WO2003056016A1

WO2003056016A1 - Lysyle oxydases d'origine fongique

Info

Publication number: WO2003056016A1
Application number: PCT/JP2002/013559
Authority: WO
Inventors: Kensuke Yuuki; Atsuki Toumoto; Masayuki Machida; Keietsu Abe; Katsuya Gomi; Kiyoshi Asai; Motoaki Sano; Taishin Kin; Hideki Nagasaki; Akira Hosoyama; Osamu Akita; Naotake Ogasawara; Satoru Kuhara
Original assignee: National Institue Of Advanced Industrial Science And Technology; National Institute Of Technology And Evalution; National Research Institute Of Brewing
Priority date: 2001-12-27
Filing date: 2002-12-25
Publication date: 2003-07-10
Also published as: WO2003056018A1; CN1622998A; DK1466979T3; DE60217549D1; DE60217549T2; US20050142650A1; AU2002361098A1; US7186540B2; US20040082053A1; EP1466982A4; EP1466979A4; AU2002367111A1; JP4205589B2; EP1466982A1; JPWO2003056018A1; EP1466979B1; EP1466979A1; CN1617927A; JPWO2003056016A1; CN1622998B

Description

明細書糸状菌由来リシル才キシダーゼ技術分野

本発明は糸状菌由来のリシルォキシダーゼ及びそれをコードする D N A、並びにそれらの利用に関する。背景技術

糸状菌の中でも、特にァスペルギウス '才リゼ（キコウジ菌）等を含む麹菌は、清酒、みそ、醤油、及び、みりん等を製造する、わが国における醸造産業において古くから利用され、直接に食されてきた菌類であり、米国の F D A (食品医薬局）により G R A S (General ly Recognized as Safe) にリス卜アップされている安全な遺伝子源である。

従って、通常の菌由来の遺伝子を食品などに利用する際に必要な慢性毒性検査等の安全審査において、通常の菌由来の遺伝子の場合には約 1 0億円要するのに対して、上記の G R A Sグレードである遺伝子の場合にはその約 3分の 1 程度の経費で済むし、更に、該審査に要する時間もより短いというメリツ卜がある。このように、糸状菌、特に麴菌は、安全性及び経済性の点から極めて利用価値の高い遺伝子の宝庫と言える。本発明に関連する技術が以下の文献に開示される。特許第 2 7 9 6 1 1 4号公報（特許文献 1 ) 及び特許第 2 9 7 7 2 4 5号公報 (特許文献 2 ) 発明の開示

従って、これら菌のゲノム D N A情報を明らかにし、それにコードされる遺伝子等の機能を明らかにすることによって、バイオテクノロジ一を利用した物質生産等のような、食品産業において安全な遺伝子資源の有効な活用法を提供するとともに、農薬及び医薬分野における各種遺伝子スクリ一二ングの為の有用な情報を提供することが出来る。

更に、近縁種であるァスペルギルス ' フラバス（Aspergi I lus f lavus) 、ァスぺルギルス ·フミガタス（Aspergi I lus f um ί ga t us)等のように穀物汚染菌、ヒ卜感染菌のゲノム情報を解析する有用なツールともなり得るものである。

以上の課題に鑑み検討を行った結果、本発明者らは麹菌の一種であるァスペルギルス ·才リゼのゲノムを解析することに成功し、それらの塩基配列（及びそれがコードするアミノ酸配列）及び各種機能等を決定した。かかる成果に基づいて、先の出願（特願 2 0 0 1 — 4 0 3 2 6 1 ) においてァスペルギウス · 才リゼ由来の各種 D N A、並びに、これらの D N Aから調製されるヌクレオチド配列からなる G R A Sグレードの糸状菌遺伝子の増幅用プライマーセッ卜及び糸状菌遺伝子検出用プローブ等を開示した。

本発明者らは得られた麹菌ゲノム情報を基に更なる検討を行った。即ち、リシル才キシダーゼに注目し、得られた塩基配列の中からリシル才キシダ一ゼをコ一ドする配列を特定し、またその配列によってコ一ドされるタンパク質のアミノ酸配列を同定することを試みた。尚、リシルォキシダーゼはァミン才キシダーゼの —種であり、タンパク中のリジン残基を酸化することによりリジン残基同士を架橋させる作用を持つ。動物由来のリシルォキシダーゼについては古くからその存在が知られており、かかるリシルォキシダーゼは、蛋白質を架橋させることによる食感の向上などに応用もされてきた（例えば上記の特許文献 1 及び 2を参照）。近年になって微生物由来のリシル才キシダーゼについての研究がなされ、酵母の —種であるピキア ·パストリス (Pichia Pastoris から哺乳動物由来のものと類似した基質特異性を有するリシル才キシダーゼが発見された（FEBS Lett. 1988 238, 74- 76)。このピキア由来のリシル才キシダーゼは哺乳類由来のものと性質が似ているだけではなく、細菌類であるエスケリチア ■ コリ (Escherichia col i)、ァルスロパクター ' グロビホルミス (Arthrobacter globけ ormis) 等のアミン才キシダーゼと類似した構造をとっていることが判明している（J Inorg Biochem. 2001 83 (2- 3) :193- 204)。しかし、酵母と同じく高等微生物である糸状菌からのリシル才キシダ一ゼの単離に成功したという報告はこれまでになかった。

鋭意検討した結果、本発明者らは既報のピキア ·パス卜リス (Pichia Pastoris) 由来リシルォキシダーゼ遺伝子と相同性の高い配列を麹菌ゲノム内に見出すことに成功した。そして、糸状菌を宿主として当該配列がコードするタンパク質を発現させたところリシル才キシダーゼ活性を示した。この結果から当該配列がリシル才キシダーゼをコードすることが実験的に確認された。一方で当該配列におけるコード領域の特定に成功し、当該配列がコードするタンパク質が新規なァミノ酸配列を有することを見出した。このように、本発明者らは糸状菌由来のリシルォキシダーゼ遺伝子及びそのアミノ酸配列の同定に初めて成功した。

本発明は以上の成果に基づき完成されたものであり、本発明における具体的な課題は糸状菌由来のリシル才キシダーゼ及びそれをコードする D N A、並びに当該糸状菌由来リシル才キシダーゼの生産方法等を提供することである。かかる課題を解決すべく、以下の構成が提供される。

[1 ] 以下の（a)又は（b)のタンパク質からなるリシル才キシダーゼ：

(a)配列番号 2で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質；

(b)配列番号 2で示されるァミノ酸配列の一部を改変したァミノ酸配列を有し、リシル才キシダーゼとして機能するタンパク質。

[2] 以下の（A)又は（B)の DNA：

(A) [1 ]に記載のリシル才キシダ一ゼをコ一ドする DNA；

(B) (A) の DNAとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、それがコードするタンパク質がリシルォキシダーゼとして機能する DNA。

[3 ] 以下の（i)~(i i i)のいずれかの配列を有する DNA：

(ί)配列番号 3で示される塩基配列；

(i i)配列番号 4で示される塩基配列；

(i i i)配列番号 5で示される塩基配列；

(iv)配列番号 6で示される塩基配列；

(V)配列番号 1 で示される塩基配列；

(νί)配列番号 7で示される塩基配列。

[4 ] [2 ]又は [3 ]に記載の DNAを保持するベクター。

[5 ] [2 ]又は [3 ]に記載の DNAが外来的に導入されている糸状菌。

[6] 以下の（1)及び（2)のステップを含む、リシルォキシダーゼの生産方法：

(1) [5 ]に記載の糸状菌を、前記 DNAのコードするタンパク質が産生可能な条件で培養するステップ；及び

(2)産生されたタンパク質を回収するステップ。本発明における「DNA」は 2本鎖 DNAに限らず、それを構成する 1本鎖 DNA (センス鎖及びアンチセンス鎖）を含む意味で用いられる。また、本発明の DMAにはコドンの縮重を考慮した任意の塩基配列を有する DNAが包含される。さらにはその形態も限定されず、 cDMA、ゲノム DNA、合成 DNAが含有される。

