JP2004105051A - 部位特異的突然変異導入法 - Google Patents
部位特異的突然変異導入法 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】ゲノムＤＮＡの代わりにｃＤＮＡを用いることにより１つの分子種で、多くの多様な突然変異を導入することを可能にし、細胞への部位特異的突然変異導入を飛躍的に簡便化する方法を提供する。
【解決手段】ｃＤＮＡに部位特異的に突然変異を導入し、この変異ｃＤＮＡをゲノムＤＮＡの一部として用いてターゲティングベクターを構築してなるターゲティングベクター、ならびにこのターゲティングベクターを用いて相同組換えにより該突然変異を細胞に導入してなる細胞。
【選択図】 図１
【解決手段】ｃＤＮＡに部位特異的に突然変異を導入し、この変異ｃＤＮＡをゲノムＤＮＡの一部として用いてターゲティングベクターを構築してなるターゲティングベクター、ならびにこのターゲティングベクターを用いて相同組換えにより該突然変異を細胞に導入してなる細胞。
【選択図】 図１
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｃＤＮＡを用いた細胞への部位特異的突然変異導入法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
部位特異的突然変異導入法は、ＤＮＡに予定された変異を部位特異的に導入するものであり、プロモーター等の特別なＤＮＡ配列の機能解明や酵素の活性部位などの探索、さらには人工的なタンパク誘導体の作成等のために重要な方法である。この部位特異的突然変異導入法においては、ＤＮＡの化学合成技術とＤＮＡ複製の酵素反応が巧みに組み合わされており、望みの部位を改変したＤＮＡを任意に得ることができるので、広く利用されている。しかしながら、従来、ゲノムＤＮＡを用いて遺伝子標的法により細胞への突然変異導入する場合、複数の突然変異を同時もしくは逐次に導入し、その遺伝子部位が離れているときには、異なったエクソンを含むゲノムＤＮＡ断片を用意し、それぞれのＤＮＡ断片に突然変異を導入しなければならないため、多大な時間を必要とする。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ゲノムＤＮＡの代わりにｃＤＮＡを用いることにより１つの分子種で、多くの多様な突然変異を導入することを可能にし、細胞への部位特異的突然変異導入を飛躍的に簡便化する方法を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、ｃＤＮＡに部位特異的に突然変異を導入し、この変異ｃＤＮＡをゲノムＤＮＡの一部として用いてターゲティングベクターを構築してなるターゲティングベクター；ならびにこのターゲティングベクターを用いて相同組換えにより該突然変異を細胞に導入してなる細胞、にある。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
本発明において、ｃＤＮＡに部位特異的に突然変異を導入し、この変異ｃＤＮＡをゲノムＤＮＡの一部として用いてターゲティングベクターを構築してなるターゲティングベクターが作成される。ｃＤＮＡに部位特異的に突然変異を導入するに際して、突然変異の種類は特に制限されず、欠失、挿入もしくは塩基置換のいずれであってもよい。さらに、部位も特に制限されない。
【０００７】
本発明においては、このターゲティングベクターを用いて相同組換えにより該突然変異を真核細胞に導入し得る。そして、この細胞を用いて、変異を導入した変異タンパクを細胞内に産生させることもできる。このようにして産生された変異タンパクは常法により精製される。
【０００８】
そして、精製された変異タンパクを動物に注射した後に、通常数週間後に血液を採取して抗血清から該変異タンパクに対する抗体を得ることができる。あるいは、精製された変異タンパクをマウスに注射した後に、通常数週間後に脾臓を採取しこの脾臓由来のリンパ球を用いて常法により該変異タンパクに対するモノクローナル抗体を得ることができる。本発明において突然変異が導入される細胞がマウスの胚幹（ＥＳ）細胞である場合、常法、たとえばモデル動物等の個体もしくは組織を作成し得る。さらに、細胞が体細胞である場合、クローン化技術を用いて個体もしくは組織を作成しうる。
【０００９】
以下に、本発明方法により、Ｇ群色素性乾皮症原因遺伝子（ＸＰＧ）の遺伝子をもつモデルマウスを作製する場合について説明する。すなわち、たとえばＸＰＧ ｃＤＮＡに部位特異的変異を導入して、ＸＰＧの８１１番目のアミノ酸を指定するコドンを、ミスセンス変異もしくはナンセンス変異させ、得られた部位特異的変異導入ＸＰＧ ｃＤＮＡを用いてターゲティングベクターを構築し、ついでこのベクターをマウスのＥＳ細胞に導入し、この変異ＥＳ細胞からマウス個体を作製する方法である。このＥＳ細胞への導入はたとえばエレクトロポレーション法等により行われ、相同的組換えを起こしたＥＳ細胞クローンが選択される。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかはサザンブロッティング法等により確認しうる。このＥＳ細胞クローンを用いて生殖系列キメラマウスを作成し、野生型マウスと交配させヘテロ接合体マウスを得る。ついで、このヘテロ接合体マウス同士を交配させ、メンデルの法則により産生する目的とするマウスおよび野生型マウスが作製される。
【００１０】
