RU2626531C2 - Способ получения 2,4-дигидроксимасляной кислоты - Google Patents
Способ получения 2,4-дигидроксимасляной кислоты Download PDFInfo
- Publication number
- RU2626531C2 RU2626531C2 RU2013123481A RU2013123481A RU2626531C2 RU 2626531 C2 RU2626531 C2 RU 2626531C2 RU 2013123481 A RU2013123481 A RU 2013123481A RU 2013123481 A RU2013123481 A RU 2013123481A RU 2626531 C2 RU2626531 C2 RU 2626531C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- seq
- enzyme
- malate
- microorganism
- host
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 32
- UFYGCFHQAXXBCF-UHFFFAOYSA-N 2,4-dihydroxybutanoic acid Chemical compound OCCC(O)C(O)=O UFYGCFHQAXXBCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 8
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims abstract description 110
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 106
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 106
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 103
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 52
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 43
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 38
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 48
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 17
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 17
- -1 focA-pflB Proteins 0.000 claims description 17
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 15
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 11
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 8
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 7
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 6
- FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N galp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1N=CNC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](C)N)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CNC=N1 FJEKYHHLGZLYAT-FKUIBCNASA-N 0.000 claims description 5
- 101100536799 Acinetobacter baylyi (strain ATCC 33305 / BD413 / ADP1) tgnE gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 claims description 4
- 101100351124 Bacillus subtilis (strain 168) pckA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100139916 Escherichia coli (strain K12) rarA gene Proteins 0.000 claims description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 4
- 101100433987 Latilactobacillus sakei subsp. sakei (strain 23K) ackA1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101100398785 Streptococcus agalactiae serotype V (strain ATCC BAA-611 / 2603 V/R) ldhD gene Proteins 0.000 claims description 4
- 241000235033 Zygosaccharomyces rouxii Species 0.000 claims description 4
- 101100386830 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 31821 / ZM4 / CP4) ddh gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150006213 ackA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150014383 adhE gene Proteins 0.000 claims description 4
- SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N arachidonyl-2'-chloroethylamide Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(=O)NCCCl SCJNCDSAIRBRIA-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 4
- 101150043302 gabD gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150026107 ldh1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150041530 ldha gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150108859 maeB gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150083023 mgsA gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108010071189 phosphoenolpyruvate-glucose phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 101150023641 ppc gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150015622 pyk gene Proteins 0.000 claims description 4
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ACIOXMJZEFKYHZ-BXKDBHETSA-N (6r,7r)-7-amino-8-oxo-3-(pyridin-1-ium-1-ylmethyl)-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylate Chemical compound S([C@@H]1[C@@H](C(N1C=1C([O-])=O)=O)N)CC=1C[N+]1=CC=CC=C1 ACIOXMJZEFKYHZ-BXKDBHETSA-N 0.000 claims 3
- 101100134884 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) aceF gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150090997 DLAT gene Proteins 0.000 claims 3
- 101100322242 Drosophila melanogaster nAChRalpha2 gene Proteins 0.000 claims 3
- 101100182965 Escherichia coli (strain K12) maeA gene Proteins 0.000 claims 3
- 101100322911 Methanocaldococcus jannaschii (strain ATCC 43067 / DSM 2661 / JAL-1 / JCM 10045 / NBRC 100440) aksF gene Proteins 0.000 claims 3
- 101100453819 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) kgd gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150075213 frdA gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150018523 frdB gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150087653 frdC gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150023570 frdD gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150056556 gadA gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150118940 gadB gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150032444 gadC gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150118781 icd gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150067967 iclR gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150078036 odhB gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150053304 pykF gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150010065 sad gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150111745 sucA gene Proteins 0.000 claims 3
- 101150055132 sucB gene Proteins 0.000 claims 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 48
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 3
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 abstract 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 67
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 52
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 28
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 28
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 description 27
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 27
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 24
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 24
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 23
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 22
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 15
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 15
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 13
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 108020004652 Aspartate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 12
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 11
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 11
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 11
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 9
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 9
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 9
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 9
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 9
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 9
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 8
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 8
- 241000157876 Metallosphaera sedula Species 0.000 description 8
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 8
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 8
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 7
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 7
- ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N NADPH Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 ACFIXJIJDZMPPO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 7
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- 238000007824 enzymatic assay Methods 0.000 description 7
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 7
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 7
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 description 7
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 102220313168 rs1553262439 Human genes 0.000 description 6
- 102200157848 rs2236410 Human genes 0.000 description 6
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 6
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010093796 4-hydroxybutyrate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 102100028443 Aflatoxin B1 aldehyde reductase member 2 Human genes 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 102000003939 Membrane transport proteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000301 Membrane transport proteins Proteins 0.000 description 5
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 5
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229960002429 proline Drugs 0.000 description 5
- 235000013930 proline Nutrition 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 5
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 5
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 description 5
- BYGQBDHUGHBGMD-UHFFFAOYSA-N 2-methylbutanal Chemical compound CCC(C)C=O BYGQBDHUGHBGMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 4-Butyrolactone Chemical compound O=C1CCCO1 YEJRWHAVMIAJKC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- 241000203407 Methanocaldococcus jannaschii Species 0.000 description 4
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 4
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 4
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 4
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 4
- 101150107204 asd gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 4
- 229950006238 nadide Drugs 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- FWIBCWKHNZBDLS-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxyoxolan-2-one Chemical compound OC1CCOC1=O FWIBCWKHNZBDLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102100029112 Endothelin-converting enzyme 1 Human genes 0.000 description 3
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 description 3
- 101000841259 Homo sapiens Endothelin-converting enzyme 1 Proteins 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108090000472 Phosphoenolpyruvate carboxykinase (ATP) Proteins 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 3
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 3
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 3
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- UFYGCFHQAXXBCF-VKHMYHEASA-N (2s)-2,4-dihydroxybutanoic acid Chemical compound OCC[C@H](O)C(O)=O UFYGCFHQAXXBCF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108010046276 FLP recombinase Proteins 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M Formate Chemical compound [O-]C=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 2
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 description 2
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N Methylglyoxal Chemical compound CC(=O)C=O AIJULSRZWUXGPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JGGLZQUGOKVDGS-VYTIMWRQSA-N aspartate semialdehyde Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC(=O)C)CO[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(C)=O)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@H]([C@@H](O[C@@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@H](CO[C@@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]4[C@H]([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O4)O)[C@@H](O)[C@H](CO)O3)O)O2)O)[C@H](CO)O1 JGGLZQUGOKVDGS-VYTIMWRQSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 230000009483 enzymatic pathway Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 230000004190 glucose uptake Effects 0.000 description 2
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L glutamate group Chemical group N[C@@H](CCC(=O)[O-])C(=O)[O-] WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-L 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N glyoxylic acid Chemical compound OC(=O)C=O HHLFWLYXYJOTON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N oxaloacetic acid Chemical compound OC(=O)CC(=O)C(O)=O KHPXUQMNIQBQEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- UIUJIQZEACWQSV-UHFFFAOYSA-N succinic semialdehyde Chemical compound OC(=O)CCC=O UIUJIQZEACWQSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 2
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 2
- XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidaz Chemical group C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N 0.000 description 1
- NBIPQJXKGATNAC-DKWTVANSSA-N (2s)-2-aminobutanedioic acid;2-hydroxybutanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O.OC(=O)C(O)CC(O)=O NBIPQJXKGATNAC-DKWTVANSSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoroacetic acid;hydrate Chemical compound [OH3+].[O-]C(=O)C(F)(F)F XXMFJKNOJSDQBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AXZMBXXTNXSOCI-YFKPBYRVSA-N 2-[(4s)-2,2-dimethyl-5-oxo-1,3-dioxolan-4-yl]acetaldehyde Chemical compound CC1(C)O[C@@H](CC=O)C(=O)O1 AXZMBXXTNXSOCI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 2-methylpentane-2,4-diol Chemical compound CC(O)CC(C)(C)O SVTBMSDMJJWYQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 108010053754 Aldehyde reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100027265 Aldo-keto reductase family 1 member B1 Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 101100523058 Aspergillus niger pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- 101000742087 Bacillus subtilis (strain 168) ATP-dependent threonine adenylase Proteins 0.000 description 1
- 101100007857 Bacillus subtilis (strain 168) cspB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100242035 Bacillus subtilis (strain 168) pdhA gene Proteins 0.000 description 1
- 241000123346 Chrysosporium Species 0.000 description 1
- 229910021591 Copper(I) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101100310802 Dictyostelium discoideum splA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100456896 Drosophila melanogaster metl gene Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101100508941 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) ppa gene Proteins 0.000 description 1
- 101000691478 Homo sapiens Placenta-specific protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 101100533888 Hypocrea jecorina (strain QM6a) sor4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235649 Kluyveromyces Species 0.000 description 1
- 101100123255 Komagataeibacter xylinus aceC gene Proteins 0.000 description 1
- HOSWPDPVFBCLSY-VKHMYHEASA-N L-aspartic 4-semialdehyde Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CC=O HOSWPDPVFBCLSY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229910015667 MoO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 101100276041 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) ctpD gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 102100026184 Placenta-specific protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 101100381593 Planococcus sp. (strain L4) bgaP gene Proteins 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101100134871 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) aceE gene Proteins 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 235000017304 Ruaghas Nutrition 0.000 description 1
- 241000554738 Rusa Species 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100053441 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) YPR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 1
- 235000014897 Streptococcus lactis Nutrition 0.000 description 1
- 101100370749 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) trpC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010084086 Succinate-Semialdehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000005566 Succinate-Semialdehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 101150104425 T4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001136494 Talaromyces funiculosus Species 0.000 description 1
- 101000774739 Thermus thermophilus Aspartokinase Proteins 0.000 description 1
- 101710113476 Transcriptional repressor IclR Proteins 0.000 description 1
- 101100354953 Treponema denticola (strain ATCC 35405 / DSM 14222 / CIP 103919 / JCM 8153 / KCTC 15104) pyrBI gene Proteins 0.000 description 1
- 241000405217 Viola <butterfly> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000282485 Vulpes vulpes Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 101150094017 aceA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 1
- 125000003172 aldehyde group Chemical group 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N arabinose Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-WDCZJNDASA-N 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150070136 axeA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 150000001277 beta hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 101150008667 cadA gene Proteins 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 101150014229 carA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150070764 carB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M copper(I) chloride Chemical compound [Cu]Cl OXBLHERUFWYNTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 101150110403 cspA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150068339 cspLA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 101150071678 dsbB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008713 feedback mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 101150077334 focA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150091561 galP gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000036433 growing body Effects 0.000 description 1
- 108010082140 gulonate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 1
- 230000026030 halogenation Effects 0.000 description 1
- 238000005658 halogenation reaction Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- ROBFUDYVXSDBQM-UHFFFAOYSA-L hydroxymalonate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C(O)C([O-])=O ROBFUDYVXSDBQM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N isocitric acid Chemical compound OC(=O)C(O)C(C(O)=O)CC(O)=O ODBLHEXUDAPZAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 1
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 1
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 229940045184 malt extract Drugs 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000006241 metabolic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 108010046778 molybdenum cofactor Proteins 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 101150111581 pflB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150004519 pilC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 101150100525 pykA gene Proteins 0.000 description 1
- 101150089778 pyr-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150098691 pyrB gene Proteins 0.000 description 1
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical group 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M sodium nitrite Substances [Na+].[O-]N=O LPXPTNMVRIOKMN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004544 sputter deposition Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M tetrabutylammonium hydroxide Chemical compound [OH-].CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC VDZOOKBUILJEDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229940045136 urea Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
- C07C59/235—Saturated compounds containing more than one carboxyl group
- C07C59/245—Saturated compounds containing more than one carboxyl group containing hydroxy or O-metal groups
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
- C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
- C07F9/09—Esters of phosphoric acids
- C07F9/095—Compounds containing the structure P(=O)-O-acyl, P(=O)-O-heteroatom, P(=O)-O-CN
- C07F9/096—Compounds containing the structure P(=O)-O-C(=X)- (X = O, S, Se)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0008—Oxidoreductases (1.) acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
- C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
- C12Y102/01011—Aspartate-semialdehyde dehydrogenase (1.2.1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y102/00—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2)
- C12Y102/01—Oxidoreductases acting on the aldehyde or oxo group of donors (1.2) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.2.1)
- C12Y102/01018—Malonate-semialdehyde dehydrogenase (acetylating) (1.2.1.18)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/02—Phosphotransferases with a carboxy group as acceptor (2.7.2)
- C12Y207/02004—Aspartate kinase (2.7.2.4)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
- C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к получению 2,4-дигидроксимасляной кислоты (2,4-ДГМ). Предложен способ получения 2,4-ДГМ, включающий первую стадию превращения малата в 4-фосфомалат с использованием фермента, способного осуществить подобное превращение, вторую стадию превращения 4-фосфомалата в малат-4-полуальдегид с использованием фермента, способного осуществить подобное превращение, и третью стадию превращения малат-4-полуальдегида в 2,4-ДГМ с использованием фермента, способного осуществить подобное превращение. При этом на первой стадии используют фермент, который имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 43 и SEQ ID No. 45. На второй стадии используют фермент, который имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 66 и SEQ ID No. 231. На третьей стадии используют фермент, который имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 74, SEQ ID No. 76, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 225 и SEQ ID No. 227. Предложены также варианты ферментов, используемых в способе, варианты нуклеиновых кислот, кодирующих соответствующие ферменты, варианты химерных генов для трансформации микроорганизма-хозяина и экспрессии в этом микроорганизме соответствующего фермента, варианты вектора экспрессии, варианты микроорганизма-хозяина, экспрессирующего соответствующий фермент. 19 н. и 12 з.п. ф-лы, 5 ил., 16 табл.,12 пр.
Description
Настоящее изобретение относится к новому способу получения 2,4-дигидроксимасляной кислоты из малата при помощи синтетического пути, который включает ферменты, обладающие, соответственно, малаткиназной, малат полуальдегиддегидрогеназной и 2,4-дигидроксибутиратдегидрогеназной активностью.
Карбоновые кислоты, цитированные в настоящей заявке на изобретение, в равной степени названы в соответствии со своей солевой (например, 2,4-дигидроксибутират) или кислотной формой (например, 2,4-дигидроксимасляная кислота).
2,4-Дигидроксимасляная кислота (в равной степени 2,4-ДГМ или ДГМ) представляет собой соединение, представляющее значительный экономический интерес. ДГМ может быть легко превращен в α-гидрокси-γ-бутиролактон в водных средах путем поддержания подходящего рН. α-Гидрокси-γ-бутиролактон представляет собой значимый предшественник для продукции метионинового заместителя 2-гидрокси-4-(метилтио)-бутирата (ГМТБ) (Deck et al., 2008), который занимает значительный рынок в кормлении животных. В настоящее время, α-гидрокси-γ-бутиролактон происходит из γ-бутиролактона при помощи многостадийного способа, который обеспечивает галогенирование γ-бутиролактона в позиции α, и последующее замещение атома галогена гидроксильной группой в щелочной среде (Deck et al., 2008).
