CN110129346A

CN110129346A - 一种高效的基因工程载体

Info

Publication number: CN110129346A
Application number: CN201810108390.2A
Authority: CN
Inventors: 姜有为; 李云飞
Original assignee: HANGZHOU JINGYINKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HANGZHOU JINGYINKANG BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2018-02-02
Publication date: 2019-08-16
Also published as: WO2019149288A1

Abstract

本发明提供5’到3’分别为T‑F‑GOI；T‑GOI‑F；F‑T‑GOI；F‑GOI‑T；GOI‑T‑F；GOI‑F‑T；F‑GOI；GOI‑F；或P‑F‑GOI；P‑GOI‑F；F‑P‑GOI；F‑GOI‑P；GOI‑P‑F；GOI‑F‑P；F‑GOI；GOI‑F所示核苷酸构建物，各元件如说明书所述。利用该核苷酸构建物可将大量外源基因整合在基因组中，但不破坏整合位点附近的基因功能，不影响宿主细胞的生存。

Description

一种高效的基因工程载体

技术领域

本发明涉及生物技术领域；具体地说，本发明涉及通过两次重组而将大量外源基因整合在生物机体的基因组中，同时避免破坏宿主细胞基因功能的新型基因工程载体。

背景技术

N-糖基化是蛋白翻译后的一个重要修饰过程，对蛋白的结构和功能起着重要的作用。哺乳动物细胞和酵母细胞在内质网腔合成新生肽链的同时，对新生肽链进行相同的N-糖基化起始步骤及修饰加工过程，首先前体寡糖G1c₃Man₉GlcNAc₂被连接到新生肽链Asn-X-Thr/Ser(X为除Pro外的任意氨基酸)保守序列中的Asn残基上，然后在葡萄糖苷水解酶I、Ⅱ和甘露糖苷水解酶I等糖苷水解酶的作用下，蛋白的糖链被加工形成Man₈GlcNAc₂糖链结构，随后带有该糖链的蛋白被转运至高尔基体中。但是在哺乳动物细胞和酵母高尔基体内，蛋白糖链的进一步修饰加工过程则完全不同。在哺乳动物细胞高尔基体内，蛋白上的Man₈GlcNAc₂糖链首先在甘露糖苷水解酶I(MnsI)的作用下，去除三个甘露糖，形成Man₅GlcNAc₂糖链结构；然后在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)的作用下添加一个N-乙酰氨基葡萄糖，形成GlcNAcMan₅GlcNAc₂糖链结构；然后在甘露糖苷水解酶II(MnsII)的作用下，再去除两个甘露糖，形成GlcNAcMan₃GlcNAc₂糖链结构；接着在N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II(GnTII)的作用下再添加一个N-乙酰氨基葡萄糖，形成GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖链结构；最后在半乳糖转移酶(GalT)和唾液酸转移酶(ST)的作用下，加工形成Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂和Sia₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂复杂型糖链结构。但是在酵母细胞高尔基体内，在OCH1基因编码的α-l,6-甘露糖转移酶(Ochlp)的作用下,蛋白上的Man₈GlcNAc₂糖链首先接受一个α-l,6-甘露糖，形成Man₉GlcNAc₂糖链结构，然后在其它各种甘露糖转移酶的作用下继续添加甘露糖，形成高甘露糖型的糖链结构。因此，用酵母生产蛋白的一个主要缺陷是对蛋白N-糖基化修饰形成与人体不同的高甘露糖链，它可能改变糖蛋白的结构，影响其功能，具有免疫原性(Kornfeld,R.&Kornfeld,S.Assembly ofasparagine-linked oligosaccharides.Annu.Rev.Biochem.54,631–664,1985)。

应用基因工程技术可以改造酵母的糖基化修饰途径，使其能对蛋白进行与人体相同的N-糖基化修饰。为了达到这个目标，不仅需要敲除酵母的OCH1基因，还需要表达大量的外源基因，包括合适的甘露糖苷水解酶I(MnsI)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GnTI)、甘露糖苷水解酶II(MnsII)、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶II(GnTII)、半乳糖转移酶(GalT)、唾液酸转移酶(ST)、以及与半乳糖和唾液酸生物合成相关的基因等(Hamilton SR,Davidson RC,Sethuraman N,Nett JH,Jiang Y,Rios S,et al.Humanization of yeast to producecomplex terminally sialylated glycoproteins.Science 2006；313:1441-3)。为了将这些外源基因整合在酵母基因组中进行表达，需要有不同的载体、选择标记、和基因组整合位点可供选择使用。

有些载体，包括pBLADE-SX,、pBLARG-SX、pBLHIS-SX,、pBLURA3-SX等，利用选择表记基因ADE1、ARG4、HIS4、URA3等生物合成基因，通过单交换重组将外源基因整合在对应的营养缺陷型酵母细胞的基因座上。整合的载体通过对酵母营养缺陷的互补作用(原养型)可以在不完全培养基中筛选出来。例如携带有HIS4基因的pBLHIS-SX载体可以将外源基因通过单交换重组整合在组氨酸缺陷型GS115菌的his4基因座上，补偿其组氨酸缺陷，用不含组氨酸的培养基筛选出来(Lin Cereghino GP,Lin Cereghino J,Sunga AJ,Johnson MA,LimM,Gleeson MA,Cregg JM.New selectable marker/auxotrophic host straincombinations for molecular genetic manipulation of Pichia pastoris.Gene.2001,263:159-69)。

也有些载体利用显性选择标记基因，通过单交换重组将外源基因整合在酵母的特定基因座上。例如GlycoSwitch载体利用博来霉素(zeocin)，诺尔丝菌素(noureothricin)，遗传霉素(G418)，潮霉素(hygromycin)等显性选择标记基因将外源的MnsI、GnTI、MnsII、GnTII、和GalT基因整合在毕赤酵母细胞的AOX1或GAPDH基因启动子上(Jacobs P,GeysensS,Vervecken W,Contreras R,Callewaert N,Engineering complex-type N-glycosylation in Pichia pastoris using GlycoSwitch technology,NatProtoc.2009；4:58-70)。

但是通过单交换重组将外源基因载体整合在酵母基因组的靶基因位点时，会形成靶基因的同向重复序列。同向重复的靶基因序列之间可以再次发生同源重组，切除整合的外源载体，恢复靶基因原来的状态。而且，通过同向重复序列之间不同位置的同源重组可以将靶基因恢复成野生型或者缺陷型的状态，无法通过选择筛选条件来防止同源重组切除载体过程的发生。因此，通过单交换重组整合在基因组中的外源基因载体，具有遗传不稳定性。

与单交换重组不同，有些载体利用选择标记基因，通过双交换重组能将外源基因载体稳定整合在酵母基因组中，是基因工程改造的优先选择。例如pPIC9、pPIC3.5、pHIL-D2和pHIL-S1(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)等载体，通过双交换重组将外源基因整合在毕赤酵母的AOX1基因座上，结果产生Mut^S表型，在有甲醇的培养基中生长缓慢。另外利用URA5标记基因，通过双交换重组将外源基因稳定整合在ura3营养缺陷型毕赤酵母的OCH1基因座上。(Nett JH,Gerngross TU,Cloning and disruption of the PpURA5 gene andconstruction of a set of integration vectors for the stable geneticmodification of Pichia pastoris,Yeast.2003,20:1279-90)。

但是目前通过这些载体的双交换重组，主要将外源基因整合在基因组的个别已知基因座上，同时破坏这些基因座的基因表达和功能不会影响宿主细胞的生存。但是在酵母基因组中这些已知的基因座整合位点很少，无法满足整合大量外源基因的需求。

因此，目前的基因操作技术对基因组进行大规模改造受到许多限制，主要在于缺乏可供大量使用的表达载体、选择标记，以及基因组基因座的整合位点。

因此，需要开发新的方法和材料，克服这些限制，将大量外源基因整合在基因组中，同时避免破坏整合位点附近的基因功能，这样才能够使专业技术人员在糖基化工程等合成生物领域完成复杂的基因工程改造。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因工程载体，利用该基因工程载体可以将大量外源基因整合在基因组中，同时避免破坏整合位点附近的基因功能，不影响宿主细胞的生存。