色素性乾皮症（ｘｅｒｏｄｅｒｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ：ＸＰ）は、常染色体劣性遺伝様式をとる遺伝性疾患であり、日光に過敏性を示す。ＸＰ患者は、出生時には一見正常に見えるが、乳児期には日光に短時間さらされるだけで急性の皮膚炎症状を呈するので、異常に気がつくことになる。そして、幼児期になると、急性の皮膚炎症状はないが、日光露出部位の皮膚は乾燥、角化し色素が沈着する。さらに、これらの部位に正常人の数千倍の高頻度で皮膚がんを発症し、神経精神症状等の多面的な臨床症状を示す。
【００１１】
ＸＰ患者が日光過敏性を示すことに対応して、患者由来細胞（ＸＰ細胞）は紫外線に高感受性を示し、ＤＮＡの損傷を修復する能力に欠損がある。ＤＮＡ修復はすべての生物において認められる生体防御機能であり、いくつかの機構が知られている。ＸＰはこのうちのとくにヌクレオチド除去修復機構の初期過程に欠損を示す。すなわち、ＤＮＡ損傷を認識し、損傷部位の両側（５’および３’側）にニック（切れ目）を入れ、さらに損傷部位を含むＤＮＡ断片を取除く過程に欠損を示す。このように、ＸＰではＤＮＡ損傷が修復されないために、何らかの機構により突然変異および細胞死を誘発し、高発がん性の原因となっていると考えられる。
【００１２】
ＸＰのＤＮＡ修復欠損には、全く修復できない重い欠損から、正常よりやや低下した軽い欠損までその程度に差異があり、それが臨床症状の重篤度と対応することがわかってきた。異なったＸＰ患者由来の細胞同士を融合させ雑種細胞を形成させると、両者が互いの欠損を補完しあって正常な修復能を示すことがある。これは、両者で欠損している遺伝子が異なるために、雑種細胞において、一方の細胞由来の正常な遺伝子が他方の欠損した遺伝子の働きを補うためと考えられ、この２種の細胞は異なった相補性群に属するといわれる。そして、多くのＸＰ細胞について相補性テストが行なわれ、Ａ〜Ｇ群、およびバリアントと呼ばれる合計８つの遺伝的相補性群の存在が確認されており、少なくとも８つの異なる遺伝子がＸＰに関係し、ヌクレオチド除去修復の初期過程には多くの遺伝子が関与していることが明らかとなっている。
【００１３】
以上のように、ＸＰ細胞は、紫外線により生じたＤＮＡ損傷を回復する機構、除去修復機構の初期過程に欠損があることが示されており、これらのＸＰ原因遺伝子はヌクレオチド除去修復の初期過程において重要な働きをするタンパクをコードしていることが明らかにされてきた。このなかでＸＰＧタンパクは、ヌクレオチド除去修復において損傷部位の３’側でニックを入れてＤＮＡ鎖を切断する構造特異的エンドヌクレアーゼとして機能していることがわかってきた。そしてさらに、ＸＰＧは塩基除去修復もしくは転写の伸長においても重要な役割を果たしており、この機能の欠損が成長阻害や早期老化・死亡を特徴とするコケイン症候群（ＣＳ）の併発の原因であるとの説が出された。
【００１４】
ＸＰＧの８１１番目のアミノ酸を指定するコドンを、部位特異的突然変異によりミスセンス変異もしくはナンセンス変異させ、これらの変異を導入したマウスは以下のステップで作製される。
１．ＸＰＧ ｃＤＮＡへの部位特異的突然変異の導入
ＸＰＧの８１１番目のアミノ酸（アスパラギン酸）をアラニンあるいはストップコドンに置き換えるためにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のキットを使用して、試験管内突然変異導入法によりＸＰＧ ｃＤＮＡの２４３１番目から２４３３番目の塩基をＧＡＴからＧＣＣ（アラニン）あるいはＴＡＡ（ストップ）に部位特異的に置き換えた。この変異部位はエクソン１１に存在する。
２．部位特異的変異を導入したｃＤＮＡを用いた遺伝子ターゲティングベクターの構築
マウスＸＰＧゲノムＤＮＡからエクソン８の一部を含むＨｉｎｄＩＩＩ （Ｈ）−ＰｖｕＩＩ（Ｐ）断片（Ｈ−Ｐ断片）と部位特異的突然変異を含む（コントロールとして正常ＸＰＧ）ｃＤＮＡのＰ−Ｂ（ＢａｍＨＩ）断片を結合し、さらにその下流にポジティブ選択マーカーのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）およびＸＰＧゲノムＤＮＡ（Ｓｐｅ−Ｓｃａ）断片、さらにネガティブ選択マーカーのヘルペスシンプレックスウイルスのＴＫ遺伝子を結合させた３種類のターゲティングベクターを構築した（図１中段ターゲティングベクター参照）。
３．マウスＥＳ細胞のＸＰＧ遺伝子への部位特異的変異の導入
このターゲティングベクターそれぞれをマウスのＥＳ細胞にエレクトロポレーション法を用いて導入した。薬剤Ｇ４１８入りの培地中でＥＳ細胞を培養し、ネオマイシン遺伝子が導入されてＧ４１８に耐性になった細胞クローンを選び出した。ターゲティングベクターＤＮＡが相同組換えによって細胞のＸＰＧ
ＤＮＡと置き換わったクローンを選び出すため３’側の相同組み換えをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法で，５’側の相同組み換えをサザンブロッティング法で確認した（図１下段の突然変異体対立遺伝子参照）。
４．ＸＰＧ遺伝子に部位特異的変異を導入したマウスの作製
ＸＰＧ遺伝子を個体レベルでの表現型を確認するため、これら３種類のＥＳ細胞を定法にしたがってマウス初期胚に微量注入し、さらにこれらの初期胚を偽妊娠させた仮親マウスに移植し生殖系列キメラマウスを得た。さらにそれぞれの変異をヘテロに持つ個体を掛け合わせて、それぞれの変異をホモに持つ胎児細胞を得た。これらの変異遺伝子が生体内で機能しているか否かを判定するため、それぞれの変異をホモに持つ細胞の紫外線感受性を調べた。ＸＰＧ遺伝子の一部を正常ＸＰＧ ｃＤＮＡ断片で置き換えた細胞は、正常細胞と同程度に紫外線抵抗性になることから、ｃＤＮＡ断片で置き換えたＸＰＧ遺伝子は正常に機能することがわかった。Ｄ８１１ストップコドン変異をホモに持つ細胞は紫外線に対して高感受性を示した。Ｄ８１１アラニン変異をホモに持つ細胞も、Ｄ８１１ストップコドン変異ほどではないが紫外線に対し高感受性を示した（図２参照）。このことからそれぞれの変異が細胞内で表現されていることが確認された。