Вследствие растущих цен на масло возрастает потребность в продукции ДГМ из возобновляемых источников. Микроорганизмы способны превращать происходящий из биомассы сырьевой материал, например сахара или органические кислоты, в огромное разнообразие различных химических соединений (Werpy & Petersen, 2004). Параллельно с растущей массой биохимической и генетической информации возможно модифицировать микроорганизмы, такие что они сверхпродуцируют встречающиеся в природе метаболические промежуточные соединения с высоким выходом и продуктивностью (Bailey, 1991). Оптимизация продукции микроорганизмов часто требует рационального конструирования метаболических сетей, которые обеспечивают, кроме того, сверхэкспрессию ферментов, требующихся для биосинтеза интересующего метаболита, и устранение ингибирования продукта по механизму обратной связи. Еще одна возможность заключается в применении новых ферментативных систем, которые катализируют продукцию интересующего метаболита.
Подходы метаболической инженерии и ферментативные катализы требуют подробного знания биохимии и регуляции метаболического пути, приводящего к интересуемому метаболиту. В случае продукции ДГМ данная информация отсутствует. Только в нескольких исследованиях сообщается о появлении ДГМ у пациентов, страдающих от дефицита дегидрогеназы янтарного полуальдегида (Shinka et al., 2002), тем не менее без идентификации ферментативных реакций, вовлеченных в продукцию ДГМ. Таким образом, для ферментативной продукции ДГМ требуется (1) идентификация термодинамически реализуемого пути, который превращает доступный предшественник в ДГМ, (2) идентификация или конструирование ферментов, которые способны катализировать отдельные реакционные стадии в пути и (3) функциональная экспрессия ферментов в пути в соответствующем продуцирующем организме.
Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы удовлетворять этим потребностям.
Соответственно, одной из задач настоящего изобретения является способ получения 2,4-ДГМ, при котором осуществляют первую стадию превращения малата в 4-фосфомалат с использованием малаткиназы, вторую стадию превращения 4-фосфомалата в малат-4-полуальдегид с использованием малат полуальдегид дегидрогеназы, третью стадию превращения малат-4-полуальдегида в 2,4-ДГМ с использованием ДГМ дегидрогеназы.
В первой реакции (смотри фиг.1 (i)) малат (1) превращается в 4-фосфомалат (2) путем действия фермента, который обладает малаткиназной активностью (А). Во второй реакции (В) 4-фосфомалат превращается в малат-4-полуальдегид (3) путем действия фермента, который обладает малат полуальдегид дегидрогеназной активностью. Точнее, реакцию (В) катализируют при помощи фермента, обладающего дефосфорилирующей 4-фосфомалат редуктазной активностью в биосинтетическом пути. В третьей реакции (С) малат-4-полуальдегид превращается в ДГМ (4) путем действия фермента, который обладает ДГМ дегидрогеназной активностью. Точнее реакцию (С) катализируют при помощи фермента, обладающего малат-4-полуальдегид редуктазной активностью в биосинтетическом пути.
Ни один из вышеописанных ферментов и промежуточных продуктов не был описан и идентифицирован в живых клетках. Сами малаткиназа, малат полуальдегид дегидрогеназа, ДГМ дегидрогеназа и 4-фосфомалат представляют собой дополнительные задачи изобретения.
В еще одном из аспектов изобретения первая стадия в способе получения 2,4-ДГМ включает малаткиназу, которая характеризуется тем, что превращает малат в 4-фосфомалат. Указанный фермент получают при помощи по меньшей мере одной мутации фермента, где указанная(ые) мутация(и) улучшает(ют) активность и/или субстратную аффинность мутантного фермента в отношении малата.
В настоящем изобретении выражение "улучшают активность и/или субстратную аффинность" означает, что фермент до мутации был или не способен использовать субстрат (малат, 4-фосфомалат или малат-4-полуальдегид) и/или синтезировал продукт реакции (4-фосфомалат или малат-4-полуальдегид или ДГМ) с максимальной специфической скоростью, которая была по меньшей мере в три раза меньше, и/или
обладал аффинностью в отношении малата, 4-фосфомалата или малат-4-полуальдегида, которая была по меньшей мере в три раза меньше, и/или
обладал аффинностью в отношении природного субстрата (аспартат, 4-фосфо-аспартат, аспартат-4-полуальдегид), которая была по меньшей мере в 3 раза выше.
В еще одном из своих аспектов изобретение относится к применению малаткиназы для превращения малата в 4-фосфомалат.
Малаткиназная активность может быть измерена при помощи ферментативного теста, описанного в примере 1 (смотри "Ферментативный анализ").
В соответствии с еще одним аспектом изобретения малаткиназа может быть получена путем мутации аспартаткиназы.
Фиг.2 демонстрирует совмещение аминокислотных последовательностей аспартаткиназ различного биологического происхождения. Все ссылки на позицию аминокислот сделаны на основе аминокислотной последовательности аспартаткиназы, кодируемой геном LysC E.coli (представленной в SEQ ID No. 4). Относительные позиции соответствующих консервативных областей в других аспартаткиназах из различных организмов легко могут быть найдены специалистом в данной области техники путем простого совмещения последовательности, как представлено на Фиг.2, с ферментами, перечисленными ниже:
- AKIN - аспартаткиназа III из E. Coli (SEQ ID No. 4),
- AKI (SEQ ID No. 87) аспартаткиназа I из E.coli,,
- AKII (SEQ ID No. 88) - аспартаткиназа II из E.coli,
- MJ - Methanococcus jannaschii (SEQ ID No. 89),
- TT - Thermus thermophilus (SEQ ID No. 90),
- CG - Corynebacterium glutamicum (SEQ ID No. 91),
- AT - Arabidopsis thaliana (SEQ ID No. 92),
- SC - Saccharomyces cerevisiae. (SEQ ID No. 93).
Указанное совмещение может быть осуществлено при помощи программного обеспечения ClustaIW2. Например, остаток Е119 аспартаткиназы, представленной в SEQ ID No. 4, соответствует остатку Е207 аспартаткиназы А.thaliana (SEQ ID No. 50) или остатку Е147 аспартаткиназы S.cerevisiae (SEQ ID No. 51).
Мутантная аспартаткиназа в соответствии с изобретением содержит по меньшей мере одну мутацию по сравнению с ферментом дикого типа в по меньшей мере одной из следующих позиций: S39, Т45, V115, Е119, F184 и/или S201, где встречающаяся в природе аминокислота в указанных позициях заменена на любую из других 19 существующих в природе белокобразующих аминокислот, то есть на аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин или валин.
В неисключительном примере конструирование малаткиназы путем сайтнаправленного мутагенеза продемонстрировано с использованием аспартаткиназы Lys С из Escherichia coli в качестве матрицы. В соответствии с одним из аспектов изобретения субстратная специфичность LysC меняется в сторону малата путем замены глутаминовой кислоты в позиции 119 на аспарагин, глутамин, цистеин, пролин, серин, треонин, валин или глицин.
В еще одном аспекте изобретения малаткиназа представлена в SEQ ID No. 9 и конкретней в SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24 или SEQ ID No. 26.
Аспартаткиназы типично ингибируются метионином, треонином или лизином. Таким образом, малаткиназы, конструируемые путем случайного или сайтнаправленного мутагенеза аспартаткиназ также могут ингибироваться указанными аминокислотами. В еще одном аспекте изобретения ингибирование малаткиназы метионином, лизином или треонином уменьшается путем мутагенеза малаткиназы.
В специфическом аспекте изобретения вышеописанная мутантная LysC (малаткиназа) становится нечувствительной к ингибированию лизином путем мутации по меньшей мере по одной из следующих аминокислот Е250, М318, S321, V339, S338, F324, L.325, V339, S345, Е346, D340, Т344 и/или Т352 (смотри пример 3).
Настоящее изобретение также охватывает такие модифицированные ферменты и конкретней ферменты, представленные в SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 43 или SEQ ID No. 45.
В еще одном аспекте вторая стадия способа получения 2,4-ДГМ в соответствии с изобретением включает малат полуальдегид дегидрогеназу, отличающуюся тем, что она превращает 4-фосфомалат в малат-4-полуальдегид, где указанный фермент обладает активностью, дефосфорилирующей 4-фосфомалат редуктазу, в пути биосинтеза.
Малат полуальдегид дегидрогеназная активность может быть измерена при помощи ферментативного теста, описанного в примере 4 (смотри "Ферментативный анализ"),
Указанный фермент получают при помощи по меньшей мере одной мутации фермента, где указанная(ые) мутация(и) улучшает(ют) активность и/или субстратную аффинность мутантного фермента в отношении 4-фосфомалата.
В соответствии с еще одним аспектом малат полуальдегид дегидрогеназа по изобретению может быть получена путем мутации фермента, обладающего известной полуальдегид дегидрогеназной активностью, конкретней обладающего дефосфорилирующей активностью в восстановительном аспекте реакции, конкретней действующего на органические молекулы, которые состоят из 3, 4 или 5 углеродных молекул. В конкретном аспекте изобретения указанную малат полуальдегид дегидрогеназу получают путем мутации аспартат полуальдегид дегидрогеназы.
Аспартат полуальдегид дегидрогеназа, Asd из Е.coli и Hom2 из Saccharomyces cerevisiae в природе демонстрируют дегидрогеназную активность в отношении 4-фосфомалата 2.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения малат полуальдегид дегидрогеназа может быть улучшена путем мутации аспартат полуальдегид дегидрогеназы.
Фиг.3 демонстрирует совмещение аминокислотных последовательностей аспартат полуальдегид дегидрогеназ различного биологического происхождения. Все ссылки на аминокислоты сделаны на основе аспартат полуальдегид дегидрогеназы, кодируемой геном Asd из Е.coli (как представлено в SEQ ID No. 20). Относительные позиции соответствующих консервативных областей в других аспартат полуальдегид дегидрогеназ из различных организмов легко могут быть найдены специалистом в данной области техники путем простого совмещения последовательностей, представленных на Фиг.4, с ферментами, перечисленными ниже:
- ЕС - Е.Coli (SEQ ID No. 49),
- MJ - Methanococcus jannaschii (SEQ ID No. 94),
- TT - Thermus thermophilus (SEQ ID No. 95),
- BS - Bacillus subtilis (SEQ ID No. 96),
- CG - Corynebacterium glutamicum (SEQ ID No. 97),
- AT - Arabidopsis thaliana (SEQ ID No. 98),
- SC - Saccharomyces cerevisiae. (SEQ ID No. 99)
Указанное совмещение легко может быть осуществлено с использованием программного обеспечения ClustaIW2.
Конструирование ферментов, обладающих улучшенной малат полуальдегид дегидрогеназной активностью, может быть осуществлено следующим образом.
Малат полуальдегид дегидрогеназа в соответствии с изобретением соответствует в специфическом аспекте аспартат полуальдегид дегидрогеназе, содержащей, по меньшей мере, одну мутацию по сравнению с ферментом дикого типа в по меньшей мере одной из позиций Т136, Q162, I230, Е241 и/или Н274, где встречающаяся в природе аминокислота в указанных позициях заменена на любую из других 19 существующих в природе белокобразующих аминокислот, то есть на аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин или валин.
Как продемонстрировано в примере 5, сайтнаправленный мутагенез asd из Е.coli может улучшить активность и субстратную аффинность мутантного фермента в отношении 4-фосфомалата, в то же самое время уменьшая предпочтение фермента в отношении своего природного субстрата 4-фосфо-аспартата.
Для улучшения активности Asd в отношении 4-фосфомалата, и в соответствии с одним из аспектов изобретения Е241 заменен на остаток глутамина, аланина, цистеина, глицина, гистидина, изолейцина или метионина путем сайтнаправленного мутагенеза (Пример 5).
В еще одном аспекте изобретения малат полуальдегид дегидрогеназа представлена в SEQ ID No. 68 и конкретней в SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 64 или SEQ ID No. 66.
В еще одном аспекте изобретение относится к применению малат полуальдегид дегидрогеназы для превращения 4-фосфомалата в малат-4-полуальдегид.
В еще одном аспекте третья стадия способа получения 2,4-ДГМ в соответствии с изобретением включает ДГМ дегидрогеназу, отличающуюся тем, что она превращает малат-4-полуальдегид в 2,4-ДГМ, где указанный фермент обладает малат-4-полуальдегид редуктазной активностью в биосинтетическом пути.
Ферменты-кандидаты ДГМ дегидрогеназы, которые потенциально уже обладают ДГМ дегидрогеназной активностью, могут быть выбраны из класса β-гидроксикислот дегидрогеназ, которые действуют на С3, С4 или С5 соединения.
В соответствии с еще одним аспектом изобретения указанные ферменты ДГМ дегидрогеназы могут быть структурно и механистически отнесены к гидроксикислот дегидрогеназам, таким как редуктазы тартронат полуальдегида, редуктазы янтарного полуальдегида, редуктазы малонат полуальдегида, редуктазы метилбутиральдегида, алкогольдегидрогеназы цинкового типа, L-треонин-3-дегидрогеназы или редуктазы гомосерина.
Настоящее изобретение также относится к применению редуктазы метилбутиральдегида или редуктазы янтарного полуальдегида для превращения малат-4-полуальдегида в 2,4-ДГМ.В конкретных воплощениях указанная редуктаза метилбутиральдегида представлена в SEQ ID No. 74 и указанная редуктаза янтарного полуальдегида представлена в SEQ ID No. 76. ДГМ дегидрогеназная активность может быть измерена при помощи ферментативного теста, описанного в примере 6 (смотри "Ферментативный анализ").
Аффинность ДГМ дегидрогеназы в отношении малат-4-полуальдегида может быть увеличена при помощи по меньшей мере одной мутации фермента, где указанная(ые) мутация(и) увеличивают активность и/или субстратную аффинность мутантного фермента в отношении малат-4-полуальдегида и/или уменьшает(ют) активность или аффинность в отношении своего природного субстрата по меньшей мере вдвое.
ДГМ дегидрогеназа в соответствии с изобретением соответствует в специфическом аспекте редуктазе янтарного полуальдегида М.sedula (SEQ ID No 76), содержащей по меньшей мере одну мутацию по сравнению с ферментом дикого типа в по меньшей мере одной из позиций S40, N43, Н39 Т49, F85, Q108, L281 и N305, где встречающаяся в природе аминокислота в указанных позициях заменена на любую из других 19 существующих в природе белокобразующих аминокислот, то есть на аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глутамин, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серин, треонин, триптофан, тирозин или валин.
