JPH10113183A - 発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法 - Google Patents
発酵法によるｌ−アミノ酸の製造法Info
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- JPH10113183A JPH10113183A JP8272114A JP27211496A JPH10113183A JP H10113183 A JPH10113183 A JP H10113183A JP 8272114 A JP8272114 A JP 8272114A JP 27211496 A JP27211496 A JP 27211496A JP H10113183 A JPH10113183 A JP H10113183A
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
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- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1217—Phosphotransferases with a carboxyl group as acceptor (2.7.2)
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- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 発酵法によるＬ−アミノ酸の効率の良い
製造法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が
解除される変異を有するエシェリヒア属細菌由来のアス
パルトキナーゼIIIをコードするＤＮＡとが細胞内に導
入されることによって形質転換されたエシェリヒア属細
菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中にＬ−アミノ
酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取す
る。
製造法を提供する。 【解決手段】 Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が
解除される変異を有するエシェリヒア属細菌由来のアス
パルトキナーゼIIIをコードするＤＮＡとが細胞内に導
入されることによって形質転換されたエシェリヒア属細
菌を、好適な培地中で培養し、該培養物中にＬ−アミノ
酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は微生物工業に関連し
たものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−アミノ酸の
製造法、この製造法に用いるＤＮＡ及び微生物に関する
ものである。
たものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−アミノ酸の
製造法、この製造法に用いるＤＮＡ及び微生物に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】発酵法によりＬ−リジンを製造する場
合、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌
株または該菌株の人工変異株が用いられている。Ｌ−リ
ジンを生産する人工変異株は数多く知られており、その
多くはアミノエチルシステイン（ＡＥＣ）耐性変異株で
あり、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、
バチルス属、またはエシェリヒア属に属している。ま
た、組換えＤＮＡを使用した形質転換体を用いる（米国
特許第4278765号）等、アミノ酸の生産を増加させる種
々の技術が開示されている。
合、生産性を向上させるために、自然界から分離した菌
株または該菌株の人工変異株が用いられている。Ｌ−リ
ジンを生産する人工変異株は数多く知られており、その
多くはアミノエチルシステイン（ＡＥＣ）耐性変異株で
あり、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属、
バチルス属、またはエシェリヒア属に属している。ま
た、組換えＤＮＡを使用した形質転換体を用いる（米国
特許第4278765号）等、アミノ酸の生産を増加させる種
々の技術が開示されている。
【０００３】例えば、エシェリヒア属においては、特開
昭56-18596号公報、米国特許第4346,170号およびApplie
d Microbiology and Biotechnology 15, 227 (1982)に
おいてジヒドロジピコリン酸合成酵素（以下、「ＤＤＰ
Ｓ」と略すことがある）を増強する事による、Ｌ−リジ
ンの製造法が示されている。
昭56-18596号公報、米国特許第4346,170号およびApplie
d Microbiology and Biotechnology 15, 227 (1982)に
おいてジヒドロジピコリン酸合成酵素（以下、「ＤＤＰ
Ｓ」と略すことがある）を増強する事による、Ｌ−リジ
ンの製造法が示されている。
【０００４】ところで、ジヒドロジピコリン酸合成酵素
（ＤＤＰＳ）は、アスパルトセミアルデヒドとピルビン
酸を脱水縮合させ、ジヒドロジピコリン酸を合成する酵
素であり、この反応はアスパラギン酸系アミノ酸の生合
成において、Ｌ−リジン生合成系への分岐の入口となっ
ている。エシェリヒア属細菌においてはアスパルトキナ
ーゼとともにＬ−リジン生合成の重要な調節部位を担っ
ている事が知られている。
（ＤＤＰＳ）は、アスパルトセミアルデヒドとピルビン
酸を脱水縮合させ、ジヒドロジピコリン酸を合成する酵
素であり、この反応はアスパラギン酸系アミノ酸の生合
成において、Ｌ−リジン生合成系への分岐の入口となっ
ている。エシェリヒア属細菌においてはアスパルトキナ
ーゼとともにＬ−リジン生合成の重要な調節部位を担っ
ている事が知られている。
【０００５】ＤＤＰＳはE. coli（エシェリヒア・コ
リ）ではda pAという遺伝子にコードされている。このda
pAはすでにクローニングされており、塩基配列も決定さ
れている（Richaud,F. et al. J. Bacteriol. 297 (198
6)）。
リ）ではda pAという遺伝子にコードされている。このda
pAはすでにクローニングされており、塩基配列も決定さ
れている（Richaud,F. et al. J. Bacteriol. 297 (198
6)）。
【０００６】一方、アスパルトキナーゼ（以下、「Ａ
Ｋ」と略すことがある）は、アスパラギン酸をβホスホ
アスパラギン酸に変える反応を触媒する酵素であり、ア
スパラギン酸系のアミノ酸の生合成系の主な調節酵素と
なっている。E. coliのＡＫは３種あり（ＡＫI, ＡＫI
I,ＡＫIII）、うち２つはホモセリンデヒドロゲナーゼ
（以下、「ＨＤ」と略すことがある）との複合酵素であ
る。複合酵素の内のひとつはthrA遺伝子にコードされる
ＡＫI−ＨＤIであり、もう一方はmetLM遺伝子にコード
されるＡＫII−ＨＤIIである。ＡＫIはスレオニンとイ
ソロイシンによる協奏的抑制及びスレオニンによる阻害
を受け、ＡＫIIはメチオニンによる抑制を受ける。
Ｋ」と略すことがある）は、アスパラギン酸をβホスホ
アスパラギン酸に変える反応を触媒する酵素であり、ア
スパラギン酸系のアミノ酸の生合成系の主な調節酵素と
なっている。E. coliのＡＫは３種あり（ＡＫI, ＡＫI
I,ＡＫIII）、うち２つはホモセリンデヒドロゲナーゼ
（以下、「ＨＤ」と略すことがある）との複合酵素であ
る。複合酵素の内のひとつはthrA遺伝子にコードされる
ＡＫI−ＨＤIであり、もう一方はmetLM遺伝子にコード
されるＡＫII−ＨＤIIである。ＡＫIはスレオニンとイ
ソロイシンによる協奏的抑制及びスレオニンによる阻害
を受け、ＡＫIIはメチオニンによる抑制を受ける。
【０００７】これらに対し、ＡＫIIIのみは単機能酵素
であり、lysCと名付けられた遺伝子の産物であって、Ｌ
−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けるこ
とが知られている。菌体内でのこれらの活性の割合は、
ＡＫI:ＡＫII:ＡＫIII＝約５:１:４となっている。
であり、lysCと名付けられた遺伝子の産物であって、Ｌ
−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けるこ
とが知られている。菌体内でのこれらの活性の割合は、
ＡＫI:ＡＫII:ＡＫIII＝約５:１:４となっている。
【０００８】E. coli のlysC はすでにクローニングさ
れており、塩基配列も決定されている（Cassan,M., Par
sot,C., Cohen,G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Chem. 2
61,1052 (1986)）。
れており、塩基配列も決定されている（Cassan,M., Par
sot,C., Cohen,G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Chem. 2
61,1052 (1986)）。
【０００９】リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れる変異を有するda pAとリジンによるフィードバック阻
害が解除される変異を有するlysCを有するE. coliを用
いてＬ−リジンを製造する方法は国際公開パンフレット
WO95/16042に開示されている。
れる変異を有するda pAとリジンによるフィードバック阻
害が解除される変異を有するlysCを有するE. coliを用
いてＬ−リジンを製造する方法は国際公開パンフレット
WO95/16042に開示されている。
【００１０】発酵法によりＬ−スレオニンを製造する場
合、微生物としては自然界から分離した菌株または該菌
株の人工変異株が用いられている。Ｌ−スレオニンを生
産する人工変異株は数多く知られており、その多くはα
−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐性があり、エシェ
リヒア属、セラチア属、またはブレビバクテリウム属、
コリネバクテリウム属に属している。エシェリヒア属に
おいては特開昭55-131397号公報、特開昭59-31691号公
報、特開昭56-15696号公報、および特表平3-501682号公
報でスレオニンオペロンを含有した組換えプラスミドに
より形質転換された菌株によるL-スレオニンを製造する
方法が示されている。
合、微生物としては自然界から分離した菌株または該菌
株の人工変異株が用いられている。Ｌ−スレオニンを生
産する人工変異株は数多く知られており、その多くはα
−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐性があり、エシェ
リヒア属、セラチア属、またはブレビバクテリウム属、
コリネバクテリウム属に属している。エシェリヒア属に
おいては特開昭55-131397号公報、特開昭59-31691号公
報、特開昭56-15696号公報、および特表平3-501682号公
報でスレオニンオペロンを含有した組換えプラスミドに
より形質転換された菌株によるL-スレオニンを製造する
方法が示されている。
【００１１】また、リジンによるフィードバック阻害が
解除される変異を有するl ysCを有するE. coliを用いて
Ｌ−スレオニンを製造する方法は国際公開パンフレット
WO94/11517に開示されている。
解除される変異を有するl ysCを有するE. coliを用いて
Ｌ−スレオニンを製造する方法は国際公開パンフレット
WO94/11517に開示されている。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、Ｌ−リジン
によるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリ
ヒア属細菌由来のＡＫIIIを取得し、従来よりもさらに
改良された発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供す
ることを課題とする。
によるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリ
ヒア属細菌由来のＡＫIIIを取得し、従来よりもさらに
改良された発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供す
ることを課題とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｌ−リジンに
よるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリヒ
ア属細菌由来のＡＫIIIをコードするＤＮＡを取得する
ことに成功した。尚、Ｌ−リジンによるフィードバック
阻害が十分に解除されたE. coli由来のＡＫIIIをコード
するＤＮＡを本明細書において変異型lysCあるいは変異
型ＡＫIII遺伝子とよぶことがある。
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｌ−リジンに
よるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリヒ
ア属細菌由来のＡＫIIIをコードするＤＮＡを取得する
ことに成功した。尚、Ｌ−リジンによるフィードバック
阻害が十分に解除されたE. coli由来のＡＫIIIをコード
するＤＮＡを本明細書において変異型lysCあるいは変異
型ＡＫIII遺伝子とよぶことがある。
【００１４】なお、Ｌ−リジンによるフィードバック阻
害が十分に解除されたE. coli由来のＤＤＰＳをコード
するＤＮＡを本明細書において変異型dapAあるいは変異
型ＤＤＰＳ遺伝子とよぶことがある。
害が十分に解除されたE. coli由来のＤＤＰＳをコード
するＤＮＡを本明細書において変異型dapAあるいは変異
型ＤＤＰＳ遺伝子とよぶことがある。
【００１５】さらに本願発明者らは、変異型lysCを細胞
内に有するエシェリヒア属細菌を創製した。そして同エ
シェリヒア属細菌を好適な培地で培養することにより、
該培養物中にＬ−リジンまたはＬ−スレオニンを著量生
産蓄積させ得ることを見出した。
内に有するエシェリヒア属細菌を創製した。そして同エ
シェリヒア属細菌を好適な培地で培養することにより、
該培養物中にＬ−リジンまたはＬ−スレオニンを著量生
産蓄積させ得ることを見出した。
【００１６】すなわち本願発明は、エシェリヒア属細菌
のアスパルトキナーゼIIIをコードし、該アスパルトキ
ナーゼIIIのリジンによるフィードバック阻害を解除す
る変異をコーディング領域内に有する遺伝子を含有する
ＤＮＡであって、該変異がアスパルトキナーゼIIIの318
番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基に置換させか
つ323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換さ
せる変異、325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基
に置換させかつ347番目のバリン残基を別のアミノ酸残
基に置換させる変異、323番目のグリシン残基を別のア
ミノ酸残基に置換させかつ347番目のバリン残基を別の
アミノ酸残基に置換させる変異、325番目のロイシン残
基を別のアミノ酸残基に置換させかつ345番目のセリン
残基を別のアミノ酸残基に置換する変異、323番目のグ
リシン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ358番目
のセリン残基を別のアミノ酸残基に置換する変異、344
番目のスレオニン残基を別のアミノ酸残基に置換させる
変異、250番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基
に置換させる変異、346番目のグルタミン酸残基を別の
アミノ酸残基に置換させかつ347番目のロイシン残基を
別のアミノ酸残基に置換させる変異、250番目のグルタ
ミン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ364番目
のスレオニン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変
異、202番目のアスパラギン酸残基を別のアミノ酸残基
に置換させかつ321番目のセリン残基を別のアミノ酸残
基に置換させる変異、283番目のアルギニン残基を別の
アミノ酸残基に置換させかつ333番目のアラニン残基を
別のアミノ酸残基に置換させかつ338番目のセリン残基
を別のアミノ酸残基に置換させかつ346番目のグルタミ
ン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ414番目の
アスパラギン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変
異、318番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基に置
換させかつ321番目のセリン残基を別のアミノ酸残基に
置換させかつ328番目のバリン残基を別のアミノ酸残基
に置換させかつ349番目のバリン残基を別のアミノ酸残
基に置換させかつ405番目のグルタミン酸残基を別のア
ミノ酸残基に置換させる変異であるものである。
のアスパルトキナーゼIIIをコードし、該アスパルトキ
ナーゼIIIのリジンによるフィードバック阻害を解除す
る変異をコーディング領域内に有する遺伝子を含有する
ＤＮＡであって、該変異がアスパルトキナーゼIIIの318
番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基に置換させか
つ323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換さ
せる変異、325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基
に置換させかつ347番目のバリン残基を別のアミノ酸残
基に置換させる変異、323番目のグリシン残基を別のア
ミノ酸残基に置換させかつ347番目のバリン残基を別の
アミノ酸残基に置換させる変異、325番目のロイシン残
基を別のアミノ酸残基に置換させかつ345番目のセリン
残基を別のアミノ酸残基に置換する変異、323番目のグ
リシン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ358番目
のセリン残基を別のアミノ酸残基に置換する変異、344
番目のスレオニン残基を別のアミノ酸残基に置換させる
変異、250番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基
に置換させる変異、346番目のグルタミン酸残基を別の
アミノ酸残基に置換させかつ347番目のロイシン残基を
別のアミノ酸残基に置換させる変異、250番目のグルタ
ミン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ364番目
