JP6342385B2 - ２，４−ジヒドロキシ酪酸を生成する方法 - Google Patents

Description

本発明は、マレートおよび／またはグリオキシレートおよび／またはスクシニルＣｏＡをマリルＣｏＡに、マリルＣｏＡをマレート−４−セミアルデヒドに変換し、次いで前記マレート−４−セミアルデヒドを、２，４−ジヒドロキシ酪酸（２，４−ＤＨＢ）に変換する合成経路を行うことにより、マレートおよび／またはグリオキシレートおよび／またはスクシニルＣｏＡから２，４−ジヒドロキシ酪酸を生成する新規な方法に関する。

本出願内に列挙するカルボン酸は、その塩（例えば、２，４−ジヒドロキシブチレート）または酸の形態（例えば、２，４−ジヒドロキシ酪酸）のもとに等しく命名されるものである。

２，４−ジヒドロキシ酪酸（等しく、２，４−ＤＨＢまたはＤＨＢ）は、経済的な関心を相当集めている化合物である。ＤＨＢは、水性媒質中、適切なｐＨに調節することにより、α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンに容易に変換することができる。α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、動物栄養において大きな市場を有する、メチオニン代替品である２−ヒドロキシ−４−（メチルチオ）−ブチレート（ＨＭＴＢ）（ＵＳ２００９／３１８７１５）の生成に卓越した前駆物質である。現在、α−ヒドロキシ−γ−ブチロラクトンは、γ−ブチロラクトンのα位におけるハロゲン化、引き続きアルカリ媒質中のハロゲン原子のヒドロキシル基による置換を伴う多段プロセスにより、γ−ブチロラクトンから派生する（ＵＳ２００９／３１８７１５）。

原油価格の増大から、ＤＨＢを再生可能な資源から生成する必要性が生じている。微生物は、バイオマス由来の原料、例えば、糖または有機酸を、多種多様な異なる化学物質に変換することができる（ＷｅｒｐｙおよびＰｅｔｅｒｓｅｎ、２００４）。生化学情報およびゲノム情報量の増大に伴い、微生物が天然に生じる代謝中間体を高収率および高生産性で過剰生産するように、微生物を修飾することが可能である（Ｂａｉｌｅｙ、１９９１）。生成する微生物の最適化はしばしば、数ある中でも対象の代謝産物の生合成に必要とされる酵素の過剰発現、および生成物のフィードバック阻害の軽減を確実にする代謝ネットワークの合理的な操作を必要とする。別の一可能性は、対象の代謝産物の生成を触媒する新規な酵素系の実行である。

代謝工学の取組み、および酵素触媒は、対象の代謝産物に通じる代謝経路の生化学および調節の詳しい知識を必要とする。２，４−ＤＨＢ生成の場合、この情報は入手可能ではない。スクシニックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損を有する患者における２，４−ＤＨＢの出現を報告する研究がいくつかあるが（Ｓｈｉｎｋａら、２００２）、ＤＨＢ生成に関係する酵素反応は同定されていない。したがって、２，４−ＤＨＢの、発酵による生成または酵素的生成には、（ｉ）身近な前駆物質を２，４−ＤＨＢに変換する熱力学的に実行可能な経路の同定、（ｉｉ）経路において個々の反応工程を触媒することができる酵素の同定または構築、および（ｉｉｉ）適切な生成生物体におけるその経路酵素の機能的発現が必要とされる。

本発明は、一目的として、これらの必要性を満たす必要がある。

したがって、本発明の一目的は、マレートおよび／またはグリオキシレートおよび／またはスクシニルＣｏＡをマリルＣｏＡに変換する第１の工程と、マリルＣｏＡをマレート−４−セミアルデヒドに変換する第２の工程と、マレート−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換する第３の工程とを含む、２，４−ＤＨＢを生成する方法である。

したがって、本発明の一目的は、マレートを、マリルＣｏＡシンテターゼ活性を保有する酵素の作用によってマリルＣｏＡに変換し［１．１］、かつ／またはスクシニルＣｏＡを、スクシニルＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有する酵素の作用によってマリルＣｏＡに変換し［１．２］、かつ／またはグリオキシレートを、マリルＣｏＡリアーゼ活性を保有する酵素の作用によってマリルＣｏＡに変換する［１．３］、第１の反応（図１を参照されたい）を含む、２，４−ＤＨＢを生成する方法である。第２の反応において［２］、マリルＣｏＡを、マリルＣｏＡレダクターゼ活性を保有する酵素の作用によってマレート−４−セミアルデヒドに変換する。第３の反応において［３］、マレート−４−セミアルデヒドを、ＤＨＢデヒドロゲナーゼ活性を保有する酵素の作用によってＤＨＢに変換する。より正確に、反応［３］は、経路の生合成的意味において、マレート−４−セミアルデヒドレダクターゼ活性を担う酵素によって触媒される。

本発明の別の一側面内では、２，４−ＤＨＢを生成する方法の第１の工程は、マレート、スクシニルＣｏＡ、またはグリオキシレートをマリルＣｏＡにそれぞれ変換する、マリルＣｏＡシンテターゼ（マレートチオキナーゼまたはマレートコエンザイムＡリガーゼ（ＡＤＰ形成性）ＥＣ６．２．１．９と等しく命名された）、スクシニルＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．３）、またはマリルＣｏＡリアーゼ（ＥＣ４．１．３．２４）活性を有する酵素に関与する。

前記酵素は、ホルムアルデヒドの固定にセリンサイクルを使用するメチロトローフ細菌において（Ｃｈｉｓｔｏｓｅｒｄｏｖａら、２００９；Ｓｍｅｊｋａｌｏｖａら、２０１０；Ｖｕｉｌｌｅｕｍｉｅｒら、２００９）、グリオキシレートサイクルおよびイソシトレートリアーゼ活性と独立のアセテート同化経路に依存する細菌において（Ｍｅｉｓｔｅｒら、２００５）、ならびに独立栄養性の増殖に３−ヒドロキシプロピオネートＣＯ２固定サイクルを使用する細菌において（Ｚａｒｚｙｃｋｉら、２００９）同定されている。

上記の酵素と相同性を共有するタンパク質、例えば、機能的バリアントまたは機能的フラグメントも、本発明の別の一側面である。

マリルＣｏＡシンテターゼは、２つのサブユニットであるＭｔｋＡおよびＭｔｋＢからなる。したがって、本発明によると、マリルＣｏＡシンテターゼ活性を含んでいるタンパク質は、メチリビウムペトロレイフィルム（M.petroleiphilum）（ＹＰ ００１０２２４４４およびＹＰ ００１０２２４４５）メチロバクターエクストロケンス（Methylobacter extorquens）（ＹＰ００２９６２８５１およびＹＰ ００２９６２８５２）のマリルＣｏＡシンテターゼサブユニットであるＭｔｋＡおよびＭｔｋＢ、またはメチロコッカスカプスラツス（M.capsulatus）（ＹＰ １１４１７９およびＹＰ １１４１８０）のＳｕｃＣおよびＳｕｃＤの２つのサブユニットのタンパク質配列と、少なくとも３０％の同一性、優先的に少なくとも５０％、より優先的に７０％の同一性を有する全てのポリペプチドを指定する。

マリルＣｏＡリアーゼはホモ６量体であり、アセテート同化にグリオキシレートサイクルを使用しない細菌において見出される（Ｍｅｉｓｔｅｒら、２００５）。したがって、本発明によると、マリルＣｏＡリアーゼ活性を含んでいるタンパク質は、メチロバクターエクストロケンス、ロドバクターカプスラツス（Rhodobacter capsulatus）、またはストレプトミセスセリカラー（Streptomyces coelicolor）のマリルＣｏＡリアーゼであるＭｃｌのタンパク質配列に、少なくとも３０％の同一性、優先的に少なくとも５０％、より優先的に７０％の同一性を有する全てのポリペプチドを指定する。

本発明のさらなる一側面において、本発明のマリルＣｏＡリアーゼは、配列番号１によって、またはその任意のバリアントによって表される。

スクシニル−ＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼは、２つのサブユニットであるＳｍｔＡおよびＳｍｔＢからなる（Ｚａｒｚｙｃｋｉら、２００９）（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎら、２００６）。したがって、本発明によると、スクシニル−ＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質は、クロロフレクサスアウランティアカス（Chloroflexus aurantiacus）のスクシニル−ＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼサブユニットのＳｍｔＡおよびＳｍｔＢのタンパク質配列（配列番号１９１および配列番号１９３によって表され、または配列番号１９２および配列番号１９４によってコードされる）に、少なくとも３０％の同一性、優先的に少なくとも５０％、より優先的に７０％の同一性を有する全てのポリペプチドを指定する。

より一般的に、本発明の意味内で、２つのタンパク質配列間の同一性は、当業者にはよく知られている方法によって決定することができる。このような方法の例には、ＣＬＵＳＴＡＬＷ （Ｌａｒｋｉｎら、２００７）ソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／、デフォルトパラメータはウエブサイト上に示される）またはＢＬＡＳＴアラインメントプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ、デフォルトパラメータはウエブサイト上に示される）の使用がある。

機能的バリアントの語は、本出願内に具体的に記載する配列に比べた場合、実質的な配列の修飾を表してもよいが、オリジナルの酵素活性を依然として保持する酵素を包含する。

機能的フラグメントの語は、本発明によると、酵素の配列に含まれるアミノ酸がオリジナルのものよりも少なくてもよいが、前記切断された酵素はオリジナルの酵素活性を依然として保持することを意味する。

前記酵素の改善は、少なくとも１つの変異によって得られてもよく、前記変異は、変異した酵素の、マレート、スクシニルＣｏＡ、またはグリオキシレートのそれぞれに対する活性および／または基質親和性を改善する。

本発明内で、「活性および／または基質親和性を改善する」との表現は、変異前の酵素が、
−基質を用いることができず、かつ／または
−反応の生成物を合成する最大特異的速度が少なくとも３倍低い、かつ／または
−マレート、スクシニルＣｏＡ、もしくはグリオキシレート、マリルＣｏＡ、もしくはマレート−４−セミアルデヒドに対する親和性が少なくとも２倍、より好ましくは３倍低い、
のいずれかであったことを意味する。

マリルＣｏＡシンテターゼおよびマリルＣｏＡリアーゼの活性は、それぞれ（Ｓｍｅｊｋａｌｏｖａら、２０１０）または（Ｍｅｉｓｔｅｒら、２００５）によって記載される酵素試験により測定することができる。スクシニル−ＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ活性は、（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎら、２００６）によって記載される通りに測定することができる。

なおさらなる一側面内で、本発明による２，４−ＤＨＢを生成する方法の第２の工程は、マリルＣｏＡをマレート−４−セミアルデヒドに変換することを特徴とするマリルＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素に関与する。

前記酵素は、マロニルＣｏＡレダクターゼ、スクシニルＣｏＡレダクターゼ、もしくは報告されている３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ、もしくはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素の間で同定することができ、またはこれらは前記酵素の修飾により得ることができる。

マロニルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７５）およびスクシニルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．７６）は、二酸化炭素固定のための修飾３−ヒドロキシプロピオネートサイクルを保有する細菌において（Ａｌｂｅｒら、２００６；Ｋｏｃｋｅｌｋｏｒｎ＆Ｆｕｃｈｓ、２００９）、および嫌気性スクシネート分解経路（Ｓｅｅｄｏｒｆら、２００８；Ｓｏｈｌｉｎｇ＆Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ、１９９３）を使用する細菌において見出された。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３８、ＥＣ１．１．１．８８）は、真核生物およびいくつかの細菌におけるイソプレノイドの生合成経路の一部である。シンナモイルＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．２．１．４４）は、リグニン生合成に関係する酵素である（Ｋａｗａｓａｋｉら、２００６）。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．２．１．１０）は、非常に多様な細菌において見出され、エタノール生成経路への進入またはアセトアルデヒドの解毒を触媒する。

本発明のさらなる一側面内で、マリルＣｏＡレダクターゼは、配列番号７もしくは配列番号１０によって、またはその任意の機能的バリアントもしくはその任意の機能的フラグメントによって表される。

したがって、本発明によると、マロニルＣｏＡレダクターゼ活性を有するタンパク質は、スルホロブストコダイイ（Sulfolobus tokodaii）のマロニルＣｏＡレダクターゼであるＭｃｒ（配列番号７）のタンパク質配列に少なくとも３０％の同一性を有する全てのポリペプチドを指定する。優先的に、これらは少なくとも５０％、より優先的に７０％の同一性を有する。

クロロフレクサスアウランティアカス（Chloroflexus auranthiacus）のマロニルＣｏＡレダクターゼ（配列番号１９０によってコードされる配列番号１８９）は、本発明の別の一側面を構成する。クロロフレクサスアウランティアカスのタンパク質配列に少なくとも３０％の同一性を有するポリペプチドも本発明の一部である。優先的に、これらは少なくとも５０％、より優先的に７０％の同一性を有する。

したがって、本発明によると、スクシニルＣｏＡレダクターゼ活性を有するタンパク質は、ポルフィロモナスジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）のスクシニルＣｏＡレダクターゼであるＳｕｃＤのタンパク質配列（配列番号１０）に、または二機能性のスルホロブストコダイイのマロニルＣｏＡおよびスクシニルＣｏＡレダクターゼであるＭｃｒ（配列番号７）に、少なくとも３０％の同一性を有する全てのポリペプチドを指定する。優先的に、これらは少なくとも５０％、より優先的に７０％の同一性を有する。

