JPH08500733A

JPH08500733A - グルコースの存在下で活性的な真菌プロモーター

Info

Publication number: JPH08500733A
Application number: JP6505947A
Authority: JP
Inventors: ハンネレナカリ，ティイナ; オンネラ，マイヤ−レーナ; ハンネレイルメン，マルヤ; ミルジャヘレナネバライネン，カイス; エリサペンティレ，メルヤ
Original assignee: アルコグループリミティド
Priority date: 1992-08-19
Filing date: 1993-08-19
Publication date: 1996-01-30
Also published as: AU4712193A; EP0656943A1; WO1994004673A1; CA2142602A1

Abstract

(57)【要約】一定環境条件、たとえばグルコース培地での増殖下で発現するクロモーターの同定及びクローニング法が記載される。この方法を用いて、操作可能的に連結されるコード配列を高く発現できる５種のトリコダーマプロモーターが同定され、この１種はＴ．リセイtef1のためのプロモーターである。グルコースがそのようなプロモーターからの発現をもはや抑制しないように変更された変更cbh1プロモーターもまた供給される。本発明はさらに、そのようなプロモーターを利用するベクター及び宿主、並びにそのような宿主からユニークなカビ酵素組成物も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】グルコースの存在下で活性的な真菌プロモーター発明の背景Ｉ．プロモーターの同定のための方法遺伝子の翻訳開始部位のすぐ上流に位置する遺伝子及びそれらのプロモーターを同定するためには、多くのシステムがこれまで使用されて来た。それらの技法は大まかに次の２種のカテゴリーに分けられ得る：（１）この目的は、いわゆるプロモータープローブベクターシステムによりランダムにプロモーター活性を含むゲノムDNAフラグメントを単離することであり、そして（２）この目的は、ゲノムバンク（ライブラリー）から遺伝子自体を単離することであり、そしてその対応するプロモーターの単離がそれらに続く。プロモータープローブベクターシステムにおいては、ゲノムDNAフラグメントが、クローン化されたフラグメントがプロモーター活性を含む場合のみ、発現されるレポーター遺伝子のコード配列の前にランダムにクローン化される(Neve，R .L. et al.，Natune 277：324−325(1979))。プロモータープローブベクターは、Ｅ．コリ(E.coli)(An，G．et al.，J．Bact．140：400−407(1979))及び他の細菌宿主（Band．L．et al.，Gene 26：313-315（1983）；Achen，M．G.，Gene 45：45-49(1986)）、酵母（Goodey，A.R. etal.，Mol．Gen．Genet．204：505-5 11(1986)）及び哺乳類細胞（Pater，M．M．et al.，J．Mol．App．Gen．2：363- 371(1984)）においてのプロモーターのクローニングのために企画されている。トリコダーマ(Trichoderma)プロモーターはＥ．コリ及び酵母においては作動しないことが当業界において良く知られているので（たとえば、Penttila，M.E. et al.，Mol．Gen．Genet．194：494-499(1984)）、それらの生物はトリコダーマプロモーターを単離するための宿主としては使用され得ない。トリコダーマの形質転換の間、その形質転換性DNAはランダム位置に種々のコピーでカビゲノム中に組込む事実のために、トリコダーマ自体をクローニング宿主として使用することによるこの方法の適用は、また成功しそうもなく、そして所望する性質を有するトリコダーマプロモーターの効果的単離のためには実際的でない。既知の遺伝子は、検出法としてハイブリダイゼーションを用いてcDNA又は染色体遺伝子バンク（ライブラリー）のいづれかから単離され得る。そのようなハイブリダイゼーションは、他の生物からの対応する相同遺伝（たとえば、Vanhanen et al.，Curr．Genet．15：181-186(1986)）、又はアミノ酸配列における予測される類似性に基づいて企画されたプローブを伴う。アミノ酸配列がその対応するタンパク質のために利用され得る場合、遺伝子の単離のためにハイブリダイゼーションに使用され得るオリゴヌクレオチドがまた、企画され得る。遺伝子が発現バンク中にクローン化されている場合、遺伝子の発現生成物はまた、特異的抗体又は活性試験を用いることによって、そのような発現バンクから検出され得る。特定の遺伝子は、Ｅ．コリ又は酵母における突然変異の相補性（たとえば、Ke esey，J.K. et al.，J．Bact．152：954-958(1982)；Kaslow，D.C.，J．Biol．C hem．265：12337−12341(1990)；Krunstad，J.W.，Gene 79：97-106(1989)）、又はたとえばSIB選択を用いることによっての糸状菌の対応する変異体の相補性( Akins et al.，Mol．Cell．Biol．5：2272-2278(1985))を用いることによって単離され得る。しかしながら、主要な関心は、所望するプロモーター性質を有する特定の遺伝子、たとえばグルコースが培地に存在する場合、最とも高く発現される遺伝子をいかに単離するかである。遺伝子が生物に最とも高く発現され、そして特に糸状菌からは発現されないことを示す情報は文献からは入手できない。酵母サッカロマイセスセレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）からのホスホグリセレートキナーゼ(PGK)プロモーターは、タンパク質生成のために強いプロモーターであると思われる。しかしながら、本発明者により得られた結果は、その対応するトリコダーマプロモーターがそのようなタンパク質生成のために適切でないことを示した。従って、一定の所望する条件下でタンパク質生成のための最良の可能なプロモーターを得るために、それらの単離のための特定のトリコダーマ遺伝子の同定は知られておらず、そして予測され得ない。従って、トリコダーマにおけるそのような目的のための遺伝子単離においては、いづれかのこれまでのヌクレオチド又はアミノ酸配列情報に頼ることもできず、又はいづれかのこれまで知られている突然変異を補うこともできない。示差ハイブリダイゼーションが、一定条件下で発現される遺伝子のクローニングのために使用されて来た。その方法は、誘発され、そして誘発されていないcD NAプローブにより別々にバンクをスクリーニングすることに頼る。この方法によれば、セルロース分解酵素の生成の間に強く発現されるトリコダーマレセイ(T richodeamareesi)遺伝子が単離された(Teeri，T．et al.，Bio/Technology１：6 96-699(1983))。この使用される示差ハイブリダイゼーシヨン法は、調査される遺伝子が一定の条件下で発現するが（セルロース上でのセルラーゼのように）、しかし使用されるcDNAプローブの１つのみとハイブリダイズするクローンをピックアップすることができるある他の条件下では発しない（グルコース上でのセルラーゼのように）考えに基づかれる。しかしながら、グルコース上で強く発現される遺伝子の単離のためには、このアプローチ（グルコース上で発現し、そして他の培地では発現しない）は適切なアプローチではなく、そして最とも高く発現される遺伝子の発見を実際、もたらさない。これは、染色体バンクを示差的にスクリーニングする場合、誘発された遺伝子のみが選択されるためである。そのような誘発された遺伝子は必ずしも、最とも強く発現された遺伝子ではない。従って、グルコース培地上でのトリコダーマに強く機能するプロモーターの同定を可能にする方法は当業界において知られていない。所望する性質を有するプロモーターを得るためのもう１つの意見は、すでに存在する意見を改良することである。これは、プロモーターの機能が、プロモーターにおける特定の別々のヌクレオチド配列に結合する調節タンパク質の相互作用に依存する事実に基づかれている。そのような相互作用は一般的な転写機械に影響を及ぼし、そして転写効率を調節する。それらのタンパク質は正のレギュレーター又は負のレギュレーター（リプレッサー）であり、そして１つのタンパク質は前後関係に依存して二重の役割を有することができる(Johnson，P.F. and Mck night，S.L. Annu．Rev．Biochem．58：799-839(1989))。しかしながら、プロモーターの調節を担持する領域の基本的な理解は相当量の実験データを必要とし、そして他の生物のその対応するプロモーターから得られたデータは通常、有用ではなく（Vanhanen，S．et al.，Gene 106：129-133(1991)）、又は他の生物に起因するプロモーターの機能を説明するのには十分ではない。 II．翻訳延長因子翻訳延長因子(TEF)は、タンパク質合成においてリボソームＡ−部位へのアミノアシル−tRNAのGTP-依存性結合を促進する、一般的に保存されたタンパク質である。GTP結合ドメインを含むタンパク質のＮ−末端が特に保存される。TEFは、合計の可溶性タンパク質の約４〜６％を含んで成る細胞においてひじょうに多くのタンパク質として知られている(Miyajima，I． et al.，J．Biochem．83：453-462(1978)；Thiele，D．et al.，J．Biol．Chem ．260：3084-3089(1985))。 tef遺伝子はいくつかの生物から単離されている。それらのいくつかにおいて、それらは多重遺伝子族を構成する。また、多くの偽遺伝子がいくつかの生物から単離されている。ヒトtef遺伝子のプロモーターは、アデノウィルスの主な後期プロモーターよりも少なくとも２倍効果的にインビトロにおいて転写を指図し、これはtefプロモーターが哺乳類発現システムにおいて強いプロモーターであることを示す（Uetsuki et al.，J．Biol．Chem．264：5791-5798(1989)）。ヒト及びA．thaliana tef１プロモーターの両者（翻訳延長因子EF-1αのための）は、遺伝子発現の高い効率を有する発現システムに使用されて来た(Kim et al. ，Gene 91：217-223(1990)；Curie et al.，Nucl．Acid Res．19：1305-1310(19 91))。両者の場合、プロモーターの十分な発現は、５′非コドン領域におけるイントロンの存在に依存した。 tefはまったく構成的に発現され、その主な概念は老化する及び静止細胞におけるその発現である。宿主の増殖基質により調節されることは知られていない。 III．トリコダーマにおける組換えタンパク質の発現糸状菌トリコダーマレセイは、特に異なったセルロース分解酵素のヒドロラーゼの効果的プロデューサーである。タンパク質分泌のためのその卓越した能力及び産業的培養のための開発された方法により、トリコダーマは非相同の組換えタンパク質の大規模生成のために強力な宿主である。カビにおいての相同及び非相同タンパク質の効果的生成は、真菌プロモーターに頼っている。トリコダーマの主なセルラーゼ遺伝子のプロモーター、すなわちセロビオヒドロラーゼ１(cbhl)は、セルロース又はその誘導体を含む培地上で増殖するトリコダーマにおける非相同タンパク質の生成のために使用されて来た(Harkk et al.，Bio/Technology 7：596-603(1989)；Salo heimo et al.，Bio/Technology 9：987-990(1991))。そのcbh１プロモーターは、トリコダーマがcbh１プロモーター活性のグルコース抑制により、グルコースを含む培地上で増殖される場合、使用され得ない。この調節は転写レベルで生じ、そして従って、グルコース抑制はプロモーター配列を通して仲介される。セルラーゼ遺伝子cbh１，cbh２，egl１及びegl２は種々の増殖条件下で同時発現されることが知られており、従って同じ調節因子が類似する機能を仲介するかなり類似するプロモーター配列上で作用することが予測される。しかしながら、糸状菌においてプロモーターレベルでのグルコース抑制の機構はまだ知られていない。酵母サッカロミセスセレビシアエにおけるグルコース抑制は、多くの年月の間、研究されて来た。しかしながら、それらの研究は、最近まで、グルコース抑制を仲介するプロモーター又はそれに結合する調節タンパク質において結合配列を同定することに失敗して来た。真核生物細胞における最初に公開されたグルコースリプレッサータンパク質及び結合配列は、Nehlin and Ronne（Nehlin，J.0. and Ronne，H．EMBO J．9：2891-2899(1990)）。このMIG１タンパク質は、サッカロミセスセレビシアエにおけるGAL遺伝子のグルコース抑制の1/5を担当すると思われ、他の因子が十分なグルコース抑制効果を得るためにまだ必要とされる (Nehlin，J.0. et al.，EMBO J．10：3373-3377(1991))。グルコース上で増殖されるトリコダーマにおいてタンパク質を生成することが所望される。グルコース基質は安価で且つ容易に入手できる他に、またトリコダーマは、グルコース上で増殖される場合、ほとんどプロテアーゼ活性を生成しない。さらに、セルラーゼ生成は、トリコダーマがグルコース上で増殖される場合、抑制され、従ってトリコダーマ培地から所望する生成物のより容易な精製を可能にする。それにもかかわらず、現在まで、グルコース上で増殖されるトリコダーマにおいて高く機能するいづれかのプロモーターの同定又は特徴化は存在しない。さらに、グルコース上で増殖されるトリコダーマにおいて非相同遺伝子の発現のためにこの強いプロモーターの使用を可能にする、通常グルコース抑制されたプロモーター、すなわちcbh１プロモーターの変性はまだ同定されていない。発明の要約本発明は、トリコダーマcbh１プロモーターに対してグルコース抑制を付与するDNA要素の同定にまず向けられる。本発明は変性されたトリコダーマcbh１プロモーターにさらに向けられ、そのような変性されたプロモーターはそのようなグルコース抑制要素を欠いており、そしてそのような変性されたプロモーターは、宿主がグルコース培地上で増殖される場合、セルラーゼを包含するタンパク質の生成のために有用である。本発明はさらに、特に糸状菌宿主、たとえばトリコダーマからの、グルコース上で高く発現される遺伝子の単離のための方法に向けられる。本発明はさらに、トリコダーマレセイからの５つのそのような前で記載されていない遺伝子及びそれらのプロモーターにも向けられる。本発明はさらに、上記配列を含むトリコダーマのための特異的クローニングベクターにも向けられる。本発明はさらに、タンパク質、たとえばグルコース上でのセルラーゼを生成できる、前記ベクターにより形質転換された糸状菌株にも向けられる。本発明はさらに、セルラーゼ又はグルコース上での他の有用な酵素を生成するための方法にも向けられる。図面の簡単な説明第１図は、tef１プロモーター及びそのコード領域の５′部分を担持するプラスミドpTHN１を示し、そしてtef１遺伝子及び配列決定された領域の相当する特徴を示す。第１Ａ図は、tef１プロモーターのヌクレオチド配列及びコード配列である〔TEF001；配列番号１〕。プロモーター配列は塩基数1234で停止する。翻訳の開始部位のメチオニンコドンは塩基数1235-1237に位置し、そして下線が引かれている。示される塩基の合計数は3461である。DNA配列組成物は850A，1044C ，860G，697T及び10個の他のものである。