のスレオニン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変
異、202番目のアスパラギン酸残基を別のアミノ酸残基
に置換させかつ321番目のセリン残基を別のアミノ酸残
基に置換させる変異、283番目のアルギニン残基を別の
アミノ酸残基に置換させかつ333番目のアラニン残基を
別のアミノ酸残基に置換させかつ338番目のセリン残基
を別のアミノ酸残基に置換させかつ346番目のグルタミ
ン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ414番目の
アスパラギン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変
異、318番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基に置
換させかつ321番目のセリン残基を別のアミノ酸残基に
置換させかつ328番目のバリン残基を別のアミノ酸残基
に置換させかつ349番目のバリン残基を別のアミノ酸残
基に置換させかつ405番目のグルタミン酸残基を別のア
ミノ酸残基に置換させる変異であるものである。
【００１７】好ましくは、エシェリヒア属細菌のアスパ
ルトキナーゼIIIをコードし、該アスパルトキナーゼIII
のリジンによるフィードバック阻害を解除する変異をコ
ーディング領域内に有する遺伝子を含有するＤＮＡであ
って、該変異がアスパルトキナーゼIIIの318番目のメチ
オニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ323番目
のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変
異、325番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に
置換させかつ347番目のバリン残基をメチオニン残基に
置換させる変異、323番目のグリシン残基をアスパラギ
ン酸残基に置換させかつ347番目のバリン残基をメチオ
ニン残基に置換させる変異、325番目のロイシン残基を
フェニルアラニン残基に置換させかつ345番目のセリン
残基をロイシン残基に置換する変異、323番目のグリシ
ン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ358番目の
セリン残基をロイシン残基に置換する変異、344番目の
スレオニン残基をメチオニン残基に置換させる変異、25
0番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変
異、346番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換さ
せかつ347番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基
に置換させる変異、250番目のグルタミン酸残基をリジ
ン残基に置換させかつ364番目のスレオニン残基をメチ
オニン残基に置換させる変異、202番目のアスパラギン
酸残基をグリシン残基に置換させかつ321番目のセリン
残基をプロリン残基に置換させる変異、283番目のアル
ギニン残基をセリン残基に置換させかつ333番目のアラ
ニン残基をスレオニン残基に置換させかつ338番目のセ
リン残基をスレオニン残基に置換させかつ346番目のグ
ルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ41
4番目のアスパラギン残基をセリン残基に置換させる変
異、318番目のメチオニン残基をリジン残基に置換させ
かつ321番目のセリン残基をプロリン残基に置換させか
つ328番目のバリン残基をフェニルアラニン残基に置換
させかつ349番目のバリン残基をグリシン残基に置換さ
せかつ405番目のグルタミン酸残基をバリン残基に置換
させる変異であるものである。
ルトキナーゼIIIをコードし、該アスパルトキナーゼIII
のリジンによるフィードバック阻害を解除する変異をコ
ーディング領域内に有する遺伝子を含有するＤＮＡであ
って、該変異がアスパルトキナーゼIIIの318番目のメチ
オニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ323番目
のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変
異、325番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に
置換させかつ347番目のバリン残基をメチオニン残基に
置換させる変異、323番目のグリシン残基をアスパラギ
ン酸残基に置換させかつ347番目のバリン残基をメチオ
ニン残基に置換させる変異、325番目のロイシン残基を
フェニルアラニン残基に置換させかつ345番目のセリン
残基をロイシン残基に置換する変異、323番目のグリシ
ン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ358番目の
セリン残基をロイシン残基に置換する変異、344番目の
スレオニン残基をメチオニン残基に置換させる変異、25
0番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変
異、346番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換さ
せかつ347番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基
に置換させる変異、250番目のグルタミン酸残基をリジ
ン残基に置換させかつ364番目のスレオニン残基をメチ
オニン残基に置換させる変異、202番目のアスパラギン
酸残基をグリシン残基に置換させかつ321番目のセリン
残基をプロリン残基に置換させる変異、283番目のアル
ギニン残基をセリン残基に置換させかつ333番目のアラ
ニン残基をスレオニン残基に置換させかつ338番目のセ
リン残基をスレオニン残基に置換させかつ346番目のグ
ルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ41
4番目のアスパラギン残基をセリン残基に置換させる変
異、318番目のメチオニン残基をリジン残基に置換させ
かつ321番目のセリン残基をプロリン残基に置換させか
つ328番目のバリン残基をフェニルアラニン残基に置換
させかつ349番目のバリン残基をグリシン残基に置換さ
せかつ405番目のグルタミン酸残基をバリン残基に置換
させる変異であるものである。
【００１８】本願発明は、前記ＤＮＡが、エシェリヒア
属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに接続さ
れて得られる組換えＤＮＡ、前記ＤＮＡを有するエシェ
リヒア属に属する微生物である。
属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに接続さ
れて得られる組換えＤＮＡ、前記ＤＮＡを有するエシェ
リヒア属に属する微生物である。
【００１９】本願発明は、前記微生物であってＬ−アミ
ノ酸生産能を有するものを発酵培地中で培養し、該培養
物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−
アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製
造法である。
ノ酸生産能を有するものを発酵培地中で培養し、該培養
物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ−
アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の製
造法である。
【００２０】尚、本明細書において、ＤＤＰＳ又はＡＫ
IIIをコードするＤＮＡ、あるいはこれらにプロモータ
ーを含むＤＮＡを、「ＤＤＰＳ遺伝子」又は「ＡＫIII
遺伝子」ということがある。また、Ｌ−リジンによるフ
ィードバック阻害が解除された変異酵素を単に「変型型
酵素」、これをコードするＤＮＡあるいはこれにプロモ
ーターを含むＤＮＡを「変異型遺伝子」ということがあ
る。さらに、「Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が
解除される」とは、実質的に阻害が解除されていればよ
いことを意味し、完全に解除されている必要はない。
IIIをコードするＤＮＡ、あるいはこれらにプロモータ
ーを含むＤＮＡを、「ＤＤＰＳ遺伝子」又は「ＡＫIII
遺伝子」ということがある。また、Ｌ−リジンによるフ
ィードバック阻害が解除された変異酵素を単に「変型型
酵素」、これをコードするＤＮＡあるいはこれにプロモ
ーターを含むＤＮＡを「変異型遺伝子」ということがあ
る。さらに、「Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が
解除される」とは、実質的に阻害が解除されていればよ
いことを意味し、完全に解除されている必要はない。
【００２１】以下、本発明について詳細に説明する。
【００２２】＜１＞本発明の変異型アスパルトキナーゼ
（ＡＫIII）をコードするＤＮＡ 本発明の変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡは、野生型
ＡＫIIIをコードするＤＮＡにおいて、コードされるＡ
ＫIIIのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れる変異を有するものである。ＡＫIIIとしては、エシ
ェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のＡＫIII
が挙げられる。また、ＡＫIIIのＬ−リジンによるフィ
ードバック阻害を解除する変異としては、配列表の配列
番号１に記載されるＡＫIIIのアミノ酸配列中、ＡＫIII
のＮ−末端からア )318番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基、好ま
しくはイソロイシン残基に置換させかつ323番目のグリ
シン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはアスパラギン
酸残基に置換させる変異、イ )325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基、好まし
くはフェニルアラニン残基に置換させかつ347番目のバ
リン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニン残
基に置換させる変異、ウ )323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基、好まし
くはアスパラギン酸残基に置換させかつ347番目のバリ
ン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニン残基
に置換させる変異、エ )325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基、好まし
くはフェニルアラニン残基に置換させかつ345番目のセ
リン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはロイシン残基
に置換する変異、オ )323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基、好まし
くはアスパラギン酸残基に置換させかつ358番目のセリ
ン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはロイシン残基に
置換する変異、カ )344番目のスレオニン残基を別のアミノ酸残基、好ま
しくはメチオニン残基に置換させる変異、キ )250番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好
ましくはリジン残基に置換させる変異、ク )346番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好
ましくはリジン残基に置換させかつ347番目のロイシン
残基を別のアミノ酸残基、好ましくはフェニルアラニン
残基に置換させる変異、ケ )250番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好
ましくはリジン残基に置換させかつ364番目のスレオニ
ン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニン残基
に置換させる変異、コ )202番目のアスパラギン酸残基を別のアミノ酸残基、
好ましくはグリシン残基に置換させかつ321番目のセリ
ン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはプロリン残基に
置換させる変異、サ )283番目のアルギニン残基を別のアミノ酸残基、好ま
しくはセリン残基に置換させかつ333番目のアラニン残
基を別のアミノ酸残基、好ましくはスレオニン残基に置
換させかつ338番目のセリン残基を別のアミノ酸残基、
好ましくはスレオニン残基に置換させかつ346番目のグ
ルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好ましくはアスパ
ラギン酸残基に置換させかつ414番目のアスパラギン残
基を別のアミノ酸残基、好ましくはセリン残基に置換さ
せる変異、シ )318番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基、好ま
しくはリジン残基に置換させかつ321番目のセリン残基
を別のアミノ酸残基、好ましくはプロリン残基に置換さ
せかつ328番目のバリン残基を別のアミノ酸残基、好ま
しくはフェニルアラニン残基に置換させかつ349番目の
バリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはグリシン残
基に置換させかつ405番目のグルタミン酸残基を別のア
ミノ酸残基、好ましくはバリン残基に置換させる変異が
挙げられる。
（ＡＫIII）をコードするＤＮＡ 本発明の変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡは、野生型
ＡＫIIIをコードするＤＮＡにおいて、コードされるＡ
ＫIIIのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れる変異を有するものである。ＡＫIIIとしては、エシ
ェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のＡＫIII
が挙げられる。また、ＡＫIIIのＬ−リジンによるフィ
ードバック阻害を解除する変異としては、配列表の配列
番号１に記載されるＡＫIIIのアミノ酸配列中、ＡＫIII
のＮ−末端からア )318番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基、好ま
しくはイソロイシン残基に置換させかつ323番目のグリ
シン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはアスパラギン
酸残基に置換させる変異、イ )325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基、好まし
くはフェニルアラニン残基に置換させかつ347番目のバ
リン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニン残
基に置換させる変異、ウ )323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基、好まし
くはアスパラギン酸残基に置換させかつ347番目のバリ
ン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニン残基
に置換させる変異、エ )325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基、好まし
くはフェニルアラニン残基に置換させかつ345番目のセ
リン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはロイシン残基
に置換する変異、オ )323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基、好まし
くはアスパラギン酸残基に置換させかつ358番目のセリ
ン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはロイシン残基に
置換する変異、カ )344番目のスレオニン残基を別のアミノ酸残基、好ま
しくはメチオニン残基に置換させる変異、キ )250番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好
ましくはリジン残基に置換させる変異、ク )346番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好
ましくはリジン残基に置換させかつ347番目のロイシン
残基を別のアミノ酸残基、好ましくはフェニルアラニン
残基に置換させる変異、ケ )250番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好
ましくはリジン残基に置換させかつ364番目のスレオニ
ン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはメチオニン残基
に置換させる変異、コ )202番目のアスパラギン酸残基を別のアミノ酸残基、
好ましくはグリシン残基に置換させかつ321番目のセリ
ン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはプロリン残基に
置換させる変異、サ )283番目のアルギニン残基を別のアミノ酸残基、好ま
しくはセリン残基に置換させかつ333番目のアラニン残
基を別のアミノ酸残基、好ましくはスレオニン残基に置
換させかつ338番目のセリン残基を別のアミノ酸残基、
好ましくはスレオニン残基に置換させかつ346番目のグ
ルタミン酸残基を別のアミノ酸残基、好ましくはアスパ
ラギン酸残基に置換させかつ414番目のアスパラギン残
基を別のアミノ酸残基、好ましくはセリン残基に置換さ
せる変異、シ )318番目のメチオニン残基を別のアミノ酸残基、好ま
しくはリジン残基に置換させかつ321番目のセリン残基
を別のアミノ酸残基、好ましくはプロリン残基に置換さ
せかつ328番目のバリン残基を別のアミノ酸残基、好ま
しくはフェニルアラニン残基に置換させかつ349番目の
バリン残基を別のアミノ酸残基、好ましくはグリシン残
基に置換させかつ405番目のグルタミン酸残基を別のア
ミノ酸残基、好ましくはバリン残基に置換させる変異が
挙げられる。
【００２３】野生型ＡＫIIIをコードするＤＮＡとして
は、特に制限されないが、エシェリヒア属細菌、例えば
E. coli由来のＡＫIIIをコードするＤＮＡが挙げられ、
具体的には配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ、さらには配列番号１に示す塩基配列のうち、塩
基番号584〜1930で表される配列が挙げられる。尚、E.
