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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft von filamentösen Pilzen abgeleitete Lysyloxidase,
eine die besagte Lysyloxidase kodierende DNA sowie Verwendungen
davon.
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STAND DER TECHNIK
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Filamentöse Pilze,
insbesondere Aspergillus, einschließend Aspergillus oryzae (gelber
Aspergillus) etc., werden üblicherweise
in der japanischen Brauindustrie verwendet, um Sake, Bohnenpaste,
Sojasauce, Mirin und dergleichen zum sofortigen Verzehr herzustellen.
Aspergillus ist eine Quelle von sicheren Genen, die in der GRAS
(Generally Recognized as Safe) -Liste der US-amerikanischen FDA
(Food and Drug Administration) aufgeführt sind.
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Für einen
Sicherheitstests, so wie einen Test auf chronische Toxizität, der erforderlich
ist, wenn von allgemeinen Pilzen abgeleitete Gene für Nahrungsmittel
etc. verwendet werden, belaufen sich daher die Kosten im Fall von
Genen, die von allgemeinen Pilzen abgeleitet sind, auf etwa 1 Milliarde
Yen. Auf der anderen Seite, im Fall von Genen, bei denen es sich
um die zuvor erwähnten
Gene der GRAS-Liste handelt, ist es vorteilhaft, dass die Kosten
auf ungefähr
ein Drittel reduziert werden können
und dass es des weiteren möglich ist,
den Test im Vergleich zum Fall der allgemeinen Gene schneller durchzuführen.
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Daher
könnten
filamentöse
Pilze, insbesondere Aspergillus, gewissermaßen eine wahre Schatztruhe von
Genen bereitstellen, die hinsichtlich der Sicherheit und der Wirtschaftlichkeit
von großem
Nutzen sind. Die mit der vorliegenden Erfindung in Zusammenhang
stehende Technologie ist in dem japanischen Patent Nr. 2796114 (Patentdokument
1) und dem japanischen Patent Nr. 2977245 (Patentdokument 2) offenbart.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Durch
die Entschlüsselung
der Information über
die genomische DNA dieser Pilze sowie der Funktionen der dadurch
kodierten Gene ist es daher möglich,
eine effektive Verwendungsmethode sicherer Genressourcen, z. B.
bei der biotechnologischen Herstellung von Materialien, in der Lebensmittelindustrie,
sowie nützliche
Informationen für
das Screening verschiedener Arten von Genen auf den Gebieten der
landwirtschaftlichen Chemie und der Medizin bereitzustellen.
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Des
weiteren würde
diese Entschlüsselung
ein nützliches
Werkzeug zur Analyse der genomischen Information von Getreide befallenden
Pilzen, so wie eng verwandten Spezies einschließend z. B. Aspergillus flavus,
Aspergillus fumigatus, etc., sowie von den Menschen infizierenden
Bakterien bereitstellen.
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Als
Ergebnis der Untersuchung im Hinblick auf die zuvor erwähnte Zielsetzung
gelang es den Erfindern der vorliegenden Erfindung, das Genom von
Aspergillus oryzae, einer Art von Aspergillus, zu analysieren und
dessen Basensequenz (ebenso wie die durch diese Basensequenz kodierte
Aminosäuresequenz)
sowie verschiedene Funktionen etc. zu bestimmen. Auf der Grundlage
solcher Ergebnisse offenbarten die Erfinder der vorliegenden Erfindung
in einer früheren
Patentanmeldung (JP2001-403261) verschiedene von Aspergillus oryzae
abgeleitete DNAs ebenso wie ein Primerset zur Amplifikation eines
Gens von filamentösen
Pilzen der GRAS-Klasse, einschließend eine von diesen DNAs produzierte
Nukleotidsequenz sowie eine Sonde zur Detektion von Genen filamentöser Pilze
etc.
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Auf
der Grundlage der resultierenden Genominformation von Aspergillus
führten
die Erfinder der vorliegenden Erfindung eine weitere Untersuchung
durch. Das heißt
die Erfinder der vorliegenden Erfindung richteten ihr Augenmerk
auf Lysyloxidase und identifizierten eine Lysyloxidase kodierende
Sequenz aus den resultierenden Basensequenzen. Die Erfinder der
vorliegenden Erfindung versuchten ebenfalls, eine Aminosäuresequenz
eines durch die Sequenz kodierten Proteins zu identifizieren. Hier
ist zu beachten, dass es sich bei der Lysyloxidase um eine Art von
Aminoxidase handelt, deren Funktion es ist, Lysinreste in Protein
zu oxidieren, um diese somit durch Crosslinking miteinander zu verknüpfen. Die
Existenz von Lysyloxidase, die von Tieren abgeleitet wurde, ist üblicherweise
bekannt und eine solche Lysyloxidase wurde zur Verbesserung der
Beschaffenheit von Nahrungsmitteln verwendet (siehe z. B. die zuvor
erwähnten
Patentdokumente 1 und 2). In den letzten Jahren wurden Studien über Lysyloxidase,
die von Mikroorganismen abgeleitet wurde, durchgeführt und
es wurde in Pichia Pastoris, einer Art von Hefe (FEBS Lett. 1988
238, 74-76), eine Lysyloxidase gefunden, die eine Substratspezifität ähnlich der
von Säugern
abgeleiteten Lysyloxidase aufweist. Es wurde gefunden, dass diese
von Pichia Pastoris abgeleitete Lysyloxidase nicht nur ähnliche
Eigenschaften wie die von Säugern
abgeleitete Lysyloxidase aufwies, sondern ebenfalls von einer den
Aminoxidasen von Bakterien wie Escherichia coli, Arthrobacter globiformis
etc. ähnlichen
Struktur war (siehe J. Inorg Biochem. 2001 83 (2-3): 193-204). Über die
Isolation von Lysyloxidase von filamentösem Pilz, d.h. einem höheren Mikroorganismus
wie Hefe, wurde jedoch bis dato nicht berichtet.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung stellten ernsthafte Forschungen
an und es gelang ihnen, im Genom von Aspergillus eine Sequenz zu
finden, die in höchstem
Maße homolog
zu den wie zuvor erwähnten von
Pichia Pastoris abgeleiteten Lysyloxidasegenen ist. Die Lysyloxidaseaktivität wurde
bei der Expression eines durch die Basensequenz kodierten Proteins
unter Verwendung eines filamentösen
Pilzes als Wirt gezeigt. Aufgrund des Resultats wurde experimentell
bestätigt,
dass die besagte Sequenz Lysyloxidase kodierte. Auf der anderen
Seite konnten die Erfinder der vorliegenden Erfindung die kodierende
Region in der Sequenz identifizieren und sie fanden, dass ein durch
die Sequenz kodiertes Protein eine neuartige Aminosäuresequenz aufweist.
Daher sind die Erfinder der vorliegenden Erfindung die ersten, denen
es gelang, eine von filamentösen
Pilzen abgeleitete Lysyloxidase und deren Aminosäuresequenz zu identifizieren.
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Die
vorliegende Erfindung wurde auf der Grundlage der zuvor erwähnten Ergebnisse
vervollständigt und
es ist die spezifische Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine
von filamentösen
Pilzen abgeleitete Lysyloxidase, eine die besagte Lysyloxidase kodierende
DNA sowie ein Verfahren zur Herstellung von Lysyloxidase, die von
filamentösen
Pilzen abgeleitet ist, bereitzustellen. Zur Lösung der genannten Aufgaben
werden die folgenden Konfigurationen bereitgestellt.
- [1] Lysyloxidase bestehend aus einem Protein wie in den nachfolgenden
Punkten (a) oder
(b) beschrieben:
(a) ein Protein mit
der wie in SEQ ID NR: 2 dargestellten Aminosäuresequenz; oder
(b) ein
Protein mit einer Aminosäuresequenz,
die durch Modifikation eines Teils der wie in SEQ ID NR: 2 dargestellten
Aminosäuresequenz
konfiguriert ist und die als eine Lysyloxidase fungiert, wobei die
Anzahl der zu modifizierenden Aminosäuren 10% oder weniger der gesamten
Aminosäuren
entspricht.
- [2] Eine DNA wie nachfolgend in den Punkten (A) oder (B) beschrieben:
(A)
eine DNA kodierend eine wie in [1] beschriebene Lysyloxidase; oder
(B)
eine DNA, die unter stringenten Bedingungen an die in (A) beschriebene
DNA hybridisiert und ein Protein kodiert, das als Lysyloxidase fungiert.
- [3] (C) oder (D):
(C) Eine DNA mit einer beliebigen der
nachfolgenden Sequenzen (i) bis (vi):
(i) eine Basensequenz
aus SEQ ID NR: 3;
(ii) eine Basensequenz aus SEQ ID NR: 4;
(iii)
eine Basensequenz aus SEQ ID NR: 5;
(iv) eine Basensequenz
aus SEQ ID NR: 6;
(v) eine Basensequenz aus SEQ ID NR: 1; und
(vi)
eine Basensequenz aus SEQ ID NR: 7.
(D) Eine DNA die unter
stringenten Bedingungen an die in (C) beschriebene DNA hybridisiert
und ein Protein kodiert, das als Lysyloxidase fungiert.
- [4] Ein Vektor, der die in [2] oder [3] beschriebene DNA trägt.
- [5] Filamentöse
Pilze, in welche die in [2] oder [3] beschriebene DNA exogen eingeführt wird.
- [6] Ein Verfahren zur Herstellung von Lysyloxidase, wobei das
Verfahren die nachfolgenden Schritte (1) und (2) einschließt:
(1)
ein Schritt zum Kultivieren der in [5] beschriebenen filamentösen Pilze
unter Bedingungen, welche die Herstellung eines durch die DNA kodierten
Proteins gestatten; und
(2) ein Schritt zur Gewinnung des hergestellten
Proteins.
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Die "DNA" der vorliegenden
Erfindung ist nicht auf eine doppelsträngige DNA beschränkt, sondern
soll eine einzelsträngige
DNA (Sense- und Antisense-Kette) einschließen, aus welcher sich die doppelsträngige DNA
zusammensetzt. Des weiteren schließt die DNA der vorliegenden
Erfindung eine DNA mit einer beliebigen Basensequenz im Hinblick
auf die Degeneriertheit der Codons ein. Des weiteren ist die Form
der DNA nicht eingeschränkt
und kann eine cDNA, eine genomische DNA und eine synthetische DNA
einschließen.
