DE69333249T2

DE69333249T2 - Neue Schimmel-Protease

Info

Publication number: DE69333249T2
Application number: DE69333249T
Authority: DE
Inventors: Dr. Frank Buxton; Dr. Albert Hinnen; Prof. Dr. Jacob Visser
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1992-04-15
Filing date: 1993-04-06
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2013-04-07
Also published as: CY2507B1; CA2093950C; FI931634A0; EP0574347B1; KR930021783A; ES2208637T3; IL170763A; NO931368L; AU663173B2; DE69333249D1; ATE252156T1; DK0574347T3; AU3695993A; JPH0646863A; IL105383A0; NO315379B1; EP0574347A2; CA2093950A1; HU219809B; NZ247397A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue DNA Sequenz, die für eine Aspergillus niger Serinprotease kodiert und ein Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft ferner einen neuen Aspergillus niger Stamm, der in einem pepC und/oder einem pepD Gen defekt ist„ der zur Expression von heterologem Protein fähig ist und ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Stamms.
Hintergrund der Erfindung
Aspergillus Spezies und insbesondere Aspergillus niger werden für die industrielle Produktion von Enzymen verwendet, die in der Lebensmittelverarbeitungsindustrie verwendet werden. A. niger hat aufgrund der großen Fähigkeit zur Sekretion von Proteinen und durch die Zugänglichkeit der Systeme für molekulargenetische Veränderungen Vorteile als Wirt zur Herstellung von rekombinanten Proteinen. Jedoch hat sich die Anwesenheit von Proteasen in der Kulturflüssigkeit auf die Expression von heterologen Proteinen in A. niger als schädlich erwiesen und in der Praxis werden Aspergillen kommerziell zur Herstellung von Proteasen verwendet. Es wurden viele extrazelluläre Proteasen von Aspergilli in der Literatur beschrieben [Barthomeuf et al., Biotech. Tech. 2: 29–34 (1988), Barthomeuf et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo), 37: 1033–1036 (1989), H. B. Bogmann, Biochim. Biophys. Acta 293: 476– 489 (1973), E. Ishima, Biochim, Biophys. Acta 2258: 274–288 (1972), S. Chopra und P. Metha, Folia Microbiol. 30: 117–125 (1985), Krishnan und Vijayalakshimi, J. Chromatogr. 329: 165–170 (1985)]. Das Gen pepA, das Aspergillopepsin A von Aspergillus awamori kodiert, wurde kürzlich kloniert [Berka et al., Gene 86: 153–162 (1990)]. Das pepA Genprodukt macht einen Hauptteil der sekretierten sauren Proteasen von A. niger aus und Stämme, worin das pepA Gen deletiert wurde, erlauben eine erhöhte Expression von heterologen Proteinen in A. niger var. awamori [Dunn-Coleman et al., Biotechnology 9: 976–981 (1991)]. Es wurden auch andere Proteasegene kürzlich aus Aspergilli kloniert und diese umfassen eine alkalische Serinprotease von A. oryzae [Tatsumi et al., Mol. Gen. genet. 219: 33–38 (1989)], eine alkalische Serinprotease von A. fumigatus [Jaton-Ogay et al., FEMS Microbiol. Letts. 982: 163– 168 (1992)] eine saure Protease, die nicht vom Pepsintyp ist von A. niger var. macrosporus [Inuoe et al. J. Biol. Chem. 266: 19484–19489 (1991)] und eine Metalloprotease, die neutrale Protease II aus A. oryzae genannt wird [Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 228: 97–103 (1991)].
Isolierte und mutierte Proteasegene von A. niger können auch für Genzerstörungsexperimente verwendet werden, das heißt zur Herstellung von Mutantenstämmen, worin das entsprechende natürliche Gen zerstört ist. Beispielsweise wurde das pepA Gen von Aspergillus awamori durch Genzerstörung zerstört, um Stämme herzustellen, die für Aspergillopepsin A defizient sind (Berka et al., obige Literaturstelle).
Wie jedoch oben erwähnt, bilden Aspergilli eine große Anzahl an verschiedenen Proteasen und so besteht ein kontinuierlicher Bedarf für Aspergillus Stämme für die industrielle Herstellung von Proteinen, die bezüglich anderer Proteasen defizient sind. Für diesen Zweck besteht auch ein Bedarf für andere Proteasegene, die zur Herstellung der für Protease defizienten Stämme durch in vitro Mutagenese verwendet werden können, beispielsweise zur Genzerstörung. Darüberhinaus besteht auch ein Bedarf für rekombinante Proteaseproteine, die industriell zur Proteinprozessierung angewendet werden können.
Ein weiterer Hautbestandteil der sekretierten Proteaseaktivitäten in A. niger sind Serinproteasen [Sakka et al., J. Ferment. Technol. 63: 479–483 (1985)]. Serinproteasen aus Pilzen wurden ausgiebig im Pilz T. album und der Hefe Saccharomvces cerevisiae charakterisiert. T. album sekretiert wahrscheinlich drei verwandte Serinproteasen, wobei die am besten charakterisierte die Proteinase K ist [Jany et al., FEBS 199: 139–144 (1986)], während ein homologes Protein in Hefe in der Vakuole lokalisiert ist [Wolf und Ehmann, Eur. J. Biochem, 98: 375–384 (1979)]. Die Gene für alle diese T. album und S. cereviseae Proteine wurden kloniert und charakterisiert [Gunkel und Gassen, Eur. J. Biochem. 179: 185–194 (1989), Samal et al., Gene 85: 329–333 81989), Samal et al., Molec. Microbiol. 4: 1789–1792 (1990) und Moehle et al., Molec. Cell. Biol. 7: 4390–4399 (1987)]. Alkalische Serinproteasen wurden kloniert und charakterisiert in A. oryzae, in A. fumigatus und in Acgremonium chrysogenum [Tatsumi et al., Mol. Gen. Genet. 219: 33–38 (1989), Jaton-Ogay et al., FEMS Microbiol. Letts. 92: 163–168 (1992), Isogai et al., Agric. Biol. Chem. 55: 471–477 (1991)]
Es wurde nun festgestellt, dass Aspergillus auch Serinproteasen herstellt, die zu der Familie der Subtilisinproteasen homolog sind. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf diesen Proteasetyp.
Ziel der Erfindung
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein DNA Molekül bereitzustellen, das für eine Serinprotease von Aspergillus niger kodiert, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus den Serinproteasen besteht, die jeweils die Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nr. 2 und 7 aufweisen.
Es ist ein weiteres Ziel, eine rekombinante Aspergillus niger Serinprotease vom Subtilisintyp bereitzustellen und für diesen Zweck auch einen transformierten Aspergillus niger Stamm zur Herstellung hiervon.
Ein weiteres Ziel ist es, einen Aspergillus Stamm bereitzustellen, der im pepC Gen und/oder pepD Gen defizient ist, wobei der Stamm für eine effizientere Produktion von heterologen Proteinen verwendet werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Serinprotease vom Subtilisintyp von Aspergillus. Eine solche Protease wird hierin als "Aspergillus Subtilisin" bezeichnet. Ein "Aspergillus Subtilisin" der vorliegenden Erfindung wird so verstanden, dass es (a) von Aspergillus spec. stammt, (b) eine Proteaseaktivität aufgrund eines katalytischen Serinrests im aktiven Zentrum aufweist und (c) ausreichende Aminosäuresequenzhomologie mit bekannten Serinproteasen aufweist, um in die Subtilisinfamilie eingruppiert zu werden. Innerhalb der Bedeutung des Ausdrucks "Aspergillus Subtilisin", wie er in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, sind jedoch auch Fragmente eines solchen Enzyms, die die Serinproteaseaktivität behalten, jedoch sind Vollängenenzyme bevorzugte Ausführungsformen. Es ist verständlich, dass auch Fusionsproteine, die ein "Aspergillus Subtilisin" der Erfindung an zusätzliche Aminosäuren, Peptide oder Proteine angefügt aufweisen, Teil der vorliegenden Erfindung sind.
In einer bevorzugten Bedeutung beschreibt das Aspergillus Subtilisin eine Protease oder ein aktives Fragment, das von Aspergillus niger stammt, bevorzugter eine Protease oder ein aktives Fragment mit der Aminosäuresequenz oder einem Teil der Sequenz, die unter SEQ ID Nr. 1 und 6 gezeigt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine isolierte DNA Sequenz, die eine Aspergillus niger Serinproteinase kodiert, ausgewählt aus der Gruppe mit jeweils den Aminosäuresequenzen SEQ ID 2 und 7 und einen Hybridvektor zur Klonierung und Vermehrung einer solchen DNA Sequenz. Die Erfindung betrifft ferner einen Expressionshybridvektor zur Herstellung einer Aspergillus niger Serinprotease, worin eine solche DNA Sequenz funktionell mit regulatorischen Regionen verbunden ist, die zur Expression des Gens für die Aspergillus niger Serinproteinase in einer geeigneten Wirtszelle geeignet sind. Die Erfindung betrifft auch transformierte Wirtszellen, die zur Expression eines Aspergillus niger Subtilisins fähig sind, beispielsweise einen Aspergillus niger Stamm, der zur Überexpression des Aspergillus niger Subtilisins aufgrund einer erhöhten Kopiezahl des Gens nach der Transformation fähig ist.
Die Erfindung betrifft auch einen Aspergillus niger Stamm, der bezüglich eines pepC und/oder pepD Gens defizient ist und ein Verfahren zur Herstellung hiervon durch eine DNA Sequenz, die ein Aspergillus niger Subtilisin kodiert, die nicht mehr zur Expression eines funktionellen Gens aufgrund von Mutagenese, beispielsweise Genzerstörung, fähig ist.
Darüberhinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer DNA Sequenz, eines Hybridvektors, eines Expressionsvektors wie auch Verfahren zur Herstellung eines Aspergillus Stamms, der in einem pepC und/oder pepD Gen defizient ist und eines Wirtsstamms mit einem Hybridexpressionsvektor.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
DNA die Aspergillus Subtilisin kodiert und Hybridvektoren zur Klonierung und Expression
Die vorliegende Erfindung betrifft ein DNA Molekül, das eine DNA Sequenz umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, die für eine Aspergillus niger Serinproteinase mit jeweils den Aminosäuresequenzen SEQ ID Nr. 2 und 7 kodiert. Die DNA Sequenz kann eine oder mehrere Introns aufweisen, wie dies bei DNA Molekülen der Fall ist, die von einer genomischen Bank isolierbar sind, wie beispielsweise das in SEQ ID Nr. 1 gezeigte pepC Gen oder das in SEQ ID Nr. 6 gezeigte pepD Gen. Jedoch betrifft die Erfindung auch eine Intron-reduzierte Variante der DNA Sequenz, wie sie beispielsweise durch cDNA Klonierung oder nach einer Mutagenese isolierbar ist, beispielsweise durch Anwendung der PCR Technologie. Solche Intron-reduzierten Gene sind besonders zur Expression in Nicht-Aspergillus Wirten brauchbar, vorzugsweise in Prokaryonten oder Hefe.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise ein DNA Molekül, das eine DNA Sequenz umfasst, welche für A. niger PepC kodiert, das die in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist, oder ein Fragment hiervon, das eine Serinproteaseaktivität behält. Eine DNA Sequenz der Erfindung ist vorzugsweise die für reife PepC Protease kodierende Region, die in der Nukleotidsequenz mit der SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist. Jedoch betrifft die Erfindung auch degenerierte DNA Sequenzen, die für PepC oder ein Fragment hiervon kodieren, das heißt Sequenzen, worin die Nukleotide ohne Veränderung der kodierten Aminosäuresequenz ersetzt sind. Solche DNA Sequenzen sind beispielsweise aufgrund der unterschiedlichen Codonverwendung in unterschiedlichen Wirten oder aufgrund des Vorkommens von neuen Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme brauchbar.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein DNA Molekül, das eine DNA Sequenz umfasst, welche für A. niger PepD kodiert, das die in SEQ ID Nr. 6 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist, oder ein Fragment hiervon, das eine Serinproteaseaktivität behält. Eine weitere bevorzugte DNA Sequenz der Erfindung ist daher auch die für die reife PepD Protease kodierende Region, die in der Nukleotidsequenz mit der SEQ ID Nr. 6 gezeigt ist. Jedoch betrifft die Erfindung auch degenerierte DNA Sequenzen, die für PepD oder ein Fragment hiervon kodieren, das heißt Sequenzen, worin die Nukleotide ohne Veränderung der kodierten Aminosäuresequenz ersetzt sind.
Die Erfindung betrifft auch einen Hybridvektor, der als Insert eine DNA Sequenz umfasst, die für ein Aspergillus niger Subtilisin der Erfindung kodiert. Ein solcher erfindungsgemäßer Hybridvektor ist zur Vermehrung und Vervielfältigung einer DNA Sequenz der Erfindung brauchbar. Ein solcher Expressionsvektor umfasst eine "Expressionskassette", worin eine DNA Sequenz, die für ein Aspergillus niger Subtilisin kodiert, funktionell mit regulatorischen Regionen verbunden ist, die zur Kontrolle der Expression einer solchen DNA Sequenz in einer gewünschten Wirtszelle geeignet sind.
Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor, einschließlich eines Expressionsvektors, kann sich von einem Vektor ableiten, der in der Gentechnik brauchbar ist, wie von Viren, Phagen, Cosmiden, Plasmiden oder chromosomaler DNA, wie Derivaten von SV40, Herpesviren, Papillomaviren, Retroviren, Baculoviren, λ Phagen, beispielsweise NM 989 oder EMBL4 oder M13 Phagen, beispielsweise M13mp8, bakteriellen Plasmiden, beispielsweise pBR322, pUC18 oder Hefeplasmiden, beispielsweise Hefe 2 μ Plasmid, oder von einem defekten Virus, Phagen oder Plasmid in Gegenwart eines Helfervirus, -phagen oder -plasmids, das die Replikation des defekten Virus, Phagen oder Plasmids erlaubt, beispielsweise M13(+)KS Vektor in Gegenwart von beispielsweise dem M14K07 Helferphagen oder auch von chromosomaler DNA, die beispielsweise von filamentösen Pilzen stammt, wie Aspergillus spec., beispielsweise A. niger, beispielsweise die, die von EP 0 184 438 A bereitgestellt wird. Bevorzugt sind Vektoren für S. cerevisiae oder filamentöse Pilze, vorzugsweise für Aspergillus spec. und noch bevorzugter A. niger.
Ein Hybridvektor der Erfindung, einschließlich eines Expressionsvektors, sorgt für eine Replikation einer gewünschten DNA in einer geeigneten Wirtszelle, entweder als extrachromosomales Element oder durch die Integration in das Wirtschromosom. Es sind mehrere mögliche Vektorsysteme zur Integration und Expression der klonierten DNA der Erfindung verfügbar. Im Prinzip sind alle Vektoren geeignet, die replizieren und in der gewählten Wirtszelle stabil sind. Daher wird der Vektor in Abhängigkeit der zur Transformation ausgewählten Wirtszelle ausgewählt. Im allgemeinen können solche Wirtszellen prokaryontische oder eukaryontische Mikroorganismen sein, wie Bakterien, Pilze, wie Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae oder filamentöse Pilze, vorzugsweise Aspergillus spec., bevorzugter A. niger oder Zellen höheren eukaryontischen Ursprungs, wie Vertebraten, beispielsweise Säugerzellen. Geeignete Wirtszellen werden später im Detail diskutiert. Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor, einschließlich eines Expressionsvektors, der als extrachromosomales Element aufrechterhalten wird, umfasst einen Replikationsursprung (ori) oder eine autonom replizierende Sequenz (ARS), Selektionsmarkersequenzen und wahlweise zusätzliche Restriktionsschnittstellen. Ein Vektor, der für eine Integration in ein Wirtschromosom bestimmt ist, muß keinen on oder keine ARS umfassen, da er in der Zelle im Zusammenhang mit dem Chromosom repliziert wird.
Ein Replikationsursprung oder eine autonom replizierende Sequenz (ein DNA Element, das extrachromosomalen Elementen autonom replizierende Fähigkeiten verleiht) wird entweder durch die Konstruktion eines Vektors, der einen exogenen Ursprung aufweist, wie er vom Simianvirus (SV 40) oder einer anderen viralen Quelle stammen kann oder durch die chromosomalen Mechanismen der Wirtszelle bereitgestellt.
Ein erfindungsgemäßer Hybridvektor, einschließlich eines Expressionsvektors, kann auch in Abhängigkeit des Wirts, in den er transformiert, selektiert und kloniert wird, Selektionsmarker enthalten. Es kann jedes Markergen verwendet werden, das die Selektion von Transformanden aufgrund der phänotypischen Expression des Markers erleichtert. Geeignete Marker sind insbesondere diejenigen, die eine Antibiotikumresistenz exprimieren, beispielsweise gegenüber Tetracyclin oder Ampicillin oder im Fall von auxotrophen Pilzmutanten, Gene, die Wirtsläsionen komplementieren. Entsprechende Gene vermitteln beispielsweise eine Resistenz gegenüber dem Antibiotikum Cycloheximid oder sorgen für die Prototrophie in einer auxotrophen Hefemutante, vorzugsweise S. cerevisiae Mutante, beispielsweise das ura3, leu2, his3 oder das trp1 Gen. Es ist auch möglich, Strukturgene als Marker zu verwenden, die mit einem autonom replizierenden Segment assoziiert sind, vorausgesetzt, dass der zu transformierende Wirt für das durch den Macker exprimierte Produkt auxotroph ist.
Von besonderem Interesse im Zusammnenhang mit Hybridvektoren, insbesondere Expressionsvektoren für A. niger sind Markergene, die A. niger Wirtsläsionen komplementieren, wie das argB Gen, das für die Ornithincarbamoyltransferase kodiert und beispielsweise von A. niger oder A. nidulans stammt ( EP 0 184 438 A ) oder A. nidu lans DNA Fragmente, die zum N. crassa pyr4 Gen homolog sind. Andere geeignete Markergene sind hierin später in Zusammenhang mit der Beschreibung der transformierten Wirte der Erfindung beschrieben.
Ein Hybridvektor der Erfindung, der zur Vermehrung der DNA geeignet ist, die für das Aspergillus Subtilisin in E. coli kodiert, ist beispielsweise das Plasmid pTZPEPC oder pTZPEPD, das hierin später in den begleitenden Beispielen beschrieben ist.
Der Ausdruck "Expressionskassette" meint im Zusammenhang mit einem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung eine DNA Sequenz, die zur Expression eines Aspergillus Subtilisins fähig ist und umfasst einen Promotor, der operativ mit einer für Aspergillus Subtilisin kodierenden Region verbunden ist und wahlweise ein oder mehrere weitere regulatorische Elemente der Gruppe, die besteht aus einer Signalsequenz, einem Transkriptionsterminator, einem Transkriptionsenhancer, einer Ribosomenbindungsstelle, einer Sequenz zur effizienten RNA Prozessierung, einer Sequenz, die für eine effiziente Proteinprozessierung kodiert und eine Sequenz, die für eine korrekte Proteinlokalisation kodiert. In einer erfindungsgemäßen Expressionskassette kann eine für ein Aspergillus Subtilisin kodierende Region mit homologen Regulationselementen kombiniert werden, das heißt, wie sie hiermit natürlich verbunden sind oder mit heterologen Regulationselementen, das heiß solchen, die von anderen Genen stammen.
Es kann eine große Vielzahl an Promotorsequenzen in Abhängigkeit der Art der Wirtszelle verwendet werden. Promotoren, die stark sind und gleichzeitig gut reguliert sind, sind die brauchbarsten.
