CN101855356A - 两步簇缺失和人源化 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于人源化小鼠的方法。具体地，本发明涉及利用同源重组和位点特异性重组的组合将小鼠基因簇置换为来自相应人簇的单或多基因的方法。

Description

两步簇缺失和人源化
发明领域
本发明涉及，一般地，用于人源化小鼠的方法。具体地，本发明涉及利用同源重组和位点特异性重组的组合将小鼠基因簇置换为来自相应人簇的一种以上基因的方法。
发明背景
小鼠模型是用于研究人疾病的非常宝贵的工具，并且广泛用于研究许多疾病的进展，和检验潜在治疗法。常规地，已经通过前核注射外源DNA产生转基因小鼠。更近期，已经通过融合胚胎干细胞和含有细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)的细胞产生小鼠，所述细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)包含目的外源基因和用于评估外源DNA区段向胚细胞基因组内整合的选择性标记，如例如WO94/02602中所述。该方法依赖于BAC或YAC通过同源重组的过程整合进入胚胎干细胞基因组。由于处理BAC和YAC中的技术要求，和通过使用大DNA构建体引起的ES细胞的低转染率，采用这种方式的转基因是耗时、低效且不准确的。
Wallace等(Cell(细胞)128，197-209 2007)近期描述了称为重组酶介导的基因组置换(RMGR)的方法。该方法使用位点特异性重组来将小鼠等位基因置换为直向同源基因的人等位基因。将两个不相互作用的位点特异性重组位点(loxP和lox511)通过同源重组插入到侧邻靶基因的小鼠染色体中。将同一对不相互作用的位点特异性重组位点插入到BAC中，从而侧邻靶基因的人等位基因。BAC向小鼠细胞中的引入，以及随后位点特异性重组酶的表达导致BAC和小鼠染色体的相容性位点特异性重组位点之间的双位点特异性重组反应(loxP/loxP和lox511/lox511)，和人基因序列相互交换为小鼠序列。然而，该方法包含多个必须在胚胎干细胞中进行的步骤，从而导致低效，这主要是因为细胞的核型经常受到破坏。因此仍然存在对最新型人源化小鼠方法的需要，该方法理想地应该需要较少的在胚胎干细胞中进行的步骤，并从而克服这些低效问题中的一些。
另外，本发明开始解决人源化小鼠生成领域中的另一个问题。例如，前述用于产生人源化小鼠模型的方法仅仅集中在将单内源小鼠基因置换为相应的人基因。这对于其中一个小鼠基因对应一个人基因的那些基因座是可接受的方法。然而，在进化中，基因簇可以发育，其经常经历反复的变化，诸如复制和多样化，所以所述簇在不同物种之间可以显著不同。因此，在簇内，有时不可能确定物种之间的真正直向同源基因。在极端的情形中，在一种物种的簇中可能仅存在一种功能基因，但是在另一物种中存在许多更多种的功能基因。一种这样的实例是代谢酶的CYP2D基因簇，其在人中仅表现出一种功能基因(CYP2D6)，但是在小鼠中表现出9种功能基因。在该情形中，通过同源重组的常规基因靶向机制将单小鼠基因置换为直向同源人基因将不导致功能人源化，这归因于来自小鼠簇的剩余基因的表达。
此外，在许多情形中，一种基因的基因产物可以构成全簇的主要功能性(例如人CYP3A簇中的CYP3A4或人CYP2C簇中的CYP2C9)且可能不可能在另一种物种中确定该基因的功能同源物。这导致关于应该置换哪种基因和用什么置换的不确定性。另外成问题的是这样的现实，即由构成全基因簇的小鼠染色体缺失大DNA片段可能不可能作为单一事件，因为如果小鼠染色体上的寻靶臂相距太远，则同源重组是低效的。
产生人源化小鼠模型的方法，其中人源化基因座成功反映(mirror)等价的目的人基因座，应该容许更现实地研究关于该基因座处编码的基因的功能，并促进研究关于与形成类似功能性的基因簇的一部分的基因有关的病症的治疗介入。
本领域中已知位点特异性重组酶可以用于使同源重组靶向特定染色体位置(参见Jessen等，1997)。该位点特异性重组酶的应用容许重组在需要添加位点特异性重组酶的条件下起始。
US2007/0061900描述了用于人源化重链和轻链免疫球蛋白可变区基因座的方法。该方法包括向两个载体，称为LTVEC中的每一个中插入位点特异性重组位点，所述点特异性重组位点是这样排列从而与人免疫球蛋白可变区的一部分相邻接。然后线性化这些LTVEC并通过同源重组将其引入小鼠细胞基因组中，以使得位点特异性重组位点侧邻小鼠免疫球蛋白可变区序列，且部分人免疫球蛋白可变区序列侧邻该位点特异性重组位点。进行位点特异性重组切除小鼠免疫球蛋白可变区序列并使两部分人免疫球蛋白可变区序列与其中包含的剩余位点特异性重组位点连接。由此产生的小鼠生成包含人可变区和小鼠恒定区的杂交抗体，通过需要的随后的转化步骤容许生成纯人抗体。免疫球蛋白可变区的区段性质容许剩余的位点特异性重组位点保持在核酸序列中，其具有很少的有害作用的机会。然而，不存在关于该技术可以用于人源化非区段基因的指示，其中编码该基因中的剩余位点特异性重组位点的核酸序列的存在应该消除它的转录能力。相反，本发明的方法容许通过在胚胎干细胞中的仅两轮靶向完全人源化任何小鼠基因或基因簇。
发明概述
按照本发明，提供关于目的基因人源化小鼠的方法，包括：
a)将一对位点特异性重组位点通过同源重组引入小鼠基因组，以使得待置换的小鼠靶基因序列在每侧侧邻重组位点；
其中这两个重组位点中的至少一个被构建为与人置换基因序列相邻接；
且所述人置换基因序列被定位为使得所述重组位点位于所述人置换基因序列和所述小鼠靶基因序列之间；
b)进行位点特异性重组位点之间的重组，以使得将人序列引入到小鼠染色体中以前被小鼠靶基因占据的位置，侧邻剩余位点特异性重组位点。
本发明机制的简单示意图显示在图1中。简言之，将两个位点特异性重组位点通过两个单独的常规同源重组反应，引入到胚胎干细胞中的小鼠染色体中。同源重组是本领域中公知的现象，然而为了帮助理解，将同源重组机制的示意图显示在图2中。两个重组反应受到靶小鼠染色体和包含位点特异性重组位点的置换核酸序列之间的同源短区的促进。这些同源区促进链侵入和随后的碱基配对，从而容许将各个重组位点插入小鼠染色体的链延长。
在小鼠靶序列的一侧或两侧，除位点特异性重组位点以外，置换核酸序列与意欲用于置换小鼠靶序列的人基因序列相连。因此，将完整人置换基因序列和附着的位点特异性重组位点同时插入到小鼠染色体中，从而导致图1中所示的排列。两个重组反应一旦完成，位点特异性重组位点应该因此侧邻小鼠靶基因。两个重组位点应该以相同的方向排列，如图1中所示，从而容许它们在适当时重组在一起。
为了切除小鼠靶基因序列并将其置换为置换人基因序列，则随后位点特异性重组在两个重组位点之间进行。该机制描述在图3中。这些重组事件导致小鼠靶基因序列的切除，从而保持人置换基因序列位于以前被小鼠靶基因占据的小鼠染色体中，侧邻由重组事件形成的剩余位点特异性重组位点。
