FI112667B - Uusi sieniproteaasi - Google Patents

Description

112667

Uusi sieniproteaasi - Nytt svampproteas Tämä keksintö koskee uutta DNA-sekvenssiä, joka koodittaa Aspergillus nigerin seriiniproteaasia ja menetelmää sen 5 valmistamiseksi. Keksintö koskee lisäksi uutta

Aspergillus-kantaa, jonka pepC- ja/tai pepD-geeni on vajavainen, ja joka on käyttökelpoinen heterologisen proteiinin ilmentämiseksi, ja menetelmää sellaisen kannan valmistamiseksi.

10

Aspergillus-ryhmää (Aspergillus species), ja erityisesti Aspergillus nigeriä, käytetään elintarvikeprosessiteolli-suudessa käytettyjen entsyymien teolliseen tuotantoon. A. niger on edullinen isäntänä yhdistelmäproteiinituotannos-15 sa johtuen sen suuresta proteiinien erityskapasiteetista, ja koska systeemit sen geneettiseksi muokkaamiseksi ovat saatavilla. Proteaasien läsnäolo kasvuliemessä on kuitenkin osoittautunut haitalliseksi heterologisten proteiinien ilmentämiselle A. nigerissä, aspergillejä itse asi-20 assa käytetään kaupallisesti proteaasien tuottamiseen. Muutamia solun ulkopuolisia aspergillien proteaaseja on kuvailtu kirjallisuudessa [Barthomeuf et ai., Biotech.

1' Tech. 2:29-34 (1988); Barthomeuf et ai., Chem. Pharm.

Γ Bull.(Tokio) 37:1333-1336 (1989); Bosmann, H.B., : 25 Biochim.Biophys. Acta 293:476-489 (1973); Ichishima, E.,

Biochim. Biophys. Acta 258:274-288 (1972); Chopra, S. ja Mehta, P., Folia Microbiol. 3^:117-125 (1985); Krishnan ,·;·, ja Vijayalakshimi, J. Chromatogr. 329:165-170 (1985)].

Geeni pepA, joka koodittaa aspergillopepsiini A:ta Asper-,, , 30 gillus awamorista, on äskettäin kloonattu [Berka et ai., • Gene 86^:153-162 (1990)]. pepA-geenituote vastaa suurinta osaa erittyvistä happamista proteaaseista A. nigerissä ja ;V: kannat, joista pepA-geeni on poistettu, ovat mahdollista- neet heterologisten proteiinien lisääntyneen ilmenemisen 35 A. niger var. awamorissa [Dunn-Coleman et ai., Biotechno-; logy 9:976-981 (1991)]. Muita proteaasigeenejä on myös 112667 2 äskettäin kloonattu aspergilleistä ja näitä ovat A. ory-zaen alkalinen seriiniproteaasi [Tatsumi et ai., Mol.

Gen. Genet. 219:33-38 (1989)], A. fumiqatuksen alkalinen seriiniproteaasi [Jaton-Ogay et ai., FEMS Microbiol.

5 Letts. 92:163-168 (1992)], ei-pepsiinityyppinen hapan proteaasi A. niqer var. macrosporuksesta [Inoue et ai., J. Biol. Chem. 266:19484-89 (1991)] ja metalloproteaasi nimeltä neutraali proteaasi II A. orvzaesta [Tatsumi et ai.. Mol. Gen. Genet. 228:97-103 (1991)].

10 A. niqerin eristettyjä ja mutatoituja proteaasigeenejä voidaan käyttää geenien hajaannuttamiskokeissa, so. mu-tanttikantojen valmistukseen, joissa vastaava luonnollinen geeni hajotetaan. Esimerkiksi pepA-geeni Aspergillus 15 awamorista on hajotettu geenien hajaannuttamisen avulla aspergillopepsiini A -negatiivisten kantojen valmistamiseksi (Berka et ai., ks. edellä).

Kuten edellä kuitenkin on mainittu, aspergillit tuottavat 20 suuren joukon erilaisia proteaaseja ja siten tarvitaan jatkuvasti Aspergillus-kantoia, jotka ovat vajavaisia muiden proteaasien suhteen, proteiinien teollista tuottamista varten. Tätä tarkoitusta varten tarvitaan myös muita proteaasigeenejä, joita voidaan käyttää proteaasinega-25 tiivisten kantojen valmistukseen in vitro -mutatoinnin, • esim. geenihajauttamisen avulla. Sen lisäksi tarvitaan ' myös yhdistelmäproteaasiproteiineja, joita voidaan käyt- ' * tää teollisesti proteiinien prosessointiin.

: : : 30 Toisen erittyneitä proteaaseja käsittävän pääryhmän muodostavat seriiniproteaasit [Sakka et ai., J. Ferment. Technol. 63:479-483 (1985)]. Sienten seriiniproteaaseja , on laajasti karakterisoitu homeella T. album ja hiivalla

Saccharomyces cerevisiae. T. album erittää luultavasti ’ ·’ 35 kolmea läheisesti toisiinsa liittyvää seriiniproteaasia, *,,,· joista parhaiten karakterisoitu on proteinaasi K [Jany et : ai., FEBS 199:139-144 (1986)], kun taas homologinen pro- 3 112667 teiini hiivassa sijaitsee vakuolissa [Wolf ja Ehmann,

Eur. J. Biochem. 98^:375-384 (1979)]. Kaikkien näiden T. albumin ja S. cerevisiaen proteiinien geenit on kloonattu ja karakterisoitu [Gunkel ja Gassen, Eur. J. Biochem.

5 175:185-194 (1989), Samal et ai., Gene 85:329-333 (1989),

Samal et ai., Molec. Microbiol. 4:1789-1792 (1990) ja Moehle et ai., Molec. Cell. Biol. 7:4390-99 (1987)]. Aikalisiä seriiniproteaaseja on kloonattu ja karakterisoitu myös A. oryzaessa, A. fumigatuksessa ja Achremonium chry- 10 sogenumissa [Tatsumi et ai., Mol. Gen. Genet. 219:33-38 (1989); Jaton-Ogay et ai., FEMS Microbiol. Letts. 92:163-168 (1992); Isogai et ai., Agric. Biol. Chem. 55:471-477 (1991)].

15 Tämän jälkeen on havaittu, että Aspergillus tuottaa myös subtilisiiniperheen proteaaseille homologisia seriinipro-teaaseja. Tämä keksintö keskittyy tämäntyyppiseen prote-aasiin.

20 Tämän keksinnön kohteena on saada aikaan Aspergillus nigerin seriiniproteaasia koodittava DNA-molekyyli, jolla seriiniproteaasilla on Sekvenssin nro 2 tai Sekvenssin nro 7 mukainen aminohapposekvenssi.

: : : 25 Keksintö koskee lisäksi Aspergillus nigerin ·;··: subtilisiinityyppistä yhdistelmäseriiniproteaasia ja tätä tarkoitusta varten myös Aspergillus niger -kantaa sen * * tuottamiseksi.

... 30 Toisena kohteena on saada aikaan pepC-geenin ja/tai pepD- geenin suhteen vajavainen Aspergillus -kanta. jota kantaa ’’ voidaan käyttää heterologisten proteiinien tuottamiseen ·/ tehokkaammin.

» ! » ‘ , 35 Tämä keksintö koskee Aspergilluksen subtilisiinityyppistä ; seriiniproteaasia. Kyseistä proteaasia nimitetään tässä yhteydessä 11 Aspergillus -subtil is i iniks i". Tämän keksinnön mukainen "Aspergillus-subtilisiini" käsitetään sellaisek- 4 112667 si, joka on (a) saatu Aspergillus-ryhmästä, (b) jolla on proteaasiaktiivisuutta johtuen katalyyttisestä seriini-tähteestä aktiivisessa kohdassa, ja (c) jonka aminohapposekvenssi on riittävän homologinen tunnettujen se-5 riiniproteaasien suhteen subtilisiiniperheeseen ryhmittämistä varten. Aspergillus-subtilisiini -ilmauksen piiriin luetaan tässä keksinnössä käytettynä myös kyseisen entsyymin fragmentit, joissa on jäljellä seriiniproteaasin aktiivisuus, täyspitkien entsyymien ollessa kuitenkin 10 edullisia suoritusmuotoja. Tulee käsittää, että myös fuu-sioproteiinit, jotka käsittävät keksinnön mukaisen "Aspergillus -subtilisiinin11 liittyneenä lisäksi tuleviin aminohappoihin, peptideihin tai proteiineihin, ovat osa tätä keksintöä.

15

Aspergillus-subtilisiini tarkoittaa edullisessa merkityksessä proteaasia tai aktiivista fragmenttia saatuna Aspergillus nigeristä, edullisemmin proteaasia tai aktiivista fragmenttia, jonka aminohapposekvenssi tai osasek-20 venssi on esitetty Sekvenssiluettelon Sekvenssi l:ssä ja vastaavasti Sekvenssi 6:ssa.

Tämä keksintö koskee myös eristettyä DNA-sekvenssiä, joka j ',· koodittaa tämän keksinnön mukaista Aspergillus nigerin : : 25 seriiniproteaasia, jolla on Sekvenssin nro 2 tai ·;··: Sekvenssin nro 7 mukainen aminohapposekvenssi, ja hybridivektoria sellaisen DNA-sekvenssin kloonaamiseksi . ja monistamiseksi. Keksintö koskee lisäksi ekspressiohybridivektoria Aspergillus nigerin , 30 seriiniproteaasin tuottamiseksi, joka sisältää sellaisen DNA-sekvenssin toiminnallisesti kytkettynä säätelyalueiden kanssa, jotka ovat sopivia Aspergillus ; nigerin seriiniproteaasigeenin ilmentämiseksi sopivassa : isäntäsolussa. Keksintö koskee myös Aspergillus nigerin 35 seriiniproteaasin ilmentämiseen kykeneviä transformoituja ! isäntäsoluja, esimerkiksi Aspergillus niger -kantaa, joka kykenee yli-ilmentämään Aspergillus nigerin 5 112667 seriiniproteaasia geenin lisääntyneen kopioluvun ansiosta transformoinnin jälkeen.

Keksintö koskee myös Aspergillus niger -kantaa, joka on 5 negatiivinen pepC- ja/tai pepD-geenin suhteen, ja menetelmää sen valmistamiseksi Aspergillus niger -seriiniproteaasia koodittavan DNA-sekvenssin avulla, joka ei enää kykene ilmentämään toiminnallista proteiinia mutatoinnista, esim. geenin hajauttamisesta, johtuen.

10 Tämä keksintö koskee sen lisäksi menetelmiä keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin, hybridivektorin ja ekspressiovektorin valmistamiseksi samoin kuin menetelmiä pepC- ja/tai pepD-geenin suhteen negatiivisen Aspergillus 15 niger -kannan ilmentämiseksi ja ekspressiohybridivektorin sisältävän isäntäkannan ilmentämiseksi.

Aspergillus-subtilisiinia koodittava DNA-sekvenssi, hyb-ridivektorit kloonaukseen ja ilmentämiseen 20 Tämä keksintö koskee DNA-molekyyliä, joka käsittää Aspergillus nigerin seriiniproteaasia, jolla on . Sekvenssin nro 2 tai Sekvenssin nro 7 mukainen • aminohapposekvenssi, koodittavan DNA-sekvenssin. DNA- : . ; 25 sekvenssi voi sisältää yhden tai useamman intronin kuten ·;*’· DNA-molekyyleillä, jotka on eristettävissä genomisista V. DNA-kirjastoista, esim. Sekvenssi l:ssä esitetyllä pepC- geenillä tai Sekvenssi 6:ssa esitetyllä pepD-geenillä. Keksintö koskee kuitenkin myös DNA-sekvenssin int-3 0 ronitonta muunnosta, esimerkiksi sellaista, joka on eris-tettävissä cDNA:n kloonauksen avulla tai mutatoinnin jäi- * f keen, esim. käyttämällä PCR-tekniikkaa. Sellaiset int-: ronittomat geenit ovat erityisesti käyttökelpoisia ilmen- tämiseen ei-Aspergillus-isännissä, edullisesti prokaryoo-35 teissä tai hiivassa.

Keksintö koskee edullisesti DNA-molekyyliä, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa A. nigerin PEPC:tä, joka 112667 6 sisältää Sekvenssi l:ssä esitetyn aminohapposekvenssin, tai sen fragmenttia, jossa on jäljellä seriiniproteaasi-aktiivisuus. Keksinnön mukainen DNA-sekvenssi on edullisesti toimintavalmiin PEPC-proteaasin kooditusalue, 5 joka on esitetty nukleotidisekvenssissä Sekvenssi l:ssä. Keksintö koskee kuitenkin myös degeneroituneita DNA-sekvenssejä, jotka koodattavat PEPC:tä tai sen fragmenttia, so. sekvenssejä, jossa nukleotidit on vaihdettu muuttamatta kooditettua aminohapposekvenssiä. Sellaiset DNA-10 sekvenssit ovat käyttökelpoisia johtuen esimerkiksi eroista edullisessa kodonikäytössä eri isännissä tai johtuen uusien tunnistuskohtien läsnäolosta restriktioent-syymeille.

15 Toinen keksinnön mukainen edullinen suoritusmuoto on DNA-molekyyli, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa A. nigerin PEPD:tä, joka sisältää Sekvenssi 6:ssa esitetyn aminohapposekvenssin, tai sen osaa, jossa on jäljellä seriiniproteaasiaktiivisuus. Toinen keksinnön 20 mukainen edullinen DNA-sekvenssi on siis valmiin PEPD-proteaasin kooditusalue, joka on esitetty nukleotidisekvenssissä Sekvenssi 6:ssa. Keksintö koskee kuitenkin myös ’ degeneroituneita DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat PEPD- ; ; :tä tai sen fragmenttia, so. sekvenssejä, joissa nukle- ; 25 otidit on vaihdettu muuttamatta kooditettua aminohap- ...,{ posekvenssiä.

• I *

Keksintö koske myös hybridivektoria, joka sisältää in-serttinä keksinnön mukaista Aspergillus niger ,,, 30 -seriiniproteaasia koodittavan DNA-sekvenssin. Sellainen ; keksinnön mukainen hybridivektori on käyttökelpoinen * ' .* keksinnön mukaisen DNA-sekvenssin lisäämiseen ja monistamiseen. Sellainen ekspressiovektori käsittää , "ekspressiokasetin", jossa Aspergillus niger -seriini- 35 proteaasia koodittava DNA-sekvenssi on toiminnallisesti ! kytketty säätelysekvensseihin, jotka sopivat sellaisen * DNA-sekvenssin ilmenemisen ohjaukseen halutussa isäntäsolussa.

112667 7

Keksinnön mukainen hybridivektori, mukaan lukien eskpres-siovektori, voidaan saada mistä tahansa geenitekniikan alalla käyttökelpoisesta vektorista, kuten esimerkiksi viruksista, faageista, kosmideista, plasmideista tai kro-5 mosomaalisesta DNA:sta, kuten esimerkiksi SV40:n, herpesvirusten, papillooma-virusten, retrovirusten, bakulovi-rusten, faagi λ:η, esim. NM 989:n tai EMBL4:n, tai faagi M13:n, esim. M13mp8:n johdannaisista, bakteeriplasmi-deista, esim. pBR322:sta, pUC18:sta, tai hiivaplasmideis-10 ta, esim. hiivan 2μ -plasmidista, tai vajavaisesta viruksesta, faagista tai plasmidista auttajaviruksen, -faagin tai -plasmidin läsnäollessa, joka mahdollistaa vajavaisen viruksen, faagin tai plasmidin replikoinnin, esim.

M13(+)KS-vektorista esim. M14K07-auttajafaagin läsnäol-15 lessa, tai myös kromosomaalisesta DNA:sta, joka on peräisin esim. rihmasienistä kuten Aspergillus-ryhmästä, esim. A. nigeristä. esimerkiksi EP 184 438:ssa esille tuoduista. Edullisia ovat vektorit S. cerevisiaelle tai rih-masienille, edullisemmin Aspergillus-rvhmälle. vielä 20 edullisemmin A. nigerille.

Keksinnön mukainen hybridivektori, mukaan lukien ekspres-siovektori, vastaa halutun DNA:n replikaatiosta sopivassa isännässä, joko ekstrakromosomaalisena elementtinä tai . 25 kiinnittymällä isäntäkromosomiin. Useita mahdollisia vek- torisysteemejä on saatavissa keksinnön mukaisen kloonatun DNA:n liittämiseksi ja ilmentämiseksi. Periaatteessa • I ' kaikki vektorit, jotka replikoituvat, ja joita säilyte- ’ ’ tään pysyvästi valitussa isännässä, ovat sopivia. Vektori : V 30 valitaan siten riippuen transformaatioon aiotuista isän- : ,· täsoluista. Sellaiset isäntäsolut voivat yleensä olla prokaryoottisia tai eukaryoottisia mikro-organismeja ku-ten bakteereja, sieniä kuten hiivoja, edullisesti S♦ ce-revisiae. tai kuten rihmasieniä, edullisesti Aspergillus-35 ryhmä, edullisemmin A. niger. tai alkuperältään korkeam-pia eukaryoottisia soluja kuten selkärankaisten soluja, esimerkiksi nisäkkäiden soluja. Sopivia isäntäsoluja kä- 112667 8 sitellään yksityiskohtaisesti jäljempänä. Keksinnön mukainen hybridivektori, mukaan lukien ekspressiovektori, jota säilytetään ekstrakromosomaalisena elementtinä, käsittää replikaation aloituskohdan (ori) tai itsenäisesti 5 replikoituvan sekvenssin (ARS), valikoitavia merkkisek-venssejä ja valinnaisesti lisärestriktiokohtia. Vektorin, joka on tarkoitettu kiinnittyväksi isäntäkromosomiin, ei tarvitse sisältää ori:a eikä ARS:ia, koska se replikoituu solussa kromosomin yhteydessä.

10

Replikoinnin aloituskohta tai itsenäisesti replikoituva sekvenssi (DNA-osa, joka antaa ekstrakromosomaalisille elementeille itsenäisesti replikoituvat kyvyt) saadaan aikaan joko konstruoimalla vektori, joka sisältää ekso-15 geenisen aloituskohdan kuten sellaisen, joka on peräisin ihmisapinaviruksesta (SV40) tai muusta viruslähteestä, tai isäntäsolun kromosomaalisten mekanismien avulla.

Keksinnön mukainen hybridivektori, mukaan lukien ekspres-20 siovektori, voi sisältää myös valikoitavia markkereita riippuen isännästä, joka on tarkoitus transformoida, valikoida ja kloonata. Mitä tahansa merkkigeeniä voidaan käyttää, joka edesauttaa transformanttien seulontaa, joka perustuu markkerin fenotyyppiseen ilmenemiseen. Sopivia 25 markkereita ovat erityisesti ne, jotka ilmentävät antibi-oottiresistenssiä, esim. tetrasykliiniä tai ampisilliiniä f vastaan, tai auksotrofisten sienimutanttien ollessa kysy myksessä, geenit, jotka korjaavat isännän puutteita. Vastaavat geenit antavat esimerkiksi resistenssin antibioo-30 tille sykloheksimidi tai saavat aikaan prototrofian auk-> : sotrofisessa hiivamutantissa, edullisesti S. cerevisiaes- sa. esimerkiksi ura3-, leu2-, his3- tai trpl-geeni♦ Markkereina on mahdollista käyttää myös rakennegeenejä, jotka ovat liittyneet itsenäisesti replikoituvaan osaseen edel-35 lyttäen, että transformoitava isäntä on auksotrofinen markkerin ilmentämän tuotteen suhteen.

112667 9

Hybridivektoreiden, erityisesti ekspressiovektoreiden, yhteydessä erityisen tärkeitä merkkigeenejä A. nlqerille ovat ne, jotka täydentävät A. niger -isännän virheitä, kuten arqB-qeeni, joka koodittaa ornitiinikarbamoyyli-5 transferaasia, esim. saatuna A. niqeristä tai A. nidulan-sista (EP 184 438) tai A. nidulansin DNA-fragmenteista, jotka ovat homologisia N. crassan pvr4-qeenille. Muita sopivia merkkigeenejä kuvaillaan tämän jälkeen keksinnön mukaisten transformoitujen isäntien kuvailun yhteydessä.

10

Keksinnön mukainen hybridivektori, joka on sopiva Asper-qillus-subtilisiinia koodittavan DNA:n monistamiseen E. colissa, on esimerkiksi plasmidi pTZPEPC tai pTZPEPD, joita kuvaillaan tämän jälkeen seuraavissa esimerkeissä. 15

Ilmaus "ekspressiokasetti" tämän keksinnön mukaisen eks-pressiovektorin yhteydessä tarkoittaa Asperqillus-subti-lisiinin ilmentämiseen kykenevää DNA-sekvenssiä ja käsittää promoottorin, joka on toimivasti kytketty Asperqil-20 lus-subtilisiinin kooditusalueen kanssa, ja valinnaisesti yhden tai useamman lisäsäätelyosan, joita ovat signaa-lisekvenssi, transkriptionaalinen lopetussekvenssi, tran-skriptionaalinen tehostinsekvenssi, ribosomaalinen sitoutumiskohta, sekvenssi RNA:n tehokkaalle prosesoinnille, , 25 proteiinin tehokasta prosessointia koodittava sekvenssi 7; ja proteiinin oikeaa sijoittumista koodittava sekvenssi.

Asperqillus-subtilisiinia koodittava alue voi tämän kek-sinnön mukaisessa ekspressiokasetissa olla yhdistetty homologisiin säätelyosiin, so. siihen luonnollisesti kyt-30 keytyviin, tai heterologisiin säätelyosiin, so. muista v ·' geeneistä saatuihin.

‘ : Useita erilaisia promoottorisekvenssejä voidaan käyttää riippuen isäntäsolun tyypistä. Käyttökelpoisimpia ovat 35 promoottorit, jotka ovat voimakkaita ja samanaikaisesti hyvin säädeltyjä.

112667 10

Esimerkkejä promoottoreista ovat prokaryoottiset XPL-, λΡ„-, E. colin lac-, trp- tai tac-promoottorit. Promoottoreita, jotka ovat sopivia hiivassa, edullisesti S♦cere-visiaessa, ilmentämistä varten, ovat TRP1-, ADHI-, ADHII-5 , PH03-, PH05-, GALlO-promoottorit tai glykolyyttiset promoottorit kuten promoottori enolaasin, glyseraldehydi- 3-fosfaattidehydrogenaasin, 3-fosfoglyseraattikinaasin (PGK), heksokinaasin, pyruvaattidekarboksylaasin, fosfo-fruktokinaasin, glukoosi-6-fosfaatti-isomeraasin, 3-fos-10 foglyseraattimutaasin, pyruvaattikinaasin, trioosifos-faatti-isomeraasin, fosfoglukoosi-isomeraasin ja gluko-kinaasin geeneille tai PH05-GAPDH-hybridipromoottori (EP-A-213 593). Muita esimerkkejä eukaryoottisistä promoottoreista ovat promoottorit, jotka on saatu eukaryoottien 15 viruksista, esim. SV40-viruksesta, Rousin sarkoomaviruk-sesta, adenovirus 2:sta, naudan papilloomaviruksesta, papovaviruksesta, sytomegaloviruksesta saadut promoottorit tai nisäkässoluperäiset promoottorit, esim. aktiini-, kollageeni-, myosiini- tai β-globiinigeenien promootto-20 rit. Eukaryoottiset promoottorit voidaan yhdistää tehostavien sekvenssien kanssa, kuten esimerkiksi hiivan, edullisesti S cerevisiaen. geenin yläpuolisten aktivoivien sekvenssien (UAS) kanssa tai virus- tai solute-hostajien kanssa, kuten esimerkiksi sytomegalovirus IE-25 tehostajien, SV-40-tehostajien, immunoglobuliinigeenin ·*· tehostajien tai muiden tehostajien kanssa.

Tehostimet ovat transkriptiota stimuloivia DNA-sekvensse-jä, peräisin esimerkiksi viruksista kuten ihmisapinan ' : 30 viruksesta, polyoomaviruksesta, naudan papilloomaviruk- T: sesta tai Moloneyn sarkoomaviruksesta, tai genomista al kuperää. Tehostinsekvenssi voi olla peräisin myös Phvsa-rum polycephalumin ekstrakromosomaalisesta ribosomaali-sesta DNA:sta (PCT/EP 8 500 278). Sopivia tehostajia ovat 35 myös esimerkiksi geenin yläpuoliset aktivaatiokohdat, Λ* jotka on saatu hiivan hapan fosfataasi PH05 -geenistä.

11 11266/

Signaalisekvenssejä voivat olla esimerkiksi esisekvenssi tai eritystä ohjaava sekvenssi, joka ohjaa polypeptidin erittymistä, tai vastaava sekvenssi. Signaalisekvenssi on esimerkiksi Asperqillus-subtilisiinin signaali- tai oh-5 jauspeptidi, esimerkiksi Sekvenssi l:ssä esitetty signaalisekvenssi. Kirjallisuudesta tunnetaan lisää signaalisekvenssejä, esim. ne, jotka koottu julkaisuun von Hej-ne, G., Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986).

10 Sekvenssit, jotka ovat tarpeellisia kopioinnin aloitukselle ja lopetukselle ja mRNArn stabiloimiseksi, ovat tavallisesti saatavissa viruksen tai eukaryootin cDNA:n 5'-alueista ja vastaavasti 3'-alueista, esim. ekspressi-oisännästä.

15

Keksintö koskee yhdessä suoritusmuodossaan ekspressiovek-toria, joka sisältää intronittoman kooditusalueen, joka koostuu Sekvenssi 1:ssä esitetystä kooditusalueen ek-sonista tai neljästä Sekvenssi 6:ssa esitetystä kooditus-20 alueen eksonista Asperqillus-subtilisiinin ilmentämiseksi prokaryooteissa, esim. E. colissa. tai edullisesti hiivassa, edullisemmin S. cerevisiaessa GALlO-promoottorin ohjauksessa, kuten esimerkiksi plasmidissa pFBY138.

. 25 Keksintö koskee edullisesti ekspressiovektoria, joka on !!'! sopiva Asperqillus-subtilisiinia koodittavan DNA-sekvens- ' ; sin ilmentämiseksi Asperqillus-kannassa.

* · * -1**1 ‘ ' Yhdentyyppinen keksinnön mukainen ekspressiovektori kä- ; ’/ 30 sittää Asperqillus-subtilisiinia. edullisesti A. niqerin subtilisiinia. koodittavan DNA-sekvenssin promoottorin ohjauksessa, joka on luonnollisesti kytkeytynyt mainit-tuun DNA-sekvenssiin, so. sen homologinen promoottori. Edullisempi on ekspressiovektori, joka sisältää Sekvenssi 35 l:n mukaisen PEPCrtä koodittavan DNA-sekvenssin, edullisimmin Sekvenssi l:ssä esitetyn DNA-sekvenssin, Sekvenssi l:ssä esitetyn promoottorialueen ohjauksessa, tai eks- 112667 12 pressiovektori, joka sisältää Sekvenssi 6:n mukaisen PEPD:tä koodattavan DNA-sekvenssin, edullisimmin Sekvenssi 6:ssa esitetyn DNA-sekvenssin Sekvenssi 6:ssa esitetyn promoottorialueen ohjauksessa. Sekvenssi l:ssä esitetty 5 PEPC:n kooditusalue voidaan kuitenkin ilmentää myös Sekvenssi 6:ssa esitetyn PEPD-promoottorin ohjauksessa, ja päinvastoin.

