BR112013010268B1 - Método de produção de ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-dhb), malato quinase e seu uso, malato semialdeído desidrogenase e seu uso, dhb desidrogenase, sequência de ácido nucleico isolado, gene quimérico, vetor de expressão, microorganismo hospedeiro, processo de produção de 2,4-dhb, uso de uma metilbutiraldeído redutase ou de uma semialdeído succínico redutase - Google Patents

Método de produção de ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-dhb), malato quinase e seu uso, malato semialdeído desidrogenase e seu uso, dhb desidrogenase, sequência de ácido nucleico isolado, gene quimérico, vetor de expressão, microorganismo hospedeiro, processo de produção de 2,4-dhb, uso de uma metilbutiraldeído redutase ou de uma semialdeído succínico redutase Download PDF

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Abstract

método de produção de ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-dhb), malato quinase, malato semialdeído desidrogenase, dhb desidrogenase, sequência de ácido nucleico isolado, gene quimérico, vetor de expressão, microorganismo hospedeiro, uso de uma metilbutiraldeído redutase ou de uma semialdeído succínico redutase, uso de uma malato quinase e uso de malato semialdeído desidrogenase. a presente invenção trata de um método de produção de ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-dhb) através de uma via sintética compreendendo a transformação de malato em 4-fosfo-malato usando uma malato quinase, referido 4-fosfo-malato sendo transformado em malato-4-semialdeído usando uma malato semialdeído desidrogenase e referido malato-4-semialdeído sendo transformado em 2,4-dhb usando uma dhb desidrogenase.

Description

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE ÁCIDO 2,4-DIHIDROXIBUTÍRICO (2,4-DHB), MALATO QUINASE E SEU USO, MALATO SEMIALDEÍDO DESIDROGENASE E SEU USO, DHB DESIDROGENASE, SEQUÊNCIA DE ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, GENE QUIMÉRICO, VETOR DE EXPRESSÃO, MICROORGANISMO HOSPEDEIRO, PROCESSO DE PRODUÇÃO DE 2,4-DHB, USO DE UMA METILBUTIRALDEÍDO REDUTASE OU DE UMA SEMIALDEÍDO SUCCÍNICO REDUTASE
[001] A presente invenção refere-se a um novo método de produção de ácido 2,4-dihidroxibutírico a partir de malato através da implementação de uma via sintética que compreende enzimas tendo malato quinase, malato semialdeído desidrogenase, e atividade 2,4-dihidroxibutirato desidrogenase, respectivamente.
[002] Os ácidos carboxílicos citados dentro do presente pedido são igualmente nomeados sob seus sais (por exemplo, 2,4-dihidroxibutirato) ou formas ácidas (por exemplo, ácido 2,4-dihidroxibutírico).
[003] Ácido 2,4-dihidroxibutírico (igualmente 2,4-DHB ou DHB) é um composto de interesse econômico considerável. DHB pode ser facilmente convertido em α-hidroxi-Y-butirolactona em meios aquosos através de ajuste do pH apropriado. α-hidroxi-Y-butirolactona é um precursor proeminente para a produção do substituto de metionina 2-hidroxi-4-(metiltio)-butirato (HMTB) (Deck et al., 2008) que tem um amplo mercado em nutrição animal. Presentemente, α-hidroxi-Y-butirolactona é derivada de γ-butirolactona através de um processo de estágios múltiplos que implica halogenação da γ-butirolactona em posição α, e substituição subsequente do átomo de halogênio por um grupo hidroxil em meio alcalino (Deck et al., 2008).
[004] A partir de crescentes preços do petróleo, a necessidade da produção de DHB a partir de recursos renováveis surge. Micro-organismos são capazes de transformar matéria-prima derivado de biomassa, por exemplo, açúcares ou ácidos orgânicos, em uma ampla variedade de diferentes compostos químicos (Werpy & Petersen, 2004). Com o crescente corpo de informação bioquímica e genômica, é possível modificar micro-organismos de modo que eles superproduzam intermediários metabólicos que ocorrem naturalmente com alto rendimento e produtividade (Bailey, 1991). Otimização de micro-organismos de produção geralmente requer engenharia racional de redes metabólicas que assegura, entre outros, superexpressão de enzimas necessárias para a biossíntese do metabólito de interesse, e alívio da inibição de retroalimentação do produto. Outra possibilidade é a implementação de novos sistemas enzimáticos que catalisam a produção de um metabólito de interesse.
[005] Abordagens de engenharia metabólica e catálise enzimática requerem conhecimento detalhado na bioquímica e regulação da via metabólica que leva ao metabólito de interesse. No caso de Produção de DHB, esta informação não está disponível. Apenas alguns estudos relatam a ocorrência de DHB em pacientes com deficiência de semialdeído succínico desidrogenase (Shinka et al., 2002) sem, entretanto, identificar reações enzimáticas implicadas em produção de DHB. A produção zimótica ou enzimática de DHB, portanto, requer (i) a identificação de uma via viável termodinamicamente que transforme um precursor acessível em DHB, (ii) a identificação ou construção de enzimas que são capazes de catalisar etapas de reação individual na via e (iii) a expressão funcional das enzimas da via em um organismo de produção apropriado.
[006] A presente invenção tem como um objetivo satisfazer estas necessidades.
[007] De acordo, um objetivo da presente invenção é um método de produção de 2,4-DHB compreendendo uma primeira etapa de transformar malato em 4-fosfo-malato usando uma malato quinase, uma segunda etapa de transformar 4-fosfo-malato em malato-4-semialdeído usando uma malato semialdeído desidrogenase, uma terceira etapa de transformar malato-4-semialdeído em 2,4-DHB usando uma DHB desidrogenase.
[008] Na primeira reação (vide Figura 1 (i)), malato (1) é convertido em 4-fosfo-malato (2) pela ação de uma enzima que possui atividade malato quinase (A). Na segunda reação (B), 4-fosfo-malato é convertido em malato-4-semialdeído (3) pela ação de uma enzima que possui atividade malato semialdeído desidrogenase. Mais precisamente, reação (B) é catalisada por uma enzima suportando desfosforilação de atividade 4-fosfo-malato redutase no sentido biossintético da via. Na terceira reação (C), malato-4-semialdeído é convertido em DHB (4) pela ação de uma enzima que possui atividade DNB desidrogenase. Mais precisamente, reação (C) é catalisada por uma enzima suportando atividade malato-4-semialdeído redutase no sentido biossintético da via.
[009] Nenhuma das enzimas citadas acima e produtos intermediários foram até agora descritos nem identificados em células vivas. Como tal malato quinase, malato semialdeído desidrogenase, DHB desidrogenase e 4-fosfo-malato são objetos adicionais da invenção.
[0010] Dentro de outro aspecto da invenção, a primeira etapa do método de produção de 2,4-DHB envolve uma malato quinase que é caracterizada pelo fato de que transforma malato em 4-fosfo-malato. Referida enzima é obtenível por pelo menos uma mutação de uma enzima, referida(s) mutação(ões) melhorando a afinidade de substrato e/ou atividade da enzima mutada para malato.
[0011] Dentro da presente invenção, a expressão "melhora a afinidade de substrato e/ou atividade" significa que a enzima antes da mutação, era
  • - incapaz de usar o substrato (malato, 4-fosfo-malato ou malato-4-semialdeído), e/ou
  • - sintetizou o produto da reação (4-fosfo-malato ou malato-4-semialdeído ou DHB) a uma taxa específica máxima pelo menos três vezes inferior, e/ou
  • - tinha uma afinidade para malato, 4-fosfo-malato ou malato-4-semialdeído que era pelo menos três vezes inferior, e/ou
  • - tinha uma afinidade para o substrato natural (aspartato, 4-fosfo-asparto, aspartato-4-semialdeído) que era pelo menos 3 vezes superior.
[0012] Dentro de outro de seus aspectos, a invenção trata do uso de uma malato quinase para transformar malato em 4-fosfo-malato.
[0013] A atividade malato quinase pode ser medida pelo teste enzimático descrito no exemplo 1 (vide "Ensaio enzimático").
[0014] De acordo com outro aspecto da invenção, a malato quinase pode ser obtida através de mutação de uma aspartato quinase.
[0015] Figura 2 mostra o alinhamento de sequências de aminoácido de aspartato quinases de diferentes origens biológicas. Todas as referências à posição de aminoácidos são feitas com base na sequência de aminoácido de aspartato quinase codificada pelo gene LysC de E. coli (representado por SEQ ID N° 4). As posições relativas de regiões conservadas correspondentes nas outras aspartato quinases de diferentes organismos pode facilmente ser encontradas pela pessoa versada na técnica através de simples alinhamento de sequência, conforme representado na Figura 2 com enzimas listadas abaixo:
  • - AKIII — aspartato quinase III de E. coli (SEQ ID N° 4),
  • - AKI (SEQ ID N° 87) aspartato quinase I de E. coli„
  • - AKII (SEQ ID N° 88)- aspartato quinase II de E. coli,
  • - MJ — Methanococcus jannaschii (SEQ ID N° 89),
  • - TT - Thermus thermophilus (SEQ ID N° 90),
  • - CG — Corynebacterium glutamicum (SEQ ID N° 91),
  • - AT — Arabidopsis thaliana (SEQ ID N° 92),
  • - SC — Saccharomyces cerevisiae. (SEQ ID N° 93).
[0016] Referido alinhamento pode ser feito com o software ClustalW2. Por exemplo, o resíduo E119 da aspartato quinase representada por SEQ ID N° 4 corresponde ao resíduo E207 da aspartato quinase de A. thaliana (SEQ ID N° 50) ou ao resíduo E147 da aspartato quinase de S. cerevisiae (SEQ ID N° 51).
[0017] A aspartato quinase mutada de acordo com a invenção compreende pelo menos uma mutação, quando comparada com o tipo selvagem da enzima, em pelo menos uma das seguintes posições: 539, T45, V115, E119, F184 e/ou 5201, em que o aminoácido que ocorre naturalmente em referidas posições é substituído por qualquer um dentre os outros 19 aminoácidos proteinogênicos de ocorrência natural, ou seja, por alanina, arginina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina.
[0018] Em um exemplo não exclusivo, a construção de uma malato quinase através de Mutagênese sítio dirigida é demonstrada usando a aspartato quinase Lys C de Escherichia coli como o modelo. De acordo com um aspecto da invenção, a especificidade de substrato de LysC foi mudada em direção ao malato através de substituição do ácido glutâmico em posição 119 por asparagina, glutamina, cisteína, prolina, serina, treonina, valina ou glicina.
[0019] Dentro de um aspecto adicional da invenção, a malato quinase é representada por SEQ ID N° 9, e mais especificamente por SEQ ID N°12, SEQ ID 30 N°14, SEQ ID N°16, SEQ ID N°18, SEQ ID N°20, SEQ ID N°22, SEQ ID N°24 ou SEQ ID N°26.
[0020] Aspartato quinases são tipicamente inibidos por metionina, treonina ou lisina. Portanto, malato quinases que foram construídas aleatoriamente ou Mutagênese sítio dirigida de aspartato quinases também podem ser inibidos por referidos aminoácidos. Em um aspecto adicional da invenção, a inibição de malato quinase através de metionina, lisina ou treonina é aliviada por mutagênese da malato quinase.
[0021] Em um aspecto específico da invenção, a LysC mutada (malato quinase) descrita acima é tornada insensível à inibição de lisina através de mutação de pelo menos um dos seguintes aminoácidos E250, M318, S321, V339, S338, F324, L325, V339, S345, E346, D340, T344 e/ou T352 (vide exemplo 3).
[0022] A presente invenção também engloba tais enzimas modificadas e mais particularmente aquelas representadas por SEQ ID N° 39, SEQ ID N°41, 10 SEQ ID N°43 ou SEQ ID N°45.
