KR100880087B1 - 신규 단백질 분해효소를 암호화하는 신규 유전자 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 Aspergillus niger로부터 얻을 수 있는 신규 프로테아제를 암호화하는 새롭게 확인된 유전자 서열에 관련된다. 본 발명은 신규 유전자의 전장 유전자 서열, 그의 cDNA 서열뿐만 아니라 전장의 기능적 단백질 및 그의 단편을 특징으로 한다. 본 발명은 또한 이들 효소를 산업 공정에서 사용하는 방법 및 진균 감염의 진단 방법에 관련된다. 본 발명에 따른 DNA로 형질전환된 세포 및 본 발명에 따른 프로테아제가 그의 활성 및/또는 발현 수준을 향상하거나 감소시키도록 유전적으로 변형된 세포 또한 본 발명에 포함된다.
프로테아제, Aspergillus, 단백질 분해효소
Description
본 발명은 Aspergillus niger로부터 분리된 신규 프로테아제를 암호화하는 유전자를 포함하는, 새롭게 확인된 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 본 발명은 신규 유전자의 전장 뉴클레오티드 서열, 신규 단백질 분해효소의 전장 암호화 서열을 포함하는 cDNA 서열, 및 전장의 기능적 단백질, 그의 단편 및 변이체를 특징으로 한다. 또한, 본 발명은 이들 효소를 산업적 공정에 이용하는 방법 및 진균 감염을 진단하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드로 형질전환(transformation)된 세포, 및 본 발명에 따른 프로테아제가 그의 활성 및/또는 발현의 수준을 향상 또는 감소시키도록 유전적으로 변형된 세포를 포함한다.
단백질 분해효소
단백질은 펩티드 결합에 의해 결합된 아미노산 빌딩 블록으로 구성된 헤테로-폴리머인 것으로 여겨질 수 있다. 단백질 내의 반복 단위는 아미노기 및 카르복시기를 갖는 중심 알파 탄소 원자이다. 글리신을 제외하고, 소위 아미노산 측쇄는 알파 탄소에 있는 두 수소 원자 중 하나를 치환한다. 아미노산은 중심 알파 탄소가 비대칭인 것으로 나타난다. 일반적으로, 단백질에서 아미노산의 L-거울상체가 발견된다. 하기 용어는 다양한 타입의 중합된 아미노산을 설명한다. 펩티드는 정의된 서열을 갖는 아미노산 잔기의 짧은 사슬이다. 잔기의 수에 대한 최대값이 실제로 있는 것은 아니지만, 상기 용어는 보통 그 성질이 아미노산 조성에 의해 주로 결정되며 고정된 3차원적 분자 배열을 갖지 않는 사슬을 의미한다. 용어 폴리펩티드는 더 긴 사슬, 일반적으로 정의된 서열 및 길이, 대체로 3차원 구조로 접히기에 적당한 길이인 것에 대하여 보통 사용된다. 용어 단백질은 정의된 3차원 구조를 나타내는 천연 폴리펩티드를 지칭한다. 단백질의 주된 기능이 화학 반응을 촉매작용하는 경우 이 단백질은 보통 효소라 불린다. 프로테아제는 (폴리)펩티드 및 단백질에 있는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매작용하는 효소이다.
생리학적 조건 하에서 프로테아제는 펩티드 결합의 가수분해를 촉매작용한다. 국제 생화학 및 분자생물학 연맹 (1984)은 용어 펩티다제를 펩티드 결합 가수분해효소의 하위분류(Subclass E. C 3.4.)로 사용하도록 권장하였다. 용어 프로테아제 및 펩티드 가수분해효소는 펩티다제와 동의어이며 본 명세서에서도 사용될 수 있다. 프로테아제는 두 분류의 효소, 엔도-펩티다제 및 엑소-펩티다제를 포함하는데, 이들은 단백질 내의 특정 지점에서 펩티드 결합을 절단하고 각각 N 또는 C-말단으로부터 순차적으로 아미노산을 제거한다. 프로테이나제는 엔도-펩티다제에 대한 동의어로서 사용된다. 펩티드 결합은 디-, 트리-, 테트라-펩티드, 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질의 내부에서 존재할 수 있다. 일반적으로 천연 펩티드 및 폴리펩티드의 아미노산 조성은 20개의 상이한 아미노산을 포함하는데, 이는 L-구조를 나타낸다 (키랄 중심을 갖지 않는 글리신은 제외). 그러나 프로테아제의 단백질 분해 활성은 20개의 천연 아미노산만을 함유한 펩티드에 제한되지 않는다. 소위 비-천연 아미노산 간의 펩티드 결합은 물론이고 변형된 아미노산 또는 아미노산 유사체 간의 펩티드 결합 역시 절단될 수 있다. 몇몇 프로테아제는 특정 위치에서 아미노산의 D-거울상이성질체를 인식한다. 일반적으로 프로테아제의 두드러진 입체선택성은 화학적 분석 공정에서 그들을 매우 유용하게 만든다. 다수의 프로테아제가 에스테라제 활성, 티올 에스테라제 활성 및 (탈)아미다제 활성과 같은 흥미로운 부활성을 나타낸다. 이들 부활성은 통상 아미노산에만 제한되는 것이 아니고 정제 화학제품의 분야에서 생물변환에서 매우 유용한 것으로 밝혀졌다.
사상 진균, 진핵성 미생물의 프로테아제가 특히 흥미로운 것에 대한 다수의 이유가 존재한다. 단백질에 있는 펩티드 결합의 가수분해성 절단의 기초 공정은 비용이 비싸고 적절하게 제어되지 않으면 유기체에게 해로울 수 있다. 단백질 분해 작용에 대한 바람직한 제한은 프로테아제의 특이성을 통해, 세포 내에 있는 프로테아제 및 기질의 구획화에 의해, 각 프로테아제에 의한 인식을 허용하는 기질의 변형을 통해, 자이모겐(zymogen) 활성화를 통한 조절을 통해, 그리고 특이적 저해제의 존재 또는 부재 및 프로테아제 유전자 발현의 조절을 통해 성취된다. 진균에서, 프로테아제는 세포내 단백질 대사, 프로세싱, 전위, 포자형성, 발아 및 분화를 포함하는 다른 중요한 세포 과정에도 관여한다. 사실, Aspergillus nidulans 및 Neurospora crassa는 생리학적 및 발생학적 과정 범위의 분자적 기초를 분석하기 위한 유기체 모델로서 사용되고 있다. 정의된 영양 및 배양 조건 하에서, 그들의 유전적 특징은 생화학 및 유전적 연구에 직접적인 접근을 허용한다. 더구나, 인간, 가축 및 농작물에 대한 병원성을 나타내는 진균의 거대한 집단이 분리되었고 단백질 분해가 그들의 병원성에서 일정한 역할 (숙주 침입, 숙주 방어 기작에 대한 대항 및/또는 감염 중의 영양물 섭취)을 담당하는 것으로 제안되었다. 프로테아제는 또한 실험실, 임상 및 산업상의 공정에서 빈번하게 사용되는데; 미생물성 및 비-미생물성 프로테아제는 둘다 식품 산업 (제빵, 양조, 치즈 제조, 육류 연화)에서, 제혁 산업에서 그리고 생물학적 제제의 제조에서 광범위하게 사용된다 (Aunstrup, 1980). 어떤 사상 진균, 특히 Aspergillus를 동종 및 이종 단백질의 생산을 위한 숙주로서 활용하는 데 있어서의 상업적 관심 또한 최근에 진균 프로테아제에 대한 관심을 촉발시켰다 (van Brunt, 1986ab). 프로테아제는 종종 진균에서 단백질의 이종 발현 및 동종 발현에서 문제를 야기한다. 특히 이종 발현은 동종 프로테아제에 의한, 발현된 생성물의 단백질 가수분해에 의해 방해된다. 이들 상업적 관심은 단백질 분해 스펙트럼의 상세한 연구 및 프로테아제 결핍 균주의 제작을 야기하였고 이들 유기체에서 프로테아제 발현 및 조절에 대한 지식을 개선하였다. 따라서 사상 진균에서 신규 프로테아제를 확인하고 제거할 필요가 있다.
예를 들어 진균과 같은 미생물은 단백질의 대규모 생산에 특히 유용하다. 이러한 단백질이 배지 내로 분비될 때 특히 그러하다. 단백질 분해효소는 이러한 생산 공정에서 일정한 역할을 담당한다. 한편으로, 특정 단백질 분해효소는 일반적으로 표적 단백질의 적합한 프로세싱 및 생산 숙주의 원활한 대사에 필요하다. 다른 한편으로, 단백질 가수분해는 분비되는 단백질의 수율을 유의하게 감소시킬 수 있다. 분비 경로에서의 불량한 폴딩은 세포내 프로테아제에 의한 분해를 야기할 수 있다. 이것이 이종 단백질 생산에서의 특별한 문제점이다. 진균에서의 분비 과정으로부터 유래된 단백질의 분해를 일으키는, 단백질 분해 과정의 세부 사항은 정확하게 공지되어 있지 않다. 진핵 세포에서 세포성 단백질의 분해는 프로테아좀에 의해 성취되며 보통 분해되는 단백질의 유비퀴틴 표지화를 포함한다. 진균에서, 프로테아좀 및 소포성 프로테아제는 또한 불량하게 폴딩된 분비 단백질의 단백질 가수분해에 대한 후보인 것으로 생각된다. 단백질 가수분해는 세포질에서 일어나는 것으로 생각되지만, 소포체 내재 프로테아제가 제외될 수는 없다. 생산 숙주 균주 개선의 측면으로부터, 단백질 분해 시스템은 유전공학 및 생산 균주 개선에 대한 흥미로운 표적이 될 수 있다. 프로테아제 유전자의 부가적인 카피, 어떤 프로테아제의 과발현, 전사 제어의 변형은 물론이고, 프로테아제 유전자의 삭제에 대한 방법은 주어진 프로테아제의 기능에서 더 상세한 통찰력을 제공할 수 있다. 프로테아제 암호화 유전자의 결실은 동종 단백질 및 이종 단백질에 대한 생산 수율을 개선하기 위하여 숙주 균주 개선에 있어서 유용한 수단이 될 수 있다.
진핵 미생물 프로테아제는 North에 의해 논의되었다 (1982). 더욱 최근에는, Suarez Rendueles 및 Wolf (1988)는 Sacharomyces cerevisiae 프로테아제 및 그들의 기능을 논의하였다.
결합의 가수분해 절단과는 별도로, 프로테아제는 결합의 형성에도 적용될 수 있다. 이 측면에서 결합은 펩티드 및 아미드 결합 뿐만 아니라 에스테르 결합도 포함한다. 프로테아제가 특정 결합의 절단을 촉매작용하는가, 아니면 형성을 촉매작용하는가 하는 것은 첫째로 반응의 열역학에 의존한다. 프로테아제와 같은 효소는 화학의 평형에 영향을 미치지 않는다. 평형은 반응이 일어나는 특정 조건에 의존한다. 생리학적 조건 하에서, 반응의 열역학은 쯔비터이온성 생성물의 열화학적으로 매우 안정한 구조로 인해 펩티드의 가수분해로 치우친다. 평형에 영향을 미치는 물리-화학적 원칙의 적용에 의해, 또는 반응물 및 생성물의 농도 또는 성질을 조작함으로써, 또는 효소 반응의 동역학적 매개변수를 활용함으로써, 프로테아제를 펩티드 결합의 합성 목적에 적용하는 것이 가능하다. 수혼화성 유기 용매의 첨가는 카르복시 성분의 이온화 정도를 감소시킴으로써 반응에 이용가능한 기질의 농도를 증가시킨다. 수율을 향상시키기 위하여, 2단계 시스템, 물 유사체, 역 교질입자(micelle), 무수 매질, 또는 생성물의 침전이 일어나도록 변형된 아미노기 및 카르복실기가 주로 사용된다. 적절한 성질을 갖는 프로테아제가 이용가능한 경우 프로테아제를 합성에 적용하는 것은 상당한 장점을 제공한다. 프로테아제는 입체선택성뿐만 아니라 위치선택성을 나타내기 때문에, 반응물 상의 민감성기는 보통 보호를 필요로 하지 않고 반응물은 광학적으로 순수할 필요가 없다. 효소 합성의 조건이 온화할 때, 불안정한 반응물의 라세미체화 및 분해가 방지될 수 있다. 아미노산 간의 결합과 별도로, 1차 아미노기, 티올기 또는 카르복시기를 나타내는 다른 화합물 또한 적당하게 선택된 프로테아제에 의해 연결될 수 있다. 게다가, 에스테르, 티올 에스테르 및 아미드는 특정 프로테아제에 의해 합성될 수 있다. 프로테아제는 단당류, 이당류 및 삼당류, 뉴클레오시드, 및 리보플라빈의 아실화에서 위치선택성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 간혹 긴축 반응 조건 하에서 안정성을 갖는 문제점은 적당한 제제화에 의해 방지될 수 있다. 캡슐화 및 고정화는 효소를 안정화할 뿐만 아니라 반응 배지로부터의 용이한 회수 및 분리를 허용한다. 광범위한 교차결합, 알데히드로의 처리, 또는 덱스트란, 폴리에틸렌글리콜, 폴리이민과 같은 특정 폴리머로 표면을 피복하는 것은 실질적으로 생체촉매의 수명을 연장시킬 수 있다.
프로테아제의 천연 역할
전통적으로, 프로테아제는 단백질을 작은 펩티드로 분해할 수 있는 분해 효소로서 생각되어 왔고, 그의 역할은 영양 단백질을 분해하거나 또는 세포성 단백질의 대사전환에 참여하는 것이다. 게다가, 프로테아제는 또한 제한된 단백질 분해에 의한 선택적 변형의 기작을 통하여, 광범위한 세포성 과정에서 핵심적인 역할을 담당하므로 필수적인 조절 기능을 가질 수 있다 (Holzer 및 Tschensche 1979; Holzer 및 Heinrich, 1980). 프로테아제의 특이성은 그의 생리학적 기능 및 그의 발현 양식에 밀접하게 관련되어 있는 것으로 추측된다. 특정 프로테아제의 기능에 관하여, 그의 위치는 간혹 매우 중요한데; 예를 들어, 다수의 소포 및 주변세포질 프로테아제는 단백질 분해에 관여하는 반면, 다수의 막-결합 프로테아제는 단백질 프로세싱에서 중요하다 (Suarez Rendueles 및 Wolf, 1988). 다수의 세포성 프로세싱에서 프로테아제의 상이한 역할은 프로테아제의 4 가지 주요 기능으로 나뉠수 있다: 1) 단밸직 분해, 2) 번역 후 프로세싱 및 특정 단백질의 (비)활성화, 3) 형태형성 및 4) 발병원인.
영양 공급원으로서 단백질을 이용하는 유기체에서 프로테아제의 명백한 역할은 영양분의 가수분해에 있다. 진균에서, 이것은 광범위 특이성을 갖는 세포외 프로테아제에 의한 세포 외부에서의 분해를 포함한다. 단백질 분해는 또한 세포성 단백질의 신속한 대사전환에 중요하며 세포가 비정상적인 단백질을 제거하고 그들 단백질의 보체를 변화하는 생리학적 조건에 적응시키는 것을 허용한다. 일반적으로, 보다 광범위한 특이성을 갖는 프로테아제는 정확한 표적 단백질 외의 단백질의 무작위 분해로부터 세포를 보호하기 위하여 극히 잘 제어되어야 한다.
가수분해와는 반대로 폴리펩티드의 합성은 리보솜 상의 ATP 구동 과정에 의해 생체내에서 일어난다. 궁극적으로 아미노산이 연결된 서열은 게놈으로부터 유래된 정보에 의해 결정된다. 이 과정은 전사로서 공지되어 있다. 1차 번역 생성물은 간혹 최종 기능성 생성물보다 더 길고, 전사 후 프로테아제에 의한 이러한 단백질 전구체의 추가 프로세싱이 일반적으로 필요하다. 프로테아제는 최종 기능성 단백질을 수득하기 위한 이러한 단백질 전구체의 성숙에서 핵심적인 역할을 담당한다. 매우 잘 제어된 트리밍(trimming) 및 재성형과는 반대로, 프로테아제는 또한 매우 파괴적이며, 폴리펩티드를 펩티드 및 아미노산으로 완전하게 분해할 수 있다. 요구되기 전에 단백질 분해 활성이 작동되는 것을 회피하기 위해, 프로테아제는 광범위한 조절을 받는다. 다수의 프로테아제는 자이모겐이라고 공지된 더 큰 전구체로서 합성되고, 이 자이모겐은 필요할 때 활성화된다. 주목할 만한 것은 상기 활성화가 항상 단백질 분해에 의해 일어난다는 것이다. 프로세싱에의 직접적인 관여 외에, 각 단백질의 선택적 활성화 및 비활성화는 특이적 프로테아제에 의해 촉매작용되는 공지된 현상이다.
제한된 단백질 가수분해의 선택성은 단백질 가수분해효소-기질 상호작용에서 더욱 직접 존재하는 것으로 보인다. 특이성은 특정 아미노산 표적 서열만을 인식하는 단백질 분해효소로부터 유래될 수 있다. 반면, 이것은 pH, 이온 강도 또는 2차 변형과 같은 어떤 조건 하에서 "프로세싱 부위'의 선택적인 노출의 결과일 수 있으며, 이로써 다른 비-특이적 프로테아제가 고도의 특이적 사건을 촉매작용하도록 할 수 있다. 제한된 단백질 분해에 의한 소포성 자이모겐의 활성화는 후자의 예를 제공한다.
형태형성 또는 분화는 유기체에서 한 상태로부터 또다른 상태로 변화하도록 유도하는 일련의 조절된 사건으로서 정의될 수 있다. 다수의 경우에서 프로테아제와 형태형성 효과 간의 직접적인 관계가 확립될 수 없음에도 불구하고, 분화, 포자형성 및 포자 발아 도중의 관찰된 광범위한 단백질 대사전환과는 별도로 프로테아제는 균사 첨단 분지 및 격벽 형성과 같은 통상적인 과정에도 직접 관여하는 것으로 생각된다 (Deshpande, 1992).
Aspergillus 종, 특히 Aspergillus fumigatus 및 Aspergillus flavus는, 아스페르길루스증이라는 인간 및 동물에서의 다수의 질병의 원인이 되는 작용인자로서 관여한다 (Bodey 및 Vartivarian, 1989). 분비된 프로테아제와 박테리아의 병독성을 연관시키는 다수의 연구가 존재하는 것과 같이 프로테아제가 Aspergillus fumigatus 및 Aspergillus flavus의 병독성에 관여하는 것이 반복적으로 제시되었다. 사실상, Aspergillus 종으로 인한 대부분의 인간 감염은 주로 콜라겐 및 엘라스틴으로 구성된 폐의 연조직의 광범위한 분해를 특징으로 한다 (Campbell et al., 1994). 연구는 주된 인간 병원체이자 엘라스틴분해 및 콜라겐분해 활성을 갖는 것으로 공지된 Aspergillus fumigatus 및 Aspergillus flavus의 병독성에서 분비되는 프로테아제의 잠정적 역할에 촛점이 맞춰졌다 (Kolattukudy 등, 1993). 이들 엘라스틴분해 활성은 마우스에서의 감염성과 시험관내에서 상호연관된 것으로 나타났다 (Kothary 등, 1984). 2개의 분비되는 프로테아제, 즉 알칼린 세린 프로테아제 (ALP) 및 중성 메탈로 프로테아제 (MEP)는 Aspergillus fumigatus 및 Aspergillus flavus에 의해 생산되는 것으로 공지되어 있다. Aspergillus fumigatus에서는 상기 두 프로테아제를 암호화하는 유전자가 분리되었고 그 특징이 규명되었고 파괴되었다 (Reicherd 등, 1990; Tang 등, 1992,1993; Jaton-Ogay 등, 1994). 그러나 alp mep 이중 돌연변이체는 야생형 균주와 비교될 때 병원성에서의 차이점을 나타내지 않는다. 그러므로, 시험관내에서 확인된, 분비되는 Aspergillus fumigatus 프로테아제가 조직의 침투에 있어서 필수적인 인자가 아니라는 결론을 내렸다 (Jaton Ogay 등, 1994). Aspergillus fumigatus가 공기로 운반되는 곰팡이 포자의 적은 비율만을 차지함에도 불구하고, 이것은 폐 및 담으로부터 가장 빈번하게 분리되는 진균류이다 (Schmitt 등, 1991). 진균류의 병독성에 대한 다른 해석은 기관지의 상태 (온도 및 영양분)가 Aspergillus fumigatus의 기생 성장에 유리할 수 있다는 것이다. 결론적으로, 침투성 아스페르길루스증은 숙주의 병원성 방어가 면역 억제 치료 또는 AIDS와 같은 질병으로 인해 약해졌을 때 나타날 수 있는 증상일 수 있다.
프로테아제의 4가지 주요 분류가 공지되어 있고 그들의 활성 부위에서 주요한 기능에 의해 명명된다 ('세린', '티올' 또는 '시스테인', '아스파르트' 또는 '카르복실' 및 '메탈로' 프로테아제). 프로테아제의 이들 주요 분류, 소분류 및 분류되지 않은 프로테아제에 대한 기술 검토의 상세한 설명은 문헌[Methods in Enzymology part 244 및 248 (A. J. Barrett 편저, 1994 및 1995)]에서 찾을 수 있다.
프로테아제의 특이성
프로테아제의 촉매 기작과는 별도로, 단백질 분해효소의 또다른 중요한 측면은 프로테아제의 특이성이다. 프로테아제의 특이성은 프로테아제가 어떤 기질을 가수분해할 것인가를 의미한다. 20개의 천연 아미노산은 펩티드를 구성하는 데 있어서 다수의 가능성을 제공한다. 예를 들어, 20개의 아미노산으로는 400가지 디펩티드 및 800가지 트리펩티드, 등을 만들 수 있다. 더 긴 펩티드에 있어서 가능성의 수는 거의 무한하게 될 것이다. 어떤 프로테아제는 매우 특이적인 지점에서 특정 서열만을 가수분해한다. 프로테아제와 펩티드 기질과의 상호작용은 펩티드 기질의 1 내지 10개까지 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 큰 단백질성 기질에서는 프로테아제와 상호작용하는 기질의 잔기가 훨씬 더 많을 수 있다. 그러나, 이것은 활성 부위 결합 균열부의 외부의 프로테아제 잔기와 덜 특이적인 상호작용을 수반하는 것으로 생각된다. 일반적으로 특이적 인식은 직선 펩티드에 제한되는데, 이는 프로테아제의 활성 부위에 결합된다.
기질과 프로테아제의 상호작용을 기술하기 위한 명명법은 1967년, Schechter 및 Berger (Biochem. Biophys. Res. Com., 1967,27, 157-162)에 의해 소개되어 문헌에서 현재 널리 사용된다. 이 시스템에서, 폴리펩티드 기질의 아미노산 잔기는 활성 부위에 있는 소위 서브-부위에 결합하는 것으로 생각된다. 협정에 의해, 프로테아제 상의 이들 서브-부위는 S (서브-부위)라 하고 상응하는 아미노산 잔기는 P (펩티드)라고 한다. 잘리기 쉬운 결합의 N-말단 쪽 아미노산 잔기는 P3, P2, P1로 번호 매기고 C-말단 쪽의 잔기는 P1', P2', P3'으로 번호 매긴다. P1 또는 P1' 잔기는 잘리기 쉬운 결합 근처에 위치한 아미노산 잔기이다. 절단 부위 주위에 있는 기질 잔기는 P8까지 번호 매길 수 있다. 기질에 상보적인 프로테아제 상의 상응하는 서브-부위는 S3, S2, S1, S1', S2', S3' 등으로 번호 매긴다. 펩티드 결합 부위에 있는 서브-부위의 선호도는 특정 지점에서 특정 아미노산 서열을 절단하기 위한 프로테아제의 선호도를 결정한다. 기질의 아미노산 서열은 서브-부위에 의해 나타나는 선호도를 따라야 한다. 어떤 기질을 향한 특이성은 기질에 대한 결합 친화도 및 그 후 잘리기 쉬운 결합이 가수분해되는 속도 둘다에 분명하게 의존한다. 그러므로 어떤 기질에 대한 프로테아제의 특이성은 일반적으로, 특이성 상수로서 더욱 잘 알려진 그의 kcat/Km 비로 표시된다. 이 특이성 상수에서 kcat은 대사전환 속도를 나타내며 Km은 해리 상수이다.
촉매작용 및 결합에 관여된 아미노산 잔기와는 별도로, 프로테아제는 다수의 다른 필수적인 아미노산 잔기를 함유한다. 몇몇 잔기는 폴딩에서 중요하고, 몇몇 잔기는 프로테아제의 전체적인 3차원 구조를 유지하며, 몇몇 잔기는 단백질 분해 활성의 조절에 포함될 수 있고 몇몇 잔기는 특정 위치에 대하여 프로테아제를 표적화할 수 있다. 다수의 프로테아제는 활성 부위 외부에서 금속 이온에 대한 하나 이상의 결합 부위를 함유한다. 이들 금속 이온은 종종 구조를 안정화하기 위한 역할을 담당한다. 게다가, 분비되는 진핵성 미생물 프로테아제는 광범위하게 글리코실화된다. N- 및 0-연결 글리코실화가 모두 일어난다. 글리코실화는 단백질 폴딩을 도울 수 있고, 용해도를 증가시킬 수 있고, 응집을 막고 성숙 단백질을 안정화시킬 수 있다. 게다가 글리코실화의 정도는 분비뿐만 아니라 단백질에 의한 물의 결합에도 영향을 미칠 수 있다.
단백질 분해 활성의 조절
상당한 수의 프로테아제가 원치 않는 단백질 분해 손상을 회피하기 위하여 광범위하게 단백질 분해 활성을 조절한다. 어느 정도까지, 이 조절은 전사 수준에서 일어난다. 예를 들어 진균에서, 분비되는 프로테아제 유전자의 전사는 외부 탄소 및 질소 공급원에 민감한 것으로 밝혀진 반면, 세포내 프로테아제를 암호화하는 유전자는 민감하지 않다. 세포외 pH는 진균에 의해 감지되고 몇몇 유전자는 pH에 의해 조절된다. 이 과정에서 전사 조절자 단백질이 결정적인 역할을 담당한다. 이러한 조절자 단백질의 단백질 분해 프로세싱은 종종 조절자 단백질을 작동시키거나 아니면 작동중지시키는 스위치이다.
프로테아제는 세포내 조절 및 세포간 조절을 받는다. 이것은 이러한 조절에 필수적인 특정 아미노산이 단백질 분해효소 분자에 존재한다는 것을 내포한다. 프로테아제는 전형적으로 자이모겐이라 공지된 더 큰 전구체로서 합성되는데, 이는 촉매작용에 있어서 비활성을 나타낸다. 일반적으로 프로테아제 전구체가 비활성을 나타내는 펩티드 사슬의 연장 범위는 프로테아제의 아미노 말단에 위치한다. 전구체는 프로-단백질로서 더 잘 공지되어 있다. 이 방법으로 프로세싱된 다수의 프로테아제가 세포로부터 분비되기 때문에, 완전한 전구체가 프레-프로-단백질로서 합성되도록 추가적으로 신호 서열 (프레-서열)을 함유한다. 프로테아제가 비활성을 나타내도록 하는 것 외에, 프로-펩티드는 종종 생산적인 폴딩을 매개하는 데 필요하다. 프로테아제의 예는 세린 프로테아제 (알파 용해 프로테아제, 서브틸리신, 아쿠아리신, 프로호르몬 콘버타제), 티올 프로테아제 (카텝신 L 및 크루지안), 아스파르트 프로테아제 (간백질 가수분해 효소 A 및 카텝신 D) 및 메탈로프로테아제를 포함한다. 게다가 프로-펩티드는 단독으로 또는 신호 펩티드와 함께 세포 수송에서 일정한 역할을 담당한다. 이것은 세포 샤페론 (chaperone)과의 상호작용을 용이하게 할 수 있고, 또는 막을 통한 수송을 용이하게 할 수 있다. 프레-프로-단백질 전구체에서의 연장 범위 크기는 실질적으로 다양하여, 짧은 펩티드부터 폴리펩티드의 범위에 이를 수 있는데, 이는 자율적인 폴딩 단위로서 존재할 수 있다. 특히 이들 더 큰 연장 범위는 종종 프로테아제로부터의 절단 이후에 조차도 프로테아제의 강력한 저해제인 것으로 관찰된다. 절단 이후에 조차도 이러한 프로-펩티드는 프로테아제의 적절한 폴딩을 도울 수 있는 것으로 관찰된다. 이러한 프로-펩티드는 분자 샤페론으로서 기능하고 이러한 프로-펩티드의 개별적 또는 추가적인 공동 발현은 프로테아제 생산에 있어서 이로울 수 있다.
배지 내로 분비되는 프로테아제와 세포 내에 남아있는 프로테아제 간의 조절 수준에는 상당한 차이점이 있다. 배지 내로 분비되는 프로테아제는 일반적으로 활성화 후에 더 이상의 제어를 받지 않으므로 하나의 구형 모듈로 이루어진 그의 분자적 구조에 있어서 비교적 단순하다. 세포내 프로테아제는 세포에 대한 손상을 회피하기 위하여 계속적인 제어를 받을 필요가 있다. 분비되는 프로테아제의 자이모겐과는 다르게 더욱 복잡한 조절 프로테아제에서 매우 거대한 폴리펩티드 분절이 단백질 분해 모듈의 신호와 자이모겐 활성화 도메인 사이에 삽입될 수 있다. 구조-기능 연구는 이러한 비-프로테아제 부분이 거시적 구조, 막, 보조인자, 기질, 이펙터(effector), 저해제, 이온과의 상호작용에 관여할 수 있다는 것을 의미하는데, 이들은 단백질 분해 모듈(군) 또는 그의 자이모겐의 활성 및 활성화를 조절한다. 비-단백질 분해 모듈은 크기 및 구조에서 상당히 다양하다. 다수의 모듈은 단백질 분해 모듈로부터 독립적인 것으로서 존재할 수 있다. 그러므로 이러한 모듈은 폴딩에 관하여 자율적인 독립적 구조 및 기능 단위에 상응하는 것으로 간주될 수 있다. 이러한 모듈 조직화의 가치는 새로운 모듈의 수득이 수용 프로테아제에게 새로운 결합 특이성을 제공할 수 있고 그 활성, 조절 및 표적화에서 극적인 변화를 유도할 수 있다는 것이다. 모듈 조직화된 단백질 분해효소의 원리는 또한 신규 상호작용, 조절, 특이성, 및/또는 모듈의 셔플에 의한 표적화를 발생시키기 위하여 분자 생물학적 기구를 적용함으로써 활용될 수 있다. 일반적으로 이러한 부가적인 모듈이 N 또는 C 말단 연장 범위로서 관찰되지만, 촉매작용 도메인의 외부 루프 내에 있는 거대한 삽입 또한 관찰된다. 이 경우에서 또한 프로테아제의 주요한 폴딩은 기능적 단백질분해 완전성을 형성하는 데 필수적인 위상 기하학을 나타내고, 삽입은 단백질 분해 모듈의 표면 상에서 폴딩된 하위구조로서 간주될 수 있다고 믿어진다.
분자 구조
원칙적으로 더 거대한 단백질의 모듈 조직화는 자연에서 일반적인 주제이다. 특히 더 거대한 다중모듈 골격 내에서 전형적인 단백질 분해 모듈은 평균 100 내지 400개 아미노산의 크기를 나타낸다. 이것은 배지 내로 분비되는 대부분의 구형 단백질 분해 효소의 평균 크기에 상응한다. 전술한 바와 같이, 폴리펩티드 모듈은 독립적인 완전체로서 폴딩하고 작용할 수 있는 폴리펩티드 단편이다. 이러한 모듈에 대한 또다른 용어는 도메인이다. 그러나 도메인은 모듈보다는 더 넓은 의미로 사용된다. 본 명세서에서 사용될 때 용어 도메인은 일반적으로 3차원 구조에서 전형적인 폴딩 위상 기하학을 나타내는 폴리펩티드 사슬의 부분을 지칭한다. 단백질에서 도메인은 변화하는 정도로 상호작용하지만, 도메인 내에 있는 구조적 요소보다는 덜 광범위하게 변화한다. 서브도메인 및 폴딩 단위와 같은 다른 용어들 또한 문헌에서 사용된다. 특정 기능을 공유하는 다수의 단백질은 동일한 도메인을 공유할 수 있는 것으로 관찰된다. 이러한 도메인은 특정 도메인에 대해 전형적인 특정 서열 패턴을 나타내는 1차 구조로부터 인식될 수 있다. 전형적인 예는 모노뉴클레오티드 결합 폴드, 셀룰로스 결합 도메인, 나선-회전-나선 (helix-turn-helix) DNA 결합 모티프, 징크 핑거, EF 핸드, 막 앵커이다. 모듈은 자율적으로 폴딩하고 기능할 것으로 기대되는 이들 도메인을 지칭한다. 당업자는 통상적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 상기 구조 및 다른 유기체 또는 종 유래의 상동 서열에 적용함으로써 1차 구조에서 특정 도메인을 확인할 수 있다.
다중모듈 또는 다중도메인 단백질이 구슬 목걸이와 같이 나타날 수 있음에도 불구하고, 실질적으로 더욱 복잡한 구조물의 집합체가 관찰되었다. 다양한 구슬이 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 존재하는 경우, 구슬은 일반적으로 모듈 또는 도메인이라 불린다. 구슬이 하나의 동일한 폴리펩티드 상에 존재하지 않고 비-공유적 상호작용을 통해 집합체를 형성할 때 용어 서브유닛은 구슬을 명명하는 것으로 사용된다. 서브유닛은 하나의 동일한 유전자에 의해 또는 상이한 유전자에 의해 전사될 수 있다. 다중모듈 단백질은 다수의 서브유닛을 유도하는 전사 후에 단백질 분해적으로 프로세싱될 수 있다. 각각의 서브유닛은 다수의 도메인으로 이루어질 수 있다. 전형적으로 100 내지 300개 아미노산으로 이루어진 더 작은 구형 단백질은 통상 하나의 도메인만을 구성한다.
단백질 분해효소의 분자적 분류
일반적으로 프로테아제는 그들의 분자적 성질에 따라 또는 그들의 기능적 성질에 따라 분류된다. 분자적 분류는 프로테아제의 1차 구조에 기초를 둔다. 단백질의 1차 구조는 그의 아미노산 서열을 나타내는데, 이는 상응하는 유전자의 뉴클레오티드 서열로부터 유래될 수 있다. 1차 구조에 있어서의 유사성을 광범위하게 추적하면, 기능적 성질로 확장될 수 있는 촉매작용의 기작 및 다른 성질에 있는 유사성을 인지할 수 있다. 용어 패밀리는 그들 1차 구조 간의 유사성에 기초한 진화상의 관계를 나타내는 프로테아제 집단을 기술하는 데 사용된다. 이러한 패밀리의 구성원은 동일한 선조로부터의 분기 진화에 의해 생겨났다고 믿어진다. 한 패밀리 내에서 서열 비교의 더욱 상세한 구별에 기초한 1차 구조를 더 세분화하면 서브패밀리가 생긴다. 프로테아제의 3차원 폴딩에 따른 분류는 2차 구조, 3차 구조 및 4차 구조를 포함할 수 있다. 일반적으로 2차 구조에 대한 분류는 2차 구조 요소의 내용 및 총체적 배향으로 제한된다. 3차 구조에서의 유사성은 수퍼패밀리 또는 클랜의 인식을 야기한다. 수퍼패밀리 또는 클랜(clan)은 그들이 공통적인 3차원적 폴딩을 나타내기 때문에 공통의 선조를 가질 것으로 생각되는 패밀리의 집단이다. 일반적으로 4차 구조는 1차 구조보다 더욱 보존된다. 결론적으로, 1차 구조의 유사성은 유사한 기능적 성질을 항상 반영하는 것은 아니다. 사실상 기능적 성질은 흥미로운 새로운 성질을 발생시키도록 실질적으로 분기할 수 있다. 현재 4차 구조는 다양한 프로테아제를 분류하는 데 적용되지 않는다. 이것은 단순한 구형 프로테아제에 대한 구조적 데이터베이스의 어떤 편향으로 인한 것일 수 있다. 활성화되거나, 조절되거나 또는 복잡한 반응 카스케이드를 겪는 다수의 단백질 분해 시스템은 다수의 도메인 또는 서브유닛으로 이루어질 수 있다. 이러한 프로테아제 시스템의 구조적 조직화에서 일반적인 주제는 새로운 타입의 분류를 유도할 수 있다.
특이성에 따른 분류
서열 정보 없이, 프로테아제는 다양한 타입으로 기능에 따라 분류되었다. 촉매작용되는 반응에 기초한 한 효소의 분류 및 명명은 효소 명명법에서 일반적인 원칙이다. 이 방법은 또한 효소의 EC 번호부여의 기초 원칙이다 (Enzyme Nomenclature 1992 Academic Press, Orlando). 두 타입의 프로테아제 (EC 3.4)는 Enzyme Nomenclatttre 1992 내에서, 엑소-펩티다제 (EC 3.4.11-19) 및 엔도-펩티다제 (EC 3.4.21-24,3.4.99)로 인식될 수 있다. 엔도-펩티다제는 말단으로부터 떨어진, 펩티드 사슬의 내부 영역에 있는 펩티드 결합을 절단한다. 엑소-펩티다제는 펩티드 사슬의 말단으로부터 잔기를 절단한다. 자유 N-말단에서의 엑소펩티다제 작용은 단일 아미노산 잔기, 디펩티드 또는 트리펩티드를 유리시키고 이는 각각 아미노 펩티다제 (EC 3.4.11), 디펩티딜 펩티다제 (EC 3.4.14) 및 트리펩티딜 펩티다제 (EC 3.3.14)라 부른다. 단일 아미노산을 유리하는 카르복시 말단으로부터 펩티드 프로세싱을 시작하는 프로테아제는 카르복시 펩티다제 (EC 3.4.16-18)라 부른다. 펩티딜-디펩티다제 (EC 3.4.15)는 카르복시 말단으로부터 디펩티드를 제거한다. 두 개의 아미노산 절반에서 디펩티드만을 특이적으로 절단하는 엑소- 및 엔도-펩티다제를 겸하는 것은 디펩티다제 (EC 3.4.13)이다. 오메가 펩티다제 (EC 3.4.19)는 치환되거나, 아니면 고리형이거나, 아니면 이소펩티드 결합에 의해 연결된 말단 잔기를 제거한다.
프로테아제가 펩티드 사슬을 절단하는 지점과는 별개로, 각 타입의 프로테아제에 있어서 기질에 있는 바람직한 아미노산의 성질에 기초하여 더 세분화할 수 있다. 일반적으로 광역, 중간 및 협소한 특이성으로 프로테아제를 구별할 수 있다. 몇몇 프로테아제는 단순히 그들이 가수분해하는 특정 단백질 또는 폴리펩티드 뒤에 명명된다 (예를 들어, 케라티나제, 콜라게나제, 엘라스타제). 협소한 특이성은 각각 제거되거나 또는 절단되는 하나의 특정 아미노산 또는 하나의 특정 서열에 구속된다. 프로테아제가 P1 또는 P1' 지점에 있는 하나의 아미노산에 대하여 특별한 선호도를 나타낼 때 이 아미노산의 명칭이 한정어가 될 수 있다. 예를 들어, 프롤릴 아미노 펩티다제는 펩티드의 아미노 말단으로부터 프롤린을 제거한다 (프롤린은 P1 잔기이다). X-Pro 또는 프롤린은 프롤린의 이미노 쪽 결합이 절단될 때 사용되며 (프롤린은 P1' 잔기), 예를 들어, 프롤린 카르복시펩티다제는 카르복시 말단으로부터 프롤린을 제거한다. 프롤릴 엔도펩티다제 (또는 Pro-X)는 프롤린의 뒤에서 절단하는 반면, 프롤린 엔도펩티다제 (X-Pro)는 프롤린의 앞에서 절단한다. 잘리기 쉬운 펩티드 결합의 앞에 있는 아미노산 잔기는 카르복시기를 펩티드 결합에 부여하는 아미노산 잔기를 지칭한다. 잘리기 쉬운 펩티드 결합의 뒤에 있는 아미노산 잔기는 아미노기를 펩티드 결합에 부여하는 아미노산 잔기를 지칭한다. 일반적인 관습에 따라 아미노산 사슬은 아미노 말단 (시작)으로부터 카르복시 말단 (끝)으로 진행하며 이에 따라 번호가 부여된다. 엔도프로테아제는 P1 또는 P1' 지점에 있는 특정 아미노산에 대하여 명백한 선호도를 나타낸다 (예를 들어, 글리실 엔도펩티다제, 펩티딜리신 엔도펩티다제, 글루타밀 엔도펩티다제). 게다가 프로제아제는 어떤 유사점을 공유하는 어떤 아미노산 집단에 선호도를 나타낼 수 있다. 바람직한 아미노산의 이러한 집단은 소수성 아미노산, 단지 부피가 큰 소수성 아미노산, 조금 소수성이거나 또는 단지 작은 아미노산, 양전하로 크게 대전된 아미노산 등을 포함할 수 있다. P1 및 P1' 잔기에 대한 선호도 외에, 특정 선호도 또는 배타성이 바람직하게는 프로테아제 상의 다른 하위부위 옆에 있는 잔기에 대하여 존재할 수 있다. 이러한 다중 선호도는 동시에 다중 결합 요구를 만족시키는 이들 서열에 대해서만 매우 특이적인 프로테아제를 일으킬 수 있다. 일반적으로 프로테아제가 차라리 더 무차별적인 효소라는 것을 이해해야 한다. 매우 특이적인 프로테아제 조차도 프로테아제의 일반적으로 관찰되는 선호도에 따르지 않는 펩티드를 절단할 수 있다. 게다가 pH, 온도, 이온 강도, 물의 활성, 용매의 존재, 경쟁 기질 또는 저해제의 존재와 같은 환경적 조건이 프로테아제의 선호도에 영향을 미칠 수 있다는 것을 이해해야 한다. 환경적 조건은 프로테아제에 영향을 미칠 뿐만 아니라 단백질성 기질이 프로테아제에게 부여되는 방법에도 영향을 미친다.