本发明的方法具有许多优势。首先，其不必须需要用BAC或YAC处理并且其显著促进人源化小鼠的产生，因为胚胎干细胞阶段需要的转化步骤在数量上减少，即使与上述Wallace方法相比。在本发明的方法中，在胚胎干细胞中需要最少2轮通过同源重组的常规靶向，即在靶序列的一侧引入位点特异性重组位点和在另一侧引入位点特异性重组位点+人基因。然后所有需要的是单一缺失步骤，其中除去小鼠靶序列。这可以在体外或体内进行。该方法学是更有效的，因为它比Wallace法少需要至少一个步骤，这在常规实践中，转化为在ES细胞期减少约8周的工作，且显著减小在多轮转染过程中在ES细胞中累积破坏的风险，所述多轮转染可能致使这些细胞不能传代种系。
还存在其他关于该方法较后期效率的优势，因为按照本发明通过同时置换内源小鼠基因或簇来人源化基因或基因簇确保人基因位于与其置换的小鼠基因相同的位点处。因此，当与纯合子杂交时，仅存在一个需要置换的基因座。相反，为了敲除小鼠基因和用位于不同染色体的人基因替换其功能，存在复杂得多的遗传背景。需要另外的杂交次数，从而获得小鼠敲除和人置换的纯合子。
本发明方法的特殊优势在其效率方面。如由Wallace的工作所证明地，试图使用重组酶介导的重组将大的染色体DNA区段置换为载体上类似尺寸的区段是极端低效的。效率报告为达到1/108的数量级。相反，在本发明期间选择的分子内重组事件通常达到1/106的数量级。此外，因为由Wallace使用的DNA的长度是如此长(达到200kb的数量级)，所以存在大量增加的发生分子内重排和不希望的同源重组事件的机会，这增加形成无功能或不正确的DNA结构的机会。这些问题利用本发明的方法来避免。
该方法导致产生在缺少等价小鼠基因的条件下表达人蛋白的小鼠；这些等价小鼠基因在该方法期间从小鼠染色体中缺失。
引入的人基因可以在其自身调节序列的控制下引入。备选地，可以安排遗传重组事件，从而使等价小鼠调节序列位于人序列的上游并因此在其适当的位置中使用。有时，应该需要保持小鼠的调节序列而非引入具有基因编码序列的假定的人调节序列。例如，在CYP3A4的情形中，构建了人源化小鼠，其携带人启动子且其活性控制CYP3A4基因的调节。然而，Cheung等(Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics(药理学和实验疗法杂志)316，1328-1334 2006)证明在这种安排下，CYP3A4蛋白不在成年雄性中表达。因此假定一些启动子元件或其他因子必须存在，其是所用构建体中缺少的。相反，通过保留小鼠调节序列和代替人序列使用这些进行调节，可以保证保持引入基因的可靠调节和避免所述问题。
本发明方法超越常规技术的一个优势是在等价小鼠基因的位点处的整合确保保持基因定位的基因组背景，在所述常规技术中，人基因整合到小鼠染色体内或多或少是随机的。通过在这样的位点处整合，局部染色体结构在这样的含义下可能是“开放的”，所述含义是转录因子或转录发生所需的其他蛋白可能接近染色体DNA。不仅如此，保持与内源小鼠基因相同的染色体背景，从而使得通过组蛋白结合和染色体局部折叠/解折叠在染色体三级结构水平上调节DNA转录得到保持。这确保基因转录的整体调节得到保持，从而使得关于引入的人基因遵从与关于内源小鼠基因观察到的相同的基因调节组织分布。这种在基因转录水平上的生理学调节机制的完全保持不是现有技术中常见。
本方法的其他优势涉及致命性问题，其由缺失重要基因或基因簇产生，特别是如果存在关于缺失的基因或基因簇的单倍性不足，这在杂合动物中导致致死。因为本发明的方法同时缺失小鼠基因和将其置换为其人功能等价物，所以不存在由该基因编码的功能受到危害的时刻。因此，假如人蛋白的功能的确代替等价小鼠蛋白的功能，则该性质的问题得到避免。
本发明还容许通过组合在染色体上的小鼠基因或簇的每侧引入的两个组成部分(component halves)形成功能性人基因。在位点特异性重组以切除小鼠基因或簇时，将人基因的组成部分集合在一起，从而形成功能性人基因。关于剩余RT位点破坏编码序列的潜在问题可以通过将该RT位点定位在内含子中解决。同等地，本发明容许通常在人染色体中不连续定位的不同基因的组合。当然，该策略使用现有技术诸如Wallace的技术不能起作用，其中待组合的成分可能在不同的染色体上或相距太远以至于不能被单BAC或YAC覆盖。
本文中所述的方法可以特别有利地用在这样的情形中，其中具体的小鼠和人功能性由许多不同的基因来编码，所述不同的基因在一个簇中的染色体中邻接相连。本方法容许将小鼠基因簇简单置换为等价人基因或簇。
类似地，且为了相同的理由，本发明的方法充分适合于小鼠遗传系统的人源化，所述小鼠遗传系统包含处于遗传水平上的高水平冗余。例如，在一种小鼠基因的功能在缺乏首选基因的条件下可以完全或部分地被相同基因簇中的另一种小鼠基因接替的情况下，当人源化以确保所有基因被人等价物置换时，非常重要；如果不进行，则人源化系统的读出(readout)将混乱并最终无意义。
附图简述
图1.本发明方法的示意图。本方法提供关于人源化的机制，其包括插入两对位点特异性重组位点，其中之一通过同源重组被排列为与人基因置换序列相邻接，和在第一对位点之间进行位点特异性重组，从而切除小鼠靶基因。通过第二对位点特异性重组位点进行重组切除人基因置换序列，从而构建基因敲除。
图2.同源重组的机制。同源重组在双链染色体断裂后发生。5’到3’外切核酸酶活性产生3’突出端并容许链侵入发生。DNA合成利用完整链作为模板并且连接修复染色体断裂，从而形成霍利迪连接体。随后分支移位和分离产生重组产物。
图3.A)LoxP位点特异性重组位点。B)位点特异性重组的机制。两个LoxP位点通过互补碱基配对比对，从而容许Cre重组酶催化这2个位点之间的重组，由此切除小鼠靶基因。
图4.如果人基因的表达受到小鼠启动子控制的本发明的原理，其中A)合适的小鼠启动子在小鼠簇的一个末端方向向内或B)合适的小鼠启动子在小鼠簇的一个末端方向向外。A)人置换基因序列插入到小鼠启动子和小鼠靶基因之间，从而容许小鼠启动子保持，和控制由人基因置换序列表达。该策略在CYP3A4的情形中，被选用到CYP3A11(参见图11)。仅为了克隆的目的而包括另外的FRT位点。B)该策略不适用于本发明的方法。因此，并也因为合适的启动子不必然位于小鼠簇的末端，所以人启动子的应用，如下图中所示，或甚至小鼠启动子的重新引入可以更加普遍地应用。