本発明において「タンパク質をコードする DNAJとは、それを発現させた場合に当該タンパク質が得られる DMAのことをいい、当該タンパク質のアミノ酸配列に対応する塩基配列を有する DMAは勿論のこと、そのような DNAにアミノ酸配列をコードしない配列が付加されてなる DNA (例えば 1 又は複数個のイン卜ロンを含む DNA) をも含む。

本発明における「糸状菌由来リシルォキシダーゼ」とは、糸状菌を出発材料として調製されたリシル才キシダ一ゼ、或はそれを取得する過程において糸状菌が保有するリシルォキシダーゼの情報（アミノ酸配列や DNA配列）を利用して調製されたリシルォキシダーゼのことをいい、糸状菌から物理的手法や生化学的手法等を用いて調製されたリシル才キシダ一ゼは勿論のこと、本発明において開示されるリシル才キシダーゼのアミノ酸配列又は D N A配列を利用した遺伝子工学的手法などを用いて調製されたリシルォキシダーゼを含む。図面の簡単な説明

図 1 は、ベクター PBALOの構築手順を模式的に示した図である。

図 2は、ベクター pBALO で形質転換した糸状菌を用いたリシルォキシダーゼ活性測定の結果をまとめた表（上段）及びグラフ（下段）である。 AB PU 1 はコントロール（ァスペルギルス 'ニドランス AB PU 1株の培養上清を用いたサンプル）を表す。

図 3は、リシルォキシダーゼ遺伝子を保持する形質転換体から抽出した RNAを錶型とし、当該遺伝子に特異的なプライマーを用いて増幅した 3 ' DNA断片の配列である。下線部は使用したプライマー（L0- 3 ' ) の位置を示す。

図 4は、ベクター pBALO- Dの搆築手順を模式的に示した図である。

図 5は、ベクター pBALO-D で形質転換した糸状菌を用いたリシルォキシダーゼ活性測定の結果をまとめた表（上段）及びグラフ（下段）である。 AB PU 1 はコン卜ロール（ァスペルギルス ·二ドランス ABPU 1株の培養上清を用いたサンプル）を表す。発明を実施するための最良の形態

(夕ンパク質）

本発明の第 1 の局面は糸状菌に由来するリシルォキシダ一ゼに関する。本発明で提供されるリシル才キシダ一ゼは例えば配列番号 2のアミノ酸配列を有する夕ンパク質からなる。後述の実施例で示されるように、当該タンパク質については糸状菌を用いた発現系において実際にリシル才キシダーゼ活性を示すことが確認されている。

ここで、一般に、あるタンパク質のアミノ酸配列の一部に改変を施した場合において、改変後のタンパク質が改変前のタンパク質と同等の機能を有することがある。即ちアミノ酸配列の改変がタンパク質の機能に対して実質的な影響を与えず、タンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。このことを考慮して、上述のリシル才キシダーゼ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列（配列番号 2 )の一部を改変して得られるアミノ酸配列を有するタンパク質（以下、「改変タンパク質」ともいう）であっても、リシル才キシダーゼとしての機能を有する限リにおいて本発明のリシル才キシダーゼ（タンパク質）を構成することができる。換言すればリシル才キシダーゼとしての機能が維持される限りにおいて一部のアミノ酸の改変が許容される。尚、改変の前後においてリシル才キシダーゼ活性が低下しないことが好ましいが、多少の変動（上昇又は低下）があってもよい。ここでの「アミノ酸配列の一部が改変されてなる」とは、ァミノ酸配列において 1 又は複数のアミノ酸が欠失、置換、付加、及び又は挿入されてなることを意味する。リシル才キシダーゼ活性が維持される限りにおいて、アミノ酸配列の改変（変異）位置は特に限定されず、また複数の位置で改変が生じていてもよい。改変にかかるアミノ酸数は、例えば全アミノ酸の 1 0 %以内に相当する数であり、好ましくは全アミノ酸の 5 %以内に相当する数である。さらに好ましくは全アミノ酸の 1 パーセン卜以内に相当する数である。以上のような改変夕ンパク質は例えば、配列番号 2のアミノ酸配列をコードする塩基配列に改変を加えた配列を有する核酸断片を調製し、これを適当な発現系において発現させるなど、遺伝子ェ学的手法を用いて作製することができる。本発明のタンパク質（改変タンパク質を含む）の中で天然の糸状菌が有するものについては、当該糸状菌ょリ抽出、精製等の操作によって調製することができる。また、本明細書で開示されるリシルォキシダーゼの情報を基にして遺伝子ェ学的手法を用いて本発明のタンパク質（改変タンパク質を含む）を調製することもできる。例えば、本発明のタンパク質をコードする DMAで適当な宿主細胞を形質転換し、形質転換体内で発現されたタンパク質を回収することにより調製することができる。回収されたタンパク質は目的に応じて適宜精製される。組換え夕ンパク質として調製する場合には種々の修飾が可能である。例えば、本発明の夕ンパク質をコードする DNAと他の適当な DNAとを同じベクターに挿入し、当該べクタ一を用いて組換えタンパク質の生産を行えば、本発明のタンパク質に他のぺプチドないしタンパク質が連結された組換えタンパク質を得ることができる。このような修飾にょリ、組換えタンパク質の抽出、精製の簡便化、又は生物学的機能の付加等が可能である。

(リシル才キシダ一ゼをコ一ドする DMA)

本発明の第 2の局面は糸状菌由来のリシル才キシダ一ゼをコ一ドする DNAを提供する。このような DMAの具体例としては、配列番号 3で示される塩基配列を有する DMA、又は配列番号 4で示される塩基配列を有する DNAを挙げることができる。前者はリシル才キシダーゼをコードするゲノム DNA (リシル才キシダ一ゼ遺伝子）に由来する配列であり、後者は当該ゲノム DNAからイントロン領域を除いた配列である。本発明の DNAの他の具体例としては、配列番号 5で示される塩基配列を有する DNA、又は配列番号 6で示される塩基配列を有する DNAを挙げることができる。前者は配列番号 3で示されるリシル才キシダーゼ遺伝子と、その推定プロモータ領域とを含む DMAである。後者は配列番号 4で示される DNA (リシルォキシダーゼ遺伝子からイン卜ロン領域を除いた DNA) と、その推定プロモー夕領域とを含む DNAである。これらの DNAではプロモータと構造遺伝子の組合わせが理想的となることから、当該 DNAを利用してリシルォキシダ一ゼの生産を行えば良好な遺伝子発現を期待できる。したがって、効率的なリシルォキシダーゼ生産系が構築される。

本発明の D NAの更なる他の具体例としては、配列番号 1 で示される塩基配列を有する DNA、又は配列番号 7で示される塩基配列を有する DNAを挙げることができる。前者は配列番号 3で示されるリシルォキシダ一ゼ遺伝子と、その推定プロモータ領域と、及びターミネータ領域とを含む DNAである。後者は配列番号 4で示される DMA (リシルォキシダーゼ遺伝子からイン卜ロン領域を除いた DNA) と、その推定プロモータ領域と、及びターミネータ領域とを含む DNAである。このような DNAを利用した場合にも、効率的なリシルォキシダーゼ生産系を構築することができる。

