NO315379B1 - Isolert DNA-molekyl, hybridvektor, Aspergillus niger-stamme, Aspergillus niger-serin protease, fremgangsmåte for fremstilling av et önsketpolypeptid samtvert transformert med en hybrid ekspresjonvektor - Google Patents

Isolert DNA-molekyl, hybridvektor, Aspergillus niger-stamme, Aspergillus niger-serin protease, fremgangsmåte for fremstilling av et önsketpolypeptid samtvert transformert med en hybrid ekspresjonvektor Download PDF

Info

Publication number
NO315379B1
NO315379B1 NO19931368A NO931368A NO315379B1 NO 315379 B1 NO315379 B1 NO 315379B1 NO 19931368 A NO19931368 A NO 19931368A NO 931368 A NO931368 A NO 931368A NO 315379 B1 NO315379 B1 NO 315379B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
dna
aspergillus
ala
gene
ser
Prior art date
Application number
NO19931368A
Other languages
English (en)
Other versions
NO931368L (no
NO931368D0 (no
Inventor
Frank Buxton
Albert Hinnen
Jacob Visser
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB939305097A external-priority patent/GB9305097D0/en
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of NO931368D0 publication Critical patent/NO931368D0/no
Publication of NO931368L publication Critical patent/NO931368L/no
Publication of NO315379B1 publication Critical patent/NO315379B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/62—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi

Description

NY SOPPRQTEASE
Foreliggende oppfinnelse vedrører isolert DNA-molekyl, hybridvektor, Aspergillus «iger-stamme, Aspergillus niger-serin protease, fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket polypeptid samt vert transformert med en hybrid ekspresjonsvektor.
OPPFINNELSENS BAKGRUNN
Aspergillus- arter, og spesielt Aspergillus niger, er nyttige for industriell produksjon av enzymer anvendt i industrien for matbearbeidelse. A. niger er fordelaktig som vert for produksjon av rekombinante proteiner på grunn av dets kapasitet for utskillelse av proteiner og på grunn av at systemene er tilgjengelige for molekylær genetisk manipule-ring. Tilstedeværelse av proteaser i væskekulturen har imidlertid vist seg å være ødeleg-gende for ekspresjonen av heterologe proteiner i A. niger og Aspergilli bur til og med anvendt kommersielt for å produsere protease. Et antall ekstracellulære proteaser fra Aspergilli er blitt beskrevet i litteraturen [Barthomeuf et al., Biotech. Tech. 2: 29-34
(1988); Barthomeuf et al., Chem. Pharm Bull. (Tokyo) 37:1333-1336 (1989); Bosmann, H.B., Biochim. Biophys. Acta 293:476-489(1973); Ichishima, E., Biochim. Biophys. Acta 258:274-288(1972); Chopra, S., ogMehta, P., Folia Microbiol. 30:117-125(1985); Krishnan og Vijayalakshimi, J. Chromatogr. 329:165-170(1985)]. Genet pepA kodende for aspergillopepsin A fra Aspergillus owamori er nylig blitt klonet [Berka et al., Gene 86:153-162(1990)]. pepA-genproduktet står for en hoveddel av den utskilte sure proteasen til A. niger og stammene hvori pepA-genet er blitt deletert har muliggjort øket ekspresjon av heterologe proteiner i A. niger var. owamori [Dunn-Coleman et al., Biotechnology 9:976-981(1991)]. Andre protease-gener er også nylig blitt klonet fra Aspergili og disse innbefatter en alkalisk serin protease fra A oryzae [Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 219:33-38(1989)], en alkalisk serin protease fra A. fumigatus [Jaton-Ogay et al., FEMS Microbiol Letts 92:163-168 (1992)], en ikke-pepsin type sur protease fra .4. niger vai. macrosporus [Inoue et al., J. Biol. Chem. 266:19484-89(1991)] og en metalloprotease betegnet nøytral protease II fra A. oryzae [Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 228:97-103(1991)].
Isolerte og muterte proteasegener fra A niger kan anvendes for gene disruption-eksperi-menter, dvs. preparering av mutantstammer hvor det tilsvarende naturlige genet blir ødelagt. For eksempel er pepA-genet fra Aspergillus owamori blitt ødelagt ved gene disruption for å preparere aspergillo- pepsin A-manglende stammer (Berka et al., op. eit.).
Som nevnt ovenfor produserer Aspergilli et stort antall forskjellige proteaser og det er derfor et konstant behov for Aspergillus- stammer som mangler andre proteaser for industriell produksjon av proteiner. På grunn av dette er det også et behov for andre protease gener som kan anvendes for preparering av proteasemanglende stammer ved in vitro mutagenese, for eksempel gene disruption. Det er derimot også et behov for rekombinante proteaseproteiner som kan bli industrielt anvendt for proteinbearbeidning.
En annen hovedbestanddel av de utskilte protease-aktivitetene i A. niger er serin proteaser [Sakka et al., J. Ferment. Technol. 63:479-483(1985)]. Serin proteaser fra sopp er blitt omfattende karakterisert i muggen T. album, og i gjæren Saccharomyces cerevisiae. T. album utskiller sannsynligvis tre beslektede serin proteaser og den best karakteriserte er protease K [Jany et al., FEBS 199:139-144(1986)], mens et homologt protein i gjær er lokalisert i vakuolen [Wolf og Ehmann, Eur. J. Biochem. 98:375-384
(1979)]. Genene for alle disse T. album og S. cerevisiae proteinene er blitt klonet og karakterisert [Gunkel og Gassen, Eur. J. Biochem. 179:185-194(1989), Samal et al.,
Gene 85:329-333(1989), Samal et al., Molec. Microbiol 4:1789-1792(1990), og Moehle et al., Molec. Cell. Biol. 7:4390-99(1987)]. Alkaliske serin proteaser er også blitt klonet og karakterisert i A. oryzae, i A. fumigatus og i Achremonium chrysogenum [Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 219:33-38 (1989); Jaton-Ogay et al., FEMS Microbiol. Letts. 92:163-168 (1992); Isogai et al., Agric Biol. Chem. 55:471-477 (1991)].
Det er nå oppdaget at Aspergillus også produserer serin proteaser som er homologe med subtilisinfamilien av proteaser. Foreliggende oppfinnelse fokuserer på denne typen av protease.
OPPFINNELSENS HENSIKT
En hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe et DNA-molekyl kodende for en Aspergillus niger serin protease valgt fra gruppen bestående av serin proteasene med aminosyre sekvensene SEQ. ID nr. 2 og nr. 7.
En annen hensikt er å tilveiebringe rekombinant Aspergillus niger serin protease av subtilisin type og for denne hensikten også en transformert Aspergillus niger stamme for produksjon derav.
En annen hensikt er å tilveiebringe en Aspergillus- stamme som er defekt i pep C-og/eller pep D-genene hvor stammen kan bli anvendt for en mer effektiv produksjon av heterologe proteiner.
OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN
Foreliggende oppfinnelse vedrører en Aspergillus niger serin protease bestående av
pepC og pepD. En slik protease er betegnet " Aspergillus -subtilisin". En " Aspergillus - subtilisin" ifølge foreliggende oppfinnelse forstås som (a) avledet fra Aspergillus spee., (b) med protease aktivitet forårsaket av et katalytisk serin residie ved det aktive setet og (c) med tilstrekkelig aminosyrehomologi med kjente serin proteaser for å bli gruppert inn i subtilisin familien. Innbefattet i betydningen av betegnelsen Aspergillus -subtilisin som anvendt i foreliggende oppfinnelse er også fragmenter av et slikt enzym som har serin protease aktivitet, men enzymer med full lengde er foretrukne fonner. Også fu-sjonsproteiner inneholdende en " Aspergillus -subtilisin" ifølge oppfinnelsen koblet til ytterligere aminosyrer, peptider eller proteiner er del av foreliggende oppfinnelse.
I en foretrukket betydning beskriver Aspergillus -substilisin en protease eller et aktivt fragment avledet fra Aspergillus niger, fortrinnsvis en protease eller et aktivt fragment med aminosyresekvensen eller del av sekvensen vist under SEQ ID NO. 1 og 6.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også en isolert DNA-sekvens kodende for en Aspergillus niger serin protease valgt fra gruppen med aminosyre sekvensene SEQ. ID nr. 2 og 7, en hybrid vektor for kloning og formering av en slik DNA-sekvens. Oppfinnelsen omfatter videre en ekspresjons hybrid vektor for produksjon av en Aspergillus niger serin protease omfattende en slik DNA-sekvens funksjonelt koblet med regulatoriske regioner egnede for ekspresjon av et Aspergillus niger gen i en egnet vertscelle. Oppfinnelsen omfatter også transformerte vertsceller med evne til uttrykking av Aspergillus niger subtilisin, for eksempel en Aspergillus niger stamme som kan overuttrykke Aspergillus niger subtilisin på grunn av et økt kopiantall av genet etter transformasjon.
Oppfinnelsen vedrører også en Aspergillus niger stamme som mangler et pepC og/eller pepD gen fremstilt ved hjelp av en DNA-sekvens kodende for Aspergillus niger subtilisin som ikke lenger kan uttrykke funksjonelt protein på grunn av mutagenese, for eksempel "gene disruption".
DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN
DNA kodende for Asperzillus - subtilisin. hvbridvektorer for kloning og ekspresjon.
Foreliggende oppfinnelse vedrører et DNA molekyl omfattende en DNA-sekvens valgt fra gruppen Aspergillus niger serin protease med aminosyre sekvensene SEQ ID 2 og 7. DNA-sekvensen kan inneholde en eller flere introner og DNA molekyler som er isoler-bare fra et genomisk DNA bibliotek, for eksempel som pepC genet vist i SEQ ED NO. 1 eller pepD genet vist i SEQ ID NO. 6. Det kan også tenkes en intron-manglende variant av DNA-sekvensen som for eksempel er isolerbar ved cDNA kloning eller etter mutagenese for eksempel ved anvendelse av PCR teknologi. Slike intron-løse gener er spesielt nyttig for ekspresjon i ikke- Aspergillus verter, fortrinnsvis i prokaryoter eller gjær.
Oppfinnelsen vedrører fortrinnsvis et DNA molekyl omfattende en DNA-sekvens kodende for A. niger PEPC med aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO. 1 eller et fragment derav som har beholdt serin protease aktiviteten. En DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis den kodende regionen for moden PEPC protease vist i nukleotid sekvensen med SEQ ID NO. 1. Oppfinnelsen vedrører også degenererte DNA-sekvenser kodende for PEPC eller et fragment derav, dvs. sekvenser hvor nukleotider er erstattet uten å forandre den kodede aminosyresekvensen. Slike DNA-sekvenser er for eksempel nyttige på grunn av forskjeller i den foretrukne kodonbruken i forskjellige verter eller på grunn av tilstedeværelse av nye gjenkjenningsseter for restriksjonsenzymer.
En annen foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er DNA molekylet omfattende en DNA-sekvens kodende for A. niger PEPD som har aminosyresekvensen vist i SEQ ID NO. 6 eller et fragment derav som har beholdt serinprotease aktiviteten. En annen foretrukket DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen er derfor også den kodende regionen for moden PEPD protease vist i nukleotidsekvensen med SEQ ID NO. 6. Oppfinnelsen ved-rører derimot også degenererte DNA-sekvenser kodende for PEPD eller et fragment derav, dvs. sekvenser der nukleotider er erstattet uten forandring av den kodede aminosyresekvensen.
Således er det tilveiebragt et isolert DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter en DNA-sekvens kodende for en Aspergillus niger serin protease valgt fra gruppen bestående av serin proteaser med aminosyresekvenser vist i henholdsvis SEQ ID NO. 2 og 7.
Dessuten tilveiebringes et DNA-molekyl ifølge det ovenstående kjennetegnet ved at det omfatter en DNA-sekvens valgt fra gruppen bestående av den pepC kodende regionen vist i SEQ ID NO. 1 og den pepD kodende regionen vist i SEQ ID NO. 6.
Oppfinnelsen vedrører også en hybridvektor omfattende en insersjon av en DNA-sekvens som koder for et Aspergillus n/ger-subtilisin ifølge oppfinnelsen. En slik hybridvektor ifølge oppfinnelsen er nyttig for propagering og formering av sn DNA-sekvens ifølge oppfinnelsen. En slik ekspresjonsvektor omfatter en "ekspresjonskassett" hvor en DNA-sekvens som koder for et Aspergillus wger-subtilisin er funksjonelt koblet med regulatoriske regioner egnede for kontroll av ekspresjonen av en slik DNA-sekvens i en ønsket vertscelle.
En hybridvektor ifølge oppfinnelsen, inkludert en ekspresjonsvektor, kan bli avledet fra en hvilken som helst vektor nyttig innenfor genetisk teknikk, så som fra virus, fag, kos-mider, plasmider eller kromosomalt DNA, så som derivater av SV40, herpes-virus, pa-pillomavirus, retrovirus, baculovirus, Xfag, for eksempel NM 989 eller EMBL4, eller Ml3- fag, for eksempel M13mp8, bakterielle plasmider, for eksempel pBR322, pUCl 8, eller gjærplasmider, for eksempel gjær 2u plasmid, eller et defekt virus, fag eller plasmid i nærvær av et hjelpervirus, fag eller plasmid som muliggjør replikasjon av nevnte defekte virus, fag eller plasmid, for eksempel M13(+)KS vektor i nærvær av for eksempel M14K07 hjelperfag, og også kromosomalt DNA, avledet for eksempel fra filamen-tøs sopp så som Aspergillus spee., for eksempel A. niger, for eksempel de som er tilveiebragt ifølge EP 184 438. Foretrukket er vektorer for S. cerevisiae eller filamentøs sopp, mer foretrukket Aspergillus spee. av fortrinnsvis A. niger.
En hybridvektor ifølge oppfinnelsen, inkludert en ekspresjonsvektor, tilveiebringer replikasjon av et ønsket DNA i en egnet vert, enten som et ekstrakromosomalt element eller ved integrering i vertskromosomet. Flere mulige vektorsystemer er tilgjengelige for integrasjon og ekspresjon av det klonede DNA ifølge oppfinnelsen. I prinsippet er alle vektorer som replikerer og blir stabilt opprettholdt i den valgte verten egnet. Vektoren blir derfor valgt avhengig av vertscellene som betraktes for transformasjon. Slike vertsceller kan generelt være prokaryote eller eukaryote mikroorganismer så som bakterier, sopp så som gjær, fortrinnsvis S. cerevisiae, eller som filamentøse sopp, fortrinnsvis Aspergillus spee, mer foretrukket er A. niger eller celler av høyere eukaryotisk opprinnelse så som vertebrat, for eksempel pattedyrceller. Egnede vertsceller vil bli disku-tert i detalj nedenfor. En hybridvektor ifølge oppfinnelsen, inkludert en ekspresjonsvektor, som blir opprettholdt som ekstrakromosomalt element omfatter et replikasjons origo (ori) eller en autonomt replikerende sekvens (ARS), selekterbare markørsekvenser og, eventuelt, ytterligere restriksjonsseter. En vektor som er ment for integrasjon inn i et vertskromosom behøver ikke å omfatte en ori eller ARS på grunn av at den blir replikert i cellen sammen med kromosomet.
Et replikasjonsorigo eller en autonomt replikerende sekvens (et DNA element som gir autonomt replikerende evner til de ekstrakromosomale elementene) blir gitt enten ved konstruksjon av en vektor inkludert et eksogent origo så som avledet fra Simian virus (SV 40) eller en annen viral kilde, eller ved vertens cellekromosomale mekanisme.
En hybridvektor ifølge oppfinnelsen, inkludert en ekspresjonsvektor, kan også inneholde selektive markører avhengig av verten som skal bli transformert, selektert og klonet. Et hvilket som helst markørgen som letter seleksjon av transformanter på grunn av den fenotypiske ekspresjonen til markøren kan anvendes. Egnede markører er spesielt de som uttrykker antibiotikaresistens, for eksempel overfor tetrasyklin eller ampicillin, eller, når det gjelder auxotrofe soppmutanter, gener som komplementerer lesjoner i verten. Tilsvarende gener utviser for eksempel resistens overfor antibiotikumet cykloheksi-mid, eller tilveiebringer prototrofi i en auxotrof vert, fortrinnsvis S. cerevisiae, mutant, for eksempel ura3, leu2, his3 eller trpl genet. Det er også mulig å anvende som markø-rer strukturelle gener som er assosiert med et autonomt replikerende segment forutsatt at verten som skal bli transformert er auxotrof for produktet uttrykt av markøren.
Av spesiell viktighet når det gjelder hybride vektorer, spesielt ekspresjonsvektorer, for A. niger er markørgener som komplementerer A. niger vertslesjoner, så som argB genet kodende for ornithin karbamoyl transferase, for eksempel avledet fra A. niger eller A. nidulans (EP 184 438), eller A. nidulans DNA fragmenter som er homologe med N. crassa pyr4 genet. Andre egnede markørgener er beskrevet nedenfor i sammenheng med beskrivelsen av transformerte verter ifølge oppfinnelsen.
En hybridvektor ifølge oppfinnelsen egnet for formering av DNA kodende for Aspergillus -subtilisin i E. coli er for eksempel plasmid pTZPEPC eller pTZPEPD beskrevet nedenfor i de vedlagte eksemplene.
Betegnelsen "ekspresjonskassett" i sammenheng med en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen betyr en DNA-sekvens som kan uttrykke Aspergillus -subtilisin og omfatter en promoter som er operabelt koblet til en Aspergillus -subtilisin kodende region og eventuelt en eller flere ytterligere regulatoriske elementer fra gruppen bestående av en signalsekvens, en transkripsjonen terminator, en transkripsjonen forsterker, et ribosomalt bindingssete, en sekvens for effektiv RNS prosessering, en sekvens kodende for effektiv proteinprosessering og en sekvens kodende for korrekt proteinlokalisering. I en ekspresjonskassett ifølge foreliggende oppfinnelse kan en i4j/?erg/7/tt.r-subtilisin-kodende region bli kombinert med homologe regulatoriske elementer, dvs. slike som er naturlig koblet dertil, eller med esterologe regulatoriske elementer, dvs. som er avledet fra andre gener.
Mange forskjellige promotersekvenser kan bli anvendt avhengig av naturen til vertscellen. Promotere som er sterke og på samme tid godt regulerte er de mest nyttige.
Eksempler på promotere er prokaryotisk X.Pl, XPr, E. coli lac, trp eller tac promotere.
Promotere egnede foT ekspresjon i gjær, fortrinnsvis S. cerevisiae, er TRP1-, ADHI-, ADHII-, PH03-, PH05-, GAL10-, eller glykolytiske promotere så som promoteren til enolase, glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase, 3-fosfoglyceratkinase (PGK), hekso-kinase, pyruvat dekarboksylase, fosfofruktokinase. glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfo-glyceratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglucoseisomerase og gluko-kinasegener eller PH05-GAPDH hybrid promoteren (EP søknad nr. EP-A-213 593). Andre eksempler på eukaryote promotere er promotere avledet fra eukaryote viruser, for eksempel SV40, Rous sarcoma virus, adenovirus 2, bovint papilloma virus, papovavi-rus, cytomegalovirus avledede promotere eller pattedyr celleavledede promotere, for eksempel fra aktin, collagen, myosin eller Ø-globin genet. De eukaryote promoterae kan også kombineres med forsterkende sekvenser så som gjær, fortrinnsvis S. cerevisiae, oppstrøms akti verende sekvenser (UAS) eller virale eller cellulære forsterkere så som cytomegalovirus IE forsterkere, SV40 forsterker, immunoglobulin genforsterker eller andre.
Forsterkere er transkripsjons-stimulerende DNA-sekvenser, for eksempel avledet fra viruser så som Simian virus, polyoma virus, bovint papilloma virus eller Moloney sarcoma virus eller med genomisk opprinnelse. En enhancer sekvens kan også bli avledet fra ekstrakromosomalt ribosomal DNA fra Physarum polycephalkum (PCT/EP 8500278). Egnede forsterkere er også for eksempel oppstrøms aktiveringsseter avledet fra sur fosfatase PH05 genet fra gjær.
Signalsekvenser kan for eksempel være en forsekvens eller sekretorisk leder som leder sekresjonen av polypeptidet eller lignende. En signalsekvens er for eksempel et signal eller lederpeptid fra Aspergillus -subtilisin, for eksempel signalsekvensen vist i SEQ ID NO. 1. Ytterligere signalsekvenser er kjent fra litteraturen, for eksempel de beskrevet i von Heijne, G., Nucleic Acids Res. 14,4683 (1986).
Sekvenser som er nødvendige for initiering og terminering av transkripsjonen og for stabilisering av mRNA er tilgjengelig fra de ikke-kodende 5'-regionene og 3-regionene til viralt eller eukaryotisk cDNA, for eksempel fra ekspresjons verten.
I en utførelsesform ifølge oppfinnelsen er en ekspresjonsvektor innbefattende en intron-manglende, kodende region bestående av to eksoner av den kodende regionen vist i SEQ ID NO. 1 eller av de fire eksonene til den kodende regionen vist i SEQ ID. NO. 6 for ekspresjon av Aspargillus- subtilisin i prokaryoter, for eksempel i E. coli, eller fortrinnsvis i gjær, mer foretrukket i S. serevisiae under kontroll GAL10 promoteren, for eksempel som i plasmid, pFBY138.
Oppfinnelsen vedrører fortrinnsvis en ekspresjonsvektor egnet for ekspresjon av en DNA-sekvens kodende for ey Aspergillus -subtilisin i er Aspergillus- vert.
En type ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen omfatter en DNA-sekvens som koder for et Aspergillus -subtilisin, fortrinnsvis A. niger, under kontroll av en promoter som er naturlig koblet med nevnte DNA-sekvens, dvs. dets homologe promoter. Mer foretrukket er en ekspresjonsvektor omfattende en DNA-sekvens kodende for PEPC ifølge SEQ ID NO. 1, fortrinnsvis DNA-sekvensen vist i SEQ ID. NO. 1, under kontroll av promoterregionen vist i SEQ ID. NO. 1 eller en ekspresjonsvektor omfattende en DNA-sekvens kodende for PEPD ifølge SEQ ED. NO. 6, fortrinnsvis DNA-sekvensen vist i SEQ ID No. 6, under kontroll av promoterregionen vist i SEQ ED NO. 6. PEPC kodende region vist i SEQ ED NO. 1 kan derimot også bli uttrykt under kontroll av PEPD promoteren vist i SEQ ID NO. 6 og vice versa.
Aspergillus -subtilisin blir fortrinnsvis skylt ut i mediet. Dette kan oppnås ved anvendelse av en signalsekvens som er funksjonelt koblet med det strukturelle genet, fortrinnsvis signalsekvensen som er naturlig koblet til Aspergillus -subtilisin strukturelle genet, for eksempel, som i plasmid pTZPEPC omfattende PEPC signalsekvensen og den kodende regionen vist i SEQ ID NO. 1 eller som i plasmid pTZPEPD omfattende PEPD signalsekvensen og den kodende regionen vist i SEQ ID NO. 6.
Dersom en slik ekspresjonsvektor blir anvendt for ekspresjon av Aspergillus -subtilisin i en vertsstamme fra arten Aspergillus -subtilisin genet opprinnelig er avledet fra, blir Aspergillus -subtilisin overuttrykt på grunn av at både det rekombinante og opprinnelige Aspergillus -subtilisin-genet er aktive under de samme ekspresjonsbetingelsene.