[0023] Dentro de um aspecto ainda adicional, a segunda etapa do método de produção 2,4-DHB de acordo com a invenção envolve uma malato semialdeído desidrogenase caracterizada pelo fato de que transforma 4-fosfo-malato em malato-4-semialdeído, referida enzima suportando uma atividade de desfosforilação 4-fosfo-malato redutase no sentido biossintético da via.
[0024] A atividade malato semialdeído desidrogenase pode ser medida pelo teste enzimático descrito no exemplo 4 (vide "Ensaio enzimático").
[0025] Esta enzima é obtenível por pelo menos uma mutação de uma enzima, referida(s) mutação(ões) melhorando a afinidade de substrato e/ou atividade da enzima mutada para 4-fosfo-malato.
[0026] De acordo com outro aspecto, a malato semialdeído desidrogenase da invenção pode ser obtida por mutação de uma enzima tendo relatado atividade semialdeído desidrogenase, mais especificamente tendo atividade de desfosforilação no sentido redutivo da reação, mais especificamente agindo sobre moléculas orgânicas que consistem de 3, 4, ou 5 moléculas de carbono. Em um aspecto específico da invenção referida malato semialdeído desidrogenase é obtida por mutação de uma aspartato semialdeído desidrogenase.
[0027] A aspartato semialdeído desidrogenase, Asd de E. coli e Hom2 de Saccharomyces cerevisiae naturalmente exibem atividade desidrogenase sobre 4-fosfo-malato 2.
[0028] De acordo com outro aspecto da invenção, a malato semialdeído desidrogenase pode ser melhorada pela mutação de aspartato semialdeído desidrogenase.
[0029] Figura 3 mostra o alinhamento de sequências de aminoácido de aspartato semialdeído desidrogenases de diferente origem biológica. Todas as referências a aminoácidos são feitas com base na aspartato semialdeído desidrogenase codificada pelo Gene Asd de E. coli (as representado por SEQ ID N° 20). As posições relativas de regiões conservadas correspondentes nas outras aspartato semialdeído desidrogenases de diferentes organismos pode ser facilmente encontrada pela pessoa versada na técnica através de simples alinhamento de sequência conforme representado na Figura 4 com enzimas listadas abaixo:
  • - EC — E. coli (SEQ ID N° 49),
  • - MJ — Methanococcus jannaschil (SEQ ID N° 94),
  • - TT - Thermus thermophilus (SEQ ID N° 95),
  • - BS — Bacillus subtilis (SEQ ID N° 96),
  • - CG Corynebacterium glutamicum (SEQ ID N° 97),
  • - AT — Arabidopsis thaliana (SEQ ID N° 98),
  • - SC — Saccharomyces cerevisiae. (SEQ ID N° 99)
[0030] Referido alinhamento pode ser facilmente feito usando o software ClustalW2.
[0031] A construção de enzimas tendo atividade malato semialdeído desidrogenase melhorada pode ser feita conforme segue.
[0032] A malato semialdeído desidrogenase de acordo com a invenção corresponde em um aspecto específico a uma aspartato semialdeído desidrogenase compreendendo pelo menos uma mutação quando comparada com o tipo selvagem da enzima em pelo menos uma das posições T136, Q162, 1230, E241 e/ou H274 em que o aminoácido que ocorre naturalmente em referidas posições é substituído por qualquer um dentre os outros 19 aminoácidos proteinogênicos de ocorrência natural, ou seja, por alanina, arginina, asparagina, cisteína, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina.
[0033] Conforme demonstrado no exemplo 5, Mutagênese sítio dirigida de Asd a partir de E. coli pode melhorar atividade e afinidade de substrato da enzima mutada para 4-fosfo-malato, ao mesmo tempo diminuindo a preferência da enzima por seu substrato natural 4-fosfo-aspartato.
[0034] A fim de melhorar a atividade de Asd sobre 4-fosfo-malato, e de acordo com um aspecto da invenção, E241 foi substituído por um resíduo de glutamina, alanina, cisteína, glicina, histidina, isoleucina ou metionina através de Mutagênese sítio dirigida (Exemplo 5).
[0035] Dentro de um aspecto adicional da invenção, a malato semialdeído desidrogenase é representada por SEQ ID N° 68 e mais especificamente por SEQ ID N°54, SEQ ID N°56, SEQ ID N°58, SEQ ID N°60, SEQ ID N°62, SEQ ID N°64 ou SEQ ID N°66.
[0036] Dentro de outro de seu aspecto, a invenção trata do uso de uma malato semialdeído desidrogenase para transformar 4-fosfo-malato em malato-4-semialdeído.
[0037] Dentro de outro aspecto, a terceira etapa do método de produção 2,4-DHB de acordo com a invenção envolve uma DHB desidrogenase caracterizada pelo fato de que transforma malato-4-semialdeído em 2,4-DHB, referida enzima suportando atividade malato-4-semialdeído redutase no sentido biossintético da via.
[0038] Enzimas DHB desidrogenase candidatas que potencialmente já possuem atividade DHB desidrogenase podem ser escolhidas dentre a classe de beta-hidroxiácido desidrogenases que agem sobre compostos C3, C4, ou C5.
[0039] De acordo com um aspecto ainda adicional da invenção, referidas Enzimas DHB desidrogenase podem ser estruturalmente e mecanicamente relacionadas a 13-hidroxiácido desidrogenases tais como tartronato semialdeído redutases, succinato semialdeído redutases, malonato semialdeído redutases, metilbutiraldeído redutases, álcool tipo zinco desidrogenases, L-treonina-3-desidrogenases, ou homoserina redutases.
[0040] A presente invenção também trata do uso da metilbutiraldeído redutase ou da semialdeído succínico redutase para transformar malato-4-semialdeído em 2,4-DHB. Em modalidades específicas, referida metilbutiraldeído redutase é representada por SEQ ID N° 74 e referida semialdeído succínico redutase é representada por SEQ ID N° 76. A atividade DHB desidrogenase pode ser medida pelo teste enzimático descrito no exemplo 6 (vide "Ensaio enzimático").
[0041] A afinidade de DHB desidrogenase para malato-4-semi aldeído pode ser aumentada por pelo menos uma mutação de uma enzima, referida(s) mutação(ões) aumentando a afinidade de substrato e/ou atividade da enzima mutada para malato-4-semialdeído, e/ou reduzindo a atividade ou afinidade para seu substrato natural por pelo menos fator 2.
[0042] A DHB desidrogenase de acordo com a invenção corresponde em um aspecto específico a M. sedula semialdeído succínico redutase (SEQ ID No76) compreendendo pelo menos uma mutação quando comparada com o tipo selvagem da enzima em pelo menos uma das posições 540, N43, H39 T49, F85, Q108, L281 e N305 em que o aminoácido que ocorre naturalmente em referidas posições é substituído por qualquer um dentre os outros 19 aminoácidos proteinogênicos de ocorrência natural, ou seja, por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, pralina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina.
[0043] Conforme demonstrado em um exemplo não exclusivo, a afinidade de M sedula semialdeído succínico redutase para (L)-malato-4-semialdeído foi aumentada através de introdução da dupla mutação H39R N43H por Mutagênese sítio dirigida, conforme representado por SEQ ID N° 81. Mutantes simples H39R (SEQ ID N° 225) e N43H (SEQ ID N° 227) são também englobados pela presente invenção (Exemplo 7).
[0044] DHB desidrogenase pode ser usada para transformar malato-4-semialdeído em 2,4-DHB, que constitui um aspecto adicional da invenção.
[0045] A sequência de ácido nucleico de genes pode ser adaptada à utilização de códons do organismo hospedeiro assim aumentando a produção das proteínas expressas heterogeneamente. Isto constitui um aspecto adicional da invenção.
[0046] A síntese de uma codificação de gene sintético para M. sedula semialdeído succínico redutase H39R N43H cuja sequência de nucleotídeo foi otimizada para a expressão de referida enzima em E. coli conforme representado por SEQ ID N°228 é um aspecto adicional da invenção.
[0047] Em um aspecto ainda adicional, a presente invenção também trata de ácidos nucleicos, e mais particularmente com sequência de ácidos nucleicos isolada codificando uma 10 malato quinase conforme descrito acima.
[0048] Em outro aspecto, referido ácido nucleico é representado por SEQ ID N° 13, SEQ ID N°15, SEQ ID N°17, SEQ ID N°19, SEQ ID N°21, SEQ ID N°23, SEQ ID N°25, SEQ ID N°27, SEQ ID N°38, SEQ ID N°40, SEQ ID N°42 ou SEQ ID N°44.
[0049] Em um aspecto ainda adicional, a presente invenção também trata de sequência de ácidos nucleicos isolada codificando uma malato semialdeído desidrogenase conforme descrito acima.
[0050] Mais especificamente, referido ácido nucleico é preferencialmente representado por SEQ ID N° 55, SEQ ID N°57, SEQ ID N°59, SEQ ID N°61, SEQ ID N°63, SEQ ID N°65 ou SEQ ID N°67.
[0051] Em um aspecto ainda adicional, a presente invenção também trata de sequência de ácidos nucleicos isolada codificando uma DHB desidrogenase conforme descrito acima.
[0052] Em outro aspecto, referido ácido nucleico é representado por SEQ ID N° ou SEQ ID N° 75, SEQ ID N° 224, SEQ ID N° 226 ou SEQ ID N°82.
[0053] De acordo com esta invenção, a "sequência de ácido nucleico” refere-se à molécula de DNA ou RNA em forma de cadeia simples ou dupla, preferencialmente uma molécula de DNA. Um "DNA isolado", conforme usado aqui, refere-se a DNA que não ocorre naturalmente ou não mais no ambiente natural em que foi originalmente presente, por exemplo, uma sequência de codificação de a DNA associada com outros elementos regulatórios em um gene quimérico, um DNA transferido para outra célula hospedeira, ou uma sequência de DNA feita sinteticamente tendo uma diferente sequência de nucleotídeo de nucleotídeo comparada com qualquer sequência de DNA que ocorre naturalmente.
[0054] A presente invenção também se refere a um gene quimérico compreendendo, funcionalmente ligado um ao outro, pelo menos um promotor que é funcional em um organismo hospedeiro, um polinucleotídeo codificando quaisquer da malato quinase, malato semialdeído desidrogenase ou DHB desidrogenase de acordo com a invenção, e um elemento terminador que é funcional no mesmo organismo hospedeiro. Os vários elementos que um gene quimérico pode conter são, primeiramente, elementos reguladores de transcrição, translação e maturação de proteínas, tais como um promotor, uma sequência codificando um peptídeo de sinal ou a peptídeo de trânsito, ou um elemento terminador constituindo um sinal de poliadenilação e, em segundo lugar, um polinucleotídeo codificando uma proteína. A expressão "funcionalmente ligados um ao outro" significa que referidos elementos do gene quimérico são ligados um ao outro de tal forma que a função de um destes elementos é afetada por aquela de outro. A título de exemplo, um promotor é funcionalmente ligado à sequência de codificação quando é capaz de afetar a expressão de referida sequência de codificação. A construção do gene quimérico de acordo com a invenção e a montagem de seus vários elementos pode ser cardada usando técnicas bem conhecidas para as pessoas versadas na técnica. A escolha dos elementos reguladores constituindo o gene quimérico depende essencialmente do organismo hospedeiro no qual eles devem funcionar, e pessoas versadas na técnica são capazes de selecionar elementos reguladores que são funcionais em um determinado organismo hospedeiro. O termo "funcional" quer dizer capaz de funcionar em um determinado organismo hospedeiro.