coliのＡＫIIIは、lysC遺伝子にコードされている。
は、特に制限されないが、エシェリヒア属細菌、例えば
E. coli由来のＡＫIIIをコードするＤＮＡが挙げられ、
具体的には配列番号１に示すアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ、さらには配列番号１に示す塩基配列のうち、塩
基番号584〜1930で表される配列が挙げられる。尚、E.
coliのＡＫIIIは、lysC遺伝子にコードされている。
【００２４】これらの配列において、上記アミノ酸残基
の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、
本発明の変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡである。
尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、その
アミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わ
ない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型Ａ
ＫIIIのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。
このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残
基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも本発明の変
異型ＡＫIII遺伝子に含まれる。
の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、
本発明の変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡである。
尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、その
アミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わ
ない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型Ａ
ＫIIIのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。
このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残
基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも本発明の変
異型ＡＫIII遺伝子に含まれる。
【００２５】例えば、後記実施例１で得られた野生型ly
sC遺伝子の塩基配列（配列番号１）は、既に発表されて
いる E. coli K-12 JC411株のlysCの配列（Cassan,M.,
Parsot,C., Cohen,G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Che
m. 261, 1052 (1986)）と６ヶ所相違しており、そのう
ち２ヶ所でコードされるアミノ酸残基が異なっている
（JC411株のlysCは、配列番号１に示すlysCのアミノ酸
配列中、Ｎ−末端から５８番目のグリシン残基がシステ
イン残基に、401番目のグリシン残基がアラニン残基に
置き換わっている）。このE. coli K-12 JC411株のlysC
と同一の配列を有するly sCであっても、上記ア)〜シ)のい
ずれかの変異を導入すれば、Ｌ−リジンによるフィード
バック阻害が解除された変異を有するlysCが得られるこ
とが予想される。
sC遺伝子の塩基配列（配列番号１）は、既に発表されて
いる E. coli K-12 JC411株のlysCの配列（Cassan,M.,
Parsot,C., Cohen,G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Che
m. 261, 1052 (1986)）と６ヶ所相違しており、そのう
ち２ヶ所でコードされるアミノ酸残基が異なっている
（JC411株のlysCは、配列番号１に示すlysCのアミノ酸
配列中、Ｎ−末端から５８番目のグリシン残基がシステ
イン残基に、401番目のグリシン残基がアラニン残基に
置き換わっている）。このE. coli K-12 JC411株のlysC
と同一の配列を有するly sCであっても、上記ア)〜シ)のい
ずれかの変異を導入すれば、Ｌ−リジンによるフィード
バック阻害が解除された変異を有するlysCが得られるこ
とが予想される。
【００２６】リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れた変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡを取得する方法
は以下の通りである。まず、野生型ＡＫIII遺伝子又は
他の変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡをイ
ンビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合
するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、
同形質転換体のうちで変異型ＡＫIIIを発現するように
至ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子
を保持している。また、野生型ＡＫIII遺伝子又は他の
変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主
に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得
て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異
処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換
体を得、同形質転換体のうちで変異型ＡＫIIIを発現す
るように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異
型遺伝子を保持している。あるいは、野生型酵素を生産
する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株
を創成した後、該変異株から変異型遺伝子を取得しても
よい。
れた変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡを取得する方法
は以下の通りである。まず、野生型ＡＫIII遺伝子又は
他の変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡをイ
ンビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合
するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、
同形質転換体のうちで変異型ＡＫIIIを発現するように
至ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子
を保持している。また、野生型ＡＫIII遺伝子又は他の
変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主
に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得
て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異
処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換
体を得、同形質転換体のうちで変異型ＡＫIIIを発現す
るように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異
型遺伝子を保持している。あるいは、野生型酵素を生産
する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株
を創成した後、該変異株から変異型遺伝子を取得しても
よい。
【００２７】ＤＮＡを直接変異処理するための薬剤とし
ては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒドロキシ
ルアミンは、シトシンをＮ4−ヒドロキシシトシンに変
えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化
学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する
場合は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−
ニトロソグアニジン（NTG）等の通常人工突然変異に用
いられている変異剤による処理を行う。
ては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒドロキシ
ルアミンは、シトシンをＮ4−ヒドロキシシトシンに変
えることによりシトシンからチミンへの変異を起こす化
学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処理する
場合は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−
ニトロソグアニジン（NTG）等の通常人工突然変異に用
いられている変異剤による処理を行う。
【００２８】上記野生型ＡＫIII遺伝子あるいは他の変
異を有するＡＫIII遺伝子を含有するDNAの供与菌として
は、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなるも
のを用いてもかまわない。具体的にはF.C.Neidhardtら
の著書（Neidhardt,F.C. et.al., Escherichia coli an
d Salmonella Typhimurium, American Society for Mic
robiology, Washington D.C., pp1208, table 1）にあ
げられるものが利用できる。たとえば、E.coli JM109株
や、MC1061株などがあげられる。
異を有するＡＫIII遺伝子を含有するDNAの供与菌として
は、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなるも
のを用いてもかまわない。具体的にはF.C.Neidhardtら
の著書（Neidhardt,F.C. et.al., Escherichia coli an
d Salmonella Typhimurium, American Society for Mic
robiology, Washington D.C., pp1208, table 1）にあ
げられるものが利用できる。たとえば、E.coli JM109株
や、MC1061株などがあげられる。
【００２９】（１）野生型ＡＫIII遺伝子の取得 以下に、ＡＫIII遺伝子を含有するDNAの調製例について
述べる。まず、野生型のlysCをもつE. coli例えばMC106
1株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養するに
は、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際の
効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが好
ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペプ
トン、肉エキス、コーンスィープリカーまたは大豆もし
くは小麦の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第
１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸
第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添
加し、更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添
加した物が用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、6〜8
に調製するのが適当である。また培養は30〜42℃、好ま
しくは37℃前後で4〜24時間、通気攪拌深部培養、振盪
培養または静置培養等により行う。
述べる。まず、野生型のlysCをもつE. coli例えばMC106
1株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養するに
は、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際の
効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが好
ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペプ
トン、肉エキス、コーンスィープリカーまたは大豆もし
くは小麦の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン酸第
１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウム、
塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸
第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添
加し、更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適宜添
加した物が用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、6〜8
に調製するのが適当である。また培養は30〜42℃、好ま
しくは37℃前後で4〜24時間、通気攪拌深部培養、振盪
培養または静置培養等により行う。
【００３０】このようにして得られた培養物を、例えば
3,000 r.p.m.で5分間遠心分離してE. coli MC1061株の
菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法
（Biochem.Biophys.Acta. 7 2, 619, (1963)）、K.S.Kir
byの方法（Biochem.J. 64, 405,(1956)）等の方法によ
り染色体DNAを得ることができる。
3,000 r.p.m.で5分間遠心分離してE. coli MC1061株の
菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法
（Biochem.Biophys.Acta. 7 2, 619, (1963)）、K.S.Kir
byの方法（Biochem.J. 64, 405,(1956)）等の方法によ
り染色体DNAを得ることができる。
【００３１】こうして得られた染色体ＤＮＡからＡＫII
I遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリー
を作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部
分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を
調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵
素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度30℃以上、好
ましくは37℃、酵素濃度1〜10unit/mlで様々な時間（1
分〜2時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化す
る。
I遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリー
を作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部
分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を
調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵
素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度30℃以上、好
ましくは37℃、酵素濃度1〜10unit/mlで様々な時間（1
分〜2時間）染色体ＤＮＡに作用させてこれを消化す
る。
【００３２】ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDN
Aに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染
色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素 Sau3AＩと同一末端
塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHＩを、温度
30℃以上、酵素濃度1〜100unit/mlの条件下で1時間以
上、好ましくは1〜3時間、ベクターＤＮＡに作用させて
これを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のよう
にして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と開裂切断されたベ
クターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好まし
くはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度4〜１16℃、酵素濃度1
〜100unit/mlの条件下で1時間以上、好ましくは６〜２
４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDN
Aに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染
色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素 Sau3AＩと同一末端
塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHＩを、温度
30℃以上、酵素濃度1〜100unit/mlの条件下で1時間以
上、好ましくは1〜3時間、ベクターＤＮＡに作用させて
これを完全消化し、切断開裂する。次いで、上記のよう
にして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と開裂切断されたベ
クターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリガーゼ、好まし
くはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度4〜１16℃、酵素濃度1
〜100unit/mlの条件下で1時間以上、好ましくは６〜２
４時間作用させて組換えＤＮＡを得る。
【００３３】得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリ
ヒア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、好ましくはＡＫ
I、II、III全欠損株、例えばE. coli GT3株（E. coli G
enetic Stock Center（米国コネチカット州）等から入
手できる）等を形質転換して染色体ＤＮＡライブラリー
を作製する。この形質転換は D.M.Morrisonの方法（Met
hods in Enzymology 68, 326, (1979)）あるいは受容菌
細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す
方法（Mandel,M. and Higa,A., J.Mol.Biol. 53,159(19
70)）等により行うことができる。
ヒア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、好ましくはＡＫ
I、II、III全欠損株、例えばE. coli GT3株（E. coli G
enetic Stock Center（米国コネチカット州）等から入
手できる）等を形質転換して染色体ＤＮＡライブラリー
を作製する。この形質転換は D.M.Morrisonの方法（Met
hods in Enzymology 68, 326, (1979)）あるいは受容菌
細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す
方法（Mandel,M. and Higa,A., J.Mol.Biol. 53,159(19
70)）等により行うことができる。
【００３４】得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中か
ら、ＡＫIII活性が増大した株あるいはＡＫIII遺伝子欠
損に起因する栄養要求性が相補された株より ＡＫIII
遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。例えば、ＡＫ
完全欠損変異株を宿主に用いた場合は、Ｌ−リジン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−メチニオンおよびジアミノピメリン
酸を含有しない培地上で、またはホモセリンおよびジア
ミノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった
形質転換株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収す
ることにより、ＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡ断片を
得ることができる。 候補株から細胞抽出液を調製し、
それより粗酵素液を調製してＡＫIII活性を確認する。
ＡＫIIIの酵素活性測定法は、E.R.Stadtmanらの方法（S
tadtman,E.R., Cohen,G.N., LeBras,G., and Robichon-
Szulmajster,H., J.Biol.Chem. 236, 2033 (1961)）に
より行うことができる。
ら、ＡＫIII活性が増大した株あるいはＡＫIII遺伝子欠
損に起因する栄養要求性が相補された株より ＡＫIII
遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。例えば、ＡＫ
完全欠損変異株を宿主に用いた場合は、Ｌ−リジン、Ｌ
−スレオニン、Ｌ−メチニオンおよびジアミノピメリン
酸を含有しない培地上で、またはホモセリンおよびジア
ミノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった
形質転換株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収す
ることにより、ＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡ断片を
得ることができる。 候補株から細胞抽出液を調製し、
それより粗酵素液を調製してＡＫIII活性を確認する。
ＡＫIIIの酵素活性測定法は、E.R.Stadtmanらの方法（S
tadtman,E.R., Cohen,G.N., LeBras,G., and Robichon-
Szulmajster,H., J.Biol.Chem. 236, 2033 (1961)）に
より行うことができる。
【００３５】そして、上記菌株より、ＡＫIII遺伝子を
含有するＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組換えＤ
ＮＡを、例えば P.Guerryらの方法（J.Bacteriol. 116,
1064, (1973)）、D.B.Clewellの方法（J.Bacteriol. 1
10, 667, (1972)）などにより単離することができる。
含有するＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組換えＤ
ＮＡを、例えば P.Guerryらの方法（J.Bacteriol. 116,
1064, (1973)）、D.B.Clewellの方法（J.Bacteriol. 1
10, 667, (1972)）などにより単離することができる。
【００３６】野生型ＡＫIII遺伝子の取得は、染色体上
にＡＫIII遺伝子を有する株から、斎藤、三浦の方法等
