KR100378507B1 - 진균성프로테아제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 아스파르트산 프로테아제를 암호화하는 신규한 DNA 서열, 아스퍼질러스 아스파르트산 프로테아제 자체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 이질성 단백질의 발현에 유용한, 아스파르트산 프로테아제-타입의 프로테아제가 결핍된 신규한 아스퍼질러스 돌연변이체 균주 및 이러한 돌연변이체 균주를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

진균성 프로테아제
본 발명은 아스퍼필러스(Aspergillus) 아스파르트산 프로테아제를 암호화하는 신규한 DNA 서열 아스퍼질러스 아스파트르산 프로테아제 자체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이질성 단백질의 발현에 유용한, 아스파르트산 프로테아제가 결핍된 신규한 아스퍼질러스 돌연변이체 균주 및 이러한 돌연변이체 균주의 제조방법에 관한 것이다.
아스퍼질러스종 및 특히는 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillul nigpr)는 식품 가공업에 사용되는 효소를 제조하기 위해 공업적으로 이용된다. 아스퍼질러스(이하, 에이)나이거는 단백질 분비능이 크고 시스템이 분자적 유전자 조작을 위해 활용가능하기 때문에 재조합 단백질 제조용 숙주로서 장점을 갖는다. 그러나. 배양액, 협막공간 또는 소포체 및 골지체 중의 프로테아제 존재는 에이. 나이거에서 이질성 단백질의 발현에 유해한 것으로 입증되었다; 사실상 아스퍼질러스는 프로테아제를 제조하는데 상업적으로 이용된다. 아스퍼질러스로부터의 각종 세포외적 프로테아제가 문헌에 기술된 바 있다. 아스퍼질러스 아와모리(A.awamori)로부터 아스퍼질로펩신 A를 암호화하는 유전자인 pepA가 최근에 클론된 바있다. 이 pepA 유전자생성물은 에이.나이거의 분비된 산성 프로테아제의 대부분을 설명하고 pepA 유전자가 소실된 균주는 에이, 나이거 변종 아와모리에서 이질성 단백질의 증가된 발현을 허용한다. 다른 프로테아제 유전자도 최근에 아스퍼질러스로부터 클론된 바있으며, 여기에는 에이 오리제(A,oryzae)의 알칼리성 아스파르트산 프로테아제, 에이.푸미가투스 (A.fumigatus)의 알칼리성 아스파르트산 프로테아제, 에이.나이거변종 마크로스포루스(A.niger var. macrosporus)로 부터의 비-펩신 유형 산 프로테아제, 에이.오리제로부터의 중성 프로테아제 1I로 불리는 메탈로프로테아제 및 에이.나이거로 부터의 두가지 세린 프로테아제가 포함된다.
에이.나이거의 분리되고 돌연변이 처리된 프로테아제 유전자는 유전자 분해 실험, 즉 상응하는 천연 유전자가 파괴된 돌연변이 균주 제조에 사용될 수 있다. 예를 들어, 아스퍼질러스 아와모리로부터의 pepA 유전자는 유전자 분해에 의해 파괴되어 아스퍼질로펜신 A 결핍 균주를 제조한다.
그러나, 상기한 바와 같이, 아스퍼질러스는 다수의 상이한 프로테아제를 생성하므로, 이에 따라 단백질의 공업적 제조를 위해 또 다른 프로테아제가 결여된 아스퍼질러스 균주가 끊임없이 요구되고 있다. 이러한 목적을 위해, 예를 들어, 유전자 분해와 같은 시험관내 돌연변이 유발에 의한 프로테아제 결핍 균주의 제조를 위해 사용될 수 있는 또 다른 프로테아제 유전자도 요구되고 있다. 또한, 단백질 가공을 위해 공업적으로 적용될 수 있는 재조합 프로테아제 단백질도 요구되고 있다.
에이,나이거에서의 분비된 프로테아제 활성물의 또 다른 주성분은 아스파르트산 프로테아제이다. 아스파르트산 프로테아제는 다수의 진균에서 클론된 바 있는데, 예를 들어 에스.세레비지애 (S.cerevisiae)의 액포 단백질 pep4(=pepA), 칸디다, 뮤코르, 리코푸스(Rhizopus), 크리포넥트리아(Cryphonectria) 및 페니실리움(Penicillium) 종의 분비된 프로테아제 및 에이 나이거 및 에이.오리제 둘다의 분비된 주요 산성 프로테아제가 그 예이다. 최근에 액포 단백질 유전자가 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)로부터 분리되었으며 효모 pep4와 상당한 서열 동질성을 갖는 것으로 나타났다.
본 발명에 이르러 아스퍼질러스는 또한 펩신과 동질성이나 공지된 아스퍼질로펩신과 거의 아무런 동질성도 나타내지 않는 다른 아스파르트산 프로테아제를 생성하는 것으로 밝혀졌다. 본 발명은 이 신규한 프로테아제에 촛점을 두고 있다.
본 발명의 목적은 아스퍼질러스 아스파르트산 프로테아제를 암호화하는 DNA 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 재조합 아스퍼질러스 아스파르트산 프로테아제 및 이러한 목적으로 이의 생산을 위해 형질전환시킨 아스퍼질러스 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 이질성 또는 동질성 단백질의 보다 효과적인 생산을 위해 사용될 수 있는, 아스파르트산 프로테아제 유전자가 결여된 아스퍼질러스 균주를 제공하는 것이다.
본 발명은 아스퍼질러스 아스파르트산 프로테아제에 관한 것이다. 이러한 프로테아제를 본원에서는 "아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제"라 한다. 본 발명의 "아스퍼질러서-아스파르트산 프로데이나제'"란 (a) 아스퍼질러스 종으로부터 유래하고 (b) 활성부위에서 촉매적 아스파르트산 잔기로 인한 프로테아제 활성을 나타내며 (c) 아스파르트산 프로테이나제 계통으로 분류시키기 위해 공지된 아스파르트산 프로테아제와 아미노산 서열 동질성이 충분한 것으로 사료된다. 그러나, 본 발명에서 사용된 용어인 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제의 의미에 또한 아스파르트산 프로테아제 활성을 보유하는 효소의 단편도 포함되나 온전한 길이의 효소가 바람직한 양태이다. 또한 추가의 아미노산. 펩타이드 또는 단백질에 부착된 본 발명의 "아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제"를 함유하는 융합 단백질 또한 본 발명의 일부인 것으로 간주된다.
바람직한 의미에서, 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제는 아스퍼질러스 나이거로부터 유래된 프로테아제 또는 활성 단편, 보다 바람직하게는 서열확인 번호 1로 나타낸 서열의 아미노산 서열 또는 이의 일부를 갖는 프로테아제 또는 활성 단편을 나타낸다.
본 발명은 또한 본 발명의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 분리된 DNA 서열. 및 이러한 DNA 서열을 클로닝 및,증폭시키기 위한 하이브리드 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 적절한 숙주세포내에서 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자를 발현시키기에 적합한 조절영역과 기능적으로 결합된 상기와 같은 DNA 서열을 포함하는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제의 생산을 위한 발현 하이브리드 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 발현시킬 수 있는 형질전환시킨 숙주세포, 예를 들면, 형질전환 후 증가된 유전자 복제수로 인해 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 과잉발현시킬 수 있는 아스퍼질러스 균주에 관한 것이다.
본 발명은 또한 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자가 결핍된 아스퍼질러스 균주 및 예를 들어, 유전자 분해와 같은 돌연변이 유발로 인해 작용성 단백질을 더 이상 발현시킬 수 없는, 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA 서열에 의한 상기 균주의 제조 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 본 발명의 DNA 서열, 하이브리드 벡터, 발현 벡터 및 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 제조방법 뿐만 아니라 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자가 결핍된 아스퍼질러스 균주 및 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 과잉생산하는 숙주 균주의 발현 방법에 관한 것이다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA, 클로닝 및 발현용 하이브리드 벡터
본 발명은 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제, 바람직하게는 아스퍼질러스 나이거의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다. 이 DNA 서열은 예를 들어, 서열확인번호 1에서 나타내어진 pepE 유전자와 같이, 게놈성 DNA 라이브러리로부터 분리 가능한 DNA 분자를 갖는 것처럼 하나 이상의 인트론을 함유할 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 예를 들어, PCR 기술을 적용시켜 cDNA 클로닝 또는 돌연변이 유발 후 분리가능한 DNA 서열의 인트론-비함유 변이체에 관한 것이다. 이같은 인트론-비함유 유전자는 특히 비-아스퍼질러스 숙주, 바람직하게는 원핵체 또는 효모내에서 발현시키는데유용하다.
본 발명은 바람직하게는 서열확인번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 에이.나이거 아스파르트산 프로테아제 PEPE 또는 아스파르트산 프로테아제 활성을 보유하는 이의 단편을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 분자에 관한 것이다. 본 발명의 DNA 서열은 바람직하게는 서열확인번호 1과의 뉴클레오티드 서열로 나타낸 성숙한 PEPE 프로테아제에 대한 암호화영역이다. 그러나, 본 발명은 또한 PEPE 또는 이의 단편을 암호화하는 축퇴성 DNA 서열, 즉 뉴클레오티드가 암호화된 아미노산 서열상에 아무런 변화없이 대체된 서열에 관한 것이다. 이러한 DNA 서열은 예를 들어, 상이한 숙주에서 바람직한 코돈 사용상의 차이점 또는 제한 효소에 대한 새로운 인지부위의 존재로 인해 유용하다.
본 발명은 또한 본 발명의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제, 바람직하게는 이의 바람직한 형태를 암호화하는 DNA 서열을 삽입체로서 포함하는 하이브리드 벡터에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 하이브리드 벡터는 본 발명의 DNA 서열을 증식 및 복제시키는데 유용하다. 본 발명은 또한 본 발명의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제, 바람직하게는 이의 바람직한 형태를 제조하는데 적합한 발현 벡터에 관한 것이다. 이같은 발현 벡터는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA 서열을 목적하는 숙주 세포내에서 상기 DNA 서열의 발현을 조절하기에 적합한 조절영역과 기능적으로 결합시킨 "발현 카세트"를 포함한다.
발현 벡터를 포함한, 본 발명의 하이브리드 벡터는 유전자 공학의 분야에서 유용한 어떠한 벡터, 예를 들어, 바이러스, 파아지, 코스미드, 플라스미드 또는 염색체성 DNA. 예를 들어 SV40의 유도체. 헤르페스 바이러스, 유두종 바이러스 로타 바이러스 바큘로바이러스. 파아지 λ , 예를 들어. NM989 또는 EMBL4. 또는 파아지M13. 예를 들어 M13mp8 박테리아성 플라스미드, 예를 들어 pBR322. pUC18, 또는 효모 플라스미드 예를 들어 효모 2μ 플라스미드 또는 결핍성 바이러스, 헬퍼 바이러스 존재하의 파아지 또는 플라스미드. 상기 결핍성 바이러스, 파아지 또는 플라스미드의 복제를 허용하는 파아지 또는 플라스미드. 예를 들어 M14K07 헬퍼 파아지 존재하의 M13(+)KS 벡터 또는, 예를 들어 EP 184,438에서 제공된, 예를 들어 에이.나이거와 같은 아스퍼질러스종의 사상 진균으로부터 유래된 염색체성 DNA로부터 유래될 수 있다. 에스.세레비지에 또는 사상 진균. 보다 바람직하게는 아스퍼질러스종. 보다 더 바람직하게는 에이.나이거에 대한 벡터가 바람직하다.
발현 벡터를 포함하는 본 발명의 하이브리드 벡터는 염색체외적 요소로서 또는 숙주 염색체로서의 통합에 의해, 적절한 숙주에서의 목적하는 DNA 발현을 위해 제공된다. 일부 가능한 벡터 시스템이 본 발명의 클론된 DNA의 통합 및 발현에 유용하며, 원칙상, 선택된 숙주에서 복제되고 안정하게 유지되는 모든 벡터가 적절하다. 따라서, 벡터는 형질 전환을 위해 목적하는 숙주세포에 따라 선택된다. 일반적으로, 이같은 숙주 세포는 원핵성 또는 진핵성 미생물, 예를 들어, 박테리아. 진균. 예를 들어, 효모. 바람직하게는 에스.세레비지애 또는 사상 진균. 바람직하게는 아스퍼질러스 종. 보다 바람직하게는 에이.나이거, 또는 척추 동물. 예를 들어, 포유동물세포와 같은 고등 진핵성 기원의 세포일 수 있다. 이같은 숙주 세포는 다음에 상세히 기술한다. 발현 벡터를 포함한. 염색체외적 요소로서 유지되는 본 발명의 하이브리드 벡터는 복제원점(ori) 또는 자발적으로 복제되는 서열(ARS: autonomously replicating sequence), 선택성 마커 서열 및, 임의로. 추가의 제한 부위를 포함한다. 숙주 염색체로 통합시키고자 하는 벡터는 ori 또는 ARS를 포함할 필요는 없는데, 이것은 세포내에서 염색체와 연결되어 복제되기 때문이다.
복제원점 또는 자발적으로 복제되는 서열(세포외적 요소에게 자발적으로 복제하는 능력을 부여하는 DNA 요소)은 시미안 바이러스(SV40)로부터 유래된 것과 같은 외래기원을 포함하는 벡터의 작제로서, 또는 숙주세포 염색체성 기작에 의한 제공된다.
발현 벡터를 포함하는, 본 발명의 하이브리드 벡터는 또한 형질전환 선택 및 클론시키고자 하는 숙주에 따라 선택성 마커를 함유할 수 있다. 마커의 표현형적 발현으로 인해 형질전환체의 선택을 촉진시키는 어떠한 마커 유전자라도 사용할 수 있다. 적절한 마커는 특히, 예를 들어 테트라사이클린 또는 암피실린에 대해 항생제 내성을 나타내는 것, 또는 영양요구성 진균 돌연변이체의 경우, 숙주의 결함을 보충하는 유전자이다. 상응하는 유전자는 예를 들어, 항생재 사이클로헥시마이드에 대한 내성을 부여하거나 영양요구성 효모, 바람직하게는 에스.세레비지에 돌연변이체, 예를 들어 ura3, leu2, his3 도는 trp1 유전자에서의 자가영양성을 제공한다. 또한, 형질전환시키고자 하는 숙주가 마커에 의해 발현된 생성물에 대해 영양요구성인 경우, 자발적으로 복제되는 단편과 관련된 구조유전자를 마커로서 사용할 수 있다.
하이브리드 벡터, 특히, 에이.나이거에 대한 발현 벡터와 관련하여 특히 중요한 것은 예를 들어, 에이.나이거 또는 에이. 니둘란스(EP 184 438). 또는 엔. 크라사 pyr4 유전자와 동질성인 에이.니둘란스 DNA 단편으로부터 유도되는 오르니틴 카바모일 트랜스퍼라제를 암호화하는 argB 유전자와 같은. 에이.나이거 숙주의 결점을 보충해주는 마커 유전자이다. 기타의 적절한 마커 유전자는 본 발명의 형질전환 숙주 설명과 관련하여 이후에 기술된다.
이 콜라이에서 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA의 복제에 적합한 본 발명의 하이브리드 벡터는 예를 들어, 하기의 실시예에서 이후 기술되는 플라스미드 pPEPE이다.