[0055] Os promotores que o gene quimérico, de acordo com a invenção, pode conter, são ou constitutivos ou induzíveis. A título de exemplo, os promotores usados para expressão em bactérias podem ser escolhidos a partir dos promotores mencionados abaixo. Para expressão em Escherichia coli pode-se mencionar lac, trp, Ipp, phoA, recA, araBAD, prou, cst-I, tetA, cadA, nar, tac, trc, Ipp-lac, Psyn, cspA, PL, PL-9G-50, PR-PL, T7, [lambda]PL-PT7, T3-lac, T5-lac, T4 gene 32, nprM-lac, VHb e os promotores da proteína A ou ainda o promotor Ptrp (WO 99/64607). Para expressão em bactérias Gram-positivas tais como Corynebacteria ou Streptomyces, pode-se mencionar os promotores PtipA ou PS1 e PS2 (FR91/09870) ou aqueles descritos no pedido EP0629699A2. Para expressão em leveduras e fungos, podem-se mencionar os promotores K. lactis PLAC4 ou o promotor K. lactis Ppgk (pedido de patente FR 91/05294), o promotor Trichoderma tef1 ou cbhl (WO94/04673), o promotor Penicillium his, csl ou apf (WO 00/68401) e o promotor Aspergilius gla.
[0056] De acordo com a invenção, o gene quimérico também pode compreender outras sequências reguladoras, que são localizadas entre o promotor e a sequência de codificação, tais como ativadores de transcrição (aprimoradores).
[0057] Como tal, o gene quimérico da invenção compreende em uma modalidade específica pelo menos, na direção de transcrição, funcionalmente ligada, uma sequência reguladora promotora que é funcional em um organismo hospedeiro, uma sequência de ácido nucleico codificando a malato quinase da malato semialdeído desidrogenase da invenção e uma sequência reguladora do terminador que é funcional em referido organismo hospedeiro.
[0058] A presente invenção também se refere à clonagem e/ou vetor de expressão compreendendo um gene quimérico de acordo com a invenção ou uma sequência de ácido nucleico da invenção. O vetor, de acordo com a invenção, é de uso para transformar um organismo hospedeiro e expressar neste organismo quaisquer dentre a malato quinase, malato semialdeído desidrogenase e/ou DHB desidrognase. Este vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um bacteriófago ou um vírus. Preferencialmente, o vetor de transformação de acordo com a invenção é um plasmídeo. Geralmente, as qualidades principais deste vetor devem ser capacidade de manter-se e de se auto-replicar nas células do organismo hospedeiro, em particular em virtude da presença de uma origem de replicação, e para expressar quaisquer dentre a malato quinase, malato semialdeído desidrogenase e/ou DHB desidrogenase no mesmo. Com o propósito de transformação estável de um organismo hospedeiro, o vetor também pode integrar-se dentro do genoma. A escolha de tal vetor, e também as técnicas de inserção do gene quimérico, de acordo com a invenção, dentro deste vetor e fazem parte do conhecimento geral de pessoas versadas na técnica. Vantajosamente, o vetor usado na presente invenção também contém, em adição ao gene quimérico, de acordo com a invenção, um gene quimérico codificando um marcador selecionável. Este marcador selecionável possibilita selecionar os organismos hospedeiros que são efetivamente transformados, ou seja, aqueles que incorporaram o vetor. De acordo com uma modalidade particular da invenção, o organismo hospedeiro a ser transformado é uma bactéria, uma levedura, um fungo. Entre os marcadores selecionáveis que podem ser usados, podem-se mencionar marcadores contendo genes para resistência a antibióticos, tais como, por exemplo, o gene da fosfotransferase de higromicina. Outros marcadores podem ser genes para complementar uma auxotrofia, tal como os genes pyrA, pyrB, pyrG, pyr4, arg4, argB e trpC, o gene da molibdopterina sintase ou aquele de acetamidase. Também se podem mencionar genes que codificam enzimas facilmente identificáveis, tais como a enzima GUS, ou genes que codificam pigmentos ou enzimas que regulam a produção de pigmentos nas células transformadas. Tais genes marcadores selecionáveis são em particular descritos nos pedidos de patente WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567 e WO 97/04103.
[0059] A presente invenção também se refere a organismos hospedeiros transformados contendo pelo menos um gene quimérico de acordo com a invenção, ou integrado dentro do seu genoma ou exercido em um elemento genético extracromossômico, por exemplo, um plasmídeo. Em um aspecto mais específico da invenção, o organismo hospedeiro transformado compreende um ácido nucleico da invenção codificando uma malato quinase ou um gene quimérico que compreende um ácido nucleico codificando uma malato quinase ou um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico codificando uma malato quinase, e/ou um ácido nucleico codificando uma malato semialdeído desidrogenase, ou um gene quimérico que compreende um ácido nucleico codificando uma malato semialdeído desidrogenase ou um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico codificando uma malato semialdeído desidrogenase, e/ou um ácido nucleico codificando uma DHB desidrogenase, um gene quimérico que compreende um ácido nucleico codificando uma DHB desidrogenase ou um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico codificando uma DHB desidrogenase.
[0060] Em um aspecto específico da invenção, o ácido nucleico codificando a malato quinase é representado por SEQ ID N° 13, SEQ ID N°15, SEQ ID N°17, SEQ ID N°19, SEQ ID N°21, SEQ ID N°23, SEQ ID N°25, SEQ ID N°27, SEQ ID N°38, SEQ ID N°40, SEQ ID N°42 ou SEQ ID N°44, o ácido nucleico codificando a malato semialdeído desidrogenase é representado por SEQ ID 55, SEQ ID N°57, SEQ D N°59, SEQ ID N°61, SEQ ID N°63, SEQ ID N°65, ou SEQ ID N°67 e o ácido nucleico codificando a DHB desidrogenase é representado por SEQ ID N° 73, SEQ ID N°75, SEQ ID N° 224, SEQ ID N° 226 ou SEQ ID N° 82.
[0061] O termo "organismo hospedeiro” quer dizer qualquer organismo monocelular inferior no qual o(s) gene(s) quimérico(s), ácido nucleico(s) ou vetor(es), de acordo com a invenção, pode(m) ser introduzido(s) a fim de produzir 2,4-DHB. Preferencialmente, o organismo hospedeiro é um micro-organismo, em particular um fungo, por exemplo do Penicillium, Aspergillus e mais particularmente Aspergillus flavus, Chrysosporium ou Trichoderma genus, uma levedura, em particular das Saccharomyces, Kluyveromyces ou a Pichia genus e mais particularmente Zygosaccharomyces rouxii, uma bactéria, por exemplo da Escherichia genus, em particular E. coli, ou a Corynebacterium genus, mais particularmente Corynebacterium glutamicum, ou do Streptomyces genus ou um baculovírus.
[0062] O organismo hospedeiro pode ser um organismo hospedeiro que naturalmente superproduz malato ou succinato a partir de açúcares tais como glicose ou um organismo hospedeiro que foi engendrado para superproduzir malato ou succinato a partir de açúcares tais como glicose e em que todos os transportadores de membrana potenciais que facilitam exportação de ácidos orgânicos, tais como malato, piruvato, succinato e fumarato foram excluídos. O organismo hospedeiro pode ser um organismo que foi engendrado para superproduzir DHB e em que todos os transportadores de membrana que facilitam exportação de ácidos orgânicos tais como malato, piruvato, succinato e fumarato foram excluídos. Exemplos de permeases que facilitam exportação de malato e outros ácidos orgânicos são Mae1 de Schizosaccharomyces pombe (Camarasa et al., 2001; Grobler et al., 1995), DctA de Bacillus subtilis (Groeneveld et al., 2010), Dct 1-4 de E. coli, Jen1 de S. cerevisiae (Akita et al., 2000). Para um especialista será possível identificar permeases candidatas em outros microorganismos baseados na homologia da sequência. Estas construções servirão para manter malato e outros ácidos orgânicos dentro da célula para torná-los disponíveis para produção de DHB.
[0063] A expressão "organismo hospedeiro transformado” quer dizer um organismo hospedeiro que incorporou dentro de seu genoma, ou em um elemento genético extra cromossômico, por exemplo um plasmídeo, pelo menos um gene quimérico, de acordo com a invenção, e consequentemente produz qualquer um dentre malato quinase, malato semialdeído desidrogenase e/ou DHB desidrogenase em seu tecido, ou em um meio de cultura. Para obter os organismos hospedeiros de acordo com a invenção, pessoas versadas na técnica podem usar um dos muitos métodos de transformação conhecidos.
[0064] Um destes métodos consiste em colocar as células dos organismos hospedeiros a ser transformadas em contato polietileno glicol (PEG) e com os vetores de acordo com a invenção. Eletroporação é outro método, que consiste em submeter as células a ser transformadas e os vetores da invenção a um campo elétrico. Outro método consiste em injetar diretamente os vetores dentro das células ou dos tecidos através de microinjeção. O método "biolístico" Poe ser usado. Consiste em bombardear células ou tecidos com partículas para as quais os vetores da invenção são adsorvidos (Pat. N° U.S. 4.945.050).
[0065] Vários métodos de transformação de bactérias são descritos na literatura para Escherichia coli e outras bactérias Gram-negativas. Conjugação também pode ser usada. Para bactérias Gram-positivas, eletroporação pode ser usada, e também transformação protoplasto, em particular para bactérias do Streptomyces genus.
[0066] Vários métodos de transformação de fungos também são descritos na literatura. Transformação de protoplasto com PEG é descrita para Aspergillus em EP 0260762, e uma adaptação deste método para a espécie Peniciffium funiculosum é descrita em WO 00136120. Transformação por integração mediada por enzima de restrição, ou REMI, também é conhecida, como é transformação de protoplasto usando bactérias do Agrobacterium genus. Técnicas para transformação de leveduras também são descritas na literatura.
[0067] Em um aspecto adicional, a invenção trata de um processo de produção de 2,4- DHB compreendendo a etapa de cultivar um micro-organismo transformado da invenção.
[0068] Para a produção de DHB vários carboidratos poderiam ser utilizados individualmente ou como uma mistura tal como glicose, fructose, sucrose, melaço, maltose, melaço blackstrap, amido hidrolisado (glicose, oligossacarídeos), lactose, maltose, amido e amido hidrolisados, celulose, celulose hidrolisada, glicerol e certos hodrocarbonos, óleos e gorduras tais como óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco bem como ácidos graxos tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoleico. Aquelas substâncias podem ser usadas individualmente ou como misturas.
[0069] Várias fontes de nitrogênio poderiam ser utilizadas individualmente ou como misturas para produção em escala piloto e comercial, incluindo compostos inorgânicos tais como amônia gasosa e aquosa, sais de amônio de ácidos orgânicos ou inorgânicos, tais como sulfato de amônio, nitrato de amônio, fosfato de amônio, cloreto de amônio, acetato de amônio e carbonato de amônio. Alternativamente, nitrogênio natural contendo materiais orgânicos como soja hidrolisada, proteína de soja HCI-hidrolisada (nitrogênio total de em torno de 7%), farelo de soja, bolo de soja hidrolisado, milhocina, caseína hidrolisada, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, ureia, peptonas e aminoácidos também podem ser utilizados.
[0070] O processo de produção pode ser executado sob condições aeróbicas, anaeróbicas e de oxigênio limitado. Pode ser executado como um processo em batelada alimentada ou um processo em batelada.
[0071] Referida produção de 2,4-DHB pode ser feita através de cultivo do organismo hospedeiro em meio onde malato (ou outro ácido orgânico tal como piruvato, succinato ou fumarato) foi adicionado sozinho ou junto com outra fonte de carbono que assegura crescimento. Malato (e outros ácidos orgânicos) pode ser adicionado ou diretamente ou através de criação de um processo de fermentação em dois estágios, onde malato (ou outros ácidos orgânicos) é produzido em um primeiro estágio de processo por um micro-organismo superprodutor de malato, e produção de 2,4-DHB é realizada no estágio seguinte por um organismo hospedeiro de acordo com a invenção.