在第一方面，本发明提供一种核苷酸构建物，所述核苷酸构建物具有以下所示的I类结构：

5’H-T-F-GOI-3’H；

5’H-T-GOI-F-3’H；

5’H-F-T-GOI-3’H；

5’H-F-GOI-T-3’H；

5’H-GOI-T-F-3’H；

5’H-GOI-F-T-3’H；

5’H-F-GOI-3’H；

5’H-GOI-F-3’H；

其中，T是外源性终止子；F是B-C-Marker-B所示基因片段；其中B是位点特异性重组位点；C是所述位点特异性重组位点相对应的重组酶表达盒；Marker是标记基因表达盒；GOI是外源基因表达盒；

或者，

所述核苷酸构建物具有以下所示的II类结构：

5’H-F-GOI-P-3’H；

5’H-GOI-F-P-3’H；

5’H-P-F-GOI-3’H；

5’H-P-GOI-F-3’H；

5’H-F-P-GOI-3’H；

5’H-GOI-P-F-3’H；

5’H-F-GOI-3’H；

5’H-GOI-F-3’H；

其中，P是外源性启动子；F、B、C、Marker和GOI如上所述。

本领域技术人员应理解，本发明的核苷酸构建物中如不含终止子或启动子，该构建物可以置于基因组中的任意位置；即，可以置于开放阅读框(ORF)中间，或其上游和下游的任意位置。

在具体的实施方式中，所述核苷酸构建物具有以下所示的I类结构：

5’H-T-F-GOI-3’H；

5’H-T-GOI-F-3’H；

5’H-F-T-GOI-3’H；

5’H-F-GOI-T-3’H；

5’H-GOI-T-F-3’H；

5’H-GOI-F-T-3’H；

其中，T、F、GOI如上所述；

或者，

所述核苷酸构建物具有以下所示的II类结构

5’H-F-GOI-P-3’H；

5’H-GOI-F-P-3’H；

5’H-P-F-GOI-3’H；

5’H-P-GOI-F-3’H；

5’H-F-P-GOI-3’H；

5’H-GOI-P-F-3’H；

其中，P、F和GOI如上所述。

在具体的实施方式中，所述转录终止子包括但不限于：酿酒酵母的ADH1、CYC1和TIF51A等转录终止子，毕赤酵母的ALG6、AOD、AOX1、ARG4、PMA1和TEF1等转录终止子；

转录启动子包括但不限于：酿酒酵母的ADH1、GAP、PGK1和TEF1等转录启动子，毕赤酵母的GAP、ILV5、PGK1、TEF1等转录启动子，诱导启动子AOX1和FLD1等。

在具体的实施方式中，所述重组酶包括但不限于Flp重组酶或Cre重组酶；优选Flp重组酶。

在优选的实施方式中，所述位点特异性重组位点以及相应的重组酶构成位点特异性重组系统，包括但不限于酿酒酵母的Flp-FRT，细菌噬菌体P1的Cre-loxP和Xygosaccharomyces rouxii的R-RS。

在优选的实施方式中，所述核苷酸构建物中可以包含多个外源基因表达盒或多个标记基因表达盒。

在优选的实施方式中，具有I类结构的核苷酸构建物中的所述外源基因表达盒中可以不含自身的转录终止子；具有II类结构的核苷酸构建物中的所述外源基因表达盒中可以不含自身的转录启动子。

在优选的实施方式中，标记基因包括一个或多个抗生素耐受性基因，优选耐受博莱霉素(zeocin)的Sh ble基因，和耐受卡那霉素(kanamycin，kan)或遗传霉素(geneticin，G418)的neo基因，耐受杀稻瘟菌素(Blasticidin)的BSD基因等。

在具体的实施方式中，所述核苷酸构建物在5’端和3’端还包含同源臂。

在具体的实施方式中，所述核苷酸构建物还可以包含当所述核苷酸构建物形成环状时，能够在宿主细胞(例如，细菌)中复制所需的其它基因X，优选细菌复制起点和抗生素耐受性基因；并且当所述核苷酸构建物形成线形构建物时，所述其它基因X的位置在所述核苷酸构建物的B之间的任何位置。

在优选的实施方式中，所述复制起点包括但不限于fl-ori、colisin、col El。

在第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含第一方面或第二方面所述的核苷酸构建物。

在第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞在其基因组中整合有第一方面或第二方面所述的核苷酸构建物。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞包括但不限于：真核和原核宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、芽胞杆菌属(Bacillus spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)、真菌和酵母菌，昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(SF9)，动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell)(CHO)、小鼠细胞、非洲绿猴细胞，培养的人类细胞和植物细胞。

在优选的实施方式中，所述酵母菌和真菌包括但不限于：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，巴斯德毕赤酵母(毕赤酵母)(Pichia pastoris)，多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，乳头假丝酵母(Candida albicas)，构巢曲霉(Aspergillusnidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)，里氏木霉(Trichoderma reesei)等。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞是酵母，更优选巴斯德毕赤酵母。

在第五方面，本发明提供一种对宿主细胞进行基因改造的方法，所述方法包括利用第一或第二方面所述的核苷酸构建物整合外源基因。

在具体的实施方式中，所述方法包括以下步骤：

a.构建第一或第二方面所述的核苷酸构建物；

b.通过同源重组将具有I类结构的核苷酸构建物功能性整合在基因组开放阅读框(ORF)的翻译终止无义密码子(例如TAA，等)的下游；

通过同源重组将具有II类结构的核苷酸构建物功能性整合在基因组开放阅读框(open reading frame，ORF)的翻译起始密码子(ATG)上游；或者

通过同源重组将具有I或II类结构的核苷酸构建物功能性整合在基因组中的任意位置；即，开放阅读框(ORF)中间，或其上游和下游的任意位置；和

c.通过重组酶介导重组去除具有I类或II类结构的核苷酸构建物中位点特异性重组位点之间的各元件，从而仅仅将具有I类或II类结构的核苷酸构建物中的一个位点特异性重组位点和外源性基因表达盒以及任选的外源性转录终止子或外源性转录启动子整合在宿主细胞的基因组中。

在优选的实施方式中，所述将具有I类结构的核苷酸构建物功能性整合在基因组开放阅读框(ORF)的翻译终止无义密码子(例如TAA，等)的下游是指具有I类结构的核苷酸构建物位于基因组开放阅读框(ORF)的翻译终止无义密码子(例如TAA，等)的第三个核苷酸(+3)到其下游另一个开放阅读框(ORF)的转录启动子或终止子之外的区域，优选到其下游的300个核苷酸(+300)之间；最优选地，具有I类结构的核苷酸构建物紧邻基因组开放读框(ORF)的翻译终止无义密码子(例如TAA，等)的第三个核苷酸(+3)的下游；

所述将具有II类结构的核苷酸构建物功能性整合在基因组开放阅读框(ORF)的翻译起始密码子(ATG)上游是指具有II类结构的核苷酸构建物位于基因组开放阅读框(ORF)起始密码子(ATG)的第一个核苷酸(1)到其上游另一个开放阅读框(ORF)的转录启动子或终止子之外的区域，优选到其上游的300个核苷酸(-300)之间；最优选地，具有II类结构的核苷酸构建物紧邻基因组开放读框(ORF)的起始密码子(ATG)的第一个核苷酸(1)的上游。

在优选的实施方式中，所述宿主细胞包括但不限于：真核和原核宿主宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、芽胞杆菌属(Bacillus spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)、真菌和酵母菌，昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(SF9)，动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell)(CHO)、小鼠细胞、非洲绿猴细胞，培养的人类细胞和植物细胞。

在第六方面，本发明提供第一或第二方面所述的核苷酸构建物或第三方面所述的表达载体在对宿主细胞进行基因改造中的用途。

在第七方面，本发明提供第五方面所述的方法改造的宿主细胞的用途，所述菌株应用于代谢工程、系统生物学与合成生物学等领域；包括但不限于：所述菌株用于生物催化反应，或者所述菌株用于生产重组蛋白。

在优选的实施方式中，所述重组蛋白中的糖基化模式得到改变。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1A描述了将外源转录终止子(TT2)和外源基因表达盒(GOI)整合在基因组开放阅读框(ORF)的翻译终止无义密码子(TAA)后面，不破坏开放阅读框的表达。在这个方法中，选择标记切除后可以反复用于将不同的外源基因整合在基因组不同的开放阅读框上。载体和基因组基因座的各组分未按比例绘制；

图1B描述了将外源转录启动子(P2)和外源基因表达盒(GOI)整合在基因组开放阅读框(ORF)的起始密码子(ATG)前面，不破坏开放阅读框的表达。在这个方法中，选择标记切除后可以反复用于将不同的外源基因整合在基因组不同的开放阅读框上。载体和基因组基因座的各组分未按比例绘制；

