CN104981542B - 重组系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在靶位点进行重组的方法，该方法包括：提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；和(c)编码识别位点特异性重组位点的重组酶的序列，其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸，并且其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列；以及使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点插入编码有功能重组酶的连续核酸序列，所述编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。
Description
发明领域
本发明涉及在靶位点进行重组的方法。
发明背景
不同的细胞类型可以用于不同的工业目的。例如哺乳动物细胞系用于抗体生产；真菌细胞是生产多肽和次级代谢物的优选生物；细菌细胞优选用于小的代谢物和抗体的生产；植物细胞优选用于口味和风味化合物。
重组技术广泛用于这样的细胞和/或使用这样的细胞的方法的生产力的最优化。这可涉及大量的选择，包括但是不限于过表达感兴趣的基因，竞争途径的缺失或失活，改变酶的区室化(compartmentalization)，增加蛋白或代谢物分泌，增加细胞器含量(organelle content)等。
就丝状真菌而言，可获得的可选择标记有限使新细胞系的构建复杂化。典型地，靶序列在体外被改变以产生带有插入的抗生素抗性标记的突变等位基因。然而，鉴于大规模使用携带抗性基因的生产菌株将这种基因扩散到生物圈的潜在风险，大多数国家的监管机构反对使用抗生素抗性标记。此外，适用于丝状真菌的可选择标记数量有限。因此，可需要除去可选择标记基因以使生产菌株可以在商业上使用和/或以使同样的标记基因可以在连续的菌株修饰中再循环利用。
发明概述
本发明涉及在例如靶基因组内在靶位点(target locus)或多个靶位点(targetloci)进行重组的方法。本发明所述的重组方法导致靶位点的改变，例如在靶位点插入核酸序列。可实施所述的方法以使在靶位点插入新的序列并伴随从靶位点除去现存的序列。也就是说，所述方法可被用于将靶位点上的序列替换为替代性序列。所述方法可方便地在宿主细胞体内实施。
典型地，当在体内实施时，不对人类或动物细胞实施本发明所述的方法。也就是说，典型地不以治疗方法的形式实施本发明所述的方法。可以离体或体外方式实施本发明所述的方法。术语离体或体外应被理解为包括对微生物(对完整活细胞或非细胞物质二者)实施的方法，但排除对人类或动物实施的方法。
典型地，实施所述方法使至少部分插入在靶位点的序列随后被移除。如果实施所述的方法以在靶位点替换序列并随后移除插入的序列，那么结果可以是使靶位点的序列缺失。
因此，可实施本发明所述的方法以改变靶位点的序列。这种改变可以是，例如添加新的序列、置换现存的序列和/或缺失/去除现存的序列。
典型地，本发明在宿主细胞体内进行。宿主细胞可以优选地是生产感兴趣的化合物的细胞。宿主细胞可以在应用本发明方法之前能够生产感兴趣的化合物。在这种情况下，本发明的方法可以用于修饰靶位点以使通过宿主细胞的感兴趣的化合物的生产改变，例如可以增加产量。或者，宿主细胞可以是由于应用本发明的方法而生产感兴趣的化合物的细胞。
因此根据本发明，提供了在靶位点进行重组的方法，该方法包括：
-提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；和(c)编码识别位点特异性重组位点的重组酶的序列，
其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸，并且
其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列；以及
-使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点插入编码有功能重组酶的连续核酸序列，所述编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。
附图简述
图1阐述了通过直接整合的ICL1移除以及分开的cre重组酶(split-crerecombinase)构建体的体内重组的原理。Cre-重组酶的表达受到GAL1启动子的调控。
图2阐述了pMA Cre-1和pMA Cre-2(pSUC225)的质粒图。pMA Cre-1包含lox66位点，GAL1启动子和失活的Cre重组酶开放阅读框5’部分，pSUC225包含Cre重组酶开放阅读框的3’失活部分、CYC1终止子和lox71位点。
图3阐述了pSUC227的质粒图。所述质粒包含lox66位点，kanMX标记盒，GAL1启动子和失活的Cre重组酶开放阅读框5’部分。
图4阐述了利用引物对DBC-03670和DBC-03761扩增ICL1基因的基因组位点的PCR反应，在野生型情况下产生3449bp PCR片段，和在标记被lox66和lox71的重组移除的KO情况下产生1812bp PCR片段。
图5阐述了质粒pEPO-US的示意图，其包含用于失活在A.niger和E.coli质粒DNA中的epo基因的置换盒的部分。该置换盒包含用于靶向的epo侧翼区域，突变loxP位点，功能性hygB标记盒和可诱导的cre重组酶表达盒。更多pEPO-US的细节可以在实施例部分找到(见下)。
图6阐述了质粒EPO-DS的示意图，其包含用于失活在A.niger和E.coli质粒DNA中的epo基因的置换盒的部分。该置换盒包含用于靶向的epo侧翼区域，cre重组酶表达盒，突变loxP位点。更多EPO-DS的细节可以在实施例部分找到(见下)。
图7阐述了5’分开的CRE片段和3’分开的CRE片段的片段产生以及如何在A.niger的转化和靶向重组中使用这些重叠的片段的可行设计的示意图。上图表示待靶向基因的基因组DNA组成。中间图显示通过PCR扩增的“5’分开的CRE”和“3’分开的CRE”片段的生成。下图显示通过基因组中5’分开的CRE和3’分开的CRE的同源重组的A.niger转化。
序列表描述
SEQ ID NO：1阐述了Cre-1合成片段的核酸序列。
SEQ ID NO：2阐述了Cre-2合成片段的核酸序列。
SEQ ID NO：3阐述了pMA Cre1完全的核酸序列。
SEQ ID NO：4阐述了pMA Cre2(pSUC225)完全的核酸序列。
SEQ ID NO：5阐述了pUG7-EcoRV完全的核酸序列。
SEQ ID NO：6阐述了引物DBC-02738的核酸序列。
SEQ ID NO：7阐述了引物DBC-02739的核酸序列。
SEQ ID NO：8阐述了带有kanMX标记PCR片段的pCR-Blunt II-TOPO载体的核酸序列。
SEQ ID NO：9阐述了pSUC227的核酸序列。
SEQ ID NO：10阐述了ICL1基因上游的5’侧翼片段的核酸序列。
SEQ ID NO：11阐述了引物DBC-03754的核酸序列。
SEQ ID NO：12阐述了引物DBC-03755的核酸序列。
SEQ ID NO：13阐述了ICL1基因下游的3’侧翼片段的核酸序列。
SEQ ID NO：14阐述了引物DBC-03758的核酸序列。
SEQ ID NO：15阐述了引物DBC-03759的核酸序列。
SEQ ID NO：16阐述了“Cre-1-kanMX”片段的核酸序列。
SEQ ID NO：17阐述了引物DBC-03756的核酸序列。
SEQ ID NO：18阐述了引物DBC-03373的核酸序列。
SEQ ID NO：19阐述了Cre-2片段的核酸序列。
SEQ ID NO：20阐述了引物DBC-03374的核酸序列。
SEQ ID NO：21阐述了引物DBC-03757的核酸序列。
SEQ ID NO：22阐述了引物DBC-03760的核酸序列。
SEQ ID NO：23阐述了引物DBC-03761的核酸序列。
SEQ ID NO：24阐述了DBC-03760和DBC-03761野生型ICL1的产物的核酸序列。
SEQ ID NO：25阐述了DBC-03760和DBC-03761ICL1缺失和kanMX标记和Cre重组酶外重组的产物的核酸序列。
SEQ ID NO：26阐述了引物DBC-07072和引物DBC-08586的产物的核酸序列。
SEQ ID NO：27阐述了引物DBC-08585和引物DBC-04415的产物的核酸序列。
SEQ ID NO：28阐述了引物DBC-07072的核酸序列。
SEQ ID NO：29阐述了引物DBC-08586的核酸序列。
SEQ ID NO：30阐述了引物DBC-08585的核酸序列。
SEQ ID NO：31阐述了引物DBC-04415的核酸序列。
发明详述
在本说明书和所附权利要求书通篇中，词语“包括”、“包含”和“具有”应被解释为包括性的。也就是说，在上下文允许时，这些词语旨在表达可能包括未明确指出的其他要素或整体。
不使用数量词时表示一个或多于一个(即一个或至少一个)的客体。例如，“要素”可表示一个要素或多于一个要素。
根据本发明所述的方法被用于在靶位点实施重组。重组指的是核酸的分子被打断然后被连上不同核酸分子的过程。本发明的重组过程典型地涉及人工和有目的地重组不同核酸分子(其可来自于相同或不同生物体)以创造重组的核酸。
术语“重组”的意思是，例如核酸序列是通过人工组合两种否则分开的序列区段(例如通过化学合成或通过用基因工程技术处理分离的核酸)得到的。
本发明所述的方法依赖于同源重组和位点特异性重组的结合。
“同源重组”指的是具有包含相似核苷酸序列的对应位点的核苷酸序列(即同源序列)之间的反应，通过所述反应分子能够相互作用(重组)以形成新的、重组的核酸序列。相似核苷酸序列的位点在本文中被分别称为“同源序列”。典型地，同源重组的频率随着同源序列的长度的增加而增加。因此，虽然同源重组能够在不完全相同的两种核酸序列之间发生，但随着两种序列之间的差异的增加，重组频率(或效率)下降。可使用将被结合的两种分子的每一种上的一种同源序列以实现重组，从而产生“单交换”的重组产物。或者，两种同源序列可被放置将被重组的两种分子的每一种上。供体上的两种同源序列和靶标上的两种同源序列之间的重组产生“双交换”的重组产物。