En annen type ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen omfatter en DNA-sekvens som koder for Aspergillus -subtilisin under kontroll av en promoter funksjonell i Aspergillus som ikke er naturlig koblet til nevnte DNA-sekvens. En promoter egnet for ekspresjon av Aspergillus -subtilisin i Aspergillus spee., spesielt i A. niger, er for eksempel en promoter av et Aspergillus spee. pectin lyase gen, fortrinnsvis promotoren til A. niger PLI (se EP-A-0 278 355),. PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF (se EP-A-0 353 188) genet, en promoter av et Aspargillus spee. polygalakturonasegen, fortrinnsvis promoteren til A. niger PGI eller PGEI gen (se EP søknad EP-A-421919), en promoter av et Aspargillus spee. pyruvat kinasegen, fortrinnsvis promoteren til A. niger pki genet (EP-søknad EP-A-439997), eller også en promoter av et Aspergillus -subtilisin-gen ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis en promoter av et Aspergillus -subtilisin gen vist i SEQ ID NO. 1 eller 6. Sekresjon av Aspergillus -subtilisin kan også i dette tilfellet bli oppnådd ved anvendelse av en signalsekvens som er funksjonelt koblet med det strukturelle genet, for eksempel signalsekvensen som er naturlig koblet til det strukturelle genet for Aspergillus -subtilisin, for eksempel når det gjelder PEPC signalsekvensen vist i SEQ ID NO. 1. En signalsekvens som er heterolog med Aspergillus -subtilisin kan imidlertid også anvendes, for eksempel en signalsekvens til Aspergillus spee. pektin lyase gen, fortrinnsvis signalsekvensen til A. niger PLI (se EP-A-0 278 355), PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF (se EP-A-0 353 188) gen, eller en signalsekvens til oi Aspergillus spee. polygalakturonase gen, fortrinnsvis signalsekvensen til A. niger PGI eller PGII gen (se EP-søknad EP-A-421919).
1 en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen, for eksempel i plasmid pPKIPEPCA, er pyruvatkinase promoteren til A. niger funksjonelt koblet med den kodende regionen vist i SEQ ID NO. 1, kodende for Aspergillus -subtilisin koblet til dets homologe signalsekvens.
I en annen foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen, for eksempel i plasmid pPKIPEPDA, er pyruvatkinase promoteren til A. niger funksjonelt koblet til den kodende regionen vist i SEQ ID NO. 6, kodende for Aspergillus -subtilisin koblet til dets homologe signalsekvens.
Således er det tilveiebragt en hybrid vektor kjennetegnet ved at den omfatter et DNA-molekyl som angitt ovenfor.
Fremgangsmåte for fremstilling av et Aspergillus - subtilisin gen.
En fremgangsmåte for fremstilling av et DNA molekyl ifølge oppfinnelsen, dvs. som koder for en Aspergillus -subtilisin ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis kodende for en foretrukket form av et Aspergillus mger-subtilisin ifølge oppfinnelsen, eller for fremstilling av en hybridvektor omfattende et slikt DNA molekyl, omfatter dyrking av en vert transformert med et nevnt DNA molekyl eller en hybridvektor ifølge oppfinnelsen. Det kan også tenkes at et DNA molekyl ifølge oppfinnelsen blir fremstilt ved kjemisk syntese ved nukleotid kondensasjon.
Dyrking av vertene blir utført i et konvensjonelt næringsmedium som kan suppleres med eller tappes for kjemiske forbindelser som muliggjør negativ eller positiv seleksjon av transformantene, dvs. slike verter som inneholder det ønskede DNA molekylet sammen med en seleksjonsmarkør, fra ikke-transformanter, dvs. slike verter som mangler det ønskede DNA molekylet.
Hvilke som helst transformerbare verter nyttige innenfor fagområdet kan anvendes, for eksempel bakterier, så som E. coli, sopp, så som Saccharomyces cerevisiae, Kluyvero-myces lactis, høyere eukaryote celler så som insektceller eller pattedyrceller, for eksempel CHO celler, eller spesielt filamentøse sopp, så som Aspergillus , for eksempel A. nidulans. A. oryzae, A. karbonarius, A. owamori og spesielt A. niger. Transformasjon av vertene blir utført ved konvensjonelle metoder.
En DNA-sekvens som koder for Aspergillus -subtilisin kan bli oppnådd fra genomet til en Aspargillus- stamme som kan uttrykke Aspergillus -subtilisin, eller kan bli fremstilt, for eksempel, ved dyrking av en vert som blir transformert med et rekombinant DNA-molekyl omfattende en DNA-sekvens kodende for en Aspergillus -subtilisin og, når nødvendig, isolering av den ønskede DNA-sekvensen derifra.
Et slikt DNA kan spesielt bli fremstilt ved en fremgangsmåte omfattende et trinn valgt fra a) isolering av genomisk DNA fra egnede Aspergillus celler, og selektering av ønsket DNA, for eksempel ved anvendelse av en DNA probe eller ved anvendelse av et egnet
ekspresjonssystem og screening for ekspresjon av ønsket polypeptid,
b) isolering av mRNA fra egnede Aspergillus celler, selektering av ønsket mRNA, for eksempel ved hybridisering med en DNA probe eller ved ekspresjon i et egnet ekspresjonssystem og screening for ekspresjon av ønsket polypeptid, preparering av enkeltrådet cDNA komplementær til det mRNA, deretter dobbeltrådet cDNA derifra, c) isolering av cDNA fra et cDNA bibliotek og selektering av ønsket cDNA, for eksempel ved anvendelse av en DNA probe eller ved anvendelse av et egnet ekspresjonssystem og screening for ekspresjon av det ønskede polypeptidet. d) Syntetisering av dobbeltrådet DNA in vitro ved PCR teknologi fra total Aspergillus DNA ved anvendelse av oligonukleotid primer konstruert fra genet kodende for A. niger
pepC eller A. niger pepD eller andre kjente serin proteaser av subtilisintypen eller
e) inkorporering av et dobbeltrådet DNA oppnåelig ifølge trinn a), b), c) eller d) inn i en hensiktsmessig vektor, transformering av en egnet vert, formering av verten og isolering
av DNA.
Genomisk DNA kan isoleres og screenes for ønsket DNA (trinn a). Genomisk DNA blir isolert fra en Aspergillus stamme som kan uttrykke en Aspergillus -subtilisin. Et genomisk DNA bibliotek blir preparert derifra ved spaltning med egnede restriksjonsendonukleaser og inkorporering inn i egnede vektorer ifølge etablerte prosedyrer. Det genomiske DNA biblioteket blir screenet med en DNA probe som beskrevet nedenfor eller uttrykt i et egnet ekspresjonssystem og de oppnådde polypeptidene blir screenet på konvensjonell måte.
Et genomisk bibliotek kan fremstilles for eksempel ved delvis spaltning av genomisk DNA til en A. niger stamme, for eksempel NW756 eller N400, med for eksempel Sau3AI eller Mbol og kloning av DNA fragmentene med høy molekylvekt i en egnet vertsvektor, for eksempel E. coli plasmid pUN121 eller en lambdavektor, for eksempel
EMBLA
Andre soppstammer som produserer en ønsket Aspergillus -subtilisin, for eksempel A. japonicus, A. oryzae, A. nidulans, A. niger kan være en kilde for det genomiske biblioteket og andre egnede vektorer, for eksempel de som er nevnt nedenfor, kan bli anvendt som mottagere for fragmentene.
For å screene det genomiske biblioteket for DNA-sekvenser kodende for Aspergillus - subtilisin på en vellykket måte er det nødvendig med en hybridiserende DNA probe. Dette kan være en syntetisk DNA probe dersom aminosyresekvensen eller del av en ønsket Aspergillus -subtilisin er kjent, eller et annet subtilisin-gen, for eksempel fra gjær eller en del derav, som hybridiserer til et Aspergillus -subtilisin-gen.
Polyadenylert messenger RNA (trinn b) blir isolert fra de egnede cellene ved hjelp av
kjente metoder. Isoleringsmetoder involverer for eksempel homogenisering i nærvær av en detergent og en ribonuklease inhibitor, for eksempel heparin, guanidinium isotiocya-nat eller merkaptoetanol, ekstrahering av mRNA med egnede kloroform-fenol blandinger, eventuelt i nærvær av salt og bufferoppløsninger, detergenter og/eller kation chela-terende midler, og presipitering av mRNA fra den gjenværende vandige, saltinnehold-ende fasen med etanol, isopropanol eller lignende. Isolert mRNA kan bli ytterligere ren-
set ved sentrifugering i en cesiumklorid gradient etterfulgt av etanolpresipitering og/eller ved kromatografiske metoder, for eksempel affinitetskromatografi, for eksempel kromatografi på oligo(dT) cellulose eller på oligo(U) sefarose. Et slikt renset totalt mRNA blir fortrinnsvis separert etter størrelse ved gradientsentrifugering, for eksempel i en lineær sukrosegradient, eller kromatografi på egnede størrelsessepareringskolonner, for eksempel på agarosegeler.
Ønsket mRNA blir valgt ved screening av mRNA direkte med en DNA probe, eller ved translasjon i egnede celler eller celle-frie systemer og screening av de oppnådde polypeptidene.
Valg av ønsket mRNA blir fortrinnsvis oppnådd ved anvendelse av en DNA hybridise-ringsprobe som beskrevet nedenfor for derved å unngå de ytterligere trinnene med translasjon. Egnede DNA prober er DNA med kjent nukleotidsekvens, for eksempel syntetiske DNA, cDNA avledet fra mRNA kodende for ønskede polypeptider, eller genomiske DNA fragmenter omfattende, for eksempel, ved tilliggende DNA-sekvenser som er isolert fra en naturlig kilde eller fra en genetisk omkonstruert mikroorganisme.
Fraksjonert mRNA kan bli translatert i celler, for eksempel friske oocyter, eller i celle-frie systemer, for eksempel i reticulocytlysater eller hvetekimekstrakter. De oppnådde polypeptidene blir screenet for enzymatisk aktivitet eller for reaksjon med antistoffer dannet mot det native polypeptidet, for eksempel i en immunanalyse, for eksempel ra-dioimmunoanalyse, enzymimmunoanalyse eller immunoanalyse med fluorescensmarkø-rer. Slike aminoanalyser og preparering av polyklonale og monoklonale antistoffer er velkjent innenfor fagområdet og blir anvendt deretter.
Fremstilling av et enkeltrådet komplementært DNA (cDNA) fra det selekterte mRNA templatet er velkjent innenfor fagområdet og det er også fremstilling av et dobbeltrådet DNA fra et enkeltrådet DNA. mRNA templatet blir inkubert med en blanding av deoksynukleosid trifosfater, eventuelt radioaktivt merkede deoksynukleosid trifosfater (for å kunne screene resultatet til reaksjonen), en primersekvens så som et oligo-dT residie hybridiserende med poIy(A) halen til mRNA og et egnet enzym så som en revers transkriptase for eksempel fra ape myeloblastosisvims (AMV). Etter degradering av templat mRNA for eksempel ved alkalisk hydrolyse blir cDNA inkubert med en blanding av deoksynukleosid trifosfater og et egnet enzym for å tilveiebringe et dobbeltrådet DNA. Egnede enzymer er for eksempel en revers transkriptase, Klenow fragmenter til E. coli DNA polymerase I eller T4DNA polymerase. Vanligvis blir en hårnålsstruktur dannet spontant når enkeltrådet cDNA virker som en primer for syntese av den andre tråden. Denne hårnålsstrukturen blir fjernet ved spaltning med Sl nuklease. Alternativt blir 3'-enden til enkeltrådet DNA først utvidet ved homopolymerisk deoksynukleotidhaler før hydrolyse av mRNA templatet og påfølgende syntese av den andre cDNA tråden.
I alternativet blir dobbeltrådet cDNA isolert fra et cDNA bibliotek og screenet for ønsket cDNA (trinn c). cDNA biblioteket blir konstruert ved isolering av mRNA fra egnede celler og fermstilling av enkeltrådet og dobbeltrådet cDNA derifra som beskrevet ovenfor. Dette cDNA blir spaltet med egnede restriksjonsendonukleaser og inkorpo-rert inn i Afag, for eksempel Åcharon 4A eller Xgtl 1 ifølge kjente prosedyrer. cDNA biblioteket replikert på nitrocellulosememraner blir screenet ved anvendelse av en DNA probe som beskrevet ovenfor eller uttrykt i et egnet ekspresjonssystem og de oppnådde polypeptidene blir screenet for reaksjon med et antistoff spesifikt for de ønskede forbin-delsene.
En annen fremgangsmåte for fremstilling av dobbeltrådet DNA er PCR teknologi (trinn
d). Denne metoden kan spesielt anvendes for fremstilling av en stor mengde dobbeltrådet DNA begynnende fra en liten mengde DNA eller RNA med i det minste delvis
kjente sekvenser. Et DNA innskudd med ukjent sekvens som er flankert av kjente vek-torsekvenser kan imidlertid også anvendes som utgangsmateriale. I PCR teknologi blir DNA molekyler, for eksempel oligonukleotider, anvendt som primer for den enzymatiske templat-avhengige syntesen av DNA. Store mengder kan bli preparert på grunn av denatureringen av dobbeltrådet DNA, hybridisering med primere og enzymatisk syntese kan bli sekvensielt gjentatt. Antall syntetisert DNA molekyler øker eksponensielt på
grunn av at de dobles i hver runde. PCR teknologi hører inn under teknikkens stand og kan bli anvendt på vanlig måte i foreliggende oppfinnelse. Oligonukleotid primeren kan bli konstruert for å hybridisere til DNA som vil kode for konserverte subtilisin-type se-
rin proteaseproteinsekvenser basert på sammenligninger mellom kjente serin proteaser av subtilisin-type. PCR teknologi er velkjent innenfor fagområdet og konvensjonelle PCR teknikker kan bli anvendt i foreliggende oppfinnelse, for eksempel de som er beskrevet i M.A. Innis et al. (eds), PCT protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego (1990).
Forskjellige fremgangsmåter er kjent innenfor fagområdet for inkorporering av dobbeltrådet cDNA eller genomisk DNA inn i en hensiktsmessig vektor (trinn e). For eksempel kan komplementære homopolymerområder bli tilsatt til dobbeltrådet DNA og vektor DNA ved inkubasjon i nærvær av tilsvarende deoksynukleosid trifosfater og et enzym så som terminal deoksynukleotidyl transferase. Vektoren og dobbelttrådet DNA blir deretter koblet ved baseparing mellom komplementære homopolymeriske haler og til slutt ligert ved spesifikke koblingsenzymer så som ligaser. Andre muligheter er tilsetning av syntetiske linkere til terminien til dobbeltrådet DNA, eller inkorporering av dobbeltrådet DNA inn i vektoren ved butt- eller utstående-endeligering. Hensiktsmessige vektorer vil i detalj bli beskrevet nedenfor.
Transformeringsprosedyrer for transformering av hensiktsmessige vertsceller med den oppnådde hybridvektoren og seleksjon og multiplikasjon av transformerte vertsceller er velkjent innenfor fagområdet. Eksempler på slike metoder er gitt nedenfor.
Isolering av ønsket DNA, mutanter og fragmenter derav ifølge oppfinnelsen blir oppnådd ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet, for eksempel ekstrahering med fenol og/eller kloroform. Eventuelt kan DNA bli ytterligere manipulert for eksempel ved behandling med mutagene midler for å oppnå mutanter, eller ved spaltning med restriksjonsenzymer for å oppnå fragmenter, modifisert i en eller begge termini for å lette inkorporering i vektoren, fjerning av mellomliggende sekvenser og lignende.
Nukleotidsekvensen til et DNA ifølge oppfinnelsen kan bli bestemt ved fremgangsmåten kjent per se, for eksempel ved Maxam-Gilbert metoden ved anvendelse av endemerket DNA eller ved dideoksy kjedet termineringsmetoden til Sanger.
Aspergillus -subtilisin gensekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli preparert ved en in vitro syntese ifølge konvensjonelle metoder. In vitro syntesen kan spesielt anvendes for preparering av mindre fragmenter av et Aspergillus -subtilisin genko-dende for fragmenter av Aspergillus -subtilisin med serinprotease aktivitet. In vivo syntese er også spesielt egnet for syntese av DNA kodende for en prometer eller et signalpeptid. In vitro syntesen blir fortrinnsvis anvendt på Aspergillus -subtilisin genet avledet fra j4. niger eller fragmenter derav, mest foretrukket til pepC genet vist i SEQ LD NO. 1 eller promoter eller signalsekvensen derav eller til pepD genet vist i SEQ ID NO. 6 eller promoter eller signalsekvensen derav.
Egnede metoder for syntese av DNA er blitt presentert i oppsummert form av S.A. Narang (Tetrahedron 39, 3, 1983). De kjente synteseteknikkene muliggjør preparering av polynukleotider opp til 120 baselengde, med et godt utbytte, med høy renhet og på relativt kort tid. Nukleotider beskyttet på egnet måte blir koblet med hverandre ved fos-fodiester metoden (K.L. Agarwal et al., Angew. Chemie 84,489,1972), den mer effek-tive fosfotriestermetoden (C.B. Reese, Tetrahedron 34, 3143,1972), fosfitt-tirestermeto-den (R.L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 98,3655,1976) eller fosforamiditmetoden (S L. Beaucage og M.H. Curruthers, Tetrahedron 22,1859,1981). Forenkling av syntesen til oligonukleotider og polynukleotider blir muliggjort ved fast fase metoden hvor nukleotidkjedene er bundet til en egnet polymer. Det dobbeltrådede DNA er bygget opp enzymatisk fra kj emisk preparerte overlappende oligonukleotider fra begge DNA trådene, som blir holdt sammen i riktig arrangement ved baseparing og blir deretter kjemisk koblet av enzym DNA ligase. En annen mulighet innbefatter inkubering av overlappende enkelte oligonukleotider fra de to DNA trådene i nærvær av de fire påkrevde deoksynukleosidtrifosfatene med en DNA polymerase, for eksempel DNA polymerase I, Klenow fragmenter til polymerase I eller T4 DNA polymerase, eller ved AMW (ape myoblastosis virus) revers transkriptase. De to oligonukelotidene blir derved holdt sammen i riktig arrangement ved baseparing og blir supplert med de nødvendige nukleotidene av enzymet for å oppnå et fullstendig dobbeltrådet DNA (S.A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356,1982).
Ved utførelse av foreliggende oppfinnelse kan et subtilisin-gen fra en annen art, for eksempel gjær, eller et fragment derav bli anvendt som probe for identifisering av en Aspergillus spee., for eksempel en A. niger, subtilisin mRNA i en RNA fraksjon eller et subtilisin DNA i et genomisk eller cDNA bibliotek. Fra den primære sekvensen til A. niger genet og sammenligning med andre proteaser kan den kodende regionen til proteasen bli avledet og forholdet mellom genet og subtilisin genfamilien kan bli bekreftet. Det oppnådde genet kan bli anvendt for fremstilling av rekombinant protease som beskrevet i detalj nedenfor.
Syntetiske DNA prober blir fremstilt ifølge kjente fremgangsmåter som beskrevet nedenfor, fortrinnsvis ved trinnvis kondensasjon ved anvendelse av fast fase fosfotriester, fosfitt-triester eller fosforoamidit metoden, for eksempel kondensasjon av dinukleotid koblende enheter ved fosfotriestermetoden. Disse metodene er tilpasset til syntese av blandinger av ønskede oligonukleotider ved anvendelse av blanding av to, tre eller fire nukleotider dA, dC, dG og/eller dT i beskyttet form eller de tilsvarende dinukleotidkob-lende enhetene i hensiktsmessige kondensasjonstrinn som beskrevet av Y. Ike et al.
(Nucleic Acids Research 11,477,1983).
For hybridisering blir DNA probene merket, for eksempel radioaktivt merket ved kinase reaksjon. Hybridisering av størrelses-fraksjonert mRNA med DNA prober inneholdende en markør blir utført ifølge kjente fremgangsmåter, for eksempel i buffer og saltoppløs-ninger inneholdende adjuvanter, for eksempel kalsium chelatorer, viskositet regulerende forbindelser, proteiner, ikke-homologt DNA og lignende, ved temperaturer som favori-serer selektiv hybridisering, for eksempel mellom 0°C og 80°C, for eksempel mellom 25°C og 50°C eller rundt 65°C, fortrinnsvis ved rundt 20° lavere enn smeltetemperatu-ren til hybrid dobbeltrådet DNA.
Transformerte verter og preparering derav
Oppfinnelsen vedrører vertsceller transformert med en hybrid eller ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis slike som koder for de foretrukne formene av Aspergillus -subtilisin ifølge oppfinnelsen.
Eksempler på egnede verter, spesielt for formering av rekombinante DNA molekyler ifølge oppfinnelsen er mikroorgansimer som mangler eller har lite restriksjonsenzymer
eller modifikasjonsenzymer, så som bakterier, spesielt stammer av Escherichia coli, for eksempel E. coli X1776, E. coli Y1090, E. coli W3110, £ coli HB101/LM1035, E. coli JA 221, E. coli DH5a, eller fortrinnsvis E. coli DHaF', JM109, MH1 eller HB101, eller E. coli K12 stammen. Egnede verter er også andre prokaryote celler, for eksempel Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus og andre, og gjær, for eksempel Saccharomyces cerevisiae så som S. cerevisiae GRF 18. Andre egnede vertsceller er celler fra høyere organismer, spesielt etablerte kontinuerlige humane eller dyrecellelinjer, for eksempel humane embryoniske lungefibroblaster LI32, humane maligne melanom bowerceller, HeLa celler, SV40 virus transformerte nyreceller fra afrikansk grønn ape COS-5 eller kinesisk hamster ovarie (CHO) celler.
Eksempler på egnede celler for ekspresjon av et Aspergillus -subtilisingen ifølge oppfinnelsen er cellene nevnt ovenfor transformert med en hensiktsmessig ekspresjonsvektor og ytterligere egnede insektsceller transformert med en hensiktsmessig Baculovirus ekspresjonsvektor og spesielt filamentøse sopp, for eksempel penicillum, cephalaspo-rium eller fortrinnsvis Aspergillus spee., for eksempel A. carbonarius, A. Awamori, A. nidulans. A. oryzae eller mer foretrukket er A. niger, transformert med en hensiktsmessig ekspresjonsvektor.
Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av slike transformanter omfattende behandling av en egnet vertscelle under transformerende betingelser med et DNA molekyl eller en hybridvektor ifølge oppfinnelsen, eventuelt sammen med et se-leksjonsmarkørgen og eventuelt selektering av transformantene. Aspergillus -subtilisin-genet kan også bli integrert i vertsgenomet etter transformasjon, spesielt dersom eukaryote celler, for eksempel Aspergillus -spee. blir anvendt som vert.
Transformering av mikroorganismer blir utført ifølge konvensjonelle metoder som beskrevet i litteraturen, for eksempel for S. cerevisiae (A. Hinnen et al., Proc.Natl. Acad. Sci.USA, 75,1929,1978) for B. subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81,741, 1961), for E. coli (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159,1970) og for Aspergillus [F. Buxton et al., Gene 37:207-14(1985), D.J. Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-9(1983)].