Как продемонстрировано в неисключительном примере аффинность редуктазы янтарного полуальдегида М sedula в отношении (L)-малат-4-полуальдегида увеличивалась путем введения двойной мутации H39R N43H путем сайтнаправленного мутагенеза, как представлено в SEQ ID No. 81. Простые мутанты H39R (SEQ ID No. 225) и N43H (SEQ ID No. 227) также охвачены настоящим изобретением (Пример 7).
ДГМ дегидрогеназа может быть использована для превращения малат-4-полуальдегида в 2,4-ДГМ, который составляет еще один аспект изобретения.
Последовательность нуклеиновой кислоты генов может быть адаптирована использованию кодонов организмом хозяином, таким образом, увеличивая продукцию гетерогенно экспрессируемых белков. Последнее составляет еще один аспект изобретения.
Синтез синтетического гена, кодирующего редуктазу янтарного полуальдегида М.sedula H39R N43H, нуклеотидная последовательность которого оптимизирована для экспрессии указанного фермента в Е.Coli, как представлено в SEQ ID No. 228, составляет еще один аспект изобретения.
В еще одном аспекте настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, и конкретней к последовательностям выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующим малаткиназу, как описано выше.
В еще одном аспекте указанная нуклеиновая кислота представлена в SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 42 или SEQ ID No. 44.
В еще одном аспекте настоящее изобретение также относится к последовательностям выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующим малат полуальдегид дегидрогеназу, как описано выше.
Конкретней, указанная нуклеиновая кислота предпочтительно представлена в SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 63, SEQ ID No. 65 или SEQ ID No. 67.
В еще одном аспекте настоящее изобретение также относится к последовательностям выделенной нуклеиновой кислоты, кодирующим ДГМ дегидрогеназу, как описано выше.
В еще одном аспекте указанная нуклеиновая кислота представлена в SEQ ID No. 73 или SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 224, SEQ ID No. 226 или SEQ ID No. 82
В соответствии с изобретением "последовательность нуклеиновой кислоты" относится к молекуле ДНК или РНК в одно- или двухцепочечной форме, предпочтительно молекуле ДНК. Использованный здесь термин "выделенная ДНК" относится к ДНК, которая не встречается в природе или больше не встречается в природном окружении, в котором она представлена исходно, например кодирующая последовательность ДНК, ассоциирующаяся с другими регуляторными элементами в химерном гене, ДНК, переносимая в другую клетку-хозяин, или искусственная синтетическая последовательность ДНК, имеющая нуклеотидную последовательность, отличающуюся от любой встречающейся в природе последовательности ДНК.
Настоящее изобретение также относится к химерному гену, содержащему, функционально связанные друг с другом, по меньшей мере один промотор, который является функциональным в организме хозяина, полинуклеотид, кодирующий любую из малаткиназы, малатполуальдегиддегидрогеназы или ДГМ дегидрогеназы в соответствии с изобретением, и терминаторный элемент, который является функциональным в том же самом организме хозяина. Различные элементы, которые может содержать химерный ген, представляют собой прежде всего элементы, регулирующие транскрипцию, трансляцию и созревание белков, таких как промотор, последовательность, кодирующую сигнальный пептид или транспортный пептид, или терминаторный элемент, составляющий сигнал полиаденилирования и, во вторых, полинуклеотид, кодирующий белок. Выражение "функционально связанные друг с другом" означает, что указанные элементы химерного гена связаны друг с другом таким образом, что на функцию одного из этих элементов влияет функция другого. В качестве примера промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, где он способен влиять на экспрессию указанной кодирующей последовательности. Конструирование химерного гена в соответствии с изобретением и сборка его различных элементов может быть осуществлена с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники. Выбор регуляторных элементов, составляющих химерный ген, зависит по существу от организма-хозяина, в котором они должны функционировать, и специалисты в данной области техники способны выбирать регуляторные элементы, которые являются функциональными в заданном организме хозяина. Подразумевается, что термин "функциональный" обозначает способность функционировать в заданном организме хозяине.
Промоторы, которые может содержать химерный ген в соответствии с изобретением, являются конститутивными или индуцируемыми. В качестве примера, промоторы, используемые для экспрессии в бактериях, могут быть выбраны из промоторов, упомянутых ниже. Для экспрессии в Escherichia coli можно упомянуть lac, trp, Ipp, phoA, recA, araBAD, prou, cst-I, tetA, cadA, nar, tac, trc, Ipp-lac, Psyn, cspA, PL, PL-9G-50, PR-PL, T7, [lambda]PL-PT7, T3-lac, T5-lac, T4 ген 32, nprM-lac, VHb и промоторы белка А или еще промотор Ptrp (WO 99/64607). Для экспрессии в грамположительных бактериях, таких как Corynebacteria или Streptomyces, можно упомянуть промоторы PtipA или PS1 и PS2 (FR91/09870) или промоторы, описанные в заявке на изобретение ЕР 0629699А2. Для экспрессии в дрожжах и грибах можно упомянуть промоторы PLAC4 К.lactis или промотор Ppgk К.lactis (заявка на патент FR 91/05294), промотор tefl или cbhl Trichoderma (WO 94/04673), промотор his, csl или apf Penicillium (WO 00/68401) и промотор gla Aspergillus.
В соответствии с изобретением химерный ген может также содержать другие регуляторные последовательности, которые располагаются между промотором и кодирующей последовательностью, такие как активаторы транскрипции (энхансеры).
Сам по себе химерный ген по изобретению содержит в конкретном воплощении по меньшей мере в направлении транскрипции функционально связанные промоторную регуляторную последовательность, которая является функциональной в организме-хозяине, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую малаткиназу малатполуальдегиддегидрогеназы по изобретению и терминаторную регуляторную последовательность, которая является функциональной в указанном организме-хозяине.
Настоящее изобретение также относится к клонированию и/или экспрессирующемуся вектору, содержащему химерный ген в соответствии с изобретением или последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению. Вектор в соответствии с изобретением используют для трансформации организма-хозяина и экспрессии в этом организме любого из малаткиназы, малатполуальдегиддегидрогеназы и/или ДГМ дегидрогеназа. Этот вектор может представлять собой плазмиду, космиду, бактериофаг или вирус. Предпочтительно, трансформирующий вектор в соответствии с изобретением представляет собой плазмиду. Как правило, основные количества этого вектора должны обладать способностью поддерживать себя и реплицировать себя в клетках организма-хозяина, в частности за счет присутствия ориджина репликации, и для экспрессии в них любой из малаткиназы, малатполуальдегиддегидрогеназы и/или ДГМ дегидрогеназы. Для задачи стабильной трансформации организма-хозяина вектор также может интегрироваться в геном. Выбор такого вектора и также способов встраивания химерного гена в соответствии с изобретением в этот вектор и представляют собой часть общего знания специалистов в данной области техники. Благоприятно, вектор, используемый в настоящем изобретении, также содержит дополнительно к химерному гену в соответствии с изобретением химерный ген, кодирующий селективный маркер. Этот селективный маркер дает возможность отобрать организмы-хозяева, которые эффективно трансформируются, т.е. хозяева, которые включают вектор. В соответствии с конкретным воплощением изобретения организм-хозяин, который подвергают трансформации, представляет собой бактерию, дрожжи, гриб. Среди селективных маркеров, которые могут быть использованы, могут быть упомянуты маркеры, содержащие гены резистентности к антибиотикам, такие как, например ген гигромицин фосфотрансферазы. Другие маркеры могут представлять собой гены для дополнения ауксотрофности, такие как гены pyrA, pyrB, pyrG, pyr4, arg4, argB и trpC, ген молибдоптерин синтетазы или ген ацетамидазы. Также можно упомянуть гены, кодирующие легко идентифицируемые ферменты, такие как фермент GUS, или гены, кодирующие пигменты или ферменты, регулирующие продукцию пигментов в трансформированных клетках. Такие селективные маркерные гены в частности описаны в заявках на патенты WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 и WO 97/04103.
Настоящее изобретение также относится к трансформированным организмам-хозяевам, содержащим по меньшей мере один химерный ген в соответствии с изобретением, интегрированный в их геном, или располагающийся на экстрахромосомальном генетическом элементе, например плазмиде. В более специфическом аспекте изобретения трансформированный организм-хозяин содержит нуклеиновую кислоту по изобретению, кодирующую малаткиназу, или химерный ген, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую малаткиназу, или экспрессирующийся вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую малаткиназу, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую малатполуальдегиддегидрогеназу, или химерный ген, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую малат полуальдегиддегидрогеназу, или экспрессирующийся вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую малатполуальдегиддегидрогеназу, и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую ДГМ дегидрогеназу, химерный ген, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую ДГМ дегидрогеназу, или экспрессирующийся вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую ДГМ дегидрогеназу.
В специфическом аспекте изобретения нуклеиновая кислота, кодирующая малаткиназу, представлена в SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 42 или SEQ ID No. 44, нуклеиновая кислота, кодирующая малат полуальдегид дегидрогеназу, представлена в SEQ ID 55, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 63, SEQ ID No. 65 или SEQ ID No. 67, и нуклеиновая кислота, кодирующая ДГМ дегидрогеназу, представлена в SEQ ID No. 73, SEQ ID No. 75, SEQ ID No. 224, SEQ ID No. 226 или SEQ ID No. 82.
Предполагается, что термин "организм-хозяин" обозначает любой низший одноклеточный организм, в который химерный(е) ген(ы), нуклеиновая(ые) кислота(ы) или вектор(ы) в соответствии с изобретением может(гут) быть введен(ы) для продукции 2,4-ДГМ.Предпочтительно, организм-хозяин представляет собой микроорганизм, в частности гриб, например рода Penicillium, Aspergillus и конкретней Aspergillus flavus, Chrysosporium или Trichoderma genus, дрожжи, в частности рода Saccharomyces, Kluyveromyces или Pichia, и конкретней Zygosaccharomyces rouxii, бактерию, например рода Escherichia, в частности Е.coli, или рода Corynebacterium, конкретней Corynebactenum glutamicum, или рода Streptomyces или бакуловируса.
Организм-хозяин может представлять собой организм-хозяин, который в природе сверхпродуцирует малат или сукцинат из сахаров, таких как глюкоза, или организм-хозяин, который сконструирован таким образом, чтобы сверхпродуцировать малат или сукцинат из сахаров, таких как глюкоза, и из которого удалены все потенциальные мембранные переносчики, которые облегчают экспорт органических кислот, таких как малат, пируват, сукцинат и фумарат. Организм-хозяин может представлять собой организм, который сконструирован для того, чтобы сверхпродуцировать ДГМ, и из которого удалены все мембранные переносчики, которые облегчают экспорт органических кислот, таких как малат, пируват, сукцинат и фумарат. Примеры пермеаз, которые облегчают экспорт малата и других органических кислот, представляют собой Мае1 из Schizosaccharomyces pombe (Camarasa et al., 2001; Grobler et al, 1995), DctA из Bacillus subtilis (Groeneveld et al., 2010), Dct 1-4 из Е.Coli, Jen1 из S.cerevisiae (Akita et al., 2000). Эксперт может идентифицировать кандидаты пермеаз в других микроорганизмах на основе гомологии последовательности. Эти конструкции служат для поддержания малата и других органических кислот внутри клетки для того, чтобы они были доступны для продукции ДГМ.
Подразумевается, что выражение "трансформированный организм-хозяин" обозначает организм-хозяин, который включает в свой геном или во внехромосомальный генетический элемент, например плазмиду, по меньшей мере один химерный ген в соответствии с изобретением и следовательно продуцирует любую из малаткиназы, малат полуальдегид дегидрогеназы и/или ДГМ дегидрогеназы в своих тканях, или в культуральной среде. Для получения организмов-хозяев в соответствии с изобретением специалисты в данной области техники могут использовать один из множества известных способов трансформации.
Один из этих способов заключается в том, чтобы привезти клетки организмов-хозяев, которые необходимо трансформировать, в контакт с полиэтиленгликолем (PEG) и с векторами в соответствии с изобретением. Электропорация представляет собой еще один способ, который заключается в том, чтобы подвергнуть клетки, которые необходимо трансформировать, и векторы по изобретению действию электрического поля. Еще один способ заключается в том, чтобы непосредственно инъецировать векторы в клетки или ткани путем микроинъекции. Может быть использован "биолистический" способ. Он состоит в бомбардировании клеток или тканей частицами, на которых адсорбированы векторы по изобретению (патент США No. 4945050).
Несколько способов трансформации бактерий описаны в литературе для Escherichia coli и других грамотрицательных бактерий. Также может быть использована конъюгация. Для грамположительных бактерий может быть использована электропорация и также трансформация протопластов, в частности для бактерий рода Streptomyces.
Несколько способов трансформации грибов также описаны в литературе. Трансформация протопластов с использованием PEG описана для Aspergillus в ЕР 0260762, и адаптация этого способа для видов Penicillium funiculosum описана в WO 00/36120. Также известна трансформация путем интеграции, опосредованной рестрикционным ферментом, или REMI, как трансформация протопласта с использованием бактерий рода Agrobacterium. В литературе также описаны способы трансформации дрожжей.
В еще одном аспекте изобретение относится к способу продукции 2,4-ДГМ, при котором осуществляют стадию выращивания трансформированного микроорганизма по изобретению.
Для продукции ДГМ различные углеводы могут быть использованы индивидуально или в виде смеси, такие как глюкоза, фруктоза, сахароза, мелассы, мальтоза, тростниковые мелассы, крахмальный гидролизат (глюкоза, олигосахариды), лактоза, мальтоза, крахмал и крахмальные гидролизаты, целлюлоза, целлюлозный гидролизат, глицерин и определенные углеводороды, масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло, а также жирные кислоты, такие как, например пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота. Эти вещества могут быть использованы индивидуально или в виде смесей.
Различные источники азота могут быть использованы индивидуально или в виде смесей для коммерческого и полупромышленного производства, включающие неорганические соединения, такие как газообразный и водный аммиак, аммониевые соли неорганических или органических кислот, такие как сульфат аммония, нитрат аммония, фосфат аммония, хлорид аммония, ацетат аммония и карбонат аммония. Альтернативно, также могут быть использованы природные азотсодержащие органические материалы, такие как соевый гидролизат, HCl-гидролизат соевого белка (общее содержание азота составляет приблизительно 7%), соевая мука, гидролизат соевого жмыха, жидкий кукурузный экстракт, казеиновый гидролизат, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, мочевина, пептоны и аминокислоты.
