ES2208637T3 - Nueva proteasa fungica. - Google Patents
Nueva proteasa fungica.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION CONCIERNE A NUEVA SECUENCIA DE DNA CODIFICADA PARA UNA SERINA PROTEASA ASPERGILLUS DE TIPO SUBTILISINA, UNA SERINA PROTEASA ASPERGILLUS DE TIPO SUBTILISINA POR SI MISMA Y UN METODO PARA SU PREPARACION. LA INVENCION ADEMAS CONCIERNE A NUEVA CADENA MUTANTE DEFECTUOSA DE ASPERGILLUS EN UNA SERINA PROTEASA DE TIPO SUBTILISINA, LA CUAL SE USA PARA LA EXPRESION DE PROTEINA HETEROLOGA, Y UN METODO PARA LA PREPARACION DE TAL CADENA MUTANTE.
Description
Nueva proteasa fúngica.
La presente invención se refiere a una nueva
secuencia de ADN que codifica para una proteasa de serina de
Aspergillus niger y a un método para su preparación. La
invención además se refiere a una nueva cepa de Aspergillus
niger defectuosa en un gen pepC y/o pepD, que es útil para la
expresión de una proteína heteróloga, y a un método para la
preparación de tal cepa.
Las especies de Aspergillus y, en
particular, Aspergillus niger, se usan en la producción
industrial de enzimas usados en la industria del procesamiento de
alimentos. A. niger tiene ventajas como hospedador para la
producción de proteínas recombinantes por su gran capacidad de
secreción de proteínas y porque se dispone de sistemas para su
manipulación genética molecular. Sin embargo, se ha demostrado que
la presencia de proteasas en el líquido de cultivo es perjudicial
para la expresión de proteínas heterólogas en A. niger; de
hecho, los Aspergilli se han usado comercialmente para
producir proteasas. Se han descrito varias proteasas extracelulares
de Aspergillus en la bibliografía [Barthomeuf et al.,
Biotech. Tech. 2: 29-34 (1988); Barthomeuf et al.,
Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 37: 1333-1336 (1989);
Bosmann, H.B., Biochim. Biophys. Acta 293: 476-489
(1973); Ichishima, E., Biochim. Biophys. Acta 258:
274-288 (1972); Chopra, S. y Mehta, P., Folia
Microbiol. 30: 117-125 (1985); Krishnan y
Vijayalakshimi, J. Chromatogr. 329: 165-170 (1985)].
El gen pepA que codifica aspergilopepsina A de Aspergillus
awamori se ha clonado recientemente [Berka et al., Gene
86:153-162 (1990)]. El producto del gen pepA es
responsable de la parte principal de proteasas ácidas secretadas de
A. niger y cepas en las que el gen pepA se ha delecionado
han permitido incrementar la expresión de proteínas heterólogas en
A. niger var. awamori [Dunn-Coleman et al.,
Biotechnology 9: 976-981 (1991)]. Recientemente
también se han clonado otros genes de proteasas de
Aspergilli y éstos incluyen una proteasa de serina alcalina
de A. oryzae [Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 219:
33-38 (1989)], una proteasa de serina alcalina de
A. fumigatus [Jaton-Ogay et al., FEMS
Microbiol. Letts 92: 163-168 (1992)], una proteasa
ácida tipo no pepsina de A. niger var. macrosporus [Inoue et
al., J. Biol. Chem. 266: 19484-89 (1991)], y una
metaloproteasa denominada proteasa neutra II de A. oryzae
[Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 228:97-103
(1991)].
Se pueden usar genes de proteasas aislados y
mutados de A. niger para experimentos de rotura génica, es
decir, la preparación de cepas mutantes en las que se destruye el
correspondiente gen natural. Por ejemplo, el gen pepA de
Aspergillus awamori se ha destruido por rotura génica con el
fin de preparar cepas deficientes en aspergilopepsina A (Berka et
al., op. cit.).
Sin embargo, como se ha mencionado anteriormente,
los Aspergilli producen un gran número de proteasas
diferentes y, por lo tanto, existe una necesidad continua de cepas
de Aspergillus deficientes en otras proteasas para la
producción industrial de proteínas. Para este propósito, también
existe la necesidad de otros genes de proteasas que pueden usarse
para la preparación de cepas deficientes en proteasas por
mutagénesis in vitro, por ejemplo, rotura génica. Además,
también existe la necesidad de proteínas proteasas recombinantes
que se pueden aplicar industrialmente para el procesamiento de
proteínas.
Otro constituyente principal de las actividades
de proteasas secretadas en A. niger son proteasas de serina
[Sakka et al., J. Ferment. Technol. 63: 479-483
(1985)]. Las proteasas de serina de los hongos se han caracterizado
a fondo en el moho T. album y la levadura Saccharomyces
cerevisiae. Probablemente, T. album secreta tres
proteasas de serina relacionadas, siendo la mejor caracterizada la
proteinasa K [Jany et al., FEBS 199: 139-144
(1986)], mientras que la proteína homóloga en levadura se localiza
en la vacuola [Wolf y Ehmann, Eur. J. Biochem. 98:
375-384 (1979)]. Los genes para todas estas
proteínas de T. album y S. cerevisiae se han clonado
y caracterizado [Gunkel y Gassen, Eur. J. Biochem. 179:
185-194 (1989), Samal et al., Gene 85:
329-333 (1989), Samal et al., Molec. Microbiol
4:1789-1792(1990), y Moehle et al., Molec.
Cell. Biol. 7: 4390-99 (1987)]. También se han
clonado y caracterizado proteasas de serina alcalinas en A.
oryzae, en A. fumigatus y en Achremonium
chrysogenum [Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 219:
33-38 (1989); Jaton-Ogay et al.,
FEMS Microbiol. Letts. 92: 163-168 (1992); Isogai et
al., Agric. Biol. Chem. 55: 471-477 (1991)].
Ahora se ha descubierto que Aspergillus
también produce proteasas de serina homólogas a la familia de
proteasas subtilisina. La presente invención se centra en este tipo
de proteasa.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una molécula de ADN que codifica una proteasa de
serina de Aspergillus niger seleccionada entre el grupo
compuesto por las proteasas de serina que tienen la secuencia de
aminoácidos SEC ID Nº 2 y 7, respectivamente.
Otro objeto es proporcionar una proteasa de
serina de Aspergillus niger recombinante del tipo
subtilisina y con este propósito también una cepa de Aspergillus
niger transformada para su producción.
Otro objeto es proporcionar una cepa de
Aspergillus defectuosa en el gen pepC y/o el gen pepD,
pudiendo usarse dicha cepa para una producción más eficaz de
proteínas heterólogas.
La presente invención se refiere a una proteasa
de serina de Aspergillus del tipo subtilisina. Tal proteasa
se denomina en la presente invención "subtilisina de
Aspergillus". Se entiende que una "subtilisina de
Aspergillus" de la presente invención (a) deriva de
Aspergillus sp., (b) presenta actividad proteasa debido a un
resto de serina catalítico en el sitio activo y (c) tiene
suficiente homología de secuencia de aminoácidos con las proteasas
de serina conocidas, agrupándose dentro de la subfamilia de la
subtilisina. Sin embargo, dentro del significado de la expresión
subtilisina de Aspergillus como se usa en la presente
invención, también se incluyen fragmentos de tal enzima que
retienen la actividad proteasa de serina, sin embargo, los enzimas
de longitud completa son realizaciones preferidas. También se
entenderá que forman parte de la presente invención las proteínas
de fusión que contienen una "subtilisina de
Aspergillus" de la invención unida a aminoácidos
adicionales, péptidos o proteínas.
En un significado preferido, "subtilisina de
Aspergillus" describe una proteasa o fragmento activo de
Aspergillus niger, más preferiblemente una proteasa o
fragmento activo que tiene la secuencia de aminoácidos o parte de la
secuencia mostrada en la SEC ID Nº 1 y 6, respectivamente.
La presente invención también se refiere a una
secuencia de ADN aislada que codifica una proteasa de serina de
Aspergillus niger seleccionada entre el grupo que tiene
secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 2 y 7, respectivamente, y un
vector híbrido para la clonación y multiplicación de tal secuencia
de ADN. La invención además se refiere a un vector híbrido de
expresión para la producción de una proteasa de serina de
Aspergillus niger que comprende tal secuencia de ADN unida
funcionalmente con regiones reguladoras adecuadas para la expresión
de un gen de proteasa de serina de Aspergillus niger en una
célula hospedadora adecuada. La invención también se refiere a
células hospedadoras transformadas capaces de expresar
Aspergillus niger, por ejemplo, una cepa de Aspergillus
niger capaz de sobreexpresar Aspergillus niger debido a
un número de copias incrementado del gen tras la transformación.
La invención también se refiere a una cepa de
Aspergillus niger deficiente en un gen pepC y/o pepD y a un
método para su producción por medio de una secuencia de ADN que
codifica Aspergillus niger que ya no es capaz de expresar la
proteína funcional debido a mutagénesis, por ejemplo, rotura
génica.
Además, la presente invención se refiere a
métodos para la preparación de una secuencia de ADN, vector
híbrido, vector de expresión, así como a métodos para la expresión
de una cepa de Aspergillus niger deficiente en un gen pepC
y/o pepD y de una cepa hospedadora con un vector híbrido de
expresión.
La presente invención se refiere a una molécula
de ADN que comprende una secuencia de ADN seleccionada entre el
grupo que codifica proteasas de serina de Aspergillus niger
que tienen las secuencias de aminoácidos SEC ID Nº 2 y 7,
respectivamente. La secuencia de ADN puede contener uno o más
intrones, como los que tienen las moléculas de ADN aislables a
partir de una biblioteca de ADN genómico, por ejemplo, como el gen
pepC mostrado en la SEC ID Nº 1 o el gen pepD mostrado en la SEC ID
Nº 6. Sin embargo, la invención también se refiere a una variante
sin intrones de la secuencia de ADN, por ejemplo, tal como la que se
puede aislar por clonación de ADNc o después de la mutagénesis, por
ejemplo, aplicando tecnología de PCR. Tales genes sin intrones son
útiles, en particular, para la expresión en hospedadores que no son
Aspergillus, preferiblemente en procariotas o en
levaduras.
La invención se refiere preferiblemente a una
molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica el
PEPC de A. niger que tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID Nº 1 o un fragmento de ésta que retiene la
actividad proteasa de serina. Una secuencia de ADN de la invención
es preferiblemente la región que codifica para la proteasa PEPC
madura mostrada en la secuencia de nucleótidos con SEC ID Nº 1. Sin
embargo, la invención también se refiere a secuencias de ADN
degenerado que codifican PEPC o un fragmento de ésta, es decir,
secuencias en las que se han reemplazado nucleótidos sin cambiar la
secuencia de aminoácidos codificada. Tales secuencias de ADN son
útiles, por ejemplo, debido a las diferencias en el uso de codones
preferido en diferentes hospedadores o debido a la presencia de
nuevos sitios de reconocimiento de los enzimas de restricción
Otra realización preferida de la invención es una
molécula de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica la
PEPD de A. niger que tiene la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC ID Nº 6 o un fragmento de ésta que retiene la
actividad proteasa de serina. De esta manera, otra secuencia de ADN
preferida de la invención también es la región que codifica la
proteasa PEPD madura mostrada en la secuencia de nucleótidos con
SEC ID Nº 6. Sin embargo, la invención también se refiere a las
secuencias de ADN degenerado que codifican PEPC o un fragmento de
ésta, es decir, secuencias en las que se han reemplazado
nucleótidos sin cambiar la secuencia de aminoácidos codificada.
La invención también se refiere a un vector
híbrido que comprende como inserción una secuencia de ADN que
codifica un Aspergillus niger de la invención. Tal vector
híbrido de la invención es útil para la propagación y multiplicación
de una secuencia de ADN de la invención. Tal vector de expresión
comprende un "cassette de expresión" en el que una secuencia
de ADN que codifica un Aspergillus niger está unida
funcionalmente a regiones reguladoras adecuadas para el control de
la expresión de tal secuencia de ADN en una célula hospedadora
deseada.
Un vector híbrido de la invención, incluyendo un
vector de expresión, puede obtenerse a partir de cualquier vector
útil en la técnica de ingeniería genética, tal como virus, fagos,
cósmidos, plásmidos o ADN cromosómico, tales como los derivados de
SV40, virus del herpes, virus del papiloma, retrovirus, baculovirus,
fago \lambda, por ejemplo NM 989 o EMBL4, o fago M13, por ejemplo
M13mp8, plásmidos bacterianos, por ejemplo pBR322, pUC18, o
plásmidos de levaduras, por ejemplo plásmido 2\mu de levadura, o
un virus, fago o plásmido defectuoso en presencia de un virus, fago
o plásmido auxiliar que permita la replicación de dicho virus, fago
o plásmido defectuoso, por ejemplo el vector M13(+)KS en presencia
de, por ejemplo, el fago auxiliar M14K07, o también ADN
cromosómico, derivado por ejemplo de hongos filamentosos tales como
Aspergillus sp., por ejemplo, A. niger, por ejemplo
los proporcionados por el documento EP 184 438. Los vectores
preferidos son de S. cerevisiae o de hongos filamentosos,
mas preferiblemente de Aspergillus sp., incluso más
preferiblemente de A. niger.
Un vector híbrido de la invención, incluyendo un
vector de expresión, proporciona la replicación de un ADN deseado
en un hospedador adecuado, bien como un elemento extracromosómico o
por integración en el cromosoma del hospedador. Se dispone de
varios sistemas de vectores posibles para integración y expresión
del ADN clonado de la invención. En principio, son adecuados todo
los vectores que se replican y se mantienen de forma estable en el
hospedador elegido. De ese modo, el vector se selecciona
dependiendo de las células hospedadores previstas para la
transformación. En general, tales células hospedadoras pueden ser
microorganismos procarióticos o eucarióticos tales como bacterias,
hongos tales como levaduras, preferiblemente S. cerevisiae, o
como hongos filamentosos, preferiblemente Aspergillus sp.,
más preferiblemente A. niger, células de origen eucariota
superior tales como células de vertebrados, por ejemplo células de
mamífero. Las células hospedadoras adecuadas se discutirán más
adelante en la presente invención con detalle. Un vector híbrido de
la invención, incluyendo un vector de expresión, que se mantiene
como un elemento extracromosómico comprende un origen de
replicación (ori) y una secuencia de replicación autónoma (ARS),
secuencias de marcadores seleccionables y, opcionalmente, sitios de
restricción adicionales. Un vector que está destinado a la
integración en un cromosoma del hospedador no necesita comprender
un ori o una ARS, ya que se replica en la célula en conexión con el
cromosoma.
Un origen de replicación o una secuencia de
replicación autónoma (un elemento de ADN que confiere capacidades
de replicación autónoma a los elementos extracromosómicos) se
proporciona mediante la construcción de un vector que incluye un
origen exógeno tal como el derivado del virus de simio (SV40) u otra
fuente vírica, o mediante los mecanismos cromosómicos de la célula
hospedadora.
Un vector híbrido de la invención, incluyendo un
vector de expresión, también puede contener marcadores selectivos
dependiendo del hospedador al que vaya a transformar, en el que se
selecciona y se clona. Puede usarse cualquier gen marcador que
facilite la selección de los transformantes por el fenotipo de
expresión del marcador. Son marcadores adecuados particularmente los
que expresan resistencia a antibióticos, por ejemplo, contra
tetraciclina o ampicilina o, en el caso de mutantes de hongos
auxotróficos, genes que complementan las lesiones del hospedador.
Los genes correspondientes confieren, por ejemplo, resistencia al
antibiótico cicloheximida, o proporcionan prototrofia en una
levadura auxotrófica, preferiblemente S. cerevisiae,
mutante, por ejemplo el gen ura3, leu2, his3 o
trp1. También es posible emplear como marcadores genes
estructurales que están asociados a un segmento de replicación
autónomo siempre que el hospedador que se vaya a transformar sea
auxotrófico para el producto expresado por el marcador.
Son de particular importancia en el contexto de
los vectores híbridos, en particular de los vectores de expresión,
para A. niger, genes marcadores que complementan lesiones
del hospedador A. niger, tales como el gen argB que
codifica la ornitina carbamoil transferasa derivada, por ejemplo, de
A. niger o de A. nidulans (documento EP 184 438), o
de fragmentos de ADN de A. nidulans homólogos con el gen
pyr4 de N. crassa. Otros genes marcadores adecuados
se describen más adelante en relación con la descripción de los
hospedadores transformados de la invención.
Un vector híbrido de la invención adecuado para
la multiplicación de ADN que codifica subtilisina de
Aspergillus en E. coli es, por ejemplo, el plásmido
pTZPEPC o pTZPEPD descrito más adelante en los ejemplos
adjuntos.
El término "cassette de expresión" en el
contexto de un vector de expresión de la presente invención
significa una secuencia de ADN capaz de expresar la subtilisina de
Aspergillus y comprende un promotor unido de forma operativa
con una región que codifica la subtilisina de Aspergillus y,
opcionalmente, uno o más elementos reguladores adicionales de grupo
compuesto por una secuencia señal, un terminador de la
transcripción, un potenciador de la transcripción, un sitio de
unión a ribosomas, una secuencia para el procesamiento eficaz del
ARN, una secuencia que codifica un procesamiento de proteína
eficaz, y una secuencia que codifica la correcta localización de la
proteína. En un casete de expresión de acuerdo con la presente
invención, una región que codifica la subtilisina de
Aspergillus puede combinarse con elementos reguladores
homólogos, es decir, como los que se unen de forma natural, o con
elementos reguladores heterólogos, es decir, derivados de otros
genes.
Pueden emplearse una amplia diversidad de
secuencias promotoras, dependiendo de la naturaleza de la célula
hospedadora. Los promotores que son potentes y al mismo tiempo bien
regulados son los más útiles.
Son ejemplos de promotores los promotores
procarióticos \lambdaP_{L}, \lambdaP_{R}, y los promotores
lac, trp o tac de E. coli. Los promotores adecuados para la
expresión en levadura, preferiblemente S. cerevisiae son
TRP1-, ADHI-, ADHII-, PHO3-, PHO5-, GAL10- o promotores glicolíticos
tales como los promotores de los genes de la enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, 3-fosfoglicerato quinasa (PGK),
kexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa, o
el promotor híbrido de PH05-GAPDH (solicitud de
patente europea Nº
EP-A-213-593). Otros
ejemplos de promotores eucarióticos son los promotores derivados de
virus eucarióticos, por ejemplo, SV40, virus del sarcoma de Rous,
adenovirus 2, virus del papiloma bovino, papovavirus, promotores
derivado de citomegalovirus o promotores derivados de células de
mamífero, por ejemplo, del gen de la actina, colágeno, miosina o
\beta-globina. Los promotores eucarióticos pueden
combinarse con secuencias potenciadoras tales como las secuencias
activadoras secuencia arriba (UAS) de levadura, preferiblemente de
S. cerevisiae o potenciadores virales o celulares tales como
los potenciadores de citomegalovirus IE, el potenciador de SV40, el
potenciador de genes de inmunoglobulinas u otros.