如果供体分子上的同源序列的侧翼是将被操作的序列(例如感兴趣的序列)，那么与靶分子的双交换重组将产生这样的重组的产物，其中感兴趣的序列置换本来位于靶分子上的同源序列之间的DNA序列。
“位点特异性重组”(也被称为保守的位点特异性重组)是核酸链的交换发生在仅具有有限程度的序列同源性的区段之间的一类重组。位点特异性重组酶识别和结合短DNA序列(位点)，在此处切割DNA骨架、交换参与的两种DNA螺旋并重新连接DNA链，从而使核酸区段重新排列。在一些位点特异性重组系统中，仅仅具有重组酶连同重组位点就足以执行所有这些反应；在另一些系统中，可能还需要一些辅助蛋白和辅助位点。
所述方法可被用于在靶位点实施重组以导致靶位点的修饰。因此，本发明可被用于添加、缺失或以另外的方式改变靶位点。靶位点可以是编码序列或非编码序列。可利用本发明所述的方法以使这种编码或非编码序列可被破坏和/或部分或完全缺失和/或置换。因此，本发明所述的方法可被用于置换靶位点的序列，例如用编码标记的序列。
典型地，在宿主细胞(例如微生物的细胞)体内实施本发明。优选地，宿主细胞可产生感兴趣的化合物。所述宿主细胞可以在应用本发明所述的方法之前能够产生感兴趣的化合物。在这种情况下，本发明所述的方法可被用于修饰靶位点以使所述宿主细胞的感兴趣的化合物的生产改变，例如可以增加产量。或者，所述宿主细胞可以由于应用本发明所述的方法而产生感兴趣的化合物。
因此，本发明可被用于，例如最优化宿主细胞的生产力和/或使用它们的工艺。或者，本发明可被用以，例如引入新的核酸以使宿主细胞能够产生感兴趣的新化合物。本发明可被连续使用以引入多个新的核酸序列至宿主细胞，从而引入全新的通路代谢通路。
靶位点可以是待修饰的任何核酸序列。典型地，靶位点可以是基因组(生物体的完整遗传物质)内的序列，例如染色体上的位点。这种染色体可以是线型或环形的染色体。然而，靶位点可以在染色体外，例如质粒、微型染色体或人工染色体上的位点。靶位点可以位于质粒、噬菌体或任何其它能够在体外或在宿主细胞中复制或者被复制的核酸序列。
本发明的方法可以在体外，离体或体内进行。
本发明的方法包括：
-提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；和(c)编码识别位点特异性重组位点的重组酶的序列，
其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸，并且
其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列；以及
-使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点插入编码有功能重组酶的连续核酸序列，所述编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。
本发明中，两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列。也就是说，编码重组酶的序列在两种或更多种核酸中的至少两种之间分开。因此，该方法可被称为分开重组酶法(split-recombinase approach)。可以在体内实施位点特异性重组位点之间的核酸序列的外重组。
本发明所述的方法中，体内重组可以在任何合适的宿主细胞中进行，例如在原核细胞或真核细胞中进行。
在本发明的方法中，在体内实施核酸的相互重组以及与靶位点的重组。
本发明所述的方法中，提供两种或更多种核酸。所述的两种或更多种核酸总共提供：(a)能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；和(c)编码识别位点特异性重组位点的重组酶的序列。
这并不意味着两种或更多种核酸中的每一种都包含(a)、(b)和(c)中所描述的序列。而是，两种或更多种核酸被总合在一起成为组时，这些核酸必须包含(a)、(b)和(c)中所描述的序列。因此，一种核酸可包含(a)、(b)和(c)中所描述的一种或更多种序列，第二种核酸可包含(a)、(b)和(c)中所描述的另一些序列。典型地，两种或更多种核酸中的每一种都将包含(a)、(b)和(c)中所描述的至少一种序列。然而，也可以提供不包含(a)、(b)或(c)中所描述的至少一种序列的额外核酸。
图1展示了所述方法的一种方式，其中使用4种核酸，但技术人员将很容易想到更多的方式。所述方法中使用的核酸的数目可以是2、3、4、5、6或更多。
典型地，编码重组酶的序列在两种核酸序列之间分开(这两种核酸序列中的每一种都编码无功能的部分重组酶，但当二者被重组时将编码有功能重组酶)。然而，编码重组酶的序列可被分开为3种、4种或更多种核酸序列。
当编码重组酶的序列在两种核酸序列之间分开时，典型地这两种序列中的每一种都还可以包含位点特异性重组位点。图1中展示了这种方法。或者，位点特异性重组位点可由能够与包含编码重组酶的序列的核酸序列重组的额外核酸序列提供。
在本发明所述的方法中，两种或更多种核酸能够相互同源重组以产生单一核酸。由于能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列的存在，核酸在靶位点作为单一连续序列整合。此外，两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列。
因此，在本发明的方法中，两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组。以这种方式，编码有功能重组酶的连续核酸序列可与至少两个位点特异性重组位点一起被插入至靶位点。这种有功能的编码编码的的序列典型地被插入在靶位点以使其侧翼是至少两个位点特异性重组位点。当重组酶表达时，位于位点特异性重组位点之间的序列可被外重组(out-recombined)。如果重组酶序列位于位点特异性重组位点之间，那么它将被外重组。然而，如果重组酶序列位于位点特异性重组位点之外，那么其将被保留在靶位点。
当重组发生后，位点特异性重组位点和重组酶序列的侧翼将会是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。
可实施本发明所述的方法以同时靶向多于1个(例如2、3、4、5或更多个)靶位点。在这种方法中，所述两种或更多种核酸总共包含能够与两个或更多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列。以这种方式，所述两种或更多种核酸相互重组并与靶位点的侧翼序列重组，从而导致每个靶位点处插入至少两个位点特异性重组位点。所提供的两个位点特异核酸使得编码有功能重组酶的连续核酸序列被插入在至少一个靶位点，任选地位于至少两个位点特异性重组位点之间。其它靶位点不必须地包含编码有功能重组酶的序列，但每个靶位点将包含至少两个位点特异性重组位点(可被重组酶靶向)。也可实施本发明所述的方法以在所有或一些靶位点插入编码重组酶的序列。
再次，在每个靶位点，所述位点特异性重组位点以及任何编码重组酶的序列的侧翼都将是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列。
本发明的方法中，所述两种或更多种核酸能够相互重组以产生单一核酸。由于能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列的存在，核酸在靶位点作为单一连续序列被整合。
更详细地，本发明所提供的两种或更多种核酸总共包含能够同源重组针对靶位点的两个或更多个同源重组位点的序列。典型地当所述方法靶向单一的靶位点时，所述两种或更多种核酸将提供两种这样的序列。这些序列被提供以使包含至少两种或更多种核酸的连续核酸序列(当被相互重组时)通过与靶序列侧翼的基本同源的序列重组而被插入在靶位点。
为了通过双交换事件实现同源重组，需要这些侧翼序列存在于通过所述两种或更多种核酸的重组得到的连续序列的两侧/端且需要与靶位点两侧的序列基本同源，这对技术人员而言是显而易见的。因此，能够同源重组的序列典型地被提供以使它们位于通过所述两种或更多种核酸的重组得到的核酸序列的“5’”和“3’”末端。
此外，根据本发明所提供的至少两种核酸能够相互重组。因此，核酸的末端被方便地设计以使相互重组能够发生且核酸将以期望的方向和顺序被组装。因此，所提供的核酸的末端序列将与想要与之重组的核酸的末端序列基本同源。
本发明所使用的术语“基本同源”的意思是：第一核酸序列与想要与之重组的第二核酸序列在不多于约3kb，优选地不多于约2kb，更优选地不多于约1kb，甚至更优选地不多于约0.5kb，甚至更优选地不多于约0.2kb，甚至更优选地不多于约0.1kb，如不多于约0.05kb，例如不多于约0.03kb的区域中的同一性程度为至少约70％，至少约80％，优选地至少约90％。因此，所需的同一性程度可取决于基本同源序列的长度。同源序列越短，同源性百分比可越高。
在本发明中，所述两种或更多种核酸总共包含两个或更多个位点特异性重组位点。这些位点特异性重组位点被由两种或更多种核酸总共编码的重组酶识别。关键的是，提供所述两种或更多种核酸以使至少两种核酸各包含编码无功能的部分重组酶编码序列。当重组两种或更多种核酸时，这产生编码有功能重组酶的连续序列。
所述位点特异性重组位点和重组酶被选择以使重组酶可以靶向位点特异性重组位点，导致位于重组位点之间的序列被外重组(out-recombination)。
术语“重组酶”或“位点特异性重组酶”或其类似物指的是识别和结合至短核酸位点或“位点特异性重组位点”(即重组酶识别位点)并催化与这些位点相关的核酸重组的酶或重组酶。这些酶包括重组酶、转座酶和整合酶。
“位点特异性重组位点”或其类似物指的是短核酸位点或序列(即重组酶识别位点)，其被序列或位点特异性重组酶识别并在位点特异性重组事件过程中变成交换(crossover)区域。序列特异性重组酶靶位点的实例包括但不限于lox位点、att位点、dif位点和frt位点。