图5.如果人基因的表达受到人启动子控制的本发明的原理，其中A)小鼠基因在簇末端的表达方向向外，B)小鼠基因在簇末端的表达方向向内并定义该基因的启动子或C)小鼠基因在簇末端的表达方向向内且未定义该基因的启动子。A)人置换基因序列插入到小鼠基因和小鼠启动子上游的小鼠基因组中。随后Cre介导的重组将导致包括启动子序列的簇的末端小鼠基因的物理缺失。该策略在Cyp3a簇的一个末端，在CYP3A4情形中被选用到Cyp3a11(图11)和在CYP3A4的情形中被选用到Cyp3a25(图7)，且在CYP2D人源化的情形中，在Cyp2d簇的一个末端选择(图9)。B)人置换基因序列插入到小鼠基因和小鼠启动子上游的小鼠基因组中。随后Cre介导的重组将导致包括启动子序列的簇的末端小鼠基因的物理缺失。然而，小鼠启动子的长度通常没有充分定义，因此该策略不应该用在本发明的方法中。C)人置换基因序列插入到小鼠启动子和小鼠基因之间的小鼠基因组中。Cre介导的重组将因此保持小鼠启动子完整。为了避免干扰人表达盒，剪接受体多聚A(sApA)序列终止mRNA的转录。sApA序列可以位于内含子1中，条件为是小鼠基因，或在任何下游内含子中。如果同源重组是这样的，即发生在小鼠基因的外显子中，则单独的多聚A信号(无剪接受体位点)足以终止转录。该策略在Cyp3a簇的另一个末端，在CYP3A4情形中被选用到Cyp3a11(图11)和在CYP3A4的情形中被选用到Cyp3a25(图7)，且在CYP2D人源化的情形中在Cyp2d簇的另一个末端(图9)和在CYP2C9的情形中在Cyp2c簇的两个末端均选用到Cyp2c55(图8)。应该注意到A)，B)，和C)中所示的关于小鼠簇一个末端(在所有图中以左端显示)的相同考虑也应该针对该簇的另一端进行。
图6.用于生成转基因小鼠的方法。转基因小鼠通过将一个以上改变的胚胎干细胞插入发育的胚泡中生成的。然后将胚泡植入假怀孕的小鼠中并容许发育，从而生成嵌合体。该嵌合体与缺失者品系的杂交引起小鼠靶基因的切除并生成关于人源化基因杂合的小鼠。两种所述杂合子的杂交生成关于人源化事件的纯合的小鼠。
图7.利用相应的人启动子的CYP3A4人源化方法。用于生成关于CYP3A4人源化的小鼠的靶策略，其中缺失小鼠CYP3A簇并且可以随后敲除人表达盒。
图8.利用相应的人启动子的CYP2C9人源化方法。用于生成关于CYP2C9人源化的小鼠的靶策略，其中缺失小鼠CYP2C簇并且可以随后敲除人表达盒。
图9.利用相应的人启动子的CYP2D6人源化方法。用于生成关于CYP2D6人源化的小鼠的靶策略，其中缺失CYP2D簇并且可以随后敲除人表达盒。
图10.PCR分析证明成功生成杂合CYP2D6人源化小鼠。特异性引物的应用容许通过PCR分析小鼠染色体。A)：结果证明成功引入所需的人置换CYP2D基因序列并缺失小鼠CYP2D簇，从而生成关于CYP2D6的杂合人源化小鼠。B)：PCR验证纯合CYP2D6人源化小鼠。具有IDs 224504，225938，225939和225944的小鼠是关于CYP2D6纯合人源化的并携带小鼠Cyp2d簇的缺失。C)：huCYP2D6小鼠肝中的CYP2D6蛋白表达。将1ug雄性huCYP2D6小鼠肝微粒体(MLM)(n＝1)，以及汇集的野生型小鼠(n＝20)和人肝微粒体(HLM)(n＝20)(两种性别)加载到10％Nu-PAGE凝胶上。用单克隆小鼠人特异性CYP2D6抗体(1∶2000，Gentest)和抗小鼠HRP缀合物(1∶2000，GE Healthcare(GE健康护理))温育该膜。ECL以30秒曝光显影。标准负荷如下；1，小鼠重组Cyp2d22 his-标记的(0.01pmol，CXRBiosciences(CXR生物科学))。2，人CYP2D6 baculosomes(0.01pmol，Invitrogen)，3，小鼠重组Cyp3a11his-标记的(0.1pmol，CXR Biosciences(CXR生物科学))，4，人CYP3A4 baculosomes(0.1pmol，Invitrogen)，5，小鼠重组his-标记的Cyp2c29(0.1pmol CXR Biosciences(CXR生物科学))，6，人CYP2C9 baculosomes(0.5pmol)。
图11.利用小鼠Cyp3a11启动子的huCYP3A4人源化方法。利用Cyp3a11启动子生成关于CYP3A4人源化的小鼠的靶策略，其中缺失小鼠CYP3A簇。
优选实施方案详述
本发明提供关于目的基因人源化小鼠的方法，包括：
a)将一对位点特异性重组位点通过同源重组引入小鼠染色体，以使得待置换的小鼠靶基因序列在每侧侧邻重组位点；
其中这两个重组位点中的至少一个被构建为与人置换基因序列相邻接；
且所述人置换基因序列被定位为使得所述重组位点位于所述人置换基因序列和所述小鼠靶基因序列之间；
b)进行位点特异性重组位点之间的重组，以使得将人序列引入到小鼠染色体中以前被小鼠靶基因占据的位置，侧邻剩余位点特异性重组位点。
术语“人源化(humanise，humanised和humanising)”，用于本文中时涉及将人基因引入小鼠基因组，代替内源鼠基因。该术语可以用于描述所述基因置换对小鼠染色体、细胞、组织、器官或生物体的影响。
方法学
按照本发明，插入到转基因模型中的置换人基因优选插入内源等价基因或基因簇天然存在的染色体中位置。这具有这样的优势，即保持基因座的背景，这意味着由该位点转录的保真性与野生型系统中发生的转录水平尽可能的相似。
按照本领域中公知并在下文中进一步讨论的方法，重组步骤优选在小鼠胚胎干细胞中进行。胚胎干细胞是全能细胞的培养的细胞系，其中该细胞，在引入早期胚胎时，将发育增殖为发育中的生物体的所有组织。
该方法中的第一步是将一对位点特异性重组位点引入小鼠染色体，也称为重组酶靶标或RT位点。RT位点由位点特异性重组酶(SSR)识别。暴露于SSR酶活性导致由RT位点倾向确定的DNA重排，其在线性DNA分子中导致干扰序列被切除，或切掉。
待置换的小鼠靶基因序列应该在每一侧侧邻RT位点。两个RT位点之间的重组应该由此切掉干扰序列。
两个重组位点中的一个或两个被设计为与人置换基因序列相邻接。人序列应该被定位为使得重组位点位于人置换基因序列和待置换的小鼠靶基因序列之间。这具有这样的作用，即当重组发生在两个RT位点之间时，这样切掉小鼠靶序列，人序列被引入小鼠染色体先前被小鼠靶基因占据的位置。剩余的位点特异性重组位点应该保持在小鼠靶序列以前所在的位置。有利地，设计整合事件，以使剩余RT位点不破坏引入的基因的编码序列或有害地影响由调节启动子的转录。这可以通过小心地定位RT位点，从而不干扰编码序列，或通过将RT位点定位在内含子中来实现。
在本发明的一个实施方案中，可以使用多于一个人置换基因序列，从而使人置换基因序列定位在内源小鼠靶基因序列的上游和下游。以这种方式，在位点特异性重组时，切除小鼠靶序列并将置换人序列集合在其位置处。
存在大量这样的情形，其中这样的策略可能是有利的。例如，假定现有同源重组技术的尺寸局限性，可能必需引入2个单独的人旁侧置换序列，从而引入需要量的置换序列。例如，可将CYP1A1引入到内源鼠等价物的上游，同时可将CYP1A2引入下游。
还可能合适地引入2个处于这样的方式的单独的基因，即可能在基因簇中相距太远的基因，因此它们不由单BAC或YAC覆盖，或2个位于不同染色体上的基因。这样的策略在实践中不能利用现有技术系统执行。
