JP2003509024A - ピチア・メタノリカグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ２プロモーター及びターミネーター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ピチア・メタノリカ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子（GAP2遺伝子）からの転写プロモーター及びターミネーター配列が開示される。前記配列は、培養物P.メタノリカ細胞におけるタンパク質の生成のためにDNA構造体内で有用である。発現ベクター内で、GAP2プロモーター及び/又はGAP2ターミネーターは、興味あるタンパク質をコードするDNAセグメントに操作可能的に連結される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景： メチロトローフ性酵母は、唯一の炭素源及びエネルギー源としてメタノールを
利用できるそれらの酵母である。メタノール利用のために必要な生化学的経路を
有する酵母の種は、４種の属、すなわちハンセヌラ（Hansenula）、ピチア（Pic
hia）、ガンジダ（Candida）及びトルロピシス（Torulopsis）に分類される。そ
れらの属は、細胞形態及び増殖特徴に基づけば、幾分人工的であり、そして密接
した遺伝子学的関係を表さない（Billon-Grand, Mycotaxon 35:201-204, 1989;
Kurtzman, Mycologia 84: 72-76, 1992）。さらに、それらの属内の全ての種が
炭素源及びエネルギー源としてメタノールを利用できるものではない。この分類
の結果として、属中の個々の種間で生理学及び代謝に高い差異が存在する。

【０００２】 メチロトロープ性酵母は、いくつかの理由のために組換えタンパク質生成シス
テムへの使用のための好ましい候補体である。第１に、いくつかのメチロトロー
フ性酵母は、定義された最少培地上で高いバイオマスに急速に増殖することが示
されている。第２に、組換え発現カセットがゲノム的に組み込まれ、そして従っ
て、有糸分裂的に安定している。第３に、それらの酵母は、多量の組換えタンパ
ク質を分泌することができる。例えば、Faberなど., Yeast 11:1331, 1995; Rom
anos など., Yeast 8: 423, 1992; Creggなど., Bio/Technology 11: 905, 1993
; アメリカ特許第4,855,242号；第4,857,467号；第4,879,231号；及び第4,929,5
55号；及びRaymondによるアメリカ特許第5,716,808号、第5,736,383号、第5,854
,039号及び第5,888,768号を参照のこと。

【０００３】 メチロトロープ性酵母についてのこれまで記載されている発現システムは、メ
タノール誘発性転写プロモーターの使用に高く依存する。しかしながら、メタノ
ール誘発性プロモーターの使用は、生成が商業的レベルまで拡大される場合、問
題がある。発酵工程の間に使用されるメタノールの全体の体積は、最終酵母体積
の40％ほどであり、そして100Lの発酵規模で及び誘発のために必要とされるメタ
ノールの体積以上で、複雑且つ実質的に高価な考慮すべき問題を伴なう。 経済的に重要なポリペプチド、例えば産業用酵素及び医薬タンパク質の生成の
ためへのメチロトロープ性酵母の使用を可能にする追加の材料及び方法のための
必要性が当業界に残存している。

【０００４】 発明の要約： ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）への使用のための転写プロモータ
ー及びターミネーターを提供することが本発明の目的である。P.メタノリカにお
いて異種DNAの構成的発現を得るための材料及び方法を提供することが本発明の
もう１つの目的である。産業レベルまで容易に拡大され得る、P.メタノリカにお
けるポリペプチドの生成方法を提供し、そしてそれらの方法により生成され得る
材料を供給することがまた、本発明の目的である。P.メタノリカにおいて組換え
タンパク質を生成するために異種DNAの構成転写を得るための材料及び方法を提
供することが本発明のもう１つの目的である。

【０００５】 １つの観点においては、本発明は、配列番号１のヌクレオチド93〜ヌクレオチ
ド1080を含んで成る、5000個までの長さのヌクレオチドの単離されたDNA分子を
提供する。

【０００６】 本発明の第２の観点においては、次の操作可能的に連結された要素：ヌクレオ
チド93〜ヌクレオチド1092の配列番号１の配列の少なくとも一部を含んで成る第
１DNAセグメント、ここで前記一部が機能的な転写プロモーターであり；ピチア
・メタノリカ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ以外の興味あ
るタンパク質をコードする第２DNAセグメント；及び転写ターミネーターを含ん
で成る第３DNAセグメントを含んで成るDNA構造体が提供される。１つの態様にお
いては、前記第１DNAセグメントは900〜1500個の長さのヌクレオチドである。も
う１つの態様においては、前記第１DNAセグメントは900〜1000個の長さのヌクレ
オチドである。

【０００７】 追加の態様においては、前記第１DNAセグメントは、ピチア・メタノリカ グ
リセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子コード配列を実質的に有
さない。前記DNA構造体はさらに、選択マーカー、好ましくはピチア・メタノリ
カ遺伝子、より好ましくはピチア・メタノリカADE2遺伝子を含んで成る。前記DN
A構造体は、閉環された環状分子又は線状分子であり得る。他の態様においては
、前記DNA構造体はさらに、第１及び第２DNAセグメントに操作可能的に連結され
る分泌シグナル配列、例えばS.セレビシアエα−因子プレ−プロ配列を含んで成
る。追加の態様においては、前記第３DNAセグメントは、ピチア・メタノリカAUG
1又はGAP2遺伝子の転写ターミネーターを含んで成る。

【０００８】 本発明の第３の観点においては、上記に開示されるようなDNA構造体を含むピ
チア・メタノリカ細胞が供給される。１つの態様においては、前記DNA構造体は
ゲノム的に組み込まれる。関連する態様においては、前記DNA構造体は、複数コ
ピーでゲノム的に組み込まれる。さらなる態様においては、P.メタノリカ細胞は
、液胞プロテアーゼ プロテイナーゼA及びプロテイナーゼBを機能的に欠失する
。

【０００９】 本発明の第４の観点においては、（ａ）上記に開示されるようなP.メタノリカ
細胞を培養し、それにより、第２DNAセグメントが発現され、そして興味あるタ
ンパク質が生成され；そして（ｂ）前記培養された細胞から興味あるタンパク質
を回収することを含んで成る方法が提供される。

【００１０】 本発明の第５の観点においては、次の操作可能的に連結された要素：ピチア・
メタノリカ遺伝子転写プロモーターを含んで成る第１DNAセグメント；ピチア・
メタノリカタンパク質以外の興味あるタンパク質をコードする第２DNAセグメン
ト；及び配列番号１のヌクレオチド2095〜2145を含んで成る第３DNAセグメント
を含んで成るDNA構造体が提供される。 本発明のそれらの及び他の観点は、本発明の次の特定の記載に基づいて明らか
になるであろう。

【００１１】 発明の特定の記載： 用語“対立遺伝子変異体”とは、本明細書において使用される場合、遺伝子の
他の形を示す。対立遺伝子変異体は、集団で存在することが知られており、そし
て突然変異を通して生じる。 “DNA構造体”とは、天然において存在しない配置で組合され、そして並置さ
れたDNAのセグメントを含むようヒト介在を通して修飾された、一本鎖又は二本
鎖DNA分子である。

【００１２】 “DNAセグメント”とは、特定された特性を有する大きなDNA分子の一部である
。例えば、特定されたポリペプチドをコードするDNAセグメントは、5’側から3
’側の方向に読み取られる場合、特定されたポリペプチドのアミノ酸の配列をコ
ードする長いDNA分子の一部、例えばプラスミド又はプラスミドフラグメントで
ある。

【００１３】 用語“機能的に欠失する”とは、野生型相対物における発現活性のレベルに比
較して、10％低い活性の細胞における発現を示す。好ましくは、発現レベルは、
適切なアッセイにより決定される場合、野生型相対物における活性の１％以下、
より好ましくは0.01％以下である。最も好ましくは、その活性は実施的に検出で
きない（すなわち、有意にバックグラウンド以上ではない）。遺伝子における機
能的欠失は、コード又は非コード領域における突然変異誘発により生成され得る
。