I samsvar med dette omfatter prosedyren for transformering av E. coli celler, for eksempel, Ca<2+> forbehandling av cellene for å muliggjøre DNA opptak og inkubasjon med hybridvektoren. Den påfølgende seleksjonen av de transformerte cellene kan for eksempel bli oppnådd ved overføring av cellene til et selektivt vekstmedium som muliggjør separasjon av de transformerte cellene fra foreldrecellene avhengig av naturen til mar-kørsekvensen til vektor DNA. Et vekstmedium som ikke muliggjør vekst av cellene som ikke inneholder hybridvektoren blir fortrinnsvis anvendt.
Transformasjon av sopp så som gjær eller Aspergillus spee. omfatter for eksempel trinnene for enzymatisk fjerning av celleveggen ved hjelp av glukosidase, behandling av de oppnådde sferoplastene med hybridvektoren i nærvær av polyetylenglykol og Cs<?+ >ioner og regenerering av celleveggen ved å innleire sferoblastene i agar. Regenererings-agaren blir fortrinnsvis preparert på en måte som muliggjør regenerering og seleksjon av de transformerte cellene som beskrevet ovenfor på samme tid.
Transformering av celler med høyere eukaryotisk opprinnelse, så som pattedyrcellelin-jer, blir fortrinnsvis oppnådd ved transfeksjon. Transfeksjon blir utført ved konvensjonelle teknikker, så som kalsiumfosfat presipitering, mikroinjeksjon, protoplastfusjon, elektroporering, dvs. innføring av DNA ved en kort elektrisk puls som deretter øker per-meabiliteten til cellemembranen, eller i nærvær av hjelperforbtndelser så som dietylami-noetyldekstran, dimetylsulfoksid, glycerol eller polyetylenglykol, og lignende. Etter transfeksjonsprosedyren blir transfekterte celler identifisert og selektert for eksempel ved dyrking i et selektivt medium valgt avhengig av naturen til seleksjonsmarkøren, for eksempel standard kulturmedium så som Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM), minimalt essensielt medium, RPMI1640 medium og lignende, inneholdende for eksempel det tilsvarende antibiotikum.
De transformerte vertscellene blir dyrket ved fremgangsmåter kjent innenfor fagområdet i et væskemedium inneholdende assimilierbare kilder av karbon, for eksempel karbo-hydrater så som glukose eller laktose, nitrogen, for eksempel aminosyrer, peptider, proteiner eller degraderingsprodukter derav så som peptoner, ammoniumsalter eller lignende og uorganiske salter, for eksempel sulfater, fosfater og/eller karbonater av natrium, kalium, magnesium og kalsium. Mediet inneholder videre for eksempel vekst-fremmende forbindelser, så som sporelementer, for eksempel jern, sink, mangan og lignende.
Mediet blir fortrinnsvis valgt slik at det utøver et seleksjonstrykk og hindrer veksten av cellene som ikke er blitt transformert eller som har mistet hybridvektoren. Et antibiotikum blir derfor for eksempel tilsatt til mediet dersom hybridvektoren inneholder et anti-biotisk resistensgen som markør. Dersom for eksempel en vertscelle blir anvendt som er auxotrof for en essensiell aminosyre mens den hybride vektoren inneholder et gen kodende for et enzym som komplementerer vertens defekt, blir et minimal medium som mangler nevnte aminosyre anvendt for dyrke de transformerte cellene.
Celler av høyere eukaryotisk opprinnelse så som pattedyrceller blir dyrket under vevs-kulturbetingelser ved anvendelse av kommersielt tilgjengelig medium, for eksempel Dulbeccos modifiserte Eagel medium (DMEM). Minimalt essensielt medium, RPMI 1640 medium og lignende som nevnt ovenfor, eventuelt suplementert med vekst-frem-mende forbindelser og/eller pattedyrsera. Teknikker for celledyrking under vevskultur-betingelser er velkjent innenfor fagområdet og innbefatter homogen suspensjonskultur, for eksempel i en "airlifl"-reaktor eller i en kontinuerlig omrørende reaktor eller immo-bilisert eller innesluttet cellekultur, for eksempel i hule fibere, mikrokapsler, på agarose mikrokuler, porøse glasskuler, keramiske beholdere eller andre mikrobærere.
Dyrkning blir oppnådd ved fremgangsmåter som er kjent innenfor fagområdet. Dyrk-ningsbetingelser, så som temperatur, pH verdi til mediet og fermenteringstid, blir valgt, slik at et maksimalt titer av polypeptidet eller derivatet ifølge oppfinnelsen blir oppnådd. En E. coli eller gjærstamme blir derfor fortrinnsvis dyrket under aerobe betingelser ved nedsenket kultur ved risting eller omrøring ved en temperatur på omtrent 20°C til 40°C, fortrinnsvis ved omtrent 30°C og en pH verdi på 4 til 8, fortrinnsvis ved omtrent pH 7, i omtrent 4 til 30 timer, fortrinnsvis helt til det maksimale utbyttet av polypeptidet eller derivatet ifølge oppfinnelsen blir opnådd.
For å muliggjøre seleksjon av transformerte og utransformerte celler inneholder DNA molekylene ifølge oppfinnelsen en seleksjonsmarkør eller, alternativt, blir cellene ko-transformert med en andre vektor inneholdende en slik markør. Som i andre systemer er en slik seleksjonsmarkør et uttrykkbart, strukturelt gen, der det utviste polypeptidet (et enzym) gir motstand overfor forbindelser toksiske for mottager organismen eller som fullfører enzymsystemet til en mutant som mangler et slikt essensielt polypeptid. Slike markørgener egnede for seleksjon av transformerte filamentøse soppceller er for eksempel de kjente qa-2, pyrG, pyr4, trpC amdS og argB genene.
Som beskrevet i EP-A-0 278 355 ble et markørgen, betegnet pyrA, isolert fra det genomiske biblioteket A. niger, som er relatert til og som har en lignende funksjon som pyrG for A. nidulans og pyr4 fra N. crassa, som produserer enzymet ortidin 5'-fosfat dekarboksylase. Dette enzymet katalyserer dekarboksylering av orotidin 5-fosfat til uridyl-syre (uridin 5-fosfat) og også av fluor-orot syre til toksisk fluor-uridin. DNA til annet pyr gen kodende for orotidin-5-fosfat dekarboksylase kan derimot også bli anvendt. Fra en positiv klon betegnet E. coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968), ble plasmid pCG59D7, omfattende pyrA genet isolert og anvendt for kotransformasjon av en A. niger pyrA-mutant. En slik pyrA mutant er defekt i orotidin 5'-fosfat dekarboksylasegenet og kan derfor ikke produsere det tilsvarende enzymet. En slik mutant ble preparert ved behandling av conidiosporene til A. niger N756 under muterende UV-bestrålning og kolonier som overlever i nærvær av fluor-orotinsyre og uridin blir valgt. Kolonier som overlever i nærvær i fluororotinsyre og fravær av uridin blir eliminert. De gjenværende uridin-kre-vende mutantene, ifølge deres evne til å være transformerbare, høre til to komplemente-ringsgrupper pyrA og pyrB, representert ved A. niger mutantene An8 og An 10. De blir behandlet i form av protoplaster derav under transformerende betingelser med pyrA inneholdende plasmid pCG59D7 (DSM 3968). Bare A. niger An8 (DSM 3917) koloniene ble funnet å være transformert og å inneholde pyrA genet som vist ved den hybridiserende evnen til spaltet DNA detav med DNA fra pUN 121.
Således er det tilveiebragt en vert transformert med en hybrid ekspresjonsvektor ifølge det ovenstående, idet den består av en DNA-sekvens kodende for en Aspergillus niger serin protease av subtilisin-type funksjonelt koblet med regulatoriske elementer egnede for ekspresjon av en slik DNA-sekvens i nevnte vert. Foretrukne utførelsesformer er nærmere definert i krav 10 og i beskrivelsen.
Fremgangsmåte for fremstilling av Aspergillus - subtilisin
Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for fremstilling av en Aspergillus -subtilisin ifølge oppfinnelsen, fortrinnsvis foretukne former derav, omfattende dyrking av en vert transformert med en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen under betingelser egnede for ekspresjon av Aspergillus -subtilisin genet. Når det er behov blir polypeptidet isolert på konvensjonell måte. Avhengig av konstruksjonen av ekspresjonsvektoren blir Aspergillus -subtilisin enten produsert eller, dersom en signalsekvens er til stede, produsert og utskilt.
Om en selektert vert er egnet for ekspresjon eller ikke avhenger hovedsakelig av regula-torisk sekvenser valgt for konstruering av ekspresjonsvektoren, spesielt på promoteren.
Dersom for eksempel en promoter avledet fra et Aspergillus, fortrinnsvis A. niger, gen blir anvendt for ekspresjon av et Aspergillus -subtilisin-gen ifølge oppfinnelsen, er en Aspergillus stamme, fortrinnsvis A. niger, en egnet vert. Dersom en promoter som ikke er avledet fra et Aspergillus gen blir anvendt for konstruksjon av en ekspresjonsvektor ifølge oppfinnelsen er andre verter egnede for ekspresjon, for eksempel bakterier så som E. coli, eller gjær, så som S. cerevisiae. Egnede verter og promotere for fremstilling av polypeptidene ifølge oppfinnelsen er også de som er egnede for transformasjon angitt ovenfor.
Oppfinnelsen vedrører spesielt en fremgangsmåter der en transformert Aspergillus vert uttrykker det eksogene Aspergillus -subtilisin genet under betingelser hvor endogene Aspergillus -subtilisin-gener er aktive og derfor uttrykker mer enn den normale mengden Aspergillus -subtilisin på grunn av den økte gendosen. Av denne grunn blir Aspergillus verten, spesielt A. niger, transformert med en ekspresjonsvektor omfattende et Aspergillus -subtilisin-gen under kontroll av dets homologe, dvs. naturlig koblede eks-presjonskontrollsekvenser, spesielt promotere og signalsekvens.
Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte der en transformert Aspergillus vert uttrykker det eksogene Aspergillus -subtilisingenet i høyere nivå eller under andre betingelser enn det endogene genet på grunn av at det er koblet til en annen promoter.
Betingelser for maksimal ekspresjon av det eksogene genet eller gener avhenger av det valgte ekspresjonssystemet. Dersom for eksempel en promoter av en pektin lyase (PL) eller av et polygalakturonase (PG) gen av A. niger blir anvendt er ekspresjonen av Aspergillus -subtilisin genet koblet til disse induserbar i en A. niger celle ved tillegg av pectin eller pectin degraderingsprodukter til kulturmediet. I nærvær av tilstrekkelig glukose er promoteren imidlertid ikke induserbar, dersom en A. niger stamme, for eksempel An8 (DSM 3917) blir anvendt som en vert. Dette betyr at et Aspergillus -subtilisin-gen under kontroll av en A. niger Pl eller PG promoter er "katabolit represert" i A. niger. Hvis derimot en annen Aspergillus stamme blir anvendt, fortrinnsvis A. oryzae eller mer foretrukket A. nidulans, blir et Aspergillus -subtilisin-gen under kontroll av en A. niger PL eller PG promoter uttrykt konstitutivt, dvs. også i fravær av pectin og/eller i nærvær av glukose. Det kan derfor være fordelaktig å uttrykke et Aspergillus -subtilisin-gen under kontroll av en A. niger PL eller PG promoter i en Aspergillus vert for-skjellig fra A. niger, fortrinnsvis A. oryzae eller mest foretrukket A. nidulans, på grunn av at for eksempel glukose i stedenfor pectin kan bli tilsatt til næringsmediet som energi og karbonkilde i løpet av ekspresjon av genet.
Dersom en Aspergillus, fortrinnsvis A. niger, puryvat kinase promoter blir anvendt for ekspresjon av et Aspergillus -subtilisin-gen, blir genet uttrykt dersom et minimalt medium med glukose som karbon- og energikilde blir anvendt.
Det er nå mulig å overuttrykke Aspergillus -subtilisin, hvorved forskjellige metoder kan bli anvendt. En renset enkel Aspergillus -subtilisin kan bli preparert ved en fremgangsmåte der en egnet vert som ikke kan uttrykke noe Aspergillus -subtilisin eller som uttrykker Aspergillus -subtilisin i lav mengde eller som ikke uttrykker Aspergillus -subtilisin eller induksjonsbetingelser anvendt for ekspresjon av eksogent Aspergillus -subtilisin-gen, blir transformert med en hybridvektor omfattende et strukturelt gen kodende for en Aspergillus -subtilisin, fortrinnsvis fra A. niger, mest foretrukket PEPC vist i SEQ LD NO. 1, eller et fragment av en Aspergillus -substilisin serin protease aktivitet og at nevnte strukturelle gen blir uttrykt. Dersom en vert som ikke kan uttrykke Aspergillus subtilisin blir anvendt kan respektive enkelte Aspergillus -subtilisin bli oppnådd i ren form, som betyr ikke-kontaminert av andre Aspergillus -subtilisin.
En vert som ikke kan uttrykke Aspergillus -subtilisin er enten en mikroorganisme som ikke har noe korresponderende gen eller en Aspergillus stamme hvor ekspresjonen av endogene ^jpergi/Ziis-subtilisin-gener er undertrykt i et hensiktsmessig kondisjonert vekstmedium, mens den eksogene Aspergillus -subtilisin-promoteren operabelt bundet med det ønskede Aspergillus -subtilisin strukturelle genet, for eksempel en A. niger avledet promoter, er aktiv under disse betingelsene eller hvor Aspergillus -subtilisin-genet er koblet til en annen promoter.
Andre promotere og stammer egnede for preparering av Aspergillus -subtilisin er angitt ovenfor i beskrivelsen av ekspresjonsvektorene ifølge oppfinnelsen.
Det er således tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket polypeptid, kjennetegnet ved transformering av en Aspergillus stamme med en ekspresjonsvektor inneholdende en ekspresjonskassett egnet for ekspresjon av det ønskede polypeptidet, dyrking av den transformerte Aspergillus niger stammen under betingelser egnede for ekspresjon av det ønskede polypeptidet og isolering av det ønskede polypeptidet.
Aspergillus - subtilisin og anvendelse derav
Ren Aspergillus niger serin protease av subtilisintype per se, er også betegnet " Aspergillus -subtilisin". En slik protease forstås å (a) være aveldet fra. Aspergillus spee., (b) utviser proteaseaktivitet på grunn av et katalytisk serinresidie ved det aktive setet og (c) har tilstrekkelig aminosyresekvenshomologi med kjente serinproteaser for å bli grupper i subtilisinfamilien. Inkludert i betegnelsen Aspergillus -subtilisin er også fragmenter av et slikt enzym som har beholdt serin protease aktivitet.
Oppfinnelsen vedrører fortrinnsvis en ren Aspergillus -subtilisin av Aspergillus niger, fortrinnsvis serin protease PPC som har aminosyresekvensen vist i sekvenslisten under SEQ ID NO. 1 eller serin proteasen PPD som har aminosyresekvensen vist i sekvenslisten under SEQ ID NO. 6, og fragmenter og mutanter derav som har beholdt serin protease aktiviteten.
Oppfinnelsen vedører videre enzymatiske sammensetninger som omfatter en eller flere av et Aspergillus -subtilisin og/eller et derivat derav med serinproteaseaktivitet og/eller biologiske akseptable salter detav eventuelt i en forutbestemt kombinasjon med en eller flere egnede enzymer som har en annen aktivitet enn Aspergillus -subtilisin.
Det er således tilveiebragt en Aspergillus niger serin protease kjennetegnet ved at den består av PEPC vist i SEQ ID NO. 2 og PEPD vist i SEQ ID NO. 7.
Aspergillus - stammen som mangler Aspergillus - subtilisin
Oppfinnelsen vedrører også en A. niger stamme som mangler PEPC genet vist i SEQ ID NO. 1 eller i PEPD genet vist iSEQ LD. NO 6 eller en A. niger stamme som mangler både pepC og pepD genet.
En mutert Aspergillus stamme ifølge oppfinnelsen som har et defekt Aspergillus -subtilisin-gen kan i en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen bli preparert ved "gene disruption", dvs. en DNA-sekvens tilsvarende det endogene Aspergillus genet som øn-skes å bli ødelagt er in vitro mutert til et defekt gen og transformert inn i Aspergillus vertscellen. På grunn av en homolog rekombinering i cellen blir det intakte endogene genet erstattet med det defekte eksogene. Vanligvis blir det eksogene genet ødelagt ved innskudd av et markørgen inn i den kodende regionen. Dette fører til et defekt gen som lett kan bli registrert og anvendt for selektering av transformanter der det tilsvarende endogene genet er ødelagt. Også andre metoder for mutagense kan derimot bli anvendt for preparering av en mutert Aspergillus stamme, fortrinnsvis en mutert A. niger stamme, hvor et endogent pep C gen og/eller pep D gen er mutert på en slik måte at det ikke kan bli uttrykt noe funksjonelt pep C og/eller pep D.
I en mest foretrukkt utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir en A. niger stamme transformert med en hybridvektor omfattende en defekt mutant i pepC genet vist i SEQ LD NO. 1, for eksempel et ødelagt pepC gen som har et seleksjonsmarkørgen innskutt deri, for eksempel som innbefattet i plasmid pPEPDPYRA beskrevet i de vedlagte eksemplene og transformantene blir selektert.
I en annen mest foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir en A. niger stamme transformert med en hybridvektor omfattende en defekt mutant av pepD genet vist i SEQ ID NO. 6, for eksempel et ødelagt pepD gen som har et innskudd seleksjonsmar-kørgen, for eksempel som innbefattet i plasmid pPEPDPYRA beskrevet i de vedlagte eksemplene og transformantene blir selektert.
I en tredje mest foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen blir en A. niger stamme transformert med en defekt mutant av pepC genet vist i SEQ ID NO. 1, for eksempel et ødelagt pepC gen som har et seleksjonsmarkørgen skutt inn, for eksempel som innbefattet i plasmid pPEPCPYRA beskrevet i de vedlagte eksemplene, og med en defekt mutant i pepD genet vist i SEQ ED NO. 6, for eksempel et ødelagt pepD gen med et innskutt seleksjonsmarkørgen, for eksempel som innbefattet i plasmid pPEPDPYRA beskrevet i de vedlagte eksemplene og transformanter som mangler både pepC og pepD blir valgt.
Et mutert Aspergillus niger stamme ifølge oppfinnelsen som har et defekt pep C og/eller pep D gen er nyttig for ekspresjon av en forbedret produksjon av heterologe eller homologe proteiner enten intra- eller ekstracellulært.
Ekspresjon av heterologe eller homologe proteiner i Aspergillus spee. kan bli oppnådd ifølge konvensjonelle metoder. Vanligvis blir en ekspresjonsvektor konstruert omfattende et homologt eller heterologt gen operabelt koblet til en homolog eller heterolog promoter som er funksjonell i Aspergillus og eventuelt med andre ekspresjons kontroll-sekvenser som er funksjonelle Asperagillus, for eksempel de som er definert ovenfor. Når nødvendig blir polypeptidet isolert på konvensjonell måte. Avhengig av kontruksjo-nen av ekspresjonsvektoren blir produktene enten produsert i vertscellen eller, dersom en signalsekvens er til stede, blir de produsert i cellen og utskilt.
Strukturelle gener i denne sammenhengen er for eksempel strukturelle gener som har opprinnelse fra viruser, prokaryote celler eller eukaryote celler og som kan bli avledet fra genomisk DNA eller fra cDNA preparert via mRNA veien eller kan bli syntetisert kjemisk, kodende for forskjellige nyttige polypeptider, inkludert glykosylerte polypeptider, spesielt fra høyere eukaryote, spesielt pattedyr, så som dyr eller spesielt med human opprinnelse, så som enzymer som for eksempel kan bli anvendt for produksjon av næ-ringsmidler og for å utføre enzymatiske reaksjonen i kjemi, eller polypeptider, som er nyttige og verdifulle for behandling av sykdommer i mennesker og dyr eller for forhind-ring derav, for eksempel, hormoner, polypeptider med immunmodulerende, anti-virale og anti-tumor egenskaper, antistoffer, viral antigener, vaksiner, koaguleringsfaktorer, matvarer og lignende.
Eksempler på slike strukturelle gener er for eksempel de som koder for Aspergillus polygalakturonase, for eksempel PGI eller PGII, eller Aspergillus pektinlyase, for eksempel PLI, PLA, PLB, PLC, PLE og PLF, eller hormoner så som sekretin, thyomosin, re-laksin, kalsitonin, luteiniserende hormon, parathyroidhormon, adrenokortikotropin, me-lanocyt-stimulerende hormon, p-lipotropin, urogastron eller insulin, vekstfaktorer, så som epidermal vekstfaktor, insulin-lignende vekstfaktor (IGF), for eksempel IGF-I og IGF-II, mastcelle vekstfaktor, nervevekstfaktor, gliaavledet nervecellevekstfaktor eller transformerende vekstfaktor (TGF), så som TGFP, veksthormoner, så som humane eller bovine veksthormoner, interleukin, så som interleukin-1 eller -2, human makrofag mi-grerende inhibitorisk faktor (MLF), interferoner, så som humane A-interferon, for eksempel interferon -AA, AB, AD eller AF, p-interferon, A.-interferon eller en hybrid interferon, for eksempel en AA- AD- eller en AB-AD-hybrid interferon, spesielt hybrid interferon BDBB, proteinase inhibitorer så som A^-antitrypsin, SLP1 og lignende, hepatitt
virus antigener, så som hepatitt B virus overflate eller kjerne antigen eller hepatitt A virus antigen, eller hepatitt ikke A- ikke-B antigen, plasminogen aktivatorer, så som vevs-
plasminogen aktivator elter urokinase, tumornekrosefaktor, somatostatin, renin, p-en-dorfin, immunoglobluiner, så som lette og/eller tunge kjeder av immunoglobulin D, E eller G, eller humane-muse hybrid immunoglobuliner, immunoglobulinbindende faktorer, så som immunoglobulin E bindende faktor, kalsitonin, human kalsitonin-relatert peptid, blodkoagulerende faktorer, så som faktor IX eller VLIIC, erytropoietin, eglin, så som eglin C, hirudin, desulfatohirudin, så som desulfatohirudin variant HVI, HV2 eller PA, human superoksid dismutase, viral thymidin kinase, p-laktamase, glukoseisome-rase. Foretrukne gener er de som koder for et humant A-interferon eller hybridinterferon, spesielt hybrid-interferon BDBB, human vevsplasminogenaktivator (t-PA), hepatitt B virusoverflate antigen (HBVsAg), insulin-lignende vekstfaktor I og II, eglin C og desulfatohirudin, for eksempel, variant HVI.
Således er det tilveiebragt en Aspergillus niger stamme, kjennetegnet ved at den består av Aspergillus niger som har en defekt i pepC genet til sekvensen med SEQ. ID. NO. 1, Aspergillus niger med en defekt i pepD genet til sekven sen med SEQ ID NO. 6 og Aspergillus niger som har en defekt i pepC og pepD genene til sekvensene med henholdsvis SEQ LD NO. 1 og 6.
De mest foretrukne utførelsesformene er de som er beskrevet i de vedlagte eksemplene.