본 발명의 발현 벡터와 관련하여 "발현 카세트"란 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 발현시킬 수 있는 DNA서열을 의미하고 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 암호화 영역과 조작적으로 결합된 프로모터 및 시그날 서열. 전사종결자. 전사증진자. 리보좀 결합 부위, 효율적인 RNA 프로세싱 서열, 효율적인 단백질 프로세싱을 암호화하는 서열 및 정확한 단백질 위치결정을 암호화하는 서열로 구성된 그룹의 임의의 하나 이상의 추가 조절요소를 포함한다. 본 발명에 따른 발현 카세트에서, 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 암호화 영역은 여기에 자연적으로 결합된 동질성 조절 요소 또는 다른 유전자로부터 유도된 이질성 조절 요소와 혼합될 수도 있다.
숙주 세포의 특성에 따라 광범위한 각종 프로모터 서열이 사용될 수 있다. 강하며 동시에 잘 조절되는 프로모터가 가장 유용하다.
프로모터의 예로는, λPL, λPR, 이.콜라이 lac, trp, 또는 tac 프로모터이다. 효모. 바람직하게는 에스.세레비지애내에서 발현시키기에 적절한 프로모터는 TRR1-. ADHI-, ADHII-, PH03-, PH05-, GAL10-또는 해당 프로모터, 예를 들어, 에놀라제. 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 3-포스포글리세레이트키나제(PGK). 헥소키나제. 피루베이트 데카복실라제, 포스포프락토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제 유전자의 프로모터 또는 PH05-GAPDH 하이브리드 프로모터(EP 출원번호 제EP-A-213, 593)이다. 다른 진핵성 프로모터의 예는 진핵성 바이러스, 예를 들어, SV40, 로우즈 육종 바이러스, 아데노바이러스 2, 소 유두종 바이러스, 파포바바이러스, 거대세포바이러스 유래 프로모터로부터 유래된 프로모터 또는 포유동물 세포, 예를 들어, 액틴, 콜라겐, 미오신 또는 β-글로빈 유전자 기원의 프로모터이다, 진핵성 프로모터는 인핸서 서열, 예를 들어 효모, 바람직하게는 에스. 세레비지애 상류 활성화 서열(UAS) 또는 바이러스성 또는 세포성 인핸서, 예를 들어, 사이토메갈로바이러스 IE 인핸서, SV40 인핸서, 면역글로불린 유전자 인핸서 등과 혼합할 수도 있다.
인핸서는 전사-촉진성 DNA 서열, 즉, 시미안 바이러스, 폴리오마 바이러스, 소 유두종 바이러스 또는 멀로니(Moloney) 육종 바이러스 기원이거나 또는 게놈 기원이다. 인핸서 서열은 또한 피사룸 폴리세팔룸(Physarum polycephalum)(PCT/EF8500278)의 염색체외 라이보좀성 DNA로부터 유도될 수도 있다. 적절한 인핸서는 또한 예를 들어, 효모산 포스파타제 PH05 유전자로 부터 유래된 상류 활성화 부위이다.
시그날 서열은 예를 들어, 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 예비서열 또는 분비성 리더 등일 수 있다. 시그날 서열은 예를 들어, 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제의 시그날 또는 리더 펩타이드, 예를 들어 서열확인번호 1에 나타낸 시그날 서열일 수 있다. 추가의 시그날 서열은 문헌을 참조한다 [참조: Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986)] .
전사 개시 및 종결, 및 mRNA의 안정화에 필요한 서열은 각각 바이러스성 또는 진핵성 cDNA의 비암호화 5'-영역 및 3'-영역, 예를 들어 발현 숙주로부터 흔히 이용할 수 있다.
본 발명의 한 양태는 GAL10 프로모터의 조절하에, 예를 들어 플라스미드 pGALPEPE에서와 같이 원핵생물, 예를 들어, 이.콜라이, 바람직하게는 효모, 보다 바람직하게는 에스. 세레비지애에서 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 발현시키기 위한 서열확인번호 1에 나타낸 암호화 영역의 3개의 액손으로 구성된 인트론-비함유 암호화 영역을 포함하는 발현 벡터이다.
본 발명은 바람직하게는 아스퍼질러스 균주내에서 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA 서열의 발현에 적절한 발현 벡터에 관한 것이다.
본 발명에 따른 한가지 유형의 발현 벡터는, DNA 서열에 자연적으로 결합된 프로모터, 즉 이의 동질성 프로모터의 조절하에 놓인 아스퍼질러스-아스파르트산프로네이나제, 바람직하게는 에이.나이거의 프로테이나제를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 보다 바람직한 것은 서열확인번호 1에 나타낸 PEPE를 암호화하는 DNA 서열, 가장 바람직하게는 프로모터 영역의 조절하의 서열확인번호 1의 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터이다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자가 유래되는 종의 숙주 균주 내에서 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제의 발현에 상기 발현 벡터가 사용되는 경우, 재조합 및 최초 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자 모두가 동일한 발현 조건하에서 활성이므로 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제는 과잉 발현된다.
본 발명의 발현 벡터의 또 다른 유형은 상기 DNA 서열과는 자연적으로 결합되지 않는, 아스퍼질러스에서 작용성인 프로모터 조절하의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA 서열을 포함한다. 아스퍼질러스종, 특히 에이.나이거에서 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제의 발현에 적합한 프로모터는 예를 들어, 아스퍼질러스종 펙틴 용해효소 유전자의 프로모터, 바람직하게는 에이,나이거 PLI(EP-A-0 278 355), PLA, PLB, PLC, PLE 또는 PLF(EP-A-0 353 188) 유전자의 프로모터, 아스퍼질러스종 폴리갈락투로나제 유전자의 프로모터, 바람직하게는 에이.나이거 PGI 또는 PGII 유전자(EP-A-421919)의 프로모터, 아스퍼질러스종 피루베이트 키나제 유전자의 프로모터, 바람직하게는 에이.나이거 pki 유전자(EP-A-439997)의 프로모터이다.
본 발명의 바람직한 양태, 즉 플라스미드 pPKIPEPE 에서, 에이.나이거의 피루베이트 키나제 프로모터는 동질성 시그날 서열에 결합된 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는, 서열확인번호 1에 나타낸 암호화 영역에 작동적으로 결합된다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자의 제조방법
본 발명은 또한 본 발명의 DNA 분자, 즉, 본 발명의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA 분자, 바람직하게는 바람직한 형태의 본 발명의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA 분자의 제조방법, 또는 상기 DNA 분자를 포함하는 하이브리드 벡터의 제조방법에 관한 것으로, 이 방법은 상기 DNA 분자 또는 본 발명의 하이브리드 벡터를 형질전환시킨 숙주와 배양 시킴을 포함한다. 본 발명의 다른 양태에서, 본 발명의 DNA 분자는 뉴클레오티드 축합을 통해 화학적 합성으로 제조될 수 있다.
숙주의 배양은 목적하는 DNA 분자가 결여된 숙주인 비-형질전환체로부터 선별성 마커와 함께 목적하는 DNA 분자를 함유하는 숙주인 형질전환체의 네가티브 또는 포지티브 선별을 허용하는 화합물로 보충되거나 이것이 제거될 수 있는 통상의 영향 배지에서 수행된다.
당해 분야에 유용한 어떠한 형질전환성 숙주라도 사용될 수 있다: 예를 들면, 박테리아, 예를 들어 이.콜라이, 진균. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지에 클루이베로마이세스 락티스, 고등한 진핵성 세포, 예를 들어 곤충세포 또는 포유동물 세포. 예를 들어 CHO 세포, 또는 특히 사상 진균, 예를 들어 아스퍼질러스, 예를 들어, 에이.니둘란스(A.nidulans) , 에이.오리 제(A.oryzae) . 에이 .카보나리우스(A.carbonarius) . 에이.아와모리 (A.awamori). 에이 .자포니쿠스(A.japonicus) 및, 특히 에이.나이거(A.niger)가 있다. 숙주의 형질전환은 통상적인 방법으로 수행된다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA 서열은 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 발현시킬 수 있는 아스퍼질러스 균주의 게놈으로부터 수득할 수 있거나, 예를 들어, 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자로 형질전환시킨 숙주를 배양시키,필요에 따라 이로부터 목적하는 DNA 서열을 분리시켜 제조할 수 있다.
특히, 이러한 DNA는
a) 적절한 아스퍼질러스 세포로부터 게놈성 DNA를 분리하고, 예를 들어, DNA 프로브를 사용하거나 적절한 발현 시스템을 사용하여 목적하는 DNA를 선별하고 목적하는 폴리펩타이드의 발현에 대해 스크리닝하는 단계;
b) 적절한 아스퍼질러스 세포로부터 mRNA를 분리하고, DNA 프로브와 하이브리드시키거나 적절한 발현 시스템에서 발현시켜 목적하는 mRNA를 선별하고 목적하는 폴리펩타이드의 발현에 대해 스크리닝하며, mRNA에 상보적인 단쇄 cDNA를 제조한 다음. 이로부터 이본쇄 cDNA를 제조하는 단계;
c) cDNA 라이브러리로부터 cDNA를 분리하고, DNA 프로브 또는 적절한 발현 시스템을 사용하여 목적하는 cDNA를 선별하며 목적하는 폴리펩타이드의 발현에 대해 스프리닝하는 단계;
d) 에이.나이거 pepE를 암호화하는 유전자로부터 고안된 올리고뉴클레오티드 라이머를 사요하여. PCR 기술로서 전체 아스퍼질러스 DNA 중의 이본쇄 DNA를 시험관내 합성하는 단계. 또는
e) 단계 a), b). c) 또는 d)에 따라 수득가능한 이본쇄 DNA를 적절한 벡터로 혼합시키고 적절한 숙주를 형질전환 시키며 숙주를 복제시켜 DNA를 분리시키는 단계로부터 선택된 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
게놈성 DNA는 분리리어 목적하는 DNA(단계 a)에 대해 스크리닝될 수 있다.
게놈성 DNA는 아스퍼지러스-아스파르트산 프로테이나제를 발현시킬 수 있는 아스퍼질러스 균주로부터 분리된다. 게놈성 DNA 라이브러리는 입증된 방법에 따라 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 분해되고 적절한 벡터로 혼입되어 상기 DNA로부터 제조된다. 이 게놈성 DNA 라이브러리를 후술한 바와 같이 DNA 프로브로 스크리닝시키거나 적절한 발현 시스템에서 발현시키고 수득된 폴리펩타이드를 통상적인 방법으로 스크리닝한다.
게놈성 라이브러리는 에이.나이거 균주, 예를 들어 NW756 또는 N400의 게놈성 DNA를 예를 들어, Sau3AI 또는 MboI로 부분 분해시키고 고분자량의 DNA 단편을 적절한 숙주 벡터, 예를 들어, 이.콜라이 플라스미드 pUN121 또는 λ 벡터, 예를 들어, EMBL4에서 클로닝시켜 제조될 수 있다.
목적하는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 생성하는 또 다른 진균 균주, 예를 들어, 에이.자포니쿠스, 에이.오리제, 에이.니둘란스, 에이,나이거가 게놈성 라이브러리에 대한 공급원으로서 사용될 수 있으며, 또 다른 적절한 벡터,예를 들어, 전술한 바와 같은 벡터가 단편의 수용체로서 사용될 수 있다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 DNA 서열에 대한 게놈성 라이브러리를 성공적으로 스크리닝하기 위해, 하이브리드용 DNA 프로브가 필요하다. 목적하는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제의 아미노산 서열 또는 그 일부가 공지된 경우, 이는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자에 하이브리드되는 합성 DNA 프로브 또는 예를 들어, 뉴로스포라 크라사로부터의 또다른 아스파르트산 프로테이나제 유전자 또는 그 일부일 수 있다.
폴리아데닐화 mRNA(단계 b)는 공지된 방법으로 적절한 세포로부터 분리된다. 분리방법은 예를 들어 헤파린, 구아니디늄 이소티오시아네이트 또는 머캅토에탄올과 같은 청정제 및 리보뉴클레아제 억제제 존재하에 균질화시키고, 임의로 염 및 완충용액 청정제 및/또는 양이온 킬레이트화제 존재하에 mRNA를 적절한 클로로포롤-페놀 혼합물로 추출하며 잔류하는 수성, 염-함유상으로부터 에탄올. 이소프로판올 등으로 mRNA를 침전시킴을 포함한다. 분리된 mRNA는 염화세슘 구배로 원심분리한 후, 에탄올 침전 및/또는 크로마토그래피법. 예를 들어, 올리고(dT) 셀룰로즈 또는 올리고(U) 세파로즈에서의 친화성 크로마토그래피로 추가로 정제될 수 있다.
바람직하게는, 이렇게 정제한 전체 mRNA를. 예를 들어, 선형 수크로스 구배중에서 원심분리시켜 크기에 따라 분획화하거나 예를 들어, 아가로스 겔상에서 적절한 크기의 분획 칼럼상에서 크로마토그래피시켜 분획화시킨다.
목적하는 mRNA는 DNA 프로브로 직접 mRNA를 스크리닝하거나, 적합한 세포 또는 세포-비함유계에서 해독하여 수득된 폴리펩타이드를 스크리닝함으로써 선별된다.
목적하는 mRNA의 선별은 바람직하게는 하기한 바와 같이 DNA 하이브리드화프로브를 사용하여 추가의 해독 단계를 배제함으로써 수행된다. 적합한 DNA 프로브는 공지된 뉴클레오티드 서열의 DNA, 예를 들면, 합성 DNA, 목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA로부터 유도된 cDNA 또는 천연 공급원 또는 유전자 조작된 미생물로부터 분리된 인접 DNA 서열을 포함하는 게놈 DNA 단편이다.
분획화된 mRNA는 세포, 예를 들면, 개구리 난세포, 또는 세포-비함유계, 예를 들어, 망상적혈구 용해물 또는 밀 배아 추출물에서 해독될 수 있다. 수득된 폴리펩타이드를 효소활성 또는 예를 들면 면역검정(예: 방사선 면역검정, 효소 면역 검정 또는 형광성 마커를 사용한 면역검정)중 천연 플리펩타이드에 대해 유발된 항체와의 반응에 대해 스크리닝한다. 이러한 면역검정 및 폴리클로날 및 모노클로날 항체의 제조방법은 당해 분야에 널리 공지되어 적용된다.
선별된 mRNA 주형으로부터의 일본쇄 상보성 DNA(cDNA)의 제조는 일본쇄 DNA로부터의 이본쇄 DNA 제조에서와 같이 당해 분야에 널리 공지되어 있다. mRNA 주형은 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트, 임의로 방사선 표지된 데옥시뉴클레오 사이드 트리포스페이트(반응결과를 스크리닝할 수 있도록), mRNA의 폴리(A) 테일과 하이브리드화하는 올리고-dT 잔기와 같은 프라이머 서열 및, 예를 들면 조류 골수아구증 바이러스(AMV)로 부터의 역전사효소와 같은 적합한 효소의 혼합물과 함께 항온처리된다. 예를 들면 알칼리 가수분해에 의한 주형 mRNA의 분해 후, cDNA를 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트와 적합한 효소의 혼합물과 함께 항온처리시켜 이본쇄 DNA를 수득한다. 적합한 효소는 예를 들면 역전사효소 이 콜라이 DNA 폴리머라제 1 또는 T4 DNA 폴리머라제의 클레나우 단편이다. 통상, 일본쇄 cDNA에 의해 자발적으로 형성되는 헤어핀 루프 구조는 제2쇄의 합성을 위한 프라이머로서 작용한다. 이러한 헤어핀 구조는 S1 뉴클레아제로 분해하여 제거한다. 또한 일본쇄 DNA의 3' 말단은 mRNA 주형의 가수분해 및 연속되는 제2 cDNA쇄의 합성에 앞서 단독중합체성 데옥시뉴클레오티드 테일에 의해 연장된다.