５．上述の方法においては、ＸＰＧ ｃＤＮＡへの部位特異的突然変異の導入による方法を例示したが、ｃＤＮＡの代わりにゲノムＤＮＡに部位特異的突然変異を導入する常法によることもできる。
【００１５】
ＸＰＧタンパクは上述のように、ヌクレオチド除去修復においてＤＮＡ損傷の３’側にニックを入れる構造特異的ヌクレア−ゼとして機能している。Ｄ８１１ストップコドン変異を持つＸＰＧでは、損傷の３’側および５’ともにニックが入らない。そしてＤ８１１アラニン変異では、損傷の３’側にはニックは入らないが、５’にはニックが入る。すなわち、Ｄ８１１アラニン変異ではそれ自身の３’ヌクレア−ゼ活性は失っているが、５’ヌクレア−ゼのＥＲＣＣ（除去修復種間相補遺伝子）１／ＸＰＦタンパク複合体が働いて損傷部位の５’側にニックを入れるのをサポートできる。一方、Ｄ８１１ストップコドン変異では８１１番目のアミノ酸以後を欠失したために構造的に５’ヌクレア−ゼをサポートできず、５’ニッキング活性も失われると考えられる。
【００１６】
【実施例】
実施例１
（１） ターゲティングベクター構築のためのマウスＸＰＧ（Ｘｐｇ）遺伝子の単離
マウスＸｐｇ ｃＤＮＡ （Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２８， ５９−６５， １９９５）をプローブとして用いてマウスＥＳ細胞Ｄ３ゲノムライブラリー（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９， ２３６６−２３７２， １９９９）をスクリーニングし、１２個のポジティブクローンを得た。Ｘｐｇ遺伝子は１５のエクソンからなるがこれらのクローンはエクソン３からエクソン１５下流の及びエクソン１５の領域をカバーしていた。
（２）Ｘｐｇ ｃＤＮＡ への部位特異的突然変異の導入
ＳＴＡＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて部位特異的突然変異を導入した。変異を導入するため次のプライマーを用いた。
Ｄ８１１Ａ変異プライマー：ｇｃｃａｔｃｔｇｇｃｔｇｔｔｔａｇｇｇｃｃｃ（リン酸化）（配列番号１）
Ｄ８１１ｓｔｏｐ変異プライマー：ｔａａａｔｃｔｇｇｃｔｇｔｔｔａｇｇｇｃｃｃ（リン酸化）（配列番号２）
リバースプライマー：ａｃｔａｔｃｇｔｃａｇｔａａｔｃｇｔｔｃｃａｇａ （配列番号３）
１）Ｄ８１１Ａ変異Ｘｐｇの作製
ｐＳＶ２Ｘｐｇ （１μｇ／μｌ） ２ μｌ
ｄＮＴＰｓ （２５ ｍＭ） １ μｌ
Ｄ８１１Ａ変異プライマー（７５ ｎｇ／μｌ） ２ μｌ
リバースプライマー （７５ ｎｇ／μｌ） ２ μｌ
ｄＨ２Ｏ １４．５ μｌ
１０ ｘ 変異誘発バッファー ２．５ μｌ
Ｅｘｓｉｔｅ ＤＮＡポリメラーゼ （５ Ｕ／μｌ） １ μｌ を混合し、以下のＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ終了後、制限酵素Ｄｐｎ １を加え３７℃で１時間インキュベートして、元のテンプレートＤＮＡ （ｐＳＶ２Ｘｐｇ）を分解した。
ＰＣＲ産物１μｌ をアガロースゲル電気泳動にかけ、目的の変異を含む約７ｋｂのバンドが有ることを確認して次のステップに進んだ。
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ （２．５ Ｕ／μｌ）を０．５ μｌ加え、３７℃で２０分インキュベートし、ＰＣＲ産物の３’末端を平滑化した。７２℃で３０分インキュベートしてポリメラーゼを失活させた後、１００ μｌの ｄＨ２Ｏ， １０ μｌ の１０ ｘ 変異誘発バッファー ， ５ μｌ の１０ｍＭ ＡＴＰ， １０ μｌの Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ（４ Ｕ／μｌ）を加え、３７℃で１時間インキュベートしてＰＣＲ産物の連結・閉環を行った。３ μｌのＤＮＡ溶液を用いて大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞を形質転換し、５０ μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で、３７℃一夜培養した。形成されたコロニー６０個からそれぞれプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＶ消化により突然変異を確認した。オリジナルの配列は、ＥｃｏＲＶで消化されるが、突然変異が導入されるとＥｃｏＲＶ部位が消失するので消化されなくなる。１／１０のコロニー由来のプラスミドに突然変異が導入されていた。突然変異部位を含むＶｓｐＩ−ＡｐａＩ ０．２７ ｋｂの塩基配列を決定し二次的変異が導入されていないのを確認後、オリジナルのＸｐｇ ｃＤＮＡのＶｓｐＩ−ＡｐａＩを取り除き、変異を有するＶｓｐＩ−ＡｐａＩ断片と入れ替え、一カ所にのみ望みの変異を導入したＸｐｇ ｃＤＮＡを得た。
【００１７】
２） Ｄ８１１ｓｔｏｐ変異Ｘｐｇの作製
変異プライマーとしてＤ８１１ｓｔｏｐ変異プライマーを用い、Ｄ８１１Ａ変異Ｘｐｇの作製と同様にして、Ｄ８１１ｓｔｏｐ変異Ｘｐｇ ｃＤＮＡを得た。
（３）位置特異的変異を導入した Ｘｐｇ ｃＤＮＡ 断片を用いたターゲティングベクターの構築
ターゲティングベクターの構築を図１を用いて以下に説明する。