Beispiele für Promotoren sind die prokaryontischen λP_L, λP_A, E. coli lac, trp oder tac Promotoren. Promotoren, die zur Expression in Hefe, vorzugsweise S.cerevisiae geeignet sind, sind TRP1-, ADHI-, ADHII-, PHO3-, PHO5-, GAL10- oder glycolytische Promotoren, wie der Promotor der Enolase-, Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, 3-Phosphoglyceratkinase- (PGK), Hexokinase-, Pyruvatdecarboxylase-, Phosphofruktokinase-, Glucose-6-phosphatisomerase-, 3-Phosphoglyceratmutase-, Pyruvatkinase-, Triosephosphatisomerase-, Phosphoglucoseisomerase- und Glucokinasegene oder der PHO5-GAPDH Hybridpromotor ( EP 0 213 593 A ). Andere Beispiele für eukaryontische Promotoren sind Promotoren, die von eukaryontischen Viren stammen, beispielsweise SV40, Rous Sarcoma Virus, Adenovirus 2, Rinderpapillomavirus, Papovavirus, Cytomegalievirus oder von Säugerzellen stammende Promotoren, beispielsweise des Actin-, Kollagen-, Myosin- oder β-Globulingens. Die eukaryontischen Promotoren können mit Enhancersequenzen kombiniert werden, wie der stromaufwärts aktivierenden Sequenzen (UAS) der Hefe, vorzugsweise S. cerevisiae, oder virale oder zelluläre Enhancer, wie die Cytomegalievirus IE Enhancer, SV40 Enhancer, Immunglobulingenenhancer oder andere.
Enhancer sind Transkriptions-stimulierende DNA Sequenzen, die beispielsweise von Viren stammen, wie Simianvirus, Polyomavirus, Rinderpapillomavirus oder Moloneysarcomavirus oder aus genomischem Ursprung. Eine Enhancersequenz kann auch von der extrachromosomalen, ribosomalen DNA von Physarum polycephalum (WO 85/00278 A) stammen. Geeignete Enhancer sind beispielsweise auch stromaufwärts liegende Aktivierungsstellen, die vom Gen der sauren Phosphatase PHO5 der Hefe stammen.
Signalsequenzen können beispielsweise eine Präsequenz oder eine Sekretionssequenz oder dergleichen sein, die die Sekretion des Polypeptids steuern. Eine Signalsequenz ist beispielsweise ein Signal- oder Leaderpeptid des Aspergillus Subtilisins, beispielsweise die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Signalsequenz. Es sind weitere Signalsequenzen aus der Literatur bekannt, beispielsweise die, die von G. Heijne, Nucleic Acids Res. 14, 4683 (1986) zusammengestellt sind.
Sequenzen, die zur Initiation und Termination der Transkription und zur Stabilisierung der mRNA erforderlich sind, sind herkömmlich jeweils aus den nicht-kodierenden 5'-Regionen und 3'-Regionen der viralen oder eukaryontischen cDNAs erhältlich, beispielsweise vom Expressionswirt.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Expressionsvektor, der eine Intron-reduzierte Region, die sich aus den zwei Exons der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten kodierenden Region oder den vier Exons der in SEQ ID Nr. 6 gezeigten kodierenden Region zusammensetzt, zur Expression des Aspergillus Subtilisins in Prokaryonten, beispielsweise in E. coli oder vorzugsweise in einer Hefe, bevorzugter in S. cerevisiae unter der Kontrolle des GAL10 Promotors umfasst, wie beispielsweise in Plasmid pFBY138.
Die Erfindung betrifft vorzugsweise einen Expressionsvektor, der zur Expression einer DNA Sequenz, die für ein Aspergillus Subtilisin in einem Aspergillus Stamm kodiert, fähig ist.
Ein Typ eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors enthält eine DNA Sequenz, die für ein Aspergillus Subtilisin kodiert, vorzugsweise von A. niger unter der Kontrolle eines Promotors, der natürlicherweise mit dieser DNA Sequenz verbunden ist, das heißt des homologen Promotors. Bevorzugter ist ein Expressionsvektor, der eine DNA Sequenz, die für PepC von SEQ ID Nr. 1 kodiert, am bevorzugtesten die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte DNA Sequenz, unter der Kontrolle der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Promotorregion umfasst oder ein Expressionsvektor, der eine für PepD der SEQ ID Nr. 6 kodierende DNA, bevorzugter die in SEQ ID Nr. 6 gezeigte Sequenz unter der Kontrolle der in SEQ ID Nr. 6 gezeigten Promotorregion umfasst. Jedoch kann auch die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte für PepC kodierende Region unter der Kontrolle des in SEQ ID Nr. 6 gezeigten Promotors exprimiert werden und umgekehrt.
Vorzugsweise wird das Aspergillus Subtilisin in das Medium sekretiert. Dies kann durch die Verwendung einer Signalsequenz erreicht werden, die mit dem Strukturgen funktionell verbunden ist, vorzugsweise der Signalsequenz, die natürlicherweise mit dem Aspergillus Substilisin Strukturgen verbunden ist, wie beispielsweise in Plasmid pTZPEPC, das die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte PepC Signalsequenz und die kodierende Region umfasst, oder wie in Plasmid pTZPEPD, das die in SEQ ID Nr. 6 gezeigte Singnalsequenz und die kodierende Region umfasst.
Falls ein solcher Expressionsvektor zur Expression des Aspergillus Subtilisins in einem Wirtstamm verwendet wird, von dem das Aspergillus Subtilisin natürlicherweise stammt, wird das Aspergillus Subtilisin überexprimiert, da sowohl das rekombinante als auch das ursprüngliche Aspergillus Subtilisingen unter denselben Expressionsbedingungen aktiv sind.
Ein weiterer Typ eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors umfasst eine DNA Sequenz, die für ein Aspergillus Subtilisin kodiert, unter der Kontrolle eines Promotors, der in Aspergillus funktionsfähig ist, der nicht natürlicherweise mit dieser DNA Sequenz verbunden ist. Ein Promotor, der zur Expression eines Aspergillus Subtilisins in Aspergillus spec., insbesondere in A. niger geeignet ist, ist beispielsweise ein Promotor eines Aspergillus spec. Pectinlyasegens, vorzugsweise der Promotor der A. niger Gene PLI (siehe EP 0 278 355 A ), PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF (siehe EP 0 353 188 A ), ein Promotor eines Aspergillus spec. Polygalacturonasegens, vorzugsweise ein Promotor des A. niger Gens PGI oder PGII (siehe EP 0421 919 A ), ein Promotor des Aspergillus spec. Pyruvatkinasegens, vorzugsweise der Promotor des A. niger pki Gens ( EP 0 439 997 A ) oder auch ein Promotor eines Aspergillus Subtilisingens der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise ein Promotor eines Aspergillus Subtilisingens, das in SEQ ID Nr. 1 oder 6 gezeigt ist. Die Sekretion eines Aspergillus Subtilisins kann auch in diesem Fall durch die Verwendung einer Signalsequenz erreicht werden, die funktionell mit dem Strukturgen verbunden ist, beispielsweise die Signalsequenz, die natürlich mit dem Aspergillus Subtilisinstrukturgen verbunden ist, beispielsweise im Fall von PepC die in SEQ ID Nr. 1 gezeigte Sequenz. Jedoch kann auch eine Signalsequenz verwendet werden, die zum Aspergillus Subtilisin heterolog ist, beispielsweise eine Signalsequenz des Aspergillus spec. Pectinlyasegens, vorzugsweise die Signalsequenz der A. niger Gene PLI (siehe EP 0 278 355 A ), PLA, PLB, PLC, PLE oder PLF (siehe EP 0 353 188 A ), oder eine Signalsequenz eines Aspergillus spec. Polygalacturonasegens, vorzugsweise eine Signalsequenz des A. niger Gens PGI oder PGII (siehe EP 0421 919 A ), In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, beispielsweise im Plasmid pPKIPEPCA, ist der Pyruvatkinasepromotor von A. niger funktionsfähig mit der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten kodierenden Region verbunden, die ein an die homologe Singalsequenz gebundenes Aspergillus Subtilisin kodiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, beispielsweise im Plasmid pPKIPEPDA, ist der Pyruvatkinasepromotor von A. niger funktionsfähig mit der in SEQ ID Nr. 6 gezeigten kodierenden Region verbunden, die ein an die homologe Singalsequenz gebundenes Aspergillus Subtilisin kodiert.
Verfahren zur Herstellung eines Aspergillus Subtilisingens
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines DNA Moleküls der Erfindung, das heißt eines, das für das erfindungsgemäße Aspergillus Subtilisin kodiert, das vorzugsweise eine bevorzugte Form des Aspergillus niger Subtilisins der Erfindung kodiert, oder zur Herstellung eines Hybridvektors, der ein solches DNA Molekül enthält, wobei das Verfahren die Kultivierung eines Wirts umfasst, der mit einem solchen DNA Molekül oder Hybridvektor der Erfindung transformiert ist. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann ein DNA Molekül der Erfindung durch eine chemische Synthese über die Nukleotidkondensation hergestellt werden.
Die Kultivierung der Wirte wird in einem herkömmlichen Nährmedium ausgeführt, das mit chemischen Verbindungen versetzt ist oder dem chemische Verbindungen fehlen, die eine negative oder positive Selektion der Transformanden, das heißt der Wirte, die das gewünschte DNA Molekül zusammen mit einem Selektionsmarker enthalten, gegenüber nicht transformierten Zellen erlaubt, das heißt Wirten, denen das gewünschte DNA Molekül fehlt.
Es können alle transformierbaren in der Technik brauchbaren Wirte verwendet werden, beispielsweise Bakterien, wie E. coli, Pilze, wie Saccharomvces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, höhere eukaryontische Zellen, wie Insektenzellen oder Säugerzellen, beispielsweise CHO Zellen oder insbesondere filamentöse Pilze, wie Aspergillus, beispielsweise A. nidulans, A. oryzae, A. carbonarius, A. awamori und speziell A. niger. Die Transformation der Wirte wird durch herkömmliche Verfahren ausgeführt.
Eine DNA Sequenz, die für ein Aspergillus Subtilisin kodiert, kann aus dem Genom eines Aspergillus Stamms erhalten werden, der zur Expression eines Aspergillus Subtilisins fähig ist oder kann beispielsweise durch die Kultivierung eines Wirts hergestellt werden, der mit einem rekombinanten DNA Molekül transformiert ist, das eine DNA Sequenz enthält, die für ein Aspergillus Subtilisin kodiert und erforderlichenfalls der Isolierung der gewünschten DNA Sequenz hieraus.
Insbesondere kann eine solche DNA durch ein Verfahren hergestellt werden, das einen Schritt umfasst, ausgewählt aus

a) Isolierung einer genomischen DNA aus geeigneten Aspergillus Zellen und die Auswahl der gewünschten DNA, beispielsweise mittels einer DNA Sonde oder die Verwendung eines geeigneten Expressionssystems und Screenen auf die Expression des gewünschten Polypeptids,
b) Isolierung der mRNA aus geeigneten Aspergillus Zellen, Auswahl der gewünschten mRNA, beispielsweise durch Hybridisierung mit einer DNA Sonde oder durch Expression in einem geeigneten Expressionssystem und Screenen auf die Expression des gewünschten Polypeptids, Präparation der einzelsträngigen cDNA, die zu dieser mRNA komplementär ist und anschließend der doppelsträngigen cDNA hiervon,
c) Isolierung der cDNA aus einer cDNA Genbank und Selektion der gewünschten cDNA, beispielsweise mittels einer DNA Sonde oder mittels eines geeigneten Expressionssystems und Screening auf die Expression des gewünschten Polypeptids,
d) Synthese der doppelsträngigen DNA in vitro durch PCR Technologie der gesamten Aspergillus DNA mittels Oligonukleotidprimern, die für das für A. niger pepC oder A. niger pepD kodierende Gen entworfen sind, oder andere Serinproteasen vom Subtilisintyp, oder
e) Einbau einer doppelsträngigen DNA, die gemäß dem Schritt a), b), c) oder d) erhalten werden kann in einen geeigneten Vektor, Transformation eines geeigneten Wirts, Vermehrung des Wirts und Isolierung der DNA.

Die genomische DNA kann bezüglich der gewünschten DNA isoliert und gescreent werden (Schritt a). Die genomische DNA wird aus einem Aspergillus Stamm isoliert, der zur Expression eines Aspergillus Subtilisins fähig ist. Es wird eine DNA Genbank hieraus durch den Verdau mit geeigneten Restriktionsendonukleasen und einem Einbau hiervon in geeignete Vektoren gemäß etablierter Verfahren hergestellt. Die DNA Genbank wird mit einer DNA Sonde gescreent, wie dies hierin später beschrieben wird oder in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert und die erhaltenen Polypeptide werden auf herkömmliche Weise gescreent.
Eine Genbank kann beispielsweise durch einen Partialverdau der genomischen DNA eines A. niger Stamms, beispielsweise NW756 oder N400, mit beispielsweise Sau3AI oder MboI und der Klonierung der hochmolekularen DNA Fragmente in einen geeigneten Wirtsvektor, beispielsweise dem E. coli Plasmid pUN121 oder einem Lambda Vektor, beispielsweise EMBL4, hergestellt werden.
Andere Pilzstämme, die das gewünschte Aspergillus Subtilisin herstellen, beispielsweise A. japonicus, A. oryzae, A. nidulans und A. niger können als Quelle für die Genbank dienen und andere geeignete Vektoren, beispielsweise die vorher erwähnten, können als Empfänger für diese Fragmente verwendet werden.
Um die Genbank erfolgreich auf DNA Sequenzen zu screenen, die für das Aspergillus Subtilisin kodieren, ist eine DNA Hybridisierungssonde erforderlich. Dies kann eine synthetische DNA Sonde sein, falls die Aminosäuresequenz oder ein Teil hiervon eines gewünschten Aspergillus Subtilisins bekannt ist oder ein anderes Subtilisingen, beispielsweise von Hefe oder ein Teil hiervon, die mit einem Aspergillus Subtilisingen hybridisiert.
Es wird eine polyadenylierte Boten-RNA (Schritt b) aus den geeigneten Zellen durch bekannte Verfahren isoliert. Die Isolierungsverfahren umfassen beispielsweise die Homogenisierung in Gegenwart eines Detergenzes und eines Ribonukleaseinhibitors, beispielsweise Heparin, Guanidiniumisothiocyanat oder Mercaptoethanol, die Extraktion der mRNA mit geeigneten Chloroform-Phenol-Gemischen, wahlweise in Gegenwart von Salz und Pufferlösungen, Detergenzien und/oder Kationchelatmitteln, und die Ausfällung der mRNA aus der verbleibenden wässrigen, salzenthaltenden Phase mit Ethanol, Isopropanol oder dergleichen. Die isolierte mRNA kann ferner durch die Zentrifugation in einem Cäsiumchloridgradienten, gefolgt von einer Ethanolfällung und/oder von chromatographischen Verfahren gereinigt werden, beispielsweise Affinitätschromatographie, beispielsweise Chromato graphie auf Oligo(dT)-Cellulose oder auf Oligo(U)-Sepharose. Vorzugsweise wird eine so gereinigte Gesamt-mRNA nach der Größe durch Gradientenzentrifugation fraktioniert, beispielsweise in einem linearen Saccharosegradienten oder durch Chromatographie auf geeigneten Größenfraktionierungssäulen, beispielsweise auf Agarosegelen.
Die gewünschte mRNA wird durch Screenen der mRNA direkt mit einer DNA Sonde oder durch Translation in geeigneten zellhaltigen oder zellfreien Systemen und Screening der erhaltenen Polypeptide ausgewählt.
Die Selektion der gewünschten mRNA wird vorzugsweise mittels einer DNA Hybridisierungssonde erreicht, wie dies später beschrieben wird, wobei der zusätzliche Schritt der Translation vermieden wird. Geeignete DNA Sonden sind DNAs mit bekannter Nukleotidsequenz, beispielsweise synthetische DNAs, cDNAs, die von mRNA stammen, die für die gewünschten Polypeptide kodieren oder genomische DNA Fragmente, die beispielsweise benachbarte DNA Sequenzen enthalten, welche aus einer natürlichen Quelle oder einem genetisch veränderten Mikroorganismus isoliert wurden.
Fraktionierte mRNA kann in Zellen, beispielsweise Froschoocyten, oder in zellfreien Systemen, beispielsweise in Reticulocytenlysaten oder Weizenkeimextrakten translatiert werden. Die erhaltenen Polypeptide werden auf enzymatische Aktivität oder auf Reaktion mit Antikörpern getestet, die gegenüber dem nativen Polypeptid erzeugt wurden, beispielsweise in einem Immuntest, beispielsweise Radioimmuntest, Enzymimmuntest oder Immuntest mit Fluoreszenzmarkern. Solche Immuntests und die Herstellung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern sind gut bekannt und werden dementsprechend angewendet.
Die Herstellung einer einzelsträngigen, komplementären DNA (cDNA) aus der ausgewählten mRNA Matrize ist in der Technik gut bekannt, wie auch die Herstellung einer doppelsträngigen DNA aus einer einzelsträngigen DNA. Die mRNA Matrize wird inkubiert mit einem Gemisch aus Desoxynukleosidtriphosphaten, wahlweise radioaktiv markierten Desoxynukleosidtriphosphaten (um in der Lage zu sein, das Ergebnis der Reaktion zu screenen), einer Primersequenz, wie einem Oligo-dT Rest, der mit dem Poly-A-Schwanz der mRNA hybridisiert und einem geeigneten Enzym, wie einer reversen Transkriptase, beispielsweise aus dem Vogelmyoblastosevirus (AMV). Nach dem Abbau der mRNA Matrize, beispielsweise durch alkalische Hydrolyse, wird die cDNA mit einem Gemisch aus Desoxynukleosidtriphosphaten und einem geeigneten Enzym unter Bildung einer doppelsträngigen DNA inkubiert. Geeignete Enzyme sind beispielsweise eine reverse Transkriptase, das Klenow-Fragment der E. coli DNA Polymerase I oder die T4 DNA Polymerase. Gewöhnlich dient eine durch die einzelsträngige cDNA gebildete spontane Haarnadelstruktur als Primer für die Synthese des zweiten Strangs. Diese Haarnadelstruktur wird durch den Verdau mit S1 Nuklease entfernt. Alternativ dazu wird das 3'-Ende der einzelsträngigen DNA zuerst durch homopolymere Desoxynukleotidverlängerungen vor der Hydrolyse der mRNA Matrize und der anschließenden Synthese des zweiten cDNA Strangs verlängert.
Alternativ dazu wird die doppelsträngige cDNA aus einer cDNA Bank isoliert und auf die gewünschte cDNA gescreent (Schritt c). Die cDNA Bank wird durch Isolierung der mRNA aus geeigneten Zellen und der Herstellung einer einzelsträngigen und doppelsträngigen cDNA hiervon wie oben beschrieben konstruiert. Die cDNA wird mit geeigneten Restriktionsendonukleasen verdaut und in den λ-Phagen, beispielsweise λ Charon 4A oder λ gt 11, gemäß etablierter Verfahren eingebaut. Die auf Nitrocellulosemembranen replizierte cDNA Bank wird durch die Verwendung einer DNA Sonde, wie dies hierin vorher beschrieben wurde, gescreent oder in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert und die erhaltenen Polypeptide werden auf die Reaktion mit einem Antikörper gescreent, der für die gewünschten Verbindungen spezifisch ist.