또다른 대안으로, 이본쇄 cDNA는 cDNA 라이브러리로부터 분리되고, 목적하는 cDNA에 대해 스크리닝된다(단계 c). cDNA 라이브러리는 적합한 세포로부터 mRNA를 분리하고, 상기와 같이 이로부터 일본쇄 및 이본쇄 cDNA를 제조함으로써 작제된다. 이러한 cDNA는 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 분해되고. 확립된 방법에 따라 λ파지(예: λ샤론 4A 또는 λgt11)로 도입된다. 니트로셀룰로즈 막, 하전된 나일론막같은 적합한 막에서 복제된 cDNA 라이브러리를 상기한 바와 같이 DNA 프로브를 사용하여 스크리닝하거나, 적합한 발현계에서 발현시켜, 수득된 폴리펩타이드를 목적하는 화합물에 대해 특이적인 항체와의 반응을 위해 스크리닝한다.
이본쇄 DNA 제조를 위한 또 다른 방법은 PCR 기술이다 (단계 d) 이 방법은 특히 적어도 부분적으로 공지된 서열을 갖는 소량의 DNA 또는 RNA로부터 출발하는 다량의 이본쇄 DNA 제조에 사용될 수 있다. 하지만, 공지된 벡터 서열이 측면에 위치한 비공지된 서열을 갖는 DNA 삽입체를 출발물질로서 사용할 수 있다. PCR 기술에 있어, DNA 분자, 즉 올리고뉴클레오티드를 DNA의 효소 주형-의존적 합성에 대한 프라이머로서 사용한다. 이본쇄 DNA의 변성, 프라이머와의 하이브리드화 및 효소적 합성은 연속적으로 반복될 수 있기 때문에 다량이 제조될 수 있다. 합성화된 DNA 분자의 수는 매회 배가되기 때문에 지수적으로 증가한다. PCR 기술은 당해 기술분야로서 본 발명에서 편리하게 적용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 공지의 아스파르트산 프로테아제간 비교를 근거로 보유된 아스파르트산 프로테아제 단백질 서열을 암호화할 수 있는 DNA와 하이브리드화하도록 고안될 수 있다. PCR 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고 예를 들어, 문헌[참조: M. A, Innis et al. (eds.), PCR protocols. A guide to methods and application Academic Press, San Diego (1990)]에 기술된 바와 같은 통상의 PCR 기술을 본 발명에 적용할 수 있다.
이본쇄 cDNA 또는 게놈 DNA의 적절한 벡터내로의 도입에 대한 다양한 방법이 당해 분야에 공지되어 있다(단계 e). 예를 들면, 상보성 단독중합체 트랙트를 상응하는 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제와 같은 효소 존재하에 항온처리시켜 이본쇄 DNA 및 벡터 DNA로 가할 수 있다. 그런 다음, 벡터 및 이본쇄 DNA를 상보성 단독중합체 테일간에 염기 짝짓기에 의해 결합시켜 최종적으로 리가제와 같은 특이적 결합 효소에 의해 연결시킨다. 기타 가능성은 합성 링커를 이본쇄 DNA 말단에 부가하거나, 평활- 또는 엇갈린(staggered) 말단 결합에 의해 이본쇄 DNA를 벡터내로 도입시키는 것이다. 적절한 벡터는 하기에 세부적으로 기술할 것이다.
수득된 하이브리드 벡터로 적절한 숙주 세포를 형질전환 시키기 위한 형질전환방법 및 형질전환된 숙주 세포의 선별 및 증식은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 방법의 예가 하기에 추가로 제시되어 있다.
본 발명에 따른 목적하는 DNA의 분리, 이의 돌연변이체 및 단편은 당해 분야의 공지된 방법, 즉 페놀 및/또는 클로로포름을 사용한 추출에 의해 수득된다. 임의로, DNA는 예를 들면 돌연변이체 수득을 위한 돌연변이제로 처리하거나, 단편 수득을 위한 제한 효소로 분해시켜 좀 더 조작한 후, 간접서열 등을 제거하면서 한쪽 또는 양쪽 말단을 변형시켜 벡터로의 도입을 촉진시킬 수 있다.
본 발명에 따른 DNA의 뉴클레오티드 서열은 말단-표지된 DNA를 사용하는 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 방법 또는 생거(Sanger)의 디데옥시 쇄 말단화 방법에 의해 공지의 방법으로 측정될 수 있다.
본 발명의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자 서열은 또한 통상의 방법에 따라 시험관내 합성에 의해 제조될 수 있다. 시험관내 합성은 특히 아스파르트산 프로테아제 활성이 있는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제의 단편을 암호화하는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자의 보다 작은 단편을 제조하는데 적용가능하다. 시험관내 합성은 또한 특히 프로모터 또는 시그날 펩타이드를 암호화하는 DNA 합성에 적용가능하다. 시험관내 합성은 에이.나이거로부터 유도된 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자 또는 이의 단편. 가장 바람직하게는 서열확인번호 1의 pepE 유전자 또는 이의 프로모터 또는 시그날서열에 적용된다.
본 발명을 수행하는데 있어, 또 다른 종(예: N.crassa)의 아스파르트산 프로테이나제 유전자 또는 이의 단편을 아스퍼질러스종, 예를 들면, 에이.나이거, RNA 분획 중 아스파르트산 프로테이나제 mRNA 또는 게놈 또는 cDNA 라이브러리 중의 아스파르트산 프로테이나제 DNA를 확인하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 에이.나이거 유전자의 1차 서열을 다른 프로테아제와 비교하여 프로테아제의 암호화 영역을 주정하여, 아스파르트산 프로테이나제 유전자 계열에 대한 유전자의 관계를 확인할 수 있다. 수득된 유전자를 하기 세부적으로 기술되는 바와 같이 재조합 프로테아제 제조에 사용할 수 있다.
합성 DNA 프로브는 공지된 방법에 따라 배열되거나 합성될 수 있다. 목적하는 올리고뉴클레오티드 혼합물은 문헌[참조: Y. Ike et al., Nucleic Acids Research 11. 477. 1983]에 기술된 바대로 적절한 축합 단계에서 보호 형태의 2. 3또는 4개의 뉴클레오티드 dA, dC. dG 및/또는 dT 또는 상응하는 디뉴클레오티드 커플링 단위의 혼합물을 사용하여 수득될 수 있다.
하이브리드화를 위해, DVA 프로브는 예를 들어, 키니제 반응에 의해 방사성 표지시킨다. 표지를 함유하는 DNA 프로브로 크기-분별화된 mRNA의 하이브리드화를 공지의 방법, 즉 보조제; 예를 들면, 칼슘 킬레이터, 점도 조절 화합물, 단백질, 비-동질성 DNA 등을 함유하는 완충제 및 염용액에서 선택적 하이브리드화에 바람직한 온도, 즉 0℃ 내지 80℃ 예를 들면 25℃ 내지 50℃ 또는 65℃ 내외 바람직하게는 하이브리드 이본쇄 DNA 융점보다 20℃ 아래인 온도 부근에서 수행한다.
형질전환된 숙주 및 이의 제조
추가로, 본 발명은 바람직하게는 본 발명의 아스퍼릴러스-아스파르트산 프로테이나제의 바람직한 형태를 암호화하는, 본 발명의 하이브리드 또는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포에 관한 것이다.
특히 본 발명의 재조합 DNA 분자의 증식을 위해 적합한 숙주의 예로는 제한효소 또는 변형 효소가 없거나 희박한 미생물, 즉 세균, 특히 에스케리키아 콜라이 균주, 예를 들면, 이.콜라이 X1776, 이.콜라이 Y1090, 이.콜라이W3110, 이.콜라이HB101/LM1035, 이.콜라이 JA221, 이.콜라이 DH5α, 바람직하게는 이.콜라이 DH5α F. JM109, MH1 또는 HB101 또는 이.콜라이 K12 균주이다. 적합한 숙주는 또한 다른 원핵 세포, 즉 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 스테아로더 모필러스 (B.stearothermophilus). 슈도모나스(Pseudomonas). 헤모필루스(Haemophilus). 스트립토코커스(Streptococcus) 등. 및 효모 예를 들면 사카로마 아세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae). 즉 에스.세레비지애 GRF 18이다.
또다른 적합한 숙주세포는 고등 생물의 세포, 특히 확립된 연속 사람 또는 동물 세포수, 예를 들면 사람 태아 폐 섬유아세포 L132, 사람 악성 흑색종 보위스(Bowes)세포, HeLa 세포, 아프리카 녹색 원숭이 COS-7 또는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포의 SV40 바이러스 형질전환된 신장세포를 들 수 있다.
본 발명의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자의 발현에 적합한 세포의 예는 상기 언급된, 적절한 발현 벡터로 형질전환된 세포 및 추가로 적절한마클로바이러스 발현 벡터로 형질전환된 적합한 곤충세포, 및 특히 적절한 발현 벡터로 형질전환된 사상 진균, 즉 페니실리움, 세팔로스포리움 또는 바람직하게는 아스러질러스종 예를 들면, 에이.카르보나리우스 (A.carbonarius). 에이.아와모리(A. awamori). 에이.니둘란스(A.nidulans), 에이 오리제(A.oryzae) 또는 더욱 바람직하게는, 에이.나이거이다.
본 발명은 또한 형질전환 조건하에 임의로 선별성 마커 유전자와 함께 적합한 숙주 세포를 본 발명의 DNA 분자 또는 하이브리드 벡터로 처리하고 임의로 형질전환체를 선별함을 포함하는, 이러한 형질전환체를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히 진핵세포인 경우, 예를 들면 아스퍼질러스종이 숙주로 사용되는 경우, 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자는 또한 형질전환 후 숙주 게놈으로 도입될 수 있다.
미생물의 형질전환은 예를 들면, 에스.세레비지애인 경우(A.Hinnen et al., Proc. Nat1, Acad. Sci. USA. 75. 1929. 1978). 비.서브틸리스인 경우(Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol.81. 741. 1961). 이 콜라인 경우(M.Mandel et al., J. Mol. Biol. 53. 159. 1970). 및 아스퍼질러스인 경우[F. Buxton et al., Gene 37:207-14(1985). D.J. Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-9(1983)]에 상기 문헌에 기술된 통상의 방법에 따라 수행된다.
따라서, 이.콜라이 세포의 형질전환 방법은 예를 들면, DNA 흡수를 허용토록하는 세포의 Ca2+예비처리 및 하이브리드 벡터와의 항온처리를 포함한다. 형질전환된 세포의 후속적 선별은 예를 들면, 벡터 DNA의 마커 서열의 특성에 의존하는 친주 세포로부터의 형질전환된 세포의 분리를 허용하는 선택적 성장 배지에 세포를 옮김으로써 성취될 수 있다. 바람직하게, 하이브리드 벡터를 함유하지 않는 세포의 성장을 허용하지 않는 성장 배지가 사용된다.
효모 또는 아스퍼질러스종과 같은 진균의 형질전환은 예를 들면, 글루코시다제를 통한 세포벽의 효소적 제거단계, 폴리에틸렌 글리콜 및 Ca2+이온 존재하에 하이브리드 벡터를 사용한 수득된 스페로플라스트의 처리 및 스페로플라스트를 아가로 삽입시킴에 의한 세포벽의 재생 단계를 포함한다. 바람직하게, 재생 아가는 상기한 바와 같은 형질전환 세포의 재생 및 선별을 동시에 허용하는 방식으로 제조된다.
고등 진핵세포 기원의 세포, 즉 포유동물 세포주의 형질전환은 바람직하게는 형질감염에 의해 성취된다. 형질 감염은 통상의 기술, 즉 인산칼슘 침전, 미세주입, 원형질체 융합, 전기천공법(electroporation)에 의해, 즉 세포막의 투과성을 일시적으로 증가시키는 짧은 전기 자극에 의해 또는 디에틸아미노에틸덱스트란, 디메틸 설폭사이드, 글리세롤 또는 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 헬퍼 화합물의 존재하에 DNA를 도입시킴으로써 성취된다. 형질감염후, 형질감염 세포를 예를 들면, 선별 마커 특성에 따라 선택된 선별 배지, 예를 들면, 상응하는 항생제를 함유하는 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지, RPMI 1640 배지 등과 같은 표준배양 배지에서 배양하여 동정하고 선별한다.
형질전환 숙주 세포는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 탄소, 예를 들면, 글루코즈 또는 락토즈와 같은 탄수화물, 질소, 예를 들면, 아미노산, 펩타이드, 단백질 또는 이의 분해산물, 예를 들면, 펩톤, 암모늄염 등, 및 무기염, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘의 설페이트, 포스페이트 및/또는 카보네이트의 동화성 탄소 공급원을 함유하는 액체 배지에서 배양된다. 배지는 또한 예를 들면, 성장 촉진 물질, 예를 들어, 철, 아연, 망간 등의 미량 원소를 함유한다.
배지는 선별압이 작용하고, 형질전환되지 않거나 하이브리드 벡터를 상실한 세포의 성장이 방지되도록 선택해주는 것이 바람직하다. 따라서, 예를 들면, 하이브리드 벡터가 마커로서 항생제 내성 유전자를 함유하는 경우, 항생제를 배지에 가한다. 예를 들어, 필수 아미노산에 있어 영양 요구성인 숙주 세포를 사용하고 하이브리드 벡터가 숙주 결함을 보충하는 효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 경우, 상기 아미노산이 결핍된 최소 배지를 사용하여 형질전환 세포를 배양한다.
포유동물 세포와 같은 고등 진핵성 기원 세포를 시판 중인 배지, 예를 들면, 임의로 성장-촉진 물질 및/또는 포유동물 혈청이 보충된 상기된 바와 같은 둘베코 개질 이글 배지(DMEM), 최소 필수 배지, RPMI 1640 배지 등을 사용하여 조직 배양 조건하에 성장시킨다. 조직 배양 조건하의 세포 배양 기술은 당해분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들면 에어리프트 반응기 또는 연속 교반 반응기에서의 균질 현탁 배양 또는 공동 섬유, 미세캡슐내, 아가로스 마이크로비드, 다공성 유리비드, 세라믹 카트릿지 또는 기타 미세담체에서 고정화 되거나 포획된 세포 배양을 포함한다.
배양은 당해 분야에 공지된 방법으로 수행된다. 배지의 온도, pH 및 발효 시간 같은 배양 조건은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 유도체의 최대 역가가 수득되도록 선택된다. 따라서, 이 콜라이 또는 효모 균주를 약 20 내지 40℃, 바람직 하게는 약 30℃의 온도에서 pH 4 내지 8, 바람직하게는 약 pH 7에서 4 내지 30시간, 바람직하게는 본 발명의 폴리펩타이드 또는 유도체의 최대 수율에 도달할 때까지 진탕 또는 교반시키면서 심부배양시켜 호기 조건하에 배양함이 바람직하다.