Aspergillus-subtilisiini erittyy edullisesti alustaan.

10 Tämä voidaan saada aikaan käyttämällä signaalisekvenssiä, joka on toimivasti kytkettynä rakennegeeniin, edullisesti signaalisekvenssiä, joka on luonnollisesti kytkeytynyt Aspergillus-subtilisiinin rakennegeeniin, esimerkiksi kuten plasmidissa pTZPEPC, joka käsittää Sekvenssi l:ssä 15 esitetyn PEPC-signaalisekvenssin ja kooditusalueen, tai kuten plasmidissa pTZPEPD, joka käsittää Sekvenssi 6:ssa esitetyn PEPD-signaalisekvenssin ja kooditusalueen.

Jos sellaista ekspressiovektoria käytetään Asperaillus-20 subtilisiinin ilmentämiseen sen lajin isäntäkannassa, josta Aspergillus-subtilisiini on alunperin saatu, Aspergillus- subtil isiini yli-ilmenee, koska sekä yhdistelmä-geeni että alkuperäinen Aspergillus-subtilisiiniaeeni ovat aktiivisia samoissa ekspressio-olosuhteissa.

25

Toisentyyppinen keksinnön mukainen ekspressiovektori käsittää Aspergillus-subtilisiinia koodittavan DNA-sekvens-:·* sin Aspergilluksessa toiminnallisen promoottorin ohjauk sessa, joka ei ole luonnollisesti kytkeytynyt mainittuun ; '.· 30 DNA-sekvenssiin. Promoottori, joka on sopiva Aspergillus- V ·' subtilisiinin ilmentämiseen Aspergillus-ryhmässä. erityi sesti A. nigerissä, on esimerkiksi Aspergillus-rvhmän i'·’; pektiinilyaasigeenin promoottori, edullisesti A. nigerln PLI (EP-A-0 278 355) -, PLA-, PLB-, PLC-, PLE- tai PLF 35 (EP-A-0 353 188) -geenin promoottori, Aspergillus-rvhmän polygalakturonaasigeenin promoottori, edullisesti A. ni-gerin PGI- tai PGII-geenin promoottori (EP-A-421 919), 112667 13

Aspergillus-ryhmän pyruvaattikinaasigeenin promoottori, edullisesti A. nigerin pki-geenin promoottori (EP-A-439 997), tai myös tämän keksinnön mukaisen Aspergillus-sub-tilisiinigeenin promoottori, joka on esitetty Sekvenssi 5 l:ssä tai 6:ssa. Aspergillus-subtilisiinin erittyminen voidaan myös tässä tapauksessa saada aikaan käyttämällä signaalisekvenssiä, joka on toiminnallisesti kytketty rakennegeeniin, esimerkiksi signaalisekvenssiä, joka on luonnollisesti kytkeytynyt Aspergillus-subtilisiinin ra-10 kennegeeniin, esimerkiksi PEPC:n tapauksessa Sekvenssi l:ssä esitettyä signaalisekvenssiä. Voidaan kuitenkin käyttää myös signaalisekvenssiä, joka on heterologinen Aspergillus-subtilisiinille. esimerkiksi Aspergillus-ryh-män pektiinilyaasigeenin signaalisekvenssiä, edullisesti 15 A. niuer PLI (EP-A-0 278 355)-, PLA-, PLB-, PLE- tai PLF-geenin signaalisekvenssiä, tai Aspergillus-ryhmän polyga-lakturonaasi-geenin signaalisekvenssiä, edullisesti A. nigerin PGI- tai PGlI-geenin signaalisekvenssiä (EP-A-421 919).

20

Keksinnön mukaisessa edullisessa suoritusmuodossa, esimerkiksi plasmidissa pPKIPEPCA, A. nigerin pyruvaatti-kinaasipromoottori on toiminnallisesti kytketty Sekvenssi l:ssä esitettyyn kooditusalueeseen, joka koodittaa Asper-. 25 gillus-subtilisiinia kytkettynä sen homologiseen signaa- lisekvenssiin.

Toisessa keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa, esim.

' ‘ plasmidissa pPKIPEPDA, A. nigerin pyruvaattikinaasipro- ; 30 moottori on toiminnallisesti kytketty Sekvenssi 6:ssa ’ esitettyyn koodi tusalueeseen, joka koodi ttaa Aspergillus- subtilisiinia kytkettynä sen homologiseen signaalisek-venssiin.

14 '

Menetelmä Aspergillus-subtilisiinigeenin valmistamiseksi

Keksintö koskee myös menetelmää keksinnön mukaisen DNA-molekyylin valmistamiseksi, so. sellaisen DNA-molekyylin, 5 joka koodittaa keksinnön mukaista Asperqillus-subtilisii-nia, edullisesti sellaisen, joka koodittaa keksinnön mukaisen Aspergillus niger -seriiniproteaasin edullista muotoa, tai sellaisen DNA-molekyylin sisältävän hybridivektorin valmistamiseksi, mainitun menetelmän 10 käsittäessä mainitulla keksinnön mukaisella DNA- molekyylillä tai hybridivektorilla transformoidun isännän viljelyn. Vaihtoehtoisessa keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa keksinnön mukainen DNA-molekyyli voidaan valmistaa kemiallisen synteesin avulla 15 nukleotidikondensaation kautta.

Isäntien viljely suoritetaan tavanomaisessa ravintoalustassa, jota voidaan täydentää tai josta voidaan poistaa kemiallisia yhdisteitä, mikä mahdollistaa transformant-20 tien negatiivisen tai positiivisen valikoimisen, so. sellaisten isäntien, jotka sisältävät halutun DNA-molekyylin yhdessä valintamarkkerin kanssa, valikoimisen ei-trans-formanteista, so. sellaisista isännistä, joista puuttuu • · toivottu DNA-molekyyli.

25 ·;·«· Kaikkia alalla käyttökelpoisia transformoitavia isäntiä voidaan käyttää, esim. bakteereja kuten E. colia, sieniä kuten Saccharomyces cerevisiaeta, Kluyveromyces lactista, korkeampia eukaryoottisia soluja kuten hyönteissoluja tai . , 30 nisäkässoluja, esim. CHO-soluja, tai erityisesti rih- masieniä kuten Aspergillusta, esim. A. nidulansia, A. oryzaeta, A. carbonariusta, A. awamoria ja erityisesti A. nigeriä. Isäntien transformointi suoritetaan tavanomaisilla menetelmillä.

, 35 : AspergiUus-subtilisiinia koodittava DNA-sekvenssi voi daan saada Aspergillus-kannan genomista, joka kykenee ilmentämään AspergiUus-subtilisiinia, tai se voidaan 15 112667 valmistaa esimerkiksi viljelemällä isäntää, joka on transformoitu yhdistelmä-DNA -molekyylillä, joka sisältää Asperqillus-subtilisiinia koodattavan DNA-sekvenssin, ja tarvittaessa eristämällä haluttu DNA-sekvenssi siitä.

5

Erityisesti sellainen DNA voidaan valmistaa menetelmällä, joka käsittää vaiheet, joissa a) genomista DNA:ta eristetään sopivista Asperaillus-so-10 luista ja haluttu DNA valikoidaan, esim. käyttäen DNA- koetinta tai käyttäen sopivaa ekspressiosysteemiä ja seulomalla halutun polypeptidin ilmentymisen suhteen, b) mRNA:ta eristetään sopivista Asperqillus-soluista.

15 haluttu mRNA valikoidaan, esim. hybridisaation avulla DNA-koettimen kanssa tai ilmentämällä sopivassa ekspres-siosysteemissä ja seulomalla halutun polypeptidin ilmentymisen suhteen, kyseiselle mRNA:lie komplementaarinen yksijuosteinen cDNA valmistetaan, sen jälkeen kaksijuos-20 teinen DNA siitä, c) cDNA:ta eristetään cDNA-kirjastosta ja valikoidaan haluttu cDNA, esim. käyttäen DNA-koetinta tai käyttäen sopivaa ekspressiosysteemiä ja seulomalla halutun poly- 25 peptidin suhteen, ; d) kaksijuosteista DNA:ta syntetisoidaan ij]. vitro PCR- 6’ tekniikan avulla Asperqilluksen kokonais-DNA:sta käyttäen ' : oligonukleotidialukkeita, jotka on konstruoitu geenistä, : V 30 joka koodittaa A. niqerin pepC:tä tai A. niqerin pepD:tä : : tai muita muita tunnettuja subtilisiinityyppisiä se- riiniproteaaseja, tai 1 t ; , e) kohtien a), b), c) tai d) mukaisesti saatua kaksijuos- 35 teista DNA:ta liitetään sopivaan vektoriin, sopiva isäntä ’ ' transformoidaan, isäntää lisäkasvatetaan ja DNA eriste tään .

! < s 112667 16

Genominen DNA voidaan eristää ja seuloa halutun DNA:n suhteen (vaihe a). Genominen DNA eristetään Asperqillus-kannasta, joka kykenee ilmentämään Asperqillus-subti-lisiinia. Genominen DNA-kirjasto valmistetaan siitä pilk-5 komalla sopivilla restriktioendonukleaaseilla ja liittämällä sopiviin vektoreihin noudattaen vakiintuneita mene-telytapoja. Genominen DNA-kirjasto seulotaan DNA-koetti-men kanssa kuten tämän jälkeen kuvaillaan tai ilmennetään sopivassa ekspressiosysteemissä ja saadut polypeptidit 10 seulotaan tavanomaiseen tapaan.

Genomikirjasto voidaan valmistaa esim. pilkkomalla osittain A. niger -kannan, esim. NW756:n tai N400:n, genominen DNA esim. Sau3AI:llä tai Mbol:llä ja kloonaamalla 15 suurimolekyylipainoiset DNA-fragmentit sopivassa isäntä-vektorissa, esim. E. colin plasmidissa pUN121 tai lambda-vektorissa esim. EMBL4:ssä.

Muut sienikannat, jotka tuottavat haluttua Asperqillus-20 subtilisiinia, esimerkiksi A. iaponicus, A. oryzae. A.

nidulans, A. niger. voivat toimia genomikirjastolähteenä, ja muita sopivia vektoreita, esim. tätä ennen mainittuja, voidaan käyttää fragmenttien vastaanottajina.

. 25 Hybridisoituva DNA-koetin on välttämätön Asperqillus-sub- tilisiinia koodattavien DNA-sekvenssien seulomiseksi onnistuneesti genomisesta kirjastosta. Tämä voi olla syn-teettinen DNA-koetin, jos halutun Aspergillus-subtilisii-nin aminohapposekvenssi tai sen osa on tunnettu, tai toi-, 30 nen subtilisiinigeeni, esim. hiivasta, tai sen osa, joka ·' : hybridisoituu Asperqillus-subtilisiiniqeeniin.

* ; Polyadenyloitu lähetti-RNA (vaihe b) eristetään sopivista soluista tunnetuilla menetelmillä. Eristysmenetelmät kä-35 sittävät esimerkiksi homogenoinnin pesuaineen ja ribonuk-leaasin inhibiittorin, esim. hepariinin, guanidiini-iso-tiosyanaatin tai merkaptoetanolin läsnäollessa, mRNA:n 112667 17 uuttamisen sopivilla kloroformi-fenoliseoksilla, valinnaisesti suolan ja puskuriliuosten, pesuaineiden ja/tai kationeja kelatoivien aineiden läsnäollessa, ja mRNA:n saostamisen jäljelle jääneestä vesipitoisesta suolaa si-5 sältävästä faasista etanolilla, isopropanolilla tai vastaavilla aineilla. Eristetty mRNA voidaan jatkopuhdistaa sentrifugoimalla keesiumkloridigradientissa, jota seuraa seostaminen etanolilla, ja/tai kromatografisilla menetelmillä, esim. affiniteettikromatografialla, esimerkiksi 10 kromatografoimalla oligo(dT)selluloosalla tai oligo(U)se-faroosilla. Sellainen puhdistettu kokonais-RNA fraktioidaan edullisesti koon mukaan gradienttisentrifugoinnin avulla, esim. lineaarisessa sakkaroosigradientissa tai kromatografoimalla sopivissa koon mukaan fraktioivissa 15 kolonneissa, esim. agaroosigeeleillä.

Haluttu mRNA valikoidaan seulomalla mRNA suoraan DNA-koettimen kanssa tai lukemalla sopivissa soluissa tai soluvapaissa systeemeissä ja seulomalla saadut polypepti-20 dit.

Halutun mRNA:n valinta saadaan edullisesti aikaan käyttämällä DNA-hybridisaatiokoetinta kuten tämän jälkeen kuvaillaan, välttäen sillä tavalla lisäluentavaihe. Sopivia 25 DNA-koettimia ovat DNA:t, joiden nukleotidisekvenssi tun-netaan, esimerkiksi synteettiset DNA:t, mRNA: s ta saadut ; ' · cDNA:t, jotka koodittavat haluttuja polypeptidejä, tai : : genomiset DNA-fragmentit, jotka sisältävät esim. vierei- ; ; siä DNA-sekvenssejä, jotka eristetään luonnollisesta läh- 30 teestä tai geneettisesti manipuloidusta mikro-organismis- , ; . ta.

Fraktioitu mRNA voidaan lukea soluissa, esim. sammakon 1 varhaismunasoluissa, tai soluvapaissa systeemeissä, esim.

35 retikulosyyttilysaateissa tai vehnänalkiouutteissa. Saa- , ; dut polypeptidit seulotaan entsyymiaktiivisuuden suhteen ; tai reaktion suhteen vasta-aineiden kanssa, jotka on saa- 112667 18 tu aikaan natiivia polypeptidiä vastaan, esim. immunomää-rityksessä, esimerkiksi radioimmunomäärityksessä, entsyy-mi-immunomäärityksessä tai immunomäärityksessä fluoresoivien markkereiden kanssa. Sellaiset immunomäärityk-5 set ja polyklonaalisten ja monoklonaalisten vasta-aineiden valmistaminen ovat hyvin tunnettuja alalla ja niitä käytetään sen mukaisesti.

Yksijuosteisen komplementaarisen DNA:n (cDNA) valmistami-10 nen valikoidusta mRNA-templaatista on alalla hyvin tunnettua kuten myös kaksijuosteisen DNA:n valmistaminen yksijuosteisesta DNA:sta. mRNA-templaattia inkuboidaan deoksinukleosiditrifosfaattiseoksen, valinnaisesti radioaktiivisesta leimattujen deoksinukleosiditrifosfaattien 15 (jotta kyettäisiin seulomaan reaktion tulos), alukesek- venssin kuten oligo-dT-tähteen, joka hybridisoituu mRNA:n poly(A)-hännän kanssa, ja sopivan entsyymin kanssa kuten käänteistranskriptaasin kanssa, esim. linnun myelo-blastoosiviruksesta (AMV). mRNA-templaatin hajottamisen 20 jälkeen esim. alkalisella hydrolyysillä, cDNA:ta inkuboidaan deoksinukleosiditrifosfaattiseoksen ja sopivan entsyymin kanssa, jolloin saadaan kaksijuosteista DNA:ta. Sopivia entsyymejä ovat esimerkiksi käänteistranskriptaa-si, E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentti tai T4 25 DNA -polymeraasi. Itsestään yksijuosteisen cDNA:n päähän muodostunut hiusneulasilmukkarakenne toimii tavallisesti ; alukkeena toisen juosteen synteesille. Hiusneularakenne poistetaan pilkkomalla Sl-nukleaasilla. Yksijuosteisen DNA:n 3 '-päätä pidennetään ensin vaihtoehtoisesti homopo-30 lymeerisillä deoksinukleotidihännillä ennen mRNA-templaatin hydrolysoimista ja ennen seuraavaa toisen cDNA-juosteen synteesiä.

: * Kaksijuosteinen cDNA eristetään vaihtoehtoisesti cDNA- 35 kirjastosta ja seulotaan halutun cDNA:n suhteen (vaihe c). cDNA-kirjasto konstruoidaan eristämällä mRNA sopivista soluista ja valmistamalla yksijuosteista ja kaksijuos- 112667 19 teista cDNA:ta siitä kuten edellä on kuvailtu. Tämä cDNA pilkotaan sopivilla restriktioendonukleaaseilla ja liitetään λ-faagiin, esim. λ charon 4A:han tai λ gtllrsta noudattaen vakiintuneita menettelytapoja. Nitrosellu-5 loosamembraaneilla replikoitu cDNA-kirjasto seulotaan käyttäen DNA-koetinta kuten tätä ennen on kuvailtu tai ilmennetään sopivassa ekspressiosysteemissä, ja saadut polypeptidit seulotaan reaktion suhteen vasta-aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä halutuille yhdisteille.

10

Toinen menetelmä kaksijuosteisen DNA:n valmistamiseksi on PCR-tekniikka (vaihe d). Tätä menetelmää voidaan erityisesti käyttää valmistettaessa suuri määrä kaksijuosteista DNA:ta lähtien pienestä määrästä DNA:ta tai RNA:ta, joi-15 den sekvenssit tunnetaan ainakin osaksi. Lähtöaineena voidaan kuitenkin käyttää myös sekvenssiltään tuntematonta DNA-inserttiä, jota reunustavat tunnetut vektorisek-venssit. PCR-menetelmässä DNA-molekyylejä, esim. oli-gonukleotidejä, käytetään alukkeina DNA:n templaatista 20 riippuvaiselle entsymaattiselle synteesille. Suuria määriä voidaan valmistaa, koska kaksijuosteisen DNA:n dena-turointi, hybridisointi alukkeiden kanssa ja entsymaatti-nen synteesi voidaan perättäisesti toistaa. Syntetisoitujen DNA-molekyylien määrä kasvaa eksponentiaalisesti, 25 koska se kaksinkertaistuu jokaisessa kierroksessa. PCR-: tekniikka edustaa tekniikan tasoa ja sitä voidaan sopi- vasti käyttää tämän keksinnön mukaisesti. Oligonukleoti-dialuke voidaan konstruoida hybridisoitumaan DNA:hän, joka koodittaisi säilyneitä subtilisiinityyppisen se-30 riiniproteaasin sekvenssejä, perustuen vertailuihin tunnettujen subtilisiinityyppisten seriiniproteaasien kanssa. PCR-tekniikka on alalla hyvin tunnettua ja tavanomaista PCR-tekniikkaa voidaan soveltaa tähän keksintöön, esim. menetelmiä, joita kuvaillaan julkaisussa: 35 M.A. Innis et ai.(edit.), PCR protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego (1990).

112667 20

Alalla tunnetaan useita erilaisia menetelmiä kaksijuos-teisen cDNA:n tai genomisen DNA:n liittämiseksi sopivaan vektoriin (vaihe e). Kaksijuosteiseen DNAihan ja vektori-DNAihan voidaan esimerkiksi lisätä komplementaarisia ho-5 mopolymeerialueita inkuboimalla vastaavien deoksinukle-osiditrifosfaattien ja entsyymin kuten terminaalisen de-oksinukleotidyylitransferaasin läsnäollessa. Vektori ja kaksijuosteinen DNA yhdistetään sen jälkeen emäspariutta-malla komplementaariset homopolymeerihännät ja yhdiste-10 tään lopuksi spesifisten liittävien entsyymien kuten li-gaasien avulla. Muut mahdollisuudet käsittävät synteettisten kytkijöiden lisäämisen kaksijuosteisen DNA:n päihin tai kaksijuosteisen DNA:n liittämisen vektoriin tasa-pää- tai epätasapääligaation avulla. Sopivia vektoreita 15 käsitellään tämän jälkeen yksityiskohtaisesti.

Transformaatiomenettelyt sopivien isäntäsolujen transfor-moimiseksi saadulla hybridivektorilla ja transformoitujen isäntäsolujen valikointi ja lisääminen ovat alalla hyvin 20 tunnettuja. Esimerkkejä sellaisista menetelmistä esitetään lähemmin jäljempänä.

Keksinnön mukaisen halutun DNA:n, sen mutanttien ja fragmenttien eristäminen saadaan aikaan alalla tunnetuil-25 la menetelmillä, esim. uuttamalla fenolilla ja/tai kloro-formilla. DNA:ta voidaan valinnaisesti manipuloida lisää esim. käsittelemällä mutageenisilla aineilla mutanttien saamiseksi, tai pilkkomalla restriktioentsyymeillä frag-menttien saamiseksi, modifioimalla toinen tai molemmat 30 päät vektoriin liittämisen helpottamiseksi, poistamalla koodittamattomat välisekvenssit ja vastaavilla tavoilla.

Keksinnön mukaisen DNA:n nukleotidisekvenssi voidaan mää-: ’ rittää sinänsä tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi Ma- ' 35 xam-Gilbert-menetelmällä käyttäen päästä leimattua DNA:ta ; tai Sangerin dideoksiketjunpysäytysmenetelmällä.

112667 21 Tämän keksinnön mukaisia Aspergillus-subtilisiinin geenisekvenssejä voidaan valmistaa myös in vitro -synteesin avulla tavanomaisten menetelmien mukaisesti. In vitro -synteesi soveltuu erityisesti Aspergillus-subtilisiinin 5 geenin pienempien fragmenttien valmistukseen, jotka koo-dittavat Aspergillus-subtilisiinifraqmentteia. joissa on seriiniproteaasiaktiivisuutta. In vitro -synteesi on myös erityisen käyttökelpoinen DNA:n synteesiin, joka koodit-taa promoottoria tai signaalipeptidiä. In vitro -syntee-10 siä sovelletaan edullisesti Aspergillus-subtilisiinin geeniin, joka on peräisin A. niqeristä tai sen fragment-teihin, edullisimmin Sekvenssi l:ssä esitettyyn pepC-gee-niin tai sen promoottori- tai signaalisekvenssiin, tai Sekvenssi 6:ssa esitettyyn pepD-geeniin tai sen promoot-15 tori- tai signaalisekvenssiin.

Sopivia menetelmiä DNA:n syntetisoimiseksi on esittänyt tiivistelmämuodossa S.A. Narang (Tetrahedron 39, 3, 1983). Tunnettu synteesitekniikka mahdollistaa polynukle-20 otidien valmistamisen jopa 120 emästä pitkinä, hyvällä saannolla, erittäin puhtaina ja verrattain lyhyessä ajassa. Sopivasti suojatut nukleotidit liitetään toisiinsa fosfodiesterimenetelmän avulla (K.L. Agarwal et ai., An-gew. Chemie 84, 489, 1972), tehokkaammalla fosfotrieste-25 rimenetelmällä (C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143, 1972), fosfiittitriesterimenetelmällä (R.L. Letsinger et ai., J. Am. Chem. Soc. 98, 3655, 1976) tai fosforiamidiitti-; menetelmällä (S.L. Beaucage ja M.H. Carruthers, Tetrahe dron 22, 1859, 1981). Oligonukleotidien ja polynukleoti-30 dien synteesin yksinkertaistamisen tekee mahdolliseksi kiinteäfaasinen menetelmä, jossa nukleotidiketjut sido taan sopivaan polymeeriin. Varsinainen kaksijuosteinen DNA kootaan entsymaattisesti kemiallisesti valmistetuista toisiaan peittävistä oligonukleotideistä kummastakin DNA-35 juosteesta, joita pidetään yhdessä oikeassa järjestyksessä emäspariutumisen avulla, ja jotka kytketään sen jälkeen kemiallisesti DNA-ligaasientsyymin avulla. Toinen 112667 22 mahdollisuus käsittää kahden DNA-juosteen toisiaan peittävien yksinkertaisten oligonukleotidien inkuboinnin neljän tarvittavan deoksinukleosiditrifosfaatin läsnäollessa DNA-polymeraasin, esim. DNA-polymeraasi I:n, polymeraasi 5 I:n Klenow-fragmentin tai T4 DNA -polymeraasin kanssa, tai AMV:n (linnun myeloblastoosivirus) käänteistranskrip-taasin kanssa. Kahta oligonukleotidiä pidetään sillä tavalla yhdessä oikeassa järjestyksessä emäspariutumisen avulla ja niitä täydennetään tarvittavilla nukleotideillä 10 entsyymin avulla, jolloin saadaan täydellinen kaksijuos-teinen DNA (S.A. Narang et ai., Anal. Biochem. 121. 356, 1982).

Toteutettaessa tätä keksintöä, toisen lajin, esim. hii-15 van, subtilisiinigeeniä tai sen osaa voidaan käyttää koettimena Asperqillus-rvhmän. esim A. niqerin. subti-lisiini-mRNA:n identifioimiseksi RNA-fraktiosta tai sub-tilisiini-DNA:n identifioimiseksi genomisesta tai cDNA-kirjastosta. A. niqerin geenin primäärisekvenssistä ja 20 vertailuista muihin proteaaseihin nähden, proteaasin koo- ditusalue voidaan johtaa ja geenin yhteys subtilisii-nigeeniperheeseen voidaan varmistaa. Saatua geeniä voidaan käyttää yhdistelmäproteaasin valmistukseen kuten tämän jälkeen yksityiskohtaisesti on esitetty.

25 ·· Synteettisiä DNA-koettimia syntetisoidaan tunnetuilla menetelmillä, joita jäljempänä esitellään yksityiskohtaisesti, edullisesti asteittaisen kondensaation avulla ; käyttäen kiinteäfaasista fosfotriesteri-, fosfiittitries- 30 teri- tai fosforiamidiittimenetelmää, esim. kondensoimal- ’ la dinukleotidikytkentäyksiköt fosfotriesterimenetelmäl- lä. Näitä menetelmiä sovelletaan haluttuja oligonukleoti-dejä sisältävien seosten synteesiin käyttämällä seoksia, jotka sisältävät kahta, kolmea tai neljää nukleotidiä dA, 35 dC, dG ja/tai dG suojatussa muodossa, tai vastaavia dinu-kleotidikytkentäyksikköjä sopivassa kondensaatiovaiheessa 112667 23 kuten Ike et ai. ovat kuvailleet (Nucleic Acids Research, 11, 477, 1983).

Hybridisaatiota varten DNA-koettimet leimataan esimerkik-5 si radioaktiivisesti kinaasireaktion avulla. Koon perusteella fraktioidun mRNA:n hybridisointi leiman sisältävien DNA-koettimien kanssa suoritetaan tunnettujen menetelmien mukaisesti, so. puskuri- ja suolaliuoksissa, jotka sisältävät adjunkteja, esim. kalsiumkelaattoreja, visio kositeettia sääteleviä yhdisteitä, proteiineja, ei-homo-logista DNA:ta ja vastaavia yhdisteitä lämpötiloissa, jotka suosivat valikoivaa hybridisaatiota, esim. 0°C-80°C:ssa, esimerkiksi 25°C-50°C:ssa tai suunnilleen 65°C:-ssa, edullisesti suunnilleen 20°C alemmassa lämpötilassa 15 kuin kaksijuosteisen DNA-hybridin sulamislämpötila.

Transformoituja isäntiä 1a niiden valmistaminen Keksintö koskee lisäksi isäntäsoluja, jotka on transformoitu keksinnön mukaisella hybridi- tai ekspressiovekto-20 rilla, edullisesti sellaisella, joka koodittaa keksinnön mukaisen Aspergillus-subtilisiinin edullisia muotoja.

Esimerkkejä sopivista isännistä, erityisesti keksinnön mukaisten yhdistelmä-DNA-molekyylien monistamiseksi, ovat 25 mikro-organismit, joista puuttuu tai joilla on niukasti ;r restriktioentsyymejä tai modifiointientsyymejä, kuten : esimerkiksi Escherichia coli-kannat. esimerkiksi E. coli X1776, E. coli Y1090, E. coli W3110, E. coli HB101/-. ,: LM1035, E. coli JA221, E. coli DH5a, tai edullisemmin E_j_ 30 coli DH5aF' , JM109, MH1 tai HB101 tai E. coli K12-kanta.