Eksempler
Forkortelsene har følgende betydninger:
Buffere, medier, reagenser
Følgende stammer og vektorer blir anvendt:
Eksempel 1: Konstruksjon av et genomisk bibliotek av Asper<g>illus niser
Eksempel 1. 1: Isolering av DNA med høy molekvlvekt fra A . niger N400 Konidiosporer av Aspergillus niger stamme N400 blir inokulert i 200 ml minimal medium til en sluttsporetetthet på IO<6> sporer/ml og ristet i 1 1 Erlenmeyer i 241. ved 28°C ved 300 rpm. Myceler blir høstet ved filtrering gjennom Myracloth på en Buchner trakt, vasket med kaldt sterilt saltvann, frosset i flytende nitrogen og enten lagret ved -60°C eller anvendt direkte. Fremgangsmåten anvendt for isolering av DNA for å preparere det genomiske biblioteket er basert på fremgangsmåten beskrevet av Yelton et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:1470-1474(1984)].
For bibliotekkonstruksjon blir 10 g mycelium malt i flytende nitrogen i 1 g porsjoner i en Braun mikro-dismembrator. Det malte mycelet blir overført til en 11 steril erlenmeyer, inneholdende 200 ml ekstraheirngsbuffer (50 mM EDTA pH 8,5,0,2% SDS) og 200 ul dietylpyrokarbonat. Blandingen blir sakte oppvarmet til romtemperatur og deretter oppvarmet i 20 min. til 68°C med sporadisk risting. Suspensjonen blir avkjølt til romtemperatur og sentrifugert i 15 min. ved 12.000 x g. 1/16 volum av en 8 M kalium-acetatoppløsning pH 4,2 blir tilsatt til supernatanten og blandingen blir holdt på is i en 1 t. Presipitatet blir fjernet ved sentrifugering (20 min.; 16.000 x g; 4°C). Nukleinsyrene blir presipitert fra supernatanten ved en inkubasjon med 0,6 volum isopropanol på is i 15 min. Den presipiterte nukelinsyren blir samlet ved sentrifugering (10 min.; 6.000 x g; 4°C), vasket med 70% etanol og forsiktig tørket. Pelleten blir suspendert i 10 ml TE inneholdende 20 ug/ml RNAse A, (Boehringer, Mannheim) og inkubert i 15 min. ved 37°C. DNA blir behandlet med nuklease fri pronase (1 mg/ml sluttkonsentrasjon)
(Kochlight, Coinbrook) i 11. ved 37°C.
8,5 g CsCl blir løst opp i 9 ml av den oppnådde DNA oppløsningen, 0,2 ml 10 mg/ml ethidiumbromid blir tilsatt og denne oppløsningen blir enten sentrifugert i en Beckman SW41 rotor i 601. ved 33.000 rpm, eller i en Beckman 50 Ti rotor i 401. ved 45.000 rpm. DNA båndet blir samlet og ethidiumbromid blir fjernet ved multippelekstraksjon med isopropanol ekvilibrert med en mettet oppløsning av NaCl i vann. 5 volum TE blir tilsatt og DNA oppløsningen blir deretter behandlet med TE mettet fenol, fenol/kloroform/isoamylalkohol 25:24:1 og kloroform/isoamylalkohol 24:1. DNA blir presipitert ved tilsetning av 0,1 volum 3 M natriumacetat pH 5,2,2,5 volum etanol og over-natt inkubasjon ved -20°C. Presipitatet blir samlet ved sentrifugering (1 1, 30.000 x g; 4°C), vasket med 70% etanol, tørket og løst opp i 400 ul TE.
Eksempel 1. 2: Delvis spaltning av A . niger N400 DNA med Mbol og isolering av fragmentene
For å teste Mbol konsentrasjonen som gir den største mengden av DNA fragmentene mellom 13,6 og 23 kbp, blir 1 ug porsjoner avÆ niger N400 DNA spaltet i hensiktsmessig buffer anbefalt av forhandleren med Økende mengder Mbol (0,5-0,001 U) i 11. ved 37°C i et volum på 10 ul. Reaksjonen blir stoppet ved tilsetning av 1 ul 0,25 EDTA og prøvene blir applisert på en 0,6% agarosegel i TBE buffer, inneholdende 1 ug/ml ethidiumbromid. Mbol konsentrasjonen nødvendig for å oppnå et høyt utbytte av ønskede 13,6-23 kbp fragmenter er på omtrent 0,02 U/ug DNA. 200 ug DNA i et total volum på 2 ml blir spaltet. Etter 11. ved 37°C blir EDTA tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 25 mM, enzymet blir varme-inaktivert ved 65°C i 10 min. og DNA blir presipitert, vasket, tørket og løst opp i 400 ul TE. Fragmentert DNA blir separert på en 0,4% prepara-tiv agarose gel ved 4°C og 40 V (3 V/cm). Fragmenter med riktig størrelse blir spaltet ut av gelen og DNA blir elektroeluert fra gelen i et sterilt dialyserør i 2 ml TB i 2-3 t. ved 100 V. Strømmen blir deretter reversert i 30s og buffer inneholdende DNA blir samlet. Fragmentene blir deretter konsentrert ved etanol presipitering og løst ved 100 ul TE.
Eksempel 1. 3: Preparering av vektor DNA
Det genomiske biblioteket til Å. niger stamme N400 blir konstruert i lambda vektor EMBLA Vektoren som har en kloningskapasitet på 9-23 kbp, er beskrevet av Frischauf et al. [J. Mol. Biol. 170:827-842(1983)] og Kam et al. [Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:
5172-76(1980)] og kan bli forhandlet fra Promega Biotechnology Inc. For å unngå at to innskudd med opphav fra forskjellige deler av genomet blir klonet inn i én fag, blir en minimal fragmentlengde på 13,6 kbp anvendt for kloningen. 10 ug lambda EMBL4 DNA blir fullstendig spaltet med enheter BamHI i buffer som anbefalt av forhandleren i et volum på 100 ul i 21. ved 37°C. Enzymet blir inaktivert i 10 min. ved 65°C. NaCl konsentrasjonen blir øket til 150 mM og 50 enheter Sali blir tilsatt og inkubasjonen ved 37°C blir fortsatt i ytterligere 21. Etter tilsetning av EDTA til 25 mM og inaktivering av enzymet ved oppvarming i 10 min. ved 65°C blir oppløs-ningen ekstrahert med like volum fenol (TE mettet), fenol/kloroform/isoamylalkhol 25:24:1, og kloroform/sioamylalkohol (24:1). For å eliminere de små BamHI/Sall poly-linker fragmentene blir DNA presipitert med 0,6 volum isopropanol etter tilsetning av 0,1 vol 3M narriumacetat pH 5,2. Etter 15 min. på is og 15 min. sentrifugering ved 12.000 x g ved 4°C blir presipitatet grundig vasket med 70% etanol, tørket og løst opp i 40 ul TE.
Eksempel 1. 4: Ligerin<g> og in vitro pakking av genomiske A . niger N400 DNA fragmenter
Det er vesentlig at cos setene til vektoren preparert ifølge eksempel 2,3 blir sammensmeltet før ligeringsreaksjonen. Vektoren i lOOmM Tris-HCl pH 7,5 og 10 mM MgCl2 blir raskt oppvarmet i 10 min. ved 65°C og deretter sammensmeltet i 11. ved 42°C. Fra testligeringene vet man at et forhold mellom vektor og fragmenter på omtrent 1:1 (i vekt) flest rekombinanter. Ligering foregikk i 50 mM Tris HC1 pH 7,5,10 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP, ved anvendelse av 9,5 \ ig vektor og 10 ^ig DNA fragmenter i et totalvolum på 100 ul. DNA ligase (BRL) blir tilsatt i en konsentrasjon på 0,5 U/ug DNA og ligeringsblandingen blir inkubert over-natt ved 14°C. For å teste for ligering blir en prøve av ligert DNA kjørt på en agarose gel. Som en kontroll blir 0,5 ug vektor ligert uten tilsetning av fragmentene i et 5 (il volum.
Ligeringsblandingen blir konsentrert ved etanolpresipitering og løst i 20 ul TE før in vitro pakking. In vitro pakkingen blir utført med Promega Packagene ekstrakter ifølge instruksjonen til forhandleren ved anvendelse av 10 ul porsjoner for å pakke 1 ug DNA. 1 ug kontrollfag lambda cI857 Sam7 med høy molekylvekt, tilført med ekstraktene, blir pakket separat som en kontroll. Etter pakking blir 500 ul fagoppløsningsbuffer (PSB) og 5 ul kloroform tilsatt. Rekombinante fagstamoppløsninger kan bli lagret ved 4°C.
Eksempel 1. 5: Titrering og amplifikasjon av A . niger stamme N400 genomisk bibliotek Celler fraE. coli NM539 blir dyrket på LB medium inneholdende 0,2% maltose, 10 mm MgS04 og 1 mM CaCl2 til en optisk tetthet (600 nm) på 1,0. 0,2 ml alikvoter av denne kulturen blir tilsatt til 0,1 ml av den hensiktsmessige fagfortynningen i PSB. Etter ad-sorpsjon av fagene i 20 min. ved 37°C blir 3 ml 0,6% LB topp-agar ved 45°C tilsatt, blandingen blir sådd ut på LB-agar skåler og disse blir inkubert over-natt ved 37°C. Antall plaquedannende enheter (pfu) pr. ml fagsuspensjon er 12 x 10^ og 4,2x10^ pfu/ml for to fagoppløsninger preparert ifølge eksempel 1,4. Etter subtraksjon av bakgrunnen som blir beregnet fra kontroll-ligeringene uten fragmentene (henholdsvis 17% og 40%) er det absolutt antallet rekombinanter 6x10^. DNA innbefattet i rekombinantene er ekvi-valent med mer enn 200 Aspergillus niger genomer.
For å amplifisere bibliotek blir 80 ul alikvoter av begge fagstokkene anvendt for å infi-sere E. coli NM539 cellene som blir sådd ut i LB topp-agarose på LB-agar skåler og
deretter inkubert over-natt ved 37°C. Fagene blir eluert fra agarosen ved forsiktig risting av platene med 5 ml PSB pr. skål i 11. ved romtemperatur. PSB blir samlet, sentrifugert (10 min. ved 6000 x g) for å fjerne bakterier og kloroform blir tilsatt (0,5% sluttkonsentrasjon). Begge fagstokkene, som blir amplifisert omtrent i samme grad, blir deretter blandet (40 ul stamoppløsning), titrert (8x10^ pfu/ml) og lagret ved 4°C.
Eksempel 2: Preparering av en gjær PRB probe
Eksempel 2. 1: Preparering av gjær proben.
Plasmid pGP202 (deponert som DSM 7018) inneholder et 3,2 kb fragment av gjær DNA som koder for gjær PRB genet som hensiktsmessig kan bli spaltet med HindlLT og Saul. Dette plasmidet blir spaltet med HindlLT og Saul og fragmentene blir separert på en 0,8% agarosegel. 3,2 kb fragmentet blir spaltet ut og DNA blir isoelektroeluert. 100
ng av dette fragmentet blir nick translatert med <32>P-dATP som merket nukleotid og anvendt øyeblikkelig for enten Southern eller plaque lift prober.
Eksempel 2. 2: Southern av A . niser DNA
2 jig alikvoter av A. niger DNA, fremstilt som beskrevet ovenfor, blir spaltet med enten BamHI eller HindlLT og separert på en 0,8% agarosegel. Etter fotografering av den etidi-umbromid farvede gelen blir DNA overført til nitrocellulosefilteret ved kapillær blotting [Southern, E.M., J. Mol. Biol. 98:503-517(1975)] og hybridisert som beskrevet i eksempel 3 med merket gjær PRB probe. Separate strimler av nitrocellulose inneholdende
begge spaltinger blir utsatt for forskjellige vaskeregimer for å bestemme tilstandene som ga det sterkeste signal til bakgrunnsforhold. Det ble oppdaget at en preliminær vask ved 47°C i 6xSSC etterfulgt av to romtemperatur vaskinger i 2xSSC ga de beste resultatene.
Eksempel 3: Screening av A . niser N400 bibliotek med giær PRB probe
En del av det genomiske biblioteket til Aspergillus niger stamme N400 beskrevet ovenfor (eksempel 1) blir fortynnet i SM og 0,1 ml porsjoner hver inneholdende omtrent 2000 pfu blir sådd ut. Vertsceller blir preparert ved inokulering av 50 ml LB-medium supplert med 0,2% maltose med 0,5 ml av en over-natt kultur av E. coli NM539 i LB-medium, risting i 41. ved 250 rpm ved 37°C, etterfulgt av tilsetning av 0,5 ml i en 1 M MgS04 og 0,5 ml 0,5 CaCl2- 0,2 ml alikvoter av disse cellene blir hver blandet med en 0,1 ml del av fagsuspensjonen og inkubert ved romtemperatur i en halv time. Deretter blir 3 ml 0,7% agarose i LB-medium ved 47°C tilsatt, kort vortex behandlet og øyeblikkelig sådd ut på LB-agar skåler. Skålene blir inkubert over-natt ved 37°C og avkjølt i 2 t. ved 4°C.
Fra hver skål blir to replika dannet ifølge Benton og Davis plaque hybridiseringsmeto-den [Benton, W.D. og Davis, R.W., Science 196:180-182(1977)]. Det første filteret (Schleicher og Schuell BA85) blir plassert på toppen av skålen i 1 min. den andre replika i 2 min. og posisjonen til replikaene blir markert ved anvendelse av India blekk. Etter fjerning av filtrene blir de plassert i en skål inneholdende 100 ml av en denaturer-ende oppløsning (IM NaCl, 0,5 M NaOH) i 0,5 min, og deretter i 1 min. i 100 ml nøy-traliserende oppløsning (0,5 M Tris-HCl pH 7,5,1,5 M NaCl). Filtrene blir overført til en skål inneholdende 3xSSC, forsiktig skrubbet med en behansket hånd for å fjerne bakteriell debris og blir skylt med 3xSSC. Filtrene blir blottet, tørket i 10 min. ved romtemperatur og bakt på Whatman 3 MM papir i en ovn ved 80°C i 2 timer.
De bakte filtrene blir fuktet i 3xSSC, vasket i denne oppløsningen i 11. ved romtemperatur og deretter overført til en skål inneholdende 250 ml forvarmet (65°C) prehybridi-seringsblanding (6xSSC, lOxDenhardt (0,2% BSA, Boehringer fraksjon V; 0,2% Ficoll 400, Pharmacia; 0,2% polyvinylpyrrolidon-10, Sigma), 0,1% SDS og 0,1 mg/ml skåret og friskt denaturert laksesperm DNA). Etter 11. prehybridisering ved 65°C i et ristende vannbad blir filtrene vasket en gang i en halv time i 250 ml forvarmet (65°C) hybridiseringsblanding, som er det samme som prehybridiseringsblandingen med unntagelse av at den mangler laksesperm DNA. Deretter blir filtrene overført til en skål inneholdende 150 ml forvarmet (65°C) hybridiseringsblanding hvor på forhånd merket probe blir tilsatt.
Etter hybridisering i 14 timer ved 65°C blir filtrene vasket en gang i 250 ml forvarmet (47°C) hybridiseringsblanding i en halv time ved 47°C, etterfulgt av vasking ved romtemperatur i to skift av 250 ml 2xSSC, hver i 45 min. Filtrene blir tørket og eksponert for Kodak XAR5 film i 1 til 3 dager ved -70°C ved anvendelse av en intensiverende skjerm.
På denne måten blir tre positive signaler oppnådd fra de seks screenede skålene. Positive plaque blir stukket ut med en steril Pasteur pipette ved forsiktig å posisjonere skålene på autoradiogrammet ved anvendelse av blekkmarkører. Agarstykket som inneholder de positive plaquene blir tilsatt til 1 ml SM pg 2,5 ul kloroform blir tilsatt. Fagene diffunderer ut av agaren i en time ved romtemperatur og sporadisk vortex behandling og deretter inkubert over-natt ved 4°C. Agar og celledebriet blir fjernet ved sentrifugering i 5 min, 2,5 ul kloroform blir tilsatt og fagstokkene blir lagret ved 4°C.
De positive klonene blir betegnet A.1, X2, M. På grunn av at fagene blir sådd ut i høy tetthet blir de positive plaquene renset to ganger ved utsåing av disse ved en lav tetthet og ved gjentagelse av hele prosedyren med replika plating, hybridisering og plukking av positive plaque.
Eksempel 4: Karakterisering av lamda klonene
Eksempel 4. 1: Isolering av lambda DNA
For å isolere DNA fra de rekombinante klonene blir fagene først amplifisert. For dette blir E. coli LE392 vertscellene dyrket til en optimal tetthet (600 nm) 1,0 i LB-medium
supplert med 10 mM MgSC>4 og 0,2% maltose. Deretter blir 50ul av stamoppløsningene av rensede fag separat sådd ut som beskrevet ovenfor. Etter en over-natt inkubasjon ved 37°C blir fagene eluert fra de ikke-konfluente skålene ved utsåing av 5 ml SM over skålene og inkubering i 2 timer med forsiktig risting. De eluerte fagene blir høstet og 0,1
ml kloroform blir tilsatt. Blandingen blir kort vortex behandlet og det cellulære debriet blir fjernet ved sentrifugering. Supematantene blir isolert, kloroform blir tilsatt til 0,3% og det rsulterende skållysatet blir lagret ved 4°C.
For å oppnå nesten konfluente skåler som utgangsmateriale for isolering av fag DNA blir 10 ml porsjoner av skållysatene utsådd med E. coli Le392 vertsceller. Etter over-natt inkubasjon ved 37°C blir agarose topplaget skrapet bort fra tre nesten konfluente skåler. Disse lagene blir kombinert, 20 ml SM og 0,4 ml kloroform blir tilsatt og den resulterende blandingen blir ristet ved 37°C i 30 min. Det cellulære debriet og agarose blir fjernet ved sentrifugering, supernatanten blir isolert og volumet justert til 18 ml SM. Et likt volum 2M NaCl, 20% PEG6000 (BDH, Poole, GB) i SM blir tilsatt og oppløs-ningene blir blandet og plassert på is. Etter 75 min. blir fagene pelletert ved sentrifugering i 20 min. ved 1200xg ved 4°C. Supernatanten blir dekantert og den gjenværende væsken blir fjernet med et Kleenex stykke. Pelleten blir resuspendert i 3 ml SM og deretter ekstrahert med 3 ml kloroform. Den vandige fasen blir behandlet med RNase A (67 ug/ml) og DNase I (33 ug/ml) i 20 min. ved 37°C. Deretter blir denne blandingen ekstrahert ved tilsetning av 2 ml fenol, vortex behandling, tilsetning av 1 ml kloroform, ny vortex behandling og separering av de to fasene ved sentrifugering. Den vandige fasen blir ekstrahert to ytterligere ganger, med 3 ml fenol/kloroform (1:1) og 3 ml kloroform. Deretter blir DNA presipitert fra den vandige fasen ved sekvensiell tilsetning av 0,3 ml 3 M natriumacetatbuffer (pH 5,2) og 6 ml etanol. Denne blandingen blir latt stå ved 4°C i 161. og deretter blir DNA isolert ved sentrifugering (10 min., 12000xg, 4°C). Pelleten blir løst opp i 0,4 ml TE buffer, RNase A blir tilsatt til 200ug/ml og inkubert ved 37°C i 1 time. DNA blir presipitert ved tilsetning av 38 jil 3 M natriumacetatbufFer (pH 5,2) og 0,8 ml etanol ved 4°C i 1 time. DNA blir isolert ved sentrifugering og deretter løst opp i 100 ul TE.
Eksempel 4. 2: Restriksionsanalvse av A . niger N400 pepC kloner
Det blir bestemt ved restriksjonsanalyse at alle tre fagene inneholder innskudd som er avledet fra samme region av Æ niger genomet og et delrestriksjonskart av Al blir konstruert. 2 ug fag DNA blir spaltet med 20 enheter EcoRI i et volum på 20 ul i 11. ved 37°C i bufferen anbefalt av forhandleren (BRL) og deretter oppvarmet ved 65°C i 10 min. Prø-vene blir kjørt på en 0,7% agarosegel og fotografert. DNA blir overført til nitrocellulose membran og hybridisert med den merkede gjær PRB proben. Det fremgår fra disse spaltningene at alle tre fagene er identiske inneholdende et 12 kb og et 2,7 kb EcoRI fragment. Det er også klart at 12 kb fragmentet er det eneste fragmentet som hybridi-serte til PRB proben og som derfor inneholder det meste om ikke hele det tilsvarende A. niger genet. X.1 blir valgt for ytterligere analyse.
XI blir ytterligere spaltet med forskjellige restriksjonsenzymer og utsatt fer Southern analyse på ny. Det minste båndet som så ut til å inneholde alle båndene som hybridiserer til PRB proben er et 3,2 kbp EcoRI BamHI fragment. Dette blir subklonet inn i et plasmid.
Eksempel 5: Kloning av PEPC inn i et plasmid og sekvensering derav og karakterisering
Eksempel 5. 1: Konstruksjon av pTZPEPC
A.1 DNA blir inkubert med restriksjonsenzymene BamHI og EcoRI som beskrevet ovenfor. Etter ekstrahering med kloroform blir DNA presipitert, pelletert ved sentrifugering, løst opp i prøvebuffer og utsatt for elektroforese på en 0,6% agarosegel i 1 x TBE buffer. Et gelstykke inneholdende 3,2 kbp BamHI-EcoRi fra<g>menter blir isolert og DNA elektroeluert. Dette blir deretter ekstrahert med 100 ul kloroform og etanolpresipitert og på ny løst opp i 40 ul TE buffer. DNA konsentrasjonen blir vurdert ved agarosegelelektroforese etterfulgt av visualisering av båndet under UV lys.
pTZ18R vektoren blir preparert ved spaltning med BamHI og EcoRI, under betingelsene anbefalt av forhandleren (BRL). DNA blir ekstrahert med fenol, fenol/kloroform (1:1) og kloroform og DNA etanol presipitert.
100 ng av hver av de ovennevnte fragmentene blir ligert sammen i et reaksjons volum på 25 ul, inneholdende bufferen anbefalt av BRL pluss ATP (1 mM), 1,5 U T4 DNA ligase (BRL). Reaksjonsblandingen blir inkubert i 16 timer ved 16°C og deretter anvendt for transformering av E. coli DH5aF. Cellene blir sådd ut på LB agar skåler inneholdende og inkubert over-natt ved 37°C. Flere enkelte hvite kolonier blir anvendt for å preparere over-natt kulturer i LB medium supplert med 0,1% glukose og 25 mg/ml ampicillin.
Disse kulturene blir anvendt for å isolere plasmid ved anvendelse av miniprep metoden til Holmes og Quigley [Holmes, D.S. og Quigley, M., Anal. Biochem. 114:193 (1981)]. Plasmidene blir spaltet med flere restriksjonsenzymer ifølge forhandlerens anbefalinger (BRL) og i nærvær av RNase A (0,5 mg/ml) og produktene blir analysert på en agarosegel. Plasmidene som gir opphav til BamHI-EcoRI og Hindlll fragmentene med ventet størrelse blir selektert og E. coli cellene som inneholder disse blir oppbevart på glycerol ved -20°C. Dette plasmidet blir betegnet pTZPEPC (deponert som DSM 7019).
Eksempel 5. 2: Nukleotidsekvensen til pepC
pepC subklonen, et 3,2 kbp BamHI-EcoRI fragment i pTZ18R vektoren, blir fullstendig sekvensert ved dideoksy-kjede termineringsmetoden [Sanger et al., Proe. Natl.Acad. Sei. USA 74:5463-67(1977)] ved anvendelse av syntetiske oligonukleotidprimere og sekvenase (United Biochemical Corp.).
