JP3636455B2 - 菌類プロテアーゼ - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、スブチリシン型のアスペルギラス ニガーセリンプロテアーゼをコードする新規ＤＮＡ配列、スブチリシン型のアスペルギラスセリンプロテアーゼ自体及びそれらの調製方法に関する。本発明はさらに、非相同タンパク質の発現のために有用である、スブチリシン型のセリンプロテアーゼにおいて欠陥性の新規アスペルギラス変異体株、及びそのような変異体株の調製方法に関する。
【０００２】
発明の背景
アスペルギラス種及び特にアスペルギラス ニガーは、食品加工産業において使用される酵素の産業的製造のために使用される。Ａ．ニガーは、タンパク質の分泌のための高い能力のために、及びシステムはその分子遺伝子操作のために利用できるので、組換えタンパク質の生成のための宿主として好都合である。しかしながら、培養流体におけるプロテアーゼの存在は、Ａ．ニガーにおける非相同タンパク質の発現に対して有害であることがわかっており；実際、アスペルギラスはプロテアーゼを生成するために商業的には使用される。アスペルギラスからの多くの細胞外プロテアーゼは文献にこれまで記載されて来た〔Barthomeufなど. 、Biotech.Tech. ２：29−34 (1988) ；Barthomeufなど. 、Chem.Pharm Bull.(Tokyo) 37：1333−1336 (1986) ；Bosmann,H.B., Biochim.Biophys.Acta 293： 476−489 (1973)；Ichishima,E., Biochim.Biophys.Acta 258： 274−288 (1972)； Chopra,S.,and Mehta,P., Folia Microbiol. 30： 117−125 (1985)；Krishnan and Vijayalakshimi,J. Chromatogr. 329： 165−170 (1985)〕。アスペルギラス アワモリ（Aspergillus awamori）からのアスペルギロペプシンＡをコードする遺伝子ｐｅｐＡが最近クローン化されている〔 Berkaなど. 、 Gene 86： 153〜162 (1990)〕。そのｐｅｐＡ遺伝子生成物は、Ａ．ニガーの分泌された酸プロテアーゼの主要部分を占め、そしてｐｅｐＡ遺伝子が欠失した株は、Ａ．ニガー var. アワモリにおける非相同タンパク質の高められた発現を可能にした〔Dunn-Colemanなど. 、Biotechnology ９： 976〜981 (1991)〕。他のプロテアーゼ遺伝子はまた最近、アスペルギラスからクローン化されており、そしてこれらはＡ．オリザエ（A.oryzae) のアルカリセリンプロテアーゼ〔 Tatsumiなど. 、Mol.Gen.Genet. 219：33〜38 (1989) 〕、Ａ．フミガタス（A.fumigatus ) のアルカリセリンプロテアーゼ〔Jaton-Ogayなど. 、 FEMS Microbiol Letts 92： 163〜168 (1992)〕、Ａ．ニガー var. マクロスポラス (A.niger var. macrosporus) からの非ペプシンタイプ型プロテアーゼ〔 Inoueなど. 、J.Biol.Chem. 266： 19484〜89 (1991) 〕及びＡ．オリザエからの中性プロテアーゼIIと呼ばれるメタロプロテラーゼ〔 Tatsumiなど. 、Mol.Gen.Genet. 228：97〜103 (1991)〕を包含する。
【０００３】
Ａ．ニガーの単離され、そして変異誘発されたプロテアーゼ遺伝子は、遺伝子破壊実験、すなわち対応する天然の遺伝子が破壊される変異体株の調製のために使用され得る。たとえば、アスペルギラス アワモリからのｐｅｐＡ遺伝子は、アスペルギロペプチンＡ欠陥株を調製するために遺伝子破壊により破壊されて来た(Berkaなど. 、上掲書）。
【０００４】
しかしながら、上記のように、アスペルギラスは多数の異なったプロテアーゼを生成し、そして従って、タンパク質の産業的な製造のために他のプロテアーゼにおける欠陥性のアスペルギラス株のための連続した必要性が存在する。このために、インビトロ変異誘発、たとえば遺伝子破壊によるプロテアーゼ欠陥性株の調製のために使用され得る他のプロテアーゼ遺伝子のための必要性がまた存在する。さらに、タンパク質プロセッシングのために産業的に適用され得る組換えプロテアーゼタンパク質のための必要性がまた存在する。
【０００５】
Ａ．ニガーにおける分泌されたプロテアーゼ活性の他の主要構成成分はセリンプロテアーゼである〔 Sakkaなど. 、 J.Ferment.Technol. 63： 479〜483 (1985)〕。菌類からのセリンプロテアーゼは、カビ、Ｔ．アルブム（T.album ) 及び酵母、サッカロミセス セレビシアエ (Saccharomyces cerevisiae) において広範に特徴づけられている。Ｔ．アルブムはたぶん、３種の関連するセリンプロテアーゼを分泌し、そのうち最良に特徴づけられているものはプロテイナーゼＫであり〔Janyなど. 、FEBS 199： 139〜144 (1986)〕、ところが酵母における相同タンパク質は液胞に局在する〔Wolf and Ehmann, Eur.J.Biochem. 98： 375〜384 (1979)〕。それらのＴ．アルブム及びＳ．セレビシアエタンパク質のすべてのための遺伝子はクローン化されており、そして特徴づけられている〔 Gunkel and Gassen, Eur.J.Biochem. 179： 185〜194 (1989), Samalなど．、 Gene 85： 329〜333 (1989), Samal など．、 Molec.Microbiol 4：1789〜1792 (1990) 及びMoehleなど. 、Molec.Cell.Biol. 7：4390〜99 (1987) 〕。アルカリセリンプロテアーゼはまた、Ａ．オリザエ、Ａ．フミガタス及びアクレモニウム クリソゲナム（Achremonium chrysogenum) においてクローン化され、そして特徴づけられている〔 Tatsumiなど. 、Mol.Gen.Genet. 219：33〜38 (1989) ；Jaton-Ogayなど. 、FEMS Microbiol.Letts. 92： 163〜168 (1992)；Isogaiなど. 、 Agric Biol.Chem. 55： 471〜477 (1991)〕。
アスペルギラスはまた、プロテアーゼのスブチリシン科に相同のセリンプロテアーゼを生成することが見出された。本発明はこのタイプのプロテアーゼに関する。
【０００６】
本発明の目的
スブチリシン型のアスペルギラスセリンプロテアーゼをコードするＤＮＡ分子を供給することが本発明の目的である。
さらなる目的は、スブチリシン型の組換えアスペルギラスセリンプロテアーゼ及びまた、その生成のための形質転換されたアスペルギラス株を供給することである。
もう１つの目的は、株が非相同タンパク質のより効果的な生成のために使用され得る、スブチリシン型のセリンプロテアーゼ遺伝子において欠陥性のアスペルギラス株を供給することである。
【０００７】
発明の要約
本発明は、スブチリシン型のアスペルギラスセリンプロテアーゼに関する。そのようなプロテアーゼは、本明細書においては、“アスペルギラス−スブチリシン”と命名される。本発明の“アスペルギラス−スブチリシン”は、（ａ）アスペルギラス spec.に由来し、（ｂ）活性部位での触媒性セリン残基によるプロテアーゼ活性を示し、そして（ｃ）スブチリシン科に分類されるために既知のセリンプロテアーゼと相同の十分なアミノ酸配列を有するものとして理解される。しかしながら、本発明に使用されるようなアスペルギラス−スブチリシンはまた、セリンプロテアーゼ活性を保持するような酵素のフラグメントもまた前記用語の意味するところであるが、しかしながら、十分な長さの酵素が好ましい態様である。追加のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質に結合される本発明の“アスペルギラス−スブチリシン”を含む融合タンパク質もまた本発明の一部であることが理解される。
【０００８】
好ましい態様において、アスペルギラス−スブチリシンは、アスペルギラス ニガーに由来するプロテアーゼ又はその活性フラグメント、より好ましくは配列番号１及び６にそれぞれ示されるアミノ酸配列又はその配列の一部を有するプロテアーゼ又はその活性フラグメントを意味する。
【０００９】
本発明はまた、本発明のアスペルギラス−スブチリシンをコードする単離されたＤＮＡ配列、及びそのようなＤＮＡのクローニング及び操作のためのハイブリッドベクターにも関する。本発明はさらに、適切な宿主細胞におけるアスペルギラス−スブチリシンの発現のために適切な調節領域により機能的に結合されたそのようなＤＮＡ配列を含んで成る、アスペルギラス−スブチリシンの生成のための発現ハイブリッドベクターに関する。本発明はまた、アスペルギラス−スブチリシンを発現できる形質転換された宿主細胞、たとえば形質転換の後、高められた遺伝子のコピー数によりアスペルギラス−スブチリシンを過剰発現できるアスペルギラス株にも関する。
【００１０】
本発明はまた、アスペルギラス−スブチリシン遺伝子における欠陥性のアスペルギラス株、及び変異誘発、たとえば遺伝子破壊により機能的タンパク質をもはや発現できないアスペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮＡ配列によるその生成のための方法にも関する。
【００１１】
さらに、本発明は、本発明のＤＮＡ配列、ハイブリッドベクター、発現ベクター及びアスペルギラス−スブチリシンの調製方法、並びにアスペルギラス−スブチリシン遺伝子における欠陥性のアスペルギラス株及びアスペルギラス−スブチリシンを過剰生成する宿主株の発現方法にも関する。
【００１２】
発明の特定の記載
クローニング及び発現のためにアスペルギラス−スブチリシンハイブリッドベクターをコードするＤＮＡ
本発明は、アスペルギラス−スブチリシン、好ましくはアスペルギラス ニガーをコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ分子に関する。そのＤＮＡ配列は、ゲノムＤＮＡライブラリィーから単離できるＤＮＡ分子を有する場合、たとえば配列番号１に示されるｐｅｐＣ遺伝子又は配列番号６に示されるｐｅｐＤ遺伝子として１又は複数のイントロンを含むことができる。しかしながら、本発明はまた、たとえばｃＤＮＡクローニングにより、又は変異誘発の後、ＰＣＲ技法の適用により単離できるようなＤＮＡ配列のイントロンを含まない変異体にも関する。そのようなイントロンを含まない遺伝子は特に、非アスペルギラス宿主、好ましくは原核生物又は酵母における発現のために有用である。
【００１３】
本発明は好ましくは、配列番号１で示されるアミノ酸配列又はセリンプロテアーゼ活性を保持するそのフラグメントを有するＡ．ニガー−スブチリシンＰＥＰＣをコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ分子に関する。本発明のＤＮＡ配列は好ましくは、配列番号１を有するヌクレオチド配列で示される成熟ＰＥＰＣプロテアーゼのためのコード領域である。しかしながら、本発明はまた、ＰＥＰＣをコードする変性ＤＮＡ配列、又はそのフラグメント、すなわちヌクレオチドがコードされたアミノ酸配列を変えないで置換されている配列にも関する。そのようなＤＮＡ配列は、たとえば種々の宿主への好ましいコドン利用における差異により又は制限酵素のための新規認識部位の存在により、有用である。
【００１４】
本発明のもう１つの好ましい態様は、配列番号６で示されるアミノ酸配列又はセリンプロテアーゼ活性を保持するそのフラグメントを有するＡ．ニガー−スブチリシンＰＥＰＤをコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡ分子である。従って、本発明のもう１つの好ましいＤＮＡ配列はまた、配列番号６を有するヌクレオチド配列で示される成熟ＰＥＰＤプロテアーゼのためのコード領域である。しかしながら、本発明はまた、ＰＥＰＤをコードする変性ＤＮＡ配列又はそのフラグメント、すなわちヌクレオチドがコードされたアミノ酸配列を変えないで置換されている配列にも関する。
【００１５】
本発明はまた、本発明のアスペルギラス−スブチリシン、好ましくはその好ましい形をコードするＤＮＡ配列を挿入体として含んで成るハイブリッドベクターにも関する。そのような本発明のハイブリッドベクターは、本発明のＤＮＡ配列の拡張及び操作のために有用である。本発明はまた、本発明のアスペルギラス−スブチリシン、好ましくはその好ましい形の生成のために適切な発現ベクターにも関する。そのような発現ベクターは、アスペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮＡ配列が所望する宿主細胞においてそのようなＤＮＡ配列の発現の制御のために適切な調節領域により機能的に結合されている“発現カセット”を含んで成る。
【００１６】
発現ベクターを含む本発明のハイブリッドベクターは、遺伝子工学の業界において有用ないづれかのベクター、たとえばウィルス、ファージ、コスミド、プラスミド又は染色体ＤＮＡ、たとえばＳＶ４０、ヘルペスウィルス、乳頭腫ウィルス、レトロウィルス、バキュロウィルス、ファージλ、たとえばＮＭ９８９又はＥＭＢＬ４、又はファージＭ１３、たとえばＭ１３ｍｐ８の誘導体、細菌プラスミド、たとえばｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１８又は酵母プラスミド、たとえば酵母２μプラスミド、又は欠陥ウィルス、ファージ又はプラスミドの複製を可能にするヘルパーウィルス、ファージ又はプラスミドの存在下での欠陥ウィルス、ファージ又はプラスミド、たとえばＭ１４Ｋ０７ヘルパーファージの存在下でのＭ１３（＋）ＫＳベクター、又は糸状菌、たとえばアスペルギラス spec.、たとえばＡ．ニガーに由来する染色体ＤＮＡ、たとえばＥＰ１８４４３８により供給されるものに由来する。Ｓ．セレビシアエ又は糸状菌、より好ましくはアスペルギラス spec.、さらにより好ましくはＡ．ニガーのためのベクターが好ましい。
【００１７】
発現ベクターを含む本発明のハイブリッドベクターは、染色体外要素として、又は宿主染色体における組込みにより適切な宿主における所望するＤＮＡの複製を提供する。いくつかの可能なベクターシステムが、本発明のクローン化されたＤＮＡの組込み及び発現のために利用できる。原則的に、選択された宿主において複製し、そして安定して維持されるすべてのベクターが適切である。従って、ベクターは、形質転換のために予想される宿主細胞に依存して選択される。一般的に、そのような宿主細胞は、原核又は真核微生物、たとえば細菌、菌類、たとえば酵母、好ましくはＳ．セレビシアエ、又は糸状菌として、好ましくはアスペルギラス spec.、より好ましくはＡ．ニガー、又は高等真核生物起源の細胞、たとえば脊椎動物、たとえば哺乳類細胞であり得る。適切な宿主細胞は、下記に詳細に論ぜられるであろう。染色体外要素として維持される、発現ベクターを含む本発明のハイブリッドベクターは、複製の起点（ｏｒｉ) 又は自立的に複製する配列（ＡＲＳ）、選択可能マーカー配列、及び場合によっては、追加の制限部位を含んで成る。宿主染色体中への組込みのために向けられるベクターは、染色体に関連してそれは細胞において複製されるので、ｏｒｉ又はＡＲＳを含む必要はない。
【００１８】
複製又は自立的に複製する配列の起点（染色体外要素に自立的に複製する能力を付与するＤＮＡ要素）は、たとえばＳＶ４０又は他のウィルス源に由来する外因性起点を含むベクターの構成により、又は宿主細胞染色体機構により供給される。
【００１９】
発現ベクターを含む本発明のハイブリッドベクターはまた、形質転換され、選択され、そしてクローン化される宿主に依存して選択マーカーを含むことができる。マーカーの表現型発現により形質転換体の選択を促進するいづれかのマーカー遺伝子が使用され得る。適切なマーカーは特に、テトラサイクリン又はアンピシリンに対しての抗生物質耐性、又は栄養要求性菌類変異体の場合、宿主損傷を補う遺伝子を発現するものである。その対応する遺伝子は、たとえば抗生物質シクロヘキシミドに対しての耐性を付与し、又は栄養要求性酵母、好ましくはＳ．セレビシアエにおける原栄養性に、変異体、たとえばｕｒａ３，ｌｅｕ２，ｈｉｓ３又はｔｒｐ１遺伝子を供給する。形質転換されるべき宿主がマーカーにより発現される生成物のために栄養要求性である場合、自立的に複製するセグメントに関連するマーカー構造遺伝子として使用することもまた可能である。
【００２０】
Ａ．ニガーのためのハイブリッドベクター、特に発現ベクターに関して、Ａ．ニガー宿主損傷を補足するマーカー遺伝子、たとえばＡ．ニガー又はＡ．ニジュランス（A.nidulans) （ＥＰ１８４，４３８号）、又はＮ．クラサ（N.crassa) ｐｙｒ４遺伝子に相同のＡ．ニジュランスＤＮＡフラグメントに由来するオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼをコードするａｒｇＢ遺伝子が特に重要である。他の適切なマーカー遺伝子は、本発明の形質転換された宿主の記載に関して、この後に説明される。
【００２１】
Ｅ．コリにおけるアスペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮＡの操作のために適切な本発明のハイブリッドベクターは、たとえば本発明の例にこの後、記載されるプラスミドｐＴＺＰＥＰＣ又はｐＴＺＰＥＰＤである。
【００２２】
本発明の発現ベクターに関して、用語“発現カセット”とは、アスペルギラス−スブチリシンを発現できるＤＮＡ配列を意味し、そしてアスペルギラス−スブチリシンにより操作可能的に結合されるプロモーター及び場合によっては、シグナル配列、転写ターミネーター、転写エンハンサー、リボソーム結合部位、効果的なＲＮＡプロセッシングのための配列、効果的なタンパク質プロセッシングをコードする配列及び正しいタンパク質局在化をコードする配列から成る群からの１又は複数の追加の調節要素を含んで成る。本発明の発現カセットにおいては、アスペルギラス−スブチリシンコード領域は、相同調節要素、すなわちそれらにより天然において結合されるもの、又は非相同調節要素、すなわち他の遺伝子に由来するものと共に組合され得る。
【００２３】
広範囲の種類のプロモーター配列が、宿主細胞の性質に依存して使用され得る。強く且つ同時に、十分に調節されているプロモーターが最っとも有用なものである。
【００２４】
プロモーターのための例は、原核生物のλＰ_L ，λＰ_R ，Ｅ．コリのｌａｃ，ｔｒｐ又はｔａｃプロモーターである。酵母、好ましくはＳ．セレビシアエにおける発現のために適切なプロモーターは、ＴＲＰ１−，ＡＤＨ１−，ＡＤＨII−，ＰＨＯ３−，ＰＨＯ５−，ＧＡＬ１０−、又は解糖性プロモーター、たとえばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、ホスホトリオースイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ遺伝子のプロモーター、又はＰＨＯ５−ＧＡＰＤＨハイブリッドプロモーター（ＥＰ出願番号第ＥＰ−Ａ２１３５９３号）である。真核生物プロモーターの他の例は、真核ウィルス、たとえばＳＶ４０、ラウス肉腫ウィルス、アデノウィルス２、ウシ乳頭腫ウィルス、パポーバウィルス、サイトメガロウィルス由来のプロモーター、又はたとえばアクチン、コラーゲン、ミオシン又はβ−グロビン遺伝子の哺乳類細胞由来のプロモーターである。真核生物プロモーターは、促進配列、たとえば酵母、好ましくはＳ．セレビシアエの上流の活性化配列（ＵＡＳ）又はウィルス又は細胞性エンハンサー、たとえばサイトメガロウィルスＩＥエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、免疫グロブリン遺伝子エンハンサー又は他のものと共に組合され得る。
【００２５】
エンハンサーは、たとえばウィルス、たとえばＳＶ４０、ポリオーマウィルス、ウシ乳頭腫ウィルス又は Moloney肉腫ウィルスに由来し、又はゲノム起源の転写刺激ＤＮＡ配列である。エンハンサー配列はまた、フィサラム ポリセファラム（Physarum polycephalum）の染色体外リボソームＤＮＡに由来する（ＰＣＴ／ＥＰ８５００２７８）。適切なエンハンサーはまた、酵母酸ホスファターゼＰＨＯ５遺伝子に由来する上流の活性化部位でもある。
【００２６】
シグナル配列は、たとえばポリペプチドの分泌を方向づけるプレ配列又は分泌リーダー、又は同様のものであり得る。シグナル配列は、たとえばアスペルギラス−スブチリシンのシグナル又はリーダーペプチド、たとえば配列番号１に示されるシグナル配列であり得る。追加のシグナル配列は、文献、たとえばvon Heijne,G., Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986) に包含されるものから知られる。
【００２７】
転写の開始及び停止、及びｍＲＮＡを安定化するために必要な配列は、たとえば発現宿主からのウィルス又は真核生物ｃＤＮＡのそれぞれの非コード５′−領域及び３′−領域から通常利用できる。
【００２８】
本発明の態様においては、たとえばプラスミド、ｐＦＢＹ１３８におけるようにＧＡＬ１０プロモーターの制御下で、原核生物、たとえばＥ．コリ、好ましくは酵母、より好ましくはＳ．セレビシアエにおけるアスペルギラス−スブチリシンの発現のために配列番号１に示されるコード領域の２つのエキソン又は配列番号６に示されるコード領域の４つのエキソンから構成されるイントロンを含まないコード領域を含んで成る発現ベクターである。
本発明は好ましくは、アスペルギラス株におけるアスペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮＡ配列の発現のために適切な発現ベクターに関する。
【００２９】
本発明の１つのタイプの発現ベクターは、アスペルギラス−スブチリシン、好ましくはＡ．ニガーをコードするＤＮＡ配列を、そのＤＮＡ配列により天然において結合されるプロモーター、すなわちその相同プロモーターの制御下で含んで成る。より好ましくは、配列番号１に示されるプロモーター領域の制御下で配列番号１のＰＥＰＣをコードするＤＮＡ配列、最っとも好ましくは配列番号１に示されるＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクター、又は配列番号６に示されるプロモーター領域の制御下で配列番号６のＰＥＰＤをコードするＤＮＡ配列、最っとも好ましくは配列番号６に示されるＤＮＡ配列を含んで成る発現ベクターが好ましい。しかしながら、配列番号１に示されるＰＥＰＣ領域はまた、配列番号６に示されるＰＥＰＤプロモーターの制御下で発現され、そしてまた逆も真である。
【００３０】
好ましくは、アスペルギラス−スブチリシンは、培地中に分泌される。これは、構造遺伝子により機能的に結合されるシグナル配列、好ましくは、たとえばＰＥＰＣシグナル配列及び配列番号１に示されるコード領域を含んで成るプラスミドｐＴＺＰＥＰＣにおけるように、又はＰＥＰＤシグナル配列及び配列番号６に示されるコード領域を含んで成るプラスミドｐＴＺＰＥＰＤにおけるように、アスペルギラス−スブチリシン構造遺伝子により天然において結合されるシグナル配列の使用により達成され得る。
【００３１】
そのような発現ベクターがアスペルギラス−スブチリシン遺伝子が元来、由来される種の宿主株におけるアスペルギラス−スブチリシンの発現のために使用される場合、アスペルギラス−スブチリシンは、組換え及び元来のアスペルギラス−スブチリシン遺伝子の両者が同じ発現条件下で活性的であるので過剰発現される。
【００３２】