本文中使用的术语“lox位点”指的是一种核苷酸序列，其中噬菌体P1的cre基因的产物(Cre重组酶)能够在该序列上催化位点特异性重组事件。本领域已知多种lox位点，包括天然存在的loxP、loxB、loxL和loxR以及大量突变的或变体lox位点，例如lox66、lox71、loxP511、loxP514、loxΔ86、loxΔ117、loxC2、loxP2、loxP3和lox P23。
本文中使用的术语“frt位点”指的是一种核苷酸序列，其中酵母2微米质粒的FLP基因的产物(FLP重组酶)能够在该序列上催化位点特异性重组。
位点特异性重组位点可使重组酶表达后的外重组在靶位点产生不被重组酶识别的单个突变位点特异性重组位点。特别地，所述lox位点可以是lox66和lox71(Albert，H.，Dale，E.C.，Lee，E.，&Ow，D.W.(1995)).Site-specific integration of DNA into wild-type and mutant lox sites placed in the plant genome.Plant Journal，7(4)，649-659)。
除了重组酶、位点特异性重组位点和能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列之外，可以进行这样的方法：其中两种或更多种核酸总共包含编码标记的序列，以使两种或更多种核酸的重组导致所述标记编码基因序列被插入在靶位点。这种编码标记的序列可位于至少两种能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列之间。
典型地，可实施所述方法以使编码标记的序列位于两个或更多个位点特异性重组位点之间。以这种方式，标记基因可通过重组酶的表达被外重组。
以这种方式，可以使用相同的标记以重复模式实施所述方法多于一个重组循环。可进一步将这种方法与突变位点特异性重组位点的使用相结合，其中一旦标记被外重组，所述位点就不能被重组酶靶向。
在本发明的方法中，两种或更多种核酸总共可包含两种或更多种不同的标记编码序列以使所述两种或更多种核酸的重组导致不同的标记基因编码序列被插入在各靶位点。可提供能够与两个或更多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列以实施这种方法。进一步，可以使用一种标记靶向至少两个靶位点并使用不同的标记靶向一个或更多个其它靶位点。
在本发明所述的方法中，靶位点可包含被破坏和/或部分或全部缺失的编码序列。典型地，所述方法在靶位点增加新序列；这种新序列典型地将置换靶位点的序列。
如上所述，当在宿主细胞体内实施重组时，置换序列可以例如赋予可选择的表型。在这种情况下，所述置换序列包含选择标记。优选地，实施这种方法以使标记可通过重组酶的表达被外重组。
置换序列还可以是靶序列的经修饰形式，例如以改变对感兴趣的序列的调控或表达与原始基因产物相比性质改变的经修饰的基因产物。
置换序列还可以组成已存在于宿主细胞基因组中的感兴趣的序列的额外拷贝，以扩增所述感兴趣的序列。
置换序列可以相对于宿主细胞是同源的或异源的序列。其可以从任何合适的来源获得或者可通过订制合成制备。
靶序列可以是任何感兴趣的序列。例如，靶序列可以是利用失活或修饰该序列而被研究其功能的序列。靶序列还可以是这样的序列，其失活、修饰或过表达是期望的以赋予宿主细胞期望的表型。典型地，本发明所述的方法将导致靶位点的一些核酸序列被移除。然而，本发明所述的方法可被用于在靶位点插入序列而不从靶位点丢失任何序列。
在本公开的上下文中，术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”、“核酸片断”、“分离的核酸片段”在本文中可被交换使用。
这些术语包括核苷酸序列及其类似物。核酸可以是可为单链或双链的DNA或RNA的聚合物，任选地，其含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。
DNA聚合物形式的核酸可包括cDNA、基因组DNA、合成DNA的一种或更多种区段，或其混合物中。
术语“分离的核酸”和其类似物指的是大体上不含其它核酸序列(例如但不限于其它染色体的和染色体外的DNA和/或RNA)的核酸。可从分离的核酸天然存在的宿主细胞中将其纯化。
可使用技术人员已知的常规核酸纯化方法获得分离的核酸。该术语还包括重组的核酸和化学合成的核酸。典型地，可利用本领域已知的任何扩增方法(例如PCR、RT-PCR等)产生适用于本发明的两种或更多种核酸中的每一种。本文中使用的术语“扩增”或“扩增反应”指的是用于增加核酸中靶序列拷贝的任何体外方法。有时候，扩增指的是靶核酸的“指数”增加。然而，本文中使用的“扩增”还可以指选择的核酸靶序列的数目线性增加，但典型地不同于一次、单引物延伸步骤。
典型地，两种或更多种核酸被引入宿主细胞以使重组事件可发生。可使用本领域技术人员公知的多种技术将所述的两种或更多种核酸引入宿主细胞。被用于引入异源的核酸至多种生物体的方法的非限制性实例包括：转化、转染、转导、电穿孔、超声介导的转化、粒子轰击等。在某些情况下，加入载体分子能够增加典型地被认为很难通过常规方法转化的细胞对DNA的摄取。技术人员易于得知转化的常规方法。
用于产生两种或更多种核酸以及之后将它们引入宿主细胞的程序是本领域技术人员公知的。(参见，例如Sambrook&Russell，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第三版，CSHL Press，Cold Spring Harbor，NY，2001；和Ausubel et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley InterScience，NY，1995)。
此外，标准的分子生物学技术(例如DNA分离、凝胶电泳、核酸的酶促限制性修饰、Southern分析、细胞的转化等)是技术人员已知的且被例如Sambrook等(1989)"MolecularCloning：a laboratory manual"，Cold Spring Harbor Laboratories，Cold SpringHarbor，New York和Innis等(1990)″PCR protocols，a guide to methods andapplications″Academic Press，San Diego描述。
可以按照标准的PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板和恰当的寡核苷酸引物扩增适用于本发明所述的方法的核酸。由此扩增的核酸可被克隆至恰当的载体(如果期望)和/或通过核酸序列分析被表征。
可实施本发明所述的方法以使两种或更多种核酸被重组为单一核酸，之后其与靶位点重组。
可实施本发明所述的方法，其中所述两种或更多种核酸的相互重组以及与靶位点的重组同时发生。
在本发明所述的方法中，至少两种核酸中的两种可各包含编码重组酶的序列的一部分以使它们总共包含完整的编码重组酶的序列。
可实施本发明所述的方法以表达针对位点特异性重组位点的重组酶，从而使位于两个位点特异性重组位点之间的序列被外重组。
重组酶的表达典型地受能够使重组酶在宿主细胞表达的启动子的控制。也就是说，编码重组酶的序列典型地与启动子序列可操作地连接。术语“启动子”在本文中被定义为下述DNA序列：其与RNA聚合酶结合并且将聚合酶引导至编码生物化合物的核酸序列的正确下游转录起始位点以起始转录。RNA聚合酶有效地催化与编码区的合适DNA链互补的信使RNA的组装。术语“启动子”还可被理解为包括用于在转录成mRNA之后的翻译的5’-非编码区(启动子和翻译起点之间)、顺式作用转录控制元件(如增强子)和能与转录因子相互作用的其它核苷酸序列。
启动子可以是显示转录活性的适用于真核或原核宿主细胞的任何适当的启动子序列，其包括突变的启动子、截短的启动子和杂合的启动子，可以从编码相对于细胞是同源的(天然的)或异源的(外源的)的胞外或胞内多肽的多核苷酸中获得启动子。启动子可以是组成型或诱导型启动子。通过诱导性启动子表达重组酶将允许位于位点特异性重组位点之间的序列的外重组被控制，例如包括编码重组酶的序列。
可使用的诱导型启动子的实例是淀粉-、纤维素-、半纤维素(比如木聚糖-和/或木糖-诱导型)、铜-、油酸-诱导型启动子。启动子可选自下述组，该组包括但不限于从编码以下的多核苷酸中获得的启动子：A.oryzae TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、A.niger中性α-淀粉酶、A.niger酸稳定的α-淀粉酶、A.niger或A.awamori葡糖淀粉酶(glaA)、A.niger或A.awamori木聚糖内切酶(xlnA)或β-木糖苷酶(xlnD)、T.reesei纤维二糖水解酶I(CBHI)、R.miehei脂肪酶、A.oryzae碱性蛋白酶、A.oryzae磷酸丙糖异构酶、A.nidulans乙酰胺酶、Fusarium venenatum淀粉葡糖苷酶(WO00/56900)、Fusariumvenenatum Dania(WO00/56900)、Fusarium venenatum Quinn(WO00/56900)、Fusariumoxysporum类胰蛋白酶蛋白酶(WO96/00787)、Trichoderma reeseiβ-葡萄糖苷酶、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶I、Trichoderma reesei纤维二糖水解酶II、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶I、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶II、Trichodermareesei内切葡聚糖酶III、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶IV、Trichoderma reesei内切葡聚糖酶V、Trichoderma reesei木聚糖酶I、Trichoderma reesei木聚糖酶II和Trichoderma reeseiβ-木聚苷酶，和NA2_tpi启动子(来自于编码A.niger中性α-淀粉酶和A.oryzae磷酸丙糖异构酶的多核苷酸的启动子的杂合物)及其突变的、截短的和杂合的启动子。启动子的另一些实例是WO2006/092396和WO2005/100573中描述的启动子，其通过引用而被并入本文。使用启动子的另一实例描述于WO2008/098933中。