촉매작용 기작에 의한 분류
프로테아제는 그들의 촉매작용 기작에 기초하여 세분화될 수 있다. 각 촉매작용 기작에 있어서 특이성에 기초한 상기 분류는 기작의 각 타입에 기초하여 세분화할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 프로테아제의 4가지 주요 분류가 공지되어 있으며 활성 부위에서의 주요한 작용기에 의해 명명된다: 세린 프로테아제 (EC 3.4.21 엔도 펩티다제, EC 3.4.16 카르복시 펩티다제), 티올 또는 시스테인 프로테아제 (EC 3.4.22 엔도 펩티다제, EC 3.4.18 카르복시 펩티다제), 카르복시 또는 아스파르트 프로테아제 (EC 3.4.23 엔도 펩티다제) 및 메탈로 프로테아제 (EC 3.4. 24 엔도 펩티다제, EC 3.4.18 카르복시 펩티다제). 프로테아제의 각 촉매작용 타입 구성원에 대한 독특한 저해제가 있다. 이들 저해제는 프로테아제 활성 부위의 아미노산 잔기를 비가역적으로 변형시킨다. 예를 들어, 세린 프로테아제는 페닐 메탄 술포닐 플루오르 (PMSF) 및 디이소프로필 플루오로 포스페이트 (DFP)에 의해 비활성화되는데, 이는 활성 세린과 반응하지만 반면에 클로로메틸케톤 유도체는 촉매작용 3원소의 히스티딘과 반응한다. 포스포라미돈 및 1,10-페난트롤린은 전형적으로 메탈로 프로테아제를 저해한다. 펩스타틴에 의한 저해는 일반적으로 아스파르트 프로테아제를 의미한다. E64는 구체적으로 티올 프로테아제를 저해한다. 아마스타틴 및 베스타틴은 다양한 아미노펩티다제를 의미한다. 하나의 촉매작용 분류 내에서 조차도, 저해제에 대한 프로테아제 감수성에서의 실질적인 변화가 관찰된다. 이것은 프로테아제의 특이성과 어느 정도 관련될 수 있다. 기작 기초 저해제가 촉매작용 부위에 접근하는 것을 결합 부위 구조물이 막는 경우, 이러한 프로테아제는 저해로부터 벗어나며 저해에 기초된 기작 타입의 확인이 저해된다. 예를 들어 키모스테이션 (Chymostation)은 키모트립신 유사 특이성을 갖는, 세린 프로테아제에 대한 유력한 저해제이고, 엘라스타티날 (Elastatinal)은 세린 프로테아제와 유사하게 엘라스타제를 저해하며 트립신 또는 키모트립신과는 반응하지 않고, 4 아미도 PMSF (APMSF)는 트립신 유사 특이성으로 세린 프로테아제만을 저해한다. 프로테아제의 분류에서 저해제의 사용에 대한 광범위한 설명은 문헌[Barret 및 Salvesen, Proteinase Inhibitors, Elsevier Amstardam, 1986 ; Bond 및 Beynon (eds), Proteolytic Enzymes, A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989; Methods in Enzymology, eds E. J. Barret, 244,1994권 및 248,1995권; E. Shaw, Cysteinyl proteinases and their selective inactivation, Adv Enzymol. 63: 271-347 (1990)]에 기재되어 있다.
최적 수행 조건에 따른 분류
프로테아제의 촉매작용 기작 및 그의 분자배열 보존을 위한 필요조건은 주로 프로테아제가 사용될 수 있는 조건을 결정한다. 적용 조건 하에서 최적으로 작용하는 프로테아제를 발견하는 것이 주된 과제이다. 프로테아제가 작용해야하는 조건은 간혹 최적이 아니며 특정 적용에 대하여 이상적인 조건과 프로테아제를 최상으로 적응시키는 조건 간의 균형을 나타낸다. 프로테아제의 특정 성질 외에 단백질성 기질의 표현 또한 조건에 의존하며 그것으로서 어떤 조건이 단백질 가수분해에 가장 효과적인지를 결정한다는 것을 이해해야 한다. 적용과 관련된 효소에 대한 특징은 예를 들어 pH 의존도, 온도 의존도, 금속 이온에 대한 민감성 또는 의존도, 이온 강도, 염 농도, 용매 적합성을 포함한다. 또다른 주요 인자는 프로테아제의 특이적 활성이다. 효소의 특이적 활성이 높을수록, 효소는 특이적 전환을 덜 필요로 한다. 특이적 활성이 더 낮은 효소의 필요는 더 적은 비용 및 더 적은 단백질 오염 수준을 의미한다.
pH는 적용에서 프로테아제 작용을 결정하는 주된 매개변수이다. 그러므로 pH 의존도는 프로테아제 집단을 형성하는 데 중요한 매개변수이다. 인식되는 주요 군은 산성 프로테아제, 중성 프로테아제, 알칼리성 프로테아제 및 강 알칼리성 프로테아제이다. 최적 pH는 어느 정도까지만 단백질 분해 기작에 매치되는데, 예를 들어 아스파르트 프로테아제는 종종 산성 pH에서 최적을 나타내며, 메탈로프로테아제 및 티올 프로테아제는 종종 중성 pH 내지 약 알칼리성에서 최적으로 작용하고, 세린 프로테아제는 주로 알칼리성 및 강 알칼리성 pH에서 활성을 나타낸다. 각 분류에 있어서 예외가 공지되어 있다. 게다가 시스템의 전반적인 물 활성이 일정한 역할을 담당한다. 프로테아제의 pH 최적 조건은 프로테아제가 특정 조건 하의 특정 환경에서 그의 기질의 대다수에 대해 최적의 가수분해 속도를 나타내는 pH 범위로서 정의된다. 이 범위는, 예를 들어 하나의 pH 단위로 좁을 수도 있으며, 다소 넓게는 3 내지 4 pH 만큼 꽤 넓을 수 수 있다. 일반적으로 pH 최적 조건은 단백질성 기질의 성질에도 의존한다. 특이성 뿐만 아니라 대사전환 속도 둘다는 pH의 함수로서 변화할 수 있다. 어떤 효능에 있어서, 덜 바람직한 펩티드의 생산이 회피되도록 프로테아제의 pH 최적 조건으로부터 멀리 떨어져서 프로테아제를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 덜 바람직한 펩티드는 예를 들어 매우 짧은 펩티드 또는 쓴 맛을 야기하는 펩티드가 될 수 있다. 게다가 더 협소한 특이성은 대사전환 속도에 관하여 최적 조건으로부터 벗어난 조건을 선택하는 이유가 될 수도 있다. pH에 의존하는 특이성은 예를 들어 하나의 특정 지점 또는 하나의 특정 아미노산 전후에 있는 펩티드 사슬만을 절단하는 것과 같이 협소하거나, 또는 예를 들어 다수의 지점에 있는 사슬을 절단하거나 더욱 상이한 타입의 아미노산 전후를 절단하는 것과 같이 더 광범위할 수도 있다. 사실상 pH 의존도는 적용에 있어서 단백질 분해 활성을 조절하는 중요한 도구가 될 수도 있다. 프로세싱 도중 pH가 상승하는 경우 단백질 가수분해는 프로테아제를 비활성화시키도록 더 이상 처리할 필요없이 자발적으로 정지될 수 있다. 몇몇 경우에서 단백질 가수분해는 그 자체가 pH 상승을 유발시킬 될 수 있다.
프로테아제의 적용에 있어서 매우 중대한 것은 그들의 취급 및 작동에서의 안정성이다. 프로테아제 안정성은 작용 온도에 의해 강하게 영향받기 때문에, 안정성은 또한 열안정성으로서 지칭된다. 일반적으로 프로테아제의 안정성은 프로테아제가 특정 조건 하에서 그의 단백질 분해 활성을 얼마나 오래 보유하는가를 의미한다. 특정 조건은 발효 조건, 분리 및 효소의 다운스트림 프로세싱 도중의 조건, 저장 조건, 제제화 및 작동 또는 적용 조건을 포함할 수 있다. 특정 조건이 상승된 온도를 포함할 경우 안정성은 일반적으로 열안정성을 의미한다. 화학적 변형, 언폴딩, 응집 등과 같은 효소 비활성화에 대한 일반적인 이유 외에, 프로테아제가 갖는 주된 문제점은 그들이 쉽게 자가분해된다는 것이다. 특히 프로테아제의 활용에 있어서 온도 최적 조건은 프로테아제 집단을 형성하는 것과 관련된 기준이다. 상이한 한계가 있지만, 경제적으로 가장 유용한 한계는 프로테아제가 특정 적용에서 가장 생산적인 온도 또는 온도 범위이다. 프로테아제 생산성은 안정성 및 대사전환 속도 둘다의 함수이다. 일반적으로 상승된 온도가 대사전환 속도를 증가시키면, 빠른 비활성화가 대사전환 속도에서의 증가에 반대로 작용하여 궁극적으로는 낮은 생산성의 원인이 될 것이다. 주어진 프로세싱 조건 하에서 프로테아제의 구조적 안정성은 그의 최대 작동 온도를 결정할 것이다. 프로테아제가 그의 활성 구조를 잃는 온도는 종종 언폴딩 온도 또는 용융 온도로서 지칭되며 예를 들어, NMR, 원편광 2색성 분광법, 시차 주사 열량측정법 등과 같은 다양한 방법에 따라 측정될 수 있다. 프로테아제에 있어서 언폴딩은 일반적으로 자가분해 속도에서의 큰 증가를 동반한다.
저온을 요구하는 적용에서 프로테아제는 저온 내지 중온에서의 높은 고유 활성에 중점을 두도록 선택될 수 있다. 이러한 조건 하에서는 비활성화가 비교적 느리기 때문에, 이러한 조건 하에서 활성은 생산성을 주로 결정할 수 있다. 단기간 동안에만 프로테아제 활성이 필요한 과정에서, 프로테아제의 안정성은 프로테아제를 작동 중지시키는 스위치로서 사용될 수 있다. 이러한 경우에서 열에 매우 안정한 프로테아제 대신에 더 불안정한 프로테아제가 바람직할 수 있다.
적당한 프로테아제를 선택하는 데 있어서 일정한 역할을 담당할 수 있는 다른 환경적 매개변수는 염에 대한 프로테아제의 민감성일 수 있다. 다양한 천연 물질에서 저농도로 빈번하게 발견되는 금속 이온과의 적합성은 특정 적용에 있어서 결정적일 수 있다. 특히, 메탈로 프로테아제에 있어서 특정 이온이 촉매성 금속 이온을 대체할 수 있고 활성을 감소시키거나 또는 심지어 완전히 없애 수 있다. 몇몇 적용에서 금속 이온은 프로테아제에 배위결합된 금속 이온의 유실을 막기 위한 목적으로 첨가되어야 한다. 효소의 안정성 및 수명을 위해, 칼슘 이온은 단백질 결합된 칼슘의 해리를 막기 위하여 공급되어야 한다는 것이 공지되어 있다.
대부분의 미생물은 환경 조건에서의 변화에 적응하는 것에 관하여 일정한 내성을 나타낸다. 결론적으로, 적어도 유기체가 나타낼 수 있는 단백질 분해 스펙트럼은 적어도 유사한 내성을 나타내는 것으로 보인다. 이러한 단백질 분해 스펙스럼은 홀(hole) 스펙트럼을 차지하는 다수의 프로테아제 또는 광역 스펙트럼의 소수 프로테아제에 의해 커버될 수 있다. 미생물의 전체 단백질 분해 스펙트럼을 고려해 볼 때, 위치를 고려하는 것이 매우 중요할 수 있다.
단백질 분해 프로세싱 및 분해의 세포성 위치 및 특징규명
산업적 관점에서 세포로부터 분비되는 프로테아제는, 그들이 세포의 보호없이 생존해야 하기 때문에, 대규모 생산성 및 스트레스 내성에 관하여 특정한 장점을 가진다. 세포성 프로테아제의 거대한 집단은 용해성 및 막 결합에서 더욱 세분될 수 있다. 막 결합은 막의 내부는 물론 외부에 있는 프로테아제를 포함할 수 있다. 세포내 용해성 프로테아제는 그들이 발생하는 세포의 특정 구획에 따라 더욱 세분화될 수 있다. 세포는 어느정도 환경으로부터 프로테아제를 보호하고 세포는 세포 내의 조건을 제어하기 때문에, 세포내 프로테아제는 큰 환경적 변화에 더 민감할 수 있고 그들의 최적 조건은 특정 세포내 조건과 더 양호하게 상호관련될 수 있다. 프로테아제가 존재하는 세포 구획의 조건을 알면 그들의 선호도를 알 수 있다. 세포로부터 일단 분비된 세포외 프로테아제가 일반적으로 더이상의 어떠한 조절도 필요로 하지 않으면, 세포내 프로테아제는 종종 더욱 복잡하게 제어되고 조절된다.
특정 프로테아제의 기능에 관하여, 프로테아제의 위치는 종종 매우 중요하며; 예를 들어, 다수의 소포성 및 주변세포질 프로테아제는 단백질 분해에 관련되는 반면, 다수의 막-결합 프로테아제는 단백질 프로세싱에 중요하다 (Suarez Rendueles and Wolf, 1988).
프로테아제의 생물학적 성질 및 진화에 대한 포괄적인 개설은 문헌[van den Hombergh: Thesis Landbouwuniversiteit Wageningen: An analysis of the proteolytic system in Aspergillus in order to improve protein production ISBN 90-5485-545-2]에 기재되어 있고, 이는 참고문헌으로서 본 명세서에 포함된다.
프로테아제 문제점
미생물 프로테아제에 관심을 두는 중요한 이유는 이것이 생물공정 산업에서 사용되는 몇몇 발현 숙주에서 관찰되는 프로테아제 관련 발현 문제점이기 때문이다. 재조합 DNA 기술에 의한, 단백질 생성에서의 이종 숙주의 사용 증가로 인해 현재 이 문제에 촛점이 맞춰지게 되었는데, 이는 이종 단백질이 더 가수분해되는 경향이 있기 때문이다 (Archer 등, 1992; van den Hombergh 등, 1996b).
Saccharomyces cerevisiae에서, 이미 80년대 초에 프로테아제 문제점, 및 이 문제점을 극복하기 위한 표적화된 유전자 파괴 방법을 복잡하게 하는 몇몇 프로테아제의 관련성이 인식되었다. 분비 도중 단백질은 분비 경로에 있는 몇몇 단백질 분해 활성에 노출된다. 게다가, Aspergillus와 같은 독립영양 미생물에서 분비된 단백질은 몇몇 세포외 단백질분해 활성에 노출될 수 있다.
Aspergillus에서의 이종 발현된 단백질의 분해 문제점은 문헌[van den Hombergh Thesis Landbouwuniversiteit Wageningen: An analysis of the proteolytic system in Aspergillus in order to improve protein production ISBN 90-5485-545-2]에 상세히 기재되어 있고, 소 프로키모신, 인간 인터페론 α-2 tPA, GMCSF, IL6, 락토페린, 닭의 난백 리소자임, 돼지 pIA2, Aspergillus niger 펙틴 리아제 B, E. coli 엔테로톡신 B 및 β-글루코로니다제, 및 Erwinia carotovora 펙테이트 리아제 3의 발현에서 보고되었다.
단백질 분해의 문제는 단백질 생산에서의 몇몇 단계에서 해결될 수 있다. 생물공정 엔지니어는 저온에서의 다운스트림 프로세싱에 의해, 생성물 및 프로테아제의 조기 분리에 의해 또는 프로테아제 저해제의 사용에 의해 단백질 분해의 문제점을 해결할 수 있다. 이들은 모두 문제점을 성공적으로 줄일 수 있다. 그러나 이것은 확실하게 제거되지는 않는데, 그 이유는 분해의 대부분이 단백질의 생산 도중 생체내에서 일어나기 때문이다.
단백질 분해가 세포에서 제어되는 방법을 이해하는 데 있어서, 주된 의문은 단백질 분해를 촉발하는 인식 기작에 관련된다. 어느 정도에 있어서 단백질 분해될 수 있는 (이종의) 단백질은 미스폴딩으로 인해 변종 단백질로서 인식되거나, 또는 올바르게 폴딩되었을 때는 '외래' 단백질로서 인식되는데, 이는 단백질이 숙주에 특이적인 안정성에 필수적인 특징을 갖지 않기 때문이다. 다양한 타입의 스트레스는 세포에서의 전반적인 단백질 분해가 유의하게 증가하는 것을 야기할 수 있다. 단백질 분해 속도를 증가시키는 것으로 공지된 인자는 영양적 기아 및 다양한 다른 타입의 스트레스 (즉, 온도의 상승, 삼투 스트레스, 독성 기질 및 특정 이종 단백질의 발현)이다. 생체내에서 단백질 분해-관련 발현 문제점을 다루기 위해, 아래에 고찰될 것과 같이 몇몇 방법이 성공적으로 증명되었다. 그러나, 세포내 프로테아제에 의한 단백질 분해는 다수의 본질적인 대사작용 및 '하우스키핑' 반응에 관련되기 때문에, 사실상 '비-단백질 분해성' 세포는 존재할 수 없다는 것을 명심해야만 한다. 그러므로 단백질 분해를 감소시키는 과정은 항상, 감소된 단백질 분해를 일으키는 변화된 유전적 백그라운드가 감소된 단백질 생산 (예를 들어, 감소된 성장 속도 또는 포자형성)을 일으킬 수 있는 잠재적인 2차 효과에 대하여 분석되어야 하는 과정일 것이다.
사상 진균 발현 숙주에서 프로테아제의 파괴
Berka 및 coworkers (1990)는 Aspergillus awamori pepA 유전자의 클로닝 및 파괴를 설명한다. 더욱 최근에, Aspergillus niger에 있는 3개의 파괴된 아스파르틸 프로테아제가 설명되었다. 주요 세포외 아스파르틸 프로테아제 및 주요 소포성 아스파르틸 프로테아제 둘다에 대한 파괴제가 설명되었다. 이중 및 삼중 파괴제는 재조합을 통해 생성되어 프로테아제 스펙트럼 및 발현에 대하여, 그리고 매우 쉽게 단백질 분해되는 Aspergillus niger 펙틴 리아제 PELB 단백질의 분비에 대하여 시험되었다 (van den Hombergh 등, 1995). pepA 및 pepB의 파괴는 둘다 세포외 프로테아제 활성의 감소를 일으키며, 각각 80% 및 6%이다. ΔpepE 파괴에서 다른 (소포성) 프로테아제 활성 또한 다른 소포성 프로테아제에 대한 단백질 분해 캐스케이드의 비활성에 의해 심하게 영향 받는다. 감소된 세포외 활성은 PELB의 감소된 시험관내 분해와 상호연관되며 pelB의 생체내 발현을 향상시킨다 (van den Hombergh 등, 1996f).
프로테아제 결핍 (prt) 돌연변이체 사상 진균류
몇몇 Aspergillus 프로테아제 결핍 돌연변이체는 단백질 생산이 향상되었는가에 대하여 연구되었다. Archer 및 그의 동료는 Mattern 및 그 동료들에 의해 생성된(1992) Aspergillus niger 이중 prt 돌연변이체의 상등액에서 Hen 난백 리소자임의 감소된 단백질 분해를 설명하고 분해가 없지 않았음에도 불구하고, 유의하게 감소된다고 결론지었다. Van den Hombergh 등은(1995) Aspergillus niger PELB의 시험관내 분해가 그들이 분리한 7개의 prt 보충 군 모두에서 감소된다는 것을 밝혔다. 사실상 prtB, prtF 및 prtG 돌연변이체에서 어떠한 분해도 관찰되지 않는다. 최근에, pelB 유전자의 발현은 시험된 6개의 보충 군 (prtA 내지 prtF)에서 향상되는 것으로 나타났으며 가장 높은 발현 수준은 prtB, prtF 및 prtG 돌연변이체에서 관찰되었다. 야생형 활성에 비하여 2 내지 80%로 변화하는 잔여 세포외 단백질 분해 활성을 포함하는 단일 돌연변이체 외에, 이중 돌연변이체는 재조합 및 돌연변이 유발의 부가적인 라운드에 의해 생성된다. 이 방법을 통하여 이중 prt 돌연변이체가 선택되고 그의 특징이 규명되었는데, 상기 돌연변이체는 그의 모 균주에 비해 감소된 PELB 분해를 보였다.
파괴 또는 돌연변이 유발을 통해 프로테아제 활성을 제거하는 대신에 감소된 단백질 분해는 단백질 분해활성을 간섭하는 하향-조절을 통해서도 성취될 수 있다. 이것은 유전자의 프로모터 또는 다른 조절 서열을 유전적으로 변경함으로써 성취될 수 있다. Fraissinet-Tachet 및 동료에 의해 밝혀진 바와 같이(1996), Aspergillus niger에서 세포외 프로테아제는 모두 탄소 이화생성물 억제 및 질소 대사산물 억제에 의해 조절된다. 영양적 기아 또한 강하게 증가된 세포에서의 전반적인 단백질 분해 속도를 야기하는데, 이는 세포가 영양분은 부족하지만, 기아 조건 하에서 필요하지 않거나 또는 더 적은 양으로만 필요한 단백질은 소유하고 있다는 것을 의미한다. 높은 포도당 및 암모늄 농도를 함유한 배지 상에서의 고발현을 허용하는 발현 전략에서, 감소된 단백질 분해가 보고되었다. 몇몇 구조적 포도당 분해 프로모터 (gpd 및 pkiA)는 이들 조건 하에서 높게 발현되고 계속적인 발효에서 (이종) 유전자 발현을 유도하는 데 사용될 수도 있다. 부과된 영양적 기아의 타입은 다양한 정도로 상이한 프로테아제에 영향을 미칠 수 있는데, 이는 주어진 공정에서의 영양 조건의 중요성은 관련된 단백질 분해의 타입에 의존한다는 것을 의미한다. 그러므로, 특정 단백질 분해는 많은 대규모 발효 공정에 빈번하게 사용되는 기질 제한의 조건에 의해 유도될 수 있다.
오늘날 프로테아제 문제점은 하나 이상의 상기 방법에 의해 일부 해결될 수 있다. 그러나 아직 확인되지 않은 단백질 분해효소의 잔여 단백질 분해 활성은 여전히 당업계에서 주된 문제점이 된다. 원치 않는 단백질 분해의 수준을 더욱 감소시키기 위하여, 당업계에는 동종 및 이종 발현 단백질의 분해에 관련된 신규 프로테아제를 확인할 필요성이 존재한다. 본 발명은 이러한 신규 프로테아제를 암호화하는 신규 프로테아제 유전자 서열을 제공한다. 일단 신규 프로테아제의 1차 서열이 공지되면, 하나 이상의 상기 재조합 DNA 방법은 감소된 단백질 분해 활성을 갖는 (넉-아웃) 돌연변이체를 생산하는 데 이용될 수 있다.
매우 많은 수의 산업적 공정에서 프로테아제가 널리 사용됨에도 불구하고, 현재 효소는 하기 성질 중 적어도 하나에 관하여 유의한 단점을 갖는다.
동물 사료에 첨가될 때, 현재 프로테아제는 예들 들어, 돼지 및 가금의 위장 (GI) 관에 존재하는 소화 효소에 대하여 충분한 저항력이 없다.
또다른 측면에서, 현재 이용가능한 효소는 압출 또는 펠릿 형성 도중 적용되는 특정 (높은) 온도 및 (높은) 압력 조건에 대하여 충분한 저항력이 없다.
또한 현재의 효소는, 많은 식품, 음료 제품에서는 물론이고 대부분 동물의 GI 관에서 보편적인 조건인 3 내지 7의 pH 범위에서 충분한 활성을 나타내지 않는다.
또다른 양태에 있어서 현재 이용가능한 프로테아제의 특이성은 특정 "프로테아제 내성" 단백질을 분해 또는 용해하는 기존 효소의 무력화를 일으키는 데 있어서 매우 제한적이고 따라서 낮은 펩티드 또는 아미노산 수율을 일으킨다. 게다가 새로운 특이성을 갖는 프로테아제는 새로운 펩티드의 합성을 허용한다.
현재 이용가능한 효소의 또다른 결점은 그들의 낮은 특이적 활성이다.
그러므로 다수의 적용에 있어서, 분해 효소, 고온 및/또는 고압에 대하여 보다 높은 저항성을 나타내고 가수분해의 부위에 관하여 신규 특이성을 나타내는 프로테아제가 절실히 필요하다는 것은 분명하다. 본 발명은 이러한 효소를 제공한다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 신규 프로테아제를 암호화하는 신규 뉴클레오티드를 제공하는 것이다. 추가 목적은 자연적 및 재조합으로 생산된 프로테아제는 물론이고 이들을 생산하는 재조합 균주를 제공하는 것이다. 이러한 균주는 더 빨리 또는 더 높은 수율로 전통적인 발효 제품을 생산하는 데 사용될 수도 있다. 본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 프로테아제를 생산하는 것이 결핍된 사상 진균 균주를 제공하는 것이다. 이러한 균주는 이종 또는 동종 단백질의 더욱 효과적인 생산에 사용될 수 있다. 항체 및 융합 폴리펩티드뿐만 아니라 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조 및 사용 방법도 본 발명의 일부이다.
발명의 개요
본 발명은 신규 프로테아제를 암호화하는 신규 뉴클레오티드를 제공한다.
더욱 특히, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 서열과 (바람직하게는 고도의 긴축 조건 하에서) 혼성체를 형성하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 서열과 약 60%, 바람직하게는 65%, 더 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상동성을 나타내는 핵산을 제공한다.
더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 사상 진균, 바람직하게는 Aspergillus로부터 수득할 수 있는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공하는데, 특히 Aspergillus niger가 바람직하다.
한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171 또는 그의 기능적 등가물로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171 또는 그의 기능적 등가물로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 폴리펩티드의 적어도 하나의 기능적 도메인을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
바람직한 구체예에서 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 프로테아제 유전자를 제공한다. 또다른 양태에서 본 발명은 폴리뉴클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171 또는 그 폴리펩티드의 변이체 또는 단편으로 구성된 군으로부터 선택되는 Aspergillus niger 프로테아제를 암호화하는 cDNA를 제공한다. 바람직한 구체예에서, cDNA는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114 또는 그의 기능적 등가물로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 갖는다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 게놈 클론은 또한 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57 또는 그의 단편에 따른 서열 중 임의의 서열에 상응하는 게놈 영역을 특이적으로 증폭하는 데 적합한 프로브를 선택하는 단계, 적당한 조건 하에서 Aspergillus (예를 들어 Aspergillus niger)와 같은 적당한 유기체로부터 수득된 게놈 DNA와 프로브를 혼성화하는 단계, 예를 들어 PCR (중합효소 연쇄 반응)에 의해 원하는 단편을 증폭한 후 정제하는 단계 및 증폭된 단편을 클로닝하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
훨씬 더 바람직한 구체예에서, 본 발명은 본 발명에 따른 게놈 폴리뉴클레오티드의 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는데, SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열이 바람직하다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 Aspergillus niger와 같은 적당한 숙주 유기체 내로 클로닝하여 발현시킴으로써 수득할 수 있는 cDNA를 제공한다.
본 발명에 따른 폴리펩티드는 또한 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 Aspergillus niger와 같은 적당한 숙주 유기체 내로 클로닝하여 발현시킴으로써 수득될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터, 프라이머, 프로브, 및 본 발명에 따른 DNA를 증폭 또는 검출하는 데 사용될 수 있는 단편에 관한 것이다.
더욱 바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열이 Aspergillus niger 또는 Aspergillus oryzea와 같은 적당한 숙주 세포에서 암호화된 아미노산 서열의 발현에 적합한 조절 서열과 기능적으로 연결된 벡터가 제공된다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 및 벡터의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 이종 또는 동종 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합으로 생산된 숙주 세포에 관한 것이다.
한 구체예에서, 본 발명은 제매개변수 숙주 세포를 제공하는데, 여기서 본 발명에 따른 프로테아제의 발현은 유의하게 감소되거나 또는 프로테아제의 활성이 감소되거나 또는 프로테아제가 비활성화되기도 한다. 이러한 재조합체는 동종 또는 이종 단백질의 발현에 특히 유용하다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하는데, 여기서 본 발명에 따른 프로테아제의 발현이 유의하게 증가하거나 또는 프로테아제의 활성이 증가된다. 이러한 재조합체는 요구되는 단백질 분해성 절단이 속도 제한 단계가 되는 경우 돌연변이가 심각하게 제한되는 동종 또는 이종 단백질의 발현에 특히 유용하다.
또다른 구체예에서 본 발명은 본 발명에 따른 이종 또는 동종 DNA, 바람직하게는 신호 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 함유하는 재조합으로 생산된 숙주 세포를 제공하는데, 여기서 세포는 본 발명에 따른 기능적 프로테아제를 생산할 수 있는 세포, 바람직하게는 본 발명에 따른 프로테아제를 과발현할 수 있는 세포로서, 예를 들어 본 발명에 따른 유전자 또는 cDNA의 증가된 카피 수를 포함하는 Aspergillus 균주이다.
또다른 구체예에서 본 발명은 본 발명에 따른 이종 또는 동종 DNA를 함유하는, 재조합으로 생산된 숙주 세포를 제공하고, 여기서 세포는 본 발명에 따른 기능적 프로테아제를 분비할 수 있는데, 바람직하게는 본 발명에 따른 프로테아제를 과발현할 수 있는 세포로서, 예를 들어 본 발명에 따른 유전자 또는 cDNA의 증가된 카피 수를 포함하는 Aspergillus 균주이다.
본 발명의 또다른 양태에서, 정제된 폴리펩티드가 제공된다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 본 발명에 다른 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화되는 폴리펩티드를 포함한다. SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171 또는 그의 기능적 등가물로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 폴리펩티드가 특히 바람직하다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드와 반응하는 항체를 제공한다. 이들 항체는 다클론 항체일 수도 있지만, 단일클론 항체가 특히 바람직하다. 이러한 항체는 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 정제하는 데 특히 유용하다.
본 발명에 따른 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질 또한 본 발명의 범위 내에 존재한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드 또는 그의 기능적 등가물의 존재를 검출하거나 아니면 본 발명에 따른 DNA 또는 그의 단편 또는 기능적 등가물의 존재를 검출함으로써 아스페르길루스증을 진단하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 산업적 공정에 있어서 본 발명에 따른 프로테아제의 용도에 관한 것이다.
폴리뉴클레오티드
본 발명은 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 프로테아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 기능적 등가물을 제공한다. 이들 유전자의 서열은 Aspergillus niger로부터 수득된 게놈 클론을 서열분석함으로써 결정된다. 본 발명은 이들 프로테아제를 암호화하는 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 그들의 완전한 cDNA 및 그의 암호화 서열을 제공한다. 따라서, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오티드 또는 그의 기능적 등가물에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 긴축 조건 하에서, 바람직하게는 고도의 긴축 조건 하에서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 혼성화할 수 있는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 유리하게, 이러한 폴리뉴클레오티드는 사상 진균, 특히 Aspergillus niger로부터 얻을 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
더욱 특히, 본 발명은 긴축 조건 하에서, 바람직하게는 고도의 긴축 조건 하에서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 혼성화할 수 있는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다. 유리하게, 이러한 폴리뉴클레오티드는 사상 진균, 특히 Aspergillus niger로부터 얻을 수 있다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 뉴클레오티드 서열을 갖는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
삭제
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 폴리펩티드 또는 그의 기능적 등가물의 적어도 하나의 기능적 도메인을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드에 관련된다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "유전자" 및 "재조합 유전자"는 Aspergillus niger 프로테아제와 같은 단백질을 암호화하는 오픈 리딩 프레임을 포함하는, 염색체 DNA로부터 분리될 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 유전자는 암호화 서열, 비-암호화 서열, 인트론 및 조절 서열을 포함할 수 있다. 더욱이, 유전자는 본 명세서에서 정의된 것과 같은 분리된 핵산 분자를 지칭한다.
SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 분자 또는 그의 기능적 등가물과 같은 본 발명의 핵산 분자는, 표준 분자 생물학 기술 및 본 명세서에서 제공된 서열 정보를 이용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열의 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열의 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 혼성화 프로브로서 이용하는 경우, 본 발명에 따른 핵산 분자는 표준 혼성화 및 클로닝 기술을 이용하여 분리될 수 있다 (예를 들어, Sambrook, J., Fritsh, E. F., and Maniatis, T. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
더욱이, SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열의 일부 또는 전부를 포함하는 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 함유된 서열 정보를 기초로 하여 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 분리될 수 있다.
본 발명의 핵산은 cDNA, mRNA 또는 대안으로 게놈 DNA를 주형으로 이용하고, 표준 PCR 증폭 기술에 따른 적합한 올리고뉴클레오티드를 이용하여 증폭될 수 있다. 이렇게 증폭된 핵산의 특징은 적당한 벡터 내로 클로닝되고 DNA 서열분석 검정법에 의해 규명될 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열에 상응하거나 이와 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 자동 DNA 합성기를 이용한 표준 합성 기술에 의해 제조될 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로 표시되는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열은 Aspergillus niger 프로테아제 cDNA의 암호화 영역에 상응한다. 이 cDNA는 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 Aspergillus niger 프로테아제 폴리펩티드를 암호화하는 서열을 포함한다.
또다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 분리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로 표시되는 뉴클레오티드 서열의 상보체인 핵산 분자 또는 이들 뉴클레오티드 서열의 기능적 등가물을 포함한다.
또다른 뉴클레오티드 서열에 상보적인 핵산 분자는 다른 뉴클레오티드 서열에 충분히 상보적이어서 그것이 다른 뉴클레오티드 서열과 혼성화함으로써 안정한 이합체를 형성할 수 있는 것이다.
본 발명의 한 양태는 생물학적 활성을 나타내는 단편 또는 도메인과 같이 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 기능적 등가물을 암호화하는 분리된 핵산 분자뿐만 아니라, 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 확인하기 위한 혼성화 프로브로서의 사용에 충분한 핵산 분자 및 핵산 분자의 증폭 또는 돌연변이에서 PCR 프라이머로서 사용하기에 적합한 이러한 핵산 분자의 단편에 관한 것이다.
"분리된 폴리뉴클레오티드" 또는 "분리된 핵산"은 그것이 유래된 유기체의 자연 발생 게놈에서 (5' 말단 및 3' 말단) 모두에 바로 인접한 암호화 서열에 바로 인접하지 않는 DNA 또는 RNA이다. 따라서 한 구체예에서, 분리된 핵산은 암호화 서열에 바로 인접한 5' 비-암호화 (예를 들어, 프로모터) 서열의 일부 또는 전부를 포함한다. 그러므로 이 용어는 예를 들어, 벡터 내로, 자율적으로 복제하는 플라스미드 또는 바이러스 내로, 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA 내로 도입된 재조합 DNA, 또는 다른 서열에 독립되어 개별적 분자로서 존재하는 (예를 들어, PCR 또는 제한효소인 엔도뉴클리아제 처리에 의해 생산된 cDNA 또는 게놈 DNA와 같은) 재조합 DNA를 포함한다. 이는 또한 (재조합 DNA 기술에 의해 생산될 때) 세포성 물질, 바이러스성 물질, 또는 배양 배지, 또는 (화학적으로 합성될 때) 화학물질 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없는 추가적인 폴리펩티드를 암호화하는 혼성체 유전자의 일부인 재조합 DNA를 포함한다. 게다가, "분리된 핵산 단편"은 단편으로서 자연적으로 발생하지 않고 자연 상태에서는 발견되지 않는 핵산 단편이다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산 분자"는 DNA 분자 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA) 및 RNA 분자 (예를 들어, mRNA) 및 뉴클레오티드 유사체를 이용하여 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함하도록 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥이 될 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 핵산은 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 유도체 (예를 들어, 이노신 또는 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)를 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 변경된 염기쌍 형성 능력 또는 뉴클레아제에 대해 증가된 저항성을 갖는 핵산을 제조하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 또다른 구체예는 프로테아제 핵산 분자에 대해 안티센스인 분리된 핵산 분자, 예를 들어 프로테아제 핵산 분자의 암호화 가닥을 제공한다. 또한, 본 명세서에 기재된 핵산 분자의 상보적 가닥도 본 발명의 범위에 포함된다.
서열분석 에러
본 명세서에서 제공된 것과 같은 서열 정보는 잘못 확인된 염기의 포함을 필요로 하는 것처럼 협소하게 해석되어서는 안된다. 여기에 개시된 특정 서열은 사상 진균, 특히 Aspergillus niger로부터 완전한 유전자를 분리하는 데 손쉽게 사용될 수 있으며 분리된 Aspergillus niger는 더 용이하게 서열분석됨으로서 서열분석 에러를 확인할 수 있다.
달리 명시하지 않은 한, 본 명세서에서 DNA 분자를 서열분석함으로써 결정된 모든 뉴클레오티드 서열은 자동 DNA 서열분석기를 이용하여 결정되며 본원에서 결정된 DNA 분자에 의해 암호화되는 폴리펩티드의 모든 아미노산 서열은 상기와 같이 결정된 DNA 서열의 번역에 의해 예측된다. 그러므로, 이 자동화된 방법에 의해 결정된 특정 DNA 서열에 대하여 당업계에 공지된 것과 같이, 본원에서 결정된 특정 뉴클레오티드 서열은 몇몇 에러를 포함할 수 있다. 자동 조작에 의해 결정된 뉴클레오티드 서열은 서열분석된 DNA 분자의 실제 뉴클레오티드 서열과 전형적으로 적어도 약 90%, 더욱 전형적으로는 적어도 약 95% 내지 적어도 약 99.9% 동일하다. 실제 서열은 당업계에 공지된 수동 DNA 서열분석법을 포함한 다른 방법에 의해 더욱 정확하게 결정될 수 있다. 당업계에 또한 공지된 것과 같이, 실제 서열에 비하여 결정된 뉴클레오티드 서열에 있는 단일 삽입 또는 결실은 측정된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 예측되는 아미노산 서열이 이러한 삽입 또는 결실의 지점에서 시작되는 서열분석된 DNA 분자에 의해 실제로 암호화되는 아미노산 서열과는 완전히 상이하도록 뉴클레오티드 서열의 번역에서 프레임 쉬프트를 야기할 것이다.
당업자라면 이러한 잘못 확인된 염기를 확인할 수 있고 이러한 에러를 어떻게 수정할지를 안다.
핵산 단편, 프로브 및 프라이머
본 발명에 따른 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 나타난 핵산 분자의 부분 또는 단편만을 포함할 수 있고, 예를 들어 단편은 프로브 또는 프라이머로서 또는 프로테아제 단백질의 일부를 암호화하는 단편으로서 사용될 수 있다. 프로테아제 유전자의 암호화 서열 및 cDNA로부터 결정된 뉴클레오티드 서열은 다른 프로테아제 패밀리 구성원뿐만 아니라 다른 종으로부터 유래된 프로테아제 상동체를 확인하고/확인하거나 클로닝하는 데 사용되도록 디자인된 프로브 및 프라이머의 생성을 허용한다. 프로브/프라이머는 전형적으로 실질적으로 정제된 올리고뉴클레오티드를 포함하는데 이는 바람직하게는 고도의 긴축 조건 하에서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로 표시되는 뉴클레오티드 서열 또는 그의 기능적 등가물의, 적어도 약 12 또는 15, 바람직하게는 약 18 또는 20, 바람직하게는 약 22 또는 25, 더욱 바람직하게는 약 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 또는 75개 또는 그 이상의 연속적인 뉴클레오티드와 혼성화하는 뉴클레오티드 서열의 영역을 전형적으로 포함한다.
프로테아제 뉴클레오티드 서열에 기초한 프로브는 예를 들어 다른 유기체에서 동일한 단백질 또는 상동성 단백질을 암호화하는 전사체 또는 게놈 프로테아제 서열을 검출하는 데 사용될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 프로브는 그 자신에 부착된 표지 군을 추가로 포함할 수 있는데, 예를 들어 표지 군은 방사성동위원소, 형광 화합물, 효소, 또는 효소 보조인자가 될 수 있다. 이러한 프로브는 프로테아제 단백질을 발현하는 세포를 확인하기 위한 진단용 시험 키트의 부분으로서 사용될 수 있다.
동일성 및 상동성
용어 "상동성" 또는 "퍼센트 동일성"은 본 명세서에서 호환되게 사용된다. 본 발명의 목적에 있어서, 두 아미노산 서열 또는 두 핵산 서열의 퍼센트 동일성을 측정하기 위해, 서열은 최적 비교 목적을 위해 정렬되는 것으로 정의된다 (예를 들어 간극은 제 2 아미노 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 제 1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 도입될 수 있다). 그 다음 상응하는 아미노산 지점 또는 뉴클레오티드 지점에 있는 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 비교한다. 제 1 서열에 있는 지점이 제 2 서열에서 상응하는 지점과 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되면, 분자는 그 지점에서 동일하다. 두 서열 사이의 퍼센트 동일성은 동일한 지점의 수를 서열로 나눈 함수이다 (즉, % 동일성 = 동일한 지점의 수/전체 지점의 수 (즉, 중복된 지점) x 100).
바람직하게, 두 서열은 동일한 길이이다.
당업자는 몇몇 상이한 컴퓨터 프로그램이 두 서열간의 상동성을 측정하는 데 이용가능하다는 사실을 알 것이다. 예를 들어, 두 서열간의 서열 비교 및 퍼센트 동일성의 측정은 수학적 알고리즘을 이용하여 성취될 수 있다. 바람직한 구체예에서, 두 아미노산 간의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램 ( http://www.gcg.com에서 이용가능)에 포함되어 있는 Needleman 및 Wunsch (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)) 알고리즘, Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 간극 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용하여 측정한다. 당업자는 상이한 알고리즘을 이용할 때 이들 모든 상이한 매개변수가 약간 상이한 결과를 산출하기는 하지만 두 서열의 전반적인 퍼센트 동일성은 유의하게 변경되지 않는다는 것을 이해할 것이다.
또다른 구체예에서, 두 뉴클레오티드 서열 간의 퍼센트 동일성은 GCG 소프트웨어 패키지에 있는 GAP 프로그램 (http://www.gcg.com에서 이용가능), NWSgapdna.CMP 매트릭스, 40, 50, 60, 70 또는 80의 간극 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용하여 측정한다. 또다른 구체예에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열간의 퍼센트 동일성은 ALIGN 프로그램 (버전 2.0) (http:// veqa/iqh.cnrs.fr/bin/aliqn-quess.cqi에서 이용가능)에 포함된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘 (CABIOS, 4: 11-17 (1989)), PAM120 중량 잔기 표, 12의 간극 길이 페널티 및 4의 간극 페널티를 이용하여 측정한다.
본 발명의 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어 다른 패밀리 구성원 또는 관련된 서열을 확인하도록 공개 데이터베이스에 대한 검색을 수행하기 위한 "의문 서열"로서 이용될 수도 있다. 이러한 검색은 문헌(Altschul, 등 (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 검색은 NBLAST 프로그램 (스코어 = 100, 단어길이 = 12)으로 수행되어 본 발명의 프로테아제 핵산 분자와의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램 (스코어 = 50, 단어길이 = 3)으로 수행되어 본 발명의 프로테아제 단백질 분자와의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적에 있어서 간극이 생긴 정렬을 얻기 위하여, 문헌(Altschul 등의 (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402)에서 설명된 것과 같은 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 매개변수가 이용될 수 있다. http:// www.ncbi.nlm.nih.go를 참조한다.
혼성화
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "혼성체형성"은 서로에 대하여 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 더 바람직하게는 적어도 약 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85% 내지 90%, 더 바람직하게는 적어도 약 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열이 전형적으로 서로 혼성화되어 남아있는 혼성화 및 세척 조건을 기술하기 위한 것이다.
바람직한, 이러한 혼성화 조건의 제한되지 않는 예는 약 45℃에서 6X 염화나트륨/시트르산 나트륨 (SSC)에서 혼성화한 후, 50℃, 바람직하게는 55℃, 바람직하게는 60℃ 및 더욱 바람직하게는 65℃에서 1 X SSC, 0.1 % SDS에서의 1회 이상 세척하는 것이다.
