JPH07213286A - 真菌プロテアーゼ - Google Patents

真菌プロテアーゼ

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JPH07213286A
JPH07213286A JP6267570A JP26757094A JPH07213286A JP H07213286 A JPH07213286 A JP H07213286A JP 6267570 A JP6267570 A JP 6267570A JP 26757094 A JP26757094 A JP 26757094A JP H07213286 A JPH07213286 A JP H07213286A
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aspartic protease
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】 アスペルギルスアスパラギン酸プロテアーゼ
をコードする新規ＤＮＡ配列、アスペルギルスアスパラ
ギン酸プロテアーゼそれ自体およびそれの調製方法。更
に、アスパラギン酸プロテイナーゼ型のプロテアーゼが
欠損している新規アスペルギルス株およびそのような変
異株の調製方法にも関する。 【構成】 アスペルギルス−アスパラギン酸プロテアー
ゼ遺伝子が欠損しているアスペルギルス株、および突然
変異誘発（例えば遺伝子破壊）によりもはや機能的なタ
ンパク質を発現することができないアスペルギルス−ア
スパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列を
使った前記株の製造方法。更に、本発明のＤＮＡ配列、
ハイブリッドベクター、発現ベクターおよびアスペルギ
ルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの調製方法並びに
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子
が欠損しているアスペルギルス株およびアスペルギルス
−アスパラギン酸プロテイナーゼを過剰生産する宿主株
の発現方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アスペルギルス（Aspe
rgillus ）アスパラギン酸プロテアーゼをコードする新
規ＤＮＡ配列、アスペルギルスアスパラギン酸プロテア
ーゼそれ自体、およびそれの調製方法に関する。本発明
は更に、非相同タンパク質の発現に有用である、アスパ
ラギン酸プロテアーゼが欠損している新規アスペルギル
ス変異株、およびそのような変異株の調製方法にも関す
る。
【０００２】
【従来の技術】アスペルギルス（Aspergillus ）種、特
にアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）は、
食品加工産業に使われる酵素の工業生産に利用されてい
る。Ａ．ニガーは、タンパク質分泌能力が高いためと、
系がその分子的遺伝子操作に利用可能であるために、組
換えタンパク質の生産用の宿主として利点を有する。し
かしながら、培養液、周辺腔または小胞体およびゴルジ
装置中のプロテアーゼの存在が、Ａ．ニガーにおける非
相同タンパク質の発現にとって有害であることがわかっ
た。
【０００３】実際、アスペルギルスはプロテアーゼを生
産するのに商業的に利用されている。アスペルギルス由
来の多数の細胞外プロテアーゼが文献に記載されてい
る。最近、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus a
wamori）由来のアスペルギロペプシンＡをコードするpe
pA遺伝子がクローニングされた。pepA遺伝子産物はＡ．
ニガーから分泌される酸性プロテアーゼの大部分を占
め、pepA遺伝子を削除した株はＡ．ニガー変種アワモリ
（Aspergillus niger var. awamori）における非相同タ
ンパク質の発現を増加させた。
【０００４】最近アスペルギルスから別のプロテアーゼ
遺伝子もクローニングされており、それらとしてはＡ．
オリゼ（A. oryzae）のアルカリ性アスパラギン酸プロ
テアーゼ、Ａ．フミガーツス（A. fumigatus）のアルカ
リ性アスパラギン酸プロテアーゼ、Ａ．ニガー変種マク
ロスポルス（Aspergillus niger var. macrosporus）由
来の非ペプシン型酸プロテアーゼ、、Ａ．オリゼ（A.
oryzae）由来のメタロプロテアーゼと呼ばれる中性プロ
テアーゼII、およびＡ．ニガー由来の２種のセリンプロ
テアーゼが挙げられる。
【０００５】Ａ．ニガーの単離され変異されたプロテア
ーゼ遺伝子は、遺伝子破壊実験、即ち、対応する生来の
遺伝子が破壊されている変異株の調製に用いることがで
きる。例えば、アスペルギロペプシンＡ欠損株を調製す
るために、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus a
wamori）由来のpepA遺伝子が遺伝子破壊により破壊され
た。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述し
たように、アスペルギルスは多数の異なるプロテアーゼ
を生産するため、他のプロテアーゼを欠損しているタン
パク質工業生産用のアスペルギルス株に引き続き要求が
ある。この目的のため、試験管内突然変異誘発、例えば
遺伝子破壊によるプロテアーゼ欠損株の調製に利用する
ことができる他のプロテアーゼ遺伝子も要求される。更
に、タンパク質プロセシングに産業上応用することがで
きる組換えプロテアーゼタンパク質も要求される。
【０００７】Ａ，ニガーにおける分泌型プロテアーゼ活
性の別の主成分はアスパラギン酸プロテアーゼである。
アスパラギン酸プロテアーゼは多数の真菌においてクロ
ーニングされており、例えばＳ．セレビシエ（S. cere
visiae）の液胞タンパク質pep4（＝pepA）、カンジダ
（Candida ）、ムコール（Mucor ）、リゾプス（Rhizop
us）、クリホネクトリア（Cryphonectria ）およびペニ
シリウム（Penicillium）種の分泌型プロテアーゼ、並
びにＡ．ニガーとＡ．オリゼの両方の分泌型主要酸性プ
ロテアーゼが挙げられる。最近、ニューロスポラ・クラ
ッサ（Neurosporacrassa）から液胞タンパク質遺伝子が
単離され、酵母pep4との相当な配列相同性を有すること
が示された。
【０００８】
【課題を解決するための手段】アスペルギルスはペプシ
ンと相同であるが既知のアスペルギロペプシンに対して
ほとんど相同性を示さない別のアスパラギン酸プロテア
ーゼも生産することを発見した。本発明はこの新規プロ
テアーゼに焦点を合わせる。本発明の目的は、アスペル
ギルスアスパラギン酸プロテアーゼをコードするＤＮＡ
分子を提供することである。
【０００９】更なる目的は組換えアスペルギルスアスパ
ラギン酸プロテアーゼを提供することであり、このため
に、それの生産用の形質転換されたアスペルギルス株を
提供することである。別の目的は、アスパラギン酸プロ
テアーゼ遺伝子が欠損しているアスペルギルス株を提供
することであり、その株は非相同または相同タンパク質
の一層効率的な生産に利用することができる。
【００１０】本発明は、アスペルギルス（Aspergillus
）アスパラギン酸プロテアーゼに関する。そのような
プロテアーゼは、本明細書中、「アスペルギルス−アス
パラギン酸プロテイナーゼ」と呼称される。本発明の
「アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ」
は、(a) アスペルギルス種に由来するものであり、(b)
活性部位における触媒的アスパラギン酸残基のためプロ
テアーゼ活性を示し、そして(c) アスパラギン酸プロテ
イナーゼ科に分類されるのに十分な既知アスパラギン酸
プロテアーゼとのアミノ酸配列相同性を有するものと解
釈される。
【００１１】しかしながら、本発明において使用するア
スペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼなる用語
の意味には、アスパラギン酸プロテアーゼ活性を保持し
ているそのような酵素の断片も含まれる。しかし、全長
の酵素が好ましい態様である。追加のアミノ酸、ペプチ
ドまたはタンパク質に結合された本発明の「アスペルギ
ルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ」を含む融合タン
パク質も、本発明の一部であると解釈される。
【００１２】好ましい意味では、「アスペルギルス−ア
スパラギン酸プロテイナーゼ」は、アスペルギルス・ニ
ガー（Aspergillus niger）に由来するプロテアーゼま
たは活性断片を言い、より好ましくは配列番号１のもと
に示されたアミノ酸配列または配列の一部分を有するプ
ロテアーゼまたは活性断片を言う。本発明はまた、本発
明のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを
コードする単離されたＤＮＡ配列、およびそのようなＤ
ＮＡ配列のクローニングと増殖のためのハイブリッドベ
クターに関する。
【００１３】本発明は更に、適当な宿主細胞におけるア
スペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの発現に
適当な調節領域と機能的に連結されたそのようなＤＮＡ
配列を含んで成る、アスペルギルス−アスパラギン酸プ
ロテイナーゼ生産用の発現ハイブリッドベクターに関す
る。本発明はまた、アスペルギルス−アスパラギン酸プ
ロテイナーゼを発現することのできる形質転換された宿
主細胞、例えば形質転換後の該遺伝子のコピー数の増加
によってアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナー
ゼを過剰発現することのできるアスペルギルス株、にも
関する。
【００１４】本発明は、アスペルギルス−アスパラギン
酸プロテイナーゼ遺伝子が欠損しているアスペルギルス
株、および突然変異誘発（例えば遺伝子破壊）によりも
はや機能的なタンパク質を発現することができないアス
ペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードす
るＤＮＡ配列を使った前記株の製造方法にも関する。
【００１５】更に、本発明は、本発明のＤＮＡ配列、ハ
イブリッドベクター、発現ベクターおよびアスペルギル
ス−アスパラギン酸プロテイナーゼの調製方法並びにア
スペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が
欠損しているアスペルギルス株およびアスペルギルス−
アスパラギン酸プロテイナーゼを過剰生産する宿主株の
発現方法に関する。
【００１６】
【具体的な説明】アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコー
ドするＤＮＡ、クローニング用および発現用のハイブリ
ッドベクター 本発明は、好ましくはアスペルギルス・ニガー（Asperg
illus niger）のアスペルギルス−アスパラギン酸プロ
テイナーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ
分子に関する。該ＤＮＡ配列は、例えば配列番号１に示
されるpepE遺伝子のように、ゲノムＤＮＡライブラリー
から単離することができるＤＮＡ分子を有するので１ま
たは複数のイントロンを含み得る。しかしながら、本発
明は該ＤＮＡ配列のイントロン不含有変異体、例えばｃ
ＤＮＡクローニングによりまたは例えばＰＣＲ技術の適
用による突然変異誘発後に単離可能であるものにも関す
る。そのようなイントロン不含有遺伝子は、特に非アス
ペルギルス宿主、好ましくは原核生物または酵母におけ
る発現に有用である。
【００１７】本発明は、好ましくは配列番号１に示され
るアミノ酸配列を有するＡ．ニガーアスパラギン酸プロ
テアーゼPEPEまたはアスパラギン酸プロテアーゼ活性を
保持しているその断片をコードするＤＮＡ配列を含んで
成るＤＮＡ分子に関する。本発明のＤＮＡ配列は、好ま
しくは配列番号１のヌクレオチド配列に示される成熟PE
PEプロテアーゼのコード領域である。しかしながら、本
発明は、PEPEをコードする縮重ＤＮＡ配列またはその断
片、即ち、コードされるアミノ酸配列を変えずにヌクレ
オチドが置換されている配列、にも関する。そのような
ＤＮＡ配列は、例えば、異なる宿主における好ましいコ
ドン用法の相違のため、または制限酵素用の新規認識部
位の存在のために有用である。
【００１８】本発明はまた、本発明のアスペルギルス−
アスパラギン酸プロテイナーゼ（好ましくはそれの好ま
しい形態）をコードするＤＮＡ配列を挿入断片として含
んで成るハイブリッドベクターにも関する。そのような
本発明のハイブリッドベクターは、本発明のＤＮＡ配列
の複製と増殖に有用である。本発明は、本発明のアスペ
ルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ（好ましくは
それの好ましい形態）の生産に適当な発現ベクターにも
関する。そのような発現ベクターは、アスペルギルス−
アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列
が所望の宿主細胞におけるそのようなＤＮＡ配列の発現
の調節に適当な調節領域と機能的に連結されている「発
現カセット」を含んで成る。
【００１９】本発明のハイブリッドベクター（発現ベク
ターを包含する）は、遺伝子操作の技術分野において有
用な任意のベクター、例えばウイルス、ファージ、コス
ミド、プラスミドまたは染色体ＤＮＡに由来することが
でき、例えばSV40の誘導体、ヘルペスウイルス、乳頭腫
ウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、λファ
ージ（例えばNM 989もしくはEMBL4 ）、M13 ファージ
（例えばM13mp8）、細菌プラスミド（例えばpBR322もし
くはpUC18 ）、または酵母プラスミド（例えば酵母２μ
プラスミド）、
【００２０】あるいは欠損ウイルス、ファージまたはプ
ラスミドの複製を可能にするヘルパーウイルス、ファー
ジまたはプラスミドの存在下の欠損ウイルス、ファージ
またはプラスミド（例えばM14K07ヘルパーファージの存
在下のM13(+)KSベクター）、更には、例えばアスペルギ
ルス種（例えばＡ．ニガー）のような糸状菌に由来する
染色体ＤＮＡ、例えばEP 184 438により提供されたもの
であることができる。好ましいのは、Ｓ．セレビシェー
（S. cerevisiae）または糸状菌、より好ましくはアス
ペルギルス種、更に好ましくはＡ．ニガー用のベクター
である。
【００２１】本発明のハイブリッドベクター（発現ベク
ターを包含する）は、染色体外要素としてまたは宿主染
色体中への組み込みにより、適当な宿主における所望の
ＤＮＡの複製に備える。幾つかの可能なベクター系が本
発明のクローン化ＤＮＡの組み込みと発現に利用可能で
ある。理論上は、選択される宿主において複製し且つ適
当に維持される全てのベクターが適当である。よって、
該ベクターは形質転換をもくろむ宿主細胞に依存して選
択される。
【００２２】一般に、そのような宿主細胞は、原核また
は真核微生物、例えば細菌、真菌、例えば酵母、好まし
くはＳ．セレビシエ（S. cerevisiae）、または糸状
菌、好ましくはアスペルギルス種、より好ましくはＡ．
ニガー、または高等真核生物起源の細胞、例えば脊椎動
物、例えば哺乳動物細胞であることができる。適当な宿
主細胞については下記に詳細に検討する。
【００２３】染色体外要素として維持される本発明のハ
イブリッドベクター（発現ベクターを包含する）は、複
製開始点（ori ）または自己複製配列（ＡＲＳ）、選択
可能マーカー配列、および所望により追加の制限部位を
含んで成る。宿主染色体中への組み込みに向けられるベ
クターは、それが染色体と関連して細胞中で複製される
ため、ori またはＡＲＳを含む必要はない。
【００２４】複製開始点または自己複製配列（染色体外
要素に自己複製能力を付与するＤＮＡ要素）は、シミア
ンウイルス（SV40）もしくは他のウイルス起源に由来す
る外因性起点を含むベクターの作製により、または宿主
細胞の染色体機構により提供される。
【００２５】本発明のハイブリッドベクター（発現ベク
ターを包含する）は、形質転換し、選択しそしてクロー
ニングする予定の宿主に依存する選択マーカーを含んで
もよい。マーカーの表現型発現により形質転換体の選択
を容易にする任意のマーカー遺伝子を使うことができ
る。適当なマーカーは特に、例えばテトラサイクリンや
アンピシリンに対する抗生物質耐性を示すもの、または
独立栄養性真菌変異体の場合には、宿主の傷害を補完す
る遺伝子である。
【００２６】対応する遺伝子は、例えば、抗生物質シク
ロヘキシミドに対する耐性を付与するか、または独立栄
養性酵母（好ましくはＳ．セレビシエ）変異体における
原栄養性に備え、例えばura3, leu2, his3またはtrp1遺
伝子である。形質転換させようとする宿主がマーカーに
より発現される生成物について独立栄養性であることを
規定する自己複製セグメントに関連した構造遺伝子をマ
ーカーとして使用することも可能である。
【００２７】Ａ．ニガー用のハイブリッドベクター、特
に発現ベクターに関して特に重要なのは、Ａ．ニガー宿
主の傷害を補完するマーカー遺伝子、例えばＡ．ニガー
（A.niger）もしくはＡ．ニデュランス（A. nidulan
s）に由来するオルニチンカルバモイルトランスフェラ
ーゼをコードするargB遺伝子（EP 184 438）、または
Ｎ．クラッサ（N. crassa）pyr4遺伝子に相同なＡ．ニ
デュランスＤＮＡ断片である。他の適当なマーカー遺伝
子は、本発明の形質転換された宿主の記載と関連して後
述される。
【００２８】Ｅ．コリにおけるアスペルギルス−アスパ
ラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡの増殖に適
当な本発明のハイブリッドベクターは、例えば、添付の
実施例中に後述されるプラスミドpPEPE である。
