ES2875010T3 - Procedimiento de producción de ácido 2,4-dihidroxibutírico - Google Patents

Procedimiento de producción de ácido 2,4-dihidroxibutírico Download PDF

Info

Publication number
ES2875010T3
ES2875010T3 ES13731871T ES13731871T ES2875010T3 ES 2875010 T3 ES2875010 T3 ES 2875010T3 ES 13731871 T ES13731871 T ES 13731871T ES 13731871 T ES13731871 T ES 13731871T ES 2875010 T3 ES2875010 T3 ES 2875010T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
coa
seq
malyl
malate
reductase
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES13731871T
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Walther
Clémentine Dressaire
Hélène CORDIER
Jean-Marie Francois
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Adisseo France SAS
Original Assignee
Adisseo France SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Adisseo France SAS filed Critical Adisseo France SAS
Application granted granted Critical
Publication of ES2875010T3 publication Critical patent/ES2875010T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01002—Alcohol dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.2), i.e. aldehyde reductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01061—4-Hydroxybutyrate dehydrogenase (1.1.1.61)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01075—Malonyl CoA reductase (malonate semialdehyde-forming)(1.2.1.75)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
    • C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
    • C12Y102/01076—Succinate-semialdehyde dehydrogenase (acetylating) (1.2.1.76)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
    • C12Y208/03—CoA-transferases (2.8.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/03—Oxo-acid-lyases (4.1.3)
    • C12Y401/03024—Malyl-CoA lyase (4.1.3.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01009—Malate--CoA ligase (6.2.1.9)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
    • C12Y103/01028—2,3-Dihydro-2,3-dihydroxybenzoate dehydrogenase (1.3.1.28)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

Procedimiento para preparar ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-DHB) que comprende las etapas sucesivas de: a) una primera etapa de conversión de malato y/o succinil-CoA y/o glioxilato en malil-CoA; b) una segunda etapa de conversión de malil-CoA obtenido anteriormente en malato-4-semialdehído; c) una tercera etapa de conversión de malato-4-semialdehído en 2,4-DHB utilizando una DHB deshidrogenasa; en el que: - la etapa a) está catalizada por un enzima que presenta actividad de malil-CoA sintetasa, succinil-CoA: (L)- malato-CoA transferasa y/o malil-CoA liasa, respectivamente; dichos enzimas se seleccionan de entre malato-coenzima A ligasa según se define en EC 6.2.1.9, succinil-CoA(L)-malato CoA transferasa según se define en EC 2.8.3.- o malil-CoA liasa, según se define en EC 4.1.3.24, o variante o fragmento funcional del mismo; - la etapa b) está catalizada por un enzima que presenta actividad de malil-CoA reductasa; el enzima que presenta actividad de malil-CoA reductasa se selecciona de entre la malonil-CoA reductasa según se define en EC 1.2.1.75, la succinil-CoA reductasa según se define en EC 1.2.1.76 o de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa informada según se define en EC 1.1.1.38 y EC 1.1.1.88, la cinamoil-CoA reductasa según se define en EC 1.2.1.44 o la acetaldehído deshidrogenasa según se define en EC 1.2.1.10 o cualquier mutante que mejore la actividad y/o afinidad de sustrato del enzima mutado para malil-CoA o que reduzca su actividad sobre el sustrato natural; - la etapa c) está catalizada por la metilbutiraldehído reductasa Ypr1 de S. cerevisiae, la semialdehído succínico reductasa de M. sedula, la 4-hidroxibutirato deshidrogenasa 4hbd de P. gingivalis, o la alcohol deshidrogenasa Yqhd de E. coli, cualquier mutante que mejore la actividad y/o afinidad de sustrato del enzima mutado para la malato-4-semialdehído y/o que reduzca su actividad o afinidad para su sustrato natural en un factor de por lo menos 2.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento de producción de ácido 2,4-dihidroxibutírico
La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento de producción de ácido 2,4-dihidroxibutírico a partir de malato y/o glioxilato y/o succinil-CoA mediante la implementación de una ruta sintética que convierte malato y/o glioxilato y/o succinil-CoA en malilCoA, malilCoA en malato-4-semialdehído, y después convierte dicho malato-4-semialdehído en ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-DHB).
Los ácidos carboxílicos citados en la presente solicitud se nombran igualmente como su sal (por ejemplo, 2,4-dihidroxibutirato9 o formas de ácido (por ejemplo, ácido 2,4-dihidroxibutírico).
El ácido 2,4-dihidroxibutírico (igualmente 2,4-DHB o DHB) es un compuesto de considerable interés económico. El DHB puede convertirse fácilmente en una a-hidroxi-Y-butirolactona en medios acuosos mediante el ajuste al pH apropiado. La a-hidroxi-Y-butirolactona es un precursor importante para la producción del sustituto de la metionina llamado 2-hidroxi-4-(metiltio)-butirato (HMTB) (documento n° US 2009/318715), que presenta un gran mercado en la nutrición animal. Actualmente, la a-hidroxi-Y-butirolactona se deriva de la Y-butirolactona mediante un procedimiento multietapa que implica la halogenación de la Y-butirolactona en posición a y la posterior sustitución del átomo de halógeno por un grupo de hidroxilo en medio alcalino (documento n° US 2009/318715).
Debido al crecimiento de los precios del petróleo, está creciendo la necesidad de producción de DHB a partir de recursos renovables. Los microorganismos son capaces de transformar materias primas derivadas de biomasa, por ejemplo azúcares o ácidos orgánicos, en una gran diversidad de compuestos químicos diferentes (Werpy y Petersen, 2004). Con la creciente información bioquímica y genómica disponible resulta posible modificar los microorganismos de manera que produzcan en exceso intermediarios metabólicos naturales con un elevado rendimiento y productividad (Bailey, 1991). La optimización de los microorganismos productivos con frecuencia requiere una manipulación racionalizadora de las redes metabólicas que garantice, entre otros, la sobreexpresión de los enzimas necesarios para la biosíntesis del metabolito de interés y la reducción de la inhibición por retroalimentación del producto. Otra posibilidad es la implementación de nuevos sistemas enzimáticos que catalicen la producción del metabolito de interés.
Los enfoques de ingeniería metabólica y las catálisis enzimáticas requieren un conocimiento profundo de la bioquímica y la regulación de la ruta metabólica que conduce al metabolito de interés. En el caso de la producción de 2,4-DHB, esta información no se encuentra disponible. Solo pocos estudios informan de la existencia de 2,4-DHB en pacientes con deficiencia en semialdehído succínico deshidrogenasa (Shinka et al., 2002), aunque sin, no obstante, identificar las reacciones enzimáticas que participan en la producción de la DHB. Por lo tanto, la producción zimótica o enzimática de 2,4-DHB requiere: (i) la identificación de una ruta termodinámicamente viable que transforme un precursor accesible en 2,4-DHB, (ii) la identificación o la construcción de enzimas que sean capaces de catalizar etapas de reacción individuales en la ruta, y (iii) la expresión funcional de los enzimas de la ruta en un organismo de producción apropiado.
La presente invención presenta el objetivo de satisfacer dichas necesidades.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, un objetivo de la presente invención es un procedimiento para producir 2,4-DHB, que comprende una primera etapa de conversión de malato y/o glioxilato y/o succinil-CoA en malil-CoA,una segunda etapa de conversión de malil-CoA en malato-4-semialdehído y una tercera etapa de conversión de malato-4-semialdehído en 2,4-DHB, en la que:
- la primera etapa está catalizada por un enzima que presenta actividad de malil-CoA sintetasa (igualmente denominada malato tioquinasa o malato-coenzima A ligasa (formador de ADP)), succinil-CoA: (L)-malato-CoA transferasa y/o malil-CoA liasa, respectivamente; dichos enzimas se seleccionan de entre malato-coenzima A ligasa según se define en EC 6.2.1.9, succinil-CoA(L)-malato CoA transferasa según se define en EC 2.8.3.- o malil-CoA liasa, según se define en EC 4.1.3.24, o variante o fragmento funcional del mismo,
- la segunda etapa está catalizada por un enzima que presenta actividad de malil-CoA reductasa; el enzima que presenta actividad de malil-CoA reductasa se selecciona de entre la malonil-CoA reductasa según se define en EC 1.2.1.76, la succinil-CoA reductasa o 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa informada según se define en EC 1.1.1.38 y EC 1.1.1.88, la cinamoil-CoA reductasa según se define en EC 1.2.1.44 o la acetaldehído deshidrogenasa según se define en EC 1.2.1.10 o cualquier mutante que mejore la actividad y/o afinidad de sustrato del enzima mutado para malil-CoA o que reduzca su actividad sobre el sustrato natural,
- la tercera etapa está catalizada por la metilbutiraldehído reductasa Ypr1 de S. cerevisiae, la semialdehído succínico reductasa de M. sedula, la 4-hidroxibutirato deshidrogenasa 4hbd de P. gingivalis, o la alcohol deshidrogenasa Yqhd de E. coli, cualquier mutante que mejore la actividad y/o afinidad de sustrato del enzima mutado para la malato-4-semialdehído y/o que reduzca su actividad o afinidad para su sustrato natural en un factor de por lo menos 2.
El procedimiento de producción de 2,4-DHB según la presente invención comprende una primera reacción (véase la figura 1), en la que el malato se convierte en malil-CoA por la acción de un enzima que posee actividad de malil-CoA sintetasa [1.1] y/o en la que la succinil-CoA se convierte en malil-CoA por la acción de un enzima que presenta actividad de succinil-CoA:(L)-malato CoA transferasa [1.2] y/o en la que el glioxilato se convierte en malil-CoA por la acción de un enzima que posee actividad de malil-CoA liasa [1.3]. En la segunda reacción [2], malil-CoA se convierte en malato-4-semialdehído por la acción de un enzima que posee actividad de malil-CoA reductasa. En la tercera reacción [3], malato-4-semialdehído se convierte en DHB por la acción de un enzima que posee actividad de DHB deshidrogenasa. Más exactamente, la reacción [3] resulta catalizada por un enzima que incluye actividad de malato-4-semialdehído reductasa en el sentido biosintético de la ruta.
Los enzimas de la primera etapa del procedimiento según la invención se han identificado en bacterias metilotróficas que utilizan el ciclo de las serinas para la fijación del formaldehído (Chistoserdova et al., 2009; Smejkalová et al., 2010; Vuilleumier et al., 2009), en bacterias que se basa en rutas de asimilación del acetato que son independientes del ciclo del glioxilato y de la actividad de la isocitrato liasa (Meister et al., 2005), y en bacterias que utilizan el ciclo de fijación de CO2 del 3-hidroxipropionato para el crecimiento autotrófico (Zarzycki et al., 2009).
Las proteínas que comparten homología con los enzimas anteriormente indicados también son otro aspecto de la invención, tal como variantes funcionales o fragmentos funcionales.
La malil-CoA sintetasa consiste en dos subunidades: MtkA y MtkB. Por lo tanto, según la invención, las proteínas que comprenden una actividad de malil-CoA sintetasa designan todos los polipéptidos que presentan por lo menos 30% de identidad respecto a las secuencias proteicas de las subunidades MtkA y MtkB de la malil-CoA sintetasa de M. petroleiphilum (YP 001022444 y YP 001022445) Methylobacterextorquens (YP002962851 y YP 002962852) o dos subunidades SucC y SucD de M. capsulatus (YP 114179 y YP 114180), preferentemente por lo menos 50% y más preferentemente 70% de identidad.
La malil-CoA liasa es un homohexámero y se encuentra en bacterias que no utilizan el ciclo del glioxilato para la asimilación del acetato (Meister et al., 2005). Por lo tanto, según la invención, las proteínas que comprenden actividad de malil-CoA liasa designan todos los polipéptidos que presentan una identidad de por lo menos 30% respecto a las secuencias proteicas de la malil-CoA liasa, Mcl, de Methylobacter extorquens, Rhodobacter capsulatus, o Streptomyces coelicolor, preferentemente por lo menos 50% y más preferentemente 70% de identidad.
En un aspecto adicional de la invención, la malil-CoA liasa para la utilización en la invención está representada por la SEC iD n° 1 o por cualquier variante de la misma.
La succinil-CoA:(L)-malato CoA transferasa consiste en dos subunidades: SmtA y SmtB (Zarzycki et al., 2009) (Friedmann et al., 2006). Por lo tanto, según la invención, las proteínas con una actividad de succinil-CoA:(L)-malato CoA transferasa designan todos los polipéptidos que presentan una identidad de por lo menos 30% respecto a las secuencias proteicas de las subunidades SmtA y SmtB de succinil-CoA:(O)-malato CoA transferasa de Chloroflexus aurantiacus (representada por SEC ID n° 191 y SEC ID n° 193 o codificada por SEC ID n° 192 y SEC ID n° 194), preferentemente por lo menos 50% y más preferentemente 70% de identidad.
Más generalmente, en el significado de la invención, la identidad entre dos secuencias proteicas puede determinarse mediante procedimientos bien conocidos por el experto en la materia. Son ejemplos de dichos procedimientos, la utilización del software CLUSTALW (Larkin et al., 2007) (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/con los parámetros por defecto indicados en el sitio web) o el programa de alineación BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi con los parámetros por defecto indicados en el sitio web).
La expresión variante funcional comprende enzimas que pueden presentar modificaciones de secuencia sustanciales en comparación con las secuencias específicamente indicadas en la presente solicitud pero que todavía conservan la actividad enzimática original.
La expresión fragmento funcional, según la invención, se refiere a que la secuencia del enzima puede comprender menos aminoácidos que el original, aunque dicho enzima truncado todavía conserva la actividad enzimática original.
Pueden obtenerse mejoras de dichos enzimas mediante por lo menos una mutación, en donde dicha mutación o mutaciones mejoran la actividad y/o afinidad de sustrato del enzima mutado para el malato, el succinil-CoA o el glioxilato, respectivamente.
En la presente invención, la expresión "mejora la actividad y/o afinidad para el sustrato" se refiere a que el enzima antes de la mutación:
- era incapaz de utilizar el sustrato, y/o
- sintetizó el producto de la reacción a una tasa específica máxima por lo menos tres veces inferior, y/o
- presentaba una afinidad para el malato, el succinil-CoA o el glioxilato, malil-CoA o malato-4-semialdehído, que es por lo menos dos, más preferentemente tres, veces inferior.