비형질전환 세포로부터 형질전환체를 선별하도록 하기 위해, 본 발명의 DNA 분자는 선별 마커를 함유하거나, 세포를 이들 마커를 함유하는 제2의 벡터로 공동 형질전환시킨다. 다른 시스템에서와 같이, 이러한 선별 마커는 발현가능한 구조 유전자이고, 이의 발현된 폴리펩타이드(효소)는 수용체 유기체에 독성인 화합물에 대해 내성을 제공하거나, 이러한 필수 폴리펩타이드가 결여된 돌연변이체의 효소 시스템을 보충한다. 형질전환된 사상성 진균 세포의 선별에 적합한 이같은 마커 유전자는 예를 들면, 공지된 qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS 또는 argB 유전자이다.
유럽 특허원 제0 278 355호에 기술된 pyrA로 명명되는 마커 유전자를 에이.나이거의 게놈 라이브러리로부터 분리하는데, 이는 애이.니둘란스의 pyrG 및 엔 크라사의 pyr4와 관련된 유사한 기능, 즉 효소 오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제를 생산한다. 이 효소는 오로티딘 5'-포스페이트의 우리딜산(우리딘 5'-포스페이트)으로의 탈카복실화 반응. 또한 플루오로-오로틴산의 독성 플루오로-우리딘으로의 탈카복실화 반응을 촉매화한다. 하지만. 오로티딘-5'-포스페이트 데카복실라제를 암호화하는 어떠한 다른 pyr 유전자의 DNA도 사용될 수 있다.이.콜라이BJ5183/pCG59D7(DSM3968)로 명명되는 양성 클론으로부터, pyrA 유전자를 포함하는 플라스미드 pCG59D7을 분리하여 에이.나이거 pyrA-돌연변이체의 공동형질전환에 사용한다. 이러한 pyrA­돌연변이체는 오로티딘 5'-포스페이트 데카복실라제 유전자가 결여되어 상응하는 효소를 생산할 수없다. 이러한 돌연변이체를 돌연변이화UV-조사하에 에이.나이거 N756의 분생자를 처리함으로써 제조하고. 플루오로-오로틴산 및 우리딘 존재하에 생존하는 콜로니를 선별한다. 플루오로오로틴산 존재하 및 우리딘 부재하에 생존하는 콜로니를 제거한다. 잔존하는 우리딘-요구성 돌연변이체는 형질전환할 수 있는 이들의 능력에 따라, 각각 에이.나이거 돌면변이체 An8 및 An10 으로 표시되는 2개의 보체 그룹 pyrA 및 pyrB에 속한다. 이들은 pyr4를 함유하는 플라스키드 pCG59D7(DSM3968)로 형질전환시키는 조건하에 이의 원형질체형태로 처리된다. 에이.나이거 An8 (DSM3917) 콜로니만이 형질전환되어, 이의 분해된 DNA가 pUN121의 DNA와 하이브리드화하는 능력으로 입증되는 바와 같이 pyrA 유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제의 제조방법
본 발명은 또한, 본 발명의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제, 바람직하게는 이의 바람직한 형태를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자 발현에 적합한 조건하에 본 발명의 발현 벡터로 형질진환된 벡터를 배양함을 포함한다. 필요한 경우, 폴리펩타이드를 통상의 방식으로 분리한다. 발현 벡터 작제에 따라, 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제가 생산되거나, 시그날 서열이 존재하는 경우, 생산되어 세포질로부터 배지 또는 기타 세포 구획으로 분비된다.
발현에 대한 선별된 숙주의 적합성 여부는 주로 발현 벡터 작제를 위해 선벌된 조절 서열. 특히 프로모터에 좌우된다.
예를 들면, 아스퍼질러스, 바람직하게는 에이 나이거로 부터 유도된 프로모터 유전자가 본 발명의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자 발현에 사용되는 경우, 아스퍼질러스 균주, 바람직하게는 에이,나이거가 적합한 숙주이다. 하지만, 아스퍼질러스 유전자로부터 유도되지 않는 프로모터를 본 발명의 발현 벡터 작제에 사용하는 경우, 기타 숙주, 즉 이.콜라이 같은 세균 또는 에스.세레비지애 같은 효모가 발현에 적합하다. 본 발명에 따른 폴리펩타이드 제조를 위한 적합한 숙주 및 프로모터는 상기 제시된 형질전환에 적합한 것들이기도 하다.
특히, 본 발명은 형질전환된 아스퍼질러스 숙주가 내인성 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자가 활성인 조건하에서 외인성 아스퍼질러스 아스파르트산 프로테이나제 유전자를 발현시킴으로써, 증가된 유전자 용량으로 인해 천연양의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 보다 많은 양을 발현시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 목적을 위해, 아스퍼질러스 숙주, 특히 에이.나이거를 그의 동질성, 즉 천연적으로 연결된 발현 조절 서열, 특히 프로모터 및 시그날 서열 조절하에 아스퍼질러스- 아스파르트산 프로테이나제 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환시킨다.
특히, 본 발명은 또한 형질전환된 아스퍼질러스 숙주가 상이한 프로모터에 연결되기 때문에 외인성 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자를 외인성 유전자로 보다 상이한 조건하에서 보다 고도의 수준으로 발현하는 방법에 관한 것이다.
외인성 유전자 또는 유전자들의 최대 발현 조건은 선택된 발현 시스템에 따른다. 예를 들면, 에이.나이거의 펙틴 분해효소(PL) 또는 폴리갈락투로나제(PG)유전자의 프로모터가 사용되는 경우, 이에 연결된 아스퍼질러스- 아스파르트산 프로테이나제 유전자의 발현은 펙틴 또는 펙틴 분해 생성물을 배양 배지에 부가함으로써 에이.나이거 세포내에서 유도될 수 있다. 하지만, 충분한 글루코스 존재하에, 에이,나이거 균주(예: An8(DSM3917))가 숙주로 사용되는 경우, 프로모터는 유도될 수 없다. 이것은, 에이.나이거 PL 또는 PG 프로모터 조절하에 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자가 에이.나이거내에서 "이화물 억제"되었음을 의미한다. 하지만, 또다른 아스퍼질러스 균주, 특히 에이.오리제 또는 가장 바람직하게는 에이.니둘란스가 사용되는 경우, 에이.나이거 PL 또는 PG 프로모터 조절하에 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자는 필수적으로, 즉, 펙틴 부재하 및/또는 글루코스 존재하에도 발현된다. 따라서, 예를 들면 유전자 발현중에 펙틴 대신 글루코스가 에너지 및 탄소 공급원으로서 영양 배지에 가해질 수 있기 때문에, 에이.나이거 이외의 아스퍼질러스 숙주, 바람직하게는 에이.오리제 또는 가장 바람직하게는 에이 니둘란스내에서 에이.나이거 PL 또는 PG 프로모터 조절하에 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자를 발현하는 것이 유리할 수 있다.
아스퍼질러스, 바람직하게는 에이.나이거 피루베이트 키나제 프로모터를 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자의 발현을 위해 사용하는 경우, 탄소및 에너지 공급원으로서 글루코스가 함유된 최소 배지가 사용되는 경우 유전자가 발현된다.
본 발명에서, 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 과잉발현시키는 다양한 방법을 적용할 수 있다. 정제된 단일 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제는, 어떠한 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제도 발현할 수 없거나 소량의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 발현하거나, 외인성 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자의 발현에 사용되는 유도 조건하에서는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 발현하지 않는 적합한 숙주로, 바람직하게는 에이 나이거로부터의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 암호화하는 구조 유전자 가장 바람직하게는 서열확인번호 1의 PEPE 또는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 아스파르트산 프로테아제 활성 단편을 암호화하는 구조 유전자를 포함하는 하이브리드 벡터로 형질전환하여, 이러한 구조 유전자를 발현시키는 방법에 의해 제조할 수 있다. 어떠한 다른 아스파르트산 ㅍ로테이나제도 발현할 수 없는 숙주가 사용되는 경우, 각각의 단일 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제가 순수한 형태로 수득될 수 있는데, 이것은 어떠한 다른 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제에 의해서도 오염되지 않았음을 의미한다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제를 발현할 수 없는 숙주는 상응하는 유전자가 없는 유기체이거나, 내인성 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자 발현이 적절하게 조절된 성장배지내에서는 억제된 반면, 목적하는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 구조 유전자와 작동적으로 연결된 외인성 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 프로모터, 예를 들면, 에이,나이거 유도된 프로모터가 이들 조건하 또는 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자가 다른 프로모터에 융합된 경우 활성적인 아스퍼질러스 균주이다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 제조에 적합한 기타 프로모터 및 균주가 본 발명의 발현 벡터에 기술에 대한 상기에 제시되어 있다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 및 이의 용도
본 발명은 또한 순수한 아스퍼질러스 아스파르트산 프로테아제 자체(본원중"아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제"로 언급된)에 관한 것이다. 이러한 프로테아제는, (a) 아스퍼질러스종으로부터 유래되고, (b) 활성부위에서 촉매적 아스파르트산 잔기로 인해 프로테아제 활성을 나타내며, (c) 아스파르트산 프로테이나제 계열로 분류하기 위해 공지의 아스파르트산 프로테아제와 충분한 아미노산 서열 상동성을 갖는 것으로 이해된다. 용어 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제란 또한 아스파르느산 프로테아제 활성을 보유하는 효소의 단편도 포함된다.
본 발명은 바람직하게는, 아스퍼질러스 나이거의 순수한 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제, 바람직하게는 서열확인번호 1에 나열된 서열에 나태낸 아미노산 서열을 갖는 아스파르트산 프로테아제 PEPE 및, 아스파르트산 프로테아제 활성을 보유하는 이의 단편 및 돌연변이체에 관한 것이다.
본 발명은 또한 하나 이상의 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 및/또는 아스파르트산 프로테아제 활성을 갖는 이의 유도체 및/또는 이의 생물학적으로 허용되는 염을 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 이외의 활성을 갖는 하나 이상의 적합한 효소와 임의의 예정된 배합으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제가 결핍된 아스퍼질러스 균주
본 발명은 또한 돌연변이화된 아스퍼질러스 균주, 바람직하게는 내인성 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자가 결핍된 돌연변이화된 에이.나이거 균주에 관한 것이다. 서열확인번호 1에 도시된 pepE 유전자 결핍된 에이.나이거 균주가 바람직하다. 또한 pepE 유전자 결핍되고, pepA, pepB, pepC 또는 pepD와 같은 다른 프로테아제 유전자가 결핍된 에이 나이거 균주가 바람직하다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자에 결함이 있는 본 발명의 돌연변이화된 아스퍼질러스 균주는 본 발명의 바람직한 양태에 있어 유전자 파괴에 의해, 즉, 파손시키고자 하는 내인성 아스퍼질러스 유전자에 상응하는 DNA 서열을 시험관내에서 불완전 유전자로 돌연변이시키고 아스퍼질러스 숙주 세포내로 형질전환시켜 제조할 수 있다. 세포내에서의 동형 재조합 과정으로 인해, 완전한 내인성 유전자는 불완전 외인성 유전자로 대체된다. 통상 외인성 유전자는 마커 유전자를 암호화 영역내로 삽입시켜 파괴된다. 이로써 용이하게 관측되어 상응하는 내인성 유전자가 파괴된 형질전환체 선별에 사용될 수 있는 불완전 유전자를 생성하게 된다. 하지만, 또다른 돌연변이 유발 방법이 돌연변이화된 아스퍼질러스 균주, 바람직하게는 돌연변이화 에이.나이거 균주 제조에 사용될 수 있는데, 이때, 내인성 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자는 작용성 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제가 발현될 수 없는 방식으로 돌연변이화된다.
본 발명의 가장 바람직한 양태에 있어, 에이,나이거 균주는 서열확인번호 1에 도시된 pepE 유전자의 불완전 돌연변이체, 즉 선별 마커 유전자가 삽입된 파손된 pepE 유전자가 본원 실시예에 기술된 플라스미드 pPEPEPYRA내에 포함된 하이브리드 벡터로 형질전환되고, 형질전환체가 선별된다.
불완전 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 유전자를 갖는 본 발명의 돌연변이 아스퍼질러스 균주는 세포내 또는 세포외적으로 이형 또는 동형 단백질을 향상된 수율로 발현시키는데 유용하다.
아스퍼질러스 종에서의 이형 또는 동형 단백질 발현은 통상의 방법에 따라 수득될 수 있다. 통상 발현 벡터는 아스퍼질러스 내에서 작용성인 동형 또는 이형 프로모터와 작동적으로 연결되고 임의로 상기 정의한 바와 같이 아스퍼질러스내에서 작용성인 기타 발현 조절 서열과 함께 포함하도록 작제된다. 경우에 따라, 폴리펩타이드는 통상의 방식으로 분리된다. 발현 벡터의 작제에 따라, 생성물은 숙주 세포에서 생산되거나, 시그날 서열이 존재하는 경우 세포내에서 생산되어 분비된다.
본원의 구조 유전자는, 예를 들면, 바이러스 원핵 세포 또는 진핵 세포로부터 기원하며 mRNA를 통해 제조된 cDNA로부터 또는 게놈 DNA로부터 유도되거나 화학적으로 합성될 수 있는 구조 유전자로서, 특히 고등 진핵 생물. 특히, 포유동물 또는 사람 기원의 글리코실화 폴리펩타이드, 예를 들면, 영양소 제조 및 화학분야의 효소적 반응 수행에 수용될 수 있는 효소를 포함하는 각종 유용한 폴리펩타이드 또는 사람 및 동물 질환의 치료 또는 예방에 유용하고 중요한 폴리펩타이드, 예를 들면, 호르몬, 면역조절성, 향바이러스성 및 항-종양 특성을 지닌 폴리펩타이드. 항체. 바이러스 항원. 백신. 응고인자, 식품 등에 사용되는 폴리펩타이드를 암호화한다.
이러한 구조 유전자의 예로 아스퍼질러스 폴리갈락투로나제를 암호화하는 유전자, 예를 들면 PGI 또는 PGII 또는 아스퍼질러스 펙틴 분해효소(PLI, PLA, PLB, PLC, PLE 및 PLF) 또는 세크레틴, 티모신, 릴렉신, 칼시토닌, 황체화 호르몬, 부갑상선호르몬, 아드레노코르티코트로핀, 멜라닌세포 자극 호르몬, β-리포프로핀, 우로가스트론 또는 인슐린, 성장 인자, 즉 상피 성장인자, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 예를 들면 IGF-I 및 IGF-II, 비만 세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경에서 유래된 신경 세포 성장 인자 또는 형질전환 성장 인자(TGF), 즉 TGFβ , 성장 호르몬, 즉 사람 또는 소 성장 호르몬, 인터루킨, 즉 인터루킨-1 또는 -2, 사람 대식구 이동 억제 인자(MIF), 인터페론(즉 사람 α-인터페론, 예를 들면 인터페론-α4, αB, αD 또는 αF, β-인터페론, γ-인터페론 또는 하이브리드 인터페론, 예를 들면 αA-αD- 또는 αB-αD-하이브리드 인터페론, 특히 하이브리드 인터페론 BDBB), 프로테이나제 억제제, 예를 들면 α1-안티트립신, SLPI 등, 간염 바이러스 항원, 즉 B형 간염 바이러스 표면 또는 핵 항원 또는 A형 간염 바이러스 항원 또는 비A-비B형 간염 항원, 플라스미노겐 활성화제, 즉 조직 플라스미노겐 활성화제 또는 유로키나제, 조직 괴사 인자, 소마토스타틴, 레닌, β-엔돌핀, 면역글로불린, 즉 면역글로불린 D, E 또는 G의 경쇄 및/또는 중쇄, 또는 사람-마우스 하이브리드 면역글로불린, 면역글로불린 결합 인자, 즉 면역글로불린 E 결합 인자, 칼시토닌, 사람 칼시토닌-관련 펩타이드, 혈액 응고 인자, 즉 인자 IX 또는 VIIIc, 에리트로포어틴, 에글린, 즉 에글린 C, 히루딘, 데설페이토히루딘, 즉 데설페이토히루딘 유도체 HV1, HV2 또는 PA, 사람 과산화물 디스뮤타제, 바이러스 티미딘 키나제, β-락타마제, 글루코스 이소머라제를 들 수 있다. 바람직한 유전자는 사람 α-인터페론 또는 하이브리드 인터페론, 특히 하이브리드 인터페론 BDBB, 사람 조직 플라스미노겐 활성자 (t-PA), B형 간염 표면 바이러스 항원(HBVsAg), 인슐린-유사 성장 인자 1및 II, 에글린 C 및 데설페이토히루딘, 즉 변이체 HV1을 암호화하는 유전자이다.