本発明の他のタイプの発現ベクターは、アスペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮＡ配列により天然において結合されない、アスペルギラスにおいて機能的なプロモーターの制御下で前記ＤＮＡ配列を含んで成る。アスペルギラス spec.、特にＡ．ニガーにおけるアスペルギラス−スブチリシンの発現のための適切なプロモーターは、たとえばアスペルギラス spec.ペクチンリアーゼ遺伝子のプロモーター、好ましくはＡ．ニガーＰＬＩ（ＥＰ−Ａ−０２７８３５５を参照のこと）、ＰＬＡ，ＰＬＢ，ＰＬＣ，ＰＬＥ又はＰＬＦ（ＥＰ−Ａ−０３５３１８８を参照のこと）のプロモーター、アスペルギラス spec.ポリガラクツロナーゼ遺伝子のプロモーター、好ましくはＡ．ニガーＰＧＩ又はＰＧII遺伝子（ＥＰ−出願番号ＥＰ−Ａ−４２１９１９を参照のこと）のプロモーター、アスペルギラス spec.ピルベートキナーゼ遺伝子のプロモーター、好ましくはＡ．ニガーｐｋｉ遺伝子（ＥＰ出願番号ＥＰ−Ａ−４３９９９７を参照のこと）のプロモーター、又は本発明のアスペルギラス−スブチリシン遺伝子のプロモーター、好ましくは配列番号１又は６に示されるアスペルギラス−スブチリシン遺伝子のプロモーターである。この場合、アスペルギラス−スブチリシンの分泌はまた、構造遺伝子により機能的に結合されるシグナル配列、たとえばアスペルギラス−スブチリシン構造遺伝子により天然において結合されるシグナル配列、たとえばＰＥＰＣの場合、配列番号１に示されるシグナル配列の使用により達成され得る。しかしながら、また、アスペルギラス−スブチリシンに対して非相同のシグナル配列、たとえばアスペルギラス spec.ペクチンリアーゼ遺伝子のシグナル配列、好ましくはＡ．ニガーＰＬＩ（ＥＰ−Ａ−０２７８３５５を参照のこと）、ＰＬＡ，ＰＬＢ，ＰＬＣ，ＰＬＥ又はＰＬＦ（ＥＰ−Ａ−０３５３１８８を参照のこと）遺伝子のシグナル配列、又はアスペルギラス spec.ポリガラクツロナーゼ遺伝子のシグナル配列、好ましくはＡ．ニガーＰＧＩ又はＰＧII遺伝子（ＥＰ−出願番号ＥＰ−Ａ−４２１９１９を参照のこと）のシグナル配列が使用され得る。
【００３３】
本発明の好ましい態様において、たとえばプラスミドｐＰＫＩＰＥＰＣＡにおいては、Ａ．ニガーのピルベートキナーゼプロモーターが、その相同のシグナル配列に結合されるアスペルギラス−スブチリシンをコードする、配列番号１に示されるコード領域により機能的に結合される。
【００３４】
本発明のもう１つの好ましい態様において、たとえばプラスミドｐＰＫＩＰＥＰＤＡにおいては、Ａ．ニガーのピルベートキナーゼプロモーターは、その相同シグナル配列に組合されるアスペルギラス−スブチリシンをコードする、配列番号６に示されるコード領域により機能的に結合される。
【００３５】
アスペルギラス−スブチリシン遺伝子の調製方法
本発明はまた、本発明のアスペルギラス−スブチリシンをコードする、好ましくは本発明のアスペルギラス−スブチリシンの好ましい形をコードするような本発明のＤＮＡ分子の調製方法又はそのようなＤＮＡ分子を含んで成るハイブリッドベクターの調製方法にも関し、ここで前記方法は、本発明の前記ＤＮＡ分子又はハイブリッドベクターにより形質転換された宿主を培養することを含んで成る。本発明の他の態様において、本発明のＤＮＡ分子は、核酸縮合を通して化学合成により調製され得る。
【００３６】
宿主の培養は、非形質転換体、すなわち所望するＤＮＡ分子を欠く宿主から、形質転換体、すなわち選択マーカーと共に所望するＤＮＡ分子を含む宿主の負の又は陽正選択を可能にする化合物により補充され得又はそれを除かれ得る従来の栄養培地において行なわれる。
【００３７】
当業界において有用な形質転換可能宿主、たとえば細菌、たとえばＥ．コリ、菌類、たとえばサッカロミセス セレビシアエ、クルイペロミセス ラクチス（Kluyveromyces lactis) 、高等真核細胞、たとえば昆虫細胞又は哺乳類細胞、たとえばＣＨＯ細胞、又は特に糸状菌、たとえばアスペルギラス、たとえばＡ．ニジュランス（A.nidulans) 、Ａ．オリザエ、Ａ．カルボナリウス（A.carbonarius ) 、Ａ．アワモリ及び特にＡ．ニガーが使用され得る。宿主の形質転換は、従来の方法により行なわれる。
【００３８】
アスペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮＡ配列は、アスペルギラス−スブチリシンを発現できるアスペルギラス株のゲノムから得られ、又はアスペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換えＤＮＡ分子により形質転換される宿主を培養し、そして必要な場合、所望するＤＮＡ配列をそれから単離することによって調製され得る。
【００３９】
特に、そのようなＤＮＡは：
ａ）適切なアスペルギラス細胞からゲノムＤＮＡを単離し、そしてＤＮＡプローブ又は適切な発現システムを用いて、所望するＤＮＡを選択し、そして所望するポリペプチドの発現のためにスクリーニングし、
ｂ）適切なアスペルギラス細胞からｍＲＮＡを単離し、所望するｍＲＮＡを、たとえばＤＮＡプローブによるハイブリダイゼーション又は適切な発現システムにおける発現により選択し、そして所望するポリペプチドの発現についてスクリーニングし、前記ｍＲＮＡに相補的な一本鎖ｃＤＮＡ、次にそれから二本鎖ｃＤＮＡを調製し、
ｃ）ｃＤＮＡライブラリィーからｃＤＮＡを単離し、そして所望するｃＤＮＡを、たとえばＤＮＡプローブ又は適切な発現システムを用いて選択し、そして所望するポリペプチドの発現のためにスクリーニングし、
ｄ）Ａ．ニガーｐｅｐＣ又はＡ．ニガーｐｅｐＤ又はスブチリシン型の他の既知のセリンプロテアーゼをコードする遺伝子から企画されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、全体のアスペルギラスＤＮＡの二本鎖をＰＣＲ技法によりインビトロで合成し、又は
ｅ）段階ａ），ｂ），ｃ）又はｄ）に従って得られる二本鎖ＤＮＡを適切なベクター中に組込み、適切な宿主を形質転換し、その宿主を操作し、そしてＤＮＡを単離することから選択された段階を含んで成る方法により調製され得る。
【００４０】
ゲノムＤＮＡは、所望するＤＮＡのために単離され、そしてスクリーンされ得る（段階ａ）。ゲノムＤＮＡは、アスペルギラス−スブチリシンを発現できるアスペルギラス株から単離される。ゲノムＤＮＡライブラリィーは、適切な制限エンドヌクレアーゼによる消化及び確立された方法に従って適切なベクター中への導入によりそれから調製される。そのゲノムＤＮＡライブラリィーは、この後に記載されるようにＤＮＡプローブによりスクリーンされ、又は適切な発現システムに発現され、そしてその得られたポリペプチドは従来の態様でスクリーンされる。
【００４１】
ゲノムライブラリィーは、たとえばＳａｕ３ＡＩ又はＭｂｏＩによるＡ．ニガー株、たとえばＮＷ７５６又はＮ４００のゲノムＤＮＡの部分的消化、及び適切な宿主ベクター、たとえばＥ．コリプラスミドｐＵＮ１２１又はλベクター、たとえばＥＭＢＬ４における高分子ＤＮＡフラグメントのクローニングにより調製され得る。
【００４２】
所望するアスペルギラス−スブチリシンを生成する他の菌類株、たとえばＡ．ジャポニカス（A.japonicus ) 、Ａ．ニジュランス、Ａ．オリザエ、Ａ．ニガーゲノムライブラリィーのための源とし作用し、そして他の適切なベクター、たとえば上記のものが前記フラグメントのための受容体として使用され得る。
【００４３】
アスペルギラス−スブチリシンをコードするＤＮＡ配列のためのゲノムライブラリィーを好都合良くスクリーンするためには、ハイブリダイズするＤＮＡプローブが必要である。これは、所望するアスペルギラス−スブチリシンのアミノ酸配列又はその一部が既知である場合、合成ＤＮＡプローブであり、又はアスペルギラス−スブチリシン遺伝子にハイブリダイズする、たとえば酵母からの他のスブチリシン遺伝子、又はその一部であり得る。
【００４４】
ポリアデニル化ｍＲＮＡ（段階ｂ）は、既知方法により適切な細胞から単離される。単離方法は、たとえば界面活性剤及びリボヌクレアーゼインヒビター、たとえばヘパリン、グアニジウムイソチオシアネート又はメルカプトエタノールの存在下での均質化、場合によっては、塩及び緩衝溶液、界面活性剤及び／又はカチオンキレート化剤の存在下での適切なクロロホルム−フェノール混合物によるｍＲＮＡの抽出、及び残る水性、塩含有相からエタノール、イソプロパノール又は同様のものによるｍＲＮＡの沈殿を包含する。単離されたｍＲＮＡは、塩化セシウムグラジェントによる遠心分離、続くエタノール沈殿及び／又はクロマトグラフィー処理方法、たとえばアフィニティークロマトグラフィー処理、たとえばオリゴ（ｄＴ）セルロース又はオリゴ（Ｕ）セファロース上でのクロマトグラフィー処理によりさらに精製され得る。好ましくは、そのような精製された全ｍＲＮＡは、線状スクロースグラジェントでのグラジェント遠心分離により又は適切なサイズ分別カラム、たとえばアガロースゲル上でのクロマトグラフィー処理によりサイズに従って分別される。
【００４５】
所望するｍＲＮＡは、ＤＮＡプローブによりｍＲＮＡを直接的にスクリーンし、又は適切な細胞又は細胞フリーシステムにおける翻訳により、そして得られたポリペプチドをスクリーンすることにより選択される。
【００４６】
所望するｍＲＮＡの選択は好ましくは、この後記載されるようにしてＤＮＡハイブリダイゼーションプローブを用いて達成され、それによって翻訳の追加の段階を回避できる。適切なＤＮＡプローブは、既知のヌクレオチド配列のＤＮＡ、たとえば合成ＤＮＡ、所望するポリペプチドをコードするｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、又はたとえば天然源又は遺伝子工学的に構成された微生物から単離される隣接ＤＮＡ配列を含んで成るゲノムＤＮＡフラグメントである。
【００４７】
分別されたｍＲＮＡは、細胞、たとえばカエル卵母細胞、又は細胞フリーシステム、たとえば網状赤血球溶解物又は小麦胚抽出物において翻訳され得る。得られたポリペプチドは、たとえばイムノアッセイ、たとえばラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ又は螢光マーカーによるイムノアッセイにおいて、酵素活性又は生来のポリペプチドに対して生成された抗体との反応によりスクリーンされる。ポリクローナル及びモノクローナル抗体のそのようなイムノアッセイ及び調製は、当業界において十分に知られており、そして従って適用される。
【００４８】
選択されたｍＲＮＡ鋳型からの一本鎖相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の調製は、一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡの調製と同じように当業界において良く知られている。そのｍＲＮＡ鋳型は、デオキシヌクレオシドトリホスフェート、場合によっては放射性ラベルされたデオキシヌクレオシドトリホスフェート（反応の結果をスクリーンできるために）、プライマー配列、たとえばｍＲＮＡのポリ（Ａ）末端とハイブリダイズするオリゴ−ｄＴ残基及び酵素、たとえば鳥類骨髄芽球化ウィルス（ＡＭＶ）からの逆転写酵素の混合物と共にインキュベートされる。たとえばアルカリ加水分解による鋳型ｍＲＮＡの分解の後、ｃＤＮＡは、二本鎖ＤＮＡを得るために、デオキシヌクレオシドトリホスフェート及び適切な酵素の混合物と共にインキュベートされる。適切な酵素は、たとえば逆転写酵素、Ｅ．コリＤＮＡポリメラーゼＩ又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメントである。通常、一本鎖ｃＤＮＡにより自発的に形成されるヘアピンループ構造は、第２鎖の合成のためのプライマーとして作用する。このヘアピン構造は、Ｓ１ヌクレアーゼによる消化により除去される。他方、一本鎖ＤＮＡの３′端は、ｍＲＮＡ鋳型の加水分解及び第２ｃＤＮＡ鎖の続く合成の前、ホモポリマーデオキシヌクレオチド端により拡張される。
【００４９】
他方、二本鎖ｃＤＮＡは、ｃＤＮＡライブラリィーから単離され、そして所望するｃＤＮＡについてスクリーンされる（段階ｃ）。そのｃＤＮＡライブラリィーは、適切な細胞からｍＲＮＡを単離し、そして上記のようにしてそれらから一本鎖及び二本鎖ｃＤＮＡを調製することによって構成される。このｃＤＮＡは、適切な制限エンドヌクレアーゼにより消化され、そして確立された方法に従って、λファージ、たとえばλシャロン４Ａ又はλｇｔ１１中に導入される。ニトロセルロース膜上で複製されるｃＤＮＡライブラリィーが、上記のようにしてＤＮＡプローブを用いることによってスクリーンされ、又は適切な発現システムにおいて発現され、そして得られたポリペプチドは所望する化合物に対して特異的な抗体との反応のためにスクリーンされる。
【００５０】
二本鎖ＤＮＡのもう１つの調製方法はＰＣＲ技法である（段階ｄ）。この方法は特に、少なくとも一部既知の配列を有する少量ＤＮＡ又はＲＮＡから出発して多量の二本鎖ＤＮＡの調製のために使用され得る。既知のベクターを端に有する未知の配列を有するＤＮＡ挿入体がまた、出発材料として使用され得る。ＰＣＲ技法においては、ＤＮＡ分子、たとえばオリゴヌクレオチドが、ＤＮＡの酵素鋳型依存性合成のためのプライマーとして使用され得る。二本鎖ＤＮＡの変性、プライマーによるハイブリダイゼーション及び酵素的合成が連続的に反復され得るために、多量が調製され得る。合成されたＤＮＡ分子の数は、それが個々のラウンドで二倍になるために指数的に上昇する。ＰＣＲ技法は当業界において既知であり、そして本発明に適用され得る。オリゴヌクレオチドプライマーは、スブチリシン型の既知のセリンプロテアーゼ間の比較に基づいて、保存されたスブチリシン型セリンプロテアーゼタンパク質配列をコードするＤＮＡにハイブリダイズするように企画され得る。ＰＣＲ技法は当業界において良く知られており、そして従来のＰＣＲ技法、たとえば M.A.Innisなど. （出版者）、ＰＣＲ法、A guid to methods and applications, Academic Press, San Diego (1990)に記載される技法が本発明に適用され得る。
【００５１】
適切なベクター中への二本鎖ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの導入のための種々の方法が当業界において知られている（段階ｃ）。たとえば、相補的ホモポリマー系統が、その対応するデオキシヌクレオシドトリホスフェート及び酵素、たとえばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼの存在下でのインキュベーションにより二本鎖ＤＮＡ及びベクターＤＮＡに付加され得る。次に、ベクター及び二本鎖ＤＮＡが、相補的ホモポリマー末端間を塩基対合することによって連結され、そして最後に、特定の連結酵素、たとえばリガーゼにより連結される。他の可能性は、ブラント−又は付着末端連結による、二本鎖ＤＮＡの末端への合成リンカーの付加、又はベクター中への二本鎖ＤＮＡの導入である。適切なベクターはこの後に詳細に論ぜられるであろう。
【００５２】
得られたハイブリッドベクターにより適切な宿主細胞を形質転換するための形質転換法及び形質転換された宿主細胞の選択及び操作は、当業界において良く知られている。そのような方法のための例は、下記にさらに与えられる。
【００５３】
本発明による所望するＤＮＡ、変異体及びそのフラグメントの単離は、当業界において知られている方法、たとえばフェノール及び／又はクロロホルムによる抽出により達成される。場合によっては、ＤＮＡは、たとえば変異体を得るために変異誘発剤による処理により、又は制限酵素により消化し、フラグメントを得、１又は両端を変性し、ベクター中への導入を促進し、介在配列を除去し、そして同様のことを行なうことによって、さらに操作され得る。
【００５４】
本発明のＤＮＡのヌクレオチド配列は、それ自体既知の方法により、たとえば末端ラベルされたＤＮＡを用いての Maxam-Gilbert法により又はSangerのジデオキシ鎖終結法により決定され得る。
【００５５】
本発明のアスペルギラス−スブチリシン遺伝子配列はまた、従来の方法に従ってのインビトロ合成により調製され得る。そのインビトロ合成は、セリンプロテアーゼ活性を有するアスペルギラス−スブチリシンのフラグメントをコードするアスペルギラス−スブチリシン遺伝子のより小さなフラグメントの調製のために特に適用できる。インビトロ合成はまた、プロモーター又はシグナルペプチドをコードするＤＮＡの合成のために特に適用できる。そのインビトロ合成は好ましくは、Ａ．ニガーに由来するアスペルギラス−スブチリシン遺伝子又はそのフラグメント、最っとも好ましくは配列番号１に示されるｐｅｐＣ遺伝子又はそのプロモーター又はシグナル配列、又は配列番号６に示されるｐｅｐＤ遺伝子又はそのプロモーター又はシグナル配列に適用される。
【００５６】
ＤＮＡの合成のための適切な方法は、S.A.Harang (Tetrahedron 39, 3, 1983)により要約形で示されている。既知合成技法は、長さ１２０塩基までのポリヌクレオチドの良好な収率、高い純度及び比較的短い時間での調製を可能にする。適切に保護されたヌクレオチドは、ホスホジエステル法(K.L.Agarwalなど. 、 Angew.Chemie 84, 489, 1972)、より効果的なホスホジエステル法(C.B.Reese, Tetrahedron 34, 3143, 1972) 、ホスフィットトリエステル法(R.L.Letsingerなど. 、 J.Am.Chem.Soc. 98, 3655, 1976) 又はホスホラミジット法 (S.L.Beaucage及びM.H.Carruthers, Tetrahedron 22, 1859, 1981) によりお互連結される。オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの合成の単純化は、ヌクレオチド鎖が適切なポリマーに結合される、固相法により可能にされる。実際の二本鎖ＤＮＡは、塩基対合により正しい配置で一緒に保持され、そして次に酵素ＤＮＡリガーゼにより化学的に連結される、両ＤＮＡ鎖からの化学的に調製されたオーバーラップオリゴヌクレオチドから酵素的に構築される。他の可能性は、ＤＮＡポリメラーゼ、たとえばＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリメラーゼＩのクレノウフラグメント又はＴ４ＤＮＡポリメラーゼと共に又はＡＭＶ（鳥類骨髄芽球化ウィルス）逆転写酵素と共に、４種の必要とされるデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で２種のＤＮＡ鎖からの１本のオーバーラップするオリゴヌクレオチドをインキュベートすることを含んで成る。それによって、それらの２種のオリゴヌクレオチドは塩基対合により正しい配置で一緒に保持され、そして酵素により必要とされるヌクレオチドにより補充され、完全な二本鎖ＤＮＡが得られる (S.A.Narangなど. 、Anal.Biochem. 121 , 356, 1982)。
【００５７】
本発明を実施する場合、他の種、たとえば酵母のスブチリシン遺伝子又はそのフラグメントが、アスペルギラス spec.、たとえばＡ．ニガー、ＲＮＡ画分におけるスブチリシンｍＲＮＡ又はゲノム又はｃＤＮＡライブラリィーにおけるスブチリシンＤＮＡを同定するためのプローブとして使用され得る。Ａ．ニガー遺伝子の主要配列及び他のプロテアーゼとの比較から、プロテアーゼのコード領域が推定され、そしてスブチリシン遺伝子と前記遺伝子との関係が確認され得る。得られる遺伝子は、下記に詳細に概略されているように、組換えプロテアーゼの調製のために使用され得る。
【００５８】
合成ＤＮＡプローブは、下記のようにして既知の方法に従って、好ましくは固相ホスホトリエステル、ホスフィットトリエステル又はホスホラミジット法を用いての段階的な縮合、たとえばホスホトリエステル法によるジヌクレオチド結合単位の縮合により合成される。これらの方法は、 Y.Ikeなど. (Nucleic Acids Research 11, 477, 1983)により記載されるようにして適切な縮合段階において、保護された形又は対応するジヌクレオチドカップリング単位で、２，３又は４種のヌクレオチドｄＡ，ｄＣ，ｄＧ及び／又はｄＴの混合物を用いることによって所望するオリゴヌクレオチドの混合物の合成に適合される。
【００５９】
ハイブリダイゼーションのためには、ＤＮＡプローブがラベルされ、たとえばキナーゼ反応により放射性ラベルされる。ラベルを含むＤＮＡプローブによるサイズ分別されたｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、既知の方法に従って、すなわちアジュバント、たとえばカルシウムキレート化剤、粘度調節化合物、タンパク質、非相同性ＤＮＡ及び同種のものを含む緩衝液及び塩溶液において、選択的ハイブリダイゼーションに好ましい温度、たとえば０℃〜８０℃、たとえば２５℃〜５０℃又はハイブリッド二本鎖ＤＮＡ溶融温度よりも約６５℃、好ましくは約２０℃低い温度で行なわれる。
【００６０】
形質転換された宿主及びその調製
さらに、本発明は、好ましくは本発明のアスペルギラス−スブチリシンの好ましい形をコードするような、本発明のハイブリッド又は発現ベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。
【００６１】
特に本発明の組換えＤＮＡ分子の増幅のために適切な宿主の例は、制限酵素又は変性酵素を欠く又はそれを少々含む微生物、たとえば細菌、特にＥ．コリ、たとえばＥ．コリ×１７７６，Ｅ．コリＹ１０９０，Ｅ．コリＷ３１１０，Ｅ．コリＨＢ１０１／ＬＭ１０３５，Ｅ．コリＪＡ２２１，Ｅ．コリＤＨ５α、又は好ましくはＥ．コリＤＨ５αＦ′，ＪＭ１０９，ＭＨ１又はＨＢ１０１、又はＥ．コリＫ１２株である。適切な宿主はまた、他の原核細胞、たとえばバシラス サブチリス（Bacillus subtilis) 、バシラス ステアロサーモフィラス（（Bacillus stearothermophilus) 、プソイドモナス (Pseudomonas ) 、ハエモフィラス (Haomophilus ) 、ストレプトコーカス (Streptococcus ) 及び他のもの及び酵母、たとえばサッカロミセス セレビシアエ、たとえばＳ．セレビシアエＧＲＦ１８である。さらに適切な宿主細胞は、高等生物、特に確立された連続的ヒト又は動物細胞系、たとえばヒト胚の肺繊維芽細胞Ｌ１３２、ヒト悪性黒色腫 Bowes細胞、ＨｅＬａ細胞、アフリカグリーンモンキーＣＯＳ−７のＳＶ４０ウィルス形質転換腎細胞又はチャイニースハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００６２】
本発明のアスペルギラス−スブチリシン遺伝子の発現のための適切な細胞の例は、適切な発現ベクターにより形質転換された前記細胞及びさらに、バキューロウィルス発現ベクターにより形質転換された適切な昆虫細胞、並びに特に、適切な発現ベクターにより形質転換された、糸状菌、たとえばペニシリウム(Penicillium) 、セファロスポリウム (Cephalosporium) 又は適切にはアスペルギラス s pec.、たとえばＡ．カルボナリウス、Ａ．アワモリ、Ａ．ニジュランス、Ａ．オリザエ又はより好ましくはＡ．ニガーである。
【００６３】
本発明はまた、場合によっては選択マーカー遺伝子と共に本発明のＤＮＡ分子又はハイブリッドベクターによる形質転換条件下で適切な宿主細胞の処理も含んで成る形質転換体の調製方法及び場合によっては、形質転換体の選択にも関する。アスペルギラス−スブチリシン遺伝子はまた、特に真核細胞、たとえばアスペルギラス spec.が宿主として使用される場合、形質転換の後、宿主ゲノム中に組込まれ得る。
【００６４】