Las actividades de malil-CoA sintetasa y malil-CoA liasa pueden medirse mediante los ensayos enzimáticos descritos por (Smejkalová et al., 2010) o (Meister et al., 2005), respectivamente. La actividad de succinil-CoA:(L)-malato CoA transferasa puede medirse tal como se ha descrito (Friedmann et al., 2006).
En un aspecto todavía adicional, la segunda etapa del procedimiento de producción de 2,4-DHB según la invención implica un enzima que presenta actividad de malil-CoA reductasa caracterizada por que transforma el malil-CoA en malato-4-semialdehído.
Dicho enzima puede identificarse de entre enzimas que presentan actividad de malonil-CoA reductasa, succinil-CoA reductasa o 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa informada, cinamoil-CoA reductasa o acetaldehído deshidrogenasa, o pueden obtenerse mediante modificación de dichos enzimas.
La malonil-CoA reductasa (EC 1.2.1.75) y la succinil-CoA reductasa (EC 1.2.1.76) se han encontrado en bacterias que poseen un ciclo de 3-hidroxipropionato modificado para la fijación del dióxido de carbono (Alber et al., 2006; Kockelkorn & Fuchs, 2009), y en bacterias que utilizan una ruta de degradación anaeróbica del succinato (Seedorf et al., 2008; Sohling & Gottschalk, 1993). La HMG-CoA reductasa (EC 1.1.1.38, EC.1.1.1.88) es parte de la ruta biosintética de los isoprenoides en eucariotas y en algunas bacterias. La cinamoil-CoA reductasa (EC 1.2.1.44) es un enzima implicado en la biosíntesis de la lignina (Kawasaki et al., 2006). La acetaldehído deshidrogenasa (EC 1.2.1.10) se encuentra en una gran diversidad de bacterias y cataliza la entrada en la ruta de producción de etanol o de destoxificación del acetaldehído.
En un aspecto adicional de la invención, la malil-CoA reductasa está representada por la SEC ID n° 7 o SEC ID n° 10 o por cualquier variante funcional de la misma o cualquier fragmento funcional de la misma.
Por lo tanto, según la invención, las proteínas que presentan una actividad de malonil-CoA reductasa designan todos los polipéptidos que presentan una identidad de por lo menos 30% respecto a las secuencias proteicas de la malonil-CoA reductasa de Sulfolobus tokodaii, Mcr (SEC ID n° 7). Preferentemente presentan una identidad de por lo menos 50% y más preferentemente de 70%.
La malonil-CoA reductasa de Chloroflexus auranthiacus (SEC ID n°189 codificada por la SEC ID n° 190) constituye otro aspecto de la invención. Los polipéptidos que presentan una identidad de por lo menos 30% respecto a las secuencias proteicas de Chloroflexus auranthiacus también son parte de la invención. Preferentemente presentan una identidad de por lo menos 50% y más preferentemente de 70%.
Por lo tanto, según la invención, las proteínas que presentan una actividad de succinil-CoA reductasa designan todos los polipéptidos que presentan una identidad de por lo menos 30% respecto a las secuencias proteicas de la succinil-CoA reductasa de Porphyromonasgingivalis, SucD (SEC ID n° 10) o respecto a la malonil-CoA y succinil-CoA reductasa de S. tokodaii bifuncional, Mcr (SEC ID n° 7). Preferentemente presentan una identidad de por lo menos 50% y más preferentemente de 70%.
La actividad de malil-CoA reductasa puede medirse mediante el ensayo enzimático descrito en el ejemplo 2 (véase "Ensayo enzimático").
Dicha actividad enzimática puede mejorarse mediante por lo menos una mutación de un enzima, mejorando dicha mutación o mutaciones la actividad y/o afinidad para el sustrato del enzima mutado para malil-CoA o reducen su actividad sobre el sustrato natural.
La presente invención comprende además la utilización de malil-CoA reductasa modificada que presenta actividades mejoradas.
La malil-CoA reductasa para la utilización en la invención corresponde en un aspecto específico a una malonil-CoA reductasa de Sulfolobus tokodaii que comprende por lo menos una mutación respecto al enzima de tipo salvaje en por lo menos una de las posiciones P111, L152, T154, L202, G203, D204, Y206, D207, K209, T210, T238,T239, D295 y R318, en el que el aminoácido natural en dichas posiciones se ha sustituido por cualquiera de los otros 19 aminoácidos proteinogénicos naturales existentes, es decir, por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina o valina.
La tercera etapa del procedimiento de producción de 2,4-DHB según la invención implica una DHB deshidrogenasa caracterizada por que transforma el malato-4-semialdehído en 2,4-DHB, en el que dicho enzima porta actividad de malato-4-semialdehído reductasa en el sentido biosintético de la ruta.
Los enzimas DHB deshidrogenasa candidatos que potencialmente ya presentan actividad de DHB deshidrogenasa pueden seleccionarse de la clase de beta-hidroxiácido deshidrogenasas que actúan sobre los compuestos C3, C4 o C5.
Según un aspecto todavía adicional de la invención, dichos enzimas DHB deshidrogenasas pueden estar estructural y mecanísticamente relacionados con las p-hidroxiácido deshidrogenasas, tales como las tartronato semialdehído reductasas, las succinato semialdehído reductasas, las 4-hidroxibutirato deshidrogenasas, las malonato semialdehído reductasas, las metilbutiraldehído reductasas, las alcohol deshidrogenasas de tipo cinc, las L-treonina-3-deshidrogenasas, las alcohol cinamílico deshidrogenasas, las alcohol deshidrogenasas o las homoserina deshidrogenasas.
La presente invención se refiere además a la utilización de una metilbutiraldehído reductasa o de una semialdehído succínico reductasa (igualmente denominada 4-hidroxibutirato deshidrogenasa) o de una alcohol deshidrogenasa, para transformar el malato-4-semialdehído en 2,4-DHB.
En otro aspecto específico de la invención, la DHB deshidrogenasa corresponde a metilbutiraldehído reductasa (Ypr1) de S. cerevisiae, la semialdehído succínico reductasa de M. sedula, la 4-hidroxibutirato deshidrogenasa (4hbd) de P. gingivalis, o a la alcohol deshidrogenasa (YqhD) de Escherichia coli.
En formas de realización específicas, dicha metilbutiraldehído reductasa está representada por la SEC ID n° 14; dicha semialdehído succínico reductasa está representada por la SEC ID n° 16, dicha 4-hidroxibutirato deshidrogenasa está representada por la SEC ID n° 187, dicha alcohol deshidrogenasa está representada por la SEC ID n° 185. La actividad de DHB deshidrogenasa puede medirse mediante el ensayo enzimático descrito en el ejemplo 3 (véase "Ensayo enzimático”).
La afinidad de la DBH deshidrogenasa para el malato-4-semialdehído puede incrementarse mediante como mínimo una mutación de un enzima, incrementando dicha mutación o mutaciones la actividad y/o afinidad del enzima mutado para el malato-4-semiladehído y/o reduciendo la actividad o afinidad para su sustrato natural en un factor de por lo menos 2.
La DHB deshidrogenasa para la utilización en la invención corresponde, en un aspecto específico a la semialdehído succínico reductasa de M. sedula (SEC ID n° 16), que comprende por lo menos una mutación respecto al enzima de tipo salvaje en por lo menos una de las posiciones S40, N43, H39 T49, F85, Q108, L281 y N305, en el que el aminoácido natural en dichas posiciones se ha sustituido por cualquiera de los otros 19 aminoácidos proteinogénicos naturales, es decir, por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina o valina.
Tal como se demuestra en un ejemplo no exclusivo, la afinidad de la semialdehído succínico reductasa de M. sedula para el (L)-malato-4-semialdehído se incrementó mediante la introducción de la doble mutación H39R N43H mediante mutagénesis dirigida a sitio, tal como se representa en la SEC ID n° 36. Los mutantes simples H39R (SEC ID n° 32) y N43H (SEC ID n° 34) también se encuentran comprendidos en la presente invención (Ejemplo 5).
La DHB deshidrogenasa puede utilizarse para transformar el malato-4-semialdehído en 2,4-DHB, constituyendo un aspecto adicional de la invención.
La secuencia de ácidos nucleicos de los genes puede adaptarse al uso de los codones del organismo huésped, incrementando de esta manera la producción de las proteínas expresadas heterólogamente. Lo anterior constituye un aspecto adicional de la invención.
La síntesis de un gen sintético codificante de la semialdehído succínico reductasa H39R N43H de M. sedula cuya secuencia de nucleótidos se optimizó para la expresión de dicho enzima en E. coli tal como se representa mediante la SEC ID n° 38 es un aspecto adicional de la invención.
En un aspecto todavía adicional, la presente invención se refiere además a ácidos nucleicos, y más particularmente a secuencias de ácidos nucleicos aisladas, codificantes de una malil-CoA sintetasa.
En un aspecto todavía adicional, la presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas codificantes de malil-CoA liasa, y más específicamente, a la SEC ID n° 2.
En un aspecto todavía adicional, la presente invención se refiere a secuencias de ácidos nucleicos aisladas codificantes de malil-CoA reductasa, y más específicamente, a SEC ID n° 8, SEC ID n° 11 o SEC ID n° 190.
En un aspecto todavía adicional, la presente invención se refiere además a secuencias de ácidos nucleicos aisladas codificantes de una DHB deshidrogenasa tal como se ha indicado anteriormente.
En otro aspecto, dicho ácido nucleico está representado por SEC ID n° 15 o SEC ID n° 17, SEC ID n° 37, SEC ID n° 186 o SEC ID n° 188.
Según la presente invención, una "secuencia de ácidos nucleicos" se refiere a una molécula de ADN o ARN en forma de cadena sencilla o doble, preferentemente una molécula de ADN. Un “ADN aislado”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un ADN que no es natural o ya no se encuentra en el entorno natural en el que se encontraba presente originalmente, por ejemplo una secuencia codificante de ADN asociada a otros elementos reguladores en un gen quimérico, un ADN transferido a otra célula huésped, o una secuencia de ADN artificial, producida sintéticamente, que presenta una secuencia de nucleótidos diferente de cualquier secuencia de ADN natural.
La presente exposición se refiere además a un gen quimérico que comprende, funcionalmente unidos entre sí, por lo menos un promotor que es funcional en un organismo huésped, un polinucleótido codificante de cualquiera de entre las actividades de malil-CoA sintetasa o malil-CoA liasa, malil-CoA reductasa, malonil-CoA reductasa, succinil-CoA reductasa o DHB deshidrogenasa, según se definen en la invención, y un elemento terminador que es funcional en el mismo organismo huésped. Los diversos elementos que puede contener un gen quimérico son, en primer lugar, elementos que regulan la transcripción, traducción y maduración de las proteínas, tal como un promotor, una secuencia codificante de un péptido de señal o un péptido de tránsito, o un elemento terminador que constituye una señal de poliadenilación y, en segundo lugar, un polinucleótido codificante de una proteína. La expresión "funcionalmente unidos entre sí" se refiere a que dichos elementos del gen quimérico están unidos entre sí de manera que la función de uno de dichos elementos resulta afectada por la función del otro. A modo de ejemplo, un promotor está funcionalmente unido a una secuencia codificante en el caso de que sea capaz de afectar a la expresión de dicha secuencia codificante. La construcción del gen quimérico según la invención y el ensamblaje de sus diversos elementos pueden llevarse a cabo utilizando técnicas bien conocidas por el experto en la materia. La elección de los elementos reguladores que constituyen el gen quimérico depende esencialmente del organismo huésped en el que deben funcionar, y el experto en la materia será capaz de seleccionar los elementos reguladores que son funcionales en un organismo huésped dado. El término “funcional” pretende referirse a que es capaz de funcionar en un organismo huésped dado.
Los promotores que el gen quimérico puede contener son constitutivos o inducibles. A título de ejemplo, los promotores utilizados para la expresión en bacterias pueden seleccionarse de entre los promotores indicados a continuación. Para la expresión en Escherichia coli se puede hacer mención de los promotores lac, trp, Ipp, phoA, recA, araBAD, prou, cst-I, tetA, cadA, nar, tac, trc, Ipp-lac, Psyn, cspA, PL, PL-9G-50, PR-PL, T7, [lambda]PL-PT7, T3-lac, T5-lac, T4 gene 32, nprM-lac, VHb y proteína A, o alternativamente el promotor Ptrp (documento n° WO 99/64607). Para la expresión en bacterias Gram-positivas, tales como Corynebacteria o Streptomyces, puede hacerse mención de los promotores PtipA o PS1 y PS2 (documento n° FR91/09870) o los indicados en la solicitud n° EP0629699A2. Para la expresión en levaduras y hongos, puede hacerse mención de los promotores PLAC4 de K. lactis o el promotor Ppgk de K. lactis (solicitud de patente n° FR 91/05294), el promotor tef1 o cbh1 deTrichoderma (documento n° WO 94/04673), el promotor his, csl o apf de Penicillium (documento n° WO 00/68401) y el promotor gla de Aspergillus.
El gen quimérico puede comprender además otras secuencias reguladoras, las cuales están situadas entre el promotor y la secuencia codificante, tales como los activadores (intensificadores) de transcripción.
De esta manera, el gen quimérico de la invención comprende, por lo menos en un caso específico, en la dirección de transcripción, ligadas funcionalmente, una secuencia reguladora de promotor que es funcional en el organismo huésped, una secuencia de ácidos nucleicos codificante de la malil-CoA sintetasa y/o la succinil-CoA:(L)-malato-CoA transferasa y/o la malil-CoA liasa, la malil-CoA reductasa y la DHB deshidrogenasa divulgada en la presente memoria y una secuencia reguladora de terminador que es funcional en dicho organismo huésped.