Ein weiteres Verfahren zur Herstellung einer doppelsträngigen DNA ist die PCR Technologie (Schritt d). Dieses Verfahren kann insbesondere zur Herstellung einer großen Menge an doppelsträngiger DNA ausgehend von einer kleinen Menge an DNA oder RNA mit zumindest teilweise bekannten Sequenzen verwendet werden. Jedoch kann auch ein DNA Insert mit unbekannter Sequenz, das durch bekannte Vektorsequenzen flankiert ist, als Ausgangsmaterial verwendet werden. Bei der PCR Technologie werden DNA Moleküle, beispielsweise Oligonukleotide, als Primer für die enzymatische, Matrizen-abhängige Synthese der DNA verwendet. Es können große Mengen hergestellt werden, da die Denaturierung der doppelsträngigen DNA, die Hybridisierung mit den Primern und die enzymatische Synthese sequentiell wiederholt werden können. Die Anzahl an synthetisierten DNA Molekülen steigt exponentiell, da sie sich mit jeder Runde verdoppelt. Die PCR Technologie ist Stand der Technik und kann herkömmlich in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Der Oligonukleotidprimer kann so entworfen werden, dass er mit der DNA hybridisiert, die die konservierten Serinproteaseproteinsequenzen basierend auf einem Vergleich zwischen bekannten Serinproteasen kodieren würde. Die PCR Technologie ist in der Technik gut bekannt und es können herkömmliche PCR Techniken in der vorliegenden Erfindung angewendet werden, wie sie beispielsweise beschrieben sind in: M. A. Innis et al., (Herausgeber), PCR Protocols. A guide to methods and applications. Academic Press, San Diego (1990).
Es ist eine Vielzahl an Verfahren zum Einbau einer doppelsträngigen cDNA oder einer genomischen DNA in einen geeigneten Vektor bekannt (Schritt e). Beispielsweise können komplementäre Homopolymerabschnitte an die doppelsträngige DNA und die Vektor DNA durch die Inkubation in Gegenwart der entsprechenden Desoxynukleosidtriphoshate und eines Enzyms, wie der terminalen Desoxynukleotidyltransferase angefügt werden. Der Vektor und die doppelsträngige DNA werden dann durch Basenpaarung zwischen den komplementären Homopolymerschwänzen zusammengebracht und schließlich durch spezifische verbindende Enzyme, wie Ligasen, ligiert. Andere Möglichkeiten sind die Anfügung von synthetischen Linkern an die Enden der doppelsträngigen DNA oder der Einbau der doppelsträngigen DNA in den Vektor durch eine Ligation mit stumpfen oder abgestuften Enden. Geeignete Vektoren werden später im Detail diskutiert.
Die Transformationsverfahren zur Transformation von geeigneten Wirtszellen mit dem erhaltenen Hybridvektor und die Selektion und Vermehrung der transformierten Wirtszellen sind in der Technik gut bekannt. Beispiele für diese Verfahren werden später angeführt.
Die Isolierung der erfindungsgemäßen gewünschten DNA und von Mutanten und Fragmenten hiervon wird durch in der Technik bekannte Verfahren erreicht, beispielsweise durch Extraktion mit Phenol und/oder Chloroform. Wahlweise kann die DNA weiter manipuliert werden, beispielsweise durch die Behandlung mit mutagenen Mitteln unter Bildung von Mutanten oder durch einen Verdau mit Restriktionsenzymen, um Fragmente zu erhalten, ein oder beide Enden zur Erleichterung des Einbaus in den Vektor zu modifizieren, intervenierende Sequenzen zu entfernen und dergleichen.
Die Nukleotidsequenz einer erfindungsgemäßen DNA kann durch an sich bekannte Verfahren bestimmt werden, beispielsweise durch das Maxam-Gilbert Verfahren mittels endmarkierter DNA oder durch das Didesoxykettenabbruchverfahren von Sauger.
Die Aspergillus Subtilisingensequenzen der vorliegenden Erfindung können auch durch eine in vitro Synthese gemäß herkömmlicher Verfahren hergestellt werden. Die in vitro Synthese ist speziell für die Herstellung von kleineren Fragmenten eines Aspergillus Subtilisingens anwendbar, das für Fragmente eines Aspergillus Subtilisins mit Serinproteaseaktivität kodiert. Die in vitro Synthese ist auch insbesondere anwendbar für die Synthese von DNA, die für einen Promotor oder ein Signalpeptid kodiert. Die in vitro Synthese wird vorzugsweise auf das von A. niger stammende Aspergillus Subtilisingen oder auf Fragmente hiervon angewendet, am bevorzugtesten auf das in SEQ ID Nr. 1 gezeigte pepC Gen oder den Promotor oder die Signalsequenz hiervon oder auf das in SEQ ID Nr. 6 gezeigte pepD gen oder den Promotor oder die Signalsequenz hiervon.
Geeignete Verfahren zur DNA Synthese wurden in einer Zusammenfassung von S. A. Narang (Tetrahedron 39, 3, 1983) präsentiert. Die bekannten Synthesetechniken erlauben die Herstellung von Polynukleotiden mit einer Länge von bis zu 120 Basen in guter Ausbeute, hoher Reinheit und in relativ kurzer Zeit. Geeignet geschützte Nukleotide werden miteinander durch das Phosphodiesterverfahren (K. L. Agarwal et al., Angew. Chemie 84, 489, 1972), dem effizienteren Phosphotriesterverfahren (C. B. Reese, Tetrahedron 34, 3143, 1972), dem Phosphittriesterverfahren (R. L. Letsinger et al., J. Am. Chem. Soc. 98, 3655, 1976) oder dem Phosphoramiditverfahren (S. L. Beaucage und M. H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1859, 1981) verbunden. Eine Vereinfachung der Synthese der Oligonukleotide und Polynukleotide wird durch das Festphasenverfahren ermöglicht, worin die Nukleotidketten an ein geeignetes Polymer gebunden sind. Die doppelsträngige DNA wird enzymatisch aus chemisch hergestellten überlappenden Oligonukleotiden aus beiden DNA Strängen aufgebaut, die in korrekter Anordnung durch Basenpaarung gehalten werden und dann chemisch durch das Enzym DNA Ligase verbunden werden. Eine weitere Möglichkeit umfaßt die Inkubation von überlappenden einzelnen Oligonukleotiden von den zwei DNA Strängen in Gegenwart der vier erforderlichen Desoxynukleosidtriphosphate mit einer DNA Polymerase, beispielsweise DNA Polymerase I, dem Klenowfragment der Polymerase I oder T4 DNA Polymerase oder der reversen Transkriptase von AMV (Vogelmyoblastosevirus). Die zwei Oligonukleotide werden hierbei in der korrekten Anordnung durch Basenpaarung zusammengehalten und mit den erforderlichen Nukleotiden durch das Enzym aufgefüllt, um eine vollständige doppelsträngige DNA zu ergeben (S. A. Narang et al., Anal. Biochem. 121, 356, 1982).
Bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung kann ein Subtilisingen einer anderen Spezies, beispielsweise Hefe, oder ein Fragment hiervon als Sonde zur Identifizierung einer Aspergillus spec., beispielsweise einer A. niger Subtilisin mRNA in einer RNA Fraktion oder eine Subtilisin DNA in einer genomischen oder cDNA Bank verwendet werden. Aus der Pimärsequenz des A. niger Gens und einem Vergleich mit anderen Proteasen kann die kodierende Region der Protease abgeleitet werden und die Beziehung des Gens zur Subtilisingenfamilie kann bestätigt werden. Das erhaltene Gen kann zur Herstellung einer rekombinanten Protease verwendet werden, wie dies später im Detail beschrieben ist.
Synthetische DNA Sonden können gemäß bekannter Verfahren, wie sie hierin später beschrieben werden, vorzugsweise durch schrittweise Kondensation mittels des Phosphotriester-, Phosphit- oder Phosphoramiditfestphasenverfahrens synthetisiert werden, beispielsweise der Kondensation von Dinukleotidkupplungseinheiten durch das Phosphotriesterverfahren. Die Verfahren sind auf die Synthese von Gemischen der gewünschten Oligonukleotide durch die Verwendung von Gemischen aus zwei, drei oder vier Nukleotiden aus dA, dC dG und/oder dT in geschützter Form oder der entsprechenden Dinukleotidkupplungseinheiten im geeigneten Kondensationsschritt angepasst, wie dies von Y. Ike et al. beschrieben ist (Nucleic Acids Research 11, 477, 1983).
Zur Hybridisierung werden die DNA Sonden markiert, beispielsweise durch eine Kinasereaktion radioaktiv markiert. Die Hybridisierung der größenfraktionierten mRNA mit den eine Markierung enthaltenden DNA Sonden wird gemäß bekannter Verfahren ausgeführt, das heißt in Puffer und Salzlösungen, die Zusätze enthalten, beispielsweise Calciumchelatbildner, Viskositäts-regulierende Verbindungen, Proteine, nicht-homologe DNA und dergleichen, bei Temperaturen, die eine selektive Hybridisierung favorisieren, beispielsweise zwischen 0°C und 80°C, wie zwischen 25°C und 50°C oder um etwa 65°C, vorzugsweise um etwa 20°C niedriger als die Schmelztemperatur der doppelsträngigen Hybrid-DNA.
Transformierte Wirte und Präparationen hiervon
Ferner betrifft die Erfindung Wirtszellen, die mit einem Hybridvektor oder Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung transformiert sind, der vorzugsweise die bevorzugten Formen des erfindungsgemäßen Aspergillus Subtilisins der Erfindung kodiert.
Beispiele für geeignete Wirte, insbesondere zur Vermehrung der rekombinanten DNA Moleküle der Erfindung sind Mikroorganismen, die keine oder wenige Restriktionsenzyme oder Modifikationsenzyme aufweisen, wie Bakterien, insbesondere Stämme von Escherichia coli, beispielsweise E. coli X1776, E. coli Y1090, E. coli W3110, E. coli HB101/LM1035, E. coli JA 221, E. coli DH5α oder vorzugsweise E. coli DH5αF', JM109, MH1 oder HB101 oder E. coli K12 Stämme. Geeignete Wirte sind auch andere prokaryontische Zellen, beispielsweise Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus, Pseudomonas, Haemophilus, Streptococcus und andere und Hefen, beispielsweise Saccharomyces cerevisae, wie S. cerevisiae GRF 18. Weitere geeignete Wirtszellen sind Zellen höherer Organismen, insbesondere etablierte kontinuierliche humane oder tierische Zellinien, beispielsweise humane, embryonale Lungenfibroblasten L132, humane, maligne Bowes Melanomzellen, HeLa Zellen, mit SV40 Virus transformierte Nierenzellen der afrikanischen Meerkatze COS-7 oder Ovarzellen vom Chinesischen Hamster (CHO).
Beispiele für geeignete Zellen zur Expression eines Aspergillus Subtilisingens sind die vorher erwähnten Zellen, die mit einem geeigneten Expressionsvektor transformiert sind und zusätzliche geeignete Insektenzellen, die mit einem geeigneten Baculovirus Expressionsvektor transformiert sind und insbesondere filamentöse Pilze, beispielsweise Penicillium, Cephalosporium oder vorzugsweise Aspergillus spec., beispielsweise A. carbonarius, A. awamori, A. nidulans, A. oryzae oder bevorzugter A. niger, die mit einem geeigneten Expressionsvektor transformiert sind.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von solchen Transformanden, das die Behandlung einer geeigneten Wirtszelle unter Transformationsbedingungen mit einem DNA Molekül oder Hybridvektor der Erfindung, wahlweise zusammen mit einem geeigneten Selektionsmarkergen und wahlweise die Selektion der Transformanden umfasst. Das Aspergillus Subtilisingen kann auch nach der Transformation in das Wirtsgenom integriert werden, insbesondere falls eukaryontische Zellen, beispielsweise Aspergillus spec. als Wirt verwendet werden.
Die Transformation von Mikroorganismen wird gemäß herkömmilicher Verfahren ausgeführt, wie sie in der Literatur beschrieben sind, beispielsweise für S. cerevisiae (A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929, 1978), für B. subtilis (Anagnostopoulos et al., J. Bacteriol. 81, 741, 1961), für E. coli (M. Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159, 1970) und für Aspergillus [F. Buxton et al., Gene 37: 207–214 (1985), D. J. Balance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284–289 (1983)].
Demnach umfasst das Transformationsverfahren für E. coli Zellen beispielsweise eine Ca²⁺ Vorbehandlung der Zellen, um die DNA Aufnahme zu ermöglichen, und die Inkubation mit dem Hybridvektor. Die anschließende Selektion der transformierten Zellen kann beispielsweise durch den Transfer der Zellen in ein selektives Wachstumsmedium erreicht werden, das die Trennung der transformierten Zellen von den Ausgangszellen in Abhängigkeit der Art der Markersequenz der Vektor DNA erlaubt. Vorzugsweise wird ein Wachstumsmedium verwendet, das kein Wachstum von Zellen erlaubt, die keinen Hybridvektor enthalten.
Die Transformation von Pilzen, wie Hefe oder Aspergillus spec. umfasst beispielsweise Schritte der enzymatischen Entfernung der Zellwand durch Glucosidasen, die Behandlung der so erhaltenen Spheroplasten mit dem Hybridvektor in Gegenwart von Polyethylenglycol und Ca²⁺ Ionen und die Regeneration der Zellwand durch das Einbetten der Spheroplasten in Agar. Vorzugsweise wird der Regenerationsagar auf eine Weise hergestellt, die die Regeneration und Selektion der wie oben beschrieben transformierten Zellen zur selben Zeit erlaubt.
Die Transformation von Zellen höheren eukaryontischen Ursprungs, wie Säugerzellinien, wird vorzugsweise durch Transfektion erreicht. Die Transfektion wird durch herkömmliche Techniken ausgeführt, wie Calciumphosphatfällung, Mikroinjektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, das heißt Einführung der DNA durch einen kurzen elektrischen Impuls, der vorübergehend die Permeabilität der Zellmembran erhöht oder in Gegenwart von Hilfsverbindungen, wie Diethylaminoethyldextran, Dimethylsulfoxid, Glycerin oder Polyethylenglycol und dergleichen. Nach dem Transfektionsverfahren werden die transfizierten Zellen identifiziert und beispielsweise durch Kultivierung in einem geeigneten Selektivmedium in Abhängigkeit der Art des Selektionsmarkers ausgewält, beispielsweise durch Standardkulturmedien, wie Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM), Mimimal Essential Medium, RPMI 1640 Medium und dergleichen, die beispielsweise das entsprechende Antibiotikum enthalten.
Die transformierten Wirtszellen werden durch in der Technik bekannte Verfahren in einem Flüssigmedium kultiviert, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose oder Lactose, Stickstoff beispielsweise Aminosäuren, Peptide, Proteine oder ihre Abbauprodukte, wie Peptone, Ammoniumsalze oder dergleichen und anorganische Salze, beispielsweise Sulfate, Phosphate und/oder Carbonate von Natrium, Kalium, Magnesium und Calcium enthält. Das Medium enthält ferner wachstumsfördernde Substanzen, wie Spurenelemente, beispielsweise Eisen, Zink, Mangan und dergleichen.
Das Medium wird vorzugsweise so ausgewählt, dass es einen Selektionsdruck ausübt und das Wachstum der Zellen verhindert, die nicht transformiert wurden oder den Hybridvektor verloren haben. Daher wird beispielsweise ein Antibiotikum zum Medium gegeben, falls der Hybridvektor ein Antibiotikumresistenzgen als Marker enthält. Falls beispielsweise eine Wirtszelle verwendet wird, die für eine essentielle Aminosäure auxotroph ist, während der Hybridvektor ein Gen enthält, das für ein Enzym kodiert, welches den Wirtsdefekt komplementiert, wird ein Minimalmedium, dem diese Aminosäure fehlt, zur Kultivierung der transformierten Zellen verwendet.
Zellen höheren eukaryontischen Ursprungs, wie Säugerzellen, werden unter Gewebekulturbedingungen mittels im Handel erhältlicher Medien angezogen, wie beispielsweise Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), Minimal Essential Medium, RPMI 1640 Medium und dergleichen, wie sie oben erwähnt sind, die wahlweise mit wachstumsfördernden Substanzen und/oder Säugerseren supplementiert sind. Die Techniken zur Zellkultivierung unter Gewebekulturbedingungen sind in der Technik gut bekannt und umfassen die homogene Suspensionskultur, beispielsweise in einem Airliftreaktor oder in einem kontinuierlichen Rührreaktor oder einer immobilisierten oder eingeschlossenen Zellkultur, beispielsweise in Hohlfasern, Mikrokapseln, auf Agarosemikrokügelchen, porösen Glaskügelchen, Keramikkartuschen oder anderen Mikroträgern.
Die Kultivierung wird durch Verfahren bewirkt, die in der Technik bekannt sind. Die Kulturbedingungen, wie Temperatur, pH Wert des Mediums und Fermentationszeit, werden so ausgewählt, dass ein maximaler Titer des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats erhalten wird. Daher wird ein E. coli oder Hefestamm vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durch submerse Kultur mit Schütteln oder Rühren bei einer Temperatur von etwa 20°C bis 40°C, vorzugsweise bei etwa 30°C und einem pH Wert von 4 bis 8, vorzugsweise etwa 7, für etwa 4 bis 30 Stunden geschüttelt oder gerührt, vorzugsweise bis maximale Ausbeuten des erfindungsgemäßen Polypeptids oder Derivats erreicht sind.
Um die Selektion der transformierten von den nicht-transformierten Zellen zu erlauben, tragen die DNA Moleküle der Erfindung einen Selektionsmarker oder die Zellen werden alternativ dazu mit einem zweiten Vektor cotransformiert, der einen solchen Marker enthält. Wie in anderen Systemen ist ein solcher Selektionsmaker ein exprimierbares Strukturgen, dessen exprimiertes Polypeptid (ein Enzym) eine Resistenz gegenüber Verbindungen verleiht, die für den Empfängerorganismus toxisch sind oder die das Enyzmsystem einer Mutante vervollständigen, der dieses essentielle Polypeptid fehlt. Solche Markergene, die zur Selektion von transformierten filamentösen Pilzzellen geeignet sind, sind beispielsweise die bekannten qa-2, pyrG, pyr4, trpC, amdS oder argB Gene.
Wie in EP 0 278 355 A beschrieben, wird ein pyrA genanntes Markergen aus einer Genbank von A. niger isoliert, das mit pyrG von A. niger und pyr4 von N. crassa verwandt ist und dieselbe Funktion hat, nämlich das Enzymorotidin-5'-phosphatdecarboxylase bildet. Dieses Enzym katalysiert die Decarboxylierung von Orotidin-5'-phosphat zu Uridylsäure (Uridin-5'-phosphat) und auch von Fluororotsäure zum toxischen Fluoruridin. Jedoch kann die DNA von jedem anderen pyr Gen verwendet werden, das für die Orotidin-5'-phosphatdecarboxylase kodiert. Aus einem positiven Klon mit dem Namen E. coli BJ5183/pCG59D7 (DSM 3968) wird das Plasmid pCG59D7, das das pyrA gen umfasst, isoliert und zur Cotransformation einer A. niger pyrA^– Mutante verwendet. Eine solche pyrA^– Mutante ist im Orotidin-5'-phosphatdecarboxylasegen defekt und ist daher zur Bildung des entsprechenden Enzyms unfähig. Eine solche Mutante wird durch die Behandlung der Konidiosporen von A. niger N756 unter mutierender UV Bestrahlung hergestellt und es werden Kolonien selektiert, die in Gegenwart von Fluororotsäure und Uridin überleben. Kolonien, die in Gegenwrt von Fluororotsäure und in Abwesenheit von Uridin überleben, werden eliminiert. Die verbleibenden Uridin-bedürftigen Mutanten gehören gemäß ihrer Fähigkeit zur Transformation zu den zwei Komplementationsgruppen pyrA und pyrB, die jeweils von den A. niger Mutanten An8 und An10 repräsentiert werden. Sie werden in Form von Protoplasten hiervon unter einer transformierenden Bedingung mit dem pyrA enthaltenden Plasmid pCG59D7 (DSM 3968) behandelt. Nur die A. niger An8 (DSM 3917) Kolonien werden transformiert und enthalten das pyrA Gen, wie dies durch die Hybridisierbarkeit der verdauten DNA hiervon mit DNA von pUN121 gezeigt wird.
