CN101974547B

CN101974547B - 含FLP的pBBR1MCS-2重组质粒及运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法

Info

Publication number: CN101974547B
Application number: CN2010102418023A
Authority: CN
Inventors: 邹少兰; 洪解放; 马媛媛; 张鲲; 井欣; 张敏华
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2010-07-30
Filing date: 2010-07-30
Publication date: 2012-06-27
Anticipated expiration: 2030-07-30
Also published as: CN101974547A

Abstract

本发明公开了含FLP的pBBR1MCS-2重组质粒及运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法，该质粒是用下述方法构建：将片段Pgap-FLP经ClaI和XbaI位点插入到pBBR1MCS-2中，而得到pBBR1MCS-2-Pgap-FLP，所述Pgap-FLP是序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。本发明的质粒，能通过电穿孔方式方便地转化进入运动发酵单胞菌，并能方便地被除去；结合使用来自酿酒酵母的FRT-FLP位点特异性重组系统，提供了一种快速、高效、方便、稳定的运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法；提供了一种循环使用选择标记基因进行运动发酵单胞菌基因组多个位点的DNA修饰的方法。

Description

含FLP的pBBR1MCS-2重组质粒及运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域。具体地涉及一种含FLP的pBBR1MCS-2重组质粒及运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法。

背景技术

随着包括人类基因组计划在内的各种基因组测序工程的实施与完成，以序列信息为基础的基因组功能研究随即成为生命科学领域的又一重大课题。相对于测序工程，基因组的功能研究更加复杂和困难。对于某一特定基因，要想彻底了解其生物学作用，往往需要对包含基因完整信息的基因组DNA进行克隆、删除、突变等多种修饰，从而为后续的表达和功能研究奠定基础。运动发酵单胞菌作为极有工业应用价值的、已有两个典型菌株测序的微生物，同样也面临着基因功能研究的难题。

运动发酵单胞菌是目前所知产醇能力最强的细菌之一，还能高产果聚糖、葡萄糖酸、山梨醇等生物化工产品，但它所能利用的碳源范围太窄，仅限于葡萄糖、果糖和蔗糖。对运动发酵单胞菌的改造工作，因为其遗传背景知识相对缺乏、限制修饰系统严格、有广泛而多样的内源性质粒和广泛的抗性谱等等因素，给遗传操作带来很大的难度，故几十年来虽然已经取得很大进展，但仍然远远不能满足应用研究的需要。于2005年、2009年分别发表公布的菌株ZM4(＝ATCC31821)和NCIMB11163的全基因组序列(Seo JS，Chong H，Park HS，et al.The genome sequence of the ethanologenic bacterium Zymomonas mobilis ZM4.Nature Biotechnology.2005；23：63-68.Vassili N.Kouvelis，Elizabeth Saunders，Thomas S.Brettin，et al.Complete Genome Sequence of the Ethanol Producer Zymomonas mobilis NCIMB 11163.Journal of Bacteriology，2009，191(22)：7140-7141)，将极大地推动对上述问题的认识和解决，推动运动发酵单胞菌的基础研究和应用研究；但解读测序信息、进行基因功能研究，本身就需要改进现有操作技术、发展相应的遗传操作手段。

进行微生物基因功能研究的重要方法之一是同源重组方式失活基因，观察表型。一般来说是先构建相关的整合载体，然后通过电穿孔等方式引入到胞内，利用宿主自身的基于recA的同源重组系统进行同源重组交换，将整合载体上的打靶DNA片段定点整合到胞内待修饰的基因组DNA位点，完成基因组DNA相应位点处的基因(包括功能元件)的删除或突变等修饰，然后研究相应的工程菌株的表型变化，确认其与基因组DNA修饰之间的关系。体内利用宿主自身的基于recA的同源重组系统进行的同源重组过程属于稀有事件，通常概率是很低的，因此对电穿孔的转化效率有更高的要求。另一方面，因为前述的低效的原因，通常必须使用选择标记，以方便转化子的筛选；但为了消除这些标记带来的可能的不利影响，这些选择标记最后必须除去。由于有些表型同时涉及很多基因，或基因与基因之间存在关联性，研究常常需要进行一系列的不同位点、不同基因的基因组DNA修饰，或者同一位点的不同类型的基因组DNA修饰，因此也需要使用多个选择标记；而对一个特定的菌株而言，选择标记的数目通常总是有限的，选择标记的循环使用也就很必要了。

