JP2010098998A - 1,5−ペンタンジアミンの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】1,5−ペンタンジアミンを生産する能力を有する大腸菌(E.coli)を培養することによる1,5−ペンタンジアミンの製造方法であって、前記細菌がL−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIを発現し、かつリジンデカルボキシラーゼの発現が増強されていることを特徴とする1,5−ペンタンジアミンの製造方法。
【選択図】なし
Description
<1>野生型lysCのクローニング
大腸菌(E.coli)のAKIIIをコードする遺伝子(lysC)の塩基配列は既に報告されており(Cassan M., Parsot C., Cohen G.N. and Patte J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052 (1986))、オープンリーディングフレーム(ORF)は1347塩基対よりなり、449アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわかっている。この遺伝子にはオペレーターが存在しL−リジンによる抑制を受けるため、このオペレーター領域を除くために、SD配列とORFのみを含む領域を、PCR法を用いて増幅し、クローニングすることにした。
L−リジンによる阻害の解除されたAKIIIをコードする変異型lysCを含有するプラスミド保持株は、著量のL−リジンが添加された最少培地M9上での生育が可能になると予想し、生育がL−リジンに耐性となっている株を選択することによって、変異型lysCを含有するプラスミド保持株を選択することにした。まず、変異型lysCを効率よく取得するために、<1>で作製したpSY1上のlysCに変異処理を行なうことにした。
Gif106M1/pSY1株をそれぞれ種々の濃度のL−リジンを含有するM9寒天平板培地上で培養を行なった。そしてL−リジンによる生育阻止濃度を調べ、変異型lysCを含有するプラスミド保持株の選択条件の検討を行なった。各種濃度でL−リジンを含むM9培地での形質転換体の生育を表1に示す。なお、表中の+は形質転換株が生育したことを示し、±はやや生育したことを示し、−は生育しなかったことを示す。
pSY1プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法を用いた。
2μgのpSY1を0.4M ヒドロキシルアミン中(500mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH6.0) 20μl、4M ヒドロキシルアミン塩酸塩 20μl、10mM EDTA(pH6.0)20μl、水を加えて計100μlとする)で、60℃及び62.5℃の条件下で、30分処理した。処理後のDNAをGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(GE Healthcare製)で精製後、高効率コンピテントセルE.coli XL10Gold(Takara社製)に導入し、完全培地(Lbroth:1% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5%寒天)に撒きコロニーを形成させた。プレート上に出現したコロニーをすべて掻き集め、QIAprep Spin Miniprep Kit (キアゲン社)によりプラスミド抽出し、AKI、AKIIおよびAKIII完全欠損株であるGif106M1株に導入し、これを(1−2−1)で設定した選択培地に撒き、生育可能な株を選択し候補株とした。
pSY1のプラスミドDNAを鋳型とし、配列番号18に示す合成DNAプライマーと、プロメガ(Promega)社のGeneEditor in vitro Site-Directed Mutagenesis Systemを用いて、配列番号2に示すアミノ酸配列を有するAKIII遺伝子に、N−末端から352番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異を導入した。この変異を有するアミノ酸配列を有する遺伝子は、上記に示したとおりリジンによるフィードバック阻害が解除されることが既に分かっており、これをlysCMPと命名した。そして、pSY1と同様に、図1に示すようにlysCMPをpMW119のEcoRI、XbaI部位に挿入したプラスミドpSYMPを得た。
常法に従い、今回取得したlysCM1、lysCM4、lysCM6、lysCM10、lysCM11、lysCMPそれぞれについて塩基配列を決定し、野生型lysCとの変異点を明らかにした。結果を表3に示す。(1−2−2)で取得した変異型lysCの塩基配列の変異の種類は5種類であった。lysCM6に関しては、野生型lysC遺伝子と塩基配列は同一であり、変異は確認されなかった。(1−2−3)で合成したlysCMPにおいては、配列番号2に示すアミノ酸配列のN−末端から352番目のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換された変異を確認した。
上記変異型lysCであることが確認できたlysCM1、lysCM4、lysCM10、lysCM11をpSY1同様pMW119に挿入したプラスミドを得、それぞれ図1に示した通り、pSYM1、pSYM4、pSYM10、pSYM11と命名した。そして、AKI、AKIIおよびAKIII完全欠損株Gif106M1をpSY1、pSYM1、pSYM4、pSYM10、pSYM11またはpSYMPで形質転換し、各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、AKIIIの酵素活性を測定した。
実施例1において取得したL−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有する変異型LysCを用いて、1,5−ペンタンジアミン生産を行った。
A:(NH4)2SO4 16g/L
KH2PO4 1g/L
MgSO4・7H2O 1g/L
FeSO4・7H2O 0.01g/L
MnSO4・5H2O 0.01g/L
Yeast Extract (Difco) 2g/L
KOHでpH6.5に調整し、121℃で20分オートクレーブ
B:25%グルコース(115℃で10分オートクレーブ)
A:Bを4:1で混合し、抗生物質(アンピシリン 50μg/ml)を加える。
使用カラム:CAPCELL PAK C18(資生堂)
移動相:0.1%(w/w)リン酸水溶液:アセトニトリル=4.5:5.5
検出:UV360nm