により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリ
アクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction; W
hite,T.J. et al Trends Genet. 5, 185 (1989)）によ
り、ＡＫIII遺伝子を増幅することによっても行える。
増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ＡＫIII 遺伝子
の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両
3'末端に相補するものを用いる。ＡＫIII遺伝子の一部
領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をプライマ
ーとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡライブ
ラリーよりスクリーニングする必要がある。ＡＫIII遺
伝子の全領域を増幅した場合には、増幅されたＡＫIII
遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反応液をアガ
ロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮＡ断片を抽
出することによって ＡＫIII 遺伝子を含有するＤＮＡ
断片を回収できる。
にＡＫIII遺伝子を有する株から、斎藤、三浦の方法等
により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリ
アクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction; W
hite,T.J. et al Trends Genet. 5, 185 (1989)）によ
り、ＡＫIII遺伝子を増幅することによっても行える。
増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ＡＫIII 遺伝子
の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二重鎖の両
3'末端に相補するものを用いる。ＡＫIII遺伝子の一部
領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片をプライマ
ーとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体ＤＮＡライブ
ラリーよりスクリーニングする必要がある。ＡＫIII遺
伝子の全領域を増幅した場合には、増幅されたＡＫIII
遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反応液をアガ
ロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮＡ断片を抽
出することによって ＡＫIII 遺伝子を含有するＤＮＡ
断片を回収できる。
【００３７】ＤＮＡプライマーとしては、例えばE. col
iにおいて既知となっている配列（Cassan,M., Parsot,
C., Cohen,G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Chem. 261,
1052(1986)）を基にして適宜作成できるが、lysC遺伝子
をコードする1347塩基からなる領域を増幅できるプライ
マーが適当であり、例えば配列番号２および３に示した
２種のプライマーが適当である。プライマーＤＮＡの合
成は、ホスホアミダイド法（Tetrahedron Letters 2 2,
1859 (1981)）等の常法により、市販のＤＮＡ合成装置
（例えば、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model
380B等）を用いて合成することができる。また、PCR反
応は、市販のＰＣＲ反応装置（宝酒造（株）製ＤＮＡサ
ーマルサイクラー PJ2000型等）を使用し、TaqDNAポリ
メラーゼ（宝酒造（株）より供給されている）を用い、
供給者により指定された方法に従って行うことができ
る。
iにおいて既知となっている配列（Cassan,M., Parsot,
C., Cohen,G.N., and Patte,J.C., J.Biol.Chem. 261,
1052(1986)）を基にして適宜作成できるが、lysC遺伝子
をコードする1347塩基からなる領域を増幅できるプライ
マーが適当であり、例えば配列番号２および３に示した
２種のプライマーが適当である。プライマーＤＮＡの合
成は、ホスホアミダイド法（Tetrahedron Letters 2 2,
1859 (1981)）等の常法により、市販のＤＮＡ合成装置
（例えば、Applied Biosystems社製ＤＮＡ合成機 model
380B等）を用いて合成することができる。また、PCR反
応は、市販のＰＣＲ反応装置（宝酒造（株）製ＤＮＡサ
ーマルサイクラー PJ2000型等）を使用し、TaqDNAポリ
メラーゼ（宝酒造（株）より供給されている）を用い、
供給者により指定された方法に従って行うことができ
る。
【００３８】ＰＣＲ法により増幅されたＡＫIII遺伝子
は、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能な
ベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導
入することによって、ＡＫIII遺伝子への変異の導入な
どの操作がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと
形質転換法、さらに ＡＫIII遺伝子の存在の確認方法は
上述した方法と同じである。
は、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能な
ベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導
入することによって、ＡＫIII遺伝子への変異の導入な
どの操作がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと
形質転換法、さらに ＡＫIII遺伝子の存在の確認方法は
上述した方法と同じである。
【００３９】（２）ＡＫIII遺伝子への変異の導入 上記のようにして得られたＡＫIII遺伝子に、アミノ酸
残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法と
しては、リコンビナントＰＣＲ法（Higuchi,R., 61, in
PCR Technology (Erlich,H.A. Eds., Stockton press
(1989)）、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.
J., Methods in Enzymology 154, 350 (1987); Kunkel,
T.A. et.al., Methods in Enzymology 154, 367 (198
7)）などがある。これらの方法を用いると、目的部位に
目的の変異を起こすことができる。また、目的遺伝子を
化学合成する方法によれば、目的部位への変異、あるい
はランダムな変異を導入することができる。
残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法と
しては、リコンビナントＰＣＲ法（Higuchi,R., 61, in
PCR Technology (Erlich,H.A. Eds., Stockton press
(1989)）、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.
J., Methods in Enzymology 154, 350 (1987); Kunkel,
T.A. et.al., Methods in Enzymology 154, 367 (198
7)）などがある。これらの方法を用いると、目的部位に
目的の変異を起こすことができる。また、目的遺伝子を
化学合成する方法によれば、目的部位への変異、あるい
はランダムな変異を導入することができる。
【００４０】さらに、染色体もしくはプラスミド上のＡ
ＫIII遺伝子を直接ヒドロキシルアミンで処理する方法
（Hashimoto,T. and Sekiguchi,M., J.Bacteriol. 159,
1039 (1984)）がある。また、ＡＫIII遺伝子を保有す
るエシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法またはN−
メチル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの
化学薬剤処理による方法を用いてもよい。これらの方法
によれば、ランダムに変異を導入できる。
ＫIII遺伝子を直接ヒドロキシルアミンで処理する方法
（Hashimoto,T. and Sekiguchi,M., J.Bacteriol. 159,
1039 (1984)）がある。また、ＡＫIII遺伝子を保有す
るエシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法またはN−
メチル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの
化学薬剤処理による方法を用いてもよい。これらの方法
によれば、ランダムに変異を導入できる。
【００４１】変異型ＡＫIII遺伝子の選択方法として
は、まず変異処理したＡＫIII遺伝子を含有する組換え
ＤＮＡをＡＫ完全欠損株、例えば E. coli GT3株に形質
転換する。次に著量のＬ−リジンを含む最少培地、例え
ばM9で形質転換株を培養する。野生型のＡＫIII遺伝子
を含有する組換えＤＮＡを保持する株は、唯一のＡＫが
Ｌ−リジンにより阻害されるために、Ｌ−スレオニン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノピメ
リン酸(DAP)の合成が出来なくなり生育が抑えられる。
これに対しＬ−リジンによる阻害の解除された変異型Ａ
ＫIII遺伝子を含有する組換えＤＮＡ保持株は、著量の
Ｌ−リジンが添加された最少培地上での生育が可能にな
るはずである。この現象を利用し、生育が、Ｌ−リジン
あるいはＬ−リジンのアナログであるＳ−２−アミノエ
チル・システイン（AEC）に耐性となっている株、すな
わち阻害の解除された変異型ＡＫIII遺伝子を含有する
組換えＤＮＡ保持株を選択することができる。
は、まず変異処理したＡＫIII遺伝子を含有する組換え
ＤＮＡをＡＫ完全欠損株、例えば E. coli GT3株に形質
転換する。次に著量のＬ−リジンを含む最少培地、例え
ばM9で形質転換株を培養する。野生型のＡＫIII遺伝子
を含有する組換えＤＮＡを保持する株は、唯一のＡＫが
Ｌ−リジンにより阻害されるために、Ｌ−スレオニン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノピメ
リン酸(DAP)の合成が出来なくなり生育が抑えられる。
これに対しＬ−リジンによる阻害の解除された変異型Ａ
ＫIII遺伝子を含有する組換えＤＮＡ保持株は、著量の
Ｌ−リジンが添加された最少培地上での生育が可能にな
るはずである。この現象を利用し、生育が、Ｌ−リジン
あるいはＬ−リジンのアナログであるＳ−２−アミノエ
チル・システイン（AEC）に耐性となっている株、すな
わち阻害の解除された変異型ＡＫIII遺伝子を含有する
組換えＤＮＡ保持株を選択することができる。
【００４２】こうして得られた該変異型遺伝子を、組換
えＤＮＡとして適当な微生物（宿主）に導入し、発現さ
せることによりフィードバック阻害が解除されたＡＫII
Iを保有する微生物を取得できる。
えＤＮＡとして適当な微生物（宿主）に導入し、発現さ
せることによりフィードバック阻害が解除されたＡＫII
Iを保有する微生物を取得できる。
【００４３】宿主としては、エシェリヒア属に属する微
生物が好ましく、例えば大腸菌（E. coli）が挙げられ
る。
生物が好ましく、例えば大腸菌（E. coli）が挙げられ
る。
【００４４】また、組換えＤＮＡから変異ＡＫIII遺伝
子断片を取り出し、他のベクターに挿入したものを使用
してもよい。本発明において用いることのできることの
できるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤ
ＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG29
9、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW
118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージ
ＤＮＡのベクターやトランスポゾンのベクターも利用で
きる。
子断片を取り出し、他のベクターに挿入したものを使用
してもよい。本発明において用いることのできることの
できるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤ
ＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG29
9、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW
118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージ
ＤＮＡのベクターやトランスポゾンのベクターも利用で
きる。
【００４５】さらに、変異型ＡＫIII遺伝子の発現を効
率的に実施するために、変異型ＡＫIIIをコードするＤ
ＮＡの上流に、lac、trp、PL等の微生物内で働く他のプ
ロモーターを連結してもよく、ＡＫIII遺伝子に含まれ
るプロモーターをそのまま、あるいは増幅して用いても
よい。
率的に実施するために、変異型ＡＫIIIをコードするＤ
ＮＡの上流に、lac、trp、PL等の微生物内で働く他のプ
ロモーターを連結してもよく、ＡＫIII遺伝子に含まれ
るプロモーターをそのまま、あるいは増幅して用いても
よい。
【００４６】また、上記のように、変異型遺伝子を自律
複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入
し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主に保
持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M., Bio/T
echnol. 1, 417 (1983)）、Muファージ（特開平2-10998
5）または相同性組換え（Experiments in Molecular Ge
netics, Cold SpringHabor Lab. (1972)）を用いた方法
で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入
し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主に保
持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M., Bio/T
echnol. 1, 417 (1983)）、Muファージ（特開平2-10998
5）または相同性組換え（Experiments in Molecular Ge
netics, Cold SpringHabor Lab. (1972)）を用いた方法
で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００４７】＜３＞本発明によるＬ−アミノ酸の製造 上記のようにして得られる変異型ＡＫIII遺伝子を導入
することによって形質転換されたエシェリヒア属細菌
を、好適な培地中で培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸
を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取する
ことにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造することがで
きる。
することによって形質転換されたエシェリヒア属細菌
を、好適な培地中で培養し、該培養物中にＬ−アミノ酸
を生産蓄積させ、該培養物からＬ−アミノ酸を採取する
ことにより、Ｌ−アミノ酸を効率よく製造することがで
きる。
【００４８】Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解
除されたＡＫを保持するエシェリヒア属細菌としては、
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異
を有するＡＫIIIをコードするＤＮＡが染色体ＤＮＡに
組み込まれて形質転換されたエシェリヒア属細菌、また
は該ＤＮＡとエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能
なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡが細胞
内に導入されることによって形質転換されたエシェリヒ
ア属細菌が挙げられる。さらに、エシェリヒア属細菌細
胞を変異処理することにより、変異型ＡＫIIIを産生す
るようになったエシェリヒア属細菌変異株であってもよ
い。
除されたＡＫを保持するエシェリヒア属細菌としては、
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異
を有するＡＫIIIをコードするＤＮＡが染色体ＤＮＡに
組み込まれて形質転換されたエシェリヒア属細菌、また
は該ＤＮＡとエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能
なベクターＤＮＡとを連結してなる組換えＤＮＡが細胞
内に導入されることによって形質転換されたエシェリヒ
ア属細菌が挙げられる。さらに、エシェリヒア属細菌細
胞を変異処理することにより、変異型ＡＫIIIを産生す
るようになったエシェリヒア属細菌変異株であってもよ
い。
【００４９】形質転換の宿主として用いるエシェリヒア
属細菌としては、その細胞内で変異型ＡＫIII遺伝子の
プロモーター又はこれらの遺伝子を発現させるための他
のプロモーターが機能し、さらに変異型ＡＫIII遺伝子
をプラスミド上に染色体外ＤＮＡとして導入する場合に
は、導入するのに用いるベクターＤＮＡの複製起点が細
胞内で機能して複製可能なものであれば利用できる。本
発明による変異型遺伝子を保持する微生物の培養に使用
する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応
じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
属細菌としては、その細胞内で変異型ＡＫIII遺伝子の
プロモーター又はこれらの遺伝子を発現させるための他
のプロモーターが機能し、さらに変異型ＡＫIII遺伝子
をプラスミド上に染色体外ＤＮＡとして導入する場合に
は、導入するのに用いるベクターＤＮＡの複製起点が細
胞内で機能して複製可能なものであれば利用できる。本
発明による変異型遺伝子を保持する微生物の培養に使用
する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応
じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
【００５０】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加
水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトー
ルなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸も
しくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
ス、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加
水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトー
ルなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸も
しくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００５１】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アン
モニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニ
アガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アン
モニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニ
アガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
【００５２】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、
Ｌ−イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を
適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に
応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が少量添加される。
Ｌ−イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を
適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に
応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００５３】培養は、好気的条件下で16〜72時間実施す
るのがよく、培養温度は25℃〜45℃に、培養中pHは5〜8
に制御する。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あ
るいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用す
ることができる。
るのがよく、培養温度は25℃〜45℃に、培養中pHは5〜8
に制御する。尚、pH調整には無機あるいは有機の酸性あ
るいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用す
ることができる。
【００５４】発酵液からのＬ−アミノ酸の採取は通常イ
オン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わ
せることにより実施できる。
オン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わ
せることにより実施できる。
【００５５】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する
に説明する
【００５６】
【実施例１】 変異型ＡＫIII遺伝子の取得（１） ＜１＞野生型ＡＫIII遺伝子のクローニング E. coliのＡＫIII遺伝子（lysC）の塩基配列は既に報告
されており（Cassan,M., Parsot,C., Cohen,G.N., and
Patte,J.C., J.Biol.Chem. 261,1052 (1986)）、オープ
ンリーディングフレーム(ORF)は1347塩基対よりなり、4
49アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが
わかっている。この遺伝子にはオペレーターが存在しＬ
−リジンによる抑制を受けるため、このオペレーター領
域を除くために、SD配列とORFのみを含む領域を、ＰＣ
Ｒ法を用いて増幅し、クローニングすることにした。
されており（Cassan,M., Parsot,C., Cohen,G.N., and
Patte,J.C., J.Biol.Chem. 261,1052 (1986)）、オープ
ンリーディングフレーム(ORF)は1347塩基対よりなり、4
49アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることが
わかっている。この遺伝子にはオペレーターが存在しＬ
−リジンによる抑制を受けるため、このオペレーター領
域を除くために、SD配列とORFのみを含む領域を、ＰＣ
Ｒ法を用いて増幅し、クローニングすることにした。
【００５７】E.coli K-12 MC1061株の全ゲノムＤＮＡを
斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta. 72, 619 (1
963)）により調製し、配列番号２および３に示す配列を
有する２種のプライマーを作製し、これらを用いてH.A.