La presente exposición se refiere además a un vector de clonación y/o expresión que comprende un gen quimérico o una secuencia de ácidos nucleicos de la presente exposición. El vector resulta de utilidad para transformar un organismo huésped y expresar en dicho organismo cualquiera de entre la malil-CoA sintetasa y/o la succinil-CoA:(L)-malato CoA transferasa, y/o la malil-CoA liasa, la malil-CoA reductasa y/o la DHB deshidrogenasa. Dicho vector puede ser un plásmido, un cósmido, un bacteriófago o un virus. Preferentemente, el vector de transformación es un plásmido. Generalmente, las cualidades principales de dicho vector deberían ser la capacidad de automantenerse y autorreplicarse en las células del organismo huésped, en particular en virtud de la presencia de un origen de replicación, y de expresar cualquiera de entre la malil-CoA sintetasa y/o la succinil-CoA:(L)-malato CoA transferasa y/o la malil-CoA liasa, la malil-CoA reductasa y/o la DHB deshidrogenasa en las mismas. Con el propósito de conseguir la transformación estable de un organismo huésped, el vector también puede integrarse en el genoma. La elección de dicho vector, y también las técnicas de inserción del gen quimérico en dicho vector y son parte del conocimiento general del experto en la materia. Ventajosamente, el vector utilizado contiene, además del gen quimérico, un gen quimérico codificante de un marcador seleccionable. Dicho marcador seleccionable posibilita la selección de los organismos huésped que resultan transformados eficazmente, es decir, los que han incorporado el vector. Según un caso particular, el organismo huésped que debe transformarse es una bacteria, una levadura o un hongo. Entre los marcadores seleccionables que pueden utilizarse, pueden mencionarse marcadores que contienen genes de resistencia a antibióticos, tales como, por ejemplo, el gen de higromicina fosfotransferasa. Otros marcadores pueden ser genes que complementan una auxotrofía, tal como los genes pyrA, pyrB, pyrG, pyr4, arg4, argB y trpC, el gen de molibdopterina sintasa o el de la acetamidasa. También puede hacerse mención a genes codificantes de enzimas fácilmente identificables, tales como el enzima GUS, o genes codificantes de pigmentos o enzimas reguladores de la producción de pigmentos en las células transformadas. Dichos genes marcadores seleccionables se indican en particular en las solicitudes de patente n° WO 91/02071, n° WO 95/06128, n° WO 96/38567 y n° WO 97/04103.
La presente invención se refiere además a un microorganismo modificado para una producción mejorada de 2,4-DHB, expresando dicho microorganismo los genes codificantes de los enzimas que presentan las actividades enzimáticas necesarias para la primera, segunda y tercera etapas del procedimiento de la invención tal como se ha definido anteriormente.
En la presente memoria se divulgan además organismos huésped transformados que contienen por lo menos un gen quimérico según la presente exposición, integrado en su genoma o transportador en un elemento genético extracromosómico, por ejemplo un plásmido. En un aspecto más específico, el organismo huésped transformado comprende un ácido nucleico de la presente exposición codificante de un polipéptido que presenta actividad de malil-CoA sintetasa y/o de succinil-CoA:(L)-malato-CoA transferasa y/o de malil-CoA liasa, o un gen quimérico que comprende un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de malil-CoA sintetasa y/o de succinil-CoA:(L)-malato CoA transferasa y/o de malil-CoA liasa, o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de malil-CoA sintetasa y/o de succinil-CoA:(L)-malato CoA transferasa y/o de malil-CoA liasa, y/o un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de malil-CoA reductasa, o un gen quimérico que comprende un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de malil-CoA reductasa o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de malil-CoA reductasa y/o un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de DHB deshidrogenasa, un gen quimérico que comprende un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de DHB deshidrogenasa o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de un polipéptido que presenta actividad de DHB deshidrogenasa.
La actividad de los enzimas heterólogos en el organismo huésped con frecuencia se encuentra limitada por su mala solubilidad y la formación de cuerpos de inclusión. Por lo tanto, la presente exposición se refiere además a proteínas quiméricas en las que un enzima funcional está físicamente fusionado con otra proteína o péptido (igualmente denominado proteína de fusión) con el fin de incrementar la actividad de dicho enzima con la expresión en el organismo huésped. Dichas proteínas de fusión son conocidas de la técnica y se seleccionan comúnmente de entre los ejemplos no exclusivos siguientes: proteína de unión a maltosa, Mbp, tiorredoxina, ThrX, glutatión-S-transferasa, Gst, factor de terminación de la transcripción y NusA.
La expresión "organismo huésped" pretende referirse a cualquier organismo monocelular inferior en el que puede introducirse uno o más genes quiméricos, uno o más ácidos nucleicos o uno o más vectores, a fin de producir 2,4-DHB. Preferentemente, el organismo huésped es un microorganismo, en particular, un hongo, por ejemplo del género Penicillium, Aspergillus y más particularmente Aspergillus flavus, del género Chrysosporium o Trichoderma, una levadura, en particular de las Saccharomycetaceae, Pichiaceae o Schizosaccharomycetaceae, muy preferentemente Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomycespombe, Kluyveromyceslactis, Kluyveromyces marxianus, o Pichia jadinii, Pichia stipitis o Pichia pastoris, una bacteria, preferentemente seleccionada de entre Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriacae y Corynebacteriaceae, muy preferentemente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorquens, o Lactococcus lactis.
El organismo huésped puede ser un organismo huésped que sobreproduce naturalmente malato o succinato a partir de azúcares tales como glucosa, o un organismo huésped que ha sido manipulado para sobreproducir malato o succinato a partir de azúcares tales como glucosa y en el que todos los potenciales transportadores membranales que facilitan la exportación de ácidos orgánicos, tales como malato, piruvato, succinato y fumarato, han sido delecionados. El organismo huésped puede ser un organismo que ha sido manipulado para sobreproducir DHB y en la membrana del cual se han delecionado transportadores membranales que facilitan la exportación de ácidos orgánicos, tales como malato, piruvato, succinato y fumarato. Son ejemplos de permeasas que facilitan la exportación del malato y de otros ácidos orgánicos, Mae1 de Schizosaccharomycespombe (Camarasa et al., 2001; Grobler et al., 1995), DctA de Bacillus subtilis (Groeneveld et al., 2010), Dct 1-4 de coli, Jen1 de S. cerevisiae (Akita et al., 2000). Para un experto resultará posible identificar las permeasas candidatas en E. coli basándose en la identidad de las secuencias. Estas construcciones sirven para mantener el malato y otros ácidos orgánicos dentro de la célula para que se encuentren disponibles para la producción de DHB.
La expresión "organismo huésped transformado" pretende referirse a un organismo huésped que se ha incorporado en su genoma o en un elemento genético extracromosómico, por ejemplo un plásmido, por lo menos un gen quimérico según la presente exposición y en consecuencia produce cualquiera de entre la malil-CoA sintetasa, la malil-CoA liasa, la malil-CoA reductasa y/o la DHB deshidrogenasa en el interior celular o en un medio de cultivo. Con el fin de obtener los organismos huésped según la presente exposición, el experto en la materia puede utilizar uno de entre muchos procedimientos de transformación conocidos.
Uno de dichos procedimientos consiste en poner en contacto las células de los organismos huésped que deben transformarse con polietilenglicol (PEG) y con los vectores según la presente exposición. La electroporación es otro procedimiento, que consiste en someter a las células que deben transformarse y los vectores de la presente exposición a un campo eléctrico. Otro procedimiento consiste en inyectar directamente los vectores en las células o en los tejidos mediante microinyección. Puede utilizarse el procedimiento “biolístico”. Consiste en bombardear las células o tejidos con partículas sobre las que se encuentran adsorbidos los vectores de la presente exposición (patente US n° 4.945.050).
Se describen en la literatura varios procedimientos para la transformación de bacterias para las bacterias Escherichia coli y otras bacterias Gram-negativas. También puede utilizarse la conjugación. Para las bacterias Gram-positivas, puede utilizarse la electroporación y también la transformación de protoplastos, en particular para bacterias del género Streptomyces.
En la literatura también se describen varios procedimientos para la transformación de hongos. La transformación de protoplastos con PEG se ha descrito para Aspergillus en el documento n° EP 0260762 y una adaptación de este procedimiento para la especie Penicillium funiculosum se describe en el documento n° WO 00/36120. También es conocida la transformación mediante integración mediada por enzima de restricción, o REMI, por sus siglas en inglés, al igual que la transformación de protoplastos utilizando bacterias del género Agrobacterium. También se describen en la literatura técnicas para la transformación de levaduras.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un procedimiento de producción de 2,4-DHB que comprende la etapa de cultivar un microorganismo modificado de la invención.
Para la producción de DHB pueden utilizarse diversos carbohidratos, individualmente o en forma de una mezcla, tal como glucosa, fructosa, sacarosa, melaza, maltosa, melaza negra, hidrolizado de almidón (glucosa y oligosacáridos), lactosa, maltosa, almidón e hidrolizados de almidón, celulosa, hidrolizado de celulosa, glicerol, acetato y determinados hidrocarburos, aceites y grasas, tales como aceite de soja, aceite de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco, así como ácidos grasos, tales como, por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico. Dichas sustancias pueden utilizarse individualmente o en forma de mezclas.
Podrían utilizarse diversas fuentes de nitrógeno, individualmente o en forma de mezclas, para la producción comercial y a escala piloto, incluyendo compuestos inorgánicos, tales como amonio gaseoso y acuoso, sales amónicas de ácidos inorgánicos u orgánicos, tales como sulfato amónico, nitrato amónico, fosfato amónico, cloruro amónico, acetato amónico y carbonato amónico. Alternativamente, también pueden utilizarse materiales orgánicos naturales que contienen nitrógeno, tales como hidrolizado de soja, hidrolizado de HCl de proteína de soja (aproximadamente 7% de nitrógeno total), harina de soja, hidrolizado de torta de soja, licor de maceración del maíz, hidrolizado de caseína, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, urea, peptonas y aminoácidos.
El procedimiento de producción puede llevarse a cabo bajo condiciones aeróbicas, anaeróbicas y de limitación de oxígeno. Puede llevarse a cabo en forma de procedimiento alimentado por lotes o un procedimiento discontinuo.
Dicha producción de 2,4-DHB puede llevarse a cabo mediante el cultivo del organismo huésped en medio en el que se ha añadido malato (u otro ácido orgánico, tal como piruvato, succinato o fumarato), solo o conjuntamente con otra fuente de carbono que garantice el crecimiento. El malato (y otros ácidos orgánicos) puede añadirse directamente o mediante el diseño de un procedimiento de fermentación en dos etapas en el que el malato (u otros ácidos orgánicos) es producido en una primera etapa del procedimiento por un microorganismo sobreproductor de malato y se lleva a cabo la producción de 2,4-DHB en la etapa siguiente mediante un organismo huésped según la invención.
La separación y purificación del producto es un factor muy importante que afecta enormemente a la eficiencia global del procedimiento y a los costes del producto. Los procedimientos de recuperación del producto comúnmente comprenden las etapas de separación celular, así como de purificación, concentración y secado del producto, respectivamente.
Separación celular
Puede utilizarse la ultrafiltración y la centrifugación para separar las células a partir del medio de fermentación. La separación de las células del medio de fermentación con frecuencia resulta complicada por la elevada viscosidad del medio. Por lo tanto, se pueden añadir aditivos, tales como ácido mineral o sales alcalinas, o mediante el calentamiento del caldo de cultivo, a fin de optimizar la separación de las células.
Recuperación del producto
Pueden ponerse en práctica diversos procedimientos cromatográficos de intercambio iónico para la separación de DHB antes o después de la separación de la biomasa. Entre ellos se incluyen la utilización de resinas primarias de intercambio catiónico que facilitan la separación de los productos según su punto isoeléctrico. Típicamente, la resina se carga con la solución y el producto retenido se eluye separadamente tras el incremento del pH (por ejemplo mediante la adición de hidróxido amónico) del eluyente. Otra posibilidad representa la utilización de la cromatografía de intercambio iónico utilizando resinas de lecho fijo o móvil simulado. Puede resultar necesario combinar diferentes etapas cromatográficas con el fin de alcanzar una pureza adecuada del producto. Dichos procedimientos de purificación resultan más económicos que una costosa etapa de cristalización, proporcionando además ventajas adicionales y flexibilidad respecto a la forma del producto final.
Concentración y secado del producto
El procedimiento de purificación puede comprender además una etapa de secado que puede incluir cualesquiera medios de secado adecuados, tales como un granulador de pulverización, un secador de pulverización, un secador de tambor, un secador giratorio y un secador de túnel. Pueden obtenerse soluciones de DHB concentradas mediante el calentamiento de caldos de fermentación bajo presión reducida con vapor a 130°C utilizando un concentrador multiuso o evaporador de capa fina.
Puede garantizarse la producción eficiente de DHB mediante la optimización de la redistribución del flujo de carbono en la red metabólica del organismo huésped y garantizando el suministro suficiente de NADPH y ATP para los tres enzimas de la ruta de DHB. La canalización del flujo de carbono a una ruta metabólica deseada y el suministro de cofactor NAD(P)H se ve facilitado comúnmente mediante la deleción o reducción de las rutas fermentativas naturales en competencia. Son ejemplos no exclusivos:
- la optimización de la producción del malato en S. cerevisiae mediante el bloqueo de la formación del etanol (mediante deleción de las piruvato descarboxilasas (Zelle et al., 2008; Zelle et al., 2010));
- la optimización de la producción de succinato o malato en E. coli mediante el bloqueo de la formación de lactato (por ejemplo, la deleción de IdhA), la formación de acetato (por ejemplo, la deleción de pta y ackA), la formación de etanol (por ejemplo, la deleción de adhE), la formación de formato (por ejemplo, la deleción de pflB y focA), la oxidación del piruvato (por ejemplo, la deleción de poxB), la degradación de malato (deleción de maeBy scfA), la formación de succinato (por ejemplo, la deleción de frdBC), la formación de metilglioxal (deleción de mgsA) (Jantama et al., 2008a; Jantama et al., 2008b; Lin et al., 2005; Zhang et al., 2011; Sánchez et al., 2005);
- la deleción de la fosfoglucosa isomerasa, pgi, para canalizar el flujo de carbono por la ruta de las pentosas fosfato, incrementando de esta manera la disponibilidad de NADPH para las reacciones biosintéticas (Auriol et al., 2011).
Otra posibilidad para incrementar el flujo de carbono y el suministro de ATP para la producción de ácidos orgánicos es la manipulación del nodo de ramificación del fosfoenolpiruvato (PEP)/piruvato/oxaloacetato (revisión en Sauer y Eikmanns, 2005). Son ejemplos no exclusivos de estrategias de manipulación metabólica que garantizan el incremento del flujo de carbono del fosfoenolpiruvato al oxalacetato:
- la optimización de la producción del malato en S. cerevisiae mediante el bloqueo de la función de la piruvato quinasa y el incremento de la actividad de la PEP carboxiquinasa (Zelle et al., 2010);
- la optimización de la producción de succinato en E. coli mediante el incremento de la actividad de la PEP carboxilasa, PEP carboxiquinasa o piruvato carboxilasa, natural o de expresión heteróloga (Millard et al., 1996; Sánchez et al., 2005; Zhang et al., 2011).
