ｖ_oのために必要とされる時間として定義される。時定数は、合計抵抗、及びパルス回路のキャパシタンスの積、すなわちＪ＝RXC として計算され得る。典型的には、抵抗及びキャパシタンスは、選択されるエレクトロポレーション装置に依存して、予備設定され、又は使用者により選択され得る。エレクトロポレーションプロトコールは、USSN08／683,500(引用により本明細書に組込まれる)に記載される。パルスされた細胞は、HIS４選択マーカーを用いる場合、標準の選択培地、たとえばヒスチジンを欠いている最少プレート上にプレートされる。宿主細胞の一級アルコールオキシダーゼ遺伝子は、Cregg、アメリカ特許第4,882,279 号（引用により本明細書に組込まれる）に記載されるように、特定部位の突然変異誘発又は同様の手段を用いて破壊され得る。陽性形質転換体は、DNA組込みの部位のためにはサザンブロット分析（Sambrookなど、Nolecular Cloning, A Laborator y Manual ，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY（1 989）（引用により本明細書に組込まれる））、メタノール応答性GAD65 遺伝子発現のためにはノザンブロット分析、及びGAD65 が分泌される場合、破壊された細胞又は培養培地におけるGAD65 の存在については、ウエスターンブロット又は同様の手段により特徴づけられる。高い生産性の形質転換体をスクリーニングするためにはウエスターンブロットを用いることが好ましい。次に、安定性試験が、典型的には、均等な発現レベルについて1,000 個のコロニーをアッセイすることによって実施される。次に、高い収率の安定した形質転換体が、さらなる開発のために選択される。メチロトローフ性酵母におけるGAD65発現の安定性を最大にするためには、GAD 65 発現ベクターが宿主細胞ゲノム中に組込まれ、完全な形質転換体が生成される。たとえば、宿主ゲノムにより共有される配列内のベクター、たとえば AOX １ HIS ４、等の切断は、そのゲノム遺伝子座にベクターの組込みを標的決定する相同組換え現象を剌激する。非相同遺伝子カセットの複数の組込まれたコピーによりＰ．パストリス株を構成するための方法がまた、アメリカ特許第4,895,800 号（引用により、本明細書に組込まれる）に記載されている。複数コピー発現株はまた、GAD65 をコードする遺伝子の複数コピーを有する形質転換体についてコロニードット−ブロットハイブリダイゼーションにより形質転換された細胞集団をスクリーニングすることによって（たとえば、Romano s など、Vaccine 9 : 901-906(1991)、引用により本明細書に組込まれる）、又は形質転換の前、複数の発現カセットコピーを単一のベクター中に導入することによっても同定され得る。完全な形質転換体が、タンパク質生成工程への使用のために好ましい。そのような細胞は、DNAがまれにゲノムから失われないので、連続した選択圧力を伴わないで増殖され得る。手短に言及すれば、形質転換された、及び形質転換されていない宿主 DNAが制限エンドヌクレアーゼにより消化され、電気泳動により分離され、支持膜にブロットされ、そして適切な宿主 DNAセグメントによりプローブされる。形質転換されていない及び形質転換された細胞に見出されるフラグメントのパターンの差異は、完全な形質転換の表示である。制限酵素及びプローブは、ゲノムフラグメント間から形質転換性 DNAセグメント（たとえばプロモーター、ターミネーター、非相同 DNA及び選択マーカー配列）を同定するために選択され得る。本発明の DNA構造体を含む宿主細胞が組換えGAD65 を生成するために培養される。前記細胞は、メチロトローフ性酵母の増殖のために必要とされる栄養物を含む培養培地、たとえば過剰の非誘導性炭素源（たとえばグリセロール）を有する定義された最少培地において、許容される方法に従って培養される。培養培地は一般的に、DNA構造体に対する選択マーカーにより補足される必須栄養物における薬物選択又は欠失により、DNA構成体を含む細胞について選択するであろう。GAD65 の発現は、メタノール応答性プロモーターを抑制解除するために、非誘発性炭素源を制限することによって、及び好ましくは誘発性炭素源、たとえばメタノールを添加することによって誘導される。GAD65 の発現のために特に十分に適切である形質転換された細胞（特に、高く且つ安定した発現レベルを示す細胞）は、典型的には、発現されるGAD65 及びそのGAD65 活性のレベルに基づいて選択され、そして次に継代培養される。高レベルのGAD 生成についての好ましいアッセイ方法は、タンパク質ブロティング（ Towbinなど、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 76 : 4350-4354（1979）、続く免疫染色による。理論により拘束されることは所望しないが、高レベルの発現は複数コピー組込みにたぶん起因し、ここで形質転換遺伝子のいくつかのコピーが宿主ゲノム中に組込んでいる（Romanosなど、Yeast 8 : 423-488(1992)を参照のこと）。本発明に従ってGAD65 を多量に生産するためには、GAD65 を発現する形質転換された細胞が典型的には、発酵槽において増殖される。メチロトローフ性酵母における、組換えDNA に基づくGAD65 の大規模生成のためには、フェド−バッチ(f ed-batch)又は連続培養が使用され得る。典型的には、三段階高細胞密度フェドバッチ発酵系が用いられる。最初又は増殖段階において、発現宿主が過剰の非誘導性炭素源（たとえばグリセロール）を有する定義された最少培地において培養される。そのような炭素源上で増殖される場合、非相同遺伝子発現が抑制され、 GAD65 の不在下での細胞マスの生成を可能にされる。この段階で、培地のpHは、約4.5 〜5.5、好ましくは約5.0 ±0.1 で維持される。次に、短時間の非誘導性炭素源制限が、細胞マスをさらに高め、そしてメタノール応答性プロモーターを抑制解除するために使用される。この段階の間の培地のpHは、生成相の間、維持されるpHに調節され、そしてこれは一般的に、約4.5 〜5.5 のpH、好ましくは約5.0 のpHで実施される。限定条件下での増殖の期間に続いて、生成段階の間、メタノールのみ、又は限定量の非誘発性炭素源及びメタノールが添加され、メタノール応答性プロモーターにより駆動されるGAD65 遺伝子の発現が誘発される。他方では、Ｐ．メタノリカの生成規模培養のためには、高生成物クローンの新鮮な培養物が振盪フラスコにおいて調製される。次に、その得られる培養物が発酵器における培養培地を接種するために使用される。典型的には、激しい撹拌を伴って１〜２日間、30℃で増殖されたYEPDにおける培養物500 mlを用いて、５ｌの発酵体を接種する。細胞が、塩、グルコース、ビオチン及び微量元素を含む適切な培地において、28℃，pH5.0 及び30％以上の溶解されたＯ₂下で増殖される。初期充填のグルコースが消費された後（酸素消費の低下により示されるように）、グルコール／メタノール供給物が興味あるタンパク質の生成を誘導するために容器中に供給される。大規模発酵が制限炭素の条件下で実施されるので、前記供給物におけるグルコースの存在はメタノール−誘導性プロモーターを抑制しない。グルコース−制限された条件下でのメタノールと組合してのグルコースの使用は、メタノール−誘導性遺伝子プロモーターの十分な誘導をまだ供給しながら、急速な増殖、バイオマスへの炭素の効果的な転換、及び生理学的増殖状態における急速な変化を生成する。典型的な発酵実験においては、１ｌ当たり約80〜約 400 ｇの湿潤細胞ペーストの細胞密度が得られる。“湿潤細胞ペースト”とは、典型的には、培養物の遠心分離により発酵器から細胞を収穫することによって得られる細胞マスを意味する。使用される発現ベクターに依存して、GAD65 は培養培地中に分泌され、そして次に精製され、又はそれが細胞内タンパク質である場合、それは酵母細胞から抽出されるべきである。GAD65 におけるスルフヒドリル基の数の観点においては、細胞内生成が典型的には好ましい。酵母からGAD65 を抽出するためには、細胞が微粉砕され（典型的にはガラスビースを用いて）、又は他方では、溶解され、ここで通常、細胞は、たとえば約４〜７℃で又はそれ以下での急冷を維持される。好ましくは、プロテアーゼインヒビター；還元剤、たとえばジチオトレイトール又は２−メルカプトエタノール；及び界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤、たとえばTRITON X-144（ポリエチレングリコールtert−オクチルフェニルエーテル）、TRITON X-100（ポリエチレングリコールモノ〔Ｐ−（１，１，３，３− テトラメチル−ブチル）フェニル〕エーテル）（TRITONはUnion Carbide の登録商標である）を約0.5 〜20％（体積／体積）の濃度で含む、約7.0 〜7.2 のpHに調節された抽出緩衝液が使用される。この緩衝液（但し、プロテアーゼインヒビターを含まない）はまた、続く精製段階に使用され得る。 GAD65 の精製は、従来の化学精製手段、たとえば中でも液体クロマトグラフィー、イムノアフィニティークロマトグラフィー、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、グラジエント遠心分離及びゲル電気泳動により達成され得る。タンパク質精製の方法は一般的に、たとえばScopes，R.，Protein Purification， Springer-Verlag，NY(1982)に記載されており、そしてＰ．パストリスに関して、一般的な精製プロトコールは、Clegg など、Bio/Technol. 11 : 905-910(1993 )に記載されている（前記文献は引用により本明細書に組込まれる）。還元剤、たとえばDTT 又は同様のもの、非イオン性界面活性剤及びリン酸緩衝剤は、精製されたGAD65 の安定性を維持するために精製工程のほとんどの段階を通して存在することが好ましい。活性形でのGAD65 の精製のための好ましい手段においては、一連の精製段階が供用される。細胞抽出物は典型的には重度に、粒状物質を有するので、予備・精製又は分離、たとえば水性相及び界面活性剤相(GAD65を含む)中への相分割が使用される。従って、精製工程の初期部分は、GAD65 を含む粗細胞抽出物（又は細胞画分）の調製、抽出物の透明化（たとえば遠心分離による）、及び相分割によるGAD65 の分離のように広く要約され得る。たとえば、相分割は温度を約30℃に上昇せしめ、次に抽出物を遠心分離により誘発され得、そしてGAD65 を含む界面活性剤相が残る水性相から分離される。次に、水性相が所望により再抽出され得る。Bordier, J ．Biol．Chem．256 : 1604-1607(1981)を参照のこと。相分割のもう１つの方法は、1.0 ＭのNaClに抽出物を調節し、そしてそれをフェニルSeph 結合し、そして水により溶離される。相分割による抽出物の調製に続いて、GAD65 がアニオン変換クロマトグラフィー、カチオン変換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーの組合せを用いて抽出物から精製される。