\ , .. Sopivia isäntiä ovat myös muut prokaryoottiset solut, esim. Bacillus subtilis. Bacillus stearothermophilus. Pseudomonas. Haemophilus. Streptococcus ja muut isännät, ; ·' ja hiivat, esimerkiksi Saccharomvces cerevisiae kuten S^_ ‘ 35 cerevisiae GRF 18. Muita sopivia isäntäsoluja ovat korkeampien organismien solut, erityisesti vakiintuneet jat-, kuvasti lisääntyvät ihmisen ja eläinten solulinjat, esim.

24 112 6 6 7 ihmisen sikiön keuhkojen fibroblastit L132, ihmisen pahanlaatuisen melanooman Bowes-solut, HeLa-solut, SV40-viruksella transformoidut afrikkalaisen vihreän apinan transormoidut COS-7 raunuaissolut tai kiinanhamsterin mu-5 nasarjan (CHO) solut.

Esimerkkejä sopivista soluista keksinnön mukaisen Asper-gillus-subtllisiinin geenin ilmentämiseksi ovat edellä mainitut solut, jotka on transformoitu sopivalla ekspres-10 siovektorilla, ja lisäksi sopivat hyönteissolut, jotka on transformoitu sopivalla bakuloviruksen ekspressiovekto-rilla, ja erityisesti rihmasienet, esimerkiksi Penicil-lium, Cephalosporium. tai edullisemmin Aspergillus-ryhmä, esim. A. carbonarius. A. awamori. A. nidulans. A. orvzae 15 tai vielä edullisemmin A. niger. joka on transformoitu sopivalla ekspressiovektorilla.

Keksintö koskee myös menetelmää sellaisten transformant-tien valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää sopivan 20 isäntäsolun käsittelemisen transformoivissa olosuhteissa keksinnön mukaisella DNA-molekyylillä tai hybridivekto-rilla, valinnaisesti yhdessä valintamerkkigeenin kanssa, ja valinnaisesti transformanttien valikoinnin. Aspergil-lus-subtilisiinigeeni voi myös kiinnittyä isäntägenomiin 25 transformaation jälkeen, erityisesti jos eukaryoottisia soluja, esimerkiksi Aspergillus-rvhmää. käytetään isänti-; * ; nä.

Mikro-organismien transformointi suoritetaan tavanomai-30 silla kirjallisuudessa kuvailluilla menetelmillä, esimer- i * kiksi S. cerevisiaen osalta (A. Hinnen et ai., Proc.

Natl. Acad. Sei. USA, 75, 1929, 1978), B. subtiliksen osalta (Anagnostopoulos et ai., J. Bacteriol. 8JL, 741, 1961), E. colin osalta (M. Mandel et ai., J. Mol. Biol.

35 53, 159, 1970) ja Aspergilluksen osalta [F. Buxton et ai., Gene 37:207-14 (1985), D.J. Balance et ai., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-9 (1983)].

112667 25 E. coli-soluien transformointimenetelmä sisältää sen mukaisesti esimerkiksi solujen Ca2+-esikäsittelyn DNA:n si-säänmenon mahdollistamiseksi ja inkuboinnin hybridivekto-rin kanssa. Transformoitujen solujen myöhempi valikointi 5 voidaan aikaansaada esimerkiksi siirtämällä solut valikoivalle kasvualustalle, joka mahdollistaa transformoitujen solujen erottamisen lähtösoluista riippuen vektori-DNArn merkkisekvenssin luonteesta. Edullisesti käytetään kasvualustaa, joka ei mahdollista hybridivektoria sisäl-10 tämättömien solujen kasvua.

Sienten, kuten esimerkiksi hiivojen tai Asperaillus-ryh-män, transformaatio käsittää esimerkiksi vaiheet, joissa soluseinä poistetaan entsymaattisesti glukosidaasien 15 avulla, saatuja sferoplasteja käsitellään hybridivekto-rilla polyetyleeniglykolin ja Ca2*-ionien läsnäollessa ja soluseinä regeneroidaan sulkemalla sferoplastit agariin. Regeneraatioagar valmistetaan edullisesti tavalla, joka mahdollistaa transformoitujen solujen regeneraation, ja 20 transformoidut solut valikoidaan kuten edellä on kuvailtu samanaikaisesti.

Korkeampien eukaryoottisten solujen kuten nisäkässolulin-jojen transformointi suoritetaan edullisesti transfektion 25 avulla. Transfektio suoritetaan tavanomaisilla teknii-j' koilla, joita ovat esimerkiksi kalsiumfosfaattipresipi- taatio, mikroruiskutus, protoplastifuusio, elektroporaa-tio, so. DNA:n siirtäminen lyhyen sähköpulssin avulla, joka ohimenevästi lisää solukalvon läpäisevyyttä, tai j · 30 auttajayhdisteiden kuten dietyyliaminoetyylidekstraanin, dimetyylisulfoksidin, glyserolin tai polyetyleeniglykolin ja vastaavien yhdisteiden läsnä ollessa. Transfektio-menettelyn jälkeen transfektoidut solut identifioidaan ja : ' valikoidaan esimerkiksi viljelemällä valikoivassa ‘ 35 alustassa, joka on valittu riippuen valintamarkkerin luonteesta, esimerkiksi tavanomaisissa viljelyalustoissa, kuten esimerkiksi Dulbeccon modifioidusssa Eaglen alus- 26 112667 tässä (DMEM), minimaalialustassa, RPMI 1640-alustassa ja vastaavissa alustoissa, jotka sisältävät esim. vastaavan antibiootin.

5 Transformoituja isäntäsoluja viljellään alalla tunnetuilla menetelmillä nestemäisessä alustassa, joka sisältää assimiloituvia hiilenlähteitä, esim. hiilihydraatteja kuten glukoosia tai laktoosia, typpeä, esim. aminohappoja, peptidejä, proteiineja tai niiden hajoamistuotteita 10 kuten peptoneja, ammoniumsuoloja tai vastaavia, ja epäorgaanisia suoloja, esim. natriumin, kaliumin, magnesiumin ja kalsiumin sulfaatteja, fosfaatteja ja/tai karbonaatteja. Alusta sisältää sen lisäksi esimerkiksi kasvua edistäviä aineita kuten hivenaineita, esimerkiksi, rautaa, 15 sinkkiä, mangaania ja vastaavia hivenaineita.

Alusta valitaan edullisesti aiheuttamaan valintapainetta ja estämään solujen kasvua, jotka eivät ole transformoituneet tai ovat menettäneet hybridivektorin. Näin ollen 20 alustaan lisätään esimerkiksi antibioottia, jos hybridi-vektori sisältää antibioottiresistenssimerkkigeenin. Jos esimerkiksi käytetään isäntäsolua, joka on auksotrofinen välttämättömän aminohapon suhteen, kun taas hybridivekto-. ri sisältää geenin, joka koodittaa entsyymiä, joka korjaa 25 isännän vajeen, mainitun aminohapon suhteen vajaata mini-;·· maalialustaa käytetään transformoitujen solujen vilje- : iyyn.

'· : Korkeampia eukaryoottisia soluja kuten nisäkässoluja kas- i ‘ 30 vatetaan kudosviljelyolosuhteissa käyttäen kaupallisesti i : : saatavia alustoja, kuten esimerkiksi Dulbeccon modifioi tua Eaglen alustaa (DMEM), minimaalialustaa, RPMI 1640-:alustaa ja vastaavia alustoja kuten edellä mainittiin, täydennettyinä valinnaisesti kasvua edistävillä aineilla 35 ja/tai nisäkässeerumeilla. Alalla tunnetaan hyvin solu-viljelytekniikat kudosviljelyolosuhteissa ja niitä ovat ! homogeenisen suspension viljely, esim. ilmasekotteisessa 112667 27 reaktorissa tai jatkuvatoimisesta sekoitinreaktorissa, tai immobilisoidun tai suljetun solun viljely, esim. on-telokuiduissa, mikrokapseleissa, agaroosimikrohelmissä, huokoisissa lasihelmissä, keraamisissa patruunoissa tai 5 muissa mikrokantajissa.

Viljely toteutetaan alalla tunnetuilla menetelmillä. Viljelyolosuhteet, kuten lämpötila, alustan pH-arvo ja fer-mentointiaika, valitaan niin, että keksinnön mukaista 10 polypeptidiä tai johdannaista saadaan maksimitiitteri. E, coli- tai hiivakantaa viljellään siten edullisesti aerobisissa olosuhteissa pinnanalaisviljelynä ravistellen tai sekoittaen lämpötilassa noin 20°C-40°C, edullisesti noin 30°C:ssa, ja pH-arvossa 4-8, edullisesti noin pH 7:ssä, 15 noin 4-30 tuntia, edullisesti kunnes keksinnön mukaista polypeptidiä tai johdannaista saadaan maksimitiitterit.

Transformoitujen solujen valikoinnin mahdollistamiseksi transformoitumattomista soluista keksinnön mukaiset DNA-20 molekyylit sisältävät valintamarkkerin tai vaihtoehtoisesti solut transformoidaan yhdessä toisen vektorin kanssa, joka sisältää sellaisen markkerin. Kuten muissa systeemeissä sellainen valintamarkkeri on ilmentyvä rakenne-geeni, jonka ilmennetty polypeptidi (entsyymi) saa aikaan ,25 resistenssin yhdisteille, jotka ovat toksisia saajaor-!’/! ganismille, tai joka täydentää mutantin entsyymisystee- ! miä, jolta puuttuu sellainen välttämätön polypeptidi.

' ’ Sellaisia merkkigeenejä, jotka ovat sopivia transformoi tujen rihmasienisolujen valikointiin, ovat esimerkiksi ! .' 30 tunnetut qa-2-, pyrG-. pyr4-, trpC-, amdS- tai arqB-qee-1 ,·’ · nit.

; ; Kuten EP-A-0 278 355:ssä on kuvailtu, pyrA-niminen merk- kigeeni eristettiin A. niqerin genomisesta kirjastosta, 35 joka geeni liittyy läheisesti ja jolla on samanlainen funktio kuin A. nidulansin pyrG:llä ja N. crassan pyr4: 28 1 12 6 6 7 llä, nimittäin entsyymin orotidiini-5'-fosfaattidekarbok-sylaasin tuottaminen. Tämä entsyymi katalysoi orotidiini-5'-fosfaatin dekarboksylaation uridyylihapoksi (uridiini-5'-fosfaatiksi) ja myös fluorioroottihapon toksiseksi 5 fluoriuridiiniksi. Minkä tahansa pyr-qeenin DNA:ta voidaan kuitenkin käyttää, joka koodittaa orotidiini-5' -fosfaattidekarboksylaasia. Positiivisesta E. coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968) kloonista eristettiin pyrA-aee-nin sisältävä plasmidi pCG59D7 ja sitä käytettiin A. ni-10 qer pyrA'-mutantin kotransformaatioon. Sellainen pyrA'- mutantti on vajavainen orotidiini-5'-fosfaattidekarboksy-laasigeenin suhteen ja on sen vuoksi kykenemätön tuottamaan vastaavaa entsyymiä. Sellainen mutantti valmistettiin käsittelemällä A. niqer N756:n konidiosporeja muta-15 toivasa UV-säteilyssä ja fluorioroottihapon ja uridiinin läsnäollessa eloonjääneet pesäkkeet valikoitiin. Fluorioroottihapon läsnäollessa ja uridiinin puuttuessa eloonjääneet pesäkkeet eliminoitiin. Jäljelle jääneet uridiinia tarvitsevat mutantit kuuluvat niiden transfor-20 moitavuuskyvyn mukaisesti kahteen komplementaatioryhmään pyrA ja pyrB, edustaen A. niqer-mutantteia An8 ja vastaavasti AnlO. Niitä käsitellään protoplastimuodossa transformoivissa olosuhteissa pyrA:n sisältävän plasmidin pCG59D7 (DSM 3968) kanssa. Vain A. niqer An8 (DSM 3917)-; 25 pesäkkeiden havaittiin transformoituneen ja sisältävän pyrA-qeenin, minkä osoitti siitä pilkotun DNA:n kyky hyb- i * t * ; ridisoitua pUN 121:n DNA:n kanssa.

Menetelmä Asperqillus-subtilisiinin valmistamiseksi ; 30 Keksintö koskee myös menetelmää keksinnön mukaisen Asper qillus-subtilisiinin, edullisesti sen edullisten muotojen valmistamiseksi käsittäen keksinnön mukaisella ekspres-siovektorilla transformoidun isännän viljelyn olosuhteissa, jotka ovat sopivat Asperqillus-subtilisiiniqeenln 35 ilmentämiseksi. Polypeptidi eristetään tarvittaessa tavanomaiseen tapaan. Ekspressiovektorin rakenteesta riip- 29 112667 puen Asperaillus-subtilisiinia joko muodostuu tai signaa-lisekvenssin ollessa läsnä muodostuu ja erittyy.

Se, onko valittu isäntä sopiva ilmentämiseen vai ei riip-5 puu pääasiassa ekspressiovektorin konstruointiin valituista säätelysekvensseistä, erityisesti promoottorista.

Jos esimerkiksi Asperqilluksen. edullisesti A. niaerin geenistä peräisin olevaa promoottoria käytetään keksinnön 10 mukaisen Asperaillus-subtilisiiniaeenin ilmentämiseen,

Aspergillus-kanta. edullisesti A. niger. on sopiva isäntä. Jos kuitenkin käytetään promoottoria, joka ei ole peräisin Aspergillus-geenistä keksinnön mukaisen ekspressiovektorin konstruointiin, muut isännät ovat sopivia 15 ilmentämiseen, esim. bakteerit kuten E. coli tai hiivat kuten S. cerevisiae. Sopivia isäntiä ja promoottoreja polypeptidien valmistamiseksi keksinnön mukaisesti ovat myös ne, jotka ovat sopivia edellä esitettyyn transformaatioon.

20

Keksintö koskee erityisesti menetelmää, jossa transformoitu Asperqillus-isäntä ilmentää eksogeenistä Asperqil-lus-subtilisiinigeeniä olosuhteissa, joissa endogeeniset Asperqillus-subtilisiinigeenit ovat aktiivisia, ja ilmen-; 25 tää siten enemmän kuin mikä on luonnollinen Asperqillus- subtilisiinimäärä, johtuen lisääntyneestä geeniannokses-ta. Tätä tarkoitusta varten Asperqillus-isäntä. erityisesti A. niger. transformoidaan ekspressiovektorilla, joka sisältää Asperqillus-subtilisiiniqeenin sen luonnol-! : 30 listen, so. luonnollisesti kytkeytyneiden ilmentymisen : : ohjaussekvenssien ohjauksessa, erityisesti promoottorin ja signaalisekvenssin ohjauksessa.

; Keksintö koskee erityisesti myös menetelmää, jossa trans- 35 formoitu Asperqillus-isäntä ilmentää eksogeenistä Asper-qillus-subtilisiiniqeeniä suuremmassa määrin ja eri olo- 112667 30 suhteissa kuin endogeeninen geeni, koska se on kytketty eri promoottoriin.

Olosuhteet eksogeenisen geenin tai geenien maksimaaliseen 5 ilmenemiseen riippuvat valitusta ekspressiosysteemistä. Jos käytetään esimerkiksi A. niqerin pektiinilyaasin (PL) tai polygalakturonaasin (PG) geenin promoottoria, siihen kytketyn Asperglllus-subtilisiinioeenin ilmentyminen on indusoituva A. niaer -solussa lisäämällä pektiiniä tai 10 pektiinin hajoamistuotteita kasvualustaan. Jos glukoosia kuitenkin on riittävästi läsnä, promoottori ei ole indusoituva, jos isäntänä käytetään A. nioer -kantaa, esim. An8:aa (DSM 3917). Tämä tarkoittaa sitä, että Asperqil-lus-subtilisiinigeeni A, niqerin PL- tai PG-promoottorin 15 ohjauksessa on "kataboliittirepressoitunut" A. niqerissä. Jos kuitenkin käytetään toista Asperqillus-kantaa. edullisesti A. orvzaeta tai edullisimmin A. nidulansia. Aspergillus- subtil isiiniaeeni A. niqerin PL- tai PG-pro-moottorin ohjauksessa ilmentyy konstitutiivisesti, so.

20 myös pektiinin puuttuessa ja/tai glukoosin läsnäollessa. Sen vuoksi voi olla edullista ilmentää Asperqillus-subti-lisiinin geeni A. niqerin PL- tai PG-promoottorin ohjauksessa muussa Aspergillus-isännässä kuin A. niqerissä. edullisesti A. oryzaessa tai edullisimmin A. nidulansis-25 sa, koska esimerkiksi glukoosi voidaan lisätä ravinto-alustaan pektiinin sijasta energian- ja hiilenlähteeksi geenin ilmentämisen aikana.

4 i · ’ ’ Jos Asperqilluksen. edullisesti A. niqerin pyruvaatti- 30 kinaasin promoottoria käytetään Asperqillus-subti- lisiinigeenin ilmentämiseen, geeni ilmenee, jos käytetään minimaalialustaa glukoosi hiilen- ja energianlähteenä.

Nyt on mahdollista yli-ilmentää Asperqillus-subtilisii-35 nia, jossa yhteydessä voidaan käyttää erilaisia menetelmiä. Puhdistettua yhtä ainoaa Asperqillus-subtilisiinia ; voidaan valmistaa menetelmän avulla, jossa sopiva isäntä, 31 1 12667 joka ei kykene ilmentämään Aspergi1lus-subtilisiinia, tai joka ilmentää Aspergillus-subtilisiinia vähäisessä määrin, tai joka ei ilmennä Aspergillus-subtilisiinia indusoivissa olosuhteissa, joita käytetään eksogeenisen 5 AspergiUus-subtilisiinigeenin ilmentämiseen, transformoidaan hybridivektorilla, joka sisältää Aspergi Uus - sub -tilisiinia koodittavan rakennegeenin, edullisesti A. ni-geristä, edullisimmin Sekvenssi l:ssä esitettyä PEPCrtä, tai Aspergillus-subtilisiiniseriiniproteaasiaktiivisuuden 10 sisältävää fragmenttia, ja mainittu rakennegeeni ilmennetään. Jos käytetään isäntää, joka ei kykene ilmentämään Aspergillus-subtilisiinia, vastaava yksinkertainen Aspergillus -subt il isiini voidaan saada puhtaassa muodossa, mikä tarkoittaa minkään muun Aspergillus-subtilisiinin 15 kontaminoimatta.

Isäntä, joka ei kykene ilmentämään AspergiUus-subti-lisiinia, on joko mikro-organismi, jolla ei ole vastaavaa geeniä, tai AspergiUus-kanta, jonka endogeenisten Asper-20 gillus-subtilisiinigeenien ilmentyminen on estynyt tarkoituksenmukaisesti rajoitetussa kasvualustassa, kun taas eksogeeninen AspergiUus-subtilisiinin promoottori, joka on toiminnallisesti kytketty haluttuun Aspergillus-; subtilisiinirakennegeeniin, esim. A. niger-peräinen :.:r 2 5 promoottori, on aktiivinen näissä olosuhteissa, tai milloin Aspergi 1 lus - subt ilisiinigeeni on kytketty toiseen ·*·’; promoottoriin.

Muut promoottorit ja kannat, jotka sopivat Aspergi1lus-30 subtilisiinin valmistamiseen, ovat niitä, jotka edellä on esitetty keksinnön mukaisten ekspressiovektoreiden kuvai-lun yhteydessä.

: Aspergillus-subtilisiini ja sen käyttö ; 35 Aspergilluksen subtilisiinityyppistä seriiniproteaasia ! nimitetään myös "Aspergillus-subtilisiiniksi". Sellaisen proteaasin käsitetään (a) olevan peräisin Aspergillus-ryhmästä, (b) omaavan proteaasiaktiivisuutta 32 1 12 6 6 7 katalyyttisen seriinitähteen ansiosta aktiivisessa kohdassa ja (c) sisältävän riittävästi aminohapposekvenssihomologiaa tunnettujen seriinipro-teaasien suhteen tullakseen ryhmitellyksi subtilisiini-5 perheeseen. Aspergillus-subtilisiinitermiin lasketaan kuuluvaksi myös sellaisen entsyymin fragmentit, joissa on seriiniproteaasiaktiivisuutta.

Keksintö koskee ensisijaisesti Aspergillus nigerin puh-10 dasta Aspergillus-subtilisiinia, edullisesti seriinipro-teaasi PEPC:tä, jolla on Sekvenssiluettelon Sekvenssi 1:ssä esitetty aminohapposekvenssi, tai seriiniproteaasi PEPD:tä, jolla on Sekvenssiluettelon Sekvenssi 6:ssa esitetty aminohapposekvenssi, ja niiden seriiniproteaasiak-15 tiivisuutta sisältäviä fragmentteja ja mutantteja.

Keksintö koskee lisäksi entsymaattisia koostumuksia, jotka sisältävät yhden tai useamman Aspergillus-subtilisii-nin tai niiden johdannaisen, joissa on seriiniprote-20 aasiaktiivisuutta ja/tai niiden biologisesti hyväksyttäviä suoloja valinnaisesti ennalta määritettynä yhdistelmänä yhden tai useamman sopivan, muuta kuin Aspergillus-subtilisiiniaktiivisuutta omaavan entsyymin kanssa.

25 Aspergillus-kanta, jolta puuttuu Aspergillus-subtilisiini •:*: Keksintö koskee myös mutatoitua Aspergillus-kantaa.

Edullinen on A. niger -kanta, jolta puuttuu Sekvenssi ;‘j\ 1: ssä esitetty pepC-geeni, tai jolta puuttuu Sekvenssi 6:ssa esitetty pepD-geeni. Edullinen on myös A. niger -30 kanta, jolta puuttuvat sekä pepC- että pepD-geeni.

Keksinnön mukaista mutatoitua Aspergillus-kantaa, jolla on vajavainen Aspergillus-subtilisiinigeeni, voidaan kek-; sinnön edullisessa suoritusmuodossa valmistaa hajottamal- ' . 35 la geeni useaan osaan, so. DNA-sekvenssi, joka vastaa I endogeenistä Aspergillus-geeniä, jonka toivotaan olevan tuhoutunut, mutatoidaan in vitro vajavaiseksi geeniksi ja transformoidaan Aspergillus-isäntäsoluun. Homologisesta 33 1 12667 rekombinaatiotapahtumasta solussa johtuen, intakti endo-geeninen geeni korvautuu vajavaisella eksogeenisellä geenillä. Eksogeeninen geeni tuhotaan tavallisesti liittämällä merkkigeeni kooditusalueen sisään. Tästä on seu-5 rauksena vajavainen geeni, jota voidaan helposti seurata ja käyttää transformanttien valikointiin vastaavan endo-geenisen geenin ollessa useassa osassa. Muita menetelmiä voidaan kuitenkin myös käyttää mutatointiin mutatoidun Aspergillus-kannan, edullisesti mutatoidun A. niger -kan-10 nan valmistamiseksi, jossa kannassa endogeeninen pepC-ja/tai pepD-geeni on mutatoitu sillä tavalla, että toiminnallista pepC.-tä ja/tai pepD.-tä ei voi ilmentyä.

Edullisimmassa keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa A^ 15 niger -kanta transformoidaan hybridivektorilla, joka sisältää Sekvenssi l:ssä esitetyn pepC-geenin vajavaisen mutantin, esim. useassa osassa olevalla pepC-geenillä, johon on liitetty valintamerkkigeeni, esim. kuten oheisissa esimerkeissä kuvailtu plasmidi pPEPCPYRA sisältää, 20 ja transformantit valikoidaan.

Toisessa edullisimmassa keksinnön mukaisessa suoritusmuodossa A. niger -kanta transformoidaan hybridivektorilla, • joka sisältää Sekvenssi 6:ssä esitetyn pepD-geenin vajani : 25 vaisen mutantin, esim. useassa osassa olevalla pepD-gee- ·.'·· nillä, johon on liitetty valintamerkkigeeni, esim. kuten ·*·*. oheisissa esimerkeissä kuvailtu plasmidi pPEPDPYRA sisäl- tää, ja trans f ormantit valikoidaan.

• · » •30 Kolmannessa edullisimmassa keksinnön mukaisessa suoritus-muodossa A. niger -kanta transformoidaan Sekvenssi l:ssä esitetyn pepC-geenin vajavaisella mutantilla, esim. usea-sa osassa olevalla pepC-geenillä, johon on liitetty va-.,· lintamerkkigeeni, esim. kuten oheisissa esimerkeissä ku- '·.· 35 vailtu plasmidi pPEPCPYRA sisältää, ja Sekvenssi 6:ssa esitetyn pepD-geenin vajavaisella mutantilla, esim. kuten oheisissa esimerkeissä kuvailtu plasmidi pPEPDPYRA sisäl 34 1 12 6 6 7 tää, ja transformantit valikoidaan, jotka ovat vajavaiset sekä pepC- että pepD-geenin suhteen.

Keksinnön mukainen mutatoitu Aspergillus niger -kanta, 5 joka sisältää vajavaisen pepC- ja/tai pepD-geenin, on käyttökelpoinen heterologisten tai homologisten proteiinien parannetun tuotannon ilmentämiseksi joko solunsisäi-sesti tai solunulkoisesti.

10 Heterologisten tai homologisten proteiinien ilmeneminen Aspergillus-ryhmässä voidaan saada aikaan tavanomaisilla menetelmillä. Tavallisesti konstruoidaan ekspressiovekto-ri, joka sisältää homologisen tai heterologisen geenin toimivasti kytkettynä Aspergilluksessa toiminnalliseen 15 homologiseen tai heterologiseen promoottoriin ja valinnaisesti muihin Aspergilluksessa toiminnallisiin ilmenemisen ohjaussekvensseihin, esim. tätä ennen määriteltyihin. Polypeptidi eristetään tarvittaessa tavanomaiseen tapaan. Ekspressiovektorin rakenteesta riippuen tuotteet 20 joko muodostuvat isäntäsolussa, tai jos signaalisekvenssi on läsnä, ne muodostuvat solussa ja erittyvät.

Rakennegeenejä tässä yhteydessä ovat esimerkiksi rakenne-geenit, jotka ovat peräisin viruksista, prokaryoottisistä : ' 25 soluista tai eukaryoottisista soluista, ja jotka voidaan '*’ ‘ saada genomisesta DNA: s ta tai mRNA: n kautta valmistetusta cDNA.-sta tai voidaan syntetisoida kemiallisesti, jotka : ’ koodittavat useita erilaisia käyttökelpoisia polypeptide- ;·’ jä, mukaan lukien glykosyloidut polypeptidit, erityisesti 30 korkeampaa eukaryoottista alkuperää, erityisesti nisäkkäästä kuten eläimestä tai ihmisestä, kuten esimerkiksi ; entsyymejä, joita voidaan käyttää esimerkiksi ravinteiden tuottamiseen ja entsymaattisten reaktioiden toteuttami- 35 112067 seen kemiassa, tai polypeptidejä, jotka ovat käyttökelpoisia ja arvokkaita ihmisten ja eläinten tautien hoidossa tai niiden ennalta ehkäisyssä, esimerkiksi hormoneja, polypeptidejä, joilla on immunomodulatorisia, viruksia 5 vastustavia ja tuumoria vastustavia ominaisuuksia, vasta-aineita, virusantigeenejä, rokotteita, hyytymistekijöitä, elintarvikkeita ja vastaavia polypeptidejä.