Hele nukleotidsekvensen er presentert i sekvenslisten. Den åpne leserammen blir identifisert ved sammenligning med andre kjente subtilisin familie serin proteaser og dette blir bekreftet ved transkripsjonskartlegging.
Eksempel 5. 3: RNA- kartlegging av PEPC
Totalt RNA blir preparert fra malt frysetørket mycel som blir dyrket på minimal medium med glykose som karbonkilde og ammonium som nitrogenkilde ved hjelp av metoden tilFrederick ogKinsey [Curr. Genet. 18:53-58 (1990)]. 5-endentilmessengerRNA blir identifisert ved hybridisering av total RNA med 32-P endemerket oligonukleotid, oligo A (komplementær med nukleotidene 433 til 456 SEQ LD NO. 1) og størrelsesbe-regning av "runoff' transkriptet produsert av revers transkriptase på en sekvenserende gel ved sammenligning med sekvenseringsreaksj onene produsert ved dideoksy sekvensering med samme oligonukleotid (Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring HArbor, NY, 1982). De nøyak-tige spleisesetene til intronet blir identifisert ved kloning og sekvensering av en del cDNA kopi av pepC message. Første tråd syntesen blir utført ved standardmetoder (Maniatis et al., op.cit.) med unntagelse av at priming oligonukleotid er oligo C (komplementær til nukleotidene 923 til 944 til SEQ LD No.l.). Dette cDNA blir underlagt PCR ved anvendelse av oligo B (tilsvarende nukleotidene 631 til 657 av SEQ LD No. 1) og C og klonet inn i pTZ18R. (Oligo B har i tillegg et BamHI sete på 5'-enden og oligo C har i tillegg et EcoRI sete). Begge trådene til de to uavhengige klonene blir fullstendig sekvensert. Den totale lengden til mRNA produsert av pepC genet blir bestemt ved Northern analyse ved anvendelse av 3,2 kb EcoRI-BamHI fragmentet som probe (Maniatis et al., op.cit) og er bestemt til å være mellom 1,5 og 1,8 kb som tilsvarer det som er ventet ut fra størrelsen til den åpne leserammen og posisjonen til transkripsjons-startsetet.
Eksempel 6: Genomisk oppbrudd av PEPC
Eksempel 6. 1: Konstruksjon av pTZPEPCE
Plasmid pTZPEPC blir spaltet med BamHI, behandlet med T4 polymerase og religert i nærvær av et ti molar overskudd ufosforylert EcoRI linkere (5'-GGAATTCC). Etter transformering inn i E. coli blir det riktige plasmidet med EcoRI seter som flankerer begge sidene av pepC genet identifisert ved mini screen.
Eksempel 6. 2: Konstruksjon av pAXI
Plasmid pCG59D7 som kan bli oppnådd fra Escherichia coli BJ138/pCG59D7 (DSM 3968) blir spaltet med Xbal og fragmentet inneholdende hele A. niger pyrA genet blir renset. Dette blir klonet inn i Xbal setet til pT218R for å danne plasmid pAXI (deponert som DSM 7017).
Eksempel 6. 3: Konstruksjon av pPEPCPYRA
4 kb Xbal fragmentet inneholdende pyrA genet blir tatt ut fra pAXI og renset fra vektorsekvensene. 2 u,g pTZPEPCE blir spaltet med Bglll ifølge forhandlerens anbefalinger og deretter fenolekstrahert, fenolpresipitert og på ny løst opp i 20 ul vann. Dette DNA blir deretter behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase for å fjerne 5-fosfatgruppene som anbefalt av forhandlerne. 5 kb fragmenter blir renset fra en gel.
Begge ovennevnte fragmenter blir behandlet med T4 polymerase ifølge forhandlerens instruksjoner og fenolekstrahert og etanolpresipitert. De to fragmentene blir blandet sammen og ligert. Etter transformering av E. coli blir koloniene inneholdende de riktige plasmidene identifisert ved restriksjonsspaltning av mini-plasmid prepareringer.
pPEPCPYRA består av pTZ18R vektoren inneholdende EcoRI fragment som inneholder pepC genet og som har det sentrale Bglll fragmentet som koder for både det aktive setet histidin og serin, erstattet av en Xbal DNA fragment kodende orotidin monofosfat dekarboksylase.
Eksempel 6. 4: Transformering av A . niger
10 ug plasmid pPEPCPYRA blir spaltet fullstendig av EcoRI. Den fullstendige spaltningen blir undersøkt ved å kjøre en alikvot på en gel og gjenværende DNA blir fenolekstrahert, etanolpresipitert og suspendert i 20 ul sterilt vann.
Konidale sporer av auxotrofisk A. niger An8 (DSM 3917) blir dyrket i 4 dager ved 28°C
på fullstendig medium helt til de er fullstendig sporulert. 2x10^ konidiosporer blir anvendt for å inokulere 200 ml minimal medium supplert med 1 g/l arginin og uridin.
Etter 20 timers vekst ved 28°C ved 180 rpm blir mycelet høstet ved filtrering gjennom Miracloth og vasket to ganger med 10 ml 0,8 M KC1,50 mM CaCl2 og resuspendert i 20 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2,0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries). Blandingen blir inkubert i et ristevannbad (30°C, 50 rpm) helt til tilstrekkelige protoplaster er frigjort (detektert mikroskopisk etter 90-120 min.). Protoplastsuspensjonen blir filtrert gjennom en glassullplugg i en trakt for å fjerne mycel debris. Protoplastene blir pelletert ved forsiktig sentrifugering (10 min. 200 rpm) ved romtemperatur og vasket to ganger med 10 ml 0,8 M KC1,50 mM CaCl2. Protoplastene blir til slutt resuspendert i 200-500
ul 0,8 M KC1,50 mM CaCl2 til en konsentrasjon på lxl0^ sferoplaster pr. ml.
For transformering blir en 200 ul alikvot av protoplastsuspensjonen inkubert med 5 fig EcoRI spaltet pPEPCPYRA 50 ul PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2,25% PEG 6000). Inkubasjonsblandingen blir oppbevart på is i 20 min., ytterligere 2 ml PCT blir tilsatt og blandingen inkubert i ytterligere 5 min. ved romtemperatur. 4 ml 0,8 M KC1,50 mM CaCl2 ble tilsatt og 1 ml alikvoter av den endelige transformeringsoppløs-ningen blir blandet med flytende minimal agar medium (minimal medium + 1 g/l arginin + 10 g/l bacto-Agar (difco), stabilisert med 0,8 M KC1. Blandingen blir øyeblikkelig helt ut på agarskåler med samme medium og inkubert ved 30°C.
Etter 2-3 dagers vekst ved 28°C fremkommer stabile transformanter for vigerøst voksende og sporulerende kolonier på en bakgrunnsvekst av mange hundre små, sannsynligvis mislykkede, transformanter.
Eksempel 6. 5: Identifikasjon av " gene disruption"
Fra de stabile koloniene ble individuelle sporsuspensjoner dannet og sådd ut på friske minimalt pluss argininskåler. Enkeltkolonier blir valgt og på ny sådd ut for å oppnå rene kulturer. Disse blir anvendt for å inokulere 200 ml flytende minimalmedium supplert med 1 g/l arginin. Etter 241. ved 30°C risting ved 180 rpm blir mycelet høstet på filter-papir og stykket blir frysetørket. Etter at tørkende DNA blir preparert fra de individuelle stykkene ved maling av stykkene til et fint pulvr med en mortar blir 60 mg av dette pulveret resuspendert i 3 ml 1% natrium dodecylsulfat, 0,1% Tween 80,1 M ammoniumacetat ved vortex behandling. Dette blir oppvarmet ved 65°C i 20 min. med sporadisk blanding. Celledebriet blir separert fra DNA oppløsningen ved sentrifugering ved 15000 rpm i 5 min. Supernatanten blir ekstrahert to ganger med fenol, to ganger med kloroform og etanolpresipitert. DNA pelleten blir på ny løst opp i 100 ul sterilt TE. 20 ul av hvert DNA blir spaltet med Bglll i nærvær av 1 ug RNAse A i 11. Dette blir separert på en agarosegel og overført til nitrocellulosemembran og bakt. EcoRI fragmentet fra pTZPEPC inneholdende PEPC blir renset, merket ved nick translasjon og anvendt for å probe filtrene. Stammer som inneholder en ødeleggelse av pepC genet gjenkjennes lett ved at de mangler 1,2 kb Bglll hybridiserende fragment samt at de har endret mobilitet i de to flankerende fragmentene.
En av disse stammene blir sådd ut på medium inneholdende uridin og 5-fluor-orotinsyre. Mutanter til pyrimidin auxotrof! blir identifisert ved den sterkere veksten på dette mediet og blir plukket og renset ved utstrykning for enkeltkolonier.
Eksempel 6. 6: Produksjon av interferon i pepC" A . niger stemme
En av pepC" A. niger An8 stamme isolert i eksempel 6.5 blir anvendt som en vert for påfølgende transformasjon med pyrA<+> inneholdende plasmider og ekspresjonskassetter inneholdende et heterologt gen for interferon.
Konidal sporene til uridin auxotrofisk pepC" mutanten til A. niger An8 blir dyrket i 4 dager ved 28°C i fullstendig medium helt til de er fullstendig sporulert. 2x10^ konidiosporer blir anvendt for å inokulere 200 ml minimal medium supplert med 1 g/l arginin og uridin.
Etter 20 timers vekst ved 28°C og 180 rpm blir mycelet testet ved filtrering gjennom Miracloth, vasket to ganger med 10 ml 0,8 M KC1, 50 mM CaCl2 og resuspendert i 20 ml 0,8 M KCI, 50 mM CaCtø, 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries). Blandingen blir inkubert i et ristende vannbad (30°C, 50 rpm) helt tilstrekkelige protoplaster er frigjort (detektert mikroskopisk etter 90-120 min). Protoplastsuspensjonen blir filtrert gjennom glassullplugg i en trakt for å fjeren mycel debriet. Protoplaster blir pelletert ved svak sentrifugering (10 min., 2000 rpm) ved romtemperatur og vasket to ganger med 10 ml 0,8 M KCI, 50 mM CaCl2. Protoplastene blir til slutt resuspendert i 200-500
fil 0,8 M KCI, 50 mM CaCl2 for å oppnå en konsentrasjon på lxlO^/ml.
For transformering av en 200ul alikvot av protoplastsuspensjonen blir den inkubert med 5 ug pCG59D7 (DSM 3969) og 50 ug pGIIss-LFN AMI 19 eller pGII-IFN AMI 19 DNA (begge plasmidene er fullstendig beskrevet i EP-søknad 0 421 919), 50 ul PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2,25% PEG 6000). Inkubasjonsblandingen blir helt på is i 20 min. og ytterligere 2 ml PCT blir tilsatt og blandingen inkubert i ytterligere 5 min. ved romtemperatur. 4 ml 0,8 M KCI, 50 mM CaCl2 blir tilsatt og 1 ml alikvoter av den endelige transformeringsoppløsningen blir blandet med flytende minimal agarmedium (minimal medium + 1 g/1 arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)), stabilisert med 0,8 M KCI. Blandingene blir øyeblikkelig helt på agarskåler av samme medium og inkubert ved 30°C.
Etter 2-3 dagers vekst ved 28°C fremkommer stabile transformanter som kraftig voksende og sporulerende kolonier på en bakgrunnvekst av mange hundre små, antageligvis mislykkede, transformanter.
Transformantene blir plukket og analysert for interferonekspresjon. Interferonaktiviteten bli bestemt ifølge fremgangsmåten til Armstrong (J.A. Armstrong, Appl. Microbil. 21, 732 (1971)) ved anvendelse av humane CCL-23 celler og vesikulær stomatitis virus (VSV) som utfordrende virus.
Konidalsporer fra transformantene blir individuelt predyrket inn i 50 ml av et prekultur-medium (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) 3 g/I, NH4CI2 g/l, KH2P04 0,5 g/l, NaCl 0,5 g/l, Mg2S04.7H20 0,5 g/I, Ca2S04.2H20 0,5 g/l, pH 7,0, 1% arginin). Prekulturen blir inkubert i 72 timer ved 250 rpm og 28°C. 10% av prekulturen blir anvendt for å inokulere 50 ml hovedkulturmedium (soyabønnemel 20 g/l, pectin Slow Set 5 g/l, 1% arginin). Kulturen blir dyrket opp i 72-96 timer ved 250 rpm og 28°C.
Ved forskjellige tidspunkter (hver 20. time) blir prøver tatt, cellene blir pelletert ved sentrifugering og brutt opp ved frysetørking og tørrmaling. Supernatant og celleekstrak-ter blir begge testet for interferon aktivitet som beskrevet (ovenfor). Hovedmengden av interferonaktiviteten blir funnet utskilt inn i mediet i transformanter inneholdende pGIIss-LFN AMI 19, mens i transformanter inneholdende pGEMFN AMI 19 er det hovedsakelig i celleekstraktet.
Eksempel 7: Overekspresjon av <p>e<p>C i A . niser
Eksempel 7. 1: Overekspresjon av multiple kopier
A. niger An 8 blir transformert med 1 ug pAXI pluss 10 ug pTZPEPC for å tilveiebringe uridinfotofer. Kolonier blir renset og DNA preparert som beskrevet ovenfor. Southern blot ved anvendelse av EcoRI-BamHI fragmenter til pTZPEPC viste at noen transformanter har en enkelt kopi av pTZPEPC integrert inn i deres genom mens andre har opptil og over 10 ekstra kopier i deres genom. Stammene produserte tilsvarende mer proteolytisk aktivitet og er stabile mitotisk.
Eksempel 7. 2: Overekspresjon av pepC fra genfusjoner
Plasmid pGW 1100 (deponert som DSM 5747) blir spaltet med BamHI og Sacl. 1,2 kbp fragmentet omfattende pyrivatkinase promoteren og 5'-enden blir renset, behandlet med T4 polymerase og klonet inn i det unike BamHI setet til pTZPEPC ved 5'-enden av pepC-klonen som blir gjort buttendet med T4 polymerase og behandlet med alkalisk fosfatase.
De korrekte plasmidene blir identifisert ved mini screening og et blir valgt og transformert inn i en dut- ung- E. coli stamme BW 313. Denne blir superinfisert med M13K07 for å tilveiebringe enkeltrådet uracil-substituert DNA fra plasmidet.
Oligonukleotid 1 (angitt under SEQ LD NO. 3) består av 37 nukleotider. De første 19 nukleotidene er komplementære med den første 19 nukleotidene til pepC åpen leseramme og se siste 18 er komplementære med de siste 18 nukleotidene før ATG til pyruvat kinasegenet. For in vitro mutagense av dette plasmid 5pM av oligonukleotid 1 blir fosforylert i 5-enden med lOOpM ATP ved behandling av oligoet med 10 U T4 poly-nukleotidkinase i 50 ul kinasebuffer som anbefalt av forhandleren. Reaksjonen blir avsluttet ved oppvarming ved 65°C i 10 min.
0,2pM uracil-inneholdende enkeltrådet DNA blir blandet med 0,5pM fosforylert oligonukleotid 1 i 20 mM Tris-HCl pH 7,5,10 mM MgCl2,25 mM NaCl i et sluttvolum på 10 ul. Blandingen blir inkubert ved 65°C i 5 min. sakte avkjølt til romtemperatur over
60 min. og plassert på is i 15 min. Deretter blir 2 ul 500uM dNTP, 1,5 ul 10 mM ATP,
1 ml T7 DNA polymerase (12U/ul Pharmacia) og 1 ul T» DNA ligase (1,2 U/ul BRL) tilsatt til blandingen og denne polymersieringsblandingen blir inkubert i 15 min. ved 37°C. Reaksjonen blir avsluttet ved oppvarming ved 65°C i 5 min. og alikvotene blir anvendt for å transformere E. coli DHSaF<1>.
De riktige plasmidene blir identifisert ved spaltning av mini plasmid preparatene. 3 blir valgt og EcoRI fragmentet blir fullstendig sekvensert ved anvendelse av syntetiske oli-ognukleotider. Et plasmid som inneholder en perfekt fusjon av pyruvat kinase promoteren til pepC åpen leseramme, som er betegnet pPKLPEPCA, blir anvendt med pAXI for å kotransformere A. niger An 8 til uridin prototrofi.
Tilstedeværelse av pki-pepC fusjonen blir bekreftet ved ådanne DNA fra individuelt rensede transformanter og ved anvendelse av det for Southern analyse ved anvendelse av prober fra pki og pepC. Stammer med en eller flere kopier av denne genfusjonen integrert i deres genom er vist å produsere mer proteolytisk aktivitet når cellene blir dyrket hurtig på glukose som C-kilde.
Eksempel 8: Ekspresjon av pepC i andre organismer: Ekspresjon i gjær
Plasmid pPKLPEPCA blir in vitro mutagenisert med to syntetiske oligonukleotider vist i sekvenslisten under SEQ LD NO. 4 og 5. Førstnevnte har konstruert et EcoRI sete like før ATG til pepC og lekker ut hele intronet. Dette danner et plasmid pPKIPEPCB hvor sekvensen blir bekreftet ved fullstendig sekvensering.
2,8 kb EcoRI-BamHI fragmentet som begynner like før ATG til pepC og blir avsluttet etter pepC terminatoren blir renset og ligert sammen med 520 bp BamHI-EcoRI fragmentet til pFBY129 (deponert som DSM 7016) og som inneholder gjær GallO promoteren, inn i SnaBI setet til gjær to mikron basert vektor pFBY25 (deponert som DSM 7020). Et korrekt plasmid blir identifisert ved restriksjonsspaltninger.
Dette plasmidet, pFBY138, blir transformert inn i gjær og vist å produsere pepC protein når genfusjonen blir indusert av galaktose.
Eksempel 9: Isolering av en DNA probe for screening for A . niser subtilisin- lignende serinproteaser
Eksempel 9. 1: Konstruksjon av degenererte PCR ( polymerasekjedereaksjori) primeren Polymerasekjedereaksjonen (Saiki et al., Science 230:1350-1354 (1985)) blir anvendt for å isolere prober for denne screeningen. De to regionene inneholdende aktiv sete resi-diene histidin og serin blir konservert blant forskjellige proteaser av subtilisin-klassen. En konsensus aminosyresekvens blir avledet fra hver av disse regionene og DNA-sekvensene som kan kode for disse to aminosyresekvensene blir bestemt. For å redusere degenerasjonsnivået blir to primere for hver av de konserverte regionene konstruert. PCRoligo 1 og PCRoligo2 (vist i henholdsvis SEQ LD NO. 8 og 9) tilsvarer den His aktive seteregionen og PCRoligo 3 og PCRoligo 4 (vist i SEQ LD NO. 10 og 11) tilsvarer den Ser aktive seteregionen. For å lette senere subkloning av PCR produktene inneholder PCRoligoene 1 og 2 et BamHI og PCRoligo 3 og 4 et EcoRI sete nære ved deres 5-ender.
Eksempel 9. 2: Amplifikasion av A . niser genomisk DNA
A. niger genomisk DNA blir isolert som beskrevet i eksempel 1. Fire amplifikasjonsre-aksjoner blir utført med anvendelse av en farget kombinasjon av de fire PCRoligoene beskrevet ovenfor. Reaksjonsblandingen for polymerasekjedereaksjon inneholder 100 ng total genomisk A niger DNA, 100 pmol av hver av primerene, 10 mM TRIS-HC1,50 mM KCI, 1,5 mM MgC12,1 mg/ml gelatin, (pH 8,3) og 5 enheter Taq DNA polymerase i totalt 50 ul. DNA blir denaturert ved 94°C i 30 sekunder og primerene blir deretter sammensmeltet ved 42°C i 40 sekunder og ekstensjonstrinnet blir utført ved 72°C i 60 sekunder. Disse tre trinnene blir deretter gjentatt 40 ganger.
Eksempel 9. 3: Isolering oe karakterisering av PCR produktene
Produktene fra amplifikasjonsreaksjonene blir separert på en 1% agarosegel og DNA-fragmentene blir isolert fra gelen ved elektroeluering som beskrevet ovenfor. De isolerte fragmentene (200-300 ng) blir ekstrahert med fenol og deretter med kloroform og presipitert med etanol. Etter sentrifugering blir DNA pelletene tørket og deretter løst opp i 10 jil TE buffer. Dette DNA blir deretter spaltet med 10 enheter BamHI og EcoRI reten-sjonsenzymer i et volum på 20 ul i 1 time ved 37°C i bufferen anbefalt av forhandleren (BRL). Etter ekstraksjon med fenol og kloroform og presipitering med etanol blir i spaltet DNA pelletert, tørket og på ny løst opp i 10 ul TE buffer. DNA konsentrasjonen blir vurdert ved agarosegelelektroforese etterfulgt av visualisering av DNA båndet under UV lys.
pTZ18R vektoren blir preparert ved spaltning med BamHI og EcoRI under betingelsene anbefalt av forhandleren (BRL) og deretter ekstrahert og etanolpresipitert som beskrevet ovenfor.
100 ng av de isolerte PCR fragmentene blir ligert sammen med 100 ng av den preparerte pTZl 8R vektoren beskrevet ovenfor i et volum på 20 ul med en enhet T4 DNA ligase. Bufferbetingelsene som blir anvendt er de som blir foreslått av forhandleren (BRL). Etter inkubering av reaksjonsblandingen ved 16°C i 16 timer blir den anvendt for å transformere E. coli DH5aF stammen. Cellene blir sådd ut på LB agarskåler inneholdende 25 ug/ml ampicillin, 0,005% Xgal, 0,05 mM IPTG og inkubert over-natt ved 37°C.
Flere enkelte hvite kolonier blir anvendt for å preparere over-natt kulturer i 5 ml LB-medium supplert med 0,1% glukose og 25 ug/ml ampicillin. Disse kulturene blir anvendt for å isolere plasmid DNA ved anvendelse av mini prepmetoden til Holmes og Quigley (Holmes, D.S. og Quigley, M.„ Anal Biochem. 114:193 (1981). Plasmidene blir spaltet med BamHI og EcoRI restriksjonsenzymer ifølge anbefalningene til forhandleren (BRL). Plasmider som inneholder fragmentene blir ytterligere analysert.
Innskuddene av selekterte plasmider blir sekvensert ved dideoksy-kjede termineringsmetoden (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei USA 74:5463-67 (1977) ved anvendelse av syntetiske oligonukleotid primere og sekvenase (United Biochemical Corp.).
Eksempel 9. 4: Computeranalvse av sekvensene til PCR- produktene Nukleotidsekvensene til ovennevnte innskudd blir sammenlignet med alle DNA-sekvensene i kombinert GenBank på EMBL databasene. En av disse som viser sterk homo-logi med DNA-sekvensene kodende for subtilisintypeproteaser blir valgt som probe og betegnet PCR-probe, for påfølgende screening av A niger genomisk bibliotek. Sekvensen til dette fragmentet (uten PCR-primerene) er det mellom nukleotidene 1474 og 2020 i sekvensen vist i SEQ LD NO. 6.
Eksempel 10: Screening av A niser N400 biblioteket med PCR- probe
Filtere for plaquehybridisering av det genomiske biblioteket til Aspergillus niger stamme N400 beskrevet ovenfor (eksempel 1) blir preparert og prehybridisert ifølge eksempel 3.