고도의 긴축 조건은 예를 들어, 68℃에서 5x SSC/5x Denhardt 용액/1.0% SDS에서의 혼성화 및 실온에서 0.2x SSC/0.1% SDS에서의 세척을 포함한다. 대안으로 세척은 42℃에서 수행될 수 있다.
당업자는 어떤 조건이 긴축 및 고도의 긴축 혼성화 조건에 적용되는지 알 것이다. 이러한 조건에 관한 부가적인 설명은 당업계에서 손쉽게 이용가능하며, 예를 들어 문헌[Sambrook 등, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y.; 및 Ausubel 등 (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N. Y.)]이다.
물론, (mRNAs의 3' 말단 폴리(A) 트랙과 같은) 폴리 A 서열, 또는 T (또는 U) 잔기의 상보적 가닥에만 혼성화하는 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 핵산의 일부에 특이적으로 혼성화하는 데 사용되는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 포함되지 않는데, 이는 이러한 폴리뉴클레오티드가 폴리 (A) 가닥 또는 그의 상보체를 포함하는 특정 핵산 분자 (예를 들어 실지로 어떤 이중 가닥 cDNA 클론)와도 혼성화하기 때문이다.
다른 유기체로부터 전장 DNA의 수득
전형적인 방법에서, 다른 유기체 (예를 들어, 사상 진균)로부터, 특히 Aspergillus 종으로부터 제작된 cDNA 라이브러리가 스크리닝될 수 있다.
예를 들어, Aspergillus 균주는 노던 블롯 분석법에 의하여 상동성 프로테아제 폴리뉴클레오티드에 대해 스크리닝될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드에 대해 상동성을 나타내는 전사체의 검출 후, cDNA 라이브러리는 당업자에게 공지된 표준 기술을 이용하여 적절한 균주로부터 분리된 RNA로 제작될 수 있다. 대안으로, 전체 게놈 DNA 라이브러리는 본 발명에 따른 프로테아제 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 프로브를 사용하여 스크리닝될 수 있다.
상동 유전자 서열은, 예를 들어 본 명세서에서 교시된 것과 같은 뉴클레오티드 서열을 기초로 하여 디자인된 두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 두 개의 변성 올리고뉴클레오티드 프라이머 풀을 이용하여 PCR을 수행함으로써 분리될 수 있다.
반응을 위한 주형은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 발현하는 것으로 공지되거나 또는 그럴 것으로 생각되는 균주로부터 준비된 mRNA의 역전사에 의해 수득한 cDNA가 될 수 있다. PCR 생성물은 서브클로닝하고 증폭된 서열이 새로운 프로테아제 핵산 서열, 또는 그의 기능적 등가물의 서열을 나타내는지를 보증하기 위해 서열분석된다.
PCR 단편은 그 다음에 다양한 공지된 방법에 의해 전장 cDNA 클론을 분리하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 증폭된 단편은 표지되어 박테리오파지 또는 코스미드 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 대안으로, 표지된 단편은 게놈 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.
PCR 기술은 또한 다른 유기체로부터 전장의 cDNA 서열을 분리하는 데 이용될 수 있다. 예를 들어, RNA는 표준 방법에 따라, 적절한 세포 또는 조직 공급원으로부터 분리될 수 있다. 역전사 반응은 RNA 상에서 첫번째 가닥 합성의 기폭을 위해 증폭된 단편의 대부분의 5' 말단에 대하여 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.
최종 RNA/DNA 혼성체는 그 다음 표준 말단 트랜스퍼라제 반응을 이용하여 (예를 들어, 구아닌으로) "꼬리달기"할 수 있고, 혼성체는 RNase H로 효소처리될 수 있으며, 그 다음 두번째 가닥 합성이 (예를 들어, poly-C 프라이머로) 기폭될 수 있다. 따라서, 증폭된 단편의 cDNA 서열 업스트림은 손쉽게 분리될 수 있다. 유용한 클로닝 방법의 검토를 위해 예를 들어 상기 문헌(Sambrook 등 및 Ausubel 등)을 참조한다.
벡터
본 발명의 또다른 양태는 프로테아제 단백질을 암호화하는 핵산 또는 그의 기능적 등가물을 함유하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "벡터"는 그것이 연결되어 있는 또다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 타입은 "플라스미드"로서, 이는 부가적인 DNA 분절이 라이게이션될 수 있는 고리모양의 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또다른 타입은 바이러스 벡터인데, 여기서 부가적인 DNA 분절은 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 어떤 벡터는 그것이 도입된 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아의 복제 개시점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 후 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 그럼으로써 숙주 게놈과 함께 복제된다. 더욱이, 어떤 벡터는 그들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 검출할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로서 지칭된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드의 형태이다. 용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 통상적으로 사용되는 벡터 형태이기 때문에 본 명세서에서는 호환적으로 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결핍 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 이러한 다른 형태의 발현 벡터를 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 숙주 세포에서 핵산의 발현에 적합한 형태로 본 발명의 핵산을 포함하는데, 이는 재조합 발현 벡터가, 발현에 사용되는 숙주 세포에 기초하여 선택되고 발현되는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다는 것을 의미한다. 재조합 발현 벡터 내에서, "작동가능하게 연결된"은 관심있는 뉴클레오티드 서열이 (예를 들어, 시험관내 전사/번역 시스템에서 또는 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 때 숙주 세포에서) 뉴클레오티드 서열의 발현을 허용하는 방식으로 조절 서열(군)에 연결된 것을 의미한다. 용어 "조절 서열"은 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함하도록 의도된다. 이러한 조절 서열은 예를 들어, 문헌[Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 기재되어 있다. 조절 서열은 많은 타입의 숙주 세포에서 뉴클레오티드 서열의 항시적 발현을 지시하는 것들 및 특정 숙주 세포에서만 뉴클레오티드 서열의 발현을 지시하는 것들 (예를 들어, 조직-특이적 조절 서열)을 포함한다. 발현 벡터의 디자인이 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존할 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포 내로 도입됨으로써 본 명세서에서 설명된 것과 같이 핵산에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드를 생산할 수 있다 (예를 들어 프로테아제 단백질, 프로테아제 단백질의 돌연변이체 형태, 그의 단편, 변이체 또는 기능적 등가물, 융합 단백질 등).
본 발명의 재조합 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포에서 프로테아제 단백질의 발현을 위해 디자인될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 단백질은 E. coli와 같은 박테리아 세포, (배큘로바이러스 발현 벡터를 이용한) 곤충 세포, 효모 세포 또는 포유동물 세포에서 발현될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 문헌[Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]에 더 상술되어 있다. 대안으로, 재조합 발현 벡터는 예를 들어, T7 프로모터 조절 서열 및 T7 폴리머라제를 이용하여, 시험관에서 전사되고 번역될 수 있다.
본 발명에서 유용한 발현 벡터는 염색체-, 에피솜- 및 바이러스-유래 벡터를 포함하는데, 이는 예를 들어, 박테리아 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효소 염색체 요소, 및 배큘로바이러스, 파포바 바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스, 위광견병 바이러스 및 레트로바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터, 및 플라스미드, 및 코스미드 및 파지미드와 같은 박테리오파지 유전 요소로부터 유래된 것과 같은 그의 조합물로부터 유래된 벡터이다.
DNA 삽입체는 파지 람다 PL 프로모터, E. coli lac, trp 및 tac 프로모터, SV40 초기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터와 같은, 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 다른 적당한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 특정 구체예에서, 프로모터는 사상 진균에서 프로테아제의 고 발현 수준을 지시할 수 있는 것이 바람직하다. 이러한 프로모터는 당업계에 공지되어 있다. 발현 구성체는 전사 개시, 종결을 위한 부위 및 전사된 영역에서는 번역을 위한 리보솜 결합 부위를 포함할 수 있다. 구성체에 의해 발현되는 성숙한 전사체의 암호화 부분은 시작 지점에 번역 개시 AUG 및 번역되는 폴리펩티드의 말단에 적당히 위치된 종결 코돈을 포함할 것이다.
벡터 DNA는 종래의 형질전환 또는 형질감염(transfection) 기술을 통해 원핵 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "형질전환" 및 "형질감염"은 숙주 세포 내로 외래 핵산 (예를 들어, DNA)을 도입하기 위한 다양한 당업계-인증 기술을 지칭하도록 의도되며, 이는 인산 칼슘 또는 염화 칼슘 공동-침전, DEAE-덱스트란-매개 형질감염, 감염, 리포펙션, 양이온성 지질 매개 형질감염 또는 전기천공(electroporation)을 포함한다. 숙주 세포의 적당한 형질전환 또는 형질감염 방법은 문헌[Sambrook,등. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2판. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis 등, Basic Methods in Molecular Biology (1986)] 및 다른 실험 교재에 기재되어 있다.
포유동물 세포의 안정한 형질감염에 있어서, 발현 벡터 및 사용된 형질감염 기술에 따라, 세포의 단지 적은 부분만이 세포의 게놈 내로 외래 DNA를 통합할 수 있다는 것이 공지되어 있다. 이들 통합체를 확인하고 선택하기 위하여, 선별가능한 마커를 암호화하는 (예를 들어, 항생제에 내성을 갖는) 유전자가 일반적으로 관심있는 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입된다. 바람직한 선별가능한 마커는 G418, 히그로마이신 및 메타트렉세이트와 같은, 약물에 대한 내성을 부여하는 것을 포함한다. 선별가능한 마커를 암호화하는 핵산은 프로테아제 단백질을 암호화하는 벡터와 동일한 벡터 상에서 숙주 세포 내로 도입될 수 있거나 또는 독립된 벡터 상에서 도입될 수 있다. 도입된 핵산으로 안정하게 형질감염된 세포는 약물 선별에 의해 확인될 수 있다 (예를 들어, 선별가능한 마커 유전자를 포함한 세포는 생존하고, 반면 다른 세포들은 사멸한다).
원핵생물에서 단백질의 발현은 종종 융합 또는 비-융합 단백질의 발현을 지시하는 항시적 또는 유도성 프로모터를 포함한 벡터를 갖는 E. coli에서 수행된다. 융항 벡터는 그 자신에 암호화된 단백질 (예를 들어, 재조합 단백질의 아미노 말단)에 다수의 아미노산을 부가한다. 이러한 융합 벡터는 전형적으로 세 가지 목적, 즉 1) 재조합 단백질의 발현을 증가시키고; 2) 재조합 단백질의 용해도를 증가시키고; 3) 친화도 정제에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 단백질의 정제를 돕는다는 목적을 만족시킨다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 단백질 분해 절단 부위는 융합 부분과 재조합 단백질의 접합부에 도입되어 융합 부분으로부터의 재조합 단백질의 분리 후 융합 단백질의 정제를 가능하게 한다. 이러한 효소, 및 그의 동종 인식 서열은 인자 Xa, 트롬빈 및 엔테로키나제를 포함한다.
기재된 바와 같이, 발현 벡터는 선별가능한 마커를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 마커는 진핵 세포 배양에 있어서는 디히드로폴레이트 환원효소 또는 네오마이신 내성 및 E. coli 및 다른 박테리아를 배양하는 데 있어서 테트라사이클린 또는 암피실린 내성을 포함한다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 E. coli, Streptomyces 및 Salmonella typhimurium과 같은 박테리아; 효모와 같은 진균 세포; Drosophila S2 및 Spodoptera Sf9와 같은 곤충 세포; CHO, COS 및 Bowes 흑색종과 같은 동물 세포; 및 식물 세포를 포함한다. 상기-설명된 숙주 세포를 위한 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다.
벡터 중에서 박테리아에서의 사용에 바람직한 것은 Qiagen으로부터 구입 가능한 pQE70, pQE60 및 PQE-9; Stratagene으로부터 구입 가능한 pBS 벡터, Phagescript 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH16A, pNH18A 및 pNH46A; 및 Pharmacia로부터 구입 가능한 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 및 pRIT5이다. 진핵생물 벡터 중 바람직한 것은 Stratagene으로부터 구입 가능한 PWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pZT1 및 pSG; 및 Pharmacia로부터 구입 가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL이다. 다른 적당한 벡터는 당업자에게 용이하게 명백해질 것이다.
본 발명에서의 사용을 위한 공지된 박테리아 프로모터는 E. coli lacl 및 lacZ 프로모터, T3 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR, PL 프로모터 및 trp 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 초기 및 후기 SV40 프로모터, Rous 육종 바이러스 ("RSV")의 프로모터와 같은 레트로바이러스 LTR의 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터와 같은 메탈로티오네인 프로모터를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA의, 고등 진핵생물에 의한 전사는 벡터 내로 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가할 수 있다. 인핸서는 DNA의 시스-작용 요소로서, 주어진 숙주 세포-타입에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키도록 작용하는, 보통 약 10 내지 300 bp이다. 인핸서의 예는 100 내지 270 bp에서 복제 개시점의 후방에 위치하는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 개시점의 전방에 위치한 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
소포체의 내강으로, 주변세포질 공간으로 또는 세포외 환경으로 번역된 단백질의 분비를 위하여, 적절한 분비 신호가 발현된 폴리펩티드 내에 통합될 수 있다. 신호는 폴리펩티드에 내재할 수도 있고 이종 신호가 될 수도 있다.
폴리펩티드는 융합 단백질과 같은, 변형된 형태로 발현될 수 있고, 분비 신호 뿐만 아니라 추가적인 이종 기능성 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 추가적인 아미노산, 특히 대전된 아미노산의 영역은 정제 도중 또는 그 후의 취급 및 저장 도중에 숙주 세포에서의 안정성 및 지속성을 개선하도록 폴리펩티드의 N-말단에 부가될 수 있다. 또한, 펩티드 부분은 정제를 용이하게 하도록 폴리펩티드에 부가될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드
본 발명은 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 바람직한 구체예에서 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열을 적절한 숙주에서 발현시킴으로써 얻을 수 있는 아미노산 서열뿐만 아니라, SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리뉴클레오티드 서열을 적절한 숙주에서 발현시킴으로써 얻을 수 있는 아미노산 서열을 갖는, 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 또한, 상기 폴리펩티드의 기능적 등가물을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드가 본 발명 내에 포함된다. 상기 폴리펩티드는 용어 "본 발명에 따른 폴리펩티드"에 집합적으로 포함된다.
용어 "펩티드"와 용어 "올리고펩티드"는 (통상적으로 인식되는 것과 같이) 동의어로서 생각되고 각 용어는 내용상 펩티딜 결합에 의해 커플링된 적어도 두개의 아미노산의 사슬을 의미할 필요가 있을 때 호환적으로 사용될 수 있다. 용어 "폴리펩티드"는 본 명세서에서 7개 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 사슬에 대하여 사용된다. 모든 올리고펩티드 및 폴리펩티드 식 또는 서열은 본 명세서에서 좌측으로부터 우측으로 그리고 아미노 말단으로부터 카르복시 말단으로 기술된다. 본 명세서에서 사용된 1문자 아미노산 코드는 통상적으로 당업계에 공지되어 있으며 문헌[Sambrook, 등 (Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (1989)]에 기재되어 있다.
"분리된" 폴리펩티드 또는 단백질은 그의 천연 환경으로부터 제거된 폴리펩티드 또는 단백질을 의미한다. 예를 들어 숙주 세포에서 발현되는, 재조합적으로 생산된 폴리펩티드 및 단백질은 예를 들어 문헌[Smith and Johnson, Gene 67: 31-40 (1988)]에 개시된 단일-단계 정제 방법과 같은 적절한 임의의 기술에 의해 실질적으로 정제된 천연 또는 재조합 폴리펩티드와 마찬가지로 본 발명의 목적을 위해 분리된 것으로 간주된다.
본 발명에 따른 프로테아제는 황산 암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록실아파티트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함하는 공지된 방법에 의해 재조합 세포 배양물로부터 회수되어 정제될 수 있다. 분석 목적에 있어서 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")를 정제에 사용하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 폴리펩티드는 자연적으로 정제된 생성물, 화학 합성 방법의 생성물, 및 (예를 들어, 박테리아, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포를 포함하는) 원핵 또는 진핵 숙주로부터 재조합 기술에 의해 생산된 생성물을 포함한다. 재조합 생산 방법에 사용되는 숙주에 따라, 본 발명의 폴리펩티드는 글리코실화되거나 또는 비-글리코실화된다. 게다가, 본 발명의 폴리펩티드는 또한 몇몇 경우에서는 숙주 매개 과정의 결과로서, 최초 변형된 메티오닌 잔기를 포함할 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따른 단백질은 자이모겐과 같은 전구체 단백질, 혼성체 단백질, 프로 서열 또는 프레-프로 서열로서 수득되는 단백질, 또는 임의의 다른 타입의 미성숙 형태일 수 있다.
단백질 단편
본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드의 생물학적 활성을 나타내는 단편을 특징으로 한다.
본 발명의 폴리펩티드의 생물학적 활성을 나타내는 단편은 프로테아제 단백질의 아미노산 서열 (예를 들어, SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열의 아미노산 서열)과 충분히 동일하거나 또는 이로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는데, 이는 전장 단백질보다 더 적은 아미노산을 포함하고, 전장 단백질에 상응하는 적어도 하나의 생물학적 활성을 나타낸다. 전형적으로, 생물학적 활성을 나타내는 단편은 적어도 하나의 프로테아제 단백질 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함한다. 본 발명의 단백질의 생물학적 활성을 나타내는 단편은 예를 들어, 길이가 10, 25, 50, 100 개 이상의 아미노산인 폴리펩티드일 수 있다. 더욱이, 단백질의 다른 영역이 결실된, 다른 생물학적 활성을 나타내는 부분은 재조합 기술에 의해 제조될 수 있고 본 발명의 폴리펩티드가 원래 형태에서 갖는 하나 이상의 생물학적 활성에 대해 평가될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 프로테아제 단백질의 생물학적 활성을 나타내는 단편을 암호화하는 핵산 단편을 특징으로 한다.
융합 단백질
본 발명의 단백질 또는 그의 기능적 등가물 (예를 들어, 그의 생물학적 활성 부분)은 비-프로테아제 폴리펩티드 (예를 들어, 이종 아미노산 서열)에 작동가능하게 연결되어 융합 단백질을 형성할 수 있다. 본 명세서에서 사용될 때, 프로테아제 "키메라 단백질" 또는 "융합 단백질"은 비-프로테아제 폴리펩티드에 작동가능하게 연결된 프로테아제 폴리펩티드를 포함한다. "프로테아제 폴리펩티드"는 본 발명에 따른 폴리펩티드 서열에 상응하는 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 지칭하고, 반면 "비-프로테아제 폴리펩티드"는, 예를 들어 프로테아제 단백질과 상이하고 동일한 유기체 또는 상이한 유기체로부터 유래된 단백질과 같이, 본 발명에 따른 단백질과 실질적으로 상동성을 나타내지 않는 단백질에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 지칭한다. 프로테아제 융합 단백질 내에서 프로테아제 폴리펩티드는 본 발명에 다른 단백질의 전부 또는 일부에 상응할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 프로테아제 융합 단백질은 본 발명에 따른 단백질의 적어도 하나의 생물학적 활성 단편을 포함한다. 또다른 바람직한 구체예에서, 프로테아제 융합 단백질은 본 발명에 따른 단백질의 적어도 두 개의 생물학적 활성 부분을 포함한다. 융합 단백질 내에서, 용어 "작동가능하게 연결된"은 프로테아제 폴리펩티드 및 비-프로테아제 폴리펩티드가 서로에 대하여 프레임에 맞게 융합된 것을 의미한다. 비-프로테아제 폴리펩티드는 프로테아제 폴리펩티드의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있다.
예를 들어, 한 구체예에서, 융합 단백질은 프로테아제 서열이 GST 서열의 C-말단에 융합된 GST-프로테아제 융합 단백질이다.
이러한 융합 단백질은 재조합 프로테아제의 정제를 용이하게 할 수 있다. 또다른 구체예에서, 융합 단백질은 그의 N-말단에 이종의 신호 서열을 포함하는 프로테아제 단백질이다. 어떤 숙주 세포 (예를 들어, 포유동물 세포 및 효모 숙주 세포)에서, 프로테아제의 발현 및/또는 분비는 이종의 신호 서열의 이용을 통해 증가될 수 있다.
또다른 구체예에서, 배큘로바이러스 외피 단백질의 gp67 분비 서열이 이종의 신호 서열로서 사용될 수 있다 (Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel 등, eds., John Wiley & Sons, 1992). 진핵세포의 이종 신호 서열의 다른 예는 멜리틴의 분비 서열 및 인간 태반 알칼리성 포스파타제 (Stratagene; La Jolla, California)의 분비 서열을 포함한다. 또다른 예에서, 유용한 원핵생물성 이종 신호 서열은 phoA 분비 신호 (Sambrook et al., supra) 및 단백질 A 분비신호 (Pharmacia Biotech; Piscataway, New Jersey)를 포함한다.
신호 서열은 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드의 분비 및 분리를 용이하게 하는 데 사용될 수 있다. 신호 서열의 특징은 전형적으로, 하나 이상의 절단 사건에서의 분비 도중 성숙 단백질로부터 일반적으로 절단된 소수성 아미노산의 코어에 의해 규명된다. 이러한 신호 펩티드는 이들이 분비 경로를 통과할 때 성숙 단백질로부터 신호 서열의 절단을 허용하는 프로세싱 부위를 포함한다. 신호 서열은 예를 들어 발현 벡터가 형질전환된 진핵 숙주로부터 단백질의 분비를 지시하고, 신호 서열은 그 후에 또는 그와 동시에 절단된다. 그 다음에 단백질은 당업계에 인증된 방법에 의해 세포외 배지로부터 손쉽게 정제될 수 있다. 대안으로, 신호 서열은 GST 도메인, 정제를 용이하게 하는 서열을 통해 관심있는 단백질에 연결될 수 있다. 따라서, 예를 들어 폴리펩티드를 암호화하는 서열은 펩티드를 암호화하는 서열과 같은 마커 서열에 융합될 수도 있는데, 이는 융합된 폴리펩티드의 정제를 용이하게 한다. 본 발명의 이 양태의 어떤 바람직한 구체예에서, 마커 서열은 시판되는 다른 것들 중에서도 pQE 벡터 (Qiagen, Inc.)에 제공된 태그와 같은, 헥사히스티딘 펩티드이다. 예를 들어 문헌[Gentz 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824 (1989)]에 설명된 것과 같이, 헥사히스티딘은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. HA 태그는 정제에 유용한 또다른 펩티드로서 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질에서 유래된 에피토프에 상응하며, 이는 예를 들어 문헌[Wilson 등, Cell 37: 767 (1984)]에서 설명되었다.
바람직하게, 본 발명의 프로테아제 키메라 또는 융합 단백질은 표준 재조합 DNA 기술에 의해 생산된다. 예를 들어, 상이한 폴리펩티드 서열을 암호화하는 DNA 단편은 종래 기술에 따라, 예를 들어 라이게이션을 위한 블런트 말단(blunt-end) 또는 스태거 말단(stagger-end)을 사용하고, 적절한 말단을 제공하도록 제한효소로 처리하고, 바람직하지 않은 결합을 회피하기 위해 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 효소로 라이게이션함으로써 프레임에 맞게 함께 라이게이션된다. 또다른 구체예에서, 융합 유전자는 자동 DNA 합성기를 포함하는 종래 기술에 의해 합성될 수 있다. 대안으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 앵커 프라이머를 사용하여 수행될 수 있는데 이것은 차후에 어닐링되고 재증폭되어 키메라 유전자 서열을 생성할 수 있는 두 개의 연속적인 유전자 단편 사이에 상보적 돌출부를 발생시킨다 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992 참조). 더욱이, 이미 융합 부분 (예를 들어, GST 폴리펩티드)을 암호화하는 다수의 발현 벡터가 시판된다. 프로테아제-암호화 핵산은 융합 부분이 프로테아제 단백질과 프레임이 맞게 결합되도록 이러한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
기능적 등가물
용어 "기능적 등가물" 및 "기능적 변이체"는 본 명세서에서 호환적으로 사용된다. 본 발명에 따른 DNA의 기능적 등가물은 본 명세서에서 정의된 것과 같은 Aspergillus niger 프로테아제의 특정 기능을 나타내는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 DNA 단편이다. 본 발명에 따른 폴리펩티드의 기능적 등가물은 본 명세서에서 정의된 것과 같은 Aspergillus niger 프로테아제의 적어도 하나의 기능을 나타내는 폴리펩티드이다.
기능적 단백질 또는 폴리펩티드 등가물은 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열의 하나 이상의 아미노산에서 보존적 치환 또는 비-본질적 아미노산의 치환, 삽입 또는 결실을 포함할 수 있다. 따라서, 비-본질적인 아미노산은 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에서 실질적으로 생물학적 기능 변경없이 변경될 수 있는 잔기이다. 예를 들어, 본 발명의 프로테아제 단백질 사이에서 보존되는 아미노산 잔기는, 특히 변경될 수 없을 것으로 예측된다. 더욱이, 본 발명에 따른 프로테아제 단백질들과 다른 프로테아제 사이에서 보존된 아미노산은 변경될 수 없는 것으로 생각된다.
용어 "보존적 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 교체되는 치환을 의미하도록 의도된다. 이들 패밀리는 당업계에 공지되어 있으며 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌 및 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄 (트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
기능적 핵산 등가물은 전형적으로 잠재성 돌연변이 또는 암호화된 폴리펩티드의 생물학적 기능을 변경시키지 않는 돌연변이를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 아미노산 잔기가 변화된 프로테아제 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공하는데 이 변화는 특정 생물학적 활성에 중요한 것이 아니다. 이러한 프로테아제 단백질은 아미노산 서열에서 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 구별되지만 아직 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유한다. 한 구체예에서, 분리된 핵산 분자는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 여기서 단백질은 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 나타난 아미노산 서열과 실질적으로 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함한다.
예를 들어, 표현형에 있어서 잠재적인 돌연변이 치환을 어떻게 만드는가에 관한 지침은 문헌[Bowie, J. U. et al., Science 247: 1306-1310 (1990)]에서 제공되는데, 여기서 저자는 변화하는 아미노산 서열의 포용력을 연구하기 위한 두가지 주된 방법이 있다는 것을 지적한다. 첫번째 방법은 진화의 과정에 의존하는 것으로, 여기서 돌연변이는 자연선택에 의해 수용되거나 거부된다. 두번째 방법은 클로닝된 유전자의 특정 지점에 아미노산 변화를 도입하기 위하여 유전공학적 기법을 사용하고 기능성을 유지하는 서열을 확인하도록 선별하거나 스크리닝한다. 저자가 설명한 것과 같이, 이들 연구는 단백질이 아미노산 치환에 대해 놀랄만큼 포용적이라는 것을 드러냈다. 저자는 변화가 단백질의 특정 지점에서 허용되는 것으로 생각된다고 지적한다. 예를 들어, 대부분의 내부 아미노산 잔기는 비-극성 측쇄를 필요로 하는 반면, 표면 측쇄의 일반적으로 보존되는 특징은 거의 없다. 다른 이러한 표현형 잠재성 치환은 상기 문헌(Bowie 등) 및 이 문헌에서 언급된 참조문헌에서 설명된다.
SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 단백질과의 상동성을 나타내는 프로테아제 단백질을 암호화하는 분리된 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 암호화 뉴클레오티드 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 첨가 또는 결실을 도입하여 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 삽입이 암호화된 단백질 내로 도임되도록 함으로써 생성될 수 있다. 이러한 돌연변이는 부위 특이적 돌연변이 유발 및 PCR-매개 돌연변이 유발과 같은 표준 기술에 의해 도입될 수 있다.
용어 "기능적 등가물"은 또한 Aspergillus niger 프로테아제 단백질의 오르토로그를 포함한다. Aspergillus niger 프로테아제 단백질의 오르토로그는 다른 균주 또는 종으로부터 분리될 수 있고 유사 또는 동일한 생물학적 활성을 소유한 단백질이다. 이러한 오르토로그는 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 실질적으로 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 것으로서 손쉽게 확인될 수 있다.
본 명세서에서 정의된 것과 같이, 용어 "실질적으로 상동성을 나타내는"은 두번째 아미노산 또는 뉴클레오티드에 대해 충분한 또는 최소 수의 동일 또는 등가의 (예를 들어, 유사 측쇄를 갖는) 아미노산 또는 뉴클레오티드를 함유하여 첫번째 및 두번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 공통의 도메인을 갖는 첫번째 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 예를 들어, 약 60%, 바람직하게는 655, 더 바람직하게는 70%, 더욱 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 공통 도메인을 함유한 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 충분히 동일한 것으로서 본 명세서에서 정의된다.
다른 프로테아제 패밀리 구성원을 암호화하여, SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과는 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 더욱이, 상이한 종으로부터 유래된 프로테아제 단백질을 암호화하여 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열과 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산이 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명의 프로테아제 DNA의 변이체 (예를 들어, 자연적 대립유전자 변이체) 및 상동체에 상응하는 핵산 분자는, 본 명세서에서 개시된 cDNA 또는 그의 적당한 단편을 바람직하게는 고도의 긴축 혼성화 조건 하에서 표준 혼성화 기술에 따른 혼성화 프로브로서 이용하여, 여기에 개시된 프로테아제 핵산에 대한 그들의 상동성에 기초하여 분리될 수 있다.
프로테아제 서열의 자연 발생 대립유전자 변이체 외에, 당업자는 변화가 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열의 뉴클레오티드 서열 내로 돌연변이에 의해 도입됨으로써 프로테아제 단백질 기능의 실질적인 변경없이 프로테아제 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 유도할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
본 발명의 또다른 양태에서, 개선된 프로테아제 단백질이 제공된다. 개선된 프로테아제 단백질은 적어도 하나의 생물학적 활성이 개선된 단백질이다. 이러한 단백질은 포화 돌연변이 유발과 같은 기법에 의해 프로테아제 암호화 서열의 전부 또는 일부를 따라 무작위적으로 돌연변이를 도입함으로써 얻을 수 있고, 수득된 돌연변이체는 재조합적으로 발현되고 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제의 효소 활성을 측정하기 위한 표준 검정법이 당업계에 제공되며 따라서 개선된 단백질이 쉽게 선별될 수 있다.
바람직한 구체예에서 프로테아제 단백질은 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 아미노산 서열을 갖는다. 또다른 구체예에서, 프로테아제 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 아미노산 서열과 실질적으로 상동성을 나타내며 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 다른 폴리펩티드의 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하지만, 상기 설명된 자연적 변이 또는 돌연변이로 인해 아미노산 서열에 있어서는 상이하다.
더욱 바람직한 구체예에서, 프로테아제 단백질은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 핵산과 바람직하게는 고도의 긴축 혼성화 조건 하에서 혼성화할 수 있는, 분리된 핵산 단편에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 갖는다.
따라서, 프로테아제 단백질은 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 나타난 아미노산 서열과 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하고 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 따른 폴리펩티드의 기능적 활성 중 적어도 하나를 보유한 단백질이다.
본 발명에 따른 단백질의 기능적 등가물은 또한 예를 들어, 프로테아제 활성에 대해 본 발명의 단백질의 돌연변이체 (예를 들어, 일부절단 돌연변이체)의 결합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 한 구체예에서, 변이체의 다양한 라이브러리는 핵산 수준에서 결합 돌연변이 유발에 의해 생성된다. 변이체의 다양한 라이브러리는 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 효소를 사용하여 유전자 서열 내로 라이게이션하여 가능한 단백질 서열의 변성 세트가 개별적인 폴리펩티드로서, 또는 대안으로, (예를 들어, 파지 디스플레이를 위한) 한 세트의 더 거대한 융합 단백질로서 발현될 수 있게 함으로써 생성될 수 있다. 변성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 본 발명의 폴리펩티드의 가능한 변이체의 라이브러리를 생산하는 데 이용될 수 있는 다양한 방법이 있다. 변성 올리고뉴클레오티드의 합성 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Narang (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323 ; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477 참조).
게다가, 본 발명의 폴리펩티드의 암호화 서열 단편의 라이브러리는 변이체의 차후 선별을 스크리닝하기 위한 폴리펩티드의 다양한 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어 암호화 서열 단편의 라이브러리는, 분자당 약 한번의 닉킹이 일어나는 조건 하에서 관심있는 암호화 서열의 이중 가닥 PCR 단편을 뉴클레아제로 처리하는 단계, 이중 가닥 DNA를 변성시키는 단계, 상이한 닉 형성 생성물로부터 DNA를 복원하여 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성하는 단계, S1 뉴클레아제로 처리하여 재생된 이합체로부터 단일 가닥 부분을 제거하는 단계, 및 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터 내로 라이게이션하는 단계에 의해 생성될 수 있다. 이 방법에 의하여, 관심있는 단백질의 다양한 크기의 N-말단 및 내부 단편을 암호화하는 발현 라이브러리가 파생될 수 있다.
일부절단의 점 돌연변이에 의해 만들어진 결합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고, 선택된 성질을 갖는 유전자 생성물에 대하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 몇몇 기술이 당업계에 공지되어 있다. 고용량 분석이 가능한, 거대한 유전자 라이브러리를 스크리닝하는 데 있어서 가장 널리 이용되는 기술은 전형적으로, 복제가능한 발현 벡터 내로 유전자 라이브러리를 클로닝하는 단계, 생성된 벡터 라이브러리로 적합한 세포를 형질전환하는 단계, 및 원하는 활성의 검출이 검출된 생성물을 갖는 유전자를 암호화하는 벡터의 분리를 용이하게 하는 조건 하에서 결합 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 라이브러리에서 기능적 돌연변이체의 빈도를 향상시키는 회귀 앙상블 돌연변이 유발(REM)은 스크리닝 검정과 조합으로 이용되어 본 발명의 단백질의 변이체를 확인할 수 있다 (Arkin and Yourvan (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6 (3): 327-331).
SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열로 표시되는 프로테아제 유전자 서열 외에, 프로테아제 단백질의 아미노산 서열에서 변화를 일으킬 수 있는 DNA 서열 다형성이 주어진 집단내에 존재할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 유전적 다형성은 상이한 집단에서 유래된 세포에 또는 자연적 대립유전자 변이로 인한 집단 내에 존재할 수 있다. 대립유전자 변이체는 또한 기능적 등가물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드의 단편은 또한 기능적 폴리펩티드를 암호화하지 않는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수도 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 PCR 반응에서 프로브 또는 프라이머로서 기능할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 또한 특정 유기체 (넉-아웃 돌연변이체)에서 프로테아제의 기능적 활성을 회피하는 것이 요구될 때 유용할 수 있다.
본 발명에 따른 핵산은 이들이 기능적 폴리펩티드를 암호화하는가 아니면 비-기능적 폴리펩티드를 암호화하는가에 상관없이, 혼성화 프로브 또는 중합효소 연쇄반응 (PCR) 프라이머로서 사용될 수 있다. 프로테아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 암호화하지 않는, 본 발명의 핵산 분자의 사용은, 그 중에서도 특히, (1) 예를 들어, Aspergillus niger 외의 유기체로부터 유래된 cDNA 라이브러리로부터 프로테아제 단백질을 암호화하는 유전자, 또는 그의 대립유전자 변이체를 분리하고; (2) 문헌[Verma 등의 Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988)]에 설명된 것과 같이 프로테아제 유전자의 정확한 염색체 상의 위치를 제공하기 위한 유사분열 중기 염색체 범위와의 제자리 혼성화 (예를 들어, FISH)를 수행하고; (3) 특정 조직 및/또는 세포에서 프로테아제 mRNA의 발현을 검출하기 위해 노던 블롯 분석을 수행하고, (4) 주어진 생물학적 샘플(예를 들어, 조직)에서 프로테아제 프로브와 혼성화할 수 있는 핵산의 존재를 분석하기 위한 진단용 도구로서 사용될 수 있는 프로브 및 프라이머를 포함한다.
프로테아제 유전자 또는 cDNA의 기능적 등가물을 얻는 방법 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 방법은 SEQ ID N0 : 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 그의 변이체에 따른 서열의 전부 또는 일부를 암호화하는 분리된 핵산을 포함하는 표지된 프로브를 얻는 단계; 라이브러리에 있는 핵산 단편과 프로브의 혼성화를 허용함으로써 핵산 이합체를 형성하는 조건 하에서 표지된 프로브로 핵산 단편 라이브러리를 스크리닝하는 단계; 및 어떤 표지된 이합체에 있는 핵산 단편으로부터 전장 유전자 서열을 제조하여 프로테아제 유전자에 관련된 유전자를 얻는 단계를 수반한다.
한 구체예에서, 본 발명의 프로테아제 핵산은 SEQ ID NO: 1 내지 SEQ ID NO: 57로 구성된 군으로부터 선택되는 서열, SEQ ID NO: 58 내지 SEQ ID NO: 114로 구성된 군으로부터 선택되는 서열 또는 그의 상보체에 나타난 핵산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 상동성을 나타낸다.
또다른 바람직한 구체예에서 본 발명의 프로테아제 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열에 나타난 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 상동성을 나타낸다.
숙주 세포
또다른 구체예에서, 본 발명은 예를 들어, 본 발명에 포함된 핵산을 함유한 형질전환된 숙주 세포 또는 재조합 숙주 세포를 특징으로 한다. "형질전환된 세포" 또는 "재조합 세포"는 그 안으로 (또는 그의 선조 안으로) 본 발명에 따른 핵산이 재조합 DNA 기술에 의해 도입된 세포이다. 박테리아, 진균, 효모 등과 같은 원핵 및 진핵 세포를 모두 포함하며, 특히 바람직한 세포는 사상 진균, 특히 Aspergillus niger로부터 유래된 세포이다.
숙주 세포는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나, 또는 특이적이고, 원하는 방식으로 유전자 생성물을 변형시키고 프로세싱하도록 선택될 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 프로세싱 (예를 들어, 절단)은 단백질의 최적 기능을 용이하게 할 수 있다.
다양한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 프로세싱 및 변형을 위한 특징 및 특정 기작을 갖는다. 분자 생물학 및/또는 미생물학 분야의 숙련가들에게 익숙한 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 발현되는 외래 단백질의 바람직하고 올바른 변형 및 프로세싱을 보장하도록 선택될 수 있다. 이 목적에 있어서, 유전자 생성물의 적당한 1차 전사체 프로세싱, 글리코실화, 및 포스포릴화를 위한 세포 기작을 소유한 진핵 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 당업계에 공지되어 있다.
숙주 세포는 또한 CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293,3T3, W138, 및 맥락막총 세포주와 같은 포유동물 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
원한다면, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 안정하게 형질감염된 세포주에 의해 생산될 수 있다. 포유동물 세포의 안정한 형질감염에 적당한 다수의 벡터는 시판되고, 이러한 세포를 구성하는 방법 또한 예를 들어, 상기 문헌(Ausubel 등)에 공지되어 있다.
항체
본 발명은 나아가 단일클론 또는 다클론 항체와 같은, 본 발명에 따른 프로테아제 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용될 때, 용어 "항체" (Ab) 또는 "단일클론 항체" (Mab)는 프로테아제 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 완전한 분자는 물론이고 항체 단편 (예를 들어, Fab 및 F(ab')2)을 포함하는 것을 의미한다. Fab 및 F(ab')2 단편은 완전한 항체의 Fc 단편이 없고, 순환으로부터 더욱 신속하게 제거되며, 완전한 항체의 덜 비-특이적인 조직 결합성을 가질 수 있다 (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325 (1983)). 따라서, 이들 단편이 바람직하다.
본 발명의 항체는 어떤 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 프로테아제 단백질 또는 그의 항원성 단편을 발현하는 세포는 다클론 항체를 함유한 혈청의 생산을 유도하도록 동물에게 투여될 수 있다. 바람직한 방법에서, 프로테아제 단백질의 제제는 실질적으로 자연적 오염물질이 없도록 제조되고 정제된다. 그 다음 이러한 제제는 더 큰 특이적 활성의 다클론성 항혈청을 생산하기 위하여 동물 내로 도입된다.
가장 바람직한 방법에서, 본 발명의 항체는 단일클론 항체 (또는 그의 프로테아제 단백질 결합 단편)이다. 이러한 단일클론 항체는 하이브리도마 기술을 이용하여 제조될 수 있다 (Kohler et al., Nature 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Hammering et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N. Y., pp. 563-681 (1981)). 일반적으로, 이러한 방법은 프로테아제 단백질 항체로, 또는 프로테아제 단백질 발현 세포로 동물 (바람직하게는 마우스)을 면역화하는 단계를 포함한다. 이러한 마우스의 비장세포는 추출되어 적당한 골수종 세포주와 융합된다. 임의의 적당한 골수종 세포주가 본 발명에 따라 사용될 수 있지만, American Type Culture Collection (Rockville, Maryland)으로부터 구입가능한 모체 골수종 세포 (SP2O)를 사용하는 것이 바람직하다. 융합 후, 생성된 하이브리도마 세포는 HAT 배지에서 선택적으로 유지된 다음, Wands 등 (Gastro-enterology 80225-232 (1981))에 의해 설명된 것과 같이 제한 희석됨으로써 클로닝된다. 이러한 선택을 통해 얻은 하이브리도마 세포는 프로테아제 단백질 항원에 결합할 수 있는 항체를 분비하는 클론을 확인하기 위하여 검정된다. 일반적으로, 폴리펩티드는 상기 문헌(Ausubel 등)에서 설명된 것과 같이, KLH와 같은 담체 단백질과 커플링되고, 첨가제와 혼합되어 숙주 포유동물 내로 주입될 수 있다.
특히 다양한 숙주 동물은 관심있는 폴리펩티드의 주입에 의해 면역화될 수 있다. 적당한 숙주 동물의 예는 토끼, 마우스, 기니아 피그, 및 래트를 포함한다. 다양한 첨가제는 숙주의 종에 따라 면역학적 반응을 증가시키는 데 사용될 수 있는데, 이는 프로인트 (Freund's) (완전 및 불완전) 보조제, 수산화 알루미늄과 같은 첨가제 미네랄 겔, 리솔레시틴과 같은 계면 활성 기질, 플루론 폴리올, 폴리아니온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, BCG (Bacille Calmette-Guerin) 및 Corynebacterium parvum을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다클론 항체는 면역화된 동물의 혈청으로부터 유래된 항체 분자의 이종 집단이다.
이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA, IgD 및 그의 임의의 하위부류를 포함하는 임의의 면역글로불린 부류일 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양될 수 있다.