【００２９】本発明の発現ベクターの文脈中での「発現
カセット」なる用語は、アスペルギルス−アスパラギン
酸プロテイナーゼを発現することができるＤＮＡ配列を
意味し、そしてアスペルギルス−アスパラギン酸プロテ
イナーゼコード領域と作用可能に連結されたプロモータ
ー、並びに所望により、シグナル配列、転写ターミネー
ター、転写エンハンサー、リボソーム結合部位、効率的
なＲＮＡプロセシングのための配列、効率的なタンパク
質プロセシングをコードする配列および正しいタンパク
質局在化をコードする配列から成る群のうちの１または
複数の更なる調節要素を含んで成る。
【００３０】本発明の発現カセットにおいて、アスペル
ギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼコード領域を相
同の調節要素、即ち本来それと連結しているもの、また
は非相同の調節要素、即ち別の遺伝子から誘導されるも
の、と組み合わせることができる。宿主細胞の性質に依
存して、広範囲のプロモーター配列を使用することがで
きる。強く且つ同時に良好に調節されるプロモーターが
最も有用である。
【００３１】プロモーターの例は、原核生物のλＰL ，
λＰR ，Ｅ．コリlac, trpまたはtac プロモーターであ
る。酵母、好ましくはＳ．セレビシエ中での発現に適当
なプロモーターは、TRP1-, ADHI-, ADHII-, PHO3-, PHO
5-, GAL10-または解糖系プロモーター、例えばエノラー
ゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキ
ソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフ
ルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナ
ーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、
【００３２】ホスホグルコースイソメラーゼおよびグル
コキナーゼ遺伝子のプロモーター、またはPH05−GAPDH
ハイブリッドプロモーター（欧州特許第EP-A-213 593
号）である。他の真核プロモーターの例は、真核性ウイ
ルス由来のプロモーター、例えばSV40、ラウス肉腫ウイ
ルス、アデノウイルス２、ウシ乳頭腫ウルス、パポバウ
イルス、シトメガロウイルス由来のプロモーター、また
は哺乳動物細胞由来のプロモーター、例えばアクチン、
コラーゲン、ミオシンもしくはβ−グロビン遺伝子のプ
ロモーターである。真核プロモーターは、酵母、好まし
くはＳ．セレビシエのエンハンサー配列、上流活性化配
列（ＵＡＳ）またはウイルスもしくは細胞性エンハンサ
ー、例えばシトメガロウイルスＩＥエンハンサー、SV40
エンハンサー、免疫グロブリン遺伝子エンハンサー等と
組み合わせることができる。
【００３３】エンハンサーは、ウイルス、例えばシミア
ンウイルス、ポリオーマウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス
もしくはモロニー肉腫ウイルス由来の、またはゲノム起
源の転写刺激ＤＮＡ配列である。エンハンサー配列は、
フィサルム・ポリセファルム（Physarum polycephalu
m）の染色体外リボソームＤＮＡ（PCT/EP 8500278）に
由来することもできる。適当なエンハンサーは更に、例
えば、酵母酸性ホスファターゼPH05遺伝子由来の上流活
性化部位である。
【００３４】シグナル配列は、例えば、ポリペプチドの
分泌を指令するプレ配列または分泌リーダー等であるこ
とができる。シグナル配列は、例えば、アスペルギルス
−アスパラギン酸プロテイナーゼのシグナルまたはリー
ダーペプチド、例えば配列番号１に示されるシグナル配
列である。更なるシグナル配列は文献から既知であり、
例えば、von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14, 46
83 (1986) 中に集められたものである。
【００３５】翻訳の開始および終結並びにmRNAの安定化
に必要な配列は、ウイルスまたは真核生物のｃＤＮＡの
非コード５′領域および３′領域から、例えば発現宿主
から、一般に入手可能である。本発明の一態様によれ
ば、例えばプラスミドpGALPEPE中のようなGAL10 プロモ
ーターの調節下での、原核生物中、例えばＥ．コリ中、
または好ましくは酵母中、より好ましくはＳ．セレビシ
エ中でのアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナー
ゼの発現のための、配列番号１に示されるコード領域の
３つのエキソンから成るイントロン不含有コード領域を
含んで成る発現ベクターが提供される。
【００３６】本発明は、好ましくはアスペルギルス株に
おけるアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ
をコードするＤＮＡ配列の発現に適当な発現ベクターに
関する。本発明の発現ベクターの１つの型は、好ましく
はＡ．ニガー（A. niger）のアスペルギルス−アスパラ
ギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列に生来連
結しているプロモーター、即ちそれの相同プロモーター
の調節下に、前記ＤＮＡ配列を含んで成る。より好まし
いのは、配列番号１に示されるプロモーター領域の調節
下に、配列番号１のPEPEをコードするＤＮＡ配列、最も
好ましいのは配列番号１に示されるＤＮＡ配列を含んで
成る発現ベクターである。
【００３７】そのような発現ベクターを、元来アスペル
ギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が由来す
る種の宿主株におけるアスペルギルス−アスパラギン酸
プロテイナーゼの発現に用いると、組換えアスペルギル
ス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子と元のアスペ
ルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の両方
が同一発現条件下で活性であるため、アスペルギルス−
アスパラギン酸プロテイナーゼが過剰発現される。本発
明の発現ベクターの別の型は、アスペルギルス−アスパ
ラギン酸プロテイナーゼをコードするＤＮＡ配列に生来
連結していない、アスペルギルス中で機能的なプロモー
ターの調節下に、前記ＤＮＡ配列を含んで成る。
【００３８】アスペルギルス種、特にＡ．ニガー中での
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼの発現
に適当なプロモーターは、例えば、アスペルギルス種の
ペクチンリアーゼ遺伝子のプロモーター、好ましくは
Ａ，ニガーの PLI（EP-A-0 278355参照）, PLA, PLB, P
LC, PLEまたはPLF （EP-A-0 353 188参照）遺伝子のプ
ロモーター、アスペルギルス種のポリガラクツロナーゼ
遺伝子のプロモーター、好ましくはＡ．ニガー PGIまた
はPGII遺伝子（欧州特許出願EP-A-421919 参照）のプロ
モーター、アスペルギルス種のピルビン酸キナーゼ遺伝
子のプロモーター、好ましくはＡ．ニガー pki遺伝子
（欧州特許出願EP-A-439997 参照）のプロモーターであ
る。
【００３９】本発明の好ましい態様では、例えばプラス
ミドpPKIPEPEにおいて、Ａ．ニガーのピルビン酸キナー
ゼプロモーターが、相同のシグナル配列に連結されたア
スペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコード
する配列番号１に示されるコード領域と機能的に連結さ
れる。
【００４０】アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼ遺伝子の調製方法 本発明は、本発明のＤＮＡ分子、即ち本発明のアスペル
ギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼをコードするＤ
ＮＡ分子、好ましくは本発明のアスペルギルス−アスパ
ラギン酸プロテイナーゼの好ましい形態をコードするＤ
ＮＡ分子の調製方法、またはそのようなＤＮＡ分子を含
んで成るハイブリッドベクターの調製方法にも関する。
前記方法は、本発明の前記ＤＮＡ分子またはハイブリッ
ドベクターにより形質転換された宿主細胞を培養するこ
とを含んで成る。本発明の別の態様では、ヌクレオチド
縮合を通した化学合成により、本発明のＤＮＡ分子を調
製することができる。
【００４１】宿主の培養は、非形質転換体（即ち所望の
ＤＮＡ分子を欠く宿主）からの形質転換体（即ち選択マ
ーカーと共に所望のＤＮＡ分子を含有する宿主）の陰性
または陽性選択を可能にする化学化合物が補足されてい
るかまたは欠如している常用の栄養培地中で実施され
る。
【００４２】当該技術において有用な任意の形質転換可
能な宿主、例えば、細菌、例えばＥ．コリ（E. col
i）、真菌、例えばサッカロミセス・セレビシエ（Sacch
aromyces cerevisiae）、クルイベロミセス・ラクチス
（Kluyveromyces lactis）、高等真核細胞、例えば昆虫
細胞もしくは哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、または
特に糸状菌、例えばアスペルギルス、例えばＡ．ニデュ
ランス（A. nidulans）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）、
Ａ．カルボナリウス（A. carbonarius）、Ａ．アワモリ
（A. awamori）、Ａ．ジャポニカス（A. japonicus）お
よび特にＡ．ニガー（A. niger）を使用することができ
る。宿主の形質転換は常法により実施される。
【００４３】アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼをコードするＤＮＡ配列は、アスペルギルス−ア
スパラギン酸プロテイナーゼを発現することのできるア
スペルギルス株のゲノムから得ることができ、または例
えば、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ
をコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子
により形質転換された宿主を培養し、そして必要な時、
そこから所望のＤＮＡ配列を単離することにより調製す
ることができる。
【００４４】特に、そのようなＤＮＡは次のものから選
択された段階を含んで成る方法により調製することがで
きる： a) 適当なアスペルギルス細胞からゲノムＤＮＡを単離
し、次いで例えばＤＮＡプローブを使ってまたは適当な
発現系を使って所望のＤＮＡを選択し、そして所望のポ
リペプチドの発現についてスクリーニングする； b) 適当なアスペルギルス細胞からｍＲＮＡを単離し、
例えばＤＮＡプローブとのハイブリダイゼーションによ
りまたは適当な発現系中での発現により所望のｍＲＮＡ
を選択し、そして所望のポリペプチドの発現についてス
クリーニングし、該ｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡ
を調製し、次いでそれから二本鎖ＤＮＡを調製する；
【００４５】c) ｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡを
単離し、次いで例えばＤＮＡプローブを使ってまたは適
当な発現系を使って所望のｃＤＮＡを選択し、そして所
望のポリペプチドの発現についてスクリーニングする； d) Ａ．ニガーpepEをコードする遺伝子から設計された
オリゴヌクレオチドプライマーを使って全アスパラギル
スＤＮＡのＰＣＲ技術により試験管内において二本鎖Ｄ
ＮＡを合成する；または e) 段階a), b), c)またはd)に従って得られる二本鎖Ｄ
ＮＡを適当なベクター中に組み込み、適当な宿主を形質
転換せしめ、宿主を増殖させ、そして該ＤＮＡを単離す
る。
【００４６】ゲノムＤＮＡを単離し、所望のＤＮＡにつ
いてスクリーニングすることができる（段階ａ）。アス
ペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを発現する
ことのできるアスペルギルス株からゲノムＤＮＡを単離
する。確立された手順に従った適当な制限エンドヌクレ
アーゼでの消化と適当なベクター中への組み込みによ
り、そこからゲノムＤＮＡライブラリーを調製する。ゲ
ノムＤＮＡライブラリーを後述のようなＤＮＡプローブ
を用いてスクリーニングするか、または適当な発現系中
で発現せしめ、得られたポリペプチドを常法によりスク
リーニングする。
【００４７】ゲノムライブラリーは、例えばＡ．ニガー
株、例えばNW756 またはN400のゲノムＤＮＡを、例えば
Sau3AIまたはMboIで部分消化し、そして高分子量ＤＮＡ
断片を適当な宿主ベクター、例えばＥ．コリプラスミド
pUN121またはλベクター例えばEMBL4 中でクローニング
することにより、調製することができる。所望のアスペ
ルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを生産する他
の真菌株、例えばＡ．ジャポニカス、Ａ．オリゼ、Ａ．
ニデュランス、Ａ．ニガーを、ゲノムライブラリーの入
手源として用いることができ、そして他の適当なベクタ
ー、例えば上述したものを、前記断片の受容体として使
用することができる。
【００４８】アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼをコードするＤＮＡ配列についてゲノムライブラ
リーを好結果にスクリーニングするために、ハイブリダ
イズ用ＤＮＡプローブが必要である。これは、所望のア
スペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼのアミノ
酸配列またはその一部分が既知であるならば合成ＤＮＡ
プローブであることができ、またはアスペルギルス−ア
スパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子にハイブリダイズす
る別のアスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子、例えばニ
ューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）由来の
もの、もしくはその一部分であることができる。
【００４９】既知の方法により、適当な細胞からポリア
デニル化伝令ＲＮＡを単離する（段階ｂ）。単離方法
は、例えば、界面活性剤とリボヌクレアーゼ阻害剤、例
えばヘパリン、グアニジウムイソチオシアネートまたは
メルカプトエタノールの存在下でホモジナイズし、所望
により塩および緩衝液、界面活性剤および／またはカチ
オンキレート化剤の存在下で、適当なクロロホルム−フ
ェノール混合物を用いてｍＲＮＡを抽出し、そしてエタ
ノール、イソプロパノール等を使って残った水性の塩含
有相からｍＲＮＡを沈澱させることを含む。
【００５０】単離されたｍＲＮＡは、塩化セシウム勾配
中での遠心分離に続くエタノール沈澱によりおよび／ま
たはクロマトグラフィー法、例えばアフィニティークロ
マトグラフィー、例えばオリゴ（ｄＴ）セルロースもし
くはオリゴ（Ｕ）セファロース上でのクロマトグラフィ
ーにより、更に精製することができる。好ましくは、そ
のような精製された全ｍＲＮＡは、例えば直線ショ糖勾
配中での勾配遠心により、または適当なサイズ分画カラ
ム上でのクロマトグラフィー、例えばアガロースゲル上
でのクロマトグラフィーにより、サイズ分画される。
【００５１】所望のｍＲＮＡは、ＤＮＡプロープを用い
て該ｍＲＮＡを直接スクリーニングすることによるか、
または適当な細胞もしくは無細胞系において翻訳しそし
て得られたポリペプチドをスクリーニングすることによ
り、選択される。所望のｍＲＮＡの選択は、好ましく
は、後述のようなＤＮＡハイブリダイゼーションプロー
ブを使って達成され、それによって追加の翻訳段階が回
避される。適当なＤＮＡプローブは、既知のヌクレオチ
ド配列のＤＮＡ、例えば合成ＤＮＡ、所望のポリペプチ
ドをコードするｍＲＮＡから誘導されたｃＤＮＡ、また
は例えば天然源もしくは遺伝子操作された微生物から単
離される隣接ＤＮＡ配列を含んで成るゲノムＤＮＡ断片
である。
【００５２】分画されたｍＲＮＡは、細胞、例えばカエ
ル卵母細胞、または無細胞系、例えば網状赤血球溶解物
もしくは小麦胚芽抽出物において翻訳することができ
る。得られたポリペプチドは、例えばイムノアッセイ、
例えばラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッセ
イまたは蛍光マーカーを使ったイムノアッセイにおい
て、酵素活性についてまたは生来のポリペプチドに対し
て惹起せしめた抗体との反応についてスクリーニングさ
れる。そのようなイムノアッセイやポリクローナルおよ
びモノクローナル抗体の調製は当業界において公知であ
り、従ってそれらが適用される。
【００５３】選択されたｍＲＮＡ鋳型からの一本鎖相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製は当業界において公知であ
り、一本鎖ＤＮＡからの二本鎖ＤＮＡの調製と同様であ
る。ｍＲＮＡ鋳型をデオキシヌクレオシド三リン酸、所
望により放射能標識されたデオキシヌクレオシド三リン
酸（反応の結果をスクリーニングできるようにするため
に）、該ｍＲＮＡのポリ（Ａ）末尾とハイブリダイズす
るオリゴｄＴ残基のようなプライマー配列、および例え
ばトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）からの逆転写酵素
のような適当な酵素の混合物と共にインキュベートす
る。
【００５４】例えばアルカリ加水分解による鋳型ｍＲＮ
Ａの分解後、ｃＤＮＡをデオキシヌクレオシド三リン酸
と適当な酵素の混合物と共にインキュベートして二本鎖
ＤＮＡを与える。適当な酵素は、例えば、逆転写酵素、
Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片またはＴ