Esimerkkejä sellaisista rakennegeeneistä ovat esim. ne, 10 jotka koodittavat Aspergilluksen polygalakturonaasia, esim. PGI:tä tai PGII:ta, tai Aspergilluksen pektiinily-aasia, esim. PLI:tä, PLA:ta, PLB:tä, PLC:tä, PLE:tä ja PLF:ää, tai hormoneja kuten sekretiiniä, tymosiinia, re-laksiinia, kalsitoniinia, luteinisoivaa hormonia, lisä-15 kilpirauhasen hormonia, adrenokortikotropiinia, me- lanosyyttejä stimuloivia hormoneja, β-lipotropiinia, uro-gastronia tai insuliinia, kasvutekijöitä kuten epidermi-kasvutekijää, insuliinin kaltaista kasvutekijää (IGF), esim. IGF-I:tä tai IGF-II:ta, syöttösolujen kasvutekijää, 20 hermojen kasvutekijää, hermotukikudosperäistä hermosolujen kasvutekijää tai transformoivaa kasvutekijää (TGF), kuten esim. TGF3:aa, kasvuhormoneja kuten ihmisen tai naudan kasvuhormoneja, interleukiinia kuten interleukii-ni-l:tä tai interleukiini-2:ta, makrofagin vaellusta eh-·· 25 käisevää tekijää (MIF), interferoneja kuten ihmisen a- • * I t interferonia, esimerkiksi interferoni-αΑ:ta, -aB:tä, , aD:tä tai aF:ää, β-interferonia, γ-interferonia tai hyb- ridi-interferonia, esimerkiksi aA-aD- tai aB-oD-hybridi-,, , interferonia, erityisesti hybridi-interferoni BDBB:tä, 30 proteinaasi-inhibiittoreita kuten c^-antitrypsiiniä, SLPI:tä ja vastaavia inhibiittoreita, hepatiittivirusan-tigeenejä kuten hepatiitti B -viruksen pinta-tai ydinan-tigeeniä tai hepatiitti A -virusantigeeniä tai hepatiitti * ei-A-ei-B -antigeeniä, plasminogeenin aktivattoreita ku- 35 ten kudosplasminogeenin aktivaattoria tai urokinaasia, tuumorin nekroositekijää, somatostatiinia, renniiniä, β-endorfiinia, immunoglobuliineja kuten immunoglobullini 112767 36 D:n, E:n tai G:n kevyt ja/tai raskasketjuja tai ihmisen-hiiren hybridi-immunoglobuliineja, immunoglobuliinia sitovia tekijöitä kuten immunoglobuliini E:tä sitovaa tekijää, kalsitoniinia, ihmisen kalsitoniinin kaltaista 5 peptidiä, veren hyytymistekijöitä kuten tekijä IX:tä tai Viileitä, erytropoetiinia, egliiniä kuten egliini C:tä, hirudiinia, desulfatohirudiinia kuten desulfatohiru-diinimuunnos HVlrtä, HV2:ta tai PArta, ihmisen superoksi-didismutaasia, viruksen tymidiinikinaasia, β-laktamaasia, 10 glukoosi-isomeraasia. Edullisia geenejä ovat ne, jotka koodittavat ihmisen a-interferonia tai hybridi-interferonia, erityisesti hybridi-interferoni BDBB:tä, ihmisen kudosplasminogeenin aktivaattoria (t-PA), hepatiitti B -viruksen pinta-antigeeniä (HBVsAg), insuliinin kaltaista 15 kasvutekijä I:tä ja II:ta, egliini C:tä ja desulfatohirudiinia, esim. muunnosta HV1.

Edullisimmat suoritusmuodot kuvaillaan oheen liitetyissä esimerkeissä.

20

Esimerkit

Seuraavat esimerkit auttavat valaisemaan keksintöä, niitä kuitenkaan ei ole tarkoitettu keksintöä rajoittamaan.

25 Lyhenteillä on seuraavat merkitykset: BSA naudan seerumin albumiini DTT 1,4-ditiotreitoli EDTA etyleeenidiamiinitetraetikkahappo, natriumsuola : ; 30 IPTG isopropyyli-p-D-tiogalaktopyranosidi ' kep kiloemäsparia PEG polyetyleeniglykoli SDS natriumdodekyylisulfaatti

Tris tris(hydroksimetyyli)aminometaani 35 X-gal 5-bromi-4-kloori-3-indolyyli-p-galaktosidi 37 112 6 6 7

Puskurit, alustat, reaaenssit SM 100 mM NaCl, 8,1 mM MgS04, 50 mM Tris- HC1 pH 7,5, 0,01 % gelatiinia 5 LB 1 % tryptikaasipeptonia (BBL), 0,5 % hiivauutetta (BBL), 1 % NaCl ja 0,5 mM Tris-HCl pH 7,5 LM 1 % tryptikaasipeptonia (BBL), 0,5 % 10 hiivauutetta (BBL), 10 mM NaCl ja 10 mM MgCl2 SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M tri-natriumsit- raattia 15 PSB 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM NaCl 10 mM MgCl2,

TE 10 mM Tris-HCl pH 8,0,0,1 mM EDTA pH

20 8,0 minimaalialusta 1 litrassa 1,5 g KH2P04, 0,5 g KC1, 0,5 g MgS04x7H20, 0,9 mg ZnS04x7H20, 0,2 mg MnCl2x4H20, 0,06 mg CoC12x6H20, 25 0,06 mg CuS04x5H20, 0,29 mg CaCl2x 2H20, 0,2 mg FeS04x7H20, typen- ja hiilenlähteet kuten tekstissä on , määritelty tai 6 g NaN03 ja 10 g glukoosia litrassa, ellei näitä

• ; 30 lähteitä ole erikseen mainittu, pH

'·' säädettynä arvoon 6,0 NaOH:lla 1 täydellinen alusta minimaalialusta, jossa 6 g NaN03 ja ,35 10 g glukoosia litrassa, sekä litraa kohti 2 g tryptikaasipeptonia (BBL), 1 g kasaminohappoja (Difco), 1 g 112667 38 hiivauutetta (BBL), 0,5 g ribonukle-iinihapon natriumsuolaa hiivasta (ICN, Cleveland, USA), 2 ml vitamiiniliuosta, pH säädettynä 5 arvoon 6,0 NaOH:lla vitamiiniliuos 100 ml:ssa 10 mg tiamiinia, 100 mg riboflaviinia, 10 mg pantoteeni-happoa, 2 mg biotiinia, 10 mg 10 p-aminobentsoehappoa, 100 mg nikotiiniamidia, 50 mg pyridoksiini-HC1:ää

TBE 1 litra sisältää 4 ml 0,5 M EDTA

15 pH 8,0 liuosta, 10,8 g Tris ja 5,5 g h3bo3 fenoli fenoli käsiteltynä kuten Maniatis et ai. on kuvaillut, Molecular 20 Cloning; A Laaboratory Manual, Cold

Spring Harbour Laboratory 1982 (s. 438) näytepuskuri 10 % (tilavuus/tilavuus) glyserolia, ;· 25 100 mM EDTA pH 8,0 ja 0,01 % bromifenolisinistä > 1 1 . RNaasi A RNaasi A käsiteltynä kuten Maniatis et ai. on kuvaillut Molecular 30 Cloning; A Laboratory Manual, Cold

Spring Harbour Laboratory 1982 (s. 451) 112667 39

Seuraavia kantoja ia vektoreita käytetään: A. niqer N400; villi-tyyppi.

A. ηΐσβΓ An8; uridiiniauksotrofinen mutantti pektiinikom-5 pleksia runsaasti tuottavasta A. niqer N756-kannasta, julkaistu EP-A-0 278 355:ssä, talletettuna tunnuksella DSM 3917.

E. coli LE392; F', hsdR514 (rk',mk+), supE44. supF58. IacYl 10 tai (IaclZY)6,qalK2,qalT22.metBl,trpR55.λ~.

E. coliDHSaF*; F' ,endAl,hsdR17, (r,.~.mh*). supE44, thi-1.re-cAl,gyrA,relAl,80<frlacZM15.A(lacZYA-aroF)U169, λ".

15 EMBL4; EMBL4 on lambda-vaihtovektori, jonka kloonauska-pasiteetti on 9-23 kep (Frischauf et ai., J. Mol. Biol. 170:827-842, 1983). Se sisältää monikloonausalueen lamb-da-käsivarsien ja merkityksettömän täytealueen välissä. Tämä mahdollistaa usean restriktioentsyymipilkonnan suo-20 rittamisen sillä tavalla, että täytekohdan religaatio vektorin käsivarsiin vähenee, kun kiinnostuksen kohteena oleva vieras DNA liitetään. Vektorissa käytetään myös hyväksi Spi-fenotyyppiä rekombinanttien suoran valikoinnin aikaansaamiseksi (Zissler et ai.: A.D. Hershey I. 25 (edit.) The Bacteriphage lambda, Cold Spring Harbour Laboratory, 1971).

Esimerkki 1: Aspergillus niqerin oenomisen kirjaston konstruointi ; 30 Esimerkki 1.1: Suurimolekyylipainoisen DNA:n eristäminen * A. niqer N400:sta

Aspergillus niqer -kannan N400 konidiosporeja siirroste-taan 200 ml:aan minimaalialustaa itiöiden lopputiheyteen i · 106 itiötä/ml ja ravistellaan 1 litran erlenmeyereissä 24 35 tunnin ajan 28°C:ssa nopeudella 300 rpm. Rihmasto otettiin talteen suodattamalla myrakankaan läpi biichnersuppilossa, pestiin kylmällä steriilillä saliinilla, jäädytettiin 40 Ί Ί π ζ'/ η I I L·. ϋ ό / nestetypessä ja säilytettiin joko -60°C:ssa tai käytettiin suoraan. DNA:n eristämiseen käytetty menetelmä genomisen kirjaston valmistamiseksi perustuu menetelmään, jota on kuvaillut Yelton et ai., [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 5 81:1470-1474 (1984)].

Kirjaston konstruoimiseksi 10 g rihmastoa jauhetaan nestetypessä 1 g:n erissä Braunin mikrojauhimessa. Jauhettu rihmasto siirretään 1 l:n erlenmeyeriin, joka sisältää 10 200 ml uuttopuskuria (50 mM EDTA pH 8,5,0,2 % SDS) ja 200 μΐ dietyylipyrokarbonaattia. Seos lämmitetään hitaasti huoneen lämpötilaan ja kuumennetaan sen jälkeen 20 min. kuluessa 68°C:seen ravistellen ajoittain. Suspensio jäähdytetään huoneen lämpötilaan ja sentrifugoidaan 15 min.

15 ajan 12 OOOxg. 1/16 tilavuus 8 M kaliumasetaattiliuosta pH 4,2 lisätään supernatanttiin ja seos jätetään jäiden päälle 1 tunniksi. Saostuma poistetaan sentrifugoimalla (20 min.; 16 OOOxg; 4°C). Nukleiinihapot saostetaan super-natantista inkuboimalla 0,6 tilavuuden kanssa isopro-20 panolia jäiden päällä 15 min. kuluessa. Saostunut nukleiinihappo otetaan talteen sentrifugoimalla (10 min.; 6000xg; 4°C), pestään 70 %:isella etanolilla ja kuivataan lyhytaikaisesti. Pelletti suspendoidaan 10 ml:aan TE-pus-kuria, joka sisältää 20 pg/ml RNaasi A:ta, (Boehringer, • 25 Mannheim), ja inkuboidaan 15 min. 37°C:ssa. DNA:ta käsi- : .* tellään nukleaasivapaalla pronaasilla (1 mg/ml lopputila- vuus) (Kochlight, Coinbrook) 1 tunnin ajan 37°C:ssa.

: 8,5 g CsCl:a liuotetaan 9 ml:aan saatua DNA-liuosta, 0,2 ; ; 30 ml 10 mg/ml etidiumbromidia lisätään ja tämä liuos sent rifugoidaan joko Beckman SW41-roottorissa 60 tunnin ajan ;v, 33 000 rpm nopeudessa tai Beckman 50 Ti -roottorissa 40 tunnin ajan nopeudessa 45 000 rpm. DNA-vyöhyke otetaan talteen ja etidiumbromidi poistetaan moninkertaisella 35 uuttamisella isopropanolilla, tasapainotettuna kyllästetyllä NaCl-vesiliuoksella. 5 tilavuutta TE-puskuria lisätään ja DNA-liuosta käsitellään perättäisesti TE-kylläs- 41 112067 tetyllä fenolilla, fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholilla 25:24:1 ja kloroformi/isoamyylialkoholilla 24:1. DNA seostetaan lisäämällä 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia pH 5,2, 2,5 tilavuutta etanolia ja inkuboimalla yli yön -5 20°C:ssa. Saostuma kerätään talteen sentrifugoimalla (1 tunti, 30 OOOxg; 4°C), pestään 70 %:isella etanolilla, kuivataan ja liuotetaan 400 pl:aan TE-puskuria.

Esimerkki 1.2: A. nicrer N400:n DNA:n osittainen pilkkomi-10 nen MboI:llä 1a fragmenttien eristäminen

Sen Mbol-pitoisuuden testaamiseksi, joka tuottaa suurimman DNA-fragmenttimäärän välillä 13,6-23 kep, 1 pg:n eriä A♦ niqer N400:n DNA:ta pilkotaan sopivassa toimittajan suosittamassa puskurissa alenevassa Mbol-pitoisuudessa 15 (0,5-0,001 U) 1 tunnin ajan 37°C:ssa 10 μ1:η tilavuudessa.

Reaktio pysäytetään lisäämällä 1 μΐ 0,25 M EDTA:ta ja näytteet ladataan 0,6 %:iselle agaroosigeelille TBE-pus-kurissa, joka sisältää 1 mg/ml etidiumbromidia. Mbol-pi-toisuus, joka tarvitaan tuottamaan korkea saanto haluttu-20 ja 13,6-23 kep fragmentteja, on noin 0,02 U/pg DNA:ta.

Sen mukaisesti 200 pg DNA:ta pilkotaan kokonaistilavuudessa 2 ml. Yhden tunnin kuluttua 37°C:ssa EDTA lisätään loppupitoisuuteen 25 mM, entsyymi kuumainaktivoidaan 65°C:ssa 10 min. ja DNA saostetaan, pestään, kuivataan ja 25 liuotetaan 400 pl:aan TE-puskuria. Fragmentoitu DNA ero-’ : teilaan preparatiivisella 0,4 %:isella agaroosigeelillä ; ; : 4°C:ssa ja 40 V:ssa (3 V/cm). Kooltaan sopivat fragmentit ·;*·· leikataan irti geelistä ja DNA elektroeluoidaan geelistä steriilissä dialyysipussissa 2 ml:ssa TBE:tä 2-3 tunnin , 30 ajan 100 V:n jännitteessä. Virta käännetään 30 sekunnin ajaksi ja DNA:ta sisältävä puskuri otetaan talteen. Frag-,, . mentit väkevöidään sen jälkeen etanolisaostuksella ja liuotetaan 100 pl:aan TE-puskuria.

; 35 Esimerkki 1.3: Vektori-DNA:n valmistaminen A. niqer N400 -kannan genominen kirjasto konstruoidaan lambdavektori EMBL4:ssä. Frischauf et ai., [J. Mol. Biol.

42 A A r f S ry 1 i £- o 6 / 170:827-842 (1983)] ja Karn et ai., [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:5172-76 (1980)] kuvailevat vektoria, jonka kloonauskapasitetti on 9-23 kep, ja sitä voi ostaa Prome-ga Biotechnology Inc.'lta. Sen välttämiseksi, että kaksi 5 genomin eri osista peräisin olevaa inserttiä kloonautuu yhteen faagiin, kloonaukseen käytetään fragmentin minimi-pituutta 13,6 kep.

10 mg lambda EMBL4:n DNA:ta hydrolysoidaan loppuun 50 10 yksiköllä BamHI:tä toimittajan suosittamassa puskurissa 100 μ1:η tilavuudessa 2 tunnin aikana 37°C:ssa. Entsyymi inaktivoidaan 10 min. kuluessa 65°C:ssa. NaCl-pitoisuus nostetaan tasolle 150 mM ja 50 yksikköä Sall:tä lisätään ja inkubointia 37°C:ssa jatketaan toiset 2 tuntia. EDTA-15 lisäyksen jälkeen pitoisuuteen 25 mM ja entsyymin inakti-voinnin jälkeen kuumentamalla 10 min. ajan 65°C:ssa liuos uutetaan yhtä suurilla tilavuuksilla fenolia (TE:llä kyllästetty), fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholilla 25:24:1 ja kloroformi/isoamyylialkoholilla (24:1). Pienten Bam-20 HI/Sali-polviinkkerifragmenttien eliminoimiseksi DNA sa- ostetaan 0,6 tilavuudella isopropanolia sen jälkeen kun on lisätty 0,1 tilavuutta 3 M natriumasetaattia pH 5,2.

15 min. jälkeen jäiden päällä ja 15 min. sentrifugoinnin jälkeen nopeudessa 12 OOOxg 4°C:ssa saostuma pestään pe-: 25 rusteellisesti 70 %:isella etanolilla, kuivataan ja liuo- ,· tetaan 40 ml:aan TE-puskuria.

’': Esimerkki 1.4: Ligaatio ia A. niqer N400:n qenomisten : DNA-fragmenttien in vitro pakkaaminen . 30 On olennaista, että cos-kohdat esimerkin 2.3 mukaisesti valmistetussa vektorissa pariutetaan ennen ligaatioreak-; . tiota. Vektoria kuumennetaan 100 mM Tris-HCl pH 7,5:ssä ja 10 mM MgCl2:ssa 10 min. ajan 65°C:ssa ja pariutetaan sen jälkeen 1 tunnin ajan 42°C:ssa. Koeligaatioiden perus-• 35 teella, vektorin suunnilleen 1:1 (painon mukaan) suhteel

la fragmentteihin todetaan saatavan eniten rekombinantte-. ‘ ja. Ligaatio suoritettiin liuoksessa, joka sisälsi 50 mM

112667 43

Tris-HCl:ää pH 7,5, 10 mM MgCl2:ta, 10 mM DTT:tä ja 1 mM ATP:tä, käyttäen 9,5 pg vektoria ja 10 mg DNA-fragmentte-ja kokonaistilavuudessa 100 μΐ. DNA-ligaasia (BRL) lisätään pitoisuudessa 0,5 U/pg DNA:ta ja ligaatioseosta in-5 kuboidaan yli yön 14°C:ssa. Ligaation testaamiseksi ligoi-tua DNA:ta sisältävä näyte ajetaan agaroosigeelillä. Kontrollina ligoidaan myös 0,5 pg vektoria ilman frag-menttilisäystä 5 pl:n tilavuudessa.

10 Ligaatioseos väkevöidään etanolisaostuksella ja liuotetaan 20 ml:aan TE-puskuria ennen pakkaamista in vitro. In vitro pakkaaminen tehdään Promega Packagene -uutteilla valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttäen 10 pl:n eriä 1 pg:n DNA:ta pakkaamiseksi. 1 pg suurimolekyylipainoista 15 kontrollifaagia lambda cI857 Sam 7, toimitettuna uutteiden mukana, pakataan erikseen kontrolliksi. Pakkaamisen jälkeen lisätään 500 pl faagiliuospuskuria (PSB) ja 5 pl kloroformia. Yhdistelmäfaagieriä voidaan varastoida 4°C:-ssa.

20

Esimerkki 1.5: Titraus ia A. niger N400:n qenomisen kirjaston monistaminen E. coli NM539 -soluja kasvatetaan LB-alustalla, joka sisältää 0,2 % maltoosia, 10 mM MgS04:ää ja 1 mM CaCl2:a, 25 optisen tiheyden (600 nm) arvoon 1,0. 0,2 ml:n eriä tätä .· viljelmää lisätään 0,1 ml:aan sopivaa faagilaimennusta PSB:ssä. Faagien adsorboitumisen jälkeen 20 min. kuluessa :*’! 37°C:ssa, 3 ml 0,6 %:ista LB-pinta -agaria lisätään 45°C:- ssa, seos mal jataan LB-agarmal joille ja näitä inkuboidaan 30 yli yön 37°C:ssa. Plakin muodostavien yksikköjen (pfu) määrät/ml faagisuspensiota ovat 12xl05 ja 4,2xl05 pfu/ml : kahdella faagierällä, jotka valmistettiin esimerkin 1.4 mukaisesti. Taustan vähentämisen jälkeen, joka lasketaan kontrolliligaatioista ilman fragmentteja (17 % ja vastaa-35 vasti 40 %), rekombinanttien absoluuttinen määrä on 6xl05. Rekombinanttien sisältämä DNA vastaa enemmän kuin 200:aa Aspergillus niger -genomia.

112667 44

Kirjaston monistamiseksi 80 μ1:η eriä kumpaakin faagierää käytetään E. coli NM539 -solujen infektoimiseksi, jotka maljataan LB-pinta -agaroosiin LB-agarmaljoilla ja inku-boidaan sen jälkeen yli yön 37°C:ssa. Faagit eluoidaan 5 agaroosista ravistelemalla maljoja kevyesti 5 ml:n kanssa PSB:tä maljaa kohti 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. PSB kerätään talteen, sentrifugoidaan (10 min. nopeudessa 6000xg) bakteerien poistamiseksi ja kloroformia lisätään (0,5 %:n loppupitoisuus). Kumpikin faagierä, jotka monis-10 tuvat suunnilleen samassa määrin, sekoitetaan sen jälkeen (40 μ1:η erä), titrataan (8xl09 pfu/ml) ja varastoidaan 4°C: ssa.

Esimerkki 2: PRB-hiivakoettimen valmistaminen 15 Esimerkki 2.1: Hiivakoettimen valmistaminen

Plasmidi pGP202 (talletettu tunnuksella DSM 7018) sisältää 3,2 ke fragmentin hiivan DNA:ta, joka koodittaa hiivan PRB-geeniä, joka voidan sopivasti leikata Hlndlll:11a ja Saul:llä. Tämä plasmidi pilkotaan Hindin:11a ja Sa-20 ui:llä ja fragmentit erotetaan 0,8 %:isella agaroosigee-lillä. 3,2 ke fragmentti leikataan irti ja DNA elekt-roeluoidaan. 100 ng tätä fragmenttia katkoluetaan (nick) 32P-ATP leimaavana nukleotidinä ja käytetään välittömästi koetinanalyysiin joko Southern-menetelmällä tai plakki-;· 25 hybridisaatiolla.

Esimerkki 2.2: A. niqerin DNA:n Southern-hybridisaatiot 2 pg:n näyte-erät edellä kuvaillulla tavalla valmistetusta A. niqer DNA:sta pilkotaan joko BamHI:llä tai Hindll-30 I:lla ja erotetaan 0,8 %:isella agaroosigeelillä. Eti- diumbromidilla värjätyn geelin valokuvaamisen jälkeen DNA siirretään nitroselluloosakalvoille kapillaariblottauksen avulla [Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98:503-517 (1975)] ja hybridisoidaan kuten esimerkissä 3 on kuvailtu leima-35 tun PRB-hiivakoettimen avulla. Erilliset nitrosellu- loosaliuskat, jotka sisältävät molemmat hydrolysaatit, pestään usealla erilaisella pesuohjelmalla olosuhteiden 112667 45 määrittämiseksi, joista saatiin voimakkain signaalin suhde kohinaan. Keksinnön mukaisesti todettiin, että esipesu 47°C:ssa 6xSSC:ssä, jota seurasi kaksi pesua huoneen lämpötilassa 2xSSC:ssä, tuotti parhaat tulokset.

5

Esimerkki 3: A. niqer N400:n kirjaston seulonta PRB-hii-vakoettimella

Osa edellä kuvaillun (esimerkki 1) Aspergillus niqer N400 -kannan genomisesta kirjastosta laimennetaan SM:llä ja 10 0,1 ml:n erät maljataan, joista kukin sisältää noin 2000 pfu:ta. Isäntäsolut preparoidaan siirrostamalla 50 ml:aan LB-alustaa, jota on täydennetty 0,2 %:lla maltoosia, 0,5 ml yli yön LB-alustassa kasvanutta E. coli NM539:ää, ravistelemalla 4 tuntia 250 rpm 37°C:ssa, minkä jälkeen li-15 sättiin 0,5 ml 1 M MgS04:ää ja 0,5 ml 0,5 M CaCl2:a. 0,2 ml eriin näistä soluista sekoitetaan kuhunkin 0,1 ml:n erä faagisuspensiota ja inkuboidaan huoneen lämpötilassa puoli tuntia. Sen jälkeen lisätään 3 ml 0,7 %:ista aga-roosia LM-alustassa 47°C:ssa, pyörresekoitetaan lyhytai-20 kaisesti ja maljataan välittömästi LM-agarmaljoille. Maljoja inkuboidaan yli yön 37°C:ssa ja jäähdytellään 2 tuntia 4°C:ssa.

Kustakin maljasta tehdään kaksi jäljennettä Bentonin ja 25 Davisin plakkihybridisaatiomenetelmän mukaisesti [Benton, W.D. ja Davis, R.W., Science 196:180-182 (1977)]. Ensim-: ; : mäinen kalvo (Schleicher and Schiill BA85) asetetaan mal jan pinnalle 1 minuutiksi, toinen jäljenne 2 minuutiksi ja jäljenteiden paikat merkitään käyttäen tussikynää.

30 Kalvojen poistamisen jälkeen ne asetetaan astiaan, joka sisältää 100 ml denaturoivaa liuosta (IM NaCl, 0,5 M NaOH) 0,5 minuutiksi, ja sen jälkeen 1 minuutiksi 100 ml:aan neutraloivaa liuosta (0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl). Kalvot siirretään astiaan, joka sisältää 3xSSC:tä, 35 hangataan kevyesti hansikkaisella kädellä bakteerijäänteiden poistamiseksi ja huuhdellaan 3xSSC:llä. Kalvot blotataan, kuivataan 10 min. huoneen lämpötilassa ja 112667 46 paistetaan Whatman 3 MM -paperin päällä uunissa 80°C:ssa 2 tunnin ajan.

Paistetut kalvot kostutetaan 3xSSC:ssä, pestään tässä 5 liuoksessa 1 tunti huoneen lämpötilassa ja siirretään sen jälkeen astiaan, joka sisältää 250 ml esilämmitettyä (65°C) esihybridisaatioseosta (6xSSC,lOxDenhardtin liuos (0,2 % BSA, Boehringer-fraktio V; 0,2 % Ficoll 400, Pharmacia; 0,2 % polyvinyylipyrrolidoni-10, Sigma), 0,1 % SDS 10 ja 0,1 mg/ml hierrettyä ja vasta denaturoitua sillin sperman DNA:ta). Yhden tunnin esihybridisaation jälkeen 65°C:ssa ravistelevassa vesihauteessa kalvot pestään kertaalleen puoli tuntia 250 ml:ssa esilämmitettyä (65°C) hybridisaatioseosta, joka on sama kuin esihybridisaa-15 tioseos, paitsi että siitä puuttuu sillin sperman DNA.

Kalvot siirretään sen jälkeen astiaan, joka sisältää 150 ml esilämmitettyä (65°C) hybridisaatioseosta, johon aikaisemmin leimattu koetin on juuri lisätty.