Etter hybridisering i 14-16 timer ved 65°C blir filtrene vasket en gang i 250 ml 2xSSC, 0,1% SDS i en halv time ved romtemperatur etterfulgt av vasking ved romtemperatur i 2 skift av 250 ml 0,2xSSC, 0,1% SDS hver i 20 min. og til slutt to ganger i 250 ml 0,2xSSC, 0,1% SDS ved 65°C hver i 20 min. Filtrene blir tørket og eksponert for Kodak XAR5 film i én til tre dager ved -70°C ved anvendelse av en intensiverende skjerm.
På denne måten blir fem positive signaler oppnådd fra de 6 screenede platene. Positive plaque blir skjøvet ut med en steril Pasteur pipette ved forsiktig posisjonering av skålene på autoradiogram ved anvendelse av blekkmarkører. Agarstykkene inneholdene de positive plaquene blir tilsatt til 1 ml SM og 2,5 ul kloroform blir tilsatt. Fagene blir latt diffundere ut av agaren i 1 time ved romtemperatur med sporadisk vortex behandling og deretter inkubert over-natt ved 4°C. Agar og celledebriet blir fjernet ved sentrifugering i 5 min., 2,5 ul kloroform blir tilsatt og fagstokkene blir lagret ved 4°C.
De positive klonene blir betegnet Xa, Xh, Xc, Xd og Xe. På grunn av at fagene blir sådd ut i høy tetthet blir de positive plaquene renset to ganger ved utsåing av disse ved en lav tetthet og ved å gjenta hele prosedyren med rolikaplating, hybridisering og plukking av positive plaque.
Eksempel 11: karakteriserin<g> av lambda klonene
Eksempel 11. 1: Isolering av lambda DNA og restriksionsanalyse av A . niser N400 pepD kloner
Lambda DNA blir isolert som beskrevet i eksempel 4.1.
Det er bestemt ved restriksjonsanalyse at alle fem fagene Xa til Xe inneholder innskudd som er avledet fra samme region av A. niger genomet og et dele restriksjonskart av den genomiske regionen er konstruert. 2 ug fag DNA blir spaltet med 20 enheter EcoRI eller BamHI i et volum på 20 ul i 11. ved 37°C i bufferen anbefalt av forhandleren (BRL) og deretter oppvarmet ved 65°C i 10 min. Prøvene blir kjørt på en 1,7% agarosegel og fotografert. DNA blir overført til nitrocellulosemembranen og hybridisert med merket PCR probe.
Det fremgår klart fra disse spaltningene at de 5 fagene inneholder en omtrentlig 5,5 kb overlappende region som hybridiserer til PCR-proben og derfor inneholder det meste, om ikke hele det tilsvarende A. niger genet. Et 6,0 kbp langt BamHI fragment inneholdt denne regionen og blir valgt for videre analyse.
Eksempel 12: Kloning av PEPD inn i et plasmid og sekvensering derav og karakterisering
Eksempel 12. 1: Konstruksjon avpTZPEPD
6,0 kb BamHI fragmentet blir inkubert med restriksjonsenzym Hindlll. Etter ekstrahering med kloroform blir DNA presipitert, pelletert ved sentrifugering, oppløst i prøve-
buffer og utsatt for elektroforese på en 0,6% agarosegel i 1 x TBE buffer. Et gelstykke inneholdende 3,0 kbp BamHI-Hindlll fragmenter blir isolert og DNA blir elektro eluert. Dette blir deretter ekstrahert med 100 fil kloroform og etanolpresipitert og på ny løst opp i 40 ml TE buffer. DNA konsentrasjonen blir vurdert ved agarose gelelektroforese etterfulgt av visualisering av båndet under UV lys.
pTZlSR vektoren blir dannet ved spaltning med BamHI og HindLII under betingelsene anbefalt av forhandleren (BRL). DNA blir ekstrahert med fenol, fenol/kloroform (1:1) og kloroform og DNA etanol blir presipitert.
100 ng av hver av de ovennvente fragmentene blir ligert sammen i et reaksjons volum på 25 fil inneholdende bufferen anbefalt av BRL pluss ATP (1 mM), 1,5 U T4 DNA ligase (BRL). Reaksjonsblandingen blir inkubert i 161. ved 16°C og deretter anvendt transformert E. coli DH5aF. Cellene blir sådd ut på LB agarskåler inneholdende 25fig/ml ampicillin, 0,05% Xgal, 0,05 mM LPTG og inkubert over-natt ved 37°C.
Flere enkeltvise hvite kolonier blir anvendt for å preparere over-natt kulturer i LB medium supplert med 0,1% glukose og 25 mg/ml ampicillin. Disse kulturene blir anvendt for å isolere plasmid ved anvendelse av miniprepmetoden Holmes og Quigley [Holmes, D.S. og Quigley, M., Anal. Biochem. 114:193(1981)]. Plasmidene blir spaltet med flere restriksjonsenzymer ifølge forhandlerens anbefalinger (BRL) og i nærvær av RNase A (0,5 mg/ml), og produktene blir analysert på en agarosegel. Plasmider som gir opphav til BamHI-Hindlll fragmenter med ventet størrelse blir valgt og E. coli cellene som inneholder disse blir oppbevart på glycerol ved -20°C. Dette plasmidet blir betegnet pTZPEPD (deponert som DSM 7409).
Eksempel 12. 2; Nukleotidsekvensen til pepD
PepD subklonen som er et 3,0 kbp BamHI-Hindlll fragment i pTZ18R vektoren blir fullstendig sekvensert ved dideoksykjede termineringsmetoden [Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74:5463-67(1977)] ved anvendelse av syntetiske oligonukleotid primere og sekvenase (United States Biochemical Corp.).
Den fullstendige nukleotidsekvensen er presentert i sekvenslisten under SEQ LD NO. 6. Den åpne leserammen blir identifisert ved sammenligning ved andre kjente subtilisinfa-milier serinproteaser og dette blir bekreftet ved transkripsjonskartlegning.
Eksempel 5. 3: RNA kartlegging av PEPD
Totalt RNA blir preparert fra malt frysetørket mycel som blir dyrket på minimal medium med glukose som karbonkilde og ammonium som nitrogen kilde ifølge metoden til Frederick og Kinsey [Curr. Genet. 18:53-58(1990)]. 5-enden til messenger RNA blir identifisert ved hybridisering av total RNA med 32-P endemerket oligonukleotid, oligo A (komplementært med nukleotidene 851 til 876 av SEQ LD NO. 6) og størrelsesbereg-ning av "runoff' transkriptet produsert av revers transkriptase på en sekvenseringsgel ved sammenligning ved sekvenserningsreaksjoner produsert ved dideoksy sekvensering med samme oligonukleotid (Maniatis et al., Molecualr cloning. A laboratory Manual. Cold Spring harbor laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). De nøyaktige spleisesetene til interonene blir identifisert ved kloning og sekvensering av en del cDNA kopi av pepD message. Første tråd syntesen blir utført ved standardmetoder (Maniatis et al., op. eit.), med unntagelse av at det primende oligonukleotidet er oligo C (komplementær med nukleotidene 1914 til 1941 ac SEQ LD NO. 6). Dette cDNA blir utsatt for PCR ved anvendelse av oligoene B (tilsvarende nukleotidene 1102 til 1129 av SEQ LD NO. 6) og C og klonet inn i pTZl 8R. Det er å bemerke at nukleotidene 1107-1109 (GGT) blir erstattet av ATC i oligoB som dermed danner det nye BamHI setet. Likeledes ble nukleotidene 1932 (A) og 1935 (A) erstattet med henholdsvis G og T, i oligoC som dermed dannet et nytt Hindin sete. Begge trådene til de to uavhengige klonene blir fullstendig sekvensert. Den totale lengden til mRNA produsert av pepD genet blir bestemt ved Northern analyse ved anvendelse av 3,0 kb EcoRI-HindlLI fragmentet som probe (Maniatis et al., op. eit) og blir bestemt til å være mellom 1,4 og 1,7 kb som tilsvarer det som er ventet ut fra størrelsen til den åpne leserammen og posisjonen til transkripsjons-startsetet.
Eksempel 13; Genomisk oppbrvtnin<g> av PEPD
Eksemoel 13. 1: Konstruksjon av pPEPCPYRA
4 kb Xbal fragmentet inneholdende pyrA genet blir spaltet fra pAXI (DSM 7017) og renset fra vektorsekvensene. 2 ug pTZPEPD blir spaltet med Nhel og Ncol ifølge forhandlerens abefalninger og deretter fenolekstrahert, etanolpresipitert og på ny løst opp i 20 ul vann. Dette DNA blir deretter behandlet med bakteriell alkalisk fosfatase for å fjerne S'-fosfatgruppene som anbefalt av forhandleren. 5,3 kb fragmentet som mangler 0,6 kbp Nhel-Ncol fragmentet som inneholder His og Ser aktive seter blir renset fra en gel.
Begge ovennevnte fragmenter blir behandlet med T4 polymerase ifølge forhandlerens instruksjoner og fenolekstrahert og etanolpresipitert. De to fragmentene blir blandet sammen og ligert. Etter transformering av E. coli blir koloniene som inneholder de riktige plasmidene identifisert ved restriksjonsspaltning av mini-plasmid preparatene.
pPEPDPYRA består av pTZ18R vektoren inneholdende et BamHI-HindlLT fragment som inneholder pepD genet som har det sentrale Nhel-Ncol fragmentet som koder for His og Ser aktive seter erstattet av en Xbal DNA fragment kodende orotidin monofosfat dekarboksylase.
Eksempel 13. 4: Transformerin<g> avÆ niser
10 ug plasmid pPEPDPYRA blir spaltet fullstendig av EcoRI. Fullstendigheten av spaltningen blir undersøkt ved å kjøre en alikvot på en gel og gjenværende DNA blir fenolekstrahert, etanolpresipitert og resuspendert i 20 ul sterilt vann.
Konidale sporer av auxotrof! A. niger An8 (DSM 3917) blir dyrket i 4 dager ved 28°C på fullstendig medium helt til fullstendig sporulert. 2x10* konidiosporer blir anvendt for å inokulere 200 ml minimalmedium supplert med 1 g/l arginin og uridin. ;Etter 20 timers vekst ved 28°C ved 180 rpm blir mycelet testet ved filtrering gjennom Miracloth, vasket to ganger med 10 ml 0,8 M KCI, 50 mM CaCl2 og resuspendert i 20 ml 0,8 M KCI, 50 mM CaCl2,0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries). Blandingen blir inkubert i et ristende vannbad (30°C, 50 rpm) helt til tilstrekkelig protoplaster er frigjort (detektert mikroskopisk etter 90-120 min.). Protoplastsuspensjonen blir filtrert gjennom en glassullplugg i en trakt for å fjerne myceldebris. Protoplastene blir pelletert ved svak sentrifugering (10 min., 2000 rpm) ved romtemperatur og vasket to ganger med 10 ml 0,8 M KCI, 50 mM CaCl2. Protoplastene blir til slutt resuspendert i 200-500 ;ul 0,8 M KCI, 50 ,mM CaCl2 for å oppnå en konsentrasjon på 1x10^ sferoplaster pr. ml. ;For transformasjon blir en 200 ul alikvot av protoplastsuspensjonen inkubert med 5 ug EcoRI splatet pPEPDPYRA 50 ul PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5,50 mM CaCl2, 25% PEG 6000). Inkubasjonsblandingen blir oppbevart på is i 20 min. og ytterliger 2 ml PCT blir tilsatt og blandingen inkubert i ytterligere 5 min. ved romtemperatur. 4 ml 0,8 M HC1, 50 mM caCl2 blir tilsatt og 1 ml alikvoter av den endelige transformeringsoppløs-ningen blir blandet med flytende minimal agar medium (minimalmedium + l g/l arginin + 10 g/l Bacto/Agar (Difco)), stabilisert med 0,8 M KCI. Blandingen blir øyeblikkelig helt på agarskåler av samme medium og inkubert ved 30°C. ;Etter 2-3 dagers vekst ved 28°C fremstår stabile transformanter som vigurøst voksende og sporulerende kolonier på en bakgrunnsvekst av mange hundre små, antageligvis mislykkede, transformanter. ;Eksempel 13. 5: Identifikasjon av gene disruptions ;Fra de stabile koloniene blir individuelle sporsuspensjoner dannet og strøket ut på friske minimal pluss argininskåler. Enkelt kolonier blir selektert og på ny strøket ut for å oppnå rene kulturer. Disse blir anvendt for å inokulere 200 ml flytende minimal medium supplert med 1 g/l arginin. Etter 241. ved 30°C risting ved 180 rpm blir mycelet testet på filterpapiret og stykket blir frysetørket. Etter tørking blir DNA preparert fra de individuelle stykkene ved maling av stykkene til et fint pulver med en morter. 60 mg av dette pulveret blir resuspendert i 3 ml 1% natriumdodecylsulfat, 0,1% Tween 20,1 M ammoniumacetat ved vortex behandling. Dette blir oppvarmet ved 65°C i 20 min. med sporadisk blanding. Celledebriet blir separert fra DNA oppløsningen ved sentrifugering ved 15000 rpm i 5 min. Supernatanten blir ekstrahert 2 ganger med fenol, to ganger med kloroform og etanolpresipitert. DNA pelleten blir på ny løst opp i 100 ul sterilt TE. 20 ul av hvert DNA blir spaltet med Nhel og Ncol i nærvær av 1 fig RNAaseA ilt. Dette blir separert på en agarosegel og overført til nitrocellulosemembran og bakt. Hindin-BamHI fragmentet fra pTZPEPD inneholdende PEPD blir renset, merket ved nick translasjon og anvendt for å probe filtrene. Stamme som har en ødeleggelse i pepD genet blir lett gjenkjent ved at de mangler 0,6 kb Nhel-Nhol hybridiseringsfragmentet samt at de har endret mobilitet i de andre to flankerende fragmentene. ;En av disse stammene blir sådd ut på medium inneholdende uridin og 5-fluoro-orotinsyre. Mutantene til pyrimidin auxotrofi blir uidentifisert ved den sterkere veksten på dette mediet og plukket ut og renset ved utstryking for enkeltkolonier. ;Eksempel 13. 6: Produksjon av interferon i pepD' Æ niger stamme ;En av pepD- A. niger An8 stammene isolert i eksempel 6.5 blir anvendt som en vert for påfølgende transformasjon med pyrA<+> inneholdende plasmider og ekspresjonskassetter inneholdende et heterologt gen for interferon. ;Konidiale sporer til uridin auxotroft pepD~mutant til A. niger An8 blir dyrket i 4 dager ved 28°C i fullstendig medium helt til de var fullstendig sporulerte. 2x10<&> konidiosporer blir anvendt for å inokulere 200 ml minimal medium supplert med 1 g/l arginin og uridin. ;Etter 20 timers vekst ved 28°C og 180 rpm blir mycelet høstet ved filtrering gjennom Miracloth, vasket to ganger med 10 ml 0,8 M KCI, 50 mM CaCl2 og resuspendert i 20 ;ml 0,8 M KCI, 50 mM CaCl2,0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries). Blandingen blir inkubert i et ristende vannbad (30°C, 50 rpm) helt til tilstrekkelige protoplaster er frigjort (detektert mikroskopisk etter 90-120 min.). Protoplastsuspensjonen blir filtrert gjennom en glassullplugg i en trakt for å fjerne myceldebris. Protoplastene blir pelletert ved svak sentrifugering (10 min. 2000 rpm) ved romtemperatur og vasket to ganger med ;10 ml 0,8 M Kcl, 50 mM CaCl2. Protoplastene blir til slutt resuspendert i 200-400ul 0,8 ;M KCI, 50 mM CaCl2 for å oppnå en konsentrasjon på lxlO^/ml. ;For transformasjon blir en 200 ul alikvot av protoplastsuspensjonen inkubert med 5 ug pCG59D7 (DSM 3968) og 50 ug pGIIss-IFN AMI 19 eller pGH-LFN AMI 19 DNA (begge plasmidene er fullstendig beskrevet i EP-søknad 0.421.919), 50 ul PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl2,25% PEG 6000). Inkubasjonsblandingen blir oppbevart på is i 20 min., ytterligere 2 ml PCT blir tilsatt og blandingen blir inkubert i ytterligere 5 min. ved romtemperatur. 4 ml 0,8 M KCI, 50 mM CaCl2 blir tilsatt og 1 ml alikvoter av den endelige transformasjonsoppløsningen blir blandet med flytende minimal agar medium (minimal medium +1 g/l arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)), stabilisert med 0,8 M KCI. Blandingene blir øyeblikkelig helt på agarskåler med samme medium og inkubert ved 30°C. ;Etter 2-3 dagers vekst ved 28°C fremkommer stabile transformanter som kraftig voksende og sporulerende kolonier på en bakgrunnsvekst ved mange hyndre små, sannsynligvis mislykkede, transformanter. ;Transformantene blir plukket og analysert for interferon ekspresjon. Interferon aktiviteten blir bestemt ifølge fremgangsmåten til Armstrong (J.A. Armstrong. Appl. Microbiol. 21, 732 (1971)) ved anvendelse av humane CCL-23 celler og vesikulær stomatitis virus (VSV) som utfordrende virus. ;Konidial sporer fra transformantene blir individuelt predyrket inn i 50 ml av et prekul-turmedium (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) 3 g/l, NH4CI2 g/l, KH2PO4 0,5 g/l, NaCl 0,5 g/l, Mg2S04.7H20 0,5 g/l, Ca2S04.2H20 0,5 g/l, pH 7,0, 1% arginin). Prekulturen blir inkubert i 72 timer ved 250 rpm og 28°C. 10% av prekulturen blir anvendt for å inokulere 50 ml av hovedkulturmediet (soyabønnemel 20 g/l, pectin Slow Set 5 g/l, 1% arginin). Kulturen blir dyrket opp i 72-96 timer ved 250 rpm og 28°C. ;Ved forskjellige tidspunkter (hver 20. time) blir prøver tatt ut, cellene blir pelletert ved sentrifugering og brutt opp ved frysetørking og tørr maling. Supernatanten og celleek-straktene blir begge testet for interferonaktivitet som beskrevet (ovenfor). Hovedmengden av interferonaktiviteten blir funnet utskilt i mediet i transformanter inneholdende pGILss-IFN AMI 19, mens i transformanter inneholdende pGH-LFN AMI 19 er den hovedsakelig i celleekstraktet. ;Eksempel 14: Overekspresjon av pepD i A . niser ;Eksempel 14. 1: Overekspresjon av multiple kopier ;A. niser An8 blir transformert med 1 ug pAXI pluss 10 (xg pTZPEPD for å tilveiebringe uridin fotofer. Kolonier blir renset og DNA preparert som beskrevet ovenfor. Southern bloter ved anvendelse av HindLII fragmentet til pTZPEPD viste at noen transformanter hadde én enkelt kopi av pTZPEPD integrert i deres genom, mens andre hadde opptil og over 10 ekstrakopier i deres genom. Disse stammene produserte tilsvarende mer proteolytisk aktivitet og er stabile mitotisk. ;Eksempel 14. 