Производственный процесс может быть осуществлен в аэробных, анаэробных условиях и условиях с ограниченным содержанием кислорода. Он может быть осуществлен в виде подпитываемого процесса или периодического процесса.
Указанная продукция 2,4-ДГМ может быть осуществлена путем выращивания организма-хозяина в средах, в которые малат (или другую органическую кислоту, такую как пируват, сукцинат или фумарат) добавлены сами по себе или вместе с другим источником углерода, который обеспечивает рост. Малат (и другие органические кислоты) могут быть добавлены непосредственно или путем разработки двухстадийного способа ферментации, где малат (или другие органические кислоты) продуцирует на первой стадии способа микроорганизм, сверхпродуцирующий малат, а продукцию 2,4-ДГМ осуществляют на следующей стадии с использованием организма-хозяина по изобретению.
Разделение и очистка продукта представляет собой очень важный фактор, значительно влияющий на эффективность всего способа и стоимость продукта. Способы выделения продукта в общем содержат стадии отделения клеток, а также очистки, концентрирования и сушки продукта, соответственно.
Отделение клеток
Ультрафильтрация и центрифугирование могут быть использованы для отделения клеток из ферментационной среды. Отделение клеток от ферментационных сред часто осложняется высокой вязкостью среды. Таким образом, можно добавить добавки, такие как неорганическую кислоту или соли щелочных металлов, или нагревание культуральной среды для оптимизации клеточного разделения.
Выделение продукта
Различные способы ионообменной хроматографии могут быть применены для выделения ДГМ до или после удаления биомассы. Они включают применение первичных катионообменных смол, которые облегчают разделение продуктов в соответствии с их изоэлектрической точкой. Как правило, смола заряжается раствором, и оставшийся продукт элюируется отдельно в соответствии с увеличением рН (например, путем добавления гидроксида аммония) в элюенте. Еще одна возможность представляет собой применение ионообменной хроматографии с использованием смол с фиксированным или условным подвижным слоем. Различные хроматографические стадии могут быть комбинированы для достижения необходимой чистоты продукта. Эти способы очистки являются более экономными по сравнению с дорогостоящей стадией кристаллизации, также обеспечивая дополнительные преимущества и гибкость в отношении формы конечного продукта.
Концентрирование и сушка продукта
Способ очистки также может содержать стадию сушки, которая может включать любые подходящие средства сушки, такие как распылительный гранулятор, распылительная сушилка, барабанная сушилка, роторная сушилка и туннельная сушилка. Концентрированные растворы ДГМ могут быть приготовлены путем нагревания ферментационных бульонов при пониженном давлении паром при 130°С с использованием многофункционального концентратора или тонкослойного испарителя.
Эффективная продукция ДГМ может обеспечиваться путем оптимизации перераспределения углеродного потока в метаболической схеме организма-хозяина и путем обеспечения достаточного поступления НАДФН (восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат) и АТФ (аденозинтрифосфат) для трех ферментов в пути ДГМ.Направление углеродного потока в желаемом метаболическом пути и поступление кофактора NAD(P)H как правило облегчают путем устранения или уменьшения интенсивности конкурирующих природных ферментативных путей. Неисключительные примеры представляют собой
- оптимизацию продукции малата в S.cerevisiae путем блокирования образования этанола (путем устранения пируват декарбоксилаз (Zelle et al., 2008; Zelle et al., 2010).
- оптимизацию продукции сукцината или малата в Е.coli путем блокирования образования лактата (например, делеция ldhA), образования ацетата (например, делеция pta, ackA), образования этанола (например делеция adhE), образования формиата (например делеция pflB, focA), окисления пирувата (например делеция рохВ), разрушения малата (делеция maeB и scfA), образования сукцината (например делеция frdBC), образования метилглиоксаля (делеция mgsA) (Jantama et al., 2008a; Jantama et al., 2008b; Lin et al., 2005; Sanchez et al., 2005a; Zhang et al., 2011).
Еще одна возможность увеличения потока углерода и поступления АТФ для продукции органических кислот представляет собой конструирование фосфоенолпируват (РЕР)/пируват/оксалоацетатного пути (обзор в (Sauer & Eikmanns, 2005)). Неисключительные примеры метаболических сконструированных стратегий, которые обеспечивают увеличение потока углерода из фосфоенолпирувата в оксалоацетат, представляют собой
- оптимизацию продукции малата в S.cerevisiae путем блокирования функции пируваткиназы и увеличения активности PEP карбоксикиназы (Zelle et al., 2010).
- оптимизацию продукции сукцината в Е.coli путем увеличения активности природной или гетерологически экспрессируемой PEP карбоксилазы, PEP карбоксикиназы или пируват карбоксилазы (Millard et al., 1996; Sanchez et al., 2005b; Zhang et al., 2009).
Еще одна возможность для увеличения потока углерода и поступления АТФ для продукции органических кислот в Е.coli и другие бактерии, использующие фосфотрансферазную систему (PTS), потребляющую PEP (фосфоенолпируват), для исходной стадии фосфорилирования глюкозы заключается в устранении важных компонентов системы PTS (например ptsl или ptsG) (Lin et al., 2005; Zhang et al., 2009). Для обеспечения дополнительного захвата глюкозы в мутантах, несущих мутации, нарушающие систему PTS, должна быть обеспечена активность альтернативных систем захвата глюкозы (например GalP).
Еще одна возможность для увеличения потока углерода в желаемых путях продукции органических кислот заключается в конструировании цикла Кребса и глиоксилатного цикла. Неисключительные примеры представляют собой
- оптимизацию продукции янтарной кислоты в Е.coli путем увеличения активности изоцитратлиазы (устранение транскрипционного репрессора iclR) (Lin et al., 2005; Sanchez et al., 2005a).
- оптимизацию продукции янтарной кислоты путем устранения изоцитрат дегидрогеназы и/или сукцинат дегидрогеназы (Lin et al., 2005).
Еще одна возможность для увеличения потока углерода в желаемых путях продукции ДГМ представляет собой экспрессию соответствующих пируватдегидрогеназ и цитратсинтетаз в организме-продуценте. Природная пируватдегидрогеназа и цитратсинтетаза Е.coli ингибируются высокими внутриклеточными концентрациями НАДН, приводя к тому, что ферменты менее активны в анаэробных условиях. В Е coli экспрессия мутантной пируватдегидрогеназы, нечувствительной к НАДН, приводит в результате к сверхпродукции ацетил-СоА (ацетил-коэнзим А) в анаэробных условиях и модифицированному перераспределению потока углеродов между ферментативными конечными продуктами (ацетат, лактат, этанол, формиат и пируват) (Wang et al., 2010). Гетерологическая экспрессия цитратсинтетазы Bacillus subtilis, не чувствительной к НАДН, увеличивала продукцию янтарной кислоты в сконструированных штаммах Е.coli (Sanchez et al., 2005a). В комбинации с вышеописанными мутациями применение соответствующих пируват дегидрогеназ и цитратсинтетаз (чувствительных и нечувствительных к НАДН) дает возможность для переключения перераспределения потока углерода между реакциями глиоксилатного цикла и цикла Кребса и ферментативными путями в анаэробных и аэробных условиях.
Еще одна возможность увеличения потока углерода через ДГМ путь заключается в устранении ферментативных реакций, которые могут разрушать промежуточные соединения пути 4-фосфомалат, 4-малат полуальдегид. Ферменты-кандидаты, которые могут разрушать малат полуальдегид, представляют собой дегидрогеназы янтарного полуальдегида (sad, gabD), и другие дегидрогеназы, которые способны окислять С4 молекулы с концевыми альдегидными группами.
Еще одна возможность увеличить продуктивность ДГМ организмом-хозяином заключается в устранении метаболических реакций, которые разрушают ДГМ.ДГМ представляет собой конкурентный ингибитор малик-энзима, таким образом, обладая относительно высокой аффинностью в отношении активного сайта этого фермента (Rognstad & Katz, 1979). Таким образом, ДГМ может распознаваться другими ферментами и потенциально разрушаться. Эти ферменты могут быть идентифицированы и удалены из организма-хозяина.
Когда продукция 2,4-ДГМ основана на добавлении малата или других органических кислот, тогда микроорганизмы, продуцирующие 2,4-ДГМ, должны функционально экспрессировать белок мембранного транспорта, который облегчает захват малата (или других органических кислот, таких как пируват, сукцинат и т.д).
Следующие примеры иллюстрируют изобретение. Эти примеры приведены только для иллюстрации и их не следует рассматривать как ограничивающие каким-либо путем объем изобретения.
Краткое описание графических материалов
Фиг.1: (i) Реакционная схема, которая описывает превращение (L)-малата в (L)-2,4-дигидроксибутират (ДГМ), и (ii) аналогия с превращением (L)-аспартата в (L)-гомосерин.
Фиг.2: Совмещение аминокислотных последовательностей аспартаткиназ из различных организмов. (Ес_AKIII - аспартаткиназа III (SEQ ID No. 4), LysC из Е.coli, Ec_AKI (SEQ ID No. 87) - аспартаткиназа I, ThrA из Е.coli, Ec_AKII (SEQ ID No. 88 - аспартаткиназа II, MetL из Е.coli, Mj - Methanococcus jannaschii (SEQ ID No. 89), Tt - Thermus thermophilus (SEQ ID No. 90), Cg - Corynebacterium glutamicum (SEQ ID No. 91), At - Arabidopsis thaliana (SEQ ID No. 92), Sc - Saccharomyces cerevisiae. (SEQ ID No. 93)) Изображение получено с использованием ClustaIW2 (Larkin et al., 2007).
Фиг.3: Совмещение аминокислотных последовательностей аспартат полуальдегид дегидрогеназ из различных организмов. (Ec - Е.Coli (SEQ ID No. 49), Mj - Methanococcus jannaschii (SEQ ID No. 94), Tt - Thermus thermophilus (SEQ ID No. 95), Bs - Bacillus subtilis (SEQ ID No. 96), Cg - Corynebacterium glutamicum (SEQ ID No. 97), At - Arabidopsis thaliana (SEQ ID No. 98), Sc - Saccharomyces cerevisiae. (SEQ ID No. 99)). Изображение получено с использованием ClustaIW2 (Larkin et al., 2007).
Фиг.4: масштабирование GC хроматограмм области, соответствующей времени удерживания ДГМ, демонстрирующей: (А) стандарт ДГМ (концентрация = 1 мМ); (В) композиция реакционной смеси А, содержащей малаткиназу (МК), малатполуальдегиддегидрогеназу (MSA-Dh) и малатполуальдегидредуктазу (MSA-Red); (С) композиция контрольной реакционной смеси В (такой же как А, но без MSA-Red); (D) композиция контрольной реакционной смеси С (такой же как А, но без MSA-Dh).
Фиг.5: Относительные активности очищенных мутантов LysC E119G, LysC E119G Е250К, LysC E119G Т344М, LysC E119G S345L, LysC E119G T344M, и LysC E119G T352I в отношении концентрации лизина в реакционном буфере.
Примеры
Пример 1: Тестирование аспартаткиназ LysC и Hom3 из Escherichia coli и Saccharomyces cerevisiae, соответственно, в отношении аспартат- и малаткиназной активности
Конструирование плазмид, содержащих гены дикого типа аспартаткиназы: Плазмиду pLYSCwt конструировали путем амплификации гена IysC при помощи ПЦР (полимеразной цепной реакции) с использованием высокоточной полимеразы Phusion™ (Finnzymes) и прямых и обратных праймеров 5’CACGAGGTACATATGTCTGAAATTGTTGTCTCC3’ (SEQ ID No. 1) и 5’CTTCCAGGGGATCCAGT-ATTTACTCAAAC3’ (SEQ ID No. 2), которая вводит сайты рестрикции NdeI и SamHI выше стартового кодона и ниже стоп-кодона, соответственно. Геномную ДНК из Е.coli DH5α использовали в качестве матрицы. Продукт ПЦР расщепляли при помощи NdeI и BamHI, лигировали в соответствующие сайты экспрессирующегося вектора рЕТ28а (Novagen) с использованием Т4 ДНК лигазы (Biolabs), и трансформировали в клетки Е.coli DH5α. Получающуюся в результате плазмиду pAKIIIwt выделяли, и при помощи секвенирования ДНК показали, что она содержит полноразмерный ген lysC, имеющий правильную последовательность (SEQ ID No. 3). Соответствующий белок представлен в SEQ ID No. 4.
Плазмиду pHOM3wt конструировали путем амплификации гена НОМ3 при помощи ПЦР с использованием высокоточной полимеразы Phusion™ (Finnzymes) и прямых и обратных праймеров 5’TATAATGCTAGCATGCCAATGGATTTCCAACC3’ (SEQ ID No. 5) и 5’TATAATGAATTCT-TAAATTCCAAGTCTTTTCAATTGTTC3’ (SEQ ID No. 6), которая вводит сайты рестрикции NheI и EcoRI выше стартового кодона и ниже стоп-кодона, соответственно. Геномную ДНК из S.cerevisiae BY4741wt использовали в качестве матрицы. Продукт ПЦР расщепляли при помощи NheI и EcoRI, и лигировали в соответствующие сайты экспрессирующегося вектора рЕТ28а (Novagen) с использованием Т4 ДНК лигазы (Biolabs), и трансформировали в клетки Е.coli DH5α. Получающуюся в результате плазмиду pHOM3wt выделяли, и при помощи секвенирования ДНК показали, что она содержит полноразмерный ген НОМЗ, имеющий правильную последовательность (SEQ ID No. 7). Соответствующий белок представлен в SEQ ID No. 8.
Экспрессия ферментов; Клетки Е.coli BL21 D3 star трансформировали соответствующими плазмидами. Ферменты с N-концевой последовательностью гекса-His экспрессировали в 250 мл культуры LB, которую инокулировали из ночной культуры при OD600 0,1 и выращивали до OD600 0,6, а затем экспрессию белка индуцировали путем добавления 1 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) в культуральную среду. После 3 ч экспрессии белка клетки собирали путем центрифугирования при 1300 g в течение 10 мин и хранили при -20°С до последующего анализа. Рост и экспрессию белка осуществляли при 37°С. Культуральные среды содержали 50 мкг/л канамицина.