マリルＣｏＡレダクターゼ活性は、例２に記載する酵素試験により測定することができる（「酵素アッセイ」を参照されたい）。

この酵素活性は、酵素の少なくとも１つの変異により改善することができ、前記変異は、変異した酵素のマリルＣｏＡに対する活性および／もしくは基質親和性を改善し、または天然の基質に対する変異した酵素の活性を低減する。

本発明は、改善した活性を有する修飾されたマリルＣｏＡレダクターゼも包含する。

本発明によるマリルＣｏＡレダクターゼは、具体的な一側面において、野生型酵素に比べた場合、Ｐ１１１、Ｌ１５２、Ｔ１５４、Ｌ２０２、Ｇ２０３、Ｄ２０４、Ｙ２０６、Ｄ２０７、Ｋ２０９、Ｔ２１０、Ｔ２３８、Ｔ２３９、Ｄ２９５、Ｒ３１８の少なくとも１つの位置に少なくとも１つの変異を含む、スルホロブストコダイイのマロニルＣｏＡレダクターゼに相当し、前記位置における天然に生じるアミノ酸は、他の１９種類の天然に存在する、タンパク質構成（proteinogenic）アミノ酸のいずれか１つによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって置きかえられている。

別の一側面内で、本発明による２，４−ＤＨＢを生成する方法の第３の工程は、ＤＨＢデヒドロゲナーゼがマレート−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換することを特徴とし、前記酵素が経路の生合成的意味においてマレート−４−セミアルデヒドレダクターゼ活性を担う、ＤＨＢデヒドロゲナーゼに関与する。

ＤＨＢデヒドロゲナーゼ活性を潜在的にすでに保有する、候補のＤＨＢデヒドロゲナーゼ酵素は、Ｃ３、Ｃ４、またはＣ５化合物に対して作用するベータヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼのクラスから選択することができる。

本発明のなおさらなる一側面によると、前記ＤＨＢデヒドロゲナーゼ酵素は、βヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼ、例えば、タルトロネートセミアルデヒドレダクターゼ、スクシネートセミアルデヒドレダクターゼ、４−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、マロネートセミアルデヒドレダクターゼ、メチルブチルアルデヒドレダクターゼ、亜鉛型アルコールデヒドロゲナーゼ、Ｌ−スレオニン−３−デヒドロゲナーゼ、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、またはホモセリンデヒドロゲナーゼと、構造的かつ機構的に関連し得る。

本発明は、マレート−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換するための、メチルブチルアルデヒドレダクターゼ、もしくはスクシニックセミアルデヒドレダクターゼ（４−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼと等しく命名される）の使用、またはアルコールデヒドロゲナーゼの使用も取り扱う。

本発明の別の具体的な一側面において、ＤＨＢデヒドロゲナーゼは、サッカロミセスセレビシエ（S. cerevisiae）のメチルブチルアルデヒドレダクターゼ（Ｙｐｒ１）、メタロスファエラセデュラ（M.sedula）のスクシニックセミアルデヒドレダクターゼ、ポルフィロモナスジンジバリスの４−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ（４ｈｂｄ）、または大腸菌（Escherichia coli）のアルコールデヒドロゲナーゼ（ＹｑｈＤ）に相当する。

具体的な態様において、前記メチルブチルアルデヒドレダクターゼは配列番号１４によって表され、前記スクシニックセミアルデヒドレダクターゼは配列番号１６によって表され、前記４−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼは配列番号１８７によって表され、前記アルコールデヒドロゲナーゼは配列番号１８５によって表される。ＤＨＢデヒドロゲナーゼ活性は、例３に記載する酵素試験によって測定することができる（「酵素アッセイ」を参照されたい）。

ＤＨＢデヒドロゲナーゼのマレート−４−セミアルデヒドに対する親和性は、酵素の少なくとも１つの変異によって増大することができ、前記変異は、変異した酵素のマレート−４−セミアルデヒドに対する活性および／もしくは基質親和性を増大し、かつ／またはその天然の基質に対する活性もしくは親和性を少なくとも２ファクター低減する。

本発明によるＤＨＢデヒドロゲナーゼは、具体的な一側面において、野生型酵素に比べた場合、少なくとも１つの変異を、Ｓ４０、Ｎ４３、Ｈ３９、Ｔ４９、Ｆ８５、Ｑ１０８、Ｌ２８１、およびＮ３０５の少なくとも１つの位置に含むメタロスファエラセデュラのスクシニックセミアルデヒドレダクターゼ（配列番号１６）に相当し、前記位置における天然に生じるアミノ酸は、他の１９種類の天然に存在する、タンパク質アミノ酸のいずれか１つによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって置きかえられている。

非排他的な一例において実証する通り、メタロスファエラセデュラのスクシニックセミアルデヒドレダクターゼの（Ｌ）−マレート−４−セミアルデヒドに対する親和性は、配列番号３６によって表す通り、Ｈ３９Ｒ Ｎ４３Ｈの二重変異を、部位特異的突然変異誘発によって導入することにより増大した。Ｈ３９Ｒの単一の変異体（配列番号３２）およびＮ４３Ｈの単一の変異体（配列番号３４）も、本発明により包含される（例５）。

ＤＨＢデヒドロゲナーゼを用いて、マレート−４−セミアルデヒドを２，４−ＤＨＢに変換することができ、これは本発明のさらなる一側面を構成する。

遺伝子の核酸配列を、宿主生物体のコドン使用頻度に適応させ、それにより異種性に発現されたタンパク質の生成を増大することができる。これは本発明のさらなる一側面を構成する。

ヌクレオチド配列が、配列番号３８によって表されるように大腸菌における発現に最適化された、メタロスファエラセデュラのスクシニックセミアルデヒドレダクターゼＨ３９Ｒ Ｎ４３Ｈをコードする合成遺伝子の合成は、本発明のさらなる一側面である。

なおさらなる一側面において、本発明は、核酸、より特にマリルＣｏＡシンテターゼをコードする単離された核酸配列も取り扱う。

なおさらなる一側面において、本発明は、マリルＣｏＡリアーゼをコードする単離された核酸配列、より具体的には配列番号２によってコードされる単離された核酸配列を取り扱う。

なおさらなる一側面において、本発明は、マリルＣｏＡレダクターゼをコードする単離された核酸配列、より具体的には配列番号８、配列番号１１、または配列番号１９０によってコードされる単離された核酸配列を取り扱う。

なおさらなる一側面において、本発明は、上記に記載したＤＨＢデヒドロゲナーゼをコードする単離された核酸配列も取り扱う。

別の一側面において、前記核酸は、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３７、配列番号１８６、または配列番号１８８によって表される。

本発明によると、「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖の形態のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子を意味する。ここで用いられる「単離されたＤＮＡ」は、天然に生じず、またはそれがもともと存在していた天然の環境中に最早ないＤＮＡ、例えば、キメラ遺伝子における他の制御エレメントに関連するＤＮＡコード配列、別の宿主細胞中に移されたＤＮＡ、または任意の天然に生じるＤＮＡ配列に比べて異なるヌクレオチド配列を有する人工の、合成で作られたＤＮＡ配列を意味する。

本発明は、相互に機能的に連結している、宿主生物体において機能的である少なくとも１つのプロモーター；本発明により規定するマリルＣｏＡシンテターゼまたはマリルＣｏＡリアーゼ、マリルＣｏＡレダクターゼ、マロニルＣｏＡレダクターゼ、スクシニルＣｏＡレダクターゼ、またはＤＨＢデヒドロゲナーゼ活性のいずれか１つをコードするポリヌクレオチド；および同じ宿主生物体において機能的であるターミネーターエレメントを含んでいるキメラ遺伝子にも関する。キメラ遺伝子が含んでいてもよい様々なエレメントは、第１に、転写、翻訳、およびタンパク質の成熟を制御するエレメント、例えばプロモーター、シグナルペプチドもしくは輸送ペプチドをコードする配列、またはポリアデニル化シグナルを構成するターミネーターエレメント、第２に、タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。「相互に機能的に連結している」の表現は、これらのエレメントの１つの機能が別のものによって影響を受けるようなやりかたで、キメラ遺伝子の前記エレメントが相互に連結していることを意味する。例によると、プロモーターは、プロモーターが前記コード配列の発現に影響を及ぼすことができる場合は、コード配列に機能的に連結している。本発明によるキメラ遺伝子の構築、およびその様々なエレメントの組立ては、当業者によく知られている技術を用いて行うことができる。キメラ遺伝子を構成する制御エレメントの選択は、これらが機能しなければならない宿主生物体に本質的に依存するものであり、当業者であれば、所与の宿主生物体において機能的である制御エレメントを選択することができる。「機能的な」との語は、所与の宿主生物体において機能を果たすことができることを意味するものとされる。

本発明によるキメラ遺伝子が含んでいてもよいプロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかである。例によると、細菌における発現に用いられるプロモーターを、以下に言及するプロモーターから選択してもよい。大腸菌における発現に対して、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ａｒａＢＡＤ、ｐｒｏｕ、ｃｓｔ−ｌ、ｔｅｔＡ、ｃａｄＡ、ｎａｒ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｌｐｐ−ｌａｃ、Ｐｓｙｎ、ｃｓｐＡ、ＰＬ、ＰＬ−９Ｇ−５０、ＰＲ−ＰＬ、Ｔ７、［ラムダ］ＰＬ−ＰＴ７、Ｔ３−ｌａｃ、Ｔ５−ｌａｃ、Ｔ４遺伝子３２、ｎｐｒＭ−ｌａｃ、ＶＨｂ、およびプロテインＡプロモーター、または他にＰｔｒｐプロモーターを言及してもよい（ＷＯ９９／６４６０７）。グラム陽性細菌、例えば、コリネバクテリウム（Corynebacteria）またはストレプトミセス（Streptomyces）における発現に対して、ＰｔｉｐＡまたはＰＳ１およびＰＳ２（ＦＲ９１／０９８７０）プロモーター、またはＥＰ０６２９６９９ Ａ２出願に記載されているものを言及してもよい。酵母および真菌における発現に対して、クルベイロミセスラクチス（K.lactis）のＰＬＡＣ４プロモーター、またはクルベイロミセスラクチスのＰｐｇｋプロモーター（特許出願ＦＲ９１／０５２９４）、トリコデルマ（Trichoderma）のｔｅｆ１またはｃｂｈ１プロモーター（ＷＯ９４／０４６７３）、ペニシリウム（Penicillium）のｈｉｓ、ｃｓｌ、またはａｐｆプロモーター（ＷＯ００／６８４０１）、およびアスペルギルス（Aspergillus）のｇｌａプロモーターを言及してもよい。

本発明によると、キメラ遺伝子は、プロモーターとコード配列との間に位置する、他の制御配列、例えば、転写アクチベーター（エンハンサー）も含んでいてもよい。

したがって、本発明のキメラ遺伝子は、少なくとも具体的な一態様において、転写の方向において機能的に連結している、宿主生物体において機能的であるプロモーター制御配列、マリルＣｏＡシンテターゼをコードする核酸配列、および／または本発明の、スクシニルＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ、および／またはマリルＣｏＡリアーゼ、マリルＣｏＡレダクターゼ、およびＤＨＢデヒドロゲナーゼ、ならびに前記宿主生物体において機能的であるターミネーター制御配列を含んでいる。

本発明はまた、本発明によるキメラ遺伝子、または本発明の核酸配列を含んでいる、クローニングベクターおよび／または発現ベクターに関する。本発明によるベクターは、宿主生物体を形質転換するのに、およびこの生物体においてマリルＣｏＡシンテターゼ、および／またはスクシニルＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ、および／またはマリルＣｏＡリアーゼ、マリルＣｏＡレダクターゼ、および／またはＤＨＢデヒドロゲナーゼのいずれか１つを発現させるのに有用である。このベクターは、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスであってもよい。優先的に、本発明による形質転換ベクターはプラスミドである。一般的に、このベクターの主な品質は、それ自体を維持する能力、ならびに宿主生物体の細胞において、特に複製開始点の存在によって、自己複製する能力、ならびにマリルＣｏＡシンテターゼ、および／またはスクシニルＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ、および／またはマリルＣｏＡリアーゼ、マリルＣｏＡレダクターゼ、および／またはＤＨＢデヒドロゲナーゼのいずれか１つをその中で発現させる能力でなければならない。宿主生物体の安定な形質転換の目的で、ベクターをまた、ゲノム中に組み入れてもよい。このようなベクターの選択、および本発明によるキメラ遺伝子をこのベクター中に挿入する技術は、当業者の一般的知識の一部である。有利には、本発明において用いられるベクターはまた、本発明によるキメラ遺伝子に加えて、選択マーカーをコードするキメラ遺伝子も含んでいる。この選択マーカーにより、効果的に形質転換されている宿主生物体、すなわち、ベクターを組み入れたものを選択することが可能になる。本発明の特定の態様によると、形質転換しようとする宿主生物体は、細菌、酵母、真菌である。用いることができる選択マーカーの中で、抗生物質に対する耐性のための遺伝子、例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含んでいるマーカーを言及してもよい。他のマーカーは、栄養要求性を補完するための遺伝子、例えば、ｐｙｒＡ、ｐｙｒＢ、ｐｙｒＧ、ｐｙｒ４、ａｒｇ４、ａｒｇＢ、およびｔｒｐＣ遺伝子、モリブドプテリンシンターゼ遺伝子、またはアセタミダーゼ（acetamidase）の遺伝子であってもよい。容易に同定できる酵素、例えば、ＧＵＳ酵素をコードする遺伝子、または形質転換された細胞において色素もしくは色素の生成を制御する酵素をコードする遺伝子も言及してもよい。このような選択マーカーの遺伝子は特に、特許出願ＷＯ９１／０２０７１、ＷＯ９５／０６１２８、ＷＯ９６／３８５６７、およびＷＯ９７／０４１０３に特に記載されている。