일단 생산되면, 다클론 또는 단일클론 항체는 예를 들어, 상기 문헌(Ausubel 등)에서 설명된 것과 같이, 표준 기술을 이용한 웨스턴 블롯 또는 면역침강 분석과 같은 면역 검정에서 프로테아제 폴리펩티드 또는 그의 기능적 등가물의 특이적 인식에 대하여 시험된다. 프로테아제 단백질 또는 그의 기능적 등가물에 특이적으로 결합하는 항체가 본 발명에 유용하다. 예를 들어, 이러한 항체는 Aspergillus의 병원성 또는 비병원성 균주에서 (예를 들어, Aspergillus 추출물에서) 프로테아제를 검출하기 위한 면역검정에 사용될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 항체는 하전된 잔기의 고빈도와 같은 기준에 의해, 항원성으로 생각되는 프로테아제 폴리펩티드의 단편을 이용하여 생산된다. 예를 들어, 이러한 단편은 PCR의 표준 기술에 의해 생성된 다음, pGEX 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다 (상기 문헌(Ausubel 등)). 그 다음 융합 단백질은 E. coli에서 발현되어 상기 문헌(Ausubel 등)에 설명된 것과 같이 글루타티온 아가로스 친화도 매트릭스를 이용하여 정제될 수 있다. 원한다면, 몇몇 (예를 들어, 둘 또는 셋) 융합체가 각 단백질에 대하여 생성될 수 있으며, 각 융합체는 적어도 두마리의 토끼 내로 주입될 수 있다. 항혈청은 전형적으로 3회의 부스터 주입을 포함하는 일련의 주입에 의해 발생될 수 있다. 전형적으로, 항혈청은 재조합 프로테아제 폴리펩티드 또는 그의 기능적 등가물을 면역침강시키는 그의 능력에 대해 조사되는 반면, 관련되지 않은 단백질은 면역 반응의 특이성에 대한 대조군으로서 작용할 수 있다.
대안으로, 단일 사슬 항체의 생산에 대하여 설명된 기술 (미국 특허 제4,946,778호 및 제4,704,692호)은 프로테아제 폴리펩티드 또는 그의 기능적 등가물에 대항하는 단일 사슬 항체를 생산하도록 개조될 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하기 위한 키트는 예를 들어, Pharmacia로부터 구입가능하다.
게다가, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성하고 스크리닝하는 데 이용될 수 있는 방법 및 시약의 예는, 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409호; PCT 공보 제WO 92/18619호; PCT 공보 제WO 91/17271호; PCT 공보 제WO 20791호; PCT 공보 제WO 92/20791호; PCT 공보 제WO 92/15679호; PCT 공보 제WO 93/01288호; PCT 공보 제WO 92/01047호; PCT 공보 제WO 92/09690호; PCT 공보 제WO 90/02809호; 및 문헌[Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246 ; 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734]에 기재되어 있다.
프로테아제 폴리펩티드 또는 그의 기능적 등가물에 특이적으로 결합하는 다클론 및 단일클론 항체는 예를 들어, Aspergillus의 또다른 균주에서 프로테아제 유전자 또는 그의 기능적 등가물의 발현을 검출하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 프로테아제 폴리펩티드는 Aspergillus 세포 또는 추출물의 종래 면역검정에서 손쉽게 검출될 수 있다. 적당한 검정법의 예는 웨스턴 블로팅, ELISA, 방사선면역 검정법 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
"특이적 결합"은 항체가 특정 항원, 예를 들어 프로테아제 폴리펩티드를 인식하고 결합하되 샘플 내에 있는 다른 관련되지 않은 분자들은 실질적으로 인식하고 결합하지 않는 것을 의미한다.
항체는 예를 들어, 폴리펩티드 항원이 수지 상에 고정된 친화도 크로마토그래피 방법에 의해 정제될 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드에 대한 항체 (예를 들어, 단일클론 항체)는 친화도 크로마토그래피 또는 면역침강법과 같은 표준 기술에 의해 폴리펩티드를 분리하는 데 사용될 수 있다. 더욱이, 이러한 항체는 폴리펩티드의 발현 양 및 패턴을 평가하기 위하여 (예를 들어, 세포 용해물 또는 세포 현탁액에서) 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 항체는 임상 시험 방법의 부분으로서 세포 또는 조직에서의 단백질 수준을 모니터링하기 위한 진단 목적으로 사용될 수도 있고 예를 들어, 주어진 치료 섭생법의 효능을 측정하기 위한 또는 아스페르길루스증의 진단에 사용될 수 있다.
검출은 검출가능한 물질에 항체를 커플링함으로써 용이해질 수 있다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 및 방사성 물질을 포함한다. 적당한 효소의 예는 양고추냉이 퍼록시다제, 알칼린 포스파타제, P-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린스테라제를 포함하고; 적당한 형광 물질의 예는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레신, 댄실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함하고; 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고; 생물발광 물질의 예는 루시퍼라제, 루시페린, 및 에쿼린을 포함하고; 적당한 방사성 물질의 예는 125I, 131I, 35S 및 3H를 포함한다.
항원성 펩티드에 포함된 바람직한 에피토프는 단백질의 표면에 위치한 영역, 예를 들어 친수성 영역이다. 본 발명의 단백질의 소수성 영역은 친수성 영역을 확인하는 데 이용될 수 있다. 본 발명의 단백질의 항원성 펩티드는 SEQ ID NO: 115 내지 SEQ ID NO: 171로 구성된 군으로부터 선택되는 서열의 아미노산 서열의 적어도 7개 (바람직하게는 10, 15, 20 또는 30)의 연속적인 아미노산 잔기를 포함하고 단백질의 에피토프를 포함하여 펩티드에 대해 발생된 항체가 단백질과 특이적 면역 복합체를 형성한다.
항원성 펩티드에 포함된 바람직한 에피토프는 단백질의 표면에 위치한 프로테아제의 영역, 예를 들어, 친수성 영역, 소수성 영역, 알파 영역, 베타 영역, 코일 영역, 회전 영역 및 신축성 영역이다.
면역검정
생물학적 샘플에서 본 발명에 따른 폴리펩티드의 정성 또는 정량 측정은 당업계에 공지된 어떠한 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 항체-기초 기술은 생물학적 샘플에서 특정 폴리펩티드 수준을 검정하는 데 있어서 특별한 장점을 제공한다.
여기서, 특이적 인식은 1차 항체 (다클론 또는 단일클론)에 의해 제공되지만 2차 검출 시스템은 형광물질, 효소, 또는 다른 결합된 2차 항체를 이용할 수 있다. 이로써, 면역복합체가 얻어진다.
따라서, 본 발명은 특정 유기체가 Aspergillus로 감염되었는지의 여부를 진단하는 방법을 제공하며 이는:
·Aspergillus에 감염되었을 것으로 생각되는 상기 유기체로부터 생물학적 샘플을 분리하는 단계,
·본 발명에 따른 항체와 상기 생물학적 샘플을 반응시키는 단계,
·면역복합체가 형성되었는가를 측정하는 단계
를 포함한다.
를 포함한다.
조직은 또한 웨스턴 블롯 또는 도트/슬롯 검정을 위한 단백질의 유리를 위하여 예를 들어 유레아 및 중성 세제로 추출될 수 있다. 이 기술은 또한 체액에도 적용될 수 있다.
프로테아제 유전자 발현을 검출하는 데 유용한 다른 항체-기초 방법은, 효소 면역 측정법 (ELISA) 및 방사선면역검정법 (RIA)과 같은 면역검정법을 포함한다. 예를 들어, 프로테아제-특이적 단일클론 항체는 프로테아제 단백질을 검출하고 정량하기 위한 면역흡착제 및 효소-표지된 프로브로서 사용될 수 있다. 샘플에 존재하는 프로테아제 단백질의 양은 선형 회귀 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 표준 표본에 존재하는 양과 비교함으로써 계산될 수 있다. 또다른 ELISA 검정법에서, 두 개의 구별된 특이적 단일클론 항체는 체액 중의 프로테아제 단백질을 검출하는 데 사용될 수 있다. 이 검정에서, 하나의 항체는 면역흡착제로서 사용되고 다른 것은 효소-표지된 프로브로서 사용된다.
상기 기술은 본질적으로 "1단계" 또는 "2단계"로서 수행될 수 있다. "1단계" 검정은 고정된 항체에 프로테아제 단백질을 접촉시키는 단계 후 세척 단계 없이 표지된 항체를 혼합물에 접촉시키는 단계를 포함한다. "2단계" 검정은 표지된 항체에 혼합물을 접촉시키는 단계 전에 세척 단계를 포함한다. 다른 적절한 종래 방법도 이용될 수 있다. 지지체 상에 검정 시스템의 한 성분을 고정시키는 것이 바람직한데, 그럼으로써 시스템의 다른 성분이 그 성분과 접촉하고 샘플로부터 손쉽게 제거된다.
적당한 효소 표지는 예를 들어, 옥시다제 군에서 유래된 것들을 포함하는데, 이는 기질과의 반응에 의해 과산화수소의 생산을 촉매작용한다. 옥시다제 표지의 활성은 효소-표지된 항체/기질 반응에 의해 형성되는 과산화수소의 농도를 측정함으로써 검정될 수 있다.
효소 외에, 다른 적당한 표지는 요오드 (125I, 121I), 탄소 (14C), 황 (
35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (112In), 및 테크네튬 (99mTc)과 같은 방사선동위원소, 및 플루오레신 및 로다민과 같은 발광물질 표지, 및 바이오틴을 포함한다.
프로테아제 폴리펩티드에 대한 시험 화합물의 특이적 결합은, 예를 들어 시험관내에서 기질 (예를 들어, 96-웰 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 웰 표면) 상에 프로테아제 폴리펩티드를 가역적 또는 비가역적으로 고정시킴으로써 검출될 수 있다. 폴리펩티드 및 다른 작은 분자를 고정시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어 마이크로타이터 플레이트는, 용액에 있는 폴리펩티드 (전형적으로는, 1-100㎕의 부피 중 0.05 내지 1 mg/ml의 농도)를 각 웰에 첨가하고, 0.1 내지 36 시간동안 실온 내지 37℃에서 플레이트를 인큐베이션함으로써 프로테아제 폴리펩티드로 코팅될 수 있다. 플레이트에 결합되지 않은 폴리펩티드는 과량의 용액을 진탕하고, 그 다음 물 또는 완충액으로 플레이트를 (한번 또는 반복적으로) 세척함으로써 플레이트로부터 제거될 수 있다. 전형적으로 폴리펩티드는 물 또는 완충액에 포함된다. 그 다음 플레이트는 결합 폴리펩티드가 없는 완충액으로 세척한다. 플레이트 상에 자유 단백질-결합 부위를 차단하기 위해, 플레이트를 결합된 폴리펩티드와는 관계없는 단백질로 차단한다. 예를 들어, Tris-HCl 중 2 mg/ml의 농도인 300 ㎕의 소 혈청 알부민 (BSA)이 적당하다. 적당한 기질은 한정된 교차-결합 화학적 성질을 갖는 기질 (예를 들어, Corning Costar Corp. (Cambridge, MA) 으로부터 구입된 폴리스티렌, 스티렌 또는 폴리프로필렌 기질과 같은 플라스틱 기질)을 포함한다. 원한다면, 구슬모양의 입자 (예를 들어, 구슬모양의 아가로스 또는 구슬모양의 세파로스)가 기질로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드에 대한 시험 화합물의 결합은 당업계에 공지된 임의의 방법으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 특이적 항체가 면역검정에 사용될 수 있다. 원한다면, 항체는 (예를 들어, 형광물질 또는 방사선동위원소로) 표지될 수 있고 직접 검출될 수도 있다 (예를 들어, West and McMahon, J. Cell. Biol. 74: 264,1977 참조). 대안으로, 제 2 항체가 검출에 사용될 수 있다 (예를 들어, 항-AN97 항체의 Fc 부분에 결합한 표지된 항체). 대안의 검출 방법에서, 프로테아제 폴리펩티드는 표지화되고, (예를 들어, 프로제아제 폴리펩티드를 방사선동위원소, 형광단, 발색단 등으로 표지화함으로써) 표지가 검출된다. 여전히 또다른 방법에서, 프로테아제 폴리펩티드는 광학적으로 검출될 수 있는 단백질, 예를 들어 (UV광 하에서 검출될 수 있는) 녹색 형광 단백질과의 융합 단백질로서 제조될 수 있다. 대안의 방법에서, 프로테아제 폴리펩티드는 검출가능한 효소 활성을 갖는 효소 (예를 들어, 양고추냉이 퍼록시다제, 알칼린 포스파타제, α-갈락토시다제, 또는 포도당 옥시다제)에 공유결합되거나 또는 이와 융합될 수 있다. 이들 모든 효소를 암호화하는 유전자가 클로닝되었고 당업자에 의해 손쉽게 이용가능하다. 원한다면, 융합 단백질은 항원을 포함할 수 있고, 이러한 항원은 종래 방법을 이용한 다클론 또는 단일클론 항체로 검출되고 측정될 수 있다. 적당한 항원은 효소 (예를 들어, 양고추냉이 퍼록시다제, 알칼린 포스파타제, 및 α-갈락토시다제) 및 비-효소성 폴리펩티드 (예를 들어, BSA 및 글로불린과 같은 혈청 단백질, 및 카세인과 같은 유단백질)를 포함한다.
에피토프, 항원 및 면역원
또다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 에피토프-함유 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제공한다. 이 폴리펩티드 부분의 에피토프는 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 또는 항원성 에피토프이다. "면역원성 에피토프"는 전체 단백질이 면역원일 때 항체 반응을 도출하는 단백질의 부분으로서 정의된다. 이들 면역원성 에피토프는 분자 상의 몇몇 위치에 한정되는 것으로 생각된다. 반면, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역은 "항원성 에피토프"로서 정의된다. 단백질에서 면역원성 에피토프의 수는 일반적으로 항원성 에피토프의 수보다 적다. 예를 들어, 문헌[Geysen, H. M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002 (1984)]을 참조한다.
항원성 에피토프를 갖는 (즉, 항체가 결합할 수 있는 단백질 분자의 영역을 함유한) 펩티드 또는 폴리펩티드의 선택에 있어서, 단백질 서열의 부분을 모방하는 비교적 짧은 합성 펩티드가 부분적으로 모방된 단백질과 반응하는 항혈청을 용이하게 도출할 수 있다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sutcliffe, J. G. et al., Science 219: 660-666 (1984)]을 참조한다. 단백질-반응성 혈청을 도출할 수 있는 펩티드는 종종 단백질의 1차 서열에서 나타나고, 단순한 화학적 규칙의 세트에 의해 특징규명되며, 원래 단백질의 면역우세 영역 (즉, 면역원성 에피토프), 또는 아미노 또는 카르복실 말단으로도 한정되지 않는다. 극히 소수성인 펩티드 및 6개 이하의 잔기를 갖는 펩티드는 일반적으로 모방된 단백질에 결합하는 항체를 유도하는 데 비효과적이며, 더 길고 용해성을 나타내는 펩티드, 특히 프롤린 잔기를 함유한 것이 일반적으로 효과적이다 (Sutcliffe et al., supra). 예를 들어, 이러한 지침에 따라 디자인된 20개의 펩티드 중에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 HAI 폴리펩티드 사슬 서열의 75%를 커버하는 8 내지 39 잔기를 함유하는 18개의 펩티드는 HA1 단백질 또는 원래의 바이러스와 반응하는 항체를 유도하였고, MuLV 폴리머라제 유래의 12/12 펩티드 및 공수병 글리코단백질 유래 18/18은 각 단백질을 침강시키는 항체를 유도하였다.
본 발명의 항원성 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는 그러므로 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 (단일클론 항체 포함)를 일으키는 데 유용하다. 따라서, 항원 에피토프-함유 펩티드로 면역화된 공여체로부터 유래된 비장 세포의 융합으로써 얻은 하이브리도마의 높은 비율이 일반적으로 천연 단백질과 반응하는 항체를 분비한다 (Sutcliffe et al., supra, 663). 항원성 에피토프 함유 펩티드 또는 폴리펩티드에 의해 발생된 항체는 모방된 단백질을 검출하는 데 유용하며, 상이한 펩티드에 대한 항체는 번역 후 프로세싱을 겪는 단백질 전구체의 다양한 영역의 운명을 추적하는 데 사용될 수 있다. 펩티드 및 항-펩티드 항체는 모방된 단백질에 대한 다양한 정성 또는 정량 검정에 사용될 수 있고, 예를 들어 짧은 펩티드 (예를 들어, 약 9개의 아미노산)조차도 결합하여 면역침강 검정법에서의 더 큰 펩티드를 대신할 수 있는 것으로 나타났기 때문에 경쟁 검정에서도 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Wilson, I. A. et al., Cell 37: 767-778, 777 (1984)]을 참조한다. 본 발명의 항-펩티드 항체는 또한 예를 들어, 당업계에 공지된 방법을 이용한 흡수 크로마토그래피에 의한, 모방된 단백질의 정제에 유용하다.
상기 지침에 따라 디자인된 본 발명의 항원성 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열 내에 포함된, 바람직하게 적어도 7개, 더 바람직하게는 적어도 9개 그리고 가장 바람직하게는 약 15 내지 약 30개의 아미노산을 함유한다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 더 큰 비율을 포함하는, 즉 약 30 내지 50개의 아미노산 또는 본 발명의 폴리펩티드의 전체 아미노산을 포함하고 그 이하의 길이를 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드 또한 본 발명의 에피토프-함유 펩티드 또는 폴리펩티드로 간주되며 또한 모방된 단백질과 반응하는 항체를 유도하는 데 유용하다. 바람직하게, 에피토프-함유 펩티드의 아미노산 서열은 수성 용매에서 실질적인 용해성을 나타내도록 선택되며 (즉, 서열은 비교적 친수성을 나타내는 잔기를 포함하고 고도의 소수성 잔기는 회피하는 것이 바람직함); 프롤린 잔기를 함유한 서열이 특히 바람직하다.
본 발명의 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는 펩티드 또는 폴리펩티드를 만드는 데 있어서 본 발명의 핵산 분자를 이용한 재조합 수단을 포함하는 어떠한 종래 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 짧은 에피토프-함유 아미노산 서열은 재조합 생산 및 정제 도중뿐만 아니라, 항-펩티드 항체를 생산하기 위한 면역화 도중에 담체로서 작용하는 더 큰 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
에피토프-함유 펩티드는 또한 화학적 합성의 공지된 방법을 이용하여 합성될 수 있다. 예를 들어, Houghten은 4주 내에 (ELISA-타입 결합 연구에 의해) 제제되고 그 특징이 규명된 HAI 폴리펩티드 분절의 단일 아미노산 변이체를 나타내는 10-20 mg의 248개의 상이한 13 잔기 펩티드와 같은, 다수의 펩티드의 단순한 합성 방법을 설명하였다 (Houghten, R. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 5131-5135 (1985)). 이 "자발적 다중 펩티드 합성 (SMPS)" 공정은 Houghten 등의 미국 특허 제4,631,211호 (1986)에서 더 설명된다. 이 방법에서 다양한 펩티드의 고체상 합성을 위한 개별적인 수지는 용매-투과성 패킷에 함유되는데, 이는 고체상 방법에 관련된 많은 동일 반복성 단계의 최적 사용을 가능하게 한다.
수동 방법은 500 내지 1000 이상의 합성이 자발적으로 수행되도록 한다 (상기 문헌(Houghten 등), 5134면).
본 발명의 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드는 당업계에 공지된 방법에 따라 항체를 유도하는 데 사용된다. 예를 들어, 상기 문헌(Sutcliffe 등), 상기 문헌(Wilson 등) 및 문헌[Chow, M. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 910-914; 및 Bittle, F. J. 등, J. Gen. Virol. 66: 2347-2354 (1985)]을 참조한다.
일반적으로, 동물은 유리 펩티드로 면역화될 수 있지만, 항-펩티드 항체 적정농도는 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH) 또는 파상풍 톡소이드와 같은 거대분자 담체에 펩티드를 커플링함으로써 증대된다. 예를 들어, 시스테인을 함유한 펩티드는 말레이미도벤조일 N-히드록시숙신이미드 에스테르 (MBS)와 같은 링커를 이용하여 담체에 커플링될 수 있는 반면, 다른 펩티드는 글루타르알데히드와 같은 보다 일반적인 결합제를 이용하여 담체에 커플링될 수 있다.
토끼, 래트 및 마우스와 같은 동물은, 예를 들어 약 100 ㎍ 펩티드 또는 담체 단백질 및 프로인트 보조제를 함유한 에멀젼의 복막내 및/또는 경피 주입에 의해, 유리 또는 담체-커플링된 펩티드 중 하나로 면역화된다. 몇몇 부스터 주입은 예를 들어, 약 2주의 간격으로, 고체 표면에 흡수된 유리 펩티드를 이용한 ELISA 검정에 의해 검출될 수 있는 항-펩티드 항체의 유용한 적정농도를 제공하기 위해 요구될 수 있다. 면역화된 동물로부터 유래된 혈청 중 항-펩티드 항체의 적정농도는 예를 들어, 당업계에 공지된 방법에 따른 고체 지지체 상의 펩티드로의 흡수 및 선택된 항체의 용리에 의한, 항-펩티드 항체의 선택에 의해 증가할 수 있다.
본 발명의 면역원성 에피토프-함유 펩티드, 즉 전체 단백질이 면역원일 때 항체 반응을 도출하는 단백질의 부분은, 당업계에 공지된 방법에 따라 확인될 수 있다. 예를 들어, 상기 문헌(Geysen 등)은 효소면역 측정법에서 반응하기에 충분한 순도를 갖는 수백 개의 펩티드를 고체 지지체 상에서 신속하게 동시에 합성하는 방법을 개시한다. 그 다음, 합성된 펩티드와 항체의 상호작용은 지지체로부터 그들을 제거하지 않고도 손쉽게 검출된다. 이 방식으로서 원하는 단백질의 면역원성 에피토프를 함유한 펩티드는 당업자에 의해 용이하게 확인될 수 있다. 예를 들어, 구제역 바이러스의 외피 단백질에 있는 면역학적으로 중요한 에피토프는 Geysen 등에 의해, 단백질의 전체 213개 아미노산을 커버하는 모든 208개의 가능한 헥사펩티드의 중복 세트의 합성에 의한 7개 아미노산의 분석으로 발견되었다. 그 다음, 모든 20개 아미노산이 에피토프 내에 있는 모든 지점에서 순서대로 치환된 펩티드의 완전한 교체 세트를 합성하고, 항체와의 반응에 대한 특이성을 부여하는 특정 아미노산을 결정하였다. 따라서, 본 발명의 에피토프-함유 펩티드의 펩티드 유사체는 이 방법에 의해 용이하게 만들어질 수 있다. Geysen의 미국 특허 제4,708,781호 (1987)는 원하는 단백질의 면역원성 에피토프를 함유한 펩티드를 확인하는 방법을 더 설명한다.
나아가 Geysen의 미국 특허 제5,194,392호 (1990)는 특정 파라토프 (항원 결합 부위)에 상보적인 에피토프의 위상적 등가물 (즉, "미모토프")인 모노머의 서열 (아미노산 또는 다른 화합물)을 검출하거나 결정하는 일반적인 방법을 설명한다. 더욱 일반적으로, Geysen의 미국 특허 제4,433,092호 (1989)는 관심있는 특정 수용체의 리간드 결합 부위에 상보적인 리간드의 위상적 등가물인 모노머의 서열을 검출하거나 결정하는 방법을 설명한다. 이와 유사하게, 퍼알킬화된 올리고펩티드 혼합물에 대한 Houghten, R. A. 등의 미국 특허 제5,480,971호 (1996)는 직쇄 C1-C7-알킬 퍼알킬화 올리고펩티드 및 이러한 펩티드의 세트 및 라이브러리뿐만 아니라, 관심있는 수용체 분자에 선택적으로 결합하는 퍼알킬화된 올리고펩티드의 서열을 측정하는 데 있어서 이러한 올리고펩티드 세트 및 라이브러리를 사용하는 방법을 개시한다. 따라서, 본 발명의 에피토프-함유 펩티드의 비-펩티드 유사체는 또한 이들 방법에 의해서 용이하게 제조될 수 있다.
프로테아제 활성의 제거 또는 감소
또한, 본 발명은 모세포의 돌연변이 세포를 생성하는 방법에 관한 것이며, 이것은 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열 또는 그의 제어 서열을 파괴시키거나 결실시켜, 그 결과 모세포보다 프로테아제를 덜 생성하는 돌연변이 세포를 만드는 단계를 포함한다.
프로테아제 활성이 감소된 균주의 구성은 세포에서 프로테아제 활성의 발현에 필요한 핵산 서열의 변형 또는 불활성화에 의해 편리하게 달성될 수 있다. 변형되는 또는 불활성화되는 핵산 서열은, 예를 들어 프로테아제, 또는 프로테아제 활성을 나타내는 데 필수적인 프로테아제의 일부를 암호화하는 핵산 서열일 수 있거나, 또는 핵산 서열은 핵산 서열의 암호화 서열로부터 프로테아제의 발현에 필요한 조절성 기능을 가질 수 있다. 그러한 조절성 또는 제어 서열의 예는 프로모터 서열 또는 그의 기능성 부분, 즉 프로테아제의 발현에 영향을 미치는 데 충분한 부분일 수 있다. 가능한 변형을 위한 다른 제어 서열은, 제한은 없지만, 리더, 폴리아데닐화 서열, 프로펩티드 서열, 신호 서열, 및 종결 부위를 포함한다.
핵산 서열의 변형 또는 불활성화는 세포에 대해 돌연변이유발을 수행하고, 프로테아제 생성 능력이 감소 또는 제거된 세포를 선택함에 의해 수행될 수 있다. 돌연변이유발은 특이적 또는 무작위일 수 있으며, 예를 들어 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이제의 사용, 적합한 올리고뉴클레오티드의 사용, 또는 DNA 서열에 PCR 생성 돌연변이유발을 수행함에 의해 수행될 수 있다. 더욱이, 돌연변이유발은 이들 돌연변이제들의 임의의 조합물의 사용에 의해 수행될 수 있다. 본 발명에 적합한 물리적 또는 화학적 돌연변이유발제의 예는 자외선(UV), 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG), O-메틸 히드록실아민, 아질산, 에틸 메탄 술포네이트 (EMS), 나트륨 바이술포네이트, 포름산, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 그러한 돌연변이유발제가 사용될 때, 돌연변이유발은 전형적으로, 적합한 조건하에서 선택된 돌연변이제의 존재하에 돌연변이될 세포를 인큐베이션하고, 프로테아제 활성의 발현이 감소되거나 또는 활성의 발현을 나타내지 않는 세포를 선택함에 의해 수행된다.
본 발명의 프로테아제 생성의 변형 또는 불활성화는 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열 또는 그의 전사 또는 번역에 필요한 조절성 요소에 하나 이상의 뉴클레오티드의 도입, 치환, 또는 제거에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드가 삽입 또는 제거되어 정지 코돈의 도입, 출발 코돈의 제거, 또는 오픈 리딩 프레임의 변화를 가져올 수 있다. 그러한 변형 또는 불활성화는 당업계에 공지된 방법에 따르는 부위-지정 돌연변이유발 또는 PCR 생성 돌연변이유발에 의해 달성될 수 있다.
원친적으로는 그 변형이 생체내에서, 즉 세포에 대해 직접적으로 수행될 수 있지만, 변형은 하기 예시된 대로 시험관내에서 수행되는 것이 바람직하다.
선택된 숙주 세포에 의한 생성을 불활성화 또는 감소시키는 편리한 방식의 예는 유전자 교체 또는 유전자 단절 기술을 기초로 한다. 예를 들어, 유전자 단절 방법에서, 관심의 내인성 유전자 또는 유전자 단편에 상응하는 핵산 서열이 시험관내에서 돌연변이되어 결함 있는 핵산 서열을 생성하고, 다음에 숙주 세포로 형질전환되어 결함 있는 유전자를 생성한다. 상동성 재조합에 의해, 결함 있는 핵산 서열은 내인성 유전자 또는 유전자 단편을 교체한다. 또한, 결함 있는 유전자 또는 유전자 단편은 프로테아제를 암호화하는 유전자가 변형되거나 파괴된 형질전환체의 선택에 사용될 수 있는 마커를 암호화하는 것이 바람직할 수 있다.
또는 달리, 본 발명의 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열의 변형 또는 불활성화는 프로테아제 암호화 서열에 상보하는 뉴클레오티드 서열을 사용하는 확립된 안티센스 기술에 의해 수행될 수 있다. 더 구체적으로, 세포에 의한 프로테아제의 생성은, 세포에서 전사될 수 있고 세포에서 생성된 프로테아제 mRNA에 혼성화할 수 있는 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열에 상보하는 뉴클레오티드 서열을 도입합에 의해 감소 또는 제거될 수 있다. 상보성 안티센스 뉴클레오티드 서열이 프로테아제 mRNA에 혼성화하는 것을 허용하는 조건하에서, 번역된 프로테아제의 양은 이와 같이 감소 또는 제거된다.
본 발명의 방법에 따라서 변형되는 세포는 미생물 기원, 예를 들어 세포에 상동성 또는 이종성을 나타내는 원하는 단백질 생성물의 생성에 적합한 진균 균주인 것이 바람직하다.
추가로, 본 발명은 프로테아제를 암호화하는 핵산 서열 또는 그의 제어 서열의 파괴 또는 결실을 포함하며, 그 결과 돌연변이 세포가 모세포보다 프로테아제를 덜 생성하는, 모세포의 돌연변이 세포에 관한 것이다.
그렇게 만들어진 프로테아제-결함 돌연변이 세포는 상동성 및/또는 이종성 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포로서 유용하다. 따라서, 추가로, 본 발명은 (a) 폴리펩티드의 생성에 도움이 되는 조건하에서 돌연변이 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는, 상동성 또는 이종성 폴리펩티드를 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 문맥에서, 용어 "이종성 폴리펩티드"는 숙주 세포 내에 천연적으로 존재하지 않은 폴리펩티드, 천연 서열을 변경시키도록 변형된 천연 단백질, 재조합 DNA 기술에 의한 숙주 세포 조작의 결과로서 발현이 정량적으로 변경된 천연 단백질로서 본원에서 정의된다.
본질적으로 프로테아제가 없는 생성물을 생성하는 본 발명의 방법은 진핵세포 폴리펩티드, 특히 효소와 같은 진균 단백질의 생성에서 특히 관심의 대상이다. 또한, 프로테아제-결함 세포는 식품 산업에서 관심의 이종성 단백질을 발현하는 데, 또는 관심의 제약 분야에 사용될 수 있다.
산업 공정에서의 프로테아제의 사용
또한, 본 발명은 일부 산업 및 제약 공정에서의 본 발명에 따른 프로테아제의 용도에 관한 것이다. 이들 공정에서 얻어진 장기간의 경험에도 불구하고, 본 발명에 따른 프로테아제는 현재 사용되는 효소에 비하여 많은 현저한 이점을 특징으로 한다. 특정한 용도에 따라서, 이들 이점은 저렴한 생산 비용, 기질을 향한 높은 특이성, 더 적은 항원, 더 적은 바람직하지 않는 부활성, 적합한 미생물에서 생성되었을 때의 더 높은 수율, 더욱 적합한 pH 및 온도 범위, 최종 제품의 더 나은 맛 뿐만 아니라 식품 등급 및 코우셔 양태와 같은 양태를 포함할 수 있다.
식품 또는 사료 생산을 목표로 하는 대규모의 산업적 용도에서, 단백질 가수분해 효소는 통상 단백질 용해성, 추출 수율, 점도 또는 맛, 질감, 영양적 가치, 항원성 또는 항영양 인자의 최소화, 색 또는 기능성과 같은 양태 뿐만 아니라, 단백질성 미가공 재료의 여과성과 같은 프로세싱 양태를 개선하는 데 사용된다. 이들 용도에서, 단백질성 미가공 재료는 동물 또는 식물 기원일 수 있으며, 예로는 콩단백질, 밀 글루텐, 평지씨 단백질, 완두콩 단백질, 자주개자리 단백질, 해바리기 단백질, 콩과 열매 단백질, 목화씨 또는 참깨씨 단백질, 옥수수 단백질, 보리 단백질, 사탕수수 단백질, 감자 단백질, 쌀단백질, 커피 단백질과 같은 식물성 단백질, 및 밀크 단백질(예를 들어, 카세인, 유장 단백질), 달걀 흰자, 어류 단백질, 젤라틴을 포함하는 육류 단백질, 콜라겐, 혈액 단백질(예를 들어, 헤모글로빈), 털, 깃털 및 어분과 같은 동물성 단백질이 포함된다.
본 발명에 따른 프로테아제의 중요한 양태는, 그것들이 여러 가지 용도에 대해 이상적으로 적합하게 된 pH 및 온도 최적 조건의 전범위를 커버한다는 것이다. 예를 들어, 많은 대규모 공정은 미생물 감염의 위험을 제어하기 위해서 50℃ 이상의 상대적으로 높은 프로세싱 온도가 유리하다. 본 발명에 따른 몇가지 프로테아제는 이런 요구에 응할 수 있지만, 동시에 극단적이지 않은 열안정성을 나타냄으로써, 그것들이 추가 열처리에 의해 효소를 불활성화하려는 시도에 저항할 수 없게 한다. 후자의 특징은 잔류한 단백질 가수분해 활성이 없는 최종 생성물을 얻는 생성 경로를 허용한다. 유사하게, 많은 사료 및 식품 제품은 약간 산성의 pH 값을 가지며, 따라서 그것들의 프로세싱 프로테아제는 산성 또는 중성 근처의 pH 최적 조건을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 프로테아제는 또한 이런 요구에 따른다.
엔도프로테아제의 특이성은 통상, 각각 P1 위치에 있는 아미노산 잔기의 카르복실과 P1' 위치에 있는 잔기의 아미노기 사이의 결합의 우선적인 절단으로 정의된다. 선호성은 P1에 의해(예컨대, 트립신의 기질에 있는 양으로 하전된 잔기), P1'에 의해(예컨대, 써모리신에 의한 분열에서 소수성 잔기)에 의해, 또는 P1 및 P2 모두에 의해(예컨대, 부신속질 세린 엔도프로테아제에 의한 2개의 양으로 하전된 잔기 사이의 특이적 절단) 우세하게 조건화될 수 있다. 어떤 경우, 더욱 먼 잔기가 절단 선호성을 결정할 수 있으며, 스트렙토코칼 펩티다제 A에 대해 P2를 예로 들 수 있다. 어떤 잔기들은 절단에 부정적인 영향을 준다고 알려져 있는데; P1' 위치에서 프롤린과의 결합이 많은 프로테아제의 작용에 대해 내성을 나타낸다는 것이 잘 공지되어 있다. 대부분의 엔도프로테아제는 소수성 환경에서 또는 음으로 하전된 잔기 부근에서 우선적으로 절단한다. 예를 들어, 키모트립신(소의 췌장으로부터 얻어짐) 또는 섭틸리신, 중성 금속 엔도프로테아제 또는 써모리신(모두 바실루스 종으로부터 얻어짐)과 같은 산업적으로 이용가능한 엔도프로테아제는 -Phe, -Leu 및 -Tyr과 같은 소수성 아미노산 "뒤에서의" 절단을 선호하는 경향이 있다. 다른 산업적으로 이용가능한 엔도프로테아제는 -Arg 및 -Lys 뒤에서의 절단을 선호하는 트립신(소의 췌장으로부터 얻어짐) 및 -Arg 뒤에서의 절단을 선호하는 파파인(파파야 열매로부터 얻어진 프로테아제를 포함하는 다양한 효소의 복합 혼합물)이다.
반면에, Ala, Gly, Ser, Thre 뿐만 아니라 Ile 및 Pro와 같은 작은 크기의 잔기에 의해 형성된 펩티드 결합은 나쁜 기질이다(Keil, B et al.; Protein Seq Data Anal (1993) 5; 401-407). 이런 상황은 제약, 식품 및 음료, 농업 및 심지어 화학 산업과 깊은 관련을 가진다. 본 발명에 따른 프로테아제는 평범하지 않은 절단 선호성을 나타낸다.
엑소펩티다제는 폴리펩티드 사슬의 단부 근처에서만 작용한다. 자유 N-말단에서의 이들 작용은 단일 아미노산 잔기(소위 아미노펩티다제라고 함) 또는 디펩티드 또는 트리펩티드(소위 디펩티딜-펩티다제 및 트리펩티딜-펩티다제라고 함)를 유리시킨다. 자유 C-말단에서의 이들 작용은 단일 잔기(소위 카르복시펩티다제라고 함) 또는 디펩티드(소위 펩티딜-디펩티다제라고 함)를 유리시킨다. 카르복시펩티다제는 촉매 기작에 기초하여 3개의 군, 즉 세린-형 카르복시펩티다제, 금속카르복시펩티다제 및 시스테인-형 카르복시펩티다제로 분류된다. 다른 엑소펩티다제는 디펩티드(소위 디펩티다제라고 함)에 대해 특이적이거나, 또는 알파-카르복실 또는 알파-아미노기(소위 오메가 펩티다제라고 함)에 속한 것들 이외의 다른 펩티드 결합을 절단할 수 있다. 그러한 새로운 오메가 펩티다제의 예들은 본 발명에서 확인된 피로글루타밀-펩티다제 및 아실아미노아실-펩티다제이다(표 1 참조, 각각 유전자 18 및 45).
본 발명에 따른 프로테아제가 우수한 성능을 제공할 것으로 예상될 수 있으며 순수한 엔도프로테아제의 사용에 의존하는 산업적 용도의 전형적인 예들은 식물 또는 동물 기원 재료들의 프로세싱을 포함한다. 이들 프로세싱 단계는 미정제 재료 또는 (부분적으로) 정제된 단백질 분획의 특성들의 큰 어레이를 변형시키는 것을 목표로 할 수 있다. 예를 들어, 이들 프로세싱 단계는 생성물 용해성, 여과성, 분리성, 단백질 추출 수율 및 소화성을 최대화하거나, 또는 독성, 나쁜 맛 및 점도를 최소화하는 것을 목표로 할 수 있다. 더욱이, 그 처리는 미정제 재료 또는 정제된 (또는 부분적으로 정제된) 단백질의 물리-화학적 특성들을 변경시키는 것에 관한 것일 수 있다. 이들 이점은, 본 발명에 따른 엔도프로테아제가 산업적 용도에서 프로세싱 보조제로서 적용되는 경우 뿐만 아니라, 동물 사료에서 활성 효소 성분으로서 적용되는 경우에도 적용된다. 구체적으로, 본 발명에 따른 엔도프로테아제는, 예를 들어 빵의 부패를 지연시키거나 또는 도우의 점성을 줄이기 위해 제빵 산업에서 빵의 식품 첨가제로서 적용될 수 있다. 또는, 엔도프로테아제는 바람직하지 않은 단백질 탁도의 형성을 방지하거나 또는 최소화하기 위해 맥주 및 와인 산업에서 사용될 수 있다. 또는 달리, 맥주 산업에서 사용되어 맥아즙의 제조에 사용된 곡물의 단백질 추출 수율을 최적화할 수 있다. 더욱이, 또한 우수한 특성을 갖는 밀크 응고제로서 또는 다양한 밀크 성분의 질감, 거품형성 또는 응고 특성을 최적화하기 위해 낙농 산업에서 사용될 수 있다. 낙농 산업에서의 다른 용도는 효소 변형 치즈(EMC)의 제조에서 신규한 프로테아제의 사용이다.
더욱이, 다양한 단백질성 기질은 본 발명의 엔도프로테아제에 따를 수 있으며, 통상 다른 단백질 가수분해 효소와 조합하여 의학적 또는 비-의학적 용도를 위한 가수분해물을 얻는다. 본원에서, 본 발명에 따른 엔도프로테아제는 단백질성 기질의 완전한 가수분해를 달성하는 데 있어서 놀랄 만큼 효과적이며, 그래서 심지어 프로테아제 내성 부분도 충분히 가수분해되고, 이 엔도프로테아제는 또한 최종 가수분해물의 알레르기항원성을 최소화하거나 또는 쓴맛의 형성을 억제하는 데 있어 놀랄 만큼 높은 활성을 나타낸다.
더 구체적으로, 본 발명에 따른 엔도프로테아제는, 특히 Ala, Gly, Ser 및 Thr의 작은 크기의 아미노산 잔기, 또는 P1 또는 P1' 위치에 있는 Ile 및 Pro 잔기를 갖는, 통상적이지 않은 펩티드 결합에서 단백질을 절단하는 것에 대한 그의 선호성을 특징으로 한다(Keil, B et al.; Protein Seq Data Anal (1993) 5; 401-407). 결과적으로, 선행 기술의 엔도프로테아제를 사용한 가수분해에 대해 내성을 나타내는 단백질성 출발 물질의 이들 분획은 본 발명에 따른 엔도프로테아제를 사용하여 용해되고 가수분해될 수 있다. 비제한적인 그러한 프로테아제 내성 분획의 예들은 식물성 물질 및 콜라겐의 소위 익스텐신, 젤라틴 뿐만 아니라 동물성 물질의 특정 밀크 성분을 포함한다.
예를 들어, 대두와 같은 다양한 사료는 트립신 억제제를 함유한다. 이들 단백질은, 예를 들어 돼지 및 가금의 위장관에서 트립신 활성을 억제한다. 이 트립신 억제 활성은 이들 동물에서 최적 아래의 단백질 소화성을 가져오며, 그 결과 폐기물 생성이 증가되고 경제적으로 좋지 않다. 이런 문제는 고온에서 대두를 구움으로써 부분적으로 극복될 수 있다. 2가지 상이한 종류의 트립신 억제제가 대두에서 확인되었는데, Bowman-Birk 형 트립신 억제제와 Kunitz 형 트립신 억제제이다.
이제, 본 발명은 굽는 것 이상으로 트립신 억제 활성을 변성시키는 다른 방식을 제공하는데, 그것은 Kunitz 형 트립신 억제제의 카르복실-말단 근처의 로이신 176과 아스파르테이트 177 사이의 펩티드 결합에서 절단할 수 있는 시스테인 프로테아제(EC 3.4.22, 표 1)를 제공한다(Wilson(1988) in CRC Critical Reviews in Biotechnology 8(3):197-216 참조). 이것은 대두에서 이 트립신 억제제의 불활성화를 가져온다. 놀랍게도 진균 Aspergillus niger에 의해 분비된 시스테인 프로테아제가 다른 유기체로부터 유래된 유사한 효소보다 이들 기준을 훨씬 더 충족시킨 것으로 밝혀졌다.
또한, 프로테아제는 치즈 제조 분야에 널리 사용된다. 치즈의 생산에서는, 유장으로부터 치즈 물질, 예를 들어 카세인을 분리할 수 있도록 치즈 밀크를 응고시키는 것이 필수적이다. 몇몇 밀크 응고 효소, 또는 응고제로서 언급된 것이 설명되었으며, 이것들은 (소) 키모신, 소 펩신, 돼지 펩신 뿐만 아니라, Rhizomucor miehei 프로테아제, Rhizomucor pusillus 프로테아제 및 Cryptonectria parasitic 프로테아제와 같은 미생물 효소를 포함한다. 키모신은 송아지의 위에서 얻어질 수 있지만, 또한 예를 들어 Kluyveromyces lactis에 의해 미생물적으로 생성될 수도 있다. 모든 이들 효소는 잔기 105(페닐알라닌)와 잔기 106(메티오닌) 사이의 펩티드 결합 또는 κ-카세인에서 그것에 인접한 결합에 대한 특이성을 갖는 것을 특징으로 한다. 이것은 치즈 제조에서 이들 효소를 사용함에 의해, κ-카세인이 파라-κ-카세인과 음전하를 지닌 글리코매크로펩티드(GMP)라고 하는 매크로-펩티드 부분 사이의 합류점에서 분할된다는 것을 의미한다. 이것이 일어날 때, 매크로펩티드는 유장으로 확산되며, 카세인 미셀의 용해성에 대한 그의 안정화 효과가 상실되고, 일단 충분한 κ-카세인이 가수분해되었다면 카세인 교질입자가 엉기기 시작할 수 있다. 밀크의 효소적 응고에 대한 더 이상의 상세한 사항은, 예를 들어 문헌[D. G. Dalctleish in Advanced Dairy Chemistry 1판 P.F.Fox 편저, Elsevier, London, 1992]을 참조한다.
