JP2013543727A - ２，４−ジヒドロキシ酪酸の生成の方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、リンゴ酸キナーゼを使用した、リンゴ酸の４−ホスホ−リンゴ酸への変換を含む合成経路によって、２，４−ジヒドロキシ酪酸（２，４−ＤＨＢ）を生成する方法であって、前記４−ホスホ−リンゴ酸は、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素を使用してリンゴ酸−４−セミアルデヒドに変換され、前記リンゴ酸−４−セミアルデヒドは、ＤＨＢ脱水素酵素を使用して２，４−ＤＨＢに変換される方法を扱う。
【選択図】なし

Description

本発明は、リンゴ酸キナーゼ（ｍａｌａｔｅ ｋｉｎａｓｅ）、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素（ｍａｌａｔｅ ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、および２，４−ジヒドロキシブチレート脱水素酵素活性をそれぞれ有する酵素を含む合成経路の実行による、リンゴ酸からの２，４−ジヒドロキシ酪酸の生成の新規な方法に関する。

本願で引用したカルボン酸は、それらの塩（例えば２，４−ジヒドロキシブチレート）または酸の形態（例えば２，４−ジヒドロキシ酪酸）にも同様に名付けられる。

２，４−ジヒドロキシ酪酸（２，４−ＤＨＢまたはＤＨＢと同じ）は、重要な経済的関心が高い化合物である。ＤＨＢは、適切なｐＨを調整することによって、水性培地において、α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに容易に転換することができる。α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、動物栄養における大きい市場を有するメチオニン代替品２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−ブチレート（ＨＭＴＢ）の作製のための卓越した前駆体である（Ｄｅｃｋら、２００８）。現在のところ、α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、α位におけるγ−ブチロラクトンのハロゲン化、およびそれに続くアルカリ培地におけるヒドロキシル基でのハロゲン原子の置換を伴う多段階のプロセスによって、γ−ブチロラクトンに由来して得られる（Ｄｅｃｋら、２００８）。

原油価格の上昇のため、再生可能資源からのＤＨＢの作製に関する必要性が生じている。微生物は、バイオマスに由来する原材料、例えば糖または有機酸を、多種多様の種々の化学化合物に変換する能力がある（Ｗｅｒｐｙ＆Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、２００４）。増加している多数の生化学およびゲノム情報を用いて、微生物を、それらが高い収量および生産性で天然の代謝中間体を過剰産生するように改変することが可能である（Ｂａｉｌｅｙ、１９９１）。産生微生物の最適化は、とりわけ、対象の代謝生成物の生合成に必要な酵素の過剰発現および生成物フィードバック阻害の軽減を保証する、代謝ネットワークの合理的な操作をしばしば必要とする。別の可能性は、対象の代謝生成物の生成を触媒する新規な酵素系の実行である。

代謝操作手法および酵素触媒作用は、生化学および対象の代謝生成物をもたらす代謝経路の調節に関する詳細な知識を必要とする。ＤＨＢ生成の場合、この情報は利用できない。わずかな研究が、ＤＨＢ生成に結びつけられる酵素反応を同定することなしに、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素欠乏症を有する患者におけるＤＨＢの出現を報告しているのみである（Ｓｈｉｎｋａら、２００２）。したがって、発酵または酵素によるＤＨＢの生成は、（ｉ）利用できる前駆体をＤＨＢに転換する熱力学的に実行可能な経路の同定、（ｉｉ）経路における個々の反応ステップを触媒する能力がある酵素の同定または構築、および（ｉｉｉ）適切な生成生物における経路酵素の機能発現を必要とする。

本発明は、これらの必要性を満たすことを目的とする。

したがって、本発明の１つの対象は、２，４−ＤＨＢを生成する方法であって、リンゴ酸キナーゼを使用して、リンゴ酸を４−ホスホ−リンゴ酸に変換する第１のステップ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素を使用して、４−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−４−セミアルデヒドに変換する第２のステップ、ＤＨＢ脱水素酵素を使用して、リンゴ酸−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換する第３のステップを含む方法である。

第１の反応（図１（ｉ）を参照）において、リンゴ酸（１）は、リンゴ酸キナーゼ活性を有する酵素（Ａ）の作用によって、４−ホスホ−リンゴ酸（２）に転換される。第２の反応（Ｂ）において、４−ホスホ−リンゴ酸は、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を有する酵素の作用によって、リンゴ酸−４−セミアルデヒド（３）に転換される。より正確には、反応（Ｂ）は、経路の生合成の意味において、脱リン酸化４−ホスホ−リンゴ酸還元酵素活性を有する酵素によって、触媒される。第３の反応（Ｃ）において、リンゴ酸−４−セミアルデヒドは、ＤＨＢ脱水素酵素活性を有する酵素の作用によって、ＤＨＢ（４）に転換される。より正確には、反応（Ｃ）は、経路の生合成の意味において、リンゴ酸−４−セミアルデヒド還元酵素活性を有する酵素によって触媒される。

上記の酵素および中間生成物のいずれも、今までのところ、生細胞において、報告も同定もされていない。それ自体で、リンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素、ＤＨＢ脱水素酵素および４−ホスホ−リンゴ酸は、本発明の別の目的である。

本発明の別の態様内で、２，４−ＤＨＢを生成する方法の第１のステップは、リンゴ酸を４−ホスホ−リンゴ酸に変換することを特徴とするリンゴ酸キナーゼを伴う。前記酵素は、酵素の少なくとも１つの変異によって得ることができ、前記変異は、リンゴ酸への変異酵素の活性および／または基質親和性を改善する。

本発明内で、「活性および／または基質親和性を改善する」という表現は、変異前の酵素が、
−基質（リンゴ酸、４−ホスホ−リンゴ酸もしくはリンゴ酸−４−セミアルデヒド）を使用することができなかった、および／または
−反応の生成物（４−ホスホ−リンゴ酸もしくはリンゴ酸−４−セミアルデヒドもしくはＤＨＢ）を、少なくとも３倍低い最大比速度で合成するものであった、および／または
−リンゴ酸、４−ホスホ−リンゴ酸もしくはリンゴ酸−４−セミアルデヒドへの少なくとも３倍低い親和性を有していた、および／または
−天然基質（アスパラギン酸、４−ホスホ−アスパラギン酸、アスパラギン酸−４−セミアルデヒド）への少なくとも３倍高い親和性を有していた
のいずれかであったことを意味する。

その態様の別のもの内で、本発明は、リンゴ酸を４−ホスホ−リンゴ酸に変換するためのリンゴ酸キナーゼの使用を扱う。

リンゴ酸キナーゼ活性は、例１において記載した酵素試験によって測定することができる（「酵素アッセイ」を参照）。

本発明の別の態様によれば、リンゴ酸キナーゼは、アスパラギン酸キナーゼの変異によって、得ることができる。

図２は、異なる生物学的起源のアスパラギン酸キナーゼのアミノ酸配列のアラインメントを示す。アミノ酸の位置へのすべての参照は、Ｅ．ｃｏｌｉのＬｙｓＣ遺伝子によってコードされるアスパラギン酸キナーゼのアミノ酸配列（配列番号４によって表される）に基づいて言及される。種々の生物由来の他のアスパラギン酸キナーゼにおける対応する保存領域の相対位置を、当業者は、以下に一覧にした酵素に関する図２において表される単純配列アラインメントによって、簡単に発見することができる：
−ＡＫＩＩＩ−Ｅ．ｃｏｌｉのアスパラギン酸キナーゼＩＩＩ（配列番号４）、
−ＡＫＩ（配列番号８７）Ｅ．ｃｏｌｉのアスパラギン酸キナーゼＩ、
−ＡＫＩＩ（配列番号８８）−Ｅ．ｃｏｌｉのアスパラギン酸キナーゼＩＩ、
−ＭＪ−Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（配列番号８９）、
−ＴＴ−Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（配列番号９０）、
−ＣＧ−Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（配列番号９１）、
−ＡＴ−Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号９２）、
−ＳＣ−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号９３）。

前記アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ソフトウェアを用いて行うことができる。例えば、配列番号４によって表されるアスパラギン酸キナーゼのＥ１１９残基は、Ａ．ｔｈａｌｉａｎａのアスパラギン酸キナーゼ（配列番号５０）のＥ２０７残基またはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのアスパラギン酸キナーゼ（配列番号５１）のＥ１４７残基に対応する。

本発明による変異アスパラギン酸キナーゼは、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｓ３９、Ｔ４５、Ｖ１１５、Ｅ１１９、Ｆ１８４および／またはＳ２０１の少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの変異を含み、ここで、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている。

非排他的な例において、部位特異的な変異誘発によるリンゴ酸キナーゼの構築は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのアスパラギン酸キナーゼＬｙｓＣを鋳型として使用して、実証される。本発明の１つの態様によれば、ＬｙｓＣの基質特異性は、位置１１９におけるグルタミン酸を、アスパラギン、グルタミン、システイン、プロリン、セリン、トレオニン、バリンまたはグリシンのいずれかによって置き換えることによって、リンゴ酸に対して変えられた。

本発明の別の態様内で、リンゴ酸キナーゼは、配列番号９によって、より明確には、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４または配列番号２６によって表される。

アスパラギン酸キナーゼは、メチオニン、トレオニンまたはリシンのいずれかによって典型的に阻害される。したがって、アスパラギン酸キナーゼのランダムまたは部位特異的な変異誘発によって構築されたリンゴ酸キナーゼも、前記アミノ酸によって阻害され得る。本発明の別の態様において、メチオニン、リシンまたはトレオニンによるリンゴ酸キナーゼの阻害は、リンゴ酸キナーゼの変異誘発によって軽減される。

本発明の特定の態様において、上記の変異ＬｙｓＣ（リンゴ酸キナーゼ）は、以下のアミノ酸Ｅ２５０、Ｍ３１８、Ｓ３２１、Ｖ３３９、Ｓ３３８、Ｆ３２４、Ｌ３２５、Ｖ３３９、Ｓ３４５、Ｅ３４６、Ｄ３４０、Ｔ３４４および／またはＴ３５２の少なくとも１つの変異によって、リシン阻害に対して非感受性にされる（例３を参照）。

本発明は、かかる修飾酵素、より詳細には、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５によって表されるものも包含する。

さらに別の態様内で、本発明による２，４−ＤＨＢを生成する方法の第２のステップは、４−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−４−セミアルデヒドに変換することを特徴とするリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素であって、経路の生合成の意味において、脱リン酸化４−ホスホ−リンゴ酸還元酵素活性を有するリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素を伴う。

リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素活性は、例４において記載した酵素試験によって測定することができる（「酵素アッセイ」を参照）。

この酵素は、酵素の少なくとも１つの変異によって得ることができ、前記変異は、４−ホスホ−リンゴ酸への変異酵素の活性および／または基質親和性を改善する。

別の態様によれば、本発明のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素は、報告されたセミアルデヒド脱水素酵素活性を有する、より明確には、反応の還元的な意味において脱リン酸化活性を有する、より明確には、３、４、または５個の炭素分子からなる有機分子に対して作用する、酵素の変異によって、得ることができる。本発明の特定の態様において、前記リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素は、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素の変異によって、得られる。

アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、Ｅ．ｃｏｌｉのＡｓｄおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＨｏｍ２は、４−ホスホ−リンゴ酸２に及ぼす脱水素酵素活性を本来示す。

本発明の別の態様によれば、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素は、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素の変異によって改善することができる。

図３は、異なる生物学的起源のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列のアラインメントを示す。アミノ酸へのすべての参照は、Ｅ．ｃｏｌｉのＡｓｄ遺伝子によってコードされるアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（配列番号２０によって表される）に基づいて言及される。種々の生物由来の他のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素における対応する保存領域の相対位置を、当業者は、以下に一覧にした酵素に関する図４において表される単純配列アラインメントによって、簡単に発見することができる：
−ＥＣ−Ｅ．Ｃｏｌｉ（配列番号４９）、
−ＭＪ−Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（配列番号９４）、
−ＴＴ−Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（配列番号９５）、
−ＢＳ−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号９６）、
−ＣＧ−Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（配列番号９７）、
−ＡＴ−Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号９８）、
−ＳＣ−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号９９）。

前記アラインメントは、ＣｌｕｓｔａｌＷ２ソフトウェアを使用して、簡単に行うことができる。

改善されたリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を有する酵素の構築は、以下のように行うことができる。

本発明によるリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素は、特定の態様において、野生型酵素と比較した場合、位置Ｔ１３６、Ｑ１６２、Ｉ２３０、Ｅ２４１および／またはＨ２７４の少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの変異を含むアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素に対応し、ここで、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている。

例５において実証するように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｓｄの部位特異的な変異誘発は、４−ホスホ−リンゴ酸への変異酵素の活性および基質親和性を改善することができ、同時に、その天然基質４−ホスホ−アスパラギン酸への酵素の優先度を減少させる。

４−ホスホ−リンゴ酸に対するＡｓｄの活性を改善するために、本発明の１つの態様によれば、Ｅ２４１は、部位特異的な変異誘発によって、グルタミン、アラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシンまたはメチオニン残基によって置き換えられた（例５）。

本発明の別の態様内で、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素は、配列番号６８によって、より明確には、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４または配列番号６６によって表される。