Los potenciadores son secuencias de ADN
estimuladoras de la transcripción, por ejemplo, derivadas de virus
tales como el virus de simio, virus del polioma, el virus del
papiloma bovino o el virus del sarcoma de Moloney, o de origen
genómico. Una secuencia potenciadora también puede derivar del ADN
ribosómico extracromosómico de Physarum polycephalum (PCT/EP
8500278). Son también potenciadores adecuados, por ejemplo, sitios
de activación secuencia arriba derivados del gen de la fosfatasa
ácida PH05 de levadura.
Las secuencias señal pueden ser, por ejemplo, una
presecuencia o líder secretor que dirige la secreción del
polipéptido, o similar. Una secuencia señal es, por ejemplo, una
señal o péptido líder de subtilisina de Aspergillus, por
ejemplo, la secuencia señal mostrada en la SEC ID Nº 1. Por la
bibliografía se conocen más secuencias señal, por ejemplo, las
recopiladas en von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14, 4683
(1986).
Las secuencias necesarias para la iniciación y
terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm
frecuentemente están disponibles en las regiones 5' y 3' no
codificantes, respectivamente, de los ADNc virales o eucarióticos,
por ejemplo, del hospedador de expresión.
Una realización de la invención es un vector de
expresión que comprende una región codificante sin intrones
compuesta por los dos exones de la región codificante mostrada en
la SEC ID Nº 1 o por los cuatro exones de la región codificante
mostrada en la SEC ID Nº 6 para la expresión de la subtilisina de
Aspergillus en procariotas, por ejemplo, en E. coli, o
preferiblemente en levaduras, más preferiblemente en S.
cerevisiae bajo el control del promotor GAL10, por ejemplo como
en el plásmido pFBY138.
La invención se refiere preferiblemente a un
vector de expresión adecuado para la expresión de una secuencia de
ADN que codifica una subtilisina de Aspergillus en una cepa
de Aspergillus.
Un tipo de vector de expresión de acuerdo con la
invención comprende una secuencia de ADN que codifica una
subtilisina de Aspergillus, preferiblemente de A.
niger, bajo el control de un promotor que naturalmente está
unido con dicha secuencia de ADN, es decir, su promotor homólogo. Es
más preferido un vector de expresión que comprende una secuencia de
ADN que codifica PEPC de la SEC ID Nº 1, más preferiblemente la
secuencia de ADN mostrada en la SEC ID Nº 1, bajo el control de la
región promotora mostrada en la SEC ID Nº 1 o un vector de
expresión que comprende una secuencia de ADN que codifica PEPD de
la SEC ID Nº 6, más preferiblemente la secuencia de ADN mostrada en
la SEC ID Nº 6, bajo el control de la región promotora mostrada en
la SEC ID Nº 6. Sin embargo, la región que codifica para PEPC
mostrada en la SEC ID Nº 1 también puede expresarse bajo el control
del promotor de PEPD mostrado en la SEC ID Nº 6 y viceversa.
Preferiblemente la subtilisina de
Aspergillus se secreta al medio. Esto puede conseguirse
usando una secuencia señal que está unida funcionalmente al gen
estructural, preferiblemente la secuencia señal unida de forma
natural al gen estructural de la subtilisina de Aspergillus,
por ejemplo, como en el plásmido pTZPEPC que comprende la secuencia
señal de PEPC y la región codificante mostrada en la SEC ID Nº 1 o
como en el plásmido pTZPEPD que comprende la secuencia señal de
PEPD y la región codificante mostrada en SEC ID Nº 6.
Si tal vector de expresión se usa para la
expresión de la subtilisina de Aspergillus en una cepa
hospedadora de la especie de la que procede el gen de la
subtilisina de Aspergillus, la subtilisina de
Aspergillus se sobreexpresa, ya que ambos genes de
subtilisina de Aspergillus, el recombinante y el original,
son activos bajo las mismas condiciones de expresión.
Otro tipo de vector de expresión de la invención
comprende una secuencia de ADN que codifica la subtilisina de
Aspergillus bajo el control de un promotor funcional en
Aspergillus, que no está unido de forma natural a dicha
secuencia de ADN. Un promotor adecuado para la expresión de la
subtilisina de Aspergillus en Aspergillus sp, en
particular en A. niger es, por ejemplo, un promotor del gen
pectina liasa de un Aspergillus sp., preferiblemente el
promotor de los genes PLI (véase el documento
EP-A-0 278 355), PLA, PLB, PLC, PLE
o PLF (véase el documento EP-A-0 353
188) de A. niger, un promotor del gen poligalacturonasa de
Aspergillus sp., preferiblemente el promotor del gen PGI o
PGII de A. niger (véase la solicitud de patente europea,
EP-A-421919), un promotor del gen de
la piruvato quinasa de Aspergillus sp., preferiblemente el
promotor del gen pki de A. niger (solicitud de patente
europea EP-A-439997), o también un
promotor de un gen de subtilisina de Aspergillus de la
presente invención, preferiblemente un promotor de un gen de
subtilisina de Aspergillus mostrado en SEC ID Nº 1 ó 6. La
secreción de subtilisina de Aspergillus también puede
conseguirse en este caso usando una secuencia señal que está unida
funcionalmente al gen estructural, por ejemplo, la secuencia señal
unida naturalmente al gen estructural de subtilisina de
Aspergillus, por ejemplo, en el caso de la secuencia señal
de PEPC mostrada en SEC ID Nº 1. Sin embargo, también puede usarse
una secuencia señal heteróloga para la subtilisina de
Aspergillus, por ejemplo una secuencia señal del gen de la
pectina liasa de un Aspergillus sp., preferiblemente la
secuencia señal del gen PLI (véase el documento
EP-A-0 278 355 ), PLA, PLB, PLC,
PLE o PLF (véase el documento EP-A-0
353 188) de A. niger, o una secuencia señal del gen de la
poligalacturonasa de un Aspergillus sp., preferiblemente la
secuencias señal de gen PGI o PGII de A. niger (véase la
solicitud de patente europea
EP-A-421919).
En una realización preferida de la invención, por
ejemplo, en el plásmido pPKIPEPCA, el promotor de la piruvato
quinasa de A. niger está unido funcionalmente a la región
codificante mostrada en la SEC ID Nº 1, que codifica la subtilisina
de Aspergillus unida a su secuencia señal homóloga.
En otra realización preferida de la invención,
por ejemplo, en el plásmido pPKIPEPDA, el promotor de la piruvato
quinasa de A. niger está unido funcionalmente a la región
codificante mostrada en la SEC ID Nº 6 que codifica la subtilisina
de Aspergillus unida a su secuencia señal homóloga.
La invención también se refiere a un proceso para
la preparación de una molécula de ADN de la invención, es decir, la
que codifica una subtilisina de Aspergillus de la invención,
preferiblemente la codifica una forma preferida de un
Aspergillus niger de la invención, o para la preparación de
un vector híbrido que comprende tal molécula de ADN, comprendiendo
dicho proceso el cultivo de un hospedador transformado con dicha
molécula de ADN o vector híbrido de la invención. En una
realización alternativa de la invención, puede prepararse una
molécula de ADN de la invención por síntesis química por
condensación de nucleótidos.
El cultivo de los hospedadores se realiza en un
medio nutriente convencional que puede complementarse o privarse de
compuestos químicos que permitan la selección negativa o positiva
de los transformantes, es decir, los hospedadores que contienen la
molécula de ADN deseada junto con un marcador de selección, de los
que no se han transformado, es decir, los hospedadores que carecen
de la molécula de ADN deseada.
Puede usarse cualquier hospedador transformable
útil en la técnica, por ejemplo, bacterias tales como E.
coli, hongos tales como Saccharomyces cerevisiae o
Kluyveromyces lactis, células eucariotas superiores tales
como células de insectos o células de mamíferos, por ejemplo,
células CHO, o en particular hongos filamentosos, tales como
Aspergillus, por ejemplo, A. nidulans, A.
oryzae, A. carbonarius, A. awamori y especialmente
A. niger. La transformación de los hospedadores se lleva a
cabo por métodos convencionales.
Puede obtenerse una secuencia de ADN que codifica
la subtilisina de Aspergillus a partir del genoma de una
cepa de Aspergillus capaz de expresar subtilisina de
Aspergillus, o puede prepararse, por ejemplo, cultivando un
hospedador transformado con una molécula de ADN recombinante que
comprende una secuencia de ADN que codifica una subtilisina de
Aspergillus y, cuando se requiera, aislar la secuencia de
ADN deseada a partir del cultivo.
En particular, tal ADN puede prepararse por un
método que comprende una etapa seleccionada entre:
a) aislar ADN genómico de células de
Aspergillus adecuadas, y seleccionar el ADN deseado, por
ejemplo, usando una sonda de ADN o usando un sistema de expresión y
selección adecuado para la expresión del polipéptido deseado,
b) aislar ARNm a partir de células de
Aspergillus adecuadas, seleccionar el ARNm deseado, por
ejemplo, por hibridación con una sonda de ADN o por expresión en un
sistema de expresión y selección adecuado para la expresión del
polipéptido deseado, preparar ADNc monocatenario complementario de
este ARNm, y después ADNc bicatenario a partir del mismo,
c) aislar ADNc a partir de una biblioteca de ADNc
y seleccionar el ADNc deseado, por ejemplo, usando una sonda de ADN
o usando un sistema de expresión y de selección adecuado para la
expresión del polipéptido deseado,
d) sintetizar ADN bicatenario in vitro por
tecnología de PCR del ADN total de Aspergillus usando
oligonucleótidos cebadores diseñados a partir del gen que codifica
pepC de A. niger o pepD de A. niger u otra proteasa de
serina conocida del tipo de la subtilisina, o
e) incorporar un ADN bicatenario obtenido de
acuerdo con las etapas a), b), c) o d) en un vector apropiado,
transformar un hospedador adecuado, multiplicar el hospedador y
aislar el ADN.
Puede aislarse y seleccionarse ADN genómico para
el ADN deseado (etapa a). El ADN genómico se aisla a partir de una
cepa de Aspergillus capaz de expresar una subtilisina de
Aspergillus. Se prepara una biblioteca de ADN genómico a
partir de dicho ADN por digestión con enzimas de restricción
apropiados e incorporación en vectores apropiados siguiendo
procedimientos establecidos. La biblioteca de ADN genómico se
selecciona con una sonda de ADN como se describe más adelante, o se
expresa en un sistema de expresión adecuado y los polipéptidos
obtenidos se seleccionan de manera convencional.
Puede prepararse una biblioteca genómica, por
ejemplo, por digestión parcial del ADN genómico de una cepa de
A. niger, por ejemplo NW756 o N400 con, por ejemplo, Sau3AI
o MboI, y clonación de los fragmentos de ADN de alto peso molecular
en un vector hospedador apropiado, por ejemplo, el plásmido pUN121
de E. coli o un vector lambda, por ejemplo, EMBL4.
Otras cepas de hongos que producen una
subtilisina de Aspergillus deseada, por ejemplo, A.
japonicus, A. oryzae, A. nidulans o A.
niger pueden servir como fuente para la biblioteca genómica y
pueden usarse otros vectores adecuados, por ejemplo, los
mencionados anteriormente, como receptor para los fragmentos.
Para una selección eficaz en la biblioteca
genómica de las secuencias de ADN que codifican la subtilisina de
Aspergillus es necesaria una sonda de ADN que hibride. Ésta
puede ser una sonda de ADN sintética si se conoce la secuencia de
aminoácidos o parte de ésta de una subtilisina de Aspergillus
deseada, u otro gen de subtilisina, por ejemplo, de levaduras, o
una parte del mismo que hibride con un gen de subtilisina de
Aspergillus.
El ARN mensajero poliadenilado (etapa b) se aisla
a partir de las células adecuadas por métodos conocidos. Los
métodos de aislamiento implican, por ejemplo, homogeneizar en
presencia de un detergente y un inhibidor de ribonucleasas, por
ejemplo, heparina, isotiocianato de guanidinio o mercaptoetanol,
extraer el ARNm con mezclas de cloroformo y fenol adecuadas,
opcionalmente en presencia de soluciones de sales y tampón,
detergentes y/o agentes quelantes de cationes, y precipitar el ARNm
de la fase acuosa con sales que queda con etanol, isopropanol o
similares. El ARNm aislado puede purificarse adicionalmente por
centrifugación en un gradiente de cloruro de cesio seguido de
precipitación con etanol y/o métodos cromatográficos, por ejemplo,
cromatografía de afinidad, por ejemplo una cromatografía en
oligo(dT) celulosa o en oligo(U) sefarosa.
Preferiblemente, tal ARNm total purificado se fracciona de acuerdo
con el tamaño por centrifugación en gradiente, por ejemplo, en un
gradiente lineal de sacarosa, o por cromatografía en columnas de
fraccionamiento por tamaño adecuadas, por ejemplo, en geles de
agarosa.
El ARNm deseado se selecciona por selección del
ARNm directamente con una sonda de ADN, o por traducción en células
adecuadas o en sistemas sin y selección de los polipéptidos
obtenidos.
La selección de ARNm deseado se consigue
preferiblemente usando una sonda de hibridación de ADN como se
describe más adelante, evitando de ese modo la etapa adicional de
traducción. Las sondas de ADN adecuadas son ADN de secuencia de
nucleótidos conocida, por ejemplo ADN sintéticos, ADNc derivados de
ARNm que codifican los polipéptidos deseados, o fragmentos de ADN
genómico que comprenden, por ejemplo, secuencias de ADN contiguas
que se aislan a partir de una fuente natural o a partir de
microorganismos modificados por ingeniería genética.
El ARNm fraccionado puede traducirse en células,
por ejemplo en oocitos de rana, o en sistemas sin células, por
ejemplo, en lisado de reticulocitos o en extractos de germen de
trigo. Los polipéptidos obtenidos se seleccionan con respecto a la
actividad enzimática o la reacción con anticuerpos producidos contra
el polipéptido nativo, por ejemplo, en un inmunoensayo, por ejemplo
un radioinmunoensayo inmunoensayo enzimático o inmunoensayo con
marcadores fluorescentes. Tales inmunoensayos y la preparación de
anticuerpos policlonales o monoclonales son bien conocidos en la
técnica y se aplican de acuerdo con esto.
La preparación de un ADN complementario (ADNc)
monocatenario a partir de molde de ARNm seleccionado es bien
conocida en la técnica, así como la preparación de un ADN
bicatenario a partir de un ADN monocatenario. El molde de ARNm se
incuba con una mezcla de desoxinucleósido trifosfatos,
opcionalmente desoxinucleósido trifosfatos marcados radiactivamente
(para ser capaces de seleccionar el resultado de la reacción), una
secuencia cebadora tal como un resto de oligo-dT
que hibrida con la cola de poli(A) del ARNm y un enzima
adecuado como una transcriptasa inversa, por ejemplo, del virus de
la mieloblastosis de aves (AMV). Tras la degradación del ARNm
molde, por ejemplo, por hidrólisis alcalina, el ADNc se incuba con
una mezcla de desoxinucleósido trifosfatos y un enzima apropiado
para dar un ADN bicatenario. Son enzimas adecuados, por ejemplo, una
transcriptasa inversa, el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I
de E. coli o la ADN polimerasa de T4. Normalmente, una
estructura de horquilla formada espontáneamente por el ADNc
monocatenario actúa como cebador para la síntesis de la segunda
cadena. Esta estructura en horquilla se elimina por digestión con la
nucleasa S1. Como alternativa, primero se extiende el extremo 3'
del ADN monocatenario con las colas homopoliméricas de
desoxinucleótidos antes de la hidrólisis de ARNm molde y de la
posterior síntesis de la segunda cadena de ADNc.
En la alternativa, el ADNc bicatenario se aísla a
partir de una biblioteca de ADNc y se selecciona para el ADNc
deseado (etapa c). La biblioteca de ADNc se construye aislando el
ARNm de células adecuadas, y preparando ADNc monocatenario y
bicatenario a partir de éste, como se ha descrito anteriormente.
Este ADNc se digiere con las endonucleasas de restricción adecuadas
y se incorpora en el fago \lambda, por ejemplo, \lambda charon
4A o \lambda gt11 siguiendo procedimientos establecidos. La
biblioteca de ADNc replicada en membranas de nitrocelulosa se
selecciona usando una sonda de ADN como se ha descrito
anteriormente, o se expresa en un sistema de expresión apropiado y
los polipéptidos obtenidos se seleccionan por reacción con un
anticuerpo específico para los compuestos deseados.
Otro método para la preparación de ADN
bicatenario es por tecnología de PCR (etapa d). Este método puede
usarse, en particular, para la preparación de una gran cantidad de
ADN bicatenario a partir de una pequeña cantidad de ADN o de ARN
con secuencias al menos parcialmente conocidas. Sin embargo, también
puede usarse como material de partida una inserción de ADN de
secuencia desconocida que está flanqueada por secuencias conocidas
de un vector. En la tecnología de PCR, se usan moléculas de ADN,
por ejemplo oligonucleótidos, como cebadores para la síntesis
enzimática de ADN dependiente de molde. Pueden prepararse grandes
cantidades ya que puede repetirse secuencialmente la
desnaturalización del ADN bicatenario, la hibridación con los
cebadores y la síntesis enzimática. El número de moléculas de ADN
sintetizadas aumenta exponencialmente ya que se dobla en cada
ciclo. La tecnología de PCR pertenece al estado de la técnica y
puede aplicarse de forma convencional en la presente invención.
Puede diseñarse un oligonucleótido cebador para hibridar con el ADN
que codificaría secuencias de proteínas proteasas de serina
conservadas del tipo de la subtilisina basándose en la comparación
entre proteasas de serina conocidas del tipo de la subtilisina. La
tecnología de PCR es bien conocida en la técnica y pueden aplicarse
técnicas de PCR convencionales a la presente invención, por ejemplo,
las descritas en: M.A. Innis et al. (eds.), PCR protocols. A guide
to methods and applications. Academic Press, San Diego (1990).
Se conocen en la técnica diversos métodos para la
incorporación de ADNc bicatenario o ADN genómico en un vector
apropiado (etapa e). Por ejemplo, pueden añadirse extensiones de
homopolímero complementarias al ADN bicatenario y al vector de ADN
por incubación en presencia de los correspondientes
desoxinucleósido trifosfatos y un enzima tal como la
desoxinucleotidil transferasa terminal. El vector y el ADN
bicatenario después se unen por apareamiento de bases entre las
colas homopoliméricas complementarias y finalmente se ligan por
enzimas específicos de unión tales como ligasas. Otras posibilidad
son la adición de enlazadores sintéticos a los extremos del ADN
bicatenario, o la incorporación del ADN bicatenario en el vector
para la unión de extremos romos o en bisel. Los vectores apropiados
se discutirán con detalle más adelante.