2: Overekspresjon av <p>epD fra <g>enfusioner ;En genfusjon blir konstruert bestående av A. niger pyruvatkinase promoter regionene og av de kodende og terminator regionene til A. niger pepD genet. Fusjonen blir konstruert ved rekombinant pCR (R. Higuchi: Recombinant PCR s 177-183 i Innis et al., (eds) PCR Protocols, Academic Press, Inc. (1990)). Fire oligonukleotidprimere blir konstruert og fusoligol, 2 og 3, er vist i SEQ LD NO. 12,13 og 14, mens fusoligo 4 er komplementær til sekvensen mellom nukleotidene 2858 og 2874 i SEQ LD 1. Fusoligo 1 hybridiserer til pki promoteren 0,75 kbp oppstrøms ved ATG startkodonet. Fusoligo 2 og 3 er delvis overlappende på komplementære tråder, begge inneholder sekvenser av pki promotoren rett oppstrøms fra ATG translasjonsstartkodonet, selve ATG kodonet og også sekvenser til pepD kodende regionen rett nedstrøms for ATG kodonet. Fusoligo 4 hybridiserer til pepD gen nedstrømsregionen, 0,65 kbp nedstrøms for translasjons stoppse-tet. To PCR reaksjoner blir utført vesentlig som beskrevet ovenfor. I den første blir et 0,75 kbp pki promoter fragment amplifisert ved anvendelse av fusoligo 1 og 2 og pGWl 100 (DSM 5747) som templat. I den andre blir 2,0 kb fragmentet som inneholder pepD kodende og termineringsregioner amplifisert ved anvendelse av fusoligo 3 og 4 og pTZPEPD som templat. Amplifikasjonsproduktene blir renset fra agarosegel, kombinert, denaturert og på ny forseglet. De to fragmentene danner homo- og også heterodup-lekser i løpet av gjensammensmeltningsreaksjonen på grunn av deres overlappende ender forårsaket av fusoligo 2 og 3. Denne sammensmeltede blandingen blir deretter re-amplifisert ved PCR ved anvendelse av to "utenforliggende" primere (fusoligo 1 og 4). Produktet fra denne reaksjonen blir isolert, renset og subklonet inn i en plasmidvektor. ;De korrekte plasmidene blir identifisert ved spaltning av miniplasmidpreparater. To blir valgt og innskuddet blir fullstendig sekvensert ved anvendelse av syntetiske oligonukleotider. Et plasmid som inneholder en perfekt fusjon av pyruvatkinasepromoteren til pepD åpne leserammen, som er betegnet pPKIPEPD A, blir anvendt med p AXI for å kotransformere A. niger An8 til uridin prototrofi. ;Tilstedeværelse av pki-pepD fusjonen blir bekreftet ved å danne DNA fra individuelt rensede transformanter og anvendelse derav for Southern analyse ved anvendelse av prober fra pki og pepD. Stammene med en eller flere kopier av denne genfusjonen integrert inn i deres genom er vist å produsere mer protolytisk aktivitet når cellene blir dyrket hurtig på glukose som C kilde. ;Eksempel 15: Ekspresjon av pe<p>D i andre organismer: Ekspresjon i gjær ;Plasmid pTZPEPD blir spaltet av EcoRI, gjort buttendet med T4 polymerase og religert for derved å fjerne EcoRI setet fra polylinkerregionen. Det resulterende plasmidet blir deretter in vitro mutagenisert med 4 syntetiske oligonukleotider, oligogjær 1,2, 3 og 4 vist i sekvenslisten under SEQ ID No. 15,16,17 og 18. Oligogjær 1 konstruerer et EcoRI sete like oppstrøms for ATG til pepD og de andre tre "løkker" alt av hver av de tre intronene. Dette danner plasmid pTZPEPDa der sekvensen er bekreftet ved fullstendig sekvensering. ;2,2 kb EcoRI-BamHI fragmentet som begynner like før ATG til pepD og avlsuttes etter terminatorregionen blir renset og ligert sammen med 520 bp BamHI-EcoRI fragmentet til pFBY129(DSM 7016) som inneholder gjær GallO promoteren, inn i SnaBI setet til gjær to mikron basert vektor pFBY25 (DSM7020). Et korrekt plasmid blir identifisert ;ved restriksjonsspaltninger. Dette plasmidet pGALPEPD blir transformert inn i gjær og vist å produsere pepD proteinet når ekspresjonen av genfusjonen blir indusert av galaktose. ;Deponering av mikroorganismer ;Følgende mikroorganismer er deponert ifølge Budapest avtalen til Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg lb, D-3300 Braunschweig: ;Sekvens liste ;Generell Informasjon: Antall sekvenser: 18 ;Informasjon for SEQ ID NO: 1: Sekvenskarakteristikk: Lengde: 3220 basepar Type: nukleinsyre Trådtype: dobbel Topologl: lineær Molekyltype: DNA (genomisk) ;Opprinnelig kilde: Organisme: Aspergillus niger Stamme: N400 ;Øyeblikkelig kilde: ;klon: pTZPEPC ;Trekk: ;Navn: promoter beliggenhet: 1..377 ;Trekk: ;Navn: signalpeptid Beliggenhet: 378..435 ;Trekk: ;navn: modent peptid ;Annen informasjon: subtilIsin-type protease; PEPC til Aspergillus niger; ;produkt av genet pepC ;Trekk: ;navn: intron ;beliggenhet: 757..826 ;Trekk: ;Navn: kodende sekvens (inkludert stopp kodon) ;Beliggenhet: kobler (388..756, 827..2059) ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO: 1: ;GGATCCATCC ATTCACTCAG CTTTCCTTGT CGGTGGACTG TCGAGTCTAC CCCAGGTCCC 60 ;"ÅGTTTCTCCG ACCGCGCTAA TCGGGGGCTA TCGACAACCA GTGATTCTGC TGTGTCATCC 120 ;GGGCGTATGG CGTAAATTAC CGTATGCCGG TTGCATCATC ACCTGCIQCC CTB3CCTCTT 180 ;GCTGAATACC GTCCGCCATC CATCTGTCCT CCTCTCCCTC TCTCTKZAT2 TCCAACCTCC 240 ;CCTTCCTCCT CCCTCCCTCC TICTCTTCAT CTTTATCTTG ACCTATTTCC ATCTTTCTCA 300 ;TCTCTCAGTT GTTTCAATCT CTTGTACACG CCCTACTCAC TCTCCTTTTC ACCGGGCTGC 360 ;TGTGGGTTCC GTCTTAAGCT ATCCATC ATG AAG GGC ATC CTC GGC CTT ICC 411 ;Met Lys Gly Ile Leu Gly Leu Ser ;-16 -15 -10 ;CTC CTC CCG TTG CTC ACG GCT GCG TCG CCC GTC TTC GTT GAC TCC ATC 459 ;Leu Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ala Ser Pro Val Phe Val Asp Ser Ile ;-5 1 5 ;CAT AAT GAA GCT GCC CCC ATC TTG TCT GCT ACC AAC GCG AAG GAG GTT 507 ;His Asn Glu Ala Ala Fro Ile Leu Ser Ala Thr Asn Ala Lys Glu Val ;LO 15 20 ;CCC GAC TCC TAC ATC GTC GTT TTC AAG AAG CAC GTC ACT TCA GAG CTG z! 35 ;Pro Asp Ser Tyr Ile Val Val Phe Lys Lys His val Thr Ser Glu Leu ;25 30 35 40 ;GCT TOG GCT CAC CAC AGC TGG GTG CAG GAC ATC CAT GAC TOT CAG AGC 603 ;Ala Ser Ala His His Ser Trp Val Gin Asp Ile His Asp Ser Gin Ser ;45 50 55 ;GAG CGG ACT GAG CTG AAG AAG CGG TCG CTC TTC GGC CTT GGG GAC GAG 651 ;Glu Arg Thr Glu Leu Lys Lys Arg Ser Leu Phe Gly Leu Gly Asp Glu ;60 65 70 ;GTC TAT CTG GGT CTC AAG AAC ACC TIT GAC ATT GCT GGT TCT CTG ATC 699 ;Val Tyr Leu Gly Leu Lys Asn Thr Phe Asp Ile Ala Gly Ser Leu Ile ;/; 75 80 85 ;GGT TAC TCT GGT CAC TTC CAC GAG GAT GTC ATC GAG CAA GTC CGC AGA 747 ;Gly Tyr Ser Gly His Phe His Glu Asp Val Ile Glu Gin Val Arg Arg ;90 95 100 ;CAC CCC GAT GTGAGTTACA CCCCCTATCT AAGCATCCCT CGTTATCTCT 796 ;His Pro Asp ;105 ;AAGATAAGCT TCTAACATCG GTCAATGTAG GTC GAT TAC ATC GAG CGG GAT TCC 850 ;Val Asp Tyr Ile Glu Arg Asp Ser ;110 115 ;GAA GTT CAC ACC ATG GAA GGG GCC ACC GAA AAG AAC GCC CCT TGG GGT 898 ;Glu Val His Thr Met Glu Gly Ala Thr Glu Lys Asn Ala Pro Trp Gly ;120 125 130 ;CTG GCT CGT ATC TCT CAC CGT GAT AGC CTG ACC TTC GGT AAC TTC AAC 946 ;Leu Ala Arg Ile Ser His Arg Asp Ser Leu Thr Phe Gly Asn Phe Asn ;135 140 145 ;AAG TAC CTG TAT GCC TCC GAG GGG GGT GAG GGC GTT GAC GCC TAC ACC 994 ;Lys Tyr Leu Tyr Ala Ser Glu Gly Gly Glu Gly Val Asp Ala Tyr Thr ;150 155 160 ;ATT GAC ACG GGT ATC AAC GTT GAC CAC GTT GAC TTC GAG GGC CGT GCC 1042 ;Ile Asp Thr Gly Ile Asn Val Asp His Val Asp Phe Glu Gly Arg Ala ;165 170 175 ;ACT TGG GGC AAG ACA ATC CCT ACC AAC GAT GAA GAT CTC GAT GGC AAT 1090 ;Thr Trp Gly Lys Thr Ile Pro Thr Asn Asp Glu Asp Leu Asp Gly Asn ;180 185 190 195 ;"GGT CAC GGA ACT CAC TGC TCC GGA ACC ATG GCT GGT AAG AAG TAC GGT 1138 ;Gly His Gly Thr His Cys Ser Gly Thr Met Ala Gly Lys Lys Tyr Gly ;200 205 210 ;GTT GCC AAG AAG GCC AAC CTC TAT GCT GTC AAG GTC CTC CGG TCG AGC 1186 ;Val Ala Lys Lys Ala Asn Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Arg Ser Ser ;215 220 225 ;GGC TCT GGC ACC ATG TCT GAT GTC GTT TCT GGT GTC GAG TAT GCC GTC 1234 ;Gly Ser Gly-Thr Met Ser Asp Val Val Ser Gly Val Glu Tyr Ala Val ;230 235 240 ;CAG GCT CAT ATC AAG AAG GCC AAG GAT GCC AAG AAC GGC AAG GTC AAG 1282 ;Gin Ala His Ile Lys Lys Ala Lys Asp Ala Lys Asn Gly Lys Val Lys ;245 250 255 ;GGA TTC AAG GGC AGC GTT GCC AAC ATG AGT CTC GGT GGT GGC AAG TCT 1330 ;Gly Phe Lys Gly Ser Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly Gly Lys Ser ;260 265 270 275 ;AAG ACC CTC GAG GAT GCT GTT AAC GCT GGT GTT GAG GCT GGT CTT CAC - 1378 ;F..ys Thr Leu Glu Asp Ala Val Asn Ala Gly Val Glu Ala Gly Leu His ;280 285 290 ;TTC GCC GTT GCC GCC GGT AAT GAC AAT GCT GAT GCT TGC AAC TAC TCT 14.-lu ;Phe Ala Val Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asp Ala Cys Asn Tyr Ser ;295 300 305 ;CCT GCT GCT GCC GAG AAG GCC ATC ACC GTT GGT GCC TCG ACA CTT GCT 1474 ;Pro Ala Ala Ala Glu Lys Ala Ile Thr Val Gly Ala Ser Thr Leu Ala ;310 315 320 ;GAC GAG CGT GCG TAC TTC TCC AAC TAC GGA GAG TGC ACT GAC ATC TTC 1522 ;Asp Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Tyr Gly Glu Cys Thr Asp Ile Phe ;325 330 335 ;GCT CCT GGT CTC AAC ATC CTG TCC ACC TGG ATT GGC AGC AAC TAC GCC 1570 ;Ala Pro Gly Leu Asn Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Ser Asn Tyr Ala ;346 345 350 355 ;ACC AAC ATC ATC TCT GGC ACT TCC ATG GCC TCT CCT CAC ATT GCT GGC 1618 ;Thr Asn Ile Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His Ile Ala Gly ;360 365 370 ;CTG CTG GCC TAC TTT GTC TCC CTC CAG CCC TCC TCG GAC TCT GGA TTC 1666 ;Leu Leu Ala Tyr Phe Val Ser Leu Gin Pro Ser Ser Asp Ser Ala Phe ;375 380 385 ;GCT GTT- GAG GAG CTT ACT CCT GCT AAG CTG AAG AAG GAC ATC ATC GCC 1714 ;Ala Val Glu Glu Leu Thr Pro Ala Lys Leu Lys Lys Asp Ile Ile Ala ;390 395 400 ;ATC GCC ACC GAG GGC GCT CTC ACT GAC ATT CCC TCC AAC ACC CCC AAC 1762 ;Ile Må Thr Glu Gly Ala Leu Thr Asp Ile Pro Ser Asn Thr Pro Asn ;405 410 415 ;GTA AGT CAT GCC GCT GTT GGT ATT TAT AAG AGA AAC GAG CTA ACT CAG 1810 ;Val Ser His Ala Ala Val Gly Ile Tyr Lys Arg Asn Glu Leu Thr Gin ;420 425 430 435 ;AAATTC AGC TCC TTG CCT GGA ACG GTG GTG GTT CCG AGA ACT ACA CCG 1858 ;Lys Phe Ser Ser Leu Pro Gly Thr Val Val Val Pro Arg Thr Thr Pro ;440 445 450 ;ACA TCG TTG GCA GCG GTG GCT ACA AGG TCT CCT CTG CCA AGA ACC GCA 1906 ;Thr Ser Leu Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Pro Leu Pro Arg Thr Ala ;455 460 465 ;TCG AGG ACC GTA TTG AGG GTC TCG TTC ACA AGG CCG AAG AGC TGC TCA 1954 ;Ser Arg Thr Val Leu Arg Val Ser Phe Thr Arg Pro Lys Ser Cys Ser ;470 475 480 ;CCG AGG AGC TTG GTG CCA TCT ACA GCG AGA TCC AGG ATG CCG TCG TCG 2002 ;"Pro Arg Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Arg Ser Arg Met Pro Ser Ser ;485 490 495 ;CAT AGA TCA GAA CTC GTG CTT TCC AGA CGT AGA TCG GAA GAC TTG GTT 2050 ;His Arg Ser Glu Leu Val Leu Ser Arg Arg Arg Ser Glu Asp Leu Val ;500 505 510 515 ;TTT TTT TGAGGTATGG GATGGTTGAT CGGACATTTT GGCGCTGGTC TCTTTTTATT 2106 ;Phe Phe ;GTGTTTGGTC TCGAAGACGC TGATGCATTG ACTGTATCGG CTGTATCACT CCGCCCCTGC 2166 ;TTATCTGTTT GGTTCATCTT TATGGTAGTA TACATGTCTG CAAAGAAGGT TTTGTTACCT 2226 ;CACTTAGAAT GTTCTGGTTC TATAACAGAC TGACAATCTC ACTGGGTTAT CTAAGAGATC 2286 ;TGACAAACGC TTGGTAGAAG AGAAAGGTGA GGGAGTAGAC ATCATCAGTC TAAATCCACA 2346 ;TTACGACATG CCGTAATAGA TGAGAGCACC GGATGCTAGC CTTTGTAGAC TACAAAGGAG 2406 ;AAAACCCCTA GGAAAGGTAA TTTCTAAGTC ATGCCCACCT ATTCTCTCTA TCTCTTACTG 2466 ;XGACAGTCAA TCCCATGACG AACAACTAAT GACATCATOG GTCACGCTAC GGGGTCATGC 2526 ;CGAAACGAAG CCGAAGTACT ACTCCTAAGT AAAGCCACAA CTTTGCATAC GTTCATTCAG 2536 ;GAAACGGAAA CACAGGAGGA AGAATATTGA AATATCTTGA GGGGCTTCAT ATAGAATAGA 2646 ;CAGATATATA ATAGTTGTCA AAGTATACAA AAAGACCTCA TGCATGCTAA CAGATAAAGC 2706 ;AAAGGATCTC ATATTGATAG ACTGTGCTGT ATACCACCTC TTAATGCAGC GCCTGCGCTA 2766 ;TGCCACGATG AAATATAAAG GGGGAAAAAG TCATGTAAGT AGTAAGTAGA AACTCCAAGC 2826 ;GCCAAATATA TAGATAGTAA TAGGGGTGGC GACATAATTT GGCTTTTATA CTTGATAGGT 2886 ;TGAACAAATC AAGTGGCCCT GTGCTCGTCT TCCTCCTCAT CACTGCCGGA ATCTTGGTCT 2946 ;TCGTCATCGT CATCGACGTC AAGGTCCTCG TCGGAGTCGC TACCGCCGAA GACGTCGTCG 3006 ;TCCACATCGC TCTCGGCCCA GAAGTCQGAG TCGTCCTTCT CCACAGGTTT GGAGACTGTC 3066 ;GTGGTGGATT CGTGAGTCGG CATGACGAAT CCCTCGGGAA TATCGTTCTT CGAATCCTCC 3126 ;ACGTGCTGTT TCACGATCGA TTTGTATTCG TCGGGGCTCT TGCGCAACAT GACCGAGGCG 3186 ;"^AACGTTGG CQGGGGAAGA GATCCGGGGA ATTC 3!:20 ;Enformasjon for SEQ ID NO: 2: ;Sekvens karakteristikk: ;lengde: 533 aminosyrer ;type: aminosyre ;topologi: lineær ;Molekyl type: protein ;Trekk: subtilisintype protease PEPC til Aspergillus niger; ;produkt fra genet ;pepC; modent peptid med signalpeptid ;Sekvensbeskrivelse: SEQ ID NO: 2: ;Met Lys Gly Ile Leu Gly Leu Ser Leu Leu Pro Leu Leu Thr Ala Ala ;-16 -15 -10 -5 ;Ser Pro Val Phe Val Asp Ser Ile His Asn Glu Ala Ala Pro Ile Leu ;15 10 15 ;Ser Ala Thr Asn Ala Lys Glu Val Pro Asp Ser Tyr Ile Val Val Phe ;20 25 30 ;Lys Lys His Val Thr Ser Glu Leu Ala Ser Ala His His Ser Trp Val ;35 40 45 ;Gin Asp Ile His Asp Ser Gin Ser Glu Arg Thr Glu Leu Lys Lys Arg ;50 55 60 ;.Ser Leu Phe Gly Leu Gly Asp Glu Val Tyr Leu Gly Leu Lys Asn Thr ;65 70 75 80 ;Phe Asp" Ile Ala Gly Ser Leu Ile Gly Tyr Ser Gly His Phe His Glu ;85 90 95 ;Asp Val Ile Glu Gin Val Arg Arg His Pro Asp Val Asp Tyr Ile Glu ;100 105 110 ;Arg Asp Ser Glu Val His Thr Met Glu Gly Ala Thr Glu Lys Asn Ala ;115 120 125 ;Pro Trp Gly Leu Ala Arg Ile Ser His Arg Asp Ser Leu Thr Phe Gly ;130 135 140 ;Asn Phe Asn Lys Tyr Leu Tyr Ala Ser Glu Gly Gly Glu Gly Val Ac-L45 L50 155 lod ;.V.a Tyr Thr Ile Asp Thr Gly Ile Asn Vai Asp His Val Asp Phe Glu 165 170 . 175 ;Gly Arg Ala Thr Trp Gly Lys Thr Ile Pro Thr Asn Asp Glu Asp Leu ;180 185 190 ;Asp Gly Asn Gly His Gly Thr His Cys Ser Gly Thr Met Ala Gly Lys ;195 200 205 ;Lys Tyr Gly Val Ala Lys Lys Ala Asn Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu 210 215 220 ;.-Arg Ser Ser Gly Ser Gly Thr Met Ser Asp Val Val Ser Gly Val Glu 225 230 235 240 ;Tyr Ala Val Gin Ala His Ile Lys Lys Ala Lys Asp Ala Lys Asn Gly ;245 250 255 ;Lys Val Lys Gly Phe Lys Gly Ser Val Ala Asn Met Ser Leu Gly Gly ;260 "265 . 270 ;Gly Lys Ser Lys Thr Leu Glu Asp Ala Val Asn Ala Gly Val Glu Ala ;275 280 285 ;Gly Leu His Phe Ala Val Ala Ala Gly Asn Asp Asn Ala Asp Ala Cys ;290 295 300 ;Asn Tyr Ser Pro Ala Ala Ala Glu Lys Aia Ile Thr Val Gly Ala Ser i-05 310 315 320 ;Thr Leu Ala Asp Glu Arg Ala Tyr Phe Ser Asn Tyr Gly Glu Cys Thr 325 330 335 ;Asp Ile Phe Ala Pro Gly Leu Asn Ile Leu Ser Thr Trp Ile Gly Sev 340 345 350 ;Asn Tyr Ala Thr Asn Ile Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Ser Pro His ;355 360 365 ;Ile Ala Gly Leu Leu Ala Tyr Phe Val Ser Leu Gin Pro Ser Ser Asp ;370 375 380 ;Ser Ala Phe Ala Val Glu Glu Leu Thr Pro Ala Lys Leu Lys Lys Asp 385 390 395 400 ;Ile Ile Ala Ile Ala Thr Glu Gly Ala Leu Thr Asp Ile Pro Ser Asn ;405 410 415 ;Thr Pro Asn Val Ser His Ala Ala Val Gly Ile Tyr Lys Arg Asn Glu ;420 425 430 ;Leu Thr Gin Lys Phe Ser Ser Leu Pro Gly Thr Val Val Val Pro Arg ;435 440 445 ;Thr Thr Pro Thr Ser Leu Ala Ala Val Ala Thr Arg Ser Pro Leu Pro ;450 455 460 ;Arg Thr Ala Ser Arg Thr Val Leu Arg Val Ser Phe Thr Arg Pro Lys 465 470 475 480 ;Ser Cys Ser Pro Arg Ser Leu Val Pro Ser Thr Ala Arg Ser Arg Met ;485 490 495 ;Pro Ser Ser His Arg Ser Glu Leu Val Leu Ser Arg Arg Arg Ser Glu ;500 505 510 ;Asp Leu Val Phe Phe ;515 ;Informasjon for SEQ ID NO: 3: ;Sekvens karakteristikk: ;Lengde: 37 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær ;Molekyltype: DNA ;Trekk: ;Navm: region homolog med A. niger pepC Beliggenhet: 1..19 ;Trekk: ;Navn: region homolog med A. niger- pki genet ;Beliggenhet: 20..37 ;Sekvensbeskrivelse: SEQ ID NO: 3: ;GGCCGAGGAT GCCCTTCATC TTGACGGATG ATTGATC 37 ;Informasjon for SEQ ID NO: 4: ;Sekvenskaraktertrekk: ;Lengde: 44 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær ;Molekyltype: DNA ;Sekvensbeskrivelse: SEQ ID NO: 4: ;GCCGAGGATG CCCTTCATCT TGAATTCGGA TGATTGATCT CTAC 44 ;(2) Informasjon for SEQ ID NO: 5: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 32 basepar ;Type: nukleinsyre Trådtype: enkel ;Topoligi: lineær Molekyltype: DNA ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO: 5: ;GCTCGATGTA ATCGACATCG GGGTGTCTGC GG 32;Informasjon for SEQ ID NO: 6: ;Sekvenskaraktertrekk: ;Lengde: 2993 basepar Type: nukleinsyre Trådtype: dobbel Topologi: lineær Molekyltype: DNA (genomisk) ;Opprinnelig kilde: ;Organisme: Aspergillus niger Stamme: N400 ;Øyeblikkelig kilde: ;klon: pTZPEPD ;Trekk: ;navn: promoter Beliggenhet: 1..829 ;Trekk: ;navn: kodende sekvens Inkludert stopp kodon beliggenhet: koble(830..1153, 1205..1649, 1697..1785, 1841..2233) ;Annen informasjon: subtilisin-type protease PEPD til Aspergillus niger; produkt fra gen pepD ;Trekk: ;Navn: intron ;Beliggenhet: 1154..1204 ;Trekk: ;Navn: intron ;Beliggenhet: 1650..1696 ;Xfekk: ;Navn: intron ;Beliggenhet: 1786..1840 ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO: 6: ;.