Erlichらの方法（PCR Technology, Stockton press (19
89)）に従ってＰＣＲ反応を行い、ＡＫIII遺伝子の増幅
を行った。得られたＤＮＡをBamHIとAseIで消化した
後、平滑末端にし、低コピーベクターpMW119のSmaI部位
に挿入してpMLYSC2を構築した。このSmaI部位はベクタ
ー内に存在するlacZプロモーターの下流側に位置してお
り、pMW119のSmaI部位にＤＮＡ断片を挿入して得られる
組換えＤＮＡをE. coliに導入すると、lacZプロモータ
ー制御による転写により、挿入されたＤＮＡ断片が転写
される（図１）。
斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta. 72, 619 (1
963)）により調製し、配列番号２および３に示す配列を
有する２種のプライマーを作製し、これらを用いてH.A.
Erlichらの方法（PCR Technology, Stockton press (19
89)）に従ってＰＣＲ反応を行い、ＡＫIII遺伝子の増幅
を行った。得られたＤＮＡをBamHIとAseIで消化した
後、平滑末端にし、低コピーベクターpMW119のSmaI部位
に挿入してpMLYSC2を構築した。このSmaI部位はベクタ
ー内に存在するlacZプロモーターの下流側に位置してお
り、pMW119のSmaI部位にＤＮＡ断片を挿入して得られる
組換えＤＮＡをE. coliに導入すると、lacZプロモータ
ー制御による転写により、挿入されたＤＮＡ断片が転写
される（図１）。
【００５８】＜２＞変異型ＡＫIII遺伝子のクローニン
グ 国際公開パンフレットWO94/11517及びWO95/16042に記載
されている変異型ＡＫIII遺伝子を持つプラスミドpLYSC
1*80、pLYSC1*117、pLYSC1*126をEcoRIとHindIIIで消化
して変異型ＡＫIII遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出
し、この断片をpMW119のEcoRI-HindIII部位に挿入して
それぞれpMLYSC2*80、pMLYSC2*117、pMLYSC2*126と名付
けたプラスミドをそれぞれ構築した。
グ 国際公開パンフレットWO94/11517及びWO95/16042に記載
されている変異型ＡＫIII遺伝子を持つプラスミドpLYSC
1*80、pLYSC1*117、pLYSC1*126をEcoRIとHindIIIで消化
して変異型ＡＫIII遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出
し、この断片をpMW119のEcoRI-HindIII部位に挿入して
それぞれpMLYSC2*80、pMLYSC2*117、pMLYSC2*126と名付
けたプラスミドをそれぞれ構築した。
【００５９】なお、プラスミドpLYSC1*80は国際公開パ
ンフレットWO94/11517の記載に従って、pLLC*80から調
製可能である。pLLC*80がE. coli HB101株に導入されて
得られる株はAJ12750と命名されて1992年９月１日付で
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番
号３０５ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託さ
れて、受託番号FERM P-13136が付与されている。同株は
1993年11月４日付でブタペスト条約に基づく国際寄託に
移管されており、新たに受託番号FERM BP-4462が付与さ
れている。pLYSC1*117、pLYSC1*126は寄託されていない
が、それぞれの変異点が国際公開パンフレットWO94/115
17に開示されているのでpLYSC1*80を出発材料として容
易に調製できる。
ンフレットWO94/11517の記載に従って、pLLC*80から調
製可能である。pLLC*80がE. coli HB101株に導入されて
得られる株はAJ12750と命名されて1992年９月１日付で
通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番
号３０５ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託さ
れて、受託番号FERM P-13136が付与されている。同株は
1993年11月４日付でブタペスト条約に基づく国際寄託に
移管されており、新たに受託番号FERM BP-4462が付与さ
れている。pLYSC1*117、pLYSC1*126は寄託されていない
が、それぞれの変異点が国際公開パンフレットWO94/115
17に開示されているのでpLYSC1*80を出発材料として容
易に調製できる。
【００６０】＜３＞新規変異型ＡＫIII遺伝子の選択条
件の検討 pMLYSC1をＡＫ完全欠損株E. coli GT3(thrA1016b, metL
M10 05, lysC1004)に導入して得られる形質転換株をGT3/
pMLYSC2と命名した。同様にしてGT3/pMLYSC2*80、GT3/p
MLYSC2*117、GT3/pMLYSC2*126を得た。GT3/pMLYSC2株は
野生型のlysCを含むプラスミドを保持し、同プラスミド
上のlysCにコードされるＡＫIIIが唯一のＡＫである。
最少培地において著量のＬ−リジン存在下では唯一のＡ
Ｋである野生型ＡＫIIIがＬ−リジンにより阻害される
ために、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチ
オニン、及びジアミノピメリン酸(DAP)の合成ができな
くなり生育が抑えられた。Ｌ−リジンによる阻害が解除
された変異型lysCを有するプラスミド保持株は著量のＬ
−リジンが添加された最少培地上での生育が可能になる
と予想し、生育がＬ−リジン耐性となっている株を選択
することによってＬ−リジンによる阻害の解除された変
異型l ysCを含有するプラスミドを保持する株を選択する
ことにした。GT3/pMLYSC2株、GT3/pMLYSC2*80株、GT3/p
MLYSC2*117株、GT3/pMLYSC2*126株をそれぞれ種々の濃
度のＬ−リジンを含有する最少寒天平板培地上で培養を
行い、生育阻止濃度を調べ変異型lysCを含有するプラス
ミド保持株の選択条件の検討を行った。各種濃度でＬ−
リジンを含む最少寒天平板培地での形質転換体の生育を
表１に示す。尚、表中の＋は形質転換株が生育したこと
を示し、±はやや生育したことを示し、−は生育しなか
ったことを示す
件の検討 pMLYSC1をＡＫ完全欠損株E. coli GT3(thrA1016b, metL
M10 05, lysC1004)に導入して得られる形質転換株をGT3/
pMLYSC2と命名した。同様にしてGT3/pMLYSC2*80、GT3/p
MLYSC2*117、GT3/pMLYSC2*126を得た。GT3/pMLYSC2株は
野生型のlysCを含むプラスミドを保持し、同プラスミド
上のlysCにコードされるＡＫIIIが唯一のＡＫである。
最少培地において著量のＬ−リジン存在下では唯一のＡ
Ｋである野生型ＡＫIIIがＬ−リジンにより阻害される
ために、Ｌ−スレオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチ
オニン、及びジアミノピメリン酸(DAP)の合成ができな
くなり生育が抑えられた。Ｌ−リジンによる阻害が解除
された変異型lysCを有するプラスミド保持株は著量のＬ
−リジンが添加された最少培地上での生育が可能になる
と予想し、生育がＬ−リジン耐性となっている株を選択
することによってＬ−リジンによる阻害の解除された変
異型l ysCを含有するプラスミドを保持する株を選択する
ことにした。GT3/pMLYSC2株、GT3/pMLYSC2*80株、GT3/p
MLYSC2*117株、GT3/pMLYSC2*126株をそれぞれ種々の濃
度のＬ−リジンを含有する最少寒天平板培地上で培養を
行い、生育阻止濃度を調べ変異型lysCを含有するプラス
ミド保持株の選択条件の検討を行った。各種濃度でＬ−
リジンを含む最少寒天平板培地での形質転換体の生育を
表１に示す。尚、表中の＋は形質転換株が生育したこと
を示し、±はやや生育したことを示し、−は生育しなか
ったことを示す
【００６１】
【表１】
【００６２】野生型lysCを持つGT3/pMLYSC2株ではＬ−
リジンが0.2Mの添加区で生育が完全に抑えられた。ま
た、従来より知られている変異型lysCを持つGT3/pMLYSC
2*80株、GT3/pMLYSC2*117株、GT3/pMLYSC2*126株でも0.
4MのＬ−リジン添加区で生育がほぼ抑制された。この結
果よりＬ−リジンが0.4Mの添加区において選択を行うこ
とによりこれまでに知られている変異型lysCよりもさら
に阻害解除度の高い変異型が取得できる可能性が示唆さ
れた。なお、この生育阻害はホモセリン及びジアミノピ
メリン酸の同時添加により消去されることを確認した。
リジンが0.2Mの添加区で生育が完全に抑えられた。ま
た、従来より知られている変異型lysCを持つGT3/pMLYSC
2*80株、GT3/pMLYSC2*117株、GT3/pMLYSC2*126株でも0.