Очистка ферментов: Замороженные клеточные осадки экспрессирующихся культур ресуспендировали в 0,5 мл разрушающего буфера (50 мМ Hepes, 300 мМ NaCl, pH 7,5) и разрушали при помощи четырех последующих раундов ультразвуковой обработки (Bioblock Scientific, VibraCell™ 72437) с выходной мощностью, составляющей 30%. Клеточный дебрис удаляли путем центрифугирования неочищенных экстрактов в течение 15 мин при 4°С при 13000 g, и получали прозрачный супернатант. РНК и ДНК удаляли из экстрактов путем добавления 15 мг/мл стрептомицина (Sigma), центрифугирования образцов при 13000 g в течение 10 мин при 4°С и получения супернатанта. Прозрачный белковый экстракт инкубировали в течение 1 ч при 4°С с объемом слоя кобальтовой аффинной смолы Talon™ (Clontech) 0,75 мл. Суспензию центрифугировали при 700 g в настольной центрифуге, и супернатант удаляли. Смолу промывали 10 объемами слоя промывающего буфера (50 мМ Через, 300 мМ NaCl, 15 мМ Имидазол, рН 7,5), а затем аспартаткиназы элюировали 0,5 мл элюирующего буфера (50 мМ Hepes, 300 мМ NaCl, 500 мМ Имидазол, рН 7,5). Чистоту элюрованных ферментов проверяли при помощи анализа SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия).
Ферментативный анализ. Активности аспартат- или малаткиназы измеряли путем сочетания продукции АДФ (аденозиндифосфата) в киназных реакциях с окислением НАДН в присутствии фосфоенолпирувата, пируваткиназы и лактатдегидрогеназы.
Схема реакции:
Аспартат (или малат) киназа
аспартат (или малат) + АТФ → 4-фосфо-(L)-аспартат (или 4-фосфо-(L)-малат) + АДФ
Пируваткиназа
АДФ + фосфоенолпируват → АТФ + пируват
Лактатдегидрогеназа
пируват + НАДН → NAD+ + лактат
Анализируемая смесь содержала 50 мМ Hepes (рН 7,5), 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,24 мМ НАДН, 0,96 мМ АТФ, 0,96 мМ ФЕП (фосфоенолпируват), 9 мкг/мл лактатдегидрогеназы (Sigma, L2500), 12,4 мкг/мл пируваткиназы (Sigma, P1506), и соответствующие количества очищенной аспартат (малат) киназы. Реакции инициировали путем добавления 50 мМ (L)-аспартата или (L)-малата. Ферментативные анализы осуществляли при 30°С в 96-луночных плоскодонных микротитровальных планшетах в конечном объеме 250 мкл. Реакции контролировали по характеристическому поглощению НАДН при 340 нм в микропланшетном ридере (BioRad 680XR).
Гидроксаматный анализ. Для проверки фосфорилирования субстрата, т.е. образования ацилфосфатного ангидрида аспартаткиназами дикого типа или мутантными аспартаткиназами продукт киназной реакции инкубировали с гидроксиламином с образованием соответствующего аспартат- или малатгидроксаматного производного. Анализируемая смесь содержала 120 мМ Hepes (рН 8), 200 мМ KCl, 10 мМ АТФ, 200 мМ гидроксиламин, 10 мМ аспартат или малат, и соответствующее количество очищенного белка. Реакцию останавливали через 30 мин путем добавления равного объема 1,7% (масс./об.) FeCl3 в 1 М соляной кислоты. Образование комплекса гидроксамата с железом подтверждали путем измерения его характеристического поглощения при 540 нм в микропланшетном ридере. Анализируемые смеси, содержащие все компоненты за исключением АТФ, использовали в качестве отрицательного контроля.
Результаты: Очищенные LysC (без His последовательности, SEQ ID No. 4) и Hom3 (без His последовательности, SEQ ID No. 7) ферменты демонстрировали аспартаткиназную активность, но не способны фосфорилировать малат, что подтверждается при помощи гидроксаматного анализа (Keng & Viola, 1996). Максимальные активности для LysC и Hom3 по аспартату составляли 4,5 мкмоль/(мин*мгбелка) и 1,6 мкмоль/(мин*мгбелка), соответственно. Значение Km для аспартата оценивали при помощи способа Eadie и Hofstee путем измерения исходных скоростей реакции (v) при различных концентрациях субстрата (с) и путем вычитания наклона v в зависимости от графика v/c. Оценивали, что Km очищенного LysC с His последовательностью составляла приблизительно 0,6 мМ, демонстрируя то, что белок с His последовательностью обладает той же самой субстратной аффинностью как и очищенный фермент без концевой последовательности, которая, как сообщается, составляет 0,6 мМ (Marco-Marin et al., 2003).
Пример 2: Сайтнаправленный мутагенез аспартаткиназы LysC из Escherichia coli и тестирование мутантных ферментов в отношении малаткиназной активности
Сайтнаправленный мутагенез осуществляли с использованием пар олигонуклеотидов, перечисленных в таблице 1, и плазмиды pLYSCwt (SEQ ID No. 3) в качестве матрицы. Точечные мутации для изменения аминокислотной последовательности вводили при помощи ПЦР (Phusion 1U, буфер HF 20% (об./об.), dNTP 2,5 мМ, прямые и обратные праймеры по 1 мкМ каждого, матричная плазмида 200 нг, вода) с использованием пары олигонуклеотидов, представленной в таблице 1. Плазмиды, образованные при помощи ПЦР, содержали новый сайт рестрикции для Nco1 (введенный с использованием молчащих мутаций) в дополнение к функциональной мутации для облегчения идентификации мутантных клонов. Продукты ПЦР расщепляли при помощи DpnI при 37°С в течение 1 ч для удаления матричной ДНК, и трансформировали в NEB 5-альфа компетентные клетки Е.coli (NEB). Мутантные плазмиды идентифицировали при помощи анализа по сайтам рестрикции и убеждались в том, что они несут желаемые мутации, при помощи секвенирования ДНК.
Последовательность, демонстрирующая мутацию в позиции 119, может быть представлена в SEQ ID No. 9, где остаток в позиции 119 представляет собой X, где Х представляет собой любую из 19 встречающихся в природе аминокислот (за исключением глутамина).
Мутантные ферменты экспрессировали, очищали и тестировали в отношении аспартат- и малаткиназной активности, как описано в примере 1. Результаты обобщены в таблице 2.
Ни один из мутантов, перечисленных в Таблице 2, не обладал активностью в отношении аспартата.
Результаты демонстрируют, что аспартаткиназа может быть превращена в малаткиназу путем замены консервативного глутамата в позиции 1.19 на цистеин, глицин, аспарагин, пролин, глутамин, серин, треонин или валин.
Соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты фермента, представленного в таблице 2, представляют собой SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25 и SEQ ID No. 27.
Пример 3: Конструирование малаткиназы с сильно уменьшенной чувствительностью для ингибирования лизином
Сайтнаправленный мутагенез осуществляли с использованием пар олигонуклеотидов, представленных в таблице 3, и плазмиды pLYSC_E119G в качестве матрицы (плазмида pLYSC_E119G получена, как описано в примере 2 путем осуществления следующих изменений в последовательности ДНК гена lysC: (SEQ ID No. 15). Точечные мутации для изменения аминокислотных последовательностей вводили при помощи ПЦР (Phusion 1U, буфер HF 20% (об./об.), dNTP 2,5 мМ, прямой и обратный праймеры 1 мкМ каждого, матричная плазмида 200 нг, вода) с использованием пар олигонуклеотидов, перечисленных в таблице 1. Когда возможно, плазмиды, созданные при помощи ПЦР, содержали новые сайты рестрикции (введенные с использованием молчащих мутаций) в дополнение к функциональной мутации для облегчения идентификации мутантных клонов. Продукты ПЦР расщепляли при помощи DpnI при 37°С в течение 1 ч для удаления матричной ДНК, и трансформировали в NEB 5-альфа компетентные клетки Е.coli (NEB). Мутантные плазмиды идентифицировали при помощи анализа сайтов рестрикции и убеждались в том, что они несут желаемые мутации, при помощи секвенирования ДНК.
Последовательность нуклеиновой кислоты белка LysC E119G, содержащая дополнительную мутацию, соответствующую (2) замене глутаминовой кислоты в позиции 250 на лизин, представлена в SEQ ID No. 38; ее соответствующая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID No. 39; (2) замена треонина в позиции 344 на метионин представлена в SEQ ID No. 40; ее соответствующая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID No. 41; (3) замена треонина в позиции 352 на изолейцин представлена в SEQ ID No. 42; ее соответствующая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID No. 43, (4) замена серина в позиции 345 на лейцин представлена в SEQ ID No. 44; ее соответствующая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID No. 45.
Экспрессия и очистка ферментов; Экспрессию белка для His-маркированных ферментов LysC E119G, LysC E119G Е250К, LysC E119G Т344М, LysC E119G S345L, LysC E119G T352I осуществляли, как описано в примере 1.
Ферментативный анализ: Малаткиназные активности измеряли как описано в примере 1. Концентрация лизина в реакционном буфере варьировала.
Результаты: Введение мутаций Е250К, Т344М или S345L в LysC E119G приводит к тому, что малаткиназная активность становится в значительной степени нечувствительной к повышенным концентрациям лизина (смотри Фиг.4).
Пример 4: Тестирование аспартат полуальдегид дегидрогеназ Asd из Escherichia coli в отношении аспартат- и малат полуальдегид дегидрогеназной активности
Конструирование плазмид, содержащих гены дикого типа аспартат полуальдегид дегидрогеназы; Плазмиду pASDwt конструировали путем амплификации гена asd из Е.coli при помощи ПЦР с использованием высокоточной полимеразы Phusion™ (Finnzymes) и прямых и обратных праймеров 5’TATAATGCTAGCATGAAAAATGTTGGTTTTATCGG3’ (SEQ ID No. 46) и 5’TATAATGGATCCTTACGCCAGTTGACGAAGC3’ (SEQ ID No. 47), которая вводит сайт рестрикции NheI и BamHI выше стартового кодона и ниже стоп-кодона, соответственно. Геномную ДНК из Е.coli DH5α использовали в качестве матрицы. Продукт ПЦР расщепляли при помощи NheI и BamHI, лигировали в соответствующие сайты экспрессирующегося вектора рЕТ28а (Novagen) с использованием Т4 ДНК лигазы (Biolabs), и трансформировали в клетки Е.coli DH5α. Получающуюся в результате плазмиду pASDwt выделяли и при помощи секвенирования ДНК показали, что она содержит полноразмерный ген asd, имеющий правильную последовательность (SEQ ID No. 48). Соответствующая аминокислотная последовательность указанного фермента представлена в SEQ ID No. 49.
Экспрессия и очистка ферментов: Экспрессию белка для His-маркированных ферментов Asd осуществляли, как описано в примере 1.
Ферментативный анализ: Аспартат или малат полуальдегид дегидрогеназные активности измеряли в обратном направлении биосинтеза по восстановлению НАДФ во время окисления аспартат или малат полуальдегида до 4-фосфо-(L)-аспартата или 4-фосфо-(L)-малата, соответственно (Roberts et al., 2003).
(L)-аспартат полуальдегид (или (L)-малат полуальдегид) + НАДФ + Pi → 4-фосфо-(L)-аспартат (или 4-фосфо-(L)-малат) + НАДФН
Анализируемая смесь содержала 200 мМ Hepes (pH 9), 50 мМ K2HPO4, 0,25 мМ НАДФ. Реакции инициировали путем добавления (L)-аспартат полуальдегида или (L)-малатполуальдегида. (L)-аспартатполуальдегид добавляли в форме L-аспарагиновой кислоты β-полуальдегида гидрата трифторацетата (поддерживаемого при pH 3 для предупреждения разрушения), который представлял собой подходящий субстрат для ферментативных тестов гомосерин дегидрогеназы и аспартат полуальдегид дегидрогеназы (Roberts et al., 2003). Нестабильный малат полуальдегид готовили свежим перед ферментативными тестами путем удаления защиты со стабильного малат полуальдегидного производного 2-[(4S)-2,2-диметил-5-оксо-1,3-диоксолан-4-ил]ацетальдегида (DMODA). Малат полуальдегид получали путем инкубации DMODA в 2М соляной кислоте в течение 15 мин при 25°С и выпаривания высвободившегося ацетона (35°С, 50 мбар). pH малат полуальдегидного раствора удерживали на уровне 3 с использованием бикарбоната натрия.
Ферментативные анализы осуществляли в 96-луночных плоскодонных микротитровальных планшетах в конечном объеме 250 мкл при 30°С. Реакции контролировали при помощи при помощи характеристического поглощения НАДФН при 340 нм в микропланшетном ридере (BioRad 680XR).
Результаты: His-маркированная аспартат полуальдегид дегидрогеназа дикого типа, Asd, окисляла (L)-аспартат полуальдегид до 4-фосфо-(L)-аспартата с максимальной специфической активностью 160 мкмоль/(мин*мгбелка). В отношении (L)-малат полуальдегида фермент обладал активностью 0,01 мкмоль/(мин*мгбелка).
Пример 5: Сайтнаправленный мутагенез аспартат полуальдегид дегидрогеназы Asd из Escherichia coli и тестирование мутантных ферментов в отношении малат полуальдегид дегидрогеназной активности
Точечные мутации в аминокислотной последовательности Asd вводили с использованием плазмиды pASDwt в качестве матрицы и в соответствии с протоколом, изложенном в примере 2. Пары олигонуклеотидов, перечисленные в таблице 4, использовали для мутации глутаматного остатка в позиции 241 или остатка треонина в позиции 136. Мутантные плазмиды идентифицировали при помощи анализа сайтов рестрикции и убеждались в том, что они несут желаемые мутации, при помощи секвенирования ДНК
Белок Asd, мутантный в позиции 241, может быть представлен в SEQ ID No. 68, где остаток в позиции 241 представляет собой X, где Х представляет собой любую из других 19 биологически встречающихся аминокислот (за исключением глутамина).
Результаты: Активности и значения Km Asd, мутантной в позиции Е241, обобщены в таблице 5. Мутанты Asd, где глутамат 241 был замещен на аланин, цистеин, глицин, гистидин, изолейцин, метионин или глутамин, окисляли (L)-аспартат-4-полуальдегид до 4-фосфо-(L)-аспартата со значительно более высокой максимальной специфической активностью, чем фермент дикого типа. Двойной мутант Asd E241Q T136N (SEQ ID No. 231) обладал максимальной специфической активностью 0,25 мкмоль/(мин*мгбелка) и Km 0,25 мМ.
Соответствующие нуклеиновые кислоты представлены в SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 48, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 63, SEQ ID No. 65 и SEQ ID No. 67.
Двойной мутант Asd E241Q T136N имел последовательность нуклеиновой кислоты, представленную на SEQ ID No. 230.