微生物の形質転換は、たとえばＳ．セレビシアエ (A.Hinnenなど. 、Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 75, 1929, 1978) 、Ｂ．サブチリス(Anagnostopoulosなど．、 J.Bacteriol. 81, 741, 1961)、Ｅ．コリ (M.Mandelなど．、J.Mol.Biol. 53, 159, 1970)及びアスペルギラス〔F.Buxtonなど．、 Gene 37： 207〜14 (1985), D.J.Balanceなど. 、 Biochem.Biophys.Res.Commun. 112： 284〜9 (1983)〕のために、文献に記載されるような従来の方法に従って行なわれる。
【００６５】
従って、Ｅ．コリ細胞の形質転換方法は、ＤＮＡ摂取を可能にするために細胞のＣａ²⁺前処理及びハイブリッドベクターと共にインキュベーションを包含する。形質転換された細胞の続く選択は、たとえばベクターＤＮＡのマーカー配列の性質に依存して親細胞から形質転換された細胞の分離を可能にする選択増殖培地に細胞を移すことによって達成され得る。好ましくは、ハイブリッドベクターを含まない細胞の増殖を可能にしない増殖培地が使用される。
【００６６】
菌類、たとえば酵母又はアスペルギラス spec.の形質転換は、たとえばグルコシダーゼによる細胞壁の酵素的除去、ポリエチレングリコール及びＣａ²⁺イオンの存在下でハイブリッドベクターによるその得られたスフェロプラストの処理、及び寒天中へのそのスフェロプラストの固定化による細胞壁の再生の段階を含んで成る。好ましくは、再生寒天は、上記のようにして、形質転換された細胞の同時再生及び選択を可能にする手段で調製される。
【００６７】
高等真核生物起源の細胞、たとえば哺乳類細胞系の形質転換は好ましくは、トランスフェクションにより達成される。トランスフェクションは、従来の技法、たとえばリン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、すなわち、細胞膜の透過能力を一時的に高める短い電気パルスによる、又はヘルパー化合物、たとえばジエチルアミノエチルデキストラン、ジメチルスルホキシド、グリセロール又はポリエチレングリコールの存在下でのＤＮＡの導入、及び同様の方法により行なわれる。トランスフェクション方法の後、トランスフェクトされた細胞が、たとえば選択マーカーの性質に依存して選択された選択培地、たとえば標準培養培地、たとえばダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必須培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及び同様のもの（たとえば対応する抗生物質を含む）においての培養により同定され、そして選択される。
【００６８】
形質転換された宿主細胞は、当業界において既知の方法により、同化できる炭素源、たとえば炭水化物、たとえばグルコース又はラクトース、窒素、たとえばアミノ酸、ペプチド、タンパク質又はそれらの分解生成物、たとえばペプトン、アンモニウム塩又は同様のもの、及び無機塩、たとえばスルフェート、ホスフェート及び／又はナトリウム、カリウム、マグネシウム及びカルシウムのカーボネートを含む液体培地において培養される。その培地はさらに、たとえば増殖促進物質、たとえば微量元素、たとえば鉄、亜鉛、マンガン及び同様のものを含む。
【００６９】
培地は好ましくは、選択圧力を付与し、そして形質転換されてなく、又はハイブリッドベクターを失なった細胞の増殖を妨ぐために選択される。従って、たとえばハイブリッドベクターがマーカーとして耐抗生物質遺伝子を含む場合、抗生物質が培地に添加される。たとえば必須アミノ酸において栄養要求性であるが、所ろがハイブリッドベクターが宿主欠陥を補足する酵素をコードする遺伝子を含む宿主細胞が使用される場合、前記アミノ酸を欠く最少培地が前記形質転換された細胞を培養するために使用される。
【００７０】
高等真核生物起源の細胞、たとえば哺乳類細胞が、市販の培地、たとえば上記のようなダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最少必須培地、ＲＰＭＩ１６４０培地及び同様のもの（場合によっては、増殖促進物質及び／又は哺乳類血清により補充されている）を用いて組織培養条件下で増殖される。組織培養条件下での細胞培養のための技法は、当業界において十分知られており、そしてたとえばエアリフト反応器又は連続撹拌反応器における均質懸濁培養、又はたとえば中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ、多孔性ガラスビーズ、セラミックカートリッジ又は他の微小キャリヤー上での固定化された又は閉じ込められた細胞培養を包含する。
【００７１】
培養は、当業界において知られている方法によりもたらされる。培養条件、たとえば温度、培地のpH値及び発酵時間は、本発明のポリペプチド又はその誘導体の最大力価が得られるように選択される。従って、Ｅ．コリ又は酵母株は好ましくは、約２０℃〜４０℃、好ましくは約３０℃及び４〜８のpH、好ましくは約７のpHで、約４〜３０時間、好ましくは本発明のポリペプチド又は誘導体の最大収率に達するまで、振盪又は撹拌しながら、含浸培養により好気性条件下で培養される。
【００７２】
非形質転換細胞から形質転換細胞の選択を可能にするために、本発明のＤＮＡ分子は選択マーカーを担持し、又は他方、細胞がそのようなマーカーを含む第２ベクターにより同時形質転換される。他のシステムにおけるように、そのような選択マーカーは発現可能な構造遺伝子であり、その発現されたポリペプチド（酵素）は受容体生物に対して毒性の化合物に対して耐性を付与し、又はそのような必須ポリペプチドを欠く変異体の酵素システムを完全にする。形質転換された糸状菌細胞の選択のために適切なそのようなマーカー遺伝子は、たとえば既知のｑａ−２，ｐｙｒＧ，ｐｙｒ４，ｔｒｐＣ，ａｍｄＳ又はａｒｇＢ遺伝子である。
【００７３】
ＥＰ−Ａ−０２７８３５５に記載されるように、マーカー遺伝子、すなわちｐｙｒＡはＡ．ニガーのゲノムライブラリィーから単離され、これはＡ．ニジュランスのｐｙｒＧ及びＮ．クラサ（N.crassa) のｐｙｒ４、すなわち酵素オロチジン５′−ホスフェートデカルボキシラーゼの生成に関連し、そしてそれと類似する機能を有する。この酵素は、オロチジン５′−ホスフェートのウリジル酸（ウリジン５′−ホスフェート）への脱炭酸化及び又は、フルオロ−オロト酸の毒性フルオロ−ウリジンへの脱炭酸化を触媒する。しかしながら、オロチジン−５′−ホスフェートデカルボキシラーゼをコードするいづれか他のｐｙｒ遺伝子のＤＮＡが使用され得る。Ｅ．コリＢＪ５１８３／ｐＣＧ５９Ｄ７（ＤＳＭ３９６８）と称する陽性クローンから、ｐｙｒＡ遺伝子を含むプラスミドｐＣＧ５９Ｄ７が単離され、そしてＡ．ニガーｐｙｒ^- 変異体の同時形質転換のために使用された。そのようなｐｙｒ^- Ａ変異体はオロチジン５′−ホスフェートデカルボキシラーゼ遺伝子を欠き、そして従って、その対応する酵素を生成できない。そのような変異体は、変異誘発ＵＶ照射下でＡ．ニガーＮ７５６の分生子柄を処理することによって調製され、そしてフルオロ−オロト酸及びウリジンの存在下で生存するコロニーが選択される。フルオロオロト酸の存在及びウリジンの不在下で生存するコロニーが排除される。残るウリジン要求変異体は、形質転換できるそれらの能力に従って、それぞれＡ．ニガー変異体Ａｎ８及びＡｎ１０により表わされる２種の相補性グループｐｙｒＡ及びｐｙｒＢに属する。それらは、ｐｙｒＡ含有プラスミドｐＣＧ５９Ｄ７（ＤＳＭ３９６８）による形質転換条件下で、そのプロトプラストの形で処理される。Ａ．ニガーＡｎ８（ＤＳＭ３９１７）コロニーのみが、ｐＵＮ１２１のＤＮＡとのその消化されたＤＮＡのハイブリダイズする能力により明らかなように、形質転換され、そしてｐｙｒＡ遺伝子を含むことが見出された。
【００７４】
アスペルギラス−スブチリシンの調製方法
本発明はまた、本発明のアスペルギラス−スブチリシン、好ましくはその好ましい形の調製方法にも関し、ここで前記方法は、本発明の発現ベクターにより形質転換された宿主を、アスペルギラス−スブチリシン遺伝子の発現のために適切な条件下で培養することを含んで成る。必要とされる場合、ポリペプチドは従来の手段で単離される。発現ベクターの構成に依存して、アスペルギラス−スブチリシンが、生成され、又はシグナル配列が存在する場合、生成され、そして分泌される。
選択された宿主が発現のために適切か又は適切でないかは、発現ベクターを構成するために選択された調節配列、特にプロモーターに主に依存する。
【００７５】
アスペルギラス、好ましくはＡ．ニガー遺伝子に由来するプロモーターが本発明のアスペルギラス−スブチリシン遺伝子の発現のために使用される場合、アスペルギラス株、好ましくはＡ．ニガーが適切な宿主である。しかしながら、アスペルギラスに由来しないプロモーターが本発明の発現ベクターの構成のために使用される場合、他の宿主、たとえば細菌、たとえばＥ．コリ、又は酵母、たとえばＳ．セレビシアエがその発現のために適切である。本発明のポリペプチドの調製のための適切な宿主及びプロモーターはまた、前記に与えられた形質転換のために適切なものでもある。
【００７６】
特に本発明は、形質転換されたアスペルギラス宿主が、内因性アスペルギラス−スブチリシン遺伝子が活性的である条件下で外因性アスペルギラス−スブチリシン遺伝子を発現し、そして従って、高められた遺伝子用量のために天然量のアスペルギラス−スブチリシンよりも多く発現する方法に関する。このためには、アスペルギラス宿主、特にＡ．ニガーが、アスペルギラス−スブチリシン遺伝子を含む発現ベクターにより、その相同性の、すなわち天然において結合される発現制御配列、特にプロモーター及びシグナル配列の制御下で形質転換される。
【００７７】
特に、本発明はまた、形質転換されたアスペルギラス宿主が、外因性アスペルギラス−スブチリシン遺伝子を、それは異なったプロモーターに融合されるので、より高いレベルに又は内因性遺伝子よりも異なった条件下で発現する方法にも関する。
【００７８】
外因性遺伝子の最大発現のための条件は、選択された発現システムに依存する。たとえば、Ａ．ニガーのペクチンリアーゼ（ＰＬ）又はポリガラクツロナーゼ（ＰＧ）遺伝子のプロモーターが使用される場合、それらと共に結合されるアスペルギラス−スブチリシン遺伝子の発現は、培養培地へのペクチン又はペクチン分解生成物の添加によりＡ．ニガー細胞において誘発できる。しかしながら、十分なグルコースの存在においては、プロモーターは、Ａ．ニガー株、たとえばＡｎ８（ＤＳＭ３９１７）が宿主として使用される場合、誘発できない。これは、Ａ．ニガーＰＬ又はＰＧプロモーターの制御下でのアスペルギラス−スブチリシン遺伝子がＡ．ニガーにおいて“カタボライトリプレッション”されることを意味する。しかしながら、他のアスペルギラス株、好ましくはＡ．オリザエ又は最っとも好ましくはＡ．ニジュランスが使用される場合、Ａ．ニガーＰＬ又はＰＧプロモーターの制御下でのアスペルギラス−スブチリシン遺伝子が、構成的に、すなわち、またペクチンの不在及び／又はグルコースの存在下で発現される。従って、たとえばペクチンの代わりにグルコースが遺伝子の発現の間、エネルギー及び炭素源として栄養培地に添加され得るので、Ａ．ニガー以外のアスペルギラス宿主、好ましくはＡ．オリザエ又は最っとも好ましくはＡ．ニジュランスにおいてＡ．ニガーＰＬ又はＰＧプロモーターの制御下でアスペルギラス−スブチリシン遺伝子を発現することが好都合である。
【００７９】
アスペルギラス、好ましくはＡ．ニガーのピルベートキナーゼプロモーターがアスペルギラス−スブチリシン遺伝子の発現のために使用される場合、その遺伝子は、炭素源及びエネルギー源としてグルコースを含む最少培地が使用される場合に発現される。
【００８０】
アスペルギラス−スブチリシンを過剰発現することが現在可能であり、それによって、種々の方法が適用され得る。精製された単一のアスペルギラス−スブチリシンは、次の方法により調製され得、ここで前記方法とは、いづれのアスペルギラス−スブチリシンも発現できず、又はアスペルギラス−スブチリシンを低量で発現し、又は外因性アスペルギラス−スブチリシン遺伝子の発現のために使用される誘発条件下でアスペルギラス−スブチリシンを発現しない適切な宿主が、好ましくはＡ．ニガー、最っとも好ましくは配列番号１に示されるＰＥＰＣ又はアスペルギラス−スブチリシンセリンプロテアーゼ活性のフラグメントからの、アスペルギラス−スブチリシンをコードする構造遺伝子を含んで成るハイブリッドベクターにより形質転換され、そして前記構造遺伝子が発現されることを含んで成る。いづれのアスペルギラス−スブチリシンも発現できない宿主が使用される場合、それぞれ単一のアスペルギラス−スブチリシンが純粋な形で得られ、このことはいづれか他のアスペルギラス−スブチリシンによって汚染されていないことを意味する。
【００８１】
いづれのアスペルギラス−スブチリシンも発現できない宿主は、対応する遺伝子を有さない微生物、又は内因性アスペルギラス−スブチリシン遺伝子の発現が適切に条件づけられた増殖培地において抑制されるが、しかし所望するアスペルギラス−スブチリシン構造遺伝子、たとえばＡ．ニガー由来のプロモーターにより操作可能的に結合される外因性アスペルギラス−スブチリシンプロモーターがそれらの条件下で活性的であり、又はアスペルギラス−スブチリシン遺伝子が他のプロモーターに融合されているアスペルギラス株のいづれかである。
アスペルギラス−スブチリシンの調製のために適切な他のプロモーター及び株は、本発明の発現ベクターの記載に与えられる。
【００８２】
アスペルギラス−スブチリシン及びその使用
本発明はまた、スブチリシン型自体の純粋なアスペルギラスセリンプロテアーゼ（この後、“アスペルギラス−スブチリシン”と称する）にも関する。そのようなプロテアーゼは、（ａ）アスペルギラス spec.に由来し、（ｂ）活性部位での触媒性セリン残基によりプロテアーゼ活性を示し、そして（ｃ）スブチリシン科へのグループ分けのために既知のセリンプロテアーゼとの十分なアミノ酸配列相同性を有するものとして理解されている。用語アスペルギラス−スブチリシンとはまた、セリンプロテアーゼ活性を保持するような酵素のフラグメントも包含する。
【００８３】
本発明は好ましくは、アスペルギラス ニガーの純粋なアスペルギラス−スブチリシン、好ましくは配列番号１に列挙する配列に示されるアミノ酸配列を有するセリンプロテアーゼＰＥＰＣ又は配列番号６に列挙する配列に示されるアミノ酸配列を有するセリンプロテアーゼＰＥＰＤ及びセリンプロテアーゼ活性を保持するそれらのフラグメント及び変異体に関する。
【００８４】
本発明はさらに、１又は複数のアスペルギラス−スブチリシン及び／又はセリンプロテアーゼ活性を有するそのフラグメント、及び／又は生物学的に許容できるその塩、及び場合によっては、アスペルギラス−スブチリシン活性以外の活性を有する１又は複数の適切な酵素を含んで成る酵素組成物にも関する。
【００８５】
アスペルギラス−スブチリシンにおいて欠陥性のアスペルギラス株
本発明はまた、内因性アスペルギラス−スブチリシン遺伝子において欠陥性の、変異誘発されたアスペルギラス株、好ましくは変異誘発されたＡ．ニガー株にも関する。配列番号１に示されるｐｅｐＣ遺伝子又は配列番号６に示されるｐｅｐＤ遺伝子において欠陥性のＡ．ニガー株が好ましい。ｐｅｐＣ及びｐｅｐＤ遺伝子の両者において欠陥性のＡ．ニガー株もまた好ましい。
【００８６】
欠陥性アスペルギラス−スブチリシン遺伝子を有する本発明の変異誘発されたアスペルギラス株は、本発明の好ましい態様においては、遺伝子破壊により調製され得、すなわち破壊されることが所望される内因性アスペルギラス遺伝子に対応するＤＮＡ配列が欠陥遺伝子にインビトロ変異誘発され、そしてアスペルギラス宿主細胞が形質転換される。細胞における相同組換え出来事により、損なわれていない内因性遺伝子が欠陥性外因性遺伝子により置換される。通常、外因性遺伝子は、コード領域中にマーカー遺伝子を挿入することによって破壊される。これは、容易にモニターされ得、そして破壊されたその対応する内因性遺伝子による形質転換体の選択のために使用される欠陥性遺伝子を導びく。しかしながら、変異誘発のための他の方法もまた、内因性アスペルギラス−スブチリシン遺伝子が機能的なアスペルギラス−スブチリシンが発現され得ないような手段で変異誘発される、変異誘発されたアスペルギラス株、好ましくは変異誘発されてＡ．ニガー株の調製のためにも使用され得る。
【００８７】
本発明の最っとも好ましい態様においては、Ａ．ニガー株が、配列番号１に示されるｐｅｐＣ遺伝子の欠陥性変異体、たとえば添付例に記載されるプラスミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡに含まれるような、挿入される選択マーカー遺伝子を有する破壊されたｐｅｐＣ遺伝子を含んで成るハイブリッドベクターにより形質転換され、そして形質転換体が選択される。
【００８８】
本発明のもう１つの最っとも好ましい態様においては、Ａ．ニガー株が、配列番号６に示されるｐｅｐＤ遺伝子の欠陥性変異体、たとえば添付例に記載されるプラスミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡに含まれるような、挿入される選択マーカー遺伝子を有する破壊されたｐｅｐＤ遺伝子を含んで成るハイブリッドベクターにより形質転換され、そして形質転換体が選択される。
【００８９】
本発明の第三の最っとも好ましい態様においては、Ａ．ニガー株が、配列番号１に示されるｐｅｐＣ遺伝子の欠陥性変異体、たとえば添付例に記載されるプラスミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡに含まれるような、挿入される選択マーカー遺伝子を有する破壊されたｐｅｐＣ遺伝子により、及び配列番号６に示されるｐｅｐＤ遺伝子の欠陥性変異体、たとえば添付例に記載されるプラスミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡに含まれるような、挿入される選択マーカー遺伝子を有する破壊されたｐｅｐＤ遺伝子により形質転換され、そして両ｐｅｐＣ及びｐｅｐＤにおいて欠陥性の形質転換体が選択される。
【００９０】
欠陥性アスペルギラス−スブチリシン遺伝子を有する本発明の変異誘発されたアスペルギラス株は、非相同性又は相同性タンパク質の改良された生成の細胞内又は細胞外発現のために有用である。
アスペルギラス spec.における非相同又は相同タンパク質の発現は、従来の方法に従って達成され得る。通常、アスペルギラスにおいて機能的な相同又は非相同プロモーター及び場合によっては、アスペルギラスにおいて機能的な他の発現制御配列、たとえば前記に定義されたものにより操作可能的に結合される相同又は非相同遺伝子を含んで成る発現ベクターが構成される。必要とされる場合、ポリペプチドは従来の手段で単離される。発現ベクターの構成に依存して、生成物は、宿主細胞に生成され、又はシグナル配列が存在する場合、細胞に生成され、そして分泌される。
【００９１】
これに関しての構造遺伝子は、たとえばウィルス、原核細胞又は真核細胞に起因し、そしてゲノムＤＮＡ、又はｍＲＮＡ路を通して調製されたｃＤＮＡに由来し、又は化学的に合成され得、そして広範囲の種類の有用なポリペプチド、たとえば特に高等真核生物、特に哺乳類、たとえば動物又は特にヒト起源のグリコシル化されたポリペプチド、たとえば栄養物の生成及び酵素反応を化学的に行なうために使用され得る酵素、又はヒト及び動物疾病の処置又はその予防のために有用且つ価値があるポリペプチド、たとえばホルモン、免疫調節、抗ウィルス及び抗腫瘍性質を有するポリペプチド、抗体、ウィルス抗原、ワクチン、血餅因子、食物及び同様のものをコードする。
【００９２】
そのような構造遺伝子の例は、アスペルギラスポリガラクツロナーゼ、たとえばＰＧＩ又はＰＧII、又はアスペルギラスペクチンリアーゼ、たとえばＰＬＩ，ＰＬＡ，ＰＬＢ，ＰＬＣ，ＰＬＥ及びＰＬＦ、又はホルモン、たとえばセレクチン、チモシン、レラキシン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、副甲状腺ホルモン、アデノコルチコトロピン、メラニン細胞刺激ホルモン、β−リポトロピン、ウロガストロン又はインスリン、増殖因子、たとえば上皮増殖因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、たとえばＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−II、マスト細胞増殖因子、神経増殖因子、グリア由来の神経細胞増殖因子、又は形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、たとえばＴＧＦβ、増殖ホルモン、たとえばヒト又はウシ増殖ホルモン、インターロイキン、たとえばインターロイキン−１又は２、ヒトマクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）、インターフェロン、たとえばヒトα−インターフェロン、たとえばインターフェロン−αＡ，αＢ，αＤ又はαＦ，β−インターフェロン、γ−インターフェロン又はハイブリッドインターフェロン、たとえばαＡ−αＤ−又はαＢ−αＤ−ハイブリッドインターフェロン、特にハイブリッドインターフェロンＢＤＢＢ、プロテイナーゼインヒビター、たとえばα₁ −抗トリプシン、ＳＬＰＩ及び同様のもの、肝炎ウィルス抗原、たとえばＢ型肝炎ウィルス表面又はコア抗原又はＡ型肝炎ウィルス抗原、又は非Ａ−非Ｂ型肝炎抗原、プラスミノーゲン活性化因子、たとえば組織プラスミノーゲン活性化因子又はウロキナーゼ、腫瘍壊死因子、ソマトスタチン、レニン、β−エンドロピン、免疫グロブリン、たとえば免疫グロブリンのＬ及び／又はＨ鎖、又はヒト−マウスハイブリッド免疫グロブリン、免疫グロブリン結合因子、たとえば免疫グロブリンＥ結合因子、カルシトニン、ヒトカルシトニン−関連ペプチド、血餅因子、たとえば第IX又は第VIIIｃ因子、エリトロポエチン、エグリン(eglin) 、たとえばエグリンＣ、ヒルジン、デスルファトヒルジン、たとえばデスルファトヒルジン変異ＨＶ１，ＨＶ２又はＰＡ、ヒトスーパーオキシドジスムターゼ、ウィルスチミジンキナーゼ、β−ラクタマーゼ、グルコースイソメラーゼをコードするものである。好ましい遺伝子は、ヒトα−インターフェロン又はハイブリッドインターフェロン、特にハイブリッドインターフェロンＢＤＢＢ、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢＶｓＡｇ）、インスリン様増殖因子Ｉ及びII、エグリンＣ及びデスルファトヒルジン、たとえば変異ＨＶＩをコードするものである。
最っとも好ましい態様は、次の例に記載されるものである。
【００９３】
【実施例】
次の例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。
略語は次の意味を有する：
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
ＤＴＴ：１，４−ジチオトレイトール
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩
ＩＰＴＧ：イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
kbp ：キロ塩基対
ＰＥＧ：ポリエチレングリコール
ＳＤＳ：ドデシル硫酸ナトリウム
Tris：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｘ−ｇａｌ：５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−ガクラトシド
【００９４】