目前导入DNA到运动发酵单胞菌胞内的相对方便、简单、稳定的操作方式是电穿孔转化法。关于电穿孔转化的具体操作条件和效率，已有一些报道，其与宿主菌株、质粒类型都直接相关，报道彼此出入很大；其中用于定点整合、基因组DNA修饰的电穿孔转化的报道极少，应用的机制仍然只是宿主自身的基于recA的同源重组系统。另外，虽然运动发酵单胞菌自身就具有广泛的抗性谱，但限于种种原因，目前运动发酵单胞菌通常的选择标记仍然只是有限的几种抗性标记。

综上所述，目前的运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法仍然是相对单一、低效的，难以满足运动发酵单胞菌分子生物学研究和进一步的改造应用研究的需要，本领域亟需建立更加多样化、更加有效方便的运动发酵单胞菌基因组DNA修饰方法。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种含酿酒酵母位点特异性重组酶基因FLP的pBBR1MCS-2重组质粒。

本发明的第二个目的是提供一种能快速、方便、高效敲除基因组修饰成功后不需要的选择标记基因、循环使用选择标记基因的运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法。

本发明的技术方案概述如下：

含FLP的pBBR1MCS-2重组质粒，用下述方法构建：

将片段Pgap-FLP经ClaI和XbaI位点插入到pBBR1MCS-2中，而得到pBBR1MCS-2-Pgap-FLP，所述Pgap-FLP是序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列。

运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法，包括如下步骤：

(1)在运动发酵单胞菌基因组DNA的位点1处整合含有两个同向的FRT位点的DNA片段，所述DNA片段的两个FRT位点之间含有选择标记基因，得到位点1处被修饰的菌株；

(2)经电穿孔的方法将pBBR1MCS-2-Pgap-FL P引入到步骤(1)构建的菌株中，筛选得到因FLP表达而删除了两个FRT位点之间的DNA和一个FRT位点的转化子菌株；

(3)将所述转化子菌株中的pBBR1MCS-2-Pgap-FLP除去，得到基因组位点1处只有一个FRT位点的重组菌株，所述pBBR1MCS-2-Pgap-FLP是含有序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列的质粒。

所述选择标记基因为氯霉素抗性基因cml，四环素抗性基因tet，氨苄青霉素抗性基因amp或链霉素抗性基因spe。

步骤(2)所述电穿孔操作的参数为：2mm电击杯中感受态细胞体积为80μl～160μl；电场强度为11.0～12.5kV/cm；复苏时间为2～3h。

步骤(3)所述的将所述转化子菌株中的pBBR1MCS-2-Pgap-FLP除去的方法为：将步骤(2)得到的转化子菌株于30℃、RM液体培养，转接2-3次，所得菌液涂布RM平板，筛选鉴定平板上生长的菌落。

本发明的有益效果在于：

1、提供了一种用于运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的含有FLP基因的质粒，此质粒能通过电穿孔方式方便地转化进入运动发酵单胞菌，又能方便地从运动发酵单胞菌中被除去；

2、结合使用宿主自身的基于recA的同源重组系统和来自酿酒酵母的FRT-FLP位点特异性重组系统，提供了一种快速、高效、方便、稳定的运动发酵单胞菌基因组DNA修饰的方法；

3、提供了一种循环使用选择标记基因进行运动发酵单胞菌基因组多个位点的DNA修饰的方法。

附图说明

图1为pBBR1MCS-2-Pgap-FLP的构建示意图。

图2为实施例2中使用鉴定引物对P5、P6所做的菌落PCR所得产物的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中1为ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)对照，2为转化子，3为ZM4对照，4为DNA marker。