GAD65 は、アニオン交換媒体に結合することが見出されており、ところが汚染物はカチオン変換媒体に選択的に結合する。メチロトローフ性酵母において生成されるGAD65 は典型的にはアルコールオキシダーゼにより汚染され、これはアニオン交換クロマトグラフィーにより、特に強いアニオン変換体（たとえば第四アンモニウム基を有する媒体）上でのクロマトグラフィーにより除去される。種々のイオン交換媒体が当業界において知られており、そして商業的供給者から入手できる。そのような媒体は典型的には、デオストラン、架橋されたアガロース、又は類似する材料から構成される樹脂ビーズの形で存在する。イオン交換媒体は典型的には、分別されるべき材料が溶液として供給されるカラムにおいて調製される。本発明においては、弱いアニオン交換体、たとえばDEAE（ジエチルアミノエチル）又はQAE(第四アンノエチル)基を含むものを用いて（但し、強いアニオン交換体もまた使用され得るけれども）、抽出物をまず分別することが好ましい。GA D65 はひじょうに低いイオン強度の条件下でそのような媒体に結合し、そしてより高いイオン強度の緩衝液（約50〜200 mMのNaClに等しい）により溶離され得る。次に、GAD65 含有溶離物がカチオン交換カラム、たとえば汚染物を選択的に結合するカルボキシメチル又はスルホプロピル基を含む媒体に適用される。結果的に、好ましくは、強いアニオン交換体を用いてのアニオン交換クロマトグラフィーが、アルコールオキシダーゼを除去するために使用される。第２アニオン交換段階からのGAD65 含有溶離物がヒドロキシアパタイトに適用され、そしてGAD65 がリン酸カリウムにより溶離される。それらの分別段階の特に好ましい態様は、下記により詳細に記載される。好ましい第１のアニオン交換のクロマトグラフィー段階は、DEAE（ジエチルアミノエチル）クロマトグラフィーを用いる。DEAEカラ ay，NJ）がサンプル緩衝液により平衡化され、そしてカラムへの界面活性剤相GA D65-含有サンプルの適用の前、サンプルがプロテアーゼインヒビター含有緩衝液において希釈され、相分別段階から存在する粒状物を除去するために約５℃で遠心分離され得る。次に、希釈されたサンプルがDEAEカラムに適用され、カラムが緩衝液により洗浄され、そしてGAD65 が塩溶液−含有グラジエント（たとえば0. 8 ＭのNaCl）により溶離される。GAD65 がウェスターンブロットにおいてGAD65- 特異的モノクローナル抗体により検出され（50〜200 mMのNaClからの広いバンドとして溶離する）、そしてGAD65 画分が所望によりプールされる。本発明の好ましい態様においては、DEAE精製段階からの精製されたGAD65 は、還元剤及び界面活性剤、たとえばDTT 及びTriton X-114を含み、そしてさらに、アミノエチル−イソチオウロニウムブロミド臭酸塩、モルホリノエタンスルホン酸、EDTA及びプロテアーゼインヒビター、たとえば初期抽出工程に存在するものを含む緩衝液に対して、pH≧6.0、好ましくは約6.0 〜6.4 のpHで、より好ましくは約6.2 のpHで透析される。次に、透析されたGAD65 は、S-Se もの上を通される。GAD65 はサンプル負荷の間、カラムを通過し、そして通過物が集められる。 7.8 〜8.2 のpH、好ましくは8.0 のpHに調節され、そして約8.0 のムに適用される（たとえば、20mMのトリス、20mMのMES，20 mMのMOPS，５mMのED TA，１mMのDTT，１mMのAET，20 μｍのピリドキサールリン酸、0.2 ％のTriton X-114及び20mMの酢酸の緩衝液（pH8.0 にNaOHにより調節されている））。カラムが前記緩衝液により洗浄され、そして洗浄が終結される場合、グラジエントが pH8.0 の緩衝液と5.7 以下、好ましくは約3.5 〜5.0、より好ましくは約4.26のp Hを有する同じ緩衝液との間で進行される。もう１つの態様においては、pHグラジエントが、所望するpH範囲にわたって異なったpHを有する多くの緩衝液を含んで成る溶離剤を用いて進行される。たとえば、pH８〜pH５のグラジエントは、約８，７，６及び５のpkを有する緩衝液の組合せを用いて進行され得る。そのようなシステムは、所望するpH範囲にわたって均等なグラジエントの進行を可能にする。GAD65 は、高い色原体の汚染物（アルコールオキシダーゼ）が 5 含有画分がpH7.0 にすばやく調節され、そして還元剤及び界面活性剤を有するリン酸緩衝液（たとえば、10mMのリン酸カリウム、５mMのDTT，５mMのEDTA，１m MのAET，20 μＭのピリドキサールリン酸及び0.2 ％のTriton X-114を含む）に対して透析される。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、好ましいGAD65 精製プロトコールにおいて使用される。たとえば、１つの態様においては、プールされたQ-Seph arose 精製からのGAD65 が、Q-Sepharose 精製からの透析された材料と実質的に同じ緩衝液、たとえば還元剤及び界面活性剤を含む、pH7.0 のリン酸緩衝液により平衡化されたヒドロキシアパタイトのカラム上に負荷される。結合されたGAD6 5 はリン酸塩、典型的には、リン酸カリウム又はリン酸ナトリウムのグラジエントにより溶離する。GAD65 はほとんどすぐに溶離し始め、そしてピークは典型的には、長い尾が付随する。これは実質的に精製されたGAD である。もう１つの精製プロトコールにおいては、最初のアニオン交換段階か、界面活性剤及び水性画分中へ相分割の前、初期の精製段階として使用される。前記方法に対する変法がまた、最初のアニオン交換に続いて、及び相分割の前、サンプルの純度を高めるために使用され得る。１つの変法は、アニオン交換層の溶離の間、一連の“後カラム”の付加を用いる。後カラムは、セラミック性ヒドロキシアパタイト（Bio-Rad Laboratories）であり得る。溶離条件のわずかな変法は、後カラムによる溶離流路からの追加のタンパク質除去を可能にしながら、両マトリックスを通してのGAD65 溶離を可能にする。溶離条件に対する変法は、NaClの代わりにリン酸カリウムを用いて溶離緩衝液のイオン強度を0.4 Ｍに増大することを包含する。この変性された溶離緩衝液は、ヒドロキシアパタイトマトリックスへのGAD65 の結合を阻害し、そして汚染タンパク質を除去する。合計タンパク質負荷量のその得られる低下は、相分割を促進する。高温による相分割の誘発に基づいて、上部の消耗された相及び関連するタンパク質は、溶媒方法(H₂O)の上昇を経験し、これが上部相から相界面上及び／又は相界面中への界面活性可溶性汚染物の落下を引き起こす。これは、相界面の可視化を不明確にし、そして縮合された相の一部を物理的に汚染することによって、低部相におけるGAD65 の正確且つ完全な収穫を最小にすることができる。この観点と取り組むために、他の界面活性剤、たとえばTriton X-114及びTriton X-45 から成る二元界面活性剤システムを用いる冷縮合法が使用され得る。Triton X-4 5 のモル割合を高めることによって、そのシステムは０〜５℃ほどの低い温度で曇り／分割するよう強制され得、そして上部相から低部相に落下する汚染物の効果を減じることができる。他方では、縮合されたTX-114相が30％グリセロール及び下記の標準の２％TX-114一次GAD の緩衝液(PGB)システムを用いることによって、消耗された相の上部に浮動され得る。30％グリセロールの包含は、縮合されたTriton相よりも界面活性消耗された相をより濃くし、その結果、Triton相が上部相になり、縮合された相中へのいづれかの汚染沈澱の効果を無効にする。もう１つの変法においては、Triton濃度がこの段階で２％から４％に高められる。縮合の前、Triton濃度を二倍にすることは、縮合された相の体積を二倍にし、それにより、同じ界面汚染がより大きな合計体積の縮合された相上で生じるにつれて収穫物におけるGAD65 の損失を最少にし、低相の収集の間、分別損失を最少にする。合計の縮合された相の上昇は、GAD6 5 のための見掛けのトランスファー率を高めることができ、この段階での利用できるGAD65 のより完全な回収をもたらす。もう１つの精製プロトコールにおいては、上記のカチオン変換段階が削除され得る。相分割段階からのGAD65 含有界面活性剤相が、第２のアニオン変換クロマトグラフィー段階、続くヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより、上記で概略されたようにしてさらに精製される。好ましい精製プロトコールに従って調製される場合、GAD65 特異的活性は、少なくとも約0.12単位／mg〜0.47単位／mg又はそれ以上に変化する（活性の単位は、基質として放射性ラベルされたグルタミン酸を用いてタンパク質１mg当たり・１分当たり発生されたCO₂のμモルである）。クーマシーブルー染色されたゲルは、α及びβGAD バンド、並びに微量レベルのダイマー及びほんのわずかな量のいくつかの分解フラグメントを示す。従って、上記のように、本発明はメチロトローフ性酵母から単離された組換え GAD65 を供給する。多量での及び高い酵素活性を有する精製されたGAD65 がまた供給される。好ましくは少なくとも約70〜80％、より好ましくは約90〜95％、及び最も好ましくは96〜99％の実質的に純粋なGAD65 が、医薬及び診断用途のために特に好ましい。所望により、部分的に又は均質性に精製されるとすぐに、組換えGAD65 は、抗−GAD65 自己抗体についてのアッセイ法、等において、抗体を生成するために使用され得る。そのような方法は、たとえばPCT 公開WO92／20811 号（引用により本明細書に組込まれる）に記載される。次の例は、例示的であって、本発明を限定するものではない。例１Ｐ．パストリスにおけるGAD65 の発現ピチアパストリスGAD65 発現ベクターを、プラスミドPHIL−D2(Invitrogen Corp.，San Diego，CA中に、Sacl-Xbal GAD65 cDNAフラグメント(Karlsenなど、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA ，88 : 8337-8341(1991))をサブクローニングすることにより構成した。GAD65 cDNAフラグメントをT4DNA ポリメラーゼによりブラント末端化し、そしてpHIL-D2 の（ブラント末端化された）Eco RI部位中に挿入した。pCZR65として命名されたその得られるプラスミドを、NotＩによる消化により線状化し、そしてプラスミド10μｇを用いて、Ｐ．パストリス株GS115(His^- )(Invitogen Corp.)〜 His⁺を、供給者(Invitrogen Corp.)により明記されるエレクトロポレーションプロトコールを用いて形質転換した。 