４ ＤＮＡポリメラーゼである。通常、一本鎖ｃＤＮＡ
により自然に形成されるヘアピンループ構造が第二鎖の
合成用のプライマーとして作用する。このヘアピン構造
はＳ１ヌクレアーゼでの消化により除去される。あるい
は、ｍＲＮＡ鋳型の加水分解前に最初にホモポリマーの
デオキシヌクレオチド末尾により一本鎖ＤＮＡの３′末
端を伸長し、次いで第二ｃＤＮＡ鎖の合成を行う。
【００５５】別法では、ｃＤＮＡライブラリーから二本
鎖ｃＤＮＡを単離し、所望のｃＤＮＡについてスクリー
ニングする（段階ｃ）。適当な細胞からｍＲＮＡを単離
しそして上述したようにそれから一本鎖および二本鎖ｃ
ＤＮＡを調製することにより、ｃＤＮＡライブラリーを
作製する。このｃＤＮＡを適当な制限エンドヌクレアー
ゼで消化し、そして確立された手順に従ってλファー
ジ、例えばλcharon 4Aまたはλgt11中に組み込む。適
当な膜、例えばニトロセルロース膜、荷電ナイロン膜、
例えばHybondR , Immobilon R またはGeneScreenR 上で
複製させたｃＤＮＡライブラリーを、後述のＤＮＡプロ
ーブを使ってスクリーニングするか、または適当な発現
系中で発現せしめそして得られたポリペプチドを所望の
化合物に特異的な抗体との反応についてスクリーニング
する。
【００５６】二本鎖ＤＮＡの調製の別法はＰＣＲ技術で
ある（段階ｄ）。この方法は特に、少なくとも部分的に
既知の配列を有する少量のＤＮＡまたはＲＮＡから出発
して大量の二本鎖ＤＮＡを調製するのに用いることがで
きる。しかしながら、既知のベクター配列により隣接さ
れている未知の配列を有するＤＮＡ挿入断片を出発物質
として使うこともできる。ＰＣＲ技術では、ＤＮＡの酵
素的鋳型依存性合成のためのプライマーとしてＤＮＡ分
子、例えばオリゴヌクレオチドが使われる。二本鎖ＤＮ
Ａの変性、プライマーとのハイブリダイゼーションおよ
び酵素的合成を連続的に繰り返すことができるため、多
量のＤＮＡを調製することができる。
【００５７】合成されるＤＮＡ分子の数は、各回に倍加
するので指数的に増加する。ＰＣＲ技術は技術の発達状
態にあり、慣例的に本発明において適用することができ
る。オリゴヌクレオチドプライマーは、既知のアスパラ
ギン酸プロテアーゼ間での比較に基づいて保存されたア
スパラギン酸プロテアーゼタンパク質配列をコードする
であろうＤＮＡにハイブリダイズするように設計するこ
とができる。ＰＣＲ技術は当業界において公知であり、
従来のＰＣＲ技術、例えばM.A. Innisら（編）, PCR pr
otocols. A guide to methods and applications. Acad
emic Press, San Diego (1990)中に記載されたもの、を
本発明に適用することができる。
【００５８】適当なベクター中への二本鎖ｃＤＮＡまた
はゲノムＤＮＡの組み込みのための様々な方法が知られ
ている（段階ｅ）。例えば、対応するデオキシヌクレオ
シド三リン酸とターミナルデオキシヌクレオチジルトラ
ンスフェラーゼのような酵素の存在下でのインキュベー
ションにより、二本鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡに相補的
ホモポリマー領域を付加することができる。次いで、該
ベクターと二本鎖ＤＮＡを相補的ホモポリマー末尾間の
塩基対合により結合し、そして最後にリガーゼのような
特異的連結酵素により連結する。他の可能性は、二本鎖
ＤＮＡの末端への合成リンカーの付加、または平滑もし
くは粘着末端連結によるベクター中への二本鎖ＤＮＡの
組み込みである。適当なベクターについては下記に詳述
する。
【００５９】得られたハイブリッドベクターにより適当
な宿主細胞を形質転換せしめるための形質転換法並びに
形質転換された宿主細胞の選択および増殖は当業界にお
いて公知である。そのような方法の例を下記に与える。
本発明の所望のＤＮＡ、変異体およびその断片の単離
は、当業界において既知の方法、例えばフェノールおよ
び／またはクロロホルムでの抽出により達成される。所
望により、該ＤＮＡを変異誘発物質での処理により操作
して変異体を得ることができ、または制限酵素での消化
により更に操作して断片を得たり、一端もしくは両端を
変更してベクター中への組み込みを容易にしたり、介在
配列を除去したりなどすることができる。
【００６０】本発明のＤＮＡのヌクレオチド配列は、そ
れ自体既知の方法により、例えば末端標識ＤＮＡを使っ
たマキサム−ギルバート法により、またはサンガーのジ
デオキシチェーンターミネーション法により、決定する
ことができる。本発明のアスペルギルス−アスパラギン
酸プロテイナーゼ遺伝子配列も常法に従った試験管内合
成により調製することができる。
【００６１】この試験管内合成は、特にアスパラギン酸
プロテアーゼ活性を有するアスペルギルス−アスパラギ
ン酸プロテイナーゼの断片をコードするアスパラギン酸
プロテイナーゼ遺伝子の小断片の調製に適用することが
できる。試験管内合成は、特にプロモーターまたはシグ
ナルペプチドをコードするＤＮＡの合成にも適用可能で
ある。この試験管内合成は、好ましくはＡ．ニガー由来
のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝
子またはその断片、最も好ましくは配列番号１に示され
るpepE遺伝子またはそれのプロモーターもしくはシグナ
ル配列に適用される。
【００６２】本発明を実施する際、ＲＮＡ分画中のアス
ペルギルス種（例えばＡ．ニガー）のアスパラギン酸プ
ロテイナーゼｍＲＮＡを同定するためまたはゲノムライ
ブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリー中のアスパラギ
ン酸プロテイナーゼＤＮＡを同定するためのプローブと
して、別の種（例えばＮ．クラッサ）のアスパラギン酸
プロテイナーゼ遺伝子またはその断片を使用することが
できる。Ａ．ニガー遺伝子の一次配列と他のプロテアー
ゼへの比較から、該プロテアーゼのコード領域を推定
し、そして該遺伝子とアスパラギン酸プロテイナーゼ遺
伝子ファミリーとの関係を確認することができる。得ら
れた遺伝子は、下記に詳述するような組換えプロテアー
ゼの調製に利用することができる。
【００６３】合成ＤＮＡプローブは注文することがで
き、または既知の方法に従って合成することができる。
所望のオリゴヌクレオチドの混合物は、Y. Ikeら（Nucl
eic Acids Research 11, 477, 1983 ）により記載され
たように、適当な縮合段階において保護形態の２種、３
種もしくは４種のｄＡ，ｄＣ，ｄＧおよび／またはｄＴ
の混合物または対応するジヌクレオチドカップリング単
位を使用することにより得ることができる。
【００６４】ハイブリダイゼーションに向けて、ＤＮＡ
プローブが標識され、例えばキナーゼ反応により放射能
標識される。標識を含むＤＮＡプローブとサイズ分画さ
れたｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションは既知の手順
に従って実施され、即ち、付加物（例えばカルシウムキ
レート化剤、粘度調節化合物、タンパク質、非相同ＤＮ
Ａ等）を含有する緩衝液および塩溶液中で、選択的ハイ
ブリダイゼーションに好ましい温度、例えば０℃〜80
℃、例えば25℃〜50℃または65℃付近、好ましくはハイ
ブリッド二本鎖ＤＮＡ融解温度よりも低い20℃付近で実
施される。
【００６５】形質転換された宿主およびその調製 更に、本発明は、本発明のハイブリッドまたは発現ベク
ター、好ましくは本発明のアスペルギルス−アスパラギ
ン酸プロテイナーゼの好ましい形態をコードするベクタ
ー、により形質転換された宿主細胞に関する。
【００６６】特に本発明の組換えＤＮＡ分子の増殖用の
適当な宿主の例は、制限酵素または修飾酵素が欠けてい
るかまたは乏しい微生物、例えば細菌、特にエシェリキ
ア・コリ（Escherichia coli）の株、例えばＥ．コリ X
1776、Ｅ．コリ Y1090、Ｅ．コリ W3110、Ｅ．コリ HB1
01/LM1035 、Ｅ．コリ JA221、Ｅ．コリ DH5α、または
好ましくはＥ．コリ DH5αF', JM109, MH1もしくはHB10
1 、またはＥ．コリ K12株である。適当な宿主は更に別
の原核細胞、例えばバシラス・サブチリス（Bacillus
subtilis）、
【００６７】バシラス・ステアロサーモフィラス（Baci
llus stearothermophilus）、シュードモナス（Pseudo
monas ）、ヘモフィルス（Haemophilus ）、ストレプト
コッカス（Streptococcus ）等、および酵母、例えばサ
ッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisia
e）、例えばＳ．セレビシエ GRF18である。他の適当な
宿主細胞は、高等生物の細胞、特に確立された連続ヒト
または動物細胞系、例えばヒト胎児肺繊維芽細胞 L132
、ヒト悪性黒色腫Bowes 細胞、HeLa細胞、SV40ウイル
スにより形質転換されたアフリカミドリザルの腎細胞 C
OS-7またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO) 細胞であ
る。
【００６８】本発明のアスペルギルス−アスパラギン酸
プロテイナーゼ遺伝子の発現用の適当な細胞の例は、適
当な発現ベクターにより形質転換された上述の細胞、更
には適当なバキュロウイルス発現ベクターにより形質転
換された昆虫細胞、および特に、適当な発現ベクターに
より形質転換された糸状菌、例えばペニシリウム属、セ
ファロスポリウム属または好ましくはアスペルギルス
種、例えばＡ．カルボナリウス（A. carbonarius）、
Ａ．アワモリ（A. awamori）、Ａ．ニデュランス（A.
nidulans）、Ａ．オリゼ（A. oryzae）またはより好ま
しくはＡ．ニガー（A. niger）である。
【００６９】本発明はそのような形質転換体の調製方法
にも関し、該方法は、所望により適当なマーカー遺伝子
と一緒に本発明のＤＮＡ分子またはハイブリッドベクタ
ーを使って形質転換条件下で適当な宿主細胞を処理し、
そして所望により該形質転換体を選択することを含んで
成る。アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ
遺伝子は、特に宿主として真核細胞、例えばアスペルギ
ルス種が使われる場合、形質転換後に宿主ゲノム中に組
み込まれた状態になってもよい。
【００７０】微生物の形質転換は、例えばＳ．セレビシ
エについて（A. Hinnen ら、Proc.Natl. Acad. Sci. US
A, 75, 1929, 1978）、Ｂ．サブチリスについて（Anagn
ostopoulos ら、J. Bacteriol. 81, 741, 1961 ）、
Ｅ．コリについて（M. Mandelら、J. Mol. Biol. 53, 1
59, 1970 ）、およびアスペルギルスについて〔F. Buxt
on ら、Gene 37:207-14 (1985), D.J. Balanceら、Bio
chem. Biophys. Res. Commun. 112:284-9 (1983) 〕、
文献中に記載されたような常法に従って実施される。
【００７１】従って、Ｅ．コリ細胞の形質転換法は、例
えば、ＤＮＡ取り込みを可能にするための細胞のCa2+前
処理、およびハイブリッドベクターとのインキュベーシ
ョンを含んで成る。その後の形質転換された細胞の選択
は、例えば、ベクターＤＮＡのマーカー配列の性質に依
存して親細胞からの形質転換細胞の分別を可能にする選
択増殖培地に細胞を移すことにより達成される。好まし
くは、ハイブリッドベクターを含まない細胞の増殖を許
容しない増殖培地が使われる。
【００７２】酵母またはアスペルギルス種といった真菌
の形質転換は、例えば、グルコシダーゼを使った細胞壁
の酵素的除去の段階、ポリエチレングリコールとCa2+イ
オンの存在下でのハイブリッドベクターによる得られた
スフェロプラストの処理の段階、および該スフェロプラ
ストを寒天中に包埋することによる細胞壁の再生の段階
を含んで成る。好ましくは再生用寒天は、上述の形質転
換された細胞の再生と選択を同時に可能にするような方
法で調製される。
【００７３】高等真核生物起源の細胞、例えば哺乳動物
細胞系の形質転換は、好ましくはトランスフェクション
により達成される。トランスフェクションは、常用技術
により、例えばリン酸カルシウム沈澱、マイクロインジ
ェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーシ
ョン、即ち一時的に細胞膜の透過性を増加させる短い電
気パルスによるＤＮＡの導入、またはヘルパー化合物、
例えばジエチルアミノエチルデキストラン、ジメチルス
ルホキシド、グリセロールもしくはポリエチレングリコ
ールの存在下でのＤＮＡの導入等により実施される。ト
ランスフェクション操作の後、トランスフェクトされた
細胞は、選択マーカーの性質に依存して選ばれた選択培
地、例えば対応する抗生物質を含有する標準培地、例え
ばダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、最少必須培
地、RPMI 1640 培地等の中での培養により同定され選択
される。
【００７４】形質転換された宿主細胞は、同化できる炭
素源、例えば炭化水素、例えばグルコースやラクトー
ス、窒素源、例えばアミノ酸、ペプチド、タンパク質ま
たはそれらの分解生成物、例えばペプトン、アンモニウ
ム塩等、並びに無機塩、例えばナトリウム、カリウム、
マグネシウムおよびカルシウムの硫酸塩、リン酸塩およ
び／または炭酸塩を含有する液体培地中で、当業界にお
いて既知の方法により培養される。培地は更に例えば増
殖促進物質、例えば微量元素、例えば鉄、亜鉛、マンガ
ン等も含有する。
【００７５】培地は、好ましくは、選択圧力を発揮し且
つ形質転換されていないかまたはハイブリッドベクター
を失ってしまった細胞の増殖を防ぐように選択される。
例えば、ハイブリッドベクターがマーカーとして抗生物
質耐性遺伝子を含む場合、培地に抗生物質が添加され
る。例えば必須アミノ酸中で独立栄養性である宿主細胞
を使用し、そしてハイブリッドベクターが宿主の欠損を
補完する酵素をコードする遺伝子を含む場合、形質転換
された細胞を培養するのに前記アミノ酸を欠く最少培地
が使われる。
【００７６】哺乳動物細胞のような高等真核生物起源の
細胞は、所望により増殖促進物質および／または哺乳類
血清が補足された、市販の培地、例えば上述したような
ダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、最少必須培地、
RPMI 1640 培地等を使って、組織培養条件下で増殖され
る。組織培養条件下での細胞培養技術は当業界において
周知であり、それらの技術としては、例えばエアーリフ
ト反応器中または連続攪拌反応器中での均一懸濁培養、
あるいは例えば中空繊維中、マイクロカプセル中、アガ
ロース微小ビーズ上、多孔質ガラスビーズ上、セラミッ
クカートリッジ上もしくは他の微小担体上での固定化ま
たは封入細胞培養が挙げられる。
【００７７】培養は当業界において既知である方法によ
り行われる。培養条件、例えば温度、培地のpHおよび醗
酵時間は、本発明のポリペプチドまたは誘導体の最大力
価が得られるように選択される。例えば、Ｅ．コリまた
は酵母株は、約20℃〜40℃、好ましくは約30℃、および
４〜８のpH値、好ましくは約７のpH値において、約４〜
30時間、好ましくは本発明のポリペプチドまたは誘導体
の最大収量に達するまで、振盪または攪拌しながら深部
培養により好気性条件下で培養される。
【００７８】非形質転換細胞からの形質転換細胞の選択
を可能にするために、本発明のＤＮＡ分子は選択マーカ
ーを担持しているか、あるいはまた、そのようなマーカ
ーを含有する第二のベクターにより細胞が同時形質転換
される。他の系の中でそのような選択マーカーは発現可
能な構造遺伝子であるので、それから発現されるポリペ
プチド（酵素）は受容体生物に毒性の化合物に対する耐
性を付与するかまたはそのような必須ポリペプチドを欠
いている変異体の酵素系を補完する。形質転換された糸
状菌細胞の選択に適するそのようなマーカー遺伝子は、
例えば、既知のqa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdSまたはar
gB遺伝子である。
【００７９】EP-A-0 278 355に記載されたように、Ａ．
ニガーのゲノムライブラリーからpyrAと命名されたマー
カー遺伝子が単離された。これはＡ．ニデュランスのpy
rGおよびＮ．クラッサのpyr4に関連があり且つ同様な機
能を有し、即ち、オロチジン５′−リン酸デカルボキシ
ラーゼ酵素を産生する。この酵素は、オロチジン５′−
リン酸からウリジル酸（ウリジン５′−リン酸）への脱
炭酸と、フルオロオロト酸から毒性フルオロウリジンへ
の脱炭酸を触媒する。
【００８０】しかしながら、オロチジン５′−リン酸デ
カルボキシラーゼをコードする他の任意のpyr 遺伝子の
ＤＮＡを使ってもよい。Ｅ．コリ BJ5183/pCG59D7 (DSM
3968)と命名された陽性クローンから、pyrA遺伝子を含
んで成るプラスミド pCG59D7を単離し、Ａ．ニガーpyrA
- 変異体の同時形質転換に使用した。そのようなpyrA -
変異体はオロチジン５′−リン酸デカルボキシラーゼ遺
伝子が欠損しており、従って対応する酵素を生産するこ
とができない。そのような変異体は、Ａ．ニガー N756
の分生子柄を変異誘発ＵＶ照射下で処理し、そしてフル
オロオロト酸の存在下で生き残ったコロニーを選択する
ことにより調製した。
【００８１】フルオロオロト酸の存在下で且つウリジン
の非存在下で生き残ったコロニーは排除される。残った
ウリジン要求変異体は、形質転換され得るそれらの能力
に従って、それぞれＡ．ニガー変異体An8 およびAn10に
より表される２つの相補群pyrAおよびpyrBに属する。そ
れらをそのプロトプラストの形において形質転換条件下
でpyrA含有プラスミドpCG59D7 (DSM 3968)により処理す
る。Ａ．ニガーAn8 (DSM 3917)コロニーのみが形質転換