图2描述了构建pFZ载体的示意图，载体各组分未按比例绘制；

图3描述了构建pFZ-ARG2-cAtMnsI表达载体的示意图，载体各组分未按比例绘制；

图4A描述了将pFZ-ARG2-cAtMnsI表达载体整合在ARG2基因座及切除Zeocin的示意图，载体和基因组基因座的各组分未按比例绘制；

图4B显示PCR结果确认pFZ-ARG2-cAtMnsI表达载体整合在ARG2基因座；

图4C显示PCR结果确认在ARG2基因座中切除Zeocin抗性基因；

图5描述了构建pFZ-PNO1-cAtMnsI表达载体，载体各组分未按比例绘制；

图6A描述了将pFZ-PNO1-cAtMnsI表达载体整合在PNO1基因座及切除Zeocin的示意图，载体和基因组基因座的各组分未按比例绘制；

图6B显示PCR结果确认pFZ-PNO1-cAtMnsI表达载体整合在PNO1基因座；

图6C显示PCR结果确认在PNO1基因座中切除Zeocin抗性基因。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现一种新型基因工程载体，该载体通过两次重组能将大量外源基因整合在生物机体的基因组中。利用该基因工程载体，不仅能够保持基因组整合位点附近基因的正常表达，还避免破坏宿主细胞基因功能，不影响宿主细胞的生存，从而可广泛应用于完成基因组大规模改造项目。在此基础上完成了本发明。

本发明涉及用载体将外源基因稳定整合在基因组的方法和材料。本文所用的术语根据以下定义。

"基因打靶"是在基因组上整合外源基因(或DNA)的方法，通常导致靶基因的改造、替换或复制。这种机制适用于所有生物体。

单交换重组(single cross-over recombination)和双交换重组(double cross-over recombination)是同源重组整合外源性DNA进入基因组的两种不同方式。在单交换重组过程中，外源DNA与基因组中的靶基因同源区域配对时，线性外源DNA的末端指向彼此，通过单交换重组将DNA整合进入基因组，这种方法可简称为“Ends-in”或“roll in”基因打靶。单交换重组后由于产生同向的重复序列，可以再通过重复序列间的同源重组切除外源DNA，恢复靶基因原来的状态。在双交换重组过程中，外源DNA与基因组中的同源区域配对时，线性外源DNA的末端背离彼此，通过末端靶向侧翼和宿主基因组的同源序列之间的双交换重组将DNA插入基因组中，这种方法可简称为“Ends-out”基因打靶。“Ends-out”基因打靶常用于小鼠和酵母，因为它可以直接替换或删除靶基因。但是，“ends-out”发生的概率远低于“ends-in”事件。(Paques and Haber 1999,Microbiology and Molecular BiologyReviews,63:349–404)。在本发明中，基因打靶是指双交换同源重组的“ends-out”基因打靶，除非专门表明是通过单交换同源重组的“ends-in”基因打靶。

"细胞"或"机体"是用于实施本发明的基因打靶的机体的术语。

可用于本发明的宿主细胞的例子包括典型的真核和原核宿主，例如大肠杆菌(E.coli)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、芽胞杆菌属(Bacillus spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)、真菌和酵母菌，昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(SF9)，动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cell)(CHO)、小鼠细胞、非洲绿猴细胞，培养的人类细胞和植物细胞。

酵母菌和真菌包括但不限于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，巴斯德毕赤酵母(毕赤酵母)(Pichia pastoris)，多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)和乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)，乳头假丝酵母(Candida albicas)，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)，黑曲霉(Aspergillus niger)，里氏木霉(Trichoderma reesei)等。酵母是优选的本发明宿主细胞。巴斯德毕赤酵母是更优选的宿主细胞。

"细胞转化和转染"是指外源DNA导入细胞的过程。一般是指将外源DNA整合到细胞的基因组中或导入可自我复制质粒的过程。

将载体DNA引入宿主细胞以供同源重组，可按照本领域技术人员熟知的方法进行宿主细胞的转化和转染。

合适的转化方法包括病毒感染、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、基因枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射等等。方法的选择通常依赖于所转化的细胞类型和进行转化的条件。这些方法的常规讨论可在文献中查阅(Ausubel,et al.,Short Protocols inMolecular Biology,3rd ed.,Wiley&Sons,1995)。

例如，可采用不同的方法实施酵母转化，包括球形体方法、电穿孔、聚乙二醇方法、碱性阳离子方法等等[Gregg JM(2010)Pichia Protocols,Second edition.Totowa,NewJersey:Humanna Press]。

"靶基因"或"目标基因"是指通过本发明的方法予以改变的细胞内的基因或DNA区段。靶基因可以是细胞基因组中的任何DNA片段或先前导入机体的外源DNA片段，包括但不限于多肽编码区、开放阅读框(open reading frame,ORF)、控制区、内含子、外显子或它们的一部分。

5'和3'区域的核苷酸编号是指将开放阅读框(ORF)的相应起始密码子作为核苷酸1-3，其5’上游区域用负号编号；而相应的终止密码子作为核苷酸+1至+3，其3'下游区域用加号编号。

打靶载体也可称为载体。用于重组DNA技术的载体通常是"质粒"的形式。在本说明书中，术语"载体"和"质粒"可互换使用。

表达盒作为载体的一部分，在细胞内生成RNA和蛋白质。它的组成包括，但不限于，启动子序列，开放阅读框和终止子序列按已知的位置和方向排列。

在本文，某区域与相应基因区域同源表示该区域与所述基因区域的碱基序列有至少90％、优选至少92％、更优选至少94％、还要更优选至少96％、还要更优选至少98％、还要更优选至少99％、最优选100％相同。这种“同源区域”或“同源序列”优选源自所述的基因区域。

同源重组区域的长度不作特别限定。该区域的长度优选适于发生同源重组。因此，该区域的长度至少40个碱基对。

当考虑将本发明的载体转入细菌细胞传代时，优选载体中包含细菌复制起点和抗生素耐受性基因，以确保细菌传代过程中保有该载体。细菌复制起点包括fl-ori、colisin、col El和本领域已知的其它起点。抗生素耐受性基因包括氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)、博莱霉素(zeocin)、卡那霉素(kanamycin，kan)、四环素(Tetracyclines)耐受性基因和本领域已知的其它抗生素耐受性基因。

"标记"代表基因或序列，其存在或不存在能提供机体可检测表型。可利用一种或多种标记选择和筛选基因打靶事件。

标记基因的表达可以使得机体具有对一组特定条件耐受或敏感的表型。这些标记包括对不同抗生素的耐受基因，例如耐受博莱霉素(zeocin)的Sh ble基因，耐受卡那霉素(kanamycin，kan)或遗传霉素(geneticin，G418)的neo基因，耐受杀稻瘟菌素(blasticidin)的灭瘟素脱氨酶(blasticidin S deaminase)BSD基因，耐受诺尔丝菌素(nourseothricin)的nat基因，耐受潮霉素(hygromycin)的潮霉素磷酸转移酶基因，以及本领域已知的其它抗生素耐受性基因等。

标记体系也可以由营养缺陷突变型机体和野生型生物基因构成，补充机体对不完全培养基的缺陷，例如，酿酒酵母或毕赤酵母的ADE1、ARG4、HIS4和URA3野生型基因作为标记基因可分别用于ade1、arg4、his4和ura3营养缺陷型酵母的转化，以及在本领域已知的其它基因。

标记也可以传递可观察和可区分的特征。这些标记包括荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)；报道酶，例如β-半乳糖苷酶(lacZ)、碱性磷酸酶(AP)、β-内酰胺酶、β-葡萄糖醛酸酶、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、荧光素酶和本领域已知的其它酶。

本发明开发了一种载体，能将外源基因稳定整合在基因组中。这类载体的组成，主要包括但不局限于重组酶表达盒、标记基因表达盒、复制起点、位点特异性重组位点、外源基因、和同源序列等诸部分，也可以包括转录启动子或转录终止子。载体中可以有一个或多个选择标记，应用于酵母和大肠杆菌筛选。这些部分可以相连形成环状载体，如果需要的话，该环状载体在诸部分之间可以含有其它部分和接头。然而，本发明也应包括功能等价的其它形式载体。