20 14 tunnin hybridisoinnin jälkeen 65°C:ssa kalvot pestään kerran 250 ml:ssa esilämmitettyä (47°C) hybridisaatioseosta puoli tuntia 47°C:ssa, sen jälkeen pestiin huoneen lämpötilassa vaihtaen kaksi kertaa 250 ml:ssa 2xSSC:tä, kumpikin kerta 45 min. Kalvot kuivataan ja valotetaan Kodak :· 25 XAR5 -filmille yhdestä kolmeen päivään -70°C:ssa käyttäen vahvistusvarj ostinta.

____; Tällä tavalla saadaan 3 positiivista signaalia kuudesta seulotusta maljasta. Positiiviset plakit poistetaan ste-30 rillillä pasteurpipetillä asettamalla maljat varovasti autoradiogrammin päälle käyttäen tussimerkitsijöitä. Positiiviset plakit sisältävät agarpalat lisätään 1 ml:aan SM:ää ja 2,5 μΐ kloroformia lisätään. Faagien annetaan diffundoitua agarista yhden tunnin ajan huoneen lämpöti-35 lassa, pyörresekoittaen ajoittain ja inkuboidaan sen jälkeen yli yön 4°C:ssa. Agar ja solujäänteet poistetaan 47 112 6 6 7 sentrifugoimalla 5 min., 2,5 μΐ kloroformia lisätään ja faagierät varastoidaan 4°C:ssa.

Positiiviset kloonit nimetään λΐ, λ2, λ4. Koska faagit 5 maljataan suuressa tiheydessä, positiiviset plakit puh distetaan kahdesti maljäämällä pienessä tiheydessä ja toistamalla koko toistomaljausmenettely, hybridisointi ja positiivisten plakkien poiminta.

10 Esimerkki 4; Lambda-kloonien karakterisointi Esimerkki 4.1; Lambda-DNA:n eristäminen DNA:n eristämiseksi yhdistelmäklooneista faagit monistetaan ensiksi. Tätä tarkoitusta varten E. coli LE392 -isäntäsoluja kasvatetaan optisen tiheyden (600 nm) ar-15 voon 1,0 LB-alustassa, jota oli täydennetty 10 mM MgS04:l-lä ja 0,2 %:lla maltoosia. Tämän jälkeen 50 μΐ puhdistettujen faagien varastoeristä maljataan erikseen kuten edellä on kuvailtu. Yli yön kestäneen inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa faagit eluoidaan täyteenkasvamattomilta maljoilta 20 levittämällä 5 ml SM:ää maljojen pinnalle ja inkuboimalla kaksi tuntia kevyesti ravistellen. Eluoidut faagit kerätään talteen ja 0,1 ml kloroformia lisätään. Seosta pyör-resekoitetaan lyhytaikaisesti ja solujäännökset poistetaan sentrifugoimalla. Supernatantit otetaan talteen, 25 kloroformia lisätään pitoisuuteen 0,3 % ja tuloksena saa-tua malj alysaattia säilytetään 4°C:ssa.

·· Jotta saataisiin lähes täyteen kasvaneita maljoja lähtö- , ; aineeksi faagi-DNA:n eristämistä varten, 10 ml:n eriä 30 maljalysaatteja maljataan E. coli LE392 -isäntäsolujen kanssa. Yli yön kestäneen inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa agaroosipintakerros kaavitaan pois kolmelta melkein täyteen kasvaneelta maljalta. Nämä kerrokset yhdistetään, 20 ml SM:ää ja 0,4 ml kloroformia lisätään ja tuloksena saa-35 tua seosta ravistellaan 37°C:ssa 30 min. ajan. Solujäännökset ja agaroosi poistetaan sentrifugoimalla, superna-tantti otetaan talteen ja sen tilavuus säädetään 18 Λ Ί Γ: ί C Η „ο I U.06/ 48 ml:ksi SM:llä. Vastaava tilavuus, joka sisältää 2 M NaCl, 20 % PEG6000 (BDH, Poole, Iso-Britannia) SM:ssä lisätään ja liuokset sekoitetaan ja asetetaan jäiden päälle. 75 min. kuluttua faagit sentrifugoidaan 20 min. ajan no-5 peudessa 12 OOOxg 4°C:ssa. Supernatantti dekantoidaan ja loppuneste poistetaan Kleenex-kankaan avulla. Pelletti resuspendoidaan 3 ml:aan SM:ää ja uutetaan sitten 3 ml:11a kloroformia. Vesifaasia käsitellään RNaasi A:11a (67 yg/ml) ja DNaasi I:llä (33 pg/ml) 20 min. ajan 37°C:-10 ssa. Tämä seos uutetaan sitten lisäämällä 2 ml fenolia, pyörresekoitetaan, lisätään 1 ml kloroformia, taas pyör-resekoitetaan ja erotetaan kaksi faasia sentrifugoimalla. Vesifaasi uutetaan vielä kahdesti 3 ml:11a fenoli/kloro-formia (1:1) ja vastaavasti 3 ml:11a kloroformia. DNA 15 saostetaan sen jälkeen vesifaasista lisäämällä perättäi-sesti 0,3 ml 3 M natriumasetaattipuskuria (pH 5,2) ja 6 ml etanolia. Tämä seos jätetään 4°C:seen 16 tunniksi ja DNA otetaan sen jälkeen talteen sentrifugoimalla (10 min., 12 OOOxg, 4°C). Pelletti liuotetaan 0,4 ml:aan TE-20 puskuria, RNaasi A:ta lisätään pitoisuuteen 200 pg/ml ja inkuboidaan 37°C:ssa 1 tunnin ajan. DNA saostetaan lisäämällä 38 μΐ 3 M natriumasetaattipuskuria (pH 5,2) ja 0,8 ml etanolia 4°C:ssa 1 tunnin kuluessa. DNA otetaan talteen sentrifugoimalla ja liuotetaan sitten 100 pl:aan TE-pus-25 kuria.

' *

Esimerkki 4.2: A. niger N400:n pepC-kloonien restriktlo- • analyysi

Restriktioanalyysillä osoitetaan, että kaikki kolme faa-30 gia sisältävät inserttejä, jotka ovat peräisin A. nigerin genomin samalta alueelta, ja osittainen restriktiokartta λΐ:stä konstruoidaan.

2 yg faagi-DNA:ta pilkotaan 20 yksiköllä EcoRI:tä 20 yl:n 35 tilavuudessa 1 tunnin kuluessa 37°C:ssa toimittajan (BRL) suosittamassa puskurissa ja kuumennetaan sen jälkeen 65°C:ssa 10 min. Näytteet ajetaan 0,7 %:isella aga- 112667 49 roosigeelillä ja valokuvataan. DNA siirretään nitrosellu-loosakalvolle ja hybridisoidaan leimatulla PRB-hiivakoet-timella. Näistä pilkonnoista käy selväksi, että kaikki kolme faagia ovat identtiset sisältäen 12 ke ja 2,7 ke 5 EcoRI-fragmentin. On myös selvää, että 12 ke fragmentti on ainoa fragmentti, joka hybridisoitui PRB-koettimeen ja sisältää siten suurimman osan ellei kaikkea vastaavasta A. niaer -geenistä, λΐ valitaan jatkoanalyysiin.

10 λΐ pilkotaan edelleen usealla eri restriktioentsyymillä ja analysoidaan jälleen Southern-hybridisaation avulla. Pienin vyöhyke, joka näytti sisältävän kaikki PRB-koettimeen hybridisoituvat vyöhykkeet, on 3,2 kep EcoRI /BamHI- fragmentti . Tämä siis subkloonataan plasmidiin. 15

Esimerkki 5: PEPC:n kloonaus plasmidiin ia sen sekvensointi 1a karakterisointi Esimerkki 5.1: pTZPEPC;n konstruointi

Xl-DNA:ta inkuboidaan restriktioentsyymien BamHI ja EcoRI 20 kanssa, olennaisesti kuten edellä on kuvailtu. Kloroformilla uuttamisen jälkeen DNA seostetaan, sentrifugoidaan pelletiksi, liuotetaan näytepuskuriin ja elektroforesoi-daan 0,6 %:isella agaroosigeelillä lxTBE-puskurissa. 3,2 kep BamHI-EcoRI -fragmentin sisältävä geelipala otetaan 25 talteen ja DNA elektroeluoidaan. Tämä uutetaan sen jäl-! keen 100 piillä kloroformia ja saostetaan etanolilla ja : ; liuotetaan uudelleen 40 ml:aan TE-puskuria. DNA-pitoisuus : arvioidaan agaroosigeelielektroforeesin avulla, jota seu raa vyöhykkeen visuaalinen tarkastelu UV-valossa.

: ; 30 pTZ18R-vektori valmistetaan pilkkomalla BamHI:llä ja EcoRI :llä toimittajan (BRL) suosittamissa olosuhteissa. DNA uutetaan fenolilla, fenoli/kloroformilla (1:1) ja kloroformilla ja DNA saostetaan etanolilla.

100 ng kutakin edellä olevista fragmenteista ligoidaan yhdessä reaktiotilavuudessa 25 μΐ, joka sisältää BRL:n 35 112667 50 suosittaman puskurin sekä ATP:tä (1 mM), 1,5 U T4 DNA -ligaasia (BRL). Reaktioseosta inkuboidaan 16 tuntia 16°C:-ssa ja käytetään sen jälkeen E. coli DH5aF':n transfor-mointiin. Solut maljataan LB-agarmaljoille, jotka sisäl-5 tävät 25 mg/ml ampisilliiniä, 0,005 % Xgal:ia, 0,05 mM IPTG:tä ja inkuboidaan yli yön 37°C:ssa.

Useita yksittäisiä valkoisia pesäkkeitä käytetään yliöis-ten viljelmien valmistamiseksi LB-alustassa, johon on 10 lisätty 0,1 % glukoosia ja 25 mg/ml ampisilliiniä. Näitä viljelmiä käytetään plasmidin eristämiseen, käyttäen Holmesin ja Quigleyn pienimittaista valmistusmenetelmää [Holmes, D.S. ja Quigley, M., Anal. Biochem. 114:193 (1981)]. Plasmidit pilkotaan useilla restriktioentsyymei-15 lä toimittajan (BRL) suositusten mukaisesti ja RNaasi A:n (0,5 mg/ml) läsnäollessa ja tuotteet analysoidaan agaroo-sigeelillä. Plasmidit, joista saadaan odotetunkokoisiä BamHI-EcoRI ja HindiII -fragmentteja, valitaan ja E. coli -soluja, jotka sisältävät niitä, säilytetään glyserolissa 20 -20°C:ssa. Tätä plasmidia nimitetään tunnuksella pTZPEPC

(talletettu tunnuksella DSM 7019).

Esimerkki 5.2: pepC:n nukleotidisekvenssi pepC:n subklooni, 3,2 kep BamHI-EcoRI -fragmentti pTZ18R-25 vektorissa sekvensoidaan kokonaan dideoksi-ketjunpysäy-tysmenetelmällä [Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 74:5463-67 (1977)] käyttäen synteettisiä oligonukle-otidialukkeita ja Sequenasea (United States Biochemical Corp. ).

! ; 30 ' Täydellinen nukleotidisekvenssi esitetään Sekvenssiluet- telossa. Avoin lukukehys identifioidaan vertailemalla muihin tunnettuihin subtilisiiniperheen seriiniprote-aaseihin ja tämä varmistetaan transkriptiokartoituksella. 35 112:6/ 51

Esimerkki 5.3: PEPC;n RNA-kartoitus

Kokonais-RNA valmistetaan jauhetuista pakastekuivatuista rihmastoista, joita on kasvatettu minimaalialustoilla glukoosi hiilenlähteenä ja ammoniumtyppi typenlähteenä 5 Frederickin ja Kinseyn menetelmällä [Curr. Genet. 18:53-58 (1990)]. Lähetti-RNA:n 5'-pää identifioidaan hybri-disoimalla kokonais-RNA 32-P:llä päästä leimatun oli-gonukleotidin, oligo A:n kanssa (komplementaarinen nukleotideille 433-456 Sekvenssi l:ssä) ja määrittämällä 10 käänteistranskriptaasin avulla tuotetun ylimenevän tran-skriptin (runoff) koko sekvensointigeelillä vertailemalla sekvensointireaktioihin, jotka on muodostettu dideok-sisekvensoinnin avulla saman oligonukleotidin kanssa (Ma-niatis et ai., Molecular Cloning. A Laboratory Manual.

15 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Intronin täsmälliset silmukointikohdat identifioidaan kloonaamalla ja sekvensoimalla pepC-koodin osittainen cDNA-kopio. Ensimmäisen juosteen synteesi suoritetaan vakiomenetelmillä (Maniatis et ai., viitatussa julkaisus-20 sa), paitsi että synteesin aloitusnukleotidi on oligo C (komplementaarinen nukleotideille 923-944 Sekvenssi l:ssä). Tälle cDNAtlle suoritetaan PCR käyttäen oligo B:tä (vastaten nukeotidejä 631-657 Sekvenssi l:ssä) ja oligo C:tä ja kloonataan pTZ18R:ään. (Huomattakoon, että 25 oligo B:ssä on lisäksi BamHI-kohta 5'-päässä ja oligo C:ssä on lisäksi EcoRI-kohta). Kahden itsenäisen kloonin molemmat juosteet sekvensoidaan kokonaan. pepC-geenin tuottaman mRNA:n kokonaispituus määritetään Northern-ana-lyysin avulla käyttäen 3,2 ke EcoRI-BamHI -fragmenttia 30 koettimena (Maniatis et ai., viitatussa julkaisussa) ja määritetään olemaan välillä 1,5-1,8 ke, joka vastaa pituutta, jota odotetaan avoimen lukukehyksen koolta ja : kopioinnin aloituskohdan paikalta.

112667 52

Esimerkki 6: PEPC:n oenominen hajaannuttaminen Esimerkki 6.1: pTZPEPCE:n konstruointi

Plasmidi pTZPEPC pilkotaan BamHI:llä. käsitellään T4-po-lymeraasin kanssa ja religoidaan, kun läsnä on kymmenker-5 täinen molaarinen ylimäärä fosforyloimattomia EcoRI-kvt-kijöitä (5'GGAATTCC). E. coliin transformoinnin jälkeen oikea plasmidi, jossa on EcoRI-kohdat pepC-geenin vieressä molemmilla puolilla, identifioidaan miniseulonnalla.

10 Esimerkki 6.6: pAXI:n konstruointi

Plasmidi pCG59D7, joka voidaan saada Escherichia coli BJ5138/pCG59D7:stä (DSM 3968), pilkotaan Xbal:llä ja fragmentti, joka sisältää A. niger pyrA-geenin kokonaan, puhdistetaan. Tämä kloonataan pTZ18R:n Xbal-kohtaan plas-15 midi pAXI:n muodostamiseksi (talletettu tunnuksella DSM 7017).

Esimerkki 6.3: pPEPCPYRA:n konstruointi pyrA-geenin sisältävä 4 ke Xbal-fragmentti leikataan pA-20 XI:stä ja puhdistetaan vektorisekvensseistä.

2 pg pTZPEPCErtä katkaistaan Bglll:11a valmistajan suositusten mukaisesti ja uutetaan sen jälkeen fenolilla, seostetaan etanolilla ja liuotetaan uudelleen 20 pl:aan • 25 vettä. Tätä DNA:ta käsitellään sen jälkeen bakteerisella . alkalisella fosfataasilla 5'-fosfaattiryhmien poistami seksi valmistajan suositusten mukaisesti. 5 ke fragmentti puhdistetaan geelistä.

; 30 Molempia edellä olevista fragmenteista käsitellään T4- polymeraasin kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti ja uutetaan fenolilla ja seostetaan etanolilla. Mainitut kaksi fragmenttia sekoitetaan keskenään ja ligoidaan. E_j_ ‘ colin transformoinnin jälkeen oikeat plasmidit sisältävät 35 pesäkkeet identifioidaan miniplasmidivalmisteiden rest-riktiopilkonnalla.

112667 53 pPEPCPYRA sisältää pTZl8R-vektorin, joka sisältää EcoRI-fragmentin, joka sisältää PEPC-geenin, jossa on keskinen Bqlll-fraqmentti. joka koodittaa sekä aktiivista kohtaa histidiiniä että seriiniä, korvattuna Xbal DNA -fragmen-5 tiliä, joka koodittaa orotidiinimonofosfaattidekarboksy-laasia.

Esimerkki 6.4: A.niqerin transformointi 10 pg plasmidia pPEPCPYRA hydrolysoidaan loppuun EcoRI:-10 llä. Hydrolyysin täydellisyys tarkistetaan ajamalla näyte-erä geelillä ja loput DNA:sta uutetaan fenolilla, sa-ostetaan etanolilla ja resuspendoidaan 20 pl:aan steriiliä vettä.

15 Auksotrofisen A. niger An8:n (DSM 3917) konidiosporeja kasvatetaan 4 päivää 28°C:ssa täydellisessä alustassa täysin itiöisiksi. 2xl08 konidiosporia käytetään·siirrostet-taessa 200 ml minimaalialustaa, johon on lisätty 1 g/1 arginiinia ja uridiinia.

20 20 tunnin kasvatuksen jälkeen 28°C:ssa nopeudella 180 rpm rihmasto otetaan talteen suodattamalla mirakankaan läpi, pestään kahdesti 10 mlrlla 0,8 M KCL:ää, 50 mM CaCl2:a ja resuspendoidaan 20 ml:aan 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a, 0,5 :· 25 mg/ml Novozym 234:ää (Novo Industries). Seosta inkuboi- daan ravistelevassa vesihauteessa (30°C, 50 rpm) kunnes riittävä määrä protoplasteja on vapautunut (havainnoituna , mikroskooppisesti 90-120 min. kuluttua). Protoplastisus- pensio suodatetaan lasivillatupon läpi suppilossa rihmas-’ 30 tojäänteiden poistamiseksi. Protoplastit sakkautetaan kevyen sentrifugoinnin avulla (10 min., 2000 rpm) huoneen lämpötilassa ja pestään kahdesti 10 ml:11a 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a. Protoplastit suspendoidaan lopuksi 200-500 pl:aan 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a, jotta saadaan pitoi-35 suudeksi 1x10® sferoplastia/ml.

112667 54

Transformaatiota varten 200 μ1:η näyte-erää protoplas-tisuspensiosta inkuboidaan, kun läsnä on 5 pg EcoRI:llä pilkottua pPEPCPYRA:aa 50 ml PCT:tä (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2, 25 % PEG6000). Inkubaatioseosta pidetään 5 jäiden päällä 20 minuuttia, toiset 2 ml PCT:tä lisätään ja seosta inkuboidaan vielä 5 min. huoneen lämpötilassa.

4 ml liuosta, joka sisältää 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2 lisätään ja 1 ml:n näyte-eriä lopullisesta transformaatioli-uoksesta sekoitetaan nestemäisen minimaaliagaralustan 10 kanssa (minimaalialusta + 1 g/1 arginiinia + 10 g/1 Bac-to-Agaria (Difco)), stabiloidaan 0,8 M KCl:llä. Seokset kaadetaan välittömästi samaa alustaa sisältäville agar-maljoille ja inkuboidaan 30°C:ssa.

15 2-3 päivän kasvatuksen jälkeen 28°C:ssa, pysyvät transfor- mantit tulevat näkyviin voimakkaasti kasvavina ja itiöi-vinä pesäkkeinä taustakasvunaan monia satoja pieniä, luultavasti hylkääviä transformantteja.

20 Esimerkki 6.5: Geenihalaantumien identifiointi

Pysyvistä pesäkkeistä valmistetaan yksittäisiä itiösus-pensioita ja levitetään tuoreille minimaali + arginiini -maljoille. Yksittäisiä pesäkkeitä valikoidaan ja levitetään uudelleen puhdasviljelmien saamiseksi. Näitä käyte-25 tään, kun siirrostetaan 200 ml nestemäistä minimaalialus-taa, johon on lisätty 1 g/1 arginiinia. 24 tunnin ravistelun kuluttua 30°C:ssa nopeudella 180 rpm, rihmastot kerätään talteen suodinpaperille ja kakku pakastekuivataan. Kuivaamisen jälkeen DNA:ta preparoidaan yksittäisistä 30 kakuista jauhamalla ne hienoksi jauheeksi huhmaren ja survimen avulla. 60 mg tätä jauhetta resuspendoidaan 3 ml:aan liuosta, joka sisältää 1 % natriumdodekyylisul-faattia, 0,1 % Tween 80:tä, 1 M ammoniumasetaattia, pyör-resekoittaen. Liuosta kuumennetaan 65°C:ssa 20 min. se-35 koittaen ajoittain. Solujäännös erotetaan DNA-liuoksesta sentrifugoimalla nopeudessa 15 000 rpm 5 min ajan. Super-natantti uutetaan kahdesti fenolilla, kahdesti klorofor- 112667 55 millä ja seostetaan etanolilla. DNA-pelletti liuotetaan uudelleen 100 ml:aan steriiliä TE-puskuria.

20 μΐ kutakin DNA:ta pilkotaan Bqlll:11a 1 tunnin ajan, 5 kun läsnä on 1 pg RNaasi A:ta. Tämä erotetaan aga- roosigeelillä ja siirretään nitroselluloosakalvolle ja paistetaan. EcoRI-fragmentti pTZPEPC:stä, joka sisältää PEPC:n, puhdistetaan, leimataan katkoluennan avulla ja käytetään kalvojen koetinkäsittelyyn. Kannat, jotka si-10 sältävät pepC-geenin useassa osassa, on helppo tunnistaa hybridisoituvan 1,2 ke Bqlll:n puuttumisesta samoin kuin kahden muun viereisen fragmentin muuttuneesta vaihtelevuudesta.

15 Yksi näistä lannoista maljataan alustoille, jotka sisältävät uridiinia ja 5-fluorioroottihappoa. Pyrimidiiniauk-sotrofiamutantit identifioidaan voimakkaamman kasvun perusteella tällä alustalla ja poimitaan ja puhdistetaan levityshajotuksella yksittäisten pesäkkeiden saamiseksi.

20

Esimerkki 6.6: Interferonin tuottaminen pepC* A. niqer -kannassa

Yhtä esimerkissä 6.5 eristettyä pepC' A. niqer An8 -kantaa käytetään isäntänä seuraavaan transformaatioon pyrA*: n I* 25 sisältävillä plasmideilla ja ekspressiokaseteilla, jotka sisältävät heterologisen interferonigeenin.

: A. niqer An8:n uridiiniauksotrofisen pepC'-mutantin koni- diosporeja kasvatetaan 4 päivää 28°C:ssa täydellisessä 30 alustassa täyteen itiöitä. 2x10® konidiosporia käytetään siirrostettaessa 200 ml:aan minimaalialustaa, johon on lisätty lg/1 arginiinia ja uridiinia.

20 tunnin kasvatuksen jälkeen 28°C:ssa nopeudella 180 rpm 35 rihmasto otetaan talteen suodattamalla mirakankaan läpi, pestään kahdesti 10 ml:11a 0,8 M KCL:ää, 50 mM CaCl2:a ja resuspendoidaan 20 ml:aan 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a, 0,5 112667 56 mg/ml Novozym 234:ää (Novo Industries). Seosta inkuboi-daan ravistelevassa vesihauteessa (30°C, 50 rpm) kunnes riittävä määrä protoplasteja on vapautunut (havainnoituna mikroskooppisesti 90-120 min. kuluttua). Protoplastisus-5 pensio suodatetaan lasivillatupon läpi suppilossa rihmas-tojäänteiden poistamiseksi. Protoplastit sakkautetaan kevyen sentrifugoinnin avulla (10 min., 2000 rpm) huoneen lämpötilassa ja pestään kahdesti 10 ml:11a 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a. Protoplastit suspendoidaan lopuksi 200-500 10 pl:aan 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a, jotta saadaan pitoisuudeksi lxl08/ml.

Transformaatiota varten 200 μ1:η näyte-erää protoplas-tisuspensiosta inkuboidaan seoksessa, joka sisältää 5 pg 15 pCG59D7:ää (DSM 3968) ja 50 pgpGIIss-IFN AM119- tai pGII-IFN AM119 -DNA:ta (kumpikin plasmidi on täysin esitelty EP-patenttihakemuksessa 0 421 919), 50 μΐ PCT:tä (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2, 25 % PEG 6000). Inkubaa-tioseosta pidetään jäiden päällä 20 minuuttia, toiset 2 20 ml PCT:tä lisätään ja seosta inkuboidaan vielä 5 min.

huoneen lämpötilassa. 4 ml liuosta, joka sisältää 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2 lisätään ja 1 ml:n näyte-eriä lopullisesta transformaatioliuoksesta sekoitetaan nestemäisen mini-maaliagaralustan kanssa (minimaalialusta + 1 g/1 arginii-25 nia + 10 g/1 Bacto-Agaria (Difco)), stabiloidaan 0,8 M KCl:llä. Seokset kaadetaan välittömästi samaa alustaa sisältäville agarmaljoille ja inkuboidaan 30°C:ssa.

2-3 päivän kasvatuksen jälkeen 28°C:ssa, pysyvät transfor-30 mäntit tulevat näkyviin voimakkaasti kasvavina ja itiöi- vinä pesäkkeinä taustakasvunaan monia satoja pieniä, luultavasti hylkääviä transformantteja.

; Transformantit poimitaan ja interferonin ilmeneminen ana- 35 lysoidaan. Interferonin aktiivisuus määritetään Armstron-gin menetelmän mukaisesti (J.A. Armstrong, Appi. Micro- 57 Ί12667 biol. 21,732 (1971)) käyttäen ihmisen CCL-23 -soluja ja vesikulaaristomatiittivirusta (VSV) ärsykeviruksena.

Transformanttien konidiosporeja esiviljellään yksittäi-5 sesti 50 ml:ssa esiviljelyalustaa (pektiini Slow SetL

(Unipectin, SA, Redon, Ranska) 3 g/1, NH4C1 2 g/1, KH2P04 0,5 g/1, NaCl 0,5 g/1, MgS04x7H20 0 , 5 g/1, CaS04x2H20 0,5 g/1, pH 7,0, 1 % arginiini). Esiviljelmää inkuboidaan 72 tuntia nopeudella 250 rpm ja 28°C. 10 % esiviljelmästä 10 käytetään siirrostettaessa 50 ml:aan pääviljelyalustaa (soijajauho 20 g/1, pektiini Slow Set 5 g/1, 1 % arginiini). Viljelmää kasvatetaan 72-96 tuntia nopeudella 250 rpm ja 28°C.

15 Eri ajankohtina (joka 20. tunti) otetaan näytteitä, solut sentrifugoidaan ja rikotaan pakastekuivaamalla ja kuiva-jauhatuksella. Sekä supernatantista että solu-uutteista testataan interferoniaktiivisuus kuten edellä on kuvailtu. Valtaosan interferoniaktiivisuudesta havaitaan erit-20 tyvän alustaan transformanteista, jotka sisältävät pGIIss-IFN AM119:n, kun taas transformanteissa, jotka sisältävät pGII-IFN AM119:n, aktiivisuus on pääasiassa solu-uutteessa.