ここで配列番号 1 、 5、 6、又は 7の配列における推定プロモー夕領域はおよそ 1 600 bpであってプロモータ領域としては大きいことから、プロモータ活性に直接関与しているのは一部の領域であると予想される。このことを考慮して、これらの配列内の推定プロモータ領域（5 '側の約 1 600 b p) における連続した一部からなる領域であってもリシル才キシダーゼ遺伝子に対するプロモータとしての機能が認められれば、これを本発明の DNAにおけるプロモータとして用いることができる。従って、例えばこのようにして特定されたプロモータ領域と、配列番号 3 で示される配列の構造遺伝子と組合わせて、本発明の DNA (リシル才キシダーゼをコードする DNA) を構成することができる。ここで、一般に、プロモータの機能領域は構造遺伝子の直前に位置することが多いことを考慮すれば、例えば、配列番号 1 の配列における 569番目の塩基〜 1 568番目の塩基まで、好ましくは 769 番目の塩基〜 1 568番目の塩基まで機能領域の有力な候補となる。

以上の本発明の DNAは、適当な糸状菌ゲノ厶 DNAライブラリ一又は cDMAライブラリー、或は糸状菌の菌体内抽出液から、本発明のリシルォキシダ一ゼをコードする遺伝子（例えば配列番号 3で示される塩基配列を有する DNA) に対して特異的にハイプリダイズ可能なプローブ、プライマーなどを適宜利用して調製することができる。尚、本発明の DMAを調製するために用いる糸状菌ゲノム DNAライブラリ一又は cDNAライブラリ一の作製方法については、例えば Molecular Cloning, Thi rd Ed i t i on, Co I d Spring Harbor Laboratory Press, New York を梦照できる。

具体的には、例えば次の手順で本発明の DNAを調製することができる。まず、目的の DMAを保有すると予想される糸状菌を所定時間培養した後、ろ過によリ集菌する。洗浄後、菌体を凍結乾燥させる。続いて乳鉢などを用いて菌体を粉砕した後、適当量の抽出用緩衝液（例えば SDS含有 Tris- HCI 緩衝液）を加えて抽出液とする。続いて、フエノール抽出、エタノール沈殿等によってゲノム DNAの抽出、精製を行う。このようにして得られたゲノム DMAを錶型として目的の DMAに特異的なプライマーを用いた PCR法を実施することにより、目的の DMAが増幅産物として得られる。

適当な糸状菌ゲノム DNAライブラリー又は cDNAライブラリーを入手可能な場合にはこれらを利用して本発明の DNAを調製することもできる。使用するライブラリーの種類に応じてプラークハイプリダイゼーシヨン法あるいはコロニーハイブリダィゼーシヨン法などが利用される（Molecular Cloni ng, Thi rd Edi t ion, Col d Spring Harbor Laboratory Press, New York 等を参照）。例えばプラスミドを用いて構築されたライブラリ一の場合を例に採ればコロニーハイプリダイゼーシヨン法が利用される。目的の DNAを保有するクローンの選択には、本発明の DMA に特異的な配列を有するプローブが用いられる。目的とするクローンが選択されれば、このクローンが保有する DNAを錶型とし、目的の DNAの配列に特異的なプライマーを用いた PCR法等を実施することにより、本発明の DNAを増幅産物として得ることができる。得られたクローンが保有する DMAを適当なベクターにサブクローニングして以降の利用に供することができる。これによつて例えば、形質転換用の組換えべクターの構築や、或は塩基配列解読に適したプラスミドの構築ができる。

ここで、一般に、あるタンパク質をコードする DMAの一部に改変を施した場合において、改変後の DMAがコードするタンパク質が、改変前の DNAがコードするタンパク質と同等の機能を有することがある。即ち DMA配列の改変が、コードするタンパク質の機能に実質的に影響を与えず、コードするタンパク質の機能が改変前後において維持されることがある。このことを考慮して、上述した本発明の DMAの一部を改変した塩基配列を有する DNA (以下、「改変 DMAJともいう）であつても、それがコードするタンパク質がリシルォキシダーゼとしての機能を有する限りにおいて本発明の DNAを構成することができる。換言すれば、コードする夕ンパク質が有する、リシルォキシダーゼとしての機能が維持される限りにおいて —部の配列の改変が許容される。尚、改変の前後において、コードするタンパク質のリシルォキシダーゼ活性が低下しないことが好ましいが、多少の変動（上昇又は低下）があってもよい。

ここで「一部の改変」とは、典型的には、改変前の塩基配列において 1 若しくは複数の塩基が置換、欠失、挿入、又は付加されることをいう。このような改変は複数の部位に生じていてもよい。ここでの「複数」とは改変が行われる位置ゃ改変の種類によっても異なるが例えば 2 ~ 1 0 0個、好ましくは 2〜5 0個、より好ましくは 2 ~ 1 0個である。以上のような改変 DNAは例えば、制限酵素処理、ェキソヌクレアーゼゃ DNA リガーゼ等による処理、位置指定突然変異導入法（Mo I ecu I ar Cloning, Thi rd Edi t ion, Chapter 13 , Co I d Spring Harbor Labo ra to r y Press, New York) やランダム突然変異導入法（Molecular Cloning, Thi rd Ed i t i on, Chapter 13 , Co I d Spring Harbor Laboratory Press, New York) による変異の導入などによって得られる。また、リシル才キシダーゼ遺伝子を保有する糸状菌を紫外線で処理し、その後改変された遺伝子を単離することなど、公知の変異処理を利用した方法によっても取得することができる。

尚、上記のような塩基の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位等の変異にはリシルォキシダーゼを保持する微生物の個体差、種ゃ属の違いに基づく場合など、天然に生じる変異も含まれる。

改変 DNAの調製方法としては、改変 DMAを保有する天然の糸状菌（例えばァスペルギルス * ォリゼ）からゲノム（染色体） DMA を抽出し、これを適当な制限酵素で処理した後に本発明の DMA (例えば配列番号 3で示される配列を有する DMA) 又はその一部をプローブとしたスクリーニングにおいてストリンジェン卜な条件でハイプリダイズする DNAを選択、単離する方法を例示することができる。改変 DNAを保有するクローンを含むゲノム（染色体） DNAライブラリーを利用可能な場合には、当該ライプラリーを本発明の DMA (例えば配列番号 3で示される配列を有する DNA) 又はその一部をプローブとしてストリンジェン卜な条件下でスクリ一二ングすることによつても得ることができる

上記本発明の DNA (例えば配列番号 3で示される配列を有する DNAやこれに上記改変を加えて得られる DNA)とス卜リンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、かつそれがコードするタンパク質がリシル才キシダーゼとして機能する DNAを本発明の DNAとすることもできる。ここでいう「ス.卜リンジェン卜な条件」とはいわゆる特異的な八イブリッドが形成され、非特異的なハイプリッドが形成されない条件をいう。ス卜リンジェン卜な条件は配列の長さや構成塩基の種類によっても変動するが、例えば、ハイブリダィゼーシヨン液（50%ホルムアルデヒド、 10XS SC(0.15 NaCI , 15m sodium c rate, pH 7.0), 5XDenhardt溶液、 1% SDS、 1 0% デキス卜ラン硫酸、 lO ig/ml の変性サケ精子 DNA、 50mM リン酸バッファー（p H7.5)) を用いて 42°Cでインキュベーションし、その後 0.1XSS (；、 0.1% SDS を用いて 68°Cで洗浄する条件である。更に好ましいス卜リンジェン卜な条件としては、ハイブリダィゼ一シヨン液として 50%ホルムアルデヒド、 5XSSC(0.15M NaC 1 , 15mM sodium ci trate, pH 7.0)、 1 X Denha rd t溶液、 1 %SDS、 10%デキストラン硫酸、 10 ig/ml の変性サケ精子 DNA、 50mM リン酸バッファー（ρΗ7· 5) ) を用いる条件を例示することができる。