【００１４】 用語“遺伝子”とは、ポリペプチドをコードするDNAセグメントを示すために
本明細書において使用される。情況が許す場合、その用語は、ゲノムDNA（介在
性配列を有するか又は有さない）、cDNA及び合成DNAを包含する。遺伝子は、プ
ロモーター要素を包含する非コード配列を包含することができる。 用語“単離された”とは、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオ
チドがその天然の遺伝的環境から除去され、そして従って、他の無関係な又は所
望しないコード配列を有さず、そして遺伝子的に構築されたタンパク質生成シス
テム内での使用のために適切な形で存在することを示す。そのような単離された
分子は、それらの天然の環境から分離され、そしてcDNA及びゲノム クローンを
含む分子である。

【００１５】 “操作可能的に連結された”とは、DNAセグメントに適用される場合、前記セ
グメントが、それらの意図された目的のために協力して機能し、例えば転写がプ
ロモーターにおいて開始し、そしてコードセグメントを通してターミネーターに
進行するよう配列されることを示す。

【００１６】 “ポリヌクレオチド”は、5’末端から3’末端に読み取られるデオキシリボヌ
クレオチド又はリボヌクレオチド塩基の一本鎖又は二本鎖ポリマーである。ポリ
ヌクレオチドは、RNA及びDNAを包含し、そして天然源から単離され、インビトロ
で合成され、又は天然及び合成分子の組み合わせから調製され得る。ポリヌクレ
オチドのサイズは、塩基対(略語“bp”)、ヌクレオチド（“nt”）、又はキロ塩
基（“kb”）として表される。ここで、後者の２つの用語は、一本鎖又は二本鎖
であるポリヌクレオチドを記載する。

【００１７】 この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全体の長さを示すために使用
され、そして用語、“塩基対”に等しいことが理解されるであろう。二本鎖ポリ
ヌクレオチドの二本の鎖は長さにおいてわずかに異なり、そしてその末端が酵素
分解の結果として異なることは、当業者により理解されており；従って、二本鎖
ポリヌクレオチド分子内のすべてのヌクレオチドは一対に成り得ない。そのよう
な不対端は一般的に、20ｎtの長さを越えないであろう。

【００１８】 “ポリペプチド”は、天然において生成されても又は合成的に生成されてもい
ずれにせよ、ペプチド結合により連結されるアミノ酸残基のポリマーである。約
10個以下のアミノ酸残基のポリペプチドが、通常“ポリペプチド”として言及
される。

【００１９】 用語“プロモーター”とは、RNA ポリメラーゼの結合及び転写の開始を提供す
るDNA配列を含む遺伝子の部分を示すために本明細書において使用される。プロ
モーター配列は通常、遺伝子の5’ 非コード領域に見出されるが、しかし必ずし
もそうではない。転写の開始において機能するプロモーター内の配列はしばしば
、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられる。それらのプロモーター
要素は、RNAポリメラーゼ結合部位、TATA配列、及び転写因子結合部位を包含す
る。一般的には、Watsonなど., eds., Molecular Biology of the Gene, 4^th ed
., The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Menlo Park, CA, 1987
を参照のこと。

【００２０】 “プロ配列”とは、通常、分泌タンパク質をコードする遺伝子の成熟コード配
列のすぐ5’側に存在するDNA配列である。プロ配列は、タンパク質が分泌路を通
して移動するにつれて、シス−作用性カペロンとして作用するプロペプチドをコ
ードする。 用語“タンパク質”は、1又は複数のポリペプチド鎖を含んで成る高分子であ
る。タンパク質はまた、非ペプチド成分、例えば炭水化物基を含むことができる
。炭水化物及び他の非ペプチド置換基は、タンパク質が生成される細胞により付
加され、そして細胞型により変化するであろう。タンパク質は、それらのアミノ
酸主鎖により本明細書において定義され；置換基、例えば炭水化物基は一般的に
、特定されないが、しかしそれにもかかわらず、存在することができる。

【００２１】 用語“分泌シグナル配列”とは、それが合成される細胞の分泌路を通してより
大きなポリペプチドを、より大きなポリペプチドの成分として方向ずけるポリペ
プチド（“分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を示す。前記のより大きなポ
リペプチドは、分泌路を通しての移動の間、分泌ペプチドを除去するために通常
分解される。分泌ペプチド及びプロペプチドは、集合的には、プレ−プロペプチ
ドとして言及され得る。

【００２２】 本発明は、ピチア・メタノリカ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（GAPDH）遺伝子プロモーターを含んで成る単離されたDNA分子を提供する
。本発明はまた、P.メタノリカGAPDH遺伝子ターミネーターを含んで成る単離さ
れたDNA分子も提供する。前記プロモーター及びターミネーターは、興味あるタ
ンパク質、例えば医薬又は産業価値のタンパク質を生成する方法内に使用され得
る。

【００２３】 ピチア・メタノリカ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（GA
PDH）遺伝子プロモーター、コード領域及びターミネーターを含んで成るDNA分子
の配列は、配列番号１で示される。前記遺伝子はGAP2と命名されている。当業者
は、配列番号１がP.メタノリカGAP2遺伝子の単一の対立遺伝子を表し、そして他
の機能的対立遺伝子（対立遺伝子変異体）がたぶん存在し、そして対立遺伝子変
異体がプロモーター領域、コード領域又はターミネーター領域におけるヌクレオ
チド変化を包含することができることを理解するであろう。

【００２４】 GAP1と称する第２のP.メタノリカ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ遺伝子の部分配列が、配列番号２で示される。 配列番号１内で、GAPDH読み取り枠は、ヌクレオチド1093−1095でのメチオニ
ンコドン（ATG）により開始する。転写プロモーターは、ATGの上流に位置する。
遺伝子発現実験は、機能的プロモーターがGAP2遺伝子の約1000個のヌクレオチド
の5’−フランキング領域内に含まれることを示した。

【００２５】 転写プロモーターとして本発明内での使用のために配列番号１で示される配列
の好ましい部分は、配列番号１の5’非コード領域の少なくとも900個の連続ヌク
レオチド、及び好ましくは、配列番号１で示される配列のヌクレオチド93〜ヌク
レオチド1080を含んで成るセグメントを包含する。当業者は、P.メタノリカGAP2
遺伝子の5’非コード領域の長い部分がまた使用され得ることを理解するであろ
う。

【００２６】 従って、本発明のプロモーター配列は、3’方向に、配列番号１〜ヌクレオチ
ド1092の配列を含むことができ、そして5’方向に、ヌクレオチドまで又はそれ
以上に延長することができる。一般的に、発現DNA構造体内に使用されるプロモ
ーターは、1.5kbの長さを越えず、そして好ましくは、1.0kbの長さを越えない。
それらのプロモーターフラグメントの他に、本発明はまた、約3300bpまでの単離
されたDNA分子、及び5000bpまでの単離されたDNA分子を提供し、ここで前記分子
は、P.メタノリカGAP2プロモーター配列を含んで成る。

【００２７】 続く例において、より詳細に開示されるように、ヌクレオチド93〜ヌクレオチ
ド1080の配列番号１の配列は機能的転写プロモーターを提供する。しかしながら
、追加のヌクレオチドが、この配列のいずれか又は両端から除去され、そして得
られる配列が、それを、タンパク質、好ましくは便利なアッセイが容易に利用で
きるタンパク質をコードする配列に連結することによって、プロモーター機能に
ついて試験され得る。

【００２８】 本発明においては、好ましくは、GAP2プロモーターは、配列番号１におけるヌ
クレオチド1093で開始するGAP2遺伝子コード配列を実質的に有さない。本明細書
において使用される場合、GAP2遺伝子コード配列を“実質的に有さない”とは、
プロモーターDNAがGAP2コード配列の15個よりも多くないヌクレオチド、好まし
くは10個よりも多くないヌクレオチド及びより好ましくは、３個よりも多くない
ヌクレオチドを含むことを意味する。本発明の好ましい態様においては、GAP2プ
ロモーターは、P.メタノリカGAP2遺伝子のコード配列を除いて供給される。