J· 25 Esimerkki 7: pepC:n yli-ilmeneminen A. niqerissä ,.’. Esimerkki 7.1: Multippelien kopioiden vli-ilmeneminen A. niger An8 transformoidaan 1 pg:lla pAXI:a + 10 pg:lla pTZPEPC:a jolloin sadaan uridiiniprototrofeja. Pesäkkeet puhdistetaan ja DNA preparoidaan kuten edellä on kuvail-30 tu. Southern-blotit, joissa käytettiin pTZPEPC:n EcoRI-‘ BamHI -fragmenttia, osoittivat, että joillakin transfor- manteilla on yksi ainoa pTZPEPC-kopio kiinnittyneenä ge-: nomiin, kun taas muilla on jopa 10 tai enemmän ylimää- : räistä kopiota genomissaan. Nämä kannat tuottivat vastaa- 35 vasti enemmän proteolyyttistä aktiivisuutta ja ovat mi-toottisesti pysyviä.

58 11266/

Esimerkki 7.2: pepC;n yli-ilmeneminen qeenifuusioista Plasmidi pGWHOO (talletettu tunnuksella DSM 5747) katkaistaan BamHI:llä ja Sacl:llä. 1,2 kep fragmentti, joka käsitti pyruvaattikinaasipromoottorin ja 5'-pään, puhdis-5 tettiin, käsiteltiin T4-polymeraasin kanssa ja kloonattiin pTZPEPC:n tunnusomaiseen BamHI-kohtaan pepC-kloonin 5'-päässä, joka tehdään myös tasapäiseksi T4-polymeraa-silla ja käsitellään alkalisella fosfataasilla.

10 Oikeat plasmidit identifioidaan miniseulonnan avulla ja yksi valitaan ja transformoidaan dut-ung- E. coli BW313 -kantaan. Tämä superinfektoidaan M13K07:llä jolloin saadaan yksijuosteista urasiili-substituoitua DNA:ta plasmi-dista.

15

Oligonukleotidi 1 (kuvattu Sekvenssi 3:ssa) käsittää 37 nukleotidiä. Ensimmäiset 19 nukleotidiä ovat komplementaarisia pepC:n avoimen lukukehyksen ensimmäisten 19 nukleotidin kanssa ja viimeiset 18 ovat komplementaarisia 20 viimeisten 18 nukleotidin suhteen ennen ATG:tä pyruvaat-tikinaasigeenissä. Tämän plasmidin in vitro mutatointia varten 5 pM oligonukleotidi l:tä fosforyloidaan 5'-päästä 100 pM:lla ATP:tä käsittelemällä oligoa 10 U:lla T4-po-lynukleotidikinaasia 50 plrssa kinaasipuskuria toimitta-25 jän suositusten mukaisesti. Reaktio pysäytetään kuumentamalla 65°C:ssa 10 min.

0,2 pM urasiilia sisältävää yksijuosteista DNA:ta sekoitetaan 0,5 pM:n kanssa fosforyloitua oligonukleotidi l:tä 30 liuoksessa, joka sisältää 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM

MgCl2, 25 mM NaCl lopputilavuudessa 10 μΐ. Seosta inkuboi-daan 65°C:ssa 5 min. ajan, jäähdytetään hitaasti huoneen lämpötilaan 60 min. kuluessa ja asetetaan jäiden päälle 15 minuutiksi. Seokseen lisätään sen jälkeen 2 μΐ 500 mM 35 dNTP:tä, 1,5 μΐ 10 mM ATP:tä, 1 ml T7 DNA -polymeraasia (12 U/μΙ Pharmacia) ja 1 μΐ T4 DNA -ligaasia (1,2 U/μΙ BRL) ja tätä polymerisaatioseosta inkuboidaan 15 min.

59 112367 ajan 37°C:ssa. Reaktio pysäytetään kuumentamalla 65°C:ssa 5 min. ja näyte-eriä käytetään E. coli DH5aF':n transfor-mointiin.

5 Oikeat plasmidit identifioidaan pilkkomalla miniplasmidi-valmisteita. 3 valitaan ja EcoRI-fragmentti sekvensoidaan kokonaan käyttäen synteettisiä oligonukleotidejä. Yhtä plasmidia, joka sisältää pyruvaattikinaasipromoottorin täydellisen fuusion pepC:n avoimeen lukukehykseen, joka 10 on nimeltään pPKIPEPCA, käytetään pAXl:n kanssa A. niqer An8:n kotransformoimiseksi uridiiniprototrofiseksi.

pki-pepC -fuusion läsnäolo varmistetaan preparoimalla DNA:ta yksittäisistä puhdistetuista transformanteista ja 15 käyttämällä sitä Southern-analyysiin käyttäen koettimia pkirstä ja pepC:stä. Kantojen, joissa tämän geenifuusion yksi tai useampi kopio on kiinnittynyt genomiin, näyttävät tuottavan enemmän proteolyyttistä aktiivisuutta, kun solut kasvavat nopeasti glukoosi C-lähteenä.

20

Esimerkki 8: pepC:n ilmentäminen muissa organismeissa: ilmentäminen hiivassa

Plasmidi pPKIPEPCA mutatoidaan in vitro Sekvenssiluette-, 25 lon Sekvenssi 4:ssä ja 5:ssä esitettyjen kahden synteet tisen oligonukleotidin kanssa. Edellinen oligo saa aikaan EcoRI-kohdan juuri ennen pepC:n ATG:tä ja toinen silmukoi pois koko intronin. Tästä muodostuu plasmidi pPKIPEPCB, jonka sekvenssi varmistetaan täydellisellä sekvensoinnil-30 la.

2,8 ke EcoRI-BamHI -fragmentti, joka alkaa juuri ennen ; pepC:n ATG:tä ja päättyy pepC:n terminaattorin jälkeen, puhdistetaan ja ligoidaan yhdessä pFBY129:n (talletettu 35 tunnuksella DSM 7016) 520 ep BamHI-EcoRI -fragmentin kanssa, joka sisältää hiivan GALlO-promoottorin, hiivan kaksimikroni-pohjaisen vektori pFBY25:n (talletettu tun- 112667 60 nuksella DSM 7020) SnaBI-kohtaan. Oikea plasmidi identifioidaan restriktiopilkonnoilla.

Tämä pFBY138-plasmidi transformoidaan hiivaan ja sen 5 osoitetaan tuottavan pepC-proteiinia, kun geenifuusio indusoidaan galaktoosilla.

Esimerkki 9: DNA-koettimen eristäminen A. niqerin subti-lisiinityyppisten seriiniproteaasien seulomiseksi 10 Esimerkki 9.1: Degeneroituneiden PCR (polymeraasiketjureaktio) -alukkeiden rakentelu

Polymeraasiketjureaktiota (Saiki et ai., Science 230:1350-1354 (1985)) käytetään koettimien eristämiseksi tätä seulontaa varten. Kaksi aluetta, jotka sisältävät 15 aktiivisen kohdan tähteet histidiinin ja vastaavasti se-riinin, ovat hyvin säilyneitä subtilisiiniryhmän eri pro-teaasien joukossa. Konsensusaminohapposekvenssi saadaan kummallekin näistä alueista ja DNA-sekvenssit, jotka kykenevät koodittamaan näitä kahta aminohapposekvenssiä, 20 johdetaan. Degeneraatiotason alentamiseksi, kaksi aluket-ta kummallekin säilyneelle alueelle suunnitellaan. PCRo-ligo 1 ja PCRoligo 2 (esitetty Sekvenssi 8:ssa ja vastaavasti Sekvenssi 9:ssä) vastaavat His aktiivisen kohdan aluetta ja PCRoligo3 ja PCRoligo 4 (esitetty Sekvenssi 25 10:ssä ja vastaavasti Sekvenssi llrssä) vastaavat Ser aktiivisen kohdan aluetta. PCR-tuotteiden myöhemmän subk- i loonauksen helpottamiseksi, PCRoligot 1 ja 2 sisältävät BamHI-restriktiokohdan ja PCRoligot 3 ja 4 sisältävät ‘ EcoRI-restriktiokohdan lähellä 5'-päitä lisäksi.

6 30 ; Esimerkki 9.2; A. niqerin qenomisen DNA:n monistaminen A. niqerin genominen DNA eristetään kuten esimerkissä 1 ; on kuvailtu. Neljä monistusreaktiota suoritetaan käyttäen

neljän edellä kuvaillun PCR-oligon parittaisyhdistelmää. 35 Reaktioseos polymeraasiketjureaktiota varten sisältää 100 ng A. niqerin genomista kokonais-DNA:ta, 100 pmoolia kutakin aluketta, 10 mM Tris-HCl:ää, 50 mM KCl:ää, 1,5 mM

112667 61

MgCl2:a, 1 mg/ml gelatiinia (pH 8,3) ja 5 yksikköä Taq DNA -polymeraasia kokonaistilavuudessa 50 μΐ. DNA denaturoidaan 94°C:ssa 30 sekunnin kuluessa, sen jälkeen alukkeet pariutetaan 42°C:ssa 40 sekunnin kuluessa ja pidennysvaihe 5 suoritetaan 72°C:ssa 60 sekunnin kuluessa. Nämä kolme vaihetta toistetaan sitten 40 kertaa.

Esimerkki 9.3: PCR-tuotteiden eristäminen ia karakterisointi 10 Monistusreaktiotuotteet erotetaan 1 %:isella agaroosigee-lillä ja DNA-fragmentit eristetään geelistä elektroeluoi-malla kuten edellä on kuvailtu. Eristetyt fragmentit (200-300 ng) uutetaan fenolilla ja sen jälkeen kloroformilla ja seostetaan etanolilla. Sentrifugoinnin jälkeen 15 DNA-pelletit kuivataan ja liuotetaan sitten 10 pl:aan TE-puskuria. Tämä DNA pilkotaan sitten 10 yksiköllä BamHI-ja EcoRI -restriktioentsyymejä 20 μ1:η tilavuudessa 1 tunnin ajan 37°C:ssa toimittajan (BRL) suosittamassa puskurissa. Fenolilla ja kloroformilla uuttamisen jälkeen ja 20 etanolilla saostamisen jälkeen pilkottu DNA sentrifugoi-daan, kuivataan ja liuotetaan 10 pl:aan TE-puskuria. DNA-pitoisuus arvioidaan agaroosigeelielektroforeesin avulla, jota seuraa DNA-vyöhykkeen visuaalinen tarkastelu UV-va-lossa.

25 pTZ18R-vektori valmistetaan pilkkomalla BamHI:llä ja Eco-RI:llä toimittajan (BRL) suosittamissa olosuhteissa ja uutetaan sitten ja seostetaan etanolilla kuten edellä on kuvailtu.

30 100 ng eristettyjä fragmentteja ligoidaan yhdessä 100 ng: kanssa edellä kuvaillusta valmistettua pTZ18R-vektoria 20 μ1:η tilavuudessa 1 yksikön kanssa T4 DNA -ligaasia. Käytetyt puskuriolosuhteet ovat toimittajan (BRL) esittämät 35 olosuhteet. Reaktioseoksen inkuboinnin jälkeen 16°C:ssa 16 tunnin ajan sitä käytetään E, coli DH5aF' -kannan transformaatioon. Solut maljataan LB-agarmaljoille, jotka si- 112667 62 sältävät 25 pg/ml ampisilliiniä, 0,005 % Xgal:ia, 0,05 mM IPTG:tä ja inkuboidaan yli yön 37°C:ssa.

Useita yksittäisiä valkoisia pesäkkeitä käytetään yliöis-5 ten viljelmien valmistamiseksi 5 ml:ssa LB-alustaa, johon on lisätty 0,1 % glukoosia ja 25 pg/ml ampisilliiniä.

Näitä viljelmiä käytetään plasmidi-DNA:n eristämiseen käyttäen Holmesin ja Quigleyn minivalmistusmenetelmää (Holmes, D.S. ja Quigley, M., Anal. Biochem. 114:193 10 (1981). Plasmidit pilkotaan BamHI- ja EcoRI -restriktio- entsyymeillä toimittajan (BRL) suositusten mukaisesti. Fragmentit sisältäviä plasmideja jatkoanalysoidaan.

Valikoitujen plasmidien insertit sekvensoidaan dideoksi-15 ketjunpysäytysmenetelmällä (Sanger et ai., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA 74:5463-67 (1977)) käyttäen synteettisiä oligonukleotidialukkeita ja Sequenasea (United States Biochemical Corp.).

20 Esimerkki 9.4: PCR-tuotteiden sekvenssien tietokoneanalyysi

Edellä mainittujen inserttien nukleotidisekvenssejä verrataan kaikkiin DNA-sekvensseihin yhdistetyissä GenBank-ja EMBL-tietueissa. Yksi niistä, joka on runsaasti homo-25 loginen subtilisiinityyppisiä proteaaseja koodittavien DNA-sekvenssien kanssa, valitaan koettimeksi ja nimetään PCR-koettimeksi A. nioerin genomisen kirjaston myöhempää seulontaa varten. Tämän fragmentin sekvenssi (ilman PCR-; alukkeita) on nukleotidien 1474 ja 2020 välinen sekvenssi 30 Sekvenssi 6:ssa.

Esimerkki 10: A. niger N400:n kirjaston seulonta PCR-koettimella

Kalvot edellä (esimerkki 1) kuvaillun Aspergillus niger 35 N400 -kannan genomisen kirjaston plakkihybridisaatiota varten preparoidaan ja esihybridisoidaan esimerkin 3 mukaisesti.

112δ 67 63

Hybridisoinnin jälkeen 14-16 tuntia 65°C:ssa kalvot pestään kerran 250 mlrssa 2xSSC:tä, 0,1 % SDS:ää puolen tunnin ajan huoneen lämpötilassa, jota seuraa pesu huoneen lämpötilassa vaihtaen kahdesti 250 ml:ssa 0,2xSSC:tä, 0,1 5 % SDSrää kumpikin 20 min., ja lopuksi kahdesti 250 mlrssa 0,2xSSC:tä, 0,1 % SDSrää 65°C:ssa kumpikin 20 min. Kalvot kuivataan ja valotetaan Kodak XAR5 -filmille yhdestä kolmeen päivään -70°C:ssa käyttäen vahvistusvarjostinta.

10 Tällä tavalla saadaan 5 positiivista signaalia kuudelta seulotulta maljalta. Positiiviset plakit poistetaan steriilillä pasteurpipetillä sijoittamalla maljat varovasti autoradiogrammin päälle käyttäen tussimerkitsijöitä. Positiiviset plakit sisältävät agarpalat lisätään 1 ml:aan 15 SMrää ja 2,5 μΐ kloroformia lisätään. Faagien annetaan diffundoitua agarista yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa pyörresekoittaen ajoittain ja inkuboidaan sitten yli yön 4°C:ssa. Agar ja solujäänteet poistetaan sentrifu-goimalla 5 min., 2,5 μΐ kloroformia lisätään ja faagierät 20 varastoidaan 4°C:ssa.

Positiiviset kloonit ovat nimeltään Xa, Xb, Xc, Xd ja Xe. Koska faagit maljataan suuressa tiheydessä, positiiviset plakit puhdistetaan kahdesti maljaamalla ne pienessä ti-25 heydessä ja toistamalla koko menettely, joka käsittää toistomaljauksen, hybridisaation ja positiivisten plakkien poiminnan.

I Esimerkki 11: Lambda-kloonien karakterisointi V 30 Esimerkki 11.1: Lambda-DNA:n eristäminen ia A. niger N400:n pepD-kloonien restriktioanalyysi

Lambda-DNA eristetään kuten esimerkissä 4.1 on kuvailtu.

Restriktioanalyysin avulla on osoitettu, että kaikki vii-35 si faagia Xa - Xe sisältävät inserttejä, jotka ovat peräisin A. nigerin genomin samalta alueelta ja kyseisen genomialueen osittainen restriktiokartta konstruoidaan.

64 11206/ 2 pg faagi-DNA:ta pilkotaan 20 yksiköllä EcoRI:tä tai BamHI:tä 20 μ1:η tilavuudessa 1 tunnin ajan 37°C:ssa valmistajan (BRL) suosittamassa puskurissa ja kuumennetaan sen jälkeen 65°C:ssa 10 min. ajan. Näytteet ajetaan 0,7 5 %:isella agaroosigeelillä ja valokuvataan. DNA siirretään nitroselluloosakalvolle ja hybridisoidaan leimatun PCR-koettimen kanssa.

Näiden hydrolysaattien perusteella on selvää, että 5 faa-10 gia sisältää suunnilleen 5,5 kep sisältävän peittoalueen, joka hybridisoitui PCR-koettimeen ja tästä johtuen sisältää suurimman osan ellei kaikkea vastaavasta A. nioer -geenistä. 6,0 kep pitkä BamHI-fragmentti sisälsi tämän alueen ja valitaan jatkoanalyysiin.

15

Esimerkki 12: PEPD:n kloonaus plasmidiin ia sen sekvensointi ia karakterisointi Esimerkki 12.1: pTZPEPD:n konstruointi 6 ke BamHI-fragmenttia inkuboidaan restriktioentsyymi 20 Hindlll:n kanssa. Kloroformiuuton jälkeen DNA-saostetaan sentrifugoidaan pelletiksi, liuotetaan näytepuskuriin ja elektroforesoidaan 0,6 %:isella agaroosigeelillä lxTBE-puskurissa. 3,0 kep BamHI-HindiII -fragmentin sisältävä geelipala otetaan talteen ja DNA elektroeluoidaan. Tämä 25 uutetaan sen jälkeen 100 pl:lla kloroformia ja seostetaan etanolilla ja liuotetaan uudelleen 40 mitään TE-puskuria. DNA-pitoisuus arvioidaan agaroosigeelielektroforeesin avulla, jota seuraa vyöhykkeen visuaalinen tarkastelu UV-• valossa.

V 30 pTZ18R-vektori valmistetaan pilkkomalla BamHI:llä ja Hindlll :11a toimittajan (BRL) suosittamissa olosuhteissa.

DNA uutetaan fenolilla, fenoli/kloroformilla (1:1) ja kloroformilla ja DNA saostetaan etanolilla.

100 ng kutakin edellä olevista fragmenteista ligoidaan yhdessä reaktiotilavuudessa 25 μΐ, joka sisältää BRL:n ; : 35 65 11256/ suosittaman puskurin sekä ATP:tä (1 mM), 1,5 U T4 DNA -ligaasia (BRL). Reaktioseosta inkuboidaan 16 tuntia lepissä ja käytetään sen jälkeen E, coli DH5aF':n transfor-mointiin. Solut maljataan LB-agarmaljoille, jotka sisäl-5 tävät 25 mg/ml ampisilliiniä, 0,005 % Xgal:ia, 0,05 mM IPTG:tä ja inkuboidaan yli yön 37°C:ssa.

Useita yksittäisiä valkoisia pesäkkeitä käytetään yliöis-ten viljelmien valmistamiseksi LB-alustassa, johon on 10 lisätty 0,1 % glukoosia ja 25 mg/ml ampisilliiniä. Näitä viljelmiä käytetään plasmidin eristämiseen, käyttäen Holmesin ja Quigleyn pienimittaista valmistusmenetelmää [Holmes, D.S. ja Quigley, M., Anal. Biochem. 114:193 (1981)]. Plasmidit pilkotaan useilla restriktioentsyymei-15 lä toimittajan (BRL) suositusten mukaisesti ja RNaasi A:n (0,5 mg/ml) läsnäollessa ja tuotteet analysoidaan agaroo-sigeelillä. Plasmidit, joista saadaan odotetunkokoisia BamHI-Hindlll -fragmentteja, valitaan ja E. coli -soluja, jotka sisältävät niitä, säilytetään glyserolissa -20°C:~ 20 ssa. Tätä plasmidia nimitetään tunnuksella pTZPEPD (talletettu tunnuksella DSM 7409).

Esimerkki 12.2: pepD:n nukleotidisekvenssi pepD:n subklooni, 3,0 kep BamHI-HindiII -fragmentti 25 pTZ18R-vektorissa, sekvensoidaan kokonaan dideoksi-ket- junpysäytysmenetelmällä [Sanger et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74:5463-67 (1977)] käyttäen synteettisiä oli-gonukleotidialukkeita ja Sequenasea (United States Biochemical Corp.).

• ; 30

Kokonainen nukleotidisekvenssi on läsnä Sekvenssiluette-lon Sekvenssi 6:ssa. Avoin lukukehys identifioidaan vertaamalla muihin tunnettuihin subtilisiiniperheen se-riiniproteaaseihin ja tämä varmistetaan transkriptiokar-35 toituksella.

112667 66

Esimerkki 12.3: PEPD:n RNA-kartoitus

Kokonais-RNA valmistetaan jauhetuista pakastekuivatuista rihmastoista, joita on kasvatettu minimaalialustoilla glukoosi hiilenlähteenä ja ammoniumtyppi typenlähteenä 5 Frederickin ja Kinseyn menetelmällä [Curr. Genet. 18:53-58 (1990)]. Lähetti-RNA:n 5'-pää identifioidaan hybri-disoimalla kokonais-RNA 32-P:llä päästä leimatun oli-gonukleotidin, oligo A:n kanssa (komplementaarinen nukleotideille 851-876 Sekvenssi 6:ssä) ja määrittämällä 10 käänteistranskriptaasin avulla tuotetun ylimenevän tran-skriptin (runoff) koko sekvensointigeelillä vertailemalla sekvensointireaktioihin, jotka on muodostettu dideok-sisekvensoinnin avulla saman oligonukleotidin kanssa (Ma-niatis et ai., Molecular Cloning. A Laboratory Manual.

15 Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Intronin täsmälliset silmukointikohdat identifioidaan kloonaamalla ja sekvensoimalla pepD-koodin osittainen cDNA-kopio. Ensimmäisen juosteen synteesi suoritetaan vakiomenetelmillä (Maniatis et ai., viitatussa julkaisus-20 sa), paitsi että synteesin aloitusnukleotidi on oligo C (komplementaarinen nukleotideille 1914-1941 Sekvenssi 6:ssa). Tälle cDNA:lle suoritetaan PCR käyttäen oligo B:tä (vastaten nukeotidejä 1102-1129 Sekvenssi 6:ssa) ja oligo C:tä ja kloonataan pTZ18R:ään. Huomattakoon, että 25 nukleotidit 1107-1109 (GGT) korvataan ATC:llä oligo B:ssä, mikä siten muodostaa uuden BamHI-kohdan. Samalla tavoin nukleotidit 1932 (A) ja 1935 (A) korvattiin G:llä ja vastaavasti T:llä oligo C:ssä, mikä siten muodosti uuden HindiII-kohdan. Molemmat juosteet kahdessa itsenäi-v 30 sessä kloonissa sekvensoidaan kokonaan. pepD-geenillä muodostuneen mRNArn kokonaispituus määritetään Northern-analyysin avulla käyttäen 3,0 ke EcoRI-HindiII -fragmenttia koettimena (Maniatis et ai., viitaussa teoksessa) ja . , määritetään olevaksi 1,4-1,7 ke, joka vastaa pituutta, 35 joka on odotettu avoimen lukukehyksen ja kopioinnin aloituskohdan paikan perusteella.

112667 67

Esimerkki 13; PEPD:n genominen hajaannuttaminen Esimerkki 13.1; pPEPDPYRA;n konstruointi pyrA-geenin sisältävä 4 ke Xbal-fragmentti leikataan pA-XI:stä (DSM 7017) ja puhdistetaan vektorisekvensseistä.

5 2 pg pTZPEPD:tä katkaistaan Nhel:llä ja Ncol:llä valmistajan suositusten mukaisesti ja uutetaan sen jälkeen fenolilla, saostetaan etanolilla ja liuotetaan uudelleen 20 pl:aan vettä. Tätä DNA:ta käsitellään sen jälkeen baktee-10 risella alkalisella fosfataasilla 5'-fosfaattiryhmien poistamiseksi valmistajan suositusten mukaisesti. 5,3 ke fragmentti, josta puuttuu 0,6 kep Nhel-Ncol -fragmentti, joka sisältää aktiiviset His- ja Ser- kohdat, puhdistetaan geelistä.

15

Molempia edellä olevista fragmenteista käsitellään T4-polymeraasin kanssa valmistajan ohjeiden mukaisesti ja uutetaan fenolilla ja saostetaan etanolilla. Mainitut kaksi fragmenttia sekoitetaan keskenään ja ligoidaan. E^ 20 colin transformoinnin jälkeen oikeat plasmidit sisältävät pesäkkeet identifioidaan miniplasmidivalmisteiden rest-riktiopilkonnalla.

pPEPDPYRA sisältää pTZ18R-vektorin, joka sisältää BamHI-25 HindiII -fragmentin, joka sisältää pepD-geenin, jossa on keskinen Nhel-Ncol -fragmentti, joka koodittaa aktiivisia His- ja Ser-kohtia, korvattuna Xbal DNA -fragmentilla, joka koodittaa orotidiinimonofosfaattidekarboksylaasia.

i ‘ ; ;'>*; 30 Esimerkki 13.4: A.nigerin transformointi 10 pg plasmidia pPEPDPYRA hydrolysoidaan loppuun EcoRI:-, v, llä. Hydrolyysin täydellisyys tarkistetaan ajamalla näy te-erä geelillä ja loput DNA:sta uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja resuspendoidaan 20 pl:aan sterii-; 35 liä vettä.

68 112567

Auksotrofisen A. niger An8:n (DSM 3917) konidiosporeja kasvatetaan 4 päivää 28°C:ssa täydellisessä alustassa täysin itiöisiksi. 2xl08 konidiosporia käytetään siirrostet-taessa 200 ml minimaalialustaa, johon on lisätty 1 g/1 5 arginiinia ja uridiinia.

20 tunnin kasvatuksen jälkeen 28°C:ssa nopeudella 180 rpm rihmasto otetaan talteen suodattamalla mirakankaan läpi, pestään kahdesti 10 ml:11a 0,8 M KCL:ää, 50 mM CaCl2:a ja 10 resuspendoidaan 20 ml:aan 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a, 0,5 mg/ml Novozym 234:ää (Novo Industries). Seosta inkuboi-daan ravistelevassa vesihauteessa (30°C, 50 rpm) kunnes riittävä määrä protoplasteja on vapautunut (havainnoituna mikroskooppisesti 90-120 min. kuluttua). Protoplastisus-15 pensio suodatetaan lasivillatupon läpi suppilossa rihmasto jäänteiden poistamiseksi. Protoplastit sakkautetaan kevyen sentrifugoinnin avulla (10 min., 2000 rpm) huoneen lämpötilassa ja pestään kahdesti 10 ml:11a 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a. Protoplastit suspendoidaan lopuksi 200-500 20 pl:aan 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a, jotta saadaan pitoisuudeksi 1x10® sferoplastia/ml.

Transformaatiota varten 200 yl:n näyte-erää protoplas-tisuspensiosta inkuboidaan, kun läsnä on 5 pg EcoRI:llä ; 25 pilkottua pPEPDPYRA:aa 50 ml PCT:tä (10 mM Tris-HCl pH

7,5, 50 mM CaCl2, 25 % PEG6000). Inkubaatioseosta pidetään jäiden päällä 20 minuuttia, toiset 2 ml PCT:tä lisätään ja seosta inkuboidaan vielä 5 min. huoneen lämpötilassa.

'· 4 ml liuosta, joka sisältää 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2 lisä- V 30 tään ja 1 ml:n näyte-eriä lopullisesta transformaatioli- uoksesta sekoitetaan nestemäisen minimaaliagaralustan . kanssa (minimaalialusta + 1 g/1 arginiinia + 10 g/1 Bac- to-Agaria (Difco)), stabiloidaan 0,8 M KCl:llä. Seokset kaadetaan välittömästi samaa alustaa sisältäville agar-35 maljoille ja inkuboidaan 30°C:ssa.