本发明还容许通过组合在染色体上的小鼠基因或簇的每侧引入的两种组成部分形成功能性人基因。在位点特异性重组以切除小鼠基因或簇时，将人基因的组成部分集合在一起，从而形成功能性人基因。通过该方法，可以获得人基因的时间或组织特异性活化和小鼠基因的灭活。剩余RT位点破坏编码序列的潜在问题可以通过将该RT位点定位在内含子中来解决。
用于将RT位点引入染色体的方法应该是本领域中技术人员已知的，且优选通过使用同源重组方法进行。同源重组涉及可以用于容许将核酸序列插入到小鼠染色体中的遗传机制。该机制由比对双链小鼠和人核酸序列起始。小鼠序列中双链断裂和5’到3’外切核酸酶活性促进链侵入，由此导致同源人和小鼠序列通过短同源区配对。随后的小鼠序列链延长使用人序列作为模板并且分离生成具有位于其中的人序列的小鼠基因组序列，同时人序列保持完整。
用于执行同源重组的方法是本领域中已知的，且使用外源提供的DNA分子和靶染色体之间的同源区引入RT位点。合适的定向递送系统的实例对于本领域中技术人员应该是清楚的，且包括使用注射的或定向的裸DNA，包封和/或与DNA复合的定向脂质体，定向的反转录病毒系统和定向缩合DNA诸如鱼精蛋白和聚赖氨酸-缩合DNA，或电穿孔。还可以使用其他的递送方法，诸如通过利用核酸表达载体、聚阳离子缩合DNA或配体连接DNA(参见Curiel(1992)Hum Gene Ther(人基因疗法)3：147-154；Wu(1989)J Biol Chem(生物化学杂志)264：16985-16987)，和使用基因转移基因枪，(US 5,149,655中所述)。还可以使用裸DNA，如在国际专利申请WO 90/11092中详细记述地。
RT对优选选自由LoxP，FRT，attP/attB和rox组成的组(Sauer和McDermott.Nucleic Acids Res.(核酸研究)32(20)：6086-95，2004)。该列表仅通过举例的方式提供，并不意欲进行限制。在该方面中，所述位点特异性重组位点对之间的重组分别通过相应的位点特异性重组酶，即Cre，FLP，PhiC31和Dre来进行。应该理解所述位点特异性重组可以在体内或体外进行。
作为实际的问题，每个RT位点应该被构建为与选择性标记物相连，和优选相邻接。包括选择性标记物容许检测小鼠染色体中的RT位点，并同样容许监测RT位点对的成功插入。
每种选择性标记物优选这样定位以使其位于小鼠靶序列和RT位点之间的间隔中。这意味着在成功重组时，选择性标记物从染色体中除去并且因此不参与在该方法中的其他部分。这样，可以确定选择性标记物对人源化后染色体中保持的人序列的调节不具有干扰作用。
每种选择性标记物优选彼此不同。这容许每个重组位点的插入得到彼此分开和独立地监测。
选择性标记物优选是编码针对生长ES细胞可以对其暴露的化合物诸如抗生素具有抗性的一些类型的基因。实例包括使用赋予针对加入到细胞生长培养基中的抗生素的抗性的选择性标记物，例如赋予针对G418，潮霉素或嘌呤霉素的抗性的新霉素抗性标记物。另外的实例包括利用核酸序列的检测，所述核酸序列是互补序列和与按照本发明前述方面的核酸序列或其组成部分杂交。实例应该包括Southern印迹分析，northern印迹分析和PCR。
优选的策略包括构建改变的鼠胚胎干细胞，优选以分开的步骤，由此每个RT位点与其选择性标记物分开引入。改变的胚胎干细胞可以随后插入到胚泡中。常规地，胚泡由交配后约3天的雌性小鼠中分离。应该理解至多20个改变的胚胎干细胞可以同时插入该胚泡，优选约16个。通过将改变的胚胎干细胞插入胚泡，胚胎干细胞将被引入发育早期的胚胎中，优选通过其移植进入假怀孕小鼠，该小鼠已被诱导为反映怀孕小鼠的特征。根据该方法，含有改变的胚胎干细胞的胚泡将植入假怀孕小鼠的子宫壁内，并将在小鼠体内持续发育直到完成妊娠。改变的胚胎干细胞将增殖并分裂，从而增殖发育转基因小鼠的所有组织，包括其生殖系。
在该方法的一个方面，构建的转基因小鼠可以是嵌合体，其在每个体组织中和生殖系中包含改变的和未改变的细胞。
为了进行RT位点之间的重组，必须将基因组暴露于处于SSR酶形式的SSR活性。术语“SSR”指在特定DNA基因座中介导DNA重排的任何重组系统的任何蛋白成分，包括整合酶或解离酶/转化酶类型的SSR(Abremski，K.E.和Hoess，R.H.(1992)Protein Engineering(蛋白质工程)5，87-91；Khan，等，(1991)Nucleic acids Res.(核酸研究)19，851-860；Nunes-Duby等，(1998)Nucleic Acids Res(核酸研究)26391-406；Thorpe和Smith，(1998)P.N.A.S USA 95 5505-10)和由内含子编码的内切核酸酶介导的位点特异性重组(Perrin等，(1993)EMBO J.(EMBO杂志)12，2939-2947)。
优选的重组酶蛋白选自由以下各项组成的组：FLP重组酶，Cre重组酶，Dre重组酶，来自鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)质粒pSR1的R重组酶，来自果蝇克鲁维酵母(Kluyveromyces drosophilarium)质粒pKD1的重组酶，来自Kluyveromyces waltii质粒pKW1的重组酶，来自杆菌属(Bacillus)转座子Tn4430的TrpI，λInt重组系统的任意成分，phiC31，Gin重组系统的任意成分，或其变体。
用于调节Cre/lox-介导的缺失，适合于缺失大DNA片段(200kb-数百万碱基)的方法已经记述在以下文献中(Li ZW，Stark G，Gotz J，Rulicke T，Gschwind M，Huber G，Muller U，Weissmann C.Generation of mice with a200-kb amyloid precursor protein gene deletion by Cre recombinase-mediatedsite-specific recombination in embryonic stem cells(生成具有通过胚胎干细胞中的Cre重组酶-介导的位点特异性重组缺失的200-kb淀粉状前体蛋白基因的小鼠)Proc Natl Acad Sci USA.(美国国际科学院学报)1996年6月11日；93(12)：6158-62.勘误表在：Proc Natl Acad Sci USA(美国国际科学院学报)1996年10月15日；93(21)：12052中；在Su H，Wang X，Bradley A.Nested chromosomal deletions induced with retroviral vectors in mice(在小鼠中用反转录病毒载体诱导的嵌套染色体缺失).Nat Genet.(自然遗传学)2000年1月；24(1)：92-5)中；Call LM，Moore CS，Stetten G，Gearhart JD.Acre-lox recombination system for the targeted integration of circular yeastartificial chromosomes into embryonic stem cells(用于将环形酵母人工染色体定向整合进入胚胎干细胞的cre-lox重组系统).Hum Mol Genet.(人分子遗传学)2000年7月22日；9(12)：1745-51)。