所述位点特异性重组位点可以通过位点特异性重组酶切除。本文所用的“位点特异性重组酶”是指能在其相应的位点特异性重组位点之间功能性催化重组的任何酶。所述位点特异性重组酶可以是天然产生的或保留天然产生的重组酶活性的重组表达的多肽、片段、变体或衍生物(Craig(1988)Annu.Rev.Genet.22,77-105)。所述位点特异性重组酶优选在诱导型启动子(例如AOX1、FLD1、NPS等诱导型启动子)控制下表达。本发明可采用任何位点特异性重组系统。适合于本发明的位点特异性重组系统的例子包括酿酒酵母的Flp-FRT，细菌噬菌体P1的Cre-loxP，和Xygosaccharomyces rouxii的R-RS，等。各系统由分别催化识别位点FRT、loxP或RS之间重组的重组酶构成。在具体的实施方式中，所述重组酶是Flp重组酶或Cre重组酶。在优选的实施方式中，所述重组酶是Flp重组酶。

标记基因包括一个或几个抗生素耐受性基因，优选耐受博莱霉素(zeocin)的Shble基因，和耐受卡那霉素(kanamycin，kan)或遗传霉素(geneticin，G418)的neo基因。

复制起点包括fl-ori、colisin、col El和本领域已知的其它复制起点。

重组酶表达盒、标记基因表达盒和复制起点互相连接后，侧接两个位点特异性重组位点，两个位点特异性重组位点之间通过多克隆位点连成环状载体，然后将外源基因、同源序列、以及转录启动子或转录终止子分别连接在多克隆位点。

这里上游同源序列(5’H)的5’端与下游同源序列(3’H)的3’端之间有限制性内切位点，用于线性化。优选上游同源序列的5’端带有一半限制性内切位点(如GCT)，下游同源序列的3’端带有另一半限制性内切位点(如AGC)，用重叠PCR将两者拼接，由此产生限制性内切位点(如AGCGCT用于Afe I)，用于载体的酶切线性化。

根据另一方面，本发明提供线性载体，可利用限制性酶消化使环状载体线性化，或者可通过基因化学合成得到。

线性载体的实质性部分包括重组酶表达盒、选择标记表达盒、复制起点、位点特异性重组位点、外源基因(GOI)、同源序列、转录启动子或转录终止子等诸部分。线性载体可含有其它部分，如果需要，可在诸部分之间含有接头。以不同顺序相连的重组酶表达盒(例如FLP)、选择标记表达盒(Marker)和复制起点(例如ori)在其上游和下游侧分别连接位点特异性重组位点(例如FRT)；位点特异性重组位点的两侧连接外源基因(GOI)和转录终止子(TT2)或转录启动子(P2)；线性载体最外侧接同源序列(5’H和3’H)。线性载体的连接包括但不限于下列方式：

5’H-TT2-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-GOI-3’H；

5’H-TT2-GOI-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-3’H；

5’H-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-TT2-GOI-3’H；

5’H-GOI-TT2-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-3’H；

其中，位点特异性重组位点FRT之间的重组酶表达盒(FLP)，Marker，和复制起点(ori)等各部分的位置可以互换；

或者

5’H-GOI-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-P2-3’H；

5’H-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-GOI-P2-3’H；

5’H-GOI-P2-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-3’H；

5’H-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-P2-GOI-3’H；

其中，位点特异性重组位点FRT之间的重组酶表达盒(FLP)，Marker，和复制起点(ori)等各部分的位置可以互换。

在优选的实施方式中，本发明的载体在插入宿主细胞的基因组时，为确保不破坏插入位点基因的功能，优选采取以下结构：

5’H-TT2-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-GOI-3’H；

5’H-TT2-GOI-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-3’H；

或者

5’H-GOI-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-P2-3’H；

5’H-FRT-FLP-Marker-ori-FRT-GOI-P2-3’H；

将线性载体引入宿主细胞以供同源重组，可按照本领域技术人员熟知的方法进行宿主细胞的转化和转染。

线性载体通过双交换同源重组稳定整合在宿主细胞基因组后，诱导表达的重组酶可在位点特异性重组位点准确有效地切除重组酶、选择标记和复制起点，留下一个位点特异性重组位点和外源基因表达盒。由此，切除的选择标记可以反复使用，将外源基因整合在宿主细胞基因组的不同位点，不受有限选择标记的制约。

图1A描述了在基因组开放阅读框翻译终止无义密码子下游整合外源基因的一种方式。图中标出基因组中的一个基因座的5’调控区(5’region)及其转录启动子(P1)、开放阅读框(ORF)、3’调控区(3’region)及其转录终止子(TT1)、开放阅读框的翻译终止无义密码子(如TAA，TGA，TAG)。线性载体中，可以按不同顺序相连的重组酶表达盒(FLP)、标记基因表达盒(Marker)和复制起点(ori)在其上游和下游侧分别连接位点特异性重组位点(FRT)。位点特异性重组位点的上游侧接一个转录终止子(TT2)，下游侧接外源基因表达盒(GOI，gene of interest,)，最外侧接同源序列(5’H和3’H)。线性载体中可以连接多个标记基因和外源基因。可用于毕赤酵母的转录终止子包括，但不限于，酿酒酵母的ADH1、CYC1和TIF51A等转录终止子；毕赤酵母的ALG6、AOD、AOX1、ARG4、PMA1和TEF1等转录终止子；以及本领域已知的其它转录终止子。

中国专利申请号201510218188.1表明线性载体能通过双交换重组高效整合在翻译终止无义密码子下游。整合后开放读框自己的转录终止子(TT1)被替换成外源的转录终止子(TT2)。它能转录出与野生型相似的mRNA，翻译出野生型蛋白质，发挥正常功能。因此，整合位点附近开放阅读框编码的蛋白质不会因为外源基因的整合而受到破坏。

诱导表达的重组酶可在位点特异性重组位点准确有效地切除重组酶表达盒(FLP)、选择标记基因表达盒(Marker)和复制起点(ori)，留下转录终止子(TT2)、一个位点特异性重组位点(FRT)和外源基因(GOI)。由此，切除的标记基因可以反复使用，将外源基因整合在宿主细胞基因组的不同位点，不受有限选择标记的制约。

在线性载体的整合和自我切除的过程中，基因组整合位点附近的开放阅读框的转录和翻译始终未受破坏，能正常发挥功能。因此，宿主细胞基因组中的任何开放阅读框，包括生存所必需的基因，都可以用作外源基因整合的位点。同时通过线性载体的自我切除，切除的标记基因可以反复使用。

另外，外源基因也可以省略其转录终止子，基因组整合后利用开放阅读框的转录终止子(TT1)。

图1B描述了在基因组开放阅读框翻译起始密码子上游整合外源基因的一种方式。图中标出基因组中的一个基因座的5’调控区(5’region)及其转录启动子(P1)、开放阅读框(ORF)、3’调控区(3’region)及其转录终止子(TT1)、开放阅读框的翻译起始密码子(如ATG)。线形载体中，可以按不同顺序相连的重组酶表达盒(FLP)、标记基因表达盒(Marker)和复制起点(ori)在其上游和下游侧分别连接位点特异性重组位点(FRT)。位点特异性重组位点的上游侧接外源基因表达盒(GOI)，下游侧接转录启动子(P2)，最外侧接同源序列(5’H和3’H)。线性载体中可以连接多个标记基因和外源基因。可用于毕赤酵母的转录启动子包括，但不限于，酿酒酵母的ADH1、GAP、PGK1和TEF1等启动子，毕赤酵母的GAP、ILV5、PGK1、TEF1等启动子，AOX1和FLD1等诱导启动子，以及本领域已知的其它转录启动子。

中国专利申请号201510218188.1表明线性载体能通过双交换重组高效整合在翻译起始密码子上游。整合后开放阅读框自己的转录启动子(P1)被替换成外源的转录启动子(P2)。它能转录出与野生型相似的mRNA，翻译出野生型蛋白质，发挥正常功能。因此，整合位点附近开放阅读框编码的蛋白质不会因为外源基因的整合而受到破坏。

诱导表达的重组酶可在位点特异性重组位点准确有效地切除重组酶(FLP)、选择标记基因(Marker)和复制起点(ori)，留下外源基因(GOI)、一个位点特异性重组位点(FRT)和外源转录启动子(P2)。由此，切除的标记基因可以反复使用，将外源基因整合在宿主细胞基因组的不同位点，不受有限选择标记的制约。