【００９５】

【００９６】
例１：アスペルギラス ニガーのゲノムライブラリィーの構成例
１．１：Ａ．ニガーＮ４００から高分子量ＤＮＡの単離
アスペルギラス ニガー株Ｎ４００の分生子柄を、２００mlの最少培地に接種し、１０⁶ 個の胞子／mlの最終胞子密度にし、そして１ｌの三角フラスコにおいて２８℃で２４時間、３００rpm で振盪する。菌糸をブフナー漏斗上での Myraclothを通しての濾過により収穫し、冷たい滅菌塩溶液により洗浄し、液体窒素中で凍結し、そして−６０℃で貯蔵し又は直接的に使用する。ゲノムライブラリィーを調製するためにＤＮＡの単離に使用される方法は、Yeltonなど. 〔 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470〜1474 (1984) 〕に記載される方法に基づかれる。
【００９７】
ライブラリィー構成のためには、１０ｇの菌糸を、 Braunマイクロ−ディスメンブレーターにおいて、１ｇづつ液体窒素中で粉砕する。粉砕された菌糸を、２００mlの抽出緩衝液（５０mMのＥＤＴＡ，pH８．５，０．２％のＳＤＳ）及び２００μｌのジエチルピロカーボネートを含む１ｌの滅菌三角フラスコに移す。その混合物をゆっくり室温に暖め、そして時々振盪しながら、６８℃に２０分間にわたって加熱する。その懸濁液を室温に冷却し、そして１２，０００×ｇで１５分間、遠心分離する。８Ｍの酢酸カリウム溶液（pH４．２）の１／１６体積を、前記上清液に添加し、そしてその混合物を氷上に１時間放置する。沈殿物を遠心分離（２０分；１６，０００×ｇ；４℃）により除去する。核酸を、氷上で１５分間イソプロパノール０．６体積と共にインキュベーションすることにより上清液から沈殿せしめる。その沈殿された核酸を遠心分離（１０分；６，０００×ｇ；４℃）により集め、７０％エタノールにより洗浄し、そしてすぐに乾燥せしめる。ペレットを、２０μｇ／mlのRNAse Ａ (Boehringer, Mannheim) を含むＴＥ１０mlに懸濁し、そして３７℃で１５分間インキュベートする。ＤＮＡをヌクレアーゼを含まないプロナーゼ（１mg／mlの最終濃度)(Kochlight, Coinbrook) により３７℃で１時間、処理する。
【００９８】
８．５ｇのＣｓＣｌを、得られたＤＮＡ溶液９mlに溶解し、１０mg／mlの臭化エチジウム０．２mlを添加し、そしてこの溶液を、Beckman ＳＷ４１ローターにより３３，０００rpm で６０時間又はBeckman ５０ Ｔｉローターにより４５，０００rpm で４０時間、遠心分離する。ＤＮＡバンドを集めし、そして臭化エチジウムを、水中、ＮａＣｌの飽和溶液により平衡化されたイソプロパノールによる複数回の抽出により除去する。５体積のＴＥを添加し、そしてそのＤＮＡ溶液を、ＴＥ飽和フェノール、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール２５：２４：１及びクロロホルム／イソアミルアルコール２４：１により連続的に処理する。そのＤＮＡを、０．１体積の３Ｍの酢酸ナトリウムpH５．２、２．５体積のエタノールの添加及び−２０℃での一晩のインキュベーションにより沈殿せしめる。沈殿物を遠心分離（１時間；３０，０００×ｇ；４℃）により集め、７０％エタノールにより洗浄し、乾燥せしめ、そして４００μｌのＴＥに溶解する。
【００９９】
例１．２：ＭｂｏＩによるＡ．ニガーＮ４００ＤＮＡの部分的消化及びフラグメントの単離
１３．６〜２３kbp のＤＮＡフラグメントの最大量を付与するＭｂｏＩ濃度について試験するために、１μｇのＡ．ニガーＮ４００ＤＮＡを、供給者により推薦される適切な緩衝液において、低下する量のＭｂｏＩ（０．５〜０．００１Ｕ）により３７℃で１時間、１０μｌの体積で消化する。その反応を、０．２５ＭのＥＤＴＡ １μｌの添加により停止し、そしてサンプルを、１μｇ／mlの臭化エチジウムを含むＴＢＥ緩衝液において０．６％のアガロースゲル上に負荷する。高収率の所望する１３．６〜２３kbp フラグメントを得るために必要とされるＭｂｏＩ濃度は約０．０２Ｕ／μｇ ＤＮＡである。従って、２mlの合計体積でのＤＮＡ ２００μｇを消化する。３７℃で１時間後、ＥＤＴＡを添加し、２５mMの最終濃度にし、酵素を６５℃で１０分間、熱不活性化し、そしてＤＮＡを沈殿せしめ、洗浄し、乾燥せしめ、そして４００μｌのＴＥに溶解する。フラグメント化されたＤＮＡを、４℃及び４０Ｖ（３Ｖ／cm）で０．４％の予備アガロース上で分離する。正しい大きさのフラグメントをゲルから切断し、そしてＤＮＡを１００Ｖで２〜３時間、２mlのＴＢＥにおいて滅菌透析管においてゲルから電気溶離する。電流を３０秒間、逆転し、そしてＤＮＡを含む緩衝液を集める。次に、フラグメントをエタノール沈殿法により濃縮し、そして１００μｌのＴＥに溶解する。
【０１００】
例１．３：ベクターＤＮＡの調製
Ａ．ニガー株Ｎ４００のゲノムライブラリィーを、λベクターＥＭＢＬ４で構成した。９〜２３kbp のクローニング容量を有するベクターは、 Frischaufなど. 〔 J.Mol.Biol. 170： 827〜842 (1983)〕及びKarnなど. 〔 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：5172〜76 (1980) 〕により記載されており、そしてPromega Biotechnology Inc.から購入され得る。１つのファージ中にクローン化されるゲノムの異なった部分から由来する２種の挿入体を回避するために、１３．６kbp の最少長さのフラグメントをクローニングのために使用する。
【０１０１】
λＥＭＢＬ４のＤＮＡ １０μｇを、供給者により推薦される緩衝液において、１００μｌの体積で３７℃で２時間、５０単位のＢａｍＨＩにより完結まで消化する。酵素を６５℃で１０分間、不活性化する。ＮａＣｌ濃度を１５０mMに高め、そして５０単位のＳａｌＩを添加し、そして３７℃でのインキュベーションをさらに２時間続ける。その後、ＥＤＴＡを添加し、２５mMの濃度にし、そして６５℃で１０分間、加熱することによって酵素を不活性化する。その溶液を、等体積のフェノール（ＴＥ飽和された）、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール２５：２４：１及びクロロホルム／イソアミルアルコール２４：１により抽出する。小さなＢａｍＨＩ／ＳａｌＩポリリンカーフラグメントを排除するために、ＤＮＡを、３Ｍの酢酸ナトリウム（pH５．２）０．１体積の添加後、イソプロパノール０．６体積により沈殿せしめる。氷上で１５分間及び４℃及び１２，０００×ｇでの１５分間の遠心分離の後、沈殿物を７０％エタノールにより十分に洗浄し、乾燥せしめ、そして４０μｌのＴＥに溶解する。
【０１０２】
例１．４：ゲノムＡ．ニガーＮ４００ＤＮＡフラグメントの連結及びインビトロパッケージング
例２．３に従って調製されたベクターのＣＯＳ部位を、連結反応の前、アニールすることが必須である。１０mMのトリス−ＨＣｌ（pH７．５）及び１０mMのＭｇＣｌ₂ におけるベクターを、６５℃で１０分間加熱し、そして次に、４２℃で１時間アニールする。試験連結から、約１：１（重量）のベクター：フラグメント比は、ほとんどの組換え体を付与することが見出される。連結は、５０mMのトリスＨＣｌ（pH７．５），１０mMのＭｇＣｌ₂ ，１０mMのＤＴＴ及び１mMのＡＴＰにおいて、９．５μｇのベクター及び１０μｇのＤＮＡフラグメントを用いて、合計体積１００μｌで起こる。ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を、０．５Ｕ／μｇのＤＮＡ濃度で添加し、そしてその連結混合物を１４℃で一晩インキュベートする。連結について試験するために、連結されたＤＮＡのサンプルをアガロースゲル上で実験する。また、対照として、０．５μｇのベクターを、５μｌの体積でフラグメントの添加を伴わないで連結する。
【０１０３】
連結混合物をエタノール沈殿法により濃縮し、そしてインビトロパッケージングの前、２０μｌのＴＥに溶解する。インビトロパッケージングは、１μｇのＤＮＡをパッケージするために１０μｌの部分を用いて製造業者の指示に従って、 Promega Packagene抽出物により行なう。抽出物により供給される、１μｇの高分子量の対照ファージλｃＩ８５７ Ｓａｍ７を、対照として別々にパッケージする。パッケージングの後、５００μｌのファージ溶液緩衝液（ＰＳＢ）及び５μｌのクロロホルムを添加する。組換え体ファージストックを４℃で貯蔵する。
【０１０４】
例１．５：Ａ．ニガー株Ｎ４００ゲノムライブラリィーの滴定及び増幅
Ｅ．コリＮＭ５３９の細胞を、０．２％マルトース、１０mMのＭｇＳＯ₄ 及び１mMのＣａＣｌ₂ を含むＬＢ培地上で、１．０の光学密度（６００nm）に増殖する。この培養物の０．２mlのアリコートを、ＰＳＢにおける適切なファージ希釈溶液０．１mlに添加する。３７℃で２０分間のファージの吸着の後、４５℃での０．６％ＬＢ上部寒天３mlを添加し、その混合物をＬＢ寒天プレート上にプレートし、そしてそれらを３７℃で一晩インキュベートする。ファージ懸濁液１ml当たりのプラーク形成単位(pfu) の数は、例１．４に従って調製された２種のファージストックのために１２×１０⁵ 及び４．２×１０⁵pfu／mlである。フラグメントを伴わないで（それぞれ１７％及び４０％）、対照連結から計算されるバックグラウンドを減じた後、組換え体の絶対数は６×１０⁵ である。組換え体に含まれるＤＮＡは、２００以上のアスペルギラス ニガーゲノムに等しい。
【０１０５】
ライブラリィーを増幅するために、両ファージストックの８０μｌアリコートを、ＬＢ寒天プレート上でのＬＢ上部アガロースにプレートし、そして次に３７℃で一晩インキュベートされるＥ．コリＮＭ５３９細胞を感染せしめるために使用する。ファージを、室温で１時間、プレート当たり５mlのＰＳＢを有するプレートを軽く振盪することによってアガロースから溶離する。ＰＳＢを集め、細菌を除去するために遠心分離し（６０００×ｇで１０分）、そしてクロロホルムを添加する（０．５％の最終濃度）。同じ程度にほぼ増幅される両ファージストックを、混合し（４０μｌのストック）、滴定し（８×１０⁹pfu／ml) 、そして４℃で貯蔵する。
【０１０６】
例２：酵母ＰＲＢプローブの調製例
２．１：酵母プローブの調製
プラスミドｐＧＰ２０２（ＤＳＭ７０１８として寄託されている）は、ＨｉｎｄIII 及びＳａｕＩにより便利に切断され得る、酵母ＰＲＢ遺伝子をコードする、酵母ＤＮＡの３．２kbフラグメントを含む。このプラスミドをＨｉｎｄIII 及びＳａｕＩにより消化し、そしてフラグメントを０．８％アガロースゲル上で分離する。３．２kbのフラグメントを切断し、そしてＤＮＡを電気溶離する。このフラグメント１００ngを、ラベルされたヌクレオチドとして、³²Ｐ−ｄＡＴＰによりニックトランスレーションし、そしてすぐに、サザンブロット又はプラークリフトプロービングのために使用する。
【０１０７】
例２．２：Ａ．ニガーＤＮＡのサザンブロット
上記ようにして調製されたＡ．ニガーＤＮＡの２μｇリコートを、ＢａｍＨＩ又はＨｉｎｄIII のいづれかにより消化し、そして０．８％アガロースゲル上で分離する。臭化エチジウム染色ゲルの写真を撮った後、ＤＮＡを細管ブロッティングによりニトロセルロースフィルターに移し〔 Southern,E.M., J.Mol.Biol. 98： 503〜517 (1975)〕、そして例３に記載されているようにして、ラベルされた酵母ＰＲＢプローブによりハイブリダイズする。両消化物を含むニトロセルロースの別々のストリップを、種々の洗浄手段にゆだね、ノイズ比に対する最強のシグナルを付与する条件を決定する。６×ＳＳＣにおける４７℃での予備洗浄、続く２×ＳＳＣにおける室温での２回の洗浄が最良の結果を付与した。
【０１０８】
例３：酵母ＰＲＢプローブによるＡ．ニガーＮ４００ライブラリィーのスクリーニング
上記（例１）アスペルギラス ニガー株Ｎ４００のゲノムライブラリィーの一部を、ＳＭに希釈し、そしてそれぞれ約２０００pfu を含む０．１mlの部分をプレートする。宿主細胞を、０．２％マルトースにより補充されたＬＢ−培地５０mlをＬＢ−培地中、Ｅ．コリＮＭ５３９の一晩の培養物０．５mlにより接種し、３７℃，２５０rpm で４時間振盪し、続いて０．５mlの１Ｍ ＭｇＳＯ₄ 及び０．５mlの０．５Ｍ ＣａＣｌ₂ を添加することによって調製する。それぞれの細胞の０．２mlアリコートを、ファージ懸濁液０．１mlと共にそれぞれ混合し、そして室温で３０分間インキュベートする。次に、４７℃でのＬＭ−培地中、０．７％アガロース３mlを添加し、短時間撹拌し、そしてすぐに、ＬＭ寒天プレート上にプレートする。そのプレートを３７℃で一晩インキュベートし、そして４℃で２時間、急冷する。
【０１０９】
Benton and Davisプラークハイブリダイゼーション法〔 Benton,W.D. and Davis,R.W., Science 196： 180〜182 (1977)〕に従って、個々のプレートから２種のレプリカを製造する。第１のフィルター(Schleicher and Schuell BA85) をプレートの上部に１分間配置し、第２レプリカを２分間配置し、そしてレプリカの位置を Indiaインクを用いて印を付ける。フィルターの除去の後、それらを、変性溶液（１ＭのＮａＣｌ，０．５ＭのＮａＯＨ）１００mlを含む皿に０．５分間配置し、そして次に中和溶液（０．５Ｍのトリス−ＨＣｌ，pH７．５，１．５ＭのＮａＣｌ）１００mlに１分間配置する。フィルターを３×ＳＳＣを含む皿に移し、手ぶくろをした手で軽くこすり、細菌残骸を除去し、そして３×ＳＳＣによりすすぐ。フィルターをブロットし、室温で１０分間、乾燥せしめ、そしてWhatman ３ＭＭ紙上で８０℃で２時間、オーブン中において焼付ける。
【０１１０】
焼付けられたフィルターを３×ＳＳＣにおいて湿潤し、室温で１時間その溶液により洗浄し、そして次に、２５０mlの予熱された（６５℃）プレハイブリダイゼーション混合物（６×ＳＳＣ，１０×Denhardt's（０．２％ＢＳＡ，Boehringer画分Ｖ；０．２％ Ficoll ４００， Pharmacia；０．２％ポリビニルピロリドン−１０，Sigma)，０．１％ＳＤＳ及び０．１mg／mlの剪断され、そして新たに変性されたニシン精子ＤＮＡ）を含む皿に移す。振盪水においての６５℃での１時間のプレハイブリダイゼーションの後、フィルターを２５０mlの予熱された（６５℃）ハイブリダイゼーション混合物に３０分間、１度洗浄し、ここで前記混合物は前記プレハイブリダイゼーション混合物と同じであるが、但しニシン精子ＤＮＡを欠いている。次に、フィルターを、１５０mlの予熱された（６５℃）ハイブリダイゼーション混合物を含む皿に移し、これに、前もってラベルされたプローブが新たに添加される。
【０１１１】
６５℃で１４時間のハイブリダイゼーションの後、フィルターを、２５０mlの予熱された（４７℃）ハイブリダイゼーション混合物により４７℃で３０分間、１度洗浄し、続いて２５０mlの２×ＳＳＣにより２回、それぞれ４５分間、室温で洗浄する。フィルターを乾燥せしめ、そして増感スクリーンを用いて、Kodak ＸＡＲ５フィルムに−７０℃で１〜３日間、感光する。
【０１１２】
この場合、３種の陽性シグナルがスクリーンされた６種のプレートから得られる。陽性プラークを、インクマーカーを用いてオートラジオグラム上のプレートを注意して位置決定することにより滅菌ピペットにより打抜く。陽性プラークを含む寒天の断片を、ＳＭ １mlに添加し、そしてクロロホルム２．５μｌを添加する。ファージを、室温で１時間、時々撹拌しながら、寒天から拡散せしめ、そして次に４℃で一晩インキュベートする。寒天及び細胞残骸を５分間の遠心分離により除去し、クロロホルム２．５μｌを添加し、そしてファージストックを４℃で貯蔵する。
陽性クローンをλ１，λ２，λ４と命名する。ファージは高密度でプレートされるので、陽性プラークを、それらを低密度でプレートし、そしてレプリカプレーティング、ハイブリダイゼーション及び陽性プラークのピッキングの完全な方法をくり返すことによって２度精製する。
【０１１３】
例４：λクローンの特徴化例
４．１：λＤＮＡの単離
組換えクローンからＤＮＡを単離するために、ファージまず増幅する。このためには、Ｅ．コリＬＥ３９２宿主細胞を、１０mMのＭｇＳＯ₄ 及び０．２％のマルトースにより補充されたＬＢ−培地において１．０の光学密度（６００nm）に増殖する。次に、精製されたファージのストック５０μｌを上記のようにして別々にプレートする。３０℃での一晩のインキュベーションの後、ファージを、プレート上にＳＭ ５mlを広げ、そして軽く振盪しながら、２時間インキュベートすることによって非集密性プレートから溶離する。溶離されたファージを収穫し、そしてクロロホルム０．１mlを添加する。その混合物を短時間撹拌し、そして細胞残骸を遠心分離により除去する。上清液を回収し、クロロホルムを添加し、０．３％にし、そして得られたプレート溶解物を４℃で貯蔵する。
【０１１４】
ファージＤＮＡの単離のために出発材料としてほぼ集密性のプレートを得るために、プレート溶解物１０mlを、Ｅ．コリＬＥ３９２宿主細胞によりプレートする。３７℃で一晩のインキュベーションの後、アガロース上部層を３種のほぼ集密的なプレートから削取る。それらの層を組合し、２０mlのＳＭ及び０．４mlのクロロホルムを添加し、そして得られた混合物を３７℃で３０分間振盪する。細胞残骸及びアガロースを遠心分離により除去し、上清液を回収し、そしてその体積をＳＭにより１８mlに調整する。ＳＭ中、等体積の２ＭのＮａＣｌ，２０％のＰＥＧ６０００（ＢＤＨ，Pooole, ＧＢ）を添加し、そしてその溶液を混合し、そして氷上にプレートする。７５分後、ファージを、４℃及び１２００×ｇで２０分間の遠心分離によりペレット化する。上清液をデカントし、そして残る流体を Kleenexティシュにより除去する。ペレットを３mlのＳＭに再懸濁し、そして続いて３mlのクロロホルムにより抽出する。水性相を３７℃で２０分間、RNase Ａ（６７μｇ／ml）及びDNase Ｉ（３３μｇ／ml）により処理する。次に、その混合物を、フェノール２mlを添加し、撹拌し、クロロホルム１mlを添加し、再び撹拌し、そして遠心分離により２つの相に分離することによって抽出する。水性相を、それぞれ３mlのフェノール／クロロホルム（１：１）及び３mlのクロロホルムにより２度以上抽出する。次に、ＤＮＡを、３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．２）０．３ml及びエタノール６mlの連続的な添加により水性相から沈殿せしめる。この混合物を４℃で１６時間放置し、そして次にＤＮＡを遠心分離（１０分、１２０００×ｇ，４℃）により回収する。ペレットをＴＥ緩衝液０．４mlに溶解し、RNase Ａを添加し、２００μｇ／mlにし、そして３７℃で１時間インキュベートする。ＤＮＡを、３Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（pH５．２）３８μｌ及びエタノール０．８mlの添加により４℃で１時間、沈殿せしめる。ＤＮＡを遠心分離により回収し、そして続いて、ＴＥ １００μｌに溶解する。