(ベクター）

本発明の他の局面は、上記本発明の DMA (改変 DNAを含む）を保持するべクタ一を提供する。このようなベクターは、既存のベクター又はそれに改変を施したベクター内に本発明の DMAを組込むことによリ作製される。本発明の DNAを保持し得るものであれば原則としていかなるベクターを出発材料としてもいが、使用目的（クローニング、ポリペプチドの発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。本発明の DNAのベクターへの組込みは、制限酵素及び DNA リガーゼを用いた周知の方法（Molecular Cloning, Thi rd Edi t io n, 1.84， Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yo rk)により行うことができる。

尚、プロモータ領域をも含む DNA (例えば配列番号 1、 5、 6、 7のいずれかに示される配列を有する DMA) を用いる場合には、別個に用意したプロモータ領域と構造遺伝子（及びターミネータ）とをベクターに組込むことによリ組換えべクタ一を構築してもよい。このような場合には、プロモータ機能が適切に発揮されることを条件として、ベクター内において両者の間に他の配列が介在していてもよい。また、まずプロモータ領域を保持するベクターを構築し、その後に構造遺伝子の連結を行ってもよい。

形質転換用のベクターには、典型的には、リシル才キシダーゼ遺伝子（例えば配列番号 3に示される配列を有する DNA)、プロモータ、およびターミネータが含有される。プロモータによる構造遺伝子の適切な転写が達成されるように、上流から下流に向かって順にプロモータ、リシルォキシダ一ゼ遺伝子、及びターミネ一夕が配置される。ベクター内に、選択マーカーゃェンハンサー機能を有する配列、シグナルべプチドをコ一ドする配列などを含有させてもよい。

(形質転換体）

形質転換用ベクターは糸状菌の形質転換に利用される。即ち、上記の形質転換用ベクターを用いて、糸状菌の形質転換体の調製方法を構築することができる。かかる調製方法によれば、本発明の DNAが外来的に導入された糸状菌が得られる。このようにして得られた糸状菌形質転換体はリシル才キシダーゼの生産に利用され得る。具体的には、本発明の DNAが外来的に導入された糸状菌形質転換体を、当該 DNAのコードするタンパク質（リシルォキシダーゼ）が発現可能な条件で培養することにより、リシル才キシダーゼを産生させることができる。培地は使用する宿主に応じて適切なものが用いられる。例えぱ市販の各種培地又はこれらにアルギニン、ゥリジン等の形質転換体の生育、選択、タンパク質の発現促進などに必要な成分を添加した培地を用いることができる。

所望時間培養した後の培養液又は菌体より目的のタンパク質（リシル才キシダーゼ）を回収することができる。菌体外に産生された場合には培養液より、それ以外であれば菌体内より回収することができる。培養液から回収する場合には、例えば培養上清をろ過、遠心処理して不溶物を除去した後、硫安沈殿等の塩析、透析、各種クロマトグラフィーなどを組み合わせて分離、精製を行うことにより目的のタンパク質を取得することができる。他方、菌体内から回収する場合には、例えば菌体を加圧処理、超音波処理などによって破砕した後、上記と同様に分離、精製を行うことにより目的のタンパク質を取得することができる。尚、ろ過、遠心処理などによって予め培養液から菌体を回収した後、上記一連の工程（菌体の破砕、分離、精製）を行ってもよい。尚、本発明のリシルォキシダーゼは通常菌体外に産生されることから、その分離、精製は比較的容易である。

形質転換に供される宿主糸状菌の種類は特に限定されず、ァスペルギルス属（ァスペルギルス ·才リゼ、ァスペルギルス ·二ガー、ァスペルギルス■二ドランス、ァスペルギルス ·ソーャ、ァスペルギルス ·ァヮモリ、ァスペルギルス ·力ヮチ、ァスペルギルス ·パラシティクス、ァスペルギルス ·フラバス、ァスペルギルス · ノミウス、ァスペルギルス 'フミガタス等）、ぺニシリウ厶属、トリコデルマ属、リゾプス属、厶コール属、又はフザリウ厶属等に分類される糸状菌を用いることができる。好ましくはァスペルギルス属の糸状菌が用いられる。中でもァスペルギルス · 才リゼ、又は二ガーを用いることが安全性点から好ましい。

形質転換用ベクターの宿主糸状菌への導入（形質転換）は公知の方法で行うことができる。例えば、プロ卜プラスト化した菌体を用いた Turnerら方法（Gene, 36, 321-331 (1985)) により行うことができる。その他、五味らの方法（Agri Biol. Chem. , 51， 323-328 (1987)) などを採用してもよい。

以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれに限定されるものではない。なお、実施例における各種遺伝子操作は、上記の Current protocols in molecular biol ogy (edited by Frederick M. Ausube I et a , 1987) に記載されている方法に従った。

<実施例 1 >

[ホールゲノムショットガンライブラリーの作製方法]

1 . インサ一卜側の調製

( 1 ) 染色体 DNAの取得

糸状菌 Aspergi I lus oryzae RIB-40株（ATCC 42149)の胞子を YPD培地（0.5% Yeast extract, 1¾ Peptone, 2¾ G I ucose)に植菌し 30°Cで一晚振盪培養した。その後、飯村（Argri Biol. Chem. 323-328, 51 (1987)) の方法に従ってゲノム DNAの抽出を行った。ゲノム DMA に混在しているミ卜コンドリア DMAを Watson らの方法 (Methods Enzymol. 57-75 118 (1986) )に従って染色体 DNAのみになるよう塩化セシゥ厶超遠心による精製を行った。

(2) 染色体 DMAの断片化

取得した純粋な染色体 DMAをランダム DMA断片化装置 HydroShear (卜ミ一精ェ）にかけ、染色体 DNAを l-2kb程度に断片化した。

(3 ) 断片化した DNAの末端処理

断片化した染色体 DNA を BAL31 ヌクレアーゼ（TAKARA)処理、その後 Klenow Fragment (TAKARA)処理を行い末端を平滑化した。

(4 ) 末端への Adaptorの付加

末端を平滑化した染色体 DMA断片の両端に、（Ρ)5'- CGAGAGCGGCCGCTAC- 3'および (Ρ)5'- GTAGCGGCCGCTC- 3'からなるアダプターを Τ4 DNA Ligase (TAKARA)を用いて連結した。

2. 形質転換

PUC19を制限酵素 Sal I (TAKARA)により切断を行った後、 dTを Taq DNAポリメラーゼ（ロシュ. ダイァグノステイクス）によリ Sal I切断部分に挿入した。このようにして作製したプラスミドを Alkaline Phosphatase (TAKARA)処理によリ脱リン酸化しベクターとして利用した。ベクターと上記で作製した染色体 DMA断片を T4 DMA Ligaseを用いて連結させ、大腸菌 DH10B (Gibco)にエレクトロポレーション法によリ形質転換を行った。

3. 塩基配列の決定

プラスミド DMAは、大腸菌形質転換体を 2xYP培地で 37°C、 10時間培養し、集菌後、滅菌水中で 99°C、 10分間加熱処理した。この上澄を錶型 DMA水溶液として用い、 98°Cで 20秒、 68°Cで 2分の 30サイクルの PCRによって、シークェンス用プライマーがァニールする部位を含む挿入断片全長を増幅した。得られた DNA断片は、サンガー法の錶型として用い、 M13 ユニバーサルプライマーあるいは M13 リバースプライマ一と、 Perkin Elmer社製 PRISM Dye-Terminator シークェンシングキットを用いて、キッ卜に添付の説明書に従ってシークェンス反応を行った。シークェンス反応産物は、ゲルろ過法などを用いて未反応の Dye- terminatorを除去した後、 Perkin Elmer社製 3700 DNA Sequencerを用いて、 DMA断片の塩基配列を解読した。 3700 D N ASequencerによって出力された波形データは、 Ph red (Phi I Green) で再解析し、ベクター及びアダプター配列を除去した後、 SPS Phrap (Southwest Parallel Software 社）を使用してアッセンブルし、麹菌ゲノム D N A塩基配列のコンテイダを構築した。