第２図は、tef１プロモーター及び対応する特徴を有するコード領域を担持するプラスミドpEA33を示す。第３図は、プロモーター及びクローンcDNA１のコード領域を担持するプラスミドpTHN３を示し、そして対応する特徴を示す。第３Ａ図は、cDNA１プロモーターのヌクレオチド配列及びコード配列である〔配列番号２〕。プロモーター配列は塩基数1157で停止する。翻訳の開始部位のメチオニンコドンは第３Ａ図に示されるように塩基数1158-1160で位置し、そして下線が引かれている。第４図は、プロモーター、及びクローンcDNA10及び対応する領域のコード領域及び配列決定された領域を担持するプラスミドpEA10 を示す。斜めに線影を付けられたもの＝挿入体；実線＝配列決定された領域（ゲノムDNA）；十文字を付けられた四角＝配列決定された領域（cDNA）。すべてのE coRV及びNdeＩ部位が示されているわけではない。第４Ａ図は、cDNA10プロモーターのヌクレオチド配列及びコード配列である〔CDNA10SEQ；配列番号３〕。プロモーター配列は塩基数1522で停止する。翻訳の開始部位のメチオニンコドンは塩基数1523-1525に位置し、そして下線が引かれている。示される塩基の合計数は2868である。DNA配列組成物は760Ａ，765Ｃ，675Ｇ及び668Ｔである。第５図はクローンcDNA12及び対応する特徴及び配列決定された領域を担持するプラスミドpEA12を示す。斜めに線影を付けられたもの＝挿入体；実線＝配列決定された領域（ゲノムDNA）；十文字を付けられた四角＝配列決定された領域（c DNA）；？＝配列決定されていないイントロン領域。注：AvaＩはユニーク部位ではない。第５Ａ図はcDNA12プロモーターのヌクレオチド配列及びコード配列である〔A12DNA；配列番号４〕。プロモーター配列は塩基数1101で停止する。翻訳の開始部位のメチオニンコドンは塩基数1102-1104に位置し、そして下線が引かれている。塩基の合計数は2175である。DNA配列組成物は569Ａ，602Ｃ，480Ｇ，51 9Ｔ及び５つの他のものである。第６図は、プロモーター及びクローンcDNA15のコード領域及び対応する特徴及び配列決定された領域を担持するプラスミドpEA155を示す。斜めに線影を付けられたもの＝挿入体；実線＝配列決定された領域（ゲノムDNA）；十文字を付けられた四角＝配列決定された領域（cDNA）。すべてのPstＩ及びEcoRＩ部位が示されているものではない。第６Ａ図はcDNA15のヌクレオチド配列及びコード配列である〔配列番号５〕。塩基の合計数は2737である。DNA組成物は 647Ａ，695Ｃ，742Ｇ，649Ｔ及び４つの他のものである。第７図は、egl１cDNAを担持するプラスミドpPLE3を示す。すぐ上部のプラスミド地図は、cbh１プロモーター及びegl１シグナル配列〔配列番号18及び16〕の間に正確な連結部〔配列番号26、配列番号27〕を構成するためにプラスミドからの SacII及びAsp718小フラグメントを除去するように構成されたアダプター分子〔配列番号25〕の配列である。第７Ａ図はeglＩcDNAの1588bp配列を示す（369Ａ， 527Ｃ，418Ｇ、及び274Ｔ）〔配列番号16〕。第７Ｂ図はpPLE131の745bp cbh１ターミネーターの配列を示す(198Ａ，191Ｃ，177Ｇ及び179Ｔ)（配列番号23〕。第８図は、プラスミドpEM-3Aの構成及び配列番号28を示す。プラスミド地図上の“Ａ”は、EGＩ末端配列を示し、そして“Ｂ”はEGＩヒンジ配列を示す。第９図は、tef１プロモーター下でのEGＩcoreの発現のためのプラスミドpTHN1 00B及び配列番号28を示す。第10図は、フロットブロットからのEGＩ特異的抗体により分析される宿主株QM 9414の培養培地中へのプラスミドpTHN100BからのEGＩcoreの生成を示す。レーン１：pTHN100B-166，200μｌのグルコース上清液；レーン２：QM9414，200μｌのグルコース上清液；レーン３：TBS；レーン４：QM9414，200μｌのsolka floc １：500希釈上清液；レーン５：QM9414，200μｌのsolka floc １：5,000希釈上清液；レーン６：QM9414，200μｌのsolka floc１：10,000希釈上清液；レーン７：pTHN100B-166，200μｌのグルコース１：５希釈上清液；レーン８：QM941 4，200μｌのグルコース１：５希釈上清液；レーン９：200ｎｇのEGＩタンパク質；レーン10：100ｎｇのEGＩタンパク質；レーン11：50ｎｇのEGＩタンパク質；及びレーン12：25ngのEGＩタンパク質。第11図は、浮清−消耗穀類又はグルコース培地において増殖されたpTHN10OB-1 6c株及びグルコース培地から精製されたEGＩcoreの培養培地のEGＩ特異的抗体によるウェスターンブロットを示す。レーン１：pTNH100B-16c，10μｌの浮清消耗穀類上清液；レーン２：pTNH100B-16c，５μｌの浮清消耗穀類上清液；レーン３ −５：pTHN100B-16cグルコース発酵から精製されたEGＩcore；レーン６：pTHN10 0B-l6c，15μｌのグルコース発酵上清液、100×に濃縮される；レーン７：pTHN1 00B-16c，7.5μｌのグルコース発酵上清液、100×に濃縮される；及びレーン８：94KDa，67KDa，43KDa，30KDa及び20.1KDaでの低分子量マーカー（バンド１− ５は、ゲルの上部レーン６から出発する）。第12図はグルコース培地上で増殖されたpTHN100B-l6c株の培養培地のウェスターンブロットを示す。レーン１：EGＩタンパク質、約540ng；レーン２、EGＩタンパク質、約220ng；レーン３、EGＩタンパク質、約110ng：レーン４、pTHN100B -16c、30μｌのグルコース発酵体上清液、4.2倍に濃縮された；レーン５、pTHN1 00B-16c、30μｌのグルコース発酵体上清液、4.2倍に濃縮された；レーン６、94 KDa，67KDa，43KDa，30KDa及び20.1KDaでの低分子量マーカー（バンド１−５はレーン６、すなわちゲルの上部から出発する）。第13図は、プラスミドpML016の要素を示す。第13Ａ図はプラスミドpML016のcb h１プロモーターの配列である〔配列番号18〕。第13Ｂ図はプラスミドpML016及びそれに由来するプラスミド上のＴ．レセイcbh１ターミネーターの配列である〔配列番号24〕。第14図は、トリコダーマレセイQM9414(A2-F5)のpML016de15(11)−形質転換体におけるグルコース培地上のβ−ガラクトシダーゼの発現を示す。Ａ１：QM94 14宿主株；Ｃ１及びＥ１：損なわれていないcbh１プロモーターを有するβ−ガラクトシダーゼ発現カセットの１つのコピーがcbh１遺伝子座を置換しているQM9414形質転換体；Ｂ１，Ｄ１及びＦ１：空のウェル。第15図は、lacZ遺伝子に融合されるcbh１プロモーターの短くされた形及びcbh １ターミネーターを担持する、プラスミドpML016de15(11)の制限地図を示す。第 15Ａ図は、切断されたcbh１プロモーターの配列である〔（pML016de15(11)〕：配列番号19〕。ポリリンカーは下線が引かれている。矢印は欠失部位を示す。第16図は、cbh１染色体遺伝子に融合されるcbh１プロモーターの短くされた形を担持する、プラスミドpML017の制限地図を示す。肩文字の十字“＋”により印される制限部位は単一の部位ではない。第16Ａ図は、染色体cbh１遺伝子を含むK spＩ-XmaＩフラグメント（下線部分）の配列を示す〔配列番号17〕。第17図は、トリコダーマレセイQM9414のpML017形質転換体におけるグルコース培地上でのCBH１の発現を示す。単一胞子培養物の収集（数及び文字コード）及び種々の対照サンプルが示される。第18図は、pMI-24，pMI-25，pMI-26，pMI-27及びpMI-28のcbh１プロモーターにおけるmig様配列（Ｍ）の特異的変異誘発を示す。ここに示されるプロモーターは、pML016（第13図を参照のこと）又はpML016de10(2)(第19図を参照のこと) について記載されるようなlacZ遺伝子及びcbh１ターミネーターに融合された。＊：種々の組合せでcbh１プロモーターに行なわれた配列の変更。位置1505-1500 で、ゲノム配列は５′-CTGGGGであり、そして変更された配列は５′-TCTAAAである。位置1001-996で、ゲノム配列は５′-CTGGGGであり、そして変更された配列は５′-TCTAAAである。位置720−715で、ゲノム配列は５′-GTGGGGであり、そして変更された配列は５′-TCTAGAである。pML016de10(2)はpMI-25，pMI-26，pMI- 27、及びpMI-28のための出発ベクターとして使用された。▽＝ポリリンカー。第18Ａ図は、pMI-24(PMI27PROM)の変更されたcbh１プロモーターの配列である（〔配列番号20〕）。塩基の合計数は1776である。配列組成物は487Ａ，399 Ｃ，434Ｇ及び456Ｔである。ポリリンカーは下線が示され、そして配列の変更はボックスで示される。第18Ｂ図はpMI-27の変更されたcbh１プロモーターの配列である（〔配列番号２１〕）。ポリリンカーは下線が引かれており、矢印は欠失点を示し、そして配列の変更はボックスで示される。第１８Ｃ図はpMI-28の変更されたcbh１プロモーターの配列である(PMI28PROM)（〔配列番号22〕）。ポリリンカーは下線が引かれており、矢印は欠失点を示し、そして配列の変更はボックスで示される。塩基の合計数は1776である。配列組成物は490Ａ，399Ｃ，430Ｇ及び457Ｔである。第19図は、lacZ遺伝子及びcbh１ターミネーターに融合されるcbh１プロモーターの短くされた形を担持する、プラスミドpML016de10(2)の制限地図を示す。第20図は、pML016de10(2)，pMI-25，pMI-27，pMI-28，pML016及びpMI-24により形質転換されたトリコダーマレセイQM9414における、示される培地上でのβ −ガラクトシダーゼの発現を示す。好ましい態様の詳細な記載Ｉ．グルコース培地上で発現する真菌遺伝子の同定次の記載においては、分子遺伝子及び生物学の当業者に知られている種々の方法が言及される。言及されるそのような既知の方法を示す出版物及び他の材料は、それらの生体を引用により本明細書に組込まれる。糸状菌の生化学及び分子生物学の一般的概念はたとえばFinkelstein，D.B. et al.，eds.，Biotechnology of Filamentous Fungi：Technology and Products，Butterworth-Heinemann，publishers，Stone ham，MA(1992)及びBennett，J.W. et al.，More Gene Manipulations in Fungi ，Academic Press-HarcourtBrace Jovanovich，publisher，San Diego CA(1991) に示されている。特にトリコダーマがグルコース上で増殖される場合、トリコダーマからタンパク質生成のための多種のシステムを開発できるようにするためには、グルコース上で高く発現されるこれまで知られていないトリコダーマ遺伝子及びそれらのプロモーターの単離のための方法が開発されて来た。本発明の方法は、プローブのたった１つのcDNA集団の使用を要する。本発明の方法は、細胞が暴露されるいづれかの所望される環境条件下で活性的であるプロモーター配列の同定のために有用であり、そしてグルコース培地において発現できるプロモーターの例示された同定では必ずしもない。“環境条件” とは、物理的又は化学的剤の存在を意味し、そのような剤は細胞環境に細胞外的又は細胞内的に存在する。物理的剤はたとえば、ある増殖温度、特に高い又は低い温度を包含する。化学的剤は、いづれかの化合物又は炭素増殖基質、薬物、大気ガス、等を含む混合物を包含する。本発明の方法によれば、生物はまず、所望する増殖条件下で、たとえば炭素源としてグルコースを用いて増殖される。次に、生mRNAが生物から抽出され、そして好ましくは、全RNA集団から少なくともポリＡ＋mRNAの富化を通して精製される。cDNAバンクは、逆転写酵素を用いてこのmRNA集団及び適切なベクター、たとえば市販のλ-ZAPベクターシステム（Stratagene）中にクローン化されたcDNA集団から製造される。λ-ZAPベクターシステム又はいづれかのベクターシステムを用いる場合、cDNAは、λバクテリオファージ感染に敏感ないづれかのＥ．コリ株の感染のために適切であるようにパッケージされる。 cDNAバンクは、スクリーニングのためにニトロセルロースフィルター上に標準のコロニーハイブリダイゼーション抜法によりトランスファーされる。そのバンクはプレートされ、そしてプラークリフトがニトロセルロース上に取られる。バンクは、緊縮ハイブリダイゼーション条件を用いて、クローン化されたcDNAバンクが構成される同じRNA集団に対して合成された、ラベルされたcDNAの集団によりスクリーンされる。その遺伝子は、この選択工程の間、いづれの手段においても発現されないことが注目されるべきである。これは、種々の強度でハイブリダイズするクローンをもたらし、そして最強のシグナルを示すクローンがピックアップされる。元の集団において最とも強く発現される遺伝子は全mRNAプールの大部分を含み、そして従って、この選択において強いシグナルを付与する。最強のシグナルを有するクローンにおける挿入体が、当業界において知られているようないづれかのDNA配列決定技法を用いて、挿入体の３′端から配列決定される。これは個々のクローンの第１の同定を提供し、そして同一のクローンの排除を可能にする。個々の所望するクローンがcDNAλ−バンクに表わされる頻度が、クローン−特異的PCRプローブに対するバンクのハイブリダイゼーションにより決定される。所望するクローンは、上記のような最強のシグナルを有する他に、またcDNAバンクにおいて最高の頻度で表わされるものである。なぜならば、これは、その集団における多量性mRNAが比較的高く、そして従って、その遺伝子のためのプロモーターが増殖条件下でひじょうに活性的であることを意味するからである。従って、このアプローチの適切性及びそれから同定されたいづれかのクローンは二重チェックされ得る：特異的クローンのハイブリダイゼーションシグナルの強度はそのクローンがcDNAバンクに見出される頻度と陽性的に相互関係すべきである。この態様で選択されるクローンの挿入体、たとえば cDNA配列に対応する挿入体は、染色体バンク、たとえば上記のようにλ中にクローン化されたものからその対応する遺伝子及びそれらのプロモーターを単離するためのプローブとして使用され得る。本発明の方法はトリコダーマのみには限定されず、そしていづれかの宿主から、又は特定の組織からの遺伝子をクローニングするためにも用いられ、そしてそのような宿主（これから、cDNAバンクが構成される）は、原核（細菌）宿主及びいづれかの真核宿主植物、哺乳類、昆虫、酵母及びいづれかの培養された細胞集団を包含する。たとえば、本発明の方法を用いて、トリコダーマレセイがグルコース上で増殖される場合、そのようなトリコダーマにおいて比較的高レベルのmRNAを発現する５つの遺伝子が同定された。それらの遺伝子は配列決定され、そしてクローン cDNA33，cDNA１，cDNA10，cDNA12及びcDNA15として同定された。トリコダーマ染色体λ−バンクをスクリーンするために使用される場合、その対応する遺伝子及びそれらのプロモーターが同定された。