현재 이용가능한 응고제는 다소 높은 수율의 치즈를 허용하지만, 생성된 막대한 부피의 치즈로 인해, 10% 포인트 크기 정도의 수율 증가가 실질적인 경제적 이점을 구성할 수 있도록 실현되어야 한다. 결국, (심지어 약간) 개선된 수율을 갖는 응고제가 당업계에서 상당히 필요하다.
응고제는 높은 기질 특이성을 특징으로 하지만, 이것은 pH 및 온도에도 의존한다. 전형적인 치즈 제조 공정에서, pH는 처음에 pH 6.3에서 4.5 내지 5.5 범위의 더 낮은 pH 값까지 변할 것이며, 최종 값은 치즈 생산 공정 동안 사용된 사용된 조건에 따른다. 어떤 응고제는 다른 것들보다 pH 변화에 더 민감하다. 예를 들어, Rhizomucor pusillus 프로테아제는 키모신보다 pH 변화에 더 민감하다. pH에 더하여, 온도 및 물 함량과 같은 다른 매개변수들이 또한 프로테아제 특이성에 영향을 미칠 수 있다. 대부분의 응고제는 pH가 변화함에 따라 기질 특이성도 변화한다는 것이 잘 알려져 있으며, 그 결과 치즈 제조 공정의 나중 단계에서는 단백질 가수분해 활성이 변경된다. 또한, 응고제는 카세인 가수분해도에 차이가 있으며, 그것들은 또한 단백질 가수분해 동안 생성된 펩티드 패턴에서 차이를 나타낼 수 있다는 것이 잘 알려져 있다. 이것들은 치즈 숙성 동안 관련되는 요인들이며, 맛, 향미 및 질감 같은 치즈 성질에 영향을 미칠 수 있다. 어떤 경우, 응고제는 쓴 맛을 내는 펩티드 또는 나쁜 맛의 형성과 같은 바람직하지 않은 효과를 일으킨다. 이에 더하여, 단백질 가수분해 특이성의 변화는 수율의 감소를 가져올 수 있다. 많은 소 키모신 제제에 있는 잘 알려진 성분인 펩신이 순수한 키모신과 비교하여 수율 및 맛의 저하를 일으키는 프로테아제의 예이다. 새롭고 개선된 치즈 질감 및 맛을 일으키는 응고제에 대한 필요성이 여전히 있다. 그러한 신규한 응고제는 치즈 숙성에 관하여 맛 및 질감 프로파일의 가속된 발달을 가져오며, 그로써 실질적인 경제적 이점을 제공한다.
자유 아미노산이 맛 및 향미 발생에 매우 중요하다는 것이 잘 알려져 있다. 특히, 아미노산 로이신, 페닐알라닌, 메티오닌 및 발린은 전형적인 치즈 맛 및 향미 성분의 발생에서 중요한 역할을 한다. 자유 아미노산은 치즈 제조 프로세서 동안 첨가된 미생물에 의한 발효에 의해, 메탄디올, 디메틸디술피드, 메틸프로탄산 및 메틸프로파날과 같은 실제 향미 및 맛 발생 성분으로 전환된다. 엑소펩티다제는 자유 아미노산의 발생에서 중요한 역할을 한다. 그러나, 그것들은 적합한 특이성의 엔도프로테아제와 조합되었을 때는 단지 효과적일 수만 있다. 엑소-프로테아제와 엔도-프로테아제의 적합한 조합물이 치즈 제조에 사용될 수 있으며, 그 결과 새롭고 개선된 맛 프로파일을 갖는 치즈가 제조된다.
본 발명에 따른 효소는 전유, 탈지유, 카세인, 유장 단백질, 또는 카세인과 유장 단백질의 혼합물과 같은 동물 기원의 단백질성 물질을 가수분해하는 데 사용될 수 있다. 카세인과 유장 단백질의 그러한 혼합물은, 예를 들어 사람 젖에서 발견된 것들과 유사한 비율로 사용될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 따른 효소 혼합물은, 예를 들어 밀 글루텐 맥아 또는 비맥아 보리 또는 맥주 제조에 사용되는 다른 곡물, 두유, 그의 농축물 또는 분리물, 옥수수 단백질 농축물 및 그의 분리물, 및 쌀 단백질과 같은 식물 기원의 단백질성 물질을 가수분해하는 데 사용될 수 있다.
대규모 산업 프로세서의 영역 내에서, 어떤 용도는 엔도프로테아제의 사용에만 의존하는 반면, 다른 용도에서는 엔도프로테아제와 엑소프로테아제의 조합물이 필수적이다. 순수한 엔도프로테아제의 사용에 의존하며, 본 발명에 따른 프로테아제가 우수한 성능을 제공할 수 있는 전형적인 예들은, 점성의 최소화 또는 거품형성 또는 다른 물리-화학적 특성의 최적화를 목표로 하는 콩 또는 완두콩 또는 곡물 단백질의 프로세싱, 또한 도우의 점성 감소를 목표로 하는 제빵 산업에서 빵의 식품 첨가물, 단백질 탁도의 방지 또는 곡물 추출 수율의 최적화를 목표로 하는 맥주 및 와인 산업에서 프로세싱 보조제, 장 흡수의 증진 또는 창자에서 미생물 활성의 조정을 목표로 하는 바이오 산업에서 사료 첨가제, 다양한 밀크 성분의 응고, 거품형성 또는 응고 특성의 최적화를 목표로 하는 낙농 산업에서 프로세싱 보조제와 같은 용도들을 포함한다. 더욱이, 특수한 시장 분야를 위해, 밀크 또는 콩 또는 콜라겐으로부터 유래된 단백질을 프로테아제에 노출시켜 소위 단백질 가수분해물을 생성한다. 이들 단백질 가수분해물에 대한 주된 판로는 유아용 유동식 및 입원 환자를 위한 식품 제품이지만, 운동선수 또는 슬리밍 다이어트 중인 사람과 같이 비-의학적 필요를 갖는 사람을 위한 제품이 빠르게 성장하고 있는 분야를 형성한다. 이들 모든 용도에서, 단백질 가수분해물은 알레르기 항원성의 저하, 위장관 흡수의 촉진, 글루타민 및 시스테인과 같은 바람직한 아미노산의 보다 적은 화학적 열화, 및 마지막으로 연장된 저장 기간 동안 산성 음료에서 단백질성 침전의 부재와 같은 매력적인 이점을 제공한다. 만일 가수분해물이 디- 및 트리펩티드의 혼합물로서 제공된다면, 모든 이들 이점이 조합될 수 있다. 그러나, 현재 모든 상업적으로 입수가능한 가수분해물은 몇몇 엔도프로테아제를 조합함에 의해 생성된다. 후자의 방법은 단백질의 비-균일한 그리고 불완전한 변성을 의미한다. 디- 및 트리펩티드의 바람직한 혼합물을 얻기 위해서, 다양한 디- 및 트리펩티딜펩티다제의 조합물을 사용하는 가수분해 공정이 이상적일 것이다. 불행하게도, 식품 등급이며 산업적으로 허용되는 미생물로부터의 이들 효소들 중 단지 소수만이 공지되어 있으며 산업적으로 이용가능하다. 본 발명에 따르면, 몇가지의 매우 유용한 디- 및 트리펩티딜펩티다제가 비교적 순수한 상태로 경제적으로 얻어질 수 있다. 절단되는 기질을 향한 낮은 선택성을 나타내는, 즉 최소의 아미노산 잔기 절단 선호성을 나타내는 디- 또는 트리펩티딜펩티다제가 바람직하다. 천연 발생 펩티드 결합을 높은 퍼센트로 가수분해하는 디- 또는 트리펩티딜펩티다제의 조합물이 바람직하다. 천연 발생 펩티드 결합에 대한 이런 높은 활성에도 불구하고, 자유 아미노산에 대한 총 가수분해는 디- 및 트리펩티딜펩티다제의 성질에 의해 방지된다. 또한, pH 4 내지 8에서 최적 활성을 갖고, 충분한 온도 안정성을 나타내는 디- 또는 트리펩티딜펩티다제가 바람직하다. 충분한 온도 안정성은, 초기 가수분해 활성의 적어도 40%, 바람직하게 적어도 60%, 더 바람직하게 70 내지 100%가 50℃에서 1시간 동안 기질과 함께 효소를 가열한 후에도 살아 남는다는 의미이다.
디- 또는 트리펩티드 또는 디- 및 트리펩티드 혼합물의 효과적인 생성을 향한 공정은 본 발명에 따른 효소의 유용성에 따라 정해지지만, 단백질성 기질과 함께 인큐베이션하는 첫번째 효소는 통상 엔도프로테아제일 것이다. 바람직하게, 광범위한 엔도펩티다제를 갖는 엔도프로테아제가 그 상황에 적합했으며, 예를 들어 중성 근처의 조건에 섭틸리신(DSM의 Delvolase), 중성 금속 프로테아제(NOVO의 Neutrase) 또는 써모리신(Daiwa Kasei의 Thermoase) 및 산성 조건에 펩신 또는 아스페르길로펩신(예를 들어, Shin Nihon의 Sumizyme AP)이다. 이 첫번째 소화의 목표는 물/단백질 혼합물의 용해성을 개선하고, 점성을 감소시키고, 열응고 특성을 감소시키는 것이다. 더욱이, 엔도뉴클레아제를 사용한 이 전처리는 디- 및 트리펩티딜펩티다제를 위한 충분한 출발 지점을 만드는 데 필수적이며, 이로써 디- 또는 트리펩티드 형성의 공정을 가속화한다. 선택적으로, 가수분해물의 쓴맛을 없애려는 의도의 프로테아제는, 디- 또는 트리펩티딜펩티다제와 함께, 공정 중 이 단계에서 또는 더 늦게 포함될 수 있다.
후반 가수분해물의 주된 목표는 생성물의 알레르기 항원성을 최소화하거나, 또는 위장 흡수를 용이하게 하는 것이다. 그러한 가수분해물의 생성에서, 디펩티딜- 및 트리펩티딜-펩티다제의 사용은, 그것들이 가수분해물을 생성하는 효과적인 방식을 제공하므로 특별한 중요성을 가진다.
이들 식품 및 사료 산업에서의 다른 용도는 전적으로 하나 이상의 엔도프로테아제(들)과 하나 이상의 엑소프로테아제(들)의 조합물에 의존한다. 엔도프로테아제와 엑소프로테아제의 그러한 조합물은 전형적으로 최종 제품의 맛 및 색과 같은 양태를 개선하기 위하여 산업 분야에서 사용된다. 이것은 맛 및 색의 발생이 자유 아미노산의 존재에 크게 의존하기 때문이다. 자유 아미노산은 카르복시펩티다제 및 아미노펩티다제와 같은 엑소프로테아제에 의해서 뿐만 아니라, 펩티딜-디펩티다제에 의해서도 얻어질 수 있다. 엔도프로테아제 또는 심지어 디펩티딜- 또는 트리펩티딜-펩티다제와 조합된다면, 카르복시펩티다제, 아미노펩티다제, 및 펩티딜-디펩티다제는 더 적은 시간으로 더 많은 양의 자유 아미노산을 만들 수 있다. 그러나, 이들 공정 모두에서, 아미노산 또는 심지어 비-단백질성 성분의 제어되지 않은 방출을 피하여 바람직하지 않은 부 반응물을 최소화하여야 한다.
그와 같은 자유 아미노산은 많은 느낌의 맛을 이끌어 내지만, 이들 맛의 느낌은 매우 기본적인 것이며(쓴맛, 단맛, 신맛 및 "우마미"), 이들 맛을 알아채기 위해서는 고농도의 아미노산이 필요하다. 이들 높은 역치에도 불구하고, 자유 아미노산은 다수의 향미 증진 기작을 통해 훨씬 더 낮은 농도 범위에서 주요한 지각 효과를 창출할 수 있다. 이들 기작 중 하나는 소위 Maillard 반응에서의 자유 아미노산과 당의 매개변수를 포함한다. 자유 아미노산에 비하여, 이들 Maillard 생성물에 있어, 압도적으로 복잡한 향미 및 악취 시스템은 자유 아미노산에 대해 기록된 것들보다 몇 차수의 더 낮은 크기의 역치에서 발생할 수 있다. Maillard 생성물은 통상 요리 중의, 빵을 굽는 중의, 또는 고기를 굽는 중의 상승된 온도에서 형성된다. 이들 온도 동안, 색 및 큰 어레이의 향기가 발생한다. 이들 반응에서, 아미노기는 제 1 단계로서 환원 화합물과 반응하고, 궁극적으로는 전체 패밀리의 반응 경로를 가져온다. 식품 또는 사료에서, 포함되는 아미노 화합물은 다양한 프로테아제에 의해 단백질성 미정제 재료로부터 방출된 자유 아미노산이 우세하며, 필요한 환원 화합물은 주로 환원당을 나타낸다. 이것은 미정제 재료의 프로세싱 동안, 자유 아미노산 및 당의 바람직하지 않은 방출을 피하여 후속 가열 단계 동안, 예를 들어 분무 건조 또는 멸균 동안 발생될 수 있는 나쁜 맛을 최소화하여야 한다는 것을 함축한다. 후자의 개념은 본 발명에 따른 효소의 우수한 순도 및 저렴한 비용의 이점을 한번 더 강조한다.
Maillard 반응과는 별도로, 아미노산은 또한 주변 온도에서 중요한 화학적 변이를 겪을 수 있다. 후자의 종류의 변이는 효소 의존적이며, 맥주, 요구르트, 치즈 숙성 및 육류 및 와인 숙성 공정와 같은 발효 식품에서 매우 흔하다. 이들 발효 공정에서, 자유 아미노산은 첨가된 프로테아제에 의해 또는 미정제 원료로부터의 단백질 가수분해 효소 활성 또는 사용된 미생물 발효균에 의해 사용된 미정제 원료로부터 유리된다. 숙성 단계 동안, 미생물 대사 활성은 그 후 자유 아미노산을 증가된 지각 특성을 갖는 유도체로 전환시킨다. 예를 들어, L-로이신, L-이소로이신 및 L-발린은 맥주 발효에서 아밀알콜 및 이소부탄올과 같은 유익한 고급 알콜의 형성을 가져온다. 유사하게, 메탄티올 및 디메틸디술피드와 같은 치즈 휘발물은 치즈의 메티오닌 뿐만 아니라 메틸프로판산 및 발린에 대한 메틸프로탄알의 발생까지 거슬러 올라간다. 마지막으로, 자유 아미노산 글루타메이트는 소위 5'-리보뉴클레오티드라 하는 RNA의 파괴 생성물과의 상승효과 때문에 강한 풍미 증진 효과를 창출할 수 있다. 5'-IMP 및 5'-GMP와 같은 적합한 농도의 5'-리보뉴클레오티드와 조합된 경우, 글루타메이트에 의해 발생된 우마미 맛의 검출 역치는 크기를 거의 2 차수까지 저하시키는 것으로 알려져 있다.
모든 이들 공정에서 뚜렷하며 명확한 맛을 얻기 위해서는, 단백질성 기질이 엔도- 및 엑소프로테아제의 조합물을 사용하여 가수분해되어야 하며, 여기서 엔도 또는 엑소프로테아제 중 적어도 하나는, 바람직하게는 엔도- 및 엑소프로테아제 둘다는 순수하며 바람직하게는 특이적 세트의 아미노산(들)에 대해 선택적이거나, 또는 바람직한 아미노산(들)을 우선적으로 방출한다. 그렇게 바람직한 프로테아제는 절단될 수 있는 아미노산 서열에 대한 높은 선택성을 특징으로 하며, 이 개념은 특히 중요한 "숙성효소"로서 공지된 Aspergillus 내의 효소 카테고리를 만든다.
식품 및 사료 산업과는 별도로, 프로테아제는 또한 화학적, 약학적, 진단적 및 개인 위생 산업에 의해 통상적으로 사용된다.
개인 위생 산업에서는, 프로테아제를 사용하여 피부 느낌, 윤기 및 보호와 같은 양태를 개선하기 위하여 여러 가지의 제품에 첨가되는 펩티드를 만들어 낸다. 더욱이, 프로테아제의 직접적인 국소 적용에 대한 새로운 경향이 있다. 후자의 용도에서 제 1의 목표는 피부의 청결, 제모 및 연화이며, 이것은 가죽 산업에서의 효소 사용과 매우 유사하다.
화학적 및 약학적 산업에서, 프로테아제는 값비싼 성분 또는 중간체를 생성하는 데 있어서의 유익한 도구로서 개발되고 있다. 이들 산업에서, 프로테아제는 그것들의 가수분해 능력 때문에, 그리고 천연 또는 비-천연 아미노산으로부터 펩티드를 합성하는 능력 때문에 사용된다. 후자의 옵션은 써모리신과 같은 엔도프로테아제를 사용하여 그의 아미노산 기재 빌딩 블록으로부터 아스파테임(aspartame)을 합성할 수 있는 가능성에 의해 명백히 증명된다.
식품 및 사료 산업에서의 상황과는 달리, 원하는 화학적 변형을 달성하기 위해서 통상적이지 않은 반응 조건이 필요할 수도 있지만, 프로테아제의 입체- 및 위치-선택성이 또한 중요한 장점으로 고려된다. 이 산업에서 프로테아제 적용의 전형적인 예는 인슐린, 항생물질, 레닌 및 ACE-억제제와 같은 약물을 위한 다양한 중간체의 생성에서 엔도프로테아제, 아미노펩티다제, 및 카르복시펩티다제의 사용을 포함한다. 문헌[Industrial Biotransformations, A. Liese, K. Seelbach, C. Wandrey, Wiley-VCH ; ISBN 3-527-30094-5]에 그러한 사용이 개략적으로 기재되어 있다.
바람직한 특이성, 입체- 및 위치-선택성, 부 첨가제의 부재 및 높은 용매 농도와 같은 통상적이지 않은 반응 조건에 대한 저항성의 관점에서, 본 발명에 따른 프로테아제의 개선된 성능은 실질적인 이점을 제공한다.
약학적 관점에서, 프로테아제의 역할은 문헌[Martindale's, "The Extra Pharmaco-poeia" (Pharmaceutical Press, London, UK)] 기재된 상당수의 참고자료에 의해 예시된다. 더욱이, 모든 종류의 생물학적 공정을 조절하는 데 있어서 매우 특이적인 프로테아제의 중요한 역할은 많은 호르몬이 그러한 매우 특이적인 프로테아제에 의해 대부분 불활성을 나타내는 전구체 분자를 프로세싱한 후에만 활성을 나타낸다는 사실에 의해 예시된다. 특정 카테고리의 그러한 특이적 프로테아제에 대한 활성 억제제는 모든 종류의 새로운 약물의 개발에 연루되고 있다. 따라서, 프로테아제에 대한 새롭고 효과적인 억제제가 본원에 제공된 서열들을 사용하여 비로써 확인될 수 있다.
본원에 인용된 각 문헌의 전체 명세서가 본원에 참고자료로서 수록된다.
SEQ ID NO | 암호화된 단백질의 기능 | EC 번호 | ||
유전자 | cDNA | 단백질 | ||
1 | 58 | 115 | 펩신 A3 | EC3.4.23.1 |
2 | 59 | 116 | 메탈로프로테아제 | EC3.4.24.56 |
3 | 60 | 117 | 아실아미노아실-펩티다제 | EC3.4.19.1 |
4 | 61 | 118 | 트리펩티딜아미노펩티다제 | EC3.4.14.- |
5 | 62 | 119 | 세린 카르복시펩티다제 | EC3.4.16.6 |
6 | 63 | 120 | 세린 엔도프로테아제 | EC3.4.21.- |
7 | 64 | 121 | 카르복시펩티다제 Y | EC3.4.16.5 |
8 | 65 | 122 | 아스페르길로펩신 II-상동 | EC3.4.23.19 |
9 | 66 | 123 | 트리펩티딜 펩티다제 | EC3.4.14.9 |
10 | 67 | 124 | 트리펩티딜 펩티다제 | EC3.4.14.9 |
11 | 68 | 125 | 아스페르길로펩신 II-상동 | EC3.4.23.19 |
12 | 69 | 126 | 트리펩티딜 펩티다제 | EC3.4.14.9 |
13 | 70 | 127 | 메탈로프로테아제 | EC3.4.24.- |
14 | 71 | 128 | 아스페르길로펩신 I | EC3.4.23.18 |
15 | 72 | 129 | 펩시노겐 E | EC3.4.23.25 |
16 | 73 | 130 | 아스페르길로펩신 I-상동 | EC3.4.23.18 |
17 | 74 | 131 | 아스페르길로펩신II | EC3.4.23.19 |
18 | 75 | 132 | Pyro-glu 펩티다제 | EC3.4.19.3 |
19 | 76 | 133 | 디펩티딜 펩티다제 | EC3.4.14.2 |
20 | 77 | 134 | Secr.아미노펩티다제 | EC3.4.11.10 |
21 | 78 | 135 | 알칼린 D-펩티다제 | EC3.4.16.4 |
22 | 79 | 136 | 카르복시펩티다제 | EC3.4.16.1 |
23 | 80 | 137 | 카르복시펩티다제 | EC3.4.16.1 |
24 | 81 | 138 | 카르복시펩티다제-II | EC3.4.16.1 |
25 | 82 | 139 | 아스파르트 프로테이나제 | EC3.4.23.- |
26 | 83 | 140 | 트리펩티딜 펩티다제 | EC3.4.14.9 |
27 | 84 | 141 | 카르복시펩티다제 | EC3.4.16.1 |
28 | 85 | 142 | 시스테인 프로테이나제 | EC3.4.22.- |
29 | 86 | 143 | 메탈로카르복시펩티다제 | EC3.4.17.- |
SEQ ID NO | 암호화된 단백질의 기능 | EC 번호 | ||
유전자 | cDNA | 단백질 | ||
30 | 87 | 144 | 서브틸리신 홈 | EC3.4.21.62 |
31 | 88 | 145 | 카르복시펩티다제 Y | EC3.4.16.5 |
32 | 89 | 146 | 메탈로프로테아제 | EC3.4.24.- |
33 | 90 | 147 | 카르복시펩티다제 Y | EC3.4.16.5 |
34 | 91 | 148 | 메탈로프로테아제 | EC3.4.24.- |
35 | 92 | 149 | 트리펩티딜 펩티다제 | EC3.4.14.- |
36 | 93 | 150 | 아스파르트 프로테아제 | EC3.4.23.24 |
37 | 94 | 151 | 아스파르트 프로테아제 | EC3.4.23.24 |
38 | 95 | 152 | 펩신 A3 | EC3.4.23.1 |
39 | 96 | 153 | 아스파르트 프로테아제 | EC3.4.23.24 |
40 | 97 | 154 | 아스파르트 프로테아제 | EC3.4.23.24 |
41 | 98 | 155 | Kex | EC3.4.21.61 |
42 | 99 | 156 | 세린 프로테아제 | EC3.4.21.- |
43 | 100 | 157 | 글루타밀 엔도프로테아제 | EC3.4.21.82 |
44 | 101 | 158 | 아스페르길로펩신II-상동 | EC3.4.23.19 |
45 | 102 | 159 | 아실아미노아실-펩티다제 | EC3.4.19.1 |
46 | 103 | 160 | 트리펩티딜아미노펩티다제 | EC3.4.14.- |
47 | 104 | 161 | 세린 카르복시펩티다제 | EC3.4.16.6 |
48 | 105 | 162 | Gly-X 카르복시펩티다제 | EC3.4.17.4 |
49 | 106 | 163 | 아스파르트 프로테아제 | EC3.4.23.- |
50 | 107 | 164 | 트리펩티딜 펩티다제 | EC3.4.14.9 |
51 | 108 | 165 | 카르복시펩티다제-I | EC3.4.16.1 |
52 | 109 | 166 | 세린 카르복시펩티다제 | EC3.4.16.6 |
53 | 110 | 167 | 세린 카르복시펩티다제 | EC3.4.16.6 |
54 | 111 | 168 | Secr. 아미노펩티다제 | EC3.4.11.10 |
55 | 112 | 169 | 프롤릴 엔도펩티다제 | EC3.4.21.26 |
56 | 113 | 170 | 아스페르길로펩신I-상동 | EC3.4.23.18 |
57 | 114 | 171 | 아미노펩티다제 | EC3.4.11.- |
실시예 1
프로테아제 활성 및 특이성 검정
프로테아제 활성은 다양한 펩티드 기질을 사용함으로써 연구할 수 있다. 합성 기질은 스크리닝, 배양에 있어서, 분리 도중에 단백질 가수분해 효소를 검출하고, 효소 활성을 분석하고, 효소 농도를 결정하고, 특이성을 조사하고 저해제와의 상호작용을 연구하기 위해, 널리 사용된다. 활성이 연속적으로 따라오고 따라서 운동 측정이 허용될 수 있기 때문에, 펩티드 p-니트로아닐리드는 프로테아제 활성을 검정하는 데 바람직하게는 사용된다. 펩티드 p-니트로아닐리드를 절단한 후, 4-니트로아닐리드의 방출 시 410nm에서 흡수의 증가를 측정할 수 있다. 파라니트로닐리드 기질은 일반적으로 세린 및 시스테인 프로테아제에 사용된다. 더욱이 펩티드 티오에스테르 및 7-아미노-p-메틸코우마린 펩티드가 사용된다. 티오에스테르결합은 아미드 결합보다 더 절단하기 쉽기 때문에, 펩티드 티오에스테르는 상대적으로 높은 대사전환 속도를 나타내는 세린 및 메탈로프로테아제에 대해 매우 민감한 기질이다. 테오에스테르의 절단은 4,4-디티오피리딘(324nm) 또는 5,5-디티오비스 2-니트로벤조산(405nm)과 같은 티올 시약으로 할 수 있다. 동일한 증가된 대사전환 속도는 통상적으로 아미드 결합에 대응하는 에스테르 결합의 절단에 대해 관찰된다. 프로테아제의 에스테라아제 활성을 분석하는 데 있어서 가장 잘 공지된 기질은 p-니트로페놀 유도체이다. p-니트로페놀의 방출은 사용되는 pH에 따라 다른 파장에서 모니터링할 수 있는데, 예를 들어 중성 pH 주변에서는 340nm의 파장이 사용되는 반면, 9 이상의 pH에서의 모니터링은 약 405nm 주변에서 행해진다. 게다가 에스테르의 가수분해에 이어서, pH-stat 장치를 사용하여 적정한다. 에스테라제 활성을 정성적으로 측정할 때 pH 감수성 염료가 사용될 수 있다.
대안으로서, 펩티드는 형광 이탈기에 부착될 수 있다. 단백질 가수분해는 적절한 파장에서 모니터링할 때 형광성의 증가를 수반한다. 팹티딜 2-나프틸아미드 및 펩티딜 4-메틸-7-코우마릴아미드가 보통 사용된다. 예를 들어 7-아미노-4 메틸코우마린의 방출은 350nm의 여기 파장 및 460nm의 방사 파장을 사용하여 측정된다. 7-아미노-4 트리플우로로메틸코우마린의 사용은 형광성(여기 400nm, 방사 505nm) 및 발색성(흡수 380nm)을 나타내는 이탈기의 잇점을 갖는다. 절단되는 결합의 양쪽 측면에서 아미노 산이 존재하는 것이 필수적일때, 형광성을 억제하는 기의 도입이 유용할 수 있다. 그러한 기질의 일반적인 특성은 펩티드 서열은 형광 공여체기를 형광성의 억제자로서 작용하는 수용체 기로부터 분리시키는 것이다. 억제 기와 형광발색단 사이의 펩티드 결합의 절단은 형광성의 실질적인 증가를 초래할 것이다. 공여체로서 o-아미노벤조산 (Abz) 및 수용체로서 2,4-디니트로페닐(Dnp), 공여체로서 5-[(2'아미노에틸)-아미노]나프탈렌술폰산(EDANS) 및 수용체로서 4-[[4'-(디메틸아미노]페닐]아조]벤조산(DABCYL)를 포함하여, 몇가지 공여체-수용체 쌍이 보고되었다. Abz/EDDnp는 전체 가수분해 후에, 형광성이 인자 7 에서 100까지 증가하고 EDDnp의 흡수 스펙트럼은 pH에 따라 변하지 않기 때문에 매우 편리한 공여체-수용체 쌍을 나타낸다. 더욱이, 펩티드 서열은 억제 효과의 상실 없이 10개 잔기까지 함유할 수 있다. 연결 펩티드의 크기가 증가할수록, 잘라지는 결합의 위치는 덜 특이적이 될 수 있다. 따라서 단백질 가수분해가 일어나는지 여부를 성립함에 더하여, 생성물의 추가적인 분석이 필요할 수 있다. 이것은 HPLC에 의해 생산된 펩티드를 분석하고 분리하고 단편들의 아미노산 서열을 결정함으로써 수행될 수 있다. 게다가 요약한 펩티드 조성을 조합된 HPLC/질량-분광 기술을 사용함으로써 직접 분석할 수 있다.
정의된 서열의 펩디드를 사용하는 것과는 독립적으로 프로테아제 특이성을 연구하기 위해 합성 펩티드 라이브러리를 사용할 수 있다. 펩티드는 무작위 또는 반-무작위 방식으로 고체 상 합성에 의해 합성된다. 예를 들어 문헌[E.g. Meldal te al.(PANS USA 91,3314, 1994)]에서는 H-Lys(Abz)-수지로 시작하고, 펩티드를 갖는 수지를 6개 아미노산의 길이로 확장하고, 최종적으로 Tyr(NO2)를 펩티드에 커플링함에 의한 프로테아제 기질 군을 제조하는 것이 보고되어 있다. 각각의 수지 비드는 고유의 서열을 갖고 Tyr(NO2) 함유 펩티드가 방출됨에 따라 프로테아제로의 치료에서 가장 민감한 것은 형광성을 갖게 된다. 민감한 것에서의 펩티드의 서열 분석은 프로테아제의 특이성에 대한 정보를 줄 것이다.
프로테아제 활성은 보통 유닛으로 표현된다. 일반적으로 국제 표준 단위인 IU는 효소의 양으로서 정의되며, 정의된 상태하에서 분당 하나의 마이크로몰의 기질을 이동시킨다. 특히 프로테아제와 함께 IU는 분당 하나의 마이크로몰 펩티드 결합의 가수분해와 관련된다. 그러나 프로테아제 단위의 경우에 국제 정의의 편차는 예외적이기보다는 규칙적이다. 특히 하나의 결합에서 절단되는 본보기 펩티드로, IU의 계산이 수월하고, 프로테아제가 다양한 정도로 다양한 위치에서 절단할 수 있는 단백질성 기질에 대해 많은 편차 단위 정의가 사용된다. 사용되는 단위의 정의와는 별도로, 어떠한 가수분해 실험은 단위가 측정되는 조건하에서 상태의 적절한 기술이 필요하다. 그러한 상태는 예를 들어, 기질 농도, 효소-기질 비, pH 및 온도를 포함한다. 프로테아제의 특이적 활성을 결정하기 위한 전형적인 분석은 예를 들어 변성된 헤모글로빈, 인슐린 또는 카제인과 같은 단백질성 기질을 포함한다. 폴리펩티드 기질은 고정된 상태에서 고정된 시간 간격 동안에 프로테아제에 의해 소화된다. 소화되지 않은 큰 폴리펩티드는 TCA으로 촉진되고 TCA 가용성 생성물은 220 또는 280nm에서의 흡수를 측정하거나, 또는 가용성 펩티드를 폴린 시약, 닌히드린, 플루로 2,4, 디니트로벤젠/단실클로라이드, TNBS 법 또는 플루오레신으로 적정함으로써 결정된다. 가수분해후에 생성물을 표지화하는 것 대신에, 또는 이미 특정 염료 또는 예를 들어 플루오레신과 같은 형광발색단에 의해 표지화된 폴리펩티드 기질이 사용될 수 있다. 게다가 표준 실험실 분석기를 사용하여 아미노산 분석의 표준 방법을 적용할 수 있다. 프로테아제에 의해 발생된 펩티드의 크기 분포에 있어서 통찰력을 얻기 위해서, 겔 크로마토그래피 실험을 수행할 수 있다. 이 HPLC에 더하여 역상 기술은 프로테아제에 의해 발생된 펩티드 패턴의 결과를 더 나은 해상을 얻기 위해 적용된다. 단백질성 기질의 가수분해의 과정은 보통 가수분해의 정도 또는 DH로 표현된다. pH-stat가 사용되어 가수분해의 과정을 따르는 경우, DH는 가수분해동안 염기 소비로부터 유도될 수 있다 (Enzymatic Hydrolysis of Food Protein, J. Adler-Nissen, 1986, Elsevier Apllied Science Publishers LTD). DH는 용해성, 유화 능력, 거품형성 및 거품 안정성, 휘핑(whipping) 팽윤, 감각 수용성과 같은 가수분해물의 다양한 기능적 특성들과 관련된다. 게다가 맛은 식품 등급 가수분해물의 중요한 측면이다. 쓴맛은 단백질 가수분해물에서 중요한 문제가 될 수 있다. 가수분해 반응의 종료는 pH, 열 활성화, SDS, 아세토니트릴 등과 같은 변성제를 변화시킴으로써 수행될 수 있다.
표 1에 나타낸 폴리펩티드는 당업계에 공지된 표준 과정에 따라 적어도 부분적으로 정제된다. 그들은 위에서 기술된 적어도 한가지 방법에 따라 분석되었고 표 1에 열거된 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2
프로테아제 기질에 대한 Kcat/Km 비 직접 결정
합성 기질은 정제하는 동안에 효소 활성을 모니터링하고, 효소 농도를 결정하고, 억제 상수를 결정하고 또는 기질 특이성을 연구하는 데 사용할 수 있다. Kcat/Km 비의 결정은 기질 특이성의 측정을 가져온다. 동일한 효소에 대한 다른 기질의 특이성 또는 동일한 기질을 절단하는 다른 효소와 가수분해율의 비교를 허용한다. 이 비율은 두번째 순서 속도 상수의 단위를 갖고 그후 1/(농도.시간)으로 표현된다. 10.5 내지 10.6 M-1.sec-1 범위의 Kcat/Km 비를 갖는 기질은 매우 좋은 기질 즉, 우수한 친화력과 빠른 대사전환을 나타내는 기질로 간주된다. 그러나, 일부 기질은 10.4 M-1. sec-1 범위에 있는 Kcat/Km 값으로 매우 특이적이 될 수 있다.
개별적인 매개변수의 결정 후에 Kcat/Km 비를 계산할 수 있다. 그러한 경우, Km과 Vm은 다양한 선형 그래프로부터(예를 들어, Hanes 또는 Cornish-Bowden 법) 또는 비선형 회귀법에 의해 얻어질 수 있다. Vm=Kcat.Et(Et는 최종 활성 효소 농도이고 그러면 Kcat=Vm/Et.
이전의 방법에 의해 Kcat/Km 비의 결정은 생성물 또는 기질 억제가 발생할때 또는 기질이 높은 농도에서 침전할 때 방지될 수 있다. 그러나 첫번째-순서 조건하에서 즉, 어림잡은 Km 훨씬 아래의 기질 농도에서 작동하는 Kcat/Km 비의 정확한 값을 얻는 것이 가능하다. 이들 조건에서, Michaelis-Menten 식: v = (Vm.S)/(Km + S)는:
v= (Vm.S)/Km (S<<Km이므로)
또는 v= (Vm/Km).S = kobs.S =-dS/dt
여기서 , InS=-kobs.t + InSo으로서 적분되고, So는 출발 기질 농도이고 S는 주어진 시간에서 기질 농도이다. 속도는 기질 농도에 비례한다. 다시 말하면, 첫번째 속도 상수 kobs=Vm/Km= (kcat. Et)/Km (Vm=kcat. Et이므로)로서 kobs와 함께 기질 가수분해는 첫번째 과정을 따른다.
연속적인 기질 가수분해 기록은 InS 대 시간 그래프로부터 kobs의 그래프 결정을 따를 것이다. Kcat/Km비는 간단히 활성 효소 농도를 제공하는 kobs로부터 알려진다: kcat/Km=kobs/Et
분석법: 어림값 Km 훨씬 아래의 출발 기질 농도 및 낮은 효소 농도를 사용하여 기질 가수분해가 기록되도록 한다. 생성물 생성에 대한 첫번째 곡선을 얻을 것이다.
기질의 총 가수분해 후에, 생성물의 흡수(또는 형광 단위)는 Pt=So(Pt=So이므로) 정확한 결정을 따를 것이다. kobs는 InS 대 시간 그래프의 기울기로부터 또는 대안으로서 피팅 소프트웨어(Enzfitter, SigmaPlot.)를 사용하여 결정된다.
NB: P 대 시간의 도시화가 정확한 kobs를 제공하지 않기 때문에 어떠한 주어진 시간동안 생성물 농도(S=So-P)로부터 기질 농도를 잊지 말고 계산한다. (dP/dt=kobs.S는 동일한 식으로 적분되지 않는다)
대안으로서, 첫번째 과정에서:
t1/2 = In2/kobs=0. 693/kobs (kobs= 0.693/t1/2이므로)
생성물 출현 곡선으로부터 연속 t1/2(반감기)를 측정할 수 있다.
이 방법을 사용하면 진 첫번째 소멸 (연속 t1/2에 대한 똑같은 값)을 체크하할 수 있다.
실시예 3
Aspergillus에서 프로테아제 유전자의 비활성화
Aspergillus의 게놈에서 프로테아제 유전자를 비활성화하는 가장 편리한 방식은 유전자 대체 기술이다(또한 "한 단계 유전자 파괴"라고 부른다). 이 기술의 기본은 문헌[Rothstein RJ in Meth. Enzymol. 101, p202, 1983]에 의해 기술되었다. 본래 기술은 균류 세포의 게놈 DNA와 변형된 DNA 단편의 상동 재조합에 기초한다. 이중 교차를 통해 불활성화 유전자는 세포가 변형되는 DNA 단편에 의해 (부분적으로) 대체된다. 바람직하게 변형된 DNA 단편은 Aspergillus niger에 대해 선택가능한 마커 유전자를 함유한다. 기본적으로 DNA의 조작 및 불활성화 구조물의 생성은 일반적인 분자 생물학적 기술을 사용하여 수행된다. 먼저, 게놈 DNA는 Aspergillus niger 종으로부터 분리되어 나중에 프로테아제 유전자의 불활성화를 위해 사용된다. Aspergillus niger의 게놈 DNA는 기술된 기술중 어떤 것에 의해 예를 들어 문헌[de Graaff et al. (1988) Curr. Genet. 13, 315-321]에 기술되고 당업자들에게 공지된 방법에 의해 분리될 수 있다. 이 게놈 DNA는 폴리머라제 사슬 반응을 사용함으로써 프로테아제의 유전자의 측면 영역의 증폭에 대한 주형으로서 사용된다. (PCR; Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 측면 영역은 여기서 불활성화되는 프로테아제 유전자의 업스트림과 다운스트림의 비-암호화 영역을 의미한다. 바람직하게는 측면 영역은 각각 길이가 1.0kb 이상이 되어야 한다. 두개의 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드는 각각의 측면 영역의 PCR 증폭의 기폭제에 사용된다. 5'-측면 영역에 대해, 하나의 프라이머는 프로타제 유전자의 암호화 서열의 시작의 DNA 서열 업스트림과 상동성을 나타낸다. 바람직하게는 상동 영역은 번역 시작 부위의 상부 1.0 kb이상에 위치한다. 두번째 프라이머는 프로테아제 유전자의 암호화 서열의 바로 업스트림에 위치한 상보적 서열 및 역 DNA 서열과 상동성을 나타낸다.
3'-인접 영역에 대해, 하나의 프라이머는 프로테아제 유전자의 암호화 서열의 바로 다운스트림의 DNA 서열과 상동성을 나타낸다. 두번째 프라이머는 바람직하게는 프로테아제 유전자의 암호화 서열의 1.0kb이상 위치한 상보 서열 및 역 DNA 서열과 상동성을 나타낸다. 모든 프라이머에 포함되고 Aspergillus niger 게놈과 상동인 DNA 서열은 최소 15개 뉴클레오티드 길이, 바람직하게는 18개 뉴클레오티드 이상 길이가 되어야 한다. 보다 편리하게는, 모든 프라이머는 Aspergillus niger 게놈과 상동인 서열의 적절한 제한 효소 업스트림의 인식 부위에 대한 DNA 서열 암호화를 함유해야만 한다. 이들 여분의 인식 부위는 클로닝 과정을 촉진한다.
프라이머와 Aspergillus niger의 게놈 DNA 모두는 당업자들에게 알려진 조건하에서 PCR 영역에서 사용된다. 프라이머의 어닐링 온도는 Aspergillus niger의 게놈과 상동인 DNA 서열의 부분으로부터 계산될 수 있다. 5'-인접 영역 및 3'-인접 영역을 함유하는 두 단편은 일반적인 분자 생물학적 기술을 사용하여 E. coli에 번식할 수 있는 벡터로 클론된다. Aspergillus niger는 그후 두개의 인접 영역 사이에 클로닝된다. 보다 편리하게는 마커 유전자는 Aspergillus niger, 바람직하게는 내생 Aspergillus niger 프로모터로 발현되는 프로모터의 조절하에 있다. 마커 유전자의 삽입의 배향은 본래의 프로테아제 유전자와 바람직하게는 동일한 방향에 있다. 최종 불활성 단편은 바람직하게는 Aspergillus niger 내성 프로모터의 조절하에서, 5'-인접 영역, 선택 마커 유전자 및 모든 방향과 배향으로 3'-인접 영역을 함유한다. 최종 구조물의 DNA는 E. coli에서 번식될 수 있는 벡터 안으로 클로닝된다.
불활성화 구조물은 E. coli 벡터 서열을 제거하는 적절한 제한 효소로 소화되고 불활성화 단편은 표준 기술을 사용하여 분리된다(Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 최종적으로 Aspergillus niger는 불활성화 단편으로 문헌에 기술된 방법을 사용하여 예를 들어, 문헌[Kusters-van Someren et al. (1991) Curr. Genet. 20, 293-299]에 의해 기술된 방법에 의해 형질전환된다. 형질전환된 세포는 형질전환 혼합물을 마커 유전자를 발현하는 Aspergillus niger 균주의 성장에 대해 선택적인 한천 플레이트 위에 플레이팅함으로써 선택된다. 복제 플레이팅에 의해 형질전환된 Aspergillus 균주의 정제 후에, 대표 수의 균주는 Southern 블롯팅에 의해 분석된다(Sambrook et al. (1989) Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 따라서, 형질전환된 균주의 균사체의 게놈 DNA가 분리되고 적절한 제한 효소로 소화된다. 제한 단편은 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 분리되고, 니트로셀룰로스 막에 블로팅되고 마커 유전자의 표지화된 단편으로 프로브된다. 잡종화 및 세척은 엄격한 조건하에 있다. 정확한 길이의 표지화된 제한 단편을 함유하는 균주는 정확한 것으로 간주된다. 이 방법을 사용하여, Aspergillus niger 균주를 선택의 불활성화 프로테아제 유전자로 선택할 수 있다.