本発明は、これらのゲノム中に組み入れられる、または染色体外遺伝エレメント、例えば、プラスミド上に保有されるいずれかの、本発明によるキメラ遺伝子を少なくとも１つ含んでいる形質転換された宿主生物体にも関する。本発明のより具体的な一側面において、形質転換された宿主生物体は、マリルＣｏＡシンテターゼ活性、および／もしくはスクシニルＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ、および／もしくはマリルＣｏＡリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする本発明の核酸；またはマリルＣｏＡシンテターゼ活性、および／もしくはスクシニルＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ、および／もしくはマリルＣｏＡリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでいるキメラ遺伝子；またはマリルＣｏＡシンテターゼ活性、および／もしくはスクシニルＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼおよび／もしくはマリルＣｏＡリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでいる発現ベクター；ならびに／またはマリルＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸；またはマリルＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでいるキメラ遺伝子；またはマリルＣｏＡレダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでいる発現ベクター；ならびに／またはＤＨＢデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸；ＤＨＢデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでいるキメラ遺伝子；またはＤＨＢデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含んでいる発現ベクターを含んでいる。

異種性の酵素の宿主生物体における活性はしばしば、これら酵素の溶解性が劣り、封入体を形成することによって制限される。したがって、本発明はまた、機能的な酵素が宿主生物体において発現される時にその活性を増大させるために、別のタンパク質またはペプチドに物理的に融合しているという点で、キメラタンパク質（融合タンパク質と等しく命名される）に関する。このような融合タンパク質は当技術分野において知られており、以下の非排他的な例の中から一般的に選択される：マルトース結合性タンパク質Ｍｂｐ、チオレドキシンＴｈｒＸ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼＧｓｔ、転写終結因子ＮｕｓＡ。

「宿主生物体」との語は、２，４−ＤＨＢを生成するために、その中に本発明によるキメラ遺伝子、核酸、またはベクターが導入されてもよい、任意の下等な単細胞生物体を意味するものとされる。好ましくは、宿主生物体は、微生物、特に、真菌、例えば、ペニシリウム、アスペルギルス、より特に黄色コウジ菌（Aspergillus flavus）、クリソスポリウム（Chrysosporium）、またはトリコデルマ（Trichoderma）属、酵母、特にサッカロミセス科（Saccharomycetaceae）、ピキア科（Pichiaceae）、またはシゾサッカロミケス科（Schizosaccharomycetaceae）、最も優先的にサッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ（Schizosaccharomycespombe）、クルイベロミセスラクチス、クルイベロミセスマルキスアヌス（Kluyveromyces marxianus）、またはピキアジャディニ（Pichia jadinii）、ピキアスティピティス（Pichia stipitis）、またはピキアパストリス（Pichia pastoris）；腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、クロストリジウム科（Clostridiaceae）、バシラス科（Bacillaceae）、ストレプトミセス科（Streptomycetaceae）、ストレプトコッカス科（Streptococcaceae）、メチロバクテリウム科（Methylobacteriacae）、およびコリネバクテリウム科（Corynebacteriaceae）、最も優先的に、大腸菌、枯草菌（Bacillus subtilis）、コリネバクテリウムグルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、クロストリジウムアセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、メチロバクテリウムエキストロクエンス（Methylobacterium extorquens）、または乳酸菌（Lactococcus lactis）の中から優先的に選択される細菌である。

宿主生物体は、糖、例えば、グルコースからマレートもしくはスクシネートを天然に過剰生成する宿主生物体、または糖、例えば、グルコースからマレートもしくはスクシネートを過剰生成するように操作され、かつ有機酸、例えば、マレート、ピルベート、スクシネート、およびフマレートの搬出を促進する潜在的な膜輸送体が全て欠失している宿主生物体であってもよい。宿主生物体は、ＤＨＢを過剰生成するように操作され、かつ有機酸、例えば、マレート、ピルベート、スクシネート、およびフマレートの搬出を促進する膜輸送体が欠失している生物体であってもよい。マレートおよび他の有機酸の搬出を促進するパーミアーゼの例として、シゾサッカロミセスポンベからのＭａｅ１（Ｃａｍａｒａｓａら、２００１）（Ｇｒｏｂｌｅｒら、１９９５）、枯草菌からのＤｃｔＡ（Ｇｒｏｅｎｅｖｅｌｄら、２０１０）、大腸菌からのＤｃｔ１−４、サッカロミセスセレビシエからのＪｅｎ１（Ａｋｉｔａら、２０００）がある。一専門家にとって、配列同一性に基づいて、大腸菌における候補のパーミアーゼを同定することは可能である。これらの構築はマレートおよび他の有機酸を細胞内に維持して、これらをＤＨＢ生成に利用可能にするように働く。

「形質転換された宿主生物体」の表現は、そのゲノム中に、または染色体外の遺伝エレメント、例えば、プラスミドに、本発明による少なくとも１つのキメラ遺伝子を組み入れ、したがって細胞の内部に、または培養培地中に、マリルＣｏＡシンテターゼ、マリルＣｏＡリアーゼ、マリルＣｏＡレダクターゼ、および／またはＤＨＢデヒドロゲナーゼのいずれか１つを生成する宿主生物体を意味するものとされる。本発明による宿主生物体を得るために、当業者であれば、多くの既知の形質転換方法の１つを用いてもよい。

これらの方法の１つは、形質転換させようとする宿主生物体の細胞を、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および本発明によるベクターと接触させることにある。電気穿孔法は、形質転換させようとする細胞および本発明のベクターを電界に暴露することにある、別の一方法である。別の一方法は、ベクターを細胞または組織中にマイクロインジェクションにより直接注射することにある。「微粒子銃」方法を用いてもよい。これは細胞または組織に、その上に本発明のベクターを吸着させた粒子で衝撃を与えることにある（米国特許第４，９４５，０５０）。

細菌を形質転換するためのいくつかの方法が、大腸菌および他のグラム陰性細菌に関する文献に記載されている。コンジュゲーションをまた、用いてもよい。グラム陽性細菌に対して、特にストレプトミセス属の細菌に対して、電気穿孔法を用いてもよく、プロトプラスト形質転換をまた用いてもよい。

真菌を形質転換するための方法もいくつか、文献に記載されている。ＰＥＧでのプロトプラスト形質転換はアスペルギルスについてＥＰ０２６０７６２に記載されており、ペニシリウムフニクロスム（Penicillium funiculosum）種へのこの方法の適応についてはＷＯ００／３６１２０に記載されている。制限酵素媒介組入れ、すなわちＲＥＭＩによる形質転換も、アグロバクテリウム（Agrobacterium）属の細菌を用いたプロトプラスト形質転換として知られている。酵母を形質転換するための技術も文献に記載されている。

さらなる一側面において、本発明は、本発明の形質転換された微生物を培養する工程を含む、２，４−ＤＨＢを生成するプロセスを取り扱う。

ＤＨＢを生成するために、様々な炭水化物を、個々に、またはグルコース、フルクトース、ショ糖、糖蜜、マルトース、廃糖蜜、デンプン加水分解物（グルコース、オリゴ糖）、ラクトース、マルトース、デンプンおよびデンプン加水分解物、セルロース、セルロース加水分解物、グリセロール、アセテートおよびある種の炭化水素、油および脂肪、例えば、ダイズ油、ヒマワリ油、ラッカセイ油、およびココナツ油、ならびに脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、およびリノール酸などの混合物として利用してもよい。これらの物質を、個々にまたは混合物として用いてもよい。

無機化合物、例えば、気体および水性のアンモニア、無機酸または有機酸のアンモニウム塩、例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、および炭酸アンモニウムを含めた、様々な窒素源を、営業生産およびパイロット規模の生成用に、個々にまたは混合物として利用してもよい。あるいは、ダイズ加水分解物、ダイズタンパク質ＨＣｌ加水分解物（全窒素約７％）、ダイズミール（soy bean meal）、ダイズかす加水分解物、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、イースト抽出物、肉エキス、麦芽エキス、尿素、ペプトン、およびアミノ酸などの天然の窒素含有有機材料も利用してもよい。

生成プロセスは、好気的な、嫌気的な、および酸素制限した条件下で行うことができる。これは、流加培養プロセスまたはバッチプロセスとして行うことができる。

２，４−ＤＨＢの前記の生成は、マレート（または別の有機酸、例えば、ピルベート、スクシネート、もしくはフマレート）を単独で、または増殖を確実にする別の炭素源と一緒に加えた培地中で宿主生物体を培養することにより行うことができる。マレート（および他の有機酸）を、直接、または２段階発酵プロセスを指定することのいずれかにより加えることができ、マレート（または他の有機酸）は第１のプロセス段階においてマレートを過剰に生成する微生物によって生成され、２，４−ＤＨＢ生成は次の段階において本発明による宿主生物体によって実現される。

生成物の分離および精製は、全体のプロセス効率および製品原価に莫大な影響を及ぼす、極めて重要なファクターである。生成物を回収するための方法は、一般的に、細胞の分離、ならびに生成物の精製、濃縮、および乾燥のそれぞれの工程を含んでいる。

細胞の分離
限外濾過および遠心分離を用いて、細胞を発酵媒体から分離することができる。発酵媒体からの細胞の分離は、培地の粘度が高いことにより、しばしば複雑化する。そこで、添加剤、例えば、鉱酸もしくはアルカリ塩を加え、または培養ブロスを加熱して細胞分離を最適化することができる。

生成物の回収
バイオマスを除去する前または後のいずれかにＤＨＢを分離するために、様々なイオン交換クロマトグラフィー法を適用することができる。これには、その等電点に従って生成物の分離を促進する、一次の（primary）陽イオン交換樹脂の使用が含まれる。典型的には、樹脂を溶液で荷電し、保持した生成物は、溶離液におけるｐＨの増大（例えば、水酸化アンモニウムを加えることによる）に従って別々に溶出される。別の一可能性は、固定または疑似移動床式の樹脂を用いた、イオン交換クロマトグラフィーの使用である。生成物の十分な純度を達成するために、様々なクロマトグラフィー工程を組み合わせる必要があり得る。これらの精製方法は、高価な結晶化工程に比べてより経済的であり、最終生成物の形態に関してさらなる利点および柔軟性も提供する。

生成物の濃縮および乾燥
精製プロセスは、任意の適切な乾燥手段、例えば、噴霧造粒機、噴霧乾燥器、ドラム乾燥機、回転乾燥機、トンネル乾燥機を伴ってもよい乾燥工程も含むことができる。濃縮されたＤＨＢ溶液は、多目的コンセントレータまたは薄層エバポレーターを用いて１３０℃の蒸気により、減圧下で発酵ブロスを加熱することにより得ることができる。

ＤＨＢの効果的な生成は、宿主生物体の代謝ネットワークにおける炭素流入再分配を最適化することにより、およびＤＨＢ経路の３つの酵素にＮＡＤＰＨおよびＡＴＰの十分な供給を確実にすることにより、確実にすることができる。所望の代謝経路への炭素流入のチャネリング、およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ補助因子の供給は、通常、天然の発酵経路の競合を除去または軽減することにより促進される。非排他的な例として、
−エタノールの形成を妨害することによる、サッカロミセスセレビシエにおけるマレート生成の最適化（ピルベートデカルボキシラーゼの欠失による）（Ｚｅｌｌｅら、２００８）（Ｚｅｌｌｅら、２０１０）
−ラクテートの形成（例えば、ＩｄｈＡの欠失）、アセテートの形成（例えば、ｐｔａ、ａｃｋＡの欠失）、エタノールの形成（例えば、ａｄｈＥの欠失）、ホルメートの形成（例えば、ｐｆｌＢ、ｆｏｃＡの欠失）、ピルベートの酸化（例えば、ｐｏｘＢの欠失）、マレートの分解（ｍａｅＢおよびｓｃｆＡの欠失）、スクシネートの形成（例えば、ｆｒｄＢＣの欠失）、メチルグリオキサルの形成（ｍｇｓＡの欠失）による大腸菌におけるスクシネートまたはマレート生成の最適化（Ｊａｎｔａｍａら、２００８ａ）（Ｊａｎｔａｍａら、２００８ｂ）（Ｌｉｎら、２００５）（Ｚｈａｎｇら、２０１１）（Ｓａｎｃｈｅｚら、２００５）
−ペントースリン酸経路全体にわたって炭素流入をチャネリングし、それにより生合成反応に対するＮＡＤＰＨ利用能を増大するためのホスホグルコースイソメラーゼｐｇｉの欠失（Ａｕｒｉｏｌら、２０１１）
がある。

有機酸を生成するために炭素流入およびＡＴＰ供給を増大する別の一可能性は、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）／ピルベート／オキサロアセテートのブランチノード（branch node）の操作である（（Ｓａｕｅｒ＆Ｅｉｋｍａｎｎｓ、２００５）において論評されている）。ホスホエノールピルベートからオキサロアセテートへの炭素流入の増大を確実にする代謝操作の戦略に対する非排他的な例として、
−ピルベートキナーゼの機能を妨害し、ＰＥＰカルボキシキナーゼの活性を増大することによる、サッカロミセスセレビシエにおけるマレート生成の最適化（Ｚｅｌｌｅら、２０１０）
−天然の、または異種性に発現された、ＰＥＰカルボキシラーゼ、ＰＥＰカルボキシキナーゼ、またはピルベートカルボキシラーゼの活性を増大することによる、大腸菌におけるスクシネート生成の最適化（Ｍｉｌｌａｒｄら、１９９６）（Ｓａｎｃｈｅｚら、２００５）（Ｚｈａｎｇら、２０１１）
がある。