另外，外源基因也可以省略其转录启动子，基因组整合后利用开放阅读框的转录启动子(P1)。

除了将外源基因整合在开放阅读框的上游和下游，它也可以整合在开放阅读框的中间，破坏开放阅读框的表达和生物功能。因此，整合的开放阅读框应该是宿主细胞的非必需基因。

本发明开发的这项方法和载体，能够将外源基因稳定整合在宿主细胞的基因组中，同时极小甚至不影响基因组整合位点附近开放阅读框的表达和功能。因此，宿主细胞基因组中的任何开放阅读框，包括生存所必需的基因，都可以用作外源基因整合的位点。在这项方法中，切除的标记基因可以反复使用。因此，这项方法能将大量的外源基因稳定整合在基因组的不同位点，可用于基因组的大规模改造，克服了现有方法所受到的几个主要限制：包括有限的标记基因和有限的基因组整合位点等。

本发明的技术具有广泛的应用。有经验的技术人员可以在不偏离本发明基本原理的基础上，做某些修改或改进，通过这些修改可以将本发明应用于其它宿主细胞。此外，有经验的技术人员可以将本发明应用于其它方面，包括但不局限于代谢工程、系统生物学与合成生物学等相关领域的基因组改造。这些修改、改进、和应用也在本发明的可预期范围内。

本发明的优点：

1.本发明的新型基因工程载体能够将大量的外源基因整合在生物机体的基因组中，同时不影响宿主细胞的生存；

2.基因组中的任何开放阅读框都可以用作外源基因的整合位点；

3.本发明提供的方法和材料能够有效循环使用选择标记；和

4.本发明的基因工程载体和方法可广泛应用于完成基因组大规模改造项目。

以下结合具体实施案例对本发明的技术方案进一步描述，但以下实施案例不构成对本发明的限制，所有依据本发明的原理和技术手段采用的各种施用方法，均属于本发明范围。例如，虽然本发明的实施例在优选的毕赤酵母中进行，但是本发明也通过基因组数据库，在不同的宿主中进行。基因组数据可以从发表的科学文献和专业网站获取。例如公共数据库NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)提供原核生物、真核生物、和病毒等基因组详细信息。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例

材料

用于基因重组的产生、验证和应用的化学试剂、酶、培养基和溶液是常用的并且是分子和细胞生物学领域的技术人员熟知的；它们可以从许多公司获得，包括Thermo FisherScientific、Invitrogen、Sigma、New England BioLabs、Takara Biotechnology、Toyobo、TransGen Biotech和Generay Biotechnology等等。其中许多以试剂盒的形式提供。

pPIC9K、pPICZα和POG44载体获自Invitrogen。

大肠杆菌(E.coli)菌株Trans1-T1获自TransGen Biotech。

方法

除非另有表示，按照分子和细胞生物学领域技术人员熟知的标准方法进行本发明所用的方法，包括聚合酶链式反应(PCR)、限制性酶克隆、DNA纯化、细菌、酵母、细胞培养、转化、转染和蛋白质印迹等，例如以下手册所述的：Sambrook J et al.(Molecular CloningA Laboratory Manual(Third Edition),Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,2001),Ausubel F M et al.(Current Protocols in MolecularBiology,Wiley InterScience,2010),and Gregg JM(Pichia Protocols,(Secondedition),Totowa,New Jersey:Humanna Press,2010)。

大肠杆菌菌株Trans1-T1用于构建和扩增载体。菌株用含合适抗生素的Luria-Bertani(LB)培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和5g/L氯化钠)或LB平板(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物和5g/L氯化钠、20g/L琼脂)培养。抗生素的加入浓度如下所述：100mg/L氨苄青霉素、50mg/L卡那霉素、25mg/L Zeocin。

毕赤酵母菌株利用YPD培养基(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖)和YPD平板(10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖、20g/L琼脂)培养。利用不含氨基酸的YNB培养基(67g/L酵母氮源(yeast nitrogen base)、5g/L葡萄糖)和不含氨基酸的YNB平板(67g/L酵母氮源、5g/L葡萄糖,20g/L琼脂)来选择毕赤酵母原养型菌株。一些毕赤酵母营养缺陷型菌株利用SC培养基(8g/L SC不含组氨酸和尿嘧啶，20g/L葡萄糖)和SC平板(8g/LSC不含组氨酸和尿嘧啶，20g/L葡萄糖，20g/L琼脂)进行挑选，视需要适当添加抗生素。抗生素的加入浓度如下所述：250mg/L G-418硫酸盐、100mg/L Zeocin。

采用乙酸锂-SDS裂解，然后进行乙醇沉淀提取毕赤酵母中的基因组DNA，该方法描述于以下出版物：Looke et al.2011,Biotechniques.50:325–328。

利用MicroPulser^TM电穿孔设备，按照生产商(BioRad)的操作使用说明书，通过电穿孔进行毕赤酵母的转化。

实施例1

构建pFZ载体

图2描述了构建pFZ载体的示意图。

PCR1，用POG44载体作为模板，用FLP F(SEQ ID NO:1)和FLP R(SEQ ID NO:2)引物对(该引物对具有5’AOX1和AOX1TT同源序列以供同源重组)作PCR扩增FLP基因编码区。

PCR2，用pPICZα载体作为模板，用PICZ F(SEQ ID NO:3)和PICZ R(SEQ ID NO:4)引物对作PCR扩增AOX1TT-Zeocin-ori-5’AOX1片段。

用EZfusion同源重组酶(Generay)将上面两个PCR产物(1、2)连接成环状FLP表达载体(pPICZ-FLP)。

PCR3，用FLP表达载体作为模板，用SSKFRT F(SEQ ID NO:5，该引物具有Sph I、SalI和Kpn I限制性酶切位点和FRT序列)和FLP R(SEQ ID NO:2)引物对作PCR扩增FRT-5’AOX1-FLP片段。

PCR4，用FLP表达载体作为模板，用FLP F(SEQ ID NO:1)和FRTAAS R(SEQ ID NO:6，该引物具有Apa I,Afl II,和Sph I限制性酶切位点，及FRT序列)引物对作PCR扩增FLP-AOX1TT-Zeocin-ori-FRT片段。

用限制性酶消化PCR(3、4)产物后，FRT-5’AOX1-FLP和FLP-AOX1TT-Zeocin-ori-FRT的EcoR I/Sph I片段用T4连接酶环化，产生pFZ载体。

实施例2

构建pFZ-ARG2-cAtMnsI表达载体

图3描述了构建pFZ-ARG2-cAtMnsI表达载体的一个示例。

PCR1，用毕赤酵母基因组DNA作为模板，用ARG2 3’H F(SEQ ID NO:7，该引物具有Sph I限制性酶切位点)和ARG2 3’H R(SEQ ID NO:8，该引物具有ARG2 5’同源序列的重叠序列以供融合PCR)引物对作PCR扩增ARG2 3’同源序列(3’H)(719bp)。

PCR2，用毕赤酵母基因组DNA作为模板，用ARG2 5’H F(SEQ ID NO:9，该引物具有ARG2 3’同源序列的重叠序列以供融合PCR)和ARG2 5’H R(SEQ ID NO:10，该引物具有ADH1TT重叠序列以供融合PCR)引物对作PCR扩增ARG2 5’同源序列(5’H)(978bp)。

PCR3，用酿酒酵母基因组DNA作为模板，用ADH1TT F(SEQ ID NO:11，该引物具有ARG2 5’同源序列的重叠序列以供融合PCR)和ADH1TT R(SEQ ID NO:12，该引物具有Kpn I限制性酶切位点)引物对作PCR扩增ADH1转录终止子(ADH1TT)。

PCR4，用ARG2 3’H F(SEQ ID NO:7)和ADH1TT R(SEQ ID NO:12)引物对，通过重叠-延伸PCR连接以上三种PCR产物(1、2、3)。这产生了ARG2-3’H-5’H-ADH1TT的融合片段，在3’H和5’H间有Afe I限制性酶切位点。

用限制性酶消化产物后，ARG2-3’H-5’H-ADH1TT的SphI/KpnI片段用T4连接酶连接到pFZ载体的相同位点，产生pFZ-ARG2载体。

PCR4，用合成的杂合cAtMns表达盒(SEQ ID NO:13)作为模板，用ApaGAP F(SEQ IDNO:14，该引物具有Apa I限制性酶切位点)和TIF51ASph R(SEQ ID NO:15，该引物具有SphI限制性酶切位点)引物对作PCR扩增杂合cAtMnsI基因表达盒。

用限制性酶消化产物后，杂合cAtMnsI的ApaI/SphI片段用T4连接酶连接到pFZ-ARG2载体的相同位点，产生杂合cAtMnsI表达载体pFZ-ARG2-cAtMnsI。