【０１１５】
例４．２：Ａ．ニガーＮ４００ｐｅｐＣクローンの制限分析
すべての３種のファージがＡ．ニガーゲノムの同じ領域に由来する挿入体を含み、そしてλ１の部分的制限地図が構成されることは、制限分析により確立する。
ファージＤＮＡ２μｇを、供給者により推薦される緩衝液（ＢＲＬ）において２０μｌの体積でのＥｃｏＲＩ ２０単位により３７℃で１時間消化し、そして次に６５℃で１０分間加熱する。サンプルを０．７％アガロースゲル上で実験し、そして写真を撮る。ＤＮＡをニトロセルロース膜に移し、そしてラベルされた酵母ＰＲＢプローブによりハイブリダイズする。１２kb及び２．７kbのＥｃｏＲＩフラグメントを含むすべての３種のファージは同一であることがそれらの消化物から明らかである。１２kbのフラグメントは、ＰＲＢプローブにハイブリダイズされる唯一のフラグメントであり、そして従って、対応するＡ．ニガー遺伝子のすべてではないが、ほとんどを含むことがまた明らかである。λ１を追加の分析のために選択する。
【０１１６】
λ１を種々の制限酵素によりさらに消化し、そして再びサザン分析にゆだねる。ＰＲＢプローブにハイブリダイズするすべてのバンドを含むと思われる最少バンドは、３．２kbのＥｃｏＲＩ ＢａｍＨＩフラグメントである。その結果、これはプラスミド中にサブクローン化される。
【０１１７】
例５：プラスミド中へのＰＥＰＣのクローニング及びその配列決定及び特徴化例５．１：ｐＴＺＰＥＰＣの構成
λ１ＤＮＡを上記のようにして、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩと共にインキュベートする。クロロホルムによる抽出の後、ＤＮＡを沈殿せしめ、遠心分離によりペレット化し、サンプル緩衝液に溶解し、そして１×ＴＢＥ緩衝液中、０．６％アガロースゲル上での電気泳動にゆだねる。３．２kbp のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを含むゲルスライスを回収し、そしてＤＮＡを電気溶離する。次に、それをクロロホルム１００μｌにより抽出し、そしてエタノール沈殿せしめ、そしてＴＥ緩衝液４０mlに再溶解する。ＤＮＡ濃度を、アガロースゲル電気泳動、続くＵＶ光下でのバンドの可視化により推定する。
【０１１８】
ｐＴＺ１８Ｒベクターを、供給者（ＢＲＬ）により推薦される条件下で、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによる消化により調製する。ＤＮＡをフェノール、フェノール／クロロホルム（１：１）及びクロロホルムにより抽出し、そしてＤＮＡをエタノール沈殿せしめる。
上記個々のフラグメント１００ngを、ＢＲＬにより推薦される緩衝液＋ＡＴＰ（１mM），１．５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を含む反応体積２５μｌにおいて一緒に連結する。その反応混合物を１６℃で１６時間インキュベートし、そして次にＥ．コリＤＨ５αＦ′を形質転換する。細胞を、２５μｇ／mlのアンピシリン、０．００５％のＸｇａｌ，０．０５mMのＩＰＴＧを含むＬＢ寒天プレート上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートする。
【０１１９】
いくつかの単一の白色コロニーを用いて、０．１％のグルコース及び２５mg／mlのアンピシリンにより補充されたＬＢ培地において一晩の培養物を調製する。それらの培養物を、Holmes及びQuigley 〔 Holmes,P.S. and Quigley,M., Anal.Biochem. 114：193 (1981)〕のminiprep法を用いて、プラスミドを単離するために使用する。プラスミドを、供給者（ＢＲＬ）の推薦に従って及びRNase Ａ（０．５mg／ml）の存在下で、いくつかの制限酵素により消化し、そして生成物をアガロースゲル上で分析する。予測されるサイズのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄIII フラグメントを生ぜしめるプラスミドを選択し、そしてそれらを含むＥ．コリ細胞をグリセロール上で−２０℃で維持する。このプラスミドを、ｐＴＺＰＥＰＣ（ＤＳＭ７０１７とし寄託された）と称する。
【０１２０】
例５．２：ｐｅｐＣのヌクレオチド配列
ｐｅｐＣサブクローン、すなわちｐＴＺ１８Ｒベクターにおける３．２kbp のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントを、合成オリゴヌクレオチドプライマー及びSequenase (United States Biochemical Corp.)を用いて、ジデオキシ−鎖停止法〔Sangerなど. 、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463〜67 (1977) 〕により完全に配列決定する。
完全なヌクレオチド配列は、配列表に存在する。その読み取り枠を他の既知のスブチリシン科のセリンプロテアーゼとの比較により同定し、そしてこれを転写マッピングにより確かめる。
【０１２１】
例５．３：ＰＥＰＣのＲＮＡマッピング
全ＲＮＡを、炭素源としてグルコース及び窒素源としてアンモニアを含む最少培地上で増殖される粉砕凍結乾燥された菌糸体から Frederick及びKinsey〔Curr.Genet. 18：53〜58 (1990) 〕の方法により調製する。ｍＲＮＡの５′端を、３２−Ｐ末端ラベル化オリゴヌクレオチド、すなわちオリゴＡ（配列番号１のヌクレオチド４３３〜４５６に相補的）により全ＲＮＡをハイブリダイズし、そして同じオリゴヌクレオチドによるジデオキシ配列決定により生成される配列決定反応と比較することにより、配列決定ゲル上での逆転写酵素により生成される流出転写体をサイズ分類することによって同定する（Maniatisなど．、Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982)。イントロンの正確なスプライス部位を、ｐｅｐＣ情報の一部のｃＤＮＡコピーをクローン化し、そして配列決定することによって同定する。第１の鎖合成を標準方法（Maniatisなど．、前記）により行なう。但し、プライミングオリゴヌクレオチドはオリゴＣ（配列番号１のヌクレオチド９２３〜９４４に相補的）である。このｃＤＮＡを、オリゴＢ（配列番号１のヌクレオチド６３１〜６５７に対応する）及びＣを用いてＰＣＲにゆだね、そしてｐＴＺ１８Ｒ中にクローン化する。（オリゴＢはさらに、その５′端上にＢａｍＨＩ部位を有し、そしてオリゴＣはさらにＥｃｏＲＩ部位を有することを注目すること）。２種の独立したクローンの両鎖を完全に配列決定する。ｐｅｐＣ遺伝子により生成されるｍＲＮＡの全長さを、３．２kbのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをプローブとして用いて、ノザン分析により決定し（Maniatisなど．、前記）、そして１．５〜１．８kbの間であることが決定され、それは読み取り枠のサイズ及び転写開始部位の位置から予測されるものに相当する。
【０１２２】
例６：ＰＥＰＣのゲノム破壊例
６．１：ｐＴＺＰＥＰＣＥの構成
プラスミドｐＴＺＰＥＰＣを、ＢａｍＨＩにより消化し、Ｔ４ポリメラーゼにより処理し、そして１０モル過剰のリン酸化されていないＥｃｏＲＩリンカー（５′GGAATTCC) の存在下で連結する。Ｅ．コリの形質転換の後、ｐｅｐＣ遺伝子の両端を端に有するＥｃｏＲＩ部位を有する正しいプラスミドをミニスクリーンにより同定する。
【０１２３】
例６．２：ｐＡＸＩの構成
Ｅ．コリＢＪ５１３８／ｐＣＧ５９Ｄ７（ＤＳＭ３９６８）から得られるプラスミドｐＣＧ５９Ｄ７をＸｂａＩにより消化し、そしてＡ．ニガーｐｙｒＡ遺伝子の全体を含むフラグメントを精製する。これを、ｐＴＺ１８ＲのＸｂａＩ部位中にクローン化し、プラスミドｐＡＸＩ（ＤＳＭ７０１７として寄託される）を構築する。
【０１２４】
例６．３：ｐＰＥＰＣＰＹＲＡの構成
ｐｙｒＡ遺伝子を含む４kbのＸｂａＩフラグメントを、ｐＡＸＩから切断し、そしてそのベクター配列から精製する。
２μｇのｐＴＺＰＥＰＣＥを製造業者の推薦に従ってＢｇｌIIにより切断し、そしてフェノール抽出し、エタノール沈殿せしめ、そして水２０μｌに再溶解する。このＤＮＡを、製造業者により推薦されるようにして、細菌アルカリホスファターゼにより処理し、５′ホスフェト基を除去する。５kbのフラグメントをゲルから精製する。
【０１２５】
上記フラグメントの両者を、製造業者の指示に従って、Ｔ４ポリメラーゼにより処理し、そしてフェノール抽出し、そしてエタノール沈殿せしめる。それらの２種のフラグメントを一緒に混合し、そして連結する。Ｅ．コリの形質転換の後、正しいプラスミドを担持するコロニーを、ミニ−プラスミド調製物の制限消化物により同定する。
【０１２６】
ｐＰＥＰＣＰＹＲＡは、オロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼをコードするＸｂａＩ ＤＮＡフラグメントにより置換された、活性部位ヒスチジン及びセリンの両者をコードする、中央のＢｇｌIIフラグメントを有する、ＰＥＰＣ遺伝子を担持するＥｃｏＲＩフラグメント上に含むｐＴＺ１８Ｒベクターから成る。
【０１２７】
例６．４：Ａ．ニガーの形質転換
１０μｇのプラスミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡを、ＥｃｏＲＩにより完全に消化する。消化物の完全性を、ゲル上にアリコートを作用せしめることによって調べ、そして残りのＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈殿せしめ、そして２０μｌの滅菌水に再懸濁する。
【０１２８】
栄養要求性Ａ．ニガーＡｎ８（ＤＳＭ３９１７）の分生胞子を、十分に胞子形成されるまで、完全培地上で２８℃で４日間、増殖する。２×１０⁸ 個の分生子柄を用いて、１ｇ／ｌのアルギニン及びウリジンにより補充された最少培地２００mlを接種する。
【０１２９】
２８℃及び１８０rpm での２０時間の増殖の後、菌糸体を Miraclothを通しての濾過により収穫し、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液１０mlにより２度洗浄し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ ，０．５mg／mlのNovozym ２３４(Novo Industries) の溶液２０mlに再懸濁する。その混合物を、十分なプロトプラストが開放されるまで（９０〜１２０分後、顕微鏡により検出される）、振盪水浴においてインキュベートする（３０℃，５０rpm ）。プロトプラスト懸濁液を、菌糸体残骸を除去するために、漏斗におけるガラス羊毛プラグを通して濾過する。プロトプラストを室温で、軽い遠心分離（１０分、２０００rpm ）によりペレット化し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液１０mlにより２度洗浄する。最終的にプロトプラストを０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液２００〜５００μｌに再懸濁し、１×１０⁸ 個のスフェロプラスト／mlの濃度を付与する。
【０１３０】
形質転換のために、プロトプラスト懸濁液の２００μｌアリコートを、ＥｃｏＲＩにより消化されたｐＰＥＰＣＰＹＲＡ ５μｇ及び５０μｌのＰＣＴ（１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５，５０mMのＣａＣｌ₂ ，２５％のＰＥＧ６０００）と共にインキュベートする。そのインキュベーション混合物を２０分間氷上に保持し、他の２mlのＰＣＴを添加し、そしてその混合物を室温でさらに５分間インキュベートする。０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液４mlを添加し、そして最終形質転換溶液の１mlアリコートを、液体最少寒天培地（最少培地＋１ｇ／ｌのアルギニン＋１０ｇ／ｌのBacto-Agar (Difco)) と共に混合し、０．８ＭのＫＣｌにより安定化する。その混合物をすぐに、同じ培地の寒天プレート上に注ぎ、そして３０℃でインキュベートする。
２８℃で２〜３日間の増殖の後、安定した形質転換体は激しく増殖し、そして数百の小さな、たぶん早産の形質転換体のコロニーをバックグラウンド増殖に対して胞子形成するように思われる。
【０１３１】
例６．５：遺伝子破壊の同定
安定コロニーから、個々の胞子懸濁液を製造し、そして新鮮な最少＋アルギニンプレート上で画線培養する。単一のコロニーを選択し、そして再画線培養し、純粋な培養物を付与する。それらは、１ｇ／ｌのアルギニンにより補充された液体最少培地２００mlを接種するために使用される。３０℃で２４時間１８０rpm での振盪の後、菌糸体をフィルター紙上に収穫し、そしてパッドを凍結乾燥せしめる。乾燥の後、ＤＮＡを個々のパッドから、そのパッドを乳棒及び乳ばちを用いて細かな粉末に粉砕することによって調製する。この粉末６０mgを、１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％のTween ８０，１Ｍの酢酸アンモニウムの溶液３mlに撹拌しながら再懸濁する。これを、時々混合しながら、６５℃で２０分間加熱する。細胞残骸を、１５，０００rpm での５分間の遠心分離によりＤＮＡ溶液から分離する。上清液をフェノールにより２度、クロロホルムにより２度抽出し、そしてエタノール沈殿せしめる。そのＤＮＡを滅菌ＴＥ １００mlに再溶解する。
【０１３２】
個々のＤＮＡ ２０μｌを、 RNAase Ａ １μｇの存在下で１時間、ＢａｌIIにより消化する。これをアガロース上で分離し、そしてニトロセルロース膜に移し、そして焼き付ける。ＰＥＰＣを含むｐＴＺＰＥＰＣからのＥｃｏＲＩフラグメントを精製し、ニックトランスレーションによりラベルし、そしてフィルターをプローブするために使用する。ｐｅｐＣ遺伝子の破壊を担持する株は、１．２kbのＢｇｌIIハイブリダイゼーションフラグメントを欠き、そして他の２つのフランキングフラグメントの変更された移動性を有することによって容易に認識される。
【０１３３】
それらの株の１つを、ウリジン及び５−フルオロ−オロト酸を含む培地上にプレートする。ピリミジン栄養要求性に対する変異体を、この培地上で最強の増殖により同定し、そして採取し、そして単一のコロニーのために画線培養することによって精製する。
【０１３４】
例６．６：ｐｅｐＣ ^- Ａ．ニガー株におけるインターフェロンの生成
例６．５で単離されたｐｅｐＣ^- Ａ．ニガーＡｎ８株の１つを、ｐｙｒＡ⁺ 含有プラスミド及びインターフェロンのための非相同遺伝子を含む発現カセットによる続く形質転換のための宿主として使用する。
【０１３５】
Ａ．ニガーＡｎ８のウリジン栄養要求性ｐｅｐＣ^- 変異体の分生胞子を、十分に胞子形成されるまで、完全培地において２８℃で４日間、培養する。２×１０⁸ 個の分生子柄を用いて、１ｇ／ｌのアルギニン及びウリジンにより補充された最少培地２００mlを接種する。
【０１３６】
２８℃及び１８０rpm での２０時間の増殖の後、菌糸体を、 Miraclothを通しての濾過により収穫し、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液１０mlにより２度洗浄し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ ，０．５mg／mlのNovozym ２３４(Novo Industries) の溶液２０mlに再懸濁する。その混合物を、十分なプロトプラストが開放されるまで（９０〜１２０分後、顕微鏡により検出される）、振盪水浴においてインキュベートする（３０℃，５０rpm ）。そのプロトプラスト懸濁液を漏斗におけるガラス羊毛プラグを通して濾過し、菌糸残骸を除去する。プロトプラストを室温で軽い遠心分離（１０分、２０００rpm ）によりペレット化し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液１０mlにより２度洗浄する。最後に、プロトプラストを、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液２００〜５００μｌに再懸濁し、１×１０⁸ ／mlの濃度を得る。
【０１３７】
形質転換のために、プロトプラスト懸濁液の２００μｌアリコートを、５μｇのｐＣＧ５９Ｄ７（ＤＳＭ３９６８）及び５０μｇのｐＧIIｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１９又はｐＧII−ＩＦＮ ＡＭ１１９ＤＮＡ（両プラスミドはＥＰ−出願第０４２１９１９号に十分に開示される）、及び５０μｌのＰＣＴ（１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５，５０mMのＣａＣｌ₂ ，２５％のＰＥＧ６０００）と共にインキュベートする。そのインキュベーション混合物を２０分間氷上に保持し、他の２mlのＰＣＴを添加し、そしてその混合物を室温でさらに５分間インキュベートする。０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液４mlを添加し、そして最終形質転換溶液の１mlアリコートを、液体最少寒天培地（最少培地＋１ｇ／ｌのアルギニン＋１０ｇ／ｌのBacto-Agar (Difco)) と共に混合し、０．８ＭのＫＣｌにより安定化する。その混合物をすぐに、同じ培地の寒天プレート上に注ぎ、そして３０℃でインキュベートする。
２８℃で２〜３日間の増殖の後、安定した形質転換体は激しく増殖し、そして数百の小さな、たぶん早産の形質転換体のコロニーをバックグラウンド増殖に対して胞子形成するように思われる。
【０１３８】
形質転換体を採取し、そしてインターフェロン発現について分析する。インターフェロン活性を、ヒトＣＣＬ−２３細胞及び挑戦ウィルスとして水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）を用いて、 Armstrongの方法(J.A.Armstrong, Appl.Microbiol. 21, 732 (1971)) に従って決定する。
【０１３９】
形質転換体からの分生胞子を、予備培養培地(Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) ３ｇ／ｌ，ＮＨ₄ Ｃｌ ２ｇ／ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．５ｇ／ｌ，Ｃａ₂ ＳＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．５ｇ／ｌ，pH７．０，１％のアルギニン）５０ml中で個々に予備培養する。その予備培養物を、２５０rpm 及び２８℃で７２時間インキュベートする。１０％の予備培養物を用いて、主要培養培地（大豆粉２０ｇ／ｌ、ペクチン Slow Set ５ｇ／ｌ，１％のアルギニン）５０mlを接種する。その培養物を、２５０rpm 及び２８℃で、７２〜９６時間、増殖せしめる。