グルコースの初期のリン酸化工程にＰＥＰ消費性のホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）を用いる大腸菌および他の細菌において有機酸を生成させるために炭素流入およびＡＴＰ供給を増大する別の一可能性は、ＰＴＳ系の不可欠な成分（例えば、ｐｔｓｌまたはｐｔｓＧ）の欠失である（Ｌｉｎら、２００５）（Ｚｈａｎｇら、２００９）。ＰＴＳ系の有害な変異を保有する変異体においてさらなるグルコース取込みを確実にするために、代替のグルコース取込み系（例えば、ＧａｌＰ）の活性を確実にする必要がある。

有機酸を生成するのに所望の経路への炭素流入を増大する別の一可能性は、クエン酸サイクルおよびグリオキシレートサイクルの操作である。非排他的な例として、
−イソシトレートリアーゼの活性を増大することによる、大腸菌におけるコハク酸生成の最適化（転写リプレッサーｉｃｌＲの欠失）（Ｌｉｎら、２００５）（Ｓａｎｃｈｅｚら、２００５）（Ｌｉｎら、２００５；Ｓａｎｃｈｅｚら、２００５ａ）
−イソシトレートデヒドロゲナーゼおよび／またはスクシネートデヒドロゲナーゼの欠失による、コハク酸生成の最適化（Ｌｉｎら、２００５）
がある。

ＤＨＢ生成経路に入る反応の基質である、マレート、グリオキシレート、およびアセチルＣｏＡの利用能を増大する別の一可能性は、アスパルテートトランスアミナーゼ（ａｓｐＣ、ｔｙｒＢ）、フマラーゼ（ｆｕｍＡＢＣ）、フマレートレダクターゼ（ｆｒｄＢＣ）、マレートシンターゼ（ａｃｅＢ）、およびグリオキシレートレダクターゼ（ｇｈｒＡＢ）酵素の減弱である。

別の代謝の一設定において、２，４−ＤＨＢの前駆物質であるマレートを、クレブスサイクルおよびグリオキシル酸短絡回路によって排他的に生成することが可能である。この設定には、サイトゾルの、および膜結合したマレートデヒドロゲナーゼであるそれぞれｍｄｈおよびｍｑｏの欠失が必要とされる。この取組みは、アスパルテートおよびその誘導体への炭素流入の潜在的な漏出を殆ど回避する。

２，４−ＤＨＢを生成するために所望の経路への炭素流入を増大する別の一可能性は、生成生物体における、適切なピルベートデヒドロゲナーゼおよびシトレートシンターゼの発現である。大腸菌の天然のピルベートデヒドロゲナーゼおよびシトレートシンターゼは、嫌気性条件下でこれら酵素の活性を低くする細胞内ＮＡＤＨが高濃度であることにより阻害される。大腸菌において、ＮＡＤＨに非感受性であるピルベートデヒドロゲナーゼ変異体の発現は、嫌気性条件下でアセチルＣｏＡの過剰生成をもたらし、修飾された炭素流入の、発酵の最終産物（アセテート、ラクテート、エタノール、ホルメート、およびピルベート）間での再分配をもたらす（Ｗａｎｇら、２０１０）。ＮＡＤＨに非感受性である、枯草菌のシトレートシンターゼの異種性の発現は、操作した大腸菌系統におけるコハク酸の生成を増大した（Ｓａｃｈｅｚら、２００５）。上記の変異と組み合わせて、適切なピルベートデヒドロゲナーゼおよびシトレートシンターゼ（ＮＡＤＨ感受性または非感受性）を使用すると、嫌気性および好気性の条件下で、グリオキシレートおよびクエン酸サイクル反応と発酵経路との間の炭素流入再分配の調整が可能になる。

ＤＨＢ経路による炭素流入を増大する別の一可能性は、経路の中間体であるマリルＣｏＡ、または４−マレートセミアルデヒドを分解し得る酵素反応の欠失である。マレートセミアルデヒドを分解し得る候補酵素は、スクシニックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｓａｄ、ｇａｂＤ）、および末端にアルデヒド基のある短いおよび中間の炭素鎖分子を酸化することができる他のデヒドロゲナーゼである。さらに、マリルＣｏＡは、シトレートシンターゼによって分解され得ることが知られている。

宿主生物体の２，４−ＤＨＢの生産性を増大する別の一可能性は、２，４−ＤＨＢを分解する代謝反応の欠失である。２，４−ＤＨＢはマリック酵素の競合的阻害物質であり、ゆえにこの酵素の活性部位に対して比較的高い親和性を有する（Ｒｏｇｎｓｔａｄ＆Ｋａｔｚ、１９７９）。したがって、２，４−ＤＨＢは他の酵素によって認識され、潜在的に分解され得る。これらの酵素は、同定し、宿主生物体から除去することができる。

２，４−ＤＨＢ生成がマレートまたは他の有機酸の添加に基づく場合、２，４−ＤＨＢ生成性の微生物は、マレート（または他の有機酸、例えば、ピルベート、スクシネートなど）の取込みを促進する膜輸送タンパク質を機能的に発現しなければならない。

本発明の形質転換された宿主生物体は、２，４−ＤＨＢを合成するさらなる経路をさらに含んでいてもよく、前記宿主生物体は、宿主生物体のゲノム中に組み入れられるか、または染色体外遺伝エレメント（例えば、マレートキナーゼをコードするプラスミド、もしくはマレートキナーゼをコードする核酸を含んでいるキメラ遺伝子、もしくはマレートキナーゼをコードする核酸を含んでいる発現ベクター、および／もしくはマレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸、もしくはマレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含んでいるキメラ遺伝子、もしくはマレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含んでいる発現ベクター、および／もしくはＤＨＢデヒドロゲナーゼをコードする核酸、ＤＨＢデヒドロゲナーゼをコードする核酸を含んでいるキメラ遺伝子、もしくはＤＨＢデヒドロゲナーゼをコードする核酸）上で輸送される、キメラ遺伝子を少なくとも１つ含んでいる。前記の酵素は、国際特許出願ＷＯ２０１２／０５６３１８に記載されている。

以下の例は本発明を説明するものである。これらの例は説明を目的とするにすぎず、本発明の範囲をいかなる方法でも制限するものと解釈してはならない。

（ｉ）（Ｌ）−マレート、スクシニルＣｏＡ、またはグリオキシレートの（Ｌ）−２，４−ジヒドロキシブチレート（２，４−ＤＨＢ）への変換を記載する反応図。 図は、マレートセミアルデヒドに対する活性（上のグラフ）、スクシニックセミアルデヒドに対する活性（中央のグラフ）、マレートセミアルデヒドおよびスクシニックセミアルデヒドに対する変異体の活性の、マレートセミアルデヒドおよびスクシニックセミアルデヒドに対する野生型の活性の比率に対する、対数として表現した、野生型酵素に比べた酵素特異性の変化（下のグラフ）を示す。（正の値は特異性の変化がマレートセミアルデヒドに有利であることを示す。） ２ｍＭアセチルＣｏＡ、２ｍＭグリオキシレート、および２ｍＭＮＡＤＰＨを様々な組合せのＤＨＢ経路酵素とインキュベートした後の２，４−ＤＨＢの存在を示すクロマトグラム（反応１：マリルＣｏＡリアーゼ（１５０μｇ／ｍＬ Ｍｅ−Ｍｃｌ）、マリルＣｏＡレダクターゼ（１００μｇ／ｍＬ Ｓｔ−Ｍｃｒ）、およびマレートセミアルデヒドレダクターゼ（１００μｇ／ｍＬ Ｍｓ−ＳＳＡｒｅｄ Ｈ３９Ｒ Ｎ４３Ｈ）；反応２：反応１と同じであるがマリルＣｏＡレダクターゼとして１００μｇ／ｍＬＰｇ−ＳｕｃＤを用いた；対照１：反応１と同じであるがマリルＣｏＡレダクターゼなし；対照２：反応１と同じであるがマレートセミアルデヒドレダクターゼなし）。

［実施例］
例１：マリルＣｏＡリアーゼ活性の実証
マリルＣｏＡリアーゼをコードする野生型遺伝子を含むプラスミドの構築：メチロバクターエクストロケンス（Ａｒｐｓら、１９９３）およびロドバクターカプスラツス（Ｍｅｉｓｔｅｒら、２００５）においてマリルＣｏＡリアーゼをコードするｍｃｌ遺伝子のＤＮＡ配列を、ＧＥＮＥｉｕｓソフトウエア（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）を用いて大腸菌における発現に最適化した。最適化した配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ ＯＰＥＲＯＮ（登録商標）により、ｍｃｌの開始コドンの上流および終止コドンの下流にそれぞれＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を加えることによって合成し、このため、合成したＤＮＡフラグメントの、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた、ｐＥＴ２８ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）への直接的なクローニングが可能になった。ライゲーション生成物を大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換し、増幅し、プラスミドｐＥＴ２８−Ｍｅｘ−ｍｃｌ（メチロバクターエクストロケンスからマリルＣｏＡリアーゼを発現する）およびｐＥＴ２８−Ｒｃａ−ｍｃｌ（ロドバクターカプスラツスからマリルＣｏＡリアーゼを発現する）を、標準の遺伝学的プロトコールを用いて単離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。利用したｍｃｌタンパク質配列のＮＣＢＩおよびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｉｃｓのリファレンス、ならびに対応する天然および合成のＤＮＡ配列に対するリファレンスを表１に列挙する。

酵素の発現：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、適切なプラスミドで、標準の遺伝学的プロトコールを用いて形質転換した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。Ｎ末端ヘキサＨｉｓタグを有する酵素をＬＢ培養液２５０ｍＬ中で発現させたが、ＬＢ培養液はＯＤ₆₀₀ ０．１の一夜培養液から接種し、ＯＤ₆₀₀ ０．６に増殖させた後、培養培地に１ｍＭイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を加えることにより、タンパク質発現を誘導したものであった。タンパク質を発現させて３時間後、１３０００ｇで１０分間遠心分離することにより細胞を回収し、上清を廃棄した。細胞ペレットを、さらなる分析まで−２０℃で貯蔵した。増殖およびタンパク質の発現を３７℃で行った。培養培地は５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含んでいた。

酵素の精製：発現培養物の凍結した細胞ペレットを、切断バッファー（breakage buffer）（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７，５）０．５ｍＬ中に再懸濁し、連続４ラウンドの超音波によりこじ開けた（超音波の間隔：２０秒、パワー出力：３０％、超音波処理器：Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶｉｂｒａＣｅｌｌ（商標）７２４３７）。粗製抽出物を４℃、１３０００ｇで１５分間遠心分離し、澄明な上清を保持することにより、細胞デブリを除去した。１５ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を加え、４℃、１３０００ｇで１０分間試料を遠心分離し、上清を保持することにより、ＲＮＡおよびＤＮＡを抽出物から除去した。澄明なタンパク質抽出物を室温で２０分間（４℃で１時間）、Ｔａｌｏｎ（商標）Ｃｏｂａｌｔ親和性樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）０．３（総容積）（０．７５ｍＬ）でインキュベートした。懸濁液を卓上型遠心機において７００ｇで遠心分離し、上清を除去した。樹脂を、総容積１０の洗浄バッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭイミダゾール、ｐＨ７，５）で洗浄した後、タンパク質を溶出バッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７，５）０．５ｍＬで溶出した。溶出した酵素の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により検証した。タンパク質濃度をブラッドフォード法で推定した。

酵素学的アッセイ：マリルＣｏＡリアーゼ活性を、（Ｍｅｉｓｔｅｒら、２００５）から適応した方法を用いてアッセイした。マリルＣｏＡリアーゼによるマリルＣｏＡ合成を、シトレートシンターゼ触媒性のコエンザイムＡの放出に結びつけ、コエンザイムＡの放出をＤＴＮＢとの自発的反応によりモニタリングした。

反応スキーム
マリルＣｏＡリアーゼ：
アセチルＣｏＡ＋グリオキシレート→（Ｌ）−マリルＣｏＡ
シトレートシンターゼ：
（Ｌ）−マリルＣｏＡ→（Ｌ）−マレート＋コエンザイムＡ
自発的：
コエンザイムＡ＋ＤＴＮＢ→ＣｏＡ−ＤＴＮＢジスルフィド
アッセイ１による反応混合物は、５０ｍＭ ＭＯＰＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、０．２５ｍＭ ＤＴＮＢ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭアセチルＣｏＡ、２０Ｕ／ｍＬシトレートシンターゼ（生成物は全てＳｉｇｍａより）、および適切な量の精製したマリルＣｏＡリアーゼまたは細胞抽出物を含んでいた。１０ｍＭグリオキシレートを加えることにより、反応を開始させた。酵素学的アッセイを、最終体積２５０μＬの９６ウエル平底マイクロタイタープレート中３７℃で行った。反応の後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ ６８０ＸＲ）において、４１２ｎｍにＤＮＴＢ（ε_DNTB+CoA＝１３．６ｍＭ^-1ｃｍ^-1）の特徴的な吸収があった。

特徴付けを行ったメチロバクターエクストロケンスからの精製したマリルＣｏＡリアーゼは、Ｖｍａｘ３６μｍｏｌ／（ｍｉｎ ｍｇ ｐｒｏｔ）、およびグリオキシレートに対してＫｍ０．５ｍＭを有していた。