His⁺コロニーを、メタノールを含む寒天培地（１％のメタノール、２％の寒天 (Difco Laboratories，Detroit，MI)、１×酵母窒素基材(Difco)、400 μｇ／ml のビオチン）上にプレートし、ニトロセルロースフィルターにより被覆し、そして30℃で48時間インキュベートした。それに付着する酵母コロニーを有する前記ニトロセルロースを、0.2 ＮのNaOH／１％のSDS により30分間、処理し、細胞を溶解した。次に、前記フィルターをNFM-TTBS(20mMのトリス(pH7.5)における５％脱脂ミルク粉末、160 mMのNaCl，0.1 ％のTween20)によりブロックし、GAD６抗体、すなわちGAD65に対して特異的なモノクローナル抗体により１時間プローブし（Chang and Gottlieb，J ．Neurosci.，8 : 2123-2130(1988)）、次にホースラディシュペルオキシダーゼ−接合されたヤギ抗−ウサギポリクローナル抗体（ The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）により１時間プローブした。陽性シグナルを、増強された化学ルミネセンス(Amersham Corp.，Arlington Heights， IL)及びオートラジオグラフィーにより可視化した。His⁺コロニーの約20％が、GAD65 を発現することが見出された。スクリーンされた数百のコロニーのうち、１〜２％が、イムノアッセイにおける化学ルミネセンスのレベルにより決定される場合、高められたレベルのGAD65 を生成するように思えた。それらのコロニーのうち14のコロニーがさらなる分析のために選択された。それらを、５mlの最少メタノールブイヨン（１×酵母窒素基材（Difco），400 μｇ／mlのビオチン、１％のメタノール）、又は５mlの最少グルコースブイヨン（１×酵母窒素基材(Difco)，400 μｇ／mlのビオチン、１％のグルコース）において48時間、培養した。細胞を収穫し、そして溶解緩衝液（５％SDS，８Ｍの尿素、100 mMのトリス、pH6.8,2 mMのEDTA，10％のグリセロール）におけるガラスビーズにより破壊した。タンパク質濃度を、Lowry など、(J ．Biol．Chem．193 : 265-275(1951))の方法により測定した。個々の株からのタンパク質１μｇを、SDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてニトロセルロースに移した(“Western”ブロッティング；Towbinなど、Proc ．Natl ．Acad．Sci．USA ，76 : 4350-4354(1979))。ブロットを、上記のようにして GA D６抗体により進行せしめた。GAD４と命名された１つの株は最高レベルのGAD65 を製造し、そしてさらなる分析のために選択した。Ｐ．パストリス GAD４によるGAD65 の生成のために、前記株を、非誘発性グルコース（Ｇ）又は誘発性メタノール（Ｍ）において上記のようにして増殖せしめた。10μｇの合計タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、そしてクーマシーブリリアントブルーにより染色した。１μｇの合計タンパク質により負荷された類似するゲルを、ニトロセルロースにブロットし、そして GAD６抗体によりプローブした。その結果は、メタノールがこの株においてGAD65 の発現を強く誘発したことを示した。例２Ｐ．パストリスからのGAD65 の精製例１に記載されるようなGAD65 を発現する酵母からGAD65 を抽出するために、酵母をDYNO−MILLにおいて、５℃で又は５℃以下での急冷を維持しながら、微粉砕した。抽出緩衝液は、プロテアーゼインヒビター及び界面活性剤Triton X-114 を含んだ。緩衝液成分は、40mMのHEPES，５mMのDTT，５mMのEDTA，20mMのピリドキサールリン酸（PL），１mMのアミノエチルイソチオウロニウムブロミド臭酸塩 (AET)，20％（ｗ／ｖ）の予備縮合されたTriton X-114，25μｇ／mlのアプロチニン、５μｇ／mlのロイペプチン、５μｇ／mlのペプスタチン、及び0.1 mMのPM SFであった。緩衝液をpH7.2 に調節した。２％の予備縮合されたTriton X-114を有するが、しかしプロテアーゼインヒビターを含まないこの緩衝液は、続くクロマトグラフィー段階に使用される一次緩衝液であり、そして標準のGAD 緩衝液又は SGBとして本明細書において言及される。微粉砕された抽出物を、粒状物質により重度に負荷した。相分割を、サンプルを通して均等な温度を達成するために十分に長く30℃にサンプル温度を高めることによって誘発した。次に、サンプルを、4000xgで10分間、30℃で遠心分離した。GAD を含む底部の油状相を、サイホンで吸い取り、そして残る水性相を再抽出した。再抽出を、水性相を10％（ｗ／ｖ）の予備縮合されたTriton X-114に導き、そしてそれを熱サイクル及び遠心分離工程を通して再び取ることによって行なった。GAD を含む第２の界面活性剤相を、第１のものと組合した。 rmacia Biotech)カラムを用いて、１つの５ｌ発酵の処理に起因するタンパク質充填材料を処理した。カラムを上記SGB により平衡化した。界面活性剤相GAD-含有サンプルを適用する前、それをプロテアーゼインヒビターによりSGB において１：５に希釈し、そして4000xgで30分間、５℃で遠心分離した。これは、相分割段階の間に収穫された粒状物を除去した。次に、希釈され、回転せしめられたサンプルを、カラムに20ml／分で適用した。充填が実結された場合、カラムを出発緩衝液(SGB)により洗浄した。ODが基線に戻った時、S GB と0.8 ＭのNaClを含むSGB との間で形成される９ｌのグラジエントを開始した。GAD65(ウエスターンブロットにおいて GAD６モノクローナル抗体により検出される)が、50−200 mMのNaClから広いバンドとして溶離した。サンプルをウエスターンブロット及びクーマンーブルー染色されたゲルによりアッセイし、そしてGAD65 を含む画分をプールした。 DEAE段階からのプールされた材料を、次の成分：５mMのMES(モルホリノエタンスルホン酸)；５mMのEDTA；５mMのジチオトレイトール(DTT)；１mMのAET；0.2 ％のTriton X-114；及び上記の初期微粉砕工程に存在するプロテアーゼインヒビターを、それらのそれぞれの濃度で含むpH6.2 の緩衝液に対しての透析により、 S-Sepharos 透析されたタンパク質の導電率は、約１ミリセイメン(milliSeimen)であった。次に、タンパク質を、同じ緩衝液により前もって平階は、サンプル負荷の間、GAD65 がカラムを通過する場合、“負の結合”段階であった。“通過物”が収集され、そして保存された。そして２ＮのNaOHによりそのpHを8.0 のpHに注意して調節することの材料の導電率は約2.35ミリセイメンであった。220 mlのQ-Sephar ose カラムを、次の緩衝液により充填し、そして平衡化した：緩衝液Ａ：pH＝8. 0 ；20mMのトリス；20mMのMES ; 20mMのMOPS；５mMのEDTA；１mMのDTT ；１mMの AET ；20μＭのピリドキサールリン酸（PL）；0.2 ％のTriton X-114；及び20mM の酢酸。この緩衝液は、NaOHによりpH8.0 に調節され、そして4.5 ミリセイメンの導電率を有した。続いて、カラムを250 mlの緩衝液Ａにより洗浄した。洗浄が終結された場合、２ｌのグラジエントを、緩衝液Ａ(pH＝8.0)と緩衝液Ｂ（4.26のpHを有する緩衝液Ａ）との間で進行せしめた。GAD は、高い色原体の汚染物（アルコールオキシダーゼ）が溶離する直前に、やく、pH7.0 に調節し、そして精製の最終段階のための調製において、前記画分を、10mMのリン酸カリウム、５mMのDTT,５mMのEDTA，１mMのAET，20 μＭのピリドキサールリン酸及び0.2 ％のTriton X-114を含む緩衝液に対して透析した。この点での速度は、不安定でリン酸から溶離する濃縮されたGAD として重要であった。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのために、プールされ階からの透析された材料と同じ緩衝液により平衡化された100 mlのヒドロキシアパタイトカラム上に負荷した。結合されたGAD65 を、10mMのリン酸カリウム、５ mMのDTT,５mMのEDTA，１mMのAET，20 μＭのピリドキサールリン酸及び0.2 ％の Triton X-114(pH6.8)の緩衝液250 mlと、150 mMのリン酸カリウムを含む同じ緩衝液250 mlとの間で形成されるリン酸カリウムのグラジエントにより溶離した。 GAD65 はほとんどすぐに溶離を開始し、そしてピークには長い尾が付随した。これは実質的に精製されたGAD であった。それ自体調製される場合、酵素比活性は、0.12単位／mgから0.47単位／mgに変化した（活性の単位は、基質として放射性ラベルされたグルタミン酸によりタンパク質１mg・分当たりに生成されるCO₂のμモルである）。クーマシーブルー染色されたゲルは、α及びβGAD バンド、及び微量レベルのダイマー、並びにほんのわずかな量のいくつかの分解フラグメントを示した。 GAD65 の酵素活性を、Wnなど、Methods Enzymol. 113 : 3-11(1985)の方法を用いてアッセイした。1.5 mlの管に、21μｌの冷グルタミン酸原液（アッセイ緩衝液において５mM）、８μｌのＬ−（１−¹⁴Ｃ）グルタミン酸（Amersham Corp. ，Arlington Heights，IL），71μｌのアッセイ緩衝液(50mMのリン酸カリウム、 pH7.2,5 mMのジチオトレイトール、１％のTriton X-114，１mMの１−アミノエチルイソチオウロニウムブロミド(Sigma Chemical Co.，St．Louis, MO)及び0.2 m Mのピクドキサールリン酸(Sigma))を添加した。反応を、アッセイ緩衝液（37℃ に予備平衡化されている）中、サンプル50μｌを添加することによって開始せしめた。50mlのHyamine 塩基(Packard Instrument Co.，Meriden，CT)を、管のフタに配置されるフィルターディスク（Whatman，Inc.，Clifton，NJ）中にピペットで添加した。次に、管をフタし、そして37℃で２時間、次に４℃で60分間インキュベートした。フィルターを、２mlのシンチレーション液体(Ultima Gold^TM， Packard Instrument，Co.)に移し、そより計数した。サンプルを、既知量のGAD を用いて調製された標準曲線の直線範囲に存在するよう希釈した。１酵素単位を、37℃で１分当たりに形成される１μ モルの生成物として定義した。結果（表１）を、アッセイにおける放射性ラベルされたグルタミン酸塩に対するアッセイにおける合計のグルタミン酸塩の比から決定された換算係数により調節した。例３Ｐ．メタノリカにおけるGAD65 の発現Ａ．Ｐ．メタノリカ細胞(American Type Culture Collection，Rockville，MD からの菌株CBS6515)を、UV照射により突然変異誘発した。