その態様の別のもの内で、本発明は、４−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−４−セミアルデヒドに変換するためのリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素の使用を扱う。

別の態様内で、本発明による２，４−ＤＨＢを生成する方法の第３のステップは、リンゴ酸−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換することを特徴とするＤＨＢ脱水素酵素であって、経路の生合成の意味において、リンゴ酸−４−セミアルデヒド還元酵素活性を有するＤＨＢ脱水素酵素を伴う。

ＤＨＢ脱水素酵素活性を潜在的にすでに有する候補ＤＨＢ脱水素酵素は、Ｃ３、Ｃ４またはＣ５化合物に対して作用するベータ−ヒドロキシ酸脱水素酵素のクラスから選択することができる。

本発明のさらに別の態様によれば、前記ＤＨＢ脱水素酵素は、タルトロン酸セミアルデヒド還元酵素、サクシネートセミアルデヒド還元酵素、マロン酸セミアルデヒド還元酵素、メチルブチルアルデヒド還元酵素、亜鉛型アルコール脱水素酵素（ｚｉｎｃ−ｔｙｐｅ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）、Ｌ−トレオニン−３−脱水素酵素またはホモセリン還元酵素などの、β−ヒドロキシ酸脱水素酵素に構造的および機構的に関連し得る。

本発明は、リンゴ酸−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換するためのメチルブチルアルデヒド還元酵素またはコハク酸セミアルデヒド還元酵素の使用も扱う。特定の態様において、前記メチルブチルアルデヒド還元酵素は、配列番号７４によって表され、前記コハク酸セミアルデヒド還元酵素は、配列番号７６によって表される。ＤＨＢ脱水素酵素活性は、例６において記載した酵素試験によって測定することができる（「酵素アッセイ」を参照）。

リンゴ酸−４−セミアルデヒドへのＤＨＢ脱水素酵素の親和性は、酵素の少なくとも１つの変異によって増加させることができ、前記変異は、リンゴ酸−４−セミアルデヒドへの変異酵素の活性および／もしくは基質親和性を増加させ、ならびに／または少なくとも因子２によってその天然基質への活性もしくは親和性を低減する。

本発明によるＤＨＢ脱水素酵素は、特定の態様において、野生型酵素と比較した場合、位置Ｓ４０、Ｎ４３、Ｈ３９、Ｔ４９、Ｆ８５、Ｑ１０８、Ｌ２８１およびＮ３０５の少なくとも１つにおいて、少なくとも１つの変異を含むＭ．ｓｅｄｕｌａコハク酸セミアルデヒド還元酵素（配列番号７６）に対応し、ここで、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている。

非排他的な例において実証するように、（Ｌ）−リンゴ酸−４−セミアルデヒドへのＭ ｓｅｄｕｌａコハク酸セミアルデヒド還元酵素の親和性は、配列番号８１によって表される、部位特異的な変異誘発によって、二重変異Ｈ３９Ｒ Ｎ４３Ｈを導入することによって増加した。単純変異体（ｓｉｍｐｌｅ ｍｕｔａｎｔ）Ｈ３９Ｒ（配列番号２２５）およびＮ４３Ｈ（配列番号２２７）も、本発明によって包含される（例７）。

ＤＨＢ脱水素酵素を使用して、リンゴ酸−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換することができ、これは、本発明の別の態様を構成する。

遺伝子の核酸配列を、宿主生物のコドン使用頻度に適応させて、それによって、異質に発現されるタンパク質の生成を増加させることができる。これは、本発明の別の態様を構成する。

そのヌクレオチド配列が、配列番号２２８によって表されるＥ．ｃｏｌｉにおける前記酵素の発現に最適化された、Ｍ．ｓｅｄｕｌａコハク酸セミアルデヒド還元酵素Ｈ３９Ｒ Ｎ４３Ｈをコード化する合成遺伝子の合成は、本発明の別の態様である。

さらに別の態様において、本発明は、核酸、より詳細には、上述したリンゴ酸キナーゼをコードする単離された核酸配列も扱う。

別の態様において、前記核酸は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２または配列番号４４によって表される。

さらに別の態様において、本発明は、上述したリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする単離された核酸配列も扱う。

より明確には、前記核酸は、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５または配列番号６７によって優先的に表される。

さらに別の態様において、本発明は、上述したＤＨＢ脱水素酵素をコードする単離された核酸配列も扱う。

別の態様において、前記核酸は、配列番号７３または配列番号７５、配列番号２２４、配列番号２２６または配列番号８２によって表される。

本発明に従って、「核酸配列」は、一本または二本鎖型であるＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子を表す。本明細書では、「単離されたＤＮＡ」は、自然発生ではない、または、元々存在していたが、もはや天然環境においてはないＤＮＡ、例えば、キメラ遺伝子における他の制御エレメントに関連しているＤＮＡコード配列、別の宿主細胞中に移されたＤＮＡ、または、任意の天然のＤＮＡ配列と比較して異なるヌクレオチド配列を有する人工的な合成的に作製されたＤＮＡ配列を表す。

本発明は、互いに機能的に連結した、宿主生物において機能的である少なくとも１つのプロモーター、本発明によるリンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素またはＤＨＢ脱水素酵素のいずれかをコードするポリヌクレオチド、および同じ宿主生物において機能的であるターミネーターエレメントを含むキメラ遺伝子にも関する。キメラ遺伝子が含有してもよい様々なエレメントは、第１に、タンパク質の転写、翻訳および成熟を制御するエレメント、例えばプロモーター、シグナルペプチドもしくは輸送ペプチドをコードする配列、またはポリアデニル化シグナルを構成するターミネーターエレメント、第２に、タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。「互いに機能的に連結した」という表現は、キメラ遺伝子の前記エレメントが、これらのエレメントの１つの機能が別のものの機能によって影響されるように、互いに連結していることを意味する。一例として、プロモーターは、それが前記コード配列の発現に影響する能力がある場合、コード配列に機能的に連結している。本発明によるキメラ遺伝子の構築およびその様々なエレメントの組立は、当業者によく知られている技法を使用して、行うことができる。キメラ遺伝子を構成する制御エレメントの選択は、それらがその中で機能しなければならない宿主生物に本質的に依存し、当業者は、所与の宿主生物において機能的である制御エレメントを選択する能力がある。「機能的」という用語は、所与の宿主生物において機能する能力があることを意味することが意図されている。

本発明によるキメラ遺伝子が含有してもよいプロモーターは、構成的または誘導性のいずれかである。一例として、細菌における発現に使用するプロモーターは、以下のプロモーターから選択してもよい。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおける発現に関して、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ、ｐｒｏｕ、ｃｓｔ−１、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、Ｐｓｙｎ、ｃｓｐＡ、ＰＬ、ＰＬ−９Ｇ−５０、ＰＲ−ＰＬ、Ｔ７、［ラムダ］ＰＬ−ＰＴ７、Ｔ３−ｌａｃ、Ｔ５−ｌａｃ、Ｔ４ｇｅｎｅ３２、ｎｐｒＭ−ｌａｃ、ＶＨｂおよびタンパク質Ａプロモーターまたは他にＰｔｒｐプロモーター（ＷＯ９９／６４６０７）を挙げることができる。グラム陽性細菌、例えばＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａまたはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓにおける発現に関して、ＰｔｉｐＡまたはＰＳ１およびＰＳ２（ＦＲ９１／０９８７０）プロモーターまたは出願ＥＰ０６２９６９９Ａ２において報告されているものを挙げることができる。酵母および真菌における発現に関して、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ ＰＬＡＣ４プロモーターまたはＫ．ｌａｃｔｉｓ Ｐｐｇｋプロモーター（特許出願ＦＲ９１／０５２９４）、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｔｅｆ１またはｃｂｈ１プロモーター（ＷＯ９４／０４６７３）、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｈｉｓ、ｃｓｌまたはａｐｆプロモーター（ＷＯ００／６８４０１）およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｇｌａプロモーターを挙げることができる。

本発明によれば、キメラ遺伝子は、他の制御配列、例えば転写活性化因子（エンハンサー）も含んでもよく、これらはプロモーターとコード配列との間に位置している。

そのようなものとして、本発明のキメラ遺伝子は、特定の態様において、転写の方向に、機能的に連結した、宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、本発明のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素のリンゴ酸キナーゼをコードする核酸配列および前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列を少なくとも含む。

本発明は、本発明によるキメラ遺伝子または本発明の核酸配列を含むクローニングおよび／または発現ベクターにも関する。本発明によるベクターは、宿主生物を形質転換し、この生物においてリンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素および／またはＤＨＢ脱水素酵素のいずれかを発現させるのに役立つ。このベクターは、プラスミド、コスミド、バクテリオファージまたはウイルスであってもよい。優先的に、本発明による形質転換ベクターは、プラスミドである。一般に、このベクターの主要な性質は、特に複製起点の存在のおかげで、宿主生物の細胞においてそれ自体を維持するおよび自己複製する、ならびにリンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素および／またはＤＨＢ脱水素酵素のいずれかをその中に発現する能力であるべきである。宿主生物の安定な形質転換の目的で、ベクターも、ゲノム中に組み込まれてもよい。かかるベクターの選択、およびこのベクター中への本発明によるキメラ遺伝子の挿入の技法も、当業者の一般知識の部分である。有利に、本発明において使用するベクターは、本発明によるキメラ遺伝子に加えて、選択マーカーをコードするキメラ遺伝子も含有する。この選択マーカーは、効果的に形質転換された宿主生物、すなわちベクターを組み込んだものを選択することを可能にする。本発明の特定の態様によれば、形質転換される宿主生物は、細菌、酵母、真菌である。使用することができる選択マーカーの中で、抗生物質に対する耐性に関する遺伝子、例えばハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有するマーカーを挙げることができる。他のマーカーは、栄養要求性を補完するための遺伝子、例えばｐｙｒＡ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒ４、ａｒｇ４、ａｒｇＢおよびｔｒｐＣ遺伝子、モリブドプテリンシンターゼ遺伝子またはアセトアミダーゼ（ａｃｅｔａｍｉｄａｓｅ）のそれであってもよい。容易に同定できる酵素、例えばＧＵＳ酵素をコードする遺伝子、または色素もしくは形質転換細胞における色素の生成を制御する酵素をコードする遺伝子も挙げてもよい。かかる選択マーカー遺伝子は、特許出願ＷＯ９１／０２０７１、ＷＯ９５／０６１２８、ＷＯ９６／３８５６７およびＷＯ９７／０４１０３において特に報告されている。

本発明は、それらのゲノム中に組み込まれた、または染色体外遺伝因子、例えばプラスミド上に有された、少なくとも１つの本発明によるキメラ遺伝子を含有する形質転換された宿主生物にも関する。本発明のより特定の態様において、形質転換された宿主生物は、リンゴ酸キナーゼをコードする本発明の核酸もしくはリンゴ酸キナーゼをコードする核酸を含むキメラ遺伝子もしくはリンゴ酸キナーゼをコードする核酸を含む発現ベクター、および／またはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする核酸もしくはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする核酸を含むキメラ遺伝子もしくはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする核酸を含む発現ベクター、および／またはＤＨＢ脱水素酵素をコードする核酸、ＤＨＢ脱水素酵素をコードする核酸を含むキメラ遺伝子、もしくはＤＨＢ脱水素酵素をコードする核酸を含む発現ベクターを含む。

本発明の特定の態様において、リンゴ酸キナーゼをコードする核酸は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２または配列番号４４によって表され、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする核酸は、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５または配列番号６７によって表され、ＤＨＢ脱水素酵素をコードする核酸は、配列番号７３、配列番号７５、配列番号２２４、配列番号２２６または配列番号８２によって表される。

「宿主生物」という用語は、２，４−ＤＨＢを生成するために、本発明によるキメラ遺伝子、核酸またはベクターをその中に導入することができる任意の下等単細胞生物を意味することが意図されている。好ましくは、宿主生物は、微生物、特に、例えばＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、より詳細にはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、もしくはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属の真菌、特にＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、もしくはＰｉｃｈｉａ属、より詳細にはＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉの酵母、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、特にＥ．ｃｏｌｉ、もしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、より詳細にはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、もしくはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の細菌、またはバキュロウイルスである。

宿主生物は、糖、例えばグルコースからリンゴ酸もしくはサクシネートを天然に過剰産生する宿主生物、または糖、例えばグルコースからリンゴ酸またはサクシネートを過剰産生するように操作され、有機酸、例えばリンゴ酸、ピルビン酸、サクシネートおよびフマル酸の搬出を促進するすべての潜在的な膜輸送体が欠失された宿主生物とすることができる。宿主生物は、ＤＨＢを過剰発現するように操作され、有機酸、例えばリンゴ酸、ピルビン酸、サクシネートおよびフマル酸の搬出を促進するすべての膜輸送体が欠失された生物とすることができる。リンゴ酸および他の有機酸の搬出を促進する透過酵素の例は、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ由来のＭａｅ１（Ｃａｍａｒａｓａら、２００１；Ｇｒｏｂｌｅｒら、１９９５）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来のＤｃｔＡ（Ｇｒｏｅｎｅｖｅｌｄら、２０１０）、Ｅ．Ｃｏｌｉ由来のＤｃｔ １−４、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＪｅｎ１（Ａｋｉｔａら、２０００）である。専門家にとって、配列相同性に基づいて、他の微生物における候補透過酵素を同定することが可能となる。これらの構築は、リンゴ酸および他の有機酸を細胞内に保持して、それらをＤＨＢ生成に利用できるようにするのに役立つことになる。