され、消化されたそれのＤＮＡがpUN 121 のＤＮＡとハ
イブリダイズする能力により立証されるようにpyrA遺伝
子を含むことがわかった。
【００８２】アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼの調製方法 本発明はまた、本発明のアスペルギルス−アスパラギン
酸プロテイナーゼ、好ましくはそれの好ましい形態の調
製方法であって、アスペルギルス−アスパラギン酸プロ
テイナーゼ遺伝子の発現に適当な条件下で本発明の発現
ベクターにより形質転換された宿主を培養することを含
んで成る方法にも関する。必要ならば、該ポリペプチド
は常法により単離される。発現ベクターの作製方法に依
存して、アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナー
ゼは生産されるか、またはシグナル配列が存在する場合
には生産されそして細胞質から培地中もしくは別の細胞
区画中に分泌される。
【００８３】選択される宿主が発現に適するか否かは、
発現ベクターを作製するのに選ばれる調節配列、特にプ
ロモーターに主として依存する。例えば、本発明のアス
ペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の発
現にアスペルギルス種、好ましくはＡ．ニガー遺伝子由
来のプロモーターが使われる場合、アスペルギルス種、
好ましくはＡ．ニガーが適当な宿主である。しかしなが
ら、本発明の発現ベクターの作製にアスペルギルス遺伝
子に由来しないプロモーターが使われる場合、他の宿
主、例えば細菌、例えばＥ．コリ、または酵母、例えば
Ｓ．セレビシエが発現に適する。本発明のポリペプチド
の調製に適する宿主とプロモーターは、前に与えた形質
転換に適するものでもよい。
【００８４】特に、本発明は、内因性アスペルギルス−
アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が活性である条件
下で形質転換されたアスペルギルス宿主が外因性アスペ
ルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子を発現
しており、よって遺伝子量の増加のために本来の量より
も多量のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナー
ゼを発現している方法に関する。このために、アスペル
ギルス宿主、特にＡ．ニガーは、相同の（即ち本来連結
している）発現調節配列、特にプロモーターおよびシグ
ナル配列の調節下にアスペルギルス−アスパラギン酸プ
ロテイナーゼ遺伝子を含んで成る発現ベクターにより形
質転換される。
【００８５】特に、本発明は、内因性遺伝子が異なるプ
ロモーターに融合されているために、形質転換されたア
スペルギルス宿主が内因性遺伝子よりも高レベルにまた
は内因性遺伝子とは異なる条件下で外因性アスペルギル
ス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子を発現してい
る方法にも関する。
【００８６】１または複数の外因性遺伝子の最大発現の
ための条件は、選択される発現系に依存する。例えば、
Ａ．ニガーのペクチンリアーゼ（ＰＬ）またはポリガラ
クツロナーゼ（ＰＧ）遺伝子のプロモーターが使われる
場合、それに連結されたアスペルギルス−アスパラギン
酸プロテイナーゼ遺伝子の発現は、Ａ．ニガー細胞にお
いて培地中へのペクチンまたはペクチン分解生成物の添
加により誘導可能である。
【００８７】しかしながら、Ａ．ニガー株、例えばAn8
(DSM 3917)を宿主として使用する場合、十分なグルコー
スの存在下では該プロモーターは誘導できない。これ
は、Ａ．ニガーのＰＬまたはＰＧプロモーターの調節下
のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝
子がＡ．ニガーにおいて「代謝産物抑制」されることを
意味する。しかし、別のアスペルギルス株、好ましくは
Ａ．オリゼまたは最も好ましくはＡ．ニデュランスを使
うと、Ａ．ニガーＰＬまたはＰＧプロモーターの調節下
のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝
子は常に発現され、即ち、ペクチンの非存在下および／
またはグルコースの存在下でも発現される。
【００８８】従って、Ａ．ニガー以外のアスペルギルス
宿主、好ましくはＡ．オリゼ、最も好ましくはＡ．ニデ
ュランスにおいてＡ．ニガーのＰＬまたはＰＧプロモー
ターの調節下のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテ
イナーゼ遺伝子を発現させることが有利であろう。何故
なら、該遺伝子の発現の間のエネルギー源および炭素源
としてペクチンに代わりグルコースを栄養培地に添加す
ることができるからである。
【００８９】アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼ遺伝子の発現にアスペルギルス、好ましくはＡ．
ニガーのピルビン酸キナーゼプロモーターが使われる場
合、該遺伝子は炭素源およびエネルギー源としてグルコ
ースを有する最少培地を使用すれば発現される。
【００９０】様々な方法を適用できることにより、アス
ペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを過剰発現
させることが可能になった。全くアスペルギルス−アス
パラギン酸プロテイナーゼを発現することができないか
または少量のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼを発現するかまたは外因性アスペルギルス−アス
パラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の発現に使われる誘導
条件下でアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナー
ゼを発現しない適当な宿主を、好ましくはＡ．ニガー由
来のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ、
最も好ましくは配列番号１に示されるPEPE、
【００９１】またはアスペルギルス−アスパラギン酸プ
ロテイナーゼのアスパラギン酸プロテアーゼ活性を有す
る断片をコードする構造遺伝子を含んで成るハイブリッ
ドベクターにより形質転換せしめ、そして前記構造遺伝
子を発現せしめるという方法により、精製された単一の
アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼを調製
することができる。他のアスパラギン酸プロテイナーゼ
を発現することができない宿主を使用すると、それぞれ
の単一のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナー
ゼを精製された形で（これは、他のアスペルギルス−ア
スパラギン酸プロテイナーゼにより汚染されていないこ
とを意味する）得ることができる。
【００９２】全くアスペルギルス−アスパラギン酸プロ
テイナーゼを発現することができない宿主は、対応する
遺伝子を持たない微生物であるか、または内因性アスペ
ルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子の発現
が適当に条件付けられた増殖培地中で抑制されている一
方で、所望のアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼ構造遺伝子と作用可能に連結された外因性アスペ
ルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼプロモーター
（例えばＡ．ニガー由来のプロモーター）がそれらの条
件下で活性であるアスペルギルス株、もしくは該アスペ
ルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が別の
プロモーターに融合されているアスペルギルス株であ
る。
【００９３】アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼの調製に適する他のプロモーターおよび株は、上
記の本発明の発現ベクターの説明のところで与えたもの
である。
【００９４】アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼおよびそれの利用 本発明は、本明細書中「アスペルギルス−アスパラギン
酸プロテイナーゼ」と命名された純粋なアスペルギルス
アスパラギン酸プロテアーゼそれ自体にも関する。その
ようなプロテアーゼは、(a) アスペルギルス種に由来
し、(b) 活性部位における触媒的アスパラギン酸残基の
ためプロテアーゼ活性を示し、そして(c)アスパラギン
酸プロテイナーゼ科に分類するのに十分な既知のアスパ
ラギン酸プロテアーゼとのアミノ酸配列相同性を示すと
解釈される。アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼという用語には、アスパラギン酸プロテアーゼ活
性を保持しているそのような酵素の断片も包含される。
【００９５】本発明は、優先的にはアスペルギルス・ニ
ガー（Aspergillus niger）の純粋なアスペルギルス−
アスパラギン酸プロテイナーゼ、好ましくは配列表中の
配列番号１のもとに示されるアミノ酸配列を有するアス
パラギン酸プロテアーゼPEPE、並びにアスパラギン酸プ
ロテアーゼ活性を保持しているそれの断片および変異体
に関する。
【００９６】本発明は更に、所望によりアスペルギルス
−アスパラギン酸プロテイナーゼ活性以外の活性を有す
る１または複数の適当な酵素との予め決められた組合せ
において、１もしくは複数のアスペルギルス−アスパラ
ギン酸プロテイナーゼおよび／またはアスパラギン酸プ
ロテアーゼ活性を有するそれの誘導体および／または生
物学的に許容されるそれの塩を含んで成る酵素組成物に
関する。
【００９７】アスペルギルス−アスパラギン酸プロテイ
ナーゼが欠損しているアスペルギルス株 本発明は、内因性アスペルギルス−アスパラギン酸プロ
テイナーゼ遺伝子が欠損している変異型アスペルギルス
株、好ましくは変異型Ａ．ニガー株にも関する。好まし
いのは、配列番号１に示されるpepE遺伝子が欠損してい
るＡ．ニガー株である。pepE遺伝子が欠損しており且つ
他のプロテアーゼ遺伝子例えばpepA, pepB, pepCまたは
pepDが欠損しているＡ．ニガー株も好ましい。
【００９８】欠損アスペルギルス−アスパラギン酸プロ
テイナーゼ遺伝子を有する本発明の変異型アスペルギル
ス株は、本発明の好ましい態様によれば、遺伝子破壊に
より、即ち、破壊しようと望む内因性アスペルギルス遺
伝子に対応するＤＮＡ配列を試験管内で欠損遺伝子に変
異せしめそしてアスペルギルス宿主細胞中に形質転換せ
しめることにより、調製することができる。細胞内での
相同組換え現象により、完全な内因性遺伝子が外因性欠
損遺伝子により置き換えられる。
【００９９】通常、コード領域中にマーカー遺伝子を挿
入することにより内因性遺伝子が破壊される。これは、
容易にモニタリングすることができ且つ対応する内因性
遺伝子が破壊されている形質転換体を選択するのに使う
ことができる欠損遺伝子をもたらす。しかしながら、機
能的なアスペルギルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ
を全く発現できないような方法で内因性アスペルギルス
−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子が変異されてい
る変異型アスペルギルス株、好ましくは変異型Ａ．ニガ
ー株の調製に他の突然変異誘発法を使ってもよい。
【０１００】本発明の最も好ましい態様では、配列番号
１に示されるpepE遺伝子の欠損変異体、例えば選択マー
カー遺伝子が挿入されている破壊されたpepE遺伝子、例
えば後述の実施例に記載されるプラスミドpPEPEPYRA 中
に含まれるような破壊されたpepE遺伝子、を含んで成る
ハイブリッドベクターを用いてＡ．ニガー株が形質転換
され、そして形質転換体が選択される。欠損アスペルギ
ルス−アスパラギン酸プロテイナーゼ遺伝子を有する本
発明の変異型アスペルギルス株は、細胞内または細胞外
のいずれかにおける非相同または相同タンパク質の改良
生産の発現に有用である。
【０１０１】アスペルギルス種における異種性（hetero
logous）または同種性（homologous）タンパク質の発現
は常法に従って達成することができる。通常、アスペル
ギルス中で機能的な相同または非相同プロモーターおよ
び所望によりアスペルギルス中で機能的な他の発現調節
配列（例えば上述したもの）と作用可能に連結された相
同または非相同遺伝子を含んで成る発現ベクターを作製
する。必要ならば、常法によりポリペプチドを単離す
る。発現ベクターの構成に依存して、生成物は宿主細胞
中で生産され、またはシグナル配列が存在する場合に
は、宿主細胞中で生産されそして分泌される。
【０１０２】本明細書中の構造遺伝子は、例えば、ウイ
ルス、原核細胞または真核細胞に由来し、そしてゲノム
ＤＮＡからまたはｍＲＮＡを経由して調製されたｃＤＮ
Ａから誘導することができまたは化学的に合成すること
ができる構造遺伝子であり、特に高等真核生物、特に哺
乳類、例えば動物または特にヒト起源の多種多様の有用
なポリペプチド（グリコシル化ポリペプチドを含む）、
例えば栄養素の生産におよび化学において酵素反応を実
施するのに利用することができる酵素、またはヒトや動
物の病気の治療やその予防に有用であり且つ有効である
ポリペプチド、例えばホルモン、免疫調節性、抗ウイル
ス性および抗腫瘍性を有するポリペプチド、抗体、ウイ
ルス抗原、ワクチン、凝固因子、食品等をコードする構
造遺伝子である。
【０１０３】そのような構造遺伝子の例は、例えば、ア
スペルギルスポリガラクツロナーゼ、例えばPGI および
PGII、またはアスペルギルスペクチンリアーゼ、例えば
PLI,PLA, PLB, PLC, PLE およびPLF 、またはホルモ
ン、例えばセクレチン、チモシン、レラキシン、カルシ
トニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、アドレ
ノコルチコトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、β−
リポトロピン、ウロガストロンもしくはインスリン、増
殖因子、例えば表皮増殖因子、インスリン様増殖因子(I
GF) 、例えばIGF-I およびIGF-II、マスト細胞増殖因
子、神経成長因子、グリア由来神経細胞増殖因子、また
は形質転換増殖因子(TGF) 、例えば TGFβ、成長ホルモ
ン、例えばヒトもしくはウシ成長ホルモン、
【０１０４】インターロイキン、例えばインターロイキ
ン−１もしくは−２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子
(MIF) 、インターフェロン、例えばヒトα−インターフ
ェロン、例えばインターフェロン−αＡ，αＢ，αＤも
しくはβ−インターフェロン、γ−インターフェロンま
たはハイブリッドインターフェロン、例えばαＡ−αＤ
−もしくはαＢ−αＤ−ハイブリッドインターフェロ
ン、特にハイブリッドインターフェロンBDBB、プロテイ
ナーゼ阻害因子、例えばα1 −抗トリプシン、SLPI等、
肝炎ウイルス抗原、例えばＢ型肝炎ウイルス表面もしく
はコア抗原、
【０１０５】Ａ型肝炎ウイルス抗原、または非Ａ非Ｂ型
肝炎抗原、プラスミノーゲン活性化因子、例えば組織プ
ラスミノーゲン活性化因子もしくはウロキナーゼ、腫瘍
壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エンドルフィ
ン、免疫グロブリン、例えば免疫グロブリンＤ，Ｅもし
くはＧの軽鎖および／または重鎖、またはヒト−マウス
ハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン結合因
子、例えば免疫グロブリンＥ結合因子、カルシトニン、
ヒトカルシトニン関連ペプチド、血液凝固因子、例えば
第IXもしくはVIIIc 因子、エリトロポイエチン、エグリ
ン、例えばエグリンＣ、
【０１０６】ヒルジン、デスルフェートヒルジン、例え
ばデスルフェートヒルジン変異体HV1, HV2もしくはPA、
ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、ウイルスチミジン
キナーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコースイソメラーゼ
をコードするものである。好ましい遺伝子は、ヒトα−
インターフェロンまたはハイブリッドインターフェロ
ン、特にハイブリッドインターフェロンBDBB、ヒト組織
プラスミノーゲン活性化因子（t-PA）、Ｂ型肝炎ウイル
ス表面抗原（HBVsAg）、インスリン様増殖因子Ｉおよび
II、エグリンＣ、並びにデスルフェートヒルジン、例え
ば変異体HV1 をコードするものである。
【０１０７】
【実施例】最も好ましい態様を実施例において記載す
る。次の実施例は本発明を説明するためものものであ
り、それを制限するためのものではない。
【０１０８】使用する略語は次の意味を有する： ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン ＤＴＴ：１，４−ジチオトレイトール EDTA：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩 IPTG：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド kbp ：キロ塩基対 ＰＥＧ：ポリエチレングリコール ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン X-gal ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β
−ガラクトシド
【０１０９】緩衝液、培地、試薬 ＳＭ：100mM NaCl, 8.1mM MgSO4, 50mM Tris-HCl pH 7.