５’側の相同領域としてＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）−ＰｓｔＩ（Ｐ）断片約３．８ ｋｂのＸｐｇゲノムＤＮＡを用いた。５’相同領域の下流に変異を含むＸｐｇ ｃＤＮＡのＰｓｔＩ（Ｐ）−ＢａｍＨＩ（Ｂ）断片２．５ ｋｂを連結し、さらにその下流にｌｏｘＰで挟まれたＰＧＫ−１プロモーターとｎｅｏ遺伝子（大阪大学、岡部勝博士より入手）をつなぎ、ポジティブセレクションマーカーとした。３’側の相同領域として、Ｘｐｇ遺伝子のエクソン１５の下流のＳｐｅＩ−ＳｃａＩ断片約１．９ｋｂをｎｅｏの下流に連結した。３’相同領域の下流にはネガティブセレクションマーカーとして、ヘルペスシンプレックスウイルスのＴＫ遺伝子（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１９， ２３６６−２３７２， １９９９）をつなぎターゲティングベクターとした。Ｄ８１１Ａ， Ｄ８１１ｓｔｏｐ及び正常Ｘｐｇ ｃＤＮＡ断片を含む３種類のターゲティングベクターを得た。
（４）Ｒ１ 細胞へのターゲティングベクターのエレクトロポレーション
Ｒ１細胞は１２９系マウス胚盤胞から樹立された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である（トロント、マウントサイナイ病院のＡ． Ｎａｇｙ博士より入手）。Ｒ１細胞はＣ５７ＢＬ／６胎児由来線維芽細胞をフィーダーにし（５ ｘ １０５細胞／３５ｍｍ培養皿）、ヒトＬＩＦを添加（１０３ユニット／ｍｌ）し、２０ ％牛胎児血清、ヌクレオシド、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノールを含むダルベッコ改変培地で培養した。Ｒ１細胞 （１０６個）を１００μｌのＰＢＳ（＋）に浮遊させ、ＨｉｎｄＩＩＩで線状化したターゲティングベクターを添加（５０μｇ／ｍｌとなるように）し、島津のソマティックハイブリダイザーＳＳＨ−１０を用いてエレクトロポレーションした（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９， ２３６６−２３７２， １９９９）。エレクトロポレーション後、２４時間上記培養条件で培養し、その後２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地と交換した。毎日Ｇ４１８培地を交換し、約７日間培養を続けた。
（５）相同組み換え体の同定
Ｇ４１８抵抗性のクローンを選択し、増殖させ、一部を凍結保存し、残りの細胞からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、５’側報道領域の外側にあるＥｃｏＲＩ（Ｅ）−ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ） ０．９ｋｂ断片をプローブにして、サザンハイブリダイゼーションを行った。野生型の対立遺伝子では、８．３ｋｂのバンドが認められ相同組み換え体では、８．３ｋｂと５．５ｋｂのバンドが認められた。このことから、対立遺伝子の一方がターゲティングベクターと５’相同領域で相同組み換えを起こしていることが確認された。Ｎｅｏ遺伝子領域にフォワードのプライマー（５’−ｇｃｇａａｇｇｇｇｃｃａｃｃａａａｇａａｃｇｇ−３’） （配列番号４）を設定し、３’相同領域のＳｃａＩの下流でリバースのプライマー（５’−ｃａｇｔｃｃｔｇｇｔｔｇｔａｇａｃａｃａｇｔａｃｃ−３’） （配列番号５）を設定した。ＰＣＲ条件、９４℃ ２分 １サイクル、９６℃ ２５秒 ６４℃ ３０秒 ７２℃ ５分 ３０サイクルで３’側相同領域での相同組み換え体では、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物が増幅され、ターゲティングベクターと対立遺伝子が３’側相同領域で相同組み換えを起こしていることが確認された。５’側及び３’側の両方で相同組み換えを起こしているクローンを選び出して、以後のキメラマウス作製に用いた。
（６）キメラマウス及び Ｄ８１１Ａ，Ｄ８１１ｓｔｏｐ 変異導入 Ｘｐｇ 変異マウスの作製
上記のような相同組み換え体Ｒ１細胞をＣ５７ＢＬ／６系マウス（放射線医学総合研究所にて生産）胚盤胞に１０−１５個注入し、仮親子宮に移植した。Ｄ８１１Ａ変異については、２０個の胚を、Ｄ８１１ｓｔｏｐ変異については、６０個の胚を、コントロールのＸｐｇ ｃＤＮＡについては４２個の胚を計６匹の仮親に移植して、それぞれ９， １８， ２０匹の仔を得た。毛色から、それぞれ２匹， ７匹， ５匹がキメラマウスであった。キメラマウスの雄とＣ５７ＢＬ／６雌とを交配し生殖系列のキメラが確認され、それぞれの変異の導入されたヘテロ接合体マウスを得た。ヘテロ接合体マウスの雄と雌を交配してそれぞれの変異をホモに持つホモ接合体マウスを得た。
（７）ホモ接合体マウス細胞の紫外線感受性
それぞれの変異をヘテロに持つヘテロ接合体の雄と雌を交配し、それぞれの変異をホモに持つ胎児細胞を得た（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９， ２３６６−２３７２， １９９９）。これらの変異遺伝子が生体内で機能しているか否かを判定するため、それぞれの変異をホモに持つ細胞の紫外線感受性を調べた。Ｘｐｇ遺伝子の一部を正常Ｘｐｇ ｃＤＮＡ断片で置き換えた細胞は、正常細胞と同程度に紫外線抵抗性になることから、ｃＤＮＡ断片で置き換えたＸｐｇ遺伝子は正常に機能することがわかった。Ｄ８１１ｓｔｏｐ変異をホモに持つ細胞は紫外線に対して高感受性を示した。Ｄ８１１Ａ変異をホモに持つ細胞も、Ｄ８１１ｓｔｏｐほどではないが紫外線に対し高感受性を示した（図２）。このことからそれぞれの変異が細胞内で表現されていることが確認された。
【００１８】
【発明の効果】
本発明は、ゲノムＤＮＡの代わりにｃＤＮＡを用いることにより１つの分子種で、多くの多様な突然変異を導入することを可能にし、細胞への部位特異的突然変異導入を飛躍的に簡便化する方法を提供しうる。