致死曲線をまず、約2 00 〜250 個の細胞／プレートでいくつかのプレート上に細胞をプレートすることによって生成した。次に、プレートを、表２に示されるように一定時間、プレートの表面から25cmの場所にて示されたG8T5殺菌用ランプ(Sylvania)を用いてUV 線に照射した。次に、プレートを、可視源から保護し、そして30℃で２日間インキュベートした。次に、大規模突然変異誘発を２秒UV照射を用いて行ない、約20％の細胞を殺した。細胞を、８種のYEPDプレート上に約10⁴個の細胞／プレートでプレート（表３）、ここで前記プレートは同起源栄養不足を有する可能性ある栄養要求株の増殖を補充するために添加される、それぞれ100 mg／ｌのウラシル、アデニン及びロイシンにより補充されている。（Ｐ．メタノリカ栄養要求変異体の調製はまた、引用により本明細書に組込まれる、1996年８月26日に出願された自身の出願ドケット番号96−17にも記載されている。）UV照射に続いて、プレートを箔に包み、そして30℃で一晩インキュベートした。次の日、プレート上のコロニー（合計約10⁵個）を水に再懸濁し、そして水により１度洗浄した。0.1 〜0.2 のOD₆₀₀を付与するために十分な多量の細胞懸濁液を用いて、１％グルコース及び400 ｇ／ｌのビオチンにより補充されているが、アミノ酸又はアンモニアを有さない、酵母窒素基材により製造された最少ブイヨン500 mlを接種した。培養物を2.8 ｌの調節されたBellフラスコに配置し、そして30℃で一晩、激しく振盪した。次の日、細胞は、約1.0 〜2.0 のOD₆₀₀に達した。細胞をペレット化し、そして５ｇ／ｌの硫酸アンモニウムにより補充された最少ブイヨン500 mlに再懸濁は、その細胞懸濁液を2.8 ｌの調節されたBellフラスコに配置し、そして30 ℃で６時間、激しく振盪した。培養物50mlを、対照として250 mlのフラスコに保留し、そして培養物の残りに、１mgのナイスタチン(nystatin)(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)を添加し、栄養要求変異体について選択した（Snow，Nature 211 : 206-207，1966）。培養物を、振盪しながら、さらに１時間インキュベートした。対照及びナイスチン処理された細胞を、遠心分離により収穫し、そして水により３度、洗浄した。洗浄された細胞を、1.0 のOD₆₀₀になるまで50％グリセロールに再懸濁し、そして凍結した。コロニー形成単位についてのナイスタチン処理された細胞vs．対照細胞の力価は、ナイスチン富化が生存細胞の数を10⁴ 倍、低めたことを示した。ナイスタチン−処理された細胞の10^-2希釈溶液を、15のYEPDプレート上にプレートした。コロニーを、最少プレート（２％寒天、１×YNB,２％グルコース、40 0 ｇ／ｌのビオチン）上にレプリカ−プレートした。栄養要求株の頻度は約２〜４％であった。約180 個の栄養要求性コロニーを、YEPD+Ade，Leu，Uraプレートに取り、そして種々のドロップアウトプレートにレプリカ−プレートした。栄養要求株のすべては、Ade^-であった。それらのうち30個を、ドロップアウトプレート（LEU D，HIS D,等；表３を参照のこと）上に取った。30個のピンク色の変異体のうち、21個を追加の研究のために選択し；残りはADE Ｄプレート上での増殖のために漏れやすく、又は野生型細胞により汚染された。次に、Ade^-変異体を、相補性分析及び表現型試験にゆだねた。前記変異体により定義される遺伝子座の数を決定するために、すべての21個の変異体を、単一のピンク色のAde^-試験株（株＃２）に接合した。接合は、細胞懸濁液(OD₆₀₀＝１) を混合し、そしてYEPDプレート上に10ｌのアリコートにおける前記混合物をプレートすることによって実施された。次に、細胞をSPOR培地(0.5％酢酸ナトリウム、１％KCl,１％グルコース、１％寒天)に複製し、そして30℃で一晩インキュベートした。次に、細胞を、表現型の評価のためにADE Ｄプレートにレプリカ−プレートした。表３に示されるように、変異体のいくつかの組合せは、Ade⁺コロニー（株＃２におけるのと同じ遺伝子座をたぶん定義する）を付与するのに失敗し、ところが他は種々のAde⁺コロニー（別の遺伝子座をたぶん定義する）を生ぜしめた。変異体＃３は、＃２に接合される場合、Ade⁺コロニーを付与するので、相補性試験を変異体＃３によりくり返した。変異体のグループが２種の遺伝子座を定義する場合、株＃２に接合される場合にAde⁺コロニーを付与するのに失敗したすべての変異体は、＃３に接合される場合、Ade⁺コロニーを付与するにちがいない。前記交雑の結果は、表４に示される。表４に示されるように、ほとんどの変異体は、２種のグループの１つに分類され、このことは、制限アデニン培地上でピンク色のコロニーをもたらす２種のアデニン生合成遺伝子が存在する認識と一致した。３種のコロニー（＃４，＃12、及び＃16）は、第３の遺伝子座を定義するか又は遺伝子間相補性を示すかのいづれかであり得る。２種の相補性グループ（＃３及び＃10；＃６及び＃11）の個々からの２種の強く着色された変異体を、さらなる特徴化のために選択した。さらなる分析は、Ade^-がそれらの株に存在する唯一の栄養要求株であったことを示した。Ｐ．メタノリカクローンバンクを、ベクターpRS426、すなわち２μ及びＳ．セレビシアエ URA３配列を含んで成るシャトルベクターにおいて構成し、Ｓ．セレビシアエにおけるその増殖を可能にした。ゲノム DNAを、標準の方法に従って、株CBS6515 から調製した。手短に言及すれば、細胞を富化培地において一晩、培養し、チモリアーゼ(zymolyase)によりスフェロプラスト化し、そしてSDS により溶解した。DNAをエタノールにより溶解物から沈澱せしめ、そしてフェノール／クロロホルム混合物により抽出し、次に酢酸アンモニウム及びエタノールにより沈澱せしめた。DNA調製物のゲル電気泳動は、損なわれていない高分子量 DNA 及び適切な量のRNA の存在を示した。前記 DNAを、酵素の一連の希釈溶液の存在下で DNAをインキュベートすることによって、Sun 3Aにより部分的に消化した。消化物のサンプルを電気泳動により分析し、フラグメントのサイズ分布を決定した。４〜12Kbを移動する DNAをゲルから切断し、そしてゲルスライスから抽出した。次に、サイズ分別された DNAを、BamHI により消化され、そしてアルカリホスファターゼにより処理されているpRS426に連結した。その反応混合物のアリコートを、製造業者により推薦されるようにしてBioRad Gene Pulser装置を用いて、Ｅ．コリMC1061細胞において電気泳動した。ゲノムライブラリーを用いて、Ｓ．セレビシアエ株HBY21A(ade2 ura3)をエレクトロポレーションにより形質転換した(Becker and Guarente，Mechods Enzymo l. 194 : 182-187，1991)。細胞を1.2Ｍのソルビトールに再懸濁し、そして６種の300 μｌアリコートを、ADE Ｄ，ADE DS，URA Ｄ及びURA DSプレート上にプレートした（表３）。プレートを30℃で４〜５日間インキュベートした。Ade⁺コロニーは、ADE Ｄ又はADE DSプレート上で回収されなかった。URA Ｄ及びURA DSプレートからのコロニーをADE Ｄプレートにレプリカ−プレートし、そして２種の密接に間隔をあけられた白色のコロニーを得た。それらのコロニーを再画線培養し、そして Ura⁺及び Ade⁺であることを確認した。Ade１及び Ade６として命名されたそれらの２種の株を、５FOA(５フルオロオロト酸；Sikorski and Boeke，Methods Enzymol. 194 : 302-318)を含む培地上に画線培養した。レプリカプレートに基づいて Ade^-であることが見出された Ura^-ニーを得た。それらの結果は、Ade⁺相補的活性がプラスミド−担持の URA３マーカーに遺伝的に連結されることを示す。酵母株 Ade１及び Ade６から得られたプラスミドは、下記のように制限マッピングにより同一であることがわかった。それらのゲノムクローンは、それぞれpADE１−１及びpADE１−６と命名された。全 DNAを、HBY21A形質転換体 Ade１及び Ade６から単離し、そしてそれを用いて、Amp^Rに対するＥ．コリ株MC1061を形質転換した。DNAを、Ade１の２つの Amp^R コロニー及び Ade６の３つの Amp^Rコロニーから調製した。前記 DNAを PstＩ， ScaＩ、及び PstＩ＋ ScaＩにより消化し、そしてゲル電気泳動により分析した。すべての５種の単離物は、同じ制限パターンを生成した。 PCR プライマーを、Ｐ．メタノリカ ADE２遺伝子(また、ADE１としても知られている；Hiepなど、Yeast ９：1251-1258，1993)の公開された配列から企画した。プライマー9080（配列番号３）を、ADE２ DNA（配列番号１）の塩基406 −429 でプライムするよう企画し、そしてプライマー9079（配列番号４）を、塩基285 2−2829でプライムするよう企画した。両プライマーは、増幅された配列の個々の末端で AvrII及び SpeＩ部位を導入するために末端を含んだ。得られるPCR フラグメントの予測される大きさは、2450bpであった。 PCR を、鋳型 DNAとして５種の推定上の ADE２クローンからのプラスミド DNA を用いて実施した。100 μｌの反応混合物は、１×Taq PCR 緩衝液(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，10〜100 ngのプラスミド DNA、0.25mMのdNTP，1 00 Ｐモルの個々のプライマー、及び１μｌのTaq ポリメラーゼ(Boehringer Man nheim)を含んだ。PCR を、94℃で30秒、50℃で60秒及び72℃で120 秒、30サイクル行なった。５種の推定上の ADE２ゲノムクローンの個々は、予測される丈夫さ(2.4Kb)のPCR 生成物を生成した。１つの反応からの DNAフラグメントの制限マッピングは、BglII又は SalＩにより消化される場合、予測される大きさのフラグメントを付与した。陽性のPCR 反応をプールし、そしてSpe Ｉにより消化した。ベクターpRS426を Spe Ｉにより消化し、そしてウシ腸ホスファターゼにより処理した。４μｌのPC R フラグメント及び１μｌのベクター DNAを、従来の連結条件を用いて、10μｌの反応混合物において組合した。その連結された DNAを、ゲル電気泳動により分析した。Spe Ｉ消化物を分析し、pRS426内の ADE２遺伝子のサブクローンを担持するプラスミドを同定した。正しいプラスミドを、pCZR118 と命名した。 pCZR118 における ADE２遺伝子はPCR により増幅されたので、前記遺伝子の機能的特徴を無能にした突然変異が生成されていることは可能であった。そのような突然変異について試験するために、所望する挿入体を有するサブクローンを用いて、サッカロミセスセレビシアエ株HBY21Aを別々に形質転換した。細胞を、標準の方法に従って、電気的コンピテントにし、そして形質転換した。