4MのＬ−リジン添加区で生育がほぼ抑制された。この結
果よりＬ−リジンが0.4Mの添加区において選択を行うこ
とによりこれまでに知られている変異型lysCよりもさら
に阻害解除度の高い変異型が取得できる可能性が示唆さ
れた。なお、この生育阻害はホモセリン及びジアミノピ
メリン酸の同時添加により消去されることを確認した。
【００６３】変異導入実験にはpMLYSC2を用い、最少寒
天培地M9にＬ−リジン0.4Mを添加したものを、変異型ly
sCを含有するプラスミド保持株の選択に用いた。以下、
実施例１においてこの培地を選択培地という。
天培地M9にＬ−リジン0.4Mを添加したものを、変異型ly
sCを含有するプラスミド保持株の選択に用いた。以下、
実施例１においてこの培地を選択培地という。
【００６４】＜４＞ＡＫIII遺伝子の変異処理と変異型
ＡＫIII遺伝子の取得 pMLYSC1プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを
直接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理
法に加え、変異に多様性を与えるため、即ちヒドロキシ
ルアミンによるシトシンからチミンへの変異以外の変異
を期待して、ＰＣＲ変異処理法の２種の方法を用いた。
ＡＫIII遺伝子の取得 pMLYSC1プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを
直接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理
法に加え、変異に多様性を与えるため、即ちヒドロキシ
ルアミンによるシトシンからチミンへの変異以外の変異
を期待して、ＰＣＲ変異処理法の２種の方法を用いた。
【００６５】2μgのpMLYSC2を 0.4M ヒドロキシルアミ
ン中（0.1M KH2PO4-1mM EDTA (pH6.0) 100μl、1M ヒド
ロキシルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、
水を加えて計200μlとする）で 、75℃の条件下で、１
〜４時間処理した。処理後のＤＮＡをガラスパウダーで
精製後、ＡＫ完全欠損株E. coli GT3株に導入し、完全
培地（ L-broth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast ext
ract, 0.5％ NaCl, 50mg/L Ampicillin, 1.5％ agar）
に撒きコロニーを形成させた。これを選択培地にレプリ
カし、選択培地上に生育可能な株を選択し候補株とし
た。
ン中（0.1M KH2PO4-1mM EDTA (pH6.0) 100μl、1M ヒド
ロキシルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、
水を加えて計200μlとする）で 、75℃の条件下で、１
〜４時間処理した。処理後のＤＮＡをガラスパウダーで
精製後、ＡＫ完全欠損株E. coli GT3株に導入し、完全
培地（ L-broth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast ext
ract, 0.5％ NaCl, 50mg/L Ampicillin, 1.5％ agar）
に撒きコロニーを形成させた。これを選択培地にレプリ
カし、選択培地上に生育可能な株を選択し候補株とし
た。
【００６６】ＰＣＲ法によるランダム変異処理はC.Cadw
ellらの方法（Cadwell,C. and G.F.Joyce, PCR Methods
Applic. 2, 28, (1982)）に従って行った。すなわちpM
LYSC2とM13ユニバーサルプライマーを用いて上記の方法
によりlysC断片を増幅した。この断片をEcoRIとHi ndIII
で消化した後、pMW119のEcoRI-H indIII部位に挿入して
ＡＫ完全欠損株E. coli GT3に導入し、完全培地（ L-br
oth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％
NaCl, 50mg/L Ampicillin, 1.5％ agar）に撒きコロニ
ーを形成させた。これを選択培地にレプリカし、選択培
地上に生育可能な株を選択し候補株とした。
ellらの方法（Cadwell,C. and G.F.Joyce, PCR Methods
Applic. 2, 28, (1982)）に従って行った。すなわちpM
LYSC2とM13ユニバーサルプライマーを用いて上記の方法
によりlysC断片を増幅した。この断片をEcoRIとHi ndIII
で消化した後、pMW119のEcoRI-H indIII部位に挿入して
ＡＫ完全欠損株E. coli GT3に導入し、完全培地（ L-br
oth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％
NaCl, 50mg/L Ampicillin, 1.5％ agar）に撒きコロニ
ーを形成させた。これを選択培地にレプリカし、選択培
地上に生育可能な株を選択し候補株とした。
【００６７】上記で得られた候補株、すなわち、ヒドロ
キシルアミンによる変異処理由来の44株、ＰＣＲ法によ
るランダム変異処理由来の3株、合計47株よりプラスミ
ドを回収して変異型lysCの塩基配列を決定し、変異点を
同定した。塩基配列の決定はDNAシークエンサーABI Mod
el 373A（ABI社製）を使用して、常法に従い行なった。
その結果、ヒドロキシルアミンによる変異処理由来から
4種類（No.1, No.6, No.14, No.21）、ＰＣＲ法による
ランダム変異処理由来から3種類（No.28, No.29, No.3
0）の新規変異点を持つ変異型ＡＫIIIを取得することが
できた（表２）。
キシルアミンによる変異処理由来の44株、ＰＣＲ法によ
るランダム変異処理由来の3株、合計47株よりプラスミ
ドを回収して変異型lysCの塩基配列を決定し、変異点を
同定した。塩基配列の決定はDNAシークエンサーABI Mod
el 373A（ABI社製）を使用して、常法に従い行なった。
その結果、ヒドロキシルアミンによる変異処理由来から
4種類（No.1, No.6, No.14, No.21）、ＰＣＲ法による
ランダム変異処理由来から3種類（No.28, No.29, No.3
0）の新規変異点を持つ変異型ＡＫIIIを取得することが
できた（表２）。
【００６８】
【表２】
【００６９】これら7種類のプラスミド（pMLYSC2*Y1, p
MLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, MLYSC2*Y28, p
MLYSC2*Y29, pMLYSC2*Y30）をＡＫ完全欠損株であるGT3
に導入し、各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、Ａ
ＫIIIの酵素活性を測定した。無細胞抽出液及びＡＫIII
酵素活性の測定は、E.R.Stadtmanらの方法（Stadtman,
E.R., Cohen,G.N., LeBras,G., and Robichon-Szulmajs
ter,H., J.Biol.Chem.236, 2033 (1961)）に従った。ま
た、ＡＫIIIの酵素活性を測定する際、酵素反応液中に
種々の濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンによる阻害
の度合を調べ、結果を表３に示した。 尚、阻害解除度
はＬ−リジン非存在下でのＡＫ活性に対するＬ−リジン
0.4M存在下でのＡＫ残存活性の割合を示している。
MLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, MLYSC2*Y28, p
MLYSC2*Y29, pMLYSC2*Y30）をＡＫ完全欠損株であるGT3
に導入し、各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、Ａ
ＫIIIの酵素活性を測定した。無細胞抽出液及びＡＫIII
酵素活性の測定は、E.R.Stadtmanらの方法（Stadtman,
E.R., Cohen,G.N., LeBras,G., and Robichon-Szulmajs
ter,H., J.Biol.Chem.236, 2033 (1961)）に従った。ま
た、ＡＫIIIの酵素活性を測定する際、酵素反応液中に
種々の濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンによる阻害
の度合を調べ、結果を表３に示した。 尚、阻害解除度
はＬ−リジン非存在下でのＡＫ活性に対するＬ−リジン
0.4M存在下でのＡＫ残存活性の割合を示している。
【００７０】
【表３】
【００７１】この結果が示すように、今回用いた選択方
法により、これまでに知られている代表的な変異型ＡＫ
III（pMLYSC2*80及びpMLYSC2*117にコードされている変
異型ＡＫIII）よりもＬ−リジンに対する阻害解除度が
優れた変異型ＡＫIIIを取得することができた。また総
蛋白当りの比活性は、菌体の生育状況や試料の調製に影
響されるが、いずれもほとんどが野生型及びこれまでの
変異型と同等であり、変異導入による活性低下の問題は
ほとんどなかった。このことより、ＡＫIIIの活性中心
とＬ−リジンによる調節部位がそれぞれ独立しているこ
とが予想された。
法により、これまでに知られている代表的な変異型ＡＫ
III（pMLYSC2*80及びpMLYSC2*117にコードされている変
異型ＡＫIII）よりもＬ−リジンに対する阻害解除度が
優れた変異型ＡＫIIIを取得することができた。また総
蛋白当りの比活性は、菌体の生育状況や試料の調製に影
響されるが、いずれもほとんどが野生型及びこれまでの
変異型と同等であり、変異導入による活性低下の問題は
ほとんどなかった。このことより、ＡＫIIIの活性中心
とＬ−リジンによる調節部位がそれぞれ独立しているこ
とが予想された。
【００７２】
【実施例２】 変異型ＡＫIII遺伝子の取得（２） 358番目のSerをLeuに変異させたlysC遺伝子はLA PCR in
vitro Mutagenesis Kit（宝酒造株式会社製）を用いて
部位特異的変異を導入することで作製した。この際、国
際公開パンフレットWO94/11517及びWO95/16042に記載の
pLYSC1を鋳型として、配列表番号４に記載のプライマー
を変異導入用のプライマーとして用いた。PCR増幅断片
の両端をEcoRIとHindIIIで切断し、pUC19のEcoRIとHind
IIIで切断した断片と接続したものをpLYSC358Lとした。
345番目のSerをIleまたはValに変異させた変異型ＡＫII
I遺伝子は上記と同様の方法で、但しプライマーとして
配列表番号５または配列表番号６を用いて作製した。pU
C19をEcoRIとHindIIIで切断した断片と接続したものを
各々pLYSC345I、pLYSC345Vとした。
vitro Mutagenesis Kit（宝酒造株式会社製）を用いて
部位特異的変異を導入することで作製した。この際、国
際公開パンフレットWO94/11517及びWO95/16042に記載の
pLYSC1を鋳型として、配列表番号４に記載のプライマー
を変異導入用のプライマーとして用いた。PCR増幅断片
の両端をEcoRIとHindIIIで切断し、pUC19のEcoRIとHind
IIIで切断した断片と接続したものをpLYSC358Lとした。
345番目のSerをIleまたはValに変異させた変異型ＡＫII
I遺伝子は上記と同様の方法で、但しプライマーとして
配列表番号５または配列表番号６を用いて作製した。pU
C19をEcoRIとHindIIIで切断した断片と接続したものを
各々pLYSC345I、pLYSC345Vとした。
【００７３】また国際公開パンフレットWO94/11517及び
WO95/16042記載のpLYSC1*48, pLYSC1*117, pLYSC1*126,
pLYSC1*150, pLYSC1*158のEcoRIとHindIIIで切り出さ
れるlysCを含む方の断片をpUC19のEcoRI-HindIII切断部
位に挿入したものを作製し、各々pLYSC2*48, pLYSC2*11
7, pLYSC2*126, pLYSC2*150, pLYSC2*158と命名した。
国際公開パンフレットWO94/11517及びWO95/16042には、
pLYSC1の構造、pLYSC1*48, pLYSC1*117, pLYSC1*126, p
LYSC1*150, pLYSC1*158の変異点の位置が開示されてい
るので、上記プラスミドpLYSC1*80からこれらプラスミ
ドを調製することができる。
WO95/16042記載のpLYSC1*48, pLYSC1*117, pLYSC1*126,
pLYSC1*150, pLYSC1*158のEcoRIとHindIIIで切り出さ
れるlysCを含む方の断片をpUC19のEcoRI-HindIII切断部
位に挿入したものを作製し、各々pLYSC2*48, pLYSC2*11
7, pLYSC2*126, pLYSC2*150, pLYSC2*158と命名した。
国際公開パンフレットWO94/11517及びWO95/16042には、
pLYSC1の構造、pLYSC1*48, pLYSC1*117, pLYSC1*126, p
LYSC1*150, pLYSC1*158の変異点の位置が開示されてい
るので、上記プラスミドpLYSC1*80からこれらプラスミ
ドを調製することができる。
【００７４】次に、このようにして得られた1塩基変異
型lysCの変異点群の中央付近に存在するSspI切断部位
と、pUC19上のlysC下流側に存在するSspI切断部位を用
いて、2種類の変異を合わせもつ変異型lysC遺伝子を作
製した。すなわち、pLYSC2*48のlysC遺伝子上流領域を
含むSspI断片とpLYSC2*158のlysC下流領域を含むSspI断
片を結合してpU2547Mを、pLYSC2*126のlysC上流領域を
含むS spI断片とpLYSC2*158のlysC下流領域を含むSspI断
片を結合してpU2347Mを、pLYSC2*48のlysC上流領域を含
むSspI断片とpLYSC2*117のlysC下流領域を含むSspI断片
を結合してpU2545Lを、pLYSC2*126のlysC上流領域を含
むSs pI断片とpLYSC358LのlysC下流領域を含むSspI断片
を結合してpU2358Lを、pLYSC2*126のlysC上流領域を含
むSspI断片とpLYSC345VのlysC下流領域を含むS spI断片
を結合してpU2345Vを、pLYSC2*126のlysC上流領域を含
むSspI断片とpLYSC345IのlysC下流領域を含むSsp断片を
結合してpU2345Iを、各々作製した。また、pLYSC2*150
とpLYSC2*126の変異点は共にSspI切断部位よりも上流に
位置するため、この2点の変異を合わせ持つ2塩基変異型
lysCの作製は以下のようにして行った。まずpLYSC2*126
を鋳型とし、配列表番号７に示すオリゴヌクレオチドを
プライマーとして、上述のキットを用いて2点の変異を
持つDNA断片を増幅した。次に、得られたDNA断片の両端
をEcoRIとHindIIIで切断し、pUC19のEcoRIとHindIIIで
切断した断片と接続した。このようにして得られたもの
をpU1823Dとした。
型lysCの変異点群の中央付近に存在するSspI切断部位
と、pUC19上のlysC下流側に存在するSspI切断部位を用
いて、2種類の変異を合わせもつ変異型lysC遺伝子を作
製した。すなわち、pLYSC2*48のlysC遺伝子上流領域を
含むSspI断片とpLYSC2*158のlysC下流領域を含むSspI断
片を結合してpU2547Mを、pLYSC2*126のlysC上流領域を
含むS spI断片とpLYSC2*158のlysC下流領域を含むSspI断
片を結合してpU2347Mを、pLYSC2*48のlysC上流領域を含
むSspI断片とpLYSC2*117のlysC下流領域を含むSspI断片
を結合してpU2545Lを、pLYSC2*126のlysC上流領域を含
むSs pI断片とpLYSC358LのlysC下流領域を含むSspI断片
を結合してpU2358Lを、pLYSC2*126のlysC上流領域を含
むSspI断片とpLYSC345VのlysC下流領域を含むS spI断片
を結合してpU2345Vを、pLYSC2*126のlysC上流領域を含
むSspI断片とpLYSC345IのlysC下流領域を含むSsp断片を
結合してpU2345Iを、各々作製した。また、pLYSC2*150
とpLYSC2*126の変異点は共にSspI切断部位よりも上流に
位置するため、この2点の変異を合わせ持つ2塩基変異型
lysCの作製は以下のようにして行った。まずpLYSC2*126
を鋳型とし、配列表番号７に示すオリゴヌクレオチドを
プライマーとして、上述のキットを用いて2点の変異を
持つDNA断片を増幅した。次に、得られたDNA断片の両端
をEcoRIとHindIIIで切断し、pUC19のEcoRIとHindIIIで
切断した断片と接続した。このようにして得られたもの
をpU1823Dとした。
【００７５】以上のようにして得られた2塩基変異型lys
C遺伝子産物（ＡＫIII）のLysに対する阻害解除度を実
施例１に記載したように測定した。その結果、どの2塩
基変異型ＡＫIIIの阻害解除度もそれを構成する1塩基変
異型ＡＫIIIの阻害解除度よりも向上していた（表
４）。なお、pLYSC358L、pLYSC345I、pLYSC345V上にあ
る変異型lysCは新規変異型遺伝子である。各々の遺伝子
産物はリジンによるフィードバック阻害が解除されてい
るが、他の変異と組み合わさることによってその阻害解
除度はさらに向上する。すなわち、2塩基変異型ＡＫIII
構築のための中間体としても有用である。