5, 0.01 ％ゼラチン ＬＢ：１％トリプティカーゼペプトン(BBL) 、0.5 ％酵
母エキス(BBL) 、１％NaClおよび0.05mM Tris-HCl pH
7.5 ＬＭ：１％トリプティカーゼペプトン(BBL) 、0.5 ％酵
母エキス(BBL) 、10mM NaCl および10mM MgCl2 ＳＳＣ：0.15M NaCl、0.015Mクエン酸三ナトリウム ＰＳＢ：10mM Tris-HCl pH 7.6, 100mM NaCl, 10mM MgC
l2 ＴＥ：10mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA pH 8.0
【０１１０】最少培地：１リットルが 1.5 g KH2PO4,
0.5 g KCl, 0.5 g MgSO4・7H2O, 0.9mg ZnSO4・7H2O,
0.2 mg MnCl2・4H2O, 0.06 mg CoCl2・6H2O, 0.06 mg
CuSO4・5H2O, 0.29 mg CaCl2・62H2O, 0.2 mg FeSO4
・7H2O, 明細書中に明記したような炭素源および窒素源
またはそれらの源が明白に言及されない場合１リットル
あたり6 g のNaNO3 と10 gのグルコースを含有し、NaOH
でpH 6.0に調整したもの
【０１１１】完全培地：１リットルあたり6 g のNaNO3
と10 gのグルコース、並びに１リットルあたり2 g のト
リプティカーゼペプトン(BBL) 、1 g のカザミノ酸(Dif
co) 、1 g の酵母エキス(BBL) 、0.5 g の酵母由来リボ
核酸ナトリウム塩(ICN, Cleveland, USA), 2 ml のビタ
ミン溶液を含有し、NaOHでpH 6.0に調整したもの ビタミン溶液：100 mlあたり10 mg のチアミン、100 mg
のリボフラビン、10 mgのパントテン酸、2 mgのビオチ
ン、10 mg のｐ−アミノ安息香酸、100 mgのニコチンア
ミド、50 mg のピリドキシン−HCl
【０１１２】ＴＢＥ：１リットルが4 mlの0.5M EDTA pH
8.0溶液、10.8 gのTrisおよび5.5 gのH3BO3 を含有す
る フェノール：Maniatisら、Molecular Cloning: A Labor
atory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982
（438 頁）により記載されたように処理したフェノール 試料緩衝液：10％(v/v) グリセロール、100mM EDTA pH
8.0 および0.01％ブロモフェノールブルー ＲＮアーゼＡ：Maniatisら、Molecular Cloning: A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1982
（451 頁）により記載されたように処理したＲＮアーゼ
Ａ
【０１１３】使用する菌株およびベクター Ａ．ニガー N400 ：野生型。 Ａ．ニガー An8 ：EP-A-0 278 355に開示されておりDS
M 3917として寄託されたペクチナーゼ複合体高度産生株
のウリジン独立栄養性変異体。 Ｅ．コリ LE392： F- , hsdR514(rk- , mk+ ), supE44,
supF58, lacY1または(lac1ZY)6, galK2, galT22, metB
1, trpR55, λ- 。 Ｅ．コリ DH5αF'： F' , endA1, hsdR17(rk - , mk
+ ), supE44, thi-1, recA1, gyrA, relA1, 80φlacZ
M15, Δ(lacZYA-argF)U169, λ- 。
【０１１４】EMBL4 ：EMBL4 は、9 〜23 kbpのクローニ
ング容量を有するλ置換ベクターである（Frischauf
ら、J. Mol. Biol. 170:827-842, 1983 ）。それはλア
ームと非必須詰め物領域の間に多重クローニング領域を
含む。これは着目の外来ＤＮＡが挿入される時ベクター
への詰め物への再連結が除去されるような方法での複数
の制限酵素消化を実施可能にする。該ベクターはまた、
組換え体についての直接選択を提供するのにSpi 表現型
を利用する（Zissler ら、A.D. Hershey編、The Bacter
iophage lambda, Cold Spring Harbor Laboratory, 197
1 ）。
【０１１５】実施例中、ＰＣＲ技術において一連のオリ
ゴヌクレオチドが使われる。次のものはオリゴ体の簡単
な特徴づけである。配列は配列表の中に示される。 オリゴヌクレオチド１：pki プロモーター中のBamHI 部
位の直前でプライムするように設計される。 オリゴヌクレオチド２：ピルビン酸キナーゼのＡＴＧの
直前にPstI部位を挿入するように設計される。 オリゴヌクレオチド３：pepEのＡＴＧの直前にPstI部位
を挿入するように設計される。 オリゴヌクレオチド４：pepEの終結コドンの直後にXhoI
部位を挿入するように設計される。
【０１１６】オリゴヌクレオチド５：ピルビン酸キナー
ゼの終結コドンの直後にSalI部位を挿入するように設計
される。 オリゴヌクレオチド６：ピルビン酸キナーゼターミネー
ターの終わりにBamHI 部位を置くように設計される。 オリゴヌクレオチド７：pepE中の第一イントロンをルー
プアウトするように設計される。 オリゴヌクレオチド８：pepE中の第二イントロンをルー
プアウトするように設計される。 オリゴヌクレオチド９：pepE中の第三イントロンをルー
プアウトするように設計される。
【０１１７】オリゴヌクレオチドＡ：pepE ＲＮＡから
の印刷（runoff）転写物をプライムするように設計され
る。 オリゴヌクレオチドＢ：pepEの第一および第三エキソン
の一部並びに第二エキソンの全部を増幅させるためのＰ
ＣＲプライマーとして設計される。 オリゴヌクレオチドＣ：pepE ＲＮＡからのｃＤＮＡ合
成を開始させそしてpepEの第一および第三エキソンの一
部並びに第二エキソンの全部を増幅させるように設計さ
れる。
【０１１８】オリゴヌクレオチドＤ：pepEの第三および
第四エキソンの一部を増幅させるためのＰＣＲプライマ
ーとして設計される。 オリゴヌクレオチドＥ：pepE ＲＮＡからのｃＤＮＡ合
成を開始させそしてpepEの第三および第四エキソンの一
部を増幅させるように設計される。
【０１１９】実施例１：アスペルギルス・ニガーのゲノ
ムライブラリーの作製 実施例 1.1：Ａ．ニガー N400 からの高分子量ＤＮＡの
単離 アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）の分生
子柄を200 mlの最少培地中に106 胞子／mlの最終胞子密
度に接種し、11個のアーレンマイヤフラスコ中で28℃に
て300 rpm で24時間振盪する。ブフナー漏斗上でのミラ
クロス(Myracloth) を通した濾過により菌糸を収集し、
冷却した無菌塩溶液で洗浄し、液体窒素中で凍結させ、
−60℃で貯蔵するかまたはそのまま使用する。ゲノムラ
イブラリーを作製するためのＤＮＡの単離に使用する方
法は、Yeltonら〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1470
-1474 (1984)〕により記載された手順に基づく。
【０１２０】ライブラリー作製のため、10 gの菌糸を1
g ずつ液体窒素中でBraun 小型膜除去器中で粉砕する。
粉砕した菌糸を、200 mlの抽出緩衝液（50mM EDTA pH
8.5,0.2% SDS）と200 μl のジエチルピロカーボネート
の入った11本の無菌アーレンマイヤーに移す。この混合
物をゆっくり室温まで温め、次いで時折振盪させながら
68℃に20分間加熱する。懸濁液を室温に冷やし、12,000
×g で15分間遠心する。上清に１／16容の８Ｍ酢酸カリ
ウム溶液 pH 4.2 を加え、該混合物を氷上に１時間置い
ておく。
【０１２１】遠心（20分；16,000×g ；４℃）により沈
澱を除去する。氷上で15分間の0.6容のイソプロパノー
ルとのインキュベーションにより、上清から核酸を沈澱
させる。沈澱した核酸を遠心（10分；6,000 ×g ；４
℃）により収集し、70％エタノールで洗浄し、手短に乾
燥する。ペレットを20μg/mlのＲＮアーゼＡ（Boehring
er, Mannheim）を含む10 ml のＴＥ中に懸濁させ、そし
て37℃で15分間インキュベートする。該ＤＮＡをヌクレ
アーゼ不含有プロナーゼ（最終濃度１mg/ml ）（Kochli
ght, Coinbrook）により37℃にて１時間処理する。
【０１２２】得られたＤＮＡ溶液 9 ml に8.5 g のCsCl
を溶かし、0.2 mlの10 mg/ml臭化エチジウムを添加し、
この溶液をBeckman SW41ローター中で33,000 rpmで60時
間遠心するか、またはBeckman 50 Ti ローター中で45,0
00 rpmで40時間遠心する。ＤＮＡバンドを集め、NaCl飽
和水溶液で平衡化されたイソプロパノールでの繰り返し
抽出により臭化エチジウムを除去する。
【０１２３】５容のＴＥを添加し、ＴＥで飽和したフェ
ノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコ
ール 25:24:1、およびクロロホルム／イソアミルアルコ
ール24:1 により該ＤＮＡ溶液を順次処理する。0.1 容
の３Ｍ酢酸ナトリウム pH 5.2 、2.5 容のエタノールの
添加と−20℃での一晩のインキュベーションによりＤＮ
Ａを沈澱させる。沈澱物を遠心（１時間；30,000×g ；
４℃）により収集し、70％エタノールで洗浄し、乾燥
し、そして400 μl のＴＥに溶かす。
【０１２４】実施例 1.2：MboIによるＡ．ニガー N400
ＤＮＡの部分消化および断片の単離 13.6〜23 kbpに最大量のＤＮＡ断片を与えるMboI濃度を
試験するために、１μg 部分のＡ．ニガー N400 ＤＮＡ
を、製造業者が推奨する適当な緩衝液中で減少する量の
MboI（0.5 〜0.001 Ｕ）を使って10μl の容量で37℃に
て１時間消化する。１μl の0.25M EDTAの添加により反
応を停止させ、そして１μg/mlの臭化エチジウムを含む
ＴＢＥ緩衝液中 0.6％アガロースゲルの上に試料を負荷
した。所望の13.6〜23 kbp断片の高収量を与えるのに必
要なMboI濃度は約0.02Ｕ／μg ＤＮＡである。
【０１２５】従って、総容量２mlにおいて200 μg のＤ
ＮＡを消化する。37℃で１時間後、25mMの最終濃度にED
TAを添加し、65℃で10分間酵素を不活性化し、ＤＮＡを
沈澱させ、洗浄し、乾燥し、そして400 μl のＴＥに溶
かす。断片化されたＤＮＡを４℃，40Ｖ（３Ｖ／cm）に
て 0.4％調製用アガロースゲル上で分離する。正しいサ
イズの断片をゲルから切り取り、２mlのＴＢＥを含む無
菌の透析チューブの中で100 Ｖで２〜３時間ゲルからＤ
ＮＡを電気溶出させる。電流を30秒間逆流させ、該ＤＮ
Ａを含む緩衝液を回収する。次いでエタノール沈澱によ
り該ＤＮＡ断片を濃縮し、100 μl のＴＥに溶かす。
【０１２６】実施例 1.3：ベクターＤＮＡの調製 λベクターEMBL4 中にＡ．ニガーN400株のゲノムライブ
ラリーを作製する。9〜23 kbpのクローニング容量を有
するこのベクターは、Frischauf ら〔J. Mol.Biol. 17
0:827-842 (1983)〕とKarnら〔Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 77:5172-76 (1980)〕により記載されており、Prom
ega Biotechnology Inc.から購入することができる。該
ゲノムの異なる部分から生じた２つの挿入断片が１つの
ファージの中にクローニングされるのを避けるために、
最小の断片の長さ 13.6 kbp をクローニングに使用す
る。
【０１２７】10μg のλEMBL4 ＤＮＡを製造業者が推奨
する適当な緩衝液中で100 μl の容量において50単位の
BamHI により37℃にて２時間完全消化する。65℃で10分
間酵素を不活性化する。NaCl濃度を150mM に高め、50単
位のSalIを加え、そして更に２時間37℃でのインキュベ
ーションを続ける。25mMへのEDTAの添加後、65℃で10分
間加熱することにより酵素を不活性化する。
【０１２８】同容量のフェノール（ＴＥ飽和）、フェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール(25:24:1)
、およびクロロホルム／イソアミルアルコール(24:1)
により溶液を抽出する。小さいBamHI/SalIポリリンカー
断片を除去するために、0.1 容の３Ｍ酢酸ナトリウム p
H 5.2 の添加後に0.6 容のイソプロパノールでＤＮＡを
沈澱させる。氷上に15分置きそして12,000×g で４℃に
て15分間遠心した後、沈澱物を70％エタノールで徹底的
に洗浄し、乾燥し、40μl のＴＥに溶かす。
【０１２９】実施例 1.4：Ａ．ニガー N400 ＤＮＡゲノ
ム断片の連結および試験管内パッケージング 連結反応前に実施例 2.3に従って調製したベクターのco
s 部位がアニールされることが不可欠である。100mM Tr
is-HCl pH 7.5 および10mM MgCl2の中のベクターを65℃
で10分間加熱し、次いで42℃で１時間アニーリングす
る。試験連結から約１：１（重量で）のベクター対断片
の比が最大量の組換え体を与えることがわかった。
【０１３０】50mM Tris-HCl pH 7.5, 10mM MgCl2, 10mM
DTTおよび1mM ATP 中で総容量100μl において9.5 g
のベクターと10μg のＤＮＡ断片を使って連結を行う。
ＤＮＡリガーゼ(BRL) を0.5 Ｕ／μg ＤＮＡの濃度に添
加し、そして連結混合物を14℃で一晩インキュベートす
る。連結について試験するために、連結したＤＮＡの試
料をアガロースゲル上に負荷する。また、対照として、
断片の添加を伴わずに0.5 μg のベクターを５μl の容
量において連結せしめる。
【０１３１】連結混合物をエタノール沈澱により濃縮
し、試験管内パッケージング前に20μl のＴＥに溶か
す。試験管内パッケージングは、Promega Packagene 抽
出物を使って製造業者の教示に従って10μl 部分を使っ
て１μg のＤＮＡをパッケージングする。該抽出物を与
えた１μg の高分子量対照ファージλcI857 Sam7を対照
として別にパッケージングする。パッケージング後、50
0 μl のファージ溶液緩衝液（ＰＳＢ）と５μl のクロ
ロホルムを加える。組換えファージ原液を４℃で保存す
ることができる。
【０１３２】実施例 1.5：Ａ．ニガー株 N400 ゲノムラ
イブラリーの滴定および増幅 Ｅ．コリ NM539の細胞を、0.2 ％マルトース、10mM MgS
O4および1mM CaCl2 を含むＬＢ培地上で1.0 の光学濃度
（600 nm）まで増殖させる。この培養物の0.2mlアリコ
ートをＰＳＢ中の適当なファージ希釈液 0.1 ml に添加
する。該ファージを37℃で20分間吸着させた後、45℃の
0.6 ％ＬＢ−トップアガー3 mlを加え、混合物をＬＢ寒
天プレート上に塗抹し、それらを37℃で一晩インキュベ
ートする。
【０１３３】ファージ懸濁液１mlあたりのプラーク形成
単位(pfu) は、実施例 1.4に従って調製した２つのファ
ージ原液についてそれぞれ12×105 と 4.2×105 pfu/ml
である。断片なしでの対照連結から算出されたバックグ
ラウンド（それぞれ17％と40％）を差し引いた後の組換
え体の絶対数は 6×105 である。組換え体中に含まれる
ＤＮＡはアスペルギルス・ニガーのゲノム数 200以上に
等しい。
【０１３４】該ライブラリーを増幅させるために、両フ
ァージ原液80μl アリコートを使ってＥ．コリNM539 細
胞を感染させ、これをＬＢ寒天プレート上のＬＢトップ
−アガロース中に塗抹し、次いで37℃で一晩インキュベ
ートする。該プレートをプレートあたり5 mlのＰＳＢと
共に室温で１時間穏やかに振盪することにより、アガロ
ースからファージを溶出させる。ＰＳＢを収集し、遠心
（6000×g で10分）して細菌を除去し、クロロホルムを
加える（最終濃度0.5 ％）。ほぼ同じ程度に増幅された
両ファージ原液を混合し（40μl 原液）、滴定し（８×
109 pfu/ml）、そして４℃で保存する。
【０１３５】実施例２：Ｎ．クラッサpep4プローブの調
製 実施例 2.1：Ｎ．クラッサプローブの調製 プラスミドpNCPEP4 は、Ｎ．クラッサ（N. crassa）pe
p4遺伝子をコードするＮ．クラッサＤＮＡの3.8 kb断片
を含有する。このコード領域の一部はSalIにより簡単に
切り出すことができる。従ってプラスミドpNCPEP4 をSa
lIで消化し、1.2 ％アガロース上で断片を分離する。0.
6 kb断片を切り取り、ＤＮＡを電気溶出させる。この断
片 100 ng を、標識ヌクレオチドとして32P-ATP を使っ
てニックトランスレーションし、すぐにサザンまたはプ
ラークリフトプロービングのいずれかに使用する。
【０１３６】実施例 2.2：Ａ．ニガーＤＮＡのサザンブ
ロット 上述の通りに調製したＡ．ニガーＤＮＡの２μg アリコ
ートをBamHI かHindIII のいずれかで消化し、0.8 ％ア
ガロースゲル上で分離する。臭化エチジウム染色したゲ
ルを撮影した後、毛管ブロッティングによりニトロセル
ロース膜にＤＮＡを移行させ〔Southern, E.M., J. Mo
l. Biol. 98:503-517 (1975) 〕、そして実施例３に記
載したように標識酵母ＰＲＢプローブとハイブリダイズ
せしめる。両方の消化物を含むニトロセルロースの各切
片を様々な洗浄法にかけ、最強のシグナル対ノイズ比を
与える条件を決定する。２×ＳＳＣ中室温にて30分間の
１回の洗浄に続き２×ＳＳＣ中56℃にて30分間の２回の
洗浄が最良の結果を与えることがわかった。
【０１３７】実施例３：Ｎ．クラッサpep4プローブを用
いたＡ．ニガーN400ライブラリーのスクリーニング 上述のアスペルギルス・ニガーN400株のゲノムライブラ
リー（実施例１）の一部をＳＭ中に希釈し、各々が約20
00 pfuを含む0.1 ml部分を平板培養する。0.2％マルト
ースが補足されたＬＢ培地 50 mlをＬＢ培地中のＥ．コ
リ NM539の一晩培養物 0.5 ml に接種し、37℃において
250 rpm で４時間振盪し、次いで0.5 mlの1M MgSO4と0.