「形質転換された宿主生物」という表現は、そのゲノム中に、または染色体外遺伝因子、例えばプラスミドにおいて、少なくとも１つの本発明によるキメラ遺伝子を組み込んだ、したがって、リンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素および／またはＤＨＢ脱水素酵素の任意の１つを、その組織においてまたは培養培地において産生する宿主生物を意味することが意図されている。本発明による宿主生物を得るために、当業者は、多くの知られている形質転換方法の１つを使用してもよい。

これらの方法の１つは、形質転換される宿主生物の細胞をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および本発明によるベクターと接触させることにある。エレクトロポレーションは、別の方法であり、これは、形質転換される細胞および本発明のベクターを、電場に供することにある。別の方法は、マイクロインジェクションによって、細胞または組織中にベクターを直接的に注入することにある。「微粒子銃」方法を使用してもよい。それは、細胞または組織を、本発明のベクターがその上に吸着された粒子に衝突させることにある（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，９４５，０５０）。

細菌を形質転換するためのいくつかの方法が、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよび他のグラム陰性細菌に関する文献において報告されている。コンジュゲーションも、使用してもよい。グラム陽性細菌に関して、エレクトロポレーションを使用することができ、特に、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属の細菌に関して、プロトプラスト形質転換も使用してもよい。

真菌を形質転換するためのいくつかの方法も、文献において報告されている。ＰＥＧを用いたプロトプラスト形質転換が、ＥＰ０２６０７６２においてＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓに関して報告されており、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ種へのこの方法の適応は、ＷＯ００／３６１２０において報告されている。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌を使用したプロトプラスト形質転換と同様に、制限酵素媒介組込み（restriction enzyme mediated integration）、またはＲＥＭＩによる形質転換も、知られている。酵母を形質転換するための技法も、文献において報告されている。

別の態様において、本発明は、本発明の形質転換された微生物を培養するステップを含む、２，４−ＤＨＢの生成のプロセスを扱う。

ＤＨＢの生成のために、グルコース、フルクトース、スクロース、糖蜜、マルトース、廃糖蜜、デンプン加水分解物（グルコース、オリゴ糖）、ラクトース、マルトース、デンプンおよびデンプン加水分解物、セルロース、セルロース加水分解物、グリセロールおよびある種の炭化水素などの様々な炭水化物、ダイズ油、ヒマワリ油、ラッカセイ油およびヤシ油などの油および脂肪、ならびにパルミチン酸、ステアリン酸およびリノール酸などの脂肪酸を、個々にまたは混合物として利用することができる。これらの物質は、個々にまたは混合物として使用してもよい。

気体アンモニアおよびアンモニア水などの無機化合物、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、および炭酸アンモニウムなどの無機または有機酸のアンモニウム塩を含めた、窒素の様々な供給源を、商業的パイロット規模の生成のために、個々にまたは混合物として利用することができる。代わりに、ダイズ加水分解物、ダイズタンパク質ＨＣｌ加水分解物（約７％の総窒素）、ダイズ食品、ダイズかす加水分解物、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、尿素、ペプトンおよびアミノ酸などの、天然の窒素を含有する有機材料を利用してもよい。

生成プロセスは、好気性、嫌気性、および酸素が限定された条件下で行うことができる。それを、流加プロセスまたは回分プロセスとして行うことができる。

２，４−ＤＨＢの前記生成は、リンゴ酸（またはピルビン酸、サクシネートもしくはフマル酸などの別の有機酸）が単独でまたは増殖を保証する別の炭素源と共に加えられた培地において宿主生物を培養することによって行うことができる。リンゴ酸（および他の有機酸）を、直接的に加えることができ、または、リンゴ酸を過剰生成する微生物によってリンゴ酸（もしくは他の有機酸）が第１のプロセス段階において生成され、本発明による宿主生物によって次の段階において２，４−ＤＨＢ生成が実現化される２段階の発酵プロセスを設計することによって加えることができる。

生成物分離および精製は、全体のプロセス効率性および生成物コストに莫大に影響する非常に重要な因子である。生成物回収のための方法は、通例、細胞分離、ならびに生成物精製、濃縮および乾燥のステップをそれぞれ含む。

細胞の分離
限外ろ過および遠心分離を使用して、細胞を発酵培地から分離することができる。発酵培地からの細胞分離は、高い培地粘度によって、しばしば複雑化される。したがって、我々は、添加剤、例えば鉱酸またはアルカリ塩を加えて、または培養ブロスを加熱して、細胞分離を最適化することができる。

生成物の回収
いろいろなイオン交換クロマトグラフィーの方法を、バイオマス除去の前または後のいずれかに、ＤＨＢの分離に適用することができる。それらは、生成物の等電点による生成物の分離を促進する一次の陽イオン交換樹脂の使用を含む。典型的には、樹脂に溶液を投入し、保持された生成物は、（例えば、水酸化アンモニウムを加えることによる）溶出剤におけるｐＨの増加に続いて別々に溶出される。固定または疑似移動床式の樹脂（ｆｉｘｅｄ ｏｒ ｓｉｍｕｌａｔｅｄ ｍｏｖｉｎｇ ｂｅｄ ｒｅｓｉｎｓ）を使用したイオン交換クロマトグラフィーの使用も可能である。種々のクロマトグラフィーのステップを、十分な生成物純度を達成するために、組み合わせる必要があり得る。それらの精製方法は、高価な結晶化ステップと比較して、より経済的であり、また最終生成物の形態に関して追加の利点および適応性を提供する。

生成物濃縮および乾燥
精製プロセスは、噴霧式造粒機、噴霧式乾燥機、ドラム乾燥機、回転式乾燥機およびトンネル乾燥機などの任意の適した乾燥手段を伴ってもよい乾燥ステップも含んでもよい。濃縮されたＤＨＢ溶液は、多目的の濃縮機または薄膜蒸発機を使用して、１３０℃の蒸気によって、減圧下で発酵ブロスを加熱することによって得ることができる。

ＤＨＢの効率的な生成は、宿主生物の代謝ネットワークにおける炭素フラックス再分割（ｃａｒｂｏｎ ｆｌｕｘ ｒｅｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）を最適化することによって、ならびにＤＨＢ経路の３つの酵素への十分なＮＡＤＰＨおよびＡＴＰ供給を保証することによって保証することができる。望ましい代謝経路中への炭素フラックスのチャネリングおよびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ補助因子の供給は、競合する天然の発酵経路を欠失させるまたは軽減することによって、通例促進される。非排他的な例は、
−（ピルビン酸脱炭酸酵素の欠失によって、）エタノールの形成を妨害することによる、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるリンゴ酸生成の最適化（Ｚｅｌｌｅら、２００８；Ｚｅｌｌｅら、２０１０）、
−乳酸の形成（例えばＩｄｈＡの欠失）、酢酸の形成（例えばｐｔａ、ａｃｋＡの欠失）、エタノールの形成（例えばａｄｈＥの欠失）、ギ酸の形成（例えばｐｆｌＢ、ｆｏｃＡの欠失）、ピルビン酸の酸化（例えばｐｏｘＢの欠失）、リンゴ酸の分解（ｍａｅＢおよびｓｃｆＡの欠失）、サクシネートの形成（例えばｆｒｄＢＣの欠失）、メチルグリオキサールの形成（ｍｇｓＡの欠失）を妨害することによる、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるサクシネートまたはリンゴ酸生成の最適化（Ｊａｎｔａｍａら、２００８ａ；Ｊａｎｔａｍａら、２００８ｂ；Ｌｉｎら、２００５；Ｓａｎｃｈｅｚら、２００５ａ；Ｚｈａｎｇら、２０１１）、
である。

有機酸の生成のための炭素フラックスおよびＡＴＰ供給を増加させるための別の可能性は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）／ピルビン酸／オキサロ酢酸分岐節を操作することである（（Ｓａｕｅｒ＆Ｅｉｋｍａｎｎｓ、２００５）において総説されている）。ホスホエノールピルビン酸からオキサロ酢酸への炭素フラックスの増加を保証する代謝操作戦略に関する非排他的な例は、
−ピルビン酸キナーゼの機能を妨害することおよびＰＥＰカルボキシキナーゼの活性を増加させることによる、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅにおけるリンゴ酸生成の最適化（Ｚｅｌｌｅら、２０１０）、
−天然または異種性に発現したＰＥＰカルボキシラーゼ、ＰＥＰカルボキシキナーゼまたはピルビン酸カルボキシラーゼの活性を増加させることによる、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるサクシネート生成の最適化（Ｍｉｌｌａｒｄら、１９９６；Ｓａｎｃｈｅｚら、２００５ｂ；Ｚｈａｎｇら、２００９）、
である。

グルコースの最初のリン酸化ステップのためにＰＥＰを消費するホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を用いる、Ｅ．ｃｏｌｉおよび他の細菌における有機酸の生成のための炭素フラックスおよびＡＴＰ供給を増加させるための別の可能性は、ＰＴＳ系の必須成分（例えばｐｔｓＩまたはｐｔｓＧ）の欠失である（Ｌｉｎら、２００５；Ｚｈａｎｇら、２００９）。ＰＴＳ系の有害な変異を有する変異体における別のグルコース取り込みを保証するために、代替のグルコース取り込み系（例えばＧａｌＰ）の活性を保証しなければならない。

有機酸の生成のための望ましい経路中への炭素フラックスを増加させるための別の可能性は、クエン酸およびグリオキシル酸回路を操作することである。非排他的な例は、
−イソクエン酸リアーゼの活性を増加させることによる（転写抑制因子ｉｃｌＲの欠失）、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるコハク酸生成の最適化（Ｌｉｎら、２００５；Ｓａｎｃｈｅｚら、２００５ａ）、
−イソクエン酸脱水素酵素、および／またはサクシネート脱水素酵素の欠失による、コハク酸生成の最適化（Ｌｉｎら、２００５）、
である。

ＤＨＢの生成のための望ましい経路中への炭素フラックスを増加させるための別の可能性は、生成生物における、適切なピルビン酸脱水素酵素およびクエン酸合成酵素の発現である。Ｅ．ｃｏｌｉの天然のピルビン酸脱水素酵素およびクエン酸合成酵素は、嫌気性条件下でこれらの酵素をより低い活性にする、高い細胞内ＮＡＤＨ濃度によって阻害される。Ｅ ｃｏｌｉにおいて、ＮＡＤＨに対して非感受性であるピルビン酸脱水素酵素変異体の発現は、嫌気性条件下でアセチルＣｏＡの過剰生成をもたらし、発酵性の最終生成物（酢酸、乳酸、エタノール、ギ酸およびピルビン酸）間の炭素フラックス再分割を改変した（Ｗａｎｇら、２０１０）。ＮＡＤＨに対して非感受性であるＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓクエン酸合成酵素の異種性の発現は、操作されたＥ．ｃｏｌｉ株におけるコハク酸生成を増加させた（Ｓａｎｃｈｅｚら、２００５ａ）。上記の変異と組み合わせて、適切なピルビン酸脱水素酵素およびクエン酸合成酵素（ＮＡＤＨ感受性または非感受性）の使用は、嫌気性および好気性条件下で、グリオキシル酸およびクエン酸回路反応および発酵経路間の炭素フラックス再分割の調整を可能にする。

ＤＨＢ経路を通る炭素フラックスを増加させる別の可能性は、経路中間体４−ホスホリンゴ酸、４−リンゴ酸セミアルデヒドを分解することができる酵素反応の欠失である。リンゴ酸セミアルデヒドを分解することができる候補酵素は、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（ｓａｄ、ｇａｂＤ）、および末端アルデヒド基でＣ４分子を酸化することができる他の脱水素酵素である。

宿主生物のＤＨＢ生産性を増加させるための別の可能性は、ＤＨＢを分解する代謝反応の欠失である。ＤＨＢは、リンゴ酸の酵素の競合的阻害剤であり、したがって、この酵素の活性部位への比較的高い親和性を有する（Ｒｏｇｎｓｔａｄ＆Ｋａｔｚ、１９７９）。したがって、ＤＨＢを他の酵素によって認識し、潜在的に分解することができる。これらの酵素は、宿主生物から同定し欠失させることができる。

２，４−ＤＨＢ生成が、リンゴ酸または他の有機酸の追加に基づく場合、２，４−ＤＨＢ生成微生物は、リンゴ酸（またはピルビン酸、サクシネートなどの他の有機酸）の取り込みを促進する膜輸送タンパク質を機能的に発現するはずである。

以下の例は、本発明を説明するものである。これらの例は、例示のみを目的とし、いかなる様式においても本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。