【０１４０】
種々の時間（２０時間ごとに）で、サンプルを採取し、細胞を遠心分離によりペレット化し、そして凍結乾燥及び乾燥粉砕により破壊する。上清液及び細胞抽出物を、記載のようにしてインターフェロン活性について両者とも試験する。大部分のインターフェロン活性は、ｐＧIIｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９を担持する形質転換体においては、培地中に分泌されることが見出され、そしてｐＧII−ＩＦＮ ＡＭ１１９を担持する形質転換体においては、それは細胞抽出物に主に見出される。
【０１４１】
例７：Ａ．ニガーにおけるｐｅｐＣの過剰発現例
７．１：複数コピーの過剰発現
Ａ．ニガーＡｎ８を、１μｇのｐＡＸＩ＋１０μｇのｐＴＺＰＥＰＣにより形質転換し、ウリジンフォートフス(Photohuhs) を生成する。コロニーを精製し、そしてＤＮＡを上記のようにして調製する。ｐＴＺＰＥＰＣのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを用いてのサザンブロットは、いくつかの形質転換体がそれらのゲノム中に組込まれたｐＴＺＰＥＰＣの単一コピーを有し、ところが他はそれらのゲノム中に１０までの及び１０以上の余分なコピーを有することを示した。それらの株は、対応して一層のタンパク質分解活性を生成し、そして分裂的に安定する。
【０１４２】
例７．２：遺伝子融合体からｐｅｐＣの過剰発現
プラスミドｐＧＷ１１００（ＤＳＭ５７４７として寄託される）をＢａｍＨＩ及びＳａｃＩにより切断する。ピルベートキナーゼプロモーター及び５′端を含む１．２kbp のフラグメントを精製し、Ｔ４ポリメラーゼにより処理し、そしてＴ４ポリメラーゼによりブラント末端化され、そしてアクリルホスファターゼにより処理される、ｐｅｐＣクローンの５′端でｐＴＺＰＥＰＣのユニークＢａｍＨＩ部位中にクローン化する。
【０１４３】
正しいプラスミドを、ミニスクリーニングにより同定し、そして１つを選択し、そしてｄｕｔ−，ｕｎｇ−Ｅ．コリ株ＢＷ３１３を形質転換する。これをＭＢＫ０７により過剰感染せしめ、プラスミドからの一本鎖ウラシル−置換されたＤＮＡを得る。
【０１４４】
オリゴヌクレオチド（配列番号３）は、３７個のヌクレオチドから成る。初めの１９個のヌクレオチドは、ｐｅｐＣ読み取り枠の初めの１９個のヌクレオチドに対して相補的であり、そして最後の１８個はピルベートキナーゼ遺伝子のＡＴＧの前の最後の１８個のヌクレオチドに対して相補的である。このプラスミドのインビトロ変異誘発のためには、５pMのオリゴヌクレオチド１を、供給者により推薦されるように、５０μｌのキナーゼ緩衝液中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１０Ｕによりオリゴヌクレオチドを処理することによって、１００pMのＡＴＰにより５′末端でリン酸化する。その反応を、６５℃で１０分間加熱することによって停止せしめる。
【０１４５】
０．２pMのウラシル含有一本鎖ＤＮＡを、２０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５，１０mMのＭｇＣｌ₂ ，２０mMのＮａＣｌ中において、１０μｌの最終体積で、０．５pMのリン酸化されたオリゴヌクレオチド１と共に混合する。その混合物を６５℃で５分間インキュベートし、ゆっくり室温に６０分間にわたって冷却し、そして氷上に１５分間置く。次に、５００μＭのｔＮＴＰ ２μｌ、１０mMのＡＴＰ １．５μｌ，Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（１２Ｕ／μｌ Pharmacia）１ml及びＴ４ＤＮＡリガーゼ（１．２Ｕ／μｌ ＢＲＬ）１μｌを前記混合物に添加し、そしてこの重合混合物を３７℃で１５分間インキュベートする。その反応を６５℃で５分間加熱することによって停止し、そしてアリコートを用いて、Ｅ．コリＤＨ５αＦ′を形質転換する。
【０１４６】
正しいプラスミドを、ミニプラスミド調製物を消化することによって同定する。３種を選択し、そしてＥｃｏＲＩフラグメントを、合成オリゴヌクレオチドを用いて完全に配列決定する。ｐＰＫＩＰＥＰＣＡと呼ばれる、ｐｅｐＣ読み取り枠へのピルベートキナーゼプロモーターの完全な融合体を含む１つのプラスミドを、ｐＡＸＩと共に使用し、ウリジン原栄養性にＡ．ニガーＡｎ８を同時形質転換する。
【０１４７】
ｐｋｉ−ｐｅｐＣ融合体の存在は、個々の精製された形質転換体からＤＮＡを製造し、そしてｐｋｉ及びｐｅｐＣからのプローブを用いてサザン分析のためにそれを使用することによって確認される。ゲノム中に組込まれる遺伝子融合体の１又は複数のコピーを有する株は、細胞がＣ源としてのグルコース上で急速に増殖される場合、より一層のタンパク質分解活性を生成することが示される。
【０１４８】
例８：他の生物におけるｐｅｐＣの発現：酵母における発現
プラスミドｐＰＫＩＰＥＰＣＡを、配列番号４及び５に列挙する配列に示される２種の合成オリゴヌクレオチドによりインビトロ変異誘発する。前者は、ｐｅｐＣのＡＴＧのすぐ前にＥｃｏＲＩ部位を構築し、そして他は全イントロンをループする。これは、その配列が完全な配列決定により確認されているプラスミドｐＰＫＩＰＥＰＣＢを創造する。
【０１４９】
ｐｅｐＣのＡＴＧのすぐ前で開始し、そしてｐｅｐＣターミネーターの後で終わる２．８kbのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、そして酵母ＧＡＬ１０プロモーターを含む、ｐＦＢＹ１２９（ＤＳＭ７０１６として寄託される）の５２０bpのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと共に、酵母基材の２μｍベクターｐＦＢＹ２５（ＤＳＭ７０２０として寄託される）のＳｎａＢＩ部位中に連結する。正しいプラスミドを、制限消化物により同定する。
このプラスミド、すなわちｐＦＢＹ１３８を用いて酵母を形質転換し、そして遺伝子融合がガラクトースにより誘発される場合、ｐｅｐＣタンパク質を生成することが示される。
【０１５０】
例９：Ａ．ニガースブチリシン株セリンプロテアーゼについてのスクリーニングのためのＤＮＡプローブの単離
例９．１：変性ＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）のプライマーの構成
ポリメラーゼ鎖反応(Saikiなど. 、 Science 230：1350〜1354 (1985))を用いて、このスクリーニングのためのプローブを単離する。それぞれ、活性部位残基ヒスチジン及びセリンを含む２つの領域は、スブチリシンクラスの異なったプロテアーゼ間に十分に保存される。コンセンサスアミノ酸配列がそれらの個々の領域のために誘導され、そしてそれらの２つのアミノ酸配列をコードできるＤＮＡ配列が推定される。縮重のレベルを減じるために、保存された領域の個々のための２つのプライマーを構成する。ＰＣＲオリゴ１及びＰＣＲオリゴ２（それぞれ配列番号８及び９に示される）はＨｉｓ活性部位領域に対応し、そしてＰＣＲオリゴ３及びＰＣＲオリゴ４（それぞれ配列番号１０及び１１に示される）は、Ｓｅｒ活性部位領域に対応する。ＰＣＲ生成物の後でのサブクローニングを促進するためには、ＰＣＲオリゴ１及び２はＢａｍＨＩを含み、そしてＰＣＲオリゴ３及び４は、同様にそれらの５′端近くにＥｃｏＲＩ制限部位を含む。
【０１５１】
例９．２：Ａ．ニガーゲノムＤＮＡの増幅
Ａ．ニガーゲノムＤＮＡを、例１に記載されるようにして単離する。４種の増幅反応を、上記４種のＰＣＲオリゴの対様組合せを用いて行なう。ポリメラーゼ鎖反応のための反応混合物は、１００ngの完全なゲノムＡ．ニガーＤＮＡ、１００ｐモルの個々のプライマー、１０mMのトリス−ＨＣｌ，５０mMのＫＣｌ，１．５mMのＭｇＣｌ₂ ，１mg／mlのゼラチン（pH８．３）及び５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを合計５０μｌで含む。そのＤＮＡを９４℃で３０秒間変性し、次にプライマーを４２℃で４０秒間アニールし、そして拡張段階を７２℃で６０秒間行なう。それらの３段階を４０回くり返す。
【０１５２】
例９．３：ＰＣＲ生成物の単離及び特徴化
前記増幅反応の生成物を、１％アガロースゲル上で分離し、そしてＤＮＡフラグメントを上記のようにして電気溶離によりゲルから単離する。単離されたフラグメント（２００〜３００ng）をフェノール及び次にクロロホルムにより抽出し、そしてエタノールにより沈殿せしめる。遠心分離の後、ＤＮＡペレットを乾燥せしめ、そして次に、１０μｌのＴＥ緩衝液に溶解する。次に、このＤＮＡを１０単位のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素により２０μｌの体積で３７℃で１時間、供給者（ＢＲＬ）により推薦される緩衝液中で消化する。フェノール及びクロロホルムによる抽出及びエタノールによる沈殿化に続いて、消化されたＤＮＡをペレット化し、乾燥せしめ、そして１０μｌのＴＥ緩衝液に再溶解する。そのＤＮＡ濃度を、アガロースゲル電気泳動、続くＵＶ光下でのＤＮＡバンドの可視化により推定する。
【０１５３】
ｐＴＺ１８Ｒベクターを、供給者（ＢＲＬ）により推薦される条件下でＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによる消化により調製し、そして次に上記のようにして抽出し、そしてエタノール沈殿せしめる。
１００ngの単離されたＰＣＲフラグメントを、上記調製されたｐＴＺ１８Ｒベクター１００ngと共に２０μｌの体積で、１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼにより連結する。使用される緩衝液条件は、供給者（ＢＲＬ）により示唆される条件である。１６℃で１６時間、その反応混合物をインキュベートした後、それを用いて、Ｅ．コリＤＨ５αＦ′株を形質転換する。細胞を、２５μｇ／mlのアンピシリン、０．００５％のＸｇａｌ，０．０５mMのＩＰＴＧを含むＬＢ寒天プレート上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートする。
【０１５４】
いくつかの単一の白色コロニーが、０．１％のグルコース及び２５μｇ／mlのアンピシリンにより補充された５mlのＬＢ培地における一晩の培養物を調製するために使用される。これらの培養物は、Holmes及びQuigley (Holmes D.S. and Quigley,M., Anal Biochem. 114：193 (1981)) のミニプレ方法を用いて、プラスミドＤＮＡを単離するために使用される。プラスミドを、供給者（ＢＲＬ）の推薦に従ってＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ制限酵素により消化する。
【０１５５】
選択されたプラスミドの挿入体を、合成オリゴヌクレオチドプライマー及びSequenase (United States Biochemical Corp.) を用いて、ジデオキシ−鎖停止方法 (Sangerなど. 、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463〜67 (1977))により配列決定する。
【０１５６】
例９．４：ＰＣＲ生成物の配列のコンピューター分析
上記挿入体のヌクレオチド配列を、組合された GenBank及びＥＭＢＬデータベースにおけるすべてのＤＮＡ配列に比較する。それらの中で、スブチリシン型プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列に対して強い相同性を示すものをプローブとして選択し、そしてＡ．ニガーゲノムライブラリィーの続くスクリーニングのためにＰＣＲ−プローブと称する。このフラグメント（ＰＣＲプライマーを有さない）の配列は、配列番号６に示される配列におけるヌクレオチド１４７４〜２０２０間の配列である。
【０１５７】
例１０：ＰＣＲプローブによるＡ．ニガーＮ４００ライブラリィーのスクリーニング
上記アスペルギラス ニガーが株Ｎ４００のゲノムライブラリィーのプラークハイブリダイゼーションのためのフィルター（例１）を調製し、そして例３に従ってプレハイブリダイズする。
６５℃で１４〜１６時間のハイブリダイゼーションの後、フィルターを、室温で２５０mlの２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で３０分間、１度洗浄し、続いて室温で２５０mlの０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中でそれぞれ２０分間、２度洗浄し、そして最後に、２５０mlの０．２×ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中において６５℃でそれぞれ２０分間、２度洗浄する。フィルターを乾燥せしめ、そして増強スクリーンを用いて、Kodak ＸＡＲ５フィルムに−７０℃で１〜３日間、暴露する。
【０１５８】
この場合、５種の陽性シグナルが６種のスクリーンされたプレートから得られる。陽性プラークを、インクマーカーを用いてオートラジオグラム上のプレートを注意して位置決定することによって滅菌 Pasteurピペットにより打抜く。陽性プラークを含む寒天断片を、１mlのＳＭに添加し、そして２．５μｌのクロロホルムを添加する。ファージを、時々撹拌しながら、室温で１時間、寒天からの拡散を可能にせしめ、そして次に４℃で一晩インキュベートする。寒天及び細胞残骸を５分間の遠心分離により除去し、２．５μｌのクロロホルムを添加し、そしてファージストックを４℃で貯蔵する。
【０１５９】
例１１：λクローンの特徴化
例１１．１：λＤＮＡの単離及びＡ．ニガーＮ４００ｐｅｐＤクローンの制限分析
λＤＮＡを、例４．１に記載しているようにして単離する。
すべての５種のファージλａ〜λｅは、Ａ．ニガーゲノムの同じ領域に由来する挿入体を含むことは制限分析により確立され、そしてそのゲノム領域の部分的制限地図を構成する。
【０１６０】
２μｇのファージＤＮＡを、供給者（ＢＲＬ）により推薦される緩衝液において３７℃で１時間、２０μｌの体積で、２０単位のＥｃｏＲＩ又はＢａｍＨＩにより消化し、そして次に、６５℃で１０分間、加熱する。サンプルを０．７％アガロースゲル上で実験し、そして写真を撮る。そのＤＮＡをニトロセルロース膜に移し、そしてラベルされたＰＣＲプローブによりハイブリダイズせしめる。
【０１６１】
５つのファージは、ＰＣＲ−プローブにハイブリダイズし、そして従って対応するＡ．ニガー遺伝子のほとんど（すべてではないが）を含む約５．５kbのオーバーラップ領域を含むことはそれらの消化物から明らかである。６．０kbp の長さのＢａｍＨＩフラグメントがこの領域を含み、そして追加の分析のために選択する。
【０１６２】
例１２：プラスミド中へのＰＥＰＤのクローニング及びその配列決定及び特徴化
例１２．１：ｐＴＺＰＥＰＤの構成
６．０kbのＢａｍＨＩフラグメントを、制限酵素ＨｉｎｄIII と共にインキュベートする。クロロホルムによる抽出の後、ＤＮＡを沈殿せしめ、遠心分離によりペレット化し、サンプル緩衝液に溶解し、そして１×ＴＢＥ緩衝液において０．６％アガロースゲル上での電気泳動にゆだねる。３．０kbp のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを含むゲルスライスを回収し、そしてＤＮＡを電気溶離する。次にこれを１００μｌのクロロホルムにより抽出し、そしてエタノール沈殿せしめ、そして４０mlのＴＥ緩衝液に再溶解する。そのＤＮＡ濃度を、アガロースゲル電気泳動、続くＵＶ光下でのバンドの可視化により推定する。
【０１６３】
ｐＴＺ１８Ｒベクターを、供給者（ＢＲＬ）により推薦される条件下で、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII による消化により調製する。そのＤＮＡを、フェノール、フェノール／クロロホルム（１：１）及びクロロホルムにより抽出し、そしてエタノール沈殿せしめる。
個々の上記フラグメント１００ngを、ＢＲＬにより推薦される緩衝液＋ＡＴＰ（１mM），１５ＵのＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＢＲＬ）を含む、２５μｌの反応体積において一緒に連結する。その反応混合物を１６℃で１６時間インキュベートし、そして次に、それを用いてＥ．コリＤＨ５αＦ′を形質転換する。細胞を、２５μｇ／mlのアンピシリン、０．００５％のＸｇａｌ，０．０５mMのＩＰＴＧを含むＬＢ寒天プレート上にプレートし、そして３７℃で一晩インキュベートする。
【０１６４】
いくつかの単一の白色コロニーが、０．１％のグルコース及び２５μｇ／mlのアンピシリンにより補充されたＬＢ培地における一晩の培養物を調製するために使用される。これらの培養物は、Holmes及びQuigley (Holmes D.S. and Quigley,M., Anal Biochem. 114：193 (1981)) のミニプレ方法を用いて、プラスミドを単離するために使用される。プラスミドを、供給者（ＢＲＬ）の推薦に従って及びRNase Ａ（０．５mg／ml）の存在下でいくつかの制限酵素により消化し、そして生成物をアガロースゲル上で分析する。予測されるサイズのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを生成するプラスミドを選択し、そしてそれらを有するＥ．コリ細胞を−２０℃でグリセロール上に維持する。このプラスミドを、ｐＴＺＰＥＰＤ（ＤＳＭ７４０９として寄託されている）と称する。
【０１６５】
例１２．２：ｐｅｐＤのヌクレオチド配列
ｐＴＺ１８ＲベクターにおけるｐｅｐＤサブクローン、すなわち３．０kbp のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを、合成オリゴヌクレオチドプライマー及びSequenase (United States Biochemical Corp.) を用いて、ジデオキシ−鎖停止方法〔Sangerなど. 、 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74：5463〜67 (1977) 〕により完全に配列決定する。
【０１６６】
その完全なヌクレオチド配列は、配列番号６として配列表に存在する。その読み取り枠を、他の既知のスブチリシン型のセリンプロテアーゼとの比較により同定し、そしてこれを転写マッピングにより確かめる。
【０１６７】
例１２．３：ＰＥＰＤのＲＮＡマッピング