Los procedimientos de transformación para
transformar células hospedadores apropiadas con el vector híbrido
obtenido y la selección y multiplicación de células hospedadores
transformadas son bien conocidos en la técnica. Más adelante se
proporcionan ejemplos de tales métodos.
El aislamiento del ADN deseado, mutantes y
fragmentos de éstos de acuerdo con la invención se consigue por
métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, extracción con fenol
y/o cloroformo. Opcionalmente, el ADN puede manipularse
adicionalmente, por ejemplo, por tratamiento con agentes mutagénicos
para obtener mutantes, o por digestión con enzimas de restricción
para obtener fragmentos, modificación de uno o ambos extremos
terminales para facilitar la incorporación en el vector,
eliminación de secuencias de intervención y similares.
La secuencia de nucleótidos de un ADN de acuerdo
con la invención puede determinarse por métodos conocidos per
se, por ejemplo, por el método de Maxam y Gilbert usando ADN de
extremos marcados o por el método didesoxi de determinación de la
cadena de Sanger.
Las secuencias del gen de la subtilisina de
Aspergillus de la presente invención también pueden
prepararse por una síntesis in vitro de acuerdo con métodos
convencionales. La síntesis in vitro es aplicable
especialmente a la preparación de fragmentos más pequeños de un gen
de subtilisina de Aspergillus que codifica para los
fragmentos de subtilisina de Aspergillus con actividad
proteasa de serina. La síntesis in vitro también es
particularmente aplicable a la síntesis de ADN que codifica un
promotor o un péptido señal. La síntesis in vitro se aplica
preferiblemente al gen de la subtilisina de Aspergillus
derivado de A. niger o a fragmentos de éste, más
preferiblemente al gen de pepC mostrado en la SEC ID Nº 1 o a su
promotor o secuencia señal, o al gen pepD mostrado en la SEC. ID: Nº
6 o a su promotor o secuencia señal.
S. A. Narang (Tetrahedron 39, 3, 1983) ha
presentado a modo de resumen los métodos adecuados para la síntesis
de ADN. Las técnicas de síntesis conocidas permiten la preparación
de polinucleótidos hasta una longitud de 120 bases, con buen
rendimiento, alta pureza y en relativamente poco tiempo. Los
nucleótidos convenientemente protegidos se unen entre sí por el
método del fosfodiéster (K.L. Agarwal et al., Angew. Chemie
84, 489, 1972), el método más eficaz del fosfotriéster (C.
B. Reese, Tetrahedron 34, 3143, 1972), el método del fosfito
triéster (R.L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 98, 3655,
1976) o el método de fosforamidita (S.L. Beaucage y M.H.
Carruthers, Tetrahedron 22, 1859, 1981). La simplificación
de la síntesis de los oligonucleótidos y polinucleótidos ha sido
posible por el método en fase sólida, en el que las cadenas de
nucleótidos se unen a un polímero adecuado. El verdadero ADN
bicatenario se construye enzimáticamente a partir de
oligonucleótidos solapantes que se preparan químicamente a partir
de ambas cadenas de ADN, que se ponen juntos en el orden correcto
por apareamiento de bases y después se unen químicamente por el
enzima ADN ligasa. Otra posibilidad comprende incubar
oligonucleótidos únicos solapantes procedentes de las dos cadenas de
ADN en presencia de los cuatro desoxinucleósido trifosfatos
requeridos con una ADN polimerasa, por ejemplo la ADN polimerasa I,
el fragmento Klenow de la polimerasa I o la ADN polimerasa de T4, o
con la transcriptasa inversa de AMV (virus de la mieloblastosis de
aves). De ese modo, los dos oligonucleótidos se ponen juntos en el
orden correcto por apareamiento de bases y se complementan con los
nucleótidos requeridos por el enzima para dar una doble cadena de
ADN completa (S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356,
1982).
En la realización de la presente invención puede
usarse un gen de subtilisina de otras especies, por ejemplo,
levaduras, o un fragmento de éste como sonda para identificar un
ARNm de subtilisina de Aspergillus sp., por ejemplo, de A.
niger, en una fracción de ARN o un ADN de subtilisina en una
biblioteca genómica o de ADNc. A partir de la secuencia primaria
del gen de A. niger y en comparación con otras proteasas,
puede deducirse la región codificante de la proteasa y puede
confirmarse la relación del gen con la familia de genes de
subtilisina. El gen obtenido puede usarse para la preparación de la
proteasa recombinante como se indica con detalle más adelante.
Las sondas de ADN sintético se sintetizan de
acuerdo con métodos conocidos como se detalla más adelante,
preferiblemente condensación por etapas usando el método de
fosfotriéster en fase sólida, fosfito triéster o fosforamidita, por
ejemplo, la condensación de unidades de acoplamiento dinucleotídicas
por el método del fosfotriéster. Estos métodos se adaptan para la
síntesis de mezclas de los oligonucleótidos deseados usando mezclas
de dos, tres o cuatro nucleótidos dA, dC, dG y/o dT en forma
protegida o las correspondientes unidades de acoplamiento
dinucleotídicas en la etapa de condensación apropiada como describe
por Y. Ike et al., (Nucleic Acids Research 11, 477,
1983).
Para la hibridación, las sondas de ADN se marcan,
por ejemplo, marcado radiactivamente por la reacción de la quinasa.
La hibridación del ARNm fraccionado por tamaño con las sondas de
ADN que contienen un marcador se realiza de acuerdo con
procedimientos conocidos, por ejemplo, en tampón y soluciones
salinas con la adición de, por ejemplo, quelantes de calcio,
compuestos que regulan la viscosidad, proteínas, ADN no homólogos y
similares, a temperaturas que favorecen la hibridación selectiva,
por ejemplo entre 0ºC y 80ºC, por ejemplo entre 25ºC y 50ºC o
alrededor de 65ºC, preferiblemente alrededor de 20ºC por debajo de
la temperatura de fusión del ADN híbrido bicatenario.
Además, la invención se refiere a células
hospedadoras transformadas con un híbrido o vector de expresión de
la invención, preferiblemente que codifica las formas preferidas de
la subtilisina de Aspergillus de la invención.
Son ejemplos de hospedadores adecuados,
particularmente para la multiplicación de las moléculas de ADN
recombinante, microorganismos que están desprovistos o son pobres
en enzimas de restricción o enzimas de modificación, tales como
bacterias, en particular cepas de Escherichia coli, por
ejemplo, las cepas E. coli X1776, E. coli Y1090, E.
coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA221,
E. coli DH5\alpha, o preferiblemente E. coli
DH5\alphaF', JM109, MH1 o HB101, o la cepa de E. coli K12.
También son hospedadores adecuados otras células procarióticas, por
ejemplo, Bacillus subtilis, Bacillus
stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus,
Streptococcus y otros, y levaduras, por ejemplo,
Saccharomyces cerevisiae tales como S. cerevisiae GRF
18. Otros células hospedadoras adecuadas son células de organismos
superiores, en particular líneas celulares animales o humanas
establecidas continuas, por ejemplo, fibroblastos de pulmón
embrionario humano L132, las células de melanoma maligno humano de
Bowes, células HeLa, células COS-7 de riñón de mono
verde africano transformadas con el virus SV40 o células de ovario
de hámster chino (CHO):
Son ejemplos de células adecuadas para la
expresión de un gen de subtilisina de Aspergillus de la
invención las células mencionadas anteriormente transformadas con
un vector de expresión apropiado y adicionalmente células de
insecto adecuadas transformadas con un vector de expresión de
Baculovirus apropiado y, en particular, hongos filamentosos, por
ejemplo Penicillium, Cephalosporium o preferiblemente
Aspergillus sp., por ejemplo, A. carbonarius, A.
awamori, A. nidulans, A. oryzae o más
preferiblemente A. niger, transformados con un vector de
expresión apropiado.
La invención se refiere también a un método para
la preparación de tales transformantes que comprende el tratamiento
de una célula hospedadora adecuada en condiciones de transformación
con una molécula de ADN o un vector híbrido de la invención,
opcionalmente junto con un gen marcador de selección y
opcionalmente la selección de los transformantes. El gen de
subtilisina de Aspergillus también puede integrarse en el
genoma del hospedador tras la transformación, en particular si se
usan células eucarióticas como hospedadores, por ejemplo
Aspergillus sp.
La transformación de microorganismos se realiza
de acuerdo con métodos convencionales como los descritos en la
bibliografía, por ejemplo para S. cerevisiae (A. Hinnen et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978), para B.
subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741, 1961),
para E. coli (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53,
159, 1970) y para Aspergillus [F. Buxton et al., Gene
37:207-14 (1985), D.J. Balance et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 112: 284-9 (1983)].
Por consiguiente, el procedimiento de
transformación de células de E. coli incluye, por ejemplo,
pretratamiento de las células con Ca^{2+} para permitir la
captación de ADN, e incubación con el vector híbrido. La selección
posterior de las células transformadas puede lograrse, por ejemplo,
transfiriendo las células a un medio de crecimiento selectivo que
permita la separación de las células transformadas de las células
parentales dependiendo de la naturaleza de la secuencia marcadora
del vector de ADN. Preferiblemente se usa un medio de crecimiento
que no permita el crecimiento de las células que no contiene el
vector híbrido.
La transformación de hongos tales como levaduras
o Aspergillus sp. comprende, por ejemplo, etapas de
eliminación enzimática de la pared celular mediante glicosidasas,
tratamiento de los esferoplastos obtenidos con el vector híbrido en
presencia de polietilenglicol y de iones de Ca^{2+}, y
regeneración de la pared celular incluyendo los esferoplastos en
agar. Preferiblemente, la regeneración en agar se prepara de forma
que permita la regeneración y la selección de las células
transformadas al mismo tiempo, como se ha descrito
anteriormente.
La transformación de células de origen
eucariótico superior, tales como líneas celulares de mamíferos,
preferiblemente se consigue por transfección. La transfección se
realiza por técnicas convencionales tales como la precipitación con
fosfato cálcico, microinyección, fusión de protoplastos,
electroporación, es decir, introducción del ADN por un pulso
eléctrico corto que incremente de forma transitoria la permeabilidad
de la membrana celular, o en presencia de compuestos auxiliares
tales como dietilaminoetildextrano, dimetilsulfóxido, glicerol o
polietilenglicol, y similares. Tras el procedimiento de
transfección, se identifican las células transfectadas y se
seleccionan, por ejemplo, por cultivo en un medio selectivo elegido
dependiendo de la naturaleza del marcador de selección, por
ejemplo, medios de cultivo convencionales tales como medio de Eagle
modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo, medio RPMI
1640 y similares, que contienen, por ejemplo, el correspondiente
antibiótico.
Las células hospedadoras transformadas se
cultivan por métodos conocidos en la técnica en un medio líquido
que contiene fuentes de carbono asimilables, por ejemplo,
carbohidratos tales como glucosa o lactosa, nitrógeno, por ejemplo,
aminoácidos, péptidos, proteínas o sus productos de degradación
tales como peptonas, sales de amonio o similares, y sales
inorgánicas, por ejemplo, sulfatos, fosfatos y/o carbonatos de
sodio, potasio, magnesio y calcio. El medio contiene además, por
ejemplo, substancias que promueven el crecimiento, tales como
oligoelementos, por ejemplo, hierro, zinc, manganeso y
similares.
El medio preferiblemente se elige para ejercer
una presión selectiva y prevenir el crecimiento de células que no
han sido transformadas o que han perdido el vector híbrido. De esta
manera, por ejemplo, se añade un antibiótico al medio si el vector
híbrido contiene un gen de resistencia a antibióticos como marcador.
Si, por ejemplo, se usa una célula hospedadora que es auxotrófica
para un aminoácido esencial mientras que el vector híbrido contiene
un gen que codifica para un enzima que complementa el defecto de
hospedador, se usa un medio mínimo deficiente en dicho aminoácido
para cultivar las células transformadas.
Las células de origen eucariótico superior, tales
como células de mamífero, se desarrollan en condiciones de cultivo
tisular usando medios disponibles en el mercado, por ejemplo medio
de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), medio esencial mínimo,
medio RPMI 1640 y similares como se ha mencionado anteriormente,
complementados opcionalmente con substancias que promueven el
crecimiento y/o sueros de mamífero. Las técnicas para el cultivo
celular en condiciones de cultivo tisular son bien conocidas en la
técnica e incluyen cultivos homogéneos en suspensión, por ejemplo,
en un reactor de agitación por aspas o reactor de agitación
continua, o cultivos de células inmovilizadas o atrapadas, por
ejemplo, en fibras huecas, microcápsulas, microperlas de agarosa,
partículas de vidrio poroso, cartuchos de cerámica y otros
microsoportes.
El cultivo se realiza por procesos que son
conocidos en la técnica. Las condiciones de cultivo, tales como
temperatura, valor de pH del medio y tiempo de fermentación, se
eligen para obtener un título máximo del polipéptido o derivado de
la invención. De esta manera, una cepa de E. coli o de
levadura se cultiva preferiblemente en condiciones aerobias en
cultivo sumergido con agitación o removiendo a una temperatura de
aproximadamente 20ºC a 40ºC, preferiblemente a aproximadamente
30ºC, y a un valor de pH de 4 a 8, preferiblemente de
aproximadamente pH 7, durante aproximadamente 4 a 30 horas,
preferiblemente hasta que se consiguen rendimientos máximos del
polipéptido o derivado de la invención.
Para permitir la selección de las células
transformadas de las células no transformadas, las moléculas de ADN
de la invención llevan un marcador de selección o, como
alternativa, las células se cotransforman con un segundo vector que
contiene tal marcador. Como ocurre en otros sistemas, dicho marcador
de selección es un gen estructural expresable, cuyo polipéptido
expresado (un enzima) proporciona resistencia contra compuestos
tóxicos para el organismo receptor o que completa el sistema
enzimático de un mutante carente de tal polipéptido esencial. Tales
genes marcadores adecuados para la selección de células fúngicas
filamentosas transformadas son, por ejemplo, los genes conocidos
qa-2, pyrG, pyr4, trpC,
amdS o argB.
Como se describe en el documento
EP-A-0 278 355, se aisló un gen
marcador, denominado pyrA, de la biblioteca genómica de
A. niger, que está relacionado y tiene una función similar a
pyrG de A. nidulans y pyr4 de N.
crassa, que concretamente produce el enzima orotidina
5'-fosfato descarboxilasa. Este enzima cataliza la
descarboxilación de la orotidina 5'-fosfato a ácido
uridílico (uridina 5'-fosfato) y también del ácido
fluoro-orótico a la fluorouridina tóxica. Sin
embargo, puede usarse el ADN de cualquier otro gen pyr que
codifique la orotidina 5'-fosfato descarboxilasa. A
partir de un clon positivo denominado BJ5183/pCG59D7 (DSM3968) de
E. coli se aisló el plásmido pCG59D7 que comprende el gen
pyrA, y se usó para la cotransformación de un mutante
pyrA^{-} de A. niger. Tal mutante pyrA- es defectuoso en
el gen de la orotidina 5'-fosfato descarboxilasa y,
por lo tanto, es incapaz de producir el correspondiente enzima. Tal
mutante se prepara tratado las conidiosporas de A. niger
N756 bajo irradiación UV mutante y se seleccionan las colonias que
sobreviven en presencia de ácido fluoro orótico y uridina. Las
colonias que sobreviven en presencia de ácido fluoro orótico y en
ausencia de uridina se eliminan. Los restantes mutantes que
requieren uridina, según su capacidad para ser transformados,
pertenecen a dos grupos de complementación pyrA y
pyrB, representados por los mutantes An8 y An10 de A.
niger, respectivamente. Se tratan en forma de protoplastos en
condiciones de transformación con el plásmido pCG59D7 (DSM 3968) que
contiene pyrA. Se descubrió que sólo se transformaban las
colonias de A. niger An8 (DSM 3917) y que contenían el gen
pyrA, como se demostró por la capacidad de hibridación de su ADN
digerido con el ADN de pUN 121.
La invención también se refiere a un proceso para
la preparación de una subtilisina de Aspergillus de la
invención, preferiblemente sus formas preferidas, que comprende
cultivar un hospedador transformado con un vector de expresión de
la invención en condiciones adecuadas para la expresión del gen de
la subtilisina de Aspergillus. Cuando se requiere, se aisla
el polipéptido de forma convencional. Dependiendo de la
construcción del vector de expresión, la subtilisina de
Aspergillus se produce o, si está presente una secuencia
señal, se produce y se secreta.
El hecho de que un hospedador seleccionado sea
adecuado o no para la expresión depende principalmente de las
secuencias reguladoras elegidas para la construcción del vector de
expresión, en particular del promotor.
Por ejemplo, si se usa un promotor derivado de un
gen de Aspergillus, preferiblemente A. niger, para la
expresión de un gen de subtilisina de Aspergillus de la
invención, es un hospedador adecuado una cepa de
Aspergillus, preferiblemente de A. niger. Sin embargo,
si se usa un promotor que no deriva de un gen de Aspergillus
para la construcción de un vector de expresión de la invención,
otros hospedadores son adecuados para la expresión, por ejemplo,
bacterias tales como E. coli, o levaduras tales como S.
cerevisiae. También son hospedadores y promotores adecuados para
la preparación de polipéptidos de acuerdo con la invención los
adecuados para la transformación proporcionados anteriormente.
En particular, la invención se refiere a un
proceso en el que un hospedador Aspergillus transformado
expresa el gen exógeno de subtilisina de Aspergillus en
condiciones en las que los genes endógenos de subtilisina de
Aspergillus están activos y, por lo tanto, expresa más
subtilisina de Aspergillus que la cantidad natural debido al
incremento de la dosis génica. Para este propósito, el hospedador
Aspergillus, en particular A. niger, se transforma
con un vector de expresión que comprende un gen de subtilisina de
Aspergillus bajo el control de sus secuencias de control de
la expresión homólogas, es decir unidas de forma natural, en
particular el promotor y la secuencia señal.
En particular, la invención también se refiere a
un proceso en el que un hospedador Aspergillus transformado
expresa el gen exógeno de subtilisina de Aspergillus a mayor
nivel o en diferentes condiciones que el gen endógeno, ya que está
unido a un promotor diferente.
Las condiciones para una expresión máxima del gen
o genes exógenos dependen del sistema de expresión seleccionado.