[0072] Separação e purificação do produto é fator muito importante que afeta enormemente a eficiência geral do processo e custos do produto. Métodos para recuperação do produto geralmente compreendem as etapas de separação de célula, bem como purificação, concentração e secagem do produto, respectivamente.
Separação de célula
[0073] Ultrafiltração e centrifugação pode ser usada para separar células do meio de fermentação. Separação de célula de meio de fermentação é geralmente complicada por alta viscosidade do meio. Portanto, podemos adicionar aditivos tais como ácido mineral ou sais alcalinos, ou aquecer o caldo de cultura para otimizar a separação de célula.
Recuperação de produto
[0074] A variedade de métodos de cromatografia de troca iônica pode ser aplicada para a separação de DHB ou antes ou depois de remoção de biomassa. Eles incluem o uso de resinas de permuta catiônica primárias que facilitam a separação de produtos de acordo com seu ponto isoelétrico. Tipicamente, a resina é carregada com a solução, e produto retido é eluído separadamente seguindo o aumento de pH (por exemplo, através de adição de hidróxido de amônio) no eluente. Outra possibilidade representa o uso de cromatografia de troca iônica usando resinas de leito móvel fixo ou simulado. Diferentes etapas cromatográficas podem ter de ser combinadas a fim de atingir pureza do produto adequada. Aqueles métodos de purificação são mais econômicos comparados com a etapa de cristalização dispendiosa, também provendo vantagens adicionais e flexibilidade em relação à forma do produto final.
Concentração e secagem do produto
[0075] O processo de purificação também pode compreender uma etapa de secagem que pode envolver qualquer meio de secagem adequado, tal como um granulador por pulverização, secador por pulverização, secador de tambor, secador rotativo e secador de túnel. Soluções de DHB concentradas podem ser obtidas através de aquecimento de caldos de fermentação sob pressão reduzida através de vapor a 130°C usando um concentrador multiuso ou evaporador de película fina.
[0076] Produção eficiente de DHB pode ser assegurada através de otimização de reparticionamento de fluxo de carbono na rede metabólica do organismo hospedeiro e assegurando suprimento de NADPH e ATP suficiente para as três enzimas da via de DHB. Canalização de fluxo de carbono para dentro de uma via metabólica desejada e suprimento de cofator NAD(P)H é geralmente facilitada através de exclusão ou alívio de vias fermentativas naturais concorrentes. Exemplos não exclusivos são
  • - a otimização de produção de malato em S. cerevisiae malato através de impedimento de formação de etanol (através da exclusão de piruvato descarboxilases (Zelle et al., 2008; Zelle et al., 2010).
  • - a otimização de succinato ou produção de malato em E. coli através de impedimento da formação de lactato (por exemplo, exclusão de IdhA), a formação de acetato (por exemplo, exclusão de pta, ackA), a formação de etanol (por exemplo, exclusão de adhE), a formação de formato (por exemplo, exclusão de pflB, focA), a oxidação de piruvato (por exemplo, exclusão de poxB), a degradação de malato (exclusão de maeB e scfA), a formação de succinato (por exemplo, exclusão de frdBC), a formação de metilglioxal (exclusão de mgsA) (Jantama et al., 2008a; Jantama et al., 2008b; Lin et al., 2005; Sanchez et al., 2005a; Zhang et al., 2011).
[0077] Outra possibilidade para aumentar fluxo de carbono e suprimento de ATP para a produção de ácidos orgânicos é engendrar o nodo de ramo fosfoenolpiruvato (PEP)/piruvato/oxaloacetato (revisto em (Sauer & Eikmanns, 2005)). Exemplos não exclusivos para estratégias de engenharia metabólica asseguram o aumento de fluxo de carbono de fosfoenolpiruvato para oxaloacetato são
  • - a otimização de produção de malato em S. cerevisiae através de impedimento da função de piruvato quinase e aumento da atividade de PEP carboxiquinase (Zelle et al., 2010).
  • - a otimização de produção de succinato em E. coli através de aumento da atividade de PEP carboxilase expressa natural ou heterologamente, PEP carboxiquinase, ou piruvato carboxilase (Millard et al., 1996; Sanchez et al., 2005b; Zhang et al., 2009).
[0078] Outra possibilidade para aumentar fluxo de carbono e Suprimento de ATP para a produção de ácidos orgânicos em E. coli e outras bactérias empregando o sistema de fosfotransferase (PTS) que consume PEP para a etapa de fosforilação inicial de glicose é a exclusão de componentes essenciais do sistema PTS (por exemplo ptsl ou ptsG) (Lin et al., 2005; Zhang et al, 2009). Para assegurar captação adicional de glicose em mutantes que transportam mutações deletérias do sistema PTS, a atividade de sistemas de captação de glicose alternativos (por exemplo, GaIP) tem de ser assegurada.
[0079] Outra possibilidade para aumentar fluxo de carbono para dentro das vias desejadas para a produção de ácidos orgânicos é engendrar o ácido cítrico e ciclo do glioxilato. Exemplos não exclusivos são
  • - a otimização de produção de ácido succínico em E. coli através de aumento da atividade de isocitrato liase(exclusão de repressor transcripcional iclR) (Lin et al., 2005; Sanchez et al., 2005a).
  • - a otimização de produção de ácido succínico através da exclusão de isocitrato desidrogenase, e/ou succinato desidrogenase (Lin et al., 2005).
[0080] Outra possibilidade para aumentar fluxo de carbono para dentro das vias desejadas para a produção de DHB é a expressão de piruvato desidrogenases e citrato sintases apropriadas no organismo de produção. Piruvato desidrogenase natural e citrato sintase de E. coli são inibidas por altas concentrações de NADH intracelular tornando estas enzimas menos ativas sob condições anaeróbicas. Em E coli, a expressão de um mutante piruvato desidrogenase que é insensível a NADH resultou na superprodução de acetil-CoA sob condições anaeróbicas e reparticionamento de fluxo de carbono modificado entre os produtos finais fermentativos (acetato, lactato, etanol, formato e piruvato) (Wang et al., 2010). A expressão heteróloga da citrato sintase de Bacillus subtilis que é insensível à produção de ácido succínico aumentado de NADH nas estirpes engendradas E. coli (Sanchez et al., 2005a). Em combinação com as mutações descritas acima, o uso das piruvato desidrogenases e citrato sínteses apropriadas (NADH sensível ou insensível) permite a sintonização de reparticionamento fluxo de carbono entre reações de glioxilato e ciclo de ácido cítrico e vias fermentativas sob condições anaeróbicas e aeróbicas.
[0081 ] Outra possibilidade para aumentar fluxo de carbono através da via DHB é a exclusão de reações enzimáticas que podem degradar os intermediários de via 4-fosfomalato, 4-malato semialdeído. Enzimas candidatas que podem degradar malato semialdeído são semialdeído succínico desidrogenases (sad, gabD), e outras desidrogenases que são capazes de oxidar moléculas C4 com grupos aldeído terminais.
[0082] Outra possibilidade para aumentar produtividade de DHB do organismo hospedeiro é a exclusão de reações metabólicas que degradam DHB. DHB é um inibidor concorrente de enzima málico, assim, tendo comparativamente alta afinidade para o sítio ativo desta enzima (Rognstad & Katz, 1979). Portanto, DHB pode ser reconhecido por outras enzimas e potencialmente degradado. Estas enzimas podem ser identificadas e excluídas do organismo hospedeiro.
[0083] Quando 2,4-produção de DHB é baseada na adição de malato ou outros ácidos orgânicos, os micro-organismos produtores de 2,4-DHB deveriam funcionalmente expressar uma proteína de transporte de membrana que facilita captação de malato (ou outros ácidos orgânicos tais como piruvato, succinato etc.).
[0084] Os seguintes exemplos ilustram a invenção. Estes exemplos têm o propósito de ilustração apenas e não devem ser interpretados como limitando o escopo da invenção de qualquer maneira.
Breve descrição das Figuras
[0085] Figura 1: (i) Esquema de reação que descreve uma conversão de (L)-malato em 5 (L)-2,4-dihidroxibutirato (DHB), e (ii) a analogia à conversão de (L)-aspartato em (L)-homoserina.
[0086] Figura 2: Alinhamento de sequências de aminoácido de aspartato quinases de diferentes organismos. (Ec AKIII — aspartato quinase III (SEQ ID N° 4), LysC, de E. coli, Ec_AKI (SEQ ID N° 87)- aspartato quinase I, ThrA, de E. coli, Ec_AKII (SEQ ID N° 88— aspartato quinase II, Meth., de E. coli, Mj — Methanococcus jannaschii (SEQ ID N° 89), Tt - Thermus thermophilus (SEQ ID N° 90), Cg —Corynebacterium glutamicum (SEQ ID N° 91), At — Arabidopsis thaliana (SEQ ID N° 92), Sc — Saccharomyces cerevisiae. (SEQ ID N° 93)) A figura foi produzida usando ClustalW2 (Larkin et a, 2007).
[0087] Figura 3: Alinhamento de sequências de aminoácido de aspartato semialdeído desidrogenases de diferentes organismos. (Ec —E. coli (SEQ ID N° 49), Mj —Methanococcus jannaschii (SEQ ID N° 94), Tt - Thermus thermophilus (SEQ ID N° 95), Bs — Bacillus subtilis (SEQ ID N° 96), Cg — Corynebacterium glutamicum (SEQ ID N° 97), At — Arabidopsis thaliana (SEQ ID N° 98), Sc —Saccharomyces cerevisiae. (SEQ ID N° 99)) A figura foi produzida usando ClustalW2 (Larkin et al., 2007).
[0088] Figura 4: cromatogramas GC que se aproximam da região que corresponde ao tempo de retenção de DHB mostrando: (A) padrão DHB (concentração = 1 mm); (B) composição de Reação A contendo malato quinase (MK), malato semialdeído desidrogenase (MSA-Dh), e malato semialdeído redutase (MSA-Red); (C) composição de Reação B de controle (mesma que A mas faltando MSA-Red); (D) composição de Reação C de controle (mesma que A mas faltando MSA-Dh).
[0089] Figura 5: Atividades relativas de mutantes de LysC E119G, LysC E119G E250K, LysC 30 E119G T344M, LysC E119G S345L, LysC E119G T344M, e LysC E119G T352I purificados com relação à concentração de lisina no tampão de reação.
Exemplos
[0090] Exemplo 1: Teste de aspartato quinases LysC e Hom3 de Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae, respectivamente, para aspartato e atividade malato quinase
[0091 ] Construção de plasmídeos contendo genes do tipo selvagem de aspartato quinase: O plasmídeo pLYSCwt foi construído através de amplificação do gene LysC por PCR usando alta fidelidade da polimerase PhusionTM (Finnzymes) e os iniciadores direto e inverso 5'CACGAGGTACATATGTCTGAAATGTTGTCTCC3' (SEQ ID N° 1) e 5'CTTCCAGGGGATCCAGT-ATTTACTCAAAC3' (SEQ ID N° 2) que introduzem sítios de restrição Ndel e BamHI a montante do códon de início e a jusante do códon de parada, respectivamente. DNA genômico de E. coli DH5a foi usado como o modelo. O produto PCR foi digerido com Ndel e BamHI, ligado nos sítios correspondentes do vetor de expressão pET28a (Novagen) usando T4 DNA ligase (Biolabs), e transformado em células E. coli DH5a. O plasmídeo pAKIllwt resultante foi isolado e mostrou, através de sequência de DNA, conter o gene LysC de comprimento completo tendo a sequência correta (SEQ ID N° 3). A proteína correspondente é representada por SEQ ID N° 4.