例２：マリルＣｏＡレダクターゼ活性の実証
マロニルＣｏＡレダクターゼおよびスクシニルＣｏＡレダクターゼをコードする野生型遺伝子を含んでいるプラスミドの構築：スルホロブストコダイイｓｔｒ７においてマリルＣｏＡレダクターゼをコードするｍｃｒ遺伝子のＤＮＡ配列を（Ａｌｂｅｒら、２００６）、ＧＥＮＥｉｕｓソフトウエア（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）を用いて大腸菌における発現に最適化した。最適化したｍｃｒ配列、およびポルフィロモナスジンジバリスＷ８３においてスクシニルＣｏＡレダクターゼをコードするｓｕｃＤ遺伝子の天然のＤＮＡ配列を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ ＯＰＥＲＯＮ（登録商標）により、ｍｃｒの開始コドンの上流および終止コドンの下流にそれぞれＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を加えることによって合成し、このため、合成したＤＮＡフラグメントの、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた、ｐＥＴ２８ａ＋ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）中への直接的なクローニングが可能になった。ライゲーション生成物を大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換し、増幅し、プラスミドｐＥＴ２８−Ｓｔ−ｍｃｒ（スルホロブストコダイイからマロニルＣｏＡレダクターゼを発現する）およびｐＥＴ２８−Ｐｇｉ−ｓｕｃＤ（ポルフィロモナスジンジバリスからスクシニルＣｏＡレダクターゼを発現する）を、標準の遺伝学的プロトコールを用いて単離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。利用したｍｃｒおよびｓｕｃＤタンパク質配列のＮＣＢＩリファレンス、ならびに対応する天然および合成のＤＮＡ配列に対するリファレンスを表２に列挙する。

Ｐｇ−ＳｕｃＤの発現および精製を、例１に記載した通りに、プラスミドｐＥＴ２８−Ｐｇｉ−ｓｕｃＤを用いて行った。

Ｓｔ−ｍｃｒ遺伝子を、プラスミドｐＥＴ２８−Ｓｔ−ｍｃｒから、開始コドンの上流および終止コドンの下流にそれぞれＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を加えた、プライマー５’−ＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＣＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＧＣＣＧＴ−３’（配列番号１２）および５’−ＴＡＴＡＡＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＣＴＣ−３’（配列番号１３）を用いて増幅した。ＰＣＲフラグメントをｐＡＣＴ３発現ベクター中に、ＳａｃＩおよびＢａｍＨＩ制限部位を用いてライゲートした。得られたプラスミドｐＡＣＴ３−Ｓｔ−Ｍｃｒを、大腸菌ＭＧ１６５５系統に形質転換した。得られた発現系統を、無機培地上３７℃で培養した。無機培地１リットルは、グルコース２０ｇ、Ｎａ₂ＨＰＯ₄ ^*１２Ｈ₂Ｏ１８ｇ、ＫＨ₂ＰＯ₄３ｇ、ＮａＣｌ０．５ｇ、ＮＨ₄Ｃｌ２ｇ、ＭｇＳＯ₄ ^*７Ｈ₂Ｏ０．５ｇ、ＣａＣｌ₂ ^*２Ｈ₂Ｏ０．０１５、濃ＨＣｌを１００倍希釈して調製した０．０６ｍｏｌ／ＬＦｅＣｌ₃保存液１ｍＬ、１０ｍＭチアミンＨＣｌ保存液２ｍＬ、ＭＯＰＳ２０ｇ、カナマイシン硫酸塩５０μｇ（および、必要に応じてクロラムフェニコール２５μｇ）、ならびに微量元素溶液１ｍＬ（１リットルあたり：Ｎａ₂ＥＤＴＡ^*２Ｈ₂Ｏ０．０４ｇ、ＣｏＣｌ₂ ^*６Ｈ₂Ｏ０．１８ｇ、ＺｎＳＯ₄ ^*７Ｈ₂Ｏ、Ｎａ₂ＭｏＯ₄ ^*２Ｈ₂Ｏ０．０４ｇ、Ｈ₃ＢＯ₃０．０１ｇ、ＭｎＳＯ₄ ^*Ｈ₂Ｏ０．１２ｇ、ＣｕＣｌ₂ ^*Ｈ₂Ｏ０．１２ｇを含んでいる）を含んでいた。培地のｐＨを７に調節し、培地を濾過滅菌した。

指数関数的に増殖していた培養液がＯＤ（６００ｎｍ）０．６に到達したら、１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、培養液を１４時間２０℃でインキュベートし、その後、遠心分離（１３０００×ｇ、１０分間）により細胞を回収した。上清を廃棄した後、細胞ペレットを−２０℃で貯蔵した。

Ｓｔ−Ｍｃｒを精製するため、凍結した発現培養物の細胞ペレットを、切断バッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）０．５ｍＬ中に再懸濁し、連続４ラウンドの超音波によりこじ開けた（超音波の間隔：２０秒、パワー出力：３０％、超音波処理器：Ｂｉｏｂｌｏｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＶｉｂｒａＣｅｌｌ（商標）７２４３７）。粗製抽出物を４℃、１３０００×ｇで１５分間遠心分離し、澄明な上清を保持することにより、細胞デブリを除去した。大腸菌の天然タンパク質を、３０分間８５℃で加熱沈殿し、その後１３０００×ｇで遠心分離することにより除去した。タンパク質調製物の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、予想したサイズのＳｔ−Ｍｃｒタンパク質に相当する１本のバンドのみが示された。

酵素学的アッセイ：マリルＣｏＡレダクターゼ活性を、アッセイ１またはアッセイ２を用いた反応の、還元的および酸化的方向のそれぞれにおいてアッセイした。

アッセイ１（反応スキーム）：
マリルＣｏＡリアーゼ：
グリオキシレート＋アセチルＣｏＡ→マリルＣｏＡ＋アセテート
マリルＣｏＡレダクターゼ：
（Ｌ）−マリルＣｏＡ＋ＮＡＤＰＨ→（Ｌ）−マレートセミアルデヒド＋コエンザイムＡ＋ＮＡＤＰ
アッセイ２（反応スキーム）：
（Ｌ）−マレートセミアルデヒド＋コエンザイムＡ＋ＮＡＤＰ→（Ｌ）−マリルＣｏＡ＋ＮＡＤＰＨ
アッセイ１による反応混合物は、５０ｍＭ ＭＯＰＳ／ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭグリオキシレート、４ｍＭアセチルＣｏＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２５ｍＭ ＮＡＤＰＨ（生成物は全てＳｉｇｍａより）、５Ｕ／ｍＬマリルＣｏＡリアーゼ、および適切な量の精製したマリルＣｏＡレダクターゼまたは細胞抽出物を含んでいた。グリオキシレートを加えることにより、反応を開始させた。酵素学的アッセイを、最終体積２５０μＬの９６ウエル平底マイクロタイタープレート中３７℃で行った。反応の後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ ６８０ＸＲ）中、３４０ｎｍにＮＡＤＰＨ（ε_NADPH＝６．２２ｍＭ^-1ｃｍ^-1）の特徴的な吸収があった。

アッセイ２による反応混合物は、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ９）、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＮＡＤＰ、０．５ｍＭコエンザイムＡ（生成物は全てＳｉｇｍａより）、および適切な量の精製したマリルＣｏＡレダクターゼを含んでいた。５ｍＭ（Ｌ）−マレートセミアルデヒドを加えることにより、反応を開始させた。酵素学的アッセイを、最終体積２５０μＬの９６ウエル平底マイクロタイタープレート中３７℃で行った。反応の後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ ６８０ＸＲ）中、３４０ｎｍにＮＡＤＰＨ（ε_NADPH＝６．２２ｍＭ^-1ｃｍ^-1）の特徴的な吸収があった。不安定なマレートセミアルデヒドが新たに生成された後、安定なマレートセミアルデヒド誘導体である２−［（４Ｓ）−２，２−ジメチル−５−オキソ−１，３−ジオキソラン−４−イル］アセトアルデヒド（ＤＭＯＤＡ）（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（登録商標）により供給）を脱保護することにより酵素学的試験を行った。適切な量のＤＭＯＤＡを２Ｍ塩酸中に溶解し、懸濁液を沸点まで短時間加熱し、熱懸濁液を室温に１５分間放置することにより、マレートセミアルデヒドを得た。放出されたアセトンを、ロータリーエバポレーター中３５℃、５０ｍｂａｒで蒸発させた。マレートセミアルデヒド溶液のｐＨを、炭酸水素ナトリウムを用いて３．５に固定した。

表３および４に列挙する結果は、スルホロブストコダイイのマロニルＣｏＡレダクターゼＭｃｒ、およびポルフィロモナスジンジバリスのスクシニルＣｏＡレダクターゼＳｕｃＤに対するマリルＣｏＡレダクターゼ活性を実証するものである。

例３：ＤＨＢデヒドロゲナーゼ活性の実証
適切な２，４ＤＨＢデヒドロゲナーゼを同定するために、様々な生物学的源からのベータヒドロキシ酸デヒドロゲナーゼを、マレートセミアルデヒドを還元する能力について試験した。試験した酵素の中には、サッカロミセスセレビシエからのメチルブチルアルデヒドレダクターゼであるＹｐｒ１（Ｆｏｒｄ＆Ｅｌｌｉｓ、２００２）（配列番号１４）、ポルフィロモナスジンジバリスの４−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼである４ｈｂｄｈ（配列番号１８７）、大腸菌のアルコールデヒドロゲナーゼであるＹｑｈＤ（配列番号１８５）、およびメタロスファエラセデュラからのスクシニックセミアルデヒドレダクターゼであるＭｓ−Ｓｓｒ（Ｋｏｃｋｅｌｋｏｒｎ＆Ｆｕｃｈｓ、２００９）（配列番号１６）があった。遺伝子ＹＰＲ１、４ｈｂｄｈ、ｙｑｈＤ、およびＭｓ−ＳＳＲを、表５に記載するプライマーを用いて増幅し、ベクターｐＥＴ２８中にクローニングし（制限酵素は表５を参照されたい）、それぞれプラスミドｐＥＴ２８−Ｓｃｅ−ＹＰＲ１、ｐＥＴ２８−Ｐｇｉ−４ｈｂｄｈ、ｐＥＴ２８−Ｅｃｏ−ｙｑｈｄ、およびｐＥＴ２８−Ｍｓｅ−ＳＳＲを得た。タンパク質を、例１に記載した通りに発現させ、精製した。

マレートセミアルデヒドレダクターゼ活性に対する試験：
反応スキーム：
（Ｌ）−マレートセミアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ→（Ｌ）−２，４−ジヒドロキシ酪酸＋ＮＡＤ（Ｐ）
アッセイ混合物は、２００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２４ｍＭ ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ、および適切な量の精製した酵素または細胞抽出物を含んでいた。１０ｍＭ（Ｌ）−マレートセミアルデヒドを加えることにより反応を開始させた（マレートセミアルデヒドは試験毎に新たに調製した、例３を参照されたい）。酵素学的アッセイを、最終体積２５０μＬの９６ウエル平底マイクロタイタープレート中３０℃で行った。反応の後、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ ６８０ＸＲ）中、３４０ｎｍにＮＡＤ（Ｐ）Ｈ（ε_NADPH＝６．２２ｍＭ^-1ｃｍ^-1）の特徴的な吸収があった。結果を表６に列挙する。

メタロスファエラセデュラからのスクシニックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、およびサッカロミセスセレビシエからのメチルブチルアルデヒドレダクターゼは、マレートセミアルデヒドレダクターゼ活性を有する。マレートセミアルデヒドに対するＭｓ−ＳＳＲのＫｍは４ｍＭであった。

例４：改善されたマリルＣｏＡレダクターゼ酵素の合理的な構築
部位特異的突然変異誘発を、表７に列挙したオリゴヌクレオチド対、およびテンプレートとしてｐＥＴ２８−Ｓｔｏ−ｍｃｒプラスミドを用いて行った。アミノ酸配列を変更するための点変異をＰＣＲにより導入した（Ｐｈｕｓｉｏｎ １Ｕ、ＨＦバッファー２０％（ｖ／ｖ）、ｄＮＴＰ２．５ｍＭ、直接およびリバースプライマー各１μＭ、テンプレートプラスミド２００ｎｇ、水）。可能であれば、ＰＣＲにより作り出されたプラスミドは、変異したクローンの同定を促進するための機能的変異に加えて、新たな制限部位を含んでいた（サイレント変異を用いて導入された）。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩにより３７℃で２×２時間消化してテンプレートＤＮＡを除去し、ＮＥＢ ＤＨ５−αコンピテント大腸菌細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。変異したプラスミドを制限部位の分析により同定し、ＤＮＡシーケンシングにより所望の変異を伴うことを確認した。

Ｓｔ−Ｍｃｒ遺伝子修飾の影響を、例２に記載したアッセイ３を用いた反応の酸化的方向において試験した。図３は、天然のＴｙｒ２０６を他のアミノ酸によって置きかえると、天然の基質であるスクシニックセミアルデヒドに対する活性が低減し、同時に、マレートセミアルデヒドに対して増大した、または少なくとも一定の活性がもたらされることを示す。このように、Ｔｙｒ２０６を適切なアミノ酸残基により置きかえると、ＤＨＢ経路の中間体に対するＭｃｒの特異性に関して選択的な利点がもたらされる。

２０６位における好ましいアミノ酸残基は、したがって、フェニルアラニン、ヒスチジン、イソロイシン、リジン、メチオニン、グリシン、アスパラギン、プロリン、アルギニン、グルタミン、ロイシン、セリン、トリプトファン、およびスレオニンである。