如本文所述，在本发明所述的方法中，所述两种或更多种核酸总共可包含编码标记的序列以使所述两种或更多种核酸的重组导致所述编码标记的序列被定位于同源重组位点之间。
两种或更多种核酸的重组可导致所述编码标记的序列被定位于位点特异性重组位点之间以使标记可通过重组酶的表达而被外重组。
可以使用任何合适的标记并且公知这种标记用于确定核酸是否被包括在细胞内。典型地，标记(例如可选择标记)允许易于选择被转化的细胞。可选择标记是其产物提供杀虫剂或病毒抗性、重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。
标记基因的实例包括但不限于：(1)核酸区段，其编码的产物提供对否则有毒的化合物的抗性(例如抗生素)；(2)核酸区段，其编码在受体细胞中否则缺乏的产物(例如必需产物、tRNA基因、营养缺陷型标记)；(3)核酸区段，其编码的产物抑制基因产物的活性；(4)核酸区段，其编码的产物可易于被鉴定(例如表型标记(例如抗生素抗性标记(例如β-内酰胺酶))、β-半乳糖苷酶、荧光或其它有色标记(例如绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、红色荧光蛋白(RFP)和青色荧光蛋白(CFP)和细胞表面蛋白)；(5)核酸区段，其与否则对细胞生存和/或功能有害的产物结合；(6)核酸区段，其抑制以上1-5中所述的任何核酸区段的活性(例如反义寡核苷酸)；(7)核酸区段，其与修饰底物的产物结合(例如限制性内切酶)；(8)核酸区段，其可被用于分离或鉴定期望的分子(例如特异性蛋白结合位点)；(9)核酸区段，其编码否则可无功能的特定核苷酸序列(例如分子亚群的PCR扩增)；(10)核酸区段，当其缺失时，将直接或间接授予对特定化合物的抗性或敏感性；(11)核酸区段，其编码在受体细胞中有毒的或将相对无毒的化合物转化为有毒的化合物的产物(例如单纯疱疹胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶)；(12)核酸区段，其抑制含有它们的核酸分子的复制、分离或遗传性；和/或(13)核酸区段，其编码条件性复制功能(例如在某些宿主或宿主细胞株中或者在某些环境条件(例如温度、营养条件等)下复制)。
在丝状真菌细胞中使用的可选择标记可选自下述组，该组包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、bleA(腐草霉素结合)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5′-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶)、NAT或NTC(诺尔斯菌素)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及来源于其它物种的等同物。优选的用于Aspergillus和Penicillium细胞是amdS(见例如EP 635574 B1，EP0758020A2，EP1799821A2，WO 97/06261A2)和A.nidulans或A.oryzae的pyrG基因和Streptomyces hygroscopicus的bar基因。更优选地，使用amdS基因，甚至更优选使用来自A.nidulans或A.niger的amdS基因。最优选的可选择标记基因是A.nidulans amdS编码序列融合至A.nidulans gpdA启动子(EP635574B1)。另一些优选的AmdS标记是在WO2006/040358中描述的标记。也可以使用来自其他丝状真菌的AmdS基因(WO 97/06261)。
本发明的方法中，体内重组可以在任何合适的宿主细胞中进行，例如在原核或真核细胞中进行。合适的真核宿主细胞可以是哺乳动物，昆虫，植物，真菌，或藻类细胞。宿主细胞可以是微生物或微生物宿主细胞，例如原核或真核宿主细胞。典型地，本发明的方法不会在人或动物体内进行。
典型地，根据本发明的方法所用的宿主细胞可以是适合感兴趣的化合物生产的细胞并且宿主细胞的选择可以根据这样的用途进行。例如，如果根据本发明在宿主细胞中生产的感兴趣的化合物用于食品应用，宿主细胞可以选自食品等级的生物例如Saccharomyces cerevisiae。特殊的用途包括但是不限于，食品、(动物)饲料、药物、农业例如作物保护，和/或个人护理应用。
本发明的方法可以用于赋予宿主细胞生产感兴趣的化合物的能力和/或修饰现有的感兴趣的化合物生产的方式，例如提高这样的感兴趣的化合物的产量。
适用于本发明方法的微生物宿主细胞可以是原核细胞。优选地，原核宿主细胞是细菌细胞。术语“细菌细胞”包括革兰氏阴性和革兰氏阳性微生物二者。合适的细菌可以选自例如Escherichia，Anabaena，Caulobactert，Gluconobacter，Rhodobacter，Pseudomonas，Paracoccus，Bacillus，Brevibacterium，Corynebacterium，Rhizobium(Sinorhizobium)，Flavobacterium，Klebsiella，Enterobacter，Lactobacillus，Lactococcus，Methylobacterium，Staphylococcus或Streptomyces。优选地，细菌细胞选自由B.subtilis，B.amyloliquefaciens，B.licheniformis，B.puntis，B.megaterium，B.halodurans，B.pumilus，G.oxydans，Caulobactert crescentus CB 15，Methylobacterium extorquens，Rhodobacter sphaeroides，Pseudomonaszeaxanthinifaciens，Paracoccus denitrificans，E.coli，C.glutamicum，Staphylococcus carnosus，Streptomyces lividans，Sinorhizobium melioti和Rhizobium radiobacter组成的组。
适合本发明使用的宿主细胞可以是真核宿主细胞。这样的真核细胞可以是哺乳动物，昆虫，植物，真菌或藻类细胞。优选的哺乳动物细胞包括例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，COS细胞，293细胞，PerC6细胞和杂交瘤。优选的昆虫细胞包括例Sf9和Sf21细胞以及其衍生物。更优选地，真核细胞是真菌细胞，例如酵母细胞，例如Candida，Hansenula，Kluyveromyces，Pichia，Saccharomyces，Schizosaccharomyces或Yarrowia菌株。更优选来自Kluyveromyces lactis，S.cerevisiae，Hansenula polymorpha，Yarrowia lipolytica和Pichia pastoris。最优选地，真核细胞是丝状真菌细胞。
丝状真菌包括Eumycota和Oomycota亚门的所有丝状形式(由Hawksworth等，Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，第8版，1995，CAB International，University Press，Cambridge，UK定义)。丝状真菌的特征是菌丝体的壁由甲壳质，纤维素，葡聚糖，壳聚糖，甘露聚糖和其他复杂的多糖构成。营养生长通过菌丝延长并且碳代谢专性需氧。丝状真菌菌株包括但是不限于以下的菌株：Acremonium，Agaricus，Aspergillus，Aureobasidium，Chrysosporium，Coprinus，Cryptococcus，Filibasidium，Fusarium，Humicola，Magnaporthe，Mucor，Myceliophthora，Neocallimastix，Neurospora，Paecilomyces，Penicillium，Piromyces，Panerochaete，Pleurotus，Schizophyllum，Talaromyces，Thermoascus，Thielavia，Tolypocladium，和Trichoderma。
优选的丝状真菌细胞属于Acremonium，Aspergillus，Chrysosporium，Myceliophthora，Penicillium，Talaromyces，Thielavia，Fusarium或Trichoderma属的物种，最优选的物种是Aspergillus niger,Acremonium alabamense，Aspergillus awamori，Aspergillus foetidus，Aspergillus sojae，Aspergillus fumigatus，Talaromycesemersonii，Aspergillus oryzae，Chrysosporium lucknowense，Fusarium oxysporum，Myceliophthora thermophila，Trichoderma reesei，Thielavia terrestris或Penicillium chrysogenum。更优选的宿主细胞属于Aspergillus属，更优选地，宿主细胞属于物种Aspergillus niger。当根据本发明的宿主细胞是Aspergillus niger宿主细胞时，宿主细胞优选地CBS 513.88、CBS124.903或其衍生物。