图3为pUC19-gfoR-FRT-cml-FRT-talBtktA-gfoL的构建示意图。

图4为实施例3中以染色体为模板，鉴定引物对P11、P12为引物所做的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中1为ZM4(ldh::FRT)gfo::FRT-tktAtalB)菌株，2为ZM4(ldh::FRT)对照菌株，3为ZM4(ldh::FRT)gfo::FRT-cml-FRT-tktA talB)菌株，4为ZM4(ldh::FRT)对照菌株，5为DNA marker。

具体实施方式

目前对运动发酵单胞菌进行的基于recA的同源重组的基因组DNA定点修饰方法，首先需要构建含有较长的两个同源臂序列和抗生素抗性选择标记基因的整合质粒载体，抗生素抗性选择标记基因位于两个同源臂序列之间。整合质粒载体电穿孔进入细胞后，选择标记基因随着两个同源臂序列之间的其它序列一起被交换整合到染色体上，从而使得整合菌株可通过使用相应的抗性平板得到筛选。可以理解的是，整合菌株中的选择标记基因若想再除去是很困难的：用前述的同源重组方法，因效率很低无法筛选；若为方便筛选而用另一个选择标记基因来替换，则达不到最终除去标记基因的目的。

酿酒酵母的FLP-FRT位点特异性重组系统包含FLP基因和两个同向FRT位点，FLP酶蛋白特异性地识别FRT位点，并催化两个同向FRT位点之间的片段弹出，只剩下一个FRT位点。因此，可以理解的是，要在运动发酵单胞菌中应用FLP-FRT系统，需要解决如下问题：1、运动发酵单胞菌中目前还没有关于FRT位点的研究报道，因此，要在运动发酵单胞菌中应用此系统，首先需要在进行同源重组整合时就引入FRT位点；需要敲除时，在待敲除的DNA(选择标记基因)两端各加上一个FRT位点；2、FLP能否在运动发酵单胞菌中顺利表达；3、由于FLP最终也不得在工程菌株内保留，加上运动发酵单胞菌的转化技术仍然不是很成熟(ZM4尤其如此)，引入FLP的载体，既要能方便地转化到运动发酵单胞菌中，又要能被方便地除去。

本发明的技术，选择了运动发酵单胞菌的强启动子即3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gap启动子来表达FLP；选择了宽宿主质粒pBBR1MCS-2作为载体，并反复优化了其电穿孔操作条件。

应当理解的是，运动发酵单胞菌胞内稳定存在的任何含两个同向的FRT位点的DNA，不论其用何种手段引入，均可应用本发明的质粒和方法敲除其两个FRT位点之间的DNA。

应用理解的是，本发明的质粒和方法，可顺次用于运动发酵单胞菌基因组DNA位点1、位点2、位点3……的修饰。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的保护范围不仅限于此。若非特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1pBBR1MCS-2-Pgap-FLP的构建

本构建的示意图见图1，所涉及的引物P1到P4见表1。

表1、本发明构建用和运动发酵单胞菌工程菌株鉴定用引物

以运动发酵单胞菌测序菌株ZM4的基因组DNA为模板，根据已公布的ZM4全基因组序列AE008692设计引物P1和P2，扩增得到347bp、含ZM4的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gap启动子区的产物，命名为PCR1；

以pCP20质粒为模板，用P3和P4扩增得到1474bp、含酿酒酵母位点特异性重组酶基因FLP的产物，命名为PCR2；

再以PCR1和PCR2为模板，以P1和P4为引物，扩增得到1801bp的产物，命名为PCR3，PCR3含有ClaI位点、XbaI位点和Pgap-FLP。

按Promega公司的TA克隆载体pGEM-T easy试剂盒的说明书操作，将PCR3连至pGEM-T easy，得到质粒pGEM-T easy-PCR3，测序结果表明没有突变发生，Pgap-FLP的核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO：1。

pGEM-T easy-PCR3用ClaI和XbaI双切得到1783bp大小的片段，与pBBR1MCS-2的ClaI和XbaI双切大片段(5095bp)连接，连接产物用CaCl2化学法方法转化Top10感受态细胞，用LB+Amp100μg/ml的筛选平板筛选，所得转化子用LB+Amp100μg/ml培养液后提取质粒，进行酶切鉴定，证明得到pBBR1MCS-2-Pgap-FLP(6880bp)。用于保存和扩增pBBR1MCS-2-Pgap-FLP的菌株JM110(pBBR1MCS-2-Pgap-FLP)，命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2010年7月13日，保藏号为CGMCC No.4003。