（ｉ）（Ｌ）−２，４−ジヒドロキシブチレート（ＤＨＢ）への（Ｌ）−リンゴ酸の転換を記載する反応スキーム、および（ｉｉ）（Ｌ）−ホモセリンへの（Ｌ）−アスパラギン酸の転換との類似性を示す図。 種々の生物由来のアスパラギン酸キナーゼのアミノ酸配列のアラインメント。（Ｅ．ｃｏｌｉのＥｃ＿ＡＫＩＩＩ−アスパラギン酸キナーゼＩＩＩ（配列番号４）、ＬｙｓＣ、Ｅ．ｃｏｌｉのＥｃ＿ＡＫＩ（配列番号８７）−アスパラギン酸キナーゼＩ、ＴｈｒＡ、Ｅ．ｃｏｌｉのＥｃ＿ＡＫＩＩ（配列番号８８−アスパラギン酸キナーゼＩＩ、ＭｅｔＬ、Ｍｊ−Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（配列番号８９）、Ｔｔ−Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（配列番号９０）、Ｃｇ−Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（配列番号９１）、Ａｔ−Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号９２）、Ｓｃ−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号９３））図は、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｌａｒｋｉｎら、２００７）を使用して作成した。 種々の生物由来のアスパラギン酸キナーゼのアミノ酸配列のアラインメント。（Ｅ．ｃｏｌｉのＥｃ＿ＡＫＩＩＩ−アスパラギン酸キナーゼＩＩＩ（配列番号４）、ＬｙｓＣ、Ｅ．ｃｏｌｉのＥｃ＿ＡＫＩ（配列番号８７）−アスパラギン酸キナーゼＩ、ＴｈｒＡ、Ｅ．ｃｏｌｉのＥｃ＿ＡＫＩＩ（配列番号８８−アスパラギン酸キナーゼＩＩ、ＭｅｔＬ、Ｍｊ−Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（配列番号８９）、Ｔｔ−Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（配列番号９０）、Ｃｇ−Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（配列番号９１）、Ａｔ−Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号９２）、Ｓｃ−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号９３））図は、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｌａｒｋｉｎら、２００７）を使用して作成した。 種々の生物由来のアスパラギン酸キナーゼのアミノ酸配列のアラインメント。（Ｅ．ｃｏｌｉのＥｃ＿ＡＫＩＩＩ−アスパラギン酸キナーゼＩＩＩ（配列番号４）、ＬｙｓＣ、Ｅ．ｃｏｌｉのＥｃ＿ＡＫＩ（配列番号８７）−アスパラギン酸キナーゼＩ、ＴｈｒＡ、Ｅ．ｃｏｌｉのＥｃ＿ＡＫＩＩ（配列番号８８−アスパラギン酸キナーゼＩＩ、ＭｅｔＬ、Ｍｊ−Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（配列番号８９）、Ｔｔ−Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（配列番号９０）、Ｃｇ−Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（配列番号９１）、Ａｔ−Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号９２）、Ｓｃ−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号９３））図は、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｌａｒｋｉｎら、２００７）を使用して作成した。 種々の生物由来のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素のアミノ酸配列のアラインメント。（Ｅｃ−Ｅ．Ｃｏｌｉ（配列番号４９）、Ｍｊ−Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（配列番号９４）、Ｔｔ−Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（配列番号９５）、Ｂｓ−Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号９６）、Ｃｇ−Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（配列番号９７）、Ａｔ−Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ（配列番号９８）、Ｓｃ−Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（配列番号９９）。）図は、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｌａｒｋｉｎら、２００７）を使用して作成した。 （Ａ）ＤＨＢ標準（濃度＝１ｍＭ）；（Ｂ）リンゴ酸キナーゼ（ＭＫ）、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素（ＭＳＡ−Ｄｈ）、およびリンゴ酸セミアルデヒド還元酵素（ＭＳＡ−Ｒｅｄ）を含有する反応Ａの組成物；（Ｃ）対照反応Ｂの組成物（Ａと同様であるが、ＭＳＡ−Ｒｅｄを欠いている）；（Ｄ）対照反応Ｃの組成物（Ａと同様であるが、ＭＳＡ−Ｄｈを欠いている）を示す、ＤＨＢの保持時間に対応する領域を拡大したＧＣクロマトグラム。 反応緩衝液におけるリシン濃度に関して、精製されたＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ、ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ Ｅ２５０Ｋ、ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ Ｔ３４４Ｍ、ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ Ｓ３４５Ｌ、ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ Ｔ３４４Ｍ、およびＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ Ｔ３５２Ｉ変異体の相対活性を示す図。

発明の詳細な説明

［実施例］
例１：アスパラギン酸およびリンゴ酸キナーゼに関する、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅそれぞれに由来するアスパラギン酸キナーゼＬｙｓＣおよびＨｏｍ３の試験
アスパラギン酸キナーゼの野生型遺伝子を含有するプラスミドの構築：プラスミドｐＬＹＳＣｗｔを、高忠実度ポリメラーゼ（ｈｉｇｈ ｆｉｄｅｌｉｔｙ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ならびに、それぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流にＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入するダイレクトおよび逆方向プライマー^５’ＣＡＣＧＡＧＧＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＴＧＡＡＡＴＴＧＴＴＧＴＣＴＣＣ^３’（配列番号１）および^５’ＣＴＴＣＣＡＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＴ−ＡＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＣ^３’（配列番号２）を使用して、ＰＣＲによって、ｌｙｓＣ遺伝子を増幅することによって構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α由来のゲノムＤＮＡを、鋳型として使用した。ＰＣＲ生成物をＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクターの対応する部位中にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞に形質転換した。生じたｐＡＫＩＩＩｗｔプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定によって、正確な配列（配列番号３）を有する全長ｌｙｓＣ遺伝子を含有することが示された。対応するタンパク質は、配列番号４によって表される。

プラスミドｐＨＯＭ３ｗｔを、高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ならびに、それぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流にＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を導入するダイレクトおよび逆方向プライマー^５’ＴＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＣＣＡＡＴＧＧＡＴＴＴＣＣＡＡＣＣ^３’（配列番号５）および^５’ＴＡＴＡＡＴＧＡＡＴＴＣＴ−ＴＡＡＡＴＴＣＣＡＡＧＴＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧＴＴＣ^３’（配列番号６）を使用して、ＰＣＲによって、ＨＯＭ３遺伝子を増幅することによって構築した。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＢＹ４７４１ ｗｔ由来のゲノムＤＮＡを、鋳型として使用した。ＰＣＲ生成物をＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクターの対応する部位中にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞に形質転換した。生じたｐＨＯＭ３ｗｔプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定によって、正確な配列（配列番号７）を有する全長ＨＯＭ３遺伝子を含有することが示された。対応するタンパク質は、配列番号８によって表される。

酵素の発現：Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ Ｄ３星細胞（ｓｔａｒ ｃｅｌｌ）を、適切なプラスミドで形質転換した。Ｎ末端ｈｅｘａ−Ｈｉｓタグを有する酵素を、０．１のＯＤ_６００で一晩の培養から接種され、０．６のＯＤ_６００まで増殖された２５０ｍｌ ＬＢ培養物において発現させ、その後タンパク質発現を、培養培地への１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の追加によって誘導した。タンパク質発現の３時間後、細胞を、１３０００ｇでの１０分間の遠心分離によって採取し、別の分析まで−２０℃で保管した。増殖およびタンパク質発現を、３７℃で行った。培養培地は、５０μｇ／Ｌカナマイシンを含有した。

酵素の精製：発現培養物の凍結した細胞ペレットを、０．５ｍＬの切断緩衝液（ｂｒｅａｋａｇｅ ｂｕｆｆｅｒ）（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７、５）に再懸濁し、３０％まで設定された電力出力での超音波処理（Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶｉｂｒａＣｅｌｌ（商標）７２４３７）の４回の連続したラウンドによって、壊し開けた。粗抽出物を１３０００ｇで４℃で１５分間、遠心分離し、清澄な上清を保持することによって、細胞片を取り出した。１５ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を加え、試料を１３０００ｇで４℃で１０分間遠心分離し、上清を保持することによって、ＲＮＡおよびＤＮＡを抽出物から取り出した。清澄なタンパク質抽出物を、０．７５ｍＬの総容積のＴａｌｏｎ（商標）Ｃｏｂａｌｔ親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で、４℃で１時間インキュベートした。懸濁液をテーブルトップ遠心分離機において７００ｇで遠心分離し、上清を取り出した。樹脂を１０総容積の洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．５）で洗浄し、アスパラギン酸キナーゼを０．５ｍＬの溶出緩衝液（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｐＨ７．５）で溶出した。溶出した酵素の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって検証した。

酵素アッセイ：ホスホエノールピルビン酸、ピルビン酸キナーゼおよび乳酸脱水素酵素の存在下で、キナーゼ反応におけるＡＤＰ生成をＮＡＤＨ酸化にカップリングすることによって、アスパラギン酸またはリンゴ酸キナーゼ活性をアッセイした。

反応スキーム：
アスパラギン酸（またはリンゴ酸）キナーゼ
アスパラギン酸（またはリンゴ酸）＋ＡＴＰ→４−ホスホ−（Ｌ）−アスパラギン酸（または４−ホスホ−（Ｌ）−リンゴ酸）＋ＡＤＰ
ピルビン酸キナーゼ
ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸→ＡＴＰ＋ピルビン酸
乳酸脱水素酵素
ピルビン酸＋ＮＡＤＨ→ＮＡＤ^＋＋乳酸
アッセイ混合物は、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０、２４ｍＭ ＮＡＤＨ、０、９６ｍＭ ＡＴＰ、０、９６ｍＭ ＰＥＰ、９μｇ／ｍＬの乳酸脱水素酵素（Ｓｉｇｍａ、Ｌ２５００）、１２．４μｇ／ｍＬピルビン酸キナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ１５０６）、および適切な量の精製されたアスパラギン酸（リンゴ酸）キナーゼを含有した。反応を、５０ｍＭ （Ｌ）−アスパラギン酸または（Ｌ）−リンゴ酸を加えることによって、開始した。酵素アッセイを、２５０μＬの最終体積において、９６ウェル平底のマイクロタイタープレートにおいて、３０℃で行った。反応の後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ ６８０ＸＲ）における３４０ｎｍでのＮＡＤＨの特性吸収が続いた。

ヒドロキサム酸アッセイ：野生型または変異アスパラギン酸キナーゼによる、基質のリン酸化、すなわちリン酸アシル無水物（ａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）の形成を検証するために、キナーゼ反応の生成物を、ヒドロキシルアミンでインキュベートし、対応するアスパラギン酸またはリンゴ酸ヒドロキサム酸（ｍａｌａｔｅ ｈｙｄｒｏｘａｍａｔｅ）誘導体を形成した。アッセイ混合物は、１２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８）、２００ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＡＴＰ、２００ｍＭヒドロキシルアミン、１０ｍＭアスパラギン酸またはリンゴ酸、および適切な量の精製されたタンパク質を含有した。反応を、等しい体積の１Ｍ塩酸中の１．７％（ｗ／ｖ）ＦｅＣｌ_３の追加によって、３０分後に停止した。ヒドロキサム酸−鉄錯体の形成を、マイクロタイタープレートリーダーにおける、５４０ｎｍでのその特性吸光度を測定することによって検証した。ＡＴＰを除いたすべての成分を含有するアッセイ混合物を、ブランクとして使用した。

結果：精製されたＬｙｓＣ（Ｈｉｓ−ｔａｇを有さない、配列番号４）およびＨｏｍ３（Ｈｉｓ−ｔａｇを有さない、配列番号７）酵素は、ヒドロキサム酸アッセイ（Ｋｅｎｇ＆Ｖｉｏｌａ、１９９６）によって検証されるように、アスパラギン酸キナーゼ活性を示したが、リンゴ酸をリン酸化することができなかった。アスパラギン酸に対するＬｙｓＣおよびＨｏｍ３に関する最大活性は、それぞれ、４．５μｍｏｌ／（ｍｉｎ^＊ｍｇ_ｐｒｏｔ）および１．６μｍｏｌ／（ｍｉｎ^＊ｍｇ_ｐｒｏｔ）であった。アスパラギン酸に関するＫｍ値は、種々の基質濃度（ｃ）での、最初の反応速度（ｖ）を測定することによって、およびｖ対ｖ／ｃプロットの勾配を抽出することによって、ＥａｄｉｅおよびＨｏｆｓｔｅｅの方法で推定した。精製されたＨｉｓタグをつけたＬｙｓＣのＫｍは、約０．６ｍＭと推定され、これは、Ｈｉｓタグをつけたタンパク質が、０．６ｍＭであると報告されたタグをつけていない精製された酵素と同じ基質親和性を有することを示している（Ｍａｒｃｏ−Ｍａｒｉｎら、２００３）。

例２：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のアスパラギン酸キナーゼＬｙｓＣの部位特異的な変異誘発およびリンゴ酸キナーゼ活性に関する変異酵素の試験。

部位特異的な変異誘発を、表１において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対およびｐＬＹＳＣｗｔ （配列番号３）プラスミドを鋳型として使用して行った。アミノ酸配列を変化させるための点変異を、表１において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対を使用して、ＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ １Ｕ、ＨＦ緩衝液２０％（ｖ／ｖ）、ｄＮＴＰ ２．５ｍＭ、ダイレクトおよび逆方向プライマー各１μΜ、鋳型プラスミド２００ｎｇ、水）によって導入した。ＰＣＲによって作られたプラスミドは、変異クローンの同定を促進するための機能的変異に加えて、（サイレント変異を使用して導入された）Ｎｃｏ１に関する新しい制限部位を含有した。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩによって３７℃で１時間消化して鋳型ＤＮＡを取り出し、ＮＥＢ ５−アルファコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。変異プラスミドを、制限部位分析によって同定し、ＤＮＡ配列決定によって、望ましい変異を有することを検証した。