Por ejemplo, si se usa un promotor del gen de una pectina liasa
(PL) o de una poligalacturonasa (PG) de A. niger, la
expresión del gen de subtilisina de Aspergillus unido a éste
es inducible en una célula de A. niger por adición al medio
de cultivo de pectina o de productos de la degradación de la
pectina. Sin embargo, en presencia de una cantidad suficiente de
glucosa, el promotor no es inducible si se usa como hospedador una
cepa de A. niger, por ejemplo An8 (DSM 3917). Esto significa
que un gen de subtilisina de Aspergillus bajo el control de
un promotor de PL o PG de A. niger se "reprime por
catabolito" en A. niger. Sin embargo, si se usa otra cepa
de Aspergillus, preferiblemente A. oryzae o mas
preferiblemente A. nidulans, un gen de la subtilisina de
Aspergillus bajo el control de un promotor PL o PG de A.
niger se expresa constitutivamente, es decir, también en
ausencia de pectina y/o en presencia de glucosa. Por lo tanto,
puede ser ventajoso expresar un gen de subtilisina de
Aspergillus bajo el control de un promotor de PL o PG de
A. niger en un hospedador Aspergillus distinto de
A. niger, preferiblemente A. oryzae o más
preferiblemente A. nidulans, ya que, por ejemplo, puede
añadirse glucosa en vez de pectina al medio nutriente como fuente de
energía y de carbono durante la expresión del gen.
Si se usa un promotor de una piruvato quinasa de
Aspergillus, preferiblemente de A. niger para la
expresión de un gen de subtilisina de Aspergillus, el gen se
expresa si se usa un medio mínimo con glucosa como fuente de
carbono y de energía.
Ahora es posible sobreexpresar subtilisina de
Aspergillus, por lo que pueden aplicarse varios métodos.
Puede prepararse una única subtilisina de Aspergillus
purificada por un método en el que un hospedador adecuado que no es
capaz de expresar ninguna subtilisina de Aspergillus, que
expresa subtilisina de Aspergillus en baja cantidad o que no
expresa subtilisina de Aspergillus en las condiciones de
inducción usadas para la expresión del gen exógeno de subtilisina
de Aspergillus, se transforma con un vector híbrido que
comprende un gen estructural que codifica para una subtilisina de
Aspergillus, preferiblemente de A. niger, más
preferiblemente la PEPC mostrada en la SEC ID Nº 1, o un fragmento
de una actividad proteasa de serina de subtilisina de
Aspergillus, y que dicho gen estructural se exprese. Si se
usa un hospedador que no es capaz de expresar ninguna subtilisina de
Aspergillus, se puede obtener la respectiva subtilisina de
Aspergillus única en forma pura, lo que significa que no
está contaminada con ninguna otra subtilisina de
Aspergillus.
Un hospedador incapaz de expresar ninguna
subtilisina de Aspergillus es un microorganismos que no
tiene el gen correspondiente o una cepa de Aspergillus en la
que se ha suprimido la expresión de los genes endógenos de
subtilisina de Aspergillus en un medio de crecimiento
acondicionado de manera apropiada, mientras que el promotor de
subtilisina de Aspergillus exógena operativamente unido con
el gen estructural de subtilisina de Aspergillus deseado,
por ejemplo, un promotor derivado de A. niger, es activo en
estas condiciones o donde el gen de subtilisina de
Aspergillus está unido a otro promotor.
Otros promotores y cepas adecuadas para la
expresión de subtilisina de Aspergillus se proporcionan a
continuación en la descripción de los vectores de expresión de la
invención.
La proteasa de serina pura de Aspergillus
del tipo subtilisina per se también se denomina
"subtilisina de Aspergillus". Se entiende que tal
proteasa (a) deriva de Aspergillus sp., (b) muestra actividad
proteasa debido a un resto catalítico de serina en el sitio activo
y (c) tiene suficiente homología de secuencia de aminoácidos con
proteasas de serina conocidas que se agrupan en la familia de la
subtilisina. Dentro de la expresión subtilisina de
Aspergillus también se encuentran fragmentos de dicho enzima
que retienen la actividad proteasa de serina.
La invención se refiere preferiblemente a una
subtilisina de Aspergillus pura de Aspergillus niger,
preferiblemente la proteasa de serina PEPC que tiene la secuencia
de aminoácidos mostrada en la secuencia de secuencias presentada
bajo la SEC ID Nº 1 o la proteasa de serina PEPD que tiene la
secuencia de aminoácidos presentada bajo la SEC ID Nº 6, y
fragmentos y mutantes de las mismas que retienen la actividad
proteasa de serina.
La invención se refiere además a composiciones
enzimáticas que comprenden una o más de una subtilisina de
Aspergillus y/o un derivado de la misma con actividad
proteasa de serina y/o sus sales biológicamente aceptables,
opcionalmente en una combinación predeterminada con uno o más
enzimas adecuados que tiene otra actividad aparte de la de
subtilisina de Aspergillus.
La invención también se refiere a una cepa de
Aspergillus mutada. Se prefiere una cepa de A. niger
deficiente en el gen pepC mostrado en la SEC ID Nº 1 o en el gen
pepD mostrado en la SEC ID Nº 6. También se prefiere una cepa de
A. niger deficiente en ambos genes pepC y pepD.
En una realización preferida de la invención,
puede prepararse por rotura génica una cepa de Aspergillus
mutada de la invención que tenga un gen de subtilisina de
Aspergillus defectuoso, es decir, una secuencia de ADN que
corresponde con el gen endógeno de Aspergillus que se desea
destruir muta in vitro a un gen defectuoso y transforma a
células hospedadoras de Aspergillus. Debido a un suceso de
recombinación homóloga en la célula, el gen endógeno intacto se
reemplaza por el exógeno defectuoso. Normalmente, el gen endógeno
se destruye por inserción de un gen marcador dentro de la región
codificante. Esto lleva a un gen defectuoso que puede controlarse
fácilmente y usarse para la selección de transformantes con el
correspondiente gen endógeno interrumpido. Sin embargo, también
pueden usarse otros métodos de mutagénesis para la preparación de
una cepa de Aspergillus mutada, preferiblemente una cepa
mutada de A. niger, en la cual está mutado un gen pepC y/o un
gen pepD de forma que no se pueden expresar pepC y/o pepD
funcionales.
En una realización más preferida de la invención
se transforma una cepa de A. niger con un vector híbrido que
comprende un mutante defectuoso del gen pepC mostrado en la SEC ID
Nº 1, por ejemplo un gen pepC interrumpido que tiene un marcador de
selección insertado, por ejemplo, como el comprendido en el plásmido
pPEPCPYRA descrito en los ejemplos adjuntos, y se seleccionan los
transformantes.
En otra realización más preferida de la
invención, se transforma una cepa de A. niger con un vector
híbrido que comprende un mutante defectuoso del gen pepD mostrado
en la SEC ID Nº 6, por ejemplo, un gen pepD interrumpido que tiene
un gen marcador de selección insertado, por ejemplo, como el
comprendido en el plásmido pPEPDPYRA descrito en los ejemplos
adjuntos, y se seleccionan los transformantes.
En una tercera realización más preferida de la
invención se transforma una cepa de A. niger con un mutante
defectuoso del gen pepC mostrado en la SEC ID Nº 1, por ejemplo, un
gen pepC interrumpido que tiene un gen marcador de selección
insertado, por ejemplo, como el comprendido en el plásmido pPEPCPYRA
descrito en los ejemplos adjuntos, y con un mutante defectuoso del
gen pepD mostrado en la SEC ID Nº 6, por ejemplo, un gen pepD
interrumpido que tiene un gen marcador de selección insertado, por
ejemplo, como el comprendido en el plásmido pPEPDPYRA descrito en
los ejemplos adjuntos, y se seleccionan transformantes defectuosos
tanto en pepC como en pepC.
Una cepa mutada de Aspergillus niger que
tiene un gen defectuoso pepC y/o pepD es útil para la expresión de
una producción aumentada de proteínas heterólogas u homólogas intra
o extracelularmente.
La expresión de proteínas heterólogas u homólogas
en Aspergillus sp. puede conseguirse de acuerdo con métodos
convencionales. Normalmente, se construye un vector de expresión
que comprende un gen homólogo o heterólogo unido de forma operativa
con un promotor homólogo o heterólogo funcional en
Aspergillus y, opcionalmente, con otras secuencias de
control de la expresión funcionales en Aspergillus, por
ejemplo, las definidas anteriormente. Cuando se requiere, el
polipéptido se aisla de una manera convencional. Dependiendo de la
construcción del vector de expresión, los productos se producen en
la célula hospedadora o, si está presente una secuencia señal, se
producen en la célula y se secretan.
En este contexto, los genes estructurales son,
por ejemplo, genes estructurales que se originan a partir de virus,
células procarióticas o células eucarióticas y que pueden derivar
de ADN genómico o de ADNc preparado a través de la ruta del ARNm o
pueden sintetizarse químicamente, codificando una amplia diversidad
de polipéptidos útiles, incluyendo polipéptidos glicosilados, en
particular de eucariotas superiores, especialmente mamíferos, tales
como de origen animal o especialmente humano, tales como enzimas
que pueden usarse, por ejemplo, para la producción de nutrientes y
para realizar reacciones enzimáticas en química, o polipéptidos,
que son útiles y valiosos para el tratamiento de enfermedades
humanas y animales o para la prevención de las mismas, por ejemplo,
hormonas, polipéptidos con propiedades inmunomoduladoras,
antivirales y antitumorales, anticuerpos, antígenos virales,
vacunas, factores de coagulación, productos alimentarios y
similares.
Son ejemplos de tales genes estructurales, por
ejemplo, los que codifican la poligalacturonasa de
Aspergillus, por ejemplo, PGI o PGII, o la pectina liasa de
Aspergillus, por ejemplo, PLI, PLA, PLB, PLC, PLE y PLF, u
hormonas tales como secretina, timosina, relaxina, calcitonina,
hormona luteinizante, hormona paratiroidea, adrenocorticotropina,
hormona estimuladora de melanocito,
\beta-lipotropina, urogastrona o insulina,
factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento
epidérmico, el factor de crecimiento similar a insulina (IGF), por
ejemplo, IGF-I e IGF-II, factor de
crecimiento de mastocitos, factor de crecimiento nervioso, factor
de crecimiento de células nerviosas derivadas de glia, o factor de
crecimiento transformante (TGF), tal como TGF\beta, hormonas de
crecimiento tales como la hormona de crecimiento humana o bovina,
interleuquinas, tales como la interleuquina-1 o -2,
factor de inhibición de la migración de macrófagos humano (MIF),
interferones, tales como el interferón-\alpha
humano, por ejemplo interferón-\alphaA, \alphaB,
\alphaD o \alphaF, interferón-\beta,
interferón-\gamma o un interferón híbrido, por
ejemplo un interferón híbrido \alphaA-\alphaD o
un \alphaB-\alphaD, especialmente el interferón
híbrido BDBB, inhibidores de proteinasas tales como
\alpha_{1}-antitripsina, SLPI y similares,
antígenos del virus de la hepatitis, tales como el antígeno de
superficie o del núcleo del virus de la hepatitis B o el antígeno
del virus de la hepatitis A, o el antígeno de la hepatitis no A no
B, activadores del plasminógeno tales como el activador de
plasminógeno tisular o uroquinasa, factor de necrosis tumoral,
somatostatina, renina, \beta-endorfina,
inmunoglobulinas tales como las cadenas ligeras y/o pesadas de las
inmunoglobulinas D, E o G, o inmunoglobulinas híbridas
humano-ratón, factores que unen inmunoglobulinas,
tales como el factor que une inmunoglobulina E, calcitonina,
péptido humano relacionado con la calcitonina, factores de
coagulación sanguínea, tales como el factor IX o VIIIc,
eritropoyetina, eglina, tales como la eglina C, hirudina,
desulfatohirudinas, tales como las variantes de desulfatohirudinas
HV1, HV2 o PA, superóxido dismutasa humana, timidina quinasa viral,
\beta-lactamasa y glucosa isomerasa. Son genes
preferidos los que codifican para un
interferón-\alpha o interferón híbrido humano,
particularmente el interferón híbrido BDBB, el activador del
plasminógeno de tejido humano (t-PA), el antígenos
de la superficie del virus de la hepatitis B (HBVsAg), factor de
crecimiento similar a la insulina I y II, eglina C y
desulfatohirudina, por ejemplo, la variante HV1.
Las realizaciones más preferidas son las
descritas en los ejemplos adjuntos.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
invención, sin embargo, de ninguna forma pretenden limitarla.
Las abreviaturas tienen los siguientes
significados:
BSA | albúmina de suero bovino |
DTT | 1,4-ditiotreitol |
EDTA | ácido etilendiamina tetra acético, sal disódica |
IPTG | isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido |
kpb | kilopares de bases |
PEG | polietilenglicol |
SDS | dodecil sulfato sódico |
Tris | tris (hidroximetil) aminometano |
X-gal | 5-bromo-4-cloro-3 indoil-\beta-galactósido |
- SM
- NaCl 100 mM, MgSO_{4} 8,1 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, gelatina al 0,01%
- LB
- tripticasa peptona (BBL) al 1%, extracto de levadura (BBL) al 0,5%, NaCl al 1% y Tris-HCl 0,5 mM pH 7,5
- LM
- tripticasa peptona (BBL) al 1%, extracto de levadura (BBL) al 0,5%, NaCl 10 mM y MgCl_{2} 10 mM
- SSC
- NaCl 0,15 M, citrato tri-sódico 0,015 M
- PSB
- Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 100 mM, MgCl_{2} 10 mM
- TE
- Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM pH 8,0
- medio mínimo
- 1 litro contiene 1,5 g de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g de KCl, 0,5 g de MgSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,9 mg de ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,2 mg de MnCl_{2}\cdot4H_{2}O, 0,06 mg de CoCl_{2}\cdot6H_{2}O, 0,06 mg de CuSO_{4}\cdot5H_{2}O, 0,29 g de CaCl_{2}\cdot62 H_{2}O, 0,2 mg de FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, fuentes de carbono y nitrógeno según se especifica en el texto o 6 g de NaNO_{3} y 10 g de glucosa por litro si estas fuentes no se mencionan explícitamente, ajustado a pH 6,0 con NaOH.
- medio completo
- medio mínimo con 6 g de NaNO_{3} y 10 g de glucosa por litro más 2 g de tripticasa peptona (BBL), 1 g de casaminoácidos (Difco), 1 g de extracto de levadura (BBL), 0,5 g de sal sódica de ácido ribonucleico de levadura (ICN, Cleveland, USA), 2 ml de solución de vitamina por litro, ajustado a pH 6,0 con NaOH.
- solución de vitaminas
- 10 mg de tiamina, 100 mg de riboflavina, 10 mg de ácido pantoténico, 2 mg de biotina, 10 mg de ácido p-aminobenzoico, 100 mg de nicotinamida, 50 mg de piridoxina-HCl por 100 ml.
- TBE
- 1 litro contiene 4 ml de solución de EDTA 0,5 M pH 8,0, 10,8 g de Tris y 5,5 g de H_{3}BO_{3}
- Fenol
- Fenol tratado como se describe en Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 1982 (p438)
- Tampón de muestra
- glicerol al 10% (v/v), EDTA 100 mM, pH 8,0 y azul de bromofenol al 0,01%.
- ARNasa A
- ARNasa A tratada como se describe en Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 1982 (p451)
Se usan las siguientes cepas y vectores:
- A. niger N400
- tipo silvestre
- A. niger An8
- mutante auxotrófico para uridina de la cepa de A. niger N756 altamente productora del complejo pectinasa, descrita en el documento EP-A-0 278 355, depositada como DSM 3917.
- E. coli LE392
- F^{-}, hsdR514 (r_{k}^{-}, m_{k}^{+}), supE44, supF58, lacY1, o (lac1ZY)6, galK2, galT22, metB1, trpR55, \lambda^{-} .
- E. coli DH5\alphaF'
- F^{-}, endA1, hsdR17, (r_{k}^{-}, m_{k}^{+}), supE44, thi-1, recA1, gyrA, relA1)80\diameterlacZ M15, \Delta(lac ZYA-argF)U169, \lambda^{-}.
- EMBL4
- EMBL4 es un vector lambda de substitución con una capacidad de clonación de 9-23 kpb (Frischauf et al., J. Mol. Biol. 170:827-842, 1983). Contiene una región de clonación múltiple entre los brazos de lambda y la región no esencial de relleno. Esto permite realizar digestiones múltiples con enzimas de restricción de forma que el religamiento del relleno en los brazos del vector se reduzca cuando se inserta el ADN extraño de interés. El vector también hace uso del fenotipo Spi para proporcionar una selección directa del recombinante (Zissler et al., en: A.D. Hershey (ed.) The Bacteriophage lambda, Cold Spring Harbour Laboratory, 1971).
Ejemplo
1.1
Se inoculan conidiosporas de la cepa N400 de
Aspergillus niger en 200 ml de medio mínimo a una densidad
final de esporas de 10^{6} esporas/ml y se agitan en 11
Erlenmeyers durante 24 h a 28ºC a 300 rpm. El micelio se recoge por
filtración a través de Myracloth en un embudo Buchner, se lava con
solución salina estéril fría, se congela en nitrógeno líquido y se
conserva a -60ºC o se usa directamente. El método usado para el
aislamiento de ADN para preparar la biblioteca genómica se basa en
el procedimiento descrito por Yelton et al. [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81:1470-1474 (1984)].
Para la construcción de la biblioteca, se
trituran 10 g de micelio en nitrógeno líquido en porciones de 1 g
en un microdesmembrador de Braun. El micelio triturado se
transfiere a 11 Erlenmeyers estériles que contienen 200 ml de
tampón de extracción (EDTA 50 mM pH 8,5, SDS al 0,2%) y 200 \mul
de dietilpirocarbonato. La mezcla se atempera lentamente a
temperatura ambiente y luego se calienta a 68ºC durante 20 min con
agitación ocasional. La suspensión se enfría a temperatura ambiente
y se centrifuga durante 15 min a 12.000 x g. Se añade al
sobrenadante 1/16 de volumen de una solución de acetato potásico pH
4,2 y se deja la mezcla en hielo durante 1 h. El precipitado se
retira por centrifugación (20 min; 16.000 x g; 4ºC). Los ácidos
nucleicos se precipitan del sobrenadante por una incubación con 0,6
volúmenes de isopropanol en hielo durante 15 min. El ácido nucleico
precipitado se recoge por centrifugación (10 min; 6.000 x g; 4ºC),
se lava con etanol al 70% y se seca brevemente. El sedimento se
resuspende en 10 ml de TE que contiene 20 \mug/ml de ARNasa A
(Boehringer, Mannheim) y se incuba durante 15 min a 37ºC. El ADN se
trata con nucleasa sin pronasa (concentración final de 1 mg/ml)
(Kochlight, Coinbrook) durante 1 hora a 37ºC.