[0092] O plasmídeo pHOM3wt foi construído através de amplificação do gene HOM3 por PCR usando alta fidelidade da polimerase PhusionTM (Finnzymes) e os iniciadores direto e inverso 5'TATAATGCTAGCATGCCAATGGATTTCCAACC3' (SEQ ID N° 5) e 5'TATAATGAATTCT-TAAATTCCAAGTCTTTTCAATTGTTC3' (SEQ ID N° 6) que introduzem sítios de restrição Ndel e EcoRI a montante do códon de início e a jusante do códon de parada, respectivamente. DNA genômico de S. cerevisiae BY4741 wt foi usado como o modelo. O produto PCR foi digerido com Nhel e EcoRI, e ligado nos sítios correspondentes do vetor de expressão pET28a (Novagen) usando T4 DNA ligase (Biolabs), e transformado em células E. coli DH5a. O plasmídeo pHOM3wt resultante foi isolado e mostrou, através de sequência de DNA, conter o gene HOM3 de comprimento completo tendo a sequência correta (SEQ ID N° 7). A proteína correspondente é representada por SEQ ID N° 8.
[0093] Expressão de enzimas: E. coli BL21 D3 células estreladas foram transformadas com os plasmídeos apropriados. Enzimas com um N-terminal hexa-His tag foram expressas em culturas LB de 250 ml que foram inoculadas a partir de uma cultura durante a noite a OD600 de 0,1 e cresceram para OD600 de 0,6 antes que a expressão da proteína fosse induzida através de adição de 1 mm de isopropil β-D-l-thiogalactopiranosido (IPTG) ao meio de cultura. Após 3h de expressão da proteína, células foram colhidas através de centrifugação a 13000g durante 10min e armazenadas a -20°C até análise adicional. Crescimento e expressão da proteína foram executados a 37°C. Meio de cultura continha 50 Mg/L de canamicina.
[0094] Purificação de enzimas: Pellets de célula congelada de culturas de expressão foram ressuspensas em 0,5 ml de ruptura de tampão (50 mm de Hepes, 300mm de NaCI, pH 7,5) e arrombado por quatro rodadas sucessivas de sonicação (Bioblock Scientific, VibraCellTM 72437) com a saída de potência estabelecida para 30%. Detritos da célula foram removidos através de centrifugação dos extratos brutos durante 15min a 4°C a 13000g e retenção do sobrenadante claro. RNA e DNA foram removidos dos extratos através de adição de 15 mg/ml de estreptomicina (Sigma), centrifugação das amostras a 13000 g durante 10 min a 4°C e retenção do sobrenadante. Extrato de proteína claro foi incubado durante 1h a 4°C com 0,75 ml de volumes de leito de afinidade de resina Talon™ Cobalt (Clontech). A suspensão foi centrifugada a 700 g em uma centrífuga de mesa e sobrenadante foi removido. A resina foi lavada com 10 volumes de leito de tampão de lavagem (50 mm de Hepes, 300 mm de NaCI, 15 mm de Imidazol, pH 7,5) antes das aspartato quinases serem eluídas com 0,5 ml de tampão de eluição (50 mm de Hepes, 300 mm de NaCI, 500 mm de Imidazol, pH 7,5). Pureza de enzimas eluídas foi verificada por análise de SDS-PAGE.
[0095] Ensaio enzimático: Aspartato ou atividade malato quinases foram ensaiados através de acoplamento de produção de ADP nas reações de quinase para oxidação de NADH na presença de fosfoenolpiruvato, piruvato quinase e lactato desidrogenase.
Esquema de reação:
Aspartato (ou malato) quinase
aspartato (ou malato) + ATP ^ 4-fosfo-(L)-aspartato (ou 4-fosfo-(L)-malato) + ADP
Piruvato quinase
ADP + fosfoenolpiruvato ^ ATP + piruvato
Lactato desidrogenase
piruvato + NADH ^ NAD+ + lactato
[0096] A mistura de ensaio continha 50 mm de Hepes (pH 7,5), 50 mm de KCl, 5 mm de MgCl2, 0,24 mm de NADH, 0,96 mm de ATP, 0,96 mm de PEP, 9 gg/ml de lactato desidrogenase (Sigma, L2500), 12,4 gg/ml de piruvato quinase (Sigma, P1506), e quantias apropriadas de aspartato (malato) quinase purificada. Reações foram iniciadas através de adição de 50 mm de (L)-aspartato ou (L)-malato. Ensaios enzimáticos foram executados a 30°C em placas de microtitulação de fundo chato de 96 poços em um volume final de 250 gL. As reações foram seguidas pela absorção característica de NADH 10 a 340 nm em um leitor de microplacas (BioRad 680XR).
[0097] Ensaio de hidroxamato: Para verificar fosforilação do substrato, ou seja, formação de um anidrido acilfosfato, através de aspartato quinase mutadas ou do tipo selvagem, o produto da reação de quinase foi incubado com hidroxilamina para formar o derivado aspartato ou malato hidroxamato correspondente. A mistura de ensaio continha 120 mm de Hepes (pH 8), 200 mm de KCl, 10 mm de ATP, 200 mm de hidroxilamina, 10 mm de aspartato ou malato, e quantia apropriada de proteína purificada. A reação foi parada após 30 min através de adição de um volume igual de 1,7% (w/v) de FeCl3 em 1 M de ácido clorídrico. Formação do complexo hidroxamato-ferro foi verificada pela medição de sua absorbância característica a 540 nm em um leitor de placas de microtitulação. Mistura de ensaios contendo todos os componentes, com exceção de ATP, foi usada como um branco.
[0098] Resultados: enzimas LysC (sem His-tag, SEQ ID N° 4) e Hom3 (sem His-tag, SEQ ID N°7) purificadas exibiram atividade aspartato quinase mas não foram capazes de fosforilar malato, conforme verificado pelo ensaio hidroxamato (Keng & Viola, 1996). Atividades máximas para LysC e Hom3 em aspartato foram 4,5 qmol/(min*mgprot) e 1,6 qmol(min*mgprot), respectivamente. O valor de Km para aspartato foi estimado com o método de Eadie e Hofstee através de medição de taxas de reação iniciais (v) a diferentes concentrações de substrato (c) e através de extração do declive do v versus linearização v/c. A Km de LysC His-tagged purificada foi estimada em torno de 0,6 mm mostrando que a proteína His-tagged tem a mesma afinidade de substrato que a enzima purificada não-tagged que foi relatada como sendo 0,6 mm (Marco-Marin et al., 2003).
[0099] Exemplo 2: Mutagênese sítio dirigida de aspartato quinase LysC de Escherichla coli e teste de enzimas mutantes quanto à atividade malato quinase.
[00100] Mutagênese sítio dirigida foi executada usando os pares de oligonucleotídeos listados na Tabela 1 e o plasmídeo pLYSCwt (SEQ ID N°3) como o modelo. Mutações pontuais para alterar a sequência de aminoácido foram introduzidos por PCR (Phusion 1U, tampão HF a 2% (v/v), dNTPs 2,5 mm, iniciadores direto e inverso 1 pm cada, plasmídeo modelo de 200 ng, água) usando o par de oligonucleotídeos listado na Tabela 1. Plasmídeos criados por PCR continham um novo sítio de restrição para Ncol (introduzido usando mutações silenciosas) em adição à mutação funcional para facilitar identificação de clones mutados. Os produtos de PCR foram digeridos por Dpnl a 37°C durante 1h para remover DNA modelo, e transformado em células E. coli competentes NEB 5-alpha (NEB). Os plasmídeos mutados foram identificados através de análise de sítio de restrição e verificados por transportar as mutações desejadas por sequência de DNA.
Tabela 1: Oligonucleotídeos usados para mutar aspartato quinase lysC de E. coli em posição E119.
Figure img0001
[00101] A sequência representando uma mutação em posição 119 pode ser representada por SEQ ID N°9, em que o resíduo em posição 119 é X, X sendo qualquer um dos 19 aminoácidos que ocorrem naturalmente (exceto glutamina).
[00102] Enzimas mutantes foram expressas, purificadas e testadas quanto a aspartato e atividade malato quinase, conforme descrito no exemplo 1. Resultados estão resumidos na Tabela 2.
Tabela 2: Caracterização de enzimas mutantes quanto à atividade malato quinases. Valores correspondem à média de pelo menos dois experimentos independentes.
Figure img0002
[00103] Nenhum dos mutantes listados na Tabela 2 teve atividade sobre aspartato.
[00104] Os resultados mostram que aspartato quinase pode ser transformada em malato quinase através de substituição do glutamato conservado na posição 119 por cisteína, glicina, asparagina, prolina, glutamina, serina, treonina ou valina. A sequência de ácidos nucleicos correspondente da enzima listada em Tabela 2 são SEQ ID N°13, SEQ ID N°15, SEQ ID N°17, SEQ ID N°19, SEQ ID N°21, SEQ ID N°23, SEQ ID N°25 e SEQ ID N°27.
Exemplo 3: Construção de uma malato quinase com sensibilidade fortemente diminuída para inibição por lisina
[00105] Mutagênese sítio dirigida foi executada usando os pares de oligonucleotídeo listados na Tabela 3 e o plasmídeo pLYSC_E119G como o modelo (o plasmídeo pLYSC_E119G foi obtido conforme descrito no exemplo 2 através de introdução das seguintes mudanças na sequência de DNA do gene LysC: (SEQ ID N° 15). Mutações pontuais para mudar as sequências de aminoácido foram introduzidas por PCR (Phusion 1U, Tampão de HF 20% (v/v), dNTPs 2,5 mm, iniciadores direto e inverso 1 pm cada, plasmídeo modelo 200 ng, água) usando os pares de oligonucleotídeos listados na Tabela 1. Quando possível, plasmídeos criados por PCR continham novos sítios de restrição (introduzidos usando mutações silenciosas) em adição à mutação funcional para facilitar identificação de clones mutados. Os produtos de PCR foram digeridos por Dpnl a 37°C durante 1h para remover DNA modelo, e transformados em células E. coli competentes NEB 5-alpha (NEB). Os plasmídeos mutados foram identificados por análise de sítio de restrição e verificados por transportar as mutações desejadas por sequência de DNA.
Tabela 3: Oligonucleotídeos usados para mutar malato quinase LysC E119G de E. coli.
Figure img0003
Figure img0004
[00106] A sequência de ácido nucleico da proteína LysC E119G compreendendo uma mutação adicional correspondente a (i) a substituição do ácido glutâmico em posição 250 por uma lisina é representada por SEQ ID N° 38; sua sequência de aminoácido correspondente é representada por SEQ ID N° 39; (ii) a substituição da treonina em posição 344 por metionina é representada por SEQ ID N° 40; sua sequência de aminoácido correspondente é representada por SEQ ID N° 41; (iii) a substituição da treonina em posição 352 por isoleucina é representada por SEQ ID N° 42; sua sequência de aminoácido correspondente é representada por SEQ ID N° 43; (iv) a substituição da serina em posição 345 por leucina é representada por SEQ ID N° 44; sua sequência de aminoácido correspondente é representada por SEQ ID N° 45.
[00107] Expressão e purificação de enzimas: Expressão da proteína para as enzimas His-tagged LysC E119G, LysC E119G E250K, LysC E119G T344M, LysC E119G S345L, LysC E119G T352I foi executada conforme descrito no exemplo 1.
[00108] Ensaio enzimático. Atividade malato quinases foram ensaiadas conforme descrito no exemplo 1. Concentração de Lisina no tampão de reação foi variada.
[00109] Resultados: A introdução de mutações E250K, T344M ou S345L em LysC E119G torna a atividade malato quinase amplamente insensível a concentrações elevadas de lisina (Vide Figura 4).