位置１１９における変異を表す配列は、配列番号９によって表すことができ、ここで、位置１１９における残基はＸであり、Ｘは、（グルタミンを除く）１９種の天然のアミノ酸のいずれかである。

変異酵素を発現させ精製し、例１において記載したようにアスパラギン酸およびリンゴ酸キナーゼ活性に関して試験した。結果を、表２にまとめる。

表２において一覧表にした変異体のいずれも、アスパラギン酸に対する活性を有さなかった。

結果は、保存グルタメートを、システイン、グリシン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、トレオニンまたはバリンによって位置１１９で置き換えることによって、アスパラギン酸キナーゼをリンゴ酸キナーゼに形質転換することができることを示している。

表２において一覧表にした酵素の対応する核酸配列は、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５および配列番号２７である。

例３：リシンによる阻害への強く低下した感受性を有するリンゴ酸キナーゼの構築
部位特異的な変異誘発を、表３において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対およびｐＬＹＳＣ＿Ｅ１１９Ｇプラスミドを鋳型として使用して、行った。（ｐＬＹＳＣ＿Ｅ１１９Ｇプラスミドは、例２において記載したように、ｌｙｓＣ遺伝子：（配列番号１５）のＤＮＡ配列における以下の変化を導入することによって得た。アミノ酸配列を変化させるための点変異を、表１において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対を使用して、ＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ １Ｕ、ＨＦ緩衝液２０％（ｖ／ｖ）、ｄＮＴＰ ２．５ｍＭ、ダイレクトおよび逆方向プライマー各１μΜ、鋳型プラスミド２００ｎｇ、水）によって導入した。可能な場合、ＰＣＲによって作られたプラスミドは、変異クローンの同定を促進するための機能的変異に加えて、（サイレント変異を使用して導入された）新しい制限部位を含有した。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩによって３７℃で１時間、消化して鋳型ＤＮＡを取り出し、ＮＥＢ ５−アルファコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。変異プラスミドを、制限部位分析によって同定し、ＤＮＡ配列決定によって、望ましい変異を有することを検証した。

（ｉ）位置２５０におけるグルタミン酸のリシンによる置き換えに対応する追加の変異を含むタンパク質ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇの核酸配列は、配列番号３８によって表され；その対応するアミノ酸配列は、配列番号３９によって表され；（ｉｉ）位置３４４におけるトレオニンのメチオニンによる置き換えに対応する追加の変異を含むタンパク質ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇの核酸配列は、配列番号４０によって表され；その対応するアミノ酸配列は、配列番号４１によって表され；（ｉｉｉ）位置３５２におけるトレオニンのイソロイシンによる置き換えに対応する追加の変異を含むタンパク質ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇの核酸配列は、配列番号４２によって表され；その対応するアミノ酸配列は、配列番号４３によって表され；（ｉｖ）位置３４５におけるセリンのロイシンによる置き換えに対応する追加の変異を含むタンパク質ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇの核酸配列は、配列番号４４によって表され；その対応するアミノ酸配列は、配列番号４５によって表される。

酵素の発現および精製：Ｈｉｓタグをつけた酵素ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ、ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ Ｅ２５０Ｋ、ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ Ｔ３４４Ｍ、ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ Ｓ３４５Ｌ、ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ Ｔ３５２Ｉに関するタンパク質発現を、例１において記載したように行った。

酵素アッセイ：リンゴ酸キナーゼ活性を、例１において記載したように、アッセイした。反応緩衝液におけるリシン濃度は、異なっていた。

結果：ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ中への変異Ｅ２５０Ｋ、Ｔ３４４ＭまたはＳ３４５Ｌの導入は、リンゴ酸キナーゼ活性を、上昇したリシン濃度に対して大いに非感受性にした（図４を参照）。

例４：アスパラギン酸およびリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素活性に関するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素Ａｓｄの試験
アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素の野生型遺伝子を含有するプラスミドの構築：プラスミドｐＡＳＤｗｔを、高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、ならびに、それぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流にＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を導入するダイレクトおよび逆方向プライマー^５’ＴＡＴＡＡＴＧＣＴＡＧＣＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＴＴＧＧＴＴＴＴＡＴＣＧＧ^３’（配列番号４６）および^５’ＴＡＴＡＡＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＴＴＧＡＣＧＡＡＧＣ^３’（配列番号４７）を使用して、ＰＣＲによって、Ｅ．ｃｏｌｉのａｓｄ遺伝子を増幅することによって構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α由来のゲノムＤＮＡを、鋳型として使用した。ＰＣＲ生成物をＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）発現ベクターの対応する部位中にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞に形質転換した。生じたｐＡＳＤｗｔプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定によって、正確な配列（配列番号４８）を有する全長ａｓｄ遺伝子を含有することが示された。前記酵素の対応するアミノ酸配列は、配列番号４９によって表される。

酵素の発現および精製：Ｈｉｓタグをつけた酵素Ａｓｄに関するタンパク質発現を、例１において記載したように行った。

酵素アッセイ：アスパラギン酸またはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素活性を、それぞれ、アスパラギン酸またはリンゴ酸セミアルデヒドの４−ホスホ−（Ｌ）−アスパラギン酸または４−ホスホ−（Ｌ）−リンゴ酸への酸化中のＮＡＤＰの還元を追跡することによって、逆方向生合成方向において、アッセイした（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００３）。

（Ｌ）−アスパラギン酸セミアルデヒド（または（Ｌ）−リンゴ酸セミアルデヒド）＋ＮＡＤＰ＋Ｐｉ→４−ホスホ−（Ｌ）−アスパラギン酸（または４−ホスホ−（Ｌ）−リンゴ酸）＋ＮＡＤＰＨ
アッセイ混合物は、２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ９）、５０ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４、０、２５ｍＭ ＮＡＤＰを含有した。反応を、（Ｌ）−アスパラギン酸セミアルデヒドまたは（Ｌ）−リンゴ酸セミアルデヒドを加えることによって、開始した。（Ｌ）−アスパラギン酸セミアルデヒドを、ホモセリン脱水素酵素およびアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素の酵素試験に適した基質である、（分解を防ぐためにｐＨ３で維持した）Ｌ−アスパラギン酸β−セミアルデヒド水和物トリフルオロ酢酸（Ｌ−ａｓｐａｒｔｉｃ ａｃｉｄ β−ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ ｈｙｄｒａｔｅ ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔａｔｅ）の形で加えた（Ｒｏｂｅｒｔｓら、２００３）。不安定なリンゴ酸セミアルデヒドを、安定なリンゴ酸セミアルデヒド誘導体２−［（４Ｓ）−２，２−ジメチル−５−オキソ−１，３−ジオキソラン−４−イル］アセトアルデヒド（ＤＭＯＤＡ）の脱保護によって、酵素試験に先立って、新たに作製した。ＤＭＯＤＡを２Ｍ塩酸において２５℃で１５分間インキュベートし、遊離したアセトンの蒸発（３５℃、５０ｍｂａｒ）によって、リンゴ酸セミアルデヒドを得た。リンゴ酸セミアルデヒド溶液のｐＨは、重炭酸ナトリウムを使用して、３で固定した。

酵素アッセイを、９６ウェル平底のマイクロタイタープレートにおいて、２５０μＬの最終体積において３０℃で行った。反応の後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ ６８０ＸＲ）における３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨの特性吸収が続いた。

結果：Ｈｉｓタグをつけた野生型アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素、Ａｓｄは、１６０μｍｏｌ／（ｍｉｎ^＊ｍｇ_ｐｒｏｔ）の最大比活性で、（Ｌ）−アスパラギン酸セミアルデヒドを４−ホスホ−（Ｌ）−アスパラギン酸に酸化した。（Ｌ）−リンゴ酸セミアルデヒドに対して、酵素は、０．０１μｍｏｌ／（ｍｉｎ^＊ｍｇ_ｐｒｏｔ）の活性を有した。

例５：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ由来のアスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素Ａｓｄの部位特異的な変異誘発およびリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素活性に関する変異酵素の試験。

Ａｓｄのアミノ酸配列における点変異を、ｐＡＳＤｗｔプラスミドを鋳型として使用し、例２において概略を述べたプロトコールに従って導入した。表４において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対を使用して、位置２４１においてグルタメート残基または位置１３６においてトレオニン残基を変異させた。変異プラスミドを、制限部位分析によって同定し、ＤＮＡ配列決定によって望ましい変異を有することを検証した。

位置２４１において変異したＡｓｄタンパク質は、配列番号６８によって表すことができ、ここで、位置２４１における残基はＸであり、Ｘは、（グルタミンを除く）他の１９種の生物学的に発生するアミノ酸のいずれかである。

結果：位置Ｅ２４１において変異したＡｓｄの活性およびＫｍ値を、表５にまとめる。グルタメート２４１が、アラニン、システイン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、メチオニンまたはグルタミンによって置き換えられた、Ａｓｄ変異体は、野生型酵素より著しく高い最大比活性で、（Ｌ）−アスパラギン酸−４−セミアルデヒドを４−ホスホ−（Ｌ）−アスパラギン酸に酸化した。二重変異体Ａｓｄ Ｅ２４１Ｑ Ｔ１３６Ｎ（配列番号２３１）は、０．２５μｍｏｌ／（ｍｉｎ^＊ｍｇ_ｐｒｏｔ）の最大比活性および０．２５ｍＭのＫｍを有した。

対応する核酸は、配列番号５５、配列番号５７、配列番号４８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５および配列番号６７によって表される。

二重変異体Ａｓｄ Ｅ２４１Ｑ Ｔ１３６Ｎは、配列番号２３０によって表される核酸配列を有する。

例６：２，４ ＤＨＢ脱水素酵素の同定
適した２，４ ＤＨＢ脱水素酵素を同定するために、種々の生物学的源由来のベータ−ヒドロキシ酸脱水素酵素を、リンゴ酸セミアルデヒドを還元するそれらの能力に関して試験した。試験した酵素の中に、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のメチルブチルアルデヒド還元酵素、Ｙｐｒ１（Ｆｏｒｄ＆Ｅｌｌｉｓ、２００２））（配列番号７３および配列番号７４）；およびＭｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ ｓｅｄｕｌａ由来のコハク酸セミアルデヒド還元酵素、Ｍｓ−Ｓｓｒ（Ｋｏｃｋｅｌｋｏｒｎ＆Ｆｕｃｈｓ、２００９）（配列番号７５および配列番号７６）があった。遺伝子ＹＰＲ１およびＭｓ−ＳＳＲを、表６において一覧表にしたプライマーを使用して増幅し、ベクターｐＥＴ２８（制限酵素表３を参照）中にクローニングし、それぞれ、プラスミドｐＹＰＲ１およびｐＭｓ−ＳＳＲをもたらした。例１において記載したように、タンパク質を発現させ精製した。

リンゴ酸セミアルデヒド還元酵素活性に関する試験：
反応：
（Ｌ）−リンゴ酸セミアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→（Ｌ）−２，４−ジヒドロキシ酪酸＋ＮＡＤ（Ｐ）
アッセイ混合物は、２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２）０、２４ｍＭ ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、および適切な量の精製された酵素を含有した。反応を、１０ｍＭ（Ｌ）−リンゴ酸セミアルデヒドを加えることによって、開始した（リンゴ酸セミアルデヒドは各試験のために新たに調製した、例４を参照）。酵素アッセイを、２５０μＬの最終体積において、９６ウェル平底のマイクロタイタープレートにおいて３０℃で行った。反応の後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ ６８０ＸＲ）における３４０ｎｍでのＮＡＤ（Ｐ）Ｈの特性吸収が続いた。結果を、表７において一覧表にする。

Ｍ．ｓｅｄｕｌａ由来のコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のメチルブチルアルデヒド還元酵素は、リンゴ酸セミアルデヒド還元酵素活性を有した。リンゴ酸セミアルデヒドに関するＭｓ−ＳＳＲのＫｍは、１．１ｍＭであった。

例７：Ｍ．ｓｅｄｕｌａ由来のコハク酸セミアルデヒド還元酵素の部位特異的な変異誘発
部位特異的な変異誘発を、表８において一覧表にしたオリゴヌクレオチド対およびｐＭｓ−ＳＳＲプラスミドを鋳型として使用して行った。アミノ酸配列を変化させるための点変異を、ＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ １Ｕ、ＨＦ緩衝液２０％（ｖ／ｖ）、ｄＮＴＰ ２．５ｍＭ、ダイレクトおよび逆方向プライマー各１μΜ、鋳型プラスミド２００ｎｇ、水）によって導入した。可能な場合、ＰＣＲによって作られたプラスミドは、変異クローンの同定を促進するための機能的変異に加えて、（サイレント変異を使用して導入された）新しい制限部位を含有した。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩによって３７℃で１時間消化して鋳型ＤＮＡを取り出し、ＮＥＢ ５−アルファコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。変異プラスミドを、制限部位分析によって同定し、ＤＮＡ配列決定によって、望ましい変異を有することを検証した。表９は、変異体の動態パラメーターを要約したものである。結果は、二重変異体Ｍｓ−ＳＳＲ Ｈ３９Ｒ Ｎ４３Ｈ（配列番号８１、配列番号８２）が、野生型酵素と比較した場合、リンゴ酸セミアルデヒドへの親和性を改善したことを実証している。