Se disuelven 8,5 g de CsCl en 9 ml de la solución
del ADN obtenida, se añaden 0,2 ml de bromuro de etidio a 10 mg/ml
y esta solución se centrífuga en un rotor Beckman SW41 durante 60 h
a 33.000 rpm o en un rotor Beckman 50 Ti durante 40 h a 45.000 rpm.
La banda de ADN se recoge y se elimina el bromuro de etidio por
extracción múltiple con isopropanol equilibrado con una solución
saturada de NaCl en agua. Se añaden 5 volúmenes de TE y se trata la
solución de ADN de forma secuencial con fenol saturado con TE,
fenol/cloroformo/alcohol isoamílico 25:24:1 y cloroformo/alcohol
isoamílico 24:1. El ADN se precipita por adición de 0,1 volúmenes
de acetato sódico 3 M pH 5,2, 2,5 volúmenes de etanol y una
incubación durante toda la noche a -20ºC. El precipitado se recoge
por centrifugación (1 h; 30.000 x g; 4ºC), se lava con etanol al
70%, se seca y se disuelve en 400 \mul de TE.
Ejemplo
1.2
Para probar la concentración de MboI que
proporciona la mayor cantidad de fragmentos de ADN entre 13,6 y 23
kpb, se digieren porciones de 1 \mug de ADN de A. niger
N400 en el tampón apropiado recomendado por el proveedor con
cantidades decrecientes de MboI (0,5-0,001 U)
durante 1 h a 37ºC en un volumen de 10 \mul. La reacción se
detiene por la adición de 1 \mul de EDTA 0,25 M, y las muestras
se cargan en un gel de agarosa al 0,6% en tampón TBE, que contiene
1 \mug/ml de bromuro de etidio. La concentración requerida de MboI
para dar un alto rendimiento de los fragmentos de
13,6-23 kpb deseados es de aproximadamente 0,02
U/\mug de ADN. Por consiguiente, se digieren 200 \mug de ADN en
un volumen total de 2 ml. Después de 1 h a 37ºC, se añade EDTA a una
concentración final de 25 mM, el enzima se inactiva por calor a
65ºC durante 10 min y el ADN se precipita, se lava, se seca y se
disuelve en 400 \mul de TE. El ADN fragmentado se separa en un
gel preparativo de agarosa al 0,4% a 4ºC y 40 V (3 V/cm). Los
fragmentos del tamaño correcto se recortan del gel y el ADN se
electroeluye del gel en un tubo de diálisis estéril en 2 ml de TBE
de 2 a 3 horas a 100 V. La corriente se invierte durante 30 s, y el
tampón que contiene el ADN se recoge. Después se concentran los
fragmentos por precipitación con etanol y se disuelven en 100
\mul de TE.
Ejemplo
1.3
La biblioteca genómica de la cepa N400 de A.
niger se construye en el vector lambda EMBL4. El vector, que
tiene una capacidad de clonación de 9 a 23 kpb, se describe por
Frischauf et al., [J. Mol. Biol. 170: 827-842
(1983)] y Karn et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:
5172-76 (1980)] y puede adquirirse de Promega
Biotecnology Inc. Para evitar que se clonen en un fago dos
inserciones originarias de partes diferentes del genoma, se usa
para la clonación un fragmento de longitud mínima 13,6 kpb.
Se digieren completamente 10 \mug de ADN de
lambda EMBL4 con 50 unidades de BamHI en el tampón recomendado por
el proveedor en un volumen de 100 \mul durante 2 h a 37ºC. El
enzima se inactiva a 65ºC durante 10 min. Se eleva la concentración
de NaCl hasta 150 mM y se añaden 50 unidades de Sa1I y la
incubación se continúa a 37ºC durante otras 2 horas. Tras la adición
de EDTA a 25 mM e inactivación del enzima calentando a 67ºC durante
10 min. La solución se extrae con volúmenes iguales de fenol (TE
saturado), fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1), y
cloroformo/alcohol isoamílico (24:1). Para eliminar los pequeños
fragmentos polienlazadores de BamHI/Sa1I, el ADN se precipita con
0,6 volúmenes de isopropanol después de la adición de 0,1 vol de
acetato sódico 3 M pH 5,2. Después de 15 min en hielo y 15 min de
centrifugación a 12.000 x g a 4ºC, el precipitado se lava
extensamente con etanol al 70%, se seca y se disuelve en 40 \mul
de TE.
Ejemplo
1.4
Es esencial que los sitios cos del vector
preparado de acuerdo con el ejemplo 2.3 estén hibridados antes de
la reacción de ligamiento. El vector se calienta a 65ºC durante 10
min en Tris-HCl 100 mM pH 7,5 y MgCl_{2} 10 mM y
después se hibrida durante 1 hora a 42ºC. A partir de los
ligamientos de ensayo, se ha descubierto que una relación de
aproximadamente 1:1 (en peso) proporciona la mayoría de los
recombinantes. El ligamiento tuvo lugar en Tris HCl 50 mM pH 7,5,
MgCl_{2} 10 mM, DTT 10 mM y ATP 1 mM, usando 9,5 \mug de vector
y 10 \mug de fragmentos de ADN en un volumen total de 100 \mul.
Se añade ADN ligasa (BRL) a una concentración de 0,5 U/\mug de
ADN y la mezcla de ligamiento se incuba durante toda la noche a
14ºC. Para comprobar el ligamiento se corre una muestra del ADN
ligado en un gel de agarosa. También se ligan como control 0,5
\mug del vector sin adición de fragmentos en un volumen de 5
\mul.
La mezcla de ligamiento se concentra por
precipitación con etanol y se disuelve en 20 \mul de TE antes del
empaquetamiento in vitro. El empaquetamiento in vitro
se realiza con extractos de Promega Packagene según las
indicaciones del fabricante usando porciones de 10 \mul para
empaquetar 1 \mug de ADN. Como control se empaqueta por separado
1 \mug de fago lambda de control cI857 Sam7 de alto peso
molecular, suministrado con los extractos. Tras el empaquetamiento
se añaden 500 \mul de tampón solución del fago (PSB) y 5 \mul
de cloroformo. La reserva de fagos recombinantes puede almacenarse a
4ºC.
Ejemplo
1.5
Las células de E. coli NM539 se cultivan
en medio LB que contiene maltosa al 0,2%, MgSO_{4} 10 mM y
CaCl_{2} 1 mM hasta una densidad óptica (600 nm) de 1,0. Se
añaden alícuotas de 0,2 ml de este cultivo a 0,1 ml de una dilución
apropiada del fago en PSB. Tras la adsorción de los fagos durante 20
min a 37ºC, se añaden 3 ml de agar-superior LB al
0,6% a 45ºC, la mezcla se pone en placas de agar LB y éstas se
incuban toda la noche a 37ºC. El número de unidades formadoras de
placas (pfu) por ml de suspensión de fago es de 12 x 10^{5} y 4,2
x 10^{5} pfu/ml para dos reservas de fagos preparadas de acuerdo
con el ejemplo 1.4. Después de restar el fondo calculado a partir
de los ligamientos control sin fragmentos (17% y 40%
respectivamente) el número absoluto de recombinantes es de 6 x
10^{5}. El contenido de ADN en los recombinantes es equivalente a
más de 200 de los genomas de Aspergillus niger.
Para amplificar la biblioteca, se usan alícuotas
de 80 \mul de ambas reservas de fagos para infectar células de
E. coli NM539 que se ponen en
agarosa-superior LB sobre placas de agar LB y
después se incuban toda la noche a 37ºC. Los fagos se eluyen a
partir de la agarosa por agitación suave de las placas con 5 ml de
PSB por placa durante 1 h a temperatura ambiente. Se recoge el PSB,
se centrifuga (10 min a 6.000 xg) para eliminar las bacterias y se
añade cloroformo (concentración final al 0,5%). Después se mezclan
ambas reservas de fagos que se amplifican aproximadamente al mismo
nivel (40 \mul de reserva), se titulan (8 x 10^{9} pfu/ml) y se
almacenan a 4ºC.
Ejemplo
2.1
El plásmido pGP202 (depositado como DSM 7018)
contiene un fragmento de ADN de levadura de 3,2 kb, que codifica el
gen PRB de levadura que puede escindirse convenientemente con
HindIII y SauI. Este plásmido se digiere con HindIII y SauI y los
fragmentos se separan en un gel de agarosa al 0,8%. El fragmento de
3,2 kb se recorta y se electroeluye el ADN. Se realiza una
traducción con muesca de 100 ng de este fragmento con
^{32}P-dATP como nucleótido marcado y se usa
inmediatamente para pruebas de Southern o de levantamiento de
placas.
Ejemplo
2.2
Se digieren alícuotas de 2 \mug de ADN de A.
niger preparado como se describe anteriormente con BamHI o
HindIII y se separan en un gel de agarosa al 0,8%. Tras fotografiar
los geles teñidos con bromuro de etidio, el ADN se transfiere a
filtros de nitrocelulosa mediante transferencia por capilaridad
[Southern, E.M., J. Mol. Biol.
98:503-517(1975)] y se hibrida como se
describe en el ejemplo 3 con la sonda PRB de levadura marcada. Las
tiras separadas de nitrocelulosa que contienen los dos productos de
digestión se someten a una diversidad de regímenes de lavado para
determinar las condiciones que proporcionan la proporción entre
señal y ruido más fuerte. Descubrimos que un lavado preliminar en
SSC x 6 a 47ºC seguido de dos lavados con SSC x 2 a temperatura
ambiente proporcionan los mejores resultados.
Parte de la biblioteca genómica de la cepa N400
de Aspergillus niger descrita anteriormente (ejemplo 1) se
diluye en SM y se ponen en placas porciones de 0,1 ml cada una que
contienen aproximadamente 2000 pfu. Las células hospedadoras se
preparan por inoculación de 50 ml de medio LB complementado con
maltosa al 0,2% con 0,5 ml de un cultivo de toda la noche de E.
coli NM539 en medio LB, agitando durante 4 h a 250 rpm y a
37ºC, seguido de la adición de 0,5 ml de MgSO_{4} 1 M y de 0,5 ml
de CaCl_{2} 0,5 M. Se mezclan alícuotas de 0,2 ml de estas
células, cada una con una porción de 0,1 ml de la suspensión del
fago, y se incuban a temperatura ambiente durante media hora.
Después se añaden 3 ml de agarosa al 0,7% en medio LM a 47ºC, la
mezcla se remueve brevemente e inmediatamente se pone en placas de
agar LM. Las placas se incuban toda la noche a 37ºC y se enfrían
durante 2 h a 4ºC.
A partir de cada placa se hacen dos réplicas de
acuerdo con el método de hibridación de placas de Benton y Davis
[Benton, W.D. y Davis, R.W., Science 196: 180-182
(1977)]. El primer filtro (BA85 de Schleicher y Schuell) se sitúa
sobre la placa durante 1 min, la segunda réplica durante 2 min y la
posición de las réplicas se marca usando tinta china. Después de
quitar los filtros, se sitúan en una placa que contiene 100 ml de
una solución desnaturalizante (NaCl 1M, NaOH 0,5 M) durante 0,5
min, y después durante 1 min en 100 ml de solución neutralizadora
(Tris-HCl 0,5 M pH 7,5, NaCl 1,5 M). Los filtros se
transfieren a una placa que contiene SSC x 3, se frotan suavemente
con una mano enguantada para eliminar los restos de bacterias y se
enjuaga con SSC x 3. Los filtros se transfieren, se secan durante
10 min a temperatura ambiente y se meten en un horno a 80ºC durante
2 h en papel 3MM de Whatman.
Los filtros mantenidos en el horno se empapan en
SSC x 3, se lavan en esta solución durante 1 h a temperatura
ambiente y después se transfieren a una placa que contiene 250 ml
de mezcla de prehibridación precalentada (65ºC) (SSC x 6, Denhardt
x 10 (BSA, fracción V de Boehringer al 0,2%; Ficoll 400 al 0,2%,
Pharmacia; polivinilpirrolidona-10 al 0,2%, Sigma),
SDS al 0,1% y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque cortado y
recién purificado). Después de 1 h de prehibridación a 65ºC en un
baño de agua con agitación, los filtros se lavan una vez durante
media hora en 250 ml de mezcla de hibridación precalentada (65ºC),
que es la misma que la mezcla de prehibridación excepto por la falta
de ADN de esperma de arenque. Después se transfieren los filtros a
una placa que contiene 150 ml de mezcla de hibridación precalentada
(65ºC) a la que se ha añadido recientemente la sonda marcada.
Después de la hibridación durante 14 h a 65ºC,
los filtros se lavan una vez en 250 ml de mezcla de hibridación
precalentada (47ºC) durante media hora a 47ºC, seguido del lavado a
temperatura ambiente con dos cambios de 250 ml de SSC x 2, cada uno
durante 45 min. Los filtros se secan y se exponen a una película
Kodak XAR5 durante uno a tres día a -70ºC, usando una pantalla
intensificadora.
De esta forma, se obtienen 3 señales positivas de
las seis placas analizadas. Las placas positivas se perforan con
una pipeta Pasteur estéril situando las placas cuidadosamente en el
autorradiograma usando las marcas de tinta. Los pedazos de agar que
contienen las placas positivas se añaden a 1 ml de SM y se añaden
2,5 \mul de cloroformo. Se permite que los fagos difundan fuera
del agar durante una hora a temperatura ambiente, con agitación
vorticial ocasional y, después se incuban toda la noche a 4ºC. El
agar y los restos celulares se eliminan por centrifugación durante
5 min, se añaden 2,5 \mul de cloroformo y las reservas de fagos
se almacenan a 4ºC.
Los clones positivos se denominan \lambda1,
\lambda2 y \lambda4. Como los fagos se disponen en placas a
alta densidad, las placas positivas se purifican dos veces
sembrándolas a una baja densidad y repitiendo el procedimiento
completo de réplica de las placas, hibridación y picado de las
placas positivas.
Ejemplo
4.1
Para aislar el ADN de los clones recombinantes,
primero se amplifican los fagos. Para este fin, se desarrollaron
las células hospedadores de E. coli LE392 hasta una densidad
óptica (600 nm) de 1,0 en medio LB complementado con MgSO_{4} 10
mM y maltosa al 0,2%. Después, se disponen por separado en placas
50 \mul de las reservas de los fagos purificados como se ha
descrito anteriormente. Después de una incubación durante toda la
noche a 37ºC, los fagos se eluyen de las placas no confluentes
extendiendo 5 ml de SM sobre las placas e incubando durante dos
horas con agitación suave. Se recogen los fagos eluidos y se añade
0,1 ml de cloroformo. La mezcla se remueve brevemente y se eliminan
los restos celulares por centrifugación. Se recuperan los
sobrenadantes, se añade cloroformo al 0,3% y el lisado resultante
de la placa se almacena a 4ºC.
Para obtener placas casi confluente como material
de partida para el aislamiento de ADN del fago, se disponen en
placas porciones de 10 ml de los lisados de las placas con células
hospedadoras E. coli LE392. Tras toda la noche de incubación
a 37ºC, se raspa la capa superior de agarosa de tres placas casi
confluentes. Estas capas se mezclan, se añaden 20 ml de SM y 0,4 ml
de cloroformo y la mezcla resultante se agita a 37ºC durante 30
min. Los restos celulares y la agarosa se eliminan por
centrifugación, se recupera el sobrenadante y su volumen se ajusta
a 18 ml con SM. Se añade un volumen igual de NaCl 2 M, PEG6000 al
20% (BDH, Poole, GB) en SM y las soluciones se mezclan y se ponen
en hielo. Después de 75 min, los fagos se sedimentan por
centrifugación durante 20 min a 1200 x g a 4ºC. Se decantan los
sobrenadantes y el líquido remanente se elimina con un papel
Kleenex. El sedimento se resuspende en 3 ml de SM y posteriormente
se extrae con 3 ml de cloroformo. La fase acuosa se trata con
ARNasa A (67 \mug/ml) y ADNasa I (33 \mug/ml) durante 20 min a
37ºC. Después, esta mezcla se extrae añadiendo 2 ml de fenol,
removiendo, añadiendo 1 ml de cloroformo, removiendo otra vez y
separando las dos fases por centrifugación. La fase acuosa se
extrae dos veces más, con 3 ml de fenol/cloroformo (1:1) y 3 ml de
cloroformo, respectivamente. Después, se precipita el ADN de la
fase acuosa por la adición secuencial de 0,3 ml de tampón acetato
sódico 3 M (pH 5,2) y 6 ml de etanol. Esta mezcla se deja a 4ºC
durante 16 horas y después se recupera el ADN por centrifugación
(10 min, 12000 x g, 4ºC). El sedimento se disuelve en 0,4 ml de
tampón TE, se añade ARNasa A a 200 \mug/ml, y se incuba a 37ºC
durante 1 h. El ADN se precipita por la adición de 38 \mul de
tampón acetato sódico 3 M (pH 5,2) y 0,8 ml de etanol a 4ºC durante
1 h. El ADN se recupera por centrifugación y posteriormente se
disuelve en 100 \mul de TE.
Ejemplo
4.2
Se establece por análisis de restricción que los
tres fagos contienen inserciones derivadas de la misma región del
genoma de A. niger y se construye un mapa de restricción
parcial de \lambda1.
Se digieren 2 \mug de ADN del fago con 20
unidades de EcoRI en un volumen de 20 \mul durante 1 h a 37ºC en
el tampón recomendado por el proveedor (BRL) y después se calientan
a 65ºC durante 10 min. Las muestras se procesan en un gel de
agarosa al 0,7% y se fotografían. El ADN se transfiere a membranas
de nitrocelulosa y se hibrida con la sonda PRB de levadura marcada.
Está claro a partir de estos productos de digestión que los tres
fagos son idénticos conteniendo un fragmento EcoRI de 12 kb y de
2,7 kb. También está claro que el fragmento de 12 kb es el único
fragmento que hibrida con la sonda PRB y, por lo tanto, contiene la
mayoría si no todos los genes correspondientes a A. niger.
\lambda1 se elige para más análisis.
\lambda1 también se digiere con una diversidad
de enzimas de restricción y se somete de nuevo a un análisis de
Southern. La banda más pequeña que parece contener todas las bandas
que hibridan con la sonda PRB es un fragmento EcoRI BamHI de 3,2
kpb. Por lo tanto, éste se subclona en un plásmido.