[00110] Exemplo 4: Teste de aspartato semialdeído desidrogenases Asd de Escherichia coli para aspartato e atividade malato semialdeído desidrogenase
[00111] Construção de plasmídeos contendo genes do tipo selvagem de aspartato semialdeído desidrogenase: O plasmídeo pASDwt foi construído através de amplificação do gene asd de E. coli por PCR usando alta fidelidade da polimerase PhusionTM (Finnzymes) e os iniciadores direto e inverso 5'TATAATGCTAGCATGAAAAATGTTGGTTTTATCGG3'. (SEQ ID N° 46) e 5TATAATGGATCCTTACGCCAGTTGACGAAGC3'. (SEQ ID N° 47) que introduzem o sítio de restrição Nhel e BamHl a montante do códon de início e a jusante do códon de parada, respectivamente. DNA genômico de E. coli DH5a foi usado como o modelo. O produto PCR foi digerido com Nhel e BamHI, ligado nos sítios correspondentes do vetor de expressão pET28a (Novagen) usando T4 DNA ligase (Biolabs), e transformado em células E. coli DH5a. O plasmídeo pASDwt resultante foi isolado e mostrou, através de sequência de DNA, conter o gene asd de comprimento completo tendo a sequência correta (SEQ ID N° 48). A sequência de aminoácido correspondente de referida enzima é representada por SEQ ID N° 49.
[00112] Expressão e purificação de enzimas: Expressão da proteína para as enzimas 5 His-taggIed Asd foi executado conforme descrito no Exemplo 1.
[00113] Ensaio enzimático: Aspartato ou atividade malato semialdeído desidrogenases foram ensaiados na direção biossintética inversa seguindo a redução de NADP durante a oxidação de aspartato ou malatosemialdeído para 4-fosfo-(L)-aspartato ou 4-fosfo-(L)-malato, respectivamente (Roberts et al., 2003). (L)-aspartato semialdeído (ou (L)-malato semialdeído) + NADP + Pi → 4-fosfo-(L)-aspartato (ou 4-fosfo-(L)-malato) + NADPH
[00114] A mistura de ensaio continha 200 mm de Hepes (pH 9), 50 mm de K2HPO4, 0,25 mm de NADP. Reações foram iniciadas através de adição de (L)-aspartato semialdeído ou (L)-malato semialdeído. (L)-Aspartato semialdeído foi adicionado na forma de ácido L-aspártico β-semialdeído hidrato trifluoroacetato (mantido a pH 3 para evitar degradação) que é um substrato adequado para testes enzimáticos de homoserina desidrogenase e aspartato semialdeído desidrogenase (Roberts et al., 2003). Malato semialdeído instável foi produzido pouco antes dos testes enzimáticos através da desproteção do derivado de malato semialdeído estável 2-[(45)-2,2-dimetil-5-oxo-1,3-dioxolan-4-il]acetaldeído (DMODA). Malato semialdeído foi obtido por incubação de DMODA em 2M ácido clorídrico durante 15min a 25°C, e evaporação da acetona liberada (35°C, 50 mbar). O pH da solução de malato semialdeído foi fixado a 3 usando bicarbonato de sódio.
[00115] Ensaio enzimáticos foram executados em Placas de microtitulação de fundo chato de 96 poços em um volume final de 250 mL a 30°C. As reações foram seguidas da absorção característica de NADPH a 340 nm em um leitor de microplacas (BioRad 680XR).
[00116] Resultados: aspartato semialdeído desidrogenase do tipo selvagem, His-tagged, Asd, (L)-aspartato semialdeído oxidado para 4-fosfo-(L)-aspartato com uma atividade específica máxima de 160 µmol/(min*mgprot). Em (L)-malato semialdeído a enzima teve uma atividade de 0,01 µmol/(min*mgprot).
[00117] Exemplo 5: Mutagênese sítio dirigida de aspartato semialdeído desidrogenase Asd de Escherichia coli e teste de enzimas mutantes para atividade malato semialdeído desidrogenase.
[00118] Mutações pontuais na sequência de aminoácido de Asd foram introduzidas usando o plasmídeo pASDwt como o modelo e seguindo o protocolo delineado no exemplo 2. Os pares de oligonucleotídeos listados na Tabela 4 foram usados para mutar o resíduo de glutamato em posição 241 ou o resíduo de treonina em posição 136. Os plasmídeos mutados foram identificados através de análise de sítio de restrição e verificados por transportar as mutações desejadas por sequência de DNA.
[00119] A proteína Asd mutada em posição 241 pode ser representada por SEQ ID N° 68 em que o resíduo em posição 241 é X, X sendo qualquer um dos outros 19 aminoácidos que ocorrem biologicamente (exceto glutamina).
Tabela 4: Oligonucleotídeos usados para mutar aspartato semialdeído desidrogenase Asd de E. coli em posição E241 e T136.
Figure img0005
[00120] Resultados: Atividades e valores de Km de Asd mutado em posição E241 são resumidos na Tabela 5. Mutantes Asd onde glutamato 241 foi substituído por alanina, cisteína, glicina, histidina, isoleucina, metionina ou glutamina oxidaram (L)-aspartato-4-semialdeído para 4-fosfo-(L)-aspartato com uma atividade específica significativamente maior que a enzima do tipo selvagem.
O Asd mutante duplo E241Q T136N (SEQ ID N°231) teve uma atividade específica máxima de 0,25 μmol/(min*mgprot) e uma Km de 0,25 mm.
Tabela 5: Caracterização de enzimas mutantes para atividade malato semialdeído desidrogenases. Valores correspondem à média de pelo menos dois experimentos independentes.
Figure img0006
* Valores de Km foram apenas estimados para mutantes selecionados
[00121] Os ácidos nucleicos correspondentes são representados por SEQ ID N° 55, SEQ ID N° 57, SEQ ID N° 48, SEQ ID N° 59, SEQ ID N° 61, SEQ ID N° 63, SEQ ID N° 65 e SEQ ID N° 67.
[00122] O mutante duplo Asd E241Q T136N tem uma sequência de ácido nucleico representada por SEQ ID N° 230.
Exemplo 6: Identificação da 2,4 DHB desidrogenase
[00123] Para identificar uma 2,4 DHB desidrogenase adequada, beta-hidroxiácido desidrogenases de diferentes fontes biológicas foram testadas quanto à sua capacidade de reduzir malato semialdeído. Entre as enzimas testadas estavam a metilbutiraldeído redutase, Ypr1 (Ford & Ellis, 2002) )(SEQ ID N° 73 e SEQ ID N° 74), de Saccharomyces cerevisiae; e a semialdeído succínico redutase, Ms-Ssr de Metallosphaera sedula (Kockelkom & Fuchs, 2009)(SEQ ID N° 75 e SEQ ID N° 76). Os genes YPR1 e Ms-SSR foram amplificados usando iniciadores listados na Tabela 6 e clonados para o vetor pET28 (enzimas de restrição vide Tabela 3) tornando plasmídeos pYPR1 e pMs-SSR, respectivamente. As proteínas foram expressas e purificadas conforme descrito no exemplo 1.
Tabela 6: Iniciadores e enzimas de restrição usadas para clonar beta-hidroxiácido desidrogenases candidatas
Figure img0007
Teste para atividade malato semialdeído redutase. Reação: (L)-Malato semialdeído + NAD(P)H → (L)-ácido 2,4-dihidroxibutírico + NAD(P)
[00124] A mistura de ensaio continha 200 mm de Hepes (pH 7,5), 50 mm de KCl, 5 mm de MgCl2, 0,24 mm de NADH ou NADPH, e quantias apropriadas de enzima purificada. Reações foram iniciadas através de adição de 10 mm de (L)-malato semialdeído (malato semialdeído foi preparado recente para cada teste, vide Exemplo 4). Ensaios enzimáticos foram executados a 30°C em placas de microtitulação de fundo chato de 96 poços em um volume final de 250 µl. As reações foram seguidas pela absorção característica de NAD(P)H a 340 nm em um leitor de microplacas (BioRad 680XR). Resultados são listados na Tabela 7.
Tabela 7: Redução de atividade de beta-hidroxiácido desidrogenases selecionadas em malato semialdeído (Resultados representam a média de pelo menos dois experimentos independentes).
Figure img0008
[00125] A semialdeído succinico desidrogenase de M. sedula e a metilbutiraldeído redutase de S. cerevisiae têm atividade malato semialdeído redutase. A Km de Ms-SSR para malato semialdeído foi 1.1 mm.
Exemplo 7: Mutagênese sítio dirigida de semialdeído succínico redutase de M. sedula
[00126] Mutagênese sítio dirigida foi executada usando os pares de oligonucleotídeos listados na Tabela 8 e o plasmídeo pMs-SSR como o modelo. Mutações pontuais para mudar as sequências de aminoácido foram introduzidas por PCR (Phusion 1U, Tampão de HF 20% (v/v), dNTPs 2,5 mm, iniciadores direto e inverso 1 µm cada, plasmídeo modelo 200 ng, água). Quando possível, plasmídeos criados por PCR continham novos sítios de restrição (introduzidos usando mutações silenciosas) em adição à mutação funcional para facilitar identificação de clones mutados. Os produtos de PCR foram digeridos por Dpnl a 37°C durante 1h para remover DNA modelo, e transformados em células E. coli competentes NEB 5-alpha (NEB). Os plasmídeos mutados foram identificados através de análise de sítio de restrição e verificados por transportar as mutações desejadas por sequência de DNA. Tabela 9 resume parâmetros cinéticos dos mutantes. Os resultados demonstram que o mutante duplo Ms-SSR H39R N43H (SEQ ID N° 81, SEQ ID N° 82) tem afinidade melhorada para malato semialdeído quando comparado com o tipo selvagem da enzima.
Tabela 8: Pares de iniciadores usados para mutar M. sedula semialdeído succínico redutase (Ms-SSR)
Figure img0009
Tabela 9: Resumo de parâmetros cinéticos de mutantes de M. sedula semialdeído succínico redutase (Ms-SSR) (Resultados representam a média de pelo menos dois experimentos independentes).
Figure img0010
Figure img0011
[00127] As sequências nucleicas correspondentes são representadas por SEQ ID N° 224, SEQ ID N° 226 e SEQ ID N° 82.
Exemplo 8: Produção de DHB in vitro
[00128] As enzimas malato quinase (LysC E119G, SEQ ID N° 15), malato semialdeído desidrogenase (Asd E241Q; SEQ ID N° 67), e malato semialdeído redutase (Ms SSrR, SEQ ID N° 76) foram expressas e purificadas conforme descrito no exemplo 1. Produção de DHB foi demonstrada in vitro através de adição 50 mm de malato a uma mistura de reação que continha 50 mm de Hepes (pH 7,5), 50 mm de KCl, 5 mm de MgCl2, 1 mm de NADPH, 180 pg/ml de malato quinase (Lys E119G), 325 pg/ml de malato semialdeído desidrogenase (Asd E241Q), e 130 µg/ml de malato semialdeído redutase (Ms_Ssr) (Reação A). Reações de controle continham todos os componentes, mas estavam faltando ou malato semialdeído redutase (Reação B) ou malato semialdeído desidrogenase (Reação C). Após 30 min de incubação a 30°C, a mistura de reação foi analisada por cromatografia de gás [CPG Varian Series 430; equipada com detector FID; amostrador automático CP8400; injetor sem divisão 1177 (230°C); coluna: CP-WAX58/FFAP, 30 m x 0,53 mm, df 0,50 µm; e alinhador: Manga Interna, pescoço de ganso 6,5 x 78.5 x 4 mm GWOL (Varian). Gás transportador foi nitrogênio a uma taxa de fluxo de 25 ml/min. Ionização de chama foi executada usando uma mistura ar-hidrogênio (taxas de fluxo foram 300 ml/min e 30 ml/min, respectivamente). Temperatura de detector foi 240°C. Volume de amostra injetada foi 1 pl. Programa de temperatura é provido na Tabela 10.