対応する核の配列は、配列番号２２４、配列番号２２６および配列番号８２によって表される。

例８：ＤＨＢのインビトロでの生成
酵素リンゴ酸キナーゼ（ＬｙｓＣ Ｅ１１９Ｇ、配列番号１５）、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素（Ａｓｄ Ｅ２４１Ｑ；配列番号６７）、およびリンゴ酸セミアルデヒド還元酵素（Ｍｓ ＳＳｒＲ、配列番号７６）を、例１において記載したように発現させ精製した。５０ｍＭリンゴ酸を、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１８０μｇ／ｍＬのリンゴ酸キナーゼ（Ｌｙｓ Ｅ１１９Ｇ）、３２５μｇ／ｍＬのリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素（Ａｓｄ Ｅ２４１Ｑ）、および１３０μｇ／ｍＬのリンゴ酸セミアルデヒド還元酵素（Ｍｓ＿Ｓｓｒ）（反応Ａ）を含有する反応混合物に加えることによって、ＤＨＢの生成をインビトロで実証した。対照反応は、すべての成分を含有したが、リンゴ酸セミアルデヒド還元酵素（反応Ｂ）またはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素（反応Ｃ）のいずれかを欠いていた。３０℃でのインキュベーションの３０分後、反応混合物を、ガスクロマトグラフィー［ＣＰＧ Ｖａｒｉａｎ Ｓｅｒｉｅｓ ４３０；ＦＩＤ検出器を備えた；オートサンプラーＣＰ８４００；スプリットレスインジェクター（ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ ｉｎｊｅｃｔｏｒ）１１７７（２３０℃）；カラム：ＣＰ−ＷＡＸ５８／ＦＦＡＰ、３０ｍ×０．５３ｍｍ、ｄ_ｆ０．５０μｍ；およびライナー：Ｉｎｌｅｔ Ｓｌｅｅｖｅ、グースネック６．５×７８．５×４ｍｍ ＧＷＯＬ（Ｖａｒｉａｎ）によって分析した。キャリアーガスは、２５ｍＬ／ｍｉｎの流速で、窒素であった。水素炎イオン化を、空気−水素混合物（流速は、それぞれ、３００ｍＬ／ｍｉｎおよび３０ｍＬ／ｍｉｎであった）を使用して、行った。検出器温度は、２４０℃であった。注入された試料体積は、１μＬであった。温度プログラムを、表１０において規定する。

ＤＨＢ生成が、反応Ａ（すべての酵素の存在）中に検出されたが、対照反応ＢおよびＣ中にはなかった（図５）。

例９：Ｍ．ｓｅｄｕｌａコハク酸セミアルデヒド還元酵素のコード配列のＥ．ｃｏｌｉにおけるその発現に関する最適化。

変異Ｈ３９ＲおよびＮ４３Ｈを含むＭ．ｓｅｄｕｌａコハク酸セミアルデヒド還元酵素のコード配列を、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウェアを使用して、Ｅ．ｃｏｌｉにおける最大発現に関して最適化した。合成遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）によって作製した。ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を、それぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流に導入し、ｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）中への直接的なクローニングを可能にした。

生じたｐＳＳＲ−Ｈ３９ＲＮ４３Ｈ−ｏｐｔプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定によって、正確な配列（配列番号２２８）を有する全長Ｍ ｓｅｄｕｌａ ＳＳＲ Ｈ３９Ｒ Ｎ４３Ｈ遺伝子を含有することが示された。

例１０：宿主生物としてＥ．ｃｏｌｉを使用した、リンゴ酸キナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ由来のｌｙｓＣ遺伝子の変異体）、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素、（Ｅ．ｃｏｌｉ由来のａｓｄ遺伝子の変異体）、およびＤＨＢ脱水素酵素（Ｍ．ｓｅｄｕｌａコハク酸セミアルデヒド還元酵素遺伝子の変異体）の同時発現を促進するプラスミドの構築。

プラスミドｐＬＹＳＣ−Ｅ１１９Ｇ Ｅ２５０Ｋ（配列番号３８）を、オペロン構築のための主鎖として使用した。ｐＥＴ２８（Ｎｏｖａｇｅｎ）リボソーム結合部位（ｒｂｓ）およびＡＳＤ−Ｅ２４１Ｑのコード領域を含有するＤＮＡ断片を、鋳型としてｐＡＳＤ−Ｅ２４１Ｑ（配列番号５５、ならびに、それぞれ、ｒｂｓの上流および終止コドンの下流にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を導入したダイレクトおよび逆方向プライマー^５’ＴＡＴＡＡＧＧＡＴＣＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＧＧ^３’（配列番号８３）および^５’ＴＡＴＡＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＧＣＣＡＧＴＴＧＡＣＧＡＡＧ^３’（配列番号８４）を使用して、ＰＣＲ（高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ））によって得た。ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ｐＬＹＳＣ−Ｅ１１９Ｇ Ｅ２５０Ｋの対応する部位中にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞に形質転換した。生じたｐＬＹＳＣ−Ｅ１１９Ｇ−Ｅ２５０Ｋ＿ＡＳＤ−Ｅ２４１Ｑプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定によって、正確な配列を有することが示された。

ｐＥＴ２８リボソーム結合部位（ｒｂｓ）およびコドン最適化Ｍｓ−ＳＳＲ−Ｈ３９ＲＮ４３Ｈ−ｏｐｔのコード領域を含有するＤＮＡ断片を、鋳型としてｐＳＳＲ−Ｈ３９ＲＮ４３Ｈ−ｏｐｔ、ならびに、それぞれ、ｒｂｓの上流および終止コドンの下流にＮｏｔＩおよびＰｓｐＸＩ制限部位を導入したダイレクトおよび逆方向プライマー^５’ＴＡＴＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴ^３’（配列番号８５）および^５’ＴＡＴＡＡＡＣＴＣＧＡＧＣＴＴＡＣＧＧＡＡＴＡＡＴＣＡＧＧ^３’（配列番号８６）を使用して、ＰＣＲによって得た。ＰＣＲ生成物をＮｏｔＩおよびＰｓｐＸｌで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ｐＬＹＳＣ−Ｅ１１９Ｇ−Ｅ２５０Ｋ＿ＡＳＤ−Ｅ２４１Ｑの対応する部位中にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞に形質転換した。生じたｐＥＴ２８−ＤＨＢプラスミド（配列番号２２９）を単離し、ＤＮＡ配列決定によって、正確な配列を有することが示された。

３つの遺伝子の発現を同時に制御する５’上流プロモーター領域（ｐＥＴ２８−ＤＨＢにおけるｉｅ Ｔ７プロモーター）は、ｐＥＴ２８−ＤＨＢをＳｐｈＩおよびＸｂａＩで消化し、適した制限部位を有する別のプロモーター領域をクローニングすることによって、誘導性または構成的な任意の他のプロモーターで置き換えることができる。誘導性プロモーターの使用に関する例として、ｐＥＴ２８−ＤＨＢ主鎖のＴ７プロモーターを、その特性がグルコースの存在下でのタンパク質発現を可能にするｔａｃプロモーター（ｄｅ Ｂｏｅｒら、１９８３）によって置き換えた。プラスミドｐＥＸＴ２０（Ｄｙｋｘｈｏｏｍら、１９９６）から、プラスミドをＳｐｈＩおよびＸｂａＩで消化することによって、ｔａｃプロモーターを得た。プロモーターを含有するＤＮＡ断片を精製し、ＳｐｈＩ／ＸｂａＩ消化したｐＥＴ２８−ＤＨＢプラスミド中にクローニングした。生じたｐＴＡＣ−ＤＨＢプラスミドを単離し、ＤＮＡ配列決定によって、正確な配列を有することが示された。

例１１：発酵によるＤＨＢ生成のための炭素フラックス再分割およびＮＡＤＰＨ補助因子供給を最適化するためのＥ．ｃｏｌｉ株の構築
いくつかの遺伝子を、ＤＨＢ生成のための炭素フラックス再分割および補助因子供給を最適化するために、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５において破壊した。遺伝子欠失を、Ｄａｔｓｅｎｋｏらによるラムダｒｅｄリコンビナーゼ法（ｌａｍｂｄａ ｒｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ｍｅｔｈｏｄ）（Ｄａｔｓｅｎｋｏ＆Ｗａｎｎｅｒ、２０００）を使用して行った。

欠失カセット（ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を、高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、およびプラスミドｐＫＤ４のＦＲＴが隣接したカナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）（Ｄａｔｓｅｎｋｏ＆Ｗａｎｎｅｒ、２０００）を鋳型として使用して、ＰＣＲによって調製した。センスプライマーは、ｐＫＤ４のＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴカセットに対応する２０ｂｐが後に続く、各標的遺伝子（下線が引かれた）の５’末端に対応する配列を含有した。アンチセンスプライマーは、カセットに対応する２０ｂｐが後に続く、各標的遺伝子（下線が引かれた）の３’末端領域に対応する配列を含有した。プライマーを表１２に記載する。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩで消化し、形質転換に先立って精製した。

ＬＢ液体培地において３７℃で０．６のＯＤ_６００まで細胞を増殖し、細胞を１００倍に濃縮し、氷冷の１０％グリセロールで２回洗浄することによって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５株をエレクトロコンピテントにした。細胞を、エレクトロポレーション（２ｍｍギャップキュベットにおいて２．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）によって、プラスミドｐＫＤ４６（Ｄａｔｓｅｎｋｏ＆Ｗａｎｎｅｒ、２０００）で形質転換した。形質転換体をアンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）ＬＢ固形培地上で３０℃で選択した。

破壊カセットを、ラムダＲｅｄリコンビナーゼ発現プラスミドｐＫＤ４６を有するエレクトロコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株に形質転換した。細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有する液体ＳＯＢ培地において、３０℃で増殖した。ラムダｒｅｄリコンビナーゼ系を、培養物のＯＤ_６００が０．１に達した際、１０ｍＭアラビノースを加えることによって誘導した。細胞を、０．６のＯＤ_６００までさらに増殖し、それらを遠心分離によって採取し、氷冷の１０％グリセロールで２回洗浄し、エレクトロポレーションによって、破壊カセットで形質転換した。ＬＢ液体培地における３０℃での一晩の形質発現後、細胞を、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する固形ＬＢ培地上に播種した。形質転換体を、３０℃での培養後、選択した。

遺伝子置換を、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、コロニーＰＣＲによって検証した。第１の反応を、隣接している遺伝子座特異的プライマー（ｌｏｃｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ）（表１３を参照）で行って、親断片（ｐａｒｅｎｔａｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ）および新しい変異体特異的断片の獲得の同時喪失を検証した。２つの追加の反応を、ＦＲＴ−カナマイシン耐性カセット内に、それぞれの共通の試験プライマーｋ１ｒｅｖまたはｋ２ｆｏｒ（表１３を参照）を有する、近くの遺伝子座特異的プライマー（センス遺伝子座プライマー／ｋ１ｒｅｖおよびｋ２ｆｏｒ／逆方向遺伝子座プライマー）を使用することによって行った。

その後、耐性遺伝子（ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ）を、ＦＬＰリコンビナーゼを有するプラスミドｐＣＰ２０（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ＆Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ、１９９５）を使用して、１つのＦＲＴ部位を含有する痕跡領域（ｓｃａｒ ｒｅｇｉｏｎ）を残して、染色体から切り出した。ｐＣＰ２０は、温度感受性の複製およびＦＬＰリコンビナーゼ合成の熱誘導を示すアンピシリンおよびＣｍＲプラスミドである。カナマイシン耐性変異体をｐＣＰ２０で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を３０℃で選択した。次いで、形質転換体を固形ＬＢ培地上で３７℃で増殖し、すべての抗生物質耐性の喪失に関して試験した。ＦＲＴ−カナマイシンカセットの切り出しを、ｃｒｉｍｓｏｎ ｔａｑポリメラーゼおよび隣接している遺伝子座特異的プライマー（表１３）を使用して、コロニーＰＣＲによって分析した。多重欠失を、上述したステップを繰り返すことによって得た。

単一または多重欠失を有する株を、上述したようにエレクトロコンピテントにし、ＤＨＢ経路酵素（例１０を参照）のＩＰＴＧ誘導発現を可能にするｐＴＡＣ−ＤＨＢプラスミドで形質転換し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有する固形ＬＢ培地上で選択した。