Otra posibilidad para incrementar el flujo de carbono y el suministro de ATP para la producción de ácidos orgánicos en E. coli y otras bacterias utilizando el sistema de fosfotransferasa (PTS, por sus siglas en inglés) consumidor de PEP para la etapa inicial de fosforilación de la glucosa es la deleción de los componentes esenciales del sistema PTS (por ejemplo, ptsI o ptsG) (Lin et al., 2005; Zhang et al., 2009). Para garantizar la incorporación adicional de glucosa en mutantes portadores de mutaciones deletéreas del sistema PTS, debe garantizarse la actividad de sistemas alternativos de incorporación de la glucosa (por ejemplo, GalP).
Otra posibilidad para incrementar el flujo de carbono hacia las rutas deseadas para la producción de ácidos orgánicos es la manipulación del ciclo del ácido cítrico y el glioxilato. Son ejemplos no exclusivos:
- la optimización de la producción de ácido succínico en E. coli mediante el incremento de la actividad de la isocitrato liasa (deleción del represor transcripcional icIR) (Lin et al., 2005; Sánchez et al., 2005; Lin et al., 2005; Sánchez et al., 2005a);
- la optimización de la producción de ácido succínico mediante la deleción de la isocitrato deshidrogenasa y/o la succinato deshidrogenasa (Lin et al., 2005).
Otra posibilidad es incrementar la disponibilidad de malato, glioxilato y acetil-CoA, que son los sustratos de las reacciones de entrada en las rutas productoras de DHB, es la atenuación de los enzimas aspartato transaminasa (aspC y tyrB), la fumarasa (fumABC), la fumarato reductasa (frdBC), la malato sintasa (aceB) y la glioxilato reductasa (ghrAB).
En otro contexto metabólico resulta posible producir el precursor malato de 2,4-DHB exclusivamente por el ciclo de Krebs y la ruta de derivación de glioxilato. Este contexto requiere la deleción de las malato deshidrogenasas citosólica y unida a membrana, mdh y mqo, respectivamente. El enfoque evita en gran medida la fuga potencial de flujo de carbono hacia aspartato y sus derivados.
Otra posibilidad para incrementar el flujo de carbono hacia las rutas deseadas para la producción de 2,4-DHB es la expresión de piruvato deshidrogenasas y citrato sintasas apropiadas en el organismo de producción. La piruvato deshidrogenasa y citrato sintasa naturales de E. coli resultan inhibidas por las concentraciones intracelulares elevadas de NADH, provocando que dichos enzimas sean menos activos bajo condiciones anaeróbicas. En E. coli, la expresión de una piruvato deshidrogenasa mutante que es insensible a NADH resulta en la sobreproducción de acetil-CoA bajo condiciones anaeróbicas y una redistribución modificada del flujo de carbono entre los productos finales fermentativos (acetato, lactato, etanol, formato y piruvato) (Wang et al., 2010). La expresión heteróloga de la citrato sintasa de Bacillus subtilis, que es insensible a NADH, incrementa la producción del ácido succínico en cepas manipuladas de E. coli (Sánchez et al., 2005). En combinación con las mutaciones anteriormente indicadas, la utilización de las piruvato deshidrogenasas y citrato sintasas apropiadas (sensibles o insensibles a NADH) permite el ajuste fino de la redistribución del flujo de carbono entre las reacciones del ciclo del glioxilato y el ácido cítrico y las rutas fermentativas bajo condiciones anaeróbicas y aeróbicas.
Otra posibilidad para incrementar el flujo de carbono por la ruta de DHB es la deleción de las reacciones enzimáticas que podrían degradar los intermediarios de la ruta malil-CoA o 4-semialdehído de malato. Los enzimas candidatos que podrían degradar el semialdehído de malato son las semialdehído succínico deshidrogenasas (sad, gabD) y otras deshidrogenasas que son capaces de oxidar las moléculas de cadena de carbonos corta e intermedia con grupos aldehído terminales. Además, es conocido que la malil-CoA puede resultar degrada por la citrato sintasa.
Otra posibilidad para incrementar la productividad de 2,4-DHB del organismo huésped es la deleción de las reacciones metabólicas que degradan la 2,4-DHB. 2,4-DHB es un inhibidor competitivo del enzima málico que, de esta manera, presenta una afinidad comparativamente elevada para el sitio activo de dicho enzima (Rognstad y Katz, 1979). Por lo tanto, 2,4-DHB puede ser reconocido por otros enzimas y potencialmente degradado. Dichos enzimas pueden identificarse y delecionarse del organismo huésped.
En el caso de que la producción de 2,4-DHB se base en la adición de malato u otros ácidos orgánicos, los microorganismos productores de 2,4-DHB deberían expresar funcionalmente una proteína de transporte membranal que facilite la incorporación del malato (u otros ácidos orgánicos tales como el piruvato, el succinato, etc.).
Los organismos huésped transformados de la exposición pueden contener además una ruta adicional de síntesis de 2,4-DHB; dicho organismo huésped comprende por lo menos un gen quimérico, integrado en su genoma o que se transporta en un elemento genético extracromosómico, por ejemplo un plásmido codificante de una malato quinasa o un gen quimérico que comprende un ácido nucleico codificante de la malato quinasa o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de una malato quinasa, y/o un ácido nucleico codificante de una semialdehído de malato deshidrogenasa, o un gen quimérico que comprende un ácido nucleico codificante de una semialdehído de malato deshidrogenasa o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de una semialdehído de malato deshidrogenasa y/o un ácido nucleico codificante de una DHB deshidrogenasa, un gen quimérico que comprende un ácido nucleico codificante de una DHB deshidrogenasa o un vector de expresión que comprende un ácido nucleico codificante de una DHB deshidrogenasa. Dichos enzimas se describen en la solicitud de patente internacional n° WO 2012/056318.
Los ejemplos siguientes ilustran la invención. Los presentes ejemplos se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no deben interpretarse en modo alguno como limitativas del alcance de la invención.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: (i) esquema de reacción que describe la conversión de (L)-malato, succinil-CoA o glioxilato en (L)-2,4-dihidroxibutirato (2,4-DHB).
Figura 2: la figura muestra (gráfico superior) la actividad sobre semialdehído malónico; (gráfico en la parte intermedia) actividad sobre semialdehído succínico; (gráfico inferior) cambios de especificidad enzimática en comparación con el enzima de tipo salvaje expresados como el logaritmo de la proporción de la actividad mutante sobre semialdehído malónico y semialdehído succínico sobre la proporción de la actividad de tipo salvaje sobre semialdehído malónico y semialdehído succínico. (los valores positivos indican cambios de especificidad en favor del semialdehído malónico).
Figura 3: cromatogramas que muestran la presencia de 2,4-DHB tras la incubación de acetil-CoA 2 mM, glioxilato 2 mM y NADP 2 mM, con diferentes combinaciones de enzimas de la ruta de DHB (reacción 1: malil-CoA liasa (150 pg/ml Me-Mcl), malil-CoA reductasa (100 pg/ml St-Mcr) y semialdehído de malato reductasa (100 pg/ml Ms-SSAred H39R N43H); reacción 2: igual que la reacción 1, aunque utilizando Pg-SucD 100 pg/ml como malil-CoA reductasa; control 1: igual que para la reacción 1, aunque sin malil-CoA reductasa; control 2: igual que para la reacción 1, aunque sin semialdehído de malato reductasa).
Ejemplos
Ejemplo 1: demostración de la actividad de malil-CoA liasa
Construcción de plásmidos que contienen genes de tipo salvaje codificantes de malil-CoA liasa: las secuencias de ADN de los genes mcl codificantes de la malil-CoA liasa en M. extorquens (Arps et al., 1993) y Rhodobacter capsulatus (Meister et al., 2005) se optimizaron para la expresión en Escherichia coli utilizando el software GENEius (Eurofins). Las secuencias optimizadas se sintetizaron mediante Eurofins MWG OPERON® añadiendo los sitios de restricción Nhe\ y EcoRI cadena arriba del codón de inicio y cadena abajo del codón de parada de mcl, respectivamente, que permitió la clonación directa de los fragmentos de ADN sintetizados en el vector pET28a+ (Novagen) utilizando ADN ligasa de T4 (Biolabs). Los productos de ligación se transformaron en células de E. coli DH5a y se aislaron los plásmidos pET28-Mex-mc\ (expresantes de la malil-CoA liasa de M. extorquens) y pET28-Rca-mc\ (expresante de la malil-CoA liasa de R. capsulatus) utilizando protocolos genéticos estándares (Sambrook et al., 1989). Las referencias del NCBI e Integrated Genomics de las secuencias de proteína mcI utilizadas y las referencias para las secuencias de ADN naturales y sintéticas correspondientes se listan en la tabla 1.
Tabla 1: referencias a proteínas de diferentes organismos con actividad anotada de malil-CoA liasa y referencias a secuencias de ADN naturales y optimizadas.
Figure imgf000011_0001
Expresión de los enzimas: Se transformaron células de E. coli BL21 (DE3) con los plásmidos apropiados utilizando protocolos genéticos estándares (Sambrook et al., 1989). Se expresaron enzimas con una etiqueta hexa-his N-terminal en cultivos de 250 ml de LB que se inocularon a partir de un cultivo de durante la noche a DO600 de 0.1 y se cultivaron hasta una DO600 de 0.6 antes de inducir la expresión de las proteínas mediante la adición de isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 1 mM al medio de cultivo. Tras 3 h de expresión de proteínas, se recolectaron las células mediante centrifugación a 13.000 g durante 10 minutos y se descartó el sobrenadante. Los pellets celulares se almacenaron a -20°C hasta el análisis posterior. Se llevó a cabo el crecimiento y la expresión de las proteínas a 37°C. El medio de cultivo contenía 50 pg/l de canamicina.
Purificación de enzimas: los pellets celulares congelados de los cultivos de expresión se resuspendieron en 0.5 ml de tampón de rotura (HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7.5) y se rompieron mediante cuatro rondas sucesivas de sonicación (intervalo de sonicación: 20 s, potencia de salida: 30%, sonicador: Bioblock Scientific, VibraCell™ 72437). Se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugación de los extractos en bruto durante 15 min a 4°C a 13000 g y conservando el sobrenadante clarificado. Se eliminó el ARN y el ADN de los extractos mediante la adición de estreptomicina 15 mg/ml (Sigma), la centrifugación de las muestras a 13.000 g durante 10 min a 4°C y conservando el sobrenadante. El extracto de proteínas clarificado se incubó durante 20 min a temperatura ambiente (1 h a 4°C) con 0.3 (0.75 ml) (volumen de lecho) de resina de afinidad TalonTM Cobalt (Clontech). La suspensión se centrifugó a 700 g en una centrífuga de laboratorio y se eliminó el sobrenadante. La resina se lavó con 10 volúmenes de lecho de tampón de lavado (HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 15 mM, pH 7.5) antes de eluir las proteínas con 0.5 ml de tampón de elución (HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 200 mM, pH 7.5). Se verificó la pureza de los enzimas eluidos mediante análisis de SDS-PAGE. Se estimaron las concentraciones de las proteínas con el procedimiento de Bradford.
Ensayos enzimáticos: se sometió a ensayo la actividad de malil-CoA liasa utilizando un procedimiento adaptado de Meister et al., 2005. La síntesis de malil-CoA por la malil-CoA liasa se acopló a la liberación catalizada por citrato sintasa de coenzima A, que se monitorizó mediante su reacción espontánea con DTNB.
Esquema de reacción
Malil-CoA liasa:
acetil-CoA glioxilato ->(L)-malil-CoA
Citrato sintasa:
(L)-malil-CoA ->(L)-malato Coenzima A
Espontáneo:
coenzima A DTNB -> CoA-DTNB disulfuro
La mezcla de reacción según el Ensayo 1 contenía MOPS/KOH 50 mM (pH 7.5), DTNB 0,25 mM, MgCh 5 mM, acetil-CoA 1 mM, 20 U/ml de citrato sintetasa (todos los productos de Sigma) y cantidades apropiadas de malil-CoA liasa o extracto celular purificado. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de glioxilato 10 mM. Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo a 37°C en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos en un volumen final de 250 pl. Las reacciones se monitorizaron mediante la absorción característica de d Nt B a 412 nm (£dntb+coa=13.6 mM'1 cm-1) en un lector de microplacas (BioRad 680XR).
La malil-CoA liasa purificada de M. extorquens caracterizada presentaba una Vmax de 36 pmoles/(min mg prot) y una Km con glioxilato de 0.5 mM.
Ejemplo 2: demostración de la actividad de malil-CoA reductasa
Construcción de plásmidos que contienen genes de tipo salvaje codificantes de malonil-CoA reductasa y succinil-CoA reductasa: la secuencia de ADN del gen mcr codificante de la malil-CoA reductasa en Sulfolobus tokodaii str 7 (Alber et al., 2006) se optimizó para la expresión en Escherichia coli utilizando el software GENEius (Eurofins). La secuencia de mcr optimizada y la secuencia de ADN natural del gen sucD codificante de la succinil-CoA reductasa en Porphyromonas gingivalis W83 se sintetizaron mediante Eurofins MWG OPERON® añadiendo los sitios de restricción Nhe\ y EcoRI cadena arriba del codón de inicio y cadena abajo del codón de parada de mcr, respectivamente, que permitió la clonación directa de los fragmentos de ADN sintetizados en el vector pET28a+ (Novagen) utilizando ADN ligasa de T4 (Biolabs). Los productos de ligación se transformaron en células de E. coli DH5a y se aislaron los plásmidos pET28-St-mcr (expresantes de la malonil-CoA reductasa de S. tokodaii) y pET28-Pgi-sucD (expresante de la succinil-Co reductasa de P. gingivalis) utilizando protocolos genéticos estándares (Sambrook et al., 1989). Las referencias NCBI de las secuencias de las proteínas mcr y sucD utilizadas y las referencias para las secuencias de ADN naturales y sintéticas correspondientes se listan en la tabla 2.
Tabla 2: las referencias a proteínas de diferentes organismos con actividad anotada de malil-CoA reductasa o succinil-CoA reductasa, y referencias a secuencias de ADN naturales y optimizadas.