チロシン２０６がプロリン残基によって置きかえられているタンパク質を配列番号２０２によって示す。

例５：改善されたＤＨＢデヒドロゲナーゼの合理的な構築
部位特異的突然変異誘発を、表６に列挙したオリゴヌクレオチド対、およびテンプレートとしてｐＥＴ２８−Ｍｓｅ−ＳＳＲプラスミドを用いて行った。アミノ酸配列を変更するための点変異をＰＣＲにより導入した（Ｐｈｕｓｉｏｎ １Ｕ、ＨＦバッファー２０％（ｖ／ｖ）、ｄＮＴＰ２．５ｍＭ、直接およびリバースプライマー各１μＭ、テンプレートプラスミド２００ｎｇ、水）。可能であれば、ＰＣＲにより作り出されたプラスミドは、変異したクローンの同定を促進するための機能的変異に加えて、新たな制限部位を含んでいた（サイレント変異を用いて導入された）。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩにより３７℃で２×２時間消化してテンプレートＤＮＡを除去し、ＮＥＢ ＤＨ５−αコンピテント大腸菌細胞（ＮＥＢ）に形質転換した。変異したプラスミドを制限部位の分析により同定し、ＤＮＡシーケンシングにより所望の変異を伴うことを確認した。表８は、変異体の動力学的パラメータを概要するものである。結果は、Ｍｓ−ＳＳＲ Ｈ３９Ｒ Ｎ４３Ｈ（配列番号３８）は、野生型酵素に比べた場合、マレートセミアルデヒドに対する親和性を改善したことを実証している。

対応する核酸の配列は、配列番号１７、配列番号３３、配列番号３５、および配列番号３７によって表される。

変異Ｈ３９ＲおよびＮ４３Ｈを含む、メタロスファエラセデュラのスクシニックセミアルデヒドレダクターゼのコード配列を、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（登録商標）ソフトウエアを用いて、大腸菌における最大の発現に最適化した。合成の遺伝子を、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ）により生成した。ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位をそれぞれ、開始コドンの上流および終止コドンの下流に導入し、ｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎ）への直接的なクローニングが可能になった。

得られたｐＥＴ２８−Ｍｓｅ−ＤＨＢ−Ｄｈ−Ｈ３９Ｒ＿Ｎ４３Ｈ−ｏｐｔプラスミドを単離し、ＤＮＡシーケンシングにより、正確な配列を有する全長のメタロスファエラセデュラのＳＳＲ Ｈ３９Ｒ Ｎ４３Ｈ遺伝子を含んでいることが示された（配列番号３８）。

例６：合成マリルＣｏＡ経路によるＤＨＢのｉｎ ｖｉｔｒｏ生成の実証
酵素マリルＣｏＡリアーゼ（Ｍｅ−Ｍｃｌ）、マリルＣｏＡレダクターゼ（Ｓｔ−ＭｃｒまたはＰｇ−ＳｕｃＤ）、およびＤＨＢデヒドロゲナーゼ（Ｍｓ−ＳＳＡ−ｒｅｄ Ｈ３９Ｎ Ｎ４３Ｈ）を、例１、２、および３に記載した通りに発現させ、精製した。

マリルＣｏＡリアーゼ、マリルＣｏＡレダクターゼ、およびＤＨＢデヒドロゲナーゼを含んでいる経路によるＤＨＢの生成を、２ｍＭグリオキシレートを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．５）、２ｍＭアセチルＣｏＡ、２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１００μｇ／ｍＬ ＤＨＢデヒドロゲナーゼ、１５０μｇ／ｍＬマリルＣｏＡリアーゼ、および１００μｇ／ｍＬマリルＣｏＡレダクターゼ（Ｓｔ−Ｍｃｒ（反応１）、またはＰｇ−ＳｕｃＤ（反応２）のいずれかであった）を含んでいる反応混合物に加えることにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実証した。

対照の反応は全ての成分を含んでいたが、ＤＨＢデヒドロゲナーゼ（対照１）またはマリルＣｏＡレダクターゼ（対照２）のいずれかを欠いていた。３７℃で１２０分インキュベートした後、反応混合物中のＤＨＢ含量をガスクロマトグラフィーにより分析した［ＧＣＭＳ−ＱＰ２０１０ Ｕｌｔｒａ Ｓｈｉｍａｄｚｕ；ＦＩＤ検出器（ＦＩＤ−２０１０ Ｐｌｕｓ Ｓｈｉｍａｄｚｕ）；オートサンプラーＡＯＣ２０ｓ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）；スプリットレスインジェクターＡＯＣ２０ｉ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）（２３０℃）；カラム：Ｚｅｂｒｏｎ ＺＢ−ＦＦＡＰ、３０ｍ×０．２５ｍｍ、ｄ_f０．２５μｍ；およびライナー：Ｔａｐｅｒｅｄ ｆｏｃｕｓ Ｌｉｎｅｒ５×９５×３．４ｍｍ（ＳＧＥ）を装備］。キャリアガスは合計流速２５ｍＬ／分の水素であった。空気−水素混合ガスを用いて（流速はそれぞれ３００ｍＬ／分および３０ｍＬ／分であった）、水素炎イオン化を行った。検出器温度は２４０℃であった。注入した試料体積は１μＬであった。温度プログラムを表１０に示す。

経路の全ての酵素を含んでいる反応におけるＤＨＢの存在、および３つの経路酵素のうち２つだけを含む試料におけるＤＨＢの非存在を示すクロマトグラムを、図２に示す。

例７：最適化したＤＨＢ生成系統の構築
マリルＣｏＡシンテターゼ、マリルＣｏＡレダクターゼ、およびＤＨＢデヒドロゲナーゼを同時発現するためのプラスミドの構築：メチロバクターエクストロケンスからのマリルＣｏＡリアーゼであるＭｅ−ｍｃｌのコード配列を、高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ならびに開始コドンの上流にＳａｃＩに対する制限部位（下線付）を含んでいるフォワードプライマーおよびリバースプライマー５’−ＴＣＡＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＡＴＧＴＣＧＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＴＴＣＡＧＣＡＡＧＣＧＡＣＴ−３’（配列番号３９）および５’−ＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＴＴＡＴＴＴＧＣＣＧＣＣＣＡＴＴＧＣＡＴＣＣＧＣＴＴＴＣＴＧ−３’（配列番号４０）を用いて、プラスミドｐＥＴ２８−Ｍｅｘ−ｍｃｌから増幅した。スルホロブストコダイイからのマロニルＣｏＡレダクターゼであるＳｔ−ｍｃｒのコード配列を、終止コドンの下流にＢａｍＨＩに対する制限部位を含んでいるフォワードおよびリバースプライマー５’−ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＧＣＣＧＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＣＧ−３’（配列番号４１）および５’−ＧＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＴＴＡＣＴＴＣＴＣＧＡＴＧＴＡＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＧ−３’（配列番号４２）を用いて、プラスミドｐＥＴ２８−Ｓｔｏ−ｍｃｒから増幅した。プラスミドｐＥＴ２８−Ｍｓｅ−ＤＨＢ−Ｄｈ−Ｈ３９Ｒ＿Ｎ４３Ｈ−ｏｐｔ（例５）を、終止コドンの下流にＢａｍＨＩ制限部位（下線付）を導入するフォワードおよびリバースプライマー５’−ＧＴＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＡＣＣＴＡＴＡＡＡＧＡＡＣＣＧＣＴＧＡＧＣＡＴ−３’（配列番号４３）および５’−ＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＧＡＡＴＡＡＴＣＡＧＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣ−３’（配列番号４４）を用いて、メタロスファエラセデュラからスクシニックセミアルデヒドレダクターゼＨ３９Ｒ Ｎ４３Ｈの最適化されたコード配列を増幅するためのテンプレートとして用いた。

Ｓｔ−ｍｃｒおよびメタロスファエラセデュラのスクシニックセミアルデヒドレダクターゼＨ３９Ｒ Ｎ４３Ｈに対するフォワードプライマーはｒｂｓモチーフを含んでいた。３つの遺伝子を同時に、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた、相同的組換えによりｐＡＣＴ３発現ベクター中にクローニングした。

得られたｐＡＣＴ３−ＭＣＬ−ＤＨＢ（配列番号４５）プラスミドを単離し、ＤＮＡシーケンシングにより、正確な配列を有することが示された。

マリルＣｏＡシンテターゼ、マリルＣｏＡレダクターゼ、およびＤＨＢデヒドロゲナーゼの同時発現のためのプラスミドの構築：メチロバクターエクストロケンスＡＭ１からの、マリルＣｏＡシンテターゼの２つのタンパク質サブユニットであるｍｔｋＡ（ＹＰ＿００２９６２８５）およびｍｔｋＢ（ＹＰ＿００２９６２８５２）をコードするＤＮＡ配列を、ＧＥＮＥｉｕｓソフトウエア（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）を用いて大腸菌における発現に対して最適化した。最適化したサブユニットのＤＮＡ配列を、メチロバクターエクストロケンスゲノムにおけるｍｔｋＡおよびｍｔｋＢ遺伝子間に天然に生じるＤＮＡ配列（ＣＧＡＡＣＧＧＧＧＧＡＧＧＡＡＴＣＡＣＧＣＣ、配列番号４６）により物理的に連結させた。得られたＤＮＡフラグメントである、「ｍｔｋＡ遺伝子−リンカーＤＮＡ−ｍｔｋＢ遺伝子」を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ ＯＰＥＲＯＮ（登録商標）により合成し、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を用いてｐＥＴ２８ｂ発現ベクター中にサブクローニングした。得られたＤＮＡプラスミドｐＥＴ２８−Ｍｅｘ−ｍｔｋＡＢ（配列番号４７）を用いて、メチロバクターエクストロケンスからのマリルＣｏＡシンターゼをコードする最適化された遺伝子の２つのコドンであるＭｅ−ｍｔｋＡおよびＭｅ−ｍｔｋＢを、高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ならびに開始コドンの上流にＳａｃＩに対する制限部位（下線付）を含んでいる、フォワードプライマーおよびリバースプライマー５’−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＡＴＧＧＡＴＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＡＴＣＡＧＧＣＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＣＴ−３’（配列番号４８）および５’−ＴＡＣＧＧＣＧＣＡＴＣＡＧＡＡＴＣＡＴｔａｃｇｃｃｇｃａｃｇｔｇｃｔａａｃａｃａｔｃｇｇｃａａｃ−３’（配列番号４９）を用いて同時に増幅した。スルホロブストコダイイからのマロニルＣｏＡレダクターゼであるＳｔ−ｍｃｒのコード配列を、終止コドンの下流にＢａｍＨＩに対する制限部位を含んでいるフォワードプライマーおよびリバースプライマー５’−ＧＧＣＧＴＡＡＴＧＡＴＴＣＴＧＡＴＧＣＧＣＣＧＴＡＣＣＣＴＧＡＡＡＧＣＧ−３’（配列番号５０）および５’−ＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴＣＧＡＴＧＴＡＧＣＣＴＴＴＣＴＣＣＡＣＧＡＧ−３’（配列番号５１）を用いてプラスミドｐＥＴ２８−Ｓｔｏ−ｍｃｒから増幅した。プラスミドｐＥＴ２８−Ｍｓｅ−ＤＨＢ−Ｄｈ−Ｈ３９Ｒ＿Ｎ４３Ｈ−ｏｐｔ（例５）をテンプレートとして用いて、メタロスファエラセデュラからのスクシニックセミアルデヒドレダクターゼＨ３９Ｒ Ｎ４３Ｈの最適化されたコード配列を、終止コドンの下流にＢａｍＨＩ制限部位（下線付）を導入するフォワードプライマーおよびリバースプライマー５’−ＴＡＣＡＴＣＧＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＴＡＣＣＴＡＴＡＡＡＧＡＡＣ−３’（配列番号５２）および５’−ＣＣＴＧＣＡＧＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＧＡＡＴＡＡＴＣＡＧＧＣＴＡＣＧＡＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣ−３’（配列番号５３）を用いて増幅した。

３つの遺伝子を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Ｃｌｏｎｅｔｃｈ）を用いた相同的組換えにより、ｐＥＸＴ２０発現ベクター中に同時にクローニングした。

得られたｐＥＸＴ２０−ＭＣＳ−ＤＨＢ（配列番号５４）プラスミドを単離し、ＤＮＡシーケンシングにより、正確な配列を有することが示された。

ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）カルボキシキナーゼ、ＰＥＰカルボキシラーゼ、ピルベートキナーゼ、ピルベートカルボキシラーゼ、イソシトレートリアーゼ酵素、およびガラクトース共輸送体パーミアーゼの過剰発現のためのプラスミドの構築：
大腸菌のｐｃｋ遺伝子をコードするＰＥＰカルボキシキナーゼを抱え持つプラスミドｐＡＣＴ３−ｐｃｋを、テンプレートとして大腸菌ＭＧ１６５５からのゲノムＤＮＡ、ならびにフォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれ^5’ＴＡＴＡＡＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＣＧＣＧＴＴＡＡＣＡＡＴＧＧＴＴＴＧＡＣＣ^3’（配列番号５６）および^5’ＴＡＴＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＴＡＣＡＧＴＴＴＣＧＧＡＣＣＡＧＣＣＧ^3’（配列番号５７）を用いて、ｐｃｋコード配列を増幅することにより構築した。ＤＮＡフラグメントをＸｍａＩおよびＸｂａＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いてｐＡＣＴ３発現ベクター（Ｄｙｋｘｈｏｏｒｎら、１９９６）の対応する部位中にライゲートし、大腸菌ＤＨ５α細胞に形質転換した。形質転換体を、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）を含む固体ＬＢ培地上で選択した。得られたプラスミドを単離し、ｐｃｋ遺伝子の正確な挿入をシーケンシングにより検証した。ａｃｅＡ、ｐｐｃ、ｇａｌＰ、またはｐｙｋＡ（全て大腸菌）または乳酸菌からのｐｃｋをそれぞれ抱え持つ、プラスミドｐＡＣＴ３−ａｃｅＡ、ｐＡＣＴ３−ｐｐｃ、ｐＡＣＴ３−ｇａｌＰ、ｐＡＣＴ３−ｐｃｋ、およびｐＡＣＴ３−ｐｙｃを、表１１に列挙したプライマーを用いて同様に構築した。