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Bei
der "ein Protein
kodierenden DNA" der
vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine DNA, aus der bei
der Expression ein Protein erhalten wird. Die "DNA" schließt nicht
nur eine DNA mit einer Basensequenz ein, die einer Aminosäuresequenz
des Proteins entspricht, sondern auch eine DNA, die dadurch erhalten
wird, dass man zu der DNA mit einer Basensequenz, die einer Aminosäuresequenz
des Proteins entspricht (Beispiele für eine solche DNA schließen eine
DNA mit einer Vielzahl an Introns ein), eine Sequenz hinzufügt, die
keine Aminosäuresequenz
kodiert.
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Die "von filamentösen Pilzen
abgeleitete Lysyloxidase" der
vorliegenden Erfindung schließt
Lysyloxidase ein, die unter Verwendung von filamentösen Pilzen
als Ausgangsmaterial hergestellt wird, oder Lysyloxidase, die unter
Verwendung der Information (Aminosäuresequenz oder DNA-Sequenz)
der Lysyloxidase hergestellt wird, die bei der Gewinnung von Lysyloxidase
von filamentösen
Pilzen übertragen
wird. Beispiele für eine
derartige Lysyloxidase schließen
nicht nur eine unter Verwendung eines physikalischen, biochemischen oder ähnlichen
Verfahrens aus filamentösen
Pilzen hergestellte Lysyloxidase ein, sondern auch eine Lysyloxidase,
die unter Verwendung einer Aminosäuresequenz oder einer DNA-Sequenz
der in der vorliegenden Erfindung offenbarten Lysyloxidase mittels
einer gentechnologischen Technik hergestellt wird.
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Konstruktion
eines Vektors pBALO.
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2 besteht
aus einer Tabelle (oberer Teil) und einem Diagramm (unterer Teil),
welche die Messergebnisse der Lysyloxidaseaktivität unter
Verwendung von durch den Vektor pBALO transformierten filamentösen Pilzen
zeigen. ABPUI1 repräsentiert
eine Kontrolle (eine Probe unter Verwendung eines Kulturüberstands des
ABPU1-Stamms aus Aspergillus nidulans).
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3 zeigt
eine Sequenz eines 3'-DNA-Fragments,
das unter Verwendung eines Primers amplifiziert wurde, der spezifisch
für das
Gen ist, in welchem RNA als Template verwendet wird, die aus einem
ein Lysyloxidasegen tragenden Transformanten extrahiert wurde. Ein
unterstrichener Abschnitt zeigt die Position des hierin verwendeten
Primers (LO-3')
an.
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4 ist
eine schematische Darstellung eines Verfahrens zur Konstruktion
eines Vektors pBALO-D.
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5 besteht
aus einer Tabelle (oberer Teil) und einem Diagramm (unterer Teil),
welche die Messergebnisse der Lysyloxidaseaktivität unter
Verwendung von durch den Vektor pBALO-D transformierten filamentösen Pilzen
zeigen. ABPUI1 repräsentiert
eine Kontrolle (eine Probe unter Verwendung eines Kulturüberstands
des ABPU1-Stamms aus Aspergillus nidulans).
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BESTES VERFAHREN
ZUR DURCHFÜHRUNG
DER ERFINDUNG
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Protein
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Der
erste Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine von filamentösen Pilzen
abgeleitete Lysyloxidase. Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellte
Lysyloxidase schließt
ein Protein mit beispielsweise einer wie in SEQ ID NR: 2 dargestellten
Aminosäuresequenz
ein. Wie in den nachfolgenden Beispielen gezeigt, wurde bestätigt, dass
das Protein in dem Expressionssystem unter Verwendung von filamentösen Pilzen tatsächlich eine
Lysyloxidaseaktivität
aufweist.
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Im
Fall, dass ein Teil der Aminosäuresequenz
eines Proteins modifiziert ist, hat ein Protein hierin nach der
Modifikation im allgemeinen die gleiche Funktion wie vor der Modifikation.
Das heißt
die Modifikation der Aminosäuresequenz
darf die Funktion des Proteins nicht wesentlich beeinträchtigen
und die Funktion soll vor und nach der Modifikation beibehalten
werden. Unter Berücksichtigung
dieser Tatsache soll ein Protein, das durch die Modifikation eines
Teils der Aminosäuresequenz
(SEQ ID NR: 2) des Proteins mit der zuvor erwähnten Lysyloxidaseaktivität erhalten
wurde (im nachfolgenden wird dieses Protein als "modifiziertes Protein" bezeichnet), die
Lysyloxidase (Protein) der vorliegenden Erfindung darstellen, so
lange die Funktion als Lysyloxidase aufrechterhalten wird. Mit anderen
Worten, so lange die Funktion als Lysyloxidase aufrechterhalten wird,
darf ein Teil der Aminosäuresequenz
modifiziert werden. Hier ist zu beachten, dass es bevorzugt wird, dass
die Lysyloxidaseaktivität
nicht als eine Folge der Modifikation vermindert wird; eine geringfügige Schwankung
(Anstieg oder Abnahme) der Lysyloxidaseaktivität ist jedoch gestattet.
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Der
Ausdruck "ein Teil
einer Aminosäuresequenz
wird modifiziert" soll
hierin bedeuten, dass eine oder eine Vielzahl von Aminosäuren in
der Aminosäuresequenz
deletiert, substituiert, addiert und/oder insertiert werden. Die
Position der Modifikation (Mutation) der Aminosäuresequenz ist nicht speziell
beschränkt,
so lange nur die Lysyloxidaseaktivität aufrechterhalten wird. Des
weiteren kann die Modifikation an einer Vielzahl von Positionen
durchgeführt
werden. Die Anzahl der zu modifizierenden Aminosäuren kann beispielsweise eine Anzahl
sein, die 10% oder weniger der gesamten Aminosäuren entspricht, bevorzugt
eine Anzahl, die 5% oder weniger der gesamten Aminosäuren entspricht
und weiter bevorzugt eine Anzahl, die 1% oder weniger der gesamten
Aminosäuren
entspricht. Das zuvor erwähnte
modifizierte Protein kann mittels eines gentechnologischen Verfahrens
gebildet werden, z. B. durch die Herstellung eines Nukleinsäurefragments,
das eine Sequenz aufweist, die durch die Modifikation einer Basensequenz
erhalten wird, welche die Aminosäuresequenz aus
SEQ ID NR: 2 kodiert, und dieses Fragment dazu bringt, in einem
geeigneten Expressionssystem zu exprimieren.
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Unter
den Proteinen der vorliegenden Erfindung (einschließend modifiziertes
Protein) kann das Protein aus natürlichen filamentösen Pilzen
mittels Verfahren wie Extraktion und Reinigung aus den filamentösen Pilzen
hergestellt werden. Des weiteren kann das Protein (einschließend modifiziertes
Protein) der vorliegenden Erfindung mittels des gentechnologischen
Verfahrens hergestellt werden, das auf der Information der hierin
offenbarten Lysyloxidase basiert. Beispielsweise wird eine DNA verwendet,
die das Protein der vorliegenden Erfindung kodiert, um eine geeignete
Wirtszelle zu transformieren und die in dem Transformanten exprimierten Proteine
werden gesammelt, um so die Proteine der vorliegenden Erfindung
herzustellen. Die gesammelten Proteine werden gemäß dem Verwendungszweck
in geeigneter Weise aufgereinigt. Wird ein Protein als ein rekombinantes
Protein hergestellt, so können
verschiedene Modifikationen durchgeführt werden. So kann beispielsweise
ein rekombinantes Protein erhalten werden, in welchem das Protein
der vorliegenden Erfindung mit anderen Peptiden oder Proteinen verknüpft ist,
wenn eine das Protein der vorliegenden Erfindung kodierende DNA
und andere geeignete DNAs in einen Vektor eingebracht werden und
der Vektor zu Herstellung eines rekombinanten Proteins verwendet
wird. Durch eine solche Modifikation ist es möglich, die Extraktion und Reinigung
eines rekombinanten Proteins zu vereinfachen oder ihm zusätzliche
biologische Funktionen zu verleihen oder dergleichen.
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DNA kodierende
Lysyloxidase
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine die von filamentösen Pilzen
abgeleitete Lysyloxidase kodierende DNA bereitgestellt. Spezifische
Beispiele für
eine solche DNA können
eine DNA mit einer Basensequenz aus SEQ ID NR: 3 oder SEQ ID NR:
4 einschließen.
Bei der ersteren handelt es sich um eine von einer Lysyloxidase
kodierenden genomischen DNA (Lysyloxidasegen) abgeleitete Sequenz und
bei der letzteren um eine genomische DNA, aus der Intronregionen
ausgeschlossen wurden. Ein weiteres spezifisches Beispiel für die DNA
der vorliegenden Erfindung kann eine DNA mit einer Basensequenz
aus SEQ ID NR: 5 oder SEQ ID NR: 6 einschließen. Bei der ersteren handelt
es sich um eine DNA mit einer das Lysyloxidasegen aus SEQ ID NR:
3 und dessen mutmaßliche
Promotorregion einschließenden
Sequenz. Bei der letzteren handelt es sich um eine DNA einschließend DNA
wie in SEQ ID NR: 4 dargestellt (DNA, aus der Intronregionen ausgeschlossen
wurden) und deren mutmaßliche
Promotorregion. Da diese DNAs die ideale Kombination aus einem Promotor-
und einem Strukturgen aufweisen, wenn Lysyloxidase unter Verwendung dieser
DNAs hergestellt wird, kann eine exzellente Genexpression erwartet
werden. Daher kann ein effizientes Produktionssystem für Lysyloxidase
konstruiert werden. Weitere Beispiele für die DNA der vorliegenden
Erfindung können
eine DNA mit einer Basensequenz aus SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR:
7 einschließen.
Bei der ersteren handelt es sich um eine DNA mit einer das Lysyloxidasegen
sowie dessen mutmaßliche
Promotor- und Terminatorregion
einschließenden
Sequenz aus SEQ ID NR: 3. Bei der letzteren handelt es sich um eine DNA
aus SEQ ID NR: 4 (eine DNA eines Lysyloxidasegens, aus der Intronregionen
ausgeschlossen wurden), deren mutmaßliche Promotorregion sowie
eine Terminatorregion. Wird eine solche DNA verwendet, kann ebenfalls
ein effizientes Produktionssystem für Lysyloxidase konstruiert
werden.