【００１９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で使用される３種類のターゲティングベクターならびに得られる突然変異体対立遺伝子の例を示す。
【図２】紫外線感受性を示す図。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ｃＤＮＡを用いた細胞への部位特異的突然変異導入法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
部位特異的突然変異導入法は、ＤＮＡに予定された変異を部位特異的に導入するものであり、プロモーター等の特別なＤＮＡ配列の機能解明や酵素の活性部位などの探索、さらには人工的なタンパク誘導体の作成等のために重要な方法である。この部位特異的突然変異導入法においては、ＤＮＡの化学合成技術とＤＮＡ複製の酵素反応が巧みに組み合わされており、望みの部位を改変したＤＮＡを任意に得ることができるので、広く利用されている。しかしながら、従来、ゲノムＤＮＡを用いて遺伝子標的法により細胞への突然変異導入する場合、複数の突然変異を同時もしくは逐次に導入し、その遺伝子部位が離れているときには、異なったエクソンを含むゲノムＤＮＡ断片を用意し、それぞれのＤＮＡ断片に突然変異を導入しなければならないため、多大な時間を必要とする。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ゲノムＤＮＡの代わりにｃＤＮＡを用いることにより１つの分子種で、多くの多様な突然変異を導入することを可能にし、細胞への部位特異的突然変異導入を飛躍的に簡便化する方法を提供する。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明の要旨は、ｃＤＮＡに部位特異的に突然変異を導入し、この変異ｃＤＮＡをゲノムＤＮＡの一部として用いてターゲティングベクターを構築してなるターゲティングベクター；ならびにこのターゲティングベクターを用いて相同組換えにより該突然変異を細胞に導入してなる細胞、にある。
【０００５】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
【０００６】
本発明において、ｃＤＮＡに部位特異的に突然変異を導入し、この変異ｃＤＮＡをゲノムＤＮＡの一部として用いてターゲティングベクターを構築してなるターゲティングベクターが作成される。ｃＤＮＡに部位特異的に突然変異を導入するに際して、突然変異の種類は特に制限されず、欠失、挿入もしくは塩基置換のいずれであってもよい。さらに、部位も特に制限されない。
【０００７】
本発明においては、このターゲティングベクターを用いて相同組換えにより該突然変異を真核細胞に導入し得る。そして、この細胞を用いて、変異を導入した変異タンパクを細胞内に産生させることもできる。このようにして産生された変異タンパクは常法により精製される。
【０００８】
そして、精製された変異タンパクを動物に注射した後に、通常数週間後に血液を採取して抗血清から該変異タンパクに対する抗体を得ることができる。あるいは、精製された変異タンパクをマウスに注射した後に、通常数週間後に脾臓を採取しこの脾臓由来のリンパ球を用いて常法により該変異タンパクに対するモノクローナル抗体を得ることができる。本発明において突然変異が導入される細胞がマウスの胚幹（ＥＳ）細胞である場合、常法、たとえばモデル動物等の個体もしくは組織を作成し得る。さらに、細胞が体細胞である場合、クローン化技術を用いて個体もしくは組織を作成しうる。
【０００９】
以下に、本発明方法により、Ｇ群色素性乾皮症原因遺伝子（ＸＰＧ）の遺伝子をもつモデルマウスを作製する場合について説明する。すなわち、たとえばＸＰＧ ｃＤＮＡに部位特異的変異を導入して、ＸＰＧの８１１番目のアミノ酸を指定するコドンを、ミスセンス変異もしくはナンセンス変異させ、得られた部位特異的変異導入ＸＰＧ ｃＤＮＡを用いてターゲティングベクターを構築し、ついでこのベクターをマウスのＥＳ細胞に導入し、この変異ＥＳ細胞からマウス個体を作製する方法である。このＥＳ細胞への導入はたとえばエレクトロポレーション法等により行われ、相同的組換えを起こしたＥＳ細胞クローンが選択される。この選択されたＥＳ細胞が目的とする組換え体かどうかはサザンブロッティング法等により確認しうる。このＥＳ細胞クローンを用いて生殖系列キメラマウスを作成し、野生型マウスと交配させヘテロ接合体マウスを得る。ついで、このヘテロ接合体マウス同士を交配させ、メンデルの法則により産生する目的とするマウスおよび野生型マウスが作製される。
【００１０】
色素性乾皮症（ｘｅｒｏｄｅｒｍａ ｐｉｇｍｅｎｔｏｓｕｍ：ＸＰ）は、常染色体劣性遺伝様式をとる遺伝性疾患であり、日光に過敏性を示す。ＸＰ患者は、出生時には一見正常に見えるが、乳児期には日光に短時間さらされるだけで急性の皮膚炎症状を呈するので、異常に気がつくことになる。そして、幼児期になると、急性の皮膚炎症状はないが、日光露出部位の皮膚は乾燥、角化し色素が沈着する。さらに、これらの部位に正常人の数千倍の高頻度で皮膚がんを発症し、神経精神症状等の多面的な臨床症状を示す。
【００１１】
ＸＰ患者が日光過敏性を示すことに対応して、患者由来細胞（ＸＰ細胞）は紫外線に高感受性を示し、ＤＮＡの損傷を修復する能力に欠損がある。ＤＮＡ修復はすべての生物において認められる生体防御機能であり、いくつかの機構が知られている。ＸＰはこのうちのとくにヌクレオチド除去修復機構の初期過程に欠損を示す。すなわち、ＤＮＡ損傷を認識し、損傷部位の両側（５’および３’側）にニック（切れ目）を入れ、さらに損傷部位を含むＤＮＡ断片を取除く過程に欠損を示す。このように、ＸＰではＤＮＡ損傷が修復されないために、何らかの機構により突然変異および細胞死を誘発し、高発がん性の原因となっていると考えられる。