如上提及地，位点特异性重组事件可以在体外或体内进行。位点特异性重组可以通过在转基因小鼠中诱导SSR的活性实现。实际上，在活体系统中成功使用位点特异性重组来改变基因型需要调节重组事件的策略。这可以通过控制重组酶mRNA，或蛋白质的表达进行(Baubonis和Sauer(1993)Nucl Acids Res.(核酸研究)21，2025-2029；Sauer B，(1994)Curr OpinBiotechnol(当前生物技术观点)5：521-7；Rajewsky等，(1996)J Clin Invest(临床研究杂志)98，600-3；Metzger和Feil，(1999)Curr.OpinionsBiotechnology(当前生物技术观点)10，470-476)，从而使获得的表达模式仅限于这些组织特异性元件具有活性的时间和位置。
研究人员已经使用直接转染，利用重组病毒的感染或注射编码SSR蛋白的DNA或mRNA或其蛋白本身(Konsolaki等，(1992)New Biol.(新生物学)4：551-557)，从而表达SSR酶。更精确的控制程度可以通过调节这些SSR酶的活性而非表达来获得。一种策略使用融合蛋白，其中SSR酶与类固醇受体的配体结合结构域(LBD)融合，从而提供SSR-LBD蛋白(见EP-B-0 707 599；以及Logie和Stewart(1995)P.N.A.S.USA 92：5940-5944；Brocard等，(1997)P.N.A.S.USA 94：14559-14563；Akagi等，(1997)NucleicAcids Res(核酸研究)25，1766-73)。该策略依赖于仅在配体与受体部分结合时激活SSR活性的类固醇受体的配体的应用。受体的LBD在缺乏关联配体(cognate ligand)的条件下抑制SSR活性。关联配体的递送减轻SSR抑制，由此允许RT位点之间的重组。
诱导可以因此通过诱导所述SSR转录，诱导SSR翻译，或由SSR除去抑制剂来实现。备选地，SSR可以人工引入所述转基因小鼠中。该方法的另一个要素是位点特异性重组可以在转基因小鼠内实现，由此导致切除小鼠靶基因和伴随生成人源化小鼠。
优选地，位点特异性重组可以通过转基因小鼠与缺失者品系小鼠的杂交来实现。术语“缺失者品系”用于本文中时指在这样的种系中表达位点特异性重组酶的小鼠，所述种系可以与转基因小鼠杂交从而实现小鼠靶基因的切除。以这种方式，体内重组产生关于目的基因杂合的后代。转基因小鼠与缺失者品系的杂交因此导致后代的产生，其中含有小鼠染色体的细胞改变为含有人置换基因序列和位点特异性重组酶，由此导致小鼠靶基因的切除和细胞的功能人源化。这样的转基因小鼠因此是关于特定基因或基因簇的人源化杂合的。
在该方法的另一方面，位点特异性重组酶可以仅在重组酶品系小鼠的某些组织中表达。本领域中已知缺失某些基因或基因簇可能是致命的或可能具有亚致命表现型作用。此外，将这样的基因置换为它们的人等价物可能不能阻止致命性。在这些情形中，通过仅在某些组织中表达位点特异性重组酶可能克服任何这样的致命性问题。如果已知特定基因是某组织中必需的，则特别有利，因为以这样的方式表达位点特异性重组酶容许小鼠基因保持在那些组织中。
在本发明的这个方面，SSR可以是清蛋白-Cre。清蛋白-Cre是SSR Cre的特定变体，其对RT位点LoxP起作用。清蛋白-Cre仅在肝中表达，并且因此容许小鼠靶序列保持在除肝以外的所有组织中，从而克服可能的致命性问题，同时提供功能人源化的肝。
最后，按照以上方法生成的2只杂合小鼠可以杂交，从而生成关于目的基因的人等位基因纯合的转基因小鼠。杂交2只杂合转基因小鼠产生关于人源化纯合的后代群体。
在本发明的另一个实施方案中，通过如下文中公开的方法从头生成转基因非人动物，以使其包括所有前述特性。
还可能的是，位点特异性重组事件在体细胞中进行，所述体细胞可以然后被用作核转移供体细胞，从而按照WO00/51424的方法制备克隆小鼠群体或其变种。
在本发明涉及包含使用前述核酸构建体制备转基因宿主细胞或转基因非人动物的实施方案中，细胞或非人动物可以经历另外的基因转移，其中所述基因转移是引入另外的基因或编码蛋白的核酸序列。基因转移可以是细胞或细胞系的瞬间或稳定转染，细胞或细胞系中的附加型表达系统，或通过前核显微注射，通过非胚胎干(ES)细胞中的重组事件，非人胚胎干(ES)细胞中的随机基因转移或通过转染其核用作核转移克隆程序中的供体核的细胞来制备转基因非人动物。
制备转基因细胞或细胞系，或转基因非人动物的方法，其中所述方法包括瞬间或稳定转染细胞或细胞系，在细胞或细胞系中表达附加型表达系统，或前核显微注射，ES细胞或其他细胞系中的重组事件，或通过转染可以沿不同发育途径分化且其核用作核转移供体的细胞系；其中另外的核酸序列或构建体的表达用于按照本发明前述方面筛选转染或基因转移。实例包括使用赋予针对加入到细胞生长培养基中的抗生素的抗性的选择性标记物，例如赋予针对G418抗性的新霉素抗性标记物。另外的实例包括利用核酸序列的检测，所述核酸序列是互补序列和与按照本发明前述方面的核酸序列或其组成部分杂交。实例包括Southern印迹分析，northern印迹分析和PCR。
人置换基因序列
本发明还利用许多基因中的任一种实现，如应该对本领域中技术人员清楚地。不存在针对可以在小鼠靶标和人置换之间交换的基因类型的限制。然而，本发明特别有助于遗传系统，其中小鼠功能性由许多不同的基因编码，所述不同的基因在一个簇中的染色体中邻接相连。本方法容许将小鼠基因簇简单置换为等价人基因或簇。本方法还适合于人源化小鼠遗传系统，所述小鼠遗传系统包含处于遗传水平上的高水平冗余。与先前使用的方法相反，不存在这样的要求或优选，即交换的基因是节段基因，诸如免疫球蛋白基因；在优选实施方案中，交换的基因不是分段基因，诸如免疫球蛋白基因。
优选地，因此，至少一种小鼠靶基因的表达产物保持与等价人置换基因相同、相似或等同的功能。基因可以是功能等价的，和/或结构同源的。例如，小鼠靶基因和人置换基因可以共享一定程度的同源性。优选地，所述同源性大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，或甚至大于95％。