【００２９】 しかしながら、当業者は、配列番号１の開始ATG（ヌクレオチド1093〜1095）
を含むGAP2遺伝子フラグメントが、ATGを欠いている異種コード配列に操作可能
的に連結され、そして前記GAP2 ATGが前記異種配列の翻訳の開始を提供するこ
とを理解するであろう。当業者は、追加のGAP2コード配列がまた包含され、それ
により、GAP2及び異種アミノ酸配列を含んで成る融合タンパク質が生成されるこ
とを理解するであろう。そのような融合タンパク質は、翻訳に続くGAP2及び異種
配列の分離を促進するための切断部位を含んで成る。

【００３０】 GAP2プロモーター配列の他に、本発明はまた、P.メタノリカGAP2遺伝子の3’
非コード領域に由来する転写ターミネーター配列も提供する。コンセンサス転写
終結配列（Chen and Moore, Mol. Cell. Biol. 12: 3470-3481, 1992）は、配列
番号１のヌクレオチド2136〜2145である。本発明においては、少なくとも50bp、
好ましくは少なくとも60bp、より好ましくは少なくとも90bp、さらにより好まし
くは約200bpの長さの転写ターミネーター遺伝子セグメントが提供される。本発
明のターミネーターセグメントは、配列番号１の3’非コード領域の500〜1000個
のヌクレオチドを含むことができる。

【００３１】 それらのセグメントは、上記で開示された終結配列を含んで成り、そして好ま
しくは、それらの5’末端として、配列番号１のヌクレオチド2095を有する。し
かしながら、当業者は、発現ベクターに供給される転写ターミネーターセグメン
トが、停止コドンを欠いているコード配列の挿入を可能にするために、配列番号
１のヌクレオチド2092−2094でのTAA翻訳終結コドンを、その5’末端で含むこと
ができることを理解するであろう。

【００３２】 クローン化されたDNA分子を操作し、そして種々の宿主細胞中に外来性DNAを導
入するための技法は、当業界において良く知られており、次の文献に開示される
：Sambrook など., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Murray, ed
., Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press, Clifton, NU, 19
91; Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology; Principles and Applica
tions of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994; など., (eds
.)., Short Protocols in Molecular Biology, 3^rd edition, John Wiley and S
ons, Inc., 1995; Wu など.,Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, New
York, 1997。

【００３３】 DNA ベクター、例えば発現ベクターは通常、原核宿主においてベクターの複製
及び増幅を可能にするために、細菌宿主（例えば、E．コリ）において機能する
選択マーカー及び複製の起点を含む。所望により、それらの原核要素は、それが
他の宿主中に導入される前、ベクターから除去され得る。例えば、そのような原
核配列は、P.メタノリカ宿主細胞中へのその導入の前、ベクターの線状化により
除去され得る。

【００３４】 本発明の１つの態様においては、興味あるタンパク質をコードする第２DNAセ
グメントに操作可能に連結される機能的転写プロモーターである配列番号１の配
列の少なくとも一部を含んで成る第１DNAセグメントを含んで成る発現ベクター
が提供される。興味あるタンパク質を分泌することが所望される場合、ベクター
はさらに、第１及び第２DNAセグメントに操作可能的に連結される分泌シグナル
配列を含んで成る。分泌シグナル配列は、興味あるタンパク質の配列であるか、
又はもう１つのタンパク質から誘導され得る。好ましいそのような酵母分泌シグ
ナル配列は、S.セレビシアエα−因子（MFα１）プレ−プロ配列（アメリカ特許
第4,546,082号（Kurjan）及びアメリカ特許第4,870,008号（Brake）により開示
される）である。

【００３５】 本発明の他の態様においては、興味あるタンパク質をコードする追加のDNAセ
グメントに操作可能的に連結される機能的転写ターミネーターである配列番号１
の一部を含んで成るDNAセグメントを含んで成る発現ベクターが供給される。１
つの態様においては、本発明のGAP2プロモーター及びターミネーター配列は組合
して使用され、ここで両者は発現ベクター内の興味あるタンパク質をコードする
DNAセグメントに操作可能的に連結される。

【００３６】 本発明の発現ベクターはさらに、ベクターを含むP.メタノリカ細胞の同定及び
選択を可能にするために選択マーカーを含んで成る。選択マーカーは、それらを
含む細胞の増殖利点を提供する。選択の一般的な原理は当業界において良く知ら
れている。選択マーカーは好ましくは、P.メタノリカ遺伝子である。通常使用さ
れる選択マーカーは、アミノ酸又はヌクレオチドの合成のために必要とされる酵
素をコードする遺伝子である。それらの遺伝子に突然変異を有する細胞は、突然
変異が選択マーカーにより補充されなければ、特定のアミノ酸又はヌクレオチド
を欠いている培地においては増殖することができない。

【００３７】 そのような“選択”培養培地の使用は、宿主細胞内の異種DNAの安定した維持
を確かめる。P.メタノリカへの使用のためのこのタイプの好ましい選択マーカー
は、ホスホリボシル−５−アミノイミダゾールカルボキシラーゼ（AIRC；EC4.1.
1.21）をコードするP.メタノリカADE2遺伝子である。アメリカ特許第5,736,393
号（Raymond）を参照のこと。ADE2遺伝子は、ade2宿主細胞が形質転写される場
合、アデニンの不在下での細胞の増殖を可能にする。代表的なP.メタノリカADE2
遺伝子配列のコード鎖は、配列番号３で示される。示される配列は、5’非コー
ド配列の1006個のヌクレオチド及び3’非コード配列の442個のヌクレオチド、並
びにヌクレオチド1007−1009での開始ATGコドンを包含する。

【００３８】 本発明の好ましい態様においては、ヌクレオチド407−2851を含んで成るDNAセ
グメントは、選択マーカーとして使用されるが、但しより長いか又はより短いセ
グメントが、コード部分がプロモーター及びターミネーター配列に操作可能的に
連結される限り、使用され得る。他に置いては、野生型細胞に増殖利点を提供す
る優性選択マーカーが使用され得る。典型的な優性選択マーカーは、抗生物質、
例えばネオマイシン型抗生物質（例えばG418）、ヒグロマイシンB、及びブレオ
マイシン/フレオマイシン−型抗生物質（例えば、Zeocin^TM; Invitrogen Corpor
ation, San Diego, CAから入手できる）に対する耐性を付与する遺伝子である。
P.メタノリカへの使用のための好ましい優性選択マーカーは、Zeocin^TM の活性
を阻害するSh bla遺伝子である。

【００３９】 組換えタンパク質の生成のための宿主としてのP.メタノリカ細胞の使用は、WI
PO公開WO97/17450号、WO97/17451号、WO98/02536号及びWO98/12565号；及びアメ
リカ特許第5,716,808号、第5,736,383号、第5,854,039号及び第5,736,383号に開
示される。P.メタノリカを形質転換することに使用するための発現ベクターは通
常、形質転換の前、好ましくは線状化される、二本鎖環状プラスミドとして調製
されるであろう。

【００４０】 宿主染色体中への発現ベクターDNAの組込みを促進するためには、宿主DNA配列
（例えば、AUG1 3’配列）により両端でフランギングされるプラスミドの完全
な発現セグメントを有することが好ましい。エレクトロポレーションが、P. メ
タノリカ細胞中へ興味あるポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドの導
入を促進するために使用される。2.5〜4.5kV/cm, 好ましくは約3.75kV/cmの電場
の強さ及び１〜40m秒、最も好ましくは約20m秒の時定数（τ）を有する指数的に
減衰する、パルスされた電場を用いて、エレクトロポレーションによりP．メタ
ノリカ細胞を形質転換することが好ましい。