全ＲＮＡを、炭素源としてグルコース及び窒素源としてアンモニアを含む最少培地上で増殖される粉砕された凍結乾燥菌糸体から Frederick及びKinsey〔Curr.Genet. 18：53〜58 (1990) 〕の方法により調製する。ｍＲＮＡの５′端を、３２−Ｐ末端ラベル化オリゴヌクレオチド、すなわちオリゴＡ（配列番号６のヌクレオチド８５１〜８７６に相当する）により全ＲＮＡをハイブリダイズし、そして同じオリゴヌクレオチドによるジデオキシ配列決定により生成される配列決定反応との比較により配列決定ゲル上で逆転写酵素により生成される流出転写体をサイズ分けすることによって同定する〔Maniatisなど．、Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982)。イントロンの正確なスプライス部位を、ｐｅｐＤ情報の一部のｃＤＮＡコピーをクローン化し、そして配列決定することによって同定する。第１鎖の合成を、標準方法（Maniatisなど．、前記）により行なう。但し、プライミングオリゴヌクレオチドはオリゴＣ（配列番号６のヌクレオチド１９１４〜１９４１に対して相補的である）である。このｃＤＮＡを、オリゴＢ（配列番号６のヌクレオチド１１０２〜１１２９に対応する）及びＣを用いてＰＣＲにゆだね、そしてｐＴＺ１８Ｒ中にクローン化する。ヌクレオチド１１０７〜１１０９（ＧＧＴ）はオリゴＢにおいてＡＴＣにより置換され、従って新規のＢａｍＨＩ部位を創造することを注目すること。同様に、ヌクレオチド１９３２（Ａ）及び１９３５（Ａ）を、オリゴＣにおいて、それぞれＧ及びＴにより置換し、従って新規ＨｉｎｄIII 部位を創造する。２種の独立したクローンの両鎖を完全に配列決定する。ｐｅｐＤ遺伝子により生成されるｍＲＮＡの全長さを、プローブとして３．０kbのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを用いてノザン分析により決定（Maniatisなど．、前記）、そして読み取り枠の大きさ及び転写開始部位の位置から予測される長さに対応する１．４〜１．７kbの間であることが決定される。
【０１６８】
例１３：ＰＥＰＤのゲノム破壊
例１３．１：ｐＰＥＰＣＰＹＲＡの構成
ｐｙｒＡ遺伝子を含む４kbのＸｂａＩフラグメントを、ｐＡＸＩ（ＤＳＭ７０１７）から切断し、そしてベクター配列から精製する。
２μｇのｐＴＺＰＥＰＤを、製造業者の推薦に従ってＮｈｅＩ及びＮｃｏ１により切断し、そして次にフェノール抽出し、エタノール沈殿せしめ、そして水２０μｌに再溶解する。次に、このＤＮＡを細菌アルカリホスファターゼにより処理し、５′ホスフェート基を除去する。Ｈｉｓ及びＳｅｒ活性部位を含む０．６kbp のＮｈｅＩ−ＮｃｏＩフラグメントを欠く５．３kbのフラグメントを、ゲルから精製する。
【０１６９】
上記両フラグメントを、製造業者の指示に従ってＴ４ポリメラーゼにより処理し、そしてフェノール抽出し、そしてエタノール沈殿せしめる。その２つのフラグメントを一緒に混合し、そして連結する。Ｅ．コリの形質転換の後、正しいプラスミドを担持するコロニーを、ミニ−プラスミド調製物の制限消化物により同定する。
ｐＰＥＰＤＰＹＲＡは、オロチジンモノホスフェートデカルボキシラーゼをコードするＸｂａＩ ＤＮＡフラグメントにより置換された、Ｈｉｓ及びＳｅｒ活性部位をコードする、中心ＮｈｅＩ−ＮｃｏＩフラグメントを有する、ｐｅｐＤ遺伝子を担持するＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII フラグメントを含むｐＴＺ１８Ｒベクターから成る。
【０１７０】
例１３．４：Ａ．ニガーの形質転換
１０μｇのプラスミドｐＰＥＰＣＰＹＲＡを、ＥｃｏＲＩにより完全に消化する。消化物の完全性を、ゲル上にアリコートを作用せしめることによって調べ、そして残りのＤＮＡをフェノール抽出し、エタノール沈殿せしめ、そして２０μｌの滅菌水に再懸濁する。
栄養要求性Ａ．ニガーＡｎ８（ＤＳＭ３９１７）の分生胞子を、十分に胞子形成されるまで、完全培地上で２８℃で４日間、増殖する。２×１０⁸ 個の分生子柄を用いて、１ｇ／ｌのアルギニン及びウリジンにより補充された最少培地２００mlを接種する。
【０１７１】
２８℃及び１８０rpm での２０時間の増殖の後、菌糸体を Miraclothを通しての濾過により収穫し、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液１０mlにより２度洗浄し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ ，０．５mg／mlのNovozym ２３４(Novo Industries) の溶液２０mlに再懸濁する。その混合物を、十分なプロトプラストが開放されるまで（９０〜１２０分後、顕微鏡により検出される）、振盪水浴においてインキュベートする（３０℃，５０rpm ）。プロトプラスト懸濁液を、菌糸体残骸を除去するために、漏斗におけるガラス羊毛プラグを通して濾過する。プロトプラストを室温で、軽い遠心分離（１０分、２０００rpm ）によりペレット化し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液１０mlにより２度洗浄する。最終的にプロトプラストを０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液２００〜５００μｌに再懸濁し、１×１０⁸ 個のスフェロプラスト／mlの濃度を付与する。
【０１７２】
形質転換のために、プロトプラスト懸濁液の２００μｌアリコートを、ＥｃｏＲＩにより消化されたｐＰＥＰＣＰＹＲＡ ５μｇ及び５０μｌのＰＣＴ（１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５，５０mMのＣａＣｌ₂ ，２５％のＰＥＧ６０００）と共にインキュベートする。そのインキュベーション混合物を２０分間氷上に保持し、他の２mlのＰＣＴを添加し、そしてその混合物を室温でさらに５分間インキュベートする。０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液４mlを添加し、そして最終形質転換溶液の１mlアリコートを、液体最少寒天培地（最少培地＋１ｇ／ｌのアルギニン＋１０ｇ／ｌのBacto-Agar (Difco)) と共に混合し、０．８ＭのＫＣｌにより安定化する。その混合物をすぐに、同じ培地の寒天プレート上に注ぎ、そして３０℃でインキュベートする。
２８℃で２〜３日間の増殖の後、安定した形質転換体は激しく増殖し、そして数百の小さな、たぶん早産の形質転換体のコロニーをバックグラウンド増殖に対して胞子形成するように思われる。
【０１７３】
例１３．５：遺伝子破壊の同定
安定コロニーから、個々の胞子懸濁液を製造し、そして新鮮な最少＋アルギニンプレート上で画線培養する。単一のコロニーを選択し、そして再画線培養し、純粋な培養物を付与する。それらは、１ｇ／ｌのアルギニンにより補充された液体最少培地２００mlを接種するために使用される。３０℃で２４時間１８０rpm での振盪の後、菌糸体をフィルター紙上に収穫し、そしてパッドを凍結乾燥せしめる。乾燥の後、ＤＮＡを個々のパッドから、そのパッドを乳棒及び乳ばちを用いて細かな粉末に粉砕することによって調製する。この粉末６０mgを、１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．１％のTween ８０，１Ｍの酢酸アンモニウムの溶液３mlに撹拌しながら再懸濁する。これを、時々混合しながら、６５℃で２０分間加熱する。細胞残骸を、１５，０００rpm での５分間の遠心分離によりＤＮＡ溶液から分離する。上清液をフェノールにより２度、クロロホルムにより２度抽出し、そしてエタノール沈殿せしめる。そのＤＮＡを滅菌ＴＥ １００μｌに再溶解する。
【０１７４】
個々のＤＮＡ ２０μｌを、 RNAase Ａ １μｇの存在下で１時間、ＢａｌIIにより消化する。これをアガロース上で分離し、そしてニトロセルロース膜に移し、そして焼き付ける。ＰＥＰＤを含むｐＴＺＰＥＰＤからのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、ニックトランスレーションによりラベルし、そしてフィルターをプローブするために使用する。ｐｅｐＤ遺伝子の破壊を担持する株は、０．６kbのＮｈｅＩ−ＮｈｏＩハイブリダイゼーションフラグメントを欠き、そして他の２つのフランキングフラグメントの変更された移動性を有することによって容易に認識される。
【０１７５】
それらの株の１つを、ウリジン及び５−フルオロ−オロト酸を含む培地上にプレートする。ピリミジン栄養要求性に対する変異体を、この培地上で最強の増殖により同定し、そして採取し、そして単一のコロニーのために画線培養することによって精製する。
【０１７６】
例１３．６：ｐｅｐＤ ^- Ａ．ニガー株におけるインターフェロンの生成
例６．５で単離されたｐｅｐＤ^- Ａ．ニガーＡｎ８株の１つを、ｐｙｒＡ⁺ 含有プラスミド及びインターフェロンのための非相同遺伝子を含む発現カセットによる続く形質転換のための宿主として使用する。
Ａ．ニガーＡｎ８のウリジン栄養要求性ｐｅｐＤ^- 変異体の分生胞子を、十分に胞子形成されるまで、完全培地において２８℃で４日間、培養する。２×１０⁸ 個の分生子柄を用いて、１ｇ／ｌのアルギニン及びウリジンにより補充された最少培地２００mlを接種する。
【０１７７】
２８℃及び１８０rpm での２０時間の増殖の後、菌糸体を、 Miraclothを通しての濾過により収穫し、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液１０mlにより２度洗浄し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ ，０．５mg／mlのNovozym ２３４(Novo Industries) の溶液２０mlに再懸濁する。その混合物を、十分なプロトプラストが開放されるまで（９０〜１２０分後、顕微鏡により検出される）、振盪水浴においてインキュベートする（３０℃，５０rpm ）。そのプロトプラスト懸濁液を漏斗におけるガラス羊毛プラグを通して濾過し、菌糸残骸を除去する。プロトプラストを室温で軽い遠心分離（１０分、２０００rpm ）によりペレット化し、そして０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液１０mlにより２度洗浄する。最後に、プロトプラストを、０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液２００〜５００μｌに再懸濁し、１×１０⁸ ／mlの濃度を得る。
【０１７８】
形質転換のために、プロトプラスト懸濁液の２００μｌアリコートを、５μｇのｐＣＧ５９Ｄ７（ＤＳＭ３９６８）及び５０μｇのｐＧIIｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１９又はｐＧII−ＩＦＮ ＡＭ１１９ＤＮＡ（両プラスミドはＥＰ−出願第０４２１９１９号に十分に開示される）、及び５０μｌのＰＣＴ（１０mMのトリス−ＨＣｌ，pH７．５，５０mMのＣａＣｌ₂ ，２５％のＰＥＧ６０００）と共にインキュベートする。そのインキュベーション混合物を２０分間氷上に保持し、他の２mlのＰＣＴを添加し、そしてその混合物を室温でさらに５分間インキュベートする。０．８ＭのＫＣｌ，５０mMのＣａＣｌ₂ の溶液４mlを添加し、そして最終形質転換溶液の１mlアリコートを、液体最少寒天培地（最少培地＋１ｇ／ｌのアルギニン＋１０ｇ／ｌのBacto-Agar (Difco)) と共に混合し、０．８ＭのＫＣｌにより安定化する。その混合物をすぐに、同じ培地の寒天プレート上に注ぎ、そして３０℃でインキュベートする。
【０１７９】
２８℃で２〜３日間の増殖の後、安定した形質転換体は激しく増殖し、そして数百の小さな、たぶん早産の形質転換体のコロニーをバックグラウンド増殖に対して胞子形成するように思われる。
形質転換体を採取し、そしてインターフェロン発現について分析する。インターフェロン活性を、ヒトＣＣＬ−２３細胞及び挑戦ウィルスとして水疱性口内炎ウィルス（ＶＳＶ）を用いて、 Armstrongの方法(J.A.Armstrong, Appl.Microbiol. 21, 732 (1971)) に従って決定する。
【０１８０】
形質転換体からの分生胞子を、予備培養培地(Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) ３ｇ／ｌ，ＮＨ₄ Ｃｌ ２ｇ／ｌ，ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．５ｇ／ｌ，ＮａＣｌ ０．５ｇ／ｌ，ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ ０．５ｇ／ｌ，Ｃａ₂ ＳＯ₄ ・２Ｈ₂ Ｏ ０．５ｇ／ｌ，pH７．０，１％のアルギニン）５０ml中で個々に予備培養する。その予備培養物を、２５０rpm 及び２８℃で７２時間インキュベートする。１０％の予備培養物を用いて、主要培養培地（大豆粉２０ｇ／ｌ、ペクチン Slow Set ５ｇ／ｌ，１％のアルギニン）５０mlを接種する。その培養物を、２５０rpm 及び２８℃で、７２〜９６時間、増殖せしめる。
【０１８１】
種々の時間（２０時間ごとに）で、サンプルを採取し、細胞を遠心分離によりペレット化し、そして凍結乾燥及び乾燥粉砕により破壊する。上清液及び細胞抽出物を、記載のようにしてインターフェロン活性について両者とも試験する。大部分のインターフェロン活性は、ｐＧIIｓｓ−ＩＦＮ ＡＭ１１９を担持する形質転換体においては、培地中に分泌されることが見出され、そしてｐＧII−ＩＦＮ ＡＭ１１９を担持する形質転換体においては、それは細胞抽出物に主に見出される。
【０１８２】
例１４：Ａ．ニガーにおけるｐｅｐＤの過剰発現
例１４．１：複数コピーの過剰発現
Ａ．ニガーＡｎ８を、１μｇのｐＡＸＩ＋１０μｇのｐＴＺＰＥＰＤにより形質転換し、ウリジンフォートフス(Photohuhs) を生成する。コロニーを精製し、そしてＤＮＡを上記のようにして調製する。ｐＴＺＰＥＰＤのＨｉｎｄIII フラグメントを用いてのサザンブロットは、いくつかの形質転換体がそれらのゲノム中に組込まれたｐＴＺＰＥＰＤの単一コピーを有し、ところが他はそれらのゲノム中に１０までの及び１０以上の余分なコピーを有することを示した。それらの株は、対応して一層のタンパク質分解活性を生成し、そして分裂的に安定する。
【０１８３】
例１４．２：遺伝子融合体からｐｅｐＤの過剰発現
Ａ．ニガーピルベートキナーゼプロモーター領域、及びＡ．ニガーｐｅｐＤ遺伝子のコード及びターミネーター領域から成る遺伝子融合体を構成する。その融合体は、組換えＰＣＲ(R.Higuchi：Recombinant PCR, 177〜183 ページ、 Innisなど. 、PCR Protocols, Academic Press,Inc. (1990))により構成される。 fusoligo １，２及び３がそれぞれ配列番号１２，１３及び１４に示されている４種のオリゴヌクレオチドプライマーを企画し、ところがここで fusoligo ４は配列番号１におけるヌクレオチド２８５８〜２８７４の間の配列に対して相補的である。 Fusoligo １は、ＡＴＧ開始コドンの０．７５kbp 上流のｐｋｉプロモーターにハイブリダイズする。 Fusoligo ２及び３は、相補的鎖上で一部オーバーラップし、両者は、ＡＴＧ翻訳開始コドンからのすぐ上流のｐｋｉプロモーターの配列、ＡＴＧコドン自体及びまた、ＡＴＧコドンのすぐ下流のｐｅｐＤコード領域の配列を含む。 Fusoligo ４は、翻訳停止部位の０．６５kbp 下流のｐｅｐＤ遺伝子下流領域にハイブリダイズする。２種のＰＣＲ反応は上記のようにして実質的に行なわれる。初めにおいては、０．７５kbp のｐｋｉプロモーターフラグメントを、鋳型として fusoligo １及び２、及びｐＧＷ１１００（ＤＳＭ５７４７）を用いて増幅する。次に、ｐｅｐＤコード及び終結領域を含む２．０kbフラグメントを、鋳型として fusoligo ３及び４を用いて増幅する。それらの増幅生成物をアガロースゲルから精製し、組合し、変性し、そして再アニールする。それらの２種のフラグメントは、 fusoligo ２及び３によるそれらのオーバーラップ端のために再アニール反応の間、ホモ一及び又はホモ二本鎖を形成する。次にこのアニールされた混合物を、２種の“外部 (outside)”プライマー(fusoligo １及び４）を用いてＰＣＲにより再増幅する。この反応の生成物を、単離し、精製し、そしてプラスミドベクター中にサブクローン化する。
【０１８４】
正しいプラスミドを、ミニプラスミド調製物を消化することによって同定する。２種を選択し、そしてその挿入体を、合成オリゴヌクレオチドを用いて完全に配列決定する。ｐＰＫＩＰＥＰＤＡと呼ばれる、ｐｅｐＤ読み取り枠へのピルベートキナーゼプロモーターの完全な融合体を含む１つのプラスミドを、ｐＡＸＩと共に使用し、ウリジン原栄養性にＡ．ニガーＡｎ８を同時形質転換する。
【０１８５】
ｐｋｉ−ｐｅｐＤ融合体の存在は、個々の精製された形質転換体からＤＮＡを製造し、そしてｐｋｉ及びｐｅｐＤからのプローブを用いてサザン分析のためにそれを使用することによって確認される。ゲノム中に組込まれる遺伝子融合体の１又は複数のコピーを有する株は、細胞がＣ源としてのグルコース上で急速に増殖される場合、より一層のタンパク質分解活性を生成することが示される。
【０１８６】
例８：他の生物におけるｐｅｐＤの発現：酵母における発現
プラスミドｐＴＺＰＥＰＤを、ＥｃｏＲＩにより切断し、Ｔ４ポリメラーゼによりブラント末端化し、そして連結し、従って、ポリリンカー領域からＥｃｏＲＩ部位を除去する。次に、その得られたプラスミドを、それぞれ、配列番号１５，１６，１７及び１８として配列表において示される４種の合成オリゴヌクレオチドオリゴ酵母１，２，３及び４によりインビトロ変異誘発せしめる。オリゴ酵母１は、ｐｅｐＤのＡＴＧのすぐ上流にＥｃｏＲＩ部位を構築し、そして他の３種は個々の３種の全イントロンをループする。これは、その配列が完全な配列決定により確認されているプラスミドｐＴＺＰＥＰＤを創造する。
【０１８７】
ｐｅｐＤのＡＴＧのすぐ前で始まり、そしてターミネーター領域の後で終結する２．２kbのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを精製し、そして酵母ＧＡＬ１０プロモーターを含む、ｐＦＢＹ１２９（ＤＳＭ７０１６として寄託される）の５２０bpのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩフラグメントと共に、酵母基材の２μｍベクターｐＦＢＹ２５（ＤＳＭ７０２０として寄託される）のＳｎａＢＩ部位中に連結する。正しいプラスミドを、制限消化物により同定する。このプラスミド、すなわちｐＧＡＬ１０ＰＥＰＤを用いて酵母を形質転換し、そして遺伝子融合がガラクトースにより誘発される場合、ｐｅｐＤタンパク質を生成することが示される。
【０１８８】
微生物の寄託
次の微生物を、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Wey 1b, D-3300 Braunschweig にブダペスト条約下で寄託する：