Ejemplo
5.1
El ADN de \lambda1 se incuba con los enzimas de
restricción BamHI y EcoRI, esencialmente como se ha descrito
anteriormente. Después de la extracción con cloroformo, el ADN se
precipita, se sedimenta por centrifugación, se disuelve en tampón
de muestra y se somete a electroforesis en un gel de agarosa al 0,6%
en tampón TBE x 1. Se recupera la porción del gel que contiene el
fragmento BamHI-EcoRI de 3,2 kpb y se electroeluye
el ADN. Después, éste se extrae precipitando con 100 \mul de
cloroformo y etanol y redisolviendo en 40 ml de tampón TE. La
concentración de ADN se estima por electroforesis en gel de agarosa
seguido de la visualización de la banda con luz ultravioleta.
El vector pTZ18R se prepara por digestión con
BamHI y EcoRI en las condiciones recomendadas por el proveedor
(BRL). El ADN se extrae con fenol, fenol/cloroformo (1:1) y
cloroformo y el ADN se precipita con etanol.
Se ligan juntos 100 ng de cada uno de los
fragmentos anteriores en un volumen de reacción de 25 \mul, que
contiene el tampón recomendado por BRL más ATP (1 mM) y 1,5 U de
ADN ligasa de T4 (BRL). La mezcla de reacción se incuba durante 16 h
a 16ºC y después se usa para transformar E. coli
DH5\alphaF'. Las células se disponen en placas de agar LB que
contienen 25 \mug/ml de ampicilina, Xgal al 0,005%, IPTG 0,05 mM
y se incuban toda la noche a 37ºC.
Se usan varias colonias blancas individuales para
preparar los cultivos de toda la noche en medio LB complementado
con glucosa al 0,1% y 25 mg/ml de ampicilina. Estos cultivos se
usan para aislar el plásmido, usando el método de miniprep de
Holmes y Quigley [Holmes, D.S. y Quigley, M., Anal. Biochem. 114:193
(1981)]. Los plásmido se digieren con varios enzimas de
restricción, de acuerdo con las recomendaciones del proveedor (BRL)
y en presencia de ARNasa A (0,5 mg/ml), y los productos se analizan
en un gel de agarosa. Se seleccionan los plásmidos que producen los
fragmentos BamHI-EcoRI y HindIII del tamaño esperado
y las células de E. coli que los portan se mantienen en
glicerol a -20ºC. Este plásmido se llama pTZPEPC (depositado como
DSM 7019).
Ejemplo
5.2
El subclon pepC, un fragmento
BamHI-EcoRI de 3,2 kpb en el vector pTZ18R, se
secuencia completamente por el método de terminación de cadena
didesoxi [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74:5463-67 (1977)] usando cebadores
oligonucleotídicos sintéticos y Sequenase (United States Biochemical
Corp.).
La secuencia completa de nucleótidos está
presente en el listado de secuencias. La fase de lectura abierta se
identifica por comparación con otra subtilisina conocida de la
familia de las proteasas de serina y se confirma por mapeo de
transcripción.
Ejemplo
5.3
El ARN total se prepara a partir de micelios
liofilizados y triturados que crecen en medio mínimo con glucosa
como fuente de carbono y amonio como fuente de nitrógeno por el
método de Frederick y Kinsey [Curr. Genet. 18:53-58
(1990)]. El extremo 5' del ARN mensajero se identifica por
hibridación del ARN total con oligo A, un oligonucleótido marcando
en el extremo con 32-P (complementario a los
nucleótidos 433 a 456 de la SEC ID Nº 1) y determinándose el tamaño
del transcrito producido por transcriptasa inversa procesado en un
gel de secuenciación por comparación con las reacciones de
secuenciación producidas por la secuenciación didesoxi con el mismo
oligonucleótido (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY,
1982). Los sitios precisos de ayuste del intrón se identifican por
clonación y secuenciación de una copia parcial de ADNc del
mensajero de pepC. La síntesis de la primera cadena se lleva a cabo
por métodos convencionales (Maniatis et al., op. cit.) con la
excepción de que el oligonucleótido de cebado es oligo C
(complementario a los nucleótidos 923 a 944 de la SEC ID Nº 1).
Este ADNc se somete a PCR usando oligos B (correspondientes a los
nucleótidos 631 a 657 de la SEC ID Nº 1) y C, y se clona en pTZ18R.
(Obsérvese que el oligo B tiene adicionalmente un sitio BamHI en su
extremo 5' y el oligo C adicionalmente tiene un sitio EcoRI). Ambas
cadenas de los dos clones independientes se secuencian
completamente. La longitud total del ARNm producido por el gen pepC
se determina por análisis de Northern usando el fragmento
EcoRI-BamHI de 3,2 kb como sonda (Maniatis et al.,
op. cit.) y se determina que está entre 1,5 y 1,8 kb, lo que
corresponde al tamaño esperado por la fase de lectura abierta y la
posición del sitio de iniciación de la transcripción.
Ejemplo
6.1
El plásmido pTZPEPC se digiere con BamHI, se
trata con la polimerasa de T4 y se religa en presencia de un exceso
diez molar de conectores de EcoRI desfosforilados (5' GGAATTCC).
Después de la transformación en E. coli, se identifica por
miniselección el plásmido correcto con sitios EcoRI flanqueando
ambos lados del gen pepC.
Ejemplo
6.2
El plásmido pCG59D7 que puede obtenerse a partir
de Escherichia coli BJ5138/pCG59D7 (DSM 3968) se digiere con
XbaI y se purifica el fragmento que contiene un gen pyrA de A.
niger completo. Éste se clona en el sitio XbaI de pTZ18R para
crear el plásmido pAXI (depositado como DSM 7017).
Ejemplo
6.3
El fragmento XbaI de 4 kb que contiene el gen
pyrA se escinde de pAXI y se purifica a partir de las secuencias
del vector.
Se cortan con BglII 2 \mug de pTZPEPCE de
acuerdo con las recomendaciones del fabricante y, después, se
extrae con fenol, se precipita con etanol y se redisuelve en 20
\mul de agua. Este ADN después se trata con fosfatasa alcalina
bacteriana para eliminar los grupos 5' fosfato, como recomienda el
fabricante. El fragmento de 5 kb se purifica de un gel.
Los dos fragmentos anteriores se tratan con
polimerasa de T4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante,
se extraen con fenol y se precipitan con etanol. Los dos fragmentos
se mezclan y se ligan. Después de la transformación de E.
coli, las colonias que llevan los plásmidos correctos se
identifican por digestión por restricción de preparaciones de
miniplásmidos.
pPEPCPYRA consta del vector pTZ18R que contiene
un fragmento EcoRI que lleva el gen PEPC, que tiene el fragmento
central BglII, que codifica los dos sitios activos de histidina y
serina, substituido por un fragmento de ADN XbaI que codifica la
orotidina monofosfato descarboxilasa.
Ejemplo
6.4
Se digieren completamente 10 \mug del plásmido
pPEPCPYRA con EcoRI. El grado de digestión se revisa procesando una
alícuota en un gel y el resto del ADN se extrae con fenol, se
precipita con etanol y se resuspende en 20 \mul de agua
estéril.
Las esporas conidiales del A. niger An8
auxotrófico (DSM 3917) se cultivan durante 4 días a 28ºC en medio
completo hasta la completa esporulación. Se usan 2 x 10^{8}
conidiosporas para inocular 200 ml de medio mínimo complementado
con 1 g/l de arginina y uridina.
Después de 20 horas de crecimiento a 28ºC a 180
rpm, el micelio se recoge por filtración a través de Miracloth, se
lava dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se
resuspende en 20 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y 0,5 mg/ml de
Novozym 234 (Novo Industries). La mezcla se incuba en un baño de
agua con agitación (30ºC, 50 rpm) hasta que se liberan suficientes
protoplastos (detectados microscópicamente después de 90 a 120
min). La suspensión de protoplastos se filtra a través de un lecho
corto de lana de vidrio en un embudo para eliminar los restos de
micelio. Los protoplastos se sedimentan por centrifugación suave
(10 min, 2000 rpm) a temperatura ambiente y se lavan dos veces con
10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM. Finalmente, los protoplastos
se resuspenden en 200 a 500 \mul de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM
para dar una concentración de 1 x 10^{8} esferoplastos por ml.
Para la transformación, se incuba una alícuota de
200 \mul de la suspensión de protoplastos con 5 \mug del
pPEPCPYRA digerido con EcoRI, 50 \mul de PCT
(Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2} 50 mM, PEG 6000
al 25%). La mezcla de incubación se mantiene en hielo durante 20
min, se añaden otros 2 ml de PCT y la mezcla se incuba durantes 5
min más a temperatura ambiente. Se añaden 4 ml de KCl 0,8 M,
CaCl_{2} 50 mM y se mezclan alícuotas de 1 ml de la solución final
de transformación con medio mínimo de agar líquido (medio mínimo +
1 g/l de arginina + 10 g/l de Bacto-Agar (Difco)),
estabilizado con KCl 0,8 M. Las mezclas se vierten inmediatamente
sobre placas de agar del mismo medio y se incuban a 30ºC.
Tras 2 ó 3 días de crecimiento a 28ºC, aparecen
los transformantes estables como crecimiento vigoroso y colonias
que esporulan sobre un crecimiento de fondo de muchos cientos de
transformantes pequeños, presumiblemente abortivos.
Ejemplo
6.5
A partir de las colonias estables, se preparan
suspensiones individuales de esporas y se cultivan en rayas en
placas mínimas recientes más arginina. Se seleccionan colonias
individuales y se cultivan otra vez en rayas para conseguir
cultivos puros. Éstos se usan para inocular 200 ml de medio mínimo
líquido complementado con 1 g/l de arginina. Después de 24 h de
agitación a 180 rpm a 30ºC, el micelio se recoge en papel de filtro
y la pasta se liofiliza. Después de secar, se prepara el ADN a
partir de las pastas individuales moliendo las pastas con un
mortero hasta conseguir un polvo fino. Se resuspenden 60 mg de este
polvo en 3 ml de dodecilsulfato sódico al 1%, Tween 80 al 0,1% y
acetato amónico 1 M por agitación vorticial. Esto se calienta a
65ºC durante 20 min con mezcla ocasional. Los restos celulares se
separan de la solución de ADN por centrifugación a 15.000 rpm
durante 5 min. El sobrenadante se extrae dos veces con fenol, dos
con cloroformo y se precipita con etanol. El sedimento de ADN se
redisuelve en 100 \mul de TE estéril.
Se digieren 20 \mul de cada ADN con BglII en
presencia de 1 \mug de ARNasa A durante 1 h. Esto se separa en un
gel de agarosa, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa y se
mete en un horno. Se purifica el fragmento EcoRI de pTZPEPC que
contiene PEPC, se marca por traducción con muesca y se usa como
sonda en los filtros. Las cepas que llevan una rotura del gen pepC
se reconocen fácilmente por la falta del fragmento de hibridación
BglII de 1,2 kb así como porque tienen alterada la movilidad de los
otros dos fragmentos flanqueantes.
Una de estas cepas se pone en placas con medio
que contiene uridina y ácido
5-fluoro-orótico. Los mutantes
auxotróficos para pirimidina se identifican por el crecimiento más
fuerte en este medio y se pican y purifican por cultivo en rayas
para obtener colonias individuales.
Ejemplo
6.6
Una de las cepas de A. niger An8
pepC^{-} aisladas en el ejemplo 6.5 se usa como hospedador para
una transformación posterior con pyrA^{+}que contiene plásmidos y
cassettes de expresión que contienen un gen heterólogo para
interferón.
Se cultivan esporas conidiales del mutante de
A. niger An8 pepC^{-} auxotrófico para la uridina durante
4 días a 28ºC en medio completo hasta que esporulan completamente.
Se usan 2 x 10^{8} conidiosporas para inocular 200 ml de medio
mínimo complementado con 1 g/l de arginina y uridina.
Después de 20 horas de cultivo a 28ºC y a 180
rpm, el micelio se recoge por filtración a través de Myracloth, se
lava dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se
resuspende en 20 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM, 0,5 mg/ml de
Novozym 234 (Novo Industries). La mezcla se incuba en un baño de
agua con agitación (30ºC, 50 rpm) hasta que se libera una cantidad
suficiente de protoplastos (detectada microscópicamente después de
90 a 120 min). La suspensión de protoplastos se filtra a través de
un lecho corto de lana de vidrio en un embudo para eliminar los
restos de micelio. Los protoplastos se sedimentan por
centrifugación suave (10 min, 2000 rpm) a temperatura ambiente y se
lavan dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM.
Finalmente, los protoplastos se resuspenden en
200-500 \mul de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM para
dar una concentración de 1 x 10^{8}/ml.
Para la transformación, se incuba una alícuota de
200 \mul de la suspensión de protoplastos con 5 \mug de pCG59D7
(DSM 3968) y 50 \mug de ADN de pGIIss-IFN AM119 o
pGII-IFN AM119 (ambos plásmidos se describen
completamente en la solicitud EP 0 421 919), 50 \mul de PCT
(Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2} 50 mM, PEG 6000
al 25%). La mezcla de incubación se mantiene en hielo durante 20
min, se añaden otros 2 ml de PCT y la mezcla se incuba durante 5 min
más a temperatura ambiente. Se añaden 4 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2}
50 mM y se mezclan alícuotas de 1 ml de la solución de
transformación final con medio agar mínimo licuado (medio mínimo +
1 g/l de arginina + 10 g/l de Bacto-Agar (Difco)),
estabilizado con KCl 0,8 M. Las mezclas se vierten inmediatamente en
placas de agar del mismo medio y se incuban a 30ºC.
Después de 2 ó 3 días de cultivo a 28ºC, aparecen
los transformantes estables con crecimiento vigoroso y colonias que
esporulan sobre un crecimiento de fondo de muchos cientos de
transformantes pequeños, presumiblemente abortivos.
Los transformantes se pican y se analiza la
expresión de interferón. La actividad del interferón se determina
de acuerdo con el procedimiento de Armstrong (J.A. Armstrong, Appl.
Microbiol. 21, 732 (1971)) usando células humanas
CCL-23 y el virus de la estomatitis vesicular (VSV)
como virus de exposición.
Se precultivan individualmente esporas conidiales
de los transformantes en 50 ml de un medio de precultivo (3 g/l de
Pectin Slow Set L (Unipectin, S.A. Redon, Francia), 2 g/l de
NH_{4}Cl, 0,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de NaCl, 0,5 g/l
de Mg_{2}SO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g/l de
Ca_{2}SO_{4}\cdot2H_{2}O, pH 7.0, y arginina al 1%). El
precultivo se incuba durante 72 horas a 250 rpm y a 28ºC. Se usa un
10% del precultivo para inocular 50 ml de medio de cultivo
principal (20 g/l de harina de soja, 5 g/l de pectina Slow Set, y
arginina al 1%). El cultivo se desarrolla durante 72 a 96 horas a
250 rpm y a 28ºC.
Se toman muestras a distintos tiempos (durante 20
horas), las células se sedimentan por centrifugación y se rompen
por liofilización y se trituran en seco. Se ensaya la actividad del
interferón en el sobrenadante y en los extractos celulares como se
describe (supra). La mayor parte de la actividad del
interferón se encuentra secretada en el medio en transformantes que
llevan pGIIss-IFN AM119, mientras que en los
transformantes que llevan pGII-IFN AM119
principalmente está en el extracto celular.
Ejemplo
7.1
Se transforma A. niger An8 con 1 \mug de
pAXI más 10 \mug de pTZPEPC para producir protótrofos para la
uridina. Las colonias se purifican y se prepara el ADN como se ha
descrito anteriormente. Las transferencias de Southern usando el
fragmento EcoRI-BamHI de pTZPEPC demostraron que
algunos transformantes tiene una única copia de pTZPEPC integrada
en su genoma mientras que otros tienen hasta y por encima de 10
copias extra en su genoma. Estas cepas producían en correspondencia
más actividad proteolítica y son mitóticamente estables.
Ejemplo
7.2
El plásmido pGW1100 (depositado como DSM 5747) se
corta con BamHI y SacI. El fragmento de 1,2 kpb que incluye el
promotor de la piruvato quinasa y el extremo 5' se purifica, se
trata con la polimerasa de T4 y se clona en el único sitio BamHI de
pTZPEPC en el extremo 5' del clon de pepC, que también se convierte
en extremos romos con la polimerasa de T4 y se trata con fosfatasa
alcalina.
Los plásmidos correctos se identifican por
miniselección, se elige uno y se utiliza para transformar una cepa
BW313 de E. coli dut^{-} ung^{-}. Esta cepa se
superinfecta con M13K07 para producir un ADN monocatenario
uracilo-substituido a partir del plásmido.
El oligonucleótido 1 (representado como la SEC ID
Nº 3) consta de 37 nucleótidos. Los primeros 19 nucleótidos son
complementarios a los primeros 19 nucleótidos de la fase de lectura
abierta de pepC y los 18 últimos son complementarios a los 18
nucleótidos últimos anteriores al ATG del gen de la piruvato
quinasa. Para la mutagénesis in vitro de este plásmido, se
fosforilan 5 pM del oligonucleótido 1 en el extremo 5' con ATP 100
pM tratando el oligo con 10 U de polinucleótido quinasa de T4 en 50
\mul de tampón quinasa como recomienda el proveedor. La reacción
se termina calentado a 65ºC durante 10 min.
Se mezcla una concentración 0,2 pM del ADN
monocatenario que contiene uracilo con una concentración 0,5 pM del
oligonucleótido 1 fosforilado en Tris-HCl 20 mM pH
7,5, MgCl_{2} 10 mM, NaCl 25 mM en un volumen final de 10 \mul.
La mezcla se incuba a 65ºC durante 5 min, se enfría lentamente a
temperatura ambiente durante 60 min y se pone en hielo durante 15
min. Después se añaden a la mezcla 2 \mul de dNTP 500 \muM, 1,5
\mul de ATP 10 mM, 1 ml de ADN polimerasa de T7 (12 U/\mul,
Pharmacia) y 1 \mul de ADN ligasa de T4 (1,2 U/\mul, BRL) y
esta mezcla de polimerización se incuba durante 15 min a 37ºC. La
reacción se termina calentando a 65ºC durante 5 min y se usan
alícuotas para transformar E. coli DH5\alphaF'.
Los plásmidos correctos se identifican digiriendo
preparaciones de miniplásmidos. Se eligen 3 y el fragmento EcoRI se
secuencia completamente usando oligonucleótidos sintéticos. Un
plásmido que contiene una fusión perfecta del promotor de la
piruvato quinasa con la fase de lectura abierta de pepC, que se
denomina pPKIPEPCA, se usa con pAXI para cotransformar A.
niger An8 en prototrófico para uridina.
La presencia de la fusión
pki-pepC se confirma obteniendo el ADN de
transformantes individuales purificados y usándolo en análisis de
Southern usando sondas de pki y pepC. Se demuestra que las cepas
con una o más copias de esta fusión génica integrada en su genoma
producen más actividad proteolítica cuando las células se
desarrollan rápidamente en glucosa como fuente de C.