实施例2：运动发酵单胞菌ZM4基因组乳酸脱氢酶基因ldh被失活修饰的菌株ZM4(ldh::FRT)的构建

1.在运动发酵单胞菌ZM4基因组DNA的位点1(乳酸脱氢酶基因ldh)处整合含有两个同向的FRT位点的DNA片段(即FRT-cml-FRT)，所述DNA片段的两个FRT位点之间含有选择标记基因氯霉素基因cml，得到位点1处被修饰的菌株ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)，此菌株的构建见文献(邹少兰，洪解放，马媛媛等.运动发酵单胞菌定点整合质粒的构建，南开大学学报(自然科学版)，2009，42(6)：42-47)；

2.经电穿孔的方法将pBBR1MCS-2-Pgap-FLP引入到步骤1.构建的菌株ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)中，筛选得到因FLP表达而删除了两个FRT位点之间的DNA和一个FRT位点的转化子菌株ZM4(ldh::FRT)(pBBR1MCS-2-Pgap-FLP)；

(1)ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)感受态细胞的制备

首先划线接种菌株ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)到RM固体培养基平板(2％D-glucose，1％yeast extract，0.2％KH₂PO₄，pH 6.0，agar 1.8％)，30℃静置培养3天，进行平板活化；挑取平板生长单菌落，接种RM液体培养基(2％D-glucose，1％yeast extract，0.2％KH₂PO₄，pH 6.0)，30℃静置培养18小时，为一次液体培养；上述液体培养物，按1％接种量接种RM液体，30℃静置培养至OD₆₀₀＝0.405，冰浴5min，6000rpm、4℃、3min离心收集菌体，去上清，20ml冰浴预冷的无菌10％甘油洗涤，重复3次，去上清，用培养液体积的1/100体积的冰浴预冷无菌10％甘油重悬，各分装80μl到1.5ml无菌离心管中，即得到浓缩倍数为100倍的ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)感受态细胞；

(2)pBBR1MCS-2-Pgap-FLP的制备

从大肠杆菌JM110菌株用碱法小量质粒提取法制备pBBR1MCS-2-Pgap-FLP，无菌水溶解，调整浓度为750ng/μl；pBBR1MCS-2-Pgap-FLP是含有序列表中SEQ ID NO：1所述的核苷酸序列的质粒；

(3)pBBR1MCS-2-Pgap-FLP电穿孔转化ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)感受态细胞

在步骤(1)制得的感受态细胞样品中加入步骤(2)制得的质粒pBBR1MCS-2-Pgap-FLP样品2μl，混匀，转至冰浴预冷的2mm电击杯中，冰浴5分钟，电转化仪上电场强度11.0kV/cm(对应电压为2.20kV)、电容25μF、电阻200Ω下进行电击；击毕，迅速加入30℃的0.8mlRM(1％yeast extract，酵母粉，2％D-glucose，D-葡萄糖，0.2％KH₂PO₄，磷酸二氢钾)，30℃静置3 小时复苏；复苏后的菌液离心浓缩，涂布加有卡拉霉素的RM筛选平板(卡拉霉素终浓度310μg/ml)，30℃静置培养5天，平板生长的菌落接种RM+Km310μg/ml平板(Km为卡拉霉素)，进一步确认对卡拉霉素的抗性，然后进行菌落PCR鉴定和依次点接平板RM+Cm100μg/ml、RM+Km310μg/ml、RM鉴定；菌落PCR鉴定(引物对P5、P6，见表1)的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱见图2，平板点接培养证明在Cm100中不能生长、在Km310中生长正常，证明cml已被敲除、pBBR1MCS-2-Pgap-FLP存在，即得到转化子菌株ZM4(ldh::FRT)(pBBR1MCS-2-Pgap-FLP)；