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Die
mutmaßliche
Promotorregion in den jeweils in SEQ ID NRS: 1, 5, 6 oder 7 dargestellten
Sequenzen hat eine Länge
von 1.600 bp, was für
eine Promotorregion ausgesprochen lang ist. Es wird daher erwartet, dass
ein Teil dieser Region unmittelbar an der Promotoraktivität beteiligt
ist. Unter diesem Gesichtspunkt kann eine Region, die einen zusammenhängenden
Teil in der mutmaßlichen
Promotorregion (etwa 1.600 bp an dem 5'-Ende) in diesen Sequenzen einschließt, als
ein Promotor der DNA der vorliegenden Erfindung verwendet werden,
so lange sie bezüglich
des Lysyloxidasegens nachweislich eine Funktion als Promotor aufweist.
Daher kann, beispielsweise durch Kombination der so identifizierten
Promotorregion und des Strukturgens der in SEQ ID NR: 3 dargestellten
Sequenz, die DNA der vorliegenden Erfindung (Lysyloxidase kodierende
DNA) gebildet werden. Dabei ist im allgemeinen, unter dem Gesichtspunkt,
dass eine als Promoter fungierende Region unmittelbar vor dem Strukturgen
positioniert ist, eine Region, die beispielsweise Basen an den Positionen
569 bis 1568 und bevorzugt Basen an den Positionen 769 bis 1568
einschließt,
ein vielversprechender Kandidat für die funktionierende Region.
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Die
zuvor erwähnten
DNAs der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem
man in geeigneter Weise eine Sonde, einen Primer etc. verwendet,
die/der dazu in der Lage ist, spezifisch an ein Gen zu hybridisieren,
welches die Lysyloxidase der vorliegenden Erfindung (z. B. eine
DNA mit einer Basensequenz aus SEQ ID NR: 3) aus der genomischen
DNA-Bibliothek oder einer cDNA-Bibliothek von geeigneten filamentösen Pilzen
oder einem Zellextrakt aus filamentösen Pilzen kodiert. Hierzu
ist anzumerken, dass ein Herstellungsverfahren für die genomische DNA-Bibliothek
oder die cDNA-Bibliothek von filamentösen Pilzen beispielsweise nachgelesen
werden kann in Molecular Cloning, Dritte Auflage, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, New York.
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Genauer
gesagt kann die DNA der vorliegenden Erfindung beispielsweise mittels
der nachfolgenden Verfahren hergestellt werden. Zunächst werden
filamentöse
Pilze, von denen erwartet wird, dass sie eine Target-DNA tragen,
für einen
vorbestimmten Zeitraum kultiviert. Dann wird eine Filtration durchgeführt, um
Pilze aufzufangen. Die aufgefangenen Pilze werden gewaschen und
dann gefriergetrocknet. Dann werden die Pilzkörper mit Hilfe eines Mörsers etc.
gemahlen und es wird eine geeignete Menge an Extraktionspufferlösung (z. B.
SDS enthaltende Tris-HCl-Pufferlösung)
zugegeben, um eine Extraktionslösung
zu erhalten. Dann wird eine genomische DNA extrahiert und mittels
Phenolextraktion, Ethanolpräzipitation
und dergleichen aufgereinigt. Unter Verwendung der so erhaltenen
genomischen DNA als ein Template wird das PCR-Verfahren unter Verwendung
eines für
die Target-DNA spezifischen Primers durchgeführt, so dass die zielgerichtete
DNA als ein Amplifikationsprodukt erhalten werden kann.
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Die
DNA der vorliegenden Erfindung kann auch hergestellt werden, indem
man, sofern erhältlich,
eine geeignete genomische DNA-Bibliothek oder cDNA-Bibliothek von
filamentösen
Pilze verwendet. In Übereinstimmung
mit den Arten von zu verwendenden Bibliotheken kann ein Plaque-Hybridisierungsverfahren
oder ein Kolonie-Hybridisierungsverfahren
angewandt werden (siehe z. B. Molecular Cloning, Dritte Auflage,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). So wird beispielsweise
ein Kolonie-Hybridisierungsverfahren
angewandt, wenn die Bibliothek unter Verwendung eines Plasmids konstruiert
wird. Zur Auswahl eines Klons, der die Target-DNA trägt, wird
eine Sonde mit einer für
die DNA der vorliegenden Erfindung spezifischen Sequenz verwendet.
Ist der Target-Klon unter Verwendung der von diesem Klon getragenen
DNA als ein Template ausgewählt,
so wird die PCR unter Verwendung eines für die Sequenz der Target-DNA
spezifischen Primers durchgeführt,
so dass die DNA der vorliegenden Erfindung als ein Amplifikationsprodukt
erhalten werden kann.
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Die
von dem erhaltenen Klon getragene DNA kann in einen geeigneten Vektor
subkloniert werden, um dann entsprechend verwendet zu werden. Dadurch
ist es beispielsweise möglich,
einen rekombinanten Vektor zur Transformation oder ein zur Dekodierung
einer Basensequenz geeignetes Plasmid zu konstruieren.
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Wenn
ein Teil einer ein Protein kodierenden DNA modifiziert ist, kann
im allgemeinen ein durch die modifizierte DNA kodiertes Protein
dabei manchmal eine Funktion aufweisen, die zu der eines vor der
Modifikation von der DNA kodierten Proteins äquivalent ist. Das heißt eine
Modifikation der DNA-Sequenz beeinträchtigt die Funktion des durch
die DNA kodierten Proteins nicht wesentlich und die Funktion des
kodierten Proteins kann manchmal vor und nach der Modifikation bestehen
bleiben. Unter Berücksichtigung
dieses Umstands kann eine DNA mit einer Basensequenz, die durch
Modifikation eines Teils der zuvor erwähnten DNA der vorliegenden
Erfindung (nachfolgend wird diese DNA auch als "modifizierte DNA" bezeichnet) erhalten wurde, die DNA
der vorliegenden Erfindung darstellen, so lange das durch die DNA
kodierte Protein eine Funktion als eine Lysyloxidase aufweist. Anders
ausgedrückt
darf ein Teil der Sequenz modifiziert werden, so lange die Funktion des
kodierten Proteins als Lysyloxidase aufrechterhalten wird. Hierzu
ist zu bemerken, dass es bevorzugt ist, dass die Lysyloxidaseaktivität vor und
nach der Modifikation nicht vermindert wird; eine geringfügige Schwankung
(Anstieg oder Abnahme) der Lysyloxidaseaktivität ist jedoch gestattet.
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Hierin
bedeutet "ein Teil
von ... wird modifiziert" typischerweise,
dass vor der Modifikation eine oder eine Vielzahl von Basen in der
Basensequenz substituiert, deletiert, insertiert oder addiert wird.
Eine solche Modifikation kann an einer Vielzahl von Stellen erfolgen. "Eine Vielzahl" ist hierin abhängig von
der zu modifizierenden Position oder von den Arten der Modifikationen,
doch handelt es sich in den meisten Fällen um eine Anzahl von beispielsweise
2 bis 100, bevorzugt 2 bis 50 und mehr bevorzugt 2 bis 10. Die zuvor
erwähnte
modifizierte DNA kann beispielsweise durch Behandlung mit einem
Restriktionsenzym; Behandlung mit Exonuklease, DNA-Ligase etc.;
Einführung
einer Mutation durch eine ortsgerichtete Mutagenese (Molecular Cloning, Dritte
Auflage, Kapitel 13, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York);
zufällige
Mutagenese (Molecular Cloning, Dritte Auflage, Kapitel 13, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York) und dergleichen erhalten werden.
Des weiteren kann die modifizierte DNA durch ein wohlbekanntes Verfahren
unter Anwendung einer Mutationsbehandlung erhalten werden, beispielsweise
die Behandlung filamentöser
Pilze, die ein Lysyloxidasegen tragen, mit ultravioletter Strahlung
gefolgt von der Isolation des modifizierten Gens.
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Hier
ist zu beachten, dass die Mutation durch Deletion, Insertion, Addition
oder Inversion etc. der Basen, wie zuvor erwähnt, eine natürlich vorkommende
Mutation einschließen
kann, basierend auf individuellen Unterschieden, Unterschieden bezüglich der
Spezies oder Gattung von Mikroorganismen, die Lysyloxidase tragen,
etc.
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Ein
Beispiel für
ein Verfahren zur Herstellung der modifizierten DNA kann ein Verfahren
einschließen, welches
beinhaltet: die Extraktion einer genomischen (chromosomalen) DNA aus
natürlich
vorkommenden filamentösen
Pilzen (z. B. Aspergillus oryzae), welche eine modifizierte DNA
tragen; die Behandlung der extrahierten DNA mit geeigneten Restriktionsenzymen;
und die nachfolgende Auswahl und Isolation einer DNA, die unter
stringenten Bedingungen in einem Screening unter Verwendung von
DNA der vorliegenden Erfindung (z. B. DNA mit einer Sequenz aus
SEQ ID NR: 3) oder einem Teil davon als eine Sonde hybridisiert.
Wenn eine genomische (chromosomale) DNA-Bibliothek einschließend einen
Klon, der eine modifizierte DNA trägt, verwendet werden kann,
so kann die modifizierte DNA dadurch erhalten werden, dass die Bibliothek
unter stringenten Bedingungen unter Verwendung der DNA der vorliegenden
Erfindung (z. B. eine DNA mit einer Sequenz aus SEQ ID NR: 3) oder
einem Teil davon als eine Sonde einem Screening unterzogen wird.
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Die
DNA der vorliegenden Erfindung kann eine DNA einschließen, die
unter stringenten Bedingungen an die DNA der vorliegenden Erfindung
(z. B. eine DNA mit einer Sequenz aus SEQ ID NR: 3 oder eine DNA, die
durch Modifikation der DNA, wie zuvor erwähnt, erhalten wurde) hybridisiert
und ein Protein kodiert, das als Lysyloxidase fungiert. Die "stringenten Bedingungen" bezeichnen dabei
Bedingungen, unter denen ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet
wird und die Bildung eines nicht-spezifischen Hybrids ausbleibt.
Die stringenten Bedingungen variieren in Abhängigkeit von der Länge der
Sequenz oder den Arten der konstituierenden Basen. Ein Beispiel
für die
stringenten Bedingungen schließt
jedoch Bedingungen ein, unter denen eine DNA in einer Hybridisierungslösung (50%
Formaldehyd, 10 × SSC
(0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0), 5 × Denhardtsche Lösung, 1%
SDS, 10% Dextransulfat, 10 μg/ml
denaturierte Lachssperm-DNA, 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5)) bei
42°C inkubiert
wird, gefolgt von Waschen mit 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 68°C. Ein bevorzugteres
Beispiel für
stringente Bedingungen kann Bedingungen unter Verwendung einer Hybridisierungslösung (50%
Formaldehyd, 5 × SSC
(0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0), 1 × Denhardtsche Lösung, 1%
SDS, 10% Dextransulfat, 10 μg/ml
denaturierte Lachssperm-DNA, 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,5)) einschließen.