人置换基因序列可以包括cDNA，基因组DNA，或二者的混合物。基因组DNA在许多情形中是有利的，因为将保持剪接保真性。然而，仅需要保持大部分剪接事件发生处的那些内含子，因此序列的剩余部分可以是cDNA。这可以简化克隆过程，特别是当基因组DNA包含大内含子时；在这样的情形中，假如剪接同种型不在基因组DNA的这个区域内编码，则不能包括较大的内含子。
对于用于本发明的方法中特别合适的基因的实例是药物代谢酶基因，包括，例如，1期药物代谢酶，II期药物代谢酶，和转录因子。实例包括cyp酶家族，即含有血红素铁中心并通过电子传递系统氧化多种底物的血红素蛋白家族。cyp蛋白的血红素中心通过由细胞色素P450还原酶，铁氧还蛋白，或细胞色素b5传递的电子还原，分子氧被还原的血红素基团结合和分裂，且底物氧化为醇或环氧化物，伴随血红素基团的剩余Fe3+状态的再生。这样的蛋白的综述，即比较人和鼠CYP基因由Nelson等，2004(Pharmacogenomics(药物遗传学)14(1)；1-18)提供。其它实例对本领域中技术人员是清楚的。
优选地，编码1期药物代谢酶的人DNA选自包括细胞色素P450，包括但不仅限于CYP3A4，CYP2B6，CYP2C9，CYP2C19，和CYP2D6的组。在该实例中，基因之间的等价性可以通过底物特异性，调节模式(例如通过转录因子或外源药物)，序列同源性和组织分布的组合来评估。某些基因具有精确的等价性；这样的基因的实例是CYP2E1，CYP1A1，CYP1A2，CYP2B6和CYP2D，其中人中只存在一种基因，而小鼠中存在许多等价基因。在人中存在四个CYP2C基因，且在小鼠中存在许多等价基因。在这样的情形中，至少1，优选2，3，4，5以上或甚至全部等价小鼠基因是无效的(annulled)。CYP3A4是一个实例，其中在小鼠中不存在明显的直向同源物，但CYP3A11可以被认为是至少一种等价小鼠基因，因为其肝表达，调节模式和序列同源性。另一个实例可以通过CYP2D6的情形提供，其中小鼠中存在9种基因，其对应于人中仅一种功能性基因。
为了引入到P450人源化非人动物中而选择人P450同种型主要通过多种P450同种型在相关组织中的代谢中的已知相对重要性来推动。因此，例如，至今在人肝中识别的单个最显著P450同种型是CYP3A4，且因此CYP3A4因此可能是选择用于肝的P450人源化的第一个人P450同种型。为了本发明的多-P450人源化小鼠而选择人P450由使用者的需要来指导。在这个方面，预期任何一种以上的以下人同种型是优选的：3A4，3A5，2D6，2B6，2C9，2C19，1A1，1A2，2C8，2E1。然而，应该理解引入到动物细胞中的同种型取决于使用者的需要。以这种方式，人源化的转基因动物可以被“设计”用于研究特定同种型在代谢过程中的作用。
按照本发明的教导，可以置换单个基因、基因簇或单个基因或基因簇的组合。全基因簇在可能时，应该优选被置换，而非简单置换单个基因。这形成这样的情形，其中任何基因簇中的基因表达水平的比与这些基因体内表达的比相同。引入的基因簇意欲在功能上等价于小鼠靶基因，或当存在等价基因簇时，其等价于小鼠靶基因簇。将合适的小鼠靶基因置换为等价人置换基因序列因此导致基因组、细胞、组织、器官或生物体的人源化，而不考虑人或小鼠簇是否含有相同数量的基因。
术语“簇”用于本文中时，因此是任何具有生成多于2种基因产物能力的基因组区域，并包括相同基因的多重剪接。在这个方面，基因簇可以优选编码参与代谢的蛋白质，和更优选可以形成细胞色素P450(cyp)基因簇的一部分。例如，认为小鼠中存在7种P450基因簇；即CYP2ABFGST簇，CYP2C簇，CYP2D簇，CYP2J簇，CYP3A簇，CYP4ABX簇和CYP4F簇。CYP3A，CYP2C和CYP2D簇是用于按照本发明置换的1期药物代谢酶的优选簇。任何一种以上这些基因簇可以按照本发明置换。
按照本发明，因此，参与特殊途径的部分或优选完整的基因级联可以优选被置换。这确保保持基因功能的部分冗余并因此，还监测真实的生理学状态。优选地，用于人源化的1期药物代谢酶的簇是CYP3A簇和CYP2C簇。
由于人和普遍使用的靶转基因动物诸如小鼠之间的蛋白功能的冗余，关于1期药物代谢酶的人源化优选针对缺失背景执行，在所述缺失背景中仅一些(例如1，2，3，4或5)，和优选无靶动物1期药物代谢酶以显著水平表达。
作为按照本发明人源化的候选者的人药物代谢酶的其他实例包括葡糖苷酸基转移酶，例如，UGT1A基因或基因簇，谷胱甘肽转移酶，例如GST(谷胱甘肽S-转移酶)，磺酰基转移酶和乙酰基转移酶。优选地，用于人源化的2期药物代谢酶的簇是UGT1A基因簇。
调节序列
控制转录因子表达的调节序列可以优选是人源的，或可以源自靶动物物种，例如小鼠。
在大部分情形中，应该需要使用人调节序列。这可以仅通过将这些包括在通过同源重组插入到小鼠染色体中的人置换基因序列内来实现。RT位点由此插入以使侧邻两个RT位点的小鼠靶序列包括内源小鼠启动子，所述启动子随后在位点特异性重组时被切除。
如图5中所示，当对人调节序列的使用作出选择时，必须考虑若干因素。这些包括位于簇边缘的小鼠基因的方向和关于小鼠启动子和增强子元件信息的有效性。然而，通常存在这样的机制，通过该机制人启动子可以功能性插入小鼠基因组中，从而控制人源化基因的表达。
在一个在使用人调节序列时，特别是在将置换基因插入具有转录活性的小鼠染色体区中时优选的有利实施方案中，人工多聚腺苷酸序列可以与插入的人序列上游的任何基因的下游外显子融合。例如，剪接受体多聚腺苷酸(sApA)位点可以用在本上下文中，与如Ishida和Leder(Nucleic AcidsRes.(核酸研究)27(24)，e35，1999)所述的该序列的应用类似。这确保不存在由引入的人置换基因和调节序列上游的转录活性的通读，这容许在无来自其他启动子序列的影响的条件下准确研究人序列。
在一些情况下，将人基因插入到小鼠染色体中以前被小鼠靶基因占据的位置处可以容许使用小鼠基因的内源调节序列，条件是适合的内源调节序列以需要的方向位于小鼠簇的边缘，如图4中所示。
在一些其中可能使用本发明的情形中，使用内源鼠调节序列。这样，按照本发明制备的人源化动物能够不仅以适当的生理学水平而且在其中小鼠正常表达等价内源蛋白的所有组织中表达人蛋白。然而，应该注意小鼠调节序列在一些情形中可以比相应的人启动子赋予小鼠中的人基因更加人样的表达。例如，虽然CYP3A4组成性地表达在成年男子的肝中，但是在转基因小鼠中，CYP3A4启动子在6周龄以上雄性的肝中似乎是沉默的。因此，利用显示出与人中CYP3A4启动子类似肝表达和调节的鼠Cyp3a11启动子来推动人CYP3A4的表达，可以提供该基因在小鼠中更加真实的表达。