丝状真菌的几种菌株在许多培养物保藏机构易于被公众获得，例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC))，德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM))，真菌生物多样性中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures(CBS))，农业研究服务专利培养物保藏北区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection，Northern Regional Research Center(NRRL))和俄罗斯莫斯科的俄罗斯科学院的全俄微生物保藏中心(All-Russian Collection of Microorganisms of Russian Academy ofSciences)(俄文缩写-VKM、英文缩写-RCM)。本发明上下文中用到的菌株可以是Aspergillus niger CBS 513.88，CBS124.903，Aspergillus oryzae ATCC 20423，IFO4177，ATCC 1011，CBS205.89，ATCC 9576，ATCC14488-14491，ATCC 11601，ATCC12892，P.chrysogenum CBS 455.95，P.chrysogenum Wisconsin54-1255(ATCC28089)，Penicillium citrinum ATCC38065，Penicillium chrysogenum P2，Thielaviaterrestris NRRL8126，Talaromyces emersonii CBS 124.902，Acremonium chrysogenumATCC 36225或ATCC 48272，Trichoderma reesei ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC26921，Aspergillus sojae ATCC11906，Myceliophthora thermophila C1，Garg27K，VKM-F3500D，Chrysosporium lucknowense C1，Garg 27K，VKM-F3500D，ATCC44006和其衍生物。
优选地，已经在基因组中进行了导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺陷的本发明微生物宿主细胞未进行破坏编码负责胶霉素产生的非核糖体肽合酶的gliP基因的修饰。优选地，已经在基因组中进行了导致至少一种非核糖体肽合酶的产生缺陷的本发明微生物宿主细胞不是已被修饰以破坏编码负责胶霉素产生的非核糖体肽合酶的gliP基因的Asperigllus fumigatus宿主细胞。
优选地，当根据本发明的方法使用的宿主细胞是丝状真菌宿主细胞时，已经在基因组中进行了导致至少一种非核糖体肽合酶(优选根据本发明的非核糖体肽合酶，更优选非核糖体肽合酶npsE(见WO2012/001169))的产生缺陷的本发明微生物宿主细胞另外地在其基因组中包含编码选自以下的产物的多核苷酸的一种或更多种修饰，以使宿主细胞中至少一种由包含所述修饰的多核苷酸编码的产物缺陷：葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素，优选赭曲霉素和/或伏马毒素，和蛋白酶转录调控子prtT。
因此，真菌宿主细胞额外地包含基因组的修饰，使得葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素例如赭曲霉素和伏马毒素、优选赭曲霉素和/或伏马毒素，更优选赭曲霉素A和/或伏马毒素B2，和蛋白酶转录调控子prtT中的至少一种缺陷。优选地，宿主细胞在其基因组中额外地包含编码主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的多核苷酸的一种或更多种修饰，使得宿主细胞中主要天冬氨酸蛋白酶PepA缺陷。例如，根据本发明的宿主细胞可以进一步包含编码主要细胞外天冬氨酸蛋白酶PepA的pepA基因的破坏。优选地，根据本发明的宿主细胞在基因组中额外地包含hdfA基因编码多核苷酸的一种或更多种修饰，使得宿主细胞中hdfA缺陷。例如根据本发明的宿主细胞可以进一步包含hdfA基因的破坏。
优选地，宿主细胞可以额外地包含至少两个基本同源的DNA域，其适合整合一个或更多个拷贝的编码感兴趣的化合物的多核苷酸，其中所述至少两个基本同源的DNA域中的至少一个被改造为相比其所来源的基本同源的DNA域对编码感兴趣的化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好性，并且其中经改造的基本同源的DNA域所来源的基本同源的DNA域与所述至少两个基本同源的DNA域中的另一个相比具有至少高10％的基因转化频率。这些细胞在WO2011/009700有描述。含有两个或更多个拷贝的这些基本同源的DNA域的菌株在下文中也称为含有两个或更多个扩增子的菌株。包含这样的扩增子的宿主细胞的实例为例如在van Dijck et al，2003，Regulatory Toxicology and Pharmacology 28；27-35：On thesafety of a new generation of DSM Aspergillus niger enzyme production strains中所描述的。在van Dijck et al中，描述的Aspergillus niger菌株包含7个扩增的葡糖淀粉酶基因位点，即7个扩增子。在该上下文中，可以包含两种或更多种扩增子的优选的宿主细胞属于Acremonium，Aspergillus，Chrysosporium，Myceliophthora，Penicillium，Talaromyces，Thielavia，Fusarium或Trichoderma属的物种，以及更优选地物种Aspergillus niger，Acremonium alabamense，Aspergillus awamori，Aspergillusfoetidus，Aspergillus sojae，Aspergillus fumigatus，Talaromyces emersonii，Aspergillus oryzae，Chrysosporium lucknowense，Fusarium oxysporum，Myceliophthora thermophila，Trichoderma reesei，Thielavia terrestris或Penicillium chrysogenum。
在该上下文中优选的宿主细胞是丝状真菌宿主细胞，优选A.niger宿主细胞，其包含两个或更多个扩增子，优选两个或更多个ΔglaA扩增子(优选包含3、4、5、6、7个ΔglaA扩增子)，其中具有最高基因转化频率的扩增子已经被改造为相比于与其所源自的扩增子对编码感兴趣化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好性。扩增子的改造可以根据WO2011/009700(在此处通过引用完全并入)描述的任意一种的方法来进行。在WO2011/009700中描述的这些宿主细胞的一个实例是这样的宿主细胞：其包含三个ΔglaA扩增子(为BamHI截短扩增子、SalI截短扩增子和BglII截短扩增子)，并且其中BamHI扩增子已经被改造为相比于其所来源的BamHI扩增子对编码感兴趣化合物的多核苷酸有增强的整合偏好性。包含两个或更多个扩增子且其中一个扩增子已被改造为与其所来源的扩增子相比对编码感兴趣化合物的多核苷酸具有增强的整合偏好性的宿主细胞在下文中被称为包含经改造扩增子的宿主细胞。
优选地，根据本发明的宿主细胞额外包含Sec61的修饰。优选的SEC61修饰是产生SEC61的单向突变体的修饰；即其中从头合成的蛋白能通过SEC61进入ER但是蛋白不能通过SEC61离开ER的突变体。这样的修饰在WO2005/123763中广泛的描述。最优选地，SEC 61修饰是S376W突变，其中第376位丝氨酸被色氨酸替代。
在根据本发明的方法中使用的、非核糖体肽合酶缺陷、优选根据本发明的非核糖体肽合酶缺陷，更优选非核糖体肽合酶npsE(见WO2012/001169)缺陷的优选的丝状真菌宿主细胞中额外地具有pepA，葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)和草酸水解酶(oahA)缺陷。非核糖体肽合酶缺陷、优选上述非核糖体肽合酶缺陷的另一优选的宿主细胞额外地具有pepA，葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)和hdfA缺陷。非核糖体肽合酶缺陷、优选上述非核糖体肽合酶缺陷的另一优选的宿主细胞额外地具有pepA，葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素例如赭曲霉素和/或伏马毒素以及hdfA缺陷。非核糖体肽合酶缺陷、优选上述非核糖体肽合酶缺陷的另一优选的宿主细胞额外地具有pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素例如赭曲霉素和/或伏马毒素以及hdfA缺陷。优选地，这些宿主细胞中prtT也缺陷。因此，非核糖体肽合酶缺陷、优选上述非核糖体肽合酶缺陷的另一优选的宿主细胞额外地具有pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、毒素例如赭曲霉素和/或伏马毒素、prtT和hdfA缺陷。
非核糖体肽合酶缺陷、优选根据本发明的非核糖体肽合酶缺陷，更优选非核糖体肽合酶npsE(见WO2012/001169)缺陷的另一优选的宿主细胞中额外地具有pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、赭曲霉素、伏马毒素、prtT、hdfA缺陷并且包含SEC 61修饰，所述SEC 61修饰为其中第376位丝氨酸被色氨酸替代的S376W突变。