Ｅ．ｃｏｌｉのＰＥＰカルボキシキナーゼをコードするｐｃｋ遺伝子を有するプラスミドｐＡＣＴ３−ｐｃｋを、鋳型としてＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５由来のゲノムＤＮＡ、ならびに、それぞれ、^５’ＴＡＴＡＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＣＧＣＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＣ^３’（配列番号１００）および^５’ＴＡＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧ^３’（配列番号１０１）順方向および逆方向プライマーを使用して、ｐｃｋコード配列を増幅することによって構築した。ＤＮＡ断片を、ＸｍａＩおよびＸｂａＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して、ｐＡＣＴ３発現ベクター（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら、１９９６）の対応する部位中にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α細胞に形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を含有する固形ＬＢ培地上で選択した。生じたプラスミドを単離し、ｐｃｋ遺伝子の正確な挿入を、配列決定によって検証した。それぞれ、ａｃｅＡ、ｐｐｃ、ｇａｌＰもしくはｐｙｋＡ（すべてＥ．ｃｏｌｉ）またはＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ由来のｐｙｃＡを有するプラスミドｐＡＣＴ３−ａｃｅＡ、ｐＡＣＴ３−ｐｐｃ、ｐＡＣＴ３−ｇａｌＰ、ｐＡＣＴ３−ｐｙｋＡおよびｐＡＣＴ３−ｐｙｃを、表１４において一覧表にしたプライマーを使用して、相同的に構築した。

上述したｐＡＣＴ３由来プラスミドおよびｐＴＡＣ−ＤＨＢプラスミドを、表１２において一覧表にした欠失の組合せを有するＥ．ｃｏｌｉ ＭＧ１６５５変異体に形質転換した。両方のプラスミドを含有する形質転換体を、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有する固形ＬＢ培地上で選択した。構築された株に関する例を、表１５において一覧表にする。

例１２：グルコースの発酵による２，４−ジヒドロキシ酪酸の生成
株および培養条件：プラスミドｐＴＡＣ−ＤＨＢ（例１１を参照）由来の、リンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素およびＤＨＢ脱水素酵素を同時発現する株Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＣＥ１、および空のプラスミド（すなわち上記酵素のコード配列を有さないｐＴＡＣ主鎖）のみを含有する同質遺伝子型対照株で、実験を行った。１リットル培養培地は、２０ｇグルコース、１８ｇ Ｎａ_２ＨＰＯ_４＊１２Ｈ_２Ｏ、３ｇ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．５ｇ ＮａＣｌ、２ｇ ＮＨ_４Ｃｌ、０．５ｇ ＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、０．０１５ ＣａＣｌ_２＊２Ｈ_２Ｏ、１００倍希釈した濃縮したＨＣｌにおいて調製した１ｍＬの０．０６ｍｏｌ／Ｌ ＦｅＣｌ_３保存液、２ｍＬの１０ｍＭ チアミンＨＣｌ保存液、２０ｇ ＭＯＰＳ、５０μｇ硫酸カナマイシン、および１ｍＬの微量元素溶液（１リットル当たり：０．０４ｇ Ｎａ_２ＥＤＴＡ＊２Ｈ_２Ｏ、０．１８ｇ ＣｏＣｌ_２＊６Ｈ_２Ｏ、ＺｎＳＯ４＊７Ｈ_２Ｏ、０．０４ｇ Ｎａ_２ＭｏＯ４＊２Ｈ_２Ｏ、０．０１ｇ Ｈ_３ＢＯ_３、０．１２ｇ ＭｎＳＯ_４＊Ｈ_２Ｏ、０．１２ｇ ＣｕＣｌ_２＊Ｈ_２Ｏを含有する）を含有した。ｐＨを７に調整し、培地をフィルター滅菌した。すべての培養を、１７０ｒｐｍで運転しているＩｎｆｏｒｓ回転振とう機上で、３７℃で行った。一晩培養物（試験管における３ｍＬ培地）を、グリセロールストックから播種し、５００ｍＬ振とうフラスコにおいて培養した１００ｍＬ増殖培養物における０．０５の最初のＯＤ_６００を調整するために使用した。増殖培養物におけるＯＤ_６００が０．２に達した際、ＩＰＴＧを１ｍｍｏｌ／Ｌの濃度で加えた。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によるＤＨＢ濃度の推定：培養培地を、遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ２１Ｒ、Ｒｏｔｏｒ Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｓ４１８０、１０分、４８００ｒｐｍ）によって、細胞から分離した。清澄な上清を、別の分析まで−２０℃で保管した。ＤＨＢ含有量を、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨカラム（Ｃ１８、１．７μｍ、１００×２．１ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）を備えたＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用して定量化し、質量感受性検出器（ｍａｓｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）（ＴＱ、Ｗａｔｅｒｓ、ＥＳＩモード、毛細管電圧（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｖｏｌｔａｇｅ）：２．５ｋＶ、コーン電圧２５Ｖ、Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ電圧：３Ｖ、供給源温度：１５０℃、脱溶媒和温度：４５０℃、コーンガスフロー：５０Ｌ／ｈ、脱溶媒和ガスフロー：７５０Ｌ／ｈ）にカップリングした。カラム温度は、３０℃で保った。移動層は、８８％の０．０８％テトラ−ｎ−ブチルアンモニウムヒドロキシド溶液、および１２％アセトニトリルの混合物であった。流速を０．４ｍＬ／ｍｉｎで固定した。試料の注入体積は、５μＬであった。

結果：
株Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＣＥ１および対照株の培養培地のＤＨＢ含有量を、ＩＰＴＧの追加によって、リンゴ酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素およびＤＨＢ脱水素酵素の発現を誘導した後、８時間および２４時間で推定した。表１６において参照することができるように、ＤＨＢ経路酵素を発現した株ＥＣＥ１は、対照株よりも著しく高い量のＤＨＢを生成し、これは、図１（ｉ）において示した代謝経路を通してのＤＨＢの発酵による生成の可能性を実証している。

参考文献

結果：
株Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＣＥ１および対照株の培養培地のＤＨＢ含有量を、ＩＰＴＧの追加によって、リンゴ酸キナーゼ、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素およびＤＨＢ脱水素酵素の発現を誘導した後、８時間および２４時間で推定した。表１６において参照することができるように、ＤＨＢ経路酵素を発現した株ＥＣＥ１は、対照株よりも著しく高い量のＤＨＢを生成し、これは、図１（ｉ）において示した代謝経路を通してのＤＨＢの発酵による生成の可能性を実証している。

以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］
２，４−ジヒドロキシ酪酸（２，４−ＤＨＢ）を生成する方法であって、
リンゴ酸キナーゼを使用して、リンゴ酸を４−ホスホ−リンゴ酸に変換する第１のステップ、
リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素を使用して、４−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−４−セミアルデヒドに変換する第２のステップ、
ＤＨＢ脱水素酵素を使用して、リンゴ酸−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換する第３のステップ
を含む方法。
［２］
前記リンゴ酸キナーゼが、酵素の少なくとも１つの変異によって得ることができ、前記変異が、リンゴ酸への前記変異ポリペプチドの活性および／または基質親和性を改善する、［１］に記載の方法。
［３］
前記リンゴ酸キナーゼが、アスパラギン酸キナーゼである、［２］に記載の方法。
［４］
前記変異アスパラギン酸キナーゼが、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｓ３９、Ｔ４５、Ｖ１１５、Ｅ１１９、Ｆ１５４および／またはＳ２０１の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含み、前記位置の天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、［３］に記載の方法。
［５］
前記変異アスパラギン酸キナーゼが、以下のアミノ酸：Ｅ２５０、Ｍ３１８、Ｓ３２１、Ｖ３３９、Ｓ３３８、Ｆ３２４、Ｌ３２５、Ｖ３３９、Ｓ３４５、Ｅ３４６、Ｄ３４０、Ｔ３４４および／またはＴ３５２に、少なくとも１つの変異を含み、前記アミノ酸のそれぞれが、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、［４］に記載の方法。
［６］
前記リンゴ酸キナーゼが、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５によって表される、［１］から［５］の何れか１に記載の方法。
［７］
前記リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素が、酵素の少なくとも１つの変異によって得ることができ、前記変異が、４−ホスホ−リンゴ酸への変異酵素の活性および／または基質親和性を改善する、［１］から［６］の何れか１に記載の方法。
［８］
前記酵素が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、［７］に記載の方法。
［９］
前記変異アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｔ１３６、Ｑ１６２、Ｉ２３０、Ｅ２４１および／またはＨ２７４の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含み、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、［８］に記載の方法。
［１０］
配列番号６８、より明確には配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４もしくは配列番号６６または配列番号２３１によって表される、［９］に記載の方法。
［１１］
前記ＤＨＢ脱水素酵素が、タルトロン酸セミアルデヒド還元酵素、コハク酸セミアルデヒド還元酵素、マロン酸セミアルデヒド還元酵素、メチルブチルアルデヒド還元酵素、亜鉛型アルコール脱水素酵素、Ｌ−トレオニン−３−脱水素酵素またはホモセリン還元酵素といったβ−ヒドロキシ酸脱水素酵素に構造的および機構的に関連する酵素である、［１］から［１０］の何れか１に記載の方法。
［１２］
前記ＤＨＢ脱水素酵素が、酵素の少なくとも１つの変異によって得られ、前記変異が、リンゴ酸−４−セミアルデヒドへの変異酵素の活性および／または基質親和性を改善する、［１１］に記載の方法。
［１３］
前記変異酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｓ４０、Ｎ４３、Ｈ３９、Ｔ４９、Ｆ８５、Ｑ１０８、Ｌ２８１および／またはＮ３０５の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含むコハク酸セミアルデヒド還元酵素であり、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、［１２］に記載の方法。
［１４］
配列番号７４、配列番号７６または配列番号８１、配列番号２２５または配列番号２２７によって表される、［１１］から［１３］に記載の方法。
［１５］
リンゴ酸を４−ホスホ−リンゴ酸に変換することを特徴とする、リンゴ酸キナーゼ。
［１６］
酵素の少なくとも１つの変異によって得ることができ、前記変異が、リンゴ酸への前記変異ポリペプチドの活性および／または基質親和性を改善する、［１５］に記載のリンゴ酸キナーゼ。
［１７］
前記酵素が、アスパラギン酸キナーゼである、［１６］に記載のリンゴ酸キナーゼ。
［１８］
前記変異アスパラギン酸キナーゼが、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｓ３９、Ｔ４５、Ｖ１１５、Ｅ１１９、Ｆ１５４および／またはＳ２０１の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含み、前記位置の天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、［１７］に記載のリンゴ酸キナーゼ。
［１９］
配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６によって表される、［８８］に記載のリンゴ酸キナーゼ。
［２０］
リシン阻害に対して非感受性であり、以下のアミノ酸：Ｅ２５０、Ｍ３１８、Ｓ３２１、Ｖ３３９、Ｓ３３８、Ｆ３２４、Ｌ３２５、Ｖ３３９、Ｓ３４５、Ｅ３４６、Ｄ３４０、Ｔ３４４および／またはＴ３５２に、少なくとも１つの変異をさらに含み、前記アミノ酸のそれぞれが、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、［１８］または［１９］に記載のリンゴ酸キナーゼ。
［２１］
配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５によって表される、［２０］に記載のリンゴ酸キナーゼ。
［２２］
４−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−４−セミアルデヒドに変換することを特徴とする、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
［２３］
酵素の少なくとも１つの変異によって得ることができ、前記変異が、４−ホスホ−リンゴ酸への変異酵素の活性および／または基質親和性を改善する、［２２］に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
［２４］
前記酵素が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、［２２］または［２３］に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
［２５］
前記変異アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｔ１３６、Ｑ１６２、Ｉ２３０、Ｅ２４１および／またはＨ２７４の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含み、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、［２４］に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
［２６］
配列番号６８、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号２３１によって表される、［２４］に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
［２７］
リンゴ酸−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換することを特徴とする、ＤＨＢ脱水素酵素。
［２８］
β−ヒドロキシ−脱水素酵素またはホモセリン脱水素酵素に構造的および機構的に関連する酵素である、［２７］に記載のＤＨＢ脱水素酵素。
［２９］
酵素の少なくとも１つの変異によって得られ、前記変異が、リンゴ酸−４−セミアルデヒドへの変異酵素の活性および／または基質親和性を改善する、［２７］または［２８］に記載のＤＨＢ脱水素酵素。
［３０］
前記変異酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｓ４０、Ｎ４３、Ｈ３９、Ｔ４９、Ｆ８５、Ｑ１０８、Ｌ２８１および／またはＮ３０５の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含むコハク酸セミアルデヒド還元酵素であり、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、［２９］に記載のＤＨＢ脱水素酵素。
［３１］
配列番号８１、配列番号２２５または配列番号２２７によって表される、［３０］に記載のＤＨＢ脱水素酵素。
［３２］
［１５］から［２１］の何れか１に記載のリンゴ酸キナーゼをコードする、単離された核酸配列。
［３３］
配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２または配列番号４４によって表される、［３２］に記載の単離された核酸。
［３４］
［１２］から［１６］の何れか１に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする、単離された核酸配列。
［３５］
配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、または配列番号２３０によって表される、［３４］に記載の単離された核酸。
［３６］
［２７］から［３１］の何れか１に記載のＤＨＢ脱水素酵素をコードする、単離された核酸配列。
［３７］
配列番号８２、配列番号２２４、配列番号２２６または配列番号２２８によって表される、［３６］に記載の単離された核酸。
［３８］
転写の方向に、機能的に連結した、宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、［２２］から［２７］の何れか１に記載の少なくとも１つの核酸配列および前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列を少なくとも含む、キメラ遺伝子。
［３９］
転写の方向に、機能的に連結した、
宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、
［２２］または［２３］に記載の核酸配列、
［２４］または［２５］に記載の核酸配列、
［２６］もしくは［２７］に記載の、または配列番号７３もしくは配列番号７５もしくは配列番号８２によって表される核酸配列、および
前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列
を含む、［３８］に記載のキメラ遺伝子。
［４０］
配列番号２２９によって表される、［３９］に記載のキメラ遺伝子。
［４１］
［３２］から［３７］のいずれか１に記載の核酸または［３８］から［４０］に記載のキメラ遺伝子を含む、発現ベクター。
［４２］
リンゴ酸キナーゼ、および／またはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素および／またはＤＨＢ脱水素酵素を発現する、宿主微生物。
［４３］
［３２］から［３７］に記載の核酸の少なくとも１つで、［３８］または［３９］に記載のキメラ遺伝子の少なくとも１つで、および／または［３１］に記載の発現ベクターの少なくとも１つで形質転換された、［４２］に記載の宿主微生物。
［４４］
細菌、酵母または真菌である、［４２］または［４３］に記載の宿主微生物。
［４５］
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓの中からより詳細には選択される、［４４］に記載の宿主微生物。
［４６］
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであり、表１２において一覧表にした遺伝子の少なくとも１つにおける破壊をさらに含むおよび／または表１４において一覧表にした遺伝子の少なくとも１つを過剰発現する、［４５］に記載の宿主生物。
［４７］
リンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素およびＤＨＢ脱水素酵素を発現する［４２］から［４６］の何れか１に記載の宿主微生物を培養するステップを含む、２，４−ＤＨＢの生成の方法。
［４８］
前記宿主生物が、リンゴ酸または別の有機酸、例えばピルビン酸、サクシネートまたはフマル酸が加えられた培地において培養される、［４７］に記載の２，４−ＤＨＢの生成の方法。
［４９］
前記培養培地が、別の炭素源をさらに含む、［４８］に記載の方法。
［５０］
リンゴ酸を過剰生成する微生物による、リンゴ酸または他の有機酸の生成である第１のステップを含む、２，４ ＤＨＢの生成の方法。
［５１］
リンゴ酸−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換するための、メチルブチルアルデヒド還元酵素またはコハク酸セミアルデヒド還元酵素の使用。
［５２］
前記メチルブチルアルデヒド還元酵素が、配列番号７４によって表される、［５１］に記載の使用。
［５３］
コハク酸セミアルデヒド還元酵素が、配列番号７６、配列番号８１または配列番号；２２５もしくは配列番号２２７によって表される、［５１］に記載の使用。
［５４］
リンゴ酸を４−ホスホ−リンゴ酸に変換するための、［１５］から［２１］の何れか１に記載のリンゴ酸キナーゼの使用。
［５５］
４−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−４−セミアルデヒドに変換するための、［２２］から［２６］の何れか１に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素の使用。
［５６］
４−ホスホ−リンゴ酸。