实施例5

整合pFZ-ARG2-cAtMnsI载体在ARG2基因座并切除标记基因

应用中国专利申请号201510220631.9描述的方法敲除och1基因，得到毕赤酵母och1敲除菌((JC301-och1∷loxP)(ade1 his4 ura3 och1::loxP)。

PCR1，用毕赤酵母基因组DNA作为模板，用ADE1F(SEQ ID NO:16)和ADE1 R(SEQ IDNO:17)引物对作PCR扩增ADE1基因的开放阅读框。

按照生产商(BioRad,USA)的操作使用说明书，用MicroPulserTM电穿孔设备将ADE1开放读框的PCR产物通过电穿孔转化入毕赤酵母och1敲除菌(ade1 his4 ura3 och1::loxP)的细胞。转化的细胞在补加了20mg/L组氨酸和50mg/L尿嘧啶的SC平板上生长以选择腺嘌呤原养型毕赤酵母och1敲除菌(his4 ura3 och1::loxP)。

由合成的密码子优化的小鼠白介素-22(mIL-22，针对酵母菌密码子作优化的含his-标签小鼠IL-22成熟肽的DNA序列如SEQ ID NO:18所示)做模板，用MIL22 F(SEQ IDNO:19)/MIL22R(SEQ ID NO:20)引物对作PCR扩增。用Xho I和Not I限制性酶消化PCR产物，并克隆入pPIC9K的Xho I/Not I位点以产生mIL-22表达载体，其能表达并分泌含His-标签的mIL-22。用限制性酶Sac I线性化该表达载体，并电穿孔转入och1敲除菌(his4 ura3och1::loxP)。转化的细胞在补加了250mg/L G418硫酸盐的YPD平板上25℃培养。线性化的载体通过单交换重组整合在AOX1基因座，获得mIL-22表达菌(his4 ura3 och1::loxP,mIL22)。

图4A描述了将pFZ-ARG2-cAtMnsI表达载体整合在ARG2基因座及切除Zeocin标记基因的示意图。

将pFZ-ARG2-cAtMnsI表达载体用限制性酶Afe I消化，以产生线性载体。线性载体中，相连的重组酶FLP表达盒、Zeocin标记基因和复制起点(ori)在其上游和下游侧分别连接FRT位点特异性重组位点。位点特异性重组位点的上游侧进一步侧接ADH1转录终止子(ADH1TT)，下游侧进一步侧接杂合cAtMnsI基因表达盒，最外侧接ARG2特异性同源序列(5’H和3’H)，确保通过双交换同源重组整合在基因组的ARG2基因座。

线性载体通过电穿孔转化mIL-22表达菌(his4 ura3 och1::loxP,mIL22)。转化的细胞涂布在补加了100mg/L Zeocin的YPD平板上，25℃生长以选择抗Zeocin的表达菌。在转化板上，随机挑取菌落并培养以提取基因组DNA供PCR验证基因组的整合。两个引物对，C1(SEQ ID NO:21，位于基因组ARG2的ORF，5’H同源区域下游)/C2(SEQ ID NO:22，位于ADH1TT内)和C3(SEQ ID NO:23，位于TIF51A TT内)/C4(SEQ ID NO:24，位于基因组ARG2的3’H同源区域下游)用于PCR以验证线形载体整合在基因组的ARG2基因座。1270和1076bp带的成功PCR扩增表明线性载体通过同源重组成功整合到基因组ARG2开放读框翻译终止无义密码子下游(图4B)。由此构建了杂合cAtMnsI整合菌(his4 ura3 och1::loxP,ARG2::Zeocin-cAtMnsI,mIL22)。

将杂合cAtMnsI整合菌(his4 ura3 och1::loxP,ARG2::Zeocin-AtMnsI，mIL22)在5ml YPD培养基中，28℃，225rpm振荡培养24小时。以3000g离心沉淀细胞5分钟，重悬在5mlBMGY培养基中，28℃，225rpm振荡培养24小时。然后，以3000g离心沉淀细胞5分钟，重悬在5ml BMMY培养基中，28℃，225rpm振荡培养以诱导FLP表达。用50ul 100％甲醇(1％终浓度)每日两次掺入培养液，将诱导再维持72小时。将菌液涂布在YPD平板上，25℃生长，然后将生长的菌落点在100mg/L Zeocin的YPD平板上，证实Zeocin敏感性。甲醇诱导表达的FLP重组酶通过介导FRT位点特异性重组，准确有效地切除FLP重组酶表达盒、Zeocin选择标记和复制起点，在ARG2开放阅读框翻译终止无义密码子(TAA)下游稳定留下一段ADH1转录终止子(ADH1TT)，一个位点特异性重组位点(FRT)和cAtMnsI基因表达盒。用C1/C5(SEQ ID NO:25，位于P GAP起动子)引物对YPD平板上对Zeocin敏感性的两个菌落基因组PCR扩增出预计的1712bp条带，验证基因组中FRT间的准确切除(图4C)。由此，构建了杂合cAtMnsI表达菌(his4 ura3 och1::loxP,ARG2::cAtMnsI，mIL22)。

在线性载体整合和自我切除的过程中，ARG2开放读框的转录终止子被替换成外源的ADH1转录终止子(ADH1TT)，转录和翻译始终未受破坏，能正常发挥功能，在不含精氨酸的YNB培养基中生长，没有显现arg2营养缺陷。

切除的Zeocin选择标记可以反复使用，将外源基因整合在宿主细胞基因组的不同位点，不受有限选择标记的制约。

将杂合cAtMnsI表达菌(his4 ura3 och1::loxP,ARG2::cAtMnsI，mIL22)在5mlYPD培养基中，28℃，225rpm振荡培养24小时。以3000g离心沉淀细胞5分钟，重悬在5ml BMGY培养基中，28℃，225rpm振荡培养24小时。然后，以3000g离心沉淀细胞5分钟，重悬在5mlBMMY培养基中，28℃，225rpm振荡培养以诱导mIL-22表达。用50ul 100％甲醇(1％终浓度)每日两次掺入培养液，将诱导再维持72小时。随后，3000g离心沉淀细胞10分钟收获培养上清液。通过Ni-亲和层析从上清液中纯化带His-标签的mIL-22蛋白。采用以前报道的方法，通过N-糖苷酶F(PNGaseF)(New England Biolabs,Beverly,MA)处理，从带His-标签的mIL-22蛋白释放并分离糖链(Gregg JM(2010)Pichia Protocols,Second edition.Totowa,NewJersey:Humanna Press)。利用Ultraflex MALDI-TOF(bruker daltonics,不来梅,德国)质谱仪测定糖链的分子量。测定结果显示用杂合cAtMnsI表达菌(his4 ura3 och1::loxP,ARG2::cAtMnsI，mIL22)生产的mIL-22，其N-糖链出现Man₅GlcNAc₂(m/z:1257)和Man₈GlcNAc₂(m/z:1743)，说明杂合cAtMnsI能够将Man₈GlcNAc₂转化为Man₅GlcNAc₂。

实施例6

构建pFZ-PNO1-cAtMnsI表达载体

图5描述了构建pFZ-PNO1-cAtMnsI表达载体的一个示例。

PCR1，用毕赤酵母基因组DNA作为模板，用PNO1 3’H F(SEQ ID NO:26，该引物具有Sph I限制性酶切位点)和PNO1 3’H R(SEQ ID NO:27，该引物具有PNO1 5’同源序列的重叠序列以供融合PCR)引物对作PCR扩增PNO1 3’同源序列(3’H)(985bp)。

PCR2，用毕赤酵母基因组DNA作为模板，用PNO1 5’H F(SEQ ID NO:28，该引物具有PNO1 3’同源序列重叠序列以供融合PCR)和PNO1 5’H R(SEQ ID NO:29，该引物具有Kpn I限制性酶切位点)引物对作PCR扩增PNO1 5’同源序列(5’H)(933bp)。

PCR3，用PNO1 3’H F(SEQ ID NO:26)和PNO1 5’H R(SEQ ID NO:29)引物对，通过重叠-延伸PCR连接以上两种PCR产物(1、2)。这产生了PNO1 3’H-5’H的融合片段，在3’H和5’H间有Afe I限制性酶切位点。

用限制性酶消化产物后，PNO1 3’H-5’H的SphI/KpnI片段用T4连接酶连接到pFZ载体的相同位点，产生pFZ-PNO1载体。

PCR4，用合成的杂合cAtMns表达盒作为模板，用ApaGAP F(SEQ ID NO:14，该引物具有Apa I限制性酶切位点)和TIF51ASph R(SEQ ID NO:15，该引物具有Sph I限制性酶切位点)引物对作PCR扩增杂合cAtMnsI基因。