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Vektor
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Gemäß einem
weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Vektor bereitgestellt,
der die DNA der vorliegenden Erfindung (einschließend eine
modifizierte DNA) trägt.
Ein solcher Vektor wird hergestellt, indem die DNA der vorliegenden
Erfindung in einen bestehenden Vektor oder in einen Vektor, der
durch Hinzufügen
einer Modifikation zu dem bestehenden Vektor erhalten wurde, eingeführt wird.
Im Prinzip kann jeder beliebige Vektor als Ausgangsmaterial verwendet
werden, so lange er die DNA der vorliegenden Erfindung tragen kann;
ein geeigneter Vektor kann jedoch gemäß dem Verwendungszweck (Klonierung,
Expression von Polypeptid) ausgewählt werden, wobei die Arten
von Wirtszellen zu berücksichtigen
sind. Die Einführung
der DNA der vorliegenden Erfindung in einen Vektor kann mittels
eines wohlbekannten Verfahrens unter Verwendung eines Restriktionsenzyms
und DNA-Ligase durchgeführt
werden (siehe Molecular Cloning, Dritte Auflage, 1.84, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, New York).
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Hier
ist zu beachten, dass, wenn eine DNA verwendet wird, die ebenfalls
eine Promotorregion einschließt
(z. B. eine DNA mit einer Sequenz aus einer der SEQ ID NRS: 1, 5,
6 und 7), ein rekombinanter Vektor konstruiert werden kann, indem
man eine separat hergestellte Promotorregion und ein Strukturgen
(sowie einen Terminator) in einen Vektor einbaut. In einem solchen
Fall, so lange die Promotorfunktion in geeigneter Weise gezeigt
wird, können
in dem Vektor andere Sequenzen zwischen die Promotorregion und das
Strukturgen (und den Terminator) eingefügt werden. Des weiteren kann
zunächst
ein die Promotorregion tragender Vektor konstruiert und dann an
das Strukturgen ligiert werden.
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Typischerweise
enthält
ein Vektor zur Transformation ein Lysyloxidasegen (z. B. eine DNA
mit einer Sequenz aus SEQ ID NR: 3), einen Promotor und einen Terminator.
Um eine geeignete Transkription eines Strukturgens durch einen Promoter
zu erreichen, sind ein Promotor, ein Gen einer Lysyloxidase sowie
ein Terminator hintereinander in stromabwärts führender Richtung angeordnet.
In dem Vektor können
ein Selektionsmarker, eine Sequenz mit einer Enhancerfunktion sowie
eine ein Signalpeptid kodierende Sequenz enthalten sein.
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Transformant
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Der
Vektor für
die Transformation kann zum Transformieren von filamentösen Pilzen
verwendet werden. Das heißt
es kann unter Verwendung des zuvor erwähnten Vektors zur Transformation
ein Herstellungsverfahren für
die transformierten filamentösen
Pilze entwickelt werden. Mit einem solchen Herstellungsverfahren
können
filamentöse
Pilze erhalten werden, in welche die DNA der vorliegenden Erfindung
exogen eingeführt
wird. Die so erhaltenen transformierten filamentösen Pilze können zur Herstellung von Lysyloxidase
verwendet werden. Genauer gesagt kann Lysyloxidase hergestellt werden,
indem man filamentöse
Pilze anzüchtet,
in welche die DNA der vorliegenden Erfindung exogen eingeführt wird,
und zwar unter Bedingungen, unter denen ein Protein (Lysyloxidase)
durch die DNA kodiert wird. In Übereinstimmung
mit dem zu verwendenden Wirt können
beliebige geeignete Kulturmedien verwendet werden. Es können beispielsweise
verschiedene Arten von kommerziell erhältlichen Kulturmedien verwendet
werden, oder Kulturmedien, denen ein für das Wachstum, die Selektion
und die Förderung
der Expression von beispielsweise Arginin, Uridin und dergleichen notwendiger
Inhaltsstoff beigemischt wurde.
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Aus
der Kulturmediumlösung
oder den Pilzkörpern
kann Target-Protein (Lysyloxidase) aufgefangen werden, nachdem diese
für einen
bestimmten Zeitraum kultiviert wurden. Werden die Proteine außerhalb
der Pilzkörper
produziert, so können
die Proteine aus der Kulturmediumlösung gewonnen werden; in anderen
Fällen
können
die Proteine aus den Pilzkörpern
gewonnen werden. Werden die Proteine aus der Kulturmediumlösung gewonnen,
so können
die Target-Proteine beispielsweise durch Isolation und Aufreinigung
mittels Kombination von Aussahen, so wie Ammoniumsulfatpräzipitation
etc., Dialyse, verschiedenen Arten der Chromatographie und dergleichen
erhalten werden. Wenn die Proteine aus den Pilzkörpern gewonnen werden können, so
können
andererseits die Proteine beispielsweise durch Isolation und Aufreinigung
erhalten werden, nachdem die Pilzkörper mittels Druck, Ultraschall
etc. gemahlen wurden. Hier ist zu beachten, dass, nachdem die Pilzkörper mittels
Filtration, Zentrifugation etc. zuvor aus einer Kulturmediumlösung gewonnen
wurden, die oben erwähnte
Abfolge von Schritten (Mahlen der Pilzkörper, Isolation und Aufreinigung)
durchgeführt
werden kann. Hier ist zu beachten, dass die Isolation und Aufreinigung
relativ leicht durchzuführen
ist, da die Lysyloxidase der vorliegenden Erfindung im allgemeinen
außerhalb
der Pilzkörper
produziert wird.
-
Die
Arten der zur Transformation zu verwendenden filamentösen Wirtspilze
sind nicht speziell beschränkt.
Beispiele für
die filamentösen
Wirtspilze schließen
filamentöse
Pilze der folgenden Gattungen ein: Aspergillus (Aspergillus oryzae,
Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus sojae, Aspergillus
awamori, Aspergillus Kawachii, Aspergillus parasiticus, Aspergillus
flavus, Aspergillus nomius, Aspergillus fumigatus und dergleichen),
Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor, Fusarium oder dergleichen.
Bevorzugt werden filamentöse
Pilze der Gattung Aspergillus verwendet. Darunter werden Aspergillus
oryzae oder Aspergillus niger aus Gründen der Sicherheit bevorzugt
verwendet.
-
Der
Vektor zur Transformation kann mittels eines wohlbekannten Verfahrens
in den filamentösen Wirtspilz
eingeführt
(transformiert) werden. Dies kann beispielsweise gemäß einem
Verfahren nach Turner et al. unter Verwendung des Pilzkörpers als
Protoplast durchgeführt
werden (siehe Gene, 36, 321-331 (1985)). Des weiteren kann ein Verfahren
nach Gomi et al. (Agric. Biol. Chem., 51, 323-328 (1987)) angewandt
werden.
-
Die
vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die Beispiele nachfolgend
detaillierter beschrieben, sie ist jedoch nicht notwendigerweise
auf diese Beispiele beschränkt.
Hier ist zu beachten, dass die verschiedenen Arten gentechnologischer
Verfahren in den Beispielen in Übereinstimmung
mit dem in Current Protocols in Molecular Biology (herausgegeben
von Frederick M. Ausubel et al., 1987) beschriebenen Verfahren, wie
zuvor erwähnt,
durchgeführt
wurden.
-
Beispiel 1
-
[Herstellungsverfahren
einer Gesamtgenom-Shotgun-Bibliothek]
-
1. Präparation der Insertionsstelle
-
- (1) Gewinnung chromosomaler DNA Ein YPD Kulturmedium
(0,5% Hefeextrakt, 1% Pepton und 2% Glukose) wurde mit Sporen filamentöser Pilze,
RIB-40-Stamm aus Aspergillus oryzae (ATCC 42149), inokuliert und
unter Schütteln über Nacht
bei 30°C
inkubiert. Danach wurde gemäß einem
Verfahren nach Iimura (Agric. Biol. Chem. 323-328, 51 (1987)) eine genomische DNA
extrahiert. In Übereinstimmung
mit dem Verfahren nach Watson et al. (Methods Enzymol. 57-75 118
(1986)) wurde eine mit der genomischen DNA vermischte mitochondriale
DNA mittels Cäsiumchlorid-Ultrazentrifugation
aufgereinigt, um ausschließlich
eine chromosomale DNA zu erhalten.
- (2) Fragmentierung chromosomaler DNA Die erhaltene reine chromosomale
DNA wurde in eine DNA-Fragmentierungsvorrichtung
HydroShear (Tomy Digital Biology Co., Ltd.) gegeben, um die chromosomale
DNA in Fragmente von etwa 1-2 kb zu zerlegen.
- (3) Abschließende
Behandlung fragmentierter DNA Die fragmentierte chromosomale DNA
wurde mit BAL31-Nuklease (Takara Shuzo Co. Ltd.) behandelt und anschließend wurde
deren Ende mittels einer Behandlung mit einem Klenow-Fragment (Takara
Shuzo Co. Ltd.) abgestumpft.
- (4) Addition eines Adaptors an das Ende An beide Enden des abgestumpften
chromosomalen DNA-Fragments wurde unter Verwendung von T4-DNA-Ligase
(Takara Shuzo Co. Ltd.) ein Adaptor einschließend (P) 5'-CGAGAGCGGCCGCTAC-3' und (P) 5'-GTAGCGGCCGCTC-3' ligiert.
-
2. Transformation
-
Nachdem
pUC19 mit einem Restriktionsenzym Sall (Takara Shuzo Co. Ltd.) geschnitten
wurde, wurde dT unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (Roche Diagnostics
K.K.) in den mit Sall geschnittenen Teil eingefügt. Das derart hergestellte
Plasmid wurde mittels einer Behandlung mit alkalischer Phosphatase
(Takara Shuzo Co. Ltd.) dephosphoryliert und als ein Vektor verwendet.
Der Vektor und das zuvor hergestellte DNA-Fragment wurden unter
Verwendung von T4-DNA-Ligase miteinander ligiert und die Transformation
wurde mittels Elektroporation in Escherichia coli DH10B (Gibco)
durchgeführt.