<実施例 2>

[遺伝子の特定]

ゲノム DNA塩基配列からの遺伝子の特定については、以下の手法を用いた。遺伝子の特定手法は、ゲノム DNA塩基配列のコンテイダに対し、すでに取得した EST の配列情報、既知のタンパク質アミノ酸配列データベースとの相同性情報を考慮しながら、浅井潔らによるアルゴリズ厶（Pac ic Symposium on B i ocompu t i ng 98, 228-239.) に基づく遺伝子領域予測システム GeneDecoderと後藤修によるァルゴリズ厶（Bioinformatics 2000 16: 190-202.) に基づく遺伝子領域予測システ厶 ALNを組み合わせて用いた。また、 tRNA遺伝子の予測は tRNA- scanを用いた。第 1 『BLAST相同性遺伝子候補領域の抽出』

ゲノム DMA塩基配列のコンテイダから既知の夕ンパク質アミノ酸配列と高い相同性をもつ領域を抽出する。アミノ酸配列の相同性は Karl in and A schul によるアルゴリズム BLAST (Pro Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268, 1990、 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873- 5877， 1993)によって決定することができるが、このアルゴリズムに基づいて、 BLASTX と呼ばれるプログラムが開発されており (Al tschul et al . J. Mo I. B i o 1.215 : 403-410, 1990)、ゲノム DNA塩基配列がァミノ酸配列に翻訳された場合に相同性が高い領域を直接検索することができる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である（http：〃 www. ncbi. nlm. nih. gov.)_c 本手法では、ゲノム DNA塩基配列のコンテイダを問い合わせ配列、 SWISSPR0Tバ一ジョン 39(Bai roch， A. & Apwei ler, R. Nucl eic Acids Res. 28, 45-48 (2000) .) および NRaaをデータベースとして BLASTXの検索を行い、 BLASTアルゴリズ厶における相同性の指標である E-valueで 10— ³»以下の値を持つ（E- val ueは値が低いほど相同性が高いことを示す）領域を抽出する。これらの領域から、より相同性の高い部分を優先させるようにして、互いに重ならない BLAST相同性遺伝子候補領域を抽出する。

第 2 『ALN遺伝子候補領域の抽出』

BLAST 相同性遺伝子候補領域のうち、相同性の対象となるタンパク質アミノ酸配列の全長の 9 0 %以上の領域に対して相同性をもつものを核として、コンティグ配列に対して遺伝子領域予測システム ALNを適用して ALN遺伝子候補領域を抽出する。 ALN は、相同性の対象となるタンパク質アミノ酸配列の全長を、コンテイダに対して整列させながらスプライス部位を特定することにより、遺伝子領域を予測する。

第 3 『GD相同性遺伝子候補領域の抽出』

BLAST 相同性遺伝子候補領域のうち、相同性の対象となるタンパク質アミノ酸配列の残長の 2 0 %以上 9 0 %未満の領域に対して相同性を持つものを核として、コンテイダ配列に対して遺伝子領域予測システム G e n e D e c 0 d e rを適用して G D相同性遺伝子候補領域を抽出する。 GeneDecoderは、 BLASTXの E- va I ueと、タンパク質コード領域の指向性の指標である 2連コドン統計量を統合し、さらにスプライス部位の位置依存 1 次マルコフモデルによるスコアを考慮して遺伝子領域を予測する。第 4 『EST- GD遺伝子候補領域の抽出』

コンティグ配列に対応した ESTによって遺伝子発現が確認されている領域については、その付近のコンテイダ配列に Gen eDecode r を適用することにより、 EST 配列によつて決定される遺伝子領域のみならず、遺伝子領域全体を予測し、 EST-GD 遺伝子候補領域とする。

第 5 『一般 GD遺伝子候補領域の抽出』

第 1 から第 4までの遺伝子候補領域に含まれないコンテイダ配列に対しては、 GeneDecode rを適用することにより、遺伝子領域を予測する。

第 6 『t RMA遺伝子候補領域の抽出』

t RNA- s canを全コンテイダに適用することにより、 t RNA遺伝子候補領域を抽出する。

第 7 『遺伝子候補領域の統合』

以下の手順により、第 2から第 6までの遺伝子候補領域を統合する。まず、第 2から第 6までの遺伝子候補領域のうち、 EST によって決定されるスプライス部位と矛盾した遺伝子領域を予測するものは取り除かれる。残った遺伝子候補領域を、互いに重なるものを取り除くことによって統合する。その際、 t RMA、 ALN 相同性遺伝子候補領域、 GD 相同性遺伝子候補領域、 GD- EST 遺伝子候補領域、一般 GD遺伝子候補領域の順で優先させて統合する。この統合された遺伝子候補領域を、予測遺伝子のセッ卜とする。

以上の手順により、相同性の観点からは、既知タンパク質の全長にわたって相同性をもつ遺伝子、既知タンパク質と部分的に相同性をもつ遺伝子、既知タンパク質と相同性をもたない遺伝子がこの順に従つた信頼性で特定されることが保証される。また、発現の確認の観点からは、 EST で発現が確認されている遺伝子、 EST で発現が確認されていない遺伝子の順に従った信頼性で特定され、また、すベての候補遺伝子が ESTによって特定されるスプライス部位と矛盾しないことが保証される。

用いられた手法はすべて終始コドンをタンパク質コード領域中に含むことを許さないアルゴリズムを採用しておリ、偽遺伝子を遺伝子として予測する可能性は少ない。

機能決定に関しては、予測された遺伝子領域に対して、 Mraaをデータベースとする BLAST による相同性検索を行い、機能を特定するために十分な相同性 (E-valueで 10一³ を閾値として機能を決定した。ぐ実施例 3 >

[リシルォキシダ一ゼをコ一ドする配列の検索]

実施例 2の結果、麹菌ゲノム DNAの中から特定の機能を有する配列（機能配列）が予測、抽出された。これら機能配列の中でタンパク質をコードしていると予想される配列の全てを対象として、 NCBI が提供する BLAST サーチ（Standard protein-protein BLAST： blastp) を用い、ピキア 'パス卜リス（ P ί ch i a Pas t o r ί s) 由来リシル才キシダーゼ遺伝子と相同性の高い領域を検索した。その結果、ピキァ 'パス卜リス（Pichia Pastoris) 由来リシルォキシダーゼ遺伝子と相同性の高い領域を配列番号 2 4で示される配列内（当該配列は先の出願において配列番号 3 6 8 4 5として示された配列（配列番号 8 ) を包含する）に見出すことに成功した。そこで、当該領域の機能を解析する目的、及び当該領域がコードするタンパク質のアミノ酸配列を同定する目的の下、以下に示す種々の実験を行った。

<実施例 4 >

[染色体遺伝子の取得]