在该实施方案中，当已知内源小鼠启动子以正确的位置和方向存在，从而推动人置换基因序列的表达时，将RT位点插入到小鼠染色体中，从而使RT位点对的上游的那个位于小鼠靶基因和小鼠靶基因的内源小鼠启动子之间。在位点特异性重组时，保持在染色体中的内源小鼠启动子变为与置换人基因序列通过转录连接，从而实现人置换基因序列的转录，如图4A中所示。通过“调节基因”意指包括转录目的基因所必需的任何启动子或增强子序列，5’或3’UTRs，多聚-A终止序列或其他DNA序列。用于插入人序列的转录物优选由多聚A基序终止。
通过“内源启动子”意指天然指导小鼠中目的基因表达的启动子。
关于内源和人启动子序列二者，引入对启动子活性所必需的所有5’上游序列，优选包括任何增强子，已经显示出使用强的组成型启动子实际上是不必要的且常常是不理想的；如在天然情形中，内源启动子，或完整的人可诱导的启动子优选能够以生理学相关方式指导相关蛋白的表达。一个实例通过人CYP1A2基因提供，其在转录起始点上游具有强增强子元件。当引入全部这种人序列容许合适的转录机制发生时，这些上游序列的删除导致其中存在不完全或不充足的调节序列的系统，从而容许将基因表达的保真性保持为如Chen等(Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics(药理学和实验治疗杂志)318，1330-1342，2006)所示。
使用启动子诸如现有技术中已经使用的清蛋白启动子的一个不利结果，的确在药物代谢基因诸如CYP3A2的情形中，是基因表达的进行仅可以在特定组织中监测到，在清蛋白启动子的情形中，是在肝中。当然，许多基因具有相当多样的表达模式，且这些常常是几乎没有被研究的。内源小鼠启动子或相应人启动子的应用避免所有这样的问题，且保证人基因，如果在染色体内适当构型和比对，以进行性地(developmentally)，瞬时地和以组织特异性方式保持野生型鼠表达水平的保真性。结果，人蛋白在正确的位置，以正确的水平，在正确的时间和关于适当的时间量产生。因此，在关于CYP3A2人源化的小鼠的情形中，本发明容许获得关于药物代谢过程的综合整体简单描述。
内源启动子或相应的人启动子的应用还使其具有其他优势。具体地，保持进行性表达的保真性。天然内源启动子的应用确保蛋白质表达于在其中天然存在该蛋白质的组织中，且不仅在成年动物中，而且在每种发育期中。这还使其具有这样的优势，即转基因动物更可能生存并因此有效地用作筛选物和用于下游杂交的开发。在药物代谢基因的情形中，还容许在保持药物代谢酶的胎盘表达时，将动物用于筛选测试化合物的致畸作用。在一些情形中，靶基因和人置换基因序列可以共享引导序列。这可以通过在构建体中保持至少一个内含子实现，这通常导致更好的表达。该策略还确保基因产物应该被指引到正确的胞内位置。人引导序列可能也能够实现该功能，但是代替地使用小鼠引导序列常常更安全。另外，在MRP2蛋白的情形中，可以保持小鼠蛋白的“引导序列”，其由外显子1编码。然后将无来自外显子1的序列的人cDNA引入到小鼠基因组序列的外显子2中。关于小鼠内含子1的初始剪接位点将被保持，因此该构建体编码来自小鼠外显子1和人外显子2-32的氨基酸的融合蛋白。该构建体确保高表达水平且还确保将MRP2指引到其正确的位置，即质膜。
技术人员还理解可以如何将人置换基因序列在靶基因启动子的控制下引入小鼠，从而与该启动子转录相连。通过“转录相连”意指启动子指导相应蛋白表达水平的活性。优选地，这通过将人置换基因序列与相应小鼠启动子的翻译起始位点融合来实现。例如，在多药抗性蛋白MDR1的情形中，人MDR1的cDNA可以与相应小鼠基因(Mdr1a或Mdr1b)的翻译起始位点融合。在转录因子PXR的实例中，人PXR cDNA和基因组序列的杂交可以与小鼠PXR基因的翻译起始位点融合，由此保持小鼠的起始-ATG。在另一种人转录因子CAR的情形中，人序列可以与小鼠CAR基因的翻译起始位点融合。
报告基因
本发明还有利地提供结合引入的报告基因的非人动物细胞和转基因非人动物，从而使该细胞或动物可以用于通过报告基因表达产物的常规测定来确定药物或其他异生素化合物(xenobiotic compound)在人细胞中代谢途径的指征。
当报告基因已经引入到通过本发明的方法产生的非人动物细胞或转基因非人动物中时(见下文)，该细胞或动物可以用于确定基因的调节并还可以用于通过测定报告基因DNA序列的表达，提供药物或其他异生素化合物在同源人细胞中的可能的机制和代谢的指征。该细胞或动物还可以用于提供药物或其他异生素化合物代谢程度的指征。例如，分析报告基因表达在任何具体组织中的分布容许响应于具体的药物化合物来监测基因表达诱导的程度。
报告基因是直接或间接编码可测定蛋白质的核酸序列。它们用于置换其他编码区，所述编码区的蛋白质产物不适合于或不能按照预期的测定来检测。本领域中已知且可以用于本发明的合适报告基因选自那些编码蛋白质的基因，所述蛋白质包括但不仅限于：氯霉素-乙酰转移酶，β-半乳糖苷酶，β-葡糖醛酸糖苷酶，荧光素酶，β-半乳糖苷酶，绿色荧光蛋白，分泌的碱性磷酸酶(SEAP)，主要尿蛋白(MUP)或人绒毛膜促性腺激素(hCG)。应该理解以上合适的报告基因列表不是详尽的或排他的，且不意欲限制本申请的范围。技术人员可以选择对本发明同等适用的另一种报告系统。
按照本发明，作为关于连接报告基因的优选靶标的小鼠启动子是PXR，CAR，CYP3A4，CYP2C9，CYP2C 19，CYP2B6，CYP2D6，UGT1A，MRP2和MDR1。
另外的位点特异性重组位点
在本发明的另一个实施方案中，可以将第二对RT位点引入到小鼠染色体中，同样优选通过同源重组进行。该第二对RT位点应该如此定位，从而使2个组成RT位点侧邻第一对RT位点，如图1中所示。该第二对RT位点容许人置换基因序列被切除，如果需要的话。这容许产生一群或一组可以比较其特性的转基因小鼠；完整的群因此可以包括野生型、人源化敲入和完整敲除。此外，关于某些应用，关于敲入或敲除杂合的小鼠也可以在该组中比较。
第二对RT位点可以同时、之前或随后插入到小鼠染色体中，从而在第一对位点特异性重组位点之间实现RT。优选地，同时插入这两对位点，以方便改造和克隆。
在第一对RT位点之间位点特异性重组后，将第二对RT位点定位于染色体中，侧邻人置换基因序列。在这种构象中，在第一对RT位点之间重组过程中产生的剩余RT位点应该定位在第二对位点特异性重组位点的一个组成和人置换基因序列之间，如图1中所示。
在该方面中，意欲可以在第二对RT之间进行第二轮RT，从而切除人置换基因序列和敲除目的基因。在本文中，还应该切除剩余第一RT位点，同时保持剩余第二RT位点。
第二对RT位点和第一对RT位点可以同时或分别引入到小鼠染色体中。
其中第二对RT位点与第一对RT位点同时引入，每对的一个组成优选地包含在单核酸序列中，所述单核酸序列可以通过一轮同源重组引入到小鼠染色体中。每对的另一个组成可以包含在第二核酸序列中，所述第二核酸序列通过第二轮同源重组也引入到小鼠染色体中。第二对RT位点的每个组成定位于染色体中，使得第一对RT位点的一半定位于第二对RT位点的一半和选择性标记物之间。这两轮同源重组可以同时或分别发生。