El plásmido pPKIPEPCA se somete a mutagénesis
in vitro con los dos oligonucleótidos sintéticos mostrados
en la lista de secuencias como SEC ID Nº 4 y 5. El primero
introduce un sitio EcoRI justo antes del ATG de pepC y el otro crea
un bucle con el intrón completo. Esto crea un plásmido pPKIPEPCB
cuya secuencia se confirma por secuenciación completa.
El fragmento EcoRI-BamHI de 2,8
kb que empieza justo antes del ATG de pepC y acaba después del
terminador de pepC se purifica y liga junto con el fragmento
BamHI-EcoRI de 520 pb de pFBY129 (depositado como
DSM 7016), que contiene el promotor GAL10 de levadura, en el sitio
SnaBI del vector pFBY25 de dos micras basado en levadura
(depositado como DMS 7020). El plásmido correcto se identifica por
los productos de la digestión de restricción.
Este plásmido, pFBY138, se utiliza para
transformar levaduras y se ha demostrado que produce la proteína
pepC cuando se induce la fusión génica con galactosa.
Ejemplo
9.1
La reacción en cadena de la polimerasa (Saiki et
al., Science 230:1350-1354 (1985)) se usa para
aislar sondas para esta selección. Las dos regiones que contienen
los restos de los sitios activos para histidina y serina,
respectivamente, están bien conservadas entre las diferentes
proteasas de la clase de la subtilisina. Se obtiene una secuencia
de aminoácidos consenso para cada una de estas regiones y se
deducen las secuencias de ADN capaces de codificar estas dos
secuencias de aminoácidos. Para reducir el nivel de degeneración,
se diseñan dos cebadores para cada una de las regiones conservadas.
PCRoligo 1 y PCRoligo 2 (mostrados en las SEC ID Nº 8 y 9,
respectivamente) corresponden a la región del sitio activo His, y
PCRoligo 3 y PCRoligo 4 (mostrados en las SEC ID Nº 10 y 11,
respectivamente) corresponden a la región del sitio activo Ser.
Para facilitar la subclonación posterior de los productos de PCR,
los PCRoligos 1 y 2 contienen un sitio de restricción BamHI y los
PCRoligos 3 y 4 también un sitio EcoRI próximo a sus extremos
5'.
Ejemplo
9.2
Se aísla el ADN genómico de A. niger como
se describe en el ejemplo 1. Se realizan cuatro reacciones de
amplificación usando una combinación por parejas de los cuatro
oligos para PCR descritos anteriormente. La mezcla de reacción para
la reacción en cadena de la polimerasa contiene 100 ng de ADN
genómico total de A. niger, 100 pmol de cada cebador,
Tris-HCl 10 mM, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, 1
mg/ml de gelatina, (pH 8,3) y 5 unidades de ADN polimerasa Taq en
un total de 50 \mul. El ADN se desnaturaliza a 94ºC durante 30
segundo y después se hibridan los cebadores a 42ºC durante 40
segundos y la etapa de extensión se realiza a 72ºC durante 60
segundos. Después se repiten estas tres etapas 40 veces.
Ejemplo
9.3
Los productos de las reacciones de amplificación
se separan en un gel de agarosa al 1% y los fragmentos de ADN se
aislan del gel por electroelución como se ha descrito
anteriormente. Los fragmentos aislados (200 a 300 ng) se extraen con
fenol y luego con cloroformo y se precipitan con etanol. Tras la
centrifugación, los sedimentos de ADN se secan y luego se disuelven
en 10 \mul de tampón TE. Posteriormente este ADN se digiere con 10
unidades de los enzimas de restricción BamHI y EcoRI en un volumen
de 20 \mul durante 1 h a 37ºC en el tampón recomendado por el
proveedor (BRL). Tras la extracción con fenol y cloroformo y la
precipitación con etanol, el ADN digerido se sedimenta, se seca y se
redisuelve en 10 \mul de tampón TE. La concentración de ADN se
estima por electroforesis en gel de agarosa seguido de la
visualización de las bandas de ADN bajo luz UV.
El vector pTZ18R se prepara por digestión con
BamHI y EcoRI en las condiciones recomendadas por el proveedor
(BRL) y luego se extrae y se precipita con etanol como se ha
descrito anteriormente.
Se ligan 100 ng de los fragmentos de PCR aislados
junto con 100 ng del vector pTZ18R preparado descrito anteriormente
en un volumen de 20 \mul con 1 unidad de ADN ligasa de T4. Las
condiciones del tampón usado son las sugeridas por el proveedor
(BRL). Tras la incubación de la mezcla de reacción a 16ºC durante 16
h, ésta se usa para transformar la cepa DH5\alphaF' de E.
coli. Las células se disponen en placas de agar LB que
contienen 25 \mug/ml de ampicilina, Xgal al 0,005%, IPTG 0,05 mM
y se incuban durante toda la noche a 37ºC.
Se usan varias colonias blancas individuales para
preparar cultivos de una noche en 5 ml de medio LB complementado
con glucosa al 0,1% y 25 \mug/ml de ampicilina. Estos cultivos se
usan para aislar el ADN del plásmido, usando el método de miniprep
de Holmes y Quigley (Holmes, D.S. y Quigley, M. Anal. Biochem. 114:
193 (1981)). Los plásmidos se digieren con los enzimas de
restricción BamHI y EcoRI de acuerdo con las recomendaciones del
proveedor (BRL). Los plásmidos que contienen fragmentos se analizan
adicionalmente.
Los insertos de los plásmidos seleccionados se
secuencian por el método de terminación de cadena didesoxi (Sanger
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463-67
(1977)) usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos y Sequenase
(United States Biochemical Corp.).
Ejemplo
9.4
Las secuencias de nucleótidos de los insertos
anteriores se comparan con todas la secuencias de ADN en las bases
de datos combinadas de GenBank y EMBL. Una de ellas, que muestra
una fuerte homología con las secuencias de ADN que codifican
proteasas del tipo de la subtilisina, se elige como sonda, y se
denomina sonda-PCR, para la posterior selección de
la biblioteca genómica de A. niger. La secuencia de este
fragmento (sin los cebadores de PCR) es la que está entre los
nucleótidos 1474 y 2020 en la secuencia mostrada en la SEC ID Nº
6.
Se preparan filtros para hibridación en placa de
la biblioteca genómica de la cepa N400 de Aspergillus niger
como se ha descrito anteriormente (ejemplo 1) y se prehibridan de
acuerdo con el ejemplo 3.
Tras la hibridación durante 14 a 16 h a 65ºC, los
filtros se lavan una vez con 250 ml de SSC x 2, SDS al 0,1% durante
media hora a temperatura ambiente seguido de lavado a temperatura
ambiente con dos cambios de 250 ml de SSC x 0,2 y SDS al 0,1%, de
20 min cada uno, y finalmente dos veces en 250 ml de SSC x 0,2 y SDS
al 0,1% a 65ºC, durando cada lavado 20 min. Los filtros se secan y
se exponen a una película Kodak XAR5 durante uno a tres día a -70ºC
usando una pantalla intensificadora.
De esta forma, se obtienen 5 señales positivas a
partir de las seis placas analizadas. Las placas positivas se
pinchan con una pipeta Pasteur estéril poniendo cuidadosamente las
placas en el autorradiograma usando las marcas de tinta. Los
pedazos de agar que contienen las placas positivas se añaden a 1 ml
de SM y se añaden 2,5 \mul de cloroformo. Se permite que los fagos
difundan fuera del agar durante una hora a temperatura ambiente,
con agitación vorticial ocasional y, después se incuban toda la
noche a 4ºC. El agar y los restos celulares se eliminan por
centrifugación durante 5 min, se añaden 2,5 \mul de cloroformo y
las reservas de fagos se almacenan a 4ºC.
Los clones positivos se denominan \lambdaa,
\lambdab, \lambdac, \lambdad y \lambdae. Como los fagos se
disponen en placas a alta densidad, las placas positivas se
purifican dos veces sembrándolas a una baja densidad y repitiendo
el procedimiento completo de réplica de las placas, hibridación y
picado de las placas positivas.
Ejemplo
11.1
El ADN de lambda se aisla como se describe en el
ejemplo 4.1.
Se establece por análisis de restricción que los
cinco fagos de \lambdaa a \lambdae contienen insertos derivados
de la misma región del genoma de A. niger y se construye un
mapa de restricción parcial de esta región genómica.
Se digieren 2 \mug de ADN del fago con 20
unidades de EcoRI o BamHI en un volumen de 20 \mul durante 1 h a
37ºC en el tampón recomendado por el proveedor (BRL) y después se
calientan a 65ºC durante 10 min. Las muestras se procesan en un gel
de agarosa al 0,7% y se fotografían. El ADN se transfiere a
membranas de nitrocelulosa y se hibrida con la
sonda-PCR marcada.
Está claro a partir de estos productos de
digestión que los 5 fagos contienen una región solapante de
aproximadamente 5,5 kb que hibrida con la sonda-PCR
y, por lo tanto, contiene la mayoría si no todo el gen
correspondiente a A. niger. Un fragmento BamHI de 6,0 kpb de
longitud contiene esta región y se elige para un análisis más
profundo.
Ejemplo
12.1
El fragmento BamHI de 6,0 kb se incuba con el
enzima de restricción HindIII. Tras la extracción con cloroformo,
se precipita el ADN, se sedimenta por centrifugación, se disuelve
en tampón de muestra y se somete a electroforesis en un gel de
agarosa al 0,6% en tampón TBE x 1. Se recupera una porción del gel
que contiene el fragmento BamHI-HindIII de 3,0 kpb
y el ADN se electroeluye. Entonces, éste se extrae con 100 \mul
de cloroformo, se precipita con etanol y se redisuelve en 40 ml de
tampón TE. La concentración de ADN se estima por electroforesis en
gel de agarosa seguido de la visualización de la banda bajo luz
UV.
El vector pTZ18R se prepara por digestión con
BamHI y HindIII, en las condiciones recomendadas por el proveedor
(BRL). El ADN se extrae con fenol, fenol/cloroformo (1:1) y
cloroformo, y el ADN se precipita con etanol.
Se ligan juntos 100 ng de cada uno de los
fragmentos anteriores en un volumen de reacción de 25 \mul, que
contiene el tampón recomendado por BRL más ATP (1mM) y 1,5 U de ADN
ligasa de T4 (BRL). La mezcla de reacción se incuba durante 16 h a
16ºC y después se usa para transformar E. coli DH5\alphaF'.
Las células se disponen en placas de agar LB que contiene 25
\mug/ml de ampicilina, Xgal al 0,005%, IPTG 0,05 mM y se incuban
durante toda la noche a 37ºC.
Se usan varias colonias blancas individuales para
preparar cultivos de una noche en medio LB complementado con
glucosa al 0,1% y 25 mg/ml de ampicilina. Estos cultivos se usan
para aislar el plásmido, usando el método miniprep de Holmes y
Quigley [Holmes, D.S. y Quigley, M., Anal. Biochem. 114:193 (1981)].
Los plásmidos se digieren con varios enzimas de restricción de
acuerdo con las recomendaciones del proveedor (BRL) y en presencia
de ARNasa A (0,5 mg/ml), y los productos se analizan en un gel de
agarosa. Los plásmidos que dan lugar a fragmentos
BamHI-HindIII del tamaño esperado se seleccionan y
las células E. coli que los llevan se almacenan en glicerol
a -20ºC. Este plásmido se denomina pTZPEPD (depositado como DSM
7409).
Ejemplo
12.2
El subclon de pepD, un fragmento
BamHI-HindIII de 3,0 kpb en el vector pTZ18R, se
secuencia completamente por el método de terminación de la cadena
didesoxi [Sanger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74:5463-67 (1977)] usando cebadores
oligonucleotídicos sintéticos y Sequenase (United States Biochemical
Corp.).
La secuencia de nucleótidos completa se presenta
en el lista de secuencias como SEC ID Nº 6. La fase de lectura
abierta se identifica por comparación con otras proteasas de serina
conocidas de la familia de la subtilisina y esto se confirma por
mapeo de restricción.
Ejemplo
5.3
El ARN total se prepara a partir de micelios
liofilizados y molidos que se desarrollan en medio mínimo con
glucosa como fuente de carbono y amonio como fuente de nitrógeno
por el método de Frederick y Kinsey [Curr. Genet.
18:53-58 (1990)]. El extremo 5' del ARN mensajero
se identifica por hibridación del ARN total con oligo A, un
oligonucleótido marcando en el extremo con 32-P
(complementario a los nucleótidos 851 a 876 de la SEC ID Nº 6) y
determinando el tamaño del transcrito producido por transcriptasa
inversa procesado en un gel de secuenciación por comparación con
las reacciones de secuenciación producidas por la secuenciación
didesoxi con el mismo oligonucleótido (Maniatis et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold
Spring Harbor, NY, 1982). Los sitios precisos de ayuste de los
intrones se identifican por clonación y secuenciación de una copia
parcial de ADNc del mensajero de pepD. La síntesis de la primera
cadena se realiza por métodos convencionales (Maniatis et al., op.
cit.) con la excepción de que el oligonucleótido de cebado es oligo
C (complementario a los nucleótidos 1914 a 1941 de la SEC ID Nº 6).
Este ADNc se somete a PCR usando los oligos B (correspondientes a
los nucleótidos 1102 a 1129 de la SEC ID Nº 6) y C, y se clona en
pTZ18R. Obsérvese que en el oligoB los nucleótidos 1107 a 1009 (GGT)
se reemplazan por ATC creando así un nuevo sitio BamHI. De forma
similar, en el oligoC los nucleótidos 1932 (A) y 1935 (A) se
reemplazaron por G y T, respectivamente, creando así un nuevo sitio
HindIII. Ambas cadenas de los dos clones independientes se
secuencian completamente. La longitud total del ARNm producido por
el gen pepD se determina por análisis Northern usando el fragmento
EcoRI-HindIII de 3,0 kb como sonda (Maniatis et al.,
op. cit.) y se determina que está entre 1,4 y 1,7 kb, lo que
corresponde con el tamaño esperado por la fase de lectura abierta y
la posición del sitio de iniciación de la transcripción.
Ejemplo
13.1
El fragmento XbaI de 4 kb que contiene el gen
pyrA se escinde de pAXI (DSM 7017) y se purifica a partir de las
secuencias del vector.
Se cortan 2 \mug de pTZPEPD con NheI y NcoI de
acuerdo con las recomendaciones del fabricante y después se extraen
con fenol, se precipitan con etanol y se redisuelven en 20 \mul
de agua. Después, este ADN se trata con fosfatasa alcalina
bacteriana para eliminar los grupos 5' fosfato como recomienda el
fabricante. Se purifica a partir del gel el fragmento de 5,3 kb
carente del fragmento NheI-NcoI de 0,6 kpb que
contiene los sitios activos His y Ser.
Los dos fragmentos anteriores se tratan con
polimerasa de T4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante y
se extraen con fenol y se precipitan con etanol. Se mezclan los dos
fragmentos y se ligan. Tras la transformación de E. coli,
las colonias que llevan los plásmidos correctos se identifican por
digestión de restricción de preparaciones de miniplásmidos.
pPEPDPYRA consta del vector pTZ18R que contiene
un fragmento BamHI-HindIII que lleva el gen pepD,
que tiene el fragmento central NheI-NcoI, que
codifica los sitios activos His y Ser, reemplazado por un fragmento
XbaI de ADN que codifica la
orotidina-monofosfato-descarboxilasa.
Ejemplo
13.4
Se digieren completamente 10 \mug de plásmido
pPEPDPYRA por EcoRI. El grado de digestión se revisa procesando una
alícuota en un gel y el resto del ADN se extrae con fenol, se
precipita con etanol y se resuspende en 20 \mul de agua
estéril.
Se cultivan esporas conidiales de A. niger
An8 auxotrófico (DSM 3917) durante 4 días a 28ºC en medio completo
hasta la completa esporulación. Se usan 2 x 10^{8} conidiosporas
para inocular 200 ml de medio mínimo complementado con 1 g/l de
arginina y uridina.
Después de 20 horas de crecimiento a 28ºC a 180
rpm, el micelio se recoge por filtración a través de Miracloth, se
lava dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se
resuspende en 20 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM, 0,5 mg/ml de
Novozym 234 (Novo Industries). La mezcla se incuba en un baño de
agua con agitación (30ºC, 50 rpm) hasta que se liberan suficientes
protoplastos (detectados microscópicamente después de 90 a 120
min). La suspensión de protoplastos se filtra a través de un lecho
corto de lana de vidrio en un embudo para eliminar los restos de
micelio. Los protoplastos se sedimentan por centrifugación suave
(10 min, 2000 rpm) a temperatura ambiente y se lavan dos veces con
10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM. Finalmente, los protoplastos
se resuspenden en 200 a 500 \mul de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM
para dar una concentración de 1 x 10^{8} esferoplastos por ml.
Para la transformación se incuba una alícuota de
200 \mul de la suspensión de protoplastos con 5 \mug del
pPEPDPYRA digerido con EcoRI, 50 \mul PCT
(Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2} 50 mM, PEG 6000
al 25%). La mezcla de incubación se mantiene en hielo durante 20
min, se añaden otros 2 ml de PCT y la mezcla se incuba durante 5
min más a temperatura ambiente. Se añaden 4 ml de KCl 0,8 M,
CaCl_{2} 50 mM y se mezclan alícuotas de 1 ml de la solución de
transformación final con medio mínimo de agar líquido (medio mínimo
+ 1 g/l de arginina + 10 g/l de Bacto-Agar
(Difco)), estabilizado con KCl 0,8 M. Las mezclas se vierten
inmediatamente sobre placas de agar del mismo medio y se incuban a
30ºC.
Tras 2 ó 3 días de crecimiento a 28ºC, aparecen
los transformantes estables como crecimiento vigoroso y colonias
que esporulan sobre un crecimiento de fondo de muchos cientos de
transformantes pequeños, presumiblemente abortivos.
Ejemplo
13.5
A partir de colonias estables, se preparan
suspensiones individuales de esporas y se cultivan en rayas en
placas mínimas recientes más arginina. Las colonias individuales se
seleccionan y se cultivan en rayas otra vez para conseguir cultivos
puros. Éstos se usan para inocular 200 ml de medio mínimo líquido
complementado con 1 g/l de arginina. Después de 24 h a 30ºC agitando
a 180 rpm, el micelio se recoge en papel de filtro y la pasta se
liofiliza. Después de secar, se prepara el ADN a partir de pastas
individuales moliendo las pastas con un mortero hasta conseguir un
polvo fino. Se resuspenden 60 mg de este polvo en 3 ml de
dodecilsulfato sódico al 1%, Tween 80 al 0,1% y acetato amónico 1 M
por agitación vorticial. Esto se calienta a 65ºC durante 20 min
mezclando ocasionalmente. Los restos celulares se separan de la
solución de ADN por centrifugación a 15.000 rpm durante 5 min. El
sobrenadante se extrae dos veces con fenol, dos con cloroformo y se
precipita con etanol. El sedimento de ADN se redisuelve en 100
\mul de TE estéril.