优选地，这些宿主细胞为丝状真菌细胞，更优选地为包含上述经改造的扩增子的A.niger宿主细胞。因此，在根据本发明的方法中使用的、非核糖体肽合酶缺陷、优选根据本发明的非核糖体肽合酶缺陷，更优选非核糖体肽合酶npsE(见WO2012/001169)缺陷的宿主细胞为额外地具有pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)和草酸水解酶(oahA)缺陷并且包含上述经改造的扩增子的丝状真菌宿主细胞优选A.niger宿主细胞。非核糖体肽合酶缺陷、优选根据本发明的非核糖体肽合酶缺陷，更优选非核糖体肽合酶npsE(见WO2012/001169)缺陷的另一优选的丝状真菌宿主细胞如A.niger宿主细胞额外地具有pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)和hdfA缺陷并且包含上述经改造的扩增子。非核糖体肽合酶缺陷、优选根据本发明的非核糖体肽合酶缺陷，更优选非核糖体肽合酶npsE(见WO2012/001169)缺陷的另一优选的丝状真菌宿主细胞如A.niger宿主细胞额外地具有pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、一种或更多种毒素优选赭曲霉素和/或伏马毒素以及hdfA缺陷并且包含上述经改造的扩增子。非核糖体肽合酶缺陷、优选根据本发明的非核糖体肽合酶缺陷，更优选非核糖体肽合酶npsE(见WO2012/001169)缺陷的另一优选的丝状真菌宿主细胞如A.niger宿主细胞额外地具有pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、一种或更多种毒素优选赭曲霉素和/或伏马毒素以及hdfA缺陷并且包含上述经改造的扩增子。非核糖体肽合酶缺陷、优选根据本发明的非核糖体肽合酶缺陷，更优选非核糖体肽合酶npsE(见WO2012/001169)缺陷的另一优选的丝状真菌宿主细胞如A.niger宿主细胞额外地具有pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、一种或更多种毒素优选赭曲霉素和/或伏马毒素、prtT以及hdfA缺陷并且包含上述经改造的扩增子。
非核糖体肽合酶缺陷、优选根据本发明的非核糖体肽合酶缺陷，更优选非核糖体肽合酶npsE(见WO2012/001169)缺陷的另一优选的丝状真菌宿主细胞如A.niger宿主细胞中额外地具有pepA、葡糖淀粉酶(glaA)、酸稳定α-淀粉酶(amyA)、中性α-淀粉酶(amyBI和amyBII)、草酸水解酶(oahA)、一种或更多种毒素优选赭曲霉素和/或伏马毒素、prtT、hdfA缺陷，包含SEC 61修饰，所述SEC 61修饰为其中第376位丝氨酸被色氨酸替代的S376W突变，并且包含上述经改造的扩增子。
典型地，本发明中，宿主细胞是产生感兴趣的化合物的细胞。宿主细胞可以在本发明的方法应用之前能够产生感兴趣的化合物。在这种情况下，本发明的方法可以用于修饰靶位点使得通过宿主细胞的感兴趣化合物的生产改变，例如可提高产量。或者，宿主细胞也可以由于本发明的方法的应用而产生的感兴趣的化合物的细胞。
感兴趣的化合物可以是初级代谢产物，次级代谢产物，肽或多肽或可以包括包含宿主细胞本身的生物量。感兴趣的化合物可以是选自以下的有机化合物：葡糖二酸、葡糖酸、戊二酸、己二酸、丁二酸、酒石酸、草酸、乙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、柠檬酸、富马酸、衣康酸、乙酰丙酸、木质酸、乌头酸、抗坏血酸、曲酸、香豆酸(comeric acid)、氨基酸、多不饱和脂肪酸、乙醇、1，3-丙二醇、乙烯、甘油、木糖醇、胡萝卜素、虾青素、番茄红素和叶黄素。或者，发酵产物可以是β-内酰胺抗生素例如青霉素G或青霉V和其发酵衍生物，头孢菌素，环孢菌素或洛伐他汀。
感兴趣的化合物可以是选自寡肽、多肽、(制药的或工业的)蛋白和酶的肽。在这些方法中，优选地由宿主细胞分泌肽，更优选地肽被分泌至培养基以使所述肽可易于通过分离宿主细胞的生物质和含有肽的培养基而被回收，例如通过离心或(超)过滤。
可在本发明的方法中生产的具有工业应用的蛋白质或(多)肽的实例包括酶，例如脂肪酶(例如用于清洁工业)，蛋白酶(用于清洁工业、酿造等)，碳水化合物酶和细胞壁降解酶(例如淀粉酶、葡糖苷酶、纤维素酶、果胶酶、β-1，3/4和β-1，6-葡糖聚酶、糖醛酸酶(rhamnoga-lacturonase)、甘露聚糖酶、木聚糖酶、支链淀粉酶、半乳聚糖酶、酯酶等，用于水果加工、酿酒等或饲料)，植酸酶、磷脂酶、糖苷酶(例如淀粉酶、β-葡糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、鼠李糖苷酶、洋芹糖苷酶(apiosidases)等)、乳制品酶和产物(例如凝乳酶、酪蛋白)、多肽(例如聚赖氨酸及其类似物、藻青素及其衍生物)。具有治疗、化妆品或诊断应用的哺乳动物(优选的是人类)多肽包括但不限于胶原和明胶、胰岛素、血清白蛋白(HSA)、乳铁蛋白和免疫球蛋白，包括其片段。所述多肽可以是抗体或其部分、抗原、凝集因子、酶、激素或激素变体、受体或其部分、调节蛋白、结构蛋白、报告子(reporter)或转运蛋白、参与分泌过程的蛋白、参与折叠过程的蛋白、分子伴侣、肽氨基酸转运蛋白、糖基化因子、转录因子、合成肽或寡肽、胞内蛋白。胞内蛋白可以是酶，例如蛋白酶、神经酰胺酶、环氧化物水解酶、氨肽酶、酰基转移酶、醛缩酶、羟化酶、氨肽酶、脂肪酶。
为了本发明的目的，此处定义：为了确定两种氨基酸序列或两种核酸序列的同一性百分比，以达到最佳比较目的比对完整的序列。为了优化两个序列之间的比对，可在被比较的两个序列中的任一个中引入缺口。在被比较的序列的全长上实施这种比对。同一性是报告的比对区域中两个序列之间的相同匹配的百分比。
可使用数学算法完成两个序列之间的序列比较和同一性百分比的确定。技术人员将了解下述事实：一些不同的计算机程序可被用于比对两个序列并判断两个序列之间的同源性(Kruskal，J.B.(1983)An overview of sequence comparison In D.Sankoff和J.B.Kruskal编，Time warps，string edits and macromolecules：the theory andpractice of sequence comparison，pp.1-44Addison Wesley)。可使用Needleman和Wunsch算法确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比以比对两个序列(Needleman，S.B.和Wunsch，C.D.(1970)J.Mol.Biol.48，443-453)。所述算法比对氨基酸序列以及核苷酸序列。Needleman-Wunsch算法已被应用于计算机程序NEEDLE。为了本发明的目的，使用来自EMBOSS包的NEEDLE程序(版本2.8.0或更高，EMBOSS：The European Molecular BiologyOpen Software Suite(2000)Rice，P.Longden，I.and Bleasby，A.Trends in Genetics16、(6)pp276-277，http://emboss.bioinformatics.nl/)。对于蛋白序列，EBLOSUM62被用作替代矩阵。对于核苷酸序列，使用EDNAFULL。可指定其它矩阵。为了本发明的目的，用于比对氨基酸序列的参数是：缺口空缺罚分为10，缺口延伸罚分为0.5。技术人员将意识到，当使用不同的算法时，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但两种序列总体的同一性百分比不会显著改变。
本文提到的蛋白序列可进一步被用作“查询序列”以针对序列数据库进行搜索，例如以鉴定其它的家族成员或相关的序列。可使用BLAST程序进行这种搜索。进行BLAST分析的软件通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)是公开可用的。BLASTP被用于氨基酸序列，BLASTN被用于核苷酸序列。在BLAST程序中，可使用下述默认值设置：
-缺口空缺损失：默认值＝5(对核苷酸)/11(对蛋白质)
-缺口延伸损失：默认值＝2(对核苷酸)/1(对蛋白质)
-核苷酸错配罚分：默认值＝-3
-核苷酸匹配奖励：默认值＝1
-预计值：默认值＝10
-字节：默认值＝11(对核苷酸)/28(对megablast)/3(对蛋白质)
本文提到的核酸序列可被进一步用作“查询序列”以针对公共数据库进行搜索，例如以鉴定其它的家族成员或相关的序列。可使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10中的NBLAST和XBLAST程序(版本2.0)进行这种搜索。可以利用NBLAST程序(分数＝100，字长＝12)进行BLAST核苷酸搜索以得到与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。
本文提供的序列信息不应被狭隘地解释为需要包含被错误鉴定的碱基。本文公开的特定序列可容易地被用于从丝状真菌特别是A.niger分离完整的基因，其反过来能够易于进行进一步的序列分析从而鉴定测序错误。
除非特别声明，通过对本文的DNA分子测序确定的所有核苷酸序列都是使用自动DNA测序仪测定的，且所有由在本文中测定的DNA分子编码的多肽的氨基酸序列均通过以上确定的核酸序列的翻译而被预测。因此，如本领域所知，对于任何通过这种自动的方法测定的DNA序列，本文测定的任何核苷酸序列可能含有一些错误。通过自动化测定的核苷酸序列典型地至少约90％，更典型地至少约95％到至少约99.9％与被测序DNA分子的实际核苷酸序列相同。可通过其它方法更精确地确定实际的序列，所述方法包括本领域公知的手工DNA测序法。本领域还了解，与实际序列相比，测定的核苷酸序列中单一的插入或缺失将导致核苷酸序列翻译的移码，从而所预测的由测定的核苷酸序列编码的氨基酸序列将从这种插入或缺失点开始完全不同于由被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。
本领域技术人员能够鉴定这种被错误鉴定的碱基并知道如何纠正这种错误。
本文引用的专利文件或作为现有技术给出的其它材料不能被认为是承认在任何权利要求的优先权日之前，所述文件或材料是已知的或者其包含的信息是公共常识的一部分。
本文所述的任何参考文献的公开内容均通过引用被整体并入本文。