C遺伝子産物（ＡＫIII）のLysに対する阻害解除度を実
施例１に記載したように測定した。その結果、どの2塩
基変異型ＡＫIIIの阻害解除度もそれを構成する1塩基変
異型ＡＫIIIの阻害解除度よりも向上していた（表
４）。なお、pLYSC358L、pLYSC345I、pLYSC345V上にあ
る変異型lysCは新規変異型遺伝子である。各々の遺伝子
産物はリジンによるフィードバック阻害が解除されてい
るが、他の変異と組み合わさることによってその阻害解
除度はさらに向上する。すなわち、2塩基変異型ＡＫIII
構築のための中間体としても有用である。
【００７６】
【表４】
【００７７】
【実施例３】変異型ＤＤＰＳ及び変異型ＡＫIII遺伝子
を導入した株によるＬ−リジンの発酵生産（１） 変異型ＤＤＰＳ遺伝子と変異型ＡＫIII遺伝子のＬ−リ
ジン生産に対する効果は国際公開パンフレットWO95/160
42に記載されている。これをさらに改良するために、実
施例１で得られた変異型ＡＫIII遺伝子を変異型ＤＤＰ
Ｓ遺伝子と共存させる事とした。
を導入した株によるＬ−リジンの発酵生産（１） 変異型ＤＤＰＳ遺伝子と変異型ＡＫIII遺伝子のＬ−リ
ジン生産に対する効果は国際公開パンフレットWO95/160
42に記載されている。これをさらに改良するために、実
施例１で得られた変異型ＡＫIII遺伝子を変異型ＤＤＰ
Ｓ遺伝子と共存させる事とした。
【００７８】国際公開パンフレットWO95/16042に記載さ
れている変異型ＤＤＰＳ遺伝子を持つプラスミドRSF24P
がE. coli JM109株に導入されて得られる株はAJ12395と
命名されて1993年10月28日付で通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 茨城県つくば
市東１丁目１番３号）に寄託されて、受託番号FERM P-1
3935が付与されている。同株は1994年11月１日付でブタ
ペスト条約に基づく国際寄託に移管されており、新たに
受託番号FERM BP-4858が付与されている。
れている変異型ＤＤＰＳ遺伝子を持つプラスミドRSF24P
がE. coli JM109株に導入されて得られる株はAJ12395と
命名されて1993年10月28日付で通商産業省工業技術院生
命工学工業技術研究所（郵便番号３０５ 茨城県つくば
市東１丁目１番３号）に寄託されて、受託番号FERM P-1
3935が付与されている。同株は1994年11月１日付でブタ
ペスト条約に基づく国際寄託に移管されており、新たに
受託番号FERM BP-4858が付与されている。
【００７９】変異型ＡＫIII遺伝子を含むプラスミドpML
YSC2*Y1, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, MLY
SC2*Y28, pMLYSC2*Y29, pMLYSC2*Y30及びpU2547M, pU23
47M,pU2545L, pU2358L, pU2345V, pU2345I, pU1823Dか
ら選ばれる一つと、変異型ＤＤＰＳ遺伝子を有するプラ
スミドRSF24Pから、変異型ＡＫIII遺伝子と変異型ＤＤ
ＰＳ遺伝子を有するプラスミドRSFDY1, RSFDY6, RSFDY1
4, RSFDY21, RSFDY28,RSFDY29, RSFDY30及びRSFD2547M,
RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2
345I, RSFD1823Dを図２の様にして作製した。
YSC2*Y1, pMLYSC2*Y6, pMLYSC2*Y14, pMLYSC2*Y21, MLY
SC2*Y28, pMLYSC2*Y29, pMLYSC2*Y30及びpU2547M, pU23
47M,pU2545L, pU2358L, pU2345V, pU2345I, pU1823Dか
ら選ばれる一つと、変異型ＤＤＰＳ遺伝子を有するプラ
スミドRSF24Pから、変異型ＡＫIII遺伝子と変異型ＤＤ
ＰＳ遺伝子を有するプラスミドRSFDY1, RSFDY6, RSFDY1
4, RSFDY21, RSFDY28,RSFDY29, RSFDY30及びRSFD2547M,
RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSFD2
345I, RSFD1823Dを図２の様にして作製した。
【００８０】尚、対照として国際公開パンフレットWO95
/16042に記載されているプラスミドRSFD80を用いた。プ
ラスミドRSFD80がE. coli JM109株に導入されて得られ
る株はAJ12396と命名されて1993年10月28日付で通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０
５ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されて、
受託番号FERM P-13936が付与されている。同株は1994年
11月１日付でブタペスト条約に基づく国際寄託に移管さ
れており、新たに受託番号FERM BP-4859が付与されてい
る。
/16042に記載されているプラスミドRSFD80を用いた。プ
ラスミドRSFD80がE. coli JM109株に導入されて得られ
る株はAJ12396と命名されて1993年10月28日付で通商産
業省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０
５ 茨城県つくば市東１丁目１番３号）に寄託されて、
受託番号FERM P-13936が付与されている。同株は1994年
11月１日付でブタペスト条約に基づく国際寄託に移管さ
れており、新たに受託番号FERM BP-4859が付与されてい
る。
【００８１】上記により作製したRSFDY1, RSFDY6, RSFD
Y14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29,RSFDY30及びRSFD2547
M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSF
D2345I, RSFD1823Dを常法にしたがいB-399株に導入し、
各々Ｌ−リジン生産株を得た。以上の菌株についてのＬ
−リジン生産性について評価を行なった。コントロール
として、B-399/RSFD80についてもＬ−リジン生産性の評
価を行った。なお、B-399株の入手方法は際公開パンフ
レットWO95/16042に記載されている。
Y14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29,RSFDY30及びRSFD2547
M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345V, RSF
D2345I, RSFD1823Dを常法にしたがいB-399株に導入し、
各々Ｌ−リジン生産株を得た。以上の菌株についてのＬ
−リジン生産性について評価を行なった。コントロール
として、B-399/RSFD80についてもＬ−リジン生産性の評
価を行った。なお、B-399株の入手方法は際公開パンフ
レットWO95/16042に記載されている。
【００８２】培養は、国際公開パンフレットWO95/16042
に記載されている方法と同様のＬ−リジン生産培地を用
い、培養時間48時間、温度37℃の条件下、攪拌114〜116
rpmで行った。結果を表５に示した。
に記載されている方法と同様のＬ−リジン生産培地を用
い、培養時間48時間、温度37℃の条件下、攪拌114〜116
rpmで行った。結果を表５に示した。
【００８３】
【表５】
【００８４】
【実施例４】変異型ＤＤＰＳ及び変異型ＡＫIII遺伝子
を導入した株によるＬ−リジンの発酵生産（２） エシェリヒア属細菌に変異型ＤＤＰＳ遺伝子と、変異型
ＡＫIII遺伝子を保持させて、Ｌ−リジンの生産性が改
善できることが実施例３で確認された。この効果が、宿
主を変更した場合にも維持されるかどうかを実験した。
を導入した株によるＬ−リジンの発酵生産（２） エシェリヒア属細菌に変異型ＤＤＰＳ遺伝子と、変異型
ＡＫIII遺伝子を保持させて、Ｌ−リジンの生産性が改
善できることが実施例３で確認された。この効果が、宿
主を変更した場合にも維持されるかどうかを実験した。
【００８５】宿主には、E. coli W3110(tyrA)株を用い
た。W3110(tyrA)株は欧州特許公開92年488424号公報に
その詳しい記載がある。欧州特許公開92年488424号公報
には、W3110(tyrA)株にプラスミドを導入して形成され
る株が多く記載されている。例えば、プラスミドpHATer
mを導入して得られる株は、E. coli W3110(tyrA)/pHATe
rm株と命名され、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所（郵便番号３０５ 茨城県つくば市東１丁目１
番３号）に1991年11月18日付でブタペスト条約に基づき
国際寄託されており、寄託番号FERM BP-3653が付与され
ている。このE. coli W3110(tyrA)/pHATerm株からプラ
スミドpHATermを脱落させることによってもW3110(tyrA)
株を取得することができる。プラスミドの脱落は常法に
よって行うことができる。
た。W3110(tyrA)株は欧州特許公開92年488424号公報に
その詳しい記載がある。欧州特許公開92年488424号公報
には、W3110(tyrA)株にプラスミドを導入して形成され
る株が多く記載されている。例えば、プラスミドpHATer
mを導入して得られる株は、E. coli W3110(tyrA)/pHATe
rm株と命名され、通商産業省工業技術院生命工学工業技
術研究所（郵便番号３０５ 茨城県つくば市東１丁目１
番３号）に1991年11月18日付でブタペスト条約に基づき
国際寄託されており、寄託番号FERM BP-3653が付与され
ている。このE. coli W3110(tyrA)/pHATerm株からプラ
スミドpHATermを脱落させることによってもW3110(tyrA)
株を取得することができる。プラスミドの脱落は常法に
よって行うことができる。
【００８５】前記のようにして得られたW3110(tyrA)株
に、実施例３で得られた変異型ＤＤＰＳ及び変異型ＡＫ
III遺伝子をともに含有するプラスミドRSFDY1, RSFDY6,
RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30及びRS
FD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345
V, RSFD2345I, RSFD1823Dを導入し,実施例３と同様にＬ
−リジン生産性について評価を行なった。コントロール
として、W3110(tyrA)株にRSFD80を常法に従い導入し、W
3110(tyrA)/RSFD80を得、この菌株についてもＬ−リジ
ン生産性の評価を行った。結果を表６に示した。
に、実施例３で得られた変異型ＤＤＰＳ及び変異型ＡＫ
III遺伝子をともに含有するプラスミドRSFDY1, RSFDY6,
RSFDY14, RSFDY21, RSFDY28, RSFDY29, RSFDY30及びRS
FD2547M, RSFD2347M, RSFD2545L, RSFD2358L, RSFD2345
V, RSFD2345I, RSFD1823Dを導入し,実施例３と同様にＬ
−リジン生産性について評価を行なった。コントロール
として、W3110(tyrA)株にRSFD80を常法に従い導入し、W
3110(tyrA)/RSFD80を得、この菌株についてもＬ−リジ
ン生産性の評価を行った。結果を表６に示した。
【００８６】
【表６】
【００８７】
【実施例５】 変異型ＡＫIII遺伝子を導入した株によ
るＬ−スレオニンの発酵生産 E. coliスレオニン生産菌としては B-3996株が現在知ら
れている内で最も高い生産能を持っている。そこで、変
異型ＡＫIIIを評価するに当たり、B-3996株を宿主に用
いることとした。B-3996株はUSP5,175,107 に記載され
る株で、ReserchInstitute for Genetics and Industri
al Microorganism Breedingに、登録番号BKIIM B-3996
のもとに寄託されている。また、評価する変異型ＡＫII
I遺伝子としては実施例４においてＬ−リジンの生産性
の良かった変異型の中から3種類（RSFDY6, RSFD2547M,
RSFD1823Dの変異型ＡＫIII遺伝子）を選び実験に供し
た。まず、変異型ＡＫIII遺伝子の発現量を増すため、p
MLYSC2*Y6上にあった変異型ＡＫIII遺伝子をpUC19（宝
酒造社製）のlacZプロモーター下流につなぎかえた。こ
うして作成された新規プラスミドをpLLC*Y6命名した
（図３）。pU2547MとpU1823Dについては、元々pUC19
（宝酒造社製）のlacZプロモーター下流に変異型ＡＫII
I遺伝子が位置しているのでそのまま用いた。
るＬ−スレオニンの発酵生産 E. coliスレオニン生産菌としては B-3996株が現在知ら
れている内で最も高い生産能を持っている。そこで、変
異型ＡＫIIIを評価するに当たり、B-3996株を宿主に用
いることとした。B-3996株はUSP5,175,107 に記載され
る株で、ReserchInstitute for Genetics and Industri
al Microorganism Breedingに、登録番号BKIIM B-3996
のもとに寄託されている。また、評価する変異型ＡＫII
I遺伝子としては実施例４においてＬ−リジンの生産性
の良かった変異型の中から3種類（RSFDY6, RSFD2547M,
RSFD1823Dの変異型ＡＫIII遺伝子）を選び実験に供し
た。まず、変異型ＡＫIII遺伝子の発現量を増すため、p
MLYSC2*Y6上にあった変異型ＡＫIII遺伝子をpUC19（宝
酒造社製）のlacZプロモーター下流につなぎかえた。こ
うして作成された新規プラスミドをpLLC*Y6命名した
（図３）。pU2547MとpU1823Dについては、元々pUC19
（宝酒造社製）のlacZプロモーター下流に変異型ＡＫII
I遺伝子が位置しているのでそのまま用いた。
【００８８】これらプラスミドを常法にしたがいB-3996
株に導入、評価を行なった。培養は、国際公開パンフレ
ットWO94/11517に記載されている方法により行った。
株に導入、評価を行なった。培養は、国際公開パンフレ
ットWO94/11517に記載されている方法により行った。
【００８９】B-3996株にpLLC*Y6, pU2547M, pU1823Dを
形質転換したものそれぞれについて、リジン 1g/L 添
加、無添加の２通りの条件で培養を行なった。コントロ
ールとしては宿主 B-3996株のみのものと、国際公開パ
ンフレットWO94/11517に記載されているB-3996/pLLC*80
をおいた。
形質転換したものそれぞれについて、リジン 1g/L 添
加、無添加の２通りの条件で培養を行なった。コントロ
ールとしては宿主 B-3996株のみのものと、国際公開パ
ンフレットWO94/11517に記載されているB-3996/pLLC*80
をおいた。
【００９０】結果を表７に示す。表７中のリジン感受性
とは、（リジン添加時の対消費糖収率）／（リジン無添
加時の対消費糖収率）である。リジン添加培養時にみら
れる対消費糖収率の低下はB-3996株では無添加区に対し
約0.74、B-3996/pLLC*80においては約0.90である。今回
新たに取得した変異型ＡＫIII遺伝子はそれぞれ、スレ
オニンの生産性及びリジン感受性においても若干の優位
性を示していた。
とは、（リジン添加時の対消費糖収率）／（リジン無添
加時の対消費糖収率）である。リジン添加培養時にみら
れる対消費糖収率の低下はB-3996株では無添加区に対し
約0.74、B-3996/pLLC*80においては約0.90である。今回
新たに取得した変異型ＡＫIII遺伝子はそれぞれ、スレ
オニンの生産性及びリジン感受性においても若干の優位
性を示していた。
【００９１】
【表７】
【００９２】
【発明の効果】本発明により、Ｌ−リジンによるフィー
ドバック阻害が十分に解除されたエシェリヒア属細菌由
来の変異型ＡＫIII遺伝子が得られた。この遺伝子をエ
シェリヒア属細菌に導入することにより、従来よりもさ
らに改良されたＬ−アミノ酸生産菌を得ることができ
た。このＬ−アミノ酸生産菌を用いることによって、従
来より優れた発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供
することができる。
ドバック阻害が十分に解除されたエシェリヒア属細菌由
来の変異型ＡＫIII遺伝子が得られた。この遺伝子をエ
シェリヒア属細菌に導入することにより、従来よりもさ
らに改良されたＬ−アミノ酸生産菌を得ることができ
た。このＬ−アミノ酸生産菌を用いることによって、従
来より優れた発酵法によるＬ−アミノ酸の製造法を提供
することができる。
【００９３】