5 mlの0.5M CaCl2を加えることにより、宿主細胞を調製
する。それらの細胞の0.2 mlアリコートをそれぞれファ
ージ懸濁液の0.1 ml部分と混合し、室温で30分間インキ
ュベートする。次いで、47℃のＬＭ培地中0.7 ％アガロ
ース 3 ml を添加し、手短に渦動攪拌し、即座にＬＭ寒
天プレート上に塗抹する。該プレートを37℃で一晩イン
キュベートし、そして４℃で２時間冷蔵する。
【０１３８】各プレートから、BentonおよびDavis のプ
ラークハイブリダイゼーション法〔Benton, W.D.および
Davis, R.W., Science 196:180-182 (1977) 〕に従って
２枚の複製物を作製する。該プレートの上に第一のフィ
ルター（Schleicher and Schuell BA85 ）を１分間置
き、そして第二の複製物を２分間置き、それらの複製物
の位置をIndia インクで印す。フィルターを取り外した
後、それらを100 mlの変性溶液（1M NaCl, 0.5M NaOH）
の入った皿の中に0.5 分間置き、次いで100 mlの中和溶
液（0.5M Tris-HCl pH 7.5, 1.5M NaCl ）中に１分間置
く。それらのフィルターを３×ＳＳＣの入った皿に移
し、手袋をして穏やかに表面をこすって細菌砕片を除去
し、そして３×ＳＳＣですすぐ。それらのフィルターを
ブロッティングし、室温で10分間乾燥し、Whatman 3MM
紙の上にのせて80℃のオーブン中で２時間焼く。
【０１３９】焼いたフィルターを３×ＳＳＣ中で湿ら
せ、この溶液中で室温で１時間洗浄し、次いで250 mlの
予熱した（56℃）予備ハイブリダイゼーション混合物
〔６×ＳＳＣ、10×デンハーツ溶液（0.2 ％ＢＳＡ，Bo
ehringer第Ｖ分画；0.2 ％フィコール 400, Pharmacia
；0.2 ％ポリビニルピロリドン−10, Sigma ）、0.1
％ＳＤＳおよび0.1 mg/ml の尖断され新たに変性された
ニシン精子ＤＮＡ〕を含む皿に移す。振盪湯浴中で56℃
で１時間予備ハイブリダイゼーションした後、250 mlの
予熱した（56℃）ハイブリダイゼーション混合物（ニシ
ン精子ＤＮＡを欠くこと以外は予備ハイブリダイゼーシ
ョン混合物と同じである）中でフィルターを30分間洗浄
する。次いで、予め標識されたプローブが新たに加えら
れた150 mlの予熱した（56℃）ハイブリダイゼーション
混合物を含む皿にフィルターを移す。
【０１４０】65℃で14時間のハイブリダイゼーション
後、250 mlの２×ＳＳＣ中で、室温に次いで56℃でそれ
ぞれ30分間１回ずつフィルターを洗浄する。フィルター
を乾燥し、そして映像強化膜を使って−70℃にて１〜３
日間Kodak XAR5フィルムに露出させる。
【０１４１】こうして、スクリーニングした３枚のプレ
ートから３つの陽性シグナルが得られる。インクマーカ
ーを利用してプレートをオートラジオグラムの上に注意
深く位置合わせすることにより、無菌のパスツールピペ
ットを使って陽性プラークを切り抜く。陽性プラークを
含む寒天片を１mlのＳＭに添加し、それに 2.5μl のク
ロロホルムを加える。時折渦動攪拌しながら室温で１時
間寒天から外にファージを拡散させ、次いで４℃で一晩
インキュベートする。５分間の遠心により寒天と細胞砕
片を除去し、2.5 μl のクロロホルムを加え、ファージ
原液を４℃で保存する。
【０１４２】陽性クローンをλ１，λ２，λ４と命名す
る。ファージを高密度で塗抹したので、それらを低密度
で塗抹しそして複製平板分離、ハイブリダイゼーション
および陽性プラークの選択の全手順を繰り返すことによ
り、陽性プラークを３回精製する。
【０１４３】実施例４：λクローンの特徴づけ実施例
4.1：λＤＮＡの単離 組換え体クローンからＤＮＡを単離するために、まずフ
ァージを増幅させる。このために、Ｅ．コリ LE392宿主
細胞を、10mM MgSO4と0.2 ％マルトースが補足されたＬ
Ｂ培地中で1.0 の光学濃度（600 nm）まで増殖させる。
次いで精製したファージ原液50μl を別々に上述したよ
うに塗抹する。37℃で一晩のインキュベーション後、該
プレートの上に5 mlのＳＭを拡散しそして穏やかに振盪
しながら２時間インキュベートすることにより、非集密
的プレートからファージを溶出させる。溶出したファー
ジを収集し、0.1 mlのクロロホルムを加える。この混合
物を手短に渦動攪拌し、遠心分離により細胞砕片を除去
する。上清を回収し、クロロホルムを0.3 ％に加え、得
られたプレート溶解物を４℃で保存する。
【０１４４】ファージＤＮＡの単離のための出発物質と
してほぼ集密的プレートを得るために、プレート溶解物
の10 ml 部分をＥ．コリ LE392宿主細胞に塗布する。37
℃で一晩のインキュベーション後、３つのほぼ周密的プ
レートからアガロース上層を掻き取る。それらの層を合
わせ、20 ml のＳＭと0.4 mlのクロロホルムを加え、得
られた混合物を37℃で30分間振盪する。遠心により細胞
砕片とアガロースを除去し、上清を回収し、その容量を
ＳＭで18 ml に調整する。同容量の2M NaCl, 20% PEG60
00 (BDH, Poole, GB) ／ＳＭを加え、該溶液を混合し、
氷上に置く。
【０１４５】75分後、４℃にて1200×g での20分間の遠
心によりファージをペレット化する。上清をデカンテー
ションし、残った液体をKleenex ティッシュで取り除
く。ペレットを3 mlのＳＭ中に再懸濁し、次いで3 mlの
クロロホルムで抽出する。水相をＲＮアーゼＡ（67μg/
ml）とＤＮアーゼＩ（33μg/ml）で37℃にて20分間処理
する。次いで2 mlのフェノールを加え、渦動攪拌し、1
mlのクロロホルムを加え、再度渦動攪拌し、そして遠心
により二相を分離することにより、この混合物を抽出す
る。
【０１４６】水相を3 mlのフェノール／クロロホルム
（１：１）と3 mlのクロロホルムにより、それぞれ更に
２回抽出する。次いで0.3 mlの３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝
液（pH5.2）と6 mlのエタノールを順次添加することに
より、水相からＤＮＡを沈澱させる。この混合物を４℃
で16時間放置しておき、次いで遠心（10分、12000 ×
g、４℃）によりＤＮＡを回収する。ペレットを0.4 ml
のＴＥ緩衝液に溶かし、それにＲＮアーゼＡを200 μg/
mlに添加し、そして37℃で１時間インキュベートする。
38μl の３Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（pH 5.2）と0.8 ml
のエタノールを添加することにより４℃にて１時間ＤＮ
Ａを沈澱させる。遠心により該ＤＮＡを回収し、次いで
100 μl のＴＥに溶かす。
【０１４７】実施例 4.2：Ａ．ニガー N400 pepEクロー
ンの制限分析 制限分析により３つのファージ全てがＡ．ニガーゲノム
の同一領域に由来する挿入断片を含むことが確立され、
λ１の部分制限地図が作製される。
【０１４８】２μg のファージＤＮＡを、製造業者(BR
L) が推奨する緩衝液中で20μl の容量において20単位
のBamHI により37℃で１時間消化し、次いで65℃で10分
間加熱する。試料を 0.7％アガロースゲルにかけた後、
写真撮影する。ＤＮＡをニトロセルロース膜に移行せし
め、標識したＮ．クラッサpep4プローブとハイブリダイ
ズせしめる。それらの消化物から３つのファージ全てが
同じであり、且つ5.8 kb断片がpep4プローブとハイブリ
ダイズする唯一の断片であり、よって対応するＡ．ニガ
ー遺伝子の全部でないにしても大部分を含むことが明ら
かである。３つの同一ファージのうちの１つをλ１と命
名し、次の実験に使用する。
【０１４９】実施例５：プラスミド中へのPEPEのクロー
ニングおよびそれの配列決定と特徴づけ 実施例 5.1：pPEPE の作製 本質的には上述した通りにλ１ＤＮＡを制限酵素BamHI
と共にインキュベートする。クロロホルムでの抽出後、
該ＤＮＡを沈澱させ、遠心によりペレット化し、試料緩
衝液中に溶かし、１×ＴＢＥ緩衝液中において0.6 ％ア
ガロースゲル上での電気泳動にかける。5.8 kbp のBamH
I 断片を含むゲル切片を回収し、ＤＮＡを電気溶出させ
る。次いでこれを100 μl のクロロホルムで抽出し、エ
タノール沈澱させ、40 ml のＴＥ緩衝液に再溶解する。
アガロースゲル電気泳動に続きＵＶ光下でのバンドの視
覚化により、ＤＮＡ濃度を評価する。
【０１５０】製造業者(BRL) により推奨される条件下で
のBamHI での消化により、pTZ18Rベクターを調製する。
該ＤＮＡをフェノール、フェノール／クロロホルム
（１：１）およびクロロホルムにより抽出し、エタノー
ル沈澱させる。上記断片の各々 100 ng を、BRL により
推奨される緩衝液とＡＴＰ（1 mM）、1.5 ＵのＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ(BRL) を含む25μl の反応容量において一緒
に連結せしめる。この反応混合物を16℃にて16時間イン
キュベートし、次いでＥ．コリDH5aF'を形質転換させる
のに使う。25μg/mlのアンピシリン、0.005 ％のXgal、
0.05mMのIPTGを含むＬＢ寒天プレート上に該細胞を塗布
し、37℃で一晩インキュベートする。
【０１５１】幾つかの単一白色コロニーを使って、0.1
％グルコースと25 mg/mlのアンピシリンが補足されたＬ
Ｂ培地中で一晩培養物を調製する。それらの培養物を使
ってHolmesおよびQuigley のミニプレプ法〔Holmes, D.
S.およびQuigley, M., Anal.Biochem. 114:193 (198
1)〕を利用してプラスミドを単離する。製造業者(BRL)
の教示に従ってそしてＲＮアーゼＡ（0.5 mg/ml ）の存
在下で、プラスミドを幾つかの制限酵素で消化し、そし
て生成物をアガロースゲル上で分析する。期待されるサ
イズのBamHI 断片を生じるプラスミドを選択し、それら
を含有するＥ．コリ細胞をグリセロール上で−20℃に維
持する。このプラスミドをpPEPE と命名する（ＤＳＭに
寄託される）。
【０１５２】実施例 5.2：pepEのヌクレオチド配列 pepEサブクローンであるpTZ18Rベクター中の5.8 kbp Ba
mHI 断片を、合成オリゴヌクレオチドプライマーとシー
クエナーゼ（United States Biochemical Corp. ）を使
って、ジデオキシ−チェーンターミネーション法〔Sang
erら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67 (197
7)〕により部分的に配列決定する。完全ヌクレオチド配
列を配列表に与える。他の既知のアスパラギン酸プロテ
アーゼとの比較により転写解読枠を同定し、これを転写
マッピングにより確認する。
【０１５３】実施例 5.3：PEPEのＲＮＡマッピング Frederick およびKinseyの方法〔Curr. Genet. 18:53-5
8 (1990)〕の方法により、炭素原としてグルコースを含
みそして窒素原としてアンモニアを含む最少培地上で増
殖させ凍結乾燥した菌糸の粉砕物から全ＲＮＡを調製す
る。全ＲＮＡを 32Ｐで末端標識したオリゴヌクレオチド
Ａ（配列番号12）とハイブリダイズせしめ、そして同じ
オリゴヌクレオチドを使ったジデオキシ配列決定法（Ma
niatisら、Molecular Cloning. A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,
NY, 1982 ）により行われる配列決定反応と比較するこ
とによって配列決定用ゲル上で逆転写酵素により生産さ
れた印刷転写物のサイズを決定することにより、伝令Ｒ
ＮＡの５′末端を同定する。
【０１５４】pepE情報の部分的ｃＤＮＡコピーをクロー
ニングし配列決定することにより、イントロンの正確な
スプライス部位を同定する。第一鎖合成は、プライマー
用オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドＣ（配列番
号14）かオリゴヌクレオチドＥ（配列番号16）のいずれ
かであること以外は、標準法（Maniatisら、前掲）によ
り実施する。それらのｃＤＮＡをオリゴヌクレオチドＢ
（配列番号13）とＣまたはオリゴヌクレオチドＤ（配列
番号15）とＥを使ったＰＣＲにかけ、pTZ18R中にクロー
ニングする。
【０１５５】各々の２つの独立したクローンの両鎖を完
全に配列決定する。プローブとして2.8 kb BamHI−BglI
I 断片を使ったノーザン分析（Maniatisら、前掲）によ
り、pepE遺伝子から生産されるｍＲＮＡの全長を決定す
ると、1.3 〜1.5 kbであると決定された。これは、転写
解読枠のサイズと転写開始部位の位置から期待されるも
のに一致する。
【０１５６】実施例６：PEPEのゲノム破壊 実施例 6.1：pTZ18REEの作製 pTZ18RをユニークHindIII 部位のところで切断し、これ
をＴ４ポリメラーゼでフィルインし、そして配列 5′GG
AATTCCを有する過剰量の未リン酸化 EcoRIリンカーの存
在下で連結せしめる。Ｅ．コリ中への形質転換により、
２つのEcoRI 部位（ポリリンカー配列の各端に１つず
つ）を有するプラスミドpTZ18REEが生じる。配列決定に
より正しいプラスミドを同定する。
【０１５７】実施例 6.2：pPEPEPYRA の作製 pAXIからpyrA遺伝子を含む4 kb XbaI 断片を切り取り、
ベクター配列から精製する。該断片をＴ４ポリメラーゼ
で処理して粘着末端をフィルインし、フェノール抽出
し、そしてエタノール沈澱させる。pPEPE をEcoRI で切
断し、細菌アルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸
し、Ｔ４ポリメラーゼで処理して５′突出末端をフィル
インし、次いでBamHI で切断する。アガロースゲル上で
断片を分離し、3.4 kb EcoRI（平滑）−BamHI 断片を精
製する。
【０１５８】pPEPE をHindIII で切断し、細菌アルカリ
性ホスファターゼにより脱リン酸し、Ｔ４ポリメラーゼ
で処理して５′突出末端をフィルインし、次いでBamHI
で切断する。アガロースゲル上で断片を分離し、1.4 kb
HindIII（平滑）−BamHI 断片を精製する。pTZ18RをBa
mHI で切断し、細菌アリカリ性ホスファターゼにより脱
リン酸する。上記４つの断片を一緒に連結せしめる。
Ｅ．コリの形質転換後、正しいプラスミドを含むコロニ
ーを、ミニプラスミド調製物の制限酵素消化により同定
する。
【０１５９】pPEPEPYRA は、PEPE遺伝子を有するEcoRI
断片を含有するpTZ18Rベクターから成り、オロチジン一
リン酸デカルボキシラーゼをコードするXbaIＤＮＡ断片
により置換された、成熟プロテアーゼ転写解読枠のほど
んどを含む中心の EcoRI−HindIII 断片と EcoRI−EcoR
I 断片を有する。
【０１６０】実施例 6.4：Ａ．ニガーの形質転換 10μg のプラスミドpPEPEPYRA をEcoRI により完全消化
する。アリコートをゲル上に負荷することにより消化の
完了を確認し、残りのＤＮＡをフェノール抽出し、エタ
ノール沈澱させ、そして20μl の無菌蒸留水に再懸濁す
る。独立栄養性Ａ．ニガー An8（DSM 3917）の分生胞子
を、完全培地上で十分に胞子形成するまで28℃にて４日
間増殖させる。２×108 分生子柄を使って、１g/lのア
ルギニンとウリジンが補足された最少培地 200 ml に接
種する。
【０１６１】180 rpm で28℃で20時間増殖した後、Mira
cloth を通した濾過により菌糸を収集し、10 ml の0.8M
KCl, 50mM CaCl2で２回洗浄し、そして20 ml の0.8M K
Cl,50mM CaCl2, 0.5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industr
ies) 中に再懸濁する。この混合物を、十分なプロトプ
ラストが放出されるまで振盪湯浴（30℃、50 rpm）中で
インキュベートする（90〜120 分後に顕微鏡で検出され
る）。
【０１６２】プロトプラスト懸濁液を漏斗に付けたガラ
スウール栓を通して濾過し、菌糸砕片を除去する。室温
での軽い遠心（10分、2000 rpm）によりプロトプラスト
をペレット化し、10 ml の0.8M KCl, 50mM CaCl2で２回
洗浄する。該プロトプラストを最後に200 〜500 μl の
0.8M KCl, 50mM CaCl2中に再懸濁して１×108 スフェロ
プラスト／mlの濃度を与える。
【０１６３】形質転換のため、前記プロトプラスト懸濁
液の200 μl アリコートを、50μlのＰＣＴ（10mM Tris
-HCl pH 7.5, 50mM CaCl2, 25% PEG 6000）中の EcoRI
消化されたpPEPEPYRA ５μg と共にインキュベートす
る。このインキュベーション混合物を氷上に20分間維持
し、更に2 mlのＰＣＴを加え、室温で更に５分間インキ
ュベートする。次いで4 mlの0.8M KCl, 50mM CaCl2を加
え、最終形質転換溶液の1 mlアリコートを、0.8M KClで
安定化された液体最少寒天培地〔最少培地＋1 g/l アル
ギニン＋10 g/l Bacto-Agar(Difco)〕と混合する。この
混合物をすぐに同培地の寒天プレート上に注ぎ、そして
30℃でインキュベートする。
【０１６４】28℃で２〜３日間増殖した後、何百という
小さな恐らく不全の形質転換体のバックグラウンド増殖
の上に、活発に増殖しそして胞子形成しているコロニー
として、安定な形質転換体が出現する。
【０１６５】実施例 6.5：遺伝子破壊の同定 安定なコロニーから、個々の胞子懸濁液を作り、新鮮な
最少＋アルギニンプレート上で画線培養する。単一コロ
ニーを選択し、再度画線培養して純粋培養物を与える。
それらを使って1 g/l のアルギニンが補足された液体最
少培地200 mlに接種する。180 rpm で振盪しながら30℃
で24時間後、濾紙の上に菌糸を収集し、そのパッドを凍
結乾燥する。乾燥後、乳鉢と乳棒を使って該パッドを細
粉に粉砕することにより、個々のパッドからＤＮＡを調
製する。
【０１６６】この粉末60 mg を渦動攪拌により3 mlの１
％ドデシル硫酸ナトリウム、0.1 ％Tween 80、１Ｍ酢酸
アンモニウム中に再懸濁する。これを時折混合しながら
65℃に20分間加熱する。15,000×g で５分間の遠心によ
り、このＤＮＡ溶液から細胞砕片を分離する。上清をフ
ェノールで２回、クロロホルムで２回それぞれ抽出し、
次いでエタノール沈澱せしめる。ＤＮＡペレットを100
μl の無菌ＴＥに再溶解する。
【０１６７】各ＤＮＡ20μl を１μg のＲＮアーゼＡの
存在下でEcoRI で１時間消化する。これをアガロースゲ
ル上で分離し、ニトロセルロース膜に移行させ、焼く。
PEPE遺伝子を含有するpPEPE からの BglII−HindIII 断
片を精製し、ニックトランスレーションにより標識し、
前記ニトロセルロース膜を探査するのに使用する。pepE
遺伝子の破壊を有する株は、0.5 kb EcoRIハイブリダイ
ズ断片を欠き且つ他の２つの隣接断片の移動度が異なる
ことから、容易に認識される。
【０１６８】それらの株のうちの１つを、ウリジンと５
−フルオロオロト酸を含む培地上に塗布する。この培地
上でより強力に増殖することによりピリミジン独立栄養
株への変異体を同定し、それを抜き取り、単一コロニー
に画線培養することにより精製する。
【０１６９】実施例 6.6：pepE- Ａ．ニガー株における
インターフェロンの生産 実施例 6.5で単離したpepE- Ａ．ニガー An8株のうちの
１つを、pyrA+ 含有プラスミドおよび非相同インターフ
ェロン遺伝子を含む発現カセットによるその後の形質転
換のための宿主として使用する。Ａ．ニガー An8のウリ
ジン独立栄養性pepE- 変異体の分生胞子を、十分に胞子
形成するまで完全培地中で28℃で４日間増殖させる。２
×108 分生子柄を使って、１g/l のアルギニンとウリジ
ンが補足された最少培地 200 ml に接種する。
【０１７０】180 rpm で28℃で20時間増殖した後、Mira
cloth を通した濾過により菌糸を収集し、10 ml の0.8M
KCl, 50mM CaCl2で２回洗浄し、そして20 ml の0.8M K
Cl,50mM CaCl2, 0.5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industr
ies) 中に再懸濁する。この混合物を、十分なプロトプ
ラストが放出されるまで振盪湯浴（30℃、50 rpm）中で
インキュベートする（90〜120 分後に顕微鏡で検出され
る）。プロトプラスト懸濁液を漏斗に付けたガラスウー
ル栓を通して濾過し、菌糸砕片を除去する。室温での軽
い遠心（10分、2000 rpm）によりプロトプラストをペレ
ット化し、10 ml の0.8M KCl, 50mM CaCl2で２回洗浄す
る。該プロトプラストを最後に200 〜500 μl の0.8M K
Cl, 50mM CaCl2中に再懸濁して１×108 ／mlの濃度を与
える。
【０１７１】形質転換のため、前記プロトプラスト懸濁
液の200 μl アリコートを、５μgのpAXI (DSM 7017)
と50μg のpGIIss-IFN AM119またはpGII-IFN AM119 Ｄ