-
3. Bestimmung der Basensequenz
-
Die
gesamte Länge
des Insertionsfragments der Plasmid-DNA einschließlich einer
Stelle, an der ein Sequenzierungsprimer annealt war, wurde amplifiziert,
indem ein Escherichia coli-Transformant in einem 2 × YP-Medium
bei 37°C
für 10
Stunden kultiviert wurde, um Pilze zu gewinnen, gefolgt von Hitzebehandlung
in sterilem Wasser bei 99°C
für 10
Minuten, um einen Überstand
zu erhalten; des weiteren wurde unter Verwendung des Überstands
eine PCR mit 30 Reaktionszyklen bei 98°C für 20 Sekunden und bei 68°C für 2 Minuten durchgeführt. Das
erhaltene DNA-Fragment wurde als Template für das Sanger-Verfahren verwendet,
um eine sequentielle Reaktion unter Verwendung eines PRISM Dye Terminator
Sequencing Kits (Perkin Elmer) in Übereinstimmung mit den dem
Kit beiliegenden Instruktionen durchzuführen. Das Produkt der sequentiellen Reaktion
wurde einer Gelfiltration unterzogen, um nicht abreagierten Dye-Terminator
zu entfernen, und anschließend
wurde unter Verwendung eines 3700 DNA Sequencers (Perkin Elmer)
die Basensequenz des DNA-Fragments entschlüsselt. Die wellenförmige Datenausgabe
des 3700 DNA Sequencers wurde unter Verwendung von Phred (Phil Green)
analysiert, Vektor- und Adaptorsequenzen wurden entfernt, gefolgt
von einer Assemblierung mittels SPS Phrap (Southwest Parallel Software
Inc.), um eine contig-Sequenz
der genomischen DNA-Basensequenz von Aspergillus zu konstruieren.
-
Beispiel 2
-
[Identifizierung des Gens]
-
Die
Identifizierung des Gens aus einer genomischen Basensequenz wurde
gemäß dem nachfolgenden
Verfahren durchgeführt.
In dem Verfahren zur Identifizierung von Genen wurde bezüglich der
contig-Sequenz der genomischen DNA-Basensequenz die Kombination
eines Vorhersagesystems für
Genregionen, GeneDecoder, welches auf einem Algorithmus von Kiyoshi
Asai et al. (Pacific Symposium on Biocomputing 98, 228-239) basiert,
und eines Vorhersagesystems für
Genregionen, ALN, welches auf einem Algorithmus (Bioinformatics
2000 16: 190-202) von Osamu Goto basiert, verwendet, wobei die Homologie
zwischen der Sequenzinformation über
die bereits erhaltenen ESTs und die Aminosäuresequenz-Datenbanken wohlbekannter Proteine in
Betracht gezogen wurde. Des weiteren wurde zur Vorhersage eines
tRNA-Gens ein tRNA-Scan angewandt.
-
<1> "Extraktion einer
nach BLAST in Frage kommenden homologen Genregion"
-
Es
wurde eine Region mit einer hohen Homologie zu der Aminosäuresequenz
des bekannten Proteins aus der contig-Sequenz der genomischen DNA-Basensequenz
extrahiert. Die Homologie der Aminosäuresequenz kann durch den Algorithmus
BLAST von Karlin und Altschul (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, 1990,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877, 1993) bestimmt werden.
Basierend auf diesem Algorithmus wurde ein Programm mit dem Namen
BLASTX entwickelt (Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990). Wenn
die genomische DNA-Basensequenz
in die Aminosäuresequenz
translatiert wird, kann mittels BLASTX eine Region mit einer hohen
Homologie direkt abgerufen werden. Die spezifische Technik dieser
Analyseverfahren ist wohl bekannt (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Bei dieser Technik wird dann, mittels Durchsuchen von BLASTX unter
den Bedingungen, dass die contig-Sequenz der genomischen DNA-Basensequenz
als eine Abfragesequenz verwendet wird und dass SWISSPROT Version
39 (Bairoch, A. & Apweiler,
R. Nucleic Acids Res. 28, 45-48 (2000)) und NRaa als Datenbanken
verwendet werden, eine Region mit einem E-Wert (d.h. einem Homologieindex
gemäß dem BLAST-Algorithmus) von
10–30 oder
darunter extrahiert (hier ist zu beachten, dass die Homologie hoch
ist, wenn der E-Wert gering ist). Aus diesen Regionen werden nach
BLAST in Frage kommende homologe Genregionen extrahiert, indem einem
Teil mit hoher Homologie hohe Priorität verliehen wird, so dass die
in Frage kommenden Regionen sich nicht überschneiden.
-
<2> "Extraktion der in
Frage kommenden ALN-Genregion"
-
Unter
den nach BLAST in Frage kommenden homologen Regionen wird eine Region
mit einer Homologie bezüglich
90% oder mehr der gesamten Länge
der Aminosäuresequenz
des Proteins, das ein Gegenstand der Homologie ist, zur Kernregion
gemacht und eine in Frage kommende ALN-Genregion wird extrahiert, indem
ein die Genregion vorhersagendes System ALN bezüglich der contig-Sequenz angewandt
wird. Das ALN sagt eine Genregion dadurch voraus, dass es eine Spleißstelle
identifiziert während
es die gesamte Länge
einer Aminosäuresequenz
des Proteins, das ein Gegenstand der Homologie ist, bezüglich der
contig-Sequenz ausrichtet.
-
<3> "Extraktion der in
Frage kommenden homologen GD-Genregion"
-
Von
den in nach BLAST in Frage kommenden homologen Genregionen wird
eine Region mit einer Homologie von 20% oder mehr und weniger als
90% bezüglich
der gesamten Länge
einer Aminosäuresequenz des
Proteins, das Gegenstand der Homologie ist, zur Kernregion gemacht
und eine in Frage kommende homologe GD-Genregion wird extrahiert, indem ein
die Genregion vorhersagendes System GeneDecoder bezüglich der
contig-Sequenz angewandt wird. GeneDecoder sagt eine Genregion dadurch
voraus, dass es den E-Wert aus BLASTX und die statistische Summe
von 2 Serien von Codons (Richtungsindex der das Protein kodierenden
Region) integriert und des weiteren ein Ergebnis eines positionsabhängigen primären Markov-Modells
der Spleißstelle
in Betracht zieht.
-
<4> "Extraktion einer
in Frage kommenden EST-GD-Genregion"
-
Bezüglich einer
Region, in der die Genexpression entsprechend der contig-Sequenz
durch EST dadurch bestätigt
wird, dass GeneDecoder auf die contig-Sequenz in der Nähe der Region
angewandt wird, wird nicht nur eine von der EST-Sequenz bestimmte
Region, sondern ebenfalls eine vollständige Genregion vorhergesagt.
So wird eine in Frage kommende EST-GD-Genregion erhalten.
-
<5> "Extraktion einer
in Frage kommenden allgemeinen GD-Region"
-
Bezüglich der
contig-Sequenz, die nicht in den zuvor erwähnten Punkten <1> bis <4> eingeschlossen ist,
wird eine Genregion mittels der Anwendung von GeneDecoder vorhergesagt.
-
<6> "Extraktion einer
in Frage kommenden tRNA-Genregion"
-
Mittels
der Anwendung eines tRNA-Scans auf die gesamte contig-Sequenz, wird
eine in Frage kommende tRNA-Genregion extrahiert.
-
<7> "Integration von in
Frage kommenden Genregionen"
-
Mittels
der folgenden Verfahrensweisen werden in Frage kommende Genregionen
integriert, die in den vorstehenden Punkten <2> bis <6> beschrieben wurden.
Zunächst
werden die in Frage kommenden Genregionen <2> bis <6> entfernt – eine Genregion
von der erwartet wird, dass sie Genregionen aufweist, die nicht der
durch EST bestimmten Spleißstelle
entsprechen. Die übrigen
in Frage kommenden Genregionen werden integriert, wobei die sich überschneidenden
Regionen ausgeschlossen werden. Nun werden tRNA, eine in Frage kommende
homologe ALN-Genregion, eine in Frage kommende homologe GD-Genregion,
eine in Frage kommende GD-EST-Genregion, eine in Frage kommende
allgemeine GD-Genregion integriert, wobei eine in dieser Reihenfolge
ansteigende Priorität
vergeben wird. Diese integrierten in Frage kommenden Genregionen werden
zu einem Set der zur Vorhersage verwendeten Gene gemacht.
-
Hinsichtlich
der Homologie wird durch die zuvor erwähnten Verfahrensweisen sichergestellt,
dass ein Gen, das eine Homologie über die gesamte Länge eines
wohl bekannten Proteins aufweist, ein Gen, das eine Homologie zu
einem Teil des wohl bekannten Proteins aufweist, sowie ein Gen,
das keine Homologie zu dem wohl bekannten Protein aufweist, mit
einer in dieser Reihenfolge ansteigenden Verlässlichkeit identifiziert werden.
-
Hinsichtlich
der Bestätigung
der Expression werden ein Gen, dessen Expression durch EST bestätigt ist,
und ein Gen, dessen Expression nicht durch EST bestätigt ist,
in einer dieser Reihenfolge entsprechenden Verlässlichkeit identifiziert. Des
weiteren wird sichergestellt, dass alle in Frage kommenden Gene
der durch EST identifizierten Spleißstelle entsprechen.
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Die
angewandte Technik verwendet einen Algorithmus, der kein Stopcodon
in einer ein Protein kodierenden Region enthalten darf, so dass
nur eine geringe Möglichkeit
besteht, dass ein Pseudogen als ein Gen vorhergesagt wird.
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Bezüglich der
Bestimmung von Funktionen hinsichtlich der vorhergesagten Genregion
wird die Datenbank Nraa nach BLAST auf Homologie durchsucht und
die Funktion wird mit einer ausreichenden Homologie (E-Wert: 10–30)
als einem Schwellenwert bestimmt.
-
Beisoiel 3
-
[Abrufen einer Lysyloxidase
kodierenden Sequenz]
-
Als
ein Resultat aus Beispiel 2 wurden Sequenzen mit einer bestimmten
Funktion (Funktionssequenzen) vorhergesagt und aus genomischer DNA
aus Aspergillus extrahiert. Unter diesen Funktionssequenzen wurde,
für alle
die Sequenzen, von denen erwartet wurde, dass sie Proteine enthalten,
eine vom NCBI ermöglichte
BLAST-Suche (Standard Protein-Protein
BLAST: blastp) verwendet, um eine Region abzurufen, die eine hohe
Homologie zu einem von Pichia pastoris abgeleiteten Lysyloxidasegen
aufweist. Daraus resultierend wurde die hohe Homologie zu einem
von Pichia pastoris abgeleiteten Lysyloxidasegen erfolgreich in
einer in SEQ ID NR: 24 (die Sequenz enthält eine Sequenz (SEQ ID NR:
8) wie in SEQ ID NR: 36845 in der vorhergehenden Anmeldung gezeigt)
aufgezeigten Sequenz gefunden. Daher wurden, zum Zweck der Analyse
der Funktion der Region und der Identifikation einer Aminosäuresequenz
des durch die Region kodierten Proteins, die folgenden verschiedenen
Experimente durchgeführt.