가장 바람직한 양태는 첨부된 실시예에 기술된 것들이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명을 설명하지만, 어떠한 방식으로도 이를 제한하지는 않는다.
약어는 하기 의미를 나타낸다.
ESA 소 혈청알부민
DTT 1,4-디티오트레이톨
EDTA 에틸렌디아민 테트라아세트산 이나트륨염
IPTG 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드
kbp 킬로염기쌍
PEG 폴리에틸렌 글리콜
SDS 나트륨 도데실 설페이트
Tris 트리스 (하이드록시메틸) 아미노메탄
A-gal 5-브로모-4-클로로-3 인돌릴-β-갈락토사이드
완충액. 배지. 시약
SM 100mM NaCl. 8.1mM MgSO4, 50mM 트리스-HCI
pH 7.5 0.01% 젤라틴
LB 1% 트립티카제 펩톤(BBL), 0.5% 효모 추출물(BBL). 1% NaCl 및 0.5mM 트리스-HCl pH 7.5
LM 1% 트립티카제 펩톤(BBL). 0.5% 효모 추출물(BBL), 10mM NaCl 및 10mM MgCl2
SSC 0.15M NaCl, 0.015M 삼나트륨 시트레이트
PSB 10mM 트리스-HCl, pH 7.6, 100mM NaCl, 10mM MgCl2,
TE 10mM 트리스-HCl pH 8.0, 0.1mM EDTA pH 8.0
최소 배지 1ℓ 딩 1.5g KH2PO4, 0.5g KCl, 0.5g MgSO4·7H2O, 0.9mg ZnSO4· 7H2O. 0.2mg MnCl2·4H2O, 0.06mg CoCl2·6H2O, 0.06mg CuSO4·5H2O,0.29mg CaCl2· 62H20. 0.2mg FeSO4· 7H2O, 명세서중 언급된 질소 또는 탄소 공급원. 또는 구체적으로 명시되지 않은 경우 1 ℓ당 6g NaNO3및 10g 글루코즈를 함유하고, NaOH로 pH 6.0으로 조절됨.
완전 배지 1ℓ 당 6g NaNO3및 10g 글루코즈를 함유하는 최소 배지 + 1 ℓ 당 2g 드립티카제 펩톤(BBL), 1g 카사미노산(Difco), 1g 효모 추출물 (BBL), 0.5g 효모로부터의 리보핵산 나트륨염(ICN, Cleveland, PSA). 2ml 비타민 용액 함유, NaOH로 pH 6.0으로 조절
비타민 용액 100ml 당 10mg 티아민, 100mg 리보플라빈. 10mg 판토텐산, 2mg 비오틴, 10mg p-아미노벤조산, 100mg 니코틴아미드 50mg 피리독신 -HCl
TEE 1 ℓ 당 4ml의 0.5M EDTA pH 8.0 용액. 10.8g 트리스 및 5.5g H3BO3를 함유
페놀 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 1982(p438)]에서와 같이 처리된 페놀
샘플 완충액 10%(v/v) 글리세롤, 100mM EDTA pH 8.0 및 0.01% 브로모페놀 블루RN아제 A 문헌[Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory 1982(P451)]에서와 같이 처리된 RN아제 A
하기 균주 및 벡터를 사용:
에이.나이거 N400 야생형
에이.나이거An8 EP-A-0 278 355에 기술되어 있고 DSM 3917호로 기탁되어 있는 펙티나제
고생성 균주 에이.나이거 N756의 우리딘 영양요구 돌연변이체
EMBL4 EMBL4는 9 내지 23kbp의 클로닝 능력을 지닌 λ치환 벡터이다 (참조: Frischauf et al., J. Mol. Biol, 170:827-842, 1983), 이것은 암과 필수적이지 않은 스터괴(stuffer) 영역 사이에 다수의 클로닝 영역을 함유한다. 이것은 문제의 외부 DNA가 삽입됨에 따라 벡터 암에 대한 스퍼터의 복제가 감소되는 방식으로 다중 제한 효소 분해가 수행되도록 한다. 이 벡터는 또한 Spi 표현형을 사용하여 재조합체에 대한 직접적인 선별이 이루어지도록 한다[참조: Zissler et al., in: A.D. Hershey(ed.) The Bacteriophage lambda, Cold Spring Harbour Laboratory, 1971] .
실시예에서는 일련의 올리고뉴클레오티드를 PCR 기술에 사용한다. 하기는 올리고의 간단한 특성이다. 이 서열들은 서열 목록에서 보여진다.
올리고뉴클레오티드 1: pKi 프로모터내 BamHI 부위 바로 앞에 개시되도록 고안.
올리고뉴클레오티드 2: 피루베이트 키나제의 ATG 바로 앞에 PstI 부위가 삽입되도록 고안.
올리고뉴클레오티드 3: pepE의 ATG 바로 앞에 PstI 부위가 삽입되도록 고안.
올리고뉴클레오티드 4: pepE의 정지 코돈 바로 뒤에 XhoI 부위가 삽입되도록 고안.
올리고뉴클레오티드 5: 피루베이트 키나제의 정지 코돈 바로 뒤에 SalI 부위가 삽입되도록 고안.
올리고뉴클레오티드 6: 피루베이트 키나제 종결자의 말단부에 BamHI 부위가 들어오도록 고안.
올리고뉴클레오티드 7: pepE내에서 첫번째 인트론이 루프(loop)를 형성하도록 고안.
올리고뉴클레오히프 8: pepE내에서 두번째 인트론이 루프를 형성하도록 고안.
올리고뉴클레오티드 9: pepE내에서 세번째 인트론이 루프를 형성 하도록 고안.
올리고뉴클레오티드 A: pepE RNA로부터 연속적인 전사과정이 개시되도록 고안.
올리고뉴클레오티드 B: pepE의 첫번째 및 세번째 엑손 일부 및 모든 두번쌔 엑손 부위를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로서 고안.
올리고뉴클레오티드 C: pepE RNA로부터 cDNA 합성을 개시하고 pepE의 첫 번째 및 세번째 엑손 일부 및 모든 두번째 엑손 부위를 증폭시키기 위해 고안.
올리고뉴클레오티드 D: pepE의 세번째 및 네번째 엑손 일부를 증폭시키기 위한 PCR 프라이머로서 고안.
올리고뉴클레오티드 E: pepE RNA로부터 cDNA 합성을 개시하고 pepE의 세 번째 및 네번째 엑손 일부를 증폭시키도록 고안.
실시예 1
아스퍼질러스 나이거의 게놈성 라이브러리의 작제
실시예 1.1
에어.나이거 N400으로부터의 고분자량 DNA의 분리
아스퍼질러스 나이거 균주 N400의 분생자를 200ml의 최소 배지에 최종 포자 밀도가 106포자/ml가 되도록 접종하고 11번 삼각 플라스크내에서 24시간 동안 28℃ 및 280rpm으로 진탕시킨다. 균사체를 브흐너 깔대기(Buchner funnel)상에서 미라클로쓰(Myracloth)를 통해 여과시켜 수거하고, 냉멸균 염수로 세척하며, 액채 질소 내에서 동결시키고 -60℃에 저장하거나 직접 사용한다. 게놈성 라이브러리를 제조하기 위해 DNA 분리용으로 사용된 방법은 엘톤 등(Yelton)이 기술한 방법[참조:Proe. Natl. Acad. Sci. USA 81. 1470-1474(1984)]에 기준한다.
라이브러리를 작제하기 위하여, 10g의 균사체를 브라운 마이크로-디스 멘브레이터(Baraun micro-dismembrator)내 1g 분량씩 액체 질소내에서 분쇄한다. 분쇄된 균사체를 추출 완충액(50mM EDTA pH8.5, 0.2% SDS) 200ml 및 디에틸피로카보네이트 200㎕를 함유하는, 멸균된 11번 삼각 플라스크에 이동시킨다. 이 혼합물을 실온으로 서서히 가온한 후, 이따금 진탕시키면서 68℃로 20분간 가열한다. 현탁액을 실온으로 냉각시키고 12,000xg에서 15분간 원심분리한다. 8M 아세트산 칼륨 용액(pH4.2)의 1/16 용량을 상등액에 가하고 이 혼합물을 빙상에 1시간동안 둔다. 침전물은 원심분리(20분; 16,000xg; 4℃)로 제거한다. 이소프로판올 0.6용적을 빙상에서 15분간 항온처리하여 상등액으로부터 핵산을 침전시킨다. 침전된 핵산을 원심분리(10분: 6,000xg; 4℃)로 수집하고, 70% 에탄올로 세척하여 간단히 건조시킨다. 펫렛을 20㎍/ml RNAse A (Boehringer, Mannheim)를 함유하는 TE 10ml에 현탁시키고 37℃에서 15분간 항온처리한다. 이 DNA를 뉴클레아제 비함유 프로나제(최종 농도 1mg/ml)(제조원. kochlighe. Coinbrook)로 37℃에서 1시간 동안 처리한다.
CsCl 8.5g을 수득된 DNA 용액 9ml에 용해시키고, 10mg/ml 에티듐 브로마이드 0.2ml를 가하며 이 용액을 Beckman Sw41 로터에서 33,000rpm으로 60시간동안 또는 Beckman 50 Ti 로터에서 45,000rpm으로 40시간동안 원심분리시킨다. DNA 밴드를 수집하고 에티듐 브로마이드를 수중 NaCl 포화용액으로 평형시킨 이소프로 판올로 중복 추출함으로써 제거한다. 5용적의 TE를 가하고 DNA 용액을 TE 포화된 페놀 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 25:24:1 및 클로로포름/이소아밀알콜 24:1로 연속해서 처리한다. 3M 아세트산나트륨(pH 5.2) 0.1용적. 에탄올 2.5용적을 가하여 -20℃에서 밤새 항온처리함으로써 DNA를 침전시킨다. 침전물을 원심분리(1시간. 30,000xg: 4℃)로 수정하고 70% 에탄올로 세척하며, 건조하여 TE 400㎕에 용해시킨다.
실시예 1.2
Mbol를 사용한 에이.나이거 N400 DNA의 부분 분해 및 단편의 분리
13.6 내지 23kbp 사이의 거대량의 DNA 단편을 제공하는 Mbol 농도를 시험하기 위해, 에이.나이거 N400 DNA 1㎍ 분량을 공급자가 추천한 적절한 완충액에서 Mbol의 양을 감소시키면서 (0.5 내지 0.001U) 1시간동안 37℃로 10μ 1의 용량으로 분해한다. 이 반응을 0.25M EDTA 1㎕를 가하여 정지시키고, 샘플을 1㎍/ml 에티듐 브로마이드를 함유하는, TBE 완충액 중 0.6% 아가로즈 겔상에 부하시킨다. 목적하는 13.6 내지 23kbp 단편을 고수율로 수득하는데 요구되는 Mbol 농도는 약0.02U/㎍ DNA이다. 따라서, 총 2ml의 용적중 DNA 200㎍이 분해된다. 37℃에서 1시간후 EDTA를 최종 농도가 25mM이 되도록 가하고, 효소를 65℃에서 10분간 열-불활성화시켜 DNA를 침전시키고, 세척하여 건조시키고, TE 400㎕에 용해시킨다. 단편화된 DNA를 0.4% 예비 아가로즈 겔에서 4℃ 및 40V(3V/cm)으로 분리시킨다. 정확한 크기의 단편을 겔로부터 잘라내어 이 DNA를 2ml TBE중 멸균 투석 튜브내에서 2 내지 3시간동안 100V로 겔로부터 전기용출시킨다. 전류를 30초 동안 역류시키고 DNA를 함유하는 완충액을 수집한다. 이어서, 단편을 에탄올 침전으로 농축시키고 TE 100㎕에 용해시킨다.
실시예 1.3
벡터 DNA의 제조
에이.나이거 균주 N400의 게놈성 라이브러리를 λ벡터 EMBL4에서 작제한다. 클로닝 용량이 9 내지 23kbp인 벡터는 프리쉬하프(Frischauf)등[참조: J. Mol. Biol. 170: 827-842(1983)] 및 칸(karn)등[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:5172-76(1980)]이 기술하였으며 Promega Biotechnolugy Inc. 로부터 구입할 수 있다. 하나의 파아지로 클론된 게놈의 상이한 부위로부터 기원하는 2개의 삽입체를 방지하기 위해, 13.6kbp의 최소 단편 길이를 클로닝에 사용한다.
λEMBL4 DNA 10㎍을 분해하여 100㎕ 용적중 입자가 추천한 완충액내 BamHI 50 단위를 37℃에서 2시간동안 사용하여 완료시킨다. 효소를 65℃에서 10분동안 불활성화시킨다. Nacl 농도를 150mM로 상승시키고 SalI 50 단위를 가하고 37℃에서 추가 2시간동안 연속 항온처리시킨다. EDTA를 25mM이 되도록 가한 후, 10분동안 65℃에서 가열함으로써 효소를 불활성화시킨다. 용액을 동일한 용량의 페놀(TE포화됨). 페놀/클로로포름/이소아밀 알콜 25:24:1, 및 클로로포름/이소아밀알콜(24:1)로 추출한다. 작은 BamHI/SalI 폴리링커 단편을 제거하기 위해, 3M 아세트산 나트륨(pH 5.2) 0.1 용량 첨가후 이소프로판올 0.6용량으로 DNA를 침전시킨다. 빙상에서 15분 및 12,000xg, 4℃에서 15분간 원심분리후, 침전물을 70% 에탄올로 완전히 세척, 건조하여 40㎕ TE에 용해시킨다.