Пример 6: Идентификация 2,4 ДГМ дегидрогеназы
Для идентификации подходящей 2,4 ДГМ дегидрогеназы дегидрогеназы бета-гидрокискислоты из различных биологических источников тестировали в отношении их способности восстанавливать малат полуальдегид. Среди тестируемых ферментов были метилбутиральдегид редуктаза, Ypr1 (Ford & Ellis, 2002))(SEQ ID No. 73 и SEQ ID No. 74) из Saccharomyces cerevisiae; и редуктаза янтарного полуальдегида, Ms-Ssr из Metallosphaera sedula (Kockelkorn & Fuchs, 2009)(SEQ ID No. 75 и SEQ ID No. 76). Гены YPR1 и Ms-SSR амплифицировали с использованием праймеров, перечисленных в таблице 6 и клонированных в вектор рЕТ28 (ферменты рестрикции смотри в таблице 3) с получением плазмид pYPRt и pMs-SSR, соответственно. Белки экспрессировали и очищали как описано в примере 1.
Тестирование активности малат полуальдегид редуктазы
Реакция:
(L)-Малат полуальдегид + НАД(Ф)Н → (L)-2,4-дигидроксимасляная кислота + НАД(Ф)
Анализируемая смесь содержала 200 мМ Hepes (pH 7,5), 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 0,24 мМ НАДН или НАДФН и подходящие количества очищенного фермента. Реакции запускали путем добавления 10 мМ (L)-малат полуальдегида (малат полуальдегид готовили свежим для каждого теста, смотри Пример 4). Ферментативные анализы осуществляли при 30°С в 96-луночных плоскодонных микротитровальных планшетах в конечном объеме 250 мкл. За реакциями следили при помощи характеристического поглощения NAD(P)H при 340 нм в микропланшетном ридере (BioRad 680XR). Результаты представлены в таблице 7.
Дегидрогеназа янтарного полуальдегида M.sedula и метилбутиральдегид редуктаза S.cerevisiae обладают малат полуальдегид редуктазной активностью. Km Ms-SSR для малат полуальдегида составляла 1,1 мМ.
Пример 7: Сайтнаправленный мутагенез редуктазы янтарного полуальдегида M.sedula
Сайтнаправленный мутагенез осуществляли с использованием пар олигонуклеотидов, перечисленных в таблице 8, и плазмиды pMs-SSR в качестве матрицы. Точечные мутации для изменения аминокислотных последовательностей вводили при помощи ПЦР (Phusion 1U, буфер HF 20% (об./об.), dNTP (дезоксирибонуклеотидтрифосфаты) 2,5 мМ, прямой и обратный праймеры 1 мкМ каждого, матричная плазмида 200 нг, вода). При возможности плазмиды, созданные при помощи ПЦР, содержали новые сайты рестрикции (введенные с использованием молчащих мутаций) в дополнение к функциональной мутации для облегчения идентификации мутантных клонов. Продукты ПЦР расщепляли при помощи DpnI при 37°С в течение 1 ч для удаления матричной ДНК, и трансформировали в NEB 5-альфа компетентные клетки Е.coli (NEB). Мутантные плазмиды идентифицировали при помощи анализа сайтов рестрикции и подтверждали, что они несут желаемые мутации, путем секвенирования ДНК. В таблице 9 обобщены кинетические параметры мутантов. Результаты демонстрируют, что двойной мутант Ms-SSR H39R N43H (SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 82) обладают улучшенной аффинностью в отношении малат полуальдегида по сравнению с ферментом дикого типа.
Соответствующие последовательности нуклеиновой кислоты представлены в SEQ ID No. 224, SEQ ID No. 226 и SEQ ID No. 82.
Пример 8: Продукция ДГМ in vitro
Ферменты малаткиназу (LysC E119G, SEQ ID No. 15), малат полуальдегид дегидрогеназу (Asd E241Q; SEQ ID No. 67) и малат полуальдегид редуктазу (Ms SSrR, SEQ ID No. 76) экспрессировали и очищали как описано в примере 1. Продукцию ДГМ продемонстрировали in vitro путем добавления 50 мМ малата к реакционной смеси, содержащей 50 мМ Hepes (рН 7,5), 50 мМ KCl, 5 мМ MgCl2, 1 мМ НАДФН, 180 мкг/мл малаткиназы (Lys E119G), 325 мкг/мл малат полуальдегид дегидрогеназы (Asd E241Q) и 130 мкг/мл малат полуальдегид редуктазы (Ms_Ssr) (Реакция А). Контрольные реакционные смеси содержали все компоненты, но были лишены малат полуальдегид редуктазы (Реакция В) или малат полуальдегид дегидрогеназы (Реакция С). После 30 мин инкубации при 30°С реакционную смесь анализировали при помощи газовой хроматографии [CPG Varian Series 430; оборудованный FID (пламенно-ионизационным) детектором; автосэмплером СР8400; инжектором без деления потока 1177 (230°С); колонка: CP-WAX58/FFAP, 30 м × 0,53 мм, df 0,50 мкм; и вкладыш: вводная втулка, колено 6,5×78,5×4 мм GWOL (Varian). Газ-носитель представлял собой азот при скорости потока 25 мл/мин. Пламенную ионизацию осуществляли с использованием смеси воздух-водород (скорости потока составляли 300 мл/мин и 30 мл/мин, соответственно). Температура детектора составляла 240°С. Инжектируемый объем составлял 1 мкл. Температурная программа приведена в таблице 10.
Продукцию ДГМ обнаружили в реакции А (присутствие всех ферментов), но она отсутствовала в контрольных реакциях В и С (Фиг.5).
Пример 9: Оптимизация кодирующей последовательности редуктазы янтарного полуальдегида М.sedula в отношении его экспрессии в Е.coll.
Кодирующую последовательность редуктазы янтарного полуальдегида М.sedula, включающую мутации H39R и N43H, оптимизировали в отношении максимальной экспрессии в Е.coli с использованием программного обеспечения GeneOptimizer®. Синтетический ген получали при помощи GeneArt® Gene Synthesis (Invitrogen Life Technologie). Сайты рестрикции NheI и EcoRI вводили выше стартового кодона и ниже стоп-кодона, соответственно, давая возможность для прямого клонирования в рЕТ28а+ (Novagen).
Получающуюся в результате плазмиду pSSR-H39RN43H-opt выделяли и при помощи секвенирования ДНК показали, что она содержит полноразмерный ген SSR H39R N43H М sedula, имеющий правильную последовательность (SEQ ID No. 228).
Пример 10: Конструирование плазмиды, которая облегчает одновременную экспрессию малаткиназы (мутант гена lysC из Е.coli), малат полуальдегид дегидрогеназы (мутант гена asd из Е.coli), и ДГМ дегидрогеназы (мутант гена редуктазы янтарного полуальдегида М.sedula) с использованием Е.coli в качестве организма-хозяина
Плазмиду pLYSC-E119G E250K (SEQ ID No. 38) использовали в качестве скелета для конструирования оперона. Фрагмент ДНК, содержащий сайт связывания с рибосомой рЕТ28 (Novagen) (rbs) и кодирующую область ASD-E241Q, получали при помощи ПЦР (высокоточная полимераза Phusion™ (Finnzymes)) с использованием pASD-E241Q (SEQ ID No. 55 в качестве матрицы, и прямых и обратных праймеров 5’TATAAGGATCCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGG3’ (SEQ ID No. 83) и 5’TATAAGAATTCTTACGCCAGTTGACGAAG3’ (SEQ ID No. 84), которая вводит сайт рестрикции BamHI и EcoRI выше rbs и ниже стоп-кодона, соответственно. Продукты ПЦР расщепляли при помощи BamHI и EcoRI, лигировали в соответствующие сайты pLYSC-E119G E250K с использованием Т4 ДНК лигазы (Biolabs), и трансформировали в клетки Е.coli DH5α. Получающуюся в результате плазмиду pLYSC-E119G-E250K_ASD-E241Q выделяли, и при помощи секвенирования ДНК показали, что она обладает правильной последовательностью.
Фрагмент ДНК, содержащий сайт связывания с рибосомой рЕТ28 (rbs) и кодирующую область оптимизированной по кодонам Ms-SSR-H39RN43H-opt, получали при помощи ПЦР с использованием pSSR-H39RN43H-opt в качестве матрицы, и прямых и обратных праймеров 5’TATAAGCGGCCGCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATAT3’ (SEQ ID No. 85) и 5’TATAAACTCGAGCTTACGGAATAATCAGG3’ (SEQ ID No. 86), которая вводит сайт рестрикции NotI и PspXI выше rbs и ниже стоп-кодона, соответственно. Продукты ПЦР расщепляли при помощи NotI и PspXI, лигировали в соответствующие сайты pLYSC-E119G-E250K_ASD-E241Q с использованием Т4 ДНК лигазы (Biolabs) и трансформировали в клетки Е.coli DH5α. Получающуюся в результате плазмиду рЕТ28-ДГМ (SEQ ID No. 229) выделяли и при помощи секвенирования ДНК показали, что она обладает правильной последовательностью.
Промоторная область выше 5’, одновременно регулирующая экспрессию трех генов (т.е. промотор Т7 в рЕТ28-ДГМ), может быть заменена на любой другой промотор, как индуцируемый, так и конститутивный, путем расщепления рЕТ28-ДГМ при помощи SphI и XbaI и клонирования еще одной промоторной области подходящими сайтами рестрикции. В качестве примера применения индуцируемого промотора, промотор Т7 скелета рЕТ28-ДГМ заменяли на промотор tac, характеристики которого дают возможность для экспрессии белка в присутствии глюкозы (de Boer et al., 1983). Промотор tac получали из плазмиды рЕХТ20 (Dykxhoorn et al., 1996) путем расщепления плазмиды при помощи SphI и XbaI. Фрагмент ДНК, содержащий промотор, очищали и клонировали в плазмиду рЕТ28-ДГМ, расщепленную SphI и XbaI. Получающуюся в результате плазмиду рТАС-ДГМ выделяли, и при помощи секвенирования ДНК показали, что она обладает правильной последовательностью.
Пример 11: Конструирование штаммов Е.coli для оптимизации перераспределения потока углерода и поступления кофактора НАДФН для ферментативной продукции ДГМ
Несколько генов нарушали в штамме Е.coli MG1655 для оптимизации перераспределения потока углерода и поступления кофактора для продукции ДГМ. Генные делеции осуществляли с использованием способа с рекомбиназой lambda red в соответствии с Datsenko et al. (Datsenko & Wanner, 2000).
Кассеты с делениями готовили при помощи ПЦР с использованием высокоточной полимеразы Phusion™ (Finnzymes) и FRT-фланкированным геном резистентности к канамицину (kan) плазмиды pKD4 в качестве матрицы (Datsenko & Wanner, 2000). Смысловые праймеры содержали последовательности, соответствующие 5’ концу каждого гена-мишени (подчеркнутому) с последующими 20 п.о., соответствующими кассете FRT-kan-FRT из pKD4. Антисмысловые праймеры содержали последовательности, соответствующие 3’ концевой области каждого гена-мишени (подчеркнутой) с последующими 20 п.о., соответствующими кассете. Праймеры описаны в таблице 12. Продукты ПЦР расщепляли при помощи DpnI и очищали перед трансформацией.
Штам Е.coli MG1655 делали электрокомпетентным путем выращивания клеток до OD600 0,6 в жидкой среде LB (Луриа-Бертани) при 37°С, 100-кратного концентрирования клеток и двойного промывания охлажденным на льду 10% глицерином. Клетки трансформировали плазмидой pKD46 (Datsenko & Wanner, 2000) путем электропорации (2,5 кВ, 200 Ω, 25 мкФ, в кюветах с 2 мм щелью). Трансформантов отбирали при 30°С на ампициллине (100 мкг/мл) на твердой среде LB.
Нарушающие кассеты трансформировали в электрокомпетентные штаммы Е.Coli, несущие плазмиду pKD46, экспрессирующую рекомбиназу lambda Red. Клетки выращивали при 30°С в жидкой среде SOB, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Систему рекомбиназы lambda red индуцировали путем добавления 10 мМ арабинозы, когда OD600 в культурах достигала 0,1. Клетки дополнительно выращивали до OD600 0,6, а затем их собирали путем центрифугирования, дважды промывали охлажденным на льду 10% глицерином, и трансформировали нарушающей кассетой путем электропорации. После фенотипической экспрессии в течение ночи при 30°С в среде LB клетки высевали на твердую среду LB, содержащую 25 мкг/мл канамицина. Трансформанты отбирали путем выращивания при 30°С.
Генную замену проверяли при помощи ПЦР из колонии с использованием Taq полимеразы Crimson (NEB). Первую реакцию осуществляли с фланкирующими локус-специфическими праймерами (смотри таблицу 13) для проверки одновременной утраты родительского фрагмента и получения нового специфического для мутантов фрагмента. Две дополнительные реакции осуществляли с использованием соседних локус-специфических праймеров с соответствующим общим тестовым праймером k1rev или k2for (смотри таблицу 13) в кассете FRT-резистентность к канамицину (смысловой праймер локуса/k1 rev и k2for/o6paтный праймер локуса).
Ген резистентности (FRT-kan-FRT) затем вырезали из хромосомы с использованием плазмиды рСР20, несущей FLP рекомбиназу (Cherepanov & Wackernagel, 1995), оставляя область, содержащую один сайт FRT. рСР20 представляет собой плазмиду, резистентную к амипициллину и CmR, которая демонстрирует температурочувствительную репликацию и температурную индукцию синтеза FLP рекомбиназы. Мутанты, резистентные к канамицину, трансформировали рСР20, и трансформанты, резистентные к ампициллину, отбирали при 30°С. Трансформанты затем выращивали на твердой среде LB при 37°С и тестировали в отношении утраты резистентности к антибиотикам. Вырезание кассеты FRT-канамицин анализировали при помощи ПЦР колоний с использованием taq-полимеразы crimson и фланкирующих локус-специфических праймеров (таблица 13). Множественные делеции получали путем повторения вышеописанных стадий.
Штаммы, несущие единичную или множественные делеции, делали электрокомпетентными, как описано выше, трансформировали плазмидой рТАС-ДГМ, которая давала возможность для индуцируемой IPTG (изопропилтиогалактозид) экспрессии ферментов пути ДГМ (смотри пример 10), и отбирали на твердой среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина.
Плазмида рАСТ3-pck, несущая ген pck Е.coli, кодирующий PEP карбоксикиназу, конструировали путем амплификации последовательности, кодирующей pck, с использованием геномной ДНК из Е.coli MG1655 в качестве матрицы и прямого и обратного праймеров, соответственно, 5’TATAATCCCGGGATGCGCGTTAACAATGGTTTGACC3’ (SEQ ID No. 100) и 5’TATAATTCTAGATTACAGTTTCGGACCAGCCG3’ (SEQ ID No. 101). Фрагмент ДНК расщепляли при помощи XmaI и XbaI, лигировали в соответствующие сайты экспрессирующегося вектора рАСТ3 (Dykxhoorn etal., 1996) с использованием Т4 ДНК лигазы (Biolabs), и трансформировали в клетки Е.coli DH5α. Трансформанты отбирали на твердой среде LB, содержащей хлорамфеникол (25 мкг/мл). Получающуюся в результате плазмиду выделяли, и правильность встраивания гена pck подтверждали путем секвенирования. Плазмиды рАСТ3-асеА, рАСТ3-ррс, рАСТ3-galP, рАСТ3-pykA и рАСТ3-рус, несущие, соответственно, асеА, ррс, galP, или pykA (все Е.coli) или русА из Lactococcus lactis, конструировали по аналогии с использованием праймеров, перечисленных в таблице 14.