【００４１】 インテグレイティブ形質転換体は、タンパク質生成工程への使用のために好ま
しい。そのような細胞は、DNAはゲノムからめったに失われないので、連続選択
圧力を伴なわないで増殖され得る。宿主染色体中へのDNAの組み込みは、サザン
ブロット分析により確かめられ得る。手短には、形質転換され、そして形質転換
されていない宿主DNAは、制限エンドヌクレアーゼにより消化され、電気泳動に
より分離され、支持膜にブロットされ、そして適切な宿主DNAセグメントにより
プローブされる。形質転換されない及び形質転換された細胞に見出されるフラグ
メントのパターンの差異は、インテグレイティブ形質転換の標示である。制限酵
素及びプローブは、ゲノムフラグメント間から形質転換DNAセグメント（例えば
、プロモーター、ターミネーター、異種DNA及び選択マーカー配列）を同定する
ために選択され得る。

【００４２】 異種タンパク質の発現レベルの差異は、個々の単離物間での組み込みの部位及
び発現カセットのコピー数のような要因に起因する。従って。生成株を選択する
前、発現レベルについて多くの単離物をスクリーンすることが好都合である。高
い発現レベルを示す単離物は通常、所望する発現カセットの複数の組み込まれた
コピーを含むであろう。種々の適切なスクリーニング方法が利用できる。例えば
、形質転換体のコロニーは、タンパク質を結合する膜（例えば、ニトロセルロー
ス）により被覆されるプレート上で増殖される。

【００４３】 タンパク質は、分泌により又は溶解に従って、膜に結合する細胞から開放され
る。次に結合されたタンパク質は、既知の方法、例えばイムノアッセイを用いて
アッセイされ得る。発現レベルのより正確な分析は、液体培地において細胞を培
養し、そしてならし培地又は細胞溶解物を分析することによって得られる。培地
及び溶解物からのタンパク質を濃縮し、そして精製するための方法は、興味ある
タンパク質により、一部、決定されるであろう。そのような方法は、当業者によ
り容易に選択され、そして実施される。

【００４４】 分泌されたタンパク質の生成のためには、PRB4遺伝子によりコードされ液胞プ
ロテアーゼ プロテイナーゼA、及びPRB1遺伝子によりコードされるプロテイナ
ーゼBの機能的欠失を有する宿主細胞が、擬似のタンパク質加水分解を最少にす
るために好ましい。液胞プロテアーゼ活性（及び従って、液泡プロテアーゼ欠失
）は、いくつかの既知のアッセイのいずれかを用いて測定される。好ましいアッ
セイは、サッカロミセス・セレビシアエのために開発され、そしてJones, Metho
ds Enzymol. 194:428-453, 1991により開示されるそれらのアッセイである。好
ましいそのようなアッセイは、カルボキシペプチダーゼY（CpY）に活性を検出す
るAPNEオーバーレイアッセイである。Wolf and Fink, J. Bact. 123: 1150-1156
, 1975を参照のこと。

【００４５】 チモーゲン（pro）CpYはプロテイナーゼA及びプロテイナーゼBにより活性化さ
れるので、APNEアッセイは、一般的に液胞プロテアーゼ活性の標示である。APNE
オーバーレイアッセイは、ジアゾニウム塩Fast Garnetとβ−ナフトールとの反
応により不溶性赤色色素の形成をもたらす、N−アセチル−フェニルアラニン−
β−ナフチル−エステル（APNE）からのβ−ナフイールのカルボキシペプチダー
ゼY−介在性開放を検出する。室温でのアッセイプレート（YEPDプレートが好ま
しい）上で増殖する細胞が、8mlのRxMにより被覆される。

【００４６】 MxMは、0.175gの寒天、17.5mlの水、及び１Mのトリス−HCｌ（pH7.4）5mlを組
合し、寒天を溶解するために前記混合物をマイクロウェーブ処理し、約55℃に冷
却し、新しく製造された2.5mlのAPNE（ジメチルホルムアミドにおいて2mg/ml）
（Sigma Chemical Co., St. Louis, MO）を添加し、そしてアッセイの直前、20m
gのFast Garnet GBC 塩（Sigma Chemical Co.）を添加することによって調製さ
れる。前記オーバーレイは、固化を可能にし、そして色の進行が観察される。野
生型コロニーは赤色であり、そしてCPY欠失株は白色である。

【００４７】 カルボキシペプチダーゼY活性はまた、ウェル試験により検出され得、ここで
細胞がマイクロタイター試験プレートのウェル中に分配され、そしてN−ベンゾ
イル−L−トリシンｐ−ニトロアニリド（BTPNA）及びジメチルホルムアミドの存
在下でインキュベートされる。細胞がジメチルホルムアミドにより透過され、そ
して細胞におけるBpYがBTPNAにおけるアミド結合を分解し、黄色の生成物ｐ−ニ
トロアニリンを生成する。CpYについてのアッセイは、活性が最終的に、CpY活性
の低下をもたらす限り、プロテアーゼ活性を低めるいずれかの突然変異を検出す
るであろう。

【００４８】 P. メタノリカ細胞は、炭素、窒素及び微量栄養素の適切な源を含んで成る培
地において、約25℃〜35℃の温度で培養される。液体培養物は、従来の手段、例
えば小さなフラスコを振盪し、又は発酵器のスパージングにより十分な通気を供
給される。P.メタノリカのための好ましい培養培地は、YEPD（２％のD−グルコ
ース、２％のBacto^TM Peptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1％のBact
o^TM 酵母抽出物（Difco Laboratories）、0.004％のアデニン、0.006％のL−ロ
イシン）である。

【００４９】 大規模培養に関しては、P.メタノリカ株の１〜２個のコロニーが新鮮な寒天プ
レート（例えば、YEPD寒天）から採取され、そして２Lのそらせ板付き振盪フラ
スコに含まれるYEPDブイヨン250mlに懸濁される。培養物は、30℃及び250rpmの
振盪速度で16〜24時間、増殖される。約50〜80mlの接種物が、出発発酵器体積１
L当たりに使用される（５〜８％（v/v）の接種物）。

【００５０】 好ましい発酵培地は、炭素源としてのグルコース、無機アンモニア、カリウム
、リン酸塩、鉄及びクエン酸を含んで成る可溶性培地である。本明細書において
使用される場合、“可溶性培地”とは、眼に見える沈殿を含まない培地である。
好ましくは、培地は、リン酸ガラス（ナトリウムヘキサメタホスフェート）を欠
いている。好ましい培地は、脱イオン水において調製され、そして硫酸カルシウ
ムを含まない。最少培地として、好ましくは、培地はポリペプチド又はペプチド
、例えば酵母抽出物を欠いている。しかしながら、酸加水分解されたカゼイン（
例えば、カサミノ酸、又はアミカーゼ）が、所望により、培地に添加され得る。

【００５１】 例示的な発酵培地は、次の化合物を混合することによって調製される：(NH₄)₂ SO₄ (11.5g/l), K₂HPO₄ (2,60g/l), KH₂PO₄ (9.50g/l), FeSO₄・7H₂O (0.40g/l)
及びクエン酸（1.00g/l）。蒸留され、脱イオン化された水を１Lまで添加した後
、その溶液を、オートクレーブにより滅菌し、冷却し、そして次に、次のものに
より補充される：60％（w/v）のグルコース溶液（47.5ml/l）、10×微量金属溶
液（20.0ml/l）、１MのMgSO₄ (20.0ml/l) 及びビタミン原液（2.00ml/l）。

【００５２】 10×微量金属溶液は、FeSO₄・7H₂O (100mM), CuSO₄・5H₂O (2mM), ZnSO₄・7H₂ O (8mM), MnSO₄・H₂O (8mM), CoCl₂・6H₂O (2mM), Na₂MoO₄・2H₂O (1mM), H₃BO₃ (8mM), KI (0.5mM), NiSO₄・6H₂O (1mM), チアミン（0.50g/l）及びビオチン（
5.00mg/l）を含む。ビタミン原液は、イノシトール（47,00g/ｌ）、パントテン
酸（23,00g/l）、ピロドキシン（1.20g/l）、チアミン（5.00g/l）及びゼオチン
（0.10g/l）を含む。当業者は、それらの特定の成分及び量を変えることができ
る。例えば、硫酸アンモニウムは塩化アンモニウムにより置換され、又は硫酸ア
ンモニウムの量は、約11g/lから約22g/lまで変化することができる。