-
Beispiel 4
-
[Gewinnung chromosomaler
Gene]
-
Ein
RIB-40-Stamm aus Aspergillus oryzae wurde über Nacht bei 30°C unter Verwendung
einer Sakaguchi-Flasche enthaltend 100 ml eines Kartoffeldextrosemediums
(Difco) kultiviert. Die Mediumlösung
wurde unter Verwendung eines Buchner-Trichters und einer Nutsche-Saugflasche
filtriert, um Pilzkörper
zu erhalten. Die Pilzkörper
wurde mit 300 ml Wasser gewaschen, bei –80°C gefroren und dann gefriergetrocknet.
Daraus wurden etwa 0,3 g der erhaltenen Pilzkörper zusammen mit einem Löffel Meeressand
unter Verwendung von Mörser
und Stößel zusammen
gemahlen, gefolgt von einer Suspendierung in 8 ml TE-Lösung (10
mM Tris-HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA). Zu der Suspension wurden 4
ml wässriger
10% SDS-Lösung
hinzugegeben und es wurde kräftig
gerührt.
Dann wurde die gleiche Menge an Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol
(25:24:1)-Lösung hinzugegeben
und verrührt,
gefolgt von Zentrifugation (1500 g, 5 Minuten bei Raumtemperatur),
um einen Überstand
zu erhalten. Zu dem Überstand
wurden 100 μl
TE-Lösung
enthaltend 20 mg/ml Proteinase K (Roche Diagnostics K.K.) hinzugefügt und verrührt, gefolgt
von einer Inkubation bei 37°C
für 30
Minuten. Dann wurde wiederum die gleiche Menge an Phenol: Chloroform
Isoamylalkohol-Lösung
hinzugegeben und verrührt,
gefolgt von Zentrifugation (1500 g, 5 Minuten bei Raumtemperatur),
um einen Überstand
zu erhalten. Zu dem erhaltenen Überstand
wurde vorsichtig die gleiche Menge an Isopropanol hinzugegeben.
Nach dieser Behandlung wurde chromosomale DNA, die an der Schnittstelle
präzipitierte,
unter Verwendung einer Pasteur-Pipette aufgenommen. Die chromosomale
DNA wurde mit 70% Ethanol gewaschen und luftgetrocknet. Die so erhaltene
chromosomale DNA wurde wiederum in 3 ml TE-Lösung
aufgelöst,
zu der 100 μl
10 mg/ml RNase A (SIGMA) hinzugefügt wurden, gefolgt von Inkubation
bei 37°C
für 30
Minuten. Dann wurden 25 μl
20 mg/ml Proteinase K-Lösung
hinzugefügt
und verrührt,
gefolgt von Inkubation bei 37°C
für 30
Minuten. Dann wurde die gleich Menge an Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol
(25:24:1)-Lösung
hinzugefügt.
Nach dem Rühren
wurde eine Zentrifugation (1500 g, 5 Minuten bei Raumtemperatur)
durchgeführt,
um einen Überstand
zu erhalten. Nach zweimaliger Wiederholung dieses Waschvorgangs
wurde zu dem erhaltenen Überstand
die gleiche Menge an Chloroform Isoamylalkohol (24:1)-Lösung hinzugefügt und verrührt, gefolgt
von Zentrifugation (1500 g, 5 Minuten bei Raumtemperatur), um einen Überstand
zu erhalten. Zu dem erhaltenen Überstand
wurden 1/10-Volumen 3 M NaOAc (pH 4,8) und das doppelte Volumen
Ethanol hinzugefügt
und die Mischung wurde auf –80°C abgekühlt, um
chromosomale DNA zu präzipitieren.
Die präzipitierte
chromosomale DNA wurde mittels Zentrifugation (1500 g, 5 Minuten
bei Raumtemperatur) gesammelt. Die gesammelte chromosomale DNA wurde
mit 70% Ethanol gewaschen, im Vakuum getrocknet und abschließend in
300 μl TE-Lösung gelöst, um eine
Lösung
chromosomaler DNA mit der Konzentration von etwa 1 mg/ml zu erhalten.
-
Beispiel 5
-
[Herstellung einer Sonde
zur Koloniehybridisierung]
-
Basierend
auf der Sequenzinformation bezüglich
der contig-Sequenz der in Beispiel 1 erhaltenen genomischen DNA
aus Aspergillus wurde ein Primerpaar konstruiert, welches ein in
einem BalI-Fragment eines Restriktionsenzyms (SEQ ID NR: 24) vorliegendes
genomisches DNA-Fragment amplifiziert und einen Teil der Region
des Target-Gens (des mutmaßlichen
Lysyloxidasegens) enthält,
und zwar wie folgt.
LO-2: 5'-TAGCACCATCTACTCTGAGTGGC-3' (SEQ ID NR: 11)
LOR-2:
5'-CCTGGTCATATAGTCGTAGTTGC-3' (SEQ ID NR: 12)
-
Unter
Verwendung dieses Primerpaars wurde eine PCR durchgeführt. Hier
ist zu beachten, dass die Zusammensetzung der Reaktionslösung wie
folgt war.
steriles Wasser: 36,75 μl
10 × Puffer für Pyrobest® DNA-Polymerase:
5 μl
2,5
mM dNTP-Lösung:
4 μl
10
pmol/μl
LO-2: 1 μl
10
pmol/μl
LOR-2: 1 μl
60
ng/μl RIB40
chromosomale DNA: 2 μl
5
U/μl Pyrobest® DNA-Polymerase
(Takara Shuzo Co. Ltd.): 0,25 μl/50 μl
-
In
die zuvor erwähnte
Reaktionslösung
wurden 50 μl
Mineralöl
hinzugetropft und es wurde unter Verwendung des GeneAmpTM PCR-Systems
PJ9600 (PE Bio Systems) eine PCR unter den folgenden Bedingungen
durchgeführt.
-
(1)
Reaktion bei 94°C
für 1 Minute,
(2) 30 Reaktionszyklen bei 94°C
für 30
Sekunden, bei 50°C
für 30 Sekunden
und bei 72°C
für 2 Minuten,
und (3) Stehenlassen bei 4°C.
-
Als
Resultat der PCR wurden etwa 900 bp des DNA-Fragments spezifisch
amplifiziert und das amplifizierte DNA-Fragment wurde nach der Durchführung einer
Agarose-Gelelektrophorese
unter Verwendung von GeneClean III (BIO 101) extrahiert. Das extrahierte
DNA-Fragment wurde in pUC 19 subkloniert und das eingefügte DNA-Fragment wurde mit
DIG High Prime (Roche Diagnostics K.K.) DIG-markiert, um eine Sonde
des mutmaßlichen
Lysyloxidasegens zu erhalten.
-
Beispiel 6
-
[Koloniehybridisierung]
-
40 μg der in
Beispiel 4 erhaltenen chromosomalen DNA wurden bei 37°C unter Verwendung
von 50 U Restriktionsenzym BalI (Takara Shuzo Co. Ltd.) vollständig verdaut.
Dann wurde ein DNA-Fragment mit einer Kettenlänge von 9,1 kbp mittels Agarose-Gelelektrophorese
ausgeschnitten und anschließend
unter Verwendung von GeneClean III (BIO 101) extrahiert, um so ein
Insert zur Herstellung einer Bibliothek zu produzieren. Nachdem
pUC 19 unter Verwendung von 80 U Smal (Takara Shuzo Co. Ltd.) vollständig verdaut
war (Inkubation bei 30°C
für eine
Nacht), folgte eine Dephosphorylierung unter Verwendung von alkalischer
Phosphatase (Takara Shuzo Co. Ltd.), um so einen Vektor zu Herstellung
einer Bibliothek zu produzieren. Die so hergestellte Insert-DNA
und die Vektor-DNA wurden unter Verwendung des Ligation Kit Ver.
2 (Takara Shuzo Co. Ltd.) miteinander ligiert, welches dazu verwendet
wurde, kompetente Zellen des DHS-Stamms aus Escherichia coli (TOYOBO)
zu transformieren. Es wurden gegen Ampicillin resistente Transformationsstämme inokuliert,
so dass etwa 200 Kolonien für
ein Sheet einer LA-Platte (Ampicillin (SIGMA) 100 μg/ml) gebildet
wurden, die dann bei 37°C
für eine
Nacht inkubiert wurden, um Kolonien zu züchten. Die gezüchteten
Kolonien (Gesamtanzahl etwa 4.000) wurden auf Nylonmembranen zur
Kolonie- und Plaquehybridisierung (Roche Diagnostics K.K.) aufgebracht
und DNA wurde auf einer Membran immobilisiert. Unter Verwendung
der in Beispiel 5 hergestellten Sonde wurde eine Koloniehybridisierung
derart durchgeführt,
dass Kolonien, die ein starkes Signal zeigten, unter Verwendung
des DIG Nukleinsäure-Detektionskits
(Roche Diagnostics K.K.) detektiert wurden. Als Resultat der Koloniehybridisierung
wurde ein Plasmid, das von dem ausgewählten Klon getragen wurde,
als pULO bezeichnet und enthielt das mutmaßliche Lysyloxidasegen. Hier
ist zu beachten, dass jeder der zuvor erwähnten Arbeitsschritte in Übereinstimmung
mit dem Protokoll durchgeführt
wurde, das dem Reagens oder dem Kit beilag.
-
Beispiel 7
-
[Analyse der Basensequenz
eines das mutmaßliche
Lysyloxidasegen enthaltenden Klons]
-
Basierend
auf den Informationen einer Sequenz (SEQ ID NR: 24: BalI-Fragment
(die Sequenz schließt eine
mutmaßliche
Promotorregion und eine mutmaßliche
Terminatorregion ein)), einschließend eine Region, von der erwartet
wird, dass sie Lysyloxidase kodiert, welche in den Beispielen 1
bis 3 erläutert
wurden, wurden die folgenden 10 Arten von synthetischen Primern
hergestellt. Unter deren Verwendung wurde eine Basensequenz des
Inserts des Klons pULO bestimmt. Es wurden für die Sequenzreaktion das BigDyeTM
Terminator Cycle Sequencing FS Ready Kit Ver. 2 (Applied Biosystems)
und für
die Analyse der ABI PRISM 310 Sequencer (Applied Biosystems) verwendet.