形質転換体をURA Ｄ及びADE Ｄプレート上にプレートした。３種の表現型グループを同定した。クローン１，２，11及び12は、ADE Ｄ上での多くの形質転換体の強い増殖を付与した。形質転換頻度は、Ura⁺形質転換体の頻度に匹敵できた。クローン６，８，10及び14はまた、Ura⁺及びAde⁺の両者への形質転換の高い効率を付与したが、しかし Ade⁺コロニーは、最初のグループにおける効率よりもいくらか小さかった。クローン３は多くの Ura⁺コロニーを付与するが、しかし Ade⁺コロニーを付与せず、これは、それが非機能的 ade２突然変異を担持したことを示唆する。クローン１，２，11及び12がプールされた。Ｐ．メタノリカ ade２相補性グループを同定するために、制限アデニン上で増殖される場合、深い赤色の着色に基づいて選択された、個々の相補性グループからの２種の代表的変異体（＃３及び＃10；＃６及び＃11）を、クローン化された ADE 遺伝子により形質転換した。初期対類相細胞の培養物200 mlを、3000xgでの３分間の遠心分離により収穫し、そして20mlの新鮮なKD緩衝液(25mMのDTT を含む50mMのリン酸カリウム緩衝液、pH7.5)に再懸濁した。細胞を30℃で15分間、この緩衝液においてインキュベートした。次に、細胞を収穫し、そして200 mlの氷冷却されたSTM(270mMのスクロース、10mMのトリス、pH7.5，１mMのMgCl₂)に再懸濁した。細胞を収穫し、そして100 mlの氷冷却されたSTM に再懸濁した。細胞を再び収穫し、そして３〜５mlの氷冷却されたSTM に再懸濁した。個々の培養物からの電気コンピテント細胞の100 μｌアリコートを、Not Ｉ−消化されたPADE１ −１ DNAと共に混合した。その細胞／ DNA混合物を、２mmのエレクトロポレーションキュベットに配置し、そして1000Ωの抵抗及び25μＦのキャパシタンスに設定されたBioRad Gene Pulser^TMを用いて、５kv／cmのパルスされた電場にゆだねた。パルスされた後、細胞を１mlのYEPDの添加により希釈し、そして30℃で１時間インキュベートした。次に、細胞を軽い遠心分離により収穫し、そしてアデニンを欠いている400 μｌの最少選択培地（ADE Ｄ）に再懸濁した。その再懸濁されたサンプルを200 μｌのアリコートに分け、そしてADE Ｄ及びADE DSプレート上にプレートした。プレートを30℃で４〜５日間インキュベートした。変異体＃６及び＃11は、Ade⁺形質転換体を付与した。Ade⁺形質転換体は、DNAが排除される場合、観察されず、従って、２種の単離物は ade２相補性グループを定義するように思えた。ADE２配列は、配列番号１に示される。Ｂ．セクションＡに開示されるＰ．メタノリカクローンバンクを、アルコール利用遺伝子(AUG１)をクローニングするための源として用いた。そのクローンバンクを独立したプールとして貯蔵し、個々は約200 〜250 個の個々のゲノムクローンについて表わす。個々のプールからの0.1 μｌの“ミニプレブ（miniprep） ” DNAを、ハンセヌラポリモルファ、カンジタビオジニ及びピチアパストリスからのアルコールオキシダーゼ遺伝子における保存された整列配列から企画されたPCR プライマー（8784、配列番号５；8787、配列番号６）とのポリメラーゼ鎖反応において鋳型として使用した。増幅反応を、94℃で30秒；50℃で30秒；72℃ で60秒、30サイクルを、続いて72℃で７分間のインキュベーションを行なった。１つのプール（＃５）は、約600 bpのバンドを付与した。このPCR 生成物の DNA 配列決定は、それが、AOX１遺伝子によりコードされるピチアパストリスアルコールオキシダーゼとの約70％の配列同一性、及び MOX１遺伝子によりコードされるハンセヌラポリモルファアルコールオキシダーゼとの約85％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードすることを示した。クローン化された AUG１遺伝子の配列は、配列番号２に示される。プール＃５のサブプールを、初期増幅に使用される同じプライマーを用いてPC R により分析した。１つの陽性サブプールを、陽性コロニーを同定するためにさらに分析した。この陽性コロニーをプレート上に画線培養し、そして DNAを個々のコロニーから調製した。３種のコロニーは、Cla Ｉによる消化の後、同一のパターンを付与した。ゲノムクローン及びPCR 生成物の制限マッピングは、AUG１遺伝子が7.5 Kbのゲノム挿入体上に存在し、そしてPCR フラグメント内の部位がゲノム挿入体内で独得に同定され得たことを示した。PCR フラグメント内での遺伝子の配向は知られているので、後者の情報は、ゲノム挿入体内の AUG１遺伝子のおおよその位置及び転写の方向を提供する。この領域内の DNA配列決定は、他の既知のアルコールオキシダーゼ遺伝子に対してアミノ酸レベルでひじょうに高い配列類似性を有する遺伝子を示した。Ｃ．ade ２変異体Ｐ．メタノリカ細胞を、AUG１プロモーター及びターミネーター、ヒトGAD65 DNA(Karlsenなど、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 88 : 8337-8 341，1991)、及び ADE２選択マーカーを含んで成る発現ベクターにより、実質的に上記に開示されるエレクトロポレーションを用いて形質転換する。20ｇ／ｌの Bacto-寒天(Difco）、アミノ酸を有さない6.7 ｇ／ｌの酵母窒素基材(Difco)、1 0ｇ／ｌのメタノール、及び0.4 μｇ／ｌのビオチンを含む寒天最少メタノールプレート（100mmのプレート当たり10〜100 個のコロニー）に、コロニーをパッチングする。寒天をニトロセルロースにより被覆し、そしてプレートを、水中、 50％メタノール溶液１mlを含むフタ上で逆にし、そして30℃で３〜５日間インキュベートする。次に、膜を、0.2 ＭのNaOH，0.1 ％のSDS，35 mMのジチオトレイトールにリークされたフィルターに移し、付着された細胞を溶解する。30分後、細胞残骸を蒸留水によりフィルターからすすぎ、そしてフィルターを、0.1 Ｍの酢酸によりそれを30分間すすぐことによって、中和する。次に、フィルターを、付着されたタンパク質についてアッセイする。占領されていない結合部位を、TTBS−NFM(20mMのトリス、pH7.4，0.1％のTween 20，160 mMのNaCl，５％の粉末化された脱脂ミルク)により室温で30分間、すすぐことによってブロックする。次に、フィルターを、TTBS−NFM により１：1000に希釈された、GAD６モノクローナル抗体(Chang and Gottlieb，J ．Neurosci. 8 : 2123 -2130，1988)を含む溶液に移す。フィルターを、前記抗体溶液において少なくとも１時間、軽く撹拌しながらインキュベートし、次に、TTBS（20mMのトリス、pH 7.4，0.1％のTween 20，160 mMのNaCl）によりそれぞれ５分間、２度洗浄する。次に、フィルターを、ホースラディシュペルオキシダーゼに接合されるヤギ抗− マウス抗体（TTBS−NFM において１mg／ml）において少なくとも１時間インキュベートし、次に、TTBSにより洗浄当たり５分間、３度洗浄する。次に、フィルターを、市販の化学ルミネセント試薬（ECL；Amersham Inc.，Arlington Heights ，IL）に照射する。陽性パッチから生成される光を、Ｘ−線フィルム上で検出する。 GAD65 発現のレベルをより正確に検出するために、候補体クローンを振盪フラスコ培養により培養する。コロニーを、上記で開示されるようにして、最少メタノールプレート上で30℃で２日間、増殖せしめる。そのコロニーを用いて、20ml の最少メタノール培地（アミノ酸を有さない6.7 ｇ／ｌの酵母窒素基材、10ｇ／ｌのメタノール、0.4 μｇ／ｌのビオチン）を、１×10⁶個の細胞／mlの細胞密度で接種する。培養物を激しく振盪しながら、30℃で１〜２日間増殖する。50％メタノール0.2 mlを、個々の培養物に毎日、添加する。細胞を遠心分離により収穫し、そして１ｇの細胞プレート当たり10mlの最終体積で、氷冷却された溶解緩衝液（20mMのトリス、pH8.0，40 mMのNaCl，２mMのPMSF，１mMのEDTA，１μｇ／ｌのロイペクチン、１μｇ／mlのペプスタチン、１μｇ／mlのアプロチニン）に懸濁する。その得られる懸濁液2.5 mlを、15mlの容器において、400 〜600 ミクロンの氷冷却され、酸洗浄されたガラスビーズ2.5 mlに添加し、そしてその混合物を１分間、激しく撹拌し、次に、氷上で１分間インキュベートする。この方法を、細胞が撹拌されるまで、合計５分間くり返す。大きな残骸及び破壊されていない細胞を、 1000xgでの５分間の遠心分離により除去する。次に、透明化された溶解物を清浄した容器にデカントする。透明化された溶解物を、サンプル緩衝液（５％のSDS, ８Ｍの尿素、100 mMのトリス、pH6.8，10 ％のグリセロール、２mMのEDTA，0.01 ％のブロモフェノールブルー）により希釈し、そして４〜20％のアクリルアミドグラジエントゲル（Novex，San Diego，CA）上で電気泳動する。タンパク質をニトロセルロースにブロットし、そして上記のようにして、GAD６抗体により検出する。振盪フラスコ培養物において外来性タンパク質の最高レベルのメタノール誘発された発現を示すクローンを、高い細胞密度発酵条件下でより広範囲に分析する。細胞をまず、YEPDブイヨン0.5 ｌにおいて30℃で１〜２日間、激しく撹拌しながら培養し、次にそれを用いて、５ｌの発酵装置（たとえばBioFlow III；New B runswick Scientific Co.，Inc.，Edison，NJ）を接種する。発酵容器をまず、5 7.8ｇの(NH₄)₂SO₄，68ｇのKH₂PO₄，30.8ｇのMgSO₄・７H₂O，8.6ｇのCaSO₄・２H₂ O，2.0ｇのNaCl及び10mlの消泡剤(PPG)を添加することにより、無機塩により充填する。水を添加し、2.5 ｌの体積にし、そしてその溶液を40分間オートクレープする。冷却した後、350 mlの50％のグルコース、250 mlの10×微量元素（表５）、25mlの200 μｇ／mlビオチン、及び250 mlの細胞接種物を添加する。化合物を溶液にするためには、１ｌ当たり１〜２mlのH₂SO₄を添加する。発酵容器を、28℃，pH5.0 及び30％以上の溶解されたＯ₂で運転するよう設定する。細胞は、グルコース消費の間、酸素についての鋭い需要、グルコースが消耗された後、酸素消費の続く低下により示されるように、グルコースの初期充填物を消費するであろう。初期グルコース充填物の消耗の後、NH₄ ⁺及び微量元素により補充されたグルコースーメタノール供給物を、0.2％（ｗ／ｖ）のグルコース、0.2 ％（ｗ／ｖ）のメタノールで５時間にわたって、続いて0.1 ％（ｗ／ｖ）のグルコース、0.4 ％（ｗ／ｖ）のメタノールで25時間にわたって容器中に供給する。合計550 ｇのメタノールを、12.5ml／時の初期供給速度及び25ml／時の最終供給速度を用いて純粋なメタノールとして容器の１つの口を通して供給する。