次に、そのような遺伝子及びプロモーター（又はその一部）がいづれかの所望するベクター、たとえばpSP73ベクター(Pr omega，Madison，WI，USA)中にサブクローン化され得る。本発明によれば、グルコース上で増殖されたトリコダーマに高く発現される、遺伝子及びそれらのプロモーター（又はそれらの一部）を含むクローンは、次の通りに示される：トリコダーマがグルコース上で増殖される場合に高く発現されるような、本発明に従って単離された遺伝子の１つは、１つのコードするトリコダーマ翻訳延長因子１α(tef１)として同定された。さらに、トリコダーマにおいてグルコース上で高く発現される４種の他の新規遺伝子が初めて同定された。それらのデータは、本発明に使用される方法が５種の遺伝子の単離をもたらし、この遺伝子の１つ(tef１)は他の生物において効果的に発現することが知られていることを示す。しかしながら、tef１遺伝子は本発明の方法によりトリコダーマcDNAバンクから単離された５種の遺伝子のうち最とも高く発現されたものではない。単離された５種の遺伝子のうち、tef１のみがいづれかの既知のタンパク質配列と適切な程度の相同性を示す。単離された遺伝子のすべてはまた、他の炭素源上でも発現され、そして示差クローニングの従来の方法により見出されなかった。これは特定の目的のために、たとえばグルコース含有培地上での発現のために、強いプロモーターの単離のための最とも適切な遺伝子の単離においての本発明で使用される方法の重要性を示す。それらの遺伝子のいづれかのプロモーターは、そのようなプロモーターに相同の配列に、及び特に、グルコース上で増殖されるトリコダーマ宿主からのそのような遺伝子の発現のためにその宿主トリコダーマに相同の配列に操作可能的に結合され得る。好ましくは、そのコード配列は、培地中への組換えタンパク質の分泌のために分泌シグナルを提供する。本発明のプロモーターの使用は、セルラーゼが存在せず、そして比較的少ないプロテアーゼが存在する条件下でのトリコダーマからの遺伝子の発現を可能にする。従って、初めて、組換え遺伝子が、グルコース基材の増殖培地を用いてトリコダーマ上に高く発現され得る。本発明のプロモーターは、グルコース上で強く発現されるが（すなわち、糸状菌宿主は炭素及びエネルギー源としてグルコースを供給する培地上で増殖される場合）、グルコースの不在下で抑制されない。さらに、それらは、トリコダーマ宿主がグルコース以外の炭素源上で増殖される場合、活性的である。本発明のグルコースプロモーター及び本発明の方法により同定されるプロモーターは、特に種々の種類の植物材料を加水分解できるトリコダーマ自体に生来の酵素を生成するために使用され得る。グルコース上で、真菌はそれらの酵素を天然においては生成せず、そして従って、１又は複数の特定の加水分解酵素は他の植物材料加水分解酵素を含まないグルコース培地上で生成される。これは、特定の用途のための酵素調製物又は酵素混合物をもたらす。 II．セロビオヒドロラーゼＩプロモーターの変性本発明はまた、プロモーターの活性が保持されるが、しかしそのプロモーターは、細胞がグルコース含有培地上で増殖される場合、もはや抑制されないようなセロビオヒドロラーゼＩプロモーター(cbh１)の変性法も記載する。特に、グルコース抑制を付与するDNAモチーフがこのプロモーターから同定され、そして除去され、適切な宿主、たとえばトリコダーマにおけるプロモーターにそのコード配列が操作可能的に連結される所望するタンパク質の生成を可能にする。そのような変性されたcbh１プロモーターは抑制解除されたcbh１プロモーターと称される。上記のように、そのような構造体を有する形質転換体から得られた組換え生物がグルコース含有培地上で培養される場合、セルラーゼを包含するいづれかのタンパク質が特に天然のセルラーゼの他の植物材料加水分解酵素の生成を伴わないで生成され得る。単離されたグルコースプロモーター又は抑制解除されたcbh１プロモーターが、他のヒドロラーゼ、たとえば他のセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、等のいづれの同時生成も伴わないでグルコース上で増殖される宿主における個々のセルラーゼを生成するために、又は種々の増殖培地に非相同タンパク質を生成するために使用され得る。 III．本発明のプロモーター配列に作動可能に連結されるコーディング配列の調製コーディング配列を遺伝子工学的に処理して、本発明のプロモーターのもとで発現させる方法は、注目している酵素をコードする純粋タンパク質を単離して部分的に配列を決定するかまたはこのようなタンパク質をコードできる遺伝子配列をポリメラーゼ連鎖反応法によってクローン化し、次いでこのような遺伝子配列を発現させることによって容易に行える。“遺伝子配列”という用語は、本願で用いる場合、核酸分子(好ましくはDNA)を意味するものとする。タンパク質をコードできる遺伝子配列は各種の起源に由来している。これらの起源にはゲノムDN A，cDNA，合成DNAおよびその組合わせがある。ゲノムDNAの好ましい起源は真菌のゲノムバンクである。cDNAの好ましい起源は、所望の遺伝子の発現を誘発して mRNAまたはタンパク質を産生することが分かっている条件で増殖させた真菌 mRNAから調製したcDNAバンクである。しかし、遺伝コードは普遍的なものであるから、原核（細菌）宿主、ならびに真核宿主の植物、哺乳類、昆虫類、酵母類および培養細胞集団を含めて、いずれの宿主由来のコーディング配列でも機能する（所望のタンパク質をコードする）と考えられる。ゲノムDNAは天然に存在するイントロンを含有していても含有していなくてもよい。さらにこのようなDNAは本発明の遺伝子配列の５′プロモーター領域および／または３′転写終止領域とともに得ることができる。しかし、本発明によればその固有のプロモーター領域は本発明のプロモーターで置換される。またこのようなゲノムDNAは、mRNAの５′非翻訳領域をコードする遺伝子配列および／または３′非翻訳領域をコードする遺伝子配列とともに得ることができる。宿主細胞がmRNAとタンパク質の発現に関連する転写および／または翻訳の調節シグナルを認識できる程度まで、固有遺伝子の５′および／または３′の非転写領域、および／またはmRNAの５′および／または３′の非翻訳領域が、転写と翻訳を調節するため保持され採用される。ゲノムDNAは、いずれの宿主細胞からでも特に真菌の宿主細胞から抽出し精製することができる。真菌の細胞は当該技術分野で公知の方法によって所望のタンパク質を天然に発現している。ゲノムDNA配列は当該技術分野で公知の手段によって短くして染色体領域から所望の遺伝子を単離することができる。そうしないとこの染色体領域は、宿主内で本発明の上記の遺伝子を利用するのに必要な情報以上の多くの情報を有している。例えば所望の位置で全長の配列を切断するのに制限消化を利用できる。あるいはまたはさらに、DNA分子の３′末端から切断するヌクレアーゼを使用して特定の配列を消化し短かくした形にすることができ、次いでゲル電気泳動とDNAの配列決定を行うことによって、所望の長さを同定し精製することができる。このようなヌクレアーゼとしては例えばエキソヌクレアーゼIIIとBa131がある。他のヌクレアーゼは当該技術分野で公知である。かような適切なDNA標品は（ゲノムのDNAもしくはcDNA）はそれぞれベクター中にクローン化するため、ランダムに剪断するかまたは酵素で切断し、次いで適切なベクターに連結して組換え遺伝子（ゲノムまたはcDNAの）バンクを形成させる。所望のタンパク質をコードするDNA配列またはその機能誘導体は通常の方法にしたがってDNAベクター中に挿入することができる。その方法には、連結する末端の平滑末端化または付着末端化；適切な末端を与えるための制限酵素による消化；適切な場合の付着末端のフィルイン；望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼによる処理；および適切なリガーゼによる連結が含まれる。このような操作方法は、Maniatisが開示しており〔Maniatis,Tら、Molecular Cloning(A Laboratory Manual),Cold Spring HarborLaboratory、第二版、1988 年〕、当該技術分野で公知である。所望の遺伝子をコードする配列を含有するライブラリーを選別し、次いで、所望の遺伝子が、このような遺伝子またはタンパク質をコードする配列を特異的に選択する次のような方法のいずれかによって同定される。例えばａ）このタンパク質のDNAに対して特異的な配列を含有する適切な核酸のプローブとハイブリッドを形成させる方法によるか、またはｂ）当該クローンとハイブリッドを形成する固有のmRNAを生体外で翻訳し次いでその翻訳産物をさらに特性決定するハイブリッド形成選択翻訳分析法によるか、またはｃ）クローン化された遺伝子配列がそれ自体mRNAを発現できる場合、クローンを含有する宿主が産生する翻訳タンパク質産物を免疫沈澱することによって同定される。特定のタンパク質のためのクローンを同定するのに使用できるそのタンパク質に対して特異的なオリゴヌクレオチドは、そのタンパク質のアミノ酸配列の知識またはかようなタンパク質もしくは類縁タンパク質をコードするDNAの核酸配列の知識に基づいて設計することができる。あるいは、抗体を精製された形態のタンパク質に対して生成させ、その抗体を用いて所望のクローン化タンパク質を発現する形質転換体中にユニークタンパク質決定因子の存在を同定する。アミノ酸配列を横方向に示した場合、特にことわらない限り、アミノ末端は左側に置き、カルボキシ末端は右端に置くものとする。同様に、特にことわらない限り、または前後関係から明らかであるが核酸配列は左側に５′末端を置いて示す。遺伝コードは縮重しているので、一つ以上のコドンを用いて一つの特定のアミノ酸をコードすることができる。ペプチドフラグメントを分析して、縮重性が最も低いオリゴヌクレオチドがコードできるアミノ酸配列を同定することができる。このことは単一のコドンのみによってコードされるアミノ酸を含有する配列を同定することによって実施することが好ましい。時には、一つのアミノ酸配列が単一のオリゴヌクレオチド配列だけでコードされることがあるが、アミノ酸配列が１セットの類似のオリゴヌクレオチドでコードされる場合が多い。さらに重要なことには、このセットのメンバーはすべて、同じペプチドフラグメントをコードすることができるオリゴヌクレオチド配列を含有し、したがって、そのペプチドフラグメントをコードする遺伝子と同じオリゴヌクレオチド配列を含有している可能性があるのに対し、そのセットの一つのメンバーだけがその遺伝子のエキソンコーディング配列と同一のヌクレオチド配列を含有している。このメンバーはそのセットの中に存在し、そしてそのセットの他のメンバーが存在していてもDNAとハイブリッドを形成できるので、ペプチドをコードする遺伝子をクローン化するのに単一のオリゴヌクレオチドを利用する場合と同じ方式でオリゴヌクレオチドの未分画セット（unfractionate set）を用いることができる。遺伝コードを用いて、一つ以上の異なるオリゴヌクレオチドをそのアミノ酸配列から同定することができ、そのアミノ酸配列は各々所望のタンパク質をコードすることができる。特定のオリゴヌクレオチドが実際のタンパク質インコーディング配列を実際に構成している確率は、異常な塩基対の関係および真核細胞内で特定のコドンが実際に使用される（特定のアミノ酸をコードするため）頻度を検討することによって推定することができる。“コドン使用律（codonusage rules ）”を用いて、タンパク質配列をコードできる理論的に“最も確率の高い”ヌクレオチド配列を含有する単一のオリゴヌクレオチド配列またはオリゴヌクレオチド配列のセットが同定される。特定の遺伝子のフラグメントをコードできる適切なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット（またはかようなオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセットに対して相補的な適切なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのセット）は当該技術分野で公知の方法で合成することが可能であり（例えば“Oligonucleotides and Analogues,A Practical Approach",F.Ecks tein編集、1992年、IRL Press社、米国、ニューヨーク参照）、およびかような遺伝子のためのクローンを当該技術分野で公知の方法で固定して単離するのに用いるプローブとして利用できる。核酸のハイブリッド形成法とクローン同定法は、Maniatis,T．ら、“Molecular Cloning,A Laboratory Manuarl,Cold Spring HarborLaboratories、米国、ニューヨーク州、コールドスプリング・ハーバー、1982年およびHames,B.D.ら、“Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach”，IRL Press社、米国、ワシントンDC，1985年に開示されている。かようなハイブリッド形成を行うことができることが分かっている上記の遺伝子バンクのこれらのメンバーは、次いで分析され、これらメンバーが含有しているコーディング配列の大きさと性質が測定される。所望のDNAコーディング配列の検出を容易にするために、上記のDNAプローブには検出可能な基の標識をつける。このような検出可能な基は検出可能な物理特性もしくは化学特性を有するいずれの物質でもよい。このような物質は、核酸のハイブリッド形成の分野で充分開発されており、一般に、かような方法に有用なほとんどの標識を本発明に利用することができる。特に有用なのは放射性標識であり、例えば³⁹Ｐ，³Ｈ，¹⁴Ｃ，³⁵Ｓ，¹²⁵Ｉなどである。適切なシグナルを提供しかつ充分な半減期を有するあらゆる放射性標識を利用できる。オリゴヌクレオチドは、一本鎖の場合、キナーゼ反応を用いて放射性標識をつけることができる。あるいは、ビオチン、酵素または蛍光基のような非放射性マーカーで標識を付ける場合、ポリヌクレオチドも核酸ハイブリッド形成プローブとして有用である。したがって要約すると、一部分のタンパク質配列を解明すれば、かようなペプチドをコードすることができる理論的に“最も確率が高い” DNA配列またはかような配列のセットを同定することができる。この理論的な配列に相補的なオリゴヌクレオチドを構築することによって（または最も“確率が高い”オリゴヌクレオチドのセットに相補的なオリゴヌクレオチドのセットを構築することによって）、遺伝子を含有するクローンを同定し単離するのに用いるプローブとして機能することができるDNA分子（またはDNA分子のセット）が得られる。遺伝子をクローン化する別の方法では、発現ベクターを用い、タンパク質を発現することができる細胞から調製したDNAまたはより好ましくはcDNAを発現ベクター中にクローン化することによって、バンクを作ることができる。次にこのバンクは、例えばバンクを、タンパク質に対する抗体を用いて選別することによって、所望のタンパク質を発現するメンバーについて選別する。それ故に、上記の方法は、タンパク質またはこのタンパク質の生物活性フラグメントもしくは抗原フラグメントをコードできる遺伝子配列を同定することができる。所望のコーディング配列はさらに、特異的な方式で抗体を捕捉する性能を有するタンパク質をコードするその性能、固有の非組換えタンパク質に結合できる抗体の産生を誘発する性能、そのタンパク質の特性である細胞に酵素活性を与える性能、およびとりわけ受容細胞に対し非酵素的（しかし特異的な）機能を与える性能を実証することによって、特性を決定することができる。