Figure imgf000012_0001
La expresión y purificación de Pg-SucD se llevó a cabo tal como se indica en el ejemplo 1, utilizando el plásmido pET28-Pgi-sucD.
El gen St-mcr se amplificó a partir del plásmido pET28-St-mcr utilizando los cebadores 5'-TATAATGAGCTCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGATTCTGATGC GCCGT-3'(SEC ID n° 12) y 5'-TATAATGGATCCCTCGAATTCTTACTTCTC-3' (SEC ID n° 13), que añadieron un sitio de restricción Sacl y un sitio BamHI cadena arrbia del codón de inicio y cadena abajo del codón de parada, respectivamente. El fragmento de PCR se ligó en el vector de expresión pACT3 utilizando los sitios de restricción SacI y BamHI. El plásmido resultante, pACT3-St-Mcr, se transformó en la cepa E. coli MG1655. La cepa de expresión resultante se cultivó sobre medio mineral a 37°C. Un litro de medio mineral contenía 20 g de glucose, 18 g de Na2HPO4 * 12 H2O, 3 g de KH2PO4 , 0.5 g de NaCl, 2 g de NH4Cl, 0.5 g de MgSO4 * 7 H2O, 0.015 g de CaCb * 2 H2O, 1 ml de solución madre de FeCb 0.06 moles/l preparada en HCl concentrado diluido 100 veces, 2 ml de solución madre de HCl de tiamina 10 mM, 20 g de MOpS, 50 pg de sulfato de canamicina (y 25 pg de cloranfenicol en caso necesario), y 1 ml de solución de elementos traza (contenido por litro: 0.04 g de Na2EDTA * 2 H2O, 0.18 g de CoCl2 * 6 H2O, ZnSO4 * 7 H2O, 0.04 g de Na2MoO4 * 2 H2O, 0.01 g de H3BO3 , 0.12 g de MnSO4 * H2O, 0.12 g de CuCb * H2O). El pH del medio se ajustó a 7 y el medio se esterilizó mediante filtración.
Al alcanzar el cultivo en crecimiento exponencial una DO/(600 nm) de 0.6, se añadió IPTG 1 mM y los cultivos se incubaron a 20°C durante 14 h antes de recolectar las células mediante centrifugación (13000xg, 10 min). Tras descartar el sobrenadante, los pellets celulares se almacenaron a -20°C.
Para purificar St-Mcr, los pellets celulares congelados de los cultivos de expresión se resuspendieron en 0.5 ml de tampón de rotura (HEPES 50 mM, NaCl 300 mM, pH 7.5) y se rompieron mediante cuatro rondas sucesivas de sonicación (intervalo de sonicación: 20 s, potencia de salida: 30%, sonicador: Bioblock Scientific, VibraCell™ 72437). Se eliminaron los residuos celulares mediante centrifugación de los extractos en bruto durante 15 min a 4°C a 13000 x g y conservando el sobrenadante clarificado. Las proteínas nativas de E. coli se separaron mediante precipitación por calor a 85°C durante 30 min, seguido de centrifugación a 13000 x g. La pureza de las preparaciones de proteínas se analizó mediante análisis de SDS-PAGE, que mostró únicamente una banda correspondiente al tamaño esperado de la proteína St-Mcr.
Ensayos enzimáticos: se sometió a ensayo la actividad de malil-CoA reductasa en el sentido reductor y en el sentido oxidativo de la reacción utilizando el Ensayo 1 o el Ensayo 2, respectivamente.
Ensayo 1 (esquema de reacción):
Malil-CoA liasa:
glioxilato acetil-CoA -> malil-CoA acetato
Malil-CoA reductasa:
(L)-Malil-CoA NADPH -> semialdehído de (L)-malato Coenzima A NADP
Ensayo 2 (esquema de reacción):
semialdehído de (L)-malato Coenzima A NADP -> (L)-Malil-CoA NADPH
La mezcla de reacción según el Ensayo 1 contenía MOPS/KOH 50 mM (pH 7.5), glioxilato 10 mM, acetil-CoA 4 mM, MgCl2 5 mM y NADP 0.25 mM (todos los productos de Sigma), 5 U/ml de malil-CoA liasa y cantidades apropiadas de malil-CoA reductasa o extracto celular purificado. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de glioxilato. Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo a 37°C en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos en un volumen final de 250 pl. Las reacciones se monitorizaron mediante la absorción característica de NADPH a 340 nm (£nadph=6.22 mM'1 cirr1) en un lector de microplacas (BioRad 680XR).
La mezcla de reacción según el Ensayo 2 contenía HEPES 200 mM (pH 9), MgCh 5 mM, NADP 1 mM, coenzima A 0.5 mM (todos los productos de Sigma) y cantidades apropiadas de malil-CoA reductasa purificada. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de semialdehído de (L)-malato 5 mM. Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo a 37°C en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos en un volumen final de 250 pl. Las reacciones se monitorizaron mediante la absorción característica de NADPH a 340 nm (£nadph=6.22 mM-1 cm-1) en un lector de microplacas (BioRad 680XR). Se produjo semialdehído de malato inestable nuevamente antes de los ensayos enzimáticos mediante la desprotección del derivado semialdehído de malato estable 2-[(4S)-2,2-dimetil-5-oxo-1,3-dioxolán-4-il]acetaldehído (DMODA) (proporcionado por Activation®). El semialdehído de malato se obtuvo mediante disolución de cantidades apropiadas de DMODA en ácido clorhídrico 2 M, calentamiento breve de la suspensión hasta la temperatura de ebullición y dejando la suspensión caliente durante 15 min a temperatura ambiente. La acetona liberada se evaporó a 35°C y 50 mbar en un evaporador giratorio. El pH de la solución de semialdehído de malato se fijó en 3.5 utilizando bicarbonato sódico.
Los resultados proporcionados en las tablas 3 y 4 muestran la actividad de malil-CoA reductasa para la malonil-CoA reductasa, Mcr, de S. tokodaii y la succinil-CoA reductasa, SucD, de P. gingivalis.
Tabla 3: parámetros cinéticos para el sentido reductor de reacción (las actividades de malonil-CoA reductasa y succinil-CoA reductasa se estimaron mediante la adición directa de los sustratos malonil-CoA o succinil-CoA a la mezcla de reacción).
Figure imgf000013_0001
Tabla 4: parámetros cinéticos para el sentido oxidativo de la reacción
Figure imgf000014_0002
Ejemplo 3: demostración de la actividad de DHB deshidrogenasa
Con el fin de identificar una 2,4-DHB-deshidrogenasa adecuada, se sometieron a ensayo beta-hidroxiácido deshidrogenasas de diferentes fuentes biológicas para su capacidad de reducir el semialdehído de malato. Entre los enzimas sometidos a ensayo se encontraban la metilbutiraldehído reductasa de Saccharomyces cerevisiae, Ypr1 (Ford y Ellis, 2002) (SEC ID n° 14), la 4-hidroxibutirato deshidrogenasa, 4hbdh, de P. gingivalis (SEC ID n° 187), la alcohol deshidrogenasa YqhD de E. co li(SEC ID n° 185), y la semialdehído succínico reductasa Ms-Ssr de Metallosphaera sedula (Kockelkorn y Fuchs, 2009) (SEC ID n° 16). Los genes YPR1, 4hbdh, yqhD y Ms-SSR se amplificaron utilizando cebadores listados en la tabla 5 y se clonaron en el vector pET28 (enzimas de restricción; véase la tabla 5), rindiendo los plásmidos pET28-Sce-YPR1, pET28-Pgi-4hbdh, pET28-Eco-yqhd y pET28-Mse-SSR, respectivamente. Las proteínas se expresaron y purificaron tal como se ha indicado en el ejemplo 1.
Tabla 5. Cebadores y enzimas de restricción utilizados para clonar beta-hidroxiácido deshidrogenasas candidatas
Figure imgf000014_0001
Ensayo de la actividad de semialdehído de malato reductasa:
Esquema de reacción:
Semialdehído de (L)-malato + NAD(P)H ^ ácido (L)-2,4-dihidroxibutírico + NAD(P)
La mezcla de ensayo contenía Hepes 200 mM (pH 7.5), KCl 50 mM, MgCl2 5 mM, NADH o NADPH 0.24 mM, y cantidades apropiadas de enzima o extracto celular purificado. Las reacciones se iniciaron mediante la adición de semialdehído de (L)-malato 10 mM (el semialdehído de malato se preparó nuevamente para cada ensayo; véase el ejemplo 3). Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo a 30°C en placas de microtitulación de fondo plano de 96 pocillos en un volumen final de 250 pl. Las reacciones se monitorizaron mediante la absorción característica de NAD(P)H a 340 nm (£nadph=6.22 mM'1 cm-1) en un lector de microplacas (BioRad 680XR). Se listan los resultados en la tabla 6.
Tabla 6: actividad reductora de beta-hidroxiácido deshidrogenasas seleccionadas del semialdehído de malato (los resultados son lasmedias de por lo menos dos experimentos independientes).
Figure imgf000015_0001
La semialdehído succínico deshidrogenasa de M. sedula y la metilbutiraldehído reductasa de S. cerevisiae presentan actividad de semialdehído de malato reductasa. La Km de Ms-SSR para el semialdehído de malato era de 4 mM.
Ejemplo 4: construcción racional de un enzima malil-CoA reductasa mejorado
La mutagénesis dirigida a sitio se llevó a cabo utilizando las parejas de oligonucleótidos listadas en la tabla 7 y el plásmido pET28-Sto-mcr como molde. Se introdujeron mediante PCR mutaciones puntuales para modificar la secuencia de aminoácidos (Phusion 1 U, tampón Hf al 20% (v/v), dNTP 2.5 mM, cebadores directos e inversos: 1 pM de cada uno, plásmido molde: 200 ng, agua). En caso posible, los plásmidos creados mediante PCR contenían nuevos sitios de restricción (introducidos utilizando mutaciones silenciosas) además de la mutación funcional para facilitar la identificación de los clones mutados. Los productos de PCR se digirieron mediante Dpnl a 37°C durante 2 x 2 h para eliminar el ADN molde y se transformaron en células de E. coli DH5-a NEB competentes (NEB) Los plásmidos mutados se identificaron mediante análisis de los sitios de restricción y se verificó que portaban las mutaciones deseadas mediante secuenciación del ADN.
Tabla 7: parejas de cebadores utilizadas para mutar el gen mcr de S. tokodaii
Figure imgf000015_0002
El impacto de las modificaciones genéticas de St-Mcr se sometió a ensayo en el sentido oxidativo de la reacción utilizando el Ensayo 3 descrito en el ejemplo 2. La figura 3 muestra que la sustitución de Tyr206 natural por otros aminoácidos reduce la actividad sobre el sustrato natural, el semialdehído succínico, causando simultáneamente una actividad incrementada, o por lo menos constante, sobre el semialdehído de malato. De esta manera, la sustitución de Tyr206 por residuos aminoácidos apropiados proporciona una ventaja selectiva respecto a la especificidad de Mcr para el intermediario de la ruta de DHB.
Por lo tanto, los residuos aminoácidos preferentes en la posición 206 son fenilalanina, histidina, isoleucina, lisina, metionina, glicina, asparagina, prolina, arginina, glutamina, leucina, serina, triptófano y treonina.
La proteína en la que la tirosina 206 ha sido sustituida por un residuo de prolina se representa mediante la SEC ID n° 202.
Ejemplo 5: construcción racional de una DHB deshidrogenasa mejorada
La mutagénesis dirigida a sitio se llevó a cabo utilizando las parejas de oligonucleótidos listadas en la tabla 6 y el plásmido pET28-Mse-SSR como molde. Se introdujeron mediante PCR mutaciones puntuales para modificar la secuencia de aminoácidos (Phusion 1 U, tampón HF al 20% (v/v), dNTP 2.5 mM, cebadores directos e inversos: 1 pM de cada uno, plásmido molde: 200 ng, agua). En caso posible, los plásmidos creados mediante PCR contenían nuevos sitios de restricción (introducidos utilizando mutaciones silenciosas) además de la mutación funcional para facilitar la identificación de los clones mutados. Los productos de PCR se digirieron con Dpnl a 37°C durante 2 x 2 h para eliminar el ADN molde y se transformaron en células de E. coli DH5-a NEB competentes (NEB) Los plásmidos mutados se identificaron mediante análisis de los sitios de restricción y se verificó que portaban las mutaciones deseadas mediante secuenciación del ADN. La tabla 8 resume los parámetros cinéticos de los mutantes. Los resultados demuestran que el doble mutante Ms-SSR H39R N43H (SEC ID n° 38) presenta una afinidad mejorada para el semialdehído de malato en comparación con el enzima de tipo salvaje.
Tabla 8: parejas de cebadores utilizadas para mutar la semialdehído succínico reductasa de M. sedula (Ms-SSR)
Figure imgf000016_0001
Tabla 9: resumen de los parámetros cinéticos de los mutantes de la semialdehído succínico reductasa de M.
sedula (Ms-SSR) (los resultados son las medias de por lo menos dos experimentos independientes).
Figure imgf000016_0003
Las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes están representadas por la SEC ID n° 17, SEC ID n° 33, SEC ID n° 35 y SEC ID n° 37.
La secuencia codificante de la semialdehído succínico reductasa de M. sedula que incluye las mutaciones H39R y N43H se optimizó para la expresión máxima en E. coli utilizando el software GeneOptimizer®. El gen sintético fue producido por GeneArt® Gene Synthesis (Invitrogen Life Technologie). Se introdujeron los sitios de restricción Nhel y EcoRI cadena arriba del codón de inicio y cadena abajo del codón de parada, respectivamente, permitiendo la clonación directa en pET28a+ (Novagen).
Se aisló el plásmido pET28-Mse-DHB-Dh-H39R_N43H-opt resultante y se demostró mediante secuenciación del ADN que contenía el gen SSR H39R N43H de longitud completa de M. sedula que presentaba la secuencia correcta (SEC ID n° 38).
Ejemplo 6: demostración de la producción in vitro de DHB mediante la ruta sintética de malil-CoA
Los enzimas malil-CoA liasa (Me-McI), malil-CoA reductasa (St-Mcr o Pg-SucD) y DHB deshidrogenasa (Ms-SSA-red H39N N43H) se expresaron y se purificaron tal como se indica en los ejemplos 1, 2 y 3.