Вышеупомянутые плазмиды, полученные из рАСТ3, и плазмиду рТАС-ДГМ трансформировали мутантам Е.coli MG1655, несущим комбинации делеций, перечисленных в таблице 12. Трансформанты, содержащие обе плазмиды, отбирали на твердой среде LB, содержащей хлорамфеникол (25 мкг/мл) и канамицин (50 мкг/мл). Примеры конструированных штаммов перечислены в таблице 15.
Таблица 12: |
Праймеры, используемые для нарушения генов. Последовательности, гомологичные генам-мишеням, подчеркнуты. |
Таблица 13: |
Пары праймеров, используемые для подтверждения нарушений генов |
Таблица 14: |
Праймеры, используемые для сверхэкспрессии гена. Сайты рестрикции, используемые для клонирования в рАСТ3, подчеркнуты. |
Таблица 15: |
Примеры штаммов, сконструированных для продукции ДГМ |
Пример 12: Продукция 2,4-дигидроксимасляной кислоты путем ферментации глюкозы
Штаммы и условия выращивания: Эксперименты осуществляли со штаммом Е.coli ЕСЕ1, соэкспрессирующим малаткиназу, малат полуальдегид дегидрогеназу и ДГМ дегидрогеназу из плазмиды рТАС-ДГМ (смотри пример 11), и изогенным контрольным штаммом, содержащим только пустую плазмиду (т.е. скелет рТАС без кодирующих последовательностей вышеупомянутых ферментов). 1 литр культуральной среды содержал 20 г глюкозы, 18 г Na2HPO4 * 12 H2O, 3 г ⋅ KH2PO4, 0,5 г NaCl, 2 г NH4Cl, 0,5 г MgSO4 * 7 Н2О, 0,015 CaCl2 * 2 H2O, 1 мл 0,06 моль/л концентрированного раствора FeCl3, приготовленного в разбавленной в 100 раз концентрированной HCl, 2 мл 10 мМ концентрированного раствора тиамина HCl, 20 г MOPS, 50 мкг канамицин сульфата и 1 мл раствора следовых элементов (содержащего на литр: 0,04 г Na2ЭДTA * 2H2O, 0,18 г CoCl2 * 6 H2O, ZnSO4 * 7 H2O, 0,04 г Na2MoO4 * 2 H2O, 0,01 г Н3ВО3, 0,12 г MnSO4 * H2O, 0,12 г CuCl2 * H2O). pH доводили до 7 и среду стерилизовали путем фильтрования. Все культивирования осуществляли при 37°С в роторном шейкере Infors при скорости 170 об./мин. Ночные культуры (3 мл среды в тестируемой пробирке) инокулировали из глицериновых концентрированных растворов и использовали для доведения исходной OD600 до 0,05 в 100 мл ростовых культур, выращиваемых в колбах для перемешивания объемом 500 мл. IPTG добавляли в концентрации 1 ммоль/л, пока OD600 в ростовых культурах не достигала 0,2.
Оценка концентрации ДГМ при помощи анализов LC-MS/MS (жидкостная хроматография/тандемная масс-спектрометрия)
Культуральную среду отделяли от клеток путем центрифугирования (Beckmann-Coulter Allegra 21R, Ротор Beckmann S4180, 10 мин, 4800 об./мин). Осветленный супернатант хранили при -20°С до последующего анализа. Содержание ДГМ количественно оценивали с использованием HPLC (Waters) (высокоэффективная жидкостная хроматография), оборудованной колонкой ACQUITY UPLC ВЕН (С18, 1,7 мкм, 100×2,1 мм, Waters), соединенной с масс-спектрометрическим детектором (TQ, Waters, режим ESI (ионизация путем распыления электронов), напряжение на капилляре: 2,5 кВ, напряжение на конусе 25 В, напряжение на экстракторе: 3 В, температура источника: 150°С, температура десольватации: 450°С, поток газа на конусе: 50 л/ч, поток газа для десольватации: 750 л/л). Температуру колонки поддерживали при 30°С. Подвижная фаза представляла собой смесь 88% 0,08% раствора тетра-н-бутиламмония гидрокисда и 12% ацетонитрила. Скорость потока фиксировали на уровне 0,4 мл/мин. Объем инжекции образцов составлял 5 мкл.
Результаты:
Содержание ДГМ в культуральной среде штамма Е.coli ЕСЕ1 и контрольного штамма оценивали через 8 ч и 24 ч после индукции экспрессии малаткиназы, аспартат полуальдегид дегидрогеназы и ДГМ дегидрогеназы путем добавления IPTG. Как можно видеть в таблице 16, штамм ЕСЕ1, который экспрессировал ферменты пути ДГМ, продуцировал значительно более высокие количества ДГМ по сравнению с контрольным штаммом, демонстрируя возможность ферментативной продукции ДГМ при помощи метаболического пути, представленного на Фиг.1 (i).
Ссылки:
Akita, O., Nishimori, C,, Shimamoto, T., Fujii, T. & lefuji, H. (2000). Transport of pyruvate in Saccharomyces cerevisiae and cloning of the gene encoded pyruvate permease. Biosci Biotechnol Biochem 64, 980-984.
Bailey, J.E. (1991). Toward a science of metabolic engineering. Science 252, 1668-1675.
Camarasa, C., Bidard, F., Bony, M., Barre, P. & Dequin, S. (2001). Characterization of Schizosaccharomyces pombe malate permease by expression in Saccharomyces cerevisiae. AppI Environ Microbiol 67, 4144-4151.
Cherepanov, P.P. & Wackernagel, W. (1995). Gene disruption in Escherichia coli: TcR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158, 9-14.
Datsenko, K.A. & Wanner, B.L. (2000). One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 97, 6640-6645.
Deck, P., Exner, K. & Buschhaus, B. (2008). Method for the production of D,L-hydroxy-4-alkylthio butyric acid. Edited by B. AG.
Dykxhoorn, D.M., St Pierre, R. & Linn, T. (1996). A set of compatible tac promoter expression vectors. Gene 177, 133-136.
Ford, G. & Ellis, E.M. (2002). Characterization of Yprlp from Saccharomyces cerevisiae as a 2-methylbutyraldehyde reductase. Yeast 19, 1087-1096.
Grobler, J., Bauer, F., Subden, R.E. & Van Vuuren, H.J. (1995). The mae1 gene of Schizosaccharomyces pombe encodes a permease for malate and other C4 dicarboxylic acids. Yeast 11, 1485-1491.
Groeneveld, M., Weme, R.G., Duurkens, R.H. & Slotboom, D.J. (2010). Biochemical characterization of the C4-dicarboxylate transporter DctA from Bacillus subtilis. J Bacteriol 192, 2900-2907.
James, C.L. & Viola, R.E. (2002). Production and characterization of bifunctional enzymes. Domain swapping to produce new bifunctional enzymes in the aspartate pathway. Biochemistry 41, 3720-3725.
Jantama, K., Haupt, M.J., Svoronos, S.A., Zhang, X., Moore, J.C., Shanmugam, K.T. & Ingram, L.O. (2008a). Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains of Escherichia coli C that produce succinate and malate. Biotechnol Bioeng 99, 1140-1153.
Jantama, K., Zhang, X., Moore, J.C., Shanmugam, K.T., Svoronos, S.A. & Ingram, L.O. (2008b). Eliminating side products and increasing succinate yields in engineered strains of Escherichia coli C. Biotechnol Bioeng 101, 881-893.
Keng, Y.F. & Viola, R.E. (1996). Specificity of aspartokinase III from Escherichia coli and an examination of important catalytic residues. Arch Biochem Biophys 325, 73-81.
Kockelkorn, D. & Fuchs, G. (2009). Malonic semialdehyde reductase, succinic semialdehyde reductase, and succinyl-coenzyme A reductase from Metallosphaera sedula: enzymes of the autotrophic 3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate cycle in Sulfolobales. J Bacteriol 191, 6352-6362.
Larkin, M.A., Blackshields, G., Brown, N.P. & other authors (2007). Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23, 2947-2948.
Lin, H., Bennett, G.N. & San, K.Y. (2005). Metabolic engineering of aerobic succinate production systems in Escherichia coli to improve process productivity and achieve the maximum theoretical succinate yield. Metab Eng 7, 116-127.
Marco-Marin, C., Ramon-Maiques, S., Tavarez, S. & Rubio, V. (2003). Site-directed mutagenesis of Eschehchia coli acetylglutamate kinase and aspartokinase III probes the catalytic and substrate-binding mechanisms of these amino acid kinase family enzymes and allows three-dimensional modelling of aspartokinase. J Mol Biol 334, 459-476.
Millard, C.S., Chao, Y.P., Liao, J.C. & Donnelly, M.I. (1996). Enhanced production of succinic acid by overexpression of phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 62, 1808-1810.
Roberts, S.J., Morris, J.C., Dobson, R.C. & Gerrard, J.A. (2003). The preparation of (S)-aspartate semi-aldehyde appropriate for use in biochemical studies. Bioorg Med Chem Lett 13, 265-267.
Rognstad, R. & Katz, J. (1979). Effects of 2,4-dihydroxybutyrate on lipogenesis in rat hepatocytes. J Biol Chem 254, 11969-11972.
Sanchez, A.M., Bennett, G.N. & San, K.Y. (2005a). Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway in Escherichia coli to increase succinate yield and productivity. Metab Eng 7, 229-239.
Sanchez, A.M., Bennett, G.N. & San, K.Y. (2005b). Efficient succinic acid production from glucose through overexpression of pyruvate carboxylase in an Escherichia coli alcohol dehydrogenase and lactate dehydrogenase mutant. Biotechnol Prog 21, 358-365.
Sauer, U. & Eikmanns, B.J. (2005). The PEP-pyruvate-oxaloacetate node as the switch point for carbon flux distribution in bacteria. FEMS Microbiol Rev 29, 765-794.
Shinka, T., Inoue, Y., Ohse, M., Ito, A., Ohfu, M., Hirose, S. & Kuhara, T. (2002). Rapid and sensitive detection of urinary 4-hydroxybutyric acid and its related compounds by gas chromatography-mass spectrometry in a patient with succinic semialdehyde dehydrogenase deficiency. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 776, 57-63.
Wang, Q., Ou, M.S., Kirn, Y., Ingram, L.O. & Shanmugam, K.T. (2010). Metabolic flux control at the pyruvate node in an anaerobic Escherichia coli strain with an active pyruvate dehydrogenase. Appl Environ Microbiol 76, 2107-2114.
Werpy, T. & Petersen, G. (2004). Top value added chemicals from biomass. Results of screening for potential candidates from sugars and synthesis gas. Washington, DC: http://dx.doi.org/10.2172/15008859.
Zelle, R.M., de Hulster, E., van Winden, W.A. & другие авторы (2008). Malic acid production by Saccharomyces cerevisiae: engineering of pyruvate carboxylation, oxaloacetate reduction, and malate export. Appl Environ Microbiol 74, 2766-2777.
Zeile, R.M., Trueheart, J., Harrison, J.C., Pronk, J.T. & van Maris, A.J. (2010). Phosphoenolpyruvate carboxykinase as the sole anaplerotic enzyme in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol 76, 5383-5389.
Zhang, X., Jantama, K., Moore, J.C., Jarboe, L.R., Shanmugam, K.T. & Ingram, L.O. (2009). Metabolic evolution of energy-conserving pathways for succinate production in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 106, 20180-20185.
Zhang, X., Wang, X., Shanmugam, K.T. & Ingram, L.O. (2011). L-malate production by metabolically engineered Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 77, 427-434
Claims (35)
1. Способ получения 2,4-дигидроксимасляной кислоты (2,4-ДГМ), включающий:
- первую стадию превращения малата в 4-фосфомалат с использованием фермента, способного осуществить подобное превращение, где указанный фермент имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 43 и SEQ ID No. 45;
- вторую стадию превращения 4-фосфомалата в малат-4-полуальдегид с использованием фермента, способного осуществить подобное превращение, где указанный фермент имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 66 и SEQ ID No. 231;
- третью стадию превращения малат-4-полуальдегида в 2,4-ДГМ с использованием фермента, способного осуществить подобное превращение, где указанный фермент имеет последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 74, SEQ ID No. 76, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 225 и SEQ ID No. 227.
2. Способ по п. 1, где малат, используемый на первой стадии, получают при помощи микроорганизма, сверхпродуцирующего малат.
3. Фермент, превращающий малат в 4-фосфомалат, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 18, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 43 и SEQ ID No. 45.
4. Фермент, превращающий 4-фосфомалат в малат-4-полуальдегид, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 66 и SEQ ID No. 231.
5. Фермент, превращающий малат-4-полуальдегид в 2,4-ДГМ, имеющий последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 225 и SEQ ID No. 227.
6. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая фермент по п.3, имеющая последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 42 и SEQ ID No. 44.
7. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая фермент по п.4, имеющая последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 63, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 67 и SEQ ID No. 230.
8. Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая фермент по п.5, имеющая последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 82, SEQ ID No. 224 и SEQ ID No. 226.
9. Химерный ген для трансформации микроорганизма-хозяина и экспрессии в этом микроорганизме фермента по п.3, содержащий по меньшей мере в направлении транскрипции функционально связанную промоторную регуляторную последовательность, которая является функциональной в организме-хозяине, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты по п.6 и терминаторную регуляторную последовательность, которая является функциональной в указанном организме-хозяине.
10. Химерный ген для трансформации микроорганизма-хозяина и экспрессии в этом микроорганизме фермента по п.4, содержащий по меньшей мере в направлении транскрипции функционально связанную промоторную регуляторную последовательность, которая является функциональной в организме-хозяине, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты по п.7 и терминаторную регуляторную последовательность, которая является функциональной в
указанном организме-хозяине.
11. Химерный ген по п. 10, представленный последовательностью SEQ ID No. 229.
12. Химерный ген для трансформации микроорганизма-хозяина и экспрессии в этом микроорганизме фермента по п.5, содержащий по меньшей мере в направлении транскрипции функционально связанную промоторную регуляторную последовательность, которая является функциональной в организме-хозяине, по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты по п.8 и терминаторную регуляторную последовательность, которая является функциональной в указанном организме-хозяине.