其中第二对RT位点与第一对RT位点分别引入小鼠染色体，第二对RT位点的每一半优选包含在分开的核酸序列中，且第二对RT位点通过另外两个分开的同源重组反应，通过图2中所示的机制引入到小鼠染色体中。这两轮另外的同源重组可以关于彼此和关于第一个2轮同源重组同时或相继发生。应该理解重组反应意欲在体内或体外进行。
第一和第二对RT位点优选彼此不同。
转基因小鼠
在本发明的另一方面，提供通过上述本发明任何一个实施方案的方法产生的转基因小鼠。该小鼠关于基因或基因簇人源化并且已经缺失了相应的小鼠基因或簇。
现将通过举例的方式，更详细地描述本发明的不同方面和实施方案。应该理解在不偏离本发明范围的条件下可以进行细节的改变。
实施例
实施例1：利用相应的人启动子和小鼠CYP3A簇敲除的CYP3A4人源化
小鼠CYP3A簇侧邻loxP和FRT位点，并将CYP3A4表达盒插入小鼠簇的一个末端，如图7中所示，从而容许人CYP3A4在13kb人CYP3A4启动子的控制下表达。
定向载体中包括的loxP序列元件容许Cre介导的小鼠CYP3A簇缺失，从而容许CYP3A4在缺乏相应小鼠基因条件下表达(见图7)。
随后，FRT序列元件容许Flp介导的人表达盒的缺失，从而在小鼠CYP3A基因座处引起完全敲除(图7)。
实施例2：利用相应人启动子和小鼠CYP2C簇敲除的CYP2C9人源化
小鼠CYP2C簇侧邻loxP和FRT位点，并将CYP2C9表达盒插入小鼠簇的一个末端，如图8中所示，从而容许人CYP2C9在12kb人CYP2C9启动子的控制下表达。
定向载体中包括的loxP序列元件容许Cre介导的小鼠CYP2C簇缺失，从而容许CYP2C9在缺乏相应小鼠基因条件下表达(见图8)。
随后，FRT序列元件容许Flp介导的人表达盒的缺失，从而在小鼠CYP2C基因座处引起完全敲除(图8)。
实施例3：利用相应人启动子和小鼠CYP2D簇敲除的CYP2D6人源化
小鼠CYP2D簇侧邻loxP和FRT位点，并将CYP2D6表达盒插入小鼠簇的一个末端，如图9中所示，从而容许人CYP2D6在9kb人CYP2D6启动子的控制下表达。
定向载体中包括的loxP序列元件容许Cre介导的小鼠Cyp2d簇缺失，从而容许CYP2D6在缺乏相应小鼠基因条件下表达。随后，FRT序列元件容许Flp介导的人表达盒的缺失，从而在小鼠CYP2D基因座处引起完全敲除。
特异性引物的应用容许通过PCR分析小鼠染色体。结果证明所需人置换CYP2D基因序列的成功引入和小鼠Cyp2d簇的缺失(见图10A和10B)。图10C证明人CYP2D6蛋白成功表达在这些小鼠的肝中。
实施例4：利用小鼠Cyp3a11启动子和小鼠CYP3A簇敲除的CYP3A4人源化
编码人CYP3A4的DNA序列插入到小鼠Cyp3a簇中Cyp3a11基因座处，如图10中所示，从而容许人CYP3A4在小鼠Cyp3a11启动子的控制下表达。该定向策略被设计为容许CYP3A4在雄性小鼠中表达，这在使用CYP3A4启动子时可能是不可能的。
编码人CYP3A4的DNA序列包括人CYP3A4基因内含子1的至少一部分(见图10)。
由于如图10中所示定向载体中包含FRT位点，所以选择标记物(图10中的neoR)可以通过在将人CYP3A4插入野生型小鼠Cyp3a11基因座中后，与FLP缺失者品系杂交而缺失。
由于如图中所示定向载体中包含loxP和FRT位点二者，所以大部分小鼠Cyp3a11簇可以通过与FLP缺失者品系或Cre缺失者品系杂交缺失，条件是将人CYP3A4插入到Cyp3a簇5′靶向的细胞。

Claims (23)

1.关于目的基因人源化小鼠的方法，包括：
a)将一对位点特异性重组位点通过同源重组引入小鼠基因组，以使得待置换的小鼠靶基因序列在每侧侧邻重组位点；
其中这两个重组位点中的至少一个被构建为与人置换基因序列相邻接；
且所述人置换基因序列被定位为使得所述重组位点位于所述人置换基因序列和所述小鼠靶基因序列之间；
b)实现位点特异性重组位点之间的重组，以使得将人序列引入到小鼠基因组中以前被小鼠靶基因占据的位置，侧邻剩余位点特异性重组位点。
2.权利要求1的方法，其中将所述人置换基因序列插入到小鼠染色体中天然存在内源等价小鼠靶基因的位点。
3.权利要求1或2的方法，其中所述人置换基因序列含有基因簇。
4.权利要求3的方法，其中所述基因簇编码参与药物代谢的蛋白。
5.权利要求4的方法，其中所述基因簇是细胞色素P450(CYP)基因簇的一部分。
6.以上权利要求中任一项的方法，其中所述人置换基因序列的转录在一种以上内源小鼠调节序列的控制下。
7.权利要求1-5中任一项的方法，其中所述人置换基因序列的转录在内源人调节序列的控制下。
8.以上权利要求中任一项的方法，其中每个位点特异性重组位点被构建为与选择性标记物相邻接。
9.权利要求8的方法，其中将每个选择性标记物定位为使得所述选择性标记物位于所述小鼠靶序列和所述重组位点之间。
10.权利要求8或权利要求9的方法，其中每个所述选择性标记物彼此不同。
11.权利要求8-10中任一项的方法，其中所述选择性标记物选自由新霉素和潮霉素组成的组。
12.权利要求1的方法，其中将第二对位点特异性重组位点引入小鼠基因组；其中第二对重组位点中的每一个侧邻第一对重组位点，从而使得人置换序列可以通过实现该第二对位点之间的位点特异性重组而被切除。
13.权利要求12的方法，其中将所述人置换基因序列定位于第一对位点特异性重组位点的一半和第二对位点特异性重组位点的一半之间。
14.权利要求12或权利要求13的方法，还包括在第二对位点特异性重组位点之间实现第二轮重组，从而切除人置换基因序列和敲除目的基因。
15.以上权利要求中任一项的方法，其中所述位点特异性重组位点对选自由LoxP，FRT和attP/attB组成的组。
16.以上权利要求中任一项的方法，其中所述位点特异性重组事件发生在小鼠胚胎干细胞中。
17.权利要求16的方法，其中随后将所述胚胎干细胞插入胚泡。
18.权利要求17的方法，其中随后将所述胚泡植入假怀孕小鼠中。
19.以上权利要求中任一项的方法，其中所述位点特异性重组事件在体内实现。
20.权利要求19的方法，其中所述位点特异性重组事件通过使以上权利要求中任一项产生的转基因小鼠和表达位点特异性重组酶的小鼠的杂交实现，所述位点特异性重组酶识别在将人置换基因序列引入转基因小鼠基因组中时所用的位点特异性重组位点。
21.权利要求20的方法，其中所述位点特异性重组酶的表达局限于特定组织。
22.权利要求21的方法，其中所述重组酶是清蛋白-Cre。
23.关于目的基因人源化的转基因小鼠，其中所述转基因小鼠通过按照以上权利要求中任一项的方法产生。
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