用限制性酶消化产物后，cAtMnsI的ApaI/SphI片段用T4连接酶连接到pFZ-PNO1载体的相同位点，产生杂合cAtMnsI表达载体pFZ-PNO1-cAtMnsI。

实施例7

整合pFZ-PNO1-cAtMnsI载体在PNO1基因座表达并切除标记基因

图6A描述了将pFZ-PNO1-cAtMnsI表达载体整合在PNO1基因座及切除Zeocin标记基因的示意图。

将pFZ-PNO1-cAtMnsI表达载体用限制性酶Afe I消化，以产生线性载体。线性载体中，相连的重组酶FLP表达盒、Zeocin标记基因和复制起点(ori)在其上游和下游侧分别连接FRT位点特异性重组位点。位点特异性重组位点的下游侧进一步侧接杂合cAtMnsI基因表达盒，最外侧接PNO1特异性同源序列(5’H和3’H)，确保通过双交换同源重组整合在基因组的PNO1基因座。用MicroPulserTM电穿孔设备将这些线形载体通过电穿孔转化mIL-22表达菌(his4 ura3 och1::loxP,mIL22)。转化的细胞涂布在补加了100mg/L Zeocin的YPD平板上，25℃生长以选择抗Zeocin的表达菌。在转化板上，随机挑取菌落并培养以提取基因组DNA供PCR验证基因组的整合。两个引物对，C6(SEQ ID NO:30，位于基因组中5’同源区域上游)/C7(SEQ ID NO:31，位于5’AOX1内)和C3/C8(SEQ ID NO:32，位于基因组中3’同源区域下游)用于PCR以验证线形载体整合在基因组的PNO1基因座。1411和1369bp带的成功PCR扩增表明线性载体通过同源重组成功整合到基因组上替换了PNO1的ORF(图6B)。由此，构建了pno1::cAtMnsI整合菌(his4 ura3 och1::loxP,pno1::Zeocin-cAtMnsI，mIL22)。

将杂合cAtMnsI整合菌(his4 ura3 och1::loxP,pno1::Zeocin-AtMnsI,mIL22)在5ml YPD培养基中，28℃，225rpm振荡培养24小时。以3000g离心沉淀细胞5分钟，重悬在5mlBMGY培养基中，28℃，225rpm振荡培养24小时。然后，以3000g离心沉淀细胞5分钟，重悬在5ml BMGY培养基中，28℃，225rpm振荡培养以诱导FLP表达。用50μl 100％甲醇(1％终浓度)每日两次掺入培养液，将诱导再维持72小时。将菌液涂布在YPD平板上，25℃生长，然后将生长的菌落点在100mg/L Zeocin的YPD平板上，证实Zeocin敏感性。甲醇诱导表达的FLP重组酶通过介导FRT位点特异性重组，准确有效地切除FLP重组酶表达盒、Zeocin选择标记和复制起点，在基因组PNO1基因座的开放阅读框被替换成一个位点特异性重组位点FRT和杂合cAtMnsI基因。用C6/C5引物对YPD平板上对Zeocin敏感性的两个菌落基因组PCR扩增出预计的1367bp条带，验证基因组中FRT间的准确切除(图6C)。由此，构建了杂合cAtMnsI表达菌(his4 ura3 och1::loxP,pno1::cAtMnsI，mIL22)。用这个菌表达的mIL-22的N-糖链，用MALDI-TOF分析显示含有Man₅GlcNAc₂(m/z:1257)和Man₈GlcNAc₂(m/z:1743)，说明杂合cAtMnsI能够将Man₈GlcNAc₂转化为Man₅GlcNAc₂。

本发明所用的序列总结于下表：

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 杭州菁因康生物科技有限公司

<120> 一种高效的基因工程载体

<130> P2017-1490

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

taattattcg aaacgatgcc acaatttgat atattatg 38

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctaaggcta caaacttata tgcgtctatt tatgtag 37

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtttgtagcc ttagacatga ctg 23

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgtttcgaat aattagttgt tttttg 26

<210> 5

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acatgcatgc gtcgacggta ccgaagttcc tattccgaag ttcctattct ctagaaagta 60

taggaacttc agatctaaca tccaaagacg 90

<210> 6

<211> 90

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acatgcatgc cttaaggggc ccgaagttcc tatactttct agagaatagg aacttcggaa 60

taggaacttc gatctcatga ccaaaatccc 90

<210> 7

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaggcatgc gtcgacggta ccagacgaga tcaattagaa cc 42

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tttcaagtca gtagcgcttc gattgttcta gataag 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tagaacaatc gaagcgctac tgacttgaaa tccttg 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcataagaaa ttcgcttatc cattccagga aggttg 36

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcctggaatg gataagcgaa tttcttatga tttatg 36

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cggaatagga acttcggtac cttgtcctct gaggacataa a 41

<210> 13

<211> 2835

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttttttgtag aaatgtcttg gtgtcctcgt ccaatcaggt agccatctct gaaatatctg 60