本発明のベクター中に組換えタンパク質を産生させるためには、かようなコーディング配列を、グルコースによって調節できる本発明のプロモーターに作動可能に連結することが好ましい。そのコーディング配列と本発明の作動可能に連結されたプロモーターとを受容体の真核細胞（好ましくは真菌の宿主細胞）内に、非複製DNA（もしくはRNA）すなわち非組込み分子として導入されると、コードされたタンパク質の発現は導入された配列の一過性（非安定）発現〔transient （ nonstable） expression〕によって起こる。コーディング配列は、DNA分子に組込むことが好ましく、例えば自律複製ができない閉環もしくは直鎖の分子好ましくは宿主の染色体に組込まれている直鎖分子に導入される。遺伝子が安定な形質転換体はベクター系または形質転換系で構築することができ、この場合、所望のDN Aは宿主の染色体に組込まれる。このような組込みは細胞内で新たに起こるかまたは所望のDNA自体を宿主の染色体中に機能的に挿入するベクターで形質転換を行うことによって促進される。本発明のプロモーターに作動可能に連結された、所望のタンパク質をコードする遺伝子は、一つのプラスミドを構築中に形質転換マーカー遺伝子によって配置され、次いで形質転換によって宿主細胞中に導入されるか、またはマーカー遺伝子は、コーディング配列の構築物とともに宿主細胞を同時形質転換する別の構築物上にある。ベクターの性質は宿主生物に依存している。本発明を実際に理解するため、線維状のトリコダーマの真菌をモデルに使用した。すなわち、トリコダーマの真菌および特にＴ．レセイに対しては、発現カセット（その転写と翻訳の調節要素に作動可能に連結されたコーディング配列）を宿主の染色体に組込むDN Aを有するベクターが好ましい。特定部位に対する染色体挿入をねらう必要はない。しかし、特定の遺伝子座への組込みは、特異的なコーディング配列もしくはフランキング配列を、この遺伝子座に適切な頻度で直接組込むのに充分な量で、組換え構造体に与えることによって達成することができる。その染色体に、導入DNAを安定に組込まれた細胞は、染色体中に発現ベクターを含有する宿主細胞を選択できるようにする一つ以上のマーカーを導入することによって選択され、例えばそのマーカーは殺生物剤耐性例えば抗生物質もしくは銅のような重金属類などに対する耐性を付与する。選択可能なマーカー遺伝子は、発現すべきDNA遺伝子配列に直接連結するか、または同時形質転換によって同じ細胞に導入することができる。特に本発明の宿主の形質転換に用いる遺伝子マーカーはamdsであり、これはアセトアミダーゼをコードするのでトリコダーマの真菌を唯一の窒素源としてのアセトアミド上で増殖させることができる。線維状真菌を形質転換するのに用いる選択可能なマーカーとしては、例えばアセトアミダーゼ（amds遺伝子）、ベノミル（benomyl)耐性、オリゴマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性、アミノグルコシド耐性、ブレオマイシン耐性、および栄養素要求体を有するマーカー、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（OCTアーゼもしくはargBの遺伝子）がある。このようなマーカーの使用については、Finkelstein D.B.ら編集“Biotechnology of Filamentous Fungi :Tech nology andProducts”，（1992年）6章、113〜156頁（米国、マサチュセッツ州、ストーンハム、Butterworth-Heinemann,publishers）に、Finkelstein D.B．が概説している。所望のタンパク質および／またはその活性誘導体を発現させるためには、適切な宿主が認識できる転写シグナルと翻訳シグナルが必要である。上記の方法によって好ましくは二本鎖形で得られたクローン化コーディング配列は、発現ベクター中の転写発現を制御する配列に作動可能に連結され、次いで原核もしくは真核の宿主細胞内に導入されて組換えタンパク質またはその機能誘導体を産生することができる。そのコーディング配列のどちらのストランドを、転写発現を制御する配列に作動可能に連結するかによって、アンチセンスRNAまたはその機能誘導体を発現することができる。異なる宿主でタンパク質を発現させると、タンパク質の特性を変化させる異なる翻訳後修飾が起こることがある。本発明では、タンパク質またはその機能誘導体の発現を真核細胞中、特に真菌中で行うことが好ましい。核酸分子例えばDNAは、転写調節情報が入っている発現制御配列をもっている場合ポリペプチドを“発現できる”といわれ、そしてこのような配列はそのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に“作動可能に連結されている”。作動可能な結合とは、配列の発現を調節配列の影響下もしくは制御下に置くような方式で、配列が単一（もしくは複数）の調節配列に接続される結合である。二つのＤＮＡ配列（例えばコーディング配列の５′ー端に連結されたコーディング配列とプロモーター領域配列）は次のような場合に作動可能に連結されているといわれる。すなわち、プロモーターの機能が誘発されると所望のタンパク質をコードするmRNAが転写される場合：ならびに二つのDNA配列間の結合の性質が、（１）クレームシフト突然変異を誘導しない、（２）タンパク質、アンチセンス RNAの発現を命令する発現調節配列の性能を妨害しない、または（３） DNA鋳型の転写される性能を妨害しない場合である。したがって、プロモーターがDNAの配列の転写を行うことができる場合、そのプロモーター領域はそのＤＮＡ配列に作動可能に連結されているのである。遺伝子発現を行うのに必要な調節領域の正確な性質は、種と細胞のタイプによって変わるが、一般に必要な場合、転写と翻訳それぞれの開始に関与する５′非転写配列と５′非翻訳配列（非コーディング配列）例えばTATAボックス、キャッピング配列、CAAT配列などを有し、これらの要素はプロモーター配列が本発明のプロモーターによって提供される場合に必要である。またこのような転写制御配列は、所望により、エンハンサー配列または上流のアクチベーター配列を有している。真菌のような真核宿主内でタンパク質を発現させるには、かような宿主内で機能する調節領域および好ましくは真菌の調節系を使う必要がある。宿主の性質によって、多種類の転写および翻訳の調節配列を利用することができる。これらの調節シグナルは、その生来の状態で、宿主細胞内で高レベルで発現できる特定の遺伝子に関連していることが好ましい。真核細胞において転写が翻訳に連結されていない場合、このような制御領域は、クローン化配列がイニシエーターのメチオニンを含有しているか否かによって、イニシエーターのメチオニン（AUG）コドンを与えても与えなくてもよい。このような領域は一般に、宿主細胞内でのRNAの合成開始を命令するのに充分なプロモーター領域を含有している。翻訳可能なmRNA産物をコードする線維状真菌の遺伝子由来のプロモーターが好ましく、そして特に、宿主細胞内でプロモーターとして作用する場合、協力なプロモーターを使用することができる。広く知られているように、真核mRNAの翻訳は最初のメチオニンをコードするコドンで開始される。そのため、真核プロモーターと、所望のタンパク質またはその機能誘導体をコードするDNA配列との結合部が、メチオニンをコードできる介在コドンを含有しないことを保証することが好ましい。このようなコドンが存在していると、融合タンパク質を生成する（AUGコドンがタンパク質をコードするD NA配列と同じ読み取り枠内にある場合）、またはフレームシフト突然変異（AUG コドンがタンパク質をコードする配列と同じ読み取り枠内にない場合）を起こす。タンパク質の（通常アミノ末端における）部分コーディング配列と、第二タンパク質の第二コーディング配列（部分もしくは完全な配列）とを含有する融合産物を構築することが望ましいことがある。上記の第一コーディング配列は、宿主細胞からタンパク質を分泌させるシグナル配列として機能してもしなくてもよい。例えば所望のタンパク質をコードする配列は、特定の宿主からタンパク質を分泌できるかまたは特定の宿主内でタンパク質の区画化を行うことができるシグナル配列に連結することができる。このような融合タンパク質配列は、所望のペプチド配列をその後に取り出し易いように、特異的なプロテアーゼ部位ありまたはなしで設計することができる。好ましい実施態様では、真菌タンパク質の固有のシグナル配列が用いられるか、またはそれに作動可能に連結されているペプチドの分泌を命令する性能を保持する上記配列の機能誘導体が使用される。アスペルギルス属（Aspergillus）の真菌のリーダー／分泌シグナル要素はトリコダーマ属の真菌内でも機能する。所望の場合、所望のタンパク質をコードする配列の３′側の非転写領域および／または非翻訳領域は、上記のクローン化法で得ることができる。この３′−非転写領域は、その転写終止調節配列要素に対してまたは真核細胞内でポリアデニル化反応を命令するそれら要素に対して保持できる。生来の発現制御配列のシグナルが宿主細胞内で充分に機能しない場合は、宿主細胞内で機能する配列で置換できる。本発明のベクターはさらに、一つ以上の宿主細胞内でベクターを維持するために抗生物質耐性または複製開始点を与えるDNA要素のような他の作動可能に連結された調節要素を含有していてもよい。特定のプラスミドまたはウイルスベクターを選択する場合の重要な因子としては、そのベクターを含有している受容細胞が認識されて、そのベクターを含有していない受容細胞から選択される容易さ；特定の宿主内で要望されるベクターのコピー数；および異なる種の宿主の細胞間でベクターをシャトルさせることができることが望ましいか否かがある。上記構築体を含有するベクターまたはDNA配列が発現させるために製造されたならば、そのDNA構築体は、形質転換法を含む各種の適切な方法によって、適切な宿主細胞に導入される。ベクターを導入した後、受容細胞を、ベクター含有細胞を選択増殖させる選択培地で増殖させる。この培地がグルコースを含有している場合、クローン化された遺伝子配列が発現されると、所望のタンパク質を産生するか、または所望の場合このタンパク質のフラグメントを産生する。この発現は、形質転換細胞内で連続方式で行うか、または例えば発現を誘発させることによって制御された方式で行うことができる。また真菌の形質転換は当該技術分野で公知の方法にしたがって行われる。例えば相同的組換え法を用い、真菌の宿主内に遺伝子を安定に挿入するかおよび／または宿主細胞の性能を破壊して特定のタンパク質を発現させる。本発明に用いる組換え宿主として有用な真菌としては、例えばトリコダーマ属とアスペルギルス属の種の真菌、クラビセプス・プルプレア（Claviceps purpur ea）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium Chrysogenum）、マグナポルテ・グリセア（Magnaporthe grisea）、ニユーロスポラ属（Neurospora）とマイコスフェレラ属（Mycosphaerella）の真菌、コレクトトリカム・トリフオリ（Co llectotrichum trifolii）、二形性真菌のヒストプラスミア・カプスラタム（Hi stoplasmia capsulatum）、ネクチア・ハエマトコカ（Nectia haematococca）（アナモルフ：フサリウム・ソラニ(Fisarium solani)f.sp.phaseoliおよびf.sp.p isi)、ウスチラゴ・ビオラセア（Ustilago violacea）、ウスチラゴ・マイジス（Ustilago maydis）、セファロスポリウム・アクレモニウム（Cephalosporium acremonium）、スギゾフイラム・コムネ（Schizophyllum commune）、ポドスポラ・アンセリナ（Podosporaanserina）、ソルダリア・マクロスポラ（Sordaria macrospora）、ムコル・シルシネロイデス（Mucor circinelloides）およびコレクトトリカム・カプシシ（Collectotrichum capsici）がある。これらの各真菌の形質転換法と選択法はすでに報告されている〔Finkelstein D.B.ら編゜“Biotechnology of F ilamentous Fungi ：Technology and Products” （1992年）第6章、113〜156 頁（米国、マサチューセッツ州、ストーンハム所在のButterworthーHeinemann p ublishers社発行）のFinkelstein D.B.の論文に概説されている〕。特に好ましい真菌は、トリコダーマ・レセイ、Ｔ．ハルジアナム（T.harzianum）、Ｔ．ロンギブラキアタム（T.longibrachiatum）、Ｔ．ビリデ（T.viride）、Ｔ．コニンギー（T.koningii）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillusnidulans ）、Ａ．ニガ（A.niger）、Ａ．テレウス（A.terreus）、Ａ．フィカム（A.ficu m）、Ａ．オリゼ（A.oryzae）、Ａ．アワモリ（A.awamori）およびニューロスポラ・クラッサ（Neurosporacrassa）である。本発明の宿主にはトリコダーマ属のすべての真菌が含まれるものとする。トリコダーマ属の真菌は相似性の形態学的証拠に基づいて分類される。Ｔ．レセイは以前、Ｔ．ビリデPers．またはＴ．コニンギーオウデム（T.koningii Oudem）として知られていたが、あるときＴ．ロンギブラキアタムのグループの別個の種として分類された。すべてのトリコダーマ属の種の真菌は、一般に、迅速に増殖するコロニーを生成し、ふさ状または膿庖状の繰り返し分枝した分生子柄を有し、この分生子柄にはフラスコ形のフィアリドとヒアリンまたは緑色の分生子が粘性頭部に生成している（Bissett,J.Can.J.Bot．，62巻、924〜931頁、1984年）。Ｔ．レセイと呼ばれている真菌は、菌株QM6aを起源とする遺伝ファミリーすなわち特定の分離菌株QM6aの単一核を起源とする共通の遺伝背景を有する菌株のファミリーとして明確に定義されている。これらの菌株だけがＴ．レセイと呼ばれている。形態学の方法による分類には問題があり、Ｔ．レセイとＴ．ロンギブラキアタムのセロビオヒドロラーゼ2（cbh2）遺伝子の最近刊行されたDNAフィンガー分析による分子データおよびハイブリッド形成のパターンは、これらの菌株の分化を明確に示している（Meyer，W．ら、Curr.Genet．，21巻、27〜30頁、1992年； M orawetz R．ら、Curr.Genet.,21巻、31〜36頁、1992年）。しかし、異なるトリコダーマ属の種の真菌間には分子レベルで相似性がある証拠があり、この証拠は、各種のトリコダーマ属の種の真菌が共有している巨大分子の構成要素の核酸およびアミノ酸の配列が保存されていることに見出される。例えば、Cheng,C．ら、Nucl.Acids.Res.,18巻、5559頁、1990年はＴ．ビリデのc bh1のヌクレオチド配列が開示さている。この遺伝子は、Ｔ．レセイの配列に基づいたプローブを用いて単離された。上記文献の著者はＴ．ビリデとＴ．レセイの遺伝子のアミノ酸配列間の相同性は95％であると報告している。Goldman,G.H ．ら、Nucl.Aids Res.,18巻、6717頁、1990年には、Ｔ．ビリデ由来のホスホグリセリン酸キナーゼ類のヌクレオチド配列が開示され、その推定アミノ酸配列は．Ｔ．レセイ由来のホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子との相同性が81％であると報告されている。