サンプル前処理:分析サンプル25μlに内標として、1,4−ジアミノブタン(0.03M)を25μl、炭酸水素ナトリウム(0.075M)を150μlおよび2,4−ジニトロフルオロベンゼン(0.2M)のエタノール溶液を添加混合し、37℃の温度で1時間保温する。上記の反応溶液50μlを1mlアセトニトリルに溶解後、10,000rpmで5分間遠心した後の上清10μlをHPLC分析した。
染色体中に存在するリジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現量を増強させるために、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターを大腸菌のgapA遺伝子(グリセルアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子)プロモーターと置換した株の作製を試みた。プロモーターの置換は、FLPレコンビナーゼを用いた相同組換えによる遺伝子破壊方法を改変して行った。以下に、作製方法を示す。
大腸菌W3110株を培養し遠心回収後、UltraClean Microbial DNA Isolation Kit(MO BIO社製)を用いてゲノムDNAの抽出を行った。詳細な操作方法は、付属のプロトコールに従った。
次に、<1>で得られた大腸菌W3110のゲノムDNAを鋳型として、オリゴヌクレオチド(配列番号9(CadAF2)、配列番号10(CadAR2))をプライマーセットとしてPCRを行い、リジンデカルボキシラーゼをコードしているcadA遺伝子のクローニングを行った。PCR増幅反応は、伸張反応のみ2分に変えた以外は<1>と同様な条件で行った。なお、遺伝子増幅用プライマー(配列番号9(CadAF2)、配列番号10(CadAR2))には、5末端側にHindIII、3末端側にXbaI認識配列が付加されるようにして作製した。得られたDNA断片を<1>と同様な方法でpUC118ベクターにライゲーションし、cadA遺伝子が挿入されているpUC118ベクターを得た。得られたベクターを制限酵素HindIIIおよびXbaIで切断して、cadA遺伝子が挿入されているプラスミドを確認した。
次に、クロラムフェニコール耐性遺伝子(cat遺伝子)およびその上下流にFLP認識サイト(FRT)を有するベクターpKD3を鋳型、オリゴヌクレオチド(配列番号11、配列番号12)をプライマーセットとして、PCRによりcat遺伝子のクローニングを行った。PCR増幅反応は、伸張反応のみ1分に変えた以外は<1>と同様な条件で行った。なお、遺伝子増幅用プライマー(配列番号11、配列番号12)には、5末端側にBamHI、3末端側にSacI認識配列が付加されるようにして作製した。得られたDNA断片を<1>と同様な方法でpUC118ベクターにライゲーションし、cat遺伝子が挿入されているpUC118ベクターを得た。得られたベクターを制限酵素BamHIおよびSacIで切断して、cat遺伝子が挿入されているプラスミドを確認した。
次に、cat遺伝子が挿入されているpUC118ベクターを制限酵素BamHIで切断し、得られたDNA断片を上記pHS7のBamHI/SacI切断部位に導入したプラスミドを作製した。得られたベクターを制限酵素BamHIおよびSacIで切断して、cat遺伝子が挿入されていることを確認した。このようにして得られたプラスミドをpKS5とした。
次に、gapAプロモーターが挿入されたpUC118ベクターを制限酵素HindIIIで切断し、得られたDNA断片を上記pKS5のHindIII切断部位に導入したプラスミドを作製した。このプラスミドDNAを鋳型、オリゴヌクレオチド(配列番号13(M13 RV)、配列番号8(KS030))をプライマーセットとしてPCRを行った。PCRにはPremixTaq ExTaqバージョン Ver(タカラバイオ社製)を用いた。このPCRにより、約500bpの増幅断片が得られるプラスミドを目的のプラスミドとして選抜した。このようにして得られたプラスミドをpKS8とした。
大腸菌で1,5−ペンタンジアミンを大量生産させるためには、リジンデカルボキシラーゼ遺伝子の発現を増強した宿主を用いることが好ましい。そこで、変異型lysCが大腸菌で1,5−ペンタンジアミンを大量する際に及ぼす影響を評価するに当たり、実施例3で作製したW3110(gap−cadA)株を使用した。
W3110株をpSY1で形質転換し、得られた形質転換体について実施例2と同様にして、1,5−ペンタンジアミン生産性を調べた。結果を表7に示す。
実施例2で得られたW3110(gapA−cadA)株をpSY1で形質転換し、得られた形質転換体について実施例2と同様に1,5−ペンタンジアミン生産性を調べた。結果を表8に示す。
Claims (4)
- 1,5−ペンタンジアミンを生産する能力を有する大腸菌(E.coli)を培養することによる1,5−ペンタンジアミンの製造方法であって、前記細菌がL−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIを発現し、かつリジンデカルボキシラーゼの発現が増強されていることを特徴とする1,5−ペンタンジアミンの製造方法。
- 前記L−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異を有するアスパルトキナーゼIIIが、大腸菌(E.coli)由来のアスパルトキナーゼIIIの変異体であることを特徴とする、請求項1に記載の1,5−ペンタンジアミンの製造方法。
- 前記L−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異が、配列番号2で表されるアミノ酸配列のN−末端から354番目のアスパラギン酸残基がアスパラギンに置換する変異、354番目のアスパラギン酸残基がバリン残基に置換する変異、該アミノ酸配列の381番目のグルタミン酸残基がバリン残基に置換する変異、該アミノ酸配列の354番目のアスパラギン酸残基がバリン残基に置換しかつ381番目のグルタミン酸残基がバリン残基に置換する変異、該アミノ酸配列の321番目のセリン残基がフェニルアラニン残基に置換する変異および該アミノ酸配列の421番目のグリシン残基がアスパラギン酸残基に置換する変異からなる群から選択される変異を有することを特徴とする請求項1または2に記載の1,5−ペンタンジアミンの製造方法。
- 前記リジンデカルボキシラーゼが、大腸菌(E.coli)由来であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の1,5−ペンタンジアミンの製造方法。
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