【００５３】 微量金属及びビタミンの添加の後、培地のpHは典型的には、10％のH₃PO₄の添
加によりpH4.5に調節される。一般的に、約10mg/lが添加され、そして追加の酸
添加は必要とされないであろう。発酵の間、pHは、５NのNH₄OHの添加により、生
成されるタンパク質に依存して、約3.5〜約5.5又は約4.0〜約5.0維持される。

【００５４】 例示的な発酵器は、BIOFLO 3000発酵器システム（New Brunswick Scientific
Company, Inc., Edison, NJ) である。この発酵器システムは、６L又は14Lの発
酵器容器を取り扱うことができる。６Lの容器により行われる発酵は、３Lの培地
により調製され、そして14Lの容器により行われる発酵は、６Lの培地により調製
される。発酵器の操作温度は典型的には、発酵の間、30℃に設定されるが、但し
その温度は、発現されるタンパク質に依存して、27〜31℃の範囲である。発酵は
バッチモードで開始される。最初に存在するグルコースはしばしば、約10時間の
経過発酵時間（EFT）により使用され、この時点で、グルコース供給が細胞マス
を高める開始され得る。

【００５５】 例示的なグルコース供給物は、900mlの60％（w/v）グルコース、60mlの50％（
w/v）(NH₄)₂SO₄、60mlの10×微量金属溶液、及び30mlの１MのMgSO₄を含む。ピチ
ア・メタノリカ発酵は、強力であり、そして30％以上の％溶解された酵素飽和を
維持するために、高い撹拌、通気及び酸素スパージングを必要とする。％溶解さ
れた酵素は、最適な発現及び増殖のために15％以下に低めるべきではない。バイ
オマスは典型的には、48時間のEFTで、約30〜約80gの細胞乾量/ｌに達する。

【００５６】 本発明に従って生成されるタンパク質は、従来の方法を用いて、宿主細胞から
回収される。タンパク質が細胞内生成される場合、細胞は収穫され（例えば、遠
心分離により）、そして細胞質含有物を開放するために溶解される。溶解方法は
、酵素による及び機械的破壊を包含する。次に、粗抽出物が、既知の方法に従っ
て分別され、その特徴が興味ある特定タンパク質について決定されるであろう。
分泌されたタンパク質は、標準の方法を用いて、ならし培養培地から回収され、
または、特定のタンパク質について選択される。一般的に、Scopes, Protein pu
rification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1994を参
照のこと。

【００５７】 本発明の材料及び方法は、興味ある研究、産業又は医薬のためのタンパク質を
生成するための使用され得る。そのようなタンパク質は、酵素、例えばリパーゼ
、セルラーゼ及びプロテアーゼ；酵素インヒビター、例えばプロテアーゼインヒ
ビター；成長因子、例えば血小板由来の成長因子（PDGF）、線維芽細胞成長因子
（FGF）、上皮成長因子（EGF）、血管内皮成長因子（VEGF）；グルタミン酸デカ
ルボキシラーゼ（GAD）；サイトカイン、例えばエリトロポエチン、トロボポイ
エチン、コロニー刺激因子、インターロイキン及びインターロイキンアンタゴニ
スト；ホルモン、例えばインスリン、プロインスリン、レプチン及びグルカゴン
；及び切断された形（“可溶性受容体”）、又は免疫グルブリン不変領域配列と
の融合タンパク質として発現され得る受容体、例えば成長因子受容体を包含する
。

【００５８】 例えば、アメリカ特許第4,889,919号；第5,219,759号；第4,868,119号；第4,9
68,607号；第4,599,311号；第4,784,950号；第5,792,850号；第5,827,734号；第
4,703,008号；第4,431,740号及び第4,762,791号；及びWIPO公開WO95/21920号及
びWO96/22308号を参照のこと。

【００５９】 グリコシル化されていない医薬タンパク質を生成することが本発明において特
に好ましい。酵母細胞、例えばP.メタノリカ細胞は、それらの哺乳類相対物とは
異なる炭水化物鎖を有する糖タンパク質を生成する。従って酵母細胞において生
成される哺乳類糖タンパク質は、哺乳類中に導入される場合、“外来性”として
見なされ、そして例えば、それらの天然においてグルコシル化された相対物より
も異なった薬力学を示すことができる。 本発明は、次の非制限的な例によりさらに示される。

【００６０】 実施例例１ ： P.メタノリカGAP1遺伝子をクローン化するために、センス（ZC11,356；配列番
号４）及びアンチセンス（ZC11,357; 配列番号５）PCRプライマーを、サッカロ
ミセス・セレビシアエ、クルイベノミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）
及びマウスのGAPDH遺伝子のコード領域の一列整列から企画した。次に、プライ
マーを用いて、P．メタノリカゲノムDNAを増幅した。608bpの長さの増幅された
配列を回収し、そしてその対応するS. セレビシアエGAPDH遺伝子配列に対して78
.1％の相同性を有することが見出された。

【００６１】 P．メタノリカゲノムライブラリーを、ベクターpRS426（Christiansonなど.,
Gene110：119-122, 1992）、すなわち２μ及びS.セレビシアエURA３配列（S.セ
レビシアエにおいてその増殖を可能にする）を含んで成るシャトルベクターにお
いて構成した。ゲノムDNAを、標準の方法に従って、CBS6515株から調製した。手
短に言及すれば、細胞を富化培地において一晩、培養し、チモリアーゼによりス
フェロプラスト化し、そしてSDSにより溶解した。DNAを、前記溶解物からエタノ
ールにより沈殿せしめ、そしてフェノール/クロロホルム混合物により抽出し、
次に酢酸アンモニウム及びエタノールにより沈殿せしめた。

【００６２】 DNA調製物のゲル電気泳動は、損なわれていない高分子量、及び測定できる量
のRNAの存在を示した。DNAを、酵素の一連の希釈溶液の存在下でDNAをインキュ
ベートすることによって、Sau 3Aにより部分的に消化した。消化物のサンプルを
、電気泳動により分析し、フラグメントのサイズ分布を決定した。４〜12kb間で
移動するDNAをゲルから切除し、そしてゲルスライスから抽出した。次に、サイ
ズ−分別されたDNAを、Bam HIにより消化され、そしてアルカリホスファターゼ
により処理されたpRS426に連結した。反応混合物のアリコート、エレクトロポレ
−ター（Gene Pulser^TM ; BioRad Laboratories, Hercules, CA）を用いて、製
造業者の推薦に従って、E.コリMC1061細胞中にエレクトロポレートした。

【００６３】 ライブラリーを、P．メタノリカGAPDHの配列決定された領域から企画されたセ
ンス（ZC11,733; 配列番号６）及びアンチセンス（ZC11,734;配列番号７）を用
いてPCRによりスクリーンした。PCR反応混合物を、94℃で１分間；次に94℃で１
分間、52℃で45秒間、72℃で２分間（34サイクル）；及び94℃で１分間、54℃で
１分間、72℃で11分間（終結サイクル）、インキュベートした。43のライブラリ
ープールから出発して、陽性のプールを同定し、そして個々のコロニーに分解し
た。その挿入体としてP.メタノリカGAPDH遺伝子を含むpRS426プラスミドを有す
る単一コロニーを単離した。挿入体におけるGAPDH遺伝子の配向及び5’及び3’
側フランキング配列の長さを、DNA配列決定により検出した（配列番号２）。こ
の遺伝子を、GAP１と命名した。