したがって、Ｔ．ビリデとＴ．レセイに分類されている種は遺伝的に互いに非常に近いにちがいない。さらに、トリコダーマ属の種の真菌間には形質転換の条件に高度の相似性がある。実際に産業上重要なすべてのトリコダーマ属の種は以前に考案されたトリコダーマの区分のロングブラキアタムに見られるが、この区分に帰属されていないトリコダーマのいくつかの他の種がある。このような種としては例えばトリコダーマ・ハルジアナムがあり、この真菌は植物の病原体に対する生物防除剤として作用する。このトリコダーマ属の種の真菌に対する形質転換システムも開発されているが（He rrera-Estrella,A．ら、Molec．Macrobiol．，4巻、839〜843頁、1990年）、本願に教示したシステムとほとんど同じである。したがって、たとえトリコダーマ・ハルジアナムがロンギブラキアタムの区分に帰属されていなくても、形質転換を行う前にスフェロプラストを製造する際HerreraーEstrellaが用いた方法は同じでる。Herrera-Estrellaの教示は、本発明の形質転換システムがすべてのトリコダーマには機能しないは考えられる程、トリコダーマの種に有意な多様性はないことを示している。さらに、真菌の種の間には、真菌転写制御シグナルの共通のファンクショナリティ（functionality）がある。少なくとも三つのＡ．ニジュランスのプロモーターamdS，argBおよびgpdはＴ．レセイ内で遺伝子を発現させると報告されている。amdSとargBの場合、選択可能な表現型については遺伝子の一つもしくは二つのコピーだけで充分である（Penttilaら、Gene，61巻、155〜164頁、1987年）。 Gruber,F．ら、Curr.Genetic，18巻、71〜76頁、1990年にも、真菌の遺伝子は異なる種で発現することに成功することが多いと報告されている。それ故に、本発明で同定された、グルコースで調節されるプロモーターは他の真菌内でもグルコースによって調節可能であると考えられる。cbh1を除いて、グルコースで調節される本発明のプロモーターは、グルコースによって直接には調節されず、むしろグルコースの存在に関係なく機能すると解される。多数の種の真菌、特にトリコダーマ属の真菌は真菌のカルチャーコレクションをもっている広範囲の供給センターから入手できる。さらにトリコダーマ属の種の真菌は各種のデータベースのカタログに記載されている。これらの資源とデータベースは、D.B.Fingelstein編、“Bio chemistry of Filamentous Fungi：Thechnology and Products”1992年、3〜39 頁、（米国、マサチューセッツ州ストーンハム所在のButterworth-Heinemann社刊行）の0'Donnell，Kらの文献に要約されている。ベクターを導入し次いで形質転換体を選択した後、受容細胞は、ベクター含有細胞を選択して増殖させる選択培地で増殖させる。クローン化された遺伝子配列を発現させると、宿主細胞の培地の中に、所望の非相同もしくは相同のタンパク質を合成もしくは分泌するかまたは相同のタンパク質のフラグメントを産生する。好ましい実施態様では、そのコーディング配列はリグノセルロースを加水分解することができる酵素の配列である。このような配列の例としては次のような酵素をコードするDNA配列が挙げられる。すなわちセロビオヒドロラーゼＩ（CBHI ）、セロビオヒドロラーゼII（CBHII）、エンドグルカナーゼＩ（EGI）、エンドグルカナーゼII（EGII）、エンドグルカナーゼIII（EGIII）、β−グルコシダーゼ類、キシラナーゼ類（エンドキシラナーゼ類とβ−キシロシダーゼを含む）、側基切断活性体（例えばα−アラビノシダーゼ、α−Ｄ−グルクロニダーゼおよびアセチルエステラーゼ）、マンナナーゼ類、ペクチナーゼ類（例えばエンドーポリガラクツロナーゼ、エキソーポリガラクツロナーゼ、ペクチンエステラーゼ、またはペクチンとペクチン酸のリアーゼ）、ならびにリグニンポリマーを分解する酵素〔例えば、フェレビア・ラジアタ（Phlebia radiata）（Saloheimoら、 Gene,85巻、343〜351頁、1989年）もしくは他のリグニナーゼの遺伝子由来のリグニンペルオキシダーゼＬIII、ラカーゼ（laccase）またはMnペルオキシダーゼ（Aubertら編、“Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradatio，FEMS Symposium No.43”1988年315〜332頁、ロンドン、AcademicPress,Harcourt Brac e Jovanovitch Publishersの(17)Kirkの文献）〕をコードするDNA配列である。セルロース分解酵素の遺伝子のクローン化はすでに報告されており、最近概説がなされた（FinkelsteinD.B.ら編“Biotechnology of Filamentous Fungi :Techn ology andProducts”1992年、14章、417〜445頁（米国、マサチューセッツ州、ストーンハム所在のButterworth-Heinemann publishers刊行）のTeeri,T.T.の文献）。生来のセロビオヒドロラーゼCBHIの配列の遺伝子は、Shoemakerら（Sho emaker,S．ら、Bio/Technology，1巻、691〜696頁、1983年）およびTerriら（Te rriら、Bio／Technology，１巻、696〜699頁、1983年）がクローン化しており、その遺伝子の全ヌクレオチド配列は公知である（Shoemaker,S．ら、Bio/Technol ogy，１巻、691〜696頁、1983年）。またＴ．レセイから、主要なエンドグルカナーゼ（EGI）の遺伝子がクローン化され特性が決定された（Penttila,M．ら、G ene,45巻、253〜263頁、1986年；ヨーロッパ特許願第137,280号； Van Arstel,J .N.V．ら、Bio/Technology,5巻、60〜64頁）。その外の単離されたセルラーゼ遺伝子としては、cbh2（国際特許願WO第85/04672号；Chen,C.M．ら、Bio/Technolo gy，5巻、274〜278頁、1987年）およびegl３（Saloheimo,M.ら、Gene,63巻、1 1〜21頁、1988年）がある。Ｔ．レセイの二つのエンドーβ−キシラナーゼ類（x lnlとxln2）の遺伝子はすでにクローン化され、本願出願人の同時係属出願の米国特許第07/88,983号（1992年5月29日出願）に記載されている。これらキシラナーゼタンパク質は精製され特性が決定されている（Tenkanen,M．ら、Proceeding of the Xylans andXylanases Symposium，1991年、オランダ、ワーゲニンゲン）。発現されたタンパク質は、通常の条件例えば抽出、沈澱、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動などにしたがって宿主の培地から単離して精製することができる。例えば細胞を遠心分離によってまたは適切な緩衝液で集め、分解し、次いでタンパク質が例えばDEAE−セルロース、ホスホセルロース、ポリリボシチジル酸アガロース、ヒドロキシアパタイトのカラムクロマトグラフィー、または電気泳動法もしくは免疫沈澱法によって単離される。本発明を実施する方式および方法は、以下の実施例を参照することによって当該技術分野の当業者は一層充分に理解できる。しかしこれらの実施例は、本発明の適用範囲または本発明の特許請求の範囲の適用範囲を限定するものではない。実施例１グルコースで強力に発現されるトリコダーマレセイの遺伝子の単離グルコースで誘発されるmRNAを単離するため、トリコダーマレセイ菌株QM94 14（Mandels,M．ら、Appl.Microbiol．，21巻、152〜154頁、1971年）を、10ｌ発酵槽内のグルコース培地（グルコース60ｇ／ｌ、Bacto-Pepton ５ g／ｌ、酵母エキス１ｇ／ｌ、KH₂P0₄４ｇ／ｌ、（NH₄）₂S0₄ ４ｇ／ｌ、MgS0₄ 0.5ｇ／ｌ、CaCl₂ 0.5ｇ／ｌならびに痕跡の成分FeS0₄・7H₂0 5mg／ｌ、MnS0₄・ H₂01.6m g／ｌ、ZnS0₄・7H₂0 1.4mg／ｌおよびCoCl₂・6H₂0 3.7mg／ｌ、pH 5.0〜4.0）で増殖させた。グルコースの供給（465g/20h）は増殖開始30時間後に始めた。菌糸体を増殖45時間後に収穫し、次いでChirgwin J.M．ら、Biochem.J.,18巻、5294 〜5299頁、1979年の方法にしたがってRNAを単離した。ポリＡ＋RNAを、オリゴ（ dT）−セルロースクロマトグラフィーによって全RNAから単離し（Maniatis，T．ら、“Molecular Cloning:A Laboratory Manuar”Cold Spring Harbor Laboratory、米国，ニューヨーク州，コールドスプリングハーバー）、c DNAの合成とそのcDNAのクローン化は、λ-ZAPベクター中にメーカーの指示にしたがって実施した（ZAP-cDNA合成キット、Stratagene社）。得られたcDNAバンクをニトロセルロースフィルター上に移し、そのバンクが構築された同じポリＡ＋ RNAから合成された³²Ｐ標識化一本鎖cDNA（Teeri,T.T．ら、Anal.Biochem.,164巻、60〜67頁、1987年）を用いて選別した。この標識をつけたcDNAに、³²P−dCTP （Random Primed DNA Labeling Kit，Boehringer-Mannheim社）で再度標識を付けた。ハイブリッド形成条件は、Maniatis,T．ら、“Molecular Cloning:A Labo ratory Manuar,Cold SpringHarbor Laboratory、米国，ニューヨーク州，コールドスプリングハーバー、1982年に記載されているのと同じにした。最も強い陽性反応を示す50個のクローンを単離し、そのcDNAをメーカーの指示にしたがって、Bluescript SK（−）プラスミド中に生体内でサブクローン化した（ZAP-cDNA 合成キット、Stratagene社）。得られたクローンを同定し取出すために、これらクローンはすべて標準の方法を用いて３′末端から配列を決定した。そのcDNAλバンク中の各特定のクローンの頻度は、そのバンクを、クローンに特異的なPCRプローブとハイブリッドを形成させることによって求めた。５種の最高の頻度を示すクローンcDNA33,cDNA1,c DNA10，cDNA12,cDNA15は、全mRNAのプールの１〜３％であった。実施例２単離された、グルコースで発現されるトリコダーマの遺伝子とそのプロモーターの特性決定クローンcDNA33,cDNA1,cDNA10,cDNAl2およびcDNAl5のcDNAをプローブとして用いて、すでに製造されているトリコダーマの染色体のλバンク（Vanhanen,S．ら、Curr,Genet.,15巻、181〜186 頁、1989年）から対応する遺伝子とプロモーターを単離した。染色体λクローンについて実施した制限酵素消化のサザーン分析に基づいて、そのプロモーターおよび染色体遺伝子の５′部分または全遺伝子を、適切な制限酵素を用いてpSP73 ベクター（Promega社、米国，マディソン）中にサブクローン化し、クローンのc DNA33,cDNA1，cDNA10,cDNAl2およびcDNA15それぞれに対応する、プラスミドpTHN 1（図１）、pEA33（図２）、pTHN3（図３）、pEA10（図４）、pEA12（図５）およびpEA155（図６）を得た。先に得た配列から設計したプライマーを用いて、遺伝子の５′末端およびプロモーターから配列を得た。単離したプロモーターおよび遺伝子もしくはその一部の配列（cDNAもしくは染色体DNAから得た）を、cDNA3 3についてはSEQ ID1に、cDNA1についてはSEQ ID 2に、cDNA10についてはSEQ ID 3に、cDNA12についてはSEQ ID 4に、およびcDNA15についてはSEQ ID 5に示す。タンパク質データバンク内の公知の配列に対する配列類似性に基づいて、クローンcDNA33を翻訳延長因子、TEF1αとして定義することができた。実施例３トリコダーマ内でtef1−プロモーターのもとでEGI−コアを発現させるのに用いるベクターの構築 cbh1プロモーターと約700ntの長さのAvaIIターミネーターフ来のegl1cDNAのEcoRI- BamH Iフラグメントを保有するプラスミドpPLE3（図７）のegl1cDNA〔CSEQ ID 16および図７Ａ〕配列に対して内側に位置するXhoI＋DraI IIフラグメントを、プラスミドpEG131（Nitisinprasert,S.,Reports from Depar tment of Microbiology、ヘルシンキ大学、1990年）由来のcDNAのXhol- DraIII フラグメントで置換した。このＰPEGl3１挿入配列は、停止コドンがegll遺伝子のヒンジ領域の直前に構築されているegl1cDNAである。cbh１ターミネーター配列は図７Ｂ〔SEQ ID 23〕に示す。SEQ ID 23は短くしたcbh１ターミネーター配列でありSEQ ID 24に類似している（５′末端において30個のヌクレオチドを欠いている以外 “長い”cbh１ターミネーター）。 pPLE3はpUC18の骨格を有し、かつEcoRI部位に挿入されたcbh１プロモーターを保有している。このcbh１プロモーターは全長のegl1cDNAコーディング配列とcbh １転写ターミネーターに作動可能に連結されている。そのori遺伝子とamp遺伝子は細菌プラスミド由来のものである。得られたプラスミドpEM-3（図８）は、egllコア領域の後に転写停止コドンを有するegl1cDNAのコピーをもっている（EGIアミノ酸1〜22はEGIシグナル配列である； EGIアミノ酸23〜393は、Thrで終っているが“コア”配列とみなす）。次いでpEM-3をEcoRIとSphIで消化し、そのプラスミドの放出されたBluescribe M l3＋部分（Vector Cloning Systems社、米国，サンディエゴ）を、プラスミドp3 SR2（Hynes,M.J．ら、Mol.Cell.Biol., 3巻、1430〜1439頁、1983年；Ｔilburn,J ．ら、Gene、26巻、205〜221頁、1983年）由来の3.4kbのamdSフラグメントを含有するEcoRIと SphＩで消化したpAMD（図８）で置換した。こうして得られたプラスミドpEM-3A（図８）をEcoRIで消化し次いでKspＩで部分的に消化してcbh１プロモーターを有する2.3kbのフラグメントを放出させ、このプラスミドの残りの部分を保有する8.6kbのフラグメントをアガロースゲルで精製した。tef１プロモーター（SEQ ID1の塩基１〜1234）の配列データに基づいて、二つのプライマー（SEQ ID 6とSEQ ID 7）を設計し、PCR反応に使用して、tef1遺伝子の翻訳開始部位に隣接する１．２ｋｂのプロモーターフラグメントを単離した。５′プライマーは、 ACCGGAATTCATATCTAGAGGAGCCCGCGAGTTTGGATACGCC（SEQ ID 6）であり、そして３ ′プライマーは ACCGCCGCGGTTTGACGGTTTGTGTGATGTAGCG（SEQ ID 7）であった。５′プライマー中に太文字で示し下線を付けたGAATTCはEcoRI部位である。また５′プライマー中に太文字で示し下線を付けたTCTAGAはXbaＩ部位である。３′プライマー中に太文字で示し下線を付けたCCGCGGはSacII部位である。