La producción de DHB mediante la ruta que comprende malil-CoA liasa, malil-CoA reductasa y DHB deshidrogenasa se demostró in vitro mediante la adición de glioxilato 2 mM a una mezcla de reacción que contenía HEPES 50 mM (pH 7.5), acetil-CoA 2 mM, NADPH 2 mM, 100 pg/ml de DHB deshidrogenasa, 150 pg/ml de malil-CoA liasa y 100 pg/ml de malil-CoA reductasa (que era St-Mcr (reacción 1) o Pg-SucD (reacción 2)).
Las reacciones de control contenían todos los componentes, aunque no presentaban DHB deshidrogenasa (Control 1) o malil-CoA reductasa (Control 2). Tras 120 min de incubación a 37°C, se analizó el contenido de DHB en la mezcla de reacción mediante cromatografía de gases [GCMS-QP2010, Ultra Shimadzu, dotado de un detector de FID (FID-2010 Plus Shimadzu); automuestreador AOC20s (Shimadzu); inyector splitless AOC20i (Shimadzu) (230°C); columna: Zebron ZB-FFAP, 30 m x 0.25 mm, df 0.25 pm; y mezclador ("liner"): Tapered focus Liner5 x 95 x 3.4 mm (SGE). El gas portador era hidrógeno, a un caudal total de 25 ml/min. La ionización de llama se llevó a cabo utilizando una mezcla de aire-hidrógeno (los caudales eran 300 ml/min. y 30 ml/min., respectivamente). La temperatura del detector era 240°C. Volumen de muestra inyectado: 1 pl. En la tabla 10 se proporciona un programa de temperaturas.
Los cromatogramas que muestran la presencia de DHB en las reacciones que contenían todos los enzimas de la ruta y ausencia de DHB en muestras que contenían únicamente dos de los tres enzimas de la ruta se muestra en la figura 2.
Tabla 10: programa de temperaturas para el análisis de CG de las mezclas de reacción
Figure imgf000016_0002
Ejemplo 7: construcción de cepas productoras de DHB optimizadas
Construcción de un plásmido para la expresión simultánea de malil-CoA sintetasa, malil-CoA reductasa y DHB deshidrogenasa:
La secuencia codificante de la malil-CoA liasa de M. extorquens, Me-mcl, se amplificó a partir del plásmido pET28-Mex-mcl utilizando la polimerasa Phusion de alta fidelidad (Fermentas) y los cebadores directo e inverso 5'-TCACACAGGAAACAGAATTCGAGCTCGGTAATGTCGTTTACCCTGATTCAG CAAGCGACT-3' (SEC ID n° 39) y 5'-GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTTATTTGCCGCCCATTGCATCCGCTT TCTG-3' (SEC ID n° 40) que contenían sitios de restricción para SacI cadena arriba del codón de inicio (subrayado). La secuencia codificante de la malonil-CoA reductasa de S. tokodaii, St-mcr, se amplificó a partir del plásmido pET28-Sto-mcr utilizando los cebadores directo e inverso 5'-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGATTCTGATGCGCCGTACCCTGA AAGCG-3' (SEC ID n° 41) y 5'-GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACTTACTTCTCGATGTAGCCTTTCTCCA CGAG-3' (SEC ID n° 42) que contenían los sitios de restricción para BamHI cadena abajo del codón de parada. El plásmido pET28-Mse-DHB-Dh-H39R_N43H-opt (Ejemplo 5) se utilizó como el molde para amplificar la secuencia codificante optimizada de la semialdehído succínico reductasa H39R N43H de M. sedula utilizando los cebadores directo e inverso 5'-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAAGCAGCAGTTCTGCATACCT ATAAAGAACCGCTGAGCAT-3' (SEC ID n° 43) y 5'-ATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTACGGAATAATCAGGCTACGA ATTGCTTC-3' (SEC ID n° 44) que introducían un sitio de restricción BamHI cadena abajo del codón de parada (subrayado).
Los cebadores directos para St-mcr y la semialdehído succínico reductasa H39R N43H de M. medula contenían un motivo rbs. Los tres genes se clonaron simultáneamente en el vector de expresión pACT3 mediante recombinación homóloga utilizando el kit de clonación In-Fusion (Clontech).
Se aisló el plásmido pACT3-MCL-DHB resultante (SEC ID n° 45) y se demostró mediante secuenciación de ADN que contenía la secuencia correcta.
Construcción de un plásmido para la expresión simultánea de malil-CoA sintetasa, malil-CoA reductasa y DHB deshidrogenasa:
Las secuencias de ADN codificantes de las dos subunidades de proteína de la malil-CoA sintetasa, mtkA (YP_00296285) y mtkB (YP_002962852), de Methylobacterium extorquens AM1 se optimizaron para la expresión en Escherichia coli utilizando el software GENEius (Eurofins). Las secuencias de ADN optimizadas de la subunidad se unieron físicamente mediante la secuencia de ADN natural entre los genes mtkA y mtkB en el genoma de M. extorquens (CGAACGGGGGAGGAATCACGCC, SEC ID n° 46). El fragmento de ADN resultante, 'gen mtkA - ADN conector - gen mtkB', fue sintetizado por Eurofins MWG OPERON® y subclonado en el vector de expresión pET28b utilizando los enzimas de restricción NheI y EcoRI. El plásmido de ADN resultante pET28-Mex-mtkAB ( s E c ID n° 47) se utilizó para amplificar simultáneamente los dos genes de codones optimizados codificantes de malil-CoA sintetasa de M. extorquens, Me-mtkA y Me-mtkB utilizando la polimerasa de alta fidelidad Phusion (Fermentas) y los cebadores directo e inverso 5'-CAGGAAACAGAATTCGAGCTCGGTAATGGATGTGCACGAATATCAGGCGA AAGAACTGCT-3' (SEC ID n° 48) y 5'-TACGGCGCATCAGAATCATtacgccgcacgtgctaacacatcggcaac-3' (SEC ID n° 49) que contenían sitios de restricción para SacI cadena arriba del codón de inicio (subrayado). La secuencia codificante de la malonil-CoA reductasa de S. tokodaii, St-mcr, se amplificó a partir del plásmido pET28-Sto-mcr utilizando los cebadores directo e inverso 5'-GGCGTAATGATTCTGATGCGcCGTACCCTGAAAGCG-3' (SEC ID n° 50) y 5'-CTGCTGCTTTCATTACTTCTCGATGTAGCCTTTCTCCACGAG-3' (SEC ID n° 51) que contenían los sitios de restricción para BamHI cadena abajo del codón de parada. El plásmido pET28-Mse-DHB-Dh-H39R_N43H-opt (Ejemplo 5) se utilizó como el molde para amplificar la secuencia codificante optimizada de la semialdehído succínico reductasa H39R N43H de M. sedula utilizando los cebadores directo e inverso 5'-TACATCGAGAAGTAATGAAAGCAGCAGTTCTGCATACCTATAAAGAAC-3' (SEC ID n° 52) y 5'-CCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCTTACGGAATAATCAGGCTACGAATT GCTTCAC-3' (SEC ID n° 53) que introducían un sitio de restricción BamHI cadena abajo del codón de parada (subrayado).
Los tres genes se clonaron simultáneamente en el vector de expresión pEXT20 mediante recombinación homóloga utilizando el kit de clonación In-Fusion (Clontech).
Se aisló el plásmido pEXT20-MCS-DHB resultante (SEC ID n° 54) y se demostró mediante secuenciación de ADN que contenía la secuencia correcta.
Construcción de plásmidos para la sobreexpresión de los enzimas fosfoenolpiruvato (PEP) carboxiquinasa, PEP carboxilasa, piruvato quinasa, piruvato carboxilasa e isocitrato liasa, y la simportador de galactosa permeasa:
El plásmido pACT3-pck que alojaba el gen pck codificante de la PEP carboxiquinasa de E. coli se construyó mediante la amplificación de la secuencia codificante de pck utilizando ADN genómico de E. coli MG1655 como el molde y los cebadores directo e inverso 5'TATAATCCCGGGATGCGCGTTAACAATGGTTTGACC3' (SEC ID n° 56) y 5'TATAATTCTAGATTACAGTTTCGGACCAGCCG3' (SEC ID n° 57), respectivamente. Se digirió el fragmento de DNA con XmaI y Xbal, se ligó en los sitios correspondientes del vector de expresión pACT3 (Dykxhoorn et al., 1996) utilizando ADN ligasa de T4 (Biolabs) y se transformó en células de E. coli DH5a. Los transformantes se seleccionaron en medio LB sólido que contenía cloranfenicol (25 pg/ml). Se aisló el plásmido resultante y se verificó la inserción correcta del gen pck mediante secuenciación. Se construyeron los plásmidos pACT3-aceA, pACT3-ppc, pACT3-galP, pACT3-pck y pACT3-pyc, que alojaban aceA, ppc, galP, o pykA(todos de E. coli) o pck de Lactococcus lactis, respectivamente, utilizando los cebadores listados en la tabla 11.
Tabla 11: cebadores utilizados para la construcción de plásmidos para la sobreexpresión génica. Los sitios de restricción utilizados para la clonación en pACT3 están subrayados.
Figure imgf000018_0001
Se entiende que la eliminación del gen lacI del esqueleto de los plásmidos anteriormente indicados junto con la deleción genómica de lacl en la cepa huésped pueden convertir la expresión de proteína a partir de los plásmidos anteriormente indicados en constitutiva.
Construcción de cepas con flujo de carbono optimizado distribuyendo la producción de DHB
Se interrumpieron varios genes en E. coli cepa MG1655 a fin de optimizar la distribución de flujos de carbono y el suministro de cofactores para la producción de DHB. Las deleciones génicas se llevaron a cabo utilizando el procedimiento de recombinasa roja de lambda según Datsenko et al. (Datsenko y Wanner, 2000) o el procedimiento de transducción fágica adaptado de Miller (Miller, 1992).
El protocolo para la introducción de deleciones génicas utilizando el procedimiento de recombinasa roja de lambda: los casetes de deleción se prepararon mediante PCR utilizando la polimerasa de alta fidelidad Phusion™ (Finnzymes) y el gen de resistencia a canamicina (kan) flanqueado por FRT del plásmido pKD4 como el molde (Datsenko y Wanner, 2000). Los cebadores de sentido contenían secuencias correspondientes al extremo 5' de cada gen diana (subrayado) seguido de 20 pb correspondientes al casete FRT-kan-FRT de pKD4. Los cebadores antisentido contenían secuencias correspondientes a la región de extremo 3' de cada gen diana (subrayado) seguido de 20 pb correspondientes al casete. Los cebadores se indican en la tabla 12. Los productos de p Cr se digirieron con DpnI y se purificaron antes de la transformación.
La cepa E. coli MG1655 se convirtió en electrocompetente mediante el cultivo de las células a una DO600 de 0.6 en medio líquido LB a 37°C, concentrando las células 100 veces y lavándolas dos veces con glicerol al 10% helado. Las células se transformaron con el plásmido pKD46 (Datsenko y Wanner, 2000) mediante electroporación (2.5 kV, 200 O, 25 pF, en cubetas de 2 mm de hueco). Los transformantes se seleccionaron a 30°C en medio sólido LB con ampicilina (100 pg/ml).
Se transformaron los casetes de disrupción en cepas de E. coli electrocompetentes que alojaban el plásmido pKD46 expresantes de recombinasa roja de lambda. Las células se cultivaron a 30°C en medio SOB líquido que contenía ampicilina (100 pg/ml). El sistema de recombinasa roja de lamba se indujo mediante la adición de arabinosa 10 mM al alcanzar la DO600 de los cultivos 0,1. Las células se cultivaron adicionalmente a una DO600 de 0.6 antes de recolectarlas mediante centrifugación, se lavaron dos veces con glicerol al 10% helado y se transformaron con el casete de disrupción mediante electroporación. Tras una expresión fenotípica de durante la noche a 30°C en medio líquido LB, las células se sembraron en medio LB sólido que contenía 25 pg/ml de canamicina. Los transformantes se seleccionaron tras el cultivo a 30°C.
La sustitución génica se verificó mediante PCR de las colonias utilizando la polimerasa Taq Crimson (NEB). Se llevó a cabo una primera reacción con los cebadores específicos de locus flanqueantes (véase la tabla 12) para verificar la pérdida simultánea del fragmento parental y la ganancia del nuevo fragmento específico mutante. Se llevaron a cabo dos reacciones adicionales mediante la utilización de un cebador específico de locus junto con uno de los cebadores correspondientes, k1 rev o k2for (véase la tabla 12) que se alinean con el casete de resistencia a canamicina-FRT (cebador de locus de sentido/k1rev y k2for/cebador de locus inverso).
El gen de resistencia (FRT-kan-FRT) se extrajo seguidamente del cromosoma utilizando el plásmido que aloja recombinasa FLP pCP20 (Cherepanov y Wackernagel, 1995), dejando una región cicatriz que contenía un sitio de FRT. El plásmido pCP20 es un plásmido de ampicilina y CmR que muestra replicación sensible a la temperatura e inducción térmica de la síntesis de recombinasa FLP. Se transformaron mutantes resistentes a canamicina con pCP20 y se seleccionaron transformantes resistentes a la ampicilina a 30°C. A continuación, los transformantes se cultivaron sobre medio LB sólido a 37°C y se sometieron a ensayo para la pérdida de todas las resistencias a antibiótico. La extracción del casete de FRT-canamicina se analizó mediante PCR de colonias utilizando polimerasa Taq Crimson y los cebadores específicos de locus flanqueantes (Tabla 12). Se obtuvieron deleciones múltiples mediante repetición de las etapas anteriormente indicadas.
Tabla 12: cebadores utilizados para disrupciones génicas. Las secuencias homólogas a los genes diana están subrayadas.
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Tabla 13: parejas de cebadores utilizadas para la verificación de las disrupciones génicas
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000021_0001
El protocolo de introducción de deleciones génicas utilizando el procedimiento de transducción fágica: se obtuvieron cepas portadoras de las deleciones individuales deseadas a partir de la colección Keio (Baba et al., 2006). Se prepararon lisados fágicos de mutantes de deleción individual mediante inoculación de 10 ml de medido LB que contenía 50 pg/ml de canamicina, 2 g/l de glucosa y CaCl25 mM con 100 pl de precultivos de durante la noche. Tras una incubación de 1 h a 37°C, se añadieron 200 pl de lisado fágico preparados a partir de la cepa MG1655 de tipo salvaje y se incubaron los cultivos durante 2 a 3 h adicionales hasta completar la lisis celular. Tras la adición de 200 pl de cloroformo, las preparaciones celulares en primer lugar se agitaron vigorosamente con vórtex y después se centrifugaron durante 10 min a 4500 x g. El lisado clarificado se recuperó y se almacenó a 4°C.