gctccgttgc aactccgaac gacctgctgg caacgtaaaa ttctccgggg taaaacttaa 120

atgtggagta atggaaccag aaacgtctct tcccttctct ctccttccac cgcccgttac 180

cgtccctagg aaattttact ctgctggaga gcttcttcta cggccccctt gcagcaatgc 240

tcttcccagc attacgttgc gggtaaaacg gaagtcgtgt acccgaccta gcagcccagg 300

gatggaaaag tcccggccgt cgctggcaat aatagcgggc ggacgcatgt catgagatta 360

ttggaaacca ccagaatcga atataaaagg cgaacacctt tcccaatttt ggtttctcct 420

gacccaaaga ctttaaattt aatttatttg tccctatttc aatcaattga acaactatca 480

aaacacaacg cgtatgtcta gtgtacctta taattcccaa cttcctatat ccaaccatct 540

agagtacgat gaagatgaaa agaagagcag aggctcaaaa ctaggcctga aatataaaat 600

gatatactgg aggaaaactt tatgcagttc gctagcgaga tggagaaagc taatactatt 660

aatatcttta gctttgtttt tattcatatg gataagcgat tccaccataa gcagaaatcc 720

atctaccaca agttttcaag gccaaaatag taacgataat aagttgagta atactggttc 780

tagcatcaac tccaaaagat atgtaccacc atattctaag agatcaagat ggtcgttttg 840

gggtaccggc aataagcctt tgaagactct gaaggatgcc ccagaagatc cagttgataa 900

acagcgaagg cagaaagtaa aagaggcaat gatccatgct tggagctctt atgaaaagta 960

tgcatggggg aaagatgagc ttcagcctcg gacaaaagat ggcactgata gctttggtgg 1020

ccttggagca actatggtag attctttaga tacactctat ataatgggtc tagatgagca 1080

gtttcaaaaa gccagagagt gggttgcaag ctcattggat ttcgacaagg attatgacgc 1140

cagtatgttt gagacaacca taagagttgt aggcggactt cttagtgcgt atgatctttc 1200

tggggacaaa atgttccttg aaaaggctaa ggatattgca gacagattat tgcctgcatg 1260

gaatactcca acgggtatac cttacaatat tatcaacttg agaaatggaa atgctcacaa 1320

tccttcatgg gcggcagggg gagacagtat tctcgcagac tccggcactg agcagctcga 1380

atttattgcc ctttcccaaa ggacagggga cccaaaatat cagcagaagg tagagaaggt 1440

tattacagaa ctgaataaga actttcctgc tgatggttta cttcccatct atataaatcc 1500

ggataatgct aatccatcgt actctaccac aacatttggt gccatgggag atagctttta 1560

tgagtatttg ctcaaagttt gggtgcaagg gaacaaaaca tctgccgtga aaccctatag 1620

agatatgtgg gagaaatcaa tgaaaggttt gttaagcttg gtcaagaaat caacaccttc 1680

atcatttacg tatatatgtg agaagaacgg aaataatttg attgataaga tggatgaatt 1740

ggcgtgcttt gctcctggaa tgttggcttt aggagcttca ggttatggcc ctgatgaaga 1800

aaaaaagttt ctttcacttg ctggagagct tgcctggact tgttataact tttaccaatc 1860

gacaccaacg aaacttgctg gagagaacta tttcttcact gcagggcagg acatgagtgt 1920

tggcacatct tggaacattt taagaccaga aaccgttgaa tcactgtttt acctctggcg 1980

attaactggg aacaagacat atcaagagtg gggatggaat atatttcaag catttgagaa 2040

gaactctcgc gtagaatctg gatatgtagg cttgaaggat gtcaatacag gtgctaaaga 2100

caacaagatg caaagcttct tcttagctga gactcttaag tatctatatc ttctcttttc 2160

gccttcatct gttatttcat tagacgagtg ggttttcaac acagaagccc atccgcttaa 2220

gattgtggca cggaatgatc cgcgtaagcc aactatagca ctacgccaga ggaagtttgg 2280

tcatcagatt aacgtttagc tcgagaccgg ttaacatcat ggcatgggat ataaatgaaa 2340

aaagaaaaaa aaactccgac gccccttcca tcacatcatg tactcttcgc tgaaccgggt 2400

ttttttcttt gcaatttttt tttcgttctc ctaaagcata cacaaataaa tccttttttt 2460

tattttctat ttattttgtt atttatcatc tatatagcaa taatatactt tgtttttatt 2520

cgtatttcac acttttcttt ttccttatgc aggcagtgta attcattggg gaggatgatt 2580

ttcatgtgcg catatctacc ggctgcaagc agccggtcgg tggcaaatcc ggcgcttccc 2640

cctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaag ggaactctca gaacggggga ggttgaagag 2700

caggccaagg gaaatattag ttttgaccta tgtgggaaac agaattttca atgagttatg 2760

gcaacttggc cgagtggtta aggcgaaaga ttagaaatct tttgggcttt gcccgcgcag 2820

gttcgagtcc tgcag 2835

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttggggccct tttttgtaga aatgtcttgg 30

<210> 15

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

acatgcatgc ctgcaggact cgaacctgcg c 31

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

atgtccattg tgaacactga tc 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcaagcccat ttcttgccag 20

<210> 18

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttgccagtca acaccagatg caaattggag gtctcaaact ttcaacagcc atacatcgtt 60

aatagaactt ttatgcttgc taaggaagct tcattggccg ataacaatac cgacgttaga 120

ttgattggtg aaaagctttt tagaggagtc agtgccaagg atcaatgtta cttgatgaaa 180

caggttttga acttcactct tgaagatgtc ttgcttccac aatcagacag atttcaacct 240

tatatgcagg aggttgtccc attcttgaca aagctttcaa atcagttgtc ttcctgccat 300

attagtggag atgaccaaaa catccagaag aatgttagaa gattgaaaga aactgtcaag 360

aaacttggtg aatctggaga gattaaagca atcggagagt tggacttgct ttttatgtcc 420

ttgagaaacg cttgtgttca tcaccatcac catcactaa 459

<210> 19

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ccgctcgaga aaagagaggc tgaagctttg ccagtcaaca ccagatg 47

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ataagaatgc ggccgcttag tgatggtg 28

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atgaccctac cagagctatt ac 22

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cgacctcatg ctatacctga g 21

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tgtaattcat tggggaggat g 21

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atgcgtgtgc tattcgctgg ag 22

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtagaagaag ctctccagca gag 23

<210> 26

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

acatgcatgc caaatacgaa attgaaggtg g 31

<210> 27

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

attaatgtta gtagcgctca atctcttcca aagttc 36

<210> 28

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tggaagagat tgagcgctac taacattaat agtac 35

<210> 29

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cggggtacca tggcctgtat aagtatcag 29

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

gctccaatta cattgccaca g 21

<210> 31

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

caaacatgaa cctcgccagg g 21

<210> 32

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gttataagga gcgtaactag tc 22

Claims

1.一种核苷酸构建物，所述核苷酸构建物具有以下所示的I类结构：

5’H-T-F-GOI-3’H；

5’H-T-GOI-F-3’H；

5’H-F-T-GOI-3’H；

5’H-F-GOI-T-3’H；

5’H-GOI-T-F-3’H；

5’H-GOI-F-T-3’H；

5’H-F-GOI-3’H；

5’H-GOI-F-3’H；

其中，

T是外源性终止子；

F为B-C-Marker-B所示基因片段；其中B是位点特异性重组位点；C是所述位点特异性重组位点相对应的重组酶表达盒；Marker是标记基因表达盒；

GOI是外源基因表达盒；

或者，

所述核苷酸构建物具有以下所示的II类结构：

5’H-F-GOI-P-3’H；

5’H-GOI-F-P-3’H；

5’H-P-F-GOI-3’H；

5’H-P-GOI-F-3’H；

5’H-F-P-GOI-3’H；

5’H-GOI-P-F-3’H；

5’H-F-GOI-3’H；

5’H-GOI-F-3’H；

其中，

P是外源性启动子；

F、B、C、Marker和GOI如上所述。

2.如权利要求1所述的核苷酸构建物，所述核苷酸构建物具有以下所示的I类结构：

5’H-T-F-GOI-3’H；

5’H-T-GOI-F-3’H；

5’H-F-T-GOI-3’H；

5’H-F-GOI-T-3’H；

5’H-GOI-T-F-3’H；

5’H-GOI-F-T-3’H；

其中，T、F、GOI如权利要求1所述；

或者，

所述核苷酸构建物具有以下所示的II类结构

5’H-F-GOI-P-3’H；

5’H-GOI-F-P-3’H；

5’H-P-F-GOI-3’H；

5’H-P-GOI-F-3’H；

5’H-F-P-GOI-3’H；

5’H-GOI-P-F-3’H；

其中，P、F和GOI如权利要求1所述。

3.如权利要求1或2所述的核苷酸构建物，其特征在于，所述转录终止子包括但不限于：酿酒酵母的ADH1、CYC1和TIF51A等转录终止子，毕赤酵母的ALG6、AOD、AOX1、ARG4、PMA1和TEF1等转录终止子；

转录启动子包括但不限于：酿酒酵母的ADH1、GAP、PGK1和TEF1等转录启动子，毕赤酵母的GAP、ILV5、PGK1、TEF1等转录启动子，诱导启动子AOX1和FLD1等；

所述位点特异性重组位点以及相应的重组酶构成位点特异性重组系统，包括但不限于酿酒酵母的Flp-FRT，细菌噬菌体P1的Cre-loxP和Xygosaccharomyces rouxii的R-RS；

标记基因包括一个或多个抗生素耐受性基因，优选耐受博莱霉素(zeocin)的Shble基因，和耐受卡那霉素(kanamycin，kan)或遗传霉素(geneticin，G418)的neo基因，耐受杀稻瘟菌素(Blasticidin)的BSD基因等。

4.如权利要求1或2所述的核苷酸构建物，其特征在于，所述重组酶包括但不限于Flp重组酶或Cre重组酶；优选Flp重组酶。

5.如权利要求1或2所述的核苷酸构建物，其特征在于，所述核苷酸构建物在5’端和3’端还包含同源臂。

6.如权利要求1-5中任一项所述的核苷酸构建物，其特征在于，所述核苷酸构建物还可以包含当所述核苷酸构建物形成环状时，能够在宿主细胞(例如，细菌)中复制所需的其它基因X，优选细菌复制起点和抗生素耐受性基因；并且当所述核苷酸构建物形成线形构建物时，所述其它基因X的位置在所述核苷酸构建物的B之间的任何位置。

7.一种表达载体，所述表达载体包含权利要求1-6中任一项所述的核苷酸构建物。

8.一种宿主细胞，所述宿主细胞在其基因组中整合有权利要求1-6任一项所述的核苷酸构建物。

9.一种对宿主细胞进行基因改造的方法，所述方法包括利用权利要求1-6中任一项所述的核苷酸构建物整合外源基因。

10.如权利要求9所述的方法，所述方法包括以下步骤：

a.构建权利要求1-6中任一项所述的核苷酸构建物；

通过同源重组将具有II类结构的核苷酸构建物功能性整合在基因组开放阅读框(openreading frame，ORF)的翻译起始密码子(ATG)上游；或者

通过同源重组将具有I或II类结构的核苷酸构建物功能性整合在基因组中的任意位置，即，开放阅读框(ORF)中间，或其上游和下游的任意位置；和

11.权利要求1-6中任一项所述的核苷酸构建物或权利要求7所述的表达载体在对宿主细胞进行基因改造中的用途。

12.权利要求9或10所述的方法改造的宿主细胞的用途，所述菌株应用于代谢工程、系统生物学与合成生物学等领域；包括但不限于：所述菌株用于生物催化反应，或者所述菌株用于生产重组蛋白。