ァスペルギルス ■才リゼ（Aspergi I lus oryzae) RIB- 40株をポテトデキス卜口ース培地（Difco社） 100ml を入れた坂口フラスコを用いて 30°C—晚培養した後、ブフナー漏斗及びヌッチェ吸引瓶を用いて培養液をろ過し、菌体を得た。水 300ml を用いて菌体を洗浄し、 - 80°Cで凍結後、凍結乾燥させた。その結果得られた重量約 0.3gの菌体を薬匙 1 杯の海砂とともに乳鉢、乳棒を用いて破砕し、 TE (lOmM Tris-HCI (pH8.0), 1mM EDTA) 溶液 8ml に懸濁した。そこへ 4tnl の 10% SDS水溶液を加え、激しく攪拌した。続いて等量のフエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール（25:24:1 ) 溶液を加えて攪拌した後、遠心分離（l，500g、 5min、室温）して上清を得た。この上清に 20mg/ml のプロティナーゼ K (Roche社）を含む TE溶液 100M I を加えて攪拌し、 37° ( 、 30分間インキュベートした。その後再び等量のフエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール溶液を加えて攪拌した後、遠心分離（1，500g、 5m in, 室温）を行い、その結果得られた上清に等量のィソプロパノールを穏やかに加えた。この処理によって界面に析出した染色体 DMAをパスツールピペットで巻き取り、 70%エタノールで洗浄し、風乾した。このようにして得られた染色体 DNAを再び TE 3ml に溶解じ、 10mg/ml RNase A (SIGMA 社） 100/i l を加えた後、 37°C、 30分間インキュベートした。次いで、 20mg/ml プロティナーゼ K 溶液 25μ I を加えて 37°C、 30分間インキュベートした後、等量のフエノール：クロ口ホルム：イソアミルアルコール（25:24:1 ) 溶液を加えた。攪拌後、遠心分離（l，500g、 5min、室温）を行い上清を得た。この洗浄操作を 2 回繰り返した後、得られた上清に等量のクロ口ホルム：イソアミルアルコール

(24:1) 溶液を加えて攪拌し、その後遠心分離（l，500g、 5min, 室温）を行った。その結果得られた上清に対して、その 1/10容量の 3M NaOAc (pH4.8) と 2倍容量のエタノールを加えて- 80°Cで冷却することにより染色体 DNAを析出させた。析出した染色体 DNAを遠心処理（l，500g、 5min、室温）により回収した。回収された染色体 DNAを 70% エタノールで洗浄した後、真空乾燥させ、最後に 300 μ Ι の TE 溶液に溶解して濃度約 1mg/ml の染色体 DNA溶液を得た。ぐ実施例 5 >

[コロニーハイブリダィゼ一シヨンのプローブ作製]

実施例〗で得られた麴菌ゲノム DMAコンテイダの配列情報をもとに、制限酵素〃断片（配列番号 2 4) 中に存在し、目的の遺伝子（推定リシル才キシダーゼ遺伝子）領域の一部を含むゲノム DMA断片を増幅させるプライマ一対を以下の様に設計した。

L0-2 5' -TAGCACCATCTACTCTGAGTGGC-3' (配列番号 1 1 )

L0R-2 5' -CCTGGTCATATAGTCGTAGTTGC-3' (配列番号 1 2)

このプライマー対を用いて PCR反応を行った。尚、反応液の組成は以下のとおりとした。

滅菌水： 36.75μ I

Pyrobest DNA Polymerase 用 10xノ、' 'ンファー： 5μ I

2.5m dNTP溶液： 4 I

lOpmol/ I LO-2： 1 μ I

lOpmol/μ I LOR-2： 1 μ. I

60ng/ I RIB40染色体 DNA : 2μ I

51 H Pyrobest DNA Polymerase (宝酒造社）： 0.25^ 1/50^ 1

上記反応液にミネラルオイル 50 I を滴下し PE バイオシステム社 GeneAmp^TM PCR System PJ9600を用い、以下の条件で PCRを実施した。

(1) 94°Cで 1分間、（2)94°Cで 30秒間、 50°Cで 30秒間、及び 72°Cで 2分間のサイクルを 30サイクル、（3)4°Cで放置。

PCR反応の結果、約 900bpの DMA断片が特異的に増幅し、ァガロースゲル電気泳動後 GeneCleanl I I (BIO 101社）を用いて増幅 DNA断片を抽出した。抽出した DNA断片を pUC19にサブクローンした後、挿入 DMA断片を DIG High Prime (Roche 社）を用いて DIG標識し、推定リシル才キシダ一ゼ遺伝子のプローブとした。 <実施例 6 >

[コロニーハイプリダイゼーション]

実施例 4で得られた染色体 DMA 40 gを制限酵素 Sa// (宝酒造社） 50Uを用い 37°Cで完全消化した後、ァガロース電気泳動により鎖長 9. Ikbpの DMA断片を切リ出し、続いて GeneCleanl l l (BIO 101) を用いて抽出し、ライブラリー作製の為のインサートとした。一方、 PUC19を Smal (宝酒造社） 80Uで完全消化（30°Cで一晩インキュベート）した後、アルカリフォスファターゼ（宝酒造社）を用いて脱リン酸化し、ライブラリー作製の為のベクターとした。以上のようにして調製したインサート DMA及びベクター DMAを Ligation Kit ver.2 (宝酒造社）を用いてライゲーシヨンし、これを用いて大腸菌 DH5株コンビテン卜セル（T0Y0B0社）を形質転換した。アンピシリン耐性形質転換株を、 LA プレー卜（アンピシリン (SIGMA社） 100Aig/ml) —枚あたり約 200個のコロニーが形成されるように撒き、 37°Cで一晚ィンキュベー卜してコロニーを生育させた。生育した総計約 4， 000のコロニー ¾： Nylon Membranes for Colony and Plaque Hybridization (Roche社) にリフトし、メンブレン上に DMAを固定化した。実施例 5で作製したプローブを用いてコロニーハイブリダィゼーシヨンを行い DIG Nucleic Acid Detection Kit (Roche 社）を用いて強いシグナルを示すコロニーを検出した。コロニーハイブリダィゼーシヨンの結果選択されたクローンが保持するプラスミドを pULO と名づけ、推定リシル才キシダーゼ遺伝子を含むプラスミドとした。尚、以上の各操作は、使用した試薬又はキッ卜に添付のプロ卜コールに従って行った。ぐ実施例 7 >

[推定リシル才キシダ一ゼ遺伝子を含むクローンの塩基配列解析]

実施例 1 ~ 3によって明らかとなった、リシルォキシダーゼをコードすると予想される領域を含む配列（配列番号 2 4 ： Bal l 断片（当該配列は推定プロモータ領域及び推定ターミネータ領域を含む））の情報をもとに、以下の合成プライマー 10種を作製し、これらを用いてクローン pULOのインサー卜の塩基配列を決定した。 Sequence反 !:、は BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing FS Ready Kit VER.2 (アプライド ·バイオシステムズ社）を用い、解析は ABI PRISM 310シークェンサー（アプライド ·バイオシステムズ社）を使用した。

L-1 ： 5' -GCTAGCTTATACTAACCC-3' (配列番号 1 3)

L-2： 5' -GACTATGTTCTCGTGCGC-3' (配列番号 1 4 )

L-3： 5' -TCTTTGCATTTGTCCAGG-3' (配列番号 1 5)

L- 4： 5' -TCTGCGTCGTTGGACAAC-3' (配列番号 1 6)

L-5： 5' -GACTGACCCTCATTATGC-3' (配列番号 1 7)

L-6： 5' -AACACCGAGGGACCATGG-3' (配列番号 1 8)

L- 7： 5' -TACCTCACCCTCCGATCC-3' (配列番号 1 9 )

L-8： 5' -GGGACAGCACACCTGACG-3' (配列番号 2 0 )

L-9： 5' -AACCCGAATGATCCGTAC-3' (配列番号 2 1 )

L-10： 5' -AGAGAATAATCGAAATGG-3' (配列番号 2 2)

決定された塩基配列の一部は、配列番号 8に示される配列（推定リシルォキシダーゼの構造遺伝子並びにプロモータ及びターミネータを含む配列）と完全に一致した。従って、プラスミド pULOは配列番号 8に示される配列（リシル才キシダーゼの推定プロモータ、推定構造遺伝子、推定夕一ミネ一夕を含む配列）を完全にカバーする DNA断片を保持していることが判明した。