このフラグメントをEcoRIで消化し次いでKspIで部分的に消化し、アガロースゲルで精製し、8.6kbのpEM-3A フラグメントに連結してプラスミドpTHN100B（図９）を得た。この発現ベクターは、tef１プロモーターに作動可能に連結されたEGIコア構造要素をコードするDN Aを保有している。またこのプラスミドは、トリコダーマ属真菌の形質転換体を選択するのに用いるamdSマーカー遺伝子も保有している。実施例４トリコダーマ属真菌の形質転換、EGIコア産生クローンの精製およびその分析トリコダーマレセイ菌株QM9414を、6〜10μｇのプラスミドpTHN100Bを用い、Penttila,M．ら、Gene）61巻、155〜164頁、1987年に記載してあるのとほとんど同様にして形質転換した。得られたAmd⁺形質転換体を、アセトアミドを含有するスラント上に２ 1987年）。その後、Potato Dextrose agar（Difco社）上で増殖させた形質転換体で胞子懸濁液を作製した。５％グルコースで補充したを用いこれにグルコースを追加供給しながら（追加供給したグルコースの合計量は20％グルコース溶液６mlであった）50ml振盪フラスコで培養した培養物から、EGI特異的抗体を用いてスロットブロッティングを行うことによって、EGIコア産生について試験した。EGIコア産生クローンの胞子懸濁物を、Pota to Dextrose agarプレート上で単胞子培養物にまで精製した。EGIコアの産生は、先に述べたのと同様にして、これらの精製されたクローンから再び分析した（図１０）。実施例５グルコース上で増殖させたトリコダーマ属真菌が産生したEGIコアの特性決定 EGIコア産生菌株pTHN100B-16Cを、酵母エキスを除外しグルコースの供給量を5 55g／22hにしたことを除いて実施例１で先に記載したのと同様にして、10l発酵器内のグルコース培地中で増殖した。培養物の上澄み液を、遠心分離によって菌糸体から分離した。トリコダーマ属真菌がEGIコアを分泌することは、濃縮した培養上澄み液をSDS-PAGEで泳動させ次いでブロットされたフィルターをEGIコアに対して特異的なモノクローナル抗体で処理する通常の方法でウエスタンブロッティングを行うことによって確かめた（図１１と１２）。濃縮培養上澄み液および基質として3mMクロロニトロフェニルラクトシドを用い、次いで405nmの波長光の吸光度を測定することによる(Clayessens,M.ら、Biochem.J.,261巻、819〜825 頁、1989年）微量滴定プレート検定法で、その酵素活性が半定量的であることが分かった。実施例６ｃｂｈ１プロモーターの端を切取ったフラグメントによるβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターの構築ベクターpML016(図13)は、トリコダーマレセイの染色体遺伝子バンクから単離された、５′末端でEcoRI部位から始まる2.3kbのcbh1プロモーターフラグメント（SEQ ID 18、図13Ａ）（Teeri,T.ら、J.Bio／Technology、１巻、696〜699頁、1983年）；プラスミドpAN924-21由来のlacZ遺伝子の3.lkbの BamHIフラグメント（van Gorcomら、Gene、40巻、99〜106頁、1985年）；および翻訳停止コドンから84bp上流から始まり３′末端のBamHI部位まで延びる1.6kbの cbh1ターミネーター（図l3Ｂ、SEQ ID 24）（Shoemaker,S．ら、Bio／Technol ogy、１巻、691〜696頁、1983年； Teeri,T.ら、Bio／Technology、１巻、696〜 699頁、1983年）を含有している。これらの断片を、pBR322の2.3kb長のEcoRI- P vuII領域に連結して（Sutcliffe,J.G.,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.,4 3巻、77〜90頁、1979年）図13に示す結合部を生成させた。2.3kbのcbh1プロモーターと3.1kbのlacZ遺伝子との間の正確なインフレーム結合部（in frame joint ）を図１３に示すオリゴを用いて構築した。プロモーターを欠失させるため、図 13に示すポリリンカーをcbh1プロモーター内の単一の内部XbaI部位にクローン化した。SalIと SphIによる制限消化によって発現カセットをベクターから放出させることができるように、図13に示す短いSalIリンカーを、pBR322のフラグメントとcbh1プロモーターのフラグメントとの間の結合部にクローン化した。ベクターをKpnIおよびXhoIで切断し、Erase-A-Base System（Promega社、米国，マディソン）をメーカーの指示にしたがって用いることによって、進行的一方向性欠失（progressive unidirectional deletion）をcbh1プロモーターに導入した。異なる欠失時間の時点で得たプラスミドを用いて、Hanahan,D.,J.Mol.Biol.,166巻、557〜580頁、1983年に記載の方法によってイー・コリ菌株DH5α（BRL社）を形質転換し、その欠失末端部を標準の方法を用いることによって配列を決定した。実施例７トリコダーマ属真菌の形質転換、β−ガラクトシダーゼ産生クローンの単離およびそれらクローンの分析 2.3kbの無傷のcbh 1プロモーターまたはその端を切り取られた変形物を含有する、β−ガラクトシダーゼの発現ベクター（実施例６に説明したようにして調製した）で、トリコダーマレセイの菌株QM9414を形質転換した。20μｇのプラスミドをSalIと SphIで消化してベクターから発現カセットを放出させ、これらの混合物と、アセトアミダーゼ遺伝子を含有する３μｇのプラスミドp3SR2(Hynes, M.J.ら、Mol.Cell.Biol., ３巻、1430〜1439頁、1983年)とを用いて、トリコダーマ属の真菌を同時形質転換した。この形質転換法はいる方法であった。そしてAmd⁺形質転換体を、実施例４にすでに述べたのと同じようにして選別した。Amd⁺形質転換体のβ−ガラクトシダーゼ産生については、２％グルコース、２％フルクトースおよび0.2％ペプトンを補充しpHを７に調節した固体最少培地いる微量滴定プレートのウエル上に胞子懸濁液を接種することによって試験した。２８℃で２４ｈインキュベートした後、色原体の基質X-gal（20mg／ml）を10 μｌづつ各ウエルに添加し、ブルー色が生じたときβ−ガラクトシダーゼ活性の表示とみなした。プロモーターの内部ポリリンカーから始まって翻訳開始部位の前の385bpの位置で終わるcbh1プロモーター中の1110bpの欠失（図15）があるプラスミドpML016de15（11）（図14）で形質転換した形質転換体には濃いブルー色が検出できた。この端を切り取られたプロモーターの配列をSEQ ID 19（図15Ａ）として示す。実施例８グルコースによって抑制を解除されたｃｂｈ１プロモーターによる、グルコース上でのCBHIの産生グルコース上でCBHIを産生させるため、発現プラスミドpML017（図16）を構築した。プラスミドpML016de15(11)を、酵素のKsp I（認識配列の最初のヌクレオチドはATGから−16の位置にある）とXma I （認識配列の最初のヌクレオチドは cbh1遺伝子の翻訳停止コドンから下流へ76個のヌクレオチドの位置にある）で消化した。短くしたcbh1プロモーターを含有するベクター部分、cbh1のターミネーターおよびpBR322の配列を、トリコダーマレセイの染色体遺伝子バンク（Teer i,T.ら、Bio／Technology、１巻、696〜699頁、1983年）からKspI- Xma Iフラグメントとして単離した染色体cbh1遺伝子に連結した。このフラグメントの配列は図16Ａ（〔SEQ ID 17〕）に下線を付けた部分として示す。プラスミドpML017でトリコダーマレセイ菌株QM9414を形質転換し、次いでAmd⁺形質転換体をすでに実施例７で述べたのと同様にして選別し 61巻、155〜164頁、1987年）を用い追加のグルコースの供給（供給グルコースの合計量は6mg／200μｌ培養物であった）を行いながら実施した微量滴定プレート培養（200μｌ、３日間）によって、40個の形質転換体からのCBHIの産生について試験した。培養物の上澄み液をニトロセルロースのフィルター上にスロットブロットを行い、次いでCBHIを特異的な抗体で検出した。最高にCBHIを産生する10 個の形質転換体の胞子懸濁液を、アセトアミドとTriton X-100を Gene）61巻、155〜164頁、1987年）。先に述べたのと同じ培地で実施して振盪フラスコ培養（50ml；６日間）で、30個の単胞子培養物をCBHI産生について試験した。供給グルコースの合計量は1.8g／50ml培養物であった。培養上澄み液を希釈した液のスロットブロットを行い次いでCBHIを特異的な抗体で検出した（図17）。実施例９ cbh1プロモーター内に、グルコースの抑制を解除する特異的な突然変更を有する β−ガラクトシダーゼ発現ベクターサッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）のグルコースレプレッサータンパク質MIG1の結合部位に類似していることが見出されたcbh1プロモーター中の３個の6bp配列（NehlinおよびRonne,EMBO J.,9巻、2891〜2899頁、19 90年； Nehlinら、EMBO J.,10巻、3373〜3377頁、1991年）を、トリコダーマレセイの固有のcbh1プロモーターのグルコース抑制作用を仲介するこれらのおはじき石（mig）様配列の機能を試験するため、他のヌクレオチドに変更した。特異的な突然変異を保有するcbh1プロモーターを有するβ−ガラクトシダーゼ発現ベクターを構築するためにプライマー内の配列を変更した。具体的に述べると次のとおりである。 TCT TCA AGA ATT GCT CGA CCA ATT CTC ACG GTG AAT GTA GG (SEQID 8);ACA CAT CTA GAG GTG ACC TAG GCA TTC TGG CCA CTA GATATA TAT TTA GAA GGT TCT TGT AGC TCA AAA GAG C(SEQ ID 9)；GGG AAT TCT CTA GAA ACG CGT TGG CAA ATT ACG GTA CG (SEQ ID10);GGG AAT TCG GTC ACC TCT AAA TGT GTA ATT TGC CTG CTT G ACC(SEQ ID 11);GGG AAT TCG GTC ACC TCT AAA TGT GTA ATT TGCCTG CTT GAC CG A TCT AAA CTG TTC GAA GCC CGA ATG TAG G(SEQID 12);GGG AAT TCT TCT AGA TT G CAG AAG CAC GGC AAA GCC CACTTA CCC(SEQ ID 13);TAG CGA ATT CTA GGT CAC CTC TAA AGG TACCCT GCA GCT CGA GCT AG(SEQ ID 14);およびGGG AAT TCA TGA T GCGCA GTC CGC GG(SEQ ID 15)。これらのプライマーはcbh1プロモーターとcbh1プロモーターの内部ポリリンカーとに対して特異的であったので、クローン化する場合のcbh1プロモーター配列のPCR増幅に利用した。 pML016（図13）を、PCR鋳型として用い適切なプライマーによって、−1500位のポリリンカーに始まりATGの上流−720で終わる770bp のフラグメントＡ（プライマー：TAG CGA ATT CTA GGT CACCTC TAA AGG TAC CCT GCA GCT CGA GCT AG （SEQ ID 14）およびGGGAAT TCT CTA GAA ACG CGT TGG CAA ATT ACG GTA CG(S EQ ID 10)）、ならびに−720位に始まり16位のKspI部位で終わる720bpのフラグメントＢ（プライマー：GGG AAT TCT TCT AGA TTG CAG AAG CACGGC AAA GCC CAC TTA CCC（SEQ ID 13）およびGGG AAT TCA TGA TGCGCA GTC CGC GG(SEQ ID 15) ）を得た。フラグメントＡとフラグメントＢをアガロースゲルで精製し、それぞれBstEII−Xba IおよびXbaI− Ksp Iで消化し、pML016の7.8kbのフラグメントに連結してpMI-24を製造した。得られたcbh 1プロモーターは、無傷のcbh 1プロモーターの翻訳開始コドンの上流−720〜−715位に配列変更がある（図18）（ゲノム配列：５′GTGGGG、変更後の配列：５′TCTAGA）。pMI-24の変更後のcbh1プロモーターの配列を図18Ａと SEQ ID 20に示す。プロモーターの内部ポリリンカーから始まり翻訳開始部位の前の1025bpで終わる460bpの欠失をcbh1プロモーター内に有するpML016del0(2)（図19）を実施例６に記載されているのと同様にして構築し、次いでこのpML016de10(2)を、PCR鋳型として用い、プライマー：TCT TCA AGA ATT GCT CGA CCA ATT CTC ACG GTG AAT GTAGG(SEQ ID 8)およびACA CAT CTA GAG GTG ACC TAG GCA TTC TGGCCA CTA GAT ATA TAT TTA GAA GGT TCT TGT AGC TCA AAA GAG C(SEQ ID 9)によって、cbh1プロモーターの５′末端から始まりそのプロモーターの内部ポリリンカーで終わる800bpのフラグメントＣを得た。フラグメントＣをアガロースゲルで精製し、SalI−XbaIで消化し次いでpML016de10 (2)の7.6kbのSalI- XbaIフラグメントに連結してpMI-25を製造した。pMI-25のcb hIプロモーターには、無傷のcbhIプロモーターの翻訳開始コドンの上流−1505− 1500の位置に配列の変更がある（図18）（ゲノム配列：５′ GTGGGG、変更後の配列：５′ TCTAAA）。 pML016de10(2)をＰＣＲ鋳型として用い、プロモーターの内部ポリリンカーから始まり−16位のKsp I部位で終わる750bpのフラグメントＤを得た（プライマーとしてはGGG AAT TCG GTC ACC TCT AAATGT GTA ATT TGC CTG CTT GAC CGA TCT A AA CTG TTC GAA GCC CGAATG TAG G(SEQ ID 12)およびGGG AAT TCA TGA TGC GCA GTC CGCGG(SEQ ID 15)を使用した〕。フラグメントＤをアガロースゲルで精製し、BstEII− KspIで消化し、次いでpMI-25の7.8kbのBstEIIKspIフラグメントに連結してpMI-26を製造した。pMI-26のcbh1プロモーターには配列変更がある。すなわち無傷のcbh1プロモーターの翻訳開始コドンの上流−1505−1500位（ゲノム配列：５′ GTGGGG、変更後の配列：５′TCTAAA）および同上流の−1001−996位（ゲノム配列：５′ CTGGGG、変更後の配列：５′ TCTAAA）に配列変更がある（図 18）。 