【０１８９】
【配列表】

【０１９０】

【０１９１】

【０１９２】

【０１９３】

【０１９４】

【０１９５】

【０１９６】

【０１９７】

【０１９８】

【０１９９】

【０２００】

【０２０１】

【０２０２】

【０２０３】

【０２０４】

【０２０５】

【０２０６】

Claims (8)

1. スブチリシン型のアスペルギラス・ニガー セリンプロテアーゼのための遺伝子における変異誘発による機能的タンパク質をもはや発現できない欠陥を有するアスペルギラス・ニガー株において、前記変異誘発前の遺伝子が、
   （１）配列番号：２に記載の１位のアミノ酸から517位のアミノ酸までのアミノ酸配列を有するスブチリシン型セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
   （２）配列番号：２に記載の１位のアミノ酸から517位のアミノ酸までのアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されているアミノ酸配列を有するスブチリシン型セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
   （３）配列番号：１に記載のヌクレオチド配列を有するDNAのコード領域に高スタリンジェント条件下でハイブリダイズし、スブチリシン型セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
   （４）配列番号：７に記載のアミノ酸配列を有するスブチリシン型セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
   （５）配列番号：７に記載のアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換により修飾されているアミノ酸配列を有するスブチリシン型セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；あるいは
   （６）配列番号：６に記載のヌクレオチド配列を有するDNAのコード領域に高スタリンジェント条件下でハイブリダイズし、スブチリシン型セリンプロテアーゼをコードする遺伝子；
   であることを特徴とするアスペルギラス・ニガー株。
2. 配列番号１の配列のpepC遺伝子における欠陥を有するアスペルギラス・ニガー、配列番号６の配列のpepD遺伝子における欠陥を有するアスペルギラス・ニガー、又はそれぞれ配列番号１及び６の配列のpepC及びpepD遺伝子の両者における欠陥を有するアスペルギラス・ニガーから成る群から選択された請求項１記載のアスペルギラス・ニガー株。
3. 前記変異誘発による欠陥が、インビトロ変異誘発による欠陥である、請求項１又は２に記載のアスペルギラス・ニガー株。
4. 前記変異誘発による欠陥が、遺伝子の破壊である、請求項２に記載のアスペルギラス・ニガー株。
5. 前記遺伝子の破壊が、セリンプロテアーゼ内因性遺伝子の欠陥のある外因性遺伝子による置換、又はセリンプロテアーゼ遺伝子へのマーカー遺伝子の挿入による破壊である、請求項４に記載のアスペルギラス・ニガー株。
6. 請求項１〜５の何れか１項に記載の、スブチリシン型のアスペルギラス・ニガー セリンプロテアーゼのための遺伝子における欠陥を有するアスペルギラス・ニガー株の調製方法であって、スブチリシン型のセリンプロテアーゼのための内因性染色体アスペルギラス・ニガー遺伝子に変異を導入することを含んで成る方法。
7. スブチリシン型のアスペルギラス・ニガー セリンプロテアーゼのための遺伝子における欠陥を有するアスペルギラス・ニガーの調製のための方法において、スブチリシン型のアスペルギラス・ニガー セリンプロテアーゼのための遺伝子のインビトロ変異、スブチリシン型のセリンプロテアーゼのための対応する内因性染色体遺伝子を担持するアスペルギラス・ニガー宿主の前記インビトロ変異された遺伝子による形質転換、及び前記内因性遺伝子が前記インビトロ変異された遺伝子により置換されている変異体の単離、を含んで成る請求項６記載の方法。
8. 前記内因性遺伝子が、配列番号１を有する配列のアスペルギラス・ニガーpepC遺伝子、配列番号６を有する配列のアスペルギラス・ニガーpepD遺伝子、又は前記pepC及びpepD遺伝子の両者である請求項６又は７に記載の方法。