실시예 1.4:
게놈성 에이.나이거 N400 DNA 단편의 연결 및 시험관내 패키징(packaging)
실시예 2.3에 따라서 제조한 벡터의 cos 부위를 연결 반응 전에 어닐화함은필수적이다. 100mM 트리스0HCI(pH 7.5)및 10mM MgCl2중의 벡터를 10분간 65℃ 에서 가령한 후 1시간동안 42℃에서 어닐링시킨다. 시험 연결물로부터 단편에 대한 벡터의 비가 약 1:1(중량단위)일 때 재조합체가 가장 많이 수득됨이 밝혀졌다. 벡터 9.5㎍ 및 DNA 단편 10㎍을 총 용적 100㎕ 중에 사용하여 50mM 트리스 HCl(pH 7.5) 10mM MgCl2. 10mM DTT 및 1mM ATP에서 연결시킨다. DNA 리가제(BRL)를 DNA 0.50/㎍의 농도로 가하고 연결 혼합물을 14℃에서 밤새 항온처리한다. 연결 여부를 시험하기 위해 연결된 DNA 샘플을 아가로즈 겔상에 전개시킨다. 또한 대조군으로서 벡터 5㎍을 5㎕ 용략으로 단편을 가하지 않으면서 연결시킨다.
연결 혼합물을 에탄올 침전으로 농축시키고 시험관내 패키징 전에 20㎕ TE에 용해시킨다. 시험관내 패키징은 1㎍의 DNA를 패키징하기 위해 10㎕ 부분을 사용하는 업자의 지침에 따라 프로메가 패키진 추출물(Promega Packagene extracts)을 사용하여 수행된다. 추출물과 함께 제공된 고분자량의 대조군 파아지 λc1857 Sam7 1㎍을 대조군으로서 별도로 패키징한다. 패키징후, 파아지 용액 완충액(PSB) 500㎕ 및 클로로포름 5㎕를 가한다. 재조합체 파아지 스톡을 4℃에서 저장할 수 있다.
실시예 1.5
에이.나이거 N400 게놈성 라이브러리의 검정 및 증폭
이.콜라이 NM539의 세포를 0.2% 말토즈, 10mM MgSO4및 1mM CaCl2가 함유된 LB 배지상에서 흡광도(600nm) 1.0까지 생육시키고 이 배양물 0.2ml 분취량을 PSB중적절한 파아지 희석액 0.1ml에 가한다. 37℃에서 20분동안 파아지를 흡착시킨후, 45℃에서 0.6% LB 탑-아가 3ml를 가하고, 이 혼합물을 LB 아가 플레이트상에 플레이팅시키고 37℃에서 밤새 항온처리한다. 파아지 현탁액 1ml당 플라크 형성 단위(pfu)의 수는 실시예 1.4에 따라 제조된 2개의 파아지 스톡에 대해 12×105및4.2×105pfu/ml이다. 단편이 없이 대조군 연결체로부터 계산되는 배경( 각각 17%및 40%)을 감한 후의 재조합체의 절대수는 6×105이다. 재조합체에 함유된 DNA는 200개 이상의 아스퍼질러스 나이거 게놈에 상응한다.
라이브러리를 증폭시키기 위해, 2개의 파아지 스톡으 80㎕ 분취량을 LB 아가 플레이트상의 LB 탑-아가로즈내에 플레이팅한 후, 37℃에서 밤새 항온처리시킨 이.콜라이 NM 539 세포를 감염시키는데 사용한다. 플레이트당 5ml의 PSB와 플레이트를 1시간동안 실온에서 온화하게 진탕시킴으로써 파아지를 아가로즈로부터 용출시킨다. PSB를 수집.원심분리 (6000xg에서 10분)하여 세균을 제거하고 클로로포름을 가한다 (0.5% 최종 농도) 이어서, 동일한 정도로 적절하게 증폭시킨 파이지 스톡을 둘 다 혼합(40㎕ 스톡)시키고, 적정(8×109pfu/ml)하여 4℃에서 저장한다.
실시예 2:
엔.크라사 pep4 프로브의 제조
실시예 2.1:
엔.크라사 프로브의 제조
플라스미드 pNCPEP4는 엔.크라사 pep4 유전자를 암호화하는, 엔.크라스 DNA의 3.8kb 단편을 함유한다. 암호화 영역 일부를 SalI으로 편리하게 절단할 수 있다. 이후 플라스미드 pNCPEP4를 SalI으로 분해하고 단편을 1.2% 아가로즈 겔상에서 분리한다. 0.6kb 단편을 절단하여 DNA를 전기용출한다. 이 단편 100ng을 표지된 뉴클레오티드로서32P-dATP를 사용하여 닉 해독시키고 즉시 서던 분석 또는 플라크 변위 프로브화에 사용한다.
실시예 2.2:
에이.나이거 DNA의 서던 분석
상술한 바와 같이 제조한, 에이.나이거 DNA 2㎍ 분취량을 BamHI 또는 HindIII로 분해하여 0.8% 아가로즈 겔상에서 분리한다. 염색된 겔의 사진을 에티듐 브로마이드로 찍은후 DNA를 모세관 블롯팅[참조: Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98: 503-517(1975)]으로서 니트로셀룰로즈 여과기로 옮기고 표지된 효모 PRB프로브를 사용하여 실시예 3에서 기술한 바와 같이 하이브리드화한다. 분해물을 둘 다 함유하는 니트로 셀룰로즈의 각각의 스트립을 다양한 세척법에 적용시켜 노이즈에 대해 가장 강력한 시그날 비를 수득하는 조건을 측정한다. 본 발명자들은 실온에서 30분동안 2XSSC에서 1회 세척한 후, 56℃에서 2XSSC에서 30분간 2회 세척하는 것이 가장 우수한 결과를 가져옴을 알았다.
실시예 3:
엔.크라사 pep4 프로브를 사용한 에이.나이거 N400의 스크리닝
상숭한(실시예 1) 아스퍼질러스 나이거 균주 N400의 게놈성 라이브러리 일부를 SM에 희석시키고 각각 약 2000pfu를 함유하는 0.1ml 분량을 플레이팅한다. 숙주 세포를 0.2% 말토즈로 보충된 LB-배지 50ml를 LB-배지중 이.콜라이 NM539의 밤새 배양물 0.5ml와 함께 접종시키고, 37℃, 250rpm에서 4시간 동안 진탕시킨 후, 1M MgSO4, 0.5ml 및 0.5 CaCl2· 0.5ml를 가하여 제조한다. 이 세포의 0.2ml 분취량을 각각 파아지 현탁액 0.1ml 분획과 혼합하고 실온에서 1시간 30분 동안 항온처리한다. 이어서, 47℃에서 LM-배지중 0.7% 아가로즈 3ml를 가하고, 약하게 볼텍싱한 후, 즉시 LM 아가 플레이트 상에 플레이팅시킨다. 이 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리시키고 4℃에서 2시간동안 급냉시킨다.
각각의 플레이트로부터 벤톤 및 데이비스 플라크 하이브리드화법[참조: Benton. W.D. 및 Davis. R.W., Science 196: 180-182 (1977)]에 따라 2개의 레플리카를 제조한다. 제1 필터(Schleicher 및 Schuell Ba85)를 1분간 플레이트의 상단에 두고, 제2의 레플리카는 2분간 두며 레플리카의 위치는 인디아 잉크를 사용하여 표시한다. 필터를 제거한 후, 이를 변성 용액(1M, Nacl, 0.5M NaOH) 100ml를 함유하는 디쉬내에 0.5분간 둔 후, 중화 용액(0.5M 트리스-HCL pH 7.5 1.5M NaCl)100ml에 1분간 둔다. 여과기를 3xSSC를 함유하는 디쉬로 이동시키고 장갑을 낀 손으로 부드럽게 문질러서 세균 파괴물을 제거하고 3xSSC로 세척한다. 필터를 블롯팅하고, 실온에서 10분간 건조시키며 오븐내 와트만 3MM 페이퍼상에서 80℃로 2시간동안 굽는다.
구운 필터를 3xSSC에서 습윤시키고, 이 용액으로 실온에서 1시간동안 세척한 후, 예열(56℃)시킨 예비하이브리드화 혼합물 [6xSSC, 10x Denhardt's (0.2% BSA. Boehringer fraction V: 0.2% Ficoll 400, Pharmacia; 0.2% 폴리비닐피롤리돈-10.Sigma). 0.1% SDS 및 0.1mg/ml 전단 및 새로이 변성시킨 청어 정자 DNA]를 250㎖함유하는 디쉬에 옮긴다. 진탕용 수욕에서 56℃로 1시간동안 예비하이브리드화한 후, 필터를 예열 (56℃)시키고 청어 정자 DNA가 없는 예비하이브리드화 혼합물 250ml에서 30분간 1회 세척한다. 이후 필터를 예온(56℃)된 하이브리드화 혼합물 150ml를 함유하는 디쉬에 이동시키고 여기에 이미 표지시킨 프로브를 새로이 가한다.
65℃에서 14시간동안 하이브리드화한 후, 필터를 250ml에서 1회 세척한 다음, 실온에서 세척하고 56℃에서 SSC 250ml에서 각각 30분간 2회 세척한다. 필터를 건조시키고 강화 스크린(intersitying screen)을 사용하는, 코닥 XAR5 필름에 1 내지 3일간 -70℃에서 노출시킨다.
이러한 방법으로 3개의 양성 시그날을 선별된 3개의 플레이트로부터 수득한다. 양성 플라크는 잉크 마커를 사용하는 오토라디오그램(autoradiogram)상에 플레이트를 조심스럽게 위치시킴으로써 멸균 파스퇴르 피펫으로 펀치하여 위치를 표시한다. 양성 플라크를 함유하는 아가 조각을 SM 1ml에 가하고 클로로포름 2.5㎕를 가한다. 때때로 볼텍싱하면서 파아지를 실온에서 1시간동안 아가로부터 확산시킨다음, 4℃에서 밤새 항온처리한다. 아가 및 세포 파편을 5분간 원심분리로써 제거하고, 클로로포름 2.5㎕를 가하고 파아지 스톡을 4℃에서 저장한다.
양성 클론을 λ1, λ2, λ4로 명명한다. 파아지가 고밀도로 플레이팅되므로, 양성 플라크를 저밀도로 플레이팅하고 레플리카 플레이팅, 하이브리드화 및 양성 플라크 피킹의 전 과정을 반복하여 3회 정제한다.
실시예 4: λ클론의 특징화
실시예 4.1 : λDNA의 분리
재조합체 클론으로부터 DNA를 분리시키기 위하여, 우선 파아지를 증폭시킨다. 이러한 목적을 위해 이.콜라이 LE392 숙주 세포를 10mM MgSO4및 0.2% 말토즈로 보충한 LB-배지 중에서 1.0의 흡광도(600nm)로 성장시킨다. 이후, 정제된 파아지 스톡 50㎕를 상술한 바와 같이 별도로 플레이팅한다. 37℃ 에서 밤새 항온처리한 후, SM 5ml를 플레이트상에 도말하여 약하게 진탕하면서 2시간동안 항온처리함으로써 비합치성 플레이트로부터 파아지를 용출시킨다. 용출된 파아지를 수거하고 클로로포름 0.1ml를 가한다. 이 혼합물을 약하게 볼텍싱하고 세포 파괴물은 원심 분리로 제거한다. 상등액을 회수하고, 클로로포름을 0.3%가 되도록 가하고 수득되는 플레이트 분해물은 4℃에서 저장한다.
파아지 DNA 분리용 출발물질로서 거의 합치성인 플레이트를 수득하기 위하여, 플레이트 분해물 10ml 분획을 이.콜라이 LE392 숙주 세포를 플레이팅한다. 37℃에서 밤새 항온처리한 후, 아가로즈 상부층을 3개의 거의 합치성인 플레이트로 부터 긁어낸다. 이들 층을 합하고, SM 20ml 및 클로로포름 0.4ml를 가하고 수득되는 혼합물을 37℃에서 30분간 진탕시킨다. 세포 파편 및 아가로즈를 원심분리로 제거하고 상등액을 회수하여 이의 용적을 SM으로 18ml로 조정한다. SM중 동량의 2M Nacl, 20% PEG6000(BDH, Poole, GB)을 가하고 용액을 혼합하여 빙상에 둔다. 75분후 파아지를 20분동안 1200xg에서 4℃로 원심분리하여 펠렛화한다. 상층액을 따라내고 잔류액을 크리넥스 티슈로 제거한다. 펠렛을 SM 3ml에 재현탁시키고 계속해서 클로로포름 3ml로 추출한다. 수성상을 RN아제 A(67 ㎍/ml) 및 DN아제 I(33㎍/ml)로 20분 동안 37℃에서 처리한다. 이후 페놀 2ml를 가하고, 볼텍싱하며, 클로로포름 1ml를 가하고 다시 볼텍싱하며 2개의 상을 원심분리로써 분리하여 혼합물을 추출한다. 수성상을 페놀/클로로 포름(1:1) 3ml 및 클로로포름 3ml로 각각 2회 이상 추출한다. 다음 3M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.2) 0.3ml 및 에탄올 6ml를 연속하여 가함으로써 DNA를 수성상으로부터 침전시킨다. 이 혼합물을 4℃에서 16시간동안 정치시킨 후, DNA를 원심분리(10분, 12000xg, 4℃)로 회수한다. 펠렛을 TE 완충액 0.4ml에 용해시키고, RN아제 A를 200㎍/ml로 가하고, 37℃에서 1시간동안 항온처리한다. 3M 아세트산나트륨 완충액(pH 5.2) 38㎕ 및 에탄올 0.8ml을 4℃에서 1시간동안 가함으로써 DNA를 침전시킨다. 원심분리로 DNA를 회수하고 연속해서 TE 100㎕에 용해시킨다.
실시예 4.2: 에이.나이거 N400 pepE 클론의 제한 분석
제한 분석에 의해 3개의 모든 파아지가 에이.나이거 게놈의 동일 영역으로 부터 기원한 삽입체를 함유하고 λ1의 부분적인 제한지도가 작제됨이 입증된다.
파아지 DNA 2㎍을 업자(BRL)가 추천한 완충액중 37℃에서 1시간동안 20㎕용량중 BamHI 20단위로 분해한 후 65℃에서 10분간 가열한다. 이 샘플을 0.7% 아가로즈 겔에서 전개시킨 후 사진을 찍는다. DNA를 니트로셀룰로즈 막에 이동시켜 표지된 엔.크라사 pep4 프로브로 하이브리드화한다. 이들 분해물로부터 3개의 모든 파아지가 동일하며 5.8kb 단편이 pep4 프로브에 하이브리드화되고 이로써 모든 상응하는 에이.나이거 유전자가 존재하지 않을 경우 대부분을 함유하는 유일한 단편임이 분명해진다. 3개의 동일한 파아지중 하나를 λ1으로 명명하고 추가 실험용으로 선택한다.
실시예 5: 플라스미드로의 PEPE의 클로닝 및 이의 서열화 및 특성화
실시예 5.1 : pPEPE의 작제
λ1DNA를 특히 상술한 바와 같이 제한효소 BamHI으로 항온처리한다. 클로로포름으로 추출한 후, DNA를 침전시키고, 원심분리로 펠렛화하며, 샘플 완충액에 용해시키고 1xTBE 완층액 중 0.6% 아가로즈 겔에서 전기영동시킨다. 5.8kbp BamHI 단편을 함유하는 겔 조각을 회수하고 DNA를 전기용출시킨다. 이어서, 이를 클로로포름 100㎕로 추출하고 에탄올 침전시키며 TE 완충액 40ml에 재용해시킨다. DNA농도를 아가로즈 겔 전기영동으로 측정한 후, UV광하에 밴드를 가시화한다.
업자(BRL)가 추천한 조건하에, BamHI으로 분해함으로서 pTZ18R 벡터를 제조한다. DNA를 페놀. 페놀/클로로포름(1:1) 및 클로로포름으로 추출하고 DNA를 에탄올 침전시킨다.