실시예 4
이온 교환 크로마토그래피에 의한 프로테아제 분리
여기서 제공되는 바와 같이 뉴클레오티드 서열에 의해 암화화되는 소량의 프로테아제는 적절한 DNA 서열을 함유하는 발현 플라스미드를 건설하고, Aspergillus niger 균주를 플라스미드로 형질전환함으로써 Aspergillus niger 균주를 성장시킴으로써 얻는다. 세포를 오염시키지 않고 찾아낸 프로테아제를 정제할 수 있다.
본질적으로 순수한 형태로 제공된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 바와 같은 프로테아제를 분리시키기 위해 몇가지 단계가 이어질 수 있다. 이들 단계의 모두는 관련 과학 문헌에서 적절하게 기술되어 있다(예를 들어 Protein Purification Handbook, 18-1132-29 Edition AA as published by Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). 복합 혼합물로부터 프로테아제를 정제하는 데 응용가능한 과정이 다음에 제공된다. 원하는 효소 특성쪽으로 선택적인 적절한 분석이 이용가능하다는 것이 필수적이다. 실시예 1에서 기술된 바와 프로테아제의 경우 전형적으로 발색성 합성 펩티드 기질이 사용된다. 그러한 펩티드 기질은 엔도프로테아제, 카르복시펩티다제, 아미노펩티다제 또는 오메가펩티다아제에 대해 선택적이 될 수 있다. 실시예 11에서 특이 트리펩티딜펩티다제에 대한 선택성이 기술된다. 관련 합성 펩티드에서 올바른 아미노산 잔기를 선택함으로써, 원하는 특이성을 갖는 프로테아제가 선택될 수 있다.
먼저 프로테아제를 생성하기 위해 선택된 발현 시스템에 따라, 프로테아제가 배지 안으로 분비되는지 여부를 결정해야 하고, 그것은 세포에서 분비되고 함유될 수 있다. 만일 프로테아제가 배양 배지 안으로 분비되면, 세포 또는 이들 세포의 단편들을 제조하는 것은 원심분리 또는 여과에 의해 제거되어야 하고 결과적으로 깨끗한 또는 정제된 배지는 추가 정제를 위한 출발 배지가 된다. 원하는 프로테아제가 분비되지 않는 경우에, 생성하는 세포는 파괴되어 프로테아제의 정제를 가능하게 해야 한다. 수집된 세포 덩어리를 연마재로 잘 연마하고, 비즈로 밀링하고 한외초음파처리기, 또는 French 프레스 또는 Manton-Gaulin 균질화기로 처리한 후 여과하거나 원심분리시킨다. 프로테아제가 소수성이거나 또는 결합된 막인 경우에, 여과 또는 원심분리 단계전에 프로테아제를 용해가기 위해 비이온성 세정제의 첨가가 필요할 수 있다.
정화 단계 후에, 3상 정제 기법을 적용하여 본질적으로 순수항 상태의 미지의 프로테아제를 얻을 수 있다. 이들 3상의 전부 또는 일부에서 세정제의 첨가가 필요할 수도 있다.
첫번째 또는 캡쳐 상에서 표적 프로테아제가 분리되고, 부분적으로 정제되고 농축된다. 이러지는 중간 정제 단계 동안에, 대부분의 벌크 불순물이 제거되고 최종 광택 상에서 더 많은 양의 밀접하게 관련된 물질들의 미량의 남아있는 불순물들을 제거하고 효소를 원하는 완충제에 용해시킨다. 언제든지 쓸수 있는 프로테아제의 성질 및 물리적 특성에 의존하여, 당업자들은 약간 변형된 형의 다른 단백질 결합 물질을 사용하여 3상을 최적화할 수 있고 이들을 다소 변화된 조건하에서 적용할 수 있다. 그러나, 모든 경우에 선택적인 분석 평가는 그것이 더욱더 정제된 단백질분해 활성의 연속적인 모니터링을 가능하게 할 것이기 때문에 필수불가결이다. 목적에 적합한 분석 평가는 이전에 언급된 바와 같이 발색 펩티드 기질의 사용을 포함한다.
정제의 첫번째 캡쳐 상에서 음이온 형의 강한 이온 교환 수지를 사용하여 정제되고 염분이 제거된 효소를 함유하는 배지를 도포하는 것이 바람직하다. 수지에 대한 원하는 단백질 분해 활성의 결합을 보증하기 위해, 배지 및 수지의 3 또는 4개의 다른 pH 값들을 낮은 전도성 조건하에서 실험한다. 이들 테스트에서 수지는 항상 효소 함유 배지와 동일한 pH 값과 전도성의 완충제와 평형을 이룬다. 그후 배지는 칼럼에 도포되고 수지에 대한 프로테아제의 적절한 결합을 허용하는 것으로 나타난 pH 조건하에서, 즉 원하는 효소 활성 중 어떠한 것도 런-스루 배지에서 추적해서 밝혀낼 수 없다. 이어서 원하는 효소 활성을, 수지 평형 완충제로 시작하여 1 mol/리터의 NaCl이 첨가된 이 완충제로 끝나는 연속적인 염 구배를 사용하여 이온 교환 수지로부터 용출시킨다. 분석에 따르는 원하는 활성을 함유하는 용출된 부분들을 모으고 그후 추가의 정제 단계를 위해 준비시킨다. 이러한 추가의 정제 단계는 모아진 부분에서의 원하는 효소의 순도에 의존한다: 만일 대부분 순수하고, 추가의 겔 여과 단계는 적절한 것으로 입증될 것이고 소수성 상호작용 수지에 대해 크로마토그래피 겔 여과 단계가 이어진다.
소수성 상호작용 수지 위에서의 크로마토그래피를 이온교환 수지로부터 얻어진 모아진 부분의 염 함량을 4몰/리터의 NaCl로 먼저 증가시키고 형성된 어떠한 침전물을 제거함으로써 수행한다. 만일 생성되는 깨끗한 부분이 원하는 활성을 함유하지 않으면, 이 활성은 명백히 침전물에 존재하고 본질적으로 순수한 상태로 회수될 수 있다. 만일 결과의 깨끗한 부분이 분석에서 여전히 원하는 활성을 나타내면, 그후 액체는 동일한 pH와 전도성을 갖는 높은 염 완충제중에서 평형을 이룬 페닐 세파로스 수지(파마시아)에 그렇게 도포된다. 만일 원하는 효소 활성이 페닐 세파로스 수지에 결합되면, 활성은 연속 구뱅의 감소 염 함량으로 용출시키고 이어서 염이 없는 워시로 용출하고 만약 필요하다면, 무질서유발제(Chaotropic agent)로 용출한다. 구배로부터 그러한 부분을 모으기 전에 최종적으로 겔여과 단계를 거친다. 만일 많은 오염물 때문에 원하는 효소 활성이 페닐 세파로스 수지에 결합되지 않으면, 컬럼의 공극 부피에 존재하는 바와 같은 원하는 단백질 분해 활성은 겔여과 컬럼에 적용하기 전에 보다 농축된 형태로 활성을 얻기 위해 추가의 한외여과 단계만이 필요하다.
비록 이 방법이 일반적으로 프로테아제의 분리 및 정제에 대해 적용가능하지만, 보다 특이적인 분리 기술이 실시예 4에 기술된다. 실시예에서 Aspergillus 프로테아제의 분리는 고정화 바시트라신, 다양한 종류의 프로테아제와 선택적인 상호작용으로 알려진 펩티드 항생제를 사용함으로써 기술된다.
실시예 5
친화도 크로마토그래피에 의한 프로테아제의 분리
소량의 프로테아제를 정제하기 위한 대안 방법은 친화도 크로마토그래피에 의한 것이다. 프로테아제를 정제된 형태로 얻기 위해서, 100 밀리리터 배양균을 통기 교반 플라스크에서 성장시켰다. 원심분리를 하여 어떠한 용해되지 않는 물질을 제거하기 위해, 상청액을 0.05몰/리터 소듐 아세테이트 pH 5.0과 평형을 이룬 40 밀리미터 바시트라신-세파로스 칼럼으로 도포한다. 칼럼에 결합된 프로테아제는 1몰/리터의 NaCl 및 10%(v/v) 이소프로판올로 보충한 아세테이트 완충액을 이용하여 용리한다 (J.Appl.Biochem., 1983 pp420-428). 활성 부분을 수집하고, 증류수에 대하여 투석한 후 20 밀리리터 바시트라신-세파로스 컬럼에 가한 다음, 다시 아세테이트 완충액으로 평형시켰다. 전과 같이, 용리는 NaCl 및 이소프로판올로 보충한 아세테이트 완충액을 이용하여 수행한다. 활성 부분, 즉 찾고자 하는 활성을 나타내는 부분을 수집하여 pH 5.0의 5 밀리몰/리터 아세테이트 완충액에 대항하여 투석한 다음 Amicon PM-10 막으로 한외여과하여 농축한다. 본질적으로 순수한 상태인 프로테아제를 얻기 위하여, 0.05 몰/리터 아세트산 나트륨 완충액으로 평형을 맞추고 0.5 몰/리터 NaCl로 보충한 Superdex 75 컬럼을 통해 농축액을 크로마토그래피한다.
PAGE 상에서 정제된 효소로 수행한 그 이상의 실험은 분자량이 이용가능한 서열 데이터의 기초로 기대될 수 있는 것과 일치하는지를 확인할 수 있다. 최종 확인은 부분적인, N-말단 아미노산 분석을 수행함으로써 얻을 수 있다.
실시예 6
Aspergillus niger 유래의 신규 시스테인 프로테아제의 성질
이 실시예에서는 앞서 설명한 것과 같이 Aspergillus 유전자 28번을 클로닝하고 Aspergillus niger에서 과발현하였다. 얻은 효소는 실시예 4에서 설명한 방법에 따라 정제하여 다양한 조건 하에서 대두로부터의 트립신 저해 활성을 파괴하는 데 사용하였다. 기준 물질로서 파파인 및 브로멜라인을 사용하였다. 브로멜라인은 Sigma로부터 구입하였고, 파파인은 DSM Food Specialties Business Unit Beverage Ingredients (PO Box 1, 2600 MA Delft, the Netherlands)로부터 구입하였다.
트립신 저해는 문헌[Kakade, M.L., Rackis, J.J., McGhee, J.E. 및 Puski, G. (1974): J. Cereal Chemistry 51: 376-382]의 방법에 따라 측정하였다. 기질 N-벤조일-L-아르기닌-p-니트로아닐린을 N-벤조일-L-아르기닌 및 p-니트로아닐린으로 분해하는 능력은 트립신 활성의 척도로서 사용하였다. 트립신은 british Droug Houses Ltd로부터 구입하였고 생성물의 그람당 0.54 Anson Units 이상을 함유한 소의 췌장으로부터 유래하였다. 대두에 대한 Kunitz 저해제 또한 Sigma로부터 구입하였다.
트립신 저해제는 트립신 저해를 측정하기에 앞서 pH 3의 50 mM Na-아세테이트 완충액 중 상기 언급된 시스테인 프로테아제 효소로 2 mg/ml의 농도에서 사전-인큐베이션하였다. 효소 단백질 대 트립신 저해제의 비율이 1:100 (중량/중량)이 되도록 효소를 첨가하였다. 알부민은 효소에 대한 음성 대조구로서 작용하였다. 남아있는 트립신 활성은 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션한 후 측정하였다. 결과는 표 2에 나타난다.
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
시험한 효소 | 남아있는 TI 활성 (%) | 펩신 처리 후 남아있는 TI 활성 | 75℃에서 열 처리 후 남아있는 TI 활성 | 90℃에서 열 처리 후 남아있는 TI 활성 |
파파인 | 25 | 55 | 78 | 95 |
브로멜라인 | 30 | 62 | 86 | 99 |
Aspergillus niger | 26 | 26 | 28 | 35 |
알부민 (대조군) | 100 | 100 | 100 | 100 |
TI : 트립신 저해제 활성
트립신 저해제와 함께 시스테인 프로테아제를 사전-인큐베이션하는 동안 펩신의 존재 하에서 실험을 반복하였다. 1.3 mg/ml의 최종 농도로 펩신을 첨가하였다. 결과는 3번란에 나타난다.
열 안정성을 체크하기 위하여 또다른 시리즈의 실험을 수행하였다. 5분 동안 75 및 90℃에서 시스테인 프로테아제를 인큐베이션 하였고 이 효소를 첨가하기에 앞서 트립신 저해제로 사전-인큐베이션 하였다. 결과는 4 및 5번란에 나타난다.
이들 결과는 동물 사료에서 트립신 저해제의 비활성화를 위해 현재 이용되는 시스테인 프로테아제를 상회하는, Aspergillus niger로부터 유래한 이들 신규 시스테인 프로테아제의 보다 우세한 활성을 분명하게 예증한다.
실시예 7
치즈 숙성 및 치즈 맛을 증진시키는 엑소-펩티다제
앞서 설명된 방법에 따라 유전자 20 및 54 (표 1 참조)에 의해 암호화되는 아미노-펩티다제를 Aspergillus niger에서 과발현하였다. 이들 효소의 정제는 실시예 4에서 설명된 것과 같은 방법에 따라 수행하였다. 정제한 효소 샘플의 활성은 다수의 소수성 아미노산 (3 mM)의 파라-니트로 아닐리드 유도체를 기질로서 함유한 수성 인산 완충액 (50 mM)에서 pH 7.2에서 측정하였다. 아미노 펩티다제에 의한 기질의 전환은, 대조군으로서 효소를 함유하지 않은 용액을 사용하여, 기질 전환의 결과로서 400 nm에서의 흡광도 변화를 모니터링하여 측정하였다. 활성 (A)은 분당 OD의 변화로서 계산하였고, 사용한 기질에 따라 예를 들어, Phe-AP, Leu-AP 또는 Val-AP 단위로서 표현하였다. 정상 치즈 우유는 Delvo-tec™ DX 31 범위 (DSM Food Specialities Delft, The Netherlands)의 시작 배양물로 접종하여 구다-타입 치즈를 얻었고 평균량의 응고제 (치즈 우유의 리터당 50 IMCU)로 응고시켰다. 게다가, 25 Phe-유닛의 각 엑소프로테아제를 두 개의 실험용 치즈에 첨가하였고 반면에 대조군은 어떠한 엑소프로테아제도 함유하지 않는다. 치즈 제조 매개변수는 두 치즈에 있어서 반-경질 치즈에 적용되는 방법에 맞도록 사용하였다. 실험 치즈와 대조군 치즈 간의 향미 및 향기 발생에 관한 차이점을 기록하였는데, 그 정도는 실험 치즈는 3주 후에 그의 최대 감각 수용성을 얻었고 반면 대조군은 6주 후에 유사한 자격을 얻었다. 3주 후의 유리 아미노산 수준은 실험 치즈에서 두 배 높은 것으로 나타났고; 숙성 6주 후에는 그 수준이 다시 유사해졌다. 아미노산 분석은 Waters (Milford MA, USA)의 Picotag 방법에 따라 수행하였다.
이들 데이터는 치즈의 저장 품질을 감소시키지 않고 3주 더 일찍 생성물을 판매할 준비가 된다는 것을 제시한다. 실험 치즈의 감각 수용성은 대조군 치즈의 경미한 고미 경향을 갖는 블랜드 치즈 향미가 아미노-펩티다제의 존재 하에서 실험 치즈를 극복하는 정도로 대조군과 상이하였다. 치즈의 질감도 마찬가지로 어느 정도 더 부드러운 것으로 나타났다.
실시예 8
유전자 55에 의해 암호화되는 프로테아제의 신규 특이성
전술한 바와 같이, 어떤 단백질은 특이적 아미노산 배열 또는 특이적 3차 구조의 결과로서 효소의 가수분해에 저항할 수 있다. 이러한 경우에서 프로테아제 저항성 단백질로부터 용해될 수 있는 펩티드의 양은 신규 특이성을 나타내는 프로테아제를 사용함으로써 극적으로 개선할 수 있다.
베타-카세인은 매우 제한된 3차 구조를 갖되 현저하게 높은 수준의 프롤린 잔기를 갖는 단백질이다. 다수의 프로테아제는 프롤린 함유 서열을 절단하기가 어렵기 때문에 통상적으로 이용가능한 프로테아제로 베타-카세인을 가수분해하면, 프로테아제-내성을 나타내는 거대 펩티드가 비교적 풍부한 가수분해물을 얻는다. 후자의 내성 펩티드는 가수분해물에서 다수의 바람직하지 않은 성질에 기여할 수 있다. 예를 들어, 이들 거대 펩티드는 알레르겐성 및 고미 상에 비교적 강한 효과를 갖는다는 것이 공지되어 있다. 더욱이, 이들 펩티드는 유리 아미노산으로의 더 나아간 분해에 저항하므로 어떤 과정에서는 이들 거대하고 프로테아제에 내성인 펩티드의 발생이 수율 손실과 같은 뜻을 의미한다. 그러므로, 단백질의 프로테아제-내성 부분을 절단할 수 있는 프로테아제의 유용성 및 사용은, 중대한 기술적 및 경제적 이익으로 해석된다.
베타-카세인은 우유의 주요 카세인 부분의 하나를 나타낸다. 단백질은 그의 아미노산 서열에 관하여 충분히 특징규명되어 있고 거의 순수한 형태에서 상업적으로 이용가능하다. 이와 같이, 베타-카센인은 효소 절단 부위와 효소 가수분해 도중 형성된 다양한 펩티드의 길이 사이의 관계를 연구하는 데 있어서 우수한 시험 기질을 제공한다.
이 실시예는 엔도프로테아제 서브틸리신의 광범위한 스펙트럼 절단 특징에도 불구하고, 유전자 55 (표 1 참조)에 의해 암호화되는 프롤릴 엔도프로테아제와 같이 매우 특이적인 효소의 첨가가 형성되는 베타-카세인의 크기에 주요한 영향력을 갖는다는 것을 예증한다.
최소 90%의 베타-카세인을 갖는 우유 유래의 베타카세인 (동결건조, 특히 무염 분말)은 Sigma로부터 구입하였다. B. licheniformis 유래의 서브틸리신 (Delvolase®, 그람 당 560 000 DU)은 DSM Food Specialities (Seclin, France)로부터 구입하였다. 유전자 55에 의해 암호화되는 것과 같은 프롤린-특이적 엔도프로테아제는 Aspergillus niger에서 과발현하여 실시예 4에 설명한 방법을 이용하여 정제하였다.
베타-카세인 분말은 pH7.0인 0.1 몰/리터 인산 완충 용액 중 0.1% (중량/중 량) Delvolase™ 분말과 함께 10% (중량/중량)의 농도로 용해하였다. 진탕 수욕에서 45℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 후, 90℃에서 15분 동안 용액을 가열하여 반응을 정지시켰다. 용액의 1/2에 (100 밀리그람의 베타-카세인을 함유한 1 ml) 100 마이크로리터의 프롤린-특이적 프로테아제를 첨가하고 45℃에서 또다른 24시간 동안 반응을 계속하였다. 90℃에서 또다른 열 쇼크 이후, Delvolase™ 및 Delvolase™ + 프롤린-특이적 엔도프로테아제 처리된 베타-카세인 재료의 두 샘플은 LC/MS 장치로 분석하여 두 샘플 내에서의 정확한 펩티드 크기 분포를 연구하였다.
LC/MS 분석
P4000 펌프(Thermoquest, Breda, the Netherlands)에 커플링된 이온 트랩 질량분석계(Thermoquest, Breda, the Netherlands)를 이용한 HPLC는 본 발명의 효소 혼합물에 의해 생성되는 효소 단백질 가수분해물을 특징규명하는 데 이용하였다. 형성된 펩티드는 용리를 위하여 Milli Q 증류수 (Millipore, Bedford, MA, USA) 중 0.1% 포름산 (용액 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 포름산 (용액 B)의 구배와 조합된 PEPMAP C18 300A (MIC-15-03-C18-PM, LC Packings, Amsterdam, The Netherlands) 컬럼을 이용하여 분리하였다. 구배는 100%의 용액 A에서 시작하여 70%의 용액 B로 증가하였고 후자의 비율에서 또다른 5분동안 유지하였다. 이용한 주입 부피는 50 밀리리터이고, 유속은 분당 50 마이크로리터이며 컬럼 온도는 30℃에서 유지하였다. 주입한 샘플의 단백질 농도는 대략 50 마이크로그램/마이크로리터였다.
개별적인 펩티드의 상세한 정보는 이온 트랩 질량분석계를 위한 특징적인 알고리즘인 "스캔 의존적" MS/MS 알고리즘을 이용함으로써 얻을 수 있다. 전체 스캔 분석 후에 전체 스캔 질량 범위에서 가장 짙은 이온의 전하 상태를 측정하기 위하여 줌 스캔 분석을 한다. 후자 이온의 순차적인 MS/MS 분석은 부분적 펩티드 서열 정보를 가져오며, 이는 Xcalibur Bioworks (Thermoquest™, Breda, Netherlands)의 SEQUEST 적용을 이용한 데이터베이스 검색에 이용할 수 있다. 이용된 데이터뱅크는 사용된 적용에 있어서 관심있는 단백질을 포함하는, NCBI (National Centre for Biotechnology informatics)에서 이용가능한 OWL.fasta 데이터뱅크로부터 인용하였다.
스크리닝 방법으로서 이 기술을 이용함으로써 대략 400 내지 2000 달톤 범위의 질량을 갖는 펩티드만이 MS 서열분석에 의한 더 나아간 분석에 적합한 것으로 고려하였다.
안지오텐신 (M=1295.6)은 MS 모드에서의 최적 민감성 및 MS/MS 모드에서의 최적 분열에 대하여 조율하는 데 사용하였고, 60 ㎍/ml의 일정한 주입을 수행하여, MS모드에서 주로 이중 및 삼중으로 대전된 종 및 MS/MS 모드에서 약 35%의 최적 충돌 에너지를 일으켰다.
Delvolase만으로 효소처리한 샘플에서, LC/MS/MS 분석은 베타-카세인 분자의 다양한 부분을 덮는 40 펩티드를 확인하였다. 이들 펩티드와 함께 전체 베타-카세인 서열의 79%가 밝혀졌다. C18 컬럼 상에서 펩티드의 상이한 체류 시간은 2 내지 23 아미노산 잔기 범위를 갖는 펩티드 길이로 역추적하였다. 계속해서 발견된 <15%의 펩티드가 6개 아미노산 보다 더 작았다. Delvolase™ 및 프롤린-특이적 프로테아제로 효소처리한 샘플은 베타-카세인으로부터 다수의 ofl 확인가능한 펩티드를 생성하였다. 계속해서 이들 펩티드는 전체 베타-카세인 단백질 서열의 > 50%를 커버하였다. 이 샘플에서 펩티드 크기 분포는 매우 균등하여 2에서 6개 잔기 길이인 펩티드 범위만 있었다. 결과는 프롤린-특이적 프로테아제로 제조된 가수분해물에는 2, 3, 또는 6개 아미노산으로 이루어진 펩티드의 큰 부분이 포함된다는 것을 나타내며, 이는 비범한 특이성을 특징으로 하는 엔토프로테아제와 공동-인큐베이션에 있어서 뚜렷한 이로운 효과를 나타낸다. 유전자 55에 따른 엔도프로테아제가 프롤린 잔기의 카르복시말단에서 펩티드 사슬을 절단하는 엔도프로테아제를 암호화한다는 것 또한 이들 실험으로 분명해진다.
실시예 9
향미 형성을 촉진하기 위한 특정 아미노산의 선택적 방출
류신 및 페닐알라닌과 같은 유리 아미노산은 Maillard 반응에 뿐만 아니라 다양한 식품 발효에서 바람직한 향기를 위한 전구체로서 관련된다. 식품 발효에서 또는 식품의 가열, 굽기 단계 도중에 이러한 향기의 형성을 촉진하기 위하여, 유리 형태의 이들 특정 아미노산을 비교적 높은 수준으로 함유한 단백질 가수분해물을 이들 생성물 내로 통합시키는 것이 이로울 수 있다. 이 실시예에서, 본 발명자들은 선택적으로 류신 및 페닐알라닌이 풍부한 효모 추출물의 생산을 설명한다. 이러한 풍부함은 아미노산 잔기의 선택된 세트에 대하여 절단 선호도를 갖는 엔도프로테아제와, 아미노산 잔기의 유사한 세트의 방출을 선호하는 엑소프로테아제와의 조합으로써 얻는다. 엔도프로테아제의 선호도는 사용된 엑소프로테아제의 선호도와 매치되어야 한다. 예를 들어, 본 발명자들은 유전자 20 및 54 (표 1 참조)에 의해 암호화되는 아미노펩티다제가 써모리신의 절단 선호도와 매치되는, 류신 및 페닐알라닌 잔기를 방출하기 위한 한정된 선호도를 특징으로 한다는 것을 확립하였다. 유전자 23 및 24에 의해 암호화되는 카르복시펩티다제는 아르기닌 및 리신 잔기를 방출하는 데 있어서 트립신의 절단 선호도와 매치하는 선호도를 갖는다. 유전자 5에 의해 암호화되는 카르복시펩티다제는 글리신을 방출하는 데 있어서 파파인에 존재하는 어떤 엔도프로테아제와 결합될 수 있는 고도로 유별난 선호도를 특징으로 한다. 유전자 51에 의해 암호화되는 카르복시펩티다제는 글루탐산 잔기를 제거할 수 있고 이는 유전자 43에 의해 암호화되는 글루탐산 특이적 프로테아제와 매치한다.
Daiwa Kasei KK (Osaka, Japan)사의 (Thermoase로서 시판되는) 엔도프로테아제 써모리신인 C 180은 Leu 및 Phe과 같이 부피가 크고, 소수성을 나타내는 아미노산의 아미노 말단 사슬에 있는 펩티드 결합을 절단하는 것으로 공지되어 있다. 따라서 새롭게 형성된 펩티드로부터 노출된 아미노산을 유리시키기 위하여, 본 발명자들은 유전자 20 및 54에 의해 암호화되는 아미노-펩티다제를 사용하였다 (표 1 참조). 이들 유전자는 앞서 설명된 방법에 따라 Aspergillus niger에서 과발현하였고 실시예 4에서 설명된 것과 같은 방법에 따라 이들 효소의 정제를 수행하였다.
효소의 이러한 조합으로 바람직하지 않은 아미노산의 부수적인 방출 없이 가능한한 많은 류신 및 페닐알라닌을 방출하기 위하여, 효소의 가수분해 도중 이용한 조건을 조심스럽게 선택해야만 한다는 것이 분명하다. 더욱이, 효모 자신의 내재성 (그리고 특이적인) 프로테아제를 비활성화해야 한다. 다수의 시험 인큐베이션 후, 이들 두 개의 새로운 효소를 이용하여 효모 단백질로부터 류신 및 페닐알라닌의 놀랍도록 선택적이고 효과적인 방출이 일어나는 프로토콜이 세워졌다.
효모의 내재성 프로테아제를 비활성화하기 위하여, 효모 현탁액을 95℃에서 5분동안 두었다. 그 다음 현탁액을 원하는 온도까지 재빨리 냉각하고 4N NaOH를 이용하여 pH를 7.0으로 조절하였다. 효모, 써모리신 및 아미노펩티다제 중 하나를 하기 조건 하에서 동시에 모두 인큐베이션하였다. 열 쇼크 이후, 2000 밀리리터 효소 현탁액의 pH를 7.0으로 조절한 다음 680 밀리그람의 Thermoase를 첨가하고, 교반한 후, 정제된 아미노펩티다제를 첨가하였다. 혼합물은 50℃에서 3시간동안 교반하면서 인큐베이션하고 원심분리하였다. 모든 효소 활성을 정지시키기 위하여 상청액의 pH를 4로 조절하고 95℃에서 45분동안 또다른 열처리를 하였다. 또다른 원심분리 후 상청액으로부터 아미노산 분석을 위한 샘플을 얻었다. Hereaus Megafuge 2.0 R 원심분리기에서 3500 rpm으로 15분동안 원심분리하여 침전되거나 용해되지 않은 물질을 제거하였다. 상청액을 제거하고 -20℃에서 동결을 유지하였다.
상청액의 샘플은 해동 직후에, Waters의 Picotag 방법 (Milford MA, USA)에 따라 아미노산 함량에 대하여 분석하였다.
아미노산 분석에서 Trp 및 Cys 수치를 빼고 Asp 및 Asn 수치를 하나의 수치로서 합산하였다. 얻은 결과에 따라, 결과적 가수분해물에서 알라닌과 류신 (21.3: 11.7)사이의 비율은 1: 0.5이었다. 시판되는 효모 가수분해물은 전형적으로 알라닌 대 류신의 비율이 1 대 0.3으로 나타난다.
두번째 실험에서, 유리 글루탐산이 풍부한 효소 추출물을 준비하였다. 이를 성취하기 위하여, 글루탐산의 C-말단에서의 절단 선호도를 나타내는 (표 1에서 유전자 43에 의해 암호화되는) 엔도프로테아제 및 이로써 노출된 이러한 글루탐산 잔기를 제거할 수 있는 (표 1에서 유전자 51에 의해 암호화되는) 카르복시펩티다제를 사용하였다. 유전자 43에 의해 암호화되는 엔도프로테아제 및 유전자 51에 의해 암호화되는 카르복시펩티다제는 앞서 설명한 방법에 따라 Aspergillus niger에서 과발현하였다. 이들 효소의 정제는 실시예 4에서 설명된 것과 같은 방법에 따라 수행하였다.
다수의 향기 형성 과정에서 유리 글루탐산의 본질적인 역할은 충분히 보고되었고 글루탐산의 나트륨 염인 MSG는 맛을 향상시키는 데 있어서 가장 중요한 단일 성분으로서 인정된다.
이 실시예에서 200 ml 열 처리된 효모 현탁액의 pH는 8.0으로 조절한 다음, 유전자 43에 의해 암호화되는 정제된 효소 생성물을 첨가하고 혼합물은 50℃에서 4시간동안 인큐베이션 하였다. 그 다음 pH를 5.0으로 낮추고 현탁액을 원심분리하였다. 100 밀리리터의 상청액에 유전자 51의 정제된 유전자 생성물을 첨가한다. 계속해서 pH를 조절하면서 이들 카르복시펩티다제를 50℃에서 30분동안 인큐베이션 하였다. 95℃에서 5분동안 열 처리함으로써 효소 인큐베이션을 정지시킨 후, 재료를 재차 원심분리하여 (상기 참조) 아미노산 분석을 위한 샘플을 얻었다.
얻은 아미노산 데이터에 따라 (상기 참조), 결과적 가수분해물에서 알라닌과 글루탐산 간의 비율은 1:1.6이었다. 시판되는 효모 가수분해물은 전형적으로 알라닌 대 글루탐산의 비율이 1:1로 나타난다.
실시예 10
특정 아미노산이 풍부한 효모 가수분해물의 향미 평가
본 발명에 따른 특정 아미노산이 풍부한 단백질 가수분해물이 특정한 향기를 생성할 수 있다는 것을 증명하기 위하여, 앞선 실시예에서 설명한 효소 가수분해물로 다수의 실험을 수행하였다. 이 목적으로 이들 가수분해물을 다량 준비하여 동결건조하였다. 결과 분말의 효율은 몇몇 반응 조건 하의 표준화된 혼합물에서 시판되는 효소 추출물 (Gistex LS, DSM Food Specialties, Delft, The Netherlands)의 효율과 비교하였다. 표준화된 혼합물은 가수분해물 중 하나, 기초 혼합물 및 물로 구성된다.
기초 혼합물은 모르타르에 완전히 혼합된 22 그람의 Maxarome Plus Powder (높은 천연 뉴클레오티드 함량을 갖는 특수화된 효모 추출물, DSM Food Specialties로부터 구입가능), 29.2 그람의 포도당, 9 그람의 REFEL-F 지방 (경화 대두유, Barentz, Hoofddorp, The Netherlands로부터 구입가능) 및 0.2 그람의 칼슘 스테아릴 락틸레이트 (유화제, Abitec, Northampton, UK로부터 구입가능)를 함유한다.
모든 표준화된 혼합물은 5 그람의 효모 가수분해물 분말 (즉, 류신 또는 글루탐산이 풍부한 물질 또는 상업적 효모 추출물), 3 그람의 기초 혼합물 및 3 그람의 물을 함유한다. 완전히 혼합한 후, 이들 세 슬러리에 상이한 열 섭생을 수행한다 (즉, 반응 바이얼에서 65분동안 90-95℃ (액체 반응) 또는 진공 오븐에서 120℃ 및 20 밀리바로 건조 (진공 배소 반응) 또는 모든 수분의 소실 후 개방 반응 바이얼에서 10분동안 120℃로 가열 (배소 반응)).
열 처리 후 세 가지 생성물 모두는 담황색 내지 거의 검은색의 범위를 갖는 색을 나타냈따. 진공 배소 반응의 경우에서 밝은 색의 상층을 사용하였다. 가열된 생성물의 맛 평가는 검게 된 케이크를 미세한 분말로 분쇄하고 이들 분말을 0.6% (중량/중량) NaCl을 함유한 물에 2% (중량/중량)의 농도로 용해함으로써 수행하였다. 맛 심사단의 관찰은 표 3에서 상술한다
기준 | 류신 | 글루탐산 | |
액체 | 부용, 약간 그을림 | 냉차, 약간 꽃모양, 효모성 | 더욱 부용, 육류성, 효모성 |
진공 배소 | 탔음, 튀긴 감자 | 수렴성, 콩, 효모성 | 탔음, 부용, 효모성 |
배소 | 검게 그을림, 부용, 우마미 | 덜 그을림, 꽃모양, 우마미 | 그을림, 더욱 부용, 더욱 우마미 |
실시예 11
트리펩티딜펩티다제로 형성된 비-알레르기성 유장 단백질 가수분해물
유전자 19 및 55에 의해 암호화된 디펩티딜펩티다제 뿐만 아니라 유전자 4, 9, 10, 12, 26, 35, 46 및 50에 의해 암호화된 트리펩티딜펩티다제(표 1 참조)를 설명된 대로 과생성할 수 있으며, 실시예 4에 제공된 방법에 따라서 정제할 수 있다. 정제 후, 각 개별 효소의 pH 최적 조건 및 온도 안정성을 당업자에 의해 이용가능한 공지된 방법 중 어느 것에 의해 확립할 수 있다. 더욱이, 각 개별 효소의 특이성을 실시예 1에 개략된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 트리펩티딜펩티다제에 의해 나타난 선택성을 다음 실험에서 예시한다.
유전자 12에 의해 암호화된 효소를 Aspergillus niger 숙주 세포에서 과생성하고 실시예 4에 설명된 과정에 의해 정제했다. 이와 같이 얻어진 효소를 pH 5 및 50℃에서 상이한 합성 발색 기질, 즉 Ala-Ala-Phe-pNA 및 Ala-Phe-pNA(모두 Bachem으로부터, Swithserland)와 함께 인큐베이션했다. Ala-Ala-Phe-pNA 기질과의 인큐베이션은 410nm에서 흡광도의 상당한 증가를 가져온 반면 Ala-Phe-pNA와의 인큐베이션은 그렇지 않았다. 이 관찰은 트리펩티딜펩티다제가 트리펩티드를 절단하며, 자유 아미노산의 바람직하지 않은 증가를 가져올 수 있는 아미노펩티다제 활성을 나타내지 않는다는 것을 명백히 증명한다.
더욱이, 유전자 12에 의해 암호화된 효소는 다음의 실험에서 나타난 대로 유리한 효소 안정성 특징을 나타낸다. 4개의 효소 샘플을 각각 0, 40, 50 및 60℃에서 pH 5에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 다음에, 각 효소 샘플을 pH 5의 시트레이트 완충액 중에서 상기 언급된 Ala-Ala-Phe-pNA 기질과 함께 인큐베이션했고, 각 샘플에서의 잔류 활성을 410nm에서 흡광도의 증가를 측정함으로써 측정했다. 0℃에서 샘플은 100% 활성을 나타냈고, 40℃ 샘플은 96% 잔류 활성을 나타냈고, 50℃ 샘플은 92% 잔류 활성을 나타냈고, 60℃ 샘플은 88% 잔류 활성을 나타냈다.
높은 비율의 트리펩티드를 갖는 가수분해물을 생성하는 것을 목표로 하는 전형적인 공정에서, 유장 단백질(WPC 75)을 100g 단백질/l의 농도로 pH 8.5의 수성 매체 중에 용해/현탁할 수 있다. 첫번째 효소 인큐베이션은 광범위한 엔도프로테아제 섭틸리신(Delvolase, DSM으로부터 g 당 560 000 DU)을 사용한다. 이 효소를 사용하여, 60℃에서 2시간 동안 단백질 g 당 0.5% 효소 농축물의 농도로 유장을 사전소화한 후, 혼합물을 열처리하여 사용된 엔도프로테아제를 불활성화시킨다. 다음에, 온도를 50℃로 조정하고, 트리펩티딜펩티다제를 첨가하고, 전체 혼합물을 원하는 수준의 트리펩티드에 도달할 때까지 인큐베이션한다. 이와 같이 얻어진 가수분해물의 더 이상의 프로세싱 단계는 구체적인 용도에 의존하지만, 미세여과 또는 원심분리와, 이어서 증발 및 분무 건조를 병용할 수 있다.