【００１２】
ＸＰのＤＮＡ修復欠損には、全く修復できない重い欠損から、正常よりやや低下した軽い欠損までその程度に差異があり、それが臨床症状の重篤度と対応することがわかってきた。異なったＸＰ患者由来の細胞同士を融合させ雑種細胞を形成させると、両者が互いの欠損を補完しあって正常な修復能を示すことがある。これは、両者で欠損している遺伝子が異なるために、雑種細胞において、一方の細胞由来の正常な遺伝子が他方の欠損した遺伝子の働きを補うためと考えられ、この２種の細胞は異なった相補性群に属するといわれる。そして、多くのＸＰ細胞について相補性テストが行なわれ、Ａ〜Ｇ群、およびバリアントと呼ばれる合計８つの遺伝的相補性群の存在が確認されており、少なくとも８つの異なる遺伝子がＸＰに関係し、ヌクレオチド除去修復の初期過程には多くの遺伝子が関与していることが明らかとなっている。
【００１３】
以上のように、ＸＰ細胞は、紫外線により生じたＤＮＡ損傷を回復する機構、除去修復機構の初期過程に欠損があることが示されており、これらのＸＰ原因遺伝子はヌクレオチド除去修復の初期過程において重要な働きをするタンパクをコードしていることが明らかにされてきた。このなかでＸＰＧタンパクは、ヌクレオチド除去修復において損傷部位の３’側でニックを入れてＤＮＡ鎖を切断する構造特異的エンドヌクレアーゼとして機能していることがわかってきた。そしてさらに、ＸＰＧは塩基除去修復もしくは転写の伸長においても重要な役割を果たしており、この機能の欠損が成長阻害や早期老化・死亡を特徴とするコケイン症候群（ＣＳ）の併発の原因であるとの説が出された。
【００１４】
ＸＰＧの８１１番目のアミノ酸を指定するコドンを、部位特異的突然変異によりミスセンス変異もしくはナンセンス変異させ、これらの変異を導入したマウスは以下のステップで作製される。
１．ＸＰＧ ｃＤＮＡへの部位特異的突然変異の導入
ＸＰＧの８１１番目のアミノ酸（アスパラギン酸）をアラニンあるいはストップコドンに置き換えるためにＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のキットを使用して、試験管内突然変異導入法によりＸＰＧ ｃＤＮＡの２４３１番目から２４３３番目の塩基をＧＡＴからＧＣＣ（アラニン）あるいはＴＡＡ（ストップ）に部位特異的に置き換えた。この変異部位はエクソン１１に存在する。
２．部位特異的変異を導入したｃＤＮＡを用いた遺伝子ターゲティングベクターの構築
マウスＸＰＧゲノムＤＮＡからエクソン８の一部を含むＨｉｎｄＩＩＩ （Ｈ）−ＰｖｕＩＩ（Ｐ）断片（Ｈ−Ｐ断片）と部位特異的突然変異を含む（コントロールとして正常ＸＰＧ）ｃＤＮＡのＰ−Ｂ（ＢａｍＨＩ）断片を結合し、さらにその下流にポジティブ選択マーカーのネオマイシン耐性遺伝子（ｎｅｏ）およびＸＰＧゲノムＤＮＡ（Ｓｐｅ−Ｓｃａ）断片、さらにネガティブ選択マーカーのヘルペスシンプレックスウイルスのＴＫ遺伝子を結合させた３種類のターゲティングベクターを構築した（図１中段ターゲティングベクター参照）。
３．マウスＥＳ細胞のＸＰＧ遺伝子への部位特異的変異の導入
このターゲティングベクターそれぞれをマウスのＥＳ細胞にエレクトロポレーション法を用いて導入した。薬剤Ｇ４１８入りの培地中でＥＳ細胞を培養し、ネオマイシン遺伝子が導入されてＧ４１８に耐性になった細胞クローンを選び出した。ターゲティングベクターＤＮＡが相同組換えによって細胞のＸＰＧ
ＤＮＡと置き換わったクローンを選び出すため３’側の相同組み換えをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法で，５’側の相同組み換えをサザンブロッティング法で確認した（図１下段の突然変異体対立遺伝子参照）。
４．ＸＰＧ遺伝子に部位特異的変異を導入したマウスの作製
ＸＰＧ遺伝子を個体レベルでの表現型を確認するため、これら３種類のＥＳ細胞を定法にしたがってマウス初期胚に微量注入し、さらにこれらの初期胚を偽妊娠させた仮親マウスに移植し生殖系列キメラマウスを得た。さらにそれぞれの変異をヘテロに持つ個体を掛け合わせて、それぞれの変異をホモに持つ胎児細胞を得た。これらの変異遺伝子が生体内で機能しているか否かを判定するため、それぞれの変異をホモに持つ細胞の紫外線感受性を調べた。ＸＰＧ遺伝子の一部を正常ＸＰＧ ｃＤＮＡ断片で置き換えた細胞は、正常細胞と同程度に紫外線抵抗性になることから、ｃＤＮＡ断片で置き換えたＸＰＧ遺伝子は正常に機能することがわかった。Ｄ８１１ストップコドン変異をホモに持つ細胞は紫外線に対して高感受性を示した。Ｄ８１１アラニン変異をホモに持つ細胞も、Ｄ８１１ストップコドン変異ほどではないが紫外線に対し高感受性を示した（図２参照）。このことからそれぞれの変異が細胞内で表現されていることが確認された。
５．上述の方法においては、ＸＰＧ ｃＤＮＡへの部位特異的突然変異の導入による方法を例示したが、ｃＤＮＡの代わりにゲノムＤＮＡに部位特異的突然変異を導入する常法によることもできる。
【００１５】
ＸＰＧタンパクは上述のように、ヌクレオチド除去修復においてＤＮＡ損傷の３’側にニックを入れる構造特異的ヌクレア−ゼとして機能している。Ｄ８１１ストップコドン変異を持つＸＰＧでは、損傷の３’側および５’ともにニックが入らない。そしてＤ８１１アラニン変異では、損傷の３’側にはニックは入らないが、５’にはニックが入る。すなわち、Ｄ８１１アラニン変異ではそれ自身の３’ヌクレア−ゼ活性は失っているが、５’ヌクレア−ゼのＥＲＣＣ（除去修復種間相補遺伝子）１／ＸＰＦタンパク複合体が働いて損傷部位の５’側にニックを入れるのをサポートできる。一方、Ｄ８１１ストップコドン変異では８１１番目のアミノ酸以後を欠失したために構造的に５’ヌクレア−ゼをサポートできず、５’ニッキング活性も失われると考えられる。
【００１６】