112667 69 2-3 päivän kasvatuksen jälkeen 28°C:ssa, pysyvät transfor-mantit tulevat näkyviin voimakkaasti kasvavina ja itiöi-vinä pesäkkeinä taustakasvunaan monia satoja pieniä, luultavasti hylkääviä transformantteja.

5

Esimerkki 13.5: Geenihalaantumien identifiointi Pysyvistä pesäkkeistä valmistetaan yksittäisiä itiösus-pensioita ja levitetään tuoreille minimaali + arginiini -maljoille. Yksittäisiä pesäkkeitä valikoidaan ja levite-10 tään uudelleen puhdasviljelmien saamiseksi. Näitä käytetään, kun siirrostetaan 200 ml nestemäistä minimaalialus-taa, johon on lisätty 1 g/1 arginiinia. 24 tunnin ravistelun kuluttua 30°C:ssa nopeudella 180 rpm, rihmastot kerätään talteen suodinpaperille ja kakku pakastekuivataan. 15 Kuivaamisen jälkeen DNA:ta preparoidaan yksittäisistä kakuista jauhamalla ne hienoksi jauheeksi huhmaren ja survimen avulla. 60 mg tätä jauhetta resuspendoidaan 3 ml:aan liuosta, joka sisältää 1 % natriumdodekyylisul-faattia, 0,1 % Tween 80:tä, 1 M ammoniumasetaattia, pyör-20 resekoittaen. Liuosta kuumennetaan 65°C:ssa 20 min. sekoittaen ajoittain. Solujäännös erotetaan DNA-liuoksesta sentrifugoimalla nopeudessa 15 000 rpm 5 min ajan. Super-natantti uutetaan kahdesti fenolilla, kahdesti kloroformilla ja saostetaan etanolilla. DNA-pelletti liuotetaan 25 uudelleen 100 ml:aan steriiliä TE-puskuria.

20 μΐ kutakin DNA:ta pilkotaan Nhel:llä ja Ncol:llä 1 tunnin ajan, kun läsnä on 1 pg RNaasi A:ta. Tämä erotetaan agaroosigeelillä ja siirretään nitroselluloosakal-30 voile ja paistetaan. HindiII-BamHI -fragmentti pTZPEPD:-stä, joka sisältää PEPC:n, puhdistetaan, leimataan katko-luennan avulla ja käytetään kalvojen koetinkäsittelyyn. Kannat, jotka sisältävät pepD-geenin useassa osassa, on helppo tunnistaa hybridisoituvan 0,6 ke Nhel-NhoI puuttu-35 misesta samoin kuin kahden muun viereisen fragmentin muuttuneesta vaihtelevuudesta.

70 112667

Yksi näistä kannoista maljataan alustoille, jotka sisältävät uridiinia ja 5-fluorioroottihappoa. Pyrimidiiniauk-sotrofiamutantit identifioidaan voimakkaamman kasvun perusteella tällä alustalla ja poimitaan ja puhdistetaan 5 levityshajotuksella yksittäisten pesäkkeiden saamiseksi.

Esimerkki 13.6; Interferonin tuottaminen pepD~ A. niger -kannassa

Yhtä esimerkissä 6.5 eristettyä pepD' A. nioer An8 -kantaa 10 käytetään isäntänä seuraavaan transformaatioon pyrA*; n sisältävillä plasmideilla ja ekspressiokaseteilla, jotka sisältävät heterologisen interferonigeenin.

A. nioer An8:n uridiiniauksotrofisen pepD'-mutantin koni-15 diosporeja kasvatetaan 4 päivää 28°C:ssa täydellisessä alustassa täyteen itiöitä. 2xl08 konidiosporia käytetään siirrostettaessa 200 ml:aan minimaalialustaa, johon on lisätty lg/1 arginiinia ja uridiinia.

20 20 tunnin kasvatuksen jälkeen 28°C:ssa nopeudella 180 rpm rihmasto otetaan talteen suodattamalla mirakankaan läpi, pestään kahdesti 10 ml:11a 0,8 M KCL:ää, 50 mM CaCl2:a ja resuspendoidaan 20 ml:aan 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a, 0,5 mg/ml Novozym 234:ää (Novo Industries). Seosta inkuboi-25 daan ravistelevassa vesihauteessa (30°C, 50 rpm) kunnes riittävä määrä protoplasteja on vapautunut (havainnoituna mikroskooppisesti 90-120 min. kuluttua). Protoplastisus-pensio suodatetaan lasivillatupon läpi suppilossa rihmas-tojäänteiden poistamiseksi. Protoplastit sakkautetaan 30 kevyen sentrifugoinnin avulla (10 min., 2000 rpm) huoneen lämpötilassa ja pestään kahdesti 10 ml:lla 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a. Protoplastit suspendoidaan lopuksi 200-500 pl:aan 0,8 M KCl:ää, 50 mM CaCl2:a, jotta saadaan pitoisuudeksi lxl08/ml.

Transformaatiota varten 200 ml:n näyte-erää protoplas-tisuspensiota inkuboidaan liuoksessa, joka sisältää 5 pg 35 112667 71 pCG59D7:ää (DSM 3968) ja 50 pg pGIIss-IFN AM119- tai pGII-IFN AM119 -DNA:ta (molemmat plasmidit julkaistaan täydellisesti EP-patenttihakemuksessa 0 421 919), 50 μΐ PCTrtä (10 mM Trsi-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2, 25 % PEG 5 6000). Inkubaatioseosta pidetään jäiden päällä 20 minuut tia, toiset 2 ml PCTrtä lisätään ja seosta inkuboidaan vielä 5 min. huoneen lämpötilassa. 4 ml liuosta, joka sisältää 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2 lisätään ja 1 ml:n näyte-eriä lopullisesta transformaatioliuoksesta sekoitetaan 10 nestemäisen minimaaliagaralustan kanssa (minimaalialusta + 1 g/1 arginiinia + 10 g/1 Bacto-Agaria (Difco)), stabiloidaan 0,8 M KClrllä. Seokset kaadetaan välittömästi samaa alustaa sisältäville agarmaljoille ja inkuboidaan 30°C:ssa.

15 2-3 päivän kasvatuksen jälkeen 28°C:ssa, pysyvät transfor-mantit tulevat näkyviin voimakkaasti kasvavina ja itiöi-vinä pesäkkeinä taustakasvunaan monia satoja pieniä, luultavasti hylkääviä transformantteja.

20

Transformantit poimitaan ja interferonin ilmeneminen analysoidaan. Interferonin aktiivisuus määritetään Armstron-gin menetelmän mukaisesti (J.A. Armstrong, Appi. Microbiol. 21,732 (1971)) käyttäen ihmisen CCL-23 -soluja ja 25 vesikulaaristomatiittivirusta (VSV) ärsykeviruksena.

Transformanttien konidiosporeja esiviljellään yksittäi-. sesti 50 mlrssa esiviljelyalustaa (pektiini Slow SetL

(Unipectin, SA, Redon, Ranska) 3 g/1, NH4C1 2 g/1, KH2P04 30 0,5 g/1, NaCl 0,5 g/1, MgS04x7H20 0,5 g/1, CaS04x2H20 0,5 g/1, pH 7,0, 1 % arginiini). Esiviljelmää inkuboidaan 72 tuntia nopeudella 250 rpm ja 28°C. 10 % esiviljelmästä käytetään siirrostettaessa 50 ml:aan pääviljelyaluetaa (soijajauho 20 g/1, pektiini Slow Set 5 g/1, 1 % arginii-35 ni). Viljelmää kasvatetaan 72-96 tuntia nopeudella 250 rpm ja 28°C.

72 112567

Eri ajankohtina (joka 20. tunti) otetaan näytteitä, solut sentrifugoidaan ja rikotaan pakastekuivaamalla ja kuiva-jauhatuksella. Sekä supernatantista että solu-uutteista testataan interferoniaktiivisuus kuten edellä on kuvail-5 tu. Valtaosan interferoniaktiivisuudesta havaitaan erittyvän alustaan transformanteista, jotka sisältävät pGIIss-IFN AMll9:n, kun taas transformanteissa, jotka sisältävät pGII-IFN AM119:n, aktiivisuus on pääasiassa solu-uutteessa.

10

Esimerkki 14; pepD:n vli-ilmeneminen A. niqerissä Esimerkki 14.1; Multippelien kopioiden yli-ilmeneminen A. niger An8 transformoidaan 1 pg:lla pAXI:a + 10 pg:lla pTZPEPD:a jolloin sadaan uridiiniprototrofeja. Pesäkkeet 15 puhdistetaan ja DNA preparoidaan kuten edellä on kuvailtu. Southern-blotit, joissa käytettiin pTZPEPDrn Hindlll-fragmenttia, osoittivat, että joillakin transformanteilla on yksi ainoa pTZPEPD-kopio kiinnittyneenä genomiin, kun taas muilla on jopa 10 tai enemmän ylimääräistä kopiota 20 genomissaan. Nämä kannat tuottivat vastaavasti enemmän proteolyyttistä aktiivisuutta ja ovat mitoottisesti pysyviä.

Esimerkki 14.2: pepD:n vli-ilmeneminen oeenifuusioista 25 Geenifuusio konstruoidaan, joka sisältää A. niqerin pyru- vaattikinaasin promoottorialueen ja A. niger pepD-geenin kooditus- ja terminaattorialueet. Fuusio konstruoidaan yhdistelmä-PCR:n avulla (R. Higuchi: Recombinant PCR ss. 177-183 julkaisussa Innis et ai., (edit.) PCR Protocols, 30 Academic Press, Inc. (1990)). Neljä oligonukleotidialu-ketta suunnitellaan, joista fusoligo 1, 2 ja 3 esitetään Sekvensseissä 12, 13 ja vastaavasti 14, kun taas fusoligo 4 on komplementaarinen sekvenssin suhteen nukleotidivä-lillä 2858-2874 Sekvenssi l:ssä. Fusoligo 1 hybridisoituu 35 pki-promoottoriin 0,75 kep ATG-aloituskodonin yläpuolel la. Fusoligot 2 ja 3 ovat osittain toisiaan peittävät komplementaarijuosteissa, molemmat sisältävät pki-pro- 112667 73 moottorisekvenssejä välittömästi translaation ATG-aloi-tuskodonin yläpuolella, itse ATG-kodonin ja myös sekvenssejä pepD-kooditusalueesta välittömästi ATG-kodonin alapuolella. Fusoligo 4 hybridisoituu pepD-geenin alapuoli-5 seen alueeseen, 0,65 kep translaation lopetuskohdan alapuolella. Kaksi PCR-reaktiota suoritetaan pääasiassa kuten edellä on kuvailtu. Ensimmäisessä reaktiossa, 0,75 kep pki-promoottorifragmentti monistetaan käyttäen fusoligo l:tä ja fusoligo 2:ta ja pGW1100:aa (DSM 5747) temp-10 laattina. Toisessa reaktiossa 2,0 ke fragmentti, joka sisältää pepD:n kooditus- ja lopetusalueet, monistetaan käyttäen fusoligo 3:a ja fusoligo 4:ää ja pTZPEPD:tä templaattina. Monistustuotteet puhdistetaan agaroosigee-listä, yhdistetään, denaturoidaan ja pariutetaan uudel-15 leen. Kyseiset kaksi fragmenttia muodostavat homo- ja myös heteroduplekseja pariuttamisreaktion aikana johtuen niiden toisiaan peittävistä päistä fusoligo 2:n ja fusoligo 3:n takia. Tämä pariutettu seos monistetaan sitten uudelleen PCR:n avulla käytäen kahta "ulkopuolista" alu-20 kettä (fusoligo 1 ja 4). Tämän reaktion tuote eristetään, puhdistetaan ja subkloonataan plasmidivektoriin.

Oikeat plasmidit identifioidaan pilkkomalla miniplasmidi-valmisteita. 2 valitaan ja insertti sekvensoidaan koko-·*· 25 naan käyttäen synteettisiä oligonukleotidejä. Yhtä plas- midia, joka sisältää pyruvaattikinaasipromoottorin täydellisen fuusion pepDrn avoimeen lukukehykseen, joka on *[’, nimeltään pPKlPEPDA, käytetään pAXI:n kanssa A. niaer , . An8:n kotransformoimiseksi uridiiniprototrofiseksi.

30 ‘ ' pki-pepD -fuusion läsnäolo varmistetaan preparoimalla DNA:ta yksittäisistä puhdistetuista transformanteista ja käyttämällä sitä Southern-analyysiin koettimia pkirstä ja >' : pepDrstä. Kantojen, joissa tämän geenifuusion yksi tai 35 useampi kopio on kiinnittynyt genomiin, näyttävät tuotta-! van enemmän proteolyyttistä aktiivisuutta, kun solut kas vavat nopeasti glukoosi C-lähteenä.

74 11266/

Esimerkki 15: pepD:n ilmentäminen muissa organismeissa: Ilmentäminen hiivassa

Plasmidi pTZPEPD leikataan EcoRI:llä. tasapäistetään T4-polymeraasilla ja ligoidaan uudelleen poistamalla siten 5 EcoRI-kohta polylinkkerialueelta. Tuloksena oleva plasmi di mutatoidaan sen jälkeen in vitro neljän synteettisen oligonukleotidin kanssa, oligohiiva 1, 2, 3 ja 4, jotka on esitetty Sekvenssiluettelon Sekvensseissä 15, 16, 17 ja vastaavasti 18. Oligohiiva 1 toteuttaa EcoRI-kohdan 10 juuri pepD:n ATG:n yläpuolelle ja kolme muuta silmukoivat pois kaiken kustakin kolmesta intronista. Tämä saa aikaan plasmidi pTZPEPDatn, jonka sekvenssi varmistetaan täydellisellä sekvensoinnilla.

15 2,2 ke EcoRI-BamHI -fragmentti, joka alkaa juuri ennen pepD:n ATG:tä ja päättyy terminaattorialueen jälkeen, puhdistetaan ja ligoidaan yhdessä pFBY129:n (DSM 7016) 520 ep BamHI-EcoRI -fragmentin kanssa, joka sisältää hiivan GALlO-promoottorin, hiivan kaksimikronipohjaisen vek-20 tori pFBY25:n (DSM 7020) SnaBI-kohtaan. Oikea plasmidi identifioidaan restriktiopilkontojen avulla. Tämä plasmidi pGALlOPEPD transformoidaan hiivaan ja sen osoitetaan tuottavan pepD-proteiinia, kun geenifuusion ilmentyminen indusoidaan galaktoosilla.

„ 112667 /o

Mikro-organismien tallettaminen

Seuraavat mikro-organismit on talletettu Budapestin sopimuksen mukaisesti the Deutsche Sammlung von Mikroorganis-5 men und Zellkulturen -pankkiin, Mascheroder Weg lb, D-3300, Braunschweig:

Mikro-organismi/Plasmidi Tall, pvm. Talletusnumero E. coli DH5aFVpGWllOO 18.tammik.1990 DSM 5747 10 E. coli BJ5183/pCG59D7 2.helmik.1987 DSM 3968 A. niger An8 11.jouluk.1986 DSM 3917 E. coli DH5aF'/pTZPEPC 30.maalisk.1992 DSM 7019 E. coli DH5aF'/PGP202 30.maalisk.1992 DSM 7018 E. coli DH5aF'/pFBY129 30.maalisk.1992 DSM 7016 15 E. coli DH5aF'/pAXI 30.maalisk.1992 DSM 7017 E. coli DH5dF'/pFBY25 30.maalisk.1992 DSM 7020 E. coli DH5aF'/pTZPEPD 19.tammik.1993 DSM 7409 * * » 76 11266/

Sekvenssiluettelo:

Yleisinformaatio:

Sekvenssien lukumäärä: 18

Informaatio Sekvenssi l:lle:

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 3220 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: kaksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA (genominen)

Alkuperä:

Organismi: Aspergillus niqer Kanta: N400 Välitön lähde:

Klooni: pTZPEPC

Yksityiskohta:

Nimi: promoottori Sijainti: 1..377 i Yksityiskohta:

Nimi: signaalipeptidi Sijainti: 378..435 ‘ Yksityiskohta:

Nimi: valmis peptidi i Muu informaatio: subtilisiinityyppinen proteaasi; Asper gillus nigerin PEPC; pepC-geenituote ” 112667

Yksityiskohta:

Nimi: introni Sijainti: 757..826

Yksityiskohta:

Nimi: kooditussekvenssi (mukaanlukien lopetuskodoni)

Sijainti: liitos 388..756, 827..2059

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 1: GGATCCATCC ATTCACTCAG CTTTCCTTGT CGGTGGACTG TGGAGTCTAC CCCAGGTCCC 60 AGTTIC1CCG ACCGCGCTAA TCGGGGGCTA TCGACAACCA GTGATTCIGC TGTGTCATCC 120 GGGCGTATGG CGTAAATTAC CGTATGCCGG TTGCATCATC ACCTGCTGCC CTTGCCTCTT 180 GCTGAATACC GTCCGCCATC CATCTGTCCT CCTCTCCCTC TCTCTTCATC TCCAACCTCC 240 CCTICCTCCT CCCTCCCTCC TTCTCTICAT CTTTATCTTG ACCTATTTCC ATCTTTCTCA 300 TCTCTCAGTT GTTIGAAICT CTTGTACACG CCCTACTCAC TCTCCTTTTC ACCGGGCTGC 360 TGTGGGTTCC GTCTTAAGCT ATCCATC ATG AAG GGC ATC CTC GGC OTT TCC 411

Met Lys Gly Ile Leu Gly Leu Ser -16 -15 -10 CTC CTC CCG TIG CTG ACG GCT GCG TCG CCC GTC TTC GTT GAC TCC ATC 459 :"· Leu Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ala Ser Pro Vai Phe Vai Asp Ser Ile f\: -5 15 CAT AAT GAA GCT GCC CCC ATC TTG TCT GCT ACC AAC GCG AAG GAG GTT 507

His Asn Glu Ala Ala Pro Ile Leu Ser Ala Thr Asn Ala Lys Glu Vai 10 15 20 CCC GAC TCC TAC ATC GTC GTT TTC AAG AAG CAC GTC ACT TCA GAG CTG 555

Pro Asp Ser Tyr Ile Vai Val Phe Lys Lys His Val Thr Ser Glu Leu 25 30 35 40 78 1 12 6 6 7 GOT TCG GCT CAC CAC AGC TGG GIG CAG GAC ATC CAT GAC TCT CAG AGC 603

Ala Ser Ala His His Ser Trp Val Gin Asp lie His Asp Ser Gin Ser 45 50 55 GAG CGG ACT GAG CTG AAG AAG CGG TCG CTC TTC GGC CTT GGG GAC GAG 651

Glu Arg Thr Glu Leu Lys Lys Arg Ser Leu Phe Gly Leu Gly Asp Glu 60 65 70 GTC TAT CTC GGT CTC AAG AAC ACC TTT GAC ATT GCT GGT TCT CTC ATC 699

Val Tyr Leu Gly Leu Lys Asn Thr Phe Asp lie Ala Gly Ser Leu lie 75 80 85 GGT TAC TCT GGT CAC TTC CAC GAG GAT GTC ATC GAG CAA GTC CGC AGA 747

Gly iyr Ser Gly His Phe His Glu Asp Val lie Glu Gin Val Arg Arg 90 95 100 CAC CCC GAT GTCAGTTACA CCCCCTATCT AAGCATCCCT CGTTATCTCT 796

His Pro Asp 105 ; AAGATAAGCT TCTAACATCG GTCAATCTAG GTC GAT TAC ATC GAG CGG GAT TCC 850 . .' Val Asp iyr lie Glu Arg Asp Ser 110 115 GAA GTT CAC ACC ATC GAA GGG GCC ACC GAA AAG AAC GCC CCT TCG GGT 898

Glu Val His Thr Met Glu Gly Ala Thr Glu Lys Asn Ala Pro Trp Gly V; 120 125 130 CTC GCT CGT ATC TCT CAC CGT GAT AGC CTC ACC TTC GGT AAC TTC AAC 946

Leu Ala Arg lie Ser His Arg Asp Ser Leu Thr Phe Gly Asn Phe Asn 135 140 145 79 1 12 6 6 7 AAG TAC CTG TAT GCC TCC GAG GGG GGT GAG GGC GTT GAC GCC TAC ACC 994

Lys Tyr Leu Tyr Ala Ser Glu Gly Gly Glu Gly Val Asp Ala Tyr Thr 150 155 160 ATT GAC ACG GGT ATC AAC GTT GAC CAC GTT GAC TTC GAG GGC CGT GCC 1042 lie Asp Thr Gly lie Asn Val Asp His Val Asp Phe Glu Gly Arg Ala 165 170 175 ACT TGG GGC AAG ACA ATC CCT ACC AAC GAT GAA GAT CTC GAT GGC AAT 1090

Thr Trp Gly Lys Thr lie Pro Thr Asn Asp Glu Asp Leu Asp Gly Asn 180 185 190 195 GGT CAC GGA ACT CAC TGC TCC GGA ACC ATG GCT GGT AAG AAG TAC GGT 1138

Gly His Gly Thr His Cys Ser Gly Thr Met Ala Gly Lys Lys Tyr Gly 200 205 210 GTT GCC AAG AAG GCC AAC CTC TAT GCT GTC AAG GTC CTC CGG TCG AGC 1186

Val Ala Lys Lys Ala Asn Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Arg Ser Ser 215 220 225 GGC TCT GGC ACC ATG TCT GAT GTC GTT TCT GGT GTC GAG TAT GCC GTC 1234

Gly Ser Gly Thr Met Ser Asp Val Val Ser Gly Val Glu Tyr Ala Val .:. 230 235 240 : CAG GCT CAT ATC AAG AAG GCC AAG GAT GCC AAG AAC GGC AAG GTC AAG 1282 •' Gin Ala His lie Lys Lys Ala Lys Asp Ala Lys Asn Gly Lys Val Lys : 245 250 255 V : GGA TTC AAG GGC AGC GTT GCC AAC ATG AGT CTC GGT GGT GGC AAG TCT 1330

Gly Phe Lys Gly Ser Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Lys Ser 260 265 270 275 AAG ACC CTC GAG GAT GCT GTT AAC GCT GGT GTT GAG GCT GGT CTT CAC 1378 ; ; Lys Thr Leu Glu Asp Ala Val Asn Ala Gly Val Glu Ala Gly Leu His 280 285 290 TTC GCC GTT GCC GCC GGT AAT GAC AAT GOT GAT GCT TCC AAC TAC TCT 1426

Phe Ala Val Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asp Ala Cys Asn Tyr Ser 295 300 305 80 112667 CCT GCT GCT GCC GAG AAG GCC ATC ACC GTT GGT GCC TCG ACA CTT GCT 1474

Pro Ala Ala Ala Glu Lys Ala lie Thr Val Gly Ala Ser Thr Leu Ala 310 315 320 GAC GAG CGT GCG TAC TTC TCC AAC TAC GGA GAG TGC ACT GAC ATC TTC 1522

Asp Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Tyr Gly Glu Cys Thr Asp lie Phe 325 330 335 GCT CCT GGT CTC AAC ATC CTG TCC ACC TCG ATT GGC AGC AAC TAC GCC 1570

Ala Pro Gly Leu Asn lie Leu Ser Thr Trp lie Gly Ser Asn Tyr Ala 340 345 350 355 ACC AAC ATC ATC TCT GGC ACT TCC ATC GCC TCT CCT CAC ATT GCT GGC 1618

Thr Asn lie lie Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His lie Ala Gly 360 365 370 CTC CTC GCC TAC TTT GTC TCC CTC CAG CCC TCC TCG GAC TCT GCA TTC 1666

Leu Leu Ala Tyr Phe Val Ser Leu Gin Pro Ser Ser Asp Ser Ala Phe .:. 375 380 385 GCT GTT GAG GAG CTT ACT CCT GCT AAG CTC AAG AAG GAC ATC ATC GCC 1714

Ala Val Glu Glu Leu Thr Pro Ala Lys Leu Lys Lys Asp lie lie Ala 390 395 400 ATC GCC ACC GAG GGC GCT CTC ACT GAC ATT CCC TCC AAC ACC CCC AAC 1762 lie Ala Thr Glu Gly Ala Leu Thr Asp lie Pro Ser Asn Thr Pro Asn 405 410 415 \ GTA AGT CAT GCC GCT GTT GGT ATT TAT AAG AGA AAC GAG CTA ACT CAG 1810 7 ,‘ Val Ser His Ala Ala Val Gly lie Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Thr Gin 420 425 430 435 AAA TTC AGC ICC TTG CCT GGA ACG GTG GTG GTT CCG AGA ACT AC A CCG 1858

Lys Phe Ser Ser Leu Pro Gly Thr Vai Vai Val Pro Arg Thr Thr Pro 440 445 450 si 11266/ ACA TCG TTG GCA GCG GTG GCT ACA AGG TCT CCT CTG CCA AGA ACC GCA 1906

Thr Ser Leu Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Pro Leu Pro Arg Thr Ala 455 460 465 TCG AGG ACC GTA TTG AGG GTC TCG TTC ACA AGG CCG AAG AGC TGC TCA 1954

Ser Arg Thr Val Leu Arg Val Ser Phe Thr Arg Pro Lys Ser Cys Ser 470 475 480 CCG AGG AGC TTG GTG CCA TCT ACA GCG AGA TCC AGG ATG CCG TCG TCG 2002

Pro Arg Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Arg Ser Arg Met Pro Ser Ser 485 490 495 CAT AGA TCA GAA CTC GTG CTT ICC AGA CGT AGA TCG GAA GAC TTG GTT 2050

His Arg Ser Glu Leu Val Leu Ser Arg Arg Arg Ser Glu Asp Leu Val 500 505 510 515 TTT TTT TGAGGTATGG GATGGTTGAT CGGACATTTT GGCGCTGGTC TCTTTTTATT 2106

Phe Phe GTCTTTGGTC TCGAAGACGC TGATGCATTG ACTGTATCGG CTGTATCACT CCGCCCCTGC 2166 ·.··; TTATCTGTTT GGTTCATCTT TATGGTAGTA TACATCTCTG CAAAGAAGGT TTTGTTACCT 2226 ·, CACTTAGAAT GTICTGGTTC TATAACAGAC TGACAATCTC ACTGGGTTAT CTAAGAGATC 2286 T3ACAAACGC TTGGTAGAAG AGAAAGGTGA GGGAGTAGAC ATCATCAGTC TAAATCCACA 2346 TTACGACATG CCGTAATAGA TGAGAGCACC GGATGCTAGC CTTTGTAGAC TACAAAGGAG 2406 AAAACCCCTA GGAAAGGTAA TTTCTAAGTC ATGCCCACCT ATTCTCTCTA TCTCTTACTG 2466 AGACAGTCAA TCCCATGACG AACAACTAAT GACATCATGG GTCACGCTAC GGGGTCATGC 2526 82 11Ζυ6/ CGAAACGAAG CCGAAGTACT ACTCCTAAGT AAAGCCACAA CTTTGCATAC GTTCATTCAG 2586 GAAACGGAAA CACAGGAGGA AGAATATTGA AATATCTTCA GGGGCTTCAT ATAGAATAGA 2646 CAGATATATA ATAGTIGTCA AAGTATACAA AAAGACCTCA TGCATGCTAA CAGATAAAGC 2706 AAAGGATCTC ATATTGATAG ACIGIGCTGT ATACCACCTC TTAATCCAGC GCCTGCGCTA 2766 TGCCACGATG AAATATAAAG GGGGAAAAAG TCATGTAAGT AGTAAGTAGA AACTCCAAGC 2826 GCCAAATATA TAGATAGTAA TAGGGGTGGC GACATAATTT GGCTTTTATA CTTCATAGGT 2886 TGAACAAATC AAGTGGCCCT GTGCTCGTCT TCCTCCTCAT CACTGCCGGA ATCTTCGTCT 2946 TCGTCATCGT CATCGACGTC AAGGTCCTCG TCGGAGTCGC TACCGCCGAA GACGTCGTCG 3006 TCCACATCGC TCTCGGCCCA GAAGTCGGAG TCGTCCTTGT CCACAGGTTT GGAGACTGTC 3066 GTGGTGGATT CGTGAGIOGG CATGACGAAT CCCTCGGGAA TATCGTTCTT CGAATCCTCC 3126 ACGTGCTGTT TCACGATCGA TTTGTATTCG TCGGGGCTCT TGCGCAACAT GACCGAGGCG 3186 TCAACGTTGG CGGGGGAAGA GATCCGGGGA ATTC 3220