使用引物对P5、P6时的PCR产物预期大小分别为：ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)，1417bp；ZM4，320bp；ZM4(ldh::FRT)(pBBR1MCS-2-Pgap-FLP)，大于320bp。

3.除去转化子菌株ZM4(ldh::FRT)(pBBR1MCS-2-Pgap-FLP)中的pBBR1MCS-2-Pgap-FLP，得到ZM4(ldh::FRT)菌株

挑取步骤2中的转化子菌株ZM4(ldh::FRT)(pBBR1MCS-2-Pgap-FLP)，接种RM液体培养基，30℃、静置培养18小时，观察到浑浊后连续进行转接2次，然后涂布或划线接种RM平板，长出的菌落依次点接RM+Cm100μg/ml平板(Cm为氯霉素)、RM+Km310μg/ml平板和RM平板，仅能在RM平板上生长的菌落即为基因组位点1处只有一个FRT位点的ZM4(ldh::FRT)菌株。

本实施例中的氯霉素基因cml也可以用四环素抗性基因tet或氨苄青霉素抗性基因amp或链霉素抗性基因spe替代，实验证明也能得到相似的结果。

实施例3：运动发酵单胞菌ZM4(ldh::FRT)基因组葡萄糖果糖氧化还原酶基因gfo被失活修饰的菌株ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-tktA talB)的构建

1.在运动发酵单胞菌ZM4(ldh::FRT)基因组DNA的位点2(葡萄糖果糖氧化还原酶基因gfo)处整合含有两个同向的FRT位点的DNA片段(即FRT-cml-FRT-tktAtalB)，所述DNA片段的两个FRT位点之间含有选择标记基因cml，得到位点2处被修饰的ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-cml-FRT-tktA-talB)菌株

(1)构建整合质粒pUC19-gfoR-FRT-cml-FRT-tktA-talB-gfoL

构建全流程见图3。所使用的克隆引物P7到P10和鉴定引物P11到P12见表1。

根据已公布的ZM4全基因组序列AE008692设计引物P7到P10。以运动发酵单胞菌测序菌株ZM4的基因组DNA为模板，用P7和P8进行PCR扩增得到PCR1，以为同源重组方式失活gfo基因所需的右同源臂gfoR，两端分别含SalI和NotI/KpnI位点；SalI和KpnI双切PCR1，连至同样双切的pUC19质粒中，得到pUC19-gfoR-NotI，测序证明没有突变；

以运动发酵单胞菌测序菌株ZM4的基因组DNA为模板，用P9和P10进行PCR扩增得到PCR2，以为同源重组方式失活gfo基因所需的左同源臂gfoL，两端分别含NotI/SfiI和EcoRI位点；NotI和EcoRI双切PCR2，连至同样双切的pUC19-gfoR-NotI质粒中，得到pUC 19-gfoR-NotI/SfiI-gfoL；

从质粒pUC18SfiI-tktA-talB切下SfiI-tktA-talB-SfiI片段，与SfiI酶切的pUC19-gfoR-NotI/SfiI-gfoL片段连接，得到质粒pUC19-gfoR-NotI-SfiI-tktA-talB-SfiI-gfoL。

从质粒pUC18NotI-cml切下NotI-FRT-cml-FRT-NotI片段，连入pUC19-gfoR-NotI-SfiI-tktA-talB-SfiI-gfoL，得到pUC19-gfoR-FRT-cml-FRT-tktA-talB-gfoL；

(2)运动发酵单胞菌ZM4(ldh::FRT)感受态细胞制备

用ZM4(ldh::FRT)代替实施例2的步骤2(1)的ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)，用120μl替代80μl，其它同实施例2步骤2(1)；