【実施例】
実施例１
（１） ターゲティングベクター構築のためのマウスＸＰＧ（Ｘｐｇ）遺伝子の単離
マウスＸｐｇ ｃＤＮＡ （Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２８， ５９−６５， １９９５）をプローブとして用いてマウスＥＳ細胞Ｄ３ゲノムライブラリー（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９， ２３６６−２３７２， １９９９）をスクリーニングし、１２個のポジティブクローンを得た。Ｘｐｇ遺伝子は１５のエクソンからなるがこれらのクローンはエクソン３からエクソン１５下流の及びエクソン１５の領域をカバーしていた。
（２）Ｘｐｇ ｃＤＮＡ への部位特異的突然変異の導入
ＳＴＡＲＡＴＡＧＥＮＥ社のＥｘＳｉｔｅ ＰＣＲ−Ｂａｓｅｄ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて部位特異的突然変異を導入した。変異を導入するため次のプライマーを用いた。
Ｄ８１１Ａ変異プライマー：ｇｃｃａｔｃｔｇｇｃｔｇｔｔｔａｇｇｇｃｃｃ（リン酸化）（配列番号１）
Ｄ８１１ｓｔｏｐ変異プライマー：ｔａａａｔｃｔｇｇｃｔｇｔｔｔａｇｇｇｃｃｃ（リン酸化）（配列番号２）
リバースプライマー：ａｃｔａｔｃｇｔｃａｇｔａａｔｃｇｔｔｃｃａｇａ （配列番号３）
１）Ｄ８１１Ａ変異Ｘｐｇの作製
ｐＳＶ２Ｘｐｇ （１μｇ／μｌ） ２ μｌ
ｄＮＴＰｓ （２５ ｍＭ） １ μｌ
Ｄ８１１Ａ変異プライマー（７５ ｎｇ／μｌ） ２ μｌ
リバースプライマー （７５ ｎｇ／μｌ） ２ μｌ
ｄＨ２Ｏ １４．５ μｌ
１０ ｘ 変異誘発バッファー ２．５ μｌ
Ｅｘｓｉｔｅ ＤＮＡポリメラーゼ （５ Ｕ／μｌ） １ μｌ を混合し、以下のＰＣＲ反応を行った。
ＰＣＲ産物１μｌ をアガロースゲル電気泳動にかけ、目的の変異を含む約７ｋｂのバンドが有ることを確認して次のステップに進んだ。
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ （２．５ Ｕ／μｌ）を０．５ μｌ加え、３７℃で２０分インキュベートし、ＰＣＲ産物の３’末端を平滑化した。７２℃で３０分インキュベートしてポリメラーゼを失活させた後、１００ μｌの ｄＨ２Ｏ， １０ μｌ の１０ ｘ 変異誘発バッファー ， ５ μｌ の１０ｍＭ ＡＴＰ， １０ μｌの Ｔ４ ＤＮＡ リガーゼ（４ Ｕ／μｌ）を加え、３７℃で１時間インキュベートしてＰＣＲ産物の連結・閉環を行った。３ μｌのＤＮＡ溶液を用いて大腸菌株ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテント細胞を形質転換し、５０ μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で、３７℃一夜培養した。形成されたコロニー６０個からそれぞれプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＶ消化により突然変異を確認した。オリジナルの配列は、ＥｃｏＲＶで消化されるが、突然変異が導入されるとＥｃｏＲＶ部位が消失するので消化されなくなる。１／１０のコロニー由来のプラスミドに突然変異が導入されていた。突然変異部位を含むＶｓｐＩ−ＡｐａＩ ０．２７ ｋｂの塩基配列を決定し二次的変異が導入されていないのを確認後、オリジナルのＸｐｇ ｃＤＮＡのＶｓｐＩ−ＡｐａＩを取り除き、変異を有するＶｓｐＩ−ＡｐａＩ断片と入れ替え、一カ所にのみ望みの変異を導入したＸｐｇ ｃＤＮＡを得た。
【００１７】
２） Ｄ８１１ｓｔｏｐ変異Ｘｐｇの作製
変異プライマーとしてＤ８１１ｓｔｏｐ変異プライマーを用い、Ｄ８１１Ａ変異Ｘｐｇの作製と同様にして、Ｄ８１１ｓｔｏｐ変異Ｘｐｇ ｃＤＮＡを得た。
（３）位置特異的変異を導入した Ｘｐｇ ｃＤＮＡ 断片を用いたターゲティングベクターの構築
ターゲティングベクターの構築を図１を用いて以下に説明する。
５’側の相同領域としてＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）−ＰｓｔＩ（Ｐ）断片約３．８ ｋｂのＸｐｇゲノムＤＮＡを用いた。５’相同領域の下流に変異を含むＸｐｇ ｃＤＮＡのＰｓｔＩ（Ｐ）−ＢａｍＨＩ（Ｂ）断片２．５ ｋｂを連結し、さらにその下流にｌｏｘＰで挟まれたＰＧＫ−１プロモーターとｎｅｏ遺伝子（大阪大学、岡部勝博士より入手）をつなぎ、ポジティブセレクションマーカーとした。３’側の相同領域として、Ｘｐｇ遺伝子のエクソン１５の下流のＳｐｅＩ−ＳｃａＩ断片約１．９ｋｂをｎｅｏの下流に連結した。３’相同領域の下流にはネガティブセレクションマーカーとして、ヘルペスシンプレックスウイルスのＴＫ遺伝子（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．１９， ２３６６−２３７２， １９９９）をつなぎターゲティングベクターとした。Ｄ８１１Ａ， Ｄ８１１ｓｔｏｐ及び正常Ｘｐｇ ｃＤＮＡ断片を含む３種類のターゲティングベクターを得た。
（４）Ｒ１ 細胞へのターゲティングベクターのエレクトロポレーション