pML016de10(2)をPCR鋳型として用い、プライマー：GGG AAT TCTCTA GAA ACG C GT TGG CAA ATT ACG GTA CG(SEQ ID 10)およびGGGAAT TCG GTC ACC TCT AAA TGT GTA ATT TGC CTG CTT GAC C(SEQID 11)によって、プロモーターの内部ポリリンカーから始まり−７２０位で終わる280bpのフラグメントＥを得、およびプライマー：GGGAAT TCT TCT AGA TTG CAG AAG CAC GGC AAA GCC CAC TTA CCC(SEQID 1 3)およびGGG AAT TCA TGA TGC GCA GTC CGC GG(SEQ ID 15)によって、−720位に始まり−16位のKsp I部位で終わる720bpのフラグメントＦを得た。フラグメントＤとＥをアガロースゲルで精製し、それぞれBstEII- Xba I およびXbaI- KspIで消化し、pMI-25の7.8kbのBstEII− KspIフラグメントに連結してpMI-27を製造した。pMI-27のcbh1プロモーターには、無傷のcbh1プロモーターの翻訳開始コドンの上流の、−1505−1500位（ゲノム配列：５′GTGGGG、変更後の配列：５′ TCTAAA）および−720−715位（ゲノム配列：５′ GTGGGG、変更後の配列：５′ TCTAGA）に配列変更がある（図18）。 pMI-27の変更後のcbh1プロモーターの配列を図18ＣとSEQ ID 21に示す。 pML016de10(2)をPCR鋳型として用い、プライマー：GGG AAT TCTCTA GAA ACG C GT TGG CAA ATT ACG GTA CG(SEQ ID 10)およびGGGAAT TCG GTC ACC TCT AAA TGT GTA ATT TGC CTG CTT GAC CGA TCTAAA CTG TTC GAA GCC CGA ATG TAG G(SEQ ID 12)によって、プロモーターの内部ポリリンカーから始まり−720位で終わる280 bpのフラグメントＧを得、およびプライマー：GGG AAT TCT TCT AGA TTGCAG AAG CAC GGC AAA GCC CAC TTA CCC(SEQ ID 13)およびGGG AATTCA TGA TGC GCA GTC CGC GG(SEQ ID 15)によって、−720位で始まり−16位のKspI部位に終わる720bp のフラグメントＨを得た。フラグメントＧとＨをアガロースゲルで精製し、それぞれBstEII−XbaIおよびXbaI− KspIで消化し次いでpMI-25の 7.8kbのBstEIIKs pIフラグメントに連結してpMI-28を得た。pMI-28のcbh1プロモーターには次のような配列変更がある。すなわち無傷のcbh 1プロモーターの翻訳開始コドンの上流の、−1505−1500位（ゲノム配列：５′ GTGGGG、変更後の配列：５′ TCTAAA ）、−1001−996位（ゲノム配列：５′ CTGGGG、変更後の配列：５′ TCTAAA）、および −720 −715位（ゲノム配列：５′ GTGGGG、変更後の配列：５′ TCTAGA）に配列変更がある（図18）。pMI-28の変更後のcbh1プロモーターの配列を図18ＣとSE Q ID 22に示す。 PCRで増幅したDNAフラグメントおよび連結部をすべて標準の方法で配列を決定して、突然変異が存在し、他のヌクレオチドは全く変化してないことを確認した。トリコダーマレセイQM9414の上記ベクターによる形質転換、β−ガラクトシダーゼ産生クローンの単離およびそれらクローンの分析を実施例７に記載されているのと同様にして行った。プラスミドpMI-24，pMI-27およびpMI-28で形質転換した形質転換体をグルコースで増殖させて得たコロニーに、X-galを添加した後、β−ガラクトシダーゼ活性の指標として濃いブルー色が検出された（図20）。このことは、上記の突然変異でcbh1プロモーターを変更すると、グルコースの存在下そのcbh1プロモーターのもとでトリコダーマ属真菌内でタンパク質を充分に発現させることができることを示している。配列の列挙（１）一般情報：（ｉ）出願者：（Ａ）名称：ALKO Ltd （Ｂ）通り：Salmisaarenranta 7H （Ｃ）町：ヘルシンキ（Ｄ）国：フィンランド（Ｅ）郵便番号：FIN-00180 （ii）発明の名称：グルコースの存在下で活性的な真菌プロモーター（iii）配列の数：28 （iv）通信住所：（Ａ）住所：ALKO Ltd Law Department／Patents （Ｂ）郵便住所：P.O.Box 350 （Ｃ）町：ヘルシンキ（Ｄ）国：フィンランド（Ｅ）郵便番号：FIN-00101 （ｖ）先出願日：（Ａ）出願番号：US 07／932,485 （Ｂ）出願日：19-AUG-1992 （vi）電信情報：（Ａ）電話：358-0-13311 （Ｂ）テレファックス：358-0-1333346 （２）配列番号１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：3461個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号１：（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1636個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号２：（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：2868個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号３：（２）配列番号４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：2175個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号４：（２）配列番号５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：2737個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号５：（２）配列番号６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：43個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号６：（２）配列番号７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：34個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号７：（２）配列番号８についての情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ：41個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号８：（２）配列番号９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：73個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号９：（２）配列番号10についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：38個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号10：（２）配列番号11についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：43個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数．一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号11：（２）配列番号12についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：73個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号12：（２）配列番号13についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：45個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号13：（２）配列番号14についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：47個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号14：（２）配列番号15についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：26個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号15：（２）配列番号16についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1588個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号16：（２）配列番号17についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1820個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号17：（２）配列番号18についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：2211個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号18：（２）配列番号19についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1137個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号19：（２）配列番号20についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：2261個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号20：（２）配列番号21についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1776個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号21：（２）配列番号22についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1776個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号22：（２）配列番号23についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：745個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号23：（２）配列番号24についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1627個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号24：（２）配列番号25についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：91個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（２）配列番号26についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：97個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ix）特徴：（Ａ）名称／キー：CDS （Ｂ）位置：18..95 （xi）配列：配列番号26：（２）配列番号27についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：26個のアミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列：配列番号27：（２）配列番号28についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：15個の塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（xi）配列：配列番号28：

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９４年１０月２０日【補正内容】請求の範囲１．所望する環境条件下で活性的であるプロモーターをクローニングするための方法であって：ａ．前記環境条件、好ましくはグルコース含有培地に糸状菌宿主、好ましくはトリコダーマ宿主を暴露し；ｂ．前記宿主からmRNAを抽出し；ｃ．前記mRNAからcDNAバンクを調製し；ｄ．前記cDNAのサンプルを検出可能的にラベリングし；ｅ．前記cDNAバンクに前記ラベルされたcDNAをハイブリダイズし；ｆ．前記ハイブリダイゼーションの強度に基づいて段階（ｅ）のハイブリダイゼーションからクローンを選択し；ｇ．前記選択されたクローンの個々のためのクローン特異的プローブを用いて、段階（ｆ）からの前記選択されたクローンの個々の段階（ｃ）のcDNAバンクにおける相対量を決定し；ｈ．段階（ｆ）で決定されたような最とも豊富なcDNA及び段階（ｇ）で決定されたような豊富なcDNAを含むそれらのクローンを同定し；そしてｉ．前記環境条件下で対応するmRNAの発現を担当する宿主プロモーターを同定し、そしてクローン化するために段階（ｈ）のクローンのクローン化された挿入体を用いることを含んで成る方法。２．前記糸状菌宿主がＴ．レセイである請求の範囲第１項記載の方法。３．真菌宿主、好ましくはグルコース上で増殖されたトリコダーマ宿主において操作可能的に連結されるコード配列を発現できる単離されたプロモーター。４．前記プロモーターが：ａ．前記環境条件、好ましくはグルコース含有培地に糸状菌宿主、好ましくはトリコダーマ宿主を暴露し；ｂ．前記宿主からmRNAを抽出し；ｃ．前記mRNAからcDNAバンクを調製し；ｄ．前記cDNAのサンプルを検出可能的にラベリングし；ｅ．前記cDNAバンクに前記ラベルされたcDNAをハイブリダイズし；ｆ．前記ハイブリダイゼーションの強度に基づいて段階（ｅ）のハイブリダイゼーションからクローンを選択し；ｇ．前記選択されたクローンの個々のためのクローン特異的プローブを用いて、段階（ｆ）からの前記選択されたクローンの個々の段階（ｃ）のcDNAバンクにおける相対量を決定し；ｈ．段階（ｆ）で決定されたような最とも豊富なcDNA及び段階（ｇ）で決定されたような豊富なcDNAを含むそれらのクローンを同定し；そしてｉ．前記環境条件下で対応するmRNAの発現を担当する宿主プロモーターを同定し、そしてクローン化するために段階（ｈ）のクローンのクローン化された挿入体を用いることを含んで成る方法によりクローン化される請求の範囲第３項記載のプロモーター。５．前記糸状菌宿主がＴ．レセイである請求の範囲第４項記載のプロモーター。６．前記プロモーターがtef1プロモーターである請求の範囲第５項記載のプロモーター。７．前記tef1プロモーターが、配列番号１の翻訳開始部位に隣接する1.2kbの配列のプロモーター要素を含む請求の範囲第６項記載のプロモーター。