13. Экспрессирующийся вектор для трансформации микроорганизма-хозяина и экспрессии в этом микроорганизме фермента по п.3, содержащий нуклеиновую кислоту по п.6 или химерный ген по п.9.
14. Экспрессирующийся вектор для трансформации микроорганизма-хозяина и экспрессии в этом микроорганизме фермента по п.4, содержащий нуклеиновую кислоту по п.7 или химерный ген по пп.10 или 11.
15. Экспрессирующийся вектор для трансформации микроорганизма-хозяина и экспрессии в этом микроорганизме фермента по п.5, содержащий нуклеиновую кислоту по п.8 или химерный ген по п.12.
16. Микроорганизм-хозяин, экспрессирующий фермент по п.3, где указанный микроорганизм трансформирован по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой по п.6, по меньшей мере одним химерным геном по п.9 или по меньшей мере одним экспрессирующимся вектором по п.13.
17. Микроорганизм-хозяин по п.16, представляющий собой бактерию, дрожжи или гриб и предпочтительно выбранный из Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum, Zygosaccharomyces rouxii или Aspergillus flavus.
18. Микроорганизм-хозяин по любому из пп.16 или 17, представляющий собой Escherichia coli, дополнительно содержащий нарушение по меньшей мере одного из следующих генов ldhA, adhE, ackA, focA-pflB, pta, рохВ, sad, gabD, gadA, gadB, gadC, sfcA, maeB, ppc, pykF, mgsA, iclR, icd, sucA, sucB, frdA, frdB, frdC, frdD, ptsG, ptsl, и/или сверхэкспрессирующий по меньшей мере один из следующих генов Ec_pck, Ес_ррс, Ec_pykA, Ec_aceA, Ll_pycA, Ec_galP.
19. Микроорганизм-хозяин, экспрессирующий фермент по п.4, где указанный микроорганизм трансформирован по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой по п.7, по меньшей мере одним химерным геном по пп. 10 или 11, или по меньшей мере одним экспрессирующимся вектором по п.14.
20. Микроорганизм-хозяин по п.19, представляющий собой бактерию, дрожжи или гриб и предпочтительно выбранный из Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum, Zygosaccharomyces rouxii или Aspergillus flavus.
21. Микроорганизм-хозяин по любому из пп.19 или 20, представляющий собой Escherichia coli, дополнительно содержащий нарушение по меньшей мере одного из следующих генов ldhA, adhE, ackA, focA-pflB, pta, рохВ, sad, gabD, gadA, gadB, gadC, sfcA, maeB, ppc, pykF, mgsA, iclR, icd, sucA, sucB, frdA, frdB, frdC, frdD, ptsG, ptsl, и/или сверхэкспрессирующий по меньшей мере один из следующих генов Ec_pck, Ec_ppc, Ec_pykA, Ec_aceA, Ll_pycA, Ec_galP.
22. Микроорганизм-хозяин, экспрессирующий фермент по п.5, где указанный микроорганизм трансформирован по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой по п.8, по меньшей мере одним химерным геном по п.12 или по меньшей мере одним экспрессирующимся вектором по п.15.
23. Микроорганизм-хозяин по п.22, представляющий собой бактерию, дрожжи или гриб и предпочтительно выбранный из Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Corynebacterium glutamicum, Zygosaccharomyces rouxii или Aspergillus flavus.
24. Микроорганизм-хозяин по любому из пп.22 или 23, представляющий собой Escherichia coli, дополнительно содержащий нарушение по меньшей мере одного из следующих генов ldhA, adhE, ackA, focA-pflB, pta, рохВ, sad, gabD, gadA, gadB, gadC, sfcA, maeB, ppc, pykF, mgsA, iclR, icd, sucA, sucB, frdA, frdB, frdC, frdD, ptsG, ptsl, и/или сверхэкспрессирующий по меньшей мере один из следующих генов Ec_pck, Ec_ppc, Ec_pykA, Ec_aceA, Ll_pycA, Ec_galP.
25. Способ по п.1, при котором фермент, который используют на первой стадии, был получен путем выращивания микроорганизма-хозяина по любому из пп.16-18.
26. Способ по п.1, при котором фермент, который используют на второй стадии, был получен путем выращивания микроорганизма-хозяина по любому из пп.19-21.
27. Способ по п.1, при котором фермент, который используют на третьей стадии, был получен путем выращивания микроорганизма-хозяина по любому из пп.22-25.
28. Способ по любому из пп.25-27, где микроорганизм-хозяин выращивают в среде, в которую добавлен малат или другая органическая кислота, такая как пируват, сукцинат или фумарат и более предпочтительно культуральная среда дополнительно содержит другой источник углерода.
29. Применение фермента, имеющего последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID No. 74, SEQ ID No. 76, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 225 и SEQ ID No. 227 для превращения малат-4-полуальдегида в 2,4-ДГМ.
30. Применение фермента по п.3 для превращения малата в 4-фосфомалат.
31. Применение фермента по п.4 для превращения 4-фосфомалата в малат-4-полуальдегид.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IBPCT/IB2010/003153 | 2010-10-28 | ||
IBPCT/IB10/03153 | 2010-10-28 | ||
IBPCT/IB2011/001559 | 2011-05-23 | ||
IBPCT/IB11/01559 | 2011-05-23 | ||
PCT/IB2011/002870 WO2012056318A1 (en) | 2010-10-28 | 2011-10-27 | A method of production of 2,4-dihydroxybutyric acid |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2013123481A RU2013123481A (ru) | 2014-12-10 |
RU2626531C2 true RU2626531C2 (ru) | 2017-07-28 |
Family
ID=45464014
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2013123481A RU2626531C2 (ru) | 2010-10-28 | 2011-10-27 | Способ получения 2,4-дигидроксимасляной кислоты |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US9238829B2 (ru) |
EP (1) | EP2633038B1 (ru) |
JP (2) | JP6071887B2 (ru) |
KR (1) | KR101990014B1 (ru) |
CN (2) | CN105505892B (ru) |
AR (1) | AR083589A1 (ru) |
BR (1) | BR112013010268B1 (ru) |
ES (1) | ES2631554T3 (ru) |
RU (1) | RU2626531C2 (ru) |
TW (1) | TWI626311B (ru) |
WO (1) | WO2012056318A1 (ru) |
Families Citing this family (14)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012056318A1 (en) * | 2010-10-28 | 2012-05-03 | Adisseo France S.A.S. | A method of production of 2,4-dihydroxybutyric acid |
BR112014026149A2 (pt) | 2012-04-26 | 2017-07-18 | Adisseo France Sas | método para a preparação de 2,4-ácido dihidroxibutírico (2,4-dhb) e microrganismo. |
WO2013184602A2 (en) * | 2012-06-04 | 2013-12-12 | Genomatica, Inc. | Microorganisms and methods for production of 4-hydroxybutyrate, 1,4-butanediol and related compounds |
WO2014009432A2 (en) | 2012-07-11 | 2014-01-16 | Institut National Des Sciences Appliquées | A microorganism modified for the production of 1,3-propanediol |
RU2645260C2 (ru) * | 2012-07-11 | 2018-02-19 | Адиссео Франс С.А.С. | Способ получения 2,4-дигидроксибутирата |
CN102864196B (zh) * | 2012-10-09 | 2014-07-02 | 南京工业大学 | 一种二氢乳清酸酶法制备α-天冬氨酰小肽的方法 |
CN103773745B (zh) * | 2012-10-18 | 2018-03-23 | 中粮生物化学(安徽)股份有限公司 | 天冬氨酸激酶iii突变体及其宿主细胞和应用 |
JP2016165225A (ja) * | 2013-07-09 | 2016-09-15 | 味の素株式会社 | 有用物質の製造方法 |
CN107771214B (zh) * | 2015-04-07 | 2022-01-18 | 代谢探索者公司 | 用于具有增加的2,4-二羟基丁酸外排物的优化的2,4-二羟基丁酸产生的修饰的微生物 |
WO2016162712A1 (en) | 2015-04-07 | 2016-10-13 | Metabolic Explorer | Modified microorganism for the optimized production of 2,4-dihydroxyburyrate |
RU2743228C2 (ru) | 2015-06-25 | 2021-02-16 | Дайнамик Фуд Ингридиентс Корпорейшн | Способ производства 2,4-дигидроксимасляной кислоты |
CN108624627B (zh) * | 2017-03-22 | 2021-07-30 | 中国科学院天津工业生物技术研究所 | 催化甲酸合成甲醛酶的制备及其应用 |
WO2021162099A1 (ja) * | 2020-02-14 | 2021-08-19 | 国立大学法人神戸大学 | 組換え微細藻及び微細藻を用いた有機酸の製造方法 |
CN112322597B (zh) * | 2020-11-23 | 2022-08-23 | 天津法莫西生物医药科技有限公司 | 一种羰基还原酶突变体及其应用 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2008142188A (ru) * | 2006-03-24 | 2010-04-27 | Эвоник Рем Гмбх (De) | Способ ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07155184A (ja) * | 1993-12-08 | 1995-06-20 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるl−リジンの製造法 |
JP4088982B2 (ja) * | 1996-10-15 | 2008-05-21 | 味の素株式会社 | 発酵法によるl−アミノ酸の製造法 |
DE10014546A1 (de) * | 2000-03-23 | 2001-09-27 | Degussa | Für das dapC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur Herstellung von L-Lysin |
ZA200510463B (en) * | 2003-05-30 | 2007-03-28 | Microbia Inc | Methods and compositions for amino acid production |
RU2275424C2 (ru) * | 2003-12-05 | 2006-04-27 | Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) | Способ получения l-треонина с использованием бактерий, принадлежащих к роду escherichia |
KR100837842B1 (ko) * | 2006-08-10 | 2008-06-13 | 씨제이제일제당 (주) | 아스파테이트 세미알데히드 디하이드로게나아제 활성이증가된 l-쓰레오닌 생산 미생물 및 이를 이용한l-쓰레오닌 생산 방법 |
LT2821494T (lt) | 2007-03-16 | 2017-04-25 | Genomatica, Inc. | 1,4-butandiolio ir jo pirmtakų biosintezės būdai ir kompozicijos |
EP2350298A1 (en) | 2008-10-27 | 2011-08-03 | ButamaxTM Advanced Biofuels LLC | Carbon pathway optimized production hosts for the production of isobutanol |
WO2012056318A1 (en) * | 2010-10-28 | 2012-05-03 | Adisseo France S.A.S. | A method of production of 2,4-dihydroxybutyric acid |
-
2011
- 2011-10-27 WO PCT/IB2011/002870 patent/WO2012056318A1/en active Application Filing
- 2011-10-27 US US13/882,372 patent/US9238829B2/en active Active
- 2011-10-27 JP JP2013535529A patent/JP6071887B2/ja active Active
- 2011-10-27 CN CN201610007101.0A patent/CN105505892B/zh active Active
- 2011-10-27 CN CN201180052237.9A patent/CN103270155B/zh active Active
- 2011-10-27 BR BR112013010268-3A patent/BR112013010268B1/pt active IP Right Grant
- 2011-10-27 KR KR1020137012492A patent/KR101990014B1/ko active IP Right Grant
- 2011-10-27 RU RU2013123481A patent/RU2626531C2/ru active
- 2011-10-27 ES ES11805587.0T patent/ES2631554T3/es active Active
- 2011-10-27 EP EP11805587.0A patent/EP2633038B1/en active Active
- 2011-10-28 TW TW100139345A patent/TWI626311B/zh active
- 2011-10-28 AR ARP110103991A patent/AR083589A1/es active IP Right Grant
-
2015
- 2015-11-18 US US14/945,046 patent/US10358663B2/en active Active
-
2016
- 2016-11-01 JP JP2016214205A patent/JP6345747B2/ja active Active
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2008142188A (ru) * | 2006-03-24 | 2010-04-27 | Эвоник Рем Гмбх (De) | Способ ферментативного получения 2-гидрокси-2-метилкарбоновых кислот |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
MARCO-MARIN C. ET AL. Site-directed mutagenesis of Escherichia coli acetylglutamate kinase and aspartokinase III probes the catalytic and substrate-binding mechanisms of these amino acid kinase family enzymes and allows three-dimensional modelling of aspartokinase // J Mol Biol. 2003 Nov 28;334(3):459-76. JUN OUYANG ET AL. Use of structural comparisons to select mutagenic targets in spartate-beta-semialdehyde dehydrogenase // Biochemistry, 1995 May 16;34(19):6394-9. KOCKELKORN D. ET AL. Malonic semialdehyde reductase, succinic semialdehyde reductase, and succinyl-coenzyme A reductase from Metallosphaera sedula: enzymes of the autotrophic 3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate cycle in Sulfolobales // J. Bacteriol., 2009, 191(20):6352-62. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TWI626311B (zh) | 2018-06-11 |
EP2633038B1 (en) | 2017-04-05 |
ES2631554T3 (es) | 2017-09-01 |
KR20140091463A (ko) | 2014-07-21 |
US20130273623A1 (en) | 2013-10-17 |
JP2013543727A (ja) | 2013-12-09 |
JP6345747B2 (ja) | 2018-06-20 |
US10358663B2 (en) | 2019-07-23 |
US20160153013A1 (en) | 2016-06-02 |
CN105505892A (zh) | 2016-04-20 |
RU2013123481A (ru) | 2014-12-10 |
AR083589A1 (es) | 2013-03-06 |
BR112013010268B1 (pt) | 2020-09-08 |
KR101990014B1 (ko) | 2019-06-17 |
JP6071887B2 (ja) | 2017-02-01 |
CN105505892B (zh) | 2019-03-26 |
US9238829B2 (en) | 2016-01-19 |
EP2633038A1 (en) | 2013-09-04 |
TW201221648A (en) | 2012-06-01 |
JP2017070285A (ja) | 2017-04-13 |
BR112013010268A2 (pt) | 2016-07-05 |
CN103270155A (zh) | 2013-08-28 |
CN103270155B (zh) | 2016-02-10 |
WO2012056318A1 (en) | 2012-05-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2626531C2 (ru) | Способ получения 2,4-дигидроксимасляной кислоты | |
US11505811B2 (en) | Method for the preparation of 2,4-dihydroxybutyrate | |
EP2841584B1 (en) | A method of production of 2,4-dihydroxybutyric acid | |
JP2011515083A (ja) | グリオキサラーゼiii活性を有するポリペプチド、それをコードするポリヌクレオチドおよびその使用 | |
JP2022046736A (ja) | グリコール酸および/またはグリオキシル酸の製造のための方法および微生物 | |
US9605283B2 (en) | Microorganism modified for the production of 1,3-propanediol |