La cepa receptora se preparó mediante transducción fágica mediante un cultivo durante la noche a 37°C en medio LB. Un volumen de 1.5 ml de precultivo se centrifugó a 1500 x g durante 10 min. Se descartó el sobrenadante y el pellet celular se resuspendió en 600 pl de una solución que contenía MgSÜ410 mM y CaCl25 mM. La transducción se llevó a cabo mediante la mezcla de 100 pl de la solución que contenía la cepa receptora con 100 pl de lisado e incubación de dicha mezcla a 30°C durante 30 min. Después, se añadieron 100 pl de una solución de citrato sódico 1 M seguido de agitación con vórtex vigoroso. T ras la adición de 1 ml de medio L b , la suspensión celular se incubó a 37°C durante 1 h antes de extender las células sobre placas de agar LB que contenía 50 pg/ml de canamicina. Los clones capaces de crecer en presencia del antibiótico se confirmaron mediante PCR de las colonias para contener la deleción deseada utilizando los cebadores listados en la tabla 13. Tras la introducción de cada deleción génica, se extrajo el marcador antibiótico tal como se ha indicado anteriormente, siguiendo el procedimiento de Cherepanov y Wackernagel, 1995.
Los plásmidos coexpresantes de malil-CoA sintetasa, malil-CoA reductasa y DHB deshidrogenasa (pEXT20-MCS-DHB o pACT3-MCS-DHB), o plásmidos coexpresantes de malil-CoA liasa, malil-CoA reductasa y DHB deshidrogenasa (pEXT20-MCL-DHB o pACT3-MCL-DHB), o los plásmidos de control vacíos (pEXT20 o pACT3) se transformaron solos o junto con uno de los plásmidos pACT3-aceA, pACT3-ppc, pACT3-galP, pACT3-pck o pACT3-pyc en las cepas huésped optimizadas. Los transformantes que contenían tanto un plásmido expresante de los enzimas de la ruta de d H b y un plásmido expresante de un enzima anaplerótico se seleccionaron en medio LB sólido que contenía cloranfenicol (25 pg/ml) y canamicina (50 pg/ml). Se listan ejemplos no exclusivos de cepas construidas en la tabla 14.
Tabla 14: ejemplos de cepas construidas para la producción de DHB
Figure imgf000021_0002
Figure imgf000022_0001
Ejemplo 8: demostración de la producción zimótica de DHB mediante la ruta sintética de malil-CoA
Cepas y condiciones de cultivo: los experimentos se llevaron a cabo utilizando la cepa ECE69, que expresaba la ruta de DHB a partir del plásmido pACT3-MCL-DHB representada por la SEC ID n° 203 (el enzima Mcr de tipo salvaje se sustituyó por el mutante Mcr Tyr206Pro en el presente experimento) y la cepa de control isogénica ECE70 que contenía el plásmido vacío pACT3. Todos los cultivos se llevaron a cabo a 37°C en un agitador rotatorio Infors funcionando a 170 rpm. Los cultivos de durante la noche (3 ml de medio en probeta) se inocularon a partir de reservas en glicerol y se utilizaron para ajustar una DO600 inicial de 0.05 en cultivos de 100 ml cultivados en matraces de agitación de 500 ml. Se añadió IPTG a una concentración de 1 mmol/l al alcanzar la DO600 de los cultivos un valor de 1. La composición del medio mineral de cultivo se proporciona en el ejemplo 2.
Estimación de la concentración de DHB mediante análisis de CL-EM/EM: se cuantificó la DHB utilizando CL-EM: se llevó a cabo la cromatografía de intercambio aniónico líquido en un sistema ICS-3000 de Dionex (Sunnyvale, EE.UU.) dotado de un sistema generador de eluyente automático (KOH) (RFIC, Dionex) y un automuestreador (AS50, Dionex) que mantiene las muestras a 4°C. Los analitos se separaron en una columna lonPac AS11 HC (250 x 2 mm, Dionex) protegida con una precolumna AG11 HC (50 x 2 mm, Dionex). La temperatura de la columna se mantuvo a 25°C; el caudal se fijó en 0.25 ml/min y los analitos se eluyeron aplicando el gradiente de KOH indicado anteriormente (Groussac E, Ortiz M y Francois J, Improved protocols for quantitative determination of metabolites from biological samples using high performance ionic-exchange chromatography with conductimetric and pulsed amperometric detection. Enzyme. Microb. Technol.26, 715-723, 2000). El volumen de muestra inyectado era de 15 pl. Para la reducción del fondo, se utilizó un supresor aniónico ASRS ultra II (2 mm, modo acuoso externo, 75 mA). Los analitos se cuantificaron con un detector sensible a la masa (MSQ Plus, Thrmo) operando en modo ESI (división de 1/3, presión de nitrógeno de 90 psi, voltaje capilar de 3.5 kV, temperatura de la sonda: 450°C).
Resultados: tras 24 h de cultivo, el sobrenadante de las cepas ECE69 y ECE70 contenía DHB 0.05 mM y DHB 0 mM, respectivamente, demostrando la producción de DHB por la vía sintética.
Referencias
Akita, O., Nishimori, C., Shimamoto, T., Fujii, T. & lefuji, H. (2000). Transport of pyruvate in Saccharomyces cerevisiae and cloning of the gene encoded pyruvate permease. Biosci Biotechnol Biochem 64, 980-984. Alber, B., Olinger, M., Rieder, A., Kockelkorn, D., Jobst, B., Hügler, M. & Fuchs, G. (2006). Malonyl-coenzyme A reductase in the modified 3-hydroxypropionate cycle for autotrophic carbon fixation in archaeal Metallosphaera and Sulfolobus spp. J Bacteriol 188, 8551-8559.
Arps, P. J., Fulton, G. F., Minnich, E. C. & Lidstrom, M. E. (1993). Genetics of serine pathway enzymes in Methylobacterium extorquens AMI: phosphoenolpyruvate carboxylase and malyl coenzyme A lyase. J Bacteriol 175, 3776-3783.
Auriol, C., Bestel-Corre, G., Claude, J.-B., Soucaille, P. & Meynial-Salles, I. (2011). Stress-induced evolution of Escherichia coli points to original concepts in respiratory cofactor selectivity. Proc Natl Acad Sci U S A 108, 1278-1283.
Baba, T., Ara, T., Hasegawa, M., Takai, Y., Okumura, Y., Baba, M., Datsenko, K. A., Tomita, M., Wanner, B. L. & Mori, H. (2006). Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol 2, 2006-0008.
Bailey, J. E. (1991). Toward a science of metabolic engineering. Science 252, 1668-1675.
Camarasa, C., Bidard, F., Bony, M., Barre, P. & Dequin, S. (2001). Characterization of Schizosaccharomyces pombe malate permease by expression in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 67, 4144-4151. Cherepanov, P. P. & Wackernagel, W. (1995). Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158, 9-14.
Chistoserdova, L., Kalyuzhnaya, M. G. & Lidstrom, M. E. (2009). The expanding world of methylotrophic metabolism. Annu Rev Microbiol 63, 477-499.
Datsenko, K. A. & Wanner, B. L. (2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6640-6645.
Ford, G. & Ellis, E. M. (2002). Characterization of Yprlp from Saccharomyces cerevisiae as a 2-methylbutyraldehyde reductase. Yeast Chichester Engl 19, 1087-1096.
Friedmann, S., Steindorf, A., Alber, B. E. & Fuchs, G. (2006). Properties of succinyl-coenzyme A:L-malate coenzyme A transferase and its role in the autotrophic 3-hydroxypropionate cycle of Chloroflexus aurantiacus. J Bacteriol 188, 2646-2655.
Grobler, J., Bauer, F., Subden, R. E. & Van Vuuren, H. J. (1995). The mae1 gene of Schizosaccharomyces pombe encodes a permease for malate and other C4 dicarboxylic acids. Yeast Chichester Engl 11, 1485-1491. Groeneveld, M., Weme, R. G. J. D. O., Duurkens, R. H. & Slotboom, D. J. (2010). Biochemical characterization of the C4-dicarboxylate transporter DctA from Bacillus subtilis. J Bacteriol 192, 2900-2907.
Jantama, K., Zhang, X., Moore, J. C., Shanmugam, K. T., Svoronos, S. A. & Ingram, L. O. (2008a). Eliminating side products and increasing succinate yields in engineered strains of Escherichia coli C. Biotechnol Bioeng 101, 881-893.
Jantama, K., Haupt, M. J., Svoronos, S. A., Zhang, X., Moore, J. C., Shanmugam, K. T. & Ingram, L. O. (2008b). Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains of Escherichia coli C that produce succinate and malate. Biotechnol Bioeng 99, 1140-1153.
Kawasaki, T., Koita, H., Nakatsubo, T., Hasegawa, K., Wakabayashi, K., Takahashi, H., Umemura, K., Umezawa, T. & Shimamoto, K. (2006). Cinnamoyl-CoA reductase, a key enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small GTPase Rac in defense signaling in rice. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 230-235.
Kockelkorn, D. & Fuchs, G. (2009). Malonic semialdehyde reductase, succinic semialdehyde reductase, and succinyl-coenzyme A reductase from Metallosphaera sedula: enzymes of the autotrophic 3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate cycle in Sulfolobales. J Bacteriol 191, 6352-6362.
Larkin, M. A., Blackshields, G., Brown, N. P., Chenna, R., McGettigan, P. A., McWilliam, H., Valentin, F., Wallace, I. M., Wilm, A. & other authors. (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinforma Oxf Engl 23, 2947-2948.
Lin, H., Bennett, G. N. & San, K.-Y. (2005). Metabolic engineering of aerobic succinate production systems in Escherichia coli to improve process productivity and achieve the maximum theoretical succinate yield. Metab Eng 7, 116-127.
Meister, M., Saum, S., Alber, B. E. & Fuchs, G. (2005). L-malyl-coenzyme A/beta-methylmalyl-coenzyme A lyase is involved in acetate assimilation of the isocitrate lyase-negative bacterium Rhodobacter capsulatus. J Bacteriol 187, 1415-1425.
Millard, C. S., Chao, Y. P., Liao, J. C. & Donnelly, M. I. (1996). Enhanced production of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 62, 1808-1810. Miller, J. H. (1992). A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichica coli and Related Bacteria. Plainview (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Rognstad, R. & Katz, J. (1979). Effects of 2,4-dihydroxybutyrate on lipogenesis in rat hepatocytes. J Biol Chem 254, 11969-11972.
Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sanchez, A. M., Bennett, G. N. & San, K.-Y. (2005). Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng 7, 229-239.
Sauer, U. & Eikmanns, B. J. (2005). The PEP-pyruvate-oxaloacetate node as the switch point for carbon flux distribution in bacteria. Fems Microbiol Rev 29, 765-794.
Seedorf, H., Fricke, W. F., Veith, B., Brüggemann, H., Liesegang, H., Strittmatter, A., Miethke, M., Buckel, W., Hinderberger, J. & other authors. (2008). The genome of Clostridium kluyveri, a strict anaerobe with unique metabolic features. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 2128-2133.
Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Ito, A., Ohfu, M., Hirose, S. & Kuhara, T. (2002). Rapid and sensitive detection of urinary 4-hydroxybutyric acid and its related compounds by gas chromatography-mass spectrometry in a patient with succinic semialdehyde dehydrogenase deficiency. J Chromatogr B Anal Technol Biomed Life Sci 776, 57-63.
Smejkalová, H., Erb, T. J. & Fuchs, G. (2010). Methanol assimilation in Methylobacterium extorquens AMI: demonstration of all enzymes and their regulation. Plos One 5.
Sohling, B. & Gottschalk, G. (1993). Purification and characterization of a coenzyme-A-dependent succinatesemialdehyde dehydrogenase from Clostridium kluyveri. Eur J Biochem Febs 212, 121-127.
Vuilleumier, S., Chistoserdova, L., Lee, M.-C., Bringel, F., Lajus, A., Zhou, Y., Gourion, B., Barbe, V., Chang, J. & other authors. (2009). Methylobacterium genome sequences: a reference blueprint to investigate microbial metabolism of C1 compounds from natural and industrial sources. Plos One 4, e5584.
Wang, Q., Ou, M. S., Kim, Y., Ingram, L. O. & Shanmugam, K. T. (2010). Metabolic flux control at the pyruvate node in an anaerobic Escherichia coli strain with an active pyruvate dehydrogenase. Appl Environ Microbiol 76, 2107-2114.
Werpy, T. & Petersen, G. (2004). Top value added chemicals from biomass. Results of screening for potential candidates from sugars and synthesis gas. Washington DC.
Zarzycki, J., Brecht, V., Müller, M. & Fuchs, G. (2009). Identifying the missing steps of the autotrophic 3-hydroxypropionate CO2 fixation cycle in Chloroflexus aurantiacus. Proc Natl Acad Sci U S A 106, 21317-21322. Zelle, R. M., de Hulster, E., van Winden, W. A., de Waard, P., Dijkema, C., Winkler, A. A., Geertman, J.-M. A., van Dijken, J. P., Pronk, J. T. & van Maris, A. J. A. (2008). Malic acid production by Saccharomyces cerevisiae: engineering of pyruvate carboxylation, oxaloacetate reduction, and malate export. Appl Environ Microbiol 74, 2766-2777.
Zelle, R. M., de Hulster, E., Kloezen, W., Pronk, J. T. & van Maris, A. J. A. (2010). Key process conditions for production of C(4) dicarboxylic acids in bioreactor batch cultures of an engineered Saccharomyces cerevisiae strain. Appl Environ Microbiol 76, 744-750.
Zhang, X., Jantama, K., Shanmugam, K. T. & Ingram, L. O. (2009). Reengineering Escherichia coli for Succinate Production in Mineral Salts Medium. Appl Environ Microbiol 75, 7807-7813.
Zhang, X., Wang, X., Shanmugam, K. T. & Ingram, L. O. (2011). L-malate production by metabolically engineered Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 77, 427-434.