L-1:5'-GCTAGCTTATACTAACCC-3' (SEQ ID NR: 13)
L-2:5'-GACTATGTTCTCGTGCGC-3' (SEQ ID NR: 14)
L-3:5'-TCTTTGCATTTGTCCAGG-3' (SEQ ID NR: 15)
L-4:5'-TCTGCGTCGTTGGACAAC-3' (SEQ ID NR: 16)
L-5:5'-GACTGACCCTCATTATGC-3' (SEQ ID NR: 17)
L-6:5'-AACACCGAGGGACCATGG-3' (SEQ ID NR: 18)
L-7:5'-TACCTCACCCTCCGATCC-3' (SEQ ID NR: 19)
L-8:5'-GGGACAGCACACCTGACG-3' (SEQ ID NR: 20)
L-9:5'-AACCCGAATGATCCGTAC-3' (SEQ ID NR: 21)
L-10:5'-AGAGAATAATCGAAATGG-3' (SEQ ID NR: 22)
-
Ein
Teil der bestimmten Basensequenz war vollkommen identisch mit einer
in SEQ ID NR: 8 dargestellten Sequenz (einer Sequenz einschließend ein
Strukturgen der mutmaßlichen
Lysyloxidase ebenso wie einen Promotor und einen Terminator). Es
wurde daher gefunden, dass das Plasmid pULO ein DNA-Fragment aufwies,
das die in SEQ ID NR: 8 dargestellte Sequenz (eine Sequenz einschließend einen
mutmaßlichen
Promotor, ein mutmaßliches
Strukturgen und einen mutmaßlichen
Terminator) perfekt abdeckte.
-
Beispiel 8
-
[Konstruktion des Expressionsvektors
pBALO]
-
Als
nächstes
wurden 3 μg
pULO mit einem Restriktionsenzym BglII (Takara Shuzo Co. Ltd.) verdaut, um
ein DNA-Fragment von etwa 7,0 kbp zu erhalten (SEQ ID NR: 10; nachfolgend
wird dieses Fragment als "mutmaßliches
Lysyloxidase-DNA-Fragment" bezeichnet
werden). Das Ende des erhaltenen DNA-Fragments wurde mittels T4
DNA Polymerase (Takara Shuzo Co. Ltd.) abgestumpft, um es zu einer
Insert-DNA zu machen. Auf der anderen Seite wurden 7,5 μg des Expressionsvektors
pBAR, in den das von Aspergillus nidulans abgeleitete ArgB-Gen in die SalI-XhoI-Stelle
von pBluescript II KS (+) eingeführt
worden war, unter Verwendung von 80 U Smal (Takara Shuzo Co. Ltd.)
vollständig
verdaut (Inkubation bei 30°C
für eine
Nacht). Danach wurde mittels alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo
Co. Ltd.), die Dephosphorylierung durchgeführt, um eine Vektor-DNA herzustellen.
Die Insert-DNA und die Vektor-DNA, welche wie zuvor erwähnt hergestellt
wurden, wurden unter Verwendung des Ligation Kit Ver. 2 (Takara
Shuzo Co. Ltd.) miteinander ligiert, wodurch kompetente Zellen des
DHS-Stamms aus Escherichia coli (TOYOBO) transformiert wurden, um
einen gegen Ampicillin resistenten Transformanten zu erhalten. Das
von dem erhaltenen Klon getragene Plasmid wurde als pBALO bezeichnet
und als Expressionsvektor verwendet (siehe 1).
-
Beispiel 9
-
[Transformation von Aspergillus
nidulans]
-
Der
auxotroph mutierte ABPU1-Stamm aus Aspergillus nidulans (ein Stamm
von Aspergillus nidulans, dem das Gen für Ornithin-Carbamoyltransferase
fehlt) wurde bei 37°C
für eine
Nacht unter den folgenden Bedingungen hinsichtlich des Mediums kultiviert.
-
<Komplettmedium>
-
- Malzextrakt: 20 g
- Glukose: 20 g
- Bactopepton: 1 g
- Uridin: 2 g
- p-Amino Benzoesäure:
2,5 mg
- Riboflavin: 2,5 mg
- Pyridoxin: 2,5 mg
- Biotin: 2,5 mg
- Argininhydrochlorid: 0,55 g/L (pH 6,5)
-
Es
wurden Pilzkörper,
die durch Kultivierung unter den zuvor erwähnten Bedingungen aus 200 ml
des Kulturmediums erhalten wurden und dann unter Verwendung eines
Glasfilters (100 μm)
gewonnen wurden, in einer fertigen Protoplastenlösung mit der folgenden Zusammensetzung
suspendiert.
steriles MilliQ-Wasser: 37 ml
Natriumchlorid:
1,9 g
0,4 M Natriumphosphatlösung (pH 5,8): 1 ml
1
M wässrige
Kalziumchloridlösung:
0,8 ml
Novozyme 234 (NOVO NORDISK): 150 mg/40 ml
(aseptische
Filtration mittels Zellulosenitratfilter (0,45 μm))
-
Die
oben erwähnte
Suspension wurde zur Protoplastierung bei 30°C und 78 rpm für eine Stunde
behandelt. Die erhaltene Protoplastensuspension wurde mittels eines
Nylonfilters (230 Mesh) filtriert und das Filtrat wurde zentrifugiert
(400 g, 5 Minuten bei Raumtemperatur), um die Protoplasten zu erhalten.
Es wurden 10 ml der Protoplasten mit 0,8 M NaCl gewaschen und dann
zentrifugiert (400 g, 5 Minuten bei Raumtemperatur), um Präzipitate
der Protoplasten zu erhalten. Das erhaltene Protoplastenpräzipitat
wurde in 200 μl
0,8 M NaCl-50 mM CaCl2 suspendiert, um eine
Protoplastenlösung
zu erhalten. Die Protoplastenkonzentration wurde mittels Beobachtung
durch ein Mikroskop berechnet. Unter Verwendung der auf 2 × 108/ml verdünnten
Protoplastensuspension wurde die Transformation gemäß der folgenden
Verfahrensweise durchgeführt.
Es wurden 5 μl
pBALO-Lösung (3 μg/μl) hinzugefügt und in
50 μl Protoplastensuspension
suspendiert; dann wurden 12,5 μl
PEG-Lösung
(25% PEG 6000, 50 mM CaCl2 und 10 mM Tris-HCl
(pH 7,5)) hinzugegeben, weiter suspendiert und für 20 Minuten in Eis stehen
gelassen. Dann wurden 500 μl
PEG-Lösung
(25% PEG 6000, 50 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl
(pH 7,5)) hinzugegeben, wiederum suspendiert und für 5 Minuten
in Eis stehen gelassen. Abschließend wurde 1 ml 0,8 M NaCl-50
mM CaCl2 hinzugegeben und suspendiert. Es
wurden 0,5 ml der Suspensionslösung
in eine Schale gegeben und es wurde dann das nachfolgende regenerierte
Medium dazugegeben, um das Gemisch zu einer Platte zu verfestigen.
Es wurde bei 37°C
für 3-4
Tage inkubiert und ein einzelner Pilz wurde in dem nachfolgend erwähnten Minimalmedium
isoliert, um einen Transformantenstamm zu erhalten, in den ein mutmaßliches
Lysyloxidase-DNA-Fragment eingeführt
worden war.
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<Regeneriertes Medium>
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- Natriumnitrat: 6 g
- Kaliumphosphat: 1,52 g
- Kaliumchlorid: 0,52 g
- Sorbitol: 218,6 g
- Uridin: 2,0 g
- p-Amino Benzoesäure:
2,5 mg
- Riboflavin: 2,5 mg
- Pyridoxin: 2,5 mg
- Biotin: 2,5 mg
- Agar: 20 g/L (pH 6,5)
- (nach der Sterilisation wurden die folgenden Substanzen hinzugegeben
(121°C,
20 Minuten))
- 50% Glukose: 20 ml
- 5,2% Magnesiumsulfat-7-hydrat: 10 ml
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<Minimalmedium>
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- Natriumnitrat: 0,85 g
- Kaliumphosphat: 1,525 g
- Kaliumchlorid: 0,525 g
- Spurenelement: 1,5 ml
- Uridin: 2 g
- p-Amino Benzoesäure:
2,5 mg
- Riboflavin: 2,5 mg
- Pyridoxin: 2,5 mg
- Biotin: 2,5 mg
- Agar: 15 g/L (pH 6,5)
- (nach der Sterilisation wurden die folgenden Substanzen hinzugegeben
(121°C,
20 Minuten))
- 50% Glukose: 20 ml
- 5,2% Magnesiumsulfat-7-hydrat: 10 ml
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<Spurenelement>
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- 4-Natriumborat-10-hydrat: 40 mg
- Kupfersulfat-5-hydrat: 0,4 g
- Eisensulfat-7-hydrat: 1,6 g
- Mangansulfat-4-hydrat: 0,8 g
- Natriummolybdat-2-hydrat: 0,8 g
- Zinksulfat-7-hydrat: 8 g/L
-
Beispiel 10
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[Kultivierung des Transformanten]
-
Der
Transformant wurde unter Schütteln
für 3 Tage
bei 30°C
unter den folgenden Bedingungen kultiviert.
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<SPY-Medium + Vitamine>
-
- Stärke:
30 g
- Polypepton: 10 g
- Hefeextrakt: 5 g
- Kaliumchlorid: 2 g
- Kaliumphosphat: 1 g
- Reste aus alkoholischer Fermentation: 0,1 g
- Uridin: 2 g
- p-Amino Benzoesäure:
2,5 mg
- Riboflavin: 2,5 mg
- Pyridoxin: 2,5 mg
- Biotin: 2,5 mg
- (nach der Sterilisation wurden die folgenden Substanzen hinzugegeben
(121°C,
20 Minuten))
- 5,2% Magnesiumsulfat-7-hydrat: 10 ml/L (pH 6,5)
-
Das
unter den zuvor erwähnten
Bedingungen kultivierte Kulturmedium (10 ml) wurde zentrifugiert (2.400
g, 10 Minuten, 4°C),
um einen Kulturüberstand
zu erhalten.
-
Beispiel 11
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[Messung der enzymatischen
Aktivität
von Lysyloxidase]
-
Unter
Verwendung eines jeden der erhaltenen Kulturüberstände wurde in Übereinstimmung
mit den folgenden Verfahrensweisen die Lysyloxidaseaktivität gemessen.
Als Kontrolle wurde ein durch ähnliche
Kultivierung erhaltener ABPU1-Stamm aus Aspergillus nidulans verwendet,
der nicht transformiert worden war, und zwar in einem Medium, das
erhalten wurde, indem Argininhydrochlorid zu dem oben erwähnten Medium bis
zu einer Konzentration von 0,55 g/L hinzugegeben wurde.