グルコースを、175 ｇのグルコース、250 mlの10×微量元素及び99ｇの(NH₄)₂ SO₄を含む溶液700 mlを用いて、第２の口を通して供給する。それらの条件下で、グルコース及びメタノールは、グルコース−メタノール供給物の開始に基づいてのGAD65 発現の誘発を伴って、同時に利用される。発酵容器からの細胞を、振盪フラスコ培養物について上記に記載されるようにして、GAD65 発現について分析する。細胞を、一定の時間の間隔で発酵容器から除去し、そして続いて分析する。少ないGAD65 発現がグルコース上での増殖の間、観察される。グルコースの消耗は GAD65 タンパク質の低レベル発現を導き；発現は発酵培養物の供給の間、MeOHの添加により増強される。メタノールの添加は、メタノール応答性 AUG１プロモーターにより駆動されるヒトGAD65 の発現の明確な剌激効果を有する。Ｄ．形質転換条件が、Ｐ．メタノリカの効果的形質転換のために最適である、電場条件、DNAトポロジー及び DNA濃度を決定するために調査された。すべての実験は、Ｐ．メタノリカ ade２株＃１を使用した。コンピテント細胞を前記のようにして調製した。エレクトロポレーションを、BioRad Gene Pulser^TMを用いて実施した。次の３種の場パラメーターが、エレクトロポレーションによる形質転換効率に影響を及ぼす：キャパシタンス、場の強さ及びパルス期間、場の強さは、電気パルスの電圧により決定され、そしてパルス期間は装置の抵抗設定により決定される。この組の実験においては、種々の抵抗での場の強度設定のマトリックスが試験された。すべての実験において、装置の最高のキャパシタンス設定（25μＦ）が使用された。電気コンピテント細胞の100 mlアリコートを、制限酵素 NotＩにより線状化されている ADE２プラスミドpCZR133 約１μｇを含む DNA10μｌと共に氷上で混合した。細胞及び DNAを、２mmのエレクトロポレーションキュベット (BTX Corp.，San Diego，CA)に移し、そして0.5kv（2.5kv／cm）、0.75kv（3.75 kv／cm），1.0kv（5.0kv／cm），1.25kv（6.25kv／cm）、及び1.5kv（7.5kv／cm ）の場の強さで電気パルスした。それらの場の強さの条件を、種々のパルス期間で試験した。パルス期間を、装置設定抵抗を200 ohms，600ohms 又は“無限”の ohmsに変えることによって操作した。パルスされた細胞をYEPDに懸濁し、そして 30℃で１時間インキュベートし、収穫し、再懸濁し、そしてプレート化した。３種の別々の組の実験を行なった。個々の組においては、“無限”のohmsの抵抗での0.75kv（3.75kv／cm）のエレクトロポレーション条件が、試験された他の条件よりも劇的に高い形質転換効率を付与することが見出された（図１を参照のこと）。最適なパルス条件が確立された後、形質転換効率に対する DNAトポロジーの影響が調査された。電気コンピテント細胞を、１μｇの切断されていない環状pCZR 133 又は１μｇのNot Ｉ−消化されたpCZR133 と共に混合した。３回の別々の実験において、大まかに平均して25個の形質転換体を環状 DNAから回収し、そして線状 DNAは平均して約１× 10⁴個の形質転換体を生成した。それらのデータは、線状 DNA形質転換体が環状 DNAよりも一層高い効率を有することを示す。最終的に、DNA濃度と形質転換効率との間の関係が調査された。線状pCZR133 DNAのアリコート（10μｌの水中、１ng，10ng，100ng 及び１μｇ）を、100 μ ｌの電気コンポネント細胞と共に混合し、そしてエレクトロポレーションを3.75 kv／cm及び“無限”のohmで実施した。形質転換体の数は、約10(１ngのDNA)から 10⁴(１μｇのDNA)に変更し、そして DNA濃度に比例することが見出された。Ｅ．Ｐ．メタノリカのゲノム中への形質転換 DNAの組込みを、野生型細胞の D NA及び安定した白色形質転換体コロニーの比較により決定した。２種のクラスの組込み形質転換体を同定した。最初においては、形質転換 DNAが相同部位中に組込まれることが見出された。第２の種類において、形質転換 DNAは、内因性 AUG １読み取り枠を置換することが見出された。理論により結合されることは所望されないが、この第２の形質転換体は、“トランスプレスメント組換え現象”(Rot hstein, Methods Enzymol．194 : 281-301，1991))により生じると思われ、それにより形質転換する DNAが二重組換え現象を通して内因性 DNAを置換する。Ｐ．メタノリカ ade２株＃11を、Asp Ｉ−消化されたpCZR140,Ｐ ing Systems，La Jolla，CA)に基づくベクター、及びプロモーターとターミネーターとの間の全読み取り枠が欠失されている AUG１の変異体（図２）により Ade⁺ に対して形質転換した。ゲノム DNAを、野生型細胞、及びYEPDプレート上で30 ℃で２日間増殖された形質転換細胞から調製した。約100 〜200 mlの細胞を、水１mlに懸濁し、次にマイクロ遠心分離機により30秒間、遠心分離した。細胞ペレットを回収し、そして400 μｌの SCE＋DTT ＋チモラーゼ(1.2Ｍのソルビトール、10mMのクエン酸ナトリウム、10mMのEDTA，10mMのDTT，１〜２mg／mlのチモラーゼ100 Ｔ）に再懸濁し、そして37℃で10〜15分間インキュベートした。１％SDS 400 μｌを添加し、そしてその溶液を透明になるまで混合した。５Ｍの酢酸カリウム溶液（ pH8.9）300μｌを添加し、そしてその溶液を混合し、そしてマイクロ遠心分離機により５分間、最高速度で遠心分離した。上清液750 μｌを新しい管に移し、そして等体積のフェノール／クロロホルムにより抽出した。その得られる上清液60 0 mlを回収し、そして DNAを２体積のエタノールの添加及び冷却下での15分間の遠心分離により沈澱せしめた。DNAペレットを、50μｌのTE（10mMのトリス、pH ８，１mMのEDTA）＋100 μｇ／mlのRNアーゼに65℃で約１時間、再懸濁した。10 μｌの DNAサンプルを、37℃で一晩、100 μｌの反応体積中、EcoRI(５μｌ)により消化した。DNAをエタノールにより沈澱せしめ、遠心分離により回収し、そして7.5 μｌのTE＋2.5 μｌの５×色素に再懸濁した。10μｌの全体積を、0.5 ×TBE(10×TBEは、108 ｇ／ｌのトリス塩基、pH７〜９，55ｇ／ｌの硼酸、8.3 ｇ／ｌのニナトリウムEDTAである)ゲルにおける0.7 ％アガロースの１つのレーンに適用した。ゲルを、臭化エチジウムを含む0.5 ×TBS において100 ｖで運転した。ゲルの写真を取り、そして DNAを、 chleicher & Schuell，Keene，NH）に電気泳動的に移した。次に、膜を２×SSC によりすすぎ、変性溶液上に５分間ブロットし、２×SSC により中和し、次に自動設定に基づいてUV架橋機（Stratalink トを、市販のキット(ECL^TMキット、Amersham Corp.，Arlington He igats，IL)を用いて、PCR-生成された AUG１プロモータープローブにハイブリダイズした。結果は、形質転換 DNAが AUG１プロモーター DNAの構造を変更し、これは相同組込み現象と一致することを示唆した（図２）。第２の実験において、Ｐ．メタノリカ ade２株＃11を、Not Ｉ−消化されたpC ZR137，AUG１プロモーターとターミネーターとの間にヒトGAD65 cDNAを含むベクターにより Ade⁺に対して形質転換した（図３）。ゲノム DNAを、野生型細胞及び安定した白色の Ade⁺形質転換体から上記のようにして調製し、そしてEco RI により消化した。消化された DNAを電気泳動により分離し、そして膜にブロットした。ブロットを、AUG１読み取り枠又は AUG１プロモーターのいづれかに対応するPCR-生成されたプローブによりプローブした。結果は、AUG１読み取り枠 DN Aが形質転換体株から不在であり、そして AUG１プロモーター領域が有意な再配列を受けたことを示した。それらの結果は、形質転換 DNAと宿主ゲノムとの間の二重組換え現象（トランスプレスメント）と一致する（図３）。Ｆ．Ｐ．メタノリカの AUG１株を、高密度発酵条件下で増殖する。発酵容器を、57.8ｇの(NH₄)₂SO₄，46.6ｇのKCl，30.8 ｇのMgSO₄・７H₂O，8.6ｇのCaSO₄・２H₂O，2.0ｇのNaCl及び10mlの消泡剤(PPG)の添加により無機塩で充填する。水を添加し、2.5 ｌの体積にし、そしてその溶液を40分間オートクレーブする。冷却の後、50％グルコース350 ml，10×微量元素（表５）250 ml，30％リン酸ナトリウム210 ml，200 μｇ／mlのビオチン25ml及び細胞接種物250 mlを添加する。細胞は、３相においてグルコース又はグルコース／メタノールをバッチ供給される。相１においては、細胞は、750 ｇのグルコース、110 ｇの(NH₄)₂SO₄、及び2 78 mlの10×微量元素／1.5 ｌを用いて25時間、0.4 ％／ｌ／時でのグルコース（ｗ／ｖ最終発酵体積）を受ける。次に、細胞は、0.2 ％のグルコース、0.2 ％のメタノール／ｌ／時の一時的な供給を５時間、与えられる。最終のグルコース−補充されたメタノール供給物は、0.1 ％のグルコース、0.4 ％のメタノール／ｌ／時を25 時間、含む。最終バイオマスは、約300 ｇ／ｌの細胞ペーストである。Ｇ．Ｐ．メタノリカ aug１Δ株の発酵のために、発酵容器をまず、無機塩、グルコース、リン酸塩、微量元素及びビオチンにより上記セクションＦに開示されるようにして充填した。250 mlの細胞接種物を添加する。グルコース供給物を、 600 ｇのグルコース、108 ｇの(NH₄)₂SO₄及び273 mlの10×微量元素／1.2 ｌを用いて調製する。細胞を３相にバッチ供給する。第１の相においては、細胞は0. 4 ％／ｌ／時で12〜25時間グルコースを受ける。次に、１重量％のメタノールのボーラス添加により誘発し、そして混合された0.2 ％グルコース／0.1 ％メタノール供給物によるメタノール利用に10時間、変更する。第３相においては、0.2 ％のグルコース及び0.2 ％のメタノールの混合された供給物を、15時間、供給する。Ｈ．AUG１遺伝子がGAD65 発現構造体の挿入により破壊されているＰ．メタノリア細胞は、メタノールに基づく増殖能力を保持しており、これは第２アルコールオキシダーゼ遺伝子が存在することを示唆する。AUG２と命名される第２遺伝子は、PCR により同定される。その遺伝子の５′コード領域の配列分析は、コードされるタンパク質のＮ−末端が既知のアルコールオキシダーゼ遺伝子のＮ−末端に類似することを示した。 MC GAD８株、すなわち最少メタノールブイヨン上でほとんど増殖しない形質転換体を、AUG２遺伝子をクローニングするための源として使用した。ゲノム DNA を、MC GAD８から調製し、そして AUG１読み取り枠に対して特異的なセンス及びアンチセンスPCR プライマー（8784、配列番号５；8787、配列番号６）により増殖した。