配列番号：１ 配列の長さ：2147 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 株名：MC1061 配列の特徴： 特徴を表わす記号：-35 signal 存在位置：242..249 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：-10 signal 存在位置：265..273 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：primer bind 存在位置：536..555 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：primer bind 存在位置：2128..2147 特徴を決定した方法：Ｅ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：ＲＢＳ 存在位置：５７５．．５７８ 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：584..1933 特徴を決定した方法：Ｓ 配列の特徴： 特徴を表わす記号：terminator 存在位置：1941..1968 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60 AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120 AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180 AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240 CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC 300 CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360 AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420 TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480 ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540 CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595 Met Ser Glu Ile 1 GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643 Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met 5 10 15 20 AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691 Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val 25 30 35 GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739 Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala 40 45 50 GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787 Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala Ile Arg 55 60 65 AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835 Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val Ile 70 75 80 CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883 Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Val Leu Ala Glu 85 90 95 100 GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser 105 110 115 CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979 His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu Ile Leu Arg Glu 120 125 130 CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027 Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr 135 140 145 AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075 Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu 150 155 160 CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123 Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val Ile 165 170 175 180 ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171 Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu 185 190 195 GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219 Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu 200 205 210 CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267 His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro Gly Ile Tyr Thr 215 220 225 ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315 Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile Asp Glu Ile Ala 230 235 240 TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363 Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His 245 250 255 260 CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411 Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile Pro Val Phe Val 265 270 275 GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459 Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys 280 285 290 ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507 Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln 295 300 305 ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555 Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe 310 315 320 CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603 Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Val Asp 325 330 335 340 TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651 Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr 345 350 355 GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699 Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met 360 365 370 GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747 Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu 375 380 385 GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795 Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys 390 395 400 GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843 Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg Met Ile Cys Tyr 405 410 415 420 GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891 Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala 425 430 435 GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940 Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu 440 445 ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000 ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT 2060 ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120 TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147
【００９４】配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20
【００９５】配列番号：３ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAATTCCTTT GCGAGCAG 18
【００９６】配列番号：４ 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAGGTCAGAC CGGTGGTATC AAGGGTTAAT GC 32
【００９７】配列番号：５ 配列の長さ：51 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTATCAAGG GTTAATGCCA CGCTCACTTC GATCGTGGTG ATTAAGTCTA C 51
【００９８】配列番号：６ 配列の長さ：51 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTATCAAGG GTTAATGCCA CGCTCACTTC AACCGTGGTG ATTAAGTCTA C 51
【００９９】配列番号：７ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCAGTATAT TCAGGCTGTG CAAAGTGAGC 30
【図１】 pMLYSC2の製造工程を示す図
【図２】 RSFDシリーズのプラスミドの製造工程を示す
図
図
【図３】 pLLC*Y6の製造工程を示す図
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (6)
- 【請求項１】 エシェリヒア属細菌のアスパルトキナー
ゼIIIをコードし、該アスパルトキナーゼIIIのリジンに
よるフィードバック阻害を解除する変異をコーディング
領域内に有する遺伝子を含有するＤＮＡであって、該変
異がアスパルトキナーゼIIIの318番目のメチオニン残基
を別のアミノ酸残基に置換させかつ323番目のグリシン
残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、325番目の
ロイシン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ347番
目のバリン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、
323番目のグリシン残基を別のアミノ酸残基に置換させ
かつ347番目のバリン残基を別のアミノ酸残基に置換さ
せる変異、325番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基
に置換させかつ345番目のセリン残基を別のアミノ酸残
基に置換する変異、323番目のグリシン残基を別のアミ
ノ酸残基に置換させかつ358番目のセリン残基を別のア
ミノ酸残基に置換する変異、344番目のスレオニン残基
を別のアミノ酸残基に置換させる変異、250番目のグル
タミン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、34
6番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基に置換さ
せかつ347番目のロイシン残基を別のアミノ酸残基に置
換させる変異、250番目のグルタミン酸残基を別のアミ
ノ酸残基に置換させかつ364番目のスレオニン残基を別
のアミノ酸残基に置換させる変異、202番目のアスパラ
ギン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ321番目
のセリン残基を別のアミノ酸残基に置換させる変異、28
3番目のアルギニン残基を別のアミノ酸残基に置換させ
かつ333番目のアラニン残基を別のアミノ酸残基に置換
させかつ338番目のセリン残基を別のアミノ酸残基に置
換させかつ346番目のグルタミン酸残基を別のアミノ酸
残基に置換させかつ414番目のアスパラギン残基を別の
アミノ酸残基に置換させる変異、318番目のメチオニン
残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ321番目のセリ
ン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ328番目のバ
リン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ349番目の
バリン残基を別のアミノ酸残基に置換させかつ405番目
のグルタミン酸残基を別のアミノ酸残基に置換させる変
異であるもの。 - 【請求項２】 変異がアスパルトキナーゼIIIの318番目
のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ32
3番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させ
る変異、325番目のロイシン残基をフェニルアラニン残
基に置換させかつ347番目のバリン残基をメチオニン残
基に置換させる変異、323番目のグリシン残基をアスパ
ラギン酸残基に置換させかつ347番目のバリン残基をメ
チオニン残基に置換させる変異、325番目のロイシン残
基をフェニルアラニン残基に置換させかつ345番目のセ
リン残基をロイシン残基に置換する変異、323番目のグ
リシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ358番
目のセリン残基をロイシン残基に置換する変異、344番
目のスレオニン残基をメチオニン残基に置換させる変
異、250番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換さ
せる変異、346番目のグルタミン酸残基をリジン残基に
置換させかつ347番目のロイシン残基をフェニルアラニ
ン残基に置換させる変異、250番目のグルタミン酸残基
をリジン残基に置換させかつ364番目のスレオニン残基
をメチオニン残基に置換させる変異、202番目のアスパ
ラギン酸残基をグリシン残基に置換させかつ321番目の
セリン残基をプロリン残基に置換させる変異、283番目
のアルギニン残基をセリン残基に置換させかつ333番目
のアラニン残基をスレオニン残基に置換させかつ338番
目のセリン残基をスレオニン残基に置換させかつ346番
目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に置換させ
かつ414番目のアスパラギン残基をセリン残基に置換さ
せる変異、318番目のメチオニン残基をリジン残基に置
換させかつ321番目のセリン残基をプロリン残基に置換
させかつ328番目のバリン残基をフェニルアラニン残基
に置換させかつ349番目のバリン残基をグリシン残基に
置換させかつ405番目のグルタミン酸残基をバリン残基
に置換させる変異である請求項１記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡが、エシェリヒア
属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡに接続さ
れて得られる組換えＤＮＡ。 - 【請求項４】 請求項１記載のＤＮＡを有するエシェリ
ヒア属に属する微生物。 - 【請求項５】 請求項４項記載の微生物であってＬ−ア
ミノ酸生産能を有するものを発酵培地中で培養し、該培
養物中にＬ−アミノ酸を生産蓄積させ、該培養物からＬ
−アミノ酸を採取することを特徴とするＬ−アミノ酸の
製造法。 - 【請求項６】 Ｌ−アミノ酸がＬ−リジンまたはＬ−ス
レオニンである請求項５記載の方法。
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