-AGCTTCGTA TATAATTCCC TTTTGACAAT GTCAAAATCT TTTGGACCAC TAATATAGCT 60 ;GCATGGACCG GTTAATCAGA GGTTATTTTT GTGCTCGAAT GCCGTGTAAC ATTGGATAAT 120 ;AGTACACTCC TTTCACCCAC CCTCAGATGC CCGCCCCCTA CAGTAGGGTT GTCAATATCC 180 ;CTCACCTTTC CAATTGCTGA TGCAGAATGG ACCTGATATA GAAGCCTCAC AGCACCAGAG 240 ;ACTACCGCCT GAAGATGCCA AGTATTGATG GGTTACATTG GCTGGCGAAT AGACTGTTCA 300 ;CCATCCCCCG CCTGTACAAG GCTCATTGAG CGACCTTTAT TTCTATGAAG GCTTCTTGCA 360 ;GTGTAGAGCC GCTGTTTAGA ACTCGGAAAT AQGCGTGCAT AGTATGAACT CAATCAGCAG 420 ;AGTCAATCGA TTGACACTAA CGCCTAGCAA GCAATCAGTG CTC AG AGG AA GCTAACAGAT ;GGCTGGTTAA GCTGCCCCAG AAACGAAATG TGTCCGCAAT CCCATCCCTG CATGCTTATC 540 ;TGTATTCTGT GCATGCATGA TGCTTTCCTC ACGGGGCATT ACCCAGTAGT CCGAAGACGC 600 ;AATGTGACCA TCTGACTGAG TTTTAAATAT ACTGTCCAAG TGCCTTCTGA CCCGGTCCCC 660 ;GCTTGATGAC AATCAACAAAAGGTGAATGT GACTGAAAGG CGTGGTCCAG ACAACAGGCC 720 ;TTAGACTTTA TTGTGAGACT ATAAAAGGAT CTAACTATTG CACTACTGAA ATTAAGCATT 780 ;CTAGTCTACC ATTGACATTT CTCCCCTTTC GGTGGGCCAC TCGCTCAAC ATG GCT 835 ;Met Ala ;1 ;TTC CTC AAA CGC ATT CTC CCG CTG CTG GCC CTC ATC TTG CCT GCA GTT 883 ;Phe Leu Lys Arg Ile Leu Pro Leu Leu Ala Leu Ile Leu Pro Ala Val ;5 10 15 ;TTC AGT GCC ACA GAA CAG GTC CCT CAT CCG ACC ATC CAG ACC ATC CCG 931 ;Phe Ser Ala Thr Glu Gin Val Pro His Pro Thr Ile Glh Thr Ile Pro ;20 25 30 ;GGG AAG TAC ATT GTT ACT TTC AAG TCC GGC ATT GAC AAT GCG AAA ATT 979 ;Gly Lys Tyr Ile Val Thr Phe Lys Ser Gly Ile Asp Asn Ala Lys Ile ;35 40 45 50 ;GAG TCT CAT GCC GCA TGG GTA ACG GAG CTC CAC AGG CGC AGC TTA GAA 1027 ;Glu Ser His Ala Ala Trp Val Thr Glu Leu His Arg Arg Ser Leu Glu ;55- 60 65 ;_GGC CGC AGT ACA ACC GAA GAT GAC CTT CCC GCC GGG ATC GAG AGA ACT 1075 ;Gly Arg Sér Thr Thr Glu Asp Asp Leu Pro Ala Gly Ile Glu Arg Thr ;70 " 75 80 ;TAC AGA ATT GCC AAT TTT GCT GGG TAC GCG GGG TCT TTC GAT GAG AAA 1123 ;Tyr Arg Ile Ala Asn Phe Ala Gly Tyr Ala Gly Ser Phe Asp Glu Lys ;85 90 95 ;ACT ATC GAGGAG ATC CGC AAA CAT AAC CAT GTTTGTGTCC ACGTATCCCA 1173 ;Thr Ile Glu Glu Ile Arg Lys His Asn His ;100 105 ;GGCCGTATGG TTTCGACTAA CTGCTGTACA G GTA GCC TAT GTG GAA CAA GAT 1225 ;Val Ala Tyr Val Glu Gin Asp ;110 115 ;CAG GTC TGG TAC CTC GAT ACG CTA GTT ACC GAA AGA CGA GCT CCT TGG 1273 ;Gin Val Trp Tyr Leu Asp Thr Leu Val Thr Glu Arg Arg Ala Pro Trp ;/; 120 125 130 ;GGA CTG GGG AGC ATC TCT CAC CGT GGT GCG TCT AGC ACC GAC TAC ATC 1321 ;Gly Leu Gly Ser Ile Ser His Arg Gly Ala Ser Ser Thr Asp Tyr Ile ;135 140 145 ;TAT GAT GAC AGC GCT GGG GAG GGT ACA TAC GCT TAT GTA GTG GAC ACT 1369 ;Tyr Asp Asp Ser Ala Gly Glu Gly Thr Tyr Ala Tyr Val Val Asp Thr ;■ 150 155 160 ;GGC ATC TTG GCT ACG CAT AAT GAG TTT GGT GGT CGT GCT AGC CTG GCA 1417 ;Gly Ile Leu Ala Thr His Asn Glu Phe Gly Gly Arg Ala Ser Leu Ala ;165 170 175 ;TAC AAT GCT GCA GGG GGT GAG CAC GTT GAT GGT GTT GGA CAT GGC ACA 1465 ;Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Glu His Val Asp Gly Val Gly His Gly Thr ;L30 185 190 195 ;CAT GTA GCA GGG ACC ATC GGT GGC AAA ACA TAC GGG GTT TCG AAA AAT 1513 ;His Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Gly Val Ser Lys Asn ;<2>0Q 205 210 ;GCT CAC CTA CTG TCC GTG AAG GTG TTT GTA GGT GAA TCC AGC TCG ACA 1561 ;Ala His Leu Leu Ser Val Lys Val Phe Val Gly Glu Ser Ser Ser Thr ;215 220 225 ;TCG GTC ATT CTG GAT GGC TTC AAT TGG GCT GCC AAT GAT ATC GTG AGC 1609 ;Ser Val Ile Leu Asp Gly Phe Asn Trp Ala Ala Asn Asp Ile Val Ser ;230 235 240 ;AAG AAC CGG ACC AGT AAG GCG GCG ATT AAC ATG AGT CTT G GTATGTGCGC 1659 ;Lys Asn Arg Thr Ser Lys Ala Ala Ile Asn Met Ser Leu ;245 250 255 ;CCTCTCTGGG GATCTAATGC CGTTAACCGT GATGCAG GT GGA GGC TAC TCC TAT 1713 ;Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr ;260 ;GCG TTT AAC AAT GCA GTT GAG AAT GCT TTT GAC GAG GGT GTG CTC TCT 1761 ;Ala Phe Asn Asn Ala Val Glu Asn Ala Phe Asp Glu Gly Val Leu Ser ;265 270 275 ;TGT GTT GCC GCT GGA AAT GAG AAT GTAAGCICTG CIGAACTGTC CACCATTGAG 1815 ;Cys Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn ;280 285 ;CTAAATTTAG ACTAATGTTT TGC AG AGA GAT GCA GCA CGG ACT AGC CCG GCT 1867 ;Arg Asp Ala Ala Arg Thr Ser Pro Ala ;290 295 ;TCT GCA CCC GAC GCC. ATT ACT GTT GCC GCT ATC AAC AGA AGC AAT GCC 1915 ;Ser Ala Pro Asp Ala Ile Thr Val Ala Ala Ile Asn Arg Ser Asn Ala ;300 305 310 ;CGT GCG TCA TTC TCA AAC TAC GGC TCT GTG GTT GAC ATT TTT GCC CCG 1963 ;.-.rg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser Val Val Asp Ile Phe Ala Pro ;U5 320 325 ;GGA GAG CAA GTA CTT TCT GCA TGG ACC GGC TCG AAC TCG GCC ACC AAC 2011 ;Gly Glu Gin Val Leu Ser Ala Trp Thr Gly Ser Asn Ser Ala Thr Asn ;330 335 340 ;ACG ATC TCC GGC ACG TCC ATG GCT ACA CCT CAT GTG ACA GGT TTG ATC 2059 ;Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Thr Gly Leu Ile ;345 350 355 ;CTC TAT TTG ATG GGC TTG CGG GAC CTT GCT ACC CCA GCG GCT GCA ACG 2107 ;Leu Tyr Leu Met Gly Leu Arg Asp Leu Ala Thr Pro Ala Ala Ala Thr ;360 365 370 375 ;ACC GAG CTC AAG AGG TTG GCT ACG CGG AAT GCT GTC ACC AAT GTG GCG 2155 ;Thr Glu Leu Lys Arg Leu Ala Thr Arg Asn Ala Val Thr Asn Val Ala ;380 385 390 ;GGT AGC CCC AAT CTT CTG GCC TAC AAT GGA AAC AGC GGC GTG TCA AAA 2203 ;Gly Ser Pro Asn Leu Leu Ala Tyr Asn Gly Asn Ser Gly Val Ser Lys ;395 400 405 ;GGG GGT AGC GAT GAT GGA GAT 0\G GAC TAGGTGCGTA ACATGAGTGA 2250 ;Gly Gly Ser Asp Asp Gly Asp Giu Asp ;410 415 ;ATATGGCTTA GAATAGTGGG GATCGGAGAG TAGACTAGTT TATATGCGAA ATAAAGTGTG 2310 ;TATCAGCACC CTGGCCTGTT CATGTAAGTC GGCATTTTCA CTTTTGCCGA CACCGCAAAT 2370 ;ATGCTGTGCT TGAGGCTGTT GCCTCCCCAG CCAGCCTTCC CGAGACTGAA ACTCACACAT 2430 ;CCATTGGATG TATAAAGTTC TGCACATGCG AAATGCCGCT GCCGCTTACC TCCCGACGTG 2490 ;GTACCGGACC GAAGGCAGAC ACAGATCATG GACCGCTATA CCGCACAGAC AACTTGTGCT 2550 ;CCTTACTGAA AGTACCATTC CACAGGTCAT TGCAGCATGA TGAGTGATGA TGTACTTCTC 2610 ;CCC ATC AAG A ACCACTGACG GTGGTTGGAA TC-AATCTAGA TCAAAGAGAT CAACCGCTTC 2670 ;• :;::-:agacaga tcaggcctat <g>cccataat<g> aacc<gg>t<g>ac t<g>t<g>taaccc t<g>ttacaatc 2;j0 ;CGTTTGTTAT TCOICCTTTC TGTTTGCTGG ATGGCGTGTA CTACCTCAGA GCTTGTGCTC 2790 ;CTAGGAGCTC ATACTGGAGA CAGGTTCTTG TATATAGTCA TAGCCTAAGT CCGGTGTCTA 2850 ;GGAAACAGTA TQCTCGAGGT CTTTTCCGAT TCTCACAATG AGAACTGTCG CCCGGGTCTT 2910 ;TACGGCCCCT GTGGAAAGCG AAAAGGAGAC GCTTCTGGCG CTGCTTCCGC AATACGGGCT 2970 ;.:.'.-'iACTAGCC CCGGACGGGA TCC :. ;■ ?}. ;Informasjon for SEQ ID NO: 7: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 417 aminosyre ;Type: aminosyre ;Topologi: lineær ;Molekyltype: protein ;Trekk: subtilisin-type protease PEPD til Aspergillus niger produktet til genet pepC; modent peptid med signalpeptid ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO: 7: ;Met Ala Phe. Leu Lys Arg Ile Leu Pro Leu Leu Ala Leu Ile Leu Pro ;E 10 15 ;Ala Val Phe Ser Ala Thr Glu Gin Val Fro His Pro Thr Ile Gin Thr :o :,5 .30 : Le Pro Gly Lys Tyr Ile Val Thr Phe Lys Ser Gly Ile Asp Asn Ala ;35 40 45 ;Lys Ile Glu Ser His Ala Ala Trp Val Thr Glu Leu His Arg Arg Ser ;50 55 60 ;Leu Glu Gly Arg Ser Thr Thr Glu Asp Asp Leu Pro Ala Gly Ile Glu ;65 70 75 80 ;Arg Thr Tyr Arg Ile Ala Asn Phe Ala Gly Tyr Ala Gly Ser Phe Asp ;85 90 95 ;Glu Lys Thr Ile Glu Glu Ile Arg Lys His Asn His Val Ala Tyr Val ;100 105 110 ;Glu Gin Asp Gin Val Trp Tyr Leu Asp Thr Leu Val Thr Glu Arg Arg ;115 120 125 ;Ala Pro Trp Gly Leu Gly Ser Ile Ser His Arg Gly Ala Ser Ser Thr ;130 135 140 ;Asp Tyr Ile Tyr Asp Asp Ser Ala Gly Glu Gly Thr Tyr Ala Tyr Val 145 150 155 160 ;Val Asp Thr Gly Ile Leu Ala Thr His Asn Glu Phe Gly Gly Arg Ala ;165 170 175 ;Ser Leu Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly Glu His Val Asp Gly Val Gly ;180 185 190 ;■lis Gly Thr. His Val Ala Gly Thr Ile Gly Gly Lys Thr Tyr Gly Val 195 200 205 ;Ser Lys Asn Ala His Leu Leu Ser Val Lys Val Fhe Val Gly Glu Ser 210 215 220 ;Ser Ser Thr Ser Val Ile Leu Asp Gly Phe Asn Trp Ala Ala Asn Asp 225 230 235 240 ;Ile Val Ser Lys Asn Arg Thr Ser Lys Ala Ala Ile Asn Met Ser Leu ;245 250 255 ;Gly Gly Gly Tyr Ser Tyr Ala Phe Asn Asn Ala Val Glu Asn Ala Phe ;260 265 270 ;Asp Glu Gly Val Leu Ser Cys Val Ala Ala Gly Asn Glu Asn Arg Asp 275 280 285 ;Ala Ala Arg Thr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Asp Ala Ile Thr Val Ala 290 295 300 ;Ala Ile Asn Arg Ser Asn Ala Arg Ala Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Ser 305 310 315 320 ;Val Val Asp Ile Phe Ala Pro Gly Glu Gin Val Leu Ser Ala Trp Thr ;325 330 335 ;Gly Ser Asn Ser Ala Thr Asn Thr Ile Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr ;340 345 350 ;Pro His Val Thr Gly Leu Ile Leu Tyr Leu Met Gly Leu Arg Asp Leu ;355 360 365 ;Ala Thr Pro Ala Ala Ala Thr Thr Glu Leu Lys Arg Leu Ala Thr Arg ;370 375 380 ;Asn Ala Val Thr Asn Val Ala Gly Ser Pro Asn Leu Leu Ala Tyr Asn 385 330 395 400 ;Gly Asn Ser Gly Val Ser Lys Gly Gly Ser Asp Asp Gly Asp Glu Asp 4C5 410 415 ;Informasjon for SEQ ID NO: 8: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 26 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær ;Molekyltype: DNA ;Sekvensbeskrivelse: SEQ ID NO: 8: ;GCTGGATCCC AYGGNACNCA YGTNGC 26 ;Informasjon for SEQ ID NO: 9: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 26 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: linear ;Mo1eky 1type: DNA ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO: 9: ;GCTGGATCCC AYGGNACNCA YTGYGC 26 ;Informasjon for SEQ ID NO: 10: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 23 basepar ;Type: nukleinsyre ;Tråd type: enke1 ;Topologi: lineær ;Molekyltype: DNA ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO: 10: ;CTAGAATTCG CCATNGANGT NCC 23 ;Informasjon for SEQ ID NO: 11: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 23 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær ;Molekyltype: DNA ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO: 11: ;CTAGAATTCG CCATRCTNGT NCC 23 ;Informasjon for SEQ ID NO: 12: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 17 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær ;Molekyltype: DNA ;Sekvensbeskrivelse: SEQ ID NO: 12: ;AGAATGGATC CGCGAC 17 ;Informasjon for SEQ ID NO: 13: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 27 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær ;Molekyltype: DNA ;Trekk: ;Navn: region homolog med A. niger pepD Beliggenhet: 1..12 ;Trekk: ;Navn: region homolog med A. niger ;pki genet ;Beliggenhet: 10..27 ;Sekvensbeskrivelse: SEQ ID NO: 13: ;GAGGAAAGCC ATCTTGACGG ATGATTG 27 ;Informasjon for SEQ ID NO: 14: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 29 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær ;Molekyltype: DNA ;Trekk: ;Navn: region homolog med A. niger pki genet Beliggenhet: 1..10 ;Trekk: ;Navn: region homolog med A. niger pepD genet Beliggenhet: 8..27 ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO:14: ;CGTCAAGATG GCTTTCCTCA AACGCATTC 29 ;Informasjon for SEQ ID NO: 15: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 31 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær ;Molekyltype: DNA ;Sekvens karaktertrekk: SEQ ID NO: 15: ;GGTGGGCCAC GAATTCAACA TGGCTTTCCT C 31 ;Informasjon for SEQ ID NO: 16: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 41 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær ;Molekyltype: DNA ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO: 16: ;GGAGATCCGC AAACATAACC ATGTAGCCTA TGTGGAACAA G 41 ;Informasjon for SEQ ID NO: 17 ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 40 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær Molekyltype: DNA ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO: 17: ;GGCGATTAAC ATGAGTCTTTG GTGGAGGCTA CTCCTATGC 40 ;Informasjon for SEQ ID NO: 18: ;Sekvens karaktertrekk: ;Lengde: 40 basepar ;Type: nukleinsyre ;Trådtype: enkel ;Topologi: lineær Molekyltype: DNA ;Sekvens beskrivelse: SEQ ID NO: 18: ;GCCGCTGGAA ATGAGAATAG AGATGCAGCA CGGACTAGCC 40 *

Claims (10)

1. Isolert DNA molekyl, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens kodende for en Aspergillus niger serin protease valgt fra gruppen bestående av serin proteaser med aminosyresekvenser vist i henholdsvis SEQ ID NO. 2 og 7.
2. DNA molekyl iøflge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en DNA-sekvens valgt fra gruppen bestående av den pepC kodende regionen vist i SEQ ID NO. 1 og den pepD kodende regionen vist i SEQ ID NO. 6.
3. Hybridvektor, karakterisert ved at den omfatter et DNA-molekyl ifølge krav 1.
4. Hybridvektor ifølge krav 3, karakterisert ved at en DNA-sekvens kodende for en Aspergillus niger serin protease av subtilisin-typen er funksjonelt koblet med regulatoriske elementer egnede for ekspresjon av en slik DNA-sekvens i en egnet vertscelle.
5. Hybridvektor ifølge krav 4, karakterisert ved at en DNA-sekvens kodende for en Aspergillus niger serin protease av subtilisin-type er funksjonelt koblet med regulatoriske elementer egnede for ekspresjon av en slik DNA-sekvens i en Aspergillus stamme.
6. Aspergillus niger stamme, karakterisert ved at den består av Aspergillus niger som har en defekt i pepC genet til sekvensen med SEQ.ID.NO. 1, Aspergillus niger med en defekt i pepD genet til sekven sen med SEQ ED NO. 6 og Aspergillus niger som har en defekt i pepC og pepD genene til sekvensene med henholdsvis SEQ ID NO. 1 og 6.
7. Fremgangsmåte for fremstilling av et ønsket polypeptid, karakterisert ved transformering av en Aspergillus stamme med en ekspresjonsvektor inneholdende en ekspresjonskassett egnet for ekspresjon av det ønskede polypeptidet, dyrking av den transformerte Aspergillus niger stammen under betingelser egnete for ekspresjon av det ønskede polypeptidet og isolering av det ønskede polypeptidet.
8. Aspergillus niger serin protease, karakterisert ved at den består av PEPC vist i SEQ ID NO. 2 og PEPD vist i SEQ ID NO. 7.
9. Vert transformert med en hybrid ekspresjonsvektor ifølge krav 3, karakterisert ved at den består av en DNA-sekvens kodende for en Aspergillus niger serin protease av subtilisin-type funksjonelt koblet med regulatoriske elementer egnede for ekspresjon av en slik DNA-sekvens i nevnte vert.
10. Transformert vert ifølge krav 9, karakterisert ved at det er en Aspergillus niger stamme.
NO19931368A 1992-04-15 1993-04-14 Isolert DNA-molekyl, hybridvektor, Aspergillus niger-stamme, Aspergillus niger-serin protease, fremgangsmåte for fremstilling av et önsketpolypeptid samtvert transformert med en hybrid ekspresjonvektor NO315379B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP92810281 1992-04-15
GB939305097A GB9305097D0 (en) 1993-03-12 1993-03-12 Noval fungal protease

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO931368D0 NO931368D0 (no) 1993-04-14
NO931368L NO931368L (no) 1993-10-18
NO315379B1 true NO315379B1 (no) 2003-08-25

Family

ID=26132501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO19931368A NO315379B1 (no) 1992-04-15 1993-04-14 Isolert DNA-molekyl, hybridvektor, Aspergillus niger-stamme, Aspergillus niger-serin protease, fremgangsmåte for fremstilling av et önsketpolypeptid samtvert transformert med en hybrid ekspresjonvektor

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0574347B1 (no)
JP (2) JP3424840B2 (no)
KR (1) KR100270644B1 (no)
AT (1) ATE252156T1 (no)
AU (1) AU663173B2 (no)
CA (1) CA2093950C (no)
CY (1) CY2507B1 (no)
DE (1) DE69333249T2 (no)
DK (1) DK0574347T3 (no)
ES (1) ES2208637T3 (no)
FI (1) FI112667B (no)
HU (1) HU219809B (no)
IL (2) IL105383A0 (no)
MX (1) MX9302202A (no)
NO (1) NO315379B1 (no)
NZ (1) NZ247397A (no)
PT (1) PT574347E (no)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5821350A (en) * 1995-11-01 1998-10-13 Nexia Biotechnologies, Inc. Aspergillus niger beta-galactosidase gene
AU1092897A (en) * 1995-12-15 1997-07-14 Novo Nordisk A/S A funguns wherein the area, pepc and/or pepe genes have been inactivated
AU2152897A (en) 1996-03-27 1997-10-17 Novo Nordisk A/S Alkaline protease deficient filamentous fungi
EP0907744A1 (en) * 1996-06-05 1999-04-14 Gist-Brocades B.V. Fungal metallo protease genes
JPH1016992A (ja) * 1996-07-04 1998-01-20 Toagosei Co Ltd 接着剤用容器
US6806062B1 (en) 1998-10-05 2004-10-19 Novozymes A/S Fungal transcriptional activator useful in methods for producing polypeptides
WO2001068864A1 (en) 2000-03-14 2001-09-20 Novozymes A/S Fungal transcriptional activator useful in methods for producing polypeptides
US7858360B2 (en) 2005-10-17 2010-12-28 Novozymes A/S Use of fungal mutants for expression of antibodies
WO2009071530A1 (en) 2007-12-06 2009-06-11 Novozymes A/S Fungal pepc inhibitor
WO2011075677A2 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Novozymes, Inc. Methods for producing polypeptides in protease-deficient mutants of trichoderma
MD4186C1 (ro) * 2012-02-20 2013-06-30 Институт Микробиологии И Биотехнологии Академии Наук Молдовы Tulpină de fungi Fusarium gibbosum - producătoare de proteaze acide şi neutre, xilanaze şi b-glucozidaze
DK3019602T3 (en) 2013-07-10 2018-11-12 Glykos Finland Oy MULTIPLE PROTEASE-DEFECTED FILAMENTARY FUNGAL CELLS AND PROCEDURES FOR USE THEREOF
DK3036324T3 (en) * 2013-08-23 2019-04-01 Novozymes As Regulated PepC expression
CA2954974A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1333777C (en) * 1988-07-01 1995-01-03 Randy M. Berka Aspartic proteinase deficient filamentous fungi

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0646863A (ja) 1994-02-22
KR100270644B1 (ko) 2000-11-01
MX9302202A (es) 1994-04-29
CY2507B1 (en) 2005-12-23
HU9301087D0 (en) 1993-06-28
IL105383A0 (en) 1993-08-18
FI931634A0 (fi) 1993-04-08
AU3695993A (en) 1993-10-21
EP0574347B1 (en) 2003-10-15
NO931368L (no) 1993-10-18
PT574347E (pt) 2004-02-27
NO931368D0 (no) 1993-04-14
CA2093950C (en) 2006-05-09
ATE252156T1 (de) 2003-11-15
IL170763A (en) 2007-10-31
JP2003235591A (ja) 2003-08-26
KR930021783A (ko) 1993-11-23
EP0574347A3 (no) 1994-04-13
AU663173B2 (en) 1995-09-28
HUT67800A (en) 1995-05-29
DE69333249T2 (de) 2004-07-29
DK0574347T3 (da) 2004-01-26
NZ247397A (en) 1995-08-28
ES2208637T3 (es) 2004-06-16
DE69333249D1 (de) 2003-11-20
JP3636455B2 (ja) 2005-04-06
JP3424840B2 (ja) 2003-07-07
EP0574347A2 (en) 1993-12-15
FI931634A (fi) 1993-10-16
CA2093950A1 (en) 1993-10-16
FI112667B (fi) 2003-12-31
HU219809B (hu) 2001-08-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO315379B1 (no) Isolert DNA-molekyl, hybridvektor, Aspergillus niger-stamme, Aspergillus niger-serin protease, fremgangsmåte for fremstilling av et önsketpolypeptid samtvert transformert med en hybrid ekspresjonvektor
US5688663A (en) Gene encoding carboxypeptidase of Aspergillus niger
CA2134863C (en) Aspergillus niger aspartic protease
NO179078B (no) Replikerbar ekspresjonsvektor, anvendelse derav og transformert vert
US5846802A (en) Fungal Protease
NO302899B1 (no) Rekombinant DNA-molekyl, transformert vertscelle, anvendelse av rekombinant DNA-molekyl og hybridvektor, og pektinlyasene PLA, PLB, PLC, PLE eller PLF i ren form
JP3576549B2 (ja) 真核生物発現系
EP0439997B1 (en) Novel fungal expression system
US7001751B1 (en) PyrF gene and the utilization thereof
AU696369B2 (en) Genes encoding signal recognition particle of aspergillus niger
JP2000125859A (ja) 新規な選択マーカー遺伝子ならびにリゾムコール・プシルスの形質転換系

Legal Events

Date Code Title Description
MK1K Patent expired