【００６４】 配列番号２内で、GAPDH読み取り枠は、ヌクレオチド1733−1735でのメチオニ
ンコドン（ATG）により開始する。転写プロモーターは、ATGの上流に位置する。
遺伝子発現実験は、機能的プロモーターがGAP１遺伝子の約900個のヌクレオチド
の5’−フランキング領域内に含まれることを示した。このプロモーター配列の
分析は、サッカロミセス・セレビシアエプロモーター要素に対して相同である多
くの配列の存在を示した。

【００６５】 それらの配列は、ヌクレオチド1584〜1591でコンセンサスTATAAAボックス、ヌ
クレオチド1355〜1367でコンセンサスRap1p結合部位（Graham and Chambers, Nu
c. Acids Res. 22: 124-130, 1994）、及びヌクレオチド1225〜1229、1286〜129
0、1295〜1299、1313〜1317、1351〜1354、1370〜1374、1389〜1393及び1457〜1
461で可能性あるGcr1p結合部位（Shore, Trends Genet. 10: 408-412, 1994）を
包含する。コンセンサス転写終結配列（Chen and Moure, Nol. Cell. Biol. 12:
3470〜3481, 1992）が、配列番号２のヌクレオチド2774〜2787で同定された。

【００６６】 pGAPDHと称する、GAP1遺伝子を含むプラスミドは、American Type Culture Co
llection, Manassas, VAに、ブダペスト条件下でE．コリ株MC1061形質転換体と
して寄与されている。その寄託された株は、名称PTA−３及び1999年５月４日の
寄託日を割り当てられている。

【００６７】例２ ： プローブとして、クローン化されたGAP１遺伝子のコード領域からのPCR生成物
を用いてのサザンブロットによるP．メタノリカゲノムの分析は、３種の独立し
たGAPDH遺伝子の存在を示した。クローン化された配列から企画されたプライマ
ーを、P．メタノリカゲノムDNAを増幅するために、種々の組み合わせで使用した
。陽性プールを、PCRによりスクリーンし、そして陽性体を再増幅した。PCR生成
物を配列決定した。８種のプールが同じであることが見出され、そして前にクロ
ーン化されたGAP１遺伝子に対応した。２種のプールは、前にクローン化された
遺伝子とは異なり、そしてお互い同一であった。

【００６８】 それらの２種のプールの個々をプレートし、そして数回の細分割を通してPCR
により増幅した。サブプールを画線培養し、そして単一のコロニーを、最終回の
PCRスクリーニングのために採取した。陽性クローンを、PCR及び制限消化により
分析した。個々のクローンは、約５kbのゲノムセグメント上に担持されることが
見出された。GAP2として命名されたこの遺伝子を部分的に配列決定した。配列決
定された領域は、1000個の塩基対の読み取り枠（例えば、終結コドン）、1092個
の塩基対の5’側非コード領域、及び1239個の塩基対の3’側非コード領域（配列
番号１）を含んだ。

【００６９】例３ ： GAP2 DNAのフラグメント（配列番号１）を、２種のプライマーを用いて、PCR
により単離した。プライマーZC19,334（配列番号８）は、26bpのベクターフラン
キング配列、及びGAP2プロモーターの最初の1000bpの5’末端に対応する25bpを
含んだ。プライマーZC19,333（配列番号９）は、S.セレビシアエα因子プレ−プ
ロ配列に対応する3’末端の35bp、及びGAP2プロモーターの3’末端対応する29bp
を含んだ。後者のプライマーは、ヌクレオチド1081−1092での5’側フランキン
グ配列をGAATTCAAAAGA（配列番号10）に変更し、EcoRI部位の導入をもたらした
。

【００７０】 PCR反応条件は次の通りであった（すべてにおいて５個の管）：94℃で30秒間
、55℃で30秒間、及び72℃で１分間（20サイクル）；続いて４℃でのソーキング
。5種のサンプルを1つの管中に組合し、そして２体積の100％エタノールにより
沈殿せしめた。得られるペレットを、水10μlに再懸濁した。サンプルを、TE（1
0mMのトリス、２mMのEDTA）中に、１：５、１：25及び１：125の希釈溶液として
連続的に希釈した。DNA濃度を、１％アガロースゲル上でPCR生成物を試験するこ
とにより評価した。予測される約１kbのフラグメントが見出された。残る８μl
の生成物を、下記のようにして、組換えのために使用した。

【００７１】 P．メタノリカGAP2プロモーター、S.セレビシアエα因子プレ−プロ配列、及
びアミノ−末端Glu−Glu親和性標識（Grussenmeyerなど., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA 82: 7952-4,1985）と共にレプチンをコードするcDNAを含む、pTAP96と
称する発現プラスミドを、プラスミドpTAP37及びpCZR189の一部を用いて、相同
組換えにより構成した。プラスミドpTAP37は、修飾されたP．メタノリカGAP１プ
ロモーター、P．メタノリカADE2選択マーカー、E.コリにおけるアンピシリン耐
性のための遺伝子、S.セレビシアエURA3選択マーカー、及びS.セレビシアエのCE
N−ARSを含んで成る。

【００７２】 pCZR189は、S.セレビシアエα因子プレ−プロ配列及びレプチンコード配列を
含んで成る。100μlのコンピテント酵母細胞（S.セレビシアエ）を、約１μgのN
otI−切断pCZ189、上記のようなGAP2プロモーターを含むPCR生成物1μg、及び10
0ngのEcoRI−切断pTAP37ベクターを含む混合物７μlと共に組合し、そしてこの
混合物を0.2cmのエレクトロポレーションキュベットに移した。酵母/DNA混合物
を、0.75kV (5kV/cm)、無限オーム、25μFで電気パルスした。個々のキュベット
に、1.2Mのソルビトール600μlを添加し、そして次に、酵母を、２−URA Dプレ
ート上に２つの300−μlアリコートでプレートし、そして30℃でインキュベート
した。

【００７３】 約48時間後、単一のプレートからのUra⁺酵母形質転換体を水１mlに再懸濁し、
そして短時間、回転せしめ、酵母細胞をペレット化した。その細胞ペレットを、
1mlの溶液緩衝液（２％のｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Tri
ton（商標）X-100）, 1％SDS, 100mMのNaCl、10mMのトリス（pH8.0）、1mMのEDT
A）に再建濁した。500μlの溶解混合物を、300μlの酸−線状されたガラスビー
ズ及び200μlのフェノール−クロロホルムを含む遠心分離管に添加し、１分間隔
で２又は３度、かきまぜ、続いて遠心分離機において最大速度で５分間、回転せ
しめた。300μlの水性相を新しい管に移し、そしてDNAを600μlのエタノールに
より沈殿せしめ、続いて４℃で10分間、遠心分離した。DNAペレットを、100μl
の水に再懸濁した。

【００７４】 40μlのエレクトロコンピテントE．コリ細胞（MC1061；Casadabanなど., J. M
ol. Biol. 138, 179-207, 1980）を、2.0kV，25μF及び400オームでの１μlの酵
母DNA調製物によるエレクトロポレーションにより形質転換した。エレクトロポ
レーションに続いて、0.6mlのSOC（２％Bacto^TM トリプトン（Difco Laboratori
es）、0.5％の酵母抽出物（Difco Laboratories）、10mMのNaCl, 2.5mMのKCl, 1
0mMのMgCl₂, 10mMのMgSO₄、20mMのグルコース）を、LB＋Ampプレート（LBブイヨ
ン、1.8％Bacto^TM 寒天（Difco Laboratories）, 100mg/lのアンピシリン）上に
、１アリコートでプレートした。

【００７５】 α因子プレ−プロ/レプチン融合体のGAP2プロモーター駆動合成のための正し
い発現構造体を有する細胞を、GAP2プロモーターを生成するために使用される同
じプライマーを用いて、PCRを通してスクリーンした。PCR条件は次の通りであっ
た：94℃で30秒間、55℃で30秒間及び72℃で１分間、25サイクル；続いて４℃で
のソーキング。2つの陽性クローンを、１％アガロースゲル上で同定し、そして
配列分析にゆだねた。正しいクローンの1つを選択し、そしてpTAP96と命名した
。