Claims (56)

1. ２，４−ジヒドロキシ酪酸（２，４−ＤＨＢ）を生成する方法であって、
   リンゴ酸キナーゼを使用して、リンゴ酸を４−ホスホ−リンゴ酸に変換する第１のステップ、
   リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素を使用して、４−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−４−セミアルデヒドに変換する第２のステップ、
   ＤＨＢ脱水素酵素を使用して、リンゴ酸−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換する第３のステップ
   を含む方法。
2. 前記リンゴ酸キナーゼが、酵素の少なくとも１つの変異によって得ることができ、前記変異が、リンゴ酸への前記変異ポリペプチドの活性および／または基質親和性を改善する、請求項１に記載の方法。
3. 前記リンゴ酸キナーゼが、アスパラギン酸キナーゼである、請求項２に記載の方法。
4. 前記変異アスパラギン酸キナーゼが、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｓ３９、Ｔ４５、Ｖ１１５、Ｅ１１９、Ｆ１５４および／またはＳ２０１の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含み、前記位置の天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項３に記載の方法。
5. 前記変異アスパラギン酸キナーゼが、以下のアミノ酸：Ｅ２５０、Ｍ３１８、Ｓ３２１、Ｖ３３９、Ｓ３３８、Ｆ３２４、Ｌ３２５、Ｖ３３９、Ｓ３４５、Ｅ３４６、Ｄ３４０、Ｔ３４４および／またはＴ３５２に、少なくとも１つの変異を含み、前記アミノ酸のそれぞれが、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項４に記載の方法。
6. 前記リンゴ酸キナーゼが、配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５によって表される、請求項１から５の何れか１項に記載の方法。
7. 前記リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素が、酵素の少なくとも１つの変異によって得ることができ、前記変異が、４−ホスホ−リンゴ酸への変異酵素の活性および／または基質親和性を改善する、請求項１から６の何れか１項に記載の方法。
8. 前記酵素が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項７に記載の方法。
9. 前記変異アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｔ１３６、Ｑ１６２、Ｉ２３０、Ｅ２４１および／またはＨ２７４の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含み、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項８に記載の方法。
10. 配列番号６８、より明確には配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４もしくは配列番号６６または配列番号２３１によって表される、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＤＨＢ脱水素酵素が、タルトロン酸セミアルデヒド還元酵素、コハク酸セミアルデヒド還元酵素、マロン酸セミアルデヒド還元酵素、メチルブチルアルデヒド還元酵素、亜鉛型アルコール脱水素酵素、Ｌ−トレオニン−３−脱水素酵素またはホモセリン還元酵素といったβ−ヒドロキシ酸脱水素酵素に構造的および機構的に関連する酵素である、請求項１から１０の何れか１項に記載の方法。
12. 前記ＤＨＢ脱水素酵素が、酵素の少なくとも１つの変異によって得られ、前記変異が、リンゴ酸−４−セミアルデヒドへの変異酵素の活性および／または基質親和性を改善する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記変異酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｓ４０、Ｎ４３、Ｈ３９、Ｔ４９、Ｆ８５、Ｑ１０８、Ｌ２８１および／またはＮ３０５の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含むコハク酸セミアルデヒド還元酵素であり、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項１２に記載の方法。
14. 配列番号７４、配列番号７６または配列番号８１、配列番号２２５または配列番号２２７によって表される、請求項１１から１３に記載の方法。
15. リンゴ酸を４−ホスホ−リンゴ酸に変換することを特徴とする、リンゴ酸キナーゼ。
16. 酵素の少なくとも１つの変異によって得ることができ、前記変異が、リンゴ酸への前記変異ポリペプチドの活性および／または基質親和性を改善する、請求項１５に記載のリンゴ酸キナーゼ。
17. 前記酵素が、アスパラギン酸キナーゼである、請求項１６に記載のリンゴ酸キナーゼ。
18. 前記変異アスパラギン酸キナーゼが、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｓ３９、Ｔ４５、Ｖ１１５、Ｅ１１９、Ｆ１５４および／またはＳ２０１の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含み、前記位置の天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項１７に記載のリンゴ酸キナーゼ。
19. 配列番号９、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６によって表される、請求項８８に記載のリンゴ酸キナーゼ。
20. リシン阻害に対して非感受性であり、以下のアミノ酸：Ｅ２５０、Ｍ３１８、Ｓ３２１、Ｖ３３９、Ｓ３３８、Ｆ３２４、Ｌ３２５、Ｖ３３９、Ｓ３４５、Ｅ３４６、Ｄ３４０、Ｔ３４４および／またはＴ３５２に、少なくとも１つの変異をさらに含み、前記アミノ酸のそれぞれが、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項１８または１９に記載のリンゴ酸キナーゼ。
21. 配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３または配列番号４５によって表される、請求項２０に記載のリンゴ酸キナーゼ。
22. ４−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−４−セミアルデヒドに変換することを特徴とする、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
23. 酵素の少なくとも１つの変異によって得ることができ、前記変異が、４−ホスホ−リンゴ酸への変異酵素の活性および／または基質親和性を改善する、請求項２２に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
24. 前記酵素が、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素である、請求項２２または２３に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
25. 前記変異アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｔ１３６、Ｑ１６２、Ｉ２３０、Ｅ２４１および／またはＨ２７４の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含み、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項２４に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
26. 配列番号６８、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６４、配列番号６６または配列番号２３１によって表される、請求項２４に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素。
27. リンゴ酸−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換することを特徴とする、ＤＨＢ脱水素酵素。
28. β−ヒドロキシ−脱水素酵素またはホモセリン脱水素酵素に構造的および機構的に関連する酵素である、請求項２７に記載のＤＨＢ脱水素酵素。
29. 酵素の少なくとも１つの変異によって得られ、前記変異が、リンゴ酸−４−セミアルデヒドへの変異酵素の活性および／または基質親和性を改善する、請求項２７または２８に記載のＤＨＢ脱水素酵素。
30. 前記変異酵素が、野生型酵素と比較した場合、以下の位置：Ｓ４０、Ｎ４３、Ｈ３９、Ｔ４９、Ｆ８５、Ｑ１０８、Ｌ２８１および／またはＮ３０５の１つにおいて、少なくとも１つの変異を含むコハク酸セミアルデヒド還元酵素であり、前記位置における天然のアミノ酸が、他の１９種の自然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれかによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって、置き換えられている、請求項２９に記載のＤＨＢ脱水素酵素。
31. 配列番号８１、配列番号２２５または配列番号２２７によって表される、請求項３０に記載のＤＨＢ脱水素酵素。
32. 請求項１５から２１の何れか１項に記載のリンゴ酸キナーゼをコードする、単離された核酸配列。
33. 配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２または配列番号４４によって表される、請求項３２に記載の単離された核酸。
34. 請求項１２から１６の何れか１項に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする、単離された核酸配列。
35. 配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５、配列番号６７、または配列番号２３０によって表される、請求項３４に記載の単離された核酸。
36. 請求項２７から３１の何れか１項に記載のＤＨＢ脱水素酵素をコードする、単離された核酸配列。
37. 配列番号８２、配列番号２２４、配列番号２２６または配列番号２２８によって表される、請求項３６に記載の単離された核酸。
38. 転写の方向に、機能的に連結した、宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、請求項２２から２７の何れか１項に記載の少なくとも１つの核酸配列および前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列を少なくとも含む、キメラ遺伝子。
39. 転写の方向に、機能的に連結した、
    宿主生物において機能的であるプロモーター制御配列、
    請求項２２または２３に記載の核酸配列、
    請求項２４または２５に記載の核酸配列、
    請求項２６もしくは２７に記載の、または配列番号７３もしくは配列番号７５もしくは配列番号８２によって表される核酸配列、および
    前記宿主生物において機能的であるターミネーター制御配列
    を含む、請求項３８に記載のキメラ遺伝子。
40. 配列番号２２９によって表される、請求項３９に記載のキメラ遺伝子。
41. 請求項３２から３７のいずれか１項に記載の核酸または請求項３８から４０に記載のキメラ遺伝子を含む、発現ベクター。
42. リンゴ酸キナーゼ、および／またはリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素および／またはＤＨＢ脱水素酵素を発現する、宿主微生物。
43. 請求項３２から３７に記載の核酸の少なくとも１つで、請求項３８または３９に記載のキメラ遺伝子の少なくとも１つで、および／または請求項３１に記載の発現ベクターの少なくとも１つで形質転換された、請求項４２に記載の宿主微生物。
44. 細菌、酵母または真菌である、請求項４２または４３に記載の宿主微生物。
45. Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｌａｖｕｓの中からより詳細には選択される、請求項４４に記載の宿主微生物。
46. Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉであり、表１２において一覧表にした遺伝子の少なくとも１つにおける破壊をさらに含むおよび／または表１４において一覧表にした遺伝子の少なくとも１つを過剰発現する、請求項４５に記載の宿主生物。
47. リンゴ酸キナーゼ、リンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素およびＤＨＢ脱水素酵素を発現する請求項４２から４６の何れか１項に記載の宿主微生物を培養するステップを含む、２，４−ＤＨＢの生成の方法。
48. 前記宿主生物が、リンゴ酸または別の有機酸、例えばピルビン酸、サクシネートまたはフマル酸が加えられた培地において培養される、請求項４７に記載の２，４−ＤＨＢの生成の方法。
49. 前記培養培地が、別の炭素源をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
50. リンゴ酸を過剰生成する微生物による、リンゴ酸または他の有機酸の生成である第１のステップを含む、２，４ ＤＨＢの生成の方法。
51. リンゴ酸−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換するための、メチルブチルアルデヒド還元酵素またはコハク酸セミアルデヒド還元酵素の使用。
52. 前記メチルブチルアルデヒド還元酵素が、配列番号７４によって表される、請求項５１に記載の使用。
53. コハク酸セミアルデヒド還元酵素が、配列番号７６、配列番号８１または配列番号；２２５もしくは配列番号２２７によって表される、請求項５１に記載の使用。
54. リンゴ酸を４−ホスホ−リンゴ酸に変換するための、請求項１５から２１の何れか１項に記載のリンゴ酸キナーゼの使用。
55. ４−ホスホ−リンゴ酸をリンゴ酸−４−セミアルデヒドに変換するための、請求項２２から２６の何れか１項に記載のリンゴ酸セミアルデヒド脱水素酵素の使用。
56. ４−ホスホ−リンゴ酸。

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