Ｒ１細胞は１２９系マウス胚盤胞から樹立された胚性幹細胞（ＥＳ細胞）である（トロント、マウントサイナイ病院のＡ． Ｎａｇｙ博士より入手）。Ｒ１細胞はＣ５７ＢＬ／６胎児由来線維芽細胞をフィーダーにし（５ ｘ １０５細胞／３５ｍｍ培養皿）、ヒトＬＩＦを添加（１０３ユニット／ｍｌ）し、２０ ％牛胎児血清、ヌクレオシド、非必須アミノ酸、２−メルカプトエタノールを含むダルベッコ改変培地で培養した。Ｒ１細胞 （１０６個）を１００μｌのＰＢＳ（＋）に浮遊させ、ＨｉｎｄＩＩＩで線状化したターゲティングベクターを添加（５０μｇ／ｍｌとなるように）し、島津のソマティックハイブリダイザーＳＳＨ−１０を用いてエレクトロポレーションした（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９， ２３６６−２３７２， １９９９）。エレクトロポレーション後、２４時間上記培養条件で培養し、その後２００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含む培地と交換した。毎日Ｇ４１８培地を交換し、約７日間培養を続けた。
（５）相同組み換え体の同定
Ｇ４１８抵抗性のクローンを選択し、増殖させ、一部を凍結保存し、残りの細胞からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル電気泳動にかけ、５’側報道領域の外側にあるＥｃｏＲＩ（Ｅ）−ＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ） ０．９ｋｂ断片をプローブにして、サザンハイブリダイゼーションを行った。野生型の対立遺伝子では、８．３ｋｂのバンドが認められ相同組み換え体では、８．３ｋｂと５．５ｋｂのバンドが認められた。このことから、対立遺伝子の一方がターゲティングベクターと５’相同領域で相同組み換えを起こしていることが確認された。Ｎｅｏ遺伝子領域にフォワードのプライマー（５’−ｇｃｇａａｇｇｇｇｃｃａｃｃａａａｇａａｃｇｇ−３’） （配列番号４）を設定し、３’相同領域のＳｃａＩの下流でリバースのプライマー（５’−ｃａｇｔｃｃｔｇｇｔｔｇｔａｇａｃａｃａｇｔａｃｃ−３’） （配列番号５）を設定した。ＰＣＲ条件、９４℃ ２分 １サイクル、９６℃ ２５秒 ６４℃ ３０秒 ７２℃ ５分 ３０サイクルで３’側相同領域での相同組み換え体では、約２．３ｋｂのＰＣＲ産物が増幅され、ターゲティングベクターと対立遺伝子が３’側相同領域で相同組み換えを起こしていることが確認された。５’側及び３’側の両方で相同組み換えを起こしているクローンを選び出して、以後のキメラマウス作製に用いた。
（６）キメラマウス及び Ｄ８１１Ａ，Ｄ８１１ｓｔｏｐ 変異導入 Ｘｐｇ 変異マウスの作製
上記のような相同組み換え体Ｒ１細胞をＣ５７ＢＬ／６系マウス（放射線医学総合研究所にて生産）胚盤胞に１０−１５個注入し、仮親子宮に移植した。Ｄ８１１Ａ変異については、２０個の胚を、Ｄ８１１ｓｔｏｐ変異については、６０個の胚を、コントロールのＸｐｇ ｃＤＮＡについては４２個の胚を計６匹の仮親に移植して、それぞれ９， １８， ２０匹の仔を得た。毛色から、それぞれ２匹， ７匹， ５匹がキメラマウスであった。キメラマウスの雄とＣ５７ＢＬ／６雌とを交配し生殖系列のキメラが確認され、それぞれの変異の導入されたヘテロ接合体マウスを得た。ヘテロ接合体マウスの雄と雌を交配してそれぞれの変異をホモに持つホモ接合体マウスを得た。
（７）ホモ接合体マウス細胞の紫外線感受性
それぞれの変異をヘテロに持つヘテロ接合体の雄と雌を交配し、それぞれの変異をホモに持つ胎児細胞を得た（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． １９， ２３６６−２３７２， １９９９）。これらの変異遺伝子が生体内で機能しているか否かを判定するため、それぞれの変異をホモに持つ細胞の紫外線感受性を調べた。Ｘｐｇ遺伝子の一部を正常Ｘｐｇ ｃＤＮＡ断片で置き換えた細胞は、正常細胞と同程度に紫外線抵抗性になることから、ｃＤＮＡ断片で置き換えたＸｐｇ遺伝子は正常に機能することがわかった。Ｄ８１１ｓｔｏｐ変異をホモに持つ細胞は紫外線に対して高感受性を示した。Ｄ８１１Ａ変異をホモに持つ細胞も、Ｄ８１１ｓｔｏｐほどではないが紫外線に対し高感受性を示した（図２）。このことからそれぞれの変異が細胞内で表現されていることが確認された。
【００１８】
【発明の効果】
本発明は、ゲノムＤＮＡの代わりにｃＤＮＡを用いることにより１つの分子種で、多くの多様な突然変異を導入することを可能にし、細胞への部位特異的突然変異導入を飛躍的に簡便化する方法を提供しうる。
【００１９】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明で使用される３種類のターゲティングベクターならびに得られる突然変異体対立遺伝子の例を示す。
【図２】紫外線感受性を示す図。
Claims (12)
- ｃＤＮＡに部位特異的に突然変異を導入し、この変異ｃＤＮＡをゲノムＤＮＡの一部として用いてターゲティングベクターを構築してなるターゲティングベクター。
- 突然変異が欠失、挿入もしくは塩基置換である請求項１記載のターゲティングベクター。
- 請求項１もしくは２記載のターゲティングベクターを用いて相同組換えにより該突然変異を細胞に導入してなる細胞。
- 請求項３記載の細胞を用いて、変異を導入した変異タンパクを細胞内に産生させる方法。
- 請求項４記載の産生した変異タンパクを精製する方法。
- 請求項５記載の精製された変異タンパクを動物に注射した後に、血液を採取して抗血清から該変異タンパクに対する抗体を得る抗体の産生方法。
- 請求項５記載の精製された変異タンパクをマウスに注射した後に、脾臓を採取しこの脾臓由来のリンパ球を用いて該変異タンパクに対するモノクローナル抗体を得る抗体の産生方法。
- 細胞が真核細胞である請求項３記載の細胞。
- 細胞がマウスの胚幹（ＥＳ）細胞である請求項３記載の細胞。
- 請求項９記載のマウスのＥＳ細胞を用いて個体もしくは組織を作製する方法。
- 細胞が体細胞である請求項３記載の細胞。
- 請求項１１記載の体細胞を用いて個体もしくは組織を作製する方法。
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