AUG１生成物にサイズ的には同一であるが、しかし分析用ゲル上でひじょうに低い強さを示す生成物を得た。推定上の AUG２ PCR生成物を、一組の制限酵素により消化した。Eco RI及びPv u Ｉによる部分消化、及びいくつかのBgl II部位の存在は、DNAが少量の AUG１により汚染されていることを示した。汚染する AUG１ DNAを除去するために、PC R 混合物をEco RIにより切断し、そしてゲル精製した。MC GAD８生成物はEco RI 部位を有するように見えないので、それは変化を受けていなかった。得られるゲル精製された DNAを再増幅し、そして再び、制限消化により分析した。その DNA は、AUG１ PCR生成物のものとは異なった制限地図を付与した。サザンブロット分析を、プローブとして AUG１又は AUG２読み取り枠PCR フラグメントのいづれかを用いてMC GAD８及び野生型細胞からのゲノム DNAに対して行なった。AUG２プローブは、AUG１遺伝子座に対して低い緊縮性で及び第２の遺伝子座に対して低い及び高い緊縮性でハイブリダイズした。AUG１プローブは、低い緊縮性で両遺伝子座に結合するが、しかし高い緊縮性で AUG１遺伝子座に対して優先的に結合した。それらのデータは、MC GAD８からの新規PCR 生成物が A UG１に対して類似するが、しかしそれとは異なることを示唆した。配列分析は、 AUG１及び AUG２遺伝子生成物間で83％の同一性を示した。 AUG２ゲノム遺伝子座をクローン化するために、PCR プライマーを元の AUG２ PCRフラグメントから企画した。プライマー9885（配列番号７）及び9883（配列番号８）を用いて、Ｐ．メタノリカゲノムライブラリーをスクリーンした。陽性のクローンバンクプールを、元のMC GAD８PCR 生成物によりプローブによりプローブした。細胞を約5000個のコロニー／プレートで10個のプレート上にプレートし、そして一晩増殖せしめ、次にプレートをフィルターディスク(Hybond-N，Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)により被覆した。コロニを変性し、中和し、そしてUV架橋した。細菌残骸を５×SSC によりフィルターから洗浄し、そしてフィルターを再び架橋した。プロットを、25mlのハイブリダイゼーション緩衝液において42℃で１時間、２つ一組になって予備ハイブリダイズした。約250 ngのプローブを、個々の組のフィルターに添加した。ハイブリダイゼーションを42℃で４時間、行なった。次に、ブロットを、0.1 ×SSC,６Ｍの尿素、0.4 ％のSDS の溶液500 mlにより42℃で10分間、４度洗浄した。次に、ブロットを500 mlの２×SSC により室温で５分間、中和し、そして２回すすいだ。次に、ブロットを100 mlの展開用試薬(ECL，Amersham Corp.)に含浸した。陽性コロニーを取り、そしてPCR プライマー9885（配列番号７）及び9883（配列番号８）を用いて増幅し、それらの同一性を確認した。陽性プールを、プレート上に画線培養し、そして単一のコロニーをPCR により再スクリーンした。１つのコロニーを追加の分析（制限マッピング及び配列決定）のために選択した。AU G２遺伝子の部分的配列が配列番号９に示されている。配列番号９に示されるように、AUG２配列はHindIII部位でヌクレオチド91を開始する。この位置から上流のヌクレオチドは、ベクター配列である。そのコード配列はヌクレオチド170 で開始する。 AUG２遺伝子の破壊は、メタノール上での細胞増殖に対してほとんど効果を与えなかった。機能的 AUG１及び AUG２遺伝子生成物の両者を欠いている細胞は、メタノール上で増殖しなかった。続く分析は、AUG１遺伝子生成物が発酵器において増殖される細胞における唯一の検出できるアルコールオキシダーゼであることを示した。例４Ｐ．メタノリカからのGAD65 の精製 GAD65 を発現するＰ．メタノリカ酵母からGAD65 を、例３に記載されるようにして抽出するために、酵母を、５℃で又は５℃以下に冷たく保持したまま、DYNO −MILLにより微粉砕した。抽出緩衝液は、プロテアーゼインヒビター及び界面活性剤Triton X-114を含む。緩衝液成分は次のものである：40mMのHEPES，10 mMの DTT，10 mMのEDTA，200 μＭのピリドキサールリン酸（PL），１mMのアミノエチル−イソチオウロニウムブロミド臭酸塩(AET)，２％（ｖ／ｖ）のTriton X-114 ，25μｇ／mlのアプロチニン、５μｇ／mlのロイペプチン、５μｇ／mlのダイズトリプシンインヒビター、５μｇ／mlのペプスタチンＡ、及び0.1 mMのPMSF。緩衝液はpH7.2 に調整した。上記プロテアーゼインヒビターと共に、0.2 ％のTrit on X-114を含むこの同じ緩衝液が、続くクロマトグラフィー段階において使用される主要緩衝液である。それは、この例において、主要GAD 緩衝液(PGB)として言及されるであろう。抽出物浄化及びGAD65 捕獲（冷たい部屋で行なわれる）のために、DYNO−MILL からの抽出物は6.1 の測定されたpHを有し、そして遠心分離の前、7.2 のpHに滴定される。抽出物を、１ｌの振子式バケットBeckman 遠心分離機において、５℃ にて、3,500rpmで0.5 時間、遠心分離し、細胞残骸の実質的な部分をペレット化する。ペレットを抽出緩衝液に再懸濁し、そして最少時間（約10分）、再抽出し、この時点で、それを再び遠心分離機により回転せしめる。上清液を組合し、スラリー氷上で一晩、急冷し、再び上記のようにして遠心分離し、そして小さいが、しかし目立った白色沈殿物を除する。上清液を２ＮのNaOHによりpH8.5 に調整し、そして導電率が３〜４mmhoになるまで、PGB(この場合、pH8.5)により希釈する（約3.5 倍）。この材料を、３〜４mmho導電率で、１％（ｖ／ｖ）の最終TX-114濃度で、pH 8.5 のPGB により平衡化されたWhatman DE-52 アニオン交換体の１ｌ層を含む11 cmの直径のカラム上に、50ml／分で負荷した。１％のTX-114は結合され、そして続いて溶離されるGAD の溶解性／安定性を促進する。サンプル負荷の実結に基づいて、カラムを、平衡化緩衝液により10カラム体積を洗浄し、この後、結合されたタンパク質を0.4 ＭのNaClを含む平衡化緩衝液により22.4mmhoの導電率で“段階的”溶離し、そして３×“予備−縮合された”Triton X-114により１％TX-114 に調節した。ウェスターンブロットにより検出できるGAD65 活性の大部分を、収集された溶出物の４カラム体積内で回収する。このプールは、下記精製工程における相分割段階のために使用できる。相分割のために、上記からの溶離されたプールのTX-114濃度（わずか１％（ｖ／ｖ）のTX-114）を、プールに予備縮合されたTX-114の適切な体積の添加により２％（ｖ／ｖ）TX-114に調節する。調節されたプールの合計体積をさらに、２％ TX-114（再び予備縮合されている）PGB により１：２に希釈する。この混合物を、ストップコックにより固定された底部出口を有する11cmの直径のラム中に注ぎ、そして充填されたカラムを冷たい部室（−４℃）から暖かな部室（30°）に移し、そして一晩、分割を可能にする。濃い低部層が形成し、そしてTriton−に富んでいる低部相と界面活性剤−消耗された上部相との間の認識できる界面が観察できる。ストップコックを開き、そして縮合されたTriton，GAD65 含有相を収穫する。初期の大きな画分を集め、そして相境界がカラム出口を通過することが明らかになる場合、小さな画分が、流入流速の目立った上昇が観察されるまで（冷却器流出で低い粘性の消耗された相の到達を表わす）採取される。収穫された濃縮相は、クーマシーSDS-PAGE分析により決定される場合、有意に精製されたGAD65 を含む。収穫されたGAD65 Triton相を、導電率が４mmho以下か又はそれに等しくなるまで、PGB(pH8.0)により希釈する。次に、その材料を、pH8.0 でのPGB により平衡化されたQ-Sepharose Fast Flow アニオン交換体(Pharmacia)の層に適用し、そして20mMのトリス、20mMのMES，20 mMのMops、及び20mMの酢酸塩によりHEPES を置換することによって変性し、均等なpHグラジエントの生成を可能にする。この緩衝液はまた、TX-114の代わりに、0.1 ％のオクチルグルコシドも含む。サンプルの負荷の実結に基づいて、カラムを平衡化緩衝液の10カラム体積により洗浄する。22カラム体積のグラジエントを、pH8.0 の平衡化緩衝液とpH4.9 での同じ緩衝液との間で形成する。pH8.0 から4.9 の線状pHグラジエントを形成し、そして GAD65 をpH7.4 〜5.0 で溶離する。後者の溶離画分は、かなりの程度の汚染物を含むが、まだGAD65 の純度は著しく高まる。溶離が開始される前、画分収集器における試験管を十分なAET 及びトリス塩基により増加し、最終サンプル体積をAE T において10mMの調節し、そしてサンプルのpHを7.2 ±0.2 にする。管を、サンプル収集の後すぐに混合し、AET 及びトリス塩基との収集されたサンプルとの混合を確保する。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーのために、上記pHグラジエント−溶離されたQ-Sepharose カラムからのGAD65 含有画分をプールする。そのプールの pHを、必要なら6.8 〜7.0 に調節する。このプールの導電率は7.0 mmhoである。この材料を、Q-Sepharose段階で使用されるが、しかし6.8 〜7.0 のpHで使用され、そして濃縮されたGAD65 の溶離を促進し、そして溶離されたタンパク質の溶解性を改良するために10mMのAET を含む複数緩衝液システムにより前もって平衡化されたセラミック性ヒドロアパタイトの層に適用する。上記のようにして精製されたサンプルのクーマシー染色されたSDS-PAGEゲルは、レーン当たり20μｇまでのGAD65 の大きなバンドを示し、そして90％又はそれ以上の推定された純度を有する。従って、本発明は、メチロトローフ性酵母において500 mg／ｌ又はそれ以上までのGAD65 の高レベル発現を提供する。メチロトローフ性酵母の使用は、発酵の容易さ及びGAD65 発現の正確に調節された誘発により産業規模でのGAD65 の生成を実施可能にする。特に、本明細書に記載される精製プロトコールに従って、メチロトローフ性酵母から精製される場合、組換えGAD65 は、高い比活性を有し、そして免疫学的アッセイ及び治療プロトコールへのGAD65 の使用に不可欠である、生来の分子の抗原特性を保持する。前述の発明は理解のために例示的及び例的にいくらか詳細に記載されて来たが、一定の変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得ることは明確であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:84） (31)優先権主張番号０８／７０３，８０９ (32)優先日平成８年８月26日(1996．8．26) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ブコウスキー，トーマスアール. アメリカ合衆国，ワシントン 98103，シアトル，パラタインアベニューノース，6259 (72)発明者ビショップ，ポールディー. アメリカ合衆国，ワシントン 98024，フォールシティ，サウスイーストエイス，28425