【００７６】 プラスミドpTAP96 DNAを、市販のプラスミド単離キット（QIAGEN（商標）Plas
mid Maxi Kit; Qiagen, Inc., Valencia, CA）を用いて、アニオン交換クロマト
グラフィーにより調製した。DNAをScaIにより診断的に切断し、１％ゲル上で約1
700bp、2250bpのダブレット及び6000bpの予測されるバンドを生成した。次に、
１μgのpTAP96 DNAをNotIにより切断し、そしてアメリカ特許第5,854,039号に開
示されるようにして、エレクトロコンピテントP．メタノリカ株PMAD16（下記例
４に開示される）を形質転換した。形質転換を、−ADE DSプレート上で選択した
（表１）。

【００７７】 表１ −ADE DS : 0.056％の−Ade−Trp−Thr粉末、 アミノ酸を含まない0.67％の酵母窒素基材、 ２％D−グルコース、 0.5％の200×トリプトファン、トレオニン溶液、 18.22％のD−ソルビトール

【００７８】−Ade−Trp−Thr粉末 ： 3.0gのアルギニン、5.0gのアスパラギン酸、2.0gのヒスチジン、6.0gのイソロ
イシン、8.0gのロイシン、4.0gのリシン、2.0gのメチオニン、6.0gのフェニルア
ラニン、5.0gのセリン、5.0gのチロシン、4.0gのウラシル及び6.0gのバリン（す
べて、L−アミノ酸）を組合すことによって製造された粉末。200×トリプトファン、トレオニン溶液 ：

【００７９】 水中、3.0％L−トレオニン、0.8％L−トリプトファン。プレートのためには、
1.8％Bacto^TM 寒天（Difco Laboratories）を添加する。 ADE2遺伝子の存在を示す白色コロニーを、−ADEプレート上に貼り付け、そし
て細胞を一晩、増殖せしめた。次に、細胞YEPDプレート上にレプリカプレート、
そしてニトロセルロース膜により被覆した。次の日、フィルターを脱イオン水下
で軽く洗浄し、次に65℃で10分間、１×Wester変性緩衝液（625mMのトリス、625
mMのグリシン、pH9.0、5mMのβ−メルカプトエタノール）において変性した。フ
ィルターを、TTBS（160mMのNaCl、20mMのトリス、pH7.4、0.1％のTween20）及び
5％脱脂粉乳において30分間、ブロックした。

【００８０】 次にフィルターを、室温で１時間、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（10
mlのTTBS＋5％脱脂粉乳に希釈された抗体5μl）に接合された抗−Glu−Glu標識
抗体に暴露した。フィルターを２度、５分間、TTBS（脱脂粉乳を有さない）によ
り洗浄し、そして手短に、水によりすすいだ。フィルターを、１：１希釈溶液と
しての市販の化学発光試薬（ECL^TM 直接的ラベリングキット；Amersham Corp.,
Arlington Heights, IL）を用いてスクリーンし、そしてすぐに、フィルターを
フィルムに暴露した。１つのクローンが、検出できるシグナルを生成した。

【００８１】例４ ： 液胞プロテアーゼを欠失するP.メタノリカ株を生成するために、PEP4及びPRB1
遺伝子を同定し、そして破壊した。PEP4及びPRB1配列を、100ｐモルのプライマ
ーDNA, 1×緩衝液（Boehringer Mannheim, Indianapolis, INにより供給される
）、250μlのdNTP, 1〜100ｐモルの鋳型DNA、及び１単位のTaqポリメラーゼを含
む反応混合物において、100μlの反応体積において、PCRにより増幅した。DNAを
、94℃で30秒間、50℃で60秒間及び72℃で60秒間、30サイクル以上増幅した。

【００８２】 S．セレビシアエ（Ammererなど., Moll. Cell. Biol. 6: 2490-2499, 1986; W
oolford など．，Mol. Cell. Biol. 6:2500-2510, 1986）及びP．パストリス（P
．pastoris）(Gleeson など,. アメリカ特許第5,324,660号)に由来するPEP4配列
の一列整列を用いて、保存された領域に対応するいくつかのセンス及びアンチセ
ンスプライマーを企画した。１つのプライマー組、すなわちZC9118（配列番号11
）及びZC9464（配列番号12）は、ゲノムDNAからの予測されるサイズのPCR生成物
を生成し、そしてこの組みを用いて、増幅された領域に対応するゲノムクローン
を同定した。このゲノムクローンの一部のDNA配列決定（配列番号13で示される
）は、S.セレビシアエからのプロテイナーゼAとの70％アミノ酸同一性を有する
ポリペプチド（配列番号14）をコードする読み取り枠を示した。

【００８３】 P．メタノリカPRB1の同定のためのプライマーを、S.セレビシアエ（Moehleな
ど., Mol. Cell. Biol. 7: 4390-4399, 1987）、P.パストリス（Gleesonなど.,
アメリカ特許第5,324,660号）及びクルイベロミセス・ラクチス（Fleerなど., W
IPO公開WO94/00579号）のPRB1遺伝子間の一列整列に基づいて企画した。１つの
プライマー組、すなわちZC9126（配列番号15）及びZC9741（配列番号16）は、ゲ
ノムDNA（配列番号17）からの約400bpのフラグメントを増幅した。この生成物が
配列決定され、そしてS.セレビシアエからのプロテイナーゼBとの70％アミノ酸
同一性を有するポリペプチド（配列番号18）をコードすることが見出された。次
に、PRBプライマー組みを用いて、P．メタノリカPRB1遺伝子を包含するゲノムク
ローンを同定した。

【００８４】 P．メタノリカPEP4及びPRB1における欠失突然変異を、利用できる制限酵素部
位を用いて生成した。クローン化された遺伝子を制限マッピングした。pep4Δ対
立遺伝子を、BamHI及びNcoI部位間の約500bpの領域を欠失し、そして配列番号13
に示される配列のヌクレオチド１〜393を閉じ込めることによって創造した。prb
1Δ対立遺伝子を、NcoI及びEcoRV部位間の約１kbpの領域を欠失し、そして配列
番号17に示される配列を閉じ込めることによって生成した。クローン化されたPE
P4及びPRB1遺伝子を、pCZR139、すなわち2.4kbのSpeI ADE2挿入体を担持するフ
ァゲミドベクター（pBluescript（商標）II KS(+), Stratagene, La Jolla, CA
）中にサブクローン化し、欠失を創造した。

【００８５】 PEP4遺伝子の場合、pCZR139におけるユニークBamHI部位を、消化により切除し
、フィルインし、そして再連結した。次に、ベクターを、EcoRI及びHindIIIによ
る消化により線状化し、そしてPEP４遺伝子に及ぶ約４kbのEcoRI−HindIIIフラ
グメントを、前記線状化されたベクターに連結し、プラスミドpCZR142を生成し
た。次に、約500bpの欠失を、pCZR142をBamHI及びNcoIにより消化し、末端をフ
ィルインし、そしてDNAを再連結し、プラスミドpCZR142を生成することによって
生成した。PRB1遺伝子（約5kbのXhoI−BamHIフラグメント）を、pCZR139中にサ
ブクローン化し、そして配列番号17で示される配列を含んで成る、内部EcoRV−N
coIフラグメントを欠失し、プラスミドpCZR153を生成した。

【００８６】 プラスミドpCZR143を、ユニーク部位で切断するAsp718により線状化した。線
状化されたプラスミドを、P．メタノリカPMAD11株（アメリカ特許第5,736,383号
に開示されるようにして生成されたade2変異体）中に導入した。形質転換体を、
−ADE DS（表１）上で増殖し、Ade⁺形質転換体を同定した。２種の種類の白色A
de⁺形質転換体を分析した。１つの種類は一次形質転換プレート上ですぐに発生
し；第２の種類は、不安定なピンク色の形質転換体コロニーの縁上で白色乳頭状
物を急速に増殖することから明らかになった。