Tabela 10: Programa de temperatura para análise de mistura de reações
Figure img0012
[00129] Produção de DHB foi detectada na reação A (presença de todas as enzimas), mas foi ausente em reação de controle B e C (Figura 5).
[00130] Exemplo 9: Otimização da sequência de codificação de M. sedula semialdeído succínico redutase para sua expressão em E. coli.
[00131] A sequência de codificação de M. sedula semialdeído succínico redutase incluindo as mutações H39R e N43H foi otimizada para expressão máxima em E. coli, usando o software geneOptimizer®. O gene sintético foi produzido por GeneArt® Síntese Genética (Invitrogen Life Technologie). Sítios de restrição NheI e EcoRI foram introduzidos a montante do códon de início e a jusante do códon de parada, respectivamente, permitindo clonagem direta para pET28a+ (Novagen).
[00132] O plasmídeo pSSR-H39RN43H-opt resultante foi isolado e mostrou, através de sequência de DNA, conter o gene de comprimento completo M sedula SSR H39R N43H tendo a sequência correta (SEQ ID N° 228).
[00133] Exemplo 10: Construção de um plasmídeo que facilita a expressão simultânea de malato quinase (mutante do gene LysC de E. coli), malato semialdeído desidrogenase, (mutante do gene Asd de E. coli, e DHB desidrogenase (mutante do gene M. sedula semialdeído succínico redutase) usando E. coli como o organismo hospedeiro.
[00134] O plasmídeo pLYSC-E119G E250K (SEQ ID N°38) foi usado como a estrutura principal para a construção operon. Um fragmento de DNA contendo o sítio ligador de ribossomo (rbs) pET28 (Novagen) e a região de codificação de ASD-E241Q foi obtido por PCR (alta fidelidade da polimerase PhusionTM (Finnzymes)) usando pASD-E241Q (SEQ ID N° 55 como o modelo, e os iniciadores direto e inverso 5’TATAAGGATCCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGG3' (SEQ ID N° 83) e 5’TATAAGAATTCTTACGCCAGTTGACGAAG3'. (SEQ ID N° 84) que introduziu um sítio de restrição BamHl e EcoRI a montante do rbs e a jusante do códon de parada, respectivamente. Os produtos de PCR foram digeridos com BamHI e EcoRI, ligados nos sítios correspondentes de pLYSC-E119G E250K, usando T4 DNA ligase (Biolabs), e transformado em células E. coli DH5a. O plasmídeo pLYSC-E119G-E250K_ASD-E241Q resultante foi isolado e mostrou, através de sequência de DNA, ter a sequência correta.
[00135] Um fragmento de DNA contendo o sítio ligador de ribossomo (rbs) pET28 e a região de codificação do Ms-SSR-H39RN43H-opt otimizado por códon foi obtido por PCR usando pSSR-H39RN43H-opt como o modelo, e os iniciadores direto e inverso 5’TATAAGCGGCCGCGTTTAACTTTAAGAAGGAGATAT3' (SEQ ID N°85) e 5’TATAAACTCGAGCTTACGGAATAATCAGG3' (SEQ ID N° 86) que introduziu um sítio de restrição Nati e a PspXl a montante do rbs e a jusante do códon de parada, respectivamente. Os produtos de PCR foram digeridos com Noll e PspXI, ligados nos sítios correspondentes de pLYSC-E119G-E250K ASD-E241Q, usando T4 DNA ligase (Biolabs), e transformados em células E. coli DH5a. O plasmídeo pET28-DHB resultante (SEQ ID N° 229) foi isolado e mostrou, através de sequência de DNA, ter a sequência correta.
[00136] A região promotora 5’ a montante que regula simultaneamente a expressão dos três genes (ou seja, promotor T7 em pET28-DHB) pode ser substituída com qualquer outro promotor, induzível ou constitutivo, através de digestão de pET28-DHB com SphI e XbaI e clonando outra região promotora com sítios de restrição adequados. Como um exemplo para o uso de um promotor induzível, o promotor T7 da estrutura principal pET28-DHB foi substituído pelo promotor tac cujas características permitem expressão da proteína na presença de glicose (de Boer et al., 1983). O promotor lac foi obtido a partir de plasmídeo pEXT20 (Dykxhoom et al., 1996) através de digestão do plasmídeo com SphI e XbaI. O fragmento de DNA contendo o promotor foi purificado e clonado para o plasmídeo pET28-DHB digerido com SphI / XbaI. O plasmídeo pTAC-DHB resultante foi isolado e mostrou, através de sequência de DNA, ter a sequência correta.
Tabela 11: Lista de plasmídeos construídos neste estudo
Figure img0013
Exemplo 11: Construção de estirpes E. coli para otimizar reparticionamento de fluxo de carbono e suprimento de cofator NADPH para produção de DHB fermentativo
[00137] Vários genes foram rompidos em E. coli. estirpe MG1655 a fim de otimizar reparticionamento de fluxo de carbono e suprimento de cofator para produção de DHB. Exclusões de gene foram executadas usando o método de recombinase lambda red, de acordo com Datsenko et al. (Datsenko & Wanner, 2000).
[00138] Os cassetes de exclusão foram preparados por PCR usando alta fidelidade de polimerase PhusionTM (Finnzymes), e o gene de resistência a canamicina FRT-flanked (kan) de plasmídeo pKD4 como o modelo (Datsenko & Wanner, 2000). Iniciadores sense continham sequências correspondentes à extremidade 5' de cada gene alvo (sublinhado) seguido de 20 bp correspondente ao cassete FRT-kan-FRT de pKD4. Iniciadores anti-sense continham sequências correspondentes à região de extremidade 3' de cada gene alvo (sublinhado) seguido de 20 bp correspondente ao cassete. Os iniciadores são descritos na Tabela 12. Produtos de PCR foram digeridos com Dpnl e purificados previamente à transformação.
[00139] Estirpe E. coli MG1655 foi tornada eletricamente competente através de crescimento das células para um OD600 de 0,6 em meio líquido LB a 37°C, concentrando as células 100 vezes e lavando duas vezes com glicerol gelado a 10%. As células foram transformadas com plasmídeo pKD46 (Datsenko & Wanner, 2000) através de eletroporação (2,5 kV, 200 n, 25 µF, em tigelas de lacuna de 2 mm). Transformantes foram selecionados a 30°C em meio sólido LB ampicillina (100 µg/mL).
[00140] Cassetes de rompimento foram transformados em estirpes eletricamente competentes E. coli abrigando o plasmídeo pKD46 que expressa recombinase lambda Red. As células foram crescidas a 30°C em meio líquido SOB contendo ampicilina (100 µg/ml). O sistema de recombinase lambda red foi induzido através de adição 10 mm de arabinose quando OD600 das culturas alcançou 0,1. Células foram adicionalmente crescidas até um OD600 de 0,6 antes de serem colhidas através de centrifugação, lavadas duas vezes glicerol gelado a 10%, e transformadas com o cassete de rompimento através de eletroporação. Após uma expressão fenotípica durante a noite a 30°C em meio líquido LB, células foram banhadas em meio sólido LB contendo 25 pg/ml de canamicina. Transformantes foram selecionados após cultivo a 30°C.
[00141] A substituição do gene foi verificada através de colônia PCR usando polimerase Crimson Taq (NEB). Uma primeira reação foi executada com os iniciadores específicos lócus de acompanhamento (vide Tabelas 13) para verificar perda simultânea do fragmento parental e ganho do novo fragmento específico de mutante. Duas reações adicionais foram feitas usando iniciadores específicos em lócus próximos com o respectivo iniciador de teste comum k1rev, ou k2for (vide Tabela 13) dentro do cassete de resistência a FRT-canamicina (iniciador lócus sense/k1 rev e k2for/iniciador de lócus inverso).
[00142] O gene de resistência (FRT-kan-FRT) foi subsequentemente extirpado do cromossomo usando o plasmídeo pCP20 que abriga FLP recombinase (Cherepanov & Wackernagel, 1995) deixando uma região de cicatriz contendo um sítio FRT. pCP20 é uma ampicilina e plasmídeo CmR que mostra replicação sensível à temperatura e indução térmica de FLP recombinase síntese. Mutantes resistentes à canamicina foram transformados com pCP20, e transformantes resistentes à ampicilina foram selecionados a 30°C. Transformantes foram então crescidos em meio sólido LB a 37°C e testados quanto à perda de resistências a todos os antibióticos. Extirpação do cassete FRT-canamicina foi analisada pela colônia PCR usando polimerase crimson taq e os iniciadores específicos lócus de acompanhamento (Tabela 13). Exclusões múltiplas foram obtidas através de repetição das etapas descritas acima.
[00143] Estirpes transportando exclusões únicas ou múltiplas foram tornadas eletricamente competentes conforme descrito acima, transformadas com o plasmídeo pTAC-DHB que permite a expressão induzível por IPTG das enzimas da via DHB (vide Exemplo 10), e selecionadas em meio sólido LB contendo 50 µg/ml de canamicina.
[00144] O plasmídeo pACT3-pck que abriga a PEP carboxiquinase codificando gene pck de E. coli foi construído através de amplificação da sequência de codificação pck usando DNA genômico de E. coli MG1655 como o modelo e os iniciadores adiante e inverso, respectivamente, 5’TATAATCCCGGGATGCGCGTTAACAATGGTTTGACC3'. (SEQ ID N° 100) e 5’TATAATTCTAGATTACAGTTTCGGACCAGCCG3' (SEQ ID N° 101). O fragmento de DNA foi digerido com XmaI e XbaI, ligado nos sítios correspondentes do vetor de expressão pACT3 (Dykxhoorn et al., 1996) usando T4 DNA ligase (Biolabs), e transformado em células E. coli DH5a. Os transformantes foram selecionados em meio sólido LB contendo cloramfenicol (25 pg/ml). O plasmídeo resultante foi isolado e inserção correta do gene pck foi verificada por sequenciamento. Plasmídeos pACT3-aceA, pACT3-ppc, pACT3-galP, pACT3-pykA e pACT3-pyc abrigando, respectivamente, aceA, ppc, galP, ou pykA (todos E. coli) ou pycA de Lactococcus lactis foram construídos analogamente usando os iniciadores listados na Tabela 14.
[00145] Os plasmídeos derivados de pACT3 mencionados acima e o plasmídeo pTAC-DHB foram transformados em mutantes E. coli MG1655 transportando combinações das exclusões listadas na Tabela 12. Transformantes contendo ambos os plasmídeos foram selecionados em meio sólido LB contendo cloramfenicol (25 µg/mL) e canamicina (50 pg/ml). Exemplos para estirpes construídas estão listados na Tabela 15.
[00146] Tabela 12: Iniciadores usados para rompimentos de gene. Sequências homólogas a genes alvo estão sublinhadas.
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Tabela 13: Pares de iniciadores usados para verificação de rompimentos de gene
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Tabela 14: Iniciadores usados para superexpressão de gene. Sítios de restrição usados para clonar para pACT3 estão sublinhados.