宿主系統におけるｌａｃＩのゲノム欠失と一緒に、上記のプラスミドのバックボーンからｌａｃＩ遺伝子を除去すると、上記のプラスミドからのタンパク質発現を構成的にし得ることが理解される。

ＤＨＢ生成のために最適化した炭素流入の再分配を有する系統の構築
ＤＨＢ生成のために炭素流入の再分配および補助因子の供給を最適化するために、大腸菌ＭＧ１６５５系統におけるいくつかの遺伝子を破壊した。遺伝子の欠失を、Ｄａｔｓｅｎｋｏらによるラムダレッドリコンビナーゼ法（Ｄａｔｓｅｎｋｏ＆Ｗａｎｎｅｒ、２０００）、またはＭｉｌｌｅｒから適応されたファージ形質導入法（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２）のいずれかを用いて行った。

ラムダレッドリコンビナーゼ法を用いた遺伝子欠失の導入のためのプロトコール：欠失カセットを、高忠実度ポリメラーゼＰｈｕｓｉｏｎ（商標）（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）、およびテンプレートとしてプラスミドｐＫＤ４のＦＲＴ隣接カナマイシン耐性遺伝子（ｋａｎ）を用いてＰＣＲにより調製した（Ｄａｔｓｅｎｋｏ＆Ｗａｎｎｅｒ、２０００）。センスプライマーは、後にｐＫＤ４のＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴカセットに対応する２０ｂｐが続く、各標的化遺伝子（下線付）の５’末端に対応する配列を含んでいた。アンチセンスプライマーは、後にカセットに対応する２０ｂｐが続く、各標的化遺伝子（下線付）の３’末端領域に対応する配列を含んでいた。プライマーを表１２に記載する。ＰＣＲ生成物をＤｐｎＩで消化し、精製した後、形質転換した。

大腸菌ＭＧ１６５５系統を、ＬＢ液体培地中３７℃でＯＤ₆₀₀が０．６になるまで細胞を増殖させ、細胞を１００倍濃縮し、これらを氷冷した１０％グリセロールで２回洗浄することにより、エレクトロコンピテントにした。細胞を、電気穿孔（２ｍｍギャップキュベット（ｇａｐ ｃｕｖｅｔｔｅｓ）中２．５ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）により、プラスミドｐＫＤ４６（Ｄａｔｓｅｎｋｏ＆Ｗａｎｎｅｒ、２０００）で形質転換した。形質転換体を、アンピリシン（１００μｇ／ｍＬ）ＬＢ固体培地上３０℃で選択した。

破壊カセットを、ラムダレッドリコンビナーゼ発現性プラスミドｐＫＤ４６を抱え持つ、エレクトロコンピテント大腸菌系統に形質転換した。細胞を、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含んでいる液体ＳＯＢ培地中３０℃で増殖させた。培養物のＯＤ₆₀₀が０．１に到達したら、１０ｍＭアラビノースを加えることによりラムダレッドリコンビナーゼ系を、誘発した。細胞を、ＯＤ₆₀₀ ０．６までさらに増殖させた後、細胞を遠心分離により回収し、氷冷した１０％グリセロールで２回洗浄し、電気穿孔により破壊カセットで形質転換した。ＬＢ液体培地中３０℃で一夜、表現型を発現させた後、細胞を、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む固体ＬＢ培地上に塗抹した。３０℃で培養した後、形質転換体を選択した。

遺伝子の置換を、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ）を用いてコロニーＰＣＲにより検証した。第１の反応を、隣接する遺伝子座特異的プライマーで行って（表１２を参照されたい）、親のフラグメントの同時の喪失および新たな変異体特異的フラグメントの獲得を検証した。遺伝子座特異的プライマーの１つを、ＦＲＴカナマイシン耐性カセット内でアラインする対応するプライマーｋ１ｒｅｖまたはｋ２ｆｏｒ（表１２を参照されたい）（センス遺伝子座プライマー／ｋ１ｒｅｖおよびｋ２ｆｏｒ／リバース遺伝子座プライマー）の１つと一緒に用いることにより、さらなる２つの反応を行った。

ＦＬＰリコンビナーゼを抱え持つ（FLP reombinase-harbouring）プラスミドｐＣＰ２０（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ＆Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ、１９９５）を用いて、耐性遺伝子（ＦＲＴ−ｋａｎ−ＦＲＴ）を引き続き染色体から切り取り、ＦＲＴ部位１つを含んでいる痕跡領域（scar region）が残された。ｐＣＰ２０は、温度感受性複製およびＦＬＰリコンビナーゼ合成の熱誘導を示すアンピシリンおよびＣｍＲプラスミドである。カナマイシン耐性変異体をｐＣＰ２０で形質転換し、アンピシリン耐性形質転換体を３０℃で選択した。次いで、形質転換体を３７℃の固体ＬＢ培地上で増殖させ、全ての抗生物質耐性の喪失について試験した。ＦＲＴカナマイシンカセットの切除を、コロニーＰＣＲにより、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑポリメラーゼおよび隣接する遺伝子座特異的プライマーを用いて分析した（表１２）。上記の工程を繰り返すことにより、複数の欠失を得た。

ファージ形質導入法を用いた遺伝子欠失の導入のためのプロトコール：所望の単一の欠失を保有する株を、Ｋｅｉｏコレクションから入手した（Ｂａｂａら、２００６）。一夜前培養物１００μＬを５０μｇ／ｍＬカナマイシン、２ｇ／Ｌグルコース、および５ｍＭＣａＣｌ₂を含んでいるＬＢ培地１０ｍＬに接種することにより、単一の欠失変異体からのファージ溶解物を調製した。３７℃で１時間インキュベートした後、野生型ＭＧ１６５５系統から調製したファージ溶解物２００μＬを加え、培養物を、細胞の溶解が完了するまでさらに２〜３時間インキュベートした。クロロホルム２００μＬを加えた後、細胞調合液を最初に激しくボルテックスにかけ、次いで４５００×ｇで１０分間遠心分離した。澄明な溶解物を回収し、４℃で貯蔵した。

レセプター系統を、ＬＢ培地中３７℃で一夜培養することにより、ファージ形質導入用に調製した。前培養物１．５ｍＬ体積を、１５００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを、１０ｍＭ ＭｇＳＯ₄および５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含んでいる溶液６００μＬ中に再懸濁した。レセプター系統を含んでいる溶液１００μＬを溶解物１００μＬと混合し、この混合液を３０℃で３０分間インキュベートすることにより形質導入を行った。その後、１Ｍクエン酸ナトリウム溶液１００μＬを加え、その後激しくボルテックスにかけた。ＬＢ培地１ｍＬを加えた後、細胞懸濁液を３７℃で１時間インキュベートし、その後細胞を、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含んでいるＬＢ寒天平板上に塗抹した。抗生物質の存在下で増殖することができるクローンが、表１３に列挙するプライマーを用いて、所望の欠失を含んでいることを、コロニーＰＣＲにより確認した。各遺伝子の欠失を導入した後、上記の通り、（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ＆Ｗａｃｋｅｒｎａｇｅｌ、１９９５）の方法に従って、抗生物質マーカーを除去した。

マリルＣｏＡシンテターゼ、マリルＣｏＡレダクターゼ、およびＤＨＢデヒドロゲナーゼを同時発現するプラスミド（ｐＥＸＴ２０−ＭＣＳ−ＤＨＢもしくはｐＡＣＴ３−ＭＣＳ−ＤＨＢ）；またはマリルＣｏＡリアーゼ、マリルＣｏＡレダクターゼ、およびＤＨＢデヒドロゲナーゼを同時発現するプラスミド（ｐＥＸＴ２０−ＭＣＬ−ＤＨＢもしくはｐＡＣＴ３−ＭＣＬ−ＤＨＢ）；または空の対照のプラスミド（ｐＥＸＴ２０もしくはｐＡＣＴ３）を、単独で、またはｐＡＣＴ３−ａｃｅＡ、ｐＡＣＴ３−ｐｐｃ、ｐＡＣＴ３−ｇａｌＰ、ｐＡＣＴ３−ｐｃｋ、またはｐＡＣＴ３−ｐｙｃのプラスミドの１つと一緒に最適化した宿主系統に形質転換した。ＤＨＢ経路の酵素を発現するプラスミド、およびアナプレロティック酵素（anaplerotic enzyme）を発現するプラスミドの両方を含む形質転換体を、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含んでいる固体ＬＢ培地上で選択した。構築された系統の非排他的な例を表１４に列挙する。

例８：合成のマリルＣｏＡ経路によるＤＨＢの発酵性の生成の実証
系統および培養条件：配列番号２０３によって示されるプラスミドｐＡＣＴ３−ＭＣＬ−ＤＨＢからＤＨＢ経路を発現するＥＣＥ６９系統（この実験では、野生型Ｍｃｒ酵素がＭｃｒ Ｔｙｒ２０６Ｐｒｏ変異体により置換されている）、および空のプラスミドｐＡＣＴ３を含んでいる同質遺伝子の対照ＥＣＥ７０系統を用いて実験を行った。培養は全て、１７０ｒｐｍで作動するＩｎｆｏｒｓ回転式振盪培養機上、３７℃で行った。一夜培養物（試験管中培地３ｍＬ）を、グリセロール貯蔵物から接種し、５００ｍＬ振盪フラスコ中で培養した増殖培養物１００ｍＬ中、最初のＯＤ₆₀₀を０．０５に調節するのに用いた。増殖培養物のＯＤ₆₀₀が１に到達したら、１ｍｍｏｌ／Ｌ濃度のＩＰＴＧを加えた。無機増殖培地の組成を例２に示す。

ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によるＤＨＢ濃度の推定：ＤＨＢを、ＬＣ−ＭＳを用いて定量した。液体陰イオン交換クロマトグラフィーを、自動式の溶離液（ＫＯＨ）ジェネレーターシステム（ＲＦＩＣ、Ｄｉｏｎｅｘ）、および試料を４℃に保持するオートサンプラー（ＡＳ５０、Ｄｉｏｎｅｘ）を装備したＤｉｏｎｅｘ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＵＳＡ）のＩＣＳ−３０００システム上で行った。分析物を、ＡＧ１１ ＨＣ（５０×２ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ）プレカラムによって保護したＩｏｎＰａｃ ＡＳ１１ ＨＣ（２５０×２ｍｍ、Ｄｉｏｎｅｘ）カラム上で分離した。カラム温度を２５℃に保持し、流速を０．２５ｍＬ／分に固定し、先に記載したＫＯＨ勾配を適用して分析物を溶出した（Ｇｒｏｕｓｓａｃ Ｅ、Ｏｒｔｉｚ Ｍ＆Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｊ（２０００）伝導度測定による検出およびパルスアンペロメトリック検出を有する高速イオン交換クロマトグラフィーを用いた生物学的試料から代謝産物を定量するための改善されたプロトコール（Improved protocols for quantitative determination of metabolites from biological samples using high performance ionic-exchange chromatography with conductimetric and pulsed amperometric detection.）、Ｅｎｚｙｍｅ．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、２６、７１５〜７２３）。注入した試料体積は１５μＬであった。バックグラウンドを低減するために、ＡＳＲＳ ｕｌｔｒａ ＩＩ（２ｍｍ、外部注水モード（external water mode）、７５ｍＡ）陰イオンサプレッサー（anion suppressor）を用いた。分析物を、ＥＳＩモード（分離は１／３であり、窒素圧力は９０ｐｓｉであり、キャピラリー電圧は３．５ｋＶであり、プローブ温度は４５０℃であった）において運転する質量感受性検出器（mass-sensitive detector）（ＭＳＱ Ｐｌｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏ）で定量した。