ＮＡ（両プラスミドとも欧州特許出願第0 421 919 号の
中に完全に開示されている）、50μl のＰＣＴ（10mM T
ris-HCl pH 7.5, 50mM CaCl2, 25% PEG 6000）と共にイ
ンキュベートする。このインキュベーション混合物を氷
上に20分間維持し、更に2 mlのＰＣＴを加え、室温で更
に５分間インキュベートする。次いで4 mlの0.8M KCl,
50mM CaCl2を加え、最終形質転換溶液の1 mlアリコート
を、0.8M KClで安定化された液体最少寒天培地〔最少培
地＋1 g/l アルギニン＋10 g/l Bacto-Agar(Difco)〕と
混合する。この混合物をすぐに同培地の寒天プレート上
に注ぎ、そして30℃でインキュベートする。
【０１７２】28℃で２〜３日間増殖した後、何百という
小さな恐らく不全の形質転換体のバックグラウンド増殖
の上に、活発に増殖しそして胞子形成しているコロニー
として、安定な形質転換体が出現する。形質転換体を取
り、インターフェロン発現について分析する。インター
フェロン活性は、攻撃ウイルスとしての水疱性口内炎ウ
イルス（ＶＳＶ）とヒトCCL-23細胞を使って、Armstron
g の方法〔J.A. Armstrong, Appl. Microbiol. 21, 73
2 (1971)〕に従って測定する。
【０１７３】形質転換体からの分生胞子を個別に50 ml
の予備培養培地〔ペクチン Slow Set L (Unipectin, S
A, Redon, France) 3 g/l、NH4Cl 2 g/l 、KH2PO4 0.5
g/l、NaCl 0.5 g/l、 MgSO4・7H2O 0.5 g/l、 CaSO4・2
H2O 0.5 g/l、pH 7.0、１％アルギニン〕中で予備培養
する。この予備培養物を28℃にて250 rpm で72時間イン
キュベートする。予備培養物の10％を50 ml の本培養培
地（大豆粉末 20 g/l 、ペクチン Slow Set 5 g/l 、１
％アルギニン）に接種する。該培養物を250 rpmと28℃
で72〜96時間増殖させる。
【０１７４】様々な時点で（20時間毎に）試料を採取
し、遠心により細胞をペレット化し、そして凍結乾燥と
乾燥粉砕により破壊する。上清と細胞抽出物の両方を上
述如くインターフェロン活性について試験する（前
掲）。インターフェロン活性の大部分は、pGIIss-IFN A
M119を担持する形質転換体では培地中に分泌された状態
で認められるが、一方pGII-IFN AM119を担持する形質転
換体では主として細胞抽出物中に認められる。
【０１７５】実施例７：Ａ．ニガーにおけるpepEの過剰
発現 実施例 7.1：多重コピーの過剰発現 １μg のpAXIと10μg のpPEPE を用いてＡ．ニガー An8
を形質転換せしめてウリジン原栄養体を得る。上述した
通りにコロニーを精製してＤＮＡを調製する。pPEPE の
BglII−HindIII 断片を使ったサザンブロットは、それ
らのゲノム中に組み込まれたpPEPE の単一コピーを有し
ている形質転換体と、それらのゲノム中に10近くまたは
それ以上の余分なコピーを有している形質転換体がある
ことを示した。従ってそれらの株はより高いタンパク質
分解活性を有し、分裂上安定である。
【０１７６】実施例 7.2：遺伝子融合体からのpepEの過
剰発現 オリゴヌクレオチド１（配列番号３）とオリゴヌクレオ
チド２（配列番号４）を使ってＰＣＲ技術によりpGW110
0 (DSM 5747)からＡ．ニガーのピルビン酸キナーゼプロ
モーターを増幅せしめる。該プロモーター断片をBamHI
とPstIで切断し、アガロースゲルから精製する。
【０１７７】オリゴヌクレオチド３（配列番号５）とオ
リゴヌクレオチド４（配列番号６）を使ってＰＣＲ技術
によりpPEPE からアスペルギルス−アスパラギン酸プロ
テイナーゼコード領域を増幅せしめる。該コード領域断
片をPstIとXhoIで切断し、アガロースゲルから精製す
る。
【０１７８】オリゴヌクレオチド５（配列番号７）とオ
リゴヌクレオチド６（配列番号８）を使ってＰＣＲ技術
によりpGW1100 (DSM 5747)からＡ．ニガーのピルビン酸
キナーゼターミネーターを増幅せしめる。該ターミネー
ター断片をBamHI とPstIで切断し、アガロースゲルから
精製する。pTZ18RをBamHI で切断し、細菌アルカリ性ホ
スファターゼにより脱リン酸する。
【０１７９】上記４断片の連結とＥ．コリ中への形質転
換により、プラスミドpPKIPEPEが形成する。該プラスミ
ドの正しい構造を制限消化と配列決定により確認する。
pPKIPEPEはpTZ18R中に挿入されたBamHI 断片を含み、こ
のBamHI 断片は、Ａ．ニガーのpepE遺伝子のＡＴＧ開始
コドンに融合されたＡ．ニガーのピルビン酸キナーゼプ
ロモーターから成り、ピルビン酸キナーゼターミネータ
ーにより終結する。pPKIPEPEをpAXIと一緒に使用して、
Ａ．ニガー An8をウリジン原栄養体に同時形質転換させ
る。
【０１８０】pki-pepE融合体の存在は、個々の精製形質
転換体からＤＮＡを調製し、そしてそれを pkiとpepE由
来のプローブを用いるサザン分析に使うことによって確
認される。ゲノム中に組み込まれたこの遺伝子融合体の
１または複数のコピーを有する株は、Ｃ源としてグルコ
ース上で該細胞を増殖させた時により大きなタンパク質
分解活性を生産することが証明される。
【０１８１】実施例８：他の生物体におけるpepEの発
現：酵母中での発現 配列表にそれぞれ配列番号９，10および11のもとに示さ
れたオリゴヌクレオチド７，８および９の３つの合成オ
リゴヌクレオチドを用いてプラスミドpPEPE を試験管内
突然誘発せしめる（３つのイントロンの全てをループア
ウトする）。これによってプラスミドpPEPEIが生成し、
その配列を転写解読枠の全配列決定により確認する。
【０１８２】pFBY129 （DSM 7016として寄託）をEcoRI
で切断し、次いでＳ１ヌクレアーゼで処理して粘着末端
を除去する。この平滑末端化した分子を配列 5'CCTGCAG
G の過剰の非リン酸化リンカーと再連結し、そしてＥ．
コリ中に形質転換せしめる。EcoRI 部位がPstI部位に置
換した正しいプラスミドを配列決定により同定し、pFBY
129Pと命名する。
【０１８３】pFBY25（DSM 7020）をSnaBI で切断し、次
いでＴ４ポリメラーゼで処理して末端をフィルインす
る。この平滑末端化した分子を配列 5'GAGATCTC の過剰
の非リン酸化リンカーと再連結し、そしてＥ．コリ中に
形質転換せしめる。SnaBI 部位がBglII 部位に置換した
正しいプラスミドをプラスミドの微量調製物の制限分析
により同定し、配列決定により確認する。このプラスミ
ドをpFBY25Bgと命名する。pFBY25BgをBglII で消化し、
そして細菌アルカリ性ホスファターゼにより脱リン酸す
る。
【０１８４】オリゴヌクレオチド３と４を使ってＰＣＲ
によりpPEPEIから断片を増幅させる。イントロンを持た
ない全pepE転写解読枠を含むこの断片をPstIとXhoIで切
断し、アガロースゲルから精製する。オリゴヌクレオチ
ド５と６を使ってＰＣＲによりpGW1100 (DSM 5747)から
Ａ．ニガーピルビン酸キナーゼ遺伝子のターミネーター
を増幅させる。この断片をSalIとBamHI で切断し、アガ
ロースゲルから精製する。
【０１８５】BamHI とPstIを使ってpFBY129PからGal10
酵母プロモーターを切り取り、該断片をアガロースゲル
から精製する。上記で得られた３つの断片を BglIIで消
化され脱リン酸されたpFBY25Bgと一緒に連結せしめ、プ
ラスミドpGALPEPEを作製する。制限分析により正しい構
造を確認する。プラスミドpGALPEPEを酵母中に形質転換
せしめると、この形質転換体はグルコースによる組換え
遺伝子の発現の誘導後にPEPEタンパク質を生産すること
が証明された。
【０１８６】微生物の寄託 次の微生物は、ブダペスト条約のもとにDeutsche Samml
ung von Mikroorganismen und Zelkulturen, Mascherod
er Weg 1b, D-38124 Braunschweig に寄託されている： 微生物／プラスミド 寄託日 寄託番号 Ｅ．コリ DH5αF'／pGW1100 1990年１月18日 DSM 5747 Ａ．ニガー An8 1986年12月11日 DSM 3917 Ｅ．コリ DH5αF'／pFBY129 1992年３月30日 DSM 7016 Ｅ．コリ DH5αF'／pAXI 1992年３月30日 DSM 7017 Ｅ．コリ DH5αF'／pFBY25 1992年３月30日 DSM 7020 Ｅ．コリ DH5αF'／pPEPE 1993年10月７日 DSM 8613 Ｅ．コリ BB4／pNCPEP4 1993年10月７日 DSM 8612
【０１８７】
【配列表】
配列番号：１： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：2875塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （iii ）ハイポセティカル：NO （iii ）アンチ−センス：NO （vi）由来： （Ａ）生物：pepE （Ｂ）株 ：アスペルギルス・ニガー（Aspergillus ni
ger) N400 （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：CDS （Ｂ）位置：join（1269..1370, 1462..1612, 1669..23
23, 2382..2667） （Ｄ）他の情報：／機能＝“アスパラギン酸プロテアー
ゼ”／product ＝“PEPE”／gene＝“pepE” （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：イントロン （Ｂ）位置：order （1371..1461, 1613..1668, 2324..
2381） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：エクソン （Ｂ）位置：join（1269..1370, 1462..1612, 1669..23
23, 2382..2667） （xi）配列 GGATCCGGCC TTGCTACGTC CGGGTCGTTT GGACCGGAAG ATCGAGTTTC 50 CGTCTTTGCG CGACCGGCGT GAGCGCCGGT TGATTTTCTC TACGATAGCA 100
【０１８８】 TCCAAGATGT CGCTTTCGCC GGAAGTTGAC CTGGACTCGC TGATTGTGCG 150 CAATGAGCCC CTCTCGGGTG CGGTCATTGC CGCGATCATG CAAGAGGCGG 200 GTCTCCGTGC TGTCCGGAAG AACCGTTACA ACATCATCCC TAGGTCTGAT 250 CTCGAGGATG CTTACGCCGC CCAGGTGAAG ACCGGACAGG AAGCGGATAG 300 GTACGGGACA TTTTCTAATC TACCCGCGAT CGGGACATGG CTAACCAAGC 350 ATATAGACTC GAATTCTACC GGTAAATCAA GTATGGGACG TGCATCAGGC 400 TGGATATCGG ATTACGCAAG GCGAACAGGG GGACCGTTAG CTGTATTATC 450 AACATCTAGG CTATTTCATA TTAGGACAAC GACTGACGCA TTGGGTATTC 500 CGCTGGGGTA GTCTTATCGG TTGGGGCCAA GTACCTTGTA GAACTGTAAC 550 CCACGTTAAT ACCGCCACTT GGCTGGGGCG GTTATTTAGC ATATGTAAGC 600 TCCAGTTGGA CGGCTACCCG AGCTTCCCAT GATCTACAGG AGTACGTGTC 650 TGGCTGTCTG CTGCCTACTT GGTAGACAGG TCAGCGATAG GTAGATAGGA 700 CCTGTCCGCA GCTGTTGGCT AGTTTGGTAA GGCGGTTGCG CTAGTTTGAA 750 GTAGGCAGGC ACCGGGAACC TAAGGCGGTC TTACATCATC ACCCGCGCTC 800 GGATTCGCGT GATCCGACCA TCACGATAAG GCCTCAGGTA GCAAGGAGAC 850 CTTCCAGACA GCTCTGAATG AGACTCAAAG GTAGATATAA TGATGGAAAG 900 ATAGGATAGC TAGATCAGGC TTATTGTACC TGATCGTTAA GAGCCTAGAG 950 AAGATGTACC TGGAAGACCT GGCAGCTACA ATCACCTGGA GCGATAACCC 1000 GTGACGATCC CCTTGCCAAA TGACGCAGCC GGGCTGGCCA ACCATTGGCT 1050 GCGACCTGGC AGGTCCGTCC GCAACCAGCG CCGCCCGGCT CCAAGTCACC 1100 CGCATCACTC TTCCCTACCC CCAGACCTCC TCTTTTCCCT TGCTATCCTC 1150 CATCTCTTCT TCATCGTTCT TTGTCTCTAT CATCATTTTC TATTCATACG 1200 TGCATCCTTC AGTCGTTTGG CCCAGTCCAT CATATCCCGC TGGGTAGCCG 1250 TTTCCGCCGT CGCCCATC ATG AAA TCA GCC TCC TTG CTC ACA GCA TCC 1298 Met Lys Ser Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser 1 5 10 GTG CTG TTG GGC TGT GCC TCC GCC GAG GTT CAC AAG CTC AAG CTT 1343 Val Leu Leu Gly Cys Ala Ser Ala Glu Val His Lys Leu Lys Leu 15 20 25
【０１８９】 AAC AAG GTG CCT CTG GAA GAG CAG CTT GTGAGTGTGG TCTTTCACTG 1390 Asn Lys Val Pro Leu Glu Glu Gln Leu 30 CTTTTGTCTT TTTAGCTAGT TAGCTTCAAA GAAGCTCCAG AACCATTCAA 1440 AGCTAATTTC GTGGCCTATA G TAC ACG CAT AAC ATC GAC GCC CAT GTC 1488 Tyr Thr His Asn Ile Asp Ala His Val 35 40 CGC GCT CTG GGC CAG AAG TAC ATG GGT ATC CGC CCG TCC ATC CAC 1533 Arg Ala Leu Gly Gln Lys Tyr Met Gly Ile Arg Pro Ser Ile His 45 50 55 AAA GAG CTG GTC GAG GAG AAC CCT ATC AAT GAC ATG AGC CGT CAT 1578 Lys Glu Leu Val Glu Glu Asn Pro Ile Asn Asp Met Ser Arg His 60 65 70 GAT GTT CTG GTG GAC AAC TTC CTG AAC GCA CAG T GTATGGAGAT 1622 Asp Val Leu Val Asp Asn Phe Leu Asn Ala Gln 75 80 ACCATCTTCT TATGGCTGCA ACTACTGCTG ACCCTTCCTG CCATAG AC TTT 1673 Tyr Phe 85 TCT GAG ATC GAG CTG GGT ACT CCC CCC CAG AAG TTC AAG GTT GTC 1718 Ser Glu Ile Glu Leu Gly Thr Pro Pro Gln Lys Phe Lys Val Val 90 95 100 CTG GAC ACT GGC AGC TCG AAC CTT TGG GTT CCT TCG AGC GAA TGC 1763 Leu Asp Thr Gly Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Ser Glu Cys 105 110 115 AGC TCT ATC GCT TGC TAC CTC CAC AAC AAG TAT GAT TCG TCT GCC 1808 Ser Ser Ile Ala Cys Tyr Leu His Asn Lys Tyr Asp Ser Ser Ala 120 125 130
【０１９０】 TCC AGT ACG TAT CAC AAG AAT GGC AGT GAA TTC GCC ATC AAG TAC 1853 Ser Ser Thr Tyr His Lys Asn Gly Ser Glu Phe Ala Ile Lys Tyr 135 140 145 GGC TCT GGC AGC CTT AGC GGA TTC GTT TCT CAG GAC ACC CTG AAG 1898 Gly Ser Gly Ser Leu Ser Gly Phe Val Ser Gln Asp Thr Leu Lys 150 155 160 ATT GGC GAC CTG AAG GTC AAG GGA CAG GAC TTC GCT GAG GCG ACC 1943 Ile Gly Asp Leu Lys Val Lys Gly Gln Asp Phe Ala Glu Ala Thr 165 170 175 AAT GAG CCT GGC CTT GCC TTT GCC TTC GGC CGG TTC GAT GGC ATT 1988 Asn Glu Pro Gly Leu Ala Phe Ala Phe Gly Arg Phe Asp Gly Ile 180 185 190 CTC GGC TTG GGT TAT GAC ACC ATC TCC GTG AAC AAG ATT GTT CCT 2033 Leu Gly Leu Gly Tyr Asp Thr Ile Ser Val Asn Lys Ile Val Pro 195 200 205 CCC TTC TAC AAC ATG CTT GAC CAG GGG CTC CTC GAC GAG CCG GTC 2078 Pro Phe Tyr Asn Met Leu Asp Gln Gly Leu Leu Asp Glu Pro Val 210 215 220 TTT GCC TTC TAC CTT GGA GAC ACC AAC AAG GAG GGT GAC GAG TCC 2123 Phe Ala Phe Tyr Leu Gly Asp Thr Asn Lys Glu Gly Asp Glu Ser 225 230 235 GTG GCG ACC TTC GGT GGT GTC GAC AAG GAC CAC TAC ACC GGC GAG 2168 Val Ala Thr Phe Gly Gly Val Asp Lys Asp His Tyr Thr Gly Glu 240 245 250 CTG ATC AAG ATC CCC CTC CGG CGC AAG GCT TAC TGG GAG GTT GAG 2213 Leu Ile Lys Ile Pro Leu Arg Arg Lys Ala Tyr Trp Glu Val Glu 255 260 265
【０１９１】 CTT GAC GCC ATT GCT CTT GGC GAT GAT GTT GCT GAG ATG GAG AAC 2258 Leu Asp Ala Ile Ala Leu Gly Asp Asp Val Ala Glu Met Glu Asn 270 275 280 ACC GGT GTC ATT CTG GAC ACT GGT ACC TCC CTG ATT GCT CTG CCT 2303 Thr Gly Val Ile Leu Asp Thr Gly Thr Ser Leu Ile Ala Leu Pro 285 290 295 GCT GAC CTG GCT GAG ATG AT GTAAGTCGAA TTCCTCGGAT TCCTGGGTTG 2353 Ala Asp Leu Ala Glu Met Ile 300 AAAAGAAATG CTGCTAACAA CCTTCTAG C AAT GCT CAG ATC GGT GCT AAG 2403 Asn Ala Gln Ile Gly Ala Lys 305 310 AAG GGC TGG ACC GGC CAG TAC ACC GTT GAC TGC GAC AAG CGC TCG 2448 Lys Gly Trp Thr Gly Gln Tyr Thr Val Asp Cys Asp Lys Arg Ser 315 320 325 TCC CTG CCC GAT GTT ACT TTC ACC CTT GCC GGC CAC AAC TTC ACC 2493 Ser Leu Pro Asp Val Thr Phe Thr Leu Ala Gly His Asn Phe Thr 330 335 340 ATC TCA TCG TAT GAC TAC ACC TTG GAG GTG CAG GGC TCT TGC GTC 2538 Ile Ser Ser Tyr Asp Tyr Thr Leu Glu Val Gln Gly Ser Cys Val 345 350 355 AGT GCC TTC ATG GGC ATG GAC TTC CCT GAG CCG GTT GGT CCC TTG 2583 Ser Ala Phe Met Gly Met Asp Phe Pro Glu Pro Val Gly Pro Leu 360 365 370 GCC ATT TTG GGC GAT GCG TTC CTG CGC AAG TGG TAC AGC GTG TAT 2628 Ala Ile Leu Gly Asp Ala Phe Leu Arg Lys Trp Tyr Ser Val Tyr 375 380 385