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Tabela 15: Exemplos de estirpes construídas para produção de DHB
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Exemplo 12: Produção de ácido 2,4-dihidroxibutírico através de fermentação de glicose
[00147] Estirpes e condições de cultivo: Experimentos foram executados com estirpe E. coli ECE1 co-expressando malato quinase, malato semialdeído desidrogenase e DHB desidrogenase do plasmídeo pTAC-DHB (vide Exemplo 11), e uma estirpe de controle isogênico contendo apenas o plasmídeo vazio (ou seja, a estrutura principal pTAC sem as sequências de codificação das enzimas mencionadas acima). Meio de cultura de 1 litro continha 20 g de glicose, 18 g de Na2HPO4 * 12 H2O, 3 g de KH2PO4, 0,5 g de NaCI, 2 g de NH4CI, 0,5 g MgSO4 * 7 H2O, 0,015 CaCl2 * 2 H2O, 1 ml de 0,06 mol/L de FeCI3 de solução estoque preparada em concentrado de HCI diluído 100 vezes, 2 ml de solução estoque HCI de 10 mm de tiamina, 20 g de MOPS, 50 µg de sulfato de canamicina, e 1 ml de solução de elemento de traço (contendo por litro: 0,04 g de Na2EDTA * 2H20, 0,18 g de CoCl2 * 6 H20, ZnSO4 * 7 H2O, 0,04 g Na2MoO4 * 2 H2O, 0,01 g de H3BO3, 0,12 g de MnSO4 * H2O, 0,12 g de CuCl2 * H2O.),. pH foi ajustado para 7 e meio foi esterilizado por filtração. Todos os cultivos foram executados a 37°C em um agitador rotatório Infors funcionando a 170 rpm. Culturas durante a noite (3 ml de meio em tubo de teste) foram inoculadas a partir de estoques de glicerol e usadas para ajustar um OD600 inicial 0,05 em 100 ml de culturas de crescimento cultivadas em frascos de agitação de 500. IPTG foi adicionado a uma concentração de 1 mmol/L quando OD600 nas culturas de crescimento alcançou 0,2.
Estimativa de concentração de DHB através de análise LC-MS/MS:
[00148] Meio de cultura foi separado das células através de centrifugação (Beckmann-Coulter Allegra 21R, Rotor Beckmann S4180, 10 min, 4800 rpm). Sobrenadante claro foi armazenado a -20°C até análise adicional. Teor de DHB foi quantificado usando um HPLC (Waters) equipado uma coluna ACQUITY UPLC BEH (C18, 1,7 µm, 100 x 2,1 mm, Waters), acoplado a um detector sensível a massa (TQ, Waters, modo ESI, tensão capilar: 2,5 kV, tensão cone 25 V, tensão Extrator: 3V, temperatura da fonte: 150°C, temperatura de dessolvatação: 450°C, fluxo de gás cone: 50 L/h, fluxo de gás de dessolvatação: 750 Uh). Temperatura de coluna foi mantida a 30°C. Fase móvel foi uma mistura de 88% de uma solução de tetra-n-butilamônio hidróxido a 0,08%, e 12% de acetonitrila. Taxa de fluxo foi fixada a 0,4 ml/min. Volume de injeção das amostras foi 5 µL.
Resultados:
[00149] O teor de DHB do meio de cultura de estirpe E. coli ECE1 e da estirpe de controle foi estimado a 8h e 24h após a indução da expressão de malato quinase, aspartato semialdeído desidrogenase e DHB desidrogenase através de adição de IPTG. Conforme pode ser visto na Tabela 16, a estirpe ECE1 que expressou as enzimas da via DHB produziu quantidades significativamente maiores de DHB do que a estirpe de controle, demonstrando a possibilidade de produção zimótica de DHB através da via metabólica mostrada na Figura 1 (i). Tabela 16: DHB concentração no meio de cultura de E coli ECE1 e estirpe de controle
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Claims (21)

  1. Método de produção de ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-DHB), caracterizado pelo fato de que compreende:
    • - uma primeira etapa de transformar malato em 4-fosfo-malato usando uma malato quinase, em que a malato quinase é obtida através de pelo menos uma mutação de uma aspartato quinase, referida(s) mutação(ões) melhorando a afinidade de substrato e/ou atividade do polipeptídeo mutado para malato quando comparada com o tipo selvagem da enzima, a aspartato quinase mutada compreende pelo menos uma mutação, quando comparada com o tipo selvagem da enzima, em uma das seguintes posições: S39, T45, V115, E119, F184 e/ou S201, as referidas posições se referindo à SEQ ID No. 4, em que o aminoácido de ocorrência natural na(s) referida(s) posição(ões) é substituído por qualquer um dentre os outros 19 aminoácidos proteinogênicos de ocorrência natural, ou seja, por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina, e preferencialmente, a aspartato quinase mutada compreende adicionalmente pelo menos uma mutação nos seguintes aminoácidos: E250, M318, S321, V339, S338, F324, L325, V339, S345, E346, D340, T344 e/ou T352, as referidas posições se referindo à SEQ ID No. 4, e em que cada um dos referidos aminoácidos é substituído por qualquer um dentre os outros 19 aminoácidos proteinogênicos de ocorrência natural, ou seja, por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina, e mais preferencialmente ainda a malato quinase consiste em SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24, SEQ ID No. 26, SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 43 ou SEQ ID No. 45;
    • - Uma segunda etapa de transformar 4-fosfo-malato em malato-4-semialdeído usando uma malato semialdeído desidrogenase, em que a malato semialdeído desidrogenase é obtida por pelo menos uma mutação de uma aspartato semialdeído desidrogenase, referida(s) mutação(ões) melhorando a afinidade de substrato e/ou atividade do polipeptídeo mutado para 4-fosfo-malato quando comparada com o tipo selvagem da enzima, a aspartato semialdeído desidrogenase mutada compreende pelo menos uma mutação, quando comparada com o tipo selvagem da enzima, em uma das seguintes posições: T136, Q162, I230, E241 e/ou H274, as referidas posições se referindo à SEQ ID No. 20, em que o aminoácido de ocorrência natural nas referidas posições é substituído por qualquer um dentre os outros 19 aminoácidos proteinogênicos de ocorrência natural, ou seja, por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina, e mais preferencialmente a aspartato semialdeído desidrogenase mutada consiste em SEQ ID No. 68, e mais especificamente SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 64 ou SEQ ID No. 66 ou SEQ ID No. 231;
    • - Uma terceira etapa de transformar malato-4-semialdeído em 2,4-DHB usando uma DHB desidrogenase escolhida dentre semialdeído succínico redutase compreendendo pelo menos uma mutação, quando comparada com o tipo selvagem da enzima, referida(s) mutação(ões) melhorando a afinidade de substrato e/ou atividade da enzima mutada para malato-4-semialdeído quando comparada com o tipo selvagem da enzima em uma das seguintes posições: S40, N43, H39, T49, F85, Q108, L281 e/ou N305, as posições se referindo a SEQ ID No. 76, em que o aminoácido de ocorrência natural em referidas posições é substituído por qualquer um dentre os outros 19 aminoácidos proteinogênicos de ocorrência natural, ou seja, por alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutâmico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina ou valina, e mais particularmente ainda a referida enzima consiste em SEQ ID No. 74, SEQ ID No. 76 ou SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 225 ou SEQ ID No. 227.
  2. Malato quinase, caracterizada pelo fato de que transforma malato em 4-fosfo-malato e consiste em SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 20, SEQ ID No. 22, SEQ ID No. 24 ou SEQ ID No. 26.
  3. Malato quinase, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de ser representada por SEQ ID No. 39, SEQ ID No. 41, SEQ ID No. 43 ou SEQ ID No. 45.
  4. Malato semialdeído desidrogenase, caracterizada pelo fato de que transforma 4-fosfo-malato em malato-4-semialdeído e consiste em SEQ ID No. 68, SEQ ID No. 54, SEQ ID No. 56, SEQ ID No. 58, SEQ ID No. 60, SEQ ID No. 62, SEQ ID No. 64, SEQ ID No. 66 ou SEQ ID No. 231.
  5. DHB desidrogenase, caracterizada pelo fato de que transforma malato-4-semialdeído em 2,4-DHB e consiste em SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 225 ou SEQ ID No. 227.
  6. Sequência de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que codifica uma malato quinase, conforme definida na reivindicação 2 ou 3, consistindo em SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 17, SEQ ID No.19, SEQ ID No. 21, SEQ ID No. 23, SEQ ID No. 25, SEQ ID No. 27, SEQ ID No. 38, SEQ ID No. 40, SEQ ID No. 42 ou SEQ ID No. 44.
  7. Sequência de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que codifica uma malato semialdeído desidrogenase, conforme definida na reivindicação 4, consistindo em SEQ ID No. 55, SEQ ID No. 57, SEQ ID No. 59, SEQ ID No. 61, SEQ ID No. 63, SEQ ID No. 65, SEQ ID No. 67, ou SEQ ID No. 230.
  8. Sequência de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que codifica DHB desidrogenase, conforme definida na reivindicação 5, consistindo em SEQ ID No. 82, SEQ ID No. 224, SEQ ID No. 226 ou SEQ ID No. 228.
  9. Gene quimérico, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos na direção de transcrição, funcionalmente ligada, uma sequência reguladora promotora que é funcional em um organismo hospedeiro, pelo menos um dentre a sequência de ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8 e uma sequência reguladora do terminador que é funcional no referido organismo hospedeiro.
  10. Gene quimérico, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de ser representado por SEQ ID No. 229.
  11. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende um ácido nucleico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 6 a 8 ou um gene quimérico, conforme definido na reivindicação 9 ou 10.
  12. Micro-organismo hospedeiro, caracterizado pelo fato de ser Escherichia coli e ser transformado para expressar uma malato quinase, e/ou uma malato semialdeído desidrogenase e/ou uma DHB desidrogenase conforme definida nas reivindicações 2 a 5.
  13. Micro-organismo hospedeiro, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de ser transformado com pelo menos um dos ácidos nucleicos, conforme definido nas reivindicações 6 a 8, com pelo menos um gene quimérico, conforme definido na reivindicação 9 ou 10 e/ou com pelo menos um vetor de expressão, conforme definido na reivindicação 11.
  14. Micro-organismo hospedeiro, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente um rompimento em pelo menos um dos seguintes genes: ldhA, adhE, ackA, focA-pflB, pta, poxB, sad, gabD, gadA, gadB, gadC, sfcA, maeB, ppc, pykA, pykF, mgsA, icIR, icd, sucA, sucB, frdA, frdB, frdC, frdD, ptsG, ptsl, e/ou superexpressar pelo menos um dos seguintes genes: Ec_pck, Ec_ppc, Ec_pykA, Ec_aceA, Ll_pycA, Ec_gaIP.
  15. Processo de produção de 2,4-DHB, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cultivar um micro-organismo hospedeiro, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 14, expressando uma malato quinase, uma malato semialdeído desidrogenase e uma DHB desidrogenase.
  16. Processo de produção de 2,4-DHB, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo hospedeiro é cultivado em um meio onde malato ou outro ácido orgânico tal como piruvato, succinato ou fumarato é adicionado.
  17. Processo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura compreende adicionalmente outra fonte de carbono.
  18. Método de produção de 2,4 DHB, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma primeira etapa de produção de malato ou outro ácido orgânico através de um micro-organismo superprodutor de malato.
  19. Uso de uma metilbutiraldeído redutase ou de uma semialdeído succínico redutase, caracterizado pelo fato de que é para transformar malato-4-semialdeído em 2,4-DHB, em que a metilbutiraldeído redutase consiste em SEQ ID No. 74, e a semialdeído succínico redutase consiste em SEQ ID No. 76, SEQ ID No. 81, SEQ ID No. 225 ou SEQ ID No. 227.
  20. Uso de uma malato quinase, conforme definida na reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que é para transformar malato em 4-fosfo-malato.
  21. Uso de malato semialdeído desidrogenase, conforme definida na reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que é para transformar 4-fosfo-malato em malato-4-semialdeído.
BR112013010268-3A 2010-10-28 2011-10-27 Método de produção de ácido 2,4-dihidroxibutírico (2,4-dhb), malato quinase e seu uso, malato semialdeído desidrogenase e seu uso, dhb desidrogenase, sequência de ácido nucleico isolado, gene quimérico, vetor de expressão, microorganismo hospedeiro, processo de produção de 2,4-dhb, uso de uma metilbutiraldeído redutase ou de uma semialdeído succínico redutase BR112013010268B1 (pt)

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