【００８７】 サザンブロットを用いて、所望する相同組換え現象を受けた形質転換体を同定
した。100μlの細胞ペーストを、24〜48時間のYEPDプレートから削り取り、そし
て1mlの水により洗浄した。洗浄された細胞を、400μlのスフェロプラスト緩衝
液（1.2Mのソルビトール、10mMのクエン酸ナトリウム、pH7.5、10mMのEDTA、10m
MのDTT、1mg/mlのチモリアーゼ100T）に再懸濁し、そして37℃で10分間インキュ
ベートした。400μlの１％SDSを添加し、その細胞懸濁液を室温で、透明になる
まで混合し、1.5Mの酢酸カリウム300μlを混合し、そしてその混合物を、５分間
の微小遠心分離により透明にした。透明にされた溶解物750μlを、等体積のフェ
ノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１）により抽出し、そ
の600μlを新しい管に移し、100％エタノール２体積を添加し、そしてDNAを、４
℃での15分間の微小遠心分離により沈殿せしめた。

【００８８】 ペレットを、100μg/mlのRNAアーゼを含むTE（10mMのトリス、pH8.0、1mMのED
TA）50μlに再懸濁した。10μlのDNA（約100ng）を、合計100μlの体積において
、適切な酵素により消化し、200μlのエタノールにより沈殿せしめ、そしてDNA
負荷色素10μlに再懸濁した。DNAを0.7％アガロースゲルにおいて分離し、そし
て半乾燥ブロット装置（BioRad Laboratories, Richmond, CA）におけるナイロ
ン膜（Nytran N⁺、Amersham Corp., Arlington Heights, IL）に、製造業者によ
り推薦されるようにして移行した。

【００８９】 移行されたDNAを変性し、中和し、そしてStratalinker (Stratagene, La Joll
a, CA) を用いて、UV光により膜に架橋した。PEP4でのタンデム組み込みを有す
る株を同定するために、２種のプローブを使用した。1つのプローブは、PEP4の3
’端からの1400bpのEcoRI−Hind IIIフラグメントであった。第２のプローブは
、PEP4の5’端からの2000bpのBamHI−EcoRIフラグメントであった。フラグメン
トを、化学発光試薬（ECL^TM 直接的ラベリングキット；Amersham Corp., Arling
ton Heights, IL）を用いて検出した。

【００９０】 野生型のタンデム重複及び遺伝子の欠失対立遺伝子を有する親株を、YEPDブイ
ヨンにおいて一晩、増殖し、ループアウトされたAde^-株を生成した。次に、それ
らの細胞を、アデニン制限されたYEPDプレート上に、プレート当たり2000〜5000
のコロニーの密度でプレートし、30℃で３日間、及び室温で３日間、増殖した。
室温への移行は、まれなピンク色のAde^-コロニーの色素着色を増強した。ループ
アウトされた株は、約１つのピンク色のAde^-コロニー/スクリーンされた10,000
のコロニーの頻度で一貫して検出された。それらの株を、欠失の部位まで及ぶプ
ライマーを用いて、サザンブロット又はPCRにより、野生型又は変異体遺伝子の
保持についてスクリーンした。ade2−11 pep4Δ株を、PMAD15と命名した。

【００９１】 次に、PRB1遺伝子を、プラスミドpCZR153による形質転換により、実質的に上
記のようにして、PMAD15から欠失した。ブロットを、PRB1及びADE2遺伝子の内部
部分について、PCR−生成されたプローブによりプローブした。PRB1プローブを
、pCZR150を生成するために、ファゲミドベクターpBluescript（商標）II KS(+)
中にPRB1の2.6kbのClaI−SpeIフラグメントをサブクローンニングし、そしてプ
ライマーZC447（配列番号19）及びZC976（配列番号20）を用いて、PCRにより所
望する領域を増幅することによって生成した。ADE2プローブを、pCZR139におけ
るADE2遺伝子を、プライマーZC9079（配列番号21）及びZC9080（配列番号22）に
より増幅することによって生成した。その得られるade2−11 Pep4Δprb1Δ株を
、PMAD16といて命名した。

【００９２】 前述から、本発明の特定の態様が例示目的のために記載されて来たが、種々の
修飾が本発明の範囲内で行われ得ることが理解されるであろう。従って、本発明
は、特許請求の範囲内で制限される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA20 BA80 CA02 CA09 CA20 DA12 EA04 FA02 FA07 FA10 FA18 GA11 GA25 HA13 HA14 4B064 AG01 CA06 CA19 CC01 CC24 DA16 DA20 4B065 AA77X AA77Y AA80Y AB01 AC14 AC20 BA02 BA16 BA25 CA24

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１のヌクレオチド93〜ヌクレオチド1080を含んで成
   る、5000個までの長さのヌクレオチドの単離されたDNA分子。
2. 【請求項２】 次の操作可能的に連結された要素： ヌクレオチド93〜ヌクレオチド1092の配列番号１の配列の少なくとも一部を含
   んで成る第１DNAセグメント、ここで前記一部が機能的な転写プロモーターであ
   り； ピチア・メタノリカ グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ以外
   の興味あるタンパク質をコードする第２DNAセグメント；及び 転写ターミネーターを含んで成る第３DNAセグメントを含んで成るDNA構造体。
3. 【請求項３】 前記第１DNAセグメントが、900〜1500個の長さのヌクレオチ
   ドである請求項２記載のDNA構造体。
4. 【請求項４】 前記第１DNAセグメントが、配列番号１のヌクレオチド93〜
   ヌクレオチド1080を含んで成る請求項２記載のDNA構造体。
5. 【請求項５】 前記第１DNAセグメントが、ピチア・メタノリカ グリセル
   アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子コード配列を実質的に有さない
   請求項２記載のDNA構造体。
6. 【請求項６】 選択マーカーをさらに含んで成る請求項２記載のDNA構造体
   。
7. 【請求項７】 前記第１及び第２DNAセグメントに操作可能的に連結される
   分泌シグナルをさらに含んで成る請求項２記載のDNA構造体。
8. 【請求項８】 前記分泌シグナル配列が、サッカロミセス.セレビシアエα
   −因子プレ−プロ配列である請求項７記載のDNA構造体。
9. 【請求項９】 前記第３DNAセグメントが、ピチア・メタノリカAUG１又はGA
   P2遺伝子の転写ターミネーターを含んで成る請求項２記載のDNA構造体。
10. 【請求項１０】 前記ターミネーターが、配列番号１のヌクレオチド2095〜
    2145を含んで成る請求項９記載のDNA構造体。
11. 【請求項１１】 請求項２〜10のいずれか１項記載のDNA構造体を含むピチ
    ア・メタノリカ細胞。
12. 【請求項１２】 前記DNA構造体が、ゲノム的に組み込まれる請求項11記載
    のピチア・メタノリカ細胞。
13. 【請求項１３】 前記DNA構造体が、複数コピーでゲノム的に組み込まれる
    請求項12記載のピチア・メタノリカ細胞。
14. 【請求項１４】 前記細胞が、液胞プロテアーゼ プロテイナーゼA及びプ
    ロテイナーゼBを機能的に欠失する請求項11記載のピチア・メタノリカ細胞。
15. 【請求項１５】 興味あるタンパク質の生成方法であって、 請求項11〜14のいずれか１項記載の細胞を培養し、それにより、第２DNAセグ
    メントが発現され、そして興味あるタンパク質が生成され；そして 前記培養された細胞から興味あるタンパク質を回収することを含んで成る方法
    。
16. 【請求項１６】 次の操作可能的に連結された要素： ピチア・メタノリカ遺伝子転写プロモーターを含んで成る第１DNAセグメント
    ； ピチア・メタノリカタンパク質以外の興味あるタンパク質をコードする第２DN
    Aセグメント；及び 配列番号２のヌクレオチド2095〜2145を含んで成る第３DNAセグメントを含ん
    で成るDNA構造体。