通过下述实施例进一步阐释本发明。
实施例
需要了解的是，当表明本发明的优选实施方式时，这些实施例仅以实例说明被给出。从上述讨论和这些实施例中，本领域的技术人员能够确定本发明的必要特征，且在不脱离其宗旨和范围时，本领域的技术人员可对本发明做出多种改变和修改以适应多种用途和条件。因此，从前面的描述中，除了本发明展示和描述的那些之外的多种改变对本领域技术人员而言是明显的。这种改变也意图落入所附的权利要求的范围内。
实施例1.使用“分开的Cre/lox”方法有效整合和外重组标记的方法
1.1 分开的Cre重组酶整合的一般原理
由Gueldener等(1996)描述的使用Cre/loxP原始的方法由三步工序组成。步骤一是将由两个loxP位点包围的标记转化整合到基因组，这可导致例如基因的缺失。步骤二是转化包含Cre重组酶的质粒在GAL1半乳糖诱导型启动子的控制下。在利用半乳糖诱导Cre重组酶以及通过loxP位点重组移除标记之后，第三步由质粒的移除组成，这典型地没有预期的那么简单。本实施例描述的方法“分开的Cre重组酶整合”或“直接Cre重组酶整合”(DCI)是更加有效和非常快速的。这个基因组整合和选择标记移除的方法比较省力且只有一个转化步骤。
图1展示了利用DCI方法缺失ICL1的示意图。使用DCI方法仅需要一次菌株的转化，该转化中基因将被缺失，并且不需要从菌株移除质粒。此外，所有用到的片段可以容易地通过PCR扩增制备，在这个实施例中，用到4个片段。Cre重组酶基因的开放阅读框被分开成两部分，以阻止重组酶所有的活性直到全部四个PCR片段如图1所示在基因组重组。重组之后，标记和Cre重组酶的侧翼为loxP位点(在这个例子中是lox66和lox71[Albert，H.，Dale，E.C.，Lee，E.，&Ow，D.W.(1995).Site-specific integration of DNA into wild-typeand mutant lox sites placed in the plant genome.Plant Journal，7(4)，649-659])以及Cre重组酶的诱导使得标记包括Cre重组酶通过在lox66和lox71位点重组而被从基因组中切除。分开Cre重组酶是该方法的一个重要特征，因为它阻止了携带具有loxP位点的质粒的E.coli菌株中Cre重组酶的不需要的活性。这样的活性容易引起具有loxP位点和Cre重组酶的任何质粒的不稳定。DCI方法用到的实验步骤和方法将在这个实施例中进一步解释。
1.2 分开的Cre/loxP片段Cre-1和Cre-2的合成和克隆
两个分开的Cre/loxP片段Cre-1和Cre-2(SEQ ID No：1和2)由Geneart(雷根斯堡，德国)合成。片段Cre-1从上游到下游携带：lox66重组位点；SwaI位点以克隆入选择标记；诱导型GAL1启动子；和Cre重组酶开放阅读框的5’部分。片段Cre-2从上游到下游携带：Cre重组酶的3’部分，与Cre-1片段有100bp重叠；CYC1终止子；以及用于重组的lox71位点。lox66位点的上游lox71位点的下游，加入几个独特的限制位点以创造在表达盒中克隆的可行性。也可通过在各随后的表达盒之间加入50bp重叠来利用体内同源重组来增加表达盒。当把Cre-1和Cre-2片段整合到基因组，Cre重组酶开放阅读框通过100bp重叠的体内同源重组恢复到有功能的开放阅读框。合成之后，Geneart克隆了Cre-1和Cre-2两个片段到pMA载体，产生了构建体pMA Cre-1(SEQ ID No：3)和pMA Cre-2(SEQ ID No：4)，其质粒图在图2展示。质粒pMA Cre_2重命名为pSUC225。下一步是克隆有功能的标记到pMA Cre-1的多克隆位点。
1.3 克隆kanMX标记到pMA Cre-1载体
赋予G418抗性的kanMX标记用引物DBC-02738和DBC-02739(SEQ ID No：6和7)扩增自pUG6衍生质粒(SEQ ID No：5)。原始的pUG6也能用于PCR反应，pUG6质粒从EUROSCARF(Güldener等，1996)得到。PCR反应根据指南利用Phusion聚合酶(Finnzymes，Vantaa，芬兰)进行。用到的引物在kanMX标记的两侧添加SwaI限制位点，使得可以克隆标记到pMA Cre-1载体。利用来自Invitrogen(Carlsbad，USA)的“Zero Blunt TOPO PCR Cloning”试剂盒将得到的1381bp PCR片段克隆到“pCR-Blunt II-TOPO”载体。所有的步骤根据Invitrogen提供的说明书进行。得到的克隆用SwaI消化检测，随后琼脂糖凝胶电泳分析来验证插入大小。得到的带有kanMX标记的pCR-Blunt II-TOPO载体(SEQ ID No：8)用SwaI切割以分离kanMX标记片段。将SwaI消化的kanMX标记连接到SwaI消化的pMA Cre-1载体上并且得到的克隆用HindIII检测。在凝胶上，多个克隆显示了正确的片段大小3541bp和1405bp，并且一个克隆被保存和命名为pSUC227(SEQ ID No：9)。图3显示了pSUC227的质粒图。
1.4 用于转化的PCR片段的制备和纯化
转化需要的全部四个片段和CEN.PK113-7D中ICL1的缺失通过PCR制备。每个PCR片段与邻近的片段具有同源性，从而S.cerevisiae的体内同源重组体系在ICL1基因的位点重组和整合所述4个片段。ICL1基因的5’侧翼片段上游(629bp，SEQ ID No：10)利用引物对DBC-03754(SEQ ID No：11)和DBC-03755(SEQ ID No：12)扩增。ICL1基因的3’侧翼片段下游(603bp，SEQ ID No：13)用引物对DBC-03758(SEQ ID No：14)和DBC-03759(SEQ ID No：15)扩增。利用分离自CEN.PK113-7D的染色体DNA作为模板DNA通过PCR扩增两侧翼。用引物对DBC-03756(SEQ ID No：17)和DBC-03373(SEQ ID No：18)利用pSUC227作为模板来扩增“Cre-1-kanMX”片段(2586bp，SEQ ID No：16)。Cre-2片段(1274bp，SEQ ID No：19)利用pSUC225作为模板，用引物对DBC-03374(SEQ ID No：20)和DBC-03757(SEQ ID No：21)来扩增。所有的PCR反应根据指南利用Phusion聚合酶(Finnzymes)进行。PCR片段的大小用标准的琼脂糖电泳技术检测。PCR扩增的DNA片段根据指南用来自Zymo Research(Irvine，USA)的DNA纯化试剂盒“Clean and Concentrator”来纯化。DNA浓度用A260/A280在NanodropND-1000分光光度计上测量。
1.5 转化到S.cerevisiae和带有分开的Cre-lox的ICL1的缺失
S.cerevisiae的转化如Gietz和Woods(2002；Transformation ofthe yeast bythe LiAc/SS carrier DNA/PEG method.Methods in Enzymology 350：87-96)所描述的进行。CEN.PK113-7D(MATa URA3 HIS3 LEU2 TRP1 MAL2-8SUC2)用下列的纯化的PCR片段的量转化：1μg的片段“Cre-1-kanMX”；1μg的片段Cre-2；0.8μg的ICL1基因上游的5’侧翼片段；和0.5μg的ICL1基因下游的3’侧翼片段。转化混合物铺板在带有20g/l葡萄糖和200μg/mlG418(Sigma)的YEP琼脂上(蛋白胨10.0g/l，酵母提取物10.0g/l，氯化钠5.0g/l，琼脂15.0g/l)。在30℃下孵育3-5天后，检测平板并且平板上现了约230个克隆，而阴性对照(即转化实验中没有DNA加入)产生了空平板。
1.6 标记盒和Cre重组酶的有效外重组
从平板上挑选了六个克隆，在带有用于诱导Cre重组酶的2％半乳糖的YEP琼脂板上再划线。平板在30℃下孵育2天，在孵育过程中，半乳糖诱导的Cre重组酶介导标记和Cre重组酶有效的外重组。来自各再划线转化体的两个单克隆(总计12个分离物)用接种环转移到新鲜的具有2％半乳糖的YEP琼脂上保存。此外，在，将相同的克隆用接种环转移到12ml的葛莱娜管中2ml带有20g/l半乳糖的YEP培养基中(蛋白胨10.0g/l，酵母提取物10.0g/l，氯化钠5.0g/l)。在30℃下280rpm的旋转式震荡器上孵育过夜后，将1.5ml这些培养物转移到Eppendorf管中并以最大速度离心1分钟。从该细胞沉淀中，分离染色体DNA用于进一步PCR和测序分析(如下1.7节描述)。
1.7 确认ICL1的缺失和以及标记和Cre的不存在的分析
根据改进的方案，利用来自QIAGEN的DNeasy Blood&Tissue试剂盒，利用R-藤黄节杆菌酶将染色体DNA从细胞沉淀中分离。引物组合DBC-03760(SEQ ID No：22)和DBC-03761(SEQ ID No：23)用于PCR分析。在野生型情况下，预期3449bp(SEQ ID No：24)的条带。当失去ICL1标记和Cre重组酶时，PCR会产生1812bp(SEQ ID No：25)的条带。图4展示了基因组的情况和用到的引物的位置。根据指南，利用Phusion聚合酶(Finnzymes)进行PCR反应。PCR片段的大小用标准的琼脂糖电泳技术检测。所有检测的克隆表现1.8kb的特异条带，这是ICL1缺失以及kanMX标记和Cre重组酶外重组的正确大小。PCR片段送到Baseclear(Leiden，荷兰)测序并且测序结果验证了PCR分析的结论。从Baseclear得到的序列是序列同一性25的准确匹配，并且显示了ICL1基因已从基因组中缺失，并且kanMX标记和Cre重组酶的有效外重组已发生，作为lox66和lox71位点之间重组的结果留下了lox72位点。
实施例中的实验证明，“分开的Cre/lox”方法是用于产生可重复使用的、无标记的S.cerevisiae菌株的快速、稳定的技术。
实施例2
2.1 分开的Cre/loxP片段5’分开的CRE和3’分开的CRE的合成和制备