<110> DSM NV
<120> Novel genes encoding novel proleolytic enzymes
<130> 20095WO
<160> 171
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 2520
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 1
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<213> Aspergillus niger
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<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 13
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cttttggctt gtgatcttga ttgctagaga tgtatatcct cacggatacc gccggagtgc 60
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aagacgggct atgtctatgg aggaatccaa agtcgtggtg atatgaccat ggacatcttg 2160
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<210> 17
<211> 2349
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 17
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tctaagattc ccctcaatcc ctgctccatc tactttcctc cctctcatac cacttttgct 2640
ttttgtatag taaatatcca 2660
<210> 28
<211> 1540
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 28
taaacagaac taagcaaaag tccagatctt gtgtcccctt cgactaccaa tcggaacaat 60
aggaattaac tattagcctg caactgtctg caccatcatg caacccctct cgttgtgatt 120
gctcctgttt tacattcccc gagacatgct catctagttg caagccatct ctaacccacc 180
tgcatgaagg gtgcagaaac acgaacagtg gcgtggtagc acacactctc tgcagtactc 240
gatgccaata tttccaccag ctgaactaca atctccgcgt cagaattaat atataaccat 300
caccaatacc ccttacatcc caactcagca actacagcaa tacttacacc tatcctccac 360
aaccccacaa ctccacccca tcatgtccaa actctccgct gctatctcca aggtacttcc 420
ccatatccac aacacccccc acaccatccc tcaaatctaa caacaataac aataacctct 480
caccacccca gctctccctc tccaccatag ccaccactct gctcctcctt acccccccaa 540
ccaccgccta cttctacaaa tatcccgccc tcttcgtcta caaagacacc aactgcaccg 600
atatctcctt ctcacttgtc tacccctccc tgggtaactg caacggcgga tactacgact 660
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cgttggagat gccggtttgg tttgagttgg ggtgtatgta attgattcgt tgagtcggta 900
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tactcttact tgcttaatac accaactttc atatatctac ccagaattac tcaatcgtga 1440
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tttttttccg gtagtttaat cattccaatc aaagaattgt 1540
<210> 29
<211> 2800
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 29
acactttctt cgatgctatg tcccagccat ataaggttca attctccgac tcaagtgaca 60
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cgattctttt tattatttta gatactgttc ccttcaggtg cctatagcct atagagctta 2580
ggggtattct ctacataatt aaatacagag taattcaatg aatcgtccta tcaaataatg 2640
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<210> 30
<211> 2380
<212> DNA
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<400> 30
cccgcctgta caaggctcat tgagcgacct ttatttctat gaaggcttct tgcagtgtag 60
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<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 31
aaacgacgtt ttaggtcaat actgaagtcg ttgaaaacgc ttgattcttc gctatctagg 60
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<210> 32
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<400> 32
gtttgttgtg gttgttgttt ggggtcccat ttgcaatccc tgaaccggac cctgtcaatc 60
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gcggcaatct cacctcccga ctggatctgt tttccaagtg gcgcggtgag caatcggatg 1860
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<400> 33
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gcctccaccc aggcggtcct ccagccagag gaaccatccg acttccgtac attccacagc 540
ccatattccc cgcaccactc gatccgcatc cgccagcaga atgaatcaat ctgcgctgcc 600
cattccgccc aatacaccgg ctggctcgac atcggccgta aacatctctt cttctggtac 660
tttgagagcc agaatgaccc tgccaatgat cccctcactc tctggatgac aggagggcca 720
ggggggtcca gcatgatcgg tctgtttgaa gaagtcgggc catgtctgat caatgagtac 780
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tctaggtcac ctgagctaag actaacttcc acagggtcac tatgtccctt acctcggcag 1080
tcagatcgtc caacagaaca agctctatcc cactgagccc caggtccttc tgcactcatg 1140
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2520
<210> 34
<211> 1721
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 34
attgatacga ggcgtttgta ggtggcgttc ctgaagagga tctgataccc actggttttc 60
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<400> 36
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2280
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<211> 3231
<212> DNA
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3300
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gagcaagtcg atgctcatct gcaaatgatc cagccaacga ctcgcttcgg ccgacctaag 540
acacaaacca gcctaccgag cctcatgcca gtgtcggtta acattgatga aataagcgaa 600
gactgcttga caggcgtgac gcccatttgc cttcgccagc tctatggttt acctagcacc 660
aaggcaagcc ccgactcgag aaacgtcctc ggaatttccg gctatctgga ccagtacgcg 720
cgctacagtg acctcgacga gtttctagcc gtatactctc caaacagcgt agacgccgac 780
ttctccgtag tatcgatcaa cggaggccaa aacccacaaa actcacaaga gggaagcaca 840
gaggccagtc tcgacatcca atacgccctc tccatggcat ttgacgctaa cgcgactttc 900
tacactaccg ccggacgtgc gccatccccg tatctcgaac agctccagta tctggtgggt 960
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ctgccggagg aatacacaga agccacgtgc aatttatttg cccaattagg tgcacgcggg 1080
gtctcggtga tcttcagcag cggagactcg ggcgtcggag gatcgtgtgt atctaacgac 1140
ggaagccaga ggacccgctt tcagcctatc ttcccggcgt cgtgcccgtt tgttacatcc 1200
gtgggtggga ctgagggcgt cgggccggaa aaggctgtgg acttttcgag tggagggttc 1260
tccgagcgct ttgctcgccc gtcgtaccag aatgcgagtg tggaagcata ccttgcccgc 1320
ttaggagata aatgggatgg attgtataat ccagacggac ggggtattcc tgatgtgtcg 1380
gcccaggcta gcaactatgt aatcagggac catgggcaat ggctacaaac tgcgggaaca 1440
agtgctgccg cccctgtctt tgcagcagtc atctctcgac tgaacgctgc acgtctcgag 1500
cagggtaaac ctacactagg gtttctgaat ccttggctgt actcactcga ccagcaagga 1560
tttacggata ttgtagacgg cggatcagtg ggttgtgacg ggtcaaatgg aggagctctt 1620
gtcccgtatg ccagttggaa tgccaccaag ggatgggatc cggttactgg gctggggaca 1680
cctctgtatc agactctgga gcagttggcg cagtctgctt ag 1722
<210> 67
<211> 1758
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 67
atgcgttctt ccggtctcta cacagcactc ctgtgctccc tggccgcctc gaccaacgcg 60
attgtccatg aaaagctcgc cgcggtcccc tccggctggc atcatgtcga agatgctggc 120
tccgaccacc agataagctt gtcgatcgcg ctggcacgca agaacctcga tcagcttgaa 180
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aagattgaca cccatgtggc caaacgctcc aacagctcgt cctgtgccga tgtcatcacg 600
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gtcaatgatc agaatcaatc gacggcttcc ttgaccgagg cggacctcga tgtggaattg 840
ctcgtcggag ttgctcatcc cctcccggtg actgagttca tcacttctgg cgaacctgcc 900
gccgacaacg agaacgagcc ttacctccag tactatgagt accttctctc caagcccaac 960
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ctcgagtcgt ccggtgacga aggtatcgga tctggctgcc gaaccaccga cggcaccaac 1140
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ttggtgctgt cgttgtag 1758
<210> 68
<211> 798
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 68
atgaagacta ctgctctctt gaccgccggc ctgctggcca ccactgctat ggccgctcct 60
ctgacggcca agcgccaggc tgctcgggcc aagcgctcca cgaaccgcca gagcaaccct 120
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<210> 69
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<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 69
atggtcgcct tttcccgcat ctcggcaggc ttcgcccttg ccgcccctgc cctggccagc 60
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<213> Aspergillus niger
<400> 70
atgcatggtc tgcgcctagt atgcagcata gggacattgc ctttggttat cctggcatat 60
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<212> DNA
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gcgtattacg accaagtcta tcgtggcatg gttgccagcg gatggaccaa ctgctcggca 720
gatatccacg ctgctctgga atatattgac gatcaacttt cggatgaaga tacagctacc 780
tcggtcaaac aacttttctt cggatctggc gccgagacca actccaacgg tgatttcact 840
gcagcgctaa ctgccatcta cggctacttc caaagttatg gtatggcggg aggtattgga 900
ggtctaggcg cattctgcga gtatctcgaa attgatccca agacgaacgg gactacagga 960
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ccaacctttc tcgagctggt caatctgaat atggggacca actgcgggcc tcaggacgcg 1080
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acttggcaat actgcagcga atgggggttc ttccaggcga acaacgatgg gccgcactcg 1200
ctggcctcgc gatatcagtc ggtggaatac cagcaagaag tatgtaaccg gcagttcccc 1260
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<211> 1176
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 77
atgaagctct caatagctct tgcactcggc gcaacggctt cgacgggggt gttggctgct 60
gttgtaccgc agcaagaacc gctgataacc ccccaagatc ccccaactca tcatcatcag 120
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<211> 1329
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
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atgagaacta ctacgtcttt tgctaggctt gcattggcag tggcctcagt tggtattgtc 60
tttgctagtc caacaaaaaa taacgatggg aaactggtat atggctcacc agaatccgtc 120
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<400> 79
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acctgtaatg gcagtgactc gacactgatg tttgagatgt ataatagctc cggctcggat 300
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gatgtggaga gtccggggcc gttggagatg ccggtttggt ttgagttggg gtcactattg 420
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ttagagacta aattatactg gaaatgttat tcatcaaggc tgaatacaag tgtaaccgtg 540
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ttcaacgtcg caggtgcttc atcgataagc attcccaacg accagattga ggcgatgtat 780
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cccttcaatc catgggacag ctacaacacg attattggtc agcattggtt gagcaatttc 1020
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atgtttccct gctctcgtat ttggtctctg ctcgttgcag ccgccaccgc tagtgctgta 60
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aacacgctgg actttgtcta tgcgccagcc gtgattaatt attgggcgtt gaacctcacg 780
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atgtcgccag gtgacacaga attgatgtcc gccttgcatt cgctgagcga gttccgccat 1860
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<210> 104
<211> 1665
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 104
atgttgagta gtctgctgct tgggggtctt ctgggtctag cgaccgctca atttcctccc 60
gagccggaag gcatcactgt gctcaagtcc aagttgcatg agaatgtgac tatttctttc 120
aaagagcctg gaatttgcga aactacgccg ggtgtccgat cttattcggg ctatgtacac 180
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<210> 105
<211> 1737
<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 105
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<212> DNA
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1320
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gctgcgacta cgggtgaggc ttattttgag cagctgctgg accatcacaa cccggagaag 180
ggaacgtttt cccagcggta ctggtggagt actgaatact ggggtggacc tgggtcaccg 240
gtggtcctct ttaaccctgg agaggtctct gccgatggct atgaggggta tctcaccaac 300
gatactctca ctggtgtcta tgcgcaggag atccagggtg ccgtcattct cattgaacac 360
cgctactggg gcgactcttc gccttatgag gtgctcaatg ccgaaacact tcagtatctc 420
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agcggtgcct tgacggcttg gaccgagtct atcgcgcctg gaacgttctg ggcttaccat 600
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<210> 113
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<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 113
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<212> DNA
<213> Aspergillus niger
<400> 114
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taccatggcc acgcgttgca attacttcgc ggtaatacta cagggaccca gagcgtcctg 1560
tggggagccc aaatccagaa tggaacagct gcatcggtgc ttaatctatt gtccatacga 1620
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
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Met His Leu Pro Gln Arg Leu Val Thr Ala Ala Cys Leu Cys Ala Ser
1 5 10 15
Ala Thr Ala Phe Ile Pro Tyr Thr Ile Lys Leu Asp Thr Ser Asp Asp
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Ile Ser Ala Arg Asp Ser Leu Ala Arg Arg Phe Leu Pro Val Pro Lys
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Pro Ser Asp Ala Leu Ala Asp Asp Ser Thr Ser Ser Ala Ser Asp Glu
50 55 60
Ser Leu Ser Leu Asn Ile Lys Arg Ile Pro Val Arg Arg Asp Asn Asp
65 70 75 80
Phe Lys Ile Val Val Ala Glu Thr Pro Ser Trp Ser Asn Thr Ala Ala
85 90 95
Leu Asp Gln Asp Gly Ser Asp Ile Ser Tyr Ile Ser Val Val Asn Ile
100 105 110
Gly Ser Asp Glu Lys Ser Met Tyr Met Leu Leu Asp Thr Gly Gly Ser
115 120 125
Asp Thr Trp Val Phe Gly Ser Asn Cys Thr Ser Thr Pro Cys Thr Met
130 135 140
His Asn Thr Phe Gly Ser Asp Asp Ser Ser Thr Leu Glu Met Thr Ser
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Glu Glu Trp Ser Val Gly Tyr Gly Thr Gly Ser Val Ser Gly Leu Leu
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Gly Lys Asp Lys Leu Thr Ile Ala Asn Val Thr Val Arg Met Thr Phe
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Gly Leu Ala Ser Asn Ala Ser Asp Asn Phe Glu Ser Tyr Pro Met Asp
195 200 205
Gly Ile Leu Gly Leu Gly Arg Thr Asn Asp Ser Ser Tyr Asp Asn Pro
210 215 220
Thr Phe Met Asp Ala Val Ala Glu Ser Asn Val Phe Lys Ser Asn Ile
225 230 235 240
Val Gly Phe Ala Leu Ser Arg Ser Pro Ala Lys Asp Gly Thr Val Ser
245 250 255
Phe Gly Thr Thr Asp Lys Asp Lys Tyr Thr Gly Asp Ile Thr Tyr Thr
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Asp Thr Val Gly Ser Asp Ser Tyr Trp Arg Ile Pro Val Asp Asp Val
275 280 285
Tyr Val Gly Gly Thr Ser Cys Asp Phe Ser Asn Lys Ser Ala Ile Ile
290 295 300
Asp Thr Gly Thr Ser Tyr Ala Met Leu Pro Ser Ser Asp Ser Lys Thr
305 310 315 320
Leu His Ser Leu Ile Pro Gly Ala Lys Ser Ser Gly Ser Tyr His Ile
325 330 335
Ile Pro Cys Asn Thr Thr Thr Lys Leu Gln Val Ala Phe Ser Gly Val
340 345 350
Asn Tyr Thr Ile Ser Pro Lys Asp Tyr Val Gly Ala Thr Ser Gly Ser
355 360 365
Gly Cys Val Ser Asn Ile Ile Ser Tyr Asp Leu Phe Gly Asp Asp Ile
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Trp Leu Leu Gly Asp Thr Phe Leu Lys Asn Val Tyr Ala Val Phe Asp
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Tyr Asp Glu Leu Arg Val Gly Phe Ala Glu Arg Ser Ser Asn Thr Thr
405 410 415
Ser Ala Ser Asn Ser Thr Ser Ser Gly Thr Ser Ser Thr Ser Gly Ser
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Thr Thr Thr Gly Ser Ser Thr Thr Thr Thr Ser Ser Ala Ser Ser Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Asp Ala Glu Ser Gly Ser Ser Met Thr Ile Pro Ala Pro
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Gln Tyr Phe Phe Ser Ala Leu Ala Ile Ala Ser Phe Met Leu Trp Leu
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<213> Aspergillus niger
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Met Leu Arg Gly Leu Arg Asp Val Val Leu Leu Gln Phe Ala Ile Pro
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Leu Phe Leu Leu Leu His Phe Arg Leu Ser Leu Arg Gly Val Ile Thr
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Gly Phe Gly Ser Lys Ser His Phe Gln Arg Pro Leu Ser Lys Met Ser
35 40 45
Ser Thr Gln Lys Ser His Phe Lys Leu Leu Gln Lys Phe Lys Pro Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Val Ile Asp Gln Lys Gly Pro Lys Val Thr Gly Tyr Phe
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Val Leu Ala Thr Glu Ile Leu Asp Asp Ser Gly Ala Pro His Thr Leu
100 105 110
Glu His Leu Cys Phe Met Gly Ser Arg Asn Tyr Arg Tyr Lys Gly Phe
115 120 125
Leu Asp Lys Leu Ala Thr Arg Val Tyr Ser Ser Thr Asn Ala Trp Thr
130 135 140
Ala Thr Asp His Thr Ala Tyr Thr Leu Asp Thr Ala Gly Trp Glu Gly
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Phe Ala Gln Ile Leu Pro Val Tyr Leu Glu His Val Ile Ala Pro Thr
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Leu Thr Asp Glu Gly Cys Tyr Thr Glu Val His His Ile Asp Gly Ala
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Gly Asp Asp Ala Gly Val Val Tyr Ser Glu Met Gln Gly Val Gln Asn
195 200 205
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Arg Val Leu Thr Ala Asp Arg Ile Arg Ala Phe His Arg Glu Met Tyr
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Gln Pro Lys Asn Leu Cys Leu Ile Ile Thr Gly Glu Val Asp His Gln
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Asn Met Leu Glu Thr Leu Asp Lys Phe Glu Asp Thr Ile Leu Asp Val
275 280 285
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Gln Ala Pro Pro Leu Glu Lys Ser Ile Val Gln Thr Val Glu Phe Pro
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Glu Glu Asp Glu Ser Phe Gly Glu Ile Glu Ile Arg Phe Leu Gly Pro
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340 345 350
Tyr Leu Ala Gly Ser Ser Ala Ser Leu Leu Asp Asn Ile Leu Val Glu
355 360 365
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370 375 380
Ser Ile Glu Ile Arg Phe Thr Leu Thr Ser Val Glu Thr Glu Lys Leu
385 390 395 400
Ala Lys Val Glu Gln Arg Phe Phe Glu Val Leu Lys Asp Ala Met Glu
405 410 415
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Arg Thr Trp Lys Phe Ser Thr Glu Ser Ser Ala Ser Ser Phe Ala Glu
435 440 445
Tyr Val Ile Ser Asp Phe Leu Phe Gly Lys Arg Asp Gly Ser Thr Met
450 455 460
Leu Asp Val Ala Thr Leu Gln Glu Tyr Asp Val Leu Glu Lys Trp Ser
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Glu Glu Gln Trp Arg Ser Phe Ile Lys Thr Trp Ile Ser Asp Ala Asn
485 490 495
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500 505 510
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Glu Asn Asp Lys Glu Ile Pro Lys Glu Met Leu Glu Arg Phe Gln Ile
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Gly Ala Ala Leu Asp Ala Gly Arg Pro Ser His Lys Ala Gln Lys Leu
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Val Asp Ala Asp Gly Ser Asp Leu Pro Leu Phe Ile His Phe Glu His
595 600 605
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Phe Asn Leu Pro Val Asn Arg Asn Gly Glu Thr Ile Asn Phe Glu Gln
645 650 655
Val Val Val Glu Leu Glu Arg Asp Thr Val Gly Tyr Ser Met Glu Gly
660 665 670
Ala Arg Ser Leu Gly Asn Ser Glu Met Leu Arg Ile Ser Phe Gln Val
675 680 685
Glu Leu Glu Lys Tyr His Thr Ala Ile Ala Trp Ile Gln Glu Leu Ser
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Leu Leu Ser Asp Val Pro Asp Ser Lys Arg Ser Gly Asp Asp Met Leu
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Ala Ala Val His Val Met Val His Tyr Ala Ala Glu Ser Ile Val Arg
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Ala Arg Ser Thr Leu Val Lys Ala Arg Tyr Leu Lys Arg Ile Lys Lys
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Gln Leu Ala Glu Glu Pro Lys Ser Val Val Ala Arg Met Glu Glu Ile
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Arg Asp Ala Leu Phe Arg Phe Glu Asn Met Arg Val Leu Val Ile Ala
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Asp Leu Glu Lys Leu Gln Asn Pro Val Ser Ala Trp Lys Pro Phe Ala
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Glu Arg Leu Gly Ala Gly Ala Pro Leu Gln Pro Ile Thr Thr Arg Arg
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Pro Leu Leu Ser Glu Ala Gly Gln Lys Leu Gly Gly Lys Ser Tyr Val
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Val Pro Met Pro Thr Ile Asp Ser Ser Phe Ala Tyr Ala Thr Ala Arg
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Gly Leu Asp Ser Tyr Asp Asp Pro Arg Leu Pro Ala Leu Met Val Ala
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Ile Ala Tyr Met Asn Ala Val Glu Gly Pro Leu Trp Val Ala Val Arg
885 890 895
Gly Lys Gly Leu Ala Tyr Gly Thr Asn Phe Ala Tyr Asn Ile Asp Thr
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Gly Phe Val Asn Phe Asp Val Tyr Arg Ser Pro Asn Ala His Lys Ala
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Phe Asp Ser Ser Lys Gln Ile Val Glu Asp His Leu Ser Gly Ala Met
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Pro Phe Asp Pro Leu Met Leu Glu Gly Ser Ile Ser Ser Ile Val Val
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Ser Phe Ala Asn Glu Gln Ser Thr Ile Gly Ser Ala Ala Ser Gly Ser
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Phe Ile Arg Gln Val Ile Arg Arg Leu Pro Ser Asp Tyr Lys Glu Arg
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Val Leu Lys Gln Val Arg Ala Thr Ser Val Asp Asp Val Lys Gly Ala
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Val Val Thr Cys Ala Thr Val Leu Glu Glu Thr Ile Lys Glu Gly Leu
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Asp Asp Tyr Gly Leu Lys Val Gly Asp Asp Glu Asp Glu Glu Ser Asp
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Val Ser Ala Leu Thr Pro Glu Gln Met Ile Gly Ala Pro Arg Arg Thr
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Glu Val Ile Pro Asn Pro Ser Gly Asp Thr Gly Leu Phe Ser Thr Ser
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Gln Trp Ser Phe Asp Thr His Ser Glu Ser Thr Trp Trp Ser Leu Ile
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Asp Leu Gln Ser Gly Lys Thr Thr Thr Leu Thr Asp Asp Ser Asp Ile
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Glu Glu Ile Ile Trp Leu Gly Ser Asp Asn Ser Thr Leu Leu Tyr Ile
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Asn Ser Thr Asn Ala Gln Val Pro Gly Gly Val Glu Leu Trp Ile Ala
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Asp Ser Ser Asp Phe Ala Asn Ala Tyr Lys Ala Ala Ser Leu Ser Ala
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Gly Phe Leu Gly Ile Lys Ser Thr Val Thr Asp Ser Gly Asp Val His
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Phe Ile Leu Arg Gly Lys Ser Tyr Pro Asn Gly Thr Ala Tyr Asn Asp
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Gln Leu Ala Glu Thr Tyr Pro Ser Thr Ala Arg Ile Tyr Asp Ser Ile
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Phe Val Arg His Trp Asp Thr Tyr Leu Thr Thr Ala Ser His Ala Val
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Phe Ser Gly Thr Leu Gln Ser Ser Thr Ser Asp Asp Gly Asn Val Gln
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Gly Ser Ala Thr Ala Phe Ala Val Asn Gly Pro Asp Ser Pro Ala Thr
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Ser Asp Lys Ile Ala Tyr Phe Gln Met Ala Thr Asn Thr Tyr Glu Ser
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Asp Arg Asn Val Leu Tyr Val Tyr Ser Ile Ala Asp Asp Thr Ile Thr
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Pro Leu Ala Lys Asp Trp Asp Arg Ser Pro Ser Ser Val Thr Trp Val
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Asp Gly Asp Asn Leu Val Val Ala Ser Gln Asp Leu Gly Arg Thr Arg
355 360 365
Leu Phe Ala Ile Pro Gly Asp Ala Gly Asp Asp Phe Lys Pro Thr Asn
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Phe Thr Asp Gly Gly Ser Val Ser Ala Gln Tyr Val Leu Ser Asn Ser
385 390 395 400
Thr Leu Leu Val Thr Ser Ser Ala Phe Trp Thr Ser Trp Ser Val Tyr
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Glu Ile Asp Pro Glu Leu Ser Gly Leu Ser Ser Ser Asp Phe Glu Glu
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Phe Tyr Phe Asp Gly Asn Trp Thr Thr Leu Gln Gly Trp Ile Thr Tyr
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Pro Gln Asp Phe Asp Ser Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Ala Phe Leu Ile
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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Val Ile His Ser Asp Lys Asp Tyr Arg Ile Pro Val Ala Asn Gly Ile
645 650 655
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Ala Asn Ile Ala Gln Ala Cys Tyr Ala Thr Asn Asn Gln Thr Gly Ser
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290 295 300
Val Thr Trp Ser Asp Val Lys Ser Thr Ile Phe Glu Ala Met Tyr Leu
305 310 315 320
Pro Ser Ser Trp Pro Leu Thr Ser Glu Leu Leu Tyr Tyr Val Gln Thr
325 330 335
Arg Asn Thr Thr Ile Leu Gly Asn Ser Glu Val Tyr Asp Thr Ile Lys
340 345 350
Ser Tyr Gly Gln Ser Ala Ser Leu Thr Ser Ala Ser Asp Glu Val Gly
355 360 365
Thr Ala Ile Thr Cys Ser Asp Lys His Arg Ser Ala Thr Ile Lys Glu
370 375 380
Val Leu Pro Tyr Val Lys Ala Arg Gln Ala Leu Thr Lys Ile Gly Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Asp Gly Asp Met Arg Cys Ala Gln Trp Asn Pro Lys Met
405 410 415
Phe Ala Lys Glu Arg Tyr Ser Gly Asp Phe Glu Val Lys Thr Ala Asn
420 425 430
Pro Val Leu Ile Leu Ser Asn Thr Tyr Asp Pro Ala Thr Pro Leu Pro
435 440 445
Ala Ala Lys Asn Leu Thr Glu Thr Phe Glu Gly Ser Val Leu Leu Glu
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Ala Lys Ala Val Arg Ala Tyr Phe Thr Asn Gly Thr Leu Pro Ala Asp
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Gly Thr Ile Cys Gln Val Asp Val Pro Leu Phe Thr Asn Leu Thr Tyr
500 505 510
Lys Asp Val Trp Pro Lys Ser Phe Gln Arg Ser Val Glu Ser Arg Asp
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Asp Ala Thr Ile Leu Lys Ala Leu Met Ser Val Arg Asp Lys Met Ser
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Arg Arg Arg Met Cys Ile Tyr Leu Tyr Thr Asn Ser Ala Ser Trp Arg
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325 330 335
Ile Asn Tyr Thr Glu Ser Asn Asn Ala Val Gly Leu Ala Phe Ser Ser
340 345 350
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355 360 365
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Ala Ala Asn Phe Ser Ser Ala Gly Tyr Thr Asn Ile Val Thr Ser Asp
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485 490 495
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500 505 510
Arg Arg Leu Lys Arg Met Gly Pro Ala Leu Arg Phe Gln Met
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<213> Aspergillus niger
<400> 120
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385 390 395 400
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Ser Val Glu Ala Tyr Leu Ala Arg Leu Gly Asp Lys Trp Asp Gly Leu
435 440 445
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450 455 460
Asn Tyr Val Ile Arg Asp His Gly Gln Trp Leu Gln Thr Ala Gly Thr
465 470 475 480
Ser Ala Ala Ala Pro Val Phe Ala Ala Val Ile Ser Arg Leu Asn Ala
485 490 495
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195 200 205
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210 215 220
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245 250 255
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Ser Gly Gly Thr Ser Ala Ala Cys Pro Leu Phe Ser Ala Leu Val Gly
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Met Leu Asn Asp Ala Arg Leu Arg Ala Gly Lys Ser Thr Leu Gly Phe
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Leu Asn Pro Leu Leu Tyr Ser Lys Gly Tyr Arg Ala Leu Thr Asp Val
515 520 525
Thr Gly Gly Gln Ser Ile Gly Cys Asn Gly Ile Asp Pro Gln Asn Asp
530 535 540
Glu Thr Val Ala Gly Ala Gly Ile Ile Pro Trp Ala His Trp Asn Ala
545 550 555 560
Thr Val Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly Leu Pro Asp Phe Glu
565 570 575
Lys Leu Arg Gln Leu Val Leu Ser Leu
580 585
<210> 125
<211> 265
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 125
Met Lys Thr Thr Ala Leu Leu Thr Ala Gly Leu Leu Ala Thr Thr Ala
1 5 10 15
Met Ala Ala Pro Leu Thr Ala Lys Arg Gln Ala Ala Arg Ala Lys Arg
20 25 30
Ser Thr Asn Arg Gln Ser Asn Pro Pro Phe Lys Pro Gly Thr Asn Glu
35 40 45
Val Leu Ala Leu Asn Gly Thr Lys Asn Val Glu Tyr Ser Ser Asn Trp
50 55 60
Ala Gly Ala Val Leu Ile Gly Thr Gly Tyr Thr Ala Val Thr Ala Glu
65 70 75 80
Phe Val Val Pro Thr Pro Ser Val Pro Ser Gly Gly Ser Ser Arg Glu
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100 105 110
Thr Ala Ile Leu Gln Thr Gly Val Asp Phe Cys Val Gln Gly Ser Glu
115 120 125
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130 135 140
Phe Ser Gly Ile Ser Ile Ser Ala Gly Asp Thr Ile Lys Val Thr Val
145 150 155 160
Asp Ala Ser Ser Asp Thr Thr Gly Thr Ala Thr Ile Glu Asn Val Ser
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Leu Cys Glu Tyr Asn Ala Glu Trp Ile Val Glu Asp Phe Glu Glu Asp
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Ile Ile Asp Ile Glu Gln Asn Glu Val Leu Thr Ser Val Ser Val Ser
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 126
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Val Ala Leu Ala Arg Gln Asn Leu Asp Gln Leu Glu Glu Lys Leu Leu
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Asp Ile Asn Glu Gln Phe Pro Leu Ala Asp Asp Ala Ala Val Val
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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275 280 285
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290 295 300
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370 375 380
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530 535 540
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 127
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1 5 10 15
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
Ser Ser Lys Ser Ser Thr Phe Lys Thr Leu Glu Gly Glu Ser Trp Gln
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130 135 140
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145 150 155 160
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Val Asp Asp Asp Thr Cys Glu Ala Ile Tyr Ser Ala Ile Asp Gly Ala
290 295 300
Tyr Tyr Asp Gln Glu Val Gln Gly Trp Ile Tyr Pro Thr Asp Thr Ala
305 310 315 320
Gln Asp Lys Leu Pro Thr Val Ser Phe Ala Val Gly Glu Lys Gln Phe
325 330 335
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340 345 350
Val Tyr Gly Gly Ile Gln Ser Arg Gly Asp Met Thr Met Asp Ile Leu
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Gly Asp Thr Phe Leu Lys Ser Ile Tyr Ala Val Ser Ala Leu Leu Leu
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<213> Aspergillus niger
<400> 131
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130 135 140
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165 170 175
Glu Ala Thr Ser Lys Ser Ser Gly Ser Ala Thr Val Glu Asn Leu Thr
180 185 190
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195 200 205
Leu Cys Glu Thr Asn Ala Glu Trp Ile Val Glu Asp Phe Glu Ser Gly
210 215 220
Asp Ser Leu Val Ala Phe Ala Asp Phe Gly Ser Val Thr Phe Thr Asn
225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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<210> 132
<211> 273
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 132
Met Gly Asp Tyr Gly Pro Gly Val Ser Ser Leu Thr Ala Gln Leu Pro
1 5 10 15
Gly Asn Pro Pro Val Ser Glu Thr Asp Gln Asp Glu Ile Ser Val Leu
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Val Thr Gly Phe Gly Pro Phe Lys Ser Asn Leu Val Asn Ala Ser Tyr
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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Ser Cys Leu Asp Glu Asp Ile Glu Thr Gly Lys Glu Val Ala Val Ala
245 250 255
Leu Ile Lys Ala Leu Val Thr Ser Trp Ser Glu Gln Gln His Ser Val
260 265 270
Pro
<210> 133
<211> 542
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 133
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Leu Ala His Phe Gly Ile Asn Pro Asp Leu Gly Leu His Asn Gln Gln
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Asn Phe Ser Arg Glu Lys Tyr Pro Asp Met Asp Leu Thr Pro Gln
165 170 175
Gly Thr Pro Trp Ile Met Val Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Ile Arg Ala
180 185 190
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195 200 205
Ser Ser Ser Pro Val Glu Ala Gln Val Asn Met Ser Ala Tyr Tyr Asp
210 215 220
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225 230 235 240
Asp Ile His Ala Ala Leu Glu Tyr Ile Asp Asp Gln Leu Ser Asp Glu
245 250 255
Asp Thr Ala Thr Ser Val Lys Gln Leu Phe Phe Gly Ser Gly Ala Glu
260 265 270
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275 280 285
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355 360 365
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<211> 391
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<213> Aspergillus niger
<400> 134
Met Lys Leu Ser Ile Ala Leu Ala Leu Gly Ala Thr Ala Ser Thr Gly
1 5 10 15
Val Leu Ala Ala Val Val Pro Gln Gln Glu Pro Leu Ile Thr Pro Gln
20 25 30
Asp Pro Pro Thr His His His Gln Glu Lys Phe Leu Ile Glu Leu Ala
35 40 45
Pro Tyr Gln Thr Arg Trp Val Thr Glu Glu Glu Lys Trp Asp Leu Lys
50 55 60
Leu Asp Gly Val Asn Phe Ile Asp Ile Thr Glu Glu Arg Asn Thr Gly
65 70 75 80
Phe Tyr Pro Thr Leu His Ala Gly Ser Tyr Val His Tyr Pro Pro Thr
85 90 95
Met Lys His Ala Glu Lys Val Val Pro Leu Leu Arg Gly Leu Ser Lys
100 105 110
Asp Asn Met Glu Gln Asn Leu Asn Lys Phe Thr Ser Phe His Thr Arg
115 120 125
Tyr Tyr Arg Ser Ser Thr Gly Ile Glu Ser Ala Lys Trp Leu Tyr Ser
130 135 140
Arg Val Ser Asp Val Ile Glu Gln Ser Gly Ala Ala Glu Tyr Gly Ala
145 150 155 160
Thr Val Glu Gln Phe Ala His Ser Trp Gly Gln Phe Ser Ile Ile Ala
165 170 175
Arg Ile Pro Gly Gln Thr Asn Lys Thr Val Val Leu Gly Ala His Gln
180 185 190
Asp Ser Ile Asn Leu Phe Leu Pro Ser Ile Leu Ala Ala Pro Gly Ala
195 200 205
Asp Asp Asp Gly Ser Gly Thr Val Thr Ile Leu Glu Ala Leu Arg Gly
210 215 220
Leu Leu Gln Ser Asp Ala Ile Val Arg Gly Asn Ala Ser Asn Thr Ile
225 230 235 240
Glu Phe His Trp Tyr Ser Ala Glu Glu Gly Gly Met Leu Gly Ser Gln
245 250 255
Ala Ile Phe Ser Gln Tyr Lys Arg Asp Lys Arg Asp Ile Lys Ala Met
260 265 270
Leu Gln Gln Asp Met Thr Gly Tyr Thr Gln Gly Ala Leu Asp Ala Gly
275 280 285
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305 310 315 320
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325 330 335
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370 375 380
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385 390
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 135
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1 5 10 15
Val Gly Ile Val Phe Ala Ser Pro Thr Lys Asn Asn Asp Gly Lys Leu
20 25 30
Val Tyr Gly Ser Pro Glu Ser Val Gly Met Ile Ser Ala Pro Leu His
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
Leu Val Ala Leu Asp Gly Val Ile Val Ser Glu Phe Ala Leu Gly Lys
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100 105 110
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210 215 220
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Leu Asp Gly Val Ser Gly His Ala Gly Leu Phe Ser Thr Val Arg Asp
305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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370 375 380
Thr Gly Phe Thr Gly Thr Thr Leu Val Met Asp Arg Thr Tyr Asn Ala
385 390 395 400
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 136
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 137
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<213> Aspergillus niger
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245 250 255
Phe Pro Pro Arg Ser Gln Phe Pro Ser Val Pro Tyr Asn Ala Ser Cys
260 265 270
Asn Ile Trp Asp Ile Ile Asn Asn Ala Ser Leu Ala Leu Asn Pro Cys
275 280 285
Phe Asn Arg Tyr His Ile Pro Asp Ala Cys Pro Thr Pro Trp Asn Pro
290 295 300
Val Gly Gly Pro Ile Val Gly Leu Gly Pro Thr Asn Tyr Phe Asn Arg
305 310 315 320
Ser Asp Val Gln Lys Ala Ile Asn Ala Tyr Pro Thr Asp Tyr Phe Val
325 330 335
Cys Lys Asp Gly Ile Phe Pro Thr Ala Asn Gly Leu Asp Thr Ser Pro
340 345 350
Pro Ser Ser Leu Gly Pro Leu Pro Arg Val Ile Glu Gln Thr Asn Asn
355 360 365
Thr Ile Ile Ala His Gly Leu Met Asp Phe Glu Leu Leu Ala Gln Gly
370 375 380
Thr Leu Ile Ser Ile Gln Asn Met Thr Trp Asn Gly Lys Gln Gly Phe
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Glu Arg Glu Pro Val Glu Pro Leu Phe Val Pro Tyr Gly Gly Ser Ser
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Gly Gly Gly Val Leu Gly Thr Ala His Thr Glu Arg Gly Leu Thr Phe
420 425 430
Ser Thr Val Phe Ser Ser Gly His Glu Ile Pro Glu Tyr Ala Pro Gly
435 440 445
Ala Ala Tyr Arg Gln Leu Glu Phe Leu Leu Gly Arg Val Ala Asn Leu
450 455 460
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<211> 210
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 142
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20 25 30
Lys Tyr Pro Ala Leu Phe Val Tyr Lys Asp Thr Asn Cys Thr Asp Ile
35 40 45
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50 55 60
Tyr Asp Tyr Ala Gly Ser Phe Gln Met Phe Asn Ile Asp Ala Ala Tyr
65 70 75 80
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210
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<213> Aspergillus niger
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Met Arg His Leu Leu Ser Leu Leu Val Leu Leu Ile Ala Ser Ala Ala
1 5 10 15
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Val Glu Pro Val His Leu Leu Ser Ser Gln Pro Ser Asp Pro Arg Arg
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Leu Arg Phe Ser Leu Arg Asn His Asp Glu Ala Glu Ala Leu Ala Gln
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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340 345 350
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Cys Tyr Ile Glu Ala Ala Arg Ile Glu Gln Tyr Leu Asn Thr Pro Ala
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Val Thr Val Asp Gly Ala Gly His Phe Leu Pro Gln Asp Arg Pro Asp
450 455 460
Ile Ala Leu Asp Met Met Val Arg Trp Ile Ser Gly Ala Ser Phe Thr
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Glu
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35 40 45
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145 150 155 160
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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Asp Asp Pro Asn Tyr Glu Asp Asn Tyr Asn Phe Lys Gly Leu Leu Asn
325 330 335
Asn Phe Leu Tyr Ala Ile Asp Gly Ser Tyr Cys Asn Glu Thr Ser Ser
340 345 350
Leu Asp Pro Gln Tyr Pro Asp Pro Ser Pro Gly Gly Tyr Ser Ser Pro
355 360 365
Lys Gln Cys Gly Val Tyr Thr Pro Thr Asn Val Ile Ser Ile Ser Tyr
370 375 380
Gly Ser Pro Glu Ala Asp Leu Pro Ile Ala Tyr Gln Arg Arg Gln Cys
385 390 395 400
His Glu Phe Met Lys Leu Gly Leu Gln Gly Ile Ser Val Val Val Ala
405 410 415
Ser Gly Asp Ser Gly Val Ala Ser Ser Thr Gly Thr Cys Phe Gly Asp
420 425 430
Ala Asp Asn Val Phe Val Pro Asp Phe Pro Ala Thr Cys Pro Tyr Leu
435 440 445
Thr Ala Val Gly Gly Thr Tyr Leu Pro Leu Gly Ala Asp Ala Ala Lys
450 455 460
Asp Gln Glu Ile Ala Val Thr Arg Phe Pro Ser Gly Gly Gly Phe Ser
465 470 475 480
Asn Ile Tyr Ala Arg Pro Ser Tyr Gln Asn His Ser Val Glu Thr Tyr
485 490 495
Phe Ser Thr Thr Ser Asp Asp Leu Thr Tyr Pro Tyr Tyr Ser Gly Val
500 505 510
Asn Tyr Thr Asp Phe Ser Asn Thr Asp Gly Val Tyr Asn Arg Ile Gly
515 520 525
Arg Gly Tyr Pro Asp Val Ser Ala Ile Ala Asp Asn Ile Ile Ile Tyr
530 535 540
Asn Gln Gly Glu Ala Thr Leu Val Gly Gly Thr Ser Ala Ala Ala Pro
545 550 555 560
Ala Phe Ala Ala Met Leu Thr Arg Ile Asn Glu Glu Arg Leu Ala Lys
565 570 575
Gly Lys Ser Thr Val Gly Phe Val Asn Pro Val Leu Tyr Glu His Pro
580 585 590
Glu Ala Phe Arg Asp Val Thr Val Gly Ser Asn Pro Gly Cys Gly Thr
595 600 605
Asp Gly Phe Pro Val Ala Gly Gly Trp Asp Pro Val Thr Gly Leu Gly