상기 단편 각각 100ng을 BRL이 추천한 완충액 및 ATP(1mM0, 1.5U의 T4 DNA 리가제(BRL)를 함유하는 반응 용적 25㎕에서 함께 연결시킨다. 이 반응 혼합물을 16℃에서 16시간동안 항온처리한 후, 이.콜라이 DH5 F'을 형질전환 시키는데 사용한다. 세포를 25㎍/ml 암피실린, 0.005% Xgal, 0.05mM IPTG를 함유하는 LB 아가플레이트상에 플레이팅시키고 37℃에서 밤새 항온처리한다.
몇개의 단일 백색 콜로니를 사용하여, 0.1% 글루코즈 및 25mg/ml 암피실린으로 보충된 LB 배지에서 밤새 배양물을 제조한다. 이 배양물은 홀메스 및 퀴글리의 미니프레프법(miniprep method) [참조: Holmes. D.S. 및 Quigley. M., Anal. Biochem. 114: 193(1981)]을 사용하여 플라스미드를 분리하는데 사용한다. 플라스미드를 입자(BRL)의 지침에 따라 RN아제 A(0.5mg/ml)의 존재하에 몇 개의 제한 효소로 분해하고, 생성물을 아가로즈 겔상에서 분석한다. 예상되는 크기의 BamHI 단편을 나타내는 플라스미드를 선별하고 이들을 지닌 이.콜라이 세포를 -20℃ 에서 클리세롤상에 유지시킨다. 이 플라스미드를 pPEPE(DSM에 기탁)로 명명한다.
실시예 5.2 : pepE의 뉴클레오티드 서열
pepE 아클론인, pTZ18R 벡터내의 5.8kbp BamHI 단편을 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 시쿼나제(United states Biochemical Corp.)를 사용하는 디데옥시-쇄 종결법(참조: Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-67(1977))으로 부분 서열분석한다.
완전한 뉴클레오티드 서열은 서열 목록에 제시되어 있다. 개방 판독프레임을 다른 공지된 아스파르트산 프로테아제와 비교함으로써 동정하고 이를 전사 매핑으로 확인한다.
실시예 5.3 : PEPE의 RNA 매핑
프레더릭 및 킨세이[참조: Frederick 및 kinsey. Curr. Genet. 18: 53-58(1990)]법에 의해 탄소원으로서 글루코즈를 질소원으로서 암모니아를 함유한 최소 배지에서 성장시킨 분쇄 동결 건조된 균사로부터 총 RNA를 제조한다. mRNA 의 5'-말단은 전체 RNA를32P 말단표시된 올리고뉴클레오티드 A (서열확인번호12)와 하이브리드시키고 역전사효소에 의해 생성된 최종 전사 생성물을 동일한 올리고뉴클레오티드를 디데옥시 서열화시켜 제조한 서열반응물과 비교함으로서 크기를 재어 동정해낸다[참조: Mamiatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual Cold Spring Harnbor Laboratory, Dold Spring Harbor, NY, 1982). pepE 메세지의 부분적인 cDNA 복제물을 클로닝하고 서열분석함으로써 인트론의 정확한 스플라이스 부위를 동정한다. 제1 쇄합성은 프라이밍 올리고뉴클에오티드가 올리고뉴클레오티드C(서열확인 번호 14)이거나 올리고뉴클레오티드 E(서열확인번호 16)인 것을 제외하고는 표준방법(참조: Maniatis et al., op.cit.)으로 수행된다. 이들 cDNA를 pTZ18R로 클론된 올리고뉴클레티드 B(서열확인번호 13) 및 C 또는 올리고뉴클레오티드 D(서열확인번호 15) 및 E를 사용하는 PCR에 적용시킨다. 각각의 2개의 독립된 클론의 쇄 모두를 완전히 서열 분석한다. pepE 유전자에 의해 생성된 mRNA의 전체 길이는 프로브로서 2.8kb BamaHI-BglII 단편을 사용하는 노던 분석으로 측정되고(참조: Maniatis et al., 상기 참조)개방 판독 프레임의 크기에서 예견되는 크기 및 전사 출발 부위의 위치에 상응하는 1.3 및 1.5kb 사이에서 측정된다.
실시예 6: PEPE의 게놈성 파괴
실시예 6.1: pTZ18REE의 작제
pTZ18R을 독특한 HindIII 부위에서 절단하고, 이를 T4 폴리머라제로 채우며, 5'GGAATTCC의 서열을 지닌 과량의 포스포릴화되지 않은 EcoRI 링커 존재하에 연결시킨다. 이.콜라이로의 형질전환시, 각각의 폴리링커 서열 말단에서 2개의 EcoRI 부위를 지니는 플라스미드 pTZ18REE가 생성된다. 정확한 플라스미드를 서열분석으로 동정한다.
실시예 6.2: pPEPEPTRA의 작제
pyrA 유전자를 함유하는 4kb XbaI 단편을 pAXI로부터 절제하여 벡터 서열로부터 정제한다. 이 단편을 T4 폴리머라제로 처리하여 점성 말단을 채우고, 페놀 추출 및 에탄올 침전시킨다.
pPEPE를 EcoRI으로 절단하고. 박테리아성인 알칼리성 포스파타제로 탈포스포릴화시킨 후, T4 폴리머라제로 처리하여 5'오버행을 채운 다음, BamHI으로 절단한다. 이 단편을 아가로즈 겔에서 분리시키고 3.4kb EcoRI(평활)-BamHI 단편을 정제시킨다.
pPEPE를 HindIII로 절단하고. 박테리아성인 알칼리성 포스파타제로 탈포스포릴화시키고, T4 폴리머라제로 처리하여 5' 오버행을 채운 다음, BamHI으로 절단한다. 이 단편을 아가로즈 겔에서 분리시키고 1.4kb HindIII(평활)-BamHI 단편을 정체시킨다.
pTZ18R을 BamHI으로 절단하고 박테리아성인 알칼리성 포스파타제로 탈포스포릴화시킨다.
4개의 상기 단편을 함께 연결시킨다. 이.콜라이를 형질전환시킨 후, 정확한 플라스미드를 지닌 콜로니를 미니-플라스미드 제제의 제한 분해로 동정한다.
pPEPEPYRA는 PEPE 유전자를 수반하는 EcoRI 단편을 함유하는 pTZ18R 벡터로 이루어지며, 이는 중심의 EcoRI-HindIII 및 EcoRI-EcoRI 단편을 지니고, 오로티딘 모노포스페이트 데카복실라제를 암호화하는 XbaI DNA로 치환된, 성숙한 프로테아제 개방 판독 프레임의 대부분을 포함한다.
실시예 6.4: 에이.나이거의 형질전환
플라스미드 pPEPEPYRA 10㎍을 EcoRI으로 완전히 분해시킨다. 분해물의 완전성을 겔상에서 분취량을 전개시켜 점검하고 나머지 DNA를 페놀 추출, 에탄올 침전시킨 후, 멸균수 20㎕에 재현탁시킨다.
영양요구성 에이.나이거 An8(DSM 3917)의 분생 포자를 충분히 포자를 형성할 때까지 완전배지에서 28℃로 4일간 성장시킨다. 2x108분생 포자를 사용하여 1g/1아르기닌 및 우리딘으로 보충한 최소배지 200ml에 접종시킨다.
28℃에서 180rpm으로 20시간 생육시킨 후, 미라클로쓰를 통해 여과시켜 균사를 수거하고, 0.8M KCl, 50mM CaCl210ml로 2회 세척하고 0.8M KCl, 50mM CaCl2, 0.5mg/ml Novozym 234(제조원: Novo Industries) 20ml에 재현탁시킨다. 혼합물을 충분한 원형질체가 방출될 때까지(90 내지 120분후 현미경으로 검경) 진탕수욕(shaking waterbath, 30℃, 50rpm)에서 항온처리시킨다. 원형질체 현탁액을 깔대기내 유리 솜 플러그(glass wool plug)를 통해 여과시켜 균사 파편을 제거한다. 원형질체를 실온에서 약한 원심분리(10분, 2000rpm)로 펠렛화시키고 0.8M KCl, 50mM CaCl210ml로 2회 세척한다. 최종적으로, 원형질체를 0.8M KCl, 50mM CaCl2200 내지 500㎕에 재현탁시켜 1ml당 1x108스페로플라스트의 농도를 수득한다.
형질전환을 위해 원형질체 현탁액 200㎕ 분취량을 EcoRI로 분해시킨 pPEPEPYRA 50㎕ PCT(10mM 트리스-HCl, pH7.5, 50mM CaCl2, 25% PEG 6000) 5㎍과 함께 항온처리시킨다. 항온처리 혼합물을 빙상에 20분동안 유지시키고, 또 다른 PCT 2ml를 가하고 상기 혼합물을 실온에서 추가로 5분간 항온처리시킨다. 0.8M KCl4ml, 50mM CaCl2를 가하고 최종 형질전환 용액 1ml 분취량을 최소 아가 액체 배지[최소 배지+ 1g/1 아르기닌+10g/1 빅토-아가(제조원: Difco)]와 혼합시키고, 0.8MKCl로 안정화시킨다. 이 혼합물을 즉시 동일 배지의 아가 플레이트에 붓고 30℃에서 항온처리시킨다.
28℃에서 2 내지 3일간 성장시킨 후, 안정한 형질전환체는 수백개의 작은, 아마도 미성숙된 형질전환체의 배경 성장상에서 왕성하게 성장하는 포자형성 콜로니로서 나타난다.
실시예 6.5: 유전자 파괴의 동정
안정한 콜로니로부터, 개개의 포자 현탁액을 제조하고 최소배지+아르기닌 플레이트상에 도말시킨다. 단일 콜로니를 선별하고 재도말하여 순수한 배양물을 수득한다. 이를 사용하여 1g/1 아르기닌으로 보충된 액체 최소 배지 200ml에 접종시킨다. 180rpm에서 30℃로 진탕한지 24시간 후, 균사를 필터상에 수거하고 패드를 동결건조시킨다. 건조시킨 후, 패드를 막자 및 모르타르를 사용하여 미세 분말로 분쇄함으로써 개개의 패드로부터 DNA를 제조한다. 이 분말 60mg을 볼텍싱에 의해 1% 나트륨 도데실설페이트, 0.1% 트윈80, 1M 아세트산암모늄 3ml에 재현탁시킨다. 이것을 때때로 혼합시키면서 65℃에서 20분간 가열시킨다. 세포 파편을 15,000rpm에서 5분간 원심분리시킴으로써 DNA 용액으로부터 분리시킨다. 상등액을 페놀로 2회,클로로포름으로 2회 추출하고 에탄을 침전시킨다. 이 DNA 펠렛을 멸균 TE 100 ㎕에 재용해시킨다.
각각의 DNA 20㎕2를 RNA아제 A 1㎍의 존재하에 1시간동안 EcoRI으로 분해시킨다. 이것을 아가로즈 겔에서 분리시키고 니트로셀룰로즈 막으로 옮기고 굽는다. PEPE 유전자를 함유하는 pPEPE로부터의 BglII-HindIII 단편을 정제하고, 닉해독으로 표지하여 필터를 프로브화하는데 사용한다. pepE 유전자가 파괴된 균주는 0.5kb EcoRI 하이브리드화 단편 결핍 외에 또 다른 2개의 플랭킹 단편의 변형된 이동성을 지님으로 인해 쉽게 인지된다.
이들 균주중 하나를 우리딘 및 5-플루오로-오로트산이 함유된 배지에 플레이트시킨다. 피리미딘 영양요구주에 대한 돌연변이체는 이 배지상에서 더욱 잘 성장함으로써 동정되며 이를 떠서 단일 콜로니에 대해 도말함으로써 정제한다.
실시예 6.6: pepE 에이.나이거 균주에서의 인터페론 생산
실시예 6.5에서 분리한 pepE-에이.나이거 An8 균주 중 하나를 pyrA+함유 플라스미드 및 인터페론의 이종 유전자를 함유하는 발현 카세트를 사용한 연속적인 형질전환용 숙주로서 사용한다.
에이.나이거 An8의 우리딘 영양요구성 pepE-돌연변이체의 분생포자를 포자가 완전히 형성될 때까지 28℃ 에서 완전 배지에서 4일간 성장시킨다. 2x108분생 포자를 사용하여 1g/1 아르기닌 및 우리딘이 보충된 최소배지 200ml에 접종시킨다.
28℃ 및 180rpm에서 20시간 성장시킨 후, 균사를 미라클로쓰를 통한 여과로써 수거하고, 0.8M KCl, 50mM CaCl210ml로 2회 세척하며, 0.8M KCl, 50mM CaCl2, 0.5mg/ml Novozyme 234(Novo Industries 제조) 20ml에 재현탁시킨다. 이 혼합물을 충분한 원형질체가 방출될 때까지(현미경으로 90 내지 120분 후 검경) 진탕수욕(30℃, 50rpm)에서 항온처리시킨다. 이 원형질체 현탁액을 깔대기내 유리 솜 플러그를 통해 여과하여 균사 파편을 제거한다. 원형질체를 실온에서 약하게 원심분리(10분, 2000rpm)하여 펠렛화하고 0.8M KCl, 50mM CaCl210ml로 2회 세척한다. 이 원형질체를 최종적으로 0.8M KCl, 50mM CaCl2200 내지 500㎕에 재현탁시켜1x108/ml의 농도가 되도록 한다.
형질전환을 위해 원형절제 현탁액 200㎕ 분취량을 pAXI(DSM 7017) 5㎍ 및 pGIIss-IFN AM119 또는 pGII-IFN AM119 DNA(이 플라스미드는 둘 다 유럽 특허원 제 0 421 919호에 충분히 기술되어 있다) 50㎍, PCT(10mM 트리스-HCI, pH7.5, 50mM CaCl2, 25% PEG 6000) 50μ 1와 함께 항온처리시킨다. 이 항온처리 혼합물을 빙상에 20분간 유지시키고, 다시 PCT 2ml를 가하고 이 혼합물을 실온에서 5분간 추가로 항온처리시킨다. 0.8M KCl, 50mM CaCl24ml를 가하고 최종 형질전환 용액 1ml 분취량을 액화 최소 아가 배지[최소 배지+1g/1 아르기닌+10g/1 박토-아가(Difco 제조원)]와 함께 혼합하고, 0.8M KCl로 안정화시킨다. 이 혼합물을 동일 배지의 아가 플레이트에 즉시 붓고 30℃에서 항온처리시킨다.
28℃에서 2 내지 3일간 성장시킨 후, 안정한 형질 전환체는 수백의 작은, 아마도 미성숙된 형질전환체의 배경 성장상에서 왕성하게 성장하는 포자형성 콜로니로서 나타난다.
형질전환체를 집어 내어 인터페론 발현에 대해 분석한다. 인터페론 활성은 암스트롱의 방법[참조: J.A. Armstrong, Appl. Microbiol. 21, 732 (1971)]에 따라 사람 CCL-23 세포 및 챌린지 바이러스로서 수포성 구내염 바이러스(VSV)를 사용하여 측정한다.