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para preparar ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-DHB) que comprende las etapas sucesivas de:
a) una primera etapa de conversión de malato y/o succinil-CoA y/o glioxilato en malil-CoA;
b) una segunda etapa de conversión de malil-CoA obtenido anteriormente en malato-4-semialdehído;
c) una tercera etapa de conversión de malato-4-semialdehído en 2,4-DHB utilizando una DHB deshidrogenasa;
en el que:
- la etapa a) está catalizada por un enzima que presenta actividad de malil-CoA sintetasa, succinil-CoA: (L)-malato-CoA transferasa y/o malil-CoA liasa, respectivamente; dichos enzimas se seleccionan de entre malato-coenzima A ligasa según se define en EC 6.2.1.9, succinil-CoA(L)-malato CoA transferasa según se define en EC 2.8.3.- o malil-CoA liasa, según se define en EC 4.1.3.24, o variante o fragmento funcional del mismo;
- la etapa b) está catalizada por un enzima que presenta actividad de malil-CoA reductasa; el enzima que presenta actividad de malil-CoA reductasa se selecciona de entre la malonil-CoA reductasa según se define en EC 1.2.1.75, la succinil-CoA reductasa según se define en EC 1.2.1.76 o de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA (HMG-CoA) reductasa informada según se define en EC 1.1.1.38 y EC 1.1.1.88, la cinamoil-CoA reductasa según se define en EC 1.2.1.44 o la acetaldehído deshidrogenasa según se define en EC 1.2.1.10 o cualquier mutante que mejore la actividad y/o afinidad de sustrato del enzima mutado para malil-CoA o que reduzca su actividad sobre el sustrato natural;
- la etapa c) está catalizada por la metilbutiraldehído reductasa Ypr1 de S. cerevisiae, la semialdehído succínico reductasa de M. sedula, la 4-hidroxibutirato deshidrogenasa 4hbd de P gingivalis, o la alcohol deshidrogenasa Yqhd de E. coli, cualquier mutante que mejore la actividad y/o afinidad de sustrato del enzima mutado para la malato-4-semialdehído y/o que reduzca su actividad o afinidad para su sustrato natural en un factor de por lo menos 2.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el enzima en la etapa a) se indica en SEC ID n° 1, SEC ID n° 191 y SEC ID n° 193 o cualquier variante o fragmento del mismo.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el enzima en la etapa a) está codificado por cualquiera de los ácidos nucleicos definidos en SEC ID n° 2, SEC ID n° 194 y SEC ID n° 192 o cualquier variante o fragmento de los mismos.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 o 3, en el que el enzima en la etapa b) se indica en SEC ID n° 7, SEC ID n° 10 o SEC ID n° 189 o cualquier variante o fragmento del mismo.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que el enzima está codificado por cualquiera de los ácidos nucleicos definidos en SEC ID n° 8, SEC ID n° 11 o SEC ID n° 190 o cualquier variante o fragmento de SEC ID n° 8 o SEC ID n° 190.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la malil-CoA reductasa comprende por lo menos una mutación en comparación con el enzima de tipo salvaje malonil-CoA reductasa de Sulfolobus tokodaii en por lo menos una de las posiciones P111, L152, T154, L202, G203, D204, Y206, D207, K209, T210, T238, T239, D295, R318, en el que el aminoácido natural en dichas posiciones se ha sustituido por cualquiera de los otros 19 aminoácidos proteinogénicos existentes naturales, es decir, por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina o valina.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la malil-CoA reductasa se indica en SEC ID n° 202 o está codificada por el ácido nucleico de SEC ID n° 201.
8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el enzima en la etapa c) se indica en SEC ID n° 14, SEC ID n° 16, SEC ID n° 32, SEC ID n° 34, SEC ID n° 36, Se C ID n° 187 o cualquier variante o fragmentos de los mismos o SEC ID n° 185.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el enzima está codificado por cualquiera de los ácidos nucleicos definidos en SEC ID n° 15, SEC ID n° 17, SEC ID n° 33, SEC ID n° 35, SEC ID n° 37, SEC ID n° 188, cualquier variante o fragmento de los mismos o SEC ID n° 186.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que las etapas a), b), y c) se llevan a cabo mediante un microorganismo modificado que expresa heterólogamente por lo menos uno de los enzimas que realiza actividades enzimáticas indicadas en la etapa a), b) o c).
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que las etapas a), b) y c) se llevan a cabo dentro del mismo microorganismo.
12. Microorganismo modificado para la producción mejorada de 2,4-DHB, en el que dicho microorganismo expresa los genes codificantes de los enzimas que presentan las actividades enzimáticas necesarias para la catálisis de las etapas a), b) y c) tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
13. Microorganismo según la reivindicación 12, que es una bacteria, preferentemente seleccionada de entre Enterobacteriaceae, Clostridiaceae, Bacillaceae, Streptomycetaceae, Streptococcaceae, Methylobacteriacae y Corynebacteriaceae, muy preferentemente Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Clostridium acetobutylicum, Methylobacterium extorquens, o Lactococcus lactis, o una levadura preferentemente seleccionada de entre Saccharomycetaceae, Pichiaceae y Schizosaccharomycetaceae, muy preferentemente Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Pichia jadinii, Pichia stipitis, o Pichia pastoris.
14. Microorganismo según la reivindicación 12 o 13, en el que la expresión de por lo menos una de las actividades enzimáticas seleccionadas de entre fosfoenolpiruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, piruvato carboxilasa, isocitrato liasa, piruvato carboxilasa y permeasa del simportador de hexosas se encuentra incrementada, y/o por lo menos una de las actividades enzimáticas seleccionadas de entre lactato deshidrogenasa, alcohol deshidrogenasa, acetato quinasa, fosfato acetiltransferasa, piruvato oxidasa, isocitrato liasa, fumarato reductasa, fumarasa, 2-oxoglutarato deshidrogenasa, piruvato quinasa, enzima málico, fosfoglucosa isomerasa, fosfoenolpiruvato carboxilasa, fosfoenolpiruvato carboxiquinasa, piruvato-formato liasa, semialdehído succínico deshidrogenasa, fosfotransferasa transportadora de azúcares, aspartato aminotransferasa, glioxilato reductasa, malato xintasa o metilglioxal sintasa se encuentra reducida.
15. Microorganismo según la reivindicación 14 que es Escherichia coli que sobreexpresa por lo menos uno de los genes seleccionados de entre ppc, pck, aceA, galP, todos de E. coli; pycA de L lactis, y/o que presenta por lo menos uno de los genes delecionados seleccionados de entre ldhA, adhE, ackA, pta, poxB, focA, pflB, sad, gabABC, sfcA, maeB, ppc, pykA, pykF, mgsA, frdABCD, sucAB, ptsl, ptsG, pgi, fumABC, aldA, lldD, iclR, aceB, aspC y ghrAB.
16. Procedimiento de producción de 2,4-DHB que comprende las etapas de:
- cultivar el microorganismo modificado según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15 en un medio de cultivo apropiado,
- recuperar 2,4-DHB a partir del medio de cultivo.
17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que 2,4-DHB se purifica adicionalmente.
ES13731871T 2012-04-26 2013-04-25 Procedimiento de producción de ácido 2,4-dihidroxibutírico Active ES2875010T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IB2012001123 2012-04-26
PCT/IB2013/001071 WO2013160762A2 (en) 2012-04-26 2013-04-25 A method of production of 2,4-dihydroxybutyric acid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2875010T3 true ES2875010T3 (es) 2021-11-08

Family

ID=48699857

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES13731871T Active ES2875010T3 (es) 2012-04-26 2013-04-25 Procedimiento de producción de ácido 2,4-dihidroxibutírico

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9890400B2 (es)
EP (1) EP2841584B1 (es)
JP (1) JP6342385B2 (es)
KR (1) KR102024109B1 (es)
CN (1) CN104254612B (es)
BR (1) BR112014026149A2 (es)
ES (1) ES2875010T3 (es)
IN (1) IN2014DN09529A (es)
MY (1) MY175391A (es)
WO (1) WO2013160762A2 (es)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102093172B1 (ko) * 2012-07-11 2020-03-25 아디쎄오 프랑스 에스에이에스 2,4-다이하이드록시부티레이트의 제조 방법
CN103642765B (zh) * 2013-12-25 2015-11-18 南京工业大学 醇脱氢酶突变体及其应用
EP3129489B1 (en) * 2014-04-11 2021-10-13 String Bio Private Limited Production of succinic acid from organic waste or biogas or methane using recombinant methanotrophic bacterium
CN107690482B (zh) * 2015-04-07 2022-11-29 代谢探索者公司 用于2,4-二羟基丁酸的优化生产的经修饰的微生物
WO2016162442A1 (en) 2015-04-07 2016-10-13 Metabolic Explorer A modified microorganism for the optimized production of 2,4-dihydroxyburyrate with enhanced 2,4-dihydroxybutyrate efflux
BR112017027815B1 (pt) 2015-06-25 2021-12-21 Dynamic Food Ingredients Corporation Método de produção de 2,4-dihidroxibutirato
CN105441372A (zh) * 2015-10-30 2016-03-30 清华大学 一种重组谷氨酸棒杆菌与应用
JP7217700B2 (ja) 2016-09-13 2023-02-03 アラーガン、インコーポレイテッド 安定化非タンパク質クロストリジウム毒素組成物
CN111778200B (zh) * 2019-04-04 2022-11-01 中国科学院微生物研究所 生产L-天冬氨酸的平台菌、基于该平台菌构建的生产β-丙氨酸的重组菌及其构建方法
CN110713962B (zh) * 2019-09-06 2022-06-21 南京农业大学 一株高产丙二酰辅酶a的基因工程菌及其构建方法和应用
DE102021101004B3 (de) 2021-01-19 2022-03-10 Technische Universität Dresden, Körperschaft des öffentlichen Rechts Verfahren zur Herstellung von 2,4-Dihydroxybutyrat oder L-Threonin unter Nutzung eines mikrobiellen Stoffwechselweges
CN115820616A (zh) * 2022-07-22 2023-03-21 昆明理工大学 一种带荧光标记的噬菌体裂解酶及其应用
CN115948482B (zh) * 2023-02-07 2024-02-09 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种2，4-二羟基丁酸生物合成途径的构建方法及应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
ATE100147T1 (de) 1986-09-16 1994-01-15 Gist Brocades Nv Penicilliumtransformanten und verfahren zu ihrer herstellung.
US7705215B1 (en) 1990-04-17 2010-04-27 Dekalb Genetics Corporation Methods and compositions for the production of stably transformed, fertile monocot plants and cells thereof
JPH05501352A (ja) 1989-08-09 1993-03-18 ディカルブ　ジェネティクス　コーポレイション 安定な形質転換稔性単子葉植物およびそれらの細胞を製造するための方法および組成物
US5693781A (en) 1991-06-03 1997-12-02 Mitsubishi Chemical Corporation Promoter DNA fragment from coryneform bacteria
AU4712193A (en) 1992-08-19 1994-03-15 Alko Group Limited Fungal promoters active in the presence of glucose
FR2734842B1 (fr) 1995-06-02 1998-02-27 Rhone Poulenc Agrochimie Sequence adn d'un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase et obtention de plantes contenant un gene de l'hydroxy-phenyl pyruvate dioxygenase, tolerantes a certains herbicides
FR2736926B1 (fr) 1995-07-19 1997-08-22 Rhone Poulenc Agrochimie 5-enol pyruvylshikimate-3-phosphate synthase mutee, gene codant pour cette proteine et plantes transformees contenant ce gene
FR2780416B1 (fr) 1998-06-10 2002-12-20 Rhone Poulenc Nutrition Animal Procede industriel de production de proteines heterologues chez e. coli et souches utiles pour le procede
FR2787121B1 (fr) 1998-12-11 2003-09-12 Aventis Cropscience Sa Nouvelle methode d'isolement et de selection de genes codant pour des enzymes, et milieu de culture approprie
JP2003516112A (ja) 1999-05-06 2003-05-13 アベンテイス・アニマル・ニユートリシヨン・エス・エー 相同又は非相同タンパク質生産のための組換えペニシリウム フニクロスム
JP3687497B2 (ja) * 2000-06-28 2005-08-24 ダイソー株式会社 微生物培養法による光学活性１，２−ジオール類の製造法
DE102006025821A1 (de) * 2006-06-02 2007-12-06 Degussa Gmbh Ein Enzym zur Herstellung von Mehylmalonatsemialdehyd oder Malonatsemialdehyd
JP2010501516A (ja) 2006-08-24 2010-01-21 エボニック デグサ ゲーエムベーハー Ｄ，ｌ−２−ヒドロキシ−４−アルキルチオ酪酸の製造方法
CN1935977B (zh) 2006-10-19 2010-06-09 华东理工大学 左旋内酯水解酶产生菌及其用于制备手性羟基酸的方法
BRPI1010581A2 (pt) 2009-06-04 2016-11-08 Genomatica Inc micro-organismos para a produção de 1,4-butanodiol e métodos relacionados
CN105505892B (zh) * 2010-10-28 2019-03-26 安迪苏法国联合股份有限公司 2,4-二羟基丁酸的生产方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR102024109B1 (ko) 2019-09-23
CN104254612B (zh) 2018-06-01
JP2015514433A (ja) 2015-05-21
BR112014026149A2 (pt) 2017-07-18
US20150159182A1 (en) 2015-06-11
JP6342385B2 (ja) 2018-06-13
EP2841584A2 (en) 2015-03-04
CN104254612A (zh) 2014-12-31
WO2013160762A3 (en) 2014-01-23
US9890400B2 (en) 2018-02-13
MY175391A (en) 2020-06-23
WO2013160762A2 (en) 2013-10-31
EP2841584B1 (en) 2021-03-17
IN2014DN09529A (es) 2015-07-17
KR20150013607A (ko) 2015-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2875010T3 (es) Procedimiento de producción de ácido 2,4-dihidroxibutírico
ES2800341T3 (es) Método para la preparación de 2,4-dihidroxibutirato
RU2626531C2 (ru) Способ получения 2,4-дигидроксимасляной кислоты
CA2985231A1 (en) Biobased production of functionalized alpha-substituted acrylates and c4-dicarboxylates
Chang et al. Enhanced 3-hydroxypropionic acid production from acetate via the malonyl-CoA pathway in Corynebacterium glutamicum
US9605283B2 (en) Microorganism modified for the production of 1,3-propanediol
Chang et al. Enhanced 3-Hydroxypropionic Acid Production From Acetate via the Malonyl-CoA Pathway in