610 615 620
Thr Pro Arg Phe Glu Asp Leu Met Asp Ile Phe Val Gly Asp Asp
625 630 635
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<211> 371
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 150
Met Ala Ser Lys Thr Leu Leu Leu Ile Pro Ala Leu Ala Thr Ala Ala
1 5 10 15
Leu Gly Ser Val Leu Asp Leu Asp Ile Lys Val Asp Leu Gly Thr Pro
20 25 30
Gly Gly Pro Phe Asp Leu Met Tyr Asp Thr Gly Ser Ser Thr Leu Trp
35 40 45
Val Leu Asp Ser Asn Cys Thr Asp Asp Cys Pro Asn Val Ser Gly Tyr
50 55 60
Ser Arg His Gly Tyr Asn Leu Thr Ser Thr Gly Val Asn Leu Gly Val
65 70 75 80
Asn Asp Ser Ile Ala Tyr Ser Gly Gly Thr Val Ser Gly Phe Thr Ala
85 90 95
Thr Asp Ile Leu Thr Val Pro Asp Thr Asn Val Ser Tyr Arg Gln Ser
100 105 110
Phe Ala Val Ile Thr Asp Ser Thr Trp Ala Ala Leu Ala Ala Asp Gly
115 120 125
Phe Ile Gly Leu Ala Ser Ser Thr Ile Ala Phe Lys Asn Thr Thr Thr
130 135 140
Ala Val Glu Gln Met Met Gln Asp Gly Leu Leu Asp Glu Pro Arg Phe
145 150 155 160
Ala Ile Tyr Ala Gly Ser Gly Glu Ser Thr Val Thr Asn Pro Asn Pro
165 170 175
Glu Asn Asn Gly Val Phe Thr Phe Gly Gly Ser His Glu Glu Thr Tyr
180 185 190
Ala Asp Gly Glu Leu Gln Trp Met Lys Met Leu Ser Pro Phe Glu Ile
195 200 205
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210 215 220
Gln Ala Leu Ser Ser Asp Val Leu Asn Trp Tyr Gly Gln Thr Asn Leu
225 230 235 240
Phe Asn Val Ala Gly Ala Ser Ser Ile Ser Ile Pro Asn Asp Gln Ile
245 250 255
Glu Ala Met Tyr Ala Leu Thr Pro Phe Ser Tyr Ala Asp Ile Ser Ser
260 265 270
Gly Tyr Arg Pro Leu Cys Ser Asp Phe Asn Asp Thr Trp Ser Ile Ser
275 280 285
Phe Thr Met Gly Phe Tyr Gly Glu Gly Val Thr Phe Asn Leu Thr Gly
290 295 300
Asp Gln Leu Ala Val Pro Gly Tyr Gln Asp Asp Asp His Cys Phe Pro
305 310 315 320
Pro Phe Asn Pro Trp Asp Ser Tyr Asn Thr Ile Ile Gly Gln His Trp
325 330 335
Leu Ser Asn Phe Tyr Ala Val Phe Asp Phe Gly Ser Phe Asp Pro Glu
340 345 350
Thr Tyr Asp Ile Arg Val Gly Leu Ala Pro Leu Lys Lys Glu Tyr Leu
355 360 365
Pro Ser Ala
370
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 151
Met Phe Pro Cys Ser Arg Ile Trp Ser Leu Leu Val Ala Ala Ala Thr
1 5 10 15
Ala Ser Ala Val Pro Thr Ser Leu Ala Thr Thr His Leu Gln Ser Val
20 25 30
Asp Leu Leu Leu Thr Arg Ser Ser Tyr Gly Phe Leu Thr Asp Ile Ala
35 40 45
Leu Gly Thr Pro Gly Gln Ser Leu Pro Tyr Leu Val Asp Trp Thr Trp
50 55 60
Thr Gly His Tyr Val Val Thr Thr Leu Cys Tyr Asn Asp Pro Thr Ala
65 70 75 80
Thr Tyr Asp Cys Leu Asn Val Asp Gln Lys Ile Phe Asn Gln Thr Leu
85 90 95
Ser Ser Thr Phe Ile Asn Gln Thr Asp Gln Tyr Gly Tyr Leu Tyr Trp
100 105 110
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115 120 125
Thr Asp Met Leu Arg Ile Gly Pro Thr Ala Val Asn Thr Thr Ile Gln
130 135 140
Ala Ala Asn Phe Val Phe Asn Glu Thr Ile Ser Ala Phe Pro Phe Ser
145 150 155 160
Gly Val Tyr Gly Leu Ser Pro Val Phe Gln Gly Asp Asn Arg Ser Val
165 170 175
Gln Ala Ser Phe Tyr Gln Gly Trp Arg Ser Gly Ala Trp His Ser Pro
180 185 190
Ile Val Ser Phe Ile Tyr Cys His Asp Asn Ala Thr Lys Ala Val Cys
195 200 205
Ser Gly Tyr Asp Gly Leu Gln Thr Leu Gly Gly Tyr Asn Thr Ser His
210 215 220
Val Gln Gly Asp Ile Thr Trp Tyr Asp Ile Ile Val Thr Glu Ala Ile
225 230 235 240
Asn Thr Leu Asp Phe Val Tyr Ala Pro Ala Val Ile Asn Tyr Trp Ala
245 250 255
Leu Asn Leu Thr Arg Phe Ser Ile Gly Asp Glu Glu Gln Glu Leu Asn
260 265 270
Lys Thr Thr Thr Leu Asp Gly Lys Gln Ala Ala Val Ala Ala Phe Asp
275 280 285
His Ala Ser Tyr Gly Arg Gly Ala Pro Val Ser Val Tyr Gly Tyr Gln
290 295 300
Arg Leu Val Glu Leu Val Gly Ala Lys Ala Val Thr Leu Ser Asp Pro
305 310 315 320
Pro Asn Asn Gly Glu Gln Gly Phe Tyr Gln Phe Asp Cys Arg Asn Ser
325 330 335
Ser Leu Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Glu Phe Ala Gly Ser Glu Arg Ala
340 345 350
Trp Glu Ile Val Pro Glu Asn Tyr Val Glu Val Leu Ala Asn Gly Thr
355 360 365
Asn Lys Cys Thr Phe Asn Val Arg Thr Leu Gly Asp Gly Ala Met Val
370 375 380
Met Gly Asn Phe Gly Glu Thr Phe Ala Ile Asp Lys Tyr Val Met Phe
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
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Ile Ser Ala Arg Asp Ser Leu Ala Arg Arg Phe Leu Pro Val Pro Lys
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Pro Ser Asp Ala Leu Ala Asp Asp Ser Thr Ser Ser Ala Ser Asp Glu
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65 70 75 80
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Leu Asp Gln Asp Gly Ser Asp Ile Ser Tyr Ile Ser Val Val Asn Ile
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Gly Ser Asp Glu Lys Ser Met Tyr Met Leu Leu Asp Thr Gly Gly Ser
115 120 125
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Gly Lys Asp Lys Leu Thr Ile Ala Asn Val Thr Val Arg Met Thr Phe
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195 200 205
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245 250 255
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355 360 365
Gly Cys Val Ser Asn Ile Ile Ser Tyr Asp Leu Phe Gly Asp Asp Ile
370 375 380
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385 390 395 400
Tyr Asp Glu Leu Arg Val Gly Phe Ala Glu Arg Ser Ser Asn Thr Thr
405 410 415
Ser Ala Ser Asn Ser Thr Ser Ser Gly Thr Ser Ser Thr Ser Gly Ser
420 425 430
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435 440 445
Ser Ser Ser Asp Ala Glu Ser Gly Ser Ser Met Thr Ile Pro Ala Pro
450 455 460
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<213> Aspergillus niger
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Met Thr Ser Ser Thr Leu Arg Leu Ala Val Ala Leu Ala Leu Ser Thr
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Phe Pro Phe Gly Asn Leu Glu Asp Val His Ile Ala Lys Arg Asp Ser
35 40 45
Ser Lys Thr Val Glu Ala Pro Leu Val Ile Tyr Gly Asp Ser Tyr Trp
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Leu Thr Arg Ser Arg Val Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Asp Glu Asn
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Tyr Glu Cys Ser Asp Asp Glu Leu Cys Ser Glu Phe Gly Phe Tyr Lys
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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Ser Tyr Ser Ser Leu Gly Leu Ser Ser Val Asn Thr Ser Phe Pro Tyr
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180 185 190
Gly Asp Asn Gly Asn Thr Thr Thr Pro Ser Ile Ile Phe Gly Gly Ile
195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Gly Val Ile Ser Thr Ser Arg Phe Tyr Gly Val Leu Pro Cys Ala Arg
290 295 300
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305 310 315 320
Phe Ser Val Ser Trp Asp Glu Leu Phe Val Pro Trp Thr Arg Asp Gly
325 330 335
Leu Cys Lys Phe Gly Ile Gln Ala Gln Asp Ser Asp Tyr Lys Thr Arg
340 345 350
Ala Glu Leu Gly Val Pro Phe Leu Arg Arg Met Tyr Val Ala Val Asp
355 360 365
Tyr Asn Asn Gln Phe Val Gly Val Ala Thr Leu Lys Asp Asp Asp Asp
370 375 380
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385 390 395 400
Leu Pro Ser Ala Val Gly Asp Trp Pro Ala Ser Val Thr Ala Tyr Thr
405 410 415
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420 425 430
Ala Thr Ser Ser Gly Gly Gly Val Val Pro Thr Gly Leu Ser Glu Leu
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Gly Arg Ala Phe Leu Val Pro Gly Val Leu Gly Met Ala Val Leu Gln
450 455 460
Ala Val
465
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 154
Met Met Arg Pro Ile Leu Leu Pro Leu Leu Gly Val Phe Leu Gln Thr
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Ser Ser Ala Ser Asn Pro Tyr Val Met Ser Trp Ser Ser Gln Ala Tyr
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Gly Pro Asp Gly Pro Trp Gln Ala Val Ser Ile Asp Val Gly Ser Asn
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Thr Thr Ala Ser Ser Trp Glu Thr Thr Tyr Trp Ala Val Glu Gly Gly
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Gly Met His Ile Gly Ser Val Asp Pro Lys Ile Pro Gly Ser Leu Ile
195 200 205
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210 215 220
Gly Val Val Ser Ser Ser Gly Leu Leu Glu Leu Glu Leu Lys Asp Ile
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Gly Leu Gly Val Ala Ala Gly Ser Ser Pro Phe Ser Phe Asn Asn Glu
245 250 255
Ser Gly Leu Phe Leu Gln Ser Ser Gly Ser Val Gln Ala Lys Thr Val
260 265 270
Gln Ile Asp Pro Thr Lys Pro Tyr Met Tyr Leu Pro Gln Ala Thr Cys
275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
Ser Ala Ala Tyr Leu Ser Phe Val Phe Asn Met Asn Gly Val Asn Asn
325 330 335
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340 345 350
Gln Glu Pro Leu Val Asp Gln Asn Val Thr Tyr Phe Pro Cys Phe Leu
355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
Ala Gln Ala Pro Gly Pro Gly Tyr Ala Ser Glu Asp Ile Thr Arg Ile
405 410 415
Ala Val Ser Asp Thr Ser Leu Ser Ala Ser Asn Gly Thr Trp Glu Glu
420 425 430
Thr Trp Ala Thr Tyr Trp Gly Ile Lys Thr Ser Asp Asn Ser Ser Ser
435 440 445
Ser Lys Ser Gly Leu Ser Ser Gly Ala Lys Ile Gly Ile Gly Val Gly
450 455 460
Val Gly Val Gly Gly Ala Val Leu Ile Ala Ala Gly Ile Ala Ile Ala
465 470 475 480
Phe Cys Leu Arg Arg Arg Arg Gly Ala Ser Gln Glu Ala Ala Gly Glu
485 490 495
Gln Arg Arg Ser Met Phe Arg Gly Phe Ala Glu Leu Pro Gly Gly Ala
500 505 510
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530 535 540
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 155
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1 5 10 15
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Arg Leu Gly Ala Arg His Glu Gly Pro Val Gly Glu Leu Pro Ser His
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Asp Gln Leu Arg Asp Arg Arg Arg Leu Arg Arg Arg Ser Gly Asp
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Asp Ala Ala Val Leu Pro Ser Leu Val Gly Arg Asp Glu Gly Leu Gly
100 105 110
Gly Ile Leu Trp Ser Glu Lys Leu Ala Pro Gln Arg Lys Leu His Lys
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Gly Ile Ala Asp Pro Ile Phe Gly Glu Gln Trp His Leu Tyr Asn Thr
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Asp Tyr Asn Asp Lys Val Pro Glu Pro Arg Pro Arg Leu Ser Asp Asp
225 230 235 240
Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Ile Gly Ala Ala Lys Asn Asp
245 250 255
Val Cys Gly Val Gly Val Ala Tyr Asp Ser Arg Ile Ala Gly Ile Arg
260 265 270
Ile Leu Ser Ala Pro Ile Asp Asp Thr Asp Glu Ala Ala Ala Ile Asn
275 280 285
Tyr Ala Tyr Gln Glu Asn Asp Ile Tyr Ser Cys Ser Trp Gly Pro Tyr
290 295 300
Asp Asp Gly Ala Thr Met Glu Ala Pro Gly Thr Leu Ile Lys Arg Ala
305 310 315 320
Met Val Asn Gly Ile Gln Asn Gly Arg Gly Gly Lys Gly Ser Val Phe
325 330 335
Val Phe Ala Ala Gly Asn Gly Ala Ile His Asp Asp Asn Cys Asn Phe
340 345 350
Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile Tyr Ser Ile Thr Val Gly Ala Ile Asp
355 360 365
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370 375 380
Val Val Ala Tyr Ser Ser Gly Ala Ser Asp Ala Ile His Thr Thr Asp
385 390 395 400
Val Gly Thr Asp Lys Cys Ser Thr Thr His Gly Gly Thr Ser Ala Ala
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Gly Pro Leu Ala Ala Gly Thr Val Ala Leu Ala Leu Ser Val Arg Pro
420 425 430
Glu Leu Thr Trp Arg Asp Val Gln Tyr Leu Met Ile Glu Ala Ala Val
435 440 445
Pro Val His Glu Asp Asp Gly Ser Trp Gln Asp Thr Lys Asn Gly Lys
450 455 460
Lys Phe Ser His Asp Trp Gly Tyr Gly Lys Val Asp Thr Tyr Thr Leu
465 470 475 480
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485 490 495
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565 570 575
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580 585 590
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595 600 605
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Glu Arg Glu Gly Ala Asp Gly Glu His Ser Arg Arg
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<210> 156
<211> 149
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 156
Met Lys Thr Phe Ser Thr Val Thr Ser Leu Leu Ala Leu Phe Ser Ser
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Ala Leu Ala Ala Pro Val Asp Ser Ala Glu Ala Ala Gly Thr Thr Val
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Thr Val Ser Cys Ser Asp Gly Ala Asn Gly Leu Ile Asn Lys Gly Tyr
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65 70 75 80
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100 105 110
Gly Gly Phe Asn Ile Ala Leu Glu Ala Met Asn Thr Leu Thr Asn Asn
115 120 125
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130 135 140
Val Ser Leu Cys Ala
145
<210> 157
<211> 296
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 157
Met Ala Gln Ile Phe Trp Leu Ser Leu Phe Leu Leu Val Ser Trp Val
1 5 10 15
Arg Ala Glu Ser Asn Arg Thr Glu Val Asp Leu Ile Phe Pro Arg Asn
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Ser Tyr Pro Trp Ile Ser Ser Pro Tyr Ile Asp Gly Ser Leu Asn Ile
130 135 140
Asp Lys Val Tyr Glu Gly Phe His Tyr Thr Ala Tyr Asn Val Ile Val
145 150 155 160
Asp Arg Val Thr Phe Ser Thr Arg Glu Asp Ala Ser Gln Pro Asn Leu
165 170 175
Thr Thr Leu Thr Asn Ser Glu Asn Cys Asp Lys Val Ser Ser Leu Ala
180 185 190
Leu Leu Ser Ile Val Asp Ser Leu Arg Ile Pro Pro Gln Leu Pro Gln
195 200 205
Glu Asp Ile Asp Thr Val Ser Met Cys Pro Gln Leu Ala Asp Ala Arg
210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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290 295
<210> 158
<211> 310
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 158
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1 5 10 15
Ser Ser Gln Ser Val Asn Gly Val Val Ser Gly Met Phe Gln His Thr
20 25 30
Val Thr Ser Ser Pro Ser Phe Thr Thr Asn Gln Phe Phe Lys Lys Lys
35 40 45
Phe Thr Ala Ala Ile Ala Thr Ala Ile Phe Ala Ser Val Ala Val Ala
50 55 60
Ala Pro Gln Arg Gly Leu Glu Ala Arg Leu Lys Ala Arg Gly Ser Ser
65 70 75 80
Lys Gly Ser Arg Pro Leu Gln Ala Val Ala Arg Pro Ala Ser Thr Lys
85 90 95
Asn Gln Thr Asn Val Glu Tyr Ser Ser Asn Trp Ser Gly Ala Val Leu
100 105 110
Val Glu Pro Pro Ser Ala Ala Ala Thr Tyr Thr Ala Val Thr Gly Thr
115 120 125
Phe Thr Val Pro Glu Pro Thr Gly Asn Ser Gly Gly Ser Gln Ala Ala
130 135 140
Ser Ala Trp Val Gly Ile Asp Gly Asp Thr Tyr Gly Asn Ala Ile Leu
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165 170 175
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Asp Ile Ser Ala Gly Asp Glu Ile Val Ala Ile Val Glu Ser Tyr Thr
195 200 205
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210 215 220
Val Ser Lys Glu Leu Ser Ser Ser Ser Ser Leu Gly Gly Gln Asn Ala
225 230 235 240
Glu Trp Ile Val Glu Asp Phe Glu Glu Asn Gly Ser Leu Val Asn Leu
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Gly Gly Glu Ser Val Gly Leu Thr Asp Ala Thr Ile Ile Glu Ile Glu
275 280 285
Glu Asn Gly Gln Val Val Thr Asp Val Thr Ile Asp Ser Asp Ser Glu
290 295 300
Val Thr Ile Thr Tyr Glu
305 310
<210> 159
<211> 681
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 159
Met Arg Cys Ser Leu Ile Ser Leu Leu Gly Leu Ala Ala Ile Pro Ala
1 5 10 15
Leu Gly Gly Cys Pro Phe Ala His Thr Ala Asn Met Gly Ile Asp Asn
20 25 30
Met Val Lys Ala His Ala His Met Ser Arg Pro Leu Ile Ala Ser Lys
35 40 45
Ser Ser Pro Ser Thr Val Pro Thr Ser Ser Ser Thr Pro Ser Val Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Tyr Ile Ala Asn Thr Asp Gly Ser Asn Glu Arg Pro Leu Leu Ser
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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195 200 205
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210 215 220
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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340 345 350
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370 375 380
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485 490 495
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515 520 525
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Gly Gly Asn Lys Lys Leu Met Thr Asn Ser Met Trp Glu Asp Ser Met
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Pro Leu Phe Leu Pro Arg Glu Val Leu
675 680
<210> 160
<211> 624
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 160
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1 5 10 15
Leu Pro Ser Arg Pro His Pro Ala Lys Gly Lys Ala Ile Arg Phe Leu
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Leu Ser Leu Ala Leu Val Ala Phe Ala Ile Val Gln Leu Cys Gly Asn
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 161
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325 330 335
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<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 162
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1 5 10 15
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115 120 125
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165 170 175
Arg Gly Ala Ser Asp Cys Lys Asn Val Leu Ile Gly Leu Met Ser Val
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Ser Ile Ala Lys Phe Leu Glu Lys Lys Tyr Gly Pro Asp Ser Phe Glu
225 230 235 240
Phe Ile Leu Asp Glu Gly Gly Met Gly Leu Glu Val Leu Asp Asp Asn
245 250 255
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260 265 270
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305 310 315 320
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340 345 350
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405 410 415
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435 440 445
Ser Gly Ala Leu Ser Pro Ala Pro Val Ser Pro Thr Asp Ile Asp Thr
450 455 460
Asp Ala Val Trp Ala Arg Phe Ser Gly Val Thr Arg Ser Val Phe Glu
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500 505 510
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515 520 525
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530 535 540
Leu Tyr Tyr Asp Leu Ile Arg Ser Phe Asp Gly Arg Thr Asp Ser Ser
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Val Ile Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ala Asp Asp Glu Leu Ala His Asp
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Val Leu
<210> 163
<211> 456
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 163
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1 5 10 15
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195 200 205
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Gly Tyr Gly Val Ile Glu Cys Asp Val Lys Asp Glu Asp Phe Thr Phe
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<210> 164
<211> 664
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 164
Met Leu Val Arg Gln Leu Ala Leu Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Ser
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145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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Leu Leu Asn Glu Glu Arg Phe Ala Ile Gly Lys Gly Pro Val Gly Phe
595 600 605
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Asn Gly Thr Asn Ala Gly Cys Gly Thr Tyr Gly Phe Ser Ala Ile Glu
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645 650 655
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660
<210> 165
<211> 520
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 165
Met Arg Val Thr Thr Ala Ile Ala Ser Leu Leu Leu Val Gly Ser Ala
1 5 10 15
Thr Ser Leu Gln Asn Pro His Arg Arg Ala Val Pro Pro Pro Leu Ser
20 25 30
His Arg Ser Val Ala Ser Arg Ser Val Pro Val Glu Arg Arg Thr Thr
35 40 45
Asp Phe Glu Tyr Leu Thr Asn Lys Thr Ala Arg Phe Leu Val Asn Gly
50 55 60
Thr Ser Ile Pro Glu Val Asp Phe Asp Val Gly Glu Ser Tyr Ala Gly
65 70 75 80
Leu Leu Pro Asn Thr Pro Thr Gly Asn Ser Ser Leu Phe Phe Trp Phe
85 90 95
Phe Pro Ser Gln Asn Pro Glu Ala Ser Asp Glu Ile Thr Ile Trp Leu
100 105 110
Asn Gly Gly Pro Gly Cys Ser Ser Leu Asp Gly Leu Leu Gln Glu Asn
115 120 125
Gly Pro Phe Leu Trp Gln Pro Gly Thr Tyr Lys Pro Val Pro Asn Pro
130 135 140
Tyr Ser Trp Thr Asn Leu Thr Asn Val Val Tyr Ile Asp Gln Pro Ala
145 150 155 160
Gly Thr Gly Phe Ser Pro Gly Pro Ser Thr Val Asn Asn Glu Glu Asp
165 170 175
Val Ala Ala Gln Phe Asn Ser Trp Phe Lys His Phe Val Asp Thr Phe
180 185 190
Asp Leu His Gly Arg Lys Val Tyr Ile Thr Gly Glu Ser Tyr Ala Gly
195 200 205
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210 215 220
Thr Tyr Phe Asn Leu Lys Gly Ile Gln Ile Asn Asp Pro Ser Ile Asn
225 230 235 240
Ser Asp Ser Val Met Met Tyr Ser Pro Ala Val Arg His Leu Asn His
245 250 255
Tyr Asn Asn Ile Phe Gln Leu Asn Ser Thr Phe Leu Ser Tyr Ile Asn
260 265 270
Ala Lys Ala Asp Lys Cys Gly Tyr Asn Ala Phe Leu Asp Lys Ala Ile
275 280 285
Thr Tyr Pro Pro Pro Ser Pro Phe Pro Thr Ala Pro Glu Ile Thr Glu
290 295 300
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305 310 315 320
Pro Cys Phe Asn Tyr Tyr His Leu Ile Asp Phe Cys Pro Tyr Leu Trp
325 330 335
Asp Val Leu Gly Phe Pro Ser Leu Ala Ser Gly Pro Asn Asn Tyr Phe
340 345 350
Asn Arg Ser Asp Val Gln Lys Ile Leu His Val Pro Pro Thr Asp Tyr
355 360 365
Ser Val Cys Ser Glu Thr Val Ile Phe Ala Asn Gly Asp Gly Ser Asp
370 375 380
Pro Ser Ser Trp Gly Pro Leu Pro Ser Val Ile Glu Arg Thr Asn Asn
385 390 395 400
Thr Ile Ile Gly His Gly Trp Leu Asp Tyr Leu Leu Phe Leu Asn Gly
405 410 415
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420 425 430
Gln Arg Pro Pro Val Glu Pro Leu Phe Val Pro Tyr His Tyr Gly Leu
435 440 445
Ala Glu Leu Tyr Trp Gly Asp Glu Pro Asp Pro Tyr Asn Leu Asp Ala
450 455 460
Gly Ala Gly Tyr Leu Gly Thr Ala His Thr Glu Arg Gly Leu Thr Phe
465 470 475 480
Ser Ser Val Tyr Leu Ser Gly His Glu Ile Pro Gln Tyr Val Pro Gly
485 490 495
Ala Ala Tyr Arg Gln Leu Glu Phe Leu Leu Gly Arg Ile Ser Ser Leu
500 505 510
Ser Ala Lys Gly Asn Tyr Thr Ser
515 520
<210> 166
<211> 551
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 166
Met Arg Gly Ser Arg Leu Val Leu Leu Leu Pro Leu Ala Ala Leu Ser
1 5 10 15
Cys Ala Met Pro Glu Asn Glu Trp Ser Ser Thr Ile Arg Arg Gln Leu
20 25 30
Pro Lys Ala Ser Thr Gly Val Lys Ser Ile Lys Thr Pro Asn Asn Val
35 40 45
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50 55 60
Pro Gly Val Lys Ser Tyr Ser Gly Tyr Val Asp Leu Ser Pro Glu Ser
65 70 75 80
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85 90 95
Pro Val Thr Leu Trp Leu Asn Gly Gly Pro Gly Ser Asp Ser Leu Ile
100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Ser Gln Pro Leu Gly Val Gly Phe Ser Tyr Ser Glu Thr Glu Ala
145 150 155 160
Gly Ser Leu Asn Pro Phe Thr Gly Ala Val Glu Asn Ala Ser Phe Ala
165 170 175
Gly Val Gln Gly Arg Tyr Pro Val Ile Asp Ala Thr Ile Ile Asp Thr
180 185 190
Thr Asp Ile Ala Ala Arg Ala Thr Trp Glu Val Leu Gln Gly Phe Leu
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
His Phe Tyr Glu Gln Asn Ser Lys Ile Ala Ser Gly Glu Val Asn Gly
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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305 310 315 320
Leu Thr Asn Arg Thr Ser Leu Ser Asp Tyr Ala Ile Cys Thr Glu Ala
325 330 335
Ala Asn Met Cys Arg Asp Asn Val Glu Gly Pro Tyr Tyr Gln Phe Gly
340 345 350
Gly Arg Gly Val Tyr Asp Ile Arg His Pro Tyr Asn Asp Pro Thr Pro
355 360 365
Pro Ser Tyr Phe Val Asp Tyr Leu Lys Lys Asp Ser Val Met Asp Ala
370 375 380
Ile Gly Val Asp Ile Asn Tyr Thr Glu Ser Ser Gly Glu Val Tyr Tyr
385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
Asp Ala Asp Tyr Ile Cys Asn Trp Phe Gly Gly Gln Ala Ile Ser Leu
435 440 445
Ala Val Asn Tyr Pro His Ala Ala Gln Phe Arg Ala Ala Gly Tyr Thr
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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500 505 510
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515 520 525
Asn Gly Thr Ser Gln Ala Thr His Thr Glu Ser Phe Val Pro Leu Ser
530 535 540
Thr Ala Ser Ser Thr Val Asn
545 550
<210> 167
<211> 623
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 167
Met Pro Phe Pro Phe Ser Ser Ala Leu Leu Gly Tyr Ile Leu Thr Thr
1 5 10 15
Ser Thr Thr Leu Thr Ser Leu Val Ala Gly Gln Tyr Tyr Pro Pro Thr
20 25 30
Pro Glu Asp Leu Thr Val Ile His Ser Glu Ile Phe Pro Gly Ala Arg
35 40 45
Ile Ser Tyr Lys Gln Pro Leu Gly Ile Cys Thr Thr Thr Pro Ser Thr
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Ser Ile Pro Gly Ile Ser Ile Ser Gln Pro Tyr Pro Ile Asn Thr
85 90 95
Phe Phe Trp Tyr Phe Pro Ser Arg His His His Asn Asn Asp Thr Ser
100 105 110
Pro Leu Thr Ile Trp Met Asn Gly Gly Pro Gly Gly Ser Ser Met Ile
115 120 125
Gly Leu Phe Gln Glu Asn Gly Pro Cys Thr Val Asn Thr Asp Ser Asn
130 135 140
Ser Thr Ala Tyr Asn Pro Trp Ser Trp Asn Glu Tyr Val Asp Met Leu
145 150 155 160
Tyr Ile Glu Gln Pro Val Gln Thr Gly Phe Ser Tyr Asp Val Leu Arg
165 170 175
Asn Gly Thr Leu Asp Leu Asn Glu Thr Phe Leu Val Gly Thr Leu Pro
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
Val Ser Ser Val Asp Gly Asn Gly Gly Gly Asp Asp Arg Val Ser Ile
225 230 235 240
Trp Thr Glu Ser Tyr Gly Gly Arg Tyr Gly Pro Ala Tyr Thr Ala Leu
245 250 255
Phe Gln Glu Met Asn Glu Arg Ile Glu Ser Gly Glu Val Ser Thr Gly
260 265 270
Lys Lys Ile His Leu Asp Thr Leu Gly Ile Ile Asn Gly Cys Val Asp
275 280 285
Leu Leu Val Gln Val Pro Ser Phe Pro Glu Gln Ala Tyr Asn Asn Thr
290 295 300
Tyr Gly Ile Glu Gly Ile Asn Arg Thr Leu Tyr Asp Arg Ala Met Asp
305 310 315 320
Ser Trp Ser Lys Pro Gly Gly Cys Arg Asp Met Ile Ile Glu Cys Arg
325 330 335
Asp Ala Gly Glu Leu Gly Asp Pro Leu Ile Ile Cys Glu Glu Ala Ser
340 345 350
Asp Tyr Cys Ser Arg Glu Ile Lys Ser Leu Tyr Thr Asn Thr Ser Gly
355 360 365
Arg Gly Tyr Tyr Asp Ile Ala His Phe Thr Pro Asp Ala Ala Leu Val
370 375 380
Pro Tyr Phe Val Gly Phe Leu Asn Arg Pro Trp Val Gln Lys Ala Leu
385 390 395 400
Gly Val Pro Val Asn Tyr Thr Met Ser Ser Glu Ala Val Gly Asn Ser
405 410 415
Phe Ala Ser Thr Gly Asp Tyr Pro Arg Asn Asp Pro Arg Gly Met Ile
420 425 430
Gly Asp Ile Gly Tyr Leu Leu Asp Ser Gly Val Lys Val Ala Met Val
435 440 445
Tyr Gly Asp Arg Asp Tyr Ala Cys Pro Trp Arg Gly Gly Glu Asp Val
450 455 460
Ser Leu Leu Val Glu Tyr Glu Asp Ala Glu Lys Phe Arg Ala Ala Gly
465 470 475 480
Tyr Ala Glu Val Gln Thr Lys Ser Ser Tyr Val Gly Gly Leu Val Arg
485 490 495
Gln Tyr Gly Asn Phe Ser Phe Thr Arg Val Phe Gln Ala Gly His Glu
500 505 510
Val Pro Phe Tyr Gln Pro Glu Thr Ala Tyr Glu Ile Phe Asn Arg Ala
515 520 525
Gln Phe Asn Trp Asp Ile Ala Thr Gly Gly Ile Ser Leu Glu Gln Asn
530 535 540
Gln Ser Tyr Gly Thr Glu Gly Pro Ser Ser Thr Trp His Ile Lys Asn
545 550 555 560
Glu Val Pro Glu Ser Pro Glu Pro Thr Cys Tyr Leu Leu Ala Met Asp
565 570 575
Ser Thr Cys Thr Asp Glu Gln Arg Glu Arg Val Leu Ser Gly Asp Ala
580 585 590
Val Val Arg Asp Trp Val Val Val Asp Asp Ile Glu Ala Glu Ser Ser
595 600 605
Phe Ser Gly Val Gly Asp Gln Leu Ala Gln Val Pro Leu Gly His
610 615 620
<210> 168
<211> 439
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 168
Met Arg Thr Ser Thr Leu Leu Leu Leu Trp Ser Thr Ala Gly Ala Ala
1 5 10 15
Leu Ala Ser Pro Tyr Pro Leu Pro Asp Ser Gln Val Val Phe Ala Ala
20 25 30
Asp His Glu Val Pro Asn Thr Gln Gly Lys His Val Val Asp Glu Ala
35 40 45
Ile Leu Ser Ala Leu Asn Ala His Ser Asp Pro Val Ala Ala Met Val
50 55 60
Ser Leu Arg Pro Glu Thr Ala Ala Phe Leu Ala Glu Pro Arg Leu Leu
65 70 75 80
His Ile Arg Gly Glu Glu Lys Ala Glu Trp Met Thr Glu Gly Asp Lys
85 90 95
Leu Arg Leu Arg Gln Arg Gly Lys Lys Phe Met Asp Ile Thr Glu His
100 105 110
Gln Asp Phe Tyr Ala Glu Gln Ala Met Ala Ser Phe Ala Gly Asp Pro
115 120 125
Asn Leu Pro Lys Leu Ser His Lys Gly Leu Val Lys Pro Leu Phe Ser
130 135 140
Gln Ile Glu Thr Glu Arg Met His Asp Ile Leu Gln His Met Thr Ser
145 150 155 160
Tyr Tyr Asn Arg Tyr Tyr Gly Asp Tyr His Gly Glu Met Ser Ser Glu
165 170 175
Trp Leu His Asp Tyr Ile Ala Ala Ile Ile Ser Lys Ser Pro Phe Arg
180 185 190
Thr His Ile Ser Leu Glu Tyr Phe Thr His Pro Phe Arg Gln Ser Ser
195 200 205
Ile Ile Ala Arg Phe Glu Pro Lys Val Arg Ser Phe Ser Gln Pro Leu
210 215 220
Thr Ile Ile Gly Ala His Gln Asp Ser Ala Asn Tyr Leu Phe Pro Leu
225 230 235 240
Leu Pro Ala Pro Gly Ala Asp Asp Asp Cys Ser Gly Thr Val Ser Ile
245 250 255
Leu Glu Ala Phe Arg Val Leu Ala Glu Asn Gly Tyr Thr Pro Lys Asp
260 265 270
Gly Pro Val Glu Phe His Trp Tyr Ala Ala Glu Glu Ala Gly Leu Leu
275 280 285
Gly Ser Gln Ala Ile Ala Arg Tyr Lys Lys Glu Gln Gly Ala Lys Ile
290 295 300
Asp Ala Met Met Glu Phe Asp Met Thr Ala Phe Ile Ala Arg Asn Ala
305 310 315 320
Thr Glu Thr Ile Gly Phe Val Ala Thr Gln Ala Asp Ala Ala Leu Thr
325 330 335
Asn Trp Ala Leu Asn Leu Ser Arg Glu Tyr Ile Ser Ile Pro Ala Glu
340 345 350
Val Tyr Glu Leu Gly Pro Asn Ala Gly Ser Asp Tyr Met Ser Tyr Thr
355 360 365
Lys Leu Asn Tyr Pro Ala Ala Phe Ala Ser Glu Gly Asn Pro Leu Ala
370 375 380
Gly Gly Ser Phe Pro Gly Glu Met Asp Pro Tyr Val His Gly Ile Lys
385 390 395 400
Asp Arg Met Asp Val Asp Asp Glu Thr Gly Val Phe Ser Ile Glu His
405 410 415
Met Ala Arg Phe Ser Glu Leu Ala Ile Ala Phe Val Val Glu Gln Ala
420 425 430
Gly Trp Asp Asn Thr Trp Arg
435
<210> 169
<211> 526
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 169
Met Arg Ser Phe Ser Val Val Ala Ala Ala Ser Leu Ala Leu Ser Trp
1 5 10 15
Ala Ser Leu Ala Gln Ala Ala Arg Pro Arg Leu Val Pro Lys Pro Ile
20 25 30
Ser Arg Pro Ala Ser Ser Lys Ser Ala Ala Thr Thr Gly Glu Ala Tyr
35 40 45
Phe Glu Gln Leu Leu Asp His His Asn Pro Glu Lys Gly Thr Phe Ser
50 55 60
Gln Arg Tyr Trp Trp Ser Thr Glu Tyr Trp Gly Gly Pro Gly Ser Pro
65 70 75 80
Val Val Leu Phe Asn Pro Gly Glu Val Ser Ala Asp Gly Tyr Glu Gly
85 90 95
Tyr Leu Thr Asn Asp Thr Leu Thr Gly Val Tyr Ala Gln Glu Ile Gln
100 105 110
Gly Ala Val Ile Leu Ile Glu His Arg Tyr Trp Gly Asp Ser Ser Pro
115 120 125
Tyr Glu Val Leu Asn Ala Glu Thr Leu Gln Tyr Leu Thr Leu Asp Gln
130 135 140
Ser Ile Leu Asp Met Thr Tyr Phe Ala Glu Thr Val Lys Leu Gln Phe
145 150 155 160
Asp Asn Ser Ser Arg Ser Asn Ala Gln Asn Ala Pro Trp Val Met Val
165 170 175
Gly Gly Ser Tyr Ser Gly Ala Leu Thr Ala Trp Thr Glu Ser Ile Ala
180 185 190
Pro Gly Thr Phe Trp Ala Tyr His Ala Thr Ser Ala Pro Val Glu Ala
195 200 205
Ile Tyr Asp Phe Trp Gln Tyr Phe Tyr Pro Ile Gln Gln Gly Met Ala
210 215 220
Gln Asn Cys Ser Lys Asp Val Ser Leu Val Ala Glu Tyr Val Asp Lys
225 230 235 240
Ile Gly Lys Asn Gly Thr Ala Lys Glu Gln Gln Glu Leu Lys Glu Leu
245 250 255
Phe Gly Leu Gly Ala Val Glu His Tyr Asp Asp Phe Ala Ala Val Leu
260 265 270
Pro Asn Gly Pro Tyr Leu Trp Gln Asp Asn Asp Phe Val Thr Gly Tyr
275 280 285
Ser Ser Phe Phe Gln Phe Cys Asp Ala Val Glu Gly Val Glu Ala Gly
290 295 300
Ala Ala Val Thr Pro Gly Pro Glu Gly Val Gly Leu Glu Lys Ala Leu
305 310 315 320
Ala Asn Tyr Ala Asn Trp Phe Asn Ser Thr Ile Leu Pro Asn Tyr Cys
325 330 335
Ala Ser Tyr Gly Tyr Trp Thr Asp Glu Trp Ser Val Ala Cys Phe Asp
340 345 350
Ser Tyr Asn Ala Ser Ser Pro Ile Phe Thr Asp Thr Ser Val Gly Asn
355 360 365
Pro Val Asp Arg Gln Trp Glu Trp Phe Leu Cys Asn Glu Pro Phe Phe
370 375 380
Trp Trp Gln Asp Gly Ala Pro Glu Gly Thr Ser Thr Ile Val Pro Arg
385 390 395 400
Leu Val Ser Ala Ser Tyr Trp Gln Arg Gln Cys Pro Leu Tyr Phe Pro
405 410 415
Glu Val Asn Gly Tyr Thr Tyr Gly Ser Ala Lys Gly Lys Asn Ser Ala
420 425 430
Thr Val Asn Ser Trp Thr Gly Gly Trp Asp Met Thr Arg Asn Thr Thr
435 440 445
Arg Leu Ile Trp Thr Asn Gly Gln Tyr Asp Pro Trp Arg Asp Ser Gly
450 455 460
Val Ser Ser Thr Phe Arg Pro Gly Gly Pro Leu Val Ser Thr Ala Asn
465 470 475 480
Glu Pro Val Gln Ile Ile Pro Gly Gly Phe His Cys Ser Asp Leu Tyr
485 490 495
Met Glu Asp Tyr Tyr Ala Asn Glu Gly Val Arg Lys Val Val Asp Asn
500 505 510
Glu Val Lys Gln Ile Lys Glu Trp Val Glu Glu Tyr Tyr Ala
515 520 525
<210> 170
<211> 424
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 170
Met Gln Leu Leu Gln Ser Leu Ile Val Ala Val Cys Phe Ser Tyr Gly
1 5 10 15
Val Leu Ser Leu Pro His Gly Pro Ser Asn Gln His Lys Ala Arg Ser
20 25 30
Phe Lys Val Glu Arg Val Arg Arg Gly Thr Gly Ala Leu His Gly Pro
35 40 45
Ala Ala Leu Arg Lys Ala Tyr Arg Lys Tyr Gly Ile Ala Pro Ser Ser
50 55 60
Phe Asn Ile Asp Leu Ala Asp Phe Lys Pro Ile Thr Thr Thr His Ala
65 70 75 80
Ala Ala Gly Ser Glu Ile Ala Glu Pro Asp Gln Thr Gly Ala Val Ser
85 90 95
Ala Thr Ser Val Glu Asn Asp Ala Glu Phe Val Ser Pro Val Leu Ile
100 105 110
Gly Gly Gln Lys Ile Val Met Thr Phe Asp Thr Gly Ser Ser Asp Phe
115 120 125
Trp Val Phe Asp Thr Asn Leu Asn Glu Thr Leu Thr Gly His Thr Glu
130 135 140
Tyr Asn Pro Ser Asn Ser Ser Thr Phe Lys Lys Met Asp Gly Tyr Thr
145 150 155 160
Phe Asp Val Ser Tyr Gly Asp Asp Ser Tyr Ala Ser Gly Pro Val Gly
165 170 175
Thr Asp Thr Val Asn Ile Gly Gly Ala Ile Val Lys Glu Gln Ala Phe
180 185 190
Gly Val Pro Asp Gln Val Ser Gln Ser Phe Ile Glu Asp Thr Asn Ser
195 200 205
Asn Gly Leu Val Gly Leu Gly Phe Ser Ser Ile Asn Thr Ile Lys Pro
210 215 220
Glu Ala Gln Asp Thr Phe Phe Ala Asn Val Ala Pro Ser Leu Asp Glu
225 230 235 240
Pro Val Met Thr Ala Ser Leu Lys Ala Asp Gly Val Gly Glu Tyr Glu
245 250 255
Phe Gly Thr Ile Asp Lys Asp Lys Tyr Gln Gly Asn Ile Ala Asn Ile
260 265 270
Ser Val Asp Ser Ser Asn Gly Tyr Trp Gln Phe Ser Thr Pro Lys Tyr
275 280 285
Ser Val Ala Asp Gly Glu Leu Lys Asp Ile Gly Ser Leu Asn Thr Ser
290 295 300
Ile Ala Asp Thr Gly Thr Ser Leu Met Leu Leu Asp Glu Asp Val Val
305 310 315 320
Thr Ala Tyr Tyr Ala Gln Val Pro Asn Ser Val Tyr Val Ser Ser Ala
325 330 335
Gly Gly Tyr Ile Tyr Pro Cys Asn Thr Thr Leu Pro Ser Phe Ser Leu
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
Gly Gly Ile Gln Ser Asn Gly Asn Thr Ser Leu Gln Ile Leu Gly Asp
385 390 395 400
Ile Phe Leu Lys Ala Phe Phe Val Val Phe Asp Met Arg Gly Pro Ser
405 410 415
Leu Gly Val Ala Ser Pro Lys Asn
420
<210> 171
<211> 548
<212> PRT
<213> Aspergillus niger
<400> 171
Met Arg Ile Asp Ser Ala Ala Leu His Leu Val Pro Val Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gln Val Gly Ala Leu Gln Leu Pro Leu Val Gln Asp Ser Asn Ser Gln
20 25 30
Trp Gln Lys Pro Asn Ala Gly Asp Lys Pro Leu Ile Ser Ser Pro Leu
35 40 45
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50 55 60
Leu Tyr Lys Ile Ala Glu Leu Gly Glu Asp Glu Tyr Asn His Pro Thr
65 70 75 80
Arg Val Ile Gly Ser Lys Gly His Leu Gly Thr Leu Asp Tyr Ile Tyr
85 90 95
Ser Thr Leu Thr Asp Leu Gly Asp Tyr Tyr Thr Val Val Asn Gln Ser
100 105 110
Phe Pro Ala Val Ser Gly Asn Val Phe Glu Ser Arg Leu Val Leu Gly
115 120 125
His Asp Val Pro Lys Ser Ala Thr Pro Met Gly Leu Thr Pro Pro Thr
130 135 140
Arg Asn Lys Glu Pro Val Tyr Gly Ser Leu Val Ala Val Ser Asn Leu
145 150 155 160
Gly Cys Glu Ala Ser Asp Tyr Ser Ser Asn Leu Lys Gly Ala Val Ala
165 170 175
Phe Ile Ser Arg Gly Ser Cys Pro Phe Gly Thr Lys Ser Gln Leu Ala
180 185 190
Gly Lys Ala Gly Ala Val Ala Ala Val Ile Tyr Asn Asn Glu Arg Gly
195 200 205
Asp Leu Ser Gly Thr Leu Gly Asn Pro Thr Pro Asp His Val Ala Thr
210 215 220
Phe Gly Ile Ser Asp Glu Asp Ala Ala Pro Val Leu Glu Lys Leu Asn
225 230 235 240
Lys Gly Glu Lys Val Asp Ala Ile Ala Tyr Val Asp Ala Ile Val Glu
245 250 255
Thr Ile His Thr Thr Asn Ile Ile Ala Gln Thr Thr Asp Gly Asp Pro
260 265 270
Asn Asn Cys Val Met Leu Gly Gly His Ser Asp Ser Val Ala Glu Gly
275 280 285
Pro Gly Ile Asn Asp Asp Gly Ser Gly Thr Leu Thr Leu Leu Glu Leu
290 295 300
Ala Thr Leu Leu Thr Gln Phe Arg Val Asn Asn Cys Val Arg Phe Ala
305 310 315 320
Trp Trp Ala Ala Glu Glu Glu Gly Leu Leu Gly Ser Asp Tyr Tyr Val
325 330 335
Ser Val Leu Thr Pro Glu Glu Asn Arg Lys Ile Arg Leu Phe Met Asp
340 345 350
Tyr Asp Met Leu Gly Ser Pro Asn Phe Ala Tyr Gln Val Tyr Asn Ala
355 360 365
Thr Asn Ala Val Asn Pro Glu Gly Ser Glu Glu Leu Arg Asp Leu Tyr
370 375 380
Thr Asp Phe Tyr Glu Asp His Gly Phe Asn Tyr Thr Tyr Ile Pro Phe
385 390 395 400
Asp Gly Arg Ser Asp Tyr Asp Ala Phe Ile Arg His Gly Ile Pro Gly
405 410 415
Gly Gly Ile Ala Thr Gly Ala Glu Gly Ile Lys Thr Val Glu Glu Ala
420 425 430
Asp Met Phe Gly Gly Val Ala Gly Gln Trp Tyr Asp Pro Cys Tyr His
435 440 445
Gln Ile Cys Asp Thr Val Ala Asn Val Asn Leu Thr Ala Trp Glu Trp
450 455 460
Asn Thr Lys Leu Val Ala His Ser Ile Ala Thr Tyr Ala Lys Ser Phe
465 470 475 480
Asp Gly Phe Pro Glu Arg Ser Asp Glu Pro Ile Ser Pro Ala Ala Phe
485 490 495
Glu Glu Pro Lys Tyr His Gly His Ala Leu Gln Leu Leu Arg Gly Asn
500 505 510
Thr Thr Gly Thr Gln Ser Val Leu Trp Gly Ala Gln Ile Gln Asn Gly
515 520 525
Thr Ala Ala Ser Val Leu Asn Leu Leu Ser Ile Arg Arg Arg Gly Thr
530 535 540
Phe Ser Leu Ser
545
Claims (28)
- SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 69의 서열에 따른 분리된 폴리뉴클레오티드.
- 삭제
- 제 1 항에 있어서,사상 진균류로부터 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
- 제 3 항에 있어서,Aspergillus niger로부터 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
- SEQ ID NO: 126의 서열에 따른 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
- 제 9 항에 있어서,SEQ ID NO: 12 또는 SEQ ID NO: 69의 폴리뉴클레오티드 서열이 적합한 숙주 세포에서 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 조절 서열과 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 10 항에 있어서,적합한 숙주 세포가 사상 진균류인 것을 특징으로 하는 벡터.
- 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드의 제조 방법으로서, 상기 폴리뉴클레오티드로 형질전환(transformation)된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 숙주 세포로부터 상기 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함하는 제조 방법.
- SEQ ID NO: 126의 서열에 따른 분리된 폴리펩티드.
- 제 13 항에 있어서,Aspergillus niger로부터 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
- 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 Aspergillus niger와 같은 적절한 숙주 세포에서 발현시킴으로써 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
- 삭제
- 제 13 항 또는 제 14 항에 따른 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 적합한 숙주 세포를 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드로 형질전환하는 단계, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하는 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계, 및 상기 세포 또는 배양 배지로부터 암호화된 폴리펩티드를 선택적으로 정제하는 단계를 포함하는 제조 방법.
- 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 숙주 세포.
- 제 13 항 또는 제 14 항에 따른 폴리펩티드를 발현하는 재조합 숙주 세포.
- 삭제
- 삭제
- 제 18 항에 있어서,숙주 세포가 Aspergillus niger와 같은 Aspergillus 종으로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 재조합 숙주 세포.
- (a) 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오티드를 시험관내 돌연변이 유발시키는 단계,(b) 단계 (a)에서 얻은 돌연변이 유발된 폴리뉴클레오티드에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 내재성 유전자를 포함하는 숙주 세포를 형질전환하는 단계, 및(c) 상기 내재성 유전자가 단계 (a)에서 얻은 돌연변이 유발된 폴리뉴클레오티드로 교체된 재조합 숙주 세포를 선별하고 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있는, 기능적으로 프로테아제가 결핍된 재조합 숙주 세포.
- 제 13 항 또는 제 14 항에 따른 폴리펩티드와 반응하는 정제된 항체.
- 제 13 항 또는 제 14 항에 따른 폴리펩티드의 서열을 포함하는 융합 단백질.
- 삭제
- 삭제
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Patent Citations (1)
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