【０１９２】 GAC CTG GGC AAC AGC GCT GTT GGT CTG GCC AAG GCC AAG 2667 Asp Leu Gly Asn Ser Ala Val Gly Leu Ala Lys Ala Lys 390 395 TAAATTAGTT CTGCGGGTTG ATGTGGTATC TATGATGCAG CTGTTGCTGT 2717 CATTATTGCT TCTTGTAGCT TGATCTATGA TTTTTGCAGA CGAACACACG 2767 TGATGTTGTG AATGGTCTCA TGTTTGCAGC GGTTGCCGGA TAGATTCTAG 2817 GGATCTTCAA TGGAAAGCCG GTGATATTAT TTGACATTTA TTTGGGCACT 2867 GAAGATCT 2875
【０１９３】配列番号：２： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：398 アミノ酸 （Ｂ）型 ：アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：蛋白質 （xi）配列 Met Lys Ser Ala Ser Leu Leu Thr Ala Ser Val Leu Leu Gly Cys 1 5 10 15 Ala Ser Ala Glu Val His Lys Leu Lys Leu Asn Lys Val Pro Leu 20 25 30 Glu Glu Gln Leu Tyr Thr His Asn Ile Asp Ala His Val Arg Ala 35 40 45 Leu Gly Gln Lys Tyr Met Gly Ile Arg Pro Ser Ile His Lys Glu 50 55 60 Leu Val Glu Glu Asn Pro Ile Asn Asp Met Ser Arg His Asp Val 65 70 75 Leu Val Asp Asn Phe Leu Asn Ala Gln Tyr Phe Ser Glu Ile Glu 80 85 90 Leu Gly Thr Pro Pro Gln Lys Phe Lys Val Val Leu Asp Thr Gly 95 100 105
【０１９４】 Ser Ser Asn Leu Trp Val Pro Ser Ser Glu Cys Ser Ser Ile Ala 110 115 120 Cys Tyr Leu His Asn Lys Tyr Asp Ser Ser Ala Ser Ser Thr Tyr 125 130 135 His Lys Asn Gly Ser Glu Phe Ala Ile Lys Tyr Gly Ser Gly Ser 140 145 150 Leu Ser Gly Phe Val Ser Gln Asp Thr Leu Lys Ile Gly Asp Leu 155 160 165 Lys Val Lys Gly Gln Asp Phe Ala Glu Ala Thr Asn Glu Pro Gly 170 175 180 Leu Ala Phe Ala Phe Gly Arg Phe Asp Gly Ile Leu Gly Leu Gly 185 190 195 Tyr Asp Thr Ile Ser Val Asn Lys Ile Val Pro Pro Phe Tyr Asn 200 205 210 Met Leu Asp Gln Gly Leu Leu Asp Glu Pro Val Phe Ala Phe Tyr 215 220 225 Leu Gly Asp Thr Asn Lys Glu Gly Asp Glu Ser Val Ala Thr Phe 230 235 240 Gly Gly Val Asp Lys Asp His Tyr Thr Gly Glu Leu Ile Lys Ile 245 250 255 Pro Leu Arg Arg Lys Ala Tyr Trp Glu Val Glu Leu Asp Ala Ile 260 265 270 Ala Leu Gly Asp Asp Val Ala Glu Met Glu Asn Thr Gly Val Ile 275 280 285 Leu Asp Thr Gly Thr Ser Leu Ile Ala Leu Pro Ala Asp Leu Ala 290 295 300 Glu Met Ile Asn Ala Gln Ile Gly Ala Lys Lys Gly Trp Thr Gly 305 310 315
【０１９５】 Gln Tyr Thr Val Asp Cys Asp Lys Arg Ser Ser Leu Pro Asp Val 320 325 330 Thr Phe Thr Leu Ala Gly His Asn Phe Thr Ile Ser Ser Tyr Asp 335 340 345 Tyr Thr Leu Glu Val Gln Gly Ser Cys Val Ser Ala Phe Met Gly 350 355 360 Met Asp Phe Pro Glu Pro Val Gly Pro Leu Ala Ile Leu Gly Asp 365 370 375 Ala Phe Leu Arg Lys Trp Tyr Ser Val Tyr Asp Leu Gly Asn Ser 380 385 390 Ala Val Gly Leu Ala Lys Ala Lys 395
【０１９６】配列番号：３： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：18塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..18 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチド１” （xi）配列 CCGACCTCGC TAGGAGAG 18
【０１９７】配列番号：４： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：30塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..30 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチド２” （xi）配列 GCAGCTGCAG TGATTGATCT CTACTGAACC 30
【０１９８】配列番号：５： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：30塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..30 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチド３” （xi）配列 CCGCCTGCAG CCATCATGAA ATCAGCCTCC 30
【０１９９】配列番号：６： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：30塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..30 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチド４” （xi）配列 CAGACTCGAG TTACTTGGCC TTGGCCAGAC 30
【０２００】配列番号：７： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：28塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..28 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチド５” （xi）配列 GCTAGTCGAC ATGCAAAAGC AGTCTGGC 28
【０２０１】配列番号：８： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：28塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..28 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチド６” （xi）配列 CGATGGATCC TGATCCTCAA GGGATTCG 28
【０２０２】配列番号：９： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：36塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..36 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチド７” （xi）配列 CCTCTGGAAG AGCAGCTTTA CACGCATAAC ATCGAC 36
【０２０３】配列番号：10： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：38塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..38 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチド８” （xi）配列 CAACTTCCTG AACGCACAGT ACTTTTCTGA GATCGAGC 38
【０２０４】配列番号：11： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：38塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..38 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチド９” （xi）配列 GCTGACCTGG CTGAGATGAT CAATGCTCAG ATCGGTGC 38
【０２０５】配列番号：12： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：30塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..30 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチドＡ” （xi）配列 CAACAGCACG GATGCTGTGA GCAAGGAGGC 30
【０２０６】配列番号：13： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：20塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..20 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチドＢ” （xi）配列 GGGCTGTGCC TCCGCCGAGG 20
【０２０７】配列番号：14： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：20塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..20 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチドＣ” （xi）配列 TAAGGCTGCC AGAGCCGTAC 20
【０２０８】配列番号：15： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：20塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..20 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチドＤ” （xi）配列 CGGTGTCATT CTGGACACTG 20
【０２０９】配列番号：16： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ：20塩基対 （Ｂ）型 ：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：DNA (genomic） （ix）特徴： （Ａ）NAME／KEY ：misc feature （Ｂ）位置：1..20 （Ｄ）他の情報：／標準名＝“オリゴヌクレオチドＥ” （xi）配列 AGTAACATCG GGCAGGGACG 20
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:685） Ｃ１２Ｒ 1:685） (72)発明者 ガボル ヤライ スイス国，4104 オベルビル，シュルシュ トラーセ 16 (72)発明者 ヤコブ フィッサー オランダ国，6703 セーカー ワヘニンヘ ン，ヒンケロールドセウェフ ５

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アスペルギルス・ニガー（Aspergillus
    niger）アスパラギン酸プロテアーゼをコードするＤＮ
    Ａ配列を含んで成る単離されたＤＮＡ分子。
  2. 【請求項２】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を有
    するアスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）ア
    スパラギン酸プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を含
    んで成る、請求項１に記載のＤＮＡ分子。
  3. 【請求項３】 配列番号１に示されるＤＮＡ配列を含ん
    で成る、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のＤＮＡ配列を含んで成
    るハイブリッドベクター。
  5. 【請求項５】 アスペルギルス・ニガー（Aspergillus
    niger）アスパラギン酸プロテアーゼをコードするＤＮ
    Ａ配列が、適当な宿主細胞におけるアスペルギルス・ニ
    ガーアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子の発現に適当な
    調節領域と機能的に連結される、請求項４に記載のハイ
    ブリッドベクター。
  6. 【請求項６】 アスペルギルス・ニガー（Aspergillus
    niger）アスパラギン酸プロテアーゼをコードするＤＮ
    Ａ配列が、アスペルギルス株におけるアスペルギルス・
    ニガーアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子の発現に適当
    な調節領域と機能的に連結される、請求項５に記載のハ
    イブリッドベクター。
  7. 【請求項７】 所望のアスペルギルス・ニガー（Asperg
    illus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子と同
    種性のプロモーターを含んで成る、請求項６に記載のハ
    イブリッドベクター。
  8. 【請求項８】 所望のアスペルギルス・ニガー（Asperg
    illus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子と異
    種性のアスペルギルスプロモーターを含んで成る、請求
    項５に記載のハイブリッドベクター。
  9. 【請求項９】 請求項１に記載のＤＮＡ分子の調製方法
    であって、前記ＤＮＡ分子により形質転換された宿主細
    胞を培養し、そして宿主細胞から前記ＤＮＡ分子を単離
    することを含んで成る方法。
  10. 【請求項１０】 アスペルギルス・ニガー（Aspergillu
    s niger）アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子が欠損し
    ているアスペルギルス株。
  11. 【請求項１１】 配列番号１の配列を有するpepE遺伝子
    が欠損している、請求項１０に記載のアスペルギルス
    株。
  12. 【請求項１２】 アスパラギン酸プロテアーゼが欠損し
    ているアスペルギルス株の調製方法であって、アスペル
    ギルス・ニガー（Aspergillus niger）アスパラギン酸
    プロテアーゼ遺伝子の試験管内突然変異誘発、変異型外
    因性遺伝子による対応する内因性染色体アスペルギルス
    ・ニガーアスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子を有するア
    スペルギルス宿主の形質転換、および内因性遺伝子が変
    異型外因性遺伝子により置換されている変異株の単離を
    含んで成る方法。
  13. 【請求項１３】 アスペルギルス・ニガー（Aspergillu
    s niger）アスパラギン酸プロテアーゼ遺伝子の破壊を
    含んで成る、請求項１２に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 配列番号１の配列を有するＡ．ニガー
    pepE遺伝子を破壊することを含んで成る、請求項１３に
    記載の方法。
  15. 【請求項１５】 所望のポリペプチドの調製方法であっ
    て、所望のポリペプチドの発現に適当な発現カセットを
    担持している発現ベクターにより請求項１０に記載のア
    スペルギルス株を形質転換せしめ、形質転換されたアス
    ペルギルス株を所望のポリペプチドの発現に適当な条件
    下で培養し、そして所望のポリペプチドを単離すること
    を含んで成る方法。
  16. 【請求項１６】 アスペルギルス・ニガー（Aspergillu
    s niger）アスパラギン酸プロテアーゼ。
  17. 【請求項１７】 配列番号２に示されるアミノ酸配列を
    有する、請求項１６に記載のアスペルギルス・ニガー
    （Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ。
  18. 【請求項１８】 アスペルギルス・ニガー（Aspergillu
    s niger）アスパラギン酸プロテアーゼの調製方法であ
    って、適当な宿主におけるアスペルギルス・ニガーアス
    パラギン酸プロテアーゼ遺伝子の発現に適当な調節領域
    と機能的に連結されたアスペルギルス・ニガーアスパラ
    ギン酸プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成
    るハイブリッド発現ベクターにより形質転換された適当
    な宿主を培養することを含んで成る方法。
  19. 【請求項１９】 宿主中でのアスペルギルス・ニガー
    （Aspergillus niger）アスパラギン酸プロテアーゼ遺
    伝子の発現に適当な調節領域と機能的に連結されたアス
    ペルギルス・ニガーアスパラギン酸プロテアーゼをコー
    ドするＤＮＡ配列を含んで成るハイブリッド発現ベクタ
    ーにより形質転換された宿主。
  20. 【請求項２０】 アスペルギルス株である、請求項１９
    に記載の形質転換された宿主。
  21. 【請求項２１】 アスペルギルス株におけるアスペルギ
    ルス−アスパラギン酸プロテアーゼの発現に適当な調節
    要素を含んで成るハイブリッド発現ベクターにより形質
    転換されたアスペルギルス株である、請求項２０に記載
    の形質転換された宿主。
  22. 【請求項２２】 所望のアスペルギルス・ニガーアスパ
    ラギン酸プロテアーゼ遺伝子と相同のプロモーターを含
    んで成るハイブリッド発現ベクターにより形質転換され
    たアスペルギルス株である、請求項２１に記載の形質転
    換された宿主。
  23. 【請求項２３】 所望のアスペルギルス・ニガーアスパ
    ラギン酸プロテアーゼ遺伝子と非相同のプロモーターを
    含んで成るハイブリッド発現ベクターにより形質転換さ
    れたアスペルギルス株である、請求項２１に記載の形質
    転換された宿主。
  24. 【請求項２４】 請求項１９に記載の形質転換された宿
    主の調製方法であって、適当な宿主を、前記宿主におけ
    るアスペルギルス・ニガーアスパラギン酸プロテアーゼ
    遺伝子の発現に適当な調節領域と機能的に連結されたア
    スペルギルス・ニガーアスパラギン酸プロテアーゼをコ
    ードするＤＮＡ配列を含んで成るハイブリッド発現ベク
    ターにより形質転換せしめることを含んで成る方法。
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