在A.niger CBS513.88的基因组序列中鉴定出破坏候选者(epo基因)。A.niger基因及其基因组环境的所有核苷酸序列可以从例如EMBL(http://www.ebi.ac.uk/embl/)的NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)得到。epo基因由An08g04490编码。菌株Aspergillus niger GBA 302(ΔglaA，ΔpepA，ΔhdfA)在此处用于转化的受体菌。GBA 302的构建在WO2011009700有描述。
基因置换载体根据已知的原理设计并且根据常规的克隆程序构建，这也在EP635574B和WO 98/46772中描述。大体上，这些载体包含各自ORF序列的大约1-2kb的侧翼区域，以在预先确定的基因组位点靶向同源重组。它们可以包含例如A.nidulans双向amdS选择标记，潮霉素B标记或腐草霉素选择标记来用于转化。本文所有的实施例中基因置换用到的方法使用线性DNA，其通过双交换在侧翼序列的同源位点整合到基因组中，从而通过标记基因(例如amdS基因)替代要缺失的基因。amdS标记的缺失例如可通过在氟乙酰胺培养基上铺板来选择。
设计两个不同的缺失载体pEPO-US和pEPO-DS以能够提供两个重叠的DNA分子用于分开的cre/loxP基因靶向。两个载体中的插入片段能一起以与所谓的“二重基因靶向(bipartite gene-targeting)”方法相似(Nielsen等，2006，43：54-64)稍有类似的方式用作置换盒。由Nielsen描述的这个方法利用两段序列重叠并且其侧翼均具有非功能性选择标记和基因靶向序列的DNA片段(二重方法进一步的细节也见WO2008113847)。当重叠的无功能标记片段正确的同源重组时，通过在同源靶向位点整合选择标记成为有功能的。
第一个载体pEPO-US(功能片段的总体布置图见图5)包含有功能的hygB标记片段(PgpdA-HygB-TtrpC来自pAN7-1，NCBI gi：475166)，Lox71序列位点，cre重组酶盒和epoORF的5’上游基因侧翼区域(例如，启动子区)(epo-US)。此处用到的cre重组酶盒包含A.nidulans木聚糖酶A启动子，cre重组酶和木聚糖酶A终止子，来允许cre重组酶的木糖诱导表达。第二个pEPO-DS载体(功能片段的总体布置图见图6)包含cre重组酶盒，Lox66序列位点和epo ORF的3’下游基因侧翼区域(epo-DS)。epo上游和下游的两个基因侧翼区域靶向A.niger.中预先确定的epo基因组位点处的二重片段的同源重组。
在下面的实施例中，我们展示了本文使用的分开的cre体系是使用NHEJ缺陷的菌株时的基因破坏的非常有效的体系。
2.2 利用分开的cre/loxP重叠DNA片段有效的基因缺失
使用编码参与NHEJ的组分的基因缺陷的突变体(例如至少一种hdfA，hdfB，lig4等基因的失活)造成对通过(双)同源重组的整合载体观察到的靶向效率显著增加(例如之前WO2005095624和WO2008113847所描述)。
此外，如WO2008113847描述能够得到同源重组的靶向效率增加。此处描述的该二重基因靶向法包括提供两组DNA分子，其中第一组包含的DNA分子各包含感兴趣的置换序列的第一无功能片段，其5’端侧翼为与靶序列侧翼染色体DNA的序列基本同源的DNA序列；第二组包含的DNA分子各包含感兴趣的DNA置换序列的第二无功能片段，其与第一无功能片段重叠并且3’端侧翼为与靶序列侧翼染色体DNA的序列基本同源的DNA序列，其中重组时第一和第二无功能片段成为有功能的。
基因置换载体pEPO-US和pEPO-DS(布局如实施例2.1所描述)在靶epo ORF都包含大约1kb用于同源重组的侧翼区域。此外，它们都包含A.nidulans木聚糖酶A启动子控制的噬菌体P1Cre基因以允许在木糖诱导下Cre的诱导型表达，以及loxP位点(lox71或lox66)。
pEPO-US构建体也包含有功能的和全长的hygB选择标记盒。
根据本发明的方法，两个线性的用于epo破坏的分开的cre基因靶向片段使用pEPO-US和pEPO-DS质粒作为模板(SEQ ID No：26-31)通过PCR足量生成。在该情况下两个核苷酸片段在cre基因的重叠大约是1kb。预期两个片段在cre基因的重叠能包含无功能的和/或部分基因以及有功能的和/或全长cre基因。对于每个片段，使用1.5μgDNA转化Aspergillus niger GBA302。转化株基于潮霉素B抗性选择，根据EP635574B描述的标准程序纯化菌落并且纯化之后分析。基于利用pEPO-US和pEPO-DS上生成的两种不同的重叠PCR片段的转化，鉴别潮霉素抗性菌落。分析潮霉素抗性转化株之后，超过90％的转化株在epo靶位点表现正确的和靶向的整合。预期在epo位点具有正确的靶向破坏盒整合的转化株的基因组DNA包含突变loxP位点，潮霉素抗性盒和诱导型Cre重组酶盒，其可以被用作PCR模板DNA，例如用于扩增在宿主菌株构建中用到的双向的和/或全部破坏DNA片段。
为了在木聚糖酶启动子控制下诱导cre重组酶，使用包含1％木糖和1％葡萄糖的基本培养基琼脂板(木聚糖酶诱导培养基)。当Cre重组酶被木糖诱导时，会通过切割出现两个特异的loxP位点之间的DNA盒的缺失。在任选的额外的孢子形成和纯化步骤后，在木聚糖酶诱导培养基上生长后得到的菌落被鉴定其潮霉素B抗性。这些来自经过木糖诱导和任选的额外纯化步骤之后的转化株的孢子利用牙签转移到有和无潮霉素B(60μg/ml)的PDA平板上。潮霉素B抗性的缺失可通过cre重组酶活性与hygB标记盒缺失相关。可以预期的是在木聚糖酶诱导培养基上生长和孢子形成以及两次额外的纯化步骤之后测试的大多数菌落对于潮霉素敏感并且同时缺失了hygB盒和cre重组酶基因。
这个实施例展示了NHEJ缺陷真菌菌株中分开的cre/loxP DNA片段用于基因靶向的是高度有效的。根据本发明的分开的cre/loxP DNA片段与诱导型Cre重组体系结合使用允许在建立无标记菌株时非常有效的菌株构建/破坏而不需要在菌株构建中的第二转化或反选择程序。
Claims (15)
1.在靶位点进行重组以添加新的序列、置换现存的序列和/或缺失现存的序列的方法，该方法包括：
-提供两种或更多种核酸，它们总共包含：(a)能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列；(b)两个或更多个位点特异性重组位点；和(c)编码识别所述位点特异性重组位点的重组酶的序列，其中所述两种或更多种核酸都不包含(a)、(b)和(c)中所描述的全部序列，
其中所述两种或更多种核酸能够相互同源重组从而产生单一核酸，其中所述核酸的末端被设计为使得所述核酸以期望的方向和顺序被组装以产生所述单一核酸，并且
其中所述两种或更多种核酸中的至少两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列；以及
-将所述两种或更多种核酸引入宿主细胞以使重组到所述宿主细胞能够发生，以及
-使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点的侧翼序列重组，以在靶位点插入编码有功能重组酶的连续核酸序列和至少两个位点特异性重组位点，所述编码重组酶的序列的侧翼是至少两个位点特异性重组位点以及所述位点特异性重组位点的侧翼是能够与靶位点的侧翼序列同源重组的序列，其中核酸的相互重组以及与靶位点侧翼序列的重组在真菌细胞体内进行；其中：所述位点特异性重组位点是lox位点并且所述重组酶是Cre；所述位点特异性重组位点是FRT位点并且所述重组酶是Flp；所述重组位点是Vlox位点并且所述重组酶是VCre；或所述重组位点是Slox并且所述重组酶是SCre。
2.根据权利要求1的方法，其中所述两种或更多种核酸总共包含能够与两个或更多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列，以使所述两种或更多种核酸相互重组以及与靶位点侧翼序列重组，导致在每个靶位点插入至少两个位点特异性重组位点，其中：
编码有功能重组酶的连续核酸序列存在于位置在至少两个位点特异性重组位点之间的至少一个靶位点，以及
所述位点特异性重组位点的侧翼为能够与靶位点侧翼序列同源重组的序列。
3.根据权利要求1或2的方法，其中至少两种核酸中的两种各包含编码无功能的部分重组酶的序列，以使它们总共包含编码有功能的重组酶的核酸序列。
4.根据权利要求1的方法，其包括表达重组酶以使位置在所述位点特异性重组位点之间的序列被外重组。
5.根据权利要求4的方法，其中所述重组酶的表达受诱导型启动子的控制。
6.根据权利要求1的方法，其中所述两种或更多种核酸总共包含编码标记的序列，以使两种或更多种核酸的重组导致在靶位点或多个靶位点插入所述标记基因编码序列，从而其位于至少两个能够与靶位点或多个靶位点的侧翼序列同源重组的序列之间。
7.根据权利要求2的方法，其中所述两种或更多种核酸总共包含两种或更多种不同的编码标记的序列，以使所述两种或更多种核酸的重组导致在各靶位点插入不同的标记基因编码序列。
8.根据权利要求6的方法，其中所述两种或更多种核酸的重组导致在靶位点插入所述编码标记的序列，从而其位置在位点特异性重组位点之间并且能够通过重组酶的表达从靶位点被外重组。
9.根据权利要求4的方法，其中位点特异性重组位点之间的核酸序列的外重组在体内进行。
10.根据权利要求1的方法，其中所述真菌细胞是酵母细胞。
11.根据权利要求1的方法，其中所述真菌细胞是丝状真菌细胞。
12.根据权利要求4的方法，其中所述位点特异性重组位点使得重组酶表达后的外重组在靶位点产生不被所述重组酶识别的单一突变位点特异性重组位点。
13.根据权利要求1的方法，其中所述靶位点包含被破坏和/或部分或完全缺失的编码序列。
14.根据权利要求10的方法，其中所述酵母是S.cerevisiae或K.lactis。
15.根据权利要求11的方法，其中所述丝状真菌细胞属于Aspergillus、Penicillium、Talaromyces或Trichoderma属的物种。
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