８．前記プロモーターが配列番号２のプロモーターである請求の範囲第５項記載のプロモーター。９．前記プロモーターが配列番号３のプロモーターである請求の範囲第５項記載のプロモーター。 10．前記プロモーターが配列番号４のプロモーターである請求の範囲第５項記載のプロモーター。 11．前記プロモーターが配列番号５のプロモーターである請求の範囲第５項記載のプロモーター。 12．前記プロモーターが配列番号６のプロモーターである請求の範囲第５項記載のプロモーター。 13．前記プロモーターが変更されたcbh1プロモーターであり、そのような変更が前記cbh1プロモーターを抑制するグルコースの能力を低める請求の範囲第３項記載のプロモーター。 14．前記生来のcbh1プロモーターがほぼ位置−720〜−715で変更された mig様配列を有する請求の範囲第13項記載のプロモータ。 15．前記 mig様配列が５′−GTGGGGである請求の範囲第14項記載のプロモーター。 16．前記変更された mig様配列が５′−TCTAGAである請求の範囲第14項記載のプロモーター。 17．前記プロモーターがpMI-24のcbh1プロモーターである請求の範囲第16項記載のプロモーター。 18．前記生来のcbh1プロモーターが、位置−1505〜−1500で配列TCTAAA及び位置−720〜−715で配列TCTAGAを有する請求の範囲第13項記載のプロモーター。 19．前記生来のcbh1プロモーターが、位置−1505〜−1500で配列TCTAAA及び位置−1001〜−996で配列TCTAAA及び位置−720〜 −715で配列TCTAGAを有する請求の範囲第14項記載のプロモーター。 20．前記プロモーターが、pML016de15(11)，pMI-24，pMI-27，pMI-28,pML016d e1 (11)、配列番号19、配列番号20、配列番号21及び配列番号22から成る群のcbh 1プロモーターから選択される請求の範囲第３項記載のプロモーター。 21．プロモーターを含んで成るベクターシステムにより形質転換された糸状菌宿主、好ましくはトリコダーマ宿主の助けによりグルコースを含む培地上でタンパク質を生成するためへの請求の範囲第３〜20のいづれか１項記載のプロモーターの使用。 22．タンパク質の生成方法であって、請求の範囲第３〜20のいづれか１項のプロモーターを含んで成るベクターシステムによりトリコダーマ宿主を形質転換し、そして前記形質転換された宿主細胞をグルコースの存在下で増殖し、そして前記発酵された増殖培地又は上清液から前記宿主細胞を分離することを特徴とする方法。 23．タンパク質（酵素）組成物であって：ａ．請求の範囲第３〜20のいづれか１項記載のプロモーターを含むベクターシステムにより形質転換されたトリコダーマ宿主細胞を増殖し；ｂ．前記増殖培地から宿主細胞（菌糸体）を分離し；そしてｃ．グルコース含有増殖培地の発酵された上清液にトリコダーマ起原のタンパク質（酵素）を含んで成る、前記タンパク質（酵素）組成物におけるタンパク質（酵素）の源として段階（ｂ）からの前記増殖培地を用いることを含んで成る方法により生成される組成物。 24．請求の範囲第３〜20のいづれか１項記載のプロモーターを含むベクターシステムにより形質転換され、そして増殖培地の上清液におけるグルコース含有培地において増殖されたトリコダーマ宿主から得られるタンパク質を、グルコース含有増殖培地の発酵された上清液に含んで成るタンパク質組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:885） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＤＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ (72)発明者イルメン，マルヤハンネレフィンランド国，エフアイエヌ―00320 ヘルシンキ，セルヤティエ１エー 19 (72)発明者ネバライネン，カイスミルジャヘレナオーストラリア国，ニューサウスウェールズ 2121，ノースエッピング，マルトンロード 13／269―271 (72)発明者ペンティレ，メルヤエリサフィンランド国，エフアイエヌ―00390 ヘルシンキ，ベヘントゥバンティエ９エー６

Claims

【特許請求の範囲】１．所望する環境条件下で活性的であるプロモーターをクローニングするための方法であって：ａ．前記環境条件下に宿主を暴露し：ｂ．前記宿主からmRNAを抽出し；ｃ．前記mRNAからcDNAバンクを調製し；ｄ．前記cDNAのサンプルを検出可能的にラベリングし；ｅ．前記cDNAバンクに前記ラベルされたcDNAをハイブリダイズし；ｆ．前記ハイブリダイゼーションの強度に基づいて段階（ｅ）のハイブリダイゼーションからクローンを選択し；ｇ．前記段階（ｃ）のcDNAバンクにおける前記選択されたクローンの相対量を決定し；ｈ．前記段階（ｇ）の最とも豊富なクローンを同定し：そしてｉ．前記環境条件下で対応するmRNAの発現を担当する宿主プロモーターを同定し、そしてクローン化するために前記段階（ｈ）のクローンの挿入体を用いることを含んで成る方法。２．前記条件がグルコース含有培地における増殖である請求の範囲第１項記載の方法。３．前記宿主が糸状菌である請求の範囲第１項記載の方法。４．前記宿主が、トリコダーマ(Trichoderma)、アスペルギラス(Aspergillus) 、クラビセプスプルプレア(Claviceps purpurea)、ペニシリウムクリソゲナム(Penicillum chrysogenum)、マグナポルテグリセア(Magnaporthe grisea)、ニューロスポラ(Neurospora)、マイコスファエレラspp.(Mycosphaerella spp.) 、コレクトトリカムトリフォリ（Collectotrichum trifolii）、二形態性カビヒストプラスミアカプスラタム（Histoplasmiacapsulatum）、ネクチアハエマトコカ(Nectia haematococca)(アナモルフ：フサリウムソラニ f ．sp．ファセオリ(Fusarium solanif．sp．phaseoli)及びf．sp．ピシ(f．sp．p isi)）、ウスチラゴビオラセア(Ustilago violacea)、ウスチラゴマイジス(Us tilagomaydis)、セファロスポリウムアクレモニウム（Cephalosporiumacremon ium）、スキゾフィラムコムネ(Schizophyllum commune)、ポドスポラアンセリナ（Podospora anserina）、ソルダリアマクロスポラ(Sordaria macrospora )、ムコルシルシネロイデス(Mucor circinelloides)及びコレクトトリカムカプシシ(Collectotrichum capsici)から成る群から選択される請求の範囲第１項記載の方法。５．前記宿主がトリコダーマである請求の範囲第４項記載の方法。６．前記宿主がＴ．レセイである請求の範囲第５項記載の方法。７．グルコース上で増殖されるカビ宿主において操作可能的に連結されたコード配列を発現できる単離されたプロモーター。８．前記プロモーターが：ａ．前記環境条件下に宿主を暴露し：ｂ．前記宿主からmRNAを抽出し；ｃ．前記mRNAの第１サンプルからcDNAバンクを調製し；ｄ．前記cDNAのサンプルを検出可能的にラベリングし；ｅ．前記cDNAバンクに前記ラベルされたcDNAをハイブリダイズし；ｆ．前記ハイブリダイゼーションの強度に基づいて段階（ｅ）のハイブリダイゼーションからクローンを選択し；ｇ．前記段階（ｃ）のcDNAバンクにおける前記選択されたクローンの相対量を決定し；ｈ．前記段階（ｇ）の最とも豊富クローンを同定し；そしてｉ．前記環境条件下で対応するmRNAの発現を担当する宿主プロモーターを同定し、そしてクローン化するために前記段階（ｈ）のクローンの挿入体を用いることを含んで成る方法によりクローン化される請求の範囲第７項記載のプロモーター。９．前記宿主が糸状菌である請求の範囲第７項記載のプロモーター。 10．前記宿主が、トリコダーマ(Trichoderma)、アスペルギラス(Aspergillus) 、クラビセプスプルプレア(Claviceps purpurea)、ペニシリウムクリソゲナム（Penicillum chrysogenum）、マグナポルテグリセア（Magnaporthe grisea ）、ニューロスポラ(Neurospora)、マイコスファエレラ spp.(Mycosphaerella s pp.)、コレクトトリカムトリフォリ（Collectotrichum trifolii）、二形態性カビヒストプラスミアカプスラタム（Histoplasmiacapsulatum）、ネクチアハエマトコカ(Nectia haematococca)(アナモルフ：フサリウムソラニ f．sp．ファセオリ(Fusarium solanif．sp．phaseoli)及びf．sp．ピシ(f．sp．pisi)) 、ウスチラゴビオラセア(Ustilago violacea)、ウスチラゴマイジス(Ustilago maydis)、セファロスポリウムアクレモニウム（Cephalosporiumacremonium）、スキゾフィラムコムネ(Schizophyllum commune)、ポドスポラアンセリナ（Podospora anserina）、ソルダリアマクロスポラ(Sordaria macrospora)、ムコルシルシネロイデス(Mucor circinelloides)及びコレクトトリカムカプシシ(Collectotrichum capsici)から成る群から選択される請求の範囲第９項記載のプロモーター。 11．前記宿主がトリコダーマである請求の範囲第10項記載のプロモーター。 12．前記宿主が、Ｔ．レセイ、Ｔ．ハルジアナム(T．harzianum)、Ｔ．ロンジブラキアタム（T．longibrachiatum）、Ｔ．ビリデ（T．viride）及びＴ．コニンジ(T．koningii)から成る群から選択される請求の範囲第11項記載のプロモーター。 13．前記宿主がＴ．レセイである請求の範囲第１２項記載のプロモーター。 14．前記プロモーターがtef１プロモーターである請求の範囲第13項記載のプロモーター。 15．前記tef１プロモーターが、配列番号１の翻訳開始部位に隣接する1.2kbの配列のプロモーター要素を含む請求の範囲第14項記載のプロモーター。 16．前記プロモーターが配列番号２のプロモーターである請求の範囲第１３項記載のプロモーター。 17．前記プロモーターが配列番号３のプロモーターである請求の範囲第13項記載のプロモーター。 18．前記プロモーターが配列番号４のプロモーターである請求の範囲第13項記載のプロモーター。 19．前記プロモーターが配列番号５のプロモーターである請求の範囲第13項記載のプロモーター。 20．前記プロモーターが配列番号６のプロモーターである請求の範囲第13項記載のプロモーター。 21．前記プロモーターが変更されたcbh１プロモーターであり、そのような変更が前記cbh１プロモーターを抑制するグルコースの能力を低める請求の範囲第７項記載のプロモーター。 22．前記生来のcbh１プロモーターがほぼ位置−７２０〜−７１５で変更されたmig様配列を有する請求の範囲第２１項記載のプロモーター。 23．前記mig様配列が５′−GTGGGGである請求の範囲第22項記載のプロモーター。 24．前記変更されたmig様配列が５′−TCTAGAである請求の範囲第22項記載のプロモーター。 25．前記プロモーターがpMI-24のcbh１プロモーターである請求の範囲第24項記載のプロモーター。 26．前記生来のcbh１プロモーターが、位置1505−1500で配列TCTAAA及び位置 −720〜−715で配列TCTAGAを有する請求の範囲第21項記載のプロモーター。 27．前記生来のcbh１プロモーターが、位置−1505〜−1500で配列TCTAAA及び位置−1001〜−996で配列TCTAAA及び位置−720〜−715で配列TCTAGAを有する請求の範囲第22項記載のプロモーター。 28．前記プロモーターが、pML016de15(11)，pMI-24，pMI-27，pMI-28，pML016 de15(11)、配列番号19、配列番号20、配列番号21及び配列番号22から成る群のcb h１プロモーターから選択される請求の範囲第７項記載のプロモーター。 29．請求の範囲第９項記載のプロモーターを含んで成るベクター。 30．前記プロモーターがコード配列に操作可能的に連結されている請求の範囲第29項記載のベクター。 31．前記コード配列が酵素加水分解性リグノセルロースをコードする請求の範囲第30項記載のベクター。 32．請求の範囲第31項記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。 33．前記ベクターが、pTHN100B，pML016de15(11)，pMI-24，pMI-27，pMI-28から成る群から選択される請求の範囲第３２項記載のベクター。 34．請求の範囲第33項記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。 35．請求の範囲第30項記載のベクターにより形質転換された宿主細胞。 36．前記細胞が真菌細胞である請求の範囲第35項記載の宿主細胞。 37．前記真菌細胞が、トリコダーマ(Trichoderma)、アスペルギラス(Aspergil lus)、クラビセプスプルプレア(Clavicepspurpurea)、ペニシリウムクリソゲナム(Penicillum chrysogenum)、マグナポルテグリセア（Magnaporthe gris ea）、ニューロスポラ(Neurospora)、マイコスフアエレラ spp.(Mycosphaerella spp.)、コレクトトリカムトリフォリ（Collectotrichum trifolii）、二形態性カビヒストプラスミアカプスラタム（Histoplasmiacapsulatum）、ネクチアハエマトコカ(Nectia haematococca)(アナモルフ：フサリウムソラニ f．sp ．ファセオリ(Fusarium solanif．sp．phaseoli)及び f．sp．ピシ(f．sp．pisi ))、ウスチラゴビオラセア(Ustilago violacea)、ウスチラゴマイジス(Ustila gomaydis)、セファロスポリウムアクレモニウム（Cephalosporiumacremonium ）、スキゾフィラムコムネ(Schizophyllum commune)、ポドスポラアンセリナ（Podospora anserina）、ソルダリアマクロスポラ(Sordaria macrospora) 、ムコルシルシネロイデス（Mucor circinelloides）及びコレクトトリカムカプシシ(Collectotrichum capsici)から成る群から選択されたものである請求の範囲第36項記載の宿主細胞。 38．前記真菌がトリコダーマである請求の範囲第37項記載の宿主細胞。 39．前記真菌が、Ｔ．レセイ、Ｔ．ハルジアナム(T．harzianum)、Ｔ．ロンジブラキアタム（T．longibrachiatum）、Ｔ．ビリデ（T．viride）及びＴ．コニンジ(T．koningii)から成る群から選択される請求の範囲第38項記載の宿主細胞。 40．前記真菌がＴ．レセイである請求の範囲第39項記載の宿主細胞。 41．酵素組成物であって、下記段階：ａ．グルコースの存在下で請求の範囲第35項記載の宿主細胞を増殖し；ｂ．前記増殖培地から宿主細胞を分離し；そしてｃ．前記酵素組成物における酵素の源として段階（ｂ）の前記増殖培地を用いることを含んで成る方法により生成される組成物。