Verfahren zur Herstellung des Aspergillus Subtilisins
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Aspergillus Subtilisins der Erfindung, vorzugsweise der bevorzugten Formen hiervon, das die Kultivierung eines Wirts, der mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert ist, unter Bedingungen umfasst, die für die Expression des Aspergillus Subtilisingens geeignet sind. Erforderlichenfalls wird das Polypetid auf herkömmliche Weise isoliert. In Abhängigkeit der Konstruktion des Expressionsvektors wird das Aspergillus Subtilisin entweder gebildet oder, falls eine Signalsequenz vorhanden ist, gebildet und sekretiert.
Ob ein ausgewählter Wirt zur Expression geeignet ist oder nicht hängt hauptsächlich von den Regulationssequenzen ab, die zur Konstruktion des Expressionsvektors ausgewählt wurden, insbesondere vom Promotor.
Falls beispielsweise ein Promotor, der von einem Gen von Aspergillus, vorzugsweise A. niger stammt, zur Expression eines erfindungsgemäßen Aspergillus Subtilisingens verwendet wird, ist ein Aspergillus Stamm, vorzugsweise A. niger, ein geeigneter Wirt. Falls jedoch ein Promotor, der nicht von einem Aspergillus Gen stammt, zur Konstruktion eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors verwendet wird, sind andere Wirte zur Expression geeignet, beispielsweise Bakterien, wie E. coli oder Hefe, wie S. cerevisiae. Geeignete Wirte und Promotoren zur Herstellung von Polypeptiden gemäß der Erfindung sind auch die, die zur Transformation geeignet sind, wie sie vorher angegeben wurden.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, worin ein transformierter Aspergillus Wirt das exogene Aspergillus Subtilisingen unter Bedingungen exprimiert, unter denen endogene Aspergillus Subtilisingene aktiv sind und daher mehr als die natürliche Menge des Aspergillus Subtilisins aufgrund der erhöhten Gendosis exprimiert. Für diesen Zweck wird der Aspergillus Wirt, insbesondere A. niger, mit einem Expressionsvektor transformiert, der ein Aspergillus Subtilisingen unter der Kontrolle seiner homologen, das heißt natürlich gebundenen Expressionskontrollsequenzen umfasst, insbesondere Promotor- und Signalsequenz.
Insbesondere betrifft die Erfindung auch ein Verfahren, worin ein transformierter Aspergillus Wirt das exogene Aspergillus Subtilisingen in einer größeren Menge oder unter unterschiedlichen Bedingungen exprimiert, als das endogene Gen, da es an einen unterschiedlichen Promotor fusioniert ist.
Die Bedingungen für die maximale Expression des exogenen Gens oder der exogenen Gene hängt vom ausgewählten Expressionssystem ab. Falls beispielsweise ein Promotor einer Pectinlyase (PL) oder eines Polygalacturonasegens (PG) von A. niger verwendet wird, ist die Expression des hiermit verbundenen Aspergillus Subtilisingens in einer A. niger Zelle durch die Zugabe von Pectin oder Pectinabbauprodukten in das Kulturmedium induzierbar. In Gegenwart von ausreichend Glucose ist jedoch der Promotor nicht induzierbar, falls ein A. niger Stamm als Wirt verwendet wird, beispielsweise An8 (DSM 3917). Dies meint, dass ein Aspergillus Subtilisingen unter der Kontrolle eines A. niger PL oder PG Promotors in A. niger "katabolitreprimiert" ist. Falls jedoch ein anderer Aspergillus Stamm verwendet wird, vorzugsweise A. oryzae oder am bevorzugtesten A. nidulans wird ein Aspergillus Subtilisingen unter der Kontrolle eines A. niger PL oder PG Promotors konstitutiv exprimiert, das heißt auch in Abwesenheit von Pectin und/oder der Anwesenheit von Glucose. Es kann daher vorteilhaft sein, ein Aspergillus Subtilisingen unter der Kontrolle eines A. niger PL oder PG Promotors in einen anderen Aspergillus Wirt als A. niger zu exprimieren, vorzugsweise A. oryzae oder am bevorzugtesten A. nidulans, da beispielsweise Glucose anstelle von Pectin in das Nährmedium als Energie- und Kohlenstoffquelle während der Expression des Gens gegeben werden kann.
Falls ein Pyruvatkinasepromotor von Aspergillus, vorzugsweise A. niger zur Expression eines Aspergillus Subtilisingens verwendet wird, wird das Gen exprimiert, falls ein Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoff und Energiequelle verwendet wird.
Es ist nun möglich, das Aspergillus Subtilisin überzuexprimieren, wobei verschiedene Verfahren angewendet werden können. Ein gereinigtes einzelnes Aspergillus Subtilisin kann durch ein Verfahren hergestellt werden, worin ein geeigneter Wirt, der nicht zur Expression eines Aspergillus Subtilisins fähig ist oder der das Aspergillus Subtilisin in geringen Mengen exprimiert oder der kein Aspergillus Subtilisin unter den zur Expression des exogenen Aspergillus Serinproteinasegens verwendeten Induktionsbedingungen exprimiert, mit einem Hybridvektor transformiert wird, der ein Strukturgen umfasst, das für ein Aspergillus Subtilisin, vorzugsweise von A. niger kodiert, am bevorzugtesten PEPC, das in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist oder ein Fragment eines Aspergillus Subtilisins mit Serinproteaseaktivität und das Strukturgen wird exprimiert. Falls ein Wirt verwendet wird, der zu keiner Expression eines Aspergillus Subtilisins fähig ist, kann das jeweilige einzelne Aspergillus Subtilisin in reiner Form erhalten werden, das heißt ohne Kontamination durch ein anderes Aspergillus Subtilisin.
Ein Wirt, der nicht zur Expression eines Aspergillus Subtilisins fähig ist, ist entweder ein Mikroorganismus ohne einem entsprechenden Gen oder ein Aspergillus Stamm, dessen Expression der endogenen Aspergillus Subtilisingene in einem geeignet konditionierten Wachstumsmedium supprimiert wurde, während der exogene Aspergillus Subtilisinpromotor, der operativ mit dem gewünschten Aspergillus Subtilisinstrukturgen verbunden ist, beispielsweise ein von A. niger stammender Promotor, unter diesen Bedingungen aktiv ist oder worin das Aspergillus Subtilisingen mit einem anderen Promotor fusioniert ist.
Andere Promotoren und Stämme, die zur Herstellung eines Aspergillus Subtilisins fähig sind, sind die hierin vorher in der Beschreibung der erfindungsgemäßen Expressionsvektoren angegebenen.
Aspergillus Subtilisin und die Verwendung hiervon
Reine Aspergillus Serinprotease des Subtilisintyps an sich wird hierin auch "Aspergillus Subtilisin" genannt. Eine solche Protease wird so verstanden, dass sie (a) von Aspergillus spec stammt, (b) eine Proteaseaktivität aufgrund eines katalytischen Serinrests im aktiven Zentrum zeigt und (c) eine ausreichende Aminosäuresequenzhomologie mit bekannten Serinproteasen aufweist, um in die Familie der Subtilisinfamilie eingruppiert zu werden. Vom Ausdruck Aspergillus Subtilisin umfasst werden auch Fragmente eines solchen Enzyms, die eine Serinproteaseaktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft bevorzugt ein reines Aspergillus Subtilisin von Aspergillus niger, vorzugsweise die Serinprotease PEPC mit der Aminosäuresequenz, die in der Sequenzliste unter SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist oder die Serinprotease PEPD mit der Aminosäuresequenz, die in der Sequenzliste unter SEQ ID Nr. 6 gezeigt ist, und Fragmente und Mutanten hiervon, die eine Serinproteaseaktivität aufweisen.
Die Erfindung betrifft ferner enzymatische Zusammensetzungen, die eine oder mehrere eines Aspergillus Subtilisins und/oder ein Derivat hiervon mit Serinproteaseaktivität und/oder biologisch annehmbare Salze hiervon wahlweise in einer vorbestimmten Kombination mit einem oder mehreren geeigneten Enzymen mit einer anderen Aktivität als die Aspergillus Subtilisinaktivität umfassen.
Aspergillus Stamm der bezüglich des Aspergillus Subtilisins defizient ist
Die Erfindung betrifft auch einen mutierten Aspergillus Stamm. Bevorzugt ist ein A. niger Stamm, der im pepC Gen defizient ist, das in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist oder im pepD Gen, das in SEQ ID Nr. 6 gezeigt ist. Bevorzugt ist auch ein A. niger Stamm, der sowohl im pepC als auch im pepD Gen defizient ist.
Ein mutierter Aspergillus Stamm der Erfindung mit einem defekten Aspergillus Subtilisingen kann in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung durch eine Genzerstörung hergestellt werden, das heißt eine DNA Sequenz, die dem endogenen Aspergillus Gen entspricht, das zerstört werden soll, wird in vitro zu einem defekten Gen mutiert und in die Aspergillus Wirtszelle transformiert. Aufgrund eines homologen Rekombinationsereignisses in der Zelle wird das intakte endogene Gen durch das defekte exogene ersetzt. Gewöhnlich wird das exogene Gen durch die Insertion eines Markergens in die kodierende Region zerstört. Dies führt zu einem defekten Gen, das leicht verfolgt werden und zur Selektion von Transformanden verwendet werden kann, bei denen das entsprechende endogene Gen zerstört wurde. Jedoch können auch andere Verfahren zur Mutagenese zur Herstellung eines mutierten Aspergillus Stamms verwendet werden, vorzugsweise eines mutierten A. niger Stamms, worin ein endogenes pepC oder pepD Gen so mutiert ist, dass kein funktionelles PepC oder PepD exprimiert werden kann.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein A. niger Stamm mit einem Hybridvektor transformiert, der eine Defektmutante des pepC Gens aufweist, das in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, beispielsweise ein zerstörtes pepC Gen mit einem inserierten Selektionsmarkergen, wie dies beispielsweise im Plasmid pPEPCPYRA enthalten ist, das in den Beispielen beschrieben ist, und es werden Transformanden selektiert.
In einer weiteren am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein A. niger Stamm mit einem Hybridvektor transformiert, der eine Defektmutante des pepD Gens aufweist, das in SEQ ID Nr. 6 gezeigt ist, beispielsweise ein zerstörtes pepD Gen mit einem inserierten Selektionsmarkergen, wie dies beispielsweise im Plasmid pPEPDPYRA enthalten ist, das in den Beispielen beschrieben ist, und es werden Transformanden selektiert.
In einer dritten am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein A. niger Stamm mit einer Defektmutante des pepC Gens transformiert, das in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, beispielsweise ein zerstörtes pepC Gen mit einem inserierten Selektionsmarkergen, wie dies beispielsweise im Plasmid pPEPCPYRA enthalten ist, das in den Beispielen beschrieben ist, und mit einer Defektmutante des pepD Gens, das in SEQ ID Nr. 6 gezeigt ist, beispielsweise ein zerstörtes pepD Gen mit einem inserierten Selektionsmarkergen, wie dies beispielsweise im Plasmid pPEPDPYRA enthalten ist, das in den Beispielen beschrieben ist und es werden Transformanden selektiert, die sowohl für pepC als auch pepD defekt sind.
Ein mutierter Aspergillus niger Stamm der Erfindung mit einem defekten pepC und/oder pepD Gen ist zur Expression einer verbesserten Bildung von heterologen oder homologen Proteinen entweder intra- oder extrazellulär brauchbar.
Die Expression von heterologen oder homologen Proteinen in Aspergillus spec. kann gemäß herkömmlicher Verfahren erreicht werden. Gewöhnlich wird ein Expressionsvektor konstruiert, der ein homologes oder heterologes Gen umfasst, das operativ mit einem homologen oder heterologen Promotor verbunden ist, der in Aspergillus funktionsfähig ist und wahlweise mit anderen Expressionskontrollsequenzen, die in Aspergillus funktionsfähig sind, beispielsweise den vorher definierten. Erforderlichenfalls wird das Polypeptid auf herkömmliche Weise isoliert. In Abhängigkeit der Konstruktion des Expressionsvektors werden die Produkte entweder in der Wirtszelle oder, falls eine Signalsequenz vorhanden ist, in der Zelle produziert und sekretiert.
Strukturgene sind in diesem Zusammenhang beispielsweise Strukturgene, die von Viren, prokaryontischen Zellen oder eukaryontischen Zellen stammen und die aus einer genomischen DNA oder aus einer cDNA stammen, die über die mRNA Route hergestellt wurde oder chemisch synthetisiert wurden, die für eine große Vielzahl an brauchbaren Polypeptiden kodieren, einschließlich glycosylierter Polypeptide, insbesondere höheren eukaryontischen Ursprungs, speziell Säugerursprungs, wie tierischen oder speziell menschlichen Ursprungs, wie Enzyme, die beispielsweise zur Herstellung von Nahrungsmitteln verwendet werden können und zur Durchführung von enzymatischen Reaktionen in der Chemie, oder Polypeptide, die brauchbar und wertvoll zur Behandlung von Erkrankungen beim Menschen oder Tier oder zur Prävention hiervon sind, beispielsweise Hormone, Polypeptide mit immunmodulatorischen, Antivirus- und Antitumoreigenschaften, Antikörper, virale Antigene, Impfstoffe, Gerinnungsfaktoren, Nahrungsmittel und dergleichen.
Beispiele für solche Strukturgene sind beispielsweise die, die kodieren für Aspergillus Polygalacturonase, beispielsweise PGI oder PGII, oder Aspergillus Pectinlyase, beispielsweise PLI, PLA, PLB, PLC, PLE und PLF oder Hormone, wie Sekretin, Thymosin, Relaxin, Calcitonin, luteinisierendes Hormon, Parathyroidhormon, Adrenocorticotropin, Melanozyten-stimulierendes Hormon, β-Lipotropin, Urogastron oder Insulin, Wachstumsfaktoren, wie epidermaler Wachstumsfaktor, Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor (IGF), beispielsweise IGF-I und IGF-II, Mast zellwachstumsfaktor, Nervenwachstumsfaktor, von Gliazellen stammender Nervenzellwachstumsfaktor oder transformierender Wachstumsfaktor (TGF), wie TGFβ, Wachstumshormone, wie humane oder Rinderwachstumshormone, Interleukin, wie Interleukin-1 oder 2, humaner Makrophagenmigrationshemmfaktor (MIF), Interferone, wie humanes α-Interferon, beispielsweise Interferon-αA, αB, αD oder αF, β-Interferon, γ-Interferon oder ein Hybridinterferon, beispielsweise ein αA-αD- oder ein αB-αD-Hybridinterferon, speziell das Hybridinterferon BDBB, Proteinaseinhibitoren, wie α₁-Antitrypsin, SLPI und dergleichen, Hepatitisvirusantigene, wie Hepatitis B Virusoberflächen- oder -kernantigen oder Hepatitis A Virusantigen, oder Hepatitis nonA-nonB Antigen, Plasminogenaktivatoren, wie Gewebsplasminogenaktivator oder Urokinase, Tumornekrosefaktor, Somatostatin, Renin, β-Endorphin, Immunglobuline, wie die leichten und/oder schweren Ketten von Immunglobulin D, E oder G oder Mensch-Maus Hybridimmunglobuline, Immunglobulinbindungsfaktoren, wie Immunglobulin E Bindungsfaktor, Calcitonin, Humancalcitonin-verwandtes Peptid, Blutgerinnungsfaktoren, wie Faktor IX oder VIIIc, Erythropoetin, Eglin, wie Eglin C, Hirudin, Desulfatohirudin, wie Desulfatohirudinvariante HV1, HV2 oder PA, humane Superoxiddismutase, virale Thymidinkinase, β-Lactamase und Glucoseisomerase. Bevorzugte Gene sind die, die für ein humanes αInterferon oder Hybridinterferon kodieren, insbesondere Hybridinterferon BDBB, humanen Gewebeplasminogenaktivator (t-PA), Hepatitis B Virusoberflächenantigen (HBVsAg), Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I und II, Eglin C und Desulfatohirudin, beispielsweise die Variante HV1.
Die am meisten bevorzugten Ausführungsformen sind die, die in den begleitenden Beispielen beschrieben sind.
Beispiele
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, sollen sie jedoch nicht beschränken.

Die Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen:

BSA	Rinderserumalbumin
DTT	1,4-Dithiothreit
EDTA	Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz
IPTG	Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
kb	Kilobasenpaare
PEG	Polyethylenglycol
SDS	Natriumdodecylsulfat
Tris	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
X-Gal	5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactosid

Puffer Medien und Reagenzien
Die folgenden Stämme und Vektoren werden verwendet:
Beispiel 1: Konstruktion einer Genbank von Aspergillus niger
Beispiel 1.1: Isolierung von hochmolekularer DNA von A. niger N400
Konidiosporen von Aspergillus niger Stamm N400 werden in 200 ml Minimalmedium auf eine schließliche Sporendichte von 10⁶ Sporen/ml angeimpft und in einen 11 fassenden Erlenmeyerkolben für 24 h bei 28°C bei 300 Upm geschüttelt. Das Myzel wird durch Filtration durch Myracloth auf einer Buchner Nutsche geerntet, mit kalter Kochsalzlösung gewaschen, in flüssigem Stickstoff eingefroren und entweder bei –60°C gelagert oder direkt verwendet. Das zur Isolierung der DNA zur Herstellung einer Genbank verwendete Verfahren basiert auf dem von Yelton et al., beschriebenen Verfahren [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1470–1474 (1984)].
Zur Genbankkonstruktion werden 10 g Myzel in flüssigem Stickstoff in 1 g Portionen in einem Braun Mikrodismembrator gemahlen. Das gemahlene Myzel wird in einen sterilen 1 l Erlenmeyerkolben überführt, der 200 ml Extraktionspuffer (50 mM EDTA pH 8,5, 0,2% SDS) und 200 μl Diethylpyrocarbonat enthält. Das Gemisch wird langsam auf Raumtemperatur erwärmt und dann für 20 Minuten auf 68°C mit zeitweisem Schütteln erhitzt. Die Suspension wird auf Raumtemperatur abgekühlt und für 15 Minuten bei 12 000 × g zentrifugiert. 1/16 Volumen einer 8 M Kaliumacetatlösung mit pH 4,2 wird zum Überstand gegeben und das Gemisch wird für 1 h auf Eis gehalten. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation entfernt (20 min, 16 000 × g, 4°C). Die Nukleinsäuren werden aus dem Überstand durch die Inkubation mit 0,6 Volumen Isopropanol auf Eis für 15 Minuten gefällt. Die gefällte Nukleinsäure wird durch Zentrifugation (10 Minuten, 6 000 × g, 4°C) gewonnen, mit 70% Ethanol gewaschen und kurz getrocknet. Das Pellet wird in 10 ml TE suspendiert, worin 20 μg/ml RNase A (Boehringer Mannheim) enthalten sind und für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die DNA wird mit Nuklease-freier Pronase (1 mg/ml Endkonzentration) (Kochlight, Coinbrook) für 1 h bei 37°C inkubiert.