Informaatio Sekvenssi 2:lie » « · i, Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 533 aminohappoa : * : Tyyppi: aminohappo : ; Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: proteiini

Yksityiskohta:

Aspergillus niqerin subtilisiinityyppinen PEPC-proteaasi; _ pepC-geenituote; valmis peptidi signaalipeptidillä 83 112667

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 2:

Met Lys Gly Ile Leu Gly Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ala -16 -15 -10 -5

Ser Pro Vai Phe Vai Asp Ser Ile His Asn Glu Ala Ala Pro Ile Leu 15 10 15

Ser Ala Thr Asn Ala Lys Glu Vai Pro Asp Ser Tyr Ile Vai Vai Phe 20 25 30

Lys Lys His Vai Thr Ser Glu Leu Ala Ser Ala His His Ser Trp Vai 35 40 45

Gin Asp Ile His Asp Ser Gin Ser Glu Arg Thr Glu Leu Lys Lys Arg 50 55 60

Ser Leu Phe Gly Leu Gly Asp Glu Vai Tyr Leu Gly Leu Lys Asn Thr 65 70 75 ' 80

Phe Asp Ile Ala Gly Ser Leu Ile Gly Tyr Ser Gly His Phe His Glu 85 90 95 ;; ; Asp Vai Ile Glu Gin Vai Arg Arg His Pro Asp Vai Asp Tyr Ile Glu : v 100 105 110

Arg Asp Ser Glu Vai His Thr Met Glu Gly Ala Thr Glu Lys Asn Ala . · : 115 120 125

Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser His Arg Asp Ser Leu Thr Phe Gly 130 135 140

Asn Phe Asn Lys Tyr Leu Tyr Ala Ser Glu Gly Gly Glu Gly Vai Asp : : 145 150 155 160 84 η χ, Γ - y- ry I U.UÖ/

Ala iyr Thr Ile Asp Thr Gly Ile Asn Vai Asp His Vai Asp Phe Glu 165 170 175

Gly Arg Ala Thr Trp Gly Lys Thr Ile Pro Thr Asn Asp Glu Asp Leu 180 185 190

Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ser Gly Thr Met Ala Gly Lys 195 200 205

Lys Tyr Gly Vai Ala Lys Lys Ala Asn Leu Tyr Ala Vai Lys Vai Leu 210 215 220

Arg Ser Ser Gly Ser Gly Thr Met Ser Asp Vai Vai Ser Gly Vai Glu 225 230 235 240 iyr Ala Vai Gin Ala His Ile Lys Lys Ala Lys Asp Ala Lys Asn Gly 245 250 255

Lys Vai Lys Gly Phe Lys Gly Ser Vai Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly 260 265 . 270

Gly Lys Ser Lys Thr Leu Glu Asp Ala Vai Asn Ala Gly Vai Glu Ala 275 280 285 « f * i

Gly Leu His Phe Ala Vai Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asp Ala Cys J.: 290 295 300 < t • 1' Asn iyr Ser Pro Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ile Thr Vai Gly Ala Ser 305 310 315 320

Thr Leu Ala Asp Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Asn iyr Gly Glu Cys Thr 325 330 335 •V Asp Ile Phe Ala Pro Gly Leu Asn Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Ser 340 345 350 112667 85

Asn Tyr Ala Thr Asn lie lie Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His 355 360 365 lie Ala Gly Leu Leu Ala Tyr Phe Val Ser Leu Gin Pro Ser Ser Asp 370 375 380

Ser Ala Phe Ala Val Glu Glu Leu Thr Pro Ala Lys Leu Lys Lys Asp 385 390 395 400 lie lie Ala lie Ala Thr Glu Gly Ala Leu Thr Asp lie Pro Ser Asn 405 410 415

Thr Pro Asn Val Ser His Ala Ala Val Gly lie Tyr Lys Arg Asn Glu 420 425 430

Leu Thr Gin Lys Phe Ser Ser Leu Pro Gly Thr Val Val Val Pro Arg 435 440 445 1hr Thr Pro Thr Ser Leu Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Pro Leu Pro 450 455 460 . .: Arg Thr Ala Ser Arg Thr Val Leu Arg Val Ser Phe Thr Arg Pro Lys V 465 470 475 480 > i , ’ ; Ser cys Ser Pro Arg Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Arg Ser Arg Met j'-'ί 485 490 495

Pro Ser Ser His Arg Ser Glu Leu Val Leu Ser Arg Arg Arg Ser Glu 500 505 510

Asp Leu Val Phe Phe

Vr 515 86 11266/

Informaatio Sekvenssi 3:lie:

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 37 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: yksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA

Yksityiskohta:

Nimi: A» niqerin pepC:lle homologinen alue Sijainti: 1..19

Yksityiskohta:

Nimi: A. niqerin pki-geenille homologinen alue Sijainti: 20..37

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 3: GGCCGAGGAT GCCCTTCATC TTGACGGATG ATTGATC 37

Informaatio Sekvenssi 4:lie:

Sekvenssiominaisuudet: t ·· Pituus: 44 emäsparia

Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: yksijuosteinen ;Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA

v, Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 4: GCCGAGGATG CCCTTCATCT TGAATTCGGA TGATTGATCT CTAC 44 87 (2) Informaatio Sekvenssi 5: lie: ^ 1 L. O 6 /

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus:32 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: yksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Mo1ekyy1ityyppi: DNA

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 5: GCTCGATGTA ATCGACATCG GGGTGTCTGC GG 32

Informaatio Sekvenssi 6:lie:

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 2993 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: kaksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Mo1ekyylityyppi: DNA (genominen) >·· Alkuperä: . Organismi: Aspergillus niqer

Kanta: N400 Välitön lähde:

; Klooni: pTZPEPD

Yksityiskohta:

Nimi: promoottori ·’ Sijainti: 1..829 88 11106/

Yksityiskohta:

Nimi: kooditussekvenssi mukaanlukien lopetuskodoni Sijainti: liitos (830..1153, 1205..1649, 1697..1785, 1841..2233)

Muu informaatio: subtilisiinityyppinen Aspergillus nige-rin PEPD-proteaasi; pepD-geenituote

Yksityiskohta:

Nimi: introni Sijainti: 1154..1204

Yksityiskohta:

Nimi: introni Sijainti: 1650..1696

Yksityiskohta:

Nimi: introni Sijainti: 1786..1840

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 6: AAGCTTCGTA TATAATTCCC TTTTGACAAT GTCAAAATCT TTTGGACCAC TAATATAGCT 60 GCATCGACCG GTTAATCAGA GGTTATTTTT GTGCTCGAAT GCCGTGTAAC A1TGGATAAT 120 : AGTACACTCC TTTCACCCAC CCTGAGATGC CCGCCCCCTA CAGTAGGGTT GTCAATATCC 180 ;*·.* CTCACCTTTC CAATTGC1GA TGCAGAATGG ACCTGATATA GAAGCCTCAC AGCACCAGAG 240 ACTACCGCCT GAAGATGCCA AGTATTGATG GGTTACATIG GCTGGCGAAT AGACTGTTCA 300 CCATCCCCCG CCTGTACAAG GCTCATTGAG CGACCTTTAT TTCTATGAAG GCTTCTTGCA 360 , ’ GTGTAGAGCC GCTGTTTAGA ACTCGGAAAT AGGCGTGCAT AGTATGAACT CAATCAGCAG 420 : AGTCAATCGA TTGACACTAA CGCCTAGCAA GCAATCAGIG CTCAGAGGAA GCTAACAGAT 480 89 112 667 GGCTGGTTAA GCTGCCCCAG AAACGAAAT3 TGTCCGCAAT CCCATCCCTC CATGCTTATC 540 TGTATTCTGT GCATGCATGA TGCTTTCCTC ACGGGGCATT ACCCAGTAGT CCGAAGACGC 600 AATGTGACCA TCTGACTGAG TTTTAAATAT ACTGTCCAAG TGCCTTCTGA CCCGGTCCCC 660 GCTTGATGAC AATCAACAAA AGGTGAATST GACTGAAAGG CGTGGTCCAG ACAACAGGCC 720 TTAGACTTTA TT3TGAGACT ATAAAAGGAT CTAACTATTG CACTACTGAA ATTAAGCATT 780 CTAGTCTACC ATTGACATTT CTCCCCTTTC GGTGGGCCAC TCGCICAAC ATG GCT 835

Met Ala 1 TTC CTC AAA CGC ATT CTC CCG CTG CTC GCC CTC ATC TTG CCT GCA GTT 883

Phe Leu Lys Arg lie Leu Pro Leu Leu Ala Leu lie Leu Pro Ala Val 5 10 15 TTC AGT GCC ACA GAA CAG GTC CCT CAT CCG ACC ATC CAG ACC ATC CCG 931

Phe Ser Ala Thr Glu Gin Val Pro His Pro Thr lie Glh Thr lie Pro 20 25 30 GGG AAG TAC ATT GTT ACT TTC AAG TCC GGC ATT GAC AAT GCG AAA ATT 979

Gly Lys Tyr Ile Vai Thr Phe Lys Ser Gly Ile Asp Asn Ala Lys He 35 40 45 50 GAG TCT CAT GCC GCA TGG GTA ACG GAG CTC CAC AGG CGC AGC TTA GAA 1027 : . Glu Ser His Ala Ala Trp Val Thr Glu Leu His Arg Arg Ser Leu Glu 55 60 65 .: GGC CGC AGT ACA ACC GAA GAT GAC CTT CCC GCC GGG ATC GAG AGA ACT 1075

Gly Arg Ser Thr Thr Glu Asp Asp Leu Pro Ala Gly He Glu Arg Thr 70 75 80 90 112 6 6/ TAC AGA ATT GCC AAT TTT GOT GGG TAC GCG GGG TCT TTC GAT GAG AAA 1123 iyr Arg lie Ala Asn Phe Ala Gly iyr Ala Gly Ser Phe Asp Glu Lys 85 90 95 ACT ATC GAG GAG ATC CGC AAA CAT AAC CAT GTTTGTGTCC ACGTATCCCA 1173

Thr lie Glu Glu lie Arg Lys His Asn His 100 105 GGCCGTATGG TTTCGACTAA CTGCTGTACA G GTA GCC TAT GIG GAA CAA GAT 1225

Val Ala iyr Val Glu Gin Asp 110 115 CAG GTC TGG TAC CTC GAT ACG CTA GTT ACC GAA AGA CGA GCT CCT TGG 1273

Gin Val Trp iyr Leu Asp Thr Leu Val Thr Glu Arg Arg Ala Pro Trp 120 125 130 GGA CTG GGG AGC ATC TCT CAC CGT GGT GCG TCT AGC ACC GAC TAC ATC 1321

Gly Leu Gly Ser lie Ser His Arg Gly Ala Ser Ser Thr Asp iyr lie 135 140 145 TAT GAT GAC AGC GCT GGG GAG GGT ACA TAC GCT TAT GTA GTG GAC ACT 1369 iyr Asp Asp Ser Ala Gly Glu Gly Thr iyr Ala iyr Val Val Asp Thr 150 155 160 V GGC ATC TIG GCT ACG CAT AAT GAG TTT GGT GGT CGT GCT AGC CTG GCA 1417 Gly He Leu Ala Thr His Asn Glu Phe Gly Gly Arg Ala Ser Leu Ala :·· 165 170 175 TAC AAT GCT GCA GGG GGT GAG CAC GTT GAT GGT GTT GGA CAT GGC ACA 1465 iyr Asn Ala Ala Gly Gly Glu His Val Asp Gly Val Gly His Gly Thr 180 185 190 195 CAT GTA GCA GGG ACC ATC GGT GGC AAA ACA TAC GGG GTT TCG AAA AAT 1513 ·’: His Vai Ala Gly Thr He Gly Gly Lys Thr Tyr Gly Val Ser Lys Asn i 200 205 210 91 111067 GCT CAC CTA Cl'S TCC GTG AAG GTG TTT GTA GGT GAA TCC AGC TCG ACA 1561

Ala His Leu Leu Ser Vai Lys Vai Phe Val Gly Glu Ser Ser Ser Thr 215 220 225 TCG GTC ATT CTG GAT GGC TTC AAT TGG GCT GCC AAT GAT ATC GTG AGC 1609

Ser Val lie Leu Asp Gly Phe Asn Trp Ala Ala Asn Asp lie Val Ser 230 235 240 AAG AAC CGG ACC AGT AAG GCG GCG ATT AAC ATG AGT CTT G GTATCTGCGC 1659

Lys Asn Arg Thr Ser Lys Ala Ala lie Asn Met Ser Leu 245 250 255 CCTCTCTGGG GATCTAATGC CGTTAACCGT GATGCAG GT GGA GGC TAC TCC TAT 1713

Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr 260 GCG TTT AAC AAT GCA GIT GAG AAT GCT TTT GAC GAG GGT GTG CTC TCT 1761

Ala Phe Asn Asn Ala Val Glu Asn Ala Phe Asp Glu Gly Val Leu Ser 265 270 275 T3T GTT GCC GCT GGA AAT GAG AAT GTAAGCTCTG CT3AACTGTC CACCATTGAG 1815 Cys Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn 280 285 CTAAATTTAG ACTAAT3TTT TGCAG AGA GAT GCA GCA CGG ACT AGC CCG GCT 1867

Arg Asp Ala Ala Arg Thr Ser Pro Ala 290 295 TCT GCA CCC GAC GCC ATT ACT GTT GCC GCT ATC AAC AGA AGC AAT GCC 1915

Ser Ala Pro Asp Ala lie Thr Val Ala Ala lie Asn Arg Ser Asn Ala 300 305 310 : CGT GCG TCA TTC TCA AAC TAC GGC TCT GTG GTT GAC ATT TTT GCC CCG 1963

Arg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val Val Asp lie Phe Ala Pro t 315 320 325 92 ΊΊ. :6/ GGA GAG CAA GTA CTT TCT GCA TGG ACC GGC TCG AAC TCG GCC ACC AAC 2011

Gly Glu Gin Val Leu Ser Ala Trp Thr Gly Ser Asn Ser Ala Thr Asn 330 335 340 ACG ATC TCC GGC ACG TCC ATC GCT ACA CCT CAT GIG ACA GGT TTG ATC 2059

Thr lie Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Thr Gly Leu lie 345 350 355 CTC TAT TTG ATG GGC TTG CGG GAC CTT GCT ACC CCA GCG GCT GCA ACG 2107

Leu Tyr Leu Met Gly Leu Arg Asp Leu Ala Thr Pro Ala Ala Ala Thr 360 365 370 375 ACC GAG CTC AAG AGG TIG GCT ACG CGG AAT GCT GTC ACC AAT GTG GCG 2155

Thr Glu Leu Lys Arg Leu Ala Thr Arg Asn Ala Val Thr Asn Val Ala 380 385 390 GGT AGC CCC AAT CTT CTC GCC TAC AAT GGA AAC AGC GGC GTC TCA AAA 2203

Gly Ser Pro Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Gly Asn Ser Gly Val Ser Lys 395 400 405 GGG GGT AGC GAT GAT GGA GAT GAG GAC TAGGTCCGTA ACATCAGTCA 2250

Gly Gly Ser Asp Asp Gly Asp Glu Asp 410 415 ATATCGCTTA GAATAGTCGG GATCGGAGAG TAGACTAGTT TATATCCGAA ATAAAGTCTC 2310 TATCAGCACC CTCGCCTCTT CATCTAAGTC GGCATTTTCA CTTTTCCCGA CACCGCAAAT 2370 ATCCTCTCCT TCAGGCTCTT GCCTCCCCAG CCAGCCTTCC CGAGACTCAA ACTCACACAT 2430 CCATTCGATC TATAAAGTTC TCCACATCCG AAATCCCGCT GCCGCTTACC TCCCGACGTC 2490 GTACCGGACC GAAGGCAGAC ACAGATCATC GACCGCTATA CCGCACAGAC AACTTCTCCT 2550 : ’ · CCTTACTCAA AGTACCATTC CACAGGTCAT TCCAGCATCA TCAGTCATCA TCTACTTCTC 2610 CCCATCAAGA ACCACTCACG GTCGTTCGAA TCAATCTAGA TCAAAGAGAT CAACCGCTTC 2670 a, 11266/ 93 CCCAGACAGA TCAGGCCTAT GCCCATAATG AACCGGTGAC TGTGTAACCC TGTTACAATC 2730 CGTTTGTTAT TGGTCCTTTC TGTTTGCTGG AIGGCGTGTA CTACCTCAGA GCTTGTCCTC 2790 CTAGGAGCTC ATACTCGAGA CAGGTTCTTG TATATAGTCA TAGCCTAAGT CCGGTGTCTA 2850 GGAAACAGTA TGCTCGAGGT CTTTTCCGAT TCTCACAATG AGAACTGTCG CCCGGGTCTT 2910 TACGGCCCCT GTGGAAAGCG AAAAGGAGAC GCTTCTGGCG CTGCTTCCGC AATACGGGCT 2970 CAAACTAGCC CCGGACGGGA TCC 2993

Informaatio Sekvenssi 7:lie:

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 417 aminohappoa Tyyppi: aminohappo Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: proteiini

Yksityiskohta: Aspergillus nioerin subtilisiinityyppinen PEPD-proteaasi; pepD-geenituote; valmis peptidi signaali-peptidillä

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 7:

Met Ala Phe Leu Lys Arg Ile Leu Pro Leu Leu Ala Leu Ile Leu Pro 1 5 10 15

Ala Vai Phe Ser Ala Thr Glu Gin Vai Pro His Pro Thr Ile Gin Ttir 20 25 30 94 11206/

Ile Pro Gly Lys Tyr Ile Vai Thr Phe Lys Ser Gly He Asp Asn Ala 35. 40 45

Lys He Glu Ser His Ala Ala Trp val Thr Glu Leu His Arg Arg Ser 50 55 60

Leu Glu Gly Arg Ser Thr Thr Glu Asp Asp Leu Pro Ala Gly He Glu 65 70 75 80

Arg Thr Tyr Arg He Ala Asn Phe Ala Gly Tyr Ala Gly Ser Phe Asp 85 90 95

Glu Lys Thr He Glu Glu He Arg Lys His Asn His Val Ala Tyr Val 100 105 110

Glu Gin Asp Gin Val Trp Tyr Leu Asp Thr Leu Val Thr Glu Arg Arg 115 120 125

Ala Pro Trp Gly Leu Gly Ser He Ser His Arg Gly Ala Ser Ser Thr 130 135 140

Asp Tyr He Tyr Asp Asp Ser Ala Gly Glu Gly Thr Tyr Ala Tyr Val 145 150 155 160

Val Asp Thr Gly He Leu Ala Thr His Asn Glu Phe Gly Gly Arg Ala 7 165 170 175 * ♦

Ser Leu Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Glu His Val Asp Gly Val Gly 7; 180 185 190

His Gly Thr His Val Ala Gly Thr He Gly Gly Lys Thr Tyr Gly Val 195 200 205 ,· Ser Lys Asn Ala His Leu Leu Ser Val Lys Val Phe Val Gly Glu Ser 210 215 220 95 ιι; '6'

Ser Ser Thr Ser Val lie Leu Asp Gly Phe Asn Trp Ala Ala Asn Asp 225 230 235 240 lie Val Ser Lys Asn Arg Thr Ser Lys Ala Ala lie Asn Met Ser Leu 245 250 255

Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Ala Phe Asn Asn Ala Val Glu Asn Ala Phe 260 265 270

Asp Glu Gly Val Leu Ser Cys Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn Arg Asp 275 280 285

Ala Ala Arg Thr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Asp Ala lie Thr Val Ala 290 295 300

Ala lie Asn Arg Ser Asn Ala Arg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser 305 310 315 320

Val Val Asp lie Phe Ala Pro Gly Glu Gin Val Leu Ser Ala Trp Thr 325 330 335

Gly Ser Asn Ser Ala Thr Asn Thr lie Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr 340 345 350 ! I * $ . ., Pro His Val Thr Gly Leu lie Leu Tyr Leu Met Gly Leu Arg Asp Leu ! 355 360 365 * t · » t

Ala Thr Pro Ala Ala Ala Thr Thr Glu Leu Lys Arg Leu Ala Thr Arg 370 375 380

Asn Ala Val Thr Asn Val Ala Gly Ser Pro Asn Leu Leu Ala Tyr Asn : 385 390 395 400

Gly Asn Ser Gly Val Ser Lys Gly Gly Ser Asp Asp Gly Asp Glu Asp 405 410 415 « 112067

Informaatio Sekvenssi 8:lie:

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 26 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: yksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 8: GCTGGATCCC AYGGNACNCA YGTNGC 26

Informaatio Sekvenssi 9:lie:

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 26 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: yksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 9: GCTGGATCCC AYGGNACNCA YTGYGC 26

Informaatio Sekvenssi 10:lie:

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 23 emäsaparia ,,,: Tyyppi: nukleiinihappo

Juosteisuus: yksijuosteinen 97 11; 6/

Topologia: lineaarinen Molekyylityyppi: DNA Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 10: CTAGAATTCG CCATNGANGT NCC 23

Informaatio Sekvenssi 11:lie

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 23 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: yksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA

Sekvensskuvaus: Sekvenssi 11: CTAGAATTCG CCATRCTNGT NCC 23 ; Informaatio Sekvenssi 12:lie

Sekvenssiominaisuudet: • Pituus: 17 emäsparia 'Tyyppi: nukleiinihappo

Juosteisuus: yksi juosteinen Topologia: lineaarinen

;·, Molekyylityyppi: DNA

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 12: AGAATGGATC CGCGACG 17

Informaatio Sekvenssi 13:lie i 98 112 667

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 27 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: yksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA

Yksityiskohta:

Nimi: A. niqerin pepD:lle homologinen alue Sijainti: 1..12

Yksityiskohta:

Nimi: A. niqerin pki-geenille homologinen alue Sijainti: 10..27

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 13: GAGGAAAGCC ATCTTGACGG ATGATTG 27 « • j Informaatio Sekvenssi 14:lie:

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 29 emäsparia ’: Tyyppi: nukleiinihappo f; Juosteisuus: yksijuosteinen

Topologia: lineaarinen I ·

;·, Molekyylityypi: DNA

, V Yksityiskohta: ,,,* Nimi: A. niqerin pki-geenille homologinen alue

Sijainti: 1..10 99 li: 6Γ

Yksityiskohta:

Nimi: A. niqerin pepD-geenille homologinen alue Sijainti: 8..27

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 14: CGTCAAGATG GCTTTCCTCA AACGCATTC 29

Informaatio Sekvenssi 15:lie:

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 31 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: yksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 15: GGTGGGCCAC GAATTCAACA TGGCTTTCCT C 31 | Informaatio Sekvenssi 16:lie

Sekvenssiominaisuudet: ; Pituus: 41 emäsparia : Tyyppi: nukleiinihappo ; : Juosteisuus: yksijuosteinen

Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 16: .V. GGAGATCCGC AAACATAACC ATGTAGCCTA TGTGGAACAA G 41

Informaatio Sekvenssi 17:lie 100 112667

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 40 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: yksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 17: GGCGATTAAC ATGAGTCTTG GTGGAGGCTA CTCCTATGCG 40

Informaatio Sekvenssi 18:lie:

Sekvenssiominaisuudet:

Pituus: 40 emäsparia Tyyppi: nukleiinihappo Juosteisuus: yksijuosteinen Topologia: lineaarinen

Molekyylityyppi: DNA

Sekvenssikuvaus: Sekvenssi 18: GCCGCTGGAA ATGAGAATAG AGATGCAGCA CGGACTAGCC 40

Claims (10)

1. Eristetty DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa Aspergillus nigerin seriini- 5 proteaasia, joka on seriiniproteaasi, jolla on Sekvenssi luettelon Sekvenssi 2:ssa tai Sekvenssi 7:ssä esitetty aminohapposekvenssi .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-molekyyli, tunnettu 10 siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka on Sekvenssi l:ssä esitetty pepC:n kooditusalue tai Sekvenssi 6:ssa esitetty pepD:n kooditusalue.

3. Hybridivektori, tunnettu siitä, että se sisältää patent-15 tivaatimuksen 1 mukaisen DNA-molekyylin.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen hybridivektori, tunnettu siitä, että Aspergillus nigerin subtilisiinityyppistä serii-niproteaasia koodittava DNA-sekvenssi on toiminnallisesti 20 kytketty säätelyelementteihin, jotka sopivat sellaisen DNA-• sekvenssin ilmentämiseen sopivassa isäntäsolussa.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen hybridivektori, tunnettu siitä, että Aspergillus nigerin subtilisiinityyppistä se- : 25 riiniproteaasia koodittava DNA-sekvenssi on toiminnallisesti kytketty säätelyelementteihin, jotka sopivat sellaisen DNA-sekvenssin ilmentämiseen Aspergillus-kannassa.

6. Aspergillus niger -kanta, tunnettu siitä, että se on As- ; 30 pergillus niger, jonka Sekvenssi l:n mukaisessa pepC- : geenisekvenssissä on virhe, Aspergillus niger, jonka Sekvens si 6:n mukaisessa pepD-geenisekvenssissä on virhe tai Asper- ..... gillus niger, jonka Sekvenssi l:n ja Sekvenssi 6:n mukaisissa pepC- ja vastaavasti pepD-geenisekvensseissä on virhe, joi- 112667 loin DNA-sekvenssi ei enää kykene ilmentämään toiminnallista proteiinia.

7. Menetelmä halutun polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu 5 siitä, että patenttivaatimuksen 6 mukainen Aspergillus ni- ger -kanta transformoidaan ekspressiovektorilla, joka sisältää ekspressiokasetin, joka on sopiva halutun polypeptidin ilmentämiseen, transformoitua Aspergillus niger -kantaa viljellään olosuhteissa, jotka ovat sopivia halutun polypeptidin 10 ilmentämiseen, ja haluttu polypeptidi eristetään.

8. Aspergillus nigerin seriiniproteaasi, tunnettu siitä, että se on Sekvenssi 2:ssa esitetty PEPC tai Sekvenssi 7:ssä esitetty PEPD. 15

9. Patenttivaatimuksen 3 mukaisella hybridiekspressiovekto-rilla transformoitu isäntä, tunnettu siitä, että vektori sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa Aspergillus nigerin subtilisiinityyppistä seriiniproteaasia, ja joka on toimin- 20 nallisesti kytketty säätelyelementteihin, jotka ovat sopivia sellaisen DNA-sekvenssin ilmentämiseen mainitussa isännässä.

: 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen transformoitu isäntä, tun nettu siitä, että se on Aspergillus niger -kanta. 25 103 1 12667