結果：培養２４時間後、ＥＣＥ６９およびＥＣＥ７０系統の上清はそれぞれ、０．０５ｍＭＤＨＢおよび０ｍＭＤＨＢを含んでおり、合成経路によるＤＨＢ生成が実証された。
以下に、出願当初の特許請求の範囲の記載を発明の態様として付記する。
［１］ 連続する、
ａ）マレートおよび／またはスクシニルＣｏＡおよび／またはグリオキシレートをマリルＣｏＡに変換する第１の工程と、
ｂ）予め得たマリルＣｏＡをマレート−４−セミアルデヒドに変換する第２の工程と、
ｃ）マレート−４−セミアルデヒドを、ＤＨＢデヒドロゲナーゼを用いて２，４−ＤＨＢに変換する第３の工程と、
を含む、２，４−ジヒドロキシ酪酸（２，４−ＤＨＢ）を調製するための方法。
［２］ 工程ａ）を、マリルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ、および／またはマリルＣｏＡリアーゼの活性を有する酵素によってそれぞれ触媒する、［１］に記載の方法。
［３］ 前記酵素を、配列番号１、配列番号１９３、および配列番号１９５のいずれか１つ、またはその任意のバリアントもしくはフラグメントによって表す、［２］に記載の方法。
［４］ 前記酵素を、配列番号２、配列番号１９４、および配列番号１９６において規定される核酸のいずれか１つ、またはその任意のバリアントもしくはフラグメントによってコードする、［２］または［３］に記載の方法。
［５］ 工程ｂ）を、マリルＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素によって触媒する、［１］または［２］に記載の方法。
［６］ 前記マレートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼは、酵素の少なくとも１つの変異によって取得可能であり、前記変異が、前記変異した酵素のマリルＣｏＡに対する活性および／または基質親和性を改善する、［５］に記載の方法。
［７］ 前記マリルＣｏＡレダクターゼが、野生型酵素に比べた場合、Ｐ１１１、Ｌ１５２、Ｔ１５４、Ｌ２０２、Ｇ２０３、Ｄ２０４、Ｙ２０６、Ｄ２０７、Ｋ２０９、Ｔ２１０、Ｔ２３８，Ｔ２３９、Ｄ２９５、Ｒ３１８の少なくとも１つの位置において少なくとも１つの変異を含み、前記位置における天然に生じるアミノ酸が、他の１９種類の天然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれか１つによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって置きかえられている、［６］に記載の方法。
［８］ 前記マリルＣｏＡレダクターゼを配列番号２０２によって表す、［７］に記載の方法。
［９］ 前記酵素を配列番号２０１の核酸によってコードする、［８］に記載の方法。
［１０］ 前記酵素が、マロニルＣｏＡレダクターゼ、またはスクシニルＣｏＡレダクターゼである、［５］に記載の方法。
［１１］ 前記酵素を、マロニルＣｏＡレダクターゼまたはスクシニルＣｏＡレダクターゼの活性を有する酵素の修飾によって得る、［１０］に記載の方法。
［１２］ 前記酵素を、配列番号７、配列番号８、もしくは配列番号１９１のいずれか１つ、またはその任意のバリアントもしくはフラグメントによって表す、［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］ 前記酵素を、配列番号８、配列番号１０、もしくは配列番号１９２において規定される核酸のいずれか１つ、またはその任意のバリアントもしくはフラグメントによってコードする、［１２］に記載の方法。
［１４］ 工程ｃ）を、ＤＨＢデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によって触媒する、［１］から［１３］のいずれか一に記載の方法。
［１５］ 前記酵素が、メチルブチルアルデヒドレダクターゼ、スクシニックセミアルデヒドレダクターゼ、４−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼである、［１４］に記載の方法。
［１６］ 前記酵素を、配列番号１４、配列番号１６、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号１８７、もしくは配列番号１８９、またはこれらの任意のバリアントによって表す、［１５］に記載の方法。
［１７］ 前記酵素を、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号１８８、配列番号１９０において規定される核酸のいずれか１つ、またはその任意のバリアントもしくはフラグメントによってコードする、［１６］に記載の方法。
［１８］ 工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を、工程ａ）、ｂ）、またはｃ）に記載する酵素活性を行う酵素の少なくとも１つを異種性に発現する修飾された微生物によって行う、［１］から［１７］のいずれか一に記載の方法。
［１９］ 工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を同じ微生物内で行う、［１］から［１７］のいずれか一に記載の方法。
［２０］ ［１］から［１７］のいずれか一において規定した、工程ａ）、ｂ）、およびｃ）の触媒作用に必要な酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子を発現する、２，４−ＤＨＢの改善された生成のための修飾された微生物。
［２１］ 優先的に、腸内細菌科、クロストリジウム科、バシラス科、ストレプトミセス科、ストレプトコッカス科、メチロバクテリウム科（Methylobacteriacae）、およびコリネバクテリウム科、最も優先的に、大腸菌、枯草菌、コリネバクテリウムグルタミカム、クロストリジウムアセトブチリカム、メチロバクテリウムエキストロクエンス、もしくは乳酸菌の中から選択される細菌、または、優先的に、サッカロミセス科、ピキア科、およびシゾサッカロミケス科、最も優先的に、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、クルイベロミセスラクチス、クルイベロミセスマルキスアヌス、ピキアジャディニ、ピキアスティピティス、もしくはピキアパストリの中から選択される酵母である、［２０］に記載の微生物。
［２２］ ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ピルベートカルボキシラーゼ、イソシトレートリアーゼ、ピルベートカルボキシラーゼ、およびヘキソース共輸送体パーミアーゼの中から選択される酵素活性の少なくとも１つの発現が増大し、かつ／またはラクテートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、ピルベートオキシダーゼ、イソシトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、フマラーゼ、２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ、ピルベートキナーゼ、マリック酵素、ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシナーゼ、ピルベートホルメートリアーゼ、スクシニックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、糖輸送（sugar-transporting）ホスホトランスフェラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、グリオキシレートレダクターゼ、マレートシンターゼ、またはメチルグリオキサールシンターゼの中から選択される酵素活性の少なくとも１つが低減している、［２０］または［２１］に記載の微生物。
［２３］ 全ての大腸菌のｐｐｃ、ｐｃｋ、ａｃｅＡ、ｇａｌＰ；乳酸菌からのｐｙｃＡの中から選択される遺伝子の少なくとも１つを過剰発現し、かつ／またはｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ、ｓａｄ、ｇａｂＡＢＣ、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ｐｐｃ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｍｇｓＡ、ｆｒｄＡＢＣＤ、ｓｕｃＡＢ、ｐｔｓＩ、ｐｔｓＧ、ｐｇｉ、ｆｕｍＡＢＣ、ａｌｄＡ、ｌｌｄＤ、ｉｃｌＲ、ａｃｅＢ、ａｓｐＣ、ｇｈｒＡＢの中から選択される遺伝子の少なくとも１つを欠失した大腸菌である、［２２］に記載の微生物。
［２４］ ［１５］から［１８］のいずれか一に記載の修飾された微生物を、適切な培養培地中で培養する工程と、
前記培養培地から２，４−ＤＨＢを回収する工程と
を含む、２，４−ＤＨＢを生成する方法。
［２５］ 前記２，４−ＤＨＢをさらに精製する、［２４］に記載の方法。

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Claims (21)

1. 連続する、
   ａ）マリルＣｏＡシンテターゼ、スクシニルＣｏＡ：（Ｌ）−マレートＣｏＡトランスフェラーゼ、および／またはマリルＣｏＡリアーゼの活性を有する酵素により触媒されることにより、マレートおよび／またはスクシニルＣｏＡおよび／またはグリオキシレートをマリルＣｏＡに変換する第１の工程と、
   ｂ）マリルＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素により触媒されることにより、工程ａ）で得られたマリルＣｏＡをマレート−４−セミアルデヒドに変換する第２の工程と、
   ｃ）工程ｂ）で得られたマレート−４−セミアルデヒドを、ＤＨＢデヒドロゲナーゼを用いて２，４−ＤＨＢに変換する第３の工程と、を含む、２，４−ジヒドロキシ酪酸（２，４−ＤＨＢ）を調製するための方法。
2. 工程ａ）の前記酵素が、配列番号１、配列番号１９１、または配列番号１９３で示すポリペプチドのいずれか１つである、請求項１に記載の方法。
3. 工程ａ）の前記酵素が、配列番号２、配列番号１９４または配列番号１９２において規定される核酸のいずれか１つによってコードされるポリペプチドである、請求項１または２に記載の方法。
4. 工程ｂ）の前記酵素は、マロニルＣｏＡレダクターゼ、スクシニルＣｏＡレダクターゼ、もしくは３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）レダクターゼ、シンナモイルＣｏＡレダクターゼ、もしくはアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素の中から選ばれ、またはこれら酵素の修飾により得ることができる、請求項１に記載の方法。
5. 工程ｂ）の前記酵素が、配列番号７、配列番号１０、もしくは配列番号１８９で示すポリペプチドのいずれか１つである、請求項１または４に記載の方法。
6. 工程ｂ）の前記酵素が、配列番号８、配列番号１１配列番号１９０において規定される核酸のいずれか１つによってコードされるポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
7. 前記マリルＣｏＡレダクターゼが、配列番号７のポリペプチドで示されるスルホロブストコダイイ（Sulfolobus tokodaii）のマロニルＣｏＡレダクターゼ野生型酵素に比べた場合、Ｐ１１１、Ｌ１５２、Ｔ１５４、Ｌ２０２、Ｇ２０３、Ｄ２０４、Ｙ２０６、Ｄ２０７、Ｋ２０９、Ｔ２１０、Ｔ２３８，Ｔ２３９、Ｄ２９５、Ｒ３１８の少なくとも１つの位置において少なくとも１つの変異を含み、前記位置における天然に生じるアミノ酸が、他の１９種類の天然に存在するタンパク質構成アミノ酸のいずれか１つによって、すなわち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのいずれかによって置きかえられている、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記マリルＣｏＡレダクターゼを配列番号２０２で示す、または配列番号２０１の核酸によってコードする、請求項７に記載の方法。
9. 工程ｃ）を、ＤＨＢデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素によって触媒する、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記酵素が、メチルブチルアルデヒドレダクターゼ、スクシニックセミアルデヒドレダクターゼ、４−ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼ、またはアルコールデヒドロゲナーゼである、請求項９に記載の方法。
11. 工程ｃ）の前記酵素を、
    （１）配列番号１４、配列番号１６、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号１８７、もしくは配列番号１８５で規定されるポリペプチド、または、
    （２）上記（１）のポリペプチドの１つまたは２つのアミノ酸が変異したバリアントであって、上記（１）のポリペプチド酵素活性を維持しているバリアント、
    によって表す、請求項１０に記載の方法。
12. 工程ｃ）の前記酵素が、配列番号１５、配列番号１７、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号１８８、または配列番号１８６において規定される核酸のいずれか１つによってコードされるポリペプチドである、請求項１１に記載の方法。
13. 工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を、工程ａ）、ｂ）、またはｃ）に記載する酵素活性を有する酵素の少なくとも１つを異種性に発現する修飾された微生物によって行う、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 工程ａ）、ｂ）、およびｃ）を同じ微生物内で行う、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 請求項１から１３のいずれか一項において規定した、工程ａ）、ｂ）、およびｃ）の触媒作用に必要な酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子が、２，４−ＤＨＢを生成するために導入された変異微生物。
16. 腸内細菌科、クロストリジウム科、バシラス科、ストレプトミセス科、ストレプトコッカス科、メチロバクテリウム科（Methylobacteriacae）、およびコリネバクテリウム科の中から選択される細菌、または、サッカロミセス科、ピキア科、およびシゾサッカロミケス科の中から選択される酵母である、請求項１５に記載の微生物。
17. 大腸菌、枯草菌、コリネバクテリウムグルタミカム、クロストリジウムアセトブチリカム、メチロバクテリウムエキストロクエンス、もしくは乳酸菌の中から選択される細菌、または、サッカロミセスセレビシエ、シゾサッカロミセスポンベ、クルイベロミセスラクチス、クルイベロミセスマルキスアヌス、ピキアジャディニ、ピキアスティピティス、もしくはピキアパストリの中から選択される酵母である、請求項１６に記載の微生物。
18. ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシキナーゼ、ピルベートカルボキシラーゼ、イソシトレートリアーゼ、ピルベートカルボキシラーゼ、およびヘキソース共輸送体パーミアーゼの中から選択される酵素活性の少なくとも１つの発現が増大し、かつ／またはラクテートデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アセテートキナーゼ、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ、ピルベートオキシダーゼ、イソシトレートリアーゼ、フマレートレダクターゼ、フマラーゼ、２−オキソグルタレートデヒドロゲナーゼ、ピルベートキナーゼ、マリック酵素、ホスホグルコースイソメラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシラーゼ、ホスホエノールピルベートカルボキシナーゼ、ピルベートホルメートリアーゼ、スクシニックセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、糖輸送（sugar-transporting）ホスホトランスフェラーゼ、アスパルテートアミノトランスフェラーゼ、グリオキシレートレダクターゼ、マレートシンターゼ、またはメチルグリオキサールシンターゼの中から選択される酵素活性の少なくとも１つが低減している、請求項１５から１７のいずれか１項に記載の微生物。
19. 全ての大腸菌のｐｐｃ、ｐｃｋ、ａｃｅＡ、ｇａｌＰ；乳酸菌からのｐｙｃＡの中から選択される遺伝子の少なくとも１つを過剰発現し、かつ／またはｌｄｈＡ、ａｄｈＥ、ａｃｋＡ、ｐｔａ、ｐｏｘＢ、ｆｏｃＡ、ｐｆｌＢ、ｓａｄ、ｇａｂＡＢＣ、ｓｆｃＡ、ｍａｅＢ、ｐｐｃ、ｐｙｋＡ、ｐｙｋＦ、ｍｇｓＡ、ｆｒｄＡＢＣＤ、ｓｕｃＡＢ、ｐｔｓＩ、ｐｔｓＧ、ｐｇｉ、ｆｕｍＡＢＣ、ａｌｄＡ、ｌｌｄＤ、ｉｃｌＲ、ａｃｅＢ、ａｓｐＣ、ｇｈｒＡＢの中から選択される遺伝子の少なくとも１つを欠失した大腸菌である、請求項１８に記載の微生物。
20. 請求項１５から１９のいずれか一項に記載の修飾された微生物を、適切な培養培地中で培養する工程と、
    前記培養培地から２，４−ＤＨＢを回収する工程とを含む、２，４−ＤＨＢを生成する方法。
21. 前記２，４−ＤＨＢをさらに精製する、請求項２０に記載の方法。