형질전환체로부터의 분생포자를 예비배양 배지(펙틴 슬로우 셋트 L:Unipectin, SA, Redon, France 제조; 3g/1, NH4Cl 2g/1, KH2PO4 0.5g/1, NaCl0.5g/1, MgSO4"7H2O 0.5g/1, Ca2SO4"2H2O 0.5g/1, pH 7.0, 1%아르기닌) 50ml에 각각 예비배양시킨다. 이 예비배양물을 250rpm 및 28℃ 에서 72시간동안 항온처리한다. 10%의 예비배양물을 사용하여 주배양 배지[대두 유액 20g/1, 펙틴 슬로우 셋트 5g/1, 1% 아르기닌] 50ml에 접종한다. 이 배양물을 250rpm 및 28℃에서 72 내지 96시간동안 성장시킨다.
상이한 시간대(매 20시간)에 샘플을 취하고, 원심분리로서 세포를 펠렛화하며 동결건조 및 건조분쇄로 파괴시킨다. 상등액 및 세포 추출물을 둘 다 상술한 바와 같이 인터페론 활성에 대해 시험한다(상기 참조). 다량의 인터페론 활성은 pGIIss-IFN AM119를 지닌 형질전환체에 있어서는 배지내로 분비된 반면, PGII-IFNAM119를 지닌 형질전환체에 있어서는 주로 세포 추출물에 존재한다.
실시예 7: 에이.나이거에 있어서 pepE의 과잉발현
실시예 7.1:
중복 복제물의 과잉발현
에이.나이거 An8을 1㎍ pAXI+10㎍ pPEPE로 형질전환시켜 우리딘 자가영양체를 수득한다. 콜로니를 정제하여 상술한 바와 같이 DNA를 제조한다. pPEPE의 BglII-HindIII를 사용한 서던 블롯에서는 형질전환체 일부가 이의 게놈으로 통합된 pPEPE의 단일 복제물을 지닌 반면, 다른 것은 게놈내에 10개 이하 및 10개 이상의 복제물을 지님을 나타낸다. 이에 따라 이 군주는 보다 단백분해적 활성을 나타내며 유사분열적으로 안정하다.
실시예 7.2:유전자 유합으로부터 pepE의 과잉발현
에이.나이거 피루베이트 키나제의 프로모터를 올리고뉴클레오티드 1(서열확인번호: 3) 및 올리고뉴클레오티드 2(서열확인번호: 4)를 사용하여 PCR 기술에 의해서 pGW1100 (DSM 5747)로부터 증폭시킨다. 이 단편을 BamHI 및 PstI으로 절단하여 아가로즈 겔로부터 정제한다.
아스퍼질러스-아스파르트산 프로테이나제 암호화 영역을 올리고뉴클레오티드3(서열확인번호: 5) 및 올리고뉴클레오티드 4(서열확인번호: 6)을 사용하는 PCR 기술에 의해서 pFEPE로부터 증폭시킨다. 이 단편을 PstI 및 XhoI으로 절단하여 아가로즈 겔로부터 정제시킨다.
에이.나이거 피루베이트 키나제의 종결자를 올리고뉴클레오티드 5(서열확인번호: 7) 및 올리고뉴클레오티드 6(서열확인번호: 8)을 사용하는 PCR 기술에 의해 pGW 1100(DSM 5747)으로부터 증폭시킨다, 이 단편을 BamHI 및 PstI으로 절단하고 아가로즈 겔로부터 정제한다.
pTZ18R을 BamHI으로 절단하고 박테리아성인 알칼리성 포스파타제로 탈포스포릴화시킨다.
상기 4개의 단편의 연결 및 이.콜라이의 형질전환은 그 정확한 구조가 제한 분해 및 서열분석에 의해 확인되는 플라스미드 pPKIPEPE의 형성을 가져온다. pPKIPEPE는 pTZ18R내에 삽입된 BamHI 단편을 함유하며, 이 단편은 에이.나이거의 pepE 유전자의 ATG 출발 코돈에 융합된 에이.나이거의 피루베이트 키나제 프로모터로 이루어진 발현 카세트를 함유하며, 이는 피루베이트 키나제 종결자에 의해 종결된다. pPKIPEPE는 pAXl와 함께 사용되여 우리딘 자가영양체에 대해 에이.나이거An8을 동시형질전환시킨다.
pki-pepE 융합의 존재는 개개의 정제된 형질전환체로 부터 DNA를 제조하고 이를 pki 및 pepE로부터의 프로브를 사용하는 서던 분석에 사용함으로써 확인된다. 게놈내에 통합되어 있는 이러한 유전자 융합의 하나 이상의 복제물을 지닌 균주는 세포가 C 공급원으로서의 글루코즈에서 신속하게 성장할 때 더욱더 단백질분해 활성을 생성하는 것으로 나타난다.
실시예 8
기타 생물체에서의 pepE의 발현: 효모에서의 발현
플라스미드 pPEPE를 각각 서열화인번호 9, 10 및 11 하에 올리고뉴클레오티드 7, 8 및 9로서 서열 목록에 나타내어진, 3개의 인트론 모두가 루프를 형성하고 있는 3개의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 시험관내에서 돌연변이 유발시킨다. 이것은 개방 판독 프레임의 완전한 서열분석에 의해 그 서열이 확인되는 플라스미드 pPEPEl를 창출한다.
pFBY 129(제DSM 7016호로 기탁됨)을 EcoRI으로 절단하고 S1 뉴클레아제로 처리하여 점착성 말단을 제거한다. 이러한 평활 말단화전 분자를 서열 5'CCTGCAGG의 포스포릴화되지 않은 과량의 링커로 재연결시키고 이.콜라이로 형질전환시킨다. EcoRI 부위로 치환된 PstI 부위를 지닌 정확한 플라스미드는 서열분석으로 확인되며 pFBY129P로 명명된다.
pFBY25(DSM 7020)를 SnaBI로 절단하여 T4 폴리머라제로 처리함으로써 말단을 채운다. 이 평활 말단 분자를 서열 5'GAGATCTC의 포스포릴화되지 않은 과량의 링커로 재연결시키고 이.콜라이로 형질전환시킨다. SnaBI 부위가 치환된 BglII 부위를 지닌 정확한 플라스미드를 플라스미드 미니제제의 제한 분석으로 확인하고 서열 분석으로 확증한다. 이 플라스미드를 pFBY25Bg로 명명한다. pFBY25Bg를 BglII로 분해하고 박테리아성의 알칼리성 포스파타제로 탈포스포릴화시킨다.
단편을 올리고뉴클레오티드 3 및 4를 사용하여 pPEPEI로부터 PCR에 의해 증폭시킨다. 인트론이 없는 전체 pcpE 개방 판독 프레임을 함유하는 상기 단편을 PstI 및 XhoI으로 절단하여 아가로즈 겔로부터 정제시킨다.
에이,나이거 피루베이트 키나제 유전자의 종결자를 올리고뉴클레오티드 5 및 6을 사용하는 PCR에 의해 pGW1100 (DSM 5747)로부터 증폭시킨다. 이 단편을 SalI및 BamHI으로 절단하고 아가로즈 겔로부터 정제시킨다.
Ga110 효모 프로모터를 BamHI 및 PstI을 사용하여 pFBY129P로부터 분해하고 단편을 아가로즈 겔로부터 정제시킨다.
상기 수득한 3개의 단편을 BglII-분해되고 탈포스포릴화 시킨 pFBY25Bg와 함께 연결시켜 플라스미드 pGALPEPE를 수득한다. 정확한 구조를 제한 분석으로 확증한다. 플라스미드 PGALPEPE를 효모내로 형질전환시키고 이 형질전환체는 갈락토즈를 지닌 재즈합체 유전자의 발현 유도 후 PEPE 단백질을 생산하는 것으로 나타난다.
미생물의 기탁
하기 미생물을 부다페스트 조약하에 기탁기관(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig)에기탁하였다:
서열 목록
(1) 일반정보
(i) 출원인:
(A) 성명: 시바-가이기 아게
(B) 가: 클리벡슈트라쎄. 141
(C) 시: 바젤
(E) 국가: 스위스
(F) 우편번호 (ZIP): 4002
(G) 전화: +41 61 69 11 11
(H) 전송: +41 61 696 79 76
(I) 전신: 962 991
(ii) 발명의 명칭: 진균성 프로테아제
(iii) 서열수: 16
(iv) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC호환기종
(C) 운용시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리스 #1.0, 버젼 #1.25 (EPO)
(2) 서열확인번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 2875 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 이본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(iii) 추론사항: 없음
(iii) 안티-센스: 없음
(vi ) 공급원 :
(A) 생물체: pepE
(B) 균주: 아스퍼질러스 나이거 N400
(ix) 특성:
(A) 명칭/키 : CDS
(B) 위치: 연결(1269..1370, 1462..1612, 1669..2323, 2382..2667)
(D) 다른 정보:/기능="아스파르트산 프로테아제"
/생설물="PEPE"
/유전자="PEPE"
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 인트론
(B) 위치: 명령(1371..1461, 1613..1668, 2324 .2381)(ix) 특성:
(A) 명칭/키: 액손
(B) 위치:연결(1269..1370, 1462. 1612, 1669..2323, 2382..2667)
(xi) 서열확인번호 1에 대한 서열기술:
(2) 서열화인번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 398 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 형태: 선형
(xi) 서열확인번호 2에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형. DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..18
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 1"
(xi) 서열확인번호 3에 대한 서열기술
(2) 서열확인번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..30
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 2"
(xi) 서열확인번호 4에 대한 서열기술
(2) 서열확인번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..30
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 3"
(xi) 서열확인번호 5에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..30
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 4"
(xi) 서열확인번호 6에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 7에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..28
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 5"
(xi) 서열확인번호 7에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 8에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B)위치: 1.. 28
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 6"
(xi) 서열확인번호 8에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 9에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 36 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..36
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 7"
(xi) 서열확인번호 9에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 10에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 38 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(S) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..38
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 8"
(xi) 서열확인번호 10에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 11에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 38 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B)위치: 1..38
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 9"
(xi) 서열확인번호 11에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 12에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..30
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 A"
(xi) 서열확인번호 12에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 13에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..20
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 B"
(xi) 서열확인번호 13에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 14에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성 :
(A) 명칭/키: misc 특성
(B)위치: 1.. 20
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 C"
(xi) 서열확인번호 14에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 15에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형: DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..20
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 D"
(xi) 서열확인번호 15에 대한 서열기술:
(2) 서열확인번호 16에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 쇄형: 일본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 분자형. DNA (게놈성)
(ix) 특성:
(A) 명칭/키: misc 특성
(B) 위치: 1..20
(D) 다른정보: /표준명칭 = "올리고뉴클레오티드 E"
(xi) 서열확인번호 16에 대한 서열기술

Claims (20)

  1. 서열확인번호 2의 아미노산 서열을 갖는 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 아스파르트산 프로테아제를 코딩하는 DNA서열을 포함하는 단리된 DNA분자.
  2. 제1항에 있어서, 서열확인번호 1의 DNA서열을 포함하는 DNA분자.
  3. 제1항의 DNA 서열을 포함하는 하이브리드 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제를 코딩하는 DNA서열이 적절한 숙주 세포 내에서 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제 유전자를 발현시키기에 적절한 조절 영역과 기능적으로 연결된 하이브리드 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제를 암호화하는 DNA 서열이 아스퍼질러스 균주 내에서 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제 유전자를 발현시키기에 적절한 조절 영역과 기능적으로 연결된 하이브리드 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 목적하는 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제 유전자와 상동성인 프로모터를 포함하는 하이브리드 벡터.
  7. 제4항에 있어서, 목적하는 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제유전자와 이형인 아스퍼질러스 프로모터를 포함하는 하이브리드 벡터.
  8. 제1항의 DNA분자로 형질전환시킨 숙주 세포를 배양한 다음, 상기 DNA 분자를 숙주 세포로부터 단리시킴을 포함하는, 제1항의 DNA분자를 제조하는 방법.
  9. 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제를 코딩하는 서열확인번호 1의 pepE 전자가 결핍된 아스퍼질러스 균주.
  10. 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제를 코딩하는 서열확인번호 1의 pepE 유전자를 시험관 내에서 돌연변이 유발시키고, 돌연변이된 외인성 유전자를 사용하여 상응하는 내인성 염색체성 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제를 코딩하는 서열확인번호 1의 pepE 유전자를 지니는 아스퍼질러스 숙주를 형질전환시킨 다음, 내인성 유전자가 돌연변이된 외인성 유전자로 대체된 돌연변이체를 분리함을 포함하는, 아스파르트산 프로태아제가 결핍된 아스퍼질러스 균주를 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제 유전자 파괴(disruption)를 포함하는 방법.
  12. 제9항에 따른 아스퍼질러스 균주를 목적하는 폴리펩타이드의 발현에 적합한 발현 카세트를 지니는 발현 벡터로 형질전환시키고, 이와 같이 형질전환시킨 아스퍼질러스 균주를 목적하는 폴리펩타이드의 발현에 적합한 조건하에서 배양한 다음, 목적하는 폴리펩타이드를 단리시킴을 포함하는, 목적하는 폴리펩타이드를 제조하는 방법.
  13. 서열확인번호 2의 아미노산 서열을 갖는 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제.
  14. 숙주 내에서 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제 유전자를 발현시키기에 적절한 조절 영역과 기능적으로 연결된 서열확인번호 2의 아미노산 서열을 갖는 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제를 코딩하는 DNA서열을 포함하는 하이브리드 발현 벡터로 형질전환시킨 박테리아, 진균, 고등 진핵 세포 및 사상 진균으로 이루어진 군에서 선택된 숙주를 배양함을 포함하는, 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로태아제를 제조하는 방법.
  15. 숙주 내에서 아스퍼질러스 나이거 아스파라트산 프로테아제 유전자를 발현시키기에 적절한 조절 영역과 기능적으로 연결된 서열확인번호 2의 아미노산 서열을 갖는 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제를 코딩하는 DNA서열을 포함하는 하이브리드 발현 벡터로 형질전환시킨 박테리아, 진균, 고등 진핵 세포 및 사상 진균으로 이루어진 군에서 선택된 숙주.
  16. 제15항에 있어서, 아스퍼질러스 균주인 형질전환된 숙주.
  17. 제16항에 있어서, 아스퍼질러스 균주 내에서 아스퍼질러스-아스파르트산 프로테아제 유전자를 발현시키기에 적절한 조절 요소를 포함하는 하이브리드 발현 벡터로 형질전환시킨 아스퍼질러스 균주인 형질전환된 숙주.
  18. 제17항에 있어서, 목적하는 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제 유전자와 상동성인 프로모터를 포함하는 하이브리드 발현 벡터로 형질전환시킨 아스퍼질러스 균주인 형질전환된 숙주.
  19. 제17항에 있어서, 목적하는 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제 유전자와 이형인 프로모터를 포함하는 하이브리드 발현 벡터로 형질전환시킨 아스퍼질러스 균주인 형질전환된 숙주.
  20. 숙주 내에서 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제 유전자를 발현시키기에 적절한 조절 영역과 기능적으로 연결된 서열확인번호 2의 아미노산 서열을 갖는 아스퍼질러스 나이거 아스파르트산 프로테아제를 코딩하는 DNA서열을 포함하는 하이브리드 발현 벡터로 박테리아, 진균, 고등 진핵세포 및 사상 진균으로 이루어진 군에서 선택된 숙주를 형질전환시킴을 포함하는, 제15항의 형질전환된 숙주를 제조하는 방법.
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