Se digieren 20 \mul de cada ADN con NheI y NcoI
en presencia de 1 \mug de ARNasa A durante 1 h. Esto se separa en
un gel de agarosa, se transfiere a una membrana de nitrocelulosa y
se mete en un horno. Se purifica el fragmento
HindIII-BamHI de pTZPEPD que contiene PEPD, se marca
mediante traducción con muesca y se usa como sonda en los filtros.
Las cepas que llevan una rotura del gen pepD se reconocen
fácilmente por la falta del fragmento de hibridación
NheI-NhoI de 0,6 kb así como porque tienen alterada
la movilidad de los otros dos fragmentos flanqueantes.
Una de estas cepas se pone en placas en medio que
contiene uridina y ácido 5-fluoro orótico. Los
mutantes auxotróficos para pirimidina se identifican por el
crecimiento más fuerte en este medio y se pican y purifican por
cultivo en rayas para obtener colonias individuales.
Ejemplo
13.6
Una de las cepas de A. niger An8
pepD^{-} aisladas en el ejemplo 6.5 se usa como hospedador para
una transformación posterior con plásmidos que contienen
pyrA^{+}y cassettes de expresión que contienen un gen heterólogo
para el interferón.
Se cultivan esporas conidiales del mutante de
A. niger An8 pepD^{-} auxotrófico para la uridina durante
4 días a 28ºC en medio completo hasta que esporula completamente.
Se usan 2 x 10^{8} conidiosporas para inocular 200 ml de medio
mínimo complementado con 1g/l de arginina y uridina.
Tras 20 horas de crecimiento a 28ºC y a 180 rpm,
el micelio se recoge por filtración a través de Myracloth, se lava
dos veces con 10 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM y se resuspende
en 20 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM, 0,5 mg/ml de Novozym 234
(Novo Industries). La mezcla se incuba en un baño de agua con
agitación (30ºC, 50 rpm) hasta que se libera una cantidad suficiente
de protoplastos (detectada microscópicamente tras 90 a 120 min). La
suspensión de protoplastos se filtra a través de un tapón de lana
de vidrio en un embudo para eliminar los restos de micelio. Los
protoplastos se sedimentan por centrifugación suave (10 min, 2000
rpm) a temperatura ambiente y se lavan dos veces con 10 ml de KCl
0,8 M, CaCl_{2} 50 mM. Finalmente, los protoplastos se
resuspenden en 200 a 500 \mul de KCl 0,8 M, CaCl_{2} 50 mM para
dar una concentración de 1 x 10^{8}/ml.
Para la transformación, se incuba una alícuota de
200 \mul de la suspensión de protoplastos con 5 \mug de pCG59D7
(DSM 3968) y 50 \mug de ADN de pGIIss-IFN AM119 o
pGII-IFN AM119 (ambos plásmidos se describen
completamente en la solicitud EP 0 421 919), 50 \mul de PCT
(Tris-HCl 10 mM pH 7,5, CaCl_{2} 50 mM, PEG 6000
al 25%). La mezcla de incubación se mantiene en hielo durante 20
min, se añaden otros 2 ml de PCT y la mezcla se incuba durante 5 min
más a temperatura ambiente. Se añaden 4 ml de KCl 0,8 M, CaCl_{2}
50 mM y se mezclan alícuotas de 1 ml de la solución de
transformación final con medio agar mínimo licuado (medio mínimo +
1 g/l de arginina + 10 g/l de Bacto-Agar (Difco)),
estabilizado con KCl 0,8 M. Las mezclas se vierten inmediatamente en
placas de agar del mismo medio y se incuban a 30ºC.
Tras 2 ó 3 días de crecimiento a 28ºC, aparecen
los transformantes estables con crecimiento vigoroso y colonias que
esporulan sobre un crecimiento de fondo de muchos cientos de
transformantes pequeños, presumiblemente abortivos.
Los transformantes se pican y se analiza la
expresión de interferón. La actividad del interferón se determina
de acuerdo con el procedimiento de Armstrong (J.A. Armstrong, Appl.
Microbiol. 21, 732 (1971)) usando células humanas
CCL-23 y el virus de la estomatitis vesicular (VSV)
como virus de exposición.
Las esporas conidiales de los transformantes se
precultivan individualmente en 50 ml de un medio de precultivo (3
g/l de Pectin Slow Set L (Unipectin, S.A. Redon, Francia), 2 g/l de
NH_{4}Cl, 0,5 g/l de KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de NaCl, 0,5 g/l
de Mg_{2}SO_{4}\cdot7H_{2}O, 0,5 g/l de
Ca_{2}SO_{4}\cdot2H_{2}O, pH 7.0, y arginina al 1%). El
precultivo se incuba durante 72 horas a 250 rpm y a 28ºC. Se usa un
10% del precultivo para inocular 50 ml de medio de cultivo
principal (20 g/l de harina de soja, 5 g/l de pectina Slow Set,
arginina al 1%). El cultivo se desarrolla durante 72 a 96 horas a
250 rpm y a 28ºC.
Se toman muestras a distintos tiempos (cada 20
horas), las células se sedimentan por centrifugación, se rompen por
liofilización y se trituran en seco. Se prueba la actividad de
interferón en el sobrenadante y en los extractos celulares como se
describe (supra). La mayor parte de la actividad de
interferón se encuentra secretada en el medio en transformantes que
llevan pGIIss-IFN AM119, mientras que en los
transformantes que llevan pGII-IFN AM119
principalmente está en el extracto celular.
\newpage
Ejemplo
14.1
Se transforma A. niger An8 con 1 \mug de
pAXI más 10 \mug de pTZPEPD para producir protótrofos para la
uridina. Las colonias se purifican y se prepara el ADN como se ha
descrito anteriormente. Las transferencias de Southern usando el
fragmento HindIII de pTZPEPD demostraron que algunos transformantes
tienen una única copia de pTZPEPD integrada en su genoma mientras
que otros tienen hasta y por encima de 10 copias extra en su
genoma. Estas cepas producen en correspondencia más actividad
proteolítica y son mitóticamente estables.
Ejemplo
14.2
Se construye una fusión génica que consta de la
región promotora de la piruvato quinasa de A. niger y de las
regiones codificante y terminadora del gen pepD de A. niger.
La fusión se construye por PCR recombinante (R. Higuchi:
Recombinant PCR páginas 177-183 en Innis et al.,
(eds) PCR Protocols, Academic Press, Inc (1990). Se diseñan cuatro
oligonucleótidos cebadores de los cuales se muestran los fusoligos
1, 2 y 3 en las SEC ID Nº 12, 13 y 14, respectivamente, mientras
que el fusoligo 4 es complementario a la secuencia entre los
nucleótidos 2858 y 2874 en la SEC ID 1. El fusoligo 1 hibrida con el
promotor pki, 0,75 kpb secuencia arriba del codón de iniciación
ATG. Los fusoligos 2 y 3 solapan parcialmente en cadenas
complementarias, ambos contienen secuencias del promotor pki
inmediatamente secuencia arriba del codón de iniciación de la
traducción ATG, el propio codón ATG y también secuencias de la
región codificante de pepD inmediatamente secuencia abajo del codón
ATG. El fusoligo 4 hibrida con la región secuencia abajo del gen
pepD, 0,65 kpb secuencia abajo del sitio de terminación de la
traducción. Se llevan a cabo dos reacciones de PCR esencialmente
como se ha descrito anteriormente. En la primera, un fragmento
promotor pki de 0,75 kpb se amplifica usando los fusoligos 1 y 2 y
pGW1100 (DSM 5747) como molde. En la segunda, un fragmento de 2,0
kb que contienen las regiones codificante y de terminación de pepD
se amplifica usando los fusoligos 3 y 4 en pTZPEPD como molde. Los
productos de amplificación se purifican a partir del gel de
agarosa, se combinan, se desnaturalizan y rehibridan. Los dos
fragmentos forman homo- y también heteroduplex durante la reacción
de rehibridación ya que sus extremos se superponen debido a los
fusoligos 2 y 3. Entonces, esta mezcla hibridada se reamplifica por
PCR usando dos cebadores "exteriores" (fusoligo 1 y 4). El
producto de esta reacción se aisla, se purifica y se subclona en un
vector plasmídico.
Los plásmidos correctos se identifican por
digestión de preparaciones de miniplásmidos. Se eligen 2 y el
inserto se secuencia completamente usando oligonucleótidos
sintéticos. Un plásmido que contiene una fusión perfecta del
promotor de la piruvato quinasa con la fase de lectura abierta de
pepD, que se denomina pPKIPEPDA, se usa con pAXI para cotransformar
A. niger An8 en prototrófico para la uridina.
La presencia de la fusión
pki-pepD se confirma obteniendo el ADN de
transformantes individuales purificados y usándolo en análisis de
Southern usando sondas de pki y pepD. Se demuestra que las cepas
con una o más copias de esta fusión génica integrada en su genoma
producen más actividad proteolítica cuando las células se
desarrollan rápidamente en glucosa como fuente de C.
El plásmido pTZPEPD se corta por EcoRI, se
obtienen extremos romos con polimerasa de T4 y se religan,
eliminando de este modo el sitio EcoRI de la región polienlazadora.
Después, el plásmido resultante se somete a mutagénesis in
vitro con los cuatro oligonucleótidos sintéticos oligolevadura
1, 2, 3 y 4 mostrados en la lista de secuencias como SEC ID Nº 15,
16, 17 y 18, respectivamente. El oligolevadura 1 introduce un sitio
EcoRI justo secuencia arriba del ATG de pepD y los otros tres crean
un bucle con cada uno de los 3 intrones completos. Esto crea el
plásmido pTZPEPDa cuya secuencia se confirma por secuenciación
completa.
El fragmento EcoRI-BamHI de 2,2
kb que empieza justo antes del ATG de pepD y acaba después de la
región de terminación, se purifica y se liga junto con el fragmento
BamHI-EcoRI de 520 pb de pFBY129 (DSM 7016) que
contiene el promotor de levadura GAL10, en el sitio SnaBI del
vector pFBY25 (DSM7020) de dos micrómetros basado en levadura. Se
identifica un plásmido correcto por los productos de digestión de
restricción. Este plásmido, pGAL10PEPD, se utiliza para transformar
levaduras y muestra la producción de la proteína pepD cuando la
expresión de la fusión génica se induce con galactosa.
Los siguientes microorganismos se depositaron
según el tratado de Budapest en el Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b,
D-3300 Braunschweig:
Microorganismo/Plásmido | Fecha de Depósito | Nº. Depósito |
E. coli DH5\alphaF'/pGW1100 | 18 de enero de 1990 | DSM 5747 |
E. coli BJ5183/pCG59D7 | 2 de febrero de 1987 | DSM 3968 |
A. niger An8 | 11 de diciembre de 1986 | DSM 3917 |
E. coli DH5\alphaF'/pTZPEPC | 30 de marzo de 1992 | DSM 7019 |
E. coli DH5\alphaF'/pGP202 | 30 de marzo de 1992 | DSM 7018 |
E. coli DH5\alphaF'/pFBY129 | 30 de marzo de 1992 | DSM 7016 |
E. coli DH5\alphaF'/pAXI | 30 de marzo de 1992 | DSM 7017 |
E. coli DH5\alphaF'/pFBY25 | 30 de marzo de 1992 | DSM 7020 |
E. coli DH5\alphaF'/pTZPEPD | 19 de enero de 1993 | DSM 7409 |
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 18
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3220 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus niger
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: N400
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: pTZPEPC
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: región promotora
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..377
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido señal
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 378..435
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: péptido maduro
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: unión (436..756, 827..2056)
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "proteasa de tipo subtilisina"
\hskip6cm/producto = "PEPC de Aspergillus niger"
\hskip6cm/gen = "pepC"
\hskip6cm/marcador = PEPC
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 757..826
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: Secuencia codificante incluyendo el codón de terminación
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: unión (388..756, 827..2059)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 416 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..19
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo a pepC de A. niger"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 20..37
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo al gen pki de A. niger"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCGAGGAT GCCCTTCATC TTGACGGATG ATTGATC
\hfill37
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 44 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGAGGATG CCCTTCATCT TGAATTCGGA TGATTGATCT CTAC
\hfill44
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTCGATGTA ATCGACATCG GGGTGTCTGC GG
\hfill32
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2993 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Aspergillus niger
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: N400
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CLON: pTZPEPD
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: promotor
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..829
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia codificante incluyendo el codón de terminación
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: unión (830..1153, 1205..1649, 1697..1785, 1841..2233)
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función= "proteasa de tipo subtilisina"
\hskip6cm/producto= "PEPD de Aspergillus niger"
\hskip6cm/gen = "pepD"
\hskip6cm/marcador = PEPD
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1154..1204
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1650..1696
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: intrón
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1786..1840
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 416 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCTGGATCCC AYGGNACNCA YGTNGC
\hfill26
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCTGGATCCC AYGGNACNCA YTGYGC
\hfill26
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGAATTCG CCATNGANGT NCC
\hfill23
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTAGAATTCG CCATRCTNGT NCC
\hfill23
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGAATGGATC CGCGACG
\hfill17
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 27 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..12
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo a pepD de A. niger"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 10..27
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo al gen pki de A. niger"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGGAAAGCC ATCTTGACGG ATGATTG
\hfill27
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 29 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..10
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo al gen pki de A. niger"
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: misc_feature
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 8..27
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /función = "homólogo al gen pepD de A. niger"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGTCAAGATG GCTTTCCTCA AACGCATTC
\hfill29
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTGGGCCAC GAATTCAACA TGGCTTTCCT C
\hfill31
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGAGATCCGC AAACATAACC ATGTAGCCTA TGTGGAACAA G
\hfill41
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGATTAAC ATGAGTCTTG GTGGAGGCTA CTCCATGCG
\hfill40
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 18:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- ANTI SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:
\vskip0.333000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGCCGCTGGAA ATGAGAATAG AGATGCAGCA CGGACTAGCC
\hfill
Claims (19)
1. Una molécula de ADN aislada que comprende una
secuencia de ADN que codifica para una proteasa de serina de
Aspergillus niger seleccionada entre el grupo compuesto por
las proteasas de serina que tienen las secuencias de aminoácidos
mostradas en las SEC ID Nº. 2 y 7, respectivamente.
2. Una molécula de ADN de acuerdo con la
reivindicación 1, que comprende una secuencia de ADN seleccionada
entre el grupo compuesto por la región codificante de pepC mostrada
en la SEC ID Nº 1 y la región codificante de pepD mostrada en SEC
ID Nº 6.
3. Un vector híbrido que comprende una molécula
de ADN de acuerdo con la reivindicación 1.
4. Un vector híbrido de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que una secuencia de ADN que codifica una
proteasa de serina de Aspergillus niger del tipo de
subtilisina está unida funcionalmente a los elementos reguladores
adecuados para la expresión de dicha secuencia de ADN en una célula
hospedadora adecuada.
5. Un vector híbrido de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que una secuencia de ADN que codifica una
proteasa de serina de Aspergillus niger del tipo de
subtilisina está unida funcionalmente con elementos reguladores
adecuados para la expresión de dicha secuencia de ADN en una cepa
de Aspergillus.
6. Un vector híbrido de acuerdo con la
reivindicación 5, que comprende un promotor homólogo a la secuencia
de ADN deseada que codifica una proteasa de serina del tipo de
subtilisina de Aspergillus niger.
7. Un vector híbrido de acuerdo con la
reivindicación 4, que comprende un promotor heterólogo a la
secuencia de ADN deseada que codifica una proteasa de serina del
tipo de subtilisina de Aspergillus niger.
8. Un proceso para la preparación de una molécula
de ADN de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende cultivar
una célula hospedadora transformada con una molécula de ADN que
codifica una proteasa de serina del tipo de subtilisina de
Aspergillus niger y aislar dicha molécula de ADN a partir de
la célula hospedadora.
9. Una cepa de Aspergillus niger que tiene
un defecto en el gen pepC de la secuencia con SEC ID Nº 1 y/o en el
gen pepD de la secuencia con SEC ID Nº 6.
10. Un proceso para la preparación de una cepa de
Aspergillus niger que comprende la mutación del gen pepC
cromosómico endógeno de Aspergillus niger de la secuencia
con SEC ID Nº 1 y/o del gen pepD de Aspergillus niger de la
secuencia con SEC ID Nº 6.
11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación
10, que comprende la mutación in vitro de dicho gen, la
transformación de un hospedador de Aspergillus niger que
lleva un gen cromosómico endógeno correspondiente con el gen mutado
in vitro, y el aislamiento de mutantes en los que el gen
endógeno se substituye por el gen mutado in vitro.
12. Un proceso para la preparación de un
polipéptido deseado que comprende transformar una cepa de
Aspergillus niger de acuerdo con la reivindicación 9 con un
vector de expresión que lleva un cassette de expresión adecuado para
la expresión del polipéptido deseado, cultivar la cepa transformada
de Aspergillus niger en condiciones adecuadas para la
expresión del polipéptido deseado y aislar el polipéptido
deseado.
13. Una proteasa de serina de Aspergillus
niger seleccionada entre el grupo compuesto por PEPC mostrado
en la SEC ID Nº 2 y PEPD mostrado en la SEC ID Nº 7.
14. Un proceso para la preparación de una
proteasa de serina de Aspergillus niger del tipo de
subtilisina, comprendiendo dicho proceso cultivar un hospedador
adecuado que se transforma con un vector de expresión híbrido de
acuerdo con la reivindicación 4.
15. Un hospedador transformado con un vector de
expresión híbrido de acuerdo con la reivindicación 4.
16. Un hospedador transformado de acuerdo con la
reivindicación 15, que es una cepa de Aspergillus niger.
17. Un hospedador transformado de acuerdo con la
reivindicación 16, que es una cepa de Aspergillus niger
transformada con un vector de expresión híbrido que comprende un
promotor homólogo a la secuencia de ADN que codifica una proteasa
de serina del tipo de subtilisina de Aspergillus niger.
18. Un hospedador transformado de acuerdo con la
reivindiicación 16, que es una cepa de Aspergillus niger
transformada con un vector de expresión híbrido que comprende un
promotor heterólogo a la secuencia de ADN que codifica una proteasa
de serina del tipo de subtilisina de Aspergillus niger.
\newpage
19. Un proceso para la preparación de un
hospedador transformado de acuerdo con la reivindicación 15, que
comprende transformar un hospedador adecuado con un vector de
expresión híbrido de acuerdo con la reivindicación 4.
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