Claims

【特許請求の範囲】１．次の作用可能に連結された要素：（ａ）メタノール−誘導性転写プロモーター；（ｂ）GAD65 ポリペプチドをコードする DNAセグメント；（ｃ）転写ターミネーター；及び（ｄ）選択マーカー、を含んで成る DNA構造体により形質転換された、炭素源及びエネルギー源としてのメタノールで増殖することができるメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物。２．前記メチロトローフ性酵母が、ピチア（Pichia）、ハンセヌラ(Hansenula )又はカンジダ(Candida)である請求の範囲第１項記載のメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物。３．前記メチロトローフ性酵母がピチア・パストリス(Pichia pastoris)又はピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）である請求の範囲第２項記載のメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物。４．前記形質転換 DNA構造体のメタノール誘導性プロモーターが前記 DNA構造体により形質転換されたメチロトローフ性酵母と同じ種由来である請求の範囲第１項記載のメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物。５．前記形質転換性 DNA構造体のメタノール誘導性プロモーターがアルコールオキシダーゼ遺伝子由来である請求の範囲第２項記載のメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物。６．前記アルコールオキシダーゼ遺伝子がＰ．パストリス AOX１である請求の範囲第５項記載のメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物。７．前記 DNA構造体の転写ターミネーターがアルコールオキシダーゼ遺伝子由来である請求の範囲第５項記載のメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物。８．前記DNA構造体の転写ターミネーターがＰ．パストリス AOX１遺伝子由来である請求の範囲第７項記載のメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物。９．前記メチロトローフ性酵母がピチア・パストリスである請求の範囲第５項記載のメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物。 10．前記GAD65 ポリペプチドがヒトGAD65 である請求の範囲第１項記載のメチロトローフ性酵母の実質的に純粋な培養物。 11．メチロトローフ性酵母においてGAD65 を発現するための DNA構造体であって、次の作用可能に連結された要素：（ａ）メタノール−誘導性転写プロモーター；（ｂ）GAD65 ランゲルハンス島細胞ポリペプチドをコードする DNAセグメント；（ｃ）転写ターミネーター；及び（ｄ）選択マーカー、を含んで成る DNA構造体。 12．前記メタノール誘導性転写プロモーターがアルコールオキシダーゼ遺伝子である請求の範囲第11項記載の DNA構造体。 13．前記アルコールオキシダーゼ遺伝子がＰ．パストリス AOX１である請求の範囲第12項記載の DNA構造体。 14．前記転写ターミネーターが、アルコールオキシダーゼ遺伝子由来である請求の範囲第12項記載の DNA構造体。 15．前記アルコールオキシダーゼ遺伝子がＰ．パストリス AOX１である請求の範囲第14項記載の DNA構造体。 16．GAD65 ランゲルハンス島細胞ポリペプチドをコードする前記 DNAセグメントがヒトGAD65 をコードする請求の範囲第11項記載の DNA構造体。 17．メチロトローフ性酵母細胞の培養により発現されるGAD65 を精製するための方法であって、還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液において酵母細胞培養物からGAD65-含有細胞画分を単離し；前記GAD65 含有細胞画分を、GAD65-含有界面活性剤相及び水性相に相分割し；第１のGAD65 アニオン交換画分を生成するために、還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液において第１のアニオン交換クロマトグラフィーにより前記GAD65-含有界面活性剤相からGAD65 を分離し；わずかに酸性のpHでカチオン交換媒体を含むカラムに前記第１のGAD65 アニオン交換画分を適用し、そしてそれからのGAD65-含有画分をアルカリ性pHに調整し；還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液においてアルカリ性pHで第２のアニオン交換カラム上に前記GAD65 カチオン交換画分を負荷し、アルカリ性〜酸性pHグラジエントにおいてGAD65 を溶出し、そして前記GAD65 溶出物のpHをほぼ中性に調整し；そして還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液においてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより前記GAD65 アニオン溶離物を精製し、そして精製されたGAD65 を得る；ことを含んで成る方法。 18．前記GAD65-含有細胞画分が、酵母細胞を溶解することによってその酵母細胞培養物から単離される請求の範囲第17項記載の方法。 19．前記第１のアニオン交換クロマトグラフィーによりGAD65-含有界面活性剤相からGAD65 を分離する前、前記GAD65-含有界面活性剤相から酵母細胞粒状物を除去する段階をさらに含んで成る請求の範囲第17項記載の方法。 20．前記カチオン交換媒体が、スルホプロピルカチオン交換媒体である請求の範囲第17項記載の方法。 21．前記第２のアニオン交換カラムが、第四アンモニウムアニオン交換カラムである請求の範囲第17項記載の方法。 22．前記GAD65 溶離pHグラジエントがpH８〜pH４の間で展開される請求の範囲第17項記載の方法。 23．前記GAD65 がリン酸カリウムのグラジエントにより前記ヒドロキシアパタイトから溶出される請求の範囲第17項記載の方法。 24．前記メチロトローフ性酵母細胞がピチア又はハンセヌラの種である請求の範囲第17項記載の方法。 25．前記メチロトローフ性酵母細胞がピチア・パストリス又はピチア・メタノリカである請求の範囲第24項記載の方法。 26．前記GAD65 がヒトGAD65 である請求の範囲第17項記載の方法。 27．前記還元剤がジチオトレイドール又は２−メルカプトエタノールである請求の範囲第17項記載の方法。 28．前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求の範囲第17項記載の方法。 29．前記非イオン性界面活性剤が、ポリエチレングリコール第三オクチルフェニルエーテル、ポリエチレングリコールモノ〔Ｐ−（１，１，３，３−テトラメチル−ブチル）フェニル〕エーテル、又はｎ−オクチルグルコシドである請求の範囲第28項記載の方法。 30．メチロトローフ性酵母細胞の培養により発現されるGAD65 を精製するための方法であって、還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液において酵母細胞培養物からGAD65-含有細胞画分を単離し；第１のGAD65 アニオン交換画分を生成するために、還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液における第１のアニオン交換カラムに前記GAD65-含有細胞画分を適用し；前記第１のGAD65 アニオン交換画分を、GAD65-含有界面活性剤相及び水性相に相分割し；還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液においてアルカリ性pHで第２のアニオン交換カラム上に前記GAD65-含有界面活性剤相を負荷し、アルカリ性〜酸性pHグラジエントにおいてGAD65 を溶出し、そして前記GAD65 溶出物のpHをほぼ中性に調整し；そして還元剤及び界面活性剤を含む緩衝液においてヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより前記GAD65 アニオン溶離物を精製し、そして精製されたGAD65 を得ることを含んで成る方法。 31．前記GAD65-含有細胞画分が、酵母細胞を溶解することによってその酵母細胞培養物から単離される請求の範囲第30項記載の方法。 32．前記第１のアニオン交換カラムに前記GAD65-含有画分を適用する前、前記 GAD65-含有画分から酵母細胞粒状物を除去する段階をさらに含んで成る請求の範囲第30項記載の方法。 33．前記第２のアニオン交換カラムが第四アンモニウム交換カラムである請求の範囲第30項記載の方法。 34．相分割の前、ヒドロキシアパタイトに基づいて前記第１のGAD65 アニオン交換画分を分割することをさらに含んで成る請求の範囲第30項記載の方法。 35．前記GAD65 溶出pHグラジエントがpH８〜pH４の間で展開される請求の範囲第30項記載の方法。 36．前記GAD65 がリン酸カリウムのグラジエントにより前記ヒドロキシアパタイトから溶出される請求の範囲第30項記載の方法。 37．前記メチロトローフ性酵母細胞がピチア又はハンセヌラの種である請求の範囲第30項記載の方法。 38．前記メチロトローフ性酵母細胞がピチアパストリス又はピチアメタノリカである請求の範囲第37項記載の方法。 39．前記GAD65 がヒトGAD65 である請求の範囲第30項記載の方法。 40．GAD65 ポリペプチドを生成するメチロトローフ性酵母株の実質的に純粋な培養物を調製するための方法であって、ａ）（ｉ）メタノール−誘導性転写プロモーター、（ii）GAD65 ポリペプチドをコードする DNAセグメント、（iii）転写ターミネーター、及び（iv）選択マーカーの作用可能に連結された要素を含んで成る DNA構造体によりメチロトローフ性酵母宿主を形質転換し；ｂ）前記 DNAセグメントが発現され、そしてGAD65 ポリペプチドが生成される条件下で、前記段階（ａ）からの形質転換された細胞を培養し；ｃ）前記形質転換された細胞の単離物により生成されるGAD65 ポリペプチドのレベルをアッセイし；そしてｄ）高レベルのGAD65 ポリペプチドを生成する単離物を選択的に培養する段階を含んで成る方法。