-
Die
Lysyloxidaseaktivität
wurde aus der hergestellten Menge an Dimer berechnet, welches durch
die Polymerisation von Allicin und Lysin erzeugt wurde, welche erzeugt
wurden, nachdem das Substrat Lysin durch Lysyloxidase oxidiert worden
war. Die Menge an Lysin-Dimer
wurde unter Verwendung von LC-MS (Agilent) gemessen.
-
Es
wurde zunächst
unter Verwendung eines jeden Kulturüberstands (Rohenzymprobe) die
folgende Reaktionslösung
hergestellt.
0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0): 235 μl
1,0
M wässrige
Lysinhydrochloridlösung:
60 μl
Kulturüberstand:
6 μl
gesamt:
301 μl
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Jede
der Reaktionslösungen
wurde bei 37°C
inkubiert und es wurden jeweils nach 1, 2, 4, 8 und 24 Stunden aus
jeder Lösung
30 1 als Probe entnommen. Die Probe der Reaktionslösung wurde
für 15
Minuten einer Hitzebehandlung bei 100°C unterworfen und die Reaktion
wurde gestoppt. Dann wurde eine LC mobile Phase verwendet, um eine
10-fache Verdünnung
zu erreichen und es wurde eine zu messende Probe erhalten. Hier
ist zu beachten, dass eine Probe, welche unter Verwendung eines
Kulturüberstands
erhalten wurde, in welchem das Enzym zuvor mittels einer Hitzebehandlung
für 15
Minuten bei 100°C
inaktiviert worden war, als Kontrolle verwendet wurde.
-
Zur
Messung der Menge an Lysin-Dimer in jeder gemessenen Probe wurde
das Agilent 1100 Series LC/MSD System (Agilent) verwendet. Als Trennsäule wurde
Supelco ABZ plus (Spelco) verwendet. Ein Wert, der durch Subtraktion
eines Kontrollprobenwerts von einem Spitzenbereichswert des Verhältnisses
von Masse zu Ladung (m/Z) 275 erhalten und als ein Spitzenwert des
Lysin-Dimers im positiven Bereich nachgewiesen wurde, wurde zu einem
Messwert einer jeden Probe gemacht.
-
Unter
Verwendung des Kulturüberstands
des Transformanten wurde in manchen Proben als ein Resultat der
Messung gefunden, dass der Messwert proportional zum Zeitabschnitt
der Reaktion angestiegen war. Das heißt es wurde gefunden, dass
die Menge an Lysin-Dimer proportional zur Reaktionszeit angestiegen war.
Die Messergebnisse unter Verwendung von gemessenen Proben, deren
Zeitabschnitt der Reaktion 24 Stunden betrug, sind in der Tabelle
und dem Diagramm in 2 gezeigt. Hier ist zu beachten,
dass lediglich das Ergebnis der Probe, deren Menge an Lysin-Dimer
als erhöht
bestätigt
wurde, zur Darstellung ausgewählt wurde.
Wie aus der Tabelle und dem Diagramm hervorgeht, wurde in den Proben,
in denen jeweils der Kulturüberstand
des Transformanten LO-3, 10, 17, 26 und 48 verwendet wurde, eine
Aktivität
von nicht weniger als dem 6-fachen der Aktivität der Kontrolle (ABPU1-Stamm) gezeigt. Es
wurde somit bestätigt,
dass diese Transformanten ein Lysyloxidasegen enthielten.
-
Die
oben aufgeführten
Ergebnisse zeigten, dass ein mutmaßliches Lysyloxidase-DNA-Fragment, welches
zur Herstellung des Transformanten verwendet wurde, eine Lysyloxidase
kodierende Region enthielt.
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Beispiel 12
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[Bestimmung der Transkriptionsterminationsstelle
des Gens]
-
Der
RIB-40-Stamm aus Aspergillus oryzae und der Transformant LO-3 (Aspergillus
nidulans ABPU1), welcher in obiger Aktivitätsmessung die maximale Lysyloxidaseaktivität aufwies,
wurden in der gleichen Weise wie in Beispiel 10 kultiviert, um Pilzkörper herzustellen.
-
Mittels
des Reagens Trisol (GIBCO BRL) wurden alle RNAs aus den erhaltenen
Pilzkörpern
extrahiert. Unter Verwendung der RNAs als Templates wurde ein 3'-DNA-Fragment unter
Verwendung des 3'-Full
RACE Core Set (Takara Shuzo Co. Ltd) amplifiziert. Die spezifische
Sequenz in einem synthetischen Primer, der aus der Information des
zu verwendenden Lysyloxidasegenoms konstruiert wurde, ist nachfolgend
gezeigt.
LO-3':
5'-TGGCTGAACCTGGGGATGCACCAC-3' (SEQ ID NR: 23)
-
Als
ein Resultat der Analyse der Basensequenz des amplifizierten DNA-Fragments
erwies sich die Basensequenz (SEQ ID NR: 9) des DNA-Fragments als
identisch mit einem Teil der Basensequenz einer Region, von der
erwartet wurde, dass sie ein Strukturgen der ursprünglichen
Lysyloxidase in den Beispielen 1 bis 3 war, und die eine Poly-A-Sequenz
aufwies. Aufgrund dieser Fakten wurde gefunden, dass es sich bei
dem DNA-Fragment um ein DNA-Fragment handelte, welches das 3'-Ende des mutmaßlichen
Lysyloxidase-Strukturgens
aufwies.
-
Somit
war die Transkriptionsterminationsstelle des mutmaßlichen
Lysyloxidase-Strukturgens lokalisiert und es wurde gefunden, dass
dieser an dem 3'-Ende
positioniert war. Somit war die Transkriptionsterminationsstelle
eines Strukturgens der mutmaßlichen
Lysyloxidase bestimmt und es stellte sich heraus, dass dieser näher als
erwartet an dem 3'-Ende
positioniert war. Das heißt,
es wurde aufgrund der zuvor erwähnten
Resultate gefunden, dass sich die Sequenz eines gemäß der zuvor
erwähnten
Resultate erhaltenen Strukturgens hinsichtlich der 3'-Endregion von der ursprünglich als
ein Strukturgen identifizierten Sequenz unterschied. Hier ist zu
beachten, dass das auf der Basis der zuvor erwähnten Resultate neu identifizierte
Strukturgen sowie eine Aminosäuresequenz
davon jeweils in SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 2 gezeigt sind.
-
Beispiel 13
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[Konstruktion eines Expressionsvektors,
der eine Insert-DNA trägt,
die eine Deletion in der 3'-Endregion
aufweist]
-
Ausgehend
von dem Resultat aus Beispiel 12 wurde bestimmt, dass eine Insert-DNA
von etwa 7,0 kbp, welche in den Expressionsvektor pBALO eingeführt worden
war, eine Region aufwies, die für
die Lysyloxidaseaktivität
in deren 3'-Region
nicht notwendig ist. Um eine für
die Lysyloxidaseaktivität
notwendige Region einzugrenzen, wurde dann eine Insert-DNA verwendet,
in der ein Teil des 3'-Endes
der Insert-DNA deletiert war (nachfolgend als "deletierte Insert-DNA" bezeichnet). Es
wurden 3 μg
pBALO mit den Restriktionsenzymen AccIII und AflII (Takara Shuzo
Co. Ltd) verdaut und aufgeteilt in eine Region von etwa 2,2 kbp
an der 3'-Endregion,
von der angenommen wurde, dass sie für die Expression nicht notwendig
ist, und in ein Vektorfragment von etwa 9,4 kbp, welches eine Deletions-Insert-DNA enthielt. Dann
wurde nur das Vektorfragment extrahiert und dessen Ende wurde mit
T4 DNA-Polymerase (Takara Shuzo Co. Ltd) abgestumpft, gefolgt von
Selbstligation unter Verwendung des Ligation Kit Ver. 2 (Takara
Shuzo Co. Ltd). Unter Verwendung des somit erhaltenen Expressionsvektors
wurde der DHS-Stamm aus Escherichia coli (TOYOBO) transferiert und
es wurde ein gegen Ampicillin resistenter Transformant ausgewählt. Ein
Plasmid, welches den ausgewählten
Klon trug, wurde als pBALO-D bezeichnet und als neuer Expressionsvektor
für das
folgende Experiment verwendet (siehe 4).
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Beispiel
14 [Erhalt eines Transformanten und Messung der Lysyloxidaseaktivität] Die Messung
der Lysyloxidaseaktivität
des Transformanten, in welchen pBALO-D mittels der gleichen Verfahrensweisen
wie in den Beispielen 9 bis 11 eingeführt wurde. 5 zeigt
die Messergebnisse für
die Fälle,
in denen Messproben mit einer Reaktionszeit von 8 Stunden verwendet
wurden. Hier ist zu beachten, dass nur die Ergebnisse der Proben,
deren Menge an Lysin-Dimer als erhöht bestätigt wurde, zur Darstellung
ausgewählt
wurden. Wie aus der Tabelle und dem Diagramm ersichtlich ist, ähnlich den
Ergebnissen in Beispiel 11, wurden die Transformanten LOD-9, 16
erhalten, welche eine Aktivität
aufwiesen, die nicht weniger als das 5-fache der Aktivität der Kontrolle
(ABPU1-Stamm) betrug. Aufgrund dieser Resultate wurde bestätigt, dass
pBALO-D ein Lysyloxidasegen trug, welches zur Expression in der
Lage war. Daher wurde gefunden, dass eine von pBALO-D getragene
Deletions-Insert-DNA
(SEQ ID NR: 1) eine Sequenz aufwies, die notwendig zur Expression
des Lysyloxidasegens war. Wie zuvor erwähnt, wurde des weiteren eine
minimale zur Expression des Lysyloxidasegens notwendige Region mittels
dieses Beispiels identifiziert.
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Die
vorliegende Erfindung ist nicht auf die zuvor erwähnten Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung und Beschreibungen der Beispiele beschränkt. Die
vorliegende Erfindung schließt
ebenfalls Variationen ein, die im Rahmen der nachfolgenden Ansprüche liegen
und die vom Fachmann ohne weiteres durchgeführt werden können.
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INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine von filamentösen
Pilzen abgeleitete Lysyloxidase sowie eine diese kodierende DNA
bereitgestellt. Durch der Verwendung der DNA gemäß der vorliegenden Erfindung, wird
ein Herstellungssystem für
Lysyloxidase unter Verwendung filamentöser Pilze bereitgestellt, das
eine hohe Sicherheit bietet.
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