(3)质粒pUC19-gfoR-FRT-cml-FRT-tktA-talB-gfoL的制备

从大肠杆菌JM110菌株用碱法小量质粒提取法制备pBBR1MCS-2-Pgap-FLP，无菌水溶解，AatII酶切线性化，纯化，调整浓度为1200ng/μl；

(4)质粒pUC19-gfoR-FRT-cml-FRT-tktA-talB-gfoL电穿孔转化运动发酵单胞菌ZM4(ldh::FRT)感受态细胞，构建得到ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-cml-FRT-tktA-talB)

在步骤(2)制得的感受态细胞样品中加入步骤(3)制得的质粒pUC19-gfoR-FRT-cml-FRT-tktA-talB-gfoL样品3μl，混匀，转至冰浴预冷的2mm电击杯中，冰浴5分钟，电转化仪上电场强度12.5kV/cm(对应电压为2.50kV)、电容25μF、电阻200Ω下进行电击；击毕，迅速加入30℃的0.8ml RM(1％yeast extract，酵母粉，2％D-glucose，D-葡萄糖，0.2％KH₂PO₄，磷酸二氢钾)，30℃静置15小时复苏；复苏后的菌液离心浓缩，涂布加有氯霉素Cm的RM筛选平板(氯霉素终浓度100μg/ml)，30℃静置培养15天，平板生长的菌落接种RM+Am350μg/ml(Am为氨苄青霉素)、RM+Cm100μg/ml、RM平板，进一步确认对氯霉素的抗性，然后进行菌落PCR鉴定和RM+Cm100μg/ml液体培养鉴定；菌落PCR鉴定(引物对P11、P12，见表1)的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱见图4，抗性液体培养证明在RM+Cm100μg/ml中能正常生长、在RM+Am350μg/ml中不能生长，说明FRT-cml-FRT-tktA-talB已被整合到gfo位点处，即得到位点2处被修饰的菌株ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-cml-FRT-tktA-talB)；

P11位于gfoR上游的ZM4染色体上，P12位于talB基因上，使用引物对P11、P12时的PCR产物预期大小为6813bp；

2.经电穿孔的方法将pBBR1MCS-2-Pgap-FLP引入到步骤1.构建的菌株ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-cml-FRT-tktA-talB)中，筛选得到因FLP表达而删除了两个FRT位点之间的DNA和一个FRT位点的转化子菌株ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-tktA-talB)(pBBR1MCS-2-Pgap-FLP)

(1)ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-cml-FRT-tktA-talB)菌株感受态细胞的制备

用ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-cml-FRT-tktA-talB)菌株替代实施例2步骤2(1)的ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)菌株，用160μl替代80μl，其它同实施例2步骤2(1)；

(2)pBBR1MCS-2-Pgap-FLP的制备

操作同实施例2步骤2(2)；

(3)pBBR1MCS-2-Pgap-FLP电穿孔转化ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-cml-FRT-tktA talB)感受态细胞

在步骤(1)制得的感受态细胞样品中加入步骤(2)制得的质粒pBBR1MCS-2-Pgap-FLP 样品2μl，混匀，转至冰浴预冷的2mm电击杯中，冰浴5分钟，电转化仪上电场强度12.5kV/cm(对应电压为2.50kV)、电容25μF、电阻200Ω下进行电击；击毕，迅速加入30℃的0.8mlRM(1％yeast extract酵母粉，2％D-glucose葡萄糖，0.2％KH₂PO₄磷酸二氢钾)，30℃静置2小时复苏；复苏后的菌液离心浓缩，涂布加有卡拉霉素的RM筛选平板(卡拉霉素终浓度310μg/ml)，30℃静置培养5天，平板生长的菌落接种RM+Km310μg/ml平板(Km为卡拉霉素)，进一步确认对卡拉霉素的抗性，然后进行菌落PCR鉴定和依次点接平板RM+Cm100μg/ml、RM+Km310μg/ml、RM鉴定；菌落PCR鉴定(引物对P11、P12，见表1)的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图谱见图4，平板点接培养证明在Cm100中不能生长、在Km310中生长正常，证明cml已被敲除、pBBR1MCS-2-Pgap-FLP存在，即得到转化子菌株ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-tktA-talB)(pBBR1MCS-2-Pgap-FLP)；