<実施例 8 >

[発現べクタ一 PBAL0の構築]

次に、 3 gの PULOを制限酵素〃/ (宝酒造社）で消化し、約 7.0kbpの DMA 断片（配列番号 1 0。以下、「推定リシルォキシダーゼ DNA断片」ともいう）を得た。得られた DNA断片の末端を T4 DNA Polymerase (宝酒造社）を用いて末端平滑化しこれをインサート DNAとした。一方、 pBluescript I I KS(+)の Sal I— Xhol サイ卜にァスペルギルス '二ドランス ( pergi I lus nidulans) 由来の ArgB遺伝子を挿入した発現べクタ一 PBAR7 を Sffla/ (宝酒造社） 80Uを用いて完全消化 (30°Cでー晚インキュベート）した。その後、 Alkal ine Phosphatase (宝酒造社）を用いて脱リン酸化し、ベクター DNA とした。以上のようにして調製したインサ一卜 DNAとべクタ一 DNAを Ligation Ki t ver.2 (宝酒造社）を用いてライゲーシヨンし、これを用いて大腸菌 DH5株コンビテン卜セル（T0Y0B0社）を形質転換しアンピシリン耐性形質転換体を得た。得られたクローンの保持するプラスミドを pBALOと名づけ発現ベクターとして用いた（図 1 )。

<実施例 9 >

[ァスペルギルス ■二ドランス (Aspergillus nidulans) への形質転換]

アルギニン要求株であるァスペルギルス '二ドランス (Aspergi I lus nidulans) ABPU1 株（ァスペルギルス · ニドランスのオル二チン力ルバモイル卜ランスフエラーゼ遺伝子欠損株）を以下の培地条件で 37°C —晩培養した。

マルトエキス 20g

グルコース 20g

バクトぺプ卜ン 1g

ゥリジン 2g

p-ァミノ安息香酸 2.5mg

リボフラビン 2.5mg

ピリドキシン 2.5mg ビ才チン 2.5mg

アルギニン塩酸塩 0.55g /L (pH6.5)

上記条件下で培養して得た培養液 200ml からガラスフィルター（lOO im) を用いて集菌して得られた菌体を以下の組成のプロ卜プラス卜調製液に懸濁した。滅菌 Mil IQ水 37ml

塩化ナトリウム 1.9g

0.4M リン酸ナトリウム水溶液（ρΗ5·8) lml

1 塩化カルシウム水溶液 0.8ml

ノボザィ厶 234 (ノボノルディスク） 150mg Ζ ιηΙ

(セルロース ■ 二卜レイ卜フィルター（0·45μιη) により無菌ろ過）

上記懸濁液を用いて 30°C、 78rpmの条件下で 1時間プロ卜プラス卜化処理を行つた。得られたプロ卜プラス卜懸濁液をナイロン製フィルター（230mesh) によりろ過し、ろ液を遠心分離（400g、 5min、室温）してプロ卜プラス卜を得た。プロ卜プラス卜を 10ml の 0.8M NaCI を用いて洗浄後、再び遠心分離（400g、 5min, 室温）し、次いで 10ml の 0.8MNaC卜 50mMCaCI₂を用いて洗浄後、遠心分離（400g、 5min、室温）し、得られたプロ卜プラス卜の沈殿を 200 I の 0.8M NaC卜 50mM CaC 1₂ に懸濁し、プロ卜プラスト液とした。顕微鏡による観察によりプロ卜プラスト濃度を算出した。約 2x10Vml に希釈したプロ卜プラス卜懸濁液を用いて以下の手順で形質転換を行った。 50μ I プロ卜プラスト懸濁液に 5μ I の pBALO溶液（3 g/ I ) を加え懸濁後、 12.5μ Ι の PEG 溶液（25% PEG6000, 50mM CaCIい lOmM Tris-HCI(pH7.5)) を加え更に懸濁し、そのまま氷中に 20分間静置した。次いで 500 μ I の 25% PEG6000、 50mMCaCIい 1 OmM Tr i s- HC I (ρΗ7· 5)を加えて再び懸濁し、氷中に 5分間静置した。最後に 1ml の 0.8Μ NaC卜 50mM CaCI₂を加えて懸濁し、懸濁液 0.5ml をシャーレに入れた後、以下に示す再生培地を注ぎプレートとして固化させた。 37°Cで 3 日間から 4 日間インキュベート後、生育した形質転換体を以下に示す最少培地で単菌分離し、推定リシル才キシダーゼ DMA断片が導入された形質転換株を得た。

<再生培地 >

硝酸ナ卜リウ厶 6g

リン酸一力リウ厶 1.52g

塩化力リウ厶 0.52g

ソルビトール 218.6g

ゥリジン 2.0g

P-ァミノ安息香酸 2.5mg

リボフラビン 2.5mg

ピリドキシン 2.5mg

ビ才チン 2.5mg

寒天 20g /L (pH6.5)

(以下については滅菌（121°C 20min) 後に添加）

50¾ グルコース 20ml

5.2% 硫酸マグネシウム · 7水和物

<最少培地 >

硝酸ナ卜リウ厶 0.85g

リン酸一力リウ厶 1.525g

塩化力リウ厶 0.525g

Trace element 1.5ml

ゥリジン 2g

P -ァミノ安息香酸 2.5tng

リボフラビン 2.5mg

ピリドキシン 2.5mg ビ才チン 2.5mg

寒天 15g /L (pH6.5)

(以下については滅菌（121°C 20tnin) 後に添加）

50% グルコース 20ml

5.2¾ 硫酸マグネシウム · 7水和物 10ml

【 0 0 5 5】

ぐ卜レイス · エレメント >

4ほう酸ナトリウム · 10水和物 40mg

硫酸銅 · 5水和物 0.4g

硫酸鉄 · 7水和物 1.6g

硫酸マンガン · 4水和物 0.8g

モリブデン酸ナトリウム ■ 2水和物 0.8g

硫酸亜鉛 · 7水和物 8g

<実施例 1 0 >

[形質転換体の培養]

形質転換体を以下に示す培地条件で 30°C、 3 日間振盪培養した < <SPY培地 +ヴイタミン類 >

デンプン 30g

ポリペプトン 10g

ィース卜エキストラク卜 5g

塩化力リウ厶 2g

リン酸カリウ厶 1g

アルコール醱酵かす 0.1g

ゥリジン 2g P-ァミノ安息香酸 2.5mg

リボフラビン 2.5mg

ピリドキシン 2.5mg

ビ才チン 2.5mg

(以下については滅菌（ 1°C 20m in) 後に添加）

5.2¾ 硫酸マグネシウム · 7水和物 10ml /L (pH6.5)

上記条件下で培養した培養培地 10ml を遠心分離（2,400g、 10m in, 4°C) し、培養上清を得た。 <実施例 1 1 >

[リシル才キシダーゼの酵素活性測定]

得られた各培養上清を用いて、以下の手順でリシル才キシダーゼ活性を測定した。コントロールには、形質転換を行っていないァスペルギルス ' 二ドランス (Aspergillus n i du I ans) ^BP ^株を、上記の培地にアルギニン塩酸塩を濃度 0.55g ノ Lまで添加した培地で同様に培養して得られた培養上清を用いた。

リシル才キシダーゼの活性は、基質リジンがリシル才キシダーゼによリ酸化されて生ずるァリシンとリジンとが重合して生ずるダイマーの生成量よリ求めた。リジンダイマー量は LC- MS (Agi lent社）を用いて測定した。