8,5 g CsCl wird in 9 ml erhaltener DNA Lösung gelöst, 0,2 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid werden zugegeben und die Lösung wird entweder in einem Beckman SW41 Rotor für 60 h bei 33 000 Upm oder in einem Beckman 50 Ti Rotor für 40 h bei 45 000 Upm zentrifugiert. Die DNA Bande wird gewonnen und das Ethidiumbromid wird durch mehrfache Extraktionen mit Isopropanol entfernt, das mit einer gesättigten NaCl Lösung in Wasser äquilibriert ist. Es werden 5 Volumina TE zugegeben und die DNA Lösung wird nacheinander behandelt mit TE gesättigtem Phenol, Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25/24/1 und Chloroform/Isoamylalkohol 24/1. Die DNA wird durch die Zugabe von 0,1 Volumina an 3 M Natriumacetat mit pH 5,2, 2,5 Volumina Ethanol und einer Inkubation über Nacht bei –20°C gefällt. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen (1 h, 30 000 × g, 4°C), mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 400 μl TE gelöst.
Beispiel 1.2: Partialverdau der A. niger N400 DNA mit MboI und Isolierung der Fragmente
Um die MboI Konzentration auszutesten, die die größte Menge an DNA Fragmenten zwischen 13,6 und 23 kb ergibt, werden 1 μg Portionen der A. niger N400 DNA mit dem geeigneten Puffer, der vom Hersteller empfohlen wird, mit abnehmenden Mengen an MboI (0,5–0,001 E) für 1 h bei 37°C in einem Volumen von 10 μl verdaut. Die Reaktion wird durch die Zugabe von 1 μl 0,25 M EDTA gestoppt und die Proben werden auf ein 0,6% Agarosegel in TBE Puffer aufgetragen, das 1 μg/ml Ethidiumbromid enthält. Die für eine hohe Ausbeute der gewünschten 13,6– 23 kb Fragmente erforderliche MboI Konzentration beträgt etwa 0,02 E/μg DNA. Demnach werden 200 μg DNA in einem Gesamtvolumen von 2 ml verdaut. Nach 1 Stunde bei 37°C wird EDTA in einer Endkonzentration von 25 mM zugegeben, das Enzym wird bei 65°C für 10 Minuten hitzeinaktiviert und die DNA wird gefällt, gewaschen, getrocknet und in 400 μl TE gelöst. Die fragmentierte DNA wird auf einem präparativen 0,4% Agarosegel bei 4°C und 40 V (3 V/cm) aufgetrennt. Fragmente der korrekten Größe werden aus dem Gel ausgeschnitten und die DNA wird aus dem Gel in ein steriles Dialyseröhrchen in 2 ml TBE für 2–3 Stunden bei 100 V elektroeluiert. Die Spannung wird für 30 Sekunden umgekehrt und der die DNA enthaltende Puffer wird gewonnen. Die Fragmente werden dann durch Ethanolfällung konzentriert und in 100 μl TE gelöst.
Beispiel 1.3: Herstellung der Vektor DNA
Die Genbank des A. niger Stamms N400 wird im Lambdavektor EMBL4 konstruiert. Der Vektor, der eine Klonierungskapazität von 9–23 kb aufweist, wird von Frischauf et al. [7. Mol. Biol. 170: 827–842 (1983)] und Karn et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5172–5176 (1980)] beschrieben und kann von Promega Biotechnology Inc. bezogen werden. Um zu vermeiden, dass zwei Inserts, die von unterschiedlichen Teilen des Genoms stammen, in einen Phagen kloniert werden können, wird eine minimale Fragmentlänge von 13,6 kb zur Klonierung verwendet.
10 μg Lambda EMBL4 DNA wird vollständig mit 50 Einheiten BamHI im vom Hersteller empfohlenen Puffer in einem Volumen von 100 μl für 2 Stunden bei 37°C verdaut. Das Enzym wird für 10 Minuten bei 65°C inaktiviert. Die NaCl Konzentration wird auf 150 mM erhöht und 50 Einheiten SalI werden zugegeben und die Inkubation bei 37°C wird für weitere 2 Stunden fortgesetzt. Nach der Zugabe von EDTA bis 25 mM wird das Enzym durch Erhitzen für 10 Minuten auf 65°C inaktiviert. Die Lösung wird mit gleichen Volumina Phenol(TE gesättigt), Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25 : 24 : 1 und Chloroform/Isoamylalkohol (24 : 1) extrahiert. Um die kleinen BamHI/SalI Polylinkerfragmente zu eliminieren, wird die DNA mit 0,6 Volumina Isopropanol nach der Zugabe von 0,1 Volumina an 3 M Natriumacetat pH 5,2 gefällt. Nach 15 Minuten auf Eis und einer Zentrifugation für 15 Minuten bei 12 000 × g bei 4°C wird der Niederschlag gründlich mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 40 μl TE gelöst.
Beispiel 1.4: Ligation und in vitro Verpackung von genomischen A. niger N400 DNA Fragmenten
Es ist wesentlich, dass die cos-Stellen des gemäß Beispiel 2.3 hergestellten Vektors vor der Ligationsreaktion aneliert werden. Der Vektor wird in 100 mM Tris-HCl pH 7,5 und 10 mM MgCl₂ für 10 Minuten auf 65°C erhitzt und dann für 1 Stunde bei 42°C aneliert. Aus Testligationen ergibt ein Verhältnis von Vektor zu Fragmenten von etwa 1 : 1 (bezogen auf das Gewicht) die meisten Rekombinationen. Die Ligation findet in 50 mM Tris HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 1 mM ATP mittels 9,5 μg Vektor und 10 μg DNA Fragmenten in einem Gesamtvolumen von 100 μl statt. Es wird DNA Ligase (BRL) in einer Konzentration von 0,5 E/μg DNA zugegeben und das Ligationsgemisch wird über Nacht bei 14°C inkubiert. Um die Ligation zu testen, wird eine Probe der ligierten DNA auf einem Agarosegel aufgetrennt. Als Kontrolle werden 0,5 μg des Vektors ohne Zugabe von Fragmenten in einem Volumen von 5 μl ligiert.
Das Ligationsgemisch wird durch Ethanolfällung konzentriert und in 20 μl TE vor der in vitro Verpackung gelöst. Die in vitro Verpackung wird mit Promega Packagene Extrakten gemäß der Anleitung des Herstellers mittels 10 μl Portionen zur Verpackung von 1 μg DNA ausgeführt. 1 μg des hochmolekularen Lambda Kontrollphagen cI857 Sam7, der mit den Extrakten mitgeliefert wird, wird getrennt als Kontrolle verpackt. Nach dem Verpacken werden 500 μl Phagenlösungspuffer (PSB) und 5 μl Chloroform zugegeben. Die rekominanten Phagenstammlösungen können bei 4°C gelagert werden.
Beispiel 1,5: Titration und Amplifizierung der A niger Stamm N400 Genbank
Zellen von E. coli NM539 werden in LB Medium, das 0,2% Maltose, 10 mM MgSO₄ und 1 mM CaCl₂ enthält, bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 1,0 angezogen. 0,2 ml Aliquots dieser Kultur werden zu 0,1 ml einer geeigneten Phagenverdünnung in PSB gegeben. Nach der Adsorption der Phagen für 20 Minuten bei 37°C werden 3 ml an 0,6% LB Überschichtungsagar bei 45°C zugegeben, das Gemisch wird auf LB Platten plattiert und diese werden über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Anzahl an Plaques-bildenden Einheiten (PFU) pro ml Phagensuspension beträgt 12 × 105 und 4,2 × 10⁵ PFU/ml für die zwei Phagenstammlösungen, die in Beispiel 1,4 hergestellt wurden. Nach dem Abzug des Hintergrunds, der aus den Kontrolligationen ohne Fragmente berechnet wird (jeweils 17% und 40%) beträgt die absolute Anzalil an Rekombinanten 6 × 10⁵. Die in den Rekombinanten enthaltene DNA ist zu mehr als 200 Genomen von Aspergillus niger äquivalent.
Um die Genbank zu amplifizieren, werden 80 μl beider Phagenstammlösungen zur Infektion von E. coli NM539 Zellen verwendet, die in LB Überschichtungsagar auf LB Platten plattiert und dann über Nacht bei 37°C inkubiert werden. Die Phagen werden aus der Agarose durch sanftes Schütteln der Platten mit 5 ml PSB pro Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur eluiert. Der PSB wird gewonnen, zentrifugiert (10 Minuten bei 6000 × g), um Bakterien zu entfernen und es wird Chloroform zugegeben (0,5% Endkonzentration). Beide Phagenstammlösungen, die etwa im gleichen Ausmaß amplifiziert wurden, werden dann gemischt (40 μl Stammlösung), titriert (8 × 10⁹ PFU/ml) und bei 4°C gelagert.
Beispiel 2: Herstellung einer Hefe PRB Sonde
Beispiel 2.1: Herstellung der Hefesonde
Das Plasmid pGP202 (hinterlegt als DSM 7018) enthält ein 3,2 kg Fragment der Hefe DNA, das für das Hefe PRB gen kodiert, welches bequem mit HindIII und SauI ausgeschnitten werden kann. Dieses Plasmid wird mit HindIII und SauI verdaut und die Fragmente werden auf einem 0,8% Agarosegel getrennt. Das 3,2 kb Fragment wird ausgeschnitten und die DNA wird elektroeluiert. 100 ng dieses Fragments werden mit ³²P-dATP als markiertes Nukleotid nick-translatiert und unmittelbar entweder für Southern Blots oder Plaqueliftsonden verwendet.
Beispiel 2.2: Southern Blots von A. niger DNA
2 μg Aliquots der wie oben präparierten A. niger DNA werden entweder mit BamHI oder HindIII verdaut und auf einem 0,8% Agarosegel aufgetrennt. Nach der Photographie des mit Ethidiumbromid gefärbten Gels wird die DNA durch Kapillarblot auf Nitrocellulosefilter überführt [E. M. Southern, J. Mol. Biol. 98: 503–517 (1975)] und mit der markierten Hefe PRB Sonde hybridisiert, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist. Getrennte Nitrocellulosestreifen, die beide Verdaus enthalten, werden einer Vielzahl an Waschschritten unterzogen, um die Bedingungen zu bestimmen, die das stärkste Signal-zu-Rausch Verhältnis ergeben. Es wurde festgestellt, dass ein Waschschritt in 6 × SSC bei 37°C, gefolgt von zwei Waschschritten in 2 × SSC bei Raurmtemperatur die besten Ergebnisse ergibt.
Beispiel 3: Screening der A niger N400 Genbank mit der Hefe PRB Sonde
Ein Teil der oben beschriebenen Genbank des Aspergillus niger Stamms N400 (Beispiel 1) wird in SM verdünnt und 0,1 ml Portionen, die jeweils etwa 2000 PFU enthalten, werden plattiert. Die Wirtszellen werden durch die Beimpfung von 50 ml LB Medium, das mit 0,2% Maltose supplementiert ist, mit 0,5 ml einer Übernachtkultur von E. coli NM539 in LB Medium, einem Schütteln für 4 h bei 250 Upm bei 37°C, gefolgt von der Zugabe von 0,5 ml an 1 M MgSO₄ und 0,5 ml CaCl₂ hergestellt. 0,2 ml Aliquots dieser Zellen werden jeweils mit einer 0,1 ml Portion der Phagensuspension gemischt und bei Raumtemperatur für eine halbe Stunde inkubiert. Dann werden 3 ml an 0,7% Agarose in LM Medium bei 47°C zugegeben, kurz gemischt und sofort auf LM Agarplatten plattiert. Die Platten werden über Nacht bei 37°C inkubiert und für 2 Stunden bei 4°C gekühlt.
Aus jeder Platte werden zwei Abdrücke gemäß dem Benton und Davis Plaquehybridisierungsverfahren hergestellt [W. D. Benton und R. W. Davis, Science 196: 180–182 (1977)). Das erste Filter (Schleicher und Schuell BA85) wird für 1 Minute auf die Platte gelegt, der zweite Abdruck für 2 Minuten und die Position der Abdrücke wird mittels chinesischer Tusche markiert. Nach der Entfernung der Filter werden sie in eine Schale, die 100 ml einer Denaturierungslösung (1 M NaCl, 0,5 M NaOH) enthält für 0,5 Minuten gegeben und dann für 1 Minute in 100 ml Neutralisierungslösung (0,5 M Tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl). Die Filter werden dann in eine Schale überführt, die 3 × SSC enthält und sanft mit einer Handschuh-bestückten Hand abgerieben, um den Bakteriendebris zu entfernen und dann mit 3 × SSC gewaschen. Die Filter werden geblottet, für 10 Minuten bei Raumtemperatur getrocknet und auf Whatman 3 MM Papier in einem Ofen bei 80°C für 2 Stunden gebacken.
Die gebackenen Filter werden in 3 × SSC befeuchtet, in dieser Lösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur gewaschen und dann in eine Schale überführt, die 250 ml vorgewärmtes (56°C) Prähybridisierungsgemisch enthält (6 × SSC, 10 × Denhardts (0,2% BSA, Boehringer Fraktion V, 0,2% Ficoll 400, Pharmacia, 0,2% Polyvinylpyrrolidon-10, Sigma) 0,1% SDS und 0,1 mg/ml durch Scherkräfte zerkleinerte und frisch denaturierte Heringssperma DNA). Nach 1 Stunde Prähybridisierung bei 56°C in einem Schüttelwasserbad werden die Filter für 1,5 Stunden in 250 ml vorgewärmtem (56°C) Hybridisierungsgemisch gewaschen, das dasselbe ist, wie das Prähybridisierungsgemisch, außer dass ihm die Heringssperma DNA fehlt. Dann werden die Filter in eine Schale überführt, die 150 ml vorgewärmtes (56°C) Hybridisierungsgemisch enthält, zu der die vorher markierte Sonde frisch zugegeben wurde.
Nach der Hybridisierung für 14 Stunden bei 65°C werden die Filter eimnal in 250 ml vorgewärmten (47°C) Hybridisierungsgemisch für eine halbe Stunde bei 47°C, gefolgt von einem Waschschritt bei Raumtemperatur und zweimal gewachselten 250 ml 2 × SSC jeweils für 45 Minuten gewaschen. Die Filter werden getrocknet und gegenüber einem Kodak XARS Film für 1 bis 3 Tage bei –70°C mittels eines Verstärkerschirms exponiert.
Auf diese Weise erhält man 3 positive Signale aus den 6 gescreenten Platten. Die positiven Plaques werden mit einer sterilen Pasteurpipette ausgestanzt, indem man die Platten sorgfältig mittels der Tuschemarkierungen auf dem Autoradiogramm positioniert. Die Agarstücke, die die positiven Plaques enthalten, werden in 1 ml SM gegeben und 2,5 μl Chlorofom werden zugegeben. Die Phagen können für 1 Stunde bei Raumtemperatur aus dem Agar diffundieren, wobei zeitweise gemischt wird und sie werden dann über Nacht bei 4°C inkubiert. Der Agar und der Zelldebris werden durch Zentrifugation für 5 Minuten entfernt, 2,5 μl Chloroform werden zugegeben und die Phagenstammlösungen werden bei 4°C gelagert.
Die positiven Klone werden λ1, λ2 und λ4 genannt. Da Phagen mit einer hohen Dichte plattiert werden, werden die positiven Plaques zweimal durch Plattieren bei niedriger Dichte und der Wiederholung des kompletten Verfahrens der Replikaplattierung, Hybridisierung und Picken der positiven Plaques gereinigt.
Beispiel 4: Charakterisierung der Lambda Klone
Beispiel 4.1: Isolierung der Lambda DNA
Um DNA aus den rekombinanten Klonen zu isolieren, werden die Phagen zuerst amplifiziert. Zu diesem Zweck werden E. coli LE392 Wirtszellen bis zu einer optischen Dichte (600 nm) von 1,0 in LB Medium angezogen, das mit 10 mM MgSO₄ und 0,2% Maltose supplementiert ist. Dann werden 50 μl der Stammlösungen der gereinigten Phagen getrennt plattiert, wie dies oben beschrieben ist. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C werden die Phagen aus den nicht-konfluenten Platten durch Verteilen von 5 ml SM über die Platten und einer Inkubation für 2 Stunden unter sanftem Schütteln eluiert. Die eluierten Phagen werden geerntet und es werden 0,1 ml Chloroform zugegeben. Das Gemisch wird kurz geschüttelt und der Zelldebris wird durch Zentrifugation entfernt. Die Überstände werden gewonnen, Chloroform wird mit 0,3% zugegeben und das entstandene Plattenlysat wird bei 4°C gelagert.
Um fast vollständig konfluente Platten als Ausgangsmaterial zur Isolierung der Phagen DNA zu erhalten, werden 10 ml Portionen der Plattenlysate mit E. coli LE392 Wirtszellen plattiert. Nach einer Inkubation über Nacht bei 37°C wird die Agaroseüberschichtung von drei fast konfluenten Platten abgeschabt. Diese Lagen werden vereinigt, 20 ml SM und 0,4 ml Chloroform werden zugegeben und das entstehende Gemisch wird bei 37°C für 30 Minuten geschüttelt. Der Zelldebris und die Agarose werden durch Zentrifugation entfernt, der Überstand wird gewonnen und das Volumen wird mit SM auf 18 ml eingestellt. Ein gleiches Volumen an 2 M NaCl, 20% PEG 6000 (BDH, Poole, GB) in SM wird zugegeben und die Lösungen werden gemischt und auf Eis gestellt. Nach 75 Minuten werden die Phagen durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 1200 × g bei 4°C pelletiert. Der Überstand wird dekantiert und die verbleibende Flüssigkeit wird mit einem Kleenextuch entfernt. Das Pellet wird in 3 ml SM resuspendiert und anschließend mit 3 ml Chloroform extrahiert. Die wäßrige Phase wird mit RNase A (67 μg/ml) und DNaseI (33 μg/ml) für 20 Minuten bei 37°C behandelt. Dann wird dieses Gemisch durch die Zugabe von 2 ml Phenol, einem Vortexen, einer Zugabe von 1 ml Chloroform, einem erneuten Vortexen und einer Trennung der zwei Phasen durch Zentrifugation extrahiert. Die wäßrige Phase wird weitere zweimal jeweils mit 3 ml Phenol/Chloroform (1 : 1) und 3 ml Chloroform extrahiert. Dann wird die DNA aus der wäßrigen Phase durch die sequentielle Zugabe von 0,3 ml an 3 M Natriumacetatpuffer (pH 5,2) und 6 ml Ethanol gefällt. Das Gemisch wird bei 4°C für 16 Stunden stehengelassen und dann wird die DNA durch Zentrifugation gewonnen (10 Minuten, 12 000 × g, 4°C). Das Pellet wird in 0,4 nil TE Puffer gelöst, RNase A wird bis 200 μg/ml zugegeben und es wird bei 37°C für 1 Stunde inkubiert. Die DNA wird durch die Zugabe von 38 μl an 3 M Natriumacetatpuffer (pH 5,2) und 0,8 ml Ethanol bei 4°C für 1 Stunde gefällt. Die DNA wird durch Zentrifugation gewonnen und anschließend in 100 μl TE gelöst.
Beispiel 4.2: Restriktionsanalyse der A. niger N400 nepC Klone
Es wird durch Restriktionsanalyse gezeigt, dass alle drei Phagen Insertionen enthalten, die aus derselben Region des A. niger Genoms stammen und es wird eine partielle Restriktionskarte von λ1 erstellt.
2 μg der Phagen DNA werden mit 20 Einheiten EcoRI in einem Volumen von 20 μl für 1 Stunde bei 37°C im Puffer verdaut, der vom Hersteller (BRL) empfohlen wird, und dann für 10 Minuten auf 65°C erhitzt. Die Proben werden auf einem 0,7% Agarosegel aufgetrennt und photographiert. Die DNA wird auf eine Nitrocellulosemembran überführt und mit der markierten PRB Sonde hybridisiert. Aus diesen Verdauansätzen wird klar, dass alle drei Phagen identisch sind und ein 12 kb und ein 2,7 kb EcoRI Fragment enthalten. Es ist auch klar, dass das 12 kb Fragment das einzige Fragment ist, das mit der PRB Sonde hybridisert und somit das meiste wenn nicht das gesamte A. niger Gen enthält. λ1 wird zur weiteren Analyse ausgewählt.
λ1 wird weiter mit einer Vielzahl an Restriktionsenzymen verdaut und erneut einer Southernanalyse unterzogen. Die kleinste Bande, die alle Banden zu enthalten scheint, die mit der PRB Sonde hybridisiert, ist ein 3,2 kb EcoRI BamHI Fragment. Daher wird es in ein Plasmid kloniert.
Beispiel 5: Klonierung von PEPC in ein Plasmid und dessen Sequenzierung und Charakterisierung
Beispiel 5.1: Konstruktion von pTZPEPC
λ1 DNA wird mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI verdaut, wie dies im wesentlichen oben beschrieben ist. Nach einer Extraktion mit Chlorofom wird die DNA gefällt, durch Zentrifugation pelletiert, in Probenpuffer gelöst und einer Elektrophorese auf einem 0,6% Agarosegel in 1 × TBE Puffer unterzogen. Ein Gelstück, das das 3,2 kb BamHI-EcoRI Fragment enthält, wird gewomen und die DNA wird elektroeluiert. Diese wird dann mit 100 μl Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 40 μl TE Puffer rückgelöst. Die DNA Konzentration wird durch Agarosegelelektrophorese, gefolgt von einer Visualisierung der Bande unter UV Licht abgeschätzt.
Der pTZ18R Vektor wird durch einen Verdau mit BamHI und EcoRI unter den vom Hersteller (BRL) empfohlenen Bedingungen präpariert. Die DNA wird mit Phenol, Phenol/Chloroform (1 : 1) und Chloroform extrahiert und die DNA wird mit Ethanol gefällt.
100 ng jedes der obigen Fragmente werden in einem Reaktionsvolumen von 25 μl zusammen ligiert, das den von BRL empfohlenen Puffer plus ATP (1 mM) und 1,5 E T4 DNA Ligase (BRL) enthält. Das Reaktionsgemisch wird für 16 Stunden bei 16°C inkubieit und dann zur Transformation von E. coli DH5αF' Zellen verwendet. Die Zellen werden auf LB Agarplatten plattiert, die 25 μg/ml Ampicillin, 0,005% X-Gal und 0,05 mM IPTG enthalten und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Mehrere einzelne weiße Kolonien werden zur Herstellung von Übernachtkulturen in LB Medium verwendet, das mit 0,1% Glucose und 25 mg/ml Ampicillin supplementiert ist. Diese Kulturen werden zur Isolierung des Plasmids mittels Minipräparationsverfahren von Holmes und Quigley verwendet [D. S. Holmes und M. Quigley, Anal. Biochem. 114: 193 (1981)]. Die Plasmide werden mit mehreren Restriktionsenzymen gemäß den Empfehlungen des Herstellers (BRL) und in Gegenwart an RNase A (0,5 mg/ml) verdaut und die Produkte werden auf einem Agarosegel analysiert. Plasmide, die zu BamHI-EcoRI und HindIII Fragmenten der erwarteten Größe führen, werden selektiert und die E. coli Zellen, die sie enthalten, werden in Glycerin bei –20°C gehalten. Dieses Plasmid wird pTZPEPC genannt (hinterlegt als DSM 7019).
Beispiel 5.2: Nukleotidsequenz von pepC
Der pepC Subklon, ein 3,2 kb BamHI-EcoRI Fragment im pTZ18R Vektor wird vollständig durch das Didesoxykettenabbruchverfahren [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467 (1977)] mittels synthetischer Oligonukleotidprimer und Sequenase (United States Biochemical Corp.) sequenziert.
Die vollständige Nukleotidsequenz ist in der Sequenzliste gezeigt. Der offene Leserahmen wird durch Vergleich mit anderen bekannten Serinproteasen der Subtilisinfamilie identifiziert und wird durch Transkriptionskartierung bestätigt.
Beispiel 5.3: RNA Kartierung von PEPC
Die gesamte RNA wird aus gemahlenen, gefriergetrockneten Myzelien hergestellt, die auf Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und Ammoniak als Stickstoffquelle durch das Verfahren von Frederick und Kinsey angezogen wurden [Curr. Genet. 18: 53–58 (1990)]. Das 5'-Ende der Boten-RNA wird durch Hybridisierung der gesamten RNA mit einem durch ³²P endmarkierten Oligonukleotid, nämlich Oligo A (komplementär zu den Nukleotiden 433 bis 456 der SEQ ID Nr. 1) und der Größenbestimmung des durch reverse Transkriptase gebildeten Runoff-Transkripts auf einem Sequenziergel durch den Vergleich mit Sequenzierreaktionen identifiziert, die durch Didesoxysequenzierung mit demselben Oligonukleotid hergestellt wurden (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Die genauen Spaltstellen der Introns werden durch Klonierung und Sequenzierung von partiellen cDNA Kopien der pepC RNA identifiziert. Die Erststrangsynthese wird durch Standardverfahren (Maniatis et al., obige Literaturstelle) ausgeführt, mit der Ausnahme, dass das primende Oligonukleotid das Oligo C (komplementär zu den Nukleotiden 923 bis 944 der SEQ ID Nr. 1) ist. Diese cDNA wird mittels der Oligos B (entspricht den Nukleotiden 631 bis 657 der SEQ ID Nr. 1) und C einer PCR unterzogen und in pTZ18R kloniert. (Es wird angemerkt, dass das Oligo B zusätzlich eine BamHI Schnittstelle an dessen 5'-Ende aufweist und das Oligo C zusätzlich eine EcoRI Schnittstelle). Beide Stränge von zwei unabhängigen Klonen werden komplett sequenziert. Die gesamte Länge der durch das pepC Gen gebildeten mRNA wird durch Northern Analyse mittels des 3,2 kb EcoRI-BamHI Fragments als Sonde bestimmt (Maniatis et al, obige Literaturstelle) und wird mit einer Größe zwischen 1,5 und 1,8 kb bestimmt, die der entspricht, welche aus der Größe des offenenen Leserahmens und der Position der Transkriptionsstartstelle erwartet wird.
Beispiel 6: Genomische Zerstörung von PEPC
Beispiel 6.1: Konstruktion von pTZPEPCE
Das Plasmid pTZPEPC wird mit BamHI verdaut, mit T4 Polymerase behandelt und in Gegenwart eines zehnfachen Überschusses an unphosphorylierten EcoRI Linkern (5'-GGAATTCC) ligiert. Nach einer Transformation in E. coli wird das korrekte Plasmid mit EcoRI Schnittstellen, die beide Seiten des pepC Gens flankieren, durch ein Miniscreening identifiziert.
Beispiel 6.2: Konstruktion von pAXI
Das Plasmid pCG59D7, das aus Escherichia coli BJ5138/pCG59D7 (DSM 3968) erhalten werden kann, wird mit XbaI verdaut und das Fragment, das das gesamte A. niger pyrA Gen enthält, wird gereinigt. Dieses wird in die XbaI Schnittstelle von pTZ18R unter Bildung von Plasmid pAXI kloniert (hinterlegt als DSM 7017).
Beispiel 6.3: Konstruktion von pPEPCPYRA
Das 4 kb XbaI Fragment, das das pyrA Gen enthält, wird aus pAXI ausgeschnitten und von den Vektorsequenzen gereinigt.
2 μg von pTZPEPCE werden mit BglII gemäß den Empfehlungen des Herstellers geschnitten und dann mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und erneut in 20 μl Wasser rückgelöst. Diese DNA wird dann mit bakterieller, alkalischer Phosphatase behandelt, um die 5' Phosphatgruppen zu entfernen, wie dies vom Hersteller empfohlen wird. Das 5 kb Fragment wird aus einem Gel gereinigt.
Beide obigen Fragmente werde mit T4 Polymerase gemäß den Angaben des Herstellers behandelt und mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die zwei Fragmente werden zusammengemischt und ligiert. Nach einer Transformation von E. coli werden die Kolonien, die die korrekten Plasmide tragen, durch Restriktionsverdau von Plasmidminipräparationen identifiziert.
pPEPCPYRA besteht aus dem pTZ18R Vektor, der ein EcoRI Fragment enthält, das das PEPC Gen enthält, worin das zentrale BglII Fragment, das sowohl für das Histidin und das Serin im aktiven Zentrum kodiert, durch ein XbaI DNA Fragment ersetzt wurde, das die Orotidinmonophosphatdecarboxylase kodiert.
Beispiel 6.4: Transformation von A. niger
10 μg von Plasmid pPEPCPYRA werden vollständig mit EcoRI verdaut. Die Vollständigkeit des Verdaus wird durch Auftragen eines Aliquots auf einem Gel überprüft und die restliche DNA wird mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 20 μl sterilem Wasser resuspendiert.
Konidiosporen des auxotrophen A. niger An8 (DSM 3917) werden für 4 Tage bei 28°C auf Vollmedium angezogen, bis sie voll sporulieren. 2 × 10⁸ Konidiosporen werden zur Beimpfung von 200 ml Minimalmedium verwendet, das mit 1 g/l Arginin und Undin supplementiert ist.
Nach 20 Stunden Wachstum bei 28°C bei 180 Upm wird das Myzel durch Filtration durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ gewaschen und in 20 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂, 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) resuspendiert. Das Gemisch wird in einem Schüttelwasserbad (30°C, 50 Upm) inkubiert, bis ausreichend Protoplasten freigesetzt wurden (mikroskopisch nach 90–120 Minuten detektiert). Die Protoplastensuspension wird durch einen Glaswollestopfen in einem Trichter filtriert, um den Myzeldebris zu entfernen. Die Protoplasten werden durch milde Zentrifugation (10 Minuten, 2000 Upm) bei Raumtemperatur pelletiert und zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ gewaschen. Die Protoplasten werden schließlich in 200–500 μl an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ unter Bildung einer Konzentration an 1 × 10⁸ Sphäroplasten pro ml resuspendiert.
Zur Transformation wird ein 200 μl Aliquot der Protoplastensuspension mit 5 μg der mit EcoRI verdauten pPEPCPYRA in 50 μl PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂, 25% PEG 6000) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird für 20 Minuten auf Eis gehalten, es werden weitere 2 ml PCT zugegeben und das Gemisch wird für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 4 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ werden zugegeben und 1 ml Aliquots der schließlichen Transformationslösung werden mit flüssigem Minimalagarmedium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)) gemischt, das mit 0,8 M KCl stabilisiert ist. Das Gemisch wird sofort auf Agarplatten desselben Mediums gegossen und bei 30°C inkubiert.
Nach 2–3 Tagen Wachstum bei 28°C erscheinen stabile Transformanden als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Hintergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vermutlich abgestorbenen Transformanden.
Beispiel 6.5: Identifizierung von Genzerstörungen
Aus den stabilen Kolonien werden einzelne Sporensuspensionen hergestellt und auf frischen Minimalplatten plus Arginin ausgestrichen. Es werden einzelne Kolonien selektiert und erneut ausgestrichen, um reine Kulturen zu ergeben. Diese werden verwendet, um 200 ml flüssiges Minimalmedium anzuimpfen, das mit 1 g/l Arginin versetzt ist. Nach 24 h bei 30°C und einem Schütteln bei 180 Upm wird das Myzel auf Filterpapier geerntet und das Kissen wird gefriergetrocknet. Nach dem Trocknen wird die DNA aus einzelnen Kissen durch Mahlen der Kissen zu einem feinen Pulver mit Stößel und Mörser präpariert. 60 mg dieses Pulvers werden in 3 ml 1% Natriumdodecylsulfat, 0,1% Tween 80 und 1 M Ammoniumacetat durch Vortexen resuspendiert. Dies wird bei 65°C für 20 Minuten mit zeitweisem Mischen erhitzt. Der Zelldebris wird von der DNA Lösung durch Zentrifugation bei 15 000 Upm für 5 Minuten abgetrennt. Der Überstand wird zweimal mit Phenol und zweimal mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das DNA Pellet wird in 100 μl sterilem TE rückgelöst.
20 μl jeder DNA werden mit BglII in Gegenwart von 1 μg RNAse A für 1 Stunde verdaut. Dies wird auf einem Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran überführt und eingebacken. Das EcoRI Fragment von pTZPEPC, das das PEPC Gen enthält, wird gereinigt, durch Nick-Translation markiert und zur Sondierung der Filter verwendet. Stämme, die eine Zerstörung des pepC Gens aufweisen, erkennt man leicht, da ihnen das hybridisierende 1,2 kb BglII Fragment fehlt und sie eine veränderte Mobilität der zwei anderen flankierenden Fragmente aufweisen.
Einer dieser Stämme wird auf Medien plattiert, die Uridin und 5-Fluororotsäure enthalten. Mutanten mit einer Pyrimidinauxotrophie werden durch das stärkere Wachstum auf diesen Medien identifiziert und gepickt und durch Ausstreichen auf Einzelkolonien gereinigt.
Beispiel 6.6: Herstellung von Interferon im pepC^– A. niger Stamm
Einer der in Beispiel 6.5 isolierten pepC^– A. niger An8 Stämme wird als Wirt für eine anschließende Transformation mit pyrA⁺ enthaltenden Plasmiden und Expressionskassetten verwendet, die ein heterologes Gen für Interferon enthalten.
Konidiosporen der Uridin-auxotrophen pepC^– Mutante von A. niger An8 werden für 4 Tage bei 28°C in Vollmedium angezogen, bis sie voll sporulieren. 2 × 10⁸ Konidiosporen werden zur Beimpfung von 200 ml Minimalmedium verwendet, das mit 1 g/l Arginin und Uridin supplementiert ist.
Nach 20 Stunden Wachstum bei 28°C und 180 Upm wird das Myzel durch Filtration durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ gewaschen und in 20 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂, 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) resuspendiert. Das Gemisch wird in einem Schüttelwasserbad (30°C, 50 Upm) inkubiert, bis ausreichend Protoplasten freigesetzt wurden (mikroskopisch nach 90–120 Minuten detektiert). Die Protoplastensuspension wird durch einen Glaswollestopfen in einem Trichter filtriert, um den Myzeldebris zu entfernen. Die Protoplasten werden durch milde Zentrifugation (10 Minuten, 2000 Upm) bei Raumtemperatur pelletiert und zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ gewaschen. Die Protoplasten werden schließlich in 200–500 μl an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ unter Bildung einer Konzentration an 1 × 10⁸ pro ml resuspendiert.
Zur Transformation wird ein 200 μl Aliquot der Protoplastensuspension mit 5 μg an pCG59D7 (DSM 3968) und 50 μg an pGIIss-IFN AM119 oder pGII-IFN AM119 DNA (beide Plasmide sind in EP 0 421 919 A beschrieben) in 50 μl PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂, 25% PEG 6000) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird für 20 Minuten auf Eis gehalten, es werden weitere 2 ml PCT zugegeben und das Gemisch wird für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 4 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ werden zugegeben und 1 ml Aliquots der schließlichen Transformationslösung werden mit flüssigem Minimalagarmedium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)) gemischt, das mit 0,8 M KCl stabilisiert ist. Die Gemische werden sofort auf Agarplatten desselben Mediums gegossen und bei 30°C inkubiert.
Nach 2–3 Tagen Wachstum bei 28°C erscheinen stabile Transformanden als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Hintergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vermutlich abgestorbenen Transformanden.
Die Transformanden werden gepickt und auf eine Interferonexpression analysiert. Die Interferonaktivität wird gemäß dem Verfahren von Armstrong (J. A. Armstrong, Apll. Microbiol. 21; 732 (1971)) mittels humaner CCL-23 Zellen und dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV) als Provokationsvirus bestimmt.
Konidiosporen von Transformanden werden einzeln in 50 ml eines Präkulturmediums vorkultiviert (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) 3 g/l, NH₄Cl 2 g/l, KHP₂O₄ 0,5 g/l, NaCl 0,5 g/l, Mg₂SO₄ × 7 H₂O 0,5 g/l, Ca₂SO₄ × 2 H₂O 0,5 g/l, pH 7,0, 1% Arginin). Die Vorkultur wird für 72 Stunden bei 250 Upm und 28°C inkubiert. 10% der Vorkultur werden zum Beimpfen von 50 ml des Hauptkulturmediums (Sojabohnenumhl 20 g/l, Pectin Slow Set 5 g/l, 1% Arginin) verwendet. Die Kultur wird für 72–96 Stunden bei 250 Upm und 28°C angezogen.
Zu verschiedenen Zeiten (alle 20 Stunden) werden Proben entnommen, die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und durch Gefriertrocknung und trockene Vermahlung aufgebrochen. Der Überstand und die Zellextrakte werden beide auf Interferonaktivität getestet, wie dies beschrieben ist (siehe oben). Die Hauptmenge an Interferonaktivität wird bei Transformanden, die pGIIss-IFN AM119 enthalten, ins Medium sekretiert, während bei Transformanden, die pGII-IFN AM119 enthalten, sie hautsächlich im Zellextrakt vorkommt.
Beispiel 7: Überexpression von pepC in A. niger
Beispiel 7.1: Überexpression von mehrfachen Kopien
A. niger An8 wird mit 1 μg pAXI plus 10 μg pTZPEPC transformiert, um Uridinprototrophe zu isolieren. Die Kolonien werden gereinigt und die DNA wird wie oben beschrieben präpariert. Southern Blots mittels des Eco-RI-BamHI Fragments von pTZPEPC zeigen, dass einige Transformanden eine einzelne Kopie von pTZPEPC integriert in das Genom enthalten, während andere bis zu und über 10 zusätzliche Kopien in ihrem Genom aufweisen. Diese Stämme bilden entsprechend mehr proteolytische Aktivität und sind mitotisch stabiler.
Beispiel 7.2: Überexpression von pepE aus Genfusionen
Das Plasmid pGW1100 (hinterlegt als DSM 5747) wird mit BamHI und SacI geschnitten. Das 1,2 kb Fragment, das den Pyruvatkinasepromotor und das 5'-Ende umfasst, wird gereinigt, mit T4 Polymerase behandelt und in die BamHI Einzelschnittstelle von pTZPEPC am 5'-Ende des pepC Klons kloniert, die ebenfalls mit T4 Polymerase stumpfendig gemacht wurde und mit alkalischer Phosphatase behandelt.
Die korrekten Plasmide werden durch Miniscreening identifiziert und eines wird ausgewählt und in einen dut^– ung^– E. coli Stamm BW313 transformiert. Dieser wird mit M13K07 unter Bildung einer einzelsträngigen Uracil-substituierten DNA von dem Plasmid superinfiziert.
Das Oligonukleotid 1 (in SEQ ID Nr. 3 gezeigt) besteht aus 37 Nukleotiden. Die ersten 19 Nukleotide sind zu den ersten 19 Nukleotiden des offenen Leserahmens des pepC Gens komplementär und die letzten 18 sind zu den letzten 18 Nukleotiden vor dem ATG des Pyruvatkinasegens komplementär. Zur in vitro Mutagenese dieses Plasmids werden 5 pM des Oliginukleotids 1 am 5'-Ende mit 100 pM ATP durch die Behandlung mit dem Oligo mit 10 E an T4 Polynukleotidkinase in 50 μl Kinasepuffer phosphoryliert, wie dies vom Hersteller empfohlen ist. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 65°C für 10 Minuten beendet.
0,2 pM Uracil-enthaltende einzelsträngige DNA wird mit 0,5 pM phosphoryliertem Oligonukleotid 1 in 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 25 mM NaCl in einem Endvolumen von 10 μl phosphoryliert. Das Gemisch wird bei 65°C für 5 Minuten inkubiert, langsam auf Raumtemperatur über 60 Minuten abgekühlt und für 15 Minuten auf Eis gestellt. Dann werden 2 μl 500 μM dNTP, 1,5 μl 10 mM ATP, 1 ml T7 DNA Polymerase (12 E/μl Pharmacia) und 1 μl T4 DNA Ligase (1,2 E/μl BRL) zum Gemisch gegeben und dieses Polymerisationsgemisch wird für 15 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Erhitzen bei 65°C für 5 Minuten beendet und zur Transformation von E. coli DH5αF' verwendet.
Die korrekten Plasmide werden durch den Verdau von Plasmidminipräparationen identifiziert. Es werden 3 ausgewählt und das EcoRI Fragment wird vollständig mittels synthetischer Oligonukleotide sequenziert. Ein Plasmid, das eine perfekte Fusion des Pyruvatkinasepromotors mit dem offenen Leserahmen des pepC Gens enthält, das pPKIPEPCA genannt wird, wird mit pAXI zur Cotransformation von A. niger An8 zur Uridinprototrophie verwendet.
Die Anwesenheit der pki-pepC Fusion wird durch die Präparation von DNA aus einzelnen gereinigten Transformanden und deren Verwendung für eine Southern Analyse mittels Sonden von pki und pepC bestätigt. Die Stämme, die eine oder mehrere Kopien dieser Genfusion in ihrem Genom integriert aufweisen, weisen mehr proteolytische Aktivität auf wenn die Zellen schnell auf Glucose als C-Quelle angezogen werden.
Beispiel 8: Expression von nepC in anderen Organismen: Expression in Hefe
Das Plasmid pPKIPEPCA wird in vitro mit den zwei synthetischen Oligonukleotiden mutagenisiert, die in der Sequenzliste unter SEQ ID Nr. 4 und 5 gezeigt sind. Das Erstere bildet eine EcoRI Schnittstelle direkt vor dem ATG von pepC und das andere eliminiert das gesamte Intron. Dies bildet das Plasmid pPKIPEPCB, dessen Sequenz durch vollständiges Sequenzieren bestätigt wird.
Das 2,8 kb EcoRI-BamHI Fragment, das direkt vor dem ATG von pepC startet und nach dem pepC Terminator endet, wird gereinigt und zusammen mit dem 520 bp BamHI-EcoRI Fragment von pFBY129 (hinterlegt als DSM 7016), das den GAL10 Hefepromotor enthält, in die SnaBI Schnittstelle des auf dem Hefe 2 μ basierenden Vektor pFBY25 (hinterlegt als DSM 7020) ligiert. Ein korrektes Plasmid wird durch Restriktionsverdau identifiziert.
Dieses Plasmid, nämlich pFBY138, wird in Hefe transformiert und bildet das PepC Protein, wenn die Genfusion mit Galactose induziert wird.
Beispiel 9: Isolierung einer DNA Sonde zum Screening auf Subtilisin-ähnliche Serinproteasen von A. niger
Beispiel 9.1: Entwurf von degenerierten PCR (Polymerasekettenreaktion) Primern
Die Polymerasekettenreaktion (Saiki et al., Science 230: 1350–1354 (1985)) wird zur Isolierung von Sonden für dieses Screening verwendet. Die zwei Regionen, die jeweils die Reste Histidin und Serin des aktiven Zentrums enthalten sind unter den unterschiedlichen Proteasen der Subtilisinklasse gut konserviert. Eine Konsensusaminosäuresequenz wird für jede dieser Regionen abgeleitet und die DNA Sequenzen, die zur Kodierung dieser zwei Aminosäuresequenzen fähig sind, werden abgeleitet. Um das Ausmaß der Degeneriertheit zu reduzieren werden zwei Primer für die konservierten Regionen entworfen. PCR Oligo 1 und PCR Oligo 2 (jeweils in SEQ ID Nr. 8 und 9 gezeigt) entsprechen der His Region im aktiven Zentrum und PCR Oligo 3 und PCR Oligo 4 (jeweils in SEQ ID Nr. 10 und 11 gezeigt) entsprechen der Ser Region des aktiven Zentrums. Um die spätere Subklonierung der PCR Produkte zu erleichtern enthalten die PCR Oligos 1 und 2 auch eine BamHI Schnittstelle und die PCR Oligos 3 und 4 eine EcoRI Schnittstelle nahe an ihren 5'-Enden.
Beispiel 9.2: Amplifizierung der genomischen DNA von A. niger
Es wird genomische DNA von A. niger isoliert, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. Es werden vier Amplifizierungsreaktionen mittels einer paarweisen Kombination der vier oben beschriebenen PCR Oligos ausgeführt. Das Reaktionsgemisch für die Polymerasekettenreaktion enthält insgesamt 100 ng der genomischen DNA von A. niger, 100 pmol von jedem der Primer, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 1 mg/ml Gelatine (pH 8,3) und 5 Einheiten Taq DNA Polymerase in insgesamt 50 μl. Die DNA wird bei 94°C für 30 Sekunden denaturiert und dann werden die Primer bei 42°C für 40 Sekunden aneliert und der Verlängerungsschritt wird für 60 Sekunden bei 72°C ausgeführt. Diese 3 Schritte werden dann vierzigmal wiederholt.
Beispiel 9.3: Isolierung und Charakterisierung der PCR Produkte
Die Produkte der Amplifizierungsreaktionen werden auf einem 1% Agarosegel getrennt und die DNA Fragmente werden aus dem Gel durch Elektroelution isoliert, wie dies oben beschrieben ist. Die isolierten Fragmente (200–300 ng) werden mit Phenol und dann mit Chloroform extrahiert und dann mit Ethanol gefällt. Nach der Zentrifugation werden die DNA Pellets getrocknet und dann in 10 μl TE Puffer gelöst. Diese DNA wird dann mit 10 Einheiten der Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI in einem Volumen aus 20 μl für 1 Stunde bei 37°C im Puffer verdaut, der vom Hersteller (BRL) empfohlen ist. Nach einer Extraktion mit Phenol und Chloroform und einer Fällung mit Ethanol wird die verdaute DNA pelletiert, getrocknet und in 10 μl TE Puffer rückgelöst. Die DNA Konzentration wird durch eine Agarosegelelektrophorese gefolgt von einer Visualisierung der DNA Bande unter UV Licht abgeschätzt.
Der pTZ18R Vektor wird durch einen Verdau mit BamHI und EcoRI unter den vom Hersteller (BRL) empfohlenen Bedingungen präpariert und dann extrahiert und mit Ethanol gefällt, wie dies oben beschrieben ist.
100 ng jedes der isolierten PCR Fragmente werden zusammen mit 100 ng des wie oben beschrieben präparierten pTZ18R Vektors in einem Volumen von 20 μl mit 1 Einheit T4 DNA Ligase zusammen ligiert. Die Pufferbedingungen sind die, welche vom Hersteller (BRL) empfohlen werden. Nach der Inkubation des Reaktionsgemisches bei 16°C für 16 Stunden wird es zur Transformation des E. coli DH5αF' Stamms verwendet. Die Zellen werden auf LB Agarplatten plattiert, die 25 μg/ml Ampicillin, 0,005% X-Gal und 0,05 mM IPTG enthalten und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Mehrere einzelne weiße Kolonien werden zur Herstellung von Übernachtkulturen in 5 ml LB Medium verwendet, das mit 0,1% Glucose und 25 μg/ml Ampicillin supplementiert ist. Diese Kulturen werden zur Isolierung der Plasmid DNA mittels Minipräparationsverfahren von Holmes und Quigley verwendet (D. S. Holmes und M. Quigley, Anal. Biochem. 114: 193 (1981)). Die Plasmide werden mit den Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI gemäß den Empfehlungen des Herstellers (BRL) verdaut. Die Plasmide, die Fragmente enthalten, werden weiter analysiert.
Inserts von ausgewählten Plasmiden werden durch das Didesoxykettenabbruchverfahren (Sauger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467 (1977)) mittels synthetischer Oligonukleotidprimer und Sequenase (United States Biochemical Corp.) sequenziert.
Beispiel 9.4: Computeranalyse der Sequenzen der PCR Produkte
Die Nukelotidsequenzen der obigen Inserts werden mit allen DNA Sequenzen in den kombinierten Gen-Bank und EMBL Datenbanken verglichen. Eine von ihnen, die eine starke Homologie zu den DNA Sequenzen zeigt, die für Proteasen vom Subtilisintyp kodieren, wird als Sonde ausgewählt und PCR Sonde genannt, um anschließend die Genbank von A. niger zu screenen. Die Sequenz dieses Fragments (ohne PCR Primer) ist die zwischen den Nukleotiden 1474 und 2020 in der in SEQ ID Nr. 6 gezeigten Sequenz.
Beispiel 10: Screening der A. niger N400 Genbank mit der PCR Sonde
Filter für die Plaquehybridisierung der oben beschriebenen Genbank des Aspergillus niger Stamms N400 werden hergestellt (Beispiel 1) und gemäß Beispiel 3 prähybridisiert.
Nach einer Hybridisierung für 14 bis 16 Stunden bei 65°C werden die Filter einmal in 250 ml 2 × SSC, 0,1 % SDS für eine halbe Stunde bei Raumtemperatur gewaschen, wonach ein Waschen bei Raumtemperatur in einem zweimaligen Wechsel von 250 ml 0,2 × SSC, 0,1% SDS jeweils für 20 Minuten und schließlich zweimal in 250 ml 0,2 × SSC, 0,1% SDS jeweils bei 65°C für 20 Minuten erfolgt. Die Filter werden getrocknet und einem Kodak XARS Film für 1 bis 3 Tage bei –70°C mittels einer Verstärkerfolie exponiert.
Auf diese Weise erhält man 5 positive Signale aus den sechs gescreenten Platten. Positive Plaques werden mit einer sterilen Pasteurpipette durch sorgfältige Positionierung der Platten auf dem Autoradiogramm mittels der Tintenmarkierungen ausgestochen. Die Agarstücke, die die positiven Plaques enthalten, werden zu 1 ml SM gegeben und 2,5 μl Chloroform werden zugegeben. Die Phagen können dann für 1 Stunde bei Raumtemperatur aus dem Agar diffundieren, wobei zeitweise gevortext wird und dann wird über Nacht bei 4°C inkubiert. Der Agar und der Zelldebris werden durch Zentrifugation für 5 Minuten entfernt, 2,5 μl Chloroform werden zugegeben und die Phagenstammlösungen werden bei 4°C gelagert.
Die positiven Klone werden λa, λb, λe, λd und λe genannt. Da die Phagen mit hoher Dichte plattiert werden, werden die positiven Plaques zweimal durch die Plattierung bei niedriger Dichte und der Wiederholung der Replikaplattieurng, Hybridisierung und Picken der positiven Plaques gereinigt.
Beispiel 11: Charakterisierung der Lambda-Klone
Beispiel 11.1: Isolierung der Lambda DNA und Restriktionsanalyse der A. niger N400 pepD Klone
Die Lambda DNA wird wie in Beispiel 4.1 beschrieben isoliert.
Es wird durch Restriktionsanalyse festgestellt, dass alle 5 Phagen λa bis λe Inserts enthalten, die von derselben Region des A. niger Genoms stammen und es wird eine partielle Restriktionskarte der genomischen Region konstruiert.
2 μg der Phagen DNA werden mit 20 Einheiten von EcoRI oder BamHI in einem Volumen von 20 μl für 1 Stunde bei 37°C im Puffer verdaut, der vom Hersteller (BRL) empfohlen wird und dann für 10 Minuten auf 65°C erhitzt. Die Proben werden auf einem 0,7% Agarosegel getrennt und photographiert. Die DNA wird auf eine Nitrocellulosemembran überführt und mit der markierten PCR Sonde hybridisiert.
Es ist klar aus diesen Verdauansätzen, dass die 5 Phagen eine etwa 5,5 kb große überlappende Region enthalten, die mit der PCR Sonde hybridisiert und daher das meiste, wenn auch nicht das gesamte des entsprechenden A. niger Gens enthalten. Ein 6,0 kb langes BamHI Fragment, das diese Region enthält, wird für eine weitere Analyse ausgewählt.
Beispiel 12: Klonierung von PEPD in ein Plasmid und dessen Seguenzierung und Charakterisierung
Beispiel 12.1: Konstruktion von pTZPEPD
Das 6,0 kb BamHI Fragment wird mit dem Restriktionsenzym HindIII inkubiert. Nach einer Extraktion mit Chlorofom wird die DNA gefällt, durch Zentrifugation pelletiert, in Probenpuffer gelöst und einer Elektrophorese auf einem 0,6% Agarosegel in 1 x TBE Puffer unterzogen. Ein Gelstück, das das 3,0 kb BamHI-HindIII Fragment enthält, wird gewonnen und die DNA wird elektroeluiert. Diese wird dann mit 100 μl Chloroform extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 40 μl TE Puffer rückgelöst. Die DNA Konzentration wird durch Agarosegelelektrophorese, gefolgt von einer Visualisierung der Bande unter UV Licht abgeschätzt.
Der pTZ18R Vektor wird durch einen Verdau mit BamHI und HindIII unter den vom Hersteller (BRL) empfohlenen Bedingungen präpariert. Die DNA wird mit Phenol, Phenol/Choroform (1 : 1) und Chloroform extrahiert und die DNA wird mit Ethanol gefällt.
100 ng jedes der obigen Fragmente werden in einem Reaktionsvolumen von 25 μl zusammen ligiert, das den von BRL empfohlenen Puffer plus ATP (1 mM) und 1,5 E T4 DNA Ligase (BRL) enthält. Das Reaktionsgemisch wird für 16 Stunden bei 16°C inkubiert und dann zur Transformation von E. coli DH5αF' Zellen verwendet. Die Zellen werden auf LB Agarplatten plattiert, die 25 μg/ml Ampicillin, 0,005% X-Gal und 0,05 mM IPTG enthalten und über Nacht bei 37°C inkubiert.
Mehrere einzelne weiße Kolonien werden zur Herstellung von Übernachtkulturen in LB Medium verwendet, das mit 0,1% Glucose und 25 mg/ml Ampicillin supplementiert ist. Diese Kulturen werden zur Isolierung des Plasmids mittels Minipräparationsverfahren von Holmes und Quigley verwendet [D. S. Holmes und M. Quigley, Anal. Biochem. 114: 193 (1981)]. Die Plasmide werden mit mehreren Restriktionsenzymen gemäß den Empfehlungen des Herstellers (BRL) und in Gegenwart an RNase A (0,5 mg/ml) verdaut und die Produkte werden auf einem Agarosegel analysiert. Plasmide, die zu BamHI-HindIII Fragmenten der erwarteten Größe führen, werden selektiert und die E. coli Zellen, die sie enthalten, werden in Glycerin bei –20°C gehalten. Dieses Plasmid wird pTZPEPD genannt (hinterlegt als DSM 7409).
Beispiel 12.2: Nukleotidsequenz von pepD
Der pepD Subklon, ein 3,0 kb BamHI-HindIII Fragment im pTZ18R Vektor wird vollständig durch das Didesoxykettenabbruchverfahren [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467 (1977)] mittels synthetischer Oligonukleotidprimer und Sequenase (United States Biochemical Corp.) sequenziert.
Die vollständige Nukleotidsequenz ist in der Sequenzliste unter SEQ ID Nr. 6 gezeigt. Der offene Leserahmen wird durch Vergleich mit anderen bekannten Serinproteasen der Subtilisinfamilie identifiziert und wird durch Transkriptionskartierung bestätigt.
Beispiel 12.3: RNA Kartierung von PEPD
Die gesamte RNA wird aus gemahlenen, gefriergetrockneten Myzelien hergestellt, die auf Minimalmedium mit Glucose als Kohlenstoffquelle und Ammoniak als Stickstoffquelle durch das Verfahren von Frederick und Kinsey angezogen wurden [Curr. Genet. 18: 53–58 (1990)]. Das 5'-Ende der Boten-RNA wird durch Hybridisierung der gesamten RNA mit einem durch ³²P endmarkierten Oligonukleotid, nämlich Oligo A (komplementär zu den Nukleotiden 851 bis 876 der SEQ ID Nr. 6) und der Größenbestimmung des durch reverse Transkriptase gebildeten Runoff- Transkripts auf einem Sequenziergel durch den Vergleich mit Sequenzierreaktionen identifiziert, die durch Didesoxysequenzierung mit demselben Oligonukleotid hergestellt wurden (Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Die genauen Spaltstellen der Introns werden durch Klonierung und Sequenzierung von partiellen cDNA Kopien der pepD RNA identifiziert. Die Erststrangsynthese wird durch Standardverfahren (Maniatis et al., obige Literaturstelle) ausgeführt, mit der Ausnahme, dass das primende Oligonukleotid das Oligo C (komplementär zu den Nukleotiden 1914 bis 1941 der SEQ ID Nr. 6) ist. Diese cDNA wird mittels der Oligos B (entspricht den Nukleotiden 1102 bis 1129 der SEQ ID Nr. 6) und C einer PCR unterzogen und in pTZ18R kloniert. Es wird angemerkt, dass die Nukleotide 1107–1109 (GGT) durch das ATG in Oligo B ersetzt werden und so eine neue BamHI Schnittstelle gebildet wird. Ähnlich werden die Nukleotide 1932 (A) und 1935 (A) jeweils durch G und T in Oligo C ersetzt, wobei eine neue HindIII Schnittstelle erzeugt wird. Beide Stränge von zwei unabhängigen Klonen werden komplett sequenziert. Die gesamte Länge der durch das pepD Gen gebildeten mRNA wird durch Northern Analyse mittels des 3,0 kb EcoRI-HindIII Fragments als Sonde bestimmt (Maniatis et al, obige Literaturstelle) und wird mit einer Größe zwischen 1,4 und 1,7 kb bestimmt, die der entspricht, welche aus der Größe des offenenen Leserahmens und der Position der Transkriptionsstartstelle erwartet wird.
Beispiel 13: Genomische Zerstörung von PEPD
Beispiel 13.1: Konstruktion von pPEPCPYRA
Das 4 kb XbaI Fragment, das das pyrA Gen enthält, wird aus pAXI (DSM 7017) ausgeschnitten und von den Vektorsequenzen gereinigt.
2 μg von pTZPEPD werden mit NheI und NcoI gemäß den Empfehlungen des Herstellers geschnitten und dann mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und erneut in 20 μl Wasser rückgelöst. Diese DNA wird dann mit bakterieller, alkalischer Phopshatase behandelt, um die 5' Phosphatgruppen zu entfernen, wie dies vom Hersteller empfohlen wird. Das 5,3 kb Fragment, dem das 0,6 kb NheI-NcoI Fragment fehlt, das die aktiven Stellen His und Ser enthält, wird aus einem Gel gereinigt.
Beide obigen Fragmente werden mit T4 Polymerase gemäß den Angaben des Herstellers behandelt und mit Phenol extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die zwei Fragmente werden zusammengemischt und ligiert. Nach einer Transformation von E. coli werden die Kolonien, die die korrekten Plasmide tragen, durch Restriktionsverdau von Plasmidminipräparationen identifiziert.
pPEPDPYRA besteht aus dem pTZ18R Vektor, der ein BamHI-HindIII Fragment enthält, das das pepD Gen enthält, worin das zentrale NheI-NcoI Fragment, das sowohl für die aktiven Stellen Histidin und das Serin kodiert, durch ein XbaI DNA Fragment ersetzt wurde, das die Orotidinmonophosphatdecarboxylase kodiert.
Beispiel 13.4: Transformation von A. niger
10 μg von Plasmid pPEPDPYRA werden vollständig mit EcoRI verdaut. Die Vollständigkeit des Verdaus wird durch Auftragen eines Aliquots auf einem Gel überprüft und die restliche DNA wird mit Phenol extrahiert, mit Ethanol gefällt und in 20 μl sterilem Wasser resuspendiert.
Konidiosporen des auxotrophen A. niger An8 (DSM 3917) werden für 4 Tage bei 28°C auf Vollmedium angezogen, bis sie voll sporulieren. 2 × 10⁸ Konidiosporen werden zur Beimpfung von 200 ml Minimalmedium verwendet, das mit 1 g/l Arginin und Uridin supplementiert ist.
Nach 20 Stunden Wachstum bei 28°C bei 180 Upm wird das Myzel durch Filtration durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ gewaschen und in 20 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂, 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) resuspendiert. Das Gemisch wird in einem Schüttelwasserbad (30°C, 50 Upm) inkubiert, bis ausreichend Protoplasten freigesetzt wurden (mikroskopisch nach 90–120 Minuten detektiert). Die Protoplastensuspension wird durch einen Glaswollestopfen in einem Trichter filtriert, um den Myzeldebris zu entfernen. Die Protoplasten werden durch milde Zentrifugation (10 Minuten, 2000 Upm) bei Raumtemperatur pelletiert und zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ gewaschen. Die Protoplasten werden schließlich in 200–500 μl an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ unter Bildung einer Konzentration an 1 × 10⁸ Sphäroplasten pro ml resuspendiert.
Zur Transformation wird ein 200 μl Aliquot der Protoplastensuspension mit 5 μg der mit EcoRI verdauten pPEPDPYRA in 50 μl PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂, 25% PEG 6000) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird für 20 Minuten auf Eis gehalten, es werden weitere 2 ml PCT zugegeben und das Gemisch wird für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 4 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ werden zugegeben und 1 ml Aliquots der schließlichen Transformationslösung werden mit flüssigem Minimalagarmedium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)) gemischt, das mit 0,8 M KCl stabilisiert ist. Das Gemisch wird sofort auf Agarplatten desselben Mediums gegossen und bei 30°C inkubiert.
Nach 2–3 Tagen Wachstum bei 28°C erscheinen stabile Transformanden als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Hintergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vermutlich abgestorbenen Transformanden.
Beispiel 13.5: Identifizierung von Genzerstörungen
Aus den stabilen Kolonien werden einzelne Sporensuspensionen hergestellt und auf frischen Minimalplatten plus Arginin ausgestrichen. Es werden einzelne Kolonien selektiert und erneut ausgestrichen, um reine Kulturen zu ergeben. Diese werden verwendet, um 200 ml flüssiges Mininalmedium anzuimpfen, das mit 1 g/l Arginin versetzt ist. Nach 24 h bei 30°C und einem Schütteln bei 180 Upm wird das Myzel auf Filterpapier geerntet und das Kissen wird gefriergetrocknet. Nach dem Trocknen wird die DNA aus einzelnen Kissen durch Mahlen der Kissen zu einem feinen Pulver mit Stößel und Mörser präpariert. 60 mg dieses Pulvers werden in 3 ml 1% Natriumdodecylsulfat, 0,1% Tween 80 und 1 M Ammoniumacetat durch Vortexen resuspendiert. Dies wird bei 65°C für 20 Minuten mit zeitweisem Mischen erhitzt. Der Zelldebris wird von der DNA Lösung durch Zentrifugation bei 15 000 Upm für 5 Minuten abgetrennt. Der Überstand wird zweimal mit Phenol und zweimal mit Chloroform extrahiert und mit Ethanol gefällt. Das DNA Pellet wird in 100 μl sterilem TE rückgelöst.
20 μl jeder DNA werden mit NheI und NcoI in Gegenwart von 1 μg RNAse A für 1 Stunde verdaut. Dies wird auf einem Agarosegel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran überführt und eingebacken. Das HindIII-BamHI Fragment von pTZPEPD, das das pepD Gen enthält, wird gereinigt, durch Nick-Translation markiert und zur Sondierung der Filter verwendet. Stämme, die eine Zerstörung des pepD Gens aufweisen, erkennt man leicht, da ihnen das hybridisierende 0,6 kb NheI-NhoI Fragment fehlt und sie eine veränderte Mobilität der zwei anderen flankierenden Fragmente aufweisen.
Einer dieser Stämme wird auf Medien plattiert, die Uridin und 5-Fluororotsäure enthalten. Mutanten mit einer Pyrimidinauxotrophie werden durch das stärkere Wachstum auf diesen Medien identifiziert und gepickt und durch Ausstreichen auf Einzelkolonien gereinigt.
Beispiel 13.6: Herstellung von Interferon im pepD^– A. niger Stamm
Einer der in Beispiel 6.5 isolierten pepD^– A. niger An8 Stämme wird als Wirt für eine anschließende Transformation mit pyrA⁺ enthaltenden Plasmiden und Expressionskassetten verwendet, die ein heterologes Gen für Interferon enthalten.
Konidiosporen der Uridin-auxotrophen pepD^– Mutante von A. niger An8 werden für 4 Tage bei 28°C in Vollmedium angezogen, bis sie voll sporulieren. 2 × 10⁸ Konidiosporen werden zur Beimpfung von 200 ml Minimalmedium verwendet, das mit 1 g/l Arginin und Uridin supplementiert ist.
Nach 20 Stunden Wachstum bei 28°C und 180 Upm wird das Myzel durch Filtration durch Miracloth geerntet, zweimal mit 10 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ gewaschen und in 20 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂, 0,5 mg/ml Novozym 234 (Novo Industries) resuspendiert. Das Gemisch wird in einem Schüttelwasserbad (30°C, 50 Upm) inkubiert, bis ausreichend Protoplasten freigesetzt wurden (mikroskopisch nach 90–120 Minuten detektiert). Die Protoplastensuspension wird durch einen Glaswollestopfen in einem Trichter filtriert, um den Myzeldebris zu entfernen. Die Protoplasten werden durch milde Zentrifugation (10 Minuten, 2000 Upm) bei Raumtemperatur pelletiert und zweimal mit 10 ml 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ gewaschen. Die Protoplasten werden schließlich in 200–500 μl an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ unter Bildung einer Konzentration an 1 × 10⁸ pro ml resuspendiert.
Zur Transformation wird ein 200 μl Aliquot der Protoplastensuspension mit 5 μg an pCG59D7 (DSM 3968) und 50 μg an pGIIss-IFN AM119 oder pGII-IFN AM119 DNA (beide Plasmide sind in EP 0 421 919 A beschrieben) in 50 μl PCT (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM CaCl₂, 25% PEG 6000) inkubiert. Das Inkubationsgemisch wird für 20 Minuten auf Eis gehalten, es werden weitere 2 ml PCT zugegeben und das Gemisch wird für weitere 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 4 ml an 0,8 M KCl, 50 mM CaCl₂ werden zugegeben und 1 ml Aliquots der schließlichen Transformationslösung werden mit flüssigem Minimalagarmedium (Minimalmedium + 1 g/l Arginin + 10 g/l Bacto-Agar (Difco)) gemischt, das mit 0,8 M KCl stabilisiert ist. Die Gemische werden sofort auf Agarplatten desselben Mediums gegossen und bei 30°C inkubiert.
Nach 2–3 Tagen Wachstum bei 28°C erscheinen stabile Transformanden als stark wachsende und sporulierende Kolonien auf einem Hintergrundwachstum von vielen hundert kleinen, vermutlich abgestorbenen Transformanden.
Die Transformanden werden gepickt und auf eine Interferonexpression analysiert. Die Interferonaktivität wird gemäß dem Verfahren von Armstrong (J. A. Armstrong, Apll. Microbiol. 21; 732 (1971)) mittels humaner CCL-23 Zellen und dem vesikulären Stomatitisvirus (VSV) als Provokationsvirus bestimmt.
Konidiosporen von Transformanden werden einzeln in 50 ml eines Präkulturmediums vorkultiviert (Pectin Slow Set L (Unipectin, SA, Redon, France) 3 g/l, NH₄Cl 2 g/l, KHP₂O₄ 0,5 g/l, NaCl 0,5 g/l, Mg₂SO₄ × 7 H₂O 0,5 g/l, Ca₂SO₄ × 2 H₂O 0,5 g/l, pH 7,0, 1% Arginin). Die Vorkultur wird für 72 Stunden bei 250 Upm und 28°C inkubiert. 10% der Vorkultur werden zum Beimpfen von 50 ml des Hauptkulturmedium (Sojabohnenmehl 20 g/l, Pectin Slow Set 5 g/l, 1% Arginin) verwendet. Die Kultur wird für 72–96 Stunden bei 250 Upm und 28°C angezogen.
Zu verschiedenen Zeiten (alle 20 Stunden) werden Proben entnommen, die Zellen werden durch Zentrifugation pelletiert und durch Gefriertrocknung und trockene Vermahlung aufgebrochen. Der Überstand und die Zellextrakte werden beide auf Interferonaktivität getestet, wie dies beschrieben ist (siehe oben). Die Hauptmenge an Interferonaktivität wird bei Transformanden, die pGIIss-IFN AM119 enthalten, ins Medium sekretiert, während bei Transformanden, die pGII-IFN AM119 enthalten, sie hautsächlich im Zellextrakt vorkommt.
Beispiel 14: Überexpression von pepD in A. niger
Beispiel 14.1: Überexpression von mehrfachen Kopien
A. niger An8 wird mit 1 μg pAXI plus 10 μg pTZPEPD transformiert, um Uridinprototrophe zu isolieren. Die Kolonien werden gereinigt und die DNA wird wie oben beschrieben präpariert. Southern Blots mittels des HindIII Fragments von pTZPEPD zeigen, dass einige Transformanden eine einzelne Kopie von pTZPEPD integriert in das Genom enthalten, während andere bis zu und über 10 zusätzliche Kopien in ihrem Genom aufweisen. Diese Stämme bilden entsprechend mehr proteolytische Aktivität und sind mitotisch stabiler.
Beispiel 14.2: Überexpression von pepD aus Genfusionen
Es wird eine Genfusion konstruiert, die aus der A. niger Pyruvatkinasepromotorregion und der kodierenden Region und Terminatorregion des A. niger pepD Gens besteht. Die Fusion wird durch rekombinante PCR konstruiert (R. Higuchi: recombinant PCR, Seiten 177–183 in Innis et al., (Herausgeber), PCR Protocols, Academic Press, Inc. (1990)). Es werden 4 Oligonukleotidprimer entworfen, von denen Fusoligo 1, 2 und 3 jeweils in SEQ ID Nr. 12, 13 und 14 gezeigt sind, während Fusoligo 4 komplementär zur Sequenz zwischen den Nukleotiden 2858 und 2874 in SEQ ID Nr. 1 ist. Fusoligo 1 hybridisiert an den pki Promotor 0,75 kb stromaufwärts des ATG Startcodons. Fusoligo 2 und 3 überlappen partiell auf den komplementären Strängen, wobei beide Sequenzen des pki Promotors unmittelbar stromaufwärts des ATG Startcodons und das ATG Codon selbst und auch Sequenzen der für pepD kodierenden Region unnittelbar stromabwärs des ATG Codons enthalten. Fusoligo 4 hybridisiert an die stromabwärts liegende Region des pepD Gens 0,65 kb stromabwärts der Translationsstopstelle. Es werden zwei PCR Reaktionen im wesentlichen wie oben beschrieben hergestellt. In einer ersten Reaktion wird ein 0,75 kb pki Promotorfragment mittels Fusoligo 1 und 2 und pGW 1100 (DSM 5747) als Matrize amplifiziert. In einer zweiten Reaktion wird ein 2,0 kb Fragment, das die kodierenden und terminierenden Regionen von pepD enthält, mittels Fusoligo 3 und 4 und pTZPEPD als Matrize amplifiziert. Die Amplifizierungsprodukte werden aus einem Agarosegel gereinigt, vereinigt, denaturiert und erneut aneliert. Die zwei Fragmente bilden Homo- und auch Heteroduplexe während der Anelierungsreaktion aufgrund der überlappenden Enden von Fusoligo 2 und 3. Das anelierte Gemisch wird dann durch PCR mittels der zwei "außen" liegenden Primer (Fuoligo 1 und 4) reamplifiziert. Das Produkt dieser Reaktion wird isoliert, gereinigt und in einen Plasmidvektor subkloniert.
Die korrekten Plasmide werden durch den Verdau von Plasmidminipräparationen identifiziert. Es werden 2 ausgewählt und das Insert wird vollständig mittels synthetischer Oligonukleotide sequenziert. Ein Plasmid, das eine perfekte Fusion des Pyruvatkinasepromotors mit dem offenen Leserahmnen des pepD Gens enthält, das pPKIPEPDA genannt wird, wird mit pAXI zur Cotransformation von A. niger An8 zur Uridinprototrophie verwendet.
Die Anwesenheit der pki-pepD Fusion wird durch die Präparation von DNA aus einzelnen gereinigten Transformanden und deren Verwendung für eine Southern Analyse mittels Sonden von pki und pepD bestätigt. Die Stämme, die eine oder mehrere Kopien dieser Genfusion in ihrem Genom integriert aufweisen, weisen mehr proteolytische Aktivität auf, wenn die Zellen schnell auf Glucose als C-Quelle angezogen werden.
Beispiel 15: Expression von penD in anderen Organismen: Expression in Hefe
Das Plasmid pTZPEPD wird mit EcoRI geschnitten, mit T4 Polymerase stumpfendig gemacht und religiert, wobei die EcoRI Schnitstelle aus der Polylinkerregion entfernt wird. Das entstehende Plasmid wird dann in vitro mutagenisiert mit den vier synthetischen Oligonukleotiden Oligoyeast 1, 2, 3 und 4, die in der Sequenzliste jeweils unter SEQ ID Nr. 15, 16, 17 und 18 gezeigt sind. Oligoyeast 1 bildet eine EcoRI Schnittstelle stromaufwärts des ATG von pepD und die anderen 3 eliminieren jeweils vollständig jedes der 3 Introns. Dies erzeugt das Plasmid pTZPEPDa, dessen Sequenz durch eine vollständige Sequenzierung bestätigt wird.
Das 2,2 kb EcoRI-BamHI Fragment, das direkt vor dem ATG von pepD startet und nach der Terminatorregion endet, wird gereinigt und zusammen mit dem 520 by BamHI-EcoRI Fragment von pFBY129 (DSM 7016), das den GAL10 Hefepromotor enthält, in die SnaBI Schnittstelle des auf dem Hefe 2 μ basierenden Vektors pFBY25 (DSM 7020) ligiert. Ein korrektes Plasmid wird durch Restriktionsverdau identifiziert. Dieses Plasmid, nämlich pGAL10PEPD, wird in Hefe transformiert und bildet das pepD Protein, wenn die Expression der Genfusion durch Galaktose induziert wird.
Hinterlegung von Mikroorganismen
Die folgenden Mikroorganismen werden unter dem Budapester Vertrag bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen, Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig hinterlegt:
Sequenzliste

Claims

Isoliertes DNA Molekül, das eine DNA Sequenz umfaßt, die für eine Serinprotease von Aspergillus niger kodiert, ausgewählt aus der Gruppe, die aus Serinproteasen besteht, die die jeweils in SEQ ID Nr. 2 und 7 gezeigten Aminosäuresequenzen aufweisen.
DNA Molekül nach Anspruch 1, das eine DNA Sequenz umfaßt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus der für pepC kodierenden Region, die in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, und der für pepD kodierenden Region, die in SEQ ID Nr. 6 gezeigt ist, besteht.
Hybridvekor, der ein DNA Molekül nach Anspruch 1 umfaßt.
Hybridvektor nach Anspruch 3, worin eine DNA Sequenz, die für eine Serinprotease vom Subtilisintyp von Aspergillus niger kodiert, funktionell mit regulatorischen Elementen verbunden ist, die zur Expression einer solchen DNA Sequenz in einer geeigneten Wirtszelle geeignet sind.
Hybridvektor nach Anspruch 4, worin eine DNA Sequenz, die für eine Serinprotease vom Subtilisintyp von Aspergillus niger kodiert, funktionell mit regulatorischen Elementen verbunden ist, die zur Expression einer solchen DNA Sequenz in einem Aspergillus Stamm geeignet sind.
Hybridvektor nach Anspruch 5, der einen Promotor umfaßt, der zur gewünschten DNA Sequenz homolog ist, die für eine Serinprotease vom Subtilisintyp von Asprgillus niger kodiert.
Hybridvektor nach Anspruch 4, der einen Promotor umfaßt, der zur gewünschten DNA Sequenz heterolog ist, die für eine Serinprotease vom Subtilisintyp von Asprgillus niger kodiert.
Verfahren zur Herstellung eines DNA Moleküls nach Anspruch 1, das die Kultivierung einer Wirtszelle, die mit einem DNA Molekül transformiert ist, das für eine Serinprotease vom Subtilisintyp von Aspergillus niger kodiert und die Isolierung dieses DNA Moleküls aus der Wirtszelle umfaßt.
Aspergillus niger Stamm, der einen Defekt im pepC Gen der Sequenz der SEQ ID Nr. 1 und/oder im pepD Gen der Sequenz der SEQ ID Nr. 6 aufweist.
Verfahren zur Herstellung eines Aspergillus niger Satmms, der die Mutation des endogenen chromosomalen Aspergillus niger pepC Gens mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 1 und/oder des Aspergillus niger pepD Gens mit der Sequenz der SEQ ID Nr. 6 umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 10, das die in vitro Mutation des Gens, die Transformation eines Aspergillus niger Wirts, der ein entsprechendes endogenes chromosomales Gen trägt, mit dem in vitro mutierten Gen und die Isolierung von Mutanten, worin das endogene Gen durch das in vitro mutierte Gen ersetzt ist, umfaßt.
Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Polypeptids, das die Transformation eines Aspergillus niger Stamms nach Anspruch 9 mit einem Expressionsvektor, der eine zur Expression des gewünschten Polypeptids geeignete Expressionskassette trägt, Kultivierung des transformierten Aspergillus niger Stamms unter Bedingungen, die zur Expression des gewünschten Polypeptids geeignet sind, und die Isolierung des gewünschten Polypeptids umfaßt.
Serinprotease von Aspergillus niger, ausgewählt aus der Gruppe, die besteht aus PEPC, die in SEQ II) Nr. 2 gezeigt ist und PEPD, die in SEQ ID Nr. 7 gezeigt ist.
Verfahren zur Herstellung einer Serinprotease vom Subtilisintyp von Aspergillus niger, wobei das Verfahren die Kultivierung eines geeigneten Wirts, der mit einem Hybridexpressionsvektor nach Anspruch 4 transformiert ist, umfaßt.
Wirt, der mit einem Hybridexpressionsvektor nach Anspruch 4 transformiert ist.
Transformierter Wirt nach Anspruch 15, die ein Aspergillus niger Stamm ist.
Transformierter Wirt nach Anspruch 16, der ein Aspergillus niger Stamm ist, der mit einem Hybridexpressionsvektor transformiert ist, welcher einen Promotor enthält, der zur DNA Sequenz homolog ist, die für eine Serinprotease vom Subtilisintyp von Aspergillus niger kodiert.
Transformierter Wirt nach Anspruch 16, der ein Aspergillus niger Stamm ist, der mit einem Hybridexpressionsvektor transformiert ist, welcher einen Promotor enthält, der zur DNA Sequenz heterolog ist, die für eine Serinprotease vom Subtilisintyp von Aspergillus niger kodiert.
Verfahren zur Herstellung eines transformierten Wirts nach Anspruch 15, das die Transformation eines geeigneten Wirts mit einem Hybridexpressionsvektor nach Anspruch 4 umfaßt.