使用引物对P11、P12时的PCR产物预期大小为5883bp；

3.除去转化子菌株ZM4(ldh::FRT)(gfo::FRT-tktA-talB)(pBBR1MCS-2-Pgap-FLP)中的pBBR1MCS-2-Pgap-FLP，得到ZM4(ldh::FRT)gfo::FRT-tktA talB)重组菌株

操作同实施例2步骤3。

进一步进行了TKTA和TALB的酶活测定鉴定，方法参见文献(管于平，刘成，邹少兰等.大肠杆菌K-12转醛醇酶基因talB的克隆及在运动发酵单胞菌CP4中的表达，工业微生物，2006，36(2)：36-40；马燕，木糖利用重组运动发酵单胞菌菌株的构建及其发酵性能的初步评价.天津：天津大学化工学院，硕士论文，2006)。测定结果如下：TALB 0.23U/10min/mg蛋白，TKTA 0.40U/min/mg蛋白，对照菌株ZM4(ldh::FRT)均检测不到酶活。

实验证明所得质粒pBBR1MCS-2-Pgap-FLP的使用效果是非常好：质粒转化方便，FLP高效表达、标记基因被敲除的菌株的筛选方便，标记基因被敲除的菌株中的质粒的除去方便。本发明的技术方案很好地保证了本发明目的的实现。

本发明的技术方案中，运动发酵单胞菌ZM4(＝ATCC31821)可以从美国ATCC购得，而ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)为ZM4的衍生菌株，其构建方式见文献(邹少兰，洪解放，马媛媛等.运动发酵单胞菌定点整合质粒的构建，南开大学学报(自然科学版)，2009，42(6)：42-47)(按文献所述的方法，以ZM4为出发菌株一定会获得ZM4(ldh::FRT-cml-FRT)菌株)。

pUC19可从Invitrogen公司、Promega公司等多家公司买到。

pCP20见文献(Kirill A.Datsenko，Barry L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Eschenchia coli K-12using PCR products，Proc Natl Acad Sci U S A.2000June 6；97(12)：6640-6645)

pBBR1MCS-2见文献(文献来源Kovach，ME.，Phillips，RW.，Elzer，PH.，et al.pBBR1MCS：abroad-host-range cloning vector，BioTechniques，1994，16(5)：800-802；Kovach ME，Elzer PH，Hill DS，et al.Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBR1MCS，carrying differem antibiotic-resistance cassettes.Gene.1995；166：175-176.可求得)

pBR328-ldhR-ldhL见文献(邹少兰，洪解放，马媛媛等.运动发酵单胞菌定点整合质粒的构建，南开大学学报(自然科学版)，2009，42(6)：42-47)

pBSKS(+)-Pgap-xylAB见文献(安朝光，Z mobilis木糖代谢通量分析及关键酶基因的改造.天津：天津大学化工学院，硕士论文，2007.)

pUC18NotI-cml见文献(邹少兰，洪解放，马媛媛等.运动发酵单胞菌定点整合质粒的构建，南开大学学报(自然科学版)，2009，42(6)：42-47；刘冰，Tn5转座系统在运动发酵单胞菌中的应用.天津：天津大学化工学院，硕士论文，2007.)

pUC19-Peno-tt见文献(马燕，木糖利用重组运动发酵单胞菌菌株的构建及其发酵性能的初步评价.天津：天津大学化工学院，硕士论文，2006.)

本发明的技术方案，适用于一切运动发酵单胞菌；也适用于一切不论以何种手段构建、何种形式存在于运动发酵单胞菌胞内的含两个同向的FRT位点的DNA的两个FRT位点之间DNA的敲除。本发明通过提供一种快速、方便、高效敲除基因组修饰成功后不需要的选择标记基因、循环使用选择标记基因的运动发酵单胞菌基因组DNA修饰方法，可用于构建一系列基因被修饰的工程菌株、研究基因功能，推动运动发酵单胞菌的基础研究和应用研究。

Claims

1.一种含FLP的pBBR1MCS-2重组质粒，其特征是用下述方法构建：