まず、各培養上清（粗酵素サンプル）を用いて以下の反応液を調製した。

0.1M リン酸カリウムバッファー（pH7.0) 235 μ Ι

1.0Μ リジン塩酸塩水溶液 60 μ I

培養上清 6^ 1

合計 301 l

各反応液を 37°Cで保温し、 1, 2,4,8, 24時間毎に I ずつサンプリングした。サンプリングした反応液を 100° (：、 15分間の熱処理に供して反応を停止させ、その後 LC移動相を用いて 10倍に希釈して測定用サンプルとした。尚、予め 100°C、 15 分間の熱処理により酵素を失活させた培養上清を使用して同様に処理して得られたものをブランクとして用いた。

各測定用サンプル中のリジンダイマー量の測定には Agi lentl lOO シリーズ LC/MSDシステム（Agi l ent社）を使用した。分離カラムとして supe I co ABZ p I us (スペルコ社）を用い、 Posi tiveモードにおいてリジンダイマーのピークとして検出される質量電荷比（m/Z) 275 のピーク面積値からプランクサンプル値を差し引いた値を各サンプルの測定値とした。

測定の結果、いくつかの形質転換体の培養上清を用いたサンプルにおいて、反応時間に比例した測定値の上昇が認められた。即ち、反応時間に比例してリジンダイマー量が増大していることが認められた。反応時間が 24時間の測定サンプルを用いた測定結果を図 2の表及びグラフに示す。尚、リジンダイマー量の増大が確認されたサンプルの結果のみを抜粋して示した。この表及びグラフから明らかなように、形質転換体 L0-3、 10、 17、 26、 48の培養上清を用いたサンプルではコン卜ロール（ABPU1株）に比較して 6倍以上も高い活性を示した。このことから、これらの形質転換体はリシルォキシダーゼ遺伝子を保持していることが確認された。

以上の結果から、形質転換体の作製に使用した推定リシルォキシダーゼ DNA断片がリシル才キシダ一ゼをコ一ドする領域を含むことが実証された。

<実施例 1 2 >

[リシル才キシダ一ゼ遺伝子転写終結点の決定]

ァスペルギルス .ォリゼ (Aspergi I lus oryzae) RIB- 40株、及び上記の活性測定において最大のリシル才キシダーゼ活性を示した形質転換体 L0 - 3 (Aspergillus n i du I ans- ABPU)) について、実施例 1 0と同様な培養を行い菌体を調製した。得られた各菌体からトリゾール試薬（Gibco BRL社）を用いて全 RMA を抽出し、それらを錶型にして 3' -Full RACE Core Set (宝酒造社）を用いて 3'DNA 断片を増幅した。以下にその際に使用した、リシル才キシダ一ゼゲノム情報から設計した合成プライマー中の特異的配列を示す。

L0-3' ： 5' -TGGCTGAACCTGGGGATGCACCAC-3' (配列番号 2 3 )

増幅された DNA断片の塩基配列を解析した結果、当該 DNA断片の塩基配列（配列番号 9) は、実施例 1 ~ 3によって当初リシルォキシダーゼの構造遺伝子と予想された領域（推定リシル才キシダーゼ構造遺伝子）の塩基配列の一部と一致しており、またポリ A配列を有していた。これらの事実から当該 DMA断片は、推定リシル才キシダーゼ構造遺伝子の 3'末端を示す DNA断片である事が解った。これによリ、当該推定リシルォキシダーゼ構造遺伝子の転写終結点が明らかとなったが、それは当初の予測よりも 3'末端側に位置していた。即ち、以上の結果から得られた構造遺伝子の配列は、当初構造遺伝子として特定された配列とは 3'末端領域において異なることが判明した。尚、配列番号 3及び配列番号 2に、以上の結果に基づいて新たに同定されたリシルォキシダーゼの構造遺伝子及びアミノ酸配列をそれぞれ示す。

<実施例 1 3 >

[3'側領域を欠失させたインサー卜 DNAを保持する発現ベクターの構築]

実施例 1 2の結果より、発現ベクター pBALOに挿入された約 7.0kbpのインサ一卜 DNA にはリシル才キシダーゼ活性に不要な領域がその 3' 領域に存在することが明らかとなった。そこで、リシル才キシダーゼ活性に必要とされる領域を絞り込むことを目的として、前記インサー卜 DNAの 3'側の一部を欠失させたインサー卜 DNA (以下、「欠失インサ一ト DNAJという）を保持する発現べクタ一を次のように構築した。 3 gの pBALOを制限酵素 "〃/、 Aflll (宝酒造社）で消化し、発現に不要と考えられる約 2.2kbp の 3' 側領域と、欠失インサート DMA を含む約 9.4kbpのベクター断片とに分断した。そしてベクター断片のみを抽出し、その末端を T4 DNA Polymerase (宝酒造社）で末端平滑化した後、 Ligation Ki t ver.2 (宝酒造社）を用いてセルフライゲーシヨンさせた。このようにして得られた発現ベクターを用いて大腸菌 DH5株（T0Y0B0社）を形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を選択した。選択されたクローンの保持するプラスミドを PBALO- Dと名づけ新たな発現ベクターとして以降の実験に用いた（図 4 )。

<実施例 1 4 >

[形質転換体の取得とリシル才キシダーゼ活性の測定]

実施例 9 ~ 1 1 と同様の手順で、 pBALO- D を導入した形質転換体のリシル才キシダーゼ活性を測定した。反応時間が 8時間の測定用サンプルを用いた測定結果を回 5に示す。尚、リジンダイマー量の増大が確認されたサンプルの結果のみを抜粋して示した。これらの表及びグラフから明らかなように、実施例 1 1 の結果と同様にコントロール（ABPU1 株）に比較して 5倍以上も高い活性を示す形質転換体 L0D- 9、 16が得られた。この結果から、 pBALO- Dはリシルォキシダーゼ遺伝子を発現可能な状態に保持していることが確認された。したがって、 pBALO- D が保持する欠失インサート DNA (配列番号 1 ) はリシルォキシダーゼ遺伝子の発現に必要な配列を有していることが判明した。以上のように、本実施例によってリシル才キシダ一ゼ遺伝子を発現させるのに必要な最小領域が更に特定された。この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。産業上の利用の可能性本発明によれば、糸状菌由来のリシル才キシダーゼ及びそれをコードする D N Aが提供される。本発明の D N Aを利用すれば、安全性の高い糸状菌を用いたリシル才キシダーゼの生産系が構築される。

Claims

請求の範囲

1 . 以下の（a)又は（b)のタンパク質からなるリシル才キシダーゼ：

(b)配列番号 2で示されるアミノ酸配列の一部を改変したアミノ酸配列を有し. リシル才キシダーゼとして機能するタンパク質。

2. 以下の（A)又は（B)の DNA：

(A) 請求の範囲第 1項に記載のリシル才キシダーゼをコードする DNA；

(B) (A) の DNAとストリンジェン卜な条件下で八イブリダィズし、それがコードするタンパク質がリシル才キシダーゼとして機能する DNA。

3. 以下の（i)~ (i i i)のいずれかの配列を有する DNA：

(i)配列番号 3で示される塩基配列；

(i i)配列番号 4で示される塩基配列；

(i M)配列番号 5で示される塩基配列；

(iv)配列番号 6で示される塩基配列；

(V)配列番号 1 で示される塩基配列；

(vi)配列番号 7で示される塩基配列。

4. 請求の範囲第 2項に記載の DNAを保持するべクタ一。

5. 請求の範囲第 2項に記載の DNAが外来的に導入されている糸状菌。

6. 以下の（1)及び（2)のステップを含む、リシル才キシダーゼの生産方法 ( 1 )請求の範囲第 5項に記載の糸状菌を、前記 DNAのコードするタンパク質